特集

学生の研究活動報告−国内学会大会・国際会議参加記 28
2.2

第 65 回日本生態学会大会を終えて
池

2.2.1

方法
組織試料からの mRNA の検出

ゼブラフィッシュの lhb, b2m, g6pd, tbp, mt-cyb

也の mRNA 配列を特異的に増幅するプライマーセッ

Shizuya IKEDA

トを用いて，ゼブラフィッシュの組織試料（脳，表環境ソリューション工学科田静2017 年度卒業

皮，腸，卵 巣）か ら の mRNA の 検 出 を 試 み た．
RNA 抽 出 は，NucleoSpin RNA Plus（740984.50,1．はじめに

MACHEREY-NAGEL, Germany），ISOSPIN Cell &2018 年 3 月 14 日〜18 日，札幌コンベンションセTissue RNA（314-08211, NIPPON GENE，東京，日ンターにて開催された第 65 回日本生態学会大会に本），RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit（cat. No.74704,参加した．本大会において「環境 RNA 分析によるQiagen, Hilden, Germany）を用いた．逆転写反応は遺伝子発現解析に向けた基礎技術の検討」という題

PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser（Perfect

目でポスター発表を行った．

Real Time）（RR 047 A, TAKARA, Otsu, Japan）を用いた．また，gDNA のコンタミネーションを確認す

2．研究内容2.1

るために，逆転写酵素の代わりに RNase Free dH2O

はじめにを添加した逆転写ネガティブコントロールを作成し近年，環境水中の DNA（環境 DNA）を分析してた．試料は PCR 増幅まで 4℃ で保存した．PCR 増

簡便に水生生物を検出できる環境 DNA 分析が注目

幅は Step One-PlusTM Real-Time PCR（Life Technolo-されている．環境 DNA 分析では生物の在／不在のgies, City of Carlsbad, CA, USA）を用いた．電気泳モニタリング（Ficetola et al. 2008 ; Minamoto et al.

動は 1.5％ アガロースゲルを用いた．

2012）や生物量の推定（Takahara et al. 2012 ; Thom-2.2.2

飼育水からの環境 RNA の検出

sen et al. 2012）が行われている．野外での調査が採

ゼブラフィッシュの lhb, b2m, smyhc2, clcn2c, mt-

水のみで済み，非常に簡便な手法であるという利点

cyb の mRNA 配列を特異的に増幅するプライマーから，環境 DNA 分析は新たな調査ツールとして普セットを用いて，ゼブラフィッシュの飼育水からの及しつつある．しかし，環境 DNA 分析にはその由

環境 RNA の検出を試みた．飼育開始 4 日後のゼブ来（Turner et al. 2014 a）や，生死を含めた生物のラフィッシュの飼育水槽（50 匹／54 L, n＝3）から，状態（Merkes et al. 2014），そ し て 放 出 後 の 時 間

ポアサイズ 0.45 μm のステリベ ク ス（STERIVEX,（Thomsen et al. 2012 b）が不明といった未解明の問

cat. No.SVHV 010 RS, Merck, Germany）を 用 い て題がある．これらの問題の解決は環境 DNA 分析が0.5 L, 1 L, 1.5 L を採水，ろ過した．ブランク水槽

信頼に足る調査ツールとして普及する上で不可欠でからも同様に 1 L 採水，ろ過した．各試料に RNAl-ある．他方，特定の組織で生理状態に依存して発現ater（1.5 mL）を添加し，抽出まで−20℃ で保存しし，かつ速い分解速度を示すメッセンジャー RNAた．環境 RNA の抽出は NucleoSpin RNA Plus を用（mRNA）を環境水から分析する環境 RNA 分析のいた．ステリベクス中のろ液を遠心分離（2000 G,進展は，これらの問題を解く手がかりを与えると考1 分）で破棄し，Buffer LBP（400 μL）を添加した．

えられる．しかし，水生生物の環境 RNA 分析に関ROLLER 6 digital（IKA, Germany）上 で 回 転（20する研究報告例はごく限られている．そこで本研究rpm）させながら室温で 5 分間インキュベートし，では，ゼブラフィッシュ（Danio rerio）を対象と

遠 心 分 離（2000 G, 2 分）で ろ 液 を NucleoSpin

し，飼育水中から環境 RNA の検出を試みた．

gDNA Removal Column に移し，以降はキットのプ― S-63 ―ロトコルに従った．上記と同様に逆転写反応，PCR方々から助言を頂いた．此処に厚く感謝の意を申し増幅，電気泳動を行った．タカラバイオ株式会社の上げる．

プレミックスシーケンス解析を利用し，PCR 産物の配列決定を行った．

参考文献
Ficetola GF, Miaud C, Pompanon F, Taberlet P（2008）Spe-2.3

cies detection using environmental DNA from water sam-

結果

全ての組織試料から，対象遺伝子を検出すること

ples. Biology Letters, 4 : 423-425.
Merkes CM, McCalla SG, Jensen NR, Gaikowski MP, Am-ができた．また，飼育水中から環境 RNA を検出でberg JJ（2014）Persistence of DNA in carcasses, slime andきた．lhb は全ての試料から検出できなかった．b2

avian feces may affect interpretation of environmental DNAm は全ての試料から検出できた．smyhc2 は採水量

data.PLOS ONE, 9 : e113346

1 L の試料からのみ 検 出 で き た．clcn2c は 採 水 量0.5 L, 1 L の試料から検出できた．mt-cyb は全てのMinamoto T, Yamanaka H, Takahara T, Honjo MN, KawabataZ（2012）Surveillance of fish species composition usingenvironmental DNA. Limnology, 13 : 193-197

試料から検出できた．全ての PCR 産物は配列決定

Takahara T, Minamoto T, Yamanaka H, Doi H, Kawabata Z

され，対象遺伝子であることが確認された．

（2012）Estimation of fish biomass using environmental
DNA. PLOS ONE, 7 : e35868.

2.4

Thomsen PF, Kielgast J, Iversen LL, Wiuf C, Rasmussen M,

考察

Gilbert MT, Orlando L, Willerslev E（2012）Monitoring

本研究の結果より，魚類の環境 RNA を水中から検出できることが示された．また，鰓での発現が豊富である clcn2c が水試料から検出されたことから，
環境 DNA や環境 RNA の由来の 1 つが鰓であることが示唆された．

endangered freshwater biodiversity usingenvironmental
DNA. Molecular Ecology, 21 : 2565-2573.
Thomsen PF, Kielgast J, Iversen LL, Møller PR, Rasmussen
M, Willerslev E（2012 b）Detection of a diverse marine
fish fauna using environmental DNA from seawater samples. PLoS ONE, 7 : e41732
Turner CR, Barnes MA, Xu CCY, Jones SE, Jerde CL, Lodge

3．おわりにDM, Gilbert M（2014 a）Particle size distribution and opti-

本大会で発表するにあたり，龍谷大学山中裕樹講師，神戸大学大学院源利文准教授をはじめ，多くの

mal capture of aqueous macrobial eDNA. Methods in Ecology and Evolution, 5 : 676-684― S-64 ―