日本応用酵素協会誌

第57号

ISSN:2434-7914（Online）
ISSN:0913-3348（Print）
CODEN : NOKKEL

2023 年３月１日発行

日本応用酵素協会誌
日本応用酵素協会誌

No.57

№ 57

力覚応答に関与する低分子量Gタンパク質Rhoファミリーの活性化因子RhoGEF‥‥‥‥‥‥12022

ペプチド系天然物の生合成に関与するtRNA依存型アミド合成酵素‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥11

2022
総

説

大 橋 一 正丸 山 千 登 勢， 濱 野 吉 十
もやもや病の分子病態をめぐる幾つかの論点‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥19
森 戸 大 介,

折 井 み な み

高度好塩性古細菌 Haloarcula japonica のイソプレノイド生合成経路の解析と代謝工学による有用物質生産‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥27
八 波 利 恵2022年度 研究報告
酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥33
成人病の病因・病態の解明に関する研究助成‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥70
Vascular Biology Innovation に関する研究助成 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥115
公益財団法人全身性炎症疾患の病因・病態の解明に関する研究助成 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥146
Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥157

研究調査所 酵素情報

日本応用酵素協会

N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼV (GnT-V) ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥185
ネクロプトーシスの実行因子MLKL ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥188

公益財団法人

日本応用酵素協会

Japan Foundation for Applied Enzymology
編集兼
山田 昌樹
発行人

発行所

大阪市中央区道修町三丁目二番十号
公益財団法人 日 本 応 用 酵 素 協 会

印刷所

帝人エージェンシー株式会社

総説

力覚応答に関与する低分子量 G タンパク質
Rho ファミリーの活性化因子 RhoGEF
大橋

1. はじめに一

正*答を「力覚応答」と総称する．これまで，液性因子や細胞

私たちの体は様々な機械的な力を常に受けており，組接着による様々な細胞応答について膨大な研究が行わ織を構成する細胞は機械的な力を感知して，細胞の形態，

れ，細胞内のシグナル伝達機構は多くのことが明らかに

極性，運動，代謝，増殖と分化，細胞死など多様な生理されてきた．機械刺激でも同様の細胞応答を引き起こす的制御を行っている 1-3)．機械的な刺激は，重力や圧力，ことから，それらのシグナル伝達機構はどこかでリンク

浸透圧，呼吸，血液循環，筋収縮，また，組織の硬さやしているはずである．また，細胞応答は細胞骨格の再構細胞が発する力によるものなど多岐にわたり，そのレン

築を伴うものであり，細胞への機械的な力の変化が生じ

ジも骨や筋肉にかかる大きな力から細胞同士の微弱な力ると考えられることから，ほとんどの細胞応答は力覚応．細胞はそれらを感知まで幅広く多様である 3)（図 1）

答と共役していると考えられる．しかし，実体の無い機する多様な分子機構を有し，各々の環境に適応した応答

械的な力の作用がどのような分子機構で感知されているによって生命活動に寄与していると考えられる．本総説のか，また，既知の細胞内シグナル伝達機構にどのようでは，このような機械刺激に対する生理的応答，細胞応に統御されているのかは未だ多くの部分が不明である．

図 1. 細胞の力覚応答による多様な生理的役割
細胞に負荷される機械的な力は，細胞膜の伸縮や細胞間，細胞­基質間接着部位，細胞骨格に作用し，その部位に存在するメカノセンサー機構によって細胞内の化学的シグナルに変換され，様々な細胞応答を制御する．
それらは，様々な生理的応答，疾患に関与する．

* 東北大学大学院生命科学研究科・分子化学生物学専攻・ケミカルバイオロジー講座・分子細胞生物分野** 東北大学大学院理学研究科・化学専攻・生物化学研究室
1

総説―力覚応答に関与する低分子量 G タンパク質 Rho ファミリーの活性化因子 RhoGEF

2020 年 の ノ ー ベ ル 医 学 生 理 学 賞 の 対 象 と な っ たをする細胞骨格である 11-12)．そのため，アクチン骨格のTransient receptor potential1 (TRP1) や PIEZO と再構築を指標に力覚応答に関与するタンパク質が数多くいった機械刺激依存性カチオンチャネルは，機械刺激の見出されている 10)．本総説は，アクチン骨格の再構築

感知機構の一角を担う重要なシステムであり，Ca2+ がを複雑で多様に制御することを可能にした分子群の一つ

機械刺激による多く応答を司ることが明らかになってきとして低分子量 G タンパク質 Rho ファミリー分子の活

た 4-6)．これに対し，機械刺激の方向や力の強さを定量

性 化 因 子（GTP-GDP 交 換 因 子，Guanine nucleotide

的に感知して応答するためには，細胞骨格などの細胞内

exchange factor：GEF）である RhoGEF に注目し，力の 3 次元的な構造がセンサーとなり，応答することが覚応答のシグナル伝達への関与について解説する．

合理的であると考えられる．しかし，解析の難しさから
細胞接着や細胞骨格に負荷される力を感知するタンパク

2. 細胞が機械的な刺激を感知する分子機構

質や分子機構はわずかしか見出されていない 7-10) ( 図

細胞が機械的な力を感知するためには，機械的な力を

2) ．近年，このような細胞骨格や細胞接着に依存した細胞内の化学的なシグナルに変換する分子の存在が必要

機械刺激の感知から既知の細部内シグナル伝達機構に至である．これまでに提唱されている機械刺激を感知する

る分子機構の解明が進みつつある．特に，細胞内アクチタンパク質や分子機構を図 2 に示す．機械刺激依存性

ン骨格は，ほとんどの細胞応答において再構築される動カチオンチャネルである TRP ファミリーや PIEZO は，的な構造であるとともに，力覚応答において主要な働き

細胞膜が引き伸ばされることでゲートが開き Ca2+ を透図 2. 細胞のメカノセンサー機構
A. 機械刺激依存性カチオンチャネル．膜張力の変化で Ca2+ を透過させる．B. Coﬁlin とアクチン線維による張力感知．張力が負荷されたアクチン線維は螺旋の間隔が広がり，Coﬁlin との親和性が低下するため安定化する．その結果，細胞内では張力の負荷されたアクチン線維が維持される．C. Integrin のキャッチボンド機構．
基質と結合した Integrin は，張力の負荷によって立体構造が変化し，より強く結合する．D. Filamin. アクチ
ン骨格と結合し，張力の負荷によって 20 番目と 21 番目の Filamin repeat ドメインの 配置が変化し，Integrin 等との親和性が高くなる．E. Talin. Integrin とアクチン線維を連結し，張力の負荷によって新たにVinculin を結合することでアクチン構造を強化する．基質の硬さ等のセンサーとして機能する．
F. Vinexin α.
Integrin を介した基質との接着において，Vinculin との相互作用の変化を介して基質の硬さを感知するセンサーとして機能する．G. α-Catenin. 細胞間接着分子の Cadherin の細胞内ドメインに結合し，Cadherin への張力の負荷に伴う立体構造変化で Vinculin と結合しアクチン構造を強化する．H. MyosinVI. 細胞間接着
部位のアクチン繊維への力の負荷によって MyosinVI の Cadherin への親和性が増加する．その後，Gα12/G
α13, p114RhoGEF を細胞間接着部位へとリクルートすることで RhoA の活性化を促すメカノセンサーとして機能する．

2

総説―力覚応答に関与する低分子量 G タンパク質 Rho ファミリーの活性化因子 RhoGEF

過させ， 細胞内の局所で Ca2+ 濃度を上昇させるメカノの負荷による立体構造で機能を変化させるメカノセン

センサーである 13-14)（図 2 A）
．これは，細胞への機械

サータンパク質が更に見出されてくることが期待され刺激の場所と頻度，強さを感知する上で有効なセンサー

る．

であると考えられ，力覚応答の大きな部分を占める感知機構である．これに対し，細胞接着や細胞骨格に連動し

3. 力覚応答における低分子量 G タンパク質 Rho ファ

たメカノセンサーとして，アクチン線維が働くことが示

ミリーの機能されている．細胞内で張力が負荷され引き伸ばされたアアクチン骨格の再構築制御機構については，低分子量

クチン線維は，アクチン脱重合因子である Coﬁlin の結G タンパク質 Rho ファミリーの発見から多くの制御機

合が弱まり安定化される ( 図 2 B)．これが細胞に負荷さ構が明らかにされている．個々の Rho タンパク質は特れた力の方向と強さを感知する機構として働くと考えら

定のアクチン構造を形成する主要なスイッチタンパク質れている 15)．細胞­基質間接着部位においては，接着因として働いている．細胞応答においてアクチン骨格の再子である Integrin が張力の負荷で基質との結合が強く構築は連動しており，Rho ファミリータンパク質の活なるキャッチボンド機構によってメカノセンサーとして性制御がほとんどのシグナル伝達経路にリンクしている

機能している 16) ( 図 2 C )．アクチン繊維の束化因子でと考えられる．Rho タンパク質は，ヒトゲノムに約 20ある Filamin は，張力の負荷によって C 末端付近の立種類存在しており，各々の下流エフェクターとの相互作

体構造を変化することが示されている 17)．これによっ用によって特異的なアクチン骨格構造の形成を誘導するて Integrin などとの親和性が変化することでメカノセ

23)．これは比較的少ない分子種であり，シグナル伝達

ンサーとして機能することが示唆されている ( 図 2 D)．

経路上のボトルネックな経由点となっている．これに対また，接着斑タンパク質の Talin が張力の負荷で構造変し，上流の制御因子で活性化因子として働く RhoGEF化し，Vinexin と結合することで基質からの機械刺激やと 不 活 性 化 因 子 と し て 働 く Rho GTPase activating

基質の硬さを感知する主要な分子として機能することがprotein (RhoGAP) が様々なドメインを持つ分子種とし

示 さ れ て い る 18-19) ( 図 2 E )．接 着 斑 タ ン パ ク 質 のて共に約 80 種類存在している．
進化の過程で RhoGEF

Vinexin αも基質の硬さに応じて Vinexin との結合を変と RhoGAP が多様化し，限られた分子種の Rho ファミ

化させ，基質の硬さの感知に必要であることが報告されリータンパク質を時空間的に制御して複雑なアクチン骨ている 20) ( 図 2 F )．細胞間接着部位では，Adherens

格の再構築を可能にしていると考えられる 24-26)．力覚

junction において細胞間接着分子である Cadherin と細応答においても Rho ファミリータンパク質を介してア胞内のアクチン線維をつないでいるα-Catenin が，細クチン骨格の再構築は必須である．細胞表面を押し込ん

胞間接着部位に負荷された張力によって構造変化し，やだり引っ張ることでアクチン線維が重合することや，液はり Vinculin が結合してアクチン繊維を係留すること

体の流れによるずり応力，細胞接着を介した張力の負荷，で細胞間接着部位の構造の強化，収縮力の発生に寄与す

基質の硬さなど，様々な機械的な刺激の応答に RhoA

ることが明らかにされた 8, 21) ( 図 2 G )．また，細胞間をはじめとして寄与することが示されている 27)．しか接着部位への張力が負荷されると Myosin VI が下流のし，Rho タンパク質群を操作すると，基本的な細胞応

アクチン骨格の増強を促すメカノセンサーとして機能す

答に影響を受けるため，力覚応答における Rho タンパ

ることが報告された 22) ( 図 2 H )．この報告では，初めク質の時空間的な活性制御機構は未だ多くの点が不明でてメカノセンサーから Rho ファミリーの活性制御に至ある．近年，様々な細胞応答について Rho 経路の時空るシグナル伝達機構が報告された（後述する）．この他，間的な制御を解明するために，RhoGEF や RhoGAP に

力覚応答に関与する分子は数多く報告されているが，メついて様々な知見が得られてきている．

カノセンサーとしての作用機序が示されているものはほぼこれで全てである．しかし，多様な力覚応答を考え

4. 力覚応答に関与するRhoGEF

るとこれらの分子種では全く不足している．今後，力ヒトのRhoGEFは，約70種類のDiﬀuse B-cell lymphoma3

総説―力覚応答に関与する低分子量 G タンパク質 Rho ファミリーの活性化因子 RhoGEF( D bl) ファミリータンパク質と 11 種類の Dedicator ofて活性化した Src によって 172 番目のチロシンをリン

cytokinesis (DOCK) ファミリータンパク質が知られてい酸化されて活性化し，RhoA を活性化することが示される．Dbl ファミリー は，GEF 活 性 を 担 うDbl homology

た 28)．これは，力覚応答に関与する RhoGEF の最初の(DH) ドメインと GEF 活性と形質膜への局在に寄与する報告である．

Pleckstrin homology (PH) ドメインをタンデムに並べた共通の構造を有している．Dock ファミリーは GEFド

6. Guanine nucleotide exchange factor H1

メインとして Dbl ファミリーとは異なる構造の Dock-(GEF-H1，別名 ARHGEF2)

homology region1, 2 (DHR1 ,2) を 共 通 し て 有 す る．

血管内皮細胞は，血管の内側を覆う一層の細胞層を形

これらの RhoGEF は，GEF 活性を持つドメイン以外は成しており，心臓の拍動や血圧の変化による伸縮や血流様々なドメインが配置された多様化した分子種であり，を感知して様々な応答を行っている．そのため，古くか

進化の過程で様々な応答におけるアクチン骨格の細分化

ら力覚応答のモデルとして用いられている細胞である．

された再構築に対応していると考えられる 24-25)．細胞

血管内皮細胞は，心臓の拍動を模した繰り返し伸展刺激の機械刺激に対応したアクチン骨格の再構築も，これらによって，層構造を維持しながら伸展方向に対して垂直の RhoGEF の働きによって区別して制御されているとに配向，整列することが知られている 30)．肺動脈血管考えられる．これまでに機械刺激に対する細胞応答に関内皮細胞に対する繰り返し伸展刺激において，細胞内の与することが報告されている RhoGEF を表 1 に示す．

微小管が細胞の層構造の維持や配向に必要であることが多くは RhoA を活性化する RhoGEF である．これは，見出され，機械刺激による微小管を介したアクチン骨格負荷された力に対して収縮力を発生させる細胞応答が検の制御因子が探索された．GEF-H1 は微小管に結合する出しやすいため，収縮力の発生に主に働く RhoA の活

RhoGEF であり，微小管の脱重合によって微小管から性制御因子が多く見出されていると考えられる．Rho

解離することで活性化し RhoA を活性化することが知の上流には機械刺激を感知する多様なメカノセンサータられていたため関与が検討された．その結果，繰り返しンパク質が存在していると考えられるが，前述のとおり

伸 展 刺 激 に よ る 細 胞 の 配 向 や Rho 経 路 の 活 性 化 に未だわずかな種類しか同定されていない．RhoGEF は，

GEF-H1 が必要であることが明らかになった 31)．この報

変 化 に 富 ん だ 分 子 種 に 多 様 化 し て い る こ と か ら，

告が力覚応答に関与する RhoGEF の 2 番目の報告であRhoGEF のなかにメカノセンサーが存在する可能性がり，その後，GEF-H1 は他の機械刺激に対する応答にも示唆される．以降では，機械刺激に対する応答に関与す

関与することが報告されている．繊維芽細胞に細胞外マる個々の RhoGEF について解説する．

トリックスタンパク質の Fibronectin をコートした磁気
ビーズを付着させて磁力によって引張する刺激に対し，

5. Vav2

細胞が硬くなることや RhoA が活性化する応答に関与

腎臓の糸球体毛細血管における高血圧による傷害のメ

する RhoGEF が 探 索 さ れ ，GEF-H1 とLeukemia-

カニズムについての研究から，繰り返し伸展刺激による

associated RhoGEF (LARG, 別名 ARHGEF12) が同定

RhoA の活性化に寄与する RhoGEF が報告された 28)．

された 32)．
これは，Integrin を介した細胞­基質間接着か

糸球体毛細血管の支持細胞であるメサンギウム細胞は，

らの機械刺激と考えられ，さらに，阻害剤を用いた解析か

血圧の変化を模した繰り返し伸展刺激によって RhoA

ら，この引張刺激における LARG と GEF-H1 の活性化が活性化されることが知られており，この活性化を引きには，細胞内のリン酸化酵素である Mitogen-activated

起こす RhoGEF が探索された．繰り返し伸展刺激によ

protein kinase (MAPK)と Src ファミリーチロシンキナー

る RhoA の活性化には細胞内チロシンキナーゼである

ゼの Fyn の働きが各々必要であることが示された 32)．

Src が必要であることから，Src によるリン酸化によっ

細胞間接着部位における張力の負荷による RhoA の活て活性化される RhoGEF である Vav ファミリーが検討性化においても GEF-H1 の関与は報告されている．イ

された 29)．その結果，Vav2 が，繰り返し伸展刺激によっ

ムノグロブリンスーパーファミリーの細胞間接着因子で4

総説―力覚応答に関与する低分子量 G タンパク質 Rho ファミリーの活性化因子 RhoGEF

ある Junctional adhesion molecule A (JAM-A) の特異れる．

的抗体をコートした磁気ビーズを細胞に付着させ，細胞間接着部位での JAM-A に依存した張力負荷を模した刺8. p114RhoGEF ( 別名 ARHGEF18)

激を行うと RhoA が活性化される．これをモデルとし

Yap らのグループは，イヌ腎上皮 MDCK 細胞の細胞層て RhoGEF が探索され，GEF-H1 と p115RhoGEF ( 別において，薬剤によるアクトミオシンの活性化や直接の名 ARHGEF1) の関与が見出された 33)．また，GEF-H1が引張によって細胞間接着部位への張力を負荷する実験方

微小管との結合によって活性が制御されることはよく知法を確立した．これを用い，細胞間接着部位への張力負られていたが，力覚応答における GEF-H1 と微小管の相

荷依存的な RhoA の活性化に必要な RhoGEF が探索さ

互作用の役割は不明であった．これに対し，接着斑においれた 22)．p114RhoGEF は，上皮細胞の細胞間接着部位て KN motif and Ankyrin repeat domains 1 (KANK1)

における RhoA の活性を制御することや，上皮細胞集タンパク質が微小管を係留することで GEF-H1 を抑制

団の層構造において，細胞間接着部位の頂端側を取り巻し，接着斑の動的状態を維持する（不安定化）することがくアクトミオシンリングの収縮力発生に関与することが示された 34)．これは，接着斑の形成と消失のターンオー

報告されていたことから検討された 39-41)．その結果，バーを促す機構として働くもので，Talin の下流で基質張力の負荷によって p114RhoGEF が細胞間接着部へ集の硬さに対する応答に寄与すると考えられている 34)．

積 し RhoA を 活 性 化 す る こ と が 見 出 さ れ た．ま た，
p114RhoGEF は，3 量体型 G タンパク質の下流で働く

7. RGS-RhoGEF ファミリー

RhoGEF の一つであることから検討され，3 量体型 G

LARG, PDZ-RhoGEF ( 別 名 ARHGEF11) , p115

タンパク質の Gα12/Gα13 が，p114RhoGEF の張力

RhoGEF は，Dbl ファミリーの中で，Regulator of G

負荷依存的な細胞間接着部への集積に必要であることがprotein signaling (RGS) ドメインを N 末端に持つサブ示された．さらに，Gα12/Gα13 の集積にはモーター

ファミリーを構成している 24, 35)．RGS ドメインは 3 量タンパク質である MyosinVI が必要であり，MyosinVI

体型 G タンパク質のαサブユニットの活性を抑制するの E-Cadherin への結合がそれらのタンパク質の細胞間ドメインとして知られ，RGS-RhoGEF は，G タンパク質

接着部位への局在を規定していることが示された 22)．

共役型受容体 (G protein-coupled receptor: GPCR) のMyosinVI は，アクチン線維上を動くモータータンパク

下流で Gα12/Gα13 を抑制すると共に，その結合に質であるが，結合したアクチン線維への力の負荷によっよって活性化し，RhoA を活性化することが知られていて ATPase 活性が変化することでテンションセンサー

た 36)．力覚応答については，先に記した磁気ビーズにとして働くことが示唆されている 42)．細胞間接着部位

よる Integrin を介した細胞への張力負荷で, RhoA を活への張力負荷は細胞内のアクチン線維と結合した性化する RhoGEF として LARG の関与が示された．まE-Cadherin に作用し，細胞内のアクチン線維に張力をた先に記したように，p115RhoGEF は細胞間接着因子負荷する．これにより MyosinVI と E-Cadherin との親で あ る JAM-A を 介 し た 細 胞 へ の 引 張 刺 激 に お い て

和性が増加し，Gα12/Gα13，p114RhoGEF が集積しRhoA の活性化に必要であることが明らかにされた 33)．

て RhoA を活性化するモデルが提唱されている 22)．仮また，PDZ-RhoGEF は，細胞間接着部位における張力説の段階ではあるが，新規なメカノセンサータンパク質によって局在変化し，細胞間接着構造の制御に寄与するの同定から RhoGEF に至るシグナル伝達経路が示されことが示唆されている 37)．RGS-RhoGEF の上流因子でた興味深い報告である．

ある Gα12/Gα13 は，GPCR からのシグナルの他に心筋細胞などへの伸展の刺激で RhoA を活性化するため

9. Solo ( 別名 ARHGEF40)に必要であることが報告されており 38)，上流のメカノ

Solo は，低分子量 G タンパク質 Rho ファミリーの一つ

セ ン サ ー か ら の シ グ ナ ル を 受 け て Gα12/Gα13 がである Rac3 の結合タンパク質として酵母ツーハイブ

RGS-RhoGEF の活性化を制御している可能性が考えら

リットスクリーニングで見出され，RhoA と RhoC の5

総説―力覚応答に関与する低分子量 G タンパク質 Rho ファミリーの活性化因子 RhoGEF

GEF として働く RhoGEF である 43)．また，ゼブラフィッ

する力によって細胞の同期した運動が制御されているとシュの初期発生過程で，原腸陥入時の中胚葉細胞の収束考えられる．イヌ腎上皮 MDCK 細胞の集団移動につい伸長に必要なタンパク質であることが報告されていたて Solo，又は，K8/K18 の発現抑制を行うと，個々の44)．私たちは，血管内皮細胞に対し，繰り返し伸展刺細胞の移動速度は変化しないが，細胞集団となった時の激によって誘導される細胞の配向，整列をモデルに Dbl

移動速度が加速することが明らかになった 47)．LARG とファミリーのRhoGEF の RNA 干渉によるスクリーニン

p115RhoGEF の発現抑制によっても同じように集団移グを行い，関与するものとして Solo, LARG や GEF-H1

動速度の上昇が見られており，これらの RhoGEF は，を含む 11種類同定した 45) ( 表1)．その中で，Solo タンパ

細胞間接着部位における張力の発生や力の平衡化に寄与

ク質について解析を進め，VE-Cadherin や Fibronectin

していることが示唆される 48-49)．

をコートした磁気ビーズを用いた細胞への引張刺激による RhoA の活性化に必要であることを明らかにした 46)．

10. Obscurin（別名 ARHGEF30）

さ ら に，Solo に 対 す る プ ロ テ オ ミ ク ス 解 析 に よ り，RhoA の GEF として働く Obscurin を発現抑制した乳

Solo は，単層上皮特異的に発現する中間径フィラメン

腺上皮細胞を硬さの異なる基質上で培養すると，1 kPaトである Keratin8/Keratin18 (K8/K18) 繊維に結合す以上の硬さで細胞の運動性や移動速度が上昇することがることを見出した 46)．Solo は，N 末端から C 末端にか見出された 50)．Obscurin は，乳癌の転移を抑制する働

けて少なくとも 3 箇所の K8/K18 繊維との結合部位をきを持つことが示唆されており，基質の硬さに応じて有し，N 末端部の K8/K18 繊維との結合能を失うと張RhoA を活性化し，接着斑の増強と収縮力の発生で細胞力負荷による RhoA の活性化の能力を失い，逆に優性の移動を抑制する働きを持つことが示唆された．逆に，不活性型として振る舞うことを見出した．K8/K18 繊維

癌細胞における Obscurin の欠損は，硬さに対する細胞を発現抑制した場合も張力負荷依存的な RhoA の活性の応答が変化し，軟らかい乳腺組織において癌細胞の運化は抑制され，ケラチン繊維との相互作用が細胞の張力

動性の亢進を促し，転移を促進してしまうと考えられる

感知と RhoA の活性化による収縮力の発生に必要であ50)．
Obscurin は，類似した構造をもつ Obscurin-like-1とることを明らかにした 46)．上皮細胞は，細胞間接着をサブファミリーを形成している．Obscurin と Obscurin-

維持しながら細胞集団が同調して移動する集団移動を行

like-1 は，筋肉のサルコメア構造を形成するタンパク質うことが知られている．この時に細胞間接着部位に作用である Titin と Myomesin を架橋するものとしても働

表 1. 力覚応答に関与する RhoGEF
Rho-GEFs

別

名

Abr

関与する機械刺激

標的 Rho タンパク質

参考文献

繰り返し伸展刺激

RhoA/Rac1/Cdc42

45)

Alsin

ALS2

繰り返し伸展刺激

Rac1

45)

ARHGEF10GEF10繰り返し伸展刺激

RhoA/RhoB/RhoC

45)

Bcr

Bcr1

繰り返し伸展刺激

RhoA/Rac1/Cdc42

45)

GEF-H1

ARHGEF2

繰り返し伸展刺激, 細胞間, 細胞­基質間接着への張力負荷 RhoA

LARG

ARHGEF12

繰り返し伸展刺激, 張力負荷

RhoA

32)

Obscurin

ARHGEF30

基質の硬さ（細胞­基質間接着への張力負荷）

TC10

50)

p114RhoGEF ARHGEF18

繰り返し伸展刺激

RhoA/Rac1

22)

p115RhoGEF ARHGEF1

細胞間接着の張力負荷

RhoA

22,23)

p190RhoGEF ARHGEF28/RGNEF

繰り返し伸展刺激

RhoA

45)

PDZ-RhoGEF ARHGEF11

細胞間接着の張力負荷

RhoA

37)

繰り返し伸展刺激

Rac1/Cdc42

45)

繰り返し伸展刺激

Rac1~3/Cdc42/RhoG/TC10 45)

PLEKHG1

ARHGEF41

P-REX231-34)Solo

ARHGEF40/Scambio/Quo 繰り返し伸展刺激, 張力負荷, 細胞間接着の張力負荷

RhoA/RhoC

45-47)

α-Pix

ARHGEF6/COOL-2

繰り返し伸展刺激, 細胞間接着の張力負荷

Rac1/Cdc42

45)

β-Pix

ARHGEF7/COOL-1

繰り返し伸展刺激

Rac1/Cdc42

45,52)

繰り返し伸展刺激

RhoA

28)

Vav-2

6

総説―力覚応答に関与する低分子量 G タンパク質 Rho ファミリーの活性化因子 RhoGEF

いており，サルコメア構造の力学的な安定性に重要な役

13. おわりに割を担っていることが知られている 51)．この働きに力覚応答を制御する分子機構は，今まさに様々な分子のRhoGEF としての活性が必要であるかは不明であるが，関与が明らかにされつつある．しかし，センサーとして

直接機械的な力が負荷される分子であることから，力覚機能する分子や仕組みは未だにわずかしか明らかにされ応答に特化した機能を持つ可能性がある RhoGEF の一ていない．RhoGEF タンパク質は，RhoGAP と共にアつである．

クチン骨格の再構築を制御する分子群の中で，その種類が多様化している分子群であることから，機械的な力に

11. β-Pix（別名 ARHGEF7, COOL-1）

よってその活性が変化するものが存在している可能性は癌細胞の転移能と P-Cadherin の発現に相関があること高いと考えられる．また，分子の立体構造とその力学特が知られている．また，癌細胞の浸潤や転移は細胞の集性が正確に予測できるようになれば，メカノセンサータ

団移動によって進行することが知られている．これらのンパク質として機能するタンパク質やそのモチーフが予知見から P-Cadherin の集団移動に対する機能が解析さ測できると考えられる．それらと Rho シグナルをメカ

れ，移動方向に対する細胞­基質間，細胞間の収縮力のノセンサー分子まで追跡する研究を積み重ねることで，発生方向に P-Cadherin が特異的に寄与することが示さ

力覚応答の分子機構の全貌が明らかにされて行くと期待れた 52)．これは P-Cadherin が，移動による細胞間の張される．力覚応答に関与するタンパク質は，癌の発症や力の感知と収縮力の発生に関与することを示唆してい悪性化，代謝の制御や組織のバリア機能などの不全による．P-Cadherin の結合タンパク質としてβ-Pix が同定る多くの疾患に関連することが示唆される。これらの疾され，
β-Pix は，P-Cadherin 依存的な集団移動時の力患の原因を解明し治療をする上で，力覚応答の分子機構の発生に必要であることが示された．また，集団移動時の研究は，今後，さらに重要になると考えられる．

に P-Cadherin 依 存 的 な Rho タ ン パ ク 質 の Cell
division cycle 42 (Cdc42) の活性化に必要であること

参考文献が示された 52)．間接的ではあるが，Cdc42 を活性化す

1 ) Orr, A. W., et al.: Mechanisms of mechanotrans-

る GEF が細胞間接着における張力に応答して働くことを示した報告である．

duction, Dev. Cell. 10, 11 (2006).
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RhoGEF

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私たちは，Solo, LARG, GEFH1 とともに , 繰り返し伸transduction gone awry, Nat. Rev. Mol. Cell Biol.

展刺激による血管内皮細胞の配向に関与する RhoGEF

10, 63 (2009).

として Abr, Alsin, ARHGEF10, Bcr, p190RhoGEF,

4 ) Coste, B., et al.: Piezo1 and Piezo2 are essential

PLEKHG1, P-REX2, β-Pix を見出した ( 表 1）．これら

components of distinct mechanically activatedの中で p190RhoGEF と GEF-H1， Bcr と Abr, α-Pix

cation channels, Science. 330, 55 (2010).

とβ-Pix は各々 DH-PH ドメイン以外でも類似した構造5 ) Caterina, M. J., et al.: The capsaicin receptor: aをもつ RhoGEF であり24-25)，力覚応答において類似した

heat-activated ion channel in the pain pathway,

働きを持つことが推測される．また，Alsin, PLEKHG1,Nature. 389, 816 (1997).

pREX2, β-Pix は，アクチン骨格による突出構造である葉6 ) Earley, S., et al.: The physiological sensor chan-

状仮足や糸状仮足の形成を促す Rac や Cdc42 を活性化

nels TRP and piezo: Nobel Prize in Physiology or

する RhoGEF である．RhoA 以外の Rac や Cdc42 を

Medicine 2021, Physiol. Rev. 102, 1153 (2022).

制御している RhoGEF は新たな力覚応答の分子機構や7 ) Iskratsch, T., et al.: Appreciating force and

役割を持つことが推測される．

shape-the rise of mechanotransduction in cell7

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9

総説―力覚応答に関与する低分子量 G タンパク質 Rho ファミリーの活性化因子 RhoGEF

10

総

説

ペプチド系天然物の生合成に関与する
tRNA 依存型アミド合成酵素
丸 山

千 登 勢 *, 濱

1. はじめに野吉

十*ン酸化，NRPS ではアデニル化による ATP 依存的な活ペプチド系天然物は，その多くが細菌やカビなどの微性化が必須である．ATP-grasp ligase は，形成したア生物によって生産され，臨床利用されている 1, 2)．これ

ミノアシル - リン酸（aa-P）を直接伸長ユニットとしてらを構成するアミノ酸は，リボソーム依存的またはリボ使用してペプチド鎖の形成と伸長を触媒する．しかしな

ゾーム非依存的なシステムの触媒により，アミド（ペプがら NRPS においては，アミノアシル - アデニル酸チド）結合を介して結合している．ATP-grasp ligase 3)（aa-AMP）は，peptide carrier protein (PCP) ド メ イ（図 1 A）や 非 リ ボ ソ ー ム 型 ペ プ チ ド 合 成 酵 素

1,2)

ン上の 4 -phosphopantetheine 基の SH 基に転移され，（NRPS, 図 1 B）はリボソームに依存しないアミド合成

チオエステル結合で PCP ドメインに共有結合したアミ酵素の代表的な一群であり，その触媒過程には，基質アノ酸は，ペプチド鎖を伸長するための伸長ユニットとしミノ酸のカルボキシル基の，ATP-grasp ligase ではリて使われる．ATP-grasp ligase は aa-P とフリーで存在

図1

ペプチド鎖伸長におけるアミド形成の反応機構

A. ATP-grasp ligase：ATP 依存的にリン酸化による基質アミノ酸の活性化とアミド合成反応を触媒する . B.
NRPS：基質アミノ酸は ATP 依存的にアデニル化され，PCP ドメインにチオエステル結合を介して活性化され，アミド形成に使用される．C. リボソーム依存的な翻訳システム：タンパク性アミノ酸基質は aaRS の触媒により，tRNA とのエステル結合を介して活性化され，タンパク合成に使用される．D. tRNA 依存型アミド合
成酵素：タンパク質合成システムで aaRS によって形成される aa-tRNA を基質としてアミド合成反応を触媒する．E. tRNA の二次構造* 福井県立大学大学院 生物資源学研究科
11ペプチド系天然物の生合成に関与する tRNA 依存型アミド合成酵素

するアミノ酸との縮合反応を触媒するが，NRPS ではペプチド結合の形成が PCP ドメイン上で行われる．したがって，同じリボソーム非依存的な ATP-grasp ligaseと NRPS であるが，基質アミノ酸の活性化とアミド形
成システムに違いがある．しかしこれら 2 つのシステ
ムはどちらも，基質としてタンパク性アミノ酸も非タン
パク性アミノ酸も使用できることから，多様な構造を持
つ生成物を作り出すことができる 4-6)．
それと比較して，リボソーム依存的なペプチド結合形
成においては，基質となるタンパク性アミノ酸の厳密な選択と結合に，多くの巨大分子の協調的な働きによる複雑なプロセスが必要であり，それにより基質アミノ酸の図2
dehydrophos (DHP), streptothricin-F (ST-F),
BD-12, pacidamycin (PAC), sansanmycin Q(SAN Q) の化学構造

カルボキシル基はアデニル化によって活性化される（図によって生産される phosphonopeptide 抗生物質であ1C）．
このように形成された aa-AMP は，それぞれのアミり，グラム陰性・陽性の両者に対して幅広い抗菌活性をノ酸に適した tRNA に転移され，アミノアシル -tRNA

有する．DHP の N 末端に存在する Gly と L-Leu からな（aa-tRNA）が形成される 7)．この工程は，aa-tRNA 合るジペプチド構造は，細胞内への取り込みを促進し，抗成酵素（aaRS）8) として知られる各アミノ酸特異的な菌活性に必須の構造であることが明らかになっている

活性化酵素によって触媒され，アミノ酸はそのアミノ酸

11)．ジペプチド分子の生合成には，2に適した tRNA のリボース 3ʼ -末端の水酸基にエステル

tRNA 依存型酵素，DhpK と DhpH の C 末端ドメイン

結合を介して付与される．このように NRPS のシステ

（DhpH-C）が関与しており，これらの酵素はそれぞれ

ムは，アミノ酸の活性化体として PCP ドメインとのチ

Gly-tRNAGly と Leu-tRNALeu を基質にアミド結合を形

オエステル結合を利用し，リボソーム型の翻訳システム

成する（図 3A）12)．機能未知タンパクについて，立体では，タンパク性アミノ酸の活性化体に tRNA とのエ

構想予測を基に機能推定するオンラインプログラム，

ステル結合を利用し，
これら 2 つのシステムにおけるペプ

HHpred を用いた解析で，DhpH-C と DhpK は，ペプチチド鎖の伸長はどちらも，tRNA や PCP などの巨大なドグリカン生合成に関与する酵素である Fem transferase

生体分子を足場として起こるという点で共通している．

の立体構造に類似していることが示された（図 3 B）．ペaa-tRNA は元来，リボソーム型翻訳システムで同定

プチドグリカンの構成ユニットは，N-acetylmuramic

されたものであるが，近年，aa-tRNA 依存型酵素が一acid（MurNAc）と N-acetylglucosamine（GlcNAc）

次代謝・二次代謝に関わらず，様々な細胞内プロセスでからなり，MurNAc にはペプチドが結合している 14)．

利用されていることが明らかになっている 7)．特にペプグラム陽性菌において Fem transferase は，ペプチドチド系天然生理活性物質の生合成において，aa-tRNA

グ リ カ ン 前 駆 体 で あ る UDP-MurNAc-pepntapeptide

をアミノアシル供与体として利用する酵素ファミリーのの３番目に位置する L-Lys（グラム陰性菌では meso-

数は着実に増加している（図 1D）9, 10)．本総説では，近年，diaminopimelic acid）の側鎖アミン（ε- アミノ基）に，

急 速 に 増 加 す る GCN5-related N-acetyltransferase

aa-tRNA か ら ア ミ ノ 酸 を 転 移 す る 反 応 を 触 媒 す る．

（GNAT）fold を有する tRNA 依存型アミド合成酵素のWeissella viridescens が有する FemX Wv は Ala-

知見について述べる．

tRNA

Ala

つの GNAT-foldを使って Ala を転移し，また Staphylococcus

aureus が有する FemXSa は，Gly-tRNAGly から Gly を
2.

dehydrophos の生合成に関与する GNAT-fold

転移する 15)．著者らはこの報告の中で，ペプチドグリ

tRNA 依存型アミド合成酵素

カン前駆体へ効率的かつ特異的に Ala を転移するため

dehydrophos（DHP, 図 2）は Streptomyces luridus

12には tRNA の acceptor stem 構造が重要であることをペプチド系天然物の生合成に関与する tRNA 依存型アミド合成酵素示した（図 1E）15, 16)．彼らはさらに，FemXWv の活性部

要な役割を担うと考えられている．

位として Phe304 と Lys305 を提唱した 17)．Phe304 は，

DhpH-C は，Ala(P) と称されるアミノリン酸アナログ，

tRNA3ʼ - 末端の CCA 配列のうち，真ん中の C 残基の(R)-1-aminoethylphosphanate と Lue-tRNALue との縮リボースとπスタッキングで相互作用し，また Lys305

合反応を触媒する（図 3A）．近年，van der Donk らは，は，中間体との静電的相互作用による安定的な結合に重DhpH-C と tRNALue の変異解析による触媒残基の同定と基質認識機構の解明を試みた 18, 19)．この報告で著者
らは，DhpH-C は tRNALue の acceptor stem 構造とtRNALue に結合したアミノアシル基の両方を認識する
こ と を 明 ら か に し た．ま た，DhpH-C の Phe328 とLys329 は，FemX の Phe304 と Lys305 に相当することから，おそらく tRNA と相互作用する Phe-Lys モチー
フを形成すると提唱した．DhpH-C は，Lue-tRNALue
に対して最も高い酵素活性を示したが，Ile-tRNALue，
Val-tRNAVal，Phe-tRNAPhe についても基質認識が可能であり，さらに興味深いことに，DhpH-C は，2つの非天然型 aa-tRNA 合成基質，Ile-tRNALue と acceptor stem
構造のみからなる分子についても基質として認識した．これらの知見から著者らは，DhpH-C が有する高い基質寛容性を利用して，Ile-, Ala-, Val-, norvaline-, norleucine-tRNALue を基質に DHP 類縁体を創出した 20)．
3.

streptothricin 類縁抗生物質 BD-12 の生合成から見出した GNAT-fold tRNA 依存型アミド結合
合成酵素
streptothricin（ST）類縁化合物は，L-β-lysine（β-Lys）やそのオリゴペプチド [oligo(β-Lys)] 構造を側鎖に有する N- グリコシド抗生物質の一群であり，β-Lys を
1 残基有する ST-F（図 2）が 1943 年に Streptomyceslavendulae から初めて単離された 21)．ST-F は原核生物
におけるタンパク質合成系を阻害し 22)，また哺乳類を含む真核生物の生育を強力に阻害する 23-25)．また oligo(β-Lys) 側鎖を有する ST 類縁化合物は，原核・真核生図3

3 本総説に登場する様々なアミド合成酵素の反応機構

DHP 生合成酵素，DhpH-C と DhpK（A），ペ
プチドグリカン生合成に関与する FemX（B）,
BD-12 の Gly 側鎖形成に関わる Orf11（D），

物の両者に対して毒性を示すことから 26, 27)，ST 類縁化合物の中で実際に臨床利用された化合物はない．これらの ST 類縁化合物に加えて，Streptomyces 属放線菌はβ-Lys の代わりに，Gly 側鎖や Gly 誘導体側鎖を持つ

PAC 生 合 成 酵 素，PacB（E）は い ず れ もST 類縁化合物を生産することが知られている．例えば，

GANT-fold tRNA アミド合成酵素である．またStreptomyces luteocolor NBRC 13826 によって生産さ

ST-F 生合成は NRPS システムにてアミド形成される（C）.

れる BD-12（図 2）は N-formimidoyl-Gly を側鎖に有している 28, 29)．

13

ペプチド系天然物の生合成に関与する tRNA 依存型アミド合成酵素

これまでに我々は ST-F と BD-12 の生合成研究にお2010 年に 2 つの異なる研究グループが PAC の生合

いて，streptothrisamine 分子とアミノ酸側鎖とのアミ成遺伝子群の同定を報告し 42, 43)，生化学的実験によっ

ド結合に関わる酵素群を見出し 30, 31)，非タンパク性アて 生 合 成 経 路 を 解 明 し た 44-46)．興 味 深 い こ と に，

ミノ酸であるβ-Lys 側鎖の結合には NRPS システムがpentapeptide 骨格の形成は，NRPS と aa-tRNA 依存的使用されることを証明した（図 3 C）30)．生合成経路はアミド合成酵素の共同作用によるものであった（図 3 E）．

単独型アデニル化（A）ドメインである Orf5 がβ-Lys

Streptomyces coeruleorubidus NRRL 18370 から同定のアデニル化を触媒することから始まり，形成されたβ

された PacB は，tetrapeptide 中間体の N 末端に Ala-lysyl-O-AMP は Orf18 の PCP ドメイン上にロードさを導入するために Ala-tRNAAla を使う 47)．HHpred にれる 30)．Orf18 の縮合（C）ドメインは，共有結合したよる解析で，PacB の立体構造は FemXWv や FemXSa のβ-Lys 残 基 と，フ リ ー で 存 在 す る ア ミ ノ 糖 中 間 体構造と類似しているが，その一次構造は FemX との有streptothrisamine との縮合反応を触媒し，ST-F を生意な類似性は示さなかった 47)．

成 す る 30)．そ の 一 方 で，Gly 誘 導 体 側 鎖 を 有 す る

PacB ホモログ酵素をコードする遺伝子が，NAP や

BD-12 の生合成では，FemX 様酵素である Orf11 が，MRD の生合成遺伝子群にも見つかっているが，これら

Gly-tRNAGly の Gly を streptothrisamine へ転移するの機能については明らかにされていない．しかしながら

HHpred を用いた解析で，ことが明らかにした（図3 D）31)．

最近，Hong らのグループが，新規 sansanmycin 類縁体，

Orf11 の推定構造は FemXWv の構造に類似することがSAN Q（図 2）を同定し，SAN 生合成遺伝子群が有す示唆されたが，Orf11 の一次構造は有意な類似性を示さる PacB ホモログ遺伝子 ssaB が，tRNA 依存的なアミなかった 31)．前述したように，DHP 生合成に関与する

ド形成に関与することを証明した 48)．

DhpH-C は aa-tRNA 基質に対して寛容な基質認識を有することが示されたが 20)，Orf11 は Gly-tRNAGly に特5．おわりに異的であり，Ala-tRNAAla を使ってほんのわずかに Ala

近年，原核生物や真核生物から 10 万種類を超える側鎖を有する化合物を与えた 31)．DhpH-C と同じく，GNAT スーパーファミリーが見出されており，それら

Orf11 も aa-tRNA 依存型酵素であるが，注目すべき点はそれぞれに相当する基質の，アシル化を介した複数のは，Orf11 が基質としてアミノ糖を認識することであり，生理学的機能に寄与している．このファミリーに属する

アミノ酸以外のドナー基質を認識する初めての tRNA

DhpH-C 12, 18) や DhpK 12), Orf11 31), PacB 47), SsaB

依存型アミド合成酵素であるという点である．

48)

は、ペプチド系二次代謝産物の生合成研究で見出された．これらの tRNA 依存型触媒機能と tRNA の基質
4.

uridyl peptide 抗生物質の生合成に関与する認識に関与する構造上の特徴は，ペプチドグリカン生合

GNAT-fold tRNA 依存型アミド合成酵素

成に関わる FemXWv とともにいまだに議論されている

pacidamycin（ PAC, 図 2 ） 33-35) や napsamycin

17)．実際に DhpH-C は，いくつもの aa-tRNA を認識す

(NAP) 36), mureidomycin (MRD) 37-39), sansanmycin

るほど基質に寛容であるが，他の酵素（DhpK, Orf11,(SAN, 図 2 ) 40, 41) は，Streptomyces 属放線菌によってPacB,SsaB）は 20 種類の aa-tRNA のうち，認識する生産される uridyl peptide 抗生物質である．これらのaa-tRNA 基質は 1 種類のみであり，これらの構造的な化合物はいずれも，
3ʼ -deoxy-4ʼ ,5ʼ -enaminouridine（あ違いは未解明である．これら酵素群の更なる構造解析は，

るいはその dihydrouridine 誘導体），N-methyl-2s,3s-

これらの酵素がどのように基質特異性をコントロールしaminobutyric acid，そして ureido 結合の 3 つの分子ているのかを理解するために必要であり，その結果，広を有することを構造的な特徴を持つ．これらの uridyl

い基質特異性を有する変異型酵素が構築できれば，ペプ

peptide 抗生物質は，細菌の translocase I が触媒する

チド系天然物の化学的多様性を広げるアプローチとして脂質中間体の生成を標的としてペプチドグリカン生合成

有効な手段となりうるだろう．

を阻害する．

14

ペプチド系天然物の生合成に関与する tRNA 依存型アミド合成酵素

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ペプチド系天然物の生合成に関与する tRNA 依存型アミド合成酵素

18

総

説

もやもや病の分子病態をめぐる幾つかの論点
森戸大介 *, 折 井

1. はじめにみなみ*（プロセス，メカニズムの問題）の二点が挙げられる．

もやもや病は原因不明の，かつ現在まで根治療法の確問題①については，もやもや病における内頚動脈終末

立されていない脳血管疾患である（指定難病 22）1)．

部以外の血管の形状変化（頭蓋内の末梢動脈全般におけ患者の多くが日本を始めとする東アジアにルーツを持る動脈外径の縮小）や，後述のもやもや病関連変異が他

ち，半数程度は 10 歳以下で発病している . 体幹から脳の狭窄性血管疾患とも相関していることなどが見出されに到る主要な血管の一つである内頚動脈の進行性・両側ており，必ずしも内頚動脈終末部に限った病態ではない性の狭窄に始まり，動脈内腔の狭小化による脳血流障害 ,のではないかと考えられ始めている（ただし最も明瞭・

脳虚血 , 脳梗塞へと病態は進む．さらに，慢性的な脳虚高頻度に病変が現れるのは内径動脈終末部であり，その血・低酸素状態への応答として病変部周辺に微細な毛細理由は依然として明らかでない）．

血管網を新生し（特徴的な形状から煙に例えてもやもや

問題②については，病変部の主な病理所見は動脈中膜血管と呼ばれる），血流を代償するが，やがてこの血管の菲薄化と内膜の肥厚（と血管内腔の狭小化）であるが，が破れて症状の増悪を招く（図 1）．

その起点が動脈内皮の異常なのか，それとも動脈平滑筋自体の異常なのか，あるいはマクロファージ等の免疫細胞や血中を循環する造血幹細胞の関与があるのか等，臨床においてもコンセンサスが得られておらず，研究の方向性が定まり難い状況にある．
このような状況を打破し得る重要な手掛かりとして，
2011 年にもやもや病発病と深く関わる新規遺伝子の同定が報告された．また特に 2019 年ごろから，本遺伝子に関わる分子・細胞レベルでの重要な発見が相次いでお図1

もやもや病の病態

多くは 10 歳以下の子どもで，内頚動脈が脳底で分岐する付近（内頸動脈終末部）において動脈のり，もやもや病の機序解明につながっていくことが予感されるが，個々の発見ともやもや病の関係はいまだ明瞭でない．著者らは本遺伝子の最初の分子クローニングを狭窄を生じる．そのため体幹から脳への血液供給行い，これまで生理・病態機能解明を進めてきた．本稿が障害され，患者は脳虚血・脳梗塞に陥る．血流では近年の急速な分子・細胞レベルの知見の集積によりを代償するためもやもや血管が新生されるが，成人以後にしばしばこの部位から出血を生じる．
もやもや病をめぐる最も主要な問題として，①なぜ内頚動脈（の終末部周辺）でのみ狭窄を生じるのか？（病幾らか混乱している現況の整理を試みてみたい．
2. もやもや病遺伝子ミステリン
もやもや病は日本を始めとする東アジア地域に多い

変の場所の問題），②どの組織・細胞のどのようなイベン

1)．東アジアでのもやもや病有病率は約

トを起点として，どのように病変を形成していくのか？

り，白人間での有病率約 1/100,000 に比べて 10 倍程度

1/10,000 であ* 昭和大学医学部生化学講座
19もやもや病の分子病態をめぐる幾つかの論点高い．またもやもや病患者の 10 〜 15％は明瞭な家族関する多型が見出され，もやもや病研究の大きな転機と歴を示す．これらの事実からもやもや病の発病には民族なった．

性あるいは家族性の遺伝要因が関わることが推測されていた．

小泉教授らとの共同研究として，著者（森戸，当時・京大・再生研）の手によりミステリン遺伝子の初めての2000 年代の後半ごろ，東北大・医・小児科（呉繁夫

分子クローニングを行った 3)．本遺伝子は約 600 kDa

教授ら）を中心とするグループと京大・医・環境衛生学（小の巨大な細胞内タンパク質をコードしており，その後，

泉昭夫教授ら）を中心とするグループがそれぞれ東アジ著 者 ら や Tim Clausen ら（オ ー ス ト リ ア・IMP），

ア孤発例，家族例に着目した遺伝解析を行い，遺伝要因

Felix Randow と Gisela Otten ら（英・MRC 分生研）の同定に独立に成功した 2), 3)．17 番染色体の長腕末端によって，これが微小管モーター・ダイニンに類似した領域にある新規遺伝子ミステリン（別名 RNF213）の６連続 AAA+ ATP アーゼドメインと 2 つの亜鉛結合型

ミスセンス一塩基多型（p.R4810K, あるいは長さの異ユビキチンリガーゼドメイン（RING フィンガーおよびなるアイソフォーム配列に基づいて p.R4859K とも）

RZ フィンガー）を持つユニークな酵素であることが明がそれである．東アジアもやもや病患者の約 9 割がこらかにされている 3-6)．

の多型の保因者であり，従来孤発例と考えられてきた症

ミステリンは脊椎動物を含む脊索動物に保存され，ヒ例の大部分も，実は遺伝的背景に基づいて発症していた

ト・マウスでは概ねユビキタスな発現パターンを示すが，ことが明らかとなった．一方で，明瞭な家系を形成する

特に脾臓，マクロファージなど免疫関連組織・細胞に発家族例でも同じ多型が同定された点について，なぜ対象

現が高い 2), 3)．また当初見出された p.R4810K 多型に

家系での発病頻度が同じ多型を有する見かけ上の孤発例

加えてその後、幾つかのより病原性の高いもやもや病関の家系内発病頻度を大きく上回るのか，現在も明らかで連変異が見つかっている 7-11)．ミステリンの一次構造とはない（すなわち，明瞭なもやもや病家系を特徴づける

主な変異の一覧を図 2 に示す．

要因はいまも明らかでない）．いずれにせよ見かけ上のミステリン遺伝子に変異を持たない集団でのもやもや

孤発例，家族例を含む東アジアもやもや病全体と強く相病有病率は約 1/100,000 であり，p.R4810K 保因者間図2

ミステリンの一次構造

ミステリンは６つの AAA+ ATP アーゼドメインを持つが，うち４つは活性を持たず（白抜き），中央の２つ（赤）のみ ATP 加水分解活性を示す．その後方に RING フィンガードメインと，RZ ドメインがある．ミステリン
遺伝子に変異を持たない集団におけるもやもや病有病率は約 1/100,000 と見積もられるが，RING フィンガードメイン周辺の変異および C 末端領域の変異により，有病率は約 1/300 から 1/1 まで上昇する．立体構造上，C 末端領域は RING フィンガーの近傍に位置しており，RING フィンガーの活性に関与する可能性がある．本図には代表的な変異を含めたが，ここに挙げたもの以外にも病原性が高いと考えられる変異が幾つか知られ
ている．

20

もやもや病の分子病態をめぐる幾つかの論点

図3

ミステリンの分子クローニングと命名

ミステリンの分子クローニングは 2008 年初頭ごろに行った．当時，ミステリンの N 末端部分が独立した遺伝
子 ALO17 として報告されており 12)，続く推定読み枠が RNF213 としてデータベースに登録されていた．分
子クローニングの過程でこれら遺伝子の間に新たにエクソンを４つ見出し，これらが連続した読み枠を構成することを実験的に確かめた．新たに見出されたこの遺伝子を moyamoya の m と y を含む形で mysterin と命名した．
ではこれが 約 1/300 まで上昇する 2), 3)．p.R4810K はれていたため，論文には RNF213 の名称を用いた 3)．

一塩基多型であり東アジア人口の約 0.5 〜 2.5％程度（全しかしながら著者にはユニークな名称への愛着もあった

体で約 1,500 万人）が保因している．他方，白人はもため，続報において改めて mysterin の名称を提案し 4)，ともとこの多型を持たない．すなわち東アジアでの高い

現在，著者グループを中心に本名称を用いている．

もやもや病有病率は p.R4810K 多型により説明される．
p.R4810K 多型の遺伝的浸透率はしかし不完全であり，

3. ミステリンの脂質関連機能

前述の通り有病率約 1/300，すなわち保因者の約 300

現在までミステリンの生理・病態機能として多岐に渡人に 1 人しかもやも や 病 を 発 病 し な い．従ってこれはる生体・細胞内でのはたらきが提案されているが，その発病の感受性を増大させる感受性変異であり，発病には後の検証を経て確立されたと言えるものはまだ少ない．

追加の遺伝要因ないし環境要因が必要であると考えられ

これまで脂質に関連した機能・現象が比較的よく確かめらる．
一方で，その後見出された RINGフィンガードメイン

れているが，
これは著者らによる発見を嚆矢としている．

の保存されたアミノ酸変異や周辺領域変異の保因者は，

ミステリンは新規遺伝子であり，同じドメイン構成を知られている限り全員がもやもや病を発病している．す持つ既知のファミリー遺伝子も存在しない．そのためク

なわち有病率 1/1 と推定され，これら変異は追加の要

ローニング後，ゼロから機能探索を行う必要があった．

因なしに発病を導く原因変異であると考えられる 7-11)．

著者らは幾つかの手法による機能探索を試みる中で，野ここで付記としてミステリン遺伝子の命名に触れてお生型ミステリンタンパク質が特徴的な細胞内局在パター

きたい．著者が分子クローニングを行った当時，本遺伝ンを示すことに気がついた．細胞培地に脂肪酸を加える

子の N 末端領域が独立した遺伝子 ALO17 として論文と培養細胞は中性脂肪を合成して脂肪の滴として細胞内報告されており 12)，そこから少し離れて続く推定読みに蓄積する．野生型ミステリンは脂肪滴を取り囲む美し枠が別の遺伝子 RNF213 としてデータベースに登録さい局在パターンを示す（図 4）14)．

れていた．クローニングの過程でこれら二つの遺伝子がよく知られている通り，油は水に溶けない．中性脂肪

実は単一の遺伝子を構成することが実験的に確かめられは単分子として細胞内液中を拡散することはなく，寄りたため，共同研究者間で協議の上，moyamoya の m と集まって油滴（脂肪滴）を形成する．その表面はリン脂y を冠にして本遺伝子を mysterin と命名した（図 3）．

質一重膜に覆われ，内部の疎水環境と外部の親水環境が特許申請には本名称を用いたが（特許 5854423，2009

うまく仲介されている．脂肪滴の表面には脂肪合成酵素，

年出願）13)，2011 年の論文発表時には既に何らかの経分解酵素，調節因子等が結合しており，細胞外刺激や栄緯で RNF213 の登録内容が正しい全長読み枠に訂正さ養状態に応じてタイムリーに脂肪の量や脂肪酸のリリー

21

もやもや病の分子病態をめぐる幾つかの論点

4. ミステリンの感染防御機能
ミステリンの確かな細胞内局在として現在まで脂肪滴ともう一つ，驚くべきことに細胞に感染した細菌の外膜上が知られている．Randow と Otten らは 2021 年，
非免疫細胞に感染・侵入したサルモネラ菌の外膜表面にミステリンが結合して，外膜上のリポ多糖をユビキチン
図4

ミステリンの脂肪滴局在と脂肪滴の構造

A, HeLa 細胞の核（青），脂肪滴（緑），ミステ
リン（赤）を染色している．幾つかの脂肪滴の周囲がミステリンにより取り囲まれている．特定の脂肪滴のみが取り囲まれる理由は明らかでないが，脂肪滴表面タンパク質はしばしばこのように偏った局在パターンを示す．
B, 小胞体膜上で合成された中性脂肪（TGs）は電荷・極性を持たないため高度に水不溶性であり，小胞体リン脂質二重膜の疎水面に蓄積される．蓄積に従ってレンズ状構造から球状構造へと移行し，やがて小胞体膜を離れてサイトゾル
へと遊離していく．球状構造をとった段階から脂肪滴と呼ぶことが多い．脂肪滴の表面上には
脂肪合成酵素，分解酵素，調節因子などが分布している．

化し，その下流でオートファジーによる細菌の除去とNFκB の活性化が起こることを報告して，大きな話題と な っ た 6)．続 い て ご く 短 い 期 間 の う ち に，Francis
Impens ら（ベルギー・VIB）15) や，Jörn Coers ら（米・デューク大）16), 17) により，この応答が幅広い細菌に対して起こることが確かめられた．
もともと国内の幾つかのグループにより，ミステリン
がインターフェロンβ・γや TNFαなど炎症促進性サイ
トカインによる誘導を受けることが報告されており，ミステリンと炎症の関連が想定されていた 18), 19)．その意
味は必ずしも明らかではなかったが，細菌感染に関する
近年の一連の結果を併せて考えると，免疫細胞・非免疫細胞への感染によりサイトカインが産生・放出されて，スが調節される．脂肪滴は従って，栄養代謝や脂質リソー

感染細胞内でミステリンの発現誘導が起こり，直接のエスの供給・貯蔵の重要な起点（あるいは終点）としてはフェクターとして細菌を攻撃（ユビキチン化）し，細菌

たらく．

の除去と炎症を活性化するというシンプルな流れを想定

ミステリンが脂肪滴の表面に結合すると，同じく脂肪できる．

滴表面に結合している中性脂肪分解酵素 ATGL が競合

前 述 の 脂 肪 滴 と の 関 連 で 言 え ば，興 味 深 い こ と に的に排除される．これにより脂肪分解が停止し，細胞内Impens らはインターフェロンで誘導されたミステリンの脂肪貯蔵が増強される．そして最も興味深いことにこが脂肪滴上で多量体化し，続いて細菌膜表面に移行するのようなミステリンの脂肪滴局在はもやもや病変異によことを提案している 15)．これまで脂肪滴はむしろ細菌・り障害される 14)．前述の通り，もやもや病変異には病

ウイルスにより感染・増殖のためにハイジャックされる

原性の弱い感受性変異と病原性の強い原因変異がある．

構造として認識されてきた．しかし最近になり例えば，

ミステリンの脂肪滴局在・機能は原因変異により著明に

細菌感染時に脂肪滴を足場としてエフェクタータンパク

障害されたが，一方で，感受性変異による障害はほぼ認

質複合体が形成され，脂肪滴と細菌の物理的な結合を介められなかった．すなわち変異の病原性の強さとミステして感染防御にはたらくことが報告されるなど，脂肪滴

リンの脂肪滴局在・機能異常の程度はよく相関していた．

を免疫応答の場として見直す流れが生まれつつある 20)．

従って，ミステリンの局在異常（およびそこからくる機

Impens らの発見はこの経路の一端に位置付けられるの能異常）こそがもやもや病発病の分子・細胞レベルでのではないか．

起点ではないかと考えられた．

また，より不明瞭な関連ではあるが，Tobias Walther

著者らの報告に続いて幾つかのグループがミステリンら（米・ハーバード大・公衆衛生）は，ミステリンが飽の脂肪滴局在・機能について報告している．それらはい

和脂肪酸の脂肪毒性による NFκB 活性化を仲介するこずれも代謝と云うよりは自然免疫・炎症との関連を示唆とを報告している 21)．脂肪毒性と称されるものの分子している．順序立てて議論してみたい．

実態は必ずしも明らかでないが，過剰な脂肪酸が組織を22

もやもや病の分子病態をめぐる幾つかの論点

障害することや，細胞レベルでは ROS 産生，小胞体ス

伴う AAA+ 型ドメインであること，当初見出された

トレス，細胞死等につながることが知られており，NF

AAA＋ドメインの後方にさらにもう一つの AAA+ ドメ

κB 活性化もそのうちに位置付けられる．データはパル

インが存在することなどが明らかとなった 4)．AAA+ ド

ミチン酸による NFκB 活性化がミステリンの発現抑制

メインのように配列ではなく構造で規定されるドメインで改善することを示しているが，分子メカニズム，脂肪の場合，このように単純な BLAST 解析のみでは検出に滴との関連については明らかになっていない．ミステリ

十分でないことがある．

ンにより脂肪滴が安定化されることを考えれば，パルミ

AAA+ タンパク質の多くは分子内に一つもしくは二チン酸とグリセロールの脱水縮合で生じる中性脂肪の安つの AAA+ ドメインを持つ．いずれの場合にも６分子定化により細胞内のパルミチン酸レベルは低下し，むしが 集 ま っ て ド ー ナ ツ 状 の ６ 量 体 を 形 成 し，協 調 し た

ろ脂肪毒性が低減する可能性も考えられるが，検証されATP 加水分解に伴う複合体全体の構造変化を通じて，ていない．Walther らは脂肪滴に関して世界でも有数の細胞内における幅広い物理過程を仲介する（膜の結合・研究グループを形成しており，なぜ脂肪滴との関連を検分離，タンパク質の構造破壊・複合体解離，細胞骨格と討しなかったのかよく分からない．脂肪毒性と脂肪滴，結合してのモーター機能など）．著者らが検討したとこ

感染との関連について今後の展開があるなら俟ちたい．

ろ、確かにミステリンのホモ多量体形成を示唆するデー

ここまで述べたように現在，ミステリンの炎症誘導性

タが得られたため，ミステリンも他の AAA+ タンパクと感染防御機能については前述のようにシンプルな理解質と同様，ドーナツ状６量体を形成すると考えた 4)．しが成立するだろう．一方でそれら機能とミステリンの脂かしこれは半分正しく，半分誤っていた．

質関連機能がどう相関しているのか，明確な解明はまだ2020 年に至り Clausen らは独自に精製した全長マウ与えられていない．さらにまたミステリンの免疫機能とスミステリンを用いてクライオ電子顕微鏡解析を行い，脂質関連機能のそれぞれがどのようにもやもや病の発病

ミステリンの全長構造解明に成功した 5)．驚いたことにに関わるのか，鍵となるのはもちろんそれぞれの場面に著者らが同定した二つの活性型 AAA+ ドメインの前後おけるもやもや病変異ミステリンの挙動であるが，このに，さらに二つずつの不活性 AAA+ ドメインが見出さ点についても現在、明確な解明を俟つ状況である．

れた．すなわちミステリンは合計６つの活性／不活性AAA＋ドメインを持ち，それらが分子内で 6 量体様構

5. ミステリンの ATP アーゼ活性と機能造を形成することが明らかとなった（図２）．数多いミステリンの機能について前節，前々節で述べた内容

AAA＋タンパク質のうち例外的にダイニンなどがこののうち多くは 2019 年以降の知見に基づいている．前節ような分子「内」6 量体様構造をとる．すなわちミステの末尾に述べたように，ミステリンの完全な機能解明まリンはダイニンに近い AAA+ タンパク質であり，当初ではまだ幾らか時を要する状況であるが，長い間全く手想定された分子「間」６量体はおそらく形成しないのだ

掛かりのなかったもやもや病の分子病態の解明もいよい

ろう．

よ遠くないことを感じさせる．このような最近の急速な一方で，著者らや Impens らはミステリンが ATP アー研究の進展は，著者らや Clausen，Randow，Otten ら

ゼ活性依存的に脂肪滴上で多量体化することを検出してによるミステリンタンパク質の構造と活性の解明にも支おり，これらのデータは信頼してよいように思われる

えられている．
本節と次節ではこの点に触れておきたい．

4), 14), 15)．著者らが想定した分子「間」６量体形成モデ

ミステリンの分子クローニング時，BLAST 解析によルは誤っていた可能性が高いが，ATP アーゼ依存的なり Walker 型 ATP アーゼドメインが一つと RING フィ

多量体化・局在化については支持するデータが多い．前ンガー型ユビキチンリガーゼドメインが一つ見出され，節，前々節で述べた通りミステリンの機能は局在によっ

いずれについても活性が検出された 3)．さらに二次構造て規定されるため，多量体化・局在化・機能までつない

予測などに基づいてこの ATP アーゼドメインがシンプだ包括的な理解が今後重要になるだろう．

ルな Walker 型ドメインではなく，周辺に追加の構造を

23

もやもや病の分子病態をめぐる幾つかの論点

6. ミステリンのユビキチンリガーゼ活性と機能

7. おわりに

ミステリンには二つのユビキチンリガーゼドメインが長い間，謎の疾患として認識されてきたもやもや病のある．最初に見出された典型的なユビキチンリガーゼド

研究は，責任遺伝子ミステリンの単離により転機を迎え

メインである RING フィンガー 2), 3) と，最近 Randow，

た．当初，ミステリン R4810K 変異の解析によりもや

Otten らが見出した新しいタイプのユビキチンリガーゼ

もや病の分子病態解明，動物モデル開発などが一挙に進ドメイン・RZ6) である（図２）．二つのドメインは比較

むものと思われたが，しかし培養細胞を含む in vitro の的近い位置にあり，この周辺に集中して存在するもやも

実験系を用いて R4810K 変異体について見出された幾や病変異がどちらの活性に影響を与えるのか分かりにく

つかの分子・細胞異常のうち，検証を経てコンセンサス

いが，幾つかの変異は RING フィンガーの構造形成にを得るに至ったものはまだない．著者らのこれまでの解必須の保存されたシステイン，ヒスチジン部位に入って析でも R4810K に起因する如何なる分子・細胞異常もいる 7-9)．これら変異により RING フィンガーのユビキ検出できていない 3), 4), 14), 23), 24)．また R4810K 変異をチンリガーゼ活性が消失することから 22)，RING フィ

導入したトランスジェニック／ノックインマウスが作製

ンガー活性の障害・喪失がもやもや病発病の基底にあるされたが，これまでのところ軽微な表現型を示すに留と考えられる．

まっており，もやもや病を再現するには至っていない

前述の通り，RING フィンガー変異によりミステリン18), 25)．

の脂肪滴局在は大きく損なわれ，残存の局在が部分的に

おそらくこれは R4810K 変異の病原性が低いこと（保認められるのみとなる 14)．ミステリンの RING フィン

因者有病率 1/300）を反映しており，この観点からは、

ガーユビキチンリガーゼ活性の標的基質は，では何であ

近年発見されたより病原性の高い変異に着目した解析のろうか．単純には，ミステリンが自己をユビキチン化す必要性が示唆される．とは言え，R4810K 変異がもやもることで自己の局在を規定するという可能性が最も考えや病の重大なリスク因子であることは遺伝学的には間違やすい．あるいはサイトゾル中の局在化因子や，標的膜

いなく，また本稿では触れなかったが，この変異がさら上の受容体（いずれも未同定）をユビキチン化することにアテローム血栓性脳梗塞など広範な狭窄性血管病変ので，ミステリンの正しい局在化機構が担保されている可遺伝的素因となっていることも見出されつつある 26)．

能性がある．これらについて現在まで解明が及んでおら

併せて一塩基多型である p.R4810K が東アジア地域のず，今後の検証が必要である．また Randow，Otten ら

約 1,500 万もの人々に保因されていることを考えると，の報告では，細菌膜上への局在は RING フィンガー変

本変異の研究を避けることはできない．

異の影響を受けないとしており 6)，脂肪滴の場合と異なおそらく R4810K は軽微もしくは潜在的な分子・細るようにも思えるが，これについては定量的な再検証が胞障害をもたらす変異であり，明確に焦点を絞ったアッ

今後必要ではないかと著者らは考えている．

セイ系による定量的な解析による他，分子・細胞障害のまた，RZ の活性は細菌膜のユビキチン化，細菌の除去，実態をつきとめることはできないのではないか．著者ら

NFκB 活性化に重要であることが Randow，Otten ら

はまず病原性の高い変異を対象とした解析により変異ミのデータから明確である 6)．特に興味深い点としてこのステリンの関わる細胞・生体内の病的プロセスを明確に場合のユビキチン化基質が細菌膜上のリポ多糖であるこ

した後，R4810K 変異について再度の解析を行う戦略でとがある．これまでユビキチン化はタンパク質に対して

現在，研究を進めている．

の み 起 こ る 修 飾 反 応 で あ る と 考 え ら れ て き た が，
Randow，Otten らにより初めて非タンパク質性のユビ

参考文献

キチン化反応が見出された．新たに見出されたこの活性1 ) 冨永悌二ほか：もやもや病（ウイリス動脈輪閉塞症）

がミステリンの脂肪滴上での機能およびもやもや病発病診断・治療ガイドライン（改訂版）, 脳卒中の外科 ,にどのように関わるのかは大変に興味深く，今後の検証

46, 1-24 (2018)

が俟たれる．

242 ) Kamada, F. et al .: A genome-wide association

もやもや病の分子病態をめぐる幾つかの論点

study identiﬁes RNF213 as the ﬁrst Moyamoya

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5 ) Ahel, J. et al.: Moyamoya disease factor RNF213(2021)

is a giant E3 ligase with a dynein-like core and a

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e0188822 (2022)

8 ) Raso, A. et al.: Moyamoya vasculopathy shows a18) Kobayashi, H. et al.: Biochemical and Functional

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21 ) Piccolis, M. et al .: Probing the Global Cellular

Variants With Childhood Onset Moyamoya Dis-

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ease and Diﬀuse Occlusive Vasculopathy, Neu-

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rology., 96(13), e1783-e1791 (2021)

22) Takeda, M. et al.: Moyamoya disease patient mu-

12) Cools, J. et al.: Identiﬁcation of novel fusion 0)

tations in the RING domain of RNF213 reduce its

partners of ALK, the anaplastic lymphoma

ubiquitin ligase activity and enhance NFκB acti-

kinase, in anaplastic large-cell lymphoma andvation and apoptosis in an AAA+ domain-depen-25

もやもや病の分子病態をめぐる幾つかの論点

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24) Kotani, Y. et al.: Alternative exon skipping biases
substrate preference of the deubiquitylase USP15
for mysterin/RNF213, the moyamoya diseasesusceptibility factor, Sci Rep., 7, 44293 (2017)25) Kanoke, A. et al.: Temporal proﬁle of the vascular anatomy evaluated by 9.4-tesla magnetic resonance angiography and histological analysis inmice with the R4859K mutation of RNF213, thesusceptibility gene for moyamoya disease, BrainRes., 1624, 497-505 (2015)26) Okazaki, S. et al.: Moyamoya Disease Susceptibility Variant RNF213 p.R4810K Increases the Risk
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Atherosclerosis, Circulation ., 139(2) , 295-298(2019)

26

総説

高度好塩性古細菌 Haloarcula japonica のイソプレノイド生合成経路の解析と代謝工学による有用物質生産八波

1. はじめに利恵*よるスクアレン高生産系の構築についても述べる．

イソプレノイドは，イソプレン（C5H8）を構成単位とする一群の天然化合物の総称である．イソプレノイドには，植物の精油に含まれるテルペン，ステロイド，カ
ロテノイドなどが含まれ，5 万種類以上が確認されてい2. 高度好塩性古細菌 Haloarcula japonica におけるカロテノイド生合成経路の解明[1] Ha. japonica が生産するカロテノイドの同定

る．イソプレノイドは有用物質の宝庫であり，医薬品，

高度好塩性古細菌とは，生育に 2.5 M 以上の塩化ナ

化粧品，食品添加物，工業製品原料などを通じて私たち

トリウム（NaCl）を要求する好塩性の古細菌である．

の生活に広く利用されている．そのため，生理活性の解

ある種の高度好塩性古細菌は，β- カロテンや炭素数 50

析，生合成経路の解明，微生物をはじめ，酵母・植物に（C50）のバクテリオルベリン（BR）（図 1）といったカおける大量生産系の構築など，イソプレノイド研究は常ロテノイドを生産することが知られている．高度好塩性に発展を遂げてきた 1,2)．

古細菌の一種，Halobacterium salinarum は，光駆動

本項では，筆者が古細菌として初めて明らかにした高型プロトンポンプであるバクテリオロドプシンを有し

度好塩性古細菌 Haloarcula japonica のカロテノイド

3)，その発色団であるレチナールはリコペン，
β-およびスクアレンの生合成経路を中心に，本菌がもつインを経て合成される．一方で，リコペンは，C50 カロテ

ソプレノイド生合成経路を紹介する．また，代謝工学にノイドの前駆体であり，最終的には BR に変換される．

カロテ

図 1 Ha. japonica におけるイソプレノイド生合成経路

点線は推定経路を示す．また，Hb. salinarum で同定されている CrtY および Brp,Blh にはアスタリスクを付けた．

* 東京工業大学生命理工学院
27

高度好塩性古細菌 Haloarcula japonica のイソプレノイド生合成経路の解析と代謝工学による有用物質生産

β- カロテンおよびレチナールの生合成に関与する CrtY

バロン酸経路のどちらかをとる．高度好塩性古細菌は，および Brp，Blh は，Hb. salinarum より同定されていメバロン酸経路で IPP を合成することが知られており，

る 4, 5)．また，同じく Hb. salinarum よりリコペンへの

その出発物質はアセチル Co-A である（図 1 ）．以降のC5 付加に関与するリコペンエロンガーゼ（Lye）も見経路については概略を説明するが，アセチル Co-A か

つかっていた 6）ものの，BR に至る生合成経路の全貌はら HMG-CoA，メバロン酸を経由して，C5 の IPP が合不明であった．

成される．合成された IPP は，異性化酵素（Idi）により，Haloarcula japonica は，石川県塩田土壌より分離さジメチルアリルピロリン酸（DMAPP）に異性化され，れた高度好塩性古細菌であり，三角形平板状という特徴

順次 IPP と縮合していくことにより，C10 のゲラニルピ的な形態を有している（図 2）7) ．2011 年には全ゲノ，ロリン酸（GPP），C15 のファルネシルピロリン酸（FPP）

ム配列解析が終了し，本菌は 2 つの環状染色体と 3 つ

C20 のゲラニルゲラニルピロリン酸（GGPP）というよの環状プラスミドを有することが明らかとなった 8)．本

うに鎖長を延ばしていく．
さらに，
フィトエンシンターゼ

菌のコロニーは赤色を呈しており，カロテノイドを生産（CrtB）により，ATP を用いて 2 分子の GGPP が結合すしていると推察された．そこで，Ha. japonica におけることで，イソプレノイド 8 分子からなる最初の C40 カるカロテノイド生合成に関わる酵素群の特定し，その生ロテノイドである 15- シスフィトエンが合成される 10)．

合成経路を明らかにすること目的とし，まず本菌の生産上述したように，本研究を開始した時点では高度好塩

するカロテノイドを同定することとした．Ha. japonica

性古細菌において，GGPP から BR 合成に至る生合成経を培養後，全カロテノイドを抽出し，逆相 HPLC とフォ路の全貌は明らかとされていなかった．そこで，まずトダイオードアレイ検出器を用いて解析したところ，本

フィトエン生合成に関与するフィトエンシンターゼ

菌は類縁菌 Hb. salinarum と同様，フィトエン，リコ（CrtB）をコードする遺伝子ホモログを Ha. japonica

ペン，イソペンテニルデヒドロロドピン（IDR），ビス

全ゲノム配列より検索した．その結果，染色体 1 上にアンヒドロバクテリオルベリン (BABR)，モノアンヒド

crtB 遺伝子とアノテーションされるオープンリーディ

ロバクテリオルベリン (MABR) および BR を生産してングフレーム（ORF）（c1220 遺伝子）が見出された．

いることがわかった（図 1 ）9)．

C1220 のアミノ酸配列は，土壌細菌 Pantoea ananatis
お よ び 放 射 線 耐 性 細 菌 Deinococcus radiodurans R1の CrtB11,12) といずれも 28% の相同性を示した．これより，c1220 遺伝子が本菌における CrtB をコードしていると考えられた．そこで，当該遺伝子破壊株を構築し，破壊株が生産するカロテノイドを調べた．その結果，野生 株 の 培 養 液 は BR 由 来 の 赤 色 を 呈 す る の に 対 し，

c1220 遺伝子破壊株の培養液は無色となり（図 3 ），生産するカロテノイド種が異なることが予想された．そこで，

c1220 遺伝子破壊株から得られた全カロテノイドを解
図 2 高度好塩性古細菌 Haloarcula japonicaの電子顕微鏡写真[2] ゲラニルゲラニルピロリン酸（GGPP) からリコペンの生合成経路の解明

析したところ，破壊株は BR などのカロテノイドを生産していないことがわかった．これより，c1220 遺伝子
が本菌の CrtB をコードしていることが示唆された 13)．
フィトエンからリコペンに至る反応では，ある種の細菌のカロテノイド生合成経路においてフィトエンデサ

細菌におけるカロテノイド生合成の初期段階はイソプ

チュラーゼ（CrtI）の関与が知られている．そこで上述

レンの合成である．単位構造であるイソペンテニルピロと同様に本菌ゲノム上より crtI 遺伝子ホモログの有無

リン酸（IPP）の生合成は，メバロン酸経路または非メを調べた結果，4 つの遺伝子が見出された．このうち，

28

高度好塩性古細菌 Haloarcula japonica のイソプレノイド生合成経路の解析と代謝工学による有用物質生産

イソプレンおよび水酸基を付加する二機能酵素（リコペンエロンガーゼおよび 1,2- ヒドラタターゼの両方の活性をもつ酵素），C0507 は，リコペンから BR の生合成に お い て は，3,4- デ サ チ ュ ラ ー ゼ（CrtD），そ し てC0505 はヒドラターゼ（CruF）として機能することが既に Hb. sarimurum よりわかった（図 1）15)．C0506 は，同定されている Lye と 60% 程度の相同性を有することから，LyeJ と名付けた．これより，c0507/c0506/c0505
遺伝子クラスターにコードされる 3 つの酵素がリコペンから BR の生合成系に関与することが明らかとなった．C0507 は先にも述べたとおり，フィトエンデサチュ
ラーゼ活性も有することから CrtI/D とよべる . また，本研究における CrtI，CrtD および CruF の同定は，古細菌において初めてのものであった．
図 3 野生株 (A) および c1220 遺伝子破壊株(B) の培養液の写真と生産するカロテノイドを分離したクロマトグラム
クロマトグラムは BR の吸収波長 490 nm における吸収を示す．野生株はカロテノイドに由来する赤色を呈するものの，破壊株は無色であり，クロマトグラムによる解析においてもカロテノイドを生産していないことがわかった．

3. 高度好塩性古細菌 Haloarcula japonica におけるスクアレン生合成経路の解明とスクアレン高生産系の構築[1] Ha. japonica が生産するスクアレンの同定
スクアレンは，イソプレンを構成単位とするトリテル
ペンであり，ステロイドやホパノイドなど，多くの生理既知の crtI 遺伝子と相同性のより高い 2 つの遺伝子ホ

活性物質の前駆体である．スクアレン自体にも価値があ

モログ（c0507 および d1086 遺伝子）の機能を明らか

り，保湿剤等の化粧品用途から，ワクチンのアジュバンにするため，これらの遺伝子の単独破壊株および二重破ド等の治療用用途まで幅広く利用されている 16, 17) 他，

壊株の構築し，生産するカロテノイド種の解析を行った．

近年はバイオ燃料の原料としても注目されている 18)．

その結果，Ha. japonica のフィトエンからリコペン至現在，工業的に用いられるスクアレンは，主に深海鮫のる反応においては，c0507 および d1086 遺伝子にコー

肝油から抽出されている．しかしながら，深海鮫は絶滅ドされる 2 つの crtI 遺伝子が関与する生合成経路が存危惧種に指定されており，漁獲には制限がある．従って，在することが明らかとなった（図 1）14)．

安定した供給および大量に確保することは難しく，スク[3] リコペンから BR の生合成経路の解明

アレン生産の代替え法の検討が急務となっている．上述

c0507 遺伝子近傍のゲノム配列を詳細に解析したとしたように高度好塩菌は高塩濃度環境で生育するため，

ころ，c0507 遺伝子のすぐ下流に存在する c0506 およ他の微生物の混入（コンタミネーション）の可能性が低

び c0505 遺伝子が，それぞれリコペンエロンガーゼおい．そのため，高度好塩菌は，オープンポンドでの物質

よびヒドラターゼの遺伝子ホモログであることがわかっ生産が可能な工業生産宿主であり，すでに塩湖にて好塩た．これら 3 つの遺伝子はクラスターを形成し，共転菌を培養し（生育させ），β- カロテンなどのカロテノイ

写されていたことから，本菌のカロテノイドの生合成にドを生産させる例が世界各国で進んでいる 19)．

密 接 に 関 与 し て い る と 予 想 さ れ た．そ こ で，そこで筆者らは，Ha. japonica によるスクアレン大

c0507/c0506/c0505 遺伝子クラスターを構成するそれ

量生産を目指し，まず本菌がスクアレンを生産するか否

ぞれの遺伝子の単独破壊株を構築し，それらの生産するかを調べた．Ha. japonica からテルペノイド類を抽出

カロテノイド種の分析を行った．その結果，C0506 はし，逆相 HPLC，GC-MS により解析した．その結果，

29

高度好塩性古細菌 Haloarcula japonica のイソプレノイド生合成経路の解析と代謝工学による有用物質生産

スクアレンの生産が確認された（図 4）．また，スクアレ行った．その結果，sqs1 遺伝子破壊株はスクアレンおンに水素が付加された誘導体である，ジヒドロスクアレ

よびその誘導体を生産していないことがわかった．これ

ンおよびテトラヒドロスクアレンも確認された．これらより，sqs1 遺伝子が本菌のスクアレンシンターゼをコーのスクアレン誘導体は，スクアレンが生産されたのちにドしていることが明らかとなった．

還元されたものと考えられた．これらの誘導体を生産す[3] 代謝工学によるスクアレン生産の向上

る微生物は極めて珍しく，その生理機能解明に興味が保

前述により，本菌のスクアレンシンターゼをコードす

たれるところである．

る遺伝子は sqs1 遺伝子であることがわかった．そのた[2] スクアレンシンターゼ遺伝子の同定

め，sqs1 遺伝子を過剰発現させることでスクアレン生

スクアレン生合成遺伝子は，細菌，藻類などからクロー産を向上させることができると考えた．

ニングされ，遺伝子にコードされる酵素の性質検討も行

sqs1 遺伝子を過剰発現させるために，sqs1 遺伝子高

われている．細菌におけるスクアレン生合成は，FPP

発 現 型 プ ラ ス ミ ド（pJsqsm1）を 構 築 し た．こ の 際，の合成までカロテノイド合成経路（図 1）をたどる．そプロモーターは，Ha. japonica における遺伝子高発現

して，スクアレンシンターゼ（Sqs）により 2 分子のの た め に 用 い ら れ て き た，す で に 実 績 の あ る Ha.

FPP が縮合することでスクアレンが合成される 20)．そjaponica 細胞表層糖タンパク質をコードする遺伝子

こで，Ha. japonica 全ゲノム配列をもとに sqs 遺伝子（csg 遺 伝 子）の も の を 用 い た．pJsqsm1 を Ha.

ホモログを検索したところ，染色体 1 上にフィトエン /japonica 野生株へと形質転換し，形質転換体よりテル

スクアレンシンターゼとアノテーションされている遺伝

ペノイド類を抽出して，スクアレンおよびその誘導体の子ホモログが 2 つ見出された．そのうちの 1 つ（c1220

生産量を調べた．その結果，pJsqsm1 を有する形質転

遺 伝 子）は，上 述 し た よ う に フ ィ ト エ ン シ ン タ ー ゼ

換体のスクアレンおよびその誘導体の生産量の合計は，（CrtB）をコードしていると推定されている．そこで，

4.8 mg/L であった（表 1）．一方，空ベクターであるもう一方の遺伝子が本菌のスクアレンシンターゼをコー

pWL102 を有する形質転換体生産量は 0.71 mg/L でドしていると考えられ，sqs1 遺伝子と名付けた．

あった．これより，sqs1 遺伝子を過剰発現させることで，

Ha．japonica における sqs1 遺伝子の機能を明らか

生産量は 6.8 倍となり，スクアレンおよびその誘導体のにするため，sqs1 遺伝子破壊株を構築し，スクアレン

生産向上を達成した．また，pJsqsm1 を有する形質転の生産量を調べた．破壊株からテルペノイド類を抽出し，換 体 の ス ク ア レ ン 生 産 量 は 0.94 mg/L で あ り，

上述と同様に逆相 HPLC によるスクアレンの検出を

pWL102 を有する形質転換体の約 18 倍となった．

図 4 Ha. japonica が生産するテルペノイド類のクロマトグラム (A) と GC-MS 分析より同定された
スクアレンおよびその誘導体の構造 (B)(A) スクアレンの吸収波長である 207 nm にて検出されたクロマトグラムを示す．
(B) クロマトグラムにおける各ピークに由来する物質を GC-MS により解析して同定した化合物の構造を示す．

30

高度好塩性古細菌 Haloarcula japonica のイソプレノイド生合成経路の解析と代謝工学による有用物質生産

表 1 各組換え体が生産するスクアレンおよびスクアレン誘導体の各生産量と総生産量[] 内の数字は pWL102 を保有する組換え体における生産量を 1 とした場合の生産量を表す .

4. おわりに

参考文献

本 稿 で は，高 度 好 塩 性 古 細 菌 Haloarcula japonica

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工業生産されている 21)．その世界市場規模は，現在 20nol., 8, 347 (2020).

億ドルであり，2027 年には 27 億ドルへと拡大するといわれている．また，スクアレンの市場規模はカロテノ

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ワクチン需要の増加もあり，1 億 4,300 万ドルから同-Cyclase Required for Bacteriorhodopsin Biogen-

じく 2027 年に 1 億 9,800 万ドルに達すると予測されesis in the Archaeon Halobacterium salinarum, J.

ている．現在，深海鮫からのスクアレン生産の代替法とBacteriol., 184, 2889 (2002).

して，大腸菌 22)，酵母 23) などを用いた研究が進められ5 ) Peck, R. F., et al.: brp and blh are required forている．本研究では，高度好塩性古細菌 Ha. japonica

synthesis of the retinal cofactor of bacteriorho-を用いたスクアレン高生産を試みたが，その生産量は既

dopsin in Halobacterium salinarum, J. Biol.

報と比べても低く，市場単価を考慮するとさらなる改善

Chem., 276, 5739 (2001).

が必要である．しかしながら，本菌の培養はコンタミネー6 ) Dummer, A. M. et al .: Bacterioopsin-Mediated

ションのリスクが極めて低いため，厳密な無菌操作およRegulation of Bacterioruberin Biosynthesis inび培地を含むリアクターの加圧蒸気滅菌（高温高圧滅菌）

Halobacterium salinarum, J. Bacteriol, 193, 5658

が不要である．従って，高温高圧滅菌に伴う膨大な熱エ(2011).

ネルギーの消費と CO2 排出を削減することができる．

7 ) Nishiyama, Y. et al .: Ultrastructure of the cell

そして，生産の場としては，
地球上の高塩環境（塩害土壌，

wall of the triangular halophilic archaebacterium

塩田，
塩湖など）を利用することが可能である．すなわち，

Haloarcula japonica strain TR-1, FEMS Microbi-

高度好塩菌による物質生産は，SDGs に貢献するとともol. Lett., 99, 43-47 (1992).

に，貴重な水を膨大に使用してきたこれまでの発酵産業を大きく変換・転換する生産系の一つといえよう．

8 ) Nakamura, S. et al .: Extremophiles Handbook ,vol. 2 Springer, Heidelberg (2011).

9 ) Yatsunami, Y. et al.: Identiﬁcation of carotenoids
from the extremely halophilic archaeon Haloar-

cula japonica, Front. Microbiol., 5, 1 (2014).
10) Alcaino, J. et al.: Functional characterization of31

高度好塩性古細菌 Haloarcula japonica のイソプレノイド生合成経路の解析と代謝工学による有用物質生産

the Xanthophyllomyces dendrorhous farnesyl

the lipid bilayer: implications for its function as apyrophosphate synthase and geranylgeranyl

proton permeability barrier, Biochem, Biophys,

pyrophosphate synthase encoding genes that are

Acta., 1556, 149 (2002).

ivolved in the synthesis of isoprenoid precursors,

PloS One, 9, e96626 (2014).

21) 三沢典彦 ,: 大腸菌・酵母によるカロテノイド生産 ,化学と生物 , 35, 60 (1997).

11) Misawa, N. et al.: Elucidation of the Erwinia ure-

22 ) Kakabami, A. et al.: Production of squalene bydovora carotenoid biosynthetic pathway by func-squalene synthases and their truncated mutants

tion analysis of gene products expressed in Esch-

Escherichia coli, J. Biosci. Bioeng ., 119 , 165

erichia coli, J. Bacteriol, 172, 6704 (1990).

(2015).

12 ) Zhang, L. et al.: Knockout of crtB or crtI gene23 ) Wei, L-J. et al .: Improved squalene production

blocks the carotenoid biosynthetic pathway inthrough increasing lipid contents in Saccharomy-

Deinococcus radiodurans R1 and inﬂuences its

ces cerevisiae, Biotechnol . Bioeng ., 115 , 1793

resistance to oxidative DNA-damaging agents(2018).

due to change of free radicals scavenging ability,

Arch. Microbiol, 188, 411 (2007).
13) 八 波 利 恵 , 他 .: 高 度 好 塩 性 古 細 菌 Haloarcula

japonica のフィトエンシンターゼ遺伝子のホモログの解析と当該微生物が生産するカロテノイド種の抗酸化活性，第 29 回カロテノイド談話会 (2015).
14) 八波 利恵 . : 古細菌のカロテノイド生合成経路 , 生
物工学 , 93, 394（2015）.
15) Yang, Y. et al.: Complete biosynthetic pathwayof the C50 carotenoid bacterioruberin from lycopene in the extremely halophilic archaeon

Haloarcula japonica, J. Bacteriol ., 197 , 1614(2015).
16) Amarowicz, R. et al.: Squalene: A natural antioxidant?, Eur. J. Lipid Sci. Technol . 111 , 411(2009).
17) Kopicová, Z. and Vavreinová, S.: Occurrence ofsqualene and cholesterol in various species ofCzech freshwater ﬁsh, Czech. J. Food Sci.25, 195(2007).
18) Oya S. et al.: Catalytic production of branchedsmall alkanes from biohydrocarbons, Chem. Sus.

Chem. 8, 2472 (2015).
19) Borowitzka, L. J. et al.: Commercial productionof β-carotene by Dunaliella salina in open ponds,

Bull. Mar. Sci. 47, 244 (1990).
20) Hauss, T, et al.: Squalane is in the midplane of

32

研究報告

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究
酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究

AMP キ ナ ー ゼ に よ る NAD＋ 合 成 律 速 酵 素
Nampt 制御機構の解明
五十嵐正樹て制御され，NAMPT mRNA 発現調節領域に結合する
ような新規の因子を明らかにする．
分化させた C2C12 筋管細胞を用いて，グルコース制
限や AMPK 活性化剤 AICAR による刺激実験を行うと，（東京大学医学部附属病院）

NAD＋ 合 成 酵 素 NAMPT と PGC1α mRNA 発 現 が ２倍程度に増加する．次に，転写阻害剤アクチノマイシ【研究の背景と目的】

ンＤの存在下で C2C12 筋管細胞を AICAR で処理した．

AMP キナーゼ（AMPK）は，AMP 上昇により活性化

アクチノマイシンＤ存在下で AMPK 活性化は NAMPT

され，様々な基質をリン酸化して機能を発揮するが，そmRNA の転写を上昇させることから，AMPK 活性化の活性化はエネルギー代謝に重要な役割を持ち，糖尿病

は NAMPT mRNA の 安 定 化 に 関 わ る と 考 え ら れ た．

の創薬標的としても知られる．一方，NAD＋依存性脱そ こ で，AMPK に よ る mRNA 安 定 化 に よ る NAMPT

アセチル化酵素 SIRT1 は NAD＋の上昇で活性化され，

mRNA 制御機構に着目して，新規の NAD＋制御因子を

健康長寿に重要な役割を果たす．

明らかにする．一般に mRNA 安定化に関わるといわれ

カロリー制限により寿命延長，健康増進の効果を認る 3ʼ UTR 領域に着目する．

めるが，AMPK や SIRT1 はその効果を媒介することが以上の研究により，新規の NAMPT 制御因子が明ら知られる．報告者は，骨格筋における SIRT1 活性化が，かになれば，その因子への介入を通じて，AMPK 活性筋ジストロフィーの症状，組織所見，運動耐容能を改と SIRT1 活性を同時に効果的に増幅させることが可能

善することをマウスモデルにより示した（PLoS Genet.

になる．そして，カロリー制限の効果を模倣するような

2014）．SIRT1-PGC1α の活性化が筋のミトコンドリア

加齢におけるサルコペニアの予防法開発へと展開させる

量を増加させ，筋肉の機能保持に重要な役割をもつ．そことが可能になる．

して，
AMPK と SIRT1 はポジティブフィードバックルー【研究方法】

プを形成し，互いにその活性を増加させることが，筋肉C2C12 細胞株を用いて実験を行う．RNA 安定性に関をはじめいくつかの臓器で報告されている．報告者は，わる領域を同定するために，3ʼ UTR（AU リッチエレメ

腸管上皮幹細胞に AMPK 活性および SIRT1 活性の増幅ント）に着目して，Nampt mRNA 3ʼ UTR を様々な長機構を報告した（Igarashi et. al., Cell. 2016）．SIRT1

さで欠失させたコンストラクトを作成し，pAcGFP ベク

は AMPK の活性化酵素 LKB1 を脱アセチル化すること

ターの GFP 遺伝子の後ろに挿入する．これらの GFP 発によって AMPK の活性を増加させる（Lan F et. al., J.

現ベクターを C2C12 筋管細胞や HEK293 に恒常的に発Biol. Chem 2008）．一方で，AMPK は NAD＋合成律速

現させた細胞株を作成する．この細胞をアクチノマイシ

酵素 NAMPT の mRNA レベル増加と NAD＋濃度上昇

ンＤで処理し，AICAR 処理の有無で，GFP mRNA 発

を通じて SIRT1 を活性化させる（Fulco M et. al., Dev

現の検討を行う．AMPK 活性化による NAMPT mRNA

Cell. 2008）．NAMPT は NAD＋量を規定し，その発現の応答に重要な役割をもつような領域を明らかにする．

上昇は抗加齢効果を認めるが，AMPK による NAMPT【研究成果】mRNA 制御機構は明らかにされていない．そこで，本分 化 し た C2C12 筋 管 細 胞 で は，AICAR に よ る

研 究 で は， 筋 肉 で の AMPK 活 性 化 に よ る NAMPTAMPK 活性化によって NAMPT だけでなく，NAD＋合mRNA 制御メカニズムを解明する．特に AMPK によっ成に関わる NMNAT1 mRNA の発現上昇を認めた．一133

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

方 で，NMNAT2 mRNA，NMNAT3 mRNA や NAD＋細胞ではアクチノマイシンＤ存在下で GFP mRNA 発現

分解に関わるといわれる CD38 mRNA の発現に変化をを安定して 50% 以上低下させることができた．

認めなかった．アクチノマイシン存在下で mRNA 安定

GFP-full length Nampt 3ʼUTR 発現 HEK293 細胞を性を調べると，NAMPT や NMNAT mRNA 発現は半分樹立し，AICAR による NAMPT mRNA 安定の効果が以下に低下し，AICAR 処理によって，NAMPT mRNA評価可能であると思われた．しかし，AICAR 0.5mM,や NMNAT1 mRNA は完全に回復した．AMPK 活性化

AICAR 2.0mM で処理したときの GFP mRNA 発現のは，NAMPT だけでなく NMNAT1 の mRNA 安定化を

dose response はやはり明らかではなく，また同じ実験

きたすものと考えられる．本研究では，まず NAD＋合を繰り返すとその再現性は十分ではなかった．NAMPT

成律速酵素である NAMPT の制御機構について解析を

3ʼ UTR を 3ʼ 側 か ら 様 々 な 長 さ で 欠 失 さ せ た 配 列 を進めることにした．

GFP 遺伝子の 3ʼ 端につないだベクターについても同様

一般に，mRNA 安定化に関わる 3ʼUTR に着目した．

に，KEK293 細胞に恒常的に発現した細胞を作成した．

NAMPT の 3ʼUTR は 2838bp で あ る が， 複 数 の AU

NAMPT 3ʼ UTR 全体の 90% 以上を欠失させた場合にリッチエレメントの存在を認める．まず，full length

もアクチノマイシンＤ存在下で GFP mRNA 発現が有の NAMPT 3ʼ UTR を AcGFP-N1 ベ ク タ ー の GFP の意に低下することから，Nampt の安定化配列は，Ｎ端

3ʼ 端につないだベクターを作成した．そして，それをから 100 塩基程度のところにまでに少なくとも１か所

C2C12 細 胞 に ト ラ ン ス フ ェ ク ト し，G418 で セ レ ク

は存在することがわかった．しかし，AICAR 0.5mM，ションをかけ，かつ GFP の蛍光で sorting をおこない，

AICAR 2.0mM で処理したときの GFP mRNA 発現のGFP-Nampt 3ʼ UTR 発現 C2C12 細胞を樹立した．一方

dose response はやはり明らかではなかった．これら

で，NAMPT 3ʼUTR を 3ʼ 側から様々な長さで欠失させの結果から，Nampt mRNA の安定化に関わる配列はた配列を GFP 遺伝子の 3ʼ 端につないだベクターを複数

Nampt mRNA のＣ端に存在するが，明らかに AMPK作成した．これらも同様に恒常的に発現する細胞を樹に反応する配列は Nampt mRNA のＣ端には存在しな立した．GFP-full length Nampt 3ʼUTR 発現 C2C12 細いと結論づけた．

胞をアクチノマイシン処理すると，GFP mRNA 発現はNAD＋ が mRNA5ʼ 端 の NAD＋ capping を 通 じ て

30% 程度減少する．しかし，AICAR 0.5mM, AICARmRNA 安定化に関わることが報告されており，AMPK

2.0mM で処理すると GFP mRNA の回復傾向を認めたにより NAMPT や NMNAT mRNA など複数の mRNA

が，その dose response は明らかではなく，また同じの安定性が変化したことからも，この機構の関与を考え実験を繰り返すとその再現性は十分ではなかった．特に，て解析を進めていきたい．

アクチノマイシンＤ処理後の GFP mRNA 低下が 30%前後とわずかであり，内因性の NAMPT mRNA がアク
チノマイシンＤ処理で半分以下に低下するのと対照的であった．C2C12 細胞では，実験系が安定しない可能性を考えた．
安定発現細胞株を作成する際のトランスフェクショ

低毒性がん転移阻害剤の創製を目指した CaMKP
阻害剤のケミカルバイオロジー
石田敦彦（広島大学大学院統合生命科学研究科）

ン効率が C2C12 細胞でかなり低いことから，トランス
フェクション効率の良い HEK293 を使用した．同様に，
GFP-full length Nampt 3ʼUTR 発現 HEK293 細胞を樹【目的】

立した．3ʼUTR をもたない control の GFP ベクターを

CaMKP（ 別 名 POPX2/PPM1F） は 1998 年 にラット

安定発現させた HEK293 では，GFP mRNA がアクチ

脳より，CaM キナーゼⅡの自己リン酸化部位を脱リ

ノマイシンＤ処理でまったく発現が変化しないのとは対ン酸化する酵素として，申請者らによって発見された

照的に，GFP-full length Nampt 3ʼUTR 発現 HEK293

PPM ファミリーに属するセリン／スレオニンプロテイ

234

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

ンホスファターゼである１,２）．近年，CaMKP とがん細【考察】

胞の遊走・浸潤との関連が相次いで報告されるように阻害剤が酵素をカルボニル化する結果として特異的ななったことから，本酵素は新たなドラッグターゲット

阻害をもたらすという例は，我々の知る限りこれまでにとして注目されつつあるが２），本酵素を含む PPM ファ

知られていない．今回同定された gallic acid 関連化合

ミリーホスファターゼの特異的阻害剤の報告例は少な物の合成展開をおこない，このような新奇な特異的阻害

い．申請者らは以前より CaMKP 特異的阻害剤の開発機構を利用した，より阻害特異性・阻害活性の高い阻を目指した探索的研究を進めており，CaMKP 阻害剤と害/不活化剤をデザインすることができるかも知れない．

し て，1-amino-8-naphthol-4-sulfonic acid (ANS) 及

ethyl gallate, propyl gallate は既に酸化防止剤として

び 1-amino-8-naphthol-2, 4-disulfonic acid (ANDS)

広く食品添加物に利用されており，その細胞毒性が極めを報告しているが２），これらの化合物の特異性はまだて低いことが確立されている点は興味深い．より毒性が十分ではない．より特異性の高い阻害剤を開発すべく，低く，且つ効果的にがんの転移・浸潤を抑制する薬剤を（1）新たな構造を持つ CaMKP 特異的阻害剤の探索，

デザインすることが出来れば，がん細胞の完全撲滅では（2）既報の ANS/ANDS を化学修飾することによる特異なく，がんの転移・浸潤を効果的に抑制して，がんと共性の増強，という二つのアプローチを取ることにした．

存するという新しいコンセプトに基づくがん治療が可能（1）のアプローチについては，東大創薬機構より提供となる．今後，これらの化合物の構造を元に，様々な化された化合物ライブラリーの大規模スクリーニングを行合物をデザインすることで改良を加え，より効果的な“低い，ANS/ANDS とは全く構造の異なる CaMKP 特異的

毒性がん転移抑制剤” の創製を目指していきたい．

阻害活性を持つ化合物を見いだした．ここでは知財の関【文献】

係上，(1) のアプローチに絞って現状を報告する．

１）Ishida, A., Kameshita, I. & Fujisawa, H.: A novel【結果】

protein phosphatase that dephosphorylates and

大規模スクリーニングの結果，ピロガロール骨格

regulates Ca２＋/calmodulin-dependent proteinを持つ gallic acid やそのアルキルエステル が，近縁

kinase II, J. Biol Chem. 273: 1904–1910 (1998).

の PPM1A を 殆 ど 阻 害 せ ず，CaMKP を 強 く 阻 害 す２）Ishida, A., Sueyoshi, N. & Kameshita, I.: Func-

ることが判明した．これらの化合物は阻害に伴って，tions and dysfunctions of Ca２＋/calmodulin-

CaMKP タンパク質を顕著にカルボニル化することが分

dependent protein kinase phosphatase (CaMKP/

かった．基質リン酸化ペプチド存在下ではカルボニル

PPM1F) and CaMKP-N/PPM1E, Arch. Biochem.

化が顕著に亢進すること，このカルボニル化反応にはBiophys. 640: 83–92 (2018).

Mn２＋や Cu２＋, Co２＋などの２価の金属イオンが必須で３）Akizuki, K., Ishikawa, S., Obatake, R., Ozaki,

あったこと，ピロガロール骨格の４位の水酸基がカルボ

H., Shimoda, N., Nehira, T., Yamazaki, T.,

ニル化に必須であることなどから，CaMKP の活性中心

Kinumi, T., Osawa, J., Sueyoshi, N., Kameshita,の金属結合部位，
基質ペプチド結合部位などの活性中心，

I., Shigeri, Y. & Ishida, A.: CaM kinase phos-

またはその近傍に gallic acid 及びそのアルキルエステ

phatase (CaMKP/PPM1F/POPX2) is speciﬁcally

ルが結合し，何らかのラジカル反応を介して近傍のアミ

inactivated through gallate-mediated protein

ノ酸側鎖をカルボニル化する結果，CaMKP 活性が不可

carbonylation. Arch Biochem Biophys . 720:

逆的に阻害される機構が考えられた．ヒト乳がん細胞株

109170 (2022).

MDA-MB-231 を ethyl gallate で 処 理 す る と，CaMKIのリン酸化が顕著に亢進したことから，ethyl gallate は細胞内に浸透して CaMKP 活性を抑制し得ることが示さ
れた３）．

3
35

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成て明らかにする．

膜受容体による加水分解活性と代謝性疾患制御メカ【結果】

ニズムの解明⑴

岩部美紀

PAQR ファミリー分子の糖・脂質代謝における細胞
内シグナル伝達機構の解明： AdipoR を中心とした（東京大学大学院医学系研究科）

PAQR ファミリー分子の基質特異性，さらに代謝産物
３）に関して網羅的に解析した（未発表）．さらに，代【目的】
これまでに，当研究室では，肥満に伴って生理活性物
質アディポネクチンが低下することが，生活習慣病・メ

謝産物の組成及び変化の解析より，PAQR のシグナル伝達機構の一部を明らかにした（未発表）４）．
⑵

PAQR ファミリー分子の変異体マウスを用いた病態

タボリックシンドローム・糖尿病激増の主要な原因に生理的意義の検討：新たに PAQR 変異体マウスを作なっていることを示し，アディポネクチンの受容体と製し，全身の糖代謝を解析し，各臓器における代謝産して AdipoR1 および AdipoR2 を同定した１）．非常に

２）
物の変化を解析した（未発表）．

重要な点は，AdipoR は，亜鉛イオンが結合しており，【考察】

Ｇタンパク質共役受容体（GPCR）とは逆の膜トポロジー

本課題の成果により，PAQR ファミリー分子の多様性を持つ新規の７回膜貫通型の受容体であり，Ｇタンパクと普遍性の理解がより深まり，生物界における未知の受質とは共役しておらず，構造学的・機能学的にも前例の容体活性化メカニズムが存在する可能性も示唆され，学ない受容体であることである２）．AdipoR は，Proges-

術的貢献・意義も極めて高いと考えられる．

terone and AdipoQ Receptor (PAQR) ファミリー分子【文献】の一つである．これらの発見を手がかりとして，PAQR

１）Yamauchi, T., Kamon, J., Ito, Y., Tsuchida, A.,ファミリー分子が新規の逆向き７回膜貫通型の受容体でYokomizo, T., Kita, S. et al.: Cloning of adipo-

あるだけでなく，受容体でありながら，亜鉛イオンを結nectin receptors that mediate antidiabetic meta-

合し，加水分解活性を有する全く新規のユニークな受容bolic eﬀects. Nature. 423, 762-769 (2003).

体ファミリーであることが明らかになりつつある．本課

２）Tanabe, H., Fujii, Y., Okada-Iwabu, M., Iwabu,

題では，AdipoR を中心とした PAQR ファミリー分子のM., Nakamura, Y., Hosaka, T. et al.: Crystal

新しい機能として，加水分解活性メカニズム，さらにシ

structures of the human adiponectin receptors.

グナル伝達機構を解明することを目的とする．

Nature. 520, 312-326 (2015).

【方法】⑴

PAQR ファミリー分子の糖・脂質代謝における細M., Kano, K., Kawana, H. et al.: Human adipo-

胞内シグナル伝達機構の解明：AdipoR を中心とした

nectin receptor AdipoR1 assumes closed and

PAQR ファミリー分子の基質特異性，さらに代謝産物

open structures. Commun Biol. 3, 446 (2020).

に関して網羅的に解析する．さらに，代謝産物の組成

４）Ohn, J., Been, KW., Kim, JY., Kim, EJ., Park, T.,

及び変化を解析し，AdipoR を中心とした PAQR ファ

Yoon, HJ. et al.: Discovery of a transdermally

ミリー分子のシグナル伝達機構を解明する．

deliverable pentapeptide for activating AdipoR1⑵

PAQR ファミリー分子の変異体マウスを用いた病態
生理的意義の検討：CRISPR/Cas9 システムを用いて，加水分解活性が消失した PAQR ファミリー分子の変異体マウスを作製し，全身の糖・脂質代謝を検討する．
さらに，AdipoR を中心とした PAQR ファミリー分子の変異体マウスの各臓器における代謝産物の変化を解析することにより，臓器特異的な加水分解活性につい436３）Tanabe, H., Fujii, Y., Okada-Iwabu, M., Iwabu,

to promote hair growth. EMBO Mol Med. 13,
e13790 (2021).

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

ユビキチンライゲース酵素 PRC1 の HR における新規活性制御機構
宇井彩子（東北大学加齢医学研究所）

婦人科がんの一つの特徴として，Homologous Recombination (HR) 不全（相同組換え修復不全；HRD）がある．申請者は，がんで高頻度に異常しているクロマチンリモデリングの DSB 修復や HR 修復での機能を解析してきた（業績 Ui et al., Molecular Cell, 2015;

図２
Ａ. Ｂ．図１で ENL の結合領域が PRC1 のクロマ
チンのユビキチン化に与える影響を調べるために，以前報告したＡのようなアッセイを使用した．このアッセイでは，実際に ENL が PRC1 のクロマチンへの結合を促すことが分かっている（Ui et al., Mol cell, 2015）
Ｃ．そこで本研究で見出したそれぞれの変異蛋白質をクロマチンにテザリングさせた結果，一部の領域で BMI1 の結合と，クロマチンのユビキチン化が観察された．
Ｄ．Ｂ.の結果を数値化したグラフである．

Ui et al., Oncogene, 2014; Watanabe et al., Cancer

Res., 2014; Kato et al., Molecular Cell, 2014; Ogiwara et al. Oncogene, 2011; Ogiwara et al. Carcino-

genesis, 2010; Lan et al. Molecular Cell, 2010）．その中で，申請者が以前に新規相互作用を報告した（Ui
図１
Ａ．申請者は，以前に ENL と PRC1 の BMI1 が直接相互作用することを報告した（Ui et al.,Mol Cell, 2015）

et al., Molecular Cell, 2015），白血病の原因遺伝子として知られる ENL とヒストンのユビキチンライゲース
複合体である BMI1/RING1B を含む PRC1 が新たに HRに関わることを見出した．しかし HR における ENL とＢ．そこで本研究では，ENL の BMI1 の相互作用
涼気を明らかにするために，変異型タンパク質を作成した．

PRC1 によるユビキチン化と機能に関しては不明であＣ． そ の 結 果，ENL の YEATS domain が BMI1と直接相互作用することが明らかになった．

経路の制御のメカニズム解明を明らかにするために，まる．そこで PRC1 のヒストンのユビキチン化による HR
ず本研究では ENL の PRC1 結合領域の解析と，その領域が PRC1 のクロマチンのユビキチン化活性に及ぼす

537

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

影響を解析した．

domain は相互作用に関与しないことが明らかになっ以前に申請者は，ENL が PRC1 複合体の BMI1 と直た．

接相互作用することにより，DSB に応答して PRC1 の次に，この相互作用が PRC1 のクロマチンのユビキ

転写部位での機能を促進することを報告したが，ENL

チンライゲース活性にどのような影響をもたらすかをによる PRC1 の機能制御のメカニズムは不明である．

以前開発した実験系を用いて検討した（Ui et al., Mo-

そこで，まず ENL と BMI1 がどの領域で相互作用する

lecular Cell, 2015）．この実験系は細胞のクロマチンにのかを検討した．GST タグ付きのタンパク質を精製しENL をテザリングさせることにより，BMI1 の結合とて，相互作用領域を検討したところ，ENL のＮ末端領

PRC1 のクロマチンへのユビキチン化活性を同時に検討

域の YEAT domain が直接相互作用することが明らかにできる．その結果，ENL のＮ末端領域をクロマチンになった．一方で，ENL のＣ末端領域の Anc1 homology

テザリングさせると，PRC1 のクロマチンに対するユビ
キチン化活性が促進された．一方でＣ末端領域はユビキ
チン化を促進させなかったが，BMI1 との相互作用を認めた．この図１と２の結果より，細胞内では BMI1 は
ENL とＣ末を介して相互作用できることを示している．
さらにこの ENL のＣ末を介した結合のメカニズムを明らかにするために，Ｃ末の機能解析を行った．この C
末は，PRC １複合体の別の因子である CBX8 と相互作用することが報告されている．そこで，CBX8 との相互作用領域に変異を導入して BMI1 との相互作用を確認したところ，BMI1 は ENL と結合できなくなった．以上の結果より，細胞内では C 末端領域の ENL も CBX8 を介して BMI1 と相互作用することが明らかになった．

超長鎖脂肪酸伸長酵素（ELOVL）を介した脂肪酸
プロファイル変化がもたらす血管炎症制御メカニズム上田和孝（東京大学医学部附属病院）【目的】
生活の質や生命を脅かす虚血性心疾患や脳卒中などの

6
38

図３

動脈硬化性疾患の克服は喫緊の課題であり，効果的な予Ａ．図１の精製たんぱく質と図２の細胞内のクロマチン上での ENL と BMI1 の相互作用の違いとユビキチン化への影響を検討するために，さらにＡのような変異タンパク質を作成した．

防・治療法の開発には動脈硬化形成の分子メカニズムのＢ．それぞれの変異タンパク質をクロマチンにテザリングさせた結果，一部の領域で BMI1 の結合と，クロマチンのユビキチン化が観察され，このことにより，細胞内で BMI1 は ENL のＣ
末端領域に結合する CBX8 も介して ENL と間接的に相互作用することが明らかになった．

は，動脈硬化形成時の炎症の主要な舞台として，動脈周解明が必要不可欠である．動脈硬化は血管炎症の経時的変化がもたらす慢性炎症疾患の典型といえる．申請者ら囲に存在する脂肪組織である血管周囲脂肪（perivascular adipose tissue; PVAT）に注目した（図１）．予備検討として行ったトランスクリプトーム解析で，動脈ストレスにより PVAT で炎症関連の遺伝子群が増加する

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成とともに，『PVAT の褐色脂肪化』という特徴的な応答ているのであろうか．申請者は脂肪細胞内で脂肪酸の炭を示すことを見出した．脂肪の褐色化とは，白色脂肪組

素鎖の伸長に関わる酵素である elongase of very long

織が様々な刺激により褐色脂肪組織様の性質を示す現象

chain fatty acid (ELOVL) ファミリーの働きに着目しを指す．特筆すべきことに，薬剤によりこの PVAT のた（図２）．最近の研究で，脂肪酸には炎症を惹起する

褐色脂肪化を抑制すると，血管の炎症と病的リモデリン

ものと抗炎症的に作用するものがあることが明らかに

グ（動脈硬化）が増悪することを突き止めた．これらのなってきている．また，ELOVL 分子の発現制御により

結果は，PVAT が血管炎症を感知して褐色化し，炎症を脂肪細胞で産生される脂肪酸のプロファイルに変化がみ収束に導く火消し役を果たしていることを示唆する．

られることも知られている．申請者は，褐色化制御因

では，褐色化 PVAT はいかにして炎症を収束に導い子である PRDM16 の siRNA を用いて培養脂肪細胞でPVAT 褐色化を抑制すると，複数の ELOVL 分子の発現が著明に低下することを見出した ( 図３)．
そこで本研究では，PVAT 褐色化における ELOVL
ファミリーを介した抗炎症作用のメカニズムを，遺伝子改変マウス，培養細胞，網羅的遺伝子解析を通じて検討する．本研究は，これまで単なる支持組織でしかないと考えられてきた PVAT が，ELOVL による脂肪酸発現制

図１

血管周囲脂肪組織

perivascular adipose tissue (PVAT)

御を介して血管炎症に秩序をもたらしていると捉え，「炎症」，「PVAT」，「褐色化」を有機的に結び付けることで動脈硬化形成機序の新しい革新的概念を生み出そうとするものである．本研究を通じて，動脈硬化形成メカニズ
ムを炎症の遷延と収束の観点から理解し，動脈硬化の新たな予防・治療のターゲットの創出を目指す．
【方法】
１．褐色化ブロックマウスを用いた ELOVL を介した炎症制御メカニズムの解明
本研究では脂肪細胞に特異的に発現する adiponectin

図２

超長鎖脂肪酸伸長酵素（ELOVL）ファミリーは脂肪酸プロファイルを制御するのプロモーター領域を含む配列の下流に Cre 発現遺伝
子配列を組み込んだ adipoq-Cre マウスと，脂肪褐色化を制御する PRDM16 遺伝子 exon9 の ﬂoxed マウスを交配し，脂肪特異的 PRDM16 ノックアウトマウス（adipoq-Cre PRDM16 ﬂox）を褐色化ブロックマウス
として用いる．本マウスは入手済みですぐに使用可能な状態にある．
本マウスを用いてワイヤー擦過による大腿動脈内皮傷害を作成した後，PVAT 組織における各種 ELOVL 分子の発現を，qRT-PCR，免疫組織染色，ウエスタンブロットで解析し，野生型マウスと比較する．前述の培養細胞

図３

PVAT 褐色化の抑制は様々な ELOVL 分子の発現を低下させるにおける ELOVL 分子の発現データと照合し，重要な作用を持つ ELOVL 分子の候補（複数種を想定）を見極め，
pluronic gel を用いた siRNA オリゴの in vivo 導入法を

7
39

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成用いて PVAT 局所で ELOVL をノックダウンし，病的血症型へのシフトと炎症性サイトカインの減少が認められ

管リモデリングを比較する．

た．この結果からは，各種 ELOVL の中でも少なくとも２．網羅的解析による褐色化 PVAT 由来の抗炎症性分

ELOVL3, 5, 7 の各単体においては褐色脂肪による抗炎

泌因子の同定症作用メカニズムの主体をなすものではないことが示唆

申請者らは野生型マウスの褐色化 PVAT 由来 stromal

される．今後はその他の ELOVL アイソフォームについvascular fraction (SVF) 細胞株の樹立に成功した．研ても検討を加えるほか，Elovl3 と７など，複数の因子

究１で血管リモデリングに影響を及ぼす ELOVL 分子

を同時にノックダウンした際の変化についても検討を追を同定できれば，その ELOVL 分子を野生型マウス由来

加する方針である．

PVAT-SVF を用いて in vitro でノックダウンし，炎症性２．PVAT 褐色化は傷害後の血管炎症を収束に導く/抗炎症性脂肪酸の変化と RAW264.7 への作用を解析す

褐色化ブロックマウス（adipoq-Cre PRDM16 ﬂox）

る．また，組織１細胞解析により褐色化脂肪由来の抗炎において血管傷害を作成すると，傷害 14 日後の血管内症分子を同定し，その役割を in vivo, in vitro で検証す

膜肥厚が野生型マウスに比べて増悪した．F4/80 によるる．

免疫染色では，PVAT および血管におけるマクロファー【結果】

ジの集積の程度には両群で差がなかった一方で，褐色化

１．褐色脂肪による抗炎症作用における ELOVL の役割

ブロックマウスにおいては，炎症型マクロファージマー

先行研究や自身の予備データを基に，ELOVL の中カーである iNOS 陽性細胞数は顕著に増加しており，一で炎症制御に関与している可能性が高いと思われる方で抗炎症型マクロファージである CD206 陽性細胞数

ELOVL3, 5, 7 に着目し，それぞれの siRNA オリゴをは減少していたことから，褐色化をブロックすることで用意した．PVAT 由来の SVF から褐色脂肪細胞への分マクロファージの性質が変化することが示唆された．

化を誘導する際に，Elovl 3, 5, 7 の各 siRNA オリゴを

3. 1 細胞解析による褐色化 PVAT 由来の抗炎症性分泌遺伝子導入した．各遺伝子は 80% 以上の良好なノック因子の同定

ダウン効率が得られることを q-RTPCR で確認した．一

我々は，公表されている遺伝子発現データを活用し，方で UCP1 等の褐色脂肪マーカーは Elovl のノックダ

マウス脂肪組織を用いた１細胞解析を行った．細胞ごとウンの有無に影響を受けず，Elovl は褐色脂肪分化にはの発現遺伝子の特徴によるクラスター分類で，マウス内影響しないことが確認された．その上で，褐色脂肪細

臓脂肪は個別の特徴を有する 15 のクラスターに分類さ胞の培養上清で RAW264.7 を刺激したところ，いずれれた．その中で，褐色化を刺激する β3 受容体刺激薬投の Elovl のノックダウンによっても RAW264.7 の抗炎

与後の脂肪において，ある一つのクラスター（C7）が特徴的に現れることが分かった．このクラスターの特840

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

徴を詳しく見てみると，褐色脂肪に特徴的に発現する遺どをさらに追加して行っていく予定である．

伝子群（Ucp1, Cidea, Ppargc1a 等）が増加しており，【文献】

本クラスターは褐色化した脂肪細胞の群であることが分

Adachi, Y., Ueda, K., Nomura, S., Ito, K., Katoh, M.,

かった．Gene Ontology によって遺伝子の機能的特徴

Katagiri, M., Yamada, S., Hashimoto, M., Zhai, B.,を解析すると，C7 に特徴的に発現する分泌性タンパク

Numata, G., Otani, A., Hinata, M., Hiraike, Y., Waki,

として，Neuregulin4 をコードする遺伝子 Nrg4 が見出

H., Takeda, N., Morita, H., Ushiku, T., Yamauchi,

された．

T., Takimoto, E. & Komuro, I.: Beiging of perivas-

４．褐色化 PVAT 制御による血管炎症抑制効果

cular adipose tissue regulates its inflammation and

β3 受容体刺激薬（CL316243）は PVAT の褐色化を強く促進することを確認した．この CL316243 をマウ

vascular remodeling. Nature Communications, 13(1):5117, 2022.

ス大腿動脈周囲に塗布したのち，血管傷害を加えたところ，傷害 14 日後の血管では，iNOS 陽性細胞数が減少
し，CD206 陽性細胞数は増加しており，血管リモデリ
ングは有意に抑制された．また，上記研究 2 で同定した Nrg4 から生成されるタンパク NRG4 で培養マクロ

細胞の力学的環境を感知するメカノセンサー蛋白質
の同定
大橋

一正
（東北大学大学院生命科学研究科）

ファージ細胞（RAW264.7）を刺激すると，マクロファージの抗炎症型へのシフトが起こり，炎症性サイトカインの発現も減少した．

【目的】
私たちの体は様々な機械的な力を受けており，組織を構成する細胞はこれらを感知して応答する力覚応答を行っている．その機械的な力を感知するために，細胞は力の負荷によって立体構造が変化するセンサー蛋白質を持つことが明らかにされてきた．しかし，機械的な力の作用によって酵素としての活性が変化する蛋白質はほとんど報告がない．私たちは，力覚応答に関与する低分子量 G 蛋白質 RhoA の活性化因子 RhoGEF として Solo【考察】を見出した．また，Solo は，細胞内でケラチン 8/18 繊

本研究から，血管傷害後に生じる PVAT の褐色化に維に結合して機能を発揮すること明らかにしてきた．こ

よって，PVAT から分泌される因子がマクロファージにれらの知見から，本研究は，Solo が力の作用によって作用し抗炎症型へシフトさせることで，血管の炎症を収GEF 活性が変化するメカノセンサー酵素として働く可束に導き，病的な血管リモデリングを抑制することが示

能性を検証するとともに，Solo の力覚応答における機唆された．現時点では，褐色脂肪による抗炎症効果のメ能解明を目的とした．

カニズムにおける ELOVL 分子の役割は明らかにはなっ【方法・結果】ていないが，今後さらに検討を進める予定である．一方

１．Solo がメカノセンサー酵素として働く可能性の検証で本研究では，褐色化脂肪由来の Neurelugin4 が炎症

シリコーンゴムの薄膜にケラチン繊維を共有結合で結抑制に重要な役割を持っていることが明らかとなった．

合させ，そのケラチン繊維に動物細胞に発現させて精製

この結果は，褐色化刺激薬が動脈硬化予防・治療に有用した Solo 蛋白質を結合させた．このシリコーン膜上のである可能性を示唆するものであり，今後は，将来の臨

Solo に対し RhoA の GEF 活性を測定した．反応中，シ床への応用の可能性を見据え，血管傷害以外の血管疾患

リコーン膜は Solo 結合面を引き伸ばすことができるよ

モデルでの検討や，ヒトの動脈サンプルを用いた検討な

うに装置を自作した．この装置を用い，シリコーン膜を

941

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

約 10％引き伸ばした条件で Solo の GEF 活性を測定しの生合成酵素に我々が学ぶことは多く，新規反応を触媒た．しかし，
結合した Solo 蛋白質の密度が十分ではなく，する酵素の発見とその解析は，遺伝子工学による非天然

GEF 活性の変化を測定できなかった．

型生理活性物質の創製の基盤となる．

２．細胞への張力負荷による Solo のセンサー機能の検証

MS-271 は放線菌 Streptomyces sp. M-271 から単離

FK506-binding protein (FKBP) がラパマイシンを介され，21 アミノ酸残基からなるラッソペプチド（投げし て FKBP12-rapamycin associated protein (FRB) と縄構造を持つペプチド二次代謝産物の一群）である．構

結合する化学誘導二量体形成法を利用し，人為的に収縮造上の特徴としてＣ末端にＤ-トリプトファン（Trp）をする細胞を作製した．細胞膜への局在化シグナルを付有する．その生合成について，一般にラッソペプチド

加した FKBP と，RhoA の活性化ドメイン（RhoGEF,

はリボソーム由来のため，非タンパク質性の D-Trp のLARG の DH ドメイン）と FRB の融合蛋白質を共に発導入機構に興味が持たれた．最近我々は，生合成遺伝子

現する MDCK 細胞はラパマイシン添加で収縮する．こクラスターを同定し，リボソームでの翻訳で C 末端がの細胞によって蛍光タンパク質を付加した Solo を発現

L-Trp の前駆体ペプチド（MslA）が生成し，ペプチドさせた細胞を引張し，Solo の張力負荷に対する機能を上のエピメリ化（立体反転反応）によって D-Trp が導解析した．その結果，引張刺激から 30 分経過後，Solo

入されることを明らかとした１）．また，本反応は，既知が細胞間接着部位へ集積することが明らかになった．さの立体反転酵素と全く相同性を示さない新規酵素 MslH

らに，デスモソーム構成蛋白質の一つが Solo の細胞間によって触媒されることを in vivo と in vitro 実験で見接着部位への局在に必用であることが明らかになった．

出した（図１）．本酵素は，リボソーム由来ペプチド【考察】のＣ末端のアミノ酸残基をＤ体へ変換する初の例であSolo 蛋白質への直接の力負荷による酵素活性変化は，

る２）．MslH は，特徴的なモチーフ配列や補酵素結合領

Solo のシリコーン膜への固相化密度に限界があり困難

域を持たず，反応機構が学術的に興味深い．そこで本研であった．より高密度に Solo 蛋白質を直接固相化する

究では MslH の反応機構の解明を目的とした．

方法を検討する必要がある．また，細胞への張力の負荷【方法】

で Solo が細胞間接着部位へ集積することを見出した．

MslH は，既知の酵素との相同性がなく特徴的なモ

その局在変化は張力負荷と同期しないことから，Solo

チーフ配列を持たないため，配列解析での活性残基の推は張力センサーではなく，上流のセンサー蛋白質の作用定が困難である．そこで MslH と基質類縁体を用いたＸ

により細胞間接着部位へ局在化したと考えられる．Solo

線結晶構造解析で活性残基や基質認識部位を推定し，アは，力覚応答において，局在変化によってアクチン骨格

ミノ酸変異実験により推定活性残基をそれぞれ検証しとともにケラチン繊維の構造変化を行うことで細胞間接た．

着部位の力学的環境を制御していると考えられる．

ペプチドに D-体アミノ酸残基を導入する新規エピ
メラーゼの解析と応用研究
小笠原泰志（北海道大学大学院工学研究院）【目的】
微生物や植物が生産する二次代謝産物は構造多様性があり，それらを生合成する酵素には興味深いメカニズムを有するものが数多く存在する．ゆえに，二次代謝産物

1042

図１ MS-271 の構造，生合成遺伝子クラスターと MslH の反応

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

ンが，リガンドを介した Notch シグナル伝達と腫瘍の【結果と考察】複合体の結晶構造解析には，本来の基質の代わりに反血管新生を阻害することが報告されている．NOTCH1

応が進行しない基質類縁体を用いる必要がある．これま

細胞外ドメインは，上皮成長因子様（EGF）反復配列かで MslH のエピメリ化には MslA のＣ末芳香族アミノ酸

らなるが，発現したタンパク質は細胞外への分泌の効率が必須であることが分かっていたため，Ｃ末 Trp を脂が低く，細胞内に主に保持される．これは，NOTCH1

肪族アミノ酸に置換した MslAW21V 変異体と Trp を欠が 30 以上の EGF リピートから構成されるためと推定失させた MslAΔW21 変異体を大腸菌を宿主に発現，精される．

製して調製した．各変異体と MslH との共結晶化を試み

EGF リピートは, O-フコース, O-グルコース, O-GlcNAc

たところ，MslAΔW21 変異体で共結晶が得られたことを含む３種類の O-型糖鎖で修飾される．これらの糖鎖から構造解析した．その結果，MslH に MslAΔW21 変

修飾の最初のステップは，O-フコース転移酵素１ (PO-

異体が結合した電子密度が得られ，その近傍に Ca２＋とFUT1), O-グルコース転移酵素１ (POGLUT1), EGF ド

推定される２価金属の電子密度が観測されたことから，

メ イ ン 特 異 的 O-GlcNAc 転 移 酵 素（EOGT） で あ り，

基質のＣ末 Trp が Ca２＋ に配位することが示唆された．

小胞体での酵素反応である．本研究では，これらの糖転また，推定活性部位を挟んで２つの His 残基（His88,

移酵素を様々な組み合わせにて発現させ，NOTCH 細胞

His295） と そ の 外 側 に そ れ ぞ れ Asp 残 基（Asp11,

外ドメインの分泌発現における糖転移酵素群の協調作用

Asp91）が観測された．このことから，これらがエピメについて検討した．

リ化に必要な脱プロトン化/プロトン化を担うアミノ酸残【方法と結果】

基と示唆された．また，アミノ酸変異実験で，変異体のNotch1 の分泌発現をモニターするために FLAG: N1-

エピメリ化活性が完全に消失したことから，これらのアミ

EGF 発現プラスミドを構築し，小胞体に局在する修飾ノ酸残基が反応に必須であることが示された．

酵 素 と し て，POFUT1, POGLUT1, EOGT の ３ 種 類，【文献】

ゴルジ体に局在する酵素として L-FNG を，様々な組み

１）Z, Feng., Y, Ogasawara., S, Nomura. & T. Dairi.:
Biosynthetic Gene Cluster of a D-Tryptophan-Containing Lasso Peptide, MS - 271. ChemBio-

Chem, 19, 2045 (2018).
２）Z, Feng., Y, Ogasawara. & T, Dairi.: Identiﬁcation of the Peptide Epimerase MslH Responsible
for D-amino Acid Introduction at the C-terminusof Ribosomal Peptides, Chem. Sci., 12, 2567
(2021).

糖転移酵素の協調作用を介した新たな Notch 受容体発現制御機構岡島徹也（名古屋大学糖鎖生命コア研究所）【目的】
Notch シグナルの制御異常は癌を含む様々な疾患と関

図１
FLAG: N1-EGF を POFUT1, POGLUT1, EOGT,L-FNG を含む様々な組合せで FLAG: N1-EGF とともに HEK293T 細胞に共発現させた．Medium もしくは Lysate 中のタンパク量を定量，
比較を行なった．文献１より改変

連する．これまでに，NOTCH1 受容体の細胞外ドメイ

1143

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成合わせで FLAG:N1-EGF とともに HEK293T 細胞におO-GlcNAc-Gal-NeuAc 糖ペプチドの存在比は，EOGT/

いて共発現させた（図１）．

POGLUT1 過剰発現によって EGF9, 10, 25, 31, 34 で分泌された FLAG: N1-EGF 量は EOGT の共発現に著しく増加した．一方で，O-Glc 修飾に対する EOGT/

よ り 増 加 し，L-FRING で は 増 加 し な か っ た． 内 在 性

POGLUT1 の効果は不明瞭で，EOGT/POGLUT1 の過NOTCH 受容体の分泌経路における POFUT1 及び PO-

剰発現をさせなくても，O-Glc 修飾部位は糖鎖修飾されGLUT1 の必要性に反して，FLAG: N1-EGF NOTCH1ていた．POGLUT1 を過剰発現させることで，Ｏ-グルに関する POFUT1 又は POGLUT1 の過剰発現の効果は，コース化が不十分な結果，細胞内に保持される FLAG:

統計的に有意ではなかった．一方，EOGT/POFUT1 で

N3-EGF の割合が低下したためと考えられるが，今後のはなく，EOGT/POGLUT1 を共発現させると，EOGT

更なる解析が必要である．

単独と比較して分泌がさらに亢進した．これらの結果【考察】から，HEK293T 細胞では，EOGT の主要な役割に比本研究を通じて，小胞体に局在する糖転移酵素の最適

べて，POGLUT1 には副次的な役割があるのに対して，な組み合わせは，培養細胞において NOTCH 細胞外ド

POFUT1 の影響は限定的であることが明らかとなった．

メインを効率的に分泌発現するための有効な戦略であEOGT と POGLUT1 の共発現によるＯ型糖鎖修飾のることを示した．さらに，NOTCH 受容体のＯ型糖鎖変化を評価するために，FLAG: N3-EGF を用いた質量の比較プロテオミクスのための簡便な方法論の開発に成分析を実施した．糖ペプチドの比較解析の方法論を単功した．この糖鎖分析法によるＯ型糖鎖修飾状態の評価純化するために，MS/MS スペクトルからの糖ペプチ

は，糖鎖によって安定性とリガンド結合能が調節される

ド同定に適した検索エンジンである Proteome Discov-

NOTCH 受容体において，特に重要であり，他の類似のerer と Byonic node を 利 用 し て， ラ ベ ル フ リ ー 定 量

糖タンパク質の解析にも応用可能である．

ワークフローを採用した（図２）．EOGT の糖転移酵素【文献】

活性と一致して，O-GlcNAc, O-GlcNAc-Gal，または

１）Zhang, A., Tsukamoto, Y., Takeuchi, H., Nishiwaki, K., Tashima, Y. & Okajima, T.： Secretory
expression of mammalian NOTCH tandem
epidermal growth factor-like repeats based onincreased O-glycosylation, Anal. Biochem. inpress. (2022).
２）Tsukamoto, Y., Ogawa, M., Yogi, K., Tashima, Y.,
Takeuchi H. & Okajima, T.： Glycoproteomics of
NOTCH1 EGF repeat fragments overexpressedwith diﬀerent glycosyltransferases in HEK293T
cells reveals insights into O-GlcNAcylation of
NOTCH1, Glycobiology, 32, 616-628 (2022).

図２
Proteome Discoverer と Byonic node を利用した，糖ペプチドのラベルフリー定量のワークフロー．
文献１より改変

1244

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

電位依存性ホスファターゼを原型とする，イノシ
トールリン脂質シグナル伝達解析のための分子ツー
ルの創製
岡村

報告されており，またアミノ酸変異により 3-phosphatase 酵素活性が減弱することが知られている．VSP は
5-phosphatase 活性と 3-phosphatase 活性をあわせもつが，K364 の変異により 5-phosphatase 活性のみに限康司定できる可能性を考え，K364 を Met や Leu に変更し，（大阪大学大学院医学系研究科）

電 位 依 存 的 酵 素 活 性 を 5-phosphatase 活 性，3-phosphatase 活性のそれぞれについて計測を行った．その結【目的】
膜電位感受性をもつイノシトールリン脂質脱リン酸化

果，K364A や K364I で は 3-phosphatase 活 性 が 減 弱することが判明した．

酵素である VSP を原型とし，イノシトールリン脂質シまた複数の有袋類でみられる Met へ変更した場合

グナル伝達解析に有用な分子ツールを改良することを目に は 3-phosphatase 活 性 と 5-phosphatase 活 性 の 両指した．

方が増強し，意外なことに電位センサーとの共役が増【方法】

強 し て い た．Zebraﬁsh 由 来 VSP (Dr-VSP) に 同 様 な

主にアフリカツメガエル卵母細胞の発現系細胞を用変異（K303M）を導入すると，KCNQ2/3 チャネルをい，カタユウレイボヤ由来 VSP を原型として，アミノ

PI (4,5) P2 セ ン サ ー と し て 用 い た 計 測 で， 野 生 型 Dr-

酸変異を導入し，膜電位依存的ホスファターゼ活性のVSP よりも有意に電位依存性酵素活性が増強していた．

増強と，基質特異性の変更を試みた．特に動物種間でア【考察】

ミノ酸配列の保存性の高い，４番目の電位センサー膜貫hydrophobic spine と相互作用する S4 から linker に通ヘリックスの S4 と S4 直下のリンカー部分，酵素活

かけての疎水性アミノ酸の重要性を明らかにし，また活性中心の Cx5R に着目した．発現系細胞からの電気生性中心の cysteine の１つ手前の Lys の重要性を明らか

理学的計測および FRET センサーによる Voltage clampにした．これら各部位を変更することで共役を増強する

ﬂuorometry をおこない，後者は細胞外側へのマレイミことが可能になった．これらを組み合わせることで相ド蛍光化合物の導入法および非天然蛍光性人工アミノ酸

乗的に活性を増強できるかが次のステップである．基質

Anap の導入法により蛍光分子を導入し，分子構造の変特異性について，Cx5R のアミノ酸変異により 3-phos-

化と電位依存的な構造変化の検出をした．

phatase 活性を減らすことが可能であり，これまでより【結果】

PI (4,5) P2 に特化した有用なツール開発に繋がると期待

S4 からリンカーにかけてアミノ酸変異を導入のスクできる．

リーニングを行い，S4 の細胞内側の L233, F234 の変【文献】

異により電位依存的酵素活性が大きく変化した．他の疎

１）Mizutani, N., Kawanabe, A., Jinno, Y., Narita,

水性アミノ酸へ置換することで酵素活性が増強し，こH., Yonezawa, T., Nakagawa, A. & Okamura,の変化は電位センサーと酵素のカップリングの変化で

Y.: Interaction between S4 and the phosphatase

生じることが判明した．またこれらの部位およびリン

domain mediates electrochemical coupling in

カー部分（H237 など）は，酵素ドメイン中にあって共voltage-sensing phosphatase (VSP). Proc Natl

役に重要である hydrophobic spine と直接相互作用すAcad Sci U S A. 119(26): e2200364119. (2022).

ることが判明した１）．次に，活性中心付近のアミノ酸
配列 Cx5R が，有袋類の複数の種では活性中心の Cysのひとつ手前の Lys が Met と Leu になっている．このLys (Ci-VSP のアミノ酸番号で 364 に該当) は VSP と相同性のある 3-phosphatase PTEN においても保存され，COSMIC データベースにおいて癌患者での変異が

1345

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

生体恒常性を制御する新しい RNA 修飾代謝酵素の機能解明
小川

更に外的環境に応じた RNA 修飾代謝物の生体内での変動の有無を測定し，その変動の機序について核酸分解と核酸代謝の観点から検討を行った．更に受容体を介した亜希子

代謝物の生理作用・病的作用について，生体モデルを用（東北大学加齢医学研究所）

いて検討した．
【結果】

【目的】

⑴

RNA 修飾代謝の網羅的検出法の確立

生体内の液性因子のうち，核酸型液性因子はアデノシ

生体サンプルは採取後－80° C で保存し，測定日に解ンや ATP に集約されており，他の液性因子と比べて多凍し，有機溶媒を加えて除タンパクした後に水を添加し様性が極端に乏しい．近年，RNA には 150 種にも及ぶて液層を２層に分け，そのうちの水層を限外濾過を行っ

多彩な化学修飾が存在することが発見された．RNA 修

た後に回収した．

飾は転写後の遺伝子発現制御を担い，修飾異常が疾患発回収した水層を遠心濃縮して超純水に再溶解し，質量症原因となることが明らかになりつつあるが，分解後に分析装置により RNA 修飾代謝物を検出した ( 図１)．

どのように振る舞い，細胞機能に影響を与えるか不明で⑵

RNA 修飾代謝物の生理活性の検討あった．研究代表者は RNA 修飾由来代謝物が眼房水や上記検出法を用いてヒトを含む様々な生物種の細胞外

血清中といった生体中の細胞外液に豊富に含まれること

液中の RNA 代謝物の分布を測 定したところ，多種の代を示し，さらにその中には液性因子として受容体を強力謝物が検出された．これらの代謝物はヌクレオシドの修に活性化して下流のシグナルを誘導し，生体機能を調節飾体であるため活性スクリーニングを行った．その結果，しうるものが存在することを証明した．すなわち RNA

N6-methyladenosine (m6A) がアデノシン A3 受容体修飾研究が細胞の中から外へ大きな転換点を迎えていに対して特異的な活性を有することことを同定した．

る．そこで本研究では多彩な RNA 修飾代謝の観点より，⑶

RNA 修飾代謝物の活性機構の解明と生理作用の同定

測定の最適化と関連酵素の同定と機能解析を目的とする．
【方法】⑴

RNA 修飾代謝の網羅的検出法の確立
質量分析を用いて細胞外液に含まれる RNA 修飾の代謝物を安定して測 定する手法の確立を目指して比較検討を行った．また，この系を用いてヒト眼房水や血漿，
尿中の代謝物の定量評価を行った．
⑵

RNA 修飾代謝物の生理活性の検討
ヒト細胞外液中に存在する RNA 修飾の代謝物の液性因子としての活性評価を TGF-α shedding assay 法（Inoue et al., Nature Methods. 2012）を用いて行った．
各種 G タンパク質共役受容体（GPCR）の発現ベクターとアルカリフォスファターゼ融合 TGFα (AP-TGFα) を一過性に HEK293A 細胞に強制発現させ，代謝物を添加した際に GPCR を介した活性化が起こると細胞膜から培養上清中に遊離する AP-TGFα 量を測定した．
⑶

RNA 修飾代謝物の活性機構の解明と生理作用の同定
GPCR 活性が明らかになった RNA 修飾代物の活性機構の解明を in silico モデルと変異体作成により行った．

14
46

図１

細胞外液中の RNA 修飾代謝物の検出

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

m6A の強力な受容体活性機構を解明するためにホモ46 巻 2 号 (2022). *in press

ロジーモデリングによる予測構造を調べ，さらに変異体
アッセイを行うことで裏付けを取り，m6A 結合に特異的な疎水性アミノ酸残基を同定した．次に m6A の制御機構を調べるため様々な外的刺激を加えて変動を調べたところ，細胞傷害時特異的な RNA 分解がリソソームで起こることで m6 がＡ細胞外で増えることが修飾酵素

NKT 細胞を活性化するスフィンゴ糖脂質の機能解明を目指した糖脂質合成酵素の開発
沖野望（九州大学大学院農学研究院）のノックアウト細胞株作成により分かった．さらにこの
m6A-アデノシン A3 受容体の下流シグナル伝達により生体内でＩ型アレルギーあるいは局所的な炎症性サイト
カインの産生が増えることが分かった．
【考察】

【目的】
スフィンゴ糖脂質は真核生物に幅広く存在するセラミド骨格を有する一群の糖脂質であるが，スフィンゴモナ

近年，DNA やタンパク質だけでなく，RNA もメチル

スやバクテロイデスなど一部の細菌もスフィンゴ糖脂質化やアセチル化といった化学修飾を受けることが明らかを合成することが知られている．細菌由来のスフィンゴになり，RNA 修飾がエピジェネティクスに次ぐ新たな糖脂質は真核生物と異なり，糖が α 結合でセラミドに結研究分野として定着しつつある．本研究では RNA 修飾

合するという特徴を持つと共に，ヒトやマウスのナチュ

代謝に着目し，その網羅的検出の最適化を行い，更にこラルキラーＴ（NKT）細胞の活性化能を有することから，の手法を用いて様々な検体を解析することにより成果をその生物活性に注目が集まっている．我々は最近，細菌得た．更に研究の段階で新規 RNA 修飾代謝酵素の同定

由来の α-グルクロノシルセラミド（α-GlcACer）合成に成功しており，現在解析を進めている．

酵素を同定すると共に，そのホモログを α-ガラクトシ【文献】

ルセラミド（α-GalCer）の生産菌であるバクテロイデ

１）Ogawa, A., Nagiri, C., Shihoya, W., Inoue, A.,ス属細菌に見出し，α-GalCer 合成酵素の同定にも成功

Kawakami, K., Hiratsuka, S., Aoki, J., Ito, Y.,した１）．本研究では，α-GalCer の発酵生産や機能解明

Suzuki, T., Suzuki, T., Inoue, T., Nureki, O.,に役立つ α-GalCer 合成酵素を開発することを目的としTanihara, H. & Tomizawa. K.: Wei FY. N6-て研究を実施した．

methyladenosine ( m6A ) is an endogenous【方法】

A3 adenosine receptor ligand. Mol Cell. 81,
659-674 (2021).

α-GalCer が最初に発見されたのはカイメンの一種からであり，実際にはカイメンの共生細菌が合成している

２）Watanabe-Kitamura, F., Ogawa, A., Fujimoto,

可能性が高い．そこで，本研究では α-GalCer 合成酵素

T., Iraha, S., Inoue-Mochita, M., Watanabe,のホモログを細菌ゲノムやカイメンを含む海洋メタゲノ

T., Takahashi, E., Tanihara, H. & Inoue, T.:ムのデータベースから探索した．次に，これらホモログ

Potential roles of the IL-6 family in conjunctivalの中から幾つかの遺伝子を人工合成し，マルトース結合

ﬁbrosis. Exp Eye Res. 210: 108708 (2021).

タンパク質（MBP）との融合タンパク質として大腸菌

３）Ogawa, A. & Wei, FY.: Protocol for preparation

で発現させて，セラミドに対する糖転移酵素の活性を測

and measurement of intracellular and extracel-

定した．

lular modified RNA using liquid chromatog-【結果】

raphy-mass spectrometry. STAR Protoc. 2 (4):100848 (2021). * 責任著者

α-GalCer 合成酵素のホモログとして，細菌のゲノムデータベースから４個の遺伝子を海洋メタゲノムのデー

4）小川亜希子，松尾紀孝，齋藤一創，魏范研：「COVID-19

タベースからは５個の遺伝子を選択した．それぞれの遺ワクチン接種後の RNA 修飾代謝物排泄の変動」．

伝子を大腸菌で発現させて，セラミドに対する糖転移1547

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

酵素の活性を測定したところ，細菌のゲノムデータベーであり，その解明を試みた．

スからは３個の α-GalCer 合成酵素と１個の α-GlcACer【方法・結果】

合成酵素の遺伝子を，海洋メタゲノムのデータベースか

GIST 細胞に複数の ARF に対する siRNA をトランス

らは２個の α-GlcACer 合成酵素の遺伝子を同定するこ

フェクションし，イムノブロットおよび免疫染色法・共とに成功した．

焦点レーザー蛍光顕微鏡で化合物処理のフェノコピーの【考察】探索を試みた．GIST 細胞に，メジャーな ARF のうち，本研究により，新たに３個の α-GalCer 合成酵素と３

ARF1-6 を複数の組み合わせでノックダウンし，KIT の個の α-GlcACer 合成酵素の遺伝子を同定することが出ER→ゴルジの輸送には，少なくとも，ARF1, 4, 5 が必来た．新たに同定した α-GalCer 合成酵素と α-GlcACer

須であることを見出した．ARF1, 4, 5 ノックダウン時，合成酵素の中にはそれぞれ海洋由来のサンプルも含ま

KIT の自己リン酸化および下流シグナルが抑制され，これており，本研究により，初めて海洋に α-GalCer とれらの点について，化合物処理のフェノコピーを得るに

α-GlcACer を合成する細菌が存在することが示唆され至った．さらに，開発化合物処理時に，確かに ARF1,

た．今後は，今回同定した遺伝子を出芽酵母などで発現

4, 5 が抑制されていることを確認するために，in vitro

させることにより，α-GalCer の発酵生産の基盤を構築

GGA3 プルダウンアッセイをおこなった．定常状態では，したいと考えている．

ARF1, 4, 5, 6 の活性化が認められたが，ブロッカー処理【文献】

時，ARF1, 4, 5 の活性化が有意に抑制されることが明ら

１）Okino, N., Li, M., Qu, Q., Nakagawa, T.,かになった．

Hayashi, Y., Matsumoto, M., Ishibashi, Y. & Ito,【考察】

M.: Two bacterial glycosphingolipid synthases

GIST 細胞の KIT は，ARF1, 4, 5 の三者に依存して，

responsible for the synthesis of glucuronosyl-

小胞体からシグナルの場であるゴルジ体に移行すること

ceramide and α-galactosylceramide, J. Biol.

が明らかになった．これらを同時に輸送する開発中のブChem., 295, 10709 (2020).

ロッカーは，抗がん剤として，現在，前臨床研究中であり，本研究を新機序の分子標的薬開発の一助としたい．
今後，白血病や肺腺がん等の他のがんにおける検討を進める予定である．

消化管肉腫キナーゼ KIT のゴルジシグナルの原因【関連する発表論文】となる ARF GTPase の同定，その理解に基づく

Yamawaki, K., Shiina, I., Murata, T., Tateyama, S.,

抗がん剤開発小幡

Maekawa, Y., Niwa, M., Shimonaka, M., Okamoto,

裕希

K., Suzuki, T., Nishida, T., Abe, R. & Obata, Y.:（国立がん研究センター研究所）

FLT3-ITD transduces autonomous growth signals
during its biosynthetic trafficking in acute myelog-【背景・目的】
本研究は，消化管間質細胞腫（GIST）等の大きな原因の一つである KIT チロシンキナーゼの ER→シグナルの場（ゴルジ体）の輸送阻害作用を有するブロッカーについて，抗がん剤として開発するにあたり，直接のター
ゲット分子を解明することを目的としている．開発中のブロッカーは，ARF small GTPase の阻害を介して輸送
ブロックすると考えられているが，複数同定されている
ARF のうち，どのメンバーの抑制が重要なのかは不明

16
48

enous leukemia cells. Scientiﬁc Reports, 11, 22678(2021) doi: 10.1038/s41598-021-02221-2.

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成を検出するための鋭敏かつ簡便なレポーターとしてもルシフェラーゼの改変体を利用した小胞体機能の解析と有用化合物の探索
門倉広

機能することが分った（論文準備中）．
⑵

80 種類の天然化合物からルシフェラーゼ活性を上昇させる複数の候補化合物を得たが，これらは標的タ（東北大学多元物質科学研究所）

ンパク質のシグナル配列に特異的ではなかった．よって，目的の阻害剤を得るためには，今後，より多くの【目的】
大腸菌ではジスルフィド結合形成能力の低下やタンパ

化合物を調べる必要がある．
【文献】

ク質の分泌活性の低下に伴い，β-ガラクトシダーゼを

１）Kadokura, H., Tian, H., Zander, T., Bardwell,

発現する鋭敏なレポーター１） が開発されている．我々

J.C.A. & Beckwith, J.: Snapshots of DsbA in

は，この系を参考にヒト小胞体関連機能の変化を検出す

action: Detection of proteins in the process of

る鋭敏で簡便な新規レポーターの開発を進めている．こoxidative folding. Science. 303, 534 (2004).

の目的で，蛍ルシフェラーゼに多数のシステインを導２）Kadokura, H., Dazai, Y., Fukuda, Y., Hirai,

入して作った改変型ルシフェラーゼ（FLuc*）に，分泌N., Nakamura, O. & Inaba, K.: Observing theタンパク質のシグナル配列を付与した融合タンパク質nonvectorial yet cotranslational folding of a

（FLuc*レポーター）を作製した．本タンパク質を発現

multidomain protein, LDL receptor, in the ER ofする HeLa 細胞では，ａ）小胞体内で FLuc* にジスル

mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.

フィド結合が形成され，ルシフェラーゼ活性が大きく低117, 16401 (2020).

下するが，ｂ）局在化が阻害されると，FLuc* はサイト
ゾルで正しく折り畳まれ，活性が上昇する．よって，本タンパク質は，小胞体へのタンパク質局在化効率の低下を検出するためのレポーターとして機能することが判明した．本研究では，本レポーターの更なる機能評価を行

細胞極性複合体から迫る Rap1 の活性化機構の解明と腎疾患治療への応用佐々木和教（順天堂大学大学院医学研究科）

うとともに，小胞体機能の解析と有用化合物の探索に本レポーターを利用した．
【方法】

【目的】

ジスルフィド結合形成はヒト細胞表層タンパク質の細胞極性は，タンパク質などの成分が一つの軸に沿っ立体構造形成に重要であり，小胞体内で行われる２）．

て不均等に分布する現象であり，各種シグナルの時空間

上記レポーターは，その構造の特質から，ジスルフィ

制御を通じて，細胞間接着や上皮組織の秩序に関与す

ド結合形成能力の変化も検出する可能性があり，このる．上皮組織の細胞極性異常が要因の一つとなる疾患点を検証した．
また，
小胞体機能の解析に本レポーターに，腎臓のネフローゼ症候群がある．近年，腎臓の血液を利用した．

ろ過に低分子量Ｇタンパク質 Rap1 が関与し，ネフロー⑴

ウイルスの感染に必要なタンパク質の生合成を阻害

ゼ症候群と Rap1 異常の関連が分かってきた．これまでする化合物を発見する目的で，当該タンパク質のシグに我々は，細胞極性複合体の中心的なタンパク質キナー

ナル配列の下流に FLuc* を連結し，探索実験に用いた．

ゼ aPKC の結合タンパク質を探索し，Rap1 の調節因子⑵【結果と考察】と し て Shank2 (Sasaki et al., Cell Reports 2020) と⑴

本レポーターを発現する HeLa 細胞では，小胞体内p200 を見出してきた．これら aPKC 結合タンパク質ににおけるジスルフィド結合形成能力の低下（増大）による Rap1 の調節機構を解明することで，ネフローゼ症とともない，
ルシフェラーゼ活性が再現性良く上昇（低候群の新たなバイオマーカーや治療開発が期待された．

下）した．よって，ジスルフィド結合形成能力の変化

そこで本研究では，aPKC 結合タンパク質 p200 の機能

1749

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

解析を進め，細胞極性及び Rap1 の調節における p200

【文献】の役割を明らかにすることを目的とした．

１）Ozaki, A., Motomura, H., Tamori, S., Onaga,【方法】

C., Nagashima, Y., Kotori, M., Matsuda, C.,

生化学的な結合実験：HA タグ付き aPKC と FLAG-

Matsuda, A., Mochizuki, N., Sato, T., Hara, Y.,

SBP タ グ 付 き p200 を HEK293T 細 胞 に 共 発 現 さ せ，Sato, K., Miyagi, Y., Nagashima, Y., Hanawa,

SBP タグで p200 を精製した．精製画分に対して，抗T., Harada, Y., Xiong, Y., Sasaki, K., Ohno, S.

HA タグ抗体を用いたウェスタンブロットを行った．

& Akimoto, K*.: High Expression of p62 and

細胞内局在及び表現型の解析：FLAG-SBP タグ付き

ALDH1A3 Is Associated With Poor Prognosis in

p200 を上皮細胞にトランスフェクションし，細胞を固Luminal B Breast Cancer. Anticancer Res. 42,

定後，SBP タグや細胞間接着タンパク質に対する抗体

3299-3312, 2022.

で免疫染色した．
【結果】２）Onaga, C., Tamori, S., Matsuoka, I., Ozaki, A.,
Motomura, H., Nagashima, Y., Sato, T., Sato, K.,

分子メカニズム解明のために，細胞極性タンパク質

Xiong, Y., Sasaki, K., Ohno, S. & Akimoto, K*.:aPKC に結合するタンパク質の網羅的な探索を進め，High expression of SLC20A1 is less eﬀective for

Rap1 に関連する p200 を同定した．本研究では aPKC

endocrine therapy and predicts late recurrenceと p200 の結合を検証するため，タグ付き aPKC 及び

in ER-positive breast cancer. PLoS One. 17,

p200 を培養細胞にて発現させ，生化学的な結合実験を

e0268799, 2022.

行った．タンパク質の精製画分に対するウェスタンブ

３）Sakamoto, M., Sasaki, K., Sugie, A., Nitta, Y.,

ロットの結果から，aPKC が p200 と結合することを確

Kimura, T., Gürsoy, S., Cinleti, T., Iai, M., Sen-

認した．また，p200 の欠失変異体を用いた結合実験から，

goku, T., Ogata, K., Suzuki, A., Okamoto, N.,

p200 上の aPKC 結合領域を特定した．

Iwama, K., Tsuchida, N., Uchiyama, Y., Koshi-

次に p200 の機能を探るために，上皮細胞における

mizu, E., Fujita, A., Hamanaka, K., Miyatake, S.,

p200 の細胞内局在を検討した．タグ付き p200 を培養

Mizuguchi, T., Taguri, M., Ito, S., Takahashi, H.,

上皮細胞に発現させ，タグ抗体で免疫染色を行った．共Miyake, N*. & Matsumoto, N*.: De novo ARF3

焦点蛍光顕微鏡での観察から，p200 は上皮細胞の細胞

variants cause neurodevelopmental disorder

間接着部位に局在することが分かった．そこで細胞極性with brain abnormality. Hum Mol Genet. 31,

における p200 の役割を調べるために，p200 を上皮細69-84, 2022.

胞に過剰発現し，表現型を観察した．その結果，p200

４）Motomura, H., Ozaki, A., Tamori, S., Onaga, C.,を過剰発現した細胞は，コントロール細胞に比べて細胞Nozaki, Y., Waki, Y., Takasawa, R., Yoshizawa,

間接着が強固であることが分かった．

K., Mano, Y., Sato, T., Sasaki, K., Ishiguro,【考察】

H., Miyagi, Y., Nagashima, Y., Yamamoto, K.,

本研究から，aPKC 結合タンパク質 p200 が細胞間接

Sato, K., Hanawa, T., Tanuma, S., Ohno, S. &着部位に局在し，細胞間接着に関与することが分かって

Akimoto, K*.: Glyoxalase 1 and protein kinase

きた．腎臓における aPKC, Shank2, p200 ノックアウ

Cλ as potential therapeutic targets for late-stage

トマウスは，Rap1 のノックアウトマウスと似たような

breast cancer. Oncol Lett. 22, 547, 2021.

表現型を示し，ネフローゼ症候群様の表現型を呈する．

５）Miyatake, S., Kato, M., Kumamoto, T., Hirose,

今後，aPKC- p200 複合体のさらなる解析を進め，これT., Koshimizu, E., Matsui, T., Takeuchi, H., Doi,ら複合体による Rap1 の調節機構を解明することで，ネ

H., Hamada, K., Nakashima, M., Sasaki, K.,

フローゼ症候群の新たなバイオマーカーや治療につながYamashita, A., Takata, A., Hamanaka, K., Sa-ることが期待される．

toh, M., Miyama, T., Sonoda, Y., Sasazuki, M.,

1850

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

Torisu, H., Hara, T., Sakai, Y., Noguchi, Y., Mi-

アの大きな特徴の一つとして膜脂質の構造が挙げられ

ura, M., Nishimura, Y., Nakamura, K., Asai, H.,る（図１）．細菌および真核生物の膜脂質の疎水性尾部

Hinokuma, N., Miya, F., Tsunoda, T., Togawa,は脂肪酸由来の直鎖状炭化水素であるが，アーキアではM., Ikeda, Y., Kimura, N., Amemiya, K., Horino,

枝分かれ構造のあるイソプレノイドである．よってアーA., Fukuoka, M., Ikeda, H., Merhav, G., Ekhi-

キアは脂肪酸を生合成しないと思われてきたが，近年少

levitch, N., Miura, M., Mizuguchi, T., Miyake,

量ながらもアーキア細胞から脂肪酸が検出され，その生

N., Suzuki, A., Ohga, S., Saitsu, H., Takahashi,

合成系が存在する可能性が示唆されている．しかし，そH., Tanaka, F., Ogata, K., Ohtaka-Maruyama,の生合成機構は解明されていなかった．

C. & Matsumoto, N*.: De novo ATP1A3 variants

リポ酸は硫黄元素を含む脂肪酸で（図２），グリシン

cause polymicrogyria. Sci Adv. 7, eabd2368,

由来の炭素原子を他の化合物に付加する C1 代謝で機能2021.

する補酵素である．大腸菌では脂肪酸生合成系で合成した acyl carrier protein (ACP) 上のオクタノイル基

アーキアにおける脂肪酸生合成機構の解明と機能性脂肪酸の合成佐藤（C8）を H-protein 上に転移し，lipoyl synthase (LipA)
が硫黄を挿入して，タンパク質上でリポ酸を生合成する（図3a）．一方，多くのアーキアはこれらの反応を喬章

触媒する酵素を持っていなかった．しかし申請者らは，（京都大学大学院工学研究科）

85℃の高温環境で生育する超好熱性アーキア Thermo-

coccus kodakarensis において，LipA と同じ反応を触媒するが一次配列は新規な lipoyl synthase (LipS) を同【背景・目的】
アーキアは真核生物や細菌とは異なる第三の生物群を１）．この結果からもアーキアは脂定した（図3b 右下）

構成する原核微生物であり，他の２つの生物群は持たな肪酸を生合成している可能性が示唆されたが，LipS がい特有の酵素や代謝経路を数多く有する．また，アーキ

触媒するステップ以外のリポ酸生合成経路は不明であった．そこで本研究では，アーキアにおけるリポ酸を含めた脂肪酸の生合成機構を解明することを目的とした．また，同定した各酵素の基質特異性を検討し，含硫脂肪酸
合成への応用の可能性も検討した．
【方法・結果】〇 LplA ホモログ組換え型タンパク質の in vitro 解析
Lipoate-protein ligase (LplA) はリポ酸を直接 H-protein に 結 合 す る salvage 経 路 で 機 能 す る と さ れ て いる（ 図3a 左 下 ）．T. kodakarensis に お け る LplA ホ
モログのリポ酸生合成への寄与を明らかにするため，

図１

各生物における膜脂質の構造

既 知 LplA の N, C 末 端 領 域 と そ れ ぞ れ 相 同 性 を 示 すTK1234, TK1908 の各組換え型タンパク質を大腸菌で調製し，熱処理および各種カラムクロマトグラフィーにより精製した．両精製タンパク質を添加した際に，H-protein 由来のペプチド断片とリポ酸を結合する lipoate-protein ligase 活性（図 3b 中央下）が検出された．

図２

リポ酸の構造

興味深いことにオクタン酸を基質に用いた場合でもリポ酸に対する活性とそれほど変わらない protein ligase 活

1951

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成【考察】
本研究により，LplA が構成する遊離のオクタン酸を経由する新規な含硫脂肪酸生合成経路の存在が示唆された（図3b）．これは遊離のオクタン酸を中間体とする，
アーキアの新規脂肪酸生合成経路の存在をも示唆している．LipS は基質特異性が厳密で様々な含硫脂肪酸合成への応用は難しいことが分かったが，LplA は基質特異性が広く，ペプチドの脂肪酸修飾への応用の可能性が示
唆された．
【文献】
１）Jin, J.Q., Hachisuka, S.I., Sato, T., Fujiwara,
T. & Atomi, H.: A structurally novel lipoyl
synthase in the hyperthermophilic archaeon

Thermococcus kodakarensis , Appl . Environ .
Microbiol. (Spotlight Selection) 86, e01359-20(2020).
図３

大腸菌における既知リポ酸生合成経路と T.
kodakarensis における予測新規リポ酸生
合成経路２）Jin, J.Q., Sato, T., Hachisuka, S.I.

Atomi, H.:

A lipoate-protein ligase is required for de novo
lipoyl-protein biosynthesis in the hyperthermo-性（図 3b 中央上）を示し，さらに鎖長が短いヘキサン

philic archaeon Thermococcus kodakarensis ,酸（C6）やブチル酸（C4）などの脂肪酸も基質としてAppl. Environ. Microbiol. (Spotlight Selection)

認識した．一方，octanoyl-CoA は基質とならなかった．

88, e0064422 (2022).

〇 LplA ホモログ遺伝子の in vivo 解析
LplA ホモログの遺伝子破壊株を作製し，増殖特性を調べた．LplA は遊離リポ酸 salvage で機能していると考えられており，LipS を介した de novo リポ酸生合成
機構は残っていることから，破壊株はセリン要求性を示さないと考えていた．しかし，意外なことに TK1908

タンパク質架橋酵素の局在依存的な基質架橋部位の網羅的同定・定量法の開発
辰川英樹（名古屋大学大学院創薬科学研究科）

破壊株はセリン要求性を示した．TK1234/TK1908 はリポ酸の salvage だけでなく，（オクタノイル基ではなく）オクタン酸を H-protein 上に結合する octanoateprotein ligase 活性により H-protein 上でのリポ酸生合【目的】
タンパク質架橋化酵素（トランスグルタミナーゼ，

２）．
成機構にも寄与することが示唆された（図3b）TGase）はタンパク質中のグルタミン残基（Gln）とリ〇 LipS の基質特異性の検討

ジン残基（Lys）との間に共有結合を形成して架橋修飾

含硫脂肪酸合成への応用の可能性を検討するため，を行う酵素であり，幅広い生物において標的タンパク質

hexanoyl-peptide お よ び butyryl-peptide が LipS の 基の機能や性状変換を介して種々の生命現象に関わる．血質となるかを検討したが，これらに対しては硫黄挿入活

液凝固，皮膚形成，死細胞除去を始め多彩な生命現象に性を示さなかった．また，遊離のオクタン酸やオクタン

関与する一方，異常なレベルの架橋形成は多種の疾患（肝酸とペプチド断片の混合物を基質に用いても残念ながら

腎肺疾患，神経変性疾患，糖尿病，癌の悪性化，自己免硫黄挿入活性は示さなかった２）．

疫疾患など）の原因となる．

2052

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

私たちはこれまでに肝臓，腎臓，肺の障害や炎症，線羅的に解析するため，尿素を含む組織抽出液を用いて架維化における TGase の関与について検証し，病態進行

橋反応後の組織切片を変性溶解し，トリプシン処理によに関与する経時的な TGase の活性分布および標的基質

りタンパク質を消化切断した後に，精製および同定解析

タンパク質の同定に成功してきた．同手法により同定を行った．

された候補基質タンパク質の中には，確かに生体内で【結果】

TGase の基質として架橋され，基質因子自身の活性の肺線維化のモデルマウスを作製し，未固定の組織切片向上や低下に繋がる例があった．しかしながら，同定さ上に標識プローブの BPA を添加してインキュベーショ

れたタンパク質の多くは単に存在量が多いタンパク質でンしたところ，TGase の発現が上昇する線維化領域にあり，生体内では架橋されない擬陽性の因子が多く含ま

おいて，TGase の架橋活性を反映するような BPA が修れていた．組織抽出液を用いた既存の解析法では，生体飾された基質タンパク質が顕著に検出された．次に，こ内の TGase の局在が反映されないこと，および標識プのような BPA 修飾された基質タンパク質をモノアビジ

ローブと架橋した標的ペプチド群の検出感度が低いためンレジンにより精製した後に，プロテオミクス解析をに，未修飾のペプチド由来のバックグラウンドに埋もれ行った．同様の TGase 欠損マウスを用いた比較解析をて網羅的な同定解析ができないことが問題点として挙げ経て，肺線維化において特異的に架橋される 126 個のられた．

BPA 修飾タンパク質を同定することができた．同定し本研究では，未固定の組織切片を用いて架橋反応を行た架橋基質タンパク質群の情報に基づき，パスウェイ解い，トリプシン消化後に標識プローブが架橋されたペプ析を行ったところ，肺線維化の患者における過去の遺伝

チド群のみを精製し，網羅的に架橋修飾残基を同定およ子発現解析において変動が報告された活性化経路と類似び定量する新たな実験手法の開発を目的とした．同手法性が見られ，TGase による基質の架橋修飾を起点としでは，標識化されたペプチド断片を精製するため，非特たシグナル伝達機構の活性化が病態形成に寄与する可能

異吸着や基質タンパク質の相互作用因子，基質因子の架性が示唆された．

橋されない領域由来のペプチドを除くことが可能であ

さらに TGase の架橋修飾残基を同定する手法を開発

り，既存の問題を解決できる．同手法を用いた疾患増悪するため，上記の架橋基質の同定解析手法を再検証した．

に関わる TGase 基質の架橋残基の網羅的同定は，基質トリプシンにより消化したペプチドの精製条件を厳しくの架橋修飾領域を標的とした新たな創薬シーズの提供に設定し，夾雑ペプチドを限りなく抑えて質量分析による貢献できる．

検出ピークの S/N 比を高めることにより，肺線維化に【方法】

おいて TG2 により架橋される 119 個の基質タンパク質

TGase 活性の上昇を示すブレオマイシン投与による肺線維化のモデルマウスを作製し，回収した肺組織を用と 201 個所の架橋修飾残基の網羅的同定に成功した．
【考察】

いて以下の実験を行った．未固定の組織切片上に標識プ

本研究により，これまで TGase の局在分布が失われローブ（ビオチン化ペンチルアミン ; BPA）を添加し，た組織抽出液を用いて架橋される基質タンパク質を解析

内在性の TGase 活性により切片中の基質タンパク質のしていた従来の実験手法を大きく改良することができ，

Gln 残基と BPA の一級アミン（Lys 残基を模倣）を架

組織中の TGase 活性の局在を反映した架橋基質タンパ橋させた．BPA と架橋した基質タンパク質は蛍光物質

ク質の網羅的な同定・定量解析が可能となった．また，もしくはペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンによ

架橋修飾残基を包括的に同定・定量する新たな解析手法

り検出した．TGase により特異的に架橋された BPA 修の開発に成功した．これにより，今後は基質タンパク質

飾基質を同定するため，組織切片上での反応後の抽出液の架橋修飾残基を標的とした架橋反応の特異的な制御剤

中の BPA 修飾タンパク質をモノアビジンレジンによりを探索することにより，関連疾患の新たな治療薬開発へ

精製し，質量分析を用いて架橋修飾基質を網羅的に同の貢献が期待される．

定・定量解析した．一方，BPA が修飾された残基を網2153

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成【文献】

工程）を要する上に，構造改変部位が限定される．そこ

１）Tatsukawa, H. & Hitomi, K.: Role of Transgluta-

で，より簡便かつ迅速（＜10 工程）に構築可能なマク

minase 2 in Cell Death, Survival, and Fibrosis,

ロ環含有中分子（３等, 図1C）を設計した．申請者がCells., 10, 1842 (2021).

これまでに開発した化学–酵素ハイブリッド合成法によ２）Takeuchi, T., Tatsukawa, H., Shinoda, Y., Ku-

り，単純な合成基質群（3, 4）から１の母骨格２を迅速

wata, K., Nishiga, M., Takahashi, H., Hase, N.

構築可能である１）．本研究では，本合成法を改良しなが& Hitomi, K.: Spatially resolved identiﬁcation

ら非天然型基質群（5−6）等の適用を進め，複雑母骨of transglutaminase substrates by proteomics

格（７等）の迅速構築と（図1B），デザインした分子群（８in pulmonary ﬁbrosis, Am. J. Respir. Cell. Mol.

等）の化学－酵素ハイブリッド合成に向けた基盤の確立

Biol., 65, 319 (2021).（本学プレスリリース）を進めた．

３）辰川英樹，人見清隆： 臓器の線維化を誘導するタ【方法】

ンパク質架橋酵素の網羅的な分子標的解析 , B&I バ

酵素 SfmC を活用した化学－酵素ハイブリッド合成法

イオサイエンスとインダストリー，80, 113 (2021).

の基質適用範囲拡大を目指し，天然型基質である４の１）アシル鎖長，２）アミド結合，３）L-アラニン残基をそれぞれ改変した 13 種の基質群を化学合成した．合エクテナサイジン 743 高機能化類縁体の化学-酵
素ハイブリッド合成
谷藤

成基質群をもう一つの基質である３と共に酵素 SfmC へと作用させた．酵素変換の後，中間体を単離せずにシアノ化，N-メチル化の２段階の化学変換を施して安定な化

涼合物へと変換した．LC システムを用いてそれぞれの基（東京大学）

質から得られた反応溶液を分析し，五環性母骨格に由来する 280 nm の波長の吸収ピーク面積を算出した．この面積比から，天然型基質４の変換率 100% とした相

【目的】
天然物エクテナサイジン 743（1, 図1A）は悪性軟部

対的な変換効率を算出した．全ての反応について３つの腫瘍の治療薬として臨床応用されている（Yondelisʀ）．

反応容器にて同時に実施し，平均値を計算してグラフ化

１は DNA アルキル化を担う五環性母骨格とタンパク質

し，標準誤差をエラーバーとして示している．

相互作用部位がマクロ環で連結されている．マクロ環構【結果】

造の多様化により DNA–タンパク質間相互作用を選択的

まず，天然型基質４と炭素鎖が 2 つずつ違う 9, 10 と，に制御する中分子群の創製が期待されるが，１はその構造の複雑さから，半合成においても多段階変換（＞20

図１
Ａ．研究背景，Ｂ．申請者らのこれまでの研究，Ｃ．本研究の概要

22
54

図２

SfmC による基質アナログ 9−13 の相対的変換率酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

quinoline alkaloids and systematic explorationof the substrate scope of SfmC, Tetrahedron

Chem, 1, 100010 (2022).

アミノアシル tRNA を標的とする病原性バクテリ
ア由来アセチル化酵素の特異性分子基盤
富田耕造（東京大学大学院新領域創成科学研究科）

図３

SfmC による基質アナログ 14a－h の相対
的変換率

【目的】
Toxin-antitoxin (TA) システムはバクテリアにおいて広く見いだされ，ストレス環境下にバクテリアが生

４の 2 つのアミド結合をそれぞれエステル，アリルカ

存するために獲得したシステムであり，ストレス環境

ルバメートとした 11−13 の基質群について上記手法

下におけるバクテリアの休眠・活動休止（dormancy）

に従って相対的変換率を算出した （図２）．４の変換や，抗生物質暴露時のバクテリアの抗生物質耐性獲得率を 100% とすると，9, 10 の変換率はそれぞれ 27%,

（persister/drug tolerance）などに関与している．最近，17% と著しく低下した．一方で，アミド結合の一つをサルモネラ菌においてタイプ II に属する新規な TacT

エステルとしたは天然型基質の 55% 程度の効率で変換(Toxin)-TacA (antitoxin) システムが発見された．TacTが進行した．他方のアミド結合を改変した 12, 13 では

はアセチル転移酵素にみられる GNAT (GCN5-related

どちらも 14% 程度にまで変換率は落ち込んだものの，

N-acetyltransferase) モチーフを有する Toxin であり，

SfmC には受容され対応する五環性骨格が得られた．

tRNA のアミノアシル部位のアミノ基へアセチル CoA

天然型基質４の L-アラニン残基を種々アミノ酸へのアセチル基を転移する．アミノアシル tRNA のアセと改変した基質アナログ群についても同様の検討を行

チル化によって翻訳が阻害される．しかし，TacT によなった（図３）．SfmC は非常に広い基質許容能を示し，る特異的なアミノアシル tRNA の認識・識別機構は明

全 て の 基 質 ア ナ ロ グ 14a－h か ら 対 応 す る 五 環 性 骨

らかにされていない．また，各 Toxin によって基質と格 15a－h が得られた．本成果は Tetrahedron Chem

なるアミノアシル tRNA 種が異なるが，この基質認識

誌の創刊号へ詳報として公表した ．SfmC の類縁酵素の違いの分子基盤も明らかにされていない．本研究では，

SacC についても同様の検討を進めながら，スケール・

TacT の X 線結晶構造解析および生化学的解析を通して効率の向上を進めている．

TacT の基質アミノアシル tRNA の認識・識別機構を明【文献】

らかにしたので報告する．

１）Tanifuji, R., Koketsu, K., Takakura, M., Asano,

【方法】

２）

R., Minami, A., Oikawa, H.* & Oguri, H.*:

TacT が 標 的 と す る ア ミ ノ ア シ ル tRNA の 解 析 は，

Chemo-enzymatic Total Syntheses of Jorunna-

TacT を誘導発現した大腸菌より調整したアミノアシル

mycin A, Saframycin A, and N-Fmoc SaframycintRNA 画分を質量分析によって解析した．TacT は Gly-

Y3, J . Am . Chem . Soc ., 140, 10705–10709

tRNAGly を特異的にアセチル化する活性があることが判(2018).

明したため，さらに TacT の基質認識機構を明らかに

２）Tanifuji, R.*, Haraguchi, N. & Oguri, H.*: Chemo-

するため TacT による変異体 Gly-tRNAGly のアセチル化

enzymatic total syntheses of bis-tetrahydroiso-

効率の測定，および各種アミノアシル tRNA のアセチ

2355

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

ル化の効率の測定を行った．また，TacT 変異体の大腸

内での毒性には TacT が二量体を形成することが必要で菌生育阻害解析をも行った．また，TacT とアセチル化あること，すなはち，tRNA の結合には TacT の二量体された Gly-tRNAGly との複合体の X 線結晶回折実験は化が必要であることを示している．

つくばの高エネルギー研究機構（KEK）のビーライン

今回の構造解析から，TacT による tRNA のアクセプ

BL17A を用いて行った．

ターステムの特異的な相互作用がみいだされた．特に，【結果と考察】tRNAGly のみに見出される U74（識別塩基とよびます）（ⅰ）TacT によるグリシンを受容した tRNAGly の特異とアクセプター内の G71 が TacT によって特異的な水的アセチル化素結合で認識されている様子が明らかになった．サル

2016 年にサルモネラ菌由来の TacT が各種アミノア

モネラ菌のすべての tRNA 配列を比較してみると，U74

シル tRNA をにアセチル化し，翻訳過程を阻害するとおよび G71 を有する tRNA は tRNAGly のみである．結報告された２）．そこで，TacT の標的となるアミノアシ

晶構造解析から明らかになった，tRNAGly の U74 ある

ル tRNA を解析した．TacT を大腸菌内で発現し，その後，

いは G71 を認識する TacT 内のアミノ酸へ変異を導入

直ちに大腸菌からアミノアシル tRNA を酸性条件下でし，それらの変異 TacT を大腸菌で発現誘導し，大腸菌

分離し，得られたアミノアシル tRNA を質量分析によっの成長が抑制されるか解析した．結果，G71, U73 を認て解析した．その結果，TacT によって，グリシンを受識するアミノ酸残基の変異（Trp29Phe, Asn37Ala, Ar-

容した tRNAGly が特異的にアセチル化を受けていること

g78Ala, Asn79Ala）によって，TacT の活性（大腸菌が分かった．グリシン以外のアミノ酸を受容したアミノ内での毒性）が抑制された．これらの解析より，TacT

アシル tRNA は TacT によってアセチル化されない．こは tRNAGly のみに見られる特徴的な塩基配列を認識しの結果は，以前の報告とは異なるものであった．そこで，て，他の tRNA は認識しないことが明らかになった．

試験管内で各種アミノアシル tRNA (Ala-tRNAAla, Ile-（ⅲ）TacT の tRNAGly 認識の解析

tRNAIle, Leu-tRNALeu, Trp-tRNATrp, Phe-tRNAPhe, Gln-

大 腸 菌 内 で TacT が ア セ チ ル 化 す る ア ミ ノ ア シ ル

が TacT によっtRNAGln, Cys-tRNACys, Ser-tRNASer など）

tRNA の 質 量 分 析， さ ら に Ｘ 線 結 晶 構 造 解 析 に よ るてアセチル化されるか解析を行った．その結果，TacT

TacT とアセチル化されたアミノアシル tRNA 複合体

は Gly-tRNAを他のアミノアシル tRNA と比較して，解析から，TacT が Gly-tRNAGly 特異的なアセチル転移

酵素学的に 20 ～倍以上効率よくアセチル化することが酵素であることが明らかになった．この認識メカニズ

分かった．これらの結果から，TacT は Gly-tRNAGly 特ムを明らかにするため，変異体 Gly-tRNAGly を調整し，異的なアセチル転移酵素であることが明らかになった．

TacT によるそれらのアセチル化効率を解析した．U73（ⅱ）TacT とアセチル化された Gly-tRNAGly 複合体のを A73 あるいは C73 へ変異を導入すると Gly-tRNAGly

Gly

結晶構造解析

の ア セ チ ル 化 の 効 率 は 顕 著 に 減 少 し た． 一 方，U73

TacT による Gly-tRNAGly の特異的アセチル化の分子を G73 へ 変 異 を 導 入 し た Gly-tRNAGly は 通 常 の Gly-機構を詳細に明らかにするため，TacT とアセチル化さ

tRNAGly と同レベルでアセチル化された．これは U73

れた Gly-tRNAGly (Ac-Gly-tRNAGly) の複合体結晶を作の認識に関わる TacT の Asn79 が G73 とも相互作用で製し，その三次元構造をＸ線結晶構造解析にて 3.2Å のきるためであると考えられた．また，アクセプターステ

分解能で決定した．構造解析から，TacT の二量体に２ム内の C2-G71 を G2-C71 へ変異を導入すると，Gly-

分子の tRNA 分子が結合しており，tRNA 分子のアクセ

tRNAGly のアセチル化の効率は顕著に減少した．これら

プター領域のみが TacT と相互作用し，アンチコドンの結果は，TacT とアセチル化された Gly-tRNAGly 複合領域などは TacT と相互作用しないことが明らかになっ体の結晶構造解析から明らかになった tRNA 認識機構

た．さらに，TacT の二量体分子の接触境目の領域にまと一致する．したがって，TacT が tRNAGly のみに見らたがって tRNAGly のアクセプター領域が結合することがれる特徴的な塩基配列を認識して，他の tRNA は認識分かった．このことは，以前の TacT の酵素活性や細胞しないことが支持された．

24
56

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成（ⅳ）TacT によるアミノアシル部位の認識【発表論文】tRNAGly の変異体を用いた Gly-tRNAGly のアセチル化

Yashiro, Y., Zhang, C., Sakaguchi, Y., Suzuki, T. &解析より U73 を G73 へ変異を導入した Gly-tRNAGly は*Tomita K.: Molecular basis of glycyl-tRNAGly acety-

効率よく TacT によってアセチル化されることが明ら

lation by TacT from Salmonella Trphimurium. Cell

かになった．サルモネラの tRNA 配列を調べてみると，Reports, doi: 10.1016/j.celrep.2021.110130, 2021.

G73 をもち，G71 の tRNA として，tRNAArgと tRNA

Asnが存在することが分かった．そこで，これらのアミノ
ア シ ル tRNA (Arg-tRNAArg あ る い は Asn-tRNAAsn) がTacT に よ っ て ア セ チ ル 化 さ れ る か 解 析 し た． 結 果，
Arg-tRNAArg および Asn-tRNAAsn ともに TacT によって脂肪肝形成における O-GlcNAcylation によるタ
ンパク安定化と転写因子機能制御
中川

アセチル化されないことが分かった．この結果は，大腸嘉（富山大学和漢医薬学総合研究所）

菌内で TacT を発現させたときに，Arg-tRNAArg およびAsn-tRNAAsn はアセチル化されていないことと一致す
る．また，この結果は TacT が tRNAGly の特異的な塩基【目的】

配列を認識しているだけでなく，3ʼ 末端に受容している

現在，食生活の欧米化に伴い生活習慣病患者の増加がアミノ酸をも識別していることが示唆された．TacT の社会問題であり，その中でも脂肪肝の増加が特に問題と活性触媒ポケットの近傍には，アミノアシル tRNA のなっている．脂肪肝は悪性化すると肝がんにまで悪化し，

アミノアシル部位と結合できる小さなポケットが存在

生死につながる．そのため，脂肪肝の発症メカニズムのする．このポケットは，Gly-tRNAの Gly の側鎖（Ｈ）

解明から新規治療応用が必要である．CREBH は転写因は収まることができるが，Arg-tRNAArg や Asn-tRNAAsn

子として肝臓では糖・脂質代謝に係る酵素遺伝子の発現のアミノアシル部位の側鎖は収まることができない．しを調節し，小腸では栄養吸収に係る遺伝子の発現を制御た が っ て，TacT は ア ミ ノ ア シ ル tRNA の tRNA 内 のし，腸肝を介し，全身の栄養代謝改善に機能することを特異的な配列を認識すると同時に，3ʼ 末端に受容してい明らかにしてきた（Nakagawa and Shimano, 2018）．

るアミノ酸の大きさも認識していることが示唆された．

その中で CREBH 欠損（CREBH KO）マウスは様々な

そこで，TacT の触媒ポケット近傍のアミノアシル部位

高栄養食負荷時に脂肪肝を呈する．本課題では CREBHが結合すると予想される部位に変異をかけた TacT を大KO マウスに高フルクトース食（HFruD）負荷時に生じ腸菌で発現させ，大腸菌の生育阻害効果が抑制されるかる脂肪肝の発症メカニズムを明らかにすることを目的と検討した．結果，モデルで予想されるポケットを構成すした．

るアミノ酸の変異によって TacT の毒性が抑制された．

【方法】

【要約】

・正常（WT）マウスと CREBH KO マウスに通常食 (MF)，

Gly

TacT は各種アミノアシル tRNA をアセチル化し，結果，翻訳を阻害する作用があると報告された．しかし

HFruD を８週間負荷し，血液解析，病理解析，タン
パク・遺伝子発現解析などを行った．

ながら，本研究から TacT は Gly-tRNAGly を特異的に・293 細胞に CREBH, ChREBP, O-GlcNAc transferase

アセチル化することが明らかになった．さらに，TacT(OGT) を過剰発現し，分子間の結合と O-GlcNAc 付

は Gly-tRNAGly のみにみられる，U73 と G71 を特異的

加，タンパク安定化を検証した．

に認識するとともに，小さいアミノアシル部位を認識【結果】することが明らかになった．したがって，TacT は Gly-CREBH KO マウスに HFruD を負荷すると生活習慣

tRNAGly 特異的なアセチル化酵素であることが明らかに病改善ホルモン FGF21 の血中，肝臓 mRNA レベルのなった．

低下，血中肝炎マーカーの増加に伴い，脂肪肝，肝炎の病態の増悪化が認められた．HFruD で WT マウス

2557

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成の肝臓では CREBH mRNA に変化しなかったが，タンパク量が著しく増加した．糖代謝に関わる ChREBP は
HFruD で増加するが，CREBH KO マウスでは ChREBP
mRNA，タンパクの低下に伴い，その標的遺伝子の発イノシトールリン脂質キナーゼによる膜接触部位を介した脂質交換輸送制御機構
中津史（新潟大学医学部）

現低下が観察された．CREBH KO マウスでは線維化マーカーの発現が増加した．
HFruD で肝臓内 O-GlcNAc 量が増加するが，CREBH【目的】

KO マウスではその増加が抑制された．このマウスでは近年，細胞膜やオルガネラは部分的に接して「メンO-GlcNAc の生合成経路（ヘキソサミン合成経路）を構

ブレンコンタクト」と呼ばれる領域を形成することが成するいくつかの酵素の発現が低下した．ChREBP は

わかってきた．そしてメンブレンコンタクトは，脂質OGT により O-GlcNAc が付加されることで，安定化さの輸送の場として機能することが明らかになりつつあれ る．CREBH KO マ ウ ス で は ChREBP の O-GlcNAc

る．申請者は，小胞体―細胞膜間のメンブレンコンタク

付加も抑制されることもタンパク量を減少させた原トにおいてオキシステロール結合タンパク質ファミリー

因 の 一 つ で あ っ た． 同 様 に CREBH も OGT に よ り（ORPs）により脂質が交換輸送されること，そしてそのO-GlcNAc が 付 加 さ れ る こ と で， タ ン パ ク 分 解 酵 素

仕組みとしてイノシトールリン脂質 PI4P の濃度勾配が(HRD1) による分解を回避し，安定化されることを見出

鍵を握っていることを明らかにした．本研究では，このした．

PI4P 駆動型の脂質交換輸送が小胞体－エンドソーム間

HFruD による肝臓 FGF21 の発現誘導は CREBH との脂質交換輸送も制御している可能性を検証し，PI4 キ

ChREBP により制御されており，CREBH KO マウスでナーゼによる小胞体―エンドソーム膜接触部位での脂質は FGF21 プロモーターにリクルートされる ChREBP,

交換輸送の制御機構の解明を目的とする．

Pol II， 転 写 活 性 化 の マ ー カ ー に 関 連 す る ヒ ス ト ン【方法】

マーカーである H3K9ac が低下していた．CREBH が

PI4 キナーゼ PI4K2a 及び脂質交換輸送タンパク質

CHREBP を制御することで FGF21 発現を制御すること

ORPs の局在や動態は，共焦点レーザー顕微鏡によるを見出した．

イメージング手法により解析した．ORP10 のリガンド【考察】

は，ORP10 の脂質輸送ドメインを精製し，質量分析に本研究で CREBH タンパクが糖鎖修飾を受けることより決定した．ORP10 の脂質交換輸送活性は，in vitro

で，タンパク分解系を回避し，安定化され，活性化され脂質交換輸送アッセイ系を用いて検証した．PI4 キナー

ることを見出した．さらに，そのプロセスに関わる糖ゼや ORP10 の細胞機能は，FKBP/FRB を用いたラパ質（O-GlcNAc）の合成は CREBH が制御することを新マイシン依存的２量体化法による機能獲得法，およびたに見出した．これらメカニズムを介し，CREBH が糖

CRISPR/Cas9 によるノックアウト機能喪失法により解質代謝を制御するため，CREBH KO マウスでは HFruD

析した．

負荷時の糖脂質代謝に異常を来す。そのため、CREBH【結果】の欠損は脂肪肝・肝炎を助長することを明らかにした．

イメージング解析から，ORP10 は PI4K2a によるエ本研究では糖質摂取における栄養代謝の恒常性維持におンドソーム PI4P 合成に依存して小胞体－エンドソー

いける CREBH の新たな重要性を明らかにした．

ムコンタクトに局在した．生化学的解析から，ORP10【文献】

は PI4P をリガンドとすること，また in vitro において

Nakagawa, Y. & Shimano, H.: CREBH Regulates Sys-

PI4P とホスファチジルセリン（PS）を交換輸送する活

temic Glucose and Lipid Metabolism. Int J Mol Sci,

性を有することが判明した．培養細胞のライブイメー

19(5): 1396. (2018).

ジング解析から，ORP10 は小胞体―エンドソームコン
タクトにおける PI4P/PS 交換輸送を介してエンドソー

26
58

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

ムへ PS を供給する役割を担うこと，そしてこれにより【方法及び結果】

EHD1 をエンドソームへリクルートし，エンドソームの① Pin1 による肝星細胞活性化への影響

膜分裂を制御することが明らかになった１）．

Pin1 が TGF 刺激時の細胞外マトリクスの発現に影響するかについて肝星細胞 LX-2 細胞を用いて検討した．

【考察】
小胞体―エンドソーム間の膜接触部位においても PI4

TGF 刺激を行うと，期待通り Collagen1a1/2 や星細胞

キナーゼに依存した脂質交換輸送が作動していたことか活性化マーカー Smooth Muscle actin の発現量が顕著

ら，PI4P 駆動型脂質交換輸送システムが哺乳類細胞にに増加した．一方，siRNA で Pin1 をノックダウンする

備わる普遍的な脂質輸送機構の一つであることが証明さとこれらの発現は，mRNA 及び蛋白レベルにおいて顕れた．また，ORP10 が脂質交換輸送を介して細胞内膜著に抑制された．以上の結果より，Pin1 は細胞外マト輸送を制御していることが判明し，PI4P 駆動型脂質交リクスの発現誘導に重要であることが明らかとなった．

換輸送システムが制御する生命現象が明らかになったこ② Pin1 阻害剤による細胞外マトリクス発現抑制の検討とは，基礎・医学応用の観点から大きな意義を有する．

次に，Pin1 阻害剤が同様の効果をもたらすかについ【文献】て検討した．Pin1 阻害剤として，EGCG, ATRA, API-1

１）Kawasaki et al .: PI4P/PS countertransport byを用いて TGF 刺激後の細胞外マトリクスの変化につい

ORP10 at ER-endosome membrane contact sitesて mRNA と蛋白量の測定を行った．その結果，いずれregulates endosome ﬁssion. J. Cell Biol. 221, 2022.

の阻害剤も細胞外マトリクスの発現を抑制する効果が認められた．
③ TGF 刺 激 に よ り，Smad シ グ ナ ル が 活 性 化 す る こ

プロリン異性化酵素 Pin1 による組織線維化制御機構の解明
中津と が 知 ら れ て い る． そ こ で，Pin1 が Smad family と結 合 す る か に つ い て 検 討 し た． そ の 結 果，Pin1 は，Smad2/3/4 と結合することが明らかとなった．

祐介④ Pin1 を介した Smad シグナルへの影響を検討したと（広島大学大学院医系科学研究科）

ころ，Smad3 のリン酸化や局在性には影響を与えなかったが，転写活性は Pin1 ノックダウンにより減弱した．

【目的】⑤最近，Hippo pathway の主要因子である YAP/TAZ

近年，非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）の患者数

が Smad3 と結合し，その転写活性を増加させることがは増加の一途をたどっている．NASH は，肝癌へと移報告されている．そこで，Pin1 がこれらの結合に影響行することがあるため，その発症メカニズムの解明及びするかを検討したところ，Pin1 は Smad3-YAP の複合治療薬の開発は喫緊の課題である．

体には影響を与えなかったが，Smad3-TAZ の複合体形我々が着目しているプロリン異性化酵素 Pin1 は，標的蛋白のプロリンの cis-trans 異性化を行うことによ成を促進することが明らかとなった．
【考察】り，その機能を調節しているユニークな酵素である．興上記の結果より，Pin1 は，Smad3-TAZ 複合体形成

味深いことに NASH モデルマウスの肝臓では，Pin1 のを促進することで肝星細胞の活性化に寄与にしていると発現量が顕著に増加しており，また Pin1 null マウスは考えられた．

NASH 発症を顕著に抑制する（J. Biol. Chem., 2012）．
しかしながら，その詳細なメカニズムは明らかにされていなかった．今回，肝線維化に重要な役割を果たしている肝星細胞における Pin1 の役割を明らかにすることを目的に研究を行った．

27
59

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成【考察】
炎症増進により感染症を重篤化させるリン酸化酵素の同定
原

以上の結果から，インフラマソーム応答に必要なリン酸化酵素を阻害すると感染病態が改善することから，有英樹

効な治療手段が限られる薬剤耐性菌などへの臨床応用が（旭川医科大学医学部）

期待される．
以上のような研究の進展に大いなる援助をいただいた【目的】

公益財団法人日本応用酵素協会に心より感謝申し上げま

病原体が感染するとインフラマソームとよばれる炎症す．

応答が引き起こされる．
インフラマソームの構成分子は，【文献】

NLRP3 や AIM2 などの細胞内受容体，アダプター分子１）Hara, H. et al .: The NLRP6 inflammasome

ASC，タンパク分解酵素カスパーゼ１であり，インフラ

recognizes lipoteichoic acid and regulates

マソームが活性化すると炎症性サイトカインである IL-

Gram-positive pathogen infection. Cell. 175,

1β や IL-18 が産生される．我々は，細菌感染において1651-1664, 2018.

インフラマソーム応答が感染病態を重症化させることを見出した１）．また，インフラマソームの活性化にはリン酸化経路の活性化が必須であることを突き止めている．
そこで本研究では，インフラマソーム炎症の増進に関わ

脱ユビキチン化酵素による骨格筋量制御機構の解明と筋萎縮治療への応用
常陸るリン酸化酵素の同定を行った．

圭介（藤田医科大学）【方法・結果】
ASC のリン酸化に関わる酵素をデータベースで絞り込み Kinase A がヒットしたことから，Kinase A と【目的】

ASC を反応させ質量解析を行った．その結果，ASC の筋萎縮は，高齢者や患者の生存率や生活の質を低下

３つのアミノ酸が Kinase A によってリン酸化を受けるさせる主要因であるが，筋萎縮に対する安全で有効なことが判明した．次に，同リン酸化がインフラマソー

治療法は未だ存在していない．我々は脱ユビキチン化酵

ム応答に影響するのか調べるために，同アミノ酸変異

素 Otud1 に非常に強い骨格筋量の増加作用があること

ASC を発現するマクロファージを作製し AIM2 リガンを見出した．本研究では，Otud1 による筋肥大効果をドで刺激した．その結果，92 番目のセリンを変異させ検証することで，Otud1 を利用したヒトの筋萎縮に対た場合にのみ IL-1β 産生が減弱した．次に，黄色ブドウ

する新たな治療法の開発基盤を構築することを目的とす

球菌をマクロファージに感染させ Kinase A 阻害剤を作る．

用させたところ，IL-1β 産生が顕著に減少した．また，【方法】

CRISPR/Cas9 ゲノム編集技術で Kinase Ａ欠損マクロT2A 配列を利用して，マウス Otud1 のコード配列直ファージを作製したところ，同様の結果が得られた．さ下に EGFP を発現するコンストラクトを作製した．こらに，抗菌薬の効かない薬剤耐性黄色ブドウ球菌をマのコンストラクトを元にアデノ随伴ウイルス (AAV9) をウスに感染させ，ASC のリン酸化を抑制するために Ki-作製した．ヒト初代骨格筋細胞は，過去の報告１） に基nase A 阻害剤を投与し治療効果を検証した．薬剤耐性

づいて培養を行い筋管細胞へと分化誘導処理を行った．

黄色ブドウ球菌をマウスに感染させ，ピペラシリンを投

5.0 ╳1010gc 量の AAV を筋管細胞へと感染させた．処

与したところ治療効果が認めらなかったが，Kinase A

理から 48 時間後に細胞を固定し，筋ミオシンと GFP阻害剤を投与したマウス群においては IL-1β や IL-18 の抗体を用いて免疫染色を行い筋管細胞のサイズを計測し産生が減少し，それに応じて臓器内菌数も減少した．

た．6.0╳1010gc 量の AAV を８週齢の C57BL/6J マウスの前脛骨筋へと注入した．投与から 21 日後に前脛骨2860

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

筋を単離し筋重量を測定した．前脛骨筋の切片を作製【文献】

しラミニンや GFP などの抗体を用いて免疫染色を行い，

１）Kusano,T., Nakatani,M., Ishiguro,N., Ohno,K.,

筋線維の面積を測定した．

Yamamoto,N., Morita,M., Yamada,H., Uezumi,【結果】

A. & Tsuchida, K.: Desloratadine inhibits het-

ヒト筋 管 細 胞のサイズは，GFP-AAV 感 染 群が 29.9

erotopic ossiﬁcation by suppression of BMP2-±3.52μm に 対 し て，Otud1-AAV で は 37.5±0.78μSmad1/5/8 signaling. J . Orthop . Res . 2021,

m であり Otud1 による筋肥大効果が観察された ( p＝39(6): 1297-1304.

0.0216)． 前 脛 骨 筋 の 重 量 は，GFP-AAV 感 染 群 で は47.5±0.84 mg に 対 し，Otud1-AAV で は 43.8±3.49
mg と Otud1 導入により筋量が減少した（ p＝0.0312）．
筋線維の断面積は，GFP-AAV 感染群が 1111.0±140.2
μm2 に対し，
Otud1-AAV が 1043.8±52.0μm2 と変化（ pRNA 編集技術のためのオフターゲット結合評価法
の開発
藤田

敏次
（弘前大学大学院医学研究科）＝0.2971）は認められなかった．
【考察】
ヒト骨格筋細胞においても Otud1 で筋肥大を誘導で【目的】

きることが明らかとなった．一方で，マウス骨格筋ではゲノムから転写される RNA は，mRNA として翻訳

Otud1 は筋重量の低下をもたらした．筋線維のサイズに利用されるものに加え，ノンコーディング RNA やマ自体には変化は認められないため，筋線維以外の細胞にイクロ RNA など機能性分子として作用するものが数多

Otud1 が作用している可能性が考えられる．

く知られている．細胞内 RNA の配列・修飾・機能・局在などを人為的に操作することができれば，翻訳制御
や機能制御，塩基配列置換による疾患発症制御が可能となる．近年，配列特異的に RNA を認識・切断できる
CRISPR/Cas13 が報告され，翻訳制御や機能制御が可能となった．さらに，RNA 切断活性欠損変異体である
dead Cas13 (dCas13) に ADAR 蛋白質を融合させておくことで，標的 RNA の配列変換を行うことができる．
CRISPR/Cas13 (dCas13) のこれら RNA 編集への応用には，標的 RNA 配列への特異的結合が重要である．そこで本研究では，組換え CRISPR/dCas13 分子を用いる
ことで，標的 RNA 配列への特異的結合およびオフター
ゲット結合を試験管内で評価できる技術を開発する．
【方法】
近年，我々は，精製 RNA を鋳型とした試験管内逆転
写反応において，組換え CRISPR/dCas13 分子が逆転写
酵素の伸長を阻害する阻害分子として機能することを見（Ａ）AAV-GFP と AAV-Otud1 を 導 入 し た ヒ ト 骨格筋細胞．GFP 抗体による免疫染色図．
（Ｂ）AAV-GFP と AAV-Otud1 を 導 入 し た マ ウ ス
前脛骨筋の断面図．GFP とラミニン抗体による免疫染色図．

１）．本研究では，逆転写酵素の伸長停止出した（図１）

部位を次世代シーケンス解析（NGS 解析）で同定することで，CRISPR/dCas13 分子の標的 RNA 配列への特異的結合およびオフターゲット結合を評価できる技術の開発を進めた．

29
61

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

scription by recombinant CRISPR/dCas13a ribonucleoprotein complexes in vitro, Biol. Methods

Protoc., 6, bpab009 (2021).
【謝辞】
本研究を遂行するにあたり，多大なるご支援を賜りました公益財団法人日本応用酵素協会に深く感謝いたします．

リン酸化・脱リン酸化酵素による小胞体出芽部位
ER exit site の崩壊と再形成の分子機構前田深春（秋田大学大学院医学系研究科）【目的】
インスリンやコラーゲンなど生体分子のおよそ 3 割
は細胞外に分泌されて機能する．これらのタンパク質は小胞体で翻訳された後，小胞体上の特殊な領域である
ER exit site において形成される COPII 小胞に詰め込ま
図１

CRISPR/ ｄ Cas13 による逆転写反応阻害
およびその応用

れ，ゴルジ体へ輸送される．ER exit site は通常，細胞あたり数百個存在するが，哺乳細胞では栄養状態や小胞（Ａ）CRISPR/dCas13 による逆転写反応阻害および PCR による阻害評価．

体ストレス等に応じて ER exit site の数や大きさを変化（Ｂ）本技術の検証実験．標的配列特異的な組換え
dCas13/gRNA 分子添加時に，逆転写反応が阻害された．

いることが最近明らかになってきた．また，この制御のさせることで，小胞体からの分泌量を積極的に調節して破綻は，がんや神経変性疾患などと密接に関与する可能性が示唆されている．しかしながら ER exit site が小胞【結果および考察】
本研究ではモデル系として，EGFR mRNA などを体上のどこに，どのような分子メカニズムで形成されるかは不明である．

標的 RNA として研究を進めた．ヒト細胞株から RNA

我々はこれまで，ER exit site に局在する膜タンパクを精製し，調製した RNA と標的 RNA 配列に対応した

質 TANGO1 が Sec16 と結合することを見出し，この結

dCas13/gRNA 複合体を試験管内で混合した後，逆転写

合が ER exit site の形成に必要であることを明らかにし反応を行った．市販のライブラリーの調整キットを組みてきた (Maeda et al., JCB, 2017)．さらに，TANGO1

合わせることで，NGS 解析用の cDNA ライブラリーのはカゼインキナーゼ 1δ (CK1δ) によってリン酸化され調整に成功した．現在，調整した cDNA ライブラリー

ること，プロテインホスファターゼ１（PP1）によってを NGS 解析することで，cDNA の伸長停止箇所（標的脱リン酸化されることを見出し，細胞分裂期において配列および非特異的結合領域）の解析を進めている．

TANGO1 のリン酸化が亢進することで Sec16 との結合

【文献】

親和性が低下し，一時的な ER exit site の崩壊と小胞体

１）Fujita, T., Nagata, S., Yuno, M. & Hodaka, F.:からの分泌停止が生じることを明らかにした（Maeda

Sequence-specific inhibition of reverse tran-

et al., Dev. Cell, 2020）．以上の結果から TANGO1 と30
62

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

Sec16 が ER exit site 形成の起点として機能することが明らかとなった．
さらに我々は，TANGO1 だけでなく Sec16 もリン酸化修飾を受けることを見出している．
そこで本研究では，
Sec16 の新規リン酸化・脱リン酸化酵素を明らかにすることを目的として解析を行った．
【方法】
ま ず Sec16 の 新 規 相 互 作 用 因 子 を 探 索 す る た め，
Sec16 の免疫沈降サンプルに対して LC-MS/MS を用いたショットガン解析を行った．次に，解析結果を既存のタンパク質間相互作用データベースや細胞内局在データ

図1

インテインによる二重特異性抗体の作製

ベースと重ね合わせて，より確度の高い相互作用因子を絞り込んだ．

配向性や結合親和力の違いによって，二重特異性抗体と【結果・考察】しての効果が異なってくる．このため，同じ抗原を標的

ショットガン解析の結果，Sec16 の内在免疫沈降サンとしているいくつかの抗体で組み合わせを変更して効果

プルより数千点のタンパク質が検出された．この結果をを検討する必要があり，それぞれの構成を遺伝子工学的

既存のデータベースと重ね合わせ，重複の多い順にタンに作り出す必要があるため時間と手間が大きかった．

パク質をスコアリングした．TANGO1 を含め，Sec16

本研究で対象となる酵素，インテインはもともと生体との相互作用が報告されている因子はすべてハイスコア

内で自身のポリペプチドを再連結させる酵素として見であったことから，この解析方法が妥当であることがわ出された．これは RNA での著名な自己切断反応である

かった．さらに，ハイスコアの因子からキナーゼ活性がRNA スプライシングと対比され，タンパク質スプライ報告されているものを数十種類まで絞り込むことに成功

シングと呼ばれる．インテインによってポリペプチドをした．今後は，これらの因子を個別に解析することで，結合させることができるため，これまでタンパク質の部

Sec16 のリン酸化修飾を通した ER exit site の制御メカ

分特異的同位体標識や有機化学的に固相合成したペプチニズムを明らかにしていきたい．

ドとの結合など幅広く応用されてきている．
本研究では，二種類の抗体を組み合わせて二重特異性
抗体を作り出す際に，インテインを用いて，環状構造な

蛋白質連結酵素による次世代抗体医薬品構築真壁幸樹

どで配座を固定した構造を実現する．高い効率で蛋白質
ライゲーションさせるため，インテインのタンパク質工
学的な改変を行う．現在のインテイン活性を凌駕する変（山形大学大学院理工学研究科）

異体は様々な応用へ重要である．抗体はインテインのＮ末端断片とＣ末端断片に結合させて作り出す（スプリッ【目的】
二重特異性抗体は二種類の抗原認識部位を一つのタン

トインテイン）．
【方法】

パク質分子上に持つために，二種類の抗原を空間的に近二重特異性抗体として融合させる抗体断片に一本鎖接させることが出来る．例えば癌細胞上の抗原と免疫細Fv 抗体（scFv）を用いる．我々が以前に VHH を用い胞上の抗原をそれぞれ認識する抗体から二重特異性抗体て成功させた方法に基づいて分子を構築した１）．インテを作製すると，癌細胞特異的に免疫細胞が集積し，癌のインはスプリットインテインによって，二重特異性抗体

治療薬として用いることが出来る．
二重特異性抗体では，のＮ末端側とＣ末端側に分離インテインに融合させる．

たとえ同じ抗原に対する抗体を用いても，結合する際のこのインテインの活性が二重特異性抗体の作製のボトル

31
63

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

positioning of antigen-binding sites., Biochem

Biophys Res Commun., 523(1): 72-77., 2020.

微生物由来非タンパク性アミノ酸の生合成研究と臨床診断用酵素への応用展開
丸山

千登勢（福井県立大学大学院生物資源学研究科）
図２

両端に分離インテインを融合させたタンデム
scFv の動物細胞による発現と Ni-NTA カラムによる精製．
①カラム前，②素通り，③洗浄，④溶出画分【目的】
非タンパク性アミノ酸（NPAA）は，その化学構造と物性に起因するユニークな生理活性から，ペプチド創薬への応用が期待されている．さらに NPAA 生合成に関わる酵素は，その生合成前駆体であるアミノ酸に対してネックとなるため，反応条件を検討し，短時間で反応す特徴的かつ特異的な修飾反応を触媒することから，様々る変異を見つけ出す．本研究では溶媒条件で連結反応がな疾病に起因する血中アミノ酸濃度の変化を迅速定量

起こる分離インテインを用いた．この変異体をコードしする臨床診断用酵素への応用も期待されている．そこでたプラスミドを動物細胞に導入し，発現蛋白質を精製後

我々は，NPAA および新規アミノ酸修飾酵素の新たなに末端の連結反応を行った．これによって配座が固定さ探索資源として，微生物が生産する NPAA 含有天然有

れた二重特異性抗体を作り出した．

機化合物に着目した．

【結果】

【方法】

動物細胞に構築したプラスミドをトランスフェクショ

3 つの NPAA から構成されるペプチド化合物 resor-

ンし，７日間振盪培養を行った．培地上清画分を Ni-

mycin (RM)１,２）は，Streptomyces 属放線菌が生産する

NTA カラムによって精製した（図２）．得られた目的蛋

植物病原真菌特異的な抗生物質である．構成成分の一白質を溶媒条件を変化させることで，連結反応を誘導し，つである β-hLys は，有機合成品が医薬品の合成原料や環状に連結されたタンデム scFv を作製した．連結時のアミノ酸アナログとして市販されているが，天然からリンカー長を変化させたクローンも作製し，連結効率がは唯一，RM の化学構造の中にのみ見つかっている．こリンカー長の影響を受けることを見出した．

れまでに β-hLys 構造の生合成に関する研究報告はな【考察】

く，β-hLys は新規経路によって生合成される可能性が環状に連結させた二重特異性 scFv（タンデム scFv）

示唆された．また RM の構成成分である Phe 誘導体は，の作製に成功し，その連結効率にはドメイン間のリン

Phe のクロル化や水酸化，脱水素化を経て生合成される

カー長が影響することを見出した．これはリンカーの長と考えられ，これらの生合成酵素は血中 Phe 濃度の診さが，分離インテインが複合体を形成に重要であること

断用酵素への応用が期待される．そこで我々は，RM 生を示唆している．

合成遺伝子群の解析による新規アミノ酸修飾酵素の探索

【文献】

を試みた．

１）Hemmi, S., Asano, R., Kimura, K., Umetsu,

【結果】

32
64

M., Nakanishi, T., Kumagai, I. & Makabe, K.*:

これまでの種々解析から同定した RM 生合成遺伝子

Construction of a circularly connected VHH

群（RM 遺伝子群）について遺伝子破壊実験を試みたと

bispeciﬁc antibody (cyclobody) for the desirable

ころ，RM 遺伝子群が有する 19 の遺伝子のうち，７つ

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成の遺伝子が β-hLys の生合成に関与していると予想された．７つの遺伝子のうち一つは Arg 代謝に関与する酵
素のホモログであったことから，[13C6]-L-Arg の添加培

気孔閉口応答の制御にかかわる Ca ２＋センサータ
ンパク質キナーゼの機能解析
宗正

養実験を行ったところ，生産された β-hLys にラベル体

晋太郎（岡山大学）の取込みが観察された．また RM 構造内の Phe 誘導体
は 2 つの水酸基を有しているが，Phe の水酸化に関わる酵素遺伝子は１つしか存在しておらず，その組換え酵【目的】

素を用いた in vitro 反応の結果，Phe を基質に２箇所の高等植物の葉の表皮には，一対の孔辺細胞からなる

水酸化反応を触媒した．したがって本酵素は，１つの酵

気孔と呼ばれる通気口が存在する．気孔は，光合成に素で２度の水酸化反応を触媒する新規 Phe 水酸化酵素

必要な二酸化炭素の吸収や，蒸散による水蒸気放出を調であることが判明した．

節する重要な場所である．気孔の閉鎖応答を制御する孔【考察】

辺細胞シグナル伝達において，孔辺細胞の細胞質遊離カ[13C6]-L-Arg の添加培養にて Arg が β-hLys に取り込

ルシウムイオン（[Ca2＋]cyt）がセカンドメッセンジャー

まれたことから，β-hLys の出発物質は Arg であることとして機能することが明らかとなっている．しかし孔辺が判明し，予想通り，新規生合成機構により生合成され細胞 [Ca2＋]cyt の感知を担う分子機構は完全に解明されることが強く示唆された．また本研究で見出した Pheていない．これまでに我々の研究グループは，モデル植

水酸化酵素は，１つの基質に対して２度の水酸化反応を物であるシロイヌナズナを用いた研究により，孔辺細胞

触媒することから，これまでの Phe 定量用酵素と比較[Ca2＋]cyt 感知にかかわる因子を同定してきた（Brandt,

して，２倍の酵素活性を示す高感度な Phe 診断用酵素

Munemasa et al., 2015）．
本研究では，
孔辺細胞 [Ca2＋]cyt

としての開発が期待された．

の感知にかかわる新規因子の候補である GCCK（Guard

１）M, Igarashi., N, Kinoshita., T, Ikeda., M, Kam-

Cell Ca2＋-dependent Kinase）に着目し，その機能解

eda., M, Hamada. & T, Takeuchi.: Resormycin,

析を行った．

a Novel Herbicidal and Antifungal Antibiotic【方法】

Produced by a Strain of Streptomyces platensis,

GCCK の活性制御機構を明らかにするため，大腸菌

I. Taxonomy, Production, Isolation, and Biologi-を用いた GCCK 発現系の構築を行った．また植物体に

cal Properties. 1997. J. Antibiot (Tokyo), 50(12):おける GCCK の生理機能を明らかにするため，GCCK1020-1025.

遺伝子破壊植物体の表現型解析を行った．また GCCK２）M, Igarashi., H, Nakamura., H, Naganawa. &との機能重複が想定される GCCK ホモログ遺伝子も破T, Takeuchi.: Resormycin, a Novel Herbicidal

壊した GCCK 多重遺伝子破壊植物体を作成し，その表

and Antifungal Antibiotic Produced by a Strain

現型解析を行った．

of Streptomyces platensis, II. Structure Elucida-【結果】tion of Resormycin. 1997. J. Antibiot (Tokyo),50(12): 1026-1031.

様 々 な 大 腸 菌 タ ン パ ク 質 発 現 系 を 試 験 し た が，invitro キナーゼアッセイに利用可能な GCCK リコンビナ
ントタンパク質の発現系の構築は不首尾に終わった．そのため現在，無細胞発現系や動物・植物細胞発現系を用いた GCCK リコンビナントタンパク質の調製を進めている．
遺伝子破壊植物体の気孔表現型解析により，GCCKとの機能重複が疑われるホモログ遺伝子をいくつか同定した．[Ca2＋]cyt と同様に，活性酸素種（Reactive33
65

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

Oxygen Species: ROS）も気孔閉鎖応答を媒介する孔定に成功した．SQS は２分子のファルネシル二リン酸

辺細胞シグナル伝達においてセカンドメッセンジャーと（FPP）からスクアレンを合成する酵素である．そこでして機能する．細胞内 ROS 検出試薬である H2DCF-DA

本研究では，持続可能なスクアレン生産を達成するためを用いた実験により，GCCK とそのホモログ遺伝子をに，高度好塩性古細菌 H. japonica を使って大量に生産破壊すると，孔辺細胞内の ROS 産生が抑制されること

させることを目的とした．

が明らかとなった．

【方法】

【考察】

１．H. japonica 由来 sqs 遺伝子高発現型プラスミドの本研究により，GCCK はそのホモログ遺伝子との間構築には機能重複が存在すること，また GCCK は，気孔H. japonica 由来 sqs 遺伝子を高度好塩性古細菌用発閉鎖応答を制御する孔辺細胞シグナル伝達において，現型プラスミドに挿入し，sqs 遺伝子高発現型プラスミ[Ca2＋]cyt に依存した ROS 産生に関与することが示唆さドを作製した．なお，その際 sqs 遺伝子プロモーター

れた．今後，GCCK タンパク質発現系を構築してそのは，H. japonica 内で働く強力なプロモーターに置換し活性制御機構を明らかにすることで，Ca2＋ による気孔た．発現型プラスミドを用いて H. japonica 野生株を形

開度調節機構の全容解明を進めていく．

質転換した．形質転換体よりテルペノイド類を抽出した【文献】

後 HPLC 分析に供し，スクアレンの生産量を調べた．

Brandt, B.*, Munemasa, S.*, Wang, C., Nguyen,

２．培養条件の検討

D., Yong, T., Yang, PG., Poretsky, E., Belknap, TF.,

H. japonica の培地の塩濃度を変化させ，種々の条件

Waadt, R., Alemán F. & Schroeder, JI.: Calcium

下で生育した菌体からテルペノイド類を抽出した後，上specificity signaling mechanisms in abscisic acid

述と同様にしてスクアレンの生産量を調べた．

signal transduction in Arabidopsis guard cells, eLife【結果および考察】(2015) 4: e03599.

１．H. japonica 由来 sqs 遺伝子の過剰発現によるスクアレン生産の向上

高度好塩性古細菌による持続可能なスクアレン生産
八波利恵

H. japonica において sqs 遺伝子を過剰発現させ，ス
クアレンを大量生産させることとした．野生株を sqs 遺伝子高発現型プラスミドを用いて形質転換し，形質転換（東京工業大学生命理工学院）

体のスクアレン生産量を調べた．その結果，形質転換体
は野生株に比してスクアレン生産量が 7.8 倍に向上して【目的】
スクアレンは炭素数 30（C30）の不飽和炭化水素であり，化粧品材料，工業用潤滑油として，またインフル

いた．これより，sqs 遺伝子の過剰発現は，スクアレンの増産につながることがわかった．
２．塩濃度変化によるスクアレン生産の向上

エンザワクチンのアジュバンドとしても使用されていスクアレン生産における H. japonica の最適な培養条

る 1,2)．一方，スクアレンから得られる C4, C5, C25,

件を検討するために，培地の塩濃度を変化させ，それぞC26 などの飽和炭化水素は，ガソリンやジェット燃料

れの条件下で生育した菌体が生産するスクアレンの量をなどへの利用が見出され 3)，その需要はますます拡大し調べた．その結果，本菌は 3.4 M の至適 NaCl 濃度よている．しかしながら，スクアレンは，絶滅危惧種であり低い塩濃度で培養した場合，スクアレン生産量は増加

る深海ザメから抽出されていることから，今後漁獲に規するものの，スクアレン誘導体を含めた生産量は大幅に制が入り，その生産の持続性が懸念されている．

低下することがわかった．今後は様々な温度において本申請者は，近年世界で初めて高度好塩性古細菌 Halo-

菌を培養し，その菌体のスクアレン生産量を調べ，スク

arcula japonica がスクアレンを生産することを見出し，アレン生産に最適な培養条件を決定する予定である．

生合成に関与するスクアレンシンターゼ（SQS）の同

34
66

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

【文献】

【結果】

1) Amarowicz, R.: Squalene: A natural antioxidant?,

１） 外 葉 PIP2 量 の 異 な る 細 胞 株 間 の 遺 伝 子 発 現 をEur. J. Lipid Sci. Technol. 111, 411 (2009).

RNA シークエンシングにより比較したが，候補の絞

2) Kopicová, Z. and Vavreinová, S.: Occurrence of

り込みには至らなかった．既知のリン脂質反転酵素のsqualene and cholesterol in various species of

遺伝子発現量を定量的 PCR により比較したところ，

Czech freshwater ﬁsh, Czech. J. Food Sci. 25, 195

４種の候補酵素に絞り込まれた．

(2007).

２）絞り込まれた候補酵素を外葉 PIP2 量の多い細胞株

3) Oya, S., Kanno,D., Watanabe, H., Tamura, M.,で発現抑制したところ，発現抑制により外葉 PIP2 量

Nakagawa, Y., and Tomishige, Keiichi.: Catalyticが減少する酵素１種が見出された．当該酵素をクロー

production of branched small alkanes from biohy-

ニングし，外葉 PIP2 量の少ない細胞株数種で過剰発

drocarbons, Chem. Sus. Chem. 8, 2472 (2015).

現したところ，１種の細胞株において外葉 PIP2 量が
増加した．
【考察】

細胞接着・遊走制御機に関わる細胞膜脂質反転酵素の解析
米田

当該酵素の発現抑制により外葉 PIP2 量の減少が認められたが，完全な消失にはいたらなかった．また過剰発

敦子

現実験も細胞によっては増加が観察されなかったことか（東京薬科大学）ら，当該酵素以外に増減に関わる因子の存在が考えられた．今後，当該酵素の細胞での局在の検討，細胞接着・【目的】
脂質２重層からなる細胞膜の外側（外葉）と細胞質遊走の解析を進めるとともに，さらなる制御因子の探索も進める．

側（内葉）では脂質組成が異なるが，アポトーシス時の【文献】

ホスファチジルセリンの外葉への露出のように一過的に

１）Yoneda, A., Kanemaru, K., Matsubara, A.,

反転し，重要な機能をなす例が知られている．最近我々

Takai, E., Shimozawa, M., Satow, R., Yamaguchi, H.,

は，内葉にのみ存在すると長年考えられてきたホスファ

Nakamura, Y., & Fukami, K.: Phosphatidylinositol

チジルイノシトール 4,5-二リン酸（PIP2）が細胞膜外

4,5-bisphosphate is localized in the plasma mem-

葉にも存在し，がん細胞の接着，遊走に働くことを報告

brane outer leaﬂet and regulates cell adhesion andした１）．本研究では，がん細胞の接着・遊走を制御する

motility, Biochem Biophys Res Commun. 527, 1050

PIP2 反転酵素を同定することで，外葉 PIP2 による新(2020).

規細胞接着・遊走様式の分子機構解明を目的とした．
【方法】
１）外葉 PIP2 量の異なる細胞株間の遺伝子発現を次世代 RNA シークエンシングと定量的 PCR により比較し，外葉 PIP2 量の多い細胞で発現が高く，少ない細超硫黄分子が関与する鉄硫黄クラスター組立機序の解明
和田啓（宮崎大学医学部）

胞で低いリン脂質反転酵素を探索した．
２）絞り込まれた候補酵素を外葉 PIP2 量の多い細胞で発現抑制し，外葉 PIP2 量を減少させる酵素を探索し【背景】

た．当該酵素をクローニングし，外葉 PIP2 量の少な

鉄硫黄（Fe-S）タンパク質は多様にしてかつ生物界い細胞で過剰発現し，外葉 PIP2 量が増加するか検討に普遍的に分布しており，呼吸，光合成，アミノ酸やした．

ビタミン生合成，遺伝子制御に至るまで生命活動の根幹に関わる反応を担っている．これらの機能を支えるコ

35
67

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

ファクターが Fe-S クラスターである．Fe-S クラスター

合体に結合した硫黄分子を定量した結果，一分子あたりは単純な構造だが，細胞内では多成分で構成される複雑

10 ～ 50 個という複数個の硫黄原子の結合が明らかになマシナリーが生合成を担う．その代表ある SUF マシ

なった．この硫黄結合型 SufB-SufC-SufD コア複合体をナリーは，オペロンにコードされる六種のタンパク質

用いてクライオ電子顕微鏡データを収集し，現在，構造（SufABCDSE）から構成され，SufS-SufE 複合体（硫黄解析を進めている．

の供給），SufB-SufC-SufD コア複合体（合成の足場）という多成分複合体と，単独の成分 SufA が協調的に機能する．
コア複合体の機能に必須な残基を探索したところ，

ユニークな巨大酵素ミステリンの病態機能解明
森戸

SufB サブユニット Cys405 および Cys254 が硫黄種の大介（昭和大学医学部）

受け取りに機能に必須であることを明らかにしたが，これらの残基はそれぞれ分子の両端に位置しており 25Å
以上離れていた．コア複合体の立体構造の詳細を分析したところ，これらの残基間を繋ぐように分子内部を貫通【目的】
ミステリンは４つの不活性型 ATP アーゼドメインとするトンネルが存在していることが分かった．

２つの活性型 ATP アーゼドメイン，２つのユビキチン【目的】

リガーゼドメインを持つ約 600 kDa のユニークな巨大

ごく最近，生体において硫黄原子が数珠状に連なった酵素である．脊索動物以上に保存され，ヒト・マウスで「超硫黄分子」と呼ばれる状態が存在し，様々なタンパ

はおおむねユビキタスな発現パターンを示す．ミステリ

ク質に一過的に結合していることが報告されている．現

ン・ユビキチンリガーゼドメイン周辺の変異によりヒト段階において超硫黄分子の生理的機能は未知であり，そ脳血管疾患もやもや病が引き起こされるが，そのメカニの立体構造を捉えた例も皆無に等しい．

ズムは明らかでない．

本研究では，緻密に制御された Fe-S クラスター合成

ミステリンは，細胞内においては脂肪貯蔵オルガネ

反応機構の全容を解き明かすことを目的とし，コア複合ラである脂肪滴に局在して，脂肪滴からリパーゼ ATGL体複合体内部の「トンネル構造」の生理機能を明らかにを取り去り，脂肪分解の抑制，脂肪滴の安定化を導く．

する．このトンネル構造は硫黄分子の輸送トンネルであ本研究では野生型ミステリンの脂肪滴局在・制御を指標

り，ここには硫黄分子が連なった “超硫黄分子” が充填として変異ミステリンの挙動を評価し，変異ミステリン

されることを予想している．

による細胞・個体障害の実態とメカニズムの解明を試み

【方法】

た．

それぞれの蛋白質複合体を発現・精製し，コア複合体【方法】

への硫黄転移反応を試験管内で進行させた．この際，硫ヒトおよびマウス培養細胞（HeLa, HEK293T, MEF

黄供与タンパク質（SufS および SufE）には精製用タグなど）に一過的もしくは安定的に野生型，疾患変異型，を導入することで，反応後の硫黄結合型コア複合体を分各種の酵素活性変異型ミステリンを発現させ，それぞれ離・精製した．得られた硫黄結合型コア複合体を用いて，の局在，機能について評価を行った．また分子・細胞レ

Ｘ線結晶構造解析（SPring-8/AMED BINDS）およびク

ベルでの結果に基づいて，ミステリンノックアウトマウ

ライオ電子顕微鏡解析（東北大学/AMED BINDS）を進ス，変異マウスの表現型解析を行った．

めた．

【結果】

【結果】

野生型ミステリンは脂肪滴に局在し，リパーゼ ATGL

SufS/SufE および SufB-SufC-SufD コア複合体を精製を排除して脂肪滴を安定化するが，加えて特異的に排除し，遊離システインを基質としたでデスルフィラーゼ反される複数の因子と，また排除されない複数の因子を新応によりコア複合体への硫黄充填反応を行った．コア複

たに同定した．これに対して一部の疾患変異体と一部の36
68

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

酵素活性変異体では，脂肪滴への局在・脂肪滴上での特異的な作用が失われていた．これら変異体の多くは細胞内に凝集様の構造を形成し，炎症反応を惹起した（未発表）．
また，これらの結果を踏まえてミステリンノックアウ
トマウス，変異マウスの表現型解析を行った．ノックア
ウトマウス，変異マウスそれぞれで生理的機能の欠失と病的機能の獲得に焦点をあてた解析を行い，一定の成果を得た（未発表）．
【考察】
野生型ミステリンの脂肪滴における機能の解析より，
ミステリンが複数の因子に作用することが分かった．この作用は特異的であり，何らかの特徴に基づいて特定のタンパク質グループを見分けて脂肪滴の挙動を制御するらしい．
このようなミステリンの局在と機能は一部の酵素活性変異体では失われており，それらの活性がミステリンの局在と機能に重要であることが分かった．また，もやもや病変異ミステリンが凝集様の構造を形成して炎症反応を惹起したことから，このような細胞障害性の凝集を起点とした細胞の機能変容がもやもや病発病の最も基底にあることが示唆された．
ミステリンノックアウトマウスと変異マウスを用いた解析から，ミステリンの代謝制御機能および変異による機能獲得について個体レベルでの知見を得ることができた．今後，本研究の進展によりもやもや病の発病・進展プロセスの解明が期待できる．

37
69

研究報告

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成
成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

肥満に伴う高インスリン血症における肝臓が及ぼす影響とその機序の探索
浅井

洋一郎

観察された．
４．高脂肪食群の類洞内皮細胞では，炎症や細胞外基質に関わる遺伝子群が上昇していることがわかった．
【考察】（東北大学病院糖尿病代謝科）

高脂肪食負荷マウスにおいて肝臓のインスリンクリア
ランスの低下を認め，インスリン分解に関わる遺伝子発【目的】

現，タンパク発現が低下していることがわかった．これ

肥満や脂肪肝では，肝臓におけるインスリン分解が低に加え，類洞内皮細胞の篩板孔の減少は肝臓におけるイ

下することが報告されている．そのため，高インスリン

ンスリン取り込み低下に関与することが報告されてお血症が助長され，肥満がさらに加速する悪循環が考えらり，高脂肪食群における肝臓インスリンクリアランス低れる．脂肪肝における肝臓でのインスリン分解低下の機下の原因の一つである可能性が考えられた．また，高脂序はこれまで十分に明らかとなっておらず，本研究では肪食群の類洞内皮細胞において発現が上昇していた炎症

肥満・脂肪肝モデルマウスを用いて，肝臓でのインスリや細胞外基質に関わる遺伝子群が，篩板孔減少に関与しン取り込み/分解が低下する機序の検討を行った．

ているか今後検証を行う予定である．肥満に伴う高イン【方法】

スリン血症における肝臓の役割を検討し，肥満を予防す

１．野生型マウスに対し高脂肪食の負荷を行い，肥満とるための基盤となる知見を得ることを目指して研究を進

脂肪肝を形成させ，ブドウ糖負荷試験における血中イ

める予定である．

ンスリンと血中 C ペプチドとのモル比の測定を行う
ことで肝臓のインスリンクリアランスを評価した．
２．肝臓におけるインスリン分解に関与するインス

免疫学的アプローチによる腎臓病に対する新規治療

リ ン 分 解 酵 素 (IDE: Insulin degrading enzyme),

戦略の開発

CEACAM1 (carcinoembryonic antigen-related cell

畔上達彦

adhesion molecule 1) について遺伝子発現，タンパ（慶應義塾大学保健管理センター）

ク発現を評価した．
３．走査型電子顕微鏡を用いて類洞内皮細胞の形態学的評価を行った．

【背景・目的】
慢性腎臓病（CKD）は末期腎不全や脳心血管疾患の４．MACS (Magnetic-activated cell sorting) を用いて発症・死亡のリスク因子で，患者数は本邦で 1330 万人，

特異的に類洞内皮細胞を単離し，RNA sequence に

世界で８億 5000 万人にのぼる．CKD，末期腎不全やそよる網羅的遺伝子解析を行った．

の合併症の治療に要する医療費は，医療保険財源を逼迫【結果】する一因となるが，CKD に対する根本的な治療法は確

１．高脂肪食群では肝臓のインスリンクリアランスが低立していない．したがって，CKD に対する新たな治療下することがわかった．
２．肝臓における IDE,DEACAM1 の遺伝子発現・タンパク発現は高脂肪食群で低下することがわかった．
３．高脂肪食群において類洞内皮細胞の篩板孔の減少が

170戦略を構築することは，患者個人の生命予後，健康寿命の観点だけでなく，医療経済的な側面からも，喫緊かつ重要な医療課題であると考えられる．
CKD を制御するために，本研究では，原因として最成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

多である糖尿病性腎臓病（DKD）と，進展機序の ﬁnal

２型糖尿病モデル

common pathway である間質線維化に着目した．特にDKD の発症・進展に深く関与する終末糖化産物受容体（RAGE） と， 線 維 化 の key factor で あ る connective
tissue growth factor (CTGF) を治療標的に選択した．
CKD は一般に，慢性の経過で進行するため治療が長期間に及ぶ．ワクチン接種により，標的分子の機能を阻害する抗体を誘導することができれば，少ない投薬回数

Azegami, T. et al.: Diabetes. 2021; 70(9): 2147-2158

で長期間にわたる治療効果を得ることが可能となり，医療費の軽減や治療アドヒアランスの向上に寄与することができる．
こ の よ う な 背景を踏まえ，本研究では，ア ン メ ッ

RAGE ワクチン接種群で，尿中アルブミン排泄は少なく，糸球体腫大・メサンギウム基質拡大が軽減され，
DKD に対する腎保護効果が示された．

ト・メディカル・ニーズの高い CKD に対して，RAGE,CTGF を標的とした治療ワクチンの開発に取り組み，腎臓領域における新たな治療戦略の構築を目指している．

２．CTGF ワクチンによる CKD 治療・予防効果の検討
慢性腎不全モデル【方法】
１．RAGE ワクチンによる DKD 治療・予防効果の検討
１型糖尿病モデルとして，DBA/2J マウスに膵 β 細胞毒性を持つストレプトゾトシンを投与する．また，２型糖尿病モデルとして，BKS. Cg+Leprdb/Leprdb マウス（db/db マウス）を利用する．DKD モデルマウスに，腎線維化モデル

RAGE ワクチンを隔週で計３回投与し，尿中アルブミン
排泄測定，光学顕微鏡解析（メサンギウム基質面積，糸球体径），電子顕微鏡解析（糸球体基底膜厚）を行う．
２．CTGF ワクチンによる CKD 治療・予防効果の検討
腎線維化モデルとして片側尿管結紮（UUO）マウスを，腎不全モデルとしてアデニン負荷マウスを利用する．マNakayama, T., Azegami, T.* (*corresponding author) et al.: Sci Rep. 2022; 12(1): 10933

ウスに，CTGF ワクチンを隔週で計３回投与し，両モデ

CTGF ワクチン接種群で，アデニン負荷マウスの腎機

ルマウスの腎間質線維化を光学顕微鏡で評価し，さらに能障害が軽減した．また，アデニン負荷マウス，UUO

アデニン負荷マウスの血清クレアチニン，尿中アルブミ

マウスにて，腎間質線維化が軽減され，CKD に対する

ン排泄を測定する．

腎保護効果が示された．

【結果】【考察・今後の展望】

１．RAGE ワクチンによる DKD 治療・予防効果の検討
１型糖尿病モデル

上記の検討結果にて，抗 RAGE ワクチン，抗 CTGF
ワクチンの腎保護効果が確認された．現在，特許を出願し，審査に向けて準備中である．最終的に臨床応用できるように，検討を進めていく方針である．また，今後の展開として「炎症」の制御を目的に，新たなワクチン開発（plasminogen activator inhibitor-1; PAI-1 を 標 的とするワクチン）に着手している．

271

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

百寿者の腸内細菌解析による長寿メカニズムの解明
新幸二

St22, St23 株では時間経過とともにテストステロンが減
少し，DHT，3β-アンドロスタンジオールが増加することが明らかになった（図２）．一方で Parabacteroides（慶應義塾大学医学部）

merdae は胆汁酸の代謝は効率よく行うことができるが，テストステロンへの活性は低いこと，また胆汁酸代
謝に関与する 5α-reductase を欠損した株では DHT が【目的】
昨年度より，百寿者の腸内細菌叢を解析することによ全く検出されないことから，胆汁酸代謝と同じ酵素がスり長寿に関与する腸内細菌種の同定とそのメカニズムのテロイドの変換に関与していることが明らかになった．

解明を行う．これまでの研究において，百寿者の便中にまた，興味深いことに Odoribacteraceae の 48 時間後は胆汁酸代謝に関与する細菌種が多く存在し，３位のヒの培養上清中のステロイドを測定すると，テストステロ

ドロキシ基がアルファからベータへと変換（異性化）さン，DHT，3β-アンドロスタンジオールともに検出限界

れたイソ体や５位の水素がベータからアルファへと変換

以下になっていることから，効率よくテストステロンをされたアロ体などの特殊な二次胆汁酸が多く存在してい

変換し，さらに β-アンドロスタンジオール以降も何かることが明らかになり，これらの２時胆汁酸が抗菌活性新規ステロイドへと代謝している可能性が考えられた．

を持ち病原性細菌の排除に関与していることを明らかに

そこで，次に培養上清中のノンターゲット解析を行してきた．
腸内細菌による胆汁酸の代謝経路の解明から，
ステロイド（テストステロン）も同様の代謝酵素によって代謝されると想定すると以下の図１のような経路が考えられた．そこで本年度は胆汁酸とよく似た構造をもつ
ステロイド代謝にも腸内細菌が関与しているのかを検討した．

図１

想定されるテストステロン代謝経路【方法】
百寿者由来の胆汁酸代謝に関与する腸内細菌株の培養中にステロイド化合物を添加し，時間経過を追って培養上清を回収し，残存しているステロイド化合物を四重極型質量分析計により定量する．また，新規代謝産物の同定のため Q-TOF 型の質量分析計を用いて網羅的に測定
を行う．
【結果】
胆汁酸の 5a-reductase 活性を持つ Parabacteroides

merdae １ 株，Odoribacteraceae ４株を用いて，テス
トステロンを培養液に加え培養上清中のテストステロ
ン，ジヒドロテストロン（DHT），3β-アンドロスタン
ジオールの量を測定した結果，Odoribacteraceae St21,

3
72

72

図２

培養上清中のステロイド化合物の量成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

い，どのようなステロイドが培地中に存在しているのか【背景】

を探索した．その結果，Odoribacteraceae の培養上清

我々はこれまでに軟骨細胞内 Ca2＋自発的変動を発見

中にはこれまで知られていない新規のステロイド化合

し，TRPM7 を制御分子として同定した．Trpm7 軟骨特物として，保持時間が 4.8, 6.2, 14.1, 15.68 分, m/z が異的欠損マウスが骨伸長障害を示したことから，生理416.2, 414.2, 301.2, 299.2 の 4 つの化合物が検出され的な骨伸長に軟骨細胞内 Ca2＋シグナルが重要であるこた（テストステロンは保持時間 14.4 分，m/z 289.2）．

とを着想した．そこで，骨伸長作用を有する CNP およ

現在，これら４つのステロイド化合物がどのような組成

び遺伝子欠損により骨形成不全症を来す TRIC-B に注目

式でどのような構造かを検証するため，
精密質量の測定，し，軟骨細胞内 Ca2＋制御と軟骨組織における生理的役分取して NMR 解析を行う計画で準備を行なっている．

割の解明を試みた．

【考察】

【方法】

長寿に関与する腸内細菌の役割のひとつに胆汁酸を代遺伝子欠損マウスの病理学的解析を実施した．生化学

謝し，産生された二次胆汁酸が抗菌活性を持つことを明的手法により細胞内シグナルを評価した．マウス胎児軟らかにした．一方で，これらの胆汁酸代謝に関与する細骨スライス試料を用いて Ca2＋イメージングを行った．

菌種がステロイド化合物も代謝し，新たなステロイドへ【結果】と変換していることが明らかになった．高齢になるとと

CNP 処置によって軟骨細胞内 Ca2＋シグナルが活性化

もにテストステロンやエストロゲンなどのステロイドホされることを明らかとした．複数のシグナル解析から，

ルモンが減少し，骨粗鬆症や筋量の低下につながってい

NPR2-PKG-BK チ ャ ネ ル-TRPM7 チ ャ ネ ル-CaMKII シ

ることが報告されている．そこで，今後腸内細菌によるグナル経路を同定した．Trpm7 欠損器官培養軟骨におステロイド代謝経路が明らかになれば，ステロイドホル

いては CNP の骨伸長効果が観察されなくなった．また，モンを介した長寿への関与について理解がすすむと考え

BK チャネル活性化薬により器官培養軟骨の伸長を促進られる．さらには，腸内細菌を用いた健康長寿へつなができることを見出した．以上の一連の解析から，CNP

る薬剤やサプリメントへの開発につながることが期待での骨伸長に関与する新たなシグナル経路を同定し，新きる．

たな創薬標的分子を示した（Miyazaki & Ichimura, et【文献】

al., eLife, 2022）．

１）Sato, Y.#, Atarashi, K.#, Plichta, DR.# et al.:Tric-b 欠損により軟骨組織中に死細胞が出現すること

Novel bile acid biosynthetic pathways areを見出した．Tric-b 欠損により細胞内にⅡ型コラーゲ

enriched in the microbiome of centenarians,

ンが蓄積することが明らかとなった．小胞体ストレス経

Nature, 599, 458-464, (2021) # Contributed

路の活性化が観察され，アポトーシスが惹起されている

equally.

ことがわかった．Tric-b 欠損により基底状態の細胞内Ca2＋が上昇しており，軟骨細胞内 Ca2＋ハンドリングに

軟骨細胞内 Ca

異常が生じていることが示唆された．

制御機構と生理機能の解明

2＋

市村

【考察】

敦彦

CNP が細胞内 Ca2＋を介して骨伸長を促進する新たな（京都大学大学院薬学研究科）

細胞内シグナル経路を同定した．CNP アナログが軟骨無形成症治療薬として承認されたばかりであることから，本研究成果は作用増強などに資する基盤的情報を提【目的】
本研究では，独自に樹立した軟骨細胞内 Ca2＋イメー

供することが期待される．TIRC-B 遺伝子変異は胎児骨ジング技術を用い，Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド (CNP)

格異形成症を引き起こすことが報告されており，さらな及び小胞体膜タンパク質 TRIC-B が軟骨細胞内 Ca 制

る解析による病態分子機序の解明が期待される．

2＋

御を通じて制御している生理機能の解明を目的とした．

473

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成【考察】
疾患特異的 iPS 細胞を用いた特発性拡張型心筋症の病態解明と治療化合物の探索
伊藤正道

LMNA の変異は Hutchison-Gilford 症候群に代表されるように老化の促進と関与するが，それらの詳細なメカニズムは明らかになっていない．本研究によって，ビ（東京大学大学院医学系研究科）

タミンＤによって LMNA 心筋症の治療できる可能性が示唆された．今後は他変異での有効性，Vitamin D を【背景】
特発性拡張型心筋症 (DCM) は心腔の拡大と心臓収縮用いた臨床試験を計画する．
【文献】

力の低下を特徴とする難治性の疾患である．DCM 患者

１）Sci Rep . 2018 3 1; 8(1): 1998.

の約 10% に認められるラミン遺伝子 (LMNA) 変異を持

２）JACC: Basic Transl Sci. 2019, 4(6), 670 80.

つ患者群は，既存薬物療法に反応せず，特に予後不良であり，治療法開発が急務である１）．
【目的】
LMNA 変異を有する DCM の病態を明らかにし，同疾患患者の新規治療薬候補化合物の同定を試みる．

脂肪肝再生過程で生じる肝細胞死様式選択メカニズ
ムの解明
稲葉

有香
（金沢大学新学術創成研究機構）【方法・結果】① LMNA 変異 DCM 患者由来 iPS 細胞株の樹立
LMNA 変異（p.Q353R）を持つ患者から iPS 細胞を肝細胞内脂肪蓄積は，その多寡により，異なる様式の樹立した．また，ゲノム編集により該当変異を修復し細胞死を誘導する．細胞死の様式として，非炎症性のア

たコントロール株を作成した．これらの株を心筋細胞

ポトーシスと，炎症性の溶解性細胞死が知られる．高度(iPSCM) に分化させ，解析を行った．

脂肪肝では溶解性細胞死が発症し，急性肝障害や非アル②化合物スクリーニング

コール性脂肪肝炎（NASH）の発症・増悪と密接に関与

iPSCM を 用 い，DNA 二 重 鎖 切 断 マ ー カ ー γH2A.X

する．本研究課題では，高度脂肪肝で誘導される溶解性の染色を行いその定量化を行ったところ，LMNA 変異

細胞死の様式の同定，及びその誘導メカニズムの解明を株では有意に高度に心筋細胞の DNA 損傷が蓄積してい行った．

ることが判明した．次に，DNA 損傷の蓄積軽減をリー

高脂肪食誘導性の中等度または高度脂肪肝マウスにドアウトとして化合物のスクリーニングを行った．その対し，70% 肝切除を行い，障害後の肝細胞死を検討し結果，ビタミン D2 がヒット化合物として抽出された．

た．肝細胞死は TUNEL 染色により，肝細胞死様式は

同化合物は心不全モデルマウスの心機能を改善した．

TUNEL/活性型 caspase3 (Cl-CASP3) 蛍光二重染色にLMNA 変異 iPSCM にビタミン D2 を投与して RNA-

より，評価した．高度脂肪肝切除後は，中等度脂肪肝とseq を行ったところ，投薬により DNA 修復に関与する

比較し，血中 ALT 値の高値，Cl-CASP3 陰性細胞死の酵素群の発現が誘導されていることが判明した．

増加，大規模な巣状細胞死の出現を呈した．また，溶③機序解明

解性細胞死の一つであるネクロプトーシスの制御因子

変異と DNA 損傷蓄積の関連を明らかにするため，変Ripk3 の発現と，ストレス誘導性転写因子 Atf3 の発現

異 LMNA タンパクに結合する分子のスクリーニングが誘導された．肝細胞 Ripk3 ノックダウンにより，高を行った．その結果，ビタミンＤ受容体 VDR と変異度脂肪肝で認められた巣状細胞死は消失し，血中 ALT

LMNA の結合性が，野生型 LMNA に比べて４倍程度高値も低下した．ATF3 欠損高度脂肪肝では，肝切除後のいことが明らかになった．変異 LMNA による VDR の巣状細胞死が消失し，Ripk3 発現誘導・Cl-CASP3 陰性

核膜辺縁へのトラップがビタミンＤによる修復酵素誘導

細胞死が減少し，血中 ALT 値も低下した．一方，ATF3を妨げている可能性が示唆された．

過剰発現は，Ripk3 発現を誘導し，Cl-CASP3 陰性細胞

574

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

死を増加した．ネクロプトーシス誘導における ATF3 のしている．しかし，APCC の遺伝子発現特性，特にその役割を検討する為，培養肝細胞への ATF3 過剰発現を発生についてはよくわかっていない．

行った．初代培養肝細胞では，ATF3 が Ripk3 プロモー

【目的】

ター領域に結合し，Ripk3 発現を誘導した．ネクロプトー

本研究では，APCC のトランスクリプトームを１細胞シス検出肝細胞株を用いた検討により，ATF3 過剰発現

単位で解析し，APCC の発生過程を分化経路推定解析にが，TNF 誘導性の肝細胞死をアポトーシスからネクロより明らかにすることを目的とした．

プトーシスへと変化させることを明らかにした．次に，【方法】

NASH における ATF3 依存性ネクロプトーシス誘導のヒト成人副腎２個のシングルセル RNA シークエンス

重要性を検討した．メチオニン・コリン欠損餌 (MCD)（scRNA-seq）を実施した．

誘導性マウス NASH では，肝 Atf3・Ripk3 発現が増強【結果】し た． 肝 ATF3 欠 損 は，MCD 負 荷 後 の Ripk3 発 現 を2928 個 の 副 腎 細 胞 の scRNA-seq デ ー タ を 取 得 し，抑制し，肝細胞死数を減少させ，肝炎症・線維化関連

教師なしクラスタリングとマーカー遺伝子の発現に基づ

遺伝子発現も低下させた．ヒト NASH 症例の肝生検組

いて 1765 個の副腎皮質細胞を同定した．副腎皮質細胞

織では，肝細胞障害・線維化の高度な症例で，ATF3・は６つのクラスターに分けられ，そのうち３つのクラス

RIPK3 陽性細胞数が増加した．

ター（923 細胞）が APCC/ZG 細胞で構成されていた．

高度脂肪肝で発症する溶解性細胞死が，RIPK3 依存さらにサブクラスタリングにより，APCC/ZG 細胞は的ネクロプトーシスであり，その誘導メカニズムとして

3 つのクラスター（クラスター C1, C2, C3）に分けら

ATF3 が中心的役割を担うことを明らかにした．本研究れ，最終的に APCC クラスター（C3）と ZG クラスター

成果は，ATF3 誘導性 RIPK3 発現が，急性・慢性肝障（C1）が確認された．クラスター C2 は，ZG から ZF へ

害の新規治療標的として有用である可能性を示唆していの移行細胞の可能性が推定された．RNA velocity 解析

る．

により，クラスタ ZG-クラスタ-C1 から APCC- クラス
タ-C3 への発生方向が推定された．scRNA-seq により，アルドステロン産生細胞群（APCC）の１細胞単位での遺伝子発現特性評価
馬越

多くの CYP11B2 陽性細胞が，コルチゾール産生には必須だがアルドステロン産生には必須でない CYP11B1 および/または CYP17A1 に陽性であることが判明した．

洋宜

【結論】
（九州大学病院）

本研究により APCC の遺伝子発現特性を１細胞単位で明らかにし，一部の ZG 細胞が APCC にリモデリン【背景】

グすることを示した１）．

副 腎 皮 質 は 球 状 層 (ZG: Zona Glomerulosa), 束 状層（ZF: Zona Fasciculata），網状層から構成される．

【文献】

アルドステロン合成酵素（CYP11B2）を強く発現す１）Iwahashi, N.*, Umakoshi, H.*, Seki, T., Gomez-

る ア ル ド ス テ ロ ン 産 生 細 胞 群（APCC: Aldosterone

Sanchez, CE., Mukai, K., Suematsu, M., Umeza-

Producing Cell Clusters）は，成人の副腎で頻繁にみ

wa, Y., Oya, M., Kosaka, T., Seki, M., Suzuki,

ら れ， ア ル ド ス テ ロ ン 産 生 腺 腫（APA: Aldosterone

Y., Horiuchi, Y., Ogawa, Y. & Nishimoto, K.:

Producing Adenoma） で も 検 出 さ れ る 体 細 胞 変 異"Characterization of aldosterone-producing cellを 保 有 し て い る．原発性アルドステロン症は， 主 にcluster (APCC) at single-cell resolution". J Clin

APA や 特 発 性 高 ア ル ド ス テ ロ ン 症（IHA: Idiopathic

Endocrinol Metab. 107(9): 2439-2448, 2022.

Hyperaldosteronism）に起因する．我々は，APCC が(*equal to 1st author).

IHA を引き起こしており，APA の前駆体であると推定

675

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

Bodywide transcriptome landscape inmouse models and human
浦山

恭次（国際電気通信基礎技術研究所 佐藤匠徳特別研究所）

ク質の生体内における機能解析を多臓器 RNAseq 解析，
scRNAseq 解析，生理学的及び組織学的実験によって行っている．
今後も，本データベースを活用・発展させることで新規臓器連関の解明，新規疾患マーカーや治療ターゲットの発見につながる研究を行っていく．

【目的】

【文献】

心筋梗塞を含む心臓病は未だに多くの先進国において

１）Murakoshi, M., Saiki, K., Urayama, K. & Sato, T.

も死因の上位を占めており，慢性心不全へと移行するとN.: An anthelmintic drug, pyrvinium pamoate,

生命を脅かす疾患にも関わらず，革新的な治療法がかけ

thwarts fibrosis and ameliorates myocardialている．そこで，既存の治療法の概念とは異なる新規治

contractile dysfunction in a mouse model療法を提案することを目的とし研究を行った．
その結果，

of myocardial infarction, PLoS One ., 8 ( 11 ) :細胞内代謝を制御することで抗がん作用があると報告さ

e79374 (2013)

れている回虫駆除薬（パモ酸ピルビニウム，PP）がマ

２）Kozawa, S.＊, Ueda, R.＊, Urayama, K.＊, Sagawa,

ウス心筋梗塞モデルにおいて線維化を抑制することを報F., Endo, S., Shiizaki, K., Kurosu, H., de Almei-

告した１）．また，心筋梗塞モデルにおいて，原発巣以外

da, G. M., Hasan, S. M., Nakazato, K., Ozaki,の多臓器で遺伝子発現変動が起きている事を見出し，多S., Yamashita, Y., Kuro-o, M. & Sato, T. N.: The

臓器連関ネットワーク解析へと研究を展開した．

body-wide transcriptome landscape of disease

従来の疾患研究は，少数の器官や組織に限定されていた．しかし，生体はより複雑な多臓器連関ネットワーク

models, iScience., 2, 238-268 (2018). ＊Theseauthors contributed equallyで成り立っており，多くの疾患は一つの器官だけではな
く，
複数の器官に影響を及ぼすことがわかってきている．
そこで，生体内には未だ発見されていない臓器間のクロストークが存在し，それらは個体レベルでの生理学的機能や疾患の発症において重要な役割を担っていると仮定

短眠を作る神経メカニズムの研究
大石陽（筑波大学医学医療系・国際統合睡眠医科学研究機構）

し，生体内における臓器間のクロストークを網羅的にあぶり出すことを目的として研究を行った．
【方法＆結果】【目的】
我々の睡眠覚醒はホメオスタシスやサーカディアンリ

本研究では，５つの異なる疾患モデルマウス（心筋梗

ズムなど様々な要因に制御される．経験的に明らかなよ塞，糖尿病，がん，老化促進，腎障害）における病態

うに，モチベーションも睡眠覚醒に影響を与えるが，そ発生から異なるタイムポイントで 13-23 臓器を回収しの脳内メカニズムはほぼ不明であった．我々は，腹側被RNAseq 解析を行い，各モデルの各臓器の異なるタイム

蓋野や側坐核がモチベーション行動において重要な役割

ポイントでの遺伝子発現変動を網羅的に解析し，全身レを果たす点，側坐核に睡眠物質アデノシンの受容体が発ベルでのトランスクリプトームデータベース（全身網羅

現する点に注目し，両脳領域の睡眠覚醒制御における機的多器官遺伝子発現地図, iOrgans Atlas）を構築した２）．

能解析を行った．

本データベースをデータマイニングする事で，骨で産【方法・結果】

生されるホルモン Fgf23 を介した骨と皮膚の新たな臓

まず，腹側被蓋野のドーパミン神経に着目し，同神経器連関ネットワークを解明した２）．さらに，唾液腺由来のドーパミン D2 /D3 受容体依存的な覚醒維持作用をマの分泌性タンパク質を介した骨と唾液腺という新しいウスにおいて見出した．次に，投射先の側坐核に注目し，臓器連関ネットワークを見出し，現在この分泌性タンパ

D2 受容体およびアデノシン A2A 受容体を発現する間接776

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

路神経のノンレム睡眠促進作用を見出した．同神経の活

５）Oishi, Y. & Lazarus, M.: The control of sleep

性はモチベーション刺激により低下し，それに伴って睡and wakefulness by mesolimbic dopamine sys-

眠量が低下した．従って，側坐核はモチベーション刺激

tems. Neurosci Res. 118: 66-73 (2017).

を感知し，さらに睡眠覚醒を制御する興味深い領域であることが明らかになった．
また，ジフテリア毒素の発現により腹側被蓋野をマウスにおいて欠損させたところ，予想に反して顕著な睡眠量の低下が見られた．解析の結果，GABA 作動性神経抗酸化物質キヌレン酸増加の分子機構とその意義
大橋一登（群馬大学生体調節研究所附属拠点研究支援センター）

が責任細胞であり，正常な睡眠量を維持するために必須の神経であることが判明した．一方，同欠損マウスの行【背景および目的】

動を調べたところ，自発運動量増加，抗うつ行動，不安

キヌレン酸 (KA) はトリプトファン（Trp）代謝化合様行動の減少など，多くの躁病様行動が見られた．躁病

物の一つであり，KA の増加は二型糖尿病やうつ病で認の診断基準のひとつに睡眠欲求の減少があるため，同マ

められているが，KA の増加の原因や意義はよく分かっ

ウスの睡眠恒常性を解析したところ，断眠後に通常みらていない．

れる睡眠リバウンドの消失が判明した．また，D2 受容

これまでに真核生物のモデル細胞である出芽酵母を用体欠損マウスでは GABA 神経欠損による睡眠量の減少

いて細胞内における KA の機能を調べてきた．その結果，が大きく損なわれたため，ドーパミン系を介しての睡眠KA は過剰な Trp を分解した結果で生じた排泄物の一減少メカニズムが示唆された．

種であることが示唆された（Ohashi. et al., Sci. Rep.,

一連の研究により，ドーパミン系や関連する GABA

2017）
．すなわち，KA 増加の一因は，Trp の蓄積であ作動性回路が睡眠制御や躁病様行動の表出に重要である

ると考えられる．しかし，高濃度 Trp が細胞にどのよことが明らかになった．過去に報告のないシステムが含うな影響を及ぼすかもよく分かっていない．したがって，まれるため，詳細な解析により不眠症等の新たな治療薬

過剰な Trp による細胞毒性の解析が，病態の理解につの開発につながる可能性がある．

ながると期待される．

【文献】【方法と結果】

１）Honda, T. et al.: Ablation of Ventral Midbrain/

高濃度 Trp による細胞毒性の原因を明らかにするた

Pons GABA Neurons Induces Mania-like Behav-

め，出芽酵母の非必須遺伝子変異株ライブラリを用い

iors with Altered Sleep Homeostasis and Dopa-て，高濃度 Trp への耐性に必要な遺伝子のスクリーニ

mine D2R-mediated Sleep Reduction., iScience.

ングを行った．その結果，細胞膜や細胞壁へのストレス

23(6): 101240 (2020).

応答に必要な Cell Wall Integrity (CWI) 経路の遺伝子

２）Takata, Y. et al.: Sleep and Wakefulness Are

欠損株の一部が，高濃度 Trp に感受性を示すことを見Controlled by Ventral Medial Midbrain/Pons

出した．CWI 経路の遺伝子欠損株について，改めて高GABAergic Neurons in Mice., J . Neurosci .

濃度 Trp への感受性を調べたところ，CWI 経路上流の

38(47): 10080-10092 (2018).

分子（細胞表層のセンサーなど）の遺伝子欠損株は高濃３）Oishi, Y. et al.: Slow-wave sleep is controlled by

度 Trp に感受性を示さなかったが，その下流のキナー

a subset of nucleus accumbens core neurons in

ゼカスケードや転写因子の遺伝子欠損株は高濃度の Trp

mice. Nat Commun. 8(1): 734 (2017).

に感受性を示した．このことから，CWI 経路の下流の４）Oishi, Y. et al.: Activation of ventral tegmental

シグナルが高濃度 Trp への耐性に必要であることが示

area dopamine neurons produces wakefulness

された．また，細胞内に Trp が蓄積する遺伝子変異株

through dopamine D2-like receptors in mice.

を用いて，細胞内 Trp の蓄積は細胞壁ストレスへの感

Brain Struct Funct. 222(6): 2907-2915 (2017).

受性を引き起こすことも示唆された．

8

77

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成【考察】【結果・考察】以上の結果から，細胞内の Trp の蓄積は細胞表層ス

消化管を想定した酵素条件により緑葉ルビスコを酵素

トレスへの正常な応答を妨げることが示され，この仕組

消化し，ペプチド一斉分析，包括的ペプチド情報，構造

みが Trp の毒性に寄与している可能性が考えられた．

活性相関情報から生理活性ペプチドを探索した．結果，【文献】

緑葉ルビスコ由来の６アミノ酸残基ペプチド YHIEPV

Kazuto, Ohashi. & Romanas, Chaleckis.: High levelsを選定した．

of tryptophan reduce cell wall or membrane stress

そこで視床下部器官培養系を用い，レプチンシグナル

tolerance in Saccharomyces cerevisiae, Bioscience,に及ぼす効果を検討したところ，生理食塩水を添加した

Biotechnology, and Biochemistry, 85, 10, 2131-2136

コントロール群と比較して，YHIEPV を添加した群で(2021).

は，レプチンによる STAT3 リン酸化（レプチンの中核
シグナル伝達経路）が有意に増加し，YHIEPV が細胞

食品由来シグナルによる視床下部の摂食調節ホルモンの感受性変容金子

内レプチン感受性を増強することを見出した．肥満マウ
ス個体を用いた検討により，経口投与した YHIEPV が脳室内投与したレプチンによる抗肥満効果を増大させる

賢太朗

ことを確認した．さらに器官培養系にて，Rap1 活性化（明治大学農学部）剤によるレプチン感受性障害の誘導が YHIEPV によりブロックできることを確認し，Rap1 経路の関与が示唆

【目的】

された．

視床下部の食欲中枢機能は栄養情報を脳に伝える摂食

今後の検討により，食による視床下部レプチン感受性

調節ホルモンにより制御されている．最近私たちは，腸制御の分子メカニズムや長期投与による抗肥満効果の実

管由来のインクレチンホルモン GIP の視床下部 GPCR

証が期待され，腸管由来食シグナルによるレプチン感受を介したホルモン感受性制御機構を解明し，視床下部の性の制御という新しい概念の提示に繋がることが期待さ

ホルモン感受性が腸脳連関を介した内因性・外因性のれる．

GPCR リガンドの制御下にあること示した（Cell Rep
2016, J Clin Invest 2019, Endocrinology 2020, JCI

Insight 2021）．
そこで本研究は，視床下部レプチンシグナルと相互作
用を示す外因性の新規食成分の同定と作用機序解明を目指した．

酵素活性検出蛍光プローブを用いたがん蛍光イメー
ジング
神谷

真子
（東京工業大学生命理工学院）【方法】
視床下部器官培養系はマウス新生仔より作製した脳ス
ライスを用い，実際の脳組織に近い状態でホルモンや外【目的】

因性成分の応答性が高い再現性をもって検出できる独自

高齢化が進みがんの罹患者や死亡者も増え続けているの評価系である．本系を用い，視床下部ホルモンシグナ

現在，その治療法の開発の重要性も増している．現時点

ルと相互連関を示す食成分の同定を進めた．

で最も確実な癌治療法の一つに外科的摘出があるが，目食成分で前処理した後にレプチン依存性 STAT3 リン

で見えないサイズの癌を完全に取り除くことは難しく再酸化を指標とした免疫組織化学により細胞内レプチンシ発の原因となっている．そこで我々は，蛍光法の持つ極グナルにおける食成分の効果を解析した．さらに肥満マ

めて劇的かつ精密にシグナル ON/OFF の制御が可能なウス個体を用いて，レプチン感受性への効果を検証した．

特徴を最大限に生かし，がん部位を見分けてその蛍光特性が大きく変化する Activatable 型蛍光プローブの設978

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

計・開発に取り組んだ．
【方法】
具体的には，分子内求核基を有するローダミン誘導体

副腎ペリリピン１は高血糖状態でのステロイドホルモン合成増加に関与する
亀田やロドール誘導体が示す特徴的な分子内スピロ環化平衡

啓（北海道大学病院を活用した独自の分子設計法に則り，がん部位での発現

糖尿病・内分泌内科）

亢進が報告されているアミノペプチダーゼやグリコシ
ダーゼを標的とした蛍光プローブ群を開発した．また，【背景と目的】

分子内光誘起電子移動を動作原理としたカルボシキペプ

２型糖尿病患者では，コルチゾールの基礎値と副腎皮チダーゼを標的とした蛍光プローブも開発した．さらに，

質刺激ホルモンに対する反応性が亢進しているという報開発した蛍光プローブ群を，がん培養細胞，がんモデル

告がなされており，血糖上昇のみならず血管障害や臓器

マウス，臨床検体に適用し，がん特異的に蛍光を発する

合併症の進行に関与していることが示唆されている．本蛍光プローブを探索するとともに，標的酵素の同定なら研究では２型糖尿病の病態における副腎ステロイド産生

びに，病理組織診断や免疫染色による標的酵素発現の確の亢進のメカニズムを明らかとし，２型糖尿病の高血認を行った．

糖や慢性合併症の治療・予防の新たな治療標的を見つけ【結果】出すことを目的とする．脂肪滴周囲蛋白であるペリリ開発した蛍光プローブライブラリーを臨床検体に滴下ピン１（PLIN1）に着目し２型糖尿病の病態における副し，蛍光強度の変化をがん部と非がん部で比較した結腎ステロイド産生の亢進のメカニズムを明らかにし，新果，DPPIV (DipeptidylpeptidaseIV) を標的とした蛍光

たな治療標的を見つけ出すことを総合的な目的としてプローブを用いることで食道がん特異的な蛍光イメージ研究を行った．2019 年度の実験では db/db マウスの副ングが，α-mannosidase を標的とした蛍光プローブを腎において脂肪酸取込み・分解の亢進，コレステロー

用いることで乳がんの良性腫瘍選択的な蛍光イメージン

ルの取込み・de novo 合成の亢進という代謝変化が起きグが可能であることを見出した１,２）．また，PSMA（前ており，結果的に細胞内のコレステロール量が増加し，立腺特異的膜抗原）を標的とした蛍光プローブを用いる

ステロイドホルモン合成が亢進することが示唆された．

ことで前立腺がんの蛍光イメージングが可能であること

2020 年度の実験では PLIN1 を副腎癌細胞株に過剰発も示した３）．

現したところステロイド合成酵素のベースの発現が増加【考察】し，Dhcr24 発現が増加，Irs1, Acc の発現は低下し内このように，特定の酵素活性を持つがん部位を検出

因性コレステロール産生の増加ならびにインスリンシする蛍光プローブを開発することで，迅速かつ高感

グナルと脂肪酸合成の低下が示唆された．2021 年度は度ながん検出を可能とする新たな概念に基づく EBM

DHCR24 阻害薬を db/db マウスに投与し血中ステロイ（evidence-based medicine）が可能となると期待されドホルモンと副腎遺伝子発現の変化を検討した．

る．

【方法】

【文献】

８週齢雄 db/db マウスを DHCR24 阻害薬 U18666A

１）Sci. Rep. 6, 26399 (2016).

10mg /kg/週投与群（Ｕ群）と対照の PBS 投与群（Ｐ群）

２）ACS Cent. Sci. 6, 2217–2227 (2020).

に振り分け２週間薬剤投与ののち血液と副腎を採取し，３）J. Am. Chem. Soc. 141, 10409-10416 (2019).

ステロイドホルモン濃度の測定と副腎遺伝子発現を調べた．
【結果】
薬剤投与による体重や血糖値の群間差は認めなかった．血中ステロイドホルモン（コルチコステロン，アルドステロン）はともにＵ群でＰ群と比して有意に低下

1079成人病の病因・病態の解明に関する研究助成した．副腎の皮質/髄質面積はＵ群で小さい傾向があり，るいは欠失させた動物個体を作出，改めてがんを発生さ

副腎遺伝子発現では Cpt1a の低下ならびに Scd1，Fas

せ，マルチオミクスデータを取得する．遺伝学的な介入の増加を認め脂肪酸分解の低下ならびに脂肪酸合成の増によって緩和あるいは増悪する現象を探索する，という加が示唆された．

アプローチである．
最近，本アプローチによって，宿主にニコチンアミ【考察】
肥満糖尿病モデルマウスへの DHCR24 阻害薬の投与

ド メ チ ル 基 転 移 酵 素（NNMT） が， が ん に 起 因 す る

により血中ステロイドホルモンの低下を認め，db/db マ

肝臓の代謝異常に重要な宿主因子であることを見出し

ウス副腎での代謝変化の是正が示唆された．DHCR24

た．NNMT は S-アデノシルメチオニンからニコチン阻害薬は糖尿病病態におけるステロイドホルモン過剰分

アミドへとメチル基を移し，１-メチルニコチンアミド

泌を是正し合併症の予防につながる可能性がある．

（MNAM）を生成する酵素である．複数のマウスがん移植モデルを用いた実験から，がんの移植によって肝臓にがんによる宿主生理変容のメカニズム河岡慎平

おける NNMT 並びに MNAM の発現量が増加することを見出した．この増加の意味を探るために NNMT を欠失させたマウスを作出すると，NNMT の欠失によって（東北大学・京都大学）

MNAM が消失することがわかった．つまり，NNMT
欠失マウスでは，がんに依存的な NNMT・MNAM のがんは依然として我が国の主要な死因の一つである．

増加を完全にキャンセルすることができた．

2020 年には，約 38 万人ががんで亡くなった．この数

次に，野生型・NNMT 欠失マウスにがんを移植し，は総死者数の 27% 以上に相当する．がん医療の進歩を肝臓におけるマルチオミクス解析を実施した．その結果，

もってしても根治不能な症例が多く存在することを示唆

野生型では，がんの移植によってウレア回路の異常が起するデータである．

こることが判明した．ウレア回路とは，有毒なアンモニ

根治不能ながんは個体にさまざまな悪影響をもたらアを無毒なウレアへと変換する重要な代謝回路である．

す．例えばがんによる全身性の炎症や肝臓・脂肪におけがんを移植した個体ではウレア回路を構成するアルギニ

る代謝異常，
体重の減少や食欲の減退などを挙げられる．

ンなどの代謝物が肝臓に蓄積し，血漿中のウレアの量がこれらの異常はやがて患者の Quality of Life や治療感減少していた．興味深いことに，NNMT 欠失マウスでは，受性を減少させ，最終的に個体を死に至らしめる．

これらのウレア回路の異常が緩和されていた．さらに，がんがどのようにして個体に悪影響を及ぼすのかとい

ウレア回路の異常の緩和は，ウラシル生合成経路の異常う問題に関する我々の理解は限定的である．がんによっの緩和と関連していた．以上の結果から，がんが肝臓のて起こる症状が多様で，かつ，互いに関連しあっている

ウレア回路・ウラシル生合成経路に異常を引き起こしてために，その一つ一つを切り分けて理解することが難し

いること，また，この異常には NNMT が必要であるこいのである．ある一つの症状が「悪影響」なのか「個体とが明らかとなった．

によるがんへの抵抗」なのかを見分けることさえ難しい場合もある．

NNMT がどのようにしてウレア回路やウラシル生合成経路に関係しているかは，現時点では未解明である．

研究代表者は，がんによる宿主の病態生理という問題

手がかりとして，MNAM を処理したマウスの肝臓で，に対して，ある病態生理に重要な宿主側の因子を見つけ

ウレア回路を構成する代謝物の一部が蓄積することがわる，というアプローチで研究をおこなってきた．まず，

かった．MNAM の増減がウレア回路に影響している可がんをもつ個体の宿主臓器からマルチオミクスデータを能性がある．また，本研究では，NNMT に依存しない取得する．本データを解析し，ある臓器にどのような問異常（糖代謝の異常など）も複数同定された．言い換え

題が起こっているのか，また，どの因子が重要であり得

ると，がんによって生じるさまざまな異常を，NNMTるのかを絞り込む．次に，絞り込んだ因子を過剰発現あへの依存度によって切り分けることができた．

1180

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

本研究では，NNMT ががんに依存する肝臓の代謝異常を媒介する因子であることを発見した．今後は，そのメカニズムの解明，また，NNMT を必要としない異常

前野肥大化に関与する可能性を考え解析を進めている．
【方法と結果】
自閉症リスク因子に挙げられている FGF シグナル関についての研究を進めていきたい．

連因子を胎生早期の大脳神経幹細胞特異的にノックアウ【参考文献】

トしたマウスを作成した結果，前頭前野が肥大するこMizuno, R., Hojo, H., Takahashi, M., Kashio, S.,と，また，成体においてノックアウトマウスが自閉症様Enya, S., Nakao, M., Konishi, R., Yoda, M., Harata,

行動を示すことを見出した．また，自閉症患者においてA., Hamanishi, J., Kawamoto, H., Mandai, M., Suzu-

みられる特徴である神経活動のバランス異常（E/I バラ

ki, Y., Miura, M., Bamba, T., Izumi, Y., & Kawaoka,

ンス異常）が観察された．興味深いことに，異なる Cre

S.: (2022). Remote solid cancers rewire hepatic ni-

発現マウスラインを用いてニューロンに分化してから

trogen metabolism via host nicotinamide -N- methyl-

FGF 関連因子をノックアウトしても前頭前野の肥大やtransferase. Nat Commun 13, 3346.

行動異常はみられなかった．これらの結果から，胎生期
神経幹細胞における FGF シグナルの異常が脳肥大を引

成体における社会的行動異常に関与する大脳形成不全の原因の解明川口

き起こすことで自閉症発症につながる可能性が示唆され
た．
【考察】

大地

本研究の結果から，局所脳肥大を伴う自閉症の発症（東京大学大学院薬学系研究科）

メカニズムの一旦として，胎生期神経幹細胞におけるFGF シグナルの異常が関与する可能性が示唆された．

【目的】

自閉症研究は主に生後の自閉症症状を担う分子メカニズ

自閉症スペクトラムは，言語障害・コミュニケーショ

ムの解析が中心となってきたが，本研究により胎生期にン障害・限定された興味・反復行動などを主徴とする発おいて既に発症に関わる異常が引き起こされている可能

達障害である．自閉症発症率は子供の 50－100 人に１性が考えられる．

人と高く，社会的にも大きな問題となっている．しかし，その発症原因について多くは不明である．これまでに，数割にのぼる多くの自閉症児について脳の局所（前頭前野など）における肥大が起こることが報告されている．
前頭前野は言語機能や社会的行動の調節などを担う領域

腹内側核 PACAP 発現細胞の双方向性摂食調節メ
カニズムの解明と肥満症への関与
神戸悠輝（鹿児島大学大学院医歯学総合研究科）

であり，前頭前野肥大化が自閉症発症に関与する可能性が十分に考えられるが，その関連は明らかになっていな
い．そこで本研究では，局所肥大を起こす分子メカニズ【序論】

ムを明らかにすることを目指している．これにより，多厚生労働省「国民健康・栄養調査報告」によると，

くの自閉症患者に共通する疾患発症メカニズムの解明に

20 歳以上の人の肥満の割合は男性で 33.0％，女性で繋がることを期待している．

22.3％と報告されている．肥満は単なる過剰体重だけ

近年，自閉症患者に特徴的な遺伝子変異を網羅的に探でなく，心血管疾患，糖尿病，脂肪肝，肝硬変などの原索する試みが活発に行われており，複数の FGF シグナ

因となることが知られている．この事から，新しい抗肥ル関連因子が自閉症原因候補遺伝子として挙げられてい満薬の開発あるいは創薬ターゲットの探索は社会的に強る．FGF シグナルは発生過程において細胞増殖を制御く求められている．肥満の基準である BMI の遺伝率はして組織のサイズ決定に関与することが知られており，

約 40-70% と高いことが知られている．遺伝因子は主に

申請者はこのシグナルの異常が自閉症児にみられる前頭視床下部に存在する摂食を調節する種々の神経ペプチド1281成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

およびその受容体と考えられている．PACAP もまた，

チド）が発現し，食欲を中心的に制御することが広く受

視床下部に高発現する神経ペプチドで，体温調節あるいけ入れられている．そこで，腹内側核 PACAP 過剰発現

は摂食などエネルギー収支のバランスを制御する因子でマウス弓状核におけるこれら神経ペプチドの発現を，明ある事が報告されているが，PACAP による摂食調節メ期あるいは暗期に分けて測定すると，明期では POMC

カニズムはそれぞれの報告で異なっており，詳細な解析の，暗期では AgRP の発現が有意に増加することを見が必要であった．

出した．一方で，過剰発現させた PACAP は明期・暗期【方法と結果】

問わず増加傾向であった．すなわち，腹内側核 PACAP

そこでまず，我々は PACAP-KO マウスを用いて，摂は，弓状核 AgRP あるいは POMC を介して，個体の状

食量の検討を行った．その結果，10 週齢時において態依存的（今回の研究では明期と暗期）に摂食を調節す

PACAP-KO マウスは，同腹仔のワイルドタイプ（WT）る可能性が明らかとなった．近年，弓状核の AgRP 発

マウスと比較し，体重に顕著な差は観察されなかったに現細胞あるいは POMC 発現細胞に接続されるグルタミも関わらず，
１日の摂食量は有意に少なかった．さらに，ン酸含有細胞が，摂食を制御するホルモンであるレプチ

２日間絶食したそれぞれのマウスに対して餌を再度提示

ン（明期に高値）の作用によって比較的短時間において，し，摂食量を測定すると，PACAP-KO マウスは WT マ

接続相手を両細胞間でスワップすることが報告されていウスと比較して，摂食量が有意に少なかった．すなわち，

る．一方，我々は PACAP が主にグルタミン酸含有神経

PACAP は摂食を促進する神経ペプチドであると考えら

細胞に共存することを明らかにしている．そこで，腹内れた．続いて，摂食を促進する作用のある PACAP が発側核 PACAP 発現細胞による明期・暗期間における双方

現する脳領域を探索するため，絶食下のマウスの脳標

向性の摂食調節メカニズムとして，腹内側核 PACAP 発品に対し PACAP を認識する RNA プローブを用いた in

現細胞から弓状核の AgRP 発現細胞あるいは POMC 発

situ ハイブリダイゼーションを実施すると，PACAP の現細胞への神経投射先がスワップすると仮説した．そmRNA 発現は，絶食に伴って視床下部腹内側核で顕著

こで，PACAP プロモータの制御下で Cre リコンビナーに増加した．さらに，in situ ハイブリダイゼーション

ゼを発現するノックインマウスの腹内側核に，Cre 依存の結果は，定量的 PCR によっても確認された．すなわち，的にシナプトフィジン EGFP キメラタンパク質（軸索視床下部腹内側核における PACAP は摂食促進作用を示

末端を緑色蛍光で標識）を発現させ，腹内側核 PACAP

すことが明らかになった．

発現細胞から弓状核 AgRP 発現細胞への神経投射をシ

しかし興味深いことに，１日の摂食量をマウスの休息

ナプトフィジン EGFP の蛍光強度により定量化すると，期である明期，あるいは活動期である暗期に分けて計明期と比較して暗期では神経投射が有意に多い事が明ら測すると，WT マウスと比較して PACAP-KO マウスでかとなった．以上の結果から，腹内側核 PACAP 発現細は，明期の摂食量は増加傾向を示し，暗期の摂食量は胞は，明期・暗期で神経投射をダイナミックに変えるこ

有意に減少した．また，上述の様に視床下部腹内側核とで，明期では摂食抑制的，暗期では摂食促進的に作用の PACAP は絶食に伴って増加することから，腹内側核する可能性が明らかになった．

に PACAP を過剰発現させるために，PACAP のコーディ

この解剖学的に観察された現象の機能的評価を試み

ング領域をサイトメガロウイルスプロモータの下流に組た．AgRP あるいは POMC プロモータの下流で RCaMP

み込んだアデノ随伴ウイルスを調製し，同ウイルスをマあるいは GCaMP（赤色あるいは緑色のカルシウムセン

ウス腹内側核に感染させた．この腹内側核 PACAP 過剰

サータンパク質）を発現するアデノ随伴ウイルス (AAV)発現マウスの摂食量は，コントロールの腹内側核緑色蛍を開発し，PACAP-Cre マウスの弓状核に感染させた．

光タンパク質過剰発現マウスと比較して，明期に減少傾

さらに，腹内側核 PACAP 発現細胞の活動を特異的に調向を示し，暗期に有意に増加した．視床下部弓状核には，節するために，PACAP-Cre マウスの腹内側核に，Cre

アグーチ関連ペプチド（AgRP，摂食亢進ペプチド）お依存的に hM3D（人工リガンド CNO で特異的に活性よびプロオピオメラノコルチン（POMC，摂食抑制ペプ化される Gq 共役型受容体）を発現する AAV を感染さ

1382

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成せた．その後，CNO 投与後の弓状核における赤色あるshRNA を発現させると，明期の摂食量は増加し，暗期

いは緑色の蛍光をファイバーフォトメトリーで計測す

あるいは絶食後の摂食量は減少した．これは，PACAP-

ると，腹内側核 PACAP 発現細胞を活性化したときにおKO マウスのフェノタイプと全く同じだった．

ける，POMC あるいは AgRP 発現細胞の神経活動を同【考察】

時に，自由行動下のマウスから測定できる．この実験

以上の解析から，夜間に腹内側核 PACAP 発現細胞を系を利用して，夜間に CNO を投与した後，グレリンを活性化させると，摂食抑制系の弓状核 POMC 発現細胞

脳室内投与した後において，POMC あるいは AgRP 発を抑制する可能性が明らかとなった．申請者らはこれま

現細胞の神経活動を計測した．夜間に CNO を投与してでの報告において，腹内側核 PACAP 発現細胞は夜間にも，GCaMP 蛍光強度の変化は観察されなかったもの

摂食亢進作用を惹起する可能性を示唆しており，その結の，RCaMP 蛍光強度の減弱が観察された．すなわち，

果をサポートする重要なデータである．今回は，ファイ

夜間に腹内側核 PACAP 発現細胞を活性化させると，弓バーフォトメトリー法を用いて，AgRP 発現細胞の神経状核 POMC 発現細胞の活動を抑制する可能性が示され活動を記録することが出来なかったが，AgRP プロモーた．さらに，同様の処置をしたマウスの脳室内にグレタの配列を最適化したことで，GFP の蛍光を観察する

リンを投与すると，弓状核 AgRP 発現細胞の発現することができた．今後は，この AAV を用いてファイバー

GCaMP 蛍光強度の変化は観察されなかったものの，弓フォトメトリー法を適用し，AgRP 発現細胞が上記と同状核 POMC 発現細胞の発現する RCaMP 蛍光強度の増条件において活性化することが確認できれば，非常に興強が観察された．この結果は，グレリンによる POMC

味深い結果となる．一方で，グレリンは摂食亢進ホルモ発現細胞の活性化を示唆する．一方，RCaMP およびンであることから，グレリンの投与によって摂食を抑制

GCaMP を発現しているマウスを灌流固定し，組織学的する働きのある POMC 発現細胞を活性化したことは意な解析に供すると，光ファイバーが挿入されていた部位
において RCaMP 陽性神経細胞が多数検出されたのに対して，GCaMP 陽性の細胞はほとんど観察されなかった．
このことが，GCaMP の蛍光の増減が観察出来なかった理由と推察される．そこで，AgRP-GCaMP のプロモー
タ領域を最適化し，マウスに感染後，発現細胞を観察す
ると，弓状核の POMC-RCaMP を発現しない細胞において，緑色蛍光が観察された．
一方で，腹内側核 PACAP 発現細胞は視床下部背内側核にも非常に強く投射していた．非常に興味深いことに，背内側核もまた摂食調節において双方向性が報告されている領域である．背内側核は神経ペプチド・ガラニ
ンが高発現する領域であることから，ガラニンの発現を検討すると，絶食によって増加し，この増加は PACAPKO マウスでキャンセルされた．続いて，ガラニン発現制御における腹内側核 PACAP の重要性を検討した．その結果，腹内側核において PACAP を過剰発現あるいは
ノックダウンすると，ガラニンの発現は増加あるいは本研究のまとめ減少した．すなわち，ガラニンは腹内側核 PACAP の下腹内側核 PACAP は弓状核 AgRP/POMC あるいは背内側核ガラニンの視床下部神経ペプチドネットワー
クを介し，個体の状態依存的に摂食を調節する．

流シグナルと推察される．そこで，背内側核のガラニンをノックダウンする目的で，背内側核にガラニンに対す

1483成人病の病因・病態の解明に関する研究助成外であった．この理由は不明であるが，今後詳細に解析

ロファージ亜集団の１つが，他の亜集団よりも増殖中のしていく予定である．また，腹内側核 PACAP の下流シ

骨格筋幹細胞と密接に相互作用していることが示唆されグナルとして，背内側核のガラニンを見出した．背内側

た．このマクロファージ亜集団の機能を詳細に調べるに

核ガラニンもまた，腹内側核 PACAP と同様に双方向性

は，マクロファージ集団全体からこの亜集団を分画するの摂食制御を示すことが明らかとなった．

ことが必要である．そこで，シングルセル RNA シーク

PACAP およびガラニンは摂食を促進する神経ペプチ

エンス解析で得られた遺伝子発現情報をもとに，フロードである可能性があり，同シグナルを抑制する分子は抗サイトメトリーに使用できる表面抗原マーカーの検証を

肥満薬となりうる．加えて，PACAP およびガラニンに行った．その結果，このマクロファージ亜集団が高い頻よる摂食調節は，“状態依存的” な可能性がある．すな

度で濃縮される条件を見出すことに成功した．今後，こわち，食事は個体の生命活動に必須であり，過度な食欲の条件下で分離されたマクロファージ亜集団が骨格筋幹の抑制は逆に健康を害すると考えられるが，PACAP お

細胞とどのように相互作用し，骨格筋再生に寄与するのよびガラニンは食への渇望が強い場合にのみ，摂食促進か明らかにしていく予定である．

作用を発揮するかもしれない．この特徴をうまく利用す
れば，肥満症患者の食物の過剰摂取のみを抑制できる安全な抗肥満薬の創薬ターゲットになる可能性がある．

グレリン分泌細胞における GPCR 発現解析および新規調節因子の探索

骨格筋再生を主導する多細胞間相互作用ネットワー

小山（名古屋市立大学大学院医学研究科）

クの解析
小池

博之

博之

～研究１～
（日本医科大学）【背景】
サルコペニアは筋力と筋量の低下により QOL 低下や【目的】

死の転帰を辿りうる疾患であり，早期診断と積極的な薬

サルコペニアは，骨格筋の再生が正常に機能しないこ

物介入は健康寿命を延伸し社会への貢献につながる．筆とにより起こる疾患である．骨格筋の再生は，骨格筋幹者はこれまで，グレリン細胞株を用いた網羅的遺伝子発細胞の活性化，増殖，筋分化という大きく３つのステッ

現解析を行い高発現 GPCR を同定し，トリプトファン

プを経て，連続的に行われる．この骨格筋再生過程の調などの栄養分子がグレリン分泌におよぼす影響および節に中心的な役割を果たす細胞の一つがマクロファージ

細胞内シグナル伝達経路の解明を行ってきた．ヒトにおである．本研究では，マクロファージが骨格筋幹細胞のいて複数の疾患でグレリン投与は食欲や骨格筋量を増や増殖を制御するシグナルを明らかにすることを試みる．

すことが報告されており（Nagaya et al.: Circulation.

【方法】

2004 など），サルコペニアに対する薬物治療としてグ

本年度は，マクロファージが骨格筋幹細胞の増殖を制御するシグナルについて，シングルセル RNA シークエ

レリンは有望視されている．
薬物を含めた治療介入の効果・作用機序の解析にはモンスにより解析した．

デルマウスが有用であるが，マウスはヒトと遺伝学・組【結果】

織学的に相同性が高く加齢プロセスも類似するため，サ再生過程のマウス骨格筋のシングルセル RNA シーク

ルコペニアモデルとして老化マウスが多く用いられていエンス解析により，再生骨格筋組織中のマクロファージ

る．しかし，長期間飼育すると個体差が大きくなり，統が様々なサブタイプ（亜集団）に分類されることを確認

計学的解析が困難になる問題点が存在する．一方，骨格した．リガンド・レセプター解析の結果，これらのマク

筋量や筋力が低下する遺伝子改変マウスも数多く報告さ

1584成人病の病因・病態の解明に関する研究助成れているが，正常な加齢とは異なる外観や表現型を呈するためヒトへの外挿性に乏しい欠点がある．
【目的】
老化促進マウス SAMP1 がサルコペニアモデルマウス
として有用であることを証明する．
【結果】
18 週齢の SAMP1 マウスは対照マウス（SAMR）と比較して，サルコペニアの診断（AWGS2019 サルコペ
ニア診断ガイドライン）に必須の筋量・筋力・身体機能の低下を認めた（下図）．さらにヒトサルコペニアと共通する複数の表現型（低栄養・耐糖能異常・テストステロン低下）を有していた．また，SAMP1 の血中デスア
シルグレリンおよび IGF-1 は有意な上昇を認めた．

～研究２～
【背景】
サルコペニアの診断に必要な骨格筋量の測定にはDEXA や CT がガイドラインで推奨されているが，低侵襲・経済的・アクセス容易な超音波を用いた筋量評価の有用性に関する報告は多くない．
【目的】
超音波で測定した甲状舌骨筋面積がサルコペニアの診断に有用であることを証明する．
【対象と方法】
2020 年９月～ 2021 年３月に名古屋市立大学病院で
甲状腺超音波検査を受けた 65 歳以上の患者 31 人を対象に後ろ向き横断研究を行った．甲状舌骨筋の面積は次に，18 週齢の SAMP マウスを①回転かごを置いた

両葉が最大径を示す横断画像を用いて計測し，面積とケージで飼育した Exercise 群，②回転かごを置かない

握力・年齢・BMI の相関を検討した．また，本研究でSedentary 群に分け，８週間飼育した．結果，Exercise

は AWGS2019 診断ガイドラインに基づき握力が男性群は有意にヒラメ筋重量，トレッドミル試験走行距離が28kg，女性 18kg 以下の場合をサルコペニアと定義し，増加していた．

サルコペニア診断における筋面積の有用性を ROC 解析
にて検討した．
【結果】
甲 状 舌 骨 筋 面 積 は 握 力 と 正 の 相 関 を 示 し た（r＝0.613，P＝0.000112）．また，筋面積は年齢とは弱い

1685

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

負の相関を示した（r＝0.402, P＝0.0166）一方で BMIとは有意な相関を認めなかった（r＝0.164, P＝0.378）．
サルコペニア群は非サルコペニア群と比較して甲状舌骨筋面積は有意に低下していた（P＝0.0079）が，年オレキシン２受容体作動薬の活性立体配座制御に基づく新規誘導体の創製
斉藤

毅（筑波大学国際統合睡眠医科学研究機構）

齢・BMI は両群で差を認めなかった．サルコペニアの診断における甲状舌骨筋面積の最適なカットオフ値は0.325cm2（感度 83.3％，特異度 68.4％，AUC＝0.754）
であった．

【目的】
オレキシンは，Ｇタンパク質共役型受容体（GPCR）
であるオレキシン受容体（OX1R, OX2R）に作用することで睡眠覚醒や情動を制御する神経ペプチドである１）．
オレキシン/OX2R 系の機能不全が睡眠障害ナルコレプ
シーを引き起こすことが明らかになって以降，OX2R 選
択的作動薬はナルコレプシー治療薬として期待されている２）．これまでに我々は，世界初の低分子 OX2R 選択的作動薬 YNT-185 (EC50 ＝ 28 nM (OX2R), OX1R/OX2R＝100) を見出し，ナルコレプシーモデルマウスにおいて顕著なカタプレキシー抑制作用を示すことを明らかにしている３,４）．しかしながら，YNT-185 の活性発現に必要な構造情報は未だ明らかではなく，更なる医薬品開発において詳細な構造活性相関の取得は重要である．そこで本研究では，YNT-185 の活性立体配座の探索を目的として，構造活性相関研究を実施した．
【方法】
YNT-185 は，分子内に柔軟性に富む鎖状エチレンジ
アミン構造を有し，受容体ポケット内では特定の配座を取ることで活性を発現していると考えられる．つまり，受容体との結合のためにエネルギー損失が伴っているこ【考察】とが示唆される．そのため，活性発現に必要な活性立体

AWGS2019 ではプライマリケアにて下腿周囲長測定

配座を明らかにすることができれば，より強力な作動薬が推奨されており，サルコペニアの予測モデルにおけるの創製に繋がると考えた．そこで，鎖状構造を環化する

AUC: 0.792-0.88 との報告があるが，本研究の方法はことで固定した新たな誘導体を設計，合成し，オレキシ

それに匹敵する．下肢周囲長は肥満・浮腫による過大評

ン受容体作動活性を評価した．

価や個人内変動のため正確ではない可能性があるが，甲【結果】状舌骨筋量はそうした心配が少なく，測定するエコー横

ナフタレン環を用いてアミド側鎖を伸長型と屈曲型に断像は撮影方法としてコンセンサスがあり再現性も担保それぞれ固定した誘導体を合成し，評価したところ，屈されることから，今後，本測定法のさらなる臨床応用を曲型誘導体がより強い OX2R 作動活性を示すことを見出

目指していきたい．

した．さらに，側鎖上アミド基の回転を制御するために隣接位に Me 基を導入したところ，活性は大きく向上し，
YNT-185 を上回る活性を有する YNT-3757 (EC50＝9.21
nM (OX2R), OX1R/OX2R＝16) を見出すことに成功し

1786成人病の病因・病態の解明に関する研究助成た５）．以上の結果から，屈曲した側鎖を有し，捻れたア

選択的に軽減し得ることを報告している（Shimo, N. et

ミド基を介して芳香環が配向する配座がこれら OX2R 作

al., 2015）．今回，本系の治療群と非治療群の膵島由来動薬の活性立体配座であることが示唆され，この配座はmRNA を用いて microarray 解析を実施し，非治療群

OX2R とのドッキングシミュレーションの結果から支持に比べ治療群で２倍以上の有意な高発現を示す 43 因子された．続いて，本活性配座解析を踏まえ，より効率的を抽出した．高血糖毒性に対し感受性の高いこれら遺な結合を実現するためにナフタレン環を還元したテトラ

伝子の中には，膵 β 細胞機能における役割は未知だが，リン型誘導体を設計，合成し，評価した．その結果，３GWAS において２型糖尿病疾患感受性遺伝子として報メトキシフェニル酢酸アミドを側鎖上に有する誘導体

告（Tabassum, R. et al., 2013）されている Tmem163(R)-YNT-3708 が強力な OX2R 選択的作動活性を示すこが含まれており，ヒトの糖尿病病態との関連性を想定とを見出した (EC50 ＝ 2.69 nM (OX2R), OX1R/OX2R＝し，同因子の解析を進めることとした．マウスにおける460)６）．

局在に関し，免疫染色および免疫電顕での解析により，【文献】

膵 β 細胞インスリン分泌顆粒（SG）の顆粒膜への高度１）T, Sakurai. et al.: Cell 92, 573-585 (1998).

の限局が示唆された．膵 β 細胞特異的 Tmem163 ノッ２）M, Mieda. et al.: PNAS. 101, 4649-4654 (2004).

クアウトマウス（KO）の経口ブドウ糖負荷試験におい

３）T, Nagahara. et al.: J. Med. Chem. 58, 7931-て，血糖値は対照群に比べ有意な低値を，血漿インスリ

7937 (2015).

ン値は有意な高値を示した．単離膵島のグルコース応答４）Y, Irukayama-Tomobe. et al.: PNAS. 114, 57315736 (2017).

性インスリン分泌（GSIS）も対照群に比べ有意な高値を示した．また電顕での解析にて，対照群に比べ SG の５）T, Hino. et al.: Bioorg. Med. Chem. Lett. 59,
128530 (2022).

dense core 密度低下ならびに halo の消失が確認された．
さらに対照群に比べ KO では，免疫染色にてインスリン６）K. Iio et al .: Bioorg . Med . Chem . Lett . 59,
128555 (2022).

の前駆体であるプロインスリンの分布が核周囲から細胞質全体へと変化しており，定量評価では膵島プロインス
リン含量が増加傾向を示した．
【考察】

膵 β 細胞高血糖毒性感受性遺伝子の新規同定と解析
下直樹

以上より Tmem163 は，SG の成熟を介して，膵 β 細胞からの適切な GSIS の制御において必須の役割を果た（和歌山県立医科大学）

しているものと推察される．上記インスリン分泌亢進や電顕における SG 成熟障害の像は，いずれも２型糖尿病【背景】
２型糖尿病における慢性的な高血糖は膵 β 細胞機能障
害を引き起こすことが示されており，高血糖毒性として初期に認められる所見であることから，本因子の２型糖尿病病態における意義を明らかにすべく，解析を続ける
方針としている．

知られている．一方，糖尿病治療による膵 β 細胞機能の改善も経験されるが，このような機能変化に関わる分子機序の全容は明らかでなく，未知の因子の関与が想定される．
【目的】
高血糖毒性に対する感受性が高く，
膵 β 細胞機能において重要な役割を果たす新規因子を同定し解析する．

ソーシャルディスタンスを制御する神経回路とその
分子の探索
征矢

晋吾
（筑波大学医学医療系）【方法・結果】
我々は，過食２型糖尿病モデルの db/db マウスに対本研究では，社会的接触を制御する神経基盤を探索すする１週間の SGLT2 阻害薬投与により，高血糖毒性をるためニューロペプチド B/W に注目した．ニューロペ

1887成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

プチド B/W はこれまでに痛みの制御，自律神経系の調節などに関わることが知られているが，その生理的役ｂ）免疫抗体染色により jGCaMP7c および mCherry 陽性

割は不明な点が多い．ニューロペプチド B/W の受容体細胞を CeA において可視化した（スケールバー：
100μm）．

であるニューロペプチド B/W １受容体（Npbwr1）はｃ）ファイバーフォトメトリーを用いた社会行動実験の概要．

情動応答に重要な役割を果たす扁桃体中心核（CeA）のｄ）新規の雄マウスに対する社会行動中の Npbwr1 ニューロンのカルシウム動態

GABA 作動性ニューロンにおいて顕著な発現を示すことを確認した．さらに，Npbwr1 欠損マウスを独自に

ｅ）新規の雄マウスに対する社会的接触前後（± ２秒）の Npbwr1 ニューロンのカルシウム動態．

作成し，様々な行動テストを行った結果，このマウスは

ｆ）社会的接触前後（± ２秒）における平均最大蛍光強度．

初めて対峙する相手に対して社会的接触時間が非常に長ｇ）社会的接触前後（± ２秒）における平均 AUC (Area
Under Curve)．

く，執拗な追尾行動を示すことが明らかになった．この時の心拍数，血圧を測定したところ，対照群に比べ顕著

ｈ）社会的接触前後（± ２秒）における平均個体間距離．

かつ持続的な上昇が見られた．また，恐怖記憶の形成に障害が観察された（Nagata et al., 2011）．これらの知【考察】

見から，Npbwr1 を手がかりとして Npbwr1 が発現す本研究では，CeA の Npbwr1 ニューロンに着目し，るニューロン（Npbwr1 ニューロン）の生理的役割を神

見知らぬ他個体（雄）に対する社会行動においてその経回路レベルで探索することで個体間距離を制御する分活動がどのように変化するのか観察した．その結果，子・神経基盤の描出を試みる．

CeA の Npbwr １ニューロンの活動は他個体と接触した【実験結果】

時に増加することが明らかになった．したがって CeAの Npbwr １ニューロンは新規の個体との社会的接触を調節する役割があることが示唆される．今後は CeA のNpbwr １ニューロンが新規の雌マウスや慣れ親しんだ
ケージメイト，マウスの形をした物体などに対してどのような応答をしめすのか検証する．

ブタ LES において神経型ニコチン受容体刺激が引き起こす弛緩反応の機序田中義将（九州大学病院）

上記課題について Otsuka, Y. & Tanaka, Y. et al.:Eur J Pharmacol 2021 にて明らかにした．その後さらに消化管機能に関する研究として排便を制御する中枢神経の局在と役割についての検討に関する以下の研究を行
なった．
【目的】
図１

Npbwr1 ニューロンのカルシウムイメージングａ ）Npbwr1-iCre の CeA に AAV- DIO-jGCaMP7c お
よび AAV-EF1a-DIO-mCherry を投与した．

排便は直腸平滑筋および肛門括約筋の協調運動により行われる．それらの障害により起こる便秘は，生活の質に影響を及ぼすとともに近年，循環器疾患と脳血管疾患のリスク要因となり，生存率とも相関することが報告さ

1988

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成れている．一方で，直腸平滑筋や肛門括約筋の収縮・弛が強い事が報告されており，更に非アルコール性脂肪肝

緩には神経系の関与が報告されるが，排便中枢の局在や臓病 (NAFLD) やインスリン抵抗性（IR）を引き起こす

役割など未だ不明な部分が多く，光遺伝学的手法や化学事が報告されている．URAT1 は腎臓に主に発現してお遺伝学的手法を用いてこれを明らかにすることとした．

り，高尿酸血症の発症に関与していると考えられている【方法】

が，NAFLD や IR における病態生理学的意義に関して

まず，排便中枢の同定のために複数のシナプスに逆行は不明な点が多い．我々は，URAT1 のメタボリックシ性感染する仮性狂犬病ウイルス（pseudorabies virus;

ンドロームにおける病態生理を明らかにするために肥満PRV）を肛門及び遠位結腸に注射し，脳内に標識される

マウスを用いて検討を行った．

PRV を評価した．次に，これにより得られた排便中枢【手法】

候補部位の機能を評価するために VGluT2-cre マウス，

16–18 週間，高脂肪食（HFD）もしくは通常食（NFD）

CRH-cre マウス，TH-cre マウスをそれぞれ用意し，こを投与したマウスに対して URAT1 選択的阻害薬である

れらマウスに対して光遺伝学的手法や化学遺伝学的手法を用いて遠位結腸内圧や肛門からのビーズ排出時間などの排便に関する各種評価を行った．
【結果】
PRV を用いたトレーシング実験においては橋に存在するバリントン核（Bar）や青斑核（LC）において
PRV 標識ニューロンが確認された．Bar や LC に存在す
る VGluT2 陽性ニューロンに対する光遺伝学的手法による光刺激と連動して遠位結腸内圧上昇を引き起こし，Bar に存在する CRH 陽性ニューロンに対する光刺激は時間差があるが遠位結腸内圧上昇を引き起こした．いずれにおいてもビーズ排出時間や排便量の増加を認めた．
一方で，LC に存在する TH 陽性ニューロンに対する光刺激は control 群と比較し有意な遠位結腸内圧変化やビーズ排出時間の短縮を引き起こさなかった．
【考察】

図１

以上より Bar に存在する VGLuT2 陽性ニューロン，CRH 陽性ニューロンが排便に関与する可能性が考えら

NFD

NFD+Doti

HFD

HFD+Doti

れた．また，それぞれが排便に対して異なるメカニズムで寄与することが想定された．

メタボリックシンドロームにおける URAT1 のイ
ンスリン抵抗性の制御機構の解明
田中祥朗（東京慈恵会医科大学）【背景・目的】
高尿酸血症と肥満やメタボリックシンドロームは関連

20

図２

89

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

ドチヌラド（50mg/kg/day）を更に４週間投与を行った．

既報の通り腎臓で最も発現を認めており，肝臓や褐色脂【結果】

肪組織においても発現を認めた．HFD 群で褐色脂肪組

インスリン負荷試験 (ITT)，腹腔内ブドウ糖負荷試験

織での URAT1 発現は，mRNA 及び蛋白レベルで顕著(IPGTT) では，HFD 群で NFD 群と比較して顕著な IRに増加していた．HFD 投与マウスの肝臓では，NFD 群の増悪を認めたが，ドチヌラド投与で顕著な改善を認めと比較して顕著な脂肪肝を認めており（図２）
，肝臓組

た（図１）
．また，URAT1 の mRNA の発現レベルは，織の NAFLD score，血清 ALT 活性，組織 TNFα，Ccl2の上昇が認められたが（図３），ドチヌラド投与でこれらの変化が顕著に抑制されていた．更に，褐色脂肪を観察したところ，高脂肪食投与により褐色脂肪組織において顕著な脂肪滴の沈着 (Whitening) や褐色脂肪組織全体の ROS の産生が優位に増加していたが，ドチヌラド投
与により減少しており（図４），uncoupling protein 1(UCP1) 蛋白発現の増加を認めており，rebrowning が促されている所見であった．
【考察】
URAT1 は NAFLD や褐色脂肪の白色化を介してメタ
ボリックシンドロームの IR の増悪に寄与していると考えられた．URAT1 選択的阻害薬は高尿酸血症を合併した NAFLD や IR を背景とした患者に効能があると考え
られた．
【文献】
Tanaka, Y., Nagoshi, T., Takahashi, H., Oi, Y.,
Yoshii, A., Kimura, H., Ito, K., Kashiwagi, Y.,
Tanaka, TD. & Yoshimura, M.: URAT1-selective inhibition ameliorates insulin resistance by attenuating
diet-induced hepatic steatosis and brown adipose

図３
NFD

tissue whitening in mice. Mol Metab. 55: 101411;
NFD+Doti

2022.

社会ストレスによる脳組織の超微細な細胞生物学的変化 とその機序・役割の解明
HFD

HFD+Doti

永井裕崇（神戸大学大学院医学研究科）【目的】
社会や環境より受けるストレスは抑うつや不安亢進など情動変容を誘発し，うつ病など精神疾患のリスク
図４となる．うつ病患者やマウスのストレス病態モデルにおいては前頭前皮質神経細胞の機能形態変化が情動変容に

21
90

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成重要であることが示唆されているが，その分子機序は未の７つのメンバーのうち，NOX2 および NOX4 は心筋だに不明である．これまでの検討により，慢性ストレス細胞でも豊富に発現している２）．NOX1-4 は，膜貫通タがミトコンドリア過剰分裂を伴う樹状突起退縮を生じる

ンパク質である分子量 22.0kDa の p22 phox と１：１の複こと，また，シナプスミトコンドリアを含むシナプス特合体を形成している３）．p22 phox の主な生理学的役割は，

異的にシナプス構造退縮を生じることを明らかにしてきNOX と形成するヘテロダイマーの安定化であり，さまた．その分子基盤を調べるべくプロテオミクス解析を実

ざまな臓器での ROS 産生に関与している．しかしなが施し，シナプス特異的に糖輸送体や解糖系を担う酵素のら，心筋細胞における p22 phox の正確な役割は未だ解明

発現亢進が生じること，すなわちシナプス特異的な中央されておらず，本研究では心臓における内因性 p22 phox

代謝系変容が生じることを見出してきた．従って本研究の役割を明らかにすることを目的とした．

においては，ストレスによる中央代謝系変容の実態と意【方法と結果】

義を明らかにすることを目的とする．

はじめに，ヒトの心臓サンプルで p22 phox の発現を確認したところ，心不全患者では健常者に比較して，【方法】
慢性社会ストレスに供したマウスの内側前頭前皮質をp22 phox の発現が有意に増えており，マウスの胸部大動回収し，キャピラリ電気泳動を用いた包括的メタボロミ

脈狭窄（TAC）後も同様に p22 phox の発現が有意に増え

クス解析を実施した．さらに，発現亢進の認められた中ていた．そこで，心臓特異的 p22 phox ノックアウトマウ

央代謝系を担うタンパク質について，その遺伝子発現をス（ p22 phox-cKO）を作成し，TAC を施行したところ，抑制する人工マイクロ RNA を発現するアデノ随伴ウイ

p22 phox-cKO マウスではコントロールマウスに比較しルスを両側の内側前頭前皮質に局所注入した上で慢性社て，有意に心収縮能の低下を認め，肺重量も増加してい会挫折ストレスに供し，その行動変化を社会相互作用試た．次に，質量分析で p22 phox と結合するタンパクを調験や新奇物体認識試験，
雌尿嗜好性試験を用いて調べた．

べたところ，心筋筋小胞体 Ca2＋-ATPase (SERCA2a)【結果と考察】が最も多い結果であった．そこで，p22 phox-cKO マウス

慢性社会ストレスにより，中央代謝系代謝物質並びにの SERCA2a の発現量を調べたところ，コントロール

ペントースリン酸回路の代謝物質の発現量亢進が明らか

マウスと比較し SERCA2a の mRNA の発現量に差は認となった．さらに，中央代謝系を担うタンパク質の発現めなかったが，SERCA2a のタンパク発現量が有意に減抑制により，ストレスによる新奇物体認識の低下や，雌少 し て い た． そ こ で，AAV9-SERCA2a を 用 い て， レ

尿嗜好性（報酬嗜好性）の低下が減弱した．これらの知スキュー実験を行ったところ，p22 phox-cKO マウス＋

見は，慢性社会ストレスによる中央代謝系変容がうつ様

AAV9-SERCA2a で TAC 後の心収縮力が保たれ，心不行動を導くことを示唆する．今後は，中央代謝系変容の全増悪も抑制される結果であった．

生じる意義や，中央代謝系変容が神経機能にもたらす影【考察】

響について検討する予定である．

今後は，p22 phox がどのように SERCA2a を安定化しているかについて検討するとともに，p22 phox の心臓に心臓圧負荷時におけるの分子メカニズムの解明
中田

おける ROS の産生調整などを明らかにする予定である．
【文献】
１）Maejima, Y., Kurodam J., Matsushima, S., Ago,

康紀

T. & Sadoshima, J.: Regulation of myocardial（奈良県立医科大学循環器内科）

growth and death by NADPH oxidase. J Mol

Cell Cardiol. 50, 408-16. (2011).
【目的】
NADPH オキシダーゼ（NOX）は，体内の活性酸素
種（ROS）の主要な供給源である１）．NOX ファミリー

22２）Schulz, E. & Munzel, T.: NOX5, a new "radical"
player in human atherosclerosis? J Am Coll Car-

diol. 52, 1810-1812. (2008).

91成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

３）Bedard, K. & Krause, KH.: The NOX family of

学的解析を進めることで細胞競合の分子メカニズムを解ROS-generating NADPH oxidases: physiology

析した．

and pathophysiology. Physiol Rev. 87, 245-313.

【結果】(2007).

正常細胞側にオートファジー関連遺伝子の変異が誘導されると，Yki の活性化による腫瘍形成が抑制された．
解析を進めた結果，Yki 活性化細胞に近接する正常細胞

細胞競合を介した腫瘍形成機構の遺伝学的解析
永田理奈

ではオートファジーが活性上昇しており，これにより細胞死が引き起こされることが腫瘍形成に必要であることがわかった．そこで次に，正常細胞のオートファジー誘（京都大学大学院生命科学研究科）

導に必要な Yki 活性化細胞のシグナルを解析した．その結果，Yki 活性化細胞では Yki のターゲットである
miRNA bantam を介して TOR シグナルが活性化して【目的】
細胞競合とは，組織中の適応度の高い細胞（勝者）がおり，これが周りの正常細胞のオートファジー誘導に必

適応度の低い細胞（敗者）に細胞死を誘導して排除する要であることがわかった１）．

現象であり，がんの制御に重要であることがわかってい【考察】る．例えば，転写共役因子 Yki/YAP が活性化した細胞

Yki 活性化細胞の TOR シグナルの活性化が正常細胞

は，自身が増殖するだけでなく周りの正常細胞に細胞死のオートファジー誘導に必要であることがわかったが，を誘導し，細胞競合の勝者となることが知られている．

TOR シグナルを活性化しただけの細胞は周囲の正常細しかし，その分子メカニズムは全く分かっていなかった．

胞にオートファジーを誘導しないこともわかった．
一方，

本研究では，ショウジョウバエを用いた遺伝学的解析に

bantam の過剰発現細胞は周囲の正常細胞にオートファ

より，これを明らかにすることを目的とした．

ジーを引き起こすことがわかったため，TOR シグナル【方法】に加え bantam の下流の何らかの因子が細胞競合を引き

Yki の活性化による細胞競合を制御する因子を見つけ起こすのに必要であると考えられる（図１）．今後は，るための遺伝学的スクリーニングを行った．
具体的には，

これらの知見をもとに bantam のターゲットを解析する

ショウジョウバエ複眼原基に Yki 活性化細胞集団と正ことで，細胞競合を引き起こす十分条件を明らかにする

常細胞集団をモザイク状に誘導し，正常細胞側にのみことを目指す．

CRISPR-Cas9 ノックアウト変異（約 1500 遺伝子）を【文献】

一つ一つ誘導していった際に，複眼の腫瘍形成が抑制さ

１）Nagata, R et al.: Yorkie drives supercompetition

れる系統を探索した．この結果をもとに，さらなる遺伝

by non-autonomous induction of autophagy via
bantam microRNA in Drosophila. Current Biol-ogy 32, 1064-1076 (2022).

図１

23
92

Yki 活性化による細胞競合メカニズム成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

神経ガイダンス因子による神経-免疫-代謝連関メカ
ニズムの解明中西

由光（大阪大学大学院医学系研究科）【目的】
神経由来セマフォリン 6D による情動と自律神経応答
共役の制御機構解明【方法】
神経細胞特異的セマフォリン 6D (Sema6D) 欠損マウスを用いて行動試験を行い，神経細胞由来 Sema6D を介した中枢神経応答を評価した．さらに，同マウスを用いて高脂肪食負荷肥満モデルを行い，脂肪組織，肝臓における代謝及び骨髄における造血への神経細胞由来
Sema6D の関与を検討した．また，交感神経系の関与を検討するため，Sema6D 欠損マウスにおいて β3 アド
レナリン受容体（Adrb3）を欠損させ，高脂肪食負荷肥
満モデルを行った．さらに，in situ hybridization によ

図１

神経由来 Sema6D は不安応答を抑制する

図２

神経由来 Sema6D は全身代謝を制御する

図３

神経由来 Sema6D は代謝負荷下における造血を制御するる Sema6d 発現評価および質量分析イメージングによる神経伝達物質定量評価を行った．
【結果】
Open ﬁeld test, Elevated maze test な ど の 行 動 試
験を行なったところ，神経細胞特異的セマフォリン 6D(Sema6D) 欠 損 マ ウ ス（Sema6d cKO-Tau） で は 不 安 様 行動の増強を認めた（図１）．次に高脂肪食負荷を行った
ところ，Sema6d cKO-Tau マウスでは肥満抵抗性を認めた（図２）．また，肝臓，内臓脂肪，皮下脂肪，褐色脂肪への脂肪沈着が抑制された．高脂肪食はミエロイド系血球の造血を亢進させることが知られているが，Sema6d cKO-Tau
マウスでは高脂肪食負荷下において著明な好中球増加を認めた（図３）．さらに，Sema6D 欠損マウスにおいて Adrb3 を欠損させると肥満抵抗性の改善を認めた（図４）．
情動と自律神経応答をともに制御する部位として大脳辺縁系の扁桃体が知られている．in situ hybridizationを行ったところ，扁桃体の抑制性ニューロンが Sema6Dを高発現していた（図５）．さらに質量分析イメージン
グによる GABA の定量評価を行い，Sema6D 欠損マウ
スでは扁桃体の GABA 産生低下を認めた（図６）
．

24

93

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

GABA を産生することから，GABA 産生には Sema6D【考察】
以上の結果から，扁桃体の抑制性ニューロンに発の逆行性シグナルを介した細胞内代謝制御が関与するこ

現する Sema6D は GABA 産生を介して情動と自律神とが予想される．Sema6D を介した扁桃体抑制性ニュー

経応答を共役させることが明らかとなった．しかし，ロンの細胞内代謝制御について今後検討していく予定で

Sema6D による GABA 代謝のメカニズムは不明である．

ある．

Sema6D は Plexin-A1/4 のリガンドとして神経ガイダ【結論】

ンスを制御する一方，Plexin-A4 の受容体として細胞内扁桃体の抑制性ニューロンに発現する Sema6D は代謝を制御する（Nature Immunol 2018）．抑制性ニューGABA 産生を介して情動と自律神経応答を共役させる．

ロンに Sema6D が発現しており，抑制性ニューロンが慢性活動性 EB ウイルス病に対するボルテゾミブの抗腫瘍，抗炎症効果西尾美和子（東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科）

【目的】
図４

Sema6D は交感神経応答を抑制する

慢 性 活 動 性 Epstein-Barr virus 病（Chronic active
EBV disease: CAEBV）は，EB ウイルスに感染したＴ細胞もしくは NK 細胞がクローナルに増殖，多臓器に浸潤し，感染細胞の活性化が生じて，全身臓器の慢性炎症が生じる重篤な疾患である．現在の治療法は造血幹細胞移植のみであり，有効な薬剤はない．
本研究では，プロテアソーム阻害剤であるボルテゾミ
ブに着目し，細胞株と患者腫瘍細胞を用いて CAEBV に

図５

Sema6D は扁桃体の抑制性ニューロンに高発現する

対する抗腫瘍，抗炎症作用を検討した．
【方法，結果】
EB ウイルス陽性 T/NK 細胞株および CAEBV 患者腫瘍細胞を用いてボルテゾミブを作用させた．ボルテゾ
ミブは EB ウイルス陽性 T/NK 細胞株において生存細胞数抑制および Annexin V 実験によりアポトーシス誘導に働くことが示された．またウエスタンブロット法により ER ストレス関連分子（Bip）の発現誘導が確認され，Bip 下流にあり生存促進因子である NF-kB を抑制し，アポトーシスを誘導することを示した．
次に CAEBV 患者から得られた EB ウイルス感染細胞を含む PBMC をボルテゾミブで処理することにより，細胞生存の抑制を示した．qRT-PCR 法により炎症性サ
イトカイン（IFN-γ, TNFα- ）発現の抑制がみられた．

図６

Sema6D は GABA 産生を担う

最後に CAEBV の異種移植片移植マウスを作製し，ボ
ルテゾミブの効果を検討した．コントロール群と比較し2594

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成て有意に末梢血中 EBV-DNA 量が減少した．また炎症

トール合成酵素などのリン脂質合成系が蓄積することを性サイトカイン濃度の減少もみられた．

見出し，小胞体膜上の PI が減少した条件下ではオート【考察】

ファゴソーム形成が著しく阻害されることが分かった．

本研究で，ボルテゾミブは EB ウイルス陽性ＴまたはATG3-AH は他の一般的な AH とは異なる特有の生物物

NK 細胞の細胞生存および炎症性サイトカイン産生を抑理学的な物性を有しており，その特徴が機能にも必須で制した．ボルテゾミブは CAEBV に対して，抗腫瘍のみあることが分かった．

ならず，抗炎症効果を有した魅力的な治療薬であること【考察】
本研究を通して，小胞体膜上でも特にリン脂質合成がが示唆された．
【文献】

盛んな場所の近傍でオートファゴソーム形成が開始されYoshimori, M. et al .: Antineoplastic and anti-

ることが明らかになった１,２）．また，ATG3 の AH が他

inflammatory effects of bortezomib on systemicの分子では相補出来ないユニークな機能を果たしている

chronic active EBV infection. Blood Adv. 2021; 5(7):ことが示された．複雑な酵素反応の中で AH が実際にど1805-15. 2021.

のような機能を果たしているのかは，今後詳細に検証すべき課題である．
【文献】

オートファゴソーム形成とグリセロリン脂質生合成系の密接な関係
西村

１）Nishimura, T. et al.: Autophagosome formation
is initiated at phosphatidylinositol synthase-多喜

enriched ER subdomains. EMBO J., 36, 1719（東京大学医学系研究科）

1735 (2017).
２）Nishimura, T. et al.: Emerging roles of ATG pro-【目的】
オートファゴソーム形成はダイナミックな膜伸長や膜

teins and membrane lipids in autophagosome
formation. Cell Discov., 6, 32 (2020).

動態を伴う現象であるにも関わらず，膜脂質の供給源やリン脂質代謝系との関連に関しては不明な点が多く，またオートファジー関連（ATG）分子に存在する両親媒性 α ヘリックス（AH）がオートファゴソーム形成過程

腸内細菌が腸管運動機能に及ぼす影響とその機序白暁鵬（九州大学病院）

においてどのような機能を果たしているのか，その詳細な分子機構はよく分かっていない．そこで本研究では，これらの生物学的な謎に迫ることにした．
【方法】【研究背景】
腸内細菌は，宿主における糖質，脂質およびビタミン

生化学的な手法によりオートファゴソーム関連膜精製といった栄養素の消化・吸収に不可欠であると共に，短系の確立に取り組むとともに，オートファゴソーム初期

鎖脂肪酸や胆汁酸などの代謝物を介した全身の恒常性維構造体が蓄積する条件下でリン脂質代謝系に焦点を当て

持機構において重要な役割を果たしている．腸内細菌のた局在スクリーニング解析を行なった．ATG 分子に存

種類，局在，数量および多様性に影響を及ぼす主要因と在する AH の機能解析に関しては LC3 脂質化の最終ス

して腸管運動機能が注目されてきたことは理にかなうこ

テップに関与する ATG3 に注目した解析を中心に行い，とであるが１），最近の研究にて，腸内細菌自体が宿主のさらに ATG3-AH に共通した特徴を見出すため Python

腸管神経の発達や維持に必須の役割を果たし，逆に腸管を用いた配列比較解析に取り組んだ．

運動機能を制御している可能性が示唆されたが詳細は不【結果】明である．すなわち，腸内細菌叢変化が腸管運動機能異局在スクリーニング解析では，ホスファチジルイノシ

26

常を病態とする慢性便秘症，過敏性腸症候群さらには慢95

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

性特発性偽性腸閉塞症の原因となることを示すものであ経のアセチルコリン産生酵素（ChAT）の発現は各群間

る２）．本研究の目的は，腸内細菌を標的とする腸管運動に有意な差を認めなかったが，それと共局在する神経に機能異常に起因する疾患群の新規治療薬の開発を目指し

Vasoactive intestinal peptide (VIP) の発現は腸内細菌て，腸内細菌が腸管運動機能に及ぼす影響とその機序をが存在する３群は GF 群のそれと比較して有意に強い発解明することである．

現を認めた（図２, ３）
．

【方法】

【考察】

通常の腸内細菌を有するマウス (SPF)，無菌マウス

VIP 発現量は腸管運動機能と有意な正の相関を認め，（GF），単一菌種定着ノトバイオートマウス（EC: E.coli

腸内細菌が腸神経の発達を制御することが示唆された．

或は LB：Lactobacillus）に，in vivo 消化管運動機能，さらに，EC（グラム陰性菌）群における VIP 発現量ex vivo 腸管平滑筋収縮機能，Nanostring による腸管組と腸管運動機能は LB（陽性菌）群と比較して有意に亢

織遺伝子発現，蛍光免疫染色による筋間神経叢の蛋白質

進しているため，Toll like receptor (TLR) や腸管自然発現評価を行った．

免疫の関与が考えられた．TLR 経路が活性化されない【結果】

MYD88－/－TRIF－/－マウスを用いて，無菌条件，SPF 環

胃排出機能は各群間に有意な差を認めなかった．腸管運動機能は，GF 群でその他の群と比較して有意に低境条件およびノトバイオート条件における VIP 発現量と腸管運動機能を評価する予定である．

下し，経口金属ビーズの透視下観察では特に上部小腸の蠕動低下を認めた（図１）．腸管平滑筋収縮能に関して，カルバコール刺激による筋原性収縮能は各群間に有意な差を認めなかったが，Field stimulation による収縮性は SPF 群と菌定着群で，GF 群と比較してコリン作動性神経が亢進し，強い収縮性を示した．一方，腸神

図２

図１

27
96

図3

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成【文献】

るヒストン修飾のゲノムワイドなプロファイリングと，

１）Quigley, E.M.: Microﬂora modulation of motil-

RNA-seq による遺伝子発現解析を行った．これらの解

ity. J Neurogastroenterol Motil, 17(2): p. 140-7.

析を統合し，高炭水化物食下でヒストン修飾酵素によっ2011.

て発現制御を受ける遺伝子群を同定した．現在，変異体２）Barbora, W.: Gut microbiota-motility interregu-

や D. sechellia において，これらの遺伝子群の発現調節

lation: insights from in vivo, ex vivo and in silico

不全によって，どの組織にどのような異常が生じている

studies. Gut Microbes. 14(1): 1997296. 2022.

かの解析を行っている．
２）高炭水化物食下での生殖機能を支える Activin 経路の解析

栄養への応答と代謝恒常性を支える全身性およびエ
ピジェネティック制御機構の解明
服部佑佳子（京都大学大学院生命科学研究科）

体 細 胞 と は 対 照 的 に， 高 炭 水 化 物 食 下 に お い て
Activin 経路はオスの生殖細胞で高く発現する遺伝子群を正に制御することを見出していた．そこで現在，生殖細胞特異的に Activin 経路を阻害したオスの生殖能力
や，精子数，精巣における遺伝子発現や代謝産物量の解【背景・目的】
栄養環境は，個体の成長のみならず，成体や次世代に析を行っている．
【考察】

まで影響を与える．しかし，様々な栄養環境に動物がど

今後，栄養バランス変化に対して，クロマチン構造がのように応答し適応しているかには，不明な点が多い．

どのように調節されて適応を支えているか，そして，ど

我々はこれまでに，ショウジョウバエ近縁種群のマルチの組織における遺伝子発現調節が適応に役割を担っていオミクスによる比較解析を行ってきた．そして，自然るかを中心に解析を進めていく．一方，生殖細胞におけ界で様々な果物を食べるキイロショウジョウバエ（D.

る Activin 経路については，精巣の代謝フラックス解析

melanogaster）の幼虫では，全身性の TGF-β/Activinなども行うことで，生殖機能を支える上での役割を明ら

シグナル伝達経路（Activin 経路）が，筋肉や腸，脂肪かにする予定である．

体などの体細胞において代謝遺伝子の発現を負に制御することで，代謝の恒常性を維持し，高炭水化物食下での幼虫期の成長に寄与することを見出した．一方，自摂食関連 GPCR の活性化・不活性化における分子

然界で低炭水化物の果物しか食べないセイシェルショウ

メカニズム解析

ジョウバエ（D. sechellia）では，そのような機構が働

濱本明恵（岐阜大学工学部）

かず，高炭水化物食に適応できないことを明らかにした(Watanabe et al.: Cell Reports, 2019)．本研究課題では，ヒストン修飾酵素によるクロマチン構造の制御が，【目的】

高炭水化物食への適応に果たす意義とその分子機構につエクソソームは直径 50-150 nm ほどの大きさで，細いて解析を行う．加えて，オス成熟個体の生殖細胞にお胞から分泌される細胞外小胞である．細胞間の情報伝達

ける Activin 経路が，高炭水化物食下での生殖機能に果に重要な役割を担い，近年ではドラッグデリバリーシ

たす役割の解明を目指す．

ステム（DDS）としての利用が期待されている．我々【方法・結果】

は，このエクソソームにＧタンパク質共役型結合受容体１）高炭水化物食下での個体成長を支えるクロマチン制（GPCR）を含有させ，DDS のように活用することを考御機構の解析

えた．しかし，現在エクソソームに存在する GPCR は

D. melanogaster の 野 生 型 お よ び 変 異 体， そ し て，

報告数が少なく，中でも摂食関連 GPCR の報告はない．

D. sechellia の幼虫全身を用いて，CUT&RUN 法によ

そこで，今回はメラニン凝集ホルモン受容体（MCHR1）28

97成人病の病因・病態の解明に関する研究助成に着目した．MCHR1 は摂食中枢で広く発現しており，（CABG），経皮的冠動脈形成術（PCI）が広く普及して拮抗薬投与・欠損マウスによりヤセ傾向を示すことからいるが，治療選択に関しては多く議論されている．

摂食亢進 GPCR として知られている．

患者個人の疾患背景に基づいて算出されるリスク予測
モデルは，各々の患者が治療を選択する上で一助となり【方法】
MCHR1 安定発現細胞から細胞培養液を回収し，ア

うる．血行再建前のベースラインの特徴（年齢，腎機フ ィ ニ テ ィ ー 精 製 キ ッ ト で エ ク ソ ソ ー ム を 精 製 後，

能，糖尿病，左室駆出率，左冠動脈主幹部病変，冠動脈HEK293 細胞に添加し，WB 法，RT-PCR，細胞免疫染

病変の解剖学的な複雑さ（SYNTAX score），喫煙，慢

色法，レポーターアッセイにより MCHR1 の発現と機性閉塞性肺疾患，末梢動脈疾患）をもとに，血行再建能を解析した．

（PCI, CABG）後，５/10 年間の死亡，５年間の死亡/心【結果・考察】筋梗塞/脳卒中の予後を予測するモデルとして SYNTAXMCHR1 安定発現細胞の細胞培養液から精製したエScore II 2020 が提唱されているが，日常臨床への適応

クソソームを用いて WB 法，RT-PCR 法を行ったとこという観点では，十分な検証がなされていない．

ろ，エクソソームマーカーおよび MCHR1 の存在が確【方法・結果】

認された．また，エクソソーム放出量や MCHR1 の含

CREDO-Kyoto PCI /CABG レジストリーは，冠動脈有量はリガンド添加により増加する傾向が見られた．さ

血行再建術（PCI または CABG）を初めて施行した連らに，HEK293 細胞に MCHR1 含有エクソソームを添

続 30866 症例に対して，５年間，有害事象をフォロー

加して３時間後に MCHR1 の発現が確認された．また，した日本で行われた観察研究である．このうち，重症MCHR1 安定発現細胞と HEK293 細胞の 48 時間の共冠動脈病変（三枝病変または左主幹部病変）を有する

培養においても MCHR1 がエクソソームを介して送達

7361 症例を対象に SYNTAX Score II 2020 の正確性をされる様子が確認された．続いて，送達された MCHR1

検討，その結果を基に，各々の患者において PCI またが機能的に働くかレポーター解析を行ったところ，MCH

は CABG のいずれを選択すべきかの検討も行った．

添加により NFAT 活性が上昇した．最後に，エクソソー

SYNTAX Score II 2020 における５年後の予測死亡

ムに存 在する MCHR1 は糖 鎖付加されていたことから，率と CREDO-Kyoto PCI/CABG レジストリーにおける糖鎖付加阻害剤（ツニカマイシン）処理および MCHR1

５年後の死亡率とは，PCI 後，CABG 後ともに非常に高の糖鎖付加部位を置換した変異体を現在解析中である．

い相関が示された１）．一方で死亡・心筋梗塞・脳卒中の以上より，エクソソームに MCHR1 が発現し，エクソ

複合エンドポイントの予測能力には乏しかった．

ソームを介して MCHR1 が他の細胞へと送達され機能予測精度の高い５年後の死亡に関しては，日常臨床にすることを初めて明らかにした．本研究により，エクソ

おける冠動脈血行再建術の選択（PCI または CABG）に

ソームによる GPCR の送達機構が解明され，新規 DDS

適用できるように PCI と CABG の５年後の予測死亡率としての GPCR 含有エクソソームの活用が期待される．

の差をもとに解析を行った．予測死亡率の差（PCI 後の予測死亡率-CABG 後の予測死亡率）が 4.5% 以上であ

虚血性心疾患に対する精密医療の推進
原弘典

れば CABG が望まれ，それ以外のケースでは，PCI あ
るいは CABG の選択において予後に差は認めなかった．
【考察】（東京大学医学部附属病院）

日本における日常臨床のレジストリーデータから，統計学的アプローチをもとに PCI または CABG の選択基

【背景・目的】準を提示した．最終的な治療選択は，SYNTAX Score

高齢化に伴い，冠動脈内の動脈硬化の進行が原因でII 2020 で考慮されている患者背景のみによるわけでは起こる虚血性心疾患は増加し，多様化も進行している．

ないが，リスク予測モデルが治療選択を提示することは，

現在，重症冠動脈病変患者に対し，冠動脈バイパス術

患者の治療選択に役立てられると考えられる．精密医療2998成人病の病因・病態の解明に関する研究助成のために今後もリスク予測モデルの刷新，創出が望まれレコンディショニング効果との関連について特に糸球体る．

濾過率の調整を担う糸球体尿細管フィードバック機構に【文献】

関与するアニオントランスポーターの発現調整に注目し１）Hara, H., Kimura, T., Serruys, PW. et al.: Exter-て検討することを目的とした．本研究を通じ，AKI にお

nal Validation of the SYNTAX Score II 2020. J

ける KAT5 を介した DNA 損傷修復応答の病態生理的重Am Coll Cardiol 2021; 78(12): 1227-1238.

要性，アニオントランスポーター調節機構の分子基盤が世界で初めて明らかになり，AKI の新規治療標的が同定

高齢者急性腎障害における DNA 修復因子を介したアニオントランスポーター制御機構の役割の解明
菱川される可能性が期待される．
【研究の成果】
野生型（WT），近位尿細管特異的 KAT5 ノックアウ
トマウス（KO）での両側腎虚血再灌流 (IR) モデルを彰人
（慶應義塾大学医学部）【研究成果の概要】
近年，連続した２回目の急性腎障害（AKI）は１回目より腎障害が軽減されるというプレコンディショニング効果が報告されているが，DNA 損傷修復との関連は明
らかではなかった．本研究では AKI およびそのプレコ
ンディショニング効果と DNA 損傷修復との関連について，尿細管細胞における DNA 修復因子 KAT5 を中心に解析を行ない，KAT5 が Cl チャネル KCC3 発現調節を介して AKI のプレコンディショニング効果に関与する可能性を見出した．
【研究の背景・目的】
慢性腎臓病（CKD）患者数は世界的に増加傾向にあり，

図１

有病率は 10% を超え，年間約 100 万人の死亡原因となっている．一方，急性腎障害（AKI）も増加傾向にあり，
米国ではこの 10 年で２倍以上に増加している．AKI 症
例の一部は CKD に移行することや，特に高齢者においては AKI の増悪リスクが高く，AKI 予防策の確立は腎臓病診療における最も重要な課題の一つである．
近年，連続した２回目の AKI は 1 回目より腎障害が軽減されるという「プレコンディショニング効果」が報告されており，AKI 予防策を解明する現象と期待されているが，その分子基盤は明らかではない．申請者は最近，
腎糸球体ポドサイトにおける DNA 二本鎖切断（DSB）
修復因子 KAT5 の発現低下が DNA 損傷修復不全に関連する DNA メチル化変化を惹起する可能性を見出した（Cell Rep 2019）．AKI では DNA 損傷が惹起されるこ

図２とも報告されており，今回 KAT5 と AKI およびそのプ

30

99成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

作成し，プレコンディショニング（PC. １週間前の IR）

K., Hashiguchi, A., Kinouchi, K., Yoshimoto, N.,の有無で比較した．その結果，WT では IR により腎皮

Nakamichi, R., Akashio, R., Sugita, E., Azegami, T.,

質の DNA 二本鎖切断（DSB）マーカー γH2AX, KAT5

Monkawa, T., Suematsu, M., Itoh, H.: DNA repairが増加するとともに，近位尿細管 Cl チャネル KCC3 がfactor KAT5 prevents ischemic acute kidney injury

低下，尿中アデノシンが増加し尿細管糸球体フィード

through glomerular filtration regulation. iScience.

バック（TGF）が示唆された．IR 施行後 1 週間で再度2021 Nov 14; 24(12): 103436.

IR を施行した場合，初回 IR に比べて UN, Cr 上昇は抑【学会発表】

制された（プレコンディショニング効果）．PC(＋) 群

菱川彰人，林香，久保亜紀子，宮下和季，橋口明典，吉では PC(－) 群と比較し，腎皮質の KAT5 発現が増加，

本憲史，中道蘭，杉田絵里那，赤塩理起，門川俊明，末松KCC3 低下が抑制され，尿中アデノシンは減少し TGF

誠，伊藤裕．DNA 修復因子 KAT5 を介した尿細管糸球抑制が示唆された．また近位尿細管特異的 KAT5 ノッ

体 フィードバック制御

第 64 回 日本腎臓学会学術総会

クアウトマウスでは KCC3 発現が低下し，PC 効果も減弱した．質量分析イメージング（MALDI-IMS）を用いた検討においても TGF 亢進を示唆するアデノシン（m/z 268.104）の皮質集積は，WT では IR に伴い亢進し，PC でその集積が減弱したが，KO では WT と比較し亢

概日リズム障害発症メカニズムの理解に向けた睡眠リズム制御機構の解明
平野有沙（筑波大学）

進し，
PC による有意な分布変動を認めなかった（図１）．
したがって，KAT5 を介した TGF 減弱の PC 効果への関与が示唆された（2020 年 8 月 日本腎臓学会学術総会「優秀演題賞」）．

【目的】
睡眠は動物に不可欠な生理行動である．一時的な断そして，ヒト腎生検検体では，AKI 症例で DSB マー

眠は認知・学習機能や注意力の低下をもたらすが，断カー γH2AX が亢進し KCC3 発現が低下するとともに，続的な不眠によって生物は様々な失調をきたし，重篤な

eGFR が KCC3 発現と正の相関・γH2AX と KCC3 発現

場合には死に至る．重要なことに，睡眠の量に加えてタが負の相関を認めた（図２）．さらに，Antimycin A 投イミング（位相）も我々の健康に強く影響を与える．生

与によりヒト培養尿細管細胞（HK2 細胞）に障害を惹物の行動や代謝は約１日周期のリズムを示し，このよう起した結果，２回目の投与では１回目に比して KAT5，

な概日性の生理リズムは概日時計と呼ばれる体内時計に

KCC3 が増加，KCC3 プロモーター領域のクロマチンア

よって制御される．24 時間型社会と呼ばれる現代社会

クセシビリティ上昇，ChIP 解析で同部位の KAT5 結合においては，不規則な生活による概日リズム障害が社会が増加した．

問題となっている．規則正しいリズミックな生理現象は以上の結果より，KAT5 は AKI に伴う DNA 修復に

生体恒常性の維持に必須であり，概日リズム障害とメタ

加え，KCC3 発現のエピゲノム調節を介した糸球体濾過

ボリックシンドロームや精神疾患の発症には強い相関が量調節に関与している可能性が示唆された．

見られる．そのため，概日時計から生理リズムへの出力

本研究の成果に基づき，KAT5 あるいはアニオントラ

経路の理解は，概日リズム障害によるメタボリックシン

ンスポーターをターゲットとした AKI の予防や治療法・

ドローム発症メカニズムとその予防に大きく寄与すると

CKD 進展の予防法が確立されればその臨床的意義は非期待できる．概日時計の中枢は視床下部の視交叉上核

常に大きいと考える．

（SCN）に存在し，個々の神経細胞は自律振動する分子

これらの成果を，iScience 誌にて報告した．

時計を内在する．SCN 時計は外界の明暗サイクルに同〈2021 年度の代表的な発表論文または学会発表題名〉

調し，他の脳領域や末梢組織に時刻情報を出力すること【発表論文】

で生理リズムを作り出す．概日時計から生理リズムの基

Hishikawa, A., Hayashi, K., Kubo, A., Miyashita,本である睡眠覚醒リズムへの出力は極めて重要なプロセ

31100

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成スである．そのため，概日時計の出力系の理解なくし抑制し，そのときの SCN における PER2 発現リズムをては生理リズム形成の根幹を理解したとは言い難いが，解析した．同時にマウスの行動リズムを測定し，PER2

SCN の “細胞内” の時計発振機構に比べて生理リズム

リズム，すなわち SCN における時計機能との相関を解の出力系を司る “SCN 外” の神経ネットワークの理解析 し た．SCN の PER2-LUC リ ズ ム の 解 析 に は，SCNは進んでいない．そこで本研究計画では概日時計の重要全体からの発光をクロノス HT（ATTO）を用いて経時な出力である睡眠リズムに着目し，SCN から投射され測定する方法と，CCD カメラを用いてシングルセルレ

る神経細胞の時刻・細胞特異的な操作を行うことで，睡ベルでイメージングする方法を用いた．さらに，赤色ル

眠覚醒リズムの制御メカニズムとその破綻がもたらす個シフェラーゼを用いた in vivo 非侵襲イメージングも行

体への影響を明らかにする．

なった．イメージングには赤色ルシフェラーゼである【方法】

AkaLuc をマウス脳内に発現させてルシフェラーゼの発本研究は，神経トレーサーを利用して SCN から神経

光基質を投与し，自由行動下のマウスにおける発光を投射される細胞群の同定を行うとともに，人為的に神経

MIIS in vivo imager を用いて観察した．

活動を操作することでその神経連絡の睡眠覚醒サイクル【結果】

制御における役割を明らかにする．特に，VLPO に投射

蛍光ラベルした SCN⇒VLPO 神経について，SCN にしている SCN 神経に着目し，その個性を理解するとと発現している神経ペプチドに対する免疫組織染色の結果

もに睡眠覚醒リズム形成における寄与を調べて行動リズ

から，VLPO に投射する SCN 神経は腸管作動性ペプチ

ムを生み出す分子・神経機構を明らかにすることを目指

ド（VIP）を主に発現し，アルギニンパソプレシン（AVP）

した．まずはじめに，投射先特異的に SCN の神経細胞

神経とガストリン放出ペプチド（GRP）とは共局在しな群をラベルし，その性状解析を行った．イヌ科アデノウ

いことが明らかとなった．さらに，DREADD を用いてイルス 2 型 (CAV2) は軸索末端から取り込まれ，逆行SCN⇒VLPO 神経を活性化させたところ，マウスの自発性に輸送されて細胞体において目的遺伝子を発現するた行動が有意に減少した．興味深いことに，DREADD にめ，CAV2 を VLPO に導入することで，その領域にのよる行動抑制の効果は夜間にしか観察されなかった．まみ投射している神経細胞の遺伝子操作が可能である．さた，EEG/EMG による睡眠覚醒解析の結果，マウスのらに，薬理遺伝学的手法（DREADD）を用いて，SCN

覚醒時間が有意に減少することが明らかとなった．この→ VLPO 神経を人為的に活性化したときのマウス自発結果は SCN から VLPO に投射する神経回路が直接的に行動および睡眠覚醒状態への影響を解析した．一方，神睡眠覚醒制御を行い，マウス自発行動の変化をもたらし

経毒素であるテタヌス毒素（TeNT-LC）を用いて細胞ていることを示唆する．一方，TeNT-LC を発現させたの神経小胞を阻害した．具体的には，CAV2 と TeNT-

マウスは徐々にリズムを失い，明暗サイクルにおいてもLC および EYFP を発現する AAV を用いて VLPO に投行動リズムが大きく減弱した．さらに恒暗条件において射する SCN 神経のみに神経毒素を発現させた．そのあも行動リズムはほぼ消失していた．TeNT-LC ではなくと赤外線センサーを用いてマウス行動リズムを測定しGFP を発現させたコントロールマウスにおいてはウイた．

ルスの投与後も明瞭な行動リズムが観察されたが，これさらに TeNT-LC を発現させたマウスにおいて，中枢らの結果から，マウスにおいて睡眠中枢に神経軸索を伸時計である視交叉上核（SCN）の時計機能が失われる

ばしている SCN 神経群は行動リズムの形成に必須の役のかどうかを調べるため，SCN のイメージングを行う．

割を果たしていることが明らかになった．一方，TeNT-

時計タンパク質 PER2 は振幅の大きい発現リズムを示す

LC を発現させたマウスにおいて PER2-LUC の発現リズため，PER2 にルシフェラーぜ（LUC）を融合させたタムは視交叉上核（SCN）全体で観察しても，シングル

ンパク質を用いることで PER2 タンパク質リズムを発光

セルレベルで観察しても影響は観察されなかった．この活性によってモニターできる．そこで Per2-Luc ノック

ことは，TeNT-LC マウスにおいて SCN の時計機能は正インマウスを用いて VLPO に投射する SCN 神経のみを常に働いている一方，SCN からの出力経路に異常があ

32

101

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

るために行動（睡眠）リズムが失われたことを示唆する．
Aka-Luc を用いた非侵襲計測を試みたが，発光基質ア
カルミネでは発光が長続きしないことが判明した．そこ

生理的アディポネクチン受容体・Ｔ-カドヘリンの血中可溶型フォーム（可溶性Ｔ-カドヘリン）の生で，Per2-Luc ノックインマウスを用いて，自由行動下

理病態学的意義のマウスからイメージングを行なったところ，明瞭な概福田士郎（大阪大学大学院医学系研究科）

日リズムが観察された．特に TeNT-LC を発現させたマウスからもリズミックな発光が観察されたことから，やはり in vivo においても時計機能は失われていないことが明らかとなったが，今後，さらなる検証が必要である．
【考察】

【背景】
GPI ア ン カ ー 型 膜 タ ン パ ク 質 で あ るＴ-カド ヘ リ ン（T-cad）は，脂肪細胞特異的に分泌されるアディポネ

本研究では，SCN から VLPO への神経投射に焦点をクチン (APN) と非常に高い特異性と親和性で結合すあててその性状解析および機能解析を行なった．その結る１）．APN は血中に三量体，六量体，多量体として存果，SCN⇒VLPO 神経は主に GABA および VIP 神経で在し，特に多量体 APN と２型糖尿病や冠動脈疾患の関構成されており，SCN の中でも特異的な細胞集団を形連が臨床疫学的に示されているが，この多量体 APN と成すると考えられた．特に GRP 神経が存在する外側コ

生理的濃度域で結合するのは T-cad のみである２）．

アの部分には，ほとんど VLPO に投射する神経が認め我 々 は 近 年， ヒ ト 血 中 に 130kDa 体，100kDa 体，

られなかったことは興味深い．一過性に SCN⇒VLPO

30kDa 体の合計３種類の可溶型 T-cad 分子が存在する

神経を活性化させた際にはマウスの睡眠量の増加が観察こと，またその濃度がメタボリックシンドロームに関されたが，一過性の神経活動の誘導の効果は夜間にのみ連する複数の臨床パラメータと相関することを見出し観察された．つまり，この効果には時刻依存性が存在した３）．

ており，SCN の神経活動がマウスの休息期である昼間【目的】に上昇するという先行知見を考えると夜行性のマウスに血中可溶型 T-cad の生理的・病態学的意義を明らか

おいて昼に神経活動が活発になり，神経連絡を通して視にする．

索前野の神経を活性化することで睡眠を誘導していると【方法】

考えられる．また，神経毒素を用いて SCN⇒VLPO 神

まず臨床研究として，健常者や様々な病態における血経の神経連絡を阻害したところ行動リズムの減弱が観察

中可溶型 T-cad 濃度変化を検討する．前者は人間ドッされたが，SCN のイメージング実験により SCN 内の時

ク受診者を対象とし，健診レベルで明らかな疾患のない

計因子の発現リズムには大きな異常は見られなかった．

受診者を「健常」と定義し，他疾患を有する受診者と比つまり，TeNT-LC マウスで観察された睡眠リズムの消較する．この場合「疾患」は必然的に慢性期疾患が中心

失は，SCN の時計機能が破綻したためではなく，出力となるため，後者は主に急性期疾患（心筋梗塞，敗血症，

経路の異常（SCN⇒VLPO 経路）であると考えられる．

COVID-19 など）を集積し，経時的な変化を含め解析する．
【結果・考察】急 性 期 疾 患 の 一 つ と し て ST 上 昇 型 心 筋 梗 塞 患 者の 血 中 T-cad 濃 度 を 検 討 し た． 血 中 130kDa お よ び
100kDa T-cad 濃度は病院搬入日をピークとして経時的に低下した．さらに，搬入日の血中 130kDa および100kDa T-cad 濃度が高く，かつ血中 APN 濃度が低い
患者は，他の患者と比較して心筋梗塞範囲が有意に大きかった４）．

33
102

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

健常者や他の急性期疾患は症例集積の段階であり，今マウスを作成したところ，LUBAC 複合体が消失し活性後順次解析をすすめる．

中心の HOIP を欠失したマウスと同時期に胎生致死に【文献】なることを見出した１）．

１）Fukuda, S. et al.: J Biol Chem., 292, 7840-9(2017).

LUBAC の安定化に着目してさらに解析したところ，
生化学的実験より HOIL-1L と SHARPIN の UBL の N

２）Kita, S., Fukuda, S. et al.: Elife., 8, e48675(2019).

末側に存在する α-ヘリックスに富んだ領域（LTM モ
チーフと命名）が安定な複合体形成に不可欠であること

３）Fukuda, S. et al .: 2021. J Clin Endocrinol

Metab., 106, 1333-44 (2021).
４）Iioka, M., Fukuda, S. et al .: J Atheroscler

Thromb., Online ahead of print. (2022).

に気付いた．そこで LUBAC の３サブユニットの結合に必要な領域の共発現系を構築し，共結晶構造解析に成功した（図２）．その結果，HOIL-1L と SHARPIN の２つの LTM モチーフが１つドメインを形成することで安定な結合体形成に寄与することを発見した．また LTM モ

直鎖状ユビキチン鎖が惹起する疾患の検索と制御戦略
藤田宏明

チーフの変異によって LUBAC が著減し，細胞死が誘発されることを見出した．これまでに LUBAC 阻害により
Ｂ細胞リンパ腫の増殖を抑制できることが報告されてい（京都大学大学院医学研究科）

たが，LTM の相互作用を抑制するステープルペプチドは LUBAC を減少させることでＢリンパ腫細胞の増殖を新奇のタンパク質翻訳後修飾である直鎖状ユビキ抑制することも示した．

チン鎖 ( 直鎖 ) を特異的に生成する唯一の酵素である
LUBAC ユビキチンリガーゼ (E3) は，催炎症性転写因
子 で あ る NF-κB 活 性 化， 細 胞 死 の 抑 制 に 関 与 す る．
LUBAC は直鎖生成の活性中心を有する HOIP，アクセ
サリー分子である HOIL-1L, SHARPIN の三者複合体から構成される（図１）
．

図2
図１

LUBAC 三量体形成部位の構造

LUBAC リガーゼの模式図
現 在， 臨 床 応 用 を 視 野 に HOIL-1L LTM/SHARPIN

これまでに我々は LUBAC の 3 サブユニット全てを欠LTM 結合を阻害する低分子化合物の開発を行なってい損させた細胞を樹立し，細胞死の制御に必須な LUBAC

る．これまでに LUBAC3 サブユニットの結合領域を大のドメインを探索した．その結果，LUBAC の３量体

腸菌から精製し，精製タンパク質を用いて３サブユニッ形成に必要な HOIP の２つの UBA ドメインと HOIL-

トの結合を評価する FRET 系を構築した．その FRET

1L と SHARPIN に存在する UBL ドメインを欠損させる系を用いて LTM 結合を阻害する小分子化合物のスクと，LUBAC が不安定化し，直鎖状ユビキチン鎖生成活

リーニングを行った．またカウンターアッセイとして性が顕著に減弱することで細胞死が起こることを発見しHOIL-1L /HOIP 間の結合を得られた化合物が阻害しなた１）．とりわけ，HOIL-1L の UBL と HOIP との結合がいか解析を行った．得られた化合物でＢリンパ腫細胞をより重要であるとの知見を得て，HOIL-1L の UBL 欠損

処理すると，LUBAC 発現量の減少に加え，細胞増殖を

34

103

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成抑制できることを見出した．

ビキチンリガーゼドメインのタンパク質を大腸菌より大上記に加え，別の角度から LTM 阻害剤の開発もすす

量精製し，化合物アレイにより結合化合物の探索を行っめている．近年 DEL library を用いた化合物スクリー

た．得られた化合物に関しては HOIL-1L の機能を阻害

ニングが精力的に行われている．DEL library は数十億

し，LUBAC の直鎖活性を上昇させるか検討を進める．

の化合物にそれぞれ DNA タグが結合した化合物ライブ【文献】

ラリーで，タンパク質とライブラリーを混ぜ，タンパ

１）Fujita, H., Tokunaga, A., Shimizu, S., Whiting,

ク質に結合した化合物を次世代シークエンサーで配列

AL., Aguilar-Alonso, F., Takagi, K., Walinda,

を読み，化合物を同定するものである．DEL ライブラ

E., Sasaki, Y., Shimokawa, T., Mizushima, T.,

リーによる LTM 結合化合物の探索にあたり，HOIL-1L

Ohki, I., Ariyoshi, M., Tochio, H., Bernal, F.,

LTM/SHARPIN LTM のタンパク質を精製した．LTM

Shirakawa, M., & Iwai, K.: Cooperative domain

結合部位は数十アミノ酸からなる非常に小さな領域であ

formation by homologous motifs in HOIL-1L

るが，それぞれの領域を大腸菌に共発現させ精製したとand SHARPIN plays crucial roles in LUBAC sta-

ころ，HOIL-1L LTM/SHARPIN LTM 二者複合体を大bilization. Cell reports, 23, 1192-1204 (2018).

腸菌からほぼ夾雑物なく精製することに成功した．実際

２）Fuseya, Y., Fujita, H., Kim, M., Ohtake, F.,に精製した LTM 領域のタンパク質で DEL ライブラリー

Nishide, A., Sasaki, K., Saeki, Y., Tanaka, K.,による結合化合物を探索したところ，類似構造を持つ化

Takahashi, R. & Iwai, K.: The HOIL-1L ligase

合物をいくつか取得することができた．今後，それぞれ

modulates immune signaling and cell death viaの化合物クラスターごとに LUBAC の機能阻害効果など

monoubiquitination of LUBAC. Nature Cell Biol-を検討する予定である．また実験ベースの化合物探索だ

ogy (2020), 6, 663-673

けでなく，結晶構造から AI 技術を用いて LTM 結合に結合・阻害する化合物の in silico スクリーニングも行っている．これらの解析を通して，特異性の高い LTM 阻
害剤の取得を目指している．
また，LTM 阻害だけでなく LUBAC の機能賦活化に

ノンレム睡眠特異的脳波パターンを作り出す神経回
路の解析
本城

咲季子
（筑波大学）

向けた解析を行なっている２）．LUBAC は直鎖を生成す
る活性中心である HOIP に加え，HOIL-1L にもユビキ
チンリガーゼ活性が存在する．これまでに HOIL-1L の睡眠・覚醒を通じた大脳皮質神経活動における視床マ

同活性を消失させると LUBAC の直鎖状ユビキチン鎖

トリックス細胞の役割を明らかにする生成能が亢進して，LUBAC の２つの機能，NF-κB 活【背景】

性化能と細胞死抑制能が顕著に亢進することを見いだ

視床は末梢の感覚情報を大脳皮質に伝達する必須の役

している２）．その詳細なメカニズムを解析から，HOIL-割を担っている．睡眠時，我々は外部感覚情報を認識し

1L は自分自身をモノユビキチン化し，さらに HOIP がないため，視床の活動が低下する事が睡眠に重要ではな

そのモノユビキチンを認識し，直鎖を付加することでいかと考えられてきた．これまでに我々は，視床の感覚

LUBAC 自身が直鎖化されること，さらに LUBAC の直情報の伝達を担う神経群（コア細胞）は睡眠覚醒制御に鎖化が LUBAC の機能を抑制することを見出している．

関与しない事，大脳皮質のほぼ全域に広く，非特異的にまた HOIL-1L の E3 活性を欠失させたマウスを作出し，投射している神経群（マトリックス細胞）が高頻度で発12ヵ月齢までは顕著な症状は示さないが，全ての臓器に火すると覚醒を促進する事を報告した．これらの神経群

おいて直鎖の生成が顕著に亢進することを見出している．

が睡眠時に果たす役割は明らかではなかったが，我々自上記より HOIL-1L のユビキチンリガーゼ阻害剤は身の予備的なデータから，マトリックス細胞がノンレム

LUBAC 機能賦活剤となると考えられる．HOIL-1L のユ

35
104

睡眠において果たす役割に着目した．

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成【方法】

波の時系列を解析した結果，大脳皮質徐波と視床マト

視床マトリックス細胞の睡眠制御における役割を明ら

リックス細胞の発火が同期している事が明らかになっかにするために，以下の三つの観点から解析を行った．

た．具体的には，大脳皮質徐波のうち大脳皮質神経群①睡眠・覚醒サイクルを通じた視床マトリックス細胞のが脱分極して発火する ON ピリオド中には視床マト

活動解析

リックス細胞も発火しており，大脳皮質神経細胞が同

自由行動下のマウスの睡眠覚醒サイクルを通じて，大調して活動を低下させる OFF ピリオドには視床マト

脳皮質の神経活動を測定するために NeruoNexus 社製

リックス細胞の発火も低下する事を見出した．

シリコン微小電極をマウス脳内に慢性的に留置する手術②光遺伝学を用いて，ノンレム睡眠中に，視床マトリッを行った．同時に脳波・筋電電極も挿入した．手術から

クス細胞のバースト発火を模倣する 20 ミリ秒の光刺十分に回復した後に神経活動記録装置にマウス頭部の電激を行った．その結果，大脳皮質において徐波様の局

極のコネクターを慢性的に接続し，馴化期間を置いた．

所電位パターン，および OFF ピリオド様の協調的なマウスの行動が安定した後，自由行動下のマウスにおい活動電位低下が観察された．

て 24 時間の活動電位・脳波・筋電記録を行った．記録③ AAV によりジフテリア毒素，あるいは細胞死を誘導

データはオフラインの解析において，１．脳波・筋電にする改変型カスパーゼを視床神経核（CM, VM）導入

よる睡眠覚醒判定と２．活動電位を波形に基づいて分けしてから 1, 2, 3, 4 週間後に 24 時間の睡眠覚醒記録，る Spike Sorting に用いられた．この二つの解析を完全

睡眠覚醒段階判定を行った．さらに，ノンレム睡眠中に独立に行った後，それぞれの結果を統合して睡眠時のの脳波のパターンを解析したところ，高周波数成分は発火パターンの解析を行った．

変化しないのに対し，0.5-4Hz の低周波数成分は二週②視床マトリックス細胞の活性化

間目から顕著に低下していた．

視床マトリックス細胞を特異的に標識するために，マ【考察】

トリックス細胞のマーカーとされる Calb1 遺伝子のプ

我々の結果から，視床マトリックス細胞の発火は大脳

ロモーター下で Cre リコンビナーゼを発現させた遺伝皮質のノンレム睡眠特異的脳波，徐波と同調している事

子改変マウス（以下 Calb1-Cre）を用いた．Calb1-Creが明らかとなった．また，ノンレム睡眠時のマトリックの視床 Ventromedial Nucleus (VM) に光遺伝学受容体

ス細胞の活動を模倣すると徐波が誘導されること，マトと EYFP を発現するアデノ随伴ウィルスベクター（AAV-

リックス細胞から構成される視床 VM 核，および視床EF1a-DIO-C1V1 (E162T)-TS-p2A-EYFP-WPRE） を 局

CM 各の神経を除去する事により，徐波が減弱する事を所感染させた．また光ファイバーを脳内に埋め込み，青明らかにした．これらの結果から視床マトリックス細胞

色（473 nm）の光を照射することで神経細胞の活性化

が睡眠の深さの指標である徐波の生成に寄与している事を行った．

が明らかになった．視床マトリックス細胞，および視床③視床マトリックス細胞の活動阻害

神経核 CM はそれぞれ，覚醒時の高頻度・持続的な発脳波の生成に果たす役割を解析するために，ジフテリ

火パターンで発火すると覚醒状態を促進する事がこれま

アトキシン，あるいは細胞死を誘導するためのカスパーでに報告されている．従って，これらの視床神経細胞はゼを視床神経核に AAV を用いて導入して細胞死を誘導

睡眠・覚醒ステージを通じてダイナミックに活動パター

した．これらのマウスにおいても脳波・筋電電極を挿入

ンを変化させながら，覚醒時には覚醒状態を促進し，ノし，AAV 局所注入から四週間にわたって睡眠覚醒パター

ンレム睡眠時には深いノンレム睡眠に貢献するという，ンを解析した．

多面的な機能を果たしていると考えられる．

【結果】①ノンレム睡眠中のマトリックス細胞の活動電位の頻度は覚醒時に比べて顕著に低下し，バーストと呼ばれる発火パターンを示す．この発火パターンと大脳皮質脳

36

105

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

グルカゴンをツールとしたタンパク質嗜好性制御機
構の解明
松居

翔
（京都大学大学院農学研究科）【目的】
タンパク質に対する食欲は，エネルギー摂取とは別個に調節されていることが，その調節機序は全く未解明である．タンパク質の需給を脳に伝える代謝性シグナル，
および，脳内での調節責任領域のどちらも解明されてい図１

グルカゴンはタンパク質嗜好性を抑制する

図２

グルカゴンは必須アミノ酸に対する嗜好性を
抑制する

ない．
近年，主に膵臓 α 細胞で合成・分泌されるグルカゴンの主要かつ特異的生理作用は，アミノ酸代謝の恒常性維持であることが提唱されている．このことから，グルカ
ゴンはアミノ酸の恒常性を維持するために，タンパク質の食欲制御に関わると着想した．そこで本研究では，未解明である「タンパク質に対する食欲」の調節機序を，グルカゴンをツールとして利用して解明することを目的
とする．
【方法】
９週齢雄の野生型マウスに 0.1, 0.5, 1mg/kg のグルカゴンを腹腔内（ip）投与し，普通食（NC）vs. 高タン
パク質食（HPD: カゼイン），高脂肪食（HFD）および
高ショ糖食（HSD）の食餌選択試験を行った．さらに，【考察】

9 週齢雄の野生型マウスに 1mg/kg のグルカゴンを ip

これらの結果から，グルカゴンはタンパク質特異的に投与し，二瓶選択試験（水 vs. テスト溶液）を行った．

食行動を制御することが明らかになった．また，アミノ試験溶液には１％カゼイン中に含まれるアミノ酸組成で酸の中でも必須アミノ酸ではなく，非必須アミノ酸に対作製したカゼイン溶液，必須アミノ酸溶液，非必須アミする摂取行動を制御する点については興味深い．体で合ノ酸溶液を用いた．

成できない必須アミノ酸の摂取行動を抑制することは【結果】

生命の維持において危険である．他方，体の中で合成す

0.5，1mg /kg グルカゴン投与で顕著なタンパク質嗜ることのできる非必須アミノ酸の摂取行動抑制は，窒素

好性抑制作用が認められた（図1A）．他方，同様の検証源であるタンパク質の過剰摂取を制御する上でも理にかを高ショ糖食，高脂肪食でも行ったが，それらの食餌なっている．このことから，グルカゴンは単にタンパクに対する嗜好性の変化は認められなかった（図1B, C）．

質の摂取を制御するだけでなく，これまで明らかになっ

二瓶選択試験の結果は，グルカゴン投与でカゼイン溶液ていない窒素の欲求制御を担うホルモンである可能性がと非必須アミノ酸溶液に対する嗜好性抑制作用が認めら示唆された．

れた（図2A, C）．他方，必須アミノ酸溶液に対する嗜好性の変化は認められなかった（図2B）
．

37
106

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

慢性腎臓病の治療を目指したポドサイトにおけるRho-GTPase 制御機構の解明
松田潤（大阪大学）【目的】

在，同定された個々の蛋白が，Rac1 活性や細胞の接着能・運動能に及ぼす役割について解析を進めている．

血糖変動と認知機能の関連の解明のための前向き観察研究（PROPOSAL 研究）松原正樹（奈良県立医科大学）

我が国では透析や腎移植にかかる費用が医療経済を圧迫しているが，慢性腎臓病の進行に歯止めをかける有効な治療手段の確立には至っていない．それは，腎機能低下の主な原因である糸球体障害の機序が明らかになっていないためである．

【背景】
糖尿病患者では，アルツハイマー型認知症，血管性認知症の発症リスクがそれぞれ 1.5 倍，2.5 倍に増大する

ポドサイト（糸球体上皮細胞）は，アクチン線維に富ことが知られている．糖尿病患者における認知機能低下

む特徴的な足突起を有し，血管内皮細胞および糸球体基や認知症の病態については，重症低血糖，慢性的な高血底膜とともに濾過バリアを形成することで，蛋白の尿へ

糖，高インスリン血症，脳血管障害，終末糖化産物の蓄の漏出を防いでいる．そのアクチン線維の調節に関わる積など多くの要因が示唆されているが未解明な部分が多のが，20 種類から成る Rho GTPase と呼ばれる蛋白群

く，また認知症予防のための血糖管理指標も明らかとである．Rho GTPase は「活性型」と「不活化型」の 2なっていない．近年，血糖持続測定（CGM）機器の登形態をとる分子スイッチである．遺伝子改変マウスや蛋

場により糖尿病患者の血糖プロファイルを評価すること白尿を呈する患者の腎検体を用いた既存研究から，ポドが可能となり，横断研究で血糖変動と認知機能の関連がサイトにおける代表的な Rho GTPase である Rac1 の示唆されている．

活性異常が糸球体病変や蛋白尿に関与することが分かっ【目的】てきた．しかし，ポドサイトでどのような機序によっ糖尿病患者の血糖変動と認知機能の関連を縦断的に解て Rac1 活性が制御されているかはいまだ不明である．

析することで，糖尿病患者で認知機能低下に至る病態をそこで本研究では，ポドサイトにおける Rac1 の活性解明し，また糖尿病患者における認知症予防のための新化/不活化機構を解明すべく，近位依存性ビオチン標識

規血糖管理指標を探索する．

法（BioID）を用いて Rac1 と相互作用する蛋白の網羅【方法】

的同定を試みた．
【方法】

本研究は単施設（国立循環器病研究センター）における２年間の前向き縦断研究であり，2019 年３月︲2020

Rac1 配列を含む pSTV6 ベクターを培養ポドサイト

年６月の間に軽度認知障害を認める高齢２型糖尿病患にトランスフェクションした．ドキシサイクリンとビオ

者 109 名を登録した．CGM（リブレ Pro）
，認知機能

チンを培地に加えることで，Rac1 と相互作用する蛋白試 験（Montreal Cognitive Assessment，Alzheimer'sをビオチンリガーゼ（BirA）により選択的にビオチン

Disease Assessment Scale）を登録時，１年後，２年化した後，ビオチン化蛋白をストレプトアビジンビーズ

後と縦断的に行い，得られた血糖変動指標と認知機能試

によって回収し，質量分析に供した．

験スコアとの関連を解析する．副次評価項目として，空【結果・考察】腹時血糖値，HbA1c，診察室血圧，抑うつ・意欲の変化，

Rho GTPase の活性化因子として知られる ARHGEF7

炎症マーカーを登録時，１年後，２年後に，脳小血管病

や，同不活化因子として知られる ARHGAP31 など複数

変の変化（MRI で評価）
，頚動脈の内中膜厚（IMT）をの蛋白が同定され，ポドサイトの Rac1 活性は主にこれ

登録時，２年後に，また観察期間中の心血管イベント，

らの分子によって制御されていることが示唆された．現腎イベントの発症をそれぞれ評価し，得られた血糖変動

38

107

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

指標もしくは認知機能試験スコアとの関連を解析する．
Visit は前後２か月間を許容しているため，2022 年８月に研究終了予定である．
【進捗】Long non-coding RNA から翻訳される新規ポリペプチドの解析による疾患の病因解明
松本有樹修（九州大学生体防御医学研究所）

本研究はまだ終了していないため結果は得られていな
いが，以下に後述する登録時の横断解析を行った．
【サブ解析】【目的】

２型糖尿病患者において，心筋梗塞，脳卒中などのLong noncoding RNA (lncRNA) はタンパク質を翻

動脈硬化性疾患（ASCVD）が増加するが，ACCORD，

訳しない RNA と定義されているが，われわれは一部の

ADVANCE，VADT と い っ た 大 規 模 臨 床 研 究 で は，lncRNA が翻訳されてポリペプチドを産生していること

HbA1c を管理目標とした厳格な血糖コントロールをを明らかにした [Matsumoto, A. et al., Nature (2017)]．

行っても心筋梗塞，脳卒中などは減少せず，ASCVD とそこで，これら新規ポリペプチドがどのような機能を持重症低血糖や血糖変動との関連が注目されるようになっ

つかを明らかにしていく．

てきた．血栓性脳梗塞のリスクである頭蓋内動脈狭窄に【方法と結果】

ついても，空腹時血糖値や HbA1c との関連は報告によ

われわれはこれまでに，精子特異的 lncRNA から翻り異なり一定した見解が得られていない．最近になり，訳される２つの新規ポリペプチドを同定した．これら

持続血糖モニタリング（CGM）を用いて評価した血糖変２つのポリペプチドは同一遺伝子座の第一エキソンが動と，冠動脈疾患，内頚動脈の内膜中膜複合体厚（IMT），

異なる２つのアイソフォームから翻訳されていたこと

上腕－足首脈波伝播速度（baPWV）などとの関連が報から，双子座の星から名前をとって，それぞれカスト

告されているが，我々の知る限り頭蓋内動脈狭窄との関ル Kastor，ポルックス Polluks と名付けた．これらポ連は報告されていない．そこで本研究の登録患者 109

リペプチドはアミノ酸配列が全く異なるにも関わらず，

例中 103 例を対象に血糖値，HbA1c, FreeStyle リブレ

ど ち ら も ミ ト コ ン ド リ ア の 外 膜 に 局 在 す る Voltage-から得られた SD, ％ CV, mean amplitude of glycemic

dependent anion channel (VDAC) と非常に強く結合

excursions (MAGE) と，頭部 MRA で Warfarin︲Aspi-

していた．VDAC3 欠損マウスは精子ミトコンドリアの

rin Symptomatic Intracranial Disease 法（WASID）

形態異常により雄性不妊になることが知られていたた法で評価した血管狭窄との関連をロジスティック回帰分

め，Kastor と Polluks を両方欠損するマウスを作製し析にて解析を行った．結果，WASID 法で 70% 以上のたところ，顕著な雄性不妊が見られ，さらにこの変異マ

高度狭窄がみられた８例は全て内頚動脈サイフォン部のウス由来の精子は，VDAC3 欠損精子と類似したミトコ狭窄であり，高度狭窄のない 95 例と比較し，SD 53±

ンドリアの形態異常を示した．

12 mg /dl vs.39±10 mg/dl, ％ CV 36±7 % vs. 29±

そ こ で 次 に，Kastor と Polluks が VDAC3 の 分 子 機

6 %, MAGE 114±18 mg/dl vs. 90±23 mg/dl といず

能にどう影響するかを検討することにした．VDAC はれも有意に高値であった（p＜0.01）．またロジスティッ

ミトコンドリアの代謝やカルシウムフラックスに影響

ク回帰分析では，性別で調整した高度狭窄群のオッズ

することが知られているため，Kastor と Polluks を欠

比（OR） は SD (OR, 3.00; 95% conﬁdence interval

損した精子で，質量分析計を用いたメタボローム解析(CI), 1.32-6.84), ％CV (OR,5.55; 95% CI, 1.23-25.2),

や，Seahorse XF を用いた細胞外フラックス解析，さMAGE (OR, 1.52; 95% CI, 1.06-2.19) と 有 意 で あ っらにカルシウムインディケーターを用いたカルシウムフ

た．これらの結果より，頭蓋内血管狭窄病変を同定する

ラックス解析を行ったが，いずれも変化は見られなかっにあたり，血糖変動指標に注目することが有用である可た．さらに細胞死や酸化ストレスなどにも影響はなかっ

能性が示唆された．

た．興味深いことに，これらはいずれも VDAC3 欠損精子でも変化はなかったことから，精子ミトコンドリアで39
108

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

見られた形態の異常は，精子特異的 VDAC 機能に起因するものであると考えられた．以上の結果を，Nature
Communications 誌に報告した．

ビタミンＫのフェロトーシス抑制作用の解明と還元
酵素の同定
三島

【考察】

英換
（ヘルムホルツセンター・ミュンヘン）Kastor と Polluks は共にヒトを含む哺乳類に広く保存されており，これらの生物では，共通した機能を持つと考えられる．精巣特異的な遺伝子の機能解析は，男性
不妊の原因解明だけでなく，これらを標的とした避妊薬【背景】
フェロトーシス（Ferroptosis）は 2012 年に新規細の開発への展開が期待される．

胞死概念として確立された非アポトーシスの制御性細【文献】

胞死の一種であり，細胞内における過酸化脂質の蓄積を

１）Mise, S.†, Matsumoto, A.*† ( corresponding

トリガーとして発動する細胞死である．種々の急性臓and equally ﬁrst author), Shimada, K., Hosaka,

器障害（虚血再灌流含む），神経変性疾患，がん細胞にT., Takahashi, M., Ichihara, K., Shimizu, H.,

おける抗がん薬感受性に寄与するため，フェロトーシス

Shiraishi, C., Saito, D., Suyama, M., Yasuda, T.,の制御機構の解明はこれら病態の新規治療法への展開がIde, T., Izumi, Y., Bamba, T., Kimura-Someya,

期待されている．生体は過剰な脂質酸化に対する防御機

T., Shirouzu, M., Miyata, H., Ikawa, M. & Na-

構として Glutathione peroxidase-4 (GPX4) や CoQ10-

kayama, KI.*: Kastor and Polluks polypeptides

Ferroptosis suppressor protein 1 (FSP1) 経路，内因性

encoded by a single gene locus cooperatively

抗酸化ビタミンとしてのビタミンＥを備えており，これregulate VDAC and spermatogenesis. Nat. Com-らはフェロトーシスの主要な内因性防御機構として働

mun. Feb 28; 13(1): 1071 (2022).

く１）．しかしながら生体内におけるフェロトーシスの内

２）Nita, A., Matsumoto, A.* (corresponding author),

因性または外因性の制御機構のさらなる解明が待たれてTang, R., Shiraishi, C., Ichihara, K., Saito, D.,いる

Suyama, M., Yasuda, T., Tsuji, G., Furue, M.,【目的・方法・結果】

Katayama, B., Ozawa, T., Murata, T., Dainichi,

フェロトーシス抑制能を有する新規内因性代謝物を探T., Kabashima, K., Hatano, A., Matsumoto, M.

索することを目的として，誘導性 GPX4 ノックアウト& Nakayama, KI.*: A ubiquitin-like protein en-細胞を用いて代謝物スクリーニングを行った結果，ビ

coded by the "noncoding" RNA TINCR promotes

タミンＫ（フィロキノンやメナキノン 4）が強力なフェkeratinocyte proliferation and wound healing.

ロトーシス抑制能を有していることを同定した．メナ

PLoS Genet., 17: e1009686 (2021).

キノン４はフェロトーシス動物モデルである肝臓特異３）Ichihara, K.†, Matsumoto, A.*† (corresponding

的 GPX4 KO マウスへ投与することでフェトーシスにand equally ﬁrst author), Nishida, H., Kito, Y.,

伴う臓器障害・脂質酸化を抑制した．フェロトーシス

Shimizu, H., Shichino, Y., Iwasaki, S., Imami,

抑制機序としては還元型のビタミンＫが脂質ラジカル

K., Ishihama, Y. & Nakayama, KI.*: Combinato-をスカベンジして脂質酸化を抑制することが分かった．

rial analysis of translation dynamics reveals

また，これまで CoQ10 還元酵素として知られていた

eIF2 dependence of translation initiation at

Ferroptosis suppressor protein 1 (FSP1) がフェロトー

near-cognate codons. Nucleic Acids Res., 49:

シス抑制に必要なビタミンＫの還元を担う酵素であるこ7298-7317 (2021).

とを同定した．また FSP1 は，血液凝固作用に必要なビ
タミンＫサイクルにおいてこれまで正体が未同定であったワルファリン非依存性のビタミンＫ還元酵素でもあることを明らかにした．この FSP1 によるビタミンＫの還

40

109

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

元経路がわかったことは，ワルファリン中毒時になぜビ
タミンＫが解毒剤となるのかの機序を解明したものであ【結果】
single-nucleus RNA-seq を施行した結果，APA 由来る２）．

の 3834 個の核集団を解析することが出来，12 個のク【考察】

ラスターに分類された．クラスター５はアルドステロ

ビタミンＫはフェロトーシス抑制作用を有しており，ン合成酵素である CYP11B2 をマーカー遺伝子として

今後その作用の生体内における生理的意義，およびフェおり，APA を特徴づける高度なアルドステロン合成能

ロトーシス関連疾患に対する治療応用への展開が期待さを有する集団と考えられた．クラスター５内において，れる．

CYP11B2 の遺伝子発現と強く相関する遺伝子としてカ【文献】

ルシウムチャネルをコードする CACNB2 遺伝子が抽出

１）Mishima, E. & Conrad, M.: Nutritional and

された．さらに CACNB2 の機能解析のため，発現ベク

Metabolic Control of Ferroptosis. Annu Rev

ターによる H295R への強制発現実験を施行したところ，

Nutr. 2022; 42: 275-309

CYP11B2 の遺伝子発現上昇を誘導した．

２）Mishima, E. et al.: A non-canonical vitamin K
cycle is a potent ferroptosis suppressor. Nature.

【考察】
APA 組織において高度なアルドステロン合成能を有する細胞集団を同定し，CYP11B2 に並ぶマーカー遺2022; 608: 778-783

伝子として CACNB2 を抽出した．これまでに申請者は腫瘍内不均一性に着目した原発性アルドステロン症
の病態解析
村上

APA 組織内において CACNB2 遺伝子が miRNA の制御を受けて発現誘導されている可能性を示していることからも１），CACNB2 遺伝子は APA 発症メカニズムに重要

正憲な役割を果たしていると考えられた．
（東京医科歯科大学）【文献】
１）Nakano, Y., Yoshimoto, T., Watanabe, R.,【目的】

Murakami, M., Ogawa, Y. (他7名): miRNA299

PA の 病 型 の 一 つ で あ る ア ル ド ス テ ロ ン 産 生 腺 腫

involvement in CYP11B2 expression in aldo-（APA）は，外科治療による寛解が見込まれることからsterone-producing adenoma. Eur J Endocrinol.

重要であるが，病態については不明点が多い．申請者は，

181(1): 69-78. (2019).

免疫組織学的所見から APA が腫瘍内不均一性に富む細胞集団であると報告されていることに注目し，腫瘍内の細胞集団の構成・分布が異なり，APA の臨床的特徴の不均一性に寄与している可能性を考えている．
本課題は，白血病を維持する腫瘍エンハンサーの検索
村川泰裕（京都大学高等研究院）

APA 患者から採取した凍結副腎サンプルを対象とする
single-nuclear RNA-seq 解析を基に，APA の発症機序に関わる細胞集団とその分化過程を評価することを目的

【目的】

とする．

成人病の柱の一つに悪性疾患が含まれる．とりわけ白【方法】

血病は，発症年齢が若く，社会的にも重大な疾病である．

APA 凍 結 検 体 か ら 核 抽 出 を 行 い，single-nuclear

本課題では，オリジナルなゲノム解析法から，病態解明，

RNA-seq 解析を施行した．解析によって抽出された遺新たな分子標的薬やバイオマーカー検索を目指す．その伝子の機能解析のために，ヒト副腎皮質癌由来細胞株

ため，がんの細胞で特異的に発現している RNA 分子を

H295R を使用した in vitro 解析を施行した．

ゲノムワイドに網羅的にとらえ，独自の RNA 分子アトラスを構築する．興味深いことに，ヒトゲノム 90% 以41110成人病の病因・病態の解明に関する研究助成上の領域から RNA 分子が転写されており，この中には，

中 ）． 本 手 法 で は，FLAM-seq 法， 高 効 率 逆 転 写 技(1) 蛋白質をコードする mRNA の他にも，(2) 蛋白質を術など様々な要素技術を融合することで確立した．

コードしないノンコーディング RNA (lncRNA)，そして

RNA 分子の３ʼ 末端のポリＡ鎖と 5' 末端のキャップ構(3) エンハンサー領域から合成されるエンハンサー RNA造由来のシグナルを直接的にロングリードシークエン(eRNA) などが挙げられる．しかし，これらの分子には，シング技術を用いて読むことで，完全長性をデータにとりわけ lncRNA や eRNA において，大多数の未知分子・より担保している．

未踏分子は存在していると考えられている．
本研究では，

こうした一連の独自のオリジナルのゲノム解析基盤を独自のゲノム解析法を確立することで，こうした一連のもとに，京都大学血液・腫瘍内科との共同研究により，

RNA 分子を世界で初めて包括的に同定することに挑戦

約 100 人の造血器悪性腫瘍の患者検体から機能性ゲノ

し，その中から機能的な新たな分子を探索し，白血病のム解析を実施した．

メカニズムの理解や新しいバイオマーカーや治療標的の【結果】

探索を通じた医学応用を最終目標とする．

白血病に特異的に活性化している mRNA, lncRNA,【方法】

eRNA を新しく数万の単位で同定することに成功した．

① CAGE 法 は，RNA の ５ʼ 末 端 を 次 世 代 シ ー ク エ ン

また，新しく同定した RNA 分子の中には，全く新規のサーにより網羅的に解析する技術である．我々は，

Open-reading frame を持っている RNA 分子も 100 近

短 寿 命 で 低 発 現 の lncRNA や eRNA も 超 高 感 度 にく同定した．これらの分子の中でも，白血病での発現特同定できる「NET-CAGE 法」（Hirabayashi et al. Na-

異性が高い分子は，病態解明の手掛かりにもなりえ，まture Genetics, 2019）を開発した．本 NET-CAGE 法

た，新規の診断マーカーや治療標的候補になりえる．までは，短寿命な RNA 分子を濃縮する目的で，細胞のた，現在は，一細胞５ʼ シークエンス解析法を行い，様々トータル RNA ではなく，新規に合成されている最中

な異なる文化段階の白血病細胞由来の RNA 分子と，正の新生鎖 RNA をクロマチン分画から濃縮する生化学

常骨髄由来の RNA 分子を実験データにより区別してい的分画化法と CAGE 法を融合する．

る．今後，臨床データとも紐付けした統合解析や，新規②また，CAGE プロトコールを大幅に改良することで，分子の機能解析を行い，白血病の病因・病態の解明およ

従来では１週間かかる工程を２日に短縮し，さらにび医療応用を目指す．

インデックスライブラリー法を導入し，１週間程度【考察】

で数百検体のサンプルを処理できる基盤を構築した

本研究により同定された数万もの新規 RNA 分子が，（論文執筆中）．さらに，大規模のサンプルをラボ内で患者毎にどのような発現分布をするのか，どのような機管理するための Laboratory Information Managing

能を担っているのか，そして実際に臨床現場に実装する

System (LIMS) を構築して，大量のヒト検体を効率ことが可能なのかを今後明らかにする．また，今回新し的保管・処理している．

く同定された分子の多くが，マウスには存在しておらず，③さらに，１細胞レベルで CAGE のように RNA 分子の霊長類からその発現が見いだされる．これらの霊長類・５ʼ 末端を解析できる「１細胞転写開始点解析法」を

ヒト特異的な分子が，マウスでは説明できない，ヒトの開発した．本手法では，ノイズを除去できるバイオイ

白血病の理解につながるのか今後検証する．今後は，独

ンフォマティクス法を開発し，飛躍的な正確度・感度

自に構築した大規模データアトラスから，機能的分子・で真の転写開始点のみを同定する新しい方法を確立しバイオマーカー候補分子を抽出して，そしてこれらの分た．本手法を用いて一細胞レベルでｍ RNA, lncRNA,子から新しい医療資源を創出することを目指す．

eRNA を網羅的に同定することに成功している（論文執筆中）．
④また，転写開始点のみならず，RNA 分子の完全長RNA 解析を可能にする新技術を開発した（論文執筆

42

111

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成【考察】
がん免疫の成立機構に関する研究
諸石寿朗

研究を進めていく中で，がん細胞における細胞内シグ
ナルや細胞代謝の変化は，がん細胞側と宿主側に時とし（熊本大学大学院生命科学研究部）て相反する作用を誘導することがわかった（例：Hippo
シグナルの阻害はがん細胞自身の増殖を促進する一方【目的】

で，宿主の免疫応答を活性化することにより結果として悪性腫瘍は，細胞の形質転換，腫瘍の増大，転移といっ腫瘍全体の増殖を抑える）．このことは，個々の細胞にたいくつもの過程において多様に細胞内シグナルや細胞

おける細胞内シグナルや細胞代謝の機能研究のみでは，代謝を変化させ，がん細胞と宿主の相互作用の中で進行

たくさんの細胞が複雑に相互作用する組織応答の理解はしていく．この相互作用の中で，特に，がん細胞に対す困難であることを示唆している．今後の研究において，る宿主の免疫応答は腫瘍運命に大きな影響を及ぼすが，細胞内シグナルや細胞代謝の制御を介して行われる多細がん細胞内のシグナル伝達や代謝制御が免疫応答に与え胞間のコミュニケーションを解明していきたい．

る影響については十分解明されていない．本研究では，
われわれがこれまで研究を重ねてきた Hippo 細胞内シ
グナルや鉄代謝に注目し，宿主の免疫応答に対してこれ
らの因子が与える影響を検討した．
【方法】

甲状腺ホルモン脱ヨード酵素を標的とした脂質・エ
ネルギー代謝促進薬の開発
山内一郎（京都大学大学院医学研究科）

がん細胞において Hippo シグナルや鉄代謝を変容させたマウスがんモデルを作出し，それらのがん細胞に対する宿主の免疫応答を，
組織学的解析，フローサイトメー【目的】

ター解析，シングルセル解析などの手法により調べた．

甲状腺ホルモン脱ヨード酵素には，１型（D1），２型

また，その変化が起こる分子機序について，分子生物学（D2），３型（D3）の３種類があり，これらの発現制御

や生化学的手法により検証した．

により治療へ応用することを目指している．前年度まで【結果】に，プロモーターアッセイを基盤としたハイスループッ

がん細胞における Hippo シグナルの阻害は，がん細トな系を開発し，臨床応用されている薬剤のライブラ胞の種類により腫瘍増大に有利に働く場合と不利に働く

リー（2480 種類）を用いたスクリーニング（HTS）を場合があることがわかった [Oncogene 38, 2595-2610

実施した．患者コホートを構築し，各ヒット化合物の内(2019)]．さらに，Hippo シグナルの阻害により宿主の服前後での変化をレトロスペクティブに解析した結果，がんに対する免疫応答が活性化される場合，腫瘍微小複数の化合物にて有意な変化が確認され，さらなる検証

環境を構成する免疫細胞や間質細胞の種類や性質が大を進めた．

きく変化することがわかった．特に，がん細胞におけ【方法】

る Hippo シグナルの状態の変化に伴い，全く性質の異６週齢雄の C57BL /6 マウスに化合物を給水投与し，なるがん関連線維芽細胞が誘導されることを見出した．

投与後の血清甲状腺ホルモン濃度（甲状腺機能），遺伝

また，肝細胞における鉄代謝の変容は，慢性炎症環境を子発現（甲状腺，肝臓，下垂体）を評価した．

誘導し，肝臓がんの進行を促進することがわかった [J.

【結果】

Exp. Med. 216, 950-965 (2019)]．さらに，大腸がん

HTS，コホート研究を通じて絞り込んだ化合物を投における鉄代謝異常は腸内細菌の変化と相乗的に働き，与したところ，３日後，14 日後のいずれにおいても甲腫瘍促進性の炎症応答を誘導することを見出した [JCI状腺機能に有意な変化を認めたのは，アドレナリン受容insight, in press (2022)]．

体作動薬であるリトドリン，チロシンキナーゼ阻害薬（TKI）であるスニチニブのみであった．リトドリンは

43
112

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

HTS において D2 を正に制御し，コホート研究におい腸管 NAMPT-NAD＋ 合成系を標的とした NAD＋て内服による血清 fT3/fT4 比の上昇が確認された．マウ

中間代謝産物 NMN によるインスリン抵抗性発症

スへの投与においても，血清 fT3, fT3/fT4 比の上昇と，予防法の開発研究

甲状腺 D2 mRNA の増加が認められ，矛盾しない結果

山口

であった．

慎太郎
（慶應義塾大学医学部）

TKI は，HTS では D1, D2, D3 を正に制御し，コホート研究では内服による血清 fT3, fT4 減少，血清 TSH 上昇が確認された．しかし，スニチニブをマウスへ投与す【目的】

ると，血清 fT4 減少は認めたが，肝 D3 mRNA はむし

哺 乳 類 NAD＋ 合 成 系 の 鍵 酵 素 で あ る NAMPT は 環ろ減少した．
矛盾する結果であり，甲状腺ホルモン脱ヨー

境・栄養状態に応答することで NAD＋ 量を調節し，生ド酵素以外を介した甲状腺機能の変化であることが示唆

物学的な多彩な局面で重要な役割を果たす．申請者はされた．甲状腺ホルモン合成に関連する遺伝子群の発現

脂肪細胞特異的 Nampt 欠損マウスを作製し，脂肪細胞低下を認めており，甲状腺機能変化に関連している可能

NAMPT-NAD＋合成系が，インスリン抵抗性・エネルギー性があると考えた．

代謝を制御する事を報告した (PNAS. 2019, Cell Rep.

【考察】2016)．さらに，代謝疾患において NAMPT の酵素反応

HTS に臨床データを統合させる新手法を考案し，リ産物である NMN (nicotinamide mononucleotide）な

トドリンが，甲状腺において D2 を正に制御し，甲状腺どの NAD＋ 中間代謝産物が代謝臓器の NAD＋ 量を回復

機能に有意な影響を与えるという新規の知見を得るにし，病態を改善することも報告されている．最近 NMN

至った．

のトランスポーターが小腸に存在することが報告され【文献】(Nature Metab. 2019)，代謝臓器の NAD＋ 合成系を制１）Yamauchi, I., Sakane, Y., Okuno, Y., Sugawa,

御する主座として腸管が注目されている．
以上より，腸管の NAMPT-NAD＋ 合成系のインスリ

T., Hakata, T., Fujita, H., Okamoto, K., Taura,D., Yamashita, T., Hirota, K., Ueda, Y., Fujii,

ン抵抗性発症における役割の検証を行った．

T., Yasoda, A. & Inagaki, N.: High-throughput【方法・結果】

Screening in Combination With a Cohort Study①

for Iodothyronine Deiodinases. Endocrinology.

腸管上皮細胞特異的 Nampt ノックアウト (KO) マウス

2022; 163: bqac090.

を作製した．腹腔内ブドウ糖投与試験での血糖値の変化

腸管 NAMPT-NAD＋合成系と糖代謝

２）Yamauchi, I., Sakane, Y., Yamashita, T., Hakata,にはコントロール群と有意な差は認めなかったが，経口

T., Sugawa, T., Fujita, H., Okamoto, K., Taura,

投与では，KO マウスで血糖値は有意に上昇した．そのD., Hirota, K., Ueda, Y., Fujii, T., Yasoda, A.

背景病態として，KO マウスでは GLP-1 およびインス& Inagaki, N.: Thyroid hormone economy in

リン分泌障害を認めた．KO マウスに NMN を投与し，

mice overexpressing iodothyronine deiodinases.

腸管 NAD＋量を回復させると GLP-1 産生が改善するこ

FASEB J. 2022; 36: e22141.

とが示された．細胞培養系を用いた検証により，GLP-1の産生は NAMPT-NAD＋-Wnt axis により制御されていることも見出した．
②

NMN を用いた肥満マウスへの介入
高脂肪食を負荷した C57BL /6 マウスでは，通常食群と比較して腸管 NAMPT-NAD＋合成系が有意に低下し，GLP-1 産生に関与する回腸での Proglucagon の発現が低下していた．NMN を投与したところ，GLP-1 分泌が

44

113

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

回復し，食後高血糖が改善した．
【考察】
腸 管 の NAMPT-NAD＋ 合 成 系 の 障 害 が， 肥 満 に おける GLP-1 分泌障害および食後高血糖の原因である
ことが示され，肥満２型糖尿病に対する NMN 経口投
与が GLP-1 産生促進を介する腸管を標的とした新規の糖尿病治療薬になる可能性を報告した (Nagahisa,
Yamaguchi* et al. Endocrinology. 2022)．

45
114

研究報告

Vascular
Vascular Biology
Biology Innovationに関する研究助成
Innovationに関する研究助成

血管リモデリング進展過程における血管周囲脂肪褐
色化の病態生理学的意義の解明
安達

裕助

出した．
【考察】
本研究によって，動脈血管が傷つくと PVAT に褐色化が起こり，褐色化した PVAT は抗炎症物質（NRG4）（東京大学大学院医学系研究科）を分泌して，血管傷害後に起こる炎症を適切にコント
ロールしていることが分かった１）．今後は，PVAT の機【目的】
血 管 の 周 り に は 血 管 周 囲 脂 肪 組 織（perivascular

能をターゲットにした動脈硬化性疾患の新しい治療法の開発を目的に研究を進めていく所存である．

adipose tissue; PVAT）と呼ばれる支持組織が存在して【文献】いることが知られている．血管炎症とリモデリング制御

１）Adachi, Y., Ueda, K., Nomura, S., Ito, K., Katoh,における PVAT の役割を明らかにすることを目的とし

M., Katagiri, M., Yamada, S., Hashimoto, M.,て，研究計画を立案した．

Zhai, B., Numata, G., Otani, A., Hinata, M.,【方法】

Hiraike, Y., Waki, H., Takeda, N., Morita, H.,

本研究ではマウスの血管傷害モデルを用いた分子生物

Ushiku, T., Yamauchi, T., Takimoto, E. & Ko-

学的手法に加えて，システム生物学的手法を用いた解析

muro I.: Beiging of perivascular adipose tissue

により病態の解明に挑んだ．

regulates its inﬂammation and vascular remod-【結果】

eling. Nat Commun., 13, 5117 (2022).

網羅的遺伝子発現解析の結果，血管傷害後の PVATにおいて，Ucp1 をはじめとした褐色脂肪マーカーの遺伝子発現が上昇しており，脂肪の褐色化が起きていることが分かった．褐色化の制御因子である Prdm16を脂肪組織特異的にノックアウトしたマウス（Adipoq(Adiponectin) – Cre+/−; Prdm16 flox/flox マウス）では，血アルドステロン過剰におけるアルカローシス依存性の pendrin 制御機構の解析
鮎澤信宏（杏林大学医学部付属病院）

管傷害後の PVAT の炎症と血管リモデリングが増悪することを見出した．また，低分子干渉 RNA を用いてミネラロコルチコイド受容体（MR）は高血圧や心血Prdm16 を血管周囲組織で局所的にノックダウンした場

管・腎障害の発症に関与する．助成期間中，これら病態

合も同様に，PVAT の炎症と血管リモデリングが増悪すにおける MR の活性化機構やその意義につき研究を行っることを確認した．逆に，β３アドレナリン受容体アゴ

た．以下に成果を総括する．

ニスト（CL316243）の局所投与によって PVAT の褐

１）病的状態における MR 活性化はリガンド量のみに色化を促進すると，PVAT の炎症と血管リモデリングが依らない．我々は，低分子Ｇ蛋白 Rac1 がリガンド非抑制されることが分かった．一細胞 RNA-seq 解析によ

依存性に MR を活性化することを見出した．助成期

り，褐色化したマウス脂肪細胞から分泌される抗炎症ア

間中，この Rac1-MR 経路が心不全の発症に関わるか

ディポカインとしてニューレグリン４（Nrg4）を同定し，検証した．マウス圧負荷性心不全モデルでは心臓におNrg4 をノックダウンすると，褐色化 PVAT によるマク

いて Rac1 と MR の活性化が見られたが，Rac1 阻害

ロファージの抗炎症型への分極作用が消失することを見薬や心筋特異的 Rac1 ヘテロ欠損，MR 拮抗薬により

1
115

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

Rac1-MR 経路を遮断すると，酸化ストレスが減じ，の生存率は WT マウスと比較して改善傾向にあり，左心不全が改善した．すなわち Rac1-MR 経路が心不全

心機能は有意差を持って良好であった．梗塞部位に集発症に関わることが示された．

積 す る 炎 症 細 胞 を ﬂow cytometry 法 で 解 析 す る と，

２）最近，皮質集合管 β 間在細胞に発現する pendrin

X-KO マウスでは Ly6Chigh 単球 (CD45＋CD11b＋F4/80－

が NaCl 再吸収に働き，血圧調節に関わることが示さ

Ly6Chigh) の 浸 潤 が 有 意 に 低 く，qPCR で 解 析 し た

れた．我々は RAAS 亢進時には MR を介した二つのIL-1β, IL-6 などの炎症性サイトカイン，CCL2/CCL7

経路により pendrin 活性化が起こることを見出した．

などのケモカインの遺伝子発現を検討すると，X-KO マ①アンジオテンシン II 刺激時には間在細胞 MR の脱ウスで有意に減少していた．梗塞部においてどの細胞由

リン酸化・活性化を介して pendrin 活性化が起き，来のＸが重要かを骨髄移植モデルで確認すると，間質②一次性のアルドステロン過剰時には主細胞の MR-系細胞の重要性が示唆された．Flow cytometry 法によENaC 経路活性化により起こる代謝性アルカローシス

りＸの発現を検討すると，内皮細胞と線維芽細胞でＸが pendrin 活性化を起こすことが示された．そして，の発現を認めた．一方，各細胞群を FACS でソートし，これらの pendrin 活性化機構は血圧上昇に働き，特CCL2 と CCL7 の遺伝子発現を検討すると，線維芽細胞にサイアザイド利尿薬抵抗性の病態形成に関わることでのみ有意な発現を認めた．以上より，心臓線維芽細胞も示された．

由来のＸの重要性が示唆されたため，心臓線維芽細胞特【文献】

異的Ｘコンディショナル KO マウス（Tcf21Cre/＋ Xflox/flox) に

１）Ayuzawa, N. et al.: Rac1 Mediated Activation

MI を作製し，４週間後の生存率，心機能，梗塞部炎症of Mineralocorticoid Receptor in Pressure Over-性サイトカインや CCL2/CCL7 などのケモカインの発

load Induced Cardiac Injury. Hypertension., 67,

現，炎症細胞浸潤などを検討すると，X-KO マウスで見99-106 (2016).

られた表現型が再現された．X-GFP レポーターマウス

２）Ayuzawa, N. et al.: Two Mineralocorticoid Re-に MI を作製し，２日後に GFP＋と GFP－ の心臓線維

ceptor Mediated Mechanisms of Pendrin Activa-

芽細胞を FACS でソートし，その遺伝子発現を比較検討

tion in Distal Nephrons. J Am Soc Nephrol., 31,

する．予備的データでは GFP 陽性すなわちＸ陽性線維

748-764 (2020).

芽細胞で有意に Ccl2/Ccl7 の発現が亢進していた．以３）Ayuzawa, N. et al.: The Mineralocorticoid Receptor in Salt-Sensitive Hypertension and Renal
Injury. J Am Soc Nephrol., 32, 279-289 (2021).

上の結果は in vitro 実験でも再現された．
【今後の展望】
網羅的解析を行い，in vivo での GFP＋と GFP－ の心臓線維芽細胞の比較，in vitro でのＸノックダウンとコ

免疫学的介入に基づく循環器病に対する新規治療法の開発
安西

ントロール心臓線維芽細胞の比較を行い，Ｘの下流シグナルに関して検討を行う．
急性心筋梗塞に対する再灌流療法の発達は，急性期死

淳

亡率を劇的に低下させたが，重症例の救命によって慢性（慶應義塾大学医学部）

心不全の有病率をむしろ増加させるというパラドックス
を生んだ．MI 後組織修復の過程には免疫応答の賦活化【研究目的】とそれに付随した炎症反応が不可欠であるが，これらが本研究では遺伝子Ｘを中心とした心筋梗塞後の炎症・一度過剰になるとかえって組織障害を進展させ，梗塞後修復過程の新たな分子機序を明らかにし，新規治療法へ

心不全を増悪させてしまう．近年，CANTOS 試験（NEJMと発展させることを目的とする．

2017）など，動脈硬化の二次予防に抗炎症作用を持つ【研究方法・結果】

薬剤が有効であることが実臨床でも明らかとなりつつあ

X-KO マウスに MI を作製し，28 日間観察すると，そ2
116

るが，MI 後に免疫応答や炎症反応が過剰となる機序は

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

未だ不明である．本研究で心臓線維芽細胞由来Ｘを中心

ABCC9・KCNJ8 の変異による本機構の破綻が中枢神とした新たな炎症分子カスケードが明らかになれば，梗

経障害の背景にある可能性が示唆された（Ando et al.,

塞後心不全予防のための創薬基盤につながる可能性があDevelopmental Cell. 2022）．

ると考えられる．

【文献】
１）Ando K. (co-corresponding author), Tong L.,

ペリサイトにおける ATP 依存性カリウムチャネルの心・脳における機能解析安藤康史（国立循環器病研究センター研究所）

Peng D., Vázquez-Liébanas E., Chiyoda H., He
L., Liu J., Kawakami K., Mochizuki N., Fukuhara S., Grutzendler J. & Betsholtz C.: KCNJ8/
ABCC9-containing K-ATP channel modulates
brain vascular smooth muscle development andneurovascular coupling. Developmental Cell.,【目的】

2022. 57(11): 1383-1399. e7.

本年度はペリサイト選択的に発現する ATP 依存性カ
リウムチャネル（K-ATP チャネル）の中枢における役割の解明を通して，ペリサイトを基軸とした中枢疾患発症機構の理解と治療法開発への基盤形成を目指した．
【結果・考察】心筋虚血再灌流傷害におけるフェロトーシスは小胞体の鉄過剰によって誘導される
池田昌隆（九州大学大学院医学研究院）

ATP 感受性カリウムチャネル（K-ATP）コード化遺伝子である KCNJ8 と ABCC9 の機能欠損または機能獲
得変異は，ヒトの中枢神経系に原因不明の障害を引き【目的】

起こす．そこで，マウスやゼブラフィッシュ，細胞培

フェロトーシスは，「①鉄依存性に生じる脂質酸化に養モデルを用いて，K-ATP チャネルの機能変化に由来より誘導され，②鉄のキレート剤もしくは脂質親和性抗する脳機能異常とその分子機構を解析した．その結果，酸化剤により抑制，③ GPx4 によって制御される細胞死」

KCNJ8/ABCC9 を含む K-ATP チャネルの機能を遺伝学と定義される新規制御性細胞死である．心筋虚血再灌流

的または化学的に阻害または活性化することで，脳選傷害（I/R 傷害）においてはフェロトーシスが関与する

択的に血管平滑筋細胞（VSMC）への分化がそれぞれことが報告されているが１），I/R 傷害において既知の主抑制または促進されることが分かった．さらに，脳血たる細胞死である MPT-driven necrosis と比較した際

管平滑筋は KCNJ8/ABCC9 を含む K-ATP チャネル陽性の重要性および誘導分子機序については明らかではなの（ペリサイト様）前駆細胞から発生し，K-ATP チャ

い．本研究は，GPx4 遺伝子改変マウスおよび単離心筋

ネルは電位依存性カルシウムチャネルを介した細胞内細胞を用いて I/R 傷害におけるフェロトーシスの重要性

Ca2+ 振動の調節を通じて，VSMC への分化を細胞自律および誘導分子機序を明らかにすることを目的とした．

的に制御していることが明らかになった．上記のような【方法】

VSMC の発達障害と一致するように，Kcnj8 ノックア

GPx4 過 剰 発 現 マ ウ ス に I/R モ デ ル を 作 成，MPT-

ウトマウスは，血管収縮能と神経誘発血管拡張能が欠損

driven necrosis の阻害剤としてシクロスポリン A (CsA)

しており，局所的な神経活性化依存的な血流上昇が阻害を併用し，梗塞サイズを評価した．また単離培養心筋細（neuro-vascular uncoupling）されていることが分かっ胞において低酸素 / 再酸素化刺激（H/R 刺激）を加え，鉄，

た．

過酸化脂質，細胞死を評価した．

これらの結果から，本 K-ATP チャネルによる正常【結果】な血管平滑筋分化制御は，例えば神経活性依存的な

I/R モデルにおいて，GPx4 過剰発現と CsA 投与に

脳 血 流 の 上 昇 に も 極 め て 重 要 で あ る こ と が わ か り，

よる梗塞サイズ縮小効果はほぼ同等であった．さらに

3
117

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

GPx4 過剰発現マウスに CsA を投与したところ，野生型に CsA を投与した際と同等に梗塞サイズが縮小した．
単離培養心筋細胞に H/R 刺激を加えたところ，過酸化脂質の増加と細胞死が誘導され，これらは鉄のキレート

心不全における ERAD によるオルガネラ機能制御機構の解明と新規治療法の開発池田宗一郎（九州大学大学院医学研究院）

剤であるデクサラゾキサンおよび脂質親和性抗酸化剤であるフェロスタチンによって抑制された．H/R 刺激を加えた細胞では，全体としての総鉄量は不変であったが，【目的】

小胞体内の鉄は著明に増加していた．I/R 傷害を受けた

近年，ミトコンドリアと ER 間のオルガネラ相互作

心筋組織および H/R 刺激を加えた単離心筋細胞ではヘ用が細胞機能維持において重要であることが明らかとムオキシゲナーゼ-1 (HO-1) が増加しており，HO-1 をなってきた．また，ER ストレスにおいて小胞体関連分

siRNA により silencing したところ，H/R によって生じ解（ER-associated degradation: ERAD）が注目されてる小胞体内の鉄の蓄積，過酸化脂質の増加，そして細胞いる．ERAD は ER ストレスや酸化ストレスなどにより死が抑制された．

活性化され異常タンパク質を小胞体から細胞質へ逆輸【考察】送してユビキチン化により分解することで ER ストレス

In vivo の梗塞サイズの評価では，フェロトーシスとを軽減する極めて重要な機構である．また，homocys-

MPT-driven necrosis がほぼ同等に梗塞サイズに寄与しteine-responsive ER resident ubiquitin-like domain 1ていることが明らかとなった．さらに CsA の効果は野(HERPUD1) は ERAD の構成因子としてその機能維持

生型マウスに投与した場合と GPx4 過剰発現マウスに投に必須であることが知られている．本研究は不全心筋に与した場合にてほぼ同等であることから，フェロトーシ

おける ERAD および HERPUD1 の役割を解明することスと MPT-driven necrosis は完全に独立した細胞死でを目的とした．

あることが示された．単離培養心筋細胞を用いた実験で【方法】

は，HO-1 の silencing によって H/R 刺激により誘導さ

左前下行枝の結紮による心筋梗塞モデルマウスの心筋れるフェロトーシスが抑制されており，HO-1 によるヘおよび過酸化水素刺激における HERPUD1 の発現を評

ムの分解亢進に基づく鉄が小胞体内に蓄積され，フェロ

価した．また，HERPUD1 の homozygous KO マウス

トーシスの契機となることが明らかとなった２）．

を作成し心筋梗塞を作成することで HERPUD1 の機能【文献】

評価を行った．さらに心筋細胞においてアデノウイルス

１）Fang. et al.: Ferroptosis as a target for protec-

を用いて HERPUD1 を過剰発現させ，ミトコンドリア

tion against cardiomyopathy. Proc. Natl. Acad.

機能，心筋細胞死を評価した．

Sci., 2019; 116: 2672-2680【結果】２）Miyamoto, DH. & Ikeda, M. (Corresponding au-

梗塞後心筋において HERPUD1 のタンパク量は３日thor) et al.: Iron overload via heme degradation

目に有意に増加し，28 日目にかけてベースラインまで

in the endoplasmic reticulum triggers ferroptosis

低下することが明らかとなった．また心筋細胞に対しin myocardial ischemia-reperfusion injury.

ての過酸化水素刺激でも同様に HERPUD1 のタンパク

JACC Basic. Transl. Sci., 2022; 7: 800-819

量が増加した．HERPUD1 の homozygous KO はベースラインでは心機能低下を引き起こさなかったが，心筋梗塞後の左室拡張末期径を拡大させ左室駆出率低下を増悪した．さらにアデノウイルスを用いた心筋細胞へのHERPUD1 の過剰発現は過酸化水素によるミトコンド
リア機能低下を抑制し，心筋細胞死を抑制した．

4
118

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

並行して，“non-dipper” の普遍的な発症機序を明ら【考察】
以上の結果から，HERPUD1 は梗塞後心筋において発現が増加しており，ミトコンドリア機能低下の抑制や心筋細胞死を抑制することで心筋リモデリングに対して保護的に作用することが明らかとなった．

かにするために，新たな動物モデルの開発を試みた．
【背景】
non-dipper を発症する原因として様々な背景因子が報告されている [Kimura. et. al. 2010]．大別して，①心不全・腎不全・糖尿病など腎障害（血液ろ過量低下）

ストレスホルモン制御機構である腎臓とその破綻の解析による体液量過剰をきたす疾患が背景に存在し，日中に排尿を通じた適切な体液量調節が充分に行われず夜間睡眠中も体液量過剰が残存するがゆえに睡眠中の血圧が低上田浩平

下しないと考えられている病態，②自律神経障害や睡眠（国際医療福祉大学医学部）

時無呼吸症候群など機序は不明であるが non-dipper を合併することが知られている病態，の２つである．

【これまでの経緯】①は原疾患に引き続く二次的な体液量過剰が non-2021 年度はマウス尿細管上皮 mDCT 細胞を用いてdipper 発症の原因と考えられている．しかし②につい糖質コルチコイド -GR 系による NCC 活性制御機構につてはそもそも体液量過剰をきたすのかを含め不明な点がいて解析した．機器故障により保存されていた mDCT

多く，未解明の機序が存在すると考えられる．ゆえに，細胞の状態が悪く内因性 NCC の良好な発現が確認でき②をモデル化した実験動物における non-dipper 発症機なかったので，急性腎障害バイオマーカー・A (NGAL)序の解明が求められており，さらにそのような病態モデによる NCC 活性化機序を解析した．その過程で NGAL

ルの解析を通じて，血圧の概日リズムを形成する仕組み

による NCC 活性調節因子 Camk2b のリン酸化を同定しとして不可欠な機序を明らかにすることができると考えた（図１）．Camk2b は共同研究者 Frederic Jaisser 教られる．

授による RNA-seq 解析で NGAL により発現が上昇する【目的】

遺伝子として同定されかつ最近，NCC 活性化機序とし

睡眠時無呼吸症候群モデル，すなわち睡眠時間歇的低て報告されており [Gholam, MF. et. al., 2021]，NGAL

酸素による non-dipper マウスモデルを用いて，その発による NCC 活性化制御機構として有力であり，鋭意解症機序を明らかにする．

析を進めている．

【研究計画】
睡眠時間歇的低酸素（IH）モデルマウス [Shimosawa,

et al. 2014, 2015]：C57Bl/6 野生型マウスを飼育する
密閉された飼育箱の中へ 100% 窒素を注入することにより，酸素濃度を 90 秒間で室内気（21%）から４％へ低下させ，その後 90 秒間で室内気へ戻す３分間のサイクルを，８時から 20 時まで点灯する飼育室において９時から 17 時まで１日８時間施行する．開始した日をDay 0 として，Day 5-Day 7 で連続的に血圧を測定する．
腎臓などマウス試料を採取する場合は，血圧測定用カテーテル留置外科手術の影響を考慮し，血圧測定実験用のマウスとは別に正常対照群とともに用意し，マウスの睡眠時である明期（正午）に試料を採取する．
本 研 究 計 画 で は 睡 眠 時 無 呼 吸 症 候 群 に よ る nondipper 発症機序について，IH モデルマウスを用いて，

5
119

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

長期的な血圧調節異常に不可欠である体液量過剰依存性

で，それぞれの阻害剤や，共同研究者が既に保持またはや腎機序を明らかにする．
腎機序が明らかになった場合，作出可能な受容体ノックアウトマウスを用いて，上流経

その上流経路についても探索的に可能な限り明らかにす

路を同定する．

る．具体的には以下となる．

・ レ ニン-ア ン ジ オ テ ン シ ン 系：AT1 受 容 体 losartan,

１．睡眠時間歇的低酸素による non-dipper 型血圧の
食塩感受性を明らかにする
図１に示されたように，減塩食により IH モデルの血圧日内変動が回復することを，さらにサンプル数を増AT1aR-KO・交感神経系（特に β 作用）：β1/2 阻害薬 propranolol, Adrb1/2-KO
そして睡眠時間歇的低酸素がこれら経路を活性化するやして確認する．これにより，IH モデルの non-dipper

機序として，以下を想定し解析を行う．

が食塩感受性であること，つまり Na 貯留を介した体液・低酸素誘導因子 HIF：腎尿細管特異的 Hif1a-KO（早量過剰による腎機序であることを示す．この実験は，先稲田大学・合田教授より Hif1a-Flox マウス供与予定）

行研究において non-dipper 発症機序として血管抵抗調また興味深いことに，IH モデル腎臓の mRNA 発現量

節異常（血管機序）が主に示唆されてきたなかで画期的を解析すると概日リズム形成に関わる主要な時計遺伝子と考えられる．

群の発現が著明に変化していた（図２）．特に発現が増２．睡眠時間歇的低酸素による non-dipper 型血圧の加していた Per1 は生理的には血圧が上昇する覚醒時に腎機序を明らかにする発現が上昇する．さらに Per1 による腎 NCC 活性調節

予備実験（図１）において，IH モデルの non-dipperも報告されている [Gumz. et. al., 2012] ので，Per1 抑発 症 機 序 と し て 腎 臓 の Na 輸 送 体 蛋 白， 具 体 的 に は制による IH モデルの腎 NCC・NKCC2 抑制や血圧日内Na＋-Cl- 共 輸 送 体（NCC）
・Na＋-K＋-Cl- 共 輸 送 体変動改善の有無を明らかにする．

（NKCC2）の活性化示された．共同研究者は NCC ノッ・時計遺伝子：Per 阻害薬 PF-670462

ク ア ウ ト マ ウ ス を 保 持 し て い る [Shimosawa et. al.
2011]．そこで，NCC と NKCC2 の双方が発症機序として重要であると仮定し，・IH 環境下 NCC-KO マウスに NKCC2 阻害薬 furosemide を経口投与し血圧測定
・野生型の IH モデルマウスに NCC 阻害薬 hydrochlorothiazide または furosemide を投与し血圧測定，次に hydrochlorothiazide と furosemide を併用投与し血圧測定
これにより，IH モデルの non-dipper 発症の腎機序を明らかにする．もしこれら薬剤投与により IH モデルの血圧日内変動に改善が見られなければ，その他の腎Na 輸送体蛋白，NHE3 や ENaC の代償的活性化が起きているかを確認し，それぞれの阻害剤併用投与実験を行う．
３．睡眠時間歇的低酸素による Non-dipper 型血圧の腎機序の上流経路を明らかにする
睡眠時間歇的低酸素から腎臓の NCC・NKCC2 活性化を来す機序を探索的に明らかにする．NCC や NKCC2を活性化させる機序として一般的な経路は以下であるの

6
120

図１

睡眠時間歇的低酸素（IH）による食塩依存性
Non-dipper 発症と腎 NKCC2・NCC 活性化
Ａ．IH による血圧日内変動消失
Ｂ．減塩食による血圧日内変動回復
Ｃ．IH による腎 NKCC2・NCC 活性化

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

腸-骨髄連関から動脈硬化を制御する
江本拓央

部リバイス実験を一部を日本で行い，論文受理された．
２．急性冠症候群を引き起こすプラークのシングルセル
解析（神戸大学大学院）

腸-骨髄連関の研究を行う前に，ターゲットとなる冠動脈プラーク粥腫破綻メカニズム解明のため，冠動脈粥

１．骨髄での単球の制御機構の解明
単球がどのように骨髄において維持されているのか，腫摘除術の適応となった慢性冠症候群４例，急性冠症候
群３例の免疫細胞のシングルセル解析を行った．

Colony stimulating factor-1 (CSF-1) が重要な働きを大きく分けると，Ｔ細胞，Myeloid 細胞，Ｂ細胞に担っていることはよく知られていたが，骨髄のニッチ分けられた．骨髄球系細胞にフォーカスして解析したの細胞が CSF-1 を分泌し，単球維持されているのかはところ，単球，マクロファージ（Mφ），樹状細胞，肥分かっていなかった．Cre loxp system を用いて，血管満細胞を認めた．Mφ の分画はそれぞれの特徴的な遺内皮細胞 (Cdh5-Cre), Lepr 陽性間質細胞（Lepr-Cre），

伝 子 発 現 か ら，TNF+ Mφ, C1Q＋ TREM2＋ ﬁbrotic

免疫細胞（Vav1-Cre），骨芽細胞（Osx1-Cre, Dmp-1-

Mφ, CXCL3＋IL1B＋ inﬂammatory Mφ の ３ つ に 分

マウスを掛け合わせることで，血管内けられた（図２）．IL1B を強く発現するのは，単球と皮細胞や Lepr 陽性間質細胞由来の CSF-1 が単球の維

CXCL3+IL1β+inﬂammatory Mφ であり，いずれも急持に重要であることを証明した．特に血管内皮細胞は性冠症候群でのみ認めるものであったことから，IL1B のLy6C low 単球に血管内皮と Lepr 陽性間質細胞は協調し阻害薬の投与が心筋梗塞発症患者の 2 次予防に有効でて，
Ly6C high 単球の維持をになっていることが分かった．

あったとする CANTOS trial (Ridker PM et. al. N Engl

主にはトロント大学で留学中に行った仕事であるが，一J Med. 2017) をサポートする結果であった（図２）．

Cre）と CSF-1

flox(Emoto. T et al . Circulation . May 3; 145(18):1434-1436. 2022.)
３．大動脈瘤と腸内細菌との関連
動脈硬化と関連して，動脈硬化に起因する大動脈瘤の形成が腸内細菌叢と関連しているのか，動脈硬化モデル
マウス（APOE ノックアウトマウス）にアンギオテンシ
ンⅡを負荷するモデルを使って調べた．腸内細菌を抗生剤で depletion すると動脈瘤の形成が抑制されたのに対図１

BM monocytes reside within aperisinusoidal niche

し，抗生剤を腹腔内投与しても動脈瘤の形成は抑制され(A) Representative image showing CCR2-GFP＋BM
monocytes reside adjacent to sinusoidal endothelial cells. Scale bars represent 100 mm in left panel
and 20 mm in right panel.
(B) Representative BM image from CCR2-GFP＋mice
showing immunofluorescence imaging of VE-cadherin, Ly6C, and CD117 to identify cMoP (CCR2＋
Ly6C＋ CD117＋), Ly6Chi monocytes (CCR2＋Ly6C＋

CD117－), and Ly6Clow cells (CCR2＋Ly6C－CD117－),
which could be either Ly6C monocytes or dendritic
cells (DCs). Scale bars represent 50 mm in left
panel and 25 mm in right panels.

(Emoto, T. et al . Immunity . May10; 55(5):862-878. 8. 2 022.)

図２

冠動脈プラークの sc-RAN Seq での比較

7
121

Vascular Biology Innovation に関する研究助成なかった．
免疫染色，FACS データからは，病変部への単球やマクロファージの浸潤が抑制されていることが示された．
当初は骨髄の関与を想定していたが，骨髄で作られる単球は変化なかったものの，脾臓に貯蔵（一部作られる）されている単球が著しく減少しており，脾臓から病変部へ移行する単球が減ることが動脈瘤形成に良い影響を与えることを証明した．また腸内細菌由来の物質として，
Nod1 が脾臓の単球に影響を与えていることも示すことができた．
(Shinohara, R., Nakashima, H., Emoto, T.: et al .

Hypertension. 2022. in press.)

Developmental Origins of Health and Disease としての AT1 受容体による腎脈管・血管形
成誘導メカニズムの解明
川岸裕幸（信州大学先鋭領域融合研究群バイオメディカル研究所）【目的】
本研究は，哺乳類の後腎発生における脈管・血管形
成でのアンジオテンシン II（AngII）の作用メカニズ
ム を 解 明 し，Developmental Origins of Health andDisease の予防・治療法の開発を目指すことを目的としている．
図３ Depletion of gut microbiota, not a cocktailof antibiotics itself, limited the development ofexperimental abdominal aortic aneurysm (AAA)model with Angiotensin IIＡ）Experimental design: Apolipoprotein E-deﬁcient (Apoe-/-) mice fed a highcholesterol diet for six weeks were treated with Ang II infusion for four weeks.
The control group was sustained with normal drinking water. The AVNM (oral)group was kept on drinking water containing AVNM for one week before Ang
II infusion. Cocktails of AVNM were injected ﬁve times per week for one week
before Ang II intraperitoneal infusion in the AVNM (i.p.) group.
Ｂ）Representative images of the aortae in each group. Scale bar＝5.0 mm. C)
Incidence of AAA in each group. Chi-square test with post-hoe analysis.
Ｄ ）Mortality due to AAA rupture in each group. Chi-square test with posthoe analysis.
Ｅ）Diameter of the suprarenal aorta in each group. Kruskal-Wallis test with
Dunn's post-hoe analysis. Control, n＝34; AVNM (oral), n＝35; AVNM (i.p.), n＝20. (C-E).
Ｆ）Copies of 16S rDNA per g in Control, AWM (oral), and AVNM (i.p.) in fecal sample. Kruskal-Wallis test with Dunn's post-hoe analysis. Control, n ＝ 15;
AVNM (oral), n ＝ 9; AVNM (i.p.), n ＝ 6. Error bars represent SEM (standard
error of the mean) * p <0.01, ** p <0.01. AAA, abdominal aortic aneurysm;
Ang II, angiotensin II; A, ampicillin; V, vancomycin; N, neomycin; M, metronidazole; i.p., intraperitoneal injection. Incidence ofAAA is deﬁned as morethan 1.5 mm of maximum aortic diameter.

8122

AngII は，後腎発生において，腎内脈管・血管形成を誘導する重要な生理機能を有している．AngII はアンジ
オテンシン１型受容体（AT1R）に結合することで作用し，Ｇタンパク質経路と β アレスチン経路を介して細胞機能を調節しているが，後腎発生におけるこれらの経路の特異的な作用については不明な点が多い．
【方法】
両経路を抑制する AT1R 拮抗薬「カンデサルタン」，
およびＧタンパク質経路を抑制し β アレスチン経路を活性化する β アレスチンバイアス AT1R アゴニスト「TRV027」を用いて，新生児マウスの後腎発生における両経路の役割の解明を試みた．後腎形成が進行する出
生１日目から 15 日目までの野生型マウスに生理食塩水，
カンデサルタン，TRV027 を連日皮下投与した．投与

Vascular Biology Innovation に関する研究助成したマウスの血清を用いた腎機能の評価，および腎病理組織を用いた免疫・化学組織染色をそれぞれ行った．
【結果】
マウス血液検査の結果，カンデサルタン投与群でのみ有意な腎機能障害を認めた．腎病理組織解析を行ったと
ころ，カンデサルタン投与群において小葉間動脈・輸入動脈の血管平滑筋の顕著な肥厚が確認され，皮質の菲薄化などが確認された．さらに免疫組織染色の結果から，異常な血管平滑筋様細胞の増加が認められた．
【考察】
後腎発生においては，AT1R 経路が血管の形成・成熟

図１に機能することが示された．本研究は継続中であり，現血管病との関連から心腎肺疾患を紡ぐ
VEGF-A の新機軸

在カンデサルタンによる異常な血管平滑筋様細胞の増加について，そのメカニズムを検討している．また，さら（特の予後評価指標となりうることを明らかにした４,５）なる解析のためのモデルマウスを構築中である．

許：第 7009977 号）．腎疾患：⑤慢性腎臓病患者の尿中 VEGF-A165b 濃度が腎機能障害の重症度を反映してお血管病との関連から心腎肺疾患を紡ぐ VEGF-A の新機軸
菊地り，透析導入直前の患者では血中 VEGF-A165b 濃度が上昇していることを明らかにした６）（特許：第 6675687
号）．⑥国内最大コホートに参画し，ANCA 関連血管炎

良介の寛解予測に血中 VEGF-A165b 濃度が有用であること（名古屋大学）を明らかにした７）．肺疾患：⑦肺高血圧症の病態区分に
血中 VEGF-A165b 濃度が有用であることを明らかにし2014 年 か ら 2021 年 ま で の 本 助 成 期 間 を 通 し て，

た８）．以上より，本助成期間中に臨床検査医学への応用

VEGF-A の新機軸である VEGF-A165b (VEGF-A の相反を視野に，心腎肺疾患の臨床指標としての VEGF-A165b

する作用を有するアイソフォーム）と血管病との関連かの役割について研究を展開した（図１）．

ら心腎肺疾患における VEGF-A165b の役割について下記【文献】

７点を明らかにした．血管病：①血管病の一つである末

１）Kikuchi, R., Nakamura, K., MacLauchlan, S.,

梢動脈閉塞性疾患（PAD）患者の VEGF-A 血中濃度のDoan, TM., Shimizu, I., Fuster, J., Katanasaka,

上昇は，動脈の閉塞に伴う組織の低酸素に応答した血管

Y., Qiu, Y., Yamaguchi, PT., Matsushita, T.,

新生促進反応の結果という従来の概念を覆し，「VEGF-A

Murohara, T., Bates, DO., Hamburg, NM.

研究のパラダイムシフトが起きた」とも言える研究成果& Walsh, K.: An anti-angiogenic isoform ofを世界に先駆けて明らかにした ．② PAD の発症要因

VEGF-A contributes to impaired vascularizationである肥満症患者の胃縮小術前後で血中 VEGF-A165b 濃

in peripheral artery disease, Nat. Med., 20(12),度に有意な差が認められ，微小血管障害の改善指標とし1464-1471 (2014).

１）て有用であることを明らかにした２）．③ PAD の治療法

２）Doan, TM., Farb, M., Kikuchi, R., Karki, S.,の一つである脂肪由来間葉系幹細胞移植による血管新生

Tiwari, S., Bigornia, S., Bates, DO., Hamburg,療法の治療効果判定指標に VEGF-A165b の割合変化が有NM., Vita, JA., Hess, DT., Walsh, K. & Gokce,用であることを明らかにした３）（特許：第 6685563 号）．

N.: Anti-angiogenic actions of VEGF-A165b, a

心 疾 患： ④ 急 性 心 筋 梗 塞（AMI） を 発 症 し た 患 者 で

novel isoform of VEGF-A, in human obesity,

は，VEGF-A165b が冠動脈病変の複雑性と AMI 発症後

Circulation., 130, 1072-1080 (2014).
9
123

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

３）Katagiri, T., Kondo, K., Shibata, R., Hayashida,tosis with polyangiitis in a nationwide JapaneseR., Shintani, S., Yamaguchi, S., Shimizu, Y.,prospective cohort study, Ann. Clin. Biochem.,Unno, K., Kikuchi, R., Kodama, A., Takanari,58(2). 86-94 (2021).

K., Kamei, Y., Komori, K. & Murohara, T.: Ther-

８）Adachi, S., Kikuchi, R., Shimokata, S., Suzuki,

apeutic Angiogenesis using Autologous Adipose-A., Yoshida, M., Imai, R., Nakano, Y., Kondo, T.

derived Regenerative Cells in Patients with Criti-& Murohara, T.: Endostatin and vascular endo-

cal Limb Ischaemia in Japan: A Clinical Pilot

thelial growth factor-A165b may contribute to

Study, Scientiﬁc Reports., 10, 16045 (2020).

classiﬁcation of pulmonary hypertension. Circ.

４）Shibata, Y., Kikuchi, R., Ishii, H., Suzuki, S., Ha-

Rep., 3(3). 161-169 (2021).

rada, K., Hirayama, K., Suzuki, A., Tatami, Y.,
Kondo, K. & Murohara, T.: Balance between angiogenic and anti-angiogenic isoform of VEGF-A
is associated with the complexity and severity ofcoronary artery disease, Clin. Chim. Acta., 478,
114-119 (2018).
５）Harada, K., Kikuchi, R., Ishii, H., Shibata, Y.,

一細胞解析とCRISPR/Cas9 システムの融合による心不全リプログラミング因子スクリーニ
ング
候聡志（東京大学医学部附属病院）

Suzuki, S., Tanaka, A., Suzuki, A., Hirayama,
K. & Murohara, T.: Association between theratio of anti-angiogenic isoform of VEGF-A to【背景と研究目的】

total VEGF-A and adverse clinical outcomes in細胞一つ一つから個別にトランスクリプトーム解析を

patients after acute myocardial infarction, Int. J.

行う Single-cell RNA-seq (scRNA-seq) はこの５年程のCardiol. Heart. Vasc., 19, 3-7 (2018).

間に大きく普及し，今や生物学研究に欠かせないものと

６）Kikuchi, R., Yasuda, Y., Nakatochi, M., Shibata,なった．昨今の国内外の研究情勢を鑑みるに，単なるY., Hara, T., Suzuki, A., Imaizumi, T., Suzuki,

scRNA-seq 解析のみならず，そこで得られる様々な情

S., Ishii, H., Takeshita, K., Matsushita, T.,

報をうまく処理して重要な分子生物学的事象を明らかに

Maruyama, S. & Murohara T.: Urinary and cir-

したり，トランスクリプトーム以外の階層の解析技術とculating levels of the anti-angiogenic isoform of

うまく統合したりすることが重要になってきている．申

vascular endothelial growth factor-A in patients

請者が取り組んでいる心不全研究に当てはめて言うならwith chronic kidney disease, Clin. Chim. Acta.,

ば，得られた膨大なデータを如何に処理し，有用な情報

475, 102-108 (2017).

を抽出（新規心不全治療ターゲットの探索）するのかが

７）Kikuchi, R., Tsuboi, N., Sada, K., Nakatochi, M.,

喫緊の課題と言える．申請者らは本研究助成を受け，こYokoe, Y., Suzuki, A., Maruyama, S., Murohara,の課題に対して以下のように取り組み，本年度は一定のT., Matsushitah, T. and Research Committee of

成果を得た．

Intractable Vasculitis Syndrome and Research【方法】

Committee of Intractable Renal Disease of the⑴心筋細胞-非心筋細胞間コミュニケーションの解析

10124

Ministry of Health, Labour and Welfare of Ja-

申請者等の過去の研究では心筋細胞単独に注目していpan; Amanoj, K., Atsumi, T., Takasaki, Y., Ito,

たが，心臓に存在する非心筋細胞にも着目し，scRNA-

M., Hasegawa, H., Dobashi, H., Ito, T., Makino,seq データを用いて重み付け遺伝子共発現ネットワー

H. & Matsuo, S.: VEGF-A and VEGF-A165b are

ク解析（WGCNA）やリガンド-受容体解析（LR 解析），

associated with time to remission of granuloma-

Pathway 解析といった新たな解析手法を加えることにVascular Biology Innovation に関する研究助成

より，非心筋細胞-心筋細胞相互作用に基づく新たな心⑵ scRNA-seq と 空 間 的 遺 伝 子 発 現 解 析（Spatial

不全の病態解明を目指した．

transcriptomics）の統合解析⑵ scRNA-seq と空間的遺伝子発現解析（Spatial tran­

健常及び梗塞後の心臓組織標本を “数細胞レベル” のscriptomics）の統合解析

細かい解像度で空間的遺伝子発現プロファイルの解析をscRNA-seq の最大の問題点は細胞単離の過程で元々行い，これを scRNA-seq と統合解析した結果，心筋梗

個々の細胞が存在していた位置情報が失われる点にある塞後急性期に梗塞周辺領域の心筋細胞において特徴的にが，申請者らは組織上の細かな各領域でトランスクリプ

見られる，Csrp3 に代表されるようなメカノストレス応

トームを調べる空間的遺伝子発現解析の手法を用いて，答遺伝子の発現増加が心保護的に働き，将来的な梗塞後

scRNA-seq と統合解析を試みた．

リモデリングを抑制することを見出した．

【結果及び考察】⑴心筋細胞-非心筋細胞間コミュニケーションの解析
異なる細胞種の遺伝子ネットワークのうち，特にリガンド/受容体 (LR) 遺伝子を抜き出し，LR データベース
を基に対応するリガンド-受容体 (LR) 同士をつなげることによって細胞種間コミュニケーションを可視化した
ところ，心臓においては心筋細胞-心臓線維芽細胞間のシグナル伝達のやり取りが最も盛んであることが分かった．線維芽細胞特異的に発現する Htra3 という分子に着目し，機能解析を進めたところ，Htra3 KO マウスは【文献】

圧負荷に脆弱であり，圧負荷後に線維芽細胞で TGFβ１）Ko, T. & Morita, H.: Molecular Genomic Autop-

シグナルの過剰活性化が生じ，それがさらに心筋細胞に

sy – Clues to Preventing Further Tragedy?– . Circも影響してこれを不全心筋化させることが分かった．逆J., 2022 Sep 17. doi: 10.1253/circj.CJ-22-0513.

に Htra3 の過剰発現は心保護的であり，新たな治療ター

２）Yamada, S., Ko, T. (co-first author), Hatsuse,

ゲットであると考えられる．

S., Nomura, S., Zhang, B., Dai, Z., Inoue, S.,
Kubota, M., Sawami, K., Yamada, T., Sassa,
T., Katagiri, M., Fujita, K., Katoh, M., Ito, M.,
Harada, M., Toko, H., Takeda, N., Morita, H.,
Aburatani, H. & Komuro, I.: Spatiotemporaltranscriptome analysis reveals critical roles ofmechano-sensing genes at the border zone inremodeling following myocardial infarction. Nat

Cardiovasc Res., 1: 1072-1083 (2022).
３）Katagiri, M., Yamada, S., Katoh, M., Ko, T., Ito,
M. & Komuro, I.: Heart Failure Pathogenesis
Elucidation and New Treatment Method Development. JMA J., in press (2022).
４）Ko, T. & Morita, H.: Takotsubo Cardiomyopathy
and Peripartum Cardiomyopathy: Similar in
Features, but Diﬀerent in Nature. Int Heart J.,
63: 651-653 (2022).

11
125

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

５）Ko, T. & Nomura S.: Manipulating Cardiomyo-mRNA は有意に上昇した．また TGFβ1 (5 ng/ml) でcyte Plasticity for Heart Regeneration. Front

24 時間刺激した場合も同様の結果となった．この結Cell Dev Biol., 10: 929256 (2022).

果をもとに，リコンビナント NBL1 (rNBL1) 125 ng/６）Ko, T., Nomura, S., Yamada, S., Fujita, K., Fu-

ml で HK-2 細胞を 48 ～ 72 時間刺激すると，αSMA

jita, T., Satoh, M., Oka, C., Katoh, M., Ito, M.,や vimentin 等の EMT に関するマーカーの mRNA がKatagiri, M., Sassa, T., Zhang, B., Hatsuse, S.,

有意に上昇した．また rNBL1 (500 ng/ml) で 72 時

Yamada, T., Harada, M., Toko, H., Amiya, E.,

間刺激し，western blot で蛋白の発現を検討すると，Hatano, M., Kinoshita, O., Nawata, K., Abe, H.,

αSMA は，コントロールに対して，約 1.5 倍に有意

Ushiku, T., Ono, M., Ikeuchi, M., Morita, H.,に増加し，E-cadherin は低下した．

Aburatani, H. & Komuro, I.: Cardiac ﬁbroblasts②動物実験には，KO (NBL1: –/–) マウスと WT (NBL1:

regulate the development of heart failure via+/+) マウスを使用した．マウスの右腎臓を摘除し，Htra3-TGF-β-IGFBP7 axis. Nat Commun., 13(1):２週間の回復期間を与えた後に高脂肪餌を負荷し，3275 (2022).

STZ を腹腔内投与して血糖値が 300 mg/dl 以上の個
体を糖尿病群とした．また STZ を投与せず普通餌で糖尿病性腎症の進展における新規 BMP 拮抗分子の機能解析
小林

飼育する KO マウスおよび WT マウスをコントロー
ル群とした．４週毎に体重と血糖値，尿蛋白等の測定を行い，糖尿病発症後 24 週まで飼育し，検体を採取

洋輝

した．現在は血液，腎臓での NBL1 の発現量，線維（日本大学医学部）化に関する蛋白の発現について解析を行なっている．
【考察】

【序論】

培養細胞において，NBL1 は高糖や TGFβ１刺激で発申請者は糖尿病患者を対象に，血漿中蛋白を網羅的に現が増加し，rNBL1 は EMT を起こした．今後は NBL1

解析し，その中から NBL1 が糖尿病性腎症の進展にお抑制下におけるこれらの刺激因子での EMT 現象や，さいて重要な役割を担うことを明らかにした．以上より，

らに NBL1 がどのような発現機序を持つかについて検本研究では NBL1 が腎線維化にどのように関与するか討する．

について検討した．
【方法】①ヒト近位尿細管細胞（HK-2 細胞）を用いて，NBL1

ヒト iPS 細胞由来心臓予定領域および心筋細胞のの発現を上昇させる因子の検討及びリコンビナント

作り分け

NBL1 (rNBL1) による刺激下での EMT 関連蛋白の変斎藤幸弘（岡山大学病院）化について検討した．
② NBL1 ノックアウトマウスに対して，ストレプトゾ
トシン（STZ）にて糖尿病を誘導し，尿蛋白や腎線維化の程度を評価し，糖尿病性腎症における NBL1 の役割について検討した．

【目的】
ヒト多能性幹細胞由来心筋細胞を左室・右室のサブタ
イプ別に誘導する方法は確立されていない．本研究では，【結果】

ヒト iPS 細胞から左室様心筋細胞および右室様心筋細胞① HK- ２細胞を無血清培地（コントロール：低グルコーを別々に誘導する方法を検討した．

ス 5.6 mM）で serum starvation 後，高グルコース【方法と結果】

培地（33 mM）で 24 時間刺激すると，コントロー

GSK3 阻害剤と Wnt 阻害剤を用いる心筋分化プロト

ルと比べて高グルコース刺激の細胞では，NBL1 のコール（Lian et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012）

12126

Vascular Biology Innovation に関する研究助成を用いて，ヒト iPS 細胞の心筋細胞分化を誘導した．

【目的】

通常のプロトコールでは，主に一次心臓領域に相当す

心 不 全 状 態 で は， 過 度 の 頻 脈 が 心 筋 酸 素 消 費 量

る NKX2-5+/TBX5+ 心 臓 前 駆 細 胞 が 誘 導 さ れ， こ の（MVO2）を増加させ，心機能を悪化させる．しかし，前駆細胞集団からは最終的に左室心筋細胞に相当す

不適切な心拍数（HR）の低下は，逆に血行動態を悪化

る TBX5+/MLC2v+ 心筋細胞が得られた．次に，このさせる．迷走神経刺激（VNS）の生理的反応として，

プロトコールの中胚葉誘導開始にあたる分化０日目に心拍数の低下が知られている．我々は，これまでに，迷dorsomorphin を加えたところ，主に二次心臓領域に相走神経刺激による心拍数減少の動的特性について繰り返

当する NKX2 –5+/TBX5 –/CXCR4+ 心臓前駆細胞が誘し報告をしてきた．また，近年，我々は上大静脈（SVC）

導され，この前駆細胞集団からは最終的に右室心筋細胞に留置したバスケットカテーテルを介して右迷走神経をに相当する TBX5–/MLC2v+ 心筋細胞が得られた．

刺激できる静脈内留置型 VNS カテーテル（JOHAKU）【考察】を開発した．本研究において，我々は，急性心不全状態

GSK3 阻害剤と Wnt 阻害剤を使用する心筋分化プロにおいて，JOHAKU が HR, MVO2，血行動態に与える

トコールにおいて，中胚葉誘導期に BMP シグナルを阻影響について大動物を用いて検討した．

害することで，左室の源となる一次心臓領域の誘導が抑【方法】

制され，右室の源となる二次心臓領域に相当する細胞が急性心不全状態を誘導したビーグル犬５頭を使用し特異的に誘導されることがわかった．
これまでに，レポー

た．エタノールを心筋に直接注入（0.5-2 ml/kg）し，

ター遺伝子導入（Zhang et al. Cell Stem Cell. 2019;

心筋障害を誘発した．右大腿静脈からカテーテルを挿

Pezhouman et al. Cardiovasc Res. 2022）や，細胞表入し，バスケット型電極を SVC に設置した．VNS の面マーカーに対する抗体で異なる心臓領域前駆細胞を回強度は HR が 10-20% 低下するように調整した（20Hz,

収する方法（Andersen. et al. Nat Commun. 2018）が10-22V）．HR, 血圧 (BP), 心拍出量 (CO), 左回旋動脈血

報告されている．本研究では，培地交換のみの操作で，流（CF）を同時に記録した．MVO2 はヘモグロビン濃度，

左室および右室心筋細胞を作り分けることができる簡便

CF および冠動脈と冠状静脈洞の酸素飽和度差の積で算な心筋分化プロトコールを確立した．

出した．HR, MVO2，血行動態をベースラインと刺激【学会発表】

５分後で比較した．

斎藤

幸弘，中村

一文，伊藤

浩：Diﬀerent Heart【結果】

Field Progenitors and Chamber Cardiomyocytes De-

エタノール直接注入により，CO（エタノール前：2.0

rived from Pluripotent Stem Cells，第 86 回日本循環±0.4 vs. エタノール後：1.5±0.2 l/min）と平均 BP（86

器学会学術集会，Special Session 16，
2022 年 3 月，神戸．

±6 vs. 75±15 mmHg）が低下し，左室拡張末期血圧（12±6 vs. 16±7 mmHg）は上昇した．VNS は急速かつ刺神経 - 免疫ネットワークを介して高血圧の臓器障害を抑制するニューロモデュレーション治療の開発
朔啓太

激強度依存的に HR を低下させた．急性心不全犬モデル
では，VNS は HR（ベースライン：122±7 vs. VNS5 分後：
108±14 bpm, p＜0.05）と MVO2（3.3 ±0.4 vs. 2.8±0.6 mlO2/min/100g）を有意に減少させたが，平均（国立循環器病研究センター）

BP（73±8 vs. 72±2 mmHg, p ＝ 0.56）には影響を与えなかった．

※本研究は，当初ラット高血圧モデルを対象に植え込み【考察】型迷走神経刺激装置を用いた実験を想定していたが，コ

VNS カテーテルは急性心不全モデル犬において，血ロナ禍によって装置調達が不可能となり，迷走神経刺激

行動態を悪化させることなく，HR と MVO2 を抑制さを用いた下記実験を本年度は推進した．

せることができた．本機器は不安定な血行動態における過剰な心臓負荷の抑制に寄与する可能性がある．

13
127

Vascular Biology Innovation に関する研究助成【文献】
研究推進の過程で得られた知見を基に以下の論文報告

supine position at rest correlates well with thenocturnal blood pressure variability assessed byを行った．

ambulatory blood pressure monitoring. Hyper-

１）Uemura, K., Nishikawa, T., Hasebe, N., Yokota,

tension Research., 2022, 45(6): 1008-1017.

S., Kakuuchi, M., Saku, K., Kawada, T., Moro-

７）Saku, K., Yokota, S., Nishikawa, T. & Kinugawa,

dome, S., Furukoshi, M. & Sugimachi, M.: A

K.: Interventional heart failure therapy: A newnovel triple-bladder cuﬀ method for blood pres-concept ﬁghting against heart failure. J Cardiol.,sure estimation based on pulse wave dynamics

16: S0914-5087(21) 00339-7, 2021.

in brachial artery: theoretical and experimental
analyses. IEEE Trans Biomed Eng., 2022.

８）Kawada, T.*, Nishikawa, T., Hayama, Y., Li, M.,
Zheng, C., Uemura, K., Saku, K., Miyamoto, T.

２）Ando, M., Watanabe, N., Saku, K. & Morishima,& Sugimachi, M.: Quantitative assessment of theI.: Acute phase administration of Ivabradine

central versus peripheral eﬀect of intravenous

supported by intra-aortic balloon pump in-clonidine using baroreﬂex equilibrium diagrams.

duces myocardial recovery without signiﬁcant

J Physiol Sci., 2022, 71(1): 39, 2021.

haemodynamic worsening in a patient with

９）Kawada, T.*, Yamamoto, H., Miyamoto, T.,

acute fulminant myocarditis: a case report, Eu-

Hayama, Y., Li, M., Zheng, C., Uemura, K.,ropean Heart Journal Case Reports., 2022, 6(8)Sugimachi, M. & Saku, K.: Ivabradine increases

ytac340.

the high frequency gain ratio in the vagal heart３）Kawada, T.*, Miyamoto, T., Mukkamala, R. &rate transfer function via an interaction with

Saku, K.: Linear and nonlinear identification

muscarinic potassium channels. Physiol Rep.,of the carotid sinus baroreﬂex in the very low-

2021, 9(23): e15134.

frequency range. Physiological Reports., 2022,
10: c15392.

₁₀）Umemoto, S., Abe, K.*, Hosokawa, K., Horimoto, K., Saku, K., Sakamoto, T. & Tsutsui,４）Kawada, T.*, Li, M., Suehara, S., Sawada, S.,

H.: Increased Pulmonary Arterial ComplianceZheng, C., Uemura, K., Sugimachi, M. & Saku,

after Balloon Pulmonary Angioplasty Predicts

K.: Angiotensin II inhibition increases diuresis

Exercise Tolerance Improvement in Inoperable

during acute sympathetic activation in intact

CTEPH Patients with Lower Pulmonary Arterial

and denervated kidneys in rats with chronic

Pressure. Heart Lung., 2021, 52: 8-15.

myocardial infarction. Heart and Vessels., 2022,(37) 1636-1646.
５）Li, M.*, Zheng, C., Kawada, T., Uemura, K.,
Inagaki, M., Saku, K. & Sugimachi, M.: Early
donepezil monotherapy or combination with

心筋リプログラミングによる革新的心不全治療法の
開発
貞廣

威太郎
（筑波大学医学医療系）

metoprolol significantly prevents subsequentchronic heart failure in rats with reperfused
myocardial infarction. The Journal of Physi-

ological Sciences., 2022, 72(12).

【目的】
慢性心不全には心移植を除いては根本的な治療法はな

６）Kinoshita, H., Saku, K.*, Mano, J., Mannoji, H.,

く，心臓再生医療の応用が望まれている．我々は，心臓Kanaya, S. & Sunagawa, K.: Very short-term

線維芽細胞に心筋特異的遺伝子を導入し，体内で直接心

beat-by-beat blood pressure variability in the

筋細胞を誘導して心臓を再生する「心筋直接リプログラ

14
128

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

ミング法」を開発し，マウス急性心筋梗塞モデルにおい【文献】て心筋再生と心臓機能の改善に成功している．本研究で

１）Kurotsu, S.*, Sadahiro, T.*, Harada, I. & Ieda,

は，新規治療が熱望される慢性心不全に対し，心筋直接

M.: A biomimetic hydrogel culture system to fa-

リプログラミングによる革新的治療法の確立を目的とす

cilitate cardiac reprogramming. STAR Protoc., 3,る．

101122 (2022). *Equal contributors. Correspond-【方法】

ing author

陳旧性心筋梗塞の慢性心不全マウスを作製し，心筋直接リプログラミングによる心臓再生を検討する．心臓線
維芽細胞特異的に心筋リプログラミング遺伝子を発現させるため，タモキシフェン投与により遺伝子発現を制御できる遺伝子改変マウスを作製し，治療効果や分子生物

オステオポンチンを標的とした抗線維化薬の開発
白川公亮（慶應義塾大学）

学的機序を検討する．
【結果】
１．リプログラミング遺伝子発現を時期・細胞特異的に【目的】制御できる CAG-CAT-MGTH2A Tg マウスを作製し肺には多種多彩な免疫細胞が集積し組織の恒常性をた．さらにこのマウスをタモキシフェン誘導型の心臓

維持しているが，そのバランスが破綻すると様々な肺線維芽細胞特異的 Cre マウスとレポーターマウスと疾患の増悪を来す．肺間質マクロファージは定常状態で交配した．このマウスにタモキシフェンを投与するこは恒常性を維持しているが，病的な状態における肺間質とで，陳旧性心筋梗塞内の心臓線維芽細胞特異的に心マクロファージの機能や分化機序は明らかではない．肺筋リプログラミング遺伝子と蛍光タンパクを発現させ疾患の病態を悪化させるサイトカインやケモカインは数ることが可能となった．

多く報告されているが，オステオポンチン（OPN）は

２．心筋梗塞 1 か月後のタモキシフェン投与の結果，心肺線維症などの呼吸器疾患に伴う気道周囲の線維化を増筋直接リプログラミングによって線維芽細胞から赤色の悪させ，呼吸器疾患の病態増悪に重要な役割を果たす．

心筋細胞が再生され，心臓収縮能が改善した．さらに，

OPN の過剰な産生を抑制できれば，肺線維化を抑制し心筋梗塞によって形成された線維化面積が減少した．

呼吸器疾患の予後改善につながる．本研究は，OPN 産

３．心機能改善のメカニズムを明らかにするため，対照

生肺間質マクロファージの機能や分化誘導機序を解明

群とリプログラミング群の心臓における遺伝子発現をし，肺線維化を抑制する治療法の開発を目的とした．

網羅的に解析したところ，心不全悪化と関連する線維化・【方法】

炎症関連遺伝子群が著明に抑制されることを見出した．

OPN を コ ー ド す る Spp1 遺 伝 子 の EGFP Knock-in

４．心筋再生が線維芽細胞に与える影響を生体外におい(KI) reporter マ ウ ス（Spp1Egfp/wtt KI reporter マ ウ ス ）て解析する目的で，心筋梗塞瘢痕領域と同等の足場のに経気管的に Bleomycin を投与して Flow cytometry

硬さを再現した細胞培養システムを開発した１）．

及 び 病 理 学 的 に Spp1 transcriptional activity が 上 昇【考察】

す る 細 胞 を 同 定 す る．Spp1Egfp/wtt KI reporter マ ウ ス

心筋直接リプログラミングが心臓再生だけではなく，の Bleomycin 肺線維症モデルマウスの GFP 陽性肺マ

心不全に伴う線維化リモデリングを抑制することで，慢クロファージ，GFP 陰性肺マクロファージ及び血中単性心不全の心機能を改善している可能性が示唆された．

球を Flow cytometry でソートし，bulk RNA-seq 及び

現在は，これらのマウス心臓のシングルセル解析によっ

質量分析法により網羅的に遺伝子/蛋白の解析を実施すて，分子生物学的な機序の解明を目的として，更なる解る．Spp1-EGFP 陽性マクロファージの single cell (sc)

析を続けている．

RNA-seq 解析を実施する．

15
129

Vascular Biology Innovation に関する研究助成【結果】た．同定された中で，Arginase-1 の発現が最も上昇し，Bleomycin 投与後の Spp1 transcriptional activity

その他 Transmembrane glycoprotein NMB (Gpnmb)，

上昇細胞はマクロファージであった

リンパ管内皮細胞マーカーである Podoplanin，肺の炎

Spp1egfp/－ KI reporter マウスに Bleomycin を経気管症性免疫細胞浸潤を促進する Mmp12，エンドソーム

投 与 し， 肺 の Spp1-EGFP＋cells を ﬂow cytometry で/リソソームに局在する酸性プロテアーゼ群である種々解析を実施した．Spp1-EGFP＋cells は，CD45＋CD64＋のカテプシン（D, K, S, L）を高度に発現していた．

マクロファージであり，Spp1 transcriptional activity は

IL7R＋ SiglecF－ CD11b＋マクロファージは OPN を強Bleomycin 投与後３日目から上昇し，７日目でピーク力に産生したとなり，14 日目も持続していた．Bleomycin 投与７日

OPN 産生肺間質マクロファージの heterogeneity を

目の Spp1-EGFP＋ マクロファージは大部分が SiglecF－

明らかにするために，Bleomycin-treated Spp1 EGFP/wt

CD11b＋ の 間 質 subset で あ り， Spp1-EGFP＋ マ ク ロ

EGFP ＋ SiglecF － CD11b ＋ subset の scRNA-seq を

ファージは Bleomycin 投与後肺の肥厚した間質内に集実 施 し た．Graph-based clustering method に よ っ積していた．

て 11 の ク ラ ス タ ー に 分 類 さ れ，Spp1 発 現 が 最 も 高

Spp1 -EGFP 陽性 CD11b 陽性マクロファージは肺線

い Cluster4 に注目すると，マルチオミクス解析で同定

維化と好中球浸潤を促進した

された Mmp12 などの遺伝子発現が有意に上昇していSpp1-KO マ ウ ス を 骨 髄 照 射 し， Spp1EGFP/wt も し く

た．Flow cytometry による SiglecF－ CD11b＋ マクロは Spp1EGFP/EGFP マ ウ ス の 骨 髄 を 移 植 し た マ ウ ス に，

ファージの時系列解析では，マルチオミクス解析で同Bleomycin を経気管投与した．Spp1EGFP/wt BM → Spp1

定 さ れ た Podoplanin と IL7R の 発 現 が bleomycin 投

KO mice の 14 日 目 の 肺 に は 高 度 に 炎 症 細 胞 が 浸 潤

与後より増加し，７日目には 50% 以上が Podoplanin＋

し，高度な線維化を認めた．一方で，Spp1EGFP/EGFP BM

IL7R＋ subset と な り， こ の subset で 最 も Spp1

→ Spp1 KO mice では，それらが改善された．Spp1-transcriptional activity が上昇していた．

EGFP＋ マクロファージ由来の OPN が ﬁbroblast 分化

IL7 は肺マクロファージの OPN 産生を制御したに与える影響を明らかにするため，マウス肺由来線維

Bleomycin 投与後 7 日目の肺では，気管支上皮を中芽細胞と肺由来マクロファージを共培養した．PBS-

心に IL7 の発現がみられ，周囲に Spp1-EGFP＋ subset

treated Spp1EGFP/wt EGFP－ SiglecF－ CD11b＋ subset

が 集 積 し て い た．Bleomycin を 投 与 し た Spp1Egfp/wtt

は，ﬁbroblast の αSMA 発現を誘導しなかった．一方

KI reporter マ ウ ス に αIL7R 抗 体 を i.v. 投 与 し て IL7

で，Bleomycin-treated Spp1 EGFP/wt EGFP ＋ SiglecF －signaling を抑制すると，マクロファージの絶対数は

CD11b＋ subset は 高 度 に そ の 発 現 を 誘 導 し た． さ ら

control に比して有意に減少し，Spp1 transcriptionalに，Bleomycin-treated Spp1－

activity が高度な細胞（Spp1-EGFPhigh subset）の発現

CD11b＋ subset を Spp1-KO マウスに経気管的に投与すが抑制された．さらに，IL7 signaling の阻害は，肺へると，局所的ではあるが，肺の線維化を促進し，炎症細の好中球をはじめとした炎症細胞浸潤や線維芽細胞の活胞の浸潤を促進した．

性化を抑制した．

Spp1 -EGFP 陽性 CD11b 陽性マクロファージは Ar-

IL7 は OPN 及び MMP12 を産生するマクロファージ

ginase-1 を高度に発現したへの分化誘導を促進した

EGFP/wt

EGFP＋

SiglecF

RNAseq と mass spectrometry を 組 み 合 わ せ た

Mmp12 は，scRNAseq 解析で同定された Spp1 遺伝

マ ル チ オ ミ ク ス 解 析 に よ っ て，Bleomycin 投 与 後 に子発現が最も高い Cluster4 で有意に高発現している遺Spp1 transcriptional activity が最も上昇する day 7 の伝 子 で あ っ た． 一 方 で，Cluser4 に お け る Arg1 の 発

SiglecF－ CD11b＋ マ ク ロ フ ァ ー ジ を 解 析 し た．Bleo-

現は，他のクラスターよりも低下していた．肺胞上皮

mycin-treated Spp1EGFP/wt EGFP＋ SiglecF－ CD11b＋細胞由来の GM-CSF は，肺マクロファージの分化誘導

subset で発現が上昇する 37 個の遺伝子/蛋白を同定し及 び 維 持 に 必 要 で あ る．Spp1Egfp/wtt reporter mice の16
130Vascular Biology Innovation に関する研究助成

骨髄由来マクロファージでは，GM-CSF 刺激は Arg1 と疾患の予防や治療にさえ有益であることが知られていMmp12 の遺伝子発現を著明に上昇させ，GM-CSF で培るが，しばしば運動が実施できない患者が存在するた

養した骨髄由来マクロファージに IL4 を投与すると Arg1

め，運動療法の代替法の発見も重要な課題となってい及び Mmp12 の遺伝子発現が有意に上昇した．さらに，

る１,２）．また，心臓リハビリテーションを含め，骨格筋

IL7 は Spp1 と Mmp12 の発現をさらに増加させ，一方で異常の発症機序におけるエビデンスはわずかながら蓄積

Arg1 の発現を抑制した．この結果は，scRNA-seq 解析

されつつある１－３）．一方で，心不全における骨格筋異で Spp1 発現が最も高い Cluster4 の特徴と一致していた．

常が治療できるかどうかは，未だ不明な点が多い１－６）．

【考察】

【結果】

今回の実験では，マルチオミクス解析と scRNAseq

心筋梗塞 2 週間後の心不全マウスにおける SGLT2 阻

解析を用いてブレオマイシン投与後にオステオポンチン

害剤（Empagliﬂozin, 300 mg/kg of food）の４週間投を高度に発現するマクロファージの分化機序を明らか

与は，骨格筋の脂肪酸を基質とした骨格筋ミトコンドリにした．ブレオマイシン投与後７日目は炎症期から線維

ア呼吸能および筋持久力の低下を改善した３）．これらの化への移行時期であるが，オステオポンチンは肺線維化改善には，血中ケトン体の増加が関連していた３）．そのを促進する炎症性サイトカインである．ブレオマイシ

一方で，ピルビン酸を基質とした骨格筋ミトコンドリア

ン投与７日目のオステオポンチン主要産生源は SiglecF-

呼吸能および最大酸素摂取量（最大運動能力の指標）は

CD11b+ マクロファージであり，マルチオミクス解析

低下した１）．

と scRNAseq 解 析 か ら，GM-CSF と IL4, IL7 の 刺 激【結論】によりオステオポンチン産生マクロファージに分化し

SGLT 阻害剤は，臨床試験の結果からも 6 分間歩行な

MMP12 も産生していた．オステオポンチン産生肺マク

どの持久力を改善する７－９）．今回の研究結果は，心筋

ロファージは線維化初期の Day7 より，線維芽細胞活性梗塞後から心不全に至る過程で生じる骨格筋異常の治療化による肺線維化促進と MMP12 による炎症細胞浸潤薬としての SGLT2 阻害剤の有用性を支持する１,３）．

作用により病態を悪化させていると考えられた．

【引用文献】【文献】

１）Takada, S. (corresponding author), Sabe, H. &本研究成果は現在論文投稿準備中である．また本助成金

Kinugawa, S.: Treatments for skeletal muscle

により下記論文がアクセプトされました．

abnormalities in heart failure: sodium-glucose

Kohsuke, Shirakawa. & Motoaki, Sano.: Neutrophils

transporter 2 and ketone bodies. Am J Physiol

and Neutrophil Extracellular Traps in Cardiovascu-

Heart Circ Physiol ., 1; 322(2): H117-H128,

lar Disease: An Overview and Potential Therapeutic

2022.

Approaches, Biomedicines., 2022; 10(8): 1850. doi:
10.3390/biomedicines10081850.

２）Takada, S. (corresponding author), Sabe, H. &Kinugawa, S.: Abnormalities of skeletal muscle,
adipocyte tissue, and lipid metabolism in heart

心不全の骨格筋異常の治療における SGLT2 阻害剤
高田

failure: practical therapeutic targets. Front Car-

diovasc Med., 12; 7: 79, 2020.
３）Nambu, H.*, Takada, S.* (ﬁrst and correspond-

真吾（北翔大学生涯スポーツ学部）

ing author ) , …, Kinugawa, S.: Empagliflozin
restores lowered exercise endurance capacity【背景】
心疾患は，質と量の両方で “骨格筋異常” を伴うこと

via the activation of skeletal muscle fatty acidoxidation in a murine model of heart failure.

が多く，日常生活動作や生活の質を著しく損なう主原因

Eur J Pharmacol., 5; 866: 172810, 2020.

となっている．これらの異常に対して，運動療法は心４）Matsumoto, J.*, Takada, S.* ( first author ) ,17
131

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

Kinugawa, S. et al.: Brain-derived neurotrophic

DI-E-RAMP2－/－を用いて，癌細胞のリンパ節転移の

factor improves limited exercise capacity in

検討を行った．

mice with heart failure. Circulation ., 138:

【結果】

2064-2066, 2018.

リンパ節転移しやすい様に馴化したルイス肺癌細胞

５）Matsumoto, J.*, Takada, S.* (ﬁrst author), …,(LLC) をマウス足底部に移植すると，DI-E-RAMP2－/－

Kinugawa, S.: Brain-Derived Neurotrophic Fac-

では，膝窩リンパ節への転移の亢進が認められた．DI-

tor Improves Impaired Fatty Acid Oxidation Via

E-RAMP2－/－では，リンパ節内に特異的に存在する

the Activation of Adenosine Monophosphate-ac-

血管である高内皮細静脈（HEV）の数の減少や，構造

tivated Protein Kinase-α - Proliferator-Activated

異常が認められた．さらに，組織透明化処理を行なっ

Receptor-r Coactivator-1α Signaling in Skeletal

た転移リンパ節を観察すると，DI-E-RAMP2－/－では，Muscle of Mice With Heart Failure. Circulation

HEV に沿って，リンパ節内に癌細胞が浸潤，増殖するHeart Fail., 13: e005890, 2021.

様子が確認された．RAMP2 欠損誘導後の血管内皮細胞

６）Nambu, H., Takada, S. (corresponding author),

では，細胞表面に無数の微小突起や細胞外小胞 ( エクソ…, Kinugawa, S.: Inhibition of xanthine oxidase

ソーム ) が確認された．そこで次に，TNF-α を用いて，

in the acute phase of myocardial infarction

DI-E-RAMP2－/－内皮細胞を直接刺激してみたところ，

prevents skeletal muscle abnormalities and ex-

Control と比べて，エクソソームの産生量が有意に増加

ercise intolerance. Cardiovasc Res., 22; 117(3):した．DI-E-RAMP2－/－内皮細胞由来のエクソソーム

805-819, 2021.

は，LLC 細胞の上皮間葉転換を促進させ，LLC 細胞の７）Nassif, ME. et al.: Nat Med., 27(11): 1954-1960,
2021.

増殖，遊走を亢進させた．
【考察】

８）Nunez, J. et al.: Clin Cardiol., 41(4): 476-480,
2018.

血管の AM-RAMP2 系の欠損は，リンパ節内の HEVの構造および機能を傷害し，癌細胞がリンパ節転移し９）Santos-Gallego, CG. et al.: JACC., 26; 77(3):243-255, 2021.

やすい環境を作り出すことが明らかとなった．血管のAM-RAMP2 系の傷害は，血管内皮細胞由来のエクソ
ソーム産生を介して，癌細胞の悪性化や転移を促進させアドレノメデュリン-RAMP2 系による血管恒常性る可能性がある．

制御機構による腫瘍転移抑制薬の開発
田中

多能性幹細胞における代謝機構に基づく細胞作製と愛（信州大学）

心臓再生医療への応用
遠山

【目的】

周吾
（慶應義塾大学医学部）

アドレノメデュリン（AM）は血管拡張ペプチドとして同定されたが，それ以外にも様々な作用を有すること

ヒト多能性幹細胞は心筋細胞を含む様々な細胞に分化が明らかとなっている．私はこれまで，① AM とそのする能力を有するため，心臓再生医療への応用が期待さ

受容体活性調節タンパク RAMP2 が，血管の恒常性維れている．一方で，ヒト多能性幹細胞を用いた心臓再生持に必須であること，②誘導型の血管内皮細胞特異的医療における臨床応用を実現化するためには多くの課題

RAMP2 ノックアウトマウス（DI-E-RAMP2－/－）では，を克服する必要がある．その最も重要な課題 の１つは，血管の傷害が転移前土壌形成を促進し，癌細胞の血行性

分化後に残存する未分化幹細胞を取り除き，効率よく心転移を亢進させることを報告した．本年度の研究では，

筋細胞のみを作製する技術の確立であった．我々はこれ

18
132

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

らの課題に対して，ヒト多能性幹細胞と分化心筋細胞の1406-1414.

代謝プロファイルを詳細に解析することにより，培養環４）Tanosaki, S., Tohyama, S. (Corresponding au-

境により分化後に残存する未分化幹細胞を取り除き，分thor), et al.: (2020) iScience., 23, 101535.

化心筋細胞のみを効率よくかつ大量に純化精製するとい

５）Tanosaki, S., Tohyama, S. (Corresponding au-

う画期的手法を構築することにより克服することに成功thor), et al.: (2022) STAR Protocols., 3, 101360.

．さらに，我々は多能性幹細胞特異的な代謝６）Someya, S., Tohyama, S. (Corresponding au-

した

１－３）

機構に着目することにより，残存する未分化幹細胞を特thor), et al.: (2021) iScience., 24, 102090.

異的に除去する手法を確立し４,５），これまで確立してき７）Kameda, K., Tohyama, S. (Corresponding au-

た培養液による純化精製法との組み合わせによりさらにthor), et al.: (2022) STAR Protocols., 3, 101341.

安全な心筋細胞の作製 が可能となった．
しかしながら，依然として課題が存在する．それは，ヒト多能性幹細胞を用いた再生医療における臨床応用さらには産業化を実現化するためには，大量の細胞を作製

８）Tabei, R., Kawaguchi, S., Tohyama, S. et al.:(2019) J Heart Lung Transplant., 38, 203-214.
９）Kawaguchi, S., Soma, Y., Tohyama, S. et al.:(2021) JACC-BTS., 6, 239-254.

する必要があり，それに伴い多くのコストが発生することである．この課題を克服するためには，ヒト多能性幹細胞を安価かつ効率よく作製する必要がある．一方で，ヒト多能性幹細胞における従来の培養液は，未分化維持
および増殖において最適な条件ではなかった．そこで，心臓疾患における細胞・分子挙動の網羅的理解野村

征太郎（東京大学医学部附属病院）

我々はヒト多能性幹細胞の増殖に最適な培養条件を探索し，必須アミノ酸の１つとして知 られるトリプトファ

筆者らはゲノム・オミックス解析を駆使し，心臓疾患

ン代謝を制御することにより，ヒト多能性幹細胞の増殖における細胞・分子挙動の網羅的理解を目指してきた．

が促進されることを見出した６,７）．本研究成果は，安価

まずゲノム解析によって予後不良な重症心不全の原因に大量のヒト多能性幹細胞および分化心筋細胞を作製すである LMNA 遺伝子変異を同定し（Sci Rep. 2018），

ることに繋がるため，再生医療における臨床応用あるい診療ガイドラインにおいて本変異の検出が高く推奨さは産業化の推進に貢献することが期待できる． さらに，れることとなった．また拡張型心筋症の新規原因遺伝

ヒト iPS 細胞由来心筋組織球をラットあるいはブタの心子ミオシン軽鎖キナーゼ MYLK3 を同定した（Sci Rep.

不全モデル心臓に移植し，心機能が有意に改善すること2017）．さらに，炎症・高血圧・肥満・LDL コレステローを確認している８,９）．また，最近では臨床グレードのヒ

ル高値・中性脂肪高値・糖尿病が虚血性心疾患の原因でト iPS 細胞から臨床グレードの培養液を用いて心筋細胞あることを遺伝学的に証明して遺伝的リスクスコアを構を製造し，サルの心不全モデルに移植することで，３か築した（Nat Genet. 2020）．心房細動においても遺伝

月間移植細胞が生着・成熟し，心機能が有意に改善する的リスクスコアを構築して心房細動 SNP 領域を制御すことを確認している（論文準備中）．現在，これらの技．
る転写因子 ERRg を同定した（Nat Genet. in press）

術を用いて臨床グレード心筋細胞を作製し，重症心不全

また筆者らは，心臓シングルセル RNA-seq 解析を世患者への移植に向けて準備を進めている．

界で初めて確立し，負荷で肥大した心筋が代償型・不【文献】

全型心筋に分岐すること，DNA 損傷・p53 シグナルが１）Tohyama, S. et al.: (2013) Cell Stem Cell., 12,不全型心筋を誘導することを解明した（Nat Commun.

127-137.
２）Tohyama, S. et al.: (2016) Cell Metabolism., 12,663-674.
３）Tohyama, S. et al.: (2017) Stem Cell Rep., 9,2018）．さらに，心筋 DNA 損傷の定量評価によって心不全の左室リバースリモデリングを高精度で予測できることを実証した（JACC Basic Transl Sci. 2019; 特許
登録済み）．そして，心臓組織の１分子 RNA 定量解析

19133

Vascular Biology Innovation に関する研究助成を世界初で確立し，圧負荷で胎児化する心筋は心臓の中おいて最も強く心筋分化転換効率を改善した転写因子間層に集中しており形態的に小さい，という既存の概念

ZNF281/Zfp281 に着目し，ZNF281 の司る心臓発生のを覆す結果を見出した（JMCC 2019）．また，心室性

新たな転写制御機構を解析することを目的として，研究

不整脈の原因となるドパミン D1 受容体陽性心筋を発見計画を立案した．

した（Nat Commun. 2020）．続いて，心臓線維芽細胞【方法】が発現するセリンプロテアーゼ HtrA3 を同定し，これ本研究では胚性幹細胞 (ESC) およびモデルマウスを利が TGF-β を分解して心筋の DNA 損傷を抑制すること，用し，心臓形成における ZNF281 の役割を明らかにす不全心筋から分泌される IGFBP7 は重症心不全の最も良る．そのためには ZNF281 を過剰発現もしくはノック

い予測マーカーであることを発見した（Nat Commun.

アウト（KO）した ESC を作成し，ZNF281 の発現量が2022; 特許出願済み）．また，血管周囲脂肪組織のシン

心筋分化効率に及ぼす影響を解析する．また，CRISPR/

グルセル RNA-seq によって，血管傷害によって活性化

Cas9 を用いて ZNF281 を心筋特異的に KO したマウス

したマクロファージが褐色脂肪細胞および NRG4 発現ラインを樹立し，ZNF281 が心臓発生に必須の遺伝子を誘導して炎症沈静化に寄与することを解明し（Natかを明らかにする．

Commun. in press），心筋梗塞後の心臓リモデリングの【結果】

時空間的な遺伝子発現ダイナミクスを 1 細胞レベルで解明した（Nat Cardiovasc Res. in press）．
このように筆者は世界に先駆けて心臓疾患の精密医療に資する基礎研究を展開してきた．最近は，100 種類以

これまでの研究成果として，申請者は CRISPR/Cas9
システムを用いて Zfp281KO 多能性幹 (ES) 細胞を作製し，Zfp281KO-ES 細胞では心筋分化誘導を行っても心筋細胞が誘導されない事を示してきた．

上のマーカーによるマルチプレックス免疫染色によってよ っ て 今 年 度 は CRISPR/Cas9 シ ス テ ム を 用 い て

心臓組織から多様な心不全病態を層別化する手法を確立

Zfp281KO マ ウ ス を 作 製 し た． そ の 結 果，Zfp281KO

し，オールジャパン体制のゲノムコホート研究によってマウスは産仔が 1 匹も確認できず，胎生致死であるこ

ゲノム・オミックス情報と臨床情報を AI で統合する手とが示唆された（図１）．

法を開発し，心臓疾患の精密医療のさらなる発展を目指

しかし，器官形成期の胎仔シングルセル解析の結果，
Zfp281 は個体において遍在的に発現していることが確している．

認された．そのため，この結果だけでは Zfp281 欠損がリプログラミング法を利用した新たな心臓形成転写
ネットワークの探索橋本寿之（慶應義塾大学医学部）【目的】
心臓発生に重要な複数の転写因子を強制発現させることにより線維芽細胞を心筋様細胞に直接分化転換することができる１）．最近我々はリプログラミングと心臓発生の間にはエピジェネティックなプロセスにおいて多くの共通点があることを見出した２）．このような知見から，今度は逆にリプログラミングの研究成果を参考にして，心臓発生を司る新たな転写制御機構を解明できるのではないかと考えた．よって，我々は先行研究結果３）に

20
134

図１

Zfp281KO マウスの作製フローと産仔ジェ
ノタイピング解析

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

心臓の発生より早い原腸形成期等に影響を及ぼしているる．

可能性が否定できなかった．

【参考文献】

よって，申請者は次に Zfp281ﬂox マウスを作製し，１）Ieda, M. et al.: Direct reprogramming of ﬁbro-

Mesp1-Cre マウスと Zfp281ﬂox マウスを交配すること

blasts into functional cardiomyocytes by deﬁned

により心臓中胚葉特異的 Zfp281cKO マウスを作製した

factors. Cell, 142, 375-386, (2010).
２）Hashimoto, H. et al.: Cardiac Reprogramming
Factors Synergistically Activate Genome-wide
Cardiogenic Stage-Speciﬁc Enhancers. Cell StemCell, 25, 69-86 e65, (2019).
３）Zhou, H. et al.: ZNF281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inﬂammatory gene expression. Genes & development, 31,
1770-1783, (2017).

図２

心臓中胚葉特異的 Zfp281KO マウスの作製
フローと産仔ジェノタイピング解析

DNA 損傷の心不全進展における役割解明からシス
テム生物学へ肥後友彰（The Institute of Cancer Research, London/
大阪大学大学院医学系研究科）
助成者は，本 VBIC 助成期間のうち，2013-2018 年
は大阪大学大学院医学系研究科循環器内科で，その後2018 年 6 月 よ り The Institute of Cancer Research,
London, Dynamical Systems Laboratory に て 研 究 を行なっている．今回本助成卒業にあたり，以下前半と後半に分けてそれぞれの研究について総括する．
図３

心臓中胚葉特異的 Zfp281KO マウスの胎生致死の表現型（心奇形）【DNA 損傷の心不全進展における役割解明】
DNA 損傷により誘導される DNA 損傷応答（DDR）
活性化は終末期心不全患者の心筋細胞で観察されるが，（図２）．その結果，このマウスでは胎生 9-11 日目頃よ非分裂細胞である心筋細胞において何が DDR を活性化

り発達異常や胎生致死を認め，興味深いことに様々な心させるのか，また DDR が活性化することの病態生理学

奇形を認めた（図３）．以上より，Zfp281 が心臓発生的意義は明らかになっていなかった．我々は圧負荷誘導に必須の遺伝子である事が示唆された．

性慢性心不全モデルマウスを用いて，不全心筋細胞にお【考察】

いて DNA 一本鎖切断 (single-strand break: SSB) が蓄

我 々 の 遺 伝 子 改 変 モ デ ル マ ウ ス 解 析 結 果 か ら，積していることを見出した．また SSB 修復に必須の蛋

ZNF281 は心臓発生に必須の因子である事が明らかと

白 XRCC1 を心筋細胞特異的に欠損させたマウス，およなった．今後はマルチオミクス解析及びタンパク質間相

び DDR エフェクター蛋白 ATM とのダブルノックアウ

互解析を用いて ZNF281 がどのように心筋形成の転写

トマウスを用いた実験から，不全心筋における SSB 蓄

ネットワークを司っているのかを明らかにする予定であ

積が持続的 DDR 活性化を誘導し，心不全の進展を促進

21
135Vascular Biology Innovation に関する研究助成していることを明らかにした１）．一方でマウス心筋梗塞

A., Sumida, T., Okada, K., Sakai, T., Kuramoto,

モデルでは，梗塞後数日で心臓線維芽細胞（CFs）におY., Yamaguchi, T., Ito, M., Masumura, Y., Higo,

ける DDR 活性化が認められ，CFs の老化が誘導されて

S., Lee, JK., Hikoso, S., Komuro, I. & Sakata, Y.:

いることを観察した．ATM ノックアウトマウスを用い

Int Heart J., 27; 60(4): 944-957. 2019.

た解析から，心筋細胞とは逆に CFs における DDR 活性化は心筋梗塞後の繊維化を抑制し，心臓保護的に働いていることを解明した２）．
【癌細胞形態と免疫応答の共役に関する統合的解析】
上記一連の研究から助成者は「癌細胞・システム生物

ミネラロコルチコイド受容体経路を標的とした糖尿病性腎症の新規治療法開発
広浜大五郎（University of Pennsylvania）

学」に興味を持ち，2018 年より上記 Dr. Chris Bakal
ラボへ留学をした．Bakal ラボはこれまで，ハイスルー
プット画像解析システムを用いた細胞形態解析とその決【背景・目的】定に関与するシグナル解析，およびそれらと YAP/TAZ

糖尿病に伴う腎障害（糖尿病性腎臓病，DKD）は腎や NF-kB などの細胞内シグナル伝達との共役に関する不全の原疾患として最も多いが，根本的な治療法は未確解析をシステム生物学的アプローチにより行なって来た立である．これまで DKD に対する治療法開発を妨げてラボである．そこで，メラノーマ細胞の細胞形態およびいた要因の一つとして，ヒトの病態と類似するモデル動

それに関わるシグナルが癌細胞の Neoantigen（癌細胞物の欠如があげられる．申請者らは，低分子量 G 蛋白

特異的抗原）提示能・免疫原性を制御しているという仮質 Rac1 がミネラロコルチコイド受容体（MR）転写活説の下，細胞形態を操作することで癌細胞の免疫原性を性化を促進し，この経路が生活習慣病に伴う腎障害の病高めることを最終的な目的とし，研究を進めている．こ態に関与する可能性を明らかにしてきたが（Shibata et

れまでに PD-1 抗原発現は細胞形態の影響を受けにくい

al. Nat Med 2008, Shibata et al. JCI 2011, Hirohama

が，抗原提示を行う MHC ClassI 発現は細胞形態の影響

et al. Int J Mol Sci 2020），DKD における意義は未解を受けやすいこと，また Focal adhesion が発達し，細明である．本研究は（1）ヒト DKD と類似した病態を

胞面積の大きな細胞は形態操作による MHC ClassI の示すマウスモデルを確立すること（2）確立したマウス

発現量変化を受けやすいことを明らかにしており，現在モデルを用い，主に MR に焦点をあてて DKD 進行の分

さらなる解析を進めている．

子基盤の一端を解明することが目的である．

一連の研究へ経て今後助成者はイメージング画像の定【方法】

量評価から得られた数値情報を他のオミックスデータや

肥満２型糖尿病モデルの db/db マウスに対して４

臨床データと組み合わせて，新たな疾患分類を提唱した

週齢で片腎摘出を施行後，10 週間高食塩食を投与しり心筋症の発症機序を解明したいと考えている．

（UNx-HS db/db マウス），その表現型を評価した．db/【文献】

m マウスに同様の処置を行った群をコントロール群と

１）Higo, T., Naito, AT., Sumida, T., Shibamoto, M.,

した．MR 拮抗薬，Rac1 阻害薬を UNx-HS db/db マウ

Okada, K., Nomura, S., Nakagawa, A., Yamagu-

スに投与し効果を検討した．

chi, T., Sakai, T., Hashimoto, A., Kuramoto, Y.,【結果】

Ito, M., Hikoso, S., Akazawa, H., Lee, JK., Shio-UNx-HS db/db マウスは高アルドステロン血症を認

jima, I., McKinnon, PJ., Sakata, Y. & Komuro I.:め，上皮性 Na+ チャネル活性化，低 K 血症，高血圧

DNA single-strand break-induced DNA damageを呈した．UNx-HS db/db マウスは顕著なアルブミン

response causes heart failure. Nat Commun., 24;

尿に加え，糸球体結節性病変，糸球体障害も認めた．

8: 15104. 2017.

UNx-HS db/db マウスの腎皮質と単離糸球体で，Rac1

２）Shibamoto, M., Higo, T., Naito, AT., Nakagawa,

22
136

活性化，MR 標的遺伝子 Sgk1 発現の上昇を認めた．こVascular Biology Innovation に関する研究助成

れらの結果から遠位ネフロン，糸球体両者での Rac1-

伝子・タンパク発現や三次元解析における動物モデルとMR 経路活性化が示唆された．MR 拮抗薬，Rac1 阻害の共通点・差異について検討し，モデル動物における現薬によりこれらの所見は改善された．

象の検証を推し進めていく．

【考察】

【結果】

本研究を通して DKD の新たなモデルマウスとして

BMPR2 Y247X/＋ マウスは通常大気下で血管中膜肥厚をUNx-HS db/db マウスを確立した．UNx-HS db/db マ

呈するものの有意な右室圧上昇はきたさなかった．そウスは，これまで一般的な糖尿病マウスでは認められのため PAH モデルの確立のため，BMPR2 Y247X/＋ マウ

なかった高血圧を呈し，顕著なアルブミン尿，DKD にスにおいて肺血管内皮細胞特異的に PGC-1α を欠損さ特徴とされる糸球体結節性病変を伴っていたため，ヒせ（BMPR2 Y247X/＋ ; Alk1-Cre; Pgc1αﬂ/ﬂ）， 評 価 を 行 っト DKD に近い病態を示している可能性が考えられた．

た．このマウスでは通常大気下で右室圧は有意に上昇し，

UNx-HS db/db マウスを用いた検討により，糸球体でPAH が発症したと考えられた．また血管中膜肥厚に加の Rac1-MR 経路活性化が，遠位ネフロンでの Rac1-

えて内膜の異常増殖，特に PAH 病理所見のうち最重症

MR 経路活性化によってもたらされる血圧上昇と協力しである叢状病変の出現を認めた．

て，DKD の進行に重要な役割を果たしていることが明またヒト PAH 患者の肺検体採取（移植時）の施行にらかとなった．

ついて倫理審査を通過し，すでに１例 PAH 患者の肺検【文献】

体の採取を行っている．

Hirohama, D. et al.: Hypertension., 2021; 78: 82-93.

【考察】

BMPR2 単独の変異導入ではマウスにおいて PAH は
時空間的イメージングシステムを用いた肺動脈性肺高血圧症の病態解明およびその治療応用
藤原隆行

発症しなかったが，肺血管内皮細胞特異的 PGC-1α 欠
損により通常大気下で PAH を誘導することに成功した．
これは PAH 発症メカニズムで提唱されているセカンド
ヒットセオリーに合致するものであり，また病理像もヒ（東京大学医学部附属病院）

ト重症 PAH 病変と類似しており，生理的な PAH モデルの確立に成功したと言える．今後このマウスの三次元【目的】

解析・シングルセル RNA 解析を行い，病態進展の原因

肺動脈性肺高血圧症（PAH）基礎研究における課題となる因子の同定を推し進める．またヒト検体を徐々にである (1) 従来の病理組織学的評価では複雑な血管の形収集し，新規 PAH マウスにおいて得られた知見につい態描出が困難であること，(2) PAH 動物モデルの多くはての実証を進めていきたい．

人為的誘発モデルであること，(3) PAH では肺生検は禁【文献】

忌であり，ヒト組織を用いた実証が難しいこと，を解決

１）Fujiwara, T., Takeda, N., Hara, H., Ishii, S.,

し，PAH 新規治療薬開発につながる研究を展開する．

Numata, G., Tokiwa, H., Maemura, S., Suzuki,【方法】

T., Takiguchi, H., Kubota, Y., Seo, K., Sakata,

申請者が開発した三次元可視化システム１）を用いて得A., Nomura, S., Hatano, M., Ueda, K., Harada,

られた，低酸素負荷 PAH モデルにおける肺血管内皮細M., Toko, H., Takimoto, E., Akazawa, H.,

胞 PGC-1α の代償的血管新生２）について効能検証を行う

Nishimura, S. & Komuro, I.: Three-Dimensional

ため，CRISPR-Cas9 を用いてヒト重症 PAH 家系におけ

Visualization of Hypoxia-Induced Pulmonary

る遺伝子変異（BMPR2 Y247X/＋）をマウスに導入し，よVascular Remodeling in Mice. Circulation .,り生理的な動物モデルとしての実証を進めたのちに，肺144, 1452-1455 (2021).

内皮細胞 PGC-1α の役割について検討する．またヒト２）Fujiwara, T., Takeda, N., Hara, H., Ishii, S., Nu-

PAH 患者の肺移植時における摘出肺の採取を行い，遺mata, G., Tokiwa, H., Katoh, M., Maemura, S.,

23
137

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

Suzuki, T., Takiguchi, H., Kubota, Y., Nomura,

さらに臨床応用を見据え，リンパ管新生を促進する血管

S., Hatano, M., Ueda, K., Harada, M., Toko,

内皮細胞増殖因子 (VEGF)-C を同モデルに投与し，リンH., Takimoto, E., Akazawa, H., Morita, H.,

パ管による心臓保護効果を確認する．

Nishimura, S. & Komuro, I.: PGC-1α-mediated【考察/進行状況】

angiogenesis prevents pulmonary hypertension
in mice. JCI Insight., in revision.

当初は心筋梗塞をモデルとして使用予定であったが，所属研究室でモデルとして安定して作出可能な急性心筋炎を対象として変更した．心筋ミオシン軽鎖ペプチドでリンパ管新生による炎症収束を介した心臓病治療
丸山

和晃

免疫する事で心臓にＴ細胞主体の急性炎症を引き起こす．
リンパ管欠損マウスでは当初，胚発生期の解析結果からリンパ管数は減少するかと思われたが，心臓では 8（三重大学大学院医学系研究科）

週齢では拡張したリンパ管の過形成を認めた．またリン
パ球循環障害による異所性リンパ組織を様々な臓器で認【背景】
心筋炎は心筋の炎症性疾患であり，臨床的時相，病因，めた．今後はリンパ管欠損マウスの解析とともにリンパ管欠損マウスで心筋炎モデルを作成し，解析を行う．

病理学的に，分類される．急性期には心筋細胞周囲に著【文献】

名な浮腫を呈す事が知られており，浮腫の改善とともに

１）*Kazuaki, Maruyama. ( 責 任 著 者 ), Sachiko,

回復することが多くリンパ管による作用が想定される．

Miyagawa-Tomita., Yuka, Haneda., Mayuko,

我々はこれまで心臓リンパ管に関する研究を継続しておKida., Fumio, Matsuzaki., Kyoko, Imanaka-，心臓リンパ管新生が心筋梗塞後の線維化を抑Yoshida. & *Hiroki, Kurihara.: The cardiopha-

制し，梗塞巣を縮小する事を見出している３）．心臓リン

ryngeal mesoderm contributes to lymphatic

パ管は炎症細胞の排出促進や，細胞外マトリクスなどのvessel development. bioRxiv, doi: https://doi.

マクロ分子排出路としての役割に加え，間質圧の制御な

org/10.1101/2022.03.30.486479, 2022 年 4 月

ど微小循環制御を介した多彩な作用があると想定してい２）*Kazuaki, Maruyama. ( 責 任 著 者 ), Kyoko,

るが正確な機序はわかっていない．また，加齢や動脈硬Imanaka-Yoshida. (*corresponding).: The Patho-化によりリンパ管自体の質的な機能不全が起こる事が知genesis of Cardiac Fibrosis: A Review of Recent

られているが，リンパ管欠損や質的な機能低下が心臓機

Progress. International Journal of Molecular Sci-

能にどのような影響を与えるのかはモデル作成の難しさ

ences, 23(5) 2617-2617 2022 年２月

り

１－４）

からも理解が進んでいない．
【目的】

３）*Kazuaki, Maruyama. ( 責任著者 ), Kazuaki, Naemura., Yuichiro, Arima., Yasunobu, Uchijima.,

本研究はリンパ管新生によりマクロ分子や炎症細胞動Hiroaki, Nagao., Kenji, Yoshihara., Manvendra

態などの微小循環制御に着目し心臓におけるリンパ管のK. Singh., Akiyoshi, Uemura., Fumio, Mat-

機能解析を行い心臓病の治療法開発を目指すものであsuzaki., Yutaka, Yoshida., Yukiko, Kurihara.,

る．

Sachiko, Miyagawa-Tomita. & *Hiroki Kurihara.:【方法】

Semaphorin3E-PlexinD1 signaling in coronary

我々は血管内皮細胞でリンパ管発生に重要な転写因子

artery and lymphatic vessel development withであるホメオボックス型タンパク Prox1 をノックアウ

clinical implications in myocardial recovery.

トし，
心臓リンパ管欠損を引き起こせる事を見出した（業iScience, 24(4) 102305-102305 2021 年４月

績#5）．本研究では Tie2-Cre, CDH5-CreERT2 の２種

４）Kazuaki, Maruyama., Sachiko, Miyagawa-

類のマウスで心臓リンパ管の形成を阻害し，心筋炎モデTomita., Kaoru, Mizukami., Fumio, Matsuzaki.

ルを作成し，炎症・線維化・浮腫の状態などを解析する．

& Hiroki, Kurihara.: Isl1-expressing non-venous

24
138

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

cell lineage contributes to cardiac lymphatic

から出生したホモ型マウスは，高脂肪食誘導性肥満に対vessel development. Developmental Biology ,して抵抗性を示した．この結果は，通常飼育環境下にお452(2) 134-143 2019 年 8 月

ける高脂肪食誘導性肥満を誘発したホモ型マウスと同程度であった．
【考察】

腸内環境変化に着目した肥満症に関する基礎的研究
宮本潤基

本研究結果によって，GLP-1 受容体遺伝子改変マウス（ホモ型）で観察された肥満抵抗性に腸内細菌の及（東京農工大学大学院農学研究院）

ぼす影響は微弱であることが示唆された．しかしながら，これまでの研究報告で，腸内細菌及びその代謝物が【目的】

GLP-1 分泌に関与することや，胎児期における GLP-1

これまでの研究で，食用油由来腸内細菌代謝物群の機能に腸内細菌が関与することは明らかにされておが腸管ホルモンでインクレチンの一つである GLP-1

り，腸内細菌―GLP-1 の相互作用が生体恒常性に重要(glucagon like peptide-1) の分泌亢進を介して，生体な役割を果たしていることが期待される．また，これまエネルギー代謝調節に関与することを明らかにした．

での検討で，ホモ型は離乳直後などの若齢期の段階で，その過程で，GLP-1 受容体遺伝子改変マウスは，高脂

体重が軽いことに着目し，今後，胎児期や乳児期におけ肪食誘導性肥満に対して抵抗性を示すことを見出した

る GLP-1 シグナルが，生後に伴う肥満や腸内細菌の定(unpublished data)．また，野生型と GLP-1 受容体遺着などと関与している可能性を明らかにする．

伝子改変マウスの間には劇的な腸内細菌の構成変化を明らかにしており，高脂肪食負荷時における腸内細菌の影
響を抗生物質処置によって評価したが，GLP-1 受容体
遺伝子改変マウスで観察された抗肥満作用に影響は及ぼさなかった．本研究では，妊娠期における抗生物質の投与が，次世代の高脂肪食誘導性肥満に及ぼす影響につい低分子化合物による新生児期及び成体期線維芽細胞
からの心筋直接誘導促進村岡直人（ワシントン大学）て，GLP-1 受容体遺伝子改変マウスを用いて検討することを目的とした．
【方法】

終末分化細胞である心筋細胞は再生能力の限られることから，心筋梗塞などにより障害を受けると失われ，代GLP-1 受容体遺伝子改変マウスのヘテロ型を交配し，わりに線維芽細胞に増殖により置換され，心臓のポンプ

妊娠 0.5 日目から出生（E18.5）までマウスに抗生物質（ネ

機能は低下していく．重度に心機能の低下した例では心オマイシン）を自由飲水させた．自然分娩後，出生以降移植が根本的な治療となるが，本邦ではドナー不足といの飼育環境を統一にするために，仮親飼育（C57BL/6J

う問題があることから，新たな治療法として心筋再生療マウスを使用）によって哺育した．仮親飼育期間中は水法が注目されている．代表的な心筋再生の手法として多道水を自由飲水させた．４週齢で離乳を行い，３ヶ月間，能性幹細胞由来心筋細胞の移植が挙げられるが，その高脂肪食負荷によって肥満を誘導した．なお，離乳時に臨床応用には多能性幹細胞の残存による腫瘍形成のリス

野生型，ヘテロ型，ホモ型のそれぞれの遺伝子型で高脂ク，移植心筋細胞の生着率などのいくつかの課題が残さ

肪食負荷試験を実施した．

れている．一方で，障害を受けた心臓に大量に存在する【結果】

線維芽細胞をその場で直接，高率に心筋細胞に転換でき

通常飼育環境下における高脂肪食誘導性肥満を誘発しれば前述の課題を解決できる可能性がある．これまでにた野生型マウスに対して，抗生物質を処置した母親マウ

心筋特異的転写因子である Gata4/Mef2c/Tbx5 (GMT)スから出生した野生型及びヘテロ型マウスは同程度の肥または GMT/Msep1/Myocd 組み合わせにより，マウ満症状を呈した．一方，抗生物質を処置した母親マウス

スの in vitro, in vivo，さらにはヒト線維芽細胞からも25
139

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

心筋細胞を直接誘導できることを報告したが（Ieda M,

患の表現系を呈するなど，細胞運命を制御することがCell, Inagawa K, Circ Res, Wada R, PNAS ），心筋誘示唆されている．心筋で高発現する４種の miR (miR-1,

導効率は低く，また心筋直接誘導のメカニズムは不明で-133, -208, -499) について，リプログラミングへの効あった．

果を検討した．その結果，心筋リプログラミング因子にそこで注目したのが microRNA (miR) である．MiR

miR-133 を加えることで，マウス及びヒト線維芽細胞

は 発生における重要性が知られるが，心臓発生においからの心筋誘導効率が著名改善すること，さらには，そても筋特異的 miR のノックアウトにより，先天性心疾のメカニズムとして，上皮間葉移行のマスター因子である Snai1 を miR-133 が直接抑制することで線維芽細胞の特性を消去し，心筋誘導が促進されることを明らかと．
した（Muraoka N, EMBO J ）胎児期の線維芽細胞においては高効率のリプログラ
ミンが可能となった一方で，臨床で治療対象となる小児期及び成体期の線維芽細胞では依然として効率が低いという課題が残されていた．そこで，注目したのが低分子化合物である．低分子化合物はコスト，安全面，簡便さから臨床応用に向け優れた選択肢と考えられる．低分子化合物ライブラリーを用いて，マウス新生児期および成体期線維芽細胞から心筋細胞への誘導を促進する化合物を網羅的に探索した．その結果，心筋誘導を改善する化合物として，日常臨床で汎用される非ステロイド性抗炎症薬ジクロフェナクを同定した (Muraoka N, Nature

Commun)．興味深いことに，加齢に伴い線維芽細胞においてシクロオキシゲナーゼ-2，プロスタグランジン
E2/プロスタグランジンＥ受容体 4，インターロイキン-1β/インターロイキン１受容体タイプ１経路により炎症及び線維化が活性化していること，また，シクロオキ
シゲナーゼ阻害剤であるジクロフェナクはこの経路を抑制することにより活性化されている炎症さらには線維化特性を抑え，心筋誘導を改善することが示され，加齢や老化に伴うリプログラミングの障壁が初めて明らかとなった ( 図１)．

遺伝性大動脈瘤・解離症の病態生理の探索と創薬に向けたトランスレーショナルリサーチ
図１

ジクロフェナクによる新生児期・成体期線維芽細胞からの心筋誘導促進（上）胎児期線維芽細胞（中）新生児期・成体期線維芽細胞（下）ジクロフェナク添加後

26
140

八木

宏樹
（東京大学医学部附属病院）【目的】
マルファン症候群（MFS）はフィブリリン 1 をコー

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

ドする FBN1 遺伝子の異常によって大動脈瘤・解離を【方法】

生じる常染色体顕性遺伝の全身性結合織病である．アン

Ang II による AT1 受容体の活性化と，Ang II に依存

ジオテンシン II（Ang II）1 型（AT1）受容体阻害薬（ARB）

しないメカニカルストレスによる AT1 受容体の活性化であるロサルタンは，TGF-β シグナルの過剰な活性化のどちらが MFS の大動脈瘤の病態形成に重要かを検討を抑制し大動脈瘤に対する治療効果が期待されたが，無するために，Fbn1C1041G/＋マウスにインバースアゴニス

作為化比較対照臨床試験では β 遮断薬を上回る効果がト活性を有するカンデサルタンとインバースアゴニスト

得られず，新たな分子機序の解明と創薬が急務である．

活性が低くアンタゴニスト作用のみを有するカンデサル

我々は，AT1 受容体がメカニカルストレスにより活性

タン誘導体（カンデサルタン 7H）を投与し検証した．

化し，心血管疾患の病態形成に関わることを明らかにし，【結果】

心血管疾患に対するインバースアゴニスト活性を有す

カンデサルタン投与群では，カンデサルタン 7H 投与

る ARB の有効性について報告してきた．現在，臨床現群と比較し，大動脈径の拡大が有意に抑制され，中膜の場で MFS の大動脈瘤に対して最も使用されるロサルタ

エラスチンの断裂が著明に改善し，Egr-1 や ERK1/2 のンは，インバースアゴニスト活性を有さない ARB であ

リン酸化とともに MMP 活性化の亢進が抑制された．一る．MFS 患者とそのモデルマウスである Fbn1

方で，両群間で血圧や心機能に有意差は認めなかった．

C1041G/＋

マウスの大動脈において，メカニカルストレス応答性転【考察】

写因子の Egr-1 や細胞内シグナル伝達系である ERK1/2

FBN1 異常に伴う過剰なメカニカルストレスによる AT1のリン酸化が有意に亢進していたことから，Fbn1 異常受容体の活性化が，MFS の大動脈瘤形成の重要な促進に伴う組織脆弱性から生じるメカニカルストレスが AT1因子であることを初めて見出した．インバースアゴニス

受容体を活性化させていると仮説をたて，インバースア

ト活性を有する ARB を使用することは，MFS の大動脈

ゴニスト活性に優れた ARB がより瘤形成の抑制には有瘤の進展抑制の新たな治療戦略となる可能性がある．

効なのではないかと考えた．
血管壁の機械刺激応答と病態形成を誘導するシグナ
ル分子の解析
山城

義人（国立循環器病研究センター）【目的】
内皮間葉転換（EndMT）は血管リモデリングの基本的な過程である１）．しかし，新生内膜形成時の血管リモ
デリングの正確な制御機構や新生内膜細胞の供給源は完
全には解明されていない．
【方法と結果】
新生内膜細胞の起源と血管壁リモデリングとの関連性を調べるために，EC 特異的系統追跡システム（VECadherin (Cdh5)-BAC-CreERT2 マウス）と頸動脈結紮
モデルを用い，内在性内皮細胞（EC）が CD45 を発現
図マルファン症候群の大動脈瘤形成における新たな分子メカニズムする新生内膜細胞へ分化転化する証拠を示した．新生内膜形成の初期に，EC は造血マーカーである CD45 を一過性に発現し，多くの EndMT マーカーを伴い，CD31

27
141

Vascular Biology Innovation に関する研究助成と αSMA が発達した新生内膜で顕著に発現していた．

In vitro では，結紮した血管の低酸素状態を模倣したヒト初代 EC において，塩化コバルトによる HIF1α の安定化または VHL 阻害剤によって CD45 陽性 EndMT がラミン変異特発性拡張型心筋症の分子病理学的機序
の解明
山田

臣太郎
（東京大学医学部附属病院）

誘導され，インテグリン α11-SHARPIN 複合体の形成が促進された．注目すべきは，CD45 ホスファターゼ阻害剤がこの複合体を破壊し，それによって細胞間結合を【目的】

不安定にしたことである．EC の Hif1α を欠損させると，特発性拡張型心筋症（DCM）は進行性の心機能低下

CD45 と EndMT マーカーの発現が抑制され，新生内膜と不整脈を来たす予後不良の疾患である．DCM 患者の形成が改善された．

中でラミン遺伝子（LMNA）変異を有する患者群は特【結論】に予後不良である．そこで，ラミン変異 DCM の分子病

これらの結果は，HIF によって誘導される CD45 の発現は，通常 EC の運命と細胞間結合の保持に必要であ

理学的機序の解明を目的とした．
【方法・結果】

り，CD45 陽性の EndMT（「部分 EndMT」と呼ばれる）

当 院 に 通 院 す る DCM 患 者 よ り 同 定 さ れ た LMNA

は新生内膜形成と血管壁のリモデリングに寄与すること

Q353R 変異を CRISPR/Cas9 システムを用いてマウスを示唆している．

に導入した．Lmna 変異マウスでは心臓組織において核【研究の展望】の異形を認め，また DCM 患者と同様に心拡大を認め，我々の研究は，新生内膜の起源が EC であり，それは胎生致死となった．

partial EndMT によって生成されることを明らかにし，

胎仔マウスにおいて心臓組織のシングルセル RNA-

血管損傷後の新生内膜細胞の起源について長年議論されseq (scRNA-seq) 解析を行ったところ，Lmna 変異マウてきたことに新しい証拠を与えるものである．ECs におスにおいて成熟した心筋細胞集団が減少することが分ける CD45 の異所性発現は，EndMT 過程における内皮かった．次に，シングルセル ATAC-seq (scATAC-seq)

細胞 - 細胞接合部の維持に関与していることが明らかに解析を行ったところ，シングルセル RNA-seq 解析結果なった．このデータは，
新生内膜形成を制御するために，と同様に，Lmna 変異マウスにおいて成熟心筋細胞集

EndMT 過程を標的とした治療戦略の可能性を示唆して団が減少することが分かった．さらに，シングルセル

いる２）．

ATAC-seq 解析により，それらの成熟心筋細胞集団の遺【文献】

伝子発現は因子Ｘの制御を受けるとことが分かった．こ

１）Yan, Li., Kathy, O. Lui & Bin, Zhou.: Reassess-

れらのことより，Lmna 変異マウスでは心筋細胞の成熟

ing endothelial-to-mesenchymal transition in

不良を認めるが，それは因子Ｘの制御不全が関与していcardiovascular diseases. Nature Review Cardiol-ることが考えられた．

ogy., 15: 445-456, 2018.
２）Yoshito, Yamashro., Karina, Ramirez., Kazuaki,
Nagayama., Shuhei, Tomita., Yoshiaki, Kubota.
& Hiromi, Yanagisawa.: BioRxiv., 2021.

次に，我々は患者由来の iPS 細胞から，遺伝子変異を修正して心筋細胞に分化させた細胞株（コントロール株）
および遺伝子変異を修正せずに心筋細胞に分化させた細28
142

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

胞株（変異株）を作成した．同 iPS 由来心筋細胞株を用

傷応答遺伝子 PPM1D に注目し，変異を有する免疫細胞

いて因子Ｘの ChIP-seq 解析を行ったところ，
コントローが生体に与える影響について検討した．

ル株において認めるピークが一部を変異株において認め【方法】

ないことが分かった．また，それらのピーク近傍には心免疫細胞における PPM1D 変異が心臓血管病に与える

筋細胞の成熟に関与する遺伝子が多く存在することも分影響を解析するために，レンチウイルス CRISPR/Cas9

かった．これらのことより，因子Ｘは心筋細胞成熟化にシステムを用いて，Ppm1d クローン性造血モデルマウ

関わる遺伝子を制御していると考えられた．

スを作成した．このマウスにアンジオテンシン II 負荷による心不全を発症させてその表現型を確認した．加えて，Ppm1d 変異を有するマクロファージ細胞株を作成し，その細胞機能を解析した．
【結果】

Ppm1d クローン性造血モデルマウスは，アンジオテ
ンシン II 刺激に対してコントロール群と比較して高度のリモデリングを来した．Ppm1d 変異マクロファージを用いた細胞実験においては，DNA 損傷応答が抑制され，NLRP3 インフラマソーム・炎症性サイトカインの過剰な活性化をきたしていることが確認された．変異免
疫細胞における機能異常がマウスの心臓傷害につながることが示唆された．これらの知見を論文報告した（Yura【考察】
変異マウスにおけるシングルセル RNA-seq 解析およびシングルセル ATAC-seq 解析の統合解析，変異 iPS

et al. Circ Res., 2021, Heart Fail Clin. 2022）．
【考察】

由来心筋細胞における ChIP-seq 解析を用いて，LMNA

本研究により DNA 損傷応答遺伝子変異によるクロー

Q353R 変異心筋細胞においては心筋細胞成熟化不良がン性造血が，心臓機能障害を引きおこす可能性が示唆さ起こっており，その原因として因子Ｘによる心筋細胞れた．がん治療により増強するクローン性造血が，治療成熟化遺伝子の制御不全が考えられた．今後は LMNA

関連心血管合併症の発症に関わる可能性を示したこと

Q353R 変異心筋細胞における因子Ｘの機能不全の機序で，この病態の新たな治療に繋がる道が開かれた．今後解明を目指したい．

は詳細なメカニズムの解明や他病態に与える影響について研究が期待される．

クローン性造血が心血管病に与える影響の解明
由良

分岐鎖ケト酸とその代謝酵素に着目した肥満症に対義充（名古屋大学医学部附属病院）

する新規治療薬の開発
吉田【目的】
高齢者に高頻度に確認されるクローン性造血という現尚史（Beth Israel Deaconess Medical Center andHarvard Medical School）

象は，近年明らかになった心血管疾患の新規危険因子である． クローン性造血はがん治療を受けた患者にも高肥満に起因する多くの疾患が増加しており社会問題

頻度に認められ，がん治療関連クローン性造血と呼ばれとなっているが，肥満そのものに対する治療法は，限ているが，心血管疾患に与える影響は不明であった．申定的な抗肥満薬や外科手術しか存在しない．我々は既請者はがん治療関連クローン性造血に特徴的な DNA 損に，ヒトとマウスの血漿メタボロミクスにおいて，分岐29
143

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

鎖アミノ酸（BCAA）とその cognate である分岐鎖ケト酸（BCKA）が体重と強く正に相関する代謝物である事を同定した．昨年度までに，肥満状態では褐色脂肪組織における BCAA/BCKA の利用が低下する事で血中生体膜リン脂質の” 質” 制御による血管内皮機能調
節戦略
柳田

圭介
（国立国際医療研究センター）

BCAA/BCKA が増加する事，また腸内細菌が遠隔臓器である褐色脂肪組織の BCAA/BCKA 代謝を制御する環
境因子である事，を報告した．
【目的】

【目的】
申請者は生体膜リン脂質中の脂肪酸の「質」の変容が本年度は，腸内細菌がどのように褐色脂肪組織の成人病リスクや進行に関わる可能性を考えている．本研

BCAA/BCKA 代謝を制御しているのかについて解明を究では，マウスの生体膜リン脂質脂肪酸組成を遺伝学的試みた．

に in vivo レベルで操作し，血管機能検証や成人病モデ【方法】

ルにおける病態観察により，「血管内皮細胞リン脂質の”褐色脂肪組織の BCAA/BCKA 代謝を促進する作用を持つ Bacteroides 菌を投与したマウスの褐色脂肪組織質” の違いによるその機能変容」仮説を検証する．
【方法】と，vehicle を投与したマウス（コントロール）の褐色

本年度は，血管内皮細胞リン脂質の “質” の違いによ

脂肪組織の RNA シークエンスを行い，KEGG pathway

る血管バリア機能特に血液脳関門（BBB）機能に注目し解析を行った．また褐色脂肪細胞 HB2 cell とマクロて研究を遂行した．具体的には，各種リゾリン脂質アシファージ RAW264.7 cell を用いて in vitro の実験を行っ

ル基転移酵素遺伝子欠損マウスにおいて，エバンスブ

た．

ルーの脳内漏出を評価することで血液脳関門機能を検証【結果】した．さらに脳血管内皮細胞のリピドミクスを行うこと

RNA シ ー ク エ ン ス の 結 果，Bacteroides 投 与 群 ではコントロール群に比して，TNF signaling pathway

で，リン脂質の” 質” の違いと BBB との関連を追求した．
【結果】が最も有意に低下を認めた．その他の炎症マーカも検討したリゾリン脂質アシル基転移酵素遺伝子欠損マ

Bacteroides 群で有意に低下していた．TNF signaling

ウス 8 系統いずれにおいてもエバンスブルーの脳内漏

pathway を構成する主要なサイトカインである TNF-α

出は認められなかった．一方，脳血管内皮細胞のリピドは主にマクロファージが分泌する事から，マクロファー

ミクスの結果より，これらの欠損マウスの脳血管内皮細ジが褐色脂肪組織の BCAA/BCKA 代謝に与える影響に胞においてリン脂質脂肪酸組成が実際に変動しているこ

ついて in vitro で検討を行った．その結果，活性化されとが確認された．したがって，脳血管内皮細胞がもつリたマクロファージが褐色脂肪組織の BCAA/BCKA 代謝

ン脂質脂肪酸組成の特徴そのものは定常状態の BBB 機を低下させる事が分かった．

能にさほど大きな影響を及ぼさないことがわかった．一【考察】

方，別の脂質クラスが BBB に重要である可能性を考え，褐色脂肪組織における代謝免疫連関の報告は極めて限

改めて複数の臓器における血管内皮細胞のリピドミクス

られている．今回の結果から，褐色脂肪組織におけるマ比較を行なった．その結果，脂質クラスＸが脳の血管内クロファージが，同組織の BCAA/BCKA 代謝を制御し，皮細胞に特徴的に多いことを見出した．さらに，脂質ク肥満形成に強く関与している事が示唆された．来年度以ラスＸが欠乏する遺伝子改変マウスにおいてエバンスブ

降，褐色脂肪組織における BCAA/BCKA 利用がどのよ

ルーの著しい脳内漏出が確認され，BBB が破綻していうに制御されているのか，まだ未同定な BCKA のミトることが見出された．

コンドリアトランスポーターの解明も含めて，その全容【考察】を明らかとしたい．

以上より，リン脂質脂肪酸組成変動は定常状態のBBB 機能に影響を及ぼさないことがわかった．注目す30
144

Vascular Biology Innovation に関する研究助成べき点は，脳血管内皮細胞のドコサヘキサエン酸 (DHA)【方法・結果】

含有リン脂質が BBB に重要であることが報告されてい

D1R トレーサーの開発及び評価系の確立のための検るものの，本研究において DHA 含有リン脂質が激減す討として，心臓特異的 D1R 過剰発現マウスの心臓組

る Lplat3 欠損マウスにおいても BBB 漏出が認められな織を用い，心臓における D1R の発現状況を抗体を用かったことである．代わりに「真に」BBB 機能に関わいて評価することに成功した．また，心不全時の心臓

りうる脂質クラスＸが同定されたため，今後脂質クラス

D1R の転写因子モチーフ解析によって抽出した候補因Ｘによる BBB 制御のメカニズム解明および BBB 破綻病子（NF-kB）の検証については，心不全時の心臓には小態における関与について研究を進めていきたい．

胞体ストレスがかかるとされていることに着目し，本研究の圧負荷モデルマウスの不全心において，小胞体ス
トレスの上昇及び NF-kB pathway の活性化が生じていドパミンシグナルを介した心不全の新規病態生理の解明と治療法の開発
山口ることを確認した．その上で，培養心筋細胞を用い，小胞体ストレスを誘導したところ，D1R の発現が上昇し，この発現上昇は NF-kB pathway の抑制により抑制され敏弘ることを確認した．このことから，心不全時の D1R の（東京大学医学部附属病院）

発現上昇においては，小胞体ストレスを介した NF-kB
pathway が寄与していることが示唆された．

【背景】【考察と今後の展望】

従来の心不全の基礎研究では「モデル動物とヒトとの本年度の研究の結果，心筋 D1R に着目した慢性心不種差及び心不全の病態の差異」が臨床応用を妨げる重要全治療薬の新たなターゲットとするヒト臨床応用への検な課題となってきた．我々は，ヒト心不全及び圧負荷モ討が進んだ．また，心不全において心臓 D1R が発現上

デルマウスのいずれの心臓においても発現が著増する共昇しているメカニズムを明らかとするための検証を進め

通の遺伝子としてドパミン受容体 D1 (D1R) を同定したることに成功した．

上で，同 D1R がヒト，マウスのいずれにおいても心不全時の致死的心室性不整脈の発症に寄与していることが示唆されることを明らかとした．心臓 D1R をターゲットとした新規治療法をヒト臨床応用へと繋げるために，
D1R トレーサーの開発及び評価系を確立することを目指しているところ，この評価系の確立にあたっては，心臓における D1R の発現状況について抗体を用いて描出する評価系を確立できていないことが喫緊の課題である．また，心不全において心臓 D1R が発現上昇をきたしているメカニズムは未だ不明であるところ，転写因子
モチーフ解析によってその候補因子の抽出に成功しているが，その検証ができていない．
【目的】
本研究の目的は，種を超えた心不全の本質的な病態形
成に心臓 D1R が寄与するという仮説のもと，心不全の病態生理におけるドパミンシグナルの役割を解明するとともに，D1R を介した心不全の新規治療法の開発をすることである．

31
145

研究報告

全身性炎症疾患の病因
・病態の解明に関する研究助成
全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

内視鏡的表現型に基づく回腸嚢炎発症機序の解明
秋山慎太郎

型 22 例（43%），Aﬀerent limb 型 12 例（24%），びまん性回腸嚢炎 11 例（22%），瘻孔型は 7 例（14%）という頻度であった．予後解析の結果，びまん性回腸嚢炎（筑波大学医学医療系）

または瘻孔型を有する患者では，他の表現型と比較して，回腸嚢不全リスクが有意に高いことが示された．

【目的】

【考察】

潰瘍性大腸炎（UC）患者において，内科治療抵抗性

UC 患者では，回腸嚢にびまん性の炎症や瘻孔形成を

もしくは発がんのために約 10% の患者が全大腸切除術認めた場合，予後不良であり，慎重な回腸嚢評価と治療を必要とする．炎症のない回腸で嚢を形成しているに介入が必要であることが示唆された．今後，腸上皮の杯も関わらず，最大約 50% の患者に回腸嚢炎が生じ，約細胞が分泌するムチンの性状を評価し，これら予後不良

10% で回腸嚢不全を呈することが知られる．回腸嚢炎

表現型と小腸上皮大腸化との関連を理解することで，回の内視鏡像は多彩であり，その表現型の違いが，回腸嚢腸嚢炎の病態解明を目指す．

予後と関連することが明らかになってきている．また，【文献】

回腸嚢炎患者では，小腸粘膜である回腸上皮の大腸化が１）Akiyama, S., Ollech, J.E. & Rai, V., et al.: En-

報告されており，炎症との関連が示唆される．そこで，doscopic phenotype of the J pouch in patients

本研究は，回腸嚢炎表現型と予後，さらには小腸上皮大with inﬂammatory bowel disease: A new classi-

腸化との関連を明らかにすることを目的として，現在もﬁcation for pouch outcomes., Clin Gastroenterol

解析を進めている．

and Hepatol., 20, 293-302 (2022).

【方法】
2005 年から 2022 年までに，筑波大学附属病院で大腸全摘及び回腸嚢肛門吻合術を施行され，術後回腸嚢内

自己炎症性疾患である中條-西村症候群における好視鏡評価を受けた UC 患者を対象とした．回腸嚢の解剖

中球の役割

学的部位に基づき，内視鏡所見（発赤，浮腫，びらん，

稲葉豊（和歌山県立医科大学）

潰瘍，狭窄，粗造粘膜，血管透見像消失）を評価した．
（1）正常，（2）Aﬀerent limb
シカゴ分類１）に基づき，に炎症を伴う型，（3）Inlet に炎症を伴う型，（4）びま
ん性回腸嚢炎，（5）限局性回腸嚢炎，（6）Cuﬃtis，
（7）

【目的】
中條−西村症候群（NNS）は，若年で死亡すること瘻孔を伴う型の７つの表現型に分類して評価した．

もある特異な遺伝性炎症・消耗性疾患である．2011 年【結果】に PSMB8 遺伝子のホモ変異によるプロテアソーム機能

51 例の UC 術後患者を同定した．UC 診断時及び大腸切除時の年齢中央値は，それぞれ 31 歳，41 歳，術不全症であることが判明し，遺伝性自己炎症性疾患の一つとして指定難病に登録された．

前罹患期間中央値は 5 年，全大腸炎型は 88%，内科治

プロテアソーム機能不全が自己炎症性の病態を来す詳

療抵抗性例は 71% であった．術後に実施された回腸嚢

細なメカニズムには不明な点が多い．NNS では凍瘡様内視鏡は 395 件であり，最も多い表現型は，限局性回の皮疹を呈することがあり，組織学的には好中球の浸腸 嚢 炎 39 例（77%） で，Cuﬃtis 37 例（73%），Inlet

潤を認めることがある．一方，多発性骨髄腫患者に対1146

全身性炎症疾患の病因 ･ 病態の解明に関する研究助成する治療薬として，プロテアソーム阻害剤投与例では，【文献】

sweet 病様皮疹の報告が散見されている．また好中球性

１）Felix C Weber. et.al.: Neutrophils are required

皮膚症のベーチェット病は，自己炎症性疾患との鑑別がfor both the sensitization and elicitation phase

困難な症例も存在し，両疾患とも再燃，寛解を繰り返す

of contact hypersensitivity, J. Exp. Med., 212,

好中球優位の炎症を病態の特徴とすることから両疾患の15-22 (2015).

関連性が注目されている．
これらよりプロテアソーム機能不全による皮疹形成に好中球が関与することが予想された．本研究では作成済
みの PSMB8 変異導入マウスを用い，皮疹形成における好中球の役割を解析する．

オメガ３不飽和脂肪酸の実験的ぶどう膜炎（EAU）
モデルにおける樹状細胞を介した抗炎症作用の検討
内

【方法】

翔平
（山口大学医学部附属病院）

PSMB8 変異導入マウスにおいて，自然発症の皮疹形成を認めるか確認する．
皮 疹 を 認 め な い な ら 4,6-trinitrochrolobenzene【目的】(TNCB) をハプテンとして使用し，アレルギー性接触皮我々のグループはマウスにオメガ３不飽和脂肪酸を膚炎を惹起し，耳介腫脹の程度，HE, CD4, CD8, MPO

食事摂取させることで，自己免疫性ぶどう膜炎の臨床染色にて浸潤細胞数を確認する．

学的および組織学的な炎症スコアが抑制されることを示【結果】した．オメガ３脂肪酸は細胞内に取り込まれたあと，複PSMB8 変異導入マウスにおいては，無刺激下では皮疹の形成を認めなかった．

数のメディエーターに代謝され，プロスタグランジン
PG），ロイコトリエン LT），レゾルビン，ペルオキシソー

そのためアレルギー性接触皮膚炎を誘発し，PSMB8

ム増殖因子活性化受容体（PPARγ）リガンド，および変異導入マウスにおいて耳介腫脹が野生型と比べ有意にシトクロム P450 代謝物が産生される．本研究では，オ増加していることを確認した．

メガ３脂肪酸のシトクロム P450 代謝物（EEQ）による

HE, CD4, CD8 染色にて浸潤細胞数に差異は認めなかったが，MPO 染色にて有意に野生型に比べ PSMB8
変異導入マウスにおいて MPO 陽性細胞が増加している

眼炎症に対する抑制効果について検討した．
【方法】
C57B/6 マウスに IRBP ペプチドと結核菌を含むア

ことがわかった．

ジュバンドとともに足底および鼠径部に下注射し，自【考察】

己免疫性ぶどう膜炎を誘導した．誘導後 7 − 12 日目にヒトと同様には，PSMB8 変異導入マウスにおいて皮EEQ を腹腔内投与し，14 日，21 日目に眼底検査で臨疹の発症は認めなかったが，アレルギー性接触皮膚炎を床スコア，および摘出眼球を HE 染色して組織学的スコ誘導すると優位に耳介の腫脹と浸潤好中球が増加していアを算出して対照群（Et-OH）と比較した．

ることがわかった．アレルギー性接触皮膚炎モデルにお【結果】

いて，感作相において好中球を欠損させると接触皮膚炎

ω３脂肪酸のシトクロム P450 代謝物（EEQ は，自己の程度が減弱 されることがわかっており，PSMB8 変

免疫ぶどう膜炎誘導後 14 日および 21 日の臨床スコア

異導入マウスにおいて好中球の機能異常があることが予を抑制しなかった．さらに，組織学的スコアにおいても，想された．

14 日目および 21 日目の炎症スコアを抑制しなかった．

１）

今後は，抗好中球抗体を投与し，好中球を欠損させた状態で耳介浸潤の程度の有無，また Neutrophil extracellular traps の関与に関しても解析する予定である【考察】
オメガ３不飽和脂肪酸による自己免疫ぶどう膜炎の抗炎症効果にはシトクロム P450 代謝物は関与しないことが明らかとなった．今後，オメガ３不飽和脂肪酸の抗2147全身性炎症疾患の病因 ･ 病態の解明に関する研究助成

tion 2019.
２）Hasegawa, E., Inafuku, S., Mulki, L., Okunuki,
Y., Yanai, R., Smith, KE., Kim, CB., Klokman,
G., Bielenberg, DR., Puli, N., Falck, JR., Husain,D., Miller, JW., Edin, ML., Zeldin, DC., Lee,
KSS., Hammock, BD., Schunck, WH. & Connor,
KM.: Cytochrome P450 monooxygenase lipid
metabolites are signiﬁcant second messengers in
the resolution of choroidal neovascularization.

Proc Natl Acad Sci USA, 114(36) E7545-E7553,
2017.
３）Yanai, R., Mulki, L., Hasegawa, E., Takeuchi, K.,
Sweigard, H., Suzuki, J., Gaissert, P., Vavvas,
DG., Sonoda, KH., Rothe, M., Schunck, WH.,
Miller, JW. & Connor, KM.: Cytochrome P450generated metabolites derived from ω-3 fatty
acids attenuate neovascularization. Proc Natl

Acad Sci U S A. 111: 9603-9608, 2014.

全身性強皮症における自然免疫系の役割の検討大石京介（金沢大学医薬保健研究域医学系）【目的】
炎症効果の作用メカニズムを解明することを目的とし

全身性強皮症は皮膚および内臓諸臓器の障害と線維化て，プロスタグランジン（PG），ロイコトリエン（LT），を特徴とする自己免疫疾患であるが，いまだ根本的な治レゾルビン，ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体

療法は確立されていない．その病態として近年の研究に（PPARγ）リガンドの関与について，検討する予定であより自然免疫に重要な役割を有する Toll-like receptor

る．

(TLR) の関与が示されている．TLR7 および TLR9 は様々【文献】

な細胞内のエンドソーム膜に発現しており細胞内に取り

１）Uchi S-H., Yanai, R (C)., Kobayashi, M., Hatano,

込まれた RNA や DNA 等を認識することで炎症性サイ

M., Kobayashi, Y., Yamashiro, C., Nagai, T.,

トカインの産生に関与しているが，全身性強皮症患者でTokuda, K., Connor, KM., Sonoda, K-H. &はこれら TLR7 および TLR9 の発現が亢進しており線維

Kimura, K.: Dendritic cells mediate the anti-化病変との相関関係が認められている．このことから全

inflammatory action of omega-3 long-chain

身性強皮症の病態に TLR7 および TLR9 が関与している

polyunsaturated fatty acids in experimental au-と考え，全身性強皮症における TLR7 および TLR9 の機

toimmune uveitis. PLoS One 14(7): e0219405,

能およびそのメカニズムを解明するとともに，全身性強2019. doi:10.1371/journal. pone. 0219405. eCollec-皮症に対する新規治療開発の基板形成を目指す．

3148

全身性炎症疾患の病因 ･ 病態の解明に関する研究助成

【方法】

【方法】
全身性強皮症モデルであるブレオマイシン誘発強皮症

In vitro では TGF-β で刺激した培養ヒト皮膚・肺線

マウスにおける TLR7 および TLR9 の関与を解明するた

維芽細胞の増殖・遊走，コラーゲン産生やサイトカイン

め，皮膚・肺の線維化を評価するとともに線維化組織にの発現，シグナル伝達分子のリン酸化に対するカルパイ

おける炎症細胞浸潤，サイトカイン発現を評価する．

ン阻害剤の影響を検証した．また，肺上皮細胞を用いて野 生 型 マ ウ ス（Balb/c），TLR7 欠 損 マ ウ ス，TLR9上皮間葉転換を抑制するかどうか評価した．

欠損マウスにブレオマイシン溶液を投与し皮膚や肺に線動物実験系では野生型マウスの背部に連日ブレオマイ

維化を誘導する．コントロールには PBS を用いる．ブシンを皮下注射し作成した強皮症マウスモデルで，カル

レオマイシン投与から 28 日目に皮膚・肺組織を採取

パイン阻害剤を腹腔内投与し皮膚・肺における抗線維化

し，複数の染色標本にて線維化の程度を評価する．ま

作用を検証した．

た，免疫染色によりブレオマイシン誘発強皮症モデルマ【結果】

ウス（野生型マウス，TLR7 欠損マウス，TLR9 欠損マ

In vitro においてカルパイン阻害剤を投与することで，

ウス）の皮膚・肺に浸潤した CD3＋Ｔ細胞，CD4＋Ｔ細TGF-β で刺激した皮膚・肺線維芽細胞から産生される

胞，CD8 Ｔ細胞，B220 Ｂ細胞，F4/80 マクロファー

αSMA，コラーゲン，ファイブロネクチン１を抑制し

ジ，NK1.1＋細胞の数をカウントして評価する．

た．また Smad2/3 の核内におけるリン酸化を低下させ，【結果】間葉移行に関わる転写因子である SNAIL2 や ZEB1 も

＋

＋

＋

ブレオマイシン誘発強皮症マウスでは，TLR9 欠損マ抑制した．TGF-β を用いて上皮間葉転換を誘導した肺ウス群でコントロール群，TLR7 欠損マウス群と比較し上皮細胞においてはカルパイン阻害剤の投与により上皮て有意に皮膚の線維化，肺の線維化が軽減された．そのマーカーである E カドヘリンの減少を抑え，間葉マー

一方で，TLR7 欠損マウス群はコントロール群と比較しカーの上昇を抑制させた．

て有意差はなかった．

動物実験においては，カルパイン阻害剤投与群ではブ
レオマイシンによる皮膚肥厚を有意に改善させ，真皮内【考察】
全身性強皮症の病態において，TLR7 よりも TLR9 がより重要な役割を果たしている可能性がある．

コラーゲンの増加も抑制した．さらにカルパイン阻害剤
投与群で in vitro と同様 Smad のリン酸化が低下していたことに加え，真皮内のカルパインの発現低下を確認した．コントロール群に比し，リンパ球，マクロファージ

カルパインを標的とした全身性強皮症の新規治療戦略
笠松

宏至

といった炎症細胞浸潤が弱い傾向にあった．
【考察】
カルパイン阻害剤は線維芽細胞からの細胞外マトリッ（福井大学）

クスの産生を減少させた．また強皮症マウスモデルで皮膚の線維化を抑制した．この機序として TGF-β/Smad【目的】

シグナル伝達経路を抑制することがまず挙げられ，他に全身性強皮症（以下，強皮症）は免疫異常を背景に皮上皮間葉転換への影響，カルパインを介した経路が関膚や内臓に線維化や血管病変をきたす膠原病であるが，わっている可能性がある．今後は血管障害に対する効果

その病態は明らかでなく，治療法も確立されていない．

や，詳細な機序の解析を検討する．

カルパインは細胞質内 Ca２＋要求性プロテアーゼであるが，いまだその生理機能は不明な点が多い．カルパイン
阻害剤は肺線維症・皮膚の瘢痕形成などの線維化や血管障害を抑制するとの報告がみられており，強皮症にも有用な可能性があると考え検討した．

4149

全身性炎症疾患の病因 ･ 病態の解明に関する研究助成

全身性強皮症に対するＢ細胞除去療法における組織
中Ｂ細胞の検討久住

中の topo-I 反応性 B 細胞は，抗 CD20 抗体による除去に強い抵抗性を示した．また，topo-I-SSc モデルマウスの脾臓・肺・末梢リンパ節では CXCL12 の発現が上昇

藍していた．さらに，topo-I-SSc モデルマウスの組織中Ｂ（東京大学）

細胞，特に topo-I 反応性Ｂ細胞では CXCR4 の発現が上昇していた．

【目的】

【考察】

全身性強皮症（systemic sclerosis; SSc）は予後不良

本研究の結果から，SSc の組織中Ｂ細胞，特に組織中な自己免疫疾患で，治療法は確立されていない．B 細胞の自己反応性Ｂ細胞は抗 CD20 抗体による除去に抵抗が病態形成に重要なことから，抗 CD20 抗体によるＢ性を示し，その除去抵抗性には CXCL12-CXCR4 軸のシ細胞除去療法が SSc の新規治療として期待されている

グナルが関与している可能性があることが示された．

が，しばしば治療効果に乏しい．申請者は SSc モデル
マウスの組織中 B 細胞の一部が抗 CD20 抗体による除去に抵抗性であることを見出し，これが治療抵抗性に寄与しているのではないかと着想した．
本研究では，自己抗原反応性Ｂ細胞をもつ独自のモデルーティン末梢血液検査結果を用いた機械学習によるぶどう膜炎診断
坪田欣也（東京医科大学）

ルマウスを用いて，抗 CD20 抗体による除去に抵抗性の組織中Ｂ細胞の病原性を明らかにする．また，SSc の組織微小環境が組織中Ｂ細胞の除去抵抗性に関与する可能性について，Ｂ細胞の生存と局在に重要な CXCL12-【目的】
ぶどう膜炎の中には急激な視力低下をきたす疾患や生CXCR4 軸に着目して明らかにする．

命予後不良となる仮面症候群などもあり，適切な診断の【方法】

もとに早急な治療の開始が求められるが，しばしば診断

１）抗 CD20 抗体による除去に抵抗性の組織中 B 細胞には苦慮することがある．末梢血液検査は一部のぶどうの病原性の解析膜炎の診断に有用であり，サルコイドーシスでは可溶性

野生型マウスに topoisomerase I (topo I) を免疫してIL-2 受容体などが診断基準に含まれ，ベーチェット病

作成した topo I 誘導 SSc モデルに抗 CD20 抗体を腹腔

では好中球とリンパ球比の増加が報告されている．我々

内投与し，皮膚・肺の線維化に対する効果を病理組織学

は，眼内液と機械学習を組み合わせて，様々な眼疾患の的に評価し，骨髄・脾臓・肺・末梢リンパ節・末梢血を新たなバイオマーカーの創出を報告してきた．本研究で回収し，蛍光標識された topo I 抗原に結合するＢ細胞

は末梢血液検査項目の更なる解析によって，新たなバイをフローサイトメトリーで解析し，組織中 topo I 反応

オマーカーを検出することで，眼内液の採取といった侵性Ｂ細胞の除去率を算出する．

襲的な検査を行わずに早急な治療を要するぶどう膜炎疾

２）CXCL12-CXCR4 軸の解析

患の診断を可能とすることを目的とする．

Topo I 誘導 SSc モデルの骨髄・脾臓・肺・末梢リン【方法】

パ節における CXCL12 の発現を real-time PCR および

2004 年４月から 2020 年３月に東京医科大学病院眼免疫染色で評価し，野生型と比べる．また，Topo I 誘科で新たにぶどう膜炎と診断された患者 4,423 人を対

導 SSc モデルにおける前述の各組織中の topo I 反応性

象とし，ぶどう膜炎診断時に施行されるルーティン末梢Ｂ細胞について，
CXCR4 の発現をフローサイトメトリー

血液検査結果を用いた．フォークト-小柳-原田病，サルで解析する．

コイドーシス ( サ症 )，ベーチェット病，ヘルペス性虹【結果】

彩炎，眼内リンパ腫，若年性慢性虹彩毛様体炎，急性Topo-I-SSc モデルマウスの組織中 B 細胞，特に組織

5150

網膜壊死，眼内炎，その他のぶどう膜炎 (Other)，原因

全身性炎症疾患の病因 ･ 病態の解明に関する研究助成

不明の 10 種に分類したぶどう膜炎をサポートベクター

SPF B）の腸管微生物叢を移入し，GF マウス，SPF マ

マシーン線形，サポートベクターマシーンカーネル法

ウス，元無菌マウス（SPF A 移入群：ex-GF A，SPF B(SVM-RBF)，ランダムフォレスト (RF)，決定木分析，
ナイーブベイズ，線形判別分析の６種のアルゴリズムを用いて診断し，正解率を用いて各種アルゴリズムの診断
精度を解析した．各種アルゴリズムは２分割交差検証を繰り返し 100 回行い検討した．
【結果】
ぶ ど う 膜 診 断 の 中 央 正 解 率 は RF が 最 も 高 く 0.51
±0.20， 次 い で SVM-RBF が 0.49±0.01 で あ っ た．
SVM-RBF を用いたｆ値は上位より原因不明 57.3±0.7,

図１

実験Ⅰのデザイン

図２

実験Ⅱのデザイン

眼内炎 55.0±3.2, サ症 50.7±3.3, Other 32.1±2.5 で
あった．
【考察】
眼内炎，サ症において，ルーティン末梢血液検査を用いた機械学習によるぶどう膜炎診断率は 50% を超えており，ぶどう膜炎診断の補助として有用である可能性が示唆された．しかし，本研究は単施設による診療録を用いた検討のためバイアスが大きい可能性は否定できな
い．さらに高性能な診断補助アルゴリズム作成には前向き研究，他施設研究が望まれる．

炎症性腸疾患の病態における幼少期微生物叢の関与
西成田

悠（杏林大学）【背景】
幼少期の dysbiosis が炎症性腸疾患（IBD）発症に寄

図３

Weighted Unifrac Distances PCoA plot（●: SPF A, ▼: SPF B, ◆: ex-GF A, ■: ex-GF B）

与することが示唆されている１）．幼少期に適切な腸管微生物叢に曝露することが健常な宿主免疫発達に重要であると考えられている２）．
【目的】
幼少期の宿主免疫と微生物叢の相互作用を理解するため，腸管微生物叢に曝露する時機の違いと曝露する腸管
微生物叢の違いが免疫発達に与える影響について検討した．
【方法】
４または 10 週齢無菌（GF）マウスに週齢・性別が一致する SPF マウス（４週齢群：SPF A，10 週齢群：

6

図４Weighted Unifrac Distances PCoA plot（●: SPF C, ▼: SPF D, ◆: ex-GF C, ■: ex-GF D）

151

全身性炎症疾患の病因 ･ 病態の解明に関する研究助成

移入群：ex-GF B）の腸管細菌構成，免疫機構（脾臓・腸間膜リンパ節の CD4＋T 細胞分画，大腸粘膜サイトカ

表１

日本人において頻度の高い HLA class I アリル

イン mRNA 発現）を検討した（図１, 実験Ⅰ）
．４週齢
GF マウスに性別が一致する４週齢 SPF マウス（SPF C）の腸管微生物叢を移入した群（ex-GF C）と 10 週齢のSPF マウス（SPF D）から移入した群（ex-GF D）の腸管細菌構成，免疫機構を検討した（図２, 実験Ⅱ）．
【結果】
Ex-GF A と ex-GF B の腸管細菌構成は異なっていた（図３, 雌 p＝0.041, 雄 p＝0.005）．免疫学的には exGF Ａのみ SPF と類似した．Ex-GF C と ex-GF D の腸【方法】

管細菌構成は類似し（図４, 雌 p＝0.553, 雄 p＝0.091），

日本人で頻度が高い HLA アリル（95 パーセンタイ

SPF C に類似した．ex-GF 間の免疫学的な違いは認め

ル以上）の遺伝子全長（約 8.5kb）を，日本人健常者のなかった．

ゲノム DNA より正確にクローニングした（表１）
．また，

【考察】

ゲノム DNA において HLA を完全に欠損した HeLa 細幼少期でのみ免疫学的可塑性が存在し，同期間に週齢相応の腸管細菌叢が生着して健常な免疫発達を可能とす

胞を，ゲノム編集にて作成した．
また，TRPM8 エクソン内に存在する非同義置換のる機構が存在することが示唆された．

rare variant によるタンパク産物へのダメージの影響【文献】

を，Polyphen2, SIFT, CADD を用いる in silico 解析に

１）Miyoshi, J. et al.: Early-Life Microbial Restitutionて検証した．

Reduces Colitis Risk Promoted by Antibiotic-Induced Gut Dysbiosis in Interleukin 10

−/−

Mice.

【結果】
日本人において頻度の高い HLA アリルすべての遺Gastroenterology.; 161(3): 940-952. (2021).

伝子全長について，クローニングが完了した．また，

２）Parkin, K. et al.: Risk Factors for Gut Dysbiosis in

HLA 欠損 HeLa 細胞の樹立にも成功した．現在，HLA

Early Life. Microorganisms.; 9(10): 2066. (2021).

欠損 HeLa 細胞へ，ゲノム編集を用いた HLA アリル全長のノックインを進めており，完了次第，細胞レベルで眼症状型重症薬疹の遺伝要因に由来する発症メカニ
ズムの解明と個別化医療の構築
人見祐基（国立国際医療研究センター研究所）【目的】
重症薬疹は，薬剤などを契機に生ずる重篤な病変を特徴とする疾患であり，発症メカニズムは不明である１）．
本研究では，助成者らがゲノムワイドな探索２） にて同定した疾患感受性遺伝子 HLA class I，および，患者のゲノム DNA に rare variant の集積が見られた TRPM8に起因する，発症メカニズムの解明と個別化医療の構築を目指した研究を実施した．

7
152の HLA アリル機能比較実験を予定している．
ま た， 重 症 薬 疹 症 例 に の み 検 出 さ れ た 8 か 所 のTRPM8 の rare variant は，いずれも TRPM8 タンパク機能に対して高い damaging score を示しており，発症への強い寄与が示唆された（表２）．
表２

TRPM8 にて検出された rare variant に対する
in silico 解析

全身性炎症疾患の病因 ･ 病態の解明に関する研究助成

インパクトは極めて大きい．

【考察】
本研究では，重症薬疹の発症に強く影響する２か所の近年，腸内細菌の解析は，メタゲノム解析技術の進歩

遺伝子に対する研究が大きく進捗した．現在，更なる発に伴い飛躍的に向上し，その結果 IBD 病態発症・進展

展的研究を実施中であり，新規知見を得ることができるにおいて腸内細菌の重要性がますます示唆されている．

見込みである．特に HLA においては，眼症状型以外のしかし，腸炎病態に相関する様々な細菌が同定されて重症薬疹も HLA が強く影響することが分かっており，きたものの，未だに真の病原菌は不明である．さらに，

これらも含めた発症メカニズムの解明や個別化医療の実

IBD に合併する皮膚疾患，肝炎および胆管炎，関節炎，装を前進させる研究成果が得られたと考えられる．

等の腸管外合併症の病態形成に関与する腸内細菌も次々【文献】と報告され，申請者は，皮膚疾患に関わる Lactobacil-

１）Roujeau JC, et al.: N Engl J Med 1995; 333:

lus murinus (Mikami, Y. et al. Cell Rep. 2017) を，肝臓 疾 患 に 関 わ る Lactobacillus johnsoni (Nakamoto,1600-7.
２）Kawai Y*, Hitomi Y*, Ueta M*, Khor SS*, et alN., Mikami, Y. et al., Cell Rep. 2017; Taniki, N., Mi-(* 共同筆頭著者 ).: NPJ Genom Med 2021; 6: 9.

kami, Y. et al. JCI insight 2017) を同定し，当該研究領域の発展に貢献した．IBD の病態形成における腸内細クローン病の体内侵入菌の同定と腸炎病態への関与の解明
三上菌の関与は以前より示唆されるが，病態機序や原因菌の特定には至っておらず，腸内細菌を標的とし治療法が有効であると断言できなかった．

洋平

【目的】
（慶應義塾大学医学部）

当教室で開発したヒト患者糞便サンプルから原因菌を絞り込む新規スクリーニング法 ( 図 1) を用いて，IBD【背景】
食の西洋化や抗生剤が乱用される本邦において，炎症

患者糞便より IBD の原因菌を同定し，病態解明につなげることを目的とする．

性腸疾患（IBD; inﬂammatory bowel disease）の罹患

IBD における腸管および腸管外病変の病態形成にお率は若年者を中心に急増している．遺伝的素因に加えいて，エフェクターＴ細胞が病態機序の中心的な役割をて，腸内細菌をはじめとした環境要因による影響が複雑担うとされる（Neurath, MF. Nat Rev Immunol. 2014;に絡み合って生じる腸管の慢性炎症が，IBD 病態の本質．IBD 患Biedermann, T. et al. Front Immunol. 2015）とされる．しかし，現状における IBD の治療法は炎症者の口腔内には Th1 誘導性細菌が，腸管内には Th2細胞もしくは炎症性サイトカインを標的としたものであ

お よ び Th17 誘 導 性 細 菌 が 増 殖 し て お り（Atarashi,り，とくにこれらの分子標的薬は一定の成果を上げてきK. et al. Science. 2017; Britton, GJ. et al. Immunity.

たものの，非常に高額かつ輸入に頼っており，本法の医2019），これら腸内細菌が，所属リンパ節を経由して体療経済的に安価で有効な治療法が期待されている．さら内に侵入し，腸管病変ならびに皮膚病変に関与すると想に，長期間の罹患に伴い，IBD は患者の著しい Quality

定された．図 1 で示す新しい腸内細菌スクリーニング

of Life の低下や経済的負担の増大に加えて，腸管や肛法と，IBD モデル，抗生剤乱用による dysbiosis モデル

門部に発生する炎症発がんが近年増加しており，治療法の開発は急務である．このように，病態形成後の炎症を修飾する治療は充実してきているものの，病態形成機序に即した有効的な IBD 治療法はなく，病態形成に関与する腸内細菌にアプローチした比較的安価でかつ副作用の少ない治療法の開発は，医療経済的なメリットにとど図１新規樹立した慢性免疫疾患惹起性細菌のスクリーニング法まらず，若年者の生産性の向上による実体経済へ与える8153

全身性炎症疾患の病因 ･ 病態の解明に関する研究助成

16S rRNA シーケンス法を用いて，健常人およびクローン病患者検体由来の糞便検体を解析し，糞便中の疾患特異的腸内細菌スペクトラムを解析することにより，クローン病
患者由来の “体内侵入菌” のスクリーニングを行った．
クローン病（CD）に加えて，IBD の代表疾患である
潰瘍性大腸炎 (UC) の患者便検体をアイソレーター内で無菌マウスに投与し（FMT: fecal microbiota transplantation），マウスの腸内細菌を解析したところ，CD,UC 由来の便（FMT 便）においては，健常人（HC）と比べて菌叢の多様性が低下していることが示された（図３）．これは，FMT 前の糞便（de novo 便）の多様性を
図２

実験方法の概略図

記した既報において，IBD 患者糞便中の筋層の多様性が低下しているというデータとも合致する結果となった（Lloyd-Price J (HMP2). Nature. 2019）．これを４人のを組合せて，免疫難病原因菌が，腸炎病態の発症・進展患者由来の糞便サンプルにおいて行い，同様の結果が得に及ぼす機能解析を行うことを目的とする．

られた．
さらに，既報の de novo 便の比較では，IBD と NL で【方法と結果】
まず，クローン病患者由来の “体内侵入菌” を同定すは多くの患者検体がオーバラップしている中で統計学ることを目的とし，図１で示す新しい腸内細菌スクリー

的に有意差を示していたが，FMT 便においては CD とニング法を用いて，クローン病手術患者より得られたHC の菌叢の組成がより顕著に異なり（図４），
本スクリー

腸内細菌を，無菌マウスに投与し（CD-FMT マウス），

ニングシステムの有効性が示唆される結果であった．

CD-FMT マウスの腸間膜リンパ節を培養した．さらに，【今後の展望】
すでに，入院を要する重症クローン病患者４名よりス
クリーニングした９菌が得られている．検体をさらに蓄積し，より多くの患者に存在する菌を同定するとともに，得られた菌体の中から，腸炎発症を誘引する菌（群）を絞り込む．今後とも，新規樹立したスクリーニング法を用いた IBD の原因菌の同定と Th 細胞分化を含めた疾患病態への寄与の解明，さらに特定の腸内細菌を標的とした新規治療法の開発につなげていきたい．

図３

FMT 後の菌叢の多様性
NUDT15 酵素活性制御機構の解明
宮谷侑佑（北里大学北里研究所病院）【目的】
チオプリン製剤は炎症性腸疾患 (IBD) において寛解
図４疾患による FMT 後の菌叢の相違維持療法として広く使用される．チオプリン代謝酵素
NUDT15 は 6-TGTP を 6-TGMP に 代 謝 す る 酵 素 で あ

9154

全身性炎症疾患の病因 ･ 病態の解明に関する研究助成

り，NUDT15 の遺伝子多型は白血球減少など重篤な有害事象発現と相関するとされている．しかしながら同じ

サイトカイン産生の制御機構に着目した炎症性腸疾

NUDT15 遺伝子多型においても個人間でのチオプリン

患の病態解明

投与量に差異を認め，これらの既知の因子以外にもチオ

持丸友昭（福島県立医科大学）

プリン代謝に影響を与える要因が存在すると考える．そこで我々はチオプリン代謝の詳細を明らかにするために，白血球中の 6-TGTP 代謝活性の生化学測定系の構築を試みた．
【方法】【目的】
炎症性腸疾患 (IBD) に対する初の分子標的薬として抗TNF 製剤が実用化され約 20 年が経過するが，その高いLC-MS/MS によるチオプリン代謝物を定量的に解析

有効性から抗 TNF 抗体は IBD に対し現在でも広く使用するため，予想される 6-TGTP 代謝物すべてについて検され，IBD の病態に TNF が深く関与していると考えら

量線を作成した．チオプリン非投与患者の末梢血 10ml

れている．TNF 受容体下流のシグナル制御機構についを Lymphoprep® で遠心分離し末梢血単核細胞を分取て詳細な研究が行われてきたが，TNF 産生の制御機構

し，CD3/CD28 抗体を用いて細胞増殖刺激を与えたのはその存在も含めて多くが明らかではない．

ち細胞を回収した．細胞抽出液を調製し，これを酵素源

In vitro において，マクロファージ様細胞 Raw 264

として 6-TGTP の代謝物を測定した．

は LPS 刺激で一過性に TNF を発現するが，申請者らは【結果】

ikarugamycin 併用下では TNF の発現が増強・遷延す

まず予備検討として血液由来のサンプルを酵素源とることを見出した．このことは，TNF の産生過程におし，NUDT15 遺伝子変異について既知の４名の健常者

いて，過剰な炎症を抑制する制御機構が存在することを

を解析対象とした（２名 NUDT15 野生型，２名ホモ変示唆しており，本研究では TNF 産生制御機構に着目し異）．NUDT15 タンパク質の発現量を確認すると，遺伝

免疫恒常性維持機構を明らかにすることを目的とする．

子変異を含む細胞では，NUDT15 タンパク質発現が堅【方法・結果】

調に減少していることが確認された．これらの検体を酵

Raw 264 を LPS で刺激し，細胞免疫染色による TNF

素源として 6-TGTP, 6-TGDP, 6-TGMP, thioguanosine,の動態解析を行った結果，TNF と細胞内のリソソーム

6-TG について測定したところ，野生型の検体によるの共局在を確認した．抗 TNF 抗体を培養上清に添加し6-TGMP の生成量は，変異型検体と比較して有意に高LPS 刺激を行った結果，一旦細胞表面に発現した TNF

いことが明らかになった．さらに，遺伝子多型既知のが細胞内に取り込まれることを認めた．さらに，Cell

IBD 患者９名より検体にて同様の実験を行った（７名

surface biotinylation 法でも TNF がエンドサイトーシ

NUDT15 野生型，２名テロ変異型）．いずれの検体におスされることを確認した．ikarugamycin 併用下では，いても 6-TGTP から 6-TGMP に代謝する活性が検出さ

TNF の細胞内取り込みは阻害され，細胞膜表面で発現れた．

が増強することを明らかとした．

【考察】

TNF 産生制御機構の分子機序を明らかにするため，

今回我々は血液サンプルを用いた 6-TGTP 測定系をTNF に対する免疫沈降を行い，質量分析で TNF 複合体構築した．今後は細胞抽出液の調整法，測定系の改善をの解析を行い多数のタンパクを同定した．現在，ウエス

通して，NUDT15 の酵素活性検出の効率性を上げ，チタンブロットで発現を確認し，そのタンパクの機能解析

オプリン代謝関連因子のさらなる探索を目指す．

を行なっている．
【考察】
本研究により，産生細胞レベルで TNF 発現が収束する機構が存在し，その本態はエンドサイトーシスによる制御であることを明らかにした．今後，その分子機序を

10

155

全身性炎症疾患の病因 ･ 病態の解明に関する研究助成

明らかにすることにより，炎症性疾患の新規病態解明及び治療法の開発につながることが期待される．

【結果】
移入より６週間後のマウスを用いて in vivo live im-【文献】

aging を行った．アーチファクトを低減した上で個々の１）Minamidate, A., Onizawa, M., Saito, C., Hikichi,

細胞がダイナミックに移動している状態を描出すること

R., Mochimaru, T., Murakami, M., Sakuma, C.,に成功した．

Asakawa, T., Hiraoka, Y., Oshima, S., Nagaishi,【考察】T., Tsuchiya, K., Ohira, H., Okamoto, R. &腸炎発症時及び寛解時における腸炎惹起性 CD4＋ Ｔ

Watanabe, M.: A potent endocytosis inhibitor

細胞の動態を解析するツールを構築した．今後は本法をIkarugamycin up-regulates TNF production. Bio-

用いて定量的解析を行う予定である．また，２次リンパchem Biophys Rep. 27: 101065 (2021).

装置における in vivo live imaging や，透明化を用いた
3D imaging を行うための系を構築していく予定である．
【文献】

腸炎モデルマウスにおける生体内イメージングを用いたＴ細胞動態の解析
森川

genic CD4＋ T Cells May Be a Pathogenic Reservoir亮

for Chronic Colitis, Gastroenterology., 132, 176-189（東京医科歯科大学）【目的】
炎症性腸疾患は再燃寛解を繰り返す難治性の疾患であり，長期的な投薬による維持治療が必要となることが多い．本疾患の病態を解明するために，当施設では大腸炎
モデルを用いて，炎症性腸疾患の難治性の原因が腸管粘膜局所や腸管外組織に維持されている腸炎惹起性のメモ
リーＴ細胞である可能性等を報告している．しかしながらその機序に関してはまだ詳細に解明されておらず，これには腸炎疾患モデルにおけるＴ細胞の動態や空間的配置の可視化が必要になってくると考えられる．以上より
我々は，CD4＋CD45RBhigh Ｔ細胞移入大腸炎モデルを用
いて in vivo live imaging 及び 3D imaging を行うこと
で，腸炎発症時及び寛解時における腸炎惹起性 CD4＋T
細胞の動態及び空間的配置を可視化し，新たな治療標的を探索することを目的とした．
【方法】
mTmG マ ウ ス か ら CD4＋CD45RBhigh Ｔ 細 胞 を sorting して RAG−/−マウスに移入し，大腸炎モデルを作成した．寛解モデルではこれに GFP マウスより sorting
した CD4＋CD25＋ Ｔ細胞を加えた．これら移入モデルの大腸粘膜を対象として二光子蛍光顕微鏡を用いた invivo live imaging を行った．

11
156

Nemoto, Y. et al.: Bone Marrow Retaining Colito-(2007).

研究報告

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成

膵 β 細胞における MEK/ERK シグナルの役割の解明とその治療応用
生島芳子

よびグリセロール）をエネルギー源として効果的に利用することができずにグルコースを利用するため，低い血糖値を示すのではないかと仮説を立てた．この検証のため，現在脂質負荷試験を進めている．また，カロリー制（The University of Edinburgh）

限下での雌雄のエネルギー源利用の差異の有無，およびAdiponectin の関与についても検証を進めている．

【目的】

また，末梢血・骨髄の血球解析では，カロリー制限自体

昨秋よりエジンバラ大学に移り，骨髄脂肪の全身代謝が末梢血分画に変化を生じさせること，またその効果はや免疫系における役割に焦点を当てた新たな研究を展開

雌雄によって差異が認められることを確認した．今後，している．

カロリー制限や Adiponectin が免疫系に及ぼす影響に

骨髄脂肪は体内脂肪総量の約 10% を占め，肥満やついて，一層の検討を進める計画である．

加齢等によりその量や機能が変化することが報告されているが，まだ十分な解析が進められていない．カロ
リー制限（Calorie restriction: CR）下で認められる血中 Adiponectin の濃度上昇には，骨髄脂肪から分泌される Adiponectin の増加が寄与しており，本研究ではAdiponectin 分泌を中心に，カロリー制限下における骨GLP-1 の非アルコール性脂肪肝炎（NASH）に対する臓器保護効果の機序の解明
井上智彰（株式会社麻生飯塚病院）

髄脂肪の役割の検討を進めている．
【方法】
Adiponectin 全身欠損マウスをカロリー制限下で飼育【目的】

し，耐糖能試験，脂質負荷試験等の負荷試験を行い，野糖尿病合併非アルコール性脂肪肝疾患（NAFDL）で生型や通常食（Ad libitum: AL）飼育対照群と比較する．

は肝線維化が進展し，非アルコール性脂肪肝炎 (NASH)

また，骨髄・末梢血サンプルの FACS 解析により造血幹に進展するリスクが高く，有効な治療戦略の確立が喫緊

細胞や分化細胞分画の変化を解析する．また，肝臓サンの課題である．新規糖尿病治療薬である GLP-1 受容体

プルの RNA-seq 解析により，得られる表現型の分子的アナログが NASH 患者を対象とした臨床研究（LEAN

背景を明らかにする．

試験）において，肝の線維化進行を抑制することが報告【結果・考察】されている．しかしながら，肝細胞には GLP-1 受容体

カロリー制限下のマウスは糖負荷試験において通常食が存在しないなど，組織分布とそれに対応する臓器保護

マウスよりも低い血糖値を示すが，我々は，予想外にカ効果には解離があり，機序の詳細は明らかではない．そロリー制限下の Adiponectin 全身欠損マウス（CR/KO）

こで本研究では GLP-1 受容体組織特異的欠損マウスをがカロリー制限下の野生型マウス（CR/WT）よりも用いて詳細な機序の検討を行い，GLP-1 が持ち合わせさらに低い血糖値を示すことを見出した．また，血漿る臓器保護効果のメカニズムの解明を目指す．

NEFA 濃度はカロリー制限下で上昇するが，この効果は【方法】

KO マウスにおいてより顕著であった．この結果から，申請者らが独自に作出した loxP 配列で glp1r 遺伝子

CR/KO マウスはカロリー制限下において，脂肪酸（おのエクソン 4, 5 を挟む，ﬂox マウス（GLP-1r ﬂox/ﬂox

1
157

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成mice）と，LysM-Cre マウスとの交配によって，単球・する応答システムを発達させており，細胞内恒常性維持

マクロファージ特異的 GLP-1 受容体欠損マウスを作出のための ER ストレス応答やオートファジー機構の重要する．単球・マクロファージ特異的 GLP-1 受容体欠損

性は我々も以前から指摘している．我々は，これらの恒マウスに 10 週間高脂肪食負荷を行い，コントロールマ

常性維持機構の制御に UFMylation が関与していること

ウスと比較検討することで，単球・マクロファージに発に注目し，UFMylation は膵 β 細胞の恒常性維持にも重現する GLP-1 受容体と肝臓との関連を検討する．

要な役割を果たすという仮説を提示するに至った．
本研究ではこの仮説を検証するために，膵 β 細胞特異【結果】
GLP-1R ﬂox/ﬂox LysM -Cre マウスの GLP-1 受容体

的 UFM1 欠損マウスを中心に解析を行い，膵 β 細胞にの発現が単球特異的に欠損していることを RT-PCR 法

おける UFMylation が持つ病態生理学的意義を解明するで確認した．
コントロールマウス及び単球・マクロファーことを目的とする．

ジ特異的 GLP-1 受容体欠損マウスを 10 週齢から 20 週

【方法】

齢まで高脂肪食負荷を行った．血糖値，体重，肝臓の線

Ins1 制御下に Cre-ERT を発現する Ins1-Cre-ERT マ

維化について評価を行ったが，両群に差を認めなかっウスおよび Ufm1 ﬂox/ﬂox マウスを交配し，タモキシフェ

た．肝逸脱酵素 ALT，炎症性サイトカイン TNFα，肝臓ン（TM）誘導性に膵 β 細胞特異的 Ufm1 欠損が可能な

マクロファージについては，単球・マクロファージ特異Ufm1 ﬂox/ﬂox : Ins1-Cre-ERT (UFM1-βKO) マウスを作製

的 GLP-1 受容体欠損マウスで増加していた．

し，耐糖能評価・膵島の形態学的評価を行った．

【考察】

【結果】

肝臓マクロファージ GLP-1 受容体を介したシグナル

UFM1-βKO マウスと対照群（Ctrl）マウスに対し６が，高脂肪食負荷での肝臓炎症・肝細胞障害に寄与して週齢で TM を投与した．糖負荷試験では，オスでは TMいる可能性が示唆された．GLP-1 受容体アナログが肝投与後 11 週後に，メスでは 16 週後に UFM1-βKO に臓マクロファージを介して，NASH の有効な治療薬において耐糖能が増悪した．インスリン感受性は両群で差なることが期待される．

を認めなかった．高脂肪食飼育の条件下でも経時的に耐糖能は増悪した．組織学的検討では UFM1-βKO マウスの膵島は Ctrl 群と比較してインスリン染色の染色性がユビキチン様修飾因子 UFM1 の膵 β 細胞における病態生理学的意義の解析
鵜澤博嗣

低下している傾向が見られた．電子顕微鏡では UFM1βKO 膵島では ER 形態変化が観察された．
【考察】
UFM1-βKO マウスでの耐糖能悪化やインスリン染色（順天堂大学大学院医学研究科）

性の低下は，UFMylation 欠損によって膵 β 細胞機能不全が生じる可能性を示唆している．今後は，その分子メ【目的】
ユビキチン様修飾因子（UFM1）による翻訳後修飾である UFMylation は，小胞体（ER）ストレス応答やオー
トファジーとの関連が注目されている．一方で，その病態生理学的意義は未解明な点が多い．膵 β 細胞は大量のインスリン産生に伴う恒常的ストレスに晒されている細胞であり，特に２型糖尿病発症に先行すると考えられる
インスリン抵抗性の増大によりインスリン分泌需要が増大することは膵 β 細胞に対して過酷な負荷がかかることを意味する．従って，
膵 β 細胞はそれらのストレスに対2
158

カニズムの詳細を細胞生物学的手法により明らかにしていきたい．

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

副腎由来ホルモンの多様性に基づいた糖尿病および慢性合併症進展機構の解明
馬越真希

ASB2 遺伝子の関与が示唆された．
【結語】
MR 研究により，コルチゾールと筋力・筋量低下との因果関係が明らかとなり，サルコペニア進展への影響が（九州大学大学院医学研究院）

示唆された．
【文献】【背景】

Katsuhara, S., Yokomoto-Umakoshi, M., Umakoshi,

サルコペニアは進行性があり全身性の筋力・筋肉量のH., Matsuda, Y., Iwahashi, N., Kaneko, H., Ogata,低下を特徴とする症候群で，糖尿病との関連が示唆され

M., Fukumoto, T., Terada, E., Sakamoto, R. & Oga-ている．超高齢社会を迎えたわが国では，健康寿命延伸

wa, Y.: Impact of cortisol on muscle strength andの観点より，
サルコペニアの病態解明は喫緊の課題ある．

mass: A Mendelian randomization study. J. Clin.

代表的な副腎由来ホルモンであるコルチゾールは，副腎Endocrinol. Metab. 107(4): e1477-e1487, 2022.

皮質束状層から分泌されて，ストレスに応答し，糖・脂質代謝をはじめとする生体恒常性を維持している．しかし，過剰なコルチゾールは有害であり，例えば，コルチ
ゾールを過剰に分泌するクッシング症候群やステロイド薬の長期投与による副作用として，様々な代謝疾患が認められる．一方，健常者においても加齢や過度のストレ

血管内皮における O-GlcNAc 修飾による糖尿病合併症進展機構の解明
大橋夏子（滋賀医科大学）

スが続くことによって，コルチゾール分泌が軽度かつ持続的に上昇して，筋力・筋肉量の低下に影響する可能性があるが，両者の因果関係は不明であった．
【目的】
メンデルランダム化（MR）研究によりコルチゾール【目的】
糖尿病や肥満の世界的な急増は克服すべき重要な臨床課題である．それらの疾患では高血糖やインスリン抵抗と筋力と筋量の因果関係を明らかにする．

性に伴う高インスリン血症により，全身の血管の内皮機【方法】

能障害から様々な臓器障害が惹起される．O-GlcNAc 修

健常者対象の早朝血漿コルチゾール濃度におけるゲノ

飾は，全身の血管障害により引き起こされる糖尿病合併

ムワイド関連解析（GWAS; n ＝ 12,597）より，関連す症の成因進展機構の一つとして着目されてきた．
しかし，る３つの SNP を操作変数として用いた．アウトカムは内皮細胞における O-GlcNAc 化の役割，特に肥満と内握力，インピーダンス法による全身・四肢除脂肪体重を皮細胞との関係については未だ不明である．そこで，血選択した．FUMA ソフトウエアを用いて機能的アノテー

管内皮細胞における O-GlcNAc 修飾の生理学的役割と，ションと遺伝子マッピングを実施した．

糖尿病及び肥満状態における病態生理に与える影響に関【結果】して検討する．

コ ル チ ゾ ー ル は 握 力 と 負 に 関 連 し（β, – 0.031;【方法】

95%CI –0.052 ～ –0.011; P ＝ 0.003），除脂肪体重とタモキシフェン誘導性血管内皮細胞特異的 Cre 発現も負に関連した．性差解析では女性にのみ関連を認め

マウス（VEcad-BAC-CreERT2 マウス）と Ogt-ﬂox マウ

た．多変量 MR 法によるコルチゾールと握力の関連はスとの交配を行い，タモキシフェンを腹腔内投与し血管血糖による補正後に消失し，MR ベイジアンモデル平均

内皮細胞特異的 Ogt 欠損（Ogt-VEKO）マウスを作製し法による媒介分析でも，血糖は最上位の媒介因子であった．通常食モデル，高脂肪食摂餌による肥満モデルを作た．コルチゾール関連 SNP による機能的アノテーショ

製し，その表現型を解析した．

ンと遺伝子マッピングでは，筋量の負の制御因子である

3
159

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

Ogt-VEKO マウスで観察された体重増加の減少は腸管か【結果】
Ogt-VEKO マウスは対照マウスと比較し，エネルギー

らの脂質の吸収不良によることが示唆された．興味深い

摂取および消費量に有意な差は認めなかったものの，通ことに，腸管の形態学的解析では，Ogt-VEKO マウス

常食モデルにおいて体重増加不良を呈し，高脂肪食モデのリンパ管内皮細胞-細胞接合部は連続した「ジッパー」

ルでは体重増加がより顕著に抑制された（図１）．体組構造であり，リンパ管内腔には TG 小胞がかなり少な

成解析の結果，除脂肪量には差がなく，Ogt-VEKO マ

いことが明らかとなった．次に，vascular endothelial

ウスにおいて脂肪量の有意な減少を認めた．糖代謝に関

growth factor receptor (VEGFR) がリンパ管内皮細胞しては，高脂肪食開始４週間後では，腹腔内ブドウ糖-細胞間結合の「ジッパー」構造に深く関与しているこ

負荷試験時の血糖値および血漿インスリン濃度に差はとが報告されているため，VEGFR タンパク質の発現をなかった．一方，腹腔内インスリン負荷試験中の血糖

western blotting に よ り 検 討 し た． す る と，VEGFR1

値は，対照マウスに比べ Ogt-VEKO マウスで低くなっと VEGFR2 の蛋白発現が両群で同等であるのに対し，ていた．経口ブドウ糖負荷試験でも両群に差はなかっ

VEGFR3 の蛋白発現は Ogt-VEKO マウスにおいて著したが，経口脂質負荷試験では Ogt-VEKO マウスにおいく低下していた．

て脂質負荷後のトリグリセリド（TG）の上昇が抑制さ【考察】れていた（図２）．一方で，静脈内脂質負荷試験中の

O-GlcNAc 修飾は，網膜症，腎症，神経障害などのTG は群間で同等であり，糞便中の TG は対照群に比べ糖尿病性微小血管合併症の発症に関係することが知ら

Ogt-VEKO マウスで増加していた．これらの結果より，れていることから，我々は当初より，血管内皮細胞のO-GlcNAc 修飾が糖尿病合併症において果たす役割に関して検討を行っていた．しかし，今回の我々の検討では，
STZ 投与により糖尿病を発症させた Ogt-VEKO マウス
において，網膜血管密度，尿蛋白量，感覚神経閾値は対照群と比較し有意な変化を認めなかった．これらの結果
より，血管内皮細胞における O-GlcNAc 修飾の欠損は，糖尿病モデルマウスにおける主要な糖尿病微小血管合併症に影響を与えないと考えられた．
検討を重ねていく中で，これまでの研究結果より，
血 管 内 皮 細 胞 に お け る O-GlcNAc 修 飾 の 欠 損 は， 腸

図１

高脂肪食摂餌下での体重変化

管からの脂質吸収の低下による体重増加不良，特に高脂肪食負荷時の体重増加を抑制することが明らかとなった．VEGFR3 は，腸のリンパ管維持や TG 吸収に関与することが報告されており，Ogt-VEKO マウスでは VEGFR3 のタンパク質発現が顕著に低下していたこと か ら，VEGFC-VEGFR3 経 路 を 介 し て TG の 吸 収 が低下している可能性が考えられた．さらに，VEGFCVEGFR3 シグナルは．NO 産生に寄与し，NO がリンパ管の透過性に影響を与えることが報告されている．
今後，
Ogt-VEKO マウスの経口脂質負荷時の脂質吸収の低下

図２

経口脂質負荷試験における血清 TG の変化

図１，２：＊p ＜ 0.05, ＊＊p ＜ 0.01, ＊＊＊p ＜ 0.001

4160が NO によって回復されるかどうかを検討する予定である．

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

弾性線維関連蛋白 Fibulin-5 によるインスリン抵
抗性制御機構の解明
奥山亢進や体重変化は臓器連関や間接作用を介した作用であると考えられた．今後さらなる検討を加え，新たな代謝制御機構を明らかにしていく．

朋子（横浜市立大学医学部）【目的】

血管内皮 PDK1 の病態生理学的役割の解明
小畑

細胞外弾性線維関連蛋白である Fibulin-5 (Fbln5) を淳史（医療法人仁聖会小畑醫院）

介した糖代謝およびエネルギー代謝の制御機構の解明を目的とする．
【方法・結果】【背景】
我々は血管内皮特異的に PDPK1 を欠損させること

Fbln5 欠損マウス（Fbln5KO）および野生型マウス

で，生理的または高脂肪食負荷条件下では，主に脂肪（WT）における通常食/高脂肪食負荷における代謝表現

組織における血管新生が抑制され，脂肪の縮小に伴うア型の解析により，Fbln5KO で体重非依存性のインスリ

ディポカイン発現の改善に伴い，全身でのインスリン抵

ン感受性の亢進，体重増加の抑制を認め，高脂肪食誘抗性が改善することを明らかにした．一方で，血管内皮

導性の肥満・肝脂肪蓄積・脂肪細胞肥大化が抑制され特異的に PDPK1 を欠損させることで，膵 β 細胞におけた．グルコースクランプを用いた解析により，Fbln5

る血流が低下し，血管内皮構造の構築の乱れを生じ，膵欠損による全身のインスリン感受性亢進が示唆された．

β細胞機能が低下することを明らかにした．これらの研Fbln5KO では皮脂腺の萎縮を認め，寒冷刺激に対する究は主に生理的条件または高脂肪食負荷下での表現型で体温低下が顕著であったが，脂肪組織における熱産生・あり，高血糖状態での血管内皮 PDPK1 が果たす役割は

脂肪酸燃焼に関連する遺伝子群の発現は亢進しており，明らかにされていない．また，これまで「恒常的に発現

代償性変化と考えられた．通常食下で Fbln5KO の酸素している」とされていた PDPK1 は，ヒト大動脈血管内

消費量は WT と同等であったが活動量の低下を認め，

皮では肥満に相関して発現が低下していることも明らか

30℃での飼育においても Fbln5KO では体重増加が抑制にしている．

され，インスリン感受性の亢進は残存した．Fbln5KO【目的】

は血管の脆弱性を呈することから，血管を介したインス

高血糖状態における血管内皮 PDPK1 の役割を解明す

リンの組織移行性への影響についても検証した．下大ること，及び血管内皮における PDPK1 の発現制御のメ

静脈からの標識インスリン投与後の肝臓におけるインカニズムを明らかにする．

スリン取り込みは Fbln5KO で亢進した．そこで Fbln5-【方法】

ﬂoxed マウスを入手し肝細胞特異的 Fbln5KO，脂肪細血管内皮特異的 PDPK1 欠損マウスを用いて，STZ で

胞特異的 Fbln5KO，皮膚（表皮）特異的 Fbln5KO，血高血糖を誘発し，全身の糖代謝に及ぼす影響を解明する

管平滑筋特異的 Fbln5KO，血管内皮特異的 Fbln5KO，こと，及び様々なモデルを用いて血管内皮 PDPK1 の発

骨格筋特異的 Fbln5KO を樹立したが，いずれにおいて現がどのように制御されているかを明らかにする．

も体重やインスリン感受性はコントロールマウスと同等【結果】であった．現在血管内皮/血管平滑筋両 Fbln5 欠損マウ

STZ によって高血糖を誘発すると，血管内皮特異的スを樹立している．

PDPK1 マウスではインスリン抵抗性が惹起された．ま【考察】

た Akt のリン酸化を評価したところ，その主たる臓器

弾性線維関連蛋白 Fbln5 による，皮膚を介したエネは骨格筋であることが明らかになった．骨格筋におけ

ルギー代謝制御や血管を介したインスリン移行性の制御

る vascularity は PDPK1 欠損マウスで有意に低下しての存在が示唆され，Fbln5 欠損によるインスリン感受性

おり，TUNEL assay でも有意に血管内皮の apoptosis

5161

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成の亢進が確認された．In vitro でもヒト臍帯動脈血管内を用いて M1 マクロファージ，M2 マクロファージに大皮細胞を用いて PDPK1 をノックダウンすると cleaved

別して解析されてきた．しかしながら，それぞれのマク

caspase3 の発現が有意に増加し，血管増殖に重要な役

ロファージが癌の発症・進展にどのような役割を果たし割を果たす VEGFR2 の発現は有意に低下していた．電ているか，in vivo モデルでの検討は充分に行われてお子顕微鏡による評価では，骨格筋のミトコンドリア構造

らず分子機構についても未だ明確ではない．本研究の目の乱れや脂肪の蓄積が確認された．以上から血管内皮特的は １）CD206＋M2 マクロファージが癌発症・進展を異的 PDPK1 欠損マウスは STZ 誘導性高血糖下では骨促進していないか．２）肥満による CD206＋M2 マクロ

格筋の vascularity を低下し，さらには mitochondria

ファージの表現型や細胞数の変化が，癌の発症・進展を

biogenesis を低下することで骨格筋においてインスリ促進していないかを解明することである．

ン抵抗性を惹起することが明らかになった．血管内皮【方法】

PDPK1 の発現については db/db マウス及び高脂肪食負乳癌を発症する遺伝子改変マウスを高脂肪食群と通常

荷 C57BL/6J マウスにおいては有意に発現が低下して食群に分けて，腫瘍の発生時期や，重量，体積，数を測おり，一方で STZ 誘導高血糖モデルでは有意に発現が定．摘出した腫瘍を FACS, MACS, IHC, qPCR などを増加していた．

用いて解析した．

【結論】

独自に作製した乳癌マウスモデルで CD206＋M2 マク

血管内皮 PDPK1 欠損は STZ 誘導性高血糖下では骨ロファージの数を減らした際の癌の発症・進展への影響

格筋でのインスリン抵抗性が惹起される．また，様々なを評価した（腫瘍の発生時期，腫瘍重量，腫瘍体積）．

条件により血管内皮 PDPK1 の発現は「恒常的ではない」

摘出した腫瘍について組織学的評価，遺伝子発現解析，

ことが明らかになった．

FACS などを行った．
【結果】
高脂肪食負荷で腫瘍の発生が早まり，腫瘍の重量・体肥満時の癌発症・進展における M2 マクロファー
ジの役割
角積・数が増加した．PD-1＋CD8＋Ｔ細胞の遺伝子発現を解析すると PD-1－CD8＋Ｔ細胞と比較して Opn を高発現し，細胞障害性の指標となる Ifng, Gzmb は低発現朝信であった．免疫組織化学でも PD-1＋細胞が OPN を高（富山大学医学部附属病院）

発現していた．
独自に作製した乳癌マウスモデルで CD206＋M2 マク【目的】

ロファージの数を減らすと癌の発症，進展は抑制され肥満は乳癌，大腸癌，子宮体癌など数種の癌リスクをた．摘出した腫瘍について組織学的評価，遺伝子発現増加させる．しかしながら，肥満がどのように癌発症・解析（qPCR, RNA seq），FACS などを行い，CD206＋

進展に関与するか根本的な機序は充分に解明されていな

M2 マクロファージの減少による癌周囲微小環境の変化

い．肥満者は世界的に増加傾向であり，肥満がどのようについて確認した．

に癌発症・進展に関与するか根本的な機序が解明できれ【考察】ば社会的な貢献は大きいものと考えられる．血管新生や高脂肪食による肥満で細胞障害性が低く，OPN を発

免疫抑制を介して癌細胞の増殖や転移に寄与するマクロ

現し癌細胞増加促進作用をもつ PD-1＋CD8＋Ｔ細胞がファージが存在する（Cell. 141: 39-51, 2010.）．乳癌，

腫瘍内で増加した．肥満による CD8＋Ｔ細胞の疲弊の肺癌，メラノーマ等の数種類の癌においてマクロファー

加速が癌発症・進展促進と関連することが示唆された．

ジの浸潤が高度であるほど予後が悪いことが知られ，マ

また，CD206＋M2 マクロファージの数を減らすと癌のクロファージを標的とした癌治療が有望である可能性が発症，進展は抑制されることが明確となった．今後，そ指摘されている．マクロファージは細胞表面マーカーの機序の解明を進めると同時に臨床応用を目指した基礎

6
162

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成研究を行う予定である．

答して物理的性質が劇的に変化するフェニルボロン酸を【文献】

含む高分子ゲル（ゲル）を利用して，エレクトロニクス

１）Nawaz, A., Nishida, Y., Takikawa, A., Fujisaka,

フリーで操作が簡便な，人工膵臓様デバイスを開発した．

S., Kado, T., Aminuddin, A., Bilal, M., Jeelani,

本研究では，デバイスの効果と安全性を評価するとともI., Aslam, MR., Nishimura, A., Kuwano, T.,に，臨床応用の可能性について検討した．

Watanabe, Y., Igarashi, Y., Okabe, K., Ahmed,【方法・結果】

S., Manzoor, A., Usui, I., Yagi, K., Nakagawa,

既に我々は，ゲルとシリコンカテーテルを融合させて，

T. & Tobe, K.: Astaxanthin, a Marine Carot-

マウスを用いた機能実証に成功した．今回，臨床応用を

enoid, Maintains the Tolerance and Integrity of

見据え，インスリン放出の有効表面積を拡大するために，

Adipose Tissue and Contributes to Its Healthy

血液透析用中空糸を融合した次世代型デバイスを開発しFunctions. Nutrients. Dec 6; 13(12): 4374. 2021.

た．マウスの 10 倍の体重を有するラットの皮下にデバ２）Bilal, M., Nawaz, A., Kado, T., Aslam, MR., Iga-

イスを留置したところ，血糖依存的なインスリン放出とrashi, Y., Nishimura, A., Watanabe, Y., Kuwano,

血糖低下作用および，良好な生体適合性を認めた．また，

T., Liu, J., Miwa, H., Era, T., Ikuta, K., Imura,

１型糖尿病モデルを用いた検討では，平均血糖の低下の

J., Yagi, K., Nakagawa, T., Fujisaka, S. & Tobe,

みならず，夜間活動期の血糖上昇がデバイス留置群で有K.: Fate of adipocyte progenitors during adipo-

意に抑制され，血糖日内変動が改善された．さらに我々

genesis in mice fed a high-fat diet. Mol Metab.

は，ブタを用いて検討を行い，１型糖尿病ブタにラット

2021.

用のデバイスを８個挿入することで，血糖依存的なイン

３）Watanabe, Y., Fujisaka, S., Ikeda, K., Ishikawa,

スリン放出と，血糖低下を認めが，臨床応用に向けては

M., Yamada, T., Nawaz, A., Kado, T., Kuwano,

更なるスケールアップの必要性と，侵襲性の改善が必要

T., Nishimura, A., Bilal, M., Liu, J., Yagi, K.,と考え，マイクロニードル技術を応用することを着想しHase, K. & Tobe, K.: Gut microbiota, deter-

た．マウスやブタに装着し，血糖依存性のインスリン放

mined by dietary nutrients, drive modiﬁcation

出を確認しているが，臨床応用に向けては，皮膚への刺of the plasma lipid profile and insulin resis-

入性および機能の持続性について改善が必要であり，課tance. iScience. Apr 16; 24(5): 102445. 2021.

題に取り組んでいる．
【考察】
血液透析用中空糸を融合した次世代型デバイスによグルコース応答性高分子ゲルを用いた自律型インス
リン投与デバイスの開発
木村真一郎

り，大幅なスケールアップに成功し，安全性を確認するとともに，グルコース応答性のインスリン放出特性により，平均血糖のみならず血糖日内変動が改善することを示した．さらに我々は，臨床応用を見据え，マイクロニー（名古屋大学環境医学研究所）

ドルを融合した新たなインスリンデバイスの開発を進めている．本デバイスにより，インスリン療法の早期導入【目的】
インスリン療法は糖尿病治療の根幹を成すが，QOLの促進，および糖尿病合併症の発症・進展抑制に重点を置いた新たなインスリン治療を提案できると考える．

を損なう上，低血糖の危険を有する．また近年では，平均血糖の高値に加えて，血糖変動が糖尿病血管合併症のリスクになることが報告されている．そのため，血糖応
答性にインスリンを放出する人工膵臓様デバイスの開発が求められている．そこで我々は，グルコース濃度に応

7163

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

膵島と腺房細胞の相互作用による GLP-1 を介した
膵 β 細胞制御機構の解析
京原

麻由

ンや膵島からの液性因子を介して，膵島と腺房細胞の接着を促進，また，腺房細胞での Reg1 発現の誘導により，
腺房細胞由来の Reg1 が膵島に作用して膵 β 細胞増殖を促進するという，膵島と腺房細胞との接着因子や分泌因（横浜市立大学大学院医学研究科）

子を介した機序が想定された．

【目的】
GLP-1 による膵 β 細胞増殖制御における新規経路を同定する．
【方法・結果】

エピゲノムを介した肥満・糖尿病遺伝機構の解明と
応用
小塚

智沙代

（理化学研究所生命医科学研究センター）

GLP-1 受容体作動薬のリラグルチド（Lira）を添加し一晩培養したマウス単離膵島の定量的プロテオーム解析を行った．Lira 添加により膵島において発現上昇したタ【目的】

ンパク質を解析したところ，Alpha-amylase 1 (Amy-1)

エピゲノム修飾は環境因子によって変化する．エピゲなどの膵腺房細胞に発現する外分泌酵素関連タンパクがノム異常が肥満や糖尿病の発症リスクに関与する可能性

多く同定され，GLP-1 により膵島と周囲の腺房細胞のが示唆されているが，その分子メカニズムは未だほとん

接着が促進される可能性が想定された．また Lira 添加

ど分かっていない．これまでに，胎児期の低栄養によっの膵島で，膵腺房細胞に発現し膵 β 細胞増殖に関与すて成長後に代謝疾患を発症するメカニズムに，胆汁酸る分泌因子である Lithostathine-1 (Reg1) が発現上昇す-Fernesoid X receptor (FXR) -Fibroblast growth fac-

ることも見出した．リコンビナント Reg1 添加膵島の β

tor 15/19 (FGF15/19) 経路により介在される腸-肝連関

細胞増殖は促進し，さらに Lira を添加することによるの異常が関与していることが報告されている（Endocri-

β細胞増殖の促進作用は認めなかった．膵腺房細胞に

nology 2017）．そこで，胎児期の低栄養がエピゲノム

は Glp1r 発現を認めず，Lira や高グルコース刺激腺房変化を介して腸-肝連関に異常を起こしているのではな

細胞の Reg1 発現に変化はなかった．一方，インスリンいかと考え，本研究では小腸において作用し，全身の糖刺激腺房細胞の Reg1 発現は上昇した．膵島と腺房細胞

代謝調節に関与するエピゲノム調節因子を探索した．

の共培養系を確立し，腺房細胞と共培養した膵島では【方法・結果】

Reg1，Amy1 が腺房細胞付着により増加し，P-Cad や
Cx26 等の細胞接着因子の発現が上昇した．

アセチル化ヒストンに結合する転写調節因子である
Bromodomain-containing protein 4 (Brd4) の阻害剤

次に Reg1 欠損マウスを用いた解析を行い，免疫染色である JQ-1 をマウスに 14 日間投与すると（50mg/kg/

において，Reg1 は膵腺房細胞に発現し，膵島での発現

day, ip, n ＝ 6），高血糖や耐糖能異常を呈した．このとを認めなかった．野生型マウス（WT）単離膵島と WTき，JQ-1 投与により小腸における FGF15（マウス型）

腺房細胞との共培養では，Lira により膵 β 細胞増殖はの発現が抑制され，その結果，肝臓における FGF 受容促進されたが，WT 単離膵島と Reg1 欠損マウス（KO）

体 4（FGFR4）シグナルの低下，グルコース産生の亢進

腺房細胞との共培養では Lira による膵 β 細胞増殖は促がみられた．一方，Brd4 投与による高血糖・耐糖能異進を認めなかった．一方，KO 単離膵島と WT 腺房細胞

常は，FGF19（ヒト型）の過剰発現によって完全に回の共培養では，Lira により膵 β 細胞増殖は促進された．

復した．次に，ヒト腸管細胞株 HT-29 細胞を用いてク

マウスへの Lira 皮下注による膵 β 細胞増殖は，WT にロマチン免疫沈降法により Brd4 の FGF19 プロモーター

比較し KO で低下した．

領域への結合を調べた．Brd4 が FGF19 のプロモーター【考察】

領域上に結合し，JQ-1 の添加により結合が阻害される

GLP-1 は，膵 β 細胞の GLP-1R に作用し，インスリ

8
164と FGF19 の発現レベルも低下した．

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

ともに減少した１）．一方，血管内皮機能は魚食介入後，【考察】
エ ピ ゲ ノ ム 制 御 に 関 わ る Brd4 は 小 腸 に お け る

著明に改善し，その効果は介入終了後も持続した．さらFGF15/19 の新しい転写調節因子であり，FGF15/19 のに，糖尿病患者 23 名に対する４週間の魚食介入（n-3発現変化を介して肝臓および全身の糖代謝調節に関与す

PUFA 3.0g/日）によっても，健常者と同様の結果を得ることが明らかになった．今後は胎児期の母体環境が糖た２）．

尿病発症リスクを上昇させるメカニズムへの関与を検討

介入研究 2：高繊維食・玄米食が血管内皮機能に及ぼすしていきたい．

影響３,４）
肥満・耐糖能障害者 17 名に対し低脂肪・高繊維食介【文献】
Kozuka, C. et al.: Bromodomain Inhibition Reveals

入を８週間の行った結果，エネルギー・脂質摂取量は減

FGF15/19 As a Target of Epigenetic Regulation and

少し，食物繊維摂取量は増加するとともに，体重，糖脂Metabolic Control. Diabetes 71: 1023-1033 (2022).

質代謝だけでなく歯周病マーカーを改善した．これらの効果の少なくとも一部はエネルギー摂取量だけでなく，栄養学的アプローチによる動脈硬化予防効果の検討近藤慶子（滋賀医科大学 NCD 疫学研究センター）

低脂肪・高繊維といった栄養組成によるものと考えられ
る３）．さらに，２型糖尿病患者 28 名を対象とし，主食を玄米に置き換えた高繊維食が血管内皮機能に及ぼす影響について検討した４）．対象者を主食の種類別に玄米群（n ＝ 14）および白米群（n ＝ 14）に分け，８週間【目的】のランダム化比較試験を実施した．玄米群で，食物繊維

動脈硬化症は，糖尿病，高血圧，脂質代謝異常，喫煙，摂取量の増加および血管内皮機能の明らかな改善を認め肥満などを危険因子として発症する．食事療法は糖尿病

た４）．血管内皮機能に影響を及ぼすと考えられる血糖，をはじめ様々な疾患の基本的な治療法であるが，動脈硬インスリン，高感度 CRP などは両群で差を認めなかっ化予防に関するエビデンスは十分とは言えない．本研究た．高繊維食により腸内フローラが変化するとの仮説を

助成期間中，栄養学的アプローチによる動脈硬化予防法

立て，腸内フローラ解析を行ったところ，玄米群でのみについて，健常者・糖尿病患者を対象とした介入研究，

Biﬁdobacterium 属の増加および Bacteroides 属の減少

一般住民を対象とした疫学研究を実施し論文報告を行っを認めるとともに，短鎖脂肪酸の一つである酢酸の血中た．食事療法の効果は長期的な観察が必要であるが，メレベルの上昇を認めた．

カニズムを解明するための栄養学的介入を長期に行う事

観察研究 1：2 型糖尿病患者における二重標識水法を用は困難である．そこで，メカニズムの探索を目的に血管いた総エネルギー消費量の検討５－７）

内皮機能等を動脈硬化のサロゲートマーカーとした短期糖尿病における食事管理においてエネルギー摂取量の間の介入研究，および，循環器疾患死亡等のハードエン

設定は極めて重要である．しかし，特に日本を含めたアドポイントをアウトカムとした長期間の観察を疫学研究

ジアにおける糖尿病患者の総エネルギー消費量を評価しで行った．

た報告はほとんどない．そこで，総エネルギー消費量測【方法・結果】

定のゴールデンスタンダードな方法である二重標識水＜短期的検討＞（DLW）法を用い，２型糖尿病患者における総エネル

介入研究 1：魚摂取による血管内皮機能に及ぼす影響１,２）

ギー消費量（TEE）の実態を明らかにすることを目的に健常ボランティア 17 名に対し，魚食介入（n-3 多価検討を行った．滋賀医科大学医学部附属病院に通院中の不飽和脂肪酸 [n-3 PUFA] 3.0g/日）を８週間行ったと

60-79 歳の糖尿病患者（52 名）および非糖尿病患者（15ころ，血中 n-3 PUFA 濃度の上昇とともに血中トリグリ名）を対象とし，DLW 法を用いた TEE を測定し，間接

セリド値の減少およびアディポネクチン濃度の上昇を認

熱量測定により基礎代謝量を評価した．性，年齢，脂め，これらの変化は介入終了後 n-3 PUFA 濃度の低下と肪量，除脂肪量および平均 METs で調整した平均 TEE

9165

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成(kcal/day) および標準体重 1kg 当たりの平均 TEE (kcal/

硬化予防作用との関連についてさらなる検討を行い，糖kg/day) は，糖尿病群で若干低値を示したが，２群間に尿病患者の食事指導に役立てていきたい．これまで研究有意な差は認めなかった５）．また，糖尿病患者におけるを支えてくださった，日本酵素応用財団に心より感謝い食事調査の申告誤差と肥満との関連６），TEE と身体活たします．

動レベルの推定に関する検討結果を報告した７）．

【文献】＜長期的検討＞

１）Kondo, K. et al.: JAT 2010; 30; 17(6): 628-37

疫学研究 1：日本人を対象とした食事因子による循環器

２）Kondo, K. et al.: Metabolism 2014; 63(7): 930-40

疾患死亡リスク評価チャート８）
1980 年国民栄養調査および循環器疾患基礎調査の受検者を 29 年間追跡した NIPPON DATA80 対象者男女
9115 人を対象とし，食事因子の組み合わせによる循環器疾患死亡リスクとの関連を検討した．野菜，果物，魚，
食塩摂取量の推奨量に対する過不足により，複数のカテゴリに分類し，追跡期間中の循環器疾患による死亡リス
クとの関連を検討した．食事因子の組み合わせによる循
環器疾患死亡リスクを図示した．野菜，果物，魚摂取量３）Kondo, K. et al.: Nutr Res 2014; 34(6): 491-8４）Kondo, K. et al .: PLoS One 2017; 12 ( 6 ) :e0179869
５）Morino, K., Kondo, K. et al.: BMJ Open Diabetes

Res Care 2019; 7(1): e000648
６）Miyazawa, I., Kondo, K. et al.: Clin Nutr ESPEN
2020; 39: 251-4
７）Nishida, Y., Kondo, K. et al.: Ann Nutr Metab
2020; 76(1): 62-72

が最も少なく，
食塩摂取量が多い場合，参照カテゴリ（野８）Kondo, K. et al.: Circ J 2019; 83(6): 1254-60

菜，
果物，
魚摂取量が最も多く，食塩摂取量が少ない場合）

９）Kondo, K. et al.: Cerebrovasc Dis. 2022 Aprと比較して循環器疾患死亡リスクは 2.87 倍高かった．

27:1-7

疫学研究 2：日本人一般男性における血中 n-3 PUFA
濃度と脳血管病変との関連９）
n-3 PUFA の抗動脈硬化・循環器疾患予防効果については，我々の検討を含め報告されているが，n-3 PUFA

人の糖尿病病態と膵島細胞可塑性に関する研究
椎木幾久子（山口大学医学部分子代謝制御学講座）と脳血管病変との関連については十分明らかになっていない．そこで，n-3 PUFA と頭部 MRI 検査で評価した
脳内の様々な潜在性血管病変との関連を検討した．滋賀【目的】

県動脈硬化疫学研究の男性対象者 739 名において，血膵 β 細胞の脱分化をはじめとする膵島の細胞可塑性に

中 n-3 PUFA 濃度 1 標準偏差増加あたりの脳動脈狭窄

ついて，２型糖尿病（T2D）での膵島の組織学的変化との多変量調整オッズ比は有意に低くかった．一方，そのの関連を病態進展の中で解明する．

他の脳血管病変（ラクナ梗塞，微小出血，白質病変）と【方法】

n-3 PUFA 濃度との明らかな関連は認めなかった．n-3

膵胆道疾患により外科切除された膵組織標本を用いPUFA は脳内大血管病変に対して保護的に作用する可能て，主要膵ホルモン，クロモグラニンＡ（ChgA），ア性が示唆され，本研究結果は，近年日本人に増加していミラーゼ，膵内分泌細胞分化マーカーの発現を免疫組織るアテローム血栓性脳梗塞の予防につながる可能性が示

染色により解析した．対照群（正常耐糖能患者 11 例）

唆される．

と T2D 群で年齢，肥満度をマッチさせ，さらに T2D を【まとめ】

罹患期間（５年以下 vs.10 年以上），糖尿病合併症（無糖尿病患者および健常者において，魚（n-3 PUFA）

vs. 細小血管障害を一つ以上有する），インスリンおよは短期的・長期的に動脈硬化予防効果あると考えられた．

び SU 薬治療（無 vs.1 年以上の薬剤使用）により早期

また，食物繊維，野菜，果物，食塩は動脈硬化・循環器

群 12 例と進展群 11 例，中間群３例に分類し，主要膵

疾患と関連することが示唆された．今後も，食事と動脈ホルモン陰性クロモグラニンＡ陽性細胞を脱分化細胞と

10
166

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

して計測した．

ルカゴン分泌をパラクラインに調節しているインスリン【結果・考察】（Cell Metab 2009; 9: 350-361）やソマトスタチンのT2D 膵島では ChgA 陽性細胞数は維持されるものの変化，自律神経調節の障害（N Engl J Med 2013; 369:

β細胞数低下と α 細胞数増加が共通して観察された．脱362-372）などいずれも細胞外の調節因子に注目してお

分化細胞数は早期群から進展群において進行性に増加

り α 細胞内の分泌機構の変化について検討した研究報告

し，C-peptide index と有意な逆相関を示した．β 細胞は渉猟する限り見当たらない．血中グルカゴン測定に従

脱分化が２型糖尿病の β 細胞不全に関連することが示来用いられてきたラジオイムノアッセイ法は，その交差唆された．一方，膵島内の α 細胞数は T2D において増反応の大きさのため正確性に問題があったが，近年よ加するが，進展群における早期群からの増加は観察されり正確なサンドイッチ ELISA 法を用いた検討で 2 型糖なかった．さらには，早期群に比して進展群では α 細尿病患者において食事負荷後にグルカゴン分泌が上昇

胞のグルカゴン染色性および成熟 α 細胞マーカーであしていることが報告されている（Endocr J. 2020; 67:

る MafB の発現量が低下しており，病態進展による α 細903-922）．助成者は α 細胞におけるインスリンシグナ

胞の成熟異常が示唆された．また，進展群の膵島ではルに注目し，インスリンシグナル依存性のグルカゴン制

ChgA 陽性細胞の一部がアミラーゼとの二重陽性化を示

御機構について研究することとした．

し内分泌細胞から外分泌細胞への分化転換が示唆され【目的】

た．２型糖尿病では細胞可塑性を基盤とする膵島リモデ

インスリンシグナル依存性のグルカゴン制御機構を明

リングをきたし病態形成に大きく関与していることが推らかにする．

察された．

【方法および計画】
IRS1, IRS2 ノックダウン細胞株 （alphaIRS1KD, al-【文献】
Amo-Shiinoki, K., Tanabe, K., Hoshii, Y., Matsui,phaIRS2KD）に対してグルコース応答性のグルカゴンの

H., Harano, R., Fukuda, T., Takeuchi, T., Bouchi,

変化を観察すると同時にマイクロアレイ解析を行い，イR., Takagi, T., Hatanaka, M., Takeda, K., Okuya, S.,

ンスリンシグナル下流にある新規調節因子を検討した．

Nishimura, W., Kudo, A., Tanaka, S., Tanabe, M.,

また膵 α 細胞特異的 IRS1 および IRS2 ノックアウト

Akashi, T., Yamada, T., Ogawa, Y., Ikeda, E., Naga-

マウスに対して糖負荷試験，インスリン低血糖試験を

no, H. & Tanizawa, Y.: Islet cell dediﬀerentiation is行った．同時に単離膵島を用いてグルコース依存性のグ

a pathologic mechanism of longstanding progression

ルカゴン分泌を検討した．

of type 2 diabetes, JCI insight., 6(1), e143791(2021).

並行して上記の所見をより深めるため，申請者は2021 年度初頭より mTmG 二重蛍光レポーターマウス

膵 α 細胞におけるインスリンシグナル依存性機能制
御メカニズムの解明
渋江公尊を用いてマウス α 細胞を単離し，IRS1 下流に存在する
グルカゴン分制御遺伝子を同定することを試みることとしている．申請者は本計画立案に先立ち α 細胞特異的 IRS1 ノックアウトマウスからの α 細胞単離を目的（田附興風会医学研究所北野病院）として 1. グルカゴンプロモーター下流で Cre を発現する Gcg-CreERT2 マ ウ ス，2. Rosa26-mTmG 二 重 蛍 光【背景】

レポーターマウス，3. IRS1ﬂox マウス (IRS1f/f) の３系

膵 α 細胞より分泌されるグルカゴンは１型糖尿病患

統を交配したマウス（Gcg-CreERT2-mTmG-IRS1KO）

者や進行した２型糖尿病患者において低血糖からの回を 2021 年度に作出した（未発表，論文投稿準備中）．

復に重要なホルモンであるが，その詳細な機能制御機構

このマウスでは Cre 非発現時には全ての膵島細胞はは明らかではない．糖尿病患者における血糖応答性グル

tdTomato を発現しているが，タモキシフェン誘導性のカゴン反応障害の機構についてのこれまでの研究は，グCre 発現により，α 細胞においてのみ tdTomato 発現が11
167

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

EGFP 発現に切り替わる．従って Cre 発現後に単離した
膵島から EGFP 発現細胞をフローサイトメトリーでソー

脂肪組織マクロファージを介した GIP 受容体シグトすることにより α 細胞を回収することが可能となる．

ナルの作用

これら回収した細胞を用いて IRS1 下流に存在するグル

清水辰徳（秋田大学高齢者医療先端研究センター）

カゴン分制御遺伝子のより広範なネットワークを明らか
にする．
【結果】
2021 年までの結果を下に記す．

【目的】
近年，世界の肥満人口が急増する中，抗肥満薬の開alphaIRS1KD ではインスリンによるグルカゴン抑制

発が進められている．Gastric inhibitory polypeptide

が対照群および alphaIRS2KD に比べて有意に障害され(GIP) 受容体アンタゴニストや Glucagon-like peptideており，AKT のリン酸化も減弱し，カルシウムイオン(GLP)-1 受容体・GIP 受容体のダブルアゴニストは有力の応答，ミトコンドリア機能も減弱していた．各細胞株な候補として注目を集めており，脂肪組織における GIPのマイクロアレイ解析ではカルシウム応答に関連する受容体シグナルの解明は極めて重要である．我々はこれ

Trpc3 遺伝子が alphaIRS1KD で変化していることが示までに，他組織 ( 精巣 ) において，高脂肪食下（高 GIPされた．

血症下）での GIP 受容体の発現低下（Endocrinology

マ ウ ス モ デ ル で は alphaIRS1KO マ ウ ス で は 低 血2017）を示しており，脂肪組織においても同様の発現

糖 時 の グ ル カ ゴ ン 応 答 が 障 害 さ れ， 単 離 膵 島 で は低下を確認している．また，脂肪組織においては，脂肪インスリンによるグルカゴン分泌抑制が対照群およ細胞に加え，マクロファージに GIP 受容体が高発現しび alphaIRS2KO マ ウ ス で 見 ら れ て い た の に 対 し，ていることを見出した．本研究では，脂肪組織マクロ

alphaIRS1KO マウスでは分泌抑制が障害されていた．

ファージに対する GIP 受容体シグナルの作用とその基2021年-現在に継続している状況：現在 RNA-seq 提盤となる分子メカニズムを解明することを目的とする．

出に十分な量の α 細胞を回収するため，共同研究先【方法・結果】の Joslin Diabetes Center (Boston, MA, USA) に て脂肪組織からマクロファージを含む SVF (Stromal

Gcg-CreERT2-mTmG-IRS1KO, Gcg-CreERT2-mTmG-

Vascular Fraction) を分取し，これを CD45 抗体付き

IRS2KO, Gcg-CreERT2-mTmG-IRS1/IRS2KO を繁殖しマグネットビーズによって CD45 (＋) 分画と CD45 (−)ている．一定数が揃った状況で細胞を回収し解析に取り分画を作成．RT-PCR により，マクロファージを有する掛かる予定としている．

CD45 (＋) 分画に GIP 受容体遺伝子が強く発現している【考察】

ことを見出した．発現量は脂肪細胞を含む分画よりも多インスリンシグナル依存性のグルカゴン制御にはIRS1 が主要な役割を果たしていることが示された．

く，GIP のシグナルは脂肪細胞のみならず，脂肪細胞に近接して存在するマクロファージにも生理作用を及ぼし

今後単離 α 細胞の解析を通して，
インスリンシグナルていることが強く推測された．これまでに，GIP 受容体により調節されるグルカゴン分泌制御に関するさらに詳

欠損マウスの骨髄を野生型マウスに移植することによ細なメカニズム解明に取り組んでいきたいと考えていり，脂肪組織のマクロファージを GIP 受容体欠損マクる．

ロファージに置換するモデル（以下，骨髄移植モデル）を用いた検討を重ねている．GIP 受容体欠損マウスの骨髄を野生型マウスに移植した群（KO→WT），野生型
マウスの骨髄を野生型マウスに移植した群（WT→WT）
をそれぞれ移植後８週経過したところから高脂肪食とし，体重推移・耐糖能を評価した．高脂肪食開始前の耐糖能は両群で差はなかった．高脂肪食負荷後の耐糖能は

12168

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

有意差を認めなかったものの KO→WT 群においてインスリン感受性・血糖など耐糖能において良い傾向を認め

これまで長きに渡る御支援を賜り，心より御礼申し上げます．

た．また高脂肪食負荷後の体重増加は KO→WT マウス
群において有意に抑えられており，興味深い結果と考えている．骨髄移植モデルの問題点として，移植細胞によHSP47 による脂肪組織量規定メカニズムの解明
Shin Jihoon

る置換は 100% とならず，また移植される骨髄量に個（大阪大学大学院医学系研究科）

体差が生じ得ることが挙げられ，高脂肪食負荷後の有意な耐糖能の改善がみられなかった原因と考えている．また，末梢血での移植細胞の置換率は確認しているが，脂【目的】

肪組織内での置換率の把握は困難であり，遺伝子改変技

ヒトの脂肪組織量は個人差が大きく，生理的，環境的，術を用いて作成した新たなモデルマウスでの再検証が必

病態的，遺伝的要因が総合的に関与しているが，その詳要である．CRISPR-Cas9 を用いたゲノム編集によりマ細なメカニズムは不明である．本研究では脂肪組織量をクロファージ特異的 GIP 受容体欠損マウスの作製を進規定する因子とそのメカニズムを解明すること目的とすめているが，作成に難渋している．完成後は，当マウス

る．

の摂餌量・体重推移・耐糖能を通常食下で評価する．そ【方法】の後，骨髄移植モデルで示された高脂肪食下の肥満耐性

脂肪組織量に関わる生理的，環境的，病態的，遺伝的について，当マウスで確認を行う．具体的には，高脂肪な環境のトランスクリプトームの解析から可能性の高い

食開始前後の耐糖能・インスリン抵抗の調査，高脂肪食

脂肪組織量の規定因子を探索する．マウスモデルや脂肪開始後の体重推移，脂肪組織の炎症性サイトカインの多細胞モデルを用い，規定因子の機序を調べる．

寡について検討を行いたいと考えている．

【結果】

【総括】

脂肪組織量に関わるトランスクリプトームの総合的卒業に際し，これまでについても触れる．最初に行っな解析から可能性の高い因子として，HSP47 を同定した研究は GIP の精巣への作用であり，肥満・糖尿病にた．HSP47 は ER に局在し，コラーゲンマトリックス

生じる男性不妊の原因の一つが精巣における GIP 受容のシャペロンタンパクとして知られており，そのフォー体の発現低下による可能性を示すことを目的とした．精ルディングや分泌に重要な因子である．HSP47 は脂肪巣における GIP 受容体の発現を確認したところから始組織に高発現し，摂食/過食，肥満では増加し，逆に絶まり，GIP 受容体欠損マウスの精子の受精能が野生型マ

食や運動，肥満外科治療，Cachexia では低下した．遺ウスと比較して低いという表現型を見つけたものの，そ伝的に高い HSP47 発現を有するヒトは太りやすく，逆のメカニズムの解明に難渋した．そのような中で，幸いにマウスの HSP47 阻害や欠損モデルでは脂肪組織が小なことに FFDR に参加させて頂けることとなった．毎さい．欠損モデルの脂肪組織では脂肪細胞のマスター

年開催される研究発表会は緊張の連続であったが，そのレギュレーターである PPARγ のタンパク発現が低下し中での御指摘・御助言はもちろんのこと，多くの研究者ていた．3T3-L1 脂肪細胞を用いた In vitro の実験でもの発表，素晴らしい成果にたどりつくまでに繰り返され同様の結果で，HSP47 のノックダウン及び阻害によりた多くの実験を肌で感じ，研究会から帰るときにはもう

PPARγ のタンパク発現が低下した．そのメカニズムと

少し頑張ってみようと思えた．自身の研究は，時間はして，HSP47 は脂肪細胞外のコラーゲンマトリックス

かかってしまったものの 2017 年に論文にすることがでのフォールディングや分泌を増加させ，細胞膜インテグ

き，その年の研究発表会の際には多くの先生方にお声がリンとのバインディングを介し，細胞内 FAK シグナル

け頂いたことを鮮明に覚えている．FFDR に育てて頂いを誘導，PPARγ を安定化させ，脂肪組織量を規定してたことを今の研究，次の研究に生かし，FFDR の卒業生いることが分かった．

として恥じない研究者でありたいと考えている．

13
169

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成【考察】
脂肪組織のコラーゲンマトリックスは病態的な繊維化因子としてよく知られていたが，その生理的意義や重要性については解明されていなかった．本研究ではヒトやマウスで脂肪組織に高発現し，脂肪組織量を規定する因子として HSP47 を同定した．HSP47 は栄養・病態・遺伝的環境により発現が制御され，脂肪細胞外のコラー
ゲンマトリックスのタンパクの恒常性を変化させること
図１

で脂肪組織量を規定していることが分かった．現在その詳しい分子メカニズムを解明中である．

臨床情報，ゲノム情報を活用した 2 型糖尿病のサブタイプ分類鈴木顕（The University of Manchester）
図２【目的】
本研究では，日本人集団及び欧米人集団における大規
模バイオバンクのゲノム情報，臨床情報を活用し，ポリジェニック・リスク・スコア（polygenic risk score;
PRS）およびその発展形であるパスウェイ PRS を用いて，２型糖尿病のリスク層別化およびサブタイプ分類を行う．本研究により，「遺伝情報により２型糖尿病の発症リスクおよびその表現型はどのように規定されるか」，

図３という疾患ゲノム研究の重要課題が明らかになることが期待される．
【方法】
バイオバンク・ジャパン 18 万人のゲノムデータ，臨床情報を活用し，２型糖尿病および肥満のゲノムワイド関連解析（genome-wide association study; GWAS）を実施した．そのサマリーデータを用いて，網羅的分子生物学的パスウェイ解析を実施し，これらの形質・疾

図４

患に統計学的に有意に関連する分子生物学的パスウェ
イを同定した．活用したパスウェイ・データベースは
molecular signature database (msigDB) に登録されて臨床データを活用し，２型糖尿病，肥満の GWAS を実いる一細胞遺伝子発現解析データで同定された 302 種

施し，そのサマリーデータを用いて分子生物学的パス

類の細胞種特異的遺伝子セットから構成されており，形

ウェイ解析を実施した．

質・疾患の組織・細胞特異性を明らかにすることが可能

次に，上記で同定された分子生物学的パスウェイのである．同様に UK Biobank 50 万人のゲノムデータ，

ポリジェニック・リスク・スコアを算出した．通常の

14
170

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

PRS は（リスク上昇効果）╳（リスクアリルの数）を全

try genetic study of type 2 diabetes highlights

ゲノムに渡り足し合わせるが，パスウェイ PRS では（リthe power of diverse populations for discovery

スク上昇効果）╳（リスクアリルの数）を各パスウェイにand translation. Nature genetics. in press.

所属する遺伝子領域に限定して計算することで，疾患の２）Sakaue, S., Kanai, M., Tanigawa, Y., Karj-

パスウェイ特異性を明らかにすることが期待される．

alainen, J., Kurki, M., Koshiba, S. et al.: A【結果】

cross-population atlas of genetic associations for

日本人集団における分子生物学的パスウェイ解析では２型糖尿病は膵 β 細胞，α 細胞，中脳神経細胞，消化管

220 human phenotypes. Nat Genet. 2021 Oct;53(10): 1415-24.

内分泌細胞，
胆管細胞と有意に関連し，肥満は膵 β 細胞，

３）Naito, T., Suzuki, K., Hirata, J., Kamatani, Y.,

α細胞，中脳神経細胞，腎臓集合管細胞，ヘンレ上行脚

Matsuda, K., Toda, T., et al.: A deep learning細胞等と有意に関連していた（図１）．欧米人集団におmethod for HLA imputation and trans-ethnic

ける分子生物学的パスウェイ解析では 2 型糖尿病は膵

MHC ﬁne-mapping of type 1 diabetes. Nature

β細胞，中脳神経細胞と関連し，肥満は中脳神経細胞に

communications. 2021; 12(1): 1-14.

特に強い関連を示した（図２）．

４）Hosoe, J., Suzuki, K., Miya, F., Kato, T., Tsu-

これらのパスウェイデータを活用して，２型糖尿病

noda, T., Okada, Y. et al.: Structural basis ofのパスウェイ PRS を算出し，各種臨床検査値との関連

ethnic-specific variants of PAX4 associatedを調査したところ，パスウェイにより異なる臨床検査

with type 2 diabetes. Human Genome Variation.

値に関連を示すことが明らかとなった．日本人集団に2021; 8(1): 1-3.

おいては，すべての２型糖尿病パスウェイ PRS につい

５）Hosoe, J., Sonoyama, YK., Miya, F., Kad-て，HbA1c と血糖値に対しては正の効果を有していた

owaki, H., Suzuki, K., Kato, T. et al.: Genotype-

一方で，収縮期血圧，身長，肥満，血中尿素窒素についStructure-Phenotype Correlations in Disease-てはパスウェイごとに効果の向きが異なるものが存在しAssociated IGF1R Variants and Similarities toた（図３）．欧米人集団においては，HbA1c と血糖値にThose in INSR Variants. Diabetes. 2021.

関しては全ての２型糖尿病パスウェイ PRS が性の関連を示した．一方で，肥満，LDL コレステロール，AST,eGFR，血清クレアチニン，Hb，血小板数は２型糖尿病
パスウェイ PRS と量的形質との関連の向きがパスウェ
イにより異なることが明らかとなった（図４）．

メタボローム解析を用いた脂肪細胞分化・褐色化制御に関する研究高橋春弥（京都大学大学院農学研究科）【考察】
２型糖尿病に関連する分子生物学的パスウェイに応じて計算されたパスウェイ PRS は，そのパスウェイに応【研究背景・目的】

じて異なる量的形質と関連することが分かった．これは脂肪組織は生命維持に必要なエネルギーを脂肪として日本人集団と欧米人集団のどちらにおいても観察された蓄積する役割に加え，アディポカイン分泌等を介した生現象だが，そのパターンは集団に応じて異なっていた．

体恒常性維持にも重要な役割を担う．脂肪組織を構成す

今後はパスウェイ PRS の臨床的な意義を明らかにし，る細胞の中で，脂肪細胞の機能についてはこれまでの多２型糖尿病の遺伝素因の分子生物学的パスウェイによる

くの先行研究において多面的に解析されており，特に脂特徴づけを行っていく．

肪細胞の分化過程，及び熱産生能を有するベージュ脂肪【文献】

細胞への変換（褐色化）過程は，主に遺伝子やタンパク

１）Mahajan, A., Spracklen, CN., Zhang, W., Ng,

質発現制御に関する知見に基づくメカニズム解析が盛ん

MC., Petty, LE., Kitajima, H. et al.: Trans-ances-である．他方，これらの過程における低分子代謝物の挙15
171

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成動についての知見は限られており，低分子代謝物の量的・質的変化の全体像については不明確な点が多く存在する．そこで，本研究では低分子代謝物の網羅的解析手法の一種であるメタボローム解析を活用し，本年度は特脂肪組織マクロファージの役割に関する研究
瀧川章子（富山大学医学系研究科）に，脂肪細胞の褐色化過程における代謝変動の全体像の把握及びそのメカニズム解明を目的とし，研究を行った．
【方法】【目的・方法】
脂肪組織では肥満時に慢性炎症や低酸素状態が惹起さ

培 養 脂 肪 細 胞 に mycophenolic acid (MPA, IMPれ（＝病的肥大），インスリン抵抗性の基盤病態となる．

dehydrogenase (IMPDH) inhibitor) を添加し，Ucp-1

また脂肪組織の低酸素と炎症性マクロファージ（mφ）

mRNA 発 現 量 及 び 細 胞 中 IMP 量 を 測 定 し た． ま た，には関連がある．そこで肥満時の脂肪組織 mφ の活性化

mycophenolate mofetil (MMF, MPA プロドラッグ ) を機構を解明するため，低酸素状態で活性化される転写因

マウスに摂食させ，脂肪組織褐色化に関する解析を行っ

子 HIF-1α を mφ 特異的に欠損したマウス（HIF1KO マ

た．さらに，マウス寒冷暴露時の Impdh mRNA 発現量ウス）を高脂肪食にて飼育し，解析した．

の解析を行った．

【結果】【結果・考察】HIF1KO マウスは耐糖能が改善し，脂肪組織の炎症がメタボローム解析を中心としたこれまでの研究結果軽減していた．高脂肪食下 HIF1KO マウスの脂肪組織より，脂肪細胞褐色化進行過程において，脂肪組織中では，野生型と比べ血管新生因子である VEGFa の遺伝

IMP 量が増加することを示唆するデータを得ていた．

子発現は低下したが，脂肪組織の血管数や血流量は増加

培養脂肪細胞への MPA 添加により，細胞中 IMP 量がしていた．脂肪組織の細胞を分画したところ，HIF1KO増加すると同時に，Ucp-1 mRNA 発現量も増加するこマウスでは前駆脂肪細胞分画において血管新生促進因子とを明らかにした．また，MMF マウス摂食実験より，の遺伝子発現が上昇していた．そこで前駆脂肪細胞の血

MMF がマウス脂肪組織中 Ucp-1 mRNA 発現量を増加

管新生因子が mφ に影響されるか，3T3-L1 細胞と骨髄させ，脂肪細胞小型化に寄与することを示した．さらに由来 mφ の共培養系で検討した．M1 分化刺激を加えたは，マウス寒冷暴露時に，Ucp-1 mRNA 発現量は増加

mφ と共培養した 3T3-L1 細胞では，M1 分化刺激を加する一方，Impdh mRNA 発現量は減少することを見出

えない mφ と共培養した 3T3-L1 細胞に比べ血管新生因した．これらの結果より，
脂肪細胞褐色化過程において，子の発現が低下した．

IMP 代謝経路の制御が重要であることが示された．

【考察】

【文献】

mφ の HIF-1α は肥満時の脂肪組織における慢性炎症

Takahashi, H., Tokura, M., Kawarasaki, S., Nagai,の増悪，インスリン抵抗性の進展に働く．また mφ の

H., Iwase, M., Nishitani, K., Okaze, H., Mohri, S.,

HIF-1
α が前駆脂肪細胞や血管内皮の血管新生因子の発Ito, T., Ara, T., Jheng, H-F., Nomura, W., Kawada,

現を抑制することで脂肪組織の病的肥大を悪化させるとT., Inoue, K. & Goto, T.: Metabolomics reveals

考えられた１）．

inosine 5ʼ-monophosphate is increased during mice

今後は脂肪組織常在型 mφ について，インスリン感受（10): 102456
adipocyte browning. J. Biol. Chem. 298

性維持および脂肪組織の血管新生における役割を解明し（2022）.

たい．任意のタイミングで脂肪組織常在型 mφ を除去可能な遺伝子改変マウス（CD206-DTR マウス）を用い，
常在型 mφ と前駆脂肪細胞との関連について解析を進める予定である．

16
172

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

Further studies are needed to identify the molecu-【文献】
１）Takikawa, A. et al.: HIF-1α in myeloid cells pro-lar mechanisms underlying the insulinostatic action

motes adipose tissue remodeling toward insulin

mediated by NMUR1 in β cells, and the cognate

resistance. Diabetes, 65, 3649 (2016).

receptor for NURP and functional interactions between NMU and NURP.
【方法】

ニューロメジンＵが膵 β 細胞機能に与える影響とその分子機序の解析
張All types of Gα proteins are expressed in β
cells and are involved in the regulation of insulin

維東secretion. Given that NMUR1, but not NMUR2, is（宮崎大学医学部）

expressed in β cells, and NMU suppresses intracellular calcium mobilization and insulin secretion,【目的】

we hypothesized that NMUR1 might use Gαi/o for

Neuromedin U (NMU) is a 23–25-amino acid neu-

signal transduction in β cells. Using β cell-derived

ropeptide, which was first isolated from the spinal

MIN6-K8 cells, isolated mouse and human islets,

cord of pigs in 1985, and later from other species.

and single islet cells, we identified the molecular

It is s a highly conserved peptide in mammals, andmechanisms by which NMU and NMUR1 regulate

widely expressed in the central nervous system andinsulin secretion in β cells.

peripheral tissues and has emerged as a new player

Considering NURP is also produced from preproN-

in regulating appetite control, stress response, en-

MU and is involved in the energy homeostasis, weergy metabolism, inflammation, and glucose ho-

also investigated the existence of NURP and its roles

meostasis. NMU has two receptors, NMU receptor 1

in the pancreatic function.

(NMUR1) and NMUR2, both of which are G-protein-【結果】

coupled receptors (GPCRs). Only NMUR1 is ex-

The results of molecular mechanisms of NMU inpressed in mouse islets and β cell-derived MIN6-K8

the β-cell regulation were published in PLoS ONE

cells. We previously reported that NMU produced inin 2021３）. We showed that NMUR1 in β cells uses

β cells suppresses GSIS and causes β-cell failure via

Gαi/o signaling to mediate the detrimental eﬀects of

NMUR1１,２）. NMU was upregulated both after chron-

NMU on insulin secretion. Pretreatment with the

ic palmitate treatment and in diabetic db/db mice is-Gαi/o inhibitor Bordetella pertussis toxin (PTX) abol-

lets, and then participated in β-cell dysfunction andished NMU-induced suppression of glucose-stimu-

development of diabetic pathogenesis via induction

lated insulin secretion and calcium response in βof mitochondrial dysfunction and endoplasmic re-cells. Knockdown of Gαi2 and Gαo in β cells coun-ticulum (ER) stress２）. However, the downstream sig-

teracted NMU-induced suppression of insulin secre-

nal transduction of NMUR1 in β cells has not beention and gene alterations related to mitochondrial

elucidated.

function and dynamics, ER stress, intracellular ATP

In addition, preproNMU produces another pep-level, and mitochondrial membrane potential. NMU

tide, NMU precursor-related peptide (NURP). ICV

decreased forskolin-stimulated intracellular cAMP

administration of NURP to mice increased their met-in both mouse and human islets. We concluded thatabolic rate and caused a short-term (～4 h) increase

upon NMU binding, NMUR1 coupled to PTX-sensi-

in feeding. NURP cannot activate the two NMU re-tive Gαi2 and Gαo proteins in β cells, reduced intra-

ceptors.

cellular Ca2＋ influx and cAMP level which in turn

17
173

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

suppresses insulin secretion, thereby causing β-cell【文献】

dysfunction and impairment.

１）Zhang, W., Sakoda, H., Miura, A., Shimizu, K.,

In addition, I also published a new article to de-Mori, K., Miyazato, M., Takayama, K., Hayashi,

scribe the current findings of NURP in energy ho-

Y. & Nakazato, M.: Neuromedin U suppresses

meostasis and discussed its possible interaction withglucose-stimulated insulin secretion in pancre-

NMU . Intriguingly in our study, NURP was foundatic β cells. Biochem. Biophys. Res. Commun.

to expressed in α cells not as expected in β cells of

493: 677-683 (2017).

４）

mouse islets, and in β cell-derived MIN6-K8 cells,２）Zhang, W., Sakoda, H. & Nakazato, M.: Neuro-

no NURP was detected. We further confirmed that

medin U suppresses insulin secretion by trigger-

NURP suppressed GSIS in both isolated mouse islets

ing mitochondrial dysfunction and endoplasmic

and MIN6-K8 cells. In MIN6-K8 cells, NURP was

reticulum stress in pancreatic β-cells. FASEB J.

also found to reduce intracellular Ca2＋ influx, and

34: 133-147 (2020).

impaired mitochondrial OCR.
【考察】

３）Zhang, W., Sakoda, H., Nakazato, Y., Islam,
MN., Pattou, F., Kerr-Conte, J. & Nakazato, M.:

Our results suggested that Gαi2 and Gαo are in-

Neuromedin U uses Gαi2 and Gαo to suppress

volved in signal transduction of NMUR1 in β cells.

glucose-stimulated Ca2＋ signaling and insulin

Both Gαi and Gαo belong to the Gαi/o subfamily, andsecretion in pancreatic β cells. PLoS ONE., 16:

it is usually assumed that if a receptor couples to

e0250232 (2021).

Gαi, it will also couple similarly to Gαo . In addition,４）Ueno, H., Zhang, W. & Nakazato., M.: Regula-

GPCRs can bind to distinct classes of heterotrimeriction of feeding and therapeutic application

G-proteins in different cell types. Understandingof bioactive peptides. Pharmacol Ther., 239:

more about these endogenous G-proteins opens

108187 (2022).

the door to pharmaceutically targeting their activation, which would have major therapeutic potential
in diabetes and obesity. Although the mechanisms
underlying the involvement of Gαi and Gαo signaling in NMU inhibitory effects on insulin secretion

消化管ペプチドと迷走神経ネットワークを介した恒常性維持機構の解明
坪内拡伸（宮崎大学医学部）

require detailed investigation, including studies atthe structural level, our ﬁndings provide importantleads regarding the endogenous NMUR1 transduc-【背景・目的】tion pathway. In this study, PTX abolished NMU-

グレリンは胃から分泌される生理活性物質であり，摂suppressed calcium inﬂux in β cells, suggesting that

食亢進作用と強力な抗炎症作用を有する．我々は，グレ

using different Gα proteins, NMUR1 apparently

リンの投与が強力な抗炎症作用を発揮し，肺炎症や線維exhibits opposite effects on calcium mobilization,

化を強力に抑制することを見出した．しかし，内因性グ

depending on diﬀerent cell types. Knowledge of the

レリンがどのように炎症病態に影響するのかは不明であNMU signaling cascades, NMU-NMUR1-Gαi2 andる．内因性グレリンシグナルが重篤な肺炎症においてどGαo -cAMP-calcium-insulin, and the new ﬁndings ofのような役割を持つのかを検討した．

NURP may provide new insight into β-cell biology【方法】

and the pathogenesis of diabetes related to NMU.

10 週 齢 の C57BL6 マ ウ ス お よ び グ レ リ ン 受 容 体（Ghsr1a）欠損マウス（Ghsr-KO）に，リポポリサッカ

18174

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

ライド (LPS) 5mg/kg の気管内投与による急性肺損傷モを検討ため，今年度は肥満・糖尿病の環境因子に着目しデルを作成した．摂餌量，体重変化，気管支肺胞洗浄た治療を，正常時の免疫細胞の機能を維持することによ液（BALF）中の総細胞数，肺組織中の炎症性サイトカ

り行うことを目標におき，外界への腸内環境，免疫の正インとケモカインの発現を検討した．次に腹腔内マクロ

常反応と肥満での変化を解析した．

ファージを回収し，LPS 添加２時間後の炎症性サイト【方法】

カインの発現およびミトコンドリア呼吸/解糖系比率を食物が早期に流入する小腸のリンパ組織であるパイエ

OCR/ECAR 比によって検討した．

ル板で，絶食時，摂食後に１細胞レベルで遺伝子発現を【結果】検討した．まず bulk RNA-seq を行い，その後変動が大急性肺損傷モデルにおいて，Ghsr-KO マウスでは，きいと考えられた遺伝子を発現する細胞集団を明らかに

C57BL6 マウスと比較して，摂餌量と体重には有意な差するために single cell RNA-seq (scRNA-seq) により摂は認められなかった．その一方で，
Ghsr-KO マウスでは，食時に変動する細胞集団，遺伝子発現変化，また肥満マ

血管透過性の亢進，肺組織中の TNF-α, IL-6, CXCL2ウスモデルでのこれらの変化を検出することを目指し

mRNA の発現亢進が抑制されていた．動脈血ガス分析

た．

では，P/F 比の低下が抑制され，肺組織の乾燥重量/湿【結果】

重量比も低かった．以上の結果から，グレリン受容体

Bulk RNA-seq による検討で小腸パイエル板では食の欠損は LPS に対する炎症応答が障害されていること

後，Hsp70 の発現が増加し，scRNA-seq では骨髄系細が見出された．Ghsr-KO マウスでは，C57BL6 マウス

胞，Ｂ細胞，Ｔ細胞で食後の発現が確認された．またと比較して LPS 投与 72 時間の生存率が向上していた．

空間的トランスクリプトーム解析で食後にパイエル板でGhsr シグナルの欠損が LPS に対する炎症応答を障害す

upregulate されている遺伝子を列挙すると，NF-κB にるメカニズムを検討するため，マクロファージの好気関連する遺伝子発現変化が見られた．RT-PCR で同様の的呼吸→解糖系へのシフトについて評価した．細胞外フサンプルを解析すると，IL-1β, IL-10 などいずれも NF-

ラックスアナライザーを用いて解析した結果，Ghsr-KOκB により発現誘導される因子の発現が増強していた．

マウスでは，LPS 添加刺激によってもたらされる解糖系

初代培養マクロファージにおける LPS による IκBα 蛋へのシフトが障害されていた．

白の分解はインスリンと共に 30-60 分刺激する条件で【考察】

亢進し，インスリン，LPS により活性化されるシグナル

GHSR-KO マウスを用いた検討では，内因性グレリンが合流する node のうちの一つであると考えられた．酪シグナルの欠損が LPS に対する炎症応答を抑制してい酸の存在下で，LPS とインスリンによる IκBα 蛋白のた．炎症反応の開始および維持には，マクロファージの分解が亢進したが，同じ条件で siRNA により Hsp70 を

好気的呼吸から解糖系へのシフトが重要である．本研究knockdown すると LPS とインスリンによる分解が障害により，内因性グレリンシグナルが，マクロファージのされた．

炎症応答に重要であることが見出された．

【考察】
NF-κB の活性化は肥満状態で障害される，腸管免疫

摂食時の正常な腸管免疫応答を維持する新規肥満治療の検討
戸田の正常な応答と考えられた．肥満状態では短鎖脂肪酸により促進される IκBα 蛋白の Hsp70 依存的な分解および NF-κB の活性化が障害されることにより免疫細胞の郷太郎

機能異常をきたす可能性がある．NF-κB のインスリン
（東京大学医学部附属病院）

依存的な活性化経路の中で，肥満状態で正常機能を障害する因子の同定と介入による機能解析を今後進める必要

【目的】

がある．

免疫細胞の食後の反応が肥満時に破綻するメカニズム

19175

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

白と同モチーフは特異的に結合するものと考えられた．
【考察】
原始腸管段階において RFX6 と下流遺伝子のエンハ
ヒト iPS 細胞レポーター株を用いた新生児糖尿病
原因遺伝子の膵・腸管発生成熟機構に関すンサー候補領域の RFX6 結合モチーフとの直接的な結合を介した制御機構を有する可能性が示唆された．

る役割の解明中村

Depletion of CD206 M2-like macrophage聡宏（京都大学）【目的】
膵形成不全，腸管形成不全を伴う新生児糖尿病を主activates fibro-adipogenic progenitors,
and enhances myogenesis during recovery
process
Nawaz Allah（University of Toyama）

徴とする Mitchell-Riley 症候群（MRS）の原因遺伝子

RFX6 の原始腸管レベルにおける下流遺伝子制御機構についての検討を行うこと．
【方法】【Purpose】
The purpose of this study was to investigate how

RFX6 ヒト iPS 細胞ノックインレポーター株 RFX6 +/eGFP

CD206＋ M2-like macrophages (MΦ) regulate acti-

及び RFX6 eGFP/eGFP ノックイン・ノックアウト株を用い

vation of fibro-adipogenic progenitors (FAPs) andて，in vitro での胚性内胚葉を経由した原始腸管への分

muscle regeneration.

化誘導を行った．各群においてフローサイトメトリー【Methods】

を用いて GFP 陽性細胞の生細胞ソーティングを行った．

I utilized CD206DTR, CD206CreERT2/TGF- 1f/f and

Cap analysis of gene expression (CAGE)-seq を使用し，

PDGFR CreERT2 x Fstf/f mice to clarify the involve-

RFX6 eGFP/eGFP 群で有意に遺伝子発現低下を認める遺伝

ment of CD206-derived TGF 1 and FAPs-derived

子群の転写開始点（TSS）上流配列領域からモチーフラ

FST, respectively, in recovery process.

イブラリを用いて候補モチーフ抽出解析を行った．

【Results】【結果】

Interestingly, our study show that the depletion of

上記解析によって，RFX ファミリーに共通するモCD206＋ M2-like MΦ during the early phase of re-

チーフ配列であるが RFX6 については未報告のものがpair considerably accelerated the recovery from car-

同定された．次に先行実験で RFX6 との関係が示唆さ

diotoxin (CTX)-induced muscle injury. Our total RNA

れていた後方前腸マーカー PDX1 及び中後腸マーカー

sequencing and gene expression analysis revealed

CDX2 との関係について検討を行った．上述のモチーフ

that the expressions of myogenesis-related marker

は PD X1 遺伝子 TSS 上流約 10kb，及び CDX2 遺伝子

genes, including MyoD, MyoG, and Fst, etc., were

TSS 上流約 2.6kb に確認された．これらのモチーフ含

upregulated in areas of CTX-induced muscle injury

有配列と相同な合成したビオチン化プローブと，強制発in the TA muscle of DT-treated Tg mice, suggesting

現系を用いて抽出したタグ付きの RFX6 蛋白を用いて，that the depletion of CD206＋ M2-like MΦ promotes

non-RI ゲルシフトアッセイを行った．どちらのプロー

the recovery of muscle from injury in Tg mice. Simi-

ブとも RFX6 蛋白の直接的な結合シグナルが確認でき，

lar results were obtained in CD206-derived TGF-

一方で過剰な非ビオチン化プローブの使用で結合シグナ

1 KO mice. Conversely, FAPs-derived Fst KO mice

ルの減弱を認め，モチーフ配列を除去した配列に対して

showed delayed recovery process, suggesting that

は結合シグナルが確認できなかったことから，RFX6 蛋

deletion of FAPs-speciﬁc Fst gene results in impaired20
176

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

myogenesis and muscle regeneration.

tion of beige progenitors and enhances brown-【Discussion】

ing after cold stimulation. Sci Rep 8, 14567,

Previous reports have shown that FAPs are essen-doi: 10.1038/s41598-018-32803-6 (2018).

tial for recovery process and they provide trophic

６）Nawaz, A. et al.: CD206+ M2-like macrophages

signals to enhance myogenic diﬀerentiation, thereby

regulate systemic glucose metabolism by in-. However, inter-

hibiting proliferation of adipocyte progenitors.

actions between immune cells (specifically CD206＋

Nature communications 8, 286, doi: 10.1038/

M2-like MΦ) and FAPs during recovery process re-

s41467-017-00231-1 (2017).

boosting the recovery process

１－３）

mains unknown. We recently reported that CD206＋

７）De Micheli, A. J. et al.: Single-Cell Analysis

M2-like MΦ-derived TGF- 1 inhibited the prolifera-of the Muscle Stem Cell Hierarchy Identifies

tion and diﬀerentiation of adipocyte progenitors in

Heterotypic Communication Signals Involved inadipose tissue４－６）. Our data support the notion that

Skeletal Muscle Regeneration. Cell Reports 30,

paracrine factors secreted by activated FAPs２,７,８）

3583-3595. e3585, doi: https://doi.org/10.1016/

promotes the recovery process in coordination withj.celrep.2020.02.067 (2020).

diverse MΦ populations. We have provided evi-

８）Lukjanenko, L. et al.: Aging Disrupts Muscle

dence that CD206＋ M2-like MΦ provides a niche forStem Cell Function by Impairing Matricellular

FAPs and depletion of CD206＋ M2-like MΦ results

WISP1 Secretion from Fibro-Adipogenic Pro-in reduction of TGF- signaling, thereby promoting

genitors. Cell Stem Cell 24, 433-446. e437, doi:

myogenesis and muscle regeneration.

10.1016/j.stem. 2018.12.014 (2019).

【References】
１）Wosczyna, M. N. et al.: Mesenchymal Stromal
Cells Are Required for Regeneration and Ho-

新規レポーターマウスを用いた膵 α 細胞新生・分化

meostatic Maintenance of Skeletal Muscle. Cell

機構の解明

Reports 27, 2029-2035. e2025, doi: https://doi.

氷室美和

org/10.1016/j.celrep.2019.04.074 (2019).

（順天堂大学）

２）Joe, A. W. et al.: Muscle injury activates resident ﬁbro/adipogenic progenitors that facilitate
myogenesis. Nature cell biology 12, 153-163,
doi: 10. 1038/ncb 2015 (2010).

【目的・方法】
近年，膵 α 細胞の可塑性が明らかとなってきており，α 細胞の分化機構を明らかにすることは，α-to-β３）Uezumi, A., Ikemoto-Uezumi, M. & Tsuchida, K.:

reprogramming を介した β 細胞再生医療へと繋がる可Roles of nonmyogenic mesenchymal progenitors

能性がある．我々は α 細胞分化を時間軸に沿って解析すin pathogenesis and regeneration of skeletal

るため，レポーターコンストラクト eGFP-IRES-mRFP

muscle. Frontiers in physiology 5, 68, doi:

を proglucagon gene に挿入した “Gcg-Timer マウス”

10.3389/fphys. 2014. 00068 (2014).

を作製した．本マウスでは IRES の影響により eGFP の４）Nawaz, A. & Tobe, K.: M2-like macrophages

緑色蛍光と mRFP の赤色蛍光との検出にタイムラグがserve as a niche for adipocyte progenitors in

生じ，内分泌前駆細胞から分化したばかりの新生 α 細胞

adipose tissue. Journal of diabetes investigation,は緑色蛍光，より分化した α 細胞は緑色および赤色蛍光

doi: 10.1111/jdi.13114 (2019).

を呈する細胞として標識されるため，共焦点レーザー顕５）Igarashi, Y. et al.: Partial depletion of CD206-

微鏡及び ﬂow cytometry を用いて α 細胞を経時的に観positive M2-like macrophages induces prolifera-

察できる．本マウスを用いて「α 細胞がいつ・どこで生21177

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

まれるのか？」を明らかにするとともに，α 細胞新生・外科治療の有効性は確立されているものの手術適応とな分化過程における遺伝子発現プロファイルの変化を解析

る患者数は多くない．また現存する肥満の薬物治療，外する．

科治療は全て「エネルギー摂取の抑制」を意図している【結果】

が，エネルギー収支を平衡させるためには「エネルギー

Gcg-Timer マ ウ ス 膵 を 共 焦 点 レ ー ザ ー 顕 微 鏡 及 び

消費の促進」というアプローチも考えられる．褐色脂肪ﬂow cytometry を用いて観察した結果，緑色蛍光を呈細胞はミトコンドリアにおける uncoupling protein-1

する新生 α 細胞は胎生期及び生後７日未満の新生仔期に(Ucp1) の機能を介して熱を産生しエネルギーを消費す

おいてのみ観察され，成体マウスでは認めなかった．しる機能を有し，既に BMI と褐色脂肪細胞の活性が負にかし３～ 12 週齢の Gcg 欠損 Gcg-Timer マウス膵にお相関すること，加齢に伴い褐色脂肪細胞の活性が低下

いて，顕微鏡で緑色蛍光陽性，赤色蛍光陰性の細胞を認することが報告されている．申請者らは褐色脂肪細胞

め，２～３週齢における Flow cytometry でも同様に観の分化を制御する鍵因子である転写因子 nuclear factor

察された．この結果をもとに，グルカゴン抗体やグルカ

I-A (NFIA) をゲノムワイドなオープンクロマチン解析

ゴン受容体拮抗薬を２ヶ月齢のマウスに投与し膵切片をで同定し解析してきた（Hiraike, Y. et al. Nature Cell

顕微鏡で観察した．同時期の生理条件下では認めなかっ

Biology 2017）．また中胚葉系の前駆細胞が褐色脂肪細

た緑色蛍光陽性・赤色蛍光陰性の細胞が観察された．

胞に分化するためには褐色脂肪細胞の遺伝子プログラ【考察および今後の展望】

ムの活性化に加えて骨格筋細胞の遺伝子プログラムのグルカゴンシグナル抑制が α 細胞過形成を生じること

不活性化が必要だが，NFIA はその褐色脂肪細胞分化促が報告されており，
そのメカニズムは α 細胞自己増殖に進作用とは独立に骨格筋細胞分化のマスター転写因子よると考えられてきた．しかし今回 genetic ablation モ

MyoD の転写を抑制することで褐色脂肪細胞分化を担保

デルのみでなく，薬物投与実験によっても，グルカゴン．更にする（Hiraike, Y., et al. PLoS Genetics 2020）

シグナル抑制による α 細胞量増加に α 細胞新生が寄与し我々は台湾 biobank の解析からもっとも代表的な肥満ていることが新たに示された．

感受性 SNP のひとつであり褐色脂肪細胞の機能を介し今後さらに α 細胞新生がどこから生じるか，そしてどて作用する FTO 遺伝子近傍の rs1421085 と定期的なのような因子が関与するかを明らかにするため，顕微鏡

運動習慣の間に追跡期間中の体重増加に対する遺伝子環

解析やトランスクリプトーム解析を進めていく．

境相互作用を同定した（Hiraike, Y. et al. The Journalof Clinical Endocrinology & Metabolism 2021）．risk
NFIA が褐色脂肪細胞分化を制御するメカニズム及び全身代謝への影響の解明
平池勇雄

allele を有する被験者であっても，定期的な運動習慣によって追跡期間中の体重増加が抑制された．またbaseline で定期的な運動習慣がないと回答した被験者に注目したサブグループ解析を実施し，baseline で定（東京大学保健・健康推進本部）

期的な運動習慣がなかったとしても追跡期間中に運動習慣を獲得することで risk allele 保有者の体重増加が抑制【背景】

されることを明らかにした．

肥満や 2 型糖尿病などの生活習慣病は全世界に蔓延

本研究は NFIA を標的として褐色脂肪細胞の数や働きしている．とくに肥満は polygenic risk score を用いを高めることで「エネルギー消費の促進」に基づく生活

た biobank の大規模解析において高血圧と並んで寿命

習慣病の治療を実現するための理論的基盤を提供するこに最も強い負の影響を与える因子であったにも関わらずとを目指すものである．

（Sakaue, S. et al. Nature Medicine 2020）
，我が国で

【結果】

承認されてきた肥満の治療薬は副作用等に関する懸念か

ヒト褐色脂肪細胞の活性は BMI と負に相関し加齢とら実際には殆ど使用されておらず，高度肥満例に対するともに低下するが，若年者においてもその活性には 1022178

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成倍以上の個人差が存在し，マウス近交系においても褐色

ろ Ucp1 -12kb エンハンサーには 129 由来の allele 優

脂肪細胞活性には大きな差を認めることからゲノム多位なクロマチン相互作用を認めた．NFIA の ChIP-seq型の関与が想定される．本研究において我々はマウスに allelic imbalance を 認 め る 領 域 の モ チ ー フ 解 析 か近交系のうち太りやすく褐色化能が低く Ucp1 発現が低ら，Ucp1 -12kb エンハンサーに存在する rs47238345

い C57BL/6J (B6) と太りにくく褐色化能が高く Ucp1

が転写因子 VDR (vitamin D receptor) のモチーフを崩発現が高い 129X1/SvJ (129) およびこれらを交配させすことで VDR 自身及び競合する NFIA のゲノムへの結た F1 を用いて，ゲノム多型が脂肪細胞の褐色化能を規合に影響し褐色化能を規定することを同定した．更に定するメカニズムを解明するための網羅的なゲノム-エ

rs47238345 を B6 の allele か ら 129 の allele へ 置 換

ピゲノム連関解析を遂行した．B6 と 129 それぞれのマしたマウスにおいては Ucp1 発現が上昇することを示

ウスから採取した褐色脂肪細胞は脂肪細胞分化の程度した．また 129 において B6 と比較して高発現していに差が無いにも関わらず，Ucp1 は 129 において顕著る転写因子のスクリーニングから Ucp1 の正の制御因に高発現していた．F1 マウス由来の褐色脂肪細胞にお子として Lim homeobox protein 8 (Lhx8) を同定した

いて Ucp1 mRNA には 129 由来のゲノムから優先して（Hiraike Y. et al. iScience in press）．

転 写 さ れ る allelic imbalance を 認 め，NFIA の ChIP-【今後の展望】

seq においても Ucp1 遺伝子エンハンサーへの結合に

褐色脂肪細胞における NFIA が全身代謝に及ぼす影響

129 優位の imbalance を認めた．実際，F1 細胞におい及び作用メカニズムの全貌が明らかになれば，「エネルて Hi-C を用いてエンハンサー-プロモーター間の allele-

ギー消費の促進」に基づく新たな生活習慣病の治療法のapeciﬁc なクロマチン相互作用を網羅的に解析したとこ

開発に結実することが期待される．また褐色脂肪細胞の

NFIA は cis regulatory variant に対する作用を介してマウス近交系における Ucp1 発現の差を規定する

活性が体重や血糖，心血管イベント等に与える影響をバイオバンクの大規模データで検証し特に遺伝子環境相互作用に注目して解析することにより，遺伝リスクに基づいた最適な生活指導という形で生活習慣病領域における精密医療の実現につながることが期待される．
【文献】
１）Hiraike, Y.*, Tsutsumi, S., Wada, T., Oguchi,
M., Saito, K., Nakamura, M., Ota, S., Koebis,
M., Nakao, H., Aibta, A., Nagano, G., Ohno, H.,
Oki, K., Yoneda, M., Kadowaki, T., Aburatani,
H., Waki, H. & Yamauchi, T.: NFIA determines
the cis -effect of genetic variation on Ucp1
expression in murine thermogenic adipocytes.

iScience accepted. *Corresponding author
２）GBD 2019 Adolescent Transport and Unintentional Injuries Collaborators. Adolescent transport and unintentional injuries: a systematic
analysis using the Global Burden of Disease
Study 2019. The Lancet Public Health in press
３）Hiraike, Y.*, Yang, CT., Liu, WJ., Yamada, T. &Lee, CL.: FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The

23
179

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

Taiwan Biobank study. The Journal of Clinical

いた免疫蛍光染色により APN の局在を検討した．WT

Endocrinology & Metabolism 2021; 106 ( 9 ) :の網膜において APN は細動脈から毛細血管移行部にか

e3673-e3681. *Corresponding author

けての血管内皮に局在していたが，T-cad-KO では消失

４）Hiraike, Y., Waki, H., Miyake, K., Wada, T.,

しており，APN は T-cad 依存的に網膜血管内皮細胞に

Oguchi, M., Saito, K., Tsutsumi, S., Aburatani,

集積すると考えられた．続いて，Streptozotocin (STZ)

H., Yamauchi, T. & Kadowaki, T.: NFIA diﬀer-

誘発糖尿病モデルマウスを用いて糖尿病状態における網

entially controls adipogenic and myogenic gene

膜血管の APN の集積の変化を検討した結果，網膜血管

program through distinct pathways to ensure

内皮の APN は糖尿病発症後経時的に減少することが確

adipocyte diﬀerentiation. PLoS Genetics 2020;

認された．

16(9): e1009044

糖尿病網膜症の病態早期では，単球接着因子発現の上５）Hiraike, Y., Waki, H., Yu, J., Nakamura, M.,

昇に伴う血管内皮の leukostasis や Tight-Junction の破Miyake, K., Nagano, G., Nakaki, R., Suzuki, K.,

綻が生じることで，血管透過性亢進が惹起され，その後

Kobayashi, H., Yamamoto, S., Sun, W., Aoyama,の病態進展に関与することが知られている．WT に STZ

T., Hirota, Y., Ohno, H., Oki, K., Yoneda, M.,

負荷を行ったところ，糖尿病発症後６週の早期においてWhite, AP., Tseng, YH., Cypess, AM., Larsen,

も，コントロール群に比して，網膜血管の APN 集積は

TJ., Jespersen, NZ., Scheele, S., Tsutsumi, S.,

有意に減少しており，同部位における血管透過性亢進

Aburatani, H., Yamauchi, T. & Kadowaki, T.:(Hoechst の血管外漏出により評価 ) が認められた．まNFIA co-localizes with PPARγ and transcrip-

た，STZ 群では単球接着因子である VCAM-1 発現上昇

tionally controls the brown fat gene program.

と，主要な Tight-Junction 蛋白である Claudin-5 発現

Nature Cell Biology 2017; 19(9): 1081-1092.

減少が観察された．一方で，これらの変化はいずれも，[Highlighted in News and Views, Nature Cell

SGLT2 阻害薬である Dapagliﬂozin の投与により回復しBiology 2017; 19(9): 1006-1007.]たことから，高血糖依存的であると考えられた．
最後に，早期網膜症に対する APN の役割を検討する
ために，WT と APN-KO の比較を行った．非糖尿病状

アディポネクチンの組織修復機構の解明
藤島裕也

態においては網膜血管透過性に両軍で差は認められなかった．しかし，APN-KO では，WT に比して，STZ 負荷・糖尿病発症後４週のより早期の時点で，網膜血管内皮に（大阪大学大学院医学系研究科）

おける VCAM-1 の発現上昇と Claudin-5 の発現の低下が認められ，有意な血管透過性亢進を呈していた．

【背景】

【考察】

脂肪細胞特異的分泌蛋白である Adiponectin (APN)APN は T-cad を介して網膜血管内皮に集積し，糖尿は，GPI アンカー型膜蛋白 T-cadherin (T-cad) と特異病網膜症の発症・進展に対して抑制的に作用することが的かつ高親和性に結合することで，大動脈の血管内皮細示唆された（Sci Rep 2022）現在 T-cad ﬂox マウスを胞や腎臓の血管周皮細胞に集積し，臓器保護作用を発揮

用いて，各血管構成細胞（内皮細胞あるいは周皮細胞）することを報告してきた．しかし，糖尿病網膜症に代表特異的な T-cad 欠損マウスを樹立しており，血管障害・される細小血管障害に対する APN の作用については十動脈硬化症に対する

分に明らかではない．

検討する予定である．

【方法・結果】
まず，
野生型マウス (WT), APN 欠損マウス (APN-KO),
T-cad 欠損マウス（T-cad-KO）の網膜 Flat mount を用

24
180

APN/T-cad の役割をより詳細に

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成【方法】
１）FoxO1 と T-bet の共免疫沈降アッセイ
１型糖尿病における CD8＋ Ｔ細胞の分化制御機構の解明
宮地

助成者は，FoxO1 阻害薬は，抗原刺激後の CD8 ＋Ｔ
細胞内の転写因子 T-bet を抑制する予備データを得ている．T-bet はＴ細胞分化のマスターレギュレーターであ康高

り，IFNγ の制御することが知られている．HEK293 細（九州大学病院）

胞に FoxO1-Flag と T-bet (-GFP) 発現プラスミドを過剰発現させ，ビーズ付き Flag 抗体により免疫沈降し，【目的】
１型糖尿病は，膵島炎を病理学的特徴とする自己免疫疾患であり，CD8 ＋Ｔ細胞は膵島炎において最も多く

FoxO1 と T-bet にタンパク質間相互作用の有無を検討した．
２）IFNγ のプロモーターアッセイ

認められる炎症細胞である．樹状細胞などの抗原提示

HEK293 細 胞 に Luc コ ン ス ト ラ ク ト と T-bet 発 現細胞は膵島自己抗原を取り込み，CD4 ＋Ｔ細胞が認識

プラスミドを導入し，FoxO1 の転写活性阻害によるする．CD4 ＋Ｔ細胞はヘルパー細胞（Th1）に分化し，IFNγ プロモーター活性の変化を比較した．

CD8 ＋Ｔ細胞が細胞障害性Ｔ細胞（エフェクターＴ細３）NOD マウスへの FoxO1 阻害薬投与

胞）に分化するのを促進する．細胞障害性Ｔ細胞はイン

糖尿病発症前の NOD マウスにポンプを植え込み，ターフェロン（IFN）やパーフォリンを分泌して β 細胞

FoxO1 阻害薬を４週間持続投与した．経時的に血糖値を破壊する．

を測定し，糖尿病の発症・進展が抑制されるか否かを検先行研究により，ナイーブ CD8 ＋Ｔ細胞がエフェク討した．投与終了後に膵臓組織を採取し，残存 β 細胞面

ター CD8 ＋Ｔ細胞に分化する際，複数の転写因子が協積と炎症細胞浸潤を評価した．

調して作用すると想定されており，転写因子 FoxO1 は【結果】

主要なものとして知られている．ウイルス感染などの刺１）FoxO1 と T-bet の共免疫沈降アッセイ

激により，ナイーブ CD8 ＋Ｔ細胞における FoxO1 のHEK293 細 胞 に FoxO1 と T-bet の 発 現 プ ラ ス ミ ド

転写活性が低下するとエフェクター CD8 ＋Ｔ細胞に分を過剰発現させて T-bet (FLAG) 抗体で免疫沈降をおこ化する．一方，FoxO1 の転写活性が維持されることが，なった．図１に示す通り，T-bet の濃縮には成功したが，メモリー CD8 ＋Ｔ細胞に分化するために必須であるこFoxO1 のバンドを確認できなかった．

とが報告されている．
助成者は１型糖尿病モデル（NOD）マウスから脾
細 胞 を 単 離 し，FoxO1 阻 害 薬（Cell 2017; 171(4):以上から，この実験系で FoxO1 と T-bet のタンパク
質間相互作用を確認することはできなかった．
２）IFNγ のプロモーターアッセイ

824-835. e18.）の前処置後に抗 CD3/CD28 抗体で刺マウス脾臓をテンプレートとして，マウス IFNγ プロ

激し，３日後に FACS 解析を実施した．コントロール

モーターの転写開始点から約 1.5kb 上流をクローニンの DMSO 群と比較して FoxO1 阻害薬投与群ではナイー

グして，プロモーターアッセイをおこなった．過去のブ CD8 ＋Ｔ細胞の増加とメモリーおよびエフェクター

報告通り，転写因子 T-bet によりプロモーターの活性がCD8 ＋Ｔ細胞の減少が認められた．さらに，２種類の2-3 倍上昇した．これまでに，FoxO1 は複数の転写因子

FoxO1 阻害薬を用いた検討から，上記の実験系においや転写共役因子と協調して遺伝子発現を制御することかて IFNγ の分泌が抑制されることを見出した．以上の予ら，T-bet と同時に野生型 FoxO1 あるいは恒常的活性

備データを踏まえて，本研究では，１型糖尿病において型 FoxO1(AAA) あるいはドミナントネガティブ FoxO1

FoxO1 阻害が CD8 ＋Ｔ細胞の分化を抑制するか否か，(D256) を HEK293 細胞に導入したところ，FoxO1 が病態を改善させるか否かを検証する．

T-bet 誘導性の IFNγ プロモーター活性に与える影響は軽微であることが確認された（図２）
．

25
181

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

３）NOD マウスへの FoxO1 阻害薬投与
6 週齢の NOD マウスに浸透圧ポンプ（Alzet 1004）(CD3, CD4, CD8) の浸潤に明らかな差は認めなかった．
以上から，４週間の FoxO1 阻害薬投与に忍容性があるを植え込み，FoxO1 阻害薬を高容量あるいは低容量ことが確認された．

（1/10）で４週間投与した．４週間の投与中に対照群を【考察，今後の方針】

含め糖尿病を発症する個体はいなかった．また，いずれ

本 年 度 は，in vitro で 転 写 因 子 FoxO1 と 転 写 因 子の容量でも FoxO1 阻害薬により，体重増加に影響はな

T-bet の相互作用の視点から遺伝子制御の解明に取りかった．投与終了後に肝臓および膵臓を摘出し，それぞ組んだ．現時点ではっきりとした手がかりが得られてれ遺伝子発現と免疫染色を行い，FoxO1 阻害薬の作用いるわけではないが，次年度では FoxO1 阻害薬によるを検証した．肝臓の遺伝子発現解析では，容量依存的T-bet の翻訳後修飾（リン酸化，ユビキチン化など）にに糖新生関連酵素 G6Pase の減少を認め（図３），膵臓

変化が無いか否かを検証する予定である．また，FoxO1の組織解析では，β 細胞の残存面積ならびにリンパ球阻害の前後で CD8 ＋Ｔ細胞の網羅的な転写産物解析や代謝産物解析を行い，FoxO1 阻害によるＴ細胞分化への影響を探索する．
また，in vivo の検討では，高容量の FoxO1 阻害薬の投与に忍容性があったことから，投与時期や投与期間を変えて，FoxO1 阻害薬により１型糖尿病の発症に影響があるか否かを検証する予定である．

図１

Fox01 と T-bat の共免疫沈降

非侵襲的膵 β 細胞イメージング技術を用いた，
膵β
細胞量を標的とした糖尿病の予防・治療法の開発村上隆亮（京都大学医学部附属病院）【背景・目的】
本邦では軽微な肥満であっても糖尿病を発症する患者が急増しており，耐糖能異常が出現する段階から既に
膵 β 細胞量（BCM）は減少していることが報告されて
図２

IFNγ プロモーター解析いる．このため，糖尿病の発症・重症化予防のためには，BCM を指標に，より早期に介入することが有用と考えられる．また，BCM の減少は，食事・薬物など各種治療効果の減弱または治療抵抗性の可能性に直結するため，BCM の減少を予防，または維持・回復させることが求められる．我々は，Glucagon like-peptide-1(GLP-1) 受容体に特異的に結合する Exendin-4 を骨格とした放射性同位元素標識プローブを用いた非侵襲的膵
β 細胞イメージング技術を開発し，Positron emission

図３

Fox01 阻害薬投与後肝臓の遺伝子発現解析

tomography (PET)や Single photon emission

tomography (SPECT) で の 生 体 マ ウ ス 膵 描 出， 同 法26
182

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成を用いた BCM の縦断的評価が可能であることを複数の糖尿病モデルマウスで示した．Glucose-dependent
insulinotropic polypeptide (GIP) は 高 脂 肪 食（HFD）
誘発性肥満に寄与することが知られているが，GIP のうつ様行動制御遺伝子 USP46 によるエネルギー

BCM への影響については未だ議論されている．本研

代謝制御に関する研究

究 で は 独 自 の イ ン ジ ウ ム 111 (111In) 標 識 exendin-4

村田

SPECT/CT を応用し，HFD による肥満誘導と BCM の知弥（筑波大学医学医療系）

関係に GIP 分泌の有無が与える影響を調べた．
【方法】
６週齢の野生型（WT）マウスと GIP 欠損（GIP－/－ ）【目的】

マウスを各々通常食（CFD）投与群（WT＋CFD, GIP－/－脱 ユ ビ キ チ ン 化 酵 素 USP46 は 神 経 系 に 高 発 現 し，

＋CFD） ま た は 45%HFD 投 与 群（WT＋HFD, GIP－/－

Usp46 欠損マウスはうつ様行動をほとんど示さない．

＋HFD） に 分 け，10 週間，体重と摂餌量，経 口 ブ ド

我々は培養細胞を用い，近位依存性ビオチンラベリ

ウ糖負荷試験を含む耐糖能評価，インスリン負荷試験

ング（BioID）によるタンパク質相互作用の解析を行（ITT），CT による体脂肪量解析および 111In-exendin-4

い，USP46 がエネルギー代謝関連因子と相互作用する

SPECT/CT 撮像を行った．

ことを見出した．本研究では，USP46 とエネルギー代【結果】

謝の関連の解明を目指し，Usp46 欠損マウスの解析とWT＋HFD は他群と比較して 10 週齢以降有意な体重

USP46-BioID ノックイン（KI）マウスを用いた in vivo

増加，血中 GIP・インスリン濃度の有意な上昇を認めた．

BioID を実施する．

また WT＋HFD は他群と比較して体脂肪量が多く，ITT【結果】

での血糖値変化が小さかった．111In-exendin-4 SPECT/⑴ Usp46 欠損マウスの解析

CT 撮像結果では，WT＋HFD は，WT＋CFD と比較しこれまでに Usp46 欠損マウスは若齢期に低体重を示て，10 － 16 週齢で膵 RI 集積値が有意に高かった．一

すことが判明している．この Usp46 欠損マウス成体に方，GIP＋HFD は WT＋CFD と 比 較 し て，10 週 齢

おける体重変化を検証したところ，野生型マウスとの体では膵 RI 集積値に有意差は認めず，16 週齢で GIP－/－

重差は生後４週以降，8-12 週齢にかけて小さくなる傾＋HFD の膵 RI 集積値が有意に高かった．WT＋HFD と向が認められた．しかしその後，15 か月齢まで長期飼

GIP－/－＋HFD と の 比 較 で は，WT＋HFD の 膵 RI 集 積

育したマウスでは体重差が増加に転じ，Usp46 欠損は値が 10 週齢以降有意に高値であった．

老齢期の低体重にも関連することが判明した．

【結語】

⑵

－/－

USP46-BioID-KI マウスを用いた in vivo BioID

In-exendin-4 SPECT/CT により，HFD による肥満

昨 年 度 実 施 の in vivo BioID 解 析 に よ り 見 出 し た

誘導と BCM の関係に GIP 分泌が与える影響が明らかに

USP46 の基質候補について，Usp46 欠損マウス脳におなった．

けるタンパク発現を検証した．その結果，抑制性神経伝【文献】

達を担う GABAA 受容体の α1 サブユニット（GABRA1）

Kiyobayashi, S., Murakami, T. et al.: Noninvasiveの発現低下が認められた．GABRA1 欠損マウスは若Evaluation of GIP Effects on β-Cell Mass Under

齢期に低体重を示すことが報告されており，USP46 がHigh-Fat Diet. Front Endocrinol (Lausanne), 13,

GABRA1 を安定化し体重の制御に関与する可能性が考921125 (2022).

えられた．

111

⑶

USP46 変異マウスの作製
USP46 と高い相同性を有する USP12 は，脱ユビキ

チン化活性非依存的な機能をもつ．Usp46 欠損マウス

27
183

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成の表現型が酵素活性依存的であるか検証するため，酵素療法を強化学習（Q-Learning）で予測するものである．

活性を持たない USP46-C44S 変異マウスと，Cofactor

単に今ある治療法を選ぶのではなく，その結果こうなっで あ る WDR48 と の 結 合 能 を 失 っ た USP46-Q236A,

た場合にはどのように治療するか，など，あたかも将棋

E237A 変異マウスを作製中である．後者は既に目的のの手を読むかのように動的に予測する．我々は糖尿病治

変異を有する F0 マウスを得ている．

療のアドヒアランスの継続の価値を最大化するモデルを【今後の展開】

作成検証した（ISPOR 他）．さらに現在は糖尿病専門医

Usp46 欠損マウスの摂食量やその他代謝表現型を検と同じ処方パターンを提案できる AI 構築準備を進めて証する．USP46 変異マウスと，昨年度より作製中の脳いる．

特異的 USP46 欠損マウスの表現型解析を実施する．ま２．ヘルスケアの集団的アプローチ

た USP46 による GABRA1 タンパク発現制御について〇 Real-time Systematic Review and Meta-analy-

解析を進めていく予定である．

sis の実現化
システマティックレビュー・メタアナリシスは臨床ガ

ネットワークメタアナリシスによる糖尿病の最良の治療選択エビデンスの確立：人工知能による臨床エ
ビデンスの統合と体系化
山田

イドラインの礎である．この一連のプロセスを人工知能に自動化させ，常に最新の臨床治験をアップデートする研究を進めている．我々は深層学習の技法を用い文献検索の 10 倍の省力化を報告した（JMIR）．また，メタア朋英

ナリシスの国際共同研究に参加した（Nature 他）．本研（東京大学）

究の発展により全疾患領域で，現時点で最もエビデンス
レベルが高い臨床知見を迅速かつ精密に提供することが【目的】

できる．ネットワークメタ解析に関し多くの報告を行っ

本研究は人工知能を用いたヘルスケアの個別化アプ

た（Diabetes Care 他 ）， そ の 成 果 は 米 国 内 科 学 会 のローチと集団的アプローチの統合と展開への挑戦を目標

ACP-Journal Club (Annals of Internal Medicine) や米とし，以下のプロジェクトを中心に進めた．

国の救急治療ガイドラインに引用され，現場の臨床医の【方法と結果】

治療方針の意思決定に寄与した．

１．ヘルスケアの個別化アプローチ【考察】〇 Precision Nutrition
精密栄養（精密治療）は，最適な健康のための栄養素の必要量，生活習慣が個人間で大幅に異なるという認識に起因する考え方である．我々は，ある個別の食生活や生活習慣によってその後の生存期間が改善するという個
人を人工知能でクラスター化するためのアルゴリズムを開発した．つまりある種の食事や生活習慣介入を個別に提案し，また薬剤反応性が個人で異なるという点で，最適な個別薬剤介入の設計も行う．また，
心電図やエコー，
脈波，音声などの生体情報をより精密に反映するモデルを構築していく．
〇 Dynamic Treatment Regimes
最良の個別化治療の提案と，糖尿病専門医と同じ処方パターンを提案できる AI を作る．Dynamic Treatment
Regimes は，ある状態の各糖尿病患者さんに最適の治28
184

人間の経験値・暗黙知を学んだ人工知能が代行することで人類はより創造的かつ生産的な作業に従事することが可能となる．

酵素情報

Cas9ヌクレアーゼ【はじめに】【GnT-V の酵素反応と特徴１）】

糖鎖はグルコースなどの単糖が鎖状に繋がったもので

GnT-V は，α1-6 結合したマンノース (Man) に β1-6あり，核酸・タンパク質に並ぶ第三の生命鎖として近年結合で N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）と呼ばれ注目されている．50％以上のタンパク質は，糖鎖による糖をタンパク質上の糖鎖に付加する糖転移酵素である

る修飾を受けた糖タンパク質として存在しており，付加（図）．この GlcNAc が付加することで糖鎖に分岐構造する糖鎖の構造により溶解性や安定性が変化する．糖タが生じ，その先へさらに糖鎖が伸長できるようになる．

ンパク質上の糖鎖の構造異常は，がん，アルツハイマー

GnT-V は，他の GlcNAc 糖転移酵素（Gnt-Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳa,

や糖尿病など様々な疾患の発症や悪性化に関与していⅣa など）とは異なり，多くの脊椎動物糖転移酵素に共る．
これらの糖鎖を形作っているのが糖転移酵素であり，通する糖結合モチーフである Asp-x-Asp (DXD, X は任

現在ヒトでは約 180 種類ほどが知られている．

意のアミノ酸残基 ) を欠いていることや，その触媒反応

本稿では，糖転移酵素の一種である N- アセチルグル
コサミニルトランスフェラーゼ V（GnT-V）について，は金属に非依存であることなど，ユニークな特徴を有している．

その特徴や基質選択性の仕組み，疾患との関わりについて概説する．

【GnT-V の基質選択性の仕組み１,２）】
GnT-V の変異体解析により，E297 と E526 の２つの

1
185

N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ V (GnT-V)

グルタミン酸を変異させると酵素活性が失われることか

GnT-V を発現する患者は発現しない患者と比較して遠ら，これら２つが触媒作用に不可欠であることが示され隔転移率が高くなることや生存率が低くなることが示さている．GnT-V の内部は４つのドメインから成る十字

れている．

型の構造を有しており，酵素反応が行われる中央の構造

GnT-V により β1-6 分岐が加えられた糖タンパク質は狭く深い窪みになっている．GnT-V は，その特徴的は，どのようにがんの増殖や転移を引き起こすのであろな窪みにより基質となるオリゴ糖を選択していることがうか．例えば，細胞の増殖や成長に関わるタンパク質で示唆されている．複合体結晶構造解析により，窪み部

ある EGFR が Gnt-V により β1-6 分岐糖鎖を発現すると，

分に存在する F380 と W401 の 2 つの芳香環が基質と急速なエンドサイトーシスから逃れられるようになり，なるアクセプター糖鎖（GlcNAcβ1-2Manα1-6Man）を

EGFR による細胞増殖のシグナル伝達が延長され，結果挟むように接触していることが確認されている．アク的に細胞の増殖が促進される．また，マトリプターゼは，セプター糖鎖に含まれる二糖単位（GlcNAcβ1-2Man）

GnT-V により β1-6 分岐糖鎖が形成されると分解に抵抗

は α1-3 結合した Man と α1-6 結合した Man の両方に性を示し，活性が持続することで，がん浸潤エフェクター

共通して存在するが，GnT-V は β1-6 結合の GlcNAc

であるウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベータや肝を α1-3 結合した Man には付加せず，α1-6 結合した細胞増殖因子の活性を亢進させ，がんの転移浸潤が促進

Man のみに選択して付加する．ドッキングモデルによする．

り，GnT-V と α1-3 枝 の 3 糖 単 位（GlcNAcβ1-2Man

最近，GnT-V による β1-6 分岐糖鎖の産生制御のメカニ

α1-3Man） を 重 ね 合 わ せ る と，β1-4 結 合 し た Man

ズムの一部が解明された．一般的に，GnT-V をはじめが W401 の芳香環と立体的に衝突していることから，

各種糖転移酵素は，ゴルジ体に局在し糖鎖の付加を行う

W401 が α1-6 分岐した Man を特異的に選択することが，シグナルペプチドペプチダーゼ様３というプロテに寄与していることが示唆されている．

アーゼに切断されると細胞外へ分泌される．多くの N

また，GnT-V は上記のアクセプター糖鎖を有するすべ型糖タンパク質には末端にシアル酸と呼ばれる糖が付加てのタンパク質に作用するわけではなく，特定のタンパされているが，シアル酸を欠損させた細胞では，シグナ

ク質を選別して作用する．GnT-V には，触媒作用とはルペプチドペプチダーゼ様３を介した GnT-V の細胞外無関係と考えられるＮ末端側のドメイン（Ｎドメイン）への分泌が抑制され，細胞内に留まることで GnT-V にが存在するが，Ｎドメインを欠失させると糖タンパク質より合成される β1-6 分岐の糖鎖の量が増加することがに対する GnT-V の活性は低下する． GnT-V と糖タン分かった．老化した細胞では，シアル酸量が徐々に減少

パク質基質とのドッキングモデルから，GnT-V のＮドすることが報告されていることから，GnT-V が細胞内

メインが，糖タンパク質基質のタンパク質部分と直接相に留まり β1-6 分岐の糖鎖の量が増加している可能性が互作用しており，作用するタンパク質の選別に寄与してある．これらから，GnT-V は老化によるがんの発症やいる可能性が示唆された．

悪性化メカニズムの一部を担っている可能性がある．

【GnT-V の機能調節および疾患との関わり３－７）】【おわりに】

GnT-V は，様々ながんの発症，増殖や転移に関与し

近年，様々な糖転移酵素が疾患と深く関わっているこていることが報告されている．例えば，ポリオーマウイとが判明している．例えば，今回紹介した GnT-V と同

ルスミドルＴ抗原遺伝子により乳腺腫瘍を誘導するモデ

じく糖鎖上に分岐を作る酵素である GnT-III ではアルツ

ルマウスにおいては，GnT-V を発現する野生型やヘテ

ハイマー，GnT-IVa では糖尿病，Fut8 ではがんや慢性

ロマウスと比較して GnT-V を発現しない GnT-V KO マ

閉塞性肺疾患への関与が示されている．GnT-V の例か

ウスでは，腫瘍の発生が遅れることや腫瘍のサイズが小らも，糖転移酵素を創薬ターゲットとすることにより，

さくなること，転移率が著しく低くなることが確認され疾患に関連した複数のタンパク質の活性を調節し得るこている．また，大腸がん患者においては，がん組織中にとが伺える．しかし，糖転移酵素の立体構造や基質選択

2186

N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ V (GnT-V)性の仕組みは十分に解明されておらず，特異性の高い薬剤設計が課題となる．今後，さらに様々な糖転移酵素の詳細な解析が成され，画期的な新薬開発への糸口となることに期待したい．

【参考文献】
１）Nagae, M. et al.: Structure and mechanism ofcancer-associated N-acetylglucosaminyltransferase-V, Nat. commun., 9, 3380 (2018).
２）Osuka, RF. et al.: N-acetylglucosaminyltransferase-V requires a specific noncatalytic luminal
domain for its activity toward glycoprotein substrates, J. Biol. Chem., 298(3), 101666 (2022).
３）Granovsky, M. et al .: Suppression of tumor
growth and metastasis in Mgat5-deﬁcient mice,

Nat. Med. 6, 306(2000).
４）Murata, K. et al.: Expression of N-acetylglucosaminyltransferase V in colorectal cancer correlates with metastasis and poor prognosis, Clin.

Cancer Res., 6, 1772(2000).
５）Partridge, EA. et al.: Regulation of cytokine
receptors by Golgi N-glycan processing and endocytosis, Science, 306 (5693),120-124 (2004).
６）Shinji, I. et al.: Prometastatic eﬀect of N-acetylglucosaminyltransferase V is due to modiﬁcationand stabilization of active matriptase by adding
beta 1-6 GlcNAc branching, J. Biol. Chem.,
277(19), 16960 (2002).
７）Hirata, T. et al.: Shedding of N-acetylglucosaminyltransferase-V is regulated by maturity of cellular N-glycan, Commun. Biol., 5, 743 (2022).

【著者】
田辺三菱製薬株式会社神藤

モダリティー研究所

創薬本部

モダリティー研究所

彩加

田辺三菱製薬株式会社
小寺

創薬本部

淳

3
187

酵素情報

Cas9ヌクレアーゼ

膨潤と細胞膜構造の破綻という形態学的特徴を有する細【序】
個体発生や生命の恒常性維持において，細胞死が重要胞死である．ネクロプトーシスは腫瘍壊死因子（TNF）

な働きを担っている．
細胞死は形態学的にアポトーシス，

や Fas リガンド，インターフェロン，Toll 様受容体
（TLR）

オートファジー細胞死，ネクローシスの 3 種類に分類

等から刺激を受けて引き起こされる（図 1）．各種のされる．そのなかでネクローシスは化学的・物理的な刺刺 激 を 受 け て receptor interacting serine/threonine

激に対して偶発的に生じる細胞死と考えられており，細kinase 1 (RIPK1) や RIPK3 が 活 性 化 さ れ，RIPK1/胞の膨張や破裂を特徴としている．近年になり，ネク

RIPK3/MLKL がネクロソームと呼ばれる複合体を形成

ローシスに類似した形態的特徴を持つが，細胞内で遺伝する．ネクロソームにおいて RIPK3 によってリン酸化子発現やシグナル伝達を介して生じる能動的な細胞死のされた MLKL は多量体を形成し，細胞膜に移行して細存在が明らかになり，ネクロプトーシスと名付けられた胞膜の透過性亢進や崩壊を引き起こす．また，細胞膜

１）．以後，ネクロプトーシスのメカニズムや生理的意義の破壊に伴い damage-associated molecular patterns

等についての理解が急速に進み，mixed lineage kinase(DAMPs) と呼ばれる細胞内分子が放出され，炎症反応

domain like pseudokinase (MLKL) がこの経路の最終が惹起される２）．

実行因子であることが明らかにされた．本稿では MLKL

MLKL お よ び RIPK1, RIPK3 の ド メ イ ン 構 造 を 図に焦点を当て，その機能や創薬標的としての可能性につ2 に 示 す．MLKL は N 末 端 側 の ４ ヘ リ ッ ク ス バ ン ド

いて述べる．

ル（4HB）ドメイン，２つの α ヘリックスからなるブレース領域，Ｃ末端側のシュードキナーゼドメインで構成される．通常プロテインキナーゼには酵素活性に必【ネクロプトーシスと MLKL の機能】
ネクロプトーシスとは，ネクローシスと同様に細胞の要な３つのモチーフ（VAIK, HRD, DFG）が存在する

図1 ネクロプトーシスのシグナル伝達
LPS

TNFα

ネクロプトーシス
DAMPs放出

TLR

TNFR

RIPK1
ネクロソームRIPK3MLKL ４HB
PsKD
1

膜移行

多量体化

CONFIDENTIAL

田辺三菱製薬株式会社

図１

1
188

ネクロプトーシスのシグナル伝達

図2 MLKL, RIPK1, RIPK3のドメイン構造

ネクロプトーシスの実行因子 MLKL

RIPK1

Kinase domain

RIPK3

Kinase domain

RHIM

DD

RHIM
P T357/S358

MLKL

4HB

Brace

PsKD

RHIM: RIP homotypic interaction motif, DD: death domain, 4HB: four-helix bundle,
PsKD: pseudo-kinase domain

図２

MLKL, RIPK1, RIPK3 のドメイン

が，MLKL は触媒ループ上の HRD モチーフ，金属イオ

細胞膜上でさらに高親和性結合部位を露出して安定したンと相互作用する DFG モチーフを持たないため，酵素構造を保つ５）．細胞膜上での MLKL の高次構造情報は活性が無いシュードキナーゼと分類されている．ネク
田辺三菱製薬株式会社

無く，細胞死を引き起こす詳細なメカニズムは不明なま

ロプトーシスのシグナル伝達経路において，活性化さまであるが，細胞膜に数 nm の開口部を形成するようなれた RIPK3 のキナーゼドメインと MLKL のシュードキ構造をとってイオンチャネルとして機能する可能性が報

ナーゼドメインが結合し，RIPK3 によって Thr357 と告されており，マグネシウムイオン等が細胞内へ流入す

Ser358 がリン酸化される．シュードキナーゼドメイン

ることによって最終的に細胞の膨潤と細胞膜の破綻を起がリン酸化されると構造変化が起こり，MLKL の多量こすと考えられている．

2体化が促進される．一方 ATP との結合に必要な VAIL
モチーフはシュードキナーゼドメイン内に存在し，ATP【創薬標的としての MLKL】との結合活性は保持されている．MLKL の機能に及ぼ

ネクロプトーシスの生理的役割のひとつは病原体に対す ATP の作用には不明な点が多いが，ATP 結合によっする防御機能と考えられている．すなわち，ウイルスやて MLKL 単量体が安定になることが報告されており，細菌に感染された細胞がネクロプトーシスを起こすこと

MLKL の活性化を制御する可能性が示唆されている３）．

によって感染の拡大を防ぐ作用と，DAMPs を放出する

4HB ドメインはネクロプトーシスを実行する役割をことによって宿主免疫を活性化する作用の双方によって担っている．4HB ドメインを欠損した MLKL は細胞死

宿主防御機能を担っている６）．他方で，虚血性疾患，神を誘導できないが，細胞質内で多量体化できるように修

経変性疾患や自己免疫疾患などにおいて，ネクロプトー

飾されたヒト 4HB ドメインのみを強制発現させると，シスによる組織損傷と炎症の増悪化が病態の発症・進展

膜移行してネクロプトーシスを引き起こすことが知られに関与することが報告されている７）．そのなかでも有効ている４）．ネクロプトーシスのシグナル伝達過程においな治療法が少ない疾患において，ネクロプトーシスの経て，RIPK3 によってリン酸化された MLKL は立体構造

路を制御する薬剤が新規治療薬となることが期待されてが変化し，4HB ドメインが露出されて多量体を形成す

おり，例えば RIPK1 阻害剤 SAR443820/DNL788 が筋る．4HB ドメインは細胞膜のホスファチジルイノシトー

萎縮性側索硬化症を対象として，SAR443122/DNL758

ルリン酸と相互作用することによって膜移行を促進し，が皮膚エリテマトーデスを対象としてそれぞれ第 2 相2189

ネクロプトーシスの実行因子 MLKL

臨床試験が進められている．
MLKL を直接の標的とした薬剤の開発に関してはこ
れまでほとんど報告が無い．これは MLKL が酵素活性

７）Khoury, MK. et al.: Necroptosis in the Pathophysiology of Disease. Am J Pathol . 2020;
190(2): 272-285.

を持たないシュードキナーゼであり，多量体化することによって細胞死を起こすメカニズムであるため，低分子【著者】

化合物では MLKL の機能を十分に抑制することが困難

田辺三菱製薬株式会社 創薬本部 免疫炎症創薬ユニットであることが理由として考えられる．MLKL はネクロ

杉本

プトーシスの最終実行因子であるため，ネクロプトーシ

田辺三菱製薬株式会社 創薬本部 免疫炎症創薬ユニットスとの関連が強い疾患において MLKL を標的とした治柳田

療薬は強力な病態改善効果を持ち副作用の少ない薬剤となる可能性がある．今後，MLKL の詳細な機能解析や疾患との関連性についての研究の深化を注視するとともに，ネクロプトーシスを制御する治療薬の臨床応用や，新たな創薬手法の発展による MLKL を標的とした薬剤の創出に期待したい．

【参考文献】
１）Degterev, A. et al.: Chemical inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential
for ischemic brain injury. Nat Chem Biol. 2005;
1(2): 112-9.
２）Seo, J. et al.: Necroptosis molecular mechanisms: Recent ﬁndings regarding novel necroptosis regulators. Exp Mol Med. 2021; 53(6):1007-1017.
３）Petrie, EJ. et al.: Conformational switching of
the pseudokinase domain promotes human
MLKL tetramerization and cell death by necroptosis. Nat Commun. 2018; 9(1): 2422.
４）Tanzer, MC. et al.: Evolutionary divergence ofthe necroptosis eﬀector MLKL. Cell Death Dif-

fer. 2016; 23(7): 1185-97.
５）Quarato, G. et al.: Sequential Engagement ofDistinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding
Sites Executes Necroptosis. Mol Cell . 2016;
61(4): 589-601.
６）Mocarski, ES. et al.: True grit: programmed
necrosis in antiviral host defense, inﬂammation,and immunogenicity. J Immunol. 2014; 192(5):2019-26.

3
190

貴彦
哲哉

日本応用酵素協会誌

第57号

ISSN:2434-7914（Online）
ISSN:0913-3348（Print）
CODEN : NOKKEL

2023 年３月１日発行

日本応用酵素協会誌
日本応用酵素協会誌

No.57

№ 57

力覚応答に関与する低分子量Gタンパク質Rhoファミリーの活性化因子RhoGEF‥‥‥‥‥‥12022

ペプチド系天然物の生合成に関与するtRNA依存型アミド合成酵素‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥11

2022
総

説

大 橋 一 正丸 山 千 登 勢， 濱 野 吉 十
もやもや病の分子病態をめぐる幾つかの論点‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥19
森 戸 大 介,

折 井 み な み

高度好塩性古細菌 Haloarcula japonica のイソプレノイド生合成経路の解析と代謝工学による有用物質生産‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥27
八 波 利 恵2022年度 研究報告
酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥33
成人病の病因・病態の解明に関する研究助成‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥70
Vascular Biology Innovation に関する研究助成 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥115
公益財団法人全身性炎症疾患の病因・病態の解明に関する研究助成 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥146
Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥157

研究調査所 酵素情報

日本応用酵素協会

N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼV (GnT-V) ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥185
ネクロプトーシスの実行因子MLKL ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥188

公益財団法人

日本応用酵素協会

Japan Foundation for Applied Enzymology
編集兼
山田 昌樹
発行人

発行所

大阪市中央区道修町三丁目二番十号
公益財団法人 日 本 応 用 酵 素 協 会

印刷所

帝人エージェンシー株式会社