日本応用酵素協会誌

第53号

ISSN : 2434-7914
ISSN : 2434-7914（Online）
CODEN : NOKKELISSN : 0913-3348（Print）
CODEN : NOKKEL

2019 年３月１日発行

日本応用酵素協会誌
日本応用酵素協会誌

No. 53
2018
総

説

№

53

コンドロイチン硫酸の発現調節酵素による骨格筋分化・再生制御 ･･･････････････････

2018

三

上

雅

久，北

川

裕

1

之

神経傷害特異的に応答発現するエンドペプチデース
Damage Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) ････････････････････････ 11
木

山

博

資，桐 生

寿美子

超偏極 C MRI による非侵襲的酵素活性イメージング ･ ･･･････････････････････････ 19
13

松

元

慎

吾

低酸素応答による末梢神経の髄鞘形成制御 ･･････････････････････････････････････
氏

家

悠

佳，若

月

修

二，荒

木

敏

27

之

2018年度 研究報告
酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究 ･････････････････････････････ 33
成人病の病因・病態の解明に関する研究助成 ･････････････････････････････････････ 58
公益財団法人Vascular Biology Innovation に関する研究助成･･････････････････････････････････ 87
全身性炎症疾患の病因・病態の解明に関する研究助成 ･････････････････････････････ 103
Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成･････････････････････ 109

日本応用酵素協会

研究調査所 酵素情報
ファージディスプレイによる進化分子工学的手法を用いた酵素改変 ･････････････････ 127
免疫疾患領域における創薬標的としての RIPK1 ･ ･････････････････････････････････ 130
Bruton's tyrosine kinase (Btk) ･････････････････････････････････････････････････ 133

公益財団法人

日本応用酵素協会

Japan Foundation for Applied Enzymology
編集兼
発行人

中田

繁樹

発行所

大阪市淀川区加島三丁目一六番八九号
公益財団法人 日 本 応 用 酵 素 協 会

印刷所

帝人エージェンシー株式会社

総説

コンドロイチン硫酸の発現調節酵素による骨格筋分化・再生制御
三

上

雅

久＊，北

１．はじめに川

裕

之＊への展望を述べる．

骨格筋は，ヒトの体重の約 40% を占める最大の臓器であり，身体を支え，自立的な活動を可能にする “運動２．CS 鎖の構造と生合成システム

器” の構成基盤であるとともに，個体レベルでのエネル

CS 鎖 は， 代 表 的 な 硫 酸 化 グ リ コ サ ミ ノ グ リ カ ン

ギー代謝調節の中心的な役割を果たす臓器として，肝臓（GAG）多糖の一つであり，コアとなるタンパク質のや脂肪組織と肩を並べる．骨格筋は，環境の変化に応じ特定のセリン残基に共有結合したプロテオグリカンて，量的かつ質的な可塑性を示す特徴があり，適正な栄（CSPG）として，あらゆる組織の細胞表面や細胞外マ

養摂取と運動トレーニングにより肥大するが，運動不足

トリックスに普遍的に存在している１－４）．近年の研究などによるメカニカルストレスの減少や加齢などによっ

により，CSPG は，形態形成・骨格形成や神経可塑性をて萎縮する．特に，加齢性の筋萎縮はサルコペニアと呼はじめとする様々な生命現象に関与することがわかってばれ，寝たきり状態や，肥満などの代謝異常を誘発し，きた１－14）．このような CSPG の機能の多くは，糖鎖部

ADL (activity of daily living) や QOL (quality of life)

分である CS 鎖によって担われている．実際，数多くのの低下を招く要因となっている．したがって，サルコペ

生合成酵素の働きにより産み出される CS 鎖の構造多様ニアの克服は，超高齢化社会に突入した本邦において，性は，CS 鎖が広範な生理機能を発揮する所以でもある．

健康寿命の延伸のみならず，介護や社会保障費の面から

CS 鎖は，グルクロン酸（GlcA）と N-アセチルガラ

も重要な課題である．骨格筋は，生来比較的再生能が高クトサミン（GalNAc）の二糖が繰返し重合した直鎖状

く，ダメージを受けても速やかに筋線維を再生する．しの糖鎖構造を基本骨格にもつ（図１ｂ）．CS 鎖の生合成

かしながら，この再生能も加齢に伴い低下し，サルコペ

は，まずコアタンパク質の特定のセリン（Ser）残基に，ニアの発症に繋がる．
骨格筋再生能の低下の要因として，結合領域と呼ばれる四糖構造（GlcAβ1-3Galβ1-3Galβ1-

筋組織内の微小環境変化が想定されているが，その実体

4Xylβ1-Ser : Xyl, Gal はそれぞれキシロース，
ガラクトー

はよくわかっていない．

．
スを表す）が合成されることにより始まる 1, 15)（図１ａ）

筆者らはこれまでに，あらゆる組織の主要な細胞外この四糖構造は，それぞれ固有の糖転移酵素の働きによ

マトリックス構成分子であるコンドロイチン硫酸（CS）

り，単糖単位で段階的に合成される．組み上がった四糖

多糖鎖の発現量調節が，骨格筋分化と再生過程の推進に構造は，CS 生合成のプライマーとなり，非還元末端の重要であること見出し，CS 鎖により形づくられる微小GlcA 残基に，GalNAc と GlcA が交互に付加されるこ

環境と骨格筋の正常なリモデリングとの密接な関連性をとで，CS 鎖特有の二糖繰返し領域が合成される（図１ｂ）．

紐解く解析を続けている．本総説では，CS 鎖の機能発二糖繰返し領域の生合成には，コンドロイチン合成酵

現を調節する生合成・分解システムについて概説すると素（ChSy）に代表される６種類の糖転移酵素が参画すともに，骨格筋分化・再生過程における CS 鎖の発現変る16－26）．この際，協働する糖転移酵素の組合せや硫酸動と作用基盤に関する知見を紹介し，CS 鎖の発現調節

基転移酵素との相互作用などにより，CS 鎖の重合レベ酵素によるサルコペニアをはじめとする筋疾患治療応用

ルや一本のコアタンパク質上に載る CS 鎖の本数が厳密＊神戸薬科大学生化学研究室

総説－コンドロイチン硫酸の発現調節酵素による骨格筋分化・再生制御

A, C, D, E ユニット）の組み合わせから構成されるポに制御される 27, 28)（図１ｂ）．
CS 鎖の糖鎖骨格は，基質特異性の異なる複数の硫酸

リマーと捉えることができ，多様な構造を示すようにな

基転移酵素により，主に GlcA 残基の２位や GalNAc

る（図１ｂ）．これらの修飾反応は，各硫酸基転移酵素の残基の 4 位または 6 位で硫酸化修飾を受ける 3, 29)．し競合的あるいは協調的作用によって厳密に制御され，最たがって，生合成された CS 鎖は，特徴的な二糖単位（O,

初の基質となる O ユニット（硫酸化されていない二糖

図１

CS 鎖の生合成・分解システム

数多くの糖転移酵素や硫酸基転移酵素，特異的なリン酸化酵素／脱リン酸化酵素が，CS 生合成のプライマーとなる
四糖結合領域（a）や CS 鎖の二糖繰返し領域（b）の生合成に関与する．CS 鎖の分解に寄与するエンド型の加水分解酵素（c）は，ヒアルロン酸（HA）の代謝にも関わる HA 分解酵素 HYAL によって担われる．図中の（2P）は，一時的な 2 位のリン酸化を表し，2S, 4S, 6S は，それぞれ２位，４位，６位のヒドロキシ基が硫酸基に置換された構造を示す．
（a）XylT : キシロース転移酵素，XYLK: キシロース2-O-キナーゼ（別名 FAM20B），PXYLP1: 2-O-ホスホキシロース
ホスファターゼ，GalT–I : ガラクトース転移酵素 –I，GalT–II : ガラクトース転移酵素 –II，GlcAT-I : グルクロン酸転移酵素–I．（b）ChSy : コンドロイチン合成酵素，ChPF：コンドロイチン重合化因子，ChGn : コンドロイチンN-アセチ
ルガラクトサミン転移酵素，C4ST：コンドロイチン 4-O-硫酸基転移酵素，C6ST：コンドロイチン 6-O-硫酸基転移酵素，
UST : ウロノシル 2-O-硫酸基転移酵素，GalNAc4S6ST : N-アセチルガラクトサミン 4- 硫酸 6-O-硫酸基転移酵素．
（c）
HYAL : ヒアルロン酸分解酵素2

総説－コンドロイチン硫酸の発現調節酵素による骨格筋分化・再生制御

単位）が，4-O-硫酸化されるか，あるいは 6-O-硫酸化（C. elegans）のゲノム中で同定された HYAL ホモロ

されるかによって，生成される二糖単位も異なってく

グ分子が，Chn に特異的な加水分解酵素であることがる 3, 29)．

判明した 40)．この結果を受け，哺乳類 HYAL の酵素学

興味深いことに，CS 鎖の合成量は，結合領域の Xyl

的特性が再検討され，HYAL-1 や SPAM1 は，HA 分解

残基の一過的なリン酸化によっても制御される．なぜ

活性と同等の強い CS 分解活性をもつことが確認されなら，Xyl 残基のリン酸化は，その後の連続した Gal のた 41)．一方，HYAL-4 は，HA 分解活性を示さず，CS転移と GlcA の転移を担う酵素活性に影響するためであ

特異的なエンドβ-N-アセチルガラクトサミニダーゼでる 30－32)．最近，このリン酸化と脱リン酸化を触媒するあることが報告された 42)．しかしながら，ヒト HYAL-4

責任酵素として，それぞれ Xyl 2-O-キナーゼ（XYLK，は，胎盤，骨格筋，精巣など限られた組織にしか発現し

別名 FAM20B）と 2-O-ホスホキシロースホスファターゼておらず，全身性の CS 分解は，広範な組織発現様式を（PXYLP1）が著者らにより同定され，結合領域の Xyl

示す HYAL-1 であるとする見方が現在のところ有力で残基の一過的なリン酸化による結合領域四糖構造の成熟ある．

と CS 鎖の合成量制御が，生理的にも重要なイベントであることが判明した 33－35)．また，EXTL2 という糖転移

４．CS 鎖の発現レベルと骨格筋分化との接点

酵素は，このリン酸化四糖構造の非還元末端に，α1-4CS 鎖の個体レベルでの生理学的重要性は，モデル生

結合で N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）を転移する物である線虫を用いた解析により初めて証明された．線活性をもつ 36)．このリン酸化五糖構造は，CS 生合成の虫は，硫酸化されていない CS 鎖である Chn 鎖を多くプライマーとして利用できない 36）ことから，EXTL2 は，含む 43, 44)．Chn の生合成に関わる線虫の ChSy ファミ

CSPG の品質管理に寄与しているかもしれない．

リー分子の機能不全は，初期胚において細胞質分裂不全を呈し，一度分裂した細胞が再度融合し，多核となって３．CS 鎖の分解システム

死に至る 5, 45)．同様の逆行現象による多核胚（合胞体）

CS 鎖の分解は，主にリソソームで行われ，エンド型の異常形成は，著者らが作製した CS 鎖の生合成に関わの加水分解酵素により，大まかに断片化された後，生じるグルクロン酸転移酵素– I（GlcAT-I）が欠損したマウ

たオリゴ糖が，エキソ型のグリコシダーゼやスルファスの初期胚においても観察される（図２ａ）６）．これら

ターゼにより，非還元末端側から段階的に分解されるとの知見は，CS 鎖の発現が初期胚の細胞質分裂を正常に考えられている ．しかしながら，CS 鎖の生合成系と進行させる上で必須不可欠であることを意味する．さらは対照的に，哺乳類の CS 鎖の分解系についてはあまりに穿った見方をすると，細胞融合・多核化を伴う正常なよくわかっていない．その最大の要因は，CS 分解系の体細胞の分化過程が，CS 鎖の積極的な発現低下によっ最初のステップで働く特異的なエンドグリコシダーゼがて担保されている可能性も想定された．こうした背景の不明瞭であったためである．

下，筆者らは，多核の合胞体を形成する骨格筋分化過程

37)以前より，硫酸化されていない CS 鎖であるコンドロに着目し，仮説の検証を試みた 10)．

イチン（Chn）鎖が，非硫酸化 GAG 多糖であるヒアル

骨格筋分化過程では，未分化な筋芽細胞が互いに融合

ロン酸（HA，図１ｃ参照）と構造的に類似しているこ

して多核の筋管細胞（myotube）となる劇的な変化をとから，HA 加水分解酵素（ヒアルロニダーゼ）が CS

遂げる．筆者らは，in vitro で骨格筋分化過程を再現で鎖の分解にも関与することが想定されていた．実際，きる筋芽細胞株である C2C12 細胞を用いて，分化に伴哺乳類ヒアルロニダーゼである HYAL ファミリーに属

う CS 鎖の発現変動を解析した 10)（図２ｂ）．C2C12 細する 6 つのメンバーのうち，HYAL-1, HYAL-4 および胞は，低血清条件下で培養することで一定の割合の細胞

SPAM1（精巣由来ヒアルロニダーゼ，PH-20）に CS 分が分化を開始し，やがて多核の筋管細胞を形成する 46)．

解活性があることが報告されている 38, 39)．

CS 鎖の発現レベルは，分化誘導後の初期段階では増加

近年，HA を産生しない線虫 Caenorhabditis elegans

するが，細胞融合・多核化が活発に起こる筋管形成期を

総説－コンドロイチン硫酸の発現調節酵素による骨格筋分化・再生制御

境に減少に転じた（図２ｂ）．興味深いことに，分化途

酵素 ︲１（C4ST-1）の発現をノックダウンした C2C12 細上の C2C12 細胞における CS 鎖の発現は，myogenin

胞を樹立した．なぜなら，C4ST-1 は，硫酸化酵素であ(Myog) 陽性細胞の周囲で相対的に低下した．Myog は，りながら，CS 鎖の合成量の制御にも関与し（図１ｂ），

筋管細胞への分化誘導に関わる筋特異的転写因子である

その欠損によって，CS 鎖の発現レベルが劇的に減少すことから，CS 鎖の発現レベルの減少は，Myog 制御下るからである 27, 47－49)．期待通り，C2C12 細胞におけるの細胞融合・多核化を伴う筋管形成において，プログラ

C4ST-1 のノックダウンは，CS 鎖の発現レベルの有意ムされた重要なイベントであることが示唆された．

な減少と，筋分化の顕著な亢進を再現した．これらの結そこで，筋管形成における CS 鎖の重要性を確かめる

果を裏付けるように，遊離の CS 多糖鎖を添加処理する

ため，C2C12 細胞の分化誘導系に発現する CS 鎖を強と，C2C12 細胞の筋幹形成が抑制されることも報告さ

制的に排除することによっても，筋分化が亢進するかをれている 50)．

調べた 10)．細菌由来の CS 分解酵素であるコンドロイチ
ナーゼ ABC (ChABC) を筋管形成期の培養系に添加す
ると，24 時間後には，CS 鎖の発現レベルは 50% 程度

５．骨格筋分化を制御する CS 鎖の発現調節酵素と細胞内シグナル伝達にまで低下し，多核の筋管細胞の割合が有意に増加しC4ST-1 のノックダウンは，CS 鎖の発現レベルを強た．さらに筆者らは，コンドロイチン 4-O-硫酸基転移

制的に減少させる上で効果的であったが，C2C12 細胞

図２

初期胚の細胞質分裂異常ならびに骨格筋分化過程における CS 鎖の発現

（a）通常の初期胚では，１→２→４細胞へと細胞分裂を繰返していくが，Chn/CS 鎖の発現が減少した初期胚では，細胞質分裂が正常に進行せず，分裂と融合を繰返し，多核の合胞体となって致死となる．
（b）C2C12 細胞の筋芽細胞から多核の筋管細胞への骨格筋分化過程（上段）における CS 鎖の発現変動（下段赤）．CS 鎖の発現レベルは，筋管細胞への分化誘導に関わる転写因子 Myog（下段青）や CS 鎖の分解に関わる Hyal1（下段緑）の発現と同調した変動を示し，

筋管形成期に低下する．

総説－コンドロイチン硫酸の発現調節酵素による骨格筋分化・再生制御の筋分化過程における内在性の C4ST-1 の発現パターン

では，抗 CS 抗体によって認識される CS 鎖の染色性がは，CS 鎖の発現変動と必ずしも一致しなかった．同様

減弱していた．HYAL1 を過剰発現する C2C12 細胞をに，CS 鎖の生合成に関与する糖転移酵素群についても，樹立したところ，CS 鎖の発現は常に低いレベルに抑え

筋幹形成期における CS 鎖の時期特異的な減少を説明しられ，親株細胞に比べ，多核の筋管細胞の割合が有意にうる発現変動を示すものは見出せなかった 10)．

増加した．対照的に，HYAL1 のノックダウンでは，CS

これらの結果から，骨格筋分化の過程では，むしろ鎖の蓄積と分化遅延が助長された．これらのことから，

CS 鎖の分解系が賦活化している可能性が考えられた．

骨格筋分化過程における一過的な CS 鎖の発現レベルのそこで筆者らは，CS 鎖に対する分解活性が見出されて減少は，HYAL1 を介して細胞自律的に制御されている

いる HYAL ファミリーメンバー 38, 39) の発現に注目した．

と考えられた．

当初，ヒトにおいて，胎盤や骨格筋といった合胞体形成

さらに筆者らは，C2C12 細胞の筋分化過程において，の盛んな組織に限局した発現様式を示す HYAL-4 に期

少なくともホスファチジルイノシトール３–キナーゼ

待を寄せたが，マウス由来の C2C12 細胞では，調べた（PI3K）/Akt 経路が，CS 鎖の発現レベルの減少によりいずれの分化段階でも Hyal4 の発現は検出できなかっ活性化されることを見出した（図３ａ）．PI3K/Akt シグ

た．一方で，Hyal1 は Myog と同調した発現変動を示

ナルは，筋形成過程のみならず，筋肥大や再生にも関与し（図２ｂ），Myog 陽性細胞の多くで，Hyal1 の発現がし 51, 52)，いわば筋組織で起こる現象すべてを一手に担う観察された．また，Hyal1 の発現レベルが高い細胞周囲万能シグナルである．このことからも，CS 鎖の発現レ

図３

CS 鎖による骨格筋分化・再生過程の制御（a）HYAL1 や ChABC 処理による CS 鎖の発現レベルの低下は，PI3K/Akt 経路の活性化を誘導する．
（b）筋線維の再生過程．筋線維は，運動トレーニングや筋損傷などの刺激により活性化された筋サテライト細胞を介して修復・再生される．CS 鎖の発現を一過的に減少させる手段は，この再生過程を助長する．老化や再生・壊死サイクルが常態化した骨格筋組織では，筋サテライト細胞の再生能低下の原因となる微小環境変化（4-O-硫酸化 CS 鎖の蓄積など）が起こっている．（c）CTX 投与により誘導される筋損傷モデルにおいて，ChABC を併用投与すると，中心核（赤：擬似カラー）を有する再生筋線維（緑：ラミニン陽性）の断面積が有意に増大した．スケールバーは 100 µm を示す．



総説－コンドロイチン硫酸の発現調節酵素による骨格筋分化・再生制御

ベルの減少は，骨格筋分化を正常に進行させる上で，重そこで次に，コブラ毒であるカルジオトキシン（CTX）

要なイベントであるといえよう．しかしながら，CS 鎖を投与した筋損傷モデルに ChABC を投与することによの減少がどのような形で PI3K/Akt 経路の活性化を惹起

り，その筋再生過程を促進させることができるかを調べするかなど，詳細な分子メカニズムは不明であり，さらた 10)．CTX は，筋線維を壊死させるが，筋サテライトなる解析が待たれる．興味深いことに，筋芽細胞同士の細胞などには傷害を与えないため，速やかな筋再生を促

融合が，CSPG の一つであるバーシカンの断片化によりすことができる．興味深いことに，CTX 単独投与群に促進されることが報告された53)．バーシカンの断片化が，比べて，ChABC を併用投与した場合では，中心核をも筆者らが見出した筋芽細胞周囲の CS 鎖の減少を模擬しつ再生筋線維の断面積が有意に増大していることがわているかは議論の余地があるが，CSPG が CS 鎖ならびかった（図３ｃ）．再生線維の断面積の増加は，筋芽細にコアタンパク質レベルで代謝調節されることが，骨格胞の融合がより活発に起こった結果であると考えられ，筋分化の促進に奏効することは確からしい．

CS 鎖の発現レベルを低下させる手段が，CTX 処理など
により内在性の筋再生プログラムが賦活化した筋組織に

６．CS 鎖を標的とした骨格筋再生へのアプローチ

おいて有効であることがわかった．

骨格筋は，比較的再生能力の高い組織であり，ダメー
ジを受けても速やかに再生する．再生に大きく貢献する

７．mdx マウスにおける ChABC の効果のは，筋線維の基底膜と形質膜（筋内膜）の間に局在す

代表的な筋原性疾患である筋ジストロフィーでは，筋る筋サテライト細胞であり，成体の筋組織内では静止状線維の崩壊と再生が絶え間なく起こっているが，次第に態にある．筋サテライト細胞は，運動や損傷による刺激

筋の萎縮が進行する．筋ジストロフィーモデルマウスでを受けると活性化し，細胞分裂を繰返して筋芽細胞へとある mdx マウス（ジストロフィン遺伝子に変異をもつ）

分化した後，互いに融合したり，既存の筋線維と融合しでは，生後 3 週齢以降に筋線維の壊死が起こり始めるが，たりして筋線維を再生する（図３ｂ）．したがって，筋壊死後の再生も活発化していることが知られている．実

芽細胞の融合・多核化を含む骨格筋分化過程は，損傷筋際，生後 5 ～ 6 週齢の mdx マウスでは，正常マウスのの再生過程を担保する基本原理でもある．そこで筆者ら

ではほとんど見られない中心核をもつ再生途上筋が，筋は，CS 鎖の発現調節が，サルコペニアや遺伝性筋疾患

線維の 60 ～ 70% を占めた．ChABC を mdx マウスの前の治療戦略として有用であるかを検証するために，CS脛骨筋に単回投与したところ，投与後 7 日目に一過的鎖の発現を低下させることによって，骨格筋の再生過程

な再生途上筋の割合の有意な低下（病態改善の指標）がが促進されるかを調べた 10)．

観察され，その割合は，投与後 14 日目で定常レベルに筋線維は，多核の合胞体であり，成熟した筋線維の筋まで戻ることが判明した．これらのことから，ChABC

核は筋線維の周囲に分布しているが，再生途上にある筋処理による筋再生過程の促進作用は，mdx マウスの病線維はその中心部に筋核をもつ．成熟した筋組織におい態改善にも有効であることが示唆された．

て CS 鎖は，個々の筋線維を取り囲むように，ラミニン

CSPG の一つであるビグリカンのコアタンパク質を投陽性の基底膜や筋内膜に強く発現している．マウス後肢

与することで，mdx マウスの症状が同様に改善されるの前脛骨筋に ChABC を直接投与したところ，筋線維周ことが報告されている 54)．ビグリカンは，ジストロフィ

囲の CS 鎖の発現は，ChABC 投与後 7 日目の時点でもン・糖タンパク質複合体の構成分子でもあることから，顕著に減少していたが，ChABC の浸透領域において，その mdx マウスにおける病態緩解作用は，ジストロフィ

明確な筋線維の変性・壊死像などは認められなかった．

ンの機能を代償するユートロフィンの筋細胞膜へのリク

このことから，ChABC の単回投与で，筋組織内の CS

ルートを仲介するなどして，筋細胞膜の安定性向上に貢鎖を少なくとも７日間持続的に減少させることが可能で献した結果であると考えられている．この点を考慮するあること，また，炎症や筋線維の変性を誘発するようなと，ChABC 投与による mdx マウスの一過的病態の改善

毒性がないことがわかった．

は，CS 鎖をもたないビグリカンコアタンパク質の割合

総説－コンドロイチン硫酸の発現調節酵素による骨格筋分化・再生制御を増加させ，筋細胞膜を相対的に安定化させたことも一

た HYAL-1 による細胞自律的な CS 鎖の発現制御機構は，要因であるかもしれない．

C2C12 細胞の骨格筋分化過程のみならず，筋サテライト細胞による筋再生過程でも機能しているようである．

８．骨格筋組織中の微小環境制御分子としての CS 鎖

今後，骨格筋の再生能のみならず，骨格筋への運動神経

特 筆 す べ き こ と に， デ ュ シ ェ ン ヌ 型 筋 ジ ス ト ロ

支配や，脂肪化・線維化などにおける CS 鎖の役割を網フィー（DMD）患者の筋生検では，健常者と比較して，羅的に解析していくことにより，骨格筋を機能的な面かC4ST-1（CHST11）の有意な発現増加と HYAL-4 の発らも支えうる理想的な治療戦略が確立されることを期待

現低下が見られ，4-O-硫酸化 CS 鎖の蓄積が顕著である

している．

ことが報告された 55)．これら DMD 患者の生検では，筋線維の脱落に加え，筋組織の脂肪化と線維化が観察さ

文献れる．DMD と同様に，サルコペニアにおいても，筋サ１）Sugahara, K. & Kitagawa, H.: Recent advances

テライト細胞の筋分化能の低下に伴って脂肪化と線維

in the study of the biosynthesis and functions of化が生じることが知られている．したがって，筋組織

sulfated glycosaminoglycans. Curr. Opin. Struct.

内における 4-O-硫酸化 CS 鎖の蓄積は，骨格筋再生能

Biol. 10, 518 (2000).

の低下を導く微小環境変化そのものであるかもしれな

２）Sugahara, K. et al.: (2003) Recent advances inい（図３ｂ）．筋組織における 4-O-硫酸化 CS 鎖の蓄積

the structural biology of chondroitin sulfate andの生理的かつ病理学的意義については，今後検討すべき

dermatan sulfate. Curr. Opin. Struct. Biol. 13,

重要な課題であるが，C4ST-1 や HYAL-4 の発現正常化

612 (2003).

が骨格筋の脂肪化や線維化の抑制に寄与するかなど，多３）Mikami, T. & Kitagawa, H.: Biosynthesis and

面的な解析が必要となろう．いずれにせよ，正常な可塑

function of chondroitin sulfate. Biochim. Bio-

性を失った環境を一度破壊し，骨格筋の再生に適した微phys. Acta 1830, 4719 (2013).

小環境を再整備するという意味でも，CS 鎖の発現コン
トロールの重要性が改めて強く示唆される．

４）Kitagawa, H.: Using sugar remodeling to study
chondroitin sulfate function. Biol. Pharm. Bull.
37, 1705 (2014).

９．おわりに
本総説では，CS 鎖の発現レベルが，骨格筋の分化や再生過程を制御するという，CS 鎖の新たな機能的側面

５）Mizuguchi, S. et al.: Chondroitin proteoglycans
are involved in cell division of Caenorhabditis
elegans. Nature 423, 443 (2003).

について紹介した．ChABC 投与のように，骨格筋組織

６）Izumikawa, T. et al.: Impairment of embryonic

内の CS 鎖の発現レベルを減少させる手段は，骨格筋自cell division and glycosaminoglycan biosynthe-

身のもつ再生能力を賦活化し，サルコペニアや筋ジス

sis in glucuronyltransferase-I-deﬁcient mice. J.

トロフィーの進行遅延や改善を図る有効な治療戦略とBiol. Chem. 285, 12190 (2010).

して，その応用が期待される．しかしながら，ChABC

７）Mikami, T. et al.: Contactin-1 is a functional

は，CS 鎖のみならず HA の分解にも寄与すること，さreceptor for neuroregulatory chondroitin

らに，脱離酵素であるため，ChABC 処理により生じる

sulfate-E. J. Biol. Chem. 284, 4494 (2009).

CS 鎖の分解産物は，強い抗原性を有することが知られ

８）Miyata, S. et al.: Persistent cortical plasticityている．そのため，ChABC の長期的利用により，免疫by upregulation of chondroitin 6-sulfation. Nat.

応答などを介した望まない有害作用を誘発する可能性がNeurosci. 15, 414 (2012).

懸念される．将来的に，より安全性の高い CS 鎖の発現

９）Koike, T. et al .: Chondroitin sulfate-E fine-

調節酵素の活用が望まれるが，HYAL-1 はその有望な候

tunes osteoblast differentiation via ERK1/2,

補分子であるかもしれない．実際，筆者らが明らかにしSmad3 and Smad1/5/8 signaling by binding to総説－コンドロイチン硫酸の発現調節酵素による骨格筋分化・再生制御

N-cadherin and cadherin-11. Biochem. Biophys.

has dual enzymatic activities. J. Biol. Chem.

Res. Commun. 420, 523 (2012).

278, 30235 (2003).

₁₀）Mikami, T. et al.: Chondroitin sulfate is a crucial₂₀）Yada, T. et al.: Chondroitin sulfate synthase-3.

determinant for skeletal muscle development/

Molecular cloning and characterization. J. Biol.

regeneration and improvement of muscular dys-

Chem. 278, 39711 (2003).

trophies. J. Biol. Chem. 287, 38531 (2012).

₂₁）Izumikawa, T. et al.: Involvement of chondroitin

₁₁）Izumikawa, T. et al.: Chondroitin sulfate is indis-

sulfate synthase-3 (chondroitin synthase-2) in

pensable for pluripotency and diﬀerentiation ofchondroitin polymerization through its interac-mouse embryonic stem cells. Sci. Rep. 4, 3701

tion with chondroitin synthase-1 or chondroitin-(2014).

polymerizing factor. Biochem . J . 403, 545

₁₂）Takeuchi, K. et al .: Chondroitin sulphate(2007).

N-acetylgalactosaminyl-transferase-1 inhibits₂₂）Izumikawa, T. et al.: Identiﬁcation of chondroi-

recovery from neural injury. Nat. Commun. 4,

tin sulfate glucuronyltransferase as chondroitin

2740 (2013).

synthase-3 involved in chondroitin polymeriza-

₁₃）Koike, T. et al.: Chondroitin sulfate-E mediates

tion: chondroitin polymerization is achieved by

estrogen-induced osteoanabolism. Sci. Rep. 5,

multiple enzyme complexes consisting of chon-

8994 (2014).

droitin synthase family members. J. Biol. Chem.

₁₄）Nadanaka, S. et al.: Chondroitin sulfate–medi-

283, 11396 (2008).

ated N-cadherin /β-catenin signaling is associ-₂₃）Uyama, T. et al.: Molecular cloning and expres-ated with basal-like breast cancer cell invasion.

sion of human chondroitin N-acetylgalactosami-

J. Biol. Chem. 293, 444 (2018).

nyltransferase: the key enzyme for chain initia-

₁₅）Silbert, J.E. & Sugumaran, G.: Biosynthesis oftion and elongation of chondroitin/dermatanchondroitin/dermatan sulfate. IUBMB Life 54,

sulfate on the protein linkage region tetrasac-

177 (2002).

charide shared by heparin/heparan sulfate. J.

₁₆）Kitagawa, H. et al .: Molecular cloning andexpression of a human chondroitin synthase. J.

Biol. Chem. 276, 38721 (2001).

Biol. Chem. 277, 8841 (2002).
₂₄）Gotoh, M. et al .: Enzymatic synthesis ofchondroitin with a novel chondroitin sulfate₁₇）Gotoh, M. et al.: Molecular cloning and char-N-acetylgalactosaminyltransferase that transfers

acterization of a novel chondroitin sulfate gluc-

N-acetylgalactosamine to glucuronic acid inuronyltransferase that transfers glucuronic acidinitiation and elongation of chondroitin sulfate

to N-acetylgalactosamine. J. Biol. Chem. 277,

synthesis. J. Biol. Chem. 277, 38189 (2002).

38179 (2002).

₂₅）Sato, T. et al.: Diﬀerential roles of two N-acetyl-₁₈）Kitagawa, H. et al.: Molecular cloning of a chon-galactosaminyltransferases, CSGalNAcT-1, anddroitin polymerizing factor that cooperates witha novel enzyme, CSGalNAcT-2. Initiation andchondroitin synthase for chondroitin polymer-

elongation in synthesis of chondroitin sulfate. J.

ization. J. Biol. Chem. 278, 23666 (2003).

Biol. Chem. 278, 3063 (2003).

₁₉）Yada, T. et al.: Chondroitin sulfate synthase-2.

₂₆）Uyama, T. et al.: Molecular cloning and expres-Molecular cloning and characterization of asion of a second chondroitin N-acetylgalactos-

novel human glycosyltransferase homologous toaminyltransferase involved in the initiation andchondroitin sulfate glucuronyltransferase, whichelongation of chondroitin/dermatan sulfate. J.

総説－コンドロイチン硫酸の発現調節酵素による骨格筋分化・再生制御

Biol. Chem. 278, 3072 (2003).

₃₅）Izumikawa, T. et al.: GlcUAβ1-3Galβ1-3Galβ1-₂₇）Izumikawa, T. et al.: Chondroitin 4-O-sulfotrans-

4Xyl(2-O-phosphate) is the preferred substrateferase-1 regulates the chain length of chon-for chondroitin N-acetylgalactosaminyltransfer-droitin sulfate in co-operation with chondroitin

ase-1. J. Biol. Chem. 290, 5438 (2015).

N-acetylgalactosaminyltransferase-2. Biochem.

J. 434, 321 (2011).

₃₆）Nadanaka, S. et al.: EXTL2, a member of the
EXT family of tumor suppressors, controls gly-₂₈）Izumikawa, T. et al.: Chondroitin 4-O-sulfotrans-

cosaminoglycan biosynthesis in a xylose kinase-ferase-2 regulates the number of chondroitin

dependent manner. J. Biol. Chem. 288, 9321

sulfate chains initiated by chondroitin N-acetyl-(2013).

galactosaminyltransferase-1. Biochem. J. 441,
697 (2012).
₂₉）Kusche-Gullberg, M. & Kjellén, L.: Sulfotransfer-₃₇）Prabhakar, V. & Sasisekharan, R.: The biosynthesis and catabolism of galactosaminoglycans.

Adv. Pharmacol. 53, 69 (2006).

ases in glycosaminoglycan biosynthesis. Sulfo-₃₈）Csoka, A.B. et al.: The six hyaluronidase-like

transferases in glycosaminoglycan biosynthesis.

genes in the human and mouse genomes. Ma-

Curr. Opin. Struct. Biol. 13, 605 (2003).

trix Biol. 20, 499 (2001).

₃₀）Gulberti, S. et al.: Phosphorylation and sulfation

₃₉）Stern, R. & Jedrzejas M.J.: Hyaluronidases: theirof oligosaccharide substrates critically inﬂuence

genomics, structures, and mechanisms of ac-

the activity of human beta1,4-galactosyltrans-tion. Chem. Rev. 106, 818 (2006).

ferase 7 (GalT-I) and beta1,3-glucuronosyltrans-₄₀）Kaneiwa, T. et al.: Identiﬁcation of a novel chon-ferase I (GlcAT-I) involved in the biosynthesis ofdroitin hydrolase in Caenorhabditis elegans. J.

the glycosaminoglycan-protein linkage region of

Biol. Chem. 283, 14971 (2008).

proteoglycans. J. Biol. Chem. 280, 1417 (2005).

₄₁）Honda, T. et al.: Hyaluronidases have strong₃₁）Tone, Y. et al.: 2-o-phosphorylation of xylose

hydrolytic activity toward chondroitin 4-sulfate

and 6-o-sulfation of galactose in the protein

comparable to that for hyaluronan. Biomol-

linkage region of glycosaminoglycans inﬂuenceecules 2, 549 (2012).

the glucuronyltransferase-I activity involved₄₂）Kaneiwa, T. et al .: Identification of humanin the linkage region synthesis. J. Biol. Chem.

hyaluronidase-4 as a novel chondroitin sulfate

283, 16801 (2008).

hydrolase that preferentially cleaves the galac-₃₂）Wen, J. et al.: Xylose phosphorylation functions

tosaminidic linkage in the trisulfated tetrasac-

as a molecular switch to regulate proteoglycan

charide sequence. Glycobiology 20, 300 (2010).

biosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111,

₄₃）Yamada, S. et al.: Demonstration of glycosami-

15723 (2014).
33）Koike, T. et al.: FAM20B is a kinase that phos-

noglycans in Caenorhabditis elegans. FEBS Lett.
459, 327 (1999).

phorylates xylose in the glycosaminoglycan-₄₄）Toyoda, H. et al.: Structural analysis of glycos-

protein linkage region. Biochem. J. 421, 157aminoglycans in Drosophila and Caenorhabditis(2009).

elegans and demonstration that tout-velu, a₃₄）Koike, T. et al.: Identification of phosphatase

Drosophila gene related to EXT tumor suppres-that dephosphorylates xylose in the glycosami-

sors, affects heparan sulfate in vivo. J. Biol.

noglycan-protein linkage region of proteogly-

Chem. 275, 2269 (2000).

cans. J. Biol. Chem. 289, 6695 (2014).

₄₅）Izumikawa, T. et al .: Nematode chondroitin

総説－コンドロイチン硫酸の発現調節酵素による骨格筋分化・再生制御

polymerizing factor showing cell-/organ-speciﬁcto the sarcolemma and counters dystrophic

expression is indispensable for chondroitin

pathology in mdx mice. Proc. Natl. Acad. Sci.

synthesis and embryonic cell division. J. Biol.

U. S. A. 108, 762 (2011).

Chem. 279, 53755 (2004).

₅₅）Negroni, E. et al.: Glycosaminoglycan modiﬁca-

₄₆）Yaﬀe, D. & Saxel, O.: Serial passaging and dif-

tions in Duchenne muscular dystrophy: speciﬁc

ferentiation of myogenic cells isolated from dys-

remodeling of chondroitin sulfate/dermatan

trophic mouse muscle. Nature 270, 725 (1997)

sulfate. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 73, 789₄₇）Klüppel, M. et al.: Maintenance of chondroitin
sulfation balance by chondroitin-4-sulfotransferase 1 is required for chondrocyte development
and growth factor signaling during cartilage
morphogenesis. Development 132, 3989 (2005).
₄₈）Uyama, T. et al.: Chondroitin 4-O-sulfotransferase-1 regulates E disaccharide expression ofchondroitin sulfate required for herpes simplex
virus infectivity. J. Biol. Chem. 281, 38668(2006).
₄₉）Mizumoto, S. et al.: Chondroitin 4-O-sulfotransferase-1 is required for somitic muscle development and motor axon guidance in zebrafish.

Biochem. J. 419, 387 (2009).
₅₀）Warita, K. et al.: Degree of suppression of mouse
myoblast cell line C2C12 diﬀerentiation varies
according to chondroitin sulfate subtype. Mar.

Drugs 14, 193 (2016).
₅₁）Roffe, S. et al.: Halofuginone inhibits Smad3
phosphorylation via the PI3K/Akt and MAPK/ERK pathways in muscle cells: eﬀect on myotube fusion. Exp. Cell Res. 316, 1061 (2010).
₅₂）Kim, M.H. et al.: Myogenic Akt signaling attenuates muscular degeneration, promotes myoﬁber
regeneration and improves muscle function
in dystrophin-deficient mdx mice. Hum. Mol.

Genet. 20, 1324 (2011).
₅₃）Stupka, N. et al.: Versican processing by a disintegrin-like and metalloproteinase domain withthrombospondin-1 repeats proteinases-5 and -15
facilitates myoblast fusion. J. Biol. Chem. 288,
1907 (2013).
₅₄）Amenta, A.R. et al.: Biglycan recruits utrophin

10(2014).

総説

神経傷害特異的に応答発現するエンドペプチデース

Damage Induced Neuronal Endopeptidase (DINE)
木山博

資＊，桐 生寿 美 子＊のファミリー分子を探索していたロッシュのグループ

１．はじめに
私たちは舌下神経損傷モデルを用いて，運動ニューロは，ヒトで DINE オルソログ遺伝子を同定しこの分子ンの軸索が損傷した時に発現する分子探索を行ってきを ECE-like 1(ECEL1) と命名した３）．DINE は酵素活性

た１）．その過程で損傷側の舌下神経核と健常側の舌下部位を細胞外あるいは小胞体の内腔側に有しており，ア神 経 核 で の mRNA 発 現 の 違 い を Diﬀerential display

ミノ酸配列からその構造が Neprilysin（enkephalinase）

法を用いて検討した時に，メタロエンドペプチデー

や ECE に大変類似しており，これらのメタロプロテアー

ス様構造を有する膜１回貫通型の膜蛋白質が同定さゼと並んで重要なペプチドのプロセッシングに関わるとれた．この分子を我々は Damage Induced Neuronal

考えられた．しかし，βアミロイドやエンドセリンの前Endopeptidase (DINE) と命名し 2000 年に発表した２)．

駆蛋白を基質とはせず，その基質の同定は難渋し未だ基

ほ ぼ 同 時 期 に Endothelin Converting Enzyme (ECE)質の同定に至っていない．ただ，その遺伝子発現応答がDINE / ECEL1

C
Zn

N

図１

DINE の構造と近縁ファミリーメンバー

DINE は酵素活性部位を細胞外側に有する膜１回貫通型のメタロプロテアーゼの構造を有している．アミノ酸構造の類似性から，DINE はネプリライシン（NEP）やエンドセリン転換酵素（ECE1）とファミリーを形成している．

＊名古屋大学大学院医学系研究科・機能組織学11

総説－神経傷害特異的に応答発現するエンドペプチデース Damage Induced Neuronal Endopeptidase (DINE)

神経損傷に深く関わっていることや，ノックアウトでは

1 回貫通するドメインを有し細胞外に位置する C 末側

顕著な表現型が見られることから，この分子が生体で重に酵素活性部位と想定されるドメインが存在する２)．構

要な機能を果たしていることが容易に予想できる．さらに造的には NEP や ECE と最も近くこれらの酵素とファミヒトでの遺伝子変異の家系が発見され，先天性の運動機

リーを形成する（図１）．DINE の発現は神経系が主で能障害の原因遺伝子であることが明らかになった．本総あり，他の組織での発現はほとんど見られない２,４)．脳説では，我々が独自に同定したメタロプロテアーゼであでは，神経細胞に発現しておりグリア細胞には発現してる DINE の特徴と機能的意義について紹介する．

おらず，ニューロン特異的に発現している分子であると考えられる．神経細胞において DINE は小胞体の膜上と細胞膜上に存在すると考えられている２)．

２．DINE の構造と脳内局在
DINE 遺伝子は 18 個のエクソンからなり 775 個のア

DINE mRNA は，胎生期の E12 頃より一部の神経細ミノ酸からなるメタロプロテアーゼ様構造をとる．膜を胞に特異的に発現する．特に神経管の腹側（基板）に強図２

脳内の DINE mRNA 局在分布
詳細は参考文献４参照

12

総説－神経傷害特異的に応答発現するエンドペプチデース Damage Induced Neuronal Endopeptidase (DINE)

く発現する．成熟した脳内では視床下部広域（腹内側核的に発現誘導される転写制御のメカニズムは大変興味深を除く）と脳幹・脊髄の運動ニューロンに最も多くの

く，我々はこの転写制御について DINE のプロモーター

mRNA が発現し，大脳皮質や海馬，小脳には発現して領域を用いて検討した（図３）．当初，軸索損傷ストレいない４)．この他特徴的に強い mRNA 発現がみられる

スにより cJun シグナルが誘導されること，運動ニュー領域としては，線条体の大型のコリナージックニューロ

ロンで神経損傷後に LIF の受容体 gp130 が強く誘導さンや対角帯核，さらに分界上床核などにも局在する．下れ，その下流にある STAT3 の発現と核移行が生じるこ

位脳幹では，
橋核や下オリーブ核に陽性細胞が存在する．

とが明らかになった．そこで，培養神経細胞に cJun と脊髄では前角の運動ニューロンの他，側角の交感神経節

STAT3 のシグナルを入れると DINE の mRNA 発現が前細胞に mRNA が局在している ( 図２)．末梢において上昇することが明らかになった６)．ただ，これらの転写は，特に胎生期の消化管壁の神経細胞や交感神経節など

因子は神経細胞以外にも発現しているので，神経特異に強い mRNA シグナルが見られる ．

性を出す転写因子の必要性が考えられた．そこで，損４)

傷特異的に神経細胞で発現する別の転写因子 ATF3 に着目して解析したところ，ATF3 と cJun がヘテロダイ

３．DINE の遺伝子発現応答の特徴
DINE の最も大きな特徴は，中枢末梢を問わず神経傷

マーを形成して DINE の発現を誘導することが明らかに害に応答して，その発現が上昇することにある２,５)．末なった７）．さらに解析を進めていくと，STAT3, ATF3/

梢の運動神経や知覚神経傷害，中枢の脳外傷，脳梗塞，

cJun が Sp1 というハウスキーピング転写遺伝子に結合

視神経傷害など神経損傷に応答して，神経細胞特異的にして大きな複合体を形成していることが明らかになっその発現が見られる．このような神経特異的・損傷特異

た８)．このことから，少なくとも DINE の発現誘導には，

図３

DINE の発現制御メカニズム

DINE をはじめ神経損傷に応答する遺伝子の発現には，神経損傷ストレスにかかわる多くの転写因子が関与している．
（参考文献 6－9 参照）総説－神経傷害特異的に応答発現するエンドペプチデース Damage Induced Neuronal Endopeptidase (DINE)

cJun, ATF3, STAT3 の３転写因子が主要な要素として性化が関係しているかを検討するため，レスキュー実験

作動していると考えられる．この他，神経損傷や再生にを行なった．胎生期の NMJ 形成を可能にするため，胎は KLF4 や KLF6/7, CREB なども関与していることが生期の運動ニューロンに一過性に発現する Hb9 のプロ

文献的にわかっており，これらが総合して神経特異性とモーターを用い，その下流で各種の変異 DINE を発現す

傷害応答性をつくりだしていると考えている９)．

るトランスジェニックマウスをまず作成した．次にこのマウスと DINE ノックアウトヘテロマウスを交配するこ４．DINE による神経筋接合部形成と疾患とにより，胎生期から生直後の一時期にのみ運動ニュー

DINE ノックアウトマウスを作成したところ，生まれ

ロンで，野生型あるいは変異型 DINE が発現するマウ

た新生仔は呼吸不全によりすぐに死亡した 10)．新生仔スを作成した．野生型 DINE を掛け合わせた場合は横の横隔膜は通常よりかなり薄くなっており肺に空気が隔膜など呼吸運動に関係する骨格筋の NMJ が回復し致入っていなかった．横隔膜が十分に収縮できないため呼死性が回避でき，生後通常通り成長することができた．

吸できず，死に至ったと考えられた．DINE は神経に特一方，DINE の活性コア部位であるアミノ酸 HELTH を異的に発現するため，横隔膜を支配している横隔神経を欠 損 さ せ， さ ら に E672V の 変 異 を 加 え た も の（mut調べてみると，頸髄から横隔膜に至るまでの横隔神経に

DINE1），あるいは酵素活性部位の１アミノ酸を置換しは全く異常がなかったが，神経が筋に至ってから著しいて失活させた DINE (E613V 変異)（mut DINE2）では，分岐異常を呈しており，神経筋接合部（NMJ）の形成

神経分岐不全の表現型をレスキューすることはできなが激減していた 10)．このような NMJ の形成不全はその11)かった（図４）．これらの実験により，DINE 欠損に

量的な違いはあるが多くの四肢の筋や体幹の筋でも観察よる運動神経の筋内分岐の異常は，DINE の酵素活性のされた．そこで，この表現型には DINE の酵素の不活欠損によると考えられた．

図４

横隔膜に見られる DINE ノックアウトの表現型とそのレスキュー実験

横隔膜は横隔神経が頸髄から横隔膜にいたり (*)，そこで，扇状に分岐して広く横隔膜に NMJ を形成する（WT: 矢印）．DINE ノックアウトマウスでは横隔神経は横隔膜まで到着するが，そこで分岐できず NMJ が形成されない（KO）．
そこで，ノックアウトマウスに野生型の DINE (wt DINE) を発現させると横隔膜の神経分岐はレスキューできる（KO+wt DINE）．一方，酵素活性部位に変異を入れた DINE(KO +mut DINE1, KO +mut DINE2) ではレスキューできな
かった．緑は末梢神経マーカーの peripherin，赤は NMJ のポストシナプス側のマーカーの蛍光標識ボツリヌストキシン (BTX) を示す．（参考文献 11 参照）

14

総説－神経傷害特異的に応答発現するエンドペプチデース Damage Induced Neuronal Endopeptidase (DINE)

2013 年，先天性多発性関節拘縮症 (AMC) Type 5Dクインしたところ，DINE ノックアウトマウスで見られ(DA5) の家系で DINE 遺伝子に変異が生じていることがた表現型と同様の表現型が観察できた．特に四肢遠位の初めて報告され 12)．その後，次々とこの疾患で DINE/

神経分岐異常が顕著であり，疾患の病態と類似してい

ECEL1 遺伝子に変異が発見された（図５）13)．AMC はた．さらに，この疾患に見られた１塩基変異型をノック

多くが筋に発現するミオシン重鎖などの遺伝子に変異がインしたマウスでも同様に NMJ の形成不全が生じるこあることにより発症し，筋原性の疾患であると考えられとを我々は確認した 14,15)．以上のマウスを用いた実験のていたが，DINE は神経のみに発現するため，AMC の結果から，DA5 は神経原性の疾患であり，その原因遺DA5 は神経原性であることが示唆された．そこでこの伝子の一つは DINE/ECEL1 であることが明らかになっ遺伝子変異が本当に原因であるかどうかを検討するためた 14,15)．

に，患者家系で見られる遺伝子変異配列をマウスにノッ

䠍

䠏 䠐 䠑

䠎

c.344_355delc.590G>A
c.716dupA

c.869A>G
c.874delG
c.966+1G>T
c.977C>Tc.797_801delinsGCT
c.1057dup

図５

䠒

䠓

䠔

䠕

10

c.1470G>A
c.1252C>A c.1649C>Gc.1252C>T c.1685+1G>A
c.1221_1223dup
c.1210C>T
c.1184+3A>T
c.1184G>A

11 1䠎

13

14

15

c.1819G>A

16

17

18

c.2278C>A(Cys760Arg)

先天性多発性関節拘縮症 ( AMC)Type 5(DA5) の家系に見られる遺伝子変異

AMC のうち，遠位に関節拘縮がみられる DA5 の複数の家系において，DINE/ECEL1 の遺伝子に多くの変異が存在することが，2013 年以降次々と報告されている．
（参考文献 12,13 参照）

Optic nerve injury (Flat-mount)

図６

視神経損傷時に見られる網膜視神経節細胞の DINE mRNA 発現

上段は網膜の伸展標本，下段は網膜の断面を示す．上段では健常時（Ａ）にほとんど発現の見られなかった DINE
mRNA は，視神経損傷後３日（Ｂ）には多くの視神経節細胞に観察される．
（Ｃ）は強拡大．下段でも同様に DINE mRNA
陽性細胞は神経損傷後３日より７日にかけて視神経節細胞層（GCL）に限局してみられる．このことから DINE は中枢神経系においても神経損傷に応答することがわかる．

15

総説－神経傷害特異的に応答発現するエンドペプチデース Damage Induced Neuronal Endopeptidase (DINE)

５．DINE の中枢神経系の再生における機能を紹介した 17)．DINE は今の所，発生過程での NMJ の

生直後の致死性を回避させ成長した DINE ノックア形成や，成熟動物での神経再生に関わっていることは明ウトマウスを用いて，中枢神経系の再生における DINE

らかであるが，その局在分布を考えると，知覚神経や自の機能解明を行なった．中枢神経再生における DINE

律神経の損傷や再生に関与していることが予想される．

の機能解析には，視神経の損傷モデルを用いた．中枢神

また，視床下部の多くの神経細胞が発現していることか経系である視神経の損傷においても，DINE 発現は軸索ら，代謝内分泌にも関わることが予想される．さらに，損傷に応答する．通常視神経節細胞には DINE mRNA

脳梗塞や脳の外傷においても損傷部位周辺の神経細胞にの発現は見られないが，視神経損傷後には著しい DINEDINE は発現するので，これらの疾患において，損傷部

mRNA の発現が観察される（図６）．野生型マウスでは位の神経細胞死防御，脳の回路修復や代償回路構築の促

損傷視神経は通常再生しないが，Zymosan 等で炎症応

進にも大きく関わっている可能性がある．残された一番答を惹起すると一部視神経の再生がみられる．この現象の問題は，基質ペプチドの同定である．過去に様々な手を利用して視神経再生条件下で DINE ノックアウトの影法を用いて同定を試みているが未だそのペプチドはみつ響を観察した．その結果，DINE が欠損したマウスではかっていない．中枢や末梢神経の部位により基質が異な炎症による視神経再生は著しく阻害された．この結果かり，それが DINE の多彩な機能に繋がっていると考えら

ら DINE は中枢神経軸索再生においても何らかの役割をれ，今後も基質同定に取り組んでいきたいと考えている．

担っていると考えられる ．
16)

参考文献
１）Kiryu, S. et al.: Nerve injury enhances rat neuro-

６．おわりに本稿では，我々が，長年研究を続けているメタロプロ

nal glutamate transporter expression: identiﬁca-

テアーゼ DINE 研究の端緒から現在に至るまでの経過

tion by diﬀerential display PCR, J Neurosci, 15,

図７

DINE 欠損マウスでは視神経再生が抑制される．

(a) Zymosan による炎症刺激がない状態 (PBS) では視神経の再生は野生型（WT）と DINE ノックアウト（KOTg）では差がなく，いずれもほとんど再生しない．一方，Zymosan 刺激により再生を促進した場合（下段２つ），WT では軸索再生が促進するのに比べ，DINE ノックアウト（KOTg）では再生が著しく阻害される．いずれの写真も GAP43 抗体により軸索を染色したもの．(b) は (a) の結果を定量化したもの．傷害部位からの遠位側の一定の距離（Ｘ軸）に見られる再生軸索の本数（Ｙ軸）を示す．DINE ノックアウトで再生を促進したマウス（KOTg +Zym）は野生型で再生を促進したもの（WT +Zym）に比べは明らかに再生が抑制されている．
（参考文献 16 参照）

16

総説－神経傷害特異的に応答発現するエンドペプチデース Damage Induced Neuronal Endopeptidase (DINE)

7872 (1995).
２）Kiryu-Seo, S. et al.: Damage-induced neuronaltion of neuromuscular junctions, J Neurosci, 30,
6954 (2010).

endopeptidase (DINE) is a unique metallopepti-

₁₁）Matsumoto S, et al.: Motor nerve arborizationdase expressed in response to neuronal damage

requires proteolytic domain of damage-induced

and activates superoxide scavengers, Proc Natlneuronal endopeptidase (DINE) during develop-

Acad Sci USA, 97, 4345 (2000).

ment, J Neurosci., 36, 4744 (2016).

３）Valdenaire, O. et al.: Organization and chromo-₁₂）Dieterich, K. et al.: The neuronal endopeptidase

somal localization of the human ECEL1 (XCE)

ECEL1 is associated with a distinct form ofgene encoding a zinc metallopeptidase involved

recessive distal arthrogryposis, Hum Mol Genet,in the nervous control of respiration, Biochem J,

22, 1483 (2013).

346, Pt 3:611, (2000).
４）Nagata, K. et al.: Localization and ontogeny₁₃）Shaaban, S. et al.: Expanding the phenotypic
spectrum of ECEL1-related congenital contrac-

of damage-induced neuronal endopeptidase

ture syndromes, Clin Genet, 85, 562 (2014).

mRNA-expressing neurons in the rat nervous

₁₄）Nagata, K. et al.: ECEL1 mutation implicatessystem, Neuroscience, 141, 299 (2006).
５）Ohba, N. et al.: Expression of damage-induced
neuronal endopeptidase (DINE) mRNA in peri-

impaired axonal arborization of motor nerves in
the pathogenesis of distal arthrogryposis. Acta

Neuropathol, 132, 111 (2016).

infarct cortical and thalamic neurons following₁₅）Nagata K. et al .: Distinct functional conse-

middle cerebral artery occlusion. J Neurochem.,

quences of ECEL1/DINE missense mutations in

91, 956 (2004).

the pathogenesis of congenital contracture dis-

６）Kato, R. et al.: Damage-induced neuronal endo-

orders. Acta Neuropathol Commun, 5, 83 (2017).

peptidase (DINE/ECEL) expression is regulated₁₆）Kaneko, A. et al.: Damage-induced neuronalby leukemia inhibitory factor and deprivation of

endopeptidase (DINE) enhances axonal regen-nerve growth factor in rat sensory ganglia after

eration potential of retinal ganglion cells after

nerve injury. J Neurosci., 22, 9410 (2002).

optic nerve injury, Cell Death & Disease, 8(6),７）Nakagomi, S. et al.: Expression of the activating

e2847,(2017).

transcription factor 3 prevents c-Jun N-terminal

₁₇）Kiryu-Seo, S. et al.: New Insights of a Neuronalkinase-induced neuronal death by promoting

Peptidase DINE/ECEL1: Nerve Development,

heat shock protein 27 expression and Akt acti-

Nerve Regeneration and Neurogenic Pathogen-vation, J Neurosci, 23, 5187 (2003).

esis, Neurochem Res., https://doi.org/10.1007/

８）Kiryu-Seo S. et al.: Neuronal injury-inducible

s11064-018-2665-x (2018).

gene is synergistically regulated by ATF3, c-Jun,
and STAT3 through the interaction with Sp1in damaged neurons. J Biol Chem, 283, 6988
(2008).
９）Kiryu-Seo S, Kiyama H.: The nuclear events
guiding successful nerve regeneration. Front

Mol Neurosci, 4, 53 (2011).
₁₀）Nagata K, et al .: Damage-induced neuronalendopeptidase is critical for presynaptic forma-

17

総説－神経傷害特異的に応答発現するエンドペプチデース Damage Induced Neuronal Endopeptidase (DINE)

18

総

説

超偏極13C MRIによる非侵襲的酵素活性イメージング
松

元

慎

吾＊

の形態像から得られる情報は技術的に飽和しつつあり，

１．はじめに健康寿命の延長と国民医療費の抑制という時に相反す

特定疾患の特異的マーカーを検出する分子イメージング

るベクトルの両立が喫緊の課題となっている現代におい技術あるいは，それに資する新たな分子センシング技術て，疾患の早期発見や個別医療の最適化に資する診断技の開発が重要となる．理想的な分子センシング技術に求術への期待が高まっている．疾患の早期発見のため，定められる要件として，１）高感度である，２）陽電子断期的な健康診断等で繰り返し検査を行おうとする場合，

層撮影 PET のような放射線被爆の問題がない，３）光

その検査手法は血液や尿など比較的容易に得られる生検学系イメージングでしばしば問題となる体深部の計測が体の分析か，非侵襲的な画像診断法に限局される．前者

容易である，４）蛍光標識のような生体にとっての異物においては，質量分析メタボローム技術の進歩により，構造を含まず安全である，などが挙げられる．

１グラム以下の生検体中に含まれる数百種類の代謝物の核 磁 気 共 鳴 画 像（Magnetic Resonance Imaging，

網羅的解析が可能となり，有用な疾患マーカーの発見へ

MRI）による形態像は軟組織のコントラストが高く，疾と繋がっている．同時に，メタボローム解析が明らかに患の正確な診断や治療効果の評価において臨床に不可欠したのは，あらゆる疾患は何らかの代謝変化を伴うといなものとなっている．反面，核磁気共鳴はその本質的なう事実である．一方，後者の画像診断では，組織や臓器検出感度の低さから分子イメージングへの応用は限ら

図１[1-13C] ピルビン酸アリルの超偏極 13C NMR スペクトル

パラ水素誘起偏極（PHIP）法により 13C NMR/MRI の測定感度を数万倍に増幅．励起した 13C 核スピンの分極は，縦緩和時間 T1 を時定数に元の熱平衡状態へと減衰する．

＊北海道大学大学院情報科学研究科磁気共鳴工学研究室

19

総説－超偏極 13C MRI による非侵襲的酵素活性イメージングれていた．近年，分子内の特定の核スピンに熱平衡状を皮切りに，13C 標識した基質の生体内における代謝反態の数万倍に及ぶ分極（MRI 感度に比例）を誘導する

応，つまりは特定の組織・臓器における “代謝酵素の“超偏極” 技術を用いた様々な分子イメージング技術が活性” を非侵襲的に計測し可視化する超偏極 13C MRI

開発され，その一部は既に臨床応用も始まっている１)．

代謝イメージングの研究開発が世界中で進められていOverhauser 型 MRI では測定対象となるフリーラジカ

る２－４)．2012 年には米国 University of San Francisco

ル分子中の不対電子から周囲の水分子のプロトン核へ

California (UCSF) が，前立腺癌患者におけるピルビンと動的核偏極（Dynamic Nuclear Polarization，DNP）

酸代謝イメージングで，世界初の臨床試験を実施し，現により分極を移すことで，MRI を用いて，まるで電子

在は世界 10 カ所ほどの施設で前立腺癌診断に加え，脳常磁性共鳴画像法のような生体内フリーラジカルの分布

腫瘍や癌の肝転移，心機能を目的に臨床試験が行われて画像が得られる．ルビジウム Rb 原子の光ポンピングをいる５, ６)．本稿では，筆者らの研究成果を中心に，この用いた 3He や 129Xe など希ガスの超偏極 MRI は慢性閉

超偏極現象を用いた，ヒトにも応用可能な新しい酵素活

塞性肺疾患（COPD）や喘息など肺疾患の診断に極めて性イメージング技術を紹介する．

有用であり，欧米では既に臨床応用が始まっている．
一 方，2003 年 に J. H. Ardenkajaer-Larsen や K.

２．炭素 13C 核と核偏極

Golman 等によって溶液の 13C NMR 感度を数万倍に増核磁気共鳴 NMR の測定対象は大きな磁気モーメント

幅する dissolution DNP (dDNP) 技術が報告されたのを有し，質量数が奇数の原子核である．炭素の同位体の① 代謝プローブ前駆体② パラ水素由来1Hの超偏極JCHʼ

p-H2付加

JCH

JHHʼ

分極移動

例）
[1-13C]ピルビン酸プロパルギル④ 超偏極13C 代謝プローブ③ 超偏極13C 代謝プローブ前駆体
加水分解例）超偏極[1-13C]ピルビン酸
図２

パラ水素誘起偏極（PHIP）サイドアーム法による 13C への超偏極誘導

量子状態を揃えた水素ガスであるパラ水素を , カルボン酸を有する酵素基質の不飽和エステル前駆体に付加すること
で , ２つの超偏極 1H を生成する．1H から 13C へと分極移動した後にエステル側鎖を加水分解することで，超偏極 13Cを持つ代謝プローブを作成する．

20

総説－超偏極 13C MRI による非侵襲的酵素活性イメージング

中では，スピン量子数 1/2 の炭素 13 のみが NMR 信号

1

H 核は大きな磁気モーメントを持ち，炭素 13 核の磁を与える．天然存在比が 1.1%，磁気回転比（NMR 測

気緩和を早めるため，これらを重水置換することで，化定感度は磁気回転比の３乗に比例）が 1H の４分の１の学的に更に高感度化することも有効である．

10.7 MHz/T であるため，内因性の生体内分子に含ま上述の Overhauser 型 MRI では，測定対象となるプ

れる 13C 核スピンは通常の MRI 測定では検出されない．

ローブがニトロキシルラジカル等の生体内で比較的安定

代謝基質内の特定の炭素原子を C 標識し，超偏極によかつ毒性の少ないフリーラジカル種に限られ，光ポンピ

り数万倍に NMR 感度を増幅することで，一時的に 1Hングによる肺のイメージングでは 3He と 129Xe 等の希ガ

MRI と同等の測定感度が得られる（図１）．超偏極によっス分子に限られるため，得られる生体内情報の制約が厳て増幅した 13C NMR/MRI 信号は励起直後からその縦緩しい．それに対し 13C 標識では，比較的低分子で，かつ和時間 T1 に従って急速に減衰するため，比較的に T1 の高感度に検出できるカルボニル炭素や４級炭素を持つ生

長いカルボニル炭素や４級炭素を選択的に標識すること

体内物質は糖や脂質代謝物だけでも軽く数百種類に及でより高感度な画像が得られる．炭素 13 核に隣接する

び，その代謝イメージングにより得られる情報の自由度

13|Įe, ȕn>EPR

EPR|Įe, Įn>|ȕe, ȕn>|ȕe, Įn>|Įe, Įn>EPR RF|Įe, ȕn>② EPR励起後|ȕe, ȕn>EPR RF① 熱平衡状態|ȕe, Įn>③ 核スピンの超偏極|Įe, ȕn>NMR信号の増幅஺ᕪ㑄⛣|ȕe, ȕn>ESR RFESR RF|Įe, Įn>|ȕe, Įn>NMR信号の増幅
図３

動的核偏極（DNP）による超偏極の誘導原理と臨床用 13C 核励起装置

3-5T の超電導磁石の中で，約１K の極低温条件下，約 0.1% の濃度でドープした常磁性分子の電子スピン共鳴をマ
イクロ波照射により飽和させる．動的核偏極により不対電子の電子スピンから周囲の 13C 核スピンへと分極が移動し，超偏極が 13C に誘導される．

21

総説－超偏極 13C MRI による非侵襲的酵素活性イメージングは極めて大きい．また，元来，体内に多く存在する代謝の 13C 核へと移り，高温に熱したバッファーで急速溶解

物の 13C 標識体を分子プローブとして用いるため，外来することにより，13C 核スピンが超偏極した代謝プロー

生の新規化合物を分子プローブとして用いる場合に比べブ溶液が得られる（図３）．臨床で広く用いられている

毒性の懸念も少ない．

通常の 1H MRI では MRI 装置自体の磁場強度に依存し炭素 13 核に超偏極を誘導する主な手法として，１）強制 励 起 法（Brute Force）， ２） パ ラ 水 素 誘 起 偏 極 法て核スピンの分極，即ち測定感度が決まるが，超偏極
C MRI における核スピンの分極は励起装置側の磁場強13（ParaHydrogen Induced Polarization, PHIP），３）動度で決まり，MRI 装置自体の磁場強度には依存しない．

的核偏極法，の３つが用いられている．強制励起法では，ボルツマン分布から，より高磁場かつ低温の励起装置を

14T 以上の高磁場，100 mK 以下の超低温条件に検体を用いることで分極率，つまりは最終的な MRI 測定感度

長時間置くことでボルツマン分布に従い高い分極率を得が著しく高まる．代謝プローブの観点から生体イメージられる．溶液・粉末を問わずあらゆる化合物を励起できングに十分な分極率を得るには，水もしくは DMSO やる反面，１検体の励起に数日掛かかることから，代謝イ

グリセロール等の毒性の低い有機溶媒に 1M 以上の溶解

メージングの用途には適していない．２番目のパラ水素性があり，凍結時にガラス状の結晶構造を取る必要があ

誘起偏極法は，水素分子の付加反応を用いて化学的に核る等の一定条件はあるが，DNP 法により励起できる代

スピン偏極を誘導する手法である（図２）．通常の水素謝プローブの汎用性は高く，2014 年の時点で 60 種類

ガスは４つのエネルギー状態が均等に混ざった状態とし以上もの 13C 標識分子プローブが報告されている 10)．

て存在するが，これを触媒存在下で 30K 以下に冷却することにより，最も低いエネルギーを持つパラ型の水素３．酵素活性イメージングの画像診断への応用

分子に量子状態を揃えることができる．高純度のパラ水

世界初の超偏極 13C MRI 酵素活性イメージングの臨

素を炭素多重結合を持つ代謝プローブ前駆体に付加する

床応用はピルビン酸代謝の違いによる前立腺癌の診断でと，パラ水素由来の２つの 1H 核スピンは超偏極の状態行われた５)．1H MRI による形態像からは腫瘍の位置やとなる．続いて，超偏極 1H から周囲の標識した 13C 核

形状，大きさの情報が得られ，治療に対する腫瘍サイズ

へと分極移動することで，超偏極した 13C 核スピンを持の変化から抗癌治療の効果が評価される．しかしながら，つ分子プローブを作成する７－９)．低磁場（～ 2mT），室

特定の治療の有効性が腫瘍サイズの変化として現れるに

温下で比較的安価に超偏極実験が行えるため，1980 年

は数週間から数ヶ月掛かることが多く，より早い段階で代より化学反応の研究に広く用いられて来た．しかしな治療効果を評価する，或いは逆に，治療を始める前にそがら，投与する代謝プローブを直接励起できず，炭素の治療法の有効性を判断できる画像診断法の確立が望ま

多重結合を持つ前駆体が必要であることによる化学構れている．ピルビン酸は正常組織ではミトコンドリアに

造上の制限，水素付加反応に用いる白金触媒を瞬時における酸化的リン酸化により主に水と二酸化炭素に代謝除去することが困難であること，の２つの理由によりされるのに対し，癌組織ではピルビン酸脱水素酵素の活代謝イメージングへの応用はほとんど成されていない．

性抑制と乳酸脱水素酵素（LDH）の発現増加を伴う解

従って，現在，多くの超偏極 13C MRI による代謝イメー

糖系の亢進により，主に乳酸へと代謝される代謝変容がジングの研究では，３番目の動的核偏極法（Dynamic

起こる．172.5 ppm にあるピルビン酸の１位の炭素核

Nuclear Polarization, DNP）が採用されている．

の化学シフトは，乳酸に代謝されることで 185 ppm に

動的核偏極法は，電子スピンと核スピンの二重共鳴

大きく変化し，化学シフトイメージングにより容易に区に基づく核偏極の誘導法である．13C 標識した高濃度の別して可視化できる．このピルビン酸代謝の違いを超偏代謝プローブと，EPA と呼ばれる安定な常磁性分子を

極 13C MRI によりリアルタイムに可視化することによ

約 1000：1 の割合で混合し，3︲5T の高磁場，超低温下り，わずか３分の撮像で腫瘍の正確な診断が可能となる（～１K）において，EPA 中の不対電子の電子スピン共（図４）３,４)．TRAMP モデルを用いた前立腺癌の前臨床

鳴を励起する．電子スピンの分極は交差遷移により周囲試験では，代謝イメージングから得た乳酸 /ピルビン酸

22

総説－超偏極 13C MRI による非侵襲的酵素活性イメージング

比と，組織化学から得た腫瘍の悪性度との間に高い相関ラーゼが触媒する酵素反応は補酵素を必要とせず，酵素が見られている 11)．

基質さえあれば細胞外でも酵素活性は維持されている．

炎症性疾患や抗癌治療効果の評価においては，“細胞従って，超偏極 13C フマル酸からリンゴ酸への代謝が観がどれだけ死んでいるのか” が重要な判断材料となる．

察されれば，そこで細胞膜の破壊が起きていることを意

現在，フマラーゼ酵素活性を標的にした細胞死イメージ味する．フマル酸とリンゴ酸の化学シフトが近いため，ング法の研究開発が進められている ．フマラーゼの基高いスペクトル分解能が必要とされるが，細胞死のイ質であるフマル酸を外来的に投与しても細胞内移行性がメージングは幅広い応用が期待される．

12)

低いため，細胞死が起きていない健康体ではほとんど何

疾患には遺伝的要因に依るものも多く，遺伝的な違い

も代謝物は検出されない．炎症性疾患や抗癌治療によっはそのコードする酵素反応の変化として現れ，治療効果て癌細胞にネクローシス（壊死）が起こると，障害されや予後に大きく影響する場合がある．例えば，脳腫瘍にた細胞からフマラーゼが細胞外へと放出される．フマ

おいては膠芽腫では p53 経路の遺伝子異常が 50% 近く

図４

C 標識ピルビン酸の代謝変容による癌診断

13

ピルビン酸は正常組織では主にミトコンドリアの酸化的リン酸化により水と二酸化炭素へと代謝されるが，癌組織ではピルビン酸脱水素酵素の抑制と乳酸脱水素酵素の活性化により乳酸への代謝フラックスが亢進する．この代謝変容をマーカーとした，酵素活性イメージングによる癌の画像診断が実用化されつつある．

23

総説－超偏極 C MRI による非侵襲的酵素活性イメージングに認められ，星細胞腫および乏突起細胞腫ではイソクエ

することができる．ジカルボニル構造を持つコハク酸はン酸デヒドロゲナーゼ IDH1 突然変異が 50︲80% の高細胞内移行性が悪いが，エステル化することにより移行頻度で見られる．IDH1 変異は癌化の原因ではあるが，性を改善できることが報告されている 14)．このように超この遺伝子変異による脳腫瘍は他の遺伝子変異に起因す

偏極 13C MRI による酵素活性イメージングは，遺伝子る場合と比べ予後が良く，生存年数も有意に長い．正常変異の検出にも有用であり，他の遺伝子変異を検出するな IDH1 はミトコンドリア内のクエン酸回路においてイ

様々な酵素基質プローブの開発も重要な研究分野となっソクエン酸をα-ケトグルタル酸に変換するが，変異体てきている．

の多くはα-ケトグルタル酸を 2-ヒドロキシグルタル酸に変換する異常な代謝を示す．従って，13C 標識したα-４．腫瘍における LDH 酵素活性と抗癌治療効果

ケトグルタル酸の代謝イメージを行うことにより脳内の画像診断技術の進歩により，癌の全身スクリーニング

IDH1 遺伝子変異を非侵襲的に検出できる ．また，コが可能となっている現在，見つかった腫瘍の悪性度の評

ハク酸の代謝イメージングからは癌抑制遺伝子であるコ

価や，個別の抗癌治療戦略の最適化に資する画像診断技

ハク酸デヒドロゲナーゼやフマラーゼの活性異常を計測術の開発が求められている．図５はマウス後肢に移植し13)

Hs766tA)

Mia PaCaͲ2

SU.86.86

B)

190
18
Chem
ical s0 170
hift (
ppm 160)

20
4Tim 0 6e ( 0 80
se 10
c)
0

200

Mia PaCaͲ2

SU.86.86

kpyrͲlac (/min)

Hs766t1
ical 8s 0 170
hift (
ppm 160
)

0

190
Chem

02

200

0

200
1
Che9m0 180
ical shift (170 160
ppm
)

20
4
Tim 0 6e ( 0 80s e 10c) 0

Pry0Tim 40 6e( 08se 0 1c) 00

Intensity

Lac

C)

Hs766tMiaPaCaͲ2

60
40
20
0

10 20 30 40 50 60
Days after treatment

図５100
Local control (%)

800Su8686100
Local control (%)

Local control (%)

100

80
60
40
20
0

0

10
20
30
Days after treatment

40

80

Control

60

TH302

40

XRT

20
0

0

10
20
30
Days after treatment40

ヒト膵管癌モデル３種の LDH 酵素活性イメージングと抗癌治療効果

13ᅗ䠑 䝠䝖⮅⟶⒴䝰䝕䝹䠏✀䛾㻸㻰㻴㓝⣲άᛶ䜲䝯䞊䝆䞁䜾䛸ᢠ⒴἞⒪ຠᯝ
３種類のヒト膵管癌モデルにおいて，超偏極
C MRI によりピルビン酸から乳酸への代謝フラックス（＝LDH 酵素活性）を可視化．LDH 活性の高い腫瘍は放射線治療に耐性を示すが，低酸素標的薬 TH-302 では高い治療効果が得られる．
䠏✀㢮䛾䝠䝖⮅⟶⒴䝰䝕䝹䛻䛚䛔䛶䠈㉸೫ᴟ㻝㻟㻯㻌㻹㻾㻵䛻䜘䜚䝢䝹䝡䞁㓟䛛䜙ங㓟䜈䛾௦ㅰ䝣䝷䝑䜽䝇䠄䠙㻸㻰㻴㓝⣲άᛶ䠅䜢ྍど໬䠊㻸㻰㻴άᛶ䛾㧗䛔⭘⒆䛿ᨺᑕ⥺἞⒪䛻⪏ᛶ䜢♧䛩䛜䠈ప㓟⣲ᶆⓗ⸆㼀㻴㻙㻟㻜㻞䛷䛿㧗䛔἞⒪ຠᯝ䛜ᚓ䜙䜜䜛䠊2

総説－超偏極 13C MRI による非侵襲的酵素活性イメージング

た３種類のヒト膵管癌モデルにおいて，超偏極 13Cピルれらから派生する何十種類もの代謝物を区別してイメービン酸代謝イメージングから得た LDH 酵素活性画像と，ジングすることが出来れば，メタボロームのような包括

それらの腫瘍を放射線治療，膵臓癌の第一選択薬である的代謝情報を非侵襲的に得ることも可能になり，様々な

ジェムシタビン，および低酸素標的薬である TH-302 で疾患を１度の MRI 測定で検出・診断することも可能に治療した際の生存曲線を示している 15)．同じ膵管癌の腫なると考えられる．

瘍であってもその背景にある遺伝子変異の違いにより，上述のように，既に前立腺癌や脳腫瘍診断，心機能評

腫瘍の LDH 酵素活性は大きく異なる．LDH 発現量は転価において臨床試験が始まり，世界 10カ所ほどで様々

写因子である低酸素誘導因子 HIF の制御を受けており，な代謝プローブを用いた超偏極 13C MRI の新たな臨床

低酸素腫瘍ではその発現は上昇する．従って，LDH 活試験が計画されている．その一方で，世界有数の 6000

性が高い腫瘍は酸素濃度が低い可能性が示唆され，実際台もの MRI 台数を誇る MRI 大国であるはずの日本では，に放射線治療に耐性を示した．その一方で，低酸素下に筆者の知る限り，前臨床レベルでさえも超偏極 13C MRI

おいて活性化され抗癌作用を示す低酸素標的薬 TH-302

による代謝イメージの撮像が可能なのは筆者・松元の研は，そのような LDH 活性の高い腫瘍に対して高い治療

究チームのみである．超偏極 13C MRI の国内普及が進効果を示し，LDH 活性の低い腫瘍においてはほとんど

まない主因は数億円に及ぶ現行 DNP 型の 13C 励起装置

治療効果が観察されなかった．これらの結果は，LDHの導入初期コストにある．近年の臨床試験の成功を受け，酵素活性が腫瘍の酸素状態を良く反映しており，超偏極より低価格な励起装置の実現に繋がる PHIP 法の報告数

13

C MRI が個別の癌患者に対する最適な治療方針の決定も著しく増えてきており，今後の国内普及の拡大へと繋に有用な知見を与え得ることを示唆している．

がることが期待される．

５．今後の展望

参考文献

超偏極 C MRI による代謝イメージングは，この 10１）Ross, B.D. et al .: Hyperpolarized MR imag-

年ほどで立ち上がった新しい分野である．代謝プローブ

ing: neurologic applications of hyperpolarizedの候補となる生体内分子は数百種類に及ぶ．現在までに

metabolism. AJNR Am. J. Neuroradiol. 31, 24

報告されている代謝プローブはそのほんの一部に過ぎな(2010).

13い 10)．将来，超偏極 13C MRI を意図したハード＆ソフ２）Ardenkjaer-Larsen, J.H. et al.: Increase in signal-

トウェアの開発・改良と合わせ，革新的な代謝プローブ

to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-stateが開発されていけば，医療の発展に大きく貢献できる可NMR. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 10158

能性を秘めている．

(2003).

近年の代謝研究では質量分析技術の発展により，組織

３）Golman, K. et al.: Metabolic imaging by hyper-

中に含まれる数百種類もの代謝物を一度に定量すること

polarized 13C magnetic resonance imaging forが可能となり，疾患を包括的な代謝変化として捉える，

in vivo tumor diagnosis. Cancer Res. 66, 10855

所謂メタボロームが疾患メカニズムの解明に重要な役(2006).

割を果たしている．これまでの超偏極 13C MRI 研究は，

４）Matsumoto, S. et al.: EPR oxygen imaging and

１つの代謝プローブを用いて，１つの代謝経路を選択的

hyperpolarized 13C MRI of pyruvate metabo-に検出することを目的としていた．最近の国際会議ではlism as noninvasive biomarkers of tumor treat-

灌流プローブと代謝プローブを同時に励起し，画像化す

ment response to a glycolysis inhibitor 3-bromo-

るなど，複数の異なる性質を持つ，もしくは，複数の代

pyruvate. Magn. Reson. Med. 69, 1443 (2013).

謝プローブを同時に用いて異なる代謝経路を検出するマ５）Nelson, S.J. et al.: Metabolic imaging of patients

ルチプレックス代謝イメージングの試みも報告され始めwith prostate cancer using hyperpolarizedている 16)．より多くの代謝プローブを同時に投与し，そ[1-13C] pyruvate. Sci. Transl. Med. 5, 198 (2013).

25

総説－超偏極 13C MRI による非侵襲的酵素活性イメージング

６）Charles, H. et al.: Hyperpolarized 13C metabolic
MRI of the human heart initial experience. Circ.

Res. 119, 1177 (2016).
７）Golman, K. et al.: Parahydrogen-induced polarization in imaging: Subsecond 13C angiography.

Magn. Reson. Med. 46, 1 (2001).
８）Chekmenev, E. et al.: ASADENA hyperpolarization of succinic acid for MRI and NMR spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 130, 4212 (2009).
９）Reineri, F. et al.: ParaHydrogen Induced Polarization of carboxylate resonance in acetate andpyruvate. Nat. Commun. 6, 1 (2015).
₁₀) Keshari, K.R. and Wilson, D.M. Chemistry andbiochemistry of 13C hyperpolarized magnetic
resonance using dynamic nuclear polarization.

Chem. Soc. Rev. 43, 1627 (2014).
₁₁) Albers, M.J. et al.: Hyperpolarized 13C lactate,pyruvate, and alanine: noninvasive biomarkers
for prostate cancer detection and grading. Can-cer Res. 68, 8607 (2008).
₁₂) Gallagher, F. et al.: Production of hyperpolarized[1,4-13C2] malate from [1,4-13C2] fumarate is amarker of cell necrosis and treatment response
in tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106,
19801 (2009).
₁₃) Chaumeil, M.M. et al.: Non-invasive in vivo assessment of IDH1 mutational status in glioma.

Nat. Commun. 4, 2429 (2013).
₁₄ ) Zacharias, N.M. et al .: Real-time molecularimaging of tricarboxylic acid cycle metabolism
in vivo by hyperpolarized 1-(13)C diethyl succinate. J. Am. Chem. Soc. 134, 934 (2012).
₁₅) Matsumoto, S. et al.: Metabolic and Physiologic
Imaging Biomarkers of the Tumor Microenvironment Predict Treatment Outcome with Radiation or a Hypoxia-Activated Prodrug in Mice.

Cancer Res. 78, 3783 (2018).
₁₆) von Morze, C. et al.: Simultaneous multiagent
hyperpolarized (13)C perfusion imaging. Magn.

Reson. Med. 72, 1599 (2014).
26

総

説

低酸素応答による末梢神経の髄鞘形成制御
氏

家

悠

佳＊，若

月

１．はじめに

修

二＊，荒

木

敏

之＊

子として HIF1 を見出した．本総説では，シュワン細胞

ヒトを含むほぼすべての多細胞生物は，大気中の酸素における HIF1 を介する低酸素応答の分子機構に関するを利用してエネルギーを産生する．そのため，多細胞生

著者らの研究を紹介し，ミエリン形成における低酸素応物を構成する細胞にとってその生存には酸素が不可欠で答の生理的意義について考察する．

あるが，生体局所の酸素分圧は常に変動しており，個々の細胞が生存するためにはこの変動に適応する必要が２．末梢神経ミエリン化におけるシュワン細胞の分化ある．低酸素誘導因子 1 (hypoxia inducible factor 1,

前述のように，シュワン細胞は神経堤細胞から発生

HIF1) は，細胞への酸素供給が不足したときに誘導されし，シュワン細胞前駆細胞，幼若シュワン細胞を経て，るタンパク質として発見され，酸素濃度の変動への適応

最終的にミエリン形成細胞へと分化する．幼若シュワン

応答において中心的な役割を果たす．哺乳類の胚発生は細胞はニューレグリンやラミニンなどを介した軸索との１％～５％と成体よりも低い酸素濃度で生じるため，胚クロストークにより，細胞増殖や軸索への遊走が促進さ発生における HIF 依存的な遺伝子発現調節の重要性がれて軸索に寄り添うようになる．こうして幼若シュワ

示されている．その一方で，低酸素への適応機構の異常

ン細胞はミエリン形成細胞へと分化し，1 本の軸索に対や破綻は多くの疾患の症状形成や病態の進展と密接に関して何十層ものミエリンを形成する．ミエリン形成にわることが明らかになりつつあり，HIF を介する低酸素至るまでの各ステージにおいて機能する転写因子が同応答機構を理解することは，病態生理学的な面からも極定され，それに準ずる遺伝子発現調節が明らかにされめて重要である．

ている１,２）．代表的なものとして，主に幼若シュワン細神経細胞において情報の出力を担う軸索は，標的とな胞に発現する Oct6 はミエリン形成細胞への分化を促す

る細胞と連絡して情報を伝達する．ほとんどの軸索を覆Krox20 の 転 写 を 活 性 化 し，Krox20 は MBP（myelin

う髄鞘（ミエリン）は導線を包む絶縁体のような役割を

basic protein）などのミエリン構成蛋白遺伝子のプロ

果たし，このはたらきによって，情報伝達に必要な電気モーター領域に結合して発現を促進することが知られて信号が神経細胞から標的となる細胞へ迅速かつ正確に伝いる．Oct6 および Krox20 は，それぞれの遺伝子欠損

えられる．末梢神経系において，ミエリンはシュワン細マウスを用いた検討によりミエリン形成の遅延や形成異胞によって形成される．哺乳類ではシュワン細胞は神経常が起こることが報告され，ミエリン形成の主要な転写

堤細胞から生じ，胎生中期以降に軸索へと遊走し，出生因子であると考えられている３－５）（図１）．しかしなが前後に活発にミエリン形成を開始する．出生によって胎ら，これらの報告は各ステージに限定した断片的な結果児を取り巻く酸素環境は大きく変化することから，酸素を示すものであり，ミエリン形成に至るまでのシュワン

環境の変化がミエリン形成を誘導する可能性がある．著細胞の分化制御メカニズムの全貌は未だ明らかにされて者らは神経損傷などによる末梢神経障害後の再生機構にいない．

関わる責任分子の探索するなかで，シュワン細胞の分化，
すなわちミエリン形成と正に相関する発現変動を示す分＊国立精神・神経医療研究センター神経研究所疾病研究第五部

27

総説－低酸素応答による末梢神経の髄鞘形成制御

図１

シュワン細胞の分化過程

図２

28

HIF の発現制御

総説－低酸素応答による末梢神経の髄鞘形成制御

３．HIF1 による遺伝子発現制御

で HIF1αが核内移行した．低酸素暴露後のシュワン細HIF1 は元来，肝がん細胞株において低酸素依存的に胞を回収し，定量的 PCR にてミエリン関連遺伝子の発エリスロポエチン産生を誘導する転写因子として発見

現変化を解析すると，Oct6, Krox20 および MBP 遺伝

された６）．HIF1 はすべての後生動物に存在し，HIF1α子の発現レベルが通常酸素環境（酸素濃度 20％）と比および HIF1βのふたつのサブユニットから構成され較して有意に上昇した．プロリン残基をアラニン残基

る．HIF1αサブユニットには ODD (oxygen-dependentに置換し，水酸化による分解を免れて安定的に発現する

degradation) ドメインと呼ばれる蛋白質の安定性制御

HIF1α変異体を導入したシュワン細胞は，対照群と比を担う領域が存在する．この領域に含まれる二つのプ較して Krox20 および MBP 遺伝子の発現レベルが増加

ロリン残基はプロリン水酸化酵素により酸素依存的にした．これらのことから，HIF1αの発現はシュワン細水酸化され，von Hippel-Lindau 蛋白（pVHL）を含む胞の分化，すなわちミエリン形成と正に相関することがE3 ユビキチンリガーゼによってユビキチン化されてプわかった．

ロテアソーム依存的に分解される．一方，アスパラギン
残基の水酸化は転写共役因子 CBP/p300 との結合を阻害し，転写活性が抑制される．低酸素状態では，これ５．ミエリン形成期のシュワン細胞における HIF1αの発現

らの水酸化酵素が機能しないために HIF1αは分解され次に，生体内における HIF1αの機能を調べるため，ず，細胞質内に安定化する．その後 HIF1αは HIF1βとマウスを用いて発達期の末梢神経における HIF1αの発二量体を形成して核内に移行し，標的遺伝子のプロモー

現と局在を調べた．マウスの坐骨神経では，ミエリン形

ター領域内の ACGTG/GCGTG で構成される低酸素応

成は生後２～３日に開始し，生後１週でシュワン細胞が答性領域に結合することで転写を開始することができ

軸索に沿って突起を伸展する．生後３週間後には軸索に（図２）．これまでに HIF1αは ERK (extracellular
る７, ８）

多重層構造のミエリンを形成し始め，ミエリン完成まで

signal related kinase) によって 641, 643 番のセリン残に約２か月を要する．生後２日, 10 日, ３週齢および成基がリン酸化されると核内移行が促進され転写活性が上

獣マウスの坐骨神経を採取し，HIF1αの mRNA および昇することが報告されている 9, 10）．このように，様々な蛋白の発現変化を解析したところ，成獣マウスと比較

翻訳後修飾を受けて HIF1αが安定化されることによっ

して HIF1α蛋白は生後２日齢において豊富に存在した．

て，低酸素に応答した遺伝子発現が制御される．これま

意外なことに，HIF1α mRNA は成獣マウスにおいてわ

でに，HIF1αが発現制御する遺伝子として，グリセル

ずかに発現増加が認められるのみであった．したがって，

アルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）や血HIF1α mRNA の発現レベルは発達期を通してほぼ一定

管内皮増殖因子（VEGF）などが報告されている７）．

であるのに対し，HIF1α蛋白はミエリン形成開始期では安定的に発現し，ミエリンが完成する成獣では分解さ４．シュワン細胞における HIF1α 安定発現とミエリン関連遺伝子発現変化れると考えられた．HIF1α蛋白を発現する細胞を免疫
組織化学により同定したところ，生後 10 日齢のマウス

生後 2 日目のラットから坐骨神経を採取し，シュワ

坐骨神経では，核およびシュワン細胞の核内に局在した．

ン細胞を調製した．得られた初代培養シュワン細胞はこれらの結果は，ミエリン形成初期に HIF1α蛋白が安

ホルスコリンおよびグリア増殖因子（GGF）を含む培

定発現することがシュワン細胞の分化誘導，すなわちミ地で継代することができる．シュワン細胞を低酸素環境

エリン形成の制御に関与する可能性を示唆した．

（酸素濃度１％）にて培養し，免疫染色により HIF1αの局在を観察したところ，低酸素暴露４時間後および 24

６．in vitro myelination の確立

時間後では HIF1αがシュワン細胞の細胞質および核内

筆者らは，マウスおよびラット胎仔から採取したに局在し，内因性の HIF1αの安定化と核内移行が観察

脊髄後根神経節（DRG）を用いた組織培養（explant

された．24 時間後ではおよそ 80％以上のシュワン細胞

culture）によるミエリン形成の評価系（explant 法）を

29

総説－低酸素応答による末梢神経の髄鞘形成制御確立した．胎生期 12 ～ 13 日の DRG にはシュワン細胞

る共培養系が用いられた 11－14）．この場合，神経細胞のの前駆細胞（サテライト細胞とも呼ばれる）が存在する

培養は採取してきた DRG を酵素処理で分散し，増殖性ため，explant 法は神経細胞とシュワン前駆細胞の共培

細胞を薬剤処理により除去した後に共培養を開始する．

養系となる．採取した DRG explant を NGF などの栄

シュワン細胞と神経細胞の間で細胞の由来が異種または養因子を含む培地で培養すると，約１週間で軸索が外側別個体になるため，遺伝的に変異のある動物から採取しへ向けて放射状に伸長する．シュワン細胞前駆細胞は神たシュワン細胞または神経細胞を共培養に用いることが経細胞の細胞体近傍に密集しているが，培養経日的に増可能である．また，共培養前に人工的に特定の遺伝子を殖し，軸索に沿って遊走していく．その後，アスコルビ

ノックダウンしたり，過剰発現させたりすることができ，共ン酸を添加してミエリン形成を誘導すると，誘導開始か培養後のミエリン形成で細胞特異的な loss of function

ら約２～３週間後にはミエリンが形成される（図３）．

および gain of function 解析が可能であるが，シュワン

中枢神経系ではミエリン形成を担うオリゴデンドロサイ

細胞，神経細胞ともに大量の細胞を確保する必要となる．

トは複数の軸索に対してミエリン化するが，シュワン細一方，explant 法では採取した１つの DRG から共培養

胞は１本の軸索にミエリンを構築する．したがって，観系を確立できるため，簡便性・量産性に優れている点で，察される１つのミエリンセグメントが１つのミエリン形

薬剤スクリーニングに有用なツールとなる．また，同一成細胞を意味し，ミエリンセグメントの蛍光強度や個数個体に由来したシュワン細胞と神経細胞による共培養系を定量することでミエリン形成を評価できる．

となるため，生体内における発達期のミエリン形成を一

これまで，in vitro myelination では，生後２～４日

部模倣した in vitro モデルとなると考えている．例えば，のラット由来のシュワン細胞とラット胎仔またはマウス

Charcot-Marie-Tooth 病モデルである Tremble-J マウ

胎仔由来の神経細胞の培養を別々に採取し，後に混合すス（ミエリン構成蛋白 PMP22 の変異により末梢神経に

図３

30

DRG explant culture によるミエリン形成誘導

総説－低酸素応答による末梢神経の髄鞘形成制御

脱髄を認める）から作製した explant culture では野生とが知られている 17)．著者らの観察では，HIF1α蛋白は型と比較してミエリン形成が低下しており 15, 16)，病態時

発達初期の坐骨神経に安定して存在していた．発達初期のミエリン形成異常を一部再現している．

のマウス坐骨神経にはマクロファージなどの免疫細胞が存在している．これらの免疫細胞が産生するサイトカイ

７．HIF1α 安定化によるミエリン形成の促進

ンを介したマクロファージーシュワン細胞間のクロストー

これまでの結果から，HIF1α蛋白の安定発現はシュワ

クが，HIF1α蛋白の安定化に寄与する可能性がある．

ン細胞の分化，すなわちミエリン形成を促進する可能性

これらの可能性についてもさらに検討する計画である．

がある．この仮説を裏付けるため，低酸素暴露によるミ一方，脱髄疾患では視力障害や手足の麻痺，感覚障

エリン形成への影響を explant 法により検討した．低酸害，高次機能障害などの重篤な神経障害を生じる．脱髄

素環境で 6 時間培養した後，通常酸素環境に戻し，ミ疾患で最多は多発性硬化症であり世界で 250 万人が罹

エリン形成誘導培地で３週間培養を継続した．
その結果，患する．また，アルツハイマー病や脳卒中，炎症，代軸索の密度や伸長には変化がみられないが，通常酸素環

謝異常，ビタミン B12 欠乏症などの栄養素の欠乏にお境のみの培養と比較してミエリンセグメント数が有意にいても髄鞘（ミエリン）が障害されることが報告されて増加することがわかった．次に，プロリン水酸化酵素をおり，近年では統合失調症などの精神疾患においてもミ阻害することで HIF1α蛋白を安定化する薬剤（HIF1α

エリン形成の異常が仮説として提唱されている．このよ

安定化剤）を添加してミエリン形成への影響を検討した．

うに，世界中には数千万人にも及ぶ多数の方がミエリン

HIF1α安定化剤を添加すると，HIF1α蛋白はほぼすべに障害を持ち，そのことが原因となる神経障害に苦しんてのシュワン細胞の核に局在した．ミエリン形成誘導開でいる．脱髄の抑制や髄鞘の再生を促進する方法の開発

始時にこの濃度で HIF1α安定化剤を添加して培養したはこれらの神経障害の進行の緩和に繋がるが，国内外で後，ミエリン形成誘導培地でさらに 12 日間培養してミの髄鞘（ミエリン）を標的とした研究は少なく，脱髄疾

エリン形成を評価したところ，ミエリンセグメントの数

患の発症・進行機構の解明と有効な治療戦略の提示は重が増加することがわかった．これらのことから，低酸素

要な課題であると考える．近年，血中酸素濃度の変化におよび薬剤により HIF1α蛋白が一過性に安定して発現伴い，中枢神経系のミエリン形成が活発化することが報することでミエリン形成を促進する可能性が強く示唆さ

告されている 18)．ミエリン形成の分子機構は，少なくとれた．

も部分的には中枢神経系と末梢神経系で共通するが，軸索からのシグナルに強く依存する末梢神経系と比べ，中８．おわりに枢神経系はよりシステミックな影響を受ける．今後は，

本総説では，末梢神経系の髄鞘（ミエリン）形成に

中枢神経系のミエリン形成と酸素ダイナミクスの関連性おける HIF の機能に関する著者らの研究を紹介した．

を明らかにし，脱髄疾患の発症・進行機構の解明と有効

HIF1αは転写因子としてミエリン形成を促進する遺伝な治療戦略の提示に繋げたい．

子の発現調節に関与すると考えられるため，現在，クロマチン免疫沈降法による網羅的解析（ChIP-seq 解析）

参考文献

を進めている．また，シュワン細胞において HIF1αが１）Jessen, K.R. & Mirsky, R.: The origin and devel-

どのように活性化し，ミエリン形成に関与するのかを

opment of glial cells in peripheral nerves, Nat.

動物個体レベルで理解するために，今後はシュワン細胞

Rev. Neurosci., 6(9), 671 (2005).

特異的に HIF1α遺伝子を欠損するモデル動物を用いて，

２）Pereira, J.A. et al .: Molecular mechanisms

生理学的あるいは病態生理学的環境下における HIF1α

regulating myelination in the peripheral nervousの機能解析を行う必要があると考えている．

system, Trends. Neurosci., 35(2), 123 (2012).

HIF1α蛋白の安定化は IL1β, TNFαおよび TGFβな３）Topilko, P. et al.: Krox-20 controls myelination

どのサイトカインにより低酸素非依存的に制御されるこ

in the peripheral nervous system, Nature., 371,

31

総説－低酸素応答による末梢神経の髄鞘形成制御

796 (1994).
４）Bermingham, J.R. Jr. et al.: Tst-1/Oct-6/SCIP

mGluR2 to control Schwann cell diﬀerentiationand proliferation, Sci. Rep., 6, 29856 (2016).

regulates a unique step in peripheral myelina-₁₅）Liu, N., et al.: Enhancement of Schwann celltion and is required for normal respiration,

myelin formation by K252a in the Trembler-J

Genes Dev., 10(14), 1751 (1996).

mouse dorsal root ganglion explant culture, J.

５）Jaegle, M. et al.: The POU factor Oct-6 and
Schwann cell diﬀerentiation, Science., 273, 507(1996).
６）Semenza, G.L. & Wang, G.L.: A nuclear factor
induced by hypoxia via de novo protein syn-

Neurosci. Res., 79(3), 310 (2005).
₁₆）Rangaraju, S. et al.: Rapamycin activates autophagy and improves myelination in explant
cultures from neuropathic mice, J. Neurosci.,
30(34), 11388 (2010).

thesis binds to the human erythropoietin gene₁₇）Frede, S. et al.: Regulation of hypoxia-inducible

enhancer at a site required for transcriptional

factors during inﬂammation, Methods Enzymol.

activation. Mol. Cell. Biol., 12(12), 5447 (1992).

435, 405 (2007).

７）Sharp, F.R. & Bernaudin, M.: HIF1 and oxygen₁₈）Yuen, T.J. et al.: Oligodendrocyte-encoded HIF

sensing in the brain, Nat. Rev. Neurosci., 5(6),function couples postnatal myelination and

437 (2004).

white matter angiogenesis. Cell., 158(2), 383

８）Lisy, K. & Peet, D.J.: Turn me on: regulating
HIF transcriptional activity, Cell. Death. Differ.,
15(4), 642, (2008).
９）Richard, D.E. et al.: p42/p44 mitogen-activatedprotein kinases phosphorylate hypoxia-inducible
factor 1alpha (HIF-1alpha) and enhance thetranscriptional activity of HIF-1, J. Biol. Chem.,
274(46), 32631 (1999).
₁₀）Mylonis. I., et al.: Identiﬁcation of MAPK phosphorylation sites and their role in the localization and activity of hypoxia-inducible factor1alpha, J. Biol. Chem., 281(44), 33095 (2006).
₁₁）Eldridge, C.F. et al.: Differentiation of axonrelated Schwann cells in vitro. I. Ascorbic acidregulates basal lamina assembly and myelin
formation, J. Cell. Biol., 105(2), 1023 (1987).
₁₂）Einheber, S. et al .: Axonal regulation of
Schwann cell integrin expression suggests a role
for alpha 6 beta 4 in myelination, J. Cell. Biol.,123(5), 1223 (1993).
₁₃）Saitoh, F. & Araki, T.: Proteasomal degradationof glutamine synthetase regulates schwann cell
diﬀerentiation, J. Neurosci., 30(4), 1204 (2010).
₁₄）Saitoh, F. et al .: Glutamate signals through32(2014).

研究報告

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究
酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究

新規 serine kinase ホモログの機能解析と SerK
kinase family の提唱
跡見晴

れ 242, 268, 252, 142 個のアミノ酸からなるタンパク質であった．発現の結果，MSED については不溶性のタンパク質が得られたが，SMAR, HBUT の２種につい幸て可溶性の組換え型タンパク質が得られた．SMAR は（京都大学工学研究科）

nuclease と機能推定され Tk-SerK と 45% の相同性を示した．HBUT は transcriptional regulator と推定され，Tk-SerK と 18% の 相 同 性 を 示 し た．SMAR は 85 ℃，【目的】
我々はいままでに，超好熱性アーキア Thermococcus

10 分間の熱処理，陰イオン交換クロマトグラフィー，

kodakarensis の cysteine 合成機構を解明し，TK0378

ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて精製した．HBUT

遺 伝 子 に コ ー ド さ れ る 新 規 ADP-dependent serine

は陽イオン交換クロマトグラフィーとゲル濾過クロマト

kinase (Tk-SerK) を同定した ．いままでタンパク質中グラフィーにより精製した．得られた精製タンパク質をの serine 残基をリン酸化する酵素は多数知られていた

用いて O-phosphoserine（Sep）の生成やリン酸基供与が，SerK は遊離の serine をリン酸化する酵素としては

体の消費等を測定することにより serine kinase 活性の初めての例であった（図１）．Tk-SerK は ADP をリン酸有無を検討した．

１）基供与体とし，serine に高い特異性を示し，threonine
や homoserine，ペプチド中の serine 残基には活性を示さなかった．SerK は既存の kinase family とは異なる一次構造を示すことから，Tk-SerK は新しい kinase
family の一員である可能性が示唆された．そこで本研
究ではアーキアの中では Thermococcus 属と比較的遠

図２

SMAR, HBUT が触媒する反応

縁の Crenarchaeota が保有する Tk-SerK ホモログの機能解析を進め，新しい kinase family の提唱・確立を目【結果】
SMAR および HBUT について，まず ADP-dependent

指す．

serine kinase 活性の有無を検討した．いずれのタンパ
ク質も本活性を示さないことが判明した．そこで，リン酸基供与体を変更し，ATP を用いて活性を評価した．
その結果，いずれも活性を示すことがわかった．
そこで SMAR が利用できるリン酸基供与体を調べた．
図１

Tk-SerK が触媒する反応

ATP, UTP, GTP, CTP, pyrophosphate, triphosphate の利用を検討した結果，SMAR が ATP, UTP, GTP, CTP,

【方法】

triphosphate を用いて L-serine のリン酸化反応を触媒

Crenarchaeota に 属 す る 数 種 の ア ー キ ア か ら Tk-

できることがわかった．Tk-SerK と同様，反応の生成物

SerK ホモログ遺伝子を増幅し，Escherichia coli 内では Sep であった．また L-serine に対する活性よりは低大量発現して翻訳産物の取得（MSED, SMAR, HBUT）

いものの，SMAR は D-serine に対しても活性を示した．

を目指した．Tk-SerK, MSED, SMAR, HBUT はそれぞ類似の構造をもつ threonine や homoserine は認識さ

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成れなかった．HBUT についてもリン酸基供与体の解析

確立されつつある２）．そのような中で申請者は，ラットを進めた結果，本酵素は ATP, UTP, GTP, CTP を利用

P2X4 の細胞外ドメインの一部を，立体構造を持ったまできることが明らかとなったが，UTP を用いた場合のま発現，精製に成功し３），この部位のモノクローナル抗活性が特に高いことがわかった．

体を作成した．本抗体は，ラットミクログリア細胞上の【考察】

ラット P2X4 を立体構造特異的に認識する．今回の申請

本研究により Euryarchaeota の Thermococcus 属以では本抗体を用いて，抗体と ATP 加水分解酵素をつな

外の archaea においても serine kinase が存在すること

げたコンジュゲート抗体の作成を試み，細胞外に存在すがわかった．これらは ADP ではなく種々の NTP をリる ATP を分解し，P2X4 への ATP 結合，さらにミクロン酸基供与体として利用することが明らかとなった．上グリアの活性化を抑制することが可能ではないかと考え

記 の SMAR, HBUT 以 外 に も Crenarchaeota 由 来 Tk-

た．

SerK ホモログの中に ATP-dependent serine kinase 活【方法】

性を有するものの存在が明らかとなっており，今後新しCys 残基と Lys 残基を修飾できる二架橋性試薬を用い

い serine kinase family の提唱が可能であると期待してて，ATP 加水分解酵素である Apyrase 上の Lys 残基といる．

抗 P2X4 抗体をペプシンにより処理し調製した（Fab）
ʼ【文献】

上の Cys を架橋し，コンジュゲート抗体の作成を行った．

１）Makino, Y., Sato, T., Kawamura, H., Hachisuka,【結果】

S.-I., Takeno, R., Imanaka, T. & Atomi, H.: An

Apyrase と抗ラット P2X4 抗体のコンジュゲート抗archaeal ADP-dependent serine kinase involved

体の作成を行い，ATP 分解活性を持ち，ラット P2X4

in cysteine biosynthesis and serine metabolism.

に結合するコンジュゲート抗体を得ることができた．

Nature Commun. 7, 13446, (2016).

【考察】
今後作成したコンジュゲート抗体を用いて，実際にP2X4 のカルシウム流入が抑制されるかどうかを P2X4
発現培養細胞を用いて確認する予定である．
【文献】

ATP 受容体 P2X4 に対する抗体と ATP 加水分解
酵素を利用した「痛み」抑制分子の開発
阿

部

義

人

１）Tsuda, M., Shigemoto-Mogami, Y., Koizumi,
S., Mizokoshi, A., Kohsaka, S., Salter, M.W. &Inoue, K.: P2X4 receptors induced in spinal mi-（九州大学薬学研究院）

croglia gate tactile allodynia after nerve injury,
Nature, 424, 778 (2003).

【目的】
世界にはモルヒネも効かない痛み「神経障害性疼痛」
等に罹患する患者が 2000 万人以上も存在し，救われ難２）Hattori, M. & Gouaux, E.: Molecular mechanismof ATP binding and ion channel activation in
P2X receptors, Nature, 485, 207 (2012).

い痛みに苦しんでいる．九州大学薬学研究院の井上ら

３）Igawa, T., Abe, Y., Tsuda, M., Inoue, K. & Ueda,

は「脊髄内ミクログリアの異常な活性化と，そこに発T.: Solution structure of the rat P2X4 receptor

現する ATP 受容体サブタイプ P2X4 の刺激により神経

head domain involved in inhibitory metal bind-

障害性疼痛が発症する」ことを報告した１）．この結果はing, FEBS Lett., 589, 680 (2015).

P2X4 が神経障害性疼痛における「痛み」のターゲット分子であることを示した．近年，Ｘ線結晶解析によって，P2X4 の三量体構造が解析され，ATP 結合と相関した細胞外ドメインの構造変化など，その構造的な基盤も

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成【文献】
多種類の酵素を精密に整列配置して効率的に物質変換反応を行う反応場の開発
飯嶋益１）Iijima, M. & Kuroda, S.: Scaﬀolds for oriented
and close-packed immobilization of immuno-

巳

globulins. Biosens. Bioelectron., 89, 810-821,（東京農業大学応用生物科学部）(2017).
２）Iijima, M., Somiya, M., Yoshimoto, N., Niimi,【目的】

T. & Kuroda, S.: Nano-visualization of oriented-

バイオセンサーやバイオリアクター等の固相表面に

immobilized IgGs on immunosensors by high-

酵素を固定化し，効率的に反応，触媒，エネルギー変

speed atomic force microscopy. Sci. Rep., 2,換，物質生産等を行うためには，酵素と基質が効率よく

790, (2012).

反応できるように酵素の配向性を揃えて精密に整列配置

３）Iijima, M., Kadoya, H., Hatahira, S., Hiramatsu,

することが重要である．これまでに我々は，IgG-Fc 結

S., Jung, G., Martin, A., Quinn, J., Jeong, S.Y.,

合 ZZ タグを整列提示するバイオナノ粒子（ZZ タグ提Choi, E.K., Arakawa, T., Hinako, F., Kusunoki,

示型バイオナノカプセル：ZZ-BNC）１） が，バイオセン

M., Yoshimoto, N., Niimi, T., Tanizawa T. &シング表面において IgG の配向性を精密に制御し「クKuroda, S.: Nanocapsules incorporating IgG Fc-

ラスター化と整列提示化」を同時に達成できる耐久性のbinding domain derived from Staphylococcus

高い足場分子であることを高速原子間力顕微鏡により可aureus protein-A for displaying IgGs on immu-

視化し２），各種バイオセンシングの高感度化により示して

nosensor chips. Biomaterials, 32, 1455-1464,

きた３,４）．そこで本研究では ZZ-BNC を発展させ，多種(2011).

類の酵素を精密に整列提示する足場分子の開発を目指し

４）Iijima, M., Yoshimoto, N., Niimi, T., Maturana,

た．まず第一段階として，BNC 表層に特異的 DNA 配

A.D. & Kuroda, S.: Bio-nanocapsule-based scaf-

列結合領域を提示した BNC を作製し，DNA 配列を介しfold improves the sensitivity and ligand-bindingて酵素を精密に整列提示する足場分子の開発を行った．

capacity of mammalian receptors on the sensor【方法と結果】

chip. Biotechnol. J., 11, 805-813 (2016).

ZZ-BNC と 同 様 に 出 芽 酵 母 を 用 い て DNA 結 合 型
BNC を発現・精製し，透過型電子顕微鏡（TEM），原子間力顕微鏡（AFM）及び動的光散乱法（DLS）を用
いて性状解析を行った結果，DNA 結合型 BNC は直径
約 30 nm のナノ粒子であることが判明した．そこで，
水晶発振子微量天秤法（QCM）のセンサー表面に，血高頻度変異感染症に対応できる新規経口ワクチンの
創製
植

田

充

美
（京都大学大学院農学研究科）

液凝固に関与する酵素と特異的に結合する DNA を直接または DNA 結合型 BNC を介して固定し，酵素結合

我々が世界に先駆けて開発し，2010 年に日本バイオ能を測定した結果，DNA 結合型 BNC を介すると酵素

インダストリー賞ならびに，2015 年日本農芸化学会賞

結合量が約 2 倍に上昇し，DNA １分子に結合する酵素を授与された，タンパク質のもつ機能発現する場へ輸送

分子数が約３倍増加した事から，DNA 結合型 BNC はされるためのシグナル配列を応用した「タンパク質の細DNA を介して酵素をクラスター化及び精密整列化でき

胞表層分子ディスプレイ」の手法は，自然界からだけでる足場分子としての有望性が示された．今後，様々な酵なく，人工的に作製された大規模 DNA 情報分子プール

素の精密整列提示化に応用することで，物質変換反応をから変異タンパク質，人工抗体やペプチドなど医薬とし高効率に行う反応場の創製を図っていきたい．

ての機能タンパク質ライブラリーを構築することを可能にした．さらに，我々がナノテクを使って開発した一細

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

胞スクリーニングに使えるマイクロチャンバーチップなを細胞表層に配置した分子デイスプレイ経口ワクチンをどの新しいセルチップや細胞セルソーターを用いたシス

作成し，その効能を評価したところ．これまでの抗真菌

テマテイックな選択システムにより，種々のカラム操作

薬を凌駕する効能が示された．また，インフルエンザウ

なしに，ディスプレイされた細胞などを一つの支持体とイルスの強毒性の源になるウイルス H5N1 の１次感染

して，提示されたタンパク質の網羅的改変による機能解源であるヘマグルチニンと２次感染源であるノイラミニ

析ができる．また，PCR 法なども併用すれば，導入さダーゼとさらに，それぞれの変異体について分子デイス

れた DNA の配列から提示されたタンパク質のアミノ酸プレイ法によるハイスループットな作製を完了し，国立

配列が即座に決定できる．こういった分子ディスプレイ

感染研での評価を行っている．

は，DNA 情報と機能分子の解析の距離を短縮させるモ
レキュラーツールとして注目されてきている．
この手法を駆使すれば，多くの感染症の高頻度変異
抗原タンパク質を網羅的でハイスループットな高速タ
ンパク質作製システムの構築により感染症出現に際して脂質メディエーター ɴ-アシルエタノールアミンによる摂食制御機構の生理機能解析宇山徹（香川大学医学部）

即応して調製が可能で，さらに，その変異に対合するペプチドなどのリガンドを探索する新しい研究領域の創設も同時にめざせる．申請では，世界的なパンデミック危【目的】

機をはらんでいるインフルエンザウイルスの強毒性の源

N-アシルエタノールアミンは長鎖脂肪酸とエタノーになるウイルス H5N1 の１次感染源であるヘマグルチ

ルアミンが縮合した脂溶性バイオファクターの一種で，ニンと２次感染源であるノイラミニダーゼとさらに，そ脂肪酸の鎖長や不飽和度に応じて異なる受容体に結合

れぞれの変異体について分子デイスプレイ法によるハイし，抗炎症や抗肥満作用などの多様な生物活性を示す．

スループットな作製とそれをベースにした経口抗原の作哺乳動物において N-アシルエタノールアミンは，生体製をめざすものである．本発表では，そのモデルケース

膜リン脂質から主として二段階の酵素反応によって生として，高齢化社会で，現在問題になっている真菌感染成される．まず，N-アシル転移酵素によってホスファ症カンジダ症に対する，この新しい戦略にもとづく抗体

チジルエタノールアミン（PE）のアミノ基に他のリンの作成とその経口ワクチンへの取り組みについて，現況

脂質分子の sn-1 位から脂肪酸鎖が転移され，N-アシル

をまとめて報告するとともに，インフルエンザウイルス-PE と呼ばれる特殊なリン脂質が合成される．次に，ホH5N1 のヘマグルチニンとノイラミニダーゼの分子デイ

スホリパーゼＤ型酵素によって N-アシル-PE から N-アスプレイ法による作製を完了したので報告する．

シルエタノールアミンが生成される．N-アシル転移酵【方法と結果】

素には Ca２＋ 依存性の有無で区別される２つのグループ

我々の開発したモノリスキャピラリーカラムによるナが存在するが，最近，マウスの脳を用いたプロテオーム

ノ LC/MS/MS 定量プロテオーム解析により，カンジダ

解析から Ca２＋ 依存性の N-アシル転移酵素（Ca-NAT）

真菌のマクロファージ破壊脱出機構を調べるために，カが既報の細胞質型ホスホリパーゼ A2 のε型であること

ンジダ真菌とマクロファージを相互作用させた後，分が報告された．しかしながら，その詳細な機能解析は行

離せずにナノ LC-MS/MS で測定可能なゲノム情報を基われておらず，特にヒトにおける同酵素の性状などは明にしたミックスドプロテオーム解析の系を新しく構築

らかになっていない．そこで本研究では，ヒトおよびマ

した．その結果，カンジダ真菌は，マクロファージに貪ウス Ca-NAT の精製組換えタンパク質を用い，同酵素

食されたのち，封鎖された解糖系からエネルギー生産系の性状および機能解析を行った．

をグリオキシル酸回路系にシフトさせ，ストレス耐性タ【方法】

ンパク質や病原性タンパク質も生産していることが推測

FLAG タグを付加したヒトおよびマウス Ca-NAT をされた．そこで，グリオキシル酸回路の主要タンパク質

COS-7 細胞または HEK293 細胞で過剰発現させ，組換酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

えタンパク質を抗 FLAG 抗体が結合したアフィニティー

膜の炎症を惹起し，胃がんを含む様々な胃関連疾患をひカラムで精製することで不純物を除き，高度精製組換え

き起こす．これらのことから，同疾患の予防にピロリ菌

タンパク質を調製した．本組換えタンパク質を酵素源との除菌が有用であると考えられている．しかしながら，して，性状解析を行った．

現行の除菌治療に使われている抗生物質に耐性を示すピ【結果】

ロリ菌の出現や，抗生物質による副作用の発生が，治療

ヒトのオルソログにはデータベース上で２種類のアイ

成功率の低下につながっており，近年特に問題視されてソフォームが存在したが，そのいずれもがマウス酵素といる．我々はピロリ菌に選択性を有し，高い除菌効果を同様の活性を示すことが明らかになった．次に，２価カ示す治療薬の開発を目指した．

チオンの選択性を検討した結果，活性発現には Ca２＋ が【方法】

必須であり，他の２価カチオンは無効であるか，ごく弱

我々のグループは放線菌の培養液に含まれる

依存Intervenolin (ITV) が試験管内の系で高い抗ピロリ菌活的なリン脂質への結合に関わるとされる C2 ドメインが性を有することを見出し，ITV をリード化合物としたＮ末端側に存在する．種々のリン脂質による酵素活性へ

合成展開により多くの類縁体を作製した１）．ここで得らの影響を検討したところ，Ca２＋ 存在下でホスファチジ

れた ITV 類縁体において，強い抗ピロリ菌活性を有し，ルセリンによって強く活性化され，その効果は濃度依存かつマウスを用いた毒性試験で副作用の弱いものを抽出的であった．

した（AS-1664, AS-1934）．ITV および同類縁体の作【考察】

用機序を試験管内の系を用いて解析し，さらにマウスピい作用を示した．Ca-NAT の一次構造には，Ca２＋以上の結果から，ヒトおよびマウスの Ca-NAT の Nアシル転移酵素活性は，細胞内でホスファチジルセリ

ロリ菌感染モデルを用いて抗ピロリ菌活性を評価した．
【結果】

ンの存在下で Ca２＋によって制御されることが示唆されITV および同類縁体は抗生物質耐性菌を含むピロリ菌

た．現在，Ca-NAT 欠損マウスの生化学的解析を行ってに抗菌活性を示すのに対し，腸内細菌を含むほとんどいるので，これと並行して N-アシルエタノールアミンの一般細菌に対して抗菌活性を示さなかった．このピの摂食制御機構の解析に着手する予定である．

ロリ菌選択的抗菌活性に関与する標的分子として，ピ【文献】

ロリ菌のピリミジン生合成系酵素 DHODH を同定した．

Hussain, Z., Uyama, T., Kawai, K., Mustafiz,

さらに ITV 類縁体 AS-1934 単剤経口投与は，マウス

SSB., Tsuboi, K., Araki, N. & Ueda N.:

モデルにおいて既存の３剤併用療法（clarithromycin,

Phosphatidylserine-stimulated production of N-acyl-

amoxicillin, omeprazole）に比べて有意に強い抗菌活

phosphatidylethanolamines by Ca 2+-dependent性を示した２,３）．

N-acyltransferase, Biochim. Biophys. Acta, 8,【考察】

493-502 (2018).

以上の結果は，ITV 類縁体 AS-1934 の臨床応用の可能性を示唆するものである．
【文献】

ピリミジン生合成系酵素を標的としたピロリ菌治療薬の開発
大１）Kawada, M. et al.: Intervenolin, a new antitumor
compound with anti-Helicobacter pylori activity,

石

智

一

（微生物化学研究会微生物化学研究所）

from Nocarcia sp. ML96-86F2. J. Antibiot., 66,
543-548, (2013).
２）Ohishi, T. et al.: Monotherapy with a novel【目的】
世界中の約 50％のヒトが感染していると言われているヘリコバクター・ピロリ（ピロリ菌）の感染は，胃粘intervenolin derivative, AS-1934, is an eﬀective
treatment for Helicobacter pylori infection. He-

licobacter, 23, e12470, (2018).
酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

３）Ohishi, T. et al.: Dihydroorotate Dehydrogenase【結果と考察】as a Target for the Development of Novel Heli-（１）細胞をスプライシング阻害剤で処理し，その際のcobacter pylori-Specific Antimicrobials. Chem.

転写関連因子をウェスタンブロッティングで検出した

Pharm. Bull., 66, 239-242, (2018).

が，顕著なタンパク量の変化は観察されなかった．しかしながら，これらの因子が RNA ポリメラーゼⅡへと正常にリクルートされているかどうかは明らかになってい遺 伝 子 発 現 の 正確性を担保するスプライシン グ
チェックポイント機構の解析
甲斐田大輔（富山大学大学院医学薬学研究部（医学））ない．今後は，クロマチン免疫沈降実験などにより，転写関連因子のリクルートを調べることでメカニズムを明らかにできるかもしれない．
（２）種々の RNA 結合タンパク質を細胞で過剰発現させ，それらの細胞をスプライシング阻害剤で処理したところ，いくつかの RNA 結合タンパク質を発現させた細【目的】

胞では，転写活性が回復していた．また，スプライシ

真核細胞においては，転写されたばかりの mRNA

ング活性には影響を与えなかった．これらのことから，(pre-mRNA) はスプライシングにより成熟型 mRNA と

RNA 結合タンパク質は，スプライシング活性を上昇さなる．スプライシングを行うのは，スプライソソームとせることで結果的に転写を回復させるわけではなく，直呼ばれる巨大酵素複合体である．

接転写因子に働きかけている可能性が高い．しかしなが私たちはスプライシング阻害が転写伸長を抑制するこら，これらの RNA 結合タンパク質の過剰発現によってとを見出した．しかしながら，細胞がスプライシング異も，転写関連因子のタンパク量には影響がなかったこと

常を感知する機構や，スプライシング異常の情報を Polから，転写関連因子のリクルートに影響を及ぼしているⅡへと伝達する機構は明らかになっていない．そこで，可能性がある．また，そのうちの一つの RNA 結合タン

本研究では，スプライシング阻害時における，転写関連

パク質は mRNA の安定性にも影響を与えていることが因子やスプライソソームの挙動を解析することにより，明らかとなった．この点についても，将来的に明らかにスプライシングチェックポイント機構の存在を証明し，していきたい．

その詳細なメカニズムを解明することを目的とした．
【方法】（１）スプライシング異常が転写伸長抑制を引き起こすメカニズムの解析

コンドロイチン硫酸の発現調節酵素による骨格筋分

スプライシング異常が転写伸長に与える影響を解析す

化・再生制御るために，スプライシング阻害剤スプライソスタチン A

北

川

裕

之
（神戸薬科大学薬学部）

で細胞を処理し，その際の転写関連因子の発現量に変化があるかどうかをウェスタンブロッティングで確認した．
（２）RNA 結合タンパク質の関与の検討【目的】
超高齢化社会を迎えた本邦において，自立性喪失の

種々の RNA 結合タンパク質が，スプライシング異常

要因の一つである筋萎縮症（サルコペニア）は，健康による転写伸長抑制を回復させる可能性を検討するため寿命の延伸のみならず，要介護状態への移行を防ぐ上に，RNA 結合タンパク質を細胞内で過剰発現させ，そで克服すべき重要な課題である．これまでに我々は，の後，スプライシング阻害剤で細胞を処理し，その際の硫酸化多糖の代表格で，主要な細胞外マトリックス

転写活性に変化があるかどうかを確かめた．

（ECM）成分であるコンドロイチン硫酸（CS）鎖の一過的な発現低下が骨格筋分化の進行促進に必要であるこ

8

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成と，また，細菌由来の CS 分解酵素（コンドロイチナー

酵素を利用したサルコペニア克服のための新たな治療法

ゼ ABC: ChABC）を筋損傷部位に単回投与することにの確立に繋がることが大いに期待される．

よって，筋損傷モデルマウスの再生促進や，筋ジストロ【文献】

フィーモデルマウスの症状改善に著効を示すことを見出

１）Mikami, T., Koyama, S., Yabuta, Y., & Kitagawa,

した１,２）．したがって，ChABC 投与のように，筋組織

H.: Chondroitin sulfate is a crucial determinant

内の CS 鎖の発現を一過的に減少させる手段は，骨格筋

for muscle development/regeneration and

自身のもつ再生能力を賦活化し，サルコペニアの進行遅improvement of muscular dystrophies, J. Biol.

延や改善を図る有効な治療戦略として，その応用が期待

Chem., 28, 38531 (2012).

される．しかしながら，ChABC は，CS 鎖のみならず，

２）Mikami, T. & Kitagawa, H.: Biosynthesis andCS 鎖に並ぶ ECM 成分であるヒアルロン酸の分解にもfunction of chondroitin sulfate, (2013) Biochim.

寄与すること，また，ChABC 処理により生じる CS 鎖

Biophys. Acta, 80, 4719 (2013).

の分解産物は，哺乳類組織中には通常存在し得ないもの
であり，強い抗原性を有することが知られている．そのため，ChABC に代わるより安全性の高い酵素，すなわ
ち，「骨格筋分化・再生過程の進行を正に制御する哺乳神経特異的メタロプロテアーゼ DINE の新たな機類由来の CS 鎖の発現調節酵素」の同定が望まれている．

能解析

そこで本研究では，個体レベルでの骨格筋分化・再生に

木

山

博

資
（名古屋大学医学系研究科）

寄与する CS 鎖の発現調節酵素の同定を目的とした．
【方法】
骨格筋再生過程において，CS 鎖の発現量低下に貢献【目的】

する調節酵素を同定するため，実験的筋損傷モデルマウ

運動ニューロンの軸索損傷時に発現が促進する分子のスの再生途上筋や筋衛星細胞の休止・活性化状態におけ探索過程で，膜一回貫通型の新規メタロプロテアーゼをる CS 鎖の生合成／分解系に関与する酵素群の発現動態

我々は 2000 年に同定し，Damage Induced Neuronalを調べた．また，当該調節酵素の発現プラスミドを電気Endopeptidase (DINE) と 名 付 け た (Kiryu-Seo et al,

穿孔法によりマウス後肢の筋肉内へ局所導入した筋線維

PNAS 2000). DINE (ECEL1) は， エ ン ド セ リ ン を 切

上における CS 鎖の発現変化の有無を評価した．

り出す ECE や Aβを分解するネプリライシン（NEP）【結果・考察】と極めて構造が類似しているが，基質は共有しない．

哺 乳 類 に お い て CS 鎖 の 分 解 に 寄 与 す る と さ れ る

DINE は成熟神経系では，末梢や中枢を問わず神経軸索

HYAL ファミリーメンバーに着目したところ，特定の障害に鋭敏に応答して強力な発現誘導がかかる．このこ

HYAL タンパク質のみが筋損傷に同調した発現変動を示とは，神経・精神疾患をはじめ神経細胞の障害において，すことが分かった．本酵素の発現シグナルは，損傷部位

DINE が何らかの重要な役割を担っていることを予想さにおける浸潤細胞や再生途上筋周囲の筋衛星細胞と思わせる．DINE ノックアウトマウスは生直後に横隔膜の機れる細胞で強く観察された．単一筋線維培養系を用いた能不全により呼吸できず死に至る．この原因は運動神経解析から，当該 HYAL タンパク質の発現は，活性化しが標的の骨格筋に至ってから，神経の分岐がうまくいかた筋衛星細胞で特異的に誘導されることがわかった．本ず，結果として神経筋接合部（NMJ）の形成が著しく酵素の発現プラスミドを導入した筋線維で CS 鎖の発現低下することによる．DINE の機能の解明には基質の同低下が観察された．

定が必要であるが，現在 DINE の基質探索は難渋していこれらのことから，特定の HYAL タンパク質が，局る．一方で，DINE ノックアウトの生直後の致死性をレ

所的な CS 鎖の発現低下に寄与し，骨格筋再生を助長す

スキューすることにより，ノックアウトした成熟動物を用いる細胞自律的な調節酵素である可能性が示唆された．本てさまざまな表現型の解析が可能になった．本研究では，

9酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

これらの動物を用いて DINE の機能解明をめざした．

し た メ ロ テ ル ペ ノ イ ド で あ る．Naphterpin や 1 と【方法・結果】

共 通 の ポ リ ケ タ イ ド 骨 格 を 持 つ Napyradiomycin,

胎生期の NMJ 形成を可能にするため，胎生期の運動

Furanonaphthoquinone な ど の メ ロ テ ル ペ ノ イ ド もニューロンに一過性に発現する Hb9 のプロモーターを他の放線菌によって生産されることが報告されてい用い，その下流で DINE を発現するトランスジェニッ

る．これらメロテルペノイドに共通のポリケタイド骨

クマウスを作成し，ヘテロマウスと交配した．これによ格は，Naphterpin の生合成遺伝子群（nph）にコード

り，胎生期から生直後の一時期にのみ運動ニューロンでされる NphC-E や，そのホモログである Furaquinocin

DINE が発現し，致死性を回避できた．このマウスを用の生合成遺伝子群 ( fur ) の Fur1-3 によって，５分子のいて中枢神経系の再生における DINE の機能解明を行

malonyl-CoA と L-グルタミン酸から 8-amino-ﬂaviolin

なった．DINE の中枢神経再生に関する機能解析には，(8-AF, 2) を経由して形成される．しかしながら，いず視神経損傷モデルを用いた．損傷視神経は通常再生しなれの最終産物のメロテルペノイドにおいても 8-AF にあいがザイモザン等で炎症応答を惹起すると一部再生するアミノ基が存在しない．したがって，8-AF 以降の生る．DINE ノックアウトでは，これによる視神経再生が著合成の過程で芳香環からの脱アミノ化が起こると推定さ

しく阻害された．この結果から DINE は神経軸索再生にれる．しかしながら，その脱アミノ化の詳細な反応機構

とって何らかの役割を担っていると考えられる．

や触媒する酵素の実体については不明なままである．本【考察】

研究課題では，この未知の脱アミノ化機構の全容解明をDINE は末梢運動神経や知覚神経の軸索再生に加えて，中枢神経系の軸索再生にとって重要な酵素であるこ目的としている．
【方法】とが明らかとなった．今後の基質探索によりさらに詳細

1 の 生 合 成 に お い て は， ゲ ラ ニ ル 基 転 移 酵 素

な機能解明がなされ，神経再生医療に貢献することが期（Fur7） の 基 質 で あ る 生 合 成 中 間 体，2-methoxy-3-

待される．

methylﬂaviolin (3) も同定されている．3 には既にアミ【文献】

ノ基が存在しないことから，2 から 3 への過程で未知の

１）Kaneko, A., Kiryu-Seo, S., Matsumoto, S. & Ki-

脱アミノ化が起こると考えられる．Fur4 と Fur6 はいyama, H.: Damage-induced neuronal endopep-

ずれも methyltransferase であり，Fur5 は他のメロテ

tidase (DINE) enhances axonal regeneration po-

ルペノイド生合成遺伝子クラスター間でも高度に保存

tential of retinal ganglion cells after optic nerve

された機能未知タンパク質である．そこで Fur5 が脱ア

injury, Cell Death & Disease 8(), e2847,(2017).

ミノ化反応に直接関与すると推定し，これら Fur4, 5, 6の各組換え酵素の in vitro 解析を実施した．なお，Fur5は可溶性の組換えタンパク質として取得できなかったた

放線菌のメロテルペノイド生合成における普遍的脱アミノ化反応に関する研究
葛

山

智

久

（東京大学生物生産工学研究センター）

め，Naphterpin 生合成クラスター中に存在する Fur5
ホモログ，NphH を代わりに用いた．
【結果・考察】
2 から 3 への変換が，亜硝酸塩と ATP と SAM の存在下で Fur4, Fur6, NphH の３つの酵素依存的に起こることを見出した．また，脱アミノ化反応が NphH 依存【目的】

的に進行することを明らかにした．さらに，この脱アミ本研究では，放線菌が生産し抗酸化活性と抗腫瘍活ノ化の過程は，ジアゾ基を持つ化合物 4 を経由すること，性を示す二次代謝産物，Naphterpin と Furaquinocin

亜硝酸塩の窒素原子と 2 のアミノ基に由来する窒素原(1) の生合成を研究対象とする．これらの天然化合物

子とのハイブリッドな窒素ガスが放出されることを明ら

は，テルペノイド骨格とポリケタイド骨格とが融合かにした．このようなジアゾ化合物を経由する脱アミノ

0酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

化反応を担う酵素の前例はなく，NphH (Fur5) は新奇

るウイルス検出実験に比べ，約８倍の高感度化に成功しな反応機構を持つユニークな酵素と考えられる．

た．興味深いことにウイルスシアリダーゼの活性は 37
度よりも高温条件にした方が高まることが分かり，およそ 50 ～ 60℃付近が短時間の反応では高い活性を示す
ことがわかった．さらにフィルターを用いた簡易濃縮法を行い，最適化した反応条件で酵素反応を行うことで最終的に既報の検出実験と比較して 200 倍以上の高感度

シアリダーゼ活性イメージングによる薬剤耐性イン
フルエンザウイルスの検出法開発
紅

林

佑

希

化に成功した．このウイルス検出法にシアリダーゼ阻害剤を併用することで，薬剤耐性インフルエンザウイルスの検出を行うことが出来た．
【考察】（静岡県立大学薬学部）

ウイルスシアリダーゼの酵素反応条件の最適化と遠心ろ過を利用したウイルス濃縮法を組み合わせることで【目的】

200 倍以上の高感度化に成功した．ウイルスシアリダー

申請者らは最近インフルエンザウイルスが持つシアリゼの活性は変異の激しいインフルエンザウイルスにおいダーゼ酵素活性を高感度，迅速，簡便に蛍光イメージンてウイルス間で高いレベルで維持された活性であり，本グ可能な試薬 BTP3-Neu5Ac を開発し，ウイルスや感研究においてもＡ型やＢ型の違い，亜型の違いに関わら

染細胞の蛍光イメージングを可能にする技術を確立させずウイルス検出および薬剤耐性の判定が可能であった．

た．BTP3-Neu5Ac によるウイルス検出法はウイルスの現在は，衛生検査機関の検体や臨床検体における本法のライブイメージングや蛍光単離法，薬剤耐性の検出に利

有用性について検討を行っている．

用可能である．本研究では，BTP3-Neu5Ac を用いて，【文献】

抗インフルエンザ薬であるシアリダーゼ阻害剤に対する

１）Kurebayashi, Y. et al.: High-eﬃciency capture

薬剤耐性獲得ウイルスのスクリーニングに利用可能な高of drug resistant-inﬂuenza virus by live imaging

感度検出法の確立を試みた．

of sialidase activity. PLoS ONE1(5): e0156400【方法】(2016).

高感度な薬剤耐性インフルエンザウイルスの検出法

２）Kato, D., Kurebayashi, Y. et al.: An easy, rapid,を確立するため，BTP3-Neu5Ac によるウイルスシアリ

and sensitive method for detection of drug-

ダーゼ検出時の酵素反応条件の最適化を行った．ウイ

resistant influenza virus by using a sialidase

ルスシアリダーゼの活性に重要な Ca 濃度や反応温度，

ﬂuorescent imaging probe, BTP3-Neu5Ac. PLOS

pH について最適条件を求めた．さらに高感度化を行う

ONE 13(7), e0200761 (2018).

ためウイルスの遠心フィルタートラップによる簡易濃縮法を検討した．ウイルスをフィルター上に遠心ろ過で濃縮し，フィルター上で BTP3-Neu5Ac と反応させることで検出感度の向上を行った．
確立した検出法において，反応時にシアリダーゼ阻害剤を添加することで，シアリ

細胞内シグナルのアナログ・デジタル変換の鍵となる ERK 核内移行のメカニズム解明
小

迫

英

尊
（徳島大学先端酵素学研究所）

ダーゼ活性に耐性を示すウイルスのみ酵素反応が起こり蛍光イメージングされる薬剤耐性ウイルス検出法を検討した．
【結果】
反応条件の最適化により既報の BTP3-Neu5Ac によ【目的】
ERK/MAP キナーゼは真核生物に普遍的に存在し，細胞の増殖・生存・分化・がん化などの運命決定に深く関

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成与している．このような細胞運命決定はデジタルな現象のヌクレオポリンのノックダウン実験から，ERK はヌであり，ERK の応答もデジタルなスイッチのように制クレオポリンのリン酸化を介して自身の核内移行をデジ御されると推測される．我々は最近，ERK のリン酸化

タルな応答となるように制御していることが示唆され応答ではなく，ERK の核内移行のステップでアナログた．このような ERK の核内移行のデジタルな応答特性な情報からデジタルな情報に変換されることを明らかにが，様々な細胞運命決定において生理的に重要かどうかした．このデジタルな核移行応答には ERK 自身のキナーを明らかにすることは今後の課題であると考えられる．

ゼ活性が必要であることを示したものの，ERK の核内【文献】

移行の仕組みについては不明な点が多い．そこで本研究

１）Shindo, Y., Iwamoto, K., Mouri, K., Hibino, K.,

では，最先端プロテオミクス技術を含む様々な方法にTomita, M., Kosako, H., Sako, Y. & Takahashi,

よって，アナログ・デジタル変換を生み出す ERK の核

K.: Conversion of graded phosphorylation into内移行の分子メカニズムを明らかにすることを試みた．

switch-like nuclear translocation via autoregu-【方法と結果】

latory mechanisms in ERK signalling, Nature

１）ERK 活性化前後の HeLa 細胞から抽出液を調製し，Commun., 7, 10485 (2016).

トリプシン消化後に IMAC (immobilized metal aﬃnity２）Motani, K. & Kosako, H.: Phosphoproteomic

chromatography) によってリン酸化ペプチドを精製しidentification and functional characterization

た．LC-MS/MS を用いたラベルフリー定量および PRMof protein kinase substrates by 2D-DIGE and(parallel reaction monitoring) によるターゲット定量

Phos-tag PAGE, Biochim. Biophys. Acta, doi:の結果，様々な核膜孔複合体構成因子（ヌクレオポリ

10.1016/j. bbapap. 2018. 06. 002 (2018).

ン）の多数の部位が ERK 依存的にリン酸化されることが判明した．さらにこれらのヌクレオポリンが ERK によって細胞内で stoichiometric にリン酸化されることを Phos-tag ウェスタンブロット法で明らかにした．
２）リン酸化または非リン酸化ヌクレオポリンをビーズ

レプチンシグナルを制御する新規機構の解明
新に固相化し，GFP 融合タンパク質と混合して顕微鏡観

谷

隆

史

（自然科学研究機構基礎生物学研究所）

察することで相互作用を検出する方法（Bead Halo アッセイ）により，一部のヌクレオポリンは ERK によってリン酸化されるとリン酸化型 ERK との結合が強まるこ【目的】
脂肪細胞から分泌されるレプチンは，摂食中枢であるとを見出した．

視床下部内の弓状核に働いて摂食を強力に抑制するホル

３）核内移行に伴って ERK と弱く一過的に相互作用すモンである．肥満症患者の多くは血中レプチン濃度が上る因子を大規模に同定するため，ERK にビオチンリガー

昇しているにも関わらず，レプチンによる摂食量や体重ゼを融合させて細胞内に発現させ，BioID（近位依存性の減少が認められない．すなわち，視床下部において「レ

ビオチン標識）による相互作用因子の大規模同定を行っプチン抵抗性」と呼ばれるレプチンの作用不全が生じる

た．その結果，様々なヌクレオポリンや核輸送運搬体をことが知られている．しかしながら，レプチン抵抗性の含む多数のタンパク質が同定された．

発症機序は十分に明らかになっておらず，その治療法も【考察】見つかっていない．

本研究により，細胞外刺激によってリン酸化されて活本研究においては，受容体型プロテインチロシンホス性化した ERK は様々なヌクレオポリンをリン酸化し，ファターゼである PTPRJ によるレプチンシグナルの制

リン酸化型ヌクレオポリンはリン酸化型 ERK との相互御について解析を行った．さらに，PTPRJ のレプチン作用が増強することで ERK の核内移行を促進するとい

抵抗性発症における役割について解析した．

うモデルが考えられた．数理モデルを用いた解析や一部

2

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成【方法と結果】
in-cell NMR による細胞中のライソゾーム病関連

Ptprj 遺伝子欠損マウスを用いて PTPRJ によるレプ酵素の構造解析

チンシグナルの制御機構を解析した．Ptprj 欠損マウス

菅は野生型マウスに比べて摂食量が少なく，脂肪量が少な

瀬謙治（京都大学大学院工学研究科）

いため低体重であった．また，Ptprj 欠損マウスの脳室内にレプチンを投与すると，野生型マウスに比べてレプチンシグナルの情報伝達分子である STAT3 の活性化

【目的】が顕著に亢進するとともに摂食量及び体重が有意に減少

ライソゾームは，細胞中で不要となった生体分子を分することが観察された．生化学的解析から，PTPRJ は解するオルガネラである．ライソゾームの加水分解酵素

レプチンシグナル伝達に必須の役割を果たしているプロに異常があると分解されるべき物質が老廃物として体内

テインチロシンキナーゼの JAK2 を脱リン酸化することに蓄積してしまう．異常がある酵素に応じて様々な症状

でレプチン受容体の活性化を抑制していることが判明を示し，多くの場合，若くして死に至る．これらの疾患した．実際に，PTPRJ に対する阻害剤を作用させると，は総じてライソゾーム病と呼ばれる．これまでに，正JAK2 及びレプチン受容体のリン酸化が亢進した．一方，常な酵素を外部からエンドサイトーシスを介してライソ

PTPRJ のレプチン抵抗性の獲得における役割についてゾームに取り込ませる酵素補充療法と呼ばれる治療法が検討したところ，高脂肪食摂取により視床下部において開発されている．しかし，酵素補充療法で導入した全て

PTPRJ の発現が上昇することが明らかになった．さらの酵素がプロセシングにより成熟してライソゾームに移に，Ptprj 欠損マウスを高脂肪食で長期間飼育しても野行しているか否かが判断できていない．この問題は必要

生型マウスのようにレプチン抵抗性は発症しなかった．

な投与量や投与法を最適化する上で重要である．本研究

また，ウイルスを用いて弓状核で PTPRJ を高発現させでは，当研究室が開発した in-cell NMR を用いて，酵るとレプチン抵抗性が生じた．

素補充療法を模倣して外部から導入した酵素のライソ【考察】

ゾーム内構造を解析するための方法論開発を行った．解本研究から，PTPRJ が視床下部におけるレプチンシ

析対象としては，まずはライソゾームタンパク質の約

グナルの制御において重要な役割を果たしているととも10％を占めるヒトカテプシン D (hCTSD) を選定した．

に，肥満時に視床下部において PTPRJ の発現が上昇す【方法】

ることがレプチン抵抗性の要因であることが示唆され

hCTSD は，細胞内でマンノース６リン酸（M6P）修た．一方，我々は，PTPRJ がインスリン受容体を基質

飾されてライソゾームに運ばれる．しかし，M6P 修飾とすることでインスリンシグナルを抑制していることを

hCTSD を大量調製するのは極めて困難である．そこで，既に明らかにしている．このため，PTPRJ の活性阻害

本研究ではライソゾーム移行を誘導する GILT と呼ばれ剤は，肥満症及び糖尿病の新規の治療薬となることが期

るペプチド性タグを用いた．また，導入する hCTSD の待される．

NMR シグナルを感度良く観測するためにリジン残基の【文献】

Cジメチル化を施した．従来の in-cell NMR では 15N

13

Shintani, T., Higashi, S., Suzuki, R., Takeuchi, Y.,

アミド基を測定するが，13C ジメチル化リジンでは，同Ikaga, R., Yamazaki, T., Kobayashi, K. & Noda,

じ位置に６つの 1Hシグナルが現れるため感度が６倍に

M.: PTPRJ inhibits leptin signaling, and induction

向上する．

of PTPRJ in the hypothalamus is a cause of the【結果】

development of leptin resistance. Sci. Rep., 7, 11627(2017).

hCTSD が大腸菌発現系で封入体として発現されたため，まずはリフォールディング条件を検討した．その結果，8M 尿素と 0.4M アルギニン溶液で封入体を可溶化
し，ゆっくりと尿素とアルギニンを抜くことでリフォー酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

ルディングに成功した．Ｃ末端に GILT タグを融合したらかにした２）．そこで本研究では，本酵素の生物界におhCTSD-GILT の場合でも，同様にリフォールディング

ける分布や糖鎖への Pv 付加の生物学的役割について解し，活性も有していた．さらに，hCTSD-GILT を HeLa

析することを目的とした．

細胞に添加したところ，ライソゾームに移行することが【方法・結果】

確認された．また，hCTSD-GILT を 13Cホルムアルデヒ

これまでに真核微生物において糖鎖へのピルビン酸

ドとジメチルアミンボランを用いてリジン残基のジメチの付加が報告された例は分裂酵母以外はない．そこ

ル化することに成功した．

でデータベースにより分裂酵母の Pv 転移酵素と相同【考察】

性の高いタンパク質を検索したところ，Fusarium や

現 在 ま で に， ラ イ ソ ゾ ー ム 内 の hCTSD を in-cell

Trichoderma などの糸状菌にもホモログが存在するこNMR で解析するための試料が調製できた．しかし，ことがわかった．そこで，これらの遺伝子を各種糸状菌ゲれまでのところ，感度が足りないためかライソゾーム

ノムおよび cDNA ライブラリーから増幅し，大腸菌を内の hCTSD のシグナルを in-cell NMR で検出するに用いてタンパク質を生産した．組換えタンパクと基質と至っていない．そこで，今後は，HeLa 細胞に添加する

してホスホエノールピルビン酸と 4-ニトロフェニル糖

hCTSD-GILT の量の最適化や，NMR 管内の培地を循環を添加して反応を行ったが，酵素生産物を得ることがでし細胞の寿命を延長させるバイオリアクターを使用しきなかった．また，分裂酵母の pvg1 破壊株に糸状菌のて，hCTSD のシグナルの検出を試みる．

ホモログ遺伝子を発現させても，糖鎖への Pv の付加は確認できなかった．これらの結果は，糸状菌と分裂酵母

真核生物における糖鎖へのピルビン酸転移酵素の特性解析と酸性糖鎖の生理的役割の解明
竹川薫の転移酵素の基質特異性が異なっていることが示唆された．
【考察】
本 研 究 で は， 分 裂 酵 母 Pvg1 と 相 同 性 の 高 い 遺 伝（九州大学農学研究院）

子が数種の糸状菌ゲノムに存在することがわかった
が，これらのホモログ遺伝子が実際に転移活性を有していることは明らかにできていない．そこで現在【目的】
生物の細胞表層糖鎖は，多くの場合細胞表面を負電荷

は 各 種 糸 状 菌 よ り 細 胞 表 層 多 糖 を 調 製 し て，NMRにすることに貢献している．細胞表層が酸性化している解 析 に よ り 糖 鎖 へ Pv が 実 際 に 付 加 し て い る か 解 析

理由としては，細胞への物質の流入や排出，細胞同士のを 行 っ て い る． ま た 最 近， 我 々 は ３ つ の 分 裂 酵 母

接着や病原体の宿主への接着などに重要な役割を担って（S. japonicus, S.octosporus, S. cryophilus） ゲ ノ ム にいる．数多くの酸性糖類，例えばウロン酸，ムラミン酸

pvg ホモログ遺伝子が存在することを見出し，実際にこやリン酸化・硫酸化糖，さらにシアル酸などがこれまで

れらの遺伝子は細胞内で発現していることも確認していに報告されているが，糖にピルビン酸が付加したピルビ

る．しかしながら，これらの株の糖鎖中への Pv 付加量

ン酸化（Pv化）糖も存在する．糖鎖への Pv の付加は，には差があることもわかった．今後は糸状菌類の糖鎖へ

原核細胞において普遍的な酸性糖鎖の構成成分として広の Pv 付加について構造解析を網羅的に行うことにより，く存在しているが，真核生物において糖鎖への Pv の付

転移酵素の基質特異性と機能を明らかにしていきたい．

加に関する報告は大変少ない．真核微生物である分裂酵【文献】

母 Schizosaccharomyces pombe の糖鎖末端にはガラク

１）Yoritsune, K., Matsuzawa, T., Ohashi, T. &トースの４位と６位に Pv がケタール結合している．我々

Takegawa, K.: The ﬁssion yeast Pvg1p shows

はこれまでに糖鎖への Pv の付加を触媒する転移酵素がgalactose-specific pyruvyltransferase activity,

Pvg1 であることを証明した ．さらに Pvg1 の立体構

FEBS Lett., 587, 917-921 (2013).

１）

造解析を明らかにして Pv 付加の反応機構についても明２）Higuchi, Y., Yoshinaga, S., Yoritsune, K., Tate-

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

no, H., Hirabayashi, J., Nakakita, S., Kanekiyo,

塑性を誘導する主要な酵素であることが分かっている．

M., Kakuta, Y. & Takegawa, K.: A rationally

CaMKIγの遺伝改変マウスを用いた本研究により，本酵

engineered yeast pyruvyltransferase Pvg1p

素は “扁桃体中心核シナプスにおいて可塑的変化を担う

introduces sialylation-like properties in neo-

主要な Ca２＋エフェクター酵素である可能性が高い” こhuman-type complex oligosaccharide, Sci. Rep.,とが支持された．今後，その上流・下流のシグナリング

, 26349 (2016).

ネットワークを解明することで，情動制御に寄与する新規カルシウム依存性シグナリング経路の全貌解明を目指
したい．
【文献】

カルシウム依存性タンパク質リン酸化酵素による扁桃体機能修飾と情動制御
竹本１）Takemoto-Kimura, S. et al.: Calmodulin kinases: essential regulators in health and disease.

J. Neurochem. 141 (6): 808-18, 2017.

さやか（名古屋大学環境医学研究所）

２）Ageta-Ishihara, N., Takemoto-Kimura, S. et al.:Control of cortical axon elongation by a GABAdriven Ca ２＋/calmodulin-dependent protein【目的】
情動（怖い，嬉しい，悲しいなど）は，環境や遺伝的背景に応じて変化し，過度なストレスなどによる情動異常

kinase cascade. J. Neurosci. 29 (43): 13720-9,
2009.

が，現代における社会問題ともなっている．我々は，モ

３）Takemoto-Kimura, S. et al .: Regulation of

デル動物を用い情動変化を引き起こす分子メカニズムのdendritogenesis via a lipid-raft-associated Ca2+/

解明を目指している．本研究では，神経細胞の可塑的変

calmodulin-dependent protein kinase CLICK-化に重要な役割を果たすカルシウム依存性タンパク質リ

III/CaMKIgamma. Neuron 54 (5): 755-70, 2007.

ン酸化酵素 (CaMK)１－３）のうち，自らが同定・クローニングを行った CaMKIγに焦点を当て，新たな情動制御因子であることを明らかとすることを目的とした．
【方法・結果】

MAP キナーゼの刺激特異性維持に働く二段階活性

CaMKIγのノックアウトマウスの行動学的評価を推化機構の解析

進し，ノックアウトマウスにおける情動行動の異常を見

舘

林

和

夫
（東京大学医科学研究所）出した．また，特に本酵素の発現の多い，扁桃体における機能を明らかとするため，アデノ随伴ウイルスを用いてマウス扁桃体において本酵素を過剰発現させた際の行【目的】

動学的評価を実施し，一部の行動学的評価において対照

酵母は細胞外の高浸透圧環境に適応するために細胞的な結果を得た．更に，脳内および神経細胞内局在を明

内グリセロール濃度を上昇させるが，ここで働くのがらかとするために組織学的な検討を推進し，本酵素は不高浸透圧に応答して活性化する Hog1 MAP キナーゼ

快情動中枢を構成する扁桃体の特定細胞種において多く（MAPK）経路である．我々は高浸透圧を感知し Hog1

発現し，特に樹状突起スパインに局在することを見出し

MAPK の活性化に働くセンサーとして複数の膜タンパ

た．

ク質を同定してきた１,２）が，Hog1 の活性化には上流の【考察】

膜センサーからの活性化シグナルに加え，Hog1 自身の細胞内 Ca２＋ 上昇によって活性化されるカルシウム

高浸透圧感知と応答が必要であることを示唆する新たな上昇を知見を得た．Hog1 MAPK が高浸透圧に直接応答し活細胞内生化学的変化，即ちリン酸化に変換し，神経可性化する分子機構を解明し，その生物学的意義をシグナ

依存性タンパク質リン酸化酵素は，神経 Ca２＋酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

ル伝達の面から理解することを目的として本研究を行った．
【方法，結果と考察】
酵 母 S. cerevisiae の 高 浸 透 圧 応 答 に 働 く Hog1

脳梗塞後の初期に大脳皮質ニューロンで発現する転写因子 Npas4 の解析
坪

井

昭

夫

（大阪大学大学院生命機能研究科）

MAPK 経路では，複数の膜センサーが高浸透圧を感知すると，下流のキナーゼが順次リン酸化されて，最終的に Hog1 MAPK がリン酸化・活性化される．上流の膜【目的】

センサー欠失変異体や，MAPK カスケードの各種活性脳血管障害は，本邦の死因の４位となる極めて発生頻型変異体を用いた遺伝学的解析により，Pbs2 MAPKK

度の高い疾患である．しかしながら，虚血により脳組織が Hog1 をリン酸化するステップが，高浸透圧により正が一度損傷を受けると，失われたニューロンを再生させに制御されることを見出した．さらに，変異体スクリー

る効果的な治療法は，未だ確立されていない．脳梗塞にニングにより高浸透圧刺激なしでも上流からのリン酸化より血流が阻害されると，梗塞巣の内部では，酸素や栄を受けやすくなった恒常活性型 Hog1 変異体の単離に成養の不足により大多数のニューロンは死滅する．一方，

功し，これを利用して Hog1 活性化の分子機構を解析し梗塞巣の境界には，血流が低下しながらも細胞死を免れた．その結果，酵母の Hog1 活性化には，センサー膜タている領域（penumbra）が存在し，ここでのニューロ

ンパク質を介した上流からの活性化シグナルと同時に，ンの細胞死を防ぐことが，臨床医学上の重要課題となっHog1 自身が刺激を感知しリン酸化を受けやすい構造にている１）．

変化する必要がある，という Hog1 の２段階活性化モデ【方法と結果】

ルが導出された．

１．中大脳動脈閉塞（MCAO: middle cerebral artery「 高 浸 透 圧 刺 激 が MAPK の 上 流 因 子 と MAPK 自 身

occlusion）の手術を行い，梗塞（0.5 時間）・再灌の両者に作用して初めて Hog1 が活性化する」という流モデルマウスを作製した．

Hog1 の２段階活性化機構は，上記活性型 Hog1 を用い

２．梗塞２時間後の大脳皮質において，梗塞巣との境た解析により，非刺激時における Hog1 の誤った活性化

界領域（penumbra）で発現が変化する遺伝子を，の抑制に働くことがわかった．さらに，高浸透圧以外のRNA シークエンシング法によりスクリーニングし刺激によって活性化された別の MAPK 経路から Hog1て，発現の変化する遺伝子をリストアップした．

への不適切な活性化（＝シグナルの混線）を防ぐため

３．そのリストの中から，梗塞側の penumbra での発にもこの機構は働いており，MAPK の２段階活性化機

現が反対側と比べて増加する遺伝子を，in situ ハ

構がシグナル特異性の維持に貢献していることが示され

イブリダイゼーション法を用いて 27 個に絞り込た．

んだ（申請者ら，未発表）．これらの中でも，転写【文献】

因子 Npas4 遺伝子は大脳皮質の興奮性ニューロン

１）Tatebayashi K, et al.: Osmosensing and scaf-

で顕著に発現誘導され，梗塞巣の境界に沿うよう

folding functions of the oligomeric four- trans-

な発現パターンを示すことが分かった（申請者ら，

membrane domain osmosensor Sho1. Nature

未発表）．

Communications, : 6975 (2015)

４．Npas4 欠損マウスでは野生型と比べて，梗塞後の２）Tatebayashi K, et al.: Transmembrane mucins

大脳皮質ニューロンの生存率が減少し，梗塞巣のHkr1 and Msb2 are putative osmosensors in the

サイズが拡大することが分かった（申請者ら，未SHO1 branch of yeast HOG pathway. EMBO J.

発表）．

2: 3521-3533. (2007).

５．Npas4 欠損マウスの梗塞後の運動機能について，
行動実験を用いて解析したところ，顕著に悪化することが分かった（申請者ら，未発表）．

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

また最近，申請者らは，
健常脳における嗅球介在ニュー本生化学会誌），88，220-224（2016）.

ロンの神経活動依存的なスパイン形成に，Npas4 が必須の役割を果たすことを見出した２－４）．これらの知見から，転写因子 Npas4 は，健常時のみならず障害時においても，ニューロンの発達や生存を促進することで，神経回路の再編に関与していることが示唆された（申請

直鎖状ユビキチン鎖生成酵素（LUBAC）を標的とした炎症シグナル制御
徳

永

文

稔

（大阪市立大学大学院医学研究科）

者ら，未発表）．
【考察と展望】
脳梗塞により損傷した神経細胞や神経回路を再構築す【目的】

る有効な方法の開発は，これからの超高齢化社会においNF-κB は，炎症や自然・獲得免疫応答に関連する遺て喫緊の課題の一つである．しかしながら，現在の脳梗

伝子発現制御を司る重要な因子である．我々は複合体型塞の治療法は，プラスミノーゲンアクチベーターを用いユビキチンリガーゼ（LUBAC）を発見し，LUBAC がた血栓溶解療法など，「血流を速やかに回復させること

ユビキチンのＮ末端 Met1 を介する「直鎖状ユビキチン

で，既存の神経細胞や神経回路を守る」ことに重点をお鎖」という新規ユビキチン鎖を生成し，NF-κB 活性化

いたもので，発症から治療までに有効な期間が制限されを導くことを見出した１）．また，LUBAC 活性制御の不ている．本研究は，申請者らが見出した「健常脳におけ全は，多様な疾患発症に関わることを示した２,３）．そこる神経回路の再編機構」を，「損傷脳における神経回路

で本研究で我々は，LUBAC による直鎖状ユビキチン鎖の修復機構」と比較検討することにより，これらの相違

生成を足場とした NF-κB 活性化経路を特異的に制御すを明らかにするのみならず，脳梗塞に対する新規治療法

る化合物を探索・開発する目的で，LUBAC の酵素活性の開発にもつなげるという点で独創的であり，期待され阻害剤などを探索し，細胞・個体レベルで評価することる．

を目的とした．

【文献】

【方法】

１）Lo, E. H.: A new penumbra: transitioning from

細胞レベルでの解析として，各種炎症性サイトカイン

injury into repair after stroke, Nat. Med., ,や病原体分子パターンなどによって惹起される炎症・免497-500 (2008).

疫シグナル伝達の活性化をルシフェラーゼアッセイ，定２）Yoshihara, S., Takahashi, H., Nishimura, N.,

量 PCR, ELISA，イムノブロットによって解析した．まKinoshita, M., Asahina, R., Kitsuki, M., Tat-

た，Ｂ細胞リンパ腫など癌細胞に対する選択的な細胞毒

sumi, K., Furukawa-Hibi, Y., Hirai, H., Nagai,

性や細胞死への影響を MTT アッセイ，カスパーゼ活性T., Yamada, K. & Tsuboi, A.: Npas4 regulates

化により調べた．さらに，標的分子に対する阻害剤の作Mdm2 and thus Dcx in experience-dependent

用機序を酵素・生化学的に解明するとともに，乾癬など

dendritic spine development of newborn olfac-疾患モデルマウスを用いて薬効の解析を行った．

tory bulb interneurons, Cell Rep., 8, 843-857【結果】(2014).

ま ず 我 々 は，25 万 個 の 化 合 物 ラ イ ブ ラ リ ー か３）Yoshihara, S., Takahashi, H. & Tsuboi, A.:ら LUBAC の 直 鎖 状 ユ ビ キ チ ン 鎖 生 成 を 抑 制 す る 化

Molecular mechanisms regulating the dendritic

合 物 の 探 索 を 行 い， 新 規 化 合 物（HOIPIN-1; HOIP

development of newborn olfactory bulb inter-inhibitor-1）を同定した４）．HOIPIN-1 の酵素阻害機構

neurons in a sensory experience-dependentとして，活性中心サブユニットである HOIP の RING2

manner, Front. Neurosci., 9, Article 514 (2016).

ドメイン内に位置する Cys930 残基に結合し，E2 から

４）吉原誠一，坪井昭夫：転写因子 Npas4 による神経活性中心である Cys885 残基へのユビキチン転移を阻害

活動依存的なシナプス形成の制御機構，生化学（日することで RBR 型 E3 に特有な RING-HECT-hybrid 反酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成応を阻害し，直鎖状ユビキチン鎖生成を抑制することを突き止めた．また，HOIPIN-1 が LUBAC の基質である
NEMO の細胞内直鎖状ユビキチン化を抑制し，TNF-α,

転移 RNA の修飾と癌転移の分子基盤研究
富IL-1β, CD40L, Ｔ細胞受容体 (TCR), LPS, CpG など広

田

耕

造

（東京大学大学院新領域創成科学研究科）

範な刺激によって引き起こされる NF-κB 活性化を顕著に抑制した．さらに，LUBAC の活性亢進が報告されて【目的】

いる活性化Ｂ細胞様びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫

BCDIN3D 蛋白質はメチル基転移ドメインを有する（ABC-DLBCL）細胞株に対して，顕著に NF-κB 活性抑

蛋白質であり，乳癌細胞において発現が向上しており，制やアポトーシスの亢進を介して増殖抑制能を示すと共癌転移にも関与していることが報告されてきた．また，に，イミキモド誘発性乾癬モデルマウスに対しても表皮BCDIN3D の発現向上と乳癌予後不良との関連性も報告

肥厚やサイトカイン発現など病態の抑制効果を示した

されてきている．我々は，最近，BCDIN3D が細胞質（論文投稿中）．

リン酸基を特異的にメチル化する酵素であ
tRNAHis の 5’

【考察】ることを見出している．本研究では，BCDIN3D 蛋白質

本研究から，HOIPIN-1 はユビキチン修飾系や NF-κB

による tRNAHis の特異的認識機構，RNA メチル化の制シグナル研究の重要なツールになるのみならず，NF-

御機構を明らかにすることを目指した．

κB 活性亢進が関与する疾患治療を見据えた新たな創薬【方法】

シーズとなる可能性が示された．

BCDIN3D による tRNAHis の特異的認識機構の解明の【文献】

ため，１）tRNAHis 変異体を用いた生化学的解析，２）

１）Tokunaga, F., Sakata, S., Saeki, Y., Satomi, Y.,tRNA 結合モデルによる BCDIN3D 変異体の生学的解

Kirisako, T., Kamei, K., Nakagawa, T., Kato, M.,析，そして３）構造生物学的手法を用いた解析すること

Murata, S., Yamaoka, S., Yamamoto, M., Akira,を試みた．

S., Takao, T., Tanaka, K. & Iwai, K.: Involve-【結果】

ment of linear polyubiquitylation of NEMO in

細胞質 tRNAHis は他の tRNA 種と比較した時に，ユニー

NF-κB activation, Nat. Cell Biol. 11,123 (2009).

クな特徴を有している．tRNAHis は前駆体 tRNA からプ

２）Tokunaga, F., Nakagawa, T., Nakahara, M., Sae-

ロセスされた後，その 5ʼ 末端に tRNAHis 特異的なグア

ki, Y., Taniguchi, M., Sakata, S., Tanaka, K., Na-

ニン転移酵素（tRNAHis Guanyltransferase）によって，

kano, H. & Iwai, K.: SHARPIN is a component

3ʼから 5ʼの方向にグアノシンが付加される（G-1）．結果，

of the NF-κB-activating linear ubiquitin chain

通常の tRNA はアクセプターステムの長さが７ヌクレ

assembly complex, Nature 471, 633 (2011).

オチド (nt) であるが，tRNAHis のみ 8nt の長さをもつ．

３）Tokunaga, F.: Linear ubiquitination-mediated

また，アクセプターステムの上部は G-1: A73 とミスペ

NF-κB regulation and its related disorders. J.

アが存在する．変異 tRNAHis を用いた生化学的な解析かBiochem. 154, 313 (2013).

ら，BCDIN3D はこれらの tRNAHis のみにみられる特異４）Katsuya, K., Hori, Y., Oikawa, D., Yamamoto,

的な特徴を認識していることが明らかになった．また，

T., Umetani, K., Urashima, T., Kinoshita, T.,

BCDIN3D のモデル構造，および tRNA との複合体モデ

Ayukawa, K., Tokunaga, F. & Tamaru, M.: High-

ルを作成したところ，BCDIN3D は tRNAHis のアクセプ

throughput screening for linear ubiquitin chain

ターステムの長さを測ることによって tRNAHis に対する

assembly complex (LUBAC) selective inhibitors

特異性を獲得していることが示唆された．また，RNA

using homogenous time-resolved fluorescence

認識に関わると考えられるアミノ酸の変異 BCDIN3D(HTRF)-based assay system, SLAS Discov. (inではメチル化活性が低下していた．

press).

8

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

れの代謝酵素の分解に関わるユビキチンリガーゼを同定【考察】
tRNA の変異体，BCDIN3D の変異体をもちいた生化
学的な解析，および tRNAHis と BCDIN3D の複合体モ

し，分解の仕組みを明らかにすることで，代謝の新しい制御機構を明らかにしようとしている．

デルからも，BCDIN3D が tRNAHis 特異的なメチル化酵

脂肪滴は脂質一重膜からなるオルガネラで，トリアシ

素であることが強く示唆された．現在，BCDIN3D 単体，

ルグリセロールを貯蔵，供給する役割をもつ．本研究で複合体の結晶化を進めておは，リポリシス（脂肪分解）の制御について，脂肪滴タ

および BCDIN3D-tRNA

His

り，BCDIN3D の tRNAHis に対する特異性について原子

ンパク質の安定性を切り口に解析を進めた．

レベルでの解析を行う予定である．

【方法】
データベースから半減期の短いタンパク質を抽出し【文献】
１）Tomita, K. & Liu, Y.: Human BCDIN3D is a cy-

た．脂肪滴に局在するものについて，エピトープタグを

toplasmic tRNAHis-specific 5ʼ -monophosphate

融合したタンパク質を発現させ，シクロヘキシミドチェ

methyltransferase. Front. Genet. doi: 10. 3389/

イス実験によって半減期を徹底的に調べた．短寿命であ

fgene. 2018. 00305, (2018).

ることが確認されたタンパク質について，ウサギポリク

２）Tomita, K.: A possible link between specific

ローナル抗体を作製した．これを使って，ユビキチンリ

transfer RNA methylation and tumorigenic phe-

ガーゼの変異株ライブラリーでシクロヘキシミドチェイ

notype of breast cancer. RNA & DISEASE, 4:

ス実験を行い，分解に関わるユビキチンリガーゼの候補

e1530; doi: 10.14800/rd. 1530, (2017).

を探索した．

３）Martinez, A., Yamashita, S., Nagaike, T.,E1（ユビキチン活性化酵素）と E2（ユビキチン連結

Sakaguchi, Y., Suzuki, T. & *Tomita, K.: Hu-

酵素）を大腸菌で発現させ，精製した．E3（ユビキチman BCDIN3D Monomethylates Cytoplasmic

ンリガーゼ）を昆虫細胞から精製した．酵母から脂肪滴

Histidine Transfer RNA. Nucleic Acids Res. 45,を精製するスキームを検討した．さらに，ユビキチンも5423-5436., (2017).

大腸菌で発現，精製した．これらを混合して，試験管内ユビキチン化反応を行った．
【結果】

ユビキチン・プロテアソーム系によるリポリシスの制御機構の解明中務

邦

ユビキチン化反応のメカニズムを調べるには，試験管内での再構成実験がカギとなる．すでに我々は，試験管内ユビキチン化反応について，一定レベルの経験があっ雄（名古屋市立大学大学院システム自然科学研究科）

た（たとえば，酵母ライセートを用いた in vitro 翻訳系，
酵母ライセートとミクロソーム画分を用いた ERAD の再構成，代謝酵素のユビキチン化反応など）．技術の幅【目的】

をさらに広げるために，イギリス MRC の研究室に約２

近年，様々な代謝酵素の安定性がユビキチン・プロテ

週間滞在し，ウサギ網状赤血球を使ったタンパク質の翻アソーム系によって制御されていることが分かってきた

訳，ユビキチン化反応などについて，具体的な実験手法（Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2015; Mol. Cell 2015

を習得した．諸々の技術を結集させ，脂肪滴タンパク質

ほか）．しかし，タンパク質の半減期と翻訳後修飾につのユビキチン化反応を行った結果，ユビキチン化と思わいて，質量分析を用いた網羅的な解析が進むにつれ，分れるバンドの検出に成功した．また，我々が着目してい解の意義が明らかでない代謝酵素が想像以上に多いこと

る脂肪滴タンパク質の分解が，熱ストレスによって促進が分かってきた．我々は，半減期の短い代謝酵素をデーされる可能性も見出した．

タベースから抽出し，特異的な抗体を作製して，安定性【考察】を実験的に確認する作業を進めている．さらに，それぞ

これまでに，試験管内ユビキチン化反応に必要なタン

9酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

パク質の精製標品を得ることができた．また，脂肪滴画ポーター発現プロファイル取得：30 種類以上のがん細分の単離に成功した．さらに，ユビキチン化と思われる胞株から，細胞膜画分を精製し，定量型質量分析 nano

バンドの検出にも成功した．現在はデータの質を上げる

LC-MS/MS システムを用いてプロテオーム解析を行っ工夫を行っている．熱ストレスとの関連については，基た．また，網羅的プロテオミクス予備検討の結果を基に，質の翻訳後修飾の変化などにも着目する必要がある．今がん細胞で発現が上昇しているアミノ酸トランスポー

後は，脂肪滴上のタンパク質の分解を制御するメカニズ

ターに対する抗体を使用し，スクリーニングにより選択

ムをさらに明らかにすることで，脂肪滴の生成、およびした界面活性剤を用いて免疫沈降を行い，共免疫沈降物

リポリシスの制御機構の解明につなげたい．

を質量分析計で解析し，アミノ酸トランスポーター複合【文献】

体を同定した．

結果の一部は，日本生化学会などで発表した．

網羅的リン酸化プロテオミクスによるアミノ酸により起因されるシグナル解析：細胞を任意のアミノ酸やトランスポーター阻害薬存在下･非存在下で培養する．培養

プロテオミクスによるアミノ酸膜輸送体集合体の同定とその下流シグナル全体像の解明
永

森

收

志

細胞破砕液をプロテアーゼ処理後，リン酸化ペプチドを精製して iTRAQ 試薬で標識し，イオン交換カラムで分画した後に LC-MS/MS 解析を行った．得られた結果を基にパスウェイ解析を行い，代謝経路，シグナル経路を（奈良県立医科大学）

解析した．
【結果】

【目的】

30 種類以上のがん細胞株の膜タンパク質発現プロ

膜輸送体は，膜を隔てた物質の不均衡を作り出すことファイルを取得した．アミノ酸トランスポーターとしてで様々な生体機能に関わっているが，その研究は可溶性報告のある分子についてデータ解析を行い，がん細胞にタンパク質に比べると進んでいない．例えば，アミノ酸

典型的なアミノ酸トランスポータープロファイルを明ら輸送を司るアミノ酸トランスポーターは，ヒトでは約かにした．多くの必須中性アミノ酸を輸送する LAT1/60 分子が報告されているが，分子の検出ですら容易で

SCL7A5 および CD98hc/SLC3A2 は，ほとんどの細胞ないため，発現プロファイルの把握は困難である．我々株で発現が上昇していた．さらにリン酸化プロテオミク

は，古典的な生化学的手法による生体膜調整法と最新スにより，LAT1 により取り込まれたロイシンが様々なの質量分析器によるプロテオミクスを組み合わせること

生体応答に関与していることが示された．

で，アミノ酸トランスポーターを含む膜タンパク質を網羅【考察】的に同定・定量する測定系を構築した．

多様ながん細胞株のアミノ酸トランスポーター発現がん細胞では，急速な細胞増殖を保障するため，アミプロファイルを得ることで，がん細胞特異的なアミノノ酸トランスポーターの発現が亢進している．前述の網酸取り込み機構の存在が示された．中心となる LAT1/

羅的定量プロテオミクスにより，30 種類以上のがん細SCL7A5 の基質であるロイシンが多くの生体反応に関胞株におけるアミノ酸トランスポーター発現プロファイ

わっていることから，LAT1 のトランスポーター機能をルを取得し，がん細胞におけるアミノ酸トランスポー

阻害することにより，これらの生体反応が進まなくな

ター発現の特徴を明らかにし，さらに網羅的リン酸化プり，がん細胞の増殖抑制が引き起こされることが示唆さ

ロテオミクスによって細胞内に輸送されたアミノ酸によれる．

り起因される生体反応をリン酸化シグナルの変動として【文献】

捉え，その全体像を解析することを目的とした．

１）Kongpracha, P., Nagamori, S., Wiriyasermkul, P.,【方法】
網羅的定量プロテオミクスによるアミノ酸トランス

0Tanaka, Y., Kaneda, K., Okuda, S., Ohgaki, R.
& Kanai, Y.: Structure-activity relationship of a

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

novel series of inhibitors for cancer type trans-

現可能性である．二つめは，ユビキチン化が関与する疾porter L-type amino acid transporter 1 (LAT1).

患の関連解析の可能性である．三つめは，細胞内部位にJ Pharmacol Sci. 133(2): 96-102. (2017).

依存的なユビキチン化の解析の可能性である．四つめは，
分解シグナル以外のユビキチン化修飾解析の可能性である．すなわち，「プロテアソームを介した分解」に依存

ユビキチン化酵素の基質タンパク質同定法の確立
畠山

鎮

しない手法であるため，分解シグナル以外のユビキチン化修飾の機能解明にも有効である．

次

【文献】

（北海道大学大学院医学研究院）

１）Hjerpe, R., Aillet, F., Lopitz-Otsoa, F., Lang, V.,
England, P. & Rodriguez, M.S.: Eﬃcient protec-【目的】

tion and isolation of ubiquitylated proteins using「ユビキチン化」はタンパク質分解を制御する翻訳後

tandem ubiquitin-binding entities. EMBO Rep.

修飾（酵素反応）であり，多くの生命現象を支える極め

10, 1250 (2009).

て重要な翻訳後修飾の一つである．その反応系は，ユビ２）Xu, G., Paige, J.S. & Jaﬀrey, S.R.: Global analy-

キチンリガーゼ（E3）が選択的に基質タンパク質を認識

sis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant

することによって進む反応である．ヒト遺伝子には 600

immunoaffinity profiling. Nat. Biotechnol. 28,

種以上のユビキチンリガーゼ（E3）が存在する．した

868 (2010).

がって個々の E3 に特異的な基質を同定し，基質タンパ
ク質のユビキチン化部位を決定することは，それらが関連する生命現象を理解する上で重要である．
本申請では，
最近実用化したさまざまな新しい手法を効果的に組み合

高立体選択的 C-C 結合反応を触媒する人工金属酵わせることにより，これまでの問題点を原理的に解消し素の創製た，これまでとは全く異なった新しい基質同定法を開発

藤

枝

伸

宇

（大阪府立大学大学院生命環境科学研究科）

する．
【方法】
本申請研究では，TUBE１）とユビキチンレムナント抗【目的】

体 /K-εGG 抗体（基質タンパク質とユビキチンのイソペ

有機合成化学では様々な配位子が反応系に添加され，プチド結合部分のトリプシン消化断片のペプチドである反応の促進，選択性の向上などに寄与している．シルK-εGG 配列を認識する）２）を用いた新規のテクノロジー

クタンパク質や血清タンパク質をこれら配位子の代わにより，さまざまなタイプのユビキチンリガーゼ（E3）りに，反応系中に添加することで，小分子では困難な高へ網羅的に適用し，E3－基質関係を網羅的に解析する．

立体選択的な反応を達成した例が報告されてきた．しか【結果】しながら，添加剤としてのタンパク質の有用性は示され

RBR 型 E3 で あ る Parkin と TRIM 型 E3 で あ るているものの，利用するタンパク質の分子量が大きいた

TRIM28 を用いて，本技術の開発を進めたところ，複数

め，反応点の精密制御が難しく，汎用性に乏しい．一方，の基質タンパク質候補が同定された．さらに細胞レベル

金属酵素におけるタンパク質骨格の有用性と白金族元素での解析を進めたところ，実際にそれぞれの E3 で安定の反応性を巧に組み合わせた人工金属酵素の構築が盛ん

性が制御されるタンパク質の存在も明らかになった．

に行われている．つまり，生体がいまだ利用したことの【考察】ない金属元素を人工的にタンパク質内部に導入すること

本研究により，以下の４つの研究上の応用可能性が示

で，種々の触媒活性を示す新規な生体触媒の開発が可能された．一つめは，ユビキチン化基質の網羅的解析の実であることが期待されている．我々はタンパク質を機能

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

性配位子として金属錯体を合成することで，タンパク質

異体に F104W 変異を導入することでジアステレオ選択を精密制御反応場として利用した錯体触媒として展開す性が 1:12 に向上した．また，H52A 変異体では C106N

ることが可能であると考えた．本研究では小型で安定な変異を導入することでジアステレオ選択性が反転した．

キュピンタンパク質を配位子として用い，高立体選択的

このように，作製したタンパク質配位子のライブラリー

C-C 結合反応の開発を行なった．

の中から，高い選択性を示す変異体を選択し，さらなる【結果と考察】変異導入を行うことで簡便に高選択的反応系が構築できタンパク質骨格として好熱菌 Thermotoga maritima

ることを示した．

由来のキュピンタンパク質（TM1459）に注目した．

【文献】

TM1459 タンパク質は，高い熱的安定性が期待される

１）Fujieda, N., Nakano, T., Taniguchi, Y., Ichi-

ことに加え，cis 位に空いた配位座を提供可能な４つのhashi, H., Sugimoto, H., Morimoto, Y., Nishi-

ヒスチジンから成る金属結合サイトをもつ．この金属結

kawa, Y., Kurisu, G., & Itoh, S.: A well-deﬁned

合サイトのヒスチジン残基に金属イオンを結合させる

osmium-cupin complex: hyperstable artificial

ことで，タンパク質骨格がさらに安定化され，非常に

osmium peroxygenase, J. Am. Chem. Soc., 139,

安定な生体触媒の構築が期待出来る．一方で，非ヘム

5149 (2017).

金属酵素のモデル化合物として，tris (2-pyridylmethyl)amine (TPA) を配位子として用いた金属錯体が合成され，詳細な特性評価や触媒活性が調べられてきた．当研究室では，TPA-Os 錯体が酸化剤として過酸化水素を用いたアルケンの cis ジオール化反応に対して高い触媒活性を示すことを既に報告している１）．本研究ではこのタ

網膜視細胞におけるユビキチン化酵素による光受容制御機構の解析古川貴

久（大阪大学蛋白質研究所）

ンパク質の金属結合部位である 4-His モチーフのヒスチ
ジンにアラニンを変異導入し，多様化させた第一配位圏を持つ変異体ライブラリーを構築した（Figure）
．これら

【目的】

を用い，2-azacalcone を基質，nitropropane を求核剤生物にとって外部環境からの情報を適切な感度で受けとしたマイケル付加反応の結果，H52A 変異体でジアス取ることは生存や恒常性維持に重要な役割を果たす．網

テレオ選択性が 1: 9 かつ 99% ee(－)，H54A/H58A 変

膜は外界からの光情報を受容する中枢神経組織であり，異体でジアステレオ選択性が 1:10 かつ 95% ee(＋) とヒトでは外界から得る情報の８割以上を視覚から得るとなった．さらに立体構造に基づいて，H54A/H58A 変

言われている．網膜には，光センサーとなる視細胞（桿体視細胞ならびに錐体視細胞）が存在し，この視細胞が受け取った光の刺激は，網膜神経細胞のネットワークを

X

N
N

Cu
N

Terpyridine

Y

N

N
Cu

X

Y

Bipyridine

通じて脳に伝えられる．網膜視細胞は繊毛が発達した構造である外節において外界からの光シグナルを受容す
る．桿体外節はディスクと呼ばれる脂質二重膜が重なった構造を，錐体外節は形質膜が折りたたまれたラメラ状構造をとっており，これら桿体のディスク膜と錐体のラメラ状膜にそれぞれロドプシンや錐体オプシンなどの光受容たんぱく質が存在し，光を受容する．

3-His motif
2-His motif
Figure.
Examples
of
the
first
sphereFigure. Examples of the first coordination
coordination sphere

視細胞は暗所では光受容感度を上昇させて高感度の視覚を得られるようにする一方，明所では感度を低下させることによって応答の飽和を抑制するだけでなく細胞へ2

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成のダメージを防いでいる．しかしながら，視細胞が周囲よって弱い光を感知することが可能となり（暗順応），の光強度に応じて光受容感度を調節するメカニズムは不明るいところでは光感度を下げることによって飽和せず

明な点が多い．本研究では，我々が同定した網膜視細胞に物を見ることができる（明順応）．また，明順応は光に強く発現するユビキチン化酵素の機能メカニズムの解による視細胞のダメージを軽減する役割を担うと考えら

析を通じて視細胞の光受容感度の制御機構を明らかにすれている．我々は，光の明るさが 10 万ルクス以上の晴ることを目指す．

天下の外界から，0.01 ルクス以下の暗い場所まで，シー【方法】

ムレスにものを見ることができるが，これは目の光受容網膜ユビキチン化酵素の発現を in situ ハイブリダイ

感度制御を介した明暗順応の機能によるものである．今ゼーションや作製した抗体による免疫染色によって観察回の我々の研究成果によって，今までよく分かっていな

した．網膜ユビキチン化酵素と標的たんぱく質の生化学

かった視細胞の明暗順応の仕組みが明らかになりつつあ的解析を行った．さらに，網膜ユビキチン化酵素遺伝子

る．

のノックアウトマウスを作製し，網膜組織の免疫染色解
析や網膜電図（ERG）測定による生理学的解析などの生体機能解析を行った．網膜ユビキチン化酵素の標的たんぱく質の過剰発現実験を，マウス網膜への生体エレク
トロポレーション法を用いて行った．

神経新生における脂肪酸伸長酵素 Elovl6 の役割
松坂賢（筑波大学医学医療系）【結果】
我々は，網膜に強く発現する網膜ユビキチン化酵素の生化学的解析を行い，
標的たんぱく質の同定に成功した．

【目的】

網膜ユビキチン化酵素のノックアウトマウスを作製した

Elovl6 は炭素数（C）12 ～ 16 の飽和・一価不飽和脂

ところ，網膜組織の発生には異常が観察されなかった．

肪酸を基質とし，C18 以上の長鎖脂肪酸を合成する脂次に，網膜ユビキチン化酵素のノックアウトマウスの網肪酸伸長酵素である．我々は，Elovl6 欠損マウスおよ膜電図解析を行ったところ，成体マウスにおいて，光受び脳特異的 Elovl6 欠損マウスには，脳重量の増加，神容感度制御に異常が認められた．光受容に関わるオプシ

経新生の減少，樹状突起スパインの形態異常，空間記憶

ンやトランスデューシンなどの変異マウスでは，網膜視学習の障害が認められることを見出した（未発表デー

細胞の変性が認められるが，興味深いことに網膜ユビキタ）．そこで，本研究では，脳特異的 Elovl6 欠損マウス

チン化酵素ノックアウトマウスでは網膜組織の変性は認を用いて，Elovl6 の神経新生と高次脳機能における役

められなかった．さらに，視細胞の光受容による網膜ユ割を解明することを目的とした．

ビキチン化酵素ならびに標的たんぱく質の分子レベルで【方法】の制御メカニズムの解析を行っている．
【考察】① in vivo 解析：脳特異的 Elovl6 欠損マウスの脳の組織学的解析，神経新生解析，行動解析を行い，脳におけ網膜視細胞の光感度調節においては，光の明暗によっる Elovl6 の役割を明らかにする．また，Elovl6 欠損マて視細胞の外節内の Ca２＋ 濃度の変化が起こることに関ウスおよび脳特異的 Elovl6 欠損マウスの胎生期から各連していることは知られてきたが，詳細な分子メカニズ

種脂肪酸や動物性脂肪，植物性脂肪，魚油を添加した餌ムは不明であった．本研究において，網膜ユビキチン化を給餌し，神経新生および行動テストを指標にフェノタ酵素が標的蛋白質の分解によって，視細胞の光受容感度

イプを改善する条件を探索した．② in vitro 解析：脳特を制御するという予想されていなかったメカニズムが明異的 Elovl6 欠損マウスおよびコントロールマウスの胎

らかになった．網膜視細胞は周辺環境の光強度に応じて児由来の神経幹細胞からニューロスフェアを形成し，神光に対する感度を調節する明暗順応機構を備えている．

経幹細胞の自己複製能への Elovl6 欠損の影響を解析し視細胞において，暗いところでは光感度を上げることにた．また，これらサンプルに対してトランスクリプトー酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

ム解析を行い，Elovl6 により制御され，神経幹細胞のMRI）により，標的とする任意の酵素活性の生体内分布

増殖および分化におよぼす因子を抽出した．

を非侵襲的かつリアルタイムに可視化する基盤技術を開

【結果】

発する．

脳特異的 Elovl6 欠損マウスの脳では，C16 脂肪酸の【方法】

増加および C18 脂肪酸の減少と，脳重量の増加，神経“超偏極” 13C MRI は 13C 標識した化合物の NMR 信

新生の減少が認められた．脳特異的 Elovl6 欠損マウス

号を一時的に数万倍に増幅することで，その生体内におの胎児大脳から調整した神経幹細胞の培養でもニューロ

ける代謝反応をリアルタイムに可視化する最先端技術でスフェア形成能の低下が認められ，RNA-seq 解析から，ある．超偏極 [1-13C] ピルビン酸を治療応答性の異なる

神経幹細胞の自己複製に重要な受容体およびそのシグナ

３種のヒト膵管癌モデルに投与し，13C MRI 撮像によりル伝達に関わる因子の発現が Elovl6 の欠損により低下

乳酸脱水素酵素（LDH）活性をイメージングした．

することを明らかにした．また，マウスおよびニューロ【結果】

スフェアにおいて，Elovl6 の欠損により低下する神経

超偏極 13C MRI により非侵襲的に計測した LDH 酵素

幹細胞の増殖を回復させる脂質を見出した．

活性は低酸素な腫瘍ほど高く，免疫ブロットにて測定し【考察】たタンパク発現量と相関していた（図１）．LDH 活性の本研究の結果から，Elovl6 は神経幹細胞の自己複製高い腫瘍は放射線治療に耐性を示す一方で，低酸素標的に重要であり，その異常が脳の形成と機能に影響をおよ薬である TH-302 では高い治療効果が得られた．

ぼす可能性が示唆された．今後，Elovl6 を介して産生【考察】され，神経幹細胞の機能を制御する脂質を特定し，その非侵襲的に特定の酵素活性を計測可能な超偏極 13C制御機構を分子レベルで解明することが，脳における脂MRI は癌診断や抗癌治療の最適化において，今後重要

質の新しい機能の解明や，神経・精神疾患の病態解明おな役割を果たすものと期待される．

よび新規治療法の開発などの応用研究に役立つと期待される．

超偏極 13C MRI による酵素活性イメージング
松

元

慎

吾
（北海道大学情報科学研究科）【目的】
近年，微量組織中に含まれる数百種類に及ぶ代謝物の網羅的定量が可能となっている．それらメタボローム研
究が明らかにしたのは，あらゆる疾患は何らかの酵素活性変化を伴うという事実である．疾患に伴う特定酵素の絶対量や活性の増減は診断マーカーとして臨床で広く用

図１

酵素活性イメージングの定量性評価

治療応答性の異なる３種のヒト由来膵管癌モデルにおいて，超偏極 13C MRI から求めた LDH-A 活性（a）は，

免疫ブロットの結果（b）と一致することが示された（Cancer Res 2018）．

いられているが，血液や尿など比較的容易に得られる検体から診断できる疾患は限られており，体内奥深く特定【発表論文】の臓器・組織のみで起きている酵素活性の変動を非侵

１）Matsumoto, S., Kishimoto, S., Saito, K. et al.:

襲的に計測する診断技術の開発が望まれている．本研究

Metabolic and Physiologic Imaging Biomarkers

では，超偏極 13C 核磁気共鳴画像（Hyperpolarized 13Cof the Tumor Microenvironment Predict Treat-酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

ment Outcome with Radiation or a Hypoxia-

CAVIN3 の相互作用は EGF や IGF-I などのリガンド刺Activated Prodrug in Mice. Cancer Res. e-pub

激による PI3K-AKT シグナルをカベオラ依存的なエン

ahead of print. (2018).

ドサイトーシスによって生じた初期エンドソームにおい２）Stewart, N.J., Kumeta, H., Tomohiro, M., Hashi-て厳密に制御していることが明らかとなった ( 論文投稿

moto T., Hatae, N. & Matsumoto, S.: Long-range

中 )．

Heteronuclear J-coupling constants in Esters:【考察】

Implications for 13C Metabolic MRI by Side-Arm

本研究により，これまで ROR1 は細胞膜上のカベオ

Parahydrogen-Induced Polarization. J. Magn.

ラにおいて生存シグナルを担っていると考えられてきた

Reson. e-pub ahead of print. (2018).

が，エンドサイトーシスによって生じたシグナリングエ
ンドソームにおいて様々なアダプター蛋白質をリクルー
トし，肺腺癌細胞の生存シグナルを経時的及び空間的に

ROR1 キナーゼによる生体膜ダイナミクス制御機
構の解明
山

制御していることが判明した．また，本研究の成果は，ROR1 とエンドサイトーシスに関わる CAVIN3 との相互作用を標的とした，これまでにない肺腺癌の生存シグ

口

知

也

ナルを特異的に抑える独自性の高い革新的な阻害剤の開（熊本大学大学院先導機構

発につながると期待される．

（併任）大学院生命科学研究部）【文献】
１）Yamaguchi. T., Yanagisawa, K., Sugiyama, R.,【目的】

Hosono, Y., Shimada, Y., Arima, C., Kato, S.,

これまでに私たちは，リネジ生存癌遺伝子である

Tomida, S., Suzuki, M., Osada, H. & Takahashi,

TTF-1 によって転写活性化される ROR1 が EGFR から

T.: NKX2-1/TITF1/TTF-1-induced ROR1 isの肺腺癌の生存シグナルの維持に必要な受容体型チロシ

required to sustain EGFR survival signaling in

ンキナーゼ（RTK）であることを見出し１,２），また近年，

lung adenocarcinoma, Cancer Cell 21; 348-361

ROR1 がカベオラ形成を安定化させ，カベオラに集積す(2012).

る様々な RTK の活性化の維持に寄与することで，肺腺２）Yamaguchi, T., Hosono, Y., Yanagisawa, K. &癌にとっての重要な生存シグナルを担うことを明らかに

Takahashi, T.: NKX2-1/TTF-1: An enigmatic on-した３）．そこで本研究では，受容体としての ROR1 キナー

cogene that functions as a double-edged sword

ゼの新たな機能に着目し，重要なカベオラ機能の１つでfor cancer cell survival and progression, Cancer

あるカベオラ依存的なエンドサイトーシス制御機構におCell 23; 718-723 (2013).

ける ROR1 キナーゼによる詳細な分子機序を明らかに

３）Yamaguchi, T., Lu, C., Ida, L., Yanagisawa, K.,することを目的とした．

Usukura, J., Cheng, J., Hotta, N., Shimada, Y.,【方法・結果】

Isomura, H., Suzuki, M., Fujimoto, T. & Taka-

肺腺癌細胞では，カベオラからのエンドソームの小胞hashi, T.: ROR1 sustains caveolae and survival

移動に関わる CAVIN3 と ROR1 が直接結合し，細胞膜

signaling as a scaﬀold of cavin-1 and caveolin-1,

からのエンドサイトーシスを制御し，ROR1 は CAVIN3

Nat Commun 7; 10060 (2016).

を介して MYO1C と相互作用することでアクチンフィ
ラメント上を移動することが判明した．また，ROR1 とCAVIN3 の結合は CAVIN3 の適切な細胞内局在に必須であるが，カベオラ形成そのものには影響を与えないことが分かった．さらに，肺腺癌細胞において，ROR1 と

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

好熱性放線菌ホスホリパーゼＤを利用した表皮肥厚性疾患の分子メカニズムの解明
山本圭（徳島大学大学院社会産業理工学研究部）

LyPls-PLD を外用塗布により惹起された表皮の肥厚が緩和された３）．
【考察】
以上の結果より，PLA2G2F により産生される P-LPE
は表皮肥厚性疾患を制御する新規生理活性脂質であり，創薬の対象となることが示唆された．

【目的】

【文献】

リン脂質はホスファチジルコリン（PC）やホスファ

１） Yamamoto, K., Miki, Y., Sato, M., Taketomi,

チジルエタノールアミン（PE）などの極性基の違いだ

Y., Nishito, Y., Taya, C., Muramatsu, K., Ikeda,

けではなく，グリセロール骨格の sn-1 位の炭化水素鎖

K., Nakanishi, H., Taguchi, R., Kambe, N.,がエステル（アシル型）結合したものの他にアルケニル

Kabashima, K., Lambeau, G., Gelb, M.H., &結合（ビニルエーテル型）したサブクラスも存在する．

Murakami, M.: The role of group IIF secreted

これに加えて，sn-1 位と sn-2 位に結合する脂肪酸の違

phospholipase A2 in epidermal homeostasis

いにより，リン脂質は膨大な数の分子種を構成する．我々

and hyperplasia. J. Exp. Med. 212, 1901-1919

は，リン脂質代謝酵素の一つである IIF 型分泌性ホスホ(2015)．

リパーゼ A2 (PLA2G2F) が，表皮角質細胞から分泌さ

２）Yamamoto, K., Miki, Y., Sato, H., Murase, R.,れるプラズマローゲンを加水分解し，この時に生じるプ

Taketomi, Y., & Murakami, M.: Secreted phos-

ラズマローゲン型リゾホスファチジルエタノールアミン

pholipase A2 speciﬁcity on natural membrane（P-LPE）が乾癬や皮膚癌などの表皮肥厚性疾患に関わphospholipids. Methods in Enzymol. 583,

ることを報告した１）．一方，プラズマローゲン定量用診101-117 (2017)．

断酵素の開発を目的として好熱性放線菌から単離された【知的財産権】

ホスホリパーゼＤ（LyPlsPLD）は，１）プラズマロー

３）山本圭，村上誠，酒瀬川信一 .: 表皮肥厚性疾患及ゲン型リゾリン脂質を優先的な基質としアシル型リゾリ

び／又は表皮肥厚性症状に対する予防，改善，又はン脂質やリン脂質は基質としない，２）幅広い至適 pH

治療剤，PCT/JP2018/19345，2018 年 5 月 18 日．

をもつ．そこで本研究では LyPlsPLD が乾癬を緩和する効果をもつのではないかと予想し，検討をおこなった．
【方法と結果】
マウス乾癬モデルを用いてリピドミクス２）をおこなったところ，マウス角質における P-LPE が，テープスト

髄鞘形成における低酸素誘導因子 HIF の機能解析
若

月

修

二

（国立精神・神経医療研究センター神経研究所）

リッピングにより検出可能であること，さらに乾癬の悪性度に応じて増加することを見出し，P-LPE が乾癬のバ【目的】

イオマーカーとなる可能性が示唆された．皮膚から抽出

髄鞘は電線を包む絶縁体のような役割を果たし，このしたリゾリン脂質を基質とし LyPls-PLD の基質特異性

はたらきにより情報伝達に必要な電気信号が神経ネットを調べたところ，LyPlsPLD は P-LPE を優先的な基質とワークにおいて迅速かつ正確に伝えられる．髄鞘が破壊し，プラズマローゲン型リゾホスファチジン酸（P-LPA）される病気は脱髄疾患と呼ばれ，視力障害や手足の麻痺，を産生することが明らかになった．乾癬を惹起させた感覚障害，高次機能障害などの重篤な神経障害が生じる．

マウスの耳介に LyPls-PLD を外用塗布すると，耳介中申請者のグループは末梢神経系の髄鞘化・脱髄機構を対の P-LPE 量が低下するとともに P-LPA の増加が認めら象にした研究を行い，さまざまな成果を挙げ報告してきれ，表皮の肥厚が緩和された．さらにマウスアトピー性た．神経損傷などによる末梢神経傷害後の再生に関わる皮膚炎モデルを用いて検討すると，
乾癬モデルと同様に，責任分子を探索するなかで，低酸素誘導因子 HIF がシュ酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

ワン細胞による髄鞘化に関与する可能性が示唆された．

発現制御されるのかを網羅的に調査したりすることで，本研究では，髄鞘形成における HIF の機能を明らかに

HIF による髄鞘促進効果の全貌が明らかになると考え，するとともに，HIF を標的とした髄鞘形成促進剤を探索

現在その解析を進めている．

し，同定することを目的とした．

【文献】

【方法】

１）Saitoh, F., Hagiwara, H., Wakatsuki, S., & Araki

１．HIF1α による髄鞘形成促進効果の検証
培養シュワン細胞に対して HIF1α遺伝子を過剰発現・発現抑制し，髄鞘形成に関連する遺伝子の mRNA レベ
ルの変化を定量的 PCR 法などにより検討した．
２．動物モデルを用いた検討

T.: Carboxymethylation of CRMP2 is associatedwith decreased Schwann cell myelination efﬁciency. Neurosci. Res. (2018) in press.
２）Imai, S., Koyanagi, M., Azimi, Z., Nakazato,Y., Matsumoto, M., Ogihara, T., Yonezawa, A.,HIF1α による髄鞘形成促進効果を脱髄疾患病態モデ

Omura, T., Nakagawa, S., Wakatsuki, S., Araki,

ル，再髄鞘化モデルを用いて検討した．HIF1α は分子T., Kaneko, S., Nakagawa, T., & Matsubara

内プロリン残基が水酸化酵素によりヒドロキシル化され

K.: Taxanes and platinum derivatives impairて不安定化するため，水酸化酵素阻害剤は HIF1α を安Schwann cells prior to induction of neurotoxic-

定化する．脱髄疾患モデルとして Trembler 系統，再髄ity via distinct mechanisms. Sci. Rep. 7, 5947

鞘化モデルとして坐骨神経傷害モデルを用い，水酸化酵(2017).

素阻害剤の髄鞘形成への効果を電子顕微鏡観察により判３）Saitoh, F., Wakatsuki, S., Tokunaga, S., Fujieda,

定した．

H., & Araki T.: Glutamate signals through３．新規髄鞘形成促進剤の探索

mGluR2 to control Schwann cell diﬀerentiation

水酸化酵素阻害剤は HIF1α 以外のさまざまな水酸化

and proliferation. Sci. Rep. 6, 29856 (2016).

反応を阻害する．特異性の高い「HIF1α安定化剤」など，より実効性の高い髄鞘形成促進剤を探索するために従来法と比べ簡便な培養髄鞘形成モデルを構築した．
【結果】
シュワン細胞への低酸素暴露により HIF1α 蛋白量が増加し，同時に髄鞘形成を促進する転写因子群や髄鞘構成蛋白など，髄鞘形成に関連する遺伝子の mRNA レベ
ルが増加，反対に RNA 干渉により HIF1α 遺伝子発現を抑制するとこの効果が打ち消された．動物モデルでは
水酸化酵素阻害剤が髄鞘形成を促進する予備的な結果を得た．また，髄鞘形成促進剤の探索に向け，従来法と比べ簡便な培養髄鞘形成モデルを構築した．
【考察】
本研究では，髄鞘形成と酸素ダイナミクスの関連性を明らかにし，脱髄疾患の発症・進行機構の解明と有効な治療戦略を提示することを目的とした．予備的ではあるが，動物モデルにおいて HIF の安定化により髄鞘形成が促進される可能性が示唆された．今後は，細胞特異的な HIF 遺伝子改変・欠損動物を利用したり，髄鞘形成細胞での HIF の安定化によってどのような遺伝子群が

57

研究報告

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成
成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

腸内細菌異常による疾患発症メカニズムの解明
新幸二

誘導に CD103 陽性の樹状細胞が重要であることが明らかになり，さらに TLRs を介した刺激が IL-18 の産生を増強し Th1 誘導を促進していると考えられた．また，（慶應義塾大学医学部）

RNA-seq の解析から多くの IFNg 誘導遺伝子の発現に違いがあったが，Th1 誘導の原因か結果かを注意深く【目的】

調べる必要がある．In vitro の解析から IFN-g 非依存的

ヒトの腸管内腔に存在する腸内細菌は宿主の生理機能に誘導され IFNg の positive feedback loop に関与してに大きな影響を与えており，そのため腸内細菌叢の異常いることが示唆されるデータが取れているため，少なく（dysbiosis）が様々な疾患の発症につながる可能性が示とも一部の IFNg 誘導遺伝子は Th1 細胞の誘導に関与

唆されている．しかし，どのような原因で dysbiosis がしている可能性が高いと考えられた．

起こるのか，どのような細菌種が疾患発症に直接関与【文献】

しているかについては明らかになっていない．これまAtarashi, K., Suda, W., Luo, C., Kawaguchi, T.,

での研究から，クローン病患者の唾液中に存在していMotoo, I., Narushima, S., Kiguchi, Y., Yasuma, K.,

た Klebsiella pneumoniae 2H7 株が腸管に定着すると

Watanabe, E., Tanoue, T., Thaiss, C. A., Sato, M.,

大腸で強い Th1 細胞の誘導を引き起こすことが明らか

Toyooka, K., Said, H. S., Yamagami, H., Rice, S. A.,になった．そこで本年度は，どのようなメカニズムでGevers, D., Johnson, R. C., Segre, J. A., Chen, K.,

Th1 誘導が引き起こされるかを解析した．

Kolls, J. K., Elinav, E., Morita, H., Xavier, R.J., Hat-

【方法・結果】

tori, M. & Honda, K.: Ectopic colonization of oral

2H7 株の Th1 誘導メカニズムの解析のため，Batf3欠損マウス・MyD88/Trif 欠損マウス・Il18 欠損マウス・

bacteria in the intestine drives T(H)1 cell induction
and inﬂammation, Science, 358, 359-365 (2017).

Il1r1 欠損マウスを無菌化し，2H7 株を定着させた後大腸 Th1 の誘導をフローサイトメトリーにより解析した．
その結果，Il1r1 欠損マウスのみ野生型マウスと同等のTh1 の誘導が見られたが，他のマウスはほぼ誘導が見られないか有意に誘導が弱いことが明らかになった．

生活習慣病胎児発症起源説の実験的検証－ケトン体合成不全と脂肪肝素因形成との関連－
有馬勇一郎（熊本大学大学院生命科学研究部）

また，Th1 の誘導能が弱い K. pneumoniae 2552 株と今回単離した Th1 誘導能が強い 2H7 株を無菌マウスに定着させ，1 週間後に大腸の上皮細胞と粘膜固有層の【背景】

樹状細胞を採取し，遺伝子発現の違いを RNA-seq によ

生活習慣病胎児発祥起源説 (Developmental Origins

り網羅的に解析した．その結果，2H7 株定着マウスのof Health and Disease; DOHaD) は，周産期の環境ス上皮細胞と樹状細胞ともに GBP や Cxcl9 などの IFNg

トレスがさまざまな成人後の生活習慣病リスク上昇に繋誘導遺伝子や H2-Ab1, Duox2 などが著明に上昇していがるという，疫学的に確立された概念である．現在世界た．

では 15％，日本では約 10％の出生児が低出生体重児と【考察】して生まれており，今後出生時低体重が抱える成人後リ

Batf3 欠損マウスの解析から K. pneumoniae の Th1

8

スクは看過できない問題となるが，疫学研究の結果を説成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

明する生活習慣病素因の獲得機序についてはほとんど解明されておらず，病態メカニズムに基づいた対応策を講軟骨細胞における Ca2＋動態の分子機構及び生理機じることができていない．申請者は発生学的考察に基づ能の解明

いて成人疾患を考えることで，病態の新たな側面を明ら

市

村

敦

彦
（京都大学大学院薬学研究科）

かにすることを目指した研究を進めている．
【目的】
マウスモデルを用いて，生活習慣病胎児発祥起源説のメカニズムを明らかにする．
【方法】
胎生期に 50％のカロリー制限を施すことで出生児低体重マウス ( 低体重マウス ) を作成した．得られた産仔【目的】
本研究は，細胞内 Ca2＋動態と制御機構，及びその生理機能を軟骨細胞を用いて解明することを目的とした．
【方法】
Ca2＋ は，主要な生理機構に必須と言えるほど極めてについて肝臓における表現型を検討した．

重要なシグナル分子であり，受精，筋収縮，神経伝達物【結果】

質やホルモン分泌，シナプス可塑性といった広範かつ重50％カロリー制限により，有意差を持って低体重要な生理機能の制御を担っている．一方で，Ca2＋ シグ

胎 仔 の 作 出 に 成 功 し た ( 出 生 児 体 重； カ ロ リ ー 制 限

ナルが制御している生理機能は，未知のまま多数残され群 n＝56 1.27 ± 0.16g, 対 照 群 n＝58 1.51 ± 0.14,ている．そのため，様々な細胞種における Ca2＋動態やp<0.001)．生後３日目の肝臓を評価すると，低体重マ

その制御機構を明らかにすることは，それぞれの細胞にウスで有意な脂肪沈着を認めた．また，出生時の血中ケおける特徴的な生理機能を理解する上で非常に重要であ

トン体濃度およびケトン体合成酵素の発現が低体重マる．本研究では，軟骨細胞における Ca2＋動態とその制ウス群で低下しており，ケトン体合成不全が示唆され御機構や生理機能に着目した．生体内における軟骨細胞

た．続いて我々は，CRISPR/Cas9 システムを用いてケが細胞外マトリクス中に埋め込まれるように存在しておトン体合成の律速酵素である HMGCS2 のノックアウト

り，直接観察することも，培養細胞系で再構築すること

マウスを作成し，新生仔期の表現型を評価した．ケトンも極めて困難であるため，軟骨細胞における Ca2＋動態体の一種であるβヒドロキシ酪酸（3OHB）の血中濃度やその生理機能の多くは不明であった．そこで，胎生期を測定した結果，ノックアウトマウスで有意に低下してマウス大腿骨のスライス培養サンプルを用いて生体内にいることが確認できた (3OHB: wild-type (WT) 1.35 ±おける状態に近いコンディションを保ったまま Ca2＋動0.14 mmol/L, KO 0.24 ± 0.05 mmol/L, p<0.0001)．加態を観察可能な新しい実験系を構築した．この実験系にえて，肝臓重量を比較した結果，新生仔期の HMGCS2

より，これまでは不可能であった，形態や生体内におけノックアウトマウスにおいて肝臓重量が有意に増加しる位置といった情報を保ったまま，細胞内 Ca2＋動態をていることも確認した（Liver weight: wild-type (WT)

リアルタイムに観察することを可能とした．本実験系を87.6 ± 3.4 mg, KO 123.9 ± 10.1mg, p<0.05）．腫大し用い，様々な薬理学的阻害及び活性化実験と網羅的遺伝た肝臓をオイルレッド染色にて評価した結果，脂肪沈着

子発現解析を組み合わせ，軟骨における Ca2＋動態を解が増加していることが明らかとなり，新生仔期において析するとともに，その制御分子機構の一端を明らかとしもケトン体の利用障害が脂肪酸合成を誘導することが示

た．

唆された．

【結果】

【文献】

軟骨細胞において，自発的に細胞内 Ca2＋が振幅してArima, Y*. & Hokimoto, S. et al.: Evaluation ofいることを発見した．また，薬理的スクリーニングマ

Collateral Source Characteristics With 3-Dimensional

イクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を行い，自Analysis Using Micro-X-Ray Computed Tomography.

発的 Ca2＋振幅は主として細胞膜に存在する二価陽イオ

J Am Heart Assoc. 2018 Mar 23; 7(6).

ンチャネル TRPM7 により媒介されていることを見出し

9

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成た．更に，TRPM7 阻害薬や遺伝子欠損動物由来の骨組【方法・結果】

織を解析した結果，TRPM7 の阻害や欠損により初代培①

健常人 5 名から計 10 クローンの iPS 細胞および養中指骨の伸長が阻害されることを明らかとした．

iPS-CM を作製し，未投薬時における iPS-CM の拍【考察】

動数や活動電位持続時間を評価した．その結果，そ一連の結果から，軟骨細胞においては TRPM7 を介しれらに由来クローンによる差があることが判明して自発的に流入する Ca が軟骨細胞の増殖や正常な分た．由来クローンが同一であればそれらのばらつき化に必要であることが示唆された．

は小さかった．

2＋②

5 種類のイオンチャネル阻害作用を有する薬剤，臨
床的に催不整脈作用を有することが知られている薬剤を投与し，活動電位時間変化や EAD（早期後脱ヒト iPS 細胞由来心筋細胞を用いた安全性薬理試分極）などの異常電気活動の有無を比較した．その験手法の開発と薬理反応個体間差の検討
伊藤正

結果，iPS-CM の薬理反応には由来個体による差が道（東京大学大学院医学系研究科）

存在することが判明した．
③

投薬前のデータによって薬理反応を検証する iPSCM を選別することによって，薬理反応の個体間差【背景】
薬物開発過程においてその催不整脈作用を的確に予測は軽減されることが判明した．
【考察】することは，予期せぬ突然死を軽減すると共に，本来なiPS-CM には由来クローンおよび個体による特性差がら安全な化合物の不適切な開発中止を回避することに繋存在しており，心毒性評価のためのツールとして使用すがるため，適切な薬剤安全性評価手法の確立が期待される際には，実験・解析手法のみならず細胞ソースを標準ている．

化することが必要である．

iPS 細胞およびそこから分化誘導した細胞は由来とな

今後は，iPS-CM の個体間差が被験者の遺伝的背景のる体細胞と同一のゲノムを有しているため，ヒト個体の差に由来するものかを検証するため，薬剤反応性に影響

臓器の生理的特性を反映していると考えられる．このたを与える SNP (KCNH2 rs36210421 など) との関連をめ，iPS 細胞由来心筋細胞（iPS-CM）を用いることで，評価することや，実際に薬剤性不整脈を発症した患者か薬剤による催不整脈性を既存手法よりも精度高く，個体

ら iPS 細胞を樹立し，健常者間の差を超える反応性の差ごとに予測することが可能になるのではないかと期待さが確認されるかを検証することを予定している．

れている．
しかし iPS-CM の由来ドナー，由来クローンの違いがiPS-CM の薬剤反応に与える影響は明らかになっておらず，ある 1 個体・1 クローン由来の iPS-CM による試験
結果が，集団の催不整脈性を反映しうるか，また個体ご

脂肪肝再生過程に生じる肝細胞死様式誘導メカニズム
稲

葉

有

香
（金沢大学新学術創成研究機構）との薬理反応の差が誘導した iPS-CM に反映されているのかについては明らかにされていない．
【目的】

【目的】

iPS-CM の電気的特性を評価し，薬剤反応にどの程度肝細胞死の増加は，脂肪肝における肝再生障害を引き由来クローンによる差や個体による差が存在するか検証

起こし，術後合併症の誘因となるだけでなく，非アルコー

する．またそれらの差を克服する実験・解析手法を開発

ル性脂肪性肝疾患の進行に関与する．マウス脂肪肝再生する．

過程では，脂肪肝の進行と共に増加する細胞死が，重篤な再生障害を引き起こす．我々は，重篤な再生障害を誘0成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

導する重度脂肪肝の再生過程で，ストレス応答性転写因子 ATF3 の発現が亢進することを見出した．本研究では，
重度脂肪肝の再生過程で生じる細胞死様式の選択メカニ
ズムの解明を目的とした．
【方法】

Bodywide transcriptome landscape inmouse models and human
浦

山

恭

次

（国際電気通信基礎技術研究所佐藤匠徳特別研究所）

肝臓特異的 ATF3 ノックアウト（A-KO）マウス及び対照マウスに対する高脂肪食負荷により，軽度脂肪肝ま【目的】

たは重度脂肪肝を作成し，70％肝切除後の脂肪肝再生

生体は複雑な多臓器連関ネットワークで成り立ってお過程を検討した．具体的には，肝再生過程の TUNEL 陽り，これらネットワークの異常や崩壊は様々な疾患の原性細胞数（肝細胞死数），細胞死関連因子の遺伝子発現因となっている事が知られている．近年，臓器間のクロ及びタンパク発現を評価した．TUNEL 法はアポトーシ

ストークに関わるメディエーターの発見，およびメカニ

ス細胞以外の細胞死も検出することから，TUNEL 法とズムの解明に関する研究は目覚ましく発展している．し活性型カスパーゼ３の免疫染色法を組み合わせた蛍光二かし，多くの研究がすでにクロストークを行っているこ

重染色法を行い，細胞死様式の検討を行った．

とが知られている臓器間の解析に限定されている．そこ【結果】

で，我々は，各種疾患において従来考えられていたよ重度脂肪肝の再生過程では，軽度脂肪肝と比較し，りも広範囲で多臓器連関ネットワークの変化が起きておATF3 発現・ネクロプトーシス誘導因子 RIPK3 発現・り，それらは個体レベルでの生理学的機能や疾患の発症

カスパーゼ３活性化が亢進し，壊死を伴う広汎な細胞において重要な役割を担っていると仮定した．本仮説を死が誘導され，重篤な肝再生障害を引き起こした．ま検証し，個体レベルでの多臓器連関ネットワークの全体

た，TUNEL・活性型カスパーゼ３の蛍光二重染色の結像を明らかにする最初のステップとして，我々は，生体

果，軽度脂肪肝では，TUNEL（＋）
・活性型カスパーゼ 3内における臓器間のクロストークを網羅的にあぶり出す（＋）のアポトーシス細胞のみであったのに対し，重度脂ことを目的に本研究を行った．

肪肝では，TUNEL（＋）
・活性型カスパーゼ 3（－）のアポ【方法】

トーシス非依存的な細胞死が増加した．RIPK3 欠損に本研究では，５つの異なる疾患モデルマウス（心筋梗よる検討では，このようなアポトーシス非依存的な細胞塞，糖尿病，がん，老化促進，腎障害）における病態

死が消失しており，この細胞死様式がネクロプトーシス

発生から異なるタイムポイントで 13︲23 臓器を回収しであることが示唆された．A-KO 高度脂肪肝の再生過程

RNAseq 解析を行い，各モデルの各臓器の異なるタイム

では，広汎な細胞死の誘導が阻害され，肝再生障害が改ポイントでの遺伝子発現変動を網羅的に解析し，全身レ善した．A-KO 群では，カスパーゼ３活性化は対照群とベルでのトランスクリプトームデータベース（全身網羅同等であったが，
RIPK3 発現は有意に減少した．そこで，的多器官遺伝子発現地図，iOrgans Atlas）を構築した．

細胞死様式を検討したところ，TUNEL（＋）
・活性型カス【結果＆考察】パーゼ 3（－）の細胞が有意に減少した．
【考察】

本データベースをデータマイニングする事で，先行研究から遺伝子発現の変化が想定される臓器以外の多臓器

重度脂肪肝の肝再生過程では，アポトーシス・ネクロ

においても遺伝子発現の変化が広範囲で起きていること

プトーシスという異なる様式の細胞死が誘導され，脂肪が明らかになった．また，本研究から皮膚が疾患のセン

肝再生障害を誘導すること，これら細胞様式の選択メカ

サーとして働いている事が明らかになった．本データ

ニズムとして ATF3 が重要な役割を担うことを明らかに

ベースは論文として発表し「i-organs.atr.jp」にて公開

した．

した．今後，本データベースを活用・発展させることで新規疾患マーカーや治療ターゲットの発見につながるのではないかと考えている．

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成【文献】

うに，モチベーションも睡眠覚醒に影響を与えるが，そKozawa, S.*, Ueda, R.*, Urayama, K.*, Sagawa, F.,の脳内メカニズムはほぼ不明である．本研究では，腹側Endo, S., Shiizaki, K., urosu, H., de Almeida, G. M.,

被蓋野や側坐核がモチベーション行動において重要な役

Hasan, S. M., Nakazato, K., Ozaki, S., Yamashita,

割を果たす点，側坐核に睡眠物質アデノシンの受容体がY., Kuro-o, M. & Sato, T.N.: The body-wide tran-

発現する点に注目し，両脳領域の睡眠覚醒制御におけるscriptome landscape of disease models, iScience., 2,

機能解析を目的とした．

238-268 (2018). *These authors contributed equally【方法・結果】
まず，報酬刺激に応じて活性化する腹側被蓋野のドー発生現象の再構成研究
戎

家

美

紀

（理化学研究所生命機能科学研究センター）

パミン神経に着目し，同神経の化学遺伝学的活性化による強力な覚醒維持作用をマウスにおいて見出した．この作用は，拮抗薬を用いた薬理実験により，ドーパミン
D2/D3 受容体依存的であることが示された．
次に，腹側被蓋野ドーパミン神経が投射を送る側坐核

私達は，発生現象を培養細胞上に再構成している．実に注目し，D2 受容体およびアデノシン A2A 受容体を際に作ってみることで，現在の理解がどれほど正しいか

発現する間接路神経を光遺伝学的に活性化した結果，睡検証し，さらには予想外の発見をしたい，という動機で眠の大部分を占めるステージであるノンレム睡眠が顕著ある．

に増加した．また，側坐核から腹側淡蒼球への投射経路

現在は，細胞のパターン形成，同調振動機構，組織の変形の３つのプロジェクトを行っている．いずれも多細を光遺伝学的に活性化したところ，同様にノンレム睡眠が増加した．

胞生物の発生機構の基礎的なメカニズムである．哺乳類

化学遺伝学的な側坐核間接路神経活性の抑制は，リガ

培養細胞に複数の遺伝子パーツを導入して人工遺伝子回

ンド用量依存的に睡眠量を減少させた．このため，同神路を作製し，目的とするような振る舞い（例えば細胞の経活性は正常な睡眠量の維持に必須であることが判明しパターン）が起こるか観察する．イメージングで生化学た．また，この抑制は断眠後のリバウンド睡眠に影響せパラメーターを測定し，数理モデルと比較することで，ず，さらに断眠操作自体も同神経活性を変化させなかっ作製の指針や動作原理の理解が得られることもある．たたため，同神経活性は睡眠のホメオスタシス制御とは独

だし，培養細胞と人工遺伝子回路だけでは起こりえない

立すると示唆された．最後に，モチベーション刺激をマ高次現象もやはり存在するので，最近は幹細胞やオルガウスに与えたところ，側坐核-腹側淡蒼球経路の活性がノイドを使った再構成も進めている．

低下し，それに伴って睡眠量が低下した．従って，側坐細胞のパターン形成と同調振動機構についてはだいた
いできつつあるので，近いうちに研究発表させていただ

核はモチベーション刺激を感知し，さらに睡眠覚醒を制御する興味深い領域であることが明らかになった．
今回明らかにした神経群は過去に報告のない新しい睡

きたい．

眠制御システムであるため，詳細な解析により新たな不報酬系による睡眠覚醒制御
大石陽（筑波大学国際統合睡眠医科学研究機構）

眠症治療薬の開発につながる可能性がある．
【文献】
１）Oishi, Y., et al.: Slow-wave sleep is controlled bya subset of nucleus accumbens core neurons in
mice. Nat Commun. 8(1): 734, (2017).

【目的】

２）Oishi, Y*., et al., Activation of ventral tegmental

我々の睡眠覚醒はホメオスタシスやサーカディアンリ

area dopamine neurons produces wakefulness

ズムなど様々な要因に制御される．経験的に明らかなよthrough dopamine D2-like receptors in mice.

2

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

Brain Struct Funct. 222 (6): 2907-2915, (2017).

Sas-PTP10D お よ び Slit-Robo シ ス テ ム が 機 能 す る 組*corresponding authors

織・時期を探索した．その過程で，Sas-PTP10D および

３）Oishim, Y*. & Lazarus, M.: The control of sleep

Slit-Robo システムが創傷治癒に関わる可能性を見いだ

and wakefulness by mesolimbic dopamine

した．具体的には，Sas-PTP10D あるいは Slit-Robo シ

systems. Neurosci Res. 118: 66-73, (2017). *cor-

ステムを遺伝学的に破綻させた翅成虫原基（将来，翅のresponding author

ブレード領域を形成する幼虫期の組織）に対してタング
スタンニードルにより物理的損傷を与えた際，その修復

細胞競合を介した上皮の内在性がん抑制機構の解明
大澤志津江（京都大学大学院生命科学研究科）に異常をきたすことが分かった．興味深いことに，SlitRobo システムを遺伝学的に破綻させると，創傷治癒の過程で生じる死細胞が組織から排除されずに成虫原基の上皮層にとどまる様子が観察された．この観察結果は，排除すべき死細胞を組織から除去することが創傷治癒を【目的】

行う上で重要な役割を果たす可能性を示唆している．

ヒトのがんのほとんどは上皮由来であり，上皮がんの発生・進展には上皮細胞の頂底極性（apico-basal 極性）の崩壊が深く関与している．一方で興味深いことに，apico-basal 極性を崩壊した細胞が正常な上皮組織

抗酸化物質キヌレン酸増加の分子機構とその意義
大

橋

一

登
（群馬大学生体調節研究所）に生じると，それら極性崩壊細胞は正常細胞との生存競
合 “細胞競合” に敗れて組織から排除されることが近年分かってきた．しかしながら，上皮組織において正常細【背景および目的】

胞と極性崩壊細胞が競合する際に，正常細胞がいかにしキヌレン酸はトリプトファン（Trp）から合成されて極性崩壊細胞を認識し，細胞排除を駆動するのか，そたキヌレニンがキヌレニンアミノトランスフェラーゼのメカニズムはほとんど分かっていない．また，細胞排（KAT）により脱アミノ化されることで生成する．キヌ除システムの生理機能に関しても不明である．本研究でレン酸の増加は二型糖尿病やうつ病で認められているは，上皮組織であるショウジョウバエ成虫原基をモデル

が，キヌレン酸の増加の原因や意義はよく分かっていな

系として用い，正常細胞が極性崩壊細胞を認識し，排除い．これらの病態を理解するためには，キヌレン酸の機を駆動するメカニズムの同定とその生理的意義の解明を能について知見が不足していると考えられる．本研究で目指す．

は，真核生物のモデル細胞である出芽酵母を用いて細胞【結果】

内におけるキヌレン酸の機能を明らかにする．

我々は前年度までに，リガンドー受容体システム【方法と結果】

Sas-PTP10D が上皮組織に生じたがん原性の極性崩壊

出芽酵母では，KAT 活性は検出されているが，KAT細胞を認識する上で重要な役割を果たしていることを遺伝子は特定されていない．キヌレン酸の細胞内での明らかにしてきた（Yamamoto#, Ohsawa# (# equal

機能を調べるために，KAT 遺伝子の同定とその破壊に

contribution) et al., Nature, 2017）．一方で，研究代よるキヌレン酸欠乏株の構築を試みた．ヒトの KAT と表者が所属する研究室（京都大学・井垣達吏教授）で相同性を示す酵素を選出し，それらの遺伝子多重欠損

は，神経系で反発作用を引き起こすリガンドー受容体シ株の細胞抽出液に含まれるキヌレン酸とキヌレニンを

ステム Slit-Robo が，極性崩壊細胞の排除を促進する上LC/MS で測定した．その結果，Aro9 と Aro8 の遺伝子で重要な役割を果たしていることを明らかにしてきた二重欠損株（aro8Δ aro9Δ）では細胞抽出液中のキヌ（Vaughen & Igaki, Dev Cell, 2017）．本年度は細胞排

レン酸が顕著に減少していることが確認できた．そこで除システムの生理機能を明らかにすることを目的とし，キヌレン酸欠乏の影響を明らかにするために，aro8Δ成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

aro9Δの表現型を探索したところ，この株は過剰な Trp

現していることがヒト剖検心の免疫染色及びマウスに感受性を示した．aro8Δ aro9Δの Trp への感受性は，

Langendorﬀ 摘出灌流心の膜分画蛋白レベルで確認さキヌレン酸を添加しても回復しなかった一方で，プラスれた．また，マウス心筋において，SGLT2 の発現は確ミドで Aro9 の遺伝子を再導入することで，部分的に回認できなかった．一方，phlorizin による短期的な心臓復した．以上の結果から，Aro8 と Aro9 が過剰な Trp

SGLT 阻害により虚血再灌流障害は助長され，心機能回の無毒化に必要であることが示された．

復が低下することが確認された．さらに，虚血再灌流中【考察】の SGLT 阻害が心筋細胞内への糖取り込みと解糖系活性本研究により，Aro8 と Aro9 は出芽酵母の KAT であを抑制し，ATP 供給を低下させることが証明された．

ることが分かった．また，KAT は過剰な Trp をキヌレ

加えて我々は最近，自施設の臨床データベースを用

ン酸へと変換することで，その毒性を軽減すると考えらい，急性冠症候群（ACS）の虚血発作極期に血清カリウ

れた．キヌレン酸は，ヒトや動物の尿に多く含まれていム (K) 値が一過性に低下する現象を報告した．この一過ることを考慮すると，過剰な Trp を無毒化した結果で性 K 値低下度合いは，HbA1c や HOMA-IR とは無関係生じる，排泄物である可能性が考えられた．

に，一貫して発作時の血糖値と正の相関を示しており，【文献】

ACS 虚血発作極期にインスリン抵抗性を凌駕して内因

Kazuto Ohashi, Romanas Chaleckis, Masak Takaine,

性 glucose-insulin-potassium (GIK) 系が代償性に活性Craig E. Wheelock, and Satoshi Yoshida

化されている可能性が考えられた．

Kynurenine aminotransferase activity of Aro8/【考察】

Aro9 engage tryptophan degradation by producing

心臓 SGLT1 の活性化は，虚血再灌流中の心筋への糖kynurenic acid in Saccharomyces cerevisiae

取り込み能の亢進と，これに伴う ATP 供給を介して，Scientiﬁc Reports, 7, 12180 (2017)

心保護的に働くことが示された．さらに SGLT 発現/活性が，虚血や高糖濃度環境で亢進するということ，及びナトリウム/グルコース共輸送体（SGLT1）を介した心臓エネルギー代謝制御機構と病態への関与
柏

木

雄

介

Na＋/K＋ATPase 活性化（＝ K の細胞内への取り込み亢進）が駆動力であること，を考慮すると，ACS 急性期
病態に SGLT-Na＋/K＋ATPase 連関が深く関与していることが示唆された．

（東京慈恵会医科大学医学部）

いずれにしても，心臓エネルギー代謝研究において，
SGLT は重症虚血時の短期的糖代謝活性化機構の一つと【目的】

して注目すべき存在である．

病的心筋において主要なエネルギー基質となる糖の取り込み能と利用効率の最適化は，虚血を含めた様々な心疾患の特に急性期治療において重要である．心筋細胞に食品由来シグナルによる視床下部の摂食調節ホルモ

おける糖輸送体は，濃度勾配依存性促進拡散型糖輸送

ンの感受性変容体の GLUT と，ナトリウム勾配を駆動力として糖を能金子

動輸送する SGLT に大別される．GLUT に関してはそ

賢太朗（神戸医療産業都市推進機構先端医療研究センター）の制御・作用機構はすでに広く検討されている一方で，
SGLT の病態生理作用は未知な部分が多い．我々は，虚血再灌流障害における心臓 SGLT1 の役割をエネルギー【背景】
過栄養状態では，視床下部におけるホルモンシグナル

代謝制御の観点から検討した．

応答性障害（レプチン抵抗性やインスリン抵抗性）が惹【方法および結果】

起されることにより，過食とエネルギー代謝活性の低下

最 初 に，SGLT1 が 左 右 心 房 心 室 全 体 に 相 当 量 発



を来し，更なる肥満の増悪と糖尿病などの代謝異常症候成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

群の合併が惹起される．脂質を多く含む食品の摂取がレ
プチン・インスリン抵抗性を誘導することは古くから知られているが，食餌に由来するどの成分が如何なる分子機序によりホルモン応答性を障害するのかは未解明であがんが個体に悪影響をあたえるしくみに関する研究
河

岡

慎

平

（国際電気通信基礎技術研究所佐藤匠徳特別研究所）

る．
我々は最近，レプチン抵抗性の発症に関わる新しい細がんは個体に様々な悪影響を与え，最終的には個体を胞内シグナル分子，Rap1 を同定した．脳 Rap1 欠損マ

死に至らしめる．このことは広く知られた事実であるもウスの作製により高脂肪食摂取による脳の Rap1 活性化のの，がんが個体に悪影響をあたえるメカニズムに関すがレプチン・インスリン抵抗性を惹起し肥満や糖代謝異る理解は立ち遅れている．このことが一因となり，がん常の原因となることを証明した (Cell Reports, 2016）.

による個体への悪影響を有効に緩和できる方法は，現時

Rap1 は GPCR 経路によって活性化されることから，視点では存在しない．

床下部ホルモン感受性が内因性・外因性の GPCR リガ
ンドの制御下にあることを初めて示した．

この問題を解決する一助とするために，がんによる個体への悪影響を調べるという目的に適した，新しいゼブ

食品成分や代謝・消化産物が GPCR リガンドとしてラフィッシュ腫瘍モデルの作成に取りくんだ．ゼブラ

作用することが報告されていることから，食品成分がシフィッシュの稚魚は数 mm と小さく，また，透明であグナル分子あるいは代謝産物を介して脳に作用し代謝をるため，稚魚期に腫瘍を発生させることができれば，が制御していることが考えられるが，どのような分子機序

んと個体の関係を全身的に調べることが可能となる．まにより肥満発症に関与するかは不明である．

ず，UAS の制御下に変異型 kras（krasG12D）を発現す【目的】

るトランスジェニック系統を作製した．次に，得られた

本研究では，視床下部における食品（食餌）由来シグ

トランスジェニック系統を Gal4 系統と掛け合わせ，稚ナルとレプチン・インスリンなどのホルモンシグナルの魚期に腫瘍を発生するような組み合わせを探索した．そクロストークの実態の解明と，肥満発症における視床下の結果，後腸（posterior intestine）特異的に発現する部病態の分子基盤の解明を目的とした．

Gal4 系 統（pInt-Gal4） と UAS-krasG12D 系 統 の 掛 け 合【方法】

わせにより，受精後 5 日という早い時期に後腸に腫瘍

脳組織に近い条件で視床下部のホルモンシグナルの感を発生させることに成功した．

受性評価が可能な独自の視床下部器官培養系，視床下部

腫瘍個体の全身的な解析をおこなったところ，本腫瘍

系培養細胞株，BV-2 マイクログリア細胞株をホルモン

が，個体に様々な悪影響をおよぼすことが判明した．例

感受性試験に用いた．

えば，腫瘍個体の肝臓が肥大することや，肝臓に炎症が【結果】起こることがわかった．また，腫瘍個体は野生型個体に視床下部器官培養系において，エイコサペンタエン酸

比べて成長が遅く，致死率も高かった．

やドコサヘキサエン酸がレプチン感受性を増大させる一続いて，本モデルの特性を活かして，全身的なトラン方，高脂肪食の主要成分であるパルミチン酸ではレプチ

スクリプトーム解析や代謝解析をおこなった．解析の結ン抵抗性を惹起することを見出した．また BV-2 細胞に果，腫瘍個体の肝臓では，コレステロール代謝酵素であおいて，エイコサペンタエン酸やドコサヘキサエン酸がる cyp7a1 を介した胆汁合成が不全となることが明らか

マイクログリア炎症を抑制する一方，パルミチン酸ではとなった．興味深いことに，肝臓特異的に cyp7a1 を過炎症反応を増強することを明らかにした．さらに，ビタ剰発現させ，胆汁合成を回復させると，腫瘍依存的な肝ミン類や生理的代謝産物の中からレプチン感受性に関わ臓の炎症が緩和された．一方，肝臓の肥大や成長阻害，る数種の食品由来成分の同定に成功し，また，高脂肪食個体の死といった悪影響は，本介入では緩和されなかっによって発現増加する新しい分子を発見した．現在，更た．以上の研究から，cyp7a1 を介した腫瘍－肝臓連関なる探索とメカニズム解析を実施している．

の存在が明らかとなり，本モデルの有用性の一端が示さ成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

られる．

れた．
Sora Enya, Koichi Kawakami, Yutaka Suzuki, andまた，Fgf シグナル関連因子の変異マウスが自閉症様Shinpei Kawaoka.

行動を示すのかを調べた結果，Fgf シグナル関連因子のA novel zebrafish intestinal tumor model reveals a

変異マウスでは有意に反復行動が増大すること，社会性

role for cyp7a1-dependent tumor-liver crosstalk in

行動が低下することが明らかとなった．以上の結果から，causing adverse eﬀects on the host. Disease Models

Fgf シグナルの異常により自閉症が発症する可能性が示& Mechanisms in press

唆された．

成体における社会的行動異常に関与する大脳形成不高脂肪食インスリン抵抗性発症における腸管樹状細全の原因の解明

胞・腸管 CD4 陽性 T 細胞の病態生理学的役割

川

口

大

地
（東京大学大学院薬学系研究科）

川

野

義

長
（慶應義塾大学医学部）

自閉症は発症率が子供の１～２％と高く，成人においNlrp10 は，腸管樹状細胞が外的刺激を受けてＴ細胞ても社会的行動異常を示すことから社会的にも大きな問の活性化，Ｂ細胞による抗体産生能に重要な役割を果

題となっている．しかし，その発症の原因は殆ど分かっ

たす NLR ファミリーの１つである．樹状細胞マーカーておらず治療法も確立していない．自閉症児に見られる

CD11cCre を使用し，CD11c 細胞特異的 Nlrp10 欠損

解剖学的な異常として，大脳の前方領域が肥大することマウスを作製したところ，高脂肪食負荷下において大腸が知られている．前方領域は言語機能や社会的行動の調で Foxp3 および IL-17 発現が有意に低下し，腸管の炎節などを担う領域であり，大脳前方肥大化が自閉症発症症が悪化し耐糖能が悪化した ( 下図参照 )．これらのデーに関与する可能性が十分に考えられるが，その関連は明タから樹状細胞 Nlrp10 が Treg, Th17 細胞および ILC3

らかになっていない．近年，自閉症患者に特徴的な遺伝細胞などの分化に重要な役割を果たす可能性が示唆され子変異を網羅的に探索する試みが活発に行われており，た．既報では，Th17 細胞と ILC3 細胞の分化に重要な

複数の Fgf シグナル関連因子が自閉症原因候補遺伝子と転写因子 Ror t を欠損させたマウスが，肥満を呈する事して挙げられている．Fgf シグナルは発生過程においてから，腸管 Th17 細胞や ILC3 細胞が全身の糖・エネル

細胞増殖を制御して組織のサイズ決定に関与することがギー代謝を制御している可能性が示唆されており，腸知られており，申請者はこのシグナルの異常が自閉症児

管樹状細胞 Nlrp10 もこれらの分化に影響を与えることに見られる大脳前方肥大化に関与する可能性を考えた．

で，糖・エネルギー代謝をリモートコントロールする可そこで本研究では，Fgf シグナル関連因子の変異マウ能性があり，今後解析を進めていく．

スを作製し，大脳前方肥大化とそのメカニズムの解析，

Ｔリンパ球特異的 Foxo1 ノックアウト Foxo3 ヘテロ

さらには行動解析を行った．生後において大脳のサイズ

ノックアウトマウス（T-QuarterKO; 以下 T-QKO と称を調べた結果，Fgf シグナル関連因子の変異マウスにおする）は高脂肪食負荷において負荷 10 週移行コントロー

いて大脳前方が肥大することが明らかとなった．
そこで，ルと比較して有意に体重増加が抑制され，耐糖能およびFgf シグナルがいかなる発生時期において機能すること

インスリン抵抗性が有意に改善した．

で大脳前方形成に関与するのかを調べた．その結果，胎T-QKO では，コントロールで認める高脂肪食負荷に

生期の非常に早い時期こそが大脳前方肥大に関与する重伴う小腸の長さの短縮およびパイエル板の萎縮が有意要な時期であることが示唆された．この結果から，疾患に改善する．T-QKO における小腸の所属リンパ節であにおいて見られる大脳形成の異常は胎生期の早い段階にるパイエル板の炎症関連遺伝子の発現量を Real Time

おける Fgf シグナルの異常に起因している可能性が考え

PCR を用いて検討した．その結果，T-QKO のパイエル

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

板において，Th2 サイトカインの１つである IL-4 およ大学に拠点を移し，臨床面での貢献もいっそう求めらび Treg マーカー Foxp3 の遺伝子発現がコントロールとれる立場になり，1st author として臨床にて経験した

比較して有意に増加していた．T-QKO では，酸素消費2 症例を論文報告し２, ３），過去の基礎研究と今後の臨床量の増加による抗肥満の表現型を呈し，寒冷刺激下にお活動をつなぐ疾患としてサルコペニアに注視するようにいて Pgc1a 遺伝子発現の有意の増加が褐色脂肪組織おなった．

よび皮下脂肪組織において認められた．また褐色脂肪組

サルコペニアは筋力低下を主徴とする老年症候群であ織では小腸パイエル板同様，Th2 サイトカインである

り，成因として運動不足や低栄養にくわえ慢性炎症や内IL4 および IL13 遺伝子発現の有意の増加が認められた．

分泌異常（インスリン抵抗性，性ホルモンや成長ホルモ

以上から，Ｔリンパ球における Foxo ファミリーは，ンの分泌・作用不全）が想定されているが未だ不明な点

Th2 リンパ球への分化または変換を抑制する作用があが多くエビデンスの確立した治療法は存在しないのが実ると考えられ，脂肪組織において Th2 サイトカインの情であり，超高齢社会を迎える我が国においてサルコペ発現を抑制することにより，Beige 化を抑制し，最終的ニアの病態解明および予防・治療法の確立は喫緊の課題にエネルギー消費を抑制する作用があると考えられた．

である．グレリンもサルコペニア治療のターゲットとし

T-QKO の「小腸の慢性炎症の抑制」と「脂肪組織におて現在臨床試験が進んでいる．

ける Beige 化の抑制」をつなぐメカニズムに関しては，
今後のさらなる検討が必要と考えられた．

そこで筆者は，臨床面においては 2018 年よりサルコ
ペニア外来を立ち上げ治療に従事するかたわら，EPA
や DHA などの n-3 系多価不飽和脂肪酸（PUFA）のサ
ルコペニア治療の可能性に思い至り，前向き臨床研究へ橋渡しするための研究を新規に開始した．EPA/DHA 製剤は抗炎症作用・抗動脈硬化作用を有し脂質異常症や閉塞性動脈硬化症の治療薬として実臨床にて使用されている．
本研究では，2 種類のサルコペニアモデルマウス（老齢 C57BL/6J マウスおよび，SAM (Senescence-Accelerated Mouse)-P10 マウス）に n-3 系 PUFA 慢性投与実験を行い，サルコペニアの主病態である筋肉量およびその機能（筋タンパク合成・分解・ミトコンドリア機能など）に与える影響およびその作用機序の解明に迫る．

グレリン分泌細胞における GPCR 発現解析および【文献】

新規調節因子の探索

1）Koyama, H. et al.: ʻComprehensive Proﬁling of

小

山

博

之

GPCR Expression in Ghrelin-producing Cellsʼ

（名古屋市立大学大学院医学研究科）

Endocrinology. 157(2):692-704, 20162）Koyama, H. et al.: ʻNocturnal reactive hypoglycemia well-treated subjectively and objec-【目的】
申請者はこれまで胃グレリン分泌細胞株の RNA シー
クエンシングによる網羅的遺伝子発現解析を行い，高tively with vogliboseʼ BMJ Case Reports 2017;
doi:10.1136/bcr-2017-220295

発現する GPCR のリガンドの添加実験によりトリプト3）Koyama, H. et al.: ʻSuspected case of lipoedema

ファンやパルミチン酸，長鎖脂肪酸など栄養素がグレリ

in a Japanese woman with a characteristic his-

ン分泌を制御することを明らかとしてきた ．

tology in skin biopsyʼ BMJ Case Reports 2017;１）

本研究助成を得た 2016 年 6 月より現在の名古屋市立

doi:10.1136/bcr-2017-221049

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

オレキシン受容体作動薬を規則的に投与すると，交感神

オレキシン受容体アゴニストの創製と薬理作用の解明
斉藤経の活性化を介して生体リズムのバランスが調節され，毅

抗肥満作用が発現しているのではないかと考えられる．

（筑波大学国際統合睡眠医科学研究機構）

今後，高脂肪食負荷マウスに対して YNT-185 を異なる
時間帯で投与し，時間依存的な効果の違いを検討する．
また，生化学的肥満マーカー，食欲に及ぼす効果の検証，【目的】
視床下部外側野で産生されるオレシキン（OX）は，

YNT-185 の本作用における標的部位の解析を行っていオレキシン１受容体（OX1R）およびオレキシン２受

く予定である．

容体（OX2R）に結合することで覚醒や摂食を誘導す【文献】

る１, ２）．これまでに我々は，オレキシン受容体を標的

1）Sakurai, T. et al.: Cell 92, 573-585 (1998).

とした低分子作動薬の創薬研究を実施し，OX2R 選択的

2）Chemelli, R. M. et al.: Cell 98, 437-451 (1999).

作 動 薬 YNT-185 (EC50 ＝ 28 nM (OX2R), OX1R/OX2R

3）T. Nagahara et al.: J. Med. Chem. 58, 7931-7937＝ 100)３）や OX1/2R dual 作動薬を見出してきた．特に，
OX2R 作動薬はナルコレプシー治療薬として期待４）され，YNT-185 はナルコレプシーモデルマウスに対する末梢投与（40 mg/kg）で顕著なカタプレキシー抑制作用を示した．また，ナルコレプシーの随伴症状である肥(2015).
4）M. Mieda et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
101, 4649-4654 (2004).
5）Irukayama-Tomobe, Y. et al.: Proc. Natl. Acad.

Sci. U. S. A. 114, 5731-5736 (2017).

満について YNT-185 の影響を検討したところ，有意に6）Funato, H. et al.: Cell Metab. 9, 64-76 (2009).

体重増加を抑制することを見出した５）．一方で，オレキ

7）Mieda, M. et al.: J. Neurosci. 24, 10493-10501

シンを過剰発現するマウスでは，高脂肪食により誘導される肥満や，耐糖能異常を示さないことが報告されている６）．そこで，野生型マウスにおいても YNT-185 が抗(2004).
8）Tsuneki, H. et al.: Endocrinol. 157, 4146-4157(2016).

肥満効果を示すのではないかと考え，検証を行うこととした．
【方法・結果】
ナ ル コ レ プ シ ー モ デ ル マ ウ ス で の 体 重 増 加 は，
YNT-185 を１日１回，14 日間連日投与することで抑制

睡眠の記憶における機能
坂

口

昌

徳

（筑波大学国際統合睡眠医科学研究機構）されていた．そのため，高脂肪食を負荷した野生型マ
ウスに，１日１回活動期前に YNT-185 を 40 mg/kg 腹腔内に投与し，体重変化を８日間計測した．その結果，【目的】

YNT-185 投与群では，高脂肪食負荷による体重増加が

睡眠中の脳は，覚醒時に学習した新たな情報を記憶と有意に抑制された．また，８日後のマウス血漿中の中性

して固定化する．それに携わる脳領域やそのタイミング

脂肪値を調べたところ，YNT-185 投与群では高脂肪食

は学習および睡眠それぞれの種類によって異なる．我々

負荷による中性脂肪値の上昇が有意に抑制されていた．

は独自の研究成果１,３,５）を元に，特に海馬歯状回の新生【考察】

ニューロンが睡眠中の記憶固定化メカニズムに果たす役

オレキシンは食事性のリズム構築に重要であり７），また割を検討した．ほ乳類の成体脳では，ニューロンの新生

血糖値の日内変動が緩慢である糖尿病マウスに，オレキは基本的には起こらないが，稀な例外として海馬歯状回

シン受容体非選択的拮抗薬 suvorexant を１日１回，明ではニューロン新生が生涯続く．今回，光遺伝学の手期前に投与すると，睡眠および耐糖能異常が改善する

８）法を用い，マウス脳内の新生ニューロンの興奮を睡眠ス

ことが報告されている．これらの事実から，活動期前にテージ選択的に抑制し，その記憶固定化へのメカニズム68成人病の病因・病態の解明に関する研究助成を検討した．

Rep., 7:46247, 2017, *corresponding authors,【方法】

NHK 報道等

pNestin-CreERT2 マウス（Nestin マウス）に CAG-

３）Fujinaka, A¥., Li, R¥., Hayashi, M., Kumar, D.,

loxP-stop-loxP (LSL)-eNpH3.0 マウス（Haloマウス）を

Changarathil, G., Naito, K., Miki, K., Nishiyama,

交 配 し，NestinHalo マ ウ ス を 作 成 し た． 成 獣 と な っT., Lazarus, M., Sakurai, S., Kee, N., Nakajima,

た 時 点 で Tamoxifen を 投 与 し Cre 酵 素 が 神 経 前 駆

S., Wang, SH. & Sakaguchi, M*.: Eﬀect of con-

細 胞 の ゲ ノ ム の LSL 配 列 を 除 去 す る． こ れ に よ り，

text exposure after fear learning on memory

Tamoxifen 投与期間に生まれた新生ニューロンに選択

generalization in mice, Mol. Brain, 2016 Jan,

的に Halorhodopsin 光受容体（Halo）を発現させる．

9:2, *corresponding author, ¥=equally contrib-

Halo はオレンジ色の光に反応し神経細胞内に Cl－イオ

uted, 朝日新聞掲載，筑波大学学長賞受賞等

ンを流入されるため神経の興奮を抑制できる．
【結果】４）Sakaguchi, M*., Kim, K., Yu, LMY., Hashikawa,Y., Sekine, Y., Okumura, Y., Kawano, M.,

Nestin/Halo マウスの歯状回において，スライスパッ

Hayashi, M., Kumar, D., Boyden, ES., McHugh,

チクランプ法を用いて光照射期間に限定した新生ニュー

TJ. & Hayashi, Y*.: Inhibiting the activity of

ロンの興奮抑制を確認した．リアルタイムで睡眠を分析

CA1 hippocampal neurons prevents the recall

しながら特定の睡眠ステージに選択的に光照射し，新生of contextual fear memory in inducible ArchT

ニューロンの興奮を制御するシステムを構築した．このtransgenic mice, Plos ONE, 2015 Jun 15;10 (6)方法を使って睡眠中に音で恐怖記憶を減弱させうること*=corresponding authorsを示した２）．この恐怖記憶学習直後の時間帯に，大脳皮５）Arruda-Carvalho, M., Akers, KG., Guskjolen,

質と海馬間で起こると考えられる記憶処理システムのス

AJ., Sakaguchi, M. & Josselyn, S.: Frankland

イッチング現象を見出した．この現象は睡眠依存的であPW, Post-training ablation of adult-generated

り海馬依存的な機構であることを示すデータを得た．

olfactory granule cells degrades odor-reward【考察】

memories, J.Neurosci., 2014 Nov 19; 34 (47):

我々は成体脳で新生するニューロンが，睡眠中の記憶

15793-803.

固定化に果たす役割を明らかにしつつ有る．実際に，新生ニューロンが睡眠中に記憶を固定化する際に，学習依存的にどのような活動パターンを示すかの解析を進めている．今後本研究を継続することで，哺乳類だけが持つ記憶学習メカニズムの一端を明らかにすることが可能と考えられる．

骨髄単核球、脂肪組織由来間葉系肝細胞などを用いた再生医療（血管新生療法、リンパ管新生療法など）
清

水

優

樹
（名古屋大学医学部附属病院）【助成期間中の発表論文】
１）Akers, KG., Fujita, Y., Chérasse, Y., Srinivasan,

血管およびリンパ管は全身に広く存在し，生体においS., Sakurai, T. & Sakaguchi, M*.: Role of adultては生命活動維持の為には必須の存在といえる（ノックhippocampal neurogenesis in memory process-アウトマウスではいずれも胎生致死となる）．また，生ing and regulation by sleep and epigenetics,

後において，これら脈管の機能不全が生じると，血液循Stem Cells, 2018 Feb, DOI: 10.1002/stem. 2815,

環あるいはリンパ循環が障害され，臓器障害，組織ホメ*corresponding

オスターシスの破綻などに至る．

２）Purple, R*., Sakurai, T. & Sakaguchi, M*.: Audi-

循環器疾患においても血管やリンパ管は，その病態にtory conditioned stimulus presentation during

密接に関連し，重症度およびその後の機能的予後，生命NREM sleep impairs fear memory in mice, Sci.

予後もこれらが規定している．心筋梗塞をはじめとした，9

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

虚血性心疾患に関しては世界の死因第１位を占め，さらR. & Murohara, T.: Diallyl Trisulﬁde Augments

なる病態の解明とその対策は急務である．

Ischemia-Induced Angiogenesis via an Endothe-

リンパ管研究においては，血管新生研究と比して，脆弱な脈管であることや同定する特異的マーカーなどがな

lial Nitric Oxide Synthase-Dependent Mechanism. Circ J. 2017 May 25;81(6):870-878.

かったことから基礎研究レベルから遅れをとっている．
また臨床においては，我が国でも乳がんをはじめとした術後のリンパ浮腫で悩まされる患者の存在は多く，手術による根治療法の拡大と共に，今後もさらに多くの方が発症することが予想される．これらリンパ浮腫に対する

全組織レベルの高速な遺伝子発現解析を目指す組織
透明化技術の開発
洲

﨑悦生（東京大学大学院医学系研究科）

対策は現在のところリンパマッサージや弾性ストッキン
グなどの理学療法が中心であり，根本的治療が存在しなかった．よって，難治性リンパ浮腫に対する治療法の開発も求められている．

【目的】
オミクス的アプローチにより得られる網羅的情報を従って心筋梗塞や組織障害，リンパ浮腫をターゲット

個体機能と関連づけるには，神経細胞・回路レベルでに，本研究を進めていく事により，これまで有効な治療の構造や機能のバリエーションを検出することが重要

法が存在しなかった，難治性心血管病に対する病態の解である．このような観点から，研究代表者らは，遺伝

明と新規治療法の開発につながることが期待できる．

子機能の時空間的な発現ダイナミクスや神経回路の解

本研究助成による成果として，心臓リンパ管研究の一剖学的情報を全脳スケールで捉える技術として CUBIC部を解明でき，また，
リンパ浮腫に対しては新規治療ター(Clear, Unobstructed Brain Imaging Cocktails andゲットとなりうる “治療的リンパ管新生” の可能性を示

Computational analysis) を 報 告 し た [Susaki et al.

すことができた．今後もリンパ管・血管新生研究を中心

Cell 2014; Tainaka et al. Cell 2014 他]． 本 技 術 は，とした難治性疾患の病態の解明とトランスレーショナル

高度な組織透明化とシート照明顕微鏡を組み合わせた高リサーチを継続し，さらなる研究の発展に努めていく次速な組織全体のイメージングを実現し，画像解析によ第である．

るサンプル間の定量的な比較を可能とした．本年度は，【文献】

CUBIC によるヒト病理の３次元展開や肥満研究への応

１）Shimizu, Y., Polavarapu, R., Eskla, KL., Nich-

用例を蓄積した．また，セルオミクス解析に必須となる，

olson, CK., Koczor, CA., Wang, R., Lewis, W.,

遺伝学的細胞ラベリングの高速化のため開発した「次世Shiva, S., Lefer, DJ. & Calvert, JW.: Hydrogen

代マウス遺伝学」（交配なしマウス遺伝学）についてのsulfide regulates cardiac mitochondrial bio-

英文総説を発表した．

genesis via the activation of AMPK. J Mol Cell

【結果】

Cardiol. 2018 Jan 29;116:29-40.

CUBIC による３次元観察によって，膵臓β細胞への２）Barr, LA., Lambert, JP., Shimizu, Y., Barouch,

神経支配が検出され，肥満時にβ細胞の増殖が制御されLA., Naqvi, N. & Calvert, JW.: Exercise train-

るメカニズムの一端が明らかとなった１）．ヒト臨床病理

ing provides cardioprotection by activating and学を３次元へ拡張するコンセプトスタディを行い，パラ

coupling endothelial nitric oxide synthase via a

フィンブロック標本への適応や，３次元観察による微小β 3-adrenergic receptor-AMP-activated protein

癌転移の検出感度の大幅上昇などの実例を示した２）．実kinase signaling pathway. Med Gas Res. 2017

験目的に応じて観察対象となる細胞や解剖学的構造を遺Mar 30;7(1):1-8.

伝学的にラベルする手法を高速化するために，ES 細胞

３）Hayashida, R., Kondo, K., Morita, S., Unno, K.,

でゲノム改変後の第 1 世代（F0 世代）で全身のゲノム

Shintani, S., Shimizu, Y., Calvert, JW., Shibata,改変が完了した解析個体（ES マウス）を作製するスキー0成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

ム「次世代マウス遺伝学」について，研究代表者らの成ゾトシンを投与），(2) 高脂血症（高脂肪食：HFD-60 を

果 [Ode et al. Mol Cell 2017] 等を含む関連研究をまと負荷），(3) 高尿酸血症（尿酸ならびにウリカーゼ阻害剤

め，英文総説を発表した３）．

を投与）を誘発する実験によって，オートファジーがこ【文献】

れらの疾患モデルにおいて，炎症を抑制し，腎障害を軽１）Neuronal signals regulate obesity induced β-cell

減することを見出した．

proliferation by FoxM1 dependent mechanism.

これらの結果から，オートファジーを亢進させること

Yamamoto, J., Imai, J., Izumi, T., Takahashi, H.,が，疾患の治療につながることが期待されるが，単純にKawana, Y., Takahashi, K., Kodama, S., Kaneko,

オートファジーを亢進させることが病態の改善につながK., Gao, J., Uno, K., Sawada, S., Asano, T.,

るとは限らない．我々はオートファジーと生活習慣病のKalinichenko, VV., Susaki, EA., Kanzaki, M.,研究において，オートファジーの終着点であるリソソー

Ueda, HR., Ishigaki, Y., Yamada, T. & Katagiri

ムに着目し，「リソソームの機能低下が，オートファジー

H.: Nature communications 8(1) 1930 2017.

の停滞を引き起こし，病態の悪化につながること」を見

２）CUBIC pathology: three-dimensional imaging

出した２）．すなわち，リソソームの機能が十分でないとfor pathological diagnosis. Nojima, S., Susaki,

オートファジーという機構が十分に機能しないと考えら

EA., Yoshida, K., Takemoto, H., Tsujimura, N.,

れるわけである．

Iijima, S., Takachi, K., Nakahara, Y., Tahara, S.,

一 方， 我 々 は， オ ー ト フ ァ ジ ー 抑 制 因 子 で あOhshima, K., Kurashige, M., Hori, Y., Wada, N.,

る Rubicon (Matsunaga et al. Nat Cell Biol. 2009

Ikeda, JI., Kumanogoh, A., Morii, E. & Ueda,

Apr;11(4):385-96) に も 着 目 し て き た． 理 論 上，

HR.: Scientiﬁc reports 7(1) 9269 2017.

Rubicon を ノ ッ ク ア ウ ト す る こ と に よ り オ ー ト フ ァ３）Next-generation mammalian genetics toward

ジーの活性化が得られるわけであるが，近位尿細管特異organism-level systems biology. Susaki, EA.,

的 Rubicon ノックアウトマウスでは前述の生活習慣病

Ukai, H. & Ueda, HR.: npj Systems Biology andモデルにおいて病態の改善が得られず，むしろ，通常のApplications 3 15 2017.

飼育下で肥満を呈することが判明した．これはオート
ファジーを適度に抑制しないと肥満につながることを示

生活習慣病に関連した腎障害において、慢性炎症に対抗するオートファジー
高

橋

篤

史
（大阪大学大学院医学系研究科）

唆しており，その機序を現在検討中である．オートファ
ジーは飢餓に対抗するメカニズムでもあるため，栄養が十分な状態もしくは過栄養の状態では適度に抑制されることも必要なのかもしれない．
将来的には，活性化させるか抑制するかは別として，
オートファジーを調整する薬剤が開発され，生活習慣病

糖尿病，高脂血症，高尿酸血症などの生活習慣病は，に応用されることを期待したい．

様々な機序で腎障害に関与している．近年，様々な病態【文献】

において慢性炎症の関与が示唆されているが，これらの１）Takahashi, A., Takabatake, Y., Kimura, T., Mae-

生活習慣と関連した代謝疾患による腎障害も例外ではな

jima, E., Namba, T., Matsuda, J., Minami, S.,

いと考えられる．そして，細胞レベルで機序を検討して

Kaimori, J., Matsui, I., Matsusaka, T., Niimura,

みると，細胞内恒常性維持機構であるオートファジーが，F., Yoshimori, T. & Isaka, Y.: Autophagy Inhibits

ミトコンドリアやリソソームの機能維持を介して慢性炎

the Accumulation of Advanced Glycation End症を抑制する可能性がある．

Products by Promoting Lysosomal Biogenesis

我々は，近位尿細管特異的オートファジー不全マウス
ならびに対照マウスに対して，(1) 高血糖（ストレプト

and Function in the Kidney Proximal Tubules.

Diabetes., 66 (5): 1359-1372, (2017).
成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

２）Yamamoto, T., Takabatake, Y., Takahashi, A.,

明変数と従属変数の関連性を評価するのと同じ尺度でア

Kimura, T., Namba, T., Matsuda, J., Minami, S.,

ウトカム間の差異を表現することが可能となり，リスク

Kaimori, J., Matsui, I., Matsusaka, T., Niimura,

因子とアウトカムとの関連性の理解の促進につながるもF., Yanagita, M. & Isaka, Y.: High-Fat Diet-In-のと期待される．我々は混合モデルの性質に着目し，線

duced Lysosomal Dysfunction and Impaired Au-

形混合モデルもしくは一般化線形混合モデルを拡張する

tophagic Flux Contribute to Lipotoxicity in the

ことにより，こうしたアウトカム間でのリスク因子がア

Kidney. J Am Soc Nephrol., 28(5): 1534-1551,

ウトカムに及ぼす影響の差異を単一の回帰モデル上で取(2017).

り扱える可能性を見出した．

３）Isaka, Y., Takabatake, Y., Takahashi, A., Saitoh,
T. & Yoshimori, T.: Hyperuricemia-induced inﬂammasome and kidney diseases. Nephrol Dial

Transplant., 31(6): 890-6, (2016).

アルツハイマー型認知症の病態解明と新規治療・診断法の確立に向けた研究
武田朱（大阪大学大学院医学系研究科）

リスク因子が各アウトカムに及ぼす影響の差異の検出
髙

原

充

佳
（大阪大学大学院医学系研究科）

公【目的】
アルツハイマー病の病態解明とその診断・治療法開発へ向けた基盤的研究を行う．アルツハイマー病の特徴的リスク因子がアウトカムに及ぼす影響を検討するうえ病理所見である神経原線維変化（タウ凝集体）は神経細で，回帰モデルは有用であり，これまでにも種々の性質

胞死と直接的に関連しており，診断・治療法開発の有力を持つアウトカムに対して種々の回帰モデルが考案されな標的と考えられている．申請者等はこれまでにタウ

広く利用されてきた．回帰モデルが活用できる領域は実病理の進展に関与する特殊なタウを同定しており１－３），に広く，例えばリスク因子のアウトカムに及ぼす影響がこれを標的とした治療法開発を進める．またタウを標的対象集団によって異なる場合（すなわち他の因子によっとした髄液マーカー探索のためのプレクリニカルモデルて修飾を受ける場合）であっても，それを交互作用効果の構築や，ヒト髄液検体を用いた病態マーカーの開発をとして回帰モデルに組み込むことにより，１つの回帰モ行う．さらに，認知症の超早期診断に向けた試みとして，デル上で分析することが可能である．１つの回帰モデル

高精度視線検出技術を用いた定量的認知機能評価法の開で分析できるということは，説明変数と従属変数の関連発を行う．

性を評価するのと同じ土俵，同じ尺度で評価が可能であ【方法・結果】

ることを意味する．これはモデルを用いた分析を行うう

１：タウ伝播を標的とした治療シーズの探索

えで大変な長所となる．一方，リスク因子がアウトカム

タウを標的とした免疫療法の開発をマウスモデルを用に及ぼす影響がアウトカムの属性によって異なる場合にいて行った．伝播に関与するタウを中和する抗体の選定

ついては，これを単一の回帰モデルで取り扱うことは難を行い，またペプチドワクチンの作製手法を用いてタウ

しく，
結果としてアウトカムごとに回帰モデルを構築し，伝播を阻害するために最も重要なリン酸化部位のスク

別々にモデルの解釈が行われることが多かった．しかしリーニングを開始した．さらに，in vitro タウ伝播アッモデルを別々に構築してしまうと，モデル間で，説明変セイを用いて化合物ライブラリーからタウ伝播阻害因子

数と従属変数との関連性を比較することは難しく，結果の探索を開始した．

として，アウトカム間でのリスク因子の及ぼす影響の差

２：タウ関連脳脊髄液バイオマーカーの探索

異を統計学的に検出することの障害となっていた．こうマウス脳脊髄液を覚醒自由行動下で持続的に回収するした事象を単一の回帰モデルで表すことができれば，説ための手法を開発した（論文投稿中）．これを利用して

2

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

髄液中に存在するタウ分子種の解析を行った．また，認の視点から検討した．

知症患者髄液中に存在する高分子量リン酸化タウの測定【方法・結果】を行い，その病態における意義を解析した．
３：高精度視線検出技術を用いた認知機能評価システム

肥 満 マ ウ ス 由 来 の 肝 類 洞 内 皮 細 胞（LSEC） で は，ケ モ カ イ ン MCP-1 の 受 容 体 CCR-2， 及 び 接 着 因 子（VCAM-1, Selectins） の 発 現 が 増 加 し て い た． 肥 満の開発
視線検出技術と認知機能評価映像を組み合わせ，注視

マウス肝臓の電子顕微鏡による解析では，単球・マク

点データを基に被験者の認知機能を短時間で定量的にス

ロファージが LSEC と接着する像や，肝実質細胞間にコアリングするシステムを構築した．これを用いて認知浸潤している像が多数観察された．生体イメージング症の早期診断を行い，超早期から変化する髄液マーカー

では，ob/ob マウスの肝臓において類洞壁の接着するの探索を開始した．

Lysozyme M 陽性細胞が野生型マウスと比較して有意【考察】に増加していた．還流装置による細胞接着実験では，肥アルツハイマー病タウ病理を標的とした治療法と診断

満マウス由来 LSEC において単球の接着が著明に増加マーカーの探索を進めている．また認知症の超早期診断しており，接着因子 VCAM-1 のリガンド VLA-4 に対すを目指したデバイスの開発を行い，これを利用して超早る中和抗体の前処置により接着が抑制された．同様に，期認知症患者を対象とした髄液バンク構築を行ってい

ob/ob マウスにおいて VLA-4 中和抗体を投与すると類る．これらはアルツハイマー病の早期診断・治療法開発

洞壁に接着する細胞が有意に減少した．肝細胞とマクの基盤となることが期待される．

ロファージ細胞株 RAW264.7 細胞の接触共培養では，【文献】

糖新生関連遺伝子（Pck1, G6pc）の発現誘導と糖産生

１）Takeda, S. et al.: Nature Communications 6:8490,の増加が認められ，Notch 阻害剤により Pck1, G6pc

(2015).

の発現誘導は抑制された．さらに，高脂肪食負荷マウ

２）Takeda, S. et al.: Annals of Neurology 80(3):355-67, (2016).

スへの抗 VLA-4 抗体投与により，肝臓への Gr-1 および CCR-2 陽性細胞の浸潤が抑制され，MCP-1, CCR-2,

３）Takeda, S. et al.: American Journal of Pathology
187(6): 1399-1412, (2017).

TNF-αの遺伝子発現の減少とインスリン抵抗性の改善が認められた．

４）Takeda, S. et al.: PNAS 107(15) (2010).
５）武田朱公：認知症バイオマーカーとしての CSF タウ，『実験医学』Vol.35 No.12 p210（2017）６）武田朱公：タウ伝播仮説の可能性と限界について，『実
験医学』Vol.35 No.12 p152（2017）【考察】
肥満では，LSEC において MCP-1 の発現が亢進しており，肝臓への骨髄系細胞の誘導に促進的役割を果たす
ことが示唆された．また，骨髄系細胞は LSEC との細胞接着亢進を介して肝実質に浸潤し，肝細胞との細胞接触を介して代謝異常を惹起する機構が推察された．
【文献】

細胞接着・接触を介した肝臓の糖代謝制御機構
土屋恭一郎

Miyachi, Y., Tsuchiya, K., Komiya, C., Shiba, K.,
Shimazu, N., Yamaguchi, S., Deushi, M., Osaka, M.,（山梨大学医学部）

Inoue, K., Sato, Y., Matsumoto, S., Kikuta, J., Wake,K., Yoshida, M., Ishii, M. & Ogawa, Y.: Roles for【背景・目的】肥満に伴う脂肪肝や糖脂質代謝異常において，肝実質への CCR-2 陽性骨髄系細胞の浸潤が促進的役割を果た

Cell-Cell Adhesion and Contact in Obesity-Induced
Hepatic Myeloid Cell Accumulation and Glucose
Intolerance. Cell Rep. 2017;18(11):2766-2779.

している．肥満に伴い骨髄系細胞が肝実質へ浸潤する機構，及び肝細胞との相互作用について，細胞接着・接触成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

C 型利尿ペプチドの心血管系における生理および病態生理的意義の検討
中

尾

一

泰
（国立循環器病研究センター病院）

スと比較し 1/10 以下に低下している一方，エンドセリン遺伝子や，ACE 遺伝子の有意な上昇をみとめた．同
マウスの，血漿エンドセリン濃度およびアンギオテンシ
ンⅡ濃度を測定したところ，ecKO でエンドセリン濃度の有意な上昇を認めた．さらに，同マウスにエンドセリン受容体拮抗薬を投与したところ，対照マウスと比較し【目的】
Ｃ型利尿ペプチド（CNP）は３番目のナトリウム利尿ペプチドとして，ブタの脳から発見され，主にオートて ecKO マウスで血圧の低下が大きかった．以上より，
ecKO の血圧上昇へのエンドセリン系の関与が示唆された．以上を論文発表した．

クリン，パラクリン作用により局所での生理および病態

さらに，心臓における CNP 系の意義を明らかにする

生理機能に関係していることが示唆されてきた．
その後，ために，Potin-Cre マウスと CNPflox/flox マウスを交配し，ノックアウトマウスが作製されたが，軟骨における高度の心繊維芽細胞特異的 CNPKO マウスを作製した．同マ

内軟骨骨化障害による著しい吻殿長の短縮により，心血ウスに，大動脈結紮にて心肥大モデルを作製したとこ

管系での CNP の生理学的意義を解明することは困難でろ，KO マウスはコントロールと比較し有意に心重量があった．組織特異的 CNP ノックアウトマウスを用いて重かった．今後，機序など，更なる検討を行う．

心血管系での CNP/GC-B 系の意義を明らかにすること．

【考察】【方法，結果】

Ｃ型利尿ペプチド（CNP）は心血管系において，オー

CNPflox/flox マウスおよび CNP の特異的なレセプター

トクリン，パラクリン作用により局所での病態生理機と考えられている膜型グアニル酸シクラーゼである GC-

能に関係していることが示唆される．今回の検討では，

Bflox/flox マ ウ ス を 作 製 し た．CNPflox/flox マ ウ ス と Tie2-

CNP の主な受容体と考えられる GC-B の KO では表現

Cre マウスを交配し，血管内皮細胞特異的 CNPKO マウ型が一致しておらず，更なる検討を要すると考えられる．

ス（ecKO）を作製した．このマウスは対照マウスと比【文献】

較し吻殿長に差を認めず，血管系の解析が可能となっNakao, K. & Kuwahara, K., et al .: Endothelium-

た．頸動脈に挿入したテレメトリー血圧計で 24 時間自Derived C-Type Natriuretic Peptide Contributes

由行動下の血圧を測定したところ，
対照マウスと比較し，to Blood Pressure Regulation by Maintaining

ecKO では収縮期血圧が有意に上昇していた．心拍数にEndothelial Integrity. Hypertension. 2017 Feb;は有意差は認められなかった．更に，腸間膜動脈を用い

69 (2): 286-296.

て，内皮依存性血管拡張反応を測定すると，ecKO 群は対照群と比較し，有意な減弱を認めた．次に，内皮由来
CNP が血管平滑筋の GC-B を介して作用しているという仮説のもとに，GC-Bflox/flox マウスを SM22-Cre マウ

内軟骨骨化における CNP/GC-B 系の生理的意義
中

尾

一

祐
（京都大学大学院医学研究科）

スと交配し，
血管平滑筋特異的 GC-BKO マウス（smKO）
を作製した．ecKO と対照的に，smKO は対照群と比較し，血圧および内皮依存性血管拡張反応に有意差を認め【背景・目的】なかった．これらの結果から，内皮由来 CNP は血管平C 型 ナ ト リ ウ ム 利 尿 ペ プ チ ド（CNP） は， グ ア ニ

滑筋の GC-B を介さず作用していることが示唆された．

ル酸シクラーゼ B (GC-B) を介して生物作用を発揮す

平滑筋のほかに考えうる作用部位として内皮のレセプる．我々はこれまでに CNP あるいは GC-B の全身ノッターを介している可能性があると考え，内皮の変化を評

クアウトマウスが著明な骨伸長障害を示すことを報告価するために ecKO マウスの肺から単離した血管内皮細し，CNP/GC-B 系が内軟骨性骨化により形成される骨胞の遺伝子発現を検討した．CNP の発現は ecKO マウ

伸長に対する強力な促進系であることを証明してきた．

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

CNP/GC-B 系は，脳，血管，骨など全身に幅広く分布する paracrine/autocrine 系調節因子であるが，今回成長板軟骨における意義を検討するために，Cre-loxP シ
ステムを用いて軟骨特異的 CNP ノックアウトマウス

食塩による心筋リモデリングに対するナトリウム利尿ペプチドの及ぼす効果の研究
中川仁（奈良県立医科大学医学部）（C-CNP-KO）及び GC-B ノックアウトマウス（C-GC-BKO）を作製し，解析した．更に CNP/GC-B 系の顎顔面形態形成に与える影響を検討し，顎変形症に対する新た【背景】

な治療法となる可能性を検討するために，CNP トラン

過剰なナトリウムは高血圧だけでなく，レニン・アン

スジェニックマウス（CNP-Tg マウス）および軟骨無形

ギオテンシン・アルドステロン系（RAAS）を活性化さ成症モデルマウス（Ach マウス）用いて検討した．

せ心筋肥大や心不全を引き起こす．ナトリウム利尿ペプ【方法・結果】

チドは利尿によりナトリウムを調節するホルモンである

C-CNP-KO お よ び C-GC-B-KO の 吻 殿 長 は，10 週

が，RAAS を抑制し心筋リモデリングに対して保護的

齢ではそれぞれの対照マウスの吻殿長の 78.6％およびに作用する事も知られている．しかし，ナトリウム利尿

72.5％であり，ともに椎骨と四肢長管骨は著明な短縮ペプチドがナトリウムによる心筋リモデリング増悪作用が認められ，全身性 KO の表現系をほぼ再現していた．

を抑制するかどうかは明らかにされていない．そこで，

2 週齢の C-CNP-KO および C-GC-B-KO の脛骨骨端成ナトリウム利尿ペプチドの作用不全を認めるマウスにお長板軟骨組織像は，肥大化軟骨細胞層の厚さと細胞数

いて，過剰なナトリウムが心筋リモデリングを増悪させの著明な減少を認めた．生後 1 日目の C-CNP-KO 及びるか否かについて検討をおこなった．

C-GC-B-KO から脛骨を採取し器官培養を行ったところ，【方法・結果】

共に脛骨成長板の著しい成長抑制を認めた．C-CNP-KOナトリウム利尿ペプチドの受容体が欠損 (GC-A KO)から採取した脛骨成長板は CNP 添加により，成長板軟するマウスと野生型マウスに対して，血圧を上昇させ骨の厚みが改善したが，C-GC-B-KO から採取した脛骨ない量の aldosterone (100 ng/kg/min) または vehicle

成長板は CNP 添加により全く改善しなかった．

を浸透圧ポンプで 4 週間投与し，それぞれに低食塩

また，CNPTg マウスおよび Ach マウスの顎顔面表現(0.001％），通常食塩 (0.6％），高食塩 (6.0％）を与え

系解析を行ったところ，CNP-Tg マウスは内軟骨性骨化た．野生型マウスにおいては，食塩負荷は vehicle 群，の促進により上顎過成長を，一方，Ach マウスは頭蓋aldosterone 群のいずれにおいても心筋肥大・線維化を

底軟骨結合部の早期骨化により上顎の劣成長と大後頭孔認めなかった．一方，GC-A KO マウスでは，高食塩との狭窄を呈していた．Ach マウスに認められた上顎のaldosterone 投与群において著明な心筋肥大と心臓間質

劣成長は CNP-Tg マウスとの交配により有意に改善しの線維化を認め，心肥大・線維化と酸化ストレスに関連た．さらに大後頭孔の狭窄についても改善した．組織学する遺伝子の発現が亢進しており，さらにミネラルコル

的検討の結果，軟骨結合部の早期骨化については改善でチコイド受容体（MR）の下流遺伝子である Sgk1 の遺きなかったが，軟骨結合部の骨化が生じるまでに，軟骨伝子発現も亢進していた．これらの変化は野生型マウス

結合部の成長が促進することにより顎顔面形態異常の改では認められなかった．さらに，高食塩のみでも GC-A

善できたことが明らかとなった．

KO マウスにおいては，心肥大と線維化のマーカーであ【考察】

る BNP と CTGF が有意に増加した．

成長板に発現する CNP は局所因子として，成長板軟【結論】

骨に発現する GC-B を介して，骨伸長作用を示すことを本研究では，GC-A 受容体欠損マウスの aldosterone

証明した．また，CNP 投与は軟骨無形成症患者などに投与下において，過剰な食塩が Sgk1 の上昇を伴う心筋生じる顎変形症に対する新たな治療法となりうる可能性

リモデリングを引き起こす事が明らかになった．この事が示唆された．

は，ナトリウム利尿ペプチド /GC-A 受容体のシグナル成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

が，アルドステロン /MR 系による心筋リモデリングに系を用いることで，血流に応答した内皮細胞がカルシウ

対する食塩の増悪作用を抑制する事を示唆している．さム応答を起こす様子や，YAP が流れ依存的に核内に移らに GC-A KO マウスにおいて，食塩負荷のみでも心行して転写活性化する様子を捉えている．このような観肥大と線維化のマーカーの上昇を認めていたことから，察を基に，血流に応答した YAP が，ある種の血管の管

GC-A シグナルが食塩の MR を介さない心臓リモデリン

腔構造の維持に重要な役割を果たすことを明らかにしたグ作用も抑制している可能性が示唆された．

（Nakajima et al., Dev. Cell (2017))．
血管の恒常性維持における血流の役割はよく研究され【文献】
Nakagawa, H., & Saito, Y. et al.: Salt acceleratesている一方，血管新生に関してはこれまで良い解析モデ

aldosterone-induced cardiac remodeling in the

ルが見つかっておらず，どのように流れが血管新生を制

absence of guanylyl cyclase-A signaling. Life Sci.

御するのかはほとんどわかっていなかった．今回我々は，

Nov 15; 165: 9-15. (2016).

発生過程のゼブラフィッシュでイメージングによる網羅的解析を行ったところ，血流依存的に血管形成が起こる

血流による機械的刺激に対する血管内皮細胞応答のｉｎ ｖｉｖｏ イメージング解析
中

嶋

洋

行

（国立循環器病研究センター研究所）
血管は血液が通る管であるため，血管の内側を覆う血管内皮細胞は常に血流に曝された状態にある．血流は，部位を複数箇所同定した．これを詳細に解析したところ，血流によるメカニカルストレスに依存して起こる血管新生が，従来の（血流非依存的な）血管新生とは全く異なる様態で起こっていることを新たに見出したので，本研
究発表ではこれらの観察結果を詳しく紹介する．

新たな心機能制御要素としての心臓マクロファージ

分泌性因子を介して血管機能を調節する一方，流れ自体の機能解析がメカニカルストレスとして血管内皮細胞や血管平滑筋

中

山

幸

輝
（東京大学医学部）細胞に作用する．
血流が生み出すメカニカルストレスは，動脈硬化や脳動脈瘤などの病態の発症機序にも関与する
ことから，血流に対する血管の応答性を理解することは，【目的】

成人病などの血管が関与する種々の疾病の発生機序の理

生活習慣病を原因とする心血管病は近年ますます増加

解にも繋がる医学的に重要な研究課題である．我々は，しており，心不全は依然として罹患率と死亡率が高い．

血流に対する内皮細胞の応答を in vivo イメージングに

また高齢者心不全や繰り返す心不全の予後は不良であよって細胞レベルで可視化することで，血流によるメカり，その病態生理の解明は急務である．我々はこれまで

ニカルストレスが，血管の形態や恒常性をどのように制にマウスの心臓マクロファージが心臓恒常性維持に必須御するのかを研究している．

であることを示した．そこで，心臓マクロファージの新ゼブラフィッシュは，胚が透明で遺伝子操作が容易な

たな発現制御機構の解明が新たな治療戦略になり得るとため，イメージングに適した脊椎動物モデルである．我々考えた．

は，ゼブラフィッシュの血管内で種々の細胞応答を生き【方法】

たまま可視化するトランスジェニックゼブラフィッシュ

若年マウスと老化マウスの心臓マクロファージの（TG）システムの作製を行っており，これまでに内皮細ATAC-seq を行うことで心臓マクロファージ特異的に発胞のカルシウム応答を生きたまま特異的にイメージング

現する遺伝子の転写調節領域が，老化によりどのようにできる TG システムや，Hippo 経路の標的因子である

変化するのかを捉えることができる．心臓の老化は心臓

YAP の核内移行（転写活性化）を生きたまま可視化でマクロファージと心筋細胞との相互作用の破綻が引き起きる TG システムの樹立などを行ってきた．このようなこすという視点のもと，老化を転写制御領域の変化とし成人病の病因・病態の解明に関する研究助成てゲノム上で可視化し，これらのエピゲノム変化が心機である．GATA2 変異にどのような多段階の分子異常の能低下の表現型に与える影響を解析する．

蓄積がおこって MDS の発症に至るのか，未発症家族性【結果】

MDS 患者の末梢血リンパ球から樹立したヒト iPS 細胞

我々は心臓マクロファージ由来の心筋細胞保護的制御を用いて，「GATA2 変異による遺伝性 MDS 由来 iPS 細因子として分泌タンパクのアンフィレギュリン（Areg）

胞を用いた分子発症機序の解明」を目指すことを目的とを同定した ．Areg は心臓においてマクロファージでする．

のみ発現しており，またその他の組織マクロファージで

【方法】

１）

は発現しておらず細胞特異的な発現を示す．Areg のプ

家族性に MDS や白血病発症を認める家系において，ロモーター領域は心臓マクロファージが老化するとエ遺伝子異常を解析し，GATA2 変異による家族性 MDS

ピゲノムが変化することが分かった．さらに心臓マクロ家系を検出した．GATA2 変異を有する２家系の家族性ファージの網羅的発現解析により，細胞起源によって異MDS の MDS 患者から末梢血リンパ球を無菌的に単離なることが分かった．

し，確立されている方法により２種類の GATA2 変異【考察】

iPS 細胞（R396W と P250A）を樹立した．GATA2 変心臓マクロファージの細胞起源が胎仔肝由来から骨髄異 iPS 細胞を iPS-SAC 法で造血前駆細胞まで分化誘導

単球由来のものに変わり，さらに骨髄の老化により心臓した．長期的に培養を行い，形態，表面抗原，増殖能なマクロファージが質的に変化すると考えられた．これら

どの変化を，正常 iPS 分化細胞と比較し，MDS 幹細胞のエピゲノムの変化による心臓実質へ与える影響を解析としての生物学的性状を解析した．また，骨髄移植モデすることで，老化や心不全の新たな病態解明を図る．

ルマウスを作製し，GATA2 変異をマウス造血幹細胞に【文献】

過剰発現させた．

１）Katsuhito Fujiu, Munehiko Shibata, Yukiteru【結果】

Nakayama, Fusa Ogata, Sahohime Matsumoto,GATA2 変 異 iPS 細 胞 由 来 の 造 血 前 駆 細 胞 は，正常

Issei Komuro, Ryozo Nagai, & Ichiro Manabe.:

iPS 細胞と比較して有意に CD34 陽性細胞が減少していA heart-brain-kidney network controls adapta-

た．また，骨髄移植モデルマウスを作製し，GATA2 変tion to cardiac stress through tissue macrophage

異をマウス造血幹細胞に過剰発現させたところ，分化しactivation and cellular communication. Nat

た顆粒球系細胞が著減していた．このことから GATA2

Med. 2017; 23(5): 611-622

変異単独ですでに造血幹細胞の分化障害が生じていることが明らかとなった．
【考察】

ɢＡＴＡ₂ 変異による遺伝性 MDS 由来 iPS 細胞を用いた分子発症機序の解明
西尾

家族性免疫不全／骨髄異形成症候群の原因遺伝子である GATA2 変異が，「MDS 幹細胞」を規定する遺伝子異美和子

常であることが明らかとなった．今回作製した遺伝性（文京学院大学保健医療技術学部／

MDS 由来 iPS 細胞を用いて MDS 発症に至る過程を明

国立国際医療研究センター研究所）

らかにし，MDS 発症メカニズムの解明につながることを期待している．今後，様々な協調遺伝子を同定するこ【目的】
多段階の遺伝子異常蓄積を経て発症すると考えられとで世界初のヒト化 MDS モデルマウスを作製し，MDSの治療開発に役立てることを目指している．

る骨髄異形成症候群（MDS）では，これまでに様々な遺伝子異常が同定されてきた．GATA2 変異は，常染色体優性遺伝を呈する家族性 MDS の原因遺伝子異常であり，MDS 発症の中心的役割を担うマスター遺伝子異常成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

ANP の病的血管を標的とした新たなトランスレー
ショナルリサーチへの展開野尻崇（国立循環器病研究センター研究所）

たが，肺転移は有意に減少した．本メカニズムとして，癌が転移する前に転移予定先臓器において炎症を惹起す
るいわゆる “転移前ニッチ” 形成に対して，ANP が抑制的に働くことを確認した．⑥ 4T1 乳癌及びルイス肺癌マウスに対して，ANP+CDDP 併用投与を行ったところ，vehicle+CDDP 群と比較して，腫瘍縮小作用の増【背景】
これまでに我々は，肺癌手術周術期に心房性ナトリウ

強効果が認められた．本メカニズムとして，ANP の腫瘍血管透過性制御により，腫瘍内へ効率良く抗癌剤を到

ム利尿ペプチド (ANP) を投与することにより，急性期達させることができることを確認した．

合併症だけでなく術後早期再発を抑制することを報告し【まとめ】

た．本メカニズムとして，ANP の血管保護作用により，

ANP は血管制御により様々な病態モデルに対して有癌細胞の血管への接着を抑制し，様々な癌腫の転移を防効であり，今後臨床応用に向けた新たなトランスレー

ぐことができることを明らかにしており，ANP の血管

ショナルリサーチを展開したいと考えている．

制御作用に注目している．
【目的】
様々な病態モデルに対して ANP 単独又は薬剤併用による安全性及び有用性について検討し，前向き臨床研究へ橋渡しすること．
【方法及び結果】①リポポリサッカライド誘発急性肺障害マウスに対し抗加齢遺伝子サーチュイン（Sirt1）を介した糖尿病性腎症の新規発症メカニズムの解析－尿細管・糸
球体連関－
長谷川

一宏
（慶應義塾大学医学部）て，ANP 前投与を行うと，対照群と比較して，気管支肺胞洗浄液中の炎症細胞数増加を軽減し，病理組織学的

慢性腎臓病：CKD (Chronic Kidney Disease) の最多にも炎症細胞浸潤を抑制することを確認した．②シスプ

要因の糖尿病性腎症（Diabetic Nephropathy, DN）のラチン（CDDP）誘発急性腎障害マウスに対して，ANP克服の為，DN 時に顕著に低下する抗加齢遺伝子 Sirt1

前投与を行うと，対照群と比較して，腎障害マーカーのの低下機構についてその詳細を解明したいと考え，解析増加を抑制し，病理組織学的にも腎臓へのダメージを軽を進め，SGLT2 を介したメカニズムを同定した（長谷減することを確認した．③ブレオマイシン肺線維症マ

川ら Scientiﬁc Reports 2018）ので今回ここに報告す

ウスに対して，ANP 投与により線維化が有意に抑制さる．我々は，近位尿細管（Proximal Tubules, PT）抗れること，また，血管内皮特異的 GC-A 過剰発現マウ

加齢遺伝子サ ーチュイン：Sirt1 の DN における意義をス（EC GC-A Tg）では対照マウスと比較して肺線維化明らかにした（長谷川 , 脇野 , 伊藤裕 , Nat Med 2013，が有意に軽減されたことから，ANP の血管保護による

日本腎臓学会大島賞 2017，日本心血管内分泌学会 高線維化抑制作用である可能性が示唆された．④低酸素誘峰譲吉研究奨励賞 2017)．糖尿病性腎症ではまず PT の発肺高血圧モデルマウスに対して，ANP 投与群では対Sirt1 が低下し，細胞内エネルギー代謝でミトコンドリ

照群と比較して，収縮期肺動脈圧は有意に低値であり，アの酸化的リン酸化の ATP 産生に重要な補酵素である

同様の条件下において EC GC-A Tg では，対照マウス

NAD とその前駆体 NMN の PT からの分泌が減少すると比較して，収縮期肺動脈圧が有意に改善されたことか

事で糸球体 Sirt1 も続けて低下し，その結果，アルブミ

ら，ANP は主に血管内皮を介した肺高血圧改善効果を

ン尿を生じる新規病態機構：尿細管︲糸球体連関（図１）有する可能性が示唆された．⑤ 4T1 乳癌及び Colon26を発見した．しかし Sirt1 と NMN が DN 時に PT で顕大腸癌同所移植マウスに対して，ANP 単独投与を行う

著に低下する機序は不明であり，今回，特にこのうちと，対照群と比較して腫瘍サイズは有意差を認めなかっ

Sirt1 低下に SGLT2 が関与することを見出したので，こ8成人病の病因・病態の解明に関する研究助成により，発現抑制がみられた．次に，Sirt1 発現について検討したところ，db/db マウスでは Sirt1 発現低下を認め，SGLT2 阻害薬投与で，Sirt1 発現は保持された．
以上から，糖尿病性腎症において SGLT2 発現上昇がおそらく細胞内高糖を介して，Sirt1 発現を低下させる事がマウスで認められ，同様の傾向はヒト糖尿病性腎症の生検検体でも，相関が認められ，その重要性が示唆され
図１

尿細管糸球体連関

た．

申請者は，糖尿病性腎症の新規の病態機構を同定 し た（Nat Med 2013)． ア ル ブ ミ ン 尿 や 蛋 白尿といったポドサイトや糸球体の機能・形態異常に先んじて，尿細管の代謝変化が生じる事を明らかにし，尿細管糸球体連関と名付けた（Current
Hypertension Reviwe 2016） 更 に， そ の 後 の 解析で，SGLT2 による Sirt1 低下が関与し，SGLT2
阻 害 剤 に よ る Sirt1 維 持 を 明 ら か に し た（Sci
Reports 2018）．

図３
図２

SGLT2 上昇の機序の同定

SGLT2 上昇のメカニズム

GLUT2 による SGLT2 制御（Sci Reports 2018）

SGLT2 上昇の Polarity を同定した

次に，in vitro の解析で Cell Insert を装着し，細胞のこに報告する．

頂側・基底側の両方から糖の刺激が入る実験系を構築し前述した近位尿細管 Sirt1 低下の刺激となる高糖負荷

た．上層を尿細管細胞の尿管腔側，下層を血管腔側とみが，近位尿細管の SGLT2 を介する尿細管腔由来の高糖

な し，Normal Glucose・High Glucose の medium をか，GLUT2 を介して血中に再吸収される血管腔由来

2×2 ＝ 4 通りで組み合わせて LLCPK-1 細胞（ブタ由来の高糖かは不明であった．まず db/db マウス，8 週齢の近位尿細管細胞）を培養し，SGLT2 発現がどちらか

オ ス に 混 餌 で SGLT2 阻 害 剤（Canagliﬂozin） を 投 与らの高糖負荷に依存しているのかを検討した．上層をし，解析を行なった．まず，SGLT2 阻害剤にて，血糖，

NG, HG，下層を NG, HG とした 4 通りでは，下層がHbA1c が低下し，Canagliﬂozin は有効に作用していた．

HG の際に SGLT2 上昇と Sirt1 低下を顕著に認め，血次に，SGLT2 阻害薬の作用部位である SGLT2 の発現

管腔側 HG（In vivo の血糖上昇に相当）が重要と分かっ

量が，糖尿病性腎症でどのように変わるかを検討した．

た．更に，重要なことに GLUT2 がこの系にかかわるこ

16 週 時 点（ 投 与 ８ 週 間 後 ） で，db/db 群 で，controlとが分かった．紙面スペースの関係等で詳細は割愛さ(db/m) に比して SGLT2 発現が上昇し，SGLT2 阻害薬せていただくが，その後の細胞シグナル解析で GLUT2

79成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

が Glucose を sensor し，GLUT2 と 結 合 し て い る【方法】

importin-α1 と HNF-1αが，高糖刺激で乖離し，これ一次繊毛を有するヒト網膜色素上皮細胞 (hRPE1 細らが核内へ移行し，SGLT2 の発現を上昇させることを胞 ) に MCHR1 を強制発現させた安定発現株を作製し同定した（長谷川，脇野，伊藤裕ら Scientiﬁc Reports

た．当該株を用いて MCH を添加した際の一次繊毛の形

2018)．GLUT2 の関与については，一時的に尿管腔側態観察および縮退に伴う細胞内シグナルの解析を実施しで高糖になる状況）とは，糖尿病性腎症における超早期

た．また，マウス脳切片における一次繊毛の観察条件もに高尿糖を生じ，インスリン代償分泌等により高血糖ま検討した．

では持続していない早期の病期に起こり得る状況と相当【結果・考察】し，発症早期には GLUT2 が受動輸送トランスポーター

MCHR1 が安定高発現した hRPE1 細胞（＃７）を作製のため一時的な糖逆流が生じうる可能性をも想起される

した．＃７は MCHR1 を一過性発現させた細胞より鋭敏が，これが生じているのかそれとも sensing しているのかつ安定して一次繊毛の縮退が生じ，縮退現象解明のたみであるかは今後の検討が必要と考えている．

めの有用な特徴を有していた．＃７を用いて解析を行っ

更 に，SGLT2 発 現 上 昇 が， ど の よ う に Sirt1 発 現たところ，一過性発現系で示された「縮退現象が Gi/o低下を来すのかその詳細を同定していきたい．加え特異的であり，Akt → GSK3βを介して生じる」ことをて，SGLT2 発現上昇が，Sirt1 低下の下流でどのような明確に支持する結果を得た．さらに，縮退現象の終点に

Tubulopathy を来すのか，続いて尿細管糸球体連関のあたる細胞骨格系の形成および崩壊現象を各種阻害剤に破綻をきたすか検討し，逆に SGLT2 阻害が抑止できるより解析した結果，微小管の脱重合およびアクチンの重かを検討したい．

合が繊毛縮退に重要なことを明らかにした．さらに，＃７を用いたタイムラプス解析から，同一細胞におけるリア

一次繊毛における中枢性摂食受容体の機能解析
濱

本

明

恵

ルタイムな繊毛縮退を捉えることに成功し，縮退現象に
エクトソームは関与しないことも判明した．また，マウス脳の各脳領域（海馬，線条体等）において，一次繊毛（岐阜大学工学部）

を簡便かつ高感度に検出する免疫染色条件を確立し，生体内において検出可能な基礎的条件が整いつつある．

【目的】
メラニン凝集ホルモン（MCH）は，MCHR1 を介して摂食に関与する．一次繊毛は，繊毛膜に発現する受容本研究は一次繊毛という「場」における GPCR のダイ
ナミックな機能および肥満の分子メカニズム解明に新規知見を与える物である．

体を介して微小環境を検知するセンサーとして働き，その攪乱は肥満など様々な疾患と結びつく．繊毛膜は細胞膜から連続する構造ではなく，繊毛膜へ輸送されるのは
MCHR1 を含む限られた分子のみである．先行研究において我々は，MCHR1 陽性一次繊毛が MCH 濃度依存的

レム睡眠を制御する神経基盤および分子基盤の解明と神経疾患の治療への応用
林悠（筑波大学国際統合睡眠医科学研究機構）に一次繊毛長が短くなる「縮退現象」を見出した．これまで生命現象の根幹を担う細胞内シグナルは，MCHR1を含めて細胞膜上に受容体を発現させた実験系を中心に【目的】

研究が進められてきた．そこで申請者は，MCHR1 を含本研究では，睡眠障害を頻繁に伴う疾患として認知症

む一次繊毛局在型受容体の生理機能を解明するブレイクに着目した．アルツハイマー型認知症（AD）ではレム

スルーとして「一次繊毛という特異なオルガネラに局在睡眠（いわゆる夢を見る睡眠）の減少が見られ，レビーする受容体の特徴的なシグナル系」の重要性を提唱する

小体型認知症（DLB）ではさらにレム睡眠行動障害（夢と共に詳細な解明を試みた．

のとおりに体を動かして暴力を振るう障害）が見られる．

80

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

本研究では，マウスモデルを用いてこうした睡眠異常の発症機構を解明することで，治療法の糸口を得るとともに，睡眠そのものの制御機構に関する知見を得ることを目的とした．

成体心筋細胞の分裂機序の解明と心筋再生治療法への応用を目指して
原

弘

典（東京大学大学院医学系研究科）【方法】
まずは AD の動物モデルを用いて，どのような睡眠の症状が見られるかについて解析を行った．
西道隆臣博士，【背景・目的】斉藤貴志博士（理化学研究所 脳科学総合研究センター）

近年，成人の心筋細胞も，既存の心筋細胞が分裂する

らのグループにより AD を最も忠実に再現したモデルマ

ことで僅かながらターンオーバー（自己再生）している

ウスが開発されたが，林グループは，同グループとの共ことが実証された．この成体心筋細胞の増殖能（内因性

同研究の下，このモデルマウスが示す睡眠構築の特徴を心筋再生）を増幅することは，本邦で増加しつつある心

詳細に明らかにした．また，DLB に関しては，ヒト変不全・虚血性心疾患の新たな治療戦略として期待できる．

異型シヌクレイン発現ウイルスベクターを構築し，脳に本課題では，心臓を含む臓器の「適切な大きさ（増殖）」

局所注入することで，レム睡眠行動障害やレム睡眠減少を制御している Hippo-YAP 経路に着目し，心筋細胞増の責任候補領域の特定を試みた．

殖を促進する薬剤を，高速大量スクリーニング手法によ【結果】り同定・改変し，心筋梗塞モデルマウスでの有効性と安AD モデルマウスでは，若い時期から睡眠構築に異常全性を検証することで，心筋細胞増殖と心筋再生（修復）が生じること，加齢とともに一層重症化すること，さらを促進する薬剤の創出を試みた．

に，睡眠構築の制御に重要な脳幹の領域にβアミロイド【方法・結果】

が蓄積していることが判明した．また，
DLB に関しては，

約 18,600 種類の機能未知化合物ライブラリーを用

シヌクレインを脳幹橋に導入したマウスで DLB 患者のいて，上皮細胞（２種類の細胞アッセイ系）での YAP-

レム睡眠関連症状とよく似た表現型が観察された．

TEADs 転写活性を指標とした候補化合物の選出作業を【考察】行い，その後にラット新生児初代心筋細胞の増殖能も促

代表的な認知症である AD と DLB それぞれの睡眠関進する化合物を選出した．最も有効であった化合物につ連症状の原因解明に関して，本研究から，マウスモデル

いて 30 種類以上の構造改変を行い，その活性中心構造を用いたアプローチが有効であること，そして，DLBを同定し，さらに毒性が低く，心筋細胞での効果選択性に伴うレム睡眠関連症状のメカニズムの一端を明らかにが極めて高く，生体内安定性にも考慮したフッ素化化合することができた．この結果は，睡眠制御そのものの神物（TAZ-K）を創出した．この候補化合物 TAZ-K は，経基盤を解明する上でも有用な成果である．今後，有効心筋細胞でも YAP-TEADs 転写活性を促進し，さらにな治療法の探索と，睡眠構築の異常が，認知症の進行そ

Wnt/β-catenin 経路を活性化させることで，強力な増のものに寄与する可能性の検証が重要である．

殖促進作用を発揮すると考えられた．また，RNA-seq
による網羅的な発現解析により，細胞周期の進行とサル
コメア蛋白分解などの効果の他，酸化ストレス応答転写
因子 NRF2 の効果（抗酸化・抗アポトーシス作用）も増強させていることを見出した．マウス心筋梗塞モデルに TAZ-K を腹腔内投与したところ，梗塞境界域での心筋細胞の細胞周期の促進とクローン性増殖が誘導され，線維化軽減と心機能の改善にも効果的であった．
【考察】
Hippo-YAP 経路を標的とした細胞アッセイ系を用い8

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成て，心筋細胞増殖作用と心筋障害に対する保護作用を併

間眠り続けるという結果が得られた．

せ持つ新規フッ素化誘導体（TAZ-K）を創出した．重症【考察】

心不全患者に対して，効果的な心筋再生効果を期待でき

VM の神経群は大脳皮質のほぼ全域に広く，非特異的るとともに，心筋細胞の分裂機序解明にも大きく貢献すに投射している事が知られている．また，主に皮質第一ることが予想される．

層外側に投射し，第一層に存在する抑制性神経と，興奮性神経の樹状突起の両方を標的としている（二三層，五層の錐体細胞）．これらの解剖学的知見と我々の実験結

ノンレム睡眠特異的脳波パターンを作り出す神経回路の解析

果から，VM の神経は大脳皮質の多様な神経細胞の活性化を通じ，個体の覚醒状態への遷移・および維持に重要な役割を果たしていると考えられる．

本城

咲季子

（筑波大学国際統合睡眠医科学研究機構）【目的】
大脳皮質の活性化および睡眠から覚醒への遷移における視床の役割を明らかにする．
【方法】

慢性腎臓病における PlGF・可溶型 Flt-1 による動脈硬化症発症機序に関する検討
松

井勝（奈良県立医科大学医学部）

自由行動下のマウスの睡眠覚醒サイクルを通じて，大脳皮質と視床の神経活動を測定する．また光遺伝学を用

慢性腎臓病（CKD）は糖尿病，高血圧などの生活習

い睡眠時に視床を活性化し，覚醒への遷移が起きるかど

慣病と並んで心血管疾患を発症させる独立した危険因うか検討する．また，薬理遺伝学を用い，視床の不活性子であるが，その発症・増悪の機序はまだ十分に解明さ化の影響についても検討を行う．

れていない．VEGF family の一つである胎盤増殖因子【結果】（PlGF）は血管内皮細胞の Flt-1 受容体に結合し，その大脳皮質神経群（一次運動野，二次運動野）は覚醒時

慢性的なシグナルの活性化は血管新生，単球の浸潤などとレム睡眠において発火頻度が高く，ノンレム睡眠時にの機序を介して動脈硬化巣の形成および進展に促進性には覚醒時の約 80% 程度へ発火頻度が低下する事が観察働く．一方，膜型 Flt-1 受容体遺伝子からの alternative

された．それに対し，視床内側腹側核（Ventromedial

splicing によって産生される細胞外ドメインのみより構

nucleus，以下 VM）の神経群は，ノンレム睡眠時に覚成される sFlt-1 は，PlGF と結合し，膜型 Flt-1 受容体

醒時と比べ 20％程度まで発火頻度が低下する事が明らへ結合することを阻害することにより，Flt-1 活性化にかになった．また，発火頻度の変化を解析した結果，ノ対する内因性の拮抗物質として働く．われわれは動脈硬ンレム睡眠から覚醒への過程において，まず VM 神経化進展作用を有する PlGF とその防御因子である可溶型の発火頻度が上昇し，それに続いて大脳皮質神経が発火

Flt-1 (sFlt-1) に着目して，その均衡が動脈硬化疾患の発頻度を上昇させ，
最後にマウスが動き出す事が分かった．

症あるいは進展の予防に重要であると考えた．

これらの結果は VM 神経群が大脳皮質の活性化を通じ覚醒への遷移を駆動する可能性を示唆する．

腎不全モデルマウスでは血中 PlGF 濃度の上昇と肺や腎組織における PlGF mRNA の発現の亢進と sFlt-1

そこで我々は光遺伝学を用い，ノンレム睡眠中のマウ

mRNA の発現の低下が認められた１）．また，培養細胞

スの VM 神経群の活性化を行った．その結果，VM 神

実験系において CKD 患者の血清を添加したヒト血管内経の刺激により大脳皮質が活性化し，マウスが覚醒行動

皮細胞においても PlGF mRNA の増加と sFlt-1 mRNAを示す事がわかった．また薬理遺伝学を用い VM の活の低下が確認された．さらに sFlt-1 蛋白を腎不全モデ動を阻害すると，マウスの覚醒状態が減り，より長い時ルマウスに投与すると，大動脈内プラ ーク面積が有意82

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成に減少した２）．
さらに 1351 名の CKD 症例を対象に，血中 PlGF 濃腸管および腸内環境をターゲットした慢性腎臓病の度が心血管イベントの予測因子となり得るかどうか検討

治療薬の開発した．心血管イベントに対する調整ハザード比 [95％信三島

頼区間] は 1st quartile (PlGF ≦ 10.1 pg/ml) に対して

英換
（東北大学病院）

2nd quartile (PlGF 10.2︲14.4 pg/ml) では 1.55 [0.92︲
2.66], 3rd quartile (PlGF 14.5︲19.5 pg/ml) では 3.39

【背景・目的】[2.20︲5.41]， 4th quartile (PlGF ≧ 19.6 pg/ml) で は腸管と腎臓の間の臓器連関である「腸腎連関」が近年

8.42 [5.54-13.3] であり，血清 PlGF 濃度は CKD 患者

明らかになりつつある．腸内細菌叢は CKD の病態に尿において心血管イベント発症の独立した危険因子であっ

毒素蓄積等を介して正負両面から関与するため腸管へのこの関連性は透析患者に限定したサブグルー
た ．また，

介入が慢性腎臓病（CKD）の治療法となる可能性がある．

プ解析でも同等であった．

糖 尿 病 治 療 薬 で あ る sodium glucose cotransporter３）

一方で，sFlt-1 はヘパリン負荷後に細胞表面から一過(SGLT) 阻害薬の中でも，カナグリフロジンは血糖降性に遊離した sFlt-1 濃度を測定することが全身の sFlt-1

下作用を示す SGLT2 阻害能に加えて腸管に発現するを反映していることを見出した．ヘパリン負荷試験を施SGLT1 の阻害能も有する薬剤である．SGLT1 阻害によ行した 343 名の患者では腎機能低下とヘパリン負荷後る小腸でのグルコース吸収遅延は，大腸へのグルコースsFlt-1 濃度は正の相関を認めており，sFlt-1 減少群で有エスケープを引き起こすことで腸内細菌叢を含む腸内

意に心血管イベント発症率が高かった．

環境を変化させうる．今回我々は，カナグリフロジンが以上より，われわれは動脈硬化促進作用を有する
PlGF とそのアンタゴニストである sFlt-1 の不均衡がCKD 患者における心血管疾患発症の機序に一助していCKD 病態に与える影響を腸内細菌叢を含め検討した．
【目的・方法】
CKD モデルマウス（アデニン誘発腎不全）に対してることを証明した．

カナグリフロジン（10 mg/kg/day）を２週間経口投与し，【文献】

CKD 時に体内に蓄積する各種尿毒素物質および腸管内

１）Matsui, M. et al.: Suppressed soluble Fms-like

短鎖脂肪酸，腸内細菌叢に与える影響を検討した．

tyrosine kinase-1 production aggra vates atherosclerosis in chronic kidney disease. Kidney Int.,85, 393-403 (2014).

【結果】
カナグリフロジン投与はｐクレシル硫酸，インドキシ
ル硫酸といった腸内細菌叢によって産生される悪玉尿毒２）Onoue, K. et al.: Reduction of circulating soluble

素の血中蓄積をそれぞれ－75％ , －26％減少させた (vsfms-like tyrosine kinase-1 plays a significant

control 群）．一方，尿中への各尿毒素の排泄量に有意role in renal dysfunction-associated aggravation

な変化を認めなかったことからこの減少効果は腸管でのof atherosclerosis. Circulation., 120, 2470-7

尿毒素産生抑制が機序と考えられた．また同時に，カナ(2009).

グリフロジンは CKD 時に減少する腸管内短鎖脂肪酸の３）Matsui, M. et al.: Placental Growth Factor as a増加作用を示した．さらに回盲部内容物を用いたメタゲ

Predictor of Cardiovascular Events in Patients

ノム解析からは，カナグリフロジンは CKD 時の腸内細with CKD from the NARA-CKD Study. J Am Soc

菌叢の有意な変化を引き起こしていることを認めた．

Nephrol. 26: 2871-81 (2015).

【考察】
カナグリフロジンは CKD 時における腸内細菌叢を変化させることで，腸内細菌由来尿毒素を減少させるとともに，腸管内短鎖脂肪酸を増加させる作用があることを明らかにした１）．このように他疾患での既承認薬の腎保8

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

護効果を見出すことは CKD 治療薬へのドラッグリポジ

れた直後に活発に分解され，細胞内のトータル RNA 中

ショニングが期待される．

には極僅かしか存在しない．従って，単一のサンプルの【文献】

みに対して通常の CAGE 法を行っても，エンハンサー

１）Mishima, E. et al.: Canagliﬂozin reduces plasmaは極僅かしか同定できない．この問題を解決するために，

uremic toxins and alters the intestinal micro-

本課題では，特殊な工夫を加えることでエンハンサーを

biota composition in a chronic kidney disease

１つのサンプルのみからでも高感度に同定できる改良版

mouse model. Am J Physiol Renal Physiol. 2018CAGE 法（NT-CAGE 法）を開発する．

[Epub ahead of print]【結果】
申 請 者 は，nascent RNA を 簡 単 な 生 化 学 的 作 業 のみにより精製するウェット実験手法を確立し，エンハ

白血病を維持する腫瘍エンハンサーの検索
村

川

泰

裕

（理化学研究所予防医療・診断技術開発プログラム）

ンサーを超高感度に同定および活性定量できる NETCAGE 法の実験手技を立ち上げた．そして，ヒト慢性骨髄性白血病細胞 K562 やリンパ芽球細胞 GM12878
を 含 む ENCODE の 主 な 腫 瘍 細 胞 株 4 種 類 に 対 し てNETCAGE 法を既に行った．そして，ENCODE プロジェ

【目的】

クトで蓄積されたエンハンサー，オープンクロマチン領

成人病の柱の一つに悪性疾患が含まれる．とりわけ白域や様々な転写因子の結合部位といったゲノムワイドな血病は，他の悪性疾患に比べて発症年齢が若く，社会的アノテーション情報を用いて，NET-CAGE のバイオイにも重大な疾病である．本研究課題では，白血病細胞をンフォマティクス解析のプログラムも最適化された．こ

維持しているゲノム転写ネットワーク，特にこのネットのように NET-CAGE 法の技術開発，および白血病を含ワークで中心的役割を担うエンハンサーを同定し，病態

む数種類の腫瘍への適用は既に完了した．大規模の臨床に基づいた新たな分子標的薬や予後予測バイオマーカー

検体に対してエピゲノム解析，トランスクリプトーム解を目指す．

析，ゲノムネットワーク解析を行うための基盤を形成す【方法】

ることに成功した．

エンハンサーは，遺伝子の遠位に存在し，転写因子が【考察】結合することで，標的遺伝子の発現を増大させる数百塩

今後この独自に開発した NT-CAGE 法を数百の急性白

基長のシスエレメントである．しかし，遺伝子の遠位に血病の患者のサンプルに適用し，白血病細胞に特異的な存在し，同定が困難なため十分に研究が進んでこなかっエンハンサーを検索し，白血病細胞を維持している遺伝

た．申請者の所属機関で開発された CAGE 法は，RNA子発現ネットワークを詳細に解析し，白血病の病因・病の 5' キャップ構造を利用して，5'末端を次世代シーク態の解明を目指す．グローバルな遺伝子発現異常が白血

エンサーにより網羅的に解析する技術である．遺伝子か病に一般的に認められるが，そのメカニズムは不明であら転写される RNA の 5' 末端を解読することでプロモーる．とりわけ，急性白血病ではエピジェネティクスの異タ ー 解 析 に 応 用 さ れ て き た（FANTOM Consortium,常が示唆されており興味深い．

Nature 2014）．近年，驚くことに，エンハンサーにもRNA ポリメラーゼがリクルートされ，エンハンサー自体からも両方向性に RNA（エンハンサー RNA）が合成されることが示された．従って，CAGE 法によりエンハンサー RNA の 5' 末端を検出することで，高塩基解像度でエンハンサーが同定できる（Andersson et al.
Nature 2014）．しかし，エンハンサー RNA は合成さ

8

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

ɪｎ ｖｉｖｏ・一細胞レベルでオルガネラの役割を研究するための方法の開発
柳

谷

耕

太

（奈良先端科学技術大学院大学研究推進機構）

ける一細胞レベルでのオルガネラ減少は樹立できていない．
【将来の展望】
今後は，オルガネラ減少法を活用して，オルガネラ量の恒常性を司るシステムの解明を目指す．

【目的】
真核生物において，好気呼吸によるエネルギーの産生MR 結合新規転写共役因子の探索とその機能解析
横や細胞外へのタンパク質分泌 , 脂質の代謝などの細胞の田健

一（慶應義塾大学医学部）

生命機能に重要な反応は，ミトコンドリアや小胞体，ペルオキシソームなどの脂質膜で覆われた細胞内小器官（オルガネラ）で分担して遂行される．高等動物の細胞【目的】

においては，これらのオルガネラの量は，オルガネラを

近年，糖尿病や肥満，CKD などに合併する治療抵抗有する細胞がどの程度，そのオルガネラの機能容量を必性高血圧の患者の一部で，高アルドステロン血症を呈要とするのかに依存すると考えられる．例えば，筋収縮さないにも関わらず MR 拮抗薬の併用により血圧のコによって ATP を大量に消費する心筋細胞や，細胞膜をントロールが得られる症例が存在することから，何等か越えたイオンの流入・流出に ATP を消費する神経細胞の MR の病的活性化機構の存在が示唆され，我々はこでは，ミトコンドリアが発達している．また，超長鎖脂のような病態を「MR 関連高血圧」という新規概念で提肪酸のβ酸化や胆汁酸の合成が盛んな肝臓においてはペ唱し，これまでその分子メカニズムの一部を解析してきルオキシソームが増殖している．これは，それぞれの細たが１,２），いまだ MR 活性化メカニズムには未知の部分胞において，その生理的機能を維持するために必要な量が多い．我々は，MR の新規転写共役因子の網羅的同定のオルガネラが存在することを示唆しているが，そのオを質量分析計を用いて試み，さらには同定された因子に

ルガネラ量と細胞の生理的機能の因果関係は十分に理解ついてエピゲノムを介した MR の転写調節機構の解析されていない．本研究課題では，生体内において，特定を切り口として，これまで殆ど未知であった高血圧の遺の種類の細胞の機能におけるオルガネラの役割を調べる

伝因子からの発症メカニズムを解明することを目的としための方法の開発を目指した．

た．

【方法，結果】【方法】

生体内において，特定の種類の細胞におけるオルガネ

MR 安定発現腎由来細胞を樹立し，核抽出液から抗体ラの役割を調べるための方法として，オルガネラ量を減精製にて MR 相互作用因子を取得し，LC-MS/MS を用少させる方法（オルガネラ減少法）の開発に取り組んだ．

いて網羅的に同定を試みた．そして得られた因子の中か

現在までに，培養細胞を用いた研究で，ミトコンドリア

ら，高血圧発症関連因子 CASZ1 に着目し，in vitro おやペルオキシソーム，小胞体の量を減少させることが可

よびヒトのサンプル，尿細管特異的ノックアウトマウス

能になった．さらに，
ゼブラフィッシュを用いた研究で，の表現型解析を行い，高血圧発症に対する重要性を解析

動物個体にも，このオルガネラ減少法を適用できることした．

が明らかになった．また，一細胞レベルで，オルガネラ【結果】減少を引き起こすことができるように，光照射によってスクリーニングにより同定した蛋白の中で，GWAS

活性を調節できる光活性化型オルガネラ減少法の開発を研究により高血圧との関連が示唆されていた CASZ1 に行った．その結果，培養細胞レベルで，光を照射した細注目し機能解析を進めたところ，CASZ1 は尿細管細胞のみで，ミトコンドリアやペルオキシソームの量を減胞で MR と共発現し，Mi-2/NURD 複合体と MR との少させることが可能になった．しかしながら，個体におリガンド依存性のアダプターとして機能し，ヒストン

8成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

脱アセチル化を促進して MR 標的遺伝子発現を抑制することで血圧調節に関わることを明らかにした．さらに，CASZ １遺伝子内に報告された高血圧関連 SNP は，
CASZ1 の発現量を変動させることで，高血圧発症に関与していることが示唆された．また CASZ1 の尿細管特異的ノックアウトマウスは DOCA/salt 負荷２週間後，尿中Ｋ排泄および血圧が有意に高く，この作用はスピロ
ノラクトン投与によりキャンセルされた．
【考察】
本研究により MR 転写共役因子を介したエピゲノム
制御による，高血圧発症メカニズムの一因が明らかにされた．今後，高血圧治療のターゲットとして MR の重要性が再認識され，今後臨床においても，高血圧患者のCASZ1 の SNP タイプの解析により，早期からの MR
拮抗薬の投与を考慮するといった，オーダーメイド治療にもつながる可能性がある．

86

研究報告

Vascular
Vascular Biology
Biology Innovationに関する研究助成
Innovationに関する研究助成

RAAS 活性化における間在細胞 MR 依存性および非依存性の Pedrin 制御機構
鮎

澤

信

宏

（東京大学先端科学技術研究センター）呈した．以上から，AII による PDS 制御は間在細胞 MR依存的に起こり，体液量減少時に体液量・血圧維持に働く生理学的意義を有することが示された．
一方，野生型マウスに高食塩食・Aldo 投与を行うと，NCC 活性化や PDS 発現増加・管腔側膜集積が見られ，食塩感受性高血圧を生じた．MR-B1KO マウスではこの【目的】

PDS 発現増加は部分的に抑制されるに留まり，膜移行

腎接合尿細管・皮質集合管のβ間在細胞に発現するは抑制されず，食塩感受性高血圧を含めて表現型に明ら

Pendrin(PDS) は，遠位曲尿細管に発現する NCC と相かな変化は見られなかった．すなわち，Aldo 過剰時に補的に NaCl 再吸収に働き，体液量維持や食塩感受性高は間在細胞 MR 非依存的な PDS 制御機構が存在するこ血圧の形成に関与する．

とが示唆された．

Pendrin は NCC と同様にアンジオテンシン II（AII）

昨今，Aldo 過剰に伴う NCC 活性化は，遠位曲尿細刺激や，アルドステロン（Aldo）過剰により活性化す

管 の MR を 介 さ ず， 集 合 管 主 細 胞 の MR-ENaC 経 路

ることが知られる．これらの状況において，間在細胞活性化に伴う低 K 血症によって起こることが証明されでは特異的脱リン酸化による MR 活性化が起こり，こた．そこで我々は，PDS 制御においても同様に主細胞の MR 活性化が PDS 制御と相関することが最近示されの MR-ENaC 経路活性化に伴う素因による制御機構がた．しかし，この間在細胞 MR 活性化と PDS 制御とのあると想定し，解析を行っている．これまでに間在細因果関係や，
その意義は不明である．そこで本研究では，

胞 MR 欠損マウスに加え，全ネフロン MR 欠損マウス

腎間在細胞特異的 MR 欠損マウスを作成し，AII 刺激やや，ENaC 阻害薬を用いた実験等を行い，想定の通り，

Aldo 過剰による Pendrin 制御において間在細胞 MR がAldo 過剰に伴う PDS 制御も主細胞の MR-ENaC の活性

果たす役割や，その意義につき検討した．

化に伴う素因により起こることが明らかとなった．

【方法と結果】【考察】

MR-ﬂox および Atp6v1b1-cre マウスを交配し腎間在本研究では，AII 刺激時におこる間在細胞 MR 依存性細胞 MR 欠損マウス（MR-B1KO）を作成した．これらの PDS 制御と，Aldo 過剰時におこる主細胞 MR-ENaC

マウスに AII 投与を行うと，野生型では NCC 活性化と経路の活性化に伴う素因による PDS 制御，２つの対照

ともに PDS 発現の増加が見られたが，MR-B1KO では的な経路を明らかとした．これら PDS 制御機構は既存

PDS 増加のみが有意に抑制された．生理学的には AIIの利尿薬抵抗性の高血圧などにおいて新たな治療標的とによる PDS 活性化は体液量減少時に起こり，同じく活なる可能性がある．

性化した NCC とともに NaCl 再吸収・体液量保持に働くと考えられる．実際，野生型マウスに低食塩食を投与すると腎 PDS 発現量の増加が見られ，さらに NCC 阻
害薬である hydrochlorothiazide（HCTZ）を追加すると，さらなる RAAS 活性化とともに PDS 発現量もさらに増加した．一方で MR-B1KO では，これらの状況においても PDS 増加が抑制され，体重減少・血圧低下を

8

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

分泌顆粒分解に着目した内分泌調節機構の解析
板

倉

英

祐

パク質を組み合わせ，不良タンパク質がエンドサイトー
シスを介して細胞によって除去されるか調べた【結果】（千葉大学大学院理学研究院）

細胞外シャペロン自体だけでは細胞内に顕著な取り込みを受けない一方で，細胞外シャペロンと不良タンパク【目的】

質複合体はすみやかに細胞内に取り込まれ，リソソーム

超高齢化社会を迎え，生活習慣病や神経変性疾患数は依存的に分解されることがわかった．不良タンパク質と増加する一方であり，ホルモンの分泌や血管内を健全に代替した正常タンパク質の添加では取り込み促進はみら保つことが重要である．しかし分泌タンパク質に関わるれなかったことから不良タンパク質特異的な認識がある

研究はその合成や分泌調節機構について解明されてきたことがわかった．またこの分解機構は様々な細胞で見らが，合成後の品質管理機構は全く知られていない．私はれるため，組織特異的な現象ではないと考えられる．

細胞内タンパク質分解システムに関わる研究から得た知【考察】

見を応用して，分泌顆粒内もしくは細胞外（血液内）タ

これらの結果は細胞膜上に血中内の不良タンパク質を

ンパク質の品質管理機構に焦点をあてることで，糖尿病取り除く品質管理受容体があることを強く示唆していなどの生活習慣病や神経変性疾患の新しい予防・治療法

る．したがって，CRISPR を応用した網羅的遺伝子欠損に応用できると考えている．

スクリーニングを用いて血液内の不良タンパク質を取り本研究ではこれまで継続してきた Crinophagy による除くためにはたらく品質管理受容体のスクリーニングを分泌顆粒分解系と，その延長課題として細胞外（血液内）

進めている．品質管理受容体の分子機構を解くことで，タンパク質品質管理システムの研究を進展している．

血管内を健康に保つ新しい概念の提唱が期待される．

細胞内の分泌顆粒とリソソームが直接融合し，分泌前のホルモンが分解されることを Crinophagy (Crin はギリシャ
語で分泌，phagy は食べるの意）と呼ぶ．Crinophagy
は細胞内過剰・不良分泌顆粒を除去するために働いていると考えられている．しかし，Crinophagy の分子機
構も生理機能も不明のままである．これまで開発した

AT2 受容体相互作用タンパク質の脳保護作用への影響についての検討
岩波純（愛媛大学大学院医学系研究科）

Crinophagy アッセイ法を用いて，Crinophagy の誘導機構や分子機構の解明を進めている．
細胞外，つまり血中内の不良タンパク質がどのように【目的】

除去されるのかわかっていない．そこで細胞外シャペロ

これまで我々はアンジオテンシン II タイプ２（AT2）ンに着目した．細胞外シャペロンと基質の分解経路を調受容体刺激が脳保護効果を持つこと，さらに培養神経細べることで，血管内のゴミを取り除き，健康な血管を保胞を用いた検討から，AT2 受容体の C-末端に結合してつ仕組みの解明を目指す．本発表では現在進めている細いる AT2 受容体相互作用タンパク質（ATIP）がその保胞外品質管理システムについて主に報告する．

護効果に重要であることを報告してきた．血管障害モデ【方法】

ルにおいても ATIP が AT2 受容体刺激に重要であるを細胞外タンパク質品質管理経路が存在するかどうか調報告してきたが，脳傷害時における ATIP の作用についべるため，細胞外不良タンパク質分解をモニターできるては明らかにされていない．そこで ATIP 過剰発現マウ

アッセイ法の開発に取り組んだ．まず哺乳類培養細胞のス（ATIP-Tg）を用い，脳傷害時における ATIP の影響

ゲノム組換えシステムを利用することで，蛍光タンパク

および AT2 受容体刺激薬の効果について検討した．

質を付加した細胞外シャペロンタンパク質の大量発現と【方法】

精製に成功した．精製した細胞外シャペロンと不良タン

88

10 週齢雄性 ATIP-Tg と同腹子（WT）に中大脳動脈

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

閉塞術（MCAO）を施行し，脳梗塞モデルを作成した．
AT2 受容体刺激薬（C21; 10μg/kg/day）は８週齢から２週間腹腔内投与し，MCAO を施行した．MCAO の

２．Hsd11b2 Ksp－/－マウスの高血圧は減塩食により野生型と同等レベルにまで低下した．
３．Hsd11b2 Ksp－/－マウスは低カリウム血症をきたした．

24 時間後，神経学的症状，梗塞サイズ，mRNA 発現，（AME 症候群の一症状）

MCAO 前後の脳表層血流量の変化を検討した．MCAO

これらの結果から，腎臓の 11β-HSD2 活性喪失は単前の脳表層血管の発達を墨汁灌流により検討した．

独で食塩依存性に高血圧発症機序となることが示され，【結果】

腎臓説を強く支持された．申請者らは昨年の発表時から

神経学的症状および脳梗塞サイズは，ATIP-Tg で WT

さらに解析を進め，に比べて改善傾向があったが有意差は認められなかっ１．Hsd11b2 Ksp－/－マウスは低レニン活性・低アルドス

た．C21 を投与することにより神経学的症状，脳梗塞

テロン血症・高コルチコステロン１日排泄量を示し

サイズは無投与群に比べて両マウスとも有意に改善してた．また野生型マウスのコルチコステロン血中濃度

おり，さらにこの改善効果は WT に比べて ATIP-Tg では「活動期に高く非活動期に低い」という正常な日増強していた．MCAO 後の脳血流量の減少は，中大脳内変動が見られた一方で，Hsd11b2 Ksp－/－ マウスで

動脈中心部では全ての群で有意差は認められなかった．

は両活動相を通じて高値を示し，日内変動の破綻が周辺部では WT-C21 投与群では MCAO の 24 時間後に観察された．

血流量の増加が認められた．一方，ATIP-Tg-C21 群で２．Hsd11b2 Ksp－/－ マ ウ ス の 腎 臓 で は， リ ン 酸 化 Na＋

は MCAO 直後から脳血流量の減少が軽減していたこと-Cl－cotransporter (NCC)，上皮性ナトリウムチャから脳表層血管形成を検討した．MCAO 前の脳表層のネルαサブユニットの細胞膜発現量が増加しておCollateral Circulation およびリン酸化 eNOS は ATIP-

り，これらの活性化が示唆された．一方で NKCC2

Tg-C21 群で増加傾向が認められた．また，MCAO24は増加していなかった．

時間後，神経保護因子である MMS2 mRNA の発現は３．Hsd11b2 Ksp－/－マウスに高カリウム食や K 保持性利ATIP-Tg, ATIP-Tg-C21 群で非梗塞側に比べ梗塞側で増尿薬 amiloride を投与して低カリウム血症を補正し加していた．

たところ，高血圧は同処置下野生型マウスと同等レ【結論】

ベルに改善したことから，このモデルの高血圧発症

以上の結果から，AT2 受容体刺激は ATIP を介して脳に低カリウム血症が重要であることが示された．

血流量に影響し，脳保護効果を増強していることが示唆

４．Hsd11b2 Ksp－/－マウスに MR 拮抗薬または GR 拮抗
薬を皮下徐放ペレットにより投与したところ，それされた．

らの降圧効果はマウスの活動相に応じて差異が見られた．
ストレスホルモン制御機構である腎臓とその破綻の解析

以 上 の 結 果 を 踏 ま え 現 在 は， こ の 現 象 が 腎 臓 のHsd11b2 遺伝子を欠損した状態に特異的なものなのか，
それとも高コルチコステロン血症に普遍的な現象なの

上

田

浩

平

か，更なる解析を進めている．

（東京大学先端科学技術研究センター）
申請者らは作出した腎臓特異的 Hsd11b2 遺伝子欠損
マウス（Hsd11b2 Ksp－/－マウス）の解析から，
１．Hsd11b2 Ksp－/－ マ ウ ス は 野 生 型 に 比 べ，24 時 間
telemetry 計測にて収縮期・拡張期血圧ともに有意に上昇を認めた．

89

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

加齢性骨格筋萎縮の新規分子機構の解明
遠藤仁

筋委縮の改善がみられ，傷害後の骨格筋再生を促進する効果も確認できた．
さらに，Wnt シグナルと協調的に働く YAP シグナル（慶應義塾大学医学部）

についても解析を行なった．加齢マウスおよび (P)RR
Tg マウスにおいて YAP の亢進が確認され，YAP 阻害【目的】
加齢性骨格筋萎縮の原因，分子機序については不明な点が多い．近年，老化と関連の深い Wnt シグナルを活薬 Verteporﬁn の投与により筋芽細胞融合の回復を介して筋委縮が改善することが示された．
【考察】

性化する分子の一つとして，組織 RAS の鍵分子である(P)RR Tg マウスは，稀有なサルコペニアモデル動物

プロレニン受容体（(P)RR）が同定された．本研究は，と考えられる．サルコペニアの発症機構に (P)RR-Wnt-(P)RR-Wnt シグナルを中心とした新たな加齢性骨格筋

YAP シグナルの活性化が重要であり，筋芽細胞融合の

萎縮の分子機構の解明および新規治療法開発を目的とす

障害・早熟化を介して骨格筋委縮が進展する．これらのる．

シグナル経路を阻害する薬剤が今後サルコペニアの新た【方法・結果】

な治療薬になることが期待される．

加齢に伴いヒトおよびマウスの骨格筋では (P)RR の発現が増加していた．そこで我々は，全身に (P)RR を高発現させた (P)RR Tg マウスを作製し解析をおこなった．(P)RR Tg マウスは生後約一年以内に死亡した．(P)RR

VEGF-A165b と心血管病の関連から病態評価へ
菊

地

良

介
（名古屋大学医学部附属病院）

Tg マウスは，体重減少を呈し，全身の著明な骨格筋萎
縮（速筋優位）を認めた．(P)RR Tg マウスの骨格筋では Wnt シグナルが活性化されており，組織所見では，【目的】

円形線維，筋線維の大小不同，中心核，間質の線維化が生体内で血管新生を調節する主要な因子の一つに血みられ，MHC2B 陽性線維 ( 速筋 ) の数が著明に減少し管内皮細胞増殖因子（VEGF-A）がある．165 個のアミていた．また，老化マーカーの上昇がみられ，前述の組ノ酸からなる VEGF-A165 はこれまで血管新生を正にコ織所見とともに，(P)RR Tg マウスは加齢性骨格筋萎縮

ントロールする因子として研究され，これを抑制する抗の表現型を呈していると考えられた．

体医薬が現在癌に対して臨床応用されている．ところが

筋傷害後の骨格筋再生能を (P)RR Tg マウスで評価し近年，血管新生を抑制するという全く逆の機能を有する

た．筋線維数の増加は野生型と有意な差は認めなかっ

VEGF-A165b が発見された．しかし，VEGF-A165b と心たが，多核化と筋線維の肥大が遅滞し，筋管形成（筋血管病との関連，さらには病態評価への応用については

芽細胞融合）の障害が示唆された．筋分化マーカー

不明な点が多い．

Myogenin 陽性再生線維も (P)RR Tg マウスでは傷害早そこで，本研究では VEGF-A165b と心血管病との関連期から多数認められ，筋線維の早熟分化が示唆された．

を明らかにし，さらには病態評価への応用が可能かにつ(P)RR を安定発現させた C2C12 筋芽細胞株においても，Wnt シグナルの活性化が確認され，筋成熟・筋管形成能の低下を認めた．この表現型は Wnt シグナル阻
害分子 DKK-1 の投与により改善がみられた．

いて評価することを目的とした．
【結果】
血管病の一つである末梢動脈閉塞性疾患（PAD）は，主幹動脈の閉塞と不十分な側副血管形成に起因する組織(P)RR Tg マウスに DKK-1 を投与したところ，炎症，

虚血から生じる．PAD 患者では，VEGF-A 血中濃度が線維化，老化マーカーが抑制され，骨格筋萎縮の改善が健常人と比較して有意に上昇しているにも関わらず，下みられた．次に，(P)RR と Wnt の結合をブロックする

肢虚血が改善されないという矛盾点が知られていた．そ

中和抗体を投与したところ，同様に (P)RR Tg マウスのこで私たちは，PAD 患者の上昇している VEGF-A 血中90

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

濃度に VEGF-A165b が含まれている可能性について検証(2018).

した．その結果，PAD 患者において VEGF-A165b 濃度４）Kikuchi, R. et al.: Urinary and circulating levelsが上昇していることを発見し，VEGF-A165b による PADof the anti-angiogenic isoform of vascular endo-の血管新生不全機序を解明した１）．VEGF-A 血中濃度

thelial growth factor-A in patients with chronicの上昇と病態進行との矛盾点は，他にも指摘されておkidney disease. Clin. Chim. Acta. 475:102-108

り，その中には PAD の発症リスクとして知られている(2017).

肥満症，心疾患や慢性腎臓病がある．私たちは，肥満症
患者の胃縮小術前後で血中 VEGF-A165b 濃度に有意な差が認められ，微小血管障害の改善指標として有用であ

新規単球サブセットによる高次血管ネットワークのること２），急性心筋梗塞（AMI）を発症した患者では，編成機構の解明AMI 発症後の予後評価指標となりうること３）
（特願 :

木戸屋

浩康
（大阪大学微生物病研究所）

2017-247153)．さらに，慢性腎臓病患者の尿中 VEGFA165b 濃度が腎機能障害の重症度を反映しており，透析導入直前の患者では血中 VEGF-A165b 濃度が上昇してい【目的】

ることを明らかにした４）( 特願：PCT/JP2016/65325)．

固形腫瘍が増殖するためには，酸素や栄養の供給路とまた，私たちは，汎用されている VEGF-A ELISA の測して血管を腫瘍組織内へ引き込む必要があるため，血管定原理を再発想し，新規に VEGF-A165b の測定系を樹立

新生の抑制による「兵糧攻め」のコンセプトに基づく癌した ( 特願：PCT/JP2016/65325)．この技術を応用し治療法の開発が進められてきた．これまでに VEGF を

自動分析機用 VEGF-A165b 測定試薬の開発に取り掛かはじめとする多数の血管新生誘導因子が発見され，それり，現在までにプロトタイプの試薬開発に成功した．

らに対する阻害薬が開発されているが，予想に反して血【考察】

管新生抑制剤の治療効果は限定的であった．このことは，

我々のこれまでの研究成果から，VEGF-A165b と心血管病との関連が明らかになり，さらには病態評価への応

血管新生に依存しない未知の腫瘍血管形成機構の存在を示唆している．

用についての可能性が示唆された．今後，VEGF-A165b

我々の血管発生に関する研究により，血管リモデリンによる心血管病への病態評価として臨床検査法を確立でグ過程において血管が管腔構造を保ったままスライドす

きるよう研究を進めていきたい．

ることが明らかになっている．また，この「血管束移動」【文献】と名付けた血管リモデリング過程には，特殊なミエロイ

１）Kikuchi, R. et al.: An anti-angiogenic isoform ofド系細胞群が関与していることを明らかにしている．本VEGF-A contributes to impaired vascularization

研究では，腫瘍血管形成における血管束移動の役割の解

in peripheral artery disease. Nat. Med. 20(12):明と，血管新生抑制剤に対する治療抵抗性との関連性を

pp1464-1471 (2014).

明らかにすることを目的とする．

２）Doan, TM., Farb, M. & Kikuchi, R. et al.: Anti-【方法および結果】

angiogenic actions of VEGF-A165b, a novel iso-

腫瘍組織中における血管束移動の有無を検討するた

form of VEGF-A, in human obesity. Circulation.

め，多光子共焦点レーザー顕微鏡を用いた生体イメー

130: pp1072-1080 (2014).

ジングによる経時的な解析を行った．我々が作成した

３）Harada, K. & Kikuchi, R. et al.: Association

血管イメージングマウスを用いて撮影を行ったところ，

between the ratio of anti-angiogenic isoform of

腫瘍組織内で血管束移動が起きている様子が確認でき

VEGF-A to total VEGF-A and adverse clinical

た．また，腫瘍血管組織内の血管束移動においても，血outcomes in patients after acute myocardial

管近傍にミエロイド系細胞群が蓄積していることを組

infarction. Int. J. Cardiol. Heart. Vasc. 19: 3-7

織学的な解析から明らかにした．このミエロイド系細9Vascular Biology Innovation に関する研究助成

胞は MMP9 を高発現しており，血管周囲の細胞外基質を分解することで血管束移動を誘導していると考えられる．腫瘍組織中のミエロイド系細胞には多様なサブセットが存在しており，血管束移動に関与する細胞群を「血管関連ミエロイド」として同定するために，MMP9の高発現を指標として探索したところ，CXCR2 陽性
かつ CD195 陰性のサブセットが同定された．さらに，
VEGF 阻害剤にて血管新生を抑制した場合には，血管関連ミエロイドの数と割合が増加していることが明らかと
なった．
【考察】
本研究の成果から，血管束移動が腫瘍血管の構築に寄与している可能性が示唆され，腫瘍組織にて血管束移動を制御すると思われる特殊な血管関連ミエロイドが同定された．血管束移動は血管新生阻害剤に対する治療抵抗性に関与していると考え，今後はさらなるメカニズムの解明と血管関連ミエロイドを標的とした癌治療法の開発を進めていきたい．

ヒト血管内皮コロニー形成細胞の細胞小胞を介した網膜神経血管保護作用
崎

元

晋

図１
の他のメカニズムについてはほとんどわかっていない．
【方法】（大阪大学大学院医学系研究科）

EV は 48 時間培養し 0.22μm のフィルターを通した
のち，10 kDa の MWCO 系を用いて超遠心 (4000 x g,

【目的】

45 min) を行ったのち，サイズ排除クロマトグラフィー

血 管 内 皮 コ ロ ニ ー 形 成 細 胞（Endothelial colony-

を行った．BCA タンパク質アッセイを用い，可溶性

forming cells: ECFCs）は，血管内皮前駆細胞（EPC）

タンパクの少ない EV の濃縮に適した溶出分画を決定の分画のひとつで，臨床での細胞治療に用いる自家血し，それらの EV サンプルを UF-SEC-UF-1-EV (Serial

管内皮細胞のソースとして注目を集めている（Natureultrafiltration (UF), size exclusion chromatography

Biotechnology 2014, Cell Stem Cell 2014）．ECFC の(SEC) extracellular vesicle) サンプルとし，残りの分画

パラクライン作用による血管再生メカニズム関しては，に再度同様に超遠心，アッセイを行い，得られた EV サ

ほとんど報告がされていなかった．申請者らの目的は，ンプルを UF-SEC-UF-2-EV とした．上記方法を用いてECFC による虚血性網膜症による ECFC のパラクライ

CD-XX hi お よ び CD-XX lo の ECFC か ら EV を 単 離 し，ン作用を明らかにすることである．特に近年，細胞間伝

虚血性網膜症モデルである酸素誘導性網膜症（Oxygen達の重要な因子としてエクソソームやマイクロベジクル

induced Retinopathy: OIR）モデルに注射し，虚血おに代表される細胞外小胞（Extracellular vesicles: EVs）

よび新生血管の改善効果を検討した．

が注目されている．ECFC に関しては，細胞由来の EV【結果】

中の miRNA に腎虚血障害に対する治療効果があることEVに対する透過型電子顕微鏡所見では，UC-EV に比が報告されている（Vinas et al. Kid Int 2016）が，そ較し，UF-SEC-UF-1-EV お よ び UF-SEC-UF-2-EV で は92

Vascular Biology Innovation に関する研究助成【文献】
１）Sakimoto, S. et al.: CD44 expression in endothelial colony-forming cells regulates neurovasculartrophic eﬀect. JCI Insight 2(2), e89906 (2017).
２）Dellett, M. et al.: MicroRNA-containing extracel-

図２

lular vesicles released from ECFCs modulate
angiogenesis during ischaemic retinopathy. J.
Cell. Mol. Med. 21(12), 3405-3419 (2017).

ヒト心筋細胞移植療法実現へ向けた患者移植用 iPS細胞株の樹立および選抜法の最適化
関倫

久（慶應義塾大学医学部）【目的】
末期重症心不全は内科的治療に抵抗性であり，心臓移植が唯一の根治的治療となるが，我が国ではドナー不足
により移植申請数に対する移植施行件数は大きく下回る
現状が続いている．このような状況に対して，近年 iPS細胞が末期心不全に対する心筋細胞移植療法の細胞ソースとして期待されている．既に動物実験レベルでは iPS
細胞由来心筋細胞の移植により心機能が改善することが報告されており，医療者および患者双方から早急な重症

図３

心不全に対する再生治療の実現が求められている．将来
巨大タンパクの凝集がみられなかった（図２および的な移植治療に向けて，GMP レベルの培養条件内で完

白 矢 印， バ ー は 0.2 μm）． ま た，NTA 計 測 に お い て

結可能な心筋細胞分化用 iPS 細胞樹立プロトコールを確

も UF-SEC-UF は UC に 比 較 し て 有 意 に 多 く の EV が立すること，さらに iPS 細胞樹立後の各種の未分化性と認 め ら れ た（ 図 ３）
． 生 後（P） ７ 日 か ら マ ウ ス 仔 を安全性の評価プロトコールを最適化し，移植用としてふさ

75% 酸素チャンバーで５日間飼育する OIR モデルにおわしくない細胞株を排除し，移植に適する iPS 細胞株

い て，P12 に CD-XX よ り 分 離 さ れ た EV (CD-XX -を短期間で選抜する体制を確立すべく，研究を行った．

EV) および CD-XX lo-EV を硝子体注射したところ，CD-【方法と結果】hi

hi

XX hi-EV は CD-XX lo-EV に比較して，有意に新生血管

具体的には，まず GMP レベルへ移行可能な培養系を（neovascularization） の 退 縮 効 果 お よ び 虚 血（Vaso-

確立するため，動物由来成分の含有が最小限であり，か

obliteration）の改善効果が認められた．

つ生物由来原料基準をクリアできる培養系の確立を試み【考察】た．また，iPS 細胞の品質管理に用いる遺伝子マーカー

UF-SEC-UF を用いた EV の単離は有効であり，ECFCを同定するため，公開データを含めた多数の発現データ

由来の EV は虚血の改善効果を示し，今後のサブグルーから核型を推定し統計的に解析を行うことで，臨床用にプの解析が可能であることを示した．

適さない iPS 細胞株を迅速に見分ける方法の確立を試みた．センダイウイルスベクターによる山中因子導入，及9Vascular Biology Innovation に関する研究助成

び StemFitAK02 培地，培養基剤として iMatrix-511 を者において低下しており，BDNF レベルは運動耐容能

用いることにより，従来の培養条件よりも高効率な樹と負の相関をすることを報告した（Int J Cardiol 2013;

立方法の確立に成功した．当該方法は GMP 基準へ移行

J Card Fail 2015）．そこで，骨格筋の BDNF を検討し可能な試薬のみを用いており，ヒトへの移植ができる培たところ，速筋線維に比較し，遅筋線維に豊富に局在し，養条件内で完結可能である．さらに，樹立後の選抜マー

超解像度顕微鏡画像によりミトコンドリアと共局在するカーとして，700 個のヒト多能性幹細胞のマイクロアレ

ことが明らかになり，骨格筋ミトコンドリア機能およびイデータの解析から，ヒト iPS 細胞の最頻度の核型異常

全身の運動能力を制御する可能性が示された．そこで，である 12 トリソミーを簡便に見分けるマーカーとして

BDNF が心不全における骨格筋異常および運動耐容能

GTSF1 を同定した．当該マーカーを用いることで，iPS低下に及ぼす役割を検討した．心筋梗塞 2 週後の骨格細胞培養において最頻度の核型異常である 12 トリソ

筋 BDNF レベルは心不全マウスでタンパク発現が有意ミーを有する細胞株を遺伝子発現の確認のみで排除するに低下した．

ことが可能となった．

心筋梗塞 2 週後から心不全マウスにリコンビナントヒ
ト BDNF（rhBDNF）を 2 週間投与した（皮下注，1回/日，【考察】
単一の遺伝子の発現で異常細胞のスクリーニングが可5 mg /kg /day）．心不全マウスにおける rhBDNF の投与能となる本法は再生医療の実現化にとって非常に有用では骨格筋ミトコンドリア機能・量の増加に伴い，低下しある．今後さらに複数の遺伝子の検討を重ね，より判別た運動耐容能も有意に改善した．

精度の高い方法を検討する．

【結論】
rhBDNF の投与は心不全における骨格筋ミトコンド

心不全における骨格筋治療髙田真

リア機能・量を亢進することで運動耐容能の低下を改善する．

吾（北海道大学大学院医学研究院）【背景・目的】
慢性心不全患者は運動耐容能が低下していることが知られており，それは独立した予後規定因子である．

ヒト iPS 細胞由来心筋スフェロイドの大量作製と移植システムの確立
遠

山

周

吾
（慶應義塾大学医学部）

我々は運動耐容能の主規定因子が骨格筋ミトコンド
リアであることを報告してきたが（Int Heart J 2015;

ヒト多能性幹細胞（ES 細胞や iPS 細胞）は再生医療

Cardiovasc Res 2016），その治療は運動療法しか存在における魅力的な細胞源であるが，分化後に腫瘍化のしない．しかしながら，重症患者においてはしばしば運原因となる未分化幹細胞が混入することが大きな問題

動療法を施行出来ないことがある．本研究は運動を模擬になっている．そこで，我々はヒト多能性幹細胞およびした骨格筋の収縮で分泌されるホルモン（マイオカイン）分化心筋細胞におけるグルコース，グルタミンおよび乳に着目し，その探索およびその効果を検討することを目酸の代謝プロファイルの差異を明らかにし，その性質を的とした．

利用することにより，FACS を用いることなく，特殊な【方法および結果】

培養環境により残存未分化幹細胞を除去し，分化心筋細マイオカインを探索するため，マウス骨格筋培養細胞のみを選別する技術を開発してきた（Tohyama, Cell

胞（C2C12 筋管細胞）を用いて，カフェイン添加によStem Cell 2013, Cell Metab. 2016, Circ. Res. 2017)．

り骨格筋収縮を起こした．その際のメディウムを質量

また，ヒト iPS 細胞由来分化心筋細胞を大量生産するた分析により解析すると，筋収縮群に脳由来神経栄養因

めに，我々は強制換気システムと多層培養プレートを用子（BDNF）が検出された．我々は BDNF が心不全患いた 2 次元大量培養系を確立することに成功した（Stem9Vascular Biology Innovation に関する研究助成

Cell Rep. 2017)．さらに，我々は純化心筋細胞から心本研究で我々は，日本人健康成人由来の iPS 心筋を筋スフェロイドを効率よく作製する手法を構築した．そ96 穴プレート上でパターン培養し，モーションベクト

の結果，ヒトへの移植細胞数に相当するヒト iPS 細胞由ルイメージングで解析する評価系を構築した．パターン

来の純化心筋スフェロイドの作製が可能となった．現

培養することで iPS 心筋は収縮・弛緩速度および総動き

在，免疫不全マウス・ラットあるいはマイクロミニブタ

量が収縮頻度と正の相関を示す性質を獲得した．心臓にへの細胞移植を行い，安全性・有効性の評価を行ってい対する作用が明らかな複数の薬物に対して，パターン培る．本研究成果によりヒト iPS 細胞から純化心筋細胞お養した iPS 心筋は薬物の作用機序に基づいた反応を示し

よびスフェロイドの大量作製および移植システムが確立た．パターン培養した iPS 心筋で複数の分子標的抗がん

され，今後の再生医療の実現化に貢献することが期待さ薬およびドキソルビシンの短期的および長期的影響を評れる．

価したところ，心筋細胞の収縮，弛緩，同期性に対する【文献】

影響が同じクラスに属する分子標的抗がん薬であっても１）Tohyama, S. et al.: Stem Cell Rep. 9,1406-1414

異なるパターンで出現することが明らかになった．分子(2017).

標的薬による影響の多くは軽度かつ一時的なものであっ

２）Tohyama, S. & Fukuda K.: Circ . Res . 120,
1558-1560 (2017).

たが，ドキソルビシンによる影響は時間経過とともに増悪していた．パターン培養した iPS 心筋をモーションベ

３）Tohyama, S. et al.: Cell Metab. 12, 663-674(2016).

クトルイメージングで評価することで，薬物の左室機能
毒性を in vitro で評価できる可能性が示された．

４）Tohyama, S. et al.: Cell Stem Cell 12, 127-137(2013).

制御性Ｔ細胞による脂肪組織恒常性維持機構および
脂肪細胞分化機構の解明

ヒト iPS 細胞を用いた創薬研究
内

藤

篤

中

島

啓
（東京大学大学院薬学系研究科）

彦（東邦大学医学部）【目的】

近年，過去にがん治療を受けた患者で心不全を含む心制御性Ｔ細胞（Treg）は，様々な組織環境，炎症環疾患の罹患率が高いことが報告されており，抗がん薬に境に適応する事で機能し，この適応性が炎症制御と組織よる心毒性，特に心臓の左室機能を障害するような毒性の恒常性維持に重要である．我々はこれまでに，ヒト自（左室機能毒性）に関心が集まっている．ドキソルビシ

己免疫疾患 IPEX で同定されている Foxp3 遺伝子変異ンを代表とする殺細胞性抗がん薬だけでなく，本来副作

A384T を導入したマウスの解析から，A384TTreg が，用が少ないはずの分子標的抗がん薬の一部にもメカニズ

AP-1 転写因子 BATF や GATA3, ST2 の発現制御異常をムの明らかでない左室機能毒性を示すものが存在するこ引き起こし，結果的に非リンパ組織に局在する Treg のとが報告されている．新規抗がん薬が次々に開発される

恒常性を特異的に破綻させる事を見出だした．本研究は，中，左室機能毒性を正確に，簡便に，再現性高く評価す

この発見を手がかりとして，BATF, GATA3, ST2 の発る手法の開発が求められている．

現がその機能性維持に重要とされている脂肪組織中のヒト iPS 細胞から分化誘導した心筋細胞（iPS 心筋）

Treg に着目し，A384T 変異マウスの解析から脂肪組織を用いて薬物の催不整脈性リスクを評価できる可能性がにおける Treg の適応性を制御するメカニズムを明らか示されている．一方，既存の iPS 心筋を用いた評価系でとし，Foxp3＋ Treg を介した脂肪組織恒常性維持機構おは，人間の左室機能に関する特徴が再現できないなどのよび脂肪細胞分化機構を解明する事を目的とする．

問題点がある．

9Vascular Biology Innovation に関する研究助成

療に用いる際は，長期的な持続投与が必須である．こ【方法】
Foxp3 遺伝子変異 A384T 変異マウス，R397W 変異の問題を解決すべく我々は 60 kDa のポリエチレングリ

マウス，Treg 特異的 BATF 欠損マウスおよび野生型マ

コールを AM に結合する事で血中半減期を延長させる

ウスの白色・褐色脂肪組織について，組織形態，免疫AM 誘導体の合成に成功した．そこで本研究では，AM応答（Th1/Th2/Th17 etc.)，免疫細胞集団を病理学的，誘導体の学習・記憶障害に対する効果を確認する事とし

免疫学的に解析し，Foxp3 依存的な Batf 発現制御が脂た．

肪組織の恒常性維持および脂肪細胞分化にいかに寄与し【方法】ているのか検証する．また，A384T 変異マウスと野生学習・記憶障害モデルとして４血管閉塞モデルラット型マウスをそれぞれ通常食，または高脂肪食を摂取させ，を用いた．はじめに AM 誘導体を皮下投与し，電気メエネルギー代謝変化を比較解析する．

スを用いて両側椎骨動脈閉塞手術を行った．翌日，縫【結果】

合糸を用いて麻酔下で両側総頸動脈を 30 分間閉塞し，

A384T マウスの脂肪組織を解析した結果，予想通り，

その後，縫合糸を取り除き，血流を再開通した．モリ

脂肪組織中の Treg の数・割合が非常に少ない事が分

スの水迷路は，モデル作製から９日後に１試行遊泳さかった．さらに Th1/Th2/Th17 応答を解析したところ，

せ，モデル作製から 10 日目より，１日４試行で５日間

A384T マウスの脂肪組織では Th2 応答が過剰に起こっ

Hidden platform test を行い，５日目の最終試行の 1ており，脂肪組織重量も野生型マウスと比較して低い傾時間後に Probe test を行った．AM 誘導体の投与量は 1向にあった．一方で通常食・高脂肪食を摂取させ，体重および 10 nmol/kg の 2 用量とした．

をモニタリングしたが，今の所，体重に有意な差は認め【結果と考察】AM 誘 導 体 は， １，10 nmol/kg の 両 群 で Hidden

られていない．

platform test のプラットフォームへの到達時間が短縮【考察】
A384T マウスの脂肪組織は Treg の数が少なく，過剰した．また Probe test においても AM 誘導体投与の１，な Th2 応答が起こっている事が分かった．現在のとこ

10 nmol/kg の両群で滞在率が有意に高かった．両側総ろ，WT マウスと A384T マウスでは体重に差がないも頸動脈閉塞手術時の死亡率には差が認められなかった．

のの，糖代謝など全身の代謝が変化している可能性が考つまり本試験条件下における AM 誘導体の皮下投与でえられるため，今後はこれらのパラメーターについて詳

は，４血管閉塞モデルによる記憶・学習障害に対する軽細に解析して行く予定である．

減作用が示唆された．
以上より，AM 誘導体は，学習・記憶障害を軽減でき

学習・記憶障害に対する持続性アドレノメデュリン
誘導体の効果永田

さやか（宮崎大学医学部）【背景と目的】る可能性が明らかとなり，脳虚血による認知症や脳卒中の新規治療薬の候補物質となると考えられた．

プ ロ リ ン 異 性 化 酵 素 Pin1 に よ る adipose triglyceride lipase (ATGL) 制御機構
中

津

祐

介

（広島大学大学院医歯薬保健学総合研究院）

アドレノメデュリン（AM）は，ヒト褐色細胞腫の組織抽出液より発見された生理活性ペプチドである．AMは，強力な血管拡張や血管新生，抗炎症作用など多彩な【目的】作用を有しており，これまで消化器や循環器疾患の予防

心臓での中性脂肪の蓄積は，心不全や狭心症などの原や治療における有用性が研究されてきた．しかしながら因となることが知られている．心臓での中性脂肪の分解

生理活性ペプチドである AM は血中半減期が短く，治は，adipose triglyceride lipase (ATGL) が中心となっ9

Vascular Biology Innovation に関する研究助成て行っており，ATGL 欠損は，過剰な中性脂肪の蓄積を誘発することが報告されている．

妊娠時低栄養による食塩感受性高血圧発症の中枢神我々が着目しているプロリン異性化酵素 Pin1 は，様々経機序の解明な標的蛋白に結合し，プロリンのシス-トランス異性化

西

本

光

宏

（東京大学先端科学技術研究センター）を行うことで標的蛋白の機能を調節している酵素である．
今回，Pin1 が ATGL と結合することを見出し，Pin1を介した ATGL 機能制御と心臓での中性脂肪蓄積との【目的】
高血圧を含む生活習慣病の発症要因として遺伝因子と関係を明らかにすることを目的とする．

環境因子が知られている．第二次世界大戦前後に飢饉に【方法及び結果】晒された母体から出生した子が成長後に生活習慣病を合Pin1 と中性脂肪分解との関係を明らかにするため併する頻度が高いことが報告され，環境因子への適応がに，代表的な脂肪分解酵素である ATGL と hormone

長い年月を経て発病に至る原因になった例として注目さsensitive lipase (HSL) との結合を検討した．その結果，れた．このような胎児期╱乳児期のプログラミングの機

Pin1 と両蛋白の結合が確認された．また，Pin1 は N 末序としてエピジェネティク機構が想定されるが，中で側の WW domain を介して ATGL と結合しており，一も DNA メチル化は持続的な遺伝子発現の変化をきたす

方 ATGL は S185 が Pin1 との結合に必要であった．さことから，胎児╱新生児期低栄養による成人期高血圧発らに，ATGL を CIAP で処理すると Pin1 との結合が消症への関与が考えられる．一方，低栄養母体の胎盤では去された．

コルチゾールを不活性化する 11β-HSD2 活性が低下し次に，Pin1 による ATGL 機能制御について検討したており，過剰なコルチゾール暴露が子の成長後の生活習ところ，Pin1 過剰発現により ATGL の発現は低下し，慣病発症に影響するとされている．しかし胎児期のコル

逆に Pin1 ノックダウンにより ATGL の発現は増加した．

チゾール過剰が成人後に高血圧を発症させる機序は未解

一方，ATGL mRNA 発現は，Pin1 過剰発現により影響明である．我々は，血圧調節を司る視床下部の室傍核を受けなかった．Pin1 過剰発現による ATGL の発現低（PVN）に着目し，胎児期コルチゾール過剰とエピゲノ

下は，プロテアソーム阻害剤処理により抑制されたこと

ム変化および食塩再吸収を担う腎尿細管での Na 輸送体

から，Pin1 は ATGL の発現分解を促進してると考えらの変化を検討した．

れた．

【方法】

さらに脂肪分解活性に対する Pin1 の影響を検討した

妊娠時低栄養，胎児コルチゾール過剰暴露のモデ

ところ，Pin1 欠損により脂肪分解活性は上昇した．

ルとして妊娠時低タンパク食（LP）負荷ラット及び【考察】

11βHSD2 によって不活化されない合成糖質コルチコイ

Pin1 は，ATGL と結合し，その分解を促進すること

ド（Dexamethasone）を妊娠中に投与したラット/マウ

で脂肪分解を負に制御していると考えられた．Pin1 のスからの産仔について成長後に食塩負荷を行い，血圧お発現変動や機能異常が心臓の過剰な脂肪蓄積につながる

よび PVN での renin-angiotensin 系（RA 系）構成分子可能性が示唆された．

の遺伝子発現および DNA メチル化，腎での Na 輸送体発現を検討した．またマウス培養細胞系も用いて機序の検討を行った．
【結果】
妊娠時 Dex 負荷母体ラット産仔では，妊娠時 LP ラット由来産仔と同様に，成体での食塩感受性高血圧を呈した．これら産仔の PVN では，アンジオテンシン受容体（AT1a）遺伝子の DNA 脱メチル化と AT1a mRNA 発

9Vascular Biology Innovation に関する研究助成

現増加を認め，さらに DNA メチル化酵素 DNMT3a の確立し，心不全に至る心筋リモデリング過程・心筋╱非発現と AT1a プロモータへの結合が低下していた．また，心筋の相互作用を詳細に解明してきた．

培養 PVN 神経細胞でも Dex 添加により，DNMT3a の【方法】

発現低下と DNA 脱メチル化による AT1a 発現増加を

本研究では，心不全患者のゲノム・心臓シングルセル

認めた．また DNMT3a のノックダウンによって Dexa

トランスクリプトーム情報を治療応答性などの臨床情報

非依存性の AT1a 発現増加を認めた．さらに PVN 特異と連結して心不全病態と強く関係する分子機構を明らか

的 DNMT3a-KO マウスでは AT1a 発現増加を認め，食にし，これを用いた心不全病態層別化の臨床応用性につ

塩負荷により血圧が上昇した．一方，AT1a-KO では妊いて検討する．

娠時 Dex 投与による食塩感受性高血圧発症に抵抗性で【結果】あった．Dexa 投与マウスからの産仔の腎尿細管では心不全患者の心筋１細胞解析により，健常者と比較しNa 再吸収に関わる蛋白の発現変化を認めた．

て心不全患者の心筋細胞の遺伝子発現パターンは極めて【結論】

不均一であり，この不均一性はいくつかの協調的に発現

妊娠時低栄養による食塩感受性高血圧発症機序としする遺伝子グループの発現パターンにより説明できるこて，脳内糖質コルチコイド過剰による DNA メチル化異とがわかった．またこれらの結果を臨床情報と連結する

常が AT1a 発現を増加させ，その結果食塩負荷時の血圧ことで，心筋細胞の可逆性を評価する遺伝子発現パター上昇を生じる可能性が考えられた．食塩感受性高血圧のンを明らかにした．またこれらの特徴的な遺伝子の大半発症過程におけるエピゲノム異常とその成立メカニズム

は圧負荷心不全モデルマウスの病態とも強く関連するこを解き明かし，新たな診断・治療法への手がかりを得るとを明らかにし，種を超えた心筋ストレス応答の保存性ことが出来た．一方，胎児期の低栄養/糖質コルチコイを見出した．さらに，同定した心不全病態と関連する分

ド過剰負荷が実際に腎での Na 再吸収関与分子の発現変子機構を標的とした心臓組織解析により，簡便に心不全化を来す可能性が示唆された．

患者の臨床的予後・治療応答性を予測できることを明ら
かにした．
【考察】

マルチオミックス連関による心不全分子病態の層別化
野村征太郎（東京大学大学院医学系研究科）

個々の心筋細胞の転写プログラムは細胞の機能的情報を含んでおり，心臓疾患の分子病態の解明だけでなく精密医療の実現において極めて重要である．

【目的】
心不全はゲノム要因と環境要因が絡み合い複雑な心臓分子病理を呈しているが，個々の患者においてこれらの要素を詳細に解析する手法は確立されていない．本研究はこれらの統合により心不全ゲノム分子病理を解析する技術を確立することを目指す．

心臓線維芽細胞老化の心臓線維化保護効果に関する
検討
肥

後

友

彰

（The Institute of Cancer Research, Dynamic
Cell Systems Laboratory）【背景】
我々は遺伝性心不全の主要な原因である心筋症の包括的ゲノム解析により，臨床的予後や治療応答性と関連す【目的】

る遺伝子変異を複数同定し，心不全ゲノム要因の不均一

DNA 損傷応答（DDR）は核 DNA 損傷に対し，細胞性の存在を明らかにしている．また心不全モデルマウス

周期を停止させ DNA 修復を促進する一方で，DNA 損

を用いて心臓組織の１細胞トランスクリプトームを心臓傷が深刻な際にはアポトーシスや，不可逆的な細胞周期

機能・細胞形態・エピゲノムと統合して解析する技術をの停止である細胞老化を誘導する．これまでに我々は98Vascular Biology Innovation に関する研究助成

心筋細胞における DNA 損傷と DDR 活性化が心不全進展を促進することを明らかにしてきた１）．一方で，組織線維芽細胞における DDR 活性化が創傷治癒や肝臓線維化の過程において組織保護的に働くことが報告されており，今回我々は心臓線維芽細胞（Cardiac Fibroblast:

ポドサイト傷害による糖尿病性腎症の進展機序の解明と早期診断マーカーとしての尿中ポドサイト
mRNA 排泄量の検討
福

田

顕

弘
（大分大学医学部）

CF）DDR 活性化の役割に着目した．
【方法および結果】
心筋梗塞（MI）モデルマウスを作製し，CF における

【背景・目的】DDR 活性化を経時的に観察したところ，MI 後 4 日目

糖尿病性腎症の進展機序の解明と早期診断法の開発は以降に梗塞領域・境界領域で観察され，DDR 活性化マー

透析患者を減らす上で極めて重要である．近年では糖尿カー陽性 CF の数は 7 日目で最も増加していた．またこ

病性腎症の比較的早期から，また病勢の進行とともにポれら DDR 陽性 CF は細胞増殖マーカーヒストン H3 リ

ドサイト傷害が認められることが報告されている．このン酸化陰性や p21 発現上昇，SA-βgal 染色陽性，アポことからポドサイト傷害の持続が糖尿病性腎症進展の主トーシスマーカー陰性など細胞老化に特徴的な所見を認体であり，早期診断マーカーとして尿中ポドサイト関連分

めた．CF 老化が周囲の CF へ及ぼす影響を検討するた子が有用となる可能性が示唆される．糖尿病性腎症の早め，我々は次に放射線照射による in vitro 老化 CF モデ

期診断法として用いられる微量アルブミン尿は陰性であっル作製を行い，周囲の CF に対する増殖抑制効果を検討ても糸球体傷害が進行している症例が存在し，微量アルブ

した．老化 CF と正常 CF の共培養を行ったところ，老ミン尿より精度の高い早期診断法の開発が求められる．

化 CF は傍分泌的にではなく接合分泌的に周囲の CF 増【方法】

殖を抑制していることが明らかになった．
【現在の進捗状況】

II 型糖尿病性腎症モデルとして，レプチン受容体欠損
ラットである Zucker Diabetic Fatty ラット（ZDF-fatty）

上記の結果は CF における DDR 活性化が線維化形成を使用し，レプチン受容体変異をヘテロで有するラットに抑制的に働いている可能性を示唆している．現在は（ZDF-lean）を非糖尿病モデルコントロールとした．15

DDR エフェクター分子 ATM ヘテロノックアウトマウ

週齢，30 週齢，45 週齢においてアルブミン尿，尿中ポスを作製し，MI 後の CF 老化が心臓線維化，また心不ドサイト mRNA 排泄量，糸球体容積，ポドサイト容積，全進展に抑制的に働いているのかどうかを検討中であ

ポドサイト density（体積あたりのポドサイト数）などる．

を測定し比較した．

【文献】

また，上記ラットモデルにおいて６～ 14 週齢の早１）Higo, T., Naito, AT., Sumida, T., Shibamoto, M.,

期糖尿病期の検討を行うとともに，糖尿病と診断されOkada, K., Nomura, S., Nakagawa, A., Yamagu-

た 174 例（正常アルブミン尿 99 例，微量アルブミン尿chi, T., Sakai, T., Hashimoto, A., Kuramoto, Y.,

38 例，顕性蛋白尿 37 例）を対象とし，人間ドックでIto, M., Hikoso, S., Akazawa, H., Lee, JK., Shio-

糖尿病及び高血圧を認めない 41 症例を対象コントロー

jima, I., McKinnon, PJ., Sakata, Y. & Komuro,

ルとした．

I.: DNA single-strand break-induced DNA dam-

【結果】

age response causes heart failure. Nat Commun.
2017 Apr 24; 8: 15104.

ZDF-fatty ラット群では，15, 30, 45 週と経過に伴い，糸球体とポドサイト容積のミスマッチ（glomerular
volume/ポドサイト数）がより顕著であった．さらに，
mTOR pathway 下流の Phospho-S6 のポドサイトでの発現は，ZDF-fatty ラット群で有意に上昇し，これらは40% カロリー制限により抑制できた．

99

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

ZDF-fatty ラット群では，10 週齢よりアルブミン尿

これらによりジェネティックな障壁の一部が明らかとの増加を認めたが，尿中ポドサイト (podocin) mRNAなったが，エピジェネティクスを含めた分子基盤に関し

排泄量はそれ以前の 8 週齢より増加し始めた．また，ては未だ不明な点が多く，リプログラミング効率も依然臨床症例の検討では，アルブミン尿の増加とともに尿中十分とは言えない．

ポドサイト mRNA 排泄量の増加を認めた（vs control:

そこで，注目したのが低分子化合物である．低分子

正常アルブミン尿群 : 4.3 倍 , 微量アルブミン尿群 : 4.2

化合物はコスト，安全面，簡便さから臨床応用に向け

倍 , 顕性蛋白尿群 : 16.7 倍）．さらに，正常コントロー

優れた選択肢といえる．本研究ではエピジェネティック

ル群の四分位範囲でアルブミン尿値を揃えても尿中ポド制御因子も含めた化合物ライブラリーの中から心筋誘導

サイト mRNA 排泄量は正常アルブミン尿群で有意に増を促進するものを探索することとした．心筋特異的蛋加していた（vs control: 6.7 倍 , P<0.01）．

白であるα-Myosin Heavy Chain (αMHC) を蛍光標識【結論】したαMHC-Cre/Loxp-tdTbmato (tdT) 遺伝子改変マウ

糖尿病性腎症において mTOR1 シグナルの活性化に

スの尾部線維芽細胞を用いて，GMT に加えて各種低分よる糸球体とポドサイトの容量ミスマッチが病態進展の子化合物を導入することで誘導される tdT 陽性細胞数一因を担っている可能性が考えられた．また，尿中ポド及び割合を cell image analyzer により評価し，high-

サイト mRNA 排泄量は糖尿病性腎症における早期診断

throughput screening を行い，tdT 陽性細胞の誘導をマーカーとして有用である可能性が示唆された．

促進する化合物の絞り込みに成功した．その中で，心筋直接リプログラミングを強く促進する新規低分子化合

心筋直接リプログラミングを促進する低分子化合物
村

岡

直

人

物として，化合物Ａを同定した．化合物Ａは心筋リプロ
グラミング因子 GMT/Hand2 (GHMT) に加えることで
cTnT 陽性細胞を強く促進することを ﬂow cytometer（慶應義塾大学医学部）

で確認した．また，遺伝子発現の変化を microarray 及
び qRT-PCR で確認したところ，化合物Ａを加えること

終末分化細胞である心筋細胞は再生能力が限られていで，多くの心筋関連遺伝子の発現が顕著に上昇していた．

ることから，一度障害を受けると失われ，線維芽細胞に今後は化合物Ａによる心筋直接リプログラミング促進の置換されることで，心機能は低下していく．多能性幹細メカニズムを解明していく．

胞は心筋再生の細胞源として期待されるが，その使用には分化誘導効率，腫瘍形成の可能性，移植細胞の生着率などの問題がある．心臓に内在する線維芽細胞を直接その場で高率に心筋に転換できればこれらの問題を解決でヒト iPS 心筋細胞による催不整脈リスク予測
山

崎

大

樹

（国立医薬品食品衛生研究所薬理部）

きる．これまでの研究により心筋特異的転写因子である
Gata4/Mef2cTbx5 (GMT) または GMT/Msep1/Myocdを導入することでマウスの in vitro, in vivo，さらには【目的】

ヒト細胞で線維芽細胞からの心筋直接リプログラミング

ヒト iPS 細胞由来心筋細胞（ヒト iPS 心筋細胞）は，を可能とした（Ieda M et al, Cell, 2010, Inagawa K et

ヒト心筋に発現する複数のイオンチャネルを有してい

al, Circ Res, 2012, Wada R et al, PNAS, 2013）．また，るため，複合的な催不整脈リスク評価法への応用の可筋特異的マイクロ RNA である miR-133 により心筋誘能性が示唆されており，心臓安全性評価の予測精度を導効率が改善すること，そのメカニズムとして上皮間葉向上させうる新たなツールとして非常に注目されてい移行のマスター因子である Snail を直接抑制することでる． こ れ ま で 我 々 は 1 種 類 の iPS 心 筋 細 胞 株（iCell

線維芽細胞の特性が消去され，心筋誘導が促進すること

cardiomyocyte，CDI 社）を用いて，多点電極システムを明らかとした（Muraoka N et al, EMBO J, 2014）．

により催不整脈リスクを高精度に予測できることを明ら

00Vascular Biology Innovation に関する研究助成

かにしてきた．現在，複数種類のヒト iPS 心筋細胞が市販されているが，株によって性質が異なっているため，血管壁の機械刺激応答と病態形成を誘導するシグナ

これらが医薬品の催不整脈リスク予測に応用できるかは

ル分子の解析

不明である．そこで，我々は新たなヒト iPS 心筋細胞株

山

城

義

人

（筑波大学生存ダイナミクス研究センター）

として Cor.4U（Ncardia 社）を選択し，催不整脈リス
ク予測精度について評価した．
【方法】

【目的】

ヒト iPS 心筋細胞株は Cor.4U を用いた．細胞外電位

大動脈瘤は血管壁が異常に拡張し，破裂，やがて死波形の記録は，多点電極システムを用いた．プローブにに至る疾患であり，破裂を未然に防ぐ治療法も未だ確

ヒト iPS 心筋細胞を高密度培養し，播種 1 週間後から立されていない１）．我々は，独自に開発した上行大動脈計測を開始した．Field potential duration (FPD) の変

瘤マウスモデル２）を用いて，コフィリンを介した細胞骨化の程度および異常波形である EAD の有無を指標とし格のリモデリングが瘤形成に重要である知見を報告しててスコア化（TdP risk score）した．また，EAD など

きた３）．また，横行大動脈縮窄術（TAC）による圧負荷のイベントが起こった化合物のフリー体濃度と臨床有効の増大に伴って，細胞-基質間の相互作用を触媒する細血中濃度との比を求めて，化合物ごとにプロットした．

胞外マトリクス Thrombospondin-1 (Thbs1) が上行大【結果】動脈で発現亢進する事，大動脈瘤病変で Thbs1 が過剰

iCell cardiomyocytes と同様に，Cor.4U においてもに亢進している事を見出したが３），圧負荷応答における

細胞外電位波形から得られる inter-spike interval (ISI)

Thbs1 の役割と大動脈瘤形成へどのように関与するかのと FPD の相関関係がヒト心筋の RR-QT 相関関係に近い

詳細は未だ不明である．よって，血管壁内の機械刺激応こと，hERG 阻害剤である E-4031 による逆頻度依存性

答における Thbs1 の役割を明らかにすることが大動脈が観察されること，さらには，FPD の値が 500ms を超瘤の形成メカニズムを理解する上で重要である．

えると EAD が発生しやすくなることが明らかとなった．

【方法・結果】

このことは Cor.4U がヒトの催不整脈リスク予測評価に

はじめに，生後 30 日目の大動脈瘤血管壁を Thbs1 抗有用なヒト iPS 心筋細胞であることを示している．次に体で免疫染色し，その局在を精査した．野生型の大動脈

本評価系により，TdP リスクの異なる 27 化合物を用い瘤では Thbs1 の発現はほとんど認められないのに対し，て多点電極システムによりデータを取得した．化合物ご大動脈瘤では内皮細胞と内皮細胞近傍の平滑筋細胞に高とに TdP リスクスコアおよび臨床血中濃度との比を算発現していた．次に，血管平滑筋細胞を周期的伸展刺激

出してプロットし，パラメーターごとに TdP リスクの下で培養すると，Thbs1 が細胞接着斑と共局在するこ境界を定めることで，高リスクとして９薬剤，中リスクとから，Thbs1 が細胞接着斑の形成あるいは分解に関として８薬剤，低リスクとして 10 薬剤に分類すること与している可能性が示唆された．さらに，Thbs1 のノッができた．
さらに高リスク薬剤と低リスク薬剤について，

クアウトマウスと SMKO マウスとの掛け合わせで得ら

臨床において TdP の発生を記録した CredibleMeds デー

れるダブルノックアウトマウス（DKO）は，細胞骨格

タベースとのコンコーダンス解析を行ったところ，高い調整因子コフィリンの不活性化を伴って大動脈瘤の形成相関性が得られた．

が抑止された（論文投稿中４））．透過型電子顕微鏡を用【考察】

いた解析によって，DKO マウスでは，血管弾性線維がiCell cardiomyocytes の 結 果 も 併 せ て 考 察 す る と，太くなる傾向が観察され，SMKO マウスで見られた平複数のヒト iPS 心筋細胞株において，多点電極システム

滑筋細胞と弾性線維の接着点喪失異常も見られなくなるを組み合わせたリスクカテゴリーシステムは，医薬品の事がわかった．

催不整脈リスク予測を行う上で有用なツールであること【考察】が示された．

これらの結果より，Thbs1 が血管壁のメカニカルスト

0

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

レス応答に重要な役割を担い，大動脈瘤形成に関与する細胞骨格調整因子コフィリンの上流シグナルであることが明らかになった．今後，Thbs1 の新しい役割，接着斑
形成や弾性線維形成，または Thbs1 の発現を標的とした新しい大動脈瘤の治療薬の開発が期待される．
【文献】
１）Yamashiro, Y. & Yanagisawa, H.: Crossing
bridges between Extra- and Intra-cellular eventsin thoracic aortic aneurysms. J . Athroscler .

Thromb. 25(2): 99-110. (2017).
２）Huang, J., Yamashiro, Y., Papke, CL., Ikeda,
Y., Lin, Y., Patel, M., Inagami, T., Le, VP.,
Wagenseil, JE. & Yanagisawa, H.: Angiotensinconverting enzyme ( ACE ) -induced activationof local angiotensin signaling is required forascending aortic aneurysms in ﬁbulin-4-deﬁcientmice. Sci. Transl. Med. 5(183):1 83ra58, (2013).
３）Yamashiro, Y., Papke, CL., Kim, J., Ringuette,
LJ., Zhang, QJ., Liu, ZP., Mirzaei, H., Wagenseil, JE., Davis, EC. & Yanagisawa, H.: Abnormal mechanosensing and coﬁlin activation
promote the progression of ascending aortic
aneurysms in mice. Sci. Signal. 8(399): ra105,(2015).
４）Yamashiro, Y., Thangm BQ,, Shinm SJ., Lino,
CA., Nakamura, T., Kim, J., Sugiyama, K., Tokunaga, C., Sakamoto, H., Osaka, M., Davis, EC.,
Wagenseil, JE., Hiramatsu, Y. & Yanagisawa, H.:
Role of thrombospondin-1 in mechanotransduction and development of thoracic aortic aneurysm in mouse and humans. In revision.

102

研究報告

全身性炎症疾患の病因
・病態の解明に関する研究助成
全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

潰瘍性大腸炎における抗 TNF-α抗体製剤使用前後の血小板・赤血球沈降速度・IL-6 の検討
秋

田

義

博

一定の見解が得られていない．本研究でも治療反応性を予測する結果は認めなかった．活動性のある UC は非
活動性の UC と比べ大腸上皮細胞内に多くの IL-6 が発現しているとも報告されている１）．Matts 分類と組織中（東京慈恵会医科大学医学部）

IL-6 の相関性に関しては症例に蓄積が望まれる．
【文献】

【目的】

１）Yi Li., Colin de Haar. & Min Chen.: Disease-

重症の潰瘍性大腸炎に対して抗 TNF-α抗体製剤を

related expression of the IL6/STAT3/SOCS3

導入した前後の血小板，赤血球沈降抗体（以下 ESR），

signalling pathway in ulcerative colitis and ul-

IL-6 を比較検討する．

cerative colitis-related carcinogenesis. Gut, 59,【方法】

227-235Ⅰ）血小板，ESR の検討
反応例（10 例），抵抗例（７例）にわけ使用前後の血小板，ESR を解析する．
Ⅱ）組織中 IL-6 の検討
抗 TNF-α抗体製剤使用前後に施行した大腸内視鏡検

遺伝要因を用いたベーチェット病の臨床症状形成機序の解明および臨床症状分類の構築
石

戸

岳

仁
（横浜市立大学医学部）

査で採取した生検検体に関して，IL-6 抗体を用いて特殊免疫染色を施行した．抗 TNF-α抗体製剤に対して反
応例，抵抗例別に IL-6 に対する陽性細胞数を層別化（陽【目的】

性細胞数の割合：＋（30％未満），2＋（30-60％），3 ＋ベーチェット病は全身の諸臓器に急性の炎症を繰り返（60％以上））し評価する．※陽性細胞数の評価は病理す原因不明の難治性炎症性疾患である．口腔内アフタ性医による判断を採用

潰瘍，皮膚症状，眼症状，外陰部潰瘍の４症状を主症状【結果】とし，しばしば関節炎，副睾丸炎，消化器症状，血管病

Ⅰ）使用前後での検討では，使用後 ESR は反応例の変，中枢神経病変などの副症状を伴う．

方が抵抗例と比較し有意に低かった（p ＝ 0.012）．治

ベーチェット病は多因子遺伝疾患であり，人種を超え

療反応性別での検討では反応例の血小板は使用前と比較て HLA-B 遺伝子の HLA-B＊51 アリルと顕著に相関する

して使用後は有意に低かった（p ＝ 0.013）．その他のことが知られている．また，近年のゲノム全域を対象と項目に関しては有意な差を認めなかった．

した遺伝子解析により，ベーチェット病の新規の遺伝要Ⅱ）現在解析中のため，一例の結果を報告する．反応因（疾患感受性遺伝子）が多数報告されている．一方，
ベー

例に関しては Matts 分類が３→２, IL-6 が１→１だった

チェット病の多様な症状の形成を規定する要因は未だ明が，抵抗例に関しては Matts 分類が２→３, IL-6 が０→確に決定されておらず，ベーチェット病の病態の全容解１だった．

明には依然として至っていない．したがって本研究では，【考察】

ベーチェット病の主症状および副症状の形成に影響を与

炎症性腸疾患における CRP, ESR，血小板等のバイオえる遺伝要因の解明を行った．

マーカーと疾患活動性との比較は多数報告されているが

0

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成【方法】
現在までに報告されているベーチェット病の 18 個の有力な遺伝要因（HLA-B＊51, HLA-A＊26, IL10, IL23RIL12RB2, CCR1, STAT4, KLRC4, ERAP1, TNFAIP3,

慢性移植片対宿主病様皮膚硬化モデルマウスにおけるＢ細胞の役割齊

藤明

允（筑波大学人間総合科学研究科）

MEFV, FUT2, IL12A, IL1A-IL1B, RIPK2, ADO-EGR2,
LACC1, IRF8, CEBPB-PTPN1）について，日本人患者
608 例を対象に，各遺伝子のリスクアリルの保有の有無
で患者を層別化し，各臨床症状の形成に影響を与える遺伝要因の特定を行った．

【目的】
造血細胞移植後の合併症である慢性移植片対宿主病の一症状として，強皮症様皮膚硬化が知られている．実際，我々の用いる移植片対宿主病様皮膚苔癬反応モデルマウ【結果】
層別化解析により，「HLA-A 26」は眼症状，外陰部

スは，急性移植片対宿主病様の皮膚粘膜病変が生じた後，潰瘍および中枢神経病変，「IL23R-IL12RB2」は関節炎，皮膚硬化を認めた．近年，慢性移植片対宿主病の病態生「IL10」は口腔内アフタ性潰瘍，皮膚症状，眼症状およ理における病原性Ｂ細胞の役割が注目され，同モデルに

び中枢神経病変，「STAT4」は外陰部潰瘍，「CCR1」はおけるＢ細胞の役割を解明し，新規分子標的治療薬の開血管病変，「KLRC4」は副睾丸炎，「IRF8」は眼症状と発に結びつけることを期待する．

副睾丸炎の形成に影響を与えるリスク因子であることが

【方法】

＊

示唆された．また，「HLA-A＊26 と IL10」の組み合わ

皮膚粘膜表皮角化細胞特異的に Keratin 14 プロモー

せは中枢神経病変，「HLA-A＊26, IL10 および IRF8」のター下に卵白アルブミン（OVA）をトランスジェニッ

組み合わせは眼症状，「HLA-A＊26 と STAT4」の組みクした遺伝子改変マウス（K14-mOVA Tg マウス）をレ

合わせは外陰部潰瘍，「KLRC4 と IRF8」の組み合わせ

シピエントとし，OVA 特異的Ｔ細胞受容体を発現したは副睾丸炎の発生率を大きく上昇させた．

CD8 Ｔ細胞である OT-I 細胞を持つ OT-I マウスのリン【考察】

パ節細胞をドナー細胞として養子移入１）した後，28 日

本研究により，ベーチェット病の臨床症状の形成に影観察すると全身の皮膚硬化を認めた．そこで，Ｂ細胞機響を与える遺伝要因が網羅的に見出された．今後，遺伝能欠損する CD19cre/cre/K14-mOVA double Tg マウスま要因を用いたベーチェット病の臨床症状分類を構築する

たはＢ細胞そのものが欠損するμMT/K14-mOVA Tg マ

ことで，ベーチェット病の初期段階における遺伝子検査で，ウスを作成し，皮膚硬化の程度を比較検討した．

今後形成する可能性の高い臨床症状の予測が可能になり，【結果】患者への早期の適切な治療に繋がることが期待される．

本モデルマウスにおいて，OT-I 細胞移入後は移入前と比べて，14 日までの急性の間，皮膚所属リンパ節のB220 陽性 IL-6 および IL-10 産生細胞の割合がともにぶどう膜炎の病態に関連する網膜血管因子の解明
小野久

いったん増加し，以降は移入前と同程度まで減少する．
OT-I 細胞移入後，CD19cre/cre/K14-mOVA double Tg マ

子

ウスは K14-mOVA Tg マウスと比べて，14 日までの急（東京大学大学院医学系研究科）

性期では有意に死亡率が高かった．また，この間，皮膚所属リンパ節を解析すると，両群では B220 陽性 IL-6

未発表データが含まれるため，掲載しておりません。

陽 性 細 胞 の 割 合 に 有 意 差 は な か っ た が，CD19cre/cre/
K14-mOVA double Tg マウスでは B220 陽性 IL-10 産生細胞はほぼみられなかった．次に，OT-I 細胞移入後，μMT/K14-mOVA Tg マウスは K14-mOVA Tg マウスと比べて，28 日における皮膚硬化が軽度で，真皮厚，

0

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

皮膚ハイドロキシプロリン含量，真皮αSMA 陽性筋線

マウスの大腸，脾臓，腹腔より Mφを採取し，Il1r1 の維芽細胞数が有意に減少していた．

発現を qPCR により比較した．４）WT, Myd88－/－及び【考察】

Nlrp3－/－マウスの腸管 Mφを IL-1β 10 ng/ml により刺本慢性移植片対宿主病様皮膚硬化モデルマウスにおいて，急性期に増加する B220 陽性 IL-10 産生細胞は主に激し，経時的な Il10 の発現を qPCR により評価した．
【結果および考察】

急性期のサイトカインストームによる死亡の抑制に寄与

１）SPF と無菌環境下で飼育した WT マウスにおいて，

し，B220 陽性 IL-6 産生細胞は病原細胞として慢性期

腸管 Mφの Il10 発現に差は見られなかったが，Myd88－/－の皮膚硬化を誘導している可能性が示唆された．

および Nlrp3－/－ マウスの腸管 Mφでは，WT と比較し【文献】

Il10 の発現が有意に低下していた．Myd88－/－腸管 Mφ１）Shibaki, A., Sato, A. & Katz, SI.: Induction of

では，WT と比較して Nlrp3 の発現も有意に低下してGVHD-like skin disease by passively transferredいた．２）Nlrp3 KD-BMDM では LPS ＋ ATP 刺激後のCD8(+) T-cell receptor transgenic T cells into

Il10 発現が 0.5, 1, 3 時間で WT よりも有意に低下して

keratin 14-ovalbumin transgenic mice. J Invest

いたが，ASC-, Caspase-1 KD-BMDM では差は見られ

Dermatol, 123, 109 (2004).

なかった．３）腸管 Mφでは脾臓，腹腔内 Mφと比較して，Il1r1 発現が亢進していた．４） IL-1βによる腸管

腸 管 マ ク ロ フ ァ ー ジ に お け る NLRP3 を 介 し た
IL-10 発現機序の解明
佐上

Mφの刺激では 2, 4 時間後で有意に Il10 の発現が亢進していた．本検討により，腸管マクロファージにおけるIL-10 発現には NLRP3 が関与し，インフラマソームの晋太郎

活性化とは別に，MyD88 依存的な IL-1 受容体刺激伝達（北里大学北里研究所病院）

経路を介して NALP 分子や IL-10 の発現に関与している可能性が示唆された．現在腸管 Mφにおいて NLRP3【研究の背景と目的】
炎症性腸疾患（IBD）は再燃寛解を繰り返す難治性のが IL-10 産生のための転写因子として作用しているか否かを証明するために実験を進めている．

炎症性腸疾患である．腸管マクロファージ（以下 腸管
Mφ）は健常者において，腸内抗原に対して過剰な反応を示さずに抗炎症性サイトカイン IL-10 を恒常的に産生する事によって腸内抗原に対する寛容性を保っているが，IBD でその機構が破綻していることが病態の key eventと考えられている．本研究では，この腸管 Mφにおける酸化ストレスによる全身的な炎症と加齢黄斑変性(AMD) の発症・悪化の関与を含めて更なる機序を
解明
高

山

圭
（防衛医科大学校医学部）

恒常的 IL-10 発現機序を解明することを目的とする．
【方法】
１）SPF 或 い は GF の 野 生 型（WT） マ ウ ス， お よび Myd88－/－, Nlrp3－/－ マ ウ ス の 大 腸 よ り CD11b＋ 腸【目的】
滲出型加齢黄斑変性（nAMD）の発症と悪化に眼内の管 Mφを 単 離 し，Il10 の 発 現 を qPCR に よ り 比 較 し炎症性サイトカインが関与するかどうか調べた．

た．２）WT マウスの骨髄より Bone Marrow-derived【方法】

macrophage (BMDM) を 作 成 し，lentivirus system

未治療の nAMD 症例 22 名 22 眼を対象とし，白内障に よ る イ ン フ ラ マ ソ ー ム 関 連 遺 伝 子（Nlrp3, ASC,

症例 17 名 21 眼を対照群とした．nAMD 症例は初回とCaspase-1） の knock down (KD) を 行 っ た．LPS 10

３回目の抗血管内皮増殖因子（VEGF）抗体硝子体投与

ng/ml による priming 後に ATP 5 nM による刺激を加え，の直前に，対照群は白内障手術執刀時に前房水を採取し経時的な Il10 の発現を qPCR により評価した．３）WTた．採取した前房水の 26 種類のサイトカイン（PDGF,

0

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

IL-1β, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9,とした．

IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A, eotaxin, basic【方法】

fibroblast growth factor, granulocyte-macrophage

所属施設の倫理審査委員会承認のもと，クローン病非colony-stimulating factor, IFN-γ, IP-10, MCP-1,

病変部の大腸より内視鏡的に生検を行い，生検検体からMIP-1α, MIP-1β, RANTES, TNFα, VEGF）を測定し，ヒト大腸オルガノイドを樹立した．ヒト大腸オルガノイ

nAMD と対照群との間の差と，nAMD 眼の抗 VEGF 抗

ドの炎症応答関連レセプター発現を RT-PCR 法にて解体投与による変化を調べた．

析した．炎症刺激による上皮応答を RT-PCR 法で調べ【結果】ることで解析した．また，マイクロアレイ法及び GSEAnAMD 眼 は VEGF お よ び IP-10 が 上 昇 し IL-6 が 低法を用いて，網羅的な上皮炎症応答を評価した．酸化ス

下していた．また，抗 VEGF 抗体投与により VEGF がトレスは CellROX (R) を用いて蛍光強度を測定した．

減少し IL-6 と IP-10 が増加し，VEGF と IP-10 の間に【結果】負の相関関係があった．nAMD 発症時において視力とヒト大腸オルガノイドの炎症応答関連レセプター発現

相関する中心窩網膜厚と IP-10 濃度に正の相関があるを RT-PCR にて同定した．発現を認めたレセプターのこと，抗 VEGF 抗体であるアフリベルセプトの硝子体リガンドにて刺激を行うと，IL-8 の発現上昇を認めた．

内投与の３回目直前の IL-6 濃度と視力には負の相関がさらに，１週間の持続刺激にて酸化ストレス関連遺伝子あった．

である DUOXA2 の発現上昇を認めた．応答を認めたリ【考察】

ガンドを混合して刺激を行った所，リガンド単剤での刺IP-10 は白血球および内皮細胞や平滑筋細胞などの非激と比較して最も大きい炎症応答を認めた．そこで，リ

白血球から分泌され，IP-10 は抗血管新生作用および抗ガンド混合による持続刺激を５週間行い，マイクロアレ

線維形成作用を有する．また，IL-6 は VEGF を含む多イ法にて解析したところ，炎症関連遺伝子群の上昇及び数の血管新生および炎症促進性サイトカインを誘導す

粘液形質の減少を認めた．CellROX (R) を用いた酸化ス

る．抗 VEGF 抗体投与によって，IP-10 産生を誘発し発トレス解析では蛍光強度の増加を認め，炎症刺激による症における脈絡膜新生血管の産生を予防する可能性と，酸化ストレス上昇を認めた．さらに，新規治療候補薬のIP-10 と IL-6 が相互作用して過剰な血管新生応答およ

添加により，炎症環境においても炎症関連遺伝子の低下・び抗血管新生応答を相殺する可能性が示唆された．

粘液形質の上昇を認め，酸化ストレスの低下を認めた．
新規治療候補薬による抗炎症作用，粘膜再生作用の効果

ヒト IBD 体外モデル構築による難治化病態解明
日比谷秀爾（東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科）

を確認し得た．
【結論】
ヒト大腸オルガノイドにおいて，炎症刺激の持続により，IBD の炎症環境を模倣していることが示唆された．
IBD 体外モデルの構築及び評価系の確立により，新規候補薬物のスクリーニングに有用となることが示唆され【目的】
発表者の所属する教室で構築したマウス大腸オルガノ

た．

イド培養技術 を用いて，マウス大腸初代培養細胞に炎【文献】

症刺激を長期間行い，慢性炎症の病態を模倣した体外擬

１）Yui, S., Nakamura, T. et al.: Functional engraft-１）

似モデルの構築に成功した２）．
ヒト大腸オルガノイドでも同様の手法を用いて長期間の炎症刺激を行い，炎症性腸疾患（IBD）体外モデルを

ment of colon epithelium expanded in vitro
from a single adult lgr5+ stem cell. Nat Med. 18:
618-23, (2012).

確立させるとともに，上皮細胞機能評価システムを構築

２）Hibiya, S., Tsuchiya, K. et al .: Long-term

することにより，新規治療候補薬の評価系の確立を目的

inflammation transforms intestinal epithelial0

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

cells of colonic organoids. J Crohns Colitis. 11:ら，小胞体ストレス下では，AREG の開始コドン 0 ～621-630, (2017).

－374 bp の領域に存在する ATF motif に ATF4 が直接結合し，AREG の mRNA が誘導されている可能性が示

腸管小胞体ストレスに対する免疫応答と腸炎発症メ
カニズム解明
細

見

唆された．
【結語】
組織修復や線維芽細胞の増殖などに関与する Amphi-

周平（大阪市立大学大学院医学研究科）

regulin のクローン病における発現亢進は，肥満細胞における小胞体ストレス亢進に伴う ATF4 を介した誘導であることが示唆され，クローン病の線維化病態の理解の【背景・目的】一助となることが期待される結果であった．

クローン病に特徴的な全層性慢性炎症に対する組織修復過程が，肥満細胞の集簇を伴う平滑筋細胞増生やコラーゲン産生・線維化に関与し，線維性狭窄を来すと考えられている．炎症性腸疾患患者の腸管においては，小胞体ストレスの亢進が報告されているが，肥満細胞に

全身性強皮症の皮膚硬化における microRNA let7a の関与の検討
牧

野

雄

成

（熊本大学大学院生命科学研究部）

おける小胞体ストレス応答に関する報告は少ない．そこ
で，小胞体ストレス下の肥満細胞株の網羅的遺伝子発現
解析結果から，上皮成長因子受容体のリガンドである【目的】

Amphiregulin に注目し，小胞体ストレス応答によるそ

全身性強皮症とは皮膚硬化を主症状とし，皮膚だけでの発現誘導機構の解明と，クローン病におけるその発現なく多臓器にも線維化を生じうる自己免疫疾患である．

の検討を目的とした．

全身性強皮症の硬化皮膚では，活性化された線維芽細胞【方法】

による，Ⅰ型コラーゲンを主体とした過剰な細胞外マト

コントロールとクローン病患者の手術切除標本を用い

リックス産生が生じているとされている．本研究では，て，Amphiregulin 発現の比較検討を行った．ヒト肥満

microRNA let-7a が線維芽細胞における過剰なⅠ型コ細胞株である LUVA cell line を用いて，小胞体ストレ

ラーゲン産生に関与しているか検討を行った．

ス誘導剤である Thapsigargin（Tg）刺激条件下におけ【方法/結果】

る Amphiregulin の mRNA (AREG) 発現を定量 PCR

全身性強皮症と健常人の皮膚組織より microRNA を法で，培養上清中の蛋白発現を ELISA 法で測定した．

抽 出 し，microRNA ア レ イ を 行 い 発 現 に 変 化 の あ る

また，siRNA を用いたノックダウン実験・クロマチン

microRNA を検索した．アレイ結果から，Ⅰ型コラー

免疫沈降（ChIP）
・Luciferase assay で，小胞体ストレ

ゲンの mRNA に結合することが予想される microRNA

ス応答による Amphiregulin 誘導機構を検討した．

の中で，microRNA let-7a は硬化皮膚において健常人【結果】

皮膚より減少していた．この let-7a は全身性強皮症の蛍光免疫染色では，Amphiregulin 陽性の粘膜固有層

皮膚線維芽細胞や患者血清において健常人と比較して低細胞数が，コントロールに比較してクローン病患者で下していた．次に let-7a が皮膚線維芽細胞において実は有意に高値を示した（p ＝ 0.029）．Tg 刺激により，

際Ⅰ型コラーゲン蛋白量を変化させうるのか検討を行っ

Amphiregulin の mRNA 発現及び培養上清中の蛋白発た．合成した let-7a を線維芽細胞に導入するとⅠ型コ現が誘導された．siATF4 によるノックダウンで，そのラーゲン量は減少し，逆に let-7a の阻害剤を導入する

発現誘導は抑制されたことから，小胞体ストレス応答とⅠ型コラーゲン量は増加していた．これらの結果より，性転写因子である ATF4 が発現誘導に関与している可

let-7a を増加させることで皮膚硬化が改善するのではと能性が示唆された．ChIP・Luciferase assay の結果か推測し，ブレオマイシン誘導マウス皮膚硬化モデルで検0

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成討を行った．ブレオマイシン誘導皮膚硬化マウスに let7a 腹腔内注射を行うと，ブレオマイシン投与による皮膚厚の増加は let-7a 投与により減少していた．
【考察】
microRNA によるⅠ型コラーゲン調節のメカニズムを解明することは，強皮症の新しい治療や疾患マーカーにつながる可能性がある．

炎症性腸疾患発症に関与する新たな因子の検討
松

本

佳

則

（岡山大学大学院医歯薬学総合研究科）
未発表データが含まれるため，掲載しておりません。

08

研究報告

Front Runner
Runner ofFront
of Future
Future Diabetes
Diabetes Researchに関する研究助成
Researchに関する研究助成

肥満脂肪細胞における酸化還元状態の病態学的意義
解明

成抑制，脂肪組織炎症の増加，脂肪組織線維化の増悪を介し，異所性脂肪蓄積・インスリン抵抗性を誘導する可能性が考えられた．

奥

野

陽

亮

【文献】

（大阪大学大学院医学系研究科）

Okuno, Y., Fukuhara, A., Hashimoto, E., Kobayashi,
H., Kobayashi, S., Otsuki, M. & Shimomura I.: Oxi-

【目的】
我々は，肥満状態の脂肪組織では酸化ストレス（FatROS）が亢進する事をマウス及びヒトにおいて報告して

dative stress inhibits healthy adipose expansion
through suppression of SREBF1-mediated lipogenic
pathway. Diabetes 2018; 67(6):1113-1127

きた（Furukawa et al., J Clin Invest., 2004, Hirata etal., BBRC, 2012）．しかし，メタボリック症候群における Fat ROS の病態学的意義は不明であった．
【方法・結果】

弾性線維関連蛋白 Fibulin-5 によるインスリン抵

Fat ROS 低減マウスの解析

抗性制御機構の解明
奥Fat ROS 低減マウスにおける酸化ストレス状態を詳山朋子（横浜市立大学医学部）

細に検討した．皮下脂肪組織，性腺周囲脂肪組織では
8-isoprostane，過酸化水素の低下を認めたが，腸間膜
脂肪組織，褐色脂肪組織，肝臓では差が認められなかっ【目的】

た．本マウスの皮下脂肪組織では，M2 マクロファージ

細胞外基質の糖代謝制御への関与は不明である．我々

優位の変化を示し，炎症が改善していると考えられた．

は，膵島におけるグルコキナーゼの標的分子として，細

また，PicroSirius 染色にて線維化の抑制を認めた．

胞外基質における弾性線維形成に必須の分泌タンパク

Fat ROS 増加マウスの解析である Fibulin-5 (Fbln5) を同定しており，本研究ではFat ROS 増加マウスの脂肪組織における酸化ストレ

Fbln5 の糖代謝への影響の解明を目的とし検討を行っ

ス状態を詳細に検討した．
性腺周囲脂肪組織においては，た．

8-isoprostane，過酸化水素，カルボニル化蛋白の増加【方法・結果】を認めた．

Fbln5 欠損マウス（Fbln5KO）および野生型マウス

本マウスは高脂肪食負荷下において，Fat ROS 低減（WT）に生後８週齢より通常食あるいは高脂肪食を負マウスとは対照的に，白色脂肪重量の減少，肝臓・褐色脂荷し代謝表現型の解析を行った．生後８週齢において，肪組織への脂質蓄積，
インスリン抵抗性の増悪を認めた．

Fbln5KO と WT の体重および耐糖能に差は認めなかっ白色脂肪組織においては，脂質合成系遺伝子の発現抑制，たものの，Fbln5KO ではインスリン感受性の亢進およ炎症マーカーの亢進を認めた．また，M1 マクロファー

び肝糖新生の抑制を認めた．両群の摂餌量は同等であっ

ジ優位の変化を認め，炎症が増悪していると考えられた．

たが，いずれの食餌群でも週齢とともに Fbln5KO では

また，PicroSirius 染色にて線維化の亢進を認めた．

体重増加が抑制され，高脂肪食誘導性の肥満・肝脂肪蓄【考察】

積・脂肪細胞肥大化が抑制された．グルコースクランプ

肥満脂肪組織において増加した Fat ROS は，脂質合による解析を行ったところ，Fbln5KO では全身の糖利09Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

用率の上昇および肝糖産生率の低下，骨格筋での糖取り

ロール（ﬂox/ﬂox）マウスを比較検討した．まず，①腹込みの亢進を認め，全身におけるインスリン感受性の

腔内糖負荷試験及び経口糖負荷試験を行い，耐糖能，イ改善が示唆された．また，Fbln5KO では WT に比較しンスリン値について検討を行い，②血圧測定およびレー

寒冷刺激に対する体温低下が顕著であったが，この際脂ザードップラー法により膵血流量を評価し，③単離膵島肪組織における熱産生・脂肪酸燃焼に関連する遺伝子を用いたグルコース応答性インスリン分泌能評価，及群の発現は上昇していた．これらの Fbln5KO の表現型

び膵β機能に関わる遺伝子群の発現を評価し，④免疫は，肥満抑制や耐糖能改善が報告されている皮膚特異的染色により膵β細胞量，α細胞量および，CD31 染色・SCD1 欠損マウスの表現型と酷似していることに着目

Pimonida- zole 染色により膵β細胞における血管内皮した．Fbln5KO では高脂肪食負荷による皮膚における面積及び虚血を評価した．

SCD1 発現誘導が抑制されており，皮膚特異的 SCD1 欠【結果】損マウスと同様，皮脂腺の萎縮を認めた．

通常食３ヶ月飼育下では VEPDK1KO マウスは腹腔内糖負荷試験でコントロールと比較して血糖値に全く違い【考察】
細胞外基質分子である Fbln5 は全身のインスリン感がないものの，インスリン値は有意に低値であった．大

受性・エネルギー代謝制御に関与しており，弾性線維に変興味深いことに経口糖負荷試験では KO マウスで 15富む皮膚などの組織がインスリン感受性の形成に寄与し分値血糖は有意に上昇していた．Ex-4 で前処置したとている可能性が示唆された．今後 Fbln5 欠損マウスをころ，腹腔内糖負荷試険では KO マウスで有意に血糖用いて弾性線維に富む血管におけるインスリン透過性のは高値であった．免疫染色では，膵β細胞量，α細胞

検討や，臓器特異的 Fbln5 欠損マウスを用いた検討を量は KO マウスで有意に低下していた．膵血流量は KO追加する．

マウスで有意に低下しており，膵島における CD31 陽
性面積は有意に KO マウスで低下していた．また，グルコース応答性インスリン分泌は KO マウスで減弱し血管内皮 PDK1 の病態生理学的役割の解明
小畑淳ており，Ex-4 添加によりその差はより明瞭化した．単離膵島では mRNA レベルでインスリン遣伝子やその転写因子 (ins1, ins2, mafa, pdx-1, neurod), glp-1r, irs2,

史（川崎医科大学医学部）

gck, glut2, ccnd1 など膵β細胞機能において重要な遺伝子発現が KO マウスで有意に低下しており，hif1α及【背景】

びその下流遺伝子は KO マウスで有意に上昇していた．

Phosphoinositide dependent protein kinase1

さらには，KO マウスで有意に Pimonidazole 陽性β細(PDK1) は PI3K の下流にあり，インスリンシグナル胞が増加しており，KO マウスの膵島は相対的虚血状態

において重要な役割を果たす事が知られている．我々にあった．単離膵島において，ER stress に関わる bip,

は世界に先駆けて，血管内皮特異的 PDKl 欠損マウス

s-xbp1, chop 等の遺伝子発現は有意に KO マウスで増（VEPDK1KO マウス）を作製した（Tawaramoto et al.

加しており，炎症性サイトカインの遺伝子発現も亢進しMol Endocrinol. 2012）．一方で通常食３ヶ月飼育で，ていた．

随時インスリン値が有意に低値であったことに着眼し，【結語】「血管内皮 PDK1 は膵β細胞機能に重要な役割を果たす」

血 管 内 皮 PDK1 は， 膵 島 に お け る 血 流 維 持 に と てという仮説を立てた．

も重要で，膵島を虚血から保護している．さらに ER【目的】

stress や炎症の軽減を介して膵β細胞の機能および量の血管内皮 PDK1 の膵β細胞に及ぼす役割を解明する．
【方法】
通常食３ヶ月飼育した VEPDK1KO マウスとコント

0

維持に極めて重要な役割を果たすことが示唆された．

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

肥満・糖尿病におけるメタロプロテアーゼの制御および役割
川

受容体切断といった炎症抑制への関与も示唆されている．各種 MP の制御，役割，相互作用や発現バランスについて検討することで，炎症やインスリン抵抗性の制

崎

修

二

御につながる可能性がある．
（山鹿市民医療センター）【目的】
報告者らは，TNFα分泌に不可欠なメタロプロテアー
ゼ（MP）である ADAM17 の発現・活性が，肥満・糖腸内細菌産生脂肪酸がマクロファージ極性変化に与える影響の解析後藤剛（京都大学大学院農学研究科）

尿病状態の脂肪組織（WAT）で増強，
カロリー制限（CR）
により抑制されることを証明した．本研究では，幅広く
各種 MP の制御・役割を検討する．
【方法】【背景・目的】
腸内細菌と宿主エネルギー代謝との深い関連性が示ADAMs (ADAM9, 10, 12, 17) および，ある MP (MP-X)

されているが，その詳細な分子機構は明らかにされての mRNA 発現を検討した．１）高脂肪・高ショ糖食をいない．我々は腸内細菌の脂質代謝解析を通じて，食餌与えた C57BL/6 マウス（B6-HF/HS）について，また，由来の多価不飽和脂肪酸が腸内細菌によって多彩な修飾

肥満・糖尿病モデル KK-Ay マウスについては，２）自脂肪酸へと変換されることを報告してきた．昨年までの

由摂食群（Ay-AL），３）CR 群（Ay-CR）に分けて検討研究において，リノール酸由来の腸内細菌産生脂肪酸，した．さらに，４）C57BL/6 マウスにゴールドチオグ

10-oxo-12 (Z)-octadecenoic acid が陽イオンチャネル，

ルコースを投与した過食・肥満モデルマウス（B6-GTG），

transient receptor potential cation channel subfamily

５）培養細胞（脂肪細胞，腹腔由来マクロファージ）にV member 1 (TRPV1) 依存的に褐色脂肪組織（BAT）

おいても検討した．

機能を亢進し，高脂肪食誘導性の体重増加を抑制するこ【結果】とを報告してきた．本研究では，腸内細菌産生脂肪酸

１）B6-HF/HS の WAT に て，ADAM10 は 2.0 倍，と宿主代謝調節機構の接点について明らかにすること

ADAM17 は 2.3 倍，MP-X は 6.8 倍 に 上 昇， ２）Ay-

を目的とし，n-3 系多価不飽和脂肪酸であるα-リノレン

AL の WAT にて，ADAM10 は 1.2 倍，ADAM17 は 2.4酸（ALA）と ALA 由来の腸内細菌産生脂肪酸を対象に，倍，MP-X は 15.6 倍に上昇，３）CR により ADAM10

マクロファージの極性変化に着目し，検討を行った．

は 18.5 ％，ADAM17 は 36.6 ％，MP-X は 89.5 ％ 減 少【方法・結果】

した．４）B6-GTG の週齢に従って（肥満が進行するに複数の食餌脂肪酸および食餌脂肪酸由来腸内細菌

従って），脂肪組織での MP-X の発現が上昇した．５）

産 生 脂 肪 酸 に つ い て， 骨 髄 由 来 細 胞 か ら M2 マ ク

培養細胞への LPS 添加実験では MP-X 発現の変化は無

ロファージへの分化に与える影響について検討した

かったが，パルミチン酸の添加により発現上昇することと こ ろ，ALA お よ び ALA 由 来 の 腸 内 細 菌 産 生 脂 肪が確認された．

酸，13-hydroxy-9(Z), 15(Z)-octadecadienoic acid【考察】

(13-OH), 13-oxo-9(Z), 15(Z)-octadecadienoic acid

ADAM10, 17 は，TNFα 産 生 に 関 わ る 酵 素 で あ り，

(13-oxo) が IL-4 (interleukin-4) または IL-13 存在下で肥満・糖尿病状態の脂肪組織における炎症やインスリンM2 マクロファージのマーカー遺伝子（CD206 および抵抗性の惹起に関与することが示唆された．一方，今回

arginase-1）の発現上昇を誘導することが示唆された．

の検討で特に大きな変動を示した MP-X については，脂こ れ ら の 脂 肪 酸 の 効 果 は， 脂 肪 酸 受 容 体 G protein-肪組織における報告はなく，免疫や腫瘍細胞における炎coupled receptor 40 (GPCR40) および GPCR40 下流症惹起応答への関与が報告されているが，逆に，TNFに存在する phospholipase C-βや MAPK/ ERK kinaseFront Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成の各阻害剤存在下で減弱が認められた．ALA, 13-OH,

た．Favine は脂肪組織に作用し，脂肪細胞分化と脂肪13-oxo は IL-4 存 在 下 で，M2 マ ク ロ フ ァ ー ジ 分 化 に

合成促進作用を有することが明らかになった２）．血管内

重 要 な 転 写 因 子 signal transducers and activator of

皮細胞 HUVEC において，Favine 過剰発現/発現抑制にtranscription 6 (STAT6) と peroxisome proliferator-

より，TNFα誘導性の炎症関連因子の発現が変動するこ

activated receptor γ の相互作用を亢進させることがとが明らかとなった．現在は動脈硬化性疾患との関連を明らかとなった．さらに，これら脂肪酸を３日間投与

解析している．

（1 g /kg /day）したマウスの消化管粘膜固有層において，【考察】

M2 マクロファージの集積が認められた．

Favine は，脂肪蓄積促進作用を有し，インスリン抵
抗性，血管の炎症に関与する分泌因子であることが示唆【考察】
食餌由来の ALA および ALA から腸内細菌によってされた．

産生される 13-OH, 13-oxo は，GPCR40 の活性化を介【文献】

して M2 マクロファージ分化を促進し，生体のマクロ１）Sachiko Kobayashi, Atsunori Fukuhara, Takashi

ファージ極性に影響を与えることが示唆された．

Taguchi, Morihiro Matsuda, Yoshihiro Tochino,Michio Otsuki, & Iichiro Shimomura.: Identiﬁca-

血管および脂肪組織由来新規分泌因子 Favine の機
能解析
小tion of a new secretory factor, CCDC3/Favine,in adipocytes and endothelial cells Biochem
Biophys Res Commun. 392, 29-35 (2010).

林祥子（大阪大学大学院医学系研究科）

２）Sachiko Kobayashi, Atsunori Fukuhara, Michio
Otsuki, Takayoshi Suganami, Yoshihiro Ogawa,Eiichi Morii, & Iichiro Shimomura.: Fat/Vessel-【目的】
肥満や糖尿病において動脈硬化症が発症，進展するが，
その機序には依然不明な点が多い．我々は，血管から分derived Secretory Protein (Favine)/CCDC3 Is
Involved in Lipid Accumulation. J. Biol. Chem.
290, 7443-7451 (2015).

泌される，糖尿病と肥満や動脈硬化症に関わると推定される新規因子として，Fat/vessel-derived secretory
protein (Favine)/Coiled-coil domain containing 3(CCDC3) を同定した．Favine は，血管と脂肪で高く発

Activin B による糖・エネルギー代謝制御機構の解明
小

林

直

樹

（国立国際医療研究センター研究所）

現する分泌因子であり，糖脂質代謝異常や炎症に関連する刺激により，その遺伝子発現量が変動する１）．Favineの機能解析を目的に本研究を行った．
【方法】

【目的】
TGFβスーパーファミリーリガンドのひとつである

Favine 遺伝子改変 3T3-L1 脂肪培養細胞および血管

Activin B が，肝臓において食餌摂取により発現がコン

内皮細胞の解析と Favine 欠損マウスにおける機能解析．

トロールされていることを見出し，Activin B による糖【結果】

･エネルギー代謝における役割を検討している．これまFavine 過剰発現 3T3-L1 細胞は分化が亢進し，またでの検討から，肝臓における Activin B シグナルが，①脂肪合成が促進した．Favine 欠損マウス（以下，KO

インスリン非依存的な肝糖新生抑制，② FGF21 の産生マウス）の脂肪組織では脂肪細胞サイズが小さく，脂肪･分泌の増大によるインスリン感受性亢進，③グルコー

合成関連遺伝子発現の低下が認められた．KO マウスはス応答性インスリン分泌反応亢進，などの作用を有して加齢に伴う体重増加および脂肪肝の進展が抑制され，１おり，その結果として糖尿病における耐糖能異常を改善

年齢では野生型に比してインスリン抵抗性の軽減を認めする可能性が示唆された．Activin B による上記のよう

2

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

な特徴的な薬理作用と糖尿病の病態との関連を明らかに分子である Atg7 を胎生期よりノックダウンさせたマウする目的に下記の検討を行った．

スを用いてきた．しかし糖尿病モデル動物の検討におい【方法および結果】て，インスリン抵抗性状態では AP の促進が認められ，肥満モデルおよびヒトの肝臓における Inhbb (Activin

膵β細胞の代償機構が破綻した糖尿病状態では AP 不全

B を構成するサブユニットをコードする ) の発現を検を呈することを明らかとした２）．これはインスリン抵抗

討したところ，いずれにおいても発現に変動を認めな性の継続が AP 不全をもたらし，糖代謝異常を惹起するかった．しかしながら，Activin ファミリーは内因性アと考えられ，胎生期からではなく出生以降に AP 不全がンタゴニストである Follistatin (FST) あるいはその関連もたらされるシステムがより病態を反映すると考えられ

分子 FSTL3 が存在し，これらの分子は Activin と結合た．心筋においては胎生期と出生以降に AP 不全を惹起し，Activin と受容体の結合が阻害することが知られてさせた場合には表現型が異なる事が報告されている３）．

いる．興味深いことに，肥満モデルマウスおよびヒトのそこで本研究では任意の時期に膵β細胞特異的に Atg7

脂肪組織において，FST の発現は変化を認めなかったをノックアウトすることで，成体における AP 不全が膵が，FSTL3 は肥満において強く発現していた．実際に，β細胞機能に与える影響を明らかとする．

正常マウスにおける FSTL3 の強制発現により耐糖能異【方法】

常を誘導し，また肥満マウスにおける FSTL3 のノック

MIP (mouse insulin promoter)-CreERTM マ ウ ス に

ダウンにより耐糖能異常の改善を認めた．また，肝細胞

ﬂoxed Atg7 マウスを交配し，タモキシフェン（TM）

において Activin B により誘導される細胞内シグナル伝誘導性膵β細胞特異的 Atg7 ノックアウト（Atg7KO）

達および FGF21 発現誘導は，いずれも FSTL3 の共処

マウスを作出し，耐糖能の評価を行った．

理により阻害された．さらに，in vivo における Actlvin【結果】

B と FSTL3 の関連について，肥満マウスにおいてそれTM 6 ㎎ Atg7KO マウスと対照マウスに隔日３回，計ぞれの分子を強制発現させることにより検討した結果，

18 ㎎の投与を行った．投与後２週間に膵島を単離し，Activin B 強制発現によって認められたインスリン抵抗

Western blotting による解析を行った．オートファゴ

性改善･インスリン分泌亢進･耐糖能異常改善は FSTL3ソーム形成マーカーである LC3-II は対照マウスと比較の共発現により阻害された．

して Atg7KO マウスの膵島において有意な低下を認め，【考察】

AP による蛋白分解の基質の一つである p62 の異常集

肥 満 時 に 脂 肪 組 織 に お い て 強 発 現 す る FSTL3 が積を認めたことから，TM 投与後２週間の膵島において

Activin B と拮抗作用することにより，Activin B によるイ

AP 不全が確認された．TM 投与後２週間に行った腹腔

ンスリン感受性亢進およびインスリン分泌亢進作用が阻

内ブドウ糖負荷試験において，Atg7KO マウスと対照マ

害されることが示唆された．

ウスの間に有意な差は認められなかった．TM 投与後６週間の検討では，Atg7KO マウスにおいて血糖の有意な糖尿病発症におけるオートファジーによる膵β細胞
調整メカニズムの解明
小宮幸

上昇と，血中インスリン値の有意な低下が認められた．
【考察】
これまでに膵β細胞において AP 不全から膵β細胞機

次能障害に至るまでにはタイムラグがあることが明らかと（順天堂大学大学院医学研究科）なった．今後，Atg7KO 膵島を用いたトランスクリプトー
ム解析を行うことにより，AP 不全から膵β細胞機能障害に至る分子機構の一端を明らかにしたい．

【目的】
２型糖尿病の膵β細胞維持にオートファジー（AP）【文献】

が必須であることを見出し ，そのメカニズムの探求を

１）Ebato, C. et al.: Autophagy is important in islet

行ってきた２,３）．これまでは膵β細胞特異的に AP 実行

homeostasis and compensatory increase of

１）



Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

beta cell mass in response to high-fat diet, Cell

(Metabolic equivalents) を算出した．共分散分析を用Metab., 8 (4), 325 (2008).

い，糖尿病群と非糖尿病群の比較を行った．

２）Shigihara, N. et al., Human IAPP-induced pancreatic beta cell toxicity and its regulation by【結果】
糖尿病群 52 名（平均年齢 70.2 歳，男性 28 名 [53.8%]）

autophagy, J. Clin. Invest., 124, 3634 (2014).

の う ち イ ン ス リ ン 治 療 18 名（34.6 ％）， 経 口 薬 治 療３）Honda, A. et al ., Normal pancreatic beta-

18 名（34.6％），食事療法 14 名（26.9％）であった．

cell function in mice with RIP-Cre-mediated

非糖尿病群 15 名の平均年齢は 67.1 歳，男性は 6 名inactivation of p62/SQSTM1, Endocr. J., 65, 83（40.0％）であった．平均 HbA1c は，糖尿病群 6.9％，(2018).

非糖尿病群 5.5％であった（p<0.001）．平均 BMI は，４）Abe, H. et al.: Exendin-4 improves beta-cell

糖尿病群 23.3，非糖尿病群 22.7 であった（p＝0.490）．

function in autophagy-deﬁcient beta-cells. Endo-

性， 年 齢， 脂 肪 量， 除 脂 肪 量 お よ び 平 均 METs で 調

crinology, 154, 4512 (2013).

整した平均総エネルギー消費量は，糖尿病群で 2143

５）Nakai, A. et al., The role of autophagy in cardio-

kcal/day, 非 糖 尿 病 群 で 2222kcal/day と 糖 尿 病 群 で

myocytes in the basal state and in response to

若干低値を示したが，２群間に有意な差は認めなかっ

hemodynamic stress, Nat. Med., 13, 619 (2007).

た（Mean diﬀerence: 79 kcal/day, 95% conﬁdential
interval [CI]: ︲78 to 235 kcal/day）．基礎代謝量は糖２型糖尿病患者における二重標識水法を用いた総エネルギー消費量の検討
近藤慶

尿病群で低値を示したが，２群間に統計学的有意差はな か っ た（Mean diﬀerence: -33 kcal/day, 95% CI:-80 to 15 kcal/day）．一方，身体活動レベルは糖尿病

子群（1.71）で非糖尿病群（1.81）より低い傾向を示し（滋賀医科大学）た（Mean diﬀerence: ︲0.01, 95% CI: ︲0.01 to 0.21）
．
【考察】

【目的】

正確に測定した日本人２型糖尿病患者の総エネルギー

糖尿病患者において，エネルギー摂取量の管理は治療

消費量は非糖尿病患者と同等であった．身体活動レベル上重要である．糖尿病学会ガイドラインでは，身体活動は糖尿病患者群で低い傾向を示したが，差は小さかった．

レベルにより，エネルギー必要量を設定することが推奨

研究限界として，単一病院の結果であること，症例数がされているが，正確に測定された糖尿病患者の総エネル

少なく，選択バイアスの可能性があることが挙げられる．

ギー消費量を検討した報告はほとんどない．
そこで，我々

本研究結果は，糖尿病食事療法のエネルギー必要量の設は，総エネルギー消費量測定のゴールデンスタンダード定に役立つ可能性がある．今後は，糖尿病治療別あるいな方法である二重標識水法を用い，２型糖尿病患者におは血糖コントロールとの関連を検討する予定である．

けるエネルギー消費量の実態を明らかにすることを目的に検討を行った．
【方法】
滋賀医科大学医学部附属病院糖尿病内分泌内科に外来
通院中の 60～79 歳の糖尿病患者および非糖尿病患者を新規小胞体ストレス調節因子 Sdf2l1 による肝臓での糖脂質代謝調節作用の検討
笹

子

敬

洋
（東京大学大学院医学系研究科）

対象とした．二重標識水法を用いた総エネルギー消費量を測定し，間接熱量測定により基礎代謝量を評価した．
さらに，総エネルギー消費量を基礎代謝量で除して，身【背景・目的】体 活 動 レ ベ ル（Physical activity level） を 算 出 し た．

我々は肝臓における摂食状態に応じた代謝調節機構に

また，活動量計を 14 日間装着し，期間中の平均 METs

着目し，摂食が一過性に生理的な小胞体ストレスを惹起Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成すること，コシャペロンと考えられる Sdf2l1 が摂食時に小胞体ストレスを介して糖脂質代謝を調節する一方，その発現低下が肥満・糖尿病の病態形成に関与している

生体防御調節因子としての GLP-1 の役割
佐

藤

雄

大
（秋田大学大学院医学系研究科）

可能性を示してきた．
培養細胞系における検討を端緒に，
Sdf2l1 と膜輸送関連蛋白 TMED10 との相互作用が示唆され，両者の関連について更に検討を加えた．
【方法】

【背景】
現在，糖尿病の治療薬としてインクレチン関連薬が広初代肝細胞において，Sdf2l1 と共に TMED10 をノッ

く使用されている．インクレチン関連薬は，血中の活性

クダウンし，その際の小胞体ストレスマーカー遺伝子型 GLP-1 レベルを高めることにより，インスリン分泌の発現を解析した．また中心的なシャペロンである BiP

促進作用を発揮する．GLP-1 受容体は膵島細胞以外にをノックダウンし，その影響を比較した．また肝臓の膜も様々な部位に発現しているが，GLP-1 の膵外作用に画分において，Sdf2l1 と TMED10 の相互作用が認めら

ついてはその全貌ならびに生理的な意義については今だ

れた条件で，Sdf2l1 と BiP の相互作用についても検討

未解明な部分がある．我々は，ある種の肺傷害モデルでした．

は GLP-1 受容体作動薬の投与により急性期におけるサ【結果】

イトカインの発現が亢進することを見出した．また逆Sdf2l1 と TMED の一方のノックダウンにより，小胞に GLP-1 受容体欠損マウスではこうしたサイトカイン

体ストレスマーカーである sXbp1 や CHOP の発現は同の発現が減弱していた．これらのことから，ある条件程度に上昇し，両者をノックダウンしても更なる変化

下では GLP-1 がサイトカインの発現を増強しているとは見られなかった．また Sdf2l1 と BiP の一方のノック考えられたが，我々はこのことの生体への意義としてダウンによっても，マーカー遺伝子の発現は同様に上

GLP-1 が病原体などからの防御的役割を一部担ってい昇したが，両者のノックダウンによって更なる上昇がるという仮説を立てている．この研究の目的は，生体防認められた．一方，肝臓の膜画分において，Sdf2l1 と御調節因子としての GLP-1 の役割を検討することである．

TMED10 同様，Sdf2l1 と BiP の相互作用も認められた【方法】

ものの，Sdf2l1 と結合している BiP は，膜画分におけ肺の肺障害ならびに感染症モデルマウスを作成し，る発現量のごく一部であった．

GLP-1 受容体作動薬を投与し，生存や体重推移，遺伝【考察】

子発現等を検討した．

これまで Sdf2l1 と BiP はシャペロン複合体を形成【結果】していると報告されてきたが，今回の我々の検討で肺 の 感 染 症 モ デ ル マ ウ ス で は，GLP-1 受 容 体 作 動

は，Sdf2l1 に と っ て BiP よ り も TMED10 の 方 が 主 な薬を投与することでその生存率が改善した．また逆にパートナーであると考えられた．加えて機能的にも，

GLP-1 受容体欠損マウスでは生存率が低下する傾向に

Sdf2l1 と BiP が独立に作用するのに対して，Sdf2l1 とあった．GLP-1 受容体作動薬の投与により病原体の減TMED10 は協調的に小胞体ストレスに対して保護的に少が認められ，肺の炎症が改善した．GLP-1 受容体作作用していることが示唆された．

動薬の投与によりある種のサイトカインシグナルの増強が認められ，このことが病原体の減少に寄与することが示唆された．
【考察】
これらのことより，GLP-1 が生体防御調節因子として働いている可能性が示唆された．

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

腸管内分泌Ｋ細胞およびＩ細胞を介した高脂肪食誘

数，分布に関しては免疫組織学的評価も併せて行う．
【結果】

導性肥満の機序解明

免疫染色で，Ｋ細胞，Ｉ細胞，K / I 細胞の比率は，上三小田 亜希子

部小腸で 19％ , 51％ , 30％，下部小腸で８%, 68%,
（京都大学大学院医学研究科）

24% であった．引き続きこれらの各細胞群の特徴を明らかにし，特に高脂肪食摂取下での機能面での相違の有【背景】

無を検証する．

２型糖尿病の基礎病態は，①インスリン分泌能低下，②インスリン抵抗性増大の２つである．日本人は欧米人と比較して膵β細胞のインスリン分泌能が低いため，高脂肪食を特徴とする食の欧米化を背景に，軽微な肥満であっても糖尿病を発症する患者が急増している．
「脂肪
摂取による肥満促進・インスリン抵抗性増大」の機序解

Ｗｆｓ₁ 欠損によるβ細胞機能障害とインクレチンの効果に関する研究椎木幾久子（山口大学医学部）

明が喫緊の課題である．
腸管は食事の消化・吸収を担う消化管としての働きをもつが，同時に糖質や脂質の代謝を制御する多様なホ【目的】

ルモンを分泌する生体内で最大の内分泌器官でもある．

Wolfram 症候群モデル動物 Wfs1 欠損マウスでは，膵

Gastric inhibitory polypeptide (GIP) を分泌する腸管

β細胞が進行性に減少し，高血糖を来す．我々はこれま

内分泌Ｋ細胞と，cholecystokinin (CCK) を分泌するＩでに Wfs1 欠損β細胞は脱分化することを明らかにして細胞は，ともに上部小腸に多く存在し，脂質の摂取によっきた．Wfs1 欠損膵島では高血糖を呈する以前より小胞て脂肪酸受容体 GPR120 や GPR40 を介した強い分泌

体ストレス及び酸化ストレスが増大しており，脱分化誘刺激を受ける．高脂肪食条件下では GIP・CCK ともに導との関連が推測されるが，詳細は明らかではない．ス

分泌が亢進し，各々の欠損マウスでは高脂肪食誘導性肥トレス病態における細胞内エネルギー代謝に着目し脱分満がみられない．GIP と CCK には多くの共通点があり，化との関わりを検討した．

両腸管ホルモンは協調的に相互に作用しながら，高脂肪【方法】

食誘導性肥満に寄与する可能性があるがその詳細は不明

高血糖発症前 10︲12 週齢 Wfs1 欠損マウスの単離膵である．

島を用いて，mRNA・蛋白質発現及びメタボローム解析，【目的と方法】

グルコース負荷時の酸素消費速度及び ATP 濃度を測定

高脂肪食誘導性肥満のキーホルモンである GIP およ

した．

び CCK の分泌亢進の機序解明を目的とし，まずは K 細【結果】胞，Ｉ細胞の解析を行い，各々の分布や特性を明らかに

Wfs1 欠損マウスの膵島では，解糖系中間代謝物及びする．GIP 遺伝子に GFP 遺伝子を挿入しＫ細胞を可視

ピルビン酸が増加する一方，アセチル CoA 及びクエン化したマウス（GIP-GFP マウス）と，CCK-Cre マウス

酸の低下，すなわち TCA 回路が減弱しており，その結と Rosa-TdTomato マウスを交配しＩ細胞を可視化した

果 ATP 含量が低下した．このエネルギー代謝経路の乖

マウス（CCK-TdTomato マウス）をかけ合わせ，ダブ

離について，Pyruvate dehydrogenase (PDH) の活性

ルレポーターマウス（GIP-GFP╳CCK-TdTomato マウを抑制するリン酸化（pPDH）が増加し，このことよりス）を作製する．フローサイトメーターを用いて，GFP

ピルビン酸からアセチル CoA 生成の抑制がその要因と単独陽性細胞（Ｋ細胞），TdTomato 単独陽性細胞（Ｉして推察された．Wfs1 欠損β細胞ではストレス応答分細胞），GFP-TdTomato 共陽性細胞（K/I 細胞）を単離

子 Thioredoxin-interacting protein (Txnip) の 発 現 亢

回収し，各細胞の数，分布，遺伝子発現様式を検証する．

進をきたしており，Txnip が PDH および PDH kinase1

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成への結合を介して PDH のリン酸化を促進することが示【目的】

唆された．Wfs1: Txnip 二重欠損マウスでは，Wfs1 欠

GIP 受容体が精巣に発現し，GIP シグナルが精子細胞損マウスに比して膵島での pPDH が低下し，グルコー

における Psg17 の遺伝子発現を調節することで受精にス負荷時の酸素消費速度及び ATP 濃度上昇が回復した．

影響を与えること，また肥満症・糖尿病における男性不さらに，組織学的には脱分化の抑制とともにβ細胞量妊は，このシグナルが低下することが一因であることをが維持されており，50 週齢までの観察において Wfs1:

明らかにする．

Txnip 二重欠損マウス全個体において糖尿病の発症が抑

【方法】

制された．

① 精 巣 に お け る GIP 受 容 体 の 発 現 を RT-PCR 法・insitu hybridization を用いて検討した．

【結論】
ストレス病態での細胞内エネルギー代謝障害と脱分化② 受精能の違いを野生型マウス，GIP 受容体欠損マウ

誘導との関連における Txnip の役割とその制御によるスの精子を用いた in vitro fertilization assay にて検脱分化抑制の可能性が示唆された．

討した．
③ 野生型・GIP 受容体欠損マウスの精巣組織，精子運動能，受精能に影響を与えうるテストステロン・レ

摂食と生殖能を繋ぐ分子メカニズムの解明と肥満症・糖尿病における男性不妊治療への応用
清水辰

プチンの血中濃度，レプチン受容体の発現量を検討した．
④ 受精能の低下原因検索目的に野生型マウス・GIP 受

徳

容体欠損マウスの精巣を用いたマイクロアレイ解析（秋田大学大学院医学系研究科）

を行った．
⑤ フローサイトメトリーを用いた１倍体精子細胞の遺【背景】
肥満症・糖尿病は多くの疾病・合併症を引き起こす危険因子であることが明らかにされている．一方，世界には 4850 万組に及ぶ夫婦が不妊症を抱えており，その中伝子発現の検討，精子細胞を欠如する 17 日齢マウ
ス精巣の遺伝子発現を検討した．
⑥ 上記より得られた Psg17 の発現をインスリン抵抗性
モデルマウスで検討した．

で肥満・糖尿病は，女性側においてよく知られた不妊の【結果】一因である．インスリン抵抗によって惹起される多嚢胞① GIP 受容体は精巣の精子細胞に発現していた．

性卵巣症候群などがその一つであり，メトホルミンのよ② 卵の透明帯有無に関わらず，野生型マウス精子と比うなインスリン抵抗性改善薬は妊娠率を改善させること

べ，GIP 受容体欠損マウスの精子において有意に受が報告されている．不妊症の原因の半数は男性側に原因精率が低下した．

があるとされ，近年の報告では肥満症・糖尿病は，男性③ GIP 受容体欠損マウスの精巣組織に異常は認めず，側においても不妊の一因であることが疫学的に示されて血中テストステロン・レプチンの血中濃度，レプチいる．しかしながら，肥満症・糖尿病と男性不妊の機構

ン受容体の発現量は野生型マウスと同等であった．

についてはほんど解明されておらず，これらを繋ぐ因子④ 有 意 な 変 動 を 示 す 遺 伝 子 を 抽 出 し， そ の 中 か らについては全く分かっていなかった．そのために，男性
不妊に対する治療は生殖補助医療にほぼ限られている．
肥満症男性の精子は体外受精による妊娠の成立率が低下

Psg17 に着目した．
⑤ Psg17 ならびに GIPR が精子細胞に強く発現していることを確認した．

するものの，卵細胞質内精子注入法を用いた場合は非肥⑥ ob/ob マウス・DIO マウスの精巣では GIP 受容体の満男性と同等であることが報告されており，肥満症男性

発現は有意に低下しており，同様に Psg17 の発現低の精子は卵との結合ステージにおいて何らかの障害を有下も認めた．

している可能性がある．

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

マクロファージの炎症および遊走が惹起され，それらは【結語】
肥満症・糖尿病に生じる GIP 抵抗性を改善する治療

S100A8 中和抗体にて抑制された．グルコース刺激，マが Psg17 の発現を回復させ，男性不妊の新たな治療法

クロファージ，およびパルミチン酸の組み合わせによりとなることが期待される．

誘導された膵β細胞アポトーシスは，S100A8 依存的であった．ヒト膵島においても，グルコース刺激およびマクロファージとの共培養により S100A8 の発現は上昇

グルコースシグナルを介した膵β細胞の小胞体ストレス制御メカニズムの解明
白川純（横浜市立大学大学院医学研究科）

し，S100A8 中和抗体により膵β細胞アポトーシスは抑
制された．
【考察】
グルコースシグナルの標的分子である S100A8 は，
TLR4 を介したマクロファージとの相互作用により膵
β細胞アポトーシスを制御していることを明らかにし【目的・方法】
グルコースシグナルを介した膵β細胞のストレス制た（J Biol Chem. 2018）． 現 在， 独 自 に 膵 β 細 胞 特
異 的 S100A8 欠 損 マ ウ ス を 作 製 し（MIP-Cre/ERT2;

御機構を明らかにするため，グルコキナーゼ活性化薬

S100A8-ﬂoxed mice），解析を進めている．

（GKA）により膵β細胞で発現変化する分子群の機能を

【文献】

解析する．

１）Shirakawa, J., Togashi, Y., Sakamoto, E., Kaji,【結果】

M., Tajima, K., Orime, K., Inoue, H., Kubota,

これまで，膵β細胞においてグルコキナーゼを介しN., Kadowaki, T. & Terauchi, Y.: Glucokinase

たグルコースシグナルの活性化は，IRS-2 を介した抗activation ameliorates ER stress-induced apop-

アポトーシス効果と IRS-2 に非依存的な小胞体ストレ

tosis in pancreatic β cells. Diabetes. 2 (10):ス分子の発現制御の２つの異なる経路により，小胞体

3448-58, (2013).

ストレス誘導性のアポトーシスを抑制することを示し

２）Shirakawa, J., Fernandez, M., Takatani, T.,

た（Diabetes 2013）．また，小胞体ストレスは膵β細El Ouaamari, A., Jungtrakoon, P., Okawa, ER.,

胞増殖の制御にも関与するが，GKA によるグルコース

Zhang, W., Yi, P., Doria, A. & Kulkarni, RN.:

シグナル活性化を含む代償性の膵β細胞増殖・生存は，

Insulin signaling regulates the FoxM1/PLK1/

FoxM1/PLK1/CENP-A 経路を介していることを明らか

CENP-A pathway to promote adaptive β-cellにした（Cell Metabolism 2017）．

proliferation. Cell Metab . 2 ( 4 ) : 868-882,

今回，膵β細胞でグルコキナーゼの活性化により発(2017).

現上昇する分子として Damage-associated molecular３）Inoue, H., *Shirakawa, J. (*: corresponding

pattern molecules (DAMPs) で あ る S100 calcium-

author), Togashi, Y., Tajima, K., Okuyama, T.,binding protein A8 (S100A8) に着目した．膵島におけKyohara, M., Tanaka, Y., Orime, K., Saisho, Y.,

る S100A8 の発現はグルコースシグナル依存的に増加

Yamada, T., Shibue, K., Kulkarni, RN. & Ter-し，db/db マウスや ob/ob マウスの膵島における発現

auchi, Y.: Signaling between pancreatic β-cells上昇を認めた．マクロファージとの共培養，およびパル

and macrophages via S100 calcium-binding

ミチン酸の存在下では，膵島における S100A8 の発現

protein A8 exacerbates β-cell apoptosis andは相乗的に上昇し，これらは TLR4 に非依存的であっislet inﬂammation. J Biol Chem. 29 (16) 5934 –た．膵島由来の S100A8 は，
TLR4 を介してマクロファー

5946, (2018).

ジを刺激し，マクロファージからの炎症性サイトカインの発現を誘導した．組み換え S100A8 タンパクにより，

8

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

時計遺伝子 E4BP4/DBP の膵β細胞における役割の解明
田

泌や蛋白合成に関わる遺伝子群に顕著な変動を認めた．
ChIP シーケンスでは E4BP4 がβ細胞機能に重要な遺伝子を直接制御している知見を得た．

口

昭

彦

【考察】

（山口大学大学院医学系研究科）

膵臓における転写因子 E4BP4 および DBP の役割を解析した．Wfs1－/－Ay/a マウスなどストレス存在下にあるラ氏島において E4BP4・DBP の発現は変化し，全【目的】
Wolfram 症候群は，若年発症，インスリン依存性の体としての DBP 転写活性の低下はβ細胞機能不全をも糖尿病と視神経萎縮を特徴とする常染色体劣性遺伝性疾

たらすことが明らかとなった．E4BP4・DBP は Bmal1/

患である１）．我々は Wolfram 症候群のモデルマウスでClock などのコア時計遺伝子によっても制御を受けるある Wfs1 欠損 Ay/a マウス（Wfs1

Ay/a マウス）の遺伝子であり，β細胞ストレスだけでなく時計遺伝子

ランゲルハンス氏島（ラ氏島）のマイクロアレイ解析をの異常によって引き起こされるインスリン分泌不全にしたところ，時計遺伝子である E4BP4 の発現が亢進し，も介在している可能性が考えられる．さらに今回の知DBP の発現の低下を認めた２,４）．E4BP4 および DBP は

見は，E4BP4・DBP のシグナル経路に介入することで逆位相で発現される出力系の時計遺伝子で，同じ標的遺Wolfram 症候群や２型糖尿病などによる糖代謝異常を伝子に結合し，それぞれ，転写抑制，及び活性化に働く．

制御できる可能性が示唆された４,５）．

コア時計遺伝子である Bmal1 の膵特異的欠失マウスが【参考文献】

顕著なインスリン分泌不全をきたす３）．また，Wfs1 欠１）Inoue, H., Tanizawa, Y., Oka, Y. & Permutt,

損マウスのβ細胞機能不全には小胞体（ER）ストレス

MA. et al.: A gene encoding a transmembraneが関与する．そこで今回，それらの点を念頭に，膵β細protein is mutated in patients with diabetes mel-

胞における E4BP4 や DBP の役割について解析した．

litus and optic atrophy (Wolfram syndrome). Nat【方法】

Genet. 1998 Oct; 20 (2): 143-8.

－/－

マウスインスリンプロモーター（MIP）下に E4BP4

２）Nakabayashi, H., Ohta, Y., Taguchi, A. & Ta-を強発現する MIP-E4BP4-TG マウスを発現量の異なる

nizawa, Y. et al.: Clock-controlled output gene

２ライン（TG-C, TG-D）樹立した．これらのマウス

Dbp is a regulator of Arnt/Hif-1β gene expres-を用いて，12 週齢での経口糖負荷試験を実施し全身のsion in pancreatic islet β-cells. Biochem Bio-

耐糖能を評価した．８週から 12 週齢のマウスからラ

phys Res Commun. 2013 May 3; 434(2): 370-5.

氏島を単離し，グルコース応答性のインスリン分泌能，

３）Ohta, Y., Taguchi, A., Yanai, A., Shinoda, K.

ATP/ADP 比， 細 胞 内 Ca 濃 度 を 測 定 し た． ま た 転 写& Tanizawa, Y. et al.: Clock Gene Dysregula-

因子 E4BP4 が制御する遺伝子を解析するために，WT

tion Induced by Chronic ER Stress Disrupts

および TG-C マウスラ氏島の RNA シーケンスおよび

β-cell Function. EBioMedicine. 2017 Apr; 18:

ChIP シーケンスを行った．

146-156.

【結果】４）Perelis, M., Marcheva, B., Taguchi, A. & Bass,

E4BP4, DBP の発現は，小胞体ストレスによりそれぞJ. et al.: Pancreatic β cell enhancers regulate

れ亢進，抑制された．MIP-E4BP4-TG マウスでは顕著

rhythmic transcription of genes controlling insu-

なグルコース応答性のインスリン分泌低下を認めた．まlin secretion. Science. 2015 Nov 6; 350 (6261):

たこのマウスのラ氏島において，グルコース刺激前後で

aac4250.

ATP/ADP 比の上昇が認められず，グルコース刺激後の５）Taguchi, A., Ohta, Y. & Tanizawa, Y. : Molecu-

Ca の上昇も抑制されていた．RNA シーケンス解析に

lar clock as a regulator of β-cell function. J

よると E4BP4-TG マウスラ氏島では，インスリンの分

Diabetes Investig. 2018 Mar 15.

9Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

日本人の若年発症非肥満糖尿病患者における網羅的
次世代シーケンスの試み
田

中

大

祐

ヘテロ接合であり，８名に関しては抽出基準に当てはまる変異を検出しなかった．
【考察】
網羅的次世代シーケンスを若年発症非肥満糖尿病患者（京都大学大学院医学研究科）に行うことで，複雑な遺伝的背景の解明が可能であることが示唆された．

【目的】
日本人の若年発症非肥満糖尿病患者につき，全エクソ【文献】
１）Jason Flannick., Stefan Johansson. & Pål R.

ンシーケンスを行い，発症の遺伝的背景を検討する．

Njølstad.: Common and rare forms of diabetes【方法】

mellitus: towards a continuum of diabetes

30 歳以下で糖尿病を発症し，肥満歴を有さず GAD
抗体陰性であった 11 名（男７名，女４名）のゲノム

subtypes. Nature Reviews Endocrinology, 12,394-406 (2016).

DNA を，書面による承諾を得て採取した．得られた
ゲ ノ ム DNA に つ き，Illumina Hiseq お よ び Agilent
SureSelectXT Human All Exon V6 を 使 用 し 全 エ ク
ソンシーケンスを行った．検出された塩基配列変化のうち，アミノ酸配列変化を伴うものを抽出し，dbSNP
もしくは日本人 SNP データベース（Human Genetic
Variation Database）において一般人口におけるアレ

Depletion of CD206 M2 macrophages
induces proliferation of adipocy teprogenitors and improves insulin sensitivity
Nawaz Allah（富山大学医学部）

ル頻度が 0.01 以上のものを除外し，希少変異候補とした．変異候補を Combined Annotation Dependent

Adipose tissue-resident macrophages have im-

Depletion (CADD) を用いて分析し，タンパク機能に変

portant roles in the maintenance of tissue homeo-

化をもたらし疾患発症原因となる可能性の高いものを抽

stasis and regulate insulin sensitivity, for example

出した．

by secreting pro-inﬂammatory or anti-inﬂammatory【結果】

cytokines. Here, we show that depletion of CD206

11 名 の 平 均 発 症 年 齢 は 21.8 歳 で， 平 均 BMI は

M2-like macrophages resulted in the generation of

20.8 kg/m2 であった．薬物療法は６名がインスリン，

smaller adipocytes, upregulated expression of meta-

４名が SU 薬もしくはグリニド薬，１名が無投薬であっbolically favourable genes and enhanced insulin sen-

た．全エクソンシーケンスの結果から既知単一遺伝子

sitivity in both chow and high fat diet-fed CD206-

糖尿病原因遺伝子（新生児糖尿病および MODY の原

reduced mice. In vivo and in vitro studies revealed

因となる 35 遺伝子１)）の希少変異を検討することとthat Tgfβ, abundantly expressed in CD206 M2-like

し，疾患発症への影響が強く示唆される CADD scoremacrophages, regulate adipocyte progenitors (APs)(PHRED) が 20 以上の変異を抽出した．HNF1A 遺伝子

diﬀerentiation and proliferation. To validate this hy-

については，V246fs 変異が １名 ( 患者１) に検出されpothesis, we generated genetically engineered mice

MODY3 と診断したほか，遺伝子産物機能低下が報告

in which CD206 specific Tgfβ1 was knocked out

されている G191D 変異が１名 ( 患者２) に検出された．

after tamoxifen treatment. Increased number of APs

患者２にはさらに GLIS3 遺伝子 Q450H 変異が検出さ

and smaller adipocytes were observed in the CD206

れ，疾患発症を修飾した可能性があると考えられた．さ

speciﬁc Tgfβ1 knockout mice. Collectively, we show

らに，１名（患者３）に WFS1 遺伝子 K190del 変異がthat CD206 M2-like macrophages in adipose tissues

検出され，発症への影響が示唆された．すべての変異はconstitute an important microenvironment in which

20

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

they regulate APs growth/differentiation via Tgfβ

芽酵母を用いてメチルグリオキサール感受性を指標としsignaling pathway and thereby control adiposity and

た TOR シグナルの制御因子の同定を試みた．

systemic insulin sensitivity１）.

【方法・結果】
遺伝子破壊株ライブラリーを用いたスクリーニ

References
１）Nawaz, A., Aminuddin, A., Kado, T., Takikawa,ン グ の 結 果， メ チ ル グ リ オ キ サ ー ル 感 受 性 株 と し

A., Yamamoto, S., Tsuneyama, K., Igarashi, Y.,て 31 の 遺 伝 子 破 壊 株 を 所 得 し た（J. Biol. Chem.

Ikutani, M., Nishida, Y., Nagai, Y., Takatsu, K.,

292:15039-15048, 2017）．スクリーニング結果に基づ

Imura, J., Sasahara, M., Okazaki, Y., Ueki, K.,

きメチルグリオキサール感受性についての精査を行っ

Okamura, T., Tokuyama, K., Ando, A., Matsu-

たところ，ホスファチジルイノシトール 3,5-二リン酸

moto, M., Mori, H., Nakagawa, T., Kobayashi,（PtdIns(3,5) P2）の合成不全株がメチルグリオキサー

N., Saeki, K., Usui, I., Fujisaka, S. & Tobe, K.:

ルに対して高い感受性を示すことを見出した．また，

CD206＋ M2-like macrophages regulate systemic

PtdIns(3,5) P2 合成不全株において，メチルグリオキサー

glucose metabolism by inhibiting proliferation ofルによる TOR シグナルの活性化に不全が認められた．

adipocyte progenitors. Nat Commun., 8 (1): 286【考察】(2017).

リン脂質である PtdIns (3,5) P2 がメチルグリオキサー
ルによる TOR シグナルの活性化機構に関与する可能性

解糖系代謝物による TOR シグナルの活性化
野村亘（京都大学大学院農学研究科）【背景・目的】が示唆された．

NFIA が褐色脂肪細胞分化を制御するメカニズム及び全身代謝への影響の解明
平

池TOR (target of rapamycin) はセリン・スレオニンキ

勇雄（東京大学大学院医学系研究科）

ナーゼであり，栄養シグナルにおいて重要な役割を果たしている．TOR は酵母（Tor1 および Tor2）から哺乳【背景】

類（mTOR）に至るまで進化的に保存されており，異褐色脂肪組織（brown adipose tissue, BAT）はミト

なる２つの複合体である (m)TORC1 および (m) TORC2

コンドリアにおける uncoupling protein-1 (UCP1) のを形成することで機能し，TOR シグナルを構成してい機能を介して熱を産生しエネルギーを消費する点においる．また，TOR シグナルは糖尿病に関連する病態とのて，主にエネルギーの貯蔵を担う白色脂肪組織（white

関わりが指摘されており，糖代謝や脂質代謝の制御にも

adipose tissue, WAT）とは対照的な組織である．リニ

関わることが知られている（Cell 168:960-976, 2017）．

エージトレーシングの結果から，BAT と WAT は発生学

しかしながら，その詳細な制御機構および糖尿病病態へ的な由来が異なる一方，BAT と骨格筋は共に Myf5 陽の作用機序については不明な部分も多く残っている．

性の前駆細胞から分化すると報告されている．また近年

解糖系から産生される代謝物であるメチルグリオキになって，ヒト成人においても機能的な BAT が存在す

サールは，古くから糖尿病との関連が指摘されている．

ること，BAT の活性と BMI は負に相関することが示さ

我々は，メチルグリオキサールが，TOR シグナルを活れており，BAT は肥満症，メタボリックシンドローム，

性化すること，ならびに酵母 TOR シグナルの不全株が肥満２型糖尿病の新しい治療標的になり得るとして注目

メチルグリオキサールに対して高い感受性を示すことをされている．

見出した（Mol. Cell. Biol. 35:1269-1280, 2015）．そ【結果】

こで，TOR シグナル制御機構の解明を目的として，出

我 々 は ま ず マ ウ ス BAT 及 び WAT の FAIRE-seq

2

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成(formaldehyde-assisted isolation of regulatory子の発現は有意かつ正に相関していた．以上より NFIA

elements coupled with high-throughput sequencing)

は BAT の新規主要制御因子であり，褐色脂肪遺伝子エによってゲノム上のオープンクロマチン領域を網羅的に

ンハンサーを分化前から活性化し，マスター転写因子

同定し，BAT 特異的なオープンクロマチン領域には転PPARγをリクルートすることでその作用を発揮すると写因子 Nuclear factor-I (NFI) の結合モチーフが最も強考えられた．

く濃縮していることを見出した．NFI ファミリーには４【今後の展望】

種類（NFIA, B, C, X）のアイソフォームが存在するが，組織特異的 NFIA 欠損マウス，組織特異的 NFIA トラ

うち NFIA は BAT において WAT や骨格筋と比較してンスジェニックマウスの作成及び NFIA 蛋白複合体の質

高発現しており，かつ褐色脂肪細胞の分化に伴ってその量分析に着手している．成体の BAT における NFIA の発現が上昇した．C2C12 筋芽細胞に NFIA を導入する

重要性，とりわけ耐糖能やインスリン感受性，酸素消と脂肪滴の蓄積や Ucp1 を含む褐色脂肪遺伝子の発現誘費量など全身代謝に及ぼす影響を解明すること，また導を認めた一方，骨格筋遺伝子の発現は抑制された．褐

NFIA と結合・協調して作用する因子を同定し褐色脂肪

色脂肪細胞において NFIA をノックダウンすると，脂細胞の運命決定におけるクロマチンリモデリングの全貌

肪細胞分化は保たれていたものの Ucp1 を含む褐色脂肪を明らかにすることを目指している．

遺伝子の発現が強く抑制された．褐色脂肪細胞において【文献】

ChIP-seq (chromatin immunoprecipitation coupled

１）Hiraike, Y., Waki, H., Yu, J., Nakamura, M.,with high-throughput sequencing) を行い NFI のゲノ

Miyake, K., Nagano, G., Nakaki, R., Suzuki, K.,

ムへの結合を網羅的に解析したところ，BAT 特異的遺Kobayashi, H., Yamamoto, S., Sun, W., Aoyama,

伝子の転写開始点においては WAT 特異的遺伝子の転写

T., Hirota, Y., Ohno, H., Oki, K., Yoneda, M.,

開始点と比較して１）より近傍に NFI の結合領域が存White, AP., Tseng, YH, Cypess, AM., Larsen,

在し２）転写開始点＋/－50 kb における NFI の結合領

TJ., Jespersen, NZ., Scheele, C., Tsutsumi, S.,

域の数が多く３）転写開始点＋/－50 kb における NFIAburatani, H., Yamauchi, T. & Kadowaki T.:の結合強度の総和も大きかった．また NFI の結合領域

NFIA co-localizes with PPARγ and transcrip-

は脂肪細胞分化のマスター転写因子 PPARγの結合領域

tionally controls the brown fat gene program.

と高頻度に共局在（co-localize）した．分化後に NFINature Cell Biology. 2017; 19 (9): 1081-92.

と PPARγが共局在する領域のうち，分化前から共局在が認められる領域は２割程度に留まり，半数以上の領域において分化前の時点では NFI のみが結合していた．
またこの時点で C/EBPα, C/EBPβ, EBF2 など褐色脂肪細胞分化における既知の主要転写因子群はいずれも結合

亜鉛トランスポーター ZIP13 による脂肪細胞褐色化制御機構の解明福中彩子（群馬大学生体調節研究所）

していなかった．にも関わらず，これら領域は分化前の時点でオープンクロマチン構造やヒストン K27 のアセチル化といった活性型エンハンサーの特徴を呈してい【目的】

た．NFIA 全身欠損マウスは生後すぐに死亡するが，新本研究では，亜鉛トランスポーター ZIP13 を介した

生児の BAT を解析したところホモ欠損マウスでは野生亜鉛シグナル（ZIP13-亜鉛シグナル）による脂肪細胞型に比べて UCP1 の遺伝子発現，蛋白発現が有意に低の褐色化制御機構の分子メカニズムを解明することを目下しており，RNA-seq を用いた網羅的遺伝子解析でも的とし，肥満や糖尿病の理解に貢献することを目標とする．

褐色脂肪遺伝子群の発現低下と骨格筋遺伝子群の発現【方法】

上昇が確認された．最後に，ヒト腎周囲の褐色脂肪組

亜鉛トランスポーター Zip13 のノックアウトマウス

織において NFIA の発現と UCP1 を含む褐色脂肪遺伝（Zip13-KO マウス）や ZIP13 の機能喪失型変異を保持22

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成するエーラス・ダンロス症候群患者では脂肪萎縮が見【考察】られることから，申請者は脂肪組織における ZIP13 の

我々は，ZIP13 の脂肪細胞褐色化抑制に必要な領域

役割の解析を進めた．その結果，Zip13-KO マウスでを同定した．今後この領域がどのようにして脂肪細胞褐

は，白色脂肪組織でベージュ脂肪細胞の顕著な増加・色化を制御するのか明らかにする．

エネルギー消費量の亢進・高脂肪食誘導性の肥満に抵抗性を示す・インスリン感受性が良くなること，さらに ZIP13 はベージュ脂肪細胞の分化を抑制することを見出した．これらの結果は ZIP13 が白色脂肪細胞の運

アディポネクチンの組織修復機構の解明
藤

島

裕

也
（大阪大学大学院医学系研究科）

命を制御することによって，全身の代謝を調節する分子である可能性を示しており，下記の論文を公表した（Fukunaka A, et al., PLoS Genet. (2017), Fukunaka【背景】

A (corresponding author), Fujitani Y, Int. J Mol Sci.

脂肪細胞特異的分泌蛋白アディポネクチン（APN）は，(2018)）．我々はこの知見を元に，ZIP13 による褐色化

GPI アンカー型蛋白であるＴ-カドヘリン（Tcad）への抑制の分子メカニズムを明らかにするために，ベージュ

特異的な結合を介して心血管組織に集積し，抗動脈硬脂肪細胞分化誘導系を用いて，ZIP13 の脂肪細胞褐色化作用を発揮することをこれまでに明らかとした．GPI

化抑制に必要な領域の同定を目指した．

特異的切断酵素 GPI-PLD は，糖尿病患者や NAFLD 患【結果】者で血中濃度が上昇していることが報告されており，

これまでに我々が開発したベージュ脂肪細胞分化系をAPN により血中濃度が低下する結果を得ているが，そ用いると，Zip13-KO 細胞に ZIP13 を過剰発現させると，の生体内における生理・病態学的役割は明らかとなって褐色化は抑制できるが，亜鉛輸送能を失った ZIP13 のいない．

変異体では褐色化抑制ができない．また，培地中に過【方法・結果】

剰量の亜鉛を添加した場合や，同じゴルジ体に局在し，

GPI-PLD 遺伝子発現は肝臓において圧倒的に高発現

ZIP13 と最も高い相同性を示し亜鉛トランスポーターをしており，db/db マウスおよび streptozotocin 投与マ発現した場合には，細胞質内の亜鉛量は増加するにも関ウスでは，肝臓での GPI-PLD の mRNA が上昇し，血わらず，褐色化は抑制できないことが判明した．ZIP13

中濃度の増加を伴っていた．

による亜鉛シグナルは，その量と共に質（特異性）も非続いて，GPI-PLD 欠損マウス（GP-KO）を樹立し解常に厳密に制御し，脂肪細胞褐色化の抑制を調節してい析を行った．GP-KO における Tcad 蛋白は，GPI-PLDると考えられる．

の主な産生臓器である肝臓において約 2.5 倍と有意に上

一方で，鳥類には，ベージュ脂肪細胞が存在しないこ

昇しており，少なくとも肝臓の GPI アンカー蛋白の発とが知られているが，ZIP13 は鳥類にも保存されてい現制御に関与していると考えられた．高脂肪高蔗糖食

る．マウスのベージュ脂肪細胞分化系を適用すると，ニ（HF/HS）を負荷した GP-KO マウスでは，WT に比して，ワトリ ZIP13 は亜鉛輸送能があるにも関わらず，マウ

体重の推移には差がない一方で，血中 TG 値が有意にス ZIP13 のように脂肪細胞褐色化を抑制する機能は保低値であり，OGTT にて良好な耐糖能を示した．さら存されていないことから，マウス ZIP13 にはニワトリに，GP-KO では，HF/HS 負荷に伴う肝臓の脂肪変性のZIP13 には保存されていない領域で脂肪細胞褐色化を抑程度が軽度にとどまっており，肝ジアシルグリセロール

制する可能性が考えられた．そこで，その領域を同定す（DAG）含量の増加が顕著に抑制されていた．また GP-るため，ニワトリとマウスのキメラ ZIP13 を作成する

KO マウスでは，肝臓での PKCε活性化の抑制と，インことにより，脂肪細胞褐色化抑制に必要なマウス ZIP13

スリンによる AKT リン酸化の改善を認めた．

の領域を同定した．

ラット初代培養肝細胞を用いた in vitro の検討では，
siRNA による GPI-PLD のノックダウンにより細胞内2Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

DGA 量は有意に減少した．一方でアデノウイルスによ試験，インスリン負荷試験，肝臓・精巣周囲脂肪重量，

る過剰発現では，特に GPI の前駆体を構成する脂肪酸

腸管長，肝臓組織学的検査，炎症関連遺伝子発現の評価鎖であるアラキドン酸添加時に著明な DAG 量の増加をを実施した．

認めた．

【結果】最後に，当院外来通院中の男性患者 86 名（68 名は術前に行った 75g OGTT において非糖尿病型であり，２型糖尿病を合併）を対象として，ELISA により血中膵臓切除術後の経過を追跡し得た非糖尿病 6 例（PD29

GPI-PLD 濃度を測定したところ，血中 TG 値および血例，DP32 例）の糖尿病の２年累積発症率は PD4.0 %,中 ALT 値が血中 GPI-PLD の独立した規定因子となってDP48.1％と顕著な違いを認めた．PD 症例は DP 症例

いた（共に正に相関）．

に比較し，有意に高齢であったが，性別や原疾患が癌【考察】である割合に差はなかった．また糖・脂質代謝，肝・GPI-PLD はそれ自体が生合成された小胞体において腎機能等に２群間で有意差は認めなかった．年齢，性GPI を切断することで，ホスファチジン酸を生成，これ

別，HOMA-IR 等にて調整した多変量モデルにおいて，が速やかに脱リン酸化されることにより，DAG 産生を

DP は PD に比して糖尿病発症のリスクが高いことが明促すことが報告されている．小胞体には蛋白質が付加すらかとなった．術後の 75gOGTT における活性型 GLP1

る前の前駆体を含む GPI のプールが存在し，GPI-PLD

分泌レベルは，両術式共に上昇を認めたが，PD 症例はにより肝 DAG 産生が調節され，肝インスリン感受性やDP 症例と比してより有意に上昇していた．GIP につい

脂質蓄積に関わっていることが示唆された．

ては両群とも術前後で有意な変化は認めなかった．DP
にて切除された膵組織のα細胞，β細胞の膵実質全体に占める割合は，PD にて切除された膵組織より有意に高β細胞の脱分化・形質転換と膵切除後糖尿病発症に
関する研究
坊内

値であった．OGTT における NGT と IG 症例の比較検討では，α/β比は IGT 群でより高い傾向が得られた．
DP 症例では術前後で腸内細菌叢の大きな変化は認め

良太郎

なかったものの，PD 症例では術直後（２週から４週後）（国立国際医療研究センター研究所）

から腸内細菌叢の劇的な変化を認め，その変化は６ヶ月後まで維持された．４大門の中では，Proteobacteria【目的】の割合が PD 術後に有意に増加した．また，術後の腸内膵臓切除術施行患者の耐糖能の推移と膵組織学的所

細菌の多様性が保たれる症例でインスリン抵抗性の改善

見・内分泌学的所見・腸内細菌叢との関連について検討を認めた．75gOGTT における各ポイントの胆汁酸およする．

び短鎖脂肪酸の血中濃度には有意な変化は認めなかっ【方法】

た．PD 術前および６ヶ月後の糞便の無菌マウスへの移東京医科歯科大学医学部附属病院にて膵臓切除術（膵植実験で PD による腸内細菌叢の変化と膵内分泌予後の

頭十二指腸切除；PD または膵体尾部切除；DP）を受け関連を検証中である．

た症例のうち，術前，術後，術後６ヶ月ごとに 75g ブ【結論】

ドウ糖負荷試験（OGTT），切除膵の正常部を用いた免膵切除後の糖尿病発症の術式による違いは，腸管イン

疫組織学的解析（膵β細胞面積，α細胞面積，α/β細クレチン（GLP1）分泌の変化および腸内細菌叢の変化

胞面積比）を実施した 86 名を対象とした．また術前，が関与している可能性が示唆された．β細胞の脱分化の術後，術後６ヶ月に 16S rRNA 遺伝子配列解析による

膵切除後の糖尿病発症の病態における役割についてはさ

腸内細菌解析，胆汁酸および短鎖脂肪酸解析を施行した．

らに詳細な検討が必要である．

膵切除前および術後６ヶ月の糞便を 10 週齢の無菌マウスに移植し，高脂肪食で４週間飼育，経口ブドウ糖負荷

2

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

糖代謝調節に関与するニューロメジン U (NMU)
の機能解析
三

浦

を減少させ，インスリン分泌を抑制することを立証した．さらに，NMU のβ細胞への暴露はミトコンドリア
機能を低下させることが示唆された．また，空腹時に，

綾子

NMU の発現は腸管と迷走神経節で増加し，NMUR1 発（宮崎大学医学部）

現は迷走神経節で増加した．NMU のラットへの末梢投与は，迷走神経求心線維の電気活動を亢進し，視床下部
室傍核の c-fos 発現を増加する．NMU は，空腹時に自【背景】
ニューロメジン U (NMU) は，子宮筋収縮アッセイを

律神経求心路を活性化してインスリン分泌を抑制するデ用いて脊髄より発見された 25 アミノ酸残基からなる神クレチン作用を示すペプチドの可能性が示唆された．

経ペプチドである（Minamino N, 1985）．ラット中枢【考察】への NMU 投与は，摂食を抑制し，エネルギー代謝を亢

NMU と NMUR1 は膵β細胞に発現し，オートクライ

進する（Nakazato M, 2000）．NMU KO マウスは，過ン・パラクライン作用により，インスリン分泌を抑制し食を伴う肥満を呈するとともに，エネルギー代謝が低下ていることを報告した（BBRC, 2017）．さらに，NMU は，している（Hanada R, 2004)．ヒトでは，チェコの家系

ミトコンドリア機能を低下させ，インスリン分泌を抑制

で不活性な NMU を生産する Arg165Trp 変異が発見さする可能性が示唆された．また，空腹時には神経を介すれており，小児肥満及び高トリグリセリド血症と関連するデクレチン作用の両者の機序を介して，インスリン分

る．NMU 受容体（NMUR）は G タンパク質共役型受泌を制御し，糖代謝調節に機能していると考えられる．

容体であり，主に腸管などの末梢組織に NMUR1，中【文献】

枢神経系に NMUR2 が発現している．NMUR はタンパ

Weidong Zhang., Hideyuki Sakoda., Ayako Miura.,

ク質サブクラスのうち Gq と Gi の両方に共役するが，Koichiro Shimizu., Kenji Mori., Mikiya Miyazato.,

NMUR1 は Gq を，NMUR2 は Gi を主として選択する．

Kentaro Takayama., Yoshio Hayashi., & Masamitsu

ヒト膵β細胞に NMUR1 は発現し，NMU は高グルコー

Nakazato.: Neuromedin U suppresses glucose-

ス刺激時のインスリン分泌（GSIS）を抑制する可能性

stimulated insulin secretion in pancreatic β cells.

が示唆されている．

Biochem Biophys Res Commun. 2017 Nov 4; 493 (1):【目的】

677-683.

NMU のインスリン分泌調節作用を in vivo および indoi: 10. 1016/j. bbrc. 2017. 08. 132.

vitro にて検討し，肥満や糖尿病の病態との関連を解析する．

ネットワーク・メタアナリシスによる糖尿病の最良【方法】
・マウス膵島と MIN6 細胞を用いた GSIS, Ca２＋ イの治療選択エビデンスの確立
山

メージング，ミトコンドリア機能解析田朋

英（東京大学大学院医学系研究科）

・マウス IPGTT における NMU の効果
・ラットへの NMU 末梢投与後の電気活動の測定
【結果】

【目的】

NMU と NMUR1 は 膵 β 細 胞 に も 発 現 し，NMU とネットワーク・メタアナリシスにより糖尿病の最良のNMUR1 アゴニストは in vivo（マウス）と in vitro（単治療選択エビデンスを確立する．

離膵島とβ細胞由来 MIN6 細胞）のいずれでもグルコー【方法・結果・考察】

ス刺激によるインスリン分泌を抑制した．NMU の作用

１．集中治療における最適な血糖管理目標値

２＋

重症成人患者に対するインスリンによる種々の異イメージング解析から，NMU はβ細胞への Ca２＋ 流入なる血糖管理目標が患者の予後に与える影響についは，siNmu と NMU 中和抗体で消失した．細胞内 Ca

2

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成て の 系 統 的 レ ビューとネットワーク・メタア ナ リ
シ ス を 行 い， そ の 成 果 を 報 告 し た（ICM 2017ab,
Resuscitation 2017）．36 のランダム化比較試験が解析対象となった．厳格な血糖コントロール（管理目標80-110 ㎎ /dl）群では，かなり穏やかなコントロール（管理目標 180-220mg/dl）群とやや穏やかなコン
トロール（管理目標 140-180mg/dl）と比べ約５倍の低血糖，重症低血糖のリスク増加を認めた．一方，厳格な血糖管理は死亡を改善しなかった．本結果は重症患者に対する厳格な血糖管理は支持せず，より穏やかな血糖管理目標を支持する結果となった．本論文は，アメリカ静脈経腸栄養学会（ASPEN）2017 の診療ガ
イドラインに引用された．
２．新規糖尿病薬の薬効の評価（週一回 DPP-Ⅳ阻害薬）
Weekly DPP-Ⅳ 阻 害 薬（ 週 一 回 内 服 型 製 剤 ） と
Daily DPP-Ⅳ阻害薬の薬効比較を行い，効果有害事
象ともに有意差がないことを示した (Diabetes Care2018)．
３．１型糖尿病に対する追加治療法に関する評価
１型糖尿病に対する SGLT2 阻害薬の薬効と有害事
象検討を行った．１型糖尿病への SGLT2 阻害薬の投与は，重症低血糖を増やすことなく，血糖コントロー
ル，体重が低下した．しかし生殖器感染症，糖尿病性ケトアシドーシスのリスクを約３倍増加させた．１
型糖尿病への SGLT2 阻害薬使用は，慎重に検討すべきと考えられた (DOM 2018)．本成果は ACP journal
club に採択された．
【今後の展望】
人工知能を用い，システマティックレビュー・メタア
ナリシスの自動化を目的とした国際共同研究を開始した．従来では人間が手作業で行なっている医学文献の評
価を，機械処理することにより論文数が膨大であっても高速に行なうことができる．煩雑な作業を，専門家の暗黙知を学んだ人工知能が代行することで，人間はより生産的な仕事に従事することが可能となる．

126

酵素情報

ファージディスプレイによる自己免疫疾患における Tyk2 の役割
進化分子工学的手法を用いた酵素改変
はじめにの外来蛋白質を提示する技術である．ファージディス生物が持つ酵素は様々な機能を持ち，複雑な反応を触プレイでは 109 〜 1010 にも達する多種類の遺伝子を含媒することが出来る．それは永い進化の過程で変異と淘

むファージライブラリを構築することが出来る．その汰が繰り返されてその機能を獲得したためと考えられファージライブラリに対して実験者が望んだ機能を持つ

る．多くの酵素が研究・工業用途に用いられており，酵

外来蛋白質が選択出来るような淘汰圧をかけてスクリー素を改変し，望んだ機能を向上・付与することは重要ニングすることによって，目的の機能を有する外来蛋白

な意味を持つ．では，酵素を人工的に進化させて改変す質を持ったファージを選別する．ファージ表面上に提ることは可能だろうか．人工的に進化を行うための研究示された外来蛋白質はそのファージが有する DNA を解として「進化分子工学」がある．進化分子工学では，実析することによって容易に特定することが出来る．Sir

験者が望んだ機能を持つ分子を取得することを目的としGregory P. Winter 氏はファージディスプレイを抗体にて，実験室内で適切な淘汰圧をかけることによって自然応用し，抗体創薬に大きなインパクトを与えた３）．本稿

界で発生するよりも遥かに早い時間で人工的に進化を行

では，ファージディスプレイを進化分子工学的に酵素改う．それでは，具体的にどのような手法を使えば人工的変に用いた報告を紹介する．

な進化を効率的に実施することが出来るのだろうか．
2018 年のノーベル化学賞は Frances H. Arnold 氏，・酵素活性の向上

George P. Smith 氏，Sir Gregory P. Winter 氏に贈られBacillus cereus 株 569/H/9 由来メタロβラクタマー

た．酵素の進化分子工学への貢献が評価された Frances

ゼは亜鉛イオンを活性中心に持ち，βラクタム系抗生物

H. Arnold 氏は，プロテアーゼの一種である subtilisin

質を加水分解する酵素である．このような金属要求性

E に無作為に変異を導入した多種類の変異体からなるラ酵素について進化分子工学的に活性向上が可能かどう

イブラリを構築し，ジメチルホルムアミド（DMF）存かを検証するために，ファージディスプレイによるスク在下でプロテアーゼ活性を保持する変異体を探索した．

リーニングが実施された４）．まず，無作為な変異をメタ

淘汰圧に相当する DMF 存在下でプロテアーゼ活性を有

ロβラクタマーゼに導入し，fd ファージの g3p コート

した subtilisin E 変異体に対して，さらに変異導入と淘

蛋白質と連結することによって，メタロβラクタマーゼ

汰（スクリーニング）を繰り返すことにより，60%(v/v)

変異体をファージ表面上に提示したファージライブラ

DMF 存在下での酵素活性が 256 倍向上した subtilisin

リが構築された．このライブラリの多様性（変異体数）

E 変異体（10 か所の変異が含まれていた）の作製に成は 5×106 規模として設計された．次に，βラクタム系

功した１）．この例のように，変異と淘汰により望んだ機

抗生物質であるペニシリンを固定化した担体に，エチレ能を持つ酵素を探索する進化分子工学では，多種類の変ンジアミン四酢酸で亜鉛イオンをキレート除去してメ

異体からなるライブラリを迅速にスクリーニングする技

タロβラクタマーゼ変異体の加水分解活性を不活化した術が必要とされる．George P. Smith 氏により考案されファージライブラリを混合した．その後，亜鉛イオンをたファージディスプレイは大規模な変異体ライブラリを添加することによりメタロβラクタマーゼ変異体を活性スクリーニングするために有効な手法である２）．ファー

化し，酵素活性を保持するファージはペニシリンが分解

ジディスプレイとは，大腸菌に感染する M13 ファージされることによって担体から溶出された．この手法でのなどのコート蛋白質をコードする遺伝子に外来遺伝子を淘汰圧は，メタロβラクタマーゼ変異体がペニシリンに連結することによって，１つのファージ表面上に１種類

結合し，加水分解活性を保持することであり，このよう127ファージディスプレイによる進化分子工学的手法を用いた酵素改変にして得られたメタロβラクタマーゼ変異体は野生型とン残基に置換した安定性の低い RNase T1 (4A) の安定比較して酵素活性（kcat/Km）が 1.7 倍に向上した．

性を向上させることが試みられた．RNase T1 (4A) 変
異体を fd ファージの g3p 蛋白質の N2 と CT の間に挿・低 pH 下でも活性を保持するα-アミラーゼの獲得

入して，RNase T1 (4A) 変異体をファージ表面上に提α-アミラーゼは澱粉を加水分解しオリゴ糖を産生する示したファージライブラリが構築された．変異箇所は酵素である．このα-アミラーゼが低 pH 下で活性を維持

RNaseT1 での熱安定性を向上させることが知られていすることは工業的に好ましい．低 pH 下でも活性を持つる 3 か所とし，ライブラリの理論多様性は 7×103 規模

α-アミラーゼを取得するため，ファージディスプレイにとして設計された．この手法での淘汰圧は，ファージラ

よるスクリーニングが実施された５）．まず，α-アミラー

イブラリとプロテアーゼが反応することである．つまり，

ゼの変異体を fd ファージの g3p コート蛋白質と連結す

RNase T1 (4A) 変異体がプロテアーゼにより切断されることによって，α-アミラーゼ変異体をファージ表面上た場合，g3p 蛋白質の CT から N1-N2 が切断されるたに提示したファージライブラリが構築された．変異箇

めファージが感染能を失い，プロテーゼ耐性を獲得した

所はα-アミラーゼの立体構造を参考に決定され，ライブ

RNase T1 (4A) 変異体を提示するファージのみが大腸

ラリの理論多様性は 5×10 4 規模として設計された．次菌への感染能を維持し，大腸菌への感染・増幅が可能とに，澱粉とファージライブラリを混合し，澱粉と結合しなる．プロテアーゼによる切断，大腸菌への感染，
ファー

たファージは加熱処理することにより回収した．この手ジの増幅という工程を 4 ラウンド繰り返し，プロテアー

法での淘汰圧は，澱粉とファージライブラリを混合す

ゼ耐性を持つ RNase T1 (4A) 変異体が選択された．こる際の pH を 4.5 〜 5.5 とすることである．スクリーニのようにして得られた変異体が持つ変異箇所を RNase

ングは pH 4.5 では 4 ラウンド，pH5.0 では 5 ラウン

T1 に導入したところ，野生型の RNase T1 では 50.9℃ド，pH 5.5 では 7 ラウンドが行われ，ライブラリ中にであった熱変性中点温度（Tm）が変異体では 58.7℃ま含まれる低 pH 下で澱粉との結合が維持されているα-アで向上した．この結果から，プロテアーゼ耐性と熱安

ミラーゼ変異体が選択された．このようにして得られた定性の関連性が推察された．さらに，この技術が他のα-アミラーゼ変異体について pH 4.5 と 7.5 における澱

蛋白質にも適用出来るかどうか検証するため，Bacillus

粉の加水分解活性の比率が算出され，野生型では 0.05

subtilis のコールドショック蛋白質である Bs-CspB に適であった比率が 0.13 に向上した．

用し，プロテアーゼ耐性を持つ Bs-CspB 変異体がスク
リーニングされた結果，熱変性中点温度が 28 C 向上し・耐熱性の向上た Bs-CspB 変異体が取得された７）．

酵素の熱安定性を高めることは様々な用途で酵素の実用性を広げることに繋がる．酵素の熱安定性を高めおわりにるため，ファージが大腸菌へ感染するシステムを応用

多様性の高い酵素変異体ライブラリをスクリーニング

し，ファージディスプレイによるスクリーニングが実施することが出来るファージディスプレイを用いて「適切された６）．fd ファージの g3p 蛋白質は N1, N2, CT とな淘汰圧」をかけることにより，実験者が求める機能をいう３個のドメインからなり，N1 と N2 が大腸菌への向上させるように効率的に酵素を進化させることが出来感染に必要とされる．そこで，熱安定性を向上させた

る．「適切な淘汰圧」をどのように計画するかによって，

い蛋白質変異体を N2 と CT の間に挿入し，挿入した蛋

酵素の進化の方向性は決定されるが，ここで紹介したよ白質変異体がプロテアーゼにより切断されると CT か

うなスクリーニング手法以外にも着想次第で酵素を人工

ら N1-N2 が切断されるために大腸菌への感染能が失進化させることが可能である．2018 年のノーベル化学

われることを利用する．プロテアーゼ耐性が熱安定性

賞は，「人工進化」に注目したと思われるが，今後，こと関連性があることを検証するため，リボヌクレアー

れまでにない新しい機能を持つ酵素が進化分子工学によゼ T1 (RNase T1) の 4 個のシステイン残基をアラニり創出され，様々な分野に影響を与えることが期待される．

128

ファージディスプレイによる進化分子工学的手法を用いた酵素改変

参考文献
１）Chen, K. & Arnold FH.: Tuning the activity ofan enzyme for unusual environments: sequential
random mutagenesis of subtilisin E for catalysis
in dimethylformamide. Proc. Natl. Acad. Sci. U

S A., 90, 5618 (1993).
２）Smith, GP.: Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on
the virion surface. Science, 228, 1315 (1985).
３）McCafferty, J., Griffiths, AD., Winter, G. &Chiswell, DJ.: Phage antibodies: filamentous
phage displaying antibody variable domains.

Nature, 348, 552 (1990).
４）Ponsard, I1., Galleni, M., Soumillion, P. &Fastrez, J.: Selection of metalloenzymes by catalytic activity using phage display and catalytic
elution. Chembiochem., 2, 253 (2001).
５）Verhaert, RM., Beekwilder, J., Olsthoorn, R.,
van Duin, J. & Quax, WJ.: Phage display selects
for amylases with improved low pH starchbinding. J. Biotechnol., 96, 103 (2002).
６）Sieber, V., Plückthun, A. & Schmid, FX.: Selecting proteins with improved stability by a phagebased method. Nat. Biotechnol., 16, 955 (1998).
７）Martin, A., Sieber, V. & Schmid, FX.: In-vitro
selection of highly stabilized protein variants
with optimized surface. J. Mol. Biol., 309, 717(2001).
（田辺三菱製薬株式会社
長野

創薬本部 モダリティー研究所

哲也，創薬本部 フロンティア創薬ユニット

山内

理夏子）

129

酵素情報

自己免疫疾患における Tyk2 の役割
免疫疾患領域における創薬標的としてのRIPK1【RIPK1 とその働き】【序】
生命機能を維持していく中で，「細胞死」が様々な場

RIPK1 は，幅広い組織に発現しており，タンパク質面で重要な働きをしている．細胞死の中でも，プログラ

１次構造の N 末端側にキナーゼドメインを有する RIP

ムされた細胞死であるアポトーシスと共に，近年アポキナーゼ（RIPK）ファミリーに属し（図１），ストレス

トーシス以外の細胞死として知られるネクロプトーシス/炎症シグナル伝達時における受容体共役型のタンパクの研究が進んでいる．細胞死を調節するシグナル経路の質キナーゼとして働く分子である．RIPK ファミリーの中 で，receptor-interacting protein kinase 1 (RIPK1)

中でも RIPK1 は唯一，Ｃ末端側に「DEATH ドメイン」

がアポトーシスとネクロプトーシスの両方を調節するキを有するのが特徴で，元来細胞死を誘導する分子としてナーゼ分子として注目されている．RIPK1 によるネク同定された１）経緯もあることから，長年にわたり細胞死

ロプトーシス研究の進展により，RIPK1 を介したシグメカニズムの研究が盛んに進められてきた．

ナル調節によって種々の動物モデルの病態改善報告が示

生体機能の恒常性維持における様々な場面で細胞死がされていることから，本キナーゼを標的とした薬剤開発

重要な働きを担っている．発生や分化が正常に進行するが盛んに行われている．本稿では，近年特に創薬が難しため，また生体内で役目を終えた細胞が排除される時ないとされる免疫・炎症分野における RIPK1 と疾患の関

どには，プログラムされた細胞死として知られるアポ連，及びその臨床応用についての概要を述べる．

トーシスが適切に働くことが必要である．
一方で，アポトーシス以外にネクロプトーシスなどのᅗ㻝䠊䝠䝖㻾㻵㻼㻷䝣䜯䝭䝸䞊䛸䝍䞁䝟䜽㉁䝗䝯䜲䞁ᵓ㐀
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図１

130

ヒト RIPK ファミリーとタンパク質ドメイン構造

免疫疾患領域における創薬標的としての RIPK1

細胞死も存在し，炎症の惹起や慢性炎症の原因となって症性サイトカインが細胞外で働く環境が生まれることとおり，そこで働く RIPK1 の役割が長年の研究から明らなる．

かとなってきた２,３）．その中の典型的なシグナル伝達の概略を以下に記す（図２）．

さらに，RIPK1 はネクロプトーシスやアポトーシスの細胞死誘導シグナルとは別に，下流にある転写因子

RIPK1 は，アポトーシスとネクロプトーシスの両方

nuclear factor kapper B (NF-kB) にシグナルを伝えるの細胞死を制御するシグナル調節のキー分子として働ことで炎症関連分子や生存因子（抗アポトーシス因子等）

くことが現在までの研究から明らかとなってきている．

の転写を活性化する働きも併せ持っている．

ストレス/炎症シグナル分子の一つである腫瘍壊死因子

ネクロプトーシスの結果生じた分子や NF-kB の活性

tumor necrosis factorα (TNFα) のシグナル下流におい化によって産生された分子などが再び細胞に炎症性シて，RIPK1 が caspase8 を活性化することでアポトーシ

グナルを入れ，これらの結果，RIPK1 によりネクロプ

スを誘導することが古くから示されていた．その後の細トーシスや NF-kB 活性化が起こるというシグナル伝達

胞死研究から，RIPK1 がアポトーシスとは別経路のネのポジティブループが廻ることで炎症が維持されると考クロプトーシスを引き起こすメカニズムが明らかとなっえられている（＝慢性炎症）（図２）．そのため，RIPK1てきた．RIPK1 が下流の RIPK3 をリン酸化することで，は慢性炎症において重要な分子として近年着目されていRIPK3 と mixed lineage kinase-like (MLKL) の相互作

る．

用が強まり，さらに MLKL の重合化が進み，最終的にネクロプトーシスが起こる．ネクロプトーシスにより【疾患における RIPK1 と臨床応用】

細胞内物質が細胞外に流出することで，構成成分である

ネクロプトーシスなどの細胞死研究が進められる中damage-associated molecular patterns (DAMPs) や炎で，ネクロプトーシス関連分子である RIPK1, RIPK3，ᅗ㻞䠊㻾㻵㻼㻷䝅䜾䝘䝹ᴫ␎ᅗ㼀㻺㻲䃐㼀㻺㻲䝺䝉䝥䝍䞊
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図2

RIPK シグナル概略図

131

免疫疾患領域における創薬標的としての RIPK1

MLKL の遺伝子改変マウスや RIPK1 阻害剤を用いた

４）Zhou, W. & Yuan, J.: Necroptosis in health and

実験により，ネクロプトーシスと病態との関係を示す

diseases. Semin. Cell Dev. Biol., 35, 14 (2014).

報告が蓄積されてきている．RIPK1 遺伝子改変マウス

５）Harris, P.A. et al.: Discovery of a First-in-Classや，RIPK1 阻害剤（＝ネクロプトーシス阻害剤）であ

Receptor Interacting Protein 1 (RIP1) Kinase

るネクロスタチン１を用いた実験報告，また RIPK3 やSpecific Clinical Candidate (GSK2982772) for

MLKL の遺伝子欠損マウスを用いた解析により，様々

the Treatment of Inflammatory Diseases. J .

な動物病態モデル（肝炎，腎炎，膵炎，脳梗塞，筋萎縮Med. Chem., 60, 1247 (2017).

性側索硬化症（ALS）モデル）での病態症状が改善する
ことが現在までに示されている４）．
当初は細胞死研究から注目された RIPK1 は，前項に（田辺三菱製薬株式会社 創薬本部ト

四方田純一郎）述べたように炎症関連の重要な分子として，免疫・炎（田辺三菱製薬株式会社 創薬本部

症領域の疾患においても近年注目が集まり国内外の製ト薬各社が RIPK1 を標的とした創薬を進めている．中でも創薬の難易度が高い自己免疫疾患領域において，
GlaxoSmithKline 社が RIPK1 を標的とした阻害化合物
GSK2982772５）の潰瘍性大腸炎，関節リウマチ，乾癬
を適応とした第 II 相臨床治験を進めている．また，中枢神経と免疫疾患領域において，Denali 社と Sanoﬁ 社
が DNL747 でアルツハイマーや ALS，多発性硬化症（MS）において，また DNL758 で自己免疫疾患の適応を目指して第 II 相臨床治験を共同で行うことが決定している．
RIPK1 による細胞死研究が進んではいるものの，アポトーシスとネクロプトーシスが切り替わるメカニズムなどの重要なポイントはいまだ解明されていない．今後の RIPK1 をはじめとするネクロプトーシス研究と共に
RIPK1 阻害薬の臨床応用（創薬）の更なる発展が期待される．

【参考文献】
１）Stanger B.Z. et al.: RIP: a novel protein containing a death domain that interacts with Fas/
APO-1 (CD95) in yeast and causes cell death.

Cell., 81, 513 (1995).
２）He, S. & Wang, X.: RIP kinases as modulators ofinﬂammation and immunity. Nat. Immunol., 19,
912 (2018).
３）Humphries, F. et al.: RIP kinases: key decision
makers in cell death and innate immunity. Cell

Death Differ., 22, 225 (2015).
132

免疫炎症創薬ユニッ柳田哲哉）

免疫炎症創薬ユニッ酵素情報

自己免疫疾患におけるTyk2 の役割
Bruton's tyrosine kinase(Btk)kinase) の５つのドメインから構成されている１,２）．

【はじめに】
近年，核酸治療，遺伝子治療，iPS 治療など様々な新

Btk は，形質細胞を除くＢ細胞，血小板，顆粒球，単しいモダリティを用いた治療の開発が急速に進んできて球などＴ細胞以外の血球系細胞の全般に発現している

いる．一方で，低分子薬は，経口投与可能であること，

３,４）

数はそれほど多くないが，JAK 阻害剤など抗体に劣らするプレＢ細胞受容体の機能において重要な役割を果たない薬効を示す薬剤も存在すること，新しいモダリティ

していることが知られている．Btk は spleen tyrosineに比べて廉価であること，などから依然として医薬品開kinase (Syk) の下流にあり，Ｂ細胞受容体からのシグナ

発のスタンダードなアプローチ法の一つであり，現在

ルが Syk, Btk と伝達され，最終的には NFκB 経路を活でも一定の割合で開発が進められている．低分子薬の中性化させる．

．中でも，Ｂ細胞の初期分化において選択的に発現でもキナーゼ阻害薬については，従来，標的のキナーゼ

Btk が欠損するとプロＢ細胞からプレＢ細胞への分化のみを選択的に阻害する化合物を創製することは困難で障害が生じ，結果として，末梢血の成熟Ｂ細胞欠損とあったが，近年はキナーゼの構造解析やキナーゼと阻害なる．そのため，抗体産生がなくなり，脳，肺，副鼻薬の結合様式の解析などによって，高選択型キナーゼ阻腔，および皮膚において重篤な細菌感染が頻繁に生じ害薬の開発が可能となってきており，主にがん疾患を中る５,６）．

心に多くの薬剤開発が進められている．
Bruton's tyrosine kinase (Btk) は，先天性免疫異常【Btk が関係する疾患と治療薬】症であるＸ連鎖無γグロブリン血漿の責任遺伝子として

マントル細胞リンパ腫は，リンパ節内のマントルとい同定された非受容体型チロシンキナーゼであり，この疾う部分にあるリンパ球の中のＢ細胞ががん化し，リンパ患を最初に記載した小児科医であるオグデン・ブルトン

節の中で増殖する疾患である．Btk を阻害することで，の名を冠して名付けられた１）．本稿では Btk の役割につこのがん化Ｂ細胞に細胞死をもたらし，細胞の移動や接いて概説する．

着を低下させるというコンセプトで Btk 阻害剤の開発が進められてきた．
日本では，イブルチニブが 2016 年に Btk 阻害剤とし【Btk の構造と役割】
Btk は Tec ファミリーに属するチロシンキナーゼであて初めて承認され（米国では 2013 年に承認），再発又り，659 個のアミノ酸からなる約 77kDa のタンパクでは難治性のマントル細胞リンパ腫，慢性リンパ性白血病ある．その構造は Ｎ 末端より PH (pleckstrin homolo-（小リンパ球性リンパ腫を含む）の治療に使用されていgy), TH (Tec homology), SH3 (Src homology 3), SH2

る．イブルチニブは最初に開発された経口の Btk 阻害(Src homology 2), SH1/TK (Src homology 1/Tyrosine剤であり，Btk の 481 番目のシステイン残基に不可逆

NH2Ͳ

PH
1

SH3

TH
138

215

SH2

280
図１

377

ͲCOOH

SH1/TK
659

Btk の構造133

Bruton's tyrosine kinase (Btk)

的に共有結合することにより，その機能を阻害する．

４）Smith, C. I. et al.: Expression of Brutonʼ s agam-

Btk 阻害剤は慢性リンパ性白血病や難治性のマントル

maglobulinemia tyrosine kinase gene, BTK, is

細胞リンパ腫以外の疾患への適応拡大として，SLE や関

selectively down-regulated in T lymphocytes

節リウマチといった自己免疫疾患への適応が考えられて

and plasma cells. J. Immunol., 152, 557 (1994).

おり，自己免疫疾患の動物モデルである MRL/lpr モデ５）Mohamed, A. J. et al.: Brutonʼ s tyrosine kinase

ルにおいて抗体産生を抑制し，腎症の程度が軽減したと(Btk): function, regulation, and transformationの報告や７），複数の関節炎モデルにおいて関節炎スコアwith special emphasis on the PH domain. Im-や炎症性サイトカインを抑制したとの報告もなされていmunol. Rev., 228, 58 (2009).

る８）．また自己免疫以外の疾患に関しても，一過性脳虚６）Doyle, S. L et al.: Signaling by Toll-like recep-

血モデルにおいて脳梗塞領域の拡大抑制や，神経症状のtors 8 and 9 requires Bruton's tyrosine kinase. J.

改善を示す報告がなされており ，脳梗塞への適応可能Biol. Chem., 282, 36953 (2007).

９）性が示されている．

７）Honigberg LA et al.: The Bruton tyrosine kinase

日本ではまだ上市されていないが，イブルチニブより

inhibitor PCI-32765 blocks B-cell activation and

Btk への選択性を高めたアカラブルチニブも 2017 年に

is eﬃcacious in models of autoimmune disease

米国で難治性のマントル細胞リンパ腫を適応症として承and B-cell malignancy. Proc. Natl. Acad. Sci. U

認を受けている．
アカラブルチニブはイブルチニブ同様，

S A., 107, 13705 (2010).

様々ながんで臨床試験を実施中であるが，Btk への高い

８）Chang BY et al.: The Bruton tyrosine kinase

選択性からオフターゲットによる副作用を軽減できる可

inhibitor PCI-32765 ameliorates autoimmune

能性があるため，がん以外の疾患である関節リウマチでarthritis by inhibition of multiple eﬀector cells.

も臨床試験が行われており，今後の開発が期待される .

The Bruton tyrosine kinase inhibitor PCI-32765

様々な薬が開発されて患者の QOL が格段に向上した

ameliorates autoimmune arthritis by inhibition

疾患領域もある一方で，まだまだ十分ではない疾患領域

of multiple eﬀector cells. Arthritis. Res. Ther.,

も多く残されており，世界中で今なお多くの多くの患者

13, R115 (2011).

さんが苦しんでいる．Btk 阻害薬をはじめとした新たな

９）Ito M et al.: Bruton's tyrosine kinase is essen-

薬剤がさらに開発され，患者さんのアンメットニーズがtial for NLRP3 inflammasome activation and

解決されることを期待したい．

contributes to ischaemic brain injury. Nat. Com-mun., 6, 7360 (2015).
【参考文献】
１）Hendriks, RW et al.: Targeting Bruton's tyrosine
kinase in B cell malignancies. Nat. Rev. Cancer.,14, 219 (2014).
２）Akinleye, A et al.: Ibrutinib and novel BTK
inhibitors in clinical development. J. Hematol.

Oncol., 6, 59 (2013).
３）de Weers, M. et al .: The Brutonʼ s tyrosine
kinase gene is expressed throughout B cell differentiation, from early precursor B cell stages
preceding immunoglobulin gene rearrangement
up to mature B cell stages. Eur. J. Immunol.,23, 3109 (1993).

134（田辺三菱製薬株式会社
由文彦）

創薬本部 創薬基盤研究所 三日本応用酵素協会誌

第53号

ISSN : 0913-3348
CODEN : NOKKEL

2019 年３月１日発行

日本応用酵素協会誌
日本応用酵素協会誌

No. 53
2018
総

説

№

53

コンドロイチン硫酸の発現調節酵素による骨格筋分化・再生制御 ･･･････････････････

2018

三

上

雅

久，北

川

裕

1

之

神経傷害特異的に応答発現するエンドペプチデース
Damage Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) ････････････････････････ 11
木

山

博

資，桐 生

寿美子

超偏極 C MRI による非侵襲的酵素活性イメージング ･ ･･･････････････････････････ 19
13

松

元

慎

吾

低酸素応答による末梢神経の髄鞘形成制御 ･･････････････････････････････････････
氏

家

悠

佳，若

月

修

二，荒

木

敏

27

之

2018年度 研究報告
酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究 ･････････････････････････････ 33
成人病の病因・病態の解明に関する研究助成 ･････････････････････････････････････ 58
公益財団法人Vascular Biology Innovation に関する研究助成･･････････････････････････････････ 87
全身性炎症疾患の病因・病態の解明に関する研究助成 ･････････････････････････････ 103
Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成･････････････････････ 109

日本応用酵素協会

研究調査所 酵素情報
ファージディスプレイによる進化分子工学的手法を用いた酵素改変 ･････････････････ 127
免疫疾患領域における創薬標的としての RIPK1 ･ ･････････････････････････････････ 130
Bruton's tyrosine kinase (Btk) ･････････････････････････････････････････････････ 133

公益財団法人

日本応用酵素協会

Japan Foundation for Applied Enzymology
編集兼
発行人

中田

繁樹

発行所

大阪市淀川区加島三丁目一六番八九号
公益財団法人 日 本 応 用 酵 素 協 会

印刷所

帝人エージェンシー株式会社