アセチル化酵素複合体によるクロマチン構造抑制機構
Regulation of Silenced Chromatin by the Acetyltransferase Complex
研究代表者 長田 茂宏 （大阪大学大学院薬学研究科・助手）
Shigehiro OSADA, Graduate School of Pharmaceutical Sciences,
Osaka University, Research Associate.
サイレンシングはプロモーターや DNA の塩基配列に依存しないクロマチン上の比較的 広 い 範 囲 で 起 き る 遺 伝 子 発 現 の 抑 制 機 構 で あ る 。 出 芽 酵 母 （ Saccharomycescerevisiae）においては、サイレンシング遺伝子座は接合型の決定に関与する遺伝子座（HMLα, HMRa）、テロメア領域、rDNA リピート領域に存在する。Sas2（SomethingAbout Silencing 2）タンパク質はサイレンシングに関与するヒストンアセチル化酵素複合体（SAS 複合体）の活性サブユニットとして機能する。我々は Sas2p がクロマチン形成因子 ASF1 (anti-silencing function 1)に依存して HMLα領域に作用するが、SIR1,SIR2 には依存しないことを示した。また、Sir2p の局在は SAS2 により制御を受けることを示した。これらのことから、SAS 複合体の局在が Sir2p の局在を基底し、HMLαサイレンシングに関与する可能性を示した。
AbstractSilencing affects gene repression in a regional rather than promoter- or sequence-specificmanner. In Saccharomyces cerevisiae, silenced loci include the HMLα and HMRamating-type loci, the telomere regions, and the ribosomal DNA repeats. Sas2p is a catalytic
subunit of the SAS histone acetyltransferse complex. We revealed that the SAS complex wasassociated with the HMLα locus, and ASF1, which encodes chromatin assembly factor Asf1p,
but not SIR1 and SIR2, was necessary for this localization. We also found that Sir2p
association with HMLα was partially dependent on SAS2. These data suggest that
ASF1-dependent localization of the SAS complex may function in Sir2p association and berequired for the SIR1-dependent HMLα silencing.
１. 研究目的
真核生物の核内 DNA はヒストン八量体に巻き付いたヌクレオソームを基本単位としたクロマチンに存在する。生物が正常な生命活動を営むためには、遺伝子は適切な時期に適切な量発現する以外は正常に抑制されている必要がある。
近年、エピジェネティクス（DNA の塩基配列の変化を必要とせずに、細胞分裂を通じて次世代に伝えることができる遺伝子機能制御機構）による遺伝子発現制御機構の解明がすすめられている。エ
ピジェネティクス制御のひとつとして、ヒストン修飾による制御が挙げられる。
ヒストンの N 末端領域はリジン残基などを多く含み塩基性に富んでおり、アセ-1-チル化やメチル化などの様々な化学修飾を受ける。そして、その修飾の組合せにより、活性/不活性クロマチンなどの変換が起き、遺伝子機能が制御されている。一般にヒストンのアセチル化は遺伝子発現が活発に起きている活性クロマチンに関与し、脱アセチル化は不活性クロマチン形成に関与する。出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）の Sas2p はヒストンアセチル化酵素複合体（SAS 複合体）の活性サブユニットとして機能する。出芽酵母には３種類のサイレンシング遺伝子座（接合型の決定に関与する遺伝子座（HMLα, HMRa）、テロメア領域、rDNA リピート領域）が存在する。興味深いことに、SAS2 破壊によるこれらのサイレンシング遺伝子座に与える影響は異なる。即ち、HMLα以外の遺伝子座に対しては、SAS2 破壊はサイレンシング作用を増強する。一方、HMLαの遺伝子に対しては、弱いながら遺伝子発現を活性化する。また、SIR1 破壊と組みあわせることにより、この活性化は増強される。つまり、Sas2p は HMLαに対しては遺伝子発現の抑制に働く。そこで、本課
題においてはヒストンアセチル化酵素によるサイレンシング機構を解明するために HMLαサイレンシングにおけるSas2p の役割の解明を試みた。

失するが、asf1∆sas2∆二重破壊株はそれぞれの遺伝子の単独破壊株とサイレンシング活性がほぼ同じであることから、これらの遺伝子は遺伝学的にも相互作用することを示している。また、SAS 複合体は HMLα領域に存在するα1, α2 遺伝子のプロモーター領域に局在することも明らかにしてきた。そこで Sas2p の局在に対する ASF1 破壊の影響をクロマチン免疫沈降法により解析した（図１）。

図１. ASF1 破壊のSas2p局在に与える影響（A）

２. 研究経過２.１ SAS 複合体局在に対する ASF1 破壊の影響
我々はこれまでに SAS 複合体はクロマチン形成因子 Asf1p と相互作用すること明らかにしている。また、SAS2, ASF1
ともに SIR1 遺伝子破壊と組みあわせることにより、HMLαサイレンシングが消クロマチン免疫沈降法によるSas2pの局在の検討. 用いた細胞株およびプラスミドをグラフ上に示した。免疫沈降物を鋳型にして、32P-dCTP存在下でPCRを行った。PCR産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ゲルを乾燥後オートラジオグラフィーによりバンドを検出した。そして、そのバンドの放射活性を測定し、免疫沈降の割合をグラフに示した。これら-2-の細胞におけるSas2p-Mycの発現量をウエスタAンブロット解析により調べた。（Ｂ）ASF1 破壊0によるSAS複合体分子量に与える影響. 図に示

telomere

15.1
13.2 14.7 16.7bc d e

11.2aした細胞株から全細胞抽出液を調製し、ゲルろEクションをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳22.2 kbgI

α2 α1
YCL069W
YCL068C HMLα

過クロマトグラフィーにより分画した。各フラ19.7fCHA1
MRC1
VAC1

KRR1

B動により分離し、抗Myc抗体によるウエスタンブロット解析を行った。

その結果、ASF1 破壊により、Sas2p 局在は減少した。この減少は Asf1p 発現プラ
スミド添加により回復したことから、Sas2p の局在は ASF1 に依存することが示された。この現象は SIR1 破壊株においても同様に観察されたことから、Sas2p 局在は SIR1 には依存しないと考えられた。また、ASF1 破壊は Sas2p の発現量、SAS 複合体のサイズに影響を与えないことも示した。

C0.4

wild-typeSAS2-Myc
SAS2-Myc asf1∆IP (%)

0.30.2abcdefg

ACT10

SCR10.1

図２. HMLα近傍領域における SAS 複合体の局在. （A）に示した位置のプライマーを用いてSas2p-Myc の局在を調べた（B）。その結果を図２.２ SAS 複合体局在領域
サイレンシング活性に必須である
Sir2p は前述のすべてのサイレンシング遺伝子座に局在することが報告されている。これまでは、HMLα領域のα1, α2遺伝子のプロモーター領域におけるSas2p 局在を解析してきた。そこで次にHMLα近傍領域における局在を検討した（図２）。その結果、Sas2p は HMLα領域を含む、テロメアから少なくとも10 から 20 kb の広い範囲に局在することが示された。そして、この局在も ASF1に依存した。一方 Sir2p は HMLα領域を含む、テロメアから 16.7 kb に存在する
CHA1 まで局在し（結果省略）、Sas2p と局在領域が異なることが明らかとなった。

１と同様の方法でグラフ化した（C）。

２.３ SAS2 破壊の Sir2p 局在に与える影響
SAS2 破壊の HMLαサイレンシングに与える影響を調べる目的で、サイレンシング活性に重要な Sir2p 局在について検討した。これまでの報告と同様に Sir2pは HMLα領域に局在することが示された。興味深いことにこの局在は SAS2 破壊により減少し、SIR1 破壊と組みあわせることによりさらに減少した。一方、テロメア近傍領域の Sir2p は SAS2 破壊により増加していることが示された。また、
Sir2p 発現量は SAS2 もしくは SIR1 破壊の影響を受けないことも示した。

-3-

傍の Sir2p 局在が増加し、Sir2p 発現量は変化しないことから、HMLαにおけるSir2p 局在が減少したと考えられる。この現象は SIR1 破壊により増強されることから、SAS2 破壊による HMLαサイレンシングの消失は限られた量の Sir2p 局在の減少によると考えられた。
４. 今後の研究課題と発展
Asf1p は活性/不活性クロマチンともに局在するクロマチン形成因子と考えられているが、SAS 複合体は不活性クロマチンのみに局在する。また、HMLα近傍領域の Sas2p 局在が示されたが、Sas2p局在特異性を示す機構は明らかでない。
ひとつの可能性として、活性クロマチンに存在する Asf1p に相互作用する因子がSas2p 局在を妨ぐ機構が考えられる。今後、Asf1p に相互作用する因子を解析することにより、さらに詳細なサイレンシング活性の分子機構が明らかになると考えられる。

図３. SAS2 破壊の Sir2p 局在に与える影響. 用
いた細胞株をグラフ上に示した。抗 Sir2p 抗体のクロマチン免疫沈降物を鋳型にし、HMLαおよびテロメア近傍領域の Sir2p 局在を解析し、図１と５. 発表論文リスト

同様に示した。HML は HMLα領域、TEL は第６酵母の活性・不活性化クロマチンドメイン

番染色体の末端から約 7.5 kb の局在を示す。

長田茂宏

Sir2p の発現量をウエスタンブロット解析によエピジェネティクス 、（佐々木裕之編）pp.

り調べた。

61-70.シュプリンガー・フェアラーク東京、
2004 年

３. 研究成果
SAS 複合体は HMLαおよびその近傍領域に ASF1 依存的に局在することが明らかとなった。また、HMLαにおけるSir2p 局在は SAS2 破壊により減少し、テロメア近傍領域の局在は増加した。このことから、SAS2 破壊によりテロメア近Chromatin assembly factor Asf1p-dependent
occupancy of the SAS histone acetyltransferase
complex at the silent mating-type locus HMLα.
Osada,S.,

Kurita,M.,

Nishikawa,J.,

Nishihara,T.
Nucl. Acids Res., 2005 （印刷中）-4-and