行動を制御する神経活動と神経回路網の生体内での可視化解析
Direct visualization of neural activities and circuits controlling
animal behaviors.
研究代表者

独立行政法人産業技術総合研究所 脳神経情報研究部門

研究員 戸井基道

National Institutes of Advanced and Industrial Sciences and Technology,
Neuroscience Research Institute, Researcher, Motomichi Doi

和文要旨
動物がある行動を起こす時や１つの物事を記憶する時に、脳を形成する多数の神経細胞の中でどの様な神経がどの様なタイミングで活性化し、その活動は次にどの神経に受け渡されて最終的な行動が産み出されているのだろうか。その逆に記憶等を産み出す最も単純な神経回路網はどのようなものであろうか。この様な疑問に答えるためには脳の中を走る神経情報そのものを捕まえる、すなわち動物が行動を示す際に活性化される個々の神経細胞の活動と繋がりをモニターし、その行動を制御している神経回路網を明らかにすることが１つの方法であると思われる。そのために本研究では、発達した脳を持つ哺乳類の情報処理機構を理解する前段階として、単純な神経系ではあるが様々な本能行動から学習等の複雑な情報処理を行うことも可能なモデル生物、線虫を実験材料とし、行動を制御している神経回路網とその個々の神経の活動変化を生体内で直接可視化することを目指す。

Abstract
When animals show a variety of intrinsic behaviors, or when they learn or memorize
something, what kind of neurons in the brain is activated, what the timing of their activations
are, and which neurons receive the information from them? Or, what kind of neural circuit is themost simple in order to form memory and learning? To answer these questions, it may be thebest way to directly catch the neural information itself in the brain. This means that we shouldobserve the cellular activities of each neuron and their connections in the living animals. In thisresearch, a tiny soil worm, Caenorhabditis elegans, is used as a model system to understandcomplex human brain mechanism. The C. elegans is quite useful for this purpose, because they
have a simple nervous system but they show a variety of behaviors. The aim of this research isto visualize the neural circuits controlling intrinsic behaviors, and to measure the activities ofeach neuron in the living animals.
ばれる接続を介して繋がり、神経回路網を１．研究目的動物の生命活動や本能行動を作り出す神形成することから産み出されている。特に経情報は、多数の神経細胞がシナプスと呼神経系の発達した高等動物では、感覚神経-1-

からの入力情報を脳内の複雑な神経回路網繋がる運動神経までを可視化させ、行動時が処理し、その結果生み出される出力情報にどのように活動が変化するのかを生体中が筋肉へ伝わることで一つの行動が制御さで観察する。第一段階として、２本の神経れている。これらの行動を支配している神によって支配されている線虫排泄行動時に経回路網を理解するためには、まずどの様おける神経活動のリアルタイム観察、第二な種類の神経がどのタイミングで活性化段階として化学走性を支配している神経活(発火)し、次にどの神経に情報を伝え(神経動の解析と神経回路網の同定を試みること伝達物質の放出)、受け取った神経群がさらとから、刺激(臭い)を記憶する際に起こる神に次にどの神経に情報を受け渡すのか、そ経活動、あるいは神経回路レベルの変化(神の情報の流れを知る必要がある。従来の解経情報の流れの変化)の生体内解析を目指剖学的解析や電気生理学的研究から、さましたい。

ざまな生命活動に関与した神経群の同定とそれらの接続様式(シナプス形成)、さらに活２．研究経過動パターンを基に個々の神経細胞の機能や（１）Ca2+感受性蛍光タンパク質の選定役割などを理解することから、神経回路網線虫の個々の神経活動をモニターする手の実体が少しずつ明らかになりつつある。

段として、Ca2+感受性蛍光タンパク質と各しかしながら本質的な神経回路網を同定す

神経特異的発現活性を持つプロモータを融るためには、ある行動が引き起こされてい合させた融合遺伝子を作製し、それを線虫るその時に、生体中の神経細胞をモニター体内に発現させて観察する事を試みた。まし、どの神経がどのタイミングで活動し、ず幾つかのCa2+感受性タンパク質の中から、どの様なネットワークが構成されているの線虫で最も効率よく発現する物を選択するかを、直接観察することが最も有効な手段ために、体壁筋特異的に蛍光タンパク質をだと思われる。

発現させて観察することを試みた。その結そこで本研究課題ではヒトを含めた高等果、CFP/YFP FRETを用いてCa2+測光を行う

動物の行動を制御する神経回路網可視化にYC2.12 が効率良く発現し、かつ筋収縮時に向けた第一歩として、比較的単純な神経系おけるCa2+変動をモニターすることに成功を持つモデル生物線虫を用い、行動に特異した（図１）。

的な神経回路網を形成する全神経細胞の活動変化を可視化・記録することから、神経情報処理メカニズムの実体を理解することを目的とする。具体的な手法として、線虫の神経系に活動依存的（カルシウム濃度依存的）に蛍光波長の変化する蛍光色素タンパク質を発現させ、一つの神経細胞全体からその内のシナプス部位、繋がる下流の神経、最終的にはその行動を制御する筋肉と2

（３）YC2.12 の改良と形質転換体の作製
オリジナルの YC2.12 は哺乳類の細胞での効率的な発現を目的として作製されているため、まず遺伝子のコドン変換が線虫に適したものに置き換えた。これにより、同時に線虫では長い cDNA 配列ではタンパク質への翻訳効率が低下することが知られる
ため、CFP、YFP それぞれをコードする DNA領域内に数個のイントロンが挿入された形の YC2.12 となった。しかしながら、この場2+（矢印はCa 濃度の高い筋収縮部位を示合の蛍光遺伝子領域は、蛍光強度を上げるす）ために入れられた突然変異を従来の蛍光タンパク質のものと置き換えられているため、（２）排泄行動を制御する神経活動の観察その蛍光強度は自体は低下する。したがっ

生体内での神経活動可視化解析の第１歩てオリジナル YC2.12 の塩基配列を基に、蛍として、２本の神経（AVL と DVB）により光強度を高めるための塩基置換を１カ所ず

その行動を制御されている排泄行動時の神つ、合計で７カ所挿入した CeYC2.12 を作経活動を記録することを試みた。まず AVL製した（図３）。と DVB 特異的な発現活性を持つプロモータ領域を unc-47 (GABA transporter)遺伝子の上流領域から選び出した。この領域と通常の GFP 蛍光タンパク質との融合遺伝子を用い形質転換体を作製したところ、ほぼ特異的な蛍光を確認することが出来た。次にこのプロモータ領域と YC2.12 との融合遺伝子を作製し、形質転換体の作製を試みた。
多数の形質転換体を単離し、それぞれについて蛍光発現を観察したが、顕微鏡の励起光を最大にした際にわずかな蛍光を確認でこれらの各改良した YC2.12 毎に unc-47 遺きる程度の発現を持つ転換体しか得られな伝子プロモータとの融合遺伝子を作製し形かった。神経細胞は筋肉等の他の組織と比質転換体の単離を行った。しかしながら、べて非常に微細であるため、通常より効率最終的に全ての改良を終えた後に単離されの良い、また蛍光強度の高い感受性タンパた形質転換体においても、初期の物よりもク質が必要であると思われた。そこで蛍光蛍光強度は確実に高くなっているものの、タンパク質の改良を行った。

その蛍光強度は非常に微量であり、測光に用いるのに十分なものは単離出来なかった。

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用いるプロモータ領域も数種類変更してみをリアルタイムで記録できるシステムを構たが、同様に観察に適したものを得ること築することに成功した。構築した観察シスは出来なかった。通常の GFP であれば非常テムと蛍光プローブを用いることで、筋細に強度の強い蛍光を発する形質転換体が得胞におけるカルシウム変動を生体内で記録られるにも関わらず、カルシウム感受性のすることは可能となった。また蛍光タンパ

蛍光タンパク質を用いると、非常に少量のク質の改良を重ね、神経細胞でのカルシウ分子を発現した個体した得られない事は、ム変動が可能な形質転換体を得ることも出

観察目的にしている運動神経におけるカル来た。さらに神経細胞間でカルシウム濃度シウムのバッファリング（キレート）が個の変動に大きな差違があることを見出すこ

体の生存に非常に重要であることを示してとが出来た。すなわちある一部の運動神経いるであろう。したがって、運動神経を用は、カルシウム結合タンパク質の存在によいてのイメージングを一旦中止し、感覚神り細胞内のカルシウム濃度が減少すること経を用いた観察を試みた。

が、個体の生存に大きな影響を与えるが、感覚神経等はその影響は小さい。この発見（４）化学感覚神経に CeYC2.12 を発現さは今後様々な神経を用いてイメージングをせた形質転換体の作製行う上での貴重な予備データとなりうる。

線虫の化学感覚神経に CeYC2.12 を発現
４．今度の課題と発展させるために、数種類の既知のプロモータとの融合遺伝子を作製し、形質転換体を作

現在までに、培養細胞系や単一神経での製した。その中で感覚神経と介在神経、運カルシウムイメージングについては幾つか動神経に至るまでの複数の神経に同時に強の報告があるが、シナプスを介した複数のく蛍光を発する個体を得ることに成功した。

神経細胞の活動変化をイメージングした例

現在この形質転換体を用いて、刺激を与えは存在しない。今回作製した観察系においた時の各神経の活動変化記録を試みているても、２神経の活動変化の同時観察までは（図３）。

可能と思われるが、より複雑な神経回路網における活動変化をイメージングするためには、３次元でカルシウムの濃度変化に依存した蛍光強度の変化を取得できる観察システムが必要となる。今後より S/N 比の高い蛍光プローブの探索と測定システムの改良を重ね、複雑な神経回路網の可視化解析を目指したい。
５．発表論文リスト

３．研究成果なし

これまでの研究から、生体内の神経活動4