日本応用酵素協会誌

第54号

ISSN : 0913-3348
ISSN : 2434-7914（Online）
CODEN : NOKKELISSN : 0913-3348（Print）
CODEN : NOKKEL

2020 年３月１日発行

日本応用酵素協会誌
日本応用酵素協会誌

No. 54
2019
総

説

№

54

ゲノム全域をオフターゲットなく自在に編集できる新しい2019

酵素システム系の創製とその応用 ･･･････････････････････････････････････････････
植

田

充

美

Hermansky-Pudlak syndrome (HPS) の病態と遺伝子変異･････････････････････････
加

藤

慎

1

也，五 十 川

健 太，渡

邉

実

夢，竹

森

9

洋

Unstructured 領域から始まるプロテアソームによる蛋白質分解
Proteasome-mediated protein degradation initiated from unstructured region･･････････････ 19

伊野部

智由

2019年度 研究報告
酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究 ･････････････････････････････ 25
成人病の病因・病態の解明に関する研究助成 ･････････････････････････････････････ 53
Vascular Biology Innovation に関する研究助成･･････････････････････････････････ 81
公益財団法人全身性炎症疾患の病因・病態の解明に関する研究助成 ･････････････････････････････ 96
Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成･････････････････････ 103

研究調査所 酵素情報

日本応用酵素協会

創薬標的としてのNIK ･･･････････････････････････････････････････････････････ 125
マラリア原虫から分泌されるフシギな酵素たち ･･･････････････････････････････････ 128
リボヌクレアーゼ H (Ribonuclease H, RNase H) ････････････････････････････････ 131

公益財団法人

日本応用酵素協会

Japan Foundation for Applied Enzymology
編集兼
発行人

山田

昌樹

発行所

大阪市淀川区加島三丁目一六番八九号
公益財団法人 日 本 応 用 酵 素 協 会

印刷所

帝人エージェンシー株式会社

総説

ゲノム全域をオフターゲットなく自在に編集できる
低
新しい酵素システム系の創製とその応用
植

田

微生物を用いた発酵生産は一連の多段階反応を常温常圧で行うことができることや，医薬に特有な立体選択充

美＊見や高効率で容易な変異導入法は構築されておらず，高効率なバイオ生産における律速となる１）．

的反応が可能であり有害な副産物も少ないことから，エ

本研究ではこれら問題に対して，まず，非熱耐性株か

ネルギー消費量が少なく環境に優しい手法として注目

ら熱耐性株を育種することで，熱耐性に寄与する変異のを集めている．しかし，発酵生産は一般に生育に伴う同定を目的として，さらに，そのために，ゲノムワイド

ものであり，発酵条件は微生物が生育可能な環境に限な新規塩基編集技術である CRISPR/Nickase システム

られている．例えば，酵母 Saccharomyces cerevisiaeを構築することで，短時間で高効率に変異を酵母に導入を用いたエタノール生産では，発酵熱により酵母の生できる技術の開発を行った．

育や発酵が阻害される．そのため，発酵系の冷却により S. cerevisiae が生育できる温度を維持する必要があ

１．熱耐性適応育種細胞の取得る．しかし，冷却はエネルギー消費が大きく，製造コス

熱耐性に寄与する変異の同定を目的として，至適温度

ト増大につながる．物質生産能の高い S. cerevisiae にが 30℃の S. cerevisiae 株 MT8-1 を親株として 32℃，

熱耐性を付与することで，生産コストの削減が期待でき

72 時 間 の 継 代 培 養 を 繰 り 返 し 行 っ た（ 図 １）
．親株る．さらに高温発酵により，蒸留コストの削減やコンタ

30℃時よりもより良く生育した時点で 34℃で培養した．

ミネーションリスクの低減も見込まれるため，酵母の熱同様に親株 30℃よりも生育するまで繰り返し培養して，耐性化は低コストな物質生産に大きな可能性を秘めてい適応した時点でさらに 2℃培養温度を上昇させた．同様る．しかし，酵母に熱耐性を付与できる遺伝子変異の知に繰り返して最終的に 38℃に適応した株 YK60-1 を単

図１ 適応育種法ᅗ䠍䠊㐺ᛂ⫱✀ἲ＊京都大学大学院農学研究科応用生命科学専攻

1

総説－ゲノム全域をオフターゲットなく自在に編集できる新しい酵素システム系の創製とその応用離した．また，その過程で各温度に適応した育種途中

２．細胞の熱ストレス適応戦略

株を保存した．YK60-1 は MT8-1 が生育できない 40℃

YK60-1 において熱耐性に寄与する変異を同定するでも良好に生育した２）．トランスクリプトーム解析の結た め に， 親 株 MT8-1 と の 比 較 ゲ ノ ム 解 析 を 行 っ た．

果，YK60-1 は熱ショックタンパク質などストレス応答

MT8-1 と比べて，YK60-1 では 40 個以上の変異が同定

性タンパク質を常時 30℃で発現誘導していた．さらに，された．これらの中には熱ショックタンパク質をコード

YK60-1 は二糖類の一種であるトレハロースを 30℃でする遺伝子など熱耐性への寄与が明確に知られている

多く蓄積していた（図２）．トレハロースは生体内でタものはなかった．そこで，育種途中株を解析すること

ンパク質の変性を緩和する作用があり，酵母は通常熱ス

で，育種における集団の推移や淘汰を遡って調べること

トレス下で蓄積する．また，YK60-1 のこの形質は非熱ができるため，熱耐性に寄与した変異を効率的に同定しストレス下で長期培養しても失われなかった．これらよていくことを試みた．育種途中株のゲノム解析で同定さり YK60-1 は遺伝子変異により，熱ストレス応答が恒常れた変異をもとに，進化系統樹を構築したところ，独立

的に「スイッチ ON」していることが示唆された．

した異なる系統で共通にみられる変異 CDC25 W1416C を発見した（図３）．この遺伝子にコードされる Cdc25p

ᏋᆔఇỉἚἾἡἿὊἋӳ঺ኒᅗ䠎䠊䝖䝺䝝䝻䞊䝇ྜᡂ䛾ẚ㍑
図２ トレハロース合成の比較

図３ 適応進化の系統樹
ᅗ䠏䠊㐺ᛂ㐍໬䛾⣔⤫ᶞ

2

総説－ゲノム全域をオフターゲットなく自在に編集できる新しい酵素システム系の創製とその応用

は 1416 番目の Trp が Cys に置換されている．この変ル伝達系下流のストレス応答性転写因子が活性化され異を有する集団は 38℃で優占的に生育していた．また，て，ストレス耐性が誘導される．CDC25 変異再構築株

CDC25 の異なる部位に変異を有する CDC25 W1416C をの細胞内 cAMP 濃度を測定したところ，すべての株で含む CDC25 遺伝子上の変異の熱耐性への寄与が予想さ

MT8-1 よりも cAMP 濃度が低下していた．さらにトラれた．同定した 4 種類の変異をそれぞれ親株 MT8-1 にンスクリプトーム解析によると，CDC25 変異再構築株再導入したところ，これら 4 種類の再構築株はいずれで常時発現誘導されている遺伝子のほとんどが cAMP

も熱耐性を示した（図４）．これより仮説の証明と適応

経路下流の転写因子に制御されていた．これより，変異進化の再現に成功した．

型 Cdc25p は細胞内 cAMP 濃度低下を誘導して下流のCdc25p はグアニンヌクレオチド交換因子として，細種々の転写因子を活性化することで，ストレス耐性を誘胞内のサイクリック AMP (cAMP) 濃度を間接的に調導していることが明らかになった（図５）．CDC25 変

節する．酵母では cAMP の濃度が低いときに，シグナ

異再構築株では，シグナル伝達系上流から包括的に様々

図４ 熱耐性株の比較ᅗ䠐䠊⇕⪏ᛶᰴ䛾ẚ㍑

ᅗ䠑䠊䝅䜾䝘䝹ఏ㐩⤒㊰
図５
シグナル伝達経路

3

総説－ゲノム全域をオフターゲットなく自在に編集できる新しい酵素システム系の創製とその応用なストレス応答性転写因子を活性化することで，熱応答いることが示された．酵母のトレハロース合成経路は性遺伝子を協調的に制御して熱耐性を効果的に誘導してガラクトース資化経路と一部オーバーラップしており，いることが初めて示された．

CDC25 変異株はガラクトース資化能が向上している可CDC25 変異再構築株の熱ストレス下における発酵能性も示唆された．実際にガラクトースを炭素源とした生産能を評価した．グルコースを炭素源としたとき，とき，CDC25 変異再構築株は親株 MT8-1 の最大 1.3

CDC25 変異再構築株は熱ストレス下（39℃）におい倍のエタノールを生産した．さらに 39℃においては，て親株 MT8-1 の２倍以上のエタノールを生産した．まCDC25 変異再構築株は親株の最大 5.1 倍のエタノール

た，トランスクリプトーム解析から CDC25 変異再構築を生産した（図６）３）．

株は 30℃において，トレハロース合成経路を誘導して

図６

エタノール生産量の比較ᅗ䠒䠊䜶䝍䝜䞊䝹⏕⏘㔞䛾ẚ㍑

CRISPR/Cas9 system

図７ ᅗ䠓䠊䝀䝜䝮⦅㞟CRISPR/Cas9䝅䝇䝔䝮
ゲノム編集 CRISPR/Cas9 システム4

総説－ゲノム全域をオフターゲットなく自在に編集できる新しい酵素システム系の創製とその応用

３．新規ゲノム編集法の開発による熱耐性変異株の構築

N は任意の塩基）に続く 20 塩基を認識して，Cas9 がCDC25 変異は効果的に熱耐性を誘導できるが，一般

DNA を切断する．切断領域に相補的なドナー DNA を的な手法による変異導入は約 2 週間の手間がかかるう

加えると相同組換えにより任意の配列をノックインできえ，効率も 50% 以下と非常に低い．より短期間に熱耐る．また，非相同末端結合により切断配列をランダムに性株を構築するためには，熱耐性に関わる変異の同定だ

修復するとノックアウトが可能になる（図８）．しかし，

けでなく，効率的な変異導入法の開発が求められる．近CRISPR/Cas9 システムは全てのゲノム領域を編集する

年，高効率で容易な変異体作製法として CRISPR/Cas9

ことができないという大きな欠点がある（図９）．認識システムが注目を集めている（図７）．

配列と PAM 配列以外の部位に変異を導入するように相このシステムでは，ガイド RNA が PAM 配列（NGG:

図８

同組換えを行うと編集後も認識配列が残るため，Cas9

相同組み換えの比較ᅗ䠔䠊┦ྠ⤌䜏᥮䛘䛾ẚ㍑

CRISPR/Cas9 systemỉࢊໜ⦅㞟ྍ⬟䛺䜿䞊䝇

⦅㞟୙⬟䛺䜿䞊䝇

≉␗ⓗ䛺⦅㞟

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䠇㠀≉␗ⓗ䛺⦅㞟ᅗ䠕䠊CRISPR/Cas9䝅䝇䝔䝮䛾ᙅⅬ
図９
CRISPR/Cas9 システムの弱点

5

総説－ゲノム全域をオフターゲットなく自在に編集できる新しい酵素システム系の創製とその応用による再切断が起こってしまう．生じた二本鎖切断は再Cas9 Nickase を用いる方法を考案した（図10）．Cas9度鋳型 DNA をもとにした相同組換えや非相同末端結合

Nickase で生じる一本鎖切断（ニック）は正確に修復さにより修復される．相同組換えにより修復された場合，れる．また旧来の Cas9 により生じる二本鎖切断と異な認識配列が残るためさらに再切断される．そのため，最り，ニックは相同組換えを誘導するが，非相同末端結合

終的には非相同末端結合により標的配列に望まない塩は誘導しない．そのため，Nickase による相同組換え後基の挿入，欠失が生じてしまうという大きな欠陥があに標的配列が残った時でもニックが再度導入されるだける．従って，このシステムが正確に編集できる領域は，で，非相同末端結合による余分な配列の挿入や欠損は起Cas9 が認識できる NGG 配列とそれに続く 20 塩基のみ

こらない．また，本システムはニックから 50 bp 離れであり，これはゲノム中にわずか 60% 程度しか存在した領域でも正確に編集できた．これは，本システムが編

ない４－８）．

集可能塩基に制限がある CRISPR/Cas9 よりも，理論上上述の旧来法よりもはるかにゲノムワイドで高効率な編集技術を構築するために，一本鎖切断酵素である

40% 以上も広いゲノム領域，すなわち，ほぼゲノム全域を編集できることを示している．

CRISPR Nickase systemỉૼᙹ᧏ႆኚ␗: ㄆ㆑㓄ิ䛾እഃ≉␗ⓗ䛺⦅㞟
図10 新規開発した CRISPR/Nickase システム
ᅗ10䠊᪂つ㛤Ⓨ䛧䛯CRISPR/Nickase䝅䝇䝔䝮6

総説－ゲノム全域をオフターゲットなく自在に編集できる新しい酵素システム系の創製とその応用

Gap repair cloningửМဇẲẺ‫˳ီ٭‬ನሰ

図11 Gap Repair Cloning (GRC) 法ᅗ11䠊GapRepairCloning䠄GRC䠅ἲ

図12 ゲノム編集 CRISPR/Cas9 システムと新規開発 CRISPR/Nickase システムの比較
図 (A) CRISPR/Cas9 システムと (B) CRISPR Nickase システムによるゲノム編集 Cas9 一塩基置換体である Cas9
D10A は一本鎖切断酵素として働くᅗ12䠊䝀䝜䝮⦅㞟CRISPR/Cas9䝅䝇䝔䝮䛸᪂つ㛤ⓎCRISPR/Nickase䝅䝇䝔䝮䛾ẚ㍑

7

総説－ゲノム全域をオフターゲットなく自在に編集できる新しい酵素システム系の創製とその応用新規開発した CRISPR/Nickase システムは，ガイド

５）Jinek, M. et al.: A programmable dual-RNA-

RNA の発現配列と，ドナー DNA 配列をそれぞれベク

guided DNA endonuclease in adaptive bacterial

ターに組み込む必要がある．ベクター構築は 1 週間ほimmunity, Science, 337, 816 (2012).

どの手間を要するため，本ゲノム編集の律速となってい６）Ishino, Y. et al.: Nucleotide-sequence of theた．そこで，煩雑なベクター構築作業を省くため，酵iap gene, responsible for alkaline-phosphatase

母の Gap Repair Cloning (GRC) 法を採用した．相同領

isozyme conversion in Escherichia coli , and

域をそれぞれ両端に有する DNA 断片を酵母に導入する

identiﬁcation of the gene-product, J. Bacteriol.,と，酵母内で GRC によりプラスミドが自動的に構築さ169, 5429 (1987).

．GRC を用いてベクター構築段階を省略すれた（図11）７）Barrangou, R. et al.: CRISPR provides acquired

ることで，酵母などの場合は，CRISPR/Nickase による

resistance against viruses in prokaryotes, Sci-

変異体構築法により最短 5 日で CDC25 変異株を含む

ence, 315, 1709 (2007).

様々な変異酵母を正確で高効率に作製することができた．

８）DiCarlo, J.E. et al .: Genome engineering in

開発した CRISPR/Nickase システムでは，CRISPR/

Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas

Cas9 の欠陥をすべて超越し，より正確に，理論上，ほsystems, Nucleic Acids Res., 41, 4336 (2013).

ぼゲノム全域を編集できる．これにより，ゲノム上のほ９）Satomura, A., et al.: Precise genome-wide base

ぼすべての SNPs の修復編集が可能になるとともに，逆

editing by novel CRISPR/Nickase system, Scien-に，目的通りの SNPs の導入も可能になり，これからのtific Reports, 7, 2095 (2017).

９）．
ゲノム科学の発展に貢献できると考えられた（図12）

今後さらに，動物細胞にも展開することにより，ゲノ
ム上のほぼすべての SNPs の修復編集が可能になるとともに，SNPs による遺伝病のゲノム疾患の修復による遺伝子治療の発展にも貢献できると考えられた．

文献１）Satomura, A. et al.: Environmental stress tolerance engineering by modiﬁcation of cell surface
and transcription factors in Saccharomyces cere-visiae, Curr. Environ. Eng., 1,149 (2014).
２）Satomura, A. et al.: Acquisition of thermotolerant yeast Saccharomyces cerevisiae by breeding
via stepwise adaptation, Biotechnology Progress,
29, 1116 (2013).
３）Satomura, A. et al.: Reconstruction of thermotolerant yeast by one-point mutation identiﬁed
through whole-genome analyses of adaptivelyevolved strains, Scientific Reports, 6, 23157(2016).
４）Gaj, T. et al.: ZFN, TALEN, and CRISPR/Casbased methods for genome engineering, Trends

Biotechnol., 31, 397 (2013).


総

説

Hermansky-Pudlak syndrome (HPS)の病態と遺伝子変異加藤慎也＊，五 十 川

健 太＊，渡

邉

実

夢＊，竹

森

洋＊

主に細胞外から取り込まれた各種因子の分解機能を担っ

１．はじめにHermansky-Pudlak Syndrome (HPS) は，1959 年にている７,８）．エンドサイトーシスは細胞外因子を取り囲初めて報告された常染色体劣性遺伝性疾患群である１）．

むように小胞を形成し，その小胞は初期エンドソームを

HPS 患者は共通の病態として，眼皮膚白皮症 (Oculo-

構成する．その後，初期エンドソームは後期エンドソー

cutaneous Albinism, OCA) を 発 症 す る２）． こ の 病 態

ムへと変換され，リソソームと融合することで内包されは全身のメラノサイトにおけるメラニン色素の合成低た因子を分解する．リソソーム内での因子分解に機能す

下によるものであり，メラニン色素合成の場である細る酵素は，タンパク翻訳の場である小胞体，ER から一胞内小器官メラノソームの成熟異常を認める．メラノ

旦ゴルジ体に輸送され，その後，初期及び後期エンドソー

ソームは起源の一部を伴にするリソソームの関連小胞ムへと輸送される．この間，エンドソームは融合と分裂（Lysosome-Related Organelles: LRO） に 分 類 さ れ，を繰り返すことで，それぞれの因子及び分解酵素を正し

HPS 患者では LRO へのタンパク質輸送系に異常を認め

く，リソソーム分解系路へと導く．

る３）．このタンパク質輸送系の異常が，HPS 患者での一方，エンドソームの一部はリソソームとの融合前にメラニン色素の合成低下の原因である．同様な病態に一部が分離して，再度，細胞膜表面へと輸送される９）．

Chediak-Higashi Syndrome (CHS) が挙げられる．

細胞表面到達後は，エクソサイトーシスを介して細胞膜

HPS 患者でみられる LRO へのタンパク質輸送系異タンパク質として局在するか細胞外へ因子を放出する．

常に伴う他の病態としては，血小板濃染顆粒を含む分このように，エンドソームは因子の分解と分泌の双方に泌 顆 粒 の 機 能 不 全 が 挙 げ ら れ る． そ の た め，HPS 患

関与する細胞内小胞として機能し，エンドソームの形成者の多くは，血小板機能低下に起因する出血傾向が観及び輸送異常は様々な病態に関連する．

察される．この病態は，セロトニンなどの血小板濃染

LRO はゴルジ体－エンドソームから分離され，主に分泌顆粒内容物の低下による血小板放出異常症（δstorage

系路へと導かれた小胞である．これら分泌小胞は，細胞特pooldeﬁciency:δSPD）と呼ばれる４）．一方，リソソー

異的な役割を付与され，そのもので機能構成単位を構成す

ムそのものの異常としては，不要な物質の除去不全に伴ることから，細胞内小器官に分類される．メラノサイト以外

う，骨髄などの組織の網内系細胞へのセロイド様物質のの LRO の例としては，血小板濃染顆粒，主要組織適合遺沈着が挙げられる３）．

伝子複合体（MHC）を介した抗原提示機能を有する小胞，

HPS 患者では，OCA 及び SPD に加え，水平方向の免疫系の顆粒球やナチュラルキラー（NK）細胞などの眼振が共通に認められることも特徴である ．本稿では，

溶菌性顆粒，Ⅱ型肺胞上皮細胞から分泌されるサーファ

これまで報告されている各 HPS の遺伝子変異及び HPS

クタント集合体であるラメラ体の小胞が挙げられる10）．

５）

サブファミリーごとの病態をまとめる６）．
３．メラノソーム形成とメラニン合成
２．リソソームと LRO
リソソームは真核生物の細胞内小器官の一つであり，メラニンはメラノソーム内で基質であるチロシンから生合成される．この合成は，チロシナーゼ（Tyrosinase）＊岐阜大学工学部化学・生命工学科

総説－ Hermansky-Pudlak syndrome (HPS) の病態と遺伝子変異や Tyrosinase-related protein-1 (TRP-1) が 触 媒 にる11－13）．最後に，Adapter Protein-3 (AP-3) の働きに働く10）． メ ラ ノ ソームはトランスゴルジネット ワ ー

より Tyrosinase がメラノソームへと輸送され，成熟ク（TGN) の 一 部 が 分 離 し て 形 成 さ れ， ま ず は 極 未（Stage IV）メラノソームでメラニンが合成される14）．

成熟 (Stage I) メラノソームを構成する．この過程になお，Tyrosinase は BLOC-2/3 関与の小胞輸送でもメ

Biogenesis of Lysosome-related Organelles Complex

ラノソームへ運ばれるとされている．

(BLOC)-1 と呼ばれるタンパク質複合体が関与し，膜表

成熟メラノソーム内で合成されたメラニンは，メラノ

面上でクラスリン被覆による膜の一部の隔離から始まソームごとメラノサイトから放出され，隣接するケラチ

る． な お，Stage I メ ラ ノ ソ ー ム に は，Tyrosinase やノサイトへと取り込まれる．ケラチノサイトへ取り込ま

TRP-1 は含まれていない ( 図１)．

れたメラノソームは核近傍に配置され，紫外線からの続いて，Tyrosinase の触媒活性に必要な Cu2＋ のト

DNA 損傷を防ぐ役割を担う．すなわち，メラノソーム

ランスポーター である ATP7A, Cl チャネルと示唆さも細胞内小器官のみならず，分泌小胞として機能していれる OCA2 や，膜融合に関与する Syntaxin, TRP-1 なる15,16）．

－

どを含有した初期エンドソームが Stage I メラノソー

HPS はこれら BLOC1 ～ 3 及び AP-3 を構成する因子

ムと融合することで Stage II/III メラノソームへと成に異常があるため，メラニン合成に異常をきたす．また，熟する．この過程には BLOC-2 及び BLOC-3 が関与す他の LRO の機能不全に起因する病態を併発する２）．

図１

各 HPS が属するタンパク質複合体と細胞内小胞の形成及び成熟

BLOC: Biogenesis of lysosome-related organelles complex, BLOS: BLOC-1 subunit, TGN: Trans Golgi Network,
TRP-1: Tyrosinase-related protein 1, LYST: Lysosomal trafficking regulator, AP-3: Adapter Protein 3 (LAMP-1:
Lysosomal Membrane Associated glycoproteins), ATP7A: copper-transporting P-type ATPase（銅輸送タンパクト
ランスポーター ). 以下 , Blos1, Blos2, cappuccino, snapin, muted はマウス変異体の名前 . OCA2 は Cl－トランスポー
ターと示唆されている . Rab32/38 は BLOC3 とともにメラニン合成酵素の輸送に関わる . LYST は , 後期エンドソームとリソソームの融合や分裂に関わる Chediak-Higashi Syndrome の責任遺伝子 .

10

総説－ Hermansky-Pudlak syndrome (HPS) の病態と遺伝子変異されている17）．また，HPS １はプエルトリコ以外にも

４．HPS の全体像
HPS はプエルトリコでの有病率が最も高く，約 1800

世界中で報告がされており，南ヨーロッパやインド，ア人に 1 人の割合で発症する17）．この数字から，異常なジアなどの地域で報告確認されている．HPS1 の占める遺伝子の保因者は約 21 人に 1 人と計算される．これま割合は，全 HPS の約 50% と言われている．日本におい

でに，HPS は 1 ～ 10 までのサブタイプが報告されておては HPS1, 4, 6, 9 が報告されていたが 23），最近の我々り，それぞれの責任遺伝子の産物は，図１の４つの異なの調査で，新たに HPS5 を同定した24）．以下に，現在る複合体，BLOC-1 ～ 3 及び AP-3 の構成因子として機までに報告されている各 HPS の遺伝子変異部位を病態能する2,18－22）．

順に説明する．

そ れ ぞ れ の 複 合 体 を 順 に ま と め る と，BLOC-1 はHPS7, 8, 9 が，BLOC-2 は HPS3, 5, 6 が，BLOC-3

５．HPS1/4 (BLOC-3) 変異は HPS1, 4 で 構 成 さ れ て い る． ま た，HPS2, 10 はHPS1 及び４タンパク質は BLOC3 構成因子である．

Adapter protein 3 (AP-3) の構成因子である．これら複HPS1 患者（図２）は，OCA 及び SPD の病態に加え，合体構成因子はヒトで全ての遺伝子異常が同定されてい８割を超えて肺線維症を発症する25）．肺組織においてる訳ではなく，マウスのみで変位が同定されている因子

は，リン脂質の沈着とⅡ型肺胞上皮からのサーファクタ

もある．これらタンパク質複合体が，メラノソームのみ

ント蛋白分泌異常に関連した肥大化ラメラ体が観察されならず，血小板濃染顆粒，アズール顆粒などの LRO 形成・る．これらの沈着は，分泌小胞の異常を示唆する．視覚成熟や，それに関わる細胞内小胞輸送に関与する．一方，系に関して，光彩及び網膜色素の色素量は必ずしも皮膚

HPS 遺伝子産物の機能欠損により生じる病態・症状にとの相関は無い．一方，水平方向の眼振が特徴的であは，属する複合体ごとで共通性が見受けられる．

る 2,26,27）．

BLOC-3 機 能 欠 損 で あ る HPS1, 4 は HPS の 中 で 最肺異常の発症及び病態進行は CT 撮影が利用され，30も症状が重篤とされ，特発性間質性肺炎及び肺線維症

歳半ばで発症することが多いと報告されている．また，や肉芽腫性大腸炎などを発症する17）．AP-3 機能欠損

平均死亡年齢は 30 歳後半とされる28）．しかし，個々の HPS2, 10 もやはり重篤な病態を発症する．一方，のケースでそれぞれの時期も大きく異なり，喫煙やイ

BLOC-2 機能欠損である HPS3, 5, 6 は比較的症状が軽ンフルエンザへの感染などの生活環境の影響も大きい．

いとされる．また，BLOC-1 機能欠損である HPS7, 8,

HPS1 患者の肺疾患に対しては，特発性肺線維症の治療

9 の症例報告は少ないが，軽症に分類される．

に利用されるピルフェニドン（Pirfenidone）が処方さ

HPS の中では HPS1 が最も症例報告が多く，プエル
トリコでは HPS の約 25% が HPS1 であることも報告れることもある29）．
HPS1 患者の SPD に伴う出血傾向は多くの場合，新

図２ HPS1/4 遺伝子変異 . 灰色：翻訳領域 . 太字は日本人 .

11総説－ Hermansky-Pudlak syndrome (HPS) の病態と遺伝子変異

生児期の歩行開始時期に検出される．止血までにかかるのそれぞれβ3A 因子及びδをコードする AP3B1 及び時間は＞１時間のこともあり，12 時間以上かかるケー

AP3D1 にある2, 34)．OCA, SPD 及び眼振は他の HPS 患

スもあるとされる．電子顕微鏡像から，血小板濃染顆粒

者と同様である．他の HPS 患者の病態と異なる点は，の欠損が観察される．これらのことから，血液凝固抑制

好中球減少症と再発性感染症が挙げられる．特に呼吸器作用を有するアスピリンなどの薬剤の利用は避けられる．

系への感染症が特徴である．これらの点において，ア

これら病態に加え，HPS1 患者の約 15% では炎症性ズール顆粒を欠損することによる NK 活性の低下が特腸疾患を発症する30）．特徴は大腸特異的な肉芽腫様塊を徴的な CHS に類似している35）．しかし，HPS2 患者で形成する．多くの場合は，外科的治療を必要とする．一は CHS で観察される肥大化細胞内顆粒は見られない．

方，抗腫瘍壊死因子α（TNFα）抗体のインフリキシマ

HPS2 患者の易感染に対しては，予防的な抗生物質投与

ブが有効であった例も報告されている31）．

や G-CSF 投与を行うこともある．

HPS4 患者の病態は HPS1 患者に近く，OCA, SPD，細胞内異常の特徴として，リソソーム系へのタンパク

眼振，肺線維症及び炎症性腸疾患を認める32）．また，マ質輸送不全が挙げられる．AP-3 複合体が他の HPS 因クロファージにセルロイド色素が観察されることが特子が担当するタンパク質輸送系とは別の輸送系に関与徴である．細胞生物学的検討では，HPS4 患者の血小板するため，異常が観察されるタンパク質群に違いが観察において，環状ヌクレオシドの ATP 依存的ポンプであされる．具体的には，リソソーム輸送系の異常に伴うる MRP4 (ABCC4) の細胞内顆粒の局在異常が観察され

CD63 などの細胞膜表面への局在増加と，メラニン合る33）．

成酵素 Tyrosinase のメラノソーム局在低下が観察される3,36,37）．一方，TRP1 のメラノソーム局在は正常である点が特徴である．しかし，実験動物の生体レベルでの６．HPS2/10 (AP-3) 変異
HPS2/10 患者の遺伝子変異（図３）は，AP-3 複合体

研究では，AP-3 複合体欠損でもメラニン合成は正常で

図３ HPS2/10 遺伝子変異 . 灰色：翻訳領域 .

12

総説－ Hermansky-Pudlak syndrome (HPS) の病態と遺伝子変異あることも示されており，特殊な培養環境下においてＡれた21, 34）．症例数が限られていることもあり個別事例とP-3 機能不全が Tyrosinase のメラノソームへの局在不なるが，HPS2 と同様な病態を示す．特に，免疫系の異全に繋がる可能性も示唆される38）．また他因子への影響常が共通の特徴であり，NK 細胞の脱顆粒異常も観察さとしては , トランスフェリン受容体やマンノース 6 リン

れる．血中 IgE レベルが高値であることも特徴である．

酸受容体の細胞膜発現異常も示唆される39）．

HPS2 患者同様に HPS10 患者も神経系の異常を来たし，

HPS2 患者の易感染に相関する現象として，細胞障発作が見受けられる．

害性Ｔ細胞の運動障害を含めた機能低下も挙げられ，
血球貪食性リンパ組織症も特徴の１つである．これら

７．HPS3/5/6 (BLOC-2) 変異

は，CHS 及び細胞内輸送に関わる G- タンパク質である

HPS3/5/6 タンパク質は BLOC-2 を構成しており (図４)，

RAB27A 遺伝子欠損による Griscelli 症候群に類似する．

免疫組織化学染色でもこれらタンパク質の共局在が報告

免疫系異常に加えて，神経系の異常も報告されており，されている．HPS3/5/6 患者の病態は比較的軽症とされ，バランス感覚や聴覚の異常も見受けられる37）．

類似点も多いため，まとめて紹介する23,24,40－42)．患者はHPS10 患者は HPS サブタイプとしては最後に同定さ北ヨーロッパで同定されることが多く，日本では HPS5

図４ HPS3/5/6 遺伝子変異 . 灰色：翻訳領域 . 太字は日本人

13

総説－ Hermansky-Pudlak syndrome (HPS) の病態と遺伝子変異と６に各１名が認められている．これらの患者の OCA

HPS7/8/9 遺伝子には，殆ど変異は同定されていない２）．

の度合いも HPS1 と比較して軽度である．HPS5/6 患者

HPS7/8/9 の患者は他の HPS 患者同様に OCA, SPD

においては眼振がみられる２）．

及 び 眼 振 の 病 態 を 発 症 す る19, 20, 23）．HPS8 の 患 者 のま た， こ れ ら 患 者 で は 軽 症 で は あ る が，SPD の 特

OCA は不完全型と判定されている．SPD に関しては時徴である打撲による内出血や鼻血傾向が特徴である．

に輸血を行ったとある．HPS9 患者の OCA に関しては，

HPS3 患者では僅かながらの肺機能低下も観察される皮膚は白く，髪毛のコア部分のメラニン色素も低沈着がが，HPS5/6 患者においては殆ど観察されない．また，報告されている．一方で，眼の光彩は茶色とあり極端な

HPS3/5/6 患者では炎症性腸疾患を発症することもあ

メラニン色素欠乏とは言えない．これら HP7/8/9 患者

る27, 43）．HPS5 患者では，血中コレステロール値の上昇の肺の異常は報告されていないが，HPS7 患者は呼吸のや，僅かな中性脂肪値の上昇も観察される．これらが，間隔が短いとされている．また，HPS7 患者では大腸に小胞輸送系の異常によるものか否かは不明である．

肉芽腫が観察されたとある．

８．HPS7/8/9 (BLOC-1) 変異

９．ヒトとマウスの共通点・相違点

HPS7/8/9 タ ン パ ク 質 は BLOC1 複 合 体 の 因 子 で あ

マウス遺伝学の分野においても，毛色の異常を指標る．この BLOC1 複合体を構成するタンパク質をコードに HPS 関連の自然発生突然変異体が数多く分離されてする遺伝子の変異は，ヒトで全て同定されている訳でいる37）．マウスはヒトとは異なり，統一した遺伝的背はない ( 図５)．図１に示すように，マウス変異体のみ

景のもとで個々の遺伝子変異を比較できる．そのため，もしくは人為的変異体でのみ表現型解析されている状

BLOC-1 ～ 3 及び AP-3 間の相互関係を毛色表現型及び況にある．また，他の HPS サブタイプ遺伝子と異なり他の病態で詳細に比較できる．

図５ HPS7/8/9 遺伝子変異 . 灰色：翻訳領域 . 太字は日本人 .

14

総説－ Hermansky-Pudlak syndrome (HPS) の病態と遺伝子変異

マウス系統 C57BL/6 の遺伝背景において，メラニ

ヒト HPS 患者における重篤な病態に肺線維症が挙

ン色素沈着が低下する表現型は，BLOC-1 に異常を有げられる45,46）．しかし，マウスでは肺線維症は単独のする変異体群が顕著であり，次いで BLOC-2 変異体群

Hps 変異では発症しない47）．詳細な検討により，マウが 続 く38）． 一 方，BLOC-3 異 常 と AP-3 異 常 の 変 異 体

ス Hps1 変異で僅かに肺胞異常が示唆されている．この群は，大きな色素沈着異常は見受けられない．しかし，異常は Hps1/Hps2 の 2 重変異とすることで，肺胞上皮

BLOC-3 変異と AP-3 変異が重なると，BLOC-2 変異に細胞で肥大化ラメラ体が観察される異常として検出で近い低色素沈着を示す．一方，BLOC-3 変異と BLOC-2

きるようになる47）．このことは，マウス毛色において変異が重なっても，BLOC-2 単独変異で観察される低

BLOC-3 変異と AP-3 変異が重なることで低色素症の表

色素沈着表現型を大きくは変化させない．このこと現型が現れる状況に一致する．

は，AP-3 と BLOC-3 は全く異なる系路で機能するが，加えて，ヒト HPS1 (BLOC-3 変異) 患者でみられる炎BLOC-2 と BLOC-3 とは作用系路が近いことを示唆す

症性腸疾患は，マウスでは観察されない27）．しかし我々る．

は，飼育マウス集団に，低色素症で仔を保育中に頻繁にヒト HPS 患者では，全例において OCA が観察され下痢をするマウス集団を見出した．マイクロサテライトる２）．また，元々は全てのマウス変異体も，毛色変異

解析及び遺伝子配列確認の結果，Hps5 遺伝子に変異を体として単離された経緯がある．そのため，茶色個体有することが明らかとなった48）．しかし，それまでに同（野生色：例えば C3H の遺伝的背景）では全ての Hps

定されている複数の Hps5 変異マウスでは，下痢の報告

変異マウスで低色素沈着が観察される44）．すなわち，は無かった．そこで，飼育環境の違いも考慮して，デキ

C57BL/6 の遺伝背景では Hps 変異の表現型が現れにく

ストランサルフェート誘導性の炎症性腸疾患モデルで確いと示唆され，ヒト病態の重篤度における遺伝的背景の認した．その結果，Hps5 マウスは雌雄を問わず慢性の関与も示唆される．

炎症性腸疾患に移行することが判明した（図６）．その図６

マウス Hps5 変異体で観察される大腸肉芽腫．

A. 左から C57BL/6J（野生型），C3H/HeJ（野生型），C3H/HeJ（Hps5 変異体）
．B. 生後直後の眼の色素異常（右 :Hps5 変異体）．C. Hps5 変異雌の保育中の糞便（下痢）．D. Hps5 変異体（Mut）のデキストランサルフェート誘導後に慢性化した炎症性腸疾患（大腸肉芽腫）．矢印は筋層破壊部分．

15

総説－ Hermansky-Pudlak syndrome (HPS) の病態と遺伝子変異

病態は，ヒト HPS 患者同様に大腸に肉芽腫を形成する

Pudlak syndrome-A case series, Eur J Haema-

ものであった．これらのことは，HPS の病態は遺伝的

tol., 102, 432 (2019).

背景や生活環境に大きく左右されることを示唆するものである．

５）Summers, CG. et al.: Hermansky-Pudlak syndrome. Ophthalmic findings, Ophthalmology.,
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10．おわりに６）Nakamura, M. et al.: Mutant laboratory mice

HPS は低色素症である OCA を特徴とする症候群であwith abnormalities in hair follicle morphogen-る．その原因は，エンドソームのタンパク質輸送異常に

esis, cycling, and/or structure: an update, J

よるものであり，メラノソームも属する LRO に異常を

Dermatol Sci., 69, 6 (2013).

来すことで，免疫系，呼吸器系，消化器系にも病態が

７）Raposo, G. et al.: Lysosome-related organelles:

現れる．一方で，ヒトとマウスの HPS 病態の比較から，

a view from immunity and pigmentation, Cell

病態発症には他の遺伝要因や環境因子が左右することもStruct Funct., 27, 443 (2002).

明らかである．

８）Yordanov, TE. et al.: Biogenesis of lysosome-

このことを逆にとらえると，HPS 患者の病態は外的related organelles complex-1 (BORC) regulates

要因で制御可能であることを示唆する．そこで我々は，late endosomal/lysosomal size through PIKfyve-

低分子化合物で HPS 患者病態を軽減もしく治療できる

dependent phosphatidylinositol-3,5-bisphos-のではないかと考え，メラニン合成を修飾し抗炎症作用

phate, Traffic., 20, 674 (2019).

を発揮する化合物をスクリーニングした．これまでに，

９）Cullen, PJ. & Steinberg, F.: To degrade or not to

HPS と同様に Tyrosinase や CD63 を低下させる化合物

degrade: mechanisms and signiﬁcance of endo-

及び，小胞輸送系を促進し炎症性腸疾患を緩和させる興cytic recycling, Nat Rev Mol Cell Biol., 19, 679

味深い化合物群の取得に成功している．今後は，これ(2018).

ら化合物の HPS 特異的な細胞内輸送への影響を検討し，₁₀）Delevoye, C. et al.: Lysosome-related organelles

ケミカルバイオロジー的視点から，細胞内小胞輸送系のas functional adaptations of the endolysosomal

新たな機構の解明とそれら異常による病態を改善する方

system, Curr Opin Cell Biol., 59, 147 (2019).

法の開発に取り組む予定である．

₁₁）Gerondopoulos, A. et al.: BLOC-3 mutated inHermansky-Pudlak syndrome is a Rab32/38

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18

総

説

低酸素応答による末梢神経の髄鞘形成制御
伊野部

智 由＊

ビキチン鎖に非依存的に分解される蛋白質はどのように

１．はじめに細胞内の蛋白質濃度は，合成だけでなく分解によって分解されるのか？

Unstructured 領域のない蛋白質はも制御される．真核細胞のサイトゾルや核では，このよ

どのように分解されるのか？

これらの疑問に対する答

うな分解の多くはユビキチン - プロテアソームシステム

えが，最近の構造学的，生化学的研究により明らかになっ（UPS）によって行われる．UPS のコアとなるプロテアてきている．さらにこのような新たな知見に基づいた，

ソームは巨大蛋白質複合体の分解装置であり，単にミス

蛋白質分解の制御方法も次々と考案されている．

フォールドしたりダメージを受けた蛋白質を分解するだ
けでなく，数百にも上る細胞機能の調節蛋白質の濃度を２．プロテアソーム

制御している．したがって，プロテアソームは分解すべ

プロテアソームは 20S コア粒子（CP）と制御粒子（RP）

き蛋白質と，分解すべきでない蛋白質を厳密に見分けてに分けられる．
20S CP は７量体リングが４つ積み重なっいる．本稿では，プロテアソームの厳密な基質認識のメた円筒形をしており，内側の２つのβリングは大きな内カニズムについて，最近の研究進捗状況を概説する．さ

部空洞を形成し，各リングの３つのβサブユニットは蛋らに新規基質認識メカニズムを利用した，人工的な分解

白質分解活性を持つ．αリングはβリングを挟み込むよ制御方法についても概況を述べる．

うに配置され，αリングの上部の孔を介して，βリング

プロテアソーム基質選択の基本メカニズムが，ここ十の形成する蛋白質分解内腔ににつながっている．αリン

年ほどで明らかとなってきた．33 個の異なるサブユニッ

グからβリングにつながるチャネルは狭く，折りたたま

トよりなるプロテアソームは，３つの異なるアミノ酸配れた蛋白質は通過できない．遊離 20S CP では，さらに列特異性を持った分解活性部位を内包し，様々な蛋白質

αサブユニットのＮ末端がチャネル入口をゲートのようを分解することができる．分解活性部位は外部から隔離にふさぐため，小さなペプチドでさえも分解が阻害されされた内腔にあることから，プロテアソームは基質の分る．

解活性部位へのアクセスを制御することにより，その分

αサブユニットＮ末端のゲートを開放させる RP に

解機能を制御している．プロテアソームの標的となるほ

よって，20S CP は活性化される．４種の RP が知られ

とんどの蛋白質は，ユビキチン分子により標識されていているが，その中で最もよく理解され分解に関わっている．プロテアソームはユビキチンシグナルを認識し，蛋るのは 19S RP である．19S RP は 19 個のサブユニッ

白質の非構造領域（Unstructured 領域）から分解を開トから構成され，約 900 kDa の分子量をもつ．20S CP

始する．基質蛋白質は Unstructured 領域から順次アンに１個あるいは２個 19S RP が結合した複合体は 26S

フォールドされ，分解活性部位まで送られる．このようプロテアソームとよばれ，細胞内プロテアソームの一般なプロテアソームの基質認識メカニズムが明らかになっ的な形態となる．19S RP が基質蛋白質を認識し，それてきたが，依然として多くの疑問が残っている． 例えをアンフォールドして CP に送り込むことにより，蛋白ば，プロテアソームはどのようにして蛋白質複合体の一質の分解･断片化が起こる．

つのサブユニットだけ分解することができるのか？

ユ

高解像度の 26S プロテアソームの構造は長らく不明＊富山大学学術研究部工学系

19

総説－ Unstructured 領域から始まるプロテアソームによる蛋白質分解であったが，最近の電子顕微鏡技術の発展により，20S

３．ユビキチン化

CP に結合した 19S RP の高解像度立体構造が明らかと

プロテアソームにより分解される蛋白質のほとんどなり，プロテアソーム研究に大きなブレークスルーが起は，ユビキチン標識によってプロテアソームにターゲきている１）．

ティングされる．ユビキチン活性化酵素（E1），ユビキ

19S RP の心臓部は，基質をアンフォールドし 20S CP

チン結合酵素（E2），ユビキチンリガーゼ（E3）の連続に送り込むモーターとして働く６つの ATPase サブユ

的な働きにより，ユビキチンが標的蛋白質に取り付けらニット（Rpt1-Rpt6）のリングである．ATPase サブユニッ

れる．ほとんどの場合，ユビキチンＣ末端カルボキシル

トリングの中心の ATPase チャネルは 20S CP のチャネ

基はリジン残基のεアミノ基とイソペプチド結合を形成

ルに続き，基質蛋白質の通り道となる．ATPase サブユ

するが，基質Ｎ末端アミノ基やシステイン残基に結合すニットのＣ末端部は 20S CP にドッキングし，20S CP

ることもある．最初に結合したユビキチンのリジン残基のゲートを開かせる．19S RP には，ATPase サブユニッに２番目のユビキチンが結合し，さらに３番目４番目のトリングを基盤として，３つのユビキチン受容体（Rpn1,

ユビキチンが同様に前のユビキチンに結合してポリユビ

Rpn10, Rpn13）や，脱ユビキチン化活性をもつサブユ

キチン鎖を形成することが多い．また標的蛋白質の複数ニットが集合している．３つのユビキチン受容体は連箇所にユビキチンが結合することもある．細胞内にはユ携してユビキチン化蛋白質を認識する．認識されたユビキチン鎖を除去する脱ユビキチン化酵素（DUB）もビキチン化蛋白質が ATPase サブユニットの作用により多数存在し，ポリユビキチン鎖の形成と同時にユビキチ

ATPase チャネルに引き込まれると，チャネル上部に位ン鎖の除去も行われている．

置する脱ユビキチン化活性をもつ Rpn11 によってユビ

酵母細胞内では数千もの蛋白質がユビキチン化される

キチン鎖が除去される．このように蛋白質分解に必要なものの，その半分ほどはプロテアソームにより分解され活性は，プロテアソームの長軸チャネルに沿って順番にるわけではない．48 番目の Lys 残基を介して４つ以上並べられている．19S RP の残りの部分は７量体を形成のユビキチンが結合したポリユビキチン鎖が，プロテア

し，ATPase リングを側面から覆うように，Rpn2 およ

ソームによる分解のシグナルであると長らく信じられてびユビキチン受容体 Rpn10 と，20S CP のαリングときた．一つのユビキチンが結合するモノユビキチン化や相互作用してクランプのように働いている．このクラン

ユビキチンの 63 番目の Lys を介して連結したポリユビ

プは 19S RP と 20S CP の結合を安定化させるとともに，キチン鎖は膜輸送に関係している．またユビキチンのＮ

19S RP と 20S CP の間のアロステリックな機能調整に末端とＣ末端が連結した直鎖状ポリユビキチン鎖はシグ

関わっていると考えられる．電子顕微鏡像や生化学的実

ナル伝達に関わっている．分岐したユビキチン鎖も見つ験により，ATP の結合や加水分解が 26S プロテアソー

かっており，Lys63 連結鎖と Lys11 連結鎖の分岐ポリ

ムの大きな立体構造変化をもたらし，基質認識から分解

ユビキチン鎖は細胞周期の制御に関与している．しかしに至るまでの各ステップを制御していることが分かってながらユビキチン鎖の区別は厳密ではなく，Lys63 連結

きている１）．

ポリユビキチン鎖や複数のモノユビキチン修飾は，特定

プロテアソーム構成サブユニットに加えて，プロテアの条件でプロテアソームによる分解のシグナルとなる．

ソームに一時的に結合する，脱ユビキチン化酵素 Ubp6

最近の研究によって，細胞内のプロテアソームは直接ポ（哺乳類では USP14）および UCH37 や，シャトル因子

リユビキチン化蛋白質を捕捉して分解するのではなく，

Rad23 (HR23A / B), Dsk2 (UBQLNs), Ddi1 (DDI1/2)

多くが上流因子やシャトル蛋白質を介してプロテアソー

が，分解において補助的な役割を果たす．さらにプロテムに受け渡され分解されることが分かった．上流因子

アソームは，Cdc48 (p97/VCP) などの上流因子とも協Cdc48 のコファクターである Npl4 がプロテアソーム

力している．

の Lys48 連結ユビキチン鎖の選択性を決定しているら
しい２）．

20

総説－ Unstructured 領域から始まるプロテアソームによる蛋白質分解

４．第二のプロテアソーム分解シグナル

Unstructured 領域の疎水性と電荷，柔らかさが分解と４－１．Unstructured 分解開始領域関係があることが分かった．即ち疎水的で非極性で堅い

プロテアソームは，ポリユビキチン鎖を介して基質をUnstructured 領域は効率的な分解を誘導し，親水的で認識し結合するが，分解は基質にあるフラフラと特定構

酸性でゆらぎの大きな柔らかな Unstructured 領域は分造をとらない Unstructured 領域から開始する．基質蛋解を誘導しない６）．

白質は，ユビキチン鎖を介して 19S RP に認識されると，実際プロテアソームによる分解をまぬがれることがATPase チャネルに引き込まれ，アンフォールドされる．

出来る蛋白質の Unstructured 領域のアミノ酸配列にはその後，アンフォールドされた基質は 20S CP に送り込偏りがある．例えば E2 酵素である Cdc34 は，ポリユ

まれ分解される．ATPase チャネルは小さな蛋白質でもビキチン化され，Ｃ末端に長い Unstructured 領域を入り込めないほど狭いため，最初に入り込むことがで持つのにもかかわらず，分解を免れる．その Unstruc-

きるのは Unstructured 領域だけであり，Unstructured

tured 領域は酸性アミノ酸残基に偏った配列になって領域がアンフォールディング反応の開始起点となる３）．

い る た め，Unstructured 領 域 か ら の 分 解 開 始 が 阻 害

Unstructured 領域は，古細菌や細菌のプロテアソーム

さ れ た の で あ ろ う．Cdc34 や， 同 じ く 偏 っ た 配 列 のホモログの基質にある分解シグナルと同じ働きをするとUnstructured 領域をもつ Rad23 に，偏りのない複雑な考えられる．プロテアソームでは ATPase チャネル入口

組成の Unstructured 領域を取り付けると，効率的に分から約 30 ～ 40 Å のところにある，リング内側に並ん解されるようになったことから，分解を誘導するためにだ可動ループにより Unstructured 領域が認識される．

は複雑なアミノ酸組成を持つ Unstructured 領域が必須

可動ループに到達するには，少なくとも 20 ～ 30 アミであるといえる５）．

ノ酸残基の長さの Unstructured 領域が必要となる．こさらなる確証を得るために，マウス蛋白質約 6000 種の必要な長さは，モデル基質を用いた in vitro 分解実験類において，その寿命（半減期）と Unstructured 領域の結果と一致する ．このように Unstructured 領域がのアミノ酸配列の関係のバイオインフォマティックス解ATPase 可動ループに認識されると，そこを起点にポリ析を行った．その結果，蛋白質末端に複雑なアミノ酸

ペプチド鎖に沿って引張り力が加えられ，蛋白質は順次配列の Unstructured 領域をもつ蛋白質の寿命は，末端

アンフォールドされ，20S CP に送り込まれて分解されに Unstructured 領域を持たない蛋白質より４～８時間

る．

ほど短いことがわかった．一方末端に偏りのあるアミノ

４－２．Unstructured 分解開始領域の特徴

酸配列の Unstructured 領域を持つ蛋白質は，持たない４）

効率的な分解には Unstructured 領域が必要である

蛋白質に比べ，ほとんど寿命の差は無い．このことからが，十分な長さの Unstructured 領域とプロテアソーム

細胞内蛋白質のプロテアソームによる分解の受けやすさ

結合ドメイン（ポリユビキチン鎖など）の両方を持つ

も，Unstructured 領域のアミノ酸配列の複雑さから説のにもかかわらず，プロテアソームにより分解されな明することができる５）．

い蛋白質がいくつかある．分解されない蛋白質と分解

このようなプロテアソームの Unstructured 領域配列

される蛋白質の Unstructured 領域のアミノ酸配列にの嗜好性は，ATPase チャネルの特性に由来すると考えは，何らかの違いがあると予測される．そこで我々はられる．疎水的な配列は疎水的な可動ループに認識されUnstructured 領域のアミノ酸配列について，その分解やすい．酸性アミノ酸残基は負に帯電した ATPase チャ

誘導効果を調べた．まず十数個のアミノ酸配列を調べた

ネルの内壁と反発するだろう．また堅い Unstructured

ところ，配列の複雑度と分解の受けやすさの間に相関が領域はフラフラと逸れることなくチャネルをくぐり抜あることを見いだした．つまり複雑なアミノ酸配列かけ，ATPase 可動ループに到達することができるだろう．

ら構成される Unstructured 領域をもつ蛋白質だけがプ認識に適した多様な特徴を持ち合わせた配列は，自然とロテアソームによって分解される ．さらに数百に及ぶ複雑度の高い配列になるのであろう．

５）

アミノ酸配列を調べたところ，配列の複雑度に加えて，

プロテアソームは，基質蛋白質のポリユビキチン鎖21

総説－ Unstructured 領域から始まるプロテアソームによる蛋白質分解と Unstructured 領域の両方を認識して初めて効率的にUnstructured 領域の性質はユビキチン鎖以上に重要で基質蛋白質を分解する．そのため基質蛋白質上でのポあることがうかがい知れる．

リユビキチン鎖のようなプロテアソーム結合ドメインと Unstructured 領域の立体的な配置が重要で，プロテアソーム上のそれぞれの受容体の配置と一致する必要

５．プロテアソーム上流因子 Cdc48 によるアンフォー
ルディングがある．この関係は，プロテアソーム結合ドメインと一 部 の 蛋 白 質 の プ ロ テ ア ソ ー ム に よ る 分 解 に は，Unstructured 領域の間に様々な長さのスペーサーを挿Cdc48 (p97/VCP) の補助が必要となる．Cdc48 は，ユ入したモデル蛋白質を用いて実験的に示された４）．プロ

ビキチン受容体として働く調節因子 Ufd1 (UFD1L) や

テアソーム結合ドメインと Unstructured 領域の間の距

Npl4 (NPLOC4) などと協調して働く７）．分解に Cdc48

離が短すぎても，離れすぎていても分解されることはなの助けが必要な蛋白質のほとんどは，膜蛋白質や蛋白質

く，ちょうどそれぞれの受容体の距離に相当するスペー複合体のサブユニットである．実際，Cdc48 は小胞体

サーを入れたときにだけ効率的な分解が観測された．

関連蛋白質分解（ERAD）に関わる蛋白質として知られ

４－３．蛋白質複合体の分解ている．他にも膜結合性前駆体として合成される転写因こ れ ら の Unstructured 領 域 に 関 す る 知 見 に 基 づ子 Spt23 および Mga2 は，Cdc48 依存的にプロテアソー

き，細胞内の蛋白質複合体の分解を説明することがでムにより部分的な分解を受け，膜から遊離し活性化されきる．蛋白質複合体のサブユニット特異的な分解におる８）．

いて，Unstructured 領域の性質は分解の決定要因にな

Cdc48 は，Unstructured 領 域 を 元 々 含 ま な い 強る．サイクリン - サイクリン依存性キナーゼ (Cdk)-Cdk

固な蛋白質をアンフォールドすることができる9,10）．

阻害因子複合体の周期的な構成サブユニットの分解は，Rapoport らは Cdc48 がポリユビキチン鎖に直接働き

Unstructured 領域のアミノ酸配列と位置を考慮するこかけ，ユビキチンからアンフォールドを開始することをとにより説明できる．この三者複合体のうち，一つのサ示した．高解像度の電子顕微鏡による研究で，Lys48 連

ブユニットだけ分解されるのは，そのサブユニットの結ポリユビキチン鎖の一つのユビキチンが，Ｎ末端側か

Unstructured 領域だけが，分解に適切なアミノ酸配列

ら Cdc48 に引き込まれアンフォールドしている様子がをもち，適切な位置に配置されているからだろう．また観察されている10）．このアンフォールディングを起点

ターゲット蛋白質をプロテアソームに運び込む Rad23に，イソペプチド結合を介してつながったユビキチンやなどのシャトルアダプター蛋白質の安定性も説明でき

基質蛋白質が，連鎖的に Cdc48 によりアンフォールド

る．アダプター蛋白質にも Unstructured 領域があるが，されると思われる．

その位置や長さ，アミノ酸配列のいずれかが，上記の効

上 記 の よ う な ア ン フ ォ ー ル デ ィ ン グ に よ り，率的分解のための条件を満たしていない．そのためアダCdc48 は プ ロ テ ア ソ ー ム が 認 識 す る こ と の で き る

プター蛋白質は分解を免れ，ターゲット蛋白質のみ分解

Unstructured 領域を作っているのであろう９）．そのたされるのだろう．

めプロテアソームは，より多くの蛋白質を分解できるよ４－４．ユビキチン非依存的分解基質

うになる．例えば，細胞内においてはユビキチン融合分

ユビキチン非依存的に 26S プロテアソームにより分解経路で分解される緑色蛍光蛋白質のＮ末端にユビキチ解される蛋白質（ODC や Rpn4, APOBEC3G など）も，ンが結合したキメラ蛋白質は，in vitro の系では精製プ分解を引き起こす条件を備えた Unstructured 領域を持

ロテアソームによっては分解されない．しかしながら細ち，実際この Unstructured 領域が分解シグナルとなる．

胞内では，Cdc48 の作用によりアンフォールドされる

おそらくユビキチン非依存的分解基質の Unstructured

ことによりできた Unstructured 領域を起点にしてプロ領域は非常に強く ATPase チャネル可動ループに結合す

テアソームにより分解されるのだろう．一部の古細菌るため，ポリユビキチン鎖が不要なのであろう．このこの Cdc48 は 20S CP と直接複合体を形成し，基質蛋白とからも，プロテアソームによる蛋白質分解において，質の分解に関わっている11）．進化的には元々 Cdc48 は，

22

総説－ Unstructured 領域から始まるプロテアソームによる蛋白質分解

19S RP とは異なる蛋白質群をアンフォールドするための代替 RP として働き，分解に直接関与していたのだろう．

と考えられる．
我々の研究で，ユビキチン化されていない蛋白質でも，人工アダプター蛋白質を介してプロテアソームに６．分解の人工制御

運び込まれ，分解されることがわかった13）．標的蛋白

UPS による蛋白質分解の人工制御方法が，基礎研究

質と特異的に結合する蛋白質と，プロテアソーム結合

だけでなく臨床においても注目されている．実際最も単ドメインを融合したアダプター蛋白質は，標的蛋白質

純な分解制御方法となる，ボルテゾミブやカルフィルゾ

をプロテアソームに運び込み，その分解を促進した．

ミブなどのプロテアソーム阻害剤は，有効なガン治療薬

Unstructured 領域を除くなどすれば，アダプター蛋白として承認されている．しかしながらそのようなプロテ質自身は分解されず，繰り返しターゲット蛋白質をプロアソーム阻害剤は，本来分解されるべき蛋白質の分解ま

テアソームに運びこみ，分解を誘導する．

で止めてしまい，細胞機能に対する影響は大きく，医薬有効な Unstructured 領域を標的蛋白質へ取り付け品としての副作用は無視できない．そのため特定の蛋白

れば，標的蛋白質の分解を誘導することができる．実質を標的にした分解制御方法の開発が求められている．

際，ユビキチン非依存的に分解される蛋白質（ODC な

プロテアソームによる分解のターゲティングは，上述のど）の Unstructured 領域を遺伝的にターゲット蛋白質

ようにポリユビキチン鎖と Unstructured 領域により決に融合した蛋白質は，Unstructured 領域依存的にプロ定される．そのためポリユビキチン化と Unstructured

テアソームにより分解されるようになる．我々は，遺領域の制御による，蛋白質特異的な分解制御方法が注目

伝子改変なしでも，特定蛋白質の分解誘導するために，され，現在盛んに研究されている．

Unstructured 領域ペプチドの標的蛋白質への付加反応

蛋白質特異的なユビキチン化を誘導する proteolysis-を試みている．まずは Unstructured 領域の付加のためtargeting chimeras (PROTAC) をはじめ，さまざまなに，ポリユビキチン化反応を利用した．Unstructured

誘導性分解システムが開発されており，臨床での利用が領域をユビキチンのＮ末端に取り付けた Unstructured

期待されている．PROTAC の場合，標的蛋白質とユビ

領域融合ユビキチンが，ユビキチン化反応により標的

キチンリガーゼとの相互作用を仲介するアダプター小分

蛋白質に結合し，その蛋白質の分解を促進することを確子により，標的蛋白質のポリユビキチン化を誘導し分解認している14）．ケミカルバイオロジー的な手法によりに導く12）．しかしながら，基質蛋白質のどこで，どのUnstructured 領域を任意の蛋白質に取り付けることがようなユビキチン化が起こるのか正確に理解されておらできるようになれば，臨床応用も期待できる．

ず，また取り付けられたポリユビキチン鎖がプロテア分解を引き起こす Unstructured 領域の性質を，リガ

ソームにのみターゲッティングできるかも分からない．

ンドの結合や修飾により変化させれば，特定蛋白質の分

実際，
ターゲット蛋白質に結合しているにもかかわらず，

解を抑制できる15）．我々は Unstructured 領域に結合すターゲットの分解を引き起こさない PROTAC もある．

る小分子や抗体，リガンドにより，特定蛋白質の分解を１つの可能性として，ユビキチン化はされるが，有効な阻害することができることを示した．分解を誘導する

Unstructured 領域を持たないならば，標的蛋白質の分Unstructured 領域は基質蛋白質毎に異なっていること

解誘導は期待できない．したがって，Unstructured 領から，Unstructured 領域を狙った分解阻害方法は，既域による分解開始を考慮に入れた分解制御システムの設

存のプロテアソーム阻害剤等に比べて，遙かに蛋白質特計が必要となる．

異性は高く，今後の応用活用が期待される．

我々は，Unstructured 領域に着目した分解の人工制
御方法の開発を行っている．分解の最終決定因子である

７．おわりにUnstructured 領域のプロテアソームへのアクセスを加最近の UPS の分子メカニズムの研究の結果，UPS

速させたり，阻害したりすることによって，標的蛋白質

による蛋白質の分解が，これまで考えられていた以上の特異的分解制御（分解誘導と分解抑制）が可能になるに複雑で多層的に制御されていることが明らかとなっ23

総説－ Unstructured 領域から始まるプロテアソームによる蛋白質分解

た．ユビキチン標識は蛋白質をプロテアソームに運び

Struct Mol Biol., 22, 214-221 (2015).

込むことができるが，プロテアソームが分解を開始す

６）H, Yu. et al.: Conserved Sequence Preferences

るために Unstructured 領域も認識される必要がある．

Contribute to Substrate Recognition by the

Unstructured 領域認識による分解開始のステップは，Proteasome. J Biol Chem., 291, 14526-14539

プロテアソームがどの蛋白質を分解するかの基質選択(2016).

の最終段階を担っている．プロテアソームが認識する

７）N.O, Bodnar. et al.: Structure of the Cdc48

Unstructured 領域の特徴も次第に明らかとなってきて

ATPase with its ubiquitin-binding cofactor Ufd1-

おり，その特徴は細胞内の蛋白質の安定性に大きな影

Npl4. Nat Struct Mol Biol., 25, 616-622 (2018).

響を与えているらしい．Unstructured 領域をターゲッ

８）D, Xia., W.K, Tang. & Y, Ye.: Structure andトにした人工的な分解制御法の開発も精力的に行われfunction of the AAA+ ATPase p97/Cdc48p.

ており，今後の臨床応用が期待される．しかしながらGene., 583, 64-77 (2016).

Unstructured 領域が細胞内の夾雑な環境下でどのよう

９）N.O, Bodnar. & T.A, Rapoport.: Molecularに機能するかを理解する上では，さらなる研究が必要で

Mechanism of Substrate Processing by theある．Unstructured 分解開始領域の研究は，主にモデCdc48 ATPase Complex. Cell., 169, 722-735

ル蛋白質を使用して行われており，これまでの知見が細e729 (2017).

胞内の蛋白質の分解安定性にもあてはまるか，今後シス₁₀）E.C, Twomey. et al.: Substrate processing by the

テムワイドな研究を行い，注意深く検証する必要がある．

Cdc48 ATPase complex is initiated by ubiquitin

今後のさらなる Unstructured 分解開始領域の研究は，

unfolding. Science., 365, eaax1033 (2019).

細胞機能における Unstructured 領域の役割を明らかに

₁₁）D, Barthelme. & R.T, Sauer.: Identiﬁcation ofし，より深い UPS の蛋白質分解メカニズムの理解と分

the Cdc48•20S proteasome as an ancient AAA+解制御法の開発につながるだろう．

proteolytic machine. Science (New York, NY).,
337, 843-846 (2012).

References₁₂）K.M, Sakamoto. et al.: Protacs: chimeric mol-

１）J.A.M, Bard. et al.: Structure and Function ofecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F

the 26S Proteasome. Annu Rev Biochem., 87,

box complex for ubiquitination and degrada-

697-724 (2018).

tion. Proc Natl Acad Sci U S A., 98, 8554-8559

２）H, Tsuchiya. et al.: In Vivo Ubiquitin Linkage-(2001).

type Analysis Reveals that the Cdc48-Rad23/

₁₃）S, Prakash., T, Inobe., A.J, Hatch. & A, Matous-

Dsk2 Axis Contributes to K48-Linked Chain

chek.: Substrate selection by the proteasome

Specificity of the Proteasome. Mol Cell., 66,

during degradation of protein complexes. Nat

488-502 e487 (2017).

Chem biol., 5, 29-36 (2009).

３）T, Inobe. & A, Matouschek.: Paradigms of pro-₁₄）T, Inobe., M, Tsukamoto. & M, Nozaki.: Protea-

tein degradation by the proteasome. Curr Opinsome-mediated protein degradation is enhanced

Struct Biol., 24, 156-164 (2014).

by fusion ubiquitin with unstructured degron.

４）T, Inobe., S, Fishbain., S, Prakash. & A, Matouschek.: Defining the geometry of the twocomponent proteasome degron. Nat Chem Biol.,7, 161-167 (2011).
５）S, Fishbain. et al.: Sequence composition of disordered regions ﬁne-tunes protein half-life. Nat

24

Biochem Biophys Res Commun., 501, 948-954(2018).
₁₅）K, Takahashi., A, Matouschek. & T, Inobe.:
Regulation of Proteasomal Degradation by
Modulating Proteasomal Initiation Regions. ACS

Chem Biol., 10, 2537-2543 (2015).

研究報告

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究
酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究

細胞透過性人工リコンビナーゼタンパクによる高効率で安全なゲノム編集法の開発
飯

島

健

太
（名古屋大学大学院医学系研究科）

おける機能性を明らかにした．CCR5 遺伝子を標的とした人工リコンビナーゼの開発は，当初の想定よりも配列特異性の修飾が困難であり，目的とする人工リコンビ
ナーゼの獲得には至らなかった．
【考察】
遺伝子治療において，従来のヌクレアーゼよりもリコ【目的】

ンビナーゼは優れた特長を持つことから，さらに大規模

近年，後天性免疫不全症候群の完治を目的として，ゲに人工リコンビナーゼ開発を展開することで，より安全

ノム編集技術を用いたプロウィルス DNA の除去や HIV

で有用な遺伝子治療法を導出することが可能であると考エントリーコレセプターである CCR5 遺伝子破壊が試えられる．

みられている．従来のゲノム編集で利用されるヌクレ【文献】

アーゼは，DNA 鎖切断を生じるが DNA 損傷修復経路

１）Takashina, T. et al.: Identiﬁcation of a cell-pen-

により速やかに修復されるため，遺伝子破壊効率が低い

etrating peptide applicable to a protein-basedのみならず，染色体異常を誘発するリスクを伴う．またtranscription activator-like effector expression

ウィルスベクターによる核酸導入は染色体 DNA への挿

system for cell engineering, Biomaterials., 173,

入リスクなどから臨床での利用には不安が残っている．

11-21 (2018).

本研究では HIV 感染において重要な CCR5 遺伝子を２）Karpinski, J. et al .: Directed evolution of a

破壊するために CCR5 特異的人工リコンビナーゼを開

recombinase that excises the provirus of most発する．人工リコンビナーゼは自身の酵素活性のみで組

HIV-1 primary isolates with high speciﬁcity, Nat換え反応が完結するため，遺伝子破壊効率が優れるとと

Biotechnol., 34, 401-409 (2016).

もに，切断 DNA 末端を露出しないため安全性が高い．
さらに本研究では当研究部で開発した優れた細胞透過性を示す核指向性ペプチド NTP を人工リコンビナーゼに付与することで，核酸を導入しない安全性の高い技術開発を目指す１）．
【方法】
Cre，および HIV-LTR を標的とした人工リコンビナー

膵β細胞のインスリン分泌シグナル形成障害およびβ細胞消失の過程におけるmetabolic reprogrammingを担う糖代謝関連代謝酵素の役割の解析
石

原

寿

光
（日本大学医学部）

ゼである Brec1 の NTP 付加型組換えタンパク質を精製し，in vitro，および細胞培養系での活性を評価する．
また CCR5 遺伝子を標的とした人工リコンビナーゼを獲得するために，試験管内分子進化法により Cre リコ【目的】
グルコースによる膵β細胞からのインスリン分泌にンビナーゼの標的配列特異性を修飾する 2）．

は，グルコースの代謝が必要であり，その大まかな枠組【結果】

みについては，コンセンサスが得られている．しかし，

NTP を付加した Cre, Brec1 を高純度にて精製し，invitro での基質 DNA，および，細胞培養系への添加時にグルコース代謝の過程の詳細およびその２型糖尿病発症
過程の障害・変化の詳細は，未だ不明である．

25

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成【方法】

は Pdha1 の発現抑制細胞で観察された結果は，糖尿病

そこで，グルコース代謝に重要な遺伝子発現をインス

初期のβ細胞の挙動と類似している．また，これらの細リン分泌細胞で修飾し，２型糖尿病におけるインスリン胞での解糖系中間体の蓄積が，インスリン合成能を促進分泌障害と同様な変化が認められるかを検討した．そしする可能性も示唆される．

て，インスリン分泌への影響を裏打ちする代謝の変化としてのメタボロームの変容を解析した．具体的には，開発中のインスリン分泌 MIN6 細胞の改変体で，遺伝子発現修飾を効率良くできるようにした細胞において，解糖マウス嗅覚系臨界期における刷り込み記憶形成機構
井

上

展

子

系の酵素である glucokinase (Gck), phosphoglycerate（福井大学医学部）

kinase (Pgk1), 解糖系産物 pyruvate を TCA サイクルに繋げる pyruvate dehydrogenase の触媒サブユニッ【目的】

ト Pdha1 の発現抑制細胞を，tetracycline 誘導性の遺出生直後の外界感覚入力に対する刷り込み現象とは外伝子発現修飾システムを用いて作製した．これらの細胞的環境への適応である．マウスの場合，新生仔期の刷りにおいてインスリン分泌およびインスリン含有量の変化

込み記憶が正常に起こらない場合，その後の成育に影響を検討するとともに，グルコース刺激時のメタボロームが出るだけでなく，成長後の社会性の欠如によって，生をヒューマンメタボロームテクノロジー社の受託解析を

存率の低下をも引き起こす．従って，新生仔期における用いて，解析した．

刷り込み記憶の形成機構を解明することは，ヒトの精神【結果】発達障害を理解する上でも非常に重要である．マウス嗅Gck, Pgk1, Pdha1 に 対 す る doxycycline 誘 導 的覚系における刷り込み現象の記述と，それを可能にする

shRNA の 発 現 は， 対 応 す る タ ン パ ク の 発 現 を 10 ％分子機構の解析を試みた．

︲30 ％ に 低 下 さ せ た．Gck の 発 現 抑 制 は， １ 時 間 の【方法】

20mM グルコース刺激によるインスリン分泌を約 50％

マウス幼少期における匂い刷り込みの様子を行動解析に低下させ，インスリン含有量には影響を与えなかっにより記述し，シナプス形成解析による臨界期の定義をた．Pdha1 の発現抑制では，インスリン含有量が約２行った．そして，外界の刺激依存的に匂いを「刷り込倍に増加し，細胞含有量に対するインスリン分泌は，有む」ため，神経活動依存的に機能するシナプス形成因子

意に低下した．また，Pgk1 の発現抑制では，インスリを探索し，分子遺伝学的手法により刷り込み現象への寄ン含有量が約 1.5 倍に増加し，細胞含有量に対する分泌与を調べた．刷り込み記憶には常に誘引的価値が付加さ量としては，変化を認めなかった．20mM グルコースれることが判明し，その価値付けのために必要な因子とで１時間刺激した際の細胞抽出液のメタボロームの解析

して，ペプチドホルモンであるオキシトシンに着目し，では，いずれの場合も，TCA サイクル中間体の低下と同時にオキシトシンを分泌する ADP-リボシルシクラー

ATP/ADP 比の低下が認められたが，Gck の発現抑制でゼ（CD38）の刷り込み記憶への価値付けへの寄与を各は，解糖系中間体の低下が認められたのに対し，Pgk1分子の欠損マウスや，機能回復実験を通じて検証した．

および Pdha1 の発現抑制では，解糖系中間体の増加が【結果】認められた．
【考察】
２型糖尿病発症初期の膵β細胞の特徴として，インス

幼少期の匂い曝露により，忌避性の匂いを用いても生後一週間の臨界期に経験した匂いに対してマウスは安心感を覚え，誘引的に振る舞うことを見出した．

リン含有量の増加とそれに伴う基礎分泌の増加，およびまた，外界の刺激依存的に，嗅球における嗅覚一次神高グルコースに応答するインスリン分泌の低下が知られ経と二次神経のシナプス形成を強固にする機能のある分ている．前者は，グルコースに対する応答能の低下を部子ペアとしてセマフォリン 7A（Sema7A）とその受容体，分的に補償する可能性が推定されている．Pgk1 あるいプレキシン C1 (PlxnC1) を見出した．これらの分子に26

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

よって生後に嗅いだ匂いを嗅球レベルで刷り込むことができることが変異マウス解析などを通じ明らかになった．臨界期は PlxnC1 の発現様式で定義されることも明らかになった．

酵母 TOR 複合体２シグナル経路の活性化における
細胞膜脂質成分の役割
井

上

善

晴
（京都大学農学研究科）

刷り込み記憶の発露のための回路を同定するため，匂い条件付けしたマウスの高次領域の神経活性の様子を調べると，刷り込み記憶は，愛情行動などの誘引的な出力【目的】

決定に関与する内側扁桃体を活性化し，ストレスホルモ

TOR (Target Of Rapamycin) は 真 核 生 物 に お い てンの分泌に関与する扁桃体梨状皮質移行領域を抑制して進化的に保存された Ser/Thr キナーゼであり，細胞の発露することが判明した．

成長や代謝などを司るシグナル伝達経路を構成する．

臨界期に刷り込まれた匂いは質感に関係なく，上記のTOR は機能的に異なる２種類の TOR 複合体（TORC1

ような誘引性の回路を形成する．幼少期の誘引回路形成と TORC2）を形成する．TORC1 の活性化機構についを可能にする因子として，他者との絆を深めるなどの機ては詳細な研究が進んでいるのに対し，TORC2 のそれ能を有し，生後の時期に脳内で多量に，広い範囲で分泌については未解明の部分が多い．出芽酵母の TORC2 は，されているオキシトシンに着目した．
オキシトシン欠損，細胞膜の MCT (Membrane Compartment containing

受容異常マウスに加え，オキシトシンの分泌に必要な酵

TORC2) と呼ばれる脂質マイクロドメインに局在する

素，CD38 に関して，その欠損マウス（オキシトシン分ことが知られている．しかしながら，MCT を形成す泌異常マウス）では刷り込み記憶における誘引行動が起る脂質成分，TORC2 の MCT 局在機構，MCT 局在とこらなくなることが判明した．オキシトシンとその分泌

TORC2 の機能発現との相関性などの基本的なことはま

経路に関して刷り込み記憶における寄与は同等であろう

だ解明されていない．そこで本研究では，TORC2 シグ

結果となった．

ナルに関与する因子を，脂質成分に注目して探索するこ【考察】とを目的とした．

マウスは出生直後の環境に対して誘引的な回路を形成【方法】

することで，その後の社会生活を正常なものとしている

出芽酵母の非必須遺伝子破壊株コレクション（約ようである．刷り込み記憶とは嗅球レベルで特定の匂い

4800 株）を，メチルグリオキサール（MG）含有プレーに対する応答性をシナプス形成の強化により上昇させる

トにスポットし，感受性株のスクリーニングを行った．

ことと，その入力に対して誘引性回路を形成するという【結果・考察】二つの現象が組み合わさって引き起こされるということ

われわれは以前，解糖系から派生する MG が酵母なが本研究の結果から考察できた．

らびに哺乳類細胞において TORC2 シグナルを活性化【文献】

することを発見した１）．TORC2 は生育に必須な機能

Inoue, N., Nishizumi, H., Naritsuka, H., Kiyonari,を持ち，その破壊は致死となることから，MG による

H. & Sakano, H.: Sema7A/PlxnCl signaling triggers

TORC2 シグナルの活性化は，生存に必要な応答であ

activity-dependent olfactory synapse formation, Nat.

ると考えられる．従って，MG 感受性を示す変異株は，Commun., 9, 1842 (2018).

TORC2 シグナルの活性化に関与する因子が欠損していInoue, N. & Sakano, H.: Sema7A Signaling isる可能性が期待される．スクリーニングの結果，MG にEssential for Activity-Dependent Synapse Formation

対して感受性を示す 31 株の変異株を得た．それらの中

in the Mouse Olfactory Bulb, J. Neurol. Neuromed.,に，細胞膜脂質成分であるエルゴステロール（動物細胞3, 33-38 (2018).

におけるコレステロールに相当）の合成系酵素（Erg2
および Erg3）の欠損株が含まれていた．そこで，ステロールに結合する薬剤（フィリピン，ナイスタチン，ア27

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

ムホテリシンＢ）で前処理した後に，MG ならびに，酵あることを明らかにした．このことは Unstructured 領

母 TORC2 の活性化剤オーレオバシジンＡ (AbA) によ

域のプロテアソームへのアクセスを制御すれば，分解をる TORC2 シグナルの活性化を検討した．その結果，こ制御できることを示している．そこで我々は有機化学的

れらの薬剤による前処理は，TORC2 シグナルの活性化手法や小型抗体などを利用して，細胞内夾雑系においてを阻害した．

も，特定の標的蛋白質の特異的分解制御（分解誘導と分ホスファチジルコリンのリゾ体アナログであるエデル
フォシンはステロールと親和性があり，脂質マイクロド解抑制）を可能とする技術の開発を目指した．
【結果】

メインに影響を与えることが報告されている２）．そこで，

まず Unstructured 領域の認識阻害による新規分解抑

エデルフォシンで前処理した細胞の TORC2 シグナルを制方法の開発を試みた．既に確立している細胞内でも働検討した結果，MG や AbA による TORC2 シグナルのくことができる小型抗体を用い，Unstructured 領域に活性化が阻害された．これらの結果から，酵母 TORC2抗原配列をもつモデル蛋白質の分解を阻害できることをの活性化において，エルゴステロールが重要な役割を果確かめた．そこで実際のガンで分解が亢進する NKX3.1

たしている可能性が示唆された．

を対象に，そのＣ末端の分解誘導性 Unstructured 領域【文献】

に対する小型抗体を，無細胞ディスプレイ技術を用いて

１）Nomura, W. & Inoue, Y.: Methylglyoxal acti-

還元的環境で取得した．取得した抗体は細胞内においてvates the target of rapamycin complex 2-protein

確かに NKX3.1 の分解誘導性 Unstructured 領域をもつ

kinase C signaling pathway in Saccharomyces

蛋白質の分解を抑えた．

cerevisiae . Mol . Cell . Biol . 35, 1269-1280(2015).

次に分解誘導性 Unstructured 領域ペプチドの標的蛋
白質への選択的ケミカルラベリングにより，分解を誘導

２）Castro, B.M., Fedorov, A., Hornillos, V., Del-

できるか検証を行った．まずは Unstructured 領域をも

gado, J., Acuña, A. U., Mollinedo, F. & Prieto,

つユビキチンによるポリユビキチン化が，基質蛋白質のM.: Edelfosine and miltefosine eﬀects on lipid

分解を促進することを確認した１）．次に Unstructured

raft properties: membrane biophysics in cell

領域を直接標的蛋白質に取り付けるために，Spy-tag/

death by antitumor lipids. J. Phys. Chem. B.

Spy-catcher システムを導入した．このシステムでは

117, 7929-7940 (2013).

夾 雑 環 境 で も モ デ ル 蛋 白 質（Spy-catcher） に，Spytag を融合した Unstructured 領域ペプチドを付加でき細胞内における選択的タンパク質分解制御方法の開発とその応用伊野部

た．さらにこの Unstructured 領域が付加された Spycatcher は，精製プロテアソームにより分解されることを確認している．

智由【考察】（富山大学工学部）

以上で開発した蛋白質分解制御方法を利用することにより，蛋白質分解異常が原因となる病気の治療が可能に【目的】
多くの疾患の発症には，特定蛋白質の分解異常が関なると見込まれる．
【文献】

わっている．この特定蛋白質の分解を人工的に制御する

１）Inobe, T., Tsukamoto, M., & Nozaki, M.: Protea-

ことができれば，新しい治療法の開発につながるはずで

some-mediated protein degradation is enhanced

ある．我々は，細胞内の蛋白質分解を担うユビキチン–

by fusion ubiquitin with unstructured degron.

プロテアソーム分解系において，効率的な分解には，標Biochem. Biophys. Res. Commun., 501, 948-954

的蛋白質のポリユビキチン化だけでは不十分で，標的蛋(2018).

白質自身にフラフラとした Unstructured 領域が必要で2

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

ゲノム全域をオフターゲットなく自在に編集できる
新しい酵素システム系の創製
植

田

充

美

換えにより任意の配列をノックインできます．また，非相同末端結合により切断配列をランダムに修復するとノックアウトが可能になります．しかし，CRISPR/Cas9 シス
テムは全てのゲノム領域を編集することができないとい（京都大学大学院農学研究科）

う大きな欠点があります（図Ａ）．このシステムが正確に編集できる領域は，Cas9 が認識できる NGG 配列と【目的】
近年，ゲノム編集法として CRISPR/Cas9 システム

それに続く 20 塩基のみであり，これはゲノム中にわず
か 60％程度しか存在しません．

が注目を集めています．しかし，このシステムが正確

我々は，上述の旧来法よりもはるかにゲノムワイドに編集できる領域は，Cas9 が認識できる NGG 配列とで高効率な編集技術を構築するために，一本鎖切断酵それに続く 20 塩基のみであり，これはゲノム中にわず

素 で あ る Cas9 Nickase を 用 い ま し た（ 図 Ｂ ）．Cas9

か 60％程度しか存在しません．また，ガイド RNA 認

Nickase で生じる一本鎖切断（ニック）は正確に修復さ

識配列外の塩基を編集する場合，相同組換え後もガイドれます．また旧来の Cas9 により生じる二本鎖切断と異RNA 認識配列が残るため，Cas9 ヌクレアーゼにより，なり，ニックは相同組換えを誘導するが，非相同末端結ゲノムが繰り返し切断・修復された結果，最終的には非合は誘導しません．そのため，Nickase による相同組換

相同末端結合により望まない塩基の挿入，欠失が生じてえ後に標的配列が残った時でもニックが再度導入される

しまうという大きな欠陥が目立ってきています．遺伝病

だけで，非相同末端結合による余分な配列の挿入や欠損にも関係します多様で多種の SNPs が存在することが判は起こりません．また，本システムはニックから 50 bp

明してきましたゲノムにおきまして，ゲノムの全域にわ離れた領域でも正確に編集できました．

たって，正確に，自在に編集できるゲノム編集技術の発

これは，本システムが編集可能塩基に制限がある

展が望まれています．

CRISPR/Cas9 よりも，理論上 40％以上も広いゲノム領【方法と結果】

域，すなわち，ほぼゲノム全域を編集できることを示し

近年，高効率で容易な変異体作製法として CRISPR/
Cas9 システムが注目を集めています．このシステムで

ています．
【考察】

は，ガイド RNA が PAM 配列（NGG: N は任意の塩基）本研究では，ゲノムワイドで高効率な編集技術を構築に続く 20 塩基を認識して，Cas9 が DNA を切断しまするために，一本鎖切断酵素である Cas9 Nickase を用す．切断領域に相補的なドナー DNA を加えると相同組

いた CRISPR/Nickase システムを確立しました．
近年，ゲノム編集法として CRISPR/Cas9 システムが注目を集めていますが，全てのゲノム領域を編集することができないという大きな欠点があります．
我 々 の 開 発 し た CRISPR/Nickase シ ス テ ム で は，
CRISPR/Cas9 の欠陥をすべて超越し，より正確に，理論上，ほぼゲノム全域を編集できます．これにより，ゲノム上のほぼすべての SNPs の修復編集が可能になるとともに，逆に，目的通りの SNPs の導入も可能になり，これからのゲノム科学の発展に貢献できると考えております．

図 （Ａ）CRISPR/Cas9 システムと（Ｂ）CRISPR
Nickase システムによるゲノム編集 Cas9 D10A
は一本鎖切断酵素として働く

29

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

化学合成と ｉｎ ｖｉｔｒｏ 酵素変換の融合による多環性
アルカロイドの迅速合成
大

栗

博

毅
（東京農工大学大学院工学研究院）

6 の２つのアミド結合をそれぞれ容易に切断可能な官能基（エステル／アリルカルバメート基）へと置き換えた
非天然型基質アナログ群（7–9）を設計・合成した（図２）．
【結果】
設計・合成した非天然型基質 7–9 の酵素 SfmC による変換は，いずれも高い効率で進行し，所望の五環性骨格群を得ることができた．プロセスを更に簡略化するた【背景】
サフラマイシンＡ (1) に代表されるテトラヒドロイソ

め，酵素変換と化学変換の融合を検討した．反応溶液にキノリン (THIQ) アルカロイドは，強力な抗腫瘍活性をシアン化カリウムを添加し，ワンポットでシアノ化した．

示す（図１）．1 と同様の五環性母骨格を共有するエク酵素を除いた後，還元的アミノ化を施すことで，適切

テナサイジン 743 (2) は悪性軟部腫瘍の治療薬（ヨンデに官能基化された五環性骨格を単純な合成基質 (5, 7–9)

リス，大鵬薬品）として認可されている．また，側鎖からわずか１日で合成する化学 – 酵素ハイブリッドプロ

構造が異なるジョルナマイシンＡ (3)，サフラマイシン

セスの開発に成功した．

Y3 (4) 等の類縁体も数多く存在する．

前述のリンカー ( エステル／アリルカルバメート基 )を合成化学的に切断し，長鎖脂肪酸側鎖を除去した．続く酸化反応により，３つの天然物 1, 3, 4 の化学 – 酵素２）．
ハイブリッド迅速合成（5 ～ 6 段階）を達成した（図２）

更に，本研究で創出したフェノール型の類縁体が，天然物シアノサフラシンＢよりも強力な DNA アルキル化能
図１

テトラヒドロイソキノリンアルカロイド

を示すことを見出した３）．

当研究グループでは 1 の生合成研究を展開し，ユニー
クな骨格構築機構を明らかにした１）．非リボソーム依存型ペプチド合成酵素（NRPS）のモジュールの一つである SfmC が７段階の反応を触媒し，単純な２つの基質か
ら五環性骨格を一挙に組み上げる．
【目的】

図２

本研究では，生合成酵素 SfmC を活用した THIQ ア

THIQ アルカロイド群の化学-酵素ハイブリッ
ド全合成

ルカロイド群の化学–酵素ハイブリッド迅速合成法を確立する．合成基質の酵素変換により得た多官能性の五環【文献】

性骨格に数段階の化学変換を施し，１位の側鎖や芳香環

１）Koketsu, K., Watanabe, K., Suda, H., Oguri, H.

／キノン環を自在に改変できる迅速合成法を開発する．

& Oikawa, H.: Reconstruction of the saframy-【方法】

cin core scaffold defines dual Pictet-Spengler

SfmC は，チロシン誘導体 5 とＮ末端に長鎖脂肪酸側mechanisms, Nat. Chem. Biol. 6, 408 (2010).

鎖を有する 6 を基質として認識する．この脂肪酸側鎖２）Tanifuji, R., Koketsu, K., Takakura, M., Asano,は本生合成経路で生じる 1 には存在しないが，SfmC にR., Minami, A., Oikawa, H. & Oguri, H.:よる骨格構築には必須である．そのため，五環性骨格をChemo-enzymatic Total Syntheses of Jorunna-

構築した後に脂肪酸側鎖を除去する必要がある．
しかし，

mycin A, Saframycin A, and N-Fmoc Saframy-

多数の官能基を持つ中間体に対するアミド結合加水分解

cin Y3, J. Am. Chem. Soc. 140, 10705 (2018).

による脂肪酸側鎖の除去は極めて困難である．そこで，

３）Tanifuji, R., Tsukakoshi, K., Ikebukuro, K.,30

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

Oikawa, H., & Oguri, H.: Generation of C5-des-る複数の修飾部位をアラニン置換した結果，Notch1 の

oxy analogs of tetrahydroisoquinoline alkaloids

Delta-like4 リガンドに対する結合能が低下した．

exhibiting potent DNA alkylating ability, Bioorg.
Med. Chem. Lett. 29, 1807 (2019).

マ ウ ス に お け る Eogt の mRNA 発 現 を 検 証 し た と
こ ろ， 血 管 内 皮 に お い て 高 発 現 が 認 め ら れ た．そして，血管内皮特異的な Eogt 遺伝子欠損により，血漿成 分 の 漏 出 が 認 め ら れ，Notch シ グ ナ ル 構 成 因 子 の糖転移酵素 EOGT による Notch シグナルと血管形成の制御機構の解明
岡

島

徹

也
（名古屋大学大学院医学系研究科）

haploinsufficiency の表現型と一致した．また，Notch1
や Rbpj のヘテロ接合体のバックグランドでは，これらの表現型の増強が認められた．
【考察】
以 上 の 解 析 結 果 よ り，EOGT に よ る Notch 受 容 体の O-GlcNAc 修飾は，血管 integrity において重要な役【目的】

割を果たすことが見出された．背後の分子機構として，

細胞表面に集積する糖鎖は，細胞機能の制御に中心的Notch 受容体の O-GlcNAc 単糖もしくはその伸長構造な役割を果たすと考えられている．しかしながら分子が，DLL リガンドとの相互作用を直接的に制御する仕メカニズムの多くのは未解明のままである．その中で，組みが考えられた．一方で，独立した O-GlcNAc 修飾

細胞間の主要なシグナル伝達である Notch シグナル制の分子機能として，Notch 受容体を構成する EGF ドメ

御における糖鎖機能の理解が進んできた．本研究では，

インの安定化作用も見出した．この効果は，O-フコース

Notch 受容体の EGF リピート上に存在する O-型糖鎖修や O-グルコースと同様であり，Eogt 変異細胞において飾である O-GlcNAc 修飾について，分子機能と生物学

は，Notch1 受容体の表面発現レベルに大きな異常を伴的な役割について解析を行った．

わないことから，複数の糖鎖が互いに補完関係にあると【方法】考えられた．このように，O-GlcNAc 修飾には，O-型

EGF ドメインの構造安定性における O-GlcNAc 修飾

糖鎖としての一般的な構造安定化機能と O-GlcNAc 特の役割には，還元剤を用いた unfolding assay を実施し有のリガンド結合制御機能を併せ持つと考えられた．

た．O-GlcNAc 糖鎖の検出には，CTD110.6 抗体によ

【文献】

る検出と，LC-MS/MS と糖鎖解析ソフト Byonic を用い

１）Sawaguchi, S. et al.: O-GlcNAc on NOTCH1た半定量解析を実施した．分子機能と生物学的な役割に

EGF Repeats Regulates Ligand-Induced Notch

ついては，O-GlcNAc 修飾に関わる糖転移酵素 EOGT

Signaling and Vascular Development in Mam-の遺伝子変異マウスや，それから単離した血管内皮細胞

mals. eLife., 6, e24419 (2017).

などを用いた．
【結果】
単 一 ド メ イ ン の O-GlcNAc 糖 付 加 に よ り， 還 元 剤
存 在 下 で の 構 造 安 定 性 が 増 強 さ れ た． こ の 効 果 は，

２）Ogawa M, et al .: Structural Divergence in
O-GlcNAc Glycans Displayed on Epidermal
Growth Factor-like Repeats of Mammalian
Notch1. Molecules., 23, E1745 (2018).

O-フコースや O-グルコースと類似していた．一方で，Notch 受 容 体 へ の 分 子 機 能 へ の 作 用 と し て，Deltaリガンドに対する物理的な相互作用と Notch シグナ
ル の 増 強 が 観 察 さ れ た．O-GlcNAc 糖 鎖 の 修 飾 部 位
は，Notch1 の EGF リピートの 10 箇所以上に同定され，その一部は，２糖 (O-GlcNAc-Gal) もしくは３糖(O-GlcNAc-Gal-Sia) へと伸長された．３糖へ伸長され31

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

過酸化水素分解酵素カタラーゼの細胞内局在制御による酸化ストレス応答の分子機構の解明
奥

本

寛

治

や CHO 細胞では Pex14p のリン酸化度合は非常に低い
ものの，過酸化水素などの酸化ストレス処理により高度にリン酸化された．点変異導入および質量分析により，過酸化水素処理により誘導される Pex14p のリン酸化（九州大学大学院理学研究院）

部位として３つのセリン残基を同定した．非リン酸化型(Ala) および恒常的リン酸化型 (Asp) Pex14p 変異体を【目的】

用いた解析等から，過酸化水素依存的な Pex14p のリン

活性酸素種（ROS）の１種である過酸化水素は酸化

酸化はとくにカタラーゼのペルオキシソームへの輸送を還元反応に基づく生体反応に付随して産生される酸化抑制し，サイトゾル局在性カタラーゼの増加を介して細ストレス因子であり，多くの生物種が過酸化水素を代謝

胞の酸化ストレス耐性を亢進させることが明らかとなっ（消去）する酵素としてカタラーゼを有する．哺乳類でた．これらの結果は，リン酸化を介したペルオキシソーは細胞内小器官ペルオキシソーム内腔に主に局在していムタンパク質輸送の制御機構という世界初の発見である

るが，我々は最近，ミトコンドリア外膜でアポトーシス

とともに，カタラーゼの細胞内局在の調節により酸化ス

促進因子として機能する BAK がペルオキシソームにもトレスに応答するという細胞の新たな生存戦略を示すも一部局在化し，カタラーゼのペルオキシソームからサイのである．

トゾルへの放出を介して細胞の酸化ストレス抵抗性を高めることを見出した（Hosoi et al., J. Cell Biol. 2017,
Fujiki et al., Mol. Cell. Oncol. 2017）． こ の 発 見 は，
カタラーゼのサイトゾル局在化が抗酸化ストレス反応として作用することを示すものである．さらに我々は，ペ局所的 ｉｎ ｖｉｖｏ ゲノム編集技術を用いたフィード
バック並列視覚情報処理の解明
小坂田

文隆（名古屋大学創薬科学研究科）

ルオキシソーム内腔タンパク質（酵素）の輸送因子である Pex5p のペルオキシソーム膜上受容体 Pex14p が過酸化水素依存的にリン酸化修飾され，カタラーゼの輸送【目的】

を負に制御する結果を得ている．本研究では，酸化スト

視覚情報は，網膜にて電気信号に変換され，外側膝状レスに応答したカタラーゼのサイトゾル局在化の制御と体（LGN）を経由し，大脳皮質一次視覚野（V1）に送細胞の酸化ストレス抵抗性における Pex14p のリン酸化られる．その後，高次視覚野を含む他の領野に送られ，の役割について詳細な解析を行った．

知覚・認知に至る．形・動き・色などを含む視覚情報は，【方法】

網膜内で視覚属性毎に分けられ，異なる網膜神経節細胞

点変異導入および質量分析により Pex14p の過酸化水を起源とし並列情報処理され，LGN を経て V1 に至る

素依存的なリン酸化部位を解析した．得られた知見から（Nassi and Callaway, Nat Rev Neurosci, 2009）．この非リン酸化型および恒常的リン酸化型 Pex14p 変異体を情報処理過程のいずれかに異常が起こると，視覚障害を作製，PEX14 欠損性 CHO 細胞へ導入し，イムノブロッ

引き起こす．

トや免疫染色等によりカタラーゼのペルオキシソームへ

これまでに我々は，マウス視覚系において，方向選の輸送に対する影響を解析した．また，過酸化水素処理

択性応答を示す網膜神経節細胞が LGN の shell（浅層）に対する細胞の生存率における Pex14p リン酸化の役割へ入力し，その後 shell の神経細胞は V1 の第１層へ入を MTT アッセイにより検討した．

力することを明らかにしてきた（Cruz-Martín et al.,

【結果と考察】Nature, 2014）．これにより，マウスでは LGN の core

マウス各臓器抽出液の Phos-tag PAGE およびイムノ（深層）から V1 の第４層へ伝達される経路と，LGN のブロットによる解析により Pex14p のリン酸化修飾を初

shell から V1 の第１層へ伝達される経路との２つの並めて見出した．通常培養時のラット肝臓由来 Fao 細胞列回路が存在することが示された（恩田および小坂田 ,32

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

日本薬理学雑誌 , 2017）．しかし，これら並列回路がどにフィードバック入力する第６層細胞に対して GFP をのように制御されるかは不明である．網膜→ LGN →ノックインすることで，サブタイプ毎に細胞を可視化す

V1 のフィードフォワード経路に加えて，V1 から LGNることができた．さらに，２光子顕微鏡を用いて，大脳へのフィードバック結合が知られている．本研究では，皮質の最深部でカルシウムイメージングが困難であった

V1 から LGN へのフィードバック結合に着目し，その第６層細胞から視覚応答を記録した．本研究では，これ役割を明らかにすることを目的とした．

まで極めて困難であった技術の壁を突破することができ【方法】

た．今後は，これらの手法を組み合わせることで，V1１）CRISPR/Cas9 システムを搭載したアデノ随伴ウイ

第６層細胞の細胞タイプ毎の機能を明らかにし，並列回

ルスベクター（AAV）の作製

路における役割を明らかにする予定である．

Cas9 を搭載する AAV，各遺伝子座に特異的な guide
RNA 配列およびノックインカセットを搭載する AAV【文献】
１）Nassi, JJ. & Callaway, EM.: Parallel processing

を HEK293t 細胞にて産生した．

strategies of the primate visual system. Nat Rev２）成体マウス脳へのウイルスベクターの微量注入

Neurosci., 10, 360-72 (2009).

脳定位固定装置に成体マウスを固定し，空気圧を用い

２）Cruz-Martín, A., El-Danaf, RN., Osakada, F., Sri-てウイルス溶液を微量注入した．

ram, B., Dhande, OS., Nguyen, PL., Callaway,

３）２光子イメージングを用いた覚醒下マウスの視覚応

EM., Ghosh, A. & Huberman, AD.: A dedicated

答特性の評価circuit links direction-selective retinal ganglion

カルシウム感受性蛍光タンパク質の GCaMP6m を発現させたマウスを頭部固定し２光子顕微鏡下で視覚応答を蛍光強度変化として計測した．視覚刺激として様々な

cells to the primary visual cortex. Nature., 507,
358-61 (2014).
３）恩田将成，小坂田文隆：視覚情報処理を担う神経回

角度の正弦波格子刺激を呈示した．

路の構造と機能．日本薬理学雑誌 ., 149, 274-280【結果】(2017).

マウス大脳皮質の６層細胞は異なる細胞種から構成 さ れ る． 各 細 胞 種 を 分 離 す る 目 的 で，Allen Brain
Institute の in situ hybridization お よ び single celltranscriptome データからマウス大脳皮質の６層細胞の３種類のサブタイプに特異的なマーカーを各々同定し二本鎖 DNA による新規の遺伝子ノックダウン現象
を駆動する核酸－酵素複合体の解明
小沼健（大阪大学大学院理学研究科）

た．次に，これら細胞を in vivo で可視化するために，
成体脳にて大脳皮質 V1 に局所的に AAV を微量注入し，各マーカーの遺伝子座に GFP をノックインした．大脳皮質の第６層に GFP 陽性細胞が認められた．

【目的】
我々は 2015 年に「二本鎖 DNA (dsDNA) を注入する

次に，第６層細胞の機能を明らかにする目的で，覚醒と，配列特異的に遺伝子機能が阻害される現象」を発見

下のマウスから視覚応答を計測した．マウスを２光子顕し，DNA 干渉 (DNAi) と命名した１）．これは脊索動物

微鏡下で頭部固定し，正弦波格子刺激に対する応答を記のオタマボヤで偶然に見出した現象である．PCR 産物

録した．視覚刺激に応答して GCaMP6 の蛍光強度変化を注入するだけでノックダウンができるため，遺伝子スが観察され，視覚野に特徴的な方位選択性応答および方クリーニング２）など応用性に富む生物現象である．こ向選択性応答が認められた．

の DNAi のしくみの解明を目的とした．

【考察】

DNAi では，標的 mRNA 分解がみられる２）．そこで

CRISPR/Cas9 を用いて成体脳での局所的なノックイ

RNA 干渉（RNAi）と似たしくみであるという仮説のもン法の確立に成功し，成体マウスの大脳皮質から LGNと研究を開始した．2016 年度に当財団の助成のもと研

33

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成究を開始し，DNAi では RNAi と同様，⑴ 小分子 RNA(exo siRNA) の合成や，⑵ 核酸分解酵素アルゴノート(AGO) がかかわる可能性を示した．2018 年度はこれらを進展させ，以下の知見を得た．

癌抑制タンパク質 p53 誘導性ホスファターゼによる脂肪細胞分化・脂肪滴形成制御機構の解明
坂口靖（北海道大学大学院理学研究院）【方法・結果】⑴

和DNAi を行った未受精卵を作成し，small RNA のRNA-seq 解析を行った．その結果，注入した dsDNA【目的】

断片に対応した exo siRNA に対応するリード配列が検

肥満は白色脂肪細胞における脂肪滴形成が過剰に行わ出された．未注入卵ではこれらのリード配列は検出されれ，脂肪細胞の肥大と増殖によって引き起こされる．まなかった．

た，脂肪細胞のみならず，好中球やマクロファージなど⑵

FLAG タグ標識した AGO を哺乳類細胞に発現さの免疫細胞や，精巣支持細胞であるライディッヒ細胞にせ，FLAG の免疫沈降を行ったのち qPCR によって小分

おいて脂肪滴がそれら細胞の機能に関与していることが子 RNA (miRNA) を定量した．免疫沈降の前後で小分報告されているが，詳細な脂肪滴形成機構，特に機能制

子 RNA のコピー数を比較することで，AGO と miRNA

御機構については依然として多くの部分が不明である．

の結合の有無を検討できる．オタマボヤには７種類のPPM1D (Wip1) は DNA 損傷などの細胞ストレスによAGO ホモログが存在するが，そのうち３つに結合活性り癌抑制タンパク質 p53 依存的に発現誘導される Ser/があることが示唆された．

Thr ホスファターゼとして発見された．近年，PPM1D【考察・展望】

ノックアウトマウスにおいて，PPM1D がインスリン感本研究を通じて，DNAi には ⑴ dsDNA からの exo

受性を制御し，グルコース恒常性維持に関与しているこ

siRNA 合成という新しいしくみがあることが実証できとが報告されている．このため，PPM1D が代謝調節にた．現在，内在の miRNA との共通点や違いを解析しておいても重要な役割を果たしていると考えられる．本研いる（大阪大学 元岡博士との共同研究）．また RNAi 同究の目的は，『脂肪細胞の脂肪滴形成および脂肪滴を介様に，二本鎖 RNA の段階を経て一本鎖の exo siRNAした脂肪細胞の機能制御における PPM1D の新規機能をへと変換されるのかについても検討する予定である．

解明すること』である．

⑵についても，小分子 RNA と結合する AGO を同定するための実験系が完成し，DNAi にかかわる AGO を同定できる見通しがついた．

【方法】
我々はこれまでに，PPM1D の機能解析において非常に有用なツールとなる PPM1D に対する強力かつ特異的以上が揃い次第，投稿論文を作成する予定である．こな阻害剤 SL-176 の開発に成功し，好中球の細胞分化やのように本助成を通じて，
この研究テーマを一から育て，

免疫応答能，さらには精原細胞の細胞分化に PPM1D が結実できる目前まで辿りついた．心より御礼を申し上げ

関与していることを明らかにしている１－３）．本研究でる．

は，PPM1D ホスファターゼによる脂肪細胞分化・脂肪【文献】

滴形成の分子制御機構を解明することを目的とする．今１）Omotezako, T. et al.: DNA interference: DNA-回，脂肪細胞分化の研究に広く用いられている脂肪前駆

induced gene silencing in the appendicularian

細胞 3T3-L1 をモデル系として選択し，脂肪細胞分化に

Oikopleura dioica . Proceedings of the Royal

おける PPM1D の機能を解析した．

Society B., 22 (1807): 20150435 (2015).

【結果・考察】２）小沼ら：二本鎖 DNA による新規の遺伝子ノックダ

脂肪前駆細胞 3T3-L1 の脂肪細胞への分化誘導にとウン現象 (DNAi): ガイド鎖と核酸分解酵素 Argo-

もない，PPM1D の発現量が増加することを見出した．

naute からそのしくみに迫る．日本応用酵素協会誌 .,特異的な PPM1D 阻害剤 SL-176 を用いた解析により，52, 11-18 (2018).

PPM1D 阻害が脂肪細胞分化を顕著に抑制することが示

34

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成された．また，脂肪滴の定量および脂肪滴のイメージン

P4-ATPase は，P-typeATPase のサブファミリーであり，

グ解析により，PPM1D 阻害が脂肪滴の量およびサイズ

リン脂質を外葉から内葉へとフリップすることにより非を著しく減少させることが明らかとなった．以上より，対称性の調節を行う．私は種々の P4-ATPase が特異的

PPM1D が脂肪細胞分化と脂肪滴形成の制御に関与するなリン脂質をフリップすることを明らかにしてきた１）．

ことが示された４）．さらに我々は，脂肪滴形成におけるその中，ATP10A はホスファチジルコリン（PC）をフリッ

PPM1D の標的分子および経路についても明らかとしていプするが，ATP10D はリン脂質ではなく，糖脂質のグる．今後，脂肪細胞分化および脂肪滴形成の両方に効果

ルコシルセラミド（GlcCer）をフリップすることを発を示す PPM1D を標的とした，阻害剤 SL-176 による脂肪見した．本研究では ATP10D の GlcCer の輸送機構と滴形成の抑制は，新たな肥満治療への発展が期待される．

その生理機能を理解することを目的とした．

【文献】

【方法】

１）Ogasawara, S., Kiyota, Y., Chuman, Y., Kowata,

他 の P-type ATPase 結 晶 構 造 を 元 に，ATP10D のA., Yoshimura, F., Tanino, K.,Kamada, R., &立体構造を予測した．モデル構造を基盤に ATP10A とSakaguchi, K.: Novel inhibitors targeting PPM1D

ATP10D の基質輸送に関わる可能性のあるアミノ酸に

phosphatase potently suppress cancer cell pro-

点変異を導入し，各変異体を安定発現する細胞株を用いliferation, Bioorg. Med. Chem., 23, 6246 (2015).

て PC と GlcCer に対するフリップ活性を測定した２）．

２）Kamada, R., Kudoh, F., Yoshimura, F., Tanino,【結果】K., & Sakaguchi, K.: Inhibition of Ser/Thr

ATP10A や ATP10D に 保 存 さ れ て い る TM4 の Gln

phosphatase PPM1D induces neutrophil diﬀer-

は ATP10D の GlcCer のフリップ活性に必須であるこ

entiation in HL60 cells, J. Biochem., 162, 303とがわかった．Gln 残基と近い位置にある TM6 の Leu(2017).

と Ile および TM1 の Asn と Trp が GlcCer のフリップ

３）Ogasawara, S., Chuman, Y., Michiba, T., Kamada, R., Imagawa, T., & Sakaguchi, K.: Inhibi-

活性に必須であることがわかった２）．
【考察】tion of protein phosphatase PPM1D enhances

GlcCer は，ATP10D の TM1, 4, 6 の間を介して輸送

retinoic acid-induced diﬀerentiation in human

されることが示唆された．ATP10A の TM4, 6 の同様

embryonic carcinoma cell line, J. Biochem .,の変異は PC のフリップ活性に影響がないことから，こ165, 471 (2019).

れらの残基は基質選択性と基質輸送に関わることが考え

４）Kamada, R., Kimura, N., Yoshimura, F., Tanino,られた．一方，ATP10A の TM1 の変異は PC フリップ

K., & Sakaguchi, K.: Inhibition of lipid droplet

活性も一部阻害することから，これらの残基は基質輸送

formation by Ser/Thr protein phosphataseに関わることが考えられた．ATP10D の遺伝子多型は，PPM1D inhibitor, SL-176, PLoS One , 14,動脈硬化や心筋梗塞に関連があり，血中 GlcCer の濃度

e0212682 (2019).

上昇に関わることから，ATP10D の機能を解明していくことは，このような疾患の発症メカニズムの解明に貢

糖脂質フリッパーゼの基質輸送機構の解析
申惠媛

献すると期待している．
【文献】
１）*Shin, H.-W. & Takatsu, H.: Substrates of P4-（京都大学薬学研究科）

ATPases: beyond aminophospholipids ( phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine).

【目的】

FASEB J., 33, 3087 (2019).

脂質二重層からなる生体膜の外葉と内葉では，脂質組

２）§Roland, B.P., §Naito, T., Best, J.T., Arinaiz-

成が非対称に保たれている．膜 10 回貫通タンパク質のYepez, C., Takatsu, H., Yu, R.J., Shin, H.-W.,

35

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成& Graham, T.R.: Yeast and human P4-ATPases

２．初代培養タニサイト

transport glycosphingolipids using conserved

10 日齢のマウス視床下部より初代培養タニサイトを

structural motifs. J. Biol. Chem., 294, 1794

単離・培養し３），免疫蛍光法やウェスタンブロッティン(2019).

グ法などによりペルオキシソームを解析した．
【結果と考察】視床下部の機能維持に果たすペルオキシソームの機
能と作用機構杉浦

高脂肪食を摂餌したマウスの視床下部においてペルオ
キシソームの数や形態に顕著な変化は観察されなかったが，タニサイトにおいて一部のペルオキシソームがペル歩オキシソーム特異的オートファジー（ペキソファジー）（神戸大学大学院医学研究科）

制御因子の一つである p62４）と共局在を示した．一方，
p62 やペルオキシソームタンパク質量の変化は視床下【目的】
ペルオキシソームは真核生物のほぼ全ての細胞に存

部全域のウェスタンブロッティング解析では観察されなかった．

在する脂質二重膜に囲まれたオルガネラである．細胞

高脂肪食摂餌により脳脊髄液中のパルミチン酸の濃度

内代謝の中心的な役割を担い，細胞内・外の環境に応じが上昇し，細胞毒性を発揮することが報告されているて数や形，局在を変化させながら細胞内を動的に動き回が５），タニサイトに対する作用は不明である．上記のマる．機能と動態は相互に制御されており，代謝装置としウスの結果がパルミチン酸のタニサイトへの影響かを調ての正常な機能を発揮するためにはその動態が重要であべるために，パルミチン酸添加培地で培養した初代培養

る１）．

タニサイトを解析した．細胞体において p62 陽性構造

視床下部は食事や睡眠，性行動など個体の恒常性調節の増加が観察され，一部のペルオキシソームと共局在をの中枢である．視床下部の第三脳室に面した側壁は，上示した．また，生化学的な解析により p62 の蓄積が観衣細胞やタニサイトなどのグリア様の細胞で構成されて察された．これらの結果は高脂肪食摂餌下において脳脊いる．タニサイトは栄養素の感知に加え，神経幹細胞様

髄液中のパルミチン酸濃度が上昇した結果，タニサイトの機能を持ち，視床下部の機能維持や調節において重要でのペキソファジーが抑制されたことを示唆している．

な役割を担っている２）．しかし，糖や脂質の実際の代謝

今後は電子顕微鏡などによる詳細な形態学的解析に加の場であるオルガネラの応答については未知な部分が多え，脂質酸化などのペルオキシソームの機能解析を行い，く残されている．

視床下部機能維持に果たすペルオキシソームの役割の解

本研究課題では高脂肪食摂餌マウスを視床下部ストレ

明を目指す．

スモデルとし，タニサイトを中心にペルオキシソームを【文献】

解析することにより視床下部の機能維持に果たすペルオ

１）Honsho, M., Yamashita, S. & Fujiki, Y.: Peroxi-

キシソームの機能と作用機構を解明することを試みた．

some homeostasis: Mechanisms of division【方法】

and selective degradation of peroxisomes in

１． 実験マウス

mammals, Biochim Biophys Acta., 63, 984-91

８週齢のオスマウス（C57BL/6）に高脂肪食とその(2016).

コントロール食を 16 週間給餌した．高脂肪食給餌後の２）Prevot V., Dehouck B., Sharif A., Cioﬁ P., Giaco-

マウスより，脳凍結切片を作製し，免疫蛍光法により視bini P. & Clasadonte J.: The Versatile Tanycyte:

床下部におけるペルオキシソームを解析した．同マウス

A Hypothalamic Integrator of Reproduction andより視床下部を摘出し，ウェスタンブロッティング法にEnergy Metabolism, Endocr Rev., 39, 333-368

よりペルオキシソームタンパク質量を解析した．

(2018).
３）De Francesco, PN., Castrogiovanni, D., Uriarte,36

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

M., Frassa, V., Agosti, F., Raingo, J. & Perello,【方法】

M.: A simple strategy for culturing morpholog-

温度因子解析によるホットスポット予測および配列

ically-conserved rat hypothalamic tanycytes,

データベースの情報を用いた最新の人工タンパク質設

Cell Tissue Res., 369, 369-380 (2017).

計法により耐熱性向上を目指した．前者は予測した部

４）Deosaran, E., Larsen, KB., Hua, R., Sargent,

位に aa 置換を導入することにより点変異体を作成し

G., Wang, Y., Kim, S., Lamark, T., Jauregui,

た．後者は，まず BLAST サーチによる LGOXNT1 のホ

M., Law, K., Lippincott-Schwartz, J., Brech,

モログ配列約 5,000 を取得後，MSA により LGOXNT1

A., Johansen, T. & Kim, PK.: NBR1 acts as anと非相同な aa を同定した．次に，非相同 aa のうち耐

autophagy receptor for peroxisomes, J Cell Sci.,

熱化が予想される aa を精選し，相同性が高い aa に置

126, 939-52 (2013).

換（690 aa からなる LGOXNT1 の 104 aa を置換）する

５）Posey, KA., Clegg, DJ., Printz, RL., Byun, J.,ことで，コンセンサス配列を有するフルコンセンサス型

Morton, GJ., Vivekanandan-Giri, A., Pennathur,

酵素（Fc_LGOX）を設計した．設計した遺伝子配列を

S., Baskin, DG., Heinecke, JW., Woods, SC.,

全合成し，宿主大腸菌体内に可溶性発現させ，カラムク

Schwartz, MW. & Niswender, KD.: Hypotha-

ロマトグラフィー精製した．精製酵素について耐熱性等

lamic proinflammatory lipid accumulation,の諸特性を解析した．

inﬂammation, and insulin resistance in rats fed【結果】a high-fat diet, Am J Physiol Endocrinol Metab.,296, (2009).

温度因子解析による点変異体については耐熱性が 5℃向上した．一方，精製 Fc_LGOX（比活性 30.3 U/mgprotein）の耐熱性は親型酵素（rWT）に比べ 15℃向上し，

Wet&Dry 実験を融合させた新しい酵素分子進化法による高比活性 L-グルタミン酸オキシダーゼの
耐熱性向上
杉

森

70℃，30 min インキュベ ート後でも 100％活性を維持していた（図１）．比活性，基質特異性の低下は認められず，耐熱性を向上させることに成功した．Fc_LGOXの aa 配列について分子系統解析を行った結果，rWT と大助（福島大学共生システム理工学類）

Fc_LGOX 間の aa 配列相同性は 86% と比較的高かったが，分子系統的には独立した末端節を形成した（図２）．

【研究背景】
L-グルタミン酸オキシダーゼ（LGOX）は食品や生体試料中の L-グルタミン酸（Glu）濃度の定量に利用されている産業用酵素である．現在，既存（上市）LGOXについては耐熱性と比活性の向上が望まれている．酵素の耐熱性向上については，世界中で多くの研究者が取り組んでいる課題であり，従来の進化分子工学的手法では
比活性や基質特異性を維持したまま耐熱化させることは難しいのが現状である．
【目的】
図１

そこで研究代表者らは，スクリーニングにより取得した

温度安定性試験の結果

Streptomyces sp. NT-1 株 LGOX (LGOXNT1) の比活性，
基質特異性を一切低下させずに，その耐熱性を 55℃から 70℃まで向上させることを目的とした．

【考察】
WT と Fc_LGOX の立体構造予測モデルを比較すると，

37

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

重ねによって，より普遍性の高い人工タンパク質設計法の確立につながることが期待できる．

澱粉枝作り酵素の特性制御への挑戦
鈴木龍一郎（秋田県立大学生物資源科学部）【目的】
澱粉は人類の主食として重要であり，食品・食品添加
図２

LGOXNT1 のアミノ酸配列と類縁関係を持つホモログと Fc_LGOX の分子系統樹

物および各種工業分野に利用されている．澱粉は規則正
しい分岐を伴ったアミロペクチン分子を主成分としており，アミロペクチンの構造（分岐の長さや数）は物性と相関があることが知られている．アミロペクチンは複数の酵素群の共同作業によって生合成され（図１），枝作
り酵素（BE）はアミロペクチンの分岐構造を決める鍵

図１
図３

LGOXNT1 の立体構造予測モデル（ホモ2量体）と 104 カ所のアミノ酸置換点（青ボール：一方のサブユニットのみ置換点を表示）

枝作り酵素（BE）の役割

新しい枝（太い部分）を転移することで，分岐構造の制御に関わっている．

ランダムコイルとサブユニット界面を含む溶媒露出表面に aa 置換が集中していることがわかった（図３）．また，モデル構造比較から WT と比べて Fc_LGOX では
ランダムコイルが減少するとともに，酵素分子全体がコンパクトにフォールディングすることによって変性しにくい構造をとり耐熱化したと考えられる．
以上のように，タンパク質の溶媒露出表面への aa 置換がタンパク質の機能向上につながるという結果は，これまでの定説とは真逆の結果である点で興味深いといえる．今後，さらにWet-Dry 実験から得られるデータと，その知見の積み

3

図２

枝作り酵素の結晶構造

中央（活性中心）に結合している糖鎖が酵素特性に関与している．酵素表面の糖鎖結合部位（SBS）は，ラベルした．

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成酵素である．しかし，構造を制御するメカニズムは不明

素についても構造機能相関を解明し，澱粉の酵素合成法

である．そこで本研究提案では，アミロペクチン構造のの確立を目指して研究を続けていきたい．研究成果が食制御を目的として，BE の機能改変に挑戦する．

品産業・各種工業分野への応用につながれば幸いである．

【方法】

【文献】

これまでに筆者らは，シアノバクテリア Cyanothece

Hayashi, M., Suzuki, R., Colleoni, C., Ball, S., Fujita,

sp. ATCC 51142 株由来 BE1 が糖鎖と結合した状態のN. & Suzuki, E.: Bound substrate in the structure

結晶構造を明らかにしている (Hayashi et al. 2017)．

of cyanobacterial branching enzyme supports a

筆者らは，酵素の活性中心に結合している糖鎖の非還元

new mechanistic model, J. Biol. Chem., 292, 5465

末端側の構造が反応産物の構造制御に関わっていると(2017).

予想している（図２）．非還元末端側付近に位置しているアミノ酸残基（W285, N286, N608, V609）を選び，部位特異的変異導入法によって変異体を構築した．
野生型 BE1 および変異体について，大腸菌内での発現系を用いて組換え酵素を大量調製した．これら組換え
酵素の比活性は，ヨウ素染色法によって測定した．さらメラニン合成酵素の細胞内輸送異常に相関した炎症性腸疾患の制御法開発
竹森洋（岐阜大学工学部）に，キャピラリー電気泳動法によって，反応産物の構造（鎖長分布）を解析した．
【結果と考察】【目的】

各変異体の比活性は野生型 BE1 と比べて低下してい

炎症性腸疾患は，腸内細菌に対する過剰な免疫応答にたが，半分程度の値を維持していた．また，反応産物のより引き起こされる難病である．申請者は自然発生の突鎖長分布パターンは，野生型 BE1 と比べて大きな変化

然変異マウスの解析で，メラニン合成異常を伴うヘルマは見られなかったが，重合度 (DP) 6–10 のグルカン鎖

ンスキー・パドラック症候群 5 型（HPS5）遺伝子変異の生産割合がわずかに変化していた（図３）．このことを同定した．HPS5 変異マウスは炎症性腸疾患（慢性のから，特性を大きく変化させるためには点変異だけでな

炎症性大腸炎）を発症しやすいことを明らかにした．本研究で，日本人患者にも HPS5 遺伝子変異が存在する
ことが示された．平行して，植物成分の 11αOH-カウレ
ン酸が好中球を介する過剰な免疫反応を抑制することを新たに見出した．さらに，絶滅危惧種植物ヌマダイコン
が 11αOH-カウレン酸を多量に含有することも明らかにできた．ヌマダイコンは中国・台湾で抗炎症を目的とした生薬として利用されている．本研究では，11αOH-カウレン酸が有する抗炎症作用の炎症性腸疾患治療への応

図３

野性型 BE1 と変異体の反応産物の鎖長分布（差分グラフ）縦軸は反応産物から基質の割合を引いた差分（％）を示す．
横軸はグルコースの重合度（DP）を示す．

用の可能性を検証した．
【方法】
ヒト HPS5 変異同定は mRNA の配列決定を利用した．炎症性腸疾患モデルには，デキストランサルフェート（DSS）誘導性のマウスモデル（C57BL/6J）を利用した．

く，複数の変異導入が必要であると考えられた．

11αOH-カウレン酸の調整には，ヌマダイコンの栽培法

今後は BE に複数の変異を導入することで，反応産物を確立し抽出方法を確立した．11αOH-カウレン酸のメの構造の大幅な改変を試みたい．さらに，その他関連酵

ラニン合成抑制効果を生体レベルでの薬効発現マーカー39

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成として利用し，
ヌマダイコン抽出液の投与量を決定した．
DSS 誘導性大腸炎への効果は，マウスの体重，生存率，解剖，血液マーカーで検証を行った．
【結果】

肝障害に伴い架橋されるサイトケラチンの同定と機
能解析
辰

川

英

樹

（名古屋大学大学院創薬科学研究科）

国内で初めてのヒト HPS5 変異を同定できた．変異はコンパウンドヘテロで存在し，これまで報告の無いものであった．11αOH-カウレン酸の体内動態検討の結果，【目的】

経口投与の場合は 100 mg/kg（マウス）が必要と計算

本研究は，組織線維化の増悪に関係するタンパク質架された．一方，
ヌマダイコン抽出液の経口自由摂取では，橋酵素トランスグルタミナーゼ（TGase）を対象として，

乾燥ヌマダイコン重に対して 100 倍量の熱水抽出が投病態進展に伴い架橋される標的基質タンパク質の理解を与限界量であった．この投与量では血中 11αOH-カウレ

深め，線維化の病態形成の分子機構の解明および同疾患

ン酸濃度を維持できる量ではないが，毛色で評価されるの治療・予防法の開発に繋げることを目的とする．これ

メラニン合成抑制活性は検出されたため，DSS 試験でまでに肝線維化に伴い架橋される基質タンパク質の網羅

も 100 倍量の熱水抽出を採用した．その結果，ヌマダ

的同定を行った結果，肝臓の機能保持および肝障害に密イコン抽出液は DSS 誘導性大腸炎（急性）の病態を緩接に関連するサイトケラチン 18（K18）およびこれと和した．

ヘテロ二量体を形成するサイトケラチン（K8）が同定【考察】された．これらの in vivo で得られた知見についてさら

今回，ヌマダイコン抽出液が急性の炎症性大腸炎の病なる詳細な検討を行うため，肝障害刺激を与えた肝実質態を改善する結果を得た．当初計画では，HPS5 マウス

細胞モデルでの再現および TGase の架橋修飾が及ぼすにおける慢性の大腸炎に対する効果も検証する予定で機能変換について解析を行った．

あった．しかし，申請者の異動に伴い HPS5 変異マウ

【方法】

スをクリーンアップしたことで，腸内細菌叢が変化した

８週齡の雄マウスに胆管結紮を行い，肝線維化を誘導ためか慢性炎症性大腸炎を発症しなかった．最近，本マした．胆管結紮により誘導される肝実質細胞障害についウスも慢性病態を発症するようになり，ケージ交換の際て細胞レベルで模倣するため，胆汁の主成分であるグリに床敷きの一部を残すことで，再現良く病態を発症してコケノデオキシコール酸（GCDCA）を肝細胞株に処理いる．今後，HPS5 マウスの慢性病態に対してもヌマダして実験を行った．細胞障害の程度は WST-8 やアポトー

イコン抽出液と精製 11αOH-カウレン酸の効果を検討

シスの程度により評価した．細胞中の TGase の活性にする．また，ヌマダイコンは絶滅危惧種であるが，今回ついては，細胞抽出液を作製した後，TGase アイソザ

人工栽培法を確立できたため，今後は台湾での使用に習イム特異的に反応するビオチン標識基質ペプチドや一級い新規生薬として開発する予定である．

アミンと反応させ，標的基質タンパク質に架橋されて取【文献】

り込まれるビオチン量を指標として評価した．

Kato, S., Aoe, T., Hamamoto, A., Takemori, H. &【結果】

Nishikubo, T.: New Deletions in the Hermansky-

胆管結紮後の肝臓では TGase の発現増加が見られる

Pudlak Syndrome Type 5 Gene in a Japaneseのに対し，GCDCA 処理した肝細胞では有意な発現上

Patient, Reports 2, 5 (2019).

昇は見られなかった．しかしながら，基質ペプチドやアミンの取り込みによる TGase 架橋活性については，
GCDCA 処理により上昇が見られた．興味深いことに，
一部のタンパク質の取り込み量において顕著な増加が認められた．また，TGase の siRNA や競合阻害剤を処理したところ，GCDCA による肝細胞障害は有意に抑制さ40

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成で脱凝集されることも示唆されている．しかし，その脱れた．
次に，GCDCA 処理により基質ペプチドや一級アミン

凝集のメカニズムの理解はいまだ十分ではない．本研究が特異的に取り込まれるタンパク質について，モノアビ

では，これまでに我々が様々な実験系を開発しアミロイ

ジンゲルを用いて精製し，増加したバンドの領域に含ま

ド研究に適した酵母プリオンタンパク質 Sup35NM のれるタンパク質を質量分析により検証したところ，K18系を用いて，アミロイドの生成・代謝のメカニズムを明および K8 が同定された．これらの抗体を用いた検討にらかにすることを目的とした．

おいても同様に，基質ペプチドやアミンを取り込んだタ【方法】

ンパク質中の K18 および K8 量の増加が確認された．

Sup35NM モノマータンパク質の動的な構造揺らぎ
が，モノマーが凝集して最終的に生じるアミロイドの構【考察】
これらの結果により，胆管結紮後の肝組織および胆汁造へ与える影響やアミロイドの代謝過程に関して，核磁酸刺激した肝細胞において，TGase が K18 および K8気共鳴法や一分子蛍光法などを含む各種分光法や質量解を選択的に架橋し，肝細胞の障害性に関わることが示唆

析を用いた測定を行った．また，Sup35NM アミロイド

された．

の構造多型が細胞の機能や同種・異種間におけるプリオ【文献】

ン感染性に与える影響については，出芽酵母を用いた遺１）Tatsukawa, H., Tani, Y., Otsu, R., Nakagawa, H.

伝学的解析などから検討を行った．

& Hitomi, K.: Global identiﬁcation and analysis【結果】of isozyme-specific possible substrates cross-

弱いプリオン株の表現型を示す Sup35NM S17R 変異

linked by transglutaminases using substrate pep-体のアミロイドの構造が野生型 Sup35NM のものとはtides in mouse liver ﬁbrosis, Sci. Rep., 7, 45049

大きく異なり，プリオンドメインのカルボキシル末端(2017).

にアミロイドのコアが存在することを見出した．また，

２）辰川英樹，人見清隆 ： 組織の線維化に伴い架橋さSup35NM のモノマーは天然変性であるものの，野生型

れる基質タンパク質群の網羅的同定・解析 , 日本応および S17R 変異体のモノマーには局所構造が存在し，用酵素協会誌 ，52, 1 (2017).

その構造揺らぎが互いに異なることを明らかにした．さらには，S17R 変異体アミロイドの伝播性が弱いことを見出し，アミロイド構造が決定するその脱凝集性およびアミロイドの生成・脱凝集制御機構の解明
田

中

元

雅

（理化学研究所脳科学総合研究センター）

伝播性が複数の細胞内因子によって精密に制御されていることを明らかにした．加えて，Sup35NM モノマーの構造揺らぎは，異種間プリオン感染性や，アミロイド構造を介して脱凝集効率にも大きな影響を与えうることを
見出した．

【目的】

【考察】

アルツハイマー病やパーキンソン病，プリオン病など

タンパク質のモノマー状態における動的な構造が，モ

神経変性疾患では，原因となるタンパク質が凝集し，βノマーが凝集して最終的に生じるアミロイドの構造やそシート構造に富んだ線維状のタンパク質凝集体，アミロの伝播性，共凝集効率を制御する要因になることを明ら

イドを脳内に生成する．最近の研究では，生成したアミかにした．このことは，モノマータンパク質の揺らぎのロイドの構造によって，細胞毒性や脳内伝播性が変わる

制御が神経変性疾患の新たな治療戦略になる可能性を示ことが指摘されているが，モノマーのタンパク質からア

唆するものである．

ミロイドの構造多型が生じるメカニズムには不明な点が【文献】

多い．また，アミロイドは生成し続ける一方向の現象で

１）Ohhashi, Y., Yamaguchi, Y., Kurahashi, H.,

はなく，細胞内因子によってオリゴマーやモノマーにまKamatari, Y.O., Sugiyama, S., Uluca, B., Pie-41

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

chatzek, T., Komi, Y., Shida, T., Müller, H.,

母性 TET3 が体細胞核移植胚の発生に果たす役割を明ら

Hanashima, S., Heise, H., Kuwata, K. & Tanaka,

かにするために，まず胚に異常が生じる発生ステージのM.: Molecular basis for diversiﬁcation of yeast

同定を体細胞核移植胚の in vitro 培養および仮親マウス

prion strain conformation, Proc. Natl. Acad. Sci.

への輸卵管移植後の形態観察により行った．次に，母性U. S. A., 115, 2389 (2018).

TET3 が体細胞核移植胚の遺伝子発現制御において果た

２）Tanaka, M. & Komi, Y.: Layers of structure andす役割を明らかにするために，胚発生に異常が生じる前

function in protein aggregation. Nat . Chem .

後の発生ステージの胚におけるトランスクリプトームのBiol., 11, 373 (2015).

RNA-seq 解析を行い，母性 TET3 欠損により生じる遺３）Ohhashi, Y., Ito, K., Toyama, B.H., Weissman,
J.S. & Tanaka, M.: Diﬀerences in prion strain

伝子発現変化を調べた．
【結果】

conformations result from non-native interac-

TET3 欠損による体細胞核移植胚の表現型は，①着床

tions in a nucleus. Nat. Chem. Biol., 6, 225

前の胎生 3.5 日までは形態および発生率に顕著な影響が(2010).

ないが，②全く着床せず，③胚が着床する胎生 4.5 日に【謝辞】

おいて壁栄養外胚葉形成に異常を生じた．TET3 欠損に公益財団法人日本応用酵素協会の酵素研究助成に深謝いよる遺伝子発現への影響は，④着床前の胎生 3.5 日ではたします．

顕著な変化はないが，⑤胚が着床する胎生 4.5 日では栄養膜細胞の分化に関連する遺伝子群の発現が顕著に低下
した．
【考察】

DNA 酸化酵素による全能性獲得機構の解明
束

田

裕

一

（九州大学稲盛フロンティア研究センター）

本研究により，母性 TET3 は体細胞核移植胚において壁栄養外胚葉形成に重要な役割を果たすことが示唆された．さらに，母性 TET3 の欠損が胚の着床不全を引き起こす分子メカニズムに関して，栄養膜細胞への分化に【目的】

関連する遺伝子群の発現が低下することが明らかになっ生殖は生物個体が自己と同じ種に属する個体をつくりた．しかし，栄養膜細胞への分化に関連する遺伝子群出すという，全ての生物に見られる本質的な生命現象での発現低下が，壁栄養外胚葉形成異常の原因と結果のどある．その生殖において，細胞の全能性 [totipotency]（単ちらであるかは不明である．TET3 は DNA 酸化酵素で独の細胞が自律的に発生を開始し個体を作り出す能力）あることから，TET3 欠損の表現型は DNA のメチル化

は，極めて重要な役割を果たしている．しかし，「全能の効力消去や脱メチル化の阻害による遺伝子発現抑制が性細胞とはどのような細胞であるか？」という学術的な原因と推測される．そこで現在，母性 TET3 欠損によ問いに対し，全能性の分子基盤は未解明である．本研究

る体細胞核移植胚のメチロームへの影響を PBAT (post-

では，これまでに報告例のない体細胞核移植胚特異的再bisulﬁte adaptor-tagging) 法を用いた DNA メチローム

プログラム化因子として，申請者らが同定した DNA 酸

解析により明らかにすることを試みている．

化酵素 TET3 に着目し，体細胞核移植胚の全能性獲得機
構解明を目指す．
【方法】
申請者のこれまでの研究により，母性 TET3 の欠損は体細胞核移植胚の胚盤胞期胚（胎 3.5 日）までの発生には顕著な影響を与えないが，その後の胚発生異常により出生しないことを明らかにしている．
そこで本研究では，42

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

ユビキチン転移酵素を利用した細胞内タンパク質の人工寿命制御出水させた His タグをターゲットとすることで標的タンパク質のリガンドを用いない手法を開発３）することを目指した．
【方法】

庸

介

His タグと相互作用するリガンド（NiNTA）と E3 リ
（国立医薬品食品衛生研究所）

ガンド (BS, MV1)，および，これらの分子を細胞内へ導入するための膜透過ペプチド（CPPs）をコンジュゲー
ト し た ハ イ ブ リ ッ ド 分 子（BS-NiNTA-CPPs, MV1-

【目的】
Crews 教授（Yale 大），内藤部長（国立衛研）らに

NiNTA-CPPs）を合成した．プロテインノックダウンのより開発されたプロテインノックダウン（PROTAC,

検 討 は，His タ グ 融 合 CRABP2 (10xHis-CRABP2-T7)

SNIPER）法は，ユビキチン転移酵素（E3）に結合するを安定発現させた HT1080 細胞に対して化合物処理を小分子（L）と標的タンパク質に結合するリガンド（X）

行いウェスタンブロット法によって細胞内タンパク質ををコンジュゲートした分子（L-X）を用いることで両タ

定量的に確認することで評価した（図２）．

ンパク質を架橋し，標的タンパク質を特異的にポリユビ【結果】キチン化することでプロテアソームによる分解を誘導す化合物（BS-NiNTA-CPPs, MV1-NiNTA-CPPs）はる手法である（図１）１,２）．プロテインノックダウンは，

10xHis-CRABP2-T7 を分解した．E3 リガンドとしてはタンパク質機構解明の有用な手法のひとつであるが，現BS よりも MV1 を導入した化合物がより高い活性を示在の手法では標的タンパク質に合わせたリガンドを用いした．また，プロテアソーム阻害剤である MG132 共存

なければならず広い範囲に適用が困難，リガンドが不明

下では化合物の活性が低下したことから，本分解はプロなタンパク質には適用不可であるなどの問題点が挙げら

テアソームにより行われていることが示唆された．

れる．また UPS を介したタンパク質分解の適用可能範【考察】

囲は未解明であり，これを網羅的に解析する手法は確立

開発したハイブリッド分子により His タグタンパク質

されていない．そこで本研究では，標的タンパク質に融合の分解誘導を達成できた．E3 を利用することで細胞内タンパク質の寿命を人工的にコントロールできる系の構
築は，タンパク質の機能解析だけでなく，新規医薬品の開発を助ける強力なツールとなることが期待できる．
本研究を遂行するにあたり，多大なご支援を賜りました，
公益財団法人日本応用酵素協会に深く感謝申し上げます．
【文献】
１）Paiva, S.L. & Crews, C.M.: Targeted protein

図１

PROTAC, SNIPER 法によるプロテインノックダウン

degradation: elements of PROTAC design, Curr.

Opin. Chem. Biol., 50, 111 (2019).
２）Naito, M., Ohoka, N. & Shibata, N.: SNIPERsHijacking IAP activity to induce protein degradation, Drug Dsicovery Today: Technologies,
31, 35 (2019).
３）Okitsu, K., Hattori, T., Misawa, T., Shoda, T.,
Kurihara, M., Naito, M.* & Demizu Y.*: Development of a small hybrid molecule that medi-

図2

His ダグ融合タンパク質
分解誘導分子の開発

ates degradation of His tag-fused proteins, J.

Med. Chem., 61, 576 (2018).
43

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

蛋白質リン酸化酵素 CaMKII 機能のパラダイムシ
フト

分離を起こしたが，CaMKII は取り込まれなかった．しかし，Ca２＋/CaM を添加すると CaMKII が取り込まれるのと同時に，液相内分離を起こし，CaMKII-NR2B が外

林

康

紀

側，Stargazin-PSD-95 が内側の２つに分離した．
（京都大学大学院医学研究科）

これらの結果は，CaMKII がシナプスタンパク質と共に液−液相分離を起こすことに依り，シナプス内部でのタンパク質の局在分布の調節に関与していることが示唆【目的】
Ca２＋/カ ル モ ジ ュ リ ン 依 存 性 蛋 白 質 キ ナ ー ゼ Ⅱ

された．AMPA 受容体はグルタミン酸に対する親和性(CaMKII) は，興奮性シナプス伝達の調節に重要な役割が低く，神経伝達放出部位の直下に存在しないと機能しを果たしていると考えられてきた．特に一旦活性化されない．CaMKII は，神経伝達放出部位の直下に AMPA

ると，自己リン酸化によって常時活性型になる性質か受容体を集積することに依って，シナプス伝達効率を調ら，長期増強現象を始めとするシナプス可塑性や記憶へ節している可能性がある．

の関与が示唆されてきた．しかし CaMKII には未だ大きな謎がある．一つは，シナプス後部での量，もう一つは回転対称型 12 量体構造である．これらに対し，明快な説明はなかった．我々は，CaMKII の真の機能は同様な結合により他のタンパク質と複合体を形成することにスフィンゴミエリン合成酵素とグルコシルセラミド
合成酵素のヘテロ複合体の解析林康広（帝京大学薬学部）

より，液−液相分離を起こし，それにより，活動依存的なシナプス局所へのタンパク質の移行と濃縮を起こすという仮設を立てた．

【目的】
スフィンゴミエリン（SM）とスフィンゴ糖脂質は，【方法】
CaMKII が液−液相分離を起こすかを検討するため，共通の基質であるセラミドにホスホコリンか糖のいずれ

CaMKII， 代 表 的 な PSD タ ン パ ク 質 で あ る，PSD-95,

かが結合することによってゴルジ体で産生される．400

CaMKII と結合することが知られている NMDA 受容体種以上に及ぶ多種多様な糖鎖構造を示す脊椎動物のス細胞内カルボキシル末端，AMPA 受容体補助サブユニッ

フィンゴ糖脂質の大部分は，セラミドに D-グルコース

ト Stargazin 細胞内カルボキシル末端をそれぞれ大腸がβ結合したグルコシルセラミド（GlcCer）を基本骨菌で発現し，精製した．NMDA 受容体細胞内Ｃ末端，格とする．SM 合成酵素はアミノ酸配列の異なる SMS1

AMPA 受容体補助サブユニット Stargazin 細胞内Ｃ末および SMS2 の二つのアイソフォームからなるが，哺端は蛍光タンパク質 DsRed2 との融合タンパク質とし，乳類の GlcCer 合成に関わる酵素は現在までに GlcCer

また PSD-95, CaMKII は蛍光色素を，クロスリンカー

合成酵素（GlcT）の１種しか見つかっていない．つまで結合させた．それぞれのタンパク質を Ca２＋/CaM のり，SM 合成酵素と GlcT はゴルジ体におけるセラミド

存在下，非存在下で混合，静置し，蛍光顕微鏡で観察した．

代謝の鍵酵素といえる．SM とスフィンゴ糖脂質が形成【結果・考察】する脂質マイクロドメインは空間および機能的にも異なるの非存在下では殆ことが考えられており，ゴルジ体でセラミドが SM または

ど 液 − 液 相 分 離 を 起 こ さ な か っ た． し か し， そ こ に

GlcCer のどちらに合成されるかは，脂質マイクロドメイ

Ca２＋/CaM を添加すると，液−液相分離を起こした．位ンを介した細胞間・細胞内のさまざまなイベントに影響す

相差顕微鏡観察下では，油滴状の濃縮相が多数観察され，ると思われる．

CaMKII, PSD-95, NR2B は Ca

２＋

また蛍光顕微鏡下でも３つのタンパク質が取り込まれて

我々は SM 合成酵素のホモ二量体の解析で，蛍光タンいる様子が観察された．次に Stargazin を加えた場合，パク質再構成法を用いてアミノ末端の近接を調べた．そPSD-95, NR2B, Stargazin の３つが，均一な，液−液相の解析過程で異なるゴルジ槽に局在すると考えられてい44

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

る SMS1 と GlcT の組合わせをネガティブコントロールとdigitonin 処 理 後 に 細 胞 を 免 疫 染 色 し，SMS1 と GlcTして用いたが，予想に反してゴルジ体で蛍光タンパク質の N, C 末端配向を調べた．その結果，SMS1 の N, C末の再構成が観察され，SMS1 と GlcT は近接することが端はゴルジ体において細胞質に配向するが，GlcT はＮ示唆された．Halter らはタグを付加した SMS1 と GlcT

末端がゴルジ体のルーメン側，Ｃ末端を細胞質側に配向を安定発現する HeLa 細胞において電子顕微鏡で細胞内することが明らかになり，蛍光タンパク質再構成法の結局在を調べたところ，二つのタンパク質はゴルジ体で実果を支持するものであった．これらの結果より，SMS1

質的には異なる分布を示すが部分的に共局在することをのＮ末端と GlcT のＣ末端はゴルジ体の細胞質側で近接報告している．しかしながら，ゴルジ体で共局在するすることが分かった．

SMS1 と GlcT の役割については不明な点が多い．そこ(C) SMS1 のＮ末端の SAM 領域は GlcT との親和性にで，SMS1 と GlcT のヘテロ複合体の形成に重要なアミノ酸領域，および，その機能を明らかにすることを目的と重要である
SMS1 のＮ末端（4-68 a.a.）には，sterile alpha motif

して実験を行った．

(SAM) 領域が存在する．SAM 領域はタンパク質相互作【方法・結果・考察】

用を媒介すると考えられているが，SMS1 の SAM 領域(A) GlcT は，SMS2 よりも SMS1 に親和性が高いの機能は解明されていない．SMS1 のＮ末端は GlcT のレ ト ロ ウ ィ ル ス の 発 現 系 を 用 い て， Ｃ 末 端 に V5-近傍に存在することから，SMS1 の SAM 領域が SMS1-

tag を付加した SMS1 および SMS2 を安定に発現する

GlcT ヘテロ複合体の形成に関与するのかを免疫共沈で

COS-7 細胞を作製した．これらの細胞にＣ末端に HA-調べた．興味深いことに，SMS1-ΔN68 は野生型 SMS1

tag を付加した GlcT を発現させ，１％ CHAPS で可溶と比較して GlcT との親和性が低下することが明らかと化し，抗 HA ビーズを用いて免疫共沈を行った．そのなった．コンフォーカル顕微鏡より，SMS1-ΔN68 はゴ

結果，GlcT は SMS2 よりも SMS1 と親和性が高いこと

ルジ体に局在し，細胞内局在に変化はなかった．以上のが分かった．コンフォーカル顕微鏡で細胞内局在を調ことから SMS1 の SAM 領域は，細胞内局在に影響せず

べると，SMS1 はゴルジ体で GlcT と完全に共局在するに，SMS1-GlcT ヘテロ複合体間の親和性に関わることが，SMS2 はゴルジ体および形質膜に局在するため，部が分かった．

分的にゴルジ体で GlcT と共局在した．これらの結果より，(D) SMS1-GlcT ヘテロ複合体は SM 合成を正に制御

SMS1 と GlcT はゴルジ体でヘテロ複合体を形成することが示唆された．

する
SMS1 と GlcT のヘテロ複合体の形成が，SM 合成に与(B) SMS1-GlcT ヘテロ複合体における近傍領域の同定

える影響を調べた．内在性の SMS1, GlcT による影響を

SMS1 と GlcT のアミノ末端が近接するのかを蛍光タ防ぐために，CRISPR/Cas9 システムを用いて HEK293T

ンパク質再構成法で調べた．蛍光タンパク質 Venus の細胞より SMS1-GlcT ダブルノックアウト (DKO) 細胞を作Ｎ末端側（VN）あるいはＣ末端側（VC）を SMS1 の製した．FKBP（FK506-binding protein）-SMS1 キメラ

Ｎ末端あるいはＣ末端に付加したキメラ蛋白質，そしてタンパク質と FRB (FKBP-rapamycin binding protein)-

VC を GlcT のＮ末端あるいはＣ末端に付加したキメラ

GlcT キメラタンパク質を発現する SMS1-GlcT DKO 細蛋白質の発現ベクターを構築した．これらを COS-7 細胞に対し，ラパマイシン処理でヘテロ複合体の形成を胞に発現させ，コンフォーカル顕微鏡およびフローサイ

誘導すると，ラパマイシン未処理と比べて，14C-ステア

トを用いて細胞内局在および蛍光強度を解析した．コリン酸代謝ラベルによる SM 合成速度が約 30％増加しンフォーカル顕微鏡より，各キメラ蛋白質はゴルジ体た．また，グリシンとセリンの繰り返し配列である GSに局在することが分かった．フローサイトの解析より，

リンカーでつなげた SMS1 と GlcT のキメラタンパク質でSMS1-GlcT ヘテロ複合体において，GlcT のＣ末端はも，野生型 SMS1 よりも SM 合成速度が増加したことから，

SMS1 のＮ末端と最も近接することが分かった． N, C

SMS1-GlcT 複合体は SM 合成を正に制御することが明ら

末端にタグを付けた SMS1, GlcT を細胞に発現させ，かになった．

45

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

以 上 の 研 究 成 果 を【 文 献 】 に 記 す よ う に Hayashi

化に応じた組織破壊を伴わない GSL の分解機構を解明

et al., J. Biol. Chem. (2018) で報告しました．日本応することを目的とした．

用酵素協会の研究助成金は，研究を円滑に進めて頂けた【方法】

だけではなく，研究者として大きな励みになりました．

植物材料としてシロイヌナズナの野生型株（WT），

貴財団の助成金採択者として，今後も研究に努力してい

硫 酸 イ オ ン 輸 送 体 SULTR1; 2 の 欠 損 株 (sultr1;2),

きます．

BGLU28, BGLU30 の欠損株（bglu28, bglu30, bglu28/【文献】

bglu30）を用いた．植物体各部位の採取にはバーミキュ

１）Hayashi, Y., Nemoto-Sasaki, Y., Matsumoto,ライト上で MGRL 水耕液を用いて栽培した植物を用い

N., Hama, K., Tanikawa, T., Oka, S., Saeki, T.,

た．GM 培地上で３週間育成した植物をアルミで覆うこKumasaka, T., Koizumi, T., Arai, S., Wada, I.,とで暗処理とした．硫黄十分 (+S), –S の処理は MGRL

Yokoyama, K., Sugiura, T., & Yamashita, A.:

寒 天 培 地 中 の 硫 酸 イ オ ン 濃 度 を 1500μM (S1500),

Complex formation of sphingomyelin synthase

15μM (S15), 0μM (S0) に調整して行った．

1 with glucosylceramide synthase increases

育成後の植物を抽出し，GSL (LC-MS)，硫酸イオン

sphingomyelin and decreases glucosylceramide（イオンクロマト），システイン，グルタチオン（HPLC）

levels, J. Biol. Chem., 293, 45 (2018).

量を測定した（括弧内は測定機器）．総硫黄は試料を硝酸分解後，ICP-MS で測定した．転写産物量は各植物試料から抽出した RNA から cDNA を作成し，定量 PCR

環境条件に応じた組織破壊を伴わないグルコシノ
レートの分解機構
丸山明により測定した．
【結果】①

子植物体各部位の GSL の量と組成に及ぼす–S の影

響を WT と sultr1; 2（植物体内の硫酸イオン量が少な（九州大学農学研究院）

く–S と似た表現型を示す植物３）， を用いて解析した．
葉や茎では sultr1;2 で GSL 量が減少したのに対し，さ【目的】
グルコシノレート（GSL）は，アブラナ科植物が生合成する含硫化合物であり，病虫害への忌避に働く他，発ガンを抑制する効果も知られる．GSL とその分解酵素

やや種子では sultr1;2 でも mGSL 量が維持されていた．
GSL 以外の含硫代謝物量は全ての部位で sultr1;2 で減少した４）．
②

暗処理では BGLU30 の発現が著しく上昇した．

β-グルコシダーゼ（BGLU）は別の細胞に存在し，食暗処理による GSL 蓄積への影響を WT と bglu30 で比害などの組織破砕に伴って分解が起きると考えられて較した．WT では３日間の暗処理で GSL が著しく減少きた．一方で硫黄の貯蔵物質としての GSL の役割も提したのに対し，bglu30 ではこの減少が認められなかっ唱されてきた．アブラナ科植物では総硫黄量の 30％にた．GSL 以外の含硫代謝物量は植物間で変化しなかっものぼることがあり，特に種子には多く蓄積する．植た．

物が暗条件や硫黄欠乏 (–S) にさらされると GSL 量が急③–S が GSL の蓄積に及ぼす影響を WT と bglu28,

速に減少する１,２）．これにより，一次代謝へと硫黄が回

bglu30, bglu28/bglu30 で 比 較 し た．WT と bglu28,

収され，貧栄養下で植物の生存が維持されると考えられ

bglu30 で は S15, S0 で 著 し く GSL 量 が 減 少 し た．

る．しかし，これらの環境変化に応じた GSL の分解機

bglu28/bglu30 は S1500 では WT と同程度に GSL を蓄

構についてはほとんど知見がない．BGLU28, BGLU30積したが，S15, S0 では他の植物と比べて極多量の GSLの発現が –S で，BGLU30 の発現が暗所で著しく上昇すを蓄積し，S0 では生育が抑制された．

ることから，これらが GSL の分解に働くと予測される．

【考察】

本研究では，BGLU28, BGLU30 に着目する事で環境変

46①より，–S 下でも GSL が種子に優先的に蓄えられる酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成と結論した４）．GSL の貯蔵物質としての役割が強く示いことから，その生成には細胞死の際の DNA 断片化酵唆された．②より，BGLU30 が暗所における GSL の分素が関与することが予想された．細胞死はその形態学的解を担う事を示した．
暗所では光合成も抑えられるため，な違いからアポトーシス，ネクローシスに大別され，そGSL 分解で生じるグルコースが回収され，植物の生育

れぞれの代表的な DNA 切断酵素として CAD, DNaseγ

を支えると考えられる．③より，BGLU28, BGLU30 が（ 別 名 DNase1L3） が あ り， い ず れ も DNA 断 片 化 を–S 下で GSL の分解を担う事を示した．各単一欠損株で起こすことが明らかになっている．そこで，野生型マ

は WT と違いがなく，二つの酵素が協調して働く可能

ウス（WT），それぞれの遺伝子欠損マウス（CADKO,性が示唆された．S0 での生育抑制は，GSL 分解が –S

DNaseγ KO），その両遺伝子を欠損したマウス（DKO）

での植物の生育に大きく寄与する事を示している．

に肝細胞ネクローシス，あるいは肝細胞アポトーシスを【文献】

誘導し，血中 cfDNA の検出を試みた．

１）Huseby. et al.: J. Exp. Bot., 64, 1039-1048【結果】(2013).

WT, CADKO では，アポトーシス，ネクローシスの２）Maruyama-Nakashita. et al.: Plant Cell., 1,3235-3251 (2006).
３）Maruyama-Nakashita, et al .: Plant Physiol .,132, 597-605 (2003).
４）Morikawa-Ichinose, et al.: Plants., , 95 (2019).

い ず れ に お い て も 同 程 度 の cfDNA が 認 め ら れ た が，
DNaseγ KO では，アポトーシスにおいてはその生成が部分的に抑制され，ネクローシスにおいてはさらに抑制が顕著であった．また DKO ではいずれの誘導の際にも，cfDNA は全く検出されなかった．このことは，ネクロー
シスの場合は DNaseγが，またアポトーシスの場合はCAD と DNaseγの両方が cfDNA の生成に必要である

DNA 切断酵素による血中 DNA 生成のメカニズムの解明と臨床応用の可能性
水

田

龍

信
（東京理科大学生命医科学研究所）

ことが明らかになった．
【考察】
血液中には DNaseγのほかに DNaseⅠが存在し，これまで cfDNA の生成には DNaseⅠ が主たる役割を担っていると考えられていたが，今回の結果より，DNaseⅠはむ
しろ cfDNA の分解に寄与することが示唆された．本研【目的】

究により cfDNA の生成メカニズムが解明されたが，こ

血液中には，微量ながら分解を免れた cell-free DNAの発見は，酵素の特異性をふまえた cfDNA の評価なら(cfDNA) といわれる DNA が存在する．この cfDNA のびに精製プロトコールの作製に寄与するものと期待され生成メカニズムに関しては不明な点が多いが，その応る．

用に関しては近年臨床分野で大きな注目を集めている．

【文献】

例えば，妊婦の血流中には胎児由来の cfDNA が存在

１）Watanabe, T., Takada, S., & Mizuta, R.: Cell-free

し，これは胎児の出生前診断に用いられている．またDNA in blood circulation is generated by DNa-

cfDNA の中には，がん細胞由来のものもあり，がんの

se1L3 and caspase-activated DNase, BIOCHEM.

診断に応用できることから，その解析はゲノム医療の基

BIOPH. RES. CO., 516, 790 (2019).

盤技術として大きな位置を占めつつある．本研究では，
cfDNA の生成メカニズムの解明を目的とし，特に，そ

臨床免疫・２）水田龍信：細胞死における DNaseγの役割，
アレルギー科 ，71, 114 (2019).

の生成に関与すると予想された二つの DNA 切断酵素に注目して解析を行った．
【方法】
cfDNA はモノヌクレオソーム単位の DNA 断片が多47

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

慢性ストレス応答に関連する脳内 PI3K シグナルの重要性
宮ドロサイトの脱分極レベルの調整に重要な cAMP レベ
ルが低下することを見出した．
以上の結果より，慢性ストレス負荷による成熟オリ

田

信

吾

ゴデンドロサイト特異的な SGK1 による PI3K シグナ（近畿大学東洋医学研究所）

ル経路活性化により，cAMP 量調節を介した髄鞘 Na/K
ATPase 活性調節が行われる可能性が示唆された．
【文献】

【目的】
研究代表者はこれまでに Adult マウスへの慢性ストレ

１）Miyata, S. & Tohyama, M. et al. Plasma corti-

ス負荷による脳内変化として，神経細胞ではなくグリア

costerone activates SGK1 and induces morpho-

細胞のひとつである成熟オリゴデンドロサイトでの特異

logical changes in oligodendrocytes in corpus

的な PI3K シグナルに関与するセリンスレオニンキナー

callosum. PLoS One., 6, e19859 (2011).

ゼである SGK1 (Serum and glucocorticoid-regulated
kinase 1) の発現上昇およびリン酸化による活性化が引き起こされること，さらにはこの SGK1 活性化によりカドヘリン等の接着因子群につながるシグナル伝達機序

光応答性キナーゼ酵素の開発と神経シナプスへの応用
村

越

秀

治

（自然科学研究機構生理学研究所）

を明らかにしてきた ．また，オリゴデンドロサイトの
１）

形態変化の有無等についても検討したところ，SGK1 カ
スケードの活性化により成熟オリゴデンドロサイト特異【目的】

的に突起の異常分岐と細胞質部分の増大が引き起こされ本研究では，プロテインキナーゼである CaMKII をる可能性についても明らかにしてきた１）．そこで，本研

２光子励起で，“ミリ秒レベルの時間分解能” と “マイ究助成では，慢性ストレス負荷時の成熟オリゴデンドロ

クロメートルの空間分解能” で直接制御できるように遺サイト特異的 SGK1 活性化経路の重要性の解明を目指

伝子改変する．さらにこれらを，神経細胞シナプス内でして線維束での髄鞘 /ランビエ絞輪部における詳細な検活性化させることにより，光照射によってシナプスの可討を行った．

塑的変化（長期増強）を惹起できるような光遺伝学的ツー【方法および結果，考察】

ルを開発することを目的としている．

我々は複数の慢性的ストレス負荷マウスでのうつ様症【方法】

状や不安症状の解析を試みているが，これまでの検討か

プロテインキナーゼを遺伝子改変により，光応答性

らは髄鞘 /ランビエ絞輪部での脱髄様の所見は観察され分子である LOV2 ドメインと融合することにより，２ていない．そこでより詳細に髄鞘の構造的･機能的な変光子励起によって活性化させることができる光応答性分化の有無について検討を行った．免疫染色法等による検子を遺伝子工学的に開発する．さらに光応答性 CaMKII

討からは，ランビエ絞輪部のノード領域幅は縮小していを海馬神経細胞に遺伝子銃を用いて導入し，シナプス

るもののノード−パラノード間の境界は明瞭であった．

内で，２光子励起により直接活性化することによって，

しかし，パラノード領域の縮小像とは異なり，パラノー

CaMKII の機能を直接調べ，シナプス長期増強が惹起でド局在タンパク質の一つ Caspr とジャクスタパラノー

きるかどうかを調べる．具体的には，光応答性 CaMKII

ドに局在する Kv1.1 の局在が境界領域で広がっており，を１個のシナプス（スパイン）内で活性化し，スパイン

結果的にパラノード−ジャクスタパラノード間の境界がの体積変化を２光子顕微鏡で観察する．また，シナプス

不明瞭で共局在している様な画像を得た．次に，このよ

長期増強が惹起できるかどうかを電気生理学的に調べる．

うな髄鞘 /ランビエ絞輪部の構造変化が軸索活動レベル【結果】に影響し得るか否かについて検討したところ，跳躍伝導

Phototropin1 は植物の光受容タンパク質キナーゼで活性に関連する Na/K ATPase 活性の低下やオリゴデンあり，青色光照射によって，自身の持つ LOV2 ドメイ

4酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成ンに結合していたαへリックスが解離し，分子構造が可次世代ワクチンとして注目されている．ところが，ウイ

逆的に変化する．我々は LOV2 ドメインを用いて，現ルスタンパク質が動物細胞に毒性を示すため，生産性が在までに paCaMKII のプロトタイプの開発に成功した．

低いことが実用化を妨げていた．昆虫細胞は本来の構造

海馬スライスに遺伝子銃を用いて paCaMKII を導入し，や機能を保持した組換えタンパク質を大量に産生可能で900 nm の２光子励起で paCaMKII を単一スパイン内あり，動物ウイルスのタンパク質を発現させても細胞毒で活性化させたところ，体積増大（シナプス形態的可塑性が低いことから，ウイルス様粒子を生産するための強性）が見られた．また，化学伝達物質であるグルタミン

力なプラットフォームになると考えられる．本研究では，酸の受容体である AMPA 受容体の局在が，paCaMKII

組換え昆虫細胞によりＡ型のインフルエンザウイルス様を活性化させたスパイン内で増加していることを蛍光イ

粒子を高分泌生産するための基盤技術を開発する．

メージングと電気生理実験の両面から確認することがで【方法】

きた（Shibata et al. in preparation）．さらに，海馬のインフルエンザＡウイルスの構造タンパク質のうち，

みならず，大脳皮質スライスにおいても単一スパインに

主要感染防御抗原であるヘマグルチニン（HA）とエン

可塑的形態変化を惹起することに成功した．

ベロープを裏打ちしているマトリックスタンパク質 M1【今後】の遺伝子を高発現型のプラスミドベクターを用いて昆虫

現在までに海馬・大脳スライスでシナプスの可塑的変細胞に導入し，両遺伝子を共発現する組換え細胞を作製化を惹起することに成功しているので，今後は個体マウする．分泌タンパク質や一部の膜内在性タンパク質のＮスで光照射によりスパインの体積変化が惹起出来るかど末端に存在するシグナルペプチドは，シグナル認識粒子

うかを確認する．そのために，光応答性 CaMKII をコーの作用により小胞体膜へと誘導された後，酵素シグナル

ドするアデノ随伴ウイルスを作製し，マウス大脳皮質のペプチダーゼによって切断される．本研究では，HA や神経細胞にプローブを発現させ，光応答性キナーゼを光M1 のＮ末端に付加するシグナルペプチドがウイルス様活性化できるかどうかを個体マウスのレベルで確認する粒子の分泌生産に及ぼす影響について検討する．

予定である．このようにして，個体動物にも応用可能な【結果と考察】光応答性分子を開発し，シナプスと記憶の関係を調べるためのツール開発を進める．

Drosophila 由来の BiP シグナルのＮ末端領域，中央部領域，およびＣ末端領域に特徴的なアミノ酸の種類・数を変化させ，昆虫細胞 High Five による抗体の分泌

昆虫細胞によるインフルエンザウイルス様粒子の分泌生産山

生産を比較検討した．その結果，分泌生産量は顕著に増減し，シグナル配列の改変は組換えタンパク質の生産性を向上させる有効な手段となることがわかった１）．

地

秀

樹

次に，BiP シグナルまたはバキュロウイルス由来の（神戸大学大学院工学研究科）

gp64 シグナルを付加した HA および M1 の遺伝子をHigh Five で発現させると，BiP シグナルを用いた場合【目的】に M1 の分泌発現量が増大した．BiP シグナルを付加し治療薬とは異なり，健常者を対象とするワクチンは大た HA および M1 の遺伝子を High Five に導入して作量生産が必須であり，安全で安価なワクチンを迅速に製製した安定発現細胞は，HA と M1 から構成されるウイ造する技術が必要とされる．ウイルスの表面タンパク質

ルス様粒子を高分泌生産することがわかった２）．

の遺伝子を哺乳動物細胞で発現させると，ウイルス感染【文献】

細胞と同様の生合成過程を経てウイルス様の空の粒子が

１）Ohmuro-Matsuyama, Y. & Yamaji, H.: Modiﬁca-形成，分泌される．ウイルス様粒子はゲノムをもたず感

tions of a signal sequence for antibody secretion

染性がないため安全性が高く，本来のウイルス抗原と同from insect cells, Cytotechnology., 70, 891–898

等の抗原性や免疫原性を示すことから，安全かつ有効な(2018).

49

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

２）Matsuda, T., Tanijima, T., Masumi-Koizumi,
K., Katsuda, T., & Yamaji, H.: Production of
influenza virus proteins using recombinant
insect cells, APCChE 2019 Proceedings, 6 pages(2019).

マルチカラー生物発光共鳴エネルギー移動法を用いたゲノム DNA メチル化レベル定量法の開発
吉田亘（東京工科大学応用生物学部）【目的】
DNA メチル化とは CpG 配列中のシトシンがメチル化される反応であり，遺伝子発現制御に関連している．
正常細胞と比較してがん細胞ではゲノム全体の DNA メ

Fig.1

CXXC-Oluc と MBD-Fluc を用いた DNA
メチル化レベル定量法の原理

Fig.2

CXXC-Oluc と BOBO-1 を用いたゲノム
DNA 定量結果

Fig.3

CXXC-Oluc，MBD-Fluc，BOBO-1 お よび BOBO-3 を用いたゲノム DNA メチル化
レベル定量結果チル化レベルが低下しているため，ゲノム DNA のメチ
ル化レベルはがんのバイオマーカーとなる．これまでに
本研究室ではメチル化 CpG 結合蛋白質（Methyl-CpGbinding domain: MBD）と Fireﬂy luciferase (Fluc) の融合蛋白質（MBD-Fluc）を用いた，メチル化 CpG 定量法を開発している１）．本手法はゲノム DNA に結合さ せ た イ ン タ ー カ レ ー タ ー（BOBO-3） と Fluc 間 で起こる生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）を利用した定量法である．さらに，非メチル化 CpG 結合蛋
白 質 CXXC と Fluc の 融 合 蛋 白 質（CXXC-Fluc） を 用
いて，非メチル化 CpG を定量できることを示している２）．そこで本研究では，Fluc より最大発光波長が短い Oplophorus luciferase (Oluc) を CXXC に融合させた蛋白質（CXXC-Oluc）を開発し，MBD-Fluc と同時に用いれば，メチル化と非メチル化 CpG を同時に定量できると考えた（Fig. 1）．つまり，本手法を用いればゲノム DNA のメチル化レベルを簡便に定量できると考えた．
【方法】
CXXC-Oluc 発現ベクターを構築し，BL21 (DE3) を用 い て CXXC-Oluc を 発 現 さ せ，strep-tag シ ス テ ム
を用いて精製した．精製した CXXC-Oluc とインター
カ レ ー タ ー BOBO-1 を HeLa ゲ ノ ム DNA に 混 合 し，BRET シグナルがゲノム DNA の濃度に依存するか検討50

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成した．最後に，CXXC-Oluc, MBD-Fluc, BOBO-1 および BOBO-3 を HeLa ゲノム DNA に混合し，それぞれの BRET シグナルからゲノム DNA のメチル化レベルを定量できるか検討した．

鉄硫黄クラスター生合成複合体に存在する分子内トンネルによる硫黄輸送メカニズムの解明
和田啓（宮崎大学医学部）【結果および考察】
SDS-PAGE 解析の結果，溶出画分で目的の位置（27kDa）付近にシングルバンドが確認できたことから，【目的】

CXXC-Oluc を組換え生産できたことが示された．ゲノ

鉄硫黄（Fe-S）クラスターは，タンパク質内部に存在

ム DNA に CXXC-Oluc と BOBO-1 を 加 え，BRET シ

する金属補因子であり，一般に［4Fe-4S］や［2Fe-2S］

グナルを測定した結果，ゲノム DNA の濃度依存的にの形が知られている．これら Fe-S クラスターは生物界

BRET シグナルが観察された（Fig. 2）．つまり，ゲノに普遍的に分布しており，呼吸，光合成，アミノ酸やビ

ム DNA 上 で CXXC-Oluc と BOBO-1 間 で BRET が 生

タミン生合成，遺伝子制御に至るまで生命活動の根幹にじていることが示された．最後に，CXXC-Oluc, MBD-

関わる反応の活性 / 触媒中心となっている．Fe-S クラ

Fluc, BOBO-1 お よ び BOBO-3 を ゲ ノ ム DNA に 混 合

スターは単純な構造だが，細胞内では多成分で構成さし，それぞれの BRET シグナルを測定した．その結果，れる複雑なマシナリーが生合成を担う．その代表である

CXXC-Oluc と BOBO-1 間の BRET シグナルは非 メ チ

SUF マシナリーは，オペロンにコードされる六種のタ

ル化 CpG 量に，MBD-Fluc と BOBO-3 間の BRET シグ

ンパク質（SufABCDSE）から構成される．この心臓部

ナルはメチル化 CpG 量に依存することが示された．こであるコア複合体（SufBCD 複合体）は，新規な構造（長れら BRET シグナルから，ゲノム DNA のメチル化レベ

鎖βヘリックス構造）をもち，かつ新規なオリゴマー形

ルを算出した結果，既存法で定量したメチル化レベル成様式をもつ１,２）．本研究では，構造変化により緻密にと一致した（Fig. 3）．以上の結果より，CXXC-Oluc,

制御された Fe-S クラスター合成反応機構の全容を解き

MBD-Fluc, BOBO-1 および BOBO-3 を用いたマルチカ

明かすことを目指し，コア複合体内部の「トンネル構造」

ラー BRET 法によりゲノム DNA のメチル化レベルを簡の生理機能を可視化することを目的とした．

便に定量できることが示された３）．

【方法】

【文献】

ランダム変異導入をコア複合体（SufB 領域）に導入

１）Yoshida, W., Baba, Y. & Karube, I.: Global DNAし，複合体内の機能残基を大腸菌の生育能で評価する

methylation detection system using MBD-fusedin vivo 相補実験系を進めた．機能必須残基への変異がluciferase based on bioluminescence resonance

与える影響を複合体の生化学解析により精査した．さらenergy transfer assay, Anal. Chem., , 9264に，立体構造に基づくコンピューターシミュレーション(2016).

によって，コア複合体内部のトンネル構造の機能性を推

２）Yoshida, W., Baba, Y., Banzawa, K. & Karube,
I.: A quantitative homogeneous assay for global

定した．
【結果および考察】

DNA methylation levels using CpG-binding

コア複合体の機能に必須な残基を探索したところ，

domain- and methyl-CpG-binding domain-fused

SufB サブユニット Cys405 および SufB サブユニット

luciferase, Anal. Chim. Acta., 990, 168 (2017).

Cys254 が機能に必須であることを明らかにした．分子３）Baba, Y., Yamamoto, K. & Yoshida, W.: Mul-

全体の形として細長いβヘリックス構造をもつ SufB にticolor bioluminescence resonance energy

おいて，これらの残基はそれぞれ分子の両端に位置してtransfer assay for quantiﬁcation of global DNA

いた．Cys405 は分子内部の Fe-S クラスター合成サイ

methylation, Anal. Bioanal. Chem., 411, 4765

ト付近，Cys254 は分子表面に存在し硫黄原子の受け取(2019).

りに機能することを明らかにした．コア複合体の立体構51

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

造の詳細を分析したところ，これらの残基間を繋ぐように，分子内部を貫通するトンネルが存在していることが分かった．コンピューターシミュレーション（MD 法）によって，このトンネルは硫黄原子が通過できるサイズを持つことが推定された．これらを踏まえ，SufBCD 複合体における Fe-S クラスター生合成機構を提唱した．
【文献】
１）Hirabayashi, K. et. al.: J. Biol. Chem., 290,
29717–29731 (2015).
２）Yuda, E., et. al.: Sci Rep., 7, 9387 (2017).

52

研究報告

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成
成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

腸内細菌異常による疾患発症メカニズムの解明
新幸

二ペプチドグリカンの構成が 40B3 株と KCTC2242 株で異なっている可能性が示唆された．実際にこれまでの解析において Klebsiella による Th1 細胞の活性化は Toll-（慶應義塾大学医学部）

like receptor (TLR) 依存的であるという結果が得られているため，ペプチドグリカンの違いが Th1 誘導の違【目的】

いにつながっている可能性が高いと考えられた．そこで，ヒトの腸管内腔に存在する腸内細菌は宿主の生理機能領域Ａを 40B3 株から欠損した変異株（40B3 欠損株）に大きな影響を与えており，そのため腸内細菌叢の異常と KCTC2242 株 へ 挿 入 し た 変 異 株（KCTC2242 挿 入（dysbiosis）が様々な疾患の発症につながる可能性が示株）の作製を行った．KCTC2242 株から領域Ａ外側そ唆されている．しかし，どのような原因で dysbiosis がれぞれ 1.5kbp をクローニングし，カナマイシン耐性遺起こるのか，どのような細菌種が疾患発症に直接関与

伝子をその間に組み込んだプラスミドを作成した．そのしているかについては明らかになっていない．これまで

プラスミドを 40B3 株へエレクトロポレーションで導入の研究から，クローン病患者の唾液中に存在していた

し相同組換えにより変異株を作成した．また，同様の方

Klebsiella pneumoniae 2H7 株が腸管に定着すると大法により KCTC2242 株へ 40B3 株由来の領域Ａを挿入

腸で強い Th1 細胞の誘導を引き起こすことが明らかにした変異株を作成した．これらの変異株を無菌マウスになった．そこで本年度は，K. pneumoniae の Th1 誘導経口投与し，それぞれの単独定着マウスを作成した．投に関与する因子の同定のため，K. pneumoniae のゲノ

与３週間後に大腸の Th1 細胞の活性化を解析したとこ

ム比較，K. pneumoniae の遺伝子改変を行った．

ろ，40B3 欠損株は 40B3 野生株と比較して少し弱い程【方法，結果】

度であった．KCTC2242 挿入株に関しては KCTC2242

K.pneumoniae の内，腸内に定着し Th1 細胞を強く野生株と比較して有意に Th1 細胞が活性化されていた活性化する株である 40B3 株と Th1 細胞の活性化にはが，40B3 野生株と比較すると半分程度の強度であった．

ほとんど影響を与えない KCTC2242 株から DNA を精【考察】製しゲノムシークエンスを行った．その結果，40B3以上のことから Klebsiella の Th1 細胞活性化に関与

株特異的に保有している遺伝子として 229 個の遺伝子する候補領域として 8,631bp の領域Ａを同定したが，を同定した．しかしながら，その多くが機能未知の遺変異株を用いた解析から Th1 細胞活性化に関与はする

伝子であり，遺伝子名から Th1 誘導に関与する遺伝がそこまで大きな寄与はないと考えられた．そのため，子の探索は難しいことが判明した．そこで１遺伝子でさらに詳細にゲノム比較を行うことにより候補領域・遺はなく，複数の遺伝子が含まれる 8kb 以上の領域に違伝子を探索する必要があると考えられる．

いがないかを解析した．その結果，40B3 株が保有しKCTC2242 株が保有していない領域として，３つの領域（A, B, C）が見つかった．その一つ領域Ａは 8,631bp
が KCTC2242 株で欠損しており，D-alanyl-D-alaninecarboxypeptidase や D-alanine--D-alanine ligase A な
ど細胞壁ペプチドグリカンの構成に必要なタンパク質をコードしている遺伝子が含まれていた．このことから，

53成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

新生児期におけるケトン体合成能の意義
有馬勇一郎（熊本大学大学院生命科学研究部）

飾の関与を検討した結果，Hmgcs2 KO マウスで有意にミトコンドリアタンパクのアセチル化が亢進していることが確認された．
【考察】
新生児期におけるケトン体合成能の生理的意義とし【目的】て，ミトコンドリアタンパクの過度のアセチル化を緩和

ケトン体は主に肝臓において産生され，心臓などのし，ミトコンドリア機能を保護する働きがあることを確

肝外臓器で消費されている（Arima Y. et. al., JACC

認した．生後環境の変化の中で，胎盤栄養から母乳由来

2019）．空腹時のエネルギー源として知られているが，の脂肪酸を多く含んだ栄養環境へと変化する．

新生児期においては満腹であるにも関わらずケトン体濃ケトン体合成はこの過程で，急激に増加する脂肪酸の一度が高い．我々は，周産期におけるケトン体合成の意義

部をケトン体へと変換することで，ミトコンドリア内でを明らかにすることを目的として以下の検討を行った．

のアセチル CoA の蓄積を回避し，細胞保護的に作用す【方法】

る可能性が示唆された．

CRISPR/Cas9 法 を 用 い て ケ ト ン 体 合 成 の 律 速 段【文献】

階酵 素 で あ る ミ トコンドリア型 HMG-CoA 合成 酵 素

Arima, Y.*, Izumiya, Y., Ishida, T., Takashio,(Hmgcs2) の deletion mutant を樹立し，表現型を検討

S., Ishii, M., Sueta, D., Sakamoto, K., Fujisue, K.,

した．

Kaikita, K. & Tsujita, K.: Myocardial ischemia【結果】

suppresses ketone body utilization. J Am Coll

Hmgcs2 KO マ ウ ス で は 有 意 に ケ ト ン 体 濃 度 が 低
下 し て い る こ と が 確 認 さ れ (Liver tissue; WT1564±

Cardiol. 73(2): 246-247, (2019).
(*corresponding author)

60.1mmol/g, n＝5, KO179±21.5mmol/g, n＝5, p＜
0.0001)，ケトン体合成不全マウスモデルを作成することに成功した．

Hmgcs2 KO マウスの出生率に差は認めず，胎性期にヒト iPS 細胞由来心筋細胞を用いた安全性
薬理試験手法の開発と薬理反応個体間差の検討
伊致死的な影響をもたらさないことが確認された．
一方で，

藤

正

道
（東京大学医学部附属病院）

肝臓は授乳開始後より急速に腫大し，顕著な異所性脂肪沈着を呈した．電子顕微鏡にて Hepatocyte の形状を確認すると，Hmgcs2 KO マウスの Hepatocyte では小滴性の脂肪沈着を認め，ミトコンドリアの変性所見も確認
された．

【背景】
薬物開発過程においてその催不整脈作用を的確に予測することは，予期せぬ突然死を軽減すると共に，本来な生後 3 日目の肝臓サンプルを用いてメタボローム解ら安全な化合物の不要な開発中止を回避することに繋が析を実施した結果，KO マウスにおいて解糖系は抑制さるため，適切な薬剤安全性評価手法の確立が期待されてれている一方で，アセチル CoA は有意に上昇していた．

いる．

しかしながら，TCA サイクル内の代謝産物は Hmgcs2

iPS 細胞およびそこから分化誘導した細胞は由来とな

KO マウスで有意に低下しており，ミトコンドリア機能る体細胞と同一のゲノムを有しているため，ヒト個体のの低下が示唆された．

臓器の生理的特性を反映していると考えられる．このた続いて代謝関連タンパクについて定量比較をした結め，iPS 細胞由来心筋細胞（iPS-CM）を用いることで，果，当初の予想に反して，ミトコンドリアタンパク量は薬剤による催不整脈性を既存手法よりも精度高く，個体

野生型マウスより Hmgcs2 KO マウスの方で多いことがごとに予測することが可能になるのではないかと期待さ確認された．そのため，機能低下の原因として翻訳後修

れている．

54

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

しかし iPS-CM の由来ドナー，由来クローンの違いがiPS-CM の薬剤反応に与える影響は明らかになっておら脂肪肝再生過程で生じる細胞死様式選択メカニズムず，ある１個体・１クローン由来の iPS-CM による試験の解明

結果が，集団の催不整脈性を反映しうるか，また個体ご

稲

葉

有

香
（金沢大学新学術創成研究機構）との薬理反応の差が誘導した iPS-CM に反映されているのかについては明らかにされていない．
【目的】

【目的】

iPS-CM の電気的特性を評価し，薬剤反応にどの程度

脂肪肝における再生障害は，肝障害の遷延化・重症化

由来クローンによる差や個体による差が存在するか検証を惹起するという危険性が知られる一方で，その病因・する．またそれらの差を克服する実験・解析手法を開発

治療法の詳細は，解明されていない．我々は，脂肪肝再する．

生障害誘導メカニズムの解明を進める過程で，肝再生過【方法・結果】

程の統合的ストレス応答に伴う細胞死の増加が，肝再生①健常人５名から計 10 クローンの iPS 細胞および障害に重要であることを見出している．統合的ストレス

iPS-CM を作製し，未投薬時における iPS-CM の拍動数

応答は，脂肪肝の重症化に伴い増強する．今回，高度脂や活動電位持続時間を評価した．その結果，それらの値

肪肝の再生過程では，統合的ストレス応答が増強し，スには由来クローンによる差があることが判明した．由来

トレス応答性転写因子 ATF3 発現が誘導され，細胞死（ア

クローンが同一であればそれらのばらつきは小さかった．

ポトーシス・ネクロプトーシス）が発症し，重篤な再生②５種類のイオンチャネル阻害作用を有する薬剤，臨障害を惹起することを見出した．本研究では，重篤な肝床的に催不整脈作用を有することが知られている薬剤を再生障害の誘因となる細胞死誘導における ATF3 の役割投与し，活動電位時間変化や EAD（早期後脱分極）なを解明することを目的とした．

どの異常電気活動の有無を比較した．その結果，各薬剤【方法】

に対する iPS-CM の反応性は個体における薬理反応と同

高度脂肪肝モデルは，肝臓特異的 ATF3 欠損マウス及様であったが，その反応度合には由来個体による差が存

び対照マウスに対する 16 週間の高脂肪食負荷により作在することが判明した．

成した．脂肪肝再生障害の検討は，高度脂肪肝に対する③投薬前のデータによって使用する iPS-CM を選別す

70％肝切除モデルを用いて行った．肝再生過程の血漿ることによって，薬理反応の個体間差は軽減されること

ALT 値，TUNEL 陽性細胞数（肝細胞死数 )，細胞死関が判明したが，それでも薬理反応には個体間差を認めた．

連因子の遺伝子発現及びタンパク発現により評価した．

【考察】

細胞死様式の評価は，TUNEL・活性型カスパーゼ３の

iPS-CM には由来クローンおよび個体による特性差が反映されており，心毒性評価のためのツールとして使用

蛍光二重染色により行った．
【結果】する際には，実験・解析手法のみならず細胞ソースを標

16 週間の高脂肪食負荷後の肝トリグリセリド量は，準化することが必要である．我々の手法で使用する心筋

ATF3 欠損と対照群で同程度であった．これらマウスの細胞の選別を行えば，薬理反応はある程度均質化される

切除後再生過程では，肝障害の指標である血漿 ALT 値が，それでも由来個体による差が残ることが判明した．

が，ATF3 欠損群で有意に低下した．実際，高度脂肪肝

今後は，iPS-CM の個体間差が被験者の遺伝的背景のの再生過程で生じる壊死を伴う広汎細胞死が，ATF3 欠差に由来するものかを検証するため，薬剤反応性に影響

損群では消失した．一方で，孤発性細胞死は残存するこを与える SNP（KCNH2 rs36210421 など）との関連をとが，TUNEL 染色により明らかとなった．次に，細胞評価することや，実際に薬剤性不整脈を発症した患者か

死関連因子の検討を行った．ネクロプトーシス関連因子

ら iPS 細胞を樹立し，健常者間の差を超える反応性の差

RIPK3 の発現・リン酸化が，ATF3 欠損群で減少した．

が確認されるかを検証することを予定している．

一方で，アポトーシス関連因子の発現・活性型カスパー55

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

ゼ３は対照と同等であった．そこで，細胞死様式を検討

評価，透過型電子顕微鏡による Aβの形態学的評価，脳したところ，高度脂肪肝再生過程で認められる TUNEL

血管平滑筋培養細胞を用いたカスパーゼ 3/7 を指標と陽性・活性型カスパーゼ３陰性の細胞（ネクロプトーシ

した Aβ細胞毒性評価を行った．

ス）が，ATF3 欠損群では，有意に減少した．

【結果】
Aβは，単量体が時間経過と共に次第に凝集し Aβ線【考察】
本研究により，脂肪肝再生過程のネクロプトーシス

維形成に至るが，その過程で形成される Aβ重合体（オの誘導に関与し，重篤な再生障害を引き起す因子としリゴマー），Aβ線維が細胞毒性を示す．今回，我々はて，ATF3 が重要な役割を担うことを明らかにした．現

α-エノラーゼが ① Aβオリゴマー形成，および Aβ線

在，ATF3 によるネクロプトーシス誘導メカニズムに関維形成を抑制すること ②一旦形成された Aβ線維を分して，解析を進めている．

解することを明らかにした．さらに，③α-エノラーゼ
を Aβと共に添加すると Aβによる細胞毒性が軽減され解糖系酵素に焦点をあてた脳アミロイドアンギオパ
チーの病態解析および治療開発
井

上

泰

輝
（熊本大学大学院生命科学研究部）

るというこれまでに報告のない新しい作用機序を見出し，治療応用への可能性を示した．
【考察】
α-エノラーゼが Aβの重合過程の阻害，さらに Aβ線維分解を介して，細胞毒性を軽減することを明らかにした．これらのメカニズムについて，我々はα-エノラー【目的】
脳アミロイドアンギオパチー（CAA）は，アルツハ
イマー病（AD）患者の 90% にみられ，アミロイドベー

ゼが Aβを断片化する可能性，α-エノラーゼが Aβと結合し，Aβの重合を阻害する２つの仮説を立て，検討を進めている．

タ（Aβ）が脳血管に沈着，脆弱化し脳出血を発症する．
高齢化社会が進み CAA 患者が増加する一方で，CAAの予防や治療法は未確立であり，その開発は急務である．アミロイドーシス研究において，共存タンパク質が疾患解明の鍵として認識されるようになっている．とこ
ろが，CAA における共存タンパク質はこれまで検討されておらず，代表研究者は CAA の共存タンパク質の研Bodywide transcriptome landscape inmouse models and human
浦

山

恭

次

（国際電気通信基礎技術研究所佐藤匠徳特別研究所）

究が CAA の病態生理の解明，ひいては治療法開発に結びつく可能性があると考え，プロテオミクス解析により【目的】

CAA に罹患した脳血管における共存タンパク質を複数

従来の疾患研究は，少数の器官や組織に限定されてい同定した（Inoue et al. Acta Neuropathol. 2017; 134:

ました．しかし，生体はより複雑な多臓器連関ネットワー

605-17）．次に，Aβに次いで２番目に多く CAA 罹患血

クで成り立っており，多くの疾患は一つの器官だけでは管に発現しているα-エノラーゼに着目した．α-エノラー

なく，複数の器官に影響を及ぼすことがわかってきていゼは，生命現象に深く関与する解糖系酵素として広く研ます．そこで本プロジェクトではこの多臓器連関ネット

究されている生理活性物質であるが，それ以外の機能にワークの成り立ちと作動性を理解し，Disease science

ついては長らく不明であり，in vitro において Aβの毒に役立てることを最終目的として研究を行っています．

性発現にいかなる影響を及ぼすか検討を行うことを目的

現在までに，すでにクロストークが行われていることがとした．

知られている臓器間での多臓器連関ネットワークについ【方法】ては良く解析されていますが，我々は，各種疾患においチオフラビンＴ蛍光色素を用いた Aβ線維形成過程の56て従来考えられていたよりも，生体内において広範囲に

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

変化が起きているのではないかと考え，全身での遺伝子発現パターンレベルの変化を解析することを１つ目の目
的としました．２つ目の目的として，各種疾患における短眠を作る神経メカニズムの研究
大石陽（筑波大学国際統合睡眠医科学研究機構）

全身での遺伝子発現パターンの data set を構築することで，ある臓器の遺伝子発現パターンから他の臓器の遺伝子の発現パターンが推測できるのではないかと考え，解析を行っています．
【方法】

【目的】
哺乳類において睡眠制御に重要とされる遺伝子やシス
テムは数多く提案されているが，多くの場合，それらを本研究では，ヒト疾患モデルマウス（心筋梗塞，糖尿欠損させたとしても顕著な行動変化は起きない．我々は病，がん，老化促進，腎障害）における病態発生初期か

最近，モチベーションによる睡眠覚醒制御の解析過程で，ら後期の異なるタイムポイントで 13-23 臓器を回収しある神経群の欠損によって生じる，数か月以上の長期間ました．各モデルの各臓器の異なるタイムポイントでのにわたって短眠状態を維持可能なマウスを見出した．本遺伝子発現変動を網羅的に解析し，全身レベルでのトラ研究ではその神経メカニズム解明を目的とした．

ンスクリプトームデータベース（全身網羅的多器官遺伝【方法・結果】

子発現地図，iOrgans Atlas）を構築しました．
【結果＆考察】まず，報酬刺激に応じて活性化する腹側被蓋野（VTA）に着目した．VTA のドーパミン神経の化学遺伝学的活

本データベースをデータマイニングする事で，先行研性化は強力な覚醒維持作用をもたらす．そこでジフテリ

究から遺伝子発現の変化が想定される臓器以外の多臓器

ア毒素の発現により VTA の細胞をマウスにおいて欠損においても遺伝子発現の変化が広範囲で起きていることさせたところ，予想に反して顕著な睡眠量の低下（覚醒が明らかになりました．また，本研究から皮膚が疾患のの増加）が見られた．このメカニズムを解析するため，センサーとして働いている事を明らかにし，さらに骨でVTA 神経の 60% を占めるドーパミン神経を選択的に欠産生されるホルモン Fgf23 を介した骨と皮膚の新たな損させたが，睡眠量に変化はなかった．次に残りの大部臓器連関ネットワークを解明しました．本データベース分を占める GABA 作動性神経を選択的に欠損させたとは論文として発表し「i-organs.atr.jp」にて公開していころ，通常の半分以下となる著しい睡眠量の低下が観察

ます．現在，本データベースを活用することで，新たなされた．従って，この GABA 作動性神経が正常な睡眠

臓器連関ネットワークの解明を行っており，KO マウス

量を維持するために必須の神経群であることが判明しの解析や臨床検体を用いた研究も行っています．今後，た．欠損部位が橋の一部を含んでいたため，同部位の名

本データベースを活用・発展させることで新規疾患マー称を腹側内側中脳橋（ventral medial midbrain/pons;

カーや治療ターゲットの発見につながるのではないかとVMP）とした．

考えています．

化学遺伝学的な VMP GABA 神経の抑制も睡眠を低下【文献】

させたため，一過的な神経活動の抑制も睡眠変化に十分

Kozawa, S.*, Ueda, R.*, Urayama, K.*, Sagawa, F.,であることが示された．また，この神経活動抑制及び神Endo, S., Shiizaki, K., Kurosu, H., de Almeida, G. M.,

経欠損による睡眠量低下は，ドーパミン受容体拮抗薬に

Hasan, S. M., Nakazato, K., Ozaki, S., Yamashita,

より消失もしくは軽減されたため，ドーパミン依存的に

Y., Kuro-o, M. & Sato, T. N.: The body-wide tran-

起こった行動変化であることが示唆された．

scriptome landscape of disease models, iScience., 2,

今回明らかにした神経群は過去に報告のない新しい睡238-268 (2018). *These authors contributed equally

眠制御システムであるため，詳細な解析により新たな不眠症治療薬の開発につながる可能性がある．
【文献】
１）Takata, Y., Oishi, Y.*, Zhou, XZ., Hasegawa,57

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

E., Takahashi, K., Cherasse, Y., Sakurai, T. &ムが機能する組織・時期を探索した．その過程で，Sas-

Lazarus, M.*.: Sleep and Wakefulness Are Con-PTP10D および Slit-Robo システムが創傷治癒に関わる

trolled by Ventral Medial Mid-brain/Pons GA-

可能性を見いだした．具体的には，Sas-PTP10D あるいBAergic Neurons in Mice., J. Neurosci. 3(47):は Slit-Robo システムを遺伝学的に破綻させた翅成虫原10080-10092 (2018). *Co-corresponding authors

基（将来，翅のブレード領域を形成する幼虫期の組織）に対してタングスタンニードルにより物理的損傷を与え細胞競合を介した上皮の内在性がん抑制機構の解明
大澤志津江（名古屋大学大学院理学研究科）た際，その修復に異常をきたすことが分かった．興味深いことに，Slit-Robo システムを遺伝学的に破綻させると，創傷治癒の過程で生じる死細胞が組織から排除されずに成虫原基の上皮層にとどまる様子が観察された．この観察結果は，Slit-Robo システムを破綻させた極性崩【目的】

壊細胞が排除を免れて上皮組織にとどまる現象と類似しヒトのがんのほとんどは上皮由来であり，上皮がんているものである．さらに，そのような排除されずに組の発生・進展には上皮細胞の頂底極性（apico-basal 極織にとどまった死細胞が分泌性の増殖因子を発現してい性）の崩壊が深く関与している．一方で興味深いことることが分かってきた．これらの結果は，排除すべき細に，apico-basal 極性を崩壊した細胞が正常な上皮組織

胞を速やかに組織から排除することが，創傷治癒を行うに生じると，それら極性崩壊細胞は正常細胞との生存競上で重要な役割を果たしていることを示唆している．

合 “細胞競合” に敗れて組織から排除されることが近年分かってきた．しかしながら，上皮組織において正常細胞と極性崩壊細胞が競合する際に，正常細胞がいかにして極性崩壊細胞を認識し，細胞排除を駆動するのか，そ

抗酸化物質キヌレン酸増加の分子機構とその意義
大

橋

一

登
（群馬大学生体調節研究所）のメカニズムはほとんど分かっていない．また，細胞排除システムの生理機能に関しても不明である．本研究では，上皮組織であるショウジョウバエ成虫原基をモデル【背景および目的】

系として用い，正常細胞が極性崩壊細胞を認識し，排除

キヌレン酸はトリプトファン（Trp）から合成されを駆動するメカニズムの同定とその生理的意義の解明をたキヌレニンがキヌレニンアミノトランスフェラーゼ

目指す．

（KAT）により脱アミノ化されることで生成する．キヌ【結果】

レン酸の増加は二型糖尿病やうつ病で認められている

我々はこれまでに，リガンドー受容体システム Sas-が，キヌレン酸の増加の原因や意義はよく分かっていな

PTP10D が 上 皮 組 織 に 生 じ た が ん 原 性 の 極 性 崩 壊 細い．これらの病態を理解するためには，キヌレン酸の機胞を認識する上で重要な役割を果たしていることを能について知見が不足している．

明らかにしてきた（Yamamoto#, Ohsawa# (# equal

これまでに真核生物のモデル細胞である出芽酵母を用

contribution) et al., Nature, 2017）．一方で，研究代表

いて細胞内におけるキヌレン酸の機能を調べてきた．そ者が在籍していた研究室（京都大学生命科学研究科・井の結果，キヌレン酸は過剰な Trp を分解した結果で生垣達吏教授）では，神経系で反発作用を引き起こすリガ

じた排泄物の一種であることが示唆された．すなわち，ンドー受容体システム Slit-Robo が，極性崩壊細胞の排

キヌレン酸増加の一因は，Trp の蓄積であると考えられ除を促進する上で重要な役割を果たしていることを明る．したがって，過剰な Trp による細胞毒性の解析が，らかにしてきた（Vaughen & Igaki, Dev Cell, 2017）．

病態の理解につながると期待される．実際，高 Trp 血

我々は，細胞排除システムの生理機能を明らかにする症という遺伝病も知られており，高濃度の Trp は有害ことを目的とし，Sas-PTP10D および Slit-Robo システであると考えられている．しかし，その原因は不明であ5

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

り，高濃度の Trp が細胞にどのような影響を及ぼすか

配を駆動力として糖を能動輸送する SGLT に大別されもよく分かっていない．本研究では高濃度 Trp による

る．GLUT に関してはその制御・作用機構はすでに広く

細胞毒性の原因特定のために，高濃度 Trp への耐性機検討されている．一方で，SGLT の病態生理作用は未知

構を解析する．

な部分が多い．今回我々は，虚血再灌流障害における心【方法と結果】

臓 SGLT1 の役割をエネルギー代謝制御の観点から検討

出芽酵母の非必須遺伝子変異株ライブラリ（約 5,000した．

遺伝子の欠損株）を用いて，高濃度 Trp への耐性に必

さらに，重症虚血性心疾患においては，不要代謝産

要な遺伝子のスクリーニングを行った．その結果，い物として蓄積した乳酸が重要なエネルギー基質としてくつかのオートファジー関連遺伝子が過剰な Trp への利用されることが報告されている．今回我々は，自施設耐性に必要であることを見出した．しかし，過剰な Trpの臨床データベースを用いることにより，急性心筋梗塞

によるオートファジーの活性化はほとんど認められな（AMI）症例における乳酸の血中濃度に影響を与える因

かったことから，恒常的なオートファジーが過剰な Trp

子，さらにはエネルギー基質としての乳酸利用を促進すへの耐性に必要であることが示唆された．また，RNAる因子を検討した．

シーケンス解析によって，高濃度 Trp に応答する遺伝【方法および結果】子を探索したところ，いくつかのアミノ酸代謝酵素遺伝

最 初 に，SGLT1 が 左 右 心 房 心 室 全 体 に 相 当 量 発子の発現が変動していることも確認できた．これらの実現していることがヒト剖検心の免疫染色及びマウス

験から得られた結果を統合的に解析し，高濃度 Trp へ

Langendorﬀ 摘出灌流心の膜分画蛋白レベルで確認さの応答に重要なプロテインキナーゼの特定に成功した．

れた．また，マウス心筋において，SGLT2 の発現は確【考察】

認できなかった．一方，phlorizin による短期的な心臓

オートファジー関連遺伝子やアミノ酸代謝酵素遺伝

SGLT 阻害により虚血再灌流障害は助長され，心機能回子が過剰な Trp への耐性に必要であることが分かった．

復が低下することが確認された．さらに，虚血再灌流中

オートファジーはタンパク質を分解し，アミノ酸を再の SGLT 阻害が心筋細胞内への糖取り込みと解糖系活性利用する機構であるため，過剰な Trp への耐性にはアを抑制し，ATP 供給を低下させることが証明された１）．

ミノ酸代謝が重要と考えられる．また，特定した高濃度

次に，AMI の虚血再灌流後急性期において乳酸値のTrp への応答に重要なプロテインキナーゼはアミノ酸代

動態に影響を与える因子について検討を行った．虚血再謝の制御に重要なシグナル伝達を担うと予想された．

灌流療法後の乳酸値は心不全の重症度である Killip 分類に比例すること，また，発症前に梗塞前狭心症が存在す

ナトリウム / グルコース共輸送体（SGLT1）を介した心臓エネルギー代謝制御機構と病態への関与
柏

木

雄

介

る AMI 症例ではエネルギー基質として乳酸利用が促進されていることが確認された．
【結論】
心臓 SGLT1 の活性化は，虚血再灌流中の心筋への糖（東京慈恵会医科大学医学部）

取り込み能の亢進と，これに伴う ATP 供給を介して，心保護的に働くことが示された．また臨床データの検討【背景および目的】
病的心筋において，限られたエネルギー基質をいかにから，発症前から虚血に晒されている AMI 症例ではエネルギー基質として乳酸利用が促進されていることが確

有効に利用できるかは重要な課題となり得る．虚血を含認された．

めた様々な心疾患の特に急性期治療において，主要なエ【文献】

ネルギー基質となる糖の取り込み能と利用効率の最適化

１）Kashiwagi, Y., Nagoshi, T., Yoshino, T., Tanaka,

は重要である．心筋細胞における糖輸送体は，濃度勾配

T., Ito, K., Harada, T., Takahashi, H., Ikegami,

依存性促進拡散型糖輸送体の GLUT と，ナトリウム勾M., Anzawa, R. & Yoshimura, M.: Expression59成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

of SGLT1 in Human Hearts and Impairment ofろ，レプチンによる STAT3 リン酸化を阻害し，視床下Cardiac Glucose Uptake by Phlorizin during

部レプチン抵抗性を誘導することを明らかにした．

Ischemia-Reperfu-sion Injury in Mice. PLoS

One. 2015 Jun 29; 10(6): e0130605.

次に GIP をマウスに腹腔内および脳室内投与したと
ころ，レプチンによる抗肥満作用を減弱させることを明らかにした．さらに，GIP がレプチンによる視床下部

食品由来シグナルによる視床下部の摂食調節ホルモンの感受性変容
金子賢太朗（神戸医療産業都市推進機構先端医療研究センター）

POMC ニューロンの活性化を阻害すること，GIP によるレプチン抵抗性の誘導が脳 Rap1 欠損マウスでは消失すること，GIP 受容体阻害薬の肥満マウスへ脳室内投与により体重減少作用を示すことを見出した．
以上より，GIP が視床下部 Rap1 を活性化することによりホルモン感受性異常を惹起することを明らかに【背景】

し，“腸管ホルモン－視床下部 GPCR － Rap1 活性化”

肥満では，摂食抑制ホルモンであるインスリンやレプという腸－脳連関に基づく新しいレプチン感受性の制チンの視床下部における感受性異常（抵抗性）が惹起さ

御メカニズムを解明した（Kaneko. Journal of Clinicalれ，エネルギー・糖代謝恒常性の破綻を来し肥満や糖尿

Investigation, 2019, in press）．

病が発症するが，その分子メカニズムは未解明である．
我々は最近，レプチン抵抗性の発症に関わる細胞内シ
グナル分子の探索を行い，低分子量Ｇタンパク質 Rap1が視床下部に高発現を示すこと，肥満マウスの視床下PSMA のグルタミン酸カルボキシペプチダーゼ活性を標的とした前立腺がん蛍光イメージングプロー

部で Rap1 の活性型が増加すること，を見出した．そこ

ブの開発

で視床下部の Rap1 活性化が肥満や糖代謝異常の発症に神寄与すると想定し，視床下部を含む前脳特異的 Rap1 欠

谷真子（東京大学大学院医学系研究科）

損マウスを作製することにより，視床下部 Rap1 の活性化がホルモン感受性異常を惹起することを証明した

PSMA (prostate speciﬁc membrane antigen) は，グ（Kaneko. Cell Reports, 2016）．

ルタミン酸カルボキシペプチダーゼ活性を有する膜タン【目的】

パク質であり，前立腺がんなどのがん組織での発現亢進

肥満において視床下部レプチン抵抗性を誘発するが報告されている．現在までに，PSMA を標的とした液性因子は不明である．そこで本研究では，Rap1 が診断薬や治療薬の開発が盛んに行われきたが，その多く

GPCR/Gs/cAMP 経路により活性化され得ることに着目

は PSMA に対する抗体やリガンドを用いた always-on

し，GPCR リガンドによる Rap1 活性化機序の解明を目型のプローブであった．そこで我々は，PSMA を標的的とした．

とした新たな術中イメージングツールを開発するべく，【方法】

PSMA のカルボキシペプチダーゼ活性を標的とした世外因性薬剤に応答する視床下部ニューロン網を維持し界初の activatable 型蛍光プローブの開発を目指した．

た『in vitro 視床下部器官培養系』を用いて Rap1 活性

まず初めに，PSMA の基質となり，反応前後で電子化刺激および細胞内レプチン抵抗性誘発因子を探索し密度が大きく変化するグルタミン酸誘導体を探索した

た．

ところ，アゾホルミル基を介してグルタミン酸をベン【結果】ゼン環に導入した誘導体が PSMA の基質となることを

脳スライス系において，腸管ホルモン GIP が視床下見出した．さらに，この加水分解反応に伴う電子密度部 Rap1 の活性化を誘導することを見出した．そこでの変化を利用することで，PSMA のカルボキシペプチ

GIP によるレプチン感受性における役割を検討したとこ

ダーゼ活性を検出可能な蛍光プローブを開発した．本プ

60

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

ローブは，PSMA との反応前は d-PeT (donor-excited

する複数のトランスジェニックマウス，初代培養系をも

photoinduced electron transfer) により消光している

ちいた実験の結果，本エンハンサーを欠失したマウスでが，PSMA との反応に伴いグルタミン酸が切断されると，は，負の選択が不全となることがわかった．さらに，本アゾホルミル基が脱離して強蛍光性の生成物が産生し，エンハンサーが，TCR シグナル依存的な Bim の発現に100 倍以上の蛍光強度上昇を示すことが明らかになっ必要であることも判明した．以上のことから，本エンハた．次に，PSMA 高発現前立腺がん細胞 LNCaP およびンサーが，TCR シグナル依存的な Bim の発現制御を介低発現前立腺がん細胞 PC3 に適用したところ，LNCaP

して負の選択に貢献するエンハンサーであると結論し細胞においてのみ蛍光上昇が観察され，またその蛍光上た．一方で，本エンハンサーを欠失したマウスの末梢Ｔ

昇は PSMA 特異的阻害剤 2-PMPA で抑制されることが細胞には異常が認められず，また，当該マウスは自己免示された．これらの結果から，開発したプローブにより疫疾患を発症しなかった．本マウスを実験的自己反応性

生きた培養細胞における PSMA 活性を検出できること

脳脊髄炎（EAE）実験に供したところ，野生型と全くが示された．さらに，前立腺がん患者由来の臨床検体に同じ症状を示した．つまり，本エンハンサーの欠失は，プローブを添加し，蛍光イメージング及び病理組織染色

EAE による自己免疫の症状を悪化させなかった．したを行ったところ，蛍光上昇を示す部位と PSMA を発現がって，本エンハンサーは，胸腺における自己反応性Ｔするがん部位とが概ね一致することも示された．

細胞の除去には必要であるが，末梢Ｔ細胞の恒常性・自己免疫には必要ではない，と結論した．

胸腺における負の選択に寄与するゲノミックエンハ
ンサーに関する研究
河

岡

慎

平

本研究により，胸腺における負の選択に特化した機能を持つゲノミックエンハンサーを同定した．現在，エンハンサーを欠失させるアプローチを，がんが個体に悪影響を与えるメカニズムを調べる研究にも応用している．

（京都大学ウイルス・再生医科学研究所）
胸腺における負の選択の現行モデルでは，Ｔ細胞受容体（T cell receptor; TCR）と自己抗原の結合強度が定
量的にアポトーシス遺伝子の発現量（アポトーシス強度）へと変換され，自己抗原を強く認識する TCR を持つ胸成体における社会的行動異常に関与する大脳形成不全の原因の解明
川口

大地（東京大学大学院薬学系研究科）

腺細胞が，自己反応性Ｔ細胞としてアポトーシスにより除去される．このモデルを支持する因子の一つが，アポ自閉症の原因は未だ多くは解明されていない．これまトーシス促進遺伝子 Bim である．Bim の発現量は TCRで同定されている自閉症リスク遺伝子も 1︲2% 程度の患

シグナル依存的に増加し，Bim を欠失させたマウスで者を説明するに過ぎず，その症状を広範に説明する異常は負の選択が不全となる．本モデルは広く認知されていは明らかになっていない．最近，数割にのぼる多くの自るものの，TCR シグナルと Bim 依存的なアポトーシス

閉症児について脳の局所（前頭前野など）における肥大を定量的につなぐメカニズムに関する我々の理解は限定が起こることが示された．前頭前野は言語機能や社会的的であった (Strasser et al. Immuno. Cell Biol. 2008)．

行動の調節などを担う領域であり，前頭前野肥大化が自演者は，ゲノミックエンハンサーを欠失させるアプ

閉症発症に関与する可能性が十分に考えられるが，そのローチによって，この問題に取り組んだ．まず，エピゲ

関連は明らかになっていない．近年，自閉症患者に特徴

ノム解析によって，Bim 遺伝子の上流に胸腺細胞に特的な遺伝子変異を網羅的に探索する試みが活発に行われ異的なエンハンサーを発見した．本エンハンサーを欠失ており，複数の Fgf シグナル関連因子が自閉症原因候補させたマウスを作製したところ，胸腺に，自己反応性Ｔ遺伝子として挙げられている．Fgf シグナルは発生過程

細胞の特徴を持つ細胞が蓄積した．特定の TCR を発現において細胞増殖を制御して組織のサイズ決定に関与す61成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

ることが知られており，申請者はこのシグナルの異常がて食欲・筋肉量・体重を増加させる報告があり（Bai Y

自閉症児に見られる前頭前野肥大化に関与する可能性を

et al. Support Care Center, 2017），本邦でも昨年 11

考えた．

月に製造販売承認申請された．

そこで本研究では，Fgf シグナル関連因子の変異マウ

サルコペニアは筋力低下を主徴とする老年症候群であスを作製し，前頭前野肥大化とそのメカニズムの解析，り，超高齢社会を迎える我が国においてサルコペニアの

さらには行動解析を行った．生後において大脳のサイズ

病態解明および予防・治療法の確立は喫緊の課題である．

を調べた結果，Fgf シグナル関連因子の変異マウスにお筆者は魚油に多く含まれる EPA/DHA の抗サルコペ

いて前頭前野を含む大脳前方領域が肥大することが明ら

ニア効果に着目し，骨格筋量が低下したサルコペニア

かとなった．そこで，Fgf シグナルがいかなる発生時期

モ デ ル マ ウ ス（SAMP1 マ ウ ス（Haramizu S et al, J

において機能することで大脳前方形成に関与するのかを

Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2011））への EPA/DHA

調べた．その結果，胎生期の非常に早い時期こそが大慢性給餌実験を行った．結果，対照群（コーン油投与群）

脳前方肥大に関与する重要な時期であることが示唆されと比較して体重に変化は認めなかったが，上肢の握力がた．この結果から，疾患において見られる大脳形成の異増加していることを新規に突き止めた（図１）．また，常は胎生期の早い段階における Fgf シグナルの異常に起

空腹時血糖や血清脂質（総コレステロール）といった代因している可能性が考えられる．現在，胎生期の早い段

謝パラメータの改善も認めた（図２）．こうした知見から，階において Fgf シグナルの下流でどのような因子が前頭EPA/DHA 投与によるインスリン抵抗性や炎症などの全前皮質形成に関与するのかを調べている．

身性の変化が骨格筋の筋肉内シグナルを変化させ，筋力

また，Fgf シグナル関連因子の変異マウスが自閉症様改善がもたらされた可能性が示唆され，今後さらなる解行動を示すのかを調べた結果，Fgf シグナル関連因子の析をすすめ，メカニズムの解明やサルコペニア治療標的変異マウスでは有意に反復行動が増大すること，社会性の探索を目指す．

行動が低下することが明らかとなった．
以上の結果から，また，臨床面においてはサルコペニア外来を開設し（症

Fgf シグナルの異常により自閉症が発症する可能性が示例報告など論文化２）），血糖コントロール不良のサルコ唆された．

ペニア高齢２型糖尿病患者に対し，入院管理下で血糖コントロール・（比較的）高タンパク（１～1.2g /日）の食事療法・リハビリテーション科と協働した運動療法，

グレリン分泌細胞における GPCR 発現解析および新規調節因子の探索
小山

博の集学的治療を行い，骨格筋の質・量におよぼす影響を検討する臨床試験を計画している（名古屋市立大学病院
IRB に申請中）．

之（名古屋市立大学大学院医学研究科）
申請者はこれまで胃グレリン分泌細胞株の RNA シー
クエンシングによる網羅的遺伝子発現解析を行い，高発現する GPCR のリガンドの添加実験によりトリプト
ファンやパルミチン酸，長鎖脂肪酸など栄養素がグレリン分泌を制御することを明らかとしてきた１）．グレリン
は成長ホルモン (GH)－IGF-1 分泌を介した骨や骨格筋の成長促進作用だけでなく摂食増進，心機能改善，抗炎症作用を有する．グレリンの経口アナログ製剤であるア
ナモレリンを悪液質患者に投与すると GH 分泌を介し62

図１

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

る．そのため，オレキシンの機能を補完する薬物はナルコレプシー治療薬として期待される２）．これまでに我々は，オレキシン受容体を標的とした創薬研究を実施
し，OX2R 選択的作動薬 YNT-185 を見出してきた３）．
YNT-185 はナルコレプシーモデルマウスに対する末梢投与（40mg/kg）で顕著なカタプレキシー抑制作用を示し，ナルコレプシーの随伴症状である肥満傾向を有意に抑制した４）．このように OX2R 作動薬はナルコレプ
シー治療薬として期待される一方で，内因性オレキシ
ンは OX2R のみならず OX1R にも作用する．ナルコレ
プシーにおける OX1R の機能は未だ明らかとなっていないため，本研究では OX1R の薬理効果の解明に向け
OX1R にも作動活性を有するリガンドの開発に着手した．
【方法】
YNT-185 の構造より誘導した化合物群は，いずれも高い OX2R 選択性を有していたことから新たに OX1R
図２に親和性のある異なる構造を設計することができればOX1R 作動活性が発現すると考えた．我々のグループ
では，これまでの一連のオレキシン受容体リガンドの【文献】

探索過程で，モルヒネ構造を有するκオピオイド受容体１）Koyama, H. et al.: ʻComprehensive Proﬁling of作動薬が OX1R 拮抗活性を有することを見出しており，

GPCR Expression in Ghrelin-producing Cellsʼ

構造最適化をすることでオピオイド受容体には親和性

Endocrinology. 157(2): 692-704, (2016).

を示さず高い OX1R 選択的拮抗活性を有する YNT-707

２）Koyama, H. et al.: ʻThe ﬁrst adult Japanese caseを見出している５）．そのため，YNT-707 の構造のうち

of hypophosphatasia successfully treated withOX1R 結合に必要な構造を同定することができれば，

enzyme replacement therapyʼ Internal Medicine,

OX1R 作動薬の分子設計に有用な情報が得られると考(2019). (under review)

えた．以上を踏まえ，本年度は YNT-707 の構造のうち
OX1R 選択的結合に寄与する構造の同定を行った．
【結果】

オレキシン受容体アゴニストの創製と薬理作用の解明
斉藤毅（筑波大学国際統合睡眠医科学研究機構）

YNT-707 の OX1R 拮抗活性はモルヒネ構造に起因しているおり，ファーマコフォアとして機能するスルホン
アミド構造とアミド側鎖構造を適切に配置していると考えられる．YNT-707 のこれら２つの構造を保持し，そ【目的】

れらの配向に関与するモルヒナン骨格上Ｄ環とＥ環を除

視床下部外側野で産生される神経ペプチドオレシキ

去した誘導体３種を合成し，その活性を評価した．そのンは，２つのオレキシン受容体（OX1R，OX2R）に結結果，それぞれ環を除去した誘導体は，環を除去しても合することで覚醒や摂食を制御する１）．オレキシン産十分な活性を有することがわかり，また両方の環を除去

生ニューロンの変性により脳内オレキシン量が減少すした誘導体では活性は減弱するものの，1.3μM の活性

ると，深刻な睡眠障害であるナルコレプシーを発症すが保持されることを明らかにした．この結果を考察する

63

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成ために誘導体の配座解析を行ったところ，YNT-707 よ2015）．本パイプラインと Arc 遺伝子レポータを用いり環を除去することでそれぞれのファーマコフォアの自て，MK-801 投与下のマウスの全脳神経活動解析を全由度が向上し，特にスルホンアミド部位の配座固定が20 脳の全脳イメージングデータから解析し，特徴的な

OX1R 拮抗作用に重要な役割を果たしていることがわ

反応を示す細胞群を抽出することに成功した．さらに，かった．以上の結果を踏まえ，
今後 YNT-185 の構造中に，

in situ hybridization によりこれらの活動細胞の細胞種

YNT-707 のスルホンアミド部位の配座を再現できる構同定に成功した（Neuron 2016）．組織透明化試薬のさ造を導入することで OX1R 作動薬の開発を行っていく

らなる高度化と透明化原理の解明のため，1600 種類以予定である．

上の化合物からなるスクリーニングを実施し，第二世【文献】

代 CUBIC 試薬を開発して成体マーモセット全脳の透明

1）T, Sakurai. et al.: Cell. 92, 573-585 (1998).

化と３次元観察に成功した（Cell Rep. 2018）．細胞ラ

2）T, Nagahara. et al.: J. Med. Chem. 5, 7931 –ベリング法の拡張のため，高速な「交配なし」マウス遺7937 (2015).

伝学（次世代マウス遺伝学）の構築を行い，新規レポー3）M, Mieda. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
101, 4649-4654 (2004).
4）Y, Irukayama-Tomobe. et al.: Proc. Natl. Acad.

Sci. U. S. A. 114, 5731-5736 (2017).
5）H, Nagase. et al.: J. Med. Chem. 60, 1018 – 1040
(2017).

タマウスの作出（Cell 2014-1, -2），概日時計遺伝子のレスキュー実験等での実証（Mol. Cell 2017）に成功した．さらに，免疫組織学的なラベリング法への適応も進め，マウス膵臓，腎臓，トリ胚などでのアプリケーショ
ン例を報告（Nat. Commun. 2017, Kidney Intl. 2019,
Dev. Biol. 2018） す る と と も に， ３ 次 元 病 理 学 の 実現に向けたパイロットスタディも行なった（Sci. Rep.

全組織レベルの高速な遺伝子発現解析を目指す組織
透明化技術の開発洲﨑悦2017）．これらの個体レベルのシステム生物学実現を目
指すスキームをまとめ，英文総説として発表した（CellChem Biol 2016, npj Syst. Biol. App 2017）．

生【文献】（主要なもの５報）（東京大学大学院医学系研究科）

１）Tainaka, K.*, Murakami, TC.*, Susaki, EA.,
Shimizu, C., Saito, R., Takahashi, K., Hayashi-【目的・方法】

Takagi, A., Sekiya, H., Arima, Y., Nojima, S.,

全臓器・全身スケールでの遺伝子発現解析のために，

Ikemura, M., Ushiku, T., Shimizu, Y., Murakami,

高度な組織透明化技術とライトシート顕微鏡による高速

M., Tanaka, KF., Iino, M., Kasai, H., Sasaoka,

な３次元観察方法を組み合わせ，個体レベルのシステム

T., Kobayashi, K., Miyazono, K., Morii, E., Isa,

生物学を実現させることを目指した．

T., Fukayama, M., Kakita, A. & Ueda, HR. (*co-【結果・考察】ﬁrst): Chemical Landscape for Tissue Clearing

新規の透明化試薬スクリーニング系を立ち上げ，40
種類の水溶性化合物からアミノアルコールが高度な組織

Based on Hydrophilic Reagents. Cell Rep., 24,2196-2210.e9 (2018).

透明化活性を持つことを発見した（Cell 2014-1）．また２）Ode, KL.*, Ukaim H.*, Susaki, EA.*, Narumi,

アミノアルコールがヘムを脱色する作用を有することを

R., Matsumoto, K., Hara, J., Koide, N., Abe,

発見し，マウス全身の高度な透明化に世界で初めて成T., Kanemaki, MT., Kiyonari, H. & Ueda HR.

功した（Cell 2014-2）．ライトシート顕微鏡による透明(*co-first): Knockout-Rescue Embryonic Stem化された全脳・全身画像取得と画像解析により，細胞回

Cell-Derived Mouse Reveals Circadian-Period

路の解析をオミクス的に多サンプルで解析するパイプラ

Control by Quality and Quantity of CRY1. Mol.

インの構築に成功した（Cell 2014-1, -2, Nat Protoc.

Cell, 65, 176-190 (2017).

64

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

３）Tatsuki, F.*, Sunagawa, GA.*, Shi, S.*, Susaki,

むことで分析が可能であった．一方，リスク因子がアウ

EA.*, Yukinaga, H.*, Perrin, D.*, Sumiyama, K.,

トカムに及ぼす影響がアウトカムの属性によって異なる

Ukai-Tadenuma, M., Fujishima, H., Ohno, RI.,かを検討する際，これを単一の回帰モデルで取り扱うこTone, D., Ode, KL., Matsumoto, K. & Ueda, HR.

とは難しく，アウトカムごとに回帰モデルを構築し，別々(*co-ﬁrst): Involvement of Ca2+-Dependent Hy-にモデルの解釈が行われることが多かった．しかし回帰

perpolarization in Sleep Duration in Mammals.

モデルを別々に構築してしまうと，モデル間で説明変数

Neuron, 90, 70-85 (2016).

と従属変数との関連性を比較することは難しく，結果と４）Susaki, EA. & Ueda, HR.: Whole-body and

して，アウトカム間でのリスク因子の及ぼす影響の差異

Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques

を統計学的に検出することの障害となっていた．こうしwith Single-Cell Resolution: Toward Organism-

た事象を単一の回帰モデルで表すことができれば，説明

Level Systems Biology in Mammals. Cell Chem.

変数と従属変数の関連性を評価するのと同じ尺度でアウ

Biol. 23, 137-157 (2016).

トカム間の差異を表現することが可能となり，リスク因５）Susaki, EA.*, Tainaka, K.*, Perrin, D.*, Kishino,

子とアウトカムとの関連性の理解の促進につながるもの

F., Tawara, T., Watanabe, TM., Yokoyama, C.,と期待される．我々は混合モデルの性質に着目し，線形Onoe, H., Eguchi, M., Yamaguchi, S., Abe, T.,

混合モデルもしくは一般化線形混合モデルを拡張するこKiyonari, H., Shimizu, Y., Miyawaki, A., Yokota,とで，こうしたアウトカム間でのリスク因子がアウトカ

H. & Ueda, HR. (*co-ﬁrst): Whole-Brain Imag-

ムに及ぼす影響の差異を検出できる可能性を見出した．

ing with Single-Cell Resolution Using Chemical

アウトカム間での影響の差異を単一のモデルで取りあつ

Cocktails and Computational Analysis. Cell ,かえるようになり，種々のモデル分析に応用できるもの

157, 726-739 (2014).

と期待される．

リスク因子が各アウトカムに及ぼす影響の差異の検出
髙

原

充

佳
（大阪大学大学院医学系研究科）

アルツハイマー型認知症の病態解明と新規治療・診断法の確立に向けた研究
武

田

朱

公
（大阪大学大学院医学系研究科）

リスク因子（説明変数）がアウトカム（従属変数）に及ぼす影響を検討する際，回帰モデルは大変有用な統計【目的】

学的解析手法である．これまでにも種々の性質を持つア

アルツハイマー病の病態解明とその診断・治療法開発

ウトカムに対して，様々な回帰モデルが考案され，臨床へ向けた基盤的研究を行う．アルツハイマー病の特徴的医学を含め，生命科学分野でも広く用いられてきた．あ

病理所見である神経原線維変化（タウ凝集体）は神経細る事象に関連する作業仮説について，１つの回帰モデル

胞死と直接的に関連しており，診断・治療法開発の有力で分析できれば，複数の因子を投入したとしても，それな標的と考えられている．申請者等はこれまでにタウらを同じ土俵，同じ尺度で評価・比較することが可能と病理の進展に関与する特殊なタウを同定しており１－３），なる．臨床で観察される事象は種々の因子が互いに影響

これを標的とした治療法開発を進める．またタウを標的を及ぼしあった結果として観察されることが多く，多数とした髄液マーカー探索のためのプレクリニカルモデルの因子を同時に１つのモデルに組み込める回帰分析は魅の構築や，ヒト髄液検体を用いた病態マーカーの開発を力的である．これまで，医学研究分野においても，回帰行う．さらに，認知症の超早期診断に向けた試みとして，モデルを用いて，交絡因子の調整，交互作用効果の検出

高精度視線検出技術を用いた定量的認知機能評価法の開等が試みられてきたが，いずれも１つのモデルに組み込

発を行う．

65

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成【方法・結果】
１：タウ伝播を標的とした治療シーズの探索
タウを標的とした免疫療法の開発をマウスモデルを用いて行った．伝播に関与するタウを中和する抗体の選定

５）武田朱公：認知症バイオマーカーとしての CSF タウ，『実験医学』 Vol.35 No.12 p210 (2017).
６）武田朱公：タウ伝播仮説の可能性と限界について，『実

験医学』 Vol.35 No.12 p152 (2017).

を行い，またペプチドワクチンの作製手法を用いてタウ伝播を阻害するために最も重要なリン酸化部位のスクリーニングを開始した．さらに，ハイコンテントイメー
ジング技術を導入することで従来の in vitro タウ伝播
アッセイを数百倍の高い効率にまでハイスループット化

社会ストレスによる脳組織の超微細な細胞生物学的変化とその機序・役割の解明
永

井

裕

崇
（神戸大学大学院医学研究科）することに成功し，これを用いて化合物ライブラリーからタウ伝播阻害因子の探索を継続している．
２：タウ関連脳脊髄液バイオマーカーの探索【目的】

マウス脳脊髄液を覚醒自由行動下で持続的に回収する

社会や環境より受けるストレスは抑うつや不安亢進なための手法を開発した（論文投稿中）．これを利用してど情動変容を誘発し，精神疾患のリスクとなる．マウス

髄液中に存在するタウ分子種の解析を行った．また，認の社会挫折ストレスモデルにおいては，脳内免疫細胞で知症患者髄液中に存在する高分子量リン酸化タウの測定

あるミクログリア活性化に代表される脳内炎症や前頭前を行い，その病態における意義を解析した．

皮質神経細胞の樹状突起萎縮や樹状突起スパインの喪失

３：高精度視線検出技術を用いた認知機能評価システムなどの神経形態変化が情動変容に重要であることが示唆の開発されてきているが，ミクログリアと神経細胞の相互作用

視線検出技術と認知機能評価映像を組み合わせ，注視

並びに神経形態変化の微細形態学的基盤は殆ど確立され点データを基に被験者の認知機能を短時間で定量的にスていない．従って本研究では，連続する超高解像度画像

コアリングするシステムを構築した．本件に関して１件の取得により，あらゆる細胞と細胞内小器官の三次元的の特許申請を行い，さらに１件の特許申請準備を進めて組織再構築を可能とする三次元電子顕微鏡を用いて社会いる．

挫折ストレス後脳組織における神経形態変化と神経グリ【考察】

ア相互作用の実態を明らかにすることを目的とする．

アルツハイマー病タウ病理を標的とした治療法と診断【方法】

マーカーの探索を進めてきた．また認知症の超早期診断

マウス社会挫折ストレスモデルを用い，ストレスにを目指したデバイスの開発を行い，これを利用して超早供したマウスの内側前頭前皮質第 II/III 層をシリアルブ

期認知症患者を対象とした髄液バンク構築を行っていロックフェイス走査電子顕微鏡（SBEM）により観察しる．これらはアルツハイマー病の早期診断・治療法開発

た．真空内の筐体にサンプルブロックを静置しサンプルの基盤となることが期待される．

表面の撮像と切削を繰り返す技術である SBEM を用い【文献】て１ピクセルあたり約 5 nm の平面解像度を持つ撮像と

１）Takeda, S. et al.: Nature Communications., 6:

50 nm の表面切削を繰り返すことで，連続電子顕微鏡

8490, (2015).
２）Takeda, S. et al.: Annals of Neurology., 0 (3):355-67, (2016).
３）Takeda, S. et al.: American Journal of Pathol-ogy., 17 (6):1399-1412 (2017).
４）Takeda, S. et al.: Neuroscience Research., 141:
36-42 (2019).

66

画像を取得した．取得した画像は ImageJ を用いてアライメント補正をかけた後に，手動で神経細胞やグリア細胞を分画し，立体再構成を行った．
【結果】
社会ストレスに供したマウスにおいては軸索ブトンの一部がミクログリアに覆われる頻度が増加することが明らかとなった．完全に貪食された軸索ブトンについての成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

頻度，並びにミトコンドリアやリソソームなどの細胞内の厚さと細胞数の著明な減少を認めた．生後１日目の小器官の大きさや頻度については変化が無かった．また，

C-CNP-KO 及び C-GC-B-KO から脛骨を採取し器官培養

シナプスがそのまま貪食されたような構造は殆ど存在せを行ったところ，共に脛骨成長板の著しい成長抑制を認ず，ミクログリアが軸索に選択性をもって貪食する可能めた．C-CNP-KO から採取した脛骨成長板は CNP 添加性が示唆された．

により，成長板軟骨の厚みが改善したが，C-GC-B-KO【考察】

から採取した脛骨成長板は CNP 添加により全く改善し社会ストレスがミクログリアと軸索の形態的相互作用を増強することが示唆された．今後はその機能的意義並びに分子機序について検討する必要がある．

なかった．
また，C-CNP-KO および C-GC-B-KO の顎顔面表現系
解析を行ったところ，C-CNP-KO マウスおよび C-GCB-KO マウスはともに上下顎の劣成長を認めた．上顎の成長には，頭蓋底の軟骨組織である蝶後頭軟骨結部の内内軟骨骨化における CNP/GC-B 系の生理的意義
中

尾

一

祐

軟骨性骨化による成長が重要とされているが，C-CNPKO マウスおよび C-GC-B-KO マウスの蝶後頭軟骨結合部の成長抑制が認められた．また，下顎骨の形態も劣成（京都大学大学院医学研究科）

長を呈していた．これについては下顎頭軟骨の成長抑制に加え，上顎の劣成長が咬合関係を介し，下顎の前方へ【背景・目的】の成長に抑制的に作用したことが考えられた．

Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（CNP）は，グアニル

また，C-CNP-KO マウスおよび C-GC-B-KO マウスの酸 シ ク ラ ー ゼ Ｂ（GC-B）を 介 し て 生 物 作 用 を 発 揮 す

大後頭孔が狭窄しており，組織学的解析の結果，大後頭る．我々はこれまでに CNP あるいは GC-B の全身ノッ孔を構成する軟骨組織の内軟骨性骨化の抑制を認めた．

クアウトマウスが著明な骨伸長障害を示すことを報告【考察】

し，CNP/GC-B 系が内軟骨性骨化により形成される骨成長板に発現する CNP は局所因子として，成長板軟伸長に対する強力な促進系であることを証明してきた．

骨に発現する GC-B を介して，骨伸長作用を示すことを

CNP/GC-B 系は，脳，血管，骨など全身に幅広く分布証明した．さらに CNP/GC-B 系は局所因子として，顎する paracrine/autocrine 系調節因子であるが，今回成顔面形態に対し強く影響をおよぼすことが明らかとなっ

長板軟骨における意義を検討するために，Cre-loxP シ

た．

ステムを用いて軟骨特異的 CNP ノックアウトマウス（C-CNP-KO マウス）及び GC-B ノックアウトマウス（C-GC-B-KO マウス）を作製し，解析した．更に CNP/
GC-B 系の顎顔面形態形成に与える影響を検討し，顎変形症に対する新たな治療法となる可能性を検討するため

心臓リモデリングに対する心臓局所のネプリライシンの役割についての検討
中川仁（奈良県立医科大学医学部）に，C-CNP-KO マウスと C-GC-B-KO マウスの顎顔面形
態計測を行った．
【方法・結果】【背景・目的】C-CNP-KO マウスおよび C-GC-B-KO マウスの吻殿

ナトリウム利尿ペプチド（NP）は心房・心室から分長は，10 週齢ではそれぞれの対照マウスの吻殿長の泌され，それぞれ ANP・BNP と呼ばれており，ナト

78.6％および 72.5％であり，ともに椎骨と四肢長管骨

リウム利尿作用や心臓リモデリングに対する抑制効果

は著明な短縮が認められ，全身性 KO マウスの表現系をを持ち，心不全における保護的ホルモンとして作用しほぼ再現していた．２週齢の C-CNP-KO および C-GC-ている．近年，NP をはじめとするペプチドを分解す

KO の脛骨骨端成長板軟骨組織像は，肥大化軟骨細胞層るネプリライシン（NEP）が注目され，NEP 阻害薬と67

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

Angiotensin II 受容体拮抗薬との合剤が，心不全の予後を改善する事が大規模臨床試験で報告された．なぜNEP 阻害薬が心不全の予後をこれほど改善したかについては，ホルモンとしての ANP・BNP の作用を亢進さ

血流による機械的刺激に対する血管内皮細胞応答のｉｎ ｖｉｖｏ イメージング解析
中

嶋

洋

行

（国立循環器病研究センター研究所）

せた事によると考えられているが，心臓局所における
ANP・BNP の局所組織濃度が血中よりもはるかに高い事を考えると，autocrine としての NP の作用を増強さ【目的】

せた可能性がある．本研究の目的は，NEP 遺伝子改変

血管は血液が通る管であるため，血管の内側を覆う血マウスを用いて心筋細胞における NEP の作用を検討し，管内皮細胞は常に血流に曝された状態にある．血流は，心臓リモデリングに対する心臓局所での NP と NEP の分泌性因子を介して血管機能を調節する一方，流れ自体相互作用を明らかにする事である．

がメカニカルストレスとして血管内皮細胞や血管平滑筋【方法・結果】

細胞に作用する．血流が生み出すメカニカルストレスは，野生型マウス（WT），心筋特異的ネプリライシン過動脈硬化や脳動脈瘤などの病態の発症機序にも関与する

剰発現マウス（aMHC-NEP Tg）と全身のネプリライシ

ことから，血流に対する血管の応答性を理解することは，

ン欠損マウス（NEP KO）の baseline での血漿・心臓成人病などの血管が関与する種々の疾病の発生機序の理組織での cGMP 濃度は aMCH-NEP Tg では WT に比べ解にも繋がる医学的に重要な研究課題である．我々は，て有意に低く，NEP KO では WT に比べて有意に高かっ血流に対する内皮細胞の応答を in vivo イメージングにた．大動脈縮窄術（TAC）による圧負荷を加えたところ，

よって細胞レベルで可視化することで，血流によるメカ

aMHC-NEP Tg では WT に比べて有意に心重量，肺重ニカルストレスが，血管の形成や恒常性をどのように制量，心臓間質の線維化が増悪し，心エコーでは心収縮能御するのかを理解することを目指している．

の低下を認めた．蛋白電気泳動では Serca2a の発現が【方法】

TAC 後の aMHC-NEP Tg で著明に低下していた．次に，我々は，ゼブラフィッシュの血管内で種々の細胞応

血漿の cGMP 低下を補正するため hANP 0.66μg /kg /答を生きたまま可視化するトランスジェニックゼブラ

min を皮下ポンプで投与し TAC を施行したところ，同

フィッシュ（TG）システムの作製を行っており，これ様に aMHC-NEP Tg は WT に比べて有意な心臓組織のまでに内皮細胞のカルシウム応答を生きたまま特異的に

cGMP 低下を伴う心臓リモデリングと心機能低下を認

イメージングできる TG や，Hippo 経路の標的因子であめた．興味深い事に，肺重量は aMHC-NEP Tg と WTる YAP の転写活性化を生きたまま可視化できる TG シ

では差を認めなかった．一方，WT と NEP KO に６％ステムの樹立などを行ってきた．

高食塩餌の条件で Angiotensin II (1.4 mg/kg/day) の皮【結果】

下ポンプ投与を４週間投与したところ，WT では心臓間

上記の TG システムを用いて，血流に応答した内皮細質の有意な線維化を認め，
NEP KO ではやや抑制された．

胞がカルシウム応答を起こす様子や，YAP が流れ依存線維化のマーカーである CTGF は NEP KO で有意に抑的に核内に移行して転写活性化する様子を捉えている．

制された．

このような観察を基に，血流に応答した YAP が，血管【結論】の管腔構造の維持に重要な役割を果たすことを明らかに

aMHC-NEP Tg に お い て，TAC 後 に 心 臓 組 織 のした．さらに，我々は，発生過程のゼブラフィッシュでcGMP 低下を伴う心臓リモデリングと心機能低下を認

イメージングによる網羅的解析を行い，大動脈弓や脳底

め，血漿 cGMP の低下を補正しても同様の結果であっ動脈において血流によるメカニカルストレスに依存したた．心臓局所におけるネプリライシンが，心臓リモデリ

血管新生が起こること，さらにそれらが従来の（血流非ングにおいて重要な役割を認めることを確認できた．

依存的な）血管新生とは全く異なる様態で起こっていることを新たに見出した．

6

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成の発症とを結び付ける分子メカニズムは完全には解明さ【考察】
一連の研究から我々は，血流によるメカニカルストレ

れていない．我々は，胎盤増殖因子（PlGF）とその受スを介した血管制御機構の一端を明らかにすることがで容体である Flt-1 の可溶型アイソフォームで，PlGF のきた．血流は，このような機構を介して最適な血管ネッ

内因性拮抗因子である可溶性 Flt-1 (sFlt-1) の発現不均トワークの形成に必須の役割を果たしている．
現在，我々衡が心血管疾患の発症あるいは進展に寄与することをはゼブラフィッシュの脳血管の観察を通じて，血管ネッ

示してきた３,４）．また，腎機能低下患者では sFlt-1 の発

トワークの最適化に関する研究に着手しており，イメー

現が低下し，PlGF/Flt-1 系が優位になっていることをジング解析と血流によるメカニカルファクターのシミュ

報告した３）．sFlt-1 発現を調節する因子は明確には解明

レーション解析を組み合わせることで，どのように血管されておらず，我々は尿毒症毒素が CKD 患者におけるネットワークの最適化が起こるのかを調べている．

sFlt-1 の減少に関与していると仮定した．そこで今回，【文献】

経口吸着炭である AST-120 による sFlt-1 発現レベルお１）Nakajima, H., Yamamoto, K., Agarwala, S.,

よびアテローム性動脈硬化進展に対する効果を検討しTerai, K., Fukui, H., Fukuhara, S., Ando, K.,た．

Miyazaki, T., Yokota, Y., Schmelzer, E., Belting,【方法】

H.G., Aﬀolter, M., Lecaudey, V. & Mochizuki,

まず，ヒト臍帯動脈内皮細胞（HUAEC）に尿毒素物

N.: Flow-dependent endothelial YAP regulation

質であるインドキシル硫酸と p-クレゾールを添加し，contributes to vessel maintenance, Dev. Cell.,sFlt-1 の発現変化についても検討を行った．また，動脈40, 523 (2017).

硬化モデルマウスである ApoE－/－ マウスを用いて，８２）Nakajima, H., & Mochizuki, N.: Flow pattern-

週齢で偽手術群（sham）と 5/6 腎摘群（5/6NR）の２

dependent endothelial cell responses through

群に無作為割り付けした．その後，さらに 12 週齢より

transcriptional regulation, Cell Cycle ., 16,

それぞれを AST-120 治療群，AST-120 非治療群に分け，

18931 (2017).

計４群で 22 週齢において比較検討を行った（sham; n３）◆Yokota, Y., ◆Nakajima, H.(equal ﬁrst authors),＝7, 5/6NR; n＝10, sham＋AST-120; n＝8, 5/6NR＋

Wakayama, Y., Muto, A., Kawakami, K., Fu-

AST-120; n＝8)．

kuhara, S. & Mochizuki, N.: Endothelial Ca2+

【結果】

oscillations reﬂects VEGFR signaling-regulated

尿 毒 素 物 質 が 添 加 さ れ た HUAEC で は sFlt-1 の 有

angiogenic capacity in vivo. eLife., 4, e08817

意な発現低下を認めた．また動物モデルにおいては，(2015).

5/6NR 群 で は sham 群 に 比 べ， 腎 組 織 で の sFlt-1 の発 現 が 有 意 に 低 下 し て お り，5/6NR＋AST-120 群 で心腎連関に関わる PlGF と sFlt 1 の意義およびその機序の解明中田は 5/6NR 群 に 比 べ，sFlt-1 の 発 現 低 下 が 抑 制 さ れ ていた．同様に，胸腹部大動脈の動脈硬化プラーク面積
は 5/6NR 群で sham 群に比べ有意に大きく，5/6NR＋

康

紀

AST-120 群では 5/6NR 群に比し，その範囲が有意に縮（奈良県立医科大学医学部）

小していた．動脈硬化プラーク面積は，血中インドキシ
ル硫酸，血中 p-クレシル硫酸，また sFlt-1 の発現レベ
ルと有意な相関関係を認めた．

【目的】
以前の疫学的研究により，慢性腎臓病（CKD）の患【考察】

者では心血管系の罹患率と死亡率のリスクが著しく高い

CKD 患者における動脈硬化進展に，尿毒素による．しかしながら，腎機能

sFlt-1 発現低下が寄与している可能性が示唆された．引

障害とアテローム性動脈硬化症の進行および心血管疾患

き続き CKD 患者における動脈硬化進行の分子メカニズ

ことが明らかにされている

１,２）

69

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

ムを検討する．

化が心機能に与える影響は未知である．また，骨髄は老【文献】

化すると造血幹細胞（HSC）レベルで質的変化をする．

１）Go, A.S., Chertow, G.M., Fan, D., McCulloch,

そこで，①骨髄老化に伴う心臓マクロファージのエピゲ

C.E. & Hsu, C.Y.: Chronic kidney disease

ノムの変化が，心臓の恒常性維持を破綻させ組織リモデ

and the risks of death, cardiovascular events,

リングを引き起こす，②心不全になると骨髄ニッチが変

and hospitalization. N . Engl . J . Med ., 351,

化して HSC 自体が変化する，という仮説に基づき心不1296-1305 (2004).

全の新たな病態解明を図る．

２）Ninomiya, T. et al.: Chronic kidney disease and【研究成果】

cardiovascular disease in a general Japanese

骨髄老化が心機能に与える影響を評価するため，老年

population: The Hisayama study. Kidney Int.,

マウスの骨髄を若年マウスに移植したところ，自然経過

6, 228-236 (2005).

で慢性期に心筋線維化が進んで収縮能が低下した．老化３）Onoue, K. et al.: Reduction of circulating solubleに伴って心臓の線維化を進ませるのは血清中蛋白ではな

fms-like tyrosine kinase-1 plays a signiﬁcant role

く細胞成分であり，加齢によって表現型が変化した免疫

in renal dysfunction-associated aggravation of

細胞が可塑性を失って心臓実質の恒常性を摂動させるとatherosclerosis. Circulation., 120, 2470-2477

考えられた．続いて心不全マウスの骨髄だけを正常マウ(2009).

スに移植すると，同様の線維化と心機能低下が見られ

４）Matsui, M. et al.: Suppressed soluble Fms-like

た．そこで，心不全が骨髄に与える影響を解析すると，

tyrosine kinase-1 production aggravates athero-

心不全マウスの骨髄 HSC では，老化した骨髄で見られsclerosis in chronic kidney disease. Kidney Int.,

るように，EdU 陽性 HSC が増加した．さらに，末梢循

5, 393-403 (2014).

環を共有する parabiosis マウスの片方に心不全モデルを作成すると，患側マウスの骨髄で HSC の EdU 陽性率が上がる一方で，健側マウスの骨髄には同様の所見

新たな心機能制御要素としての心臓マクロファージ
の機能解析
中

山

は認められなかった．つまり，心不全になると循環を介さない，神経を介したストレスシグナルが骨髄に入り（図中①②），HSC のエピゲノムを変化させると考え

幸輝られた．骨髄の内皮細胞や間葉系幹細胞の発現や細胞数（東京大学医学部）の解析でも心不全によって変化することが新たに分かった．さらに，老化マウスや心不全マウスの HSC を健常【目的】
高齢心不全症例の増加が顕著になっているが，従来の心不全治療では，健康寿命の延伸は得られていない．心臓の加齢変化の病態生理を解明し，繰り返す心不全を予防する新たな治療戦略を創出することは喫緊の課題である．我々は，
心臓間質に存在する組織マクロファージが，心保護的蛋白アンフィレギュリン（Areg）の分泌を介して恒常性維持に重要な役割を担っていることを解明した．近年の報告では，
心臓マクロファージの細胞起源は，心不全や加齢に伴って胎児肝単球由来のマクロファージから骨髄単球由来に変化すると考えられている．
一方で，細胞起源の変遷に伴う心臓マクロファージの表現型の変70

マウスの HSC と competitive に移植すると，若年マウ

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

ス HSC 由来細胞と比較して，両者は同様に骨髄系細胞

細胞株 THP-1 と共培養し，THP-1 の変化を解析した．

に偏向して分化することが分かった（図中③）．そして，凝固能は Ca 再加時間法，細胞表面の TF, CD11b の発老化マウスや心不全マウスの HSC 由来の心臓マクロ現量および蛍光ビーズを用いた貪食能はフローサイト

ファージが，より炎症性の表現型を示す（図中④）こと

メトリー法で，mRNA の発現は RT-PCR 法で測定した．

が分かった．

培養上清中の網羅的サイトカイン濃度解析はサイトカイ【考察】

ンアレイを用いた．

心不全を起こすと脳，神経を介して骨髄に，老化した【結果】

際と同様のリモデリングを起こし，HSC レベルでエピ

EBV 陽性 NK 細胞株上清との共培養で THP1 細胞表

ゲノムが変化して骨髄系細胞に分化しやすくなった．一

面では組織因子（TF）の発現と凝固活性が亢進した．

方で心不全マウスの HSC 由来単球は心保護的な心臓マ凝固活性の亢進は抗 TF 抗体添加により阻害された．まクロファージに分化しにくくなるということが分かった，EBV 陽性 NK 細胞株上清との共培養により THP-1

た．このことは，老化や心不全を起こした心臓で外的スはマクロファージ様の形態変化を示し，CD11b の発

トレスに対する忍容性を低下させ，さらなる心機能低下

現 お よ び 貪 食 能 の 亢 進， さ ら に IL-6, IL-8, TNFα のを引き起こすと考えられた．心不全を起こすとどのようmRNA の発現亢進を認めた．これらの結果は EBV 陽性に神経系のリモデリングが起きるのか，心臓圧センサー

Ｔ細胞株上清との共培養ではほとんど認められなかっへの介入による骨髄変化を見たり，HSC の ATAC-seq

た．培養上清では，TNFα, IL-6, IFNγ濃度が NK 細胞や骨髄の免疫染色により構造的，機能的変化を解析した

株上清特異的に高値を示した．そこで，これら炎症性サ

りして，心臓・脳・骨髄という新たな臓器連関の解明を

イトカインを THP-1 に添加したところ，凝固活性およ図る．心臓マクロファージの表現型の変化が心臓の恒常び TF 発現の亢進を認めた．

性維持の破綻を生むという仮説の元，骨髄やその上流の【結語】

脳神経系を標的とした治療戦略を目指す．

EBV 陽性 NK 腫瘍細胞が産生，分泌した炎症性サイ
トカインによって，単球系細胞では TF を介した凝固の活性化および M1 マクロファージの活性化が生じること

EBV 陽性 NK 腫瘍細胞の産生，分泌するサイトカ
インは単球様細胞の凝固活性とマクロファージへの分化を亢進させる西尾が示された．今後は原因となる炎症性サイトカインを精査し，病態との関連および抗サイトカイン療法の有用性を検証する．

美和子（東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科）【緒言】
慢性活動性 EBV 感染症や節外性 NK/T 細胞リンパ腫などの EBV 陽性 T, NK 細胞腫瘍は，全身の炎症を伴い，

抗加齢遺伝子サーチュイン（Sirt1）を介した糖尿病性腎症の新規発症メカニズムの解析－尿細管糸球
体連関－
長谷川

一宏
（慶應義塾大学医学部）

しばしば播種性血管内凝固症候群（DIC）や血球貪食症候群（HLH）を発症する．その機序を解明するため，
EBV 感染 T, NK 細胞の単球系細胞への直接作用を，細胞株を用いて検討した．
【方法】
EBV 陽性Ｔ細胞株（SNT8, SNT15, SNT16）と NK細胞株（SNK1, SNK6, SNK10）の培養上清を，単球系【目的】
2013 年 Nature Medicine に発表した糖尿病性腎症における尿細管糸球体連関分子の詳細な機能解析を進めた．
【方法】【結果】
尿細管糸球体連関研究チーム（指導

長谷川

一宏）

71

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

４）Hasegawa, K., Wakino, S., Sakamaki, Y., Kanda,
T., Tokuyama, H., Hayashi, K. & Itoh, H.:
Communication from Tubular Epithelial Cells
to Podocytes through Sirt1 and Nicotinic Acid
Metabolism. Curr Hypertens Rev. 2016; 12 (2):95-104. Review. 査読有り （発刊１年未満で impact factor 現在のところ未算出）
５）Hasegawa, K., Wakino, S., Simic, P., Sakamaki,Y., Hayashi, K., Guarente, L. & Itoh, H.: Renal
１）Sglt2 阻害剤が Sirt1 の保持作用があることを明ら

tubular Sirt1 attenuates diabetic albuminuria

かにした．Scientiﬁc Reports 2018 に報告した．

by epigenetically suppressing Claudin-1 overex-２）Nampt の尿細管における機能をあきらかにした．

pression in podocytes. Nat Med. 2013. 19 (11):Cell Reports 2019 に報告した．
３）NMN 投与における尿細管糸球体連関の保持作用を検討している．

1496-504. 査読有り (impact factor 30.3)
新聞記事掲載2013 年 10 月 22 日 3 面

読売新聞

夕刊

４）Claudin-1 の遺伝子改変マウスの解析を行なっている．
【考察】
尿細管糸球体連関は糖尿病性腎症の新規の病態発症機序であり，今後も解明を進めていきたい．

摂食関連 GPCR の活性化・不活性化における分子メカニズム解析濱本明恵（岐阜大学工学部）【文献】いずれも筆頭著者（もしくは相当）
１）Muraoka, H., Hasegawa, K. & Wakino, S. etal.: Role of Nampt-Sirt6 axis in renal proximal【目的】

tubules in extracellular matrix deposition in dia-

メラニン凝集ホルモン（MCH）の受容体 MCHR1 は

betic nephropathy. (1st and 2nd authors equally

Ｇタンパク質共役型受容体（GPCR）であり，摂食調節，

contributed.) Cell Reports. 2019 Apr 2; 27 (1):エネルギー代謝，情動などを制御する．先行研究にお199-212. e5. (impact factor 8.4)

いて MCHR1 活性化の分子メカニズムがいくつか解明

２）Hasegawa, K.: Novel tubular-glomerular inter-

されたが，MCHR1 の不活性化に関する知見は乏しい．

play in diabetic kidney disease mediated by

GPCR を介した細胞内シグナルの強度と持続時間は，受

sirtuin 1, nicotinamide mononucleotide, and

容体の活性化と不活性化のバランスに依存しているた

nicotinamide adenine dinucleotide Oshima

め，MCHR1 がどのように不活性化されるのかを明らか

Award Address 2017. Clin Exp Nephrol. 2019にすることが必要不可欠である．そこで本研究では，受Mar 11. (impact factor 2.4) Review.

容体不活性化の中心的役割を果たす “受容体インターナ

３）Umino, H., Hasegawa, K., Wakino, S. et al.:

リゼーション（細胞内移行）” に着目した．受容体インHigh Basolateral Glucose Increases Sodium-

ターナリゼーションとは，リガンド刺激により活性化さGlucose Cotransporter 2 and Reduces Sirtuin-1れた受容体がリン酸化され，細胞内へ移行し，分解またin Renal Tubules through Glucose Transporter-2

は再利用される現象である．MCHR1 において受容体イ

Detection. Sci Rep. 2018 May 1;  (1): 6791.

ンターナリゼーションに関する報告は殆んど無いため，(1st and 2nd authors equally contributed.)

その詳細を解析した．

(impact factor 4.847)

72

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成【方法】【方法・結果】

Ｎ末端に Flag タグが付加した哺乳類 MCHR1 の細胞約 18,600 種類の機能未知化合物ライブラリーから，

内第２，第３ループ領域に存在する５箇所の予測リン酸上皮細胞（２種類の細胞アッセイ系）での YAP-TEADs

化アミノ酸を Ala に順次置換した置換体を inverse PCR

転写活性を指標とした候補化合物の選出を行った．さら法で作製した．ヒト胎児由来腎臓細胞（HEK293 細胞）に，得られた候補化合物がラット新生児初代心筋細胞のに MCHR1 置換体を強制発現させてリガンド MCH を増殖能に与える影響も評価した．最も心筋細胞の増殖能

添加し，細胞免疫染色により受容体局在などを解析した．

を増幅した化合物 TAZ-12 を対象に構造改変を行い，そ【結果・考察】の活性中心構造を同定するとともに，毒性が低く，心哺乳類 MCHR1 において，細胞内第２ループ領域同筋細胞での効果選択性が極めて高く，生体内安定性も時置換体，細胞内第 3 ループ領域同時置換体，それら考慮したフッ素化化合物（TT-10）を創出した．化合を組み合わせた細胞内第２＋第３ループ領域同時置換体

物 TT-10 は，心筋細胞でも YAP-TEADs 転写活性を促

では，同程度の受容体インターナリゼーションの抑制が進し，さらに Wnt/β-catenin 経路を活性化させること観察された．従って，MCHR1 のインターナリゼーショ

で，強力な増殖促進作用を発揮すると考えられた．また，ンには，細胞内第２ループ領域の同時リン酸化，細胞内RNA-seq による網羅的な発現解析により，細胞周期の第３ループ領域の同時リン酸化が独立に関与し，第２と進行とサルコメア蛋白分解などの効果の他，酸化ストレ第３ループ間には相加・相乗効果はない可能性を示した．

ス応答転写因子 NRF2 の効果（抗酸化・抗アポトーシ

また興味深いことに，その置換体は単に受容体インタース作用）も増強させていることを見出した．マウス心筋

ナリゼーションが抑制されるのみならず，野生型よりも梗塞モデルに TT-10 を腹腔内投与したところ，梗塞境受容体インターナリゼーションが生じるタイミングが遅界域での心筋細胞の細胞周期の促進とクローン性増殖が延し，エンドサイトーシスの過程も異なることも示唆さ誘導され，線維化軽減と心機能の改善にも効果的であっれた．引き続き MCHR1 のインターナリゼーション機

た１）．さらに，この化合物が健常者由来のヒト由来 iPS

構を詳細に解析することで，MCHR1 における不活性化

心筋細胞の増殖も促進することを実証した一方で，遺伝のメカニズム解明に繋がると考えている．

子発現，心筋細胞の拍動，細胞毒性を指標とした心筋細胞の機能評価では明らかな有害事象を認めなかった２）．
【考察】

成体心筋細胞の分裂機序の解明と心筋再生治療法への応用を目指して原弘

Hippo-YAP 経路を標的とした細胞アッセイ系を用いて，心筋細胞増殖作用と心筋障害に対する保護作用を併典せ持つ化合物を創出し，ヒト由来 iPS 心筋細胞の増殖効（東京大学大学院医学系研究科）

果も実証した．重症心不全・虚血性心疾患患者に対する新たな治療を提供しうるとともに，心筋細胞の分裂機序【背景・目的】従来，心筋細胞の増殖能は，生後に急激に低下し「成解明にも貢献できると考えられる．
【文献】

体心筋細胞は増殖しない」と考えられてきたが，近年，

１）Hara, H., Takeda, N. & Komuro, I. et al.: Dis-

成体心筋細胞が僅かでも「ターンオーバー」しているこ

covery of a small molecule to increase cardio-とが実証された．この成体心筋細胞の増殖能を増幅する

myocytes and protect the heart after ischemic

ことは，心不全・虚血性心疾患の新たな治療戦略として

injury, JACC Basic Transl Sci , 3, 639-653期待できる．本課題では，心臓を含む臓器の「適切な大(2018).

きさ（増殖）」を制御している Hippo-YAP 経路に着目し，

２）Ito, M.*, Hara, H.* (*equally ﬁrst contribution),

心筋細胞増殖と心筋再生（修復）を促進する薬剤の創出

Takeda, N. & Komuro, I. et al.: Characterization

を試みた．

of a small molecule that promotes cell cycle73成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

activation of human induced pluripotent stem

25HC 濃度を GC-MS/MS を用いた内部標準法で測定す

cell-derived cardiomyocytes, J Mol Cell Cardiol,

ることに成功した．②これまでに，劇症１型糖尿病 iPS

12, 90-95 (2019).

細胞３クローン，健常人 iPS 細胞３クローン由来インス
リン陽性細胞に poly (I; C) トランスフェクションが終了

劇症 1 型糖尿病発症メカニズムの解明
細川吉

した（n＝3）．今後インスリン陽性細胞のみを FACS にて単離し PD-L1 等の遺伝子発現の差異を評価する．③

弥

免疫チェックポイント阻害薬投与中に発症した１型糖尿（大阪大学大学院医学系研究科）

病患者の切除膵を用いた免疫組織学的検討において，Ｔリンパ球の浸潤と PD-L1 発現低下を見出し報告した（下【目的】
劇症１型糖尿病は本邦で最初に報告された１型糖尿病

記）．
【文献】

のひとつの疾患単位であり，急速に進行するβ細胞破壊

Yoneda, S. & Hosokawa, Y. et al .: T lymphocyteにともなうインスリンの完全な枯渇を特徴とする．こinﬁltration to islets in the pancreas of a patient who

れまで我々は劇症１型糖尿病 iPS 細胞を用いた研究に

developed type 1 diabetes after administration of

おいて，サイトカイン刺激後の劇症１型糖尿病 iPS 細

immune checkpoint inhibitors. Diabetes Care (Epub

胞由来インスリン陽性細胞を単離し RNA シークエンス

ahead of print).

にて発現が著明に低下していた遺伝子として CH25H(Cholesterol 25-Hydroxylase) を見いだしている．また，
近年，PD-1 抗体および PD-L1 抗体などの免疫チェック

ノンレム睡眠特異的脳波パターンを作り出す神経回

ポイント阻害薬投与中に劇症１型糖尿病を発症する症例

路の解析が多数報告されているが，我々は MIN6 への poly (I;C)

本城

咲季子

（筑波大学国際統合睡眠医科学研究機構）

トランスフェクションにて PD-L1 発現が上昇するという知見を得ているとともに，免疫チェックポイント阻害薬投与中に発症した１型糖尿病患者の切除膵を得ている．これらのサンプルを用いて劇症１型糖尿病発症のメ【目的】
睡眠・覚醒を通じた大脳皮質神経活動における視床マ

カニズムを明らかにすることを目的とする．

トリックス細胞の役割を明らかにする．

【方法および結果】【背景】① CH25H は Cholesterol か ら 25HC (25Hydroxy-

視床は末梢の感覚情報を大脳皮質に伝達する必須の役

cholesterol) を産生する酵素であり，我々はこれまでの割を担っている．睡眠時，我々は外部感覚情報を認識しMIN6 における 25HC の抗アポトーシス効果の検討にないため，視床の活動が低下する事が睡眠に重要ではな

加えて，今回，劇症１型糖尿病 iPS 細胞から分化誘導しいかと考えられてきた．しかし，近年，視床の感覚情報て得られたインスリン陽性細胞を含む細胞において，サの伝達を担う神経群（コア細胞）は睡眠覚醒制御に関与

イトカイン投与にて上昇した Caspase3 活性が 25HC をせず，大脳皮質のほぼ全域に広く，非特異的に投射して投与することで有意に低下すること，また免疫染色においる神経群（マトリックス細胞）が睡眠覚醒制御を担う

いてインスリン陽性細胞に占める活性型 Caspase3 陽性事が明らかとなった．

細胞の割合が 25HC を投与することで有意に低下する【方法】

ことを見出し，劇症１型糖尿病 iPS 細胞由来インスリン

自由行動下のマウスの睡眠覚醒サイクルを通じて，大陽性細胞における 25HC の抗アポトーシス効果を見出脳皮質の神経活動を測定する．また光遺伝学を用いた視した．また，大阪大学工学部と共同で，血中 25HC 濃

床マトリックス細胞の活性化，および，薬理遺伝学を用度測定系の樹立をすすめており，今回，健常人血漿中のいた視床マトリックス細胞の不活性化が大脳皮質活動に74

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

腎不全モデルマウスでは血中 PlGF 濃度の上昇と肺及ぼす影響を検討する．

や 腎 組 織 に お け る PlGFmRNA の 発 現 の 亢 進 と sFlt-【結果】
我々は光遺伝学を用い，マウスのマトリックス細胞の1mRNA の発現低下が認められた１）．また，培養細胞実活性化を行った．5ms の刺激を 20 秒に一度という低頻験系において CKD 患者の血清を添加したヒト血管内皮度で行うと，VM 神経の刺激に大脳皮質神経が反応して細胞においても PlGFmRNA の増加と sFlt-1mRNA の発火する事が観察された．興味深い事に，ノンレム睡眠低下が確認された．さらに sFlt-1 蛋白を腎不全モデル

時には大脳皮質の反応はより大きく，ノンレム睡眠特異マウスに投与すると，大動脈プラーク面積が有意に減少

的脳波である徐派 /Slow wave の誘導が観察された．ま

した２）.

た，
予備的な結果ではあるが，薬理遺伝学によりマトリッ

さらに 1351 名の CKD 症例の血漿で血中 PlGF 濃度

クス細胞の除去を行うと，覚醒時・レム睡眠時脳波のうを測定し，心血管イベントを追跡したところ，心血管イ

ちガンマ周波数帯域の減少が観察された．

ベントの発症リスクは PlGF ≦ 10.1 pg/ml の患者群に【考察】

対 し て PlGF10.2-14.4pg/ml で は 1.55 倍，PlGF14.5-

我々の結果から，視床と大脳皮質の相互作用は睡眠覚

19.5pg/ml で は 3.39 倍，PlGF ≧ 19.6pg/ml で は 8.42

醒を通じダイナミックに変化する事が明らかになった．

倍であり，CKD 患者における PlGF 濃度と心血管イベ

また，ノンレム睡眠時の徐派，および覚醒時・レム睡眠

ント発症の関連性を臨床的に明らかにした３）．

時のガンマ派というそれぞれの脳状態における特徴的な

一方で，sFlt-1 はヘパリン負荷後に細胞表面から一過脳波に視床マトリックス細胞が関与している可能性が示性遊離した sFlt-1 濃度を測定することが全身の sFlt-1

された．

を反映していることを見出した．へパリン負荷試験施行したヒト 343 名では腎機能低下とヘパリン負荷後 sFlt-1
濃度は正の相関を認めており，sFlt-1 減少群で有意に心慢性腎臓病における PlGF・可溶型 Flt-1 による動脈硬化症発症機序に関する検討松

井勝

血管イベント発症率が高かった．sFlt-1－/－ApoE－/－ マウ
スは sFlt-1＋/＋ApoE－/－KO に比して有意に大動脈プラー
ク面積が多くなること，sFlt-1－/－マウスの圧負荷モデル
は心筋線維化の進行とともに心不全の増悪に繋がること（奈良県総合医療センター）を示し，CKD 環境でなくとも sFlt-1 が心血管疾患の発症抑制に重要な鍵因子であることを示した４）．

慢性腎臓病（CKD）は糖尿病，高血圧などの生活習以上より，われわれは，PlGF とそのアンタゴニスト

慣病と並んで心血管疾患を発症させる独立した危険因である sFlt-1 の不均衡が CKD 患者における心血管疾患

子であるが，その発症機序はまだ十分に解明されてい発症の機序に関連していることを証明した .

ない．VEGF family の一つである胎盤増殖因子（PlGF）【文献】

は血管内皮細胞の Flt-1 受容体に結合し，その慢性的な１）Matsui, M. et al.: Suppressed soluble Fms-like

シグナル活性化は血管新生や単球浸潤などの機序を介しtyrosine kinase-1 production aggravates athero-て動脈硬化巣の形成および進展を促進する．一方，膜型

sclerosis in chronic kidney disease. Kidney Int.,

Flt-1 受容体遺伝子から alternative splicing で産生され

5, 393-403 (2014).

る細胞外ドメインのみから構成される sFlt-1 は，PlGF

２）Onoue, K. et al.: Reduction of circulating solubleと結合し，膜型 Flt-1 受容体へ結合を阻害する，Flt-1

fms-like tyrosine kinase-1 plays a significant

活性化に対する内因性の拮抗物質として働く．われわれ

role in renal dysfunction-associated aggravation

は動脈硬進展作用を有する PlGF とその防御因子である

of atherosclerosis. Circulation., 120, 2470-7

sFlt-1 に着目して，その均衡が動脈硬化疾患の発症・進(2009).

展の予防に重要であると考えた．

３）Matsui, M. et al.: Placental Growth Factor as a75

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

Predictor of Cardiovascular Events in Patientstive Assessment, Alzheimer's Disease Assessmentwith CKD from the NARA-CKD Study. J Am Soc

Scale）を登録時，１年後，２年後と縦断的に行い，得Nephrol. 26: 2871-81 (2015).

られた血糖変動指標と認知機能試験スコアの変化との関

４）Seno, A. et al .: Suppressed Production of
Soluble Fms-Like Tyrosine Kinase-1 Contributes
to Myocardial Remodeling and Heart Failure.

Hypertension., 6: 678-87 (2016).

連を解析する．
【進捗】
国立循環器病研究センター倫理委員会の承認を得て，2019 年３月より患者エントリーを開始している．

血糖変動と認知機能の関連解明のための前向き観察

Cytochrome P450 基質薬のスクリーニングに研究よるフェロトーシス抑制薬の同定と機序の解明
松

原

正

樹

三

島

（国立循環器病研究センター病院）

【背景】

英

換
（東北大学病院）【背景・目的】

糖尿病患者では，アルツハイマー型認知症，血管性認

フェロトーシス（Ferroptosis）は鉄介在性の脂質酸知症の発症リスクがそれぞれ 1.5 倍，2.5 倍に増大する

化依存性プログラム細胞死であり，ROS による脂質過ことが知られている．糖尿病患者における認知機能低酸化の蓄積によって誘発されるため酸化ストレス誘導性下や認知症の病態については，高インスリン血症，慢細胞死とも呼ばれる．フェロトーシスは急性組織障害，

性的な高血糖，低血糖，脳細小血管障害，終末糖化産物

神経変性疾患，抗癌剤感受性等への病態の関与が報告さの蓄積など多くの要因が示唆されているが未解明な部分れており，脂質酸化を抑制する薬剤介入によって制御可が多く，また認知症予防のための血糖管理指標も明ら

能な細胞死でもあるためフェロトーシスの抑制は関連病

かとなっていない．近年，血糖持続測定（continuous

態の治療ターゲットとなる．Cytochrome P450（CYP）

glucose monitoring:CGM）機器の登場により糖尿病患

は脂溶性薬剤，外的異物やホルモンの代謝を行う酵素群

者の血糖プロファイルを評価する事が可能となり，これであるが過去の報告から CYP の基質となる化合物の一までの横断研究で血糖変動と認知機能の関連が示唆され部が脂質酸化を抑制することが機序が不明確ながら知らている．

れていた．これをヒントに今回我々は CYP 基質薬をター【目的】

ゲットとしてフェロトーシス抑制薬の探索と同定，機序

本研究では，糖尿病患者の血糖変動と認知機能の関連を縦断的に解析することで，糖尿病患者で認知機能低下の解明，さらに組織障害保護効果について検討した．
【方法・結果】に至る病態を解明し，また糖尿病患者における認知症予培養細胞とグルタチオン合成酵素阻害薬 BSO による防のための新規血糖管理指標を探索することを目的とす

フェロトーシス誘導系において CYP 基質薬のスクリー

る．

ニングを行った結果，臨床利用可能な複数の薬剤および【方法】

ホルモンにフェロトーシス抑制効果を見出した．これMild Cognitive Impairment (MCI) は認知症の前駆段

ら薬剤の脂質酸化抑制を介するフェロトーシス抑制機序階として知られ，年間約 10％が認知症に移行する集団

としてラジカルスカベンジャー能を検討したが代表的である．本研究では，国立循環器病研究センター通院中な ROS であるヒドロキシルラジカルやスーパーオキシの MCI を認める高齢（65︲85 歳）糖尿病患者 100 名に，ドに対する補足能は乏しかった．一方，脂質ラジカルプ

CGM（リブレ Pro）
，認知機能試験（Montreal Cogni-

ローブを用いた解析からこれらの薬剤は脂質酸化の連鎖76成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

反応に関わる脂質ペルオキシラジカルに対して高いスカルートされ，エンハンサー自体からも両方向性に RNA

ベンジャー能を有することが分かった．さらにホスファ（エンハンサー RNA）が合成される．従って，CAGE 法

チジルコリン酸化体（PCOOH）の処理による細胞内脂によりエンハンサー RNA の 5'末端を検出し，高塩基

質ペルオキシラジカルの増加状態ではこれらの薬剤の解像度でエンハンサーが同定できる (Andersson et al.

フェロトーシス抑制効果は消失したが，高濃度薬剤投与

Nature 2014)．しかし，エンハンサー RNA は合成されでは PCOOH 処理下でもフェロトーシス抑制能を認めた直後に活発に分解され，細胞内のトータル RNA 中にたため，この脂質ペルオキシラジカルに対するスカベンは極僅かしか存在しない．従って，従来の CAGE 法でジャー能がフェロトーシス抑制機序であることを明らかはエンハンサーの検出感度は極めて低かった．

にした．これら薬剤のフェロトーシス抑制効果はいずれ【方法】の細胞種（腎臓，心筋，骨格筋，神経，がん・非がん）

この問題を解決するために，我々は，特殊な工夫を加でも認め，さらに急性腎障害モデルおよび肝障害モデルえることでエンハンサーを１つのサンプルのみからでもマウスにおいて各薬剤投与群では組織障害の軽減，組織高感度に同定できる改良版 CAGE 法（NET-CAGE 法）

内脂質酸化の抑制，ミトコンドリア形態保持を認めたを開発した（Nature genetics in revision)．今回，急性ためフェロトーシス抑制を介した臓器保護効果が示され白血病の複数患者のサンプルにおいて我々の独自技術をた．

適用して，ゲノムネットワーク解析を行った．

【結語】

【結果】

CYP 基質薬等の脂質ペルオキシラジカルスカベン

ゲノムネットワーク解析の結果，白血病に特異的に活ジャー能を有する薬剤はフェロトーシス関連病態の治療

性化しているエンハンサーおよび未知の遺伝子などが網薬となる可能性が期待される．

羅的に検出された．さらに TCGA のがんゲノムアトラ
スのデータとも統合解析を行うことで，新規の診断マー
カーや治療標的候補と思われる分子を同定した．今後，白血病を維持する腫瘍エンハンサーの検索
村

川

泰

裕

（理化学研究所生命医科学研究センター）

これらの機能解析を行い，白血病の病因・病態の解明を
目指す．
【文献】
Andersson, R., Gebhard, C., Miguel-Escalada, I.,
Hoof, I., Bornholdt, J., Boyd, M., Chen, Y., Zhao,【目的】
成人病の柱の一つに悪性疾患が含まれる．とりわけ白X., Schmidl, C., Suzuki, T. et al.: An atlas of active
enhancers across human cell types and tissues. Na-

血病は，他の悪性疾患に比べて発症年齢が若く，社会的ture., 507, 455-461. (2014).

にも重大な疾病である．本研究課題では，白血病細胞をHirabayashi S., Bhagat S., Matsuki Y., Takegami

維持しているゲノム転写ネットワークの解明から，病態

Y., Uehata T., Kanemaru A., Itoh M., Shirakawa K.,に基づいた新たな分子標的薬や予後予測バイオマーカー

Takaori-Kondo A., Takeuchi O., Carninci P., Kata-を目指す．

yama S., Hayashizaki Y., Kere J., Kawaji H. & Mu-【背景】

rakawa Y.: Dynamics and Topology of Human Tran-

エンハンサーは，細胞種特異的に活性化し標的遺伝子の発現を増大させる作用を持つことから，ゲノムネッ

scribed Cis-regulatory Elements. Nature Genetics inrevision

トワークの中心的な役割を担う．申請者の所属機関で独自に開発された CAGE 法は，RNA の 5'末端を次世代
シークエンサーにより網羅的に解析する技術である．驚くことに，エンハンサーにも RNA ポリメラーゼがリク

77

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

がん免疫の成立機構に関する研究
諸

石

寿

朗

オルガネラ量の恒常性を司る仕組みの研究
柳谷（熊本大学大学院生命科学研究部）

【目的】

耕

太
（九州大学生体防御医学研究所）【目的】

がん細胞は自らの免疫原性（＝細胞が液性免疫や細胞

真核生物において，好気呼吸による ATP の合成や細性免疫などの免疫応答を誘導する性質）を低下させ，宿胞外へのタンパク質分泌，脂質の代謝などの細胞の生命

主のがんに対する免疫応答から逃れるような腫瘍微小環機能に必須な反応は，ミトコンドリアや小胞体，ペルオ

境に身を隠し増殖するが，細胞の免疫原性がどのようなキシソームなどのオルガネラで分担して遂行される．哺

分子機構で制御されているかは大きな謎となっている．

乳類を含む高等動物においては，同じ種類の細胞間で本研究では，がん細胞内のシグナル伝達経路に注目しては，各オルガネラの量は驚くほど類似している．例えば，

このメカニズムの解明をめざす．

小胞体で大量の抗体を合成する形質細胞では，どの細胞【方法】

も一様に，著しく発達した小胞体を備えている．一方，われわれは過去の研究で，細胞内 Hippo シグナルがATP の消費が著しい心筋細胞では，ミトコンドリアががん細胞において細胞の免疫原性を抑制し，宿主の抗一様に大量に増殖している．これらの事実は，それぞれ

腫瘍免疫応答を抑えていることを報告した [Cell 167,の種類の細胞に，オルガネラ量の正常範囲があり，この1525-39 (2016)]．本年度の研究では，この現象が特定範囲を逸脱した場合に，そのオルガネラ量を正常範囲にのがん種に限ったものであるのか，また，がん免疫を誘戻す恒常性維持機構が存在することを示唆している．し導するための要件やそのメカニズムを探索した．

かし，オルガネラ量の恒常性維持機構は，その存在が示【結果】

唆されているにも関らず，十分には研究されていない．

がん細胞における Hippo シグナルの阻害によって，本研究では，申請者が，これまでの研究で開発したオル

幅広い種類のがんにおいて免疫応答の誘導が認められガネラ量を人為的に減少させる技術を活用して，オルガ

た．また，がん細胞集団の中に Hippo シグナルを阻害

ネラ量の恒常性のなかでも，特に，オルガネラ不足に対した細胞が一部あれば，宿主の免疫応答が誘導されるこする細胞応答の解明を目指した．

とがわかった．さらに，Hippo シグナルを阻害したが【結果・考察】ん細胞が誘導するインターフェロン応答が，抗腫瘍免疫

これまでの研究で，申請者は，オートファジーによっ応答の成立に重要であることも示唆された．

て狙ったオルガネラを人為的に消化させるシステム（オ【考察】

ルガネラ減少法）を開発していた．この方法によって，Hippo シグナルの阻害によるがん免疫の誘導は様々狙ったオルガネラを減少させた際の細胞応答を記述するながん種で認められる共通した現象であると考えられことを計画したが，トランスフェクションによる一過的る．今後この詳細なメカニズムを明らかにすることにな発現によって，一部の細胞にしか，オルガネラ減少をよって，多細胞生物における細胞の免疫原性の制御機構

引き起こせていなかった．そこで，刺激によってオルガ

に関して理解を深めたい．

ネラ減少法の発現を誘導できる細胞株の作製を試みた．
ウイルスベクターや Flp-In T-Rex などの市販の発現誘導システムの系を用いた試みでは，目的とする細胞株は取得できなかったが，doxycycline で，非常に厳密に発現誘導ができる Tet-3G システムとトランスポゾンを用いたベクターを作製し，それを用いたところ，誘導性オ
ルガネラ減少法をゲノムに組み込んだ細胞株を作製する

7

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成ことができた．

いて 34 個，D3 について５個のヒット化合物が得られた．

【将来の展望】

D2 は既に知られているアドレナリン受容体作動薬が多樹立した誘導性オルガネラ減少法を用いて，オルガネ
ラ不足に対する細胞応答を明らかにする．

数ヒットしており，系の妥当性が支持された．ヒット化
合物が生体作用を示すかを検証するにあたり，当院に甲状腺疾患で通院中の患者のコホートを構築し，各ヒット

甲状腺ホルモン脱ヨード酵素を標的とした脂質・エネルギー代謝促進薬の開発
山

内

一

郎
（京都大学大学院医学研究科）【目的】
甲状腺ホルモンは，LDL コレステロール低下作用や化合物の内服前後での変化をレトロスペクティブに解析するという試みを行っている．

腸管 NAMPT-NAD＋合成系を標的とした NAD＋中間代謝産物 NMN によるインスリン抵抗性発症予防法の開発研究山口慎太郎（慶應義塾大学医学部）

エネルギー代謝促進による抗肥満作用を有する．臓器特異的に甲状腺ホルモン作用を調節することで治療への応用を目指している．我々が研究している甲状腺ホルモン【目的】

脱ヨード酵素には，１型（D1），２型（D2），３型（D3）

近年，哺乳類 NAD＋ 合成系の鍵酵素である NAMPTの３種類があり，それぞれ臓器毎に分布が異なっているが環境・栄養状態に応答することで NAD＋量を調節し，点が魅力的である．例えば，D1 活性を増強させると肝NAD＋消費酵素を介して代謝，老化などの生物学的な多臓を介して LDL コレステロール低下に繋がり，D2 活性

彩な局面において重要な役割を果たすことが明らかにさを増強させると褐色脂肪を介してエネルギー代謝促進にれてきた．さらに，インスリン抵抗性，２型糖尿病なよる抗肥満作用に繋がる．以上より，D1, D2, D3 の調どに代表される代謝疾患において NMN (nicotinamide

節因子を明らかにすることを目的とした．

mononucleotide) などの NAD＋ 中間代謝産物が NAD＋

【方法】

量を増加させ，病態を改善することも報告されている．

甲状腺ホルモン脱ヨード酵素は，良好に発現する細胞

実際に，申請者らは脂肪細胞特異的 Nampt ノックアウ

株に乏しく，酵素活性の測定にラジオアイソトープやカトマウスを作成し，脂肪組織の NAMPT-NAD＋ 合成系

ラム処理を要するなど，ハイスループットな検出系を構が脂肪局所の炎症およびアディポネクチン分泌をコント築する上での困難さがある．そこで，プロモーターアッ

ロールし，インスリン抵抗性を制御することを報告した

セイを基盤として，384 ウェルプレートと少ない試薬量（Cell Rep. 2016）．

で十分に検出できる系を構築した．細胞株は HEK293T

また，我々の研究室では，高脂肪食により生じる腸管を用いた．D1, D3 については HDAC 阻害剤であるトリの炎症が，脂肪組織の炎症に伴うインスリン抵抗性発症

コスタチン A, D2 についてはフォルスコリンをポジティに先行することを見出し（Cell Metab. 2016），２型糖

ブコントロールとして用い，そのシグナルに対する相対尿病の発症を予防するためには，腸管にアプローチする比を算出してプレート間の補正を行った．陽性判定とし必要があると考えた．

た化合物について，恒常発現プロモーターに対しては反

さらに，これまで経口投与された NAD＋ 中間代謝産応を示さず，再現，用量依存が見られることを確認した．

物 NMN がどのように吸収され，２型糖尿病の病態を【結果・考察】改善するか詳細なメカニズムは不明であったが，NMN

臨床応用されている薬剤のライブラリー（2560 種類）のトランスポーターが小腸に存在することが報告されを用いたスクリーニングを実施した．正に制御するもの（Nature Metab. 2019），２型糖尿病発症における腸管について確認実験を進め，D1 について６個，D2 につの重要性が認識されている．

79

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

そこで，本研究では腸管の NAMPT-NAD＋ 合成系の２型糖尿病発症における意義を検討する．
【方法・結果】
C57BL/6 マウスに高脂肪食を負荷した．白色脂肪組
織の NAMPT 低下に先行して，腸管の NAMPT が低下した．そこで，肥満による２型糖尿病発症過程における腸管 NAMPT-NAD＋合成系の役割を検討するために，
腸管特異的 Nampt ノックアウトマウスを新規に作成した．具体的には，ワシントン大学医学部内科の吉野純博
士より供与していただいた Nampt-ﬂoxed マウスと，腸管上皮細胞で Cre を発現する Villin-Cre マウスを用いた．これまでに，ノックアウトマウスの腸管各部位で
NAMPT 発現量がコントロールマウスと比較し，有意に低下していることを確認した．
【今後の方針】
腸管の NAMPT-NAD＋ 合成系が糖代謝を制御しているという仮説のもと，解析を進めていく．

80

研究報告

Vascular
Vascular Biology
Biology Innovationに関する研究助成
Innovationに関する研究助成

ミネラロコルチコイド過剰におけるアルカローシス
依存性の Pendrin 制御機構
鮎

澤

信

宏

（東京大学先端科学技術研究センター）

制無しに、Pendrin 活性化のみが抑制された。すなわち
Pendrin の制御はアルカローシスを必要とすることが分かった。さらに、NCC 欠損マウスに高食塩・アルドス
テロン投与を行ったところ、野生型より高度の Pendrin
活性化が起き、依然高血圧が残存した。本系においてＫ補充によりアルカローシスを是正すると Pendrin 抑制【目的】
アルドステロン感受性遠位ネフロン（遠位曲尿細管～集とともに降圧が得られ、アルカローシスに依る Pendrin
制御が NCC 欠損時の高血圧維持に関与することが示唆合管）は、Na-Cl 共輸送体（NCC）や上皮 Na チャネル

された。

（ENaC）を発現し、腎における NaCl 再吸収の最終調【結論】節を担う。最近、皮質集合管のβ-間在細胞に発現する

一次性のアルドステロン過剰ではアルカローシスに依Pendrin が第 ３ の NaCl 再吸収機構として働き、NCC

る Pendrin 活性化が食塩感受性高血圧発症に関与する。

と相補的に血圧調節に寄与することが報告された。

本機構はサイアザイド抵抗性高血圧における治療標的に原発性アルドステロン症のような一次性のアルドスなる可能性がある。

テロン過剰では、低Ｋ血症を生じると共に NCC および
Pendrin の活性化が起き、食塩感受性高血圧を発症する。前回我々は、この Pendrin 活性化が間在細胞特異免疫学的介入に基づく循環器病に対する新規治療法

的 MR 欠損マウスでは抑制されず、一方で主細胞 MR-の開発

ENaC 経路の遮断やＫ 補充による低Ｋ 血症の是正によ安西淳（慶應義塾大学医学部）

り抑制されることを報告した。この低Ｋ血症に関連した Pendrin 活性化機構は、低Ｋ血症より直接的に起こることが知られる NCC 活性化機構と類似したが、両者の相違点や、
前者の血圧調節における意義は不明であり、【目的】
急性心筋炎は，特に若年者における突然死，拡張型心

今回さらなる検討を行った。

筋症の主な原因の一つであり，病態の解明，治療法の確【方法と結果】

立は医学研究の急務である．急性心筋炎は感染症，自己マウスに高食塩食・アルドステロン投与を行うと、低免疫，薬物などを原因とする，心筋を主座とした炎症性Ｋ 血症に付随して代謝性アルカローシスを生じ、NCC

疾患であり，病理学的には心臓へのリンパ球やマクロと Pendrin の 活 性 化 が 見 ら れ た。 ア ル カ ロ ー シ ス はファージなどの炎症細胞浸潤，心筋壊死，間質の浮腫，

Pendrin 制御への関与が示唆されていることから、この線維化を特徴としている．急性期の炎症反応が過剰な症点に着目して解析を進めた。同系においてアミロライド

例，あるいは遷延する症例は慢性心筋炎に移行しやすい（ENaC 阻害薬）投与やＫ補充により低Ｋ血症を是正しことが知られている．心機能低下が顕著な症例では心移たところアルカローシスも是正され、NCC・Pendrin

植が唯一の治療法になるが，日本を含めた多くの国では，の活性化はともに抑制された。一方、アセタゾラミド（炭心移植に潤滑に対応できないのが現状である．

酸脱水素阻害薬）の投与を行うと、低Ｋ血症の是正無Interleukin-3 (IL-3) は，数十年前にクローニングさ

しにアルカローシスのみが是正され、NCC 活性化の抑れた造血成長因子の一つであるが，その機能については

1

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

未だ不明な点が多く，特に循環器病における役割に関する報告はほぼ皆無である．本研究では急性心筋炎マウス

ドキソルビシン心筋症におけるフェロトーシスの役

モデルを用い，その免疫応答における IL-3 の役割を解割解明明するとともに，急性心筋炎に対する新規治療法を同定

池

田

昌

隆
（九州大学大学院医学研究院）することを目的とする．
【方法と結果】
野生型，および IL-3KO マウスに 100μg の心臓特異【背景・目的】的αミオシン重鎖ペプタイドを完全フロインドアジュバ

アントラサイクリン系抗癌剤の一種であるドキソルビ

ントとともに，週に１回，２週間皮下投与し，自己免疫

シンは，現在でも造血器悪性腫瘍および乳がんを中心に性心筋炎モデルを作製した．以下に行った検討とそれに多用される抗がん剤である．一方で，用量依存性に心毒対する結果を示す．

性を示すことが知られ，他の心筋症と比較しても予後不１．野生型マウスと比較して IL-3KO マウスでは，21

良であることが報告されている．本研究では近年新規日目における組織学的スコアがより軽度であり，心に提唱された過剰な過酸化脂質に基づく regulated cell

臓の炎症が抑制されていた．

death であるフェロトーシス（ferroptosis）とその主

２．Flow cytometry 法で浸潤細胞を解析すると，IL-たる制御分子である Glutathione peroxidase 4 (GPX4)

3KO マウスで特に単球，マクロファージ，単球由に着目し１,２），ドキソルビシン心筋症におけるフェロ

来樹状細胞の浸潤が抑制されていた．

トーシス誘導の分子機序とその役割を解析した．

３．CD4 陽性Ｔ細胞が IL-3 の主な産生源であった．心筋炎患者の心臓組織中の IL-3 の遺伝子発現が正常【方法】
ドキソルビシン心筋症動物モデルは，6mg/kg/ 回を心と比較して上昇していることも確認した．

モデル作成開始 0, 2, 4 日目に尾静脈より投与して作成

４．末梢血，骨髄の白血球数，分画は両群で有意差を認した．14 日目に心エコー，臓器重量を測定し，回収しめなかった．
５．IL-3 受容体は心臓マクロファー ジに高発現しておたサンプルの生化学的解析を行った．新生仔ラット単離
心筋細胞にドキソルビシン（2μM）で 30 時間の刺激をり，CRISPR-Cas9 の手法を用いて，IL-3 がマクロ行い，生化学的評価および細胞死の評価を行った．

ファージからの CCL2, CCL7, CCL12（単球の遊走【結果】を促すケモカイン）の産生を誘導することを示した．

ドキソルビシン心筋症モデルマウスでは，14 日目に

６．抗 IL-3 抗体の投与により，野生型マウスにおけるLVEF の低下を認めた．心筋組織においては，GPX4 の急性期の炎症，慢性期における心機能，線維化の改

遺伝子および蛋白の発現量は低下しており，脂質化酸

善を認めた．

化物の一種である MDA が増加していた．さらに GPX4

【考察】の過剰発現マウスでは LVEF の低下は改善し，過酸化脂

本研究により，IL-3 のマクロファージを介した新規質の蓄積が抑制された．一方で GPX4 ヘテロ KO マウ

機能が明らかとなった．近年，癌に対する Check-point

スでは LVEF のさらなる増悪を認め，過酸化脂質の蓄積阻害薬の使用が普及しているが，その致死的副作用の一が増加した．単離心筋細胞にドキソルビシンで刺激を加つとして自己免疫性心筋炎が知られている．IL-3 は急えたところ，GPX4 の減少および過酸化脂質の増加とと性心筋炎における新規治療標的となる可能性がある１）．

もに著明な細胞死が誘導された．一方で，GPX4，特に【文献】

ミトコンドリア型 GPX4 の過剰発現により過酸化脂質

１）Anzai, A. et al.: Self-reactive CD4+ IL-3+ T cellsは抑制され，有意に細胞死が抑制された．さらに GPX4

amplify autoimmune inﬂammation in myocardi-

によるフェロトーシス阻害に加え，アポトーシス阻害剤

tis by inciting monocyte chemotaxis. J Exp Med;である zVAD-FMK を用いたところ，ドキソルビシンに216: 369-383, (2019).

よる細胞死が完全に抑制された．

2

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

【結果】

【考察】
ドキソルビシン心筋症において GPX4 の発現低下は開発した細胞外取込みアッセイ法を用いたところ，細フェロトーシス誘導の機転となっており，フェロトーシ

胞外正常タンパク質に比べて，細胞外ミスフォールドタ

スはアポトーシスとともにドキソルビシンによる細胞死

ンパク質が積極的に細胞内に取込まれリソソーム分解さにおいて重要な regulated cell death であることが示唆れていることを見出した．そこで，取込みアッセイ法とされた．

全遺伝子を標的として CRISPR による原因遺伝子を探【文献】

索した．その結果，細胞外ミスフォールドタンパク質の１）Dixon. et al.: Ferroptosis: An iron-dependent

取込みに関わる細胞外クリアランス受容体の同定に成功

form of nonapoptotic cell death, Cell., 149,

した．この受容体を欠損すると細胞外ミスフォールドタ

1060 (2012).

ンパク質の取込み分解が抑制され，細胞外ミスフォール

２）Angeli. et al.: Inactivation of the ferroptosis

ドタンパク質と受容体が直接複合体形成することも発見

regulator Gpx4 triggers acute renal failure in

した．

mice, Nat Cell Biol., 1180 (2014).

【考察】
同定した細胞膜上クリアランス受容体はアルツハイ

細胞外分泌タンパク質の分解経路の研究
板

倉

英

祐

マー病の原因となる細胞外アミロイドβの分解に関わることも見出した．つまり細胞外にも，異常タンパク質を選択的に認識して分解するタンパク質分解経路があるこ（千葉大学大学院理学研究院）とを同定した．この経路の詳細な分子機構を解き明かす
ことで，血液内のタンパク質恒常性を維持するメカニズ【目的】
生体内のタンパク質恒常性の維持は健康を保つために

ムの基盤を確立し，神経変性疾患など細胞外タンパク質沈着を伴う疾患の治療に応用できると期待される．

重要である．実際に近年の研究から細胞内タンパク質分解系であるユビキチン・プロテアソームやオートファ
ジーの多様な生理的重要性は明らかとなっている．一方で細胞外，つまり血液内にもタンパク質は豊富に存在し，細胞内と同様な熱ショックや酸化ストレスだけでなく，細胞外ではさらに細胞外プロテアーゼの攻撃，pH の変

AT2 受容体相互作用タンパク質の脳保護作用への影響についての検討
岩波純（愛媛大学大学院医学系研究科）

化（アシドーシス），循環物理的ストレスなどに晒され，タンパク質は厳しい環境を耐え忍ぶ．しかし，細胞外のこれまで我々は，脳血管障害におけるレニン・アンジ

タンパク質恒常性を維持するメカニズムはよくわかってオテンシン系（RAS）の影響について，特にアンジオテ

いない．

ンシンⅡ２型（AT2）受容体の役割について検討・報告【方法】

してきた．AT2 受容体は古典的な RAS の受容体である

細胞外ミスフォールドタンパク質がヒト培養細胞に１型（AT1）受容体に拮抗する作用を持ち，脳障害時に取込まれると赤色蛍光タンパク質が細胞内蓄積する新

保護的な作用をすることを明らかにしてきた．しかし，

規取込みアッセイ法を開発した．これにより細胞外ミス認知機能への影響については不明であったことから認知

フォールドタンパク質の細胞内取込み分解を定量的に測機能低下モデルマウスを用いて AT2 受容体の影響を検定できるようになった．さらに本アッセイ法と CRISPR討した．両頚動脈狭窄術（BCAS）により血管性認知症による網羅的遺伝子スクリーニングを組み合わせることモデルを作成し，AT2 受容体直接刺激薬，C21 を投与

で，細胞外のミスフォールドタンパク質を認識して分解してその影響を検討した．BCAS により認知機能が低下する細胞膜上受容体の原因遺伝子の同定を探索した．

していたが，BCAS 群に C21 を投与することでその低3

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

下が改善していた．脳血流量を測定したところ，BCASなった．

群で減少していたが，C21 を投与することによりその【方法および結果】減少が改善していた．さらに，AT2 受容体欠損マウスで(P)RR Tg マウスは体重減少を呈し，全身の著明な骨BCAS を行うと野生型マウス（WT）の BCAS 群に比べ

格筋萎縮（速筋優位）を認め，生後約一年以内に死亡してさらに認知機能が低下しており，脳血流量もより低下

た．骨格筋では Wnt シグナルが活性化されており，円する傾向があった．

形線維，筋線維の大小不同，中心核，間質の線維化がみ

また以前，この AT2 受容体刺激による脳保護作用にられ，MHC2B 陽性線維（速筋）の数が著明に減少してついて，受容体の細胞内 Ｃ末端に結合するタンパク

いた．また，老化マーカーの上昇がみられ，前述の組織質，ATIP が重要であることを培養神経細胞の検討から所見とともに，(P)RR Tg マウスは加齢性骨格筋萎縮の明らかにしてきた．しかし，この脳保護作用における表現型を呈していると考えられた．AAV ベクターを用ATIP の役割は不明である．そこで ATIP 過剰発現マウいた骨格筋への (P)RR 発現でも筋萎縮は誘導され，筋ス（ATIP-Tg）を用いて脳保護への影響を検討した．こ肉自体の (P)RR の寄与が明らかとなった．

のマウスで脳梗塞を誘導すると，WT に比べて ATIP-Tg(P)RR Tg マウスの自発的な筋傷害にはオートファ

で梗塞巣の減少傾向が認められた．さらに C21 を投与

ジー障害が関与していた．また，傷害後の再生過程でしていると，WT, ATIP-Tg で共に梗塞巣の減少が認めは，筋線維数の増加が野生型と有意な差を認めなかった

られるが，
ATIP-Tg でその効果が増強されていた．また，ものの，多核化と筋線維の肥大が遅滞し，筋芽細胞融合

虚血直後の脳血流量が ATIP-Tg において改善傾向を示の障害が示唆された．(P)RR Tg マウスでは傷害早期かし，C21 を投与していることで改善していた．

ら，筋分化マーカー Myogenin 陽性再生線維を多数認め，こうした結果から AT2 受容体-ATIP シグナルの活性

筋線維の早熟分化が示唆された．

化により効果的に脳血流量低下を軽減することで酸化ス(P)RR を安定発現させた C2C12 筋芽細胞株においてトレスや炎症を抑制し，脳障害の予防や neurovascular

も，Wnt シグナルの活性化が確認され，筋成熟・筋管

unit が改善することで認知機能低下抑制に繋がってい形成能の低下を認め，Wnt シグナル阻害分子 DKK-1 のる可能性がある．

投与により改善がみられた．そこで，(P)RR Tg マウスに DKK-1 を投与したところ，炎症，線維化，老化マーカーが抑制され，骨格筋萎縮の改善がみられた．次に，(P)RR

加齢性骨格筋萎縮の新規分子機構の解明
遠藤仁と Wnt の結合をブロックする中和抗体を投与したところ，同様に (P)RR Tg マウスの筋萎縮および傷害後の骨格筋再生を促進する効果が確認された．

（慶應義塾大学医学部）

さらに，Wnt シグナルと協調的に働く YAP シグナルについても，加齢マウスおよび (P)RR Tg マウスにおい【目的】
加齢性骨格筋萎縮の予防は健康寿命の伸長のために極て活性化が確認され，YAP 阻害薬 Verteporﬁn の投与により筋芽細胞融合の回復を介して筋萎縮が改善することめて重要であるが，その原因，分子機序については不明が示された．

な点が多い．近年，老化と関連の深い Wnt シグナルを【考察】活性化する分子の一つとして，組織 RAS の鍵分子であ

サルコペニアの発症機構に (P)RR-Wnt-YAP シグナル

るプロレニン受容体 ((P)RR) が同定された．我々は，加の活性化が重要であり，筋芽細胞融合の障害・早熟化を

齢に伴いヒトおよびマウスの骨格筋で (P)RR の発現が介して骨格筋委縮が進展する．これらのシグナル経路を上昇していることを発見しており，サルコペニアにおけ阻害する薬剤が今後サルコペニアの新たな治療薬になるる (P)RR の意義を明らかにするため，全身に (P)RR をことが期待される．

発現させたマウス ((P)RR Tg マウス) を作成し解析を行4

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

臓器特異的なペリサイトの機能解析
加

藤

勝

洋

されていたが，本研究の結果から別の細胞が筋線維芽細胞に分化することが示唆された．今後さらに臓器特異的なペリサイトの機能について明らかにしていく予定であ（名古屋大学医学部附属病院）

る．

【目的】
毛細血管の内腔は一層の血管内皮細胞で覆われており，そのすぐ外側にペリサイトが内皮細胞と基底膜を共有して存在している．肺におけるペリサイトの機能の多VEGF-A の質に着目した ANCA 関連血管炎の治療効果評価に寄与する評価法構築に向けて
菊

地

良

介
（名古屋大学医学部附属病院）

くはわかっていなかった．我々は複数の遺伝子改変マウスと肺厚切り切片の三次元的形態観察法を用いることで血管構成細胞の一つであるペリサイトの機能が肺胞形成【目的】に必須であること，また特異的な成長因子の分泌を介し本研究は，血管内皮細胞成長因子（VEGF-A）の質にて制御していることを見出した．そこで本研究は，さら着目した ANCA 関連血管炎の診断に寄与する評価法をに成体においての肺ペリサイトの機能を理解することを構築するために，ANCA 関連血管炎患者での治療前後目的とする．

の VEGF-A 及び抗血管新生因子（VEGF-A165b）血中濃【方法】

度との関連について評価することを目的とする．

Hippo シグナル伝達経路は発生，器官のサイズの制御，【方法】

恒常性の維持，組織再生，がん細胞の増殖・浸潤にとっANCA 関連血管炎を有する日本人患者の寛解導入て重要な役割を担うことが示されており，YAP1, TAZ

療法前向きコホート研究（RemIT-JAV）に登録されたはその中で重要分子であることが知られている．ペリサ

ANCA 関連血管炎（n＝172）と新たに診断された患者

イト特異的かつ誘導的 Yap1, Taz ダブルノックアウト

検体を用いた．血中 VEGF-A 及び VEGF-A165b 濃度は，マウスを作製し，新生仔または成体で Yap1 および Taz

ELISA kit を用いて測定した．

の遺伝子を誘導的に欠損させ解析を行った．また，ペリ【結果】

サイトに対する Cre を発現誘導可能なマウス系統とレ

我々は，種々の腎関連疾患における血中 VEGF-A 及

ポーターマウスを用いて細胞系譜追跡実験を行い，肺障

び VEGF-A165b 濃度を測定した．その結果，対照群と害において肺ペリサイトの動態を解析した．

比較して血中 VEGF-A 及び VEGF-A165b 濃度は ANCA【結果】

関連血管炎を有する患者群において有意に増加してペリサイト特異的かつ誘導的に Yap1 および Taz をい た． そ こ で， 血 中 VEGF-A 及 び VEGF-A165b 濃 度

成体において欠損させ解析したところ，ノックアウトマ

が ANCA 関連血管炎と関連しているかを評価するた

ウスにて肺重量の増加を認めた．このことから成体におめ に，RemIT-JAV 登 録 検 体 を 用 い て 治 療 前 後 で の 血

いて肺ペリサイトは血管透過性を制御していることが示

中 VEGF-A 及び VEGF-A165b 濃度変化について評価し唆された．また，ブレオマイシン肺線維症モデルを用いた． そ の 結 果， 血 中 VEGF-A 及 び VEGF-A165b 濃 度て細胞系譜追跡実験を行ったところ，ペリサイトは筋線

は，ANCA 関連血管炎の治療後に有意に減少していた

維芽細胞には分化しないことを見出した．

ANCA 関連血管炎は，好酸球性多発血管炎性肉芽腫症【考察】（EGPA），多発血管炎性肉芽腫症（GPA），顕微鏡的多本研究により成体において肺ペリサイトの機能の１つ

発血管炎（MPA）の３疾患に大別することができることして血管透過性を制御していることが考えられた．まとが知られている．そのため，どの疾患群において治た，今までの知見から肺ペリサイトが肺線維症の病態に療後の血中 VEGF-A 及び VEGF-A165b 濃度が変化しておいて，筋線維芽細胞に分化することを示唆する報告がいるかを評価した．その結果，血中 VEGF-A 濃度は，

5

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

MPA の治療後に有意に減少していた．一方で，血中たところ，腫瘍の増大に伴って血管の形成が進む様子がVEGF-A165b 濃度は EGPA の治療後に有意に減少してい確認できた．そこで，腫瘍血管の伸長方向に規則性がな

た．

いかを，時空間データのモデリングから解析した．一般【考察】

的に，腫瘍血管は腫瘍中心部の低酸素領域から産生され今 回 の 我 々 の 結 果 か ら， 血 中 VEGF-A 及 び VEGF-

る VEGF の濃度勾配に従って求心性に伸長すると考え

A165b 濃度は ANCA 関連血管炎の治療効果を評価できれている．しかしながら，我々の観察から導かれた解析る有用なマーカーとなる可能性が示唆される．今後，血結果はそのような傾向を示さず，むしろ新生血管は，腫中 VEGF-A 及び VEGF-A165b 濃度と各種評価パラメー

瘍の外縁部へ向かって伸長することを示唆していた．

ターとの関連や ANCA 関連血管炎患者の予後との関連【考察】について評価していく予定である．

動的な現象である血管形成は生体内でしか観察できな
いため，これまでの組織学的な観察結果を基にして想像

新規単球サブセットによる高次血管ネットワークの編成機構の解明
木戸屋

にて形成過程を推測しているにすぎなかった．しかしながら，本研究が示した「真の血管形成過程」は，書籍の模式図で表されるような単純ものでは無いことを示して浩康いる．このような腫瘍血管形成のダイナミクスは，これ（大阪大学微生物病研究所）

までの VEGF 阻害という概念に基づく治療法への抵抗性を生みだしている可能性がある．

【目的】
腫瘍組織の隅々にまで張り巡らされた血管ネットワー
クは，酸素や栄養分を供給することで腫瘍の増大に働いている．腫瘍血管の形成は主に血管新生と呼ばれる過程
によって進められるため，血管新生の抑制による「兵糧ヒト血管内皮コロニー形成細胞の細胞小胞を介した網膜神経血管保護作用
崎元晋（大阪大学大学院医学系研究科）

攻め」のコンセプトに基づく癌治療法の開発が進められてきた．しかしながら，VEGF 阻害剤を始めとする血管新生阻害剤は，単独で使用した場合にはほとんど抗腫瘍【目的】

効果を示さず，当初期待されたような効果は得られてい血 管 内 皮 コ ロ ニ ー 形 成 細 胞（Endothelial colony-

ない．腫瘍増殖における血管系の重要性は疑いようが無forming cells: ECFCs）は，血管内皮前駆細胞（EPC）

く，効果的でない理由は未解明のまま残されている．本の分画のひとつで，臨床での細胞治療に用いる自家血研究では，血管新生阻害剤への治療抵抗性を生みだす未管内皮細胞のソースとして注目を集めている（Nature

知の腫瘍血管形成機構が存在すると考え，腫瘍血管形成

Biotechnology 2014, Cell Stem Cell 2014）．ECFC の過程の生体内イメージング解析に取り組んだ．

パラクライン作用による血管再生メカニズム関しては，【方法および結果】

ほとんど報告がされていなかった．申請者らの目的は，腫瘍組織中における血管形成過程を時空間的に明らか

ECFC による虚血性網膜症による ECFC のパラクライにするため，生体内イメージングによる解析系の構築にン作用を明らかにすることである．特に近年，細胞間伝着手した．まず，腫瘍血管を長期的に安定して観察する達の重要な因子としてエクソソームやマイクロベジクル

ための血管イメージングマウスを作成するため，Apelinに代表される細胞外小胞（Extracellular vesicles: EVs）

遺伝子のプロモーター下で TdTomato 蛍光タンパク質が注目されている．ECFC に関しては，細胞由来の EVを発現する BAC Tg マウスを作成した．作成した血管中の miRNA が腎虚血障害に対して治療効果を示すこと

イメージングマウスの大脳表層部にグリオーマ細胞を同が報告されている（Vinas et al. Kid Int 2016）が，そ所移植し，多光子共焦点レーザー顕微鏡にて撮影を行っの他のメカニズムについてはほとんどわかっていない．

6

Vascular Biology Innovation に関する研究助成（Oxygen induced Retinopathy: OIR）モデルおよび網【方法】
EV は 48 時間培養し 0.22μm のフィルターを通した膜視細胞変性モデルマウス（RD10 マウス）に注射し，の ち，10kDa の MWCO 系 を 用 い て 超 遠 心（4000xg,

虚血および新生血管の改善および神経保護効果を検討し45min）を行ったのち，サイズ排除クロマトグラフィー

た．

を行った．BCA タンパク質アッセイを用い，可溶性【結果】

タンパクの少ない EV の濃縮に適した溶出分画を決定

EV に対する透過型電子顕微鏡所見では，UC-EV に比し，それらの EV サンプルを UF-SEC-UF-1-EV (Serial

較し，UF-SEC-UF-1-EV および UF-SEC-UF-2-EV では

ultrafiltration (UF), size exclusion chro-matography

巨大タンパクの凝集がみられなかった（図２および赤矢(SEC) extracellular vesicle) サンプルとし，残りの分画

印，バーは 0.2 μm)．また，NTA 計測においても UF-に再度同様に超遠心，アッセイを行い，得られた EV サ

SEC-UF は UC に比較して有意に多くの EV が認められンプルを UF-SEC-UF-2-EV とした ( 図１)．上記方法をた．生後 (P) ７日からマウス仔を 75％酸素チャンバーで用 い て CD-XXhi お よ び CD-XXlo の ECFC か ら EV を

5 日間飼育する OIR モデルにおいて，P12 に CD-XXhi

単離し，虚血性網膜症モデルである酸素誘導性網膜症

より分離された EV (CD-XXhi-EV) および CD-XXlo-EV
を 硝 子 体 注 射 し た と こ ろ，CD-XXhi-EV は CD-XXloEV に比較して，有意に新生血管（neovascular-ization）の退縮効果および虚血（Vaso-obliteration）の改善効果が認められた（図３）．RD10 マウスにおいても視細胞層の厚みが保たれており，神経保護効果が認められた．
【考察】
UF-SEC-UF を用いた EV の単離は有効であり、ECFC
由来の EV は虚血の改善効果を示し、今後のサブグルー
プの解析が可能であることをしめした。
【文献】
１）Sakimoto, S. et al.: CD44 expression in endothelial colony-forming cells regulates neurovasculartrophic eﬀect. JCI Insight., 2(2), e89906 (2017).
２）Dellett, M. et al.: MicroRNA-containing extracel-

図１

lular vesicles released from ECFCs modulate
angiogenesis during ischaemic retinopathy. J.

Cell. Mol. Med., 21(12), 3405-3419 (2017).

図２

代謝制御による不全心筋ミトコンドリア治療の開発
髙

田

真

吾
（北翔大学生涯スポーツ学部）【目的】
心不全に対する薬物治療や非薬物治療が普及してきた
図３が，死亡率のみならず再入院率の高さが依然として臨床的課題であり，より効果的な治療法の確立が求められて

7

Vascular Biology Innovation に関する研究助成いる．近年の研究から，心室リモデリングの発症・進展されている．我々は成体の血管 RAMP2 欠損誘導マウに心筋ミトコンドリアの機能不全が関与すると考えられ

ス (DI-E-RAMP2–/– ) と RAMP3 欠損マウス（RAMP3–/–）ている．今回，我々は心不全における心筋ミトコンドリ

を用いて，臓器間転移における AM-RAMP 系の意義を

ア機能低下のメカニズムを明らかにすること，心不全の検討した．

ミトコンドリア機能低下に対する治療法を開発すること【結果】を目的とした．

PAN02 膵癌細胞を脾臓に移植し，肝転移の検討を行【方法および結果】

うと，DI-E-RAMP2–/– は Control 群と比 べ， 転 移 率 が左冠動脈結紮による心筋梗塞後心不全マウス群の単上昇した．転移巣の癌周辺領域では，RAMP3 および離心筋ミトコンドリアにおいて，ミトコンドリア機能

PDPN の発 現と，転 移 促 進 因 子 S100A8/A9 の発 現 が（Oxygraph-2k）は，コントロール（偽手術）マウスと有意に亢進していた．一方で，RAMP3–/– では，DI-E-

比較し，有意に低下した．一方で，心不全群のミトコン

RAMP2–/–とは逆に，転移が有意に抑制され，転移巣

ドリア当たりの電子伝達系のサブユニットや複合体会合の PDPN 発現が低下していた．そこで，PDPN が AM-因子の発現量（WB, RT-PCR）はコントロール群との間

RAMP3 シグナル下に存在すると考え，RAMP3 ノックに差はなかったが，複合体としての電子伝達系の発現量

ダウン細胞を樹立した．その結果，RAMP3 発現低下に（BN-PAGE）は心不全群で有意に低下した．

伴って，PDPN 発現低下と p-Src の活性低下が示された．

心不全群では心筋組織当たりのスクシニル CoA 量（メさらに，転移巣から初代培養した RAMP3–/–CAF は，

タボローム）が減少し，ミトコンドリアタンパク質のサ癌細胞と共培養することによって，その増殖を抑制し，クシニル化（WB）が低下した．心不全群の単離心筋ミ

悪性度，遊走能も低下させた．

トコンドリアにスクシニル CoA を加えるとミトコンド【考察】

リアタンパクのスクシニル化は増加し，ミトコンドリア

以 上 か ら，DI-E-RAMP2–/– で は，AM-RAMP3 系 の機能は改善した．また，心不全群の心機能は改善した．

亢進と PDPN 発現亢進を生じ，癌の悪性度が増強した【結論】と考えられた．一方，RAMP3–/– では PDPN 陽性 CAF

心不全マウスの心筋ミトコンドリア機能低下の一因とが 減 少 し，AM-RAMP2 系 の 亢 進 を 生 じ た 結 果， 悪 性

して，スクシニル CoA およびミトコンドリアタンパク

度が低下したと考えられた．このことから，選択的な質のスクシニル化の低下が関与する．
（国際特許出願中）

RAMP2 の活性化と RAMP3 の阻害が，癌転移抑制の新
たな治療法になることが期待される．

アドレノメデュリン-RAMP2 系による血管恒常性制御機構による腫瘍転移抑制薬の開発
田中

多能性幹細胞における代謝機構に基づく細胞作製と心臓再生医療への応用

愛（信州大学医学系研究科）

遠

山

周

吾
（慶應義塾大学医学部）【目的】
アドレノメデュリン（AM）は，多彩な作用を有する

ヒト多能性幹細胞は心筋細胞を含む様々な細胞に分化ペプチドである．AM 受容体には，受容体活性調節タンする能力を有するため，心臓再生医療への応用が期待さ

パク RAMP が結合する．我々は RAMP2 が腫瘍血管新れている．一方で，ヒト多能性幹細胞を用いた心臓再生

生を制御することを報告したが，RAMP3 の腫瘍におけ医療における臨床応用を実現化するためには多くの課題

る役割は未だ不明である．一方，膵癌は，術後肝転移のを克服する必要がある．その最も重要な課題の１つは，制御が重要であり，Podoplanin (PDPN) 陽性の癌関連

分化後に残存する未分化幹細胞を取り除き，効率よく心線維芽細胞（CAF）の存在は予後不良であることが報告

筋細胞のみを作製する技術の確立であった．我々はこれVascular Biology Innovation に関する研究助成

らの課題に対して，ヒト多能性幹細胞と分化心筋細胞の薬物による心機能毒性を in vitro で評価する評価系を確

代謝プロファイルを詳細に解析することにより，培養環

立し、近年その心毒性がトピックとなっている代表的な

境により分化後に残存する未分化幹細胞を取り除き，分抗がん薬の毒性を評価することである。

化心筋細胞のみを効率よくかつ大量に純化精製すると【方法】

いう画期的手法を構築することにより克服することに日本人健康成人由来の iPS 細胞から分化誘導した心筋成功した（Tohyama, et al. Cell Stem Cell 2013, Cell

細胞（iPS 心筋）を 96 well プレート上でパターン状にMetab 2016, Stem Cell Rep 2017）．

培養し、モーションベクトルイメージングで解析する評

しかしながら，依然として課題が存在する．それは，価系を用いて複数の分子標的抗がん薬（スニチニブ、ソ

ヒト多能性幹細胞を用いた再生医療における臨床応用さ

ラフェニブ、バンデタニブ、レゴラフェニブ、イマチニ

らには産業化を実現化するためには，大量の細胞を作製

ブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ラパチニブ）およびドキする必要があり，それに伴い多くのコストが発生するこソルビシンの短期的（作用２時間後）および長期的（作とである．この課題を克服するためには，ヒト多能性幹用 48 時間後）な作用を評価した。

細胞を安価かつ効率よく作製する必要がある．一方で，【結果】

ヒト多能性幹細胞における従来の培養液は，未分化維持

強い心機能毒性が広く知られているドキソルビシン

および増殖において最適な条件ではなかった．そこで，は、短期的には iPS 心筋の動きを変化させなかったが、我々はヒト多能性幹細胞の増殖に最適な培養条件を探索

長期的には iPS 心筋の収縮、弛緩および同期性を強く低し，特定の代謝産物を増強することにより，ヒト多能性

下させており、ドキソルビシンの晩期毒性を反映してい幹細胞の増殖が促進されることを見出した．本研究成果るものと考えられた。分子標的抗がん薬の中でも VEGF

は，安価に大量のヒト多能性幹細胞および分化心筋細胞

受容体阻害薬であるスニチニブ、ソラフェニブ、バンデを作製することに繋がるため，再生医療における臨床応

タニブ、レゴラフェニブは iPS 心筋の収縮速度を濃度依用あるいは産業化の推進に貢献することが期待できる．

存性に低下させた。一方、この作用は一過性であり、長【文献】

期的にはほぼ消失した。また、スニチニブ、バンデタニブ、

１）Tohyama, S. et al.: Stem Cell Rep., 9, 1406-1414

ラパチニブは収縮の同期性を低下させる作用を示した。

(2017).

これら３つの分子標的抗がん薬は心機能毒性が規制当局

２）Tohyama, S. et al.: Cell Metab., 12, 663-674(2016).

から警告されている薬物であり、収縮の同期性を指標として心機能毒性を予測できる可能性が示唆された。これ

３）Tohyama, S. et al.: Cell Stem Cell., 12, 127-137(2013).

らの結果から、パターン培養した iPS 心筋のモーション
ベクトルイメージングによる解析で抗がん薬の心機能毒性が予測できる可能性が示された。

iPS 細胞を用いた創薬研究
内藤

篤

制御性Ｔ細胞による脂肪組織恒常性維持機構および彦（東邦大学医学部）

脂肪細胞分化機構の解明
中島啓（東京大学大学院薬学系研究科）【目的】
心臓に対する毒性は医薬品の開発中止理由として最も大きな割合を占めている。医薬品候補化合物の催不整脈【目的】

性を評価する手法は確立されている一方で、心臓の収縮・

制御性Ｔ細胞（Treg）は，様々な組織環境，炎症環

弛緩・伝導能を障害するような毒性（心機能毒性）を評境に適応する事で機能し，この適応性が炎症制御と組織価するための手法は確立されていない。本研究の目的はの恒常性維持に重要である．我々はこれまでに，ヒト自9Vascular Biology Innovation に関する研究助成

己免疫疾患 IPEX で同定されている Foxp3 遺伝子変異の Th2 型炎症亢進が全身の代謝にどのように寄与してA384T を導入したマウスの解析から，A384T Treg が，いるかは現在のところ不明である．今後は脂肪組織がAP-1 転写因子 BATF や GATA3, ST2 の発現制御異常をTh2 型に亢進している生物学的意義（褐色化の亢進など）引き起こし，結果的に非リンパ組織に局在する Treg のを明らかにし，脂肪組織における Treg の役割を解明し恒常性を特異的に破綻させる事を見出だした．
本研究は，たいと考えている．

この発見を手がかりとして，BATF, GATA3, ST2 の発現がその機能性維持に重要とされている脂肪組織中のTreg に着目し，A384T 変異マウスの解析から脂肪組織

生理活性ペプチドの臨床応用に向けた研究
永田における Treg の適応性を制御するメカニズムを明らか

さやか（宮崎大学医学部）とし，Foxp3＋Treg を介した脂肪組織恒常性維持機構および脂肪細胞分化機構を解明する事を目的とする．
【方法】

我々は，これまで本講座で発見されたビッグアンジオ

Foxp3 遺伝子変異 A384T 変異マウス，R397W 変異

テンシン-25（Bang-25）やアドレノメデュリン（AM）

マウス，Treg 特異的 BATF 欠損マウスおよび野生型マの臨床応用に向けての研究を行ってきた．そこで最終研

ウスの白色・褐色脂肪組織について，組織形態，免疫応究報告として Bang-25 と AM の研究成果について報告答（Th1/Th2/Th17 etc.），免疫細胞集団を病理学的，する．

免疫学的に解析し，Foxp3 依存的な Batf 発現制御が脂① Bang-25 の診断薬開発に向けた研究：レニン・アン

肪組織の恒常性維持および脂肪細胞分化にいかに寄与しジオテンシン系（RA 系）は循環器疾患や腎臓疾患に重ているのか検証する．また，A384T 変異マウスと野生要な役割を果たしている．また組織中には組織 RA 系が型マウスをそれぞれ通常食，または高脂肪食を摂取させ，血中 RA 系とは独立して存在していると考えられるが，エネルギー代謝変化を比較解析する．

その生成機構や役割に関しては不明な点が多い．そこで【結果】

組織 RA 系の機序や役割を明確にするためにアンジオテ

A384T マウスの脂肪組織を解析した結果，予想通り，

ンシンペプチドの系統的探索を行った．その結果，ヒト

脂肪組織中の Treg の数・割合が野生型マウスに比べての尿中に 25 個のアミノ酸からなり 14 番目の Asn が糖非常に少ないことが分かった．さらに Th1/Th2/Th17

鎖修飾を受けたペプチドを発見し，Bang-25 と命名した．

応答を解析したところ，A384T マウスの脂肪組織ではBang-25 は，心臓や副腎髄質，膵臓ではラ氏島のβ細胞，

Th2 応答が過剰に起こっており，脂肪組織重量も野生

腎臓のポドサイトをはじめ生体内に広く分布していた．

型マウスと比較して低い傾向にあった．一方で通常食・また，様々な疾患の尿中 Bang-25 を比較したところポ高脂肪食を摂取させ，体重をモニタリングしたが，体重ドサイト障害の進行した疾患で上昇傾向にあり，糖尿病に有意な差は認められなかった．また，通常食で飼育さでは健常人に比べて有意に高い事が明らかとなった．以せた WT と A384T マウスの糖代謝（インスリン抵抗性

上より Bang-25 は循環器・腎臓疾患の病態に関与して試験，グルコース負荷試験）を比較したが，糖代謝にもいる可能性が高いと考えられ，生成酵素の探索を行う事

有意な差は認められなかった．

で阻害薬などの開発を目指すと共に尿中 Bang-25 の測【考察】

定意義を明らかにする事で診断薬開発を目指している．

A384T マウスの脂肪組織は Treg の数が少なく，過②治療薬としての AM 誘導体の開発：AM は，ヒト褐

剰な Th2 応答が起こっているものの，糖代謝や高脂肪

色細胞腫の組織抽出液より発見され，強力な血管拡張や食負荷に伴う体重増加については，野生型マウスと比べ血管新生，抗炎症作用など多彩な作用を有している生理大きな差は認められなかった．肥満と脂肪組織の Th1

活性ペプチドである．そのため，これまで高血圧，心筋型炎症亢進には正の相関があることが良く知られている

梗塞，炎症性腸疾患（IBD）といった様々な疾患でそのものの，A384T マウスで見られているような脂肪組織

有用性が示されてきた．しかし，AM は生理活性ペプチ

90Vascular Biology Innovation に関する研究助成ドであるために血中半減期が短く，治療に用いる際は，ウスの方が高値であった．また，インスリン投与時の肝・長期的な入院下での経静脈持続投与が必要である．そこ

筋・脂肪の Akt リン酸化も KO マウスで障害が認めらで独自に開発した方法論を用いて AM のＮ末端にポリれた．そこで，次に運動能力への影響を検討するために，

エチレングリコール（PEG）を結合させた PEG-AM や

トレッドミルを用いて走行時間・距離を検討した．そのヒト IgG の Fc 領域をＮ末端に融合した Fc-AM を開発

結果，Pin1 KO マウスは，走行距離・時間ともに WTした．PEG-AM, Fc-AM 共に AM 受容体を発現した細と比べて低値であった．

胞株において AM と同程度の cAMP の産生能を有し，骨格筋での Pin1 結合蛋白を同定するために，Pull

血中半減期を著明に延長させた．また，両誘導体は，皮down assay からの銀染色・LC-MS/MS を行ったところ，

下の単回投与によって IBD や脳血管性認知症，高血圧

SERCA1 を同定した．SERCA1 は，細胞質から筋小胞に対して効果を示した事から AM 誘導体の治療薬とし体へカルシウムを取り込む蛋白であるが，サルコリピンての臨床応用を目指している．

と結合すると熱産生を行うことが知られている．そこで，
SERCA1 とサルコリピンの結合に Pin1 が影響するかを骨格筋におけるプロリン異性化酵素 Pin1 の役割
中

津

祐

介

（広島大学大学院医歯薬保健学総合研究院）

検討したところ，KO マウスの骨格筋で両者の結合が減少していた．また，KO マウスの骨格筋では，SERCAの ATPase 活性も低下していた．
【考察】
以上の結果より，Pin1 は SERCA1 の機能を亢進し，【目的】
サルコペニア等の骨格筋異常症は，糖取り込みの低下

カルシウム取り込みや熱産生を行うことで運動機能や代謝を調節していると考えられた．

等による代謝障害に関与する．一方で，代謝障害は，蛋
白合成阻害等を引き起こし，サルコペニアを誘発することがしられている．このように，代謝異常症とサルコペ
ニアは，密接に関係しており，骨格筋機能の維持は，高齢化社会の日本において重要な課題である．

妊娠時ストレスによる食塩感受性高血圧発症機序の
解明
西

本

光

宏

（東京大学先端科学技術研究センター）

プロリン異性化酵素は，様々な標的蛋白に結合し，プロリンのシスートランス異性化を行うことにより，その機能を調節している酵素である．Pin1 は，癌とアルツ【目的】

ハイマー病の発症に関与することが従来知られていた

高血圧を含む種々の疾患発症の要因として胎児期/新が，我々のグループでは，Pin1 が代謝調節に重要であ

生児期におかれた環境因子の寄与が示唆される事象がることを見出した．

報告され，DOHaD (Developmental Origins of Health

今回，骨格筋での Pin1 の役割を明らかにする目的で

and Disease) 仮説が提唱されている．機序としてエ研究に着手した．

ピジェネティクな調節機構，特に比較的長期に変化の【方法及び結果】持続する DNA メチル化調節の関与が想定される．一骨格筋特異的 Pin1 KO マウス（以下 KO マウス）を方，低栄養母体の胎盤ではコルチゾールを不活性化する

作成し，筋肉の所見を観察したところ，筋重量や筋線

11βHSD2 活性が低下しており，過剰なコルチゾール暴維タイプの割合，ミトコンドリア蛋白量等には，WT と露が子の成長後の生活習慣病発症に影響する．しかし胎KO で差が認められなかった．また，普通食時の体重や児期のコルチゾール過剰が成人後に高血圧を発症させる耐糖能には，両群で差は認められなかったが，高脂肪食

機序は未解明である．我々は，血圧調節を司る視床下部

負荷時には，KO マウスで有意な体重増加が認められた．

の室傍核，食塩再吸収調節を担う腎尿細管に着目し，変この体重増加と一致して，各脂肪重量，肝重量も KO マ化を検討した．

91

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

る（1）心筋リモデリングの分子ダイナミクスの同定１），【方法】
妊娠時低栄養，胎児コルチゾール過剰暴露のモデルと（2）遺伝子発現の空間的不均一性２），（3）同定された

して妊娠時低タンパク食負荷ラットからの産仔（LP 産分子機序による疾患層別化３），を明らかにしてきた．し仔）及び 11βHSD2 によって不活化されない合成糖質

かし，個体内の細胞・分子の挙動およびその機能を正確

コルチコイド Dexamethasone を妊娠中に投与したラッに理解するためには，①詳細な系譜追跡とそれと同時に

ト/マウスからの産仔（Dex 産仔）について成長後の血細胞表現型を解析できるシステム，②細胞・分子の相互圧および室傍核での renin-angiotensin 系（RA 系）構作用を網羅的に解析するシステム，③遺伝子・分子機能

成分子の遺伝子発現，DNA メチル化，腎での Na 輸送

を網羅的かつ相互連関的に解析するシステム，④シング体発現を検討した．またマウス培養細胞系での機序の検

ルセルオミックス間のデータを連結するシステム，を確討を行った．

立することが必須である．我々は，DNA バーコードに【結果】よる系譜追跡システムとゲノム・トランスクリプトーム

LP 産仔，Dex 産仔とも成体での食塩感受性高血圧

同時解析を組み合わせ，心臓に対するストレス応答の多を呈した．これら産仔の室傍核では，アンジオテンシ

臓器連関性をシングルセル解析することで，臓器間・臓

ン受容体（AT1a）遺伝子の DNA 脱メチル化と AT1a

器内のどの細胞・分子の相互作用・挙動が適応修復に貢mRNA 発 現 増 加 を 認 め， さ ら に DNA メ チ ル 化 酵 素献するか？各臓器においてどの細胞がどのような系譜を

DNMT3a の 発 現 と AT1a プ ロ モ ー タ へ の 結 合 が 低 下

辿ってどのような機能を発揮するか？といった問題を解していた．培養室傍核神経細胞では Dex 添加により，明するとともに，心不全患者の心臓組織検体を用いて，

DNMT3a の発現低下と DNA 脱メチル化による AT1a

適応修復機構における細胞・分子応答の臨床応用につい発現増加を認め，この反応は DNMT3a のノックダウンて検証している．本研究報告会では，これら次世代型シによって Dex 非依存性に再現された．Dex 産仔マウス

ングルセル解析研究の一端を紹介する．

の腎尿細管では Na 再吸収に関わる蛋白の発現変化を認【文献】

め，出生後の薬物治療によって改善した．

１）Nomura, S., Satoh, M., Fujita, T., Higo, T.,
Sumida, T., Ko, T., Yamaguchi, T., Tobita, T.,【結論】
妊娠時低栄養による食塩感受性高血圧発症機序としNaito, AT., Ito, M., Fujita, K., Harada, M., Toko,て，脳内糖質コルチコイド過剰による脳内でのエピジェ

H., Kobayashi, Y., Ito, K., Takimoto, E., Aka-

ネティック調節異常が関与することが示された．

zawa, H., Morita, H., Aburatani, H. & Komuro,I.: Cardiomyocyte gene programs encoding morphological and functional signatures in cardiac

心臓疾患における個体レベルの細胞・分子挙動の網羅的理解
野村

hypertrophy and failure. Nat Commun., 9(1):4435, 2018.
２）Satoh, M.*, Nomuram, S.*, Harada, M., Yama-

征太郎（東京大学大学院医学系研究科）

guchi, T., Ko, T., Sumida, T., Toko, H., Naito,
AT., Takeda, N., Tobita, T., Fujita, T., Ito, M.,
Fujita, K., Ishizuka, M., Kariya, T., Akazawa,

生体組織の適応・修復は，個体レベルで多臓器が連関

H., Kobayashi, Y., Morita, H., Takimoto, E.,

した細胞・分子の相互作用・挙動，そしてそれに伴った

Aburatani, H. & Komuro, I.: High-throughput

細胞のリモデリングといった四次元ダイナミクス機構でsingle-molecule RNA imaging analysis reveals

あり，その機構の破綻は疾患発症に直結している．我々

heterogeneous responses of cardio-myocytes

は心臓のストレスに対する適応・修復過程をシングルセto hemodynamic overload. J Mol Cell Cardiol.,

ルレベルで解析することにより，心不全発症過程におけ

12: 77-89, 2019. *co-ﬁrst authors

92

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

３）Ko, T.*, Fujita, K.*, Nomura, S.*, Uemura, Y.,

用性を検討するとともに，follow up 可能であった 114

Yamada, S., Tobita, T., Katoh, M., Satoh, M.,

例を対象とし前向きコホート研究（２年間）を行い進展

Ito, M., Domoto, Y., Hosoya, Y., Amiya, E.,

予測因子としての検討も行った．

Hatano, M., Morita, H., Fukayama, M., Abu-

【結果】

ratani, H. & Komuro, I.: Quantiﬁcation of DNA

ZDF-fatty ラット群では，高血糖やアルブミン尿をdamage in heart tissue as a novel prediction

認めない６週齢の段階ですでに尿中 IGF1, IGF2 は高tool for therapeutic prognosis of patients with

値であり，有意な糸球体肥大，mTOR pathway 下流の

dilated cardiomyopathy. JACC Basic Transl Sci.,

Phospho-S6 のポドサイトでの発現の上昇，尿中ポドサ

in press.*co-ﬁrst authors

イト mRNA 排泄量の上昇を認め，早期の段階でポドサ
イトにストレスが生じていることが示唆された．また，6, 15, 30, 45 週と経過に伴い，糸球体とポドサイト容

ポドサイト傷害による糖尿病性腎症の進展機序の解明とバイオマーカーとしての尿中ポドサイト mRNA
排泄量の有用性の検討
福田顕

積のミスマッチ（ポドサイト density の低下）がより顕著となり，アルブミン尿と非常に強い相関を認めた（R2＝0.86）．上記ポドサイトへのストレスは 40% カロリー
制限により抑制できた．

弘

さらに，臨床症例の検討では，アルブミン尿の増加と（大分大学医学部）

ともに尿中ポドサイト mRNA 排泄量の増加を認め，正常アルブミン尿群でもコントロール群と比較して有意な【背景・目的】上昇を認めた．さらに，正常コントロール群の四分位範

糖尿病性腎症の進展機序の解明は透析患者を減らす上

囲でアルブミン尿値を揃えても尿中ポドサイト mRNA

で極めて重要である．近年では糖尿病性腎症の比較的早

排泄量は正常アルブミン尿群で有意に増加していた．

期から，また病勢の進行とともにポドサイト傷害が認め

また，２年間のコホート研究において，単変量解析

られることが報告されている．このことからポドサイト

では，尿中ポドシン mRNA/クレアチニン比 (10-fold

傷害の持続が糖尿病性腎症進展の主体であり，また，尿increase) [(OR, 2.95 (95% CI, 1.18 –7.34)] と尿中アル中ポドサイト関連分子がバイオマーカーとして有用とな

ブミン・クレアチニン比 (10-fold increase) ((OR, 2.70

る可能性が示唆され，動物モデルと臨床症例で検討した．

(95% CI, 1.67– 4.36)) が有意に e-GFR の年間 4% 以上【方法】

低下と関連し，多変量解析でも同様の結果であった [OR,Ⅱ型糖尿病性腎症モデルとして，レプチン受容体欠損

2.97 (95% CI, 1.07– 8.27), OR, 3.98 (95% CI, 1.94–

ラットである Zucker Diabetic Fatty ラット（ZDF-fatty）

8.15)]．

を使用し，レプチン受容体変異をヘテロで有するラット【結論】（ZDF-lean）を非糖尿病モデルコントロールとした．６

糖尿病性腎症において Growth factor (IGF1, IGF2)

週齢，15 週齢，30 週齢，45 週齢においてアルブミン尿，の上昇による mTOR1 シグナルの活性化に伴う糸球体

尿中ポドサイト mRNA 排泄量，糸球体容積，ポドサイ

肥大が病態進展の一因を担っており，それらは高血糖やト容積，ポドサイト density（体積あたりのポドサイト

アルブミン尿出現前の早期よりすでに認められる可能性数）などを測定し比較した．

が示唆された．また，尿中ポドサイト mRNA 排泄量はまた，臨床研究では糖尿病と診断された 145 例（正糖尿病性腎症における早期診断マーカーのみならず糖尿常アルブミン尿 83 例，微量アルブミン尿 31 例，顕性病性腎症進展のリスク予測因子として有用となる可能性

蛋白尿 31 例）を対象とし，人間ドックで糖尿病及び高が示唆された．

血圧を認めない 41 症例を対象コントロールとし尿中ポドサイト mRNA 排泄量の早期診断マーカーとしての有93

Vascular Biology Innovation に関する研究助成【考察】
ドパミンシグナルを介した心不全の新規病態生理の解明と治療法の開発
山口敏

本研究の結果，心筋 D1R は慢性心不全治療薬の新
たなターゲットとして期待されるものと考える．今後，

弘D1R による Ca2＋ handling 異常をきたす機序を明らか（東京大学医学部附属病院）にし，さらなる解明を試みていく．

【背景】
心不全の従来の基礎研究では「モデル動物とヒトの種差・心不全の病態の差異」が臨床応用を妨げる重要な課
題となってきた．我々は，ヒト心不全及び圧負荷モデル

ヒト iPS 心筋細胞を用いた心毒性評価
山

崎

大

樹

（国立医薬品食品衛生研究所薬理部）

マウスのいずれの心臓においても発現が著増する共通の遺伝子としてドパミン受容体 D1 (D1R) を同定した．
【目的】

ヒト iPS 細胞由来心筋細胞（ヒト iPS 心筋細胞）は，
ヒト心筋に発現する複数のイオンチャネルを有している

本研究の目的は，種を超えた心不全の本質的な病態形

ため，複合的な催不整脈リスク評価法開発の可能性が示

成に心臓 D1R が寄与するという仮説のもと，心不全の唆され，心臓安全性評価の予測精度を向上させうる新病態生理におけるドパミンシグナルの役割を解明するとたなツールとして注目されている．同時に多点電極シ

ともに，D1R を介した心不全の新規治療法の開発を目

ステムや膜電位感受性色素を用いた催不整脈リスク評価指すことである．

系についても発展してきた．我々は，これまでヒト iPS【方法・結果】

心筋細胞と多点電極システムを組み合わせた医薬品の心不全時に増加する D1R を in situ hybridization 法

催不整脈リスク予測法の開発を行ってきており，２種で評価したところ，D1R は心筋細胞で増加していた．

類 の iPS 心 筋 細 胞 株（iCell cardiomyocyte, CDI 社 お

そこで心筋特異的に D1R を欠失するマウスを作成した

よび Cor.4U, Ncardia 社）において，ISI（inter-spike

ところ，圧負荷心不全時の心室性不整脈が抑制され，生interval）-FPD（ﬁeld potential duration） 関 係 は ヒ ト

存率も改善した．他方，心筋特異的に D1R を過剰発現

心筋の心電図における RR-QT 関係と非常に似た性質をしたマウスでは心室性不整脈が増加した．以上より，心有していること，hERG 阻害剤である E-4031 による逆不全時に増加する心筋 D1R は致死的心室性不整脈の発頻度依存性がヒト心筋と同様に観察されることを見出し症に寄与すると考えられた．不整脈発症の機序として心た．さらには，ヒトの QT 間隔が 500 ms を超えると不筋細胞内の Ca2＋ handling 異常が知られているため，ア

整脈が発生しやすくなるとの報告から，ヒト iPS 心筋細デノウイルスを用いて培養心筋細胞に D1R を強制発現

胞にて検証したところ，FPD 値が 500 ms を超えるとさせたところ D1R は細胞内 Ca2＋ handling に異常をき

EAD が発生しやすくなることも見出した．このことはたすことが明らかとなった．また，心不全時の D1R のヒト iPS 心筋がヒトの催不整脈リスク予測評価に有用な

転写制御メカニズムを明らかにするために，D1R プロ

モデルとなり得ることを示している．そこで，多点電極

モーター領域のモチーフ解析及び培養心筋細胞を用いたシステムによる細胞外電位間隔の変化の程度と致死的不検証実験を行ったところ，D1R の制御 pathway として整脈である torsade de pointes (TdP) につながることがNF-kB pathway が関与していることが示唆された．さ知られている early afterdepolarization (EAD) の発生

らに当院の心筋症患者より採取した心筋細胞の遺伝子発の有無を指標にして，TdP リスクの異なる化合物（iCell

現解析を行ったところ，持続性心室頻拍の既往あるいは

cardiomyocyte）および 27 化合物（Cor.4U）の催不整

植込み型除細動器を持つ患者群で心筋 D1R の発現が増脈リスクを評価し，３種類のリスク（高リスク，中リス

加しており，同様の結果が共同研究グループであるコロ

ク，低リスク）に分類した．次いで，３つのリスクに分

ラド大学のヒト心臓サンプルでも再現された．

類された薬剤のうち，高リスクと低リスクに分類され94

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

た薬剤について，臨床において TdP の発生を記録した

細胞の伸展刺激条件下では，発現低下していることが示

CredibleMeds データベースとのコンコーダンス解析を唆された．実際に，Thbs1 によって誘導される YAP の行ったところ，高い相関性が得られた．以上より，ヒト

核内移行は，small GTPase Rap2 や Hippo 経路を介し

iPS 心筋細胞と多点電極システムを組み合わせたリスクている事を明らかにした．さらに，Thbs1 欠損マウスは，

カテゴリーシステムは，医薬品の催不整脈リスク予測を横行大動脈縮窄術（TAC）による圧負荷の増大に伴って行う上で非常に有用なツールであることが示された．

血管壁の乖離を引き起こす事，頸動脈結紮術における新生内膜の形成に，Thbs1 を介した YAP の活性化が重要

血管壁の機械刺激応答と病態形成を誘導するシグナ
ル分子の解析
山

城な働きをしている知見を見出した．
【考察】
これらの結果は，Thbs1 が血管壁内のメカニカルス

義人（筑波大学生存ダイナミクス研究センター）

トレス応答に重要な役割を担う可能性を示唆しており，
Thbs1 を介した血管リモデリングにおける新しい役割を提起するものである．

【目的】

【文献】

血管壁は絶えずメカニカルストレス（血圧，シェア

１）Yamashiro, Y., Thang, BQ., Shin, SJ., Lino, CA.,

ストレスなど）に晒されており，その制御機構の破綻

Nakamura, T., Kim, J., Sugiyama, K., Tokunaga,が大動脈瘤などの血管病態を引き起こす事が提唱され

C., Sakamoto, H., Osaka, M., Davis, EC., Wa-

始めているが，血管壁におけるメカノセンシング機構

genseil, JE., Hiramatsu, Y. & Yanagisawa, H.:の詳細は明らかになっていない．我々は，大動脈瘤マ

Role of thrombospondin-1 in mechanotransduc-

ウスモデルを用いて，コフィリンを介した細胞骨格のtion and develop-ment of thoracic aortic aneu-

リモデリングが大動脈瘤形成に重要である知見と，横rysm in mouse and humans. Circ. Res., 123 (6):

行 大 動 脈 縮 窄 術（TAC） に よ る 圧 負 荷 の 増 大 に 伴 っ

660-672, (2018).

て，細胞-基質間の相互作用を触媒する細胞外マトリク

２）Yamashiro, Y. & Yanagisawa, H.: Crossing

ス Thrombospondin-1 (Thbs1) が発現亢進する事を報

bridges between Extra- and Intra-cellular events

告してきた（Yamashiro. Sci. Signal., 2015）．さらに，

in thoracic aortic aneurysms. J. Atheroscler.

大動脈瘤血管壁では Thbs1 が過剰に亢進している事，

Thromb., 25(2): 99-110, (2017).

Thbs1 の抑制が大動脈瘤発症の抑制に効果的である事

３）Yamashiro, Y., Papke, CL., Kim, J., Ringuette,を報告してきた（Yamashiro. Circ. Res., 2018）．しか

LJ., Zhang, QJ., Liu, ZP., Mirzaei, H., Wagen-

しながら，Thbs1 を介したメカノセンシング機構の詳

seil, JE., Davis, EC. & Yanagisawa, H.: Ab-

細は，未だ不明のままである．

normal mechanosensing and coﬁlin activation【方法・結果】

promote the progression of ascending aortic

はじめに，血管平滑筋細胞を周期的伸展刺激下で培養し，分泌されるタンパク質を網羅的に解析した結果，aneurysms in mice. Sci. Signal., (399): ra105,(2015).

Thbs1 が過剰に分泌されている事を明らかにした．次４）Huang, J., Yamashiro, Y., Papke, CL., Ikeda, Y.,に，分泌された Thbs1 は，インテグリンαvβ1 と結合し，Lin, Y., Patel, M., Inagami, T. Le, VP., Wagen-

細胞接着斑を形成する事を見出した．Thbs1 欠損細胞

seil, JE. & Yanagisawa, H.: Angiotensin-convert-

では，接着斑がうまく形成されず，細胞硬度も柔らかく

ing enzyme (ACE)-induced acti-vation of local

なることが明らかになった．加えて，RNA-seq を用い

angiotensin signaling is required for ascending

た網羅的な遺伝子発現解析の結果，メカニカルストレス

aortic aneurysms in ﬁbulin-4-deﬁcient mice. Sci.

応答性の転写因子 YAP 関連遺伝子の発現が Thbs1 欠損

Transl. Med., 5(183): 183ra58, (2013).
95

研究報告

全身性炎症疾患の病因
・病態の解明に関する研究助成
全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

低分子量 GTP 蛋白質 Ral とインフラマソームとの関連から見た炎症性大腸発癌機序の解明
飯

田

智

哉

RT-PCR，免疫染色などを行い検討した．⑸ RalGAPα2KD Colon26 及び RalGAPα2 KO 由来 CAC とインフラ
マソームとの関連について，immunoblotting を行い検討した．

（札幌医科大学医学部）【結果】⑴ 免疫染色では，RalGAPα2 はヒト大腸上皮及び通【背景・目的】

常型大腸癌では強発現していたが，CAC では有意に低炎 症 性 大 腸 発 癌（Colitis-associated cancer: CAC）

発現であった．⑵ RalGAPα2 KO マウスでは WT マウ

は，慢性持続性炎症性粘膜から発症する大腸癌であり，スと比較して，腫瘍数，腫瘍径，粘膜下層浸潤癌が有通常型大腸癌の発癌機序とは異なる機序が想定されてい意に増加した．⑶ RalGAPα2 KD Colon26 では non-

るが，未だ明らかとなっていない点が多い．CAC は早KD Colon26 と比較して，遊走能，浸潤能が有意に亢進期から深部に浸潤しやすいという臨床的特徴を有してしていた．⑷ Microarray 解析では，WT マウスと比較おり，その予後は不良である．したがって，CAC の機

して RalGAPα2 KO マウスの大腸上皮細胞で，matrix

序解明は，臨床上重要な課題である．近年，Ras family

metalloproteinase (MMP)-9, MMP-13 の発現が亢進しの一つである低分子量 GTP 蛋白質 Ral の活性化が，複ていた．また，RalGAPα2 KO マウス由来 CAC では，数の炎症性疾患や癌において重要な役割を担うことが報

WT マウス由来 CAC と比較して immunoblotting, RT-

告されている．また，Ral の抑制性活性制御因子であるPCR で MMP-9, MMP-13 の 発 現 が 亢 進 し て お り， 免

Ral に対する GTPase-activating protein (RalGAP) α1,

疫 染 色 で は 腫 瘍 先 進 部 に お い て MMP-9, MMP-13 がα2, βが同定されており，我々の予備実験において，高発現していた．⑸ RalGAPα2 KD 大腸癌細胞株及び大腸では RalGAPα2 が強発現していることが明らかと

RalGAPα2 KO マウス由来 CAC では，コントロール群なっている．しかしながら，Ral と CAC との関連につと 比 較 し て IL-1β, NLRP3, ASC, Caspase-1 の 発現がいての報告はない．本研究では，CAC の深部浸潤機序

亢進していた．また，NLRP3 阻害薬を加えて Colon26

における Ral の役割を解明することを目的とした．

における cell invasion assay を行ったところ，有意に【方法】

浸潤が抑制された．さらに，NLRP3 阻害薬を投与した⑴ ヒ ト 大 腸 上 皮， 通 常 型 大 腸 癌，CAC に お け る

RalGAPα2 KO マウスでは，WT マウスと比較して粘膜

RalGAPα2 の発現について，免疫染色を行い比較検討

下層浸潤癌が有意に減少した．

した．⑵ Ral が活性化している RalGAPα2 knockout【結論】(KO) マウスを用いて CAC モデルを作製し，Ral の活

Ral の活性化が，MMP-9, MMP-13 の発現亢進及び性 化 が CAC の 病 態 に 与 え る 影 響 に つ い て 検 討 し た．

NLRP3 インフラマソームの活性化を介して，CAC の深⑶ RalGAPα2 を knockdown (KD) した大腸癌細胞株

部浸潤機序に関与していることを明らかにした．本研究

Colon26 を用いて，Ral の活性化が細胞の遊走能，浸が CAC の早期発見や治療標的の開発につながることが潤能に与える影響について検討した．⑷ 野生型（WT）

期待される．

マウスと RalGAPα2 KO から大腸上皮細胞を単離してmicroarray 解析を行い，腫瘍の深部浸潤に関わる因子について検討した．この因子について immunoblotting,96

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

ベーチェット病の HLA リスク因子を対象としたゲ
ノムワイド遺伝子間相互作用解析
石戸

みづほ

れた．今後，新たな日本人集団および海外人種集団を対象に同様の解析を実行し，ベーチェット病の HLA リス
ク因子と遺伝子間相互作用を示す遺伝子領域を明確にする．

（横浜市立大学医学部）【文献】
１）Kirino, Y., Bertsias, G., Ishigatsubo, Y., Mizuki,
N. & Tugal-Tutkun, I. et al .: Genome-wide【目的】
ベーチェット病は口腔内アフタ性潰瘍，眼症状，皮association analysis identiﬁes new susceptibility

膚症状，外陰部潰瘍を主症状とする再発性の難治性炎

loci for Behçet's disease and epistasis between

症性疾患である．ベーチェット病は多因子疾患であり，

HLA-B*51 and ERAP1, Nat . Genet ., 45 ( 2 ) ,HLA-B*51 アリルと HLA-A*26 アリルが疾患の発症リ

202-207 (2013).

スクと顕著に相関することが報告されている．近年，複２）Mizuki, N., Meguro, A., Ota, M., Ohno, S. &数の HLA 関連免疫疾患において，HLA リスク因子が他

Shiota, T. et al.: Genome-wide association stud-の遺伝要因と相互作用を示し，疾患の発症リスクに対

ies identify IL23R-IL12RB2 and IL10 as Behçet's

して相乗効果をもたらすことが報告されている．ベー

disease susceptibility loci, Nat. Genet., 42(8),チェット病では，小胞体アミノペプチダーゼをコード703-706 (2010).

する ERAP1 遺伝子が HLA-B*51 と遺伝子間相互作用を示すことが報告されているものの１），他の遺伝子領域と HLA リスク因子の遺伝子間相互作用についてはこ

yRNA の強皮症の病態への関与の解明
稲れまでに詳細な検討は行われていない．したがって本

葉豊（和歌山県立医科大学医学部）

研究では，ベーチェット病の HLA リスク因子である
HLA-B*51 または HLA-A*26 と遺伝子間相互作用を示
す遺伝要因をゲノム全域に渡って検討した．

【目的】
全身性強皮症は皮膚など多臓器に線維化を生じる系統【方法】
日本人集団（ベーチェット病患者 611 例，健常者

的疾患であるが，線維化の原因としてのコラーゲン異常

737 例）を対象としたベーチェット病のゲノムワイド関

発現の機序は未だ不明で，線維化は一般に不可逆的であ連解析２） で取得した SNPs データを対象に，PLINK のり早期診断が必要だが有用な血液マーカーは同定されてEpistasis 機能を用いて，HLA リスク因子（HLA-B*51,

おらず，有効な治療法にも乏しい．

HLA-A*26）と SNP 間の相互作用をゲノム全域に渡っ

膠原病には一般に遺伝素因と環境素因が発症に関与すて解析した．

ると考えられているが，研究代表者らはその環境因子と【結果】して non-coding RNA に注目してきた．本研究は non-

ベーチェット病の発症リスクに対して HLA-A*26 とcoding RNA の一つである yRNA の強皮症の病態への統計学的有意に遺伝子間相互作用を示す遺伝子領域を１関与の解明により，上記の課題を解決することを目的と－9

領域同定した（P＝8.9×10 ）．また，統計学的有意にした．

達しないものの，HLA-B*51 または HLA-A*26 と遺伝【結果】

子間相互作用の可能性を示唆する遺伝子領域を複数同定

最初に，それぞれ３例の正常および強皮症皮膚由来．
した（P＜1.0×10－4）の培養皮膚線維芽細胞における yRNA1, 3, 4，および【考察】５の発現をリアルタイム PCR を用いて調べた．yRNA4

ベーチェット病の発症において，HLA リスク因子との mRNA 発現は正常および強皮症皮膚線維芽細胞間で複数の遺伝子領域の相互作用が重要であることが示唆さ変化なかった．一方，yRNA1, 3 および５の発現は強皮97

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

症の線維芽細胞で増加していたが，yRNA3 の増加のみ

網膜内の PU.1, CD11c, F4/80 の total mRNA を Real-が統計学的に有意であった．

time PCR で定量し，３群間で比較した．次に網膜炎極

次に，３例の正常皮膚組織と 5 例の強皮症病変部皮期の網膜内に浸潤した細胞を，FACS を用いて解析した．

膚から抽出した RNA において同様に yRNA1, 3, 4, お

また，ELISA および Cell beads assay (CBA) を用いて，よび５の発現を調べた．しかし，これらの mRNA 発現EAU の発症に関わる主要サイトカインである IFN-γ,量において有意な差はみられなかった．

IL-2, IL-17 および IL-10 の頸部リンパ節内における産【考察】

生と PU.1 の関係を検討した．

yRNA は約 100 塩基の non-coding RNA で Ro RNP【結果】の構成因子として見出された．長らくその働きは明らか

EAU 群の眼炎症所見は免疫後 21 日目に極期に至り，になっていなかったが，近年 DNA 複製を制御している

PU.1, CD11c, F4/80 の mRNA は免疫後 21 および 28

ことが判明し，ヒト疾患において環境因子となりうるこ

日目で他の２群よりも有意に増加し，EAU の重症度ととが示唆されている．本研究では強皮症皮膚由来培養線も比例していた．FACS では CD3, CD11c, F4/80 の発維芽細胞において yRNA3 発現が上昇していた．今後，

現が PCR で得られた結果に矛盾しない結果が得られた．

コラーゲン異常発現との関わりや臨床的意義を検討してリンパ節におけるサイトカインの産生は，PU.1 をノッいく予定である．

クダウンすることによって IFN-γと IL-2 の産生が抑制
された．
【考察】

自己免疫性ぶどう膜炎における転写因子 PU.1 を介した抑制制御メカニズムの解析
馬詰朗比古

今回の結果からは，ぶどう膜炎の炎症極期における網膜内に浸潤した樹状細胞，及びマクロファージに PU.1

in vitro ではあるが，が発現していることを示し，さらに，（東京医科大学医学部）

ぶどう膜炎に関連する炎症サイトカインである IFN-γとIL-2 の産生が抑制されたことは，PU.1 発現レベルがぶ【目的】

どう膜炎の炎症レベルに関与することを示唆している

ベーチェット病に代表される難治性ぶどう膜炎は何らかの自己免疫機序で発症すると考えられ，失明に至ることもある疾患である．これらのぶどう膜炎の治療に

全身性強皮症の線維化におけるIL-22のmicroRNA

はステロイドの点眼や内服療法や炎症性サイトカインをを介した関与標的とした生物学的製剤などが用いられている．しか澤村創一郎（熊本大学大学院生命科学研究部）

し，視力予後不良となることも少なくなく，治療の選択肢も少ない．本研究では難治性ぶどう膜炎の動物モデルである実験的自己免疫性ぶどう膜炎（experimental【目的】

autoimmune uveoretinitis: EAU）を用いて，従来の治

全身性強皮症は皮膚を主体として，多臓器に線維化療法に代わる免疫細胞療法としての遺伝子治療の可能性を生じ得る疾患であり，病変部では線維芽細胞から過を模索し，難治性ぶどう膜炎への臨床応用の実現を目的

剰なⅠ型コラーゲン産生が生じている．炎症，免疫異とする．

常，血管障害などが誘因となり，transforming growth【方法】

factor-β1 などのサイトカインを介して線維芽細胞が

C57BL6 マウスを hIRBP1-20 ペプチド含有 CFA で免活性化されると考えられている．本研究では，強皮症疫した群（EAU 群）と，CFA のみによる免疫群，非免の皮膚組織において過剰に発現していることが既知

疫群の３群に分け，免疫 14, 21, 28, 42 日目に眼底をの，インターロイキン 22（IL-22）に着目し，IL-22 が観察，炎症の程度を記録し，その後，眼球を摘出してmicroRNA を介して線維芽細胞に与える影響や患者検

9

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成体における IL-22 の発現について検討した．

障害に関与する．5ASA 製剤との相互作用で 6TGN 濃【方法】

度が上昇することが知られており，これは 5ASA 製剤

In vitro にて正常線維芽細胞または強皮症由来線維ごとの薬物送達の違いによると考えられる．今回我々は芽細胞の培養を行い，IL-22 の影響下における細胞外新規 5ASA 製剤のリアルダʀを含めた 5ASA 製剤間でのマ ト リ ッ ク ス 発 現 量 の 変 化 を，PCR array, real-time

スイッチが併用チオプリンの代謝に及ぼす影響を比較検

PCR，ウエスタンブロッティングを用いて測定した．

討した．また 5ASA 製剤毎の血中 5ASA 濃度や TPMT

microRNA 発現量の測定は real-time PCR を用いて行っ活性に与える影響も検討を行った．

た．ヒト皮膚における IL-22 の発現量は免疫染色法，血【方法】

清においては enzyme-linked immunosorbent assay を① 2017年11月－ 2018 年 7月にチオプリン製剤併用用いて行った．

下に，臨床的判断または患者希望で pH 依存性（アサコー【結果】ルʀ）もしくは時間依存性（ペンタサʀ）メサラジン製

正常皮膚由来の線維芽細胞に IL-22 を作用させると，剤から pH 依存性 MMX 製剤（リアルダʀ）へ変更しmRNA レベルでの変化を伴わず，Ｉ型コラーゲン蛋白

た UC 患者 31 例を対象とし，変更前と変更後 8 週でのの発現が有意に増加した．Ｉ型コラーゲン以外の細胞外6TGN と 6-MMP を比較検討した．② 5ASA 製剤単独

マトリックス発現に関しては，mRNA，蛋白レベルいで使用している UC 患者 41 例を対象として 5ASA 製剤

ずれも変化を認めなかった．また，IL-22 を作用させた毎の血中 5ASA 濃度，血中 N-Ac-5ASA 濃度と TPMT

正常線維芽細胞では，Ｉ型コラーゲンの発現抑制作用を活性の低下率を検討した．

持つ microRNA である，let-7a の発現量が有意に低下【結果】していることが確認された．強皮症患者の血清 IL-22 濃① 対 象 患 者 は 男 性 21 例， 女 性 10 例． 患 者 年 齢 は

度は，
コントロール群と比較し有意差は認めなかったが，23 ～ 77 歳．pH 依 存 性 製 剤 か ら pH 依 存 性 MMX 製

免疫染色法により，強皮症患者の皮膚組織では，真皮層剤では変更前後で 6TGN, 6-MMP ともに変化がなかっに浸潤するリンパ球において IL-22 が発現していること

たが，時間依存性製剤から pH 依存性 MMX 製剤へのがわかった．

変更の前 / 後では，6TGN の有意な低下（p ＝ 0.02）と【考察】

6-MMP（p ＝ 0.04）の有意な増加を認めた．変更後 24

IL-22 は，microRNA let-7a を介してＩ型コラーゲン

週目での再燃はペンタサからの変更群で有意に多かっ蛋白の過剰産生に寄与している可能性が考えられた．こた．② 5ASA 濃度と TPMT 時間依存性製剤を内服中のれらのサイトカインや microRNA によるⅠ型コラーゲ患者で血中 5ASA 濃度は有意に高く，TPMT 活性の低ン調節のメカニズムを解明することは，強皮症の新しい下率が高い傾向にあった（血中 5-ASA 濃度 : p ＝0.002）

治療につながる可能性がある．

（TPMT 低下率 : p ＝ 0.06）．
【考察】

5-ASA 製 剤 と 6-TGN の 相 互 作 用 の 検 討 お よ び
TPMT 活性の検討
森久保

時間依存性製剤から pH 依存性 MMX 製剤への変更は，
血中 5ASA 濃度低下に伴いチオプリン製剤の有効性に影響を与える可能性がある．

拓（北里大学北里研究所病院）【目的】
潰瘍性大腸炎（UC）治療薬であるチオプリン製剤（アザチオプリン，6-メルカプトプリン）はその代謝産物
6TGN が免疫調節および骨髄抑制作用に，6-MMP が肝99

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成【考察】
IL-22 binding protein による慢性腸炎病態シフトの検討
矢今回の検討により IL-22BP が欠損することにより上皮の過剰な STAT3 活性化が誘導され，それによる上皮

野

有

紗

のバリア機構の破綻により肉芽腫の発症を誘導する可能（久留米大学医学部）

性が考えられた．
【文献】

【目的】

・Mizoguchi, A., Yano, A., Himuro, H., Ezaki, Y.,

上皮細胞特異的に作用する IL-22 は，腸炎に対して正Sadanaga, T. & Mizoguchi E.: Clinical importanceと負の相異なる役割が報告されている．
この機序として，

of IL-22 cascade in IBD, J Gastroenterol., 465-474,

IL-22 の 阻 害 分 子 と し て 働 く 内 因 性 の IL-22 binding

53 (2018).

protein (IL-22BP) の役割に着目した．IL-22BP 減少に・溝口

恵美子，氷室秀知，矢野有紗，【IBD 免疫伴う過剰な IL-22 の活性化は上皮バリアの修復よりむしの更なる理解をめざして！】IBD 病態理解に役立つ上ろ破綻を誘導して腸内細菌依存性の肉芽腫性腸炎発症を

皮免疫の基礎（解説／特集），IBD Research, 32-37

誘導するという仮説の証明を目的として研究を行った．

(2018).

【方法・結果】
上皮機能の解析のために，30mM EDTA perfusion
法により陰窩単位で抽出した上皮細胞より蛋白を抽出して，様々な転写因子についてのリン酸化をマルチプレッ

全身性強皮症における resident memory T 細胞

クス法にて解析した．サンプルとして野生型マウス（6と代謝例），潰瘍性大腸炎モデル T cell receptor-α (TCRα)-/-

吉

岡

華

子
（筑波大学医学医療系）

マウス（24 例），IL-22BP-/- マウスを作成し，潰瘍性大 腸 炎 モ デ ル で あ る TCRα-/- マ ウ ス と 交 配 し た IL22BP-/- x TCRα-/- マウスについて肉芽腫陽性群（13 例）【目的】と肉芽腫陰性群（10 例），上皮特異的に STAT3 が欠失

近年，循環血中から動員された後，末梢組織に留まりし IL-22BP および TCRαも欠失した Triple knockout

続ける resident memory T 細胞（TRM）についての研マウス（13 例）を使用し，比較検討を行った．野生型

究が進んでおり，皮膚疾患との関連が報告されている．

以外は，腸炎による影響を最小限に抑えるために中等度

また，TRM は長期生存に脂肪酸を必要とするため，Ｔ細以上の腸炎のモデルマウスを使用した．解析は，STAT3胞と代謝との関連についても注目されている．例えば，(Tyrosine, Serine), STAT1, STAT2, STAT5, STAT6,

TRM は血中と末梢組織を行き来する central memory T

CREB, JNK, NFκB, MAP-p38, ERK1/2, AKT, p70S6K細胞よりも酸素消費量が亢進していること，また，全身の転写因子についての活性化（リン酸化）を検討した．

性エリテマトーデスにおいては CD4T 細胞の酸素消費結果として肉芽腫陽性群では上皮の STAT3 の過剰活性量や解糖能が亢進していることなどが報告されている．

化が認められた．委細のデータは論文投稿準備中のため

今回，全身性強皮症における TRM，また自己免疫性炎症に公表は避ける．上皮の STAT3 が過剰に活性化したこ

性皮膚疾患におけるＴ細胞と代謝との関連について検討とで粘膜固有層において肉芽腫を形成した組織においてしたため報告する．

は，上皮を剥離し付着細菌を除去した後に，16SrRNA【方法】の増幅を次世代シークエンス法にて解析を行っている．

全身性強皮症皮膚，健常皮膚中Ｔ細胞の量的質的相

また上記方法で上皮細胞より RNA を抽出して DNA マ違を免疫組織学的に，また ﬂow cytometry にて検討しイクロアレイ法で解析した結果，肉芽腫陽性群の場合はた．また強皮症血中細胞の TRM 分化能を調べるため，

ケモセンサー機能の亢進が疑われる所見が認められた．

健常人血中Ｔ細胞，強皮症血中 T 細胞と健常皮膚由来

100

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

線維芽細胞とを共培養し，TRM の発現する割合を ﬂowを惹起した．免疫後，治療群には３日おきに IKKβ阻害

cytometry にて検討した．また，健常人血中Ｔ細胞と皮薬である IMD-0354 を，対照群には PBS を腹腔内投与

膚疾患患者の血中Ｔ細胞について，細胞外フラックスア

した．IMD-0354 はコンピュータ分子設計技術を用いてナライザーを用いて酸素消費量，解糖能を測定した．

作成された IKKβ特異的阻害化合物である．免疫後７日【結果】

目から，３日おきに眼底検査によって網膜の炎症の程度

強 皮 症 皮 膚 に は 組 織 学 的 に Ｔ 細 胞 が 少 な く，ﬂow

を評価した（臨床的重症度）．21 日目に眼球を摘出し，cytometry で検討すると特に CD4 TRM の分画が減少し切片を作製後に HE 染色を行い，組織学的に網膜の炎症ていた．一方で，強皮症血中Ｔ細胞は，健常血中Ｔ細胞の程度を評価した（組織学的重症度）．さらに，免疫組と同等の TRM への分化能を有していた．強皮症で末梢織化学により，炎症で生じる網膜での転写因子 NF-κB

血Ｔ細胞が TRM に分化する能力を保持していることがp65 の核内移行を検討した．また，免疫したマウスか判明したため，TRM で亢進する酸素消費量など代謝の変ら抽出した CD4 陽性Ｔ細胞と K2 ペプチドを共培養し，化が末梢血Ｔ細胞で測定できる可能性を考えた．健常人

Ｔ細胞の増殖反応について検討し，同時に培養上清中の血中Ｔ細胞と皮膚疾患患者の血中Ｔ細胞について酸素消

サイトカイン濃度を測定した．

費量や解糖能を比較したところ，乾癬患者の血中Ｔ細胞【結果】

では，酸素消費量が有意に増加していた．

臨床的重症度でも組織学的重症度でも，IMD-0354
を 投 与 し た 治 療 群 で は 対 照 群 に 比 較 し て， マ ウ ス【考察】
強皮症皮膚では TRM が構築されておらず，骨髄炎なEAU の 炎 症 の 程 度 は 軽 症 化 し た． 免 疫 組 織 化 学 でどの局所感染症の罹患率が高くなっている一因と考えらは，IMD-0354 投 与 に よ っ て EAU マ ウ ス の 網 膜 へ のれた．一方で，強皮症血中Ｔ細胞の TRM への分化能は

NF-κB p65 サブユニットの核内移行が抑制された．さ保たれていたため，強皮症の皮膚環境により皮膚Ｔ細胞

らに，培養上清中のサイトカイン濃度を測定した結の構築が抑制される可能性を推察した．乾癬患者のＴ細果，IMD-0354 添 加 群 で は Th1 サ イ ト カ イ ン で あ る

胞では，酸素消費量，つまりミトコンドリア代謝が亢進

TNF-α, IFN-γと Th17 サイトカインである IL-17A のしていたが，今後全身性強皮症など他の自己免疫性・炎産生が抑制された．

症性疾患においても解析を進めていきたい．

【考察】
ぶどう膜炎の病態には，転写因子 NF-κB 経路が重要である．しかし NF-κB は感染防御に重要であり，非特IκB キナーゼ（IKK）β阻害薬によるマウス実験的
自己免疫性ぶどう膜網膜炎（EAU）軽症化の検討
劉野

異的に抑制することは生理的に望ましくない．我々は炎症反応時にのみ活性化される分子である IKK を特異的に阻害する，コンピュータ分子設計技術を用いて合成された化合物に注目した．この分子標的薬剤は炎症時にの（北海道大学大学院医学研究院）

み NF-κB の核内移行を抑制し，Th1 と Th17 サイトカ
インの産生を抑制することによって，眼内の炎症を軽症【目的】
マウス実験的自己免疫性ぶどう膜網膜炎（EAU）に対する IKKβ阻害薬による抗炎症効果について検討する．

化していることが示された．
【結論】
IKKβ特異的分子阻害薬は，内因性ぶどう膜炎に対する安全かつ有効な薬剤となる可能性がある．

【方法】
B10.BR (H-2k) マウスに K2 ペプチドと結核死菌を含む完全フロイドアジュバントエマルジョンを皮下に投与し，追加免疫として百日咳毒素を腹腔内投与して，EAU

101

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

IBD モデルにおける腸管二次リンパ組織の機能解析
渡

部

太

郎

織のＢ細胞が病態に深く関与することが推察された．Ｂ
細胞の機能としては一般に形質細胞への分化とそれに伴う免疫グロブリン産生が広く知られているが，その他の（東京医科歯科大学医学部）

機能でも免疫応答に寄与している可能性が推測される．
今後これらの機能をより詳細に解析することで，IBD の【目的】
潰瘍性大腸炎と虫垂切除には負の相関がみられるように，腸管二次リンパ組織は炎症性腸疾患（IBD）の病態に深く関与すると推測されるが，その機能の詳細は明らかでない．本研究は IBD モデルの発症病態における腸管二次リンパ組織の機能解析を目的とする．
【方法】
8-12 週齢の野生型 C57BL/6 マウス（WT）にオキサ
ゾロン腸炎を誘導し，臨床・病理学的評価とともに大腸
粘膜固有層リンパ球（LPL）の炎症性サイトカイン産生を測定した．また WT に対して虫垂切除術を施し２週間の回復期間の後，腸炎を誘導して同様の解析を行った．
さらに成熟Ｂ細胞を欠損するμMT マウスや YC3.60 ト
ランスジェニック（Tg）マウスに腸炎を誘導し，同様の解析や生体イメージング観察を行った．
【結果】
WT に腸炎を誘導すると，臨床症状に相関し腸管短縮，
粘膜固有層へのリンパ球・顆粒球浸潤や潰瘍形成とともに，組織内リンパ濾胞の腫大や濾胞関連上皮の傷害が観察され，LPL からは IFN-γ, IL-4, IL-17 の産生亢進が測定された．腸炎誘導における二次リンパ組織の腫大や上皮傷害に着目し，虫垂切除術後のマウスに同様の腸炎を誘導すると，腸管短縮の軽減，粘膜固有層への細胞浸潤減弱とともに LPL の IFN-γ, IL-4, IL-17 産生が減少した．さらにこうした二次リンパ組織のＢ細胞の機能に着目しμMT マウスに腸炎を誘導すると，腸管短縮の軽減，病理学スコアの減弱に相関し，LPL の IL-4, IL-17 産生が抑制された．YC3.60 Tg マウスに腸炎を誘導すると，発症早期からＢ細胞の活性化が確認された．
【考察】
一般に二次リンパ組織はＴ細胞とＢ細胞で主に構成されるが，Ｔ細胞については獲得免疫応答に重要であることは周知であることから，
今回我々はＢ細胞に着目した．
本研究ではμMT マウスで IBD モデルが減弱することが示され，虫垂切除の解析結果と併せ，腸管二次リンパ組

102

病態解明がさらに深まるものと期待する．

研究報告

Front Runner
Runner ofFront
of Future
Future Diabetes
Diabetes Researchに関する研究助成
Researchに関する研究助成

GLP-1 の非アルコール性脂肪肝炎（NASH）に対する臓器保護効果の機序の解明
井上智損していることを確認した．コントロールマウス及び組織特異的 GLP-1 受容体欠損マウスを 18 週齢まで飼育し，血糖値，食事摂取量，体重の変化について評価を彰行ったが，両群に差を認めなかった．また，肝逸脱酵素（九州大学病院）

ALT についても両群に有意な変化は認めなかった．
【考察】

【目的】

今年度は，単球特異的 GLP-1 受容体欠損マウスの作

急激な糖尿病患者の増加により，非アルコール性脂肪出に成功し表現型の解析を開始できた．しかしながら単肝疾患（NAFLD）を有した糖尿病患者が増加している．

球 GLP-1 受容体の欠損のみでは，肝機能を含めた表現

糖尿病合併 NAFLD では肝線維化が進展し，非アルコー

系に変化を認めなかった．脂肪肝の状態での評価も必要

ル性脂肪肝炎（NASH）に進展するリスクが高く，有効と考えられ，単球特異的 GLP-1 受容体欠損マウスに高な治療戦略の確立が喫緊の課題である．新規糖尿病治療

脂肪負荷を行い検討する予定としている．

薬である GLP-1 受容体アナログが発売され，現在多くの糖尿病患者の治療に使用されている．近年の，NASH患者を対象とした臨床研究（LEAN 試験）において，GLP-1 受容体アナログが肝の線維化進行を抑制することで，NASH の有用な治療法となる可能性が報告されている．しかしながら，肝細胞には GLP-1 受容体が存

血管内皮における O-GlcNAc 修飾による糖尿病合併症進展機構の解明
大

橋

夏

子
（滋賀医科大学）

在しないなど，組織分布とそれに対応する臓器保護効果には解離があり，機序の詳細は明らかではない．そこで
本研究では GLP-1 受容体組織特異的欠損マウスを用いて詳細な機序の検討を行い，GLP-1 が持ち合わせる臓【目的】
糖尿病治療において，糖尿病症状の改善はもとより，器保護効果のメカニズムの解明を目指す．

種々の合併症の発症及び進展の予防が非常に重要であ【方法】

る．我々は，血管障害による糖尿病合併症の病態解明を申請者らが最近独自に作出した loxP 配列で glp1r 遺目指し，血管内皮における O-GlcNAc 修飾の生理学的

伝子のエクソン 4, 5 を挟む，ﬂox マウス（GLP-1r ﬂox/

役割及び病態における役割に関して検討を行う．

ﬂox mice） と， 単 球 系 細 胞 特 異 的 に 発 現 す る LysM

【方法】

(lysozyme M)-Cre マウスとの交配によって，単球特異タモキシフェン誘導性血管内皮細胞特異的 Cre 発現

的 GLP-1 受容体欠損マウスを作出する．コントロール

マウス（VEcad-BAC-CreERT2 マウス ）と OGT-ﬂox マ

マウスと比較検討することで，単球 GLP-1 受容体と肝ウスとの交配を行い，10 週齢にてタモキシフェンを臓との関連を検討する．

腹腔内投与することで血管内皮細胞特異的 OGT 欠損【結果】（OGT-VEKO）マウスを作製し，通常食・高脂肪食を摂GLP-1R ﬂox/ﬂox LysM-Cre マ ウ ス の GLP-1 受 容 体の発現を RT-PCR 法で確認を行った．GLP-1R ﬂox/ﬂox
LysM-Cre マウスでは単球特異的に GLP-1 受容体が欠取している状態において表現型を解析した．
【結果】
通常食を摂取している状態では，OGT-VEKO マウス

103

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

は対照群と比較し，耐糖能や血圧，尿糖や尿中アルブミ【方法・結果】

ンをはじめとする尿所見，心臓や大動脈，腎臓におけるFat ROS 低減マウス，増加マウスの解析

組織学的変化に関して明らかな差を認めなかった．一方，皮下脂肪特異的 Fat ROS 低減マウス（aP2-Cat/Sod1

高脂肪食を摂取している状態では，OGT-VEKO マウス

ダブルトランスジェニックマウス）は，皮下脂肪組織のでは対照群に比して有意な肥満抵抗性と耐糖能改善を認

健康的肥大を呈し，腸間膜脂肪組織や肝臓への脂肪蓄積

め，その原因として OGT-VEKO マウスにおける皮下脂を減少させ，インスリン抵抗性が改善した．また，Fat肪量と肝重量の減少が考えられた．

ROS 増加マウス（脂肪細胞特異的グルタチオン合成酵【考察】

素欠損マウス ) は，これらと対照的な表現型を呈した．

O-GlcNAc 修飾は，解糖系側副路の一つであるヘキ

これらのマウスで認められた健康的脂肪肥大は，脂質ソサミン生合成経路を介して最終的に産生される UDP-

合成の亢進や線維化の抑制を伴った（Okuno Y et al.,GlcNAc を基質とし，O-GlcNAc 転移酵素により蛋白のDiabetes, 2018)．

Ser，Thr 残基に付加され，O-GlcNAc 分解酵素により除去される修飾である．高血糖状態では，細胞内へのグ

脂肪細胞特異的グルココルチコイド受容体欠損マウスの解析

ルコース流入量の増加に伴ってヘキソサミン生合成経路

脂肪細胞特異的グルココルチコイド受容体欠損マウス

が活性化されることから，O-GlcNAc 修飾は糖尿病合併

は，クッシング症候群モデルにおいて，脂肪組織の健康症の成因進展機構の一つとして着目されてきた．現時点

的肥大を呈し，肝臓への脂肪蓄積を減少させ，インスリ

までの我々の検討では，OGT-VEKO マウスの通常食摂ン抵抗性が改善した．本マウスで認められた健康的脂肪取モデルでは表現型に関して特に有意な変化を認めず，肥大は，脂質分解の抑制や線維化のターンオーバー促進

高脂肪食摂取モデルでは有意な肥満抵抗性と耐糖能改善を伴った（Hayashi R, Okuno Y et al., Endocrinology,

を認めたことから，血管内皮における O-GlcNAc 修飾2019）．

の欠損による影響は正常血糖状態では見られず，高血糖脂肪細胞における新規核内 SREBP1 結合因子の同定状態において肥満及び耐糖能を改善させることが明らか

健康的脂肪肥大において重要な役割を持つと考えられとなった．今後，ストレプトゾトシン誘発糖尿病モデル

る nSREBP1 の新規結合因子を探索した．3T3-L1 脂肪での検討，さらには現在明らかとなっている高脂肪食摂細胞において，FLAG-nSREBP1 を bait とした生化学的取モデルの表現型をもとに詳細なメカニズムの検討を行

精製の結果，機能未知因子Ｘを同定した．nSREBP1 はう．

因子 X のドメインＡに結合すると考えられた．因子Ｘが nSREBP1 の転写活性を抑制すること，因子Ｘが内分泌代謝疾患Ｂの原因遺伝子であることから，疾患Ｂは肥満脂肪細胞における酸化還元状態の病態学的意義
解明

SREBP1 活性化により発症する可能性が考えられた．
【考察】
脂肪組織の健康的肥大は，原発性肥満における脂肪組

奥

野

陽

亮

織酸化ストレスや，二次性肥満における脂肪細胞グルコ（大阪大学大学院医学系研究科）

コルチコイド受容体と関連する事が明らかになった．また，因子Ｘを制御することにより，健康的肥満を制御で【目的】
我々は，肥満状態の脂肪組織では酸化ストレス（FatROS）が亢進する事をマウス及びヒトにおいて報告してきた（Furukawa et al., J Clin Invest., 2004, Hirata etal., BBRC, 2012）．しかし，メタボリック症候群における Fat ROS の病態学的意義は不明であった．

104

きる可能性が示唆された．

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

弾性線維関連蛋白 Fibulin-5 によるインスリン抵
抗性制御機構の解明
奥山

朋

細胞特異的 Fbln5KO や脂肪細胞特異的 Fbln5KO はイ
ンスリン感受性の改善や体重変化を呈さなかったことから，Fbln5 欠損による代謝表現型の変化は臓器連関や間子接作用を介した作用であると考えられ，皮膚を介したエ（横浜市立大学医学部）

ネルギー代謝の変化や，血管におけるインスリン透過性の亢進の寄与が示唆された．

【目的】
細胞外基質の糖代謝制御への関与は不明である．細
胞外基質における弾性線維形成に必須の分子である
Fibulin-5 (Fbln5) の糖代謝への影響の解明を目的とし血管内皮 PDK1 の病態生理学的役割の解明
小検討を行った．

畑淳

史（川崎医科大学医学部）【方法・結果】
Fbln5 欠損マウス（Fbln5KO）および野生型マウス（WT）に生後８週齢より通常食あるいは高脂肪食負荷【背景】を行った．生後８週齢において，Fbln5KO と WT の体

Phosphoinositide dependent protein kinase1

重および耐糖能に差は認めなかったものの，Fbln5KO(PDK1) は PI3K の下流にあり，インスリンシグナルにではインスリン感受性の亢進および肝糖新生の抑制を認おいて重要な役割を果たす．我々は世界に先駆けて，血めた．両群の摂餌量は同等であったが，いずれの食餌群

管内皮特異的 PDK1 欠損マウス（VEPDK1KO マウス）

でも Fbln5KO では体重増加が抑制され，高脂肪食誘導を作製した．通常食３ヶ月飼育で，随時インスリン値が性の肥満・肝脂肪蓄積・脂肪細胞肥大化が抑制された．

有意に低値であったことに着眼し，「血管内皮 PDK1 はグルコースクランプによる解析により，Fbln5KO では

膵β細胞機能に重要な役割を果たす」という仮説を立て全身におけるインスリン感受性の改善が示唆された．

た．

Fbln5KO では皮脂腺の萎縮を認め，高脂肪食負荷時の【目的】

皮膚における各種脂肪酸代謝関連分子の発現誘導が消失しており，WT に比較し寒冷刺激に対する体温低下が顕著であった．この際脂肪組織における熱産生・脂肪酸燃

血管内皮 PDK1 の膵β細胞に及ぼす役割を解明する．
【方法】
通常食３ヶ月飼育した VEPDK1KO マウスとコント

焼に関連する遺伝子群の発現は上昇していた．Fbln5-

ロール（ﬂox/ﬂox）マウスを比較検討した．

ﬂoxed マウスを入手し各臓器特異的 Fbln5KO を作成し【結果】たところ，肝細胞特異的 Fbln5KO および脂肪細胞特異VEPDK1KO マウスは腹腔内糖負荷試験でコントロー

的 Fbln5KO は体重変化やインスリン感受性の変化を呈ルと比較して血糖値に違いがないものの，インスリン値さなかった．さらに，野生型マウスの肝組織および初は有意に低値であった．経口糖負荷試験では KO マウス

代培養肝細胞における Fbln5 の発現を比較したところ，で 15 分値血糖は有意に上昇していた．Ex-4 で前処置し肝臓において Fbln5 は主に肝細胞外に発現していた．

たところ，腹腔内糖負荷試験では KO マウスで有意に血Fbln5KO は血管の脆弱性を呈することから，標識イン糖は高値であった．グルコース応答性インスリン分泌はスリンをマウス下大静脈より投与し直後の肝臓におけるKO マウスで減弱しており，Ex-4 添加によりその差はインスリン取り込みを評価したところ，Fbln5KO では

より明瞭化した．単離膵島ではインスリン遺伝子やその野生型に比較し取り込みの亢進を認めた．

転写因子など膵β細胞機能において重要な遺伝子発現が【考察】

KO マウスで有意に低下しており，hif1α 及びその下流

Fbln5KO において全身におけるインスリン感受性の遺伝子は KO マウスで有意に上昇していた．さらに KO

亢進と体重増加の抑制を認めた．この機構として，肝マウスで有意に Pimonidazole 陽性β細胞が増加してい105

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

た．単離膵島において，ER stress，炎症性サイトカイのマクロファージが癌の発症・進展にどのような役割をンの遺伝子発現も亢進していた．さらには，膵島内の血果たしているか，in vivo モデルでの検討は充分に行わ

管構造を電子顕微鏡で評価したところ，KO マウスで血れておらず分子機構についても未だ明確ではない．様々管内皮の減少，基底膜の肥厚を認めた．

な組織における M2 マクロファージの役割を解析する【結語】

ため，我々は人為的に M2 マクロファージの数を減ら

血管内皮 PDK1 は，膵島における血流維持にとても重要で，膵島を虚血から保護し，ER stress や炎症の軽減を介して膵β細胞の機能・量の維持に極めて重要な役割を果たす．

すことが可能な CD206-DTR マウスを作製した（Am J
Pathol. 185(1): 162-171, 2015.）．
本研究では独自に作製したマウスモデルを用いて M2
マクロファージが癌の発症・進展に与える影響及びその分子機構について調べている．これまでの実験で M2

上記内容は下記論文として accept された．

マクロファージの減少により癌の発症・進展が抑制され

Obata, A., Kimura, T., Obata, Y., Shimoda, M.,

ることがわかり，そのメカニズムを追及している．まKinoshita, T., Kohara, K., Okauchi, S., Hirukawa, H.,

た，肥満によって癌微小環境におけるマクロファージのKamei, S., Nakanishi, S., Mune, T., Kaku, K., Kaneto,

subtype が変化し，非肥満時より癌発症が促進される可H.: Vascular endothelial PDPK1 plays a pivotal role

能性があると考え，肥満のマウスの癌におけるマクロin the maintenance of pancreatic beta cell mass and

ファージの subtype を解析している．さらには肥満時function in adult male mice. Diabetologia. 2019 Mayにおいて M2 マクロファージが癌発症・進展に与える影

4. doi:10. 1007/s00125-019-4878-1. [Epub ahead of

響は現時点で不明であり，独自に作製したマウスモデル

print]に高脂肪食を負荷し，その際に M2 マクロファージの数を減らすと癌発生が抑制あるいは促進されるのかを今後評価する予定である．肥満と癌発症をつなぐ機序に M2

肥満時の癌発症・進展における M2 マクロファー
ジの役割
角

朝

マクロファージが如何に関わるかを分子機構レベルで明らかにしたい．

信（富山大学医学部附属病院）

イソプレノイド生合成経路が脂肪組織発達に及ぼす肥満は乳癌，大腸癌，子宮体癌など数種の癌リスクを影響の検討増加させる．しかしながら，肥満がどのように癌発生に後

藤剛（京都大学大学院農学研究科）

関与するか根本的な機序は充分に解明されていない．免疫抑制因子，血管新生因子，炎症性サイトカインなどを介してマクロファージ，制御性Ｔ細胞（Treg）
，骨髄由

【【目的】

来免疫抑制細胞（MDSC）を始めとする免疫細胞が癌微

イソプレノイド合成経路はコレステロールをはじめと小環境を調節し癌細胞を支持していることが知られていする様々な生体内代謝物生産を担っている経路である．

る．癌抑制的な機能をもつマクロファージが存在する一脂肪組織は生体内最大のコレステロール貯蔵組織として方で，一部のタイプのマクロファージは免疫抑制や血管知られているが，脂肪細胞におけるイソプレノイド生合

新生を介して癌の進展・転移を促進することが報告され成経路の生理的意義は未解明である．そこで本研究では，ている．様々な種類の癌においてマクロファージは表面脂肪細胞におけるイソプレノイド生合成経路の生理的意マーカーを用いて M1 マクロファージ，
M2 マクロファー

義について明らかにすることを目的とし，種々の検討をジに大別して解析されてきた．しかしながら，それぞれ

行った．

106

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成【方法】
イソプレノイド生合成経路の律速酵素である HMG-

血管および脂肪組織由来新規分泌因子 Favine の機

CoA reductase (HMGCR) の ﬂox マウスを作成し，脂能解析

肪細胞特異的に Cre recombinase を発現するマウスと

小

林

祥

子
（大阪大学大学院医学系研究科）

交配させることにより，脂肪細胞特異的に HMGCR を欠損させたマウス（aKO マウス）を作成し種々の検討を行った．
【結果・考察】【目的】
糖尿病と肥満や動脈硬化症に関わる新規因子候補と通常食飼育下において，aKO マウスは雌雄を問わずし て， 我 々 は Fat/vessel-derived secretory protein

摂餌量・飲水量が増加し，耐糖能異常，インスリン感(Favine)/ Coiled-coil domain containing 3 (CCDC3)

受性の低下が認められた．aKO マウスでは脂肪組織がを同定した．Favine は，血管と脂肪で高く発現する分白色脂肪組織・褐色脂肪組織ともにほぼ完全に消失して泌因子であり，糖脂質代謝異常や炎症に関連する刺激におり，アディポネクチンやレプチンに代表されるアディより，その遺伝子発現量が変動する１）．Favine は脂肪

ポカインの血中レベルの顕著な低下が認められた．肝臓組織に作用し，脂肪細胞分化と脂肪合成促進作用を有すでは顕著な脂肪蓄積亢進が認められ，その一因として脂る２）．Favine のさらなる機能解析を目的に本研究を行っ

肪合成関連遺伝子の発現亢進が寄与しているものと考えた．

られた．aKO マウスに認められた上記のような種々の【方法】

代謝異常は，白色脂肪組織移植によってほぼ完全に回血管内皮培養細胞 HUVEC と Favine 欠損マウスを用復が認められた．これらの結果から aKO マウスでは顕いた機能解析

著な脂肪萎縮に伴う代謝異常が起こっていることが示【結果】唆された．HMGCR ﬂox マウスより単離した前駆脂肪

HUVEC において，Favine 添加または Favine 遺伝子

細胞に対しタモキシフェン活性化型 Cre recombinase

発現抑制により，TNFα 誘導性の炎症関連因子の発現がを導入し，脂肪細胞分化誘導後タモキシフェンにより変動した．Favine/ApoE 欠損マウスは重篤な動脈硬化

HMGCR を欠損させた細胞では，アポトーシスが誘導症の病態を呈した．現在は Favine の血管に対する作用

され，細胞生存率の低下が観察された．本現象はイソプ

機序を探索している．

レノイド化合物，ゲラニルゲラニル二リン酸（GGPP）【考察】の添加によって回復が認められた．これより，脂肪細胞

Favine は，脂肪蓄積促進作用を有し，インスリン抵においてイソプレノイド合成経路は GGPP 産生を介し抗性，血管の炎症，動脈硬化に関与する分泌因子であるて脂肪細胞の生存に必須の役割を担っていることが示唆

ことが示唆された．

された．

【文献】

【結論】

１）Sachiko, Kobayashi., Atsunori, Fukuhara., Ta-

脂肪細胞のイソプレノイド合成経路は脂肪細胞の生存に必須の役割を担っていることが明らかになった．

kashi, Taguchi., Morihiro, Matsuda., Yoshihiro,
Tochino., Michio, Otsuki., Iichiro, Shimomura.:
Identiﬁcation of a new secretory factor, CCDC3/
Favine, in adipocytes and endothelial cells, Bio-chem Biophys Res Commun., 392, 29-35 (2010).
２）Sachiko, Kobayashi., Atsunori, Fukuhara.,
Michio, Otsuki., Takayoshi, Suganami., Yoshihiro, Ogawa., Eiichi, Morii., Iichiro, Shimomura.:
Fat/Vessel-derived Secretory Protein (Favine)/107

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

CCDC3 Is Involved in Lipid Accumulation. J.

FGF21 発現誘導に寄与しており，また Activin B の強Biol. Chem., 290, 7443-7451 (2015).

制発現では FGF21 発現誘導を介して全身の代謝改善作用を及ぼすものと考えられた．

Activin B による糖・エネルギー代謝制御機構の解明
小

林

直

樹

（国立国際医療研究センター研究所）

糖尿病発症におけるオートファジーによる膵β細胞
調整メカニズムの解明
小

宮

幸

次
（順天堂大学大学院医学研究科）【目的】
TGFβスーパーファミリーリガンドのひとつである
Activin B が絶食やケトジェニック食摂取などの代謝ス【目的】

トレス時に肝臓において発現が強く誘導されたことか

２型糖尿病の膵β細胞維持にオートファジー（AP）

ら，Activin B の代謝制御における役割について明らかが必須であることを見出し１），そのメカニズムの探求をにすることを目的に検討を行った．

行ってきた２,３）．これまでは膵β細胞特異的に AP 実行【方法および結果】分子である Atg7 を胎生期よりノックダウンさせたマウ

Activin B の強制発現によってインスリン感受性・イスを用いてきたが，胎生期からではなく出生以降に AP

ンスリン分泌の改善を伴って糖尿病モデルマウスの耐不全がもたらされるシステムがより病態を反映すると考

糖能異常が著明に改善された．Activin B による効果

えられ，タモキシフェン（TM）誘導性膵β細胞特異的の作用機序について検討したところ，絶食時に誘導さAtg7 ノックアウト（Atg7KO）マウスを作出した．これ代謝調節に関与することが知られている FGF21 が，れまでに TM 投与後２週間の膵島において AP 不全が確

Activin B によって誘導され，逆に Activin B のノック

認され，TM 投与後６週間に Atg7KO マウスの有意な耐ダウンより絶食時の FGF21 発現は障害されていた．実

糖能の悪化が認められた．そこで AP 不全から膵β細胞

際に，Activin B 強制発現で認められるインスリン感受機能障害に至る分子機構を明らかとするためにトランス性亢進作用は，FGF21 のノックダウンにより消失した

クリプトーム解析を行った．

ことから，Activin B による代謝改善作用の少なくとも【方法】

一部に FGF21 誘導の寄与が考えられた．Activin B に

TM 投与後２週間と TM 投与後６週間の Atg7KO マウ

よる FGF21 発現制御メカニズムについて検討したとこ

スより膵島を単離し，トランスクリプトーム解析を行っ

ろ，Activin B は確かに FGF21 のプロモーター活性をた．

活性化したが，Activin B による FGF21 の発現誘導は【結果】

PPARa 活性に非依存的であった．さらに ActivinB によ

TM 投与後６週間の膵島ではインスリン合成や分泌にる細胞内シグナル伝達について検討した結果，Activin

関わる遺伝子発現の低下が認められたが，TM 投与後

B は 肝 臓 に お い て は ALK4 (Acvr1b) 経 路 に 加 え て

２週間の膵島では低下が認められなかった．一方で TM

ALK2 (Acvr1) 経路により，それぞれ Smad2/3 および投与後２週間と６週間に共通して発現の増加または低下

Smad1/5/8 を活性化することが明らかとなった．このしている遺伝子も見出された．

うち Activin B による FGF21 の発現誘導は ALK4 に依【考察】存的であり，絶食時の肝臓における FGF21 の発現はインスリン合成や分泌に関わる遺伝子発現に TM 投

Smad2 ノックダウンにより障害された．

与後２週間と６週間で差が見出されたのは耐糖能の表現【考察】

型に矛盾しない結果であった．更に今回共通に変化が認

Activin B とその下流シグナル伝達経路は絶食時の10められた遺伝子はオートファジーによる膵β細胞調節に

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

関与している可能性がある．２型糖尿病における膵β

また，活動量計を 14 日間装着し，期間中の平均 METs

細胞機能不全のメカニズムの一端を見出せる可能性があ(Metabolic equivalents) を算出した．共分散分析を用り，さらなる検討が必要である．

い，糖尿病群と非糖尿病群の比較を行った．

【文献】

【結果】

１）Ebato, C. et al.: Autophagy is important in islet

糖尿病群 52 名（平均年齢 70.2 歳，男性 28 名 [53.8%]）

homeostasis and compensatory increase ofのうちインスリン治療 18 名（34.6%），経口薬治療 20

beta cell mass in response to high-fat diet, Cell

名（38.5%），食事療法 14 名（26.9%）であった．非糖Metab.,  (4), 325 (2008).

尿病群 15 名の平均年齢は 67.1 歳，男性は６名（40.0%）２）Shigihara, N. et al., Human IAPP-induced pan-であった．平均 HbA1c は，糖尿病群 6.9%，非糖尿病

creatic beta cell toxicity and its regulation by

群 5.5% であった（p＜0.001）．平均 BMI は，糖尿病群

autophagy, J. Clin. Invest., 124, 3634 (2014).

23.3，非糖尿病群 22.7 であった（p＝0.490）．性，年

３）Honda, A. et al., Normal pancreatic beta-cell

齢，脂肪量，除脂肪量および平均 METs で調整した平function in mice with RIP-Cre-mediated inac-

均総エネルギー消費量は，糖尿病群で 2143 kcal/day，

tivation of p62/SQSTM1, Endocr. J., 65, 83

非糖尿病群で 2222 kcal/day と糖尿病群で若干低値を(2018).

示したが，２群間に有意な差は認めなかった（Meandifference: 79 kcal/day, 95% confidential interval[CI]: -78 to 235 kcal/day）．また，標準体重 1kg 当た

２型糖尿病患者における二重標識水法を用いた総エネルギー消費量の検討
近藤慶りの平均総エネルギー消費量は糖尿病群で 36.5 kcal/
kg/day，非糖尿病群で 37.6 kcal/kg/day であり，２群間の差は認めなかった（Mean diﬀerence: 1.1 kcal/kg/

子

day, 95% CI: -1.6 to 3.9 kcal/kg/day）．基礎代謝量は（滋賀医科大学）

糖尿病群で低値を示したが，２群間に統計学的有意差はなかった（Mean diﬀerence: -33 kcal/day, 95% CI:【目的】-80 to 15 kcal/day）．一方，身体活動レベルは糖尿病

糖尿病患者において，エネルギー摂取量の管理は治療群（1.71）で非糖尿病群（1.81）より低い傾向を示し上重要である．糖尿病学会ガイドラインでは，身体活動

た（Mean diﬀerence: -0.01, 95% CI: -0.01 to 0.21）．

レベルにより，エネルギー必要量を設定することが推奨

糖尿病群における治療法別の比較を行ったところ，インされているが，正確に測定された糖尿病患者の総エネル

スリン治療群において，総エネルギー消費量および身体

ギー消費量を検討した報告はほとんどない．
そこで，我々

活動レベルは低値を，基礎代謝量は高値を示したが，統は，総エネルギー消費量測定のゴールデンスタンダード

計学的有意差は認めなかった．

な方法である二重標識水法を用い，２型糖尿病患者にお【考察】けるエネルギー消費量の実態を明らかにすることを目的

正確に測定した日本人２型糖尿病患者の総エネルギーに検討を行った．

消費量は非糖尿病患者と同等であった．身体活動レベル【方法】

は糖尿病患者群で低い傾向を示したが，差は小さかった．

滋賀医科大学医学部附属病院糖尿病内分泌内科に外来研究限界として，単一病院の結果であること，症例数が通院中の 60～79 歳の糖尿病患者および非糖尿病患者を少なく，選択バイアスの可能性があることが挙げられる．

対象とした．二重標識水法を用いた総エネルギー消費量

本研究結果は，糖尿病食事療法のエネルギー必要量の設を測定し，間接熱量測定により基礎代謝量を評価した．

定に役立つ可能性がある．今後は，血糖コントロールとさらに，総エネルギー消費量を基礎代謝量で除して，身の関連を検討する予定である．

体 活 動 レ ベ ル（Physical activity level） を 算 出 し た．

109

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

新規小胞体ストレス調節因子 Sdf2l1 による肝臓での糖脂質代謝調節作用の検討
笹子

敬K., Kamura, T., Iwayama, K., Tokuyama, K.,
Kiyonari, H., Furuta, Y., Shibahara, J., Fukayama,M., Enooku, K., Okushin, K., Tsutsumi, T., Tateishi,

洋R., Tobe, K., Asahara, H., Koike, K., Kadowaki, T. &（東京大学大学院医学系研究科）

Ueki, .K: Hepatic Sdf2l1 controls feeding-induced ER
stress and regulates metabolism, Nat Commun., 10,【背景・目的】947 (2019).

我々は肝臓における摂食状態に応じた代謝調節機構に着目し，摂食が一過性に生理的な小胞体ストレスを惹起すること，コシャペロンと考えられる Sdf2l1 が摂食時に小胞体ストレスを介して糖脂質代謝を調節する一方，その発現低下が肥満・糖尿病の病態形成に関与している

生体防御調節因子としての GLP-1 の役割
佐

藤

雄

大
（秋田大学大学院医学系研究科）

可能性を示してきた．このような Sdf2l1 の生理的な役割について，遺伝子改変動物を用いた検討を加えた．
【方法】

【目的】

我々は既に Sdf2l1-ﬂoxed マウスを樹立していたが，現在，糖尿病の治療薬として，血中の GLP-1 濃度をその成獣にアデノウイルス Ad-Cre を投与し，肝臓特異高める薬剤が広く使われている．GLP-1 は，食事に伴的 Sdf2l 欠損マウスを作製した．その表現型を観察し，い小腸から分泌され，膵β細胞に発現する受容体に作

従来の Sdf2l1 ノックダウンモデルとの比較を行なった．

用することでインスリン分泌を促進するが，GLP-1 受【結果】

容体は膵島細胞以外にも様々な部位に発現しており，

アデノウイルス Ad-Sdf2l1 RNAi を用いたノックダウ

GLP-1 の膵外作用についてはその全貌ならびに生理的ンモデルでは，投与 10 日後までの表現型しか観察できな意義についてはほとんどわかっていない．この中でなかったが，上記ノックアウトモデルでは，投与６週間

肺はヒトやマウスで GLP-1 受容体が量も強く発現する後においても，肝臓の Sdf2l1 の発現は対照群の半分以組織の一つである．我々は，一見つながりがわからな下に低下していた．また他の組織においては，明らかない，腸管と肺の関係性を両者に共通する，バリア機能のSdf2l1 の欠損は示唆されず，肝臓特異的にノックアウ

観点から考えてきた．我々の研究の目的は，肺におけるトができたものと考えられた．このマウスはノックダウ

GLP-1 の役割を GLP-1 は生体防御を調節する因子であンモデルと同様に小胞体ストレスマーカー遺伝子の発現るという仮説の元に検証することである．

亢進，インスリン抵抗性，耐糖能障害，肝中性脂肪含量

【方法】

増加を呈した．加えてピルビン酸負荷試験にて，糖新生

肺の無菌性炎症モデルマウスと感染性炎症モデルマウ

亢進も認められた．

スを作成し，GLP-1 受容体作動薬を投与し，生存や体【考察】

重推移，遺伝子発現等を検討した．また，GLP-1 受容より長期的なノックアウトによる表現型は，短期的な体欠損マウスにおける感染症モデルにおいても同様に検ノックダウンによる表現型と同様であり，Sdf2l1 の小討を行った．

胞体ストレスと糖脂質代謝に及ぼす作用を，更に裏づけ【結果】る結果であった．この知見も含め，以下の通り論文発表を行なった：

肺の無菌性炎症モデルマウスでは GLP-1 は，サイト
カインの産生を高め，無菌性の炎症を増強することが示唆された．肺の感染症モデルマウスでは，GLP-1 受

Sasako, T., Ohsugi, M., Kubota, N., Itoh, S., Okazaki,

容体作動薬を投与することでその生存率が改善した．

Y., Terai, A., Kubota, T., Yamashita, S., Nakatsukasa,

GLP-1 受容体作動薬の投与により病原体の減少が認め110

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

られ，肺の炎症が改善した．GLP-1 受容体作動薬の投数の消化管ホルモンの変化，病態への関与を統合して捉与によりある種のサイトカインシグナルの増強が認めらえた報告は乏しい．レポーターマウス等を用いた既存のれ，このことが病原体の減少に寄与することが示唆され実験手法は，各ホルモン分泌細胞の同定，分布解析に大た．

きく寄与したが，腸管内分泌細胞を in vitro で培養する【考察】技術が存在しないという限界があり，機能の解析は困難

肺や腸管は外界と接するという点で共通している．

であった．

GLP-1 は，状況では炎症を増強し，病原体の侵入を防本研究では，ヒト iPS 細胞を用いて，十二指腸から回ぐための生体防御調節因子として働いている可能性が示

腸に至る小腸組織を部位ごとに分化誘導し，部位特異的

唆された．

なパラホルモナル腸管内分泌細胞を含む小腸チップを作成する．さらに，マイクロ流体デバイスの隔膜上で，極性を有する腸管細胞を培養することで，上層（消化管内

ヒト iPS 細胞とマイクロ流体デバイスを用いた小腸組織及び腸管内分泌細胞の成熟化機序の解明
三小田

亜希子

腔側）と下層（血管側）を区別して内分泌細胞を刺激し，分泌ホルモン解析することが可能である．外部環境の変化（食事内容）によって生じる消化管ホルモンの変化を直接解析できる新たな in vitro 実験系の構築を目指す．

（京都大学大学院医学研究科）【結果】
成体小腸は陰窩底部に存在する幹細胞からの持続的細【目的】

胞供給によって組織恒常性を維持する．パネート細胞がヒト iPS 細胞を用いて生体腸管を模した立体組織を作陰窩における幹細胞ニッチ形成に重要な機能を果たすこ成し，ヒト腸管内分泌細胞の機能を in vitro で解析できとが知られる．幹細胞から分化した内分泌細胞を含む腸る新たな実験系を開発する．成体腸管の恒常性維持機構

管粘膜上皮細胞は絨毛を構成するが，その寿命は 4–7

を，マイクロ流体デバイスを用いた腸管チップ上で再現

日と短い．したがって，成体の組織恒常性を維持した腸し，これを用いて，食事や薬剤による腸管内分泌細胞の管チップの作成には，陰窩・絨毛構造の形成が不可欠で機能変化を in vitro で捉え，糖尿病や肥満など代謝性疾ある．

患における消化管ホルモンの意義を包括的に理解するこ

ヒト iPS 細胞から，領域化された陰窩-絨毛構造を備とが本研究の目的である．

えた３次元小腸オルガノイドの作成に成功した．このオ【背景】

ルガノイドは，マウスの陰窩を単離，初代培養した陰窩

腸管からは 10 種類以上の消化管ホルモンが分泌され培養オルガノイドと酷似した構造を有し，細胞分裂が盛る．腸管は，外部環境 ( 食事内容 ) の変化を感知して全んな陰窩領域と，Villin 陽性粘膜上皮細胞，ChgA 陽性

身の代謝制御，恒常性維持に寄与する巨大な内分泌臓器

内分泌細胞が存在する絨毛領域をそれぞれ有する．ただである．
高脂肪食や高炭水化物といった食習慣の変化は，し陰窩の成熟度は新生児期マウス小腸に相当するものでイン ク レ チ ン (GIP，GLP-1) や，CCK，NTS の分 泌 をあった．今後はこのヒト iPS 細胞由来小腸オルガノイド

変化させ，糖尿病発症やインスリン抵抗性，肥満形成を，マイクロ流体デバイスに搭載し，２次元的に培養，の直接の原因となる（Inagaki N, et al. Diabetes 2014.

種々の刺激を負荷し，成体小腸への成熟を促進する．

Li J, eta al. Nature 2016.）．また腸管内分泌細胞は，複数の消化管ホルモンを同時に含有するパラホルモナルな細胞であること，腸管の部位によって発現するホルモ
ンのパターンが異なることが知られる．
協調して働くべき複数の消化管ホルモンの異常が，複合的に代謝異常を引き起こす可能性が示唆されるが，複111

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

Ｗｆｓ₁ 欠損によるβ細胞機能障害とインクレチンの効果に関する研究椎木

アミラーゼ陽性細胞に変容していることが明らかになっ
た．
【結論】

幾久子

Wolfram 症候群ではβ細胞脱分化が中心病態となり（山口大学医学部）

糖尿病を発症する．Wfs1 欠損マウスにおいて，ストレス病態での細胞内エネルギー代謝障害と脱分化誘導との【目的】

関連性が示唆される．

Wolfram 症候群 (WS) モデル動物 Wfs1 欠損マウスでは，膵β細胞が進行性に減少し糖尿病を発症する．我々は本モデルにおけるβ細胞消失の一因としてβ細胞が脱分化することを明らかにしたが，ヒトについては不明である．一方，脱分化誘導機構には，WFS1 の機能障害に脂肪組織マクロファージにおける GIP シグナルの
働き
清

水

辰

徳
（秋田大学大学院医学系研究科）

より引き起こされる小胞体及び酸化ストレス亢進との関わりが推察されるが，そのメカニズムは明らかではない．
そこで，Wfs1 欠損マウスにおける細胞内ストレスによ【目的】

る細胞可塑性制御機構を解明するとともに，WS 患者に脂肪組織には，脂肪細胞のみならずマクロファージにおけるβ細胞不全とβ細胞脱分化の関わりを明らかにすも GIP 受容体が発現している．脂肪組織マクロファー

る．

ジにおける GIP シグナルの働きと，肥満・インスリン【方法】

抵抗性との関りを明らかにすることを目的とする．

Wfs1 欠損マウス単離膵島を用いて，遺伝子発現定量
解析，メタボローム解析，細胞内代謝動態解析を行った．
マウス膵切片及び WS 患者の剖検膵について免疫組織【方法】（₁）脂肪組織間マクロファージの単離マウスから得た脂肪組織をコラゲナーゼで処理・遠心．

染色により解析した．

浮遊している脂肪細胞と沈殿している SVF を分取した．

【結果】

SVF 分画を CD45 抗体付きマグネットビーズによって10-12 週齢の Wfs1 欠損マウスでは空腹時及び随時

CD45（＋）と CD45（－）へ分けた．これらの分画を用い

血糖値は野生型と同等であるものの大部分のβ細胞がて RT-PCR を行い，遺伝子発現を解析した．

Neurogenin3 を発現する膵内分泌前駆様細胞に脱分化（₂）骨髄移植による脂肪組織間マクロファージの置換

する．同時に，Wfs1 欠損膵島ではグルコース異化障害

骨髄移植マウスは，GIP 受容体欠損マウスの骨髄を野に基づく ATP 産生障害を認めた．さらに，Wfs1 欠損膵

生型マウスに移植したもの（KO → WT）と，コントロー

島ではグルコース負荷時の解糖速度，酸素消費速度がルとして野生型マウスの骨髄を野生型マウスに移植した著しく低下していた．これらの代謝障害は，Wfs1 欠損

もの（WT → WT）を作成．移植後８週で採血を行い，膵島において顕著な発現増強を示すストレス応答分子

骨髄の置換状況を確認した．移植８週間後より高脂肪食

Thioredox-in-interacting protein (Txnip) を 欠 損 さ せの投与を開始とし，高脂肪食開始前に OGTT・ITT，高ることにより有意に回復し，脱分化の抑制とともにβ細脂肪食開始後４週間で再度 OGTT・ITT を行った．

胞量が維持された．50 週齢までの観察において Wfs1:【結果】

Txnip 二重欠損マウス全観察個体で糖尿病の発症が抑制（₁）脂肪組織間マクロファージは GIP 受容体を発現しされた．一方，WS 患者の膵組織では，インスリン陽性ている細胞の著明な減少を認め，膵ホルモン陰性内分泌細胞

SVF の CD45（ ＋）分画に GIP 受容体が強く発現してが増加していたことから，β細胞が脱分化していること

おり，脂肪組織間マクロファージに GIP 受容体は発現が推察された．さらには，膵島細胞がビメンチンまたはしているものと考えられた．この分画にはアディポネク

112

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

チンの発現は認められず，脂肪細胞の混入によるもので回復させることを示した（Endocrinology 2012）．また，はないと考えられる．

グルコースシグナルの活性化は，IRS-2 を介したアポ（₂）KO→WT マウスは高脂肪食に対する肥満耐性がある

トーシス抑制分子の誘導と小胞体ストレス分子の直接発

移植８週後に末梢血を用いて置換状況を確認したとこ

現制御の２つの異なる経路により，小胞体ストレス誘導

ろ，KO → WT マウスはおよそ７割が GIP 受容体欠損

性膵β細胞アポトーシスを抑制することを明らかにしたマウス由来に置換されていた．KO → WT マウスと WT（Diabetes 2013）．さらに，インスリン受容体と IGF-1→ WT マウスは移植後，通常食摂取下において体重差受容体の特異的阻害により，グルコースシグナルによはなかったが，高脂肪食に変更したところ KO → WTる新規膵β細胞増殖経路を見出した（Endocrinology

マウスは WT → WT マウスと比べて有意な肥満耐性を2014）．２型糖尿病ドナー由来のヒト膵島を用いた解析示した．高脂肪食開始前に行った OGTT では，15 分・から，グルコースシグナル活性化による代償性の膵β30 分で KO → WT マウスが良好な耐糖能を示していた．

細胞増殖は，FoxM1/PLK1/CENP-A 経路を介している

ITT では，120 分でのみ KO → WT マウスのインスリンことを明らかにし，この経路が２型糖尿病における膵

感受性が優れていた．しかしながら，高脂肪食負荷後４β細胞量低下の原因の１つである可能性を示した（Cell

週間後に行った OGTT・ITT では両マウス間に有意差はMetabolism 2017）．また，膵β細胞におけるグルコキ

認められなかった．

ナーゼの標的分子として，細胞外マトリックス分子で【考察】

ある Fibulin-5 と炎症性タンパクである S100A8 を同

KO → WT マウスに認められた肥満耐性は，GIP 受容

定し，Fibulin-5 は，グルコキナーゼ活性化によりカル体欠損マウスの表現型として知られており，脂肪細胞へ

シニューリン /NFAT 経路を介して誘導されインスリンの中性脂肪の取り込みを行う GIP の働きが抑制される分泌を制御することを見出し (Sci Rep. 2017), S100A8

ことによって生じるものと考えられているが，今回の結は，TLR4 を介したマクロファージとの相互作用により果は脂肪組織間マクロファージも脂肪の取り込みに関与

膵β細胞アポトーシスを制御していることを明らかにしすることを示唆するものである．現在，マクロファージた（J Biol Chem. 2018）．現在，新規グルコキナーゼ

特異的 GIP 受容体欠損マウスの作成を行っており，更標的分子の膵β細胞特異的ノックアウトマウスおよびヒに検討を進めていく．

ト膵島を用いて，さらなる解析を進めている．これまで，手厚い助成を頂きました日本応用酵素協会および関係者

グルコースシグナルを介した膵β細胞の小胞体ストの先生方へ心より御礼申し上げます．

レス制御メカニズムの解明
白川純（横浜市立大学大学院医学研究科）

single-cell RNA sequencing を用いたβ細胞新生経路の解明鈴木路

可（順天堂大学大学院医学部）

膵β細胞において解糖系の律速段階酵素であるグルコキナーゼを介したグルコースシグナルは，インスリン分泌，細胞増殖，およびアポトーシスを誘導し，糖尿病の【背景】

病態に深く関与することが知られている．申請者は，既

我々はこれまで，胎生期および成体におけるβ細胞

知の経路とは異なる，グルコースシグナルを介した膵β新生に焦点を当てて研究を行ってきた．具体的には，細胞機能の新規制御機構を明らかにしてきた．膵β細胞“Ins1-Timer マウス” を用いて新生β細胞数を定量し，でのグルコキナーゼの活性低下は，小胞体ストレスに対

新生β細胞の遺伝子発現プロファイル，および細胞周期して脆弱となり（J Biol Chem. 2011, Diabetes 2011），の特性を明らかにした（Miyatsuka T et al. Diabetes,

GLP-1 受容体シグナルがグルコースシグナルの低下を

3388–3393, 2014）．このマウスでは，FACS による新113

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

生β細胞単離および，その遺伝子プロファイル解析に成色を行い，両者の整合性を確認する．

功したものの，新生β細胞の位置情報を得ることが困難であった．このような背景を踏まえ，昨年度の申請において，新生β細胞の位置情報を得るため，Ins1-eGFP;

Timer double transgenic mouse (new Ins1-Timer) を作製した．本マウスでは，蛍光顕微鏡下で新生β細胞＝メタボローム解析を活用した糖・脂質代謝を制御す
る内因性代謝物の解明
高

橋

春

弥
（京都大学大学院農学研究科）

緑色蛍光細胞として観察可能となった．実際に新生β細胞の位置情報を得ることに成功し，更に，新生β細胞は膵管近傍に観察されるだけではなく，膵管から離れた血【研究背景・目的】

管周囲にも認められた．この観察結果は胎生期膵臓には肥満等から誘導される種々の生活習慣病の予防・改善

起源の異なる２種類の新生β細胞，即ち膵管近傍にあるを図るうえで，脂肪組織は重要な組織である．なぜな

内分泌前駆細胞がその場でβ細胞へと分化した “膵管近ら，脂肪細胞は単にエネルギー（脂肪）を貯蔵するだけ

接型” 新生β細胞（new βduct 細胞）と，膵管近傍の内でなく，条件によってはエネルギー消費にも寄与するか

分泌前駆細胞が血管周囲に移動した後に分化する “血管らである．通常の脂肪細胞（白色脂肪細胞）は主にエネ

近接型” 新生β細胞（new βvessel 細胞）が存在すること

ルギーを蓄積するが，寒冷環境下や特定の薬剤・食品成が示唆された．さらに，免疫組織学的染色の結果から，分による刺激時には，エネルギーを積極的に消費する褐

それぞれの細胞集団の間では遺伝子発現プロファイルが色様脂肪細胞に変換する．この現象は動物実験用マウス

大きく異なることが示唆された．

だけでなくヒトでも生じることが知られているが，どの【目的・方法】

ようなメカニズムで白色脂肪細胞から褐色様脂肪細胞に

前年度の結果を踏まえ，２つの異なるβ細胞新生経路

変換するのか，いまだに明らかになっていない部分が多を規定する分子メカニズムを解明するため，FACS を用く残されている．そこで，本研究では，メタボローム解

いて新生β細胞を単離し，single-cell RNA sequencing

析技術を応用し，褐色様脂肪細胞への変換を制御する内(scRNA-seq) を行った．

因性低分子代謝物の探索・同定を目的とした．

【結果・考察】【方法】

新生β細胞は遺伝子発現プロファイルの差異により，

C57BL/6J マウスにβ 3 アドレナリン受容体のアゴニ

５つのクラスターに分類され，そのうちの２つが new

ストである CL316243 (CL) を投与し，血中各種指標及

βduct 細胞および new βvessel 細胞に相当すると考えられび UCP-1 遺伝子発現量等を解析した．また，血中及びた． さ ら に，pseudotime 解 析 の 結 果 か ら，new βduct

褐色脂肪組織（BAT），鼠径部脂肪組織（IWAT），精巣細胞と new βvessel 細胞は共通の前駆細胞から別れて分

周囲脂肪組織（EWAT）の代謝物を LC-MS を用いて分化したものと考えられた．以上のように，蛍光顕微鏡に析し，得られた超精密質量データを活用したメタボロー

よる位置情報を得るための解析と，scRNA-seq による

ム解析により，CL 投与・非投与群間の差分解析を実施し，１細胞レベルでの unbiased な解析により，２つの異な代謝変動の全体像を解析した．メタボローム解析から得るβ細胞新生経路が存在することが示された．

られた，褐色様脂肪細胞への変換を制御する候補代謝物【今後の展望】

を培養脂肪細胞に添加し，UCP-1 遺伝子発現量等を解蛍光顕微鏡での観察結果から，位置情報として２つの新生β細胞の存在が示唆され，さらに scRNA-seq か析した．
【結果・考察】ら得られた unbiased な解析結果からも，同様に２つCL 投与により，IWAT を中心に UCP-1 の発現が顕著のβ細胞新生経路があることが示唆された．今後は，に増加し，白色脂肪細胞の褐色化が生じていることを確

細 胞 お よ び new

認した．この条件下で血中及び各種脂肪組織中代謝物のβvessel 細胞を特徴づける遺伝子に関し，免疫組織学的染

メタボローム解析を行い，BAT, IWAT, EWAT 及び血中

scRNA-seq か ら 得 ら れ た new β

duct

114

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成で検出された代謝物ピークに対し，CL 投与・非投与間する発症原因変異候補を 16 個に絞り込んだ．

の差分解析を実施した．その結果，CL を投与すること

このうち，ADA MTSL3 遺 伝 子 A137T 変 異で変化した代謝物ピーク数は，IWAT で最も多いことが(rs181914721) は，複数のゲノムコホートの糖尿病判明した．また，差分解析において，有意差があり，か非罹患者に比して協力医療機関の糖尿病患者 119

つ，IWAT において CL 投与により 10 倍以上変動した名において高頻度であり，さらに，同変異がみられ代謝物ピークは 28 種存在し，代謝物名が推定できた代

た糖尿病患者３名のうち１名の家系（家系２）にお謝物が 14 種類特定された．また，推定された当該代謝

いて，罹患血縁者９名中６名が同変異を有していた物の一種である低分子代謝物Ａについては，培養脂肪細ことから，糖尿病発症感受性変異である可能性が高胞に添加することで，UCP-1 発現量が増加することかいと考えた１）．

ら，当該代謝物は，褐色様脂肪細胞への変換に重要な役割を担うことが推察された．

［₂ ］30 歳 以 下 で 肥 満 歴 を 有 さ ず 糖 尿 病 を 発 症 し た
12 名を対象とした全エクソンシーケンス解析では，HNF1A 遺伝子 V246fs 変異が１名に検出され日本人の若年発症非肥満糖尿病患者における網羅的
次世代シーケンスの試み
田

中

大

祐

MODY3 と診断した．さらに別の１名において，新生児糖尿病の原因遺伝子である PTF1A 遺伝子に
S18F 変異がヘテロ接合にて検出され，35 歳未満発症の罹患血縁者に変異が共有されていたことから，（京都大学大学院医学研究科）

若年発症糖尿病の原因変異である可能性が示唆され
た．

【目的】

【考察】

単一遺伝子糖尿病の可能性が考えられる若年発症者を

若年発症糖尿病患者における網羅的次世代シーケンス対象とし，ゲノム DNA の次世代シーケンス解析を行い，が，糖尿病発症の遺伝的背景解明につながることが示唆

ゲノムワイド関連解析（GWAS）では同定困難であった，

された．

一般人口において低頻度だが疾患発症に与える影響の大【文献】

きい変異（mutation）を同定し，糖尿病遺伝素因の全１）Jambaljav, B., Tanaka, D. & Nagashima, K. et

容解明に貢献する．

al.: Whole-exome sequencing in a Japanese【方法】

family with highly aggregated diabetes identiﬁes

35 歳未満での若年発症糖尿病患者で膵島関連自己抗a candidate susceptibility mutation in ADAMT-

体陰性である 54 名およびその血縁者のゲノム DNA にSL3. Diabetes Res Clin Pract., 135: 143-149

つき全エクソンシーケンスを行う．そして，一般人口に(2018).

おいて稀であり（ゲノムデータベースおよび，共同研究中である計 10,000 人以上のゲノムコホートに属する糖尿病非罹患者において対立遺伝子頻度＜１%），タンパ
ク機能に重大な影響を及ぼす可能性が高いと予測されるグレリンの抗炎症機序の検討
坪

内

拡

伸
（宮崎大学医学部）

変異を抽出する．罹患血縁者が存在する場合は共通する変異を絞り込み，発症原因変異候補とする．
【結果】【背景・目的】［₁］インスリン分泌不全の顕著な非肥満糖尿病患者４名

グレリンは抗炎症と上皮保護効果を有し，肥満では発（空腹時血清 C-ペプチド＜0.3ng/ml）を有する家系現が低下する．グレリンの持つ抗炎症作用は，グレリン（家系１）にて，罹患者４名と家系内非罹患者２名

受容体を介した直接的作用と神経系を介する機構が考えを全エクソンシーケンスの対象とし，罹患者に共通られている．本研究では，高脂肪食負荷または迷走神経

115

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

切断処置を行ったマウスに対して，グレリンの抗炎症作

酵母（Tor1 および Tor2）から哺乳類（mTOR）に至る用の効果を検討した．

まで進化的に高度に保存されている．TOR は，異なる【方法】

２つの複合体である (m)TORC1 および (m)TORC2 を① C57BL6 マウスに，HFD 負荷（60 Kcal%fat）を 10形成することで機能し，TOR シグナルを構成している．

週間行い，ブレオマイシン（BLM）の気管内投与にまた，TOR シグナルは糖尿病に関連する病態との関わよる肥満急性肺損傷モデルを作成した．HFD コントりが指摘されており，糖代謝や脂質代謝の制御にも関与

ロール群，HFD-PBS 投与群，HFD-グレリン群の３する（Cell 168: 960-976, 2017）．しかしながら，その群で，摂餌量，体重変化，気管支肺胞洗浄液（BALF）

詳細な制御機構および糖尿病病態への作用機序について

中の総細胞数，各種の炎症性サイトカインとケモカイ

は不明な部分も多く残っている．

ンの発現を検討した．

メチルグリオキサールは解糖系から派生する代謝物で②通常食の C57BL6 マウスに，迷走神経切断手術またあり，古くから糖尿病との関連が指摘されている．しかは sham 手術を行い，手術後３日に LPS を気管内投しながら，これまでにメチルグリオキサールと糖尿病病

与し，
急性肺損傷モデルを作成した．コントロール群，態との因果関係については良くわかっていない．我々は，

LPS-PBS 投与群，LPS-グレリン群の３群で，摂餌量，メチルグリオキサールが，TOR シグナルを活性化する

体重変化，気管支肺胞洗浄液（BALF）中の総細胞数，ことを明らかにした（Mol. Cell. Biol. 35: 1269-1280,

各種の炎症性サイトカインとケモカインの発現を検討

2015）．また，出芽酵母をモデル生物とした解析で，した．

TOR シグナルの不全株がメチルグリオキサールに対し【結果】て高い感受性を示すこと見出している．さらに，遺伝子

肥満急性肺損傷モデルにおいて，グレリン群は摂餌量

破壊株ライブラリーを用いたスクリーニングの結果，メの低下が抑制されていた．BALF 中の総細胞数と蛋白質

チルグリオキサール感受性株として 31 の遺伝子破壊株

濃度，肺組織中の IL-6, IL-1βの発現は，グレリン投与を 所 得 し て い る（J. Biol. Chem. 292: 15039-15048,

により増加が抑制された．迷走神経切断手術群および2017）．そこで，TOR シグナル制御機構の解明を目的

sham 手術群において，グレリン投与は肺組織中の炎症とし，出芽酵母での知見を利用してメチルグリオキサー性サイトカインの発現の亢進が抑制された．迷走神経切ルによる TOR シグナルの制御因子の同定を試みた．

断処置により，グレリン投与による摂餌量の改善は認め【方法・結果】
メチルグリオキサール感受性株に，酵母コレステロー

られなかった．

ルであるエルゴステロールの生合成に関わる遺伝子欠損【考察】
肥満条件下でグレリン投与は抗炎症効果を認めた．ま株（erg2Δおよび erg3Δ）が含まれていたこと，ならびた，迷走神経切断後でグレリンの抗炎症効果を認めたこに TOR の局在が細胞膜直下に観察されることから，細とから，薬理量のグレリン投与は直接的な抗炎症作用を胞膜脂質に着目して解析を進めた．その結果，エルゴス有することが示唆された．

テロール動態に影響を及ぼす Amphotericin B が TOR
シグナルの活性化を阻害することを見出した．
【考察】

解糖系代謝物による TOR シグナルの活性化
野村亘

グナルの活性制御機構に関与する可能性を示唆している（京都大学大学院農学研究科）【背景・目的】
栄養シグナルにおいて中心的な役割を果たしているタ
ンパク質リン酸化酵素 TOR (target of rapamycin) は，

116

これらのことは，細胞膜のステロール動態が TOR シ
ものと考えられた．

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

NFIA が褐色脂肪細胞分化を制御するメカニズム及び全身代謝への影響の解明
平

池

勇

雄
（東京大学大学院医学系研究科）

以上から NFIA は BAT 特異的遺伝子エンハンサーを活性化し，PPARγのエンハンサーへの結合を促進することで BAT の遺伝子プログラムを正に制御すると考えられた（Hiraike Y. et al. Nature Cell Biology. 2017）．
また最近，我々は NFIA の最もＣ末端側に位置する
17 アミノ酸残基がその転写活性に必須であることを見【背景】

出した．ヒト NFIC においては，Ｃ末端側に位置する

褐色脂肪組織（brown adipose tissue, BAT）はミト

proline rich domain がその転写活性に重要であるとのコンドリアにおける uncoupling protein-1 (UCP1) の報告があり，また NFIA と NFIC のＣ末端側の配列は非機能を介して熱を産生しエネルギーを消費する点におい常によく類似していた．ルシフェラーゼレポーター解て，主にエネルギーの貯蔵を担う白色脂肪組織（white析から，proline rich domain の中でも最もＣ末端側に

adipose tissue, WAT）とは対照的な組織である．リニ

位置する 17 アミノ酸残基（pro #3 domain）が転写活

エージトレーシングの結果から，BAT と WAT は発生学性に必須であると考えられた．実際，pro #3 domain

的な由来が異なる一方，BAT と骨格筋は共に Myf5 陽を欠損させた変異体（Δpro#3 mutant）は C2C12 筋性の前駆細胞から分化すると報告されている．また近年

芽細胞へ導入した際，PPARγの発現誘導作用および脂になって，ヒト成人においても機能的な BAT が存在す

肪細胞分化の促進作用を完全に失っていた．にも関わること，BAT の活性と BMI は負に相関することが示さらず，この変異体は骨格筋分化を抑制する作用は保持れており，BAT は肥満症，メタボリックシンドローム，

していた．従来，脂肪細胞と骨格筋細胞それぞれのマ

肥満２型糖尿病の新しい治療標的になり得るとして注目

スター転写因子である PPARγと MyoD はお互いにそのされている．

発現を抑制することで，運命決定の一意性を担保する【結果】ことが知られていたが，今回の結果により，NFIA が

我 々 は マ ウ ス BAT と WAT に 対 す る FAIRE-seq 解PPARγ依存的な経路と PPARγ非依存的な経路の双方を析と BAT 特異的オープンクロマチン領域のモチーフ解

用いて骨格筋分化を抑制することによって，脂肪細胞分

析から，BAT の分化を正に制御する因子として転写因化を担保する機能を有していることが判明した．RNA-子 NFIA (nuclear factor I-A) を 同 定 し た．NFIA は 脂seq, FAIRE-seq, ChIP-seq を統合した網羅的解析により，肪細胞分化のマスター転写因子 PPARγ (peroxisome

PPARγ非依存的経路において NFIA は Myod1 エンハン

proliferator-activated receptor γ) と BAT 特異的遺伝子

サー領域に直接結合して Myod1 およびその近傍から転エンハンサーにおいて高頻度に共局在（co-localize）し写され Myog の発現を正に制御する non-coding RNAていた．NFIA のエンハンサーへの結合は PPARγを含である DRReRNA の発現を抑制し，骨格筋分化のプログ

む主要転写因子群の結合に先行し，かつ NFIA の結合はラム全体を抑制することが判明した（Hiraike Y. et al.

PPARγの結合を促進した．また NFIA が結合した時点

Submitted）．

でその領域はオープンクロマチン構造やヒストン K27【今後の展望】のアセチル化といった活性型エンハンサーの特徴を呈

組織特異的 NFIA 欠損マウス，組織特異的 NFIA トラ

していた．NFIA の導入により筋芽細胞や白色脂肪細胞

ンスジェニックマウスの作出が完了し実験に着手しておは褐色脂肪細胞へ分化した．NFIA ノックアウトマウス

り，また NFIA 蛋白複合体の質量分析にも取り組んでいの BAT では BAT 特異的な遺伝子プログラムの全体が障る．NFIA の発現や活性を高めることを介して BAT を害されていた一方，骨格筋の遺伝子プログラムは逆に活活性化し，肥満症や肥満２型糖尿病の新しい治療法の開性化された．またヒト BAT においても WAT と比較し発に結実させることを目指している．

て NFIA は高発現しており，かつその発現は UCP1 を【文献】

含む BAT 特異的な遺伝子群の発現と正に相関していた．

１）Hiraike, Y., Waki, H., Yu, J., Nakamura, M.,

117

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

Miyake, K., Nagano, G., Nakaki, R., Suzuki, K.,

ナルには特異性が存在し，脂肪細胞褐色化抑制を調節し

Kobayashi, H., Yamamoto, S., Sun, W., Aoyama,ていると考えられる．そこで亜鉛シグナルの特異性が生

T., Hirota, Y., Ohno, H., Oki, K., Yoneda, M.,

じる機構を解明するために，ZIP13 の褐色化抑制に必White, AP., Tseng, YH., Cypess, AM., Larsen,

要な領域を同定した．さらに，この領域と結合する分子

TJ., Jespersen, NZ., Scheele, C., Tsutsumi, S.,が特異性を決定しているのではないかと仮定し，ZIP13

Aburatani, H., Yamauchi, T. & Kadowaki, T.:の褐色化抑制に必要な領域を用いて，yeast two hybrid

NFIA co-localizes with PPARγ and transcrip-(Y2H) を行い，結合する分子（結合分子）を３種類選定

tionally controls the brown fat gene program.

した．これらの分子をノックダウンや過剰発現すること

Nature Cell Biology. 2017; 19 (9): 1081-92.

により，ZIP13 と同じ挙動を示す分子を同定した．

２）Hiraike, Y., Waki, H., Miyake, K., Wada, T.,【考察】

Oguchi, M., Saito, K., Tsutsumi, S., Aburatani,

我々は，自身が開発したベージュ脂肪細胞分化系を

H., Yamauchi, T. & Kadowaki, T.: NFIA diﬀer-

用いて，ZIP13 の直接の標的分子を同定することがで

entially controls adipogenic and myogenic gene

きたが，ZIP13 の標的分子がどのように脂肪細胞褐色

program through distinct pathways to ensure

化を制御するかは今後の課題である．Zip13-KO マウス

adipocyte diﬀerentiation. Submitted.

では結合組織の脆弱性を示し，結合組織形成においては ZIP13 が必須の役割を果たすことから，ZIP13 によ亜鉛トランスポーター ZIP13 による脂肪細胞褐色化制御機構の解明
福中彩る肥満糖尿病治療法確立において，脂肪細胞特異的にZIP13 の機能を阻害することが重要である．ZIP13-標的分子の制御機構がベージュ脂肪細胞以外の細胞で保存子された機構かを明らかにすることで，ZIP13 のどのよ（群馬大学生体調節研究所）

うな機能を制御すればエーラス・ダンロス症候群を発症
せず肥満糖尿病のみを防げるかが判明する．これらの解【目的】
亜鉛シグナルの健康と病気への関与に注目が集まって明により，ZIP13 を利用した新しいコンセプトの抗肥
満糖尿病治療法の開発に繋がることが期待できる．

いるが，「亜鉛シグナルがどのように標的分子の発現・活性を制御するのか」という生命現象の重大な命題が解明できていない．本研究では，ベージュ脂肪細胞分化系を用いることで，ZIP13 の直接の標的分子を同定し，アディポネクチンの組織修復機構の解明
藤

島

裕

也
（大阪大学大学院医学系研究科）

ZIP13 の脂肪細胞褐色化における役割を明らかにすることを目的とし，肥満糖尿病の理解に貢献することを目
標とする．
【結果】

【背景】
脂肪細胞特異的分泌蛋白アディポネクチン（APN）

ベージュ脂肪細胞分化系を用いると，Zip13 欠損細胞

は，GPI アンカー型蛋白であるＴ-カドヘリン（T-cad）に ZIP13 を過剰発現させると，脂肪細胞褐色化は抑制への特異的な結合を介して心血管組織に集積し，抗動できるが，亜鉛輸送能を失った ZIP13 の変異体では脂脈硬化作用を発揮することを明らかとした（FASEB J

肪細胞褐色化抑制ができない．また，培地中に過剰量の2017）．また，その想定されるメカニズムとして，APN

亜鉛を添加した場合や，同じゴルジ体に局在し，ZIP13

が T-cad 依存的に血管内皮細胞のエクソソームの産生・と最も高い相同性を示す亜鉛トランスポーターを発現し分泌を増加させることを報告した（JCI Insight 2018）．

た場合には，
細胞質内の亜鉛量は増加するにも関わらず，

心血管イベント発症の背景として，慢性腎臓病（CKD）

脂肪細胞褐色化は抑制できない．ZIP13 による亜鉛シグの存在が重要視されている．APN 欠損マウスは 5/6 腎

11Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

摘出モデルで腎線維化が増悪することを過去に報告し発症機序の解明を目的とする．内分泌学的検査により得ているが，その詳細な作用機序は明らかでなかった．こられた術前耐糖能とβ細胞脱分化を含めた膵組織学的所のような APN の腎保護作用に関しても，その結合蛋白見と術後耐糖能の変化の関連を検討し，耐糖能障害の評

T-cad が重要な役割を担っている可能性がある．

価としてのβ細胞脱分化の有用性を確立する．また，膵

【方法・結果】

切除術前後で腸内細菌叢の解析，胆汁酸および短鎖脂肪

心血管組織に比して腎臓の T-cad 発現量は少ないも酸解析を実施し，膵切除後糖尿病発症との関連についての の， 野 生 型 マ ウ ス の 腎 臓 に お い て も T-cad お よ び

検討する．

APN 蛋白が検出された．動脈血管において APN/T-cad【方法】

はほぼ血管内皮に限局して存在しているが，興味深い①膵臓手術（膵頭十二指腸切除；PD および膵体尾部切除；ことに糸球体の血管内皮には T-cad は発現しておらず，

DP）予定の症例をリクルートし，文書による同意を取

APN も検出されなかった．蛍光免疫染色の結果，皮質得する．

尿細管周囲の微小血管に APN の集積が確認され，血管②術前の内分泌学的検査：外来受診時の血糖，HbA1c，周皮細胞（pericyte）マーカーである PDGFRβと共局

病歴聴取から糖尿病の有無を確認する．非糖尿病患者に在していた．

は 75g ブドウ糖負荷試験（OGTT），24 時間蓄尿におけ

腎虚血再灌流後の急性期では，毛細血管のバリア機

る C-peptide 測定，糖尿病患者にはグルカゴン負荷試験，能が破綻し permeability が亢進することで，炎症や尿24 時間蓄尿における C-peptide 測定を行い，内因性イ

細管壊死，線維化が惹起されることが知られている．

ンスリン分泌能，インスリン抵抗性，インクレチン分泌T-cad 欠損マウスでは，野生型マウスに比して，虚血再を評価する．

灌流 24 時間後の尿細管壊死所見が増悪しており，エバ③摘出膵を用いた免疫組織学的検査：手術で摘出した膵ンスブルー静注により定量した腎血管透過性も有意に亢

臓の正常部位から免疫染色用の組織ブロックを作成す進していた．

る．作成したブロックは直ちに包埋し，－80 度にて保【考察】存する．保存ブロックから凍結切片を作成し，蛍光免疫

Pericyte は毛細血管の支持細胞であり，脳や肺など染色により単位面積あたりの膵島面積，膵島面積あたり

全身に広く分布しているが，特に腎臓においては内皮細のインスリンおよびグルカゴン陽性細胞数，脱分化した胞と協調した腎血流の調整や，血管内皮バリア機能のβ細胞や他の内分泌細胞への形質転換を起こしたβ細胞維持など，重要な生理学的役割を担っている．Pericyteの割合を評価する．

における腎 APN/T-cad システムとして，①虚血時の血④術後の糖尿病発症率の評価：非糖尿病患者においては，管新生の促進を介する組織血流の維持，②内皮バリア機

術後の糖尿病発症率を評価する目的で，75g OGTT を能の維持，③エクソソーム産生亢進を介した組織修復な術直後および退院後６か月毎に実施する．

どを想定し，検討を進めている．

⑤周術期の内分泌学的検査および膵臓組織検査と術後耐糖能の変化との関連についての検討を行う．

β細胞の脱分化・形質転換と膵切除後糖尿病発症に
関する研究
坊内

⑥膵切除前および退院直前，６ヶ月後の糞便を採取，腸内細菌叢解析，胆汁酸および短鎖脂肪酸解析を実施する．
【結果】

良太郎
（国立国際医療研究センター研究所）

研究期間中に 123 名の膵臓切除術予定者が登録され，８名が除外基準に該当，最終的に 115 名が解析対象となった．術前に糖尿病を認めたものが 26 名，非糖尿病【目的】

が 86 名であった．非糖尿病例に 75gOGTT を実施した

膵臓手術により得られるヒト膵臓組織と周術期の糖代ところ正常型 38 例，境界型 39 例，糖尿病型９例であっ謝の臨床像の詳細な解析により，膵臓手術後の糖尿病のた．追跡可能であった非糖尿病 61 例（PD29 例，DP32

119

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成例）の糖尿病の２年累積発症率は PD4.0％ , DP48.1%

は膵切除後の糖尿病発症リスクが高かった．膵切除といと顕著な違いを認めた．75gOGTT での血糖曲線下面積

う糖尿病発症リスクが高い集団においては，インスリン（AUC）は術後６ヶ月で２群間に有意差を認めた（PD

分泌能や抵抗性の評価に加え，β細胞脱分化や腸内環境＜DP）．インスリンの AUC は PD 群で有意に高かった．

の変化を考慮した糖尿病発症予測モデルの確立が有用と

PD は術後に OGTT 後に GLP-1 分泌が急激に増加，PD考えられた．

と DP における GLP-1 の AUC に有意差を認めた．一方，GIP 分泌は両群とも術前後で有意な変化を認めなかった．
膵組織学的解析において，DP 患者はβ細胞面積，α糖代謝調節に関与するニューロメジン U (NMU)

細胞面積が PD 患者より有意に大きく，α/β比が高い傾の機能解析向を認めた．DP 患者における糖尿病発症の予測因子を

三

浦

綾

子
（宮崎大学医学部）検討したところ，β細胞面積およびα細胞面積は有意な予測因子であった．術前 NGT であった DP 症例のうち
術後糖尿病発症群と非発症群から年齢，性別，BMI を【背景】

マッチさせた６例ずつを抽出し，β細胞脱分化マーカー

ニューロメジンＵ（NMU）は，子宮筋収縮アッセイ

である Aldh1a3 陽性細胞の割合を比較したところ，術を用いて脊髄より発見された 25 アミノ酸残基からなる

後糖尿病発症群は非発症群より Aldh1a3 陽性細胞の割

神経ペプチドである（Minamino N, 1985）．ラット中合が高かった．

枢への NMU 投与は，摂食を抑制し，エネルギー代謝を

膵切除後の糖尿病発症リスクが PD および DP で大き亢進する（Nakazato M, 2000）．NMU KO マウスは，

く異なる原因の解明を目的とし，各術式の術前および術過食を伴う肥満を呈するとともに，エネルギー代謝が直後，６ヶ月，１年後の糞便を採取，腸内細菌叢解析を低下している（Hanada R, 2004）．ヒトでは，チェコ実施した．DP 症例では術前後で腸内細菌叢の大きな変の家系で不活性な NMU を生産する Arg165Trp 変異が化は認めなかったものの，PD 症例では術直後（２週か発見されており，小児肥満及び高トリグリセリド血症とら４週後）から腸内細菌叢の劇的な変化を認め，その関連する．NMU 受容体（NMUR）はＧタンパク質共役

変化は６ヶ月後まで維持された．４大門（Firmicutes,型受容体であり，主に腸管などの末梢組織に NMUR1，

Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria） の 中中枢神経系に NMUR2 が発現している．NMUR はタン

では，Proteobacteria の割合が PD 術後に劇的に増加しパク質サブクラスのうち Gq と Gi の両方に共役するが，ていた．また，術後の腸内細菌の多様性が保たれる症例

NMUR1 は Gq を，NMUR2 は Gi を主として選択する．

ほど，インスリン抵抗性が改善することを見いだした．

ヒト膵β細胞に NMUR1 は発現し，NMU は高グルコー

さらに，糞便中の短鎖脂肪酸解析においては，PD におス刺激時のインスリン分泌（GSIS）を抑制する可能性

いて術後にいくつかの短鎖脂肪酸レベルが上昇することが示唆されている．

を明らかにした．便中胆汁酸濃度については解析中であ

【目的】

る．

NMU のインスリン分泌調節作用を in vivo および in【考察】

vitro にて検討し，肥満や糖尿病の病態との関連を解析

膵切除後の糖尿病発症率は術式により大きな違いがあする．

り（PD＜DP），PD での発症率の低さには，①腸管イン【方法】

クレチン（GLP1）分泌の変化，②腸内細菌叢の変化，・ミトコンドリア機能解析③短鎖脂肪酸増加などが関与している可能性が示唆され・ラットへの NMU 末梢投与後の電気活動の測定

た．加えてβ細胞の脱分化は NGT の段階でも一部の症【結果】例に認められ，β細胞脱分化をすでに起こしている症例

120

NMU と NMUR1 は 膵 β 細 胞 に も 発 現 し，NMU とFront Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

NMUR1 アゴニストは in vivo（マウス）と in vitro（単離膵島とβ細胞由来 MIN6 細胞）のいずれでもグルコー
ス刺激によるインスリン分泌を抑制した．NMU の作用
は，siNmu と NMU 中和抗体で消失した．細胞内 Ca2＋

Se 含有タンパク質セレノプロテインＰを標的とした糖尿病治療法の開発
三田雄一郎（宮崎大学医学部）

イメージング解析から，NMU はβ細胞への Ca2＋ 流入を減少させ，インスリン分泌を抑制することを立証した．さらに，NMU は，ミトコンドリアのカルシウムの【目的】

取り込み及びミトコンドリアの膜電位を阻害しており，血漿セレン (Se) 含有タンパク質である Selenoprotein

細胞内 ATP の産生も抑制した．また，NMU はミトコ

P (SeP) は糖尿病患者で血中濃度が増加し，ヒト由来

ンドリアの呼吸商 OCR を優位に抑制しており，ROS 産

SeP を投与したマウスでは耐糖能異常，インスリン分泌生を亢進した．よって，NMU のβ細胞への暴露はミト不全が引き起こされる．この SeP によって引き起こさコンドリア機能を低下させることが示唆された．また，れる糖尿病態は SeP の組織への取り込みを阻害する中空腹時に，NMU の発現は腸管と迷走神経節で増加し，和抗体を投与することで改善できることから，SeP が糖

NMUR1 発現は迷走神経節で増加した．NMU のラット

尿病を悪化させる因子であり，糖尿病の新たな治療標的への末梢投与は，迷走神経求心線維の電気活動を亢進し，になると考えられている．

視床下部室傍核の c-fos 発現を増加した．NMU は，空Se はシステインの硫黄が Se に置き換わったセレノ

腹時に自律神経求心路を活性化してインスリン分泌を抑

システイン (Sec) という形でタンパク質中に存在してい制するデクレチン作用を示すペプチドの可能性が示唆さる．Sec は通常では UGA コドンにコードされており，れた．

3ʼUTR に Sec 挿入配列（SECIS）と呼ばれる配列が存【考察】在したときのみ UGA コドンへ Sec を挿入することがNMU と NMUR1 は膵β細胞に発現し，オートクライ

可能になるという特殊な翻訳メカニズムを有している．

ン・パラクライン作用により，インスリン分泌を抑制しSECIS 配列を持つ mRNA はこれまでに 25 種類しか発ていることを報告した（BBRC, 2017）．

見されていないことに加え，SECIS 配列は mRNA ごと

ミトコンドリア機能を低下させ，インスリン分泌を抑に異なることが分かっており，SECIS を標的にする治制する可能性が示唆された．また，空腹時には神経を介療法を確立することで SeP に対する特異的な治療法をするデクレチン作用の両者の機序を介して，インスリン確立することができるのではないかと考えられる．

分泌を制御し，糖代謝調節に機能していると考えられる．

【方法】
上記の仮説のもと，SeP mRNA の SECIS 及び 3ʼUTR

Weidong, Zhang., Hideyuki, Sakoda., Ayako, Miura.,配列を標的に in silico で解析を行い SECIS 制御因子のKoichiro, Shimizu., Kenji, Mori., Mikiya, Miyazato.,探査を行った．見つかった新規遺伝子を SeP が発現しKentaro, Takayama., Yoshio, Hayashi. & Masamitsu,て い る HepG2 細 胞 に 過 剰 発 現 さ せ，SeP の mRNA，

Nakazato.: Neuromedin U suppresses glucose-

タンパク質量への影響を検証した．

stimulated insulin secretion in pancreatic β cells.

【結果】

Biochem Biophys Res Commun. 2017 Nov 4; 493(1):677-683. doi: 10. 1016/j. bbrc. 2017. 08. 132.

in silico の解析の結果，SECIS に影響を与える可能性のある新規の noncoding RNA である SeP-ncRNA が同定された．そこで，SeP-ncRNA の機能解析を行った．
は じ め に，SeP を 発 現 し て い る HepG2 細 胞 に SeP-

ncRNA を過剰発現させた．その結果，SeP mRNA 量に変化は見られなかったが，SeP タンパク質量が減少した．
他の Sec 含有タンパク質の mRNA 量・タンパク質量は121

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

変化しなかったため，SeP-ncRNA は SeP 特異的に作用

いくつかの臨床議案に関し系統的レビューを行いすると考えられた．次に，SeP タンパク質の減少メカニ

Diabetes Care などの医学雑誌に報告した 10－12）．

ズムを解析するため，SeP mRNA の転写から翻訳のど

また，国際メタアナリシストの一員として GBD のの段階が SeP-ncRNA によって阻害されているかを検討

解析に協力しコラボレーターとして活動した１－９）．

した．SeP mRNA の核外移行には SeP-ncRNA の有無

２）システマティックレビューの自動化を実現させる．

によって差が見られなかったが，SeP mRNA に結合す

PICORON-EBM (PICO and Risk Of bias Navi-

るリボソーム量及び SECIS に結合する SBP2 の減少がgator for Evidence Based Medicine) の開発を行っ確認され，翻訳段階が阻害されていることが示唆された．

た 13）．PICORON はシステマティックレビューの【結語】

Risk of Bias, PICO を評価する際に頻用される単語

今 回 新 た に 見 つ か っ た SeP-ncRNA は SBP2 と SePを簡単に素早く自動ハイライトし，レビュー省力

mRNA の SECIS の結合を阻害する事によって SeP の化を目的としたソフトである．研究者の興味に合翻訳を抑制する新規の noncoding RNA である．SeP-

わせた単語の自由な追加や削除も可能である．詳ncRNASeP 高値の患者に対する糖尿病の新たな治療標

細はホームページを参照されたい．http://www.

的になる可能性が高い．

picoron.com/index.html
３）人工知能による臨床エビデンスの統合と体系化を行う．世界のビックデータを，人工知能やテキストマ

ネットワークメタアナリシスによる糖尿病の最良の治療選択エビデンスの確立
山

田

朋

英

（マンチェスター大学コンピューターサイエンス学科）

イニングの技術を用い解析する．これはプレシジョ
ンメディシンの実現に寄与する．
T-Library の開発を行った 14）．T-Library は病歴要約などから自動でデータを分割抽出し臨床研究の解析の際のデータ抽出省力化を目的としたソフトである，詳細はホームページを参照されたい．

【目的】
本研究の目的は以下の４つである．
１）重要な臨床議案に関し質の高いネットワークメタア

http://www.picoron.com/tlibrary/index.html４）AI を用い，現場の医療者の作業の省力化や効率化，
日本の医療システムの維持と改善を目指す．

ナリシスを行い，臨床ガイドライン構築に貢献する．

現在，国内外の人工知能やテキストマイニングを

２）システマティックレビューの自動化を実現させる．

専門とする企業と提携し，現在の医療の抱える問題

３）人工知能による臨床エビデンスの統合と体系化を行点の解決に向けた多くの研究開発を進めている．

う．世界のビックデータを，人工知能やテキストマ【Publications】

イニングの技術を用い解析する．これはプレシジョ

１）GBD 2016 Neurology Collaborators. Global,

ンメディシンの実現に寄与する．
４）AI を用い，現場の医療者の作業の省力化や効率化，
日本の医療システムの維持と改善を目指す．
この４つの研究は最終的に目の前の患者にメリットをもたらす．かつ，現場の医療者にもメリットがある．
人間はより生産的かつ AI により代替不可能な作業に

regional, and national burden of neurologicaldisorders, 1990-2016: a systematic analysis for
the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurol. 2019 May; 18(5): 459-480.
２）GBD 2016 Stroke Collaborators. Global, regional, and national burden of stroke, 1990-2016:

多くの時間を割くことが出来るようになるだろう．

a systematic analysis for the Global Burden of【成果】

Disease Study 2016. Lancet Neurol. 2019 May;

１）重要な臨床議案に関し質の高いネットワークメタア

18(5): 439-458.

ナリシスを行い，臨床ガイドライン構築に貢献する．

122３）GBD 2017 SDG Collaborators. Measuring

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

progress from 1990 to 2017 and projecting

Study 2017. Lancet. 2018 Nov 10; 392(10159):

attainment to 2030 of the health-related Sustain-

1859-1922.

able Development Goals for 195 countries and９）GBD 2016 Alcohol Collaborators. Alcohol use

territories: a systematic analysis for the Global

and burden for 195 countries and territories,

Burden of Disease Study 2017. Lancet. 2018

1990-2016: a systematic analysis for the Global

Nov 10; 392(10159): 2091-2138.

Burden of Disease Study 2016. Lancet. 2018

４）GBD 2017 Population and Fertility Collaborators.
Population and fertility by age and sex for 195

Sep 22; 392(10152): 1015-1035. doi: 10.1016/
S0140-6736 (18) 31310-2.

countries and territories, 1950-2017: a system-₁₀）Yamada, T., Kamata, R., Ishinohachi, K.,

atic analysis for the Global Burden of Disease

Shojima, N., Ananiadou, S., Nom, H., Yamau-

Study 2017. Lancet. 2018 Nov 10; 392(10159):

chi, T. & Kadowaki, T.: Biosimilar vs originator

1995-2051.

insulins: Systematic review and meta-analysis.

５）GBD 2017 Risk Factor Collaborators. Global,

Diabetes Obes Metab. 2018; 20(7): 1787-1792.

regional, and national comparative risk assess-₁₁）Yamada, T., Shojima, N., Noma, H., Yamauchi,

ment of 84 behavioural, environmental and

T. & Kadowaki, T.: Sodium-glucose co-trans-

occupational, and metabolic risks or clusters

porter-2 inhibitors as add-on therapy to insulinof risks for 195 countries and territories,

for type 1 diabetes mellitus: Systematic review

1990-2017: a systematic analysis for the Global

and meta-analysis of randomized controlled

Burden of Disease Study 2017. Lancet. 2018

trials. Diabetes Obes Metab. 2018 Jul; 20(7):Nov 10; 392(10159): 1923-1994.

1755-1761.

６）GBD 2017 Disease and Injury Incidence and₁₂）Yamada, T., Shojima, N., Noma, H., Yamauchi,

Prevalence Collaborators. Global, regional, and

T. & Kadowaki, T.: Weekly Versus Daily Dipep-

national incidence, prevalence, and years lived

tidyl Peptidase 4 Inhibitor Therapy for Type 2

with disability for 354 diseases and injuries

Diabetes: Systematic Review and Meta-analysis.

for 195 countries and territories, 1990-2017:

Diabetes Care. 2018 Apr; 41(4): e52-e55.

a systematic analysis for the Global Burden₁₃）Yamada, T., Kondo, Y. & Momosaki R.: 2019.

of Disease Study 2017. Lancet. 2018 Nov 10;

PICO and Risk Of bias Navigator for Evidence392(10159): 1789-1858.

Based Medicine. PeerJ Preprints 7: e27684v1

７）GBD 2017 Mortality Collaborators. Global,

₁₄）Yamada, T., Kondo, Y. & Momosaki, R.: 2019.

regional, and national age-sex-speciﬁc mortal-

Automated data extraction software for medical

ity and life expectancy, 1950-2017: a system-summary using text mining (T-Library). PeerJ

atic analysis for the Global Burden of Disease

Preprints 7: e27685v1

Study 2017. Lancet. 2018 Nov 10; 392(10159):
1684-1735.
８）GBD 2017 DALYs and HALE Collaborators.
Global, regional, and national disability-adjusted
life-years (DALYs) for 359 diseases and injuries
and healthy life expectancy (HALE) for 195
countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease123

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

Depletion of CD206 M2-like macrophages
induces proliferation of adipocyte progenitors and improves insulin sensitivity
Allah Nawaz

the conditional and partial depletion of CD206 M2like macrophages regulates the cold-induced browning of ingWAT, however, remains unknown. We also
examined the role of CD206 M2-like macrophages in
the cold-induced browning of WAT and found that

（富山大学医学部）

partial depletion of CD206 M2-like macrophagescaused an increase in the number of beige

Previous reports suggested that adipose tissue

progenitors and also enhanced their proliferation

macrophages are involved in main-taining insulin

in ingWAT in response to cold. Thus, we concluded

sensitivity in adipocytes along with improvement inthat CD206 M2-like macrophages inhibit the

metabolic genes. Nonetheless, it is largely unknown

proliferation of white and beige progenitors. (ref 1

how depletion of M2-like macrophages regulates

and 2)

insulin sensitivity and adipocyte progenitor (AP)

【Reference】

proliferation. To understand the role of M2-like

１）Nawaz, A., Aminuddin, A., Kado, T., Takikawa,

macrophages in white adipose tissue (WAT), we

A., Yamamoto, S., Tsuneyama, K., Igarashi, Y.,

generated CD206DTR mice based on transgenic

Ikutani, M., Nishida, Y., Nagai, Y., Takatsu, K.,

expression of diphtheria toxin receptor under the

Imura, J., Sasahara, M., Okaza-ki, Y., Ueki, K.,

control of the CD206(+) promoter to specificallyOkamura, T., Tokuyama, K., Ando, A., Matsu-

deplete CD206 M2-like macrophages. Partial

moto, M., Mori, H., Nakagawa, T., Kobayashi,

depletion of CD206 M2-like macrophages resulted inN., Saeki, K., Usui, I., Fujisaka, S. & Tobe, K.:

the generation of smaller adipo-cytes, upregulated

CD206+ M2-like macro-phages regulate system-

expression of metabolically favorable genes andic glucose metabolism by inhibiting proliferation

enhanced insulin sensitivity in both chow andof adipo-cyte progenitors. Nature Communica-

high-fat diet-fed CD206-reduced mice. In vivo andtions. 2017 Aug 18; (1): 286.

in vitro studies revealed that Tgfβ1, abundantly２）Igarashi, Y., Nawaz, A., Kado, T., Bilal, M.,

expressed in CD206 M2-like macro-phages, regulate

Kuwano, T., Yamamoto, S., Sasahara, M., Jiux-

AP diﬀerentiation and proliferation. Flow cytometry

iang, X., Inujima, A., Koizumi, K., Imura, J.,

analysis revealed that the number of APs was

Shibahara, N., Usui, I., Fujisaka, S. & Tobe,

increased and cyclin gene expression levels in theK.: Partial depletion of CD206-positive M2-

AP fraction were up-regulated. To validate thislike macrophages induces proliferation of beige

hypothesis, we generated geneti-cally engineered

progenitors and enhances browning after cold

mice in which CD206 specific Tgfβ1 was knocked

stimulation. Scientific Reports. 2018 Oct 1; (1):out after tamoxi-fen treatment. Increased number

14567.

of APs and smaller adipocytes were observed in theCD206 speciﬁc Tgfβ1 knockout mice, suggesting that
CD206 cell-speciﬁc deletion of Tgfβ1 resulted in theenhanced proliferation of AP. Previous studies had
shown that type 2 cytokines and M2 macrophages
induce cold-induced browning in inguinal WAT(ingWAT) by producing catecholamines. Exactly how

124

酵素情報

自己免疫疾患におけるTyk2 の役割
免疫疾患領域における創薬標的としてのRIPK1
創薬標的としてのNIK

で多彩な生理機能に寄与している．

【序】
Nuclear factor-κB (NF-κB) は，広範な組織・細胞に

本稿では，免疫応答に重要な役割を果たしている非古発現する転写因子であり，炎症，免疫応答，細胞増殖

典的 NF-κB 経路に着目し，その中心を担う分子の一つ

およびアポトーシスといった多様な生物学的応答におである NF-κB-inducing kinase (NIK) に焦点をあてた．

いて重要な役割を担っている１,２）．NF-κB が寄与するシ

以下，NIK の機能，疾患との関連および創薬標的としグナルには，古典的経路および非古典的経路が存在すての可能性について概説する．

る．古典的経路は，tumor necrosis factor (TNF) αやinterleukin-1βといった炎症性サイトカインや，グラム陰【NIK の機能】性桿菌の内毒素リポポリサッカライドに代表される病原体

NIK は，MAP kinase kinase kinase (MAP3K) フ ァ

関連分子パターン（PAMPs）の刺激によって活性化され，

ミ リ ー に 属 す る セ リ ン ス レ オ ニ ン キ ナ ー ゼ で あ り，

NF-κB p50 と p65 から成るヘテロダイマーを介して転TNF receptor を介して NF-κB 活性化に関与するタン

写調節に寄与する．一方で，非古典的経路は，B cell

パクとして同定された３）．その構造は，Ｎ 末端に TNF

activating factor belonging to the TNF family (BAFF)，

receptor-associated factor (TRAF) 3 結 合 部 位， 中 央

CD40 リガンド，TNF-like weak inducer of apoptosis

部にキナーゼドメイン，そして C 末端に下流分子であ(TWEAK) あるいは receptor activator of NF-κB ligand

る inhibitory-κB kinase (IKK) αとの結合部位を有して(RANKL) などの TNF superfamily (TNFSF) 分子の刺激いる１）．NIK を介した非古典的 NF-κB 経路のシグナルによって活性化され，NF-κB p52 と Rel B から成るヘ伝達の概略を図１に示す．定常状態において，NIK は

テロダイマーを介して標的遺伝子の転写を調節すること

TRAF2/3 と cellular inhibitor of apoptosis proteins(b)࢙ܻ࣎

(a)ఈ৙য়ସ

TRAF3

TRAF3

Ub

NIK

TRAF2

NIK

cIAP

NIK

ϕϫτΠλʖϞ
෾մ

RelB

NIK

IKKɲ

RelB

P52

P100

TRAF2

҈ఈԿ

P

P

ඬదҪఽࢢ

ඉ‫ݻ‬ఱదNFͲʃB‫ܨ‬࿑
図ਦ11 非古典的NF-κB 経路 εήψϩ֕ྲྀਦ
シグナル概略図125

創薬標的としての NIK(cIAP) の複合体に結合し，ユビキチンプロテアソーム【NIK の創薬標的としての可能性】

系の分解を受けることで，その発現レベルが低く維持さ

非古典的 NF-κB 経路の中心を担う NIK もまた，創薬れている（図１a）．一方で，TNFSF 分子の刺激が入っ標的分子としての可能性が示唆されてきたが，NIK 阻た場合には，NIK と TRAF3 が乖離することでプロテ害剤の創製や開発に関する報告はこれまでほとんど例がアソーム分解が解除され，NIK が安定化する（図１b）．

なかった．その理由の一つとして，他のキナーゼに対その結果，NIK 下流の IKKαのリン酸化と，それに続くする選択性の担保が困難であったためであると考えられ

p100 のプロセッシングが誘導され，最終的には NF-κB

る．しかしながら，最近，Genentech 社から選択的な

p52 と RelB のヘテロダイマーが標的遺伝子の転写を調NIK 阻害活性を有する低分子化合物 SMI1 が報告され節する１,２）．

た５）．SMI1 は NIK に対する Ki 値が 0.23 nM と強力で免疫応答における NIK の役割については，NIK 遺伝

あり，222 種類の他のキナーゼに対して高い選択性を示

子欠損マウスや変異患者の解析から明らかになってきした．Ｂ細胞やＴ細胞を用いた実験で非古典的 NF-κB

た．NIK 遺伝子変異あるいは欠損マウスでは，胸腺お経路の活性化を抑制することに加え，ループス腎炎の動よび脾臓の構造異常や二次リンパ組織の形成不全が認め物モデルである NZB/WF1 マウスにおいて腎症状およられ，末梢血のＢ細胞数低下とそれに伴う免疫応答のび生存率の改善が認められている．

低下が起こる．また，NIK 遺伝子変異患者においても，

現時点では NIK 阻害剤による病態改善報告は非臨床

末梢血のＢ細胞数，濾胞性ヘルパーＴ細胞数および NK

情報にとどまっているが，NIK を標的とするアプロー

細胞数の低下や，低ガンマグロブリン血症を認め，そのチは，従来の単一リガンドや単一受容体を標的とした結果，免疫不全や易感染状態となることが知られてい場合と比べ，より強力な病態改善効果を発揮する可能性

る４）．これらの解析から NIK は免疫応答に必須の因子があると考えられる．近い将来，NIK 阻害剤のヒトでであり，自己免疫疾患を中心とした様々な疾患の病態形の有効性が確認され，自己免疫疾患や慢性炎症疾患，あ成に寄与していると考えられている．

るいは血液腫瘍等の新たな治療薬となることが期待される．

【疾患との関連】
代表的な自己免疫疾患の一つである全身性エリテマ【参考文献】

ト ー デ ス（SLE） で は，BAFF や TWEAK が 非 古 典 的

１）Paul, A. et al.: Inhibitory-κB Kinase (IKK)α and

NF-κB 経路を活性化し，自己抗体の産生や腎炎の発症

Nuclear Factor-κB (NFκB)-Inducing Kinase (NIK)を惹起することが示唆されている．また関節リウマチでas Anti-Cancer Drug Targets. Cells ., 7, 176

は，RANKL が非古典的 NF-κB 経路を活性化し，破骨(2018).

細胞形成を促進する２）．さらに多発性骨髄腫をはじめと２）Sun, S.C.: The non-canonical NF-κB pathway

したＢ細胞系の血液腫瘍では，NIK の過剰発現による

in immunity and inﬂammation. Nat. Rev. Immu-

非古典的 NF-κB 経路の異常な活性化が生じていること

nol., 17, 545 (2017).

も知られている１）．このような背景から，非古典的 NF-

３）Malinin, N.L. et al.: MAP3K-related kinase in-κB 経路は従来から創薬標的として着目され，TNFSF

volved in NF-κB induction by TNF, CD95 and分子やその受容体を標的とした治療薬の開発が進められ

IL-1. Nature., 385, 540 (1997).

てきた．すでに抗 BAFF 抗体ベリムマブは SLE を適応

４）Willmann, K.L. et al.: Biallelic loss-of-function

として上市され，現在も血管炎，シェーグレン症候群おmutation in NIK causes a primary immunode-

よび筋炎等で臨床試験が進行中である．また PEG 化抗

ficiency with multifaceted aberrant lymphoid

CD40 リガンド抗体ダピロリズマブも SLE を適応としimmunity. Nat Commun., 5, 5360 (2014).

て第Ⅱ相臨床試験の段階にある．

５）Brightbill, H.D. et al.: NF-κB inducing kinase isa therapeutic target for systemic lupus erythe-126

創薬標的としての NIK

matosus. Nat. Commun., 9, 179 (2018).
（田辺三菱製薬株式会社
ニット

免疫炎症創薬ユ

創薬本部

免疫炎症創薬ユ河野佑子）（田辺三菱製薬株式会社
ニット

創薬本部

柳田哲哉）

127

酵素情報

自己免疫疾患におけるTyk2 の役割
B (Btk)
マラリア原虫から分泌されるフシギな酵素たち【宿主改変のカギとなる酵素 Plasmepsin V】【はじめに】
結核，HIV と並んで世界三大感染症に数えられるマ

ハマダラカの吸血により生体に侵入したマラリア原虫

ラリアは，アピコンプレックス門の Plasmodium に属は，肝臓を経由した後，赤血球へ寄生する．赤血球でのするマラリア原虫により引き起こされる．世界保健機構

増殖は，血球への侵入と破壊が繰り返される為，ヒトに（WHO）の報告によれば，本原虫による感染は世界 87

発熱や貧血といった症状を引き起こす．酸素運搬に特化

カ国以上で認められ，本感染症に毎年 2 億人以上が罹した赤血球には，核はもとより，小胞体やゴルジ体など患し，約 44 万人が死亡していると推計されている１）．

のタンパク質輸送経路が存在しない．このような過酷なヒトに感染するマラリア原虫のうち，公衆衛生上環境で生き抜くため，原虫は赤血球内へと様々なタンパ

最 も 危 険 な 病 原 体 の 一 つ が， 熱 帯 熱 マ ラ リ ア 原 虫

ク質を分泌し，独自のタンパク質輸送系を構築すること（Plasmodium falciparum）である．本原虫には，寄生で，あたかも有核細胞のように赤血球を作り替え，必要した赤血球内に様々なタンパク質を送り込むことで，血な栄養素の取り込みなどを行う ( 図１)．

球の構造や性質を内部から作り替える独自の機構（宿主

原虫が赤血球へ送り込むタンパク質の多くは，そのリモデリング機構）が存在する２）．本稿では，意外と知Ｎ末端に，PEXEL/HT (Plasmodium Export Elements/

られていない熱帯熱マラリア原虫による宿主リモデリン

Host Targeting) モチーフと呼ばれる５残基からなる特グ機構を題材に，この機構に関わる酵素について，最新徴的なアミノ配列 (RxLx(D/E/Q)) をもつ．この配列をもの知見に触れながら概説したい．

つタンパク質は，原虫の小胞体に存在する Plasmepsin
V とよばれる酵素により開裂され，Ｎ末端がアセチル化

図１

12

PEXEL/HT タンパク質の分泌機構

マラリア原虫から分泌されるフシギな酵素たちされた後，タンパク質透過装置（トランスロコン）を構に関与することが示唆された７）．FIKK キナーゼの多介して赤血球へ分泌される３）．Plasmepsin は，マラリ

くは，赤血球での増殖に必ずしも必要ではないが，特定

ア原虫にのみ存在すると考えられているアスパラギンの FIKK キナーゼは，原虫のベクター内増殖（ハマダラ酸プロテアーゼであり，現在迄に少なくとも 10 種類

カ体内での増殖ステージ）に必須であるという報告もあが同定されている．なかでも，Plasmepsin V は，宿主

り８），創薬ターゲットとしての FIKK キナーゼの是非は，リモデリング機構のカギを担う分子であり，赤血球内

まだ議論の余地がある．

での原虫増殖に必須であることが示されている４）．また，Plasmepsin V の酵素活性を阻害する特異的薬剤を● Epoxide hydrolase（エポキシド加水分解酵素）用いた研究により，本酵素のプロテアーゼ活性が分泌タ

エポキシエイコサトリエン酸（EETs）は，主に血管ンパク質の輸送に不可欠であることも示されている５）．

内皮細胞により産生され，血管拡張作用や抗炎症作用

Plasmepsin V は哺乳類には存在せず，マラリア原虫にを有する生理活性物質であり，エポキシド加水分解酵のみ存在する酵素であることから，有望な創薬ターゲッ

素（EHs）により分解されることで活性を失う．マラリ

トであると考えられている．

ア原虫感染において，EETs がどのような役割を担っているかは定かではないが，原虫から赤血球へ分泌される【赤血球へと送り込まれる酵素たち】

タンパク質の中には，赤血球表面に提示され，血液中の上述の機構により赤血球へと分泌されるタンパク

EETs を分解する EHs が存在することが，近年報告され

質 は，300 ～ 400 種 類 に も 上 る と さ れ て い る が， 赤ている９）．これらの EHs は，感染局所の炎症により誘血球を用いた研究の技術的な難しさや，ゲノム特性

導される EETs を分解し，血管拡張を抑えることで，正（Plasmodium falciparum は 約 80 ％ と も い わ れ る AT

常な血流を遮断し，熱帯熱マラリアの重症化に寄与してリッチなゲノムをもつ）による研究障壁も相まって，こいることが示唆されている．

れら分泌タンパク質の生理活性に関する研究はほとんど

これらの EHs には，プロテアーゼやリパーゼなどに行われていない．ここでは，酵素活性をもつと報告され共通してみられるα/β hydrolase（α/β加水分解酵素）

た代表的な分泌タンパク質について紹介する．

ドメインが存在する．分泌タンパク質の網羅的同定を試みた最新の研究により，このドメインを有し，赤血球膜● FIKK kinase（FIKK キナーゼ）

表面へは輸送されない分泌タンパク質も新たに同定され

FIKK キナーゼは，アピコンプレクサにのみ存在するている 10）．このタンパク質の酵素活性については未だタンパク質リン酸化酵素（Ser/Thr キナーゼ）であり，確認されてはいないものの，赤血球内で脂質の加水分解

2004 年に初めて発見された．その名前は，特徴的なを担う分泌型リパーゼだと考えられている 9,10）．いずれ

アミノ酸モチーフ（Phe-Ile-Lys-Lys(FIKK)）に由来し，の分泌タンパク質も，宿主リモデリング機構への関与がその酵素活性や基質は，2013 年に初めて生化学的に証示唆されているが，赤血球内における原虫増殖には必須

明されるまで不明であった．

でないことから，創薬ターゲットとしては不向きである

熱帯熱マラリア原虫には，FIKK キナーゼが約 20 種と考えられる．

確認されており，そのうち 15 種以上が赤血球へと分泌されることが知られている．組み換えタンパク質を用い【おわりに】

た研究により，初めて酵素活性をもつことが証明され本稿では，熱帯熱マラリア原虫による宿主リモデリン

た FIKK4.1 は，赤血球骨格の一因子である dematin をグ機構に焦点をあて，この機構に関わる幾つかの代表的リン酸化することで，赤血球膜の機械的安定性を変えな酵素について紹介した．しかし，元来，マラリア原虫ると考えられている６）．その後，FIKK4.2，FIKK7.1，

はハマダラカとヒトの間を行き来する非常に複雑な生活

FIKK12 をコードする遺伝子を欠損した組換え原虫を用環をもっており，創薬の視点に立ち戻れば，赤血球内増いた研究からも，これらの酵素が，宿主リモデリング機

殖のみならず，蚊体内での発育や，肝臓での増殖に関わ129マラリア原虫から分泌されるフシギな酵素たち

る酵素も非常に魅力的な創薬ターゲットといえる．これ

erythrocyte cytoskeletal protein, is a substrate

らいずれの増殖ステージにも必須な酵素が，創薬ター

for a recombinant FIKK kinase from Plasmo-

ゲットとしては理想であり，その点で，フェノタイプド

dium falciparum. Mol. Biochm. Parasitol., 191,

ラッグディスカバリー（PDD）による創薬アプローチ

20-23 (2013).

が最も合理的な創薬手法であるといえる．

７）Osman, K.T. et al.: Biochemical characterization

マラリアは，依然アフリカにおける幼児の死亡主要

of FIKK8 – A unique protein kinase from the因の一つである．本感染症の治療は，アルテミシニン

malaria parasite Plasmodium falciparum and

誘導体多剤併用療法（Artemisinin-based Combination

other apicomplexans. Mol. Biochem. Parasitol.,

Therapy: ACT）が最も効果的とされているが，薬剤耐201, 85-89 (2015).

性株の蔓延も各地で報告されており，未だマラリア撲滅

８）Jaijyan, D.K. et al.: A novel FIKK kinase regu-

への道筋は見えない．一方，近年のグローバルヘルスの

lates the development of mosquito and liver

発展により，多くの企業が，マラリアや顧みられない熱stages of the malaria. Sci Rep., 6, 39285 (2016).

帯病（Neglected Tropical Diseases）といった感染症

９）Spillman, N.J. et al.: Exported epoxide hydro-に対する薬剤開発に着手している．このような異なる化

lases modulate erythrocyte vasoactive lipids

合物ライブラリーを基に，独立してスクリーニングを行

during Plasmodium falciparum infection. mBio.,

う取り組みは，作用機序の異なる薬剤の発見，開発へと

7, e01538-16 (2016).

つながり，現行の多剤併用療法の選択肢を広げ，耐性原10）Takano, R. et al.: A high-resolution map of SBP1虫の出現を最小限に抑えることを可能にする．複数の治interactomes in Plasmodium falciparum-infected

療薬の選択肢をもつことが，マラリア制圧の第一歩であerythrocytes. iScience, 19, 703-714 (2019).

り，今後の薬剤開発の取り組みに期待したい．
（田辺三菱製薬株式会社【参考文献】高野量）

１）World Health Organization: World malaria re-（田辺三菱製薬株式会社

port 2018: https://www.who.int/malaria/publications/world-malaria-report-2018/en/. Accessedat Nov. 4th, 2019.
２）Maier, A.G. et al.: Malaria parasite proteins that
remodel the host erythrocyte. Nat. Rev. Micro-

biol., 7, 341-354 (2009).
３）Russo, I. et al.: Plasmepsin V licenses Plasmodium proteins for export into the host erythrocyte.

Nature., 463, 632-636 (2010).
４）Boonyalai, N. et al.: Essentiality of Plasmodium

falciparum plasmepsin V. PLoS One ., 13,e0207621 (2018).
５）Sleebs, B.E. et al.: Inhibition of plasmepsin V
activity demonstrates its essential role in protein
export, PfEMP1 display, and survival of malaria
parasites. PLoS Biol., 12, e1001897 (2014).
６）Brandt, G.T. & Bailey, S.: Dematin, a human

130

三由文彦）

創薬本部

創薬基盤研究所

創薬本部

創薬基盤研究所

酵素情報

イによる

自2 の役割 (Ribonuclease H, RNase H)
リボヌクレアーゼH変
はじめに

RNA のリボース部分と相互作用している．両ドメイン

Ribonuclease H (RNase H) は，RNA を分解するリは結合ドメインと呼ばれるドメインにより連結されておボヌクレアーゼスーパーファミリーの中でも RNA を内り，さらに N 末端にはミトコンドリア移行シグナルが側から分解するエンドリボヌクレアーゼファミリーに分付加されている．ヒト RNase H1 は保存された３アミ類される酵素である．RNase H は，DNA と RNA がハノ酸残基（N151, N182, Q183）を介して RNA/DNA

イブリッド二本鎖を形成している箇所において，RNA

ハイブリッドの副溝（マイナーグルーブ）と相互作用す鎖のホスホジエステル結合部分を加水分解により切断す

る．活性中心は DEDD モチーフと呼ばれるよく保存さる．RNase H は，古細菌からウイルス，原核生物，真れた４つのアミノ酸（D145, E186, D210, D274）から核生物に至るまで普遍的に認められる酵素の一つであなり，ここで RNA 鎖のリン酸基と相互作用している．

る．これまでに知られている RNase H の生理機能とし

RNase H1 はこの DEDD モチーフに２個の Mg2＋ が配ては，DNA 複製の際にラギング鎖上に合成されるプラ

位することで活性を示す．

イマー RNA の除去に働くほか，RNA 転写に伴って形

RNase H2 は， 活 性 中 心 を 有 す る RNase H2A と，成される R-loop（DNA に相補的な RNA がハイブリッ

2B, 2C の各サブユニットからなるヘテロ三量体としドを形成し，非相補的な DNA が 1 本鎖となった状態）て機能する．酵素の全体構造としては，３つのサブユの分解除去に関わることでゲノム安定性に寄与すること

ニットが連続して並ぶ形をとっており，2A と 2B の間などが知られている．ほかにも，RNA ウイルスのなかに 2C が挟まれた構造となっている．2A サブユニット

でも HIV に代表されるレトロウイルスは，宿主ゲノムのＣ末端側の約 50 アミノ酸残基はβストランド構造をへの自らの組み込みを成立させるために逆転写酵素をとっており，これが 2B および 2C サブユニットに巻きコードしており，この一部が RNase H 活性を持つこと付くように相互作用している．RNase H2 と H1 のアミが分かっている．
また，
近年医薬品の新しいモダリティーノ酸配列の相同性はそれほど高くないが，活性中心の構として注目されているアンチセンス核酸医薬は，標的

造は非常に似通っている．すなわち，2A サブユニット

RNA とそれに相補的なアンチセンスのハイブリッドにの DEDD モチーフを形成する４個の酸性アミノ酸残基

対して RNase H が作用することにより標的 RNA の切（D34, E35, D142, D170）が位置的に高度に保存され断・分解を誘導するものである．これらのことからも，ており，ここで RNA 鎖のリン酸基と相互作用するととRNase H の生理機能や分解機構をより深く理解するこ

もに，RNase H1 のケースと同様に 2 個の Mg2＋が配位とが，より効果的で副作用の少ない医薬品のデザインをする．

はじめとした創薬研究に極めて重要であると考えられる．

RNase H の触媒機構
RNase H1 は，細胞内において DNA1 本鎖結合タン

RNase H の構造と基質認識

パク質である複製タンパク質 A と直接相互作用するこ

真核生物における RNase H は，そのアミノ酸配列のとによって DNA/RNA ハイブリッドに結合し，その後特徴により大きく RNase H1 と RNase H2 の 2 つに分RNA 鎖の切断が起こると考えられている．RNase H に類される．RNase H1 は，主として N 末端側のハイブリッ

よる RNA の切断機構としては，SN2 型リン酸転移反応

ド結合ドメインと C 末端側のエンドヌクレアーゼドメと呼ばれる反応機構が関与している．まず，脱プロトインから構成され，このエンドヌクレアーゼドメインでン化した水分子が RNA 鎖のリン酸塩に求核攻撃するこ131

リボヌクレアーゼ H (Ribonuclease H, RNase H)とで 5 価の反応中間体が形成され，これにより立体配変性を伴う重症型は，Kearns-Sayre 症候群と呼ばれる．

置が逆転したリン酸基が形成される．その後，もう一進行性外眼筋麻痺の患者由来線維芽細胞では，RNase

つの水分子により 3′ の脱離基が再プロトン化されるとH1 の転写及びタンパク質レベルの低下に加え，ミトコ

5′リン酸基と 3′-OH 基が生成し，生成物が切断部位かンドリア DNA の複製欠損が認められる．RNase H1 欠ら遊離する．この触媒反応には 2 価の金属イオンが必損マウスでは 8.5 日胚で発生が停止することが知られてが可能であるがいる．これは，主に核内およびミトコンドリアに存在す

Mg2＋ が好まれる．２つの金属イオンは非対称的に配位る RNase H1 活性の減少により，ミトコンドリア DNA

し，一方の金属イオンは求核分子の配置および活性化にの複製が十分に行われなくなり，細胞のアポトーシスが必要であり，もう一方の金属イオンは酵素基質複合体を引き起こされるためと考えられている．このことは，ミ不安定化することにより開裂反応を促進すると考えられトコンドリア DNA 複製に RNase H1 活性が必要であるている．

ことを示すとともに，ミトコンドリア機能障害の病態メ要であり，これには Mg

2＋または Mn2＋カニズム解明とその治療薬の創薬に重要な意味を持つとRNase H とアンチセンス核酸による標的 RNA の分解考えられる．

上述のような生体内での本来の反応を利用して，標的

一方，RNASE H2 遺伝子の変異は Aicardi-Goutieres

RNA に相補的な塩基配列をもった数十塩基程度の長さ症 候 群（AGS） の 原 因 と な る こ と が 知 ら れ て い る．

のオリゴ核酸（＝アンチセンス核酸）を合成し細胞に取Aicardi-Goutieres 症候群は原因遺伝子別に５つのサブ

り込ませることで，RNase H による標的 RNA の特異

グ ル ー プ（AGS1-AGS5） に 分 類 さ れ て い る が， こ の的な切断・分解を引き起こすことができる．アンチセン

う ち AGS2 は RNASE H2B 遺 伝 子，AGS3 は RNASE

ス核酸はその生体内安定性や標的に対する結合力を向上

H2C 遺伝子，AGS4 は RNASE H2A 遺伝子の変異にそさせるために，通常リン酸基や塩基部分への化学修飾がれぞれ起因する．Aicardi-Goutieres 症候群は胎生期ウ施される．アンチセンス核酸はまずエンドサイトーシス

イルス感染症と類似した経過をたどることが知られてい経路を介して細胞に取り込まれ，その後エンドソームをる．すなわち，乳児期に重篤な神経症状を示し，小頭症

経てリソソームへと移行するが，一部のアンチセンス核や精神発達遅滞がみられ，小児期に死亡に至る．病理解

酸はエンドソームから逃れ，やがて核と細胞質の両方に

析では，脳萎縮や白質ジストロフィーおよび石灰化を認分布する．アンチセンス核酸はここで標的 RNA と相補め，髄液中にはリンパ球やインターフェロンの増加がみ的に結合し，そこへ RNase H が引き寄せられる．上述られる．

のように，真核生物の RNase H には RNase H1 と H2が存在するが，RNase H1 は主に核およびミトコンドリ

おわりに

アに，RNase H2 は主に核に局在する．哺乳類細胞では

これまでの研究により，生物界に普遍的な酵素である

通常 RNase H1 より RNase H2 の方が高発現している

RNase H が，DNA 複製やゲノム安定性に寄与しているが，アンチセンス核酸による標的 RNA の切断は，主とことが解明され，その構造や反応機構についても解析がして RNase H1 によるところが大きいことが分かって進められてきた．一方で，RNase H が生体内で実際にいる．

どのような基質を認識し，どのような細胞機能に関わっているかの全容については，いまだ明らかになっていな

RNase H と疾患の関わりい．上述のように，RNase H は疾患の原因遺伝子であRNASE H1 遺伝子の変異により，常染色体劣性の進ることや，アンチセンス核酸の例のように創薬応用の行性外眼筋麻痺が引き起こされることが知られている．

うえでも重要な酵素の一つである．今後の研究の進展に進行性外眼筋麻痺はミトコンドリア病の一つとされ，眼よって，生物の核酸代謝機構とその生理機能がより深く

瞼下垂で見られるような外眼筋の進行性の筋力低下と眼理解されるとともに，新しい医薬品開発の礎となること

麻痺を認める．これに加えて，心伝導障害と網膜色素が期待される．

132

リボヌクレアーゼ H (Ribonuclease H, RNase H)

参考文献
・Cerritelli, S.M. & Crouch, R. J.: Ribonuclease
H: the enzymes in Eukaryotes, FEBS J. 276, 6,(2009).
・Crooke, S.T.: Molecular Mechanisms of Antisense
Oligonucleotides, Nucleic Acid Ther ., 27, 2,(2017).
・Hyjeka, M., Figielb, M. et al.: RNases H: Structure
and mechanism, DNA Repair, in press (2019).
（田辺三菱製薬株式会社所

創薬本部

モダリティー研究

創薬本部

モダリティー研究佐々木隆史）（田辺三菱製薬株式会社所，日本応用酵素協会

小寺淳）

133

日本応用酵素協会誌

第54号

ISSN : 0913-3348
ISSN : 2434-7914（Online）
CODEN : NOKKELISSN : 0913-3348（Print）
CODEN : NOKKEL

2020 年３月１日発行

日本応用酵素協会誌
日本応用酵素協会誌

No. 54
2019
総

説

№

54

ゲノム全域をオフターゲットなく自在に編集できる新しい2019

酵素システム系の創製とその応用 ･･･････････････････････････････････････････････
植

田

充

美

Hermansky-Pudlak syndrome (HPS) の病態と遺伝子変異･････････････････････････
加

藤

慎

1

也，五 十 川

健 太，渡

邉

実

夢，竹

森

9

洋

Unstructured 領域から始まるプロテアソームによる蛋白質分解
Proteasome-mediated protein degradation initiated from unstructured region･･････････････ 19

伊野部

智由

2019年度 研究報告
酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究 ･････････････････････････････ 25
成人病の病因・病態の解明に関する研究助成 ･････････････････････････････････････ 53
Vascular Biology Innovation に関する研究助成･･････････････････････････････････ 81
公益財団法人全身性炎症疾患の病因・病態の解明に関する研究助成 ･････････････････････････････ 96
Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成･････････････････････ 103

研究調査所 酵素情報

日本応用酵素協会

創薬標的としてのNIK ･･･････････････････････････････････････････････････････ 125
マラリア原虫から分泌されるフシギな酵素たち ･･･････････････････････････････････ 128
リボヌクレアーゼ H (Ribonuclease H, RNase H) ････････････････････････････････ 131

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