トラブルシューティング編～Bioanalyzerを使用したライブラリーQCと適切な定量方法～【イルミナiSchool 初級】
小寺 啓文
テクニカルアプリケーションサイエンティスト
March 27, 2019

© 2019 Illumina, Inc. All rights reserved.

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

本日の Outline● なぜライブラリーQCが必要か？
- 正確なライブラリーサイズ（構造）を知ることの重要性- 正確にライブラリー濃度を測定する重要性● 最終ライブラリーの期待されるトレース- 期待されるトレース（TruSeq DNA Nano, TruSeq PCR Free, RNA-seq libraries, TruSeq Small RNA,
Nextera XT, Nextera DNA Flex, Ampliconライブラリー）● 起こりうる問題点および対策- 期待と異なるサイズ（TruSeq DNA kits, TruSeq RNA kits, Nextera XT, Nextera）- ピークの消失（TruSeq and Nextera, TruSeq DNA and RNA, TruSeq Small RNA, Nextera）- 目的外の大きなサイズのピーク- 目的外の小さなサイズのピーク（TruSeq, Nextera）

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なぜライブラリーQCが必要か？

適切なライブラリー構造と濃度は、データ品質と総データ出力量の点でシーケンスパフォーマンスに大きな影響を与えます。
期待通りのラン結果を得るためには、ライブラリーの品質管理が重要です。

3正確なライブラリーサイズ（構造）を知ることの重要性

4●もし、ライブラリーにアダプター配列が適切に付加されていない場合にはフローセル上でクラスター形成ができないため、データが得られません。

●

各種フローセルに対して、適切な最終ライブラリー濃度があります。
もし、ライブラリーのサイズを適切に測定できていない場合にはモル濃度が適切に計算できないため、ライブラリー濃度を誤るリスクが生じます。

●

アダプターダイマーはフローセル上でクラスターを形成するため、もし、高い割合のアダプターダイマーの混入がある場合アダプターダイマー由来のリードにデータ量を奪われてしまうデメリットがあります。

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正確にライブラリー濃度を測定する重要性

推奨クラスター密度（PhiX Control ライブラリーの場合）
PhiX loading concentrations for validation runs on Illumina sequencing platforms
http://jp.support.illumina.com/content/illumina-support/apac/ja_JP/bulletins/2016/10/phix-loadingconcentrations-for-validation-runs-on-illumina-sequencing-platforms.html

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正確にライブラリー濃度を測定する重要性●

ライブラリー濃度が高すぎる（クラスター密度が高すぎる）場合、%PF（取得データ量）の低下や、クオリティ低下がおこりえます。
Qualityの低下

クラスター密度

Pass Filter
を通過したクラスターの密度（実際に得られるデータ量）
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正確にライブラリー濃度を測定する重要性●

さらに極端にクラスター密度が高すぎる、または低すぎる状態はクラスター由来の蛍光とバックの明るさの比（Signal to Noise比）が低くなりフォーカスを合わせにくくなるため、フォーカスエラーでランが中断する原因になり得ます。

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本セッションの目的期待通りのシーケンス結果が得られるように、弊社のライブラリー調製キットを用いて得られたライブラリーに対して適切なライブラリー構造が得られているのかが確認できるようになることを目的としその目的の達成のためにバイオアナライザーで品質チェックした場合の１）期待される検出パターンをご案内するとともに、２）予想とは異なる結果が得られた場合のトラブルシューティングの方法についてご案内いたします。

関連ウェビナー録画（ライブラリーが原因で生じる問題について）SAV（Sequencing Analysis Viewer）でランの評価と改善を行う
https://jp.illumina.com/events/webinar/2017/webinar_170614_j.html

MiSeqのランのセットアップ時・開始時によくあるトラブルの対処方法
https://jp.illumina.com/events/webinar/2017/webinar_170726_j.html

Optimizing Cluster Density on Illumina Sequencing Systems
https://support.illumina.com/content/dam/illumina8
marketing/documents/products/other/miseq-overclustering-primer-770-2014-038.pdf

本日のTopic
期待される
結果

期待と異なるサイズ

目的外の大きなサイズのピーク

目的外の小さなサイズのピーク• TruSeq Nano DNA, TruSeq DNA PCR Free
• Nextera DNA, Nextera DNA Flex, Nextera XTDNA ライブラリー• TruSeq Stranded mRNA, TruSeq
Stranded Total RNA, TruSeq RNA V2• TruSeq RNA Exome• TruSeq Small RNA

RNA ライブラリー• TruSeq Targeted RNA• TruSight Tumor 159ピークの消失

Amplicon ライブラリー

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本日のTopic
期待される
結果

期待と異なるサイズ

ピークの消失目的外の大きなサイズのピーク

ウェビナー録画（本日ご紹介しないDNA濃縮ライブラリーやAmpliSeqライブラリーに関するウェビナー）• DNA Enrichment ライブラリー
TruSeq Rapid Exome & TruSeq Exome Library Prep Kitを用いた
Easy Prep Exome【イルミナiSchool 中級】•

https://jp.illumina.com/events/webinar/archive/webinar_160527_j.html• AmpliSeq ライブラリー
イルミナで AmpliSeq for Illumina パネル解析をはじめよう-製品紹介とライブラリー調製編-【イルミナiSchool 初級】
https://jp.illumina.com/events/webinar/2018/webinar-180425-j.html

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目的外の小さなサイズのピーク

期待される結果

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期待と異なるサイズピークの消失

目的外の大きなサイズのピーク

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目的外の小さなサイズのピーク

期待されるトレース
定性では、アガロースゲル電気泳動よりも、より精密にライブラリーサイズを確認する必要がある→ Bioanalyzerの使用が有効！

蛍光強度fluorescence units

B

平らなベースラインbase pairs [bp]Lower marker

期待される
結果
12期待と異なるサイズ

Library

ピークの消失B Upper marker

目的外の大きなサイズのピーク

目的外の小さなサイズのピーク

期待されるトレース: TruSeq DNA Nano

TruSeq DNA Nano 550 bp insert

TruSeq DNA Nano 350 bp insert

TruSeq Nano DNA Kit は、SPB ビーズによるサイズセレクションがある。
最終ライブラリーには、インサートと～120 bp (single indexed adapter)または～135 bp (CD index kit or UD index kit) のアダプターが含まれる。

期待される
結果
13

期待と異なる
サイズ

ピークの消失目的外の大きなサイズのピーク

目的外の小さなサイズのピーク

期待されるトレース: TruSeq PCR Free

TruSeq PCR Free 350 bp insert

TruSeq PCR Free 550 bp insert
1000 bp前後にピーク

700 bp前後にピークlllllll

最終ライブラリーのトレース

バイオアナライザーのマーカーが2本鎖DNAなのに対して、末端のY字アダプターは1本鎖であるため、立体障害の影響により泳動速度が遅くなり、実際よりも大きなライブラリーサイズのピークとして検出されます。
期待される
結果
14

期待と異なる
サイズピークの消失

目的外の大きなサイズのピーク

目的外の小さなサイズのピーク

期待されるトレース: RNA-Seq libraries

TruSeq RNA ≈ 260 bp

TruSeq RNA V2
TruSeq Stranded mRNA
TruSeq Stranded Total RNA
TruSeq RNA Exome (before capture)

期待される
結果
15

期待と異なる
サイズピークの消失

目的外の大きなサイズのピークライブラリーサイズがブロードに見える理由は、RNAの断片化に熱処理が行われている点と、サイズセレクションのステップがないため目的外の小さなサイズのピーク

期待されるトレース: TruSeq Small RNA
TruSeq Small RNAライブラリーは、20-30ヌクレオチドのsmall RNAにアダプターが付加されたライブラリー（145～160 bp）ゲルからの切り出し（PAGE）精製をする範囲: ~145-160bp

最終ライブラリーのトレース

ゲル精製~145-160 bp

シングルピーク

多くのピークが見られるのは問題ない所見
これらの小さなピークはプライマーとプライマーダイマー
160 bpより大きいピークは、より大きなRNA種由来

期待される
結果
16

期待と異なるサイズピークの消失

目的外の大きなサイズのピーク

目的外の小さなサイズのピーク

期待されるトレース: Nextera XT
Nextera XTライブラリーは、幅広いサイズ分布（250 bp ～ 1500 bp）を示す
Nexterara XTライブラリーは物理的なせん断ではなく、酵素的断片化を行う。
また、断片化後のサイズ選択はないため、ライブラリーのサイズは他のライブラリーよりもブロードになる。

Nextera XTライブラリーでは、最終ライブラリーのトレースが、図のようにライブラリーによって異なるトレースを示しても、どちらもシーケンスが可能。
また、ライブラリーサイズが小さいものの方がクラスター形成効率が高いため、実際に得られるデータの平均サイズは、トレース上の平均サイズよりも小さくなる。

期待される
結果
17

期待と異なるサイズピークの消失

目的外の大きなサイズのピーク

目的外の小さなサイズのピーク

期待されるトレース: Nextera DNA Flex
およそ150bpから1500bp付近のサイズ分布を示し、平均サイズは~600bp

Bioanalyzer (High Sensitivity DNA kit)

ウェビナー録画
進化したNextera DNA Flexを用いたライブラリー調製【イルミナiSchool 初級】
https://jp.illumina.com/events/webinar/2018/webinar-181031-j.html
期待される
結果
18

期待と異なるサイズピークの消失

目的外の大きなサイズのピーク

目的外の小さなサイズのピーク

期待されるトレース: Ampliconライブラリー

TruSeq Targeted RNA Expression

TruSight Tumor 15

Amplicon ベースのライブラリーでは、目的のライブラリーサイズの位置にシャープなピークが得られる。

期待される
結果
19

期待と異なるサイズピークの消失

目的外の大きなサイズのピーク

目的外の小さなサイズのピーク

20

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

期待と異なるサイズ
ライブラリーのオーバーロード
オーバーロード
適切な範囲

マーカーのピークを識別することができない
ライブラリーのサイズを確認することが難しい
アーチファクトのピークが生じる可能性あり解決法：

ライブラリーを希釈したのち、再解析を行う
適切な検出限界の Bioanalyzer chip を使用する
－－－－

期待される
結果
21

期待と異なる
サイズ

ピークの消失High Sensitivity DNA Assay: 5～500 pg/μL
DNA 1000 Assay: 0.1～50 ng/μL
RNA 6000 Nano total RNA Assay: 5～500 ng/μL
RNA 6000 Pico total RNA Assay: 50～5000 pg/μL
目的外の大きなサイズのピーク

目的外の小さなサイズのピーク

期待と異なるサイズ: TruSeq DNA kits
小さすぎるライブラリーサイズ大きすぎるライブラリーサイズ考えられる原因

対策

考えられる原因

対策

インプットDNAの質が悪い

ゲル電気泳動、またはBioanalyzerのトレースでDNAが断片化されていないことを確認する

インプットDNAの量が多すぎる

QubitまたはPicogreenを用いて定量する

高分子量DNA除去の過程で、目的の（小さな）DNAが含まれる上清を捨ててしまった

上清を捨てずに、次のステップに用いる

インプットDNAの量が不十分

QubitまたはPicogreenを用いて定量を行う（DNA希釈前の定量がより正確）

ビーズ精製時のサンプルの消失

Best Practicesの手法にしたがってビーズ精製を行う

Input DNA/RNA についてのBulletin
DNA/RNA isolation considerations for Illumina Library Preparation Kits
https://support.illumina.com/bulletins/2016/05/dnarna-isolation-considerations-when-using-truseq-library-prep-kits.html

Best Practice の具体的な手法
Handling Master Mix Reagents
http://jp.support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq-nano-dna-lt-kit/best-practices.html?langsel=/jp/
期待される
結果
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期待と異なるサイズ

ピークの消失目的外の大きなサイズのピーク

目的外の小さなサイズのピーク

期待と異なるサイズ: TruSeq RNA kits

小さすぎるライブラリーサイズ

大きすぎるライブラリーサイズ考えられる原因

対策

考えられる原因

対策

サーマルサイクラーの温度が指定温度よりも高い(RNA-seq)

サーマルサイクラーの温度調整が正確かを確認

サーマルサイクラーの温度が指定温度よりも低い(RNA-seq)

サーマルサイクラーの温度調整が正確かを確認

Elute, Prime, Frag
インキュベーション（RNA断片化）を8分以上行った

質の良いRNAを用いてElute, Prime, Frag
インキュベーション
からやり直すElute, Prime, Frag
インキュベーション（RNA断片化）が8分未満であった

質の良いRNAを用いてElute, Prime, Frag
インキュベーション
からやり直す

RNA断片化時間とRNAフラグメントの長さの関係は
TruSeq Stranded Total RNA Reference Guideの36～40ページをご参照ください。
http://jp.support.illumina.com/content/dam/illuminasupport/documents/documentation/chemistry_documentation/samplepreps_truseq/truseq-stranded-total-rna-workflow/truseqstranded-total-rna-workflow-reference-1000000040499-00.pdf
23期待と異なるサイズ: Nextera XT

Nextera XTの場合の理想的なトレース例

小さすぎるライブラリーサイズ

望ましい
Input DNA

断片化したDNA

考えられる原因

対策

インプットDNAの質が悪い

ゲル電気泳動、またはBioanalyzerのトレースでDNAが断片化されていないことを確認する

インプットDNAの量が不十分

QubitまたはPicogreenを用いて定量を行う（DNA希釈前の定量がより正確）

タグメンテーションの反応時間が長すぎる
または反応温度が推奨より高い

タグメンテーション後、すぐに次のポイントに進む
サーマルサイクラーの温度調整が正確かを確認

期待される
結果
24

期待と異なる
サイズピークの消失

目的外の大きなサイズのピーク

目的外の小さなサイズのピーク

期待と異なるサイズ: Nextera libraries

Nextera XTの場合の理想的なトレース例

大きすぎるライブラリーサイズ考えられる原因

対策

インプットDNAの量が多すぎる

QubitまたはPicogreenを用いて定量を行う

タグメンテーションの反応時間が短すぎる、または反応温度が低い

タグメンテーションの時間を守る。サーマルサイ
クラーの温度調整が正確かを確認

タグメンテーションの酵素が阻害されている

インプットDNAに夾雑物が含まれていないか確認

タグメンテーションの酵素を阻害する物質としては、抽出したインプットDNAに含まれるEDTAやアルコールなどの例が考えられる。
具体的なリストは「Nextera Tips and Troubleshooting guide」をご参照下さい。
https://support.illumina.com/content/dam/illuminasupport/documents/documentation/chemistry_documentation/samplepreps_nextera/nextera-xt/nextera-xt-troubleshooting-guide.pdf
期待される
結果
25

期待と異なる
サイズピークの消失

目的外の大きなサイズのピーク

目的外の小さなサイズのピーク

Nexteraライブラリーのトラブルシューティング

ウェビナー録画- Nextera XT
トラブルシューティング編 Nexteraライブラリー調製キットシリーズで期待通りのライブラリーを得るためのヒント【イルミナiSchool】
https://jp.illumina.com/events/webinar/archive/webinar_150306_j.html- Nextera DNA Flex
進化したNextera DNA Flexを用いたライブラリー調製【イルミナiSchool 初級】
https://jp.illumina.com/events/webinar/2018/webinar-181031-j.html

26

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

期待される結果

27

期待と異なる
サイズピークの消失

目的外の大きなサイズのピーク

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

目的外の小さなサイズのピーク

ピークの消失: TruSeq and Nextera libraries
ライブラリーのピークが見られない、もしくはダイマーのピークしか見えない。

ライブラリーの定量でも濃度が確認できない場合には、ライブラリーを再度、調製していただく必要がある。

期待される
結果
28

期待と異なるサイズピークの消失

目的外の大きなサイズのピーク

目的外の小さなサイズのピーク

ピークの消失: TruSeq DNA and RNA libraries
考えられる原因

対策

インプットDNAの質が悪い

ゲル電気泳動、またはBioanalyzerのトレースでDNAが断片化されていないことを確認する

インプットDNAの量が不十分

QubitまたはPicogreenを用いて定量を行う（DNA希釈前の定量がより正確）ビーズ精製時のサンプルの消失

Best Practicesの手法にしたがってビーズ精製を行う

サーマルサイクラーの蓋が加熱されていない

サーマルサイクラーが室温以上に加熱される時は、蓋の温度を100℃にする

不完全な Fragmentation

Fragmentation後のサイズ分布をチェックする

酵素の劣化酵素を消費期限内に使用する。
凍結融解を繰り返さない (<=4)

期待される
結果
29

期待と異なる
サイズ

ピークの消失目的外の大きなサイズのピーク

目的外の小さなサイズのピーク

ピークの消失: TruSeq Small RNA

Small RNA由来の145-160 bpのピークが見られない。
本キットによりSmall RNAが回収されなかった。

期待される
結果
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期待と異なる
サイズピークの消失

目的外の大きなサイズのピーク

目的外の小さなサイズのピーク

ピークの消失: TruSeq Small RNA
18S 28S

Small RNA由来の145-160 bpのピークが見られない。
本キットによりSmall RNAが回収されなかった。

RNA input
考えられる原因

対策

質の低いインプットRNA

RIN8以上のRNAサンプルを使用する精製したRNA中にSmall RNAが存在しない

Small RNAの精製に対応したキットを使用するアダプターオリゴの二次構造の形成

70℃で温めた直後に氷上に移す

期待される
結果
31

期待と異なる
サイズピークの消失

目的外の大きなサイズのピーク

目的外の小さなサイズのピーク

ピークの消失: Nextera libraries

考えられる原因

対策

インプットDNAの質が悪い

ゲル電気泳動、またはBioanalyzerのトレースでDNAが断片化されていないことを確認する

インプットDNAの量が不十分

QubitまたはPicogreenを用いて定量を行う（DNA希釈前の定量がより正確）

ビーズ精製時のサンプルの消失

Best Practicesの手法にしたがってビーズ精製を行う

PCR時に誤ったプライマーを使用してしまった

使用予定のインデックス付アダプターが、適切なキットのものであることを確認する

酵素の劣化

酵素を消費期限内に使用する。
凍結融解を繰り返さない (<=4)

期待される
結果
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期待と異なる
サイズピークの消失目的外の大きなサイズのピーク

目的外の小さなサイズのピーク

期待される結果

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期待と異なる
サイズピークの消失

目的外の大きなサイズのピーク

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目的外の小さなサイズのピーク

目的外の大きなサイズのピーク
AMPure beadsの持ち込み

ビーズのキャリーオーバー

考えられる原因

対策

ライブラリーの回収時にビーズが混入した（ビーズのキャリーオーバー）ライブラリーが透明になるまで磁石の上に静置したのち、Best Practicesの手法にしたがってビーズ精製を行う

期待される
結果
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期待と異なる
サイズピークの消失

目的外の大きなサイズのピーク

目的外の小さなサイズのピーク

目的外の大きなサイズのピーク
PCR artifacts
PCRのアーチファクト（Bubble product）

1) サンプルの一部を 95℃、5分間加熱したのち、ヒートブロック中でゆっくり室温に戻す
または、2) サンプルの一部をtemplateとして1～2サイクルのPCRにかけた場合にピークが1つになれば Bubble productであることが確認できる。
Bubble product が生じた場合には、qPCR による定量がお勧め。

考えられる原因

対策

インプットするサンプル量が多すぎる（PCR反応に必要な試薬が枯渇）

インプットするサンプル量を減らす

PCRのcycle数が多すぎる

PCRのcycle数を減らす

期待される
結果
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期待と異なる
サイズピークの消失

目的外の大きなサイズのピーク

目的外の小さなサイズのピーク

期待される結果

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期待と異なる
サイズピークの消失

目的外の大きなサイズのピーク

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

目的外の小さなサイズのピーク

目的外の小さなサイズのピーク: TruSeq libraries
アダプターダイマー~120bp

考えられる原因

対策

インプットDNAの量が不十分

QubitまたはPicogreenを用いて定量を行う

ビーズ精製が不十分

Best Practicesの手法にしたがってビーズ精製を行う

末端修飾、または3’ 末端のアデニル化の失敗

試薬を消費期限内に使用するPCRの温度調整が正確かを確認

Heat inactivation
ステップを行わなかった

A-tailing後に70℃でインキュベート
する

アダプターダイマー
アダプターダイマーはフローセル上でクラスターを形成するもしライブラリー中にアダプターダイマーが含まれていたら、アダプターダイマー由来のリードにデータ量を奪われてしまう恐れがある。
期待される
結果
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期待と異なる
サイズピークの消失

目的外の大きなサイズのピーク

目的外の小さなサイズのピーク

目的外の小さなサイズのピーク: Nextera libraries
プライマーダイマー<100bp

考えられる原因

対策

インプットDNAの量が不十分

QubitまたはPicogreenを用いて定量を行う

ビーズ精製が不十分

Best Practicesの手法にしたがってビーズ精製を行う

タグメンテーションが不十分

タグメンテーションのステップで、正しい時間と温度でタグメンテーションを行う

プライマーダイマー
プライマーダイマーには完全なアダプター配列が含まれていないため、クラスターを形成したり、SBSケミストリーを行ったりすることはできない。
しかし、定量に影響を与える可能性があるため、追加のクリーンアップがお勧め期待される
結果
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期待と異なる
サイズピークの消失

目的外の大きなサイズのピーク

目的外の小さなサイズのピーク

TruSeq DNA & RNAのトラブルシューティング

ウェビナー録画

トラブルシューティング編 - TruSeq DNA & RNAキットを用いたライブラリー作製におけるトラブルシューティング【イルミナiSchool】
https://jp.illumina.com/events/webinar/archive/webinar_150320_j.html

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For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

定量定性まとめ - DNA kits
Kits

定量定性

TruSeq Nano DNA
TruSeq PCR Free

Fluorometric Method or qPCR
qPCR

BioAnalyzer or Fragment Analyzer
BioAnalyzer or Fragment Analyzer

Nextera DNA Flex

Fluorometric Method (QuBit/PicoGreen)

BioAnalyzer or Fragment Analyzer

Nextera XT

Fluorometric Method or Bead-based
Normalization
qPCR/BioAnalyzer

BioAnalyzer (Needed when using FluorometricMethod; Optional when using Bead-based
Normalization)
BioAnalyzer or Agarose Gel

QuBit

BioAnalyzer

Fluorometric Method or qPCR
Fluorometric Method or qPCR

BioAnalyzer or Fragment Analyzer
BioAnalyzer or Fragment Analyzer

Fluorometric Method or qPCR

BioAnalyzer

TruSight Inherited Disease

Fluorometric Method or qPCR

BioAnalyzer

TruSight Tumor 15

Fluorometric Method(AccuClear/PicoGreen/QuBit)

BioAnalyzer or Agarose Gel

BioAnalyzer

Gel/BioAnalyzer

Nextera Mate Pair
Nextera DNA Flex forEnrichment
TruSeq Exome
Nextera DNA Exome
Nextera Rapid Capture Custom
Enrichment

40

TruSight Tumor 26(TruSight Tumor)
Ampliseq(DNA Panels)
TruSight Myeloid
TruSeq Amplicon Cancer
Panel

BioAnalyzer/Fragment
Analyzer/qPCR/QuBit/AccuClear/QuantIT
Bead-based Normalization
Bead-based Normalization

BioAnalyzer or Agarose Gel

TruSeq Bovine Parentage
Sequencing Panel

Bead-based Normalization

BioAnalyzer/Fragment Analyzer/Agarose Gel

TruSeq ChIP

qPCR

BioAnalyzer

TruSeq Methyl Capture EPIC
Library Prep Kit

QuBit

BioAnalyzer

BioAnalyzer or Fragment Analyzer
BioAnalyzer or Agarose Gel

定量定性まとめ - RNA kits
Kits

定量

TruSeq RNA v2
qPCR
TruSeq Stranded
qPCR
mRNA
TruSeq Stranded Total
qPCR
RNA
TruSeq RNA ExomeqPCR/Fluorometric Method
TruSight RNA PanqPCRCancer
TruSight RNA Fusion
qPCR
TruSeq Targeted RNA
BioAnalyzer or Fragment Analyzer
Expression
TruSeq Small RNA
BioAnalyzer
BioAnalyzer/Fragment
Ampiseq (RNA Panels) Analyzer/qPCR/QuBit/AccuClear/QuantIT
SureCell WTA 3'
BioAnalyzer

定性
BioAnalyzer or Fragment Analyzer
BioAnalyzer or Fragment Analyzer
BioAnalyzer or Fragment Analyzer
BioAnalyzer or Fragment Analyzer
BioAnalyzer or Fragment Analyzer
BioAnalyzer or Fragment Analyzer
BioAnalyzer or Fragment Analyzer
BioAnalyzer
BioAnalyzer or Fragment Analyzer
BioAnalyzer

Library quantification and quality control quick reference guide
41

https://support.illumina.com/bulletins/2016/05/library-quantification-and-qualitycontrol-quick-reference-guide.html

まとめ
期待される結果• 理想的なトレースの条件
ベースラインが平ら、X軸がbpで指定、Markerのピークが確認できる• ライブラリーのオーバーロード → 希釈し再解析• ビーズ精製時のミス（T）、タグメンテーションの反応時間（N）が合っていない
期待と異なる→ ライブラリーはシーケンス可能。
サイズ• インプットDNA/RNAの量・質に問題、調製時にサンプルが消失した可能性→ シーケンス不可。ライブラリーを再度調製する必要がある。
ピークの消失目的外の大きなサイズのピーク

目的外の小さなサイズのピーク• AMPure XP ビーズの混入、PCR アーチファクト→ ライブラリーはシーケンス可能。

• Adapter dimers: ~120 bp にピーク (T)、Primer dimers: <100 bp にピーク (N)→ ライブラリーはシーケンス可能だが、追加のビーズ精製を行うほうが良い。

(T) TruSeq
42(N) Nextera

ご清聴ありがとうございました

43

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.Additional Resources● Nextera Troubleshooting Guide● TruSeq Sample Preparation Best Practices and TroubleshootingGuide● Bulletin Board- DNA/RNA isolation considerations for Illumina Library Preparation Kits
- How to thaw and store sequencing reagents for optimal performance- How to achieve more consistent cluster density on Illumina sequencing
platforms- Best practices for manually normalizing library concentrations- Library quantification and quality control quick reference guide- Recommended quality control of FFPE samples for Illumina FFPEsupported library preparation kits
44