日本応用酵素協会誌

第55号

ISSN : 0913-3348
ISSN : 2434-7914（Online）
CODEN : NOKKELISSN : 0913-3348（Print）
CODEN : NOKKEL

2021 年３月１日発行

日本応用酵素協会誌
日本応用酵素協会誌

No. 55
2020
総

説

№

55

タンパク質架橋酵素を介した上皮細胞の間葉転換機構の解析 ･･･････････････････････

2020

辰

川

英

樹，篠

田

祥

希，竹

内

大

修，人

見

清

隆

チロシンキナーゼによるＴ細胞の分化制御 ･･････････････････････････････････････
室

龍 之 介，新

田

1
11

剛

2020年度 研究報告
酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究 ･････････････････････････････ 19
成人病の病因・病態の解明に関する研究助成 ･････････････････････････････････････ 48
Vascular Biology Innovation に関する研究助成･･････････････････････････････････ 83
全身性炎症疾患の病因・病態の解明に関する研究助成 ････････････････････････････ 100
Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成･････････････････････ 112

研究調査所 酵素情報
公益財団法人自己免疫疾患領域における創薬標的としての CaMK4 ･ ････････････････････････････ 135
Prolyl Hydroxylase ･･･････････････････････････････････････････････････････････ 138

日本応用酵素協会

公益財団法人

日本応用酵素協会

Japan Foundation for Applied Enzymology
編集兼
発行人

山田

昌樹

発行所

大阪市淀川区加島三丁目一六番八九号
公益財団法人 日 本 応 用 酵 素 協 会

印刷所

帝人エージェンシー株式会社

総説

タンパク質架橋酵素を介した上皮細胞の間葉転換機構の解析

辰
竹

川
内

英
大

樹＊，篠
修＊，人

田
見

祥
清

希＊
隆＊

的治療薬は存在しない．病態の悪化により，細胞外マト

１．はじめに上皮細胞の間葉転換（Epithelial mesenchymal tran-

リクス（ECM）が過剰蓄積するような組織の線維化がsition; EMT）とは，上皮細胞が上皮としての性質を失起こり，末期腎不全に至る．ECM の蓄積自体は創傷治

い間葉系の性質を獲得する現象である．生体内の微小環

癒過程に見られる生体反応であるが，過剰な蓄積は正常境変化により上皮細胞が刺激を受けると，本来有する細な組織構築を破壊し，臓器不全に繋がる．このような線胞極性が消失すると共に，細胞間接着の減少，遊走能の維化の主原因は，腎臓の尿細管周囲の間質領域に存在し亢進，アクチン系細胞骨格のリモデリングが起こる．古て ECM を過剰産生する筋線維芽細胞の増殖・活性化でくから EMT は原腸陥入や神経管の形成などの発生段階

ある．筋線維芽細胞の由来としては，線維芽細胞や周皮に関わる現象として知られてきたが，発生に特異的な現細胞の形質転換，上皮間葉転換，内皮間葉転換，循環線

象ではなく，
慢性的な炎症組織で見られる組織の硬化（線維細胞などの遊走が挙げられるが，このうち近位尿細管維化）や癌細胞の増殖・浸潤・転移など癌の悪性化にもに存在する上皮細胞は腎臓内で初期に変化を受ける場で大きく関与する．

あり，EMT に陥った細胞が線維化促進因子の分泌を介慢性腎臓病は腎障害や機能低下が持続的に続く疾患でして線維芽細胞や周皮細胞による筋線維芽細胞の増殖・ある．この主たる原疾患としては糖尿病や高脂血症など活性化を誘導することから１,２），病態進行の起点となりの生活習慣病が挙げられるが，初期症状がほとんどない

うる近位尿細管上皮細胞の EMT の分子機構の理解が重ことから早期発見が難しく，治療法としても生活習慣の要視されている．

改善に基づく対処療法であり，腎機能を改善させる根本

ᇶ㉁䝍䞁䝟䜽㉁䠄䜾䝹䝍䝭䞁ṧᇶഃ䠅䜰䝅䝹ᇶ䠉㓝⣲
」ྜయ

TG

TG

O

SH
O

最近，著者らは線維化した腎臓の尿細管上皮細胞にお

S

O

R

H2N

(Gln)

R

䠄䃒㻙䜾䝹䝍䝭䝹䠅䜰䝭䞁⤖ྜ㻙䝫䝸䜰䝭䞁໬

NH2
(Gln)

(Gln)

N
H

O

NH3
Lys

(Gln)

N
H

(Lys)

䃔㻙䠄䃒㻙䜾䝹䝍䝭䝹䠅䝸䝆䞁㻙䜲䝋䝨䝥䝏䝗⤖ྜ

図１

TG の架橋化反応の機構

TG による 2 段階架橋化反応の機構．基質タンパク質中のグルタミン（Gln）残基と TG の間で反応中間体が形成され，これに反応する基質分子（一級アミンまたはリジン残基を持つタンパク質）により反応産物が生成される．

＊東海国立大学機構名古屋大学大学院・創薬科学研究科・細胞生化学分野

総説－タンパク質架橋酵素を介した上皮細胞の間葉転換機構の解析

いて，これまでに線維化との関連報告があるタンパク質

ことにより，基質タンパク質の新たな機能の獲得や消失

架橋酵素トランスグルタミナーゼ（Transglutaminase;を引き起こし，このことが多くの生理的・病理的現象にTG）の活性が顕著に増加することを見出した．本稿で関わる（表１）．

は同架橋酵素を標的とした組織線維化および EMT の分子機構の解明研究について近年の知見を紹介する．

４．線維化と TG の関係性
TG2 が組織線維化の形成に寄与することは多くの論文によって報告されている．TG2 による ECM に存在す

２．タンパク質架橋酵素トランスグルタミナーゼ
トランスグルタミナーゼ（TG）は，特定のタンパク

るコラーゲンの架橋は，マトリックスメタロプロテアー

質のグルタミン残基とリジン残基との間に Ca２＋依存的

ゼによるコラーゲン分解に対して抵抗性を持たせ，コにイソペプチド結合を形成する翻訳後架橋修飾酵素であラーゲンの過剰蓄積による組織線維化を誘導する６,７）．

る．同時にこの反応はイソペプチドの形成だけでなく，また，後述のように線維化を誘導する主要なサイトカイ

グルタミン残基に一級アミンを付加させるアミド化や，ンであるトランスフォーミング増殖因子-β（Transform-

水分子の付加によってグルタミン酸へと変換させる脱ア

ing growth factor-β; TGF-β） の 活 性 化 に 寄 与 す る．

ミド化の反応も触媒する（図１）３,４）．高等動物では TG

TG2 は潜在型 TGF-β結合タンパク質と ECM を構成すは８種類のアイソザイムからなるファミリーを構成し，るフィブロネクチンを架橋することにより，細胞膜上それぞれのアイソザイムが特徴的な組織分布および架橋への潜在型 TGF-βの蓄積に関わる．このことは，障害基質を介して血液凝固，皮膚形成，死細胞除去を始め多刺激の際にプロテアーゼやインテグリンなどによって彩な生命現象に関与する一方，異常なレベルの架橋形成

潜在型 TGF-β複合体から活性型 TGF-βが放出されるは種々の疾患（肝臓・腎臓・肺などの慢性障害や線維化，機構に関与する８,９）．さらに TGF-βの下流のシグナル

神経変性疾患，糖尿病，癌，自己免疫疾患など）の原因

伝達機構に重要な転写因子である核内因子κB (Nuclearとなる．

factor-kappa B; NF-κB) は TG2 と 協 調 し た ポ ジ テ ィ

３．TG ファミリーの働き

ブフィードバック機構による相乗的なシグナル伝達のTG の主要なアイソザイムとしては，Factor XⅢ（FXⅢ;

促進に関わる10,11）．これまでに肝臓12－15）・腎臓16－18）・

血液凝固第 XⅢ因子）と TG1（皮膚型）および TG2（組

肺19－21）の組織障害や線維化において，TG2 は有意に病織型）が挙げられる．FXⅢは主に血漿中に存在し，ト態の増悪に関与することが著者らの研究を含め多くの論

ロンビンによる限定分解により活性化され，血液凝固の文において報告されているが，TG2 以外の TG アイソ

最終段階としてフィブリンを架橋する．皮膚表皮に発現

ザイムに焦点を当てた解析例は乏しく，病態の理解のたする TG1 は TG3 および TG5 と共に角質化に関与する．

めにはこれらの発現や局在解析，架橋される基質分子にこれらは表皮細胞の分化に伴って段階的に活性化し，細ついて明らかにすることが重要である．

胞膜でインボルクリンやロリクリンなどの様々なタンパ
ク質を協調的に架橋重合し，角層細胞辺縁に強固な周辺帯（コーニファイドエンベロープ）を形成する．TG2

５．TG アイソザイム特異的な基質ペプチド配列の同定と応用方法

は幅広い組織に存在し，細胞の生体構造の構築や安定化，

TG ファミリーによる架橋反応はタンパク質中のグル増殖や分化，細胞死の制御など多彩な生命現象に寄与す

タミン残基のγ-カルボキシアミド基をアシル供与体とる．他のアイソザイム（TG4, TG6, TG7）については

し，リジン残基側を含む一級アミンをアシル受容体と生化学的性質や生理的意義に関する知見は未だ少ない．

して，タンパク質に対するアミン分子の共有結合的導このように TG ファミリーは Ca２＋結合部位や活性中心

入や，グルタミンとリジン残基間でのε-(γ-グルタミル )部位など一次配列上の相同領域を有するものの，それぞ

リジン-イソペプチド結合を触媒する（図１）．TG アイ

５）れの組織での発現については独自のパターンを示し ，ソザイムは同じ反応段階でチオエステル中間体を形成す

各アイソザイムが多種多様な基質分子の架橋反応を行う

るが，全てのペプチド鎖中のグルタミン残基が同じアシ

総説－タンパク質架橋酵素を介した上皮細胞の間葉転換機構の解析

ル供与体として認識されるわけではなく，架橋する相手て高い反応性を有するグルタミン残基を含む 12 残基のには反応性に対する優劣があり，様々な基質タンパク質

ペプチド配列を同定してきた22）．これまでに FXIII 23）,が同定されている．この違いは主に各 TG アイソザイム

TG124）, TG2 23）, TG3 25）, TG6 26）, TG7 27）の各アイソザイが基質タンパク質中のグルタミン残基またはリジン残基

ム（TG4 および TG5 を除く）において高い反応性を有を認識する際の両残基付近のペプチド認識配列に特異性する基質ペプチド配列を同定している（表１）．

を持つことが基質反応性の差異に起因し，架橋されるタ

このような各 TG アイソザイム特異的な基質ペプチド

ンパク質の多様性を決定していると考えられる．著者ら

配列を用いることにより，特定のタンパク質の限定されはこれまでにランダムペプチドライブラリーから各 TG

たリジン残基にペプチドタグを標識することが可能とな

アイソザイムが反応しやすい基質ペプチド配列を探索

り，様々な研究のツールとしての有効活用が期待されてしており，TG アイソザイムそれぞれについて基質としいる28, 29）．著者らは生組織中の TG 架橋活性を視覚化す

表１

TG アイソザイムの種類，存在部位，生理的意義，特異的に反応する基質ペプチド配列

TG ファミリーを構成する各アイソザイムの局在部位と生理的意義，当グループで同定したグルタミン残基（下線）側の基質として高反応かつアイソザイム特異的に架橋されるペプチド配列．

A

B
Gln

FITC

ᮍᅛᐃࡢ⤌⧊ษ∦Ca2+⤌⧊ษ∦୰䛾
ෆᅾᛶTG

⺯ග

TG1
(pepK5)TG2(pepT26)
(Day)

図２

0
䠄ṇᖖ⭈䠅

3
䠄⥺⥔໬⭈䠅

7䠄⥺⥔໬⭈䠅

蛍光標識基質ペプチドを用いた TG 架橋活性の可視化（A）各 TG アイソザイムに対する蛍光標識基質ペプチドを未固定の腎組織切片上で反応させることにより，グルタミン受容基質に対する蛍光ペプチドの取り込み量を指標として TG による架橋活性を可視化し，局在分布を評価した．
（B）一側尿管結紮法によりマウスに腎線維化を誘導し，経時的な線維化腎における TG1 および TG2 の活性分布を可視化した．黒矢
頭は尿細管上皮細胞で活性化した TG1，白矢頭は間質領域で活性化した TG2 をそれぞれ示す．スケールバーは 50μm．

総説－タンパク質架橋酵素を介した上皮細胞の間葉転換機構の解析るためのツールとして，蛍光標識した基質ペプチドを用が見られなかったことから，各基質ペプチドのシグナル

いた活性測定系を開発した．FITC 標識した基質ペプチ

特異性は確認済みである．

ドを未固定の凍結組織切片と反応させると，内在性の架橋活性の上昇が見られた領域について更なる詳細なTG 活性によって組織中の特定のタンパク質中のリジン検討を行うため，TG1 および TG2 活性と上皮細胞マー残基と基質ペプチドが架橋される．この蛍光ペプチドのカー E-cadherin との共染色を行った．腎線維化に伴い，取り込み量は内在性の酵素活性に依存するため，後述すE-cadherin の発現は顕著に低下したことから，尿細管るように各 TG アイソザイムの架橋活性の程度および局上皮細胞において EMT が誘導されることが示された．

在分布を測定することが可能となる（図２A）30）．

TG 活性と E-cadherin の発現分布を詳細に調べるため，共染色実験を行ったところ，尿細管上皮細胞で活性上６．腎線維化におけるアイソザイム特異的な TG 架橋活

昇する TG1 は E-cadherin 発現量と逆相関性を示した．
一方，TG2 については尿細管上皮細胞との共局在は見性の可視化
著者らはこれまでに腎線維化の進行に伴う TG アイ

られなかった（図３）．このことから，腎線維化においソザイムの役割を明らかにしてきた．一側尿管結紮法て TG1 は尿細管上皮の細胞障害や形質転換に関与し，（UUO）により作製した腎線維化モデルでは８種の TG

TG2 は間質領域においてマクロファージや線維芽細胞

アイソザイムのうち，TG1 および TG2 のみ病態増悪にの活性化もしくは細胞外領域での線維性タンパク質の架相関して発現量が増加した．上記の TG アイソザイムに橋による安定化を担う可能性が考えられる．

特異的な基質ペプチド（TG1: pepK5；TG2: pepT26）
を用いて活性分布を調べたところ，線維化早期（Day 3）

７．EMT と TGの尿細管上皮細胞において TG1 の顕著な活性化が見ら

EMT を誘導する中心的なシグナル伝達経路は TGF-β

れたのに対し，TG2 活性はこれまでの報告のように間を介した経路である31）．TGF-βは哺乳類では３種類の質領域に活性化が見られた（図２B）．ネガティブコン

ア イ ソ フ ォ ー ム（TGF-β1, -β2, -β3） が 存 在 し， 構

トロールとしての基質ペプチドのグルタミン残基をアス造的に類似した TGF-βスーパーファミリーとしてアパラギン残基に置換した配列（QN）では蛍光シグナル

クチビンや BMP（骨形成誘導因子）などが含まれる．

A

B

図３

腎線維化における TG の活性分布と上皮細胞マーカーの共染色TG1 および TG2 に対する蛍光標識基質ペプチドを用いて活性染色後，組織を固定して抗体を用いた染色により上皮細胞マーカー E-cadherin (E-cad) の発現分布を評価した．尿管結紮処置（UUO）後 3 日目の腎組織切片における TG1 (A,pepK5) 活性もしくは TG2 (B, pepT26) 活性と E-cadherin との共染色実験．白矢頭は TG 活性と E-cadherin の発現が共局在した領域を示す．スケールバーは 25μm．

総説－タンパク質架橋酵素を介した上皮細胞の間葉転換機構の解析

TGF-βは細胞分化・遊走・接着にも関与し，個体発生

ク ス メ タ ロ プ ロ テ ア ー ゼ（MMP2, MMP3, MMP9 なや組織再構築，創傷治癒，炎症・免疫，癌の浸潤転移など）の活性が増加し，癌細胞の足場の基底膜を分解す

どの幅広い領域において重要な役割を果たしていると考る．これにより癌の遊走性が促進され，ECM を介した

えられている．これら３種の TGF-βアイソフォームは転移が起こる．このような EMT が誘導される微小環境

TGF-β受容体（TGF-βR1–3）と結合し，シグナル伝達

では TGF-βの恒常的な活性化が見られるが，この活性因 子 SMAD 2/3，ERK (extracellular signal-regulated化が安定的に誘導されるためには，TGF-βを包み込む

kinase)，p38 MAPK (mitogen-activated protein

ような形で活性化を抑える潜在型 TGF-β結合タンパクkinase)，JNK (Jun N-terminal kinase) な ど 複 数 の質（LTBP）の蓄積が重要であり，TG は架橋反応を介

MAP キナーゼファミリーが活性化され，シグナル伝達

して LTBP を細胞膜に固定化する働きを持つ８,９）．フリーが起こる32, 33）．これらのシグナルは最終的に EMT に関の TGF-βの半減期が僅か２分であるのに対し，LTBP

連する転写因子群 SNAIL1/2 (snail family zinc ﬁngerに包まれた TGF-βの半減期は 90 分であるため，適切1/2), TWIST1 (twist family bHLH transcription factor

な状況下での TGF-βの活性化には LTBP が安定に細胞

1), ZEB1/2 (zinc finger E-box binding homeobox

膜に存在する必要がある．実際に TG2 の発現量は多く

1/2), KLF8 (Kruppel-like factor 8) な ど が 活 性 化 さの癌細胞株において癌の悪性度・転移能と関連するこれ，プロモーターへの結合や関連する制御因子を介してとに加え，TG2 の発現量は EMT マーカーの発現量とE-cadherin や Claudin などの上皮細胞マーカーの発現も相関する34）．膵臓癌細胞において TG2 は PTEN のを抑制する．さらに，TGF-β以外にも様々な増殖関連

リン酸化阻害によるタンパク質分解を促進し，Focal

因子（FGF, EGF, HGF, Wnt/β-catenin, Notch signal）

adhesion kinase/AKT シグナルを亢進させる35）．近年や低酸素刺激が EMT の誘導に関わることから，関連すはヒト結腸癌細胞株において更なる EMT の分子機構

るシグナル伝達系は多岐にわたり，生理的環境や病態にが解明されており，TG2 が Wnt 共受容体 LRP5 (Low-

対応した分子メカニズムの理解が重要である．

density lipoprotein receptor-related protein 5) と結合
し，β-catenin シグナルを介した EMT を制御すること

癌細胞が薬剤耐性および浸潤，転移能を獲得する際が報告されている36）（図４）．

にも EMT は重要である．EMT の誘導によりマトリッ

TG2

TGF-ȕRs

PI3K
PIP2

SMAD4
SMAD2/3

PTEN
P
CK2
PTEN

Snail1/2

Slug

ZEB1/2TWIST1PIP3

AKT

LRP5/6

TG2

TGF-ȕ

GSK3ȕ

TG2

ȕ-cateninศゎȕ-catenin
TCF/LEFEMT

図４

EMT 誘導機構に関わる TG2 の機能

EMT 誘導機構において，中心的に働く TGF-βは細胞膜の TGF-β受容体と結合し，SMAD シグナルを介して Snail,
ZEB, TWIST などの EMT に関連する転写因子群を活性化させる．TG2 は起点となる TGF-βの活性化に関わる他，
PTEN のリン酸化阻害による分解の促進，LRP5 との結合を介してβ-catenin シグナル伝達を促進し，EMT を誘導する．

総説－タンパク質架橋酵素を介した上皮細胞の間葉転換機構の解析

TG1 は EMT に 対 し て 抑 制 的 に 働 く こ と が 示 唆 さ れ

８．尿細管上皮細胞における TG1 の役割
尿 細 管 上 皮 細 胞 の EMT に お け る TG1 の 制 御 機 構た（図５E-G）．尿細管上皮細胞の EMT は近年，部分を理解するために，細胞レベルでの線維化誘導モデ

的 (partial) EMT と呼ばれ，細胞が基底膜から脱離しな

ルを用いて評価した．線維化を誘導する主要なサイ

いため筋線維芽細胞の形質転換への寄与度が低いことがト カ イ ン TGF-β を 腎 尿 細 管 細 胞 株 HK-2 に 処 理 し，

示されている37）．尿細管上皮細胞における TG1 の発現

E-cadherin および Collagen の発現量変化を指標として量の増減が Collagen の発現に影響しないことから，こEMT 誘導の程度について評価した（図５A）．TGF-βのような部分的 EMT の誘導機構に TG1 が関わる可能を 処 理 し た HK-2 で は 有 意 に E-cadherin の 減 少 お よ性が考えられる．

び Collagen の 発 現 が 誘 導 さ れ た が，siRNA に よ る
TG1 の発現抑制下では，Collagen の発現量には変化

９．おわりには な い も の の，E-cadherin の 発 現 の 更 な る 減 少 が 見

本研究では腎線維化におけるタンパク質架橋酵素に焦られた（図５B-D）．一方，TG1 を高発現させた HK-2

点を当て，TG ファミリー間でのアイソザイム特異的なは E-cadherin の発現低下を有意に抑制したことから，活性分布の解析を経て，尿細管上皮細胞の部分的 EMTAᒀ⣽⟶ୖ⓶⣽⬊
Collagen –E-cadherin +TGF-ȕ1

ECM protein

EMT
Collagen ++E-cadherin –

B

C

D

E

F

G

図５

尿細管上皮細胞における TG1 の役割（A）TGF-β1 を処理した尿細管上皮細胞が線維芽細胞用に形質転換する際に，上皮細胞マーカー E-cadherin (E-cad)の発現低下、線維性タンパク質の一つ Type1-collagen (Col1A1) の発現増加を誘導する．siRNA により TG1 の発現を低下（B–D）もしくは発現ベクターにより TG1 を高発現（E–G）させた尿細管上皮細胞株 HK-2 に TGF-β1 を処理し，EMT の誘導の程度ついて E-cad および Col1A1 の発現量を指標としたリアルタイム PCR により評価した．サンプル中の GAPDH の mRNA 量を用いて標準化を行い，各遺伝子の発現量を算出した．



総説－タンパク質架橋酵素を介した上皮細胞の間葉転換機構の解析の制御機構を解明する上で足掛かりとなる研究成果を提36, 659 (2009).

供することが出来た．今後は同細胞の EMT 誘導機構に８）Kojima, S. et al.: Requirement for transgluta-

関わる TG1 の基質タンパク質を同定することにより，minase in the activation of latent transforming

架橋修飾による基質の機能変換を介した EMT の更なるgrowth factor-beta in bovine endothelial cells. J.

分子機構の解明研究を進めていく．また，尿細管上皮細Cell Biol., 121, 439 (1993).

胞において特異的に TG1 を欠損したマウスについても

９）Verderio, E. et al.: Regulation of Cell Surface

現在作製中であり，動物モデルにおける TG1 と尿細管

Tissue Transglutaminase: Eﬀects on Matrix Stor-

上皮細胞の EMT との因果関係について検証する．今後

age of Latent Transforming Growth Factor-βの研究成果に基づく新たな研究展開により，慢性腎臓病

Binding Protein-1. J. Histochem. Cytochem., 47,の新しい診断，治療，予防法の開発に期待したい．

1417 (1999).
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総説－タンパク質架橋酵素を介した上皮細胞の間葉転換機構の解析

10

総

説

チロシンキナーゼによるＴ細胞の分化制御室

龍 之 介＊，新田

剛＊

原体由来のペプチドを認識して活性化したαβT 細胞は，

１．はじめに我 々 の 体 を 病 原 体 か ら 守 る 免 疫 系 は， 獲 得 免 疫（acquired immunity）と自然免疫（innate immunity）

クローン性に増殖してヘルパーＴ細胞やキラーＴ細胞へと分化し，病原体を攻撃して生体内から排除する．

からなる．獲得免疫を担うＴ細胞とＢ細胞は，ゲノム遺一方，TCRγδ鎖を発現するγδT 細胞は，αβT 細胞

伝子の再構成によって多様な抗原受容体を創出し，あらに比べて数が少なく，その分化機構や生理・病理的意義

ゆる外来抗原に対し免疫応答を誘導する能力をもつ．Ｔには未解明の点が多い．γδT 細胞は感染初期にサイト細胞は胸腺にて分化し，その過程で多様な抗原認識能を

カインを大量に産生し，防御応答に寄与する．γδT 細もつＴ細胞受容体（T cell receptor: TCR）を発現する．

胞は様々な抗原（ストレス応答性タンパク質や外来タン

TCRαβ鎖を発現するαβT 細胞は，主要組織適合遺伝子

パク質など）を直接認識し，その抗原認識機構は MHC複合体（major histocompatibility complex: MHC）にを認識するαβT 細胞とは明らかに異なっている．また，提示されたペプチドを認識することで活性化する．病

リンパ組織に局在するαβT 細胞に対し，γδT 細胞は皮図1

TCR シグナル経路の概略

抗原提示細胞の MHC/ペプチド複合体を TCR が認識することで TCR シグナルが誘導される．Lck は CD4 またはCD8 の細胞内領域と結合している．両者は MHC に結合することで，Lck を TCR 複合体の近傍へ動員し，CD3 分子群の ITAM をリン酸化する．この反応により，Zap70 が CD3 分子群に結合し，Lck によってリン酸化される．リン酸化
Zap70 は Lat をリン酸化し，下流のシグナル（NFAT, ERK, NF-κB）を活性化する．

＊東京大学大学院医学系研究科

免疫学

11

総説－チロシンキナーゼによるＴ細胞の分化制御

膚や腸，肺などの粘膜組織に多くみられる．近年，γδT残基を含む特徴的なモチーフが存在する．αβTCR が抗細胞は，皮膚の修復や骨折の治癒，熱産生，神経の制御

原を認識すると，Src ファミリーキナーゼ Lck が CD3に関与することが報告され，生理的意義が徐々に明らかの ITAM モチーフ内のチロシン残基をリン酸化する．

にされつつある．一方，がんの転移や炎症性疾患を促進

Zeta-associated protein of 70 kDa (Zap70) は２つのすることが示され，治療標的としても注目されている．

SH2 ドメインとキナーゼドメインを有する Syk ファミ

本稿では，抗原受容体シグナル伝達の重要なチロシン

リーチロシンキナーゼであり，SH2 ドメインを介してキナーゼである Zap70 と Syk に着目し，二つの分子がリン酸化された ITAM へ結合する２）．さらに，Lck が胸腺Ｔ細胞の分化へ果たす役割について解説する．

Zap70 をリン酸化することで，Zap70 の構造を不活性型から活性化型へ変化させる．

２．T 細胞受容体シグナル

活性化型 Zap70 は膜貫通タンパク質 Lat をリン酸化

αβT 細 胞 において，TCR が MHC/ペプチド複 合 体
を 認 識すると TCR シグナル が 伝 達 さ れ る（ 図 １）１）．
αβTCR は抗原認識を担う TCRα鎖と TCRβ鎖，および CD3 複 合 体（CD3εε, γ, δ, ζζ） か ら 構 成 さ れ る．
CD3 分子群の細胞内領域には ITAM (Immunoreceptor
Tyrosine-based Activation Motif) と呼ばれるチロシン

図２

する．リン酸化された Lat は 100 種類程度のシグナル
関連タンパク質が直接または間接的に結合するアダプ
タータンパクとして機能する３）．Lat 結合タンパク質の一つであるホスホリパーゼ C-γ1 (PLCγ1) は，ホスファ
チジルイノシトール-4, 5-ビスリン酸（PIP2）をイノシ

Ｔ細胞の分化

Ａ．胸腺Ｔ細胞の分化．DN3 細胞では，TCRβ鎖と代替 pTα鎖が会合することで Pre-TCR シグナルが誘導され，DN4～ DP 細胞へと分化する．DP 細胞は胸腺皮質上皮細胞（cTEC）に提示された自己抗原によって，正または負に選択される．正の選択を受けた DP 細胞は CD4SP または CD8SP 細胞へ分化し，
自己反応性 SP 細胞は胸腺髄質上皮細胞（mTEC）
によって負の選択を受ける．DN3 において TCRγ鎖と TCRδ鎖の組換えが成功すると自己会合によりγδTCR シグナ
ルが誘導され，成熟したγδT 細胞へ分化する．Ｂ．マウスの Zap70 と Syk の構造．既報の TCR シグナル伝達に障害をもたらすミスセンス変異を示した．Zap70 と Syk は類似した構造をもつ．Ｃ．自己ペプチドに対する TCR の親和性とＴ細胞選択の関係．正常なマウスでは，MHC/自己ペプチドに対して低い親和性をもつ 3, 4 番の細胞が正に選択され，高い親和性をもつ 5, 6 番の細胞が負に選択される．SKG マウスでは，TCR シグナル強度が減弱したことで，３番のＴ細胞に無の選択が誘導され，５番のＴ細胞が正に選択される．そのため，SKG マウスでは，自己反応性Ｔ細胞が正の選択を受けて分化し，自己組織を攻撃すると考えられる．



総説－チロシンキナーゼによるＴ細胞の分化制御

トール-1, 4, 5-トリスリン酸（IP3）とジアシルグリセロー

DP 細胞における正負の選択は，TCR と MHC/ペプチル（DAG）へと加水分解する．IP3 は小胞体上に発現すド複合体との結合力の総和（avidity）によって決定さる IP3 受容体に結合することで，カルシウム流入を促れる．正の選択は TCR との親和性が比較的低いペプチ

し，カルシニューリン/NFAT 経路を活性化させる．一ドによって誘導されることが知られている．対照的に，方，疎水性の DAG は，細胞膜上にて，セリン/スレオニ

TCR に対して高い親和性を持つペプチドは DP 細胞にンキナーゼであるプロテインキナーゼＣ（PKC）と Ras

強い TCR シグナルをもたらし，細胞死を誘導する．実グアニル放出タンパク質 1 (RasGRP1) を活性化する．

験的には，CD3ε抗体によって強い TCR シグナルを誘

PKC と RasGRP1 の 下 流 で は NF-κB 経 路 と Ras/ERK

導すると，DP 細胞が細胞死を起こす８）．また，オスに経路がそれぞれ活性化されて様々な遺伝子の発現を誘導発現する HY 抗原を特異的に認識する TCR を発現する

し，サイトカイン産生や細胞分裂を促進する．

マウス（HY TCR -Tg マウス）では，オス個体において全ての DP 細胞が負の選択をうける９）．一方，メス個体

３．胸腺におけるαβT 細胞の選択では，DP 細胞は何らかの自己抗原を認識することで，Ｔ細胞は胸腺にて分化する４）．胸腺は皮質と髄質領域正の選択をうける．このような単一の抗原を認識するに区分され，機能的に異なる上皮系細胞－胸腺皮質上皮

TCR-Tg マウスが多数作製され，TCR シグナル強度が細胞（cTEC）と胸腺髄質上皮細胞（mTEC）－が MHC

Ｔ細胞の運命を決定づけることが証明された．正の選択

上に自己ペプチドを提示することでＴ細胞の分化を制御をうけた SP 細胞は，ケモカインの作用により髄質へとしている５）．

移行する．mTEC は全身の臓器に相当する多様な自己

最も未熟なＴ細胞である CD4/CD8 両陰性（double

抗原を発現し，自己反応性の SP 細胞を負の選択によっ

negative: DN）細胞は，DN1-4 の分化段階に区分されて排除する５）．このような皮質/髄質における正負の選

６）
（図２Ａ）
，DN3 と DN4 の間にはβ選択というチェッ

択により，Ｔ細胞の自己・非自己の識別が可能になる．

クポイントが存在する．DN3 内では TCRβ鎖をコードする遺伝子の再編成がおこり，多様な TCRβ鎖を生成

４．正負の選択の閾値

する．機能的な TCRβ鎖は代替 TCRα鎖（pTα）と会

正負の選択に TCR シグナルが関与することは，細胞合し，pre-TCR シグナルが誘導され，DN3 細胞は DN4内シグナル分子に欠損や変異を有する遺伝子改変マウ細胞へ分化する．

スの解析によって証明されてきた．CD3ζ欠損マウスやβ選択を通過した DN 細胞は， 補助受容体 CD4 とZap70 欠損マウス，Lck 欠損マウスでは，正の選択がCD8 を 発 現 し，CD4/CD8 両 陽 性（double positive:

障害され，DP の段階で分化が停止する．また，Lat 欠DP） 細 胞 へ と 分 化 す る．DP 細 胞 で は TCRα鎖 の 遺損マウスでは，β選択が完全に障害され，DN3 以降の伝 子 再 構 成 が 起 こ り， 組 換 え に 成 功 し た TCRα鎖 はＴ細胞集団が全く認められない10）．興味深い知見とし

TCRβ鎖および CD3 複合体と会合し，TCR 複合体が完て，2003 年に坂口博士らが単離した SKG マウスに関成する．TCR 遺伝子再構成はランダムであるため，一する研究成果があげられる11）．SKG マウスはヒトの関定の確率で MHC/ペプチド複合体を認識できない TCR

節リウマチに類似した自己免疫病態を呈する自然変異マ

や，自己ペプチドに反応する TCR も生成されてしまう．

ウスであり，Zap70 遺伝子のミスセンス変異（W163C）

このような TCR 集団から外来抗原を認識しうる TCRを有し（図２Ｂ），TCR シグナル伝達機能が障害されてをもつ DP 細胞を選抜し，CD4 単陽性（CD4SP）またいる（しかし TCR シグナルが完全に遮断されている訳は CD8SP 細胞の分化を誘導する機構が正の選択であではない）．HY-TCR Tg マウスと SKG マウスを交配する７）．一方，自己ペプチドに反応する TCR をもつ DP

ると，オス個体に CD8SP 細胞が検出され，メス個体で細胞を細胞死によって取り除く機構は負の選択と呼ばれは CD8SP 細胞が減少する．これは TCR シグナル強度

る．MHC/ペプチド複合体を認識できない DP 細胞は自が減弱したことで，負の選択が正の選択へ，正の選択が発的な細胞死に至る（無の選択）．

無の選択へと誤変換されるためと考えられる．他にも，

13

総説－チロシンキナーゼによるＴ細胞の分化制御

Zap70 や Lat にミスセンス変異を有するマウスでも，

生型（γδT1）細胞は成体期にも分化する．また，γδTTCR シグナル伝達不全と自己免疫の病態が認められる．

細胞の分化と TCR 鎖には密接な関係があり，マウスで以上の一連の研究から，正と負の選択を誘導する TCR

はγδT17 細 胞 は Vγ4 と Vγ6 を，γδT1 細 胞 は Vγ1

シグナル強度には適切なレンジが存在することが示唆さと Vγ5 を使用している．
γδT1 とγδT17 細胞への運命決定はγδTCR シグナ

12）
れた（図２Ｃ）

ル強度が規定するという仮説がある．これは，抗原が存在しない状況下ではγδT17 細胞が選択的に分化し，抗５．γδT 細胞の分化γδT 細 胞 も ま た 胸 腺 に て 分 化 す る．TCRγ 鎖 と原が存在する場合はγδT1 細胞が分化するという実験

TCRδ鎖 の 遺 伝 子 再 構 成 は DN2 ～ DN3 の 段 階 で 起

結果に基づいている13,16）．また，CD3ε抗体による強いこる（図２Ａ）．γδTCR を発現したγδT 前駆細胞は，

γδTCR シグナルでγδT17 細胞の分化が抑制されるこ

TCRγ鎖と TCRδ鎖の自己会合によってシグナルを伝達とも，この仮説を支持している17）．一方で，γδT17 細し13, 14），成熟したγδＴ細胞へと分化する（図２Ａ）．

胞の分化は TCR が発現する前からプログラムされていαβT 細胞とγδT 細胞の分化について決定的に異なる点は，その機能的成熟の機構である15）．αβT 細胞るという報告もあり18），γδTCR 以外の要素もγδT 細胞の機能決定を制御している．

は胸腺で生成された後，末梢組織にて抗原刺激を受け，ヘルパーＴ細胞やキラーＴ細胞へと分化する．一方，γδT 細胞は胸腺でサイトカイン IL-17 や IFNγを産生

６．Syk 誘導性 TCR シグナルによるγδT 細胞の分化制御する能力を獲得する．IL-17 産生型γδT (γδT17) 細胞γδT 細胞の胸腺内分化を制御する TCR シグナル伝の分化は胎仔期から新生仔期に限定されるが，IFNγ産達にはどのような分子が関与し，γδT 細胞のサイトカ

図３

Zap0 欠損および Syk 欠損マウスにおけるγδT 細胞の表現型

Ａ．０日齢の Zap70 欠損または Syk 欠損マウスの胸腺におけるγδT 細胞数．Ｂ．TCR 刺激誘導後の胸腺γδT 細胞を抗リン酸化 ERK 抗体を用いて染色し，フローサイトメトリーにより解析した．Ｃ．胸腺γδT 細胞を PMA とイオノマ
イシンにより刺激し，IL-17 産生細胞の頻度を解析した．



総説－チロシンキナーゼによるＴ細胞の分化制御

イン産生能を制御しているのだろうか？過去の報告では，γδTCR 複合体には CD3δが会合していないことや，

７．Zap0 と Syk は機能的に異なるチロシンキナーゼである

CD3γ/CD3δハプロ不全マウス（CD3γ＋/－ CD3δ＋/－）でSyk はなぜγδTCR シグナルの中核的役割を担っていはαβT 細胞は正常であるがγδT 細胞の分化は障害さるのだろうか．理由の一つは Zap70 と Syk の発現の違れることが知られていた14）．従って，γδT 細胞におけいにあると考えられる．Syk の発現は DN 細胞で高く，る TCR 複合体の構造や下流のシグナル伝達経路はαβT分化に伴い徐々に低下するが，Zap70 の発現は分化に細胞とは異なり，γδT 細胞に独自の TCR シグナル伝伴い上昇していく２）．それゆえ，DN3 細胞にて誘導さ達経路があると考えられた．

れる pre-TCR シグナル伝達には，Zap70 よりも Syk の

そこで我々は，抗原受容体近傍のチロシンキナーゼで方が主要なはたらきをする21）．γδT 細胞は DN2-3 細ある Zap70 と Spleen tyrosine kinase (Syk) に着目し，胞に由来するため，Syk が初期γδTCR シグナルを制御γδT 細胞における TCR シグナル経路の解明を目指しすることはリーズナブルと言える．

た．Syk は Ｂ 細 胞 受 容 体（BCR） や Fc 受 容 体 な ど の

もう一つの理由は，Zap70 と Syk の生化学的性状の近傍で機能するチロシンキナーゼであり，SH2 を介し違いにあると考えられる．Syk は自己リン酸化能が高く，

19）．まず，我々は，胸腺て ITAM に結合する（図２Ｂ）

Lck 非依存的に活性化されることや，Zap70 と Syk でγδT 細胞において，TCR 刺激依存的に Zap70 と Syk

は ITAM に対する SH2 の結合様式が異なっていること．Zap70 と Syk のが示されている2,19, 22）．分化段階にあるγδT 細胞におどちらがγδT 細胞のシグナル伝達に必要であるかを検いて Zap70 が Syk の機能を相補できるかを検証した結証するため，CRISPR/Cas9 法により Zap70 欠損マウス

果，Zap70 はγδT 細胞の正常な分化を十分に支持でと Syk 欠損マウスを作製した．Zap70 欠損マウスでは，きないことが示された20）．これは，Syk 特有の機能が胸腺γδT 細胞の数は野生型マウスとほぼ同等であり，

γδT 細胞の初期分化に必要であることを示唆している．

がリン酸化されることを見出した

20）

TCR 刺激誘導後の ERK のリン酸化もほぼ正常であった（図３ＡＢ）．一方，Syk 欠損マウスの胸腺では，γδT 細胞の数が野生型の半分程度まで減少し，TCR シグナル

８．Syk は Lat/ERK 経路と PIK/AKT 経路を独立に制御する

伝達が著明に減弱した（図３ＡＢ）．従って，γδT 細胞

次に，我々は Syk の下流で制御される分子を探索しにおける TCR シグナル伝達を担う主要なチロシンキ

た．以前の研究から，Syk はＢ細胞やマスト細胞におナーゼは Syk であり，Zap70 の必要性は限定的である

いてホスファチジルイノシトール 3-キナーゼ (PI3K) をことが示された．

活性化すると報告されていた19）．PI3K は，ホスファチ

次 に，Zap70 欠 損 お よ び Syk 欠 損 マ ウ ス に お け る

ジルイノシトール 3, 4, 5-三リン酸（PIP3）を産生する

γδT 細胞のサイトカイン産生を解析した．新生仔期

ことで，セリン/スレオニンキナーゼである Akt のリンの マ ウ ス 胸 腺 で は 全γδT 細 胞 の う ち お よ そ 20% がγδT17 細胞であるが，Zap70 欠損マウスではこれが半減していた（図３Ｃ）．驚くことに，Syk 欠損マウスでは，γδT17 細胞は全く検出されなかった（図３Ｃ）．さらに，Syk 欠損マウスでは，Vγ4 や Vγ6 陽性γδT 細胞の顕著な減少が認められ，γδTCR レパトアに偏りが生じていた．Zap70 欠損マウスでは，Vγ6 陽性γδT 細胞のみが減少しており，これがγδT17 細胞数の部分的な減少をもたらしたと考えられた．従って，Syk は全てのγδT17 細胞の分化に必須であり，Zap70 は Vγ6 陽性γδT17 細胞の分化を制御していることが示された．

図 ４ PIK 欠 損（p0δ/p0γ二 重 欠 損 ） マ
ウスと Lat 欠損マウスの胸腺におけるγδT 細胞の表現型



総説－チロシンキナーゼによるＴ細胞の分化制御

酸化を促進する．γδT 細胞における TCR 刺激誘導後活性化することが示された（図５）．

の AKT のリン酸化は，Syk の欠損により有意に低下したが，Zap70 が欠損しても正常であった．PI3K の触媒

９．おわりにサブユニットである p110γ/p110δ二重欠損マウスを解γδT 細胞は，αβT 細胞とＢ細胞に次ぐ「第３のリ析したところ，胸腺γδT 細胞の絶対数に影響を与えるンパ球」であるが，その分化のしくみや機能には不明なことなく，γδT17 細胞だけが完全に消失した（図４）．

点が多く残され，十分に研究されたとは言い難い．我々

また，PI3K の欠損により TCR シグナル誘導性の Aktはチロシンキナーゼ Syk がγδT 細胞における重要なシのリン酸化は著しく低下したが，ERK のリン酸化には

グナル分子であることを同定し，IL-17 産生能の獲得にほとんど影響がなかった．また，PI3K を欠損するγδT

必須のシグナル経路を同定した．しかしながら，γδT細胞は正常に CD5 を発現しており，成熟した状態であ細胞におけるシグナル伝達機構の一部分を解明したに過ることがわかった．

ぎず，その全体像やγδTCR との構造的な関連は未だ不PI3K 欠損マウスで ERK のリン酸化が正常であったこ

明である．今後，リンパ球系列特異的 Syk 欠損マウスとから，Syk は ERK と AKT を独立に制御している可能や個々の Src ファミリーキナーゼの欠損マウスの解析を性が示唆された．そこで，TCR シグナル経路において通して，γδTCR シグナル伝達機構について精査する必ERK の直上に位置する Lat に着目した．Lat 欠損マウ

要がある．このような基礎研究を積み重ね，γδT 細胞

スでは，CD5 のγδT 前駆細胞の段階で分化が停止し，をよりよく理解し，その人為的な制御を実現することで，それらは TCR 刺激による ERK のリン酸化を誘導でき

がんや難治性疾患に対する有効な治療法を確立できるかず，
IL-17 産生能も全くみられなかった（図４）．しかし，もしれない．今後，γδT 細胞研究の発展にさらなる期

TCR 刺激後の Akt のリン酸化は正常なまま保たれてい待が寄せられる．

lo

た．また，Lat を欠損するγδT 細胞では，Zap70 よりも Syk が高発現していることが示された．以上の結果

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図５

αβT 細胞とγδT 細胞における TCR シグナル伝達の比較

αβT 細胞では，Zap70 が Lat をリン酸化し，シグナルを伝達する．PI3K の活性化は CD28という補助刺激受容体が制御する．γδT 細胞では，Syk がγδTCR 近傍にて主要なチロシン
キナーゼとして機能し，Lat および PI3K の活性化を制御している．また，PI3K の活性化は
γδT17 細胞の分化に必須である．

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₁₀）Zhang, W., et al.: Essential role of LAT in T cell
development, Immunity, 10, 323 (1999).

U S A., 94, 9797 (1997).
₂₂）Chu, DH., et al.: The Syk protein tyrosine kinase₁₁）Sakaguchi, N., et al .: Altered thymic T-cell

can function independently of CD45 or Lck inselection due to a mutation of the ZAP-70 geneT cell antigen receptor signaling, EMBO J., 15,causes autoimmune arthritis in mice, Nature,

6251 (1996).

426, 454 (2003).
₁₂）Takeuchi, Y., et al.: Impaired T cell receptor
signaling and development of T cell-mediatedautoimmune arthritis, Immunol Rev., 294, 164(2020).
₁₃）Jensen, KD., et al.: Thymic selection determines
gammadelta T cell eﬀector fate: antigen-naive
cells make interleukin-17 and antigen-experienced cells make interferon gamma, Immunity,17

総説－チロシンキナーゼによるＴ細胞の分化制御

18

研究報告

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究

低分子抗体と酸化還元酵素を駆使した次世代型電気化学イムノセンサーの開発
浅野竜太郎（東京農工大学大学院工学研究院）

酸化酵素（LOx）に変えて検討を行った結果，EGFR の濃度に依存したシグナルを得ることに成功した．一方，
カーボンナノチューブ結合性ペプチドを融合させた一本鎖抗体（scFv）の構築も進め，発現確認まで終了した
ため，今後の展開に期待が持たれる．
【考察】

【目的】

申請者は近年，タンパク質間を温和な条件で連結可能

現在，高感度，簡便，迅速に診断が可能なセンシン

なモジュールを利用した抗体酵素複合体の簡便な創製法

グ技術の開発が求められている．電極に固定化した捕を開発し報告したが１），実製造を見据えた場合は，やは捉抗体と，酸化還元酵素で標識した検出抗体を用いてり抗体と酵素を直接融合させる方が望ましい．一方で連ELISA 様に測定する電気化学イムノセンサーに期待が結モジュールを用いた場合も２分子の VHH を連結させ寄せられているが，検出抗体の不均一な酸化還元酵素修ることで初めて優位なシグナルが得られたので，本検出

飾，捕捉抗体の電極表面への不均一な固定化が実用化に系に於いても複数の抗体を融合させることが重要である

向けた課題となっている．

と考えられる．今後 LOx との融合抗体に関して，さらそこで，低分子抗体と酸化還元酵素を遺伝子工学的にに詳細な検討を進める予定である．

融合させると共に，捕捉抗体も電極結合性ペプチドを融【文献】

合させることで，電極表面への簡便な固定化と配向性の１）Kimura, H., Asano, R., Tsukamoto, N., Tsugawa,

制御を目指した．

W. & Sode K.: Convenient and Universal Fabri-【方法】

cation Method for Antibody-Enzyme Complexes

がんマーカーである上皮増殖因子受容体（EGFR）の計測をモデルに，抗 EGFR 抗体と溶存酸素の影響を受

as Sensing Elements Using the SpyCatcher/SpyTag System, Anal. Chem., 90, 14500 (2018).

けないため，より精度の高い測定が期待されるグルコー
ス脱水素酵素（GDH）との融合を目指した．抗 EGFR
抗体は高い生産性を期待し単ドメインで機能するラクダ
抗体由来の VHH 抗体を，また GDH は所属研究室で見出し，その熱安定性を向上させることにも成功している

耐熱性 D-アミノ酸アシラーゼの基質認識機構解明に向けた構造学的アプローチ
上

垣

浩

一
（近畿大学農学部）

Aspergillus ﬂavus 由来の GDH を用いた．さらに，電極結合性ペプチドはカーボンナノチューブ結合性ペプチドを用いた．
【結果】【目的】
近年，D-アミノ酸が健康・美容・食品だけでなく医抗 VHH 抗体と GDH を遺伝子工学的に融合させ，大薬品等の原料として有効であることが明らかになりつつ腸菌発現系を用いて調製を行った．EGFR への結合活性あり，光学的に純度の高い D-アミノ酸を安価に製造すと GDH の酵素活性の両機能を確認後，ELISA で EGFRることが産業上重要な課題となっている．本研究では熱の検出を行ったところ，優位なシグナルを得ることは出

安定性，有機溶媒耐性，高温で反応できる利点を考慮し，来なかった．そこで酵素を，ホモ４量体を形成する乳酸

耐 熱 菌（Pyrococcus 属，Thermomicrobium 属 等 ） 由9酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

来の D-アミノアシラーゼ（Pab_DAA,Tr_DAA）の構造

来の D-アミノアシラーゼは活性発現に必要な金属イオ

機能相関解明のための研究を行った．

ンが異なる事，溶液中での４次構造が異なる事等，酵素【方法】

としての諸性質が大きく異なっている事が判った．
今後，

本研究で用いた D-アミノアシラーゼは大腸菌を用

高分解能の立体構造解明に向けて結晶化条件の検討を更いた pET 発現系を用い，発現精製を行った．ただしに行っていく予定である．

Pyrococcus 属由来の D-アミノアシラーゼ（Pab_DAA）【文献】の発現・精製は大腸菌の染色体から発現を行った１）．

１）Nakamura T, Koma D, Oshima M, Hoshino H,

Pab_DAA, Tr_DAA の基質特異性は，種々の N-アセチ

Ohmoto T, Uegaki K.:Application of chromo-

ル-D-アミノ酸の分解に伴い生じる酢酸の定量により評

somal gene insertion into Escherichia coli for

価した．また市販の結晶化条件スクリーニングキットを

expression of recombinant proteins, J Biosci

用い酵素の結晶化条件の検討を行った．

Bioeng. 126, 266 (2018)【結果】
Pab_DAA の溶液中での会合状態をゲル濾過クロマト
グラフィーと動的光散乱法で求めた所，２量体である事が判った．次に本酵素の活性に対する金属イオンの影
響を検討するため，培養液に各種金属イオンを添加し，RNA 編集酵素 ADAR の exosome を介した伝播
による老化に伴う肝発癌リスク増大機構の解明
大

塚

基

之
（東京大学医学部附属病院）

発現精製を行い，活性測定を行った．従来知られている D-アミノアシラーゼは亜鉛を活性発現に要求するが，本酵素は亜鉛が最適ではなくコバルトイオンである事が【目的】

判った．コバルトイオンを用いた時の方が亜鉛より２倍

RNA 編集酵素 ADAR は，IFN 刺激で発現が誘導され，以上活性が高かった．そこで本酵素の結晶構造を決める

二本鎖 RNA に結合してアデノシンをイノシンへと変換ため結晶化条件のスクリーニングを行い，比較的大きな

する酵素（A-to-I editing）である．ADAR1 の発現は老結晶を得るができた．

化細胞で起きるので「細胞老化における ADAR 酵素の

Tr_DAA に関して，本酵素の活性の温度依存性を調発現増加から始まる一連の変化は，RNA 変異を誘導し，べた所，最適温度は約 80℃，最適 pH は pH8.0 である

加齢に伴う発癌リスクの増加に関与している可能性があことが判った．本酵素溶液に EDTA を添加したところ，るのではないか」と考えた．

酵素活性が消失した．活性の消失した酵素に種々の金属

しかしながら，生体内での「細胞老化」は，例えば肝イオンを添加し活性を再測定したところ，亜鉛イオン添

臓では，非実質細胞（間葉細胞：星細胞など）で起き

加で活性の回復が見られ Pab_DAA とは活性発現に必要る．この「非実質細胞の老化」と「実質細胞の癌化」とな金属が異なる事が判った．本酵素の溶液中での会合状いう離れた事象を説明するために，「周囲の肝実質細胞態をゲル濾過クロマトグラフィーと動的光散乱法を用いに exosome を介し ADAR などを伝播させ，それ以降のて調べたところ，三量体で存在していることが示唆され変化を惹起するのではないか」との仮説を立てた．

た．そこで本酵素の立体構造を明らかにするために結晶

本研究では，特に最近罹患数が増えている高齢者の肝化条件の探索を行い，ダイヤモンド型結晶の獲得に成功

炎ウイルス以外の要因による肝発癌にフォーカスし，「周

したが X 線照射実験の結果，3.0 Å程度の反射データし囲の間葉系細胞の細胞老化に伴って発現増加した RNA

か得られず，構造の解明には至らなかった．更に結晶化

編集酵素 ADAR が，exosome を介して肝実質細胞に取条件を探索し新たな結晶を得る事ができたので放射光施り込まれ，発癌リスクが高まる」という，老化に伴う発設での測定を行う予定である．

癌リスク増大機構に関する新しい概念を提唱することを【考察】目的とした．

本研究から Pyrococcus 属，Thermomicrobium 属由0酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成【方法】
１）不死化肝星細胞の ADAR 遺伝子座に Hibit を遺伝子編集で挿入する．

Sialyl-Tn 抗原による抗酸化酵素誘導を介したがん細胞の微小環境適応メカニズムの解明
大２）肝星細胞から ADAR-Hibit が exosome 中に放出さ

坪

和

明

（熊本大学大学院生命科学研究部）

れるかを検証する．
３）肝実質細胞への取り込みの有無を検証する．
【結果】
１）不死化肝星細胞の ADAR 遺伝子座に Hibit を遺伝子編集で挿入：【目的】
我々は腫瘍組織内に形成される低酸素環境が sTn 抗原を誘導し，がん細胞の浸潤・転移を活性化すること

遺 伝 子 編 集 手 法 を 用 い て， 不 死 化 ヒ ト 星 細 胞 のを発見した．さらに sTn 抗原が抗酸化酵素 HO-1 及びADAR1 遺伝子座に，ADAR1 蛋白のＣ端に Hibit ペプ

SOD2 の発現を誘導することを見出した．本提案研究でチドを挿入した．

は① sTn 抗原による HO-1 および SOD2 誘導メカニズ

２）ヒト肝星細胞からは ADAR-Hibit 蛋白が exosome

ムの解明，② sTn 抗原発現細胞の虚血再灌流抵抗性評価，

中に放出される：
上記の細胞の上清から Hibit を検出した．このことか③ sTn 抗原合成阻害による虚血再灌流感受性の解析を行い，がん病態形成における sTn 抗原依存的抗酸化酵

ら，ヒト肝星細胞からは ADAR-Hibit 蛋白が放出されて素誘導のメカニズムと意義の解明を目的とする．

いることが示された．

【方法】

上清から exosome を単離して，その中の Hibit 量を① sTn 抗原による HO-1 および SOD2 誘導メカニズム

検討し，exosome 中に ADAR-Hibit 蛋白が含まれるこの解明とが示された．

インテグリンシグナル伝達経路の下流及び，転写因子３）肝実質細胞への取り込みの有無の検証：

NRF2 の核移行と HO-1 遺伝子の転写制御の相関性を解不死化したヒト肝実質細胞に LargeBit を発現させた析した．加えて，sTn 抗原発現細胞における NF-κB 活

不死化ヒト肝実質細胞の上清に，上記のヒト星細胞の上性化メカニズムを AKT 及 mTORC1 の阻害剤で処理す

清を添加すると，肝実質細胞内での luciferase 活性が検ることで解析した．

出されることから，星細胞から放出された ADAR1 蛋白② sTn 抗原発現細胞の虚血再灌流抵抗性評価

を含む exosome は肝実質細胞に取り込まれることが示

in vitro 虚血再灌流実験系を用いて sTn 抗原発現細胞された．

の虚血再灌流抵抗性を解析することで，sTn 抗原発現と【考察】

虚血再灌流抵抗性との機能的関連性を解析した．

本研究で，IFN による誘導遺伝子である ADAR1 の発現が非実質細胞で起きると，その近傍の実質細胞に
exosome を介して取り込まれることが示された．
ADAR1 は RNA 編集酵素であり，その発現量の増加③ sTn 抗原合成阻害による虚血再灌流感受性の解析
sTn 抗原合成阻害剤処理細胞における虚血再灌流負荷への感受性を解析するとともに，担がんマウスへの sTn
抗原合成阻害剤の投与による，腫瘍形成抑制効果を組織は予期しない RNA 変異を惹起するため，これが実質細学的に解析した．

胞の癌化，とくに老化に伴う癌化の機序のひとつになっ【結果】ている可能性がある．

① sTn 抗原による HO-1 および SOD2 誘導メカニズムの解明
HO-1 遺伝子の転写調節を担う NRF2 の関与を解析した結果，sTn 抗原発現細胞では１）HO-1 遺伝子プロ
モーターへの NRF2 の結合レベルの上昇，２）NRF2の核局在レベルの上昇，３）NRF2 の核局在を制御する

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

AKT の活性化レベルの上昇が観察された．この結果は，面で機能する酵素触媒系の構築を目指した．抗真菌活性

sTn 抗原がインテグリン-AKT シグナル伝達経路を介しの評価は，琉球大学 平良東紀教授の協力を仰いだ．

て NRF2 の核移行を活性化し，HO-1 を誘導しているこ【結果】とを意味している．一方，SOD2 遺伝子の転写制御に

１）人工キチナーゼ集合体

おいては，１）転写因子 NF-κB のエンハンサ－領域へ

ChiA は，キチン結合ドメイン（LysM）と触媒ドメの結合レベルの上昇が観察されたが，AKT や mTORC1

イン（CatD）が柔軟なリンカー構造を介して連結され阻害剤処理の解析から，これら分子は NF-κB 活性化のている．個々のドメインを分割し，西洋わさび由来ペ

上流シグナルではないことが判明した．

ルオキシダーゼ（HRP）により認識されるチロシン残② sTn 抗原発現細胞の虚血再灌流抵抗性評価

基を含むペプチドタグ（Y-tag）の導入とそれを介した培養細胞を用いた虚血再灌流負荷実験の結果，sTn 抗重合化１），微生物由来トランスグルタミナーゼ（MTG）

原発現細胞ではスーパーオキサイドの産生やそれに伴うによる部位特異的修飾を組み合わせることで，野生型

アポトーシスが殆ど観察されなかった．

ChiA よりも高い抗真菌活性を示す人工 ChiA 集合体を

③ sTn 抗原合成阻害による虚血再灌流感受性の解析得ることができた．

sTn 抗原合成阻害剤処理細胞は高い虚血再灌流負荷経

２）人工脂質化キチナーゼの感受性を示した．担がんマウスへの sTn 抗原合成阻

上記の各ドメインに MTG により認識されるペプチド

害剤投与により，腫症組織内での sTn 抗原の発現の低タグ（Q-tag）を導入し，脂質化ペプチド基質（K-lipid）

下と，腫瘍サイズの縮小が観察された．

と連結することで人工脂質化キチナーゼを調製した２）．

【考察】

これと，脂溶性抗菌薬が可溶化された市販薬剤を組み合

本研究成果は，sTn 抗原による HO-1 や SOD2 の誘

わせたところ，脂質未修飾系では観察されない特異な抗導が，虚血再還流後の生存を可能とするための生存戦略

真菌活性の発現を示唆する結果を得た．

であることを意味している．

【考察】
ChiA による抗真菌活性の向上には，細胞壁の一部を生物界面で機能する人工生体触媒の開発
神

谷

典

穂

構成するキチン層へのアクセスを高める仕掛けが必要となる．１）では，LysM の導入方法に応じたキチン分解
ドメインの細胞壁界面への濃縮効果，２）では，脂質の（九州大学工学研究院）

導入と適切な薬物送達キャリアとの組み合わせによる相乗効果の発現が示唆された．

【目的】

【文献】

細胞は脂質二重膜構造で区画化され，膜を介した情報・

１）L. Jia, K. Minamihata, H. Ichinose, K. Tsumoto,

物質・エネルギー変換を通して動的に生命活動を営んでN. Kamiya: Polymeric SpyCatcher scaffold

いる．本研究では，カビの細胞壁に存在するキチン層のenables bioconjugation in a ratio-controllable

分解に寄与し，抗真菌活性を発現する植物由来キチナー

manner, Biotechnol. J., 12, 1700195 (2017).

ゼを題材として，当該酵素が本来有する触媒機能を人為

２）M. Takahara, N. Kamiya: Synthetic strategies for

的に拡張することを試みた．

artiﬁcial lipidation of functional proteins, Chem.

【方法】

Eur. J., 26, 4645-4655 (2020).

概念実証のためのモデルとして抗真菌活性を有する
リュウキュウイノモトソウ由来キチナーゼ （ChiA）を選択
し，酵素を用いたタンパク質の部位特異的連結技術１）並
びに部位特異的脂質導入技術２）により人工キチナーゼ集合体並びに人工脂質化キチナーゼを調製し，真菌細胞界



酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

ハチ目昆虫の行動進化とキノコ体カルシウム情報伝
達系酵素群の機能亢進の相関の実証的解析
久保健

プの分化は，社会性ではなく，むしろ高度な認知能力（空間記憶）に伴って獲得されたと考えられた．
（３）ミツバチでは PLCe の酵素活性を薬理学的に阻害雄することで，嗅覚―口吻伸展反射連合学習が阻害され（東京大学大学院理学系研究科）

ることが判明しているが３），RNAi によりハバチでもPLCe が連合学習に働くことが示された．このことから，連合学習における PLCe の役割は，両種で保存されて【目的】
高度な社会性（真社会性）をもつハチ目昆虫であるセイヨウミツバチと，原始的で単独性のカブラハバチを用いると考えられた．
【考察】

いて，脳での CaMKII と PLCεの発現パターンを，in

ハチ目昆虫では共通に，脳のキノコ体において Ca2＋

situ hybridization により調べる．また，同様の実験を情報伝達系とそれに基づく記憶学習機能が更新している

優れた視覚記憶を示すナミアゲハ，優れた空間記憶を示可能性が考えられる．一方で，キノコ体を構成するケニ

すワモンゴキブリ，原始的であるが，真社会性のネバダ

ヨン細胞のサブタイプの分化は，ミツバチを含む進化しオオシロアリについて行い，PLC のキノコ体選択的発た種類で見られる一方で，原始的なハバチにはみられな

現と CaMKII の大型ケニヨン細胞サブタイプに選択的いこと２），社会性とは関係せず，むしろ昆虫の高度な認発現がどの昆虫種で見られるか調べる．さらに，ハバチ

知機能，言わば「知性」と相関するという興味深い可能で PLCεを RNAi によりノックダウンすると，味覚-口性が初めて示された．

吻伸展反射連合学習が阻害されるか調べることを目的と

【文献】

した．

１）Suenami, S., Oya, S., Kohno, H. & Kubo, T. :【方法】

Kenyon cell subtypes/populations in the honeyミ ツ バ チ と ハ バ チ， ア ゲ ハ， ゴ キ ブ リ， シ ロ ア リ

bee mushroom bodies: possible function basedの 脳 切 片 を 作 成 し，in situ hybridization 法 に よ り，

on their gene expression proﬁles, diﬀerentiation,

CaMKII と PLCe 発現の局在性を調べた．またカブラ

possible evolution, and application of genome

ハバチにおいて嗅覚 / 味覚―口吻伸展反射連合学習系を

editing. Mini Review, Front. Psychol. –Com-

確立し，RNAi により上記連合学習における PLCe の役

parative Psychology (Edited by: Prof. Martin Gi-

割を調べた．

ulfa) 02 October | https://doi.org/10.3389/fpsyg.

【結果】

2018. 01717 (2018)（１）ミツバチでは PLCe は脳でキノコ体全体に選択的２）Oya, S., Kohno, H., Kainoh, Y., Ono, M. &に，CaMKII はキノコ体の大型ケニヨン細胞選択的にKubo, T. (2017) Increased complexity of mush-

発現するが１），ハバチでは PLCe も CaMKII もキノコ

room body Kenyon cell subtypes in the brain

体全体で選択的に発現することが判明した．
これにより，

is associated with behavioral evolution in hy-

ハバチでもミツバチ同様，キノコ体における Ca2＋情報

menopteran insects. Sci. Rep. , 13785 (2017)

伝達系の機能が更新しているが，ミツバチのようなキノ

３）Suenami, S., Iino, S. & Kubo, T. Pharmacologic

コ体を構成するケニヨン細胞のサブタイプ分化

は生

１,２）

inhibition of phospholipase C in the brain

じていないと推察された．

attenuates early memory formation in the hon-（２）アゲハ，ゴキブリ，シロアリの全てで PLCe はキ

eybee (Apis mellifera). Biol. Open Jan 12; 7 (1):ノコ体選択的に発現した一方，ゴキブリでのみ，ケニヨ

bio028191. doi: 10.1242/bio.028191 (2018)

ン細胞のサブタイプ選択的な CaMKII の発現が検出された．このことから，昆虫全般でキノコ体が記憶・学習に働くことが示唆された一方で，ケニヨン細胞サブタイ

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

風疹ウイルス非構造タンパク質のパルミトイル修飾機構とその意義の解明
坂田真

クリックケミストリーによるパルミトイル修飾の検出は十分だと考えられた．その一方，風疹ウイルスの p150
では修飾の検出が全く認められなかったこと，更にパル

史

ミチン酸の合成阻害剤処理でゲノム複製とウイルス産（国立感染症研究所）

生へ影響が認められないことから，p150 はパルミチン
修飾されない可能性が高いと考えられた．形質膜でゲノ【目的】

ム複製を行う既知のウイルスは，風疹ウイルスだけが属

風疹ウイルスを含む１本鎖プラス RNA をゲノムに持するマトナウイルス科とシンドビスウイルスを含む数十つウイルス（１本鎖プラス RNA ウイルス）は，細胞ののウイルスが属するトガウイルス科のみである．トガウ

オルガネラ膜を再構築して形成する小胞でゲノム複製をイルス科の nsP1 は相同性が高くパルミトイル修飾部位

行う共通した特徴を持つ．風疹ウイルスは細胞の形質膜も保存されているため，トガウイルス科では nsP1 のパルでゲノム複製を行う．その複製を担う非構造タンパク質

ミトイル修飾が形質膜への局在に重要だと考えられる．一（p150）は形質膜へ局在する唯一のウイルスタンパク質方，風疹ウイルスにおいては，パルミトイル修飾以外の機であり，形質膜における小胞形成に重要な役割を担っ構で p150 が形質膜へ局在していることが示唆された．

ていることが予想されるしかし，膜貫通領域を持たない
p150 が形質膜へ局在する様式や小胞形成の機構は殆ど不明である．風疹ウイルスに近縁なシンドビスウイルス

SIRT1 による栄養素嗜好性の制御機序の解明
佐々木では，非構造タンパク質（nsP1）のパルミトイル修飾

努（京都大学大学院農学研究科）

が形質膜への局在に重要であることが明らかになっている．また，申請者の予備的解析により p150 にパルミト
イル修飾部位が予測されたことから，本研究では p150の形質膜への局在にパルミトイル修飾が関与する可能性【目的】
食と健康を考える上で，食欲の調節メカニズムの解明を考えて解析を行った．

が必要である．「食べる」とは，肉体的欲求（栄養補給）【方法】

や精神的欲求（おいしさ）を満たす行為であり，「ニー

p150 あるいは nsP1 を 293T 細胞へ一過性に発現さズを満たす食は何か？」という観点での意思決定を伴う．

せて，クリックケミストリーによりウイルスタンパク質

肉体はカロリー（量）だけでなく栄養素（質）も求めるのパルミトイル修飾を検出した．次に，修飾の基質となが，栄養素ニーズを満たす食行動に関する研究は乏しい．

るパルミチン酸の合成阻害剤を用いて，風疹ウイルスの申 請 者 は， エ ネ ル ギ ー セ ン サ ー 分 子 の 一 つ で あ

ゲノム複製とウイルス産生への影響を検討した．

る NAD+ 依存性のタンパク脱アセチル化酵素である【結果】

SIRT1 が脳において，栄養素特異的に食嗜好を制御する

クリックケミストリーにより nsP1 のパルミトイル修

ことを報告した１）．同論文では，単純糖質に対する食欲飾を検出した．その一方，p150 のパルミトイル修飾ののネガティブ・フィードバック制御機構として FGF21

検出は出来無かった．また，パルミチン酸合成阻害剤の－オキシトシン系を同定した．本研究では，SIRT1 に処理では，ゲノム複製ならびにウイルス産生への影響は

よる栄養素嗜好性の制御メカニズムのうち，未解明と認められなかった．

なっている脂質嗜好性の制御メカニズムの解明に取り組

【考察】

んだ．

クリックケミストリーによるパルミトイル修飾の検出
結果から，シンドビスウイルスの nsP1 が修飾されていることを確認した．また，修飾されるアミノ酸残基を置換した変異 nsP1 では，修飾が認められなくなる事から，



【方法】
１．肝臓から生成される中鎖脂肪酸の代謝を反映するシ
グナルＸの探索
脳特異的な SIRT1 の遺伝子組換え動物では，特に中酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

鎖脂肪酸に対する嗜好性が変化する（未発表データ）．
中鎖脂肪酸は主に肝臓で代謝されるため，中鎖脂肪酸の代謝を反映する肝臓由来のシグナルＸが存在すると仮説を立て，肝臓の初代培養細胞系を用いて，代謝シグナル
Ｘの探索を試みた．
２．肝臓特異的な中鎖脂肪酸酸化欠損マウスの作製と解析
脂肪酸のβ酸化（４ステップ）の最初の段階を触媒する acyl-CoA dehydrogenase は，基質となる脂肪酸の長さにより，VLCAD, LCAD, MCAD, SCAD と担当が異なる．そこで，肝臓特異的 MCAD 欠損マウスを試みた．

図１

ヒトがんにおける KRAS ホットスポット変異

KRAS のドメイン構造を示す．12 番目のグリシンがシステインやアスパラギン，バリンに変化す
る等の変異が頻繁に観察される．Int, interacting.
Aa, amino acids.

【結果】
１．代謝シグナルＸの探索
肝臓の初代培養系を確立した．また，その上清をプロな治療法は存在しておらず，がん発生機序のより詳細な

テオミクスで解析するための準備を進めている．また，

解明とそれに立脚した新規治療法の創出は喫緊の福祉課

活性を含む分画を同定するためのスクリーニング系を確題となっている．

立中である．

近年，患者のがんゲノム解析から，膵がんや大腸がん

２．肝臓特異的 MCAD 欠損マウスの作製と解析

では ⓀʀⒶⓈ がん遺伝子が特に高い頻度で変異している目的のマウスを得るために，Cas9 法による Acadm

ことが示された．これらはホットスポット変異（図１）遺伝子（MCAD をコードする）の ﬂox マウスの作製を，として知られるが，これらに結合する化合物の開発は容AMED-BINDS 事 業 の サ ポ ー ト で 開 始 し た．Acadm-

易ではないことも近年明らかになりつつある．がん種にﬂox マウスは，現在作成中である．

よってこれらの変異の頻度が異なることも知られている【考察】が，これらの変異型 RAS を有するそれぞれのがんに対本プロジェクトは経過途中であるものの，少しずつ前進している．今後数年かけて，成果を報告したい．

する有効な治療法は十分に探索が進んでいない．
そこで本研究では，異なる変異型 RAS ががん発生に【文献】

果たす役割とその機序を解明する．本研究では特に，
ショ１）Matsui S, Sasaki T ( 責任著者 ), et al.: Neuronal

ウジョウバエを使用することで迅速な研究の遂行を図

SIRT1 regulates macronutrient-based diet selec-

る．この研究を通じて，RAS 変異の違いに応じた各種

tion through FGF21 and oxytocin signalling in

ヒトがんの個別化治療戦略樹立のための基盤を創出し，

mice, Nature Communications, 9, 4604 (2018)

社会福祉の向上に貢献することを目指す．
【方法】

ホットスポット変異型 RAS 群ががん発生を促進す
る機序の差異の解明と新規治療法の開発
園

下

将

大
（北海道大学遺伝子病制御研究所）

本研究では，各変異型 RAS ががん形質に及ぼす影響の解明と，各変異型 RAS に起因するがんの新規治療法開発の２点を実施する．新規モデル動物として，哺乳類との間で遺伝的保存度が高く，遺伝子改変が容易で，迅速・安価に研究を推進できるショウジョウバエを使用す
る．各変異型 RAS を発現する新規がん遺伝子型モデル【目的】
近年，がんの発生機序や治療法の研究が大きく進捗した．しかし，いまだほとんどの種類のがんに対して有効

ハエを作成し，このハエを使用して個体レベルの化合物
スクリーニングを実施し，各々の変異を有するがんに対する新規治療薬候補を同定する．

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

図３
図２

変異型 Ras 発現ハエ

幼虫の翅原基（赤：輪郭）で，patched (ptc) プロモー
ター活性を利用して約 10 細胞ぶんの幅の単層上皮細胞に遺伝子操作を施した．黒い領域は野生型細胞．RasG12D を活性化すると，細胞の増殖が亢進して帯が広くなる．RasG12V も細胞増殖を亢進させるが，RasG12D よりも活性が弱い．

変異型 Ras 発現ハエの生存率

RASG12D は RASG12V よりも高いハエ個体の致死性を招来する．また，MEK 阻害薬（MEKi）はこれ
らの致死性を救済する．*: P＜0.05.

効である可能性が示唆された．今後は，他のホットスポッ
ト変異型 RAS を発現するハエの作出も進め，新規治療薬候補の同定を進めるほか，これらの RAS や治療薬候補が細胞内シグナル伝達経路にどのように影響を与える【結果】
本研究ではまず，patched ( ptc) プロモーターを使か検討する予定である．

用して，各変異型の中でも特に高頻度に観察される【文献】

RASG12D や RASG12V を幼虫の翅原基で発現するがんモデ

１）Sonoshita M., Scopton A.P., Ung P.M.U., Mur-

ルハエを作出した．これらのハエは，細胞の過剰な増殖

ray, M., Silber L., Maldonado A., Real A.,を招来し，個体の生存率を著明に低下させることが分

Schlessinger A., Cagan R.L. & Dar A.C. (2018).

かった（図２，３）．特に，RAS

A whole animal platform to advance a clinical

G12Dの方が RAS

G12V

よりも顕著な形質転換表現型をもたらした．
次に，新規治療法の創出を目指し，申請者が使用実績

kinase inhibitor into new disease space. Nat

Chem Biol 14: 291-298.

のある認可済みがん治療薬ライブラリ（種々の代謝拮抗

２）Ung PMU*, Sonoshita M*, Scopton AP, Dar AC,

薬やキナーゼ阻害薬など約 90 種類の化合物）を各系統

Cagan RL, Schlessinger A. (2019). Integratedに投与した．その結果，MEK 阻害剤がハエの生存率を

computational and Drosophila cancer model

有意に救済することが分かった（図３）．

platform captures previously unappreciated【考察】

chemicals perturbing a kinase network. PLoS

以上の研究より，ホットスポット変異 RAS は個体において異なる形質転換能を有することが分かった．さらに，ヒトがんで特に高頻度に観察される RASG12D や
RASG12V が招来する形質転換の抑制に MEK 阻害剤が有26

Comput Biol. 15: e1006878. (*equal contribution)３）園下将大 . (2020). 個体を用いた新規抗がん剤創薬
基盤 生化学 92: 567-571.

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

合成酵素遺伝子の同定，機能解析を検討した．

【謝辞】
本研究を共に遂行してくれた，北海道大学遺伝子病制【結果】

御研究所がん制御学分野のメンバーに心から感謝しま

RpOx1-3 は 既 知 FAD oxidase と の 相 同 性 が 34 ～す．また，公益財団法人日本応用酵素協会のご支援に深36% と 比 較 的 ユ ニ ー ク な 配 列 を 持 つ こ と を 確 認 し謝申し上げます．

た．その一方，結晶構造が解明された大麻由来 THCA
synthase と RpOx1-3 の分子モデルの比較より，FAD

希少苔類が生産するビベンジルカンナビノイドの生合成酵素に関する基礎及び応用研究
田

浦

太

志

（富山大学大学院医学薬学研究部（薬学））

結合部位である His 及び Cys 残基は適切な位置に保存されていることが確認された．PETA の前駆体と推定される 4-geranyl dihydropinosylvin acid を基質とする酵
素アッセイを行い，生成物を L-MS により分析した結果，いずれの組換え酵素を用いた場合も PETA の生成は確認されなかった一方，RpOx3 の反応液に PETA 以外の酸化生成物の明確なピークが確認された．ラージスケー【目的】
希少苔類オオケビラゴケ（Radula perrottetii）が生産

ルの酵素反応により本生成物を調製し，分取 HPLC でするビベンジルカンナビノイドの perrottetinenic acid

精製した後 NMR により構造解析した結果，本化合物は(PETA) は大麻の薬理活性成分 tetrahydrocannabinolic

chromene 環を有する PETA の異性体であることを確acid (THCA) に類似した興味深い構造を有する（図１）．

認し，これを radulachromenic acid と命名した（図２）．

カンナビノイドは欧米では医薬品応用されているが，なお本化合物はオオケビラゴケの成分として報告されてPETA の生物活性および生合成メカニズムはほとんど検おらず，文献未記載の新規化合物である．

討されていない．本研究ではビベンジルカンナビノイド
生合成酵素の遺伝子クローニングおよび構造機能解析を目的とした．

図２

RpOx 酵素反応【考察】
RpOx3 をビベンジルカンナビノイド生合成酵素の候
図１

カンナビノイドの化学構造補と推察したが，本酵素は期待された PETA ではなく，新規なクロメン化合物 radulachromenic acid を合成するという興味深い結果を得た．現在，RpOx3 の精製な【方法】
大麻のカンナビノイドは，FAD oxidase に属するカらびに詳細な生化学的キャラクタリゼーションを検討しているところである．

ンナビノイド合成酵素によって生成することが知られて最後に本研究をご支援頂きましたこと心より感謝申し

おり，PETA の生合成にも類似の酵素が機能する可能性上げますとともに，応用研究につながる質の高い論文とが考えられた．本研究では先ずオオケビラゴケのトランできるよう今後も努めて参ります．

スクリプトームデータを構築し，生合成酵素の候補遺伝子として FAD oxidase のホモログ（RpOx1-3）をコードする配列を同定した．次いで Pichia pastoris を宿主として各組換え酵素を発現し，酵素活性の測定により生酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

青色光受容体フォトトロピンキナーゼが制御する光
シグナル伝達ネットワークの解明
武

宮

淳

史
（山口大学大学院創成科学研究科）

ファジー）は真核生物に保存されたメカニズムであるが，植物における役割についてはこれまで明らかにされていなかった．本研究は植物におけるペキソファジーの生理的意義を示した初めての例となった．
【文献】
Yamauchi, S., Mano, S., Oikawa, K., Hikino, K., Tes-

【目的】

hima, K.M., Kimori, Y., Nishimura, M., Shimazaki,

植物の表皮に存在する気孔は青色光に応答して開口

K. & Takemiya, A.: Autophagy controls reactive

し，光合成に必要な二酸化炭素の取り込みを促進する．

oxygen species homeostasis in guard cells that is

気孔を構成する孔辺細胞では，青色光は光受容体である

essential for stomatal opening, Proc. Natl. Acad. Sci.

フォトトロピンによって感知され，細胞内シグナル伝達

USA, 116, 19187-19192 (2019).

を経て細胞膜 H＋-ATPase を活性化させ，気孔開口の駆動力を形成する．本研究では，シロイヌナズナ突然変異体を用いた順遺伝学的解析により，上記シグナル伝達に関わる重要因子・メカニズムを同定することを目的としタンパク質架橋酵素を介した上皮細胞の間葉転換機
構の解析
辰

た．

川

英

樹

（名古屋大学大学院創薬科学研究科）【方法】
赤外線サーモグラフィを用いて青色光に応答した葉面
温度変化を測定し，気孔開口に異常のある変異体のスク【目的】

リーニングを行った．次世代シーケンスにより原因遺伝

腎線維化は組織に細胞外マトリクスが過剰に蓄積し，子を同定し，当該因子の気孔開口における機能解析を

正常な機能が失われる疾患である．病態初期には，腎尿行った．

細管上皮細胞の上皮間葉転換（EMT）や細胞死が病態【結果】形成の起点として考えられているが，分子機構の解明研

上記スクリーニングによって青色光による気孔開口お究は十分になされておらず，有用な制御方法は存在しな

よび細胞膜 H＋-ATPase の活性化が阻害された atg2 変い．本研究では，病態初期に起こる尿細管上皮細胞の形異体を単離した．次世代シーケンスにより原因遺伝子同質転換が，皮膚型のタンパク質架橋酵素トランスグルタ

定を行ったところ，オートファジーの必須因子のひとミナーゼ（TG1）により制御される可能性について検証つである ATG2 ( AUTOPHAGY-RELATED2) の遺伝子した．

コード領域内に１塩基挿入が生じ機能的なタンパク質が【方法】

発現できないことが分かった．次に気孔開口が阻害され腎線維化時により誘導される尿細管上皮細胞の障害をる要因について解析を進めた結果，変異体の孔辺細胞で細胞レベルで模倣するため，TGF-βもしくは H2O2 を尿は酸化されたペルオキシソームの数が増加しており，結細管上皮細胞株 HK-2 に処理した．EMT の程度につい果として青色光シグナル伝達を阻害する活性酸素が高蓄ては線維化関連遺伝子の発現量により評価し，細胞障害積していることが分かった．

の程度は生細胞数測定やアポトーシス誘導細胞数の測定【考察】により評価した．TG1 の影響を確認するため，TG1 に本研究では，オートファジーは酸化されたペルオキ

特異的な siRNA による遺伝子発現抑制および TG1 の高ソームを絶えず監視しそれを速やかに分解することで，発現実験により検証した．細胞中の TGase の活性につ孔辺細胞内の活性酸素の恒常性を維持し，青色光シグナ

いては，細胞抽出液を作製した後，ビオチン標識一級アル伝達・気孔開口を支える役割をもつことを明らかにし

ミンと反応させ，標的基質タンパク質に架橋されて取りた．ペルオキシソームの選択的オートファジー（ペキソ

込まれるビオチン量を指標として評価した．

8

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

ラクトシダーゼを作用させることで，2–8 糖のオリゴ糖【結果】
尿 細 管 上 皮 細 胞 株 HK-2 を 播 種 し，TG1 に 特 異 的として製造される．最近，アレルギー原因物質の特定がな siRNA を用いて遺伝子発現を抑制した後に TGF-β

試みられ，①４糖以上の GOS にアレルゲン性があり，や H2O2 処理による EMT や細胞死を誘導したところ，

特に分岐鎖を持つ４糖以上に高い，②一方で３糖以下のTG1 は上皮細胞に対して保護的に働き，同一ファミリー

GOS は直鎖・分岐鎖問わずアレルゲン性がない，ことの別のアイソザイムである TG2 は TGF-βの作用因子とが判明した２）．

して働くことが示された．細胞障害を誘導した HK-2 にそこで本研究では，４糖以上の GOS を産生しないβ-対して，ビオチン標識一級アミンを添加し，TGase 活

ガラクトシダーゼの創出を目指して，独自のタンパク質性により架橋されたビオチン修飾タンパク質の経時的工学技術『Enzyme Engineering by Proxy３,４）』を用いな変化を検出したところ，EMT や細胞死誘導処理の 12

た Bacillus circulans 由来β-ガラクトシダーゼ（BcBga）

時間後に BPA 修飾タンパク質が増大した．このことかの基質特異性の改変に挑んだ．

ら，EMT や細胞死の誘導に伴い TGase の活性が上昇【実験方法】

し，
特定のタンパク質を基質として架橋することにより，

１．BcBga とアクセサリータンパク質（spMB）の複EMT や細胞死誘導機構を制御することが示唆された．

4

4

4

4

4

合体のＸ線結晶構造解析
BcBga と spMB はそれぞれ既報の方法に従い３），大【考察】
尿細管上皮細胞の障害時において，TG1 の発現・活腸菌 BL21 (DE3) を用いたタンパク質発現と精製を行っ性が上昇し，これによる標的基質の架橋反応を介してた．複合体形成後のサンプルと，リザーバー溶液（0.15

EMT や細胞障害が制御される新機構を見出した．

M Ammonium sulfate, 0.1 M Tris-HCl pH 8.0, 15%【文献】(w/v) PEG4000）を用いて結晶化を行った．BcBga と１）Tatsukawa H, Takeuchi T, Shinoda Y, & Hi-

spMB に加え，３糖の GOS である 4-Galactosyllactose

tomi, K.: Global identiﬁcation and analysis of(DP3) を 加 え た ３ 者 複 合 体 に つ い て は，BcBga とisozyme-speciﬁc possible substrates crosslinked

spMB の２者複合体結晶に DP3 溶液を浸潤させるソー

by transglutaminases using substrate peptides

キング法によって結晶を得た．得られた結晶を用いて

in mouse liver fibrosis, Anal Biochem ., 604:

SPring-8 にてＸ線回折実験を行い，Ｘ線回折イメージ

113629 (2020).

を得た．その後，分子置換法により位相を決定し，構造精密化ソフトによるモデル修正を繰り返すことで，最終誰もが安心安全に摂取できるガラクトオリゴ糖の生産基盤の構築田

中構造モデルの構築に至った．
２．アクセサリータンパク質への部位特異的変異導入
QuikChange 法（Stratagene）を用いて，spMB の各俊

一（京都府立大学生命環境科学研究科）

種点変異体を作成した．そして，実験方法１と同様の操作で各タンパク質の発現，精製を行った．
３．GOS の合成反応【目的】

既報の方法に従い，GOS の合成反応を行った３）．単

近年，消費者の低カロリー志向を受け，砂糖に代わる糖，二糖，および GOS の量は ULTRON AF-HILIC-CD

人工甘味料の使用量は増加の一途である．一方，最近にカラム（信和化工）を用いて HPLC システム（LC-20AD，

なってそれらが原因によるアレルギーの発症が国内外で

島津製作所）で測定した．グルコース，ガラクトース，

確認され始めた１）．このようなアレルギーの発症が報告

ラクトースおよび上記のように調製した３糖とさらに大されている人工甘味料にガラクトオリゴ糖（GOS）がきなオリゴ糖を，これらのアッセイの標準曲線を作成す

あり，便性改善などに寄与するプレバイオティクスとしるための参照化合物として使用した．各サンプルについて広く食品に使われている．工業的には，乳糖にβ-ガて N＝3 で測定を行った．

9

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成【結果および考察】

２．BcBga による 4 糖 GOS の産生を更に抑制する改１．BcBga と spMB の複合体構造：基質特異性改変

良型 spMB の創出
本研究によって得られた BcBga-spMB-DP3 複合体のの分子メカニズム『Enzyme Engineering by Proxy』とは，人工アクセ

構造情報を基に，4 糖 GOS の産生を更に抑えるような

サリータンパク質を酵素の活性中心近傍に結合させるこ

改良型 spMB の創出を目指した．４糖 GOS の４糖目部とで基質特異性を改変する技術である．先行研究に分に立体障害を与えていると予想されるアミノ酸（Y31,より，BcBga に当技術を展開し，部分的にではあるがS83）を選択し，順にかさ高いアミノ酸へと置換した．

3,4）４糖以上の GOS の産生抑制に成功している３）．

BcBga お よ び BcBga-spMB・ 各 種 点 変 異 体 の GOS本研究では，BcBga-spMB と BcBga-spMB-DP3 の各

生 成 分 析 を 行 っ た 結 果 を 表 １ に 示 す．spMB/Y31W，複合体構造を分解能 2.6 Åと 2.4 Åで決定した．これ

spMB/S83V, spMB/S83W の３糖 GOS の産生は spMBらの構造解析から，spMB は BcBga の活性中心近傍にと 比 較 し て 減 少 し た が，spMB/S83Y は 他 の 変 異 体

結合しており，GOS の 4 糖目部分を塞ぐように存在しと異なり spMB と同程度の値を維持していた．更に，ていることが確認された（図１）．BcBga の GOS 収容

spMB/S83Y は 4︲6 糖 GOS の産生を大幅に減少させた．

ポケットは入り口（サブサイト+2）から非常に広がっしたがって，３糖 /4︲6 糖の比率は，BgaDD-spMB にており，このオープンな基質結合ポケットによって 2-8

おいて BgaDD より 2.7 倍向上しているが，本研究によ糖の多様な長さの GOS の産生を可能にしていると考えり創出した BgaDD-spMB/S83Y ではさらに 10 倍向上

られる（図１A）．一方で，spMB の活性中心近傍への（BcBga と比べると 27 倍向上）させることに成功した．

結合は３糖 GOS の収容スペース（サブサイト –1, +1,+2）は維持しつつ，４糖 GOS の 4 糖目部分の収容スペー

表１

スを立体障害的に狭めていることから，４糖 GOS 以上

spMB が与える BcBga 産生 GOS 比率への影響の産生を特異的に抑制していると考えられる（図１B）．

【文献】
１）Chiang. et al. Anaphylaxis to cowʼs milk formulacontaining short-chain galacto-oligosaccharide.

Journal of Allergy and Clinical Immunology. 130,1361 (2012)２）Kaneko. et al. Development of hypoallergenic
galactooligosaccharides on the basis of allergen
analy-sis. Bioscience, Biotechnology, and Bio-chemistry. 78, 100 (2014)
３）Tanaka. et al. Monobody-mediated alteration of
enzyme speciﬁcity. Nature Chem. Biol. 11, 762
図１．基質結合ポケット周辺の Surface models(A) BcBga による GOS 伸長メカニズム(B) spMB による BcBga の基質特異性改変メカニズム30(2015)
４）Tanaka. et al. Monobody-mediated alteration oflipase substrate speciﬁcity. ACS Chem. Biol. 13,
1487 (2018)

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

メチル化 DNA 酸化酵素による全能性獲得機構の解明
束

田

裕

一

（九州大学稲盛フロンティア研究センター）

は，転写開始点のみが TET3 欠損による影響が見られず，
DNA メチル化レベルが上昇していないという特徴があった．また，TET3 欠損により DNA メチル化レベルが上昇した DNA 領域は，野生型では５～ 20% の CpG
配列がメチル化している DNA 領域であることが示唆さ【目的】
生殖は生物個体が自己と同じ種に属する個体をつくり

れた．
【考察】

出すという，全ての生物に見られる本質的な生命現象で本研究により，母性 TET3 欠損は，体細胞核移植胚にある．その生殖において，細胞の全能性 [totipotency]（単おいて DNA メチル化レベルを上昇させることが明らか

独の細胞が自律的に発生を開始し個体を作り出す能力）になった．この結果，TET3 欠損により胎生 3.5 日まで

は，極めて重要な役割を果たしている．しかし，「全能の胚で生じ DNA のメチル化制御異常が，胎生 4.5 日に性細胞とはどのような細胞であるか？」という学術的なおける遺伝子発現異常を引き起こし，壁栄養膜細胞が消問いに対し，全能性の分子基盤は未解明である．本研究失して着床不全が生じていることが示唆された．

では，これまでに報告例のない体細胞核移植胚特異的再プログラム化因子として，申請者らが同定した DNA 酸
化酵素 TET3 に着目し，体細胞核移植胚の全能性獲得機
構解明を目指す．
【方法】

時間空間的ノックアウトマウスによるビタミン K2合成酵素 UBIAD1 の機能解明
中

川

公

恵
（神戸学院大学薬学部）

申請者は上述の研究目的のもと，2018 年度「酵素研究助成」により以下のことを明らかにした．TET3 を欠損した体細胞核移植胚は出生しないが，TET3 欠損によ

【目的】

る発生における表現型は，①着床前の胎生 3.5 日まではビタミンＫは，血液凝固や骨形成に重要な役割を担

発生率に顕著な影響はない，②全く着床しない，③胚う脂溶性ビタミンで，天然には，植物に含まれるビタが着床する胎生 4.5 日において壁栄養外胚葉形成に異常

ミン K1（フィロキノン : PK）と細菌が合成するメナキを生じる．TET3 欠損による遺伝子発現への影響は，④ノン類（MK-n）がある．いずれのビタミンＫ同族体

着床前の胎生 3.5 日では顕著な変化はないが，⑤胚が着も血液凝固因子の活性化を担うγ-グルタミルカルボシ

床する胎生 4.5 日では栄養膜細胞の分化に関連する遺伝キラーゼの補因子として働くが，特にゲラニルゲラニ

子群の発現が低下している．そこで本研究では，母性

ル側鎖構造を持つビタミン K2 ( メナキノン-4: MK-4)

TET3 が体細胞核移植胚の発生に果たす役割を明らかに

は，最も補因子としての活性が強い．また，MK-4 は核するために，TET3 欠損により核移植後から胎生 3.5 日

内受容体 steroid and xenobiotic receptor (SXR) のリまでの体細胞核移植胚で生じる DNA メチロームの変化

ガンドとして遺伝子の発現制御作用を有する．このたを PBAT (post-bisulﬁte adaptor-tagging) 法 を 用 い ため，MK-4 はビタミンＫの活性型ともいえる．これまで

DNA メチローム解析により調べた．

に申請者は，摂取した PK が生体内で MK-4 に変換さ【結果】れ，それを担う酵素が UbiA prenyltransferase domain

体細胞核移植胚では，TET3 欠損により，着床前の胎containing 1 (UBIAD1) であることを見いだした１）．ま生 3.5 日において顕著に DNA メチル化レベルが上昇した，全身性 UBIAD1 欠損マウス（UBIAD1-KO）を作出し，ていることが明らかになった．DNA の各種機能エレメ

UBIAD1-KO が胎生早期で致死となることを明らかにしントにより TET3 欠損の影響に違いは生じていなかった２）．これにより，UBIAD1 が個体発生に必須の役割をた．しかし，TET3 欠損により DNA メチル化レベルの担うことが明らかとなった．しかし，個体形成過程にお上昇が見られた Gene body とその周辺の DNA 領域でける UBIAD1 の機能は不明であり，UBIAD1 の生体に

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成おける機能の全貌を明らかではない．
そこで本研究では，関連が明らかでなかった膵臓に著明な組織構造・機能

UBIAD1 を時間的空間的に欠損させることができるコ変化が認められたことから，膵臓の機能維持において，

ンディショナルノックアウトマウスを用いて，発育過程

UBIAD1 が必須の役割を担っていることが明らかとなっごとにおける全身での UBIAD1 欠損の影響や，成熟後た．

における UBIAD1 欠損の影響を解析した．

【文献】

【方法】

１）Nakagawa K, Hirota Y, Sawada N, et al. Iden-

UBIAD1 を時間的空間的に欠損させることができる

tiﬁcation of UBIAD1 as a novel human mena-

コンディショナルノックアウトマウス（CAG-cre-ER

quinone-4 biosynthetic enzyme. Nature, 8,

Ubiad1-cKO マウス）は，Tamoxifen 誘導型全身性 cre

117-21 (2010).

発現マウス（CAG-cre-ERt）を用いて，cre/loxP シス２）Nakagawa K, Sawada N, Hirota Y, et al. Vitamin

テムにより作出した．この系では，Tamoxifen (Tam)K2 biosynthetic enzyme, UBIAD1 is essential for投与により欠損時期を制御できるため，成熟後より

embryonic development of mice. PLoS One, 9,

Tam を投与し，各組織における UBIAD1 欠損の影響

e104078 (2014).

を評価した．UBIAD1 欠損誘導後の生存性については，

３）Nakagawa K, Fujiwara K, Nishimura A, Mu-

Tam 投与後の生存個体数を経時的に測定して評価した．

rakami C, Kawamoto K, Ichinose C, Kunitou Y,

UBIAD1 欠損誘導により著明な組織萎縮が生じた膵臓Suhara Y, Okano T, Hasegawa H. UBIAD1 Playsについて，組織標本を作成して組織学的構造変化を精査

an Essential Role in the Survival of Pancreatic

し，免疫組織染色により各種細胞マーカー，酸化ストレ

Acinar Cells. Int. J. Mol. Sci. 0, 1971 (2019).

ス・アポトーシス・オートファジー関連因子の発現状態を評価した．さらに，糖代謝能の変化についても糖付加試験を行い，血中グルコース濃度およびインスリン濃度変化を解析した．
【結果】

炎症性Ｔ細胞を制御するチロシンキナーゼの同定と
機能解明
新

田

剛
（東京大学大学院医学系研究科）

出生成熟後より Tam を投与し，全身性に UBIAD1 を欠損させた結果，雌雄いずれにおいても投与後 10 から
50 日の間ですべての個体が死亡した．Tam 投与後のマ【目的】

ウス組織を調べたところ，膵臓の著明な萎縮が観察され免疫系の司令塔であるＴ細胞は，抗原受容体（TCR）

たことから，膵臓の組織標本を作製して評価した結果，の種類によって，αβＴ細胞（典型的なＴ細胞）とγδT

膵腺房細胞の消失が認められ，消失箇所において脂肪細細胞の２種類に区別される．γδT 細胞は，αβＴ細胞と胞の形成が生じていることがわかった．これにより，糖Ｂ細胞に次ぐ「第三のリンパ球」であり，全ての有顎脊

代謝能の低下による血糖値の低下とインスリン分泌能の椎動物に存在するが，その研究は他の二者に比べて遅れ低下が認められた．さらに，膵腺房細胞が消失する機ている．近年，γδT 細胞は炎症性サイトカイン IL-17

構を明らかにするため，種々のマーカー因子の発現を調を産生し，多彩な生理的・病理的役割を有することが示べた結果，酸化ストレス・アポトーシス・オートファ

され，自己免疫疾患やがんの治療標的として注目されてジーの全てのマーカー発現が亢進していることがわかっいる．本研究では，IL-17 産生型γδT 細胞（γδT17）た３）．

の分化を制御する分子機構を理解することを目的とし，【考察】

γδTCR シグナル伝達を担うチロシンキナーゼの同定とUBIAD1 は成熟後においても全身性に欠損することで致死となることから，生存に必須の因子であるといえる．また，これまでビタミンＫや UBIAD1 の機能との

機能解明をめざした．
【方法】
私 た ち は こ れ ま で の 研 究 で， 胎 仔 胸 腺 に お け る酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

γδT17 の分化にチロシンキナーゼ Syk (Spleen tyrosine kinase) が重要であることを示してきた１）．成体における Syk の機能と生理的意義を検討するため，Sykﬂox マウスと Cd127-Cre マウスを交配し，リンパ球特腸内細菌の宿主動物多糖グリコサミノグリカンの代謝機構とその常在性との相関橋本

渉（京都大学農学研究科）

異的に Syk を欠損する Syk-cKO マウスを作製した．また，TCR シ グ ナ ル の 下 流 で Syk の 活 性 化 を 担 う Src
ファミリーキナーゼとして，γδT 細胞に発現する Blk【目的】と Lck に着目し，CRISPR/Cas9 法により KO マウスを

近年，腸内細菌をはじめとする常在細菌がヒトの健康作製した．これらのマウスを用いて，γδT17 の分化とと密接に関わっていることが明らかにされている．あるTCR シグナル，およびγδT17 依存的な炎症への影響を

種の病原細菌や常在細菌は，宿主の細胞外マトリクスを解析した．

分解や定着の標的とする．ヒアルロン酸やヘパリンな【結果】

どのグリコサミノグリカン（GAG）は，動物の細胞外Syk-cKO 成体マウスでは，αβＴ細胞は正常に分化しマトリクスの重要な構成多糖として存在する．我々は，ていたが，γδT 細胞の分化は未熟段階（CD5－CD24＋）

プロバイオティクス（乳酸菌）を含めた多様な常在細で著しく阻害されていた．TCR 刺激による MAP キナー

菌が GAG を分解することを見いだし，その輸送体と分ゼ経路および PI3K-Akt 経路の活性化も顕著に低下して解・代謝系酵素を同定した．本研究では GAG 代謝酵素

いた．また，γδT17 は完全に消失し，イミキモド刺激（KduI: 4-deoxy-L-threo-5-hexosulose-uronate ketol-による皮膚炎も抑制された．従って，Syk はγδT17 を

isomerase）の構造機能相関，及び KduI と腸内細菌常在誘導するγδTCR シグナルに必須であることが明らかと性との相関の解明を目指した．

なった．γδT17 の分化を担う Src ファミリーキナーゼ【方法】

として Blk が報告されていたが，我々が作製した Blk-

乳 酸 菌 由 来 KduI を 基 質 存 在 下 で 結 晶 化 し た．

KO マウスはγδT17 細胞の異常を全く示さなかった．

SPring-8 のビームライン（BL45XU）においてＸ線回

Blk の関与についてはγδT 細胞の研究分野として再考

折データを収集し，分子置換法により KduI の立体構造する必要がある．一方，Lck-KO マウスでは，Syk-cKOを決定した．GAG 存在下でのプロバイオティクスにおマウスと酷似したγδT17 分化阻害が観察され，Lck がける遺伝子発現を明らかにするため，培養菌体から全Syk の活性化に重要である可能性が示された．

RNA を抽出し，RNA sequence 解析に供した．

【考察】

【結果】

TCR-Lck-Syk によって駆動されるシグナルが炎症性

これまでに大腸菌と腸球菌由来 KduI の立体構造が決γδT17 細胞の分化誘導に重要であることが明らかと定されているが，構造機能相関は不明である．基質存なった．Lck と Syk は炎症性疾患に対する有効な標的

在下で，KduI の立体構造（基本骨格 double-stranded

酵素となる可能性がある．

β-helix）を分解能 2.80Å で決定した．KduI ファミリー【文献】に高度に保残されているアミノ酸残基が集中するクレフ

１）Muro R, Nitta T, Nakano K, Okamura T,

ト周辺では，電子密度が薄く，基質の明瞭な電子密度もTakayanagi H, Suzuki H. γδTCR recruits the

確認できなかった．ドッキングシミュレーションの結果，

Syk-PI3K axis to drive proinﬂammatory diﬀer-

基質がクレフトに結合することが示唆された．クレフト

entiation program. J Clin Invest, 128, 415-426,に位置するアミノ酸残基（Arg163 と His200）を Ala(2018)に置換した変異体の酵素活性は顕著に低下した．
腸内細菌における KduI の普遍性を調べたところ，腸内優占種である Bacteroides をはじめ，Enterococcus
や Clostridium などの多様な腸内細菌のゲノムに KduI

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

遺伝子が見いだされた．また，Bacteroides ovatus がヒ

PB1・PB2 の３種のサブユニットタンパク質で構成されアルロン酸を資化し，その過程で乳酸や短鎖脂肪酸を分る．ウイルス mRNA の転写の過程では，RNA 合成酵

泌することがわかった．現在，このプロバイオティクス

素のサブユニットタンパク質が高度に連動して機能す性を示す B. ovatus の遺伝子発現を解析している．

る．このうち，PA サブユニットのエンドヌクレアーゼ【考察】

活性による宿主細胞 mRNA からの 5ʼ-cap の切り取りは，乳酸菌，大腸菌，及び腸球菌由来各 KduI の立体構造

ウイルス mRNA 合成と増殖に必要不可欠である１）．最を比較した結果，Arg163 の立体配置が各酵素でほぼ同近我々は，PA が宿主細胞のアセチル化酵素でアセチル一であった．さらに，R163A と H200A の酵素活性が化され，それによって PA エンドヌクレアーゼ活性が増顕著に低下することから，このクレフトが活性部位を構強されることを発見したことから，その意義を問う本研成すると考えられる．

究を開始した．

KduI 遺伝子が多様な腸内細菌のゲノムに保存されて【方法】

いることから，KduI と腸内細菌の常在性との相関が考

インフルエンザウイルスの野生型 PA，ヒトのアセチえられる．GAG は動物から恒常的に分泌されており，

ル化酵素 PCAF および GCN5 の組換えタンパク質を作常在細菌にとっては格好の栄養源である．実際，腸内優成し，試験管内でのアセチル化修飾解析と，アセチル

占種 Bacteroides 属細菌の多数が GAG 資化性を示すこ化に伴う PA エンドヌクレアーゼ活性変化の解析を行っとを見いだした．また，Bacteroides 属細菌由来 KduIにも Arg と His が完全に保存されている．以上のこと
から，代謝酵素 KduI を構成要素とする細菌の GAG 資
化機構は宿主における常在性と密接に関係していることが強く示唆される．
【文献】
Oiki, S., Nakamichi, Y., Maruyama, Y., Mikami, B.,
Murata, K. & Hashimoto, W.: Streptococcal phosphotransferase system imports unsaturated hyaluronan disaccharide derived from host extracellularmatrices. PLoS ONE, , e0224753 (2019).

インフルエンザウイルス RNA 合成酵素のアセチル化修飾はウイルス増殖効率にどう影響するのか畠山大（徳島文理大学薬学部）【目的】
現在，新規な抗ウイルス薬開発を目的として，ウイル
スタンパク質の機能解析が進められている．特に注目されているのが，ウイルス粒子内に収納されているリボ
ヌクレオプロテイン（RNP）である．RNP は，ウイルスのゲノム RNA，ヌクレオプロテイン（NP），RNA 合成酵素複合体から成る．RNA 合成酵素複合体は，PA・

図１

PA-K9Q 変異に伴うエンドヌクレアーゼ
活性変化Ａ）K19 を，アルギニン（K19R），もしくはグルタミン（K19Q）に変異させたところ，アセチル化レベ
ルが減少したことから，K19 がアセチル化標的の一つであることが示された．
Ｂ）アセチル化リジンのミミックである K19Q 変異により PA エンドヌクレアーゼ活性が賦活化され，PCAF や GCN5 と反応させずとも，基質である一本鎖 DNA のバンドがほぼ消失した（レーン 10）．
Ｃ）アセチル化リジンのミミックである K19Q 変異により，ウイルス RNA 合成酵素の活性も優位に増強された．

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

た．質量分析によりアセチル化修飾を受けるリジン残基を特定した後，そのリジン残基を，アセチル化リジンを模倣するグルタミン残基に変異させた組換えタンパク質を作成し，上記と同様に PA エンドヌクレアーゼ活性変化の解析を行った．また，グルタミンへの変異に伴うウ
イルス RNA 合成酵素活性変化も解析した．
【結果】
PA 組換えタンパク質を用いた試験管内での実験により，PA はアセチル化酵素 PCAF および GCN5 によってアセチル化され，質量分析の結果，その標的は 19 番目のリジン残基（K19）であることが示唆された．それを生化学的に解析するため，
K19 をアルギニン（PA-K19R）
またはグルタミン（PA-K19Q）に点変異させた組換えタンパク質を使用したところ，アセチル化のシグナル強度が有意に減少したことから（図１A），K19 がアセチ
ル化標的の一つであることが示された．また，アセチル化修飾に伴って，PA のエンドヌクレアーゼ活性が増強されることも明らかにした．そして，PA-K19Q 変異により，定常的なアセチル化をミミックすると，PCAF・
GCN5 と反応させずとも PA エンドヌクレアーゼ活性が増大した（図１B）．さらに，ウイルスの RNA 合成能も，

図２

PA アセチル化の生物学的意義の考察

Ａ）PA は，そのエンドヌクレアーゼ活性によって宿主細胞の mRNA から 5ʼ-cap を切り取り，それをプライマーとして用いることでウイルス mRNA が合成されるため，PA エンドヌクレアーゼ活性はウイルスにとって必要不可欠な酵素活性である．
Ｂ）PA アセチル化によってエンドヌクレアーゼ活性が活性化されたことから，この翻訳後修飾はウイル
ス mRNA 合成，およびウイルス増殖を増大させる
ことが示唆された．

PA-K19Q 変異によって有意に増加した（図１C）．以上より，PA-K19 のアセチル化によって PA エンドヌクレ

飾を抑止することでウイルスの増殖を抑えられないか」

アーゼ活性が増大し，それに伴って RNA 合成能が強めと考え，まったく新しいストラテジーを持つ抗ウイルスられることを示唆した．

薬の開発研究を遂行している．
なお，本研究成果は，日本薬学会第 0 年会の講演【考察】
以上の実験結果より，インフルエンザウイルス PA は

ハイライトに選出された（2020 年 3 月）．また，現在，

K19 がアセチル化されることで，そのエンドヌクレアー

原著論文として投稿中である．

ゼ活性が増強されることが示唆された．PA エンドヌク【文献】

レアーゼ活性は，宿主細胞の mRNA から 5ʼ-cap を切り

１）畠山

大，庄司

正樹，葛原

隆（2020)「インフ取り，ウイルス mRNA を合成するためのプライマーとルエンザウイルス RNA ポリメラーゼが有するエして利用することから，ウイルス mRNA 合成には必要

ンドヌクレアーゼ活性を阻害する化合物群」BIO

不可欠な工程である（図２A）．その PA エンドヌクレアー

Clinica，35: 73-77.

ゼ活性がアセチル化によって増強されるということは，
ウイルス増殖そのものの増強につながる可能性があることを示唆するものである（図２B）．

２）畠山

大：「インフルエンザウイルスタンパク質に対する翻訳後修飾」BIO Clinica，34: 68-73（2019)３）Hatakeyama D, Shoji M, Yamayoshi S, Yoh R,

我々はインフルエンザウイルスのゲノム RNA と相互

Ohmi N, Takenaka S, Saitoh A, Arakaki Y, Ma-

作用する NP もアセチル化され，ウイルス増殖に重要な

suda A, Komatsu T, Nagano R, Nakano M, Noda

．そこで，
現在は，

T, Kawaoka Y, Kuzuhara T. Inﬂuenza A virus「インフルエンザウイルスタンパク質へのアセチル化修

nucleoprotein is acetylated by histone acetyl-

働きを担っていることも示唆した

２－４）



酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

transferases, PCAF and GCN5. J Biol Chem 293:

糖鎖の負電荷にポリカチオン性の BP が静電的に速やか

7126-7138 (2018).

に吸着することでエンドサイトーシス / マクロピノサイ

大：「新薬開発を目指したインフルエンザウ

トーシスの経路で効率良く細胞内に取り込まれると考えイルスのリボヌクレオプロテイン構成タンパク質のられている．実際に，BP を用いてポリカチオン修飾し構造機能学的基盤研究」薬学雑誌 ，137: 205-214

たタンパク質は，細胞培養液に加えるだけで細胞機能が（2017)

制御できた例も報告されており，細胞生化学的手法の一

４）畠山

つとして認知されるとともに，抗体医薬を含むバイオ医
微生物由来の天然塩基性ペプチドを利用した酵素・タンパク質の細胞内直接送達法の開発
濱

野

吉

十

薬の新しいドラッグデリバリーシステム（DDS）として注目されている（図１B）．タンパク質や酵素を BP で修飾するための一般的，且つ，簡便な方法は，Ｎ末ある
いはＣ末に BP タグを結合させた融合タンパク質として（福井県立大学生物資源学部）

調製する方法である．しかし，酵素・タンパク質の等電点に大きな影響は与える本法は万能な手法ではなく，また，BP タグがタンパク質の表面に存在しない場合には，【目的】
酵素や抗体などのタンパク質，そして，DNA のよう期待された生体膜透過性が得られない．一方で，タンパな高分子化合物は，通常，生体膜を透過しないため，バ

ク質や酵素の表面を化学的に BP で修飾する方法は，こイオ医薬品の有効性は限定的である（図１A）．高分子の問題を解決できる．しかし，タンパク質が変性しない化合物を直接細胞内に導入する方法として，マイクロイ

温和な条件で BP 修飾するためには，特異的な化学反応

ンジェクションやエレクトロポレーションなど細胞膜を基（例えば，クリックケミストリーに利用できるクリッ

一過的に破壊して導入する方法，あるいは，リポソーム

ク官能基）を有する BP を用意する必要がある．さらに，を用いて導入する方法などが用いられてきた．しかし，有機化学的な固相合成法に頼るこの手法は，コストが高導入効率や細胞に与える損傷の大きさから必ずしも満足いためバイオ医薬品等に適用された例はない．

のいく結果は得られていない．一方で，塩基性アミノ

そこで本研究では，我々が独自に開発した微生物由来

酸（アルギニン，リジンなど）を主成分とするポリカチの天然 BP による化学修飾技術を用いて（図１C），低オン性の塩基性ペプチド（BP）は，分子量が 1,000 をコストにタンパク質，酵素，抗体をポリカチオン修飾し，超えるにも関わらず，優れた細胞膜透過性を示す．さら実用的な生体膜透過性を付与するための技術開発と有効に，分子量が数万を超えるタンパク質を BP で化学修飾性について検証した．

することで，タンパク質や酵素を動物細胞内に直接送達【方法と結果】

できる成功例も報告されている１,２）．BP で修飾された

現在，ポリカチオン化修飾法には塩基性オリゴペプチ

生体高分子が細胞膜を透過できる仕組みについては完全に理解されていないが，動物細胞表面のシアル酸を含む

図１



図２

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

delivery: design and cellular-uptake mechanisms. Biopolymers 8, 241-9 (2006).
３）Kosuge, M., Takeuchi, T., Nakase, I., Jones, A.T.
& Futaki, S. Cellular internalization and distribution of arginine-rich peptides as a function of
extracellular peptide concentration, serum, andplasma membrane associated proteoglycans.

Bioconjug. Chem. 9, 656-664 (2008).

図３

リン脂質輸送体群によるイオンチャネル制御機構の解明

ド（８残基アルギニンペプチド：R8）が汎用的に利用

原雄

二（京都大学大学院工学研究科）

されているが２,３），放線菌由来の天然ポリカチオン化合物であるε-ポリ-L-リジン（ε-PL, 図２）もポリカチオ
ン化修飾のツールとして期待できる．
これまでに我々は，【目的】

ε-PL 生産菌を OH-PEG4-azide 含有培地で培養すると，生体膜の構成成分であるリン脂質は膜タンパク質と相ε-PL のカルボキシル基末端に OH-PEG4-azide がエス互作用することで，膜タンパク質の構造や活性などを制テル結合で導入されることを見出した（図２）．生産さ御する．しかし生体膜中の脂質分子およびその動態，されたε-PL-PEG4-azide はクリックケミストリーに直接利らに脂質との相互作用によりもたらされる膜タンパク質用できることから，本研究では，タンパク質などの高分機能の調節機構については，未だその全容は明らかでな子化合物もε-PL 修飾によって生体膜透過性を付与でき

い．我々は，これまで膜外層から内層へのリン脂質輸送

るか検証するために，モデル実験として蛍光タンパク質活性を持つリン脂質フリッパーゼの細胞機能に着目し，である monomeric Azami-Green (mAG) のε-PL 修飾研究を進めてきた．その結果，リン脂質フリッパーゼにを行った．mAG に dibenzocyclooctyne（DBCO）基をよるリン脂質分子種の一つ（ホスファチジルセリン）の化学的に導入し，さらにε-PL-PEG4-azide（図１）を混輸送が，膜張力で活性化されるイオンチャネル PIEZO1

合し，クリックケミストリーにてε-PL-PEG4-azide/DBCO-の活性化を規定することを明らかにした１）．本申請では，mAG（図３A）を合成した．HeLa 細胞を用いて動物細我々の仮説「フリップ・フロップ スイッチ機構」（リン胞内への取り込みを観察したところ，未修飾の mAG と脂質の膜間輸送に伴う動的な局在変化が，膜タンパク

比較して取り込み率が10 倍以上向上した
（図３B）
．また，

質活性の ON/OFF を規定すること）をさらに発展させ，

細 胞 内 に 取 り 込 ま れ た ε-PL-PEG4-azide/DBCO-mAG

その普遍性を示すことを目的とした．

の一部は，核内にも局在することが共焦点レーザ顕微鏡【方法】

観察によって判明した（図３C）．

・PIEZO1 イオンチャネルの脂質感知部位の同定：【文献】

我々がこれまで使用してきた筋芽細胞株 C2C12 細胞

１）Schwarze, S.R., Ho, A., Vocero-Akbani, A. &を用いた．特にリン脂質フリッパーゼ欠損株（CDC50A

Dowdy, S.F. In vivo protein transduction: de-欠損株）に，PIEZO1 変異体を発現するプラスミドを導livery of a biologically active protein into the

入し，カルシウム測光法により各変異体の活性評価を

mouse. Science 8, 1569-72 (1999).

行った．

２）Futaki, S. Oligoarginine vectors for intracellular

・リン脂質フリップ・フロップにより活性制御されるイ

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

オンチャネルの同定：
HEK293 細胞について，リン脂質フリッパーゼ欠損
細胞を CRISPR/Cas9 法を用いて樹立した後，各イオン「動く」酵素の光操作による分裂期染色体の自在制御
松

尾

和

哉
（北海道大学電子科学研究所）

チャネルについて活性評価を行った．
【結果】
・PIEZO1 イオンチャネルの脂質感知部位の同定：【目的】

PIEZO1 イオンチャネルがどのように脂質動態を感細胞分裂は，１つの細胞が２つ以上の娘細胞に分かれ知するか解明を目指した．文献１で示すとおり，酸性るダイナミックな生命現象である．遺伝情報を次世代へ

リン脂質の一つホスファチジルセリン（以下 PS）がと正確に系譜するため，Ｓ期で染色体を複製し，染色体PIEZO1 チャネル活性に重要であることから，塩基性アを一度赤道面に並べた後，等分配することで，２つの等ミノ酸が PS 感知に関わる可能性を考えた．PIEZO1 は価な娘細胞が生まれる．細胞分裂Ｍ期の前中期において，2500 アミノ酸からなる長大なタンパク質であることか

染色体の動きを制御しているのが，モータータンパクら，膜脂質組成の異なるショウジョウバエの有するオル

質 CENP-E (Centromere-associated protein E) である．

ソログ PIEZO とのキメラ体を作製しそのチャネル活性

CENP-E は，ATP を加水分解することで得られる化学の評価を行った．その結果，Ｎ末端から中央領域にかけ

エネルギーを，メカニカルな「動き」に変換することでて脂質感知部位が存在することが示された．

染色体を輸送する．本研究では，光で可逆的に制御でき・リン脂質フリップ・フロップにより活性制御されるイる CENP-E 阻害剤を開発し，染色体の動きを光操作す

オンチャネルの同定：るシステムを構築することを目的とした．

Ca2＋ 透過型イオンチャネルを中心に，リン脂質の膜【方法】

間輸送（フリップ・フロップ）により活性制御されるチャ

CENP-E 阻害剤として汎用される GSK923295 の基

ネルの同定を目指した．その結果，PIEZO1 だけでなく本骨格に，フォトクロミック分子であるアリルアゾピラ

別の活性化機構を有するイオンチャネルの同定に成功しゾール誘導体を導入した化合物１（図１）を設計・化た．

学合成し，1H,13C-NMR, HR-MS で構造・純度を確認し【考察】た．得られた１の可逆的な光応答性，CENP-E 阻害活性，

これまでもイオンチャネルの活性制御機構として，リン脂質の寄与が注目されてきたが，ホスファチジルイノ

HeLa 細胞での CENP-E 阻害による細胞死，分裂期染色体の光操作を検討した．

シタイドによる制御機構が中心であった．我々はリン脂質の膜間輸送が織りなす細胞現象について，特にイオンチャネルの活性制御への寄与を明らかにした．本研究が端緒となり，リン脂質動態を基軸とした膜タンパク質全般に対する機能制御機構の解明につながるよう，さらに研究を推進したい．
【文献】

図１

光制御型 CENP-E 阻害剤１の光応答性

１）Tsuchiya M et al., Nature Commun., 2018
【結果・考察】合成した１は，アリルアゾピラゾール誘導体の trans体に特徴的な pi-pi* 遷移（340 nm 付近）と n-pi* 遷移（440 nm 付近）を示した．これに，365 nm の紫外光を照射し，光定常状態とすると，cis 体が 93% 生成した．また，510 nm の可視光照射で光定常状態とすると，

8

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

88% の trans 体 が 生 成 し た． こ の 光 異 性 化 反 応 の ス

がり，疾病と遺伝的・環境的素因の関係を明らかにする

イッチングは，何度も可逆的に行うことができた．１の上でも重要である．蛋白Ａは，下流のシグナルを介して

CENP-E 阻害能は，光照射しない条件で IC50＝5.9 μM

様々な生体の恒常性維持に寄与することが想定されていであり，紫 外光 照射時に IC50＝120μM，可視光照 射る．我々は，蛋白Ａの機能解明を通して，関節リウマチ

時 に IC50＝14μM と，10 倍 程 度 の CENP-E 阻 害 能 のの発症機序解明に応用出来ないかと考えた．そこで蛋白光スイッチングが確認できた．細胞系で CENP-E 阻害

Ａのノックアウトマウスを作製し，本検討を開始した．

活性を評価するため，HeLa 細胞を用い，cell viability【方法】

assay を行った結果，光照射しない条件および可視光

蛋白Ａノックアウトマウスより抽出した細胞を用いを照射した条件で GI50＝0.29μM であった．また，紫て，骨吸収を担う破骨細胞分化や機能を検討する．ま外光を照射した条件では GI50＝2.4μM であり，やはりたマウスの骨量を histomorphometric analysis を用い

10 倍程度の差が見られた．以上から，細胞系でも機能て解析し，骨リモデリングにおける蛋白Ａの機能を inする光制御型 CENP-E 阻害剤を開発した．

vivo でも明らかにする．

さらに，分裂期染色体を近赤外蛍光で染色し，１を【結果】添加すると，光照射前には CENP-E が阻害状態のため，

マクロファージは組織球として組織に移行する他，染色体はミス配置していたが，紫外光を照射すると，紡骨吸収を担う破骨細胞にも分化する能力を持つ．我々

錘体極付近のミス配置した染色体が赤道面方向に向かっは，蛋白Ａノックアウトマウス骨髄より分離したマクロて移動し始めた．さらに，移動途中で，可視光を照射す

ファージをサイトカイン RANKL で刺激し，破骨細胞ると，その動きはほぼ停止した．この染色体の動きは少への分化能や骨吸収能を検討した．その結果，蛋白Ａ

なくとも３回スイッチングでき，最終的に赤道面へと収ノックアウト細胞では破骨細胞分化が著明に亢進し，骨束した．以上から，染色体の移動を光で操作できるシス吸収能も増加した．更に蛋白Ａと骨リモデリングの関係

テムの構築に成功した ．

を in vivo で明らかにすべく，マウスの大腿骨を用いて【文献】

Histomorphometric analysis を行ったところ，蛋白Ａ

１）Mafy, N. N., Matsuo, K. Hiruma, S. Uehara, R.

ノックアウトマウスでは著明な骨量の低下，破骨細胞の１）& Tamaoki, N. : Photoswitchable CENP-E In-増加が見られた．

hibitor Enabling the Dynamic Control of Chro-【考察】mosome Movement and Mitotic Progression, J.

Am. Chem. Soc., 142, 1763 (2020).

蛋白Ａノックアウトにより，破骨細胞分化が亢進し，骨量が低下することが明らかとなった．蛋白Ａが関与するシグナルの解明により，関節リウマチの骨破壊や骨粗酵素コンディショナルノックアウトマウスを用いた
関節リウマチ発症機序及び新規治療法の解明
松

本

佳

則

（岡山大学大学院医歯薬学総合研究科）

鬆症を改善させる新たなターゲットを見出すことが出来ると考えており，現在更に解析を進めている．また本研究の更なる深化により，関節リウマチの病態形成に関わる蛋白Ａの役割が明らかとなれば，関節リウマチの遺伝学的な発症予測も可能になると考えており，その点についても今後明らかにしたい．

【目的】
関節リウマチをはじめとする自己免疫性炎症性疾患

最後に，本研究をご支援頂いた日本応用酵素協会の皆様方に感謝申し上げます．

は，自己または外来抗原に対する異常な免疫応答により活性化された炎症細胞から，サイトカインやケモカインが異常産生されることで生じる．これらの機序を解明す
ることは，治療ターゲットとなる新たな因子の発見に繋

9酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

ADP リボシルシクラーゼ・CD38 の概日リズム発振における役割三枝理背景）を比較したが，やはり差は見られなかった．
ファイバーフォトメトリーを用いて，視交叉上核のAVP ニューロン，VIP ニューロンにおける細胞内 Ca2＋

博

ダイナミクスを，自由行動下マウスで長期間（～２週間）（金沢大学医薬保健研究域医学系）

計測することに成功した．
【考察】
CD38－/－ マウスを用いた実験では，概日リズム発振【目的】
中枢時計・視床下部視交叉上核による概日リズム発振における CD38-cADPR カスケードの重要性は確認できには，細胞内 Ca2＋濃度の日内変動が重要であることが，なかった．視交叉上核における Ca2＋日内変動がどのよ培養スライスなど in vitro の実験により報告されている．

うに生み出され，リズム発振をどのように調節するのか，

CD38 は細胞膜表面に存在するエクト型酵素で，ニコチ

今後の課題である．

ンアミドアデニンジヌクレオチドから環状アデノシン二ファイバーフォトメトリーによる視交叉上核の長期

リン酸リボース（cADPR）を産生する．cADPR は細胞

in vivo Ca2＋計測は難易度が高く，これまでに報告例は内のリアノジン受容体のアロステリック分子で，小胞体ほとんど無い．正常マウスだけでなく，概日リズム異常など細胞内 Ca2＋ストアからの Ca2＋放出を促進する．本モデルマウスにおける視交叉上核の動態を研究する上で研究では，CD38-cADPR-Ca ダイナミクスの概日リズ

極めて有用な技術である．実際，我々が作成した概日リ

ム発振における重要性を，in vivo で解析することを目

ズム異常マウスに適用して既に重要なデータが得られ，的とした．

現在論文投稿中である．

2＋

【方法】
マウスのホームケージ内自発活動の概日行動リズム
を，受動型赤外線センサーを用いて明暗，恒常暗条件下で計測した．
また Cre 依存的に Ca2＋インディケーター jGCaMP7sを発現する組換え AAV ベクターを，視交叉上核の主要

ポリ ADP リボース合成酵素を介したヒトレトロト
ランスポゾン L1 の転移機構の解析
三好知一郎（京都大学大学院生命科学研究科）

なニューロン，AVP（バソプレシン）産生ニューロンや
VIP（血管作動性腸管ペプチド）産生ニューロンに特異的に Cre を発現するマウスの視交叉上核に局所感染さ【目的】

せて jGCaMP7s を発現させ，視交叉上核ニューロンにレ ト ロ ト ラ ン ス ポ ゾ ン は， 自 身 の RNA を 自 身 がおける細胞内 Ca2＋ダイナミクスを，ファイバーフォト

コードする逆転写酵素によって cDNA に変換し，ゲメトリー法を用いて in vivo で計測した．

ノ ム 上 を 転 移 す る 動 的 な DNA 配 列 で あ る．Long【結果】

INterspersed Element-1 (L1) は，ヒトで唯一自律的にCD38－/－マウスは概日リズム周期が約 30 分延長，活転移可能なレトロトランスポゾンだが，未だそのゲノム動期開始から約４時間後に自発活動のピークがあるこへの侵入機構および宿主制御因子はよく分かっていなと（野生型マウスでは活動期開始直後）を，ICR 遺伝

い．ポリ ADP リボシル化酵素（PARP）は，ポリ ADP的背景のマウスを用いた予備実験で見出し，本研究をリボースを標的タンパク質に付加し，これはタンパク質申請した．しかし，標準的な C57BL/6J 遺伝的背景の集積の目印ともなる．PARP1 と PARP2 は，L1 の逆転

CD38－/－ と野生型マウス（littermate）では，予備実験

写酵素 ORF2 と相互作用するが，その転移制御機構はで見られた概日リズム異常が消失した．予備実験で供与不明な点が多い．そこで本研究では PARP1/2 を介したを受けたマウスは littermate でなかったので，一度戻し

L1 のゲノム挿入過程を明らかにし，転移によるゲノム

交配を行い，
littermate の CD38－/－と野生型マウス（ICR

不安定化の理解にむけた基礎的知見を得ることを目的と

0

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成する．

tion protein A to sites of LINE-1 integration to【方法】

facilitate retrotransposition. Molecular Cell 75:

１．種々の ORF2 発現ベクターを用いて，ORF2 上の1286-1298 (2019). *co-corresponding authors

ポリ ADP リボシル化の部位の探索．

２）Miyoshi T. A battleground between human

２．ORF2 と 相 互 作 用 す る DNA 修 復 因 子 の 中 か ら，retrotransposons and host factors. Seikagaku.

PARP の制御因子を，PARP 阻害剤を用いて探索．

(2020) (In press)【結果】
１．shRNA によるノックダウン解析から，主に PARP1
が ORF2 をポリ ADP リボシル化することが明らかとなった．様々な ORF2 断片を解析したところ，ORF2の中央に位置する逆転写酵素ドメインが，主にポリ
ADP リボシル化されていた．この逆転写酵素ドメイ

種々の酵素によるヒストン修飾クロストークを介した，生殖細胞運命を規定するエピゲノム動態の解明
望月研太郎（東北大学大学院医学系研究科）

ンは PARP1 の相互作用ドメインと一致することから，
PARP1 との相互作用により，迅速に結合部位領域が修飾を受けると考えられる．しかし，その候補標的配列は逆転写酵素ドメイン内に多数存在していた．

【背景・目的】
ヒトを含む哺乳動物では，生殖細胞が唯一，精子また2．DNA LIG1 と LIG3 の DNA リ ガ ー ゼ は，ORF2 とは卵子を形成した後に，受精を経て世代の継承を保証す

相互作用するだけでなく，そのノックダウン細胞でる．マウスの生殖細胞は，胎仔期に微量な細胞集団としは，L1 の転移頻度が低下することが分かった．PARPて出現するが，その分子メカニズムの多くは依然として阻害剤を用いた実験から，LIG3 が PARP 活性依存的に不明であった．本研究では，我々がこれまでに同定しORF2 と相互作用することも分かった．一方で，LIG1

た複数の酵素１,２）かが調節するヒストン修飾間，ならびと ORF2 と相互作用するが，PARP 活性とは無関係にリ

DNA メチル化を含めた他のエピジェネティック修飾やクルートされるようだ．

クロマチンリモデリング因子・転写制御因子とのクロス【考察】

トーク（ある分子・経路が作用するときに他の分子・経本研究より，ORF2 の逆転写酵素ドメイン全体が，主路と影響し合うこと）を明らかにすることを目的とした．

に PARP1 によってポリ ADP リボシル化されることがさらに，マウス生殖細胞の発生分化に関わる遺伝子およ分かった．これは，ドメイン全体が修飾を受けること

び内在性レトロエレメント（ゲノム DNA 中に膨大に存

で，逆転写酵素活性あるいは DNA 結合能が変化するの在し，近傍遺伝子に影響を与える特殊な配列群）の発現ではないかと予想される．今後，試験管内反応を用いて制御システムを，サンプル細胞数の制限を克服して，in検証すべき課題である．一方で，PARP 活性化によって，vitro（試験管内）および in vivo（生体内）で包括的に

LIG3 が ORF2 複合体にリクルートされることが分かっ解明することを目指した．

た．LIG3 は micro homology 配列を利用して DNA 末【方法・結果・考察】

端同士を連結する alternative NHEJ に寄与することがまず，微量細胞でのクロマチン免疫沈降シークエンス

示唆されている．実際，一部の L1 の挿入配列近傍では（ChIP-seq）を応用して，初期胚や生殖細胞のゲノムにmicro homology が 検 出 さ れ る た め，LIG3 L1 cDNA

おける化学修飾状態を検出するために，実験解析系を最の挿入を担うことが予想された．今後，L1 挿入配列の適化した．その結果，主要なヒストン修飾である，H3

シーケンス解析を実施し，この可能性を検証予定である．

リジン４の３価メチル化（H3K4me3），H3 リジン 27【文献】の３価メチル化（H3K27me3）等について，細胞 1000１）*Miyoshi T., Makino T., and *Moran J.V. Poly

個から，ゲノム全領域における局在の記述が可能となっ( ADP-ribose ) polymerase 2 recruits replica-

た．次に，この技術基盤を用いて，野生型マウス胎仔

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成の初期胚および生殖細胞の発生段階を追って各修飾状態を検証した結果，特に生殖細胞の発生分化に関わる遺伝
子群において，ヒストン修飾間およびヒストン修飾とDNA メチル化との間に時系列的なキネティクスを見出

光応答性モータータンパク質による細胞分裂制御法
の開発
矢島

潤一郎
（東京大学総合文化研究科）

すことに成功した．このことから，生殖細胞の発生分化には，複数のメカニズムによる時空間特異的で段階的な遺伝子発現調節が働いていることが示唆された．
さらに，

【目的】

in vitro モデルを用いた各ヒストン修飾の責任酵素・ク

細胞分裂の進行の中心的な役割を担う酵素のひとつにロマチンリモデリング因子・転写制御因子に対する簡便モータータンパク質「キネシン」がある．キネシンは ATP

で効率的な遺伝子ノックアウト解析によって，E-box 結を加水分解する酵素であるとともに，分裂に必須なタン合型の転写制御因子がヒストン修飾酵素をリクルートす

パク質と結合し，細胞内の特定の場所まで運ぶ役割を担ること，次いで，DNA メチル化酵素群（DNMTs）がう．また，染色体の分配時には，紡錘体内の微小管との呼び込まれることが示唆された．また同時に，RNA シー

相互作用を通して適切なタイミング・場所で「力仕事」

クエンス（RNA-seq）によるトランスクリプトーム解をする酵素でもある．本研究では，分裂過程のあらゆる析を行い，各ノックアウトにおける遺伝子および内在性

タイミングで力学的機能を果たす酵素・キネシンを，光レトロエレメントの発現変動を明らかにした．

応答性タンパク質の構造変化を利用して光の照射の有無

現在，これらの成果を学術誌に投稿準備中である．

により局所的に活性化、または不活性化することで，目【文献】

的のキネシンがいつ，どこで機能しているのかを調べる

１）Mochizuki K, Hayashi Y, Sekinaka T, Otsuka K,ことが可能なメカノ-オプトツールの開発を目的とする．

Ito-Matsuoka Y, Kobayashi H, Oki S, Takehara【方法】

A, Kono T, Osumi N, Matsui Y.: Repression⑴微小管依存性タンパク質（酵素）・キネシンの活性を

of somatic genes by selective recruitmentof HDAC3 by BLIMP1 is essential for mouse

キネシンの活性を光によって制御するため，キネシ

primordial germ cell fate determination, Cell

ンのモータードメインのＮ末領域に光応答性タンパク

Reports, 24, 2682-2693.e6 (2018).

質である Lov または Zdk を融合したタンパク質を作２）Mochizuki K, Tando Y, Sekinaka T, Otsuka K,
Hayashi Y, Kobayashi H, Kamio A, Ito-Matsuoka
Y, Takehara A, Kono T, Osumi N, Matsui Y.:

成する．
⑵光依存性結合解離特性を持つタンパク質を融合したキ
ネシンの活性の光応答評価

SETDB1 is essential for mouse primordial germ

光の照射領域とタイミングとを制御可能な顕微シス

cell fate determination via ensuring BMP signal-

テムを構築し，光の照射に応答したキネシンの運動特

ing, Development, 145, dev.164160 (2018).

性（並進運動速度，回転運動速度，運動逐次性，最大【謝辞】
日本応用酵素協会 酵素研究助成のご支援に心より感謝申し上げます．



制御するメカノ-オプトツールの開発

発生力）を定量する．
【結果】⑴キネシンファミリーのうち kinesin-1，及び kinesin-5

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成のＮ末端側に光応答性タンパク質である Lov または分解酵素リパーゼの作用によって供給される．その中でZdk をそれぞれ融合した DNA コンストラクトを作成

も特にリン脂質は，様々な状況下における脂質メディし，大腸菌内で発現させ，目的タンパク質を精製した．

エーター産生の基質となるが，飽食および飢餓時におけ

Zdk を融合させた場合のみ，光に応答して Lov とのるリン脂質代謝の詳細については知見が乏しい．本研究

結合解離特性が維持されていた．

では，高脂肪食負荷および絶食時におけるリン脂質代謝⑵特定の波長の光の照射により，キネシンが発生する並に着目して脂質メタボローム解析をおこなうことで，新進運動の速度，及び回転運動の速度が，それぞれ２倍，規の脂質代謝パスウェイが存在しないか，検討をおこ

及び５倍程度上昇した．また，光の照射をやめた場合，なった．

kinesin-1 が微小管上を移動する距離（運動逐次性）【方法と結果】
通常食および高脂肪食を９週間与えた C57BL/6N マ

が 30% 程度減少した．

ウスを 48 時間完全絶食させ，エネルギー代謝に関わる【考察】
本申請研究では，細胞分裂を統御する仕組みとして，
リン酸化酵素、もしくは脱リン酸化酵素などの化学的信臓器において変動する脂質を脂質メタボローム解析により探索した．

号による制御機構に加え，「力仕事」酵素による制御機

マウス血漿中の遊離脂肪酸量は DHA＞AA＞EPA の構の可能性に着目し，力を発生する酵素の動きを光の照順であった．DHA は高脂肪食負荷により低下したもの

射で自在に制御するツールの開発を目指した．その結の，絶食による脂肪酸種の量に変化は認められなかった．

果，光の照射の有無によりキネシンの並進・回転運動，

血漿中のリゾリン脂質では，リゾフォスファチジルコリ

及び運動逐次性が制御でき一定の成果を得ることができン（LPC）（16 : 0）ならびに LPC (18 : 0) が最も多かったが，100％の阻害効果ではないため，より効果的な光た．LPC のうち LPC (18 :1) は高脂肪食負荷により増加応答性タンパク質の融合部位を検証してゆく必要があ

し，絶食により低下傾向であった．

る．In vitro でのメカノツールの検証後に，細胞内での絶食を施したマウスの内臓脂肪は全く残っていなかっ評価に取り組むととも，紡錘体内での力の定量が可能なた．内臓脂肪組織では中性脂肪の形で脂肪酸は取込まれFRET 力センサーの開発も行い，紡錘体機能における力ているが，遊離脂肪酸やリゾリン脂質の含量は他の組織発生酵素による統御機構を明らすることを目指す．

と比較して非常に低かった．
骨格筋に含まれる脂肪酸とリゾリン脂質は肝臓と比較【文献】
Yamagishi, M., Fujimura, S., Sugawa, M., Nishizaka,

して著しく低かった．興味深いことに，リゾプラズマ

T., Yajima, J: The N-terminal

β-strand of single-

ローゲンの含量が他の組織と比較して多く，高脂肪食負headed kinesin-1 can modulate the oﬀ-axis force-

荷ならびに絶食負荷によりリゾプラズマローゲンが増加

generation and resultant rotation pitch. Cytoskel-

した．

eton, in press, (2020)

通常食および高脂肪食の区別なく絶食時の肝臓ではドコサヘキサエン酸やアラキドン酸といった高度不飽和脂リン脂質代謝酵素による脂質輸送制御機構の解明
山本圭（徳島大学大学院社会産業理工学研究部）

肪酸およびリゾリン脂質が協調して増加していた．このことは絶食時の脂質代謝産物の変化にリン脂質代謝酵素のホスホリパーゼ A2 (PLA2) が機能する可能性が示唆されることから，肝臓における PLA2 遺伝子の発現を調べたところ，絶食負荷によりある PLA2 分子種が著しく増【目的】

加することが明らかになった．さらに当該 PLA2 遺伝子

エネルギー産生の根源である三大栄養素は，糖質，タ欠損マウスに絶食負荷を施したところ，遺伝子欠損マウ

ンパク質，脂質からなる．栄養素として摂取された脂肪スの肝臓では超低密度リポタンパク質 (VLDL) が合成さ

酸は中性脂肪や細胞膜リン脂質に蓄えられ必要時に脂質れないこと，肝臓で合成された中性脂肪が血中に分泌さ

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成れないこと，が明らかになり，この PLA2 は飢餓時にお方法を開発することを目的とした．これまでに本研究けるエネルギー代謝に寄与することが示唆された．

室では，メチル化 CpG 結合タンパク質 (Methyl-CpG-【考察】binding domain; MBD) にホタル由来の発光タンパク質

本研究によって PLA2 を介したリン脂質代謝が栄養飢である Fireﬂy luciferase (Luciferase) を融合した MBD-

餓時における肝臓の恒常性に寄与する可能性が示唆されluciferase を用いて，ゲノム DNA のメチル化 CpG をた．栄養飢餓時における PLA2 の機能および当酵素によ簡便に検出する方法を開発している１－４）．そこで，本り産生される機能性脂質の作用機序の解明が今後の課題

研 究 で は 8-oxoG に 特 異 的 に 結 合 す る 変 異 型 8-oxoGである．

DNA glycosylase 1 (OGG1) に luciferase を融合させたタンパク質 (OGG1-luciferase) を用いて 8-oxoG を検出できるか検討した (Fig. )．

変 異 型 8-oxoguanine DNA glycosylase 1 融【方法】

合 Luciferase を用いた酸化グアニン検出法の開発

１．OGG-luciferase の作製

吉

田

亘

野生型 OGG1 はゲノム DNA 中の 8-oxoG に結合し（東京工科大学応用生物学部）

た後に，8-oxoG を二本鎖 DNA から切除する．一方，249 番目のリシンをグルタミンに置換した変異型 OGG1

【目的】

は 8-oxoG 結合能のみを保持していることが報告されてスーパーオキシドやヒドロキシラジカル，過酸化水いる．そこで，この変異型 OGG1 融合 luciferase の発

素などの活性酸素種（Reactive oxygen species; ROS）

現ベクターを構築し，構築した発現ベクターを用いて大は酸化ストレス下で生じる．過剰に ROS が産生する

腸菌 BL21 (DE3) を形質転換した．形質転換した BL21と DNA 損傷が引き起こされ，グアニンの 8 位が酸化(DE3) を 培 養 し，OD600＝0.6 で 終 濃 度 1.2 mM と なされて 8-oxoguanine (8-oxoG) が生じる．ゲノム DNA

るように IPTG を添加し，OGG1-luciferase の発現誘中の 8-oxoG はがん細胞において増加していことから，導を行なった．その後，得られた湿菌体を Bug Buster

8-oxoG は，がんのバイオマーカーとして期待されていReagent (Novagen) を用いて破砕し，水溶性画分を調る．従来のゲノム DNA 中の 8-oxoG を検出する方法

製した．本融合蛋白質には精製タグとして StrepTagと し て，High Performance Liquid Chromatographyを融合してあるため，水溶性画分より，Streptag を利(HPLC) 法 や Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

用 し て Strep-Tactin Superﬂow Plus Cartridge 1 mL

(ELISA) 法が挙げられる．しかし，これらの手法は煩(QIAGEN) を用いて OGG1-luciferase の精製を行なっ

雑な操作や大型の精密機器を必要とする．そこで，本た．精製画分として，通過画分，洗浄画分及び溶出画分

研究ではゲノム DNA 中の 8-oxoG を簡便に検出するを回収し，OGG1-luciferase の発光強度を測定した．その後，得られた全て精製画分を SDS-PAGE で解析した．
２．OGG-luciferase を用いた 8-oxoG の検出精製した OGG1-luciferase を用いて二本鎖 DNA 中の8-oxoG を検出できるか検討した．ビオチンを修飾した
オリゴヌクレオチドと 8-oxoG を修飾したオリゴヌクレ
オチドをハイブリダイゼーションさせ，8-oxoG 修飾二本鎖 (ds) DNA を作製した．その後，作製した 8-oxoG
修飾 dsDNA をストレプトアビジンコートプレートに固Fig.  OGG-luciferase を 用 い た 8-oxoG 測 定
法の原理



定化した．このプレートに OGG1-luciferase を加えて洗浄後，発光基質を添加し，発光強度を測定した．

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成【結果・考察】

domain-and methyl-CpG-binding domain-fused

１．OGG-luciferase の作製

luciferase, Anal. Chim. Acta., 990, 168 (2017).

Strep-Tactin Superﬂow Plus Cartridge を 用 い て３）Baba, Y., Karube, I. & Yoshida, W.: Global DNA

OGG1-luciferase を精製後，得られた全ての精製画分のmethylation levelmonitoring by methyl-CpG

発光強度を測定した．その結果，溶出画分で最も高い

binding domain-fused luciferase, Anal. Lett., 52,

発光強度が得られた．また，精製した OGG1-luciferase

754 (2019).

を SDS-PAGE に よ り 解 析 を 行 な っ た 結 果， 目 的 の 位

４）Baba, Y., Yamamoto, K. & Yoshida, W.: Multi-

置 付 近 (102kDa) に バ ン ド が 確 認 さ れ た． 以 上 よ り，

color bioluminescence resonanceenergy transfer

OGG1-luciferase が精製できたことが示された．

assay for quantiﬁcation of global DNA methyla-

２．OGG-luciferase を用いた 8-oxoG の検出

tion, Anal. Bioanal. Chem., 411, 4765 (2019).

精製した OGG1-luciferase を用いて 8-oxoG を検出できるか検討した．その結果，未修飾 dsDNA と比較
して 8-oxoG 修飾 dsDNA 存在下で，高い発光強度が得られた (Fig. )．ｔ検定では，未修飾 dsDNA に対し細胞骨格のリン酸化を介した神経軸索の根元構造の形成機構の解明吉て 8-oxoG 修飾 dsDNA 条件において有意な差が示された (p＜0.01)．以上より，OGG1-luciferase を用いて村武（大阪大学大学院連合小児発達学研究科）

8-oxoG を検出できることが示された．
【目的】
神経細胞の軸索起始部は構造的にも機能的にも高度に特殊化された区画である．軸索起始部は活動電位発生の場であり情報出力装置である．さらに，軸索起始部は軸索と細胞体/樹状突起の架け橋であり，軸索に必要なものだけを通過させ不要なものを遮断するバリアとしての機能を持つ．軸索起始部の構造はアンキリンＧなどの軸索起始部に特有な膜裏打ち細胞骨格により形成されている．
アンキリン G (ANK3) の遺伝子変異は自閉スペクト
ラム症や知的発達症，てんかんなどを引き起こす．神経Fig.  8-oxoG 検出結果
（ɴ＝4, mean ± SD）

細胞が正常に機能するためには軸索起始部の膜裏打ち細胞骨格が正常に形成されることが必須であり，この構造の破綻は様々な精神・神経疾患を引き起こす．しかし，【文献】

軸索起始部の構造がどのように形成されるのか，その分

１）Yoshida, W., Baba, Y. & Karube, I.: Global DNA

子機構は殆ど理解されていない．細胞骨格の制御には多methylation detection system using MBD-fused

くのリン酸化シグナルが関与していることが知られていluciferase based on bioluminescence resonanceる．本研究の目的は，アンキリンＧをリン酸化し制御すenergy transfer assay, Anal. Chem., 88, 9264

る蛋白質リン酸化酵素を見出し，この酵素によるリン酸(2016).

化制御が軸索起始部の形成に果たす役割を明らかにする

２）Yoshida, W., Baba, Y., Banzawa, K. & Karube,
I.: A quantitative homogeneous assay for global
DNA methylation levels using CpG-bindingことである．
【方法】
GST-アンキリンＧ変異体を COS7 細胞に発現させた



酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

後にグルタチオンセファロース 4B ビーズを用いて精製
し，Cdk5 と RI ラベルされた ATP を加えて in vitro キ
ナーゼアッセイを行った．試料を SDS-PAGE で分離後，オートラジオグラフィーを用いて放射能標識されたバン破骨細胞の活性化因子として機能するグルタチオン
分解酵素の反応機構の解明
和田啓（宮崎大学医学部））

ドを検出した．
ラット胎仔脳由来の培養海馬神経細胞に Cdk 阻害剤を加えて培養した．培養神経細胞を４% パラホルムア
ルデヒドで固定後に免疫染色法を行った．
【結果】

【目的】
グルタチオン（γ-Glu-Cys-Gly）は，細胞内で最もロバストな水溶性抗酸化物質であり，分子内にグルタミン

蛋白質リン酸化酵素 Cdk5 はショウジョウバエにおい酸の側鎖を介した特殊な結合を持つトリペプチドであて軸索起始部様区画の形成に重要であることが報告され

る．γ-グルタミルトランスペプチダーゼ（GGT）はグている．我々は Cdk5 がアンキリンＧをリン酸化するか

ルタチオンを分解できる唯一の酵素であり，細胞レドッ

調べるために，GST-アンキリンＧ変異体と Cdk5 を用

クス維持の鍵酵素と 30 年以上信じられてきた．一方で，いて in vitro キナーゼアッセイを行った．Cdk5 により近年の研究では，GGT 酵素反応の副産物（Cys-Gly）は

アンキリンＧは数カ所リン酸化されていた．特に，アン

活性酸素種の発生源であり，従来の GGT の生理的意義

キリンＧのβIV-スペクトリンと相互作用する領域が強が疑問視されてきた．

くリン酸化されていた．次に，神経細胞において Cdk5

ヒト GGT はγ-グルタミル基の高い転移活性を持つ．

のキナーゼ活性の抑制が軸索に与える影響を検討した．

酵素反応速度解析から，グルタチオンなどのペプチド基

Cdk 阻害剤を処理した神経細胞において軸索起始部の質のＣ末端領域（Cys-Gly）を厳密に認識することが明

細胞骨格の破綻および MAP2 の軸索への流入が観察さらかとなっている．この転移活性にはドナー基質（グルれた．

タチオンなど）とアクセプター基質（ジペプチドなど）【考察】が必要であるが，これらの基質認識機構は未だに明らか

本研究から蛋白質リン酸化酵素 Cdk5 がアンキリンＧにされていない．そこで，ヒト GGT のドナーとアクセをリン酸化することが明らかとなった．アンキリンＧの

プター２つの基質の認識を解明するために，基質アナロ

βIV-スペクトリンと相互作用する領域がリン酸化されグを用いた構造生物学的なアプローチを進めた．

る．両者は細胞骨格分子であり，軸索起始部構造の要で

近年，GGT は破骨細胞活性化因子として骨粗鬆症をある．故に，Cdk5 によるアンキリンＧのリン酸化によ亢進することも報告された．これまでの報告をまとめる

る制御が軸索起始部の構造形成に重要な役割を果たすとと，GGT の酵素活性とは完全に独立して，GGT 分子に考えられる．Cdk5 のキナーゼ活性を抑制すると，軸索破骨細胞分化を惹起するサイトカイン様の機能をもつ

起始部の細胞骨格の破綻および MAP2 の軸索への流入「構造パーツ」が存在することが推定された．本課題では，が観察された．Cdk5 はアンキリンＧのリン酸化を介し上記の目的とともに，ヒト GGT 立体構造を明らかにすて，軸索起始部のバリア機能に重要な役割を果たすと考ることによってサイトカイン様の機能を推定することをえられる．本研究によるアンキリンＧの制御機構の解明目指した．

は，神経細胞における軸索形成の基盤が分かるだけでな【方法】

く，神経・精神疾患の病因解明の糸口になると期待される．

ヒト GGT はバキュロウイルス-昆虫細胞系を用いて発現した．精製酵素を用いたＸ線結晶構造解析により立体構造を決定した．解析に用いた GGT 特異的な基質アナ
ログは，京都大学化学研究所（渡辺文太先生）との共同研究により合成頂いた化合物群を用いた．

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成【結果および考察】
ヒト GGT の立体構造を精度良く決定することができた．さらに，触媒残基 Thr381 と共有結合する２種類の基質アナログ TSA-ethyl type と TSA-phenyl type との複合体構造も明らかにした．その結果，本研究で初めて
基質アナログの Cys-Gly 領域の電子密度を見出すことに成功した．これら２種の阻害剤の電子密度を比較することにより，ヒト GGT は Cys-Gly 領域の結合ポケッ
トを２つ持ちドナー基質を認識していることが示唆された．さらに，Cys-Gly 領域とアクセプター基質の構造類似性から，ドナー基質とアクセプター基質の結合ポケッ
トは互換性を有することが予想された．
現在，
結合ポケッ
ト周辺の残基に変異を導入して，活性測定を進めている．
一方，GGT 立体構造がもつサイトカイン様の機能に関して，現在，分子動力学シミュレーションも適用した検討を進めている．

47

研究報告

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成
成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

腸内細菌異常による疾患発症メカニズムの解明
新幸二した．その結果，便そのまま投与マウスと同様に１週間程度で迅速にクレブシエラ菌が腸内から排除された．この 37 菌株を定着マウスはアンピシリンを投与するとク（慶應義塾大学医学部）

レブシエラ菌の排除ができないことから，37 株をアン
ピシリン感受性と抵抗性に分け排除能を検討した．その【目的】

結果，アンピシリン感受性の 18 菌株が強力に排除でき，

これまでの研究において，口腔由来のクレブシエラ

残りの 19 株の排除能は弱いことがわかった．そこでこ菌が腸内に定着すると大腸で強い Th1 細胞の活性化し，の 18 株 vs19 株定着マウスの便中のメタボライトを解炎症の惹起・増悪に働くことを明らかにした．また，ク析したところ，短鎖脂肪酸や胆汁酸などに差があること

レブシエラ菌の腸内への定着は腸内細菌が阻害・抑制しがわかった．

ており，過度な炎症が起こらないように制御されている【考察】ことを見出している．しかしながら，どのような腸内細ヒト由来腸内細菌のうち，クレブシエラ菌の腸内への菌種がクレブシエラ菌の定着阻害に関与しているのか，定着を阻害している腸内細菌種を同定し，その阻害メカ

どのような分子メカニズムでクレブシエラ菌の腸内定着ニズムを明らかにすることにより，炎症性腸疾患や原発を抑えているかについては明らかになっていない．そこ

性硬化性胆管炎（PSC）などクレブシエラ菌が増悪に関で本研究では，ヒト由来腸内細菌の内，クレブシエラ菌

与する疾患に対する新たな治療薬，予防法の開発につなの腸内への定着を阻害している腸内細菌種を同定し，そげることができる可能性がある．

の阻害メカニズムを明らかにすることを目的として，研究を行った．
【方法】
無菌マウスの腸内にクレブシエラ 2H7 株を定着させた後，健常者５人の便を経口投与し，クレブシエラ菌が新生児期におけるケトン合成はミトコンドリアタン
パクの過度なアセチル化を抑制して機能を制御する
有馬勇一郎（熊本大学大学院生命科学研究部）

腸内からどのように排除されるかを検討した．さらに，クレブシエラ菌の排除に関与している菌株を特定するため，健常者の便から細菌株を単離し，単離菌で同様の実【目的】験を行った．その後，排除能が強かった菌株セットと弱ケトン体は主に肝臓において産生され，心臓などのかった菌株セットのメタボロームを比較し，排除メカニ

肝外臓器で消費されている（Arima Y. et. al., JACC

ズムの検討を行った．

2019）．空腹時のエネルギー源として知られているが，【結果】新生児期においては満腹であるにも関わらずケトン体濃健常者５人の便を経口投与し，クレブシエラ菌が腸内度が高い．我々は，周産期におけるケトン体合成の意義

からどのように排除されるかを検討した結果，健常者５を明らかにすることを目的として以下の検討を行った．

人の便すべてにおいて，投与後１週間程度で迅速にクレ【方法】

ブシエラ菌が腸内から排除されることを確認した．次に，

CRISPR/Cas9 法 を 用 い て ケ ト ン 体 合 成 の 律 速 段

健常者の一人の便から 37 菌株を単離し，これらの単離階 酵 素 で あ る ミ ト コ ン ド リ ア 型 HMG-CoA 合 成酵素菌のみでクレブシエラ菌を腸内から排除できるかを検討（Hmgcs2）の deletion mutant を樹立し，表現型を検8成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

討した．
【結果】

軟骨細胞における細胞内 Ca2＋制御機構と生理機能

Hmgcs2 KO マウスの出生率に差は認めず，胎性期にの解析

致死的な影響をもたらさないことが確認された．
一方で，

市

村

敦

彦
（京都大学大学院薬学研究科）

肝臓は授乳開始後より急速に腫大し，顕著な異所性脂肪沈着を呈した．電子顕微鏡にて Hepatocyte の形状を確認すると，Hmgcs2 KO マウスの Hepatocyte では小滴性の脂肪沈着を認め，ミトコンドリアの変性所見も確認された．
生後３日目の肝臓サンプルを用いてメタボローム解【目的】
本研究は，軟骨細胞内 Ca2＋動態を明らかとするとともに，細胞膜および小胞体膜に分布するイオンチャネルが制御している生理機能について解明することを目的と

析 を 実 施 し た 結 果，KO マ ウ ス に お い て 解 糖 系 は 抑した．

制されている一方で，アセチル CoA は有意に上昇し【方法】ていた．しかしながら，TCA サイクル内の代謝産物

Ca2＋ は，主要な生理機構に必須と言えるほど重要なは Hmgcs2 KO マ ウ ス で 有 意 に 低 下 し て お り， 単 離

シグナル分子であり，広範かつ重要な生理機能の制御をし た Hepatocyte を 用 い て 酸 素 消 費 量 測 定 を 行 う と，担っている．一方で，Ca2＋ シグナルが制御している生

Hmgcs2 KO 由来の Hepatocyte において有意に酸素消理機能は，骨形成に関連した細胞を含め多くの種類の細費量が低下していることが確認された．

胞において未解明である．そこで本研究では，軟骨細胞機能低下が生じる原因を解析する過程で，翻訳後修飾における Ca2＋動態とその制御機構や生理機能に着目しの関与に注目し，アセチル化プロテオミクス解析を実施た．我々は，骨伸長を担う軟骨細胞において生理的条件した結果，Hmgcs2 KO マウスで有意にミトコンドリア

下での細胞内 Ca2＋動態やその制御機構がほとんど未解

タンパクのアセチル化が亢進していることが確認され明であったことに着目した．これは，これまで主に用いた．単離ミトコンドリアを用いた検討でも，アセチル化

られてきた初代培養軟骨細胞では生理的条件を模倣しきの亢進に伴い TCA サイクルにおける酵素連続反応が低れず，生体内の状態と一定程度異なっていたという実験

下することが確認された．

技術的制約に起因すると考えられた．そこで，我々は胎【考察】

生期マウス大腿骨のスライス培養サンプルを用いて生体

新生児期におけるケトン体合成能の生理的意義とし

内近いコンディションを保ったまま Ca2＋動態を観察可て，ミトコンドリアタンパクの過度のアセチル化を緩和

能な新しい実験系を構築した．この実験系により，異なし，ミトコンドリア機能を保護する働きがあることを確る形態の細胞が層状に積層している軟骨組織において，認した．生後環境の変化の中で，胎盤栄養から母乳由来細胞の形態や組織構造中の位置情報を保持したまま，細の脂肪酸を多く含んだ栄養環境へと変化する．ケトン体

胞内 Ca2＋動態をライブイメージングすることが可能と合成はこの過程で，急激に増加する脂肪酸の一部をケトなった．本実験系を用い，様々な薬理学的阻害及び活性ン体へと変換することで，ミトコンドリア内でのアセチ化実験と網羅的遺伝子発現解析を組み合わせ，軟骨におル CoA の蓄積を回避し，細胞保護的に作用する可能性

ける Ca2＋動態と関連する制御分子 TRPM7 を同定した．

が示唆された．また，ミトコンドリアタンパクにおけるまた，部位特異的遺伝子欠損マウスを作出し，軟骨細胞

アセチル化は，酵素非依存的に生じる可能性も示唆されにおける細胞内 Ca2＋の担う生理的役割を解析した．更ており，細胞内小器官の環境により，アセチル化の程度に，得られた結果に基づき，共役分子の活性化薬を用いが影響を受ける可能性が示唆された．

て骨伸長への効果を調べた．
更に，その遺伝子変異により骨形成不全症や骨格異形成が引き起こされることがヒトで複数報告されている小胞体カチオンチャネル TRIC-B に注目した．Tric-b 欠損

9成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

マウスは骨芽細胞における Ca2＋ハンドリング異常から

Komazaki S, Sato C, Aoyama F, Sawaguchi A,

コラーゲン分泌が障害され，全身の膜性骨化が減弱する

Kakizawa S, Nishi M, Takeshima H. Mice lack-

ことで骨形成不全症に至ることを我々が報告した１）．更ing the intracellular cation channel TRIC-B haveに詳細に Tric-b 欠損マウス由来の骨を観察したところ，

compromised collagen production and impaired

軟骨においても異常に膨潤した死細胞が複数含まれていbone mineralization, Sci Signal. 9 (428): ra49.

ることを見出した．そこで，TRIC-B の軟骨細胞におけ(2016), †, contributed equally

る生理機能についても上述の Ca2＋イメージング系を用

２）Qian N†, Ichimura A†, Takei D, Sakaguchi R,

いて解析した．また，細胞死に至る細胞内シグナル経路

Kitani A, Nagaoka R, Tomizawa M, Miyazakiを探索した．

Y, Miyachi H, Numata T, Kakizawa S, Nishi M,
Mori Y, Takeshima H. TRPM7 channels mediate【結果】
軟骨細胞における細胞内 Ca 自発変動現象を同定しspontaneous Ca2＋ ﬂuctuations in growth plate

た．自発的 Ca2＋変動は主として細胞膜二価陽イオンチャ

chondrocytes that promote bone development.,

ネル TRPM7 により媒介されており，TRPM7 の薬理的Sci Signal . 9; 12 (576) (2019), †, contributed阻害や遺伝子欠損により初代培養中指骨の伸長が阻害さ

equally2＋

れることが明らかとなった．軟骨細胞特異的 TRPM7 欠損マウスを作出したところ，全身の軟骨内骨化が障害され対照マウスの半分程度の体格に留まることがわかった．そこで，共役分子として特定した BK チャネル活性化剤を器官培養軟骨に処置したところ，有意に骨伸長を疾患特異的 iPS 細胞を用いた特発性拡張型心筋症の病態解明と治療化合物の探索
伊

藤

正

道
（東京大学医学部附属病院）

促進出来ることを見出した．
また，Tric-b 欠損マウス由来の軟骨細胞においては，
軟骨細胞が全体的に大きくなるとともに細胞外基質が減【背景】

少傾向にあることが明らかとなった．また，定常状態の特発性拡張型心筋症 (DCM) は，心腔の拡大と心筋壁

細胞内 Ca2＋が有意に上昇し，ATP 刺激時に小胞体からの菲薄化，心臓収縮力の低下を特徴とする症候群で，心放出される Ca2＋が減少するという細胞内 Ca2＋ハンドリ

不全や致死的不整脈を合併する難治性の疾患である．患

ング障害が観察された．更に，小胞体ストレスマーカー者の約半数で遺伝子変異の関与が示唆されているもの

分子 BiP タンパク質量の有意な上昇が観察され，軟骨の病態に則した治療法は開発されておらず，病態の解細胞全体が小胞体ストレス状態にあることが明らかと明と新規治療薬の開発が喫緊の課題である．我々は本邦なった．さらなるシグナル経路解析から細胞死に至る分の DCM 患者を対象とした遺伝子解析により，患者の約子機序が解明されると期待される．

10% を占めるラミン遺伝子（LMNA）変異陽性の患者【考察】は特に成人以降，既存薬物療法に反応せず病状が進行し，軟骨細胞における TRPM7 を介した細胞内 Ca2＋ 自発

特に予後不良であることを見出した１）．さらに我々は変動が成長板軟骨細胞の正常な増殖や分化に必要である

DCM 患者の心臓の病理組織検体を用いた解析により，ことが明らかとなった ．この制御機構を活性化するこ

診断時において心筋細胞 poly (ADP-ribose) の染色で示とで，人為的に骨伸長を促進出来る可能性を示した．まされる DNA 損傷の蓄積程度が高度な患者ほど予後不良

た，TRIC-B 欠損により軟骨細胞内 Ca2＋ 制御を介してであることを見出して報告している２）．患者から樹立し成長板軟骨細胞死を引き起こす病態生理機序の一端が明た iPS 細胞およびそこから誘導した心筋細胞（iPS 由来

らかとなった．

心筋細胞；iPSCM）には，疾患発症につながる分子異２）１）Zhao C , Ichimura A , Qian N, Iida T,††

Yamazaki D, Noma N, Asagiri M, Yamamoto K,

0常が再現されている可能性があるため，病態解明やスクリーニングへの iPS 細胞の応用が期待される．

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成【目的】
予後不良な LMNA 変異を有する DCM の病態を明らるγH2A.X の染色を行いその定量化を試みた．結果，LMNA 変異株では有意に高度に心筋細胞核の DNA 損

かにし，同疾患患者の新規治療薬候補化合物の同定を試

傷が蓄積していることが判明した．

みる．

・細胞の収縮機能の解析の予備的検討；【方法・結果】① LMNA 変異 DCM 患者の同定と iPS 細胞の樹立，コ

DCM は 心 筋 の 収 縮 異 常 を 特 徴 と す る 疾 患 で あ る
ため，細胞レベルで収縮機能を評価するためいくつ

ントロール株の作成

かの検討を行った．既存の細胞収縮評価装置として

本 学 病 院 に 通 院 す る 家 族 性 DCM の 患 者（50 代 男

xCELLigence CardioECR (ACEA), SI-8000 (SONY)

性，心臓移植後）２名を対象に遺伝子解析を実施し，を用いて評価を行ったが，いずれも有意な差を再現性

LMNA にヘテロミスセンス変異を同定した（p.Q353R）．

よく検出することはできなかった．そこで DCM 患者

これらの患者から末梢血単核球を分離し，初期化因子

由来の iPSCM を扱って収縮能評価を行った過去の文(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-MYC） plasmid を導入すること

献の review を行ったところ，近年の多くの研究では，により iPS 細胞コロニーを取得した．LMNA 変異の病

iPSCM で心筋組織を作成して評価しているケースが多態における意義をより明確にするため，CRISPR/Cas9

いことがわかった３）．

を用いて当該変異を修復した iPS 細胞株の樹立を試み【考察】

た．LMNA 変異株の変異部位近傍を切断する gRNA とLMNA の変異は Hutchison-Gilford 症候群に代表さ

Cas9 タ ン パ ク を electroporation に よ り 導 入 し，WTれるような早老症と，筋ジストロフィや拡張型心筋症の配列を有するドナーオリゴとの相同組換えによって変異ような物理的ストレスを受ける臓器の変性疾患を引き起修復を行った．

こすことが知られているが，それらの詳細なメカニズム

以上より，LMNA 変異 iPS 細胞株と編集株を各２クは明らかになっていない．本研究によって，LMNA 変

ローン作製した．

異を有する患者個体の心筋細胞と iPSCM で共通する異②心筋細胞への分化誘導

常表現型として DNA 損傷の蓄積を捉えた．今後はこの既報に従い，高密度で播種された iPS 細胞に Wnt 刺異常を生じるメカニズムを解明するとともに，DNA 損

激剤・Wnt 阻害剤を順次作用させることにより，心筋傷が収縮異常につながるメカニズム，またこれらの異常

細胞の分化誘導を行った後，グルコース非含有・乳酸含を是正する化合物の探索を iPSCM を用いた研究で行っ有培地で処理することによって心筋細胞の純化を行っていく予定である．

た．心筋細胞は分化開始後 30 日前後で凍結によりストッ【文献】

クしてから実験に使用した．

１）Tobita T, Nomura S, Fujita T, Morita H, Asano③ iPSCM の表現型解析

Y, Onoue K, Ito M, Imai Y, Suzuki A, Ko T,

・核形態解析；Satoh M, Fujita K, Naito AT, Furutani Y, Toko

ラミン分子は核の裏打ちタンパクとして存在しておH, Harada M, Amiya E, Hatano M, Takimotoり，メカニカルストレスに対する核形態やクロマチン構

E, Shiga T, Nakanishi T, Sakata Y, Ono M,

造の維持に関与することが知られている．そのためラミ

Saito Y, Takashima S, Hagiwara N, Aburatani

ン抗体を用いて心筋細胞の免疫染色を行って核画像を取H, Komuro I. Genetic basis of cardiomyopathy

得し，機械学習を用いて変形した核の割合を調べたとこ

and the genotypes involved in prognosis andろ，LMNA 変異株で有意に変形した核の割合が増えて

left ventricular reverse remodeling. Sci Rep. 31;

いることが判明した．

8 (1): 1998. 2018

・DNA 損傷程度の評価；

２）Ko T, Fujita K, Nomura S, Umemura Y, Yamada

ヒト検体で見出した変化が iPSCM でも再現されていS, Tobita T, Katoh M, Satoh M, Ito M, Domoto

るかを検証するため，DNA 二重鎖切断のマーカーであY, Hosoya Y, Amiya E, Hatano M, Morita H,

51

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

Fukayama M, Aburatani H, Komuro I. JACC:

ち，肝 G6pc レポーターマウスの血中 GLuc 活性が，肝Basic Transl Sci. 4 (6), 670-80, 2019

G6pc 遺伝子発現量の指標として有用と言える．健常マ

３）Ito M, Nomura S, Morita H, Komuro I. Trends

ウスへの単回投与は，血糖値・インスリン値を低下さ

and Limitations in the Assessment of the Con-

せ，GLuc 活性を上昇させた．肥満マウスの GLuc 活性

tractile Properties of Human Induced Pluripo-

は，健常時に比べ約 10 倍に増強した．この肝糖新生応

tent Stem Cell-derived Cardiomyocytes from

答が増強した肥満マウスへの単回投与は，血糖値・イン

Patients with Dilated Cardiomyopathy. Front

スリン値を低下させたが，GLuc 活性には作用しなかっCardiovasc Med. In press. 2020

た．健常マウスは，制限給餌下での混餌 SGLT2i 投与により，体重・血糖値・インスリン値が低下し，GLuc 活

ナトリウムグルコース共輸送体２阻害剤が肝糖産生応答に及ぼす作用の解明
稲葉

有性が上昇した．一方，自由摂餌下では，SGLT2i 群で摂餌量が増加し，体重・血糖値・インスリン値・GLuc 活
性のいずれも対照と同等であった．肥満マウスでは，制香

限給餌下で，SGLT2i 群の体重・血糖値・インスリン値・（金沢大学新学術創成研究機構）

GLuc 活性が低下した．自由摂餌下では，SGLT2i 群で摂餌量が増加したものの，血糖値は低下し，インスリン【背景・目的】２型糖尿病治療薬ナトリウムグルコース共輸送体２阻害剤（SGLT2i）は，腎糖排泄を促進させることで，血値は低下傾向を示した．しかし，SGLT2i による GLuc
活性への作用は認められなかった．
【考察】

糖値を低下させる．一方で，SGLT2i は，肝糖産生を増SGLT2i の肝糖新生応答に対する作用は，インスリン

加させ，血糖低下作用を部分的に相殺する可能性が指抵抗性の有無で異なること，肥満で増強した肝糖新生は，

摘されている．しかし，代謝状態の違いが，SGLT2i の制限給餌下の SGLT2i 長期投与でのみ軽減されること，

肝糖産生応答作用に及ぼす影響は不明であった．また，を明らかにした．

SGLT2i は，摂食量を増加させることが知られているが，摂食量増加が SGLT2i 作用に及ぼす影響も明らかではな
い．本研究では，健常及び肥満マウスを用いて，自由摂餌下・制限給餌下での SGLT2i の肝糖新生応答への作用を検討した．

ムーンライト解糖系酵素に焦点を充てた脳アミロイ
ド血管症の治療開発
井

上

泰

輝

（熊本大学大学院生命科学研究部）【方法】
糖新生酵素遺伝子 G6pc のプロモーター制御下に，肝臓特異的に分泌型ルシフェラーゼ（GLuc）を発現する，【目的】

肝 G6pc レポーターマウスを作出した．健常または肥満

脳アミロイド血管症（CAA）は，アルツハイマー病のレポーターマウスに，単回・長期で SGLT2i を投与し（AD）患者の 90% にみられ，アミロイドベータ（Aβ）

た．単回投与は，経口強制投与により，長期投与は，４が脳血管に沈着，脆弱化し脳出血を発症する．高齢化週間の混餌給餌（自由摂餌，３時間毎の制限給餌）によ

社会が進み CAA 患者が増加する一方で，CAA の予防り行った．連続的に採血を行い，同一個体での経時的や治療法は未確立であり，その開発は急務である．ア

な血漿パラメーターを解析した．肝糖新生応答は，血中ミロイドーシス研究において，共存タンパク質が疾患

GLuc 活性により評価した．

解明の鍵として認識されるようになっている．ところ【結果】

が，CAA における共存タンパク質はこれまで検討され肝 G6pc レポーターマウスの血中 GLuc 活性は，肝ておらず，代表研究者は CAA の共存タンパク質の研G6pc 遺伝子の８時間毎の発現量を反映した．すなわ

究が CAA の病態生理の解明，ひいては治療法開発に結成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

びつく可能性があると考え，プロテオミクス解析によ程で形成される Aβ線維が細胞毒性を示す．これまでのり CAA に罹患した脳血管における共存タンパク質を研究で ENO1 が，① Aβ線維形成を抑制すること② 一

複数同定した（図１）(Inoue et al. Acta Neuropathol.

旦形成された Aβ線維を分解することを明らかにした．

2017; 134: 605-17)．次に，Aβに次いで２番目に多く

さらに，③ ENO1 を Aβと共に添加すると Aβによる

CAA 罹患血管に発現しているα-エノラーゼ（ENO1）

細胞毒性が軽減されるというこれまでに報告のない新しに着目した ( 図２)．α-エノラーゼは，生命現象に深くい作用機序を見出し，ENO1 が Aβの重合過程の阻害，関与する解糖系酵素として広く研究されている生理活性さらに Aβ線維分解を介して，細胞毒性を軽減すること物質であるが，それ以外の機能については長らく不明でを明らかにした．In vitro で示した ENO1 による Aβのあった．前回の研究報告において Aβは，単量体が時間

線維形成抑制効果，分解作用，細胞毒性軽減作用が生体経過と共に次第に凝集し Aβ線維形成に至るが，その過内においても発揮されれば，CAA の病態改善に繋がる

図２
図１

CAA に高発現するタンパク質

プロテオミクス解析の手順

図３

図４

フッ化ナトリウムの添加による線維形成抑制効果の消失

CAA の病理評価

図５

認知機能の評価53成人病の病因・病態の解明に関する研究助成と予測され，その機序の解明，および CAA モデルマウ

与したところ（n ＝ 3），ENO1 による病理所見の改スを用いた ENO1 による病態改善効果について検討を

善効果がなく，認知機能についても改善を認めなかっ行った．

た（現在匹数を増やし解析中）．

①α-エノラーゼの Aβ線維形成抑制作用と酵素活性と
の関連

【考察】
ENO1 が有する Aβ線維形成抑制作用，および Aβ

申請者は，ENO1 の酵素活性が Aβ線維形成抑制作

線維分解作用を生体内において立証した．また，その用と関連するという仮説をたてた．そこで，ENO1 阻

CAA 病態改善効果はα-エノラーゼの酵素活性に関連す害剤として用いられるフッ化ナトリウム（NaF）を Aβ＋ることも同時に判明した．

ENO1 の反応系に添加した．次に，ENO1 の酵素活性について吸光度変化を指標に算出し，その酵素活性がNaF 添加によって変化するか否かを検証した．
② CAA モデルマウス（APP）脳内へのα-エノラー
ゼ投与

アルドステロン産生腫瘍におけるコルチゾール合成
の意義
馬

越

洋

宜
（九州大学病院）

CAA 病態改善効果を検討するため，18 ヶ月の APP23
マウスの海馬に ENO1 を投与した．脳定位固定装置を用いマウスの側脳室に 30 ゲージの薬物注入用カニュー【目的】

レを挿入し，持続注入用のポンプは皮下に留置した．ポアルドステロン産生腫瘍とコルチゾール産生腫瘍におンプは７日間，一定の速度で内容を放出することが可能

いて，細胞内カルシウム濃度上昇と細胞内 cAMP 濃度であり．
脳内の薬物濃度を一定にすることを目的とした．

上昇に関連する遺伝子変異が報告されており，この２つ

ENO1 の脳内投与が後述のように CAA モデルマウスには細胞機能の観点から全く異なる疾患概念として理解さどのような影響を与えるか，病理学的解析，認知機能評れている．一方，近年血中メタボローム解析により，ア価の観点から評価した．

ルドステロン産生腫瘍ではミネラルコルチコイド代謝産ａ．病理学的解析

物に加えて，グルココルチコイド代謝産物の増加が確認

ENO1 の投与後，後述する認知機能評価を実施した

され，異なる合成経路のステロイドホルモンの同時過剰

後に各マウスから回収した脳の組織切片を作成し，Aβ産生が示唆されているが，その意義は明らかでない．

の沈着の程度を，抗 Aβ抗体を用いて病理学的に評価し【方法】
アルドステロン産生腫瘍（n ＝７)，コルチゾール産

た．
ｂ．認知機能評価
Y-迷路試験を用いて学習・記憶能力の改善効果を評価

生腫瘍（n ＝７）の腫瘍組織を用いて，ステロイド合成
酵素染色（アルドステロン合成酵素：CYP11B2，コル

した．

チゾール合成酵素：CYP11B1），RNA-seq 解析，メタ【結果】

ボローム解析，イメージング質量顕微鏡（n ＝３）を用①

いて組織におけるコルチゾール合成能を比較した．

NaF 添加群において，ENO1 による Aβ線維形成抑制作用が阻害され，最終的に多くの Aβ線維が形成された．また，ENO1 の酵素活性が NaF 添加によって減弱することも判明した（図３, 赤枠）．

【結果】
アルドステロン産生腫瘍およびコルチゾール産生腫瘍における CYP11B1/CYP11B2 の免疫組織染色を用いた

ENO1 投与マウスにおいて脳血管，脳実質への Aβ

局在検討では，CYP11B1 は両腫瘍共に均一に確認されの沈着が減少し（図４），さらに興味深いことに認知たが，CYP11B2 はアルドステロン産生腫瘍のみで確認

機能も有意に改善した（図５）．①での結果も受けて，され，一部の腫瘍では不均一な CYP11B2 局在が見られ申請者はさらに，95℃５分の熱処理により酵素活性た．RNA-seq においては，CYP11B2 はアルドステロを完全に失活させた ENO1 を同様にマウス脳内へ投ン産生腫瘍で有意な上昇が確認されたが，CYP11B1 お②成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

よび関連するステロイド合成酵素は両腫瘍で発現に差が解明されていない新たな臓器連関を見出し，その臓器連見られなかった．メタボローム解析においても，組織アル関の Key となる臓器特異的に発現している遺伝子群のドステロン濃度はアルドステロン産生腫瘍で有意な上昇が各種ノックアウトマウスを CRISPR/Cas9 システムを用みられたが，コルチゾール濃度に差はみられなかった．イ

いて作製した．ノックアウトマウスの表現型を全身網メージング質量顕微鏡における局在性の定量評価におい羅的に解析するために，多臓器 RNA-seq 解析・多臓器ても，アルドステロン産生腫瘍において腫瘍内で均一にコscRNA-seq や生理学的および組織学的手法により全身ルチゾール合成が行われていることが確認できた．

網羅的に解析をした．

【考察】【結果＆考察】アルドステロン産生腫瘍における血中グルココルチコ

これらの各種ノックアウトマウスの表現型解析から，イド代謝産物の上昇が腫瘍組織中におけるグルココルチ

これまであまり知られていなかった，多臓器間のクロス

コイド産生の起因することが示唆された．腫瘍内のグルコ

トークによる，臓器機能制御機構をいくつも見いだした．

コルチコイド産生の機序についての検討を進めていく．

現在は，これらの発見をもとに，さらに詳細なシングル
セルレベルかつ多臓器間レベルでの生物学的因果関係を

Bodywide transcriptome landscape in

明らかにするための研究を実施している．

mouse models and human
浦

山

恭

次

（国際電気通信基礎技術研究所佐藤匠徳特別研究所）

短眠を作る神経メカニズムの研究
大石陽（筑波大学国際統合睡眠医科学研究機構）【目的】
従来の疾患研究は，少数の器官や組織に限定されてい

【目的】

ました．
しかし，
生体はより複雑な多臓器連関ネットワー

哺乳類において睡眠制御に重要とされる遺伝子やシス

クで成り立っており，多くの疾患は一つの器官だけではテムは数多く提案されているが，多くの場合，それらをなく，複数の器官に影響を及ぼすことがわかってきてい欠損させたとしても顕著な行動変化は起きない．我々はます．そこで本プロジェクトではこの多臓器連関ネット

最近，モチベーションによる睡眠覚醒制御の解析過程で，ワークの成り立ちと作動性を理解し，Disease science

ある神経群の欠損によって生じる，数か月以上の長期間に役立てることを最終目的として研究を行っています．

にわたって短眠状態を維持可能なマウスを見出した．本

現在までに，我々は，各種疾患において従来考えられ研究ではその神経メカニズム解明を目的とし，解析をていたよりも，生体内において広範囲に変化が起きてい行った．また，同マウスの行動を多角的に解析し，短眠るのではないかと考え，ヒト疾患モデルマウス（心筋梗との関連性を調べた．

塞，糖尿病，がん，老化促進，腎障害）における全身で【方法・結果】の遺伝子発現パターンレベルの変化を解析し，全身レベ

中脳と橋にまたがる脳部位・腹側内側中脳橋（VMP）

ルでのトランスクリプトームデータベース（全身網羅的をジフテリア毒素Ａの発現により GABA 作動性選択的

多器官遺伝子発現地図，iOrgans Atlas）を構築しましに欠損させ，睡眠量が顕著に少ないマウスを作り出した．

た．そこで，これらのデータベースを活用し，新たな臓同マウスの行動を調べたところ，自発運動量増加，抗う器連関やバイオマーカーの発見を目的に解析を行っていつ行動，不安様行動の減少など，多くの躁病様行動が見ます．

られた．中脳もしくは橋の脳梗塞により後天的に躁病と【方法】

なった症例があるため，同マウスはその病態を模してい我々が構築した全身レベルでのトランスクリプトー

る可能性が考えられた．躁病の診断基準のひとつに睡眠

ムデータベースをデータマイニングし，先行研究では欲求の減少があるため，同マウスの睡眠恒常性を解析し成人病の病因・病態の解明に関する研究助成たところ，断眠後に通常みられる睡眠リバウンドの消失

経細胞の軸索ガイダンスに関わるリガンドー受容体が判明した．また，ドーパミン D2 受容体欠損マウスで

Sas-PTP10D が 上 皮 組 織 に 生 じ た 極 性 崩 壊 細 胞 を 認

は VMP GABA 神経欠損による睡眠量の減少が大きく識する上で重要な役割を果たすことを明らかにした

損なわれたため，ドーパミン系を介しての睡眠減少メカ（Yamamoto#, Ohsawa# (# Equal contribution) et

ニズムが示唆された．一方で，D2 受容体の有無は自発al., Nature, 2017）．一方で，研究代表者の前所属研究

運動量や抗うつ行動に影響しなかった．本研究により，室では，神経系で反発作用を引き起こすリガンドー受容

VMP GABA 神経が躁病様行動の表出に関連することが体 Slit-Robo が，極性崩壊細胞の排除を促進することを明らかになった．また他の躁病様行動行動とは異なり，見いだした（Dev Cell, 2017）．我々は，細胞排除シス

睡眠減少にはドーパミン D2 受容体が必要であることがテムの生理機能を明らかにするために，Sas-PTP10D お

示された．

よび Slit-Robo が機能する組織・時期を探索した．その【文献】

結果，翅成虫原基（翅を形成する上皮組織）に導入され

１）Honda T, Takata Y, Cherasse Y, Mizuno S,

た物理的損傷が修復される過程において，いずれも重要

Sugiyama F, Takahashi S, Funato H, Yanagisawa

な役割を果たすことが分かった．興味深いことに，創傷M, Lazarus M, Oishi Y., Ablation of Ventral

付近において Slit の発現が JNK シグナルに依存して上Midbrain/Pons GABA Neurons Induces Mania-

昇している様子が観察された．また，Slit-Robo システ

like Behaviors with Altered Sleep Homeostasis

ムを遺伝学的に破綻させると，創傷治癒の間で生じた死

and Dopamine D2R-mediated Sleep Reduction.,細胞が組織から排出されないこと，および，この排出iScience. 23 (6): 101240 (2020)

されなかった死細胞が増殖因子 Dpp（BMP ホモログ）
や Wingless（Wnt ホモログ）を過剰に産生し，損傷修細胞競合を介した上皮の内在性がん抑制機構の解明
大澤志津江（名古屋大学大学院理学研究科）

復を阻害することが分かった．これらの結果から，SlitRobo が，死にゆく細胞を速やかに組織から排除し，それにより，死にゆく細胞から分泌される増殖因子の量を適正に制御して組織修復に貢献することが分かった（Iida, Ohsawa et al., Sci. Rep., 2019）．

【目的】
ヒトのがんのほとんどは上皮に由来し，上皮細胞の頂底軸方向の極性の崩壊ががんの発生・進行に深く関与すると考えられている．一方で興味深いことに，極性が崩

抗酸化物質キヌレン酸増加の分子機構とその意義
大

橋

一

登
（群馬大学生体調節研究所）

壊した細胞が正常な上皮細胞に囲まれると，正常細胞との競合 “細胞競合” に敗れて組織から排除されることが近年分かってきた．すなわち，上皮組織には，がん原性【背景および目的】の極性崩壊細胞を排除する「がん抑制」機構が内包されキヌレン酸はトリプトファン（Trp）代謝化合物の一ていると考えられる．しかしながら，正常細胞がいかにつであり，キヌレン酸の増加は二型糖尿病やうつ病で認して極性崩壊細胞を認識し，細胞排除を駆動するのか，

められているが，キヌレン酸の増加の原因や意義はよく

また，細胞排除システムの生理機能も不明である．本研

分かっていない．これらの病態を理解するためには，キ

究では，ショウジョウバエ上皮をモデル系とし，正常細ヌレン酸の機能について知見が不足している．

胞が極性崩壊細胞を認識する分子機構の同定とその生理

これまでに真核生物のモデル細胞である出芽酵母を用的意義の解明を目指した．

いて細胞内におけるキヌレン酸の機能を調べてきた．そ【結果】の結果，キヌレン酸は過剰な Trp を分解した結果で生我々は，大規模遺伝学的スクリーニングを行い，神

じた排泄物の一種であることが示唆された．すなわち，

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

キヌレン酸増加の一因は，Trp の蓄積であると考えられネルギー基質となる糖の取り込み能と利用効率の最適化

る．したがって，過剰な Trp による細胞毒性の解析が，は重要である．心筋細胞における糖輸送体は，濃度勾配

病態の理解につながると期待される．実際，高 Trp 血依存性促進拡散型糖輸送体の GLUT と，ナトリウム勾症という代謝疾患も知られており，高濃度の Trp は有配を駆動力として糖を能動輸送する SGLT に大別され害であると考えられている．しかし，その原因は不明でる．GLUT に関してはその制御・作用機構はすでに広くあり，高濃度の Trp が細胞にどのような影響を及ぼす

検討されている．一方で，SGLT の病態生理作用は未知かもよく分かっていない．

な部分が多い．今回我々は，虚血再灌流障害における心

一方，高等動物では，摂取するアミノ酸に極端な偏りがあると生育が抑制される現象が知られているが，その臓 SGLT1 の役割をエネルギー代謝制御の観点から検討した．

分子機構は不明である．本研究では，高濃度 Trp によさらに，重症虚血性心疾患においては，不要代謝産る細胞毒性は，アミノ酸のバランス異常による生育抑制

物として蓄積した乳酸が重要なエネルギー基質としてに相当すると考え，その分子機構を明らかにする．

利用されることが報告されている．今回我々は，自施設【方法と結果】の臨床データベースを用いることにより，急性心筋梗塞

これまでの研究で，出芽酵母が高濃度の Trp に強い（AMI）症例における乳酸の血中濃度に影響を与える因

感受性を示すことが分かった．さらに過剰な Trp によ子，さらにはエネルギー基質としての乳酸利用を促進す

る生育抑制が，トリプトン（タンパク質分解物）の添加る因子を検討した．

によって回復することを見出した．この結果から，過剰【方法および結果】

量の Trp による生育抑制は，アミノ酸のバランス異常最 初 に，SGLT1 が 左 右 心 房 心 室 全 体 に 相 当 量 発によると予想された．そこで，出芽酵母の栄養要求性に現していることがヒト剖検心の免疫染色及びマウス

着目し，過剰な Trp に加えて Trp と同濃度の Leu を添

Langendorﬀ 摘出灌流心の膜分画蛋白レベルで確認さ加すると，Trp によって抑制された出芽酵母の生育が回れた．また，マウス心筋において，SGLT2 の発現は確復することを明らかにした．

認できなかった．一方，phlorizin による短期的な心臓【考察】

SGLT 阻害により虚血再灌流障害は助長され，心機能回

上記のように，過剰な Trp による細胞毒性は Leu の復が低下することが確認された．さらに，虚血再灌流中

添加で緩和されることが明らかになった．しかし，メタの SGLT 阻害が心筋細胞内への糖取り込みと解糖系活性ボロミクス解析では，過剰な Trp を与えても，細胞内を抑制し，ATP 供給を低下させることが証明された１）．

Leu の濃度はほとんど減少していないことも分かってき

次に，AMI の虚血再灌流後急性期において乳酸値のた．このことから，過剰な Trp によって Leu の要求量動態に影響与える因子について検討を行った．虚血再灌が増加することが推測された．

流療法後の乳酸値は心不全の重症度である Killip 分類に比例すること，また，発症前に梗塞前狭心症が存在する

ナトリウム/グルコース共輸送体（SGLT1）を介した心臓エネルギー代謝制御機構と病態への関与
柏

木

雄

介

AMI 症例ではエネルギー基質として乳酸利用が促進されていることが確認された．
【結論】
心臓 SGLT1 の活性化は，虚血再灌流中の心筋への糖（東京慈恵会医科大学医学部）

取り込み能の亢進と，これに伴う ATP 供給を介して，心保護的に働くことが示された．また臨床データの検討【背景および目的】
病的心筋において，限られたエネルギー基質をいかに有効に利用できるかは重要な課題となり得る．虚血を含から，発症前から虚血に晒されている AMI 症例ではエネルギー基質として乳酸利用が促進されていることが確認された．

めた様々な心疾患の特に急性期治療において，主要なエ成人病の病因・病態の解明に関する研究助成【文献】

バ エ 蛹 個 体 に，SPiDER-killer-βGal と hoechst を イ ン

１）Kashiwagi Y, Nagoshi T, Yoshino T, Tanaka T,

ジェクションして光照射を行ったところ，β-ガラクトシダー

Ito K, Harada T, Takahashi H, Ikegami M, An-

ゼ発現細胞においてアポトーシスシグナルが観察され，生zawa R and Yoshimura M. Expression of SGLT1

きた個体の組織においても標的細胞選択的かつ１細胞レ

in Human Hearts and Impairment of Cardiac

ベルでの細胞死誘導が可能であることが示された３）．

Glucose Uptake by Phlorizin during Ischemia-【考察】

Reperfusion Injury in Mice. PLoS One. 2015 Jun
29; 10 (6): e0130605.

今後，β-ガラクトシダーゼの代わりに，疾患で亢進している酵素を標的とすることで，疾患細胞選択的に細胞死を誘導する光増感剤が開発できると期待される．
【文献】

β-ガラクトシダーゼ発現細胞選択的に細胞死を誘導する activatable 型光増感剤の開発
神

谷

真

子

１）Angew. Chem. Int. Ed. 53, 6772-6775 (2014).
２）Angew. Chem. Int. Ed. 55, 9620-9624 (2016).
３）ACS Cent. Sci. 5, 1676-1681 (2019).

（東京大学大学院医学系研究科）【目的】
細胞機能や病因を解明する上で，生体内における特定

副腎ペリリピン１は高血糖状態でのステロイドホルモン合成増加に関与する
亀の細胞を選択的に死滅させる技術は重要である．当研究田啓（北海道大学病院）室ではこれまでに，細胞種選択的な細胞死誘導を実現するべく，レポーター酵素として汎用されているβ-ガラ
クトシダーゼを化学スイッチとして，酵素反応により初【目的】

めて光増感能が回復する activatable 型光増感剤を開発

脂肪滴周囲蛋白であるペリリピン１（PLIN1）に着目した１）．しかしながら，この光増感剤は，酵素反応によし２型糖尿病の病態における副腎ステロイド産生の亢進り生成する光毒性化合物の細胞内滞留性が十分でないたのメカニズムを明らかにし，新たな治療標的を見つけ出め，標的細胞から漏出し非標的細胞の細胞死も誘導されす．

てしまうことが課題であった．

【方法】【方法・結果】

db/db マウスならびに db/+マウスの副腎を摘出し，そこで本研究では，当教室でこれまでに開発した

DNA マイクロアレイ法を用いて遺伝子発現を網羅的に

β-ガラクトシダーゼ活性を一細胞レベルで検出可能な蛍解析し，遺伝子発現の変化はリアルタイム PCR 法で確光プローブ SPiDER-βGal２）の分子設計に基づき，β-ガ認した．

ラクトシダーゼ発現細胞の選択的な細胞死を誘導する【結果】

activatable 型光増感剤 SPiDER-killer-βGal を開発した．

db/db マウスの副腎ではステロイドホルモン合成酵

SPiDER-killer-βGal は，酵素反応により初めて活性酸素が増加，インスリンシグナルに関わる Ins1, Slc2a4

素種を産生可能な光増感剤構造になると同時に，キノンが低下，脂肪酸取り込みに関与する Cd36, Slc27a4 がメチド活性中間体を介して細胞内蛋白質などに結合する

増加，脂肪酸分解酵素 Acsl4 の増加，脂肪酸合成に関ため，細胞外へ漏出せず，標的細胞選択的な細胞死誘導

与する Scd1, Fasn, Elovl3 の低下を認めた．さらに deが可能となった．実際に，β-ガラクトシダーゼ発現╱非novo コレステロール合成系酵素 Dhcr24 が増加してい発現細胞の共培養系に適用したところ，発現細胞でのみた（図１）．

細胞の収縮・破裂が観察された．また，中胸背側にモザ【考察】

イク状にβ-ガラクトシダーゼを発現するショウジョウ

8

肥満糖尿病病態の副腎では脂肪酸取込み・分解の亢進，

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

がんによる宿主生理変容のメカニズム
河

岡

慎

平

（京都大学ウイルス・再生医科学研究所）
がんは，宿主個体にさまざまな悪影響をあたえる．がん悪液質はその代表であり，肝臓や脂肪，筋肉の異常を伴う全身性の代謝障害の総称である．慢性炎症が随伴す
図１

肥満糖尿病マウス副腎における遺伝子発現の変化ることも多い．悪液質自体はがんに特異的な現象ではな
いが，悪液質の 80% ががんに起因しており，進行がん患者の 50％以上でがん悪液質が生じるとされている．
現時点では，がん悪液質を効果的に制御する方法は確立されていない．その原因はいくつもあるが，研究代表者（河岡）は，がん悪液質のメカニズムがよくわかっていないことが主要な要因のひとつであると考えている．
特に，がん悪液質状態の宿主臓器においてどのような病態が生じているのかという全体像や，各病態に重要な宿

図 ：肥満糖尿病マウスの副腎における代謝変化

主側の責任因子がわかっていない場合が多い．
研究代表者は，がん悪液質個体の宿主臓器の異常をオ

コレステロールの取込み・de novo 合成の亢進という代

ミクス解析によって検出し，各異常に関わる宿主側の要謝変化が起きており，結果的に細胞内のコレステロール

因を見つける，という戦略でこの問題に取り組んできた．

量が増加し，ステロイドホルモン合成が亢進することがこれまでに，乳がんが肝臓の概日リズムを撹乱するとい示唆された（図２）．上記の代謝変化と PLIN １の関連

うことや（Hojo et al. Oncotarget, 2017），腸のがんがについて，今後細胞株を用いた実験を行い検証していく．

肝臓のコレステロール代謝を撹乱し，肝臓の炎症を惹起【文献】

する（Enya et al. Dis. Model. Mech., 2018），などの１）Nakamura A, Miyoshi H, Kameda H, Yamashita

成果を得てきた（本助成も活用させていただいている）．

K, Kurihara Y. Impact of sodium-glucose co-

本年度も，がん悪液質の病態メカニズムを理解するtransporter 2 inhibitors on renal function in

ことをめざして，上記のアプローチを活用した研究を

participants with type 2 diabetes and chronic

展開した．これまでに得られた成果のうち，特に，がkidney disease with normoalbuminuria. Dia-

んによる肝臓概日リズムの撹乱に着目した．がんを移betol Metab Syndr. Jan 10; 12: 4 (2020). (Corre-

植した個体では，肝臓の概日リズムが乱れ，肝臓の肥

sponding)

大や炎症など，さまざまな表現型が生じる（Hojo et al.

２）Miyoshi H, Kameda H, Yamashita K, Nakamura

Oncotarget, 2017）．一方で，概日リズムの乱れと表現

A, Kurihara Y. The protective eﬀect of sodium-型の因果関係は明らかではない．また，どの遺伝子の乱

glucose cotransporter 2 inhibitors in patientsれが重要であるかも不明である．そこで，特定の概日リwith rapid renal function decline, stage G3 or

ズム遺伝子のエンハンサーを欠失させ，その遺伝子のリ

G4 chronic kidney disease, and type 2 diabe-

ズムのみを乱す，という実験をおこなった．エンハンサー

tes. J Diabetes Investig. Nov; 10 (6): 1510-1517とは，標的遺伝子の時空間的発現パターンを制御する非(2020). (Corresponding)

コード DNA 領域の総称であり，適切なエンハンサーを見つければ，特定の遺伝子発現制御のみを個体で破壊す9成人病の病因・病態の解明に関する研究助成ることができる．この実験をおこなった結果，がんに閉症様行動を示すことが明らかとなった．これらの結果

よって生じる表現型のうち少なくとも一部が，特定の遺から，Fgf シグナルの異常により自閉症が発症する可能

伝子の概日リズムの乱れによって生じていることが判明性が示唆された．

した．現在，単一の遺伝子のリズム欠損によって肝臓に本年度において，脳が肥大する遺伝子変異マウスの肥問題が生じるメカニズムを，個体レベル，培養細胞レベ

大領域をニューロンサブタイプマーカー等を用いて詳細ルで探っているところである．

に解析したところ，興奮性ニューロンと抑制性ニューロンの構成比に異常が見られる可能性が示唆された．さらに，成体において肥大脳領域における神経活動の測定を成体における社会的行動異常に関与する大脳形成不全の原因の解明
川口

大行った結果，神経活動のバランス（E/I バランス）に異常が観察された．
【考察】地（東京大学大学院薬学系研究科）

神経活動のバランス（E╱I バランス）の異常は自閉症患者において観察されている．本研究により，肥大が原因となって活動異常が起こっている可能性が示唆され【目的】
自閉症の原因は未だ多くは解明されていない．これまで同定されている自閉症リスク遺伝子も 1︲2% 程度の患た．今後は，神経活動を脳の様々な領域で測定する実験を進め，脳肥大が神経ネットワークに与える影響をを明らかにしたい．

者を説明するに過ぎず，その症状を広範に説明する異常は明らかになっていない．最近，数割にのぼる多くの自閉症児について脳の局所（前頭前野など）における肥大が起こることが示された．前頭前野は言語機能や社会的行動の調節などを担う領域であり，前頭前野肥大化が自Incretins による副腎髄質への影響と BMP の関与
小松原基志（岡山大学大学院医歯薬学総合研究科）

閉症発症に関与する可能性が十分に考えられるが，その関連は明らかになっていない．そこで本研究では，局所肥大を起こす分子メカニズムを明らかにすることを目指【背景】

している．これにより，多くの自閉症患者に共通する疾我々のグループ（PI: 岡山大学 大塚文男教授）では分患発症メカニズムの解明に繋がることを期待している．

化・発生に重要な役割を果たす Bone Morphogenetic

近年，自閉症患者に特徴的な遺伝子変異を網羅的に探Protein (BMP) と，概日リズムによる内分泌臓器での索する試みが活発に行われており，複数の Fgf シグナル

日内変動やホルモン分泌調節機構の関連について，卵関連因子が自閉症原因候補遺伝子として挙げられてい巣・下垂体・副腎組織を中心に研究を行ってきた．副る．Fgf シグナルは発生過程において細胞増殖を制御し腎髄質においては，ラット褐色細胞腫細胞 PC12 を用て組織のサイズ決定に関与することが知られており，申いて，副腎髄質に発現する BMP-4 がカテコラミン産

請者はこのシグナルの異常が自閉症児に見られる前頭前生・分泌を調節すること，melatonin やグルココルチコ野肥大化に関与する可能性を考え解析を進めている．

イドが BMP-4 と協調的にカテコラミン産生を調節する【方法と結果】

ことを報告した [Endo 146 (2005), AJP-Endo 296 (2009), JSBMB 165 (2017)]．

前年度までに，Fgf シグナル関連因子の変異マウスをIncretins 関連薬（DPP-4 阻害薬，GLP-1 作動薬）が糖作製し，前頭前野肥大化とそのメカニズムの解析，さら尿病治療に広く使用されており，GIP, GLP-1 受容体がには行動解析を行ってきた．その結果，Fgf シグナル関

全身の様々な臓器で発現していることから，血糖降下作

連因子の変異マウスにおいて前頭前野を含む大脳前方領用に加えて様々な組織，臓器への影響が注目されている．

域が肥大すること，また，成体において変異マウスが自0成人病の病因・病態の解明に関する研究助成【目的】
摂食行動，睡眠・覚醒と内分泌臓器でのホルモン調節の関連を明らかにするため，今回の検討では Incretins
による副腎髄質でのカテコラミン産生調節に対する影響

グレリン分泌細胞における GPCR 発現解析および新規調節因子の探索
小

山

博

之

（名古屋市立大学大学院医学研究科）を検討した．
【方法】
PC12 細胞を用い，GIP/GLP-1，副腎皮質ステロイド，
BMP-4 添加 24 時間後の培養液中のカテコラミン濃度，【背景および目的】
サルコペニアは筋力低下を主徴とする老年症候群であmRNA 発現量，タンパク発現量を検討した．

り，超高齢社会を迎える我が国においてサルコペニアの【結果】

病態解明および予防・治療法の確立は喫緊の課題である．

PC12 細胞では GIP は単独でカテコラミン合成を促進

EPA/DHA に 代 表 さ れ る n-3 系 多 価 不 飽 和 脂 肪 酸

したが，GLP-1 (0-300nM) はカテコラミン合成に影響（PUFA）は n-6 系 PUFA に拮抗し，抗炎症作用を有すを与えなかった．カテコラミン合成は副腎皮質ステロイる（Calder PC. Biochim Biophys Acta. 2015）．関節炎

ドにより誘導されるが，GIP は副腎皮質ホルモン受容体

モデルラットへの EPA 投与は関節炎を改善するだけで発現を増強することで副腎皮質ステロイドと協調的にカなく，ユビキチン︲プロテアソーム系の抑制を介して筋テコラミン合成を促進した．一方で GIP は BMP-Smad

量と筋力の減少をも抑制する（Castillero E et al. Am J

シグナルを抑制することで BMP-4 のカテコラミン合成

Physio1 Regul Integr Comp Physiol. 2009）ことから，抑制作用を減弱させた．

n-3 系 PUFA がサルコペニア病態一般にも有効である可【考察】

能性が考えられる．

GIP が卵巣において BMP-Smad シグナルを増強する【方法および結果】と異なり，副腎髄質では BMP-4 作用

本研究では骨格筋量が低下したサルコペニアモデルマを抑制しカテコラミン合成促進に働く可能性が示唆された．

ウ ス（SAMP1 マ ウ ス（Haramizu S et al, J Gerontol

結果[JSBMB 178 (2018)]

A Biol Sci Med Sci. 2011））への EPA/DHA 慢性給餌実験を行った．結果，16 週齢の SAMP1 マウスに対し
EPA/DHA 含 有 餌 ま た は（n-6 系 PUFA で あ る ） コ ー
ン油含有餌を 12 週間，自由摂食させた．結果，EPA/
DHA 群はヒラメ筋重量が有意に増加していた（図１）．
ま た，EPA/DHA 群 は 肝 臓 内 TG 含 量 が 減 少 し CD68mRNA 発現が低下していた（図２, ３）．また，脂肪細胞や骨格筋における炎症マーカーの遺伝子発現（IL1bや IL6）や視床下部グリア細胞における炎症（IBA1 免
疫染色）についても EPA/DHA 群はその発現が低下していた（図４～６）．以上のことから SAMP1 マウスへの EPA/DHA 投与は中枢および末梢の炎症を抑制していることが明らかとなった．
【考察】
これまで SAMP1 の骨格筋組織においてユビキチンプ
ロテアソーム系の亢進（MuRF1/Atrogin1 発現）についての報告はあるが炎症の関与を詳細に検討したものはない．今後，SAMP1 マウスおよび対照マウス（SAMR）

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

オレキシン受容体アゴニストの創製と薬理作用の解明
斉藤毅（筑波大学国際統合睡眠医科学研究機構）【目的】
神経ペプチド「オレシキン」は，２つの受容体（OX1R,
OX2R）に結合することで覚醒を制御する１）．脳内のオレキシン量の減少は，深刻な睡眠障害であるナルコレプ
シーを引き起こすことからオレキシンの機能を補完する
薬物はナルコレプシー治療薬として期待される．これまでに我々は，オレキシン受容体を標的とした創薬研究を実施し，ナルコレプシーモデルマウスで症状改善効果を
示す OX2R 選択的作動薬 YNT-185 を見出した２,３）．しかし，内因性オレキシンは OX2R のみならず OX1R にも作用するが，ナルコレプシーにおける OX1R の機能は未だ不明である．そこで本研究では，OX1R の薬理作用の解明に向け OX1R に作動活性を有するリガンドの開発に着手した．
の NF-kB 発現を検討する．今後は骨格筋の質・量の低【方法】

下をきたすメカニズムについて炎症の観点，さらにはグ

YNT-185 よ り 誘 導 し た 化 合 物 群 は い ず れ も 高 い

レリン /GH/IGF-1 系の観点から検討を行う予定である．

OX2R 選択性を有していることから，我々のグループで臨床においては上記基礎研究に関連し，臨床試験

独自に見出したモルヒナン構造を有する OX1R 選択的拮

「高齢２型糖尿病患者の入院糖尿病治療における EPA/

抗薬 YNT-707４）を構造モチーフとして OX1R 結合に必DHA 製剤併用による筋肉量変化の検討（UMIN 試験

要な構造を同定し，YNT-185 の構造と組み合わせるこ

ID: 000038538）」を立ち上げ，2019 年 10 月に所属すとで OX1R 作動活性を示す薬物を得ようと試みた．

る名古屋市立大学病院倫理委員会に承認され現在稼働中

【結果】

である．

YNT-707 の OX1R 拮 抗 活 性 は モ ル ヒ ナ ン 構 造 に 起【文献（09 年度実績）】

因し，２つの置換基（17-スルホンアミド，6-アミド側１）Koyama H, Yasuda S, Kakoi S et al. 'Eﬀect of As-鎖）の適切な配置が重要であると推察した．そこで，

fotase Alfa on Muscle Weakness in a Japanese

YNT-707 の２つの置換基を保持し，それらの配向に関Patient Diagnosed as Adult-onset Hypophospha-

与する骨格上Ｄ環とＥ環を除去した誘導体を合成し，そtasia.' Intern Med. 2020 Mar 15; 59 (6): 811-815の活性を調査した．環構造の一方を単独で除去した誘２）Ogawa K, Yagi T, Guo T, Takeda K, Ohguchi

導体では，高い OX1R 親和性（Ki ＝ 20.2nM）を示し，

H, Koyama H et al. 'Pemafibrate, a selective

両方の環を除去した誘導体においても親和性は減弱するもPPARα modulator, and fenoﬁbrate suppress mi-

５）のの活性は保持されることが分かった（Ki ＝ 842 nM）．

croglial activation through distinct PPARα andOX1R に選択的な親和性を示すよりシンプルな構造が得

SIRT1-dependent pathways.' Biochem Biophys

られたため，続いてファーマコフォアの置換を行った．

Res Commun. 2020 Apr 2; 524 (2): 385-391

17-スルホンアミド基を除去すると活性は減弱した（Ki＝ 392nM）が，メチル基への置換では高い親和性が見成人病の病因・病態の解明に関する研究助成６）られた（Ki ＝ 50.1nM）．興味深いことに，嵩高い置を解析した結果，肝類洞内皮細胞による，Notch-RBPJ

換基を導入した誘導体では強力な拮抗活性を示した（Kiシグナルおよび TGF-β/BMP-SMAD シグナルの活性化＝ 14.8nM)．以上の結果から，OX1R 拮抗活性には 17と，肝細胞由来の内因性 LXR アゴニストがクッパー細位置換基の配向と嵩高さが重要であり，17 位置換基が胞に特異的な遺伝子の発現に必要なことが明らかとなっ受容体の構造変化を阻害していることが強く示唆された（Immunity. 2019）．次に非アルコール性脂肪肝炎

た．今後，構造活性相関をより深めることで活性転換を（NASH）におけるマクロファージの多様性を，scRNA-

目指す計画である．

seq，エンハンサー解析，イメージングによって検討し【文献】

た．NASH においては，クッパー細胞のエンハンサー

１）T. Sakurai et al. Cell 92, 573 (1998).

活性の変化と，新規に肝臓に誘導された単球の肝臓の微

２）T. Nagahara, T. Saitoh et al. J. Med. Chem. 58,

小環境依存的なクロマチンリモデリングにより，異なる

7931 (2015).
３）Y. Irukayama-Tomobe et al. Proc. Natl. Acad.

Sci. U. S. A. 114, 5731 (2017).

遺伝子発現を示す４つのマクロファージ集団が形成されることが明らかとなった（Immunity. 2020）．本研究により，我々は，マクロファージ前駆細胞が組織特異的表

４）H. Nagase et al. J. Med. Chem. 60, 1018 (2017).

現型を獲得するメカニズムを解明するための基盤を確立

５）T. Saitoh et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 29,

し，NASH における疾患特異的なマクロファージが単2655 (2019).
６）T. Saitoh et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. in

球・マクロファージのニッシェ特異的なリプログラミン
グによって出現することを明らかにした．

press.
膵β細胞高血糖毒性感受性遺伝子の新規同定と解析
これまでの研究の概要
酒井

下

直

樹
（大阪大学大学院医学系研究科）

真志人（University of California, San DiegoCellular &amp）【背景】
多細胞生物は，同一のゲノムと異なる発現遺伝子を持

２型糖尿病における慢性的な高血糖は膵β細胞機能障つ細胞から構成されており，細胞間の相互作用によっ害を引き起こすことが示されており，高血糖毒性としてて，各組織・臓器の性質が維持されている．そのため，知られている．一方，糖尿病治療による膵β細胞機能の細胞間のシグナル伝達依存性の転写制御メカニズムを知改善も経験されるが，これら膵β細胞機能障害および改ることは，生体恒常性と疾患におけるその破綻を理解す

善に関わる分子メカニズムは明らかではない．

る上で重要である．我々はまず，膵内分泌ホルモンであ【目的】

るグルカゴンによる，肝細胞のシグナル伝達と転写制御

高血糖毒性に対する感受性が高く，膵β細胞機能におを研究し，転写調節因子 CITED2 による糖新生制御機

いて重要な役割を果たす新規因子を同定し解析する．

構を新たに見出した（Nature Medicine. 2012, Nature【方法・結果】

Communications. 2016）．

我々は，過食２型糖尿病モデルの db/db マウスに対組織マクロファージの形質は，組織環境におけるシする１週間の SGLT2 阻害薬投与により，高血糖毒性をグナルによって確立・維持されているが，その分子メ選択的に軽減し得ることを報告している（Shimo N et

カニズムは十分に理解されていない．そこで，肝臓の組

al., 2015）．今回，本系の治療群と非治療群の膵島由

織マクロファージであるクッパー細胞に必要なニッシェ

mRNA を用いて microarray 解析を実施し，非治療群

シグナルの同定をおこなった．マウスの肝臓を構成するに比べ治療群で２倍以上の有意な高発現を示す 43 因子細胞を分取し，トランスクリプトーム，エンハンサー等を抽出した．高血糖毒性に対し感受性の高いこれら遺成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

伝子の中には，膵β細胞機能における役割は未知だが，を及ぼしあった結果として観察されることが多く，多数

GWAS において２型糖尿病疾患感受性遺伝子として報の因子を同時に１つのモデルに組み込める回帰分析は魅告（Tabassum R et al., 2013）されている Tmem163

力的である．通常，回帰モデルでは多元一次式を想定しが含まれており，ヒトの糖尿病病態との関連性を想定ているが，リスク因子とアウトカムの関連はこれに収まし，同因子に着目した．Tmem163 mRNA は膵島に高らないことも多く，その場合は工夫を要する場合もある．

発現を示し，免疫電顕での解析において膵β細胞インス

たとえば回帰分析において正弦関数を用いて周期性を評

リン分泌顆粒（SG）の顆粒膜への高度の限局が示唆さ価する場合，特定の周期を事前に設定すると，ノイズをれた．膵β細胞特異的 Tmem163 ノックアウトマウス

有意な周期変動として検出してしまうリスクがある．こ（KO）の糖負荷試験において，対照群に比べて KO の血うした場合に Fisher-Yates の組み換えが有用な手法で糖値は有意に低く，血中インスリンは有意に高値を示しあることを実際の臨床疫学研究において実践した．
また，た．Tmem163 は細胞内亜鉛制御に関わる可能性が報

リスク因子とアウトカムとの関連において交互作用の存告（Cuajungco MP et al., 2014）されていること，SG在が想定される場合，その取扱いには慎重を要すること

での結晶形成に亜鉛元素が必須であることから，SG のも多い．決定木解析やランダムフォレスト解析はこう

dense core を電顕で解析したところ，対照群に比べてした交互作用を取り扱いうる解析モデルの１つである．

KO では密度が低く，かつサイズが大きい所見を得た．

我々は実際に複数の臨床疫学研究において，こうしたモ

さらに，KO の膵β細胞ではインスリンの前駆体である

デルを採用することにより，アウトカムと関連しうるリ

プロインスリンの増加が確認された．

スク因子を探索・同定することを試みた．また，複数の【考察】

リスク因子について，アウトカムごとにその分布が異な

これまでの結果より，Tmem163 は SG の亜鉛制御をる場合がある．こうした場合において，異質性，すなわ

介して顆粒成熟に寄与することが示唆されている．２型

ち，リスク因子の分布が全体としてアウトカム間でどの糖尿病初期には高インスリン血症を呈するが，本因子の程度異なるかを１つの全体指標で評価することができれ発現低下は，SG の成熟障害を介して２型糖尿病初期のば感覚的にも捉えやすいと考える．我々はＣ統計量，す病態形成に関わる可能性を想定している．現在，KO に

なわち受信者動作特性曲線下面積をこうした目的にも利おける膵β細胞内の亜鉛分布変化や，インスリン分泌亢用できる可能性を見いだした．

進の機序につき解析を進めている．
ヒト iPS 細胞を用いた腎疾患，糖尿病に対する新リスク因子が各アウトカムに及ぼす影響の差異の検出髙原

充規治療法の開発

佳

豊

原

敬

（大阪大学大学院医学系研究科）

文（東北大学医学部）

リスク因子（説明変数）がアウトカム（従属変数）に

私は 2014 年度から 2019 年度まで成人病の病因・病態

及ぼす影響を検討する際，モデル解析は大変有用な統計の解明に関する研究助成で継続したご支援をいただきま

学的解析手法である．これまでにも種々の性質を持つア

した．助成いただいた期間の研究報告について主要論文

ウトカムに対して，様々なモデル解析が考案され，臨床を中心にご報告させていただきます．

医学を含め，生命科学分野でも広く用いられてきた．あ①る事象に関連する作業仮説について，１つのモデル解析
で分析できれば，複数の因子を投入したとしても，それ臨床応用を目指したヒト多能性幹細胞から腎前駆細胞への分化誘導【目的】

らを同じ土俵，同じ尺度で評価・比較することが可能と急性腎障害 (AKI) は，様々な原因により急激な腎機能なる．臨床で観察される事象は種々の因子が互いに影響低下を来たし，有効な治療法のない死亡率の高い病態で成人病の病因・病態の解明に関する研究助成ある．治療戦略の一つとしてヒト iPS 細胞を用いた再生

therapy using human induced pluripotent stem

医療の開発が期待されているが，その方法は確立されてcell-derived renal progenitors ameliorates acute

いない．今回，我々は，ヒト iPS 細胞から腎臓前駆細胞

kidney injury in mice, Stem Cells Transl. Med.,を作製し，AKI モデルマウスに対する細胞移植治療の検4, 980 (2015).

討を行った．

３）Toyohara. T. & Osafune. K.: Novel Regenera-【方法，結果】

tive Therapy for Acute Kidney Injury, Renal

Replacement Therapy, 2, 34 (2016).

我々は，以前に OSR1-GFP レポーターヒト iPS 細胞株を樹立し，OSR1 陽性中間中胚葉細胞を高効率に分化誘導することに成功している１）．腎臓を派生させる②

小蛋白質 Mitoregulin の脂肪細胞における役割の

胎生初期の中間中胚葉および腎臓前駆細胞のマーカー解明

遺伝子としてそれぞれ転写因子 Osr1 と Six2 が知られ【目的】ている．そこで，まず腎臓前駆細胞を単離するために

これまで long non coding RNA として分類されていOSR1-GFP レポーターヒト iPS 細胞株の SIX2 遺伝子

た RNA の中には一部で機能性のペプチドに翻訳される座に tdTomato を相同組換え法により導入した OSR1-ものがあることが，RNA-seq とプロテオミクスを組み

GFP/SIX2-tdTomato ダブルレポーターヒト iPS 細胞株

合わせた研究から最近明らかとなっている４）．本研究を樹立した．さらに，我々の中間中胚葉細胞の誘導方は，その一つであり元々 LINC00116 という long non

法に，成長因子と化合物を組み合わせて追加すること

coding RNA として分類されていたが，実際には翻訳さによって OSR1/SIX2 共陽性細胞を 30% 以上の効率でれる Mitoregulin (MTLN) という小蛋白質に注目した．

誘導することに成功した．この OSR1/SIX2 共陽性細胞

MTLN は筋肉に発現し電子伝達系の調節に関与するとは，生体の腎臓前駆細胞と同様の遺伝子発現を示し，inいう報告があるが５），我々は MTLN の脂肪細胞におけvitro, in vivo においてさらに分化させることでネフロる役割をノックアウトマウスおよびヒト iPS 細胞より分ン構成細胞に分化した．さらに，ヒト iPS 細胞由来腎臓化した脂肪細胞を用いて検討した．

前駆細胞を虚血再灌流 AKI モデルマウスの腎被膜下に【方法，結果】

移植することによって，腎機能障害や腎組織障害が有意

MTLN は多くの種で保存され，脂肪細胞の発生分化に軽減した．一方で，iPS 細胞由来腎臓前駆細胞の急性と共に発現量が増加することが明らかとなった．また，腎障害組織への取り込みは認められず，治療効果は腎前MTLN ノックアウトマウスでは血清脂質が優位に低下

駆細胞から分泌される腎保護因子のパラクライン作用にすることが明らかとなった．さらにマウス単離脂肪細よるものと考えられた２）．

胞やヒト iPS 細胞由来脂肪細胞で詳しく解析を行なった【考察】

結果，MTLN は脂肪分解やβ酸化を促進する役割があ

腎疾患に対する再生医療としては，細胞移植治療や３ることを解明した．さらに電子顕微鏡による局在解析や次元腎組織の再建などの方法が現在試みられており，臨

免疫沈降法とプロテオミクスによる解析を行い，MTLN

床応用が期待されている３）．本研究は，ヒト iPS 細胞をはミトコンドリア蛋白質と共同して働くことで上記の役用いた腎疾患に対する細胞移植治療の可能性を初めて示割を担うことを明らかとした６）．

したものであり，腎疾患に対する再生医療開発への貢献【考察】が期待される．

本研究は MTLN という小蛋白質が脂肪細胞内で脂質

１）Mae, S.I., Shono, A., Shiota, F. et al.: Monitoring

代謝に関わることを示したものであり，同様の小蛋白質

and robust induction of nephrogenic intermedi-

をターゲットとした脂質異常症や糖尿病に対する治療法

ate mesoderm from human pluripotent stemの開発につながる研究成果である．今後さらなる機能解

cells, Nat. Commun., 4, 1367 (2013).

析や創薬研究が進むことが期待される．

２）Toyohara, T., Mae, S., Sueta, S. et al.: Cell

４）Matsumoto, A., Pasut, A., Matsumoto M. et al.:65

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

mTORC1 and muscle regeneration are regulated

胞内貯蔵脂質から細胞膜を構成するリン脂質への経路

by the LINC00961-encoded SPAR polypeptide,（Kennedy 経路）を促進していることが明らかとなった．

Nature 541, 228 (2017).

またこの脂質代謝変化による血管平滑筋の移動能と増殖

５）Makarewich, C.A., Baskin, K.K., Munir, A.Z. et

能の低下も動脈硬化に抑制的に働いていると考えられ

al.: MOXI is a mitochondrial micropeptidethat

た．さらに血管平滑筋特異的 AADAC 強制発現動脈硬enhances fatty acid beta-oxidation. Cell Rep. 23,

化モデルマウスでは動脈硬化の改善が認められた．一方

3701 (2018).

で AADAC をノックアウトした血管平滑筋やマウスで

６）Friesen, M., Warren, C., Yu, H., Toyohara. T

は上記と逆の結果が認められた．このことから AADAC(co-first author). et al.: Mitoregulin Controlsは細胞内の脂質代謝を調節することで動脈硬化に抑制的

b-Oxidation in Human and Mouse Adipocytes,に働いていることが明らかになった９）．

Stem Cell Reports, 14, 590 (2020)【考察】
本研究は動脈硬化に罹患しにくい患者において，血管③糖尿病患者由来 iPS 細胞を用いた新規動脈硬化抑平滑筋の AADAC が上昇していることを示し，またこ

制因子の探索のたった一つの小胞体内エステラーゼの調節で病態が改【目的】

善することを示している．今後 AADAC を用いた新た糖尿病患者の中には動脈硬化になりやすい人となりにな動脈硬化治療の開発が期待できる．また，臨床的に稀くい人がいることが臨床的には知られているが，その原だが特徴のある患者由来 iPS 細胞は病態のメカニズムを

因はこれまでに明らかにされていなかった．近年，患者解明する上で有用であり，臨床と基礎の架け橋になる可由来 iPS 細胞は単一の遺伝子を原因とした疾患のみなら能性を提示したことから，iPS 細胞を用いた病態モデル

ず，生活習慣病のような複数の遺伝子を原因とする疾患の可能性をさらに拡げる研究であると考えられる．

についても病態モデルの作製において有用である可能性

７）Warren, C.R., O'Sullivan, J.F., Friesen M., Beck-が示唆されていた７,８）．本研究では長期に糖尿病に罹患

er, C.E. et al.: Induced Pluripotent Stem Cell

しているにも関わらず動脈硬化にならないという非常にDiﬀerentiation Enables Functional Validation of

稀な病態を呈する患者由来の iPS 細胞より血管細胞を分GWAS Variants in Metabolic Disease, Cell Stem

化誘導し，動脈硬化抑制因子の同定を行うことを目的とCell 20, 547 (2017).

した．
【方法，結果】
申請者は数十年以上の糖尿病罹患歴があるが心臓カテーテル検査でも心血管病変が “全く認められない患者

８）Warren, C.R., Jaquish, C.E., and Cowan, C.A.:
The NextGen Genetic Association Studies Consortium: A Foray into In Vitro Population Genetics, Cell Stem Cell 20, 431 (2017).

群” と比較的短期の糖尿病罹患歴にも関わらず “心血管９）Toyohara. T (co-corresponding author)., Roud-

カテーテル治療が必要になった患者群” からそれぞれ

nicky, F., Florido, M.H.C., Nakano, T., et al.:

iPS 細胞を樹立して，血管細胞（内皮細胞，血管平滑筋

Patient hiPSCs Identify Vascular Smooth Muscle細胞）に分化誘導したのちに遺伝子発現を比較した．そArylacetamide Deacetylase as Protective againstの結果，心血管病変が “全く認められない糖尿病患者”

Atherosclerosis., Cell Stem Cell, 27, 147 (2020).

iPS 細胞由来血管平滑筋では小胞体エステラーゼとして知られていた Arylacetamide Deacetylase (AADAC) の発現が上昇していることを明らかとした．AADAC は
リパーゼ作用があることは知られていたため，AADAC
を強制発現した血管平滑筋を Lipidomics で脂質解析を行った結果，その活性化は triacylglycerol などの細66

TMFC ではご支援と多くの刺激をいただき，上記研究を進めるにあたり本当にお世話になりました．
この場を借りて，ご支援，ご指導いただいた応用酵素協会，先生方に厚く御礼申し上げます．

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

社会ストレスによる脳組織の超微細な細胞生物学的

心臓リモデリングに対する心臓局所のネプリライシ

変化とその機序・役割の解明

ンの役割についての検討

永

井

裕

崇

中

川

（神戸大学大学院医学研究科）【目的】

仁（奈良県立医科大学医学部）【背景・目的】

社会や環境より受けるストレスは抑うつや不安亢進なナトリウム利尿ペプチド（NP）は心房・心室から分

ど情動変容を誘発し，うつ病など精神疾患のリスクとな

泌され，それぞれ ANP・BNP と呼ばれており，ナトる．うつ病患者やマウスのストレス病態モデルにおいてリウム利尿作用や心臓リモデリングに対する抑制効果

は，前頭前皮質神経細胞の樹状突起萎縮や樹状突起スパを持ち，心不全における保護的ホルモンとして作用しインの喪失などの神経形態変化が情動変容に重要であるている．近年，NP をはじめとするペプチドを分解すことが示唆されてきているが，それらの神経形態変化のるネプリライシン（NEP）が注目され，NEP 阻害薬と分子細胞生物学的機序は殆ど不明である．従って本研究

Angiotensin II 受容体拮抗薬との合剤が，心不全の予では，最先端イメージング技術やマルチオミクス解析を後を改善する事が大規模臨床試験で報告された．なぜ

用いてストレス病態を担う神経細胞の機能形態変化のメ

NEP 阻害薬が心不全の予後をこれほど改善したかにつカニズムを明らかにすることを目的とする．

いては，ホルモンとしての ANP・BNP の作用を亢進さ【方法】

せた事によると考えられているが，心臓局所における社会挫折ストレスによる神経細胞や細胞内小器官の形

ANP・BNP の局所組織濃度が血中よりもはるかに高い

態変化を調べるため，マウスの内側前頭前皮質を連続電事を考えると，autocrine としての NP の作用を増強さ

子顕微鏡法（シリアルブロックフェイス走査電子顕微鏡せた可能性がある．本研究の目的は，NEP 遺伝子改変法やアレイトモグラフィー法）あるいは膨張顕微鏡法にマウスを用いて心筋細胞における NEP の作用を検討し，よる超解像イメージングにより観察した．さらに形態変

心臓リモデリングに対する心臓局所での NP と NEP の化に関わる分子機序を明らかにするため，トランスクリ

相互作用を明らかにする事である．

プトーム解析（RNA-seq）やメタボロミクス解析を実【方法・結果】

施した．

心臓局所における NEP の働きを検討するために，
我々

【結果】

は心筋細胞での NEP の過剰発現マウス（CM-NEP Tg）

社会ストレスが樹状突起の形態変化と関連するミトコを作製した．Tg マウスのベースラインの評価として，ンドリアの形態変化を生じることを見出した．さらにス

血中の ANP 濃度が著明に低下し，血中 cGMP と心臓組

トレスによりミトコンドリア関連遺伝子の発現低下やミ織の cGMP 濃度が野生型マウス（WT）と比較して有意

トコンドリアの機能低下が導かれることが明らかとなっに低下していた．Tg マウスの血中 ANP 濃度の低下をた．加えて，中央代謝系関連分子における発現変動が生補正するために，外因性に human ANP （hANP） を浸じた．

透圧ポンプで投与し（0.66 ug/kg/min), WT マウスの内【考察】

因性マウス ANP 濃度と同程度まで上昇させた．３週間

以上の結果は，社会ストレスがミトコンドリアの遺伝の大動脈縮窄術（TAC）を施行したところ，心重量，心子発現変化や機能変化を導くことにより神経細胞の機能

臓の線維化，心機能の低下と肺重量の増加が Tg マウス

形態変化を導く可能性を示唆する．今後はミトコンドリにおいて WT マウスより有意に認められ，心臓組織でアへの薬理学的あるいは分子生物学的制御を行うことにの cGMP は Tg マウスにおいて WT マウスよりも有意よりストレスによるミトコンドリア変化の機能的意義やに低下していた．そして，外因性の hANP を投与しても，その分子機序について検討する必要がある．

Tg マウスにおける TAC による心臓リモデリングと心機成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

能低下は改善することができず，心臓組織の cGMP はていない．これまで我々は，atypical Protein Kinase C

Tg マウスにおいて WT マウスよりも有意に低下したま(aPKC; PKCζ, PKCλ/ι) の腸管における機能に関するまであった．これらのことは，心臓組織の NEP の働きは，研究を続けており，腸管上皮細胞特異的な aPKC の欠失

血中 ANP よりも心臓組織の ANP に対してより重要でが conventional pathway の大腸癌の発癌過程においてあることが示唆される．興味深いことに，Tg マウスに腫瘍促進性に働くことを示してきた．すなわち，PKCζ

おける TAC 後の肺重量の増加は，外因性 hANP を投与の欠失は癌細胞の代謝経路依存性の reprogramming，

すると改善し，ホルモンとしての hANP の利尿作用に幹細胞性の増大，miR-200 制御による転移能の増大を，

より肺重量が低下したことが示唆される．

PKCλ/ιの欠失はパネート細胞の分化阻害による機能【結論】

欠損や上皮細胞死誘導による腸管炎症の増大による腫心臓組織における NEP の発現は心臓組織の cGMP を

瘍促進効果があることを示している．しかし aPKC が低下させ，TAC 後の心肥大，心臓間質の線維化，心機

serrated pathway を介する大腸癌発癌においてどのよ能の低下を引き起こした．心臓組織での ANP に対するうな役割を果たすかは未解明である．我々は今回のプロ

NEP の局所的な働きが，心臓リモデリングに重要であジェクトにおける検討で，PKCζあるいは PKCλ/ιのどると思われる

ちらかの上皮細胞特異的欠失では腸腫瘍の自然発生は認めない一方で，PKCζと PKCλ/ιの双方を欠失させた
aPKC-double knockout (DKOIEC) マウスにおいては自然発生的に腸腫瘍が極めて短期間に発生することを確認した．興味深いことに，DKOIEC マウスにおいて発生する腸腫瘍は組織的に極めて悪性度の高い鋸歯状病変であり，かつ間質の活性化と抗腫瘍免疫の抑制という特性を持ち合わせており，ヒト大腸癌における特に予後不良の
subgroup（CCS 分類における CCS3, CMS 分類における CMS4）と相関することが明らかとなった．DKOIEC
マウスにおける腫瘍発生機序として，PKCλ/ι欠失が腸管慢性炎症を惹起することで細胞増殖を引き起こすのに加えて，PKCζ欠失が Interferon 経路を阻害することでAtypical PKC による大腸癌発生抑制機構の分子的解明と治療への応用
中西祐CD8 陽性Ｔ細胞による抗腫瘍免疫を抑制していることが明らかになり，PKCζと PKCλ/ιが協調的に serrated
pathway における癌抑制に働いていることが示された．

貴さらに，免疫チェックポイント阻害剤と TGF-b 経路阻（京都大学医学研究科）

害剤併用が抗腫瘍免疫を活性化し，DKOIEC マウスにおける腸腫瘍に対する著明な抑制効果があることが明ら

大腸癌発癌過程において，これまで主要ルートと考えかとなった．以上の結果から，aPKC は大腸癌発生のられていた通常型腺腫を前癌病変とする conventional

serrated pathway においても抑制性に機能しているこ

pathway が広く知られているが，近年大腸鋸歯状病変とが示された．加えて，aPKC は予後不良な大腸癌サブからの癌発生も注目を集めている．この鋸歯状病変に由タイプに対する極めて有効なバイオマーカーであり，か来する癌化経路は serrated (alternative) pathway と呼つ aPKC による免疫および間質反応の制御機構は癌治療

ばれ，15︲30% の孤発性大腸癌の発生に関与するとされの新規ターゲットとなり得ると考えられた．

ているが，その詳細な分子メカニズム，そして腫瘍微小環境と腫瘍細胞との相互関係については明らかにされ8成人病の病因・病態の解明に関する研究助成【考察】
新たな心機能制御要素としての心臓マクロファージ
の機能解析
中

山

心不全を起こすと脳，神経を介して骨髄に構造的リモデリングを起こし，HSC レベルでエピゲノムが変化し幸輝て骨髄系細胞に分化しやすくなった．一方で心不全マウ（東京大学医学部）

スの HSC 由来単球は心保護的な心臓マクロファージに分化しにくくなるということが分かった．このことは，【目的】
高齢化社会において心不全症例の増加が顕著になっているが，従来の心不全治療では，健康寿命の延伸は得ら

老化や心不全を起こした心臓で外的ストレスに対する忍容性を低下させ，さらなる心機能低下を引き起こすと考えられた．

れていない．心臓の加齢変化の病態生理を解明し，繰り返す心不全を予防する新たな治療戦略を創出することは喫緊の課題である．我々は，心臓間質に存在する組織マ
クロファージが，恒常性維持に重要な役割を担っている

慢性活動性 EB ウイルス感染症（CAEBV）におけるウイルス由来マイクロ RNA の発現と機能ことを解明した．近年の報告では，心臓マクロファージ

西尾

美和子

の細胞起源は，心不全や加齢に伴って胎児肝単球由来の（東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科）

マクロファージから骨髄単球由来に変化すると考えられ
ている．
一方で，
細胞起源の変遷に伴う心臓マクロファー【目的】

ジの表現型の変化が心機能に与える影響は未知である．

慢性活動性 EB ウイルス感染症（CAEBV）は進行性，また，骨髄は老化すると造血幹細胞 (HSC) レベルで質治療抵抗性の EBV 陽性 T, NK 細胞腫瘍である．希少疾的変化をする．そこで，①骨髄老化に伴う心臓マクロ患とされてきたが，診断基準の作成，公開と，WHO 造

ファージのエピゲノムの変化が，心臓の恒常性維持を破血器腫瘍分類への記載により世界的に報告数が増えて綻させ組織リモデリングを引き起こす，②心不全になる

おり，発症機構解明と治療薬開発が急務である．EBVと骨髄ニッチが変化して HSC 自体が変化する，というゲノム上にはマイクロ RNA, miR-BARTs をコードする

仮説に基づき心不全の新たな病態解明を図る．

遺伝子が存在する．EBV 陽性Ｂ細胞腫瘍において miR-

【研究成果】

BARTs は宿主細胞の遺伝子発現を制御し不死化を促す

骨髄老化が心機能に与える影響を評価するため，老年とともに，エクソソームに含有され放出されて周囲細胞

マウスの骨髄を若年マウスに移植したところ，自然経過も制御，発症へ寄与することが報告されている．そこでで慢性期に心筋線維化が進んで収縮能が低下した．老化

本研究では，CAEBV における miR-BARTs の発現とそに伴って心臓の線維化を進ませるのは血清中蛋白ではなの機能について解析をした．

く細胞成分であり，加齢によって表現型が変化した免疫【方法】

細胞が可塑性を失って心臓実質の恒常性を摂動させると

CAEBV またはその類縁疾患の患者検体から樹立さ考えられた．続いて心不全マウスの骨髄だけを正常マウ

れ た EBV 陽 性 Ｔ 細 胞 株（SNT8, SNT15, SNT16） とスに移植すると，同様の線維化と心機能低下が見られた．

EBV 陽 性 NK 細 胞 株（SNK1, SNK6, SNK10）を用い心不全マウスの骨髄 HSC では，老化モデルと同様 HSC

た．CAEBV の診断は，2015 年に厚生労働省研究班にの増殖が進行していた．HSC の変化が心臓マクロファー

よって作成された診断基準に従っておこなった．miR-ジの表現型を与える影響を解析するために，老化マウス

BARTs の発現は，HiSeq 2000 と定量的 RT-PCR 法をや心不全マウスの HSC を健常マウスの HSC と競合的使用して測定した．NF-κB はウエスタンブロット法をに移植すると，前者は末梢血で骨髄系細胞に偏向して分用いて検出した．

化する一方で，これらの HSC 由来の心臓マクロファー【結果】

ジが，より炎症性の表現型を示すことが分かった．

各 細 胞 株 か ら miR-BARTs が 検 出 さ れ た． こ れ ら9成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

miR-BARTs の標的タンパク質を調べるために in silicoには相関関係があることが分かった．次に，各 HDAC

分析をおこなった．NF-κB 阻害因子である A20 が抽出と MCHR1 を共発現させたところ，MCH 添加によりできた．マイクロアレイ解析で A20 の発現をみたとこ

HDAC3, 5, 9, 10 のタンパク質発現量が増加した．まろ，健常人由来 EBV 陰性Ｔまたは NK 細胞と比較して，た，MCHR1 安定発現細胞に HDAC3, 5, 9, 10 を過剰CAEBV 患者由来 EBV 陽性Ｔまたは NK 細胞では発現発現させることで，MCH 添加による NFAT 転写活性がが低下していた．さらに，NF-κB 活性化が確認された．

亢進した．次に，MCH 添加による HDAC と MCHR1【考察】の局在の変化を細胞免疫染色法で調べたところ，通常

CAEBV に お い て，miR-BARTs が NF-κB 阻 害 因 子

MCHR1 は MCH 添加により細胞膜上における発現が低である A20 を抑制することで，NF-κB 活性化に関与す

下するが，HDAC5, 9, 10 を共発現させることで MCHる可能性が示唆された．本研究により，miR-BARTs が添 加 に よ る 膜 発 現 低 下 が 抑 制 さ れ た． さ ら に，定量

CAEBV の治療的標的となり得ると期待される．

PCR 法を行った結果，MCH 刺激により内在性 HDAC5,9, 10 の mRNA 発現量が変化することを確認した．一方，摂食関連 GPCR の活性化・不活性化における分子メカニズム解析濱本

明

細胞内シグナルの上流では HDAC 阻害剤処理や HDACを強制発現しても差が見られなかった．
以上より，MCHR1 が HDAC と相関関係を有してお恵り，特に HDAC5, 9, 10 が重要であることが判明した．
（岐阜大学工学部）

今後詳細な分子機構を解明することで HDAC と摂食関連受容体との関係が解明され，肥満の新たな治療戦略と【背景】なることが期待される．

エピジェネティクスとは DNA 塩基配列の変化を伴わない，後天的な遺伝子の修飾機構のことである．ヒストンがアセチル化された領域では DNA の巻き付きが緩
むために転写が亢進するが，ヒストン脱アセチル化酵素

レム睡眠の脳の恒常性維持における役割の解析
林悠（京都大学医学系研究科）（HDAC）により脱アセチル化されると転写が抑制される．これまで一部のＧタンパク質共役型受容体（GPCR）と HDAC が相互作用すると報告されているが，摂食関【背景】

連 GPCR と HDAC の関係については全く不明であった．

哺乳類の睡眠はノンレム睡眠とレム睡眠から構成されそこで本研究では肥満に重要なメラニン凝集ホルモン受る．レム睡眠は睡眠全体の 15％程度にしか満たないが，

容体（MCHR1）に着目し，HDAC との相関関係を解析

この間，脳が活発に活動し，鮮明な夢が生み出される．

した．

このような独特な状態が何のためにあるかは，脳科学の【方法】

大きな謎であった．レム睡眠は生誕直後に最も多く，成MCHR1 が安定発現した HEK293 細胞を使用して，長や加齢とともに大きく減少する．通常よりもレム睡眠

HDAC 阻害剤処理による影響を調べた．また，HDACが少ない成人では，認知症の発症リスクが高まることか

クラスⅠ，Ⅱの内，どのサブタイプが MCH-MCHR1 系

ら，レム睡眠が脳の恒常性維持にかかわり，その異常がに影響を与えるかを解析するために，細胞内シグナルや認知症の発症・進行に寄与する可能性が考えられる．し発現量，局在の変化を網羅的に解析した．

かしながら，レム睡眠が脳の恒常性維持に関わることの【結果・考察】直接的な証拠はない．レム睡眠の生理的意義を解明する

HDAC 阻害剤であるトリコスタチンＡ処理により，細胞内シグナルの下流である NFAT 転写活性や MCHR1
受 容 体 発 現 量 が 変 化 し た こ と か ら MCHR1 と HDAC

0

ことで，睡眠障害に着目した全く新しい脳機能・認知症の改善方法の開発が期待される．

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成【目的】
本研究の目的は，レム睡眠の脳の恒常性維持における毛細血管の血流が上昇した．
【考察】

役割を解明することである．私たちは，レム睡眠の機能

私たちが開発したレム睡眠が不可逆的に消失したマウを追及する上で，２つのアプローチに取り組んだ．一つスでは，様々な行動への影響がみられた．レム睡眠が脳

目は，レム睡眠の ON／OFF を司るニューロンを同定し，の恒常性維持に必須な役割を担う可能性が高い．ただし，遺伝学的にその機能を阻害または亢進させることで，レ

私たちがレム睡眠阻害のために破壊したニューロンが，ム睡眠を大幅に増加または減少させた影響を検討する，

レム睡眠制御以外の役割も担っている可能性が否定できというものである．もう一つは，脳血流に注目し，生体ないため，今後，別の角度からのアプローチも重要となる．

内イメージングによって，覚醒時・ノンレム睡眠時・レ

また，マウスの脳血流を直接観察するアプローチでは，

ム睡眠時の皮質毛細血管の血流を比較する，というもの

レム睡眠中に，大脳皮質の脳血流が大幅に上昇することである．この２つのアプローチから，レム睡眠の脳の恒が判明した．１日約１時間のレム睡眠中の大脳皮質の広常性維持における役割を解明することを目指した．

範な血流上昇は，広く栄養を届けるとともに，脳の不要【方法】

な老廃物を回収することに貢献している可能性がある．

古典的な研究からレム睡眠を制御するニューロンは脳【文献】

幹橋にあることが支持されているが，ニューロンのサブ

１）Kashiwagi M, Kanuka M, Tatsuzawa C, Suzuki

タイプは分かっていない．我々はこの領域に選択的に発H, Morita M, Tanaka K, Kawano T, Shin JW,

現する Cre ノックインマウスを多く構築してきた．そSuzuki H, Itohara S, Yanagisawa M, Hayashi Y.

のうちの一つのニューロンが，レム睡眠を促進する作

Widely distributed neurotensinergic neurons

用があることを見出した．本研究では，このニューロン

in the brainstem regulate NREM sleep in mice.

を遺伝学的に破壊した．また，共同研究者の柳沢正史博

Current Biology 30: 1002-1010 (2020).

士らは，２光子励起顕微鏡下で，マウスの脳波・筋電図２）Maezono SEB, Kanuka M, Tatsuzawa C, Morita

を測定しながら脳内を観察できる実験系を構築した．私M, Kawano T, Kashiwagi M, Nondhalee P,

たちは，この実験系を活用し，脳血流を観察した．蛍光Sakaguchi M, Saito T, Saido TC, Hayashi Y.

色素（FITC-Dextran）を静脈注射により血中に加えて，Progressive changes in sleep and its relations

血漿を蛍光で可視化した．これにより，赤血球を影としto amyloid-β distribution and learning in singleて検出でき，そのスピードおよび通過数を計測すること

App knock-in mice. eNeuro 7 ( 2 ) ENEURO.

で，毛細血管の血流を計測した．

0093-20. 2020 (2020).

【結果】
私たちが同定したレム睡眠促進ニューロンに，ウイル
スベクターを用いた細胞死を誘導する遺伝子を発現させたところ，レム睡眠を不可逆的に阻害することに成功した．このマウスでは，記憶学習能力が低下し，さらには心疾患の病態生理のシステムとしての理解とその制御に関する研究東邦

康智（東京大学医学部附属病院）

不安やうつ様行動が低下していることが判明した．また，初期には，レム睡眠中に体が動き出すレム睡眠行動障害のような表現型も見られた．

心不全は予後不良の病態であり，心疾患の病態生理のまた，自然な睡眠覚醒の条件下で，脳の毛細血管の血解明と新たな治療戦略の創出が急務である．心疾患の病流を観測することに成功した．その結果，
レム睡眠中は，態生理は心臓における様々な細胞内シグナル伝達経路，

大脳皮質の血流量が覚醒時やノンレム睡眠中と比べて大細胞間相互作用及び多臓器連関が絡み合った複雑系によ

幅に上昇することが判明した．活発に運動している時とり構成されるため，システムとしての理解と介入が必要

比べても，多くの皮質領域でレム睡眠中は２倍前後まで

である．



成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

心機能の主な担い手は心筋細胞であるが，その機能は血管内皮細胞，線維芽細胞や免疫細胞等の非心筋細胞により裏打ちされている．特に血管内皮細胞は心筋細胞への血液灌流を維持するために重要な細胞である．我々は概日リズム障害発症メカニズムの理解に向けた睡眠リズム制御機構の解明
平

野

有

沙
（筑波大学医学医療系）

この血管内皮細胞が抗酸化ストレス作用を有し，心筋梗
塞後リモデリング及び圧負荷心不全における心機能の維持に重要な役割を果たすことを解明した．血管内皮細胞【目的】

は ABCG2 という膜輸送蛋白を発現している．ABCG2睡眠は動物に不可欠な生理行動である．一時的な断はプロトポルフィリンⅨ及び抗酸化物質グルタチオンの眠は認知・学習機能や注意力の低下をもたらすが，断細胞外への排出に関与し，心負荷時の血管内皮細胞及び続的な不眠によって生物は様々な失調をきたし，重篤な心筋組織の酸化ストレスを軽減する．

場合には死に至る．重要なことに，睡眠の量に加えてタ負荷が加わった心組織では炎症反応が誘導される．

イミング（位相）も我々の健康に強く影響を与える．生

我々はこの炎症反応の心疾患における役割と制御機構を物の行動や代謝は約１日周期のリズムを示し，このよう明らかにした．心組織を構成する細胞には，自然免疫受な概日性の生理リズムは概日時計と呼ばれる体内時計に

容体 TLR2 が広く発現している．我々は，心負荷時に主よって制御される．24 時間型社会と呼ばれる現代社会に心筋細胞より分泌される熱ショック蛋白質 Hsp70 がにおいては，不規則な生活による概日リズム障害が社会

TLR2 を活性化し，その結果誘導される炎症性サイトカ問題となっている．規則正しいリズミックな生理現象は

イン IL-1β が圧負荷時の心リモデリングに重要な役割を生体恒常性の維持に必須であり，概日リズム障害とメタ果たすことを明らかにした．また，IL-1βの活性化にはボリックシンドロームや精神疾患の発症には強い相関が自然免疫受容体 NLRP3 インフラマソームの活性化が重見られる．そのため，概日時計から生理リズムへの出力要である．我々は，心組織における NLRP3 インフラマ

経路の理解は，概日リズム障害によるメタボリックシン

ソームの活性化が神経シグナルにより制御されているこ

ドローム発症メカニズムとその予防に大きく寄与するととを解明し，心組織の炎症反応における心脳連関の重要期待できる．概日時計の中枢は視床下部の視交叉上核性を明らかにした．

（SCN）に存在し，個々の神経細胞は自律振動する分子

心組織における炎症反応は心負荷に対する代償反応及

時計を内在する．SCN 時計は外界の明暗サイクルに同び非代償反応の双方に寄与するが，代償期から非代償期

調し，他の脳領域や末梢組織に時刻情報を出力することへと移行していく時間軸における炎症反応の役割及び制で生理リズムを作り出す．概日時計から生理リズムの基

御機構は不明であった．我々は，代償期と非代償期にお本である睡眠覚醒リズムへの出力は極めて重要なプロセ

ける炎症性サイトカインの発現バランスが転写制御因子

スである．そのため，概日時計の出力系の理解なくしIκBζにより制御されており，この発現バランスの変化ては生理リズム形成の根幹を理解したとは言い難いが，が代償期から非代償期への移行に深く関与することを明SCN の “細胞内” の時計発振機構に比べて生理リズム

らかにした．

の出力系を司る “SCN 外” の神経ネットワークの理解

最後に，我々は，プール型表現型スクリーニングと合は進んでいない．そこで本研究計画では概日時計の重要

成生物学的手法を用いて，複数の治療標的に対し時間空な出力である睡眠リズムに着目し，SCN から投射され間分解能をもった介入を可能にする合成遺伝子回路を作る神経細胞の時刻・細胞特異的な操作を行うことで，睡成した．心不全に対する次世代の遺伝子治療として期待

眠覚醒リズムの制御メカニズムとその破綻がもたらす個

される．

体への影響を明らかにする ．
【方法】
本研究は，神経トレーサーを利用して SCN から神経投射される細胞群の同定を行うとともに，人為的に神経成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

活動を操作することでその神経連絡の睡眠覚醒サイクル（AVP）神経とは共局在しないことが明らかとなった．

制御における役割を明らかにする．特に，VLPO に投射

既に，SCN の GABA 神経のみに蛍光タンパク質を導入している SCN 神経に着目し，その個性を理解するととしてその軸索を可視化した結果から SCN の GABA 神経

もに睡眠覚醒リズム形成における寄与を調べて行動リズ

は視索前野（POA）全般にわたり軸索を伸ばし，VLPO

ムを生み出す分子・神経機構を明らかにすることを目指も含まれることを見出している．つまり，SCN からした．まずはじめに，投射先特異的に SCN の神経細胞

VLPO に神経連絡する神経は少なくとも VIP 産生神経群をラベルし，その性状解析を行った．イヌ科アデノウと GABA 産生神経で構成されていることが判明した．

イルス２型（CAV2）は軸索末端から取り込まれ，逆行

さらに，DREADD を用いて SCN → VLPO 神経を活性に輸送されて細胞体において目的遺伝子を発現するた性化させたところ，マウスの自発行動が有意に減少した．

め，CAV2 を VLPO に導入することで，その領域にの

興味深いことに，DREADD による行動抑制の効果は夜み投射している神経細胞の遺伝子操作が可能である．さ間にしか観察されなかった．また，EEG/EMG による睡らに，薬理遺伝学的手法（DREADD）を用いて，SCN

眠覚醒解析の結果，マウスの覚醒時間が有意に減少する→ VLPO 神経を人為的に活性化したときのマウス自発ことが明らかとなった．この結果は SCN から VLPO に行動および睡眠覚醒状態への影響を解析した．一方，神

投射する神経回路が直接的に睡眠覚醒制御を行い，マウ

経毒素であるテタヌス毒素（TeNT-LC）を用いて細胞ス自発行動の変化をもたらしていることを示唆する．一の神経小胞を阻害した．具体的には，CAV2 と TeNT-

方，TeNT-LC を発現させたマウスは徐々にリズムを失LC および EYFP を発現する AAV を用いて VLPO に投い，明暗サイクルにおいても行動リズムが大きく減弱射する SCN 神経のみに神経毒素を発現させた．そのあした．さらに恒暗条件においても行動リズムはほぼ消失と赤外線センサーを用いてマウス行動リズムを測定した．

していた．TeNT-LC ではなく GFP を発現させたコント

今後，自由行動下のマウスにおいて神経活動のリアル

ロールマウスにおいてはウイルスの投与後も明瞭な行動

タイムモニタリングを行うことで，実際に生体内で１日リズムが観察されたが，これらの結果から，マウスにおのどの時刻に情報出力が行われているのかを明らかにしいて睡眠中枢に神経軸索を伸ばしている SCN 神経群はて情報出力とマウス睡眠覚醒状態との相関を明らかにし行動リズムの形成に必須の役割を果たしていることが明たいと考え，in vivo での神経活動のイメージング系のらかになった．

立ち上げを試みた．しかし，神経活動のモニターに頻繁

Akaluc を利用した生物発光モニターを行ったところ，に使用される GCaMP は蛍光タンパク質であり，励起光検出された発光は十分であり，今後，基質の連続投与のの照射や蛍光の検出に光カニューレを挿入する必要があ

条件を確定させて SCN 神経における神経活動リズムをるため，SCN および SCN の投射先領域（特に SCN の観察する予定である．

直上にある SPVZ および PVN）が破壊されることが強【考察】く懸念された．そこで我々は，赤色ルシフェラーゼを用

本研究では，SCN から VLPO への神経投射に焦点をいた非侵襲イメージングを用いることにした．イメージ

あててその性状解析および機能解析を行なった．その結ングには赤色ルシフェラーゼである AkaLuc をマウス脳

果，SCN → VLPO 神経は GABA および VIP 神経で構内に発現させてルシフェラーゼの発光基質を投与し，自成されており，SCN の中でも特異的な細胞集団を形成

由行動下のマウスにおける発光を MIIS in vivo imager

すると考えられた．さらに，人工 GPCR を用いて一過を用いて観察した．

性に神経を活性化させた際にはマウスの行動量の減少と【結果】

睡眠量の増加が観察された．重要なことに，一過性の神蛍光ラベルした SCN → VLPO 神経について，SCN

経活動の誘導の効果は夜間にのみ観察された．つまり，に発現している神経ペプチドに対する免疫組織染色のこの効果には時刻依存性が存在している．これは生体内結果から，VLPO に投射する SCN 神経は腸管作動性ペで SCN の神経活動がマウスの休息期である昼間に上昇

プチド（VIP）を主に発現し，アルギニンパソプレシン

するという先行知見の結果とよく一致する．つまり，夜73成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

行性のマウスにおいては昼に神経活動が活発になり，神ユニットで初めて安定な複合体を形成するメカニズムを

経連絡を通して視索前野の神経を活性化することで睡眠解明している．

を誘導していると考えられる．また，神経毒素を用いてそこで，その知見を利用した LUBAC を不安定化する

SCN → VLPO 神経の神経連絡を阻害したところ行動リ機能抑制剤の開発を行なった．これまでに LUBAC の３

ズムの減弱が観察された．SCN から VLPO に至る出力

つのサブユニットの結合部位の共結晶構造解析に成功し経路の異常が行動リズム消失に寄与していると考えられており ( 図２)，新たに判明した HOIL-1L/SHARPIN のた．本研究で我々は SCN から睡眠リズムを形成する神結合が複合体の安定化に最も大きく寄与することを見出

経回路を同定し，その生理的役割を明らかにした．今後している．結晶構造のデータを元に同結合を阻害しうるは，さらに詳細に神経回路の性状を明らかにするため，

ペプチドを作成し，がん細胞株を用いてペプチドの評価

生体内イメージングの実験系を確立し，１日のどのタイを行なった．その結果，LUBAC の発現量を抑制し，まミングで強く神経が活性化されているのか，神経活動とた細胞の生存を LUBAC の発現量に依存しているがん細マウス行動との相関を明らかにしていく．

胞の viability を著しく傷害することを見出した．
また臨床応用を視野に HOIL-1L/SHARPIN 結合を阻

直鎖状ユビキチン鎖が惹起する疾患の検索と制御戦略
藤

田

宏

明

害する低分子化合物の開発に向けた FRET アッセイ系
構築を行なった．大腸菌で LUBAC 結合領域のタンパク質を精製し，複合体形成を FRET によりモニターした（京都大学医学部医学研究科）

ところ，精製した LUBAC 結合部位のタンパク質添加でFRET 値が上昇し，上記ペプチド添加により FRET 値が新規のタンパク質翻訳後修飾である直鎖状ユビキ

減少したことから，LUBAC 複合体形成をモニターでき

チン鎖 ( 直鎖 ) を特異的に生成する唯一の酵素であるていることが明らかとなった．またこの系を用いて小分

LUBAC ユビキチンリガーゼ（E3）は，催炎症性転写因

子化合物のスクリーニングを行い，FRET 値が減少する子である NF-κB 活性化，また細胞死の抑制に関与する．

化合物をいくつか同定した．同定した化合物が，１. ユ

LUBAC は活性中心を有する HOIP，アクセサリー分子

ビキチンアッセイにより LUBAC の活性を抑制するかである HOIL-1L, SHARPIN の三者複合体から構成され

２. 細胞内の LUBAC 量を減少させるか ３. 野生型にはる（図１）．申請者らはこれまでに，LUBAC が３サブ効果がなく，がん細胞特異的に細胞生存を傷害するか，について解析を行った．同定した化合物の中で，劇的ではないが上記 1. 2. 3 のクライテリアを満たす化合物を一つ見出した．現在，この化合物に関して，更なる解析を行っている．

図１

LUBAC リガーゼの模式図

上 記 の FRET に よ る 化 合 物 同 定 に 加 え，DNA encoded library (DEL) スクリーニング系の構築を行っている．DEL ライブラリーはそれぞれの化合物に特異的なバーコード DNA が結合しており，DNA の情報を次世代シークエンサーで読み取ることで，化合物を特定することができる．DEL ライブラリーの利点はライブ
ラリーの多様性であり，数十億の化合物を一度にスクリーニングできる．DEL ライブラリーを用いて HOIL1L/SHARPIN 特異的な結合阻害剤を同定するために，

図２



LUBAC 三量体形成部位の構造

DEL スクリーニングに用いるタンパク質の精製を行った．HOIL-1L/SHARPIN の結合部位を数十アミノ酸か成人病の病因・病態の解明に関する研究助成らなる非常に小さな領域であり，それぞれの領域を大腸菌に共発現させ，精製したところ HOIL-1L/SHARPINの小さいフラグメントが結合するこが確認できた．
現在は，同タンパク質を大量精製し，DEL スクリー

劇症１型糖尿病発症メカニズムの解明
細

川

吉

弥

（文部科学省研究振興局ライフサイエンス課）

ニングで精製タンパク質に結合する化合物を同定する予
定である．

【目的】

上記の解析に加え，活性中心である HOIP に加え，①劇症１型糖尿病患者 iPS 細胞由来インスリン陽性細HOIL-1L にも存在するユビキチンリガーゼの機能，生胞における 25HC の抗アポトーシス効果を明らかにす

理的意義を明らかにし，論文化を行った１）．これまでにる．②微量血液サンプルでの 25HC 濃度測定系を樹立

HOIL-1L の同活性を消失させると LUBAC の直鎖状ユする．③免疫チェックポイント阻害薬投与後の１型糖尿ビキチン鎖生成能が亢進して，LUBAC の２つの機能，病発症機序を組織学的に明らかにする．④劇症１型糖尿

NF-κB 活性化能と細胞死抑制能が顕著に亢進すること

病患者を含む糖尿病患者における新規血中グルカゴン測を見いだした．その詳細なメカニズムを解析し，HOIL-

定系による空腹時グルカゴン値の意義を評価する．

1L は自分自身をモノユビキチン化し，さらに HOIP が【方法・結果】

そのモノユビキチンを認識し，直鎖を付加することで①健常人由来 iPS 細胞および劇症１型糖尿病 iPS 細胞

LUBAC 自身が直鎖化されること，さらに LUBAC の直を INS 陽性細胞に分化誘導させ，ウイルス感染を模倣

鎖化が LUBAC の機能を抑制することを見出した．まする系として poly (I;C) トランスフェクションしフロー

た HOIL-1L の E3 活性を欠失させたマウスを作出し，サイトメトリーにて INS 陽性細胞のみ単離した．PDL-1

12 ヵ月齢までは顕著な症状は示さないが，全ての臓器や我々の既報（Baden MY, PLoS One, 2015）で評価において直鎖の生成が顕著に亢進し，肺では炎症時にしている１型 IFN やウイルスレセプター，ISG15 等の誘発される iBALT 様のリンパ球浸潤が認められた．ま

遺伝子発現を検討したがいずれにおいても健常人由来

た肝細胞傷害モデルである LPS+D-Gal 投与モデルに作iPS 細胞と劇症１型糖尿病 iPS 細胞で有意差を認めな成したマウスは耐性を示したのに加え，LUBAC の機能

かった．また劇症１型糖尿病患者 iPS 細胞由来インスが低下することで皮膚炎を発症する SHARPIN 欠損マ

リン陽性細胞に poly (I; C) をトランスフェクションしウスに HOIL-1L E3 欠失マウスを掛け合わせたところ，25HC の抗アポトーシス効果を検討した．種々の濃度のLUBAC の機能を上昇させることで，皮膚炎が回復する

poly (I; C) や 25HC で検討を行ったが，poly (I;C) によことを見出した．また個体の中にはＴ細胞リンパ腫を発る Caspase3 活性の有意な低下作用は認めなかった．②

症する個体もいたことから，同マウスの詳細な解析を進

大阪大学工学部と共同で，血中 25HC 濃度測定系の樹めるとともに，免疫異常が関与する炎症モデルとの関連，

立をすすめた．サンプル間の内部標準のばらつきを軽減

LUBAC の機能亢進と慢性炎症性疾患，がんについてもすることができることに成功し，また微量な血液量で検索する予定である．

の測定系の検証をすすめた結果，微量血液サンプルで【文献】の 25HC 濃度測定に一定の目途を立てることができた．

１）Fuseya Y, Fujita H, Kim M, Ohtake F, Nishide A,③抗 PD-1 抗体投与後に１型糖尿病を発症した 2 例の膵

Sasaki K, Saeki Y, Tanaka K, Takahashi R, Iwai

組織においてβ細胞は残存せず，CD3 陽性細胞の膵島

K. The HOIL-1L ligase modulates immune sig-への浸潤を認めた．④急性発症１型糖尿病患者（14±naling and cell death via monoubiquitination of

10pg/ml）では２型糖尿病患者に比し空腹時グルカゴン

LUBAC. Nature Cell Biology (2020), 6, 663-673

値（29±15pg/ml）は有意に低値であった．劇症１型
糖尿病患者（11±2 pg/ml）では急性発症１型糖尿病患者と同程度に空腹時グルカゴン値は低値であるいっぽう，緩徐進行１型糖尿病患者の空腹時グルカゴン値（25成人病の病因・病態の解明に関する研究助成±15pg/ml）は２型糖尿病患者に近い値であった（下記

【結果】

論文参照）
．⑤その他に J Diabetes Investig において劇

これまでに睡眠覚醒調節に関与すると報告されている症１型糖尿病の Mini Review が掲載された（下記参照）．

脳領域に AAV-DTA の局所感染を用いて細胞死を誘導す【文献】

るスクリーニングを行った．９脳領域を検討した結果，・Hosokawa Y, et al . Pathogenesis of Fulminant

視床のある核を除去するとノンレム睡眠時の Spindle とtype 1 diabetes: genes, viruses and the immune

呼ばれる脳波は消失するが Slow Wave は消失しないこ

mechanism, and usefulness of patient-derived iPSとが分かった（図１B）．この核に加え，視床のもう一

cells for future research. Mini Review. J Diabetes

つの核を除去する事により Slow Wave が低くなること

Investig. 10. 1158-64 (2019).

がわかった．

・Hosokawa Y, et al. Positive correlation between【考察】fasting plasma glucagon and serum C-peptide in

我々の結果から，視床の一部がノンレム睡眠時特異的Japanese patients with diabetes. 5. e01715 (2019).

脳波である徐派・Slow Wave の生成に必須であることが明らかになった．また，細胞死を誘導する AAV-DTA

ノンレム睡眠特異的脳波パターンを作り出す神経回路の解析のインジェクションから四週間経ってもこの表現型は回復しなかった．この結果から，この脳領域は徐派・Slow Wave の生成に必須であり，他の脳領域によって

本城

咲季子

この機能は補償されないと考えられる．

（筑波大学国際統合睡眠医科学研究機構）

【目的】

A

ノンレム睡眠に特異的な大脳皮質神経活動の神経基盤を明らかにする．
【背景】
脳波は大脳皮質神経活動の和であり，睡眠・覚醒状態
は脳波によって規定される．これは高次認知機能を担う

B

大脳皮質の活動が覚醒・ノンレム睡眠・レム睡眠を通じて変化する事を反映している．ノンレム睡眠時，脳波の振幅は大きくなり，またその周波数は低くなる．この脳波は徐派あるいは Slow Wave と呼ばれ（0.5－4 Hz），
睡眠圧のマーカーであると共に，睡眠による記憶の固定Cにも重要な役割を果たすと考えられている．しかし，徐派が生み出される神経基盤は未だ明らかではない．
【方法】
徐派を生み出す脳領域を特定するため，ジフテリアト
キシン（DTA）の発現による細胞死誘導を用いる．脳の各領域に DTA を発現させるための AAV を局所感染させ，同時に脳波・筋電測定用の電極埋め込み手術を行う．手術後は慢性的に脳波・筋電シグナルを記録し，1,
2, 3, 4 週間のタイムポイントにおいて睡眠覚醒判定および脳波解析を行う．



図１

 時間の睡眠覚醒記録．視床核 A ablation
手術後一週間（A），手術後三週間（B），視床核 A-B ablation 三週間

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

血糖変動と認知機能の関連解明のための前向き観察
研究した．サンプルサイズは当センターの統計解析室に推定を依頼し，横断研究の既報（Diabetes Care 2010 33:
2169-2174, PLos One. 2014 9 (1): e86284）と照らし

松

原

正

樹
（国立循環器病研究センター病院）

合わせて，α-level ＝ 0.05, power ＝ 0.90 or 0.95 で計算を行ったところ n ＝ 76 or 92 であり，本研究が経時データであることから 20％の脱落を考慮すると n ＝ 95

【背景】
糖尿病患者では，アルツハイマー型認知症，血管性認or 110 となる．以上より十分な登録数が得られたと考えられた．

知症の発症リスクがそれぞれ 1.5 倍，2.5 倍に増大することが知られている．糖尿病患者における認知機能低下や認知症の病態については，重症低血糖，慢性的な高血糖，高インスリン血症，脳血管障害，終末糖化産物の蓄積など多くの要因が示唆されているが未解明な部分が多Long non-coding RNA から翻訳される新規ポリペプチドの解析による疾患の病因解明
松本有樹修（九州大学生体防御医学研究所）

く，また認知症予防のための血糖管理指標も明らかとなっていない．近年，血糖持続測定（CGM）機器の登場により糖尿病患者の血糖プロファイルを評価することが可能となり，横断研究で血糖変動と認知機能の関連が【目的】
Long noncoding RNA (lncRNA) はタンパク質を翻示唆されている．

訳しない RNA と定義されているが，われわれは一部の【目的】

lncRNA が翻訳されてポリペプチドを産生していること

糖尿病患者の血糖変動と認知機能の関連を縦断的に解を明らかにした [Matsumoto A. et al., Nature (2017)]．

析することで，糖尿病患者で認知機能低下に至る病態をそこで，これら新規ポリペプチドがどのような機能を持解明し，また糖尿病患者における認知症予防のための新つかを明らかにしていく．

規血糖管理指標を探索する．

【方法と結果】【方法】

今回われわれは，精子特異的に発現する lncRNA か

本研究は単施設（国立循環器病研究センター）におけら翻訳される２つの新規ポリペプチドに着目した．興味る２年間の前向き縦断研究であり，軽度認知障害を認め深いことに，これら２つのポリペプチドは同一遺伝子座る高齢２型糖尿病患者を対象に，CGM（リプレ Pro），の第一エキソンが異なる２つのアイソフォームから翻訳

認 知 機 能 試 験（Montreal Cognitive Assessment, Al-

されていた．さらに，これらポリペプチドはアミノ酸配zheimer's Disease Assessment Scale）を登録時，１年列が全く異なるにも関わらず，どちらもミトコンドリア

後，２年後と縦断的に行い，得られた血糖変動指標と認の外膜に局在する Voltage-dependent anion channel

知機能試験スコアとの関連を解析する．副次評価項目と(VDAC) と非常に強く結合していた．VDAC は哺乳類

して，空腹時血糖値，HbAlc，診察室血圧，抑うつ・意では３種類のアイソフォーム（VDAC1～3）が存在し，欲の変化，炎症マーカーを登録時，１年後，２年後に，

VDAC3 欠損マウスは精子ミトコンドリアの形態異常に脳小血管病変の変化（MRI で評価）
，頚動脈の内中膜厚より雄性不妊になることが知られている．そこで，２つ（IMT）を登録時，２年後に，また観察期間中の心血管の新規ポリペプチドを両方欠損するマウスを作製したとイベント，腎イベントの発症をそれぞれ評価し，得られころ，顕著な雄性不妊が見られた．この変異マウス由来

た血糖変動指標もしくは認知機能試験スコアとの関連をの精子は，VDAC3 欠損精子と類似したミトコンドリア

解析する．

の形態異常を示した．次に，新規ポリペプチドをそれぞ【進捗】

れ単独で欠損したマウスを作製したところ，どちらのポ2019 年３月︲2020 年６月の間に 109 名の患者を登録

リペプチドを欠損しても受精能が低下したことから，こ成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

れらポリペプチドは VDAC を協調的に制御しているこ

マウスにおいて各薬剤投与群では組織障害の軽減，組織とが明らかとなった．

内脂質酸化の抑制，ミトコンドリア形態保持を認めた【考察】ためフェロトーシス抑制を介した臓器保護効果が示され以上の結果より，これら２つの新規ポリペプチドは，精子のミトコンドリア形成と受精能の獲得に必須の因子であることが明らかとなった．

た．
【結語】
CYP 基質薬等の脂質ペルオキシラジカルスカベン
ジャー能を有する薬剤はフェロトーシス関連病態の治療薬となる可能性が期待される．

脂質酸化依存性細胞死フェロトーシスを標的とした【文献】

腎臓病治療薬の開発

Mishima E, Sato E, Ito J, Yamada KI, Suzuki C, Oika-

三

島

英

換

（東北大学病院腎高血圧内分泌学分野）

wa Y, Matsuhashi T, Kikuchi K, Toyohara T, Suzuki
T, Ito S, Nakagawa K, Abe T. Drugs Repurposed as
Antiferroptosis Agents Suppress Organ Damage, In-【背景，目的】
フェロトーシス（Ferroptosis）は脂質酸化依存性のcluding AKI, by Functioning as Lipid Peroxyl Radical
Scavengers. J Am Soc Nephrol. 2020; 31: 280-296

プログラム細胞死である．フェロトーシスは急性組織障
害，神経変性疾患，抗癌剤感受性等への病態の関与が報告されており，脂質酸化を抑制する薬剤介入によって制御可能な細胞死でもあるためフェロトーシスの抑制は白血病を維持する腫瘍エンハンサーの検索
村

川

泰

裕

（理化学研究所生命医科学研究センター）

関連病態の治療ターゲットとなる．Cytochrome P450
(CYP) は脂溶性薬剤，外的異物やホルモンの代謝を行う酵素群であるが過去の報告から CYP の基質となる化合【目的】

物の一部が脂質酸化を抑制することが機序が不明確なが成人病の柱の一つに悪性疾患が含まれる．とりわけ白ら知られていた．これをヒントに今回我々は CYP 基質

血病は，他の悪性疾患に比べて発症年齢が若く，社会的薬をターゲットとしてフェロトーシス抑制薬の探索と同にも重大な疾病である．本研究課題では，白血病細胞を定，機序の解明，さらに組織障害保護効果について検討

維持しているゲノム転写ネットワークの解明から，病態した．

に基づいた新たな分子標的薬や予後予測バイオマーカー【方法，結果】を目指す．

培養細胞を用いたフェロトーシス誘導系において【背景】

CYP 基質薬のスクリーニングを行った結果，プロメタ

エンハンサーは，細胞種に特異的に活性化し，標的とジン（抗ヒスタミン薬），リファンピシン（抗菌薬），甲なる遺伝子の発現を増大させ，ゲノムネットワークにお状腺ホルモン，エストロゲンを始めとして臨床利用可能

ける中心的な役割を担う．申請者の所属機関で独自に開な複数の薬剤およびホルモンにフェロトーシス抑制効果発された CAGE 法は，RNA の５'末端を次世代シークエを見出した．これら薬剤の脂質酸化抑制を介するフェロ

ンサーにより網羅的に解析する技術である．活性化した

トーシス抑制機序を検討した結果，これらの薬剤は共通

機能的なエンハンサーには，RNA ポリメラーゼがリクして脂質酸化の連鎖反応に関わる脂質ペルオキシラジカ

ルートされ，エンハンサー自体から両方向性に RNA（エルに対して高いスカベンジャー能を有することを明らか

ンハンサー RNA）が合成される．従って，CAGE 法ににした．これら薬剤のフェロトーシス抑制効果はいずれよりエンハンサー RNA の５'末端を検出することで，一の細胞種（腎臓，心筋，骨格筋，神経，がん・非がん）

塩基れレベルの高塩基解像度で活性化した機能的なエンでも認め，さらに急性腎障害モデルおよび肝障害モデル

ハンサーを同定できる．しかし，エンハンサー RNA は

8成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

極めて短寿命であり，従来の CAGE 法ではエンハンサーの検出感度は極めて低かった．
【方法】

がん免疫の成立機構に関する研究
諸

石

寿

朗

（熊本大学大学院生命科学研究部）

そこで，新生鎖 RNA を回収するための生化学的分画化法を導入することで，エンハンサー RNA を超高感度に検出できる改良版 CAGE 法（NET-CAGE 法）をオリ【目的】

ジナルに開発した（Hirabayashi et al. Nature genetics

腫瘍微小環境においてはがん細胞と免疫細胞が相互作

2019）．後天的なゲノム変異などによりエンハンサーが用し，拮抗しながら腫瘍の運命を決定していく．細胞は異常に活性化することが白血病においても重要であるこ

常に自らの置かれた状況を感知し，細胞内外の環境変化とが明らかになりつつある．そこで，京都大学血液・腫に即応して増殖・分化・死などの細胞運命を適切に選択瘍内科との共同研究により，100 人の造血器悪性腫瘍のする．このメカニズムには，「細胞内シグナル伝達系」

患者検体を用いて，我々の独自技術を適用して，エンハによる環境変化に応じた細胞内プログラムの改変と，「代

ンサー解析を行った．

謝調節」による動力供給が協調して働くことが必要であ【結果】

り，その制御の中心を酵素が担う．われわれはこれまで独自解析の結果，白血病に特異的に活性化しているエの研究で，Hippo 細胞内シグナルや鉄代謝が広範な生ンハンサーおよびに未知の遺伝子などが新しく数万の単命機能に必須の役割を担うことを明らかにしてきた．そ位で同定された．そして，新規の診断マーカーや治療標

こで，本研究においては，腫瘍微小環境においてがんに的候補と考えられる分子を同定することに成功した．今対する免疫応答が成立する仕組みを Hippo シグナルや後，臨床データとも紐付けしたデータ解析や新規分子の鉄代謝の制御機構から理解することを目指している．

機能解析を行い，白血病の病因・病態の解明を目指す．

【方法】

【考察】

がん細胞における鉄代謝が腫瘍の進展に与える影響を

本研究により，エンハンサーや遺伝子から生成される

検証するため，鉄代謝動態を変化させうるマウスモデル

数万単位の新規の RNA 分子を同定できた．白血病を特[Cell Metab. 14, 339-51 (2011)] を用い，肝臓がんの徴づけている分子ネットワークが患者毎にどの程度異な進展における鉄代謝の役割を研究した．

るのか，白血病を維持していると考えられる多数の未知【結果】

RNA 分子がどのような機能をしているのか，そして新肝臓に鉄が蓄積するマウスでは，DEN による化学発

しい治療標的を実際に生み出すことが可能なのか，など

がん，および HCV トランスジェニックマウスによる遺を今後明らかにしたい．

伝的発がんの両方が，強力に促進されることがわかった．

【文献】

このマウスでは酸化ストレスによる肝細胞傷害と代償性

Hirabayashi S., Bhagat S., Matsuki Y., Takegamiの細胞増殖，炎症が起きており，これががんの進展に寄Y., Uehata T., Kanemaru A., Itoh M., Shirakawa

与することが RNA シーケンス解析等で明らかになった．

K., Takaori-Kondo A., Takeuchi O., Carninci P.,

さらに，鉄代謝の適正な是正により，肝臓がんの進行がKatayama S., Hayashizaki Y., Kere J., Kawaji H.,抑制されることも見出した．

Murakawa Y. NET-CAGE Characterizes Dynamics【考察】and Topology of Human Transcribed Cis-regulatory

ヒトの肝臓がん患者においても鉄代謝異常が肝臓がん

Elements. Nature Genetics, 51 (9): 1369-1379 (2019)の増悪因子となることが示唆されたことから，これらの分子機能を是正する薬剤の開発は，肝臓がん進展の予防薬となることが期待される．そこで，本研究内容の継続
課題として，これらの分子機能を制御する薬剤のスクリーニングや，さらに広義には，新規の鉄代謝関連分子9成人病の病因・病態の解明に関する研究助成の発見や鉄量を変化させる薬剤の開発なども，肝臓がん

この細胞増殖の停止は ATP 不足ではなく，ピリミジンの進展予防に重要であると考えられる．

ヌクレオチドの不足が原因であることが示唆されてい【文献】

る．このミトコンドリア不足の状態では，G1/S 期で細*Muto, Y., *Moroishi, T., Ichihara, K., Nishiyama,

胞周期を停止させる，GADD45A の発現が誘導される

M., Shimizu, H., Eguchi, H., Moriya, K., Koike, K.,ので，この因子を介して細胞周期が停止している可能性

Mimori, K., Mori, M., Katayama, Y., and Nakayama,がある．興味深いことに，thymidine によって細胞周期

K.I. Disruption of FBXL5-mediated cellular ironを G1/S 期に停止させた場合には，ミトコンドリア増殖

homeostasis promotes liver carcinogenesis. J. Exp.

が誘導される．このことから，細胞はミトコンドリア量Med. 216, 950-965 (2019). [*Equal contribution]が不十分な場合には，細胞周期を一度停止させ，ミトコ
ンドリア量が十分になるまで増殖させた後に，再び，細オルガネラ量の恒常性を司る仕組みの研究
柳谷

耕

胞周期を再開する，ミトコンドリア量チェックポイントを細胞は備えている可能性があるのではないかと，私は太考えている．

（九州大学生体防御医学研究所）【将来の展望】
オルガネラ減少法を用いて，オルガネラ不足に対する【目的】

細胞応答の根底原理を明らかにする．

真核生物において，好気呼吸による ATP の合成や細胞外へのタンパク質分泌，脂質の代謝などの細胞の生命機能に必須な反応は，ミトコンドリアや小胞体，ペルオ
キシソームなどのオルガネラで分担して遂行される．哺
乳類を含む高等動物においては，同じ種類の細胞間で甲状腺ホルモン脱ヨード酵素を標的とした脂質・エネルギー代謝促進薬の開発
山

内

一

郎
（京都大学大学院医学研究科）

は，各オルガネラの量は驚くほど類似している．例えば，小胞体で大量の抗体を合成する形質細胞では，どの細胞も一様に，著しく発達した小胞体を備えている．一【目的】

方，ATP の消費が著しい心筋細胞細胞では，ミトコン

甲状腺ホルモンは，LDL コレステロール低下作用やドリアが一様に大量に増殖している．これらの事実は，エネルギー代謝促進による抗肥満作用を有する．甲状それぞれの種類の細胞に，オルガネラ量の正常範囲があ腺ホルモン脱ヨード酵素には，１型（D1），２型（D2），り，この範囲を逸脱した場合に，そのオルガネラ量を正

３型（D3）の３種類があり，それぞれ臓器毎に分布が常範囲に戻す恒常性維持機構が存在することを示唆して異なっている．我々はこれらの発現制御により臓器特異いる．しかし，オルガネラ量の恒常性維持機構は，その的な甲状腺ホルモン作用調節を可能とし，治療へ応用す存在が示唆されているにも関らず，十分には研究されてることを目指している．

いない．本研究では，申請者が，これまでの研究で開発

2018 年度は，プロモーターアッセイを基盤としたハしたオルガネラ量を人為的に減少させる技術（オルガネイスループットな系を開発し，臨床応用されている薬剤

ラ減少法）を活用して，オルガネラ量の恒常性のなかでのライブラリー（2560 種類）を用いたスクリーニング

も，特に，オルガネラ不足に対する細胞応答の解明を目を実施した．正と負に制御するものについてそれぞれ，指した．

D1 は６個，５個，D2 は 34 個，５個，D3 は５個，２個【結果・考察】のヒット化合物が得られた．

ミトコンドリアに対するオルガネラ減少法，ミトコン

2019 年度は，ヒット化合物が生体作用を示すかを検

ドリア減少法を用いて，培養細胞をミトコンドリア不足

証するにあたり，患者コホートを構築し，各ヒット化合状態にすると，細胞の増殖が停止することを見出した．

物の内服前後での変化をレトロスペクティブに解析し80

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成た．これは臨床応用されている化合物のライブラリーを

マウスを作成し，脂肪細胞 NAMPT-NAD＋ 合成系が，用いるが故に可能な新手法である．

全身のインスリン抵抗性・エネルギー代謝を制御する事【方法】

を報告した (PNAS 2019, Cell Rep 2016)．

2005 年から 2018 年の期間に京都大学医学部附属病さらに，２型糖尿病に代表される代謝疾患において

院糖尿病・内分泌・栄養内科に通院歴があり，甲状腺機NAMPT の 酵 素 反 応 産 物 で あ る NMN (nicotinamide能を測定されていた患者を電子カルテシステムで検索しmononucleotide）などの NAD＋中間代謝産物が主要代た．次いで検証するヒット化合物の内服開始前後３ヶ月

謝臓器の NAD＋ 量を回復し，病態を改善することも報以内に甲状腺機能を測定された患者データのみを抽出

告されている（図１）．

し，甲状腺機能を修飾する疾患や治療歴を有する症例を

近年申請者の研究室では，高脂肪食により生じる腸管

除外して，解析するコホートを構築した（京都大学医のの炎症が，脂肪組織の炎症に伴うインスリン抵抗性発症

倫理委員会承認済）．

に先行することを見出し（Cell Metab 2016），代謝疾【結果・考察】

患発症における腸管の重要性を報告している．以上の知既知の D2 発現を増加させる化合物であるアドレナリン受容体作動薬について，化合物Ａ内服後に TSH 低下と fT3/fT4 比上昇が認められた．次に未報告のクラスについて，D2 発現を増加させる化合物Ｂ内服後に fT3 上昇，D2 発現を減少させる化合物Ｃ内服後に fT3/fT4 比低下が見られた．これらは D2 活性の変化として矛盾しない結果であった．現在 D1, D3 についても検証を進めている．
このようにコホート研究により生体作用が確認された化合物について，標的臓器における甲状腺ホルモン脱ヨード酵素の変化が実際に生じていることを確認するた
め，マウスへの投与実験を準備中である．
図１
腸管 NAMPT-NAD＋合成系を標的とした NAD＋中哺乳類 NAD 合成系および代謝疾患制御（生化学

第87巻２号239-244, 2015山口ら, 改）間代謝産物 NMN によるインスリン抵抗性発症予防法の開究研究山口慎太郎（慶應義塾大学医学部）【目的】
哺乳類 NAD＋(nicotinamide adenine dinucleotide）
合成系の鍵酵素である NAMPT (nicotinamide phosphoribosyltransferase) は環境・栄養状態に応答することで NAD＋量を調節し，サーチュインに代表される NAD＋

消費酵素を介して代謝，老化などの生物学的な多彩な局面で重要な役割を果たすことが明らかにされてきた．
実際に，申請者は脂肪細胞特異的 Nampt ノックアウト

8成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

見を元に，２型糖尿病の先制的な発症予防法を確立するために，腸管の NAMPT-NAD＋合成系に着目した．
【方法・結果】①高脂肪食負荷による腸管 NAMPT-NAD＋合成系の評価
C57BL/6J オスマウスに高脂肪食負荷を８週間行った
ところ，随時血糖は上昇し，通常食群と比較して小腸・大腸 Nampt 発現量が有意に低下した（Fig. 1）．
①腸管 NAMPT-NAD＋合成系の糖代謝における役割の検討
腸管上皮細胞特異的 Nampt ノックアウト（KO）マウスを新規に作成した．通常食投与下において，対照群および KO 群を用いて，インスリン抵抗性および糖代謝の評価を行った．インスリン腹腔内投与試験およびブドウ糖腹腔内投与試験での血糖値の変化には２群間で有意な差は認めなかったが，経口ブドウ糖負荷試験では，KO群で有意な血糖値の上昇を呈した．そこで，インクレチ
ン GLP-1 の前駆体，回腸 Proglucagon 発現量を評価したところ KO 群で有意な低下を認めた．
【考察】
腸管上皮細胞 NAMPT-NAD＋合成系は，インクレチン分泌を制御する可能性が示唆された（論文投稿準備中）．

82

研究報告

Vascular
Vascular Biology
Biology Innovationに関する研究助成
Innovationに関する研究助成

アルドステロン過剰におけるアルカローシス依存性の Pendrin 制御機構の解析
鮎

澤

信

宏

（東京大学先端科学技術研究センター）

性代謝性アルカローシスによる Pendrin 制御は外因性のアルカリ負荷時に働くαKG-GPR99 経路とは異なる機序により起こることが示唆された．なお最近，アルカリ負荷時には pH センサー分子を介した経路による
Pendrin 制御も起こることが報告されており，今後同分子による経路がアルドステロン過剰時の低Ｋ血症性代謝【目的】
腎皮質集合管のβ-間在細胞に発現する Pendrin は当性アルカローシスによる Pendrin 制御に関与しているか検討する予定である．

初塩基排泄を担う因子として発見されたが，昨今レニン【文献】-アンジオテンシン-アルドステロン系による調節を受け

１）Ayuzawa, N., et al .: Two Mineralocorticoidて NaCl 再吸収に働き血圧調節に関与することが明らか

Receptor-Mediated Mechanisms of Pendrin Ac-となった．最近我々は，１次性のアルドステロン過剰時

tivation in Distal Nephrons, J Am Soc Nephrol.,には，集合管主細胞の MR-ENaC 経路の活性化により

31, 748-764 (2020).

起こる低Ｋ血症性代謝性アルカローシスが Pendrin を活性化し食塩感受性高血圧の形成に寄与することを報
告した１）．一方，外因性のアルカリ負荷時には尿中α免疫学的介入に基づく循環器病に対する新規治療法

ケトグルタル酸（αKG）が増加し，その受容体であるの開発

GPR99 を介して Pendrin が活性化して塩基排泄に働く

安ことが報告された．そこで今回，アルドステロン過剰時

西淳（慶應義塾大学医学部）

や低Ｋ血症性代謝性アルカローシス誘導時の尿中αKGの変化につき検討した．
【方法と結果】

心筋梗塞（MI）に対する再灌流療法の発達は急性期死亡率を劇的に低下させたが，重症例の救命によって梗

マウスに高食塩食・アルドステロン投与を行ったとこ

塞後左室リモデリングによる慢性心不全の有病率をむ

ろ低Ｋ血症性代謝性アルカローシスを呈し，腎においてしろ増加させるというパラドックスを生んだ．MI 後組

高度の Pendrin の発現量増加と管腔側膜上への集積を

織修復の過程には免疫応答の賦活化とそれに付随した炎認めたが，尿中αKG に変化は見られなかった．一方，症反応が不可欠であるが，これらが一度過剰になるとか

マウスに重曹投与による外因性アルカリ負荷を行うと，えって組織障害を進展させ，梗塞後心不全を増悪させて尿中αKG の著明な増加を認め，中程度の Pendrin 発現

しまう．MI 後に免疫応答や炎症反応が過剰となる機序

量増加と管腔側膜上集積を認めた．他方，重曹投与に低は未だ不明であり，これらが明らかとなれば，新たな治Ｋ食投与を加えて低Ｋ血症を起こし，より高度のアルカ

療標的となり得ると考えられる．申請者はマウス MI モ

ローシスを生じさせたところ経口重曹投与時に比べて

デルを用いて網羅的遺伝子解析を行い，梗塞部で遺伝子

Pendrin 変化は増強したが，この際に尿中αKG は重曹

Ｘが上昇していることを見出した．Ｘはマイトジェン誘投与単独時に比べて増加しなかった．

導性遺伝子で，細胞増殖・生存などに関与することが白【考察】血病などの悪性腫瘍における研究で知られているもの

以上の結果から，アルドステロン過剰時の低Ｋ血症の，MI を含めた心血管疾患におけるＸの役割は全く知8Vascular Biology Innovation に関する研究助成られていない．

【方法】

本研究では MI 後組織修復の過程におけるＸの役割をラット単離培養心筋細胞においてロキサデュスタット

明らかにするために，Ｘのノックアウトマウス，X-GFPが代謝変化を誘導するかを Flux Analyzer (XFp) を用い

レポーターマウス，さらに X-ﬂox マウスを用いる．こて検証した．さらに C57BL/6J マウスにおいてロキサ

れらの遺伝子改変マウスは，in vivo でのＸの役割を明

デュスタットの事前投与が虚血再灌流傷害（45 分虚血，らかにするための強力なツールである．申請者はこれま

６時間再灌流）を抑制し得るかを検証した．

でに，１）Ｘのフルノックアウトマウスでは MI 後の生【結果】

存率や心機能が改善すること，２）Ｘのフルノックアウ

XFp による解析では単離培養心筋細胞においてロキ

トマウスでは，過剰な炎症に寄与する Ly6Chigh 単球のサデュスタット添加（25μM）により有意な Extracel-

浸潤が顕著に抑制されること，３）Ｘの発現細胞として

lular Acidiﬁcation Rate (ECAR) の増加を認め，Oxy-

心臓間質細胞が重要であり，Ly6Chigh 単球の遊走因子でgen Consumption Rate (OCR) の低下を認めた．次にある CCL2/CCL7 の強力な産生源であること，
４）MI 後，ロキサデュスタットを虚血再灌流モデル作成４時間前にＸの発現が上昇するにも関わらず，従来Ｘの下流の分子単回投与（25 mg /kg /回，皮下注射）したところ，虚血として知られる遺伝子群の発現に大きな変化を認めな

再灌流モデルにおける梗塞巣は有意に縮小し，血中のクかったこと，などを見出しており，今後心臓間質細胞とレアチニンキナーゼおよび虚血部位の TUNEL 陽性細胞

骨髄由来炎症細胞のクロストーク，およびＸの下流に位を有意に抑制した．

置する未知のカスケードの解明に主眼を置き，Ｘが MI【考察】

後の過剰な炎症を増悪させ，新たな治療標的となり得るという仮説を検証していく．

本研究は Hif-1αによる低酸素応答を介した虚血耐性を新規 PHD 阻害剤であるロキサデュスタットを用いて薬理学的に再現し，その虚血再灌流傷害の抑制効果を薬理学的なミトコンドリア機能制御を介した新たな虚血再灌流傷害に対する治療法の確立
池

田

昌

隆

明らかにした．この主たる分子機序は低酸素応答の一つである酸素代謝の変化による虚血耐性であると考えられるが，Hif-1αは数百の遺伝子を制御する転写因子であることから，実際には代謝変化を含めた複数の分子機（九州大学大学院医学研究院）

序により虚血耐性が誘導されたものと推測される．心筋
代謝を嫌気性代謝に移行させることで虚血中の ATP 産【目的】

生を維持することで虚血傷害を軽減したと考えられる

Ischemic preconditioning (IPC) は事前の一時的な心が，一方で好気性代謝を抑えることで虚血中の組織酸素

筋虚血の誘導によりその後の虚血再灌流傷害が減少する

濃度を維持し，また再灌流時の活性酸素産生を抑制した現象であり，IPC から発展した遠隔部位の一過性虚血にことも，虚血再灌流傷害の軽減に寄与したと考えられたより誘導される remote IPC (RIPC) は虚血再灌流傷害（Deguchi and Ikeda et al., Circ J 2020）．

を予防し得るとして長らく臨床への応用が期待されてき【文献】

た１）．しかしながら，近年報告された２つの大規模臨床

１）Hausenloy DJ, Mwamure PK, Venugopal V, Har-

試験では待機的 CABG における RIPC の有効性は確認

ris J, Barnard M, Grundy E, et al. Eﬀect of re-

されず ２－３），IPC を利用した新たな治療戦略の確立がmote ischaemic preconditioning on myocardial

求められてる．本研究では，Hif-1αが好気性代謝から

injury in patients undergoing coronary artery

嫌気性代謝に metabolic shift を誘導することに着目し，bypass graft surgery: a randomised controlled

新規 PHD 阻害薬であるロキサデュスタットを用いるこ

trial. The Lancet. 2007; 370: 575-9.

とで Hif-1αを介した薬理学的な IPC の再現により心筋
虚血再灌流傷害を抑制し得るかを検討した．

8２）Hausenloy DJ, Candilio L, Evans R, Ariti C,
Jenkins DP, Kolvekar S, et al. Remote IschemicVascular Biology Innovation に関する研究助成

Preconditioning and Outcomes of Cardiac Sur-

ソソームの分解活性を測定する蛍光プローブの新規開発

gery. N Engl J Med. 2015; 373: 1408-17.

にも取り組み，新規リソソーム活性測定用蛍光タンパク

３）Meybohm P, Bein B, Brosteanu O, Cremer J,

質ブローブの開発にも成功した２）．

Gruenewald M, Stoppe C, et al. A Multicenter【文献】

Trial of Remote Ischemic Preconditioning

１）Itakura E*, Chiba M, Murata T, Matsuura A.

for Heart Surgery. N Engl J Med. 2015; 373:(*single corresponding author) Heparan sulfate

1397-407.

is a clearance receptor for aberrant extracellular
proteins. J Cell Biol. 2020 Mar 2; 219 (3). pii:

血液中異常タンパク質の分解経路の研究
板

倉

英

祐

e201911126
２）Ishii S, Matsuura A, Itakura E. Identiﬁcation ofa factor controlling lysosomal homeostasis using（千葉大学大学院理学研究院）

a novel lysosomal trafficking probe. Sci Rep.
2019 Aug 12; 9 (1): 11635【目的】
血液には高濃度のタンパク質が循環している．しかし血液中（細胞外）のタンパク質の品質管理システムはよ
くわかっていない．そこで，細胞外シャペロンが細胞外臓器特異的なペリサイトの機能解析
加

藤

勝

洋
（名古屋大学医学部附属病院）の変性タンパク質をリソソームへ運び分解するシステムがあると仮説した．
【方法】

【目的】

細胞外タンパク質分解に関する因子として細胞外毛細血管の内腔は一層の血管内皮細胞で覆われておシ ャ ペ ロ ン の 一 つ Clusterin に 着 目 し た． 精 製 し たり，そのすぐ外側にペリサイトが内皮細胞と基底膜を共Clusterin タンパク質（赤色蛍光と融合）を変性タンパ

有して存在している．私は，脳，肺，心臓，網膜，脂肪ク質とともに培養培地へ添加し，培養細胞に Clusterin-に存在するペリサイトを単離し，いくつかの液性因子の変性タンパク質が取り込まれると赤色蛍光が蓄積する実発現を検証すると，血管内皮細胞と同様にペリサイトに験システムを構築した．

おいても液性因子の発現パターンが臓器特異的であるこ【結果】とを示唆する結果を得た．この結果から，ペリサイトも変性タンパク質は Clusterin と複合体を形成し，細アンジオクライン因子を介して臓器特異的な生理現象を

胞 内 に 取 込 み 分 解 さ れ る こ と が わ か っ た． さ ら に調節している可能性が示唆される．これらの組織の中で，Clusterin-変性タンパク質複合体を認識する細胞膜上の本研究では，脂肪に存在するペリサイトに注目して機能受容体の網羅的遺伝子スクリーニングをした．
その結果，を理解することを目的とする．

ヘパラン硫酸受容体が Clusterin-変性タンパク質の細胞【方法】

膜表面受容体となっていることを見出した．
【考察】

褐色脂肪組織において，ペリサイトのマーカーの１つである PDGFRβのプロモーター下に特異的に Cre を発

今回の研究から血液中（細胞外）の異常タンパク質を現誘導可能なマウス系統（Pdgfrb-CreERT2) とレポー

選択的に分解するタンパク質品質管理システムが存在す

ターマウスを用いて，免疫染色法にて細胞の局在およびることを世界で初めて明らかとした１）．この選択的な分形態観察を行った．さらに細胞系譜追跡実験を行い，新解システムのより詳細な分子機構や，基質選択性など，

生仔から成体になる脂肪新生過程での動態を解析した．

この分野を拡張発展していく礎となる成果を導けた．ま【結果】たリソソームタンパク質分解の研究を促進するため，リPdgfrb-CreERT2 マ ウ ス 系 統 と 蛍 光 蛋 白 質 で あ る

8Vascular Biology Innovation に関する研究助成

GFP を発現するレポーターマウスを組み合わせること

検体（n ＝ 172）のうち，AAV の寛解導入療法開始前で血管周囲細胞に対して新生仔から成体である８週齢まと開始後６か月の血清サンプルが取得できた 57 人をで細胞系譜実験を行うと，褐色脂肪細胞の４分の１が新対象とし，血中 VEGF-A (sVEGF-A) 及び VEGF-A165b

生仔の時の血管周囲細胞由来であることが明らかとなっ(sVEGF-A165b) 濃度を測定した．

た．さらに，その細胞周辺の脂肪細胞は，脱共役タンパ【結果】

ク質（UCP1）の発現が亢進していることを見出した．

AAV は，好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（EGPA），
多発血管炎性肉芽腫症（GPA），顕微鏡的多発血管炎【考察】
本研究により，脂肪新生過程において褐色脂肪組織に（MPA） の ３ 疾 患 に 大 別 す る こ と が で き る． そこで，存在する血管周囲細胞から脂肪細胞に分化することが明

RemIT-JAV-RPGN 登録検体を用いて寛解導入療法前

らかとなった．さらに興味深いことに，血管周囲細胞由後での sVEGF-A 及び sVEGF-A165b の濃度変化につい来脂肪細胞の周囲で熱産生効率が高いことが示唆されて AAV サブタイプ毎に評価した．その結果，MPA 患た．今後さらに血管周囲細胞から分化する脂肪細胞の褐者 で は，sVEGF-A (p＜0.001) が，EGPA 患 者 で は，色脂肪組織における生理的意義を明らかにしていく予定

sVEGF-A165b (p ＝ 0.023) が寛解導入療法前後で有意である．

な減少が認められた．その一方で，GPA 患者における【文献】

治療６か月後の sVEGF-A および sVEGF-A165b 濃度はKato K, Diéguez-Hurtado R, Park DY, Hong SP,

治療前と同等のレベルにもかかわらず，相関分析から

Kato-Azuma S, Adams S, Stehling M, Trappmann

sVEGF-A および sVEGF-A165b は寛解までの日数と負B, Wrana JL, Koh GY, Adams RH.: Pulmonary peri-の相関があることが明らかになった（r ＝－0.67, p ＝cytes regulate lung morphogenesis. Nat Commun. 9:

0.046 および r ＝－0.78, p ＝ 0.014）．

2448. (2018)【考察】
今回の我々の結果から，sVEGF-A 及び sVEGF-A165b
は GPA 症例での寛解導入療法による寛解までの日数をVEGF-A の質に着目した ANCA 関連血管炎の治評価できる有用なマーカーとなる可能性が示唆された．

療効果評価に寄与する評価法構築に向けて
菊

地

良

介
（名古屋大学医学部附属病院）【目的】

新規単球サブセットによる高次血管ネットワークの編成機構の解明木戸屋浩康（大阪大学微生物病研究所）

抗好中球細胞質抗体（ANCA）関連血管炎（AAV）には，寛解導入療法後の予後を予測するための効果的なマーカーの開発が求められている．本研究は，血管内皮細胞【目的】

成長因子（VEGF-A）の質に着目し，AAV の治療効果

腫瘍組織の隅々にまで張り巡らされた血管ネットワーを評価するために，AAV 患者での寛解導入療法前後のクは，酸素や栄養分を供給することで腫瘍の増大に働い

VEGF-A と抗血管新生因子（VEGF-A165b）の血中濃度ている．腫瘍血管の形成は主に血管新生と呼ばれる過程

変化と寛解までの日数との関連について評価することをによって進められるため，血管新生の抑制による「兵糧目的とする．

攻め」のコンセプトに基づく癌治療法の開発が進められ【方法】てきた．その結果，VEGF 阻害剤を始めとする血管新生

AAV を有する日本人患者の寛解導入療法前向きコ阻害剤が臨床で使用されているが，期待に反して単独で

ホ ー ト 研 究（RemIT-JAV-RPGN） に 登 録 さ れ た 患 者

使用した場合にはほとんど抗腫瘍効果を示さなかった．

8

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

しかしながら，腫瘍増殖における血管系の重要性は疑い

一細胞解析と ｉｎ ｖｉｖｏ CRISPR/Cas9 システムのようが無く，血管新生阻害剤が効果的でない理由は未解融合による心不全リプログラミング因子スクリーニ

明のまま残されている．本研究では，血管新生阻害剤にング

対する治療抵抗性を創出されるメカニズムの解明を目的

候とし，生体内イメージング解析を基軸とした解析を進め聡志（東京大学大学院医学系研究科）

た．
【方法および結果】
腫瘍組織中における血管形成過程を時空間的に明【背景・目的】らかにするため，血管イメージングマウス（Apelin-

心臓は様々な細胞集団によって構成され，その恒常性

TdTomato BAC Tg）の大脳表層部にグリオーマ細胞をの破綻は心不全をもたらす．本研究に関連して，申請者

同所移植し，多光子共焦点レーザー顕微鏡にて撮影を

らは昨年度，心筋細胞や非心筋細胞を用いた一細胞解析行った．その結果，血管新生阻害剤の投与は新たな血管を通して，以下のような成果を得た．

の形成を抑制する一方で，腫瘍組織中の残存血管の構造①変化が誘導されることで，腫瘍増殖が再開していること

筋 DNA 傷害の程度が心不全患者の臨床的予後・治療応が明らかとなった．そこで，この血管構造変化の制御機

答性を規定していることが分かり，治療前心筋生検組織

構を明らかにするため，血管新生阻害剤投与後の腫瘍組の DNA 傷害マーカーの染色によってこれらを高精度に織に起きる変化を検討したところ，特殊なミエロイド系

予測可能である１,２）．

心不全患者の心筋一細胞 RNA-seq 解析により，心細胞サブセット（血管制御ミエロイドと命名）が関与していることを発見した．シングルセル遺伝子発現解析を行うと，腫瘍随伴マクロファージや骨髄由来抑制細胞とは異なる新たな細胞集団であることが明らかとなった．
さらに，血管制御ミエロイドから産生されて血管再分布の誘導に関わると予測される幾つかの分子を同定した．
現在は，これら分子の阻害によって血管新生阻害剤による抗腫瘍効果が改善されるかの検討を進めている．

②

心不全モデルマウスの一細胞 RNA-seq 解析によ【考察】り，線維芽細胞における機能未知なプロテアーゼである

明確なコンセプトに基づく「腫瘍血管を標的としたがHtrA3 を同定した．HtrA3 は TGFβ1 の分解を介してん治療法」は，従来の抗がん剤と比較して副作用が少な

TGFβシグナルを制御することで，線維芽細胞のみならいことからも大きな期待を受けていた．しかしながら，ず，間接的に心筋細胞にも影響してその線維化形質やVEGF 阻害剤による治療効果が振るわなかったため，現DNA 損傷応答を制御する (Ko et al. in preparation)．

在ではがん研究の主軸からは外れてしまっている．本研
究で提示された血管新生阻害剤への治療抵抗機構の実態
は，我々の想定を超えたものであり，途絶えていた「腫瘍血管を標的としたがん治療法」の実現に繋がるものと期待できる．
このように一細胞 RNA-seq 解析によって心不全の治療ターゲットとなり得る多くの機能的因子が同定される．近年 in vitro レベルで盛んに研究されている
Perturb-seq の実験系は Cas9 発現細胞に各種 gRNA ラ

8

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

イブラリーを加えて一細胞レベルで様々な遺伝子欠損

Ko T, Yamaguchi T, Tobita T, Naito AT, Ito M,を生じさせ，その結果生じる Transcriptome の変化を

Fujita K, Harada M, Toko H, Kobayashi Y, Ito K,

RNA-seq でハイスループットに調べるものだが，本研

Takimoto E, Akazawa H, Morita H, Aburatani

究ではこれを in vivo で行うことを目的としている．

H, Komuro I. Cardiomyocyte gene programs en-【方法・結果】

coding morphological and functional signatures

dCas9-KRAB-MeCP2 コンストラクトを含む ﬂox マ
ウ ス を 作 成 し， こ れ を 心 筋 細 胞 特 異 的 な aMHC-Cre

in cardiac hypertrophy and failure. Nat Com-mun. 9 (1), 4435 (2018).

マウスと交配させて心筋細胞特異的に dCas9-KRAB-

２）Ko T, Fujita K, Nomura S, Uemura Y, Yamada

MeCP2 が発現するマウス系統を樹立した．その心臓かS, Tobita T, Katoh M, Satoh M, Ito M, Domoto

ら心筋細胞，非心筋細胞を単離して cDNA ライブラリー

Y, Hosoya Y, Amiya E, Hatano M, Morita H,

を作成して解析した結果，確かに心筋細胞でのみ目的の

Fukayama M, Aburatani H, Komuro I. Quantiﬁ-

dCas9 コンストラクトが発現していることが確認されcation of DNA damage in heart tissue as a novel

た． ま た，dCas9-KRAB-MeCP2 に 作 用 す る gRNA はprediction tool for therapeutic prognosis of pa-

AAV9 ベクターに搭載して心臓に導入する予定だが，予tients with dilated cardiomyopathy. JACC Basic

備実験の結果，AAV9 注射後 2 ～ 3 週目に最も遺伝子Transl Sci. 4 (6), 670-680 (2019).

導入効率が高いことが分かった．

ヒト血管内皮コロニー形成細胞の細胞小胞を介した網膜神経血管保護作用
崎元晋（大阪大学大学院医学系研究科）

【目的】
【考察】

血 管 内 皮 コ ロ ニ ー 形 成 細 胞（Endothelial colony-

以上のように in vivo Perturb-seq の準備が順調に進

forming cells: ECFCs）は，血管内皮前駆細胞（EPC）

行しつつあるが，将来的に成獣マウスの心筋細胞に各種の分画のひとつで，臨床での細胞治療に用いる自家血

gRNA を導入したとしても，細胞サイズの関係でそれを管内皮細胞のソースとして注目を集めている (Nature

FACS で回収することが困難なことが予想される．現在

Biotechnology 2014, Cell Stem Cell 2014)．ECFC のは新生児マウスに AAV9 ベクターを腹腔内注射投与すパラクライン作用による血管再生メカニズムに関してることで，同様に gRNA の導入が可能か検証中である．

は，ほとんど報告がされていなかった．申請者らの目的もし新生児の段階で投与して 2 週後程度で細胞をサン

は，ECFC による虚血性網膜症による ECFC のパラクプリングできれば，大口径ノズルの FACS を用いること

ライン作用を明らかにすることである．特に近年，細胞で細胞 sorting を行うことができ，効率よく gRNA 導入

間伝達の重要な因子としてエクソソームやマイクロベジ

心筋を回収することができる．今年度は実際に心筋細胞

クルに代表される細胞外小胞（Extracellular vesicles:の一細胞解析や心筋症ゲノム解析の結果を基に作成したEVs）が注目されている．ECFC に関しては，細胞由来

AAV9-gRNA ライブラリーをマウスへの投与し，解析をの EV 中の miRNA が腎虚血障害に対する治療効果があ

進めていきたい．

ることが報告されている（Vinas et al. Kid Int 2016）【文献】

が，その他のメカニズムについてはほとんどわかってい１）Nomura S, Satoh M, Fujita T, Higo T, Sumida T,

ない．

88

Vascular Biology Innovation に関する研究助成【方法】
EV は 48 時間培養し 0.22um のフィルターを通した
のち，10kDa の MWCO 系を用いて超遠心 (4000 x g,
45min) を行ったのち，サイズ排除クロマトグラフィーを行った．BCA タンパク質アッセイを用い，可溶性
タンパクの少ない EV の濃縮に適した溶出分画を決定し，それらの EV サンプルを UF-SEC-UF-1-EV (Serial
ultrafiltration (UF), size exclusion chromatography(SEC) extracellular vesicle) サンプルとし，残りの分画に再度同様に超遠心，アッセイを行い，得られた EV サ
ンプルを UF-SEC-UF-2-EV とした．上記方法を用いてCD-XXhi および CD-XXlo の ECFC から EV を単離し，虚血性網膜症モデルである酸素誘導性網膜症（Oxygen
induced Retinopathy: OIR）モデルおよび網膜視細胞
変性モデルマウス（RD10 マウス）に注射し，虚血およ

図１

び新生血管の改善および神経保護効果を検討した．
【結果】
EV に対する透過型電子顕微鏡所見では，UC-EV に比 較 し，UF-SEC-UF-1-EV お よ び UF-SEC-UF-2-EV
では巨大タンパクの凝集がみられなかった（図２およ図２び赤矢印，バーは 0.2um）．また，NTA 計測においても UF-SEC-UF は UC に 比 較 し て 有 意 に 多 く の EV が
認 め ら れ た． 生 後（P） ７ 日 か ら マ ウ ス 仔 を 75% 酸
素チャンバーで５日間飼育する OIR モデルにおいて，P12 に CD-XXhi よ り 分 離 さ れ た EV (CD-XXhi-EV)
お よ び CD-XXlo-EV を 硝 子 体 注 射 し た と こ ろ，CD-

図3

XXhi-EV は CD-XXlo-EV に 比 較 し て， 有 意 に 新 生 血
管 (neovascularization) の退縮効果および虚血 (Vasoobliteration) の 改 善 効 果 が 認 め ら れ た ( 図 ３)．RD10
マウスにおいても視細胞層の厚みが保たれており，神経保護効果が認められた（図４, ５）．
【考察】
UF-SEC-UF を用いた EV の単離は有効であり，ECFC

図４

由来の EV は虚血の改善効果を示し，今後のサブグルー
プの解析が可能であることをしめした．

図589

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

神経-免疫ネットワークを介して高血圧の臓器障害を抑制するニューロモデュレーション治療の開発
朔啓

Therapy Strikingly Attenuates Blood Pressure
Variability in Hypertensive Rats With Impaired
Baroreceptor. Hypertension . 75 ( 3 ) : 885-892(2020).

太（国立循環器病研究センター）３）Shinoda M et al.: Suppressed baroreﬂex peripheral arc overwhelms augmented neural arc and【目的】
本研究は，高血圧における電気的ニューロモデュレー
ションの効果を検証することを目的としている．

incapacitates baroreflex function in rats withpulmonary arterial hypertension. Exp Physiol.
104 (8): 1164-1178. (2019).

【方法】
神経刺激装置の確立に平行し，ダール食塩負荷ラットの確立と電気刺激に先行し同ラットにおける薬物的副交感神経活性化の効果を検証した．６週令のダール

心不全におけるΩ６脂肪酸リノール酸の役割
髙

田

真

吾
（北翔大学生涯スポーツ学部）

食塩負荷ラット（N ＝ 10）を用い，血圧測定を行いながら，生存率を観察した．また，別のダール食塩負荷
ラット（N ＝ 10）において，ドネペジル塩酸塩経口投与（5mg /kg /day を 14 週令より投与）による血圧およ【目的】
心不全を予防・治療できる「バランスの取れた食事」

び心不全進展，生存率への影響を検証した．

の確立・開発のために，心不全患者における実際の食事【結果】

構成やそれに関与する分子機序の特定を再検討する必要

ダール食塩負荷ラットは６週令より塩分負荷を行うこがある１）．現在，心不全患者の食事（療法）に関しては，とで，血圧上昇を認め，12 週令で定常となった．17 週

水分と塩分の制限のみが推奨されている．一方，必須栄令までの観察期間で 10 匹中５匹が死亡し，全てのラッ養素の一つである脂肪は分解され，脂肪酸としてエネル

トで 14 週令以降に左室短縮率の低下を認めた．また，

ギー基質や膜成分としての役割をもつ．特に，必須脂肪14 週令からのドネペジル塩酸塩投与では，血圧，心エ酸であるオメガ（Ω）６脂肪酸のリノール酸（18：2）

コー所見および生存率を改善させない一方で，活動性低は，ミトコンドリア特有のリン脂質であるカルジオリピ

下による体重減少を認めた．

ンの主要成分となる．カルジオリピンはミトコンドリア【考察】

膜に存在し，酸化的リン酸化（OXPHOS）複合体の構

ダール食塩負荷ラットの心不全進展を確認した．ドネ

造的な安定化に関与し，カルジオリピンレベルの低下は

ペジルは，ダール食塩負荷ラットでは明らかな心不全改

ミトコンドリア OXPHOS 複合体の合成低下を促進する

善を認めず，投与タイミングや容量に最適化が必要でが，食事によるリノール酸の摂取がこれらの複合体の会あった．今後，迷走神経刺激装置を同モデルに用いる場

合と心機能障害を改善できるかは不明である．

合においても，心不全前期からの介入が必要であると考【方法および結果】

えられた．
【文献】
研究推進の過程で得られた知見を基に以下の論文報告

NYHA III の心不全患者（n ＝ 15）は，NYHA II の心不全患者（n ＝ 93）と比較して，食事によるリノール酸の摂取量が少なく，一方で，他の脂肪酸摂取量にはを行った．

差がなかった２）．心筋梗塞後心不全モデルマウスにおけ１）Deguchi H et al.: Roxadustat Markedly Reduces

る心筋ミトコンドリア機能（Oroboros, Oxygraph-2k）

Myocardial Ischemia Reperfusion Injury inと同様に，単離ミトコンドリア当たりのカルジオリピ

Mice. Circ J. 84 (6): 1028-1033 (2020).

ン（質量分析）は減少した．心筋培養細胞におけるカル

２）Tohyama T et al.: Smart Baroreceptor Activation

90

ジオリピン合成酵素（Crls1）の欠損はミトコンドリア

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

超複合体（complex I/III2/IV 複合体など）の会合（BN-e8707, 2013.

PAGE），ならびに complex II サブユニット複合体の会合を低下し，それらはカルジオリピン量と有意に相関した．
そこで，心不全マウスへの食餌によるリノール酸の投与
はミトコンドリア複合体の complex III2/IV, complex
II サブユニット複合体の会合，ミトコンドリア呼吸能お多能性幹細胞における代謝機構に基づく細胞作製と心臓再生医療への応用
遠

山

周

吾
（慶應義塾大学医学部）

よび心機能（心エコー）を部分的に改善した．しかしながら，ミトコンドリア超複合体の complex I/III2/IV 複合体の会合不全はリノール酸の食事摂取によって修復さヒト多能性幹細胞は心筋細胞を含む様々な細胞に分化れなかった．

する能力を有するため，心臓再生医療への応用が期待さ【結論および考察】れている．一方で，ヒト多能性幹細胞を用いた心臓再生

リノール酸の栄養補助は，心不全を改善するのに有益であるが，心不全を完全に治すことはできなかった．

医療における臨床応用を実現化するためには多くの課題を克服する必要がある．その最も重要な課題の１つは，リノール酸の過剰摂取は有害である可能性が示唆され分化後に残存する未分化幹細胞を取り除き，効率よく心ているが３），本研究による適度なリノール酸摂取が心不筋細胞のみを作製する技術の確立であった．我々はこれ全における左心室機能，心筋ミトコンドリア機能を改善

らの課題に対して，ヒト多能性幹細胞と分化心筋細胞のする分子基盤の一助であることを示した２）．さらに，そ代謝プロファイルを詳細に解析することにより，培養環の摂取不足が心不全の重症度と関連するため，心不全患

境により分化後に残存する未分化幹細胞を取り除き，分者におけるΩ 6 脂肪酸リノール酸の適切な量の摂取や栄化心筋細胞のみを効率よくかつ大量に純化精製すると養指導が求められる．

いう画期的手法を構築することにより克服することに【文献】成功した（Tohyama, et al. Cell Stem Cell 2013, Cell

１）Takada S (Corresponding author ), Sabe H,

Metab 2016, Stem Cell Rep 2017）．さらに，我々は多Kinugawa S. Abnormalities of skeletal muscle,

能性幹細胞特異的な代謝機構に着目することにより，残adipocyte tissue, and lipid metabolism in heart

存する未分化幹細胞を特異的に除去する手法を確立し

failure: practical therapeutic targets. Front Car-（in revision），これまで確立してきた培養液による純化

diovasc Med 2020 in press.

精製法との組み合わせによりさらに安全な心筋細胞の作

２）Maekawa S, Takada S (Corresponding author),

製が可能となった．

Nambu H, Furihata T, Kakutani N, Setoyama D,

しかしながら，依然として課題が存在する．それは，Ueyanagi Y, Kang D, Sabe H, Kinugawa S. Lin-

ヒト多能性幹細胞を用いた再生医療における臨床応用

oleic acid improves assembly of the CII subunit

さらには産業化を実現化するためには，大量の細胞をand CIII2/CIV complex of the mitochondrial

作製する必要があり，それに伴い多くのコストが発生す

oxidative phosphorylation system in heart fail-

ることである．この課題を克服するためには，ヒト多能ure. Cell Commun Signal 17: 128, 2019.

性幹細胞を安価かつ効率よく作製する必要がある．一方

３）Ramsden CE, Zamora D, Leelarthaepin B,

で，ヒト多能性幹細胞における従来の培養液は，未分化

Majchrzak-Hong SF, Faurot KR, Suchindran

維持および増殖において最適な条件ではなかった．そこCM, Ringel A, Davis JM and Hibbeln JR. Use of

で，我々はヒト多能性幹細胞の増殖に最適な培養条件

dietary linoleic acid for secondary prevention

を探索し，特定の代謝産物を増強することにより，ヒof coronary heart disease and death: evaluation

ト多能性幹細胞の増殖が促進されることを見出した（inof recovered data from the Sydney Diet Heartrevision）．本研究成果は，安価に大量のヒト多能性幹Study and updated meta-analysis. BMJ 346:細胞および分化心筋細胞を作製することに繋がるため，

9

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

再生医療における臨床応用あるいは産業化の推進に貢献することが期待できる．

【目的】
本研究の目的は，ヒト iPS 細胞由来心筋細胞（hiPSCM）【文献】

を利用して心不全に対する治療効果が期待できる化合物

１）Tohyama S, et al . ( 2017 ) Stem Cell Rep .

を同定することである．

9,1406-1414.

【方法】

２）Tohyama S, et al . ( 2016 ) Cell Metab . 12,

昨年度までの研究から助成者は，市販 hiPSCM を特定の幅で線状に培養することで収縮に配向性を持たせる

663-674.
３）Tohyama S, et al. (2013) Cell Stem Cell 12,

ことで，ヒト心臓が示す生理的な表現型を模倣する独自の培養モデルを構築している．

127-137.

本年度は当該モデルを用いて培養している hiPSCMに対して様々な条件で DNA 損傷を加えることで，強iPS 細胞を用いた創薬研究内藤

篤

い細胞死を誘導することなくその収縮・弛緩運動を持彦

続的に低下させる細胞モデルを確立するとともに，治（東邦大学医学部）

療薬の候補となる化合物を作用させ，DNA 損傷による
hiPSCM の収縮・弛緩運動を予防およびまたは改善させ【背景】
心不全は高血圧や心筋梗塞といった様々な疾患が原因る化合物を同定する．
【結果】となって心臓に負荷がかかり，そのポンプ機能が失われ心筋細胞に DNA 損傷を加えるための手法として，抗た結果引き起こされる症候群である．遺伝子改変マウス

がん薬であるドキソルビシンを利用した．ドキソルビシの表現型解析を中心とした研究から，マウス心不全におンには強い心機能毒性が知られているが，工夫を加える

ける心筋細胞の異常の原因と考えられる分子やメカニズ

ことなく作用させると強い細胞毒性から hiPSCM は２ムが数多く報告されているものの，人間の心不全治療薬から４日かけて死滅してしまう．そこで，臨床において開発にはつながっていない．これまでの心不全研究が人がん患者に投与した際の薬物動態を模倣するような形で間の心不全治療薬の開発につながらない理由の一つとしドキソルビシンをさせたところ，収縮・弛緩運動機能がてマウスと人間の心臓における種間差が考えられる．

４日を底として低下し，その後２週間かけてドキソルビ

ヒト iPS 細胞の樹立法が確立したことにより，倫理上

シン投与前の 80% 程度までの回復が観察された．

の観点からこれまで利用することができなかった「ヒトドキソルビシンの心機能毒性は総投与量に比例して蓄心筋細胞」を利用した創薬研究が可能になった．ヒト

積性に進むことが知られている．そこで，初回のドキソ

iPS 細胞由来心筋細胞は成人の心臓に存在する心筋細胞

ルビシン投与から２週間後に再度ドキソルビシンを作用とは大きさや形が大きく異なるものの，少なくとも従来させたところ，初回と同様に収縮・弛緩運動機能は４日のマウスやラットの胎児・新生児心筋細胞を利用した研を底として低下したが，その後の回復が７日目には停止

究よりはヒト心臓に対する外挿性が高い結果が得られる

し，進行性に収縮・運動機能が低下していった．これはと考えられる．

ドキソルビシンによる慢性・蓄積性の心機能毒性を再現

助成者はこれまで，心不全モデルマウスにおいて非致
死的な DNA 一本鎖切断が蓄積した心筋細胞が増加してするものであり，DNA 損傷が引き起こす心不全を模倣した細胞モデルであると考えられた．

おり，病態を悪化させる要因になることを報告してい当該モデルを利用して，市販化合物を含む化合物を作る（Higo T, Naito AT, et al. Nat Commun, 8, 15104,

用させたところ，進行性に低下する収縮・運動機能を回2017）．心不全患者の心臓でも心筋細胞への DNA 損傷

復させる化合物を同定することができた．当該化合物は，蓄積が報告されており，DNA 損傷は心不全の病態を形DNA 損傷を加えていない hiPSCM に対してその収縮・成する重要な要因の一つと考えられる．

弛緩運動を改善する作用は示さなかったことから，直接

9Vascular Biology Innovation に関する研究助成

的に心筋細胞の機能を亢進させるのではなく，DNA 損型マウスをそれぞれ通常食，または高脂肪食を摂取させ，傷による心筋細胞内の未知の変化を修復することによっエネルギー代謝変化を比較解析する．

て作用していると考えられた．当該化合物の細胞内標的【結果】は不明であり，作用機序を解明するために遺伝子発現解A384T マウスの脂肪組織を解析した結果，予想通り，

析等の研究を実施中である．当該化合物は非循環器疾患

脂肪組織中の Treg の数・割合が野生型マウスに比べてを対象とした臨床試験が第三相まで成功したものの，競非常に少ないことが分かった．さらに Th1/Th2/Th17

合品との有効性・安全性の比較から市販に至らなかった応答を解析したところ，A384T マウスの脂肪組織では薬物であり，心不全治療薬としてのドラッグリポジショ

Th2 応答が過剰に起こっており，２型炎症のマーカー

ニングの有望な候補となることが考えられた．

である好酸球の割合が顕著に増えていることが分かった．さらに A384T マウスの脂肪組織重量は野生型マウ

制御性Ｔ細胞による脂肪組織恒常性維持機構および
脂肪細胞分化機構の解明
中島啓

スと比較して低い傾向にあることも分かった．一方で通常食・高脂肪食を摂取させ，体重をモニタリングしたが，体重に有意な差は認め認められなかった．また，通常食で飼育させた WT と A384T マウスの糖代謝（インスリ（東京大学大学院薬学系研究科）

ン抵抗性試験，グルコース負荷試験）を比較したが，糖代謝にも有意な差は認められなかった．

【目的】

【考察】

制御性Ｔ細胞（Treg）は，様々な組織環境，炎症環

A384T マウスの脂肪組織は Treg の数が少なく，過境に適応することで機能し，この適応性が炎症制御と組剰な Th2 応答が起こっているものの，糖代謝や高脂肪織の恒常性維持に重要である．我々はこれまでに，ヒト

食負荷に伴う体重増加については，野生型マウスと比べ自己免疫疾患 IPEX で同定されている Foxp3 遺伝子変大きな差は認められなかった．一方で，A384T マウス

異 A384T を導入したマウスの解析から，A384T Tregの脂肪重量は野生型マウスと比較して顕著に少ない傾向

が，AP-1 転写因子 BATF や GATA3，ST2 の発現制御にあることが分かり，過剰な Th2 反応が脂肪細胞の分異常を引き起こし，結果的に非リンパ組織に局在する化や分解に寄与している可能性が考えられる．実際，２Treg の恒常性を特異的に破綻させる事を見出だした．

型サイトカインである IL-4 は脂肪細胞に直接的に作用

本研究は，この発見を手がかりとして，BATF, GATA3,

し，脂肪分化を抑制し，さらに脂肪分解を促進することST2 の発現がその機能性維持に重要とされている脂肪で，脂肪細胞の肥大を抑制していることが報告されてい組織中の Treg に着目し，A384T 変異マウスの解析からる．すなわち，脂肪組織の Treg は脂肪組織の２型炎症

脂肪組織における Treg の適応性を制御するメカニズムを抑制することで，脂肪細胞の正常な分化を促進していを明らかとし，Foxp3＋Treg を介した脂肪組織恒常性維る可能性が示唆される．しなしながら，肥満と脂肪組

持機構および脂肪細胞分化機構を解明する事を目的とす

織の Th1 型炎症亢進には正の相関があることが良く知る．

られているものの，A384T マウスで見られているよう【方法】

な脂肪組織の Th2 型炎症亢進が全身の代謝にどのよう

Foxp3 遺伝子変異 A384T 変異マウス，R397W 変異に寄与しているかは現在のところ不明である．今後は

マウス，Treg 特異的 BATF 欠損マウスおよび野生型マ

脂肪組織が Th2 型に亢進している生物学的意義（褐色

ウスの白色・褐色脂肪組織について，組織形態，免疫応化の亢進など）を明らかにし，脂肪組織における Treg

答（Th1/Th2/Th17 etc.），免疫細胞集団を病理学的，の役割を解明したいと考えている．また，脂肪組織の免疫学的に解析し，Foxp3 依存的な Batf 発現制御が脂Treg の標的細胞を明らかにするため，A384T マウス

肪組織の恒常性維持および脂肪細胞分化にいかに寄与しを ST2 欠損マウスと掛けあわせ，Foxp3＜A384T＞ xているのか検証する．また，A384T 変異マウスと野生ST2 KO マウスを作製している．マウスが作製され次第，

9

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

ST2WT と ST2KO 背景の脂肪組織の炎症を比較解析すが困難でさらに血中半減期が短く，治療に用いる際は，る予定である．もし ST2KO で脂肪組織の２型炎症が抑長期的な入院下での経静脈持続投与が必要である．そこ

制された場合は，脂肪組織で ST2 を高発現するエフェ

で独自に開発した方法論を用いて AM のＮ末端にポリクターＴ細胞や２型自然免疫細胞（ILC2）が Treg の標

エチレングリコール（PEG）を結合させた PEG-AM や的と考えられるので，その抑制メカニズムを解明していヒト IgG の Fc 領域をＮ末端に融合した Fc-AM を開発

きたいと考えている．

した．PEG-AM, Fc-AM 共に AM 受容体を発現した細胞株において AM と同程度の cAMP の産生能を有し，生理活性ペプチドの臨床応用に向けた研究
永田

さやか

血中半減期を著明に延長させた．また，両誘導体は，皮下の単回投与によって潰瘍性大腸炎や脳血管性認知症，高血圧のモデル動物に対して効果を示した事から，これ（宮崎大学医学部）

らの疾患の治療薬になり得ると考えられた．

我々は，これまで生理活性ペプチド（特に循環調節ペプチド）の探索から創薬研究までを行ってきた．そのうちの２種類のペプチドについて本研究助成期間に得られプロリン異性化酵素 Pin1 による代謝調節機構
中津

た成果を以下に報告する．

祐介（広島大学大学院医系科学研究科）①ビッグアンジオテンシン-（Bang-）Bang-25 は我々が発見した新しいレニン・アンジオ【目的】

テンシン系（RA 系）のペプチドである．RA 系は循環

プロリン異性化酵素 Pin1 は，様々な標的蛋白のプロ器疾患や腎臓疾患に重要な役割を果たしており，組織中リン異性化を行うことにより，その機能調節を行っていには組織 RA 系が循環 RA 系とは独立して存在しているる酵素である．Pin1 は，従来，癌とアルツハイマー病と考えられるが，その生成機構や役割に関しては不明なとの関係で注目された蛋白であるが，我々のグループで点が多い．Bang-25 は，
古典的な循環 RA 系とは異なり，は，高脂肪食負荷したマウスの肝・筋・脂肪等で Pin1

レニンによるアンジオテンシンⅠ（Ang I）生成速度がの発現が増加したことから Pin1 と代謝との関係に着目

非常に遅い．一方でキマーゼによって速やかに Ang II

した．本研究では，主に Pin1 と糖尿病性腎症，肥満，を生成する．そのためレニン非依存性の新しい Ang II

骨格筋機能調節について検討した．

生成経路の鍵となる因子である可能性が高いと考えられ【方法，結果】

た．さらに心臓や副腎髄質，膵臓ではラ氏島のβ細胞，① Pin1 が糖尿病性腎症発症に関与するかを明らかにす

腎臓のポドサイトをはじめ生体内に広く分布していた．

るために，まずストレプトゾトシンをマウスに投与し，また，様々な疾患の尿中 Bang-25 を比較したところポ糖尿病を発症したマウス腎臓の Pin1 発現量について検ドサイト障害の進行した疾患で上昇傾向にあり，糖尿病

討した．その結果，腎臓での Pin1 発現量は，顕著に増では健常人に比べて有意に高い事が明らかとなった．以加した．興味深いことに SGLT2 阻害剤で血糖値を是正

上より Bang-25 は糖尿病性腎症に関与している可能性

すると Pin1 の発現量は，ほとんど増加しなかった．そが高いと考えられた．

こで，次に腎臓のどの細胞において Pin1 の発現量が増②アドレノメデュリン（AM）

加するかを検討したところ，メサンギウム細胞においAM は，ヒト褐色細胞腫の組織抽出液より発見され，て Pin1 の発現増加が認められた．糖尿病性腎症の発症

強力な血管拡張や血管新生，抗炎症作用など多彩な作用には，その一因としてメサンギウム細胞の増殖が関与を有している生理活性ペプチドである．そのため，AMすることが知られている．そこで，メサンギウム細胞を様々な疾患の治療薬として開発する事は重要である．

CRL1927 を用い，細胞増殖に対する Pin1 の影響を調しかし，AM は生理活性ペプチドであるために経口投与

べたところ，Pin1 ノックダウンによりその増殖が軽度

9

Vascular Biology Innovation に関する研究助成ではあるが，抑制された．

によって不活化されない合成糖質コルチコイド②高脂肪食負荷した脂肪組織では，Pin1 の発現量が顕（Dexamethasone）を妊娠中に投与したラット/マウス

著に増加する．そこで，Pin1 と脂肪分解との関係にからの産仔（LP 産仔および Dex 産仔）について成長後ついて検討したところ，Pin1 は，脂肪分解の律速酵の血圧および室傍核での renin-angiotensin 系（RA 系）

素である ATGL と結合することを見出した．Pin1 は，構成分子の遺伝子発現，DNA メチル化を検討した．まATGL の分解を促進するとともに脂肪分解活性を低下さたマウス培養視床下部細胞系での機序の検討を行った．

せた．

更に食塩感受性の実態と考えられる腎での Na＋ 再吸収③骨格筋特異的 Pin1 KO マウスは，高脂肪食負荷時の機構への影響を検討するため尿細管での Na＋ 輸送体発

体重増加が WT マウスと比較して顕著であり，また運現を検討した．

動能力も低下していた．興味深いことに，筋重量や筋線【結果】維タイプの割合は，両マウスで変わらなかった．以上のLP 産仔，Dex 産仔とも成体での食塩感受性高血圧

結果より，骨格筋の Pin1 は，筋量非依存的に代謝や運を呈した．これら産仔の室傍核では，アンジオテンシ

動を調節していると考えられた．

ン受容体（AT1a）遺伝子の DNA 脱メチル化と AT1a

【結論】mRNA 発 現 増 加 を 認 め， さ ら に DNA メ チ ル 化 酵 素

上記の結果より，Pin1 は，各臓器において様々な代謝調節に関与していることが明らかとなった．

DNMT3a の 発 現 と AT1a プ ロ モ ー タ へ の 結 合 が 低 下していた．培養室傍核神経細胞では Dex 添加により，
DNMT3a の発現低下と DNA 脱メチル化による AT1a

妊娠時ストレスによる食塩感受性高血圧発症機序の解明

発現増加を認め，この反応は DNMT3a のノックダウン
によって Dex 非依存性に再現された．Dex 産仔マウスの腎尿細管では Na 再吸収に関わる蛋白 NCC の発現上

西

本

光

宏

昇および活性化を認めた．発現上昇・活性化は高食塩食（国際医療福祉大学三田病院）

下でも残存した．これらの反応は３週齢以降の薬物治療によって抑制された．一方で NCC の mRNA について【目的】
高血圧を含む種々の疾患発症の要因として胎児期/新生児期におかれた環境因子の寄与が示唆される事象がは発現量に有意差を認めず，蛋白発現以降の制御が関与していることが示唆された．
【結論】

報告され，DOHaD (Developmental Origins of Health

妊娠時低栄養による食塩感受性高血圧発症機序としand Disease) 仮説が提唱されている．機序としてエて，脳内糖質コルチコイド過剰による脳内でのエピジェ

ピジェネティクな調節機構，特に比較的長期に変化のネティック調節異常が関与し，出生後の治療によって改持続する DNA メチル化調節の関与が想定される．一

善しうる可能性が示された．

方，低栄養母体の胎盤ではコルチゾールを不活性化する
11βHSD2 活性が低下しており，過剰なコルチゾール暴
露が子の成長後の生活習慣病発症に影響する．しかし胎児期のコルチゾール過剰が成人後に高血圧を発症させる

心臓疾患における細胞・分子挙動の網羅的理解野村

征太郎（東京大学大学院医学系研究科）

機序は未解明である．我々は，血圧調節を司る視床下部の室傍核，食塩再吸収調節を担う腎尿細管に着目し，機序および治療を検討した．
【方法】

【目的】
心臓は様々な細胞が相互作用して機能する臓器であ

妊娠時低栄養，胎児コルチゾール過剰暴露のモデル

り，その病態解明には細胞レベルの理解が欠かせない．

として妊娠時低タンパク食負荷ラット及び 11βHSD2

我々は，心不全患者の心筋シングルセル RNA-seq 解析

9Vascular Biology Innovation に関する研究助成により，予後不良の患者のみが有する不全心筋を同定し，670-680 (2019).

その細胞では DNA 損傷が蓄積していることを明らかに

３）Nomura S et al. High-throughput single-molecule

した１）．さらに臨床情報と分子病理の統合解析により，RNA imaging analysis reveals heterogeneous

治療前の心筋 DNA 損傷の程度がその後の治療応答性・

responses of cardiomyocytes to hemodynamic

予後を規定していることを解明した２）．そして不全心筋

overload. J Mol Cell Cardiol. 128: 77-89 (2019).

マーカーを含めた各種病態関連遺伝子の発現レベルを

in situ で解析できる１分子 RNA in situ hybridizationを確立した３）．続いて，これらを応用した時空間的な遺伝子発現解析を病態の理解に繋げることが必要である．
【方法】

リプログラミング法を利用した新たな心臓形成転写
ネットワークの探索
橋

本

寿

之
（慶應義塾大学医学部）

心臓組織から単離した全細胞を対象としたシング
ル セ ル RNA-seq 解 析 と 空 間 情 報 を 保 持 し た Spatialtranscriptomics の技術を統合して，心不全や心筋梗塞の病態に関係する細胞種・分子メカニズムの同定を目指【目的】
心臓発生に重要な複数の転写因子を強制発現さした．

せ る こ と に よ り 線 維 芽 細 胞 を 心 筋 様 細 胞（induced【結果】

cardiomyocyte: iCM）に直接分化転換することができ

圧負荷心不全においては，心臓線維芽細胞が，プロる（Ieda et al. Cell 2010）．最近我々はリプログラミン

テアーゼ分子を発現することで TGF-βの量を制御する

グと心臓発生の間にはエピジェネティックなプロセスにことによって心筋細胞の肥大・DNA 損傷蓄積・不全化

おいて多くの共通点があることを見出した（Hashimoto

誘導を制御していることを明らかにした．また，心筋梗

et al. 2019 Cell Stem Cell）．このような知見から，今塞においては，梗塞部位の心筋細胞が，mRNA 安定化

度は逆にリプログラミングの研究成果を参考にして，心分子を発現して RNA 量を適切に調節することによって臓発生を司る新たな転写制御機構を解明できるのではな

細胞の可塑性を制御していることを明らかにした．またいかと考えた．よって，我々は先行研究結果（Zhou et

Spatial transcriptomics によって，これらの細胞や分子al. Genes Dev 2017）において最も強く iCM への転換の発現挙動は時空間的に制御されたものであることがわ

効率を改善した転写因子 ZNF281 に着目し，ZNF281

かった．

の司る心臓発生の新たな転写制御機構を解析することを【考察】目的として，研究計画を立案した．

これら細胞レベルの時空間的な遺伝子発現解析によっ【方法】て心臓疾患の病態理解はさらに深まり，疾患層別化に応本研究では胚性幹細胞（ESC）およびモデルマウス

用することによって心臓疾患の精密医療をより高い精度を利用し，心臓形成における ZNF281 の役割を明らかで行うことが可能になるだろう．

に す る． そ の た め に は ZNF281 を 過 剰 発 現 も し く は【文献】

ノ ッ ク ア ウ ト（KO） し た ESC を 作 成 し，ZNF281 の

１）Nomura et al. Cardiomyocyte gene programs

発現量が心筋分化効率に及ぼす影響を解析する．また，encoding morphological and functional signa-

CRISPR/Cas9 を用いて ZNF281 を心筋特異的に KO しtures in cardiac hypertrophy and failure. Nat

たマウスラインを樹立し，ZNF281 が心臓発生に必須

Commun. 9, 4435 (2018).

の遺伝子かを明らかにする．

２）Nomura et al. Quantiﬁcation of DNA Damage

9

【結果】

in Heart Tissue as a Novel Prediction Tool for

我々は CRISPR/Cas9 を用いて ZNF281 をノックア

Therapeutic Prognosis of Patients With Dilated

ウトしたマウス ESC (ZNF281KOmESC) を樹立した．

Cardiomyopathy. JACC Basic Transl Sci . 4,

そして野生型の mESC と同様のプロトコルで心筋分

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

化誘導を行ったところ，ZNF281KOmESC は心筋細胞

m マウスに同様の処置を行った群をコントロール群とに分化することができなかった．また，我々は同様にした．MR 拮抗薬，Rac1 阻害薬を UNx-HS db/db マウ

CRISPR/Cas9 を用いて ZNF281 遺伝子領域を Cre リコスに投与し効果を検討した．

ンビナーゼ標的配列 loxP で挟んだ遺伝子組み換えマウ【結果】ス（ZNF281 ﬂox）を作成した．

UNx-HS db/db マウスは顕著な蛋白尿に加え，ヒト
糖尿病性腎臓病に特徴的とされる糸球体結節性病変を認【考察】
我々の in vitro の解析結果から，ZNF281 を欠損する

め，糸球体上皮細胞（ポドサイト）障害も伴っていた．

mESC は心筋分化能を欠失しており，ZNF281 は心筋

UNx-HS db/db マウスの腎皮質と単離糸球体では，活形成の転写ネットワークにおいて重要な役割を担ってい性型 Rac1, MR 標的遺伝子 Sgk1 発現の上昇を認めた．

る可能性が示唆された．今後は ZNF281 ﬂox マウスと

UNx-HS db/db マウスの糸球体蛍光染色では，活性型

心筋特異的に Cre リコンビナーゼを発現するマウスを

Rac1 とポドサイト特異的マーカー podocin のシグナル

交配し，心筋特異的に ZNF281 を欠損するマウスを作が一致して認められ，ポドサイト Rac1-MR 経路活性化

成し，解析する予定である．

が示唆された．MR 拮抗薬，Rac1 阻害薬投与によりこれらの所見は改善された．
【考察】

ミネラロコルチコイド受容体経路を標的とした糖尿病性腎症の新規治療法開発
広浜

UNx-HS db/db マウスが糖尿病性腎臓病の新たなモ
デルマウスとなる可能性が示唆された．さらに，糸球体大五郎

ポドサイト Rac1-MR 経路活性化が糖尿病性腎臓病の病（帝京大学医学部）

態形成に寄与すること，MR 拮抗薬および Rac1 阻害薬
が糖尿病性腎臓病治療の選択肢となりうることも示唆さ【背景・目的】れた．

糖尿病に伴う腎障害（糖尿病性腎臓病）は腎不全の原疾患として最も多いが，根本的な治療法は未確立である．これまで糖尿病性腎臓病に対する治療法開発を妨げていた要因の一つとして，ヒトの病態と類似するモデル動物の欠如があげられる．申請者らは，低分子量Ｇ蛋白

ドパミンシグナルを介した心不全の新規病態生理の解明と治療法の開発
山

口

敏

弘
（東京大学医学部附属病院）

質 Rac1 がミネラロコルチコイド受容体（MR）転写活性化を促進し，この経路が生活習慣病に伴う腎障害の病態に関与する可能性を明らかにしてきたが（Shibata et【背景】

al. Nat Med 2008, Shibata et al. JCI 2011, Hirohama

従来の心不全の基礎研究では「モデル動物とヒトとのet al. Int J Mol Sci 2020），糖尿病性腎臓病における

種差及び心不全の病態の差異」が臨床応用を妨げる重要

意義は未解明である．本研究は（1）ヒト糖尿病性腎臓な課題となってきた．我々は，ヒト心不全及び圧負荷モ

病と類似した病態を示すマウスモデルを確立すること

デルマウスのいずれの心臓においても発現が著増する共（2）確立したマウスモデルを用い，主に MR に焦点を通の遺伝子としてドパミン受容体 D1 (D1R) を同定してあてて糖尿病性腎臓病進行の分子基盤の一端を解明する

いる．

ことが目的である．

【目的】

【方法】

本研究の目的は，種を超えた心不全の本質的な病態形

肥満２型糖尿病モデルの db/db マウスに対して４成に心臓 D1R が寄与するという仮説のもと，心不全の週齢で片腎摘出を施行後，10 週間高食塩食を投与し病態生理におけるドパミンシグナルの役割を解明すると（UNx-HS db/db マウス）
，その表現型を評価した．db/

ともに，D1R を介した心不全の新規治療法の開発をす9Vascular Biology Innovation に関する研究助成

ることである．

メカニカルストレス応答異常と細胞骨格のリモデリング【方法・結果】

が瘤の形成に重要な役割を担っていること１），大動脈瘤

心不全時に増加する D1R を in situ hybridization 法

病変で Thrombospondin-1 (Thbs1) が過剰に発現してで評価したところ，D1R は心筋細胞で増加していた．

いること，また Thbs1 の抑制が大動脈瘤発症の抑止にそこで心筋特異的に D1R を欠失するマウスを作成した

効果的であることを示してきましたが２），血管のメカノ

ところ，圧負荷心不全時の心室性不整脈が抑制され，生トランスダクション機構における細胞外マトリクスの役

存率も改善した．他方，心筋特異的に D1R を過剰発現

割と，血管疾患発症の分子メカニズムの詳細は明らかにすると心室性不整脈は増加した．以上より，心不全時にされていませんでした．

増加する心筋 D1R は致死的心室性不整脈の発症に寄与【方法・結果】

すると考えられた．不整脈発症の機序として心筋細胞

ラ ッ ト 血 管 平 滑 筋 細 胞 を 用 い て 伸 展 刺 激（20%内の Ca2+ handling 異常が知られるため，培養心筋細strain, 1.0Hz, 20 時間）において分泌されるタンパク

胞に D1R を強制発現させたところ D1R は細胞内 Ca2+

質を網羅的に解析し，Thbs1 を含む，85 つのタンパク

handling に異常をきたし，その機序としてリアノジン質を同定しました．次いで，伸展刺激により分泌された受容体のリン酸化が関与していることが示唆された．さThbs1 が細胞基質接着を制御する integrin αvβ1 に結らに，東京大学医学部附属病院及びコロラド大学附属病合することを明らかにしました．Thbs1 欠損細胞では，院の２施設において心筋症患者より採取した心筋の遺伝

伸展刺激応答における接着斑の活性化が誘導されず，ア子発現解析を行ったところ，持続性心室頻拍の既往ある

クチンフィラメントの配向が崩れ，細胞張力が減少して

いは植込み型除細動器を持つ患者群において特に D1Rいることを明らかにしました．遺伝子発現解析（RNA-の発現が増加しており，ヒト心臓でも同様の表現型をseq）の結果，転写調節因子 YAP の標的遺伝子の発現が，とることが確認された．研究者は以上の結果をまとめ，

Thbs1 欠損細胞では伸展刺激後も抑制されること，伸Nature Communications 誌に報告した．(In Press)

展刺激による YAP の核内移行（活性化）には Thbs1 が【考察と今後の展望】必要であることを見出しました．また，YAP の核内移

本研究の結果，心筋 D1R は慢性心不全治療薬の新た行は，Thbs1 の integrin αvβ1 への結合と，低分子量なターゲットとして期待できることが明らかとなった．

Ｇタンパク質 Rap2 の不活性化を伴って，Hippo 経路依

さらにヒト臨床応用へと進めるべく，現在 Yale 大学

存的に制御されていることがわかりました．さらに，マPET center と共同して，D1R トレーサーの開発及び評ウスを用いた解析において，Thbs1 欠損マウスは，横価系を樹立し，マウスの予備実験を経て，ヒト臨床試験

行大動脈縮窄術（TAC）による圧負荷により，血管の破へ進めるための準備を行っている．

裂・解離を引き起こす一方，頸動脈狭窄術による新生内膜の形成時に，新生内膜細胞の増殖を抑制することを明

血管壁の機械刺激応答と病態形成を誘導するシグナ
ル分子の解析
山

城

らかにしました３）．
【考察】
これらの結果から，細胞のメカ二カルストレス応答の義人（筑波大学生存ダイナミクス研究センター）

中心を担う，転写調節因子 YAP の活性化を，細胞外マ
トリクス Thbs1 が制御することがわかりました．さらに，Thbs1 が制御する YAP 活性化のシグナル伝達経路【目的】
血管壁は絶えずメカニカルストレス（血圧や血流によは，血管壁の圧負荷応答や，狭窄に伴う新生内膜形成時の血管リモデリングに重要な働きを示すことを明らかにる血行力学的応力）にさらされており，その制御機構のしました．

破綻が血管疾患の根本原因ではないかと注目されていま【文献】

す．本研究グループはこれまでに，大動脈瘤において，

１）Yamashiro Y et al. Abnormal mechanosensing

98Vascular Biology Innovation に関する研究助成

and coﬁlin activation promote the progressionof ascending aortic aneurysms in mice. Sci. Sig-nal. 8 (399): ra105, 2015.
２）Yamashiro Y et al. Role of thrombospondin-1
in mechanotransduction and development of
thoracic aortic aneurysm in mouse and humans.

Circ. Res. 123 (6): 660-672, 2018.
３）Yamashiro Y* et al. Matrix mechanotransduction mediated by thrombospondin-1/integrin/YAP signaling pathway in the remodelingof blood vessels. Proc. Natl Acad. Sci. USA.
117 (18): 9896-9905, 2020. *責任著者

99

研究報告

全身性炎症疾患の病因
・病態の解明に関する研究助成
全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

強皮症自己抗原と強皮症感受性 HLA との会合の解析に基づく強皮症マウスモデルの樹立
大泊香

一方，表皮における MHC class II の発現を誘導する目的で mouse IFNγ (mIFNγ) を複数回マウスに投与し，皮膚における MHC class II の発現を ﬂow cytometryで解析した．

（大阪大学医学系研究科）

Tamoxifen を経口投与 CD74 ﬂ/ﬂ Krt5-Cre-ERT2+/–
マウス，Tamoxifen 未投与マウスを用いて，mIFNγを

目的】

投与した．

我々は，MHC class II 分子が細胞内ミスフォールド

そ の 後 マ ウ ス の 皮 膚 組 織 や ケ ラ チ ノ サ イ ト よ り，

蛋白と会合し neo-self となり細胞表面に運ぶ新たな役

MHC class II, DSG3, CD74 に対する自己抗体の有無に割を見出してきた．さらに関節リウマチのリウマトイド

ついて免疫染色や ﬂow cytometer で解析した．血清中因子，抗リン脂質抗体症候群の抗リン脂質抗体，ANCAの自己抗体について ﬂow cytometer にて解析した．

関 連 血 管 炎 MPO-ANCA が そ れ ぞ れ IgG, APOH,【結果】

myeloperoxidase と MHC class II の複合体に対する自CD74 ﬂ/ﬂ Krt5-Cre-ERT2 +/– マ ウ ス に Tamoxifen

己抗体であることを発見した．強皮症患者においても皮を経口投与する事で，長期的に皮膚特異的 CD74 欠損

膚の線維芽細胞に MHC class II が発現することが知らが維持された．

れており，強皮症発症の一因としても同様のメカニズムの関与が推測される．そこで MHC class II/強皮症自己抗原複合体による強皮症モデルマウスの作成を目標と

さらに，マウスに mIFNγを単純投与する事でケラチ
ノサイトに MHC class II が発現した．
自己抗体に関しては皮膚・血清中に現時点でまだ検出した．以前の結果より in vitro で CD74 (Invariant 鎖)を認めないが，今後も解析を続ける予定である．

の発現を低下させると MHC class II/ミスフォールド【考察】

蛋白複合体の形成が促進した．一方 in vivo で全身性にケラチン５発現部位の CD74 を後天的に欠損させる

CD74 を conditional に欠損したマウスでは自己抗体がマウスモデルの樹立ができた．現時点では皮膚特異的な産生され，全身性自己免疫疾患が発症した．以上より皮自己免疫疾患の発症には至ってないが，さらに経時的な膚特異的 CD74 欠損マウスでは皮膚特異的な自己免疫

自己抗体や MHC class II の発現の推移を詳細に検討し疾患が発症する可能性が考えられた．そこでまず表皮特ていきたい．MHC class II/ミスフォールド蛋白複合体

異的に CD74 の発現を低下させ MHC class II と自己抗は自己免疫疾患発症に重要と考えられるため，このマウ原複合体の形成を促進させる状況を作成し，表皮特異的スを用いてさらなる炎症刺激等を加えた際の臨床症状・自己免疫疾患の発症を観察した．

血清学的解析を進めていきたい．

【方法】
Tamoxifen 依存性にケラチン５プロモーター存在下
で CD74 を欠損させる，CD74 ﬂ/ﬂ Krt5-Cre-ERT2+/–
マウスを作成した．
これらのマウスに Tamoxifen 投与で皮膚特異的に
CD74 が欠損されるか，表皮細胞・脾臓細胞より DNA
抽出を行い，電気泳動で解析し比較した．

00

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

炎症性腸疾患におけるユビキチン様分子による蛋白制御を介した新規病態の解明
河本亜患における「UBD 依存的 UBL-PSM 系」の理解が一層進展するものと考えられた．

美（東京医科歯科大学医学部）【目的】

大規模ゲノムデータを用いたパスウェイ解析による
ベーチェット病の発症機序の解明
迫

炎症性腸疾患は慢性持続性の炎症・潰瘍が消化管に惹

野

卓士（横浜市立大学医学部）

起される「難病」であり，これらの調和を保つべき「腸上皮」の機能異常が病態に深く関与していることが明らかとされている．このため，本研究では炎症性腸疾患の【目的】

病態における「UBD 依存的ユビキチン様蛋白・プロテ

ベーチェット病は全身の諸臓器に炎症を繰り返す原因

アソーム系（UBD 依存的 UBL-PSM 系）」の役割につい不明の難治性炎症性疾患であり，遺伝要因と環境要因がて，「腸上皮細胞機能の制御」に焦点を当て，分子レベ複合的に関与して発症する多因子疾患と考えられていルで機能的意義の描出を試みた．

る．ベーチェット病では HLA-B*51 と HLA-A*26 が疾【方法】

患の発症リスクと顕著に相関することが報告されている

ヒト腸上皮細胞に於いて「UBD 依存的 UBL-PSM 系」

とともに，近年のゲノムワイド関連解析（GWAS）により，が分解・機能を制御する標的蛋白を同定するため，ヒベーチェット病の新たな疾患感受性遺伝子が 20 個ほどト腸上皮 UBD 過剰発現系（UBD-OE 細胞）及びヒト腸報告されている．これらの遺伝情報は，ベーチェット病

上皮 UBD 欠損系（UBD-KO 細胞）を構築した．これらの発症機序の解明，ベーチェット病のより有効な治療法

細胞で Notch 活性化と TNF-α刺激を誘導する事によりおよび予防法の確立の一助になり，非常に意義深い．し「UBD 依存的 UBL-PSM 系」を活性化する．複数の条件

かしながら，ベーチェット病において未同定の遺伝要因

で細胞内蛋白を回収し，質量分析を用いた網羅的解析等が依然として多く存在することが示唆されており，ベーにより，UBD 存在下・非存在下における発現量変化をチェット病の発症機序（発症パスウェイ）の全容は未だ指標に腸上皮における UBD 標的蛋白の同定を試みる．

解明されていない．本研究では，既に取得しているベー【結果】

チェット病の GWAS データを用いたパスウェイ解析を

１）iTRAQ 法を用いた網羅的解析により，２種の標的実行し，ベーチェット病の発症機序の解明を行った．

候補蛋白の同定に成功した．

【方法】

２）Flag タグ付き UBD 発現系（UBD-OE 細胞）を用

日本人集団（患者 611 例，健常者 737 例）とトルコ

いた免疫沈降を行い，UBD と分子間結合能を有する分人集団（患者 1209 例，健常者 1278 例）におけるベー子の探索・同定を行った．また UBD-KO 細胞を用いたチェット病の GWAS データ１,２）を対象に Imputation 解

解析から複数の候補バンドを同定し，質量分析による析を行ったのち，Imputed GWAS データを対象とした解析を行った結果，既知の p62 のみならず HDJ2 及びパスウェイ解析を実行した．本パスウェイ解析では，

GRP78 等の新規候補分子を同定した．

PANOGA (http://panoga.sabanciuniv.edu/) と KEGG

【考察と結論】(http://www.genome.jp/kegg/) を統合した手法３）を用

ヒト腸上皮細胞に於いて炎症環境で発現誘導される分いた．

子 UBD は，複数の標的分子を有し，同標的分子群の蛋【結果】

白分解制御を介し腸上皮機能を調節することで，炎症性日本人集団とトルコ人集団において，ベーチェット病

腸疾患の病態に機能的な役割を有すると考えられた．今の発症に有意（P＜1.0╳10－5）に関与するパスウェイ（生後，標的分子のさらなる探索等を行うことで炎症性腸疾

物学的過程・経路）をそれぞれ 88 個と 92 個同定した．

0

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

各々の人種集団で同定したパスウェイの多くは両人種の間で共通のパスウェイであった．
【考察】
本研究により，ベーチェット病の発症に関与するパス
ウェイが網羅的に同定された．今後新たな日本人集団および海外人種集団を対象に同様の解析（追認試験）を実行し，ベーチェット病の発症に関与するパスウェイを明

図１

確にする必要がある．ベーチェット病の発症パスウェイ

IncRAN-U909 の基本的特徴が解明されれば，発症パスウェイを対象とした治療薬の開発も可能になり，
その医学的意義は大変高いといえる．
【文献】
１）Mizuki N, Meguro A, Ota M, et al.: Genomewide association studies identify IL23R-IL12RB2
and IL10 as Behçet's disease susceptibility loci,Nat. Genet., 42 (8), 703-706 (2010).
２）Kirino Y, Bertsias G, Ishigatsubo Y, et al .:Genome-wide association analysis identifies

図２

HSV- 感染後 IncRAN-U909 発現量の
経時変化

図３

HSV- 感染後のウイルス DNA 量ならびに力価の経時変化図４

HSV- 感染後の宿主細胞生存率の経時変化

new susceptibility loci for Behçet's disease andepistasis between HLA-B*51 and ERAP1, Nat.

Genet., 45 (2), 202-207 (2013).
３）Bakir-Gungor B, Remmers EF, Meguro A, et al.:Identiﬁcation of possible pathogenic pathways
in Behcet's disease using genome-wide association study data from two diﬀerent populations,Eur. J. Hum. Genet., 23 (5), 678-687 (2015).

感染性ぶどう膜炎の病態形成に関与する長鎖ノン
コーディング RNA の同定
白濱新多朗（東京大学大学院医学系研究科）【目的】
単純ヘルペスウイルス１型（herpes simplex virus
type 1: HSV-1）の増殖を促進する宿主由来長鎖ノンコー
ディング RNA (long non-coding RNA: lncRNA) を同定し，同定 lncRNA が抗ウイルス薬の新規治療標的となり得るかを検証すること．

0

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成【方法ならびに結果】
初めに視細胞において，HSV-1 感染後に発現上昇すベーチェット病を含む自己炎症性疾患の遺伝子スクる lncRNA を，次世代シーケンサーを用いて網羅的にリーニング探索した．その結果，感染後に発現が２倍以上に上昇す土田奈緒美（横浜市立大学附属病院）

る lncRNA を合計で 19 個同定し，同定 lncRNA の中で感染後に最も発現上昇した lncRNA-U90926 に着目した．lncRNA-U90926 は全長が 522 ヌクレオチドで５【目的】

つのエクソンで構成され，非感染時には検出されず，感自己炎症性疾患の多くは，自然免疫が病態に関わると染後にのみ検出される lncRNA であった（図１）．その推定されており，多遺伝子疾患と考えられている．近年，発現量は感染後 10 時間まで徐々に上昇し，その後，感ベーチェット病の表現型を示す複数の家系発症例の全エ染後 24 時間で約 100 倍まで劇的に上昇した（図２）．

クソーム（whole exome sequencing, WES）解析から

次に，U90926 ノックダウン細胞における HSV-1 のA20 ハプロ不全症の原因遺伝子 TNFAIP3 変異が報告さ

力価は，HSV-1 感染後 3, 6, 9 および 12 時間の時点でれ，多因子性と考えられていた疾患群の一部に単一遺伝

コントロール細胞よりも有意に低かった（ p＜0.0001）．

子変異による疾患が含まれることが示唆された．

特に HSV-1 感染後 12 時間で，U90926 ノックダウン

これまでに筆者らは，ベーチェット病の 12 家系 ( 患細胞における HSV-1 力価は，コントロール細胞と比者 25 例を含む ) を集積し，WES 解析で２家系４例より較して約 93％減少していた（図３）．以上のことから，それぞれ TNFAIP3 遺伝子の新規変異を検出した１）．まlncRNA-U90926 は視細胞における HSV-1 増殖にとった，既報の A20 ハプロ不全症患者（54 例）と当施設て重要な因子であることが示唆された．

の成人ベーチェット病コホート（520 例）の比較にて，最 後 に lncRNA-U90926 の HSV-1 感 染 後 の 宿 主 細

A20 ハプロ不全症では，家族例，若年発症，発熱発作

胞生存率に及ぼす影響を評価した．その結果，HSV-1や腸管病変の合併が多く認めた１）．今回，これらの結果に 感 染 し た U90926 ノ ッ ク ダ ウ ン 細 胞 の 生 存 率 は，を踏まえ，ベーチェット病の患者の中でも，上記の臨床，９時間（ p＜0.001），
HSV-1 感染後６時間（ p＜0.05）

的特徴を有する症例に対して，遺伝子変異スクリーニン

12 時 間（ p＜0.0001） お よ び 24 時 間（ p＜0.0001）

グを試みた．

で，コントロール細胞と比較して有意に増加した．特【方法】に HSV-1 感染後 24 時間では，U90926 ノックダウン

ベーチェット病の患者の中でも，前述の臨床的特徴を細胞の生存率は 80.2％［siU90926 (1)］および 82.6％

有し，発症に遺伝学的要因が疑われる症例を対象とする．

［siU90926 (2)］であったのに対し，コントロール細胞

対象症例は，当学の遺伝学教室にて WES 解析を行う．

の生存率は 21.3％であった（図４）．これらの結果は，

ただし可能な場合には，かずさ遺伝子検査室の遺伝性自lncRNA-U90926 が HSV-1 の 増 殖 を 促 進 す る こ と で，

己炎症疾患遺伝子検査を先に行う ( 保険診療 )．検出さ

宿主細胞死を誘導していることを示唆している．

れたバリアントは，サンガーシーケンスなどで変異の確【考察】

認や由来の確認を行う．

本 研 究 を 通 じ て，HSV-1 感 染 が 宿 主 由 来 lncRNA-【結果】

U90926 の発現を誘導することで，ウイルス増殖を促進

当該期間に，新たに４例のベーチェット病患者を集積し，宿主細胞死を誘導していると考えられた．本結果は，した (P1, P2, P3, P4)．全例で 10 代までに発症し，うlncRNA-U90926 が HSV-1 に対する抗ウイルス薬の新

ち２例は親子（P1, P2）例で，残りの２例は孤発例（P3,規治療標的候補となり得ることを示唆している．

P4）であった．孤発例の P3, P4 は，発熱発作や腸管病
変を伴い，保険診療の遺伝子検査では診断には至らなかった．P1, P3, P4 に対して，WES 解析を行った．P1
で既知の自己炎症性疾患責任遺伝子Ｘに稀な新規バリア

0

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

ントを認め，サンガーシーケンスによる配列決定で，罹用する患者の血液，便，内視鏡検体を用いて薬物動態を患の母親 P2 と同バリアントを共有することが示された．

解析し，今後のテーラーメード医療に役立てる礎を構築

P3, P4 では有意なバリアントは検出されなかった．

することを目指した．

【考察】

【方法】

実臨床では，どのような症例に対して遺伝学的検査を①内視鏡検体における IFX, ADA の濃度検討すべきか，判断に悩むことが多い．本研究では，先IFX, ADA 使用中で 2018 年６月～2019 年８月に大行研究の結果に基づき，遺伝的な背景が疑われる症例に腸内視鏡検査を施行した UC, CD 患者を対象とした．

着目して遺伝学的検査を行った．今後，P1 の家系で検内視鏡にて炎症部または非炎症部より生検施行．検体出したレアバリアントに関しては，病原性の有無に関し

は蒸留水を加え，バイオマッシャーⅡで均質化したて，機能検証を検討している．P3, P4 に関しては，ト

後に遠心分離を行い，上清液を回収した２）．そして，

リオ解析を進める．

IDKmonitor を用いて ELISA 法にて濃度を測定した．

臨床的に遺伝的機序が示唆される希少疾患において，② VED の血中濃度

未だ原因特定に至らない症例も多く残されており，今後2019 年７月～ 2020 年７月に VED を開始した UC,

も引き続き症例を集積し，責任遺伝子の特定に取り組ん

CD 患者を対象とし，２週，６週，14 週において採血でいきたい．

を行い，血清を保存した．IDKmonitor を用いて ELISA【文献】

法にて VED 濃度を測定し，14 週時点での臨床的寛解の

１）Tsuchida N, Kirino Y, Soejima Y, et al: Haploin-

有無について比較を行った．なお，臨床的寛解について

suﬃciency of A20 caused by a novel nonsense

は UC では Partial Mayo Score (PMS) ２以下，CD でvariant or entire deletion of TNFAIP3 is clini-

は Crohnʼs Disease Activity Index (CDAI) 150 以下と

cally distinct from Behçet's disease. Arthritis

定義した．

Research & Therapy. 4; 21 (1):137 (2019)【結果】①対象患者 18 例（IFX：８例，ADA：10 例）の組織中

生物学的製剤を使用している潰瘍性大腸炎 , クローン病における血液 , 便 , 内視鏡検体を利用した薬物
動態の解析
日

比

濃度を測定した．IFX, ADA ともに炎症部と非炎症部において有意な差は認めなかった（IFX：0.137 μg/g vs0.176±0.162 μg/g, ADA： 0.246±0.07 μg/g vs 0.364±0.3 μg /g, p＝0.42）（図, ）．

則孝（北里大学北里研究所病院）【背景・目的】インフリキシマブ (IFX)，アダリムマブ（ADA）などの生物学的製剤は難治性の潰瘍性大腸炎（UC），クロー
ン病（CD）の寛解導入，寛解維持のために重要な薬剤

図１

図である．最近ではウステキヌマブ（UST），ベドリズマブ（VED）などの生物学的製剤も使用されている．し

②対象患者 15 例（UC：14 例，CD：１例）のうち 14 週

かし，多くの治療薬があるにも関わらず，治療効果が乏時点で臨床的寛解を得られた患者は 11 名（73.3%）でしく寛解導入，維持が困難な症例も認められる．その要あった．いずれの期間の血中濃度において寛解群と非寛因としては血中濃度の不足，抗薬物抗体の出現，薬が便解 群 では有意な差を認めていなかった（２週：41.63±

中に漏出し，腸管組織中の濃度が上昇していないなどの19.37μg /ml vs 47.3±15.93μg /ml, p＝0.64, 6 週：

複合要因が考えられる１）．本研究では生物学的製剤を使

38.27±17.74μg /ml vs 39.08±10.83μg /ml,p=0.57,

0全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

1 4 週：1 7 . 5 8 ±9 . 8 3 v s 1 7 . 5 1 ±3 . 3 4 , p ＝ 0 . 3 4 ）（図３－５）．

troenterology, 9, 350-5 (2015）.
２）Yoshihara T. et al.：Tissue Drug Concentrationsof Anti-tumor Necrosis Factor Agents Are Associated with the Long-term Outcome of Patientswith Crohnʼ s Disease, Inﬂammatory Bowel Dis-eases, , 2172-2179 (2017).

独自のマイクロ空間デバイスを用いた全身性強皮症の抗原特異的Ｂ細胞の機能解析
図３

深

澤

毅

倫
（東京大学大学院医学系研究科）【目的】
Ｂ細胞は様々な機能を有しており，自己免疫疾患においても重要な役割を果たす．特にＢ細胞受容体を介した自己抗原刺激は，自己反応性Ｂ細胞の活性化とサイトカ
イン産生を誘導し，その結果，病態の形成と進展に大きく関与すると考えられる．しかし，自己抗原に対する反
図４

応性やサイトカイン産生能，他細胞との相互作用などを含めた自己反応性Ｂ細胞の機能に関する直接的な検討
は，技術的な難しさから全く行われていない．自己免疫疾患のひとつである全身性強皮症（Systemic Sclerosis;
SSc）は免疫異常，皮膚および内臓諸臓器の線維化，血管障害を３主徴とする予後不良な疾患である．SSc 患者
では線維化や血管障害が顕在化する以前から，核内抗原である topoisomerase (topo) I などに対する自己抗体

図５が検出され，自己抗体の種類は病型と強く相関する．自己抗体産生の担い手である自己抗原反応性Ｂ細胞が病態【考察】形成において重要な役割を果たすと考えられ，SSc 患者

今回の研究では組織中濃度および血中濃度について

では memory B 細胞が異常に活性化していることから，

ELISA 法にて測定が可能であったが , サンプル数が限ら自己に対して免疫を獲得した memory B 細胞が病態へれていたため十分な結果を示すことができなかった．組

深く関与すると考えられる．本研究では，SSc における織中濃度については血中濃度や便中濃度を含めたさらな

自己抗原反応性Ｂ細胞の解析を行うことを目的とした．

る解析，VED については観察期間が短いため長期的な【方法および結果】

経過も含め検討していきたい．

独自の医工連携研究によって開発されたマイクロ空【文献】

間上に反応場を構築した単一細胞タンパク解析デバイ

１）Brandse J.F. et al.：Loss of Inﬂiximab Into Feces

スと微小空間細胞相互作用解析デバイスを用い，SSc 患

Is Associated With Lack of Response to Therapy

者と SSc モデルマウスから得られた自己抗原反応性Ｂ

in Patients With Severe Ulcerative Colitis, Gas-

細胞を解析し，自己抗原反応性Ｂ細胞が産生するサイト

0

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

カインやＴ細胞・線維芽細胞へ及ぼす影響，さらには病未知に等しかった，自己抗原反応性Ｂ細胞のサイトカイ

態への関与についての検討を行った．Interleukin (IL)-6

ンプロファイルと抗原親和性，病原性の解明に重要な貢や IL-23 といった炎症性サイトカインを産生するＢ細胞

献をなすと考えられた．

や IL-10 や IL-35 といった抑制性のサイトカインを産生するＢ細胞が topo I 特異的Ｂ細胞集団中に存在することが明らかとなった．さらに，topoI 抗原への親和性と成人発症炎症性腸疾患に関与する幼少期腸管 dys-

サイトカイン産生能との関係を検討したところ，highbiosis の検討

aﬃnity なＢ細胞において IL-6 や IL-23 を産生するＢ細三好潤（杏林大学医学部）

胞の割合が多く，それぞれのサイトカイン産生量も多い
ことが明らかとなった．同様に low aﬃnity なＢ細胞においては IL-10 や IL-35 といった抑制性のサイトカイン【目的】

を産生するＢ細胞の割合が多く，産生量も多いことが明

炎症性腸疾患（IBD）は消化管炎症を主体とする全身らかとなった．さらに topoI 抗原に対して high aﬃnity性疾患であり，慢性的に再燃を繰り返す原因不明の疾なＢ細胞が多いほど，皮膚硬化が強く，肺機能が悪いこ患である．IBD 発症には遺伝的背景，環境因子によりとが明らかとなった．

生じる免疫異常が関与していると考えられている．環次に topoI 誘発 SSc モデルマウスにおいて，Ｂ細胞

境因子にはさまざま要因が含まれるが，腸管微生物叢の aﬃnity の上昇がサイトカイン産生能に与える影響に（microbiota）が大きな役割を果たすことが示唆されてついての検討を行った．このモデルでは４回 topo I 蛋

いる．近年，妊娠中の母体や小児期の抗菌薬使用と IBD

白質を免疫することで皮膚硬化と肺の線維化が完成する

発症リスクの関連が報告され，幼少期の microbiota のが，topo I 蛋白質を免疫する毎にＢ細胞の topo I に対乱れ（dysbiosis）が将来的な IBD 発症リスクにつながする aﬃnity は強められる．Low aﬃnity なＢ細胞が多ることが示唆されている１,２）．我々は，周産期のマウス

い，topo I を１回だけ免疫したマウスにおいて，IL-10

母体に抗菌薬を投与することにより，出生後の仔に抗菌や IL-35 といった抑制性のサイトカインを産生するＢ

薬に起因する dysbiosis が伝播し持続すること，小児期細胞の割合が多かったのに対し，high aﬃnity なＢ細胞における免疫発達異常を引き起こすこと，および成育後が多い，topo I を４回免疫したマウスにおいては，IL-6に腸炎発症リスクが上昇することを報告した [3]．これや IL-23 といった炎症性のサイトカインを産生するＢ細らの知見により，幼少期の腸管 dysbiosis が将来の IBD胞の割合が多かった．これらのＢ細胞の養子移入実験に発症を決定する一因となることが示唆された．そこで，

より，topo I を１回免疫後に得られた topoI 反応性Ｂ細本研究では，⑴ dysbiosis の中のどのような要素（構成

胞は topoI 誘発 SSc モデルマウスの線維化病変を抑制

微生物，代謝物など）がどのような機序で成育後の腸炎したのに対し，topo I を４回免疫後に得た topoI 反応性発症に至るのか，⑵ 幼少期 dysbiosis は宿主の免疫発Ｂ細胞は線維化病変を促進することが明らかとなった．

達に長期的な影響を与えるのか，⑶ 上記⑵がある場合【考察】に宿主の免疫発達の方向性の決定に重要な時期（critical

topoI 反応性Ｂ細胞は topoI に対する親和性が低い場

window）が存在するのか，を検討することを目的とし合には線維化病変を抑制し，親和性が高くなると線維化た．

病変を増悪させ，これらの機能はＢ細胞からのサイトカ【方法】

イン産生を介して発揮されることが示唆された．全身性目的１：妊娠中の母体や小児期の抗菌薬使用と IBD 発

強皮症患者および全身性強皮症モデルマウスにおける自症リスクの関連という疫学的知見を再現するために我々

己抗原反応性Ｂ細胞の系にて，サイトカインプロファイが確立したマウスモデル（周産期抗菌薬投与 IBD モ

ルや抗原親和性，病原性，他免疫細胞との相互作用の解

３）デル）
で 得 ら れ た 糞 便 microbiome の metagenome

析を行い，その役割を明らかにした．本研究はこれまで

shotgun sequencing データについての MG-RAST 解析0

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

結果を再検討した．この MG-RAST 解析は抗菌薬非投（３）上記結果をふまえ，４週齢，10 週齢 GF マウスお与群（NT 群）と CPZ 群の仔の３週齢，７週齢，11 週

よび SPF マウスを用いた microbiome 移入実験を開始

齢時点が解析対象であった４）．我々は，NT 群と CPZ

した．４週齢で microbiome を移入した GF マウス群

群では，細菌構成のみならず，真菌構成，microbiome

では，８週齢の解剖時に GF マウスで特徴的な巨大盲腸機能が長期間にわたり異なることを明らかにした．さらが SPF マウスと同様のサイズにまで縮小していた．さに CPZ 群のなかでも観察期間中の自然腸炎発症率は約らなる免疫学的解析を予定している．また 10 週齢で30% であったことに着目し，自然腸炎を発症した群とmicrobiome を移入したマウスは，まだ 14 週齢に達し発症しなかった群では，自然腸炎を発症する前の 11 週ておらず，今後，解析予定である．

齢時点で，すでに糞便 microbiome の機能に差異が生じ，【考察】

窒素代謝経路（KEGG pathway: ko00910）に有意差をMG-RAST を用いた metagenome shotgun sequenc-

認めることを見出した．そこで，同経路に注目して NT

ing 解析データの再検討から，窒素代謝の変化が IBD ハ

群と CPZ 群の microbiome 機能の差異について再検討

イリスク個体（本検討の場合は，遺伝的背景として IL-を行うこととした．

10KO，環境因子として周産期抗生剤投与を有する）に

目的２：我々は既報で周産期抗菌薬投与による dysbio-

おいて腸炎発症のトリガーとなることが推測される一方

sis と仔の３週齢時点でのＴ細胞分画の変化の因果関係

で，窒素代謝経路が７週時点より NT 群と CPZ 群の間を示した ．今回，７週齢での脾臓，腸管膜リンパ節，で有意差を示さなくなること，NT 群と CPZ 群で非常

大腸粘膜固有層の制御性Ｔ細胞 (Treg), Th1, Th17 分画に多くの代謝経路が異なることから，宿主の免疫発達にについてフローサイトメトリーを用いて検討することと影響する代謝経路については本解析法のみでは同定が困した．

難と考えられた．また，宿主の発達にとって重要な微生

目的３：無菌（germ free; GF）マウスではＴ細胞分物の同定については，short reads に基づく MG-RAST

画が Th2 優位になるなど SPF マウスとは異なる免疫解析では限界があり，今後，ほぼ株レベルまで細菌構成状態となっていることが知られている．そこで，GFの検討が可能な metagenome-assembled genome によ

C57BL/6 マウスに対して，性別および週齢を一致させる手法が必要と考えられた．ただし，MG-RAST 解析でた SPF 環境 C57BL/6 マウスの microbiota を４週齢まは真菌叢の変化も認めており，細菌叢のみに注目した解たは 10 週齢に移入し，移入後４週間後（８週齢または析では他の微生物（真菌やウイルス）を評価できないこ

14 週齢）に，もともと無菌であったマウスの免疫状態とに注意が必要と考えられる．

３）が SPF マウスに類似したものに変化するかを検討する

一方，CPZ 群において７週齢時点でもＴ細胞分画がことにより，免疫発達の critical window について検討

３週齢時と同様に NT 群と異なることは，幼少期に母する方針とした．

体から伝播した抗菌薬による dysbiosis は仔の免疫発達【結果】に長期的影響を及ぼしたことを示している．幼少期の（１）３週齢時点で NT 群と CPZ 群では 121 代謝経路

microbiome の重要性を示唆する結果と考えられ，現在が 有 意 に 異 な っ て お り，ko00910 pathway に も 有 意

進行中の GF マウスを用いた実験の結果と合わせた解釈

差 を 認 め た（corrected p value＜0.01）． し か し， ７が必要と考えられる．

週齢，11 週齢時点では，それぞれ 46 経路，62 経路が【文献】

NT 群と CPZ 群で有意に異なっている一方，ko00910

１）Kronman MP, et al. Antibiotic exposure and IBD

pathway については両群間に有意差を認めなかった．

development among children: a population-（２）７週齢の脾臓，腸管膜リンパ節，大腸粘膜固有層

based cohort study. Pediatrics. 2012; 130 (4):について CPZ 群では NT 群と比較して，Treg が減少し，

e794-803.

Th1 および Th17 が増加していた．これは，我々の３週齢時の既報と同様の傾向であった．

２）Örtqvist AK, et al. Fetal and early life antibiotics exposure and very early onset inﬂammatory107

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

bowel disease: a population-based study. Gut.

かになっていない．そこで本研究では，パルミトイル化

2019; 68 (2): 218-225.

STING が下流シグナルを活性化する分子機構を明らか

３）Miyoshi J, et al. Peripartum antibiotics promoteにし，炎症性腸疾患の新規治療戦略を提案することを目

gut dysbiosis, loss of immune tolerance, and的とした．

inﬂammatory bowel disease in genetically prone【方法】

oﬀspring. Cell Rep. 2017; 20 (2): 491-504.

細胞膜においては，パルミトイル化されたタンパク質４）Miyoshi J, et al. Metagenomic alterations in gut

がスフィンゴミエリンとコレステロールで構成される脂microbiota precede and predict onset of colitis

質ドメイン（脂質ラフト）上で会合することが知られて

in the IL10 gene-deﬁcient murine model. Cell

いる．そこで，ゴルジ体のスフィンゴミエリンの脂肪酸

Mol Gastroenterol Hepatol. 2020; S2352-345X

組成を変化させることが報告されている C6- セラミド(20) 30132-6.

処理をした所，STING の活性化が劇的に抑制されることを見出した５）．このことから，パルミトイル化された

炎症性腸疾患における STING 経路の活性制御機構の解明
向井STING はゴルジ体の脂質ラフト様膜ドメインでクラスタリングして下流シグナルを活性化している可能性が考えられた．そこで本研究では，野生型 STING の DNA

康治朗（東北大学大学院生命科学研究科）

刺激依存的な活性化に，ゴルジ体のスフィンゴミエリン
及びコレステロールが必要であるかを，ゴルジ体に局在するスフィンゴミエリン代謝酵素（SMS1）及びコレス【目的】

テロール輸送タンパク質（OSBP）の阻害剤を用いて検

自然免疫は先天的に備わっている異物への応答機構で証した．また，STING がゴルジ体の脂質ラフト様ドメあり，感染初期の生体防御に重要である．自然免疫応答

インで下流シグナルを活性化しているかを，STING のシグナルの一つである STING 経路は，DNA ウイルス

下流キナーゼ TBK1 の活性化体（リン酸化体）認識抗

感染時に細胞質中に露出した DNA に応答して炎症応答体による免疫染色とスフィンゴミエリン可視化プローブを誘導するシグナル伝達経路として同定された（Barber,を用いて検証した．

Nat Rev Immunol, 2015）．さらに最近，炎症性腸疾患【結果】

モデルである IL-10 欠損マウスの病態が，STING をさ

SMS1 の阻害剤である D609 や OSBP の阻害剤であらに欠損させることでレスキューできることが報告さる 25-hydroxycholesterol (25-HC) で細胞を処理する

れ，炎症性腸疾患において STING 経路が創薬標的とと，DNA 刺激時の STING 経路の活性化が顕著に抑制なり 得 る こ と が 示唆された（Ahn, Cell Rep, 2017）．

できる結果を得た．また，DNA 刺激時にゴルジ体上にIL-10 の減少に伴う炎症性腸疾患の病態を改善するため見られるリン酸化 TBK1 はスフィンゴミエリンプローには STING 経路の活性化を阻害する必要があるが，細ブである Equinatoxin-II とよく共局在した．これらの胞内における STING 経路の活性制御機構は不明な点が結果から，DNA 刺激時に STING はゴルジ体の脂質ラ多く残されている．

フト様ドメインで下流シグナルを活性化している可能性

我々はこれまでに細胞内での STING の活性化機構を解析し，DNA 刺激依存的に STING が小胞体からゴルが示唆された（図）．
【考察】

ジ体へと輸送され，ゴルジ体で STING の Cys88,91 が本研究から，細胞内における STING のパルミトイル

パルミトイル化されることが下流シグナルの活性化に化と脂質ラフトを介した活性制御機構が明らかとなっ必要であることを発見した３−５）．しかし，膜タンパク

た．加えて，最近我々は，STING の小胞体維持機構の質である STING がパルミトイル化されることで，なぜ破綻が自己炎症性疾患につながること，及 STING 特異

STING 経路が活性化されるのか，その分子機構は明ら的パルミトイル化阻害剤が炎症病態の改善に有用である

08

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

requires exocytic membrane traﬃc from the ER.

Biochem Biophys Res Commun 503, 138-145(2018). (* co-ﬁrst author)
４）Hansen, A. L., Buchan, G. J., Rühl, M., Mukai,K., Salvatore, S. R., Ogawa, E., Andersen, S.
D., Iversen, M. B., Thielke, A. L., Gunderstofte,
C., Motwani, M., Møller, C. T., Jakobsen, A. S.,
Fitzgerald, K. A., Roos, J., Lin, R., Maier, T. J.,
Goldbach-Mansky, R., Miner, C. A., Qian, W.,
Miner, J. J., Rigby, R. E., Rehwinkel, J., Jakobsen, M. R., Arai, H., Taguchi, T., Schopfer, F.
J., Olagnier, D. & Holm, C. K. Nitro-fatty acids
are formed in response to virus infection andare potent inhibitors of STING palmitoylationand signaling. Proc Natl Acad Sci U S A 115,
図E7768-E7775 (2018).
５）Mukai, K., Konno, H., Akiba, T., Uemura, T.,

ことを見出し１―２），STING のパルミトイル化を介した

Waguri, S., Kobayashi, T., Barber, G. N., Arai,

活性化機構が自己炎症性疾患の創薬標的になりうること

H. & Taguchi, T. Activation of STING requiresを明らかした．上述の通り，STING は炎症性腸疾患モ

palmitoylation at the Golgi. Nat Commun 7,

デルである IL-10 欠損マウスにおいて病態発症に寄与し11932 (2016).

ていることが示唆されていることから (Ahn, Cell Rep,
2017), STING のパルミトイル化阻害剤や本研究で明らかにしたゴルジ体の脂質ラフト形成阻害剤が，炎症性腸疾患の有用な創薬シーズとなることが期待される．
【文献】

炎症性腸疾患と皮膚免疫に共通する EpCAM の機
能解析
森

村

壮

志
（国際医療福祉大学医学部）

１）Mukai, K., Ogawa, E., Uematsu, R., Kuchitsu,
Y., Kiku, F., Uemura, T., Waguri, S., Suzuki,T., Dohmae, N., Arai, H., Shum, A. K., and【目的】

Taguchi, T. Homeostatic regulation of STING by

Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM) は 全

the retrograde membrane traﬃc to the ER. Natての上皮細胞に発現する細胞接着分子である．EpCAM

Commun (2020). in press

遺伝子の欠損は重度の腸管障害を引き起こす致死性の２）Deng, Z., Chong, Z., Law, C. S., Mukai, K., Ho,

Congenital Tufting Enteropathy の原因となり，またF. O., Martinu, T., Backes, B. J., Eckalbar, W. L.,

EpCAM は大腸癌，乳癌，前立腺癌等の転移性悪性上皮

Taguchi, T., and Shum, A. K. A defect in COPI-

腫瘍に強く発現しており，臨床的に極めて重要である．

mediated transport of STING causes immune

我々は EpCAM の上皮組織における機能を解明するた

dysregulation in COPA syndrome. J Exp Med

め，EpCAM をコンディショナルに欠損させるマウスを

217, e20201045. (2020).

独自に作成した．本研究の目的は，EpCAM が腸管に強３）Ogawa, E.*, Mukai, K.*, Saito, K., Arai, H. &く発現することに着目し，立体的腸上皮細胞培養法（オTaguchi, T. The binding of TBK1 to STING

ルガノイド）を用いて，in vitro で EpCAM 欠損オルガ

09

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

ノイドを評価し，EpCAM が腸管免疫にどのような働き

ベルでは TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17A, IL-23p19 の産生をするのかを解明することである．また，EpCAM コン

は，EpCAM ノックアウトマウスの方が減少していた．

ディショナルノックアウトマウスを用いて，EpCAM が【考察】

皮膚免疫にどのような役割を果たすかを解析し，皮膚疾

EpCAM 欠損オルガノイドでは成長が阻害され，継患治療への応用についても検討することである（図１）．

代ができなかったことから，EpCAM が幹細胞に強く【方法】

影響していると考えられた．上皮組織を構成する tight

ROSA26CreERT2EpCAMfl/fl マウスの腸管から crypt をjunction マ ー カ ー と epithelial integrity マ ー カ ー は，

採 取 し， 特 殊 な 培 養 液（R-spondin, Noggin, EGF 等

EpCAM 欠損オルガノイドでは異常を認め，EpCAM がを含む）の中でオルガノイドを作成培養した（図２）．

上皮組織に重要な分子であることを示した．FISH では，

4-hydroxytamoxifen を培養液に添加して EpCAM 欠損

EpCAM 欠損オルガノイドでは幹細胞の数が著明に減少

オルガノイドを作成した．EpCAM 欠損オルガノイド

していたことから，EpCAM が幹細胞を維持するのに重の大きさや形態，成長率や継代率をコントロールのオ要な分子であることがわかった．加えて，EpCAM ノッ

ルガノイドと比較して評価した．細胞間接着に重要なクアウトマウスで乾癬様皮膚炎と耳の厚さ，炎症性サイ

tight junction, adherens junction, polarity, epithelial

トカインが減弱減少していたことから，乾癬様皮膚炎のintegrity 等を蛍光免疫染色，ウエスタンブロッティングで

機序に EpCAM が関与すると考えた．浸潤する炎症細評価した．Fluorescence in situ hybridization (FISH)

胞にも違いが生じており，どの細胞が炎症に関与していを用い幹細胞，Paneth 細胞の位置や分布，数をカウンるのかを調べることが今後の課題である．

トした．また，皮膚免疫を調べるため，乾癬様皮膚炎マ

以上より，EpCAM 欠損状態では腸管幹細胞が直接障

ウスモデルを用いた．マウスに連日６日間イミキモドク

害されており，EpCAM が腸管幹細胞を維持するのに重リームを皮膚及び耳に外用して乾癬様皮膚炎を起こさせ

要な細胞接着分子であることがわかった．また乾癬の病

た．乾癬様皮膚炎と皮膚の厚さを day1, 2, 7 で評価し態に EpCAM が関与していることが示唆され，治療のた．Day1, 2, 7 に耳と背部皮膚，リンパ節を採取して，応用に適応できる可能性がある．

病理組織学的解析（H&E，免疫染色），RNA レベルで
EpCAM の発現やサイトカイン，ケモカインの発現を評
価した．
【結果】
EpCAM 欠損オルガノイドは，コントロールのオル
ガノイドと比較して大きさが小さく，細胞膜が粗で辺縁周囲に破砕した細胞を多数認めた．成長率は低下し，継代は不可能であった．上皮組織を構成する adherens
junction マ ー カ ー (E-cadherin), polarity マ ー カ ー (factin) は 維 持 さ れ て い た が，tight junction マ ー カ ー

図１(claudin-1, claudin-7) や epithelial integrity は異常を認めた．FISH では，EpCAM 欠損オルガノイドでは幹細胞の数が著明に減少していた．次に乾癬様皮膚炎を評価した．EpCAM ノックアウトマウスとコントロールマ
ウスにイミキモドクリームを外用すると，EpCAM ノッ
クアウトマウスの方が有意に乾癬様皮膚炎と耳の厚さが減弱していた．病理組織では EpCAM ノックアウトマ
ウスの方が炎症細胞浸潤が少なかった．また，RNA レ

110

図２

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成【考察】
エネルギー産生・代謝異常を介した炎症性腸疾患における脳腸相関の機序の解明
良原丈

今回の検討で精神ストレスが腸炎を増悪させ，精神ス
トレスと腸炎刺激により中枢神経系でのエネルギー代謝

夫

異常が誘導されることが示唆された．中枢神経系でのエ（大阪大学大学院医学系研究科）

ネルギー代謝異常が来たす神経機能異常・腸炎に与える影響について今後解析予定である．

【背景】
炎症性腸疾患患者では抑うつ状態を呈する患者が多く，発症・増悪において精神的ストレス・抑うつ状態が引き金となることがよく知られているが，そのメカニズ
ムついてはよく分かっていない．うつ病の脆弱性の一つとして中枢神経系でのエネルギー代謝異常が挙げられていることから，腸管炎症がエネルギー代謝異常を介して脳に器質的な障害をもたらし抑うつ状態やうつ病の脆弱性となるのではないかと仮説を立てた．本研究では腸管炎症と抑うつ症状の相互関係，いわゆる脳腸相関における中枢神経系でのエネルギー代謝異常について検討することを目的とした．
【方法】
8︲12 週齢の ATP 濃度可視化タンパク質（GO-ATeam2）発現マウスに対して拘束ストレスを負荷し抑うつモデル
マウス（Restraint マウス）を作成した．またコントロー
ル群と抑うつモデルマウスに対して２％デキストラン
硫酸ナトリウム（DSS）の経口投与により腸炎を誘導した (DSS マウス，Restraint-DSS マウス )．腸炎の評価は体重変化・腸管長・病理学的評価に加えて，脾臓・大腸
粘膜固有層（LPL）からリンパ球を抽出し炎症性サイト
カイン発現の解析により行った．コントロール群・DSS
マウス・Restraint-DSS マウスから作成した脳スライスを人工脳脊髄液灌流下に蛍光実体顕微鏡で撮影し ATP
濃度の測定を行った．
【結果】
Restraint-DSS マウスでは DSS マウスと比較して体重減少と腸管長の短縮，病理スコアの悪化を認め，腸炎は有意に増悪していた．また LPL の IL-17 と脾細胞での IFN-γの mRNA 発現が有意に亢進していた．また詳
細は未発表データのため割愛するが，Restraint-DSS マ
ウスの脳スライスでは ATP 産生の異常を認め，エネル
ギー代謝異常をきたしていることが示唆された．



研究報告

Front Runner
Runner ofFront
of Future
Future Diabetes
Diabetes Researchに関する研究助成
Researchに関する研究助成

GLP-1 の非アルコール性脂肪肝炎（NASH）に対する臓器保護効果の機序の解明
井

上

智

彰

週齢まで飼育し，血糖値，食事摂取量，体重の変化について評価を行ったが，両群に差を認めなかった．また，
肝逸脱酵素 ALT についても両群に有意な変化は認めなかった．

（九州大学大学院医学研究院）【考察】
今年度は，神経特異的 GLP-1 受容体欠損マウスの作【目的】

出し表現型の解析を行った．しかしながら神経特異的

急激な糖尿病患者の増加により，非アルコール性脂GLP-1 受容体の欠損のみでは，肝機能を含めた表現系

肪肝疾患（NAFLD）を有した糖尿病患者が増加していに変化を認めなかった．脂肪肝の状態での評価も重要とる．糖尿病合併 NAFDL では肝線維化が進展し，非アル考えられ，神経組織特異的及び単球特異的 GLP-1 受容コール性脂肪肝炎（NASH）に進展するリスクが高く，体欠損マウスに高脂肪負荷を行い検討する予定としている．

有効な治療戦略の確立が喫緊の課題である．新規糖尿病治療薬である GLP-1 受容体アナログが NASH 患者を対象とした臨床研究（LEAN 試験）において，肝の線維化進行を抑制することで，NASH の有用な治療法となる可能性が報告されている．しかしながら，肝細胞には血管内皮における O-GlcNAc 修飾による糖尿病合併症進展機構の解明
大

橋

夏

子
（滋賀医科大学）

GLP-1 受容体が存在しないなど，組織分布とそれに対応する臓器保護効果には解離があり，機序の詳細は明らかではない．そこで本研究では GLP-1 受容体組織特異【目的】

的欠損マウスを用いて詳細な機序の検討を行い，GLP-1

糖尿病，特に肥満糖尿病の世界的な急増は克服すべきが持ち合わせる臓器保護効果のメカニズムの解明を目指す．

重要な臨床課題である．糖尿病や肥満では高血糖やイン【方法】

スリン抵抗性に伴う高インスリン血症により，全身の申 請 者 ら が 最 近 独 自 に 作 出 し た loxP 配 列 で glp1r

血管の内皮機能障害から様々な臓器障害が惹起される．

遺伝子のエクソン４, ５を挟む，ﬂox マウス（GLP-1r

O-GlcNAc 修飾は，全身の血管障害により引き起こされﬂox/ﬂox mice）と，神経組織特異的に発現する Nestin-

る糖尿病合併症の成因進展機構の一つとして着目されてCre マウスとの交配によって，神経組織特異的 GLP-1

きたことから，血管内皮細胞における O-GlcNAc 修飾

受容体欠損マウスを作出する．コントロールマウスと比の生理的役割と糖尿病に与える影響に関して検討する．

較検討することで，神経組織に発現する GLP-1 受容体【方法】と肝臓との関連を検討する．
【結果】

タモキシフェン誘導性血管内皮細胞特異的 Cre 発現
マウス（VEcad-BAC-CreERT2 マウス）と OGT-ﬂox マ

GLP-1R ﬂox/ﬂox Nestin-Cre マウスの GLP-1 受容体

ウスとの交配を行い，10 週齢にてタモキシフェンをの発現を RT-PCR 法で確認を行った．GLP-1R ﬂox/ﬂox

腹腔内投与することで血管内皮細胞特異的 OGT 欠損

Nestin-Cre マウスでは視床下部，脳幹において GLP-1（OGT-VEKO）マウスを作製し，表現型を解析した．

受容体が欠損していることを確認した．コントロールマ【結果】

ウス及び神経組織特異的 GLP-1 受容体欠損マウスを 18



通常食モデルにおいて，OGT-VEKO マウスは対照マ

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

ウスと比較し体重増加不良を呈した．高脂肪食モデル

expansion を抑制することを示した２）．

では，Metabolic cage を用いた基礎代謝の検討では両更に，3T3-L1 脂肪細胞において核内 SREBP1 の新規

マウスで差を認めなかったが，OGT-VEKO マウスでは結合因子を探索し，機能未知因子Ｘを同定した．結合ド

体重増加がより顕著に抑制された．さらに，空腹時血メインを同定し，Ｘが SREBP1 の活性を促進すること

糖，耐糖能及びインスリン感受性は改善し，皮下脂肪及を見出した．また，Ｘの変異を原因とする疾患の発症に

び褐色脂肪組織の肥大化の抑制，肝臓への異所性脂肪沈は，SREBP の機能変化が原因となる可能性を明らかに着の軽減と，それに伴う血中 AST 及び ALT の上昇の抑した（in submission）．

制を認め，脂肪肝炎の改善が示唆された．高脂肪食及び【文献】

STZ 投与では，網膜症や腎症，神経障害の惹起は認め

１）Okuno, Y., Fukuhara, A., Hashimoto, E.,られなかった．しかし，網膜での血管新生を評価するモ

Kobayashi, H., Kobayashi, S., Otsuki, M. &デルである相対的低酸素による虚血性網膜症モデル（未Shimomura, I.: Oxidative stress inhibits healthy

熟児網膜症モデル）で検討すると，OGT-VEKO マウス

adipose expansion through suppression ofの網膜において新生血管の増殖が顕著に抑制された．

SREBF1-mediated lipogenic pathway, Diabetes,【考察】67, 1113-1127 (2018)

OGT-VEKO マウスでは高脂肪食による肥満に抵抗性

２）Hayashi, R., Okuno, Y., Mukai, K., Kitamura, T.,を示し，血管新生が惹起される虚血性網膜症モデルにおHayakawa, T., Onodera, T., Murata, M., Fuku-

いて網膜の血管新生が顕著に抑制されることが明らかと

hara, A., Imamura, R., Miyagawa, Y., Nonomu-

なった．脂肪組織の肥大化には，組織の酸素需要の増大

ra, N., Otsuki, M. & Shimomura, I.: Adipocyteなどにより血管新生が必要となるが，OGT-VEKO マウ

GR inhibits healthy adipose expansion throughスでは肥満形成時の脂肪組織の増大に必要となる血管新multiple mechanisms in Cushing syndrome, En-

生が障害されることで，体重増加が抑制されている可能

docrinology, 160, 504-521 (2019)

性が示唆される．脂肪組織における血管の評価を含め，引き続き詳細な機序を検討していく．

弾性線維関連蛋白 Fibulin-5 によるインスリン抵
抗性制御機構の解明

肥満脂肪細胞における酸化還元状態の病態学的意義
解明

奥

山

朋

子
（横浜市立大学医学部）

奥

野

陽

亮
（大阪大学大学院医学系研究科）【目的】
我々は細胞外基質における弾性線維形成に必須の分子【目的】
肥満脂肪組織において増加する酸化ストレス（Fatである Fibulin-5 (Fbln5) がインスリン感受性やエネル
ギー代謝の制御へ関与している可能性を見出しており，ROS）の病態学的意義を探索した．

本研究ではその機構の解明を目的とし検討を行った．

【方法・結果・考察】【方法・結果】

Fat ROS 低減・増加マウスの解析から，Fat ROS は，

Fbln5 欠損マウス（Fbln5KO）および野生型マウス

healthy adipose expansion を抑制することを示した１）．

（WT）に生後８週齢より通常食あるいは高脂肪食負荷

また，脂肪細胞特異的グルココルチコイド受容体欠を行った．Fbln5KO は体重非依存性のインスリン感受損マウスやクッシング症候群脂肪組織臨床検体の解析

性の亢進を認め，高脂肪食誘導性の肥満・肝脂肪蓄積・から，クッシング症候群において脂肪細胞 GR は，脂脂肪細胞肥大化が抑制された．グルコースクランプを用

質 分 解 や 脂 肪 組 織 線 維 化 を 介 し，healthy adipose

いた解析により，Fbln5KO では全身においてインスリFront Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

ン感受性が亢進していると考えられた．Fbln5KO では特異的に PDPK1 を欠損させることで，膵β細胞におけ皮脂腺の萎縮を認め，高脂肪食負荷時の皮膚における各る血流が低下し，血管内皮構造の構築の乱れを生じ，膵

種脂肪酸代謝関連分子の発現誘導が消失しており，WT

β細胞機能が低下することを明らかにした．これらの研に比較し寒冷刺激に対する体温低下が顕著であったが，究は主に生理的条件または高脂肪食負荷下での表現型で脂肪組織における熱産生・脂肪酸燃焼に関連する遺伝子あり，高血糖状態での血管内皮 PDPK1 が果たす役割は

群の発現はむしろ上昇した．Fbln5-ﬂoxed マウスを入手

明らかにされていない．また，これまで「恒常的に発現し各臓器特異的 Fbln5KO を作成したところ，肝細胞特している」とされていた PDPK1 は，ヒト大動脈血管内異的 Fbln5KO および脂肪細胞特異的 Fbln5KO は体重

皮では肥満に相関して発現が低下していることも明らか

変化やインスリン感受性の変化を呈さなかった．
さらに，にしている．

野生型マウスの肝組織および初代培養肝細胞における【目的】

Fbln5 の発現を比較したところ，肝臓において Fbln5

高血糖状態における血管内皮 PDPK1 の役割を解明す

は主に肝細胞外に発現していた．Fbln5KO は血管の脆ること，及び血管内皮における PDPK1 の発現制御のメ弱性を呈することから，標識インスリンをマウス下大静

カニズムを明らかにする．

脈より投与し直後の肝臓におけるインスリン取り込みを【方法】

評価したところ，Fbln5KO では野生型に比較し取り込

血管内皮特異的 PDPK1 欠損マウスを用いて，STZ でみの亢進を認めた．現在血管平滑筋特異的 Fbln5KO を

高血糖を誘発し，全身の糖代謝に及ぼす影響を解明する

樹立しており，今後インスリン感受性に関する表現型をこと，及び様々なモデルを用いて血管内皮 PDPK1 の発検証する．また，現在通常食負荷 Fbln5KO および WT

現がどのように制御されているかを明らかにする．

の酸素消費量の測定を進めており，Fbln5 欠損によるエ【結果】

ネルギー代謝の変化の機構を検証していく．

STZ によって高血糖を誘発すると，血管内皮特異的
PDPK1 マウスではインスリン抵抗性が惹起された．ま【考察】
Fbln5KO において全身におけるインスリン感受性のた Akt のリン酸化を評価したところ，その主たる臓器

亢進と体重増加の抑制を認めた．臓器特異的 Fbln5 欠は骨格筋であることが明らかになった．骨格筋におけ損マウスの解析により，Fbln5 欠損による代謝表現型のる vascularity は PDPK1 欠損マウスで有意に低下して変化は臓器連関や間接作用を介した作用であると考えら

おり，TUNEL assay でも有意に血管内皮の apoptosis

れ，皮膚を介したエネルギー代謝の変化や，血管におけの亢進が確認された．In vitro でもヒト臍帯動脈血管内

るインスリン透過性の亢進の寄与が示唆された．弾性線

皮細胞を用いて PDPK1 をノックダウンすると cleaved

維を介した新たな代謝制御機構を提唱する．

caspase3 の発現が有意に増加し，血管増殖に重要な役割を果たす VEGFR2 の発現は有意に低下していた．電血管内皮 PDK1 の病態生理学的役割の解明
小

畑

淳

史

子顕微鏡による評価では，骨格筋のミトコンドリア構造の乱れや脂肪の蓄積が確認された．以上から血管内皮特異的 PDPK1 欠損マウスは STZ 誘導性高血糖下では骨（川崎医科大学医学部）

格筋の vascularity を低下し，さらには mitochondria
biogenesis を低下することで骨格筋においてインスリ【背景】

ン抵抗性を惹起することが明らかになった．血管内皮

我々は血管内皮特異的に PDPK1 を欠損させること

PDPK1 の発現については db/db マウス及び高脂肪食負で，生理的または高脂肪食負荷条件下では，主に脂肪荷 C57BL/6J マウスにおいては有意に発現が低下して組織における血管新生が抑制され，脂肪の縮小に伴うアおり，一方で STZ 誘導高血糖モデルでは有意に発現がディポカイン発現の改善に伴い，全身でのインスリン抵増加していた．

抗性が改善することを明らかにした．一方で，血管内皮Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成報告があり，特にマクロファージ，CD8＋ Ｔ細胞を評価【結論】
血管内皮 PDPK1 は STZ 誘導性高血糖下では骨格筋することとした．正常乳腺と腫瘍から F4/80＋のマクロでのインスリン抵抗性が惹起される．また，様々な条件

ファージを分離し，遺伝子発現を解析したところ，乳腺により血管内皮 PDPK1 の発現は「恒常的ではない」このマクロファージと比較して腫瘍内のマクロファージはとが明らかになった．

Opn および M1 marker genes を高発現していた．通常
食群と高脂肪食群の腫瘍内マクロファージの Opn の遺肥満時の癌発症・進展における M2 マクロファー
ジの役割
角伝子発現レベルに差はなかった．FACS で腫瘍においては CD11c＋ M1-like macrophages が多数を占めており，
通常食群と高脂肪食群で差はなかった．よって，高脂肪朝信

食負荷で腫瘍の OPN の発現が上昇する原因となってい（富山大学医学部附属病院）

る細胞はマクロファージ以外と考え，次に CD8＋ Ｔ細胞を解析した．FACS では正常乳腺と比べ腫瘍では PD-1＋【背景】

CD8＋ Ｔ細胞が増加しており，通常食群と比較して高脂

肥満は乳癌，大腸癌，子宮体癌など数種の癌リスクを肪食群で著明であった．PD-1＋ CD8＋ Ｔ細胞の遺伝子発増加させる．しかしながら，肥満がどのように癌発生に現を解析すると PD-1－CD8＋ Ｔ細胞と比較して Opn を関与するか根本的な機序は充分に解明されていない．本高発現し，細胞障害性の指標となる Ifng, Gzmb は低発研究では独自に作成したマウスモデルを用いて M2 マク

現であった．免疫組織化学でも PD-1＋細胞が OPN を高ロファージが癌の発症・進展に与える影響及びその分子発現していた．

機構について調べている．肥満と癌発症をつなぐ機序に【考察】

M2 マクロファージが如何に関わるかを分子機構レベルで明らかにしたい．

高脂肪食による肥満で細胞障害性が低く，OPN を発現し癌細胞増加促進作用をもつ PD-1＋ CD8＋ Ｔ細胞がまた，腫瘍内で細胞障害性が低下した疲弊性 T 細胞

腫瘍内で増加した．肥満による CD8＋ Ｔ細胞の疲弊のは免疫チェックポイント分子である PD-1 を発現してい加速が癌発症・進展促進と関連することが示唆された．

る．我々は肥満で癌発症・進展が促進される機序にＴ細したがって，OPN を発現する PD-1＋ CD8＋ Ｔ細胞が肥胞疲弊が関連しているのではないかと考え，本研究を満関連癌の治療ターゲットとなる可能性がある．

行った．

【文献】

【方法】

１）Kado T, Nawaz A, Takikawa A, Usui I, Tobe K.

乳癌を発症する遺伝子改変マウスを高脂肪食群と通常

Linkage of CD8+ T cell exhaustion with high-fat

食群に分けて，腫瘍の発生時期や，重量，体積，数を測

diet-induced tumourigenesis. Sci Rep. 22; 9 (1):

定．摘出した腫瘍を FACS, MACS, IHC, qPCR などを

12284 (2019).

用いて解析した．特にマクロファージ，CD8＋ Ｔ細胞を評価の対象とした．また，野生型同腹仔マウスを高脂肪食群と通常食群に分けて，正常乳腺についても同様に解
析した．
【結果】

グルコース応答性高分子ゲルを用いた自律型インス
リン投与デバイスの開発
木村真一郎（名古屋大学環境医学研究所）

高脂肪食負荷で腫瘍の発生が早まり，腫瘍の重量・体積・数が増加した．高脂肪食負荷群の腫瘍では通常食群と比較して，アポトーシス抑制などを介した癌細胞増【目的】

殖促進作用をもつ OPN が上昇していた．過去にマクロ本研究では，血糖値変動に応答して自律的にインスファージ，Ｔ細胞が OPN の主要な産生細胞であるとのリンを放出する自律型インスリン投与デバイスを開発

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

し，革新的な糖尿病治療戦略の実現を目指す．そこで
我々は，グルコース濃度に応答して物理的性質が変化するフェニルボロン酸を含む高分子ゲル（ゲル）を利用して，エレクトロニクスフリーの形式で，人工膵臓様の機膵島と腺房細胞の相互作用による GLP-1 を介した
膵β細胞制御機構の解析
京

原

麻

由

（横浜市立大学大学院医学研究科）

能を有する，スマートインスリンデバイスを開発した．
既に我々は，ゲルとシリコンカテーテルを融合させて，マウスを用いた機能実証に成功しており（Sci. Adv. 3:
eaaq0723, 2017），今回，臨床応用を見据えた次世代【目的】
膵β細胞機能制御における GLP-1 受容体作動薬作用型デバイスの開発に取り組むこととした．

の新規経路を同定する．

【方法】【方法・結果】

我々は，インスリン放出のスケールアップを図るため

マウス単離膵島に GLP-1 受容体作動薬リラグルチに，血液透析用中空糸をゲルと融合した新たなデバイス

ド（Lira）を添加し，定量的プロテオーム解析を行っを開発した．既に，体重がマウスの約 10 倍の正常ラッ

た．Lira 添加により発現上昇したタンパク質の多くは，

トを用いたグルコース負荷試験において，本デバイスのAlpha-amylase 1 (Amy-1) などの膵腺房細胞に発現す

血糖依存的なインスリン放出や血糖降下作用を確認してる外分泌酵素関連タンパクであったことから，GLP-1

いる．今回，詳細なインスリン放出特性や，血糖日内変により膵島と周囲の腺房細胞の接着が促進する可能性を動に与える影響など，その効果と安全性について解析を想定した．また Lira 添加により，膵腺房細胞に発現し行った．

膵β細胞増殖を促進することが知られる Lithostatine-1【結果】(Reg1) が発現上昇することに着目した．我々は，単離ラットの皮下に本デバイスを留置し，内頸静脈に挿入

膵島と膵腺房細胞の共培養系を確立し，膵島におけるしたカテーテルよりグルコース溶液を持続的に静注し

Reg1 遺伝子発現が，膵島単独の培養では Lira 添加にて，血糖値と血中インスリン濃度を 10 分間隔で計測しよる変化を認めないが，腺房細胞と共培養することで，た．この時，血中のデバイス由来インスリン濃度は，グ

Lira 添加により上昇することを確認した．また膵島に

ルコース注入のオン・オフに伴う血糖値の変動に対して，

おいて，Amy-1 などの膵外分泌酵素や，P-Cad や Cx26

速やかに応答することを見出した．さらに，持続血糖モなど特定の細胞接着因子の発現も同様に，腺房細胞と共ニタリング装置をラットの皮下に留置して，デバイスが培養することで，Lira 添加により上昇することを確認

血糖日内変動に及ぼす影響を評価した．ストレプトゾト

した．免疫染色にて P-cad は膵島と腺房細胞の細胞表

シンを少量用いて軽症糖尿病モデルを作製したところ，面に発現し，Lira により細胞表面における発現が上昇

主にラットの活動期に血糖値が上昇し，血糖日内変動がしたことから，Lira は接着分子の発現誘導により膵島生じた．人工膵臓デバイスを用いて治療を行うと，活動と腺房細胞の接着を促進し，腺房細胞由来の Reg1 の発期の高血糖がより顕著に改善し，一方で，非活動期の正現が上昇したと考えられた．次に Reg1 欠損マウスを用

常域血糖値には影響を及ぼさないことが明らかになった．

いた解析を行い，免疫染色にて，Reg1 はα-amylase と【考察】

共染し膵腺房細胞に発現しており，膵島での発現を認め

上述の研究成果により，大幅なスケールアップ，インなかった．Reg1 欠損マウスの単離膵島では，野生型マスリン放出特性の個体レベルでの評価などに成功した．

ウスに比較し，Lira 添加時の ATF2 遺伝子発現が低下

さらに，「血糖依存性のインスリン放出」という本デバしていた．次に，Lira を添加し培養した Reg1 欠損マウイスの特性を活かして，血糖日内変動を抑制することをス単離膵島の EdU 染色を行い，膵β細胞増殖を評価し新たに見出した（Commun. Biol. 3: 313, 2020）．次年

た．野生型マウス，Reg1 欠損マウスともに，腺房細胞度は，ヒトとほぼ同等の体重を有するブタを用いて，ヒトの付着していない膵島単独では，Lira 添加による膵β用デバイス作製の基盤となるデータを取得する予定である．

細胞増殖を認めなかった．一方，Lira 皮下注後の Reg1



Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

欠損マウスの膵β細胞増殖は，野生型マウスに比較してはより大きな体重の増加を認めたが，既報に比べてその低下していた．

差は軽微であった．

【考察】

【考察】

リラグルチドは，膵島に作用し，接着分子の発現誘導

今後，詳細解析を行っていくには十分でないと考えらにより膵島と腺房細胞の接着を促進し，腺房細胞由来のれたため，現在，マウス系統，餌の組成や給餌時期，評Reg1 の誘導により ATF2 を介して，膵β細胞増殖を促

価時期，評価方法，遺伝性の肥満・糖尿病発症モデルを進する可能性がある．

使用するなどの条件検討を行い，最適条件の設定を進めている．並行して，胎盤機能の解析手法についても条件検討を進めている．安定して表現型が得られるマウスモ

エピゲノムを介した肥満・糖尿病遺伝機構の解明と応用デルが確立でき次第，胎盤の機能解析を実施し，表現型との関連を評価していきたい．
仔の表現型をより強く，より安定的に得るため，マウ

小塚

智沙代

（理化学研究所生命医科学研究センター）

ス系統，餌の組成や給餌時期，遺伝性肥満・糖尿病発症
モデルの使用などの条件検討を行い，最適条件の設定を行う．並行して，胎盤の機能解析方法の条件検討を行い，【目的】
肥満や２型糖尿病に罹患した親を持つ子では生活習慣

安定して強い表現型の仔を得られ次第，胎盤の機能解析を実施する．

病の発症率が高く，その遺伝性が注目されている．この遺伝の機序として肥満・糖尿病により配偶子のエピゲノ
ムが変化し，それが次世代に引き継がれて子の生活習慣病リスクを上昇させる可能性が注目されている．本研究

イソプレノイド合成経路で脂肪組織発達に及ぼす影

では，母親の代謝異常が胎盤機能の異常を介して子供の響の検討

代謝疾患リスクを上昇させるのではないか，そして母性後藤剛（京都大学大学院農学研究科）

肥満と胎盤肥大を繋ぐメカニズムとして肥満女性の卵子におけるエピゲノムに異常が起こっているのではないかと仮説を立てた．この仮説を検証するために，胎盤特異助成者らは「Front Runner of Future Diabetes Re-

的インプリンティング破綻マウスモデルを用いて胎盤肥

search に関する研究助成（FFDR）」の支援の下，脂肪大が次世代の代謝に与える影響を調べる．

組織機能制御機構に関する以下の２研究課題に取り組ん

【方法】

できた．

肥満・糖尿病を発症した雌マウスから卵子を採取し，体外受精することで得られる次世代が安定的に代謝疾

１．脂肪組織形成・発達における脂肪細胞イソプレノイド合成経路の生理的意義の解明

患を発症するマウスモデルの作製に取り組んだ．雌性２．褐色脂肪組織機能制御機構の解明と褐色脂肪組織機

C57BL/6 マウスに高脂肪食を給餌し，肥満，糖尿病を能制御活性を有する腸内細菌産生代謝産物の同定お発症させた．通常食群，高脂肪食群のそれぞれから卵子

よびメカニズム解析を採取し，体外受精により子世代を得て，既報条件に従各研究課題の研究内容と成果の概要について以下に記い，子世代の表現型を解析した．

載する．

【結果】

１．脂肪組織形成・発達における脂肪細胞イソプレノイ

子世代への高脂肪食の給餌により，通常食を摂取してド合成経路の生理的意義の解明

いた母体由来の卵子から生まれた子どもに比べ，高脂肪イソプレノイド合成経路はコレステロールをはじめと食を摂取していた母体由来の卵子から生まれた子どもでする種々の内因性物質産生を担う代謝経路である．本経Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

路の律速酵素である HMG-CoA reductase (HMGCR) 阻

２．褐色脂肪組織機能制御機構の解明と褐色脂肪組織機

害剤はスタチン系薬剤として広く用いられており，疾患

能制御活性を有する腸内細菌産生代謝産物の同定おの発症とも深く関連する．助成者らはこれまでにイソプ

よびメカニズム解析

レノイド化合物である，farnesyl pyrophosphate (FPP)

褐色脂肪細胞やベージュ脂肪細胞は高い熱産生能を有や geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP) が 核 内 受

し，肥満や肥満関連疾患の標的として期待されている．

容 体 型 転 写 因 子，peroxisome proliferator-activated

助成者らは褐色脂肪細胞やベージュ脂肪細胞が担う「褐receptor γ (PPARγ) や liver X receptors (LXRs) の活

色脂肪組織（BAT, brown adipose tissue）機能」の新性制御を介して脂肪細胞分化過程を制御する内因性代

たな制御機構と制御因子について検討を行った．

謝物であることを培養細胞レベルで明らかにしてきた助成者らは肥満状態がアドレナリン刺激による BAT（Biochem J. 2011, Biochem Biophys Res Commun.

機能亢進に与える影響について検討を行い，肥満状態

2016）．本研究課題では脂肪細胞におけるイソプレノイ

では寒冷刺激による BAT 機能の亢進が抑制されること

ド合成経路の生理的意義の検討を行った．

を見出した．そこで，肥満状態の脂肪組織で惹起される

Hmgcr の第 12－14 エキソンを挟むように ﬂox 配列

マクロファージ浸潤亢進に伴う慢性炎症状態と BAT 機を導入した ﬂox マウスと脂肪細胞特異的に Cre 組換え

能の亢進の関連性について，クロドロン酸リポソーム投酵素を発現する Adipoq-Cre マウスを交配させ，脂肪細与によりマクロファージを欠乏させたマウスを用いて検胞特異的 Hmgcr 欠損マウス（aKO マウス）を作成し討した．クロドロン酸リポソーム投与マウスでは，肥満

た．aKO マウスは全身の脂肪組織がほぼ完全に消失し，に伴う脂肪組織の炎症状態の軽減が認められるととも普通食条件下で摂餌量，体重の増加を示した．さらにに，寒冷刺激による BAT 機能の亢進が強化され，肥満aKO マウスは高血糖，耐糖能異常，インスリン抵抗性，に伴う寒冷耐性の低下が減弱することが明らかになっ

高中性脂肪血症，脂肪肝などの代謝異常を示した．これた．さらに，慢性炎症状態における BAT 機能亢進の低らの症状は脂肪委縮時に認められる表現型であったた

下は，tumor necrosis factorαや interleukin-1β，一酸め，野生型マウス由来の脂肪組織を aKO マウスに移植

化窒素といったマクロファージ由来の炎症性メディエー

したところ，aKO マウスで認められた上記の代謝異常

ターよって惹起されることが示唆された（Am J Physiol

はほぼ完全に回復した．これらの結果より，脂肪細胞のCell Physiol. 2013, Cytokine. 2016, Am J Physiol

イソプレノイド合成経路は脂肪細胞の発生・発達においEndocrinol Metab. 2016）．その分子機構の一端として生理的に重要であることが示唆された．

て，炎症状態の脂肪組織における mitogen activatedHmgcr 欠損時の脂肪組織萎縮機構について詳細に検討するため，ﬂox マウスより前駆脂肪細胞を単離したのprotein kinase 経路の活性化や PPARαの発現・活性低下が関与している可能性を示した．

ち，タモキシフェン活性化型 Cre を安定発現させた細また，BAT 機能の制御因子として食事成分の腸内胞を樹立した．本細胞を脂肪細胞へと分化誘導後，タモ

細菌代謝産物の機能に着目し，検討を行った．助成者

キシフェン添加により Hmgcr を欠損させたところ，アらはこれまでの研究において，魚油に多く含まれる

ポトーシスによる細胞死の亢進が認められた．Hmgcr

n-3 系 多 価 不 飽 和 脂 肪 酸，eicosapentaenoic acid や欠損によって誘導されるアポトーシスは FPP の添加でdocosahexaenoic acid 摂取により，陽イオンチャネル

は回復しなかったが，GGPP 添加によってほぼ完全にtransient receptor potential cation channel subfamily

回復した．また，分化した脂肪細胞において GGPP 合V member 1 (TRPV1) 依存的に BAT 機能の亢進が惹起成酵素をノックダウンすると，Hmgcr 欠損時と同様にされることを明らかにした（Sci Rep. 2015）．そこで，アポトーシスが誘導された．以上より，脂肪細胞のイソ

多価飽和脂肪酸の腸内細菌代謝産物に着目し，TRPV1

プレノイド合成経路は GGPP 産生を介してアポトーシ

活性に与える影響について評価したところ，代表的なスを抑制することで脂肪組織の機能維持に必須の役割を

n-6 系多価不飽和脂肪酸であるリノール酸由来の代謝産担っていることが明らかになった（iScience. 2018）．

物，10-oxo-12( Z )-octadecenoic acid (KetoA) に よ っ118

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成て，TRPV1 の活性化が惹起されることが明らかとなっ【謝辞】

た．KetoA をマウスに対し長期投与したところ，高脂本研究課題に対して長年にわたり貴重な研究助成金

肪 食 誘 導 性 肥 満 の 抑 制， 酸 素 消 費 量 の 増 加，BAT 機を賜りましたことを，門脇孝先生をはじめとする FFDR

能の亢進が認められた．KetoA 長期投与によるこれら

審査委員および選考委員の先生方，日本応用酵素協会のの効果は TRPV1 欠損マウスでは認められなかった．

運営関係者の方々に厚く御礼申し上げます．助成者としKetoA 単回投与は脂肪組織において交感神経活性の指てご推薦頂くとともに本研究を直接ご指導下さった河田標であるノルアドレナリン代謝回転を亢進させ，褐色脂照雄先生，研究実施に携わってくれた所属研究室の大学

肪細胞・ベージュ脂肪細胞マーカー遺伝子 uncoupling

院生，職員および共同研究先の先生方にも心より深謝申protein 1 (UCP1) の発現を上昇させたが，KetoA によし上げます．

る UCP1 発現誘導はβ-アドレナリン受容体遮断薬および消化管迷走神経切除によって消失した．以上より，
KetoA は「消化管 TRPV1 活性化」→「求心性迷走神経」

血管および脂肪組織由来新規分泌因子 Favine の機→「中枢神経」→「交感神経活性化」→「BAT 機能亢進」

能解析

経路を介して BAT 機能活性化作用を示すことが明らか

小

林

祥

子
（大阪大学大学院医学系研究科）になった（FASEB J. 2017）．さらに，n-3 系多価不飽
和脂肪酸の腸内細菌代謝産物が PPARγおよび GPR40
活性化を介してマクロファージの終末分化を制御するこ【目的】とでマクロファージ極性を調節し，抗炎症作用を示すこ

我 々 は， 血 管 か ら 分 泌 さ れ る， 糖 尿 病 と 肥満や動と (FASEB J. 2018), enone 構造を有する多価不飽和脂脈硬化症に関わると推定される新規因子として，Fat/肪酸代謝産物がマクロファージに対する抗炎症活性を示

vessel-derived secretory protein (Favine)/ Coiled-coil

すことで，炎症による BAT 機能抑制作用を軽減させる

domain containing 3 (CCDC3) を同定した．我々の実．以上より，
可能性を示した（Mol Nutr Food Res. 2017）

験結果から Favine は，血管と脂肪で高く発現する分泌多価不飽和脂肪酸の腸内細菌代謝産物は TRPV1 活性化因子であり，糖脂質代謝異常や炎症に関連する刺激によや炎症抑制作用を介して BAT 機能調節作用を示すことり，その遺伝子発現量が変動することが明らかとなったが明らかとなった．これらは腸内細菌による宿主代謝制が，その機能は未知であった１）．Favine の機能解析を御機構の一端を担っていることが示唆される．

目的に本研究を行った．

【総括】

【方法】

肥満は脂肪組織の過剰蓄積状態と定義され，脂肪組織

Favine 遺伝子改変 3T3-L1 脂肪培養細胞および血管機能の解明は糖尿病など肥満関連疾患の有用な予防・改内皮培養細胞ならびに Favine ノックアウトマウスにお善策の創出への寄与が期待される．本研究課題においける機能解析

て，助成者らは，『脂肪組織形成・発達において脂肪細【結果】

胞のイソプレノイド合成経路が必須の役割を担うこと』，

Favine 過剰発現 3T3-L1 細胞は分化が亢進し，また『肥満状態で惹起される慢性炎症状態下では脂肪組織の脂肪合成が促進することが明らかとなった．Favine 欠

熱産生機能亢進が減弱すること，いくつかの多価不飽和損マウス（以下，KO マウス）は，発生，生存，成長面

脂肪酸の腸内細菌代謝産物が BAT 機能調節作用を有し，において野生型と差を認めなかった．KO マウスは，若腸内細菌による宿主代謝制御に関与する可能性があるこ

週齢時のインスリン感受性は正常であったが，加齢に伴と』を見出した．今後は，これらの知見を基盤とした肥う体重増加および脂肪肝の進展が抑制され，１年齢では満関連疾患の新たな予防・治療法の創出へと昇華させる

野生型に比してインスリン抵抗性の軽減を認めた．KO

ことを目標に，さらなる検討を進めたい．

マウスの脂肪組織では脂肪細胞サイズが小さく，脂肪合成関連遺伝子発現の低下が認められた２）．血管内皮細胞

9

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

HUVEC において，TNFαにより Favine 遺伝子発現量

伴ウィルスベクター）を用いて Activin B を持続的に発が低下し，Favine により TNFα誘導性の炎症関連因子

現させることによる影響を解析したところ，短期的なの発現が変動した．Favine/ApoE 欠損マウスは重篤なActivin B 強制発現時と同様に，肥満マウスのインスリ動脈硬化症の病態を呈した．

ン抵抗性の改善およびインスリン分泌の亢進を伴い，耐【考察】

糖能異常は著明に改善した．また，持続的な Activin B

Favine は，脂肪蓄積促進作用を有し，インスリン抵

発現亢進により除脂肪体重には変化を認めず，肥満マウ

抗性，血管の炎症，動脈硬化に関与する分泌因子である

スの脂肪量および体重は有意に低下した．遺伝子発現ことが示唆された．

解析から，皮下脂肪組織および褐色脂肪組織において【文献】

FGF21 発現の亢進を認めた．また，持続的に Activin

１）Identiﬁcation of a new secretory factor, CCDC3/B を発現亢進したマウスにおいては，肥満により組織

Favine, in adipocytes and endothelial cells. Bio-

学的に白色化した褐色脂肪組織の褐色化を認めており，

chem Biophys Res Commun. 392, 29-35 (2010)

Ucp1 や Cidea などの褐色脂肪組織特異的な遺伝子群

２）Fat/Vessel-derived Secretory Protein (Favine)/の発現量は有意に上昇していた．以上から，持続的なCCDC3 Is Involved in Lipid Accumulation. J.

Activin B 産生亢進により褐色脂肪組織機能の改善が示

Biol. Chem. 290, 7443-7451 (2015)

唆された．現在，これらの効果が FGF21 によるものか

これまでの研究助成に深謝致します．

ノックアウトマウスを用いて引き続き検証を行っている．
【考察】

Activin B による糖・エネルギー代謝制御機構の解明
小

林

直

樹

（国立国際医療研究センター研究所）

ActivinB と そ の 下 流 シ グ ナ ル 伝 達 経 路 は 絶食時のFGF21 発現誘導に寄与しており，また Activin B の強制発現では少なくとも一部で FGF21 発現誘導を介して全身の代謝改善作用を及ぼすものと考えられた．

【目的】
TGFβスーパーファミリーリガンドのひとつである
Activin B が絶食やケトジェニック食摂取などの代謝ス
トレス時に肝臓において発現が強く誘導されたことか
ら，ActivinB の代謝制御における役割を明らかにすべ

糖尿病患者における食事調査の申告誤差と肥満との関連：CLEVER 研究
近

藤

慶

子
（滋賀医科大学）

く検討を行った．
【方法および結果】
Activin B の強制発現によってインスリン感受性・イ【目的】

ンスリン分泌の改善を伴って糖尿病モデルマウスの耐糖尿病患者において，エネルギー摂取量の管理は治療

糖 能 異 常 は 著 明 に 改 善 さ れ た．ActivinB に よ る 効 果

上重要である．エネルギー摂取量の評価には，通常，食の作用機序について検討したところ，絶食時に誘導さ事記録法や思い出し法等の食事調査が用いられる．しかれ代謝調節に関与することが知られている FGF21 が，し，これらの方法は対象者の自己申告による情報をもと

Activin B によって誘導され，逆に ActivinB のノックに評価しており，特に肥満者における申告誤差が報告さ

ダウンより絶食時の FGF21 発現は障害されていた．まれている．一方で，エネルギー消費量の最も正確な評価

た，FGF21 ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス を 用 い た 検 討 か ら，

法は二重標識水法とされており，体重・体組成が一定でActivinB 強制発現によるインスリン感受性亢進作用にある場合，エネルギー消費量はエネルギー摂取量と同等おける FGF21 の寄与が示された．

となる．本研究では，糖尿病患者における，食事調査に続いて，肥満マウスモデルにおいて AAV（アデノ随0よるエネルギー摂取量と二重標識水法によるエネルギー

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

消費量の乖離と肥満との関連について検討した．

される小胞体ストレスを介して糖脂質代謝を調節する一【方法】

方，その発現低下が肥満・糖尿病の病態形成に関与して

滋賀医科大学医学部附属病院糖尿病内分泌内科に外いることを見出し，更なる詳細な機序について検討を加

来通院中の 60～79 歳の糖尿病患者を対象とした．二えた．

重標識水法を用い，総エネルギー消費量（total energy【方法】

expenditure, TEE）を測定した．また，３日間の食事

Sdf2l1 の機能を考える上で重要な，相互作用の相手記録法によりエネルギー摂取量（energy intake, EI）をとなる蛋白を探索した．またヒト肝生検検体を用い，評価した．対象者を肥満者（BMI ≥ 25kg/m2）あるい

Sdf2l1 の発現誘導と臨床情報の照らし合わせを行なっは非肥満者（BMI＜25kg/m2）に分け，TEE と EI の差

た．

および EI/TEE 比を男女別に比較した．

【結果】
独自に樹立した Sdf2l1 欠損線維芽細胞の膜画分を用【結果】
糖尿病群 52 名（平均年齢 70.2 歳，
男性 28 名 [53.8%]）

い，免疫沈降と質量分析の手法によって候補蛋白を絞りのうちインスリン治療 18 名（34.6%），経口薬治療 20

込んだ．その中から膜輸送蛋白 TMED10 に着目し，両名（38.5%）， 食 事 療 法 14 名（26.9%） で あ っ た． 全者が協調的に変異蛋白のユビキチン化に寄与している

対 象 者 に お け る TEE と EI の 差 は 238±412kcal/day,

ことを示した．またヒト糖尿病症例における転写因子

EI/TEE 比は 0.90±0.19 であった．女性において，EI/

XBP-1s による Sdf2l1 の発現誘導は，インスリン抵抗

TEE 比は BMI との間に有意な負の関連を認めた（R＝性があると低下する一方，肝線維化と負に相関すること－0.515, p＝0.010）が，男性では関連を認めなかった．

を見出した．このような結果は非糖尿病症例では認めら

一方，女性において，EI/TEE 比は肥満者で非肥満者にれなかった．

比し有意に低値を示し（0.85±0.15 vs 1.01±0.21, p【考察】＝0.045），男性では有意な差を認めなかったが，肥満

Sdf2l1 の機能はこれまで十分明らかではなかったが，者，非肥満者ともに低値を示した（0.85±0.20 vs 0.87

本研究により Sdf2l1 はおそらく小胞体膜周辺に分布し，±0.17, p＝0.785）．

TMED10 との相互作用を介して変異蛋白のユビキチン・【考察】

プロテアソーム系による分解を促すことが示唆された．

非肥満女性の EI/TEE 比は約１であり，食事調査によ

これが小胞体ストレスの軽減をもたらし，ひいては肝臓るエネルギー摂取量の推定が正確であることが示唆されにおける糖脂質代謝の改善につながるものと考えられた．一方，肥満女性および男性における EI/TEE は低く，た．一方ヒトの糖尿病ではインスリン作用が低下してお食事調査によるエネルギー摂取量は 13～15% 程度の過り，肝臓においては転写因子 XBP-1s の核移行が障害さ小評価が示唆された．食事調査を用いたエネルギー摂取れるものと想定されている．今回の肝生検検体における量の推定には注意が必要であると考えられる．

結果から，XBP-1s の転写活性が低下すると Sdf2l1 の発現が十分誘導されず，これが脂肪性肝炎の進展につな

新規小胞体ストレス調節因子 Sdf2l1 による肝臓での糖脂質代謝調節作用の検討
笹子

敬がることが明らかとなった．すなわち糖尿病合併脂肪性肝炎では，同非合併脂肪性肝炎と異なり，XBP-1s の機能低下を中心とした小胞体ストレス応答不全が病態形成

洋において重要であることが示され，Sdf2l1 の発現誘導（東京大学大学院医学系研究科）

低下がその良いマーカーとなることが期待される．
【文献】【背景・目的】我々は肝臓における摂食状態に応じた代謝調節機構に着目し，Sdf2l1 という分子が，摂食時に一過性に誘導

Sasako T, Kadowaki T, Ueki K, et al: Hepatic Sdf2l1
controls feeding-induced ER stress and regulates
metabolism, Nat Commun 10, 947 (2019).

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

腸管内分泌Ｋ細胞およびＩ細胞を介した高脂肪食誘
導性肥満の機序解明
三小田が大きく貢献している可能性が示唆された．またＩ細胞上で，種々の栄養素の感知に重要な遺伝子の発現も確認
された．

亜希子

【結語】
（京都大学大学院医学研究科）

Ｉ細胞の可視化および単離回収に成功した．小腸およ
び大腸でＩ細胞が確認され，栄養素の感知に重要な遺伝【背景】

子発現が確認された．

コレシストキニン（CCK）は，糖や脂肪などの栄養素摂取に応答して，腸管内分泌Ｉ細胞から分泌され，胆嚢収縮および膵酵素分泌を促進して腸管内脂肪の分解吸収に関与している．CCK 受容体欠損マウスでは，高脂Wfs1 欠損によるβ細胞機能障害とインクレチンの効果に関する研究：ヒトの糖尿病病態と膵β細胞

肪食誘導性肥満が軽減しており，生体内での CCK シグ

脱分化の関わりナルあるいは CCK 分泌抑制は，肥満治療のターゲット

椎木幾久子（山口大学医学部）となる可能性がある．しかし腸管内分泌Ｉ細胞の栄養素
感知，CCK 分泌機序は未だ十分に解明されていない．
【方法】

【目的】

CCK-IRES-Cre ノ ッ ク イ ン マ ウ ス と Rosa26-ﬂoxed

我々は Wolfram 症候群（WS）のモデル動物 Wfs1 欠

tdTomato マウスの交配マウス腸管を用いて，抗 RFP

損マウスにおいて，膵β細胞脱分化が膵β細胞不全の要抗体と抗 CCK 抗体で免疫組織化学染色を行った．フロー

因であることを明らかにしてきたが，ヒトについては不サイトメーターを用いて腸管内Ｉ細胞数の評価と RFP明である．一方，２型糖尿病（T2D）患者膵島におい陽性細胞の単離回収を行った．

て脱分化細胞を認めるが，脱分化の糖尿病病態進展への【結果】

関与は不明である．今回，WS 患者のβ細胞不全およびRFP 陽性細胞は，上部小腸，下部小腸，大腸で確認

T2D 患者の病態進展と脱分化との関連を解明することされ，CCK 陽性細胞と一致した．全腸管細胞あたりを目的とし研究を行った．

RFP 細 胞 は， 上 部 小 腸 0.95%， 下 部 小 腸 0.54%， 大【方法】

腸 0.06% で あ っ た．CCK mRNA は，RFP 陰 性 細 胞WS：患者２例および対照として年齢を対応させた剖

で発現を認めず，RFP 陽性細胞で高発現していた．小検膵を用いた．T2D：膵胆道疾患により外科切除された

腸 RFP 陽性細胞では，大腸 RFP 陽性細胞に比較して膵組織標本を用いた．糖尿病の家族歴がなく全経過で過有意に CCK mRNA 発現量が高く，上部小腸 RFP 陽性

体重（BMI 25 以上）を認め年齢，手術対象疾患をマッ細胞で CCK mRNA 発現が最も高い傾向を示した．脂チさせた正常耐糖能患者（対照群 11 例）と T2D 患者

肪酸および OEA をリガンドとする GPR120, GPR40,を対象とし，T2D 群を罹病期間（５年以下 vs. 10 年以GPR119 は上部小腸 RFP 陽性細胞で特異的に発現して上），糖尿病細小血管合併症（無 vs. 一つ以上有する），

いた．また下部小腸 RFP 陽性細胞では，短鎖脂肪酸とインスリンおよび SU 薬（無 vs. １年以上の薬剤使用）

胆汁酸をリガンドとする GPR43, TGR5 が特異的に発の条件に基づき早期群 12 例と進展群 11 例に分類し現していた．グルコースおよびフルクトース輸送担体

た．組織解析：主要膵ホルモン（インスリン，グルカ

SGLT1, GLUT2, GLUT5 は上部小腸 RFP 陽性細胞で高ゴン，ソマトスタチン，膵ペプチド），クロモグラニン

い傾向にあった．アミノ酸受容体である CaSR は上部小Ａ（ChgA）に対する抗体を用い免疫組織染色を行った．

腸 RFP 陽性細胞で特異的に発現していた．

膵面積に対するインスリン陽性面積比（β）およびグル【考察】

カゴン陽性面積比（α）を計測し，膵島量として ChgA

栄養素摂取後の CCK 分泌には小腸に局在するＩ細胞

陽性面積比を計測した．膵島内 ChgA 陽性細胞に対す

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

るインスリン陽性細胞比（βi），グルカゴン陽性細胞数

分画と CD45(－) 分画を作成．RT-PCR により，マクロ比（αi ）を計測した．主要膵ホルモン陰性 ChgA 陽性

ファージを有する CD45(＋) 分画に GIP 受容体遺伝子

細胞を脱分化細胞とし，ChgA 陽性細胞に対する細胞数が強く発現していることを見出した．発現量は脂肪細胞比を計測した．

を含む分画よりも多く，GIP のシグナルは脂肪細胞のみ【結果】

ならず，脂肪細胞に近接して存在するマクロファージにWS では対照に比し膵島サイズや分布に異常を認めなも生理作用を及ぼしていることが強く推測された．

かったが，インスリン陽性細胞は著減し脱分化細胞が増次 に，GIP 受 容 体 欠 損 マ ウ ス を 脂 肪 組 織 内 マ ク ロ

加していた．T2D では膵島量，βおよびαは対照群にファージに対する GIP の生理作用を検討する目的で，比し増加しているものから低下しているものまで様々

骨髄移植により，野生型マウスの脂肪組織間マクロであり代謝病態の多様性が推察された．膵島あたりのファージを GIP 受容体欠損マクロファージへの置換を

ChgA 陽性細胞数に変化はなかった一方で，T2D 膵島

試みた．GIP 受容体欠損マウスの骨髄を野生型マウスにでは対照群に比しβi 低下，αi 増加とともに脱分化細移植したもの（KO→WT）を作成し，コントロールと胞数の顕著な増加を示した．脱分化細胞数は病態進展にして作成した野生型マウスの骨髄を野生型マウスに移植ともなって増加し，β細胞機能の指標である C-peptideした群（WT→WT）と比較を行った．移植後８週で行っindex と有意な逆相関を示した．

た採血にて，移植の成功を確認している．この時点で耐【考察】

糖能を確認した後，高脂肪食の投与を開始し，体重推移・

WS の膵β細胞量減少と脱分化との関連が示唆され

高脂肪食開始後４週間での耐糖能検査を行った．高脂肪

た．T2D では病態進展と脱分化の臨床関連が示され，食開始前の耐糖能は両群で差はなし．高脂肪食負荷後の脱分化が膵β細胞不全の基盤病態であることが強く示唆

耐糖能は有意差を認めなかったものの KO→WT 群におされた．

いてインスリン感受性・血糖など耐糖能において良い
傾向を認めた．また高脂肪食負荷後の体重増加は KO→

脂肪組織におけるマクロファージを介した GIP 受
容体シグナルの役割の解明
清水辰

WT マウス群において有意に抑えられており，興味深い結果と考えている．骨髄移植モデルの問題点として，移植細胞による置換は 100% とならず，また移植される

徳

骨髄量に個体差が生じ得ることが挙げられ，高脂肪食負（秋田大学大学院医学系研究科）

荷後の有意な耐糖能の改善がみられなかった原因と考えている．遺伝子改変技術を用いて作成した新たなモデル【目的】

マウスでの再検証が必要と考えている．

GIP の分泌は食事量・栄養素の違いによって変化する
ことから，食生活を強く反映するホルモンと言える．これまで GIP シグナルは，脂肪細胞における中性脂肪の臨床情報，ゲノム情報を活用した２型糖尿病のサブ取り込みを促進することが報告されているが，我々は脂タイプ分類

肪組織内マクロファージにも GIP 受容体が強く発現し鈴木顕（大阪大学大学院医学系研究科）ていることを見出した．本研究では，GIP シグナルが脂肪組織内マクロファージを介し，近接する脂肪細胞や全身に与える影響を考察することを目的とする．
【方法・結果】【方法】
当該年度には，大規模ゲノム解析を実施し，２型糖尿

我々はこれまでに，脂肪組織からマクロファージを病に関連する遺伝子を選定した．バリアントの選定につ含む SVF (Stromal Vascular Fraction) を分取し，これいては条件を柔軟に設定し，さまざまな選定パターンをを CD45 抗体付きマグネットビーズによって CD45(＋)

実施した．公共データベースに登録されている 2500 人

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

分のゲノムデータとバリアント情報を活用し，対象集団

上により層別化や分類の精度が格段に向上した．

のジェノタイプデータを推定することで，全ゲノム上の【結果】

バリアントのカバー率を向上させた．このカバー率の向各種アルゴリズムによる解析を実施し，層別化や分類について新たな洞察を得た．まず，疾患の層別化については，従来より知られている疫学的な層別化に双肩しうる性能を有する可能性が明らかとなった．一方，分類についてはこれまで異質性，多様性が指摘されていたが，明らかな分類法は確立されていなかった．今年度の研究において，ゲノムデータに対して，これまで応用される

図１

層別化のためのスコア計算に用いた２型糖尿病 GWAS メタ解析の一例

ことが稀であったアルゴリズム・手法を積極的に応用す

２ 型 糖 尿 病 症 例 16,870 例， 対 照 群 317,601 例，
22,216,661 バリアントについて関連解析を実施した．これらの結果を用いて層別化を行った．

臨床データと各分類との関連を網羅的かつ定量的に評価ることにより，分類に関する新たな知見を得た．各種
し，特徴的な関連を同定した．また，オンライン上に公開されている公共データベースを用いて，分類の分子生物学的特徴を評価したところ，各分類に有意に関連する事象を同定することができ，各分類の分子生物学的特徴づけを行うことに成功した．上記結果は，２型糖尿病の病態の理解を促進し，２型糖尿病の診療改善に寄与することが期待される．
【考察】
当該年度には研究計画に記載した予定通り，大規模なゲノム解析を実施し，層別化と分類について知見を得る

図２

ゲノムデータを用いたサブタイプ構造解析

選択の閾値の設定の仕方により様々なサブタイプ
構造が見出された．

ことができた．特に，層別化については疫学的な層別化に比肩しうる性能を有することがわかるなど，期待の持てる結果が出てきており，今後の研究の推進に資する結果となっている．また，分類に関してもこれまで明らかではなかった分類方法が見出されており，今後深く追及することにより更なる有用な知見が得られることが期待される．

single-cell RNA sequencing を用いたβ細胞新生経路の解明鈴木路

可（順天堂大学大学院医学部）

図３

クラスターごとの糖尿病有病率

各クラスターと２型糖尿病有病率との関連を評価した．

我々はこれまで，胎生期および成体におけるβ細胞
新生に焦点を当てて研究を行ってきた．具体的には，“Ins1-Timer マウス” を用いて新生β細胞数を定量し，新生β細胞の遺伝子発現プロファイル，および細胞周期

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成の特性を明らかにした（Miyatsuka T et al. Diabetes,光陽性）” と新生β細胞（緑色蛍光のみ陽性）とを合わ

3388-3393, 2014）．このマウスでは，FACS による新せて pseudotime 解析を行った結果，２つのβ細胞は生β細胞単離および，その遺伝子プロファイル解析に成

擬似的な時間軸に沿って２つの細胞集団に分けて展開功したものの，新生β細胞の位置情報を得ることが困された．このことは Ins1-GFP; Timer マウス胎生期膵難であった．本研究課題では，この問題を克服するため

臓より FACS で単離された新生β細胞が，unbiased なに新たなレポーターマウス Ins1-eGFP; Timer double

pseudotime 解析においてもより未分化な細胞集団としtransgenic mouse (Ins1-Timer; GFP マ ウ ス) を 作 製て同定されることを示しており，GFP と Timer 蛋白のし，蛍光顕微鏡下で新生β細胞を緑色蛍光細胞として観蛍光特性の差を利用した本実験系の妥当性を異なる角度

察することに成功した．新生β細胞と膵管，血管との位から示す結果となった．

置関係を解析した結果，胎生期膵臓には起源の異なる２以上のように蛍光顕微鏡での観察結果から，位置情

種類の新生β細胞，すなわち膵管近傍にある内分泌前報として２つの新生β細胞の存在が示唆され，scRNA-

駆細胞がその場でβ細胞へと分化した “膵管近接型” 新

seq から得られた unbiased な解析結果からも新生β細生β細胞（βduct 細胞）と，膵管近傍の内分泌前駆細胞

胞間の heterogeneity を示す結果であった．今後は上記が血管周囲に移動した後に分化する “血管近接型” 新の scRNA-seq の結果をヒト ES 細胞由来インスリン産生β細胞（βvessel 細胞）が存在することが明らかとなっ生細胞の scRNA-seq データと比較検討し，上記データ

た．さらに，免疫組織学的染色を行った結果，大部分のを統合，論文化を目指す．

βduct 細胞は Mafb を，大部分のβvessel 細胞を Mafa を発現していることが明らかとなった．
次に，新生β細胞の遺伝子発現プロファイルを１細胞レベルで明らかにするために ﬂuorescence-activatedcell sorting (FACS) により新生β細胞を単離し，singlecell RNA-sequencing (scRNA-seq) を行った．得られメタボローム解析を用いた脂肪細胞分化・褐色化制御に関する研究高橋

春弥（京都大学大学院農学研究科）

た scRNA-seq データをもとに t-SNE プロットを作成し，新生β細胞間の heterogeneity を１細胞レベルで解析したところ，新生β細胞は高発現する遺伝子の特徴から，【研究背景・目的】

細胞”

肥満等から誘導される種々の生活習慣病の予防・改善② somatostatin (Sst) を高発現する “βSst 細胞”を図るうえで，脂肪組織は重要な組織である．なぜなら，③ glucagon (Gcg) を高発現する “βGcg 細胞”

脂肪細胞は単にエネルギー（脂肪）を貯蔵するだけでな④ Pdx1, Mafb を高発現する “βPdx1 細胞”

く，条件によってはエネルギー消費にも寄与するからで① Neurog3, Pax4 を高発現する “βNeurog3ある．通常の脂肪細胞（白色脂肪細胞）は主にエネルギー⑤ Ins2, Ins1 を高発現する “βIns2 細胞”細胞を蓄積するが，寒冷環境下や特定の薬剤・食品成分によが Mafb を高発現しており，イメージング解析における刺激時には，エネルギーを積極的に消費する褐色様脂

るβduct 細胞に相当する可能性が示唆された．さらに

肪細胞に変換する．この現象は動物実験用マウスだけでpseudotime 解析において擬似的に設定した時間軸になくヒトでも生じることが知られているが，どのような沿って，上記５つの細胞集団を unbiased に解析した結メカニズムで白色脂肪細胞から褐色様脂肪細胞に変換す

果，β細胞へと分化した後，α細胞

るのか，いまだに明らかになっていない部分が多く残さ系譜の特徴を具有するβGcg 細胞と，Pdx1, Ins2 といっれている．また，そもそもの脂肪細胞の分化制御機構にたβ細胞特異的遺伝子を高発現するβPdx1 細胞・βIns2 細

ついても，不明確な部分が多く残されている．そこで，胞へと別れて分化する可能性が示唆された．

本研究では，メタボローム解析技術を応用し，褐色様脂の ５ つ に 再 分 類 さ れ， そ の う ち の １ つ β

Pdx1

Neurog3

細胞からβ

Sst

さらに “分化したβ細胞（緑色蛍光陽性かつ赤色蛍肪細胞への変換及び脂肪細胞への分化を制御する内因性Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

低分子代謝物の探索・同定を目的とした．

DNA のターゲットシーケンスを行い，必要に応じて全【方法】

エクソンシーケンスを追加する．そして，一般人口におβ3 アドレナリン受容体のアゴニストである CL316243

いて稀であり（ゲノムデータベース [1000 Genomes,(CL) を投与し，脂肪細胞の褐色化を進行させた C57BL/

Human Genetic Variation Database] において対立遺6J マウスの血中及び褐色脂肪組織（BAT），鼠径部脂肪

伝子頻度＜１％），タンパク機能に重大な影響を及ぼす組織（IWAT），精巣周囲脂肪組織（EWAT）の代謝物を可能性が高いと予測される変異を抽出する．罹患血縁者

LC-MS を用いて分析し，得られた超精密質量データをが存在する場合は共通する変異を絞り込み，発症原因変

活用したメタボローム解析により，代謝変動の全体像を異候補とする．

解析した．また，分化過程の培養脂肪細胞について，経【結果】

時的に細胞内代謝物を抽出し，メタボローム解析により，［1］インスリン分泌不全の顕著な非肥満糖尿病患者

分化における代謝変動の全体像を解析した．

４名（空腹時血清 C-ペプチド＜0.3ng/ml）を有する家【結果及び考察】系（家系１）にて，罹患者４名と家系内非罹患者２名をCL 投与により，特に IWAT において，代謝変化が大きいことが観察され，データベースを用いた解析の結果，

全エクソンシーケンスの対象とし，罹患者に共通する発症原因変異候補を 16 個に絞り込んだ．

特に核酸代謝経路やアミノ酸代謝経路上に存在する低分

このうち，ADAMTSL3遺伝子 A137T 変異 (rs181914721)

子代謝物が顕著に変化することが示された．また，培養は，複数のゲノムコホート（ながはまコホート・高山コ

細胞分化過程における経時的な代謝変化については，解ホート）の糖尿病非罹患者に比して，京都大学および共析の結果，核酸代謝経路や糖代謝経路上に存在する低分

同研究機関の糖尿病患者 119 名において高頻度であり，子代謝物が顕著に変化することが示された．これらの結さらに，同変異がみられた糖尿病患者３名のうち１名の果から，脂肪細胞の分化・褐色化制御にアミノ酸・核酸・家系（家系２）において，罹患血縁者９名中６名が同変糖代謝経路が重要な役割を担うことが示唆された．

異を有していたことから，糖尿病発症感受性変異である可能性が高いと考えた１）．

日本人の若年発症非肥満糖尿病患者における網羅的
次世代シーケンスの試み
田

中

大

祐

［2］30 歳以下で糖尿病を発症し，肥満歴がなく GAD
抗体陰性で，MODY1～６の原因変異を有さない 13 名を対象とし全エクソンシーケンスを行った結果，既知の単一遺伝子異常による糖尿病の原因遺伝子（35 遺伝子）（京都大学大学院医学研究科）

における希少変異として，PPARG 遺伝子の Y173fs 変異が１名（患者１），WFS1 遺伝子の K193del 変異が１

【目的】

名（患者２），PTF1A 遺伝子の S18F 変異が１名（患者３）単一遺伝子糖尿病の可能性が考えられる若年発症者をに検出された．各変異は糖尿病発症に寄与した可能性が対象とし，ゲノム DNA の次世代シーケンス解析を行い，示唆され，特に PTF1A 遺伝子の S18F 変異は，患者３ゲノムワイド関連解析（GWAS）では同定困難であった，の血縁者で若年発症糖尿病を有する２名にも存在し，家

一般人口において低頻度だが糖尿病発症に与える影響の系の糖尿病発症原因である可能性が示唆された．

大きい変異（mutation）を同定し，糖尿病発症の遺伝【文献】

素因解明に貢献する．

１）Jambaljav B, Tanaka D, Nagashima K et al.

【方法】

Whole-exome sequencing in a Japanese family

35 歳未満での若年発症糖尿病患者で膵島関連自己抗with highly aggregated diabetes identiﬁes a can-

体陰性である 65 名およびその血縁者につき，京都大学

didate susceptibility mutation in ADAMTSL3.

および共同研究機関にてゲノム DNA を採取する．既知

Diabetes Res Clin Pract. 135: 143-149 (2018)

糖尿病発症原因遺伝子のエクソン領域についてゲノムFront Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

交感神経過活動によるグレリンの発現の低下と疾患

Depletion of CD206 M2-like macrophagesとの関連の検討

induces proliferation of adipocyte progeni-

坪

内

拡

tors and improves insulin sensitivity

伸（宮崎大学医学部）

Allah Nawaz（富山大学医学部）【背景・目的】
グレリンは胃から分泌される生理活性物質であり，摂Background

食亢進作用と強力な抗炎症作用を有する．グレリンの抗White adipose tissue (WAT) markedly adapts to

炎症効果のメカニズムは不明である．本研究では，迷走

nutrient excess through adipocyte hypertrophy and

神経切断処置を行ったマウスに対して，グレリン抗炎症

hyperplasia１－３）. The WAT expansion greatly aﬀects

作用の効果を検討した．

the pathogenesis of obesity through diﬀerent cellular【方法】

mechanisms４）. Adipocyte size is inversely related to

10 週齢の C57BL6 マウスに，迷走神経切断術または

insulin resistance５）, whereas the number of adipo-

sham 手術を行い，ブレオマイシン（BLM）の気管内投

cytes is related to the pool size of adipocyte progeni-

与による急性肺損傷モデルを作成した．それぞれ，PBS

tors (APs). Several groups, including our laboratory,

またはグレリン（3 nmol/kg）を腹腔内投与し，摂餌量，

have reported that M1 inflammatory macrophages

体重変化，気管支肺胞洗浄液（BALF）中の総細胞数，

regulate the expression of angiogenic genes in pre-肺組織中の炎症性サイトカインとケモカインの発現を検

adipocytes ３,６）, suggesting interactions between

討した．

macrophages and APs. It is still unknown how the【結果】

proliferation and diﬀerentiation of APs are regulated

急性肺損傷モデルにおいて，グレリン投与は sham 手術群において，摂餌量と体重の低下，BALF 中の炎症
細胞数の増加，血管透過性の亢進，肺組織中の TNF-α,

by M2 macrophages within WAT, thus controllingthe insulin sensitivity.
Obesity is associated with a phenotypic transfor-

IL-6, IL-1β, CXCL2 の発現の亢進が抑制されていた．

mation of macrophages, from anti-inﬂammatory

迷走神経切断群においては，グレリンの投与による摂M2 to pro-inflammatory M1 macrophages, thereby

餌量の低下の抑制は認められなかったが，BALF 中のcausing insulin resistance １, ７, ８）. Much has been

総細胞数の増加，血管透過性の亢進，肺組織中の IL-6,

known about M1-like macrophages role in the in-

IL-1βの発現の亢進の抑制が認められた．

ﬂammatory process in obese adipose tissue which is【考察】

known closely related to the development of insulin

急性肺損傷モデルにおいて，迷走神経切断群において

resistance both in human and animal. Nonetheless,もグレリン投与は抗炎症効果を認めた．以上から，薬理

it is largely unknown how depletion of M2-like mac-

量のグレリン投与は直接的な抗炎症作用を有することがrophages in lean state regulates insulin sensitivity

示唆された．

and adipocyte progenitors (APs) proliferation.
Purpose;The current study aimed to investigate the eﬀectof depletion of CD206 M2-like macrophages on systemic insulin sensitivity and adipocyte progenitorʼ sproliferation.

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

Methodobserved in the CD206 cell-derived Tgfβ1 KO mice.

To understand the role of M2-like macrophages inCollectively, we identiﬁed a novel role of CD206 M2-

white adipose tissue (WAT), we utilized previously

like macrophages in adipose tissues to constitute an

generated CD206DTR mice, based on transgenic

important microenvironment in which they regulate

expression of diphtheria toxin receptor (DTR) underAPsʼ

the control of Mrc1+ (CD206) promoter to specifi-

adiposity and systemic insulin sensitivity９, 10）.

cally deplete CD206 M2-like macrophages９）. Diph-

Conclusion

growth/differentiation and thereby control

theria toxin (DT) was intraperitoneally injected at

We concluded that CD206 M2-like macrophages

a dose of 3 ng/gram body weight 3-4 times every

provide a niche for adipocyte progenitors to regulate

other day. We determined the eﬀect of depletion of

their growth and diﬀerentiation into matured adipo-

CD206 M2-like macrophages on various parameters

cytes, thus controlling adiposity and insulin.

including insulin sensitivity, glucose tolerance, andReferences

APs proliferation.

１）Odegaard JI, Chawla A. Alternative macro-

Results
The current study revealed that adipose tissue
CD206+ cells are primarily M2-like macrophages,

phage activation and metabolism. Annu Rev

Pathol. 2011; 6: 275-97. doi:10.1146/annurevpathol-011110-130138

and ablation of CD206 M2-like macrophages en-２）Qiu Y, Nguyen KD, Odegaard JI, et al. Eosino-

hanced APs proliferation and induce systemicphils and type 2 cytokine signaling in macro-insulin sensitivity, which was associated with anphages orchestrate development of functional

increased number of smaller adipocytes, thereby,

beige fat. Cell. Jun 5 2014; 157(6): 1292-308.

control adiposity and systemic insulin sensitivity.

doi: 10.1016/j.cell.2014.03.066

The depletion of CD206 M2-like macrophages im-３）Lee YH, Petkova AP, Granneman JG. Identiﬁca-

proved glucose tolerance by increasing insulin sensi-

tion of an adipogenic niche for adipose tissue

tivity (without aﬀecting inﬂammatory status), which

remodeling and restoration. Cell Metab. Sep

is associated with increased number of smaller adi-

3 2013; 18 ( 3 ) : 355-67. doi:10.1016/j.cmet.

pocytes expressing metabolically favorable genes in-

2013.08.003

cluding adiponectin, Pgc-1α , Glut4 and Cpt-1β We４）Sun K, Kusminski CM, Scherer PE. Adipose tis-found that depletion of CD206 M2-like macrophages

sue remodeling and obesity. J Clin Invest. Jun

induced adipogenesis and proliferation of APs.

2011; 121(6): 2094-101. doi: 10.1172/jci45887

Mechanistically, we attributed these effects to the５）Salans LB, Knittle JL, Hirsch J. The role of adi-

downregulation of CD206 (+) cell-derived TGFβ topose cell size and adipose tissue insulin sensitiv-

APs. This was further conﬁrmed by direct injection

ity in the carbohydrate intolerance of humanof anti- TGFβ inhibitory antibody. In vivo and in vi-

obesity. J Clin Invest. Jan 1968; 47(1): 153-65.

tro studies revealed that Tgfβ abundantly expressed

doi: 10.1172/jci105705

in CD206 M2-like macrophages, thus regulating APs

６）Takikawa A, Mahmood A, Nawaz A, et al. HIF-

differentiation and proliferation. To validate this1alpha in Myeloid Cells Promotes Adipose

hypothesis, we generated a genetically engineered

Tissue Remodeling Toward Insulin Resistance.

Tgfβ1 KO mice in which CD206 cell-speciﬁc Tgfβ1

Diabetes. Dec 2016; 65(12): 3649-3659. doi:

was knocked out after tamoxifen treatment. In-

10.2337/db16-0012

creased number of APs and smaller adipocytes were

128７）Lumeng CN, DelProposto JB, Westcott DJ,

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

Saltiel AR. Phenotypic switching of adiposeと糖尿病病態との因果関係や，それに関する MG の機

tissue macrophages with obesity is generated

能性については良くわかっていない．これまでに我々は，

by spatiotemporal differences in macrophage

出芽酵母および脂肪細胞において，MG が mTORC2 シ

subtypes. Diabetes. 2008; 57(12): 3239-46.

グナルの活性化因子として機能することを見出してき８）Olefsky JM, Glass CK. Macrophages, inﬂamma-

た（Mol. Cell. Biol. 35: 1269-1280, 2015）．また，脂tion, and insulin resistance. Annu Rev Physiol.

肪細胞において MG は mTORC1 シグナルの活性化も2010; 72: 219-46. doi: 10.1146/annurev-

引き起こしたが，その活性化機構については不明であっphysiol-021909-135846

た． そ こ で 本 年 度 は， 脂 肪 細 胞 に お け る MG に よ る９）Nawaz A, Aminuddin A, Kado T, et al. CD206+

mTORC1 シグナル活性化機構の解明を目指して解析を

M2-like macrophages regulate systemic glu-

行った．

cose metabolism by inhibiting proliferation of【方法・結果】

adipocyte progenitors. Nature communications.

mTORC2 の制御を受ける Akt は，Tsc1/2 の制御を介

2017/08/18 2017; 8 ( 1 ) : 286. doi: 10.1038/

して mTORC1 の活性化に寄与する．MG が mTORC2

s41467-017-00231-1を活性化したことから，MG による mTORC1 シグナル₁₀）Nawaz A, Tobe K. M2-like macrophages serveの活性化における Akt の関与について，Akt 阻害剤を

as a niche for adipocyte progenitors in adipose

用いて検討を行った．その結果，MG による mTORC1

tissue. Journal of diabetes investigation. Jul 10

シグナルの活性化において，Akt 阻害剤による影響は確2019; doi: 10.1111/jdi.13114

認されなかった．次に，p38 MAP キナーゼに着目して解析を行った結果，MG は p38 MAP キナーゼのリン酸化を亢進した．また，p38 MAP キナーゼの阻害剤は，解糖系代謝物による TOR シグナルの活性化
野村亘

MG による mTORC1 シグナルの活性化を阻害した．
【考察】
これらのことは，MG による mTORC1 シグナルの活（京都大学大学院農学研究科）

性化に p38 MAP キナーゼが関与する可能性を示唆しているものと考えられた．

【背景・目的】
栄養シグナルにおいて中心的な役割を果たしているタ
ンパク質リン酸化酵素 TOR (target of rapamycin) は，酵母（Tor1 および Tor2）から哺乳類（mTOR）に至る

新規レポーターマウスを用いた膵α細胞新生・分化まで進化的に高度に保存されている．TOR は，異なる機構の解明

２つの複合体である (m)TORC1 および (m)TORC2 を

氷

室

美

和
（順天堂大学大学院医学研究科）

形成することで機能し，TOR シグナルを構成すること
で糖代謝や脂質代謝の制御に関与することが知られている（Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 21: 183-203, 2020）．

【目的・方法】

エネルギー産生経路における代謝物の中には，単な

近年，膵α細胞が可塑性に富む細胞であることがるエネルギー獲得のための反応中間体としての役割以明らかとなってきており，α細胞の分化を制御する

外に，遺伝子発現などに積極的に関与する機能性を有しメ カ ニ ズ ム の 全 容 を 明 ら か に す る こ と は， α-to-βた代謝物も存在する．メチルグリオキサール（MG）はreprogramming を介したβ細胞再生医療へと繋がる解糖系から派生する代謝物であり，古くから糖尿病との可能性がある．最近我々は内分泌前駆細胞から分化し関連が指摘されている．しかしながら，これまでに MGたばかりの新生α細胞と成熟α細胞とを区別して標識

9

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

し，α細胞分化を時間軸に沿って解析するための新規レポーターマウス “Gcg-Timer マウス” を作製した．本
マ ウ ス は eGFP-IRES-mRFP を proglucagon 遺 伝 子 に挿入しており，IRES の下流に配置した mRFP の発現量

亜鉛トランスポーター ZIP13 による脂肪細胞褐色化制御機構の解明福中彩子（群馬大学生体調節研究所）

が eGFP より低下する影響により，eGFP の緑色蛍光と
mRFP の赤色蛍光との検出にタイムラグが生じる．この特性により新生α細胞は緑色蛍光，より分化したα細胞

１．背景および目的は緑色および赤色蛍光を呈するため，両者を識別し経時

近年，肥満を伴う２型糖尿病患者数は日本人において的に観察できる．本研究課題では，同マウスを用いて「αも増加の一途をたどっており，その病態の解明と，新規細胞がいつ・どこで生まれるのか？」を明らかにすると治療薬の開発は急務である．そのため，エネルギーを貯ともに，α細胞新生・分化過程における遺伝子発現プロ

蔵する白色脂肪細胞を，エネルギーを消費する誘導性

ファイルの変化を解析する．

の褐色脂肪細胞であるベージュ脂肪細胞へと形質転換【結果】（ベージュ化）することによって，太りにくい体質に繋Gcg-Timer マウス膵を摘出し，共焦点レーザー顕微

がる食品や薬の開発に注目が集まっている．

鏡および ﬂow cytometry を用いて新生α細胞数を定量

私たちは，エーラス・ダンロス症候群原因遺伝子であ化した結果，胎生 12 日目から生後５日目にかけて新生る亜鉛トランスポーター ZIP13 を介する亜鉛シグナル

α細胞（緑色蛍光優位な細胞群）を認めたが，生後７日が，ベージュ脂肪細胞の分化に対して抑制的に作用する

目以降は認めなかった．以上より，α細胞新生は胎生期ことを明らかにしてきた（Fukunaka A, PLoS Genet.,

および生後早期に特化した現象であることが示された．

2017）．具体的には，Zip13-KO マウスの白色脂肪組織

胎生 17 日の Gcg-Timer マウス膵臓より FACS を用でベージュ脂肪細胞の顕著な増加 /エネルギー消費量のいて新生α細胞，成熟α細胞，非α細胞の各分画より

亢進 /高脂肪食誘導の肥満に抵抗性を示すことを見出し

RNA を抽出し，RNA sequencing を行った結果，新生たが，なぜ ZIP13 を欠損するとベージュ脂肪細胞が特α細胞特異的・成熟α細胞特異的に高発現する複数の遺異的に分化亢進（ベージュ化）するのか，その分子機序

伝子群を抽出することに成功した．

はまだ解明されていない．本研究は，私たちが開発した【考察および今後の展望】

ベージュ脂肪細胞分化誘導系を用いて，ZIP13 を介する

これまでの検討により，生理的条件下においてα細胞

亜鉛シグナルの特異性の調節機構を明らかにし，ZIP13

新生は胎生期から生後早期に特化した現象であることがを介する亜鉛シグナルによるベージュ化決定機構を解明示された．一方，成体においてα細胞新生を誘導されるすることを目的とする．

ような実験条件がないかについてはさらに検討を進める

２．方法

必要があり，今後様々な代謝ストレス条件下で実験を進⑴不死化前駆脂肪細胞の樹立

める．

Zip13 欠損マウスと分子Ｘの ﬂox マウスの掛け合わ

また，新生α細胞特異的または成熟α細胞特異的に高せを行い，Zip13-KO 分子 X ﬂox マウスを得た．このマ発現するいくつかの遺伝子群に対して，免疫染色によりウスの鼠蹊部から前駆脂肪細胞を採取し，SV40T 抗原

spatiotemporal pattern を解析するとともに，遺伝子改を発現するレトロウイルスに感染させ，前駆脂肪細胞を変マウスを用いてその機能を明らかにする．

不死化した．さらに Cre リコンビナーゼを発現させることにより Zip13 欠損 分子Ｘ欠損前駆脂肪細胞を得た．
⑵細胞内亜鉛量測定
ZIP13（野生体もしくは分子Ｘと結合できない変異体）を発現するレトロウイルスを Zip13 欠損細胞に感染させ，亜鉛蛍光プローブである FluoZin3 を添加し，細胞0Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

内の亜鉛量をプレートリーダーで定量した．その後細胞子Ｘは ZIP13 存在下で発現減少が観察されたことから，を溶解し，タンパク質量を測定し，FluoZin3 蛍光値を

ZIP13 存在下で分子Ｘの発現は制御されていることがタンパク質量で補正した．

示唆された．次に Zip13 欠損細胞で分子Ｘを欠損した⑶ yeast two hybrid による結合実験

ところ，Zip13 欠損細胞で亢進したベージュ化は分子Ｘ

酵母 EGY48 株に bait plasmid と prey plasmid を導を欠損させることにより抑制された．さらに分子Ｘを過入した．得られた形質転換体につい栄養要求性試験を行剰発現することにより，ベージュ化は亢進することから，い，生育を観察することで結合の有無を検討した．Bait

ZIP13 の下流で分子Ｘが機能する可能性が高いと推察

plasmid として ZIP13 IntL1 と IntL2 に変異を導入した

された．ZIP13 と分子Ｘの結合がベージュ化に果たす変異体を用いた．Prey plasmid として分子ＸのＣ末端役割について検討するために，Y2H を用いて ZIP13 の側を用いた．

分子Ｘと結合できない変異体を同定した．分子Ｘと結合⑷脂肪細胞特異的 Zip13 欠損マウスの作成と解析できない ZIP13 の変異体は亜鉛輸送能が野生型と同程

Zip13ﬂox マウス（徳島文理大学 深田俊幸教授から分度にあるにもかかわらず，この変異体存在下では分子Ｘ与）と Adiponectin-Cre マウスとの掛け合わせを行い，の発現は減少せずまたベージュ化抑制もできないことが脂肪細胞特異的 Zip13 欠損マウスを作成した．得られ判明した．以上の結果から，ZIP13 と分子Ｘが結合すたマウスに関して，通常食・高脂肪食時の体重変化を観ることがベージュ化抑制に必要であることがわかった．

察した．また酸素消費量，二酸化炭素産出量，呼吸商，

次に ZIP13 がどのように分子Ｘの発現制御を行って体組成，行動量を測定した．さらに，マウスの皮下脂

いるか種々の阻害剤を用いた実験により検討したとこ

肪組織を用いて遺伝子発現を調べると共に HE 染色を行ろ，Zip13 欠損細胞ではプロテアソーム・リソソーム分

い，組織像を観察した．

解経路が障害を受けているため，分子Ｘが分解できない

３．結果可能性が示唆された．分子Ｘは様々なユビキチン E3 リ

⑴ベージュ化における ZIP13 標的分子の同定とその制ガーゼにより分解を受けることが報告されている．今後御機構の解析

それらの E3 リガーゼの活性が Zip13 欠損細胞で変化し私たちが開発したベージュ脂肪細胞分化系を用いるているか調べる必要がある．また，分子Ｘは細胞質に存と，Zip13 欠損細胞に ZIP13 を過剰発現させると，ベー在するタンパク質であることから，リソソーム経路で分ジュ化は抑制できるが，亜鉛輸送能を失った ZIP13 の解されることを示唆する本結果は，分子Ｘがオートファ

変異体ではベージュ化抑制ができない．また，培地中にジー経路で分解されている可能性を示しており興味深い．

過剰量の亜鉛を添加した場合や，同じゴルジ体に局在し，⑵脂肪細胞特異的 Zip13 欠損マウスの解析

ZIP13 と最も高い相同性を示す亜鉛トランスポーターを

全身で Zip13 を欠損したマウスで観察されたベージュ

発現した場合には，細胞質内の亜鉛量は増加するにも関化亢進の表現系がどの細胞依存的に起きているかを調べ

わらず，ベージュ化は抑制できない．ZIP13 による亜鉛るために，成熟脂肪細胞特異的に Zip13 を欠損したマ

シグナルには特異性が存在し，ベージュ化抑制を調節しウス（Adipo-Zip13-KO マウス）を作製し解析を行った．

ていると考えられる．そこで亜鉛シグナルの特異性が生

Adipo-Zip13-KO マウスは高脂肪食負荷時の肥満に抵抗じる機構を解明するために，ZIP13 のベージュ化抑制性を示すが，種々のベージュ化亢進を示すパラメーターに必要な領域（Int-L2）を同定した．さらに，この領域に変化はなかった．また寒冷刺激時においてもベージュと結合する分子が特異性を決定しているのではないかと化亢進の所見は観察できなかった．これらの結果から，仮定し，ZIP13 のベージュ化抑制に必要な領域（Int-L2）

全身の Zip13 欠損マウスで観察されたベージュ化亢進

を用いて，yeast two hybrid (Y2H) を行い，結合するの表現系は，Adiponectin が発現するよりもより早い段

分子（結合分子）を３種類選定した．結合分子の発現を階から Zip13 を欠損させることにより観察できるでは

Zip13 欠損細胞や Zip13 欠損マウスの皮下脂肪組織でないかと考えられた．現在，前駆脂肪細胞で Zip13 を観察したところ，分子Ｘは発現増加が見られた．また分欠損させることができるように，PDGFRα-CreERT マ

131

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

ウスと Zip13ﬂox マウスとの掛け合わせを行っているところである．
４．考察

アディポネクチンの組織修復機構の解明
藤

島

裕

也
（大阪大学大学院医学系研究科）

無機イオンを介するセカンドメッセンジャーによる細胞内シグナルに関しては，これまではカルシウムイオンによる研究が大多数を占めてきたが，近年になって，カ【背景】

ルシウムシグナルの役割と思われていた現象が，実は亜脂肪細胞特異的分蛋白アディポネクチン（APN）は，鉛など他の無機イオンによるものであることが示される

GPI アンカー型蛋白Ｔ-カドヘリン（T-cad）への特異ようになった．現在では，「亜鉛シグナル」が生命活動的な結合を介して組織に集積し，動脈硬化抑制や骨格筋に深く関わるシグナル伝達システムの一端を担うことが再生作用を発揮することを明らかとしてきた（FASEB

明示され，亜鉛シグナルの健康と病気への関与に注目がJ 2017, Sci Rep 2019）．また，その想定されるメカニ集まっている．一方で，「亜鉛シグナルがどのように標ズムとして，APN による T-cad 依存的なエクソソーム的分子の発現・活性を制御するのか」という生命現象．
の産生・分泌促進作用を報告した（JCI Insight 2018）の重大な命題が解明できていない（Fukunaka A, Int J

今回 APN の腎保護作用における T-cad の役割について

Mol Sci. 2018）．我々は，自身が開発したベージュ脂肪検討を行った．

細胞分化系を用いて，ZIP13 の直接の標的分子Ｘを同【方法・結果】

定することができ，ZIP13-分子Ｘの制御機構はベージュ

腎臓組織において T-cad および APN 蛋白は，細動脈

脂肪細胞以外の細胞，例えば筋肉細胞や褐色脂肪細胞での血管内皮に検出された一方で，糸球体の毛細血管ではは保存されていないことを見出した．さらに Zip13 欠検出されなかった．一方で，尿細管周囲の微小血管周囲損細胞ではプロテアソーム・リソソーム分解経路が障害に APN の集積が確認され，血管周皮細胞（pericyte）マーを受けているため，分子Ｘが分解できにくくなり，それカーである PDGFRβ陽性細胞と共局在していた．また，によりベージュ化が亢進している可能性が示唆された．

このような腎組織の APN は T-cad 欠損マウスでは完全

今後，分子Ｘの分解制御機構に関する詳細なメカニズムに消失していた．続いて，腎虚血再灌流による急性腎不解析が必要である．

全モデル作成し，24 時間後に解析を行った．その結果，

Zip13 欠損マウスでは結合組織（骨・歯・皮膚）の脆

野生型マウスでは傷害腎の PDGFRβ陽性が有意に増加弱性を示し，結合組織形成においては ZIP13 が必須のしていたのに対し，T-cad 欠損マウスや APN 欠損マウ役割を果たすことから，ZIP13 による肥満糖尿病治療

スではむしろ減少しており，pericyte loss が示唆された．

法確立において，脂肪細胞（もしくは前駆脂肪細胞）特また，このような血管構造の破綻に伴い，T-cad 欠損マ

異的に ZIP13 の機能を阻害することが重要であると考

ウスでは，APN 欠損マウスと同様に，エバンスブルー

えられる．今回の我々の解析から成熟脂肪細胞特異的に静注により定量した腎血管透過性が顕著に亢進し，尿細Zip13 を欠損させると，高脂肪食誘導性の肥満に抵抗性

管壊死所見の増悪が認められた．

を示すものの，種々のベージュ化を示す表現系には変化

マウスの primary brain pericyte を用いた細胞実験が見られなかった．今後，前駆脂肪細胞特異的に Zip13を行ったところ，T-cad の発現と細胞への APN の集積を欠損させたマウスの解析を進め，このマウスでのベーが確認された．また，生理的な濃度の精製 APN の添加

ジュ化への影響，さらには肥満糖尿病への影響を観察す

により，pericyte からのエクソソーム分泌は有意に亢進る予定である．それにより ZIP13 をどのように欠損すしたが，siRNA による T-cad のノックダウンによりキャ

れば，エーラス・ダンロス症候群を発症せず肥満糖尿病

ンセルされた．

のみを防げるのかが明らかにできる．本研究の解明によ【考察】り，ZIP13 を利用した新しいコンセプトの抗肥満糖尿病治療法の開発に繋がることが期待できる．

pericyte は毛細血管の支持細胞として，血流調整や血管透過性の維持といった重要な生理的役割を担っている

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成が，組織常在性の間葉系幹細胞幹細胞としての側面を持示唆された．また，空腹時には神経を介するデクレチン

つことも近年明らかとされている．本研究の結果から，作用の両者の機序を介して，インスリン分泌を制御し，APN/T-cad は傷害時における pericyte の機能維持や，糖代謝調節に機能していると考えられる．

エクソソーム分泌促進を介した組織修復に関与している【文献】

ことが示唆された．

１）Zhang W, Sakoda H, Miura A et al. Neuromedin
U suppresses glucose-stimulated insulin secre-

糖代謝調節に関与するニューロメジン U (NMU)
の機能解析
三

浦

tion in pancreatic β cells. BBRC. 2017 Nov 4;493 (1): 677-683.
doi: 10.1016/j.bbrc. 2017.08.132.

綾子

２）Zhang W, Sakoda H, Nakazato M. Neuromedin（宮崎大学医学部）

U suppresses insulin secretion by triggering
mitochondrial dysfunction and endoplasmic【目的】
NMU のインスリン分泌調節作用を in vivo および invitro にて検討し，NMU の臓器連関としての肥満，糖reticulum stress in pancreatic β-cells. FASEB J.
2020 Jan; 34(1): 133-147.
doi: 10.1096/fj. 201901743R.

尿病の病態との関連を解析する．
【方法】
・NMU のミトコンドリア及び小胞体 (ER) ストレス応
答性への関与を確認する
・ラットへの NMU 末梢投与後の電気活動を測定する

うつ様行動制御遺伝子 USP46 によるエネルギー
代謝制御に関する研究
村

田

知

弥
（筑波大学医学医療系）【結果】
NMU は，ミトコンドリアの Ca２＋ の取り込み及びミトコンドリアの膜電位を阻害しており，細胞内 ATP の【目的】

産生を抑制した．また，NMU はミトコンドリアの呼吸

脱 ユ ビ キ チ ン 化 酵 素 USP46 は 神 経 系 に 高 発 現 し，商 OCR を優位に抑制しており，ROS 産生を亢進した．

USP46 欠損マウスはうつ様行動をほとんど示さない．

よって，NMU は，β細胞へのミトコンドリア機能を低

我々は神経モデル細胞を用い，近位依存性ビオチンラ

下させることが示唆された．さらに，NMU は ER スト

ベリング（BioID）によるタンパク質のインタラクトー

レス（ATF6, XBP-1s，および PERK-ATF4-CHOP を含

ム解析を実施し，USP46 が SIRT2 や DNAJC7 といっ

む ER ストレスシグナル伝達経路の活性化）を誘導し，たエネルギー代謝に関わる因子と相互作用することをdb/db マウスの膵島とパルミチン酸処理 MIN6-K8 細見出した．また予備実験の結果，野生型マウスに比べ胞の両方で NMU の発現が亢進した．また，空腹時に，

USP46 欠損マウスは体重が軽い傾向が認められた．そNMU の発現は腸管と迷走神経節で増加し，NMUR1 発

こで本研究では，USP46 とエネルギー代謝の関連を明

現は迷走神経節で増加した．NMU のラットへの末梢投らかにすることを目的とし，USP46 欠損マウスの解析

与は，迷走神経求心線維の電気活動を亢進し，視床下部と，USP46-BioID ノックイン（KI）マウスを用いた in

室傍核の c-fos 発現を増加する．NMU は，空腹時に自vivo インタラクトーム解析を実施する．

律神経求心路を活性化してインスリン分泌を抑制するデ【結果】

クレチン作用を示すペプチドの可能性が示唆された．

⑴ USP46 欠損マウスの体重を詳細に検討するため，生【考察】

後２週齢から 12 週齢まで測定を行った．その結果，

NMU は，ミトコンドリア機能低下，ER ストレスを

USP46 欠損マウスは２週齢の時点で野生型マウスに比誘導することによりインスリン分泌を抑制する可能性がべ体重が有意に低く，12 週齢まで低体重が継続していFront Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成ることが判明した．
⑵上記の体重減少の原因となる組織を特定するため，

Usp46 遺伝子座の exon 4 を挟むように loxP 配列を有する USP46flox マウスを作製した．計 34 匹のファウン
ダーマウスが得られ，ﬂox allele を持つマウス２匹を用いて系統化を進めている．
⑶ in vivo BioID アッセイを実施するため，大腸菌由来
ビオチンリガーゼの人工改変体 miniTurbo を Usp46 遺伝子の終止コドン直前に KI し，USP46-miniTurbo-KI
マウスを作製した．計 64 匹のファウンダーマウスが得られ，このうち miniTurbo KI と判定したマウス２匹を用いて系統樹立を進めている．
【今後の展開】
USP46 欠損マウスを用いて代謝表現型の解析を進めるとともに，USP46flox マウスと各種 Cre ドライバーマ
ウスを交配して，USP46 欠損による低体重の原因組織を特定する．また，USP46-miniTurbo-KI マウスを用いて in vivo BioID アッセイの実験系を立ち上げていく予
定である．

134

酵素情報

自己免疫疾患における Tyk2 の役割
自己免疫疾患領域における創薬標的としてのCaMK4

転 写 因 子 NFAT (nuclear factor of activated T cells)【序】
自己免疫疾患は，様々な原因により免疫寛容が破綻し，を脱リン酸化し，NFAT の核内移行を引き起こすことで自己抗体や免疫細胞が過剰に産生されることにより組織

IL-2 や IFN-γなどのサイトカイン産生を誘導する．一の損傷や炎症が引き起こされる疾患である．Ｔ細胞受容方，カルシウム・カルモジュリン依存性キナーゼも同体（TCR）と抗原提示細胞（APC）の結合によりＴ細様に APC による抗原提示によって T 細胞において活性胞が活性化され，Th1 細胞と Th17 細胞などのヘルパー

化 す る 酵 素 で あ り， 特 に CaMK4 (Ca2+/calmodulin-

Ｔ細胞へと分化する．これらヘルパーＴ細胞が関節リウ

dependent protein kinase IV) は制御性 T 細胞（Treg）

マチ（RA），全身性エリテマトーデス（SLE）などの自己の機能および Th17 細胞の分化に重要であることが示さ

免疫疾患の発症・進展に関与することが示唆されている．

れ，CaMK4 の阻害は自己免疫疾患の新たな治療標的とタクロリムス（FK506），シクロスポリンＡ（CsA）

して注目されている１）．以下，CaMK4 の機能，疾患とはＴ細胞の増殖・活性化に重要なカルシニューリンを抑の関連及び創薬標的としての可能性について概説する．

制する薬剤であり，これらカルシニューリン阻害薬は臓器移植や一部の自己免疫性疾患の治療薬として広く使用されており，ループス腎炎においても寛解導入や維持療法として使用されている．

【CaMK の機能】
CaMK ファミリーは，特定の基質を標的とするキナー
ゼと幅広い基質選択性を有する多機能性カルシウム/カ

カルシニューリンは TCR／CD3 複合体からのシグナ

ルモジュリン依存性蛋白質キナーゼに分類される．多機

ルを受け，細胞内カルシウム濃度の上昇により活性化し，能性カルシウム/カルモジュリン依存性蛋白質キナーゼ

図

Ｔ細胞におけるカルシニューリン，カルモジュリンシグナルとサイトカイン産生1自己免疫疾患領域における創薬標的としての CaMK4として，CaMKK, CaMK1, CaMK2 及び CaMK4 が存在

免疫細胞及び非免疫/実質細胞の両面から SLE における

し，その中でも CaMK4 は T 細胞の活性化を含む免疫

CaMK4 制御の可能性が示唆されている５）．カルシニュー応答に重要な役割を果たすことが示されている．

リン阻害薬は IL-2 産生を抑制するのに対し，CaMK4

CaMK4 はセリン/スレオニン蛋白質キナーゼファミ
リーに属し，主にリンパ球，ニューロン及び雄生殖細胞

阻害剤は IL-2 の回復が期待されることからも新しい治療薬として期待される．

において転写調節に関わっている．本酵素はセリン/ス

CaMK4 は Treg 細胞に対する作用のみならず，Th17

レオニンホスファターゼ 2A（PP2A）結合領域，カル細胞に対する作用も報告されている．Th17 細胞の関与

モジュリン（CaM）結合領域を含む五つのドメインかが示唆される自己免疫疾患として，乾癬，RA，多発性ら構成される．カルシウム/カルモジュリンと CaMK4硬化症などが想定され，多発性硬化症を想定した実験的と の 結 合 に よ り CaMK4 か ら PP2A が 除 去 さ れ た 後，

自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデルにおいて CaMK4 のCaMKK によるリン酸化を受け高活性型の CaMK4 に変欠損は組織浸潤及び脱髄の有意な抑制が示されている．

換される２）．CaMK4 活性の亢進により，CREMα及びCaMK4 は広く全身に分布し多くの機能を有することか

ICER などの転写因子の活性化，
IL-2 及び IL-17 プロモーら，ヒトでの臨床応用に向けた CaMK4 特異的な阻害剤

ター領域への結合がそれぞれ抑制及び促進され，IL-2の開発には，DDS 等の工夫や安全性の検討が必要であの転写は負に調節し，IL-17 の転写は促進される３）．

る．

【疾患との関連】【参考文献】SLE 患者では Th17 細胞数の増加，Treg 細胞数の減１）Koga T, Kawakami A. The role of CaMK4 in im-

少や機能低下が知られており，IL-2 の産生低下に起因

mune responses. Mod Rheumatol., 28, 211-214

し Th17/Treg 不均衡や組織異常が起こることが示唆さ(2017)

れている．IL-2 は濃度により異なる作用を示し，低用

２）Naz, H., Islam, A., Ahmad, F. & Hassan, M.I.

量では Treg を誘導し免疫寛容を誘導する．一方，高用Calcium/calmodulin-dependent protein kinase

量では naive CD8+T 細胞をエフェクター CD8+T 細胞

IV: a multifunctional enzyme and potentialへと誘導する．近年，低用量 IL-2 の SLE 患者への投与

therapeutic target. Prog. Biophys. Mol. Biol.,により末梢血中の Treg 細胞数を増加させることが報告

121, 54-65 (2016)

され，臨床試験の動向が注目されている ．
４）３）Hedrich CM, Crispin JC, Rauen T, Ioannidis C,
Apostolidis SA, Lo MS, et al. cAMP response el-【CaMK4 の創薬標的としての可能性】

ement modulator alpha controls IL2 and IL17A

CaMK4 は IL-2 の産生促進や Treg 細胞の機能改善がexpression during CD4 lineage commitment and

期待されることより，SLE の創薬標的としての可能性

subset distribution in lupus. Proc. Natl Acad.

が注目され，動物モデルにおいてその可能性が検証さSci. USA., 109, 16606-11 (2012)

れている．CaMK4 欠損 MRL/lpr マウスにおいて，IL-2

４）He, J. et al. Low-dose interleukin-2 treatment

産生促進や Treg 細胞の機能改善により，自己抗体産生

selectively modulates CD4+ T cell subsets in pa-の抑制，腎炎や生存率の改善が報告されている．またtients with systemic lupus erythematosus. Nat.

CaMK4 阻害剤である KN-93 がループスモデルマウス

Med., 22, 991-993 (2016)において脾臓，末梢リンパ節及び末梢血中に Treg 細胞５）Maeda, K. et al. CaMK4 compromises podocyteが有意に誘導され，これに伴い皮膚及び腎臓の損傷が減function in autoimmune and nonautoimmune

少することが示されている．また，ループス腎炎の病因

kidney disease. J. Clin. Invest., 128, 3445-3459に重要であるとされるメサンギウム細胞及びポドサイト(2018)（糸球体上皮細胞）における CaMK4 の関与も報告され，

136

自己免疫疾患領域における創薬標的としての CaMK4【著者】
田辺三菱製薬株式会社 創薬本部ト

遠藤淳一

田辺三菱製薬株式会社 創薬本部
ト

免疫炎症創薬ユニッ
免疫炎症創薬ユニッ

柳田哲哉

137

酵素情報

Prolyl Hydroxylase

また，PHD2 をノックアウトしたマウスは胎生致死で【はじめに】
嫌気性細菌等を除き，多くの生物が酸素を利用していあるが，PHD1 および PHD3 は生存に影響がない事かる．酸素は ATP 産生やオキシダーゼなどによる細胞成ら，PHD2 が生命維持には最も重要であると考えられて分の合成反応に必須のため，酸素濃度の急激な変化は生いる．

物に多大な影響を及ぼす．例えば，高山病は短期間での急激な酸素濃度の低下により引き起こされ，呼吸困難や１,２）【PHD の酵素反応と低酸素応答】

精神神経症状，場合によっては肺浮腫や脳浮腫を引き起PHD はタンパク質中のプロリン残基に水酸基を付加こす．しかし標高 4000m 以上の高地に存在する都市もする酵素である．この酵素反応には酸素分子とα-ケトあり，生物（特に高等生物）は低酸素環境に順応できる

グルタル酸が必要であり，さらに PHD の酸素に対するメカニズムが備わっている．

Km 値が大気中の酸素濃度に近いため，鋭敏に酸素濃度を感知し，水酸基付加を調節する．

本 稿 で は 生 物 の 低 酸 素 応 答 に 深 く 関 わ る prolylhydroxylase (PHD) とその阻害剤の臨床応用について

PHD の代表的な標的タンパク質として hypoxia inducible factor α (HIFα) が 挙 げ ら れ る．HIFα は HIF1α,

概説する．

HIF2αおよび HIF3αの３種類存在しており，研究が進 ん で い る の は HIF1αと HIF2αで あ る．HIF1αと１）【PHD の種類】

PHD は PHD1, PHD2 および PHD3 の３種類存在し，HIF2αは，HIFβとヘテロダイマーを形成し転写因子と発現臓器や細胞内局在が異なる．PHD2 はユビキタスにして低酸素適応遺伝子発現を誘導する．また，HIF1α

発現し，PHD1 は精巣，PHD3 は心臓で発現量が高い．

と HIF2αは PHD に よ る 分 解 制 御 が 行 わ れ て お り，また，細胞内局在も異なり，PHD2 は主に細胞質に発現

PHD が HIFαのプロリン残基を水酸基で修飾するとそする一方で，PHD1 は核に，PHD3 は細胞質と核に発現れ を 目 印 に Von Hippel-Lindau (pVHL) が 結 合 す る．

する．

pVHL は E3 リガーゼ活性を有するため，pVHL が結合

O2a-ketoglutarate

PHD

CO2
succinateOH

E3 ligase
pVHL
OH
OH

OH

HIFa

HIFa

Normoxia

Ub
Ub
Ub

HIFa
Hypoxia

HIFb
HIFa

CBP/
300

HIF標的遺伝子
PHD による酸素応答メカニズム
図 図
PHDによる酸素応答メカニズム

8

分解

転写誘導
(EPOなど)Prolyl Hydroxylase

した HIFαはプロテアソームで速やかに分解される．す大きなマイルストーンを達成したと考えられる．さらに，

なわち，酸素濃度が低下すると PHD による HIFαへの近年 PHD 阻害剤が急性腎障害を軽減させるといった報

水酸基修飾が低下し，HIFαの安定化を介した転写活性告もされ，腎性貧血以外の疾患治療に適応できる可能性の増加により標的遺伝子が誘導される（図）．

も見出されている．今後さらに研究が進み，多くの疾患の治療に役立つ事を期待したい．

【PHD 阻害剤の臨床応用】

３,４）

上述したように PHD は酸素濃度により，HIFαの分【参考文献】

解を制御し，下流遺伝子の転写活性を調節している．つ１）Sarah E. Wilkins, Emily Flashman, John S.

まり PHD を阻害する事で人工的に HIFαを安定化させ，

Scotti, Richard J. Hopkinson, Rasheduzzaman

その標的遺伝子発現を誘導する事が可能になる．HIFα

Chowdhury, Christopher J. Schoﬁeld. The Roleの代表的な標的遺伝子として VEGF, GLUT1, iNOS や

of 2-Oxoglutarate-Dependent Oxygenases inerythropoietin (EPO) などが挙げられ，近年上市が相次

Hypoxia Sensing: Chapter6, The Royal Society of

ぐ PHD 阻害剤は主に EPO 産生誘導を目的とした薬剤

Chemistry (2015)

である．
EPO は赤血球産生に必須のホルモンであり，腎臓の２）田中哲洋，南学 正臣

療法，日腎会誌

腎線維化と低酸素の薬物

2015；57（7）：1215-1224．

間質に存在する線維芽細胞の HIFαにより発現が制御さ３）Souza, Ernane; Cho, Katherine H; Harris, Shelby

れている．健常人では酸素濃度に応じた低酸素応答がT; Flindt, Naomi R; Watt, Richard K; Pai, Amy

正常に機能し，EPO 発現が調節されている．一方で進Barton. Hypoxia-inducible factor prolyl hydrox-

行した慢性腎臓病患者では EPO を産生する線維芽細胞

ylase inhibitors: a paradigm shift for treatmentが線維化を担う筋線維芽細胞に分化し，何らかのメカニof anemia in chronic kidney disease? Expert

ズムで低酸素応答が阻害される．その結果，EPO 産生

Opinion on Investigational Drugs, 2020 Aug;が低下し，正常な造血が阻害され貧血に陥る．EPO 産

29 (8): 831-844

生低下による貧血は腎性貧血と呼ばれ，治療薬として

４）相馬 友和

Erythropoiesis Stimulating Agent (ESA) 製剤が使用さ

会誌

鈴木 教郎，腎線維化と腎性貧血，日腎2015；57（7）：1193 – 1199．

れている．EPO 誘導体である ESA 製剤は直接体外から投与するのに対して，PHD 阻害剤は内在性の EPO 産生【著者】

を誘導し，腎性貧血を改善させる．ESA 製剤と PHD 阻

田辺三菱製薬株式会社 創薬本部

害剤の主な違いとして投与経路が挙げられる．

高瀬

ESA 製剤が注射剤なのに対して，PHD 阻害剤は経口剤である．ESA 製剤は，透析患者に対しては静脈内注

昌幸

田辺三菱製薬株式会社 創薬本部
小寺

モダリティー研究所
モダリティー研究所

淳

射で，透析前の保存期腎不全患者に対しては皮下注射で使用される事が多く，そのため保存期腎不全患者において注射のため２～４週間に一度通院する必要があった．
PHD 阻害剤の上市により ESA 製剤の注射が不要となり，保存期腎不全患者の通院頻度の改善が見込まれている．

【おわりに】
これまでの研究により PHD の基質や酸素感知メカニ
ズムが解明され，HIF αを介した低酸素応答に深く関わる事が示された．PHD 阻害剤が上市され，PHD 研究は139

日本応用酵素協会誌

第55号

ISSN : 0913-3348
ISSN : 2434-7914（Online）
CODEN : NOKKELISSN : 0913-3348（Print）
CODEN : NOKKEL

2021 年３月１日発行

日本応用酵素協会誌
日本応用酵素協会誌

No. 55
2020
総

説

№

55

タンパク質架橋酵素を介した上皮細胞の間葉転換機構の解析 ･･･････････････････････

2020

辰

川

英

樹，篠

田

祥

希，竹

内

大

修，人

見

清

隆

チロシンキナーゼによるＴ細胞の分化制御 ･･････････････････････････････････････
室

龍 之 介，新

田

1
11

剛

2020年度 研究報告
酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究 ･････････････････････････････ 19
成人病の病因・病態の解明に関する研究助成 ･････････････････････････････････････ 48
Vascular Biology Innovation に関する研究助成･･････････････････････････････････ 83
全身性炎症疾患の病因・病態の解明に関する研究助成 ････････････････････････････ 100
Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成･････････････････････ 112

研究調査所 酵素情報
公益財団法人自己免疫疾患領域における創薬標的としての CaMK4 ･ ････････････････････････････ 135
Prolyl Hydroxylase ･･･････････････････････････････････････････････････････････ 138

日本応用酵素協会

公益財団法人

日本応用酵素協会

Japan Foundation for Applied Enzymology
編集兼
発行人

山田

昌樹

発行所

大阪市淀川区加島三丁目一六番八九号
公益財団法人 日 本 応 用 酵 素 協 会

印刷所

帝人エージェンシー株式会社