称号及び氏名

博士（学術）Haggag Salah Zein Mostafa

学位授与の日付

平成 1８年３月３１日

論文

名「Study on Molecular and Immunochemical Characteristics of Monoclonaland Recombinant Antibodies Selective for Cucumber mosaic virus Coat
Protein and Their Applications」（キュウリモザイクウイルス（CMV）に対するモノクローナル抗体の分子・免疫学的特性とその利用）

論文審査委員

主査

宮武和孝

副査

高橋正昭

副査

藤井郁夫

副査

大木理

論文要旨
Introduction
Diseases caused by viruses are a constant and major problem for crop and livestock
production worldwide. Cucumber mosaic virus (CMV) is the type species of the genus
Cucumovirus and is one of the most widespread plant viruses in the world. It has a verybroad host range of wild and cultivated plants, with more than 1000 known hosts.
Predominantly, CMV attacks several economically important plants in Japan.
Considerable efforts are needed to control these diseases, including accurate and rapid
diagnosis using both classical and emerging technologies. The methods used are mainly
serological and molecular biological based methods. Recombinant and monoclonal
antibodies have been used to group viruses, and also to differentiate strains of viruses.
Among serological tools, ELISA has been the method of choice because of its highsensitivity, simplicity, reproducibility and versatility in screening a large number ofspecimens. The application of immunocapture reverse transcriptase polymerase chain
reaction (IC-RT-PCR) has now made it possible to amplify a low copy number of viral
RNA/DNA molecules, and their subsequent detection PCR technology for the detectionof DNA from various organisms may eventually replace some immunological assays.

The Scope of the Thesis
The major aim of producing monoclonal antibodies was developed in order to allow
fast, large scale testing of infected plants and to obtain a panel binding to different
epitopes contained in the CMV coat protein. The in vitro experiments of "mechanicalinoculation" of the monoclonal antibodies against CMV were neutralized efficiently
against virus infectivity and to block virus infection. Due to development of MAbs, theserological assays, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), western blots,
dot-immune binding assay, and immunocapture IC-RT-PCR protocols were developedand optimized for the sensitive detection of CMV. Knowledge of the specificimmunoglobulin genes used to target common epitope may lead to insights on
pathogen-host co-evolution and long term blocking virus infections in plants which may
be useful for antibody based resistance. CMV coat protein could stimulate catalytic
antibodies which identically sequence with anti-VIP, gp41-HIV, and HCV light chain
antibodies. I hypothesize that MAbs possess DNase and Protease like activity andmight be used for medical therapy.
Chapter I
The production of MAbs and PAbs are an efficient means of using long-term
maintenance to produce antibodies which are specific for CMV coat protein, The affinityof MAbs were measured with competitive ELISA. Interestingly, the affinity of the MAbs{} varied depending on the CMV subgroup, and MAbs specific subgroup-I showed a very
high specific binding affinity nanomolar level which ranged 3.0-38.3 ×10-9 against
Pepo-CMV strain. On the other hand, MAbs specific subgroup-II showed to be~100
lower than subgroup-I, however, the MAbs revealed reactivity against M2-CMV strain
was 2.8-5.2 ×10-7.
Chapter IIDue to the development of serological and molecular assay for high detection CMVcoat protein, Dot-immune binding assay was more effective for the detection of CMV.
Younger leaves are more suitable as samples for TAS-ELISA than older leaves. This
may imply a high accumulation of virus particles in younger leaves, which are still
actively growing, or alternatively there may be a reduced amount of tannins andphenolics in the younger leaves compared with the older leaves. The nucleic acid-based
detection method IC-RT-PCR is at least five times more sensitive than protein-based
serological methods for the detection of CMV in infected tissues. Predictably, specificantibodies neutralized infectivity in homologous tests of mechanical inoculation.
Subgroup-I strain Pepo specific MAb-5 which showed the highest binding affinity wasemployed for neutralizing virus infectivity. The inhibition by MAb-5 was significantly
very high and consequently tobacco plants inoculated with virus pretreated with MAb
showed clearly to be symptom-less on tobacco plants and could not be detected byimmunochemical methods.
Chapter III
The main goal of the experiments was to develop Fab to highly conserved regions ofCMV coat protein. For this purpose, I isolated, cloned and sequenced the VH and V
regions of 14 anti-CMV mAbs generated from five different fusions of BALB/c mice
immunized with native CMV coat protein, and the VH, D, JH, V, and J were determined.
The antibodies grouped into four sets, based on highly identity VH and VL genes. ThemAbs responses were oligoclonal and paratypically diverse as it was encoded bydifferent heavy chain V region gene segments. All the antibodies were found to derivefrom distinct B cells because they had utilized diverse VH, DH, and JH genecombinations, and the length of the CDR3 region ranged from seven to seventeen aminoacid residue. An abundance of VH genes from J558 family was observed (eight out offourteen) but each represented a separate member of the family. It is appears likely that
CMV-CP is capable of inducing a variety of B cells that have distinct phenotypic andgenotypic paratope. Interestingly, high affinity antibody specificity was encoded bygermline genes. Sequence analyses of PCR-amplified cDNA derived from fourteen
different hybridoma Ig variable region genes, showed that ten hybridoma cell lines
amplified that maximal enrichment is obtained for the highly represented variable Ig
gene subgroups VII gene bd2 which was a partner of a numerous of different antibodies
raised in autoimmune diseases anti-DNA, -RNA, -Sm, and -Histone. Moreover, ourpresent results show that the anti-HIV and -HCV human viruses light chain whichplays a vital and dominant function in determining antibody specificity.
Chapter IV
Molecular mimicry is one of the leading theories that attempts to explain why theimmune system turns on its own body in autoimmune diseases such as multiple
sclerosis, rheumatoid arthritis and type-one diabetes. CMV capsid protein domains areclearly exposed on the virus, and the amino acid sequence of the H-I loop forms aconspicuous, negatively charged electrostatic field on the surfaces of virions, which has
fundamentals aspects, and is conserved among Cucumoviruses. The structure plays arole in aphid vector transmission and determines the most immunodominant domain.
I hypothesize those CMV specific antibodies light chains have an identical sequence
to the catalytic antibodies, anti-VIP, -gp41 HIV and -HCV light chain antibodies, and inaddition, the MAbs specific CMV coat protein possesses DNase and Protease likeactivity. Consequently, CMV-CP specific antibodies are important for isolates such ascoat proteins of bacteria, viruses, cancer cells, etc. which are vital and might be usefulfor medical therapy.

審査結果の要旨
植物は植物ウイルスに感染することでその生産性が低下することが知られている。これらのウイルスの中でブロモウイルス科、ククモウイルス属のキュウリモザイクウイルス(CMV)は、その被害の大きさから最もよく知られた植物ウイルスのひとつであり、CMV は植物ウィルスの中で最も広い宿主範囲を持っているとされる。85 科 365 属 775種の植物に感染するとも言われ、現在宿主植物は 1000 種を越すと推定されている。実験的には、容易に汁液接種により植物に感染させることができるが、自然界ではアブラムシによって伝播され、現在約 80 種のアブラムシが CMV を伝播することが知られている。この防御には、直接ウイルスに効く農薬がないことから、伝播するアブラムシを農薬などで駆除しているが、食の安全などの問題から使用量が限定されている。このような状況において、抗体によるウイルス防御や、感染植物の早期発見により最終的には生産性の向上と環境負荷を低減した農業をめざすため、この本研究を行った。
その内容は、以下のように要約される。
まず、2 系統に大別される CMV、サブグループ I(ペポ)および II（M2）のウイルスを感染させた植物からウイルス粒子を精製して、ウイルス外被タンパク質を抗原として、モノクローナル抗体を作製し、微量、迅速、低価格での酵素抗体法について検討した。
その結果、14 種のモノクローナル抗体を得ることができ、そのいずれもが IgG に分類された。サブグループ I を抗原としたモノクローナル抗体からは、サブグループ I のウイルスのみを特異的に検出できる抗体 10 個を得た。一方サブグループ II（M2）を免疫して得られたモノクローナル抗体からは、サブグループ II（M2）のウイルスと特異的に反応する 3 つのモノクローナル抗体と、2 つのサブグループウイルスを同時に認識できるモノクローナル抗体一株を得たが、その親和性は、それぞれのサブグループウイルスを認識できる抗体の 1/100 の程度であった。そこで、入手可能な、サブグループ Iおよび II ウイルス、14 種を用いてその特異性を検討したが、明確にこれらの抗体により区別ができた。得られた抗体を用いてドットイムノブロット、あるいはImunnocaputure RT-PCR にてその感度や迅速性を確かめたところ、10 ピコグラムの抗原あるいは、植物感染してわずか 12 時間後の植物体中の感染を確認できた。これらのことから、迅速かつ早期診断により感染拡大を防げることが示唆された。
ついで、モノクローナル抗体の抗原に対する結合定数（Kｄ）をKlotzプロットから求めた。最も親和性の高い抗体は、サブグループIのウウイルスに対するもので、3x10－Ｍであり、同じ抗体の中でも最大 100 倍程度の差が見られた。一方サブグループIIに９対しては、2.7－5.2x10－7Mの値となった。この親和性の違いは、抗原としたウイルス外被タンパク質のネガティブチャージを持つ領域(βH-βIループ)に存在するアミノ酸の違いによるもので、親和性は、この領域のスレオニンがアラニンに変化することと一致していることを明らかにした。
次に、CMV に親和性の高い、モノクローナル抗体を用いて、CMV と試験管内で反応させた後にその感染力を検体植物に接種して調べたが、CMV が感染できないことを病徴観察ならびにウエスタンブロットにて確認し、抗体によりウイルス感染を完全に抑制できること示し、植物体に抗体を発現できれば、感染予防ができることを示唆した。
最後に、大腸菌にて抗体の Fab フラグメントを合成し、CMV に特異的に反応することを確かめた。さらに、抗体産生遺伝子のアミノ酸ホモロジー検索を行い、H 鎖およびL 鎖を比較した。H 鎖では、エプトープ結合部位である CDR3 に含まれるタイロシンの存在の確認をした。一方、L 鎖では、アミノ酸ホモロジー検索では、いずれの抗体でもほぼ同じであった。その値をデータベースで検索すると、触媒抗体として種々の酵素活性の報告が多数あることから、精製した抗体を用いて酵素活性を測定したところ、DNAase 様活性が検出された。これはまだ仮説の段階ではあるが、単に CMV ウイルス抗体としてだけでなく、他の動物由来のウイルス検出やウイルス治療にも応用できる可能性が示唆された。
以上のように本研究は、植物ウイルスの中でも、最も広い宿主範囲を持っている CMVを早期検出、感染予防できる可能性を明らかにしただけなく、抗体とウイルス外被タンパク質の相互作用を分子のレベルで解明し,さらに、抗体触媒の可能性についても示唆したものである。これらの成果を応用することで、増加する地球人口に対して農産物をはじめとする食糧増産を確保しながら減農薬あるいは環境負荷低減に貢献できるものである。
これらの成果は、農学、生命機能、環境科学の分野など幅広く、大きく貢献するものであり、本論文の審査ならびに最終試験の結果と合わせて博士(学術)の学位を授与することを適当と認める。