No.58
2023
総

説

ユビキチン・プロテアソームシステム依存的タンパク質分解の破綻による神経疾患の発症機序の解明 ・
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・・
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・1
大野

萌馨 ,

若月

修二 ,

荒木

敏之

質量分析イメージングを用いた酵素組織化学
Enzyme histochemistry using mass spectrometry imaging ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・9
新間

秀一

メンブレンコンタクトにおける脂質交換輸送 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・17
中津

史

酵素情報
CD38とBST1 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 24
夜久

圭介 ,

米田

敦子

中川

崇

ポリラクトサミン糖鎖生合成を調節する β1,3- -アセチルグルコサミン転移酵素 ・・・・ 27

2023年度 研究報告
酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・29
成人病の病因・病態の解明に関する研究助成 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・58
Vascular Biology Innovationに関する研究助成 ・
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・110
全身性炎症疾患の病因・病態の解明に関する研究助成 ・
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・146
Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 158

総説

ユビキチン・プロテアソームシステム依存的タンパク質分解の破綻による神経疾患の発症機序の解明

大

野

萌

馨 1,2，若 月 修

はじめに

二１，荒

木

敏

之１,2

の大部分を E3 ユビキチンリガーゼが占める 2），3）．E3 ユ

神経発達障害は運動，認知，感情または学習に障害

ビキチンリガーゼは基質を認識し，E2 からユビキチンへを伴う神経疾患であり，近年，疾患の社会的な認知度のの転移を助ける，または触媒する酵素であり，特定のタン上昇とともに発症率が増加しつつある 1）．様々な要因が発パク質の分解を決める重要である．神経系において，E3症の原因として考えられているが，その一つとして神経細ユビキチンリガーゼは神経細胞の発達，遊走，軸索の伸胞内でのシナプス関連タンパク質分解の異常が挙げられ

長や分岐，シナプスの成熟，機能の調節において役割をる．タンパク質分解経路の一つであるユビキチン・プロテ

果たしていることが報告されている 4）． しかし，神経細胞

アソーム・システム（UPS）（図 1）のいくつかの関連遺の発達，成熟における UPS の役割についての研究は少な伝子が神経発達障害のリスク遺伝子として同定され，そく，UPS 機能と神経発達障害の関連について更なる研究が必要とされている．
UPS の異常は神経変性にも関与することが知られている．ポリユビキチン形成阻害剤を変性軸索に適用すると，軸索変性の進行が有意に抑制されることから，軸索変性には UPS 分解が必要であることが示唆された 5）．完全に発達した神経軸索が壊れる軸索変性は，中枢神経系と末梢神経系の両方において，様々な状況で観察される 6）．
軸索変性は，筋萎縮性側索硬化症 7），パーキンソン病 8），
アルツハイマー病 9）など，多くの神経変性疾患の初期段階でもしばしば観察される，運動障害を伴うパーキンソン病では，UPS の活性に関与するタンパク質の遺伝子に欠図１ ユビキチンリガーゼ・プロテアソーム・損が報告されている 10）．さらに，UPS 機能低下はハンチシステム（UPS）

UPS はユビキチン分子を標的タンパク質に修飾することでタンパク質の分解，または細胞内シグナルを調節

ントン病やアルツハイマー病などの神経変性疾患の進行の促進に関与することが報告されていることから 2），UPSする役割を果たす．標的タンパク質へのユビキチン分は正常な神経細胞の機能維持に重要な役割を果たしてい子の付加（ユビキチン化）は３つの酵素（E1，E2，

ると考えられる．

E3）によって行われ，さらにユビキチン分子間の縮神経系の発達過程において，軸索やシナプスは初期に合反応を繰り返すことでポリユビキチン鎖が形成され過剰に産生され，その後，過剰な構造は成熟した神経回る．ユビキチン化タンパク質が分解の運命を辿る場
合は，26S プロテアソームによってポリユビキチン鎖が認識され，脱ユビキチン化された後 20S に送り込
むことで分解される．
1, 国立精神・神経医療研究センター路を形成するために分解される 11）．このような軸索の刈り込みは，軸索変性で観察される形態学的特徴と共通しており，軸索変性の一種とみなすこともできる．そこで本稿では，E3 ユビキチンリガーゼのうち，神経変性，神経神経研究所

疾病研究第五部

2, 東京農工大学大学院 工学府 生命工学専攻

1

総説－ユビキチン・プロテアソームシステム依存的タンパク質分解の破綻による神経疾患の発症機序の解明

発達の両者に関与する Znrf1 と Ube3a について紹介し，

CRMP2 の分解が起こり，その結果，軸索の微小管構造

脳神経系において一生涯に渡る UPS 機能の関与についが破壊されることが示唆された．（図 2 ② - ④ a）て現時点の課題を議論する．

我々は以 前 の 研 究 から，ドミナントネガティブ 型 のZNRF1 を過剰発現させると，軸索変性が抑制されるこ

1. ZNRF1 による神経変性進行メカニズムとを明らかにしていた．ZNRF1 は神経細胞において実際

１. １ ZNRF1-AKT-GSK3 β -CRMP2 経路に AKT と結合し，変性した軸索において AKT を分解す

我 々はこれまでに，ZNRF1-AKT-GSK3 β -CRMP2る標的となることが判明した 12）．また，ZNRF1 の発現抑経路が軸索変性の進行に関与することを解明した 12）．グ

制や，AKT-GSK3 βカスケードの阻害，リン酸化部位変

リコーゲン合成酵素キナーゼ 3 β（GSK3 β）の阻害は

異 型 CRMP2 の 過 剰 発 現 など，ZNRF1-AKT-GSK3β

神経突起変性に対して保護的であることを見出し，リン酸-CRMP2 経路を任意の段階で阻害すると軸索変性の進行化によって GSK3 β活性を制御する AKT も，軸索保護を抑制することから，ZNRF1-AKT-GSK3 β -CRMP2 経の役割を果たすことを突き止めた 12）．軸索損傷のような路が軸索を維持する上で重要であることが示唆された 12）.

変性刺激によって，AKT 活性は抑制され，GSK3 βは神経細胞で活性化される 13）．また我々は，変性軸索におけ１.2 ZNRF1 による細胞アポトーシスの誘導

る GSK3 βの基質として，コラプシン応答メディエーター

これまで，酸化ストレスによる神経細胞傷害が，軸索タンパク質 2（CRMP2）を同定した．GSK3 β依存的リ変性だけでなく神経細胞体の死も誘導することが示唆さ

ン酸化部位に変異を持つ CRMP2 を軸索変性の培養モれている．我々は培養神経細胞とマウスモデルを用いて，デルに過剰発現させたところ，変性の進行が有意に遅延

ZNRF1 の活性化がアポトーシスも誘導することを発見しすることを見いだした 12）．これらの結果から，変性軸索た 14）．これまでの研究で，古典的なアポトーシスシグナル

では GSK3 β依存的な CRMP2 のリン酸化が誘導され，伝達経路は，軸索変性を促進するシグナル伝達とは独立

図２ 軸索変性時と発達段階で ZNRF1 が担う機能
右：ZNRF1 が制御する神経変性メカニズム ①ストレスによる ROS 産生が，EGFR による ZNRF1 の活性化を起こす．
② ZNRF1 による AKT の分解により GSK3 βの活性が亢進する．③ GSK3 βが CRMP 2，MCL1 をリン酸化する．④ a CRMP 2 のリン酸化により微小管が不安定化し，軸索変性が促進する．④ b リン酸化 MCL1 が分解され，
BECLIN は軸索オートファジーを誘導する．⑤オートファジーによるエネルギー（ATP）産生がスクランブラーゼの持続的な活性を起こし，PS が細胞膜表面に露出する．⑥ PS の細胞膜表面への露出が貪食を誘発し，軸索変性を促進する .
左：発達段階における ZNRF1 が担う役割 ⅠZNRF1 KO では AP の波形に異常が生じる．GSK3 βによるリン酸化が Nav1.2 発現レベルの制御によって Nav1.2 の内在化に影響する可能性がある．Ⅱ ZNRF1 KO では胎児脳の皮質構造に異常を示す．ZNRF1 が未解明な基質の分解を介して，皮質構造の形成に関与すると考えられる．

2

総説－ユビキチン・プロテアソームシステム依存的タンパク質分解の破綻による神経疾患の発症機序の解明すると考えられてきた 15）．著者らの発見は ZNRF1 がアポに応答して ZNRF1 は活性化される 12）．ZNRF1 の活性

トーシスと軸索変性の両方の制御に関与することを示すも化には，酸化ストレスによって誘導される ZNRF1 の 103のであり，ZNRF1 の活性調節機構を詳細に調べることに番目のチロシンでのリン酸化が必要である 14）．我々はまより，アポトーシスと軸索変性がどのように収束するのか

た，受容体型チロシンキナーゼである上皮成長因子受容を明らかにできる可能性がある．

体（EGFR）が ZNRF1 と会合し，リン酸化することを見出した 14）（図② ①）．酸化ストレスレベルの上昇がどのよ

１.3 軸索オートファジーの誘導

うにして EGFR の活性化につながるのか，また，さまざま

MCL1 は BCL2 ファミリー分子の抗アポトーシスメンバー

な種類の刺激がどのようにして神経細胞における酸化ストであり 17），定常状態の神経細胞ではミトコンドリア外膜上

レスレベルを上昇させるのかは不明である．神経細胞におのオートファジー誘導複合体の必須成分である BECLIN1

ける酸化ストレス産生に関しては，NADPH オキシダーゼと相互作用し，オートファジーを制御している．我々はが軸索変性の開始に応答した酸化ストレス産生を担ってい

MCL1 が軸索変性に対して保護的であり，GSK3 βによっることが判明している 14）． 興味深いことに，NADPH オてリン酸化される下流分子として同定した 16）．軸索変性にキシダーゼ活性は，培養神経細胞において 6- ヒドロキシ

おいて GSK3 βが活性化されると，リン酸化された MCL1

ドーパミンなどの酸化ストレス誘導物質によって開始されは，BECLIN1 やミトコンドリア表面から解離し，F-box

る軸索変性に必要であることから，酸化ストレスが細胞内型ユビキチンリガーゼである FBXW7 に依存した UPS 分

シグナル伝達メディエーターとして作用していることが示唆解を受ける．MCL1 から切り離された BECLIN1 は，変される 23）．酸化ストレスによる NADPH オキシダーゼ活性した軸索においてオートファジーを誘導する 16）（図 2性化のメカニズムは不明であるが、細胞外に与えられた酸④ b）．オートファジーはエネルギーを産生することで，細化ストレスは、おそらくキナーゼの活性化によって翻訳さ胞機能に貢献している 19）．このことは，軸索の輸送が阻れ、NADPH オキシダーゼを活性化すると考えられる 24）。

18）

害され，必要なエネルギーを局所的に生産する必要がある軸索変性において特に重要であると考えられる．健康3. 神経発達段階での ZNRF1 の役割な軸索の細胞膜では，リン脂質は非対称に分布している

ZNRF1 はマウス胚のほぼ全ての神経細胞で発現が認

20）．アミンを含む脂質であるフォスファチジルセリン（PS）

められ，発達期での神経細胞の成熟に機能を持つ可能性とホスファチジルエタノールアミン（PE）は細胞膜上で細がある 25）．ZNRF1 を欠 損させたマウス（ZNRF1 KO）

胞質側を向いて局在する．脂質の移動はフリッパーゼとスの行動フェノタイプを明らかにするため，網羅的行動試

クランブラーゼに制御され，フリッパーゼは PS を細胞質験を行った結果，精神疾患様の行動異常や多動が確認側に局在させ，スクランプラーゼは細胞表面に露出させるされた（未発表データ）．しかし，ZNRF1 欠損が発達，21）．変性した軸索やアポトーシス細胞では，スクランブラ

成熟期においてどのような分子機序を経て神経回路に影ーゼの活性化とフリッパーゼの抑制により，PS が細胞表響し行動異常を引き起こしているのか，その詳細は不明

面に露出する 22）．我々は，スクランブラーゼ活性が，変である．我々は現在，脳・神経系の発達や成熟段階で性した軸索におけるオートファジー由来のエネルギー産生

ZNRF1 が担う機能や分子機序の解明を行っている．

によって維持されることを示した 16）（図 2 ⑤，⑥）．このことは，オートファジーが，変性部位への食細胞の動員を

3.1 電位依存性 Na チャネルと ZNRF1

介して軸索の残骸の吸収し，軸索変性を促進する可能性

統合失調症様フェノタイプを示す一部の E3 ユビキチンリを示唆している．

ガーゼ欠損マウスでは，アクションポテンシャル（AP）の波形や発生頻度，興奮性での異常が報告されている 26）．

2. ZNRF1 の活性化

これまでの検討により，ZNRF1 KO の海馬 CA1 錐体神ZNRF1 はほとんどの神経細胞で発現しているが，定経細胞では AP のピーク波形に変化が見られ，ZNRF1

常状態では不活性であり，軸索変性が始まる傷害や刺激

KO では電位依存性 Na イオンチャネル（Nav）の発現

3

総説－ユビキチン・プロテアソームシステム依存的タンパク質分解の破綻による神経疾患の発症機序の解明

増加の傾向があった．サブタイプの一つである Nav1.2

４. 神経発達障害と神経変性疾患に関与する E3は錐体神経細胞で発現するが，マウスでは 2 週齢をピー

ユビキチンリガーゼ : Ube3aクとして発達と共に発現レベルは減少する 27）．その際，E3 リガーゼ Ube3a 欠損は，発達遅延と知的・運動

Nav1.2 は細胞内へと内在化し，分解されると考えられる障害を特徴とするアンジェルマン症候群（AS）の病因でが，そのメカニズムは詳細にされていない．培養細胞を用ある．Ube3a 欠損マウスを用いた研究では複数の基質がいた検討では GSK3 βが Nav1.2 の内在化を促進するこ特定され，Ube3a による基質のユビキチン化は学習や，とが報告されている 28）．ZNRF1 KO の海馬では，不活シナプスの成熟，形態，さらに神経興奮性に影響すること

性型 GSK3 β発現量が増加していることから，ZNRF1 がを明らかにしている 32）-36）（表 1）．また，神経変性疾患

AKT-GSK3 β経路を介して細胞膜上の Nav の発現調節

モデルにおいて Ube3a を欠損させることで疾患症状の進に寄与している可能性が考えられる（未発表）（図② Ⅰ）．

行が促進されることが示されている 36）-39）．これらの結果

Nav1.2 は AP のシナプス可塑性に影響する逆伝搬を担うは Ube3a が一生涯に渡って神経機能に関与する重要なことから，現在，ZNRF1 KO でシナプス可塑性に異常がタンパク質であることを示唆している．

あるのか検討している．
4.1 運動障害と Ube3a3.2 皮質層構造と ZNRF1

Ube3a の基質である phosphotyrosyl phosphatase

皮質はⅠ - Ⅵの 6 つの層からなる構造を持つ．各神経

activator（PTPA） は 脱リン 酸 化 することで Protein

細胞がどの層を構築するかは，いつ誕生したかで決定さphosphatase 2A（PP2A）を活性化する 32）．PP2A はれる 29）．精神発達障害の一つである統合失調症の患者

樹状突起の突起形態やシナプスの成熟過程で必要な刈の脳の厚みを解析した研究では，上層が薄くなっているこ

り込みを促 進する分 子である 32）．Ube3a 欠損マウスはとが示されている 30）．また，ヒトの脳オルガノイドを用い筋力の低下，運動皮質野の神経細胞のシナプスの幼弱て皮質層構造の形成を達成した報告では，統合失調症

化，mEPSC の発生頻度の減少を示す．Ube3a 欠損マ

関連遺伝子である DISC1 に変異を生じさせた場合，層ウスでは PTPA の発現量と PP2A の活性の増加が確認さ構造の構築が阻害され，統合失調症でも現れる層構造のれ，PTPA との共欠損によりシナプスの幼弱化が是正され異常を再現している 31）．我々は妊娠齢 14 日目で新生すた 33）．さらに PP2A 阻害剤の投与により，筋力の低下とる神経細胞に GFP を導入し，出生 0 日目の皮質におい

mEPSC の発生頻度が改善された 33）ことから，Ube3aて GFP 陽性神経細胞の分布を解析したところ，ZNRF1

欠損による PTPA の分解の停滞が PP2A 活を亢進するこ

KO では脳室面側（腹側側）に分布が偏ることを判明した．

とで，シナプスの成熟に影響し，Ube3a 欠損マウスの筋

また成体 ZNRF1 KO では，皮質が薄いことを発見した（未

力低下を引き起こしていることを示唆している．

発表）（図② Ⅱ）．分布変化を起こす要因を明らかにすることが今後の課題であり，神経細胞への分化と細胞増殖

4.2 学習障害と Ube3a

頻度への影響についての検討を考えている．

Ephexin5 はアクチン動 態に関わる Rho A を活 性 化することでシナプスの成熟を阻害する働きをもつ．シナプ

表１ Ube3a の基質と AS に関連するフェノタイプ

4

総説－ユビキチン・プロテアソームシステム依存的タンパク質分解の破綻による神経疾患の発症機序の解明

ス結 合 が 進 行し，Ephexin5 がリン酸 化されることで，せるトポテカン１（Ⅰ型トポイソメラーゼ阻害剤）の HD モ

Ube3a によるユビキチン化が促進され興奮性シナプスは

デルマウスへ投与は寿命の延長，筋力低下の進行遅延，成熟過程を進む．Ube3a 欠損マウスでは Ephexin5 のハンチントンタンパク質凝集物の減少，脳萎縮の抑制が発現増加が示されている 34）．Ube3a 欠損マウスでは新規観察された 38）．この結果は Ube3a 活性が HD 進行を抑物体を用いた行動実験において記憶や学習に障害を示し，制する上で重要であることを示唆し，Ube3a が HD の進

海馬 CA1 錐体細胞のシナプス数や mEPSC 発生頻度の行に関与することをサポートするものである．

増加が観察された 34）．これらのフェノタイプは Ube3a と４.4.2 アルツハイマー病と Ube3a

Ephexin5 を欠損させることで改善が見られ 34），これら

アルツハイマー病（AD）は加齢と共に記憶や認知機の結果から，Ube3a 欠損による Ephexin5 の発現増加

能の進行的低下を伴う神経変性疾患である．AD の病理がシナプス数増加を引き起こし，学習に影響すると示唆さ学的特徴としてアミロイドβ（A β）ペプチドの異常な凝れる．

集が挙げられ，アミロイド前駆体（APP）が切断される
ことで生成される．AD モデルマウスでは凝集 A βの増加

4.3 神経興奮性と Ube3aと共に不溶画分での Ube3A 存在量は増加する 38）．さらUbe3a は軸索の機能に関与している．Ube3a 欠損マウに，Ube3A を欠損させた AD モデルマウス（AD/Ube3A

スではシナプス小胞数の減少が観察され，さらに興奮性シKO）は寿命が AD モデルマウスよりも有意に短縮する 39）．

ナプスではシナプス小胞リカバリーが遅延している 35）．こ通常，齧歯類は新規物体を好む習性は認知機能の評価の現象は Ube3a 欠損神経細胞の興奮性 - 抑制性バランとして用いられるが，８ヶ月齢以降の AD/Ube3A KO マ

スの崩れの原因と考えられる．さらに，AS 患者由来 iPS

ウスは同齢 AD マウスよりも新規物体への嗜好が低下し，細胞から分化させた神経細胞では，アクションポテンシャ

認 知 機 能の低 下がより進 行する 39）．これらの結 果からル（AP）の発火率が増加していることが示された 36）．こUbe3a が AD の進行に関与することが示唆される．

れは Ube3a が電位依存性 Big カリウムチャネル（BK）
を基質としていることに起因する．BK チャネルはアクショ

5 まとめ

ンポテンシャルの発火を調節する分子であるが，Ube3a

UPS 関連タンパク質，特に E3 ユビキチンリガーゼは脳・の欠損により BK チャネルが増加し発火が促進され，神神経細胞の発達，神経細胞の遊走，軸索の伸長や分岐，経興奮性が増強されていると考えられる．

シナプスの成熟，機能の調節において役割を果たしている．また，Ube3a や Znrf1 は神経発達，神経変性どち

4.4 神経変性疾患と Ube3aらにも関与し，UPS によるタンパク質のターンオーバーの

前述したように Ube3a の発現低下による基質の増加は制御は生涯にわたり正常な神経機能の維持に重要である

シナプス成熟や神経興奮性に影響し，神経発達障害の発ことが考えられる．神経発達障害のメカニズムの解明には，症に関与する．その一方で，Ube3a の発現低下は神経

特定の神経回路に関わる神経間の結合において，どのよ

変性疾患の進行の促進に関与している 37）- 39）．

うな分子的，電気生理学的異常が起こることによって行

４.4.1 ハンチントン病と Ube3a

動異常に至るのか明らかにする必要がある．UPS 機能破ハンチントン病（HD）はハンチントンタンパク質をコー

綻が神経の発達，成熟に影響し，どの，またはどのようにドする遺伝子領域の CAG リピート伸長によって起こる神神経回路の異常をきたし，行動異常を起こすのか明らか

経変性疾患である．Ube3a を欠損させた HD モデルマウになっていない部分は多く，神経発達障害のメカニズムのス（HD/Ube3a（m-/p+））は同齢の HD モデルマウスと比解明において，今後重大な課題と言える．

較して，寿命の短縮，筋力の低下，視床の萎縮，脳内のハンチントンタンパク質の凝集体の増加が観察された 37）．
これらの結果から Ube3a の欠損が HD の進行に影響することが考察される．さらに，Ube3a の発現量を増加さ5

総説－ユビキチン・プロテアソームシステム依存的タンパク質分解の破綻による神経疾患の発症機序の解明

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7

総説－ユビキチン・プロテアソームシステム依存的タンパク質分解の破綻による神経疾患の発症機序の解明

8

総

説

質量分析イメージングを用いた酵素組織化学

Enzyme histochemistry using mass spectrometry imaging
新

間

秀

要旨

一 1, 2, 3 *性分布を可視化する手法として酵素組織化学が 1930 年

生体組織試料上の酵素反応を可視化する手法として酵代に開発された 1,2）．従来の酵素組織化学では，試料表

素組織化学と呼ばれる方法が 1930 年代に開発された．

面へ基質を供給し，内在性の酵素反応により産生されたこの手法で酵素反応を検出するには，一般的に基質と酵物質に対し，呈色反応を行うことで可視化する．既存の素を反応させた後，得られた反応生成物をさらに呈色反酵素組織化学では，この呈色反応のステップに汎用性が応させ顕微鏡観察を行う．すなわち，既存手法では，基あるとは言い難く，呈色反応のステップを都度，設計する質と酵素の一次反応および呈色させる二次反応が必要と必要があることから，酵素組織化学自体の汎用性は低かなる．本稿で取り上げる新しい酵素組織化学では，呈色った．また，ここで用いられる呈色反応は定量性が乏しい反応による顕微鏡観察に代わり質量分析計で反応生成物という問題も挙げられる．

を試料表面から直接検出する．すなわち，組織表面上で本 研 究では，これらの課 題を解 決するために酵 素 反

直接質量分析を行うことにより，酵素機能の局在を可視

応 で 産 生された分 子を質 量 分 析イメージング（mass化することが可能となる．本総説では，これまで開発した

spectrometry imaging: MSI）にて可視化する方法を

質量分析イメージングによる酵素組織化学手法について開発した．本総説では，ターゲット酵素としてアセチルコ

解説する．

リンエステラーゼ（AChE），コリンアセチルトランスフェ
ラーゼ（ChAT）ならびにグルタミン酸でカルボキシラーゼ

はじめに（GAD）とした．具体的には，マウス脳ならびにショウジ

組織内での酵素分布を知る方法として，免疫組織化学

ョウバエにおける AChE 反応の分布を可視化 3），マウス（immunohistochemistry: IHC）が一般的に用いられ脊髄における ChAT 反応の分布を可視化 4），最後にマメている．IHC では，酵素の存在は可視化できるがその活科植物 5）と大麦 6）における GAD 反応の可視化について性を知ることはできない．IHC では得られない，酵素活

解説したい．

所属：大阪大学大学院工学研究科生物工学専攻
1

大阪大学大学院工学研究科生物工学専攻

Graduate School of Engineering, Osaka University
大阪大学・島津分析イノベーション協働研究所
Osaka University Shimadzu Analytical Innovation Laboratory3
大阪大学先導的学際研究機構
Institute for Open and Transdisciplinary Research Initiatives* 責任著者
e-mail: sshimma@bio.eng.osaka-u.ac.jp
Phone: +81-6-6879-7418
Running title: Novel enzyme histochemistry
Keywords: 質量分析イメージング；酵素組織化学；コリンエステラーゼ；コリンアセチルトランスフェラーゼ；グルタミ
ン酸脱炭酸酵素；マウス脳；ショウジョウバエ ; マウス脊髄；マメ科植物；大麦
29総説－質量分析イメージングを用いた酵素組織化学

Enzyme histochemistry using mass spectrometry imaging

マウス脳における AChE 反応の分布

MSI を用いた酵素組織化学のワークフロー
MSI を用いた酵素反応の可視化は極めてシンプルな手

ここでは野生型マウス脳を用いて，AChE 反応の分布順で実施可能である．具体的な手順を図１に示すが，観の可視化を試みた．AChE は，アセチルコリンを基質とし察する試料から凍結切片を回収し，その表面に酵素反応

コリンと酢酸に分解する酵素である．したがって，ここでの基質をスプレーにて供給する．反応後，代謝物を質量は基質としてアセチルコリンを試料表面に供給し，分解産顕微鏡と呼ばれる iMScope で検出することで，生体内の物であるコリンを検出した．MSI を用いた酵素組織化学

酵素反応分布を可視化できる．

では，内在性の代謝物（ここではコリン）と区別するために，基質として一般的に重水素ラベル化された基質を用いている．ここでは，アセチルコリン -d9 を基質とし，コリン -d9を検出した（図 2）．

Image reconstruction using
IMAGEREVEAL MS

Analysis using iMScope

図 1. MSI を用いた酵素組織化学のワークフロー

基質

O
O

生成物

コリン
D3C CD
3 エステラーゼ

N+

アセチルコリン-d9

CD3

HO
組織上での
酵素反応

基質の
噴霧

D3C CD
3
N+
CD3

コリン-d9MSI による検出（コリン-d9 分布）

図 2. ラベル化された基質を試料表面に供給し，酵素反応後の産生産物を質量分析で検出し可視化する．重水素化ラベルにより，質量が内因性のコリンと異なることから別のピークとして検出することが可能である．

10

総説－質量分析イメージングを用いた酵素組織化学

Enzyme histochemistry using mass spectrometry imaging

質 量 分 析で用いるマトリックスはα - シアノ -4- ヒドロ

した．アセチルコリン d-9 分布とコリン d-9 分布像から，キシケイ皮 酸（α -CHCA，シグマアルドリッチ）を用

IMAGEREVEAL MS で演 算を行い最 終 的な AChE 反

い，その供給には iMLayer（島津製作所）による蒸着

応分布を得た．その結果，AChE 反応は線条体（CPu），とα -CHCA のスプレー噴霧を組み合わせた 7）．MSI 測海馬（HP）ならびに視床下部（TH）で高くなり，脳梁（CC）

定は iMScope TRIO（ 島 津 製 作 所 ）を用い， 解 析は並びに小脳皮質（CBX）では低い傾向を示すことがわか

IMAGEREVEAL MS（島津製作所）を用いた（図 1）．

った（図 3B）．この結果を，既存の酵素組織化学の結基質供給後，アセチルコリン -d9 は試料表面に噴霧後果と比べたところ，非常に良い一致が得られたため本手速やかにコリン -d9 に分解することが確認され，反応時法の PoC を確認することができた．また，iMScope での

間 5 分でプラトーに達しアセチルコリン -d9 が枯渇するこ

高解像度イメージングという特徴を生かし，脳の海馬領とが確認された（図 3A）．したがって，酵素反応を可視域における酵素反応も可視化することが可能となった（図化するにあたり 5 分以内の反応で十分であることを確認

3C，3D）．

図 3.（A）組織上における酵素反応時間に対する，基質変換割合．スプレー噴霧後を 0 分としてプロットを行ったところ，5 分以内で全てのアセチルコリン -d9（基質）がコリン -d9 に変換されることが確認できた．（B）

マウス脳組織におけるコリンエステラーゼ反応分布．HE 染色結果と比較すると線条体（CPu），海馬（HP），

視床下部（TH）では反応性が高く，脳梁（CC）および小脳皮質（CBX）で反応性が低い傾向が分かった．

（C，D）マウス海馬における高解像度イメージング結果と HE 染色結果．CA3 領域で高い酵素反応を示していることがわかる．（文献 3 の図を改変）

11

総説－質量分析イメージングを用いた酵素組織化学

Enzyme histochemistry using mass spectrometry imaging

また本手法を異種動物であるショウジョウバエにも適用

マウス脊髄における ChAT 反応の分布

した．図 4 に示したように，AChE 活性はショウジョウバ

ChAT はコリンにアセチル基を転移する酵素であり，そエ体内中で偏在しており，頭部の大脳部において非常にの反 応には図 5 に示す通りコリンとアセチル CoA が必高い反応性，胸腹部においても高い反応性が確認できた．

要である．また，生成されたアセチルコリンは速やかに頭部において特に高い反応性が見られるという結果は先AChE で分解されるため，ChAT 反応の可視化において行研究の報告とも一致しており ，これは中枢神経系のは AChE の阻害剤であるフィソスチグミンを基質溶液に添

頭部神経節におけるコリン作動性神経中の AChE による加する．また，基質としてコリン -d9 を用いることで，内ものであると示唆される．一方，腹部における ChE 活性因性のアセチルコリンと酵素反応で産生されたアセチルコ

は中枢神経系の AChE によるものではないと考えられる．

リンを区別することが可能となる．

8）

AChE は神経系以外にも血リンパに存在することが報告されており 9），さらに，Zador et al. は神経細胞上に存在する膜結合型 AChE 以外に構造の異なる可溶型 AChEが存在すると述べている 10）．今回確認された腹部 AChE
活性の存在はこれらの報告と一致しており，本手法によって得られた ChE 活性局在の妥当性を示している．

図 5. ChAT の反応様式．コリンを基質とし基質溶液にアセチル CoA とフィソスチグミンンを添加することで ChAT 反応を可視化することができる．

この実 験 系をマウス脊 髄に適用した結 果を図 6 に示す． 図 6 は髄 鞘を青く染めるルクソールファストブルー（LFB）とヘマトキシリンエオシン（HE）の多重染色結果と抗 ChAT 抗体を用いた IHC 結果並びに MSI を用いた ChAT 反応の分布が示されている．LFB 染色と HE 染色の結果から脊髄の断面に特徴的なバタフライ様の灰白質が露わになっている．また IHC の結果より前根（ventralroot）と前 角（anterior horn）で ChAT 陽 性 部 位 が染色されていることがわかる．これらの結果と MSI による
ChAT 反応の結果を見比べると前根と前角で ChAT 反応
図 4. ショウジョウバエにおけるアセチルコリンエ

ステラーゼ活性分布．異種動物であるショ

ウジョウバエにおいても本法は適用可能であり，脳および腹部において酵素活性を認めた．特に腹部においては，可溶型酵素活性を検出していることになり，既存の手法では達成困難であった可視化が本法で達成できた．( 文献 3 の図を改変 )が亢進していることがわかる．また，各部位による ChAT
反応を定量化したバーグラフにおいても anterior horn とventral root で反応が最大である一方，白質では強度が低いことがわかる．
IHC 染 色 結 果と MSI の 結 果 を 見 比 べると IHC でChAT が陽性ではない，前根と前角をつなぐ間でも酵素反応が起きていることがわかる．すなわち，IHC の結果とChAT 可視化の結果で矛盾が生じていることになる．これ12

総説－質量分析イメージングを用いた酵素組織化学

Enzyme histochemistry using mass spectrometry imaging

について筆者は，IHC では染めることができない可溶型担っていると考えられている．また，GABA 高含有食品

ChAT の分布が MSI の結果では描出されているものと考が注目されており，大豆などのマメ科植物の発芽種子はえている．実際，ヒトの脊髄では前根と前角をつなぐ間で

GABA 高含有食品として流通している．以上の点から，

可溶型 ChAT が存在することが報告されている．

発芽過程における GABA 生合成に関わる GAD 酵素の局在の分布の理解は，発芽過程における GAD が植物種

マメ科植物と大麦における GAD 反応の分布
これまで哺乳類や昆虫を中心として酵素反応の分布を子の発芽過程にどのように寄与しているかの解明にもつながると考えられる．

示してきたが，本手法は植物に対しても適用可能であるとGAD 可 視 化ではグルタミン酸 -d3 を基 質として，そいう特徴がある．アミノ酸の一種であるγ -aminobutyric

れが酵素反応で変換される GABA-d3 を検出している．

acid（GABA）を L- グルタミン酸から脱炭酸反応によっ

GAD の可視化にあたり，反応時間の検討，反応温度のて生成する反応を触媒する酵素である GAD 反応の分布

検 討 及び反 応 溶 媒 pH の検 討を行い，それぞれ 3 分，について紹介する．GABA はすでによく知られている分子

60℃および pH5.8 とした．この最適条件のもとで発芽大であるが，この分子の生合成の理解は食品化学の分野に

豆種子の GAD 反応を可視化した結果を図 7 に示す．図おいても植物生理学の分野においても重要である．特に，7A で見られるように GABA-d3 強度は子葉部で極めて低植物体内において GABA はシグナル伝達，pH の調整，く，胚軸部で高い強度を示した．特に，胚軸部において

C/N 比の調整，生物的 / 非生物的なストレスへの応答なは子葉部とは反対側の先端部において高い強度を示すとどの役割を担っている 11）．またダイズ 12），イネ 13），オオ

いう結果が得られた．この結果より発芽種子においては子

ムギ 14）などの様々な植物の発芽段階で増加することが報葉部ではなく主に胚軸部において GAD 活性が高かったと告されており，GABA は種子発芽段階にも重要な役割を考えられる．

図 6. マウス脊髄における組織染色結果と ChAT 反応分布ならびに反応強度比較結果．MSI による ChAT 反応
分布の結果より前根と前角を結ぶ領域（矢頭）でも酵素反応が起きていることがわかる．IHC の結果で陽性部位でないことから，この反応を担う ChAT は IHC で染めることができない可溶型 ChAT であることが考えられる．スケールバー：500 µm .（GM：灰白質，WM：白質，AH：前角，PH：後角，VR：前根）

13

総説－質量分析イメージングを用いた酵素組織化学

Enzyme histochemistry using mass spectrometry imaging

図 7A に示した発芽種子全体の分布の中で，胚軸部に時間の検討，反応温度の検討及び反応溶媒 pH を検討し，おいて組織学的な構造に由来する分布の偏りが見られた．

その結果ダイズ種子と同じ条件であることを確認し，測定

このことから，胚軸部において高解像度分析を試みた（レを進めた．最適条件下での測定結果を図 8 に示す．図ーザー照射間 15 μ m）．分析した結果を図 7B に示した．

8A は発芽段階における GAD 反応分布変化であり，図

この分布結果から , 胚軸内の Vascular system と Root

8B はアリューロン層における GAD 反応分布の高解像

meristem で高い強度で GABA-d3 が分布していること

度測定結果である．図 8A より塩分ストレス条件下ではが認められた一方，Root parenchyma ではこれら 2 領

播種後 12 時間で胚における GAD 反応が亢進しており，域に比べて GABA-d3 の強度が低かった．この結果は，

48 時間まで高い強度が保たれている．また胚乳においてMSI を用いた高解像度測定により初めて明らかになったも，塩分ストレス下では GAD 反応が亢進する傾向にある事実である．

ことがわかる．さらに 12 時間の時点で特筆すべき点とし

本節の冒頭で，オオムギの発芽段階でも GAD が増加て，塩分ストレスにより最外層のアリューロン層においてすることを述べたが，その反応の強さも可視化することがGAD 反応が亢進していることである．アリューロン層での可能である．以下では最後に，オオムギの発芽において高解像度測定結果を図 8B に示したが，外層の形状に沿塩分ストレスを与えた場合の有無で GAD 反応がどのようって GAD 反応が亢進していた．

に変わるかを調べた結果を示す．オオムギにおいても反応

図 7. 発芽大豆における GAD 反応可視化結果．（A）pH 5.8, 60℃，反応時間 3 分での GABA-d3 分布．最適条件で MSI を行うことで発芽ダイズ切片において胚軸部でイオンの蓄積が見られた．（B）ダイズ種子胚軸部での高解像度イメージング結果．スケールバー：（A）3 mm，（B）1 mm .（文献 5 の図を改変）

図 8. 塩分ストレス下における発芽オオムギ中の GAD 反応分布可視化結果．（A）播種後 48 時間までの反応
分布の時間経過．（B）アリューロン層における GAD 反応分布．スケールバー：（A）1 mm，（B）200µm .（文献 6 の図を改変）

14

総説－質量分析イメージングを用いた酵素組織化学

Enzyme histochemistry using mass spectrometry imaging

まとめ

seeds. J Biosci Bioeng. 134, 356 (2022)

本研究によって，MSI を応用した酵素組織化学法に

6） Ikuta S, Fukusaki E, Shimma S. Visualization

よって哺 乳 類，ショウジョウバエ， 植 物 種 子におけるof Glutamate Decarboxylase Activity in

AChE，ChAT および GAD 反応の局在を可視化するこ

Barley Seeds under Salinity Stress Usingとに初めて成功した．MSI を用いた酵素組織化学により，Mass Microscope. Metabolites. 12, 1262

これまで見ることができなかった酵素の働きが可視化でき(2022)

るようになり，それが生体内の様々な部位に局在している

7） S h i m m a S , T a k a s h i m a Y, H a s h i m o t o J ,ことが明らかになった．まだまだ解決するべき課題は多い

Yonemori K, Tamura K, Hamada A. Alternative

が，現在筆者のグループではストレスマウス脳内におけるtwo-step matrix application method for

GAD 反応の可視化や生鮮食品の褐変現象の理解のため

imaging mass spectrometry to avoid tissueのチロシナーゼ反応可視化手法について取り組んでいる．

shrinkage and improve ionization efficiency. J

様々な酵素反応が本手法で可視化できるよう，今後も研Mass Spectrom. 48, 1285 (2013)

究開発を継続していきたいと考えている．

8） Toutant, J. P., Insect acetylcholinesterase:
catalytic properties, tissue distribution and

参考文献

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decarboxylase activity in germinating legume14） AL-Quraan N., AL-Ajlouni Z., and Obedat

15

総説－質量分析イメージングを用いた酵素組織化学

Enzyme histochemistry using mass spectrometry imaging

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seeds of wheat (Triticum aestivum L.) andb a r l e y (Hordeum vulgare L . ) u n d e r s a l t
stress, Seed Sci Res., 29, 250 (2019)

16

総

説

メンブレンコンタクトにおける脂質交換輸送
中 津

イントロダクション

史（PI4P）はより広く分布している．ホスファチジルイノシト

脂質は，細胞膜やオルガネラ膜などの生体膜の構成要ール -3,4,5 トリスリン酸（PI（3,4,5）P3）も主に細 胞

素としてだけでなく，エネルギー産生，シグナル伝達，膜膜に分布しているが，特定の条件下で局所的にそのレベ輸送など，様々な重要な役割を担う．真核生物において，ルが一時的に増加する．また，ホスファチジルイノシトー

多くの脂質は小胞体で合成され，その後細胞内の様々なル -3 リン酸やホスファチジルイノシトール -3,5 ビスリン酸

場所へ輸送されることで正しく機能する 1）．ひとたび脂質（PI（3,5）P 2）は，それぞれエンドソームやリソソームの輸送や分布に異常をきたすと，細胞機能は滞り，細胞に多く存在する．このような各イノシトールリン脂質種に特は病に陥る．つまり，多様で複雑な脂質の機能は，その異的な細胞内分布は，イノシトールリン脂質キナーゼやホ輸送システムに大きく依存している．

スファターゼなどによる時間・空間的な制御で作り出され細胞内における脂質輸送には，小胞輸送を介した膜輸る（図 1B および C）．そして，これが細胞膜やオルガネ

送による機構と，輸送小胞によらない機構に大別される．

ラ膜に “ 個性 ” を与え，各生体膜で起こる様々な生体反近年の研究から，細胞内脂質分布の制御には後者の小応の時間・空間的な制御を可能にしている 4）．

胞輸送非依存経路が重要な役割を担っていることが明らかになりつつある．特に，オルガネラ同士が部分的に接す

PI4P の機能と制御る特殊な領域を介して脂質が輸送小胞非依存的に輸送さイノシトール環の４位にリン酸化された PI4P は，真核れている実体も明らかになりつつある．本総説では，細胞生物において最も豊富なイノシトールリン脂質の一つであ

内脂質輸送の制御と機能について，特に筆者が着目しているイノシトールリン脂質によるオルガネラ間脂質輸送を中心に概説したい．
細胞機能を支えるイノシトールリン脂質
イノシトールリン脂質はリン脂質の一種であり，細胞内の総リン脂質の 10 〜 15％程度を占める 2）．頭部には細胞質に露出したイノシトール環を持ち，その 3 位，4 位，または 5 位に可 逆 的にリン酸 化・ 脱リン酸 化 修 飾を受け，7 種の異なるイノシトールリン脂質種が生成される 3）（図 1A）．これらのイノシトールリン脂質は，細胞内の異なるコンパートメントに異なる濃度で分布している 4）（図1B）．例えば，ホスファチジルイノシトール -4,5 ビスリン酸（PI（4,5）P2）は細胞膜に豊富に存在するが，その主要な前駆体であるホスファチジルイノシトール -4 リン酸

図１：イノシトールリン脂質（A）イノシトールリン脂質の化学構造（B）真核生物におけるイノシトールリン脂質の分布（C）イノシトールリン脂質キナーゼ・ホスファターゼにより産生されるイノシトールリン脂質群

新潟大学大学院医歯学総合研究科分子細胞機能学17

総説－メンブレンコンタクトにおける脂質交換輸送

る．その新規合成は，基質であるホスファチジルイノシト

胞形成異常やアクチン骨格形成異常等）が見られたことール（PI）のイノシトール環の４位をリン酸化するホスフから，PI4KIII αは細胞膜 PI（4,5）P2 の前駆体であるァチジルイノシトール 4 キナーゼ（phosphatidylinositol

PI4P の合成に必須であることが示された．また，PI4KIII

4-kinase: PI4K）によって媒 介される 3）． 哺 乳 動 物でα欠損細胞では，細胞膜コレステロールの減少や細胞膜は，２つの III 型 PI4Ks（PI4KIII αと PI4KIII β）およ

局在分子の異所性局在化が生じたことから，PI4KIII αにび２つの II 型 PI4Ks（PI4KII αと PI4KII β）の計４つより合成される PI4P は，細胞膜のアイデンティティ確立にの PI4Ks が存在する 5）．I 型 PI4K も以前には存在した

重要な役割を担っていることが明らかとなった 6）．さらに，が，その後の機能解析から 3 位をリン酸化する酵素（つ酵母 sfk1 のオルソログである TMEM150A も PI4KIII α

まり PI3K）であることが判明したため，現在は存在しない．

の機能制御に関与していることが判明した 7）．現在では，

PI4P の細胞内分布は，それぞれの PI4Ks の局在およびPI4KIII αは EFR3A/B，TTC7A/B，TMEM150A およ

作用部位によって決定される．PI4P は主に細胞膜，ゴルび FAM126A/B と複合体を形成することで細胞膜 PI4P

ジ体，およびエンドソーム / リソソームに分布しており，こ合成を制御していることが明らかになっている（図 3 参照）．

れらの PI4P プールはそれぞれ PI4KIII α，PI4KIII β，および PI4KII αまたは PI4KII βによって合成される．
PI4P の機能や制御については，PI（4,5）P2 に比べ大きく遅れていた．特に細胞膜においては，その主な機能は PI（4,5）P2 の前駆体としての役割だと信じられていた．しかし筆者は，豊富に存在することには何か理由があり，PI（4,5）P2 の前駆体としての機能以外に重要な役割があるはすだと考え，まずは細胞膜における合成メカニ
ズムの解明に着手した．研究開始当時，哺乳動物細胞における細胞膜の PI4P 合成メカニズムはほとんどわかっていなかった．酵母を用いた遺伝学的解析から，酵母ではstt4 が細胞膜 PI4P 合成に必須の PI4K であることが知られており，その哺乳類オルソログである PI4KIII αが哺乳動物細胞においては細胞膜 PI4P 合成を担うと予想されていた．ところが実際には，PI4KIII αの細胞膜局在を示す証拠が得られず，代わりに小胞体，ゴルジ体もしくは核に局在する等の諸説が提唱されていたことから，哺乳動物細胞における PI4P 合成機構は大きな謎に包まれていた．筆者はこの重要課題に取り組み，それまで開始コドンであると信じられていたメチオニンをコードする部位が
実は開始コドンではなく，それまでの全長 cDNA には N
末端側 59 アミノ酸をコードする配列が欠けていたことを見出した．さらに新たな PI4KIII α結合分子群（EFR3A/

図２：オキシステロール結合タンパク質ファミリー
哺乳類におけるオキシステロール結合タンパク質フ
ァミリーは１２分子種から構成され，脂質輸送ドメインである ORD を共通機能ドメインとして有する．その他，膜結合に必要な PH ドメイン，VAP タンパク質との結合に必要な FFAT モチーフや，小胞体膜にアンカーされる膜貫通領域を有する．
P H , p l e c s t r i n h o m o l o g y ; F FAT, t w o

B および TTC7A/B）を同定し，全長 PI4KIII αは新規

phenylalanines (FF) in an acidic tract;

結合分子群と複合体を形成することで細胞膜に局在するこORD, oxysterol-related domain; TM,とを示した．機能的には，PI4KIII α欠損細胞において，

transmembrane

細胞膜 PI（4,5）P2 欠損に伴う異常（クラスリン被覆小18

総説－メンブレンコンタクトにおける脂質交換輸送

PI4P の新機能：メンブレンコンタクトを介した脂質交換輸送性を有することは示されてはいたが，他の脂質がリガンド

前述の PI4KIII αによる細胞膜 PI4P 合成制御機構をとなり得ることや，交換輸送する活性があることは知られ調べる過程で，興味深い知見を得た．小胞体の Ca2+ レておらず，この研究は大きな衝撃を与えた 9）．

ベルが低下すると，小胞体におけるカルシウムセンサーでそこで筆者らは，細胞膜 PI4P が ORP ファミリーによある STIM1/2 がこれを検知してオリゴマー化し，細胞膜

る脂質輸送制御に関与するのではないかと考え，哺乳動流入を物の ORP ファミリーの局在を詳細に検討した．すると，促進して小胞体へ Ca 2+ を補充する機構（store-operated

ORP5 および ORP8 が小胞体と細胞膜が近接したメンブ

Ca2+ entry: SOCE）が存在する．PI4KIII α欠損細胞

レンコンタクト，すなわち小胞体―細胞膜コンタクトに局在では，この SOCE がうまく作動しないことを見出した 6）．

することを見出した．ORP5 および ORP8 は ORP ファミ

SOCE の際には小胞体と細胞膜が近接する “ メンブレン

リーの IV 群に属し，ドメイン構造の特徴が類似している

コンタクト ” が形成されることから，細胞膜 PI4P は小胞（図 2）．両タンパク質ともに PH ドメイン，リンカー領域，

体と細胞膜のメンブレンコンタクト形成に何らかの役割がリガンド結合領域である ORD，および膜貫通ドメインをあるのではないか，と考えた．

有する．種々の解析から，ORP5 および ORP8 の膜貫通

カルシウムチャネル Orai1 に結合することで Ca

2+

これと並 行して，PI4P が 関 与するもう１つの興 味 深

ドメインは小胞体にアンカーされること，そして PH ドメイ

い知 見 が 報 告された．オキシステロール結 合タンパク

ンが細胞膜の PI4P（および PI（4,5）P2）を認識して細質（oxysterol-binding protein-related proteins:

胞膜と結合することで小胞体と細胞膜を近接させ，メンブ

ORPs）ファミリー（図 2）は，真核生物に高度に保存

レンコンタクトを形成することが判明した．さらなる詳細なされた脂質転送タンパク質（Lipid transfer proteins:

解析から，ORP5 および ORP8 は PI4P とホスファチジル

LTPs）である 8）．酵母には７遺伝子，哺乳動物には１２

セリンの２つの脂質をリガンドとすること，そしてこの２種

遺 伝 子 が 存 在する． 酵 母 osh4 をモデルとした解 析かの脂質を交換輸送する活性を有することを見出した．実ら，osh4 はコレステロールと PI4P を in vitro で交換輸際に ORP5 および ORP8 機能欠損細胞では細胞膜 PI4P

送する活性があることが示された．それまで osh4 を含む

レベルが上昇するとともにホスファチジルセリンレベルは減少

ORP ファミリーはステロールを（一方向に）輸送する活する．また PI4KIII α欠損細胞においても，ホスファチジル

図３：小胞体―細胞膜コンタクトにおける ORP5 および ORP8 による脂質交換輸送（A）メンブレンコンタクト（赤）とは，細胞膜やオルガネラ同士が 10-30nm 程度の距離で近接した領域を指す．
小胞体はほとんど全てのオルガネラや細胞膜とメンブレンコンタクトを形成する．
（B）ORP5 および ORP8 は，細胞膜で合成された PI4P に結合して小胞体―細胞膜コンタクトを形成する．そして細胞膜から PI4P を小胞体へ輸送し，小胞体から細胞膜へホスファチジルセリンを輸送する．これは，細胞膜と小胞体の間に形成された PI4P の濃度勾配により駆動することから PI4P 駆動型脂質交換輸送と呼ばれる．
詳細は本文参照．

19

総説－メンブレンコンタクトにおける脂質交換輸送

セリンレベルの減少が脂質分析から明らかになった 10）．

質である可能性が示唆されていた．このことから，“PI4P

これらの結果から，ORP5 および ORP8 は小胞体―細胞濃度勾配が駆動する脂質交換輸送 ” メカニズムは，ORP

膜コンタクトを介して PI4P とホスファチジルセリンを交換輸

ファミリーに共通した特性である可能性が考えられた．そ送していることが判明した（図 3）．ORP5 および ORP8 は，

こでこの仮説を検証するため，PI4P が存在するにもかかまず PH ドメインによる細胞膜 PI4P との結合を介して小胞

わらず脂質交換輸送が証明されていないオルガネラであ

体と細胞膜をテザリングすることでメンブレンコンタクトを形るエンドソームに着目した．エンドソームに局在する ORP

成し，PI4KIII αにより合成された PI4P を細胞膜から小胞ファミリー分子を様々なエンドソームマーカーを指標に探体に輸送する．そして今度は小胞体で合成されたホスファチ

索したところ，機能未知である ORP10 がエンドソームに

ジルセリンを受け取り，これを細胞膜へと逆輸送する．この

局在することが判明した．さらなる細胞内局在解析から，

ように，PI4P が細胞膜から小胞体へと流れることで，ホスフ

ORP10 は Rab7 陽性エンドソームに強く局在すること，まァチジルセリンの小胞体から細胞膜への輸送が促進される．

た ORP10 によるエンドソーム局在は，自身の PH ドメイン

つまり，ORP5 および ORP8 によるホスファチジルセリンのによる PI4P の認識が重要であることも判明した．

輸送は，PI4P が駆動していたのである 10）．
では，この脂質の輸送の方向性はどのようなメカニズ

ORP10 の局 在 解 析において，ORP10 陽 性のエンド

ムで説明されるだろうか？それは PI4P が鍵となっている．

ソームの多くは小胞体に近接していた．そこで，ORP10

PI4P は細胞膜に豊富に存在する．これは，細胞膜に局が小胞体―エンドソームコンタクトに局在する可能性とそ

在する PI4KIII αの作用による．一方で小胞体には PI4Pの分子機構の解明を試みた．ORP ファミリー分子の多くはほとんど存在しない．これは小胞体に局在する PI4P 脱は，FFAT モチーフと呼ばれる小胞体タンパク質・VAPA/

リン酸化酵素（Sac1）の作用による．つまり，細胞膜とVAPB 結合モチーフを介して小胞体に局在する．しかし，小胞体の間には PI4P の濃度勾配が存在し，PI4P は細ORP10 のアミノ酸配列を解析したところ FFAT モチーフ様胞 膜（＝高 濃 度 PI4P）から小 胞 体（= 低 濃 度 PI4P）

配列の存在は確認できなかった．そこで，ORP10 は他のへと一方向に輸送される．これが，ホスファチジルセリン

タンパク質に結合することでメンブレンコンタクトに局在すの逆向きの輸送，つまり小胞体から細胞膜への輸送方向る可能性を想定し，ORP10 結合タンパク質を生化学的を決定する，というモデルである（図 3）．このモデルは，『細手法により網羅的に探索したところ，その筆頭候補分子と胞膜で合成された PI4P を，なぜわざわざ小胞体へ輸送

して ORP9 を得た．ORP9 は FFAT モチーフを有しておして代謝しているのか』という別の疑問も説明できる．すり，VAP タンパク質と結合することが知られていたことから，

なわち，小胞体から細胞膜へホスファチジルセリンを輸送

ORP10 は ORP9 に結合することで ORP9 と共に小胞体する駆動力を生み出すために，小胞体における PI4P レベ―エンドソームコンタクトに局在する可能性が示唆された．

ルを低く保つための戦略と考えられる 11）．

そこで ORP10，ORP9 および VAPB の局在を調べたとこ
ろ，これら３者は共局在し，小胞体―エンドソームコンタク

小胞体―エンドソームコンタクトにおける PI4P/ ホスファ
チジルセリン交換輸送

トを形成した．ORP10 の小胞体―エンドソームコンタクト
局在における ORP9 依存性を調べるため，ORP9 欠損細前述のとおり，哺乳動物において ORP ファミリーは 12胞を樹立して ORP10 の局在を調べたところ，予想どおり

種存在するが，細胞内における脂質交換輸送活性が証明さ

ORP10 の小胞体―エンドソームコンタクトへの局在が消失れているのは OSBP（小胞体―ゴルジ体間コンタクト）12），した．これらの結果から，ORP10 は自身の PH ドメインに

ORP5 および ORP8（小胞体―細胞膜間コンタクト）10）

よる PI4P 認識と，ORP9 への結合に依存して，小胞体―のみであった．ORP ファミリーの脂質輸送ドメインの構造

エンドソームコンタクトに局在することが明らかになった．

予測解析から，全ての ORP ファミリーの脂質輸送ドメインには共通して PI4P が結合する可能性が高いことが報告さ

ORP10 は PI4P とホスファチジルセリンを交換輸送するれており，PI4P は ORP ファミリーに共通したリガンド脂ORP10 は，脂質輸送ドメインでホスファチジルセリンに20

総説－メンブレンコンタクトにおける脂質交換輸送

結合することは報告されていたが，もう一つのリガンド脂ームのホスファチジルセリン量が顕著に減少していたことか

質は未同定であった．そこで，まず ORP10 のリガンド脂

ら，ORP10 はホスファチジルセリンをエンドソームに正常質の同定を試みた．ORP10 の脂質輸送ドメインを培養細に供給するのに必須であることが判明した．ところが，エ胞から精製し，どのようなリガンド脂質を包含しているかを

ンドソームの PI4P 量は，欠損細胞とコントロール細胞で質量分析により解析したところ，PI4P がリガンド脂質とな差が見られなかった．この原因は ORP9 であると考えらることを突き止めた．そこで，人工脂質二重膜（リポソーム）

れた．つまり，ORP9 は PI4P 輸送活性が認められていを用いた in vitro 脂質交換輸送アッセイにより ORP10ることから，ORP10 欠損細胞においてエンドソーム PI4Pの脂質交換輸送活性を検討したところ，ORP10 は PI4P

量に変化がないのは ORP9 による機能補償のためであるとホスファチジルセリンを交換輸送する活性を有することと予想した．事実，ORP9 欠損細胞におけるエンドソーが確認された．さらに，培養細胞内における脂質交換輸

ム PI4P 量は，コントロール細胞に比べて増加していた．

送活性を，ラパマイシンを用いたヘテロ２量体化法によりしたがって，ORP10 は小胞体―エンドソームコンタクトに

メンブレンコンタクトを化学ツールにより操作することでイ

おいて，エンドソームの PI4P を小胞体へ輸送すると同時メージング評価したところ，ラパマイシン添加によりエンドに，小胞体からホスファチジルセリンをエンドソームへ交

ソーム膜の PI4P は徐々に減少する一方，ホスファチジル

換輸送していることが明らかになった．

セリンは上昇した．このことから，ORP10 は小胞体とエン
ドソーム間のメンブレンコンタクトにおいて PI4P とホスフ

ORP10 による脂質交換輸送は，エンドソームにおける逆行輸送を制御するァチジルセリンを交換輸送する活性を有することが示唆さ

最後に，ORP10 による PI4P とホスファチジルセリンのれた．

交換輸送が担う細胞機能を解析した．ORP10 欠損細胞
ではエンドソームのホスファチジルセリン量が減少していた

さらに，ORP10 欠損細胞を用いて ORP10 の脂質交ことから，ホスファチジルセリンに依存してエンドソームに換輸送能を検証した．ORP10 欠損細胞では，エンドソ

局在するエンドソームタンパク質分子の局在異常が予想さ

図４：小胞体―エンドソームコンタクトにおいて ORP10 が制御する脂質交換輸送
ORP10 は，ORP9 に結合することで小胞体―エンドソームコンタクトを形成し，エンドソームから PI4P を輸送することで，ホスファチジルセリンをエンドソームへ供給する役割を担う．これにより，EHD1 をエンドソームにリクルートして，エンドソームを介した逆行性膜輸送を制御する．

21

総説－メンブレンコンタクトにおける脂質交換輸送れた．そこで，EHD1（ホスファチジルセリン依存的にエン

謝辞

ドソームに局在する AAA ATPase）に着目してその局在を今回紹介した研究は，多くの共同研究者やスタッフの方々

調べたところ，ORP10 欠損細胞ではそのエンドソーム局在のご協力のもとに行われたものです．この場を借りて深く感が減少していた．EHD1 は，エンドソームからトランスゴル

謝いたします．また，ORP10 に関する研究は（公財）日ジ網への逆行輸送の際にエンドソーム膜の分裂を促進する

本応用酵素協会による援助のもとに行われました．この場

ATPase であることが報告されている．そこで ORP10 欠損を借りて感謝申し上げます．

細胞におけるエンドソーム膜分裂をライブイメージングにより定量解析したところ，ORP10 欠損細胞ではエンドソーム

参考文献

膜の分裂に要する時間がコントロール細胞に比べて顕著に

1） van Meer G., . et al.:.. Membrane lipids: where

増大していた．事実，逆行性輸送制御を受けることが知ら

they are and how they behave. Nat. Rev. Mol.

れているカーゴ受容体であるマンノース 6 リン酸受容体の輸

Cell Biol . 9 112（2008）.

送を調べたところ，ORP10 欠損細胞ではトランスゴルジ網

2） Vance J. E.. Phospholipid synthesis andへの輸送が遅延しており，内在性のマンノース６リン酸受容transport in mammalian cells. Traffic 16 1

体はエンドソームに異常蓄積していた．

（2014）.

以上の結果から，ORP10 は PI4P の濃度勾配を利用し

3） Balla T. Phosphoinositides: tiny lipids with

た脂質交換輸送活性によりエンドソームへホスファチジルセ

giant impact on cell regulation. Physiol. Rev .

リンを供給することで EHD1 をリクルートし，エンドソーム

93 1019（2013）.

からトランスゴルジ網への逆行輸送を制御することが判明した 13）（図 4）4） Di Paolo G., De Camilli P. Phosphoinositides
in cell regulation and membrane dynamics.

Nature 443 651（2006）.
おわりに5） B a l l a A . , B a l l a T. P h o s p h a t i d y l i n o s i t o l

PI4P は細胞膜，ゴルジ体，エンドソーム・リソソーム

4-kinases: old enzymes with emergingなど広範に分布し，量的にも豊富に存在するが，その意

functions. Trends Cell Biol . 16, 351（2006）.

義は十分にわかっていなかった．また，PI4P はこれら細6） Nakatsu F., et al. PtdIns4P synthesis by

胞膜やオルガネラ膜で合成された後に，小胞体へ輸送さ

PI4KIII α at the plasma membrane and its

れて分解される意義も不明であった．しかし，PI4P が駆

impact on plasma membrane identity. J. Cell

動するメンブレンコンタクトを介した ORPs による交換輸

Biol . 199 1003（2012）.

送制御の実体が明らかになり，その謎の一部が解けた．

7） C h u n g J e t a l . , P l a s t i c i t y o f P I 4 K I I I α

つまり，PI4P はメンブレンコンタクトを介して小胞体へ輸interactions at the plasma membrane.EMBO

送されることで自身の代謝経路が構築されており，これがRep . 16 312（2015）.

小胞体で合成された脂質を細胞内各所に分配する駆動力

8） Raychaudhuri S., Prinz W. A. The diverse

として利用されていたのである 11）．そしてこの交換輸送シ

functions of oxysterol-binding proteins. Annu .

ステムを作動させるために，PI4P は広範な膜に豊富に存Rev. Cell Dev. Biol . 26, 157（2010）.

在するのかもしれない．しかし一方で，不明な点は実に多9） de Saint-Jean M., et al. Osh4p exchanges

い．メンブレンコンタクトの時空間制御，輸送される脂質

sterols for phosphatidylinositol 4-phosphate

種や輸送制御機構，生理機能や疾患との関わりなど，解between lipid bilayers. J. Cell Biol . 195 965

明しなければならない多くの課題が次々と見えてきた．自（2011）.

分らしいアプローチと視点で，これらの課題に正面から挑んでいきたい．

10） Chung J., et al. Intracellular transport. PI 4P/
phosphatidylserine countertransport at ORP5and ORP8-mediated ER-plasma membrane22

総説－メンブレンコンタクトにおける脂質交換輸送

contacts. Science 349, 428（2015b）.
11） N a k a t s u F, K a w a s a k i A , F u n c t i o n s o f
Oxysterol-Binding Proteins at Membrane
Contact Sites and Their Control by
Phosphoinositide Metabolism. Front Cell Dev

Biol . 9, 664788（2021）.
12） Mesmin B., et al.. A four-step cycle driven by
PI（4）P hydrolysis directs sterol/PI（4）P
exchange by the ER-Golgi tether OSBP. Cell
155, 830（2013）.
13） Kawasaki A et al., PI4P/PS countertransport by
ORP10 at ER-endosome membrane contact sites
regulates endosome fission. J. Cell Biol . 221 ,e202103141（2022）.

23

酵素情報

CD38とBST1
夜

久

圭

介，中 川

【はじめに】

崇【CD38 と BST1 の酵素活性】

老 化 制 御に関 連する分 子として， 近 年 補 酵 素である

哺乳類 CD38 の酵素活性はアメフラシの ADP-ribosyl

nicotinamide adenine dinucleotide（NAD+）が注目

cyclase とのアミノ酸 配 列 の 相 同 性 から見 出され た．

を集めている．NAD は補酵素としてさまざまな代謝経路

ADP-ribosyl cyclase と同様に，CD38 は NAD+ を分解を制御するだけでなく，タンパク質の翻訳後修飾や DNAし，cyclic ADP-ribose（cADPR）とニコチンアミドを生修復過程，mRNA の修飾など多様な生理機能を有して成する．また，CD38 は cADPR を加水分解し，ADPRいる．一方で，体内の NAD+ 量は加齢に伴って減少するに変換する酵素活性を有している 1）．一方で，CD38 はことが知られており，NAD+ 量の減少は NAD+ 依存的な酸性条件下において NAD+ phosphate（NADP+）の分過程の破綻からさらなる老化を引き起こすと考えられてい子内のニコチンアミドをニコチン酸に置換し，nicotinic

る．この NAD+ 減少には，NAD+ 分解酵素である CD38

acid adenine dinucleotide phosphate （NAADP）の関与が示唆されている．また，CD38 にはパラログであを合成する塩基交換反応を触媒する．CD38 によって生る Bone marrow stromal antigen 1（BST1）が存在

じる cADPR と NAADP はいずれも，細胞質へのカルシ

し，CD38 と BST1 は加齢や炎症によってその発現が上

ウムイオンの動員を促進すると考えられている．

+

昇し，NAD の分解を促進すると考えられている．本稿でBST1 は関節リウマチの骨髄間質細胞に高発現し，前は，CD38 と BST1 について，その機能や生理的役割，

駆 B 細胞の増殖を促進する因子として同定された．BST1

疾患との関わりについて概説する．

は CD38 の パラログ であり，CD38 と同 様 に BST1 は+NAD+ から cADPR を合成するとされていたが，CD38 と図 .CD38 と BST1 の酵素活性24

CD38とBST1

比較してその活性は非常に低いと考えられていた．近年，

Phenotype（SASP）因子によって誘導される 3）．実際

筆 者らは，CD38 は cyclase 活 性をもつものの，BST1に老化に伴って CD38 の発現は増加し，NAD + 量の減はほとんど活 性を示さないことを報 告した 2）． 一 方で，少を引き起こす．一方で CD38 の阻害剤の投与は NAD +BST1 は NAD+ 代謝の中間代謝物である nicotinamide

量を回復させ，老化による耐糖能異常や筋機能の低下を

riboside（NR） に 対 する 分 解 活 性 を 示した． また，改善することが報告されている 4）．CD38 の欠損や阻害

BST1 は単に NR を分解するだけではなく，NR とニコチの有効性は他の疾患に対しても検討されており，食事誘

ン酸を用いて nicotinic acid riboside（NAR）を合成

導性の肥満や，アルツハイマー病，虚血性心疾患，閉塞する塩基交換反応を触媒する活性を有していた 2）．CD38

性腎疾患，関節リウマチなどに対して効果的であることがは酸性下で塩基交換反応を行うため，生体内で本反応が報告されている．

機能する場所は限られるが，BST1 は中性付近で高い塩

BST1 は小腸に強く発現しており，陰窩における発現

基交換活性を有しており，生体内の様々な場所で本反応はカロリー制限によってさらに誘導される．誘導されたを行うと期待される．

BST1 は cADPR の産生を介して腸幹細胞の機能を調節すると考えられている 5）．また，パーキンソン病患者を対【CD38 と BST1 の組織局在】象としたゲノムワイド関連解析から，BST1 のイントロンに

CD38 は胸腺やリンパ節，骨髄などの免疫組織に強くおける SNP がパーキンソン病発症リスクと関わっているこ

発現している．ヒトでは脳や筋肉にも強い発現が認められとが見出された 5）．さらに，BST1 欠損マウスは不安や抑ており，脳ではアストロサイト，筋肉では平滑筋細胞に発鬱様行動を取ることが報告されている 5）．これらの知見か現している．CD38 はその他の組織にも偏在しており，主ら，BST1 が脳機能に関わっていることが示唆されるが，に組織中の T 細胞や B 細胞といった免疫細胞に発現する

BST1 がどのようにこれらの症状を引き起こすかについて

ほか，筋組織や腺組織中の線維芽細胞に存在している．

は不明である．また，BST1 は CD38 と同様に免疫細胞

また，マウスでは大腸に強く発現しており，炎症性腸疾患に発現し，老化や炎症によってその発現が誘導される．

との関与が示唆されている．

BST1 の遺伝子欠損は虚血性腎障害に対して保護的であ

一方，BST1 は CD38 と同様に骨髄に発現するが，ヒトとマウスのいずれにおいても消化管，特に小腸の上皮ることが報告されており，BST1 が炎症の進行に関わっていると考えられる．

細胞に強い発現が見られる．さらにヒトでは脳のオリゴデ

このように，CD38 と BST1 はいずれも，炎症によってンドロサイトやミクログリア，気管支の繊毛細胞，腎臓の免疫細胞中で誘導される酵素であり，今後，炎症性疾患

近位尿細管細胞，結腸のゴブレット細胞やパネート細胞，

をはじめとしたさまざまな疾患の治療標的としての開発が胎盤のホフバウアー細胞，精巣のセルトリ細胞，その他各期待される．

組織の平滑筋や線維芽細胞，免疫細胞に BST1 が発現している．また，BST1 は血管内皮幹細胞や胎児期の視【参考文献】

床下部への発現が確認されており，組織の分化や発生と

1）Takasawa, S. CD38-Cyclic ADP-Ribose Signalの関わりが示唆されている．

System in Physiology, Biochemistry, andPathophysiology. Int J Mol Sci . 2022; 23【CD38 と BST1 の生理機能】

2）Yaku, K et al .: BST1 regulates nicotinamide

CD38 の cyclase 活 性は膵 臓のインスリン分 泌 機 構

riboside metabolism via its glycohydrolaseに関 与していると考えられ，CD38 を介したカルシウムand base-exchange activities. Nat Commun .

動員がインスリン分泌を促進することが報告されている

2021; 12: 6767.

．また， 近 年では CD38 の阻 害による NAD+ 量 増 加3 ） C h i n i , C C S et al . : C D 3 8 e c t o - e n z y m e i nの有効性が注目を集めている．CD38 の発現は IL-6 や

immune cells is induced during aging and

TNF- αとい っ た Senescence Associated Secretory

regulates NAD（+） and NMN levels. Nat

1）

25

CD38とBST1

Metab . 2020; 2: 1284-1304.
4）Tarragó, MG et al .: A Potent and SpecificCD38 Inhibitor Ameliorates Age-Related
Metabolic Dysfunction by Reversing Tissue
NAD（+） Decline. Cell Metab . 2018; 27:1081-1095.e1010.
5）Yokoyama, S. Genetic polymorphisms of bonemarrow stromal cell antigen-1（BST-1/CD157）: implications for immune/inflammatory
dysfunction in neuropsychiatric disorders.

Front Immunol . 2023; 14: 1197265.
【著者】
富山大学学術研究部医学系
夜久

26

圭介，中川

崇

分子医科薬理学講座

ポリラクトサミン糖鎖生合成を調節する β1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素

酵素情報

ポリラクトサミン糖鎖生合成を調節する
β1,3- N -アセチルグルコサミン転移酵素
米 田 敦【はじめに】

子をβ1-3 結合で糖受容体 Gal に転移する．β3GnT は，ポリ（-N - アセチル）ラクトサミンは N ―アセチルラクト

ゴルジ体の他の糖転移酵素と同様に II 型膜タンパク質

サミン（Gal β1-4GlcNAc）２糖の繰り返し構造で，糖で，N- 末 端 側 から順に短い細 胞 質 部 分， 膜 貫 通ドメ

タンパク質の N - 結合型糖鎖と O - 結合型糖鎖，糖脂質

イン，ゴルジ体内腔 側の Stem 領 域， 触 媒 部 位からなの糖鎖に生じる（図１）．トマトレクチンを用いて検出でき，る．最初にクローニングされたβ3GnT1（iGnT）は，の細菌から高等動物と広く検出されている．ケラタン硫酸のちにβ4GAT1 であるとされ ３）， β3GnT には 2~9 があ硫酸化されていない領域も該当するが，それについては他

る．β3GnT2~8 の酵素活性や基質特異性の報告はあるの文献に委ねたい．ポリラクトサミン構造は，β1,3-N - アが（詳細は引用１）, ２）を参照頂きたい），調べた限り

セチルグルコサミン（GlcNAc）転移酵素（β3GnT）とβ3GnT9 について報告はない．ポリラクトサミン生合成へ

β1,4- ガラクトース（Gal）転移酵素（β4GalT）が交互の関与が示されているのはβ3GnT2，3，4，5，8 であに作用して合成されるが，β4GalT が広く存在するため，る．これらのうちβ3GnT2 の活性が非常に高く１），当該

β3GnT の発 現で制 御される．この糖 鎖 構 造は過 剰な酵素をコードする B3gnt2 遺伝子のノックアウトマウスで免疫応答の抑制に働くことが知られていたが１，２），ゲノム

は，N - 結合型糖鎖上の長鎖ポリラクトサミン（図１）が解析手法の発達や様々なデータベースの充実に伴い，β有 意に減 少した２）． β3GnT3 は O - 結 合 型 糖 鎖の Gal

3GnT の多くの疾病との関連がわかってきた．本稿ではポβ1-3GalNAc-Ser/Thr を糖受容体とし，これを伸長す

リラクトサミン糖鎖の生合成に関わるβ3GNT について，る（図１）１）．β3GnT4 の基質特異性の詳細は不明で，

特異性および疾病との関連を紹介する．

β3GnT5 はポリラクトサミンが伸長する糖脂質の前駆体
糖脂質（ラクト，
ネオラクト系列，図１）を基質にしている１）．

【ポリラクトサミン生合成に関わるβ3GnT と酵素活性】

当該酵素をコードする B3gnt5 遺伝子のノックアウトマウ

β3GnT は， 糖 供 与 体 UDP-GlcNAc から GlcNAc

スでは，ラクト，ネオラクト系列 の糖脂質が消失しており，

図1

様々な複合糖質上のポリラクトサミンの例

27

ポリラクトサミン糖鎖生合成を調節する β1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素

糖脂質上のポリラクトサミン修飾の消失が期待される．β

本稿執筆中に報告された８）．今後臨床応用へ向けた改良

3GnT8 は，β3GnT2 と似て，高分岐 N - 結合型糖鎖のや，他の B3GNT ファミリー分子に対する阻害剤の開発

ラクトサミンの非還元末端に GlcNAc を転移する（図１）などが待たれる．また，このような阻害剤により，ポリラク．そのため，GlcNAc 転移酵素 V によるβ1-6 分岐形

１）

トサミンの生理機能解明が進むことが期待される．

成が N - 結合型糖鎖上のポリラクトサミン形成に影響する．
さらにβ3GnT8 はβ3GnT2 と複合体を形成すると，β【参考文献】

3GnT2 を活性化する２）．このようにポリラクトサミン生合1）Togayachi, A. et al.: Cloning and characterization of
β1,3-glycosyltransferase family with a β3GT motifs,

成には複雑な機構が存在する．

Trends Glycosci. Glycotechnol., 19, 29（2007）.
【疾患との関連】

2）Togayachi, A. and Narimatsu, H.: Functional

ポリラクトサミンは，内在性レクチンで炎症に関わるガ

analysis of β 1,3-N-acetylglucosaminyltran

レクチンのリガンドとして機能し，ある種のポリラクトサミ

sferases and regulation of immunological

ンは免 疫 細 胞や多くの悪 性 腫 瘍 細 胞に検出される．まfunction by polylactosamine, Trends Glycosci.

た，B3gnt2 ノックアウトマウスでは T 細胞，B 細胞の増Glycotechnol., 24, 95（2012）.

殖が亢進し，B3gnt5 ノックアウトマウスは B 細胞の増殖

3）Praissman, J.L., et al. :B4GAT1 is the primingが亢進したことから ，β3GnT 酵素の機能として炎症と

enzyme for the LARGE-dependent functionalの関連が示唆されてきた．ゲノムワイド関連解析などから，

glycosylation of α -dystroglycan, Elife., 3,

B3GNT2 がバセドウ病，関節リウマチ，強直性脊椎炎，

e03943（2014）.

２）

乾癬と関連があることが示唆されている．また，がんとの4）https://www.proteinatlas.org/

関 連では，B3GNT2 の高 発 現 膵 臓 癌は生 存 率が 低い

5）Joung, J., et al. : CRISPR activation screen

４）．悪性黒色腫では BRAF 変異が多いが，B3GNT2 はidentifies BCL-2 proteins and B3GNT2 as

BRAF 変異と関連するとされ，我々も BRAF 阻害剤耐性

drivers of cancer resistance to T cell-mediated細胞でその発現が上昇することを見出している．さらに最cytotoxicity, Nat. Commun., 13, 1606（2022）.

近，悪性黒色腫細胞を含む種々のがん細胞が細胞障害性6）Shen, L., et al. : β 3GnT8 regulates oxaliplatin

T 細胞の攻撃から逃れるための遺伝子として B3GNT2 がresistance by altering integrin β 1 glycosylation in

挙がった５）．がん細胞と T 細胞の相互作用に関わる様々な

colon cancer cells, Oncol. Rep., 39, 2006（2018）.

分子のポリラクトサミン修飾により，２細胞種間の相互作用

7）Hao, Y., et al., : Structures and mechanism ofを阻害して，がん細胞が T 細胞からの攻撃に耐性となるとhuman glycosyltransferase β 1,3-N -提唱している．B3GNT3 も，肺癌，膵臓癌において高発acetylglucosaminyltransferase 2 （B3GNT2）,

現の場合生存率が低い４）．B3GNT8 高発現の膵臓癌はan important player in immune homeostasis,

生存率が高いが，子宮内膜腫では生存率が低い４）．大腸

J. Biol. Chem., 296, 100042（2021）.

癌で高発現しており１），抗がん剤 oxaliplatin 耐性制御に関わる可能性が示されており６），今後の解析が待たれる．

8）Jackson, J.J.,et al., : Imidazolone as an amide
bioisostere in the development of

β -1,3-N -ポリラクトサミン構造は，広く，様々な複合糖質として存

acetylglucosaminyltransferase 2 （B3GNT2）

在する重要な糖鎖であるにも関わらず，その機能について

Inhibitors, J. Med. Chem., 66, 16120 (2023).

の解析は多くない．ゲノムワイド解析や様々なデータベースから得られる情報のごく一部を紹介したが，β3GnT の様々【著者】

な疾患への関与は明らかである．最近，β3GnT2 の触媒

東京薬科大学ドメインと基質などとの複合体の結晶構造が報告され ，

米田

7）

その情報をもとに開発されたβ3GnT2 低分子量阻害剤が

28

敦子

生命科学部

ゲノム情報医科学研究室

研究報告

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成

原核生物のタンパク質品質管理機構に関与する
ClpPを利用した細胞内の人為的分解制御
石

川

文

【方法】
ClpP 活 性 化 剤である ADEP1（1） 側 鎖 部は， 代 謝
安定性の低い求電子的なα , β - 不飽和カルボニル基を備えたアミド型側鎖を有している．そこで，本研究では，

洋（近畿大学薬学部）

まず ADEP（1）側鎖部の構造展開を行うことで，代謝安定性およびタンパク質分解活性が向上した ADEP1（1）【目的】

誘導体を創製することから開始した．また，ADEP（1）原 核 生 物の細 胞内タンパク質 分 解は， 基 質タンパク誘導体に関して抗菌試験および代謝安定性試験を行っ

質を認識し，アンフォールディングさせ，迅速かつ不可

た．さらに，化合物および ClpP の濃度を人為的にコント

逆的に標的タンパク質を分解するシステムである 1）．細ロールできる in vitro にてタンパク質分解活性を評価し胞内タンパク質分解装置複合体は，ATPase およびタン

た．B.subtilis プロテオーム， 大 腸 菌 組 換え ClpP， 化

パク質 分 解 酵 素（ClpP）により形 成される．ATPase

合物を用いて分解される可能性のあるタンパク質の網羅

は基質タンパク質を解きほぐし，ClpP 活性部位への送的同定も行なった．

り込みを，ClpP は基 質タンパク質の加 水 分 解を担う．

【結果】

Streptomyces hawaiiensis から単離されたアシルデプ

まず，化合物（1）を Z-Ser-OH から 3 段階で合成した．

シペプチド（ADEP1）が，薬剤耐性菌を含むさまざまな

次に，1 のカップリングパートナー（4）を H-Ala-OBzl

病原菌に抗菌活性を示すことが報告された 2）．ADEP1から 4 段階で合成した．引き続き，1 および 4 を PyBOPの作用機序は，ADEP1-ClpP 複合体による細胞分裂にを用いて縮合体（2）を収率 70% で得た．さらに，2 か必須なタンパク質 FtsZ の分解に基づく 2）．ADEP1 を基ら 5 段 階を経て化 合 物（3）に導いた． 最 後に，3 の盤に，ClpP を自在に操作 · 制御することができれば，革Boc 基部分の改変により 21 種類の ADEP1 誘導体を合新的なタンパク質ケミカルノックダウン技術の開発が期成した．

待されるだけでなく， 次 世 代 型 抗 生 物 質 開 発へ新しい戦 略の創出につながる．そこで本 研 究では，Bacillus

subtilis をモデルにとして ClpP の機能を制御する化合物を開発し，細胞内でのタンパク質分解を人為的に制御することを目的とした．

Scheme 1. Structure of ADEP1 and 21 derivatives.

29

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成

次 に，21 種 類 の ADEP（1） 誘 導 体 を 用 いて，B.

【文献】

subtilis ATCC 6051 に対する最小発育阻止濃度（MIC）

1）Trentini, D. B., Suskiewicz, M. J., Heuck,の 算 出を行った．その 結 果，ADEP1（1）（MIC=2.5

A. et al.: Arginine phosphorylation marks

μg/mL）と比べて，強力な抗菌活性をもつ誘導体の創

proteins for degradation by a Clp protease,

製 に 成 功した（MIC=0.020-0.16 μg/mL）3）． また，Nature, 539, 48 (2016).

ADEP1（1）と比べて，タンパク質 分 解 活 性の高い誘2）Brötz-Oesterhelt, H., Beyer, D., Kroll H.-P.

導体の創製にも成功した（MIC=0.625 μg/mL）．さらet al.: Dysregulation of bacterial proteolyticに，ラット肝ミクロソームを用いた代謝安定性試験を行

machinery by a new class of antibiotics, Nat.

った．その結 果，ADEP1（t 1/2=17min）と比べて， 代Med., 11, 1082 (2005).

謝安定性も大きく向上していることが判明した（t 1/2=98258min）．定量的プロテオミクス解析により，タンパク質

3）石川文洋，田邉元三 : 環状ペプチド化合物とそれを含む抗菌剤（特願 2023-083850）

正合成に関わるタンパク質，細胞分裂に関わるタンパク質，脂肪酸生合成に関わるタンパク質など多くの創薬標的タン
パク質の分解が誘導されうることが示唆された．

指向性進化による生物発光酵素の機能拡張とその利用

Table 1. 最小発育阻止濃度（MIC）.

岩野智（宮崎大学 テニュアトラック推進室）【背景・目的】動物個体で起こる生命現象を可視化する in vivo イメ
ージング技術の研究開発が盛んである．様々な原理に基づく手法が存在するが，現状，動物に対しての拘束，切開，細い棒の浸入といったいくつかの侵襲的処置が不可
Table 2. 代謝安定性試験 .

欠である．一方で筆者は動物にやさしい非侵襲的イメー
ジング技術を目指し，生物発光反応に基づく可視化技術を開発している．これまでに，従来技術の検出感度を飛躍的に改善する AkaBLI（人工基質 AkaLumine+ 人工
酵素 Akaluc）を開発した 1,2）．本研究では，AkaBLI を基に非侵襲かつ非拘束な生体分子イメージング技術開発を目的に，生物発光反応の改変によるプローブ技術の開発に取り組んだ．

【考察】【方法・結果】

ADEP（1）側鎖部へ尿素結合を導入し，構造展開を

本研究では生物発光反応が持つ環境応答性を活用し，行うことで，さまざまな特徴をもつ ClpP 活性化剤の創製

Akaluc の発現部位での環境変化に応答し，発光強度をに成功した．ADEP1 と比べて抗菌活性および代謝安定

増減させる強度変化型の生物発光プローブの開発を試み性が大きく向上した ADEP1 誘導体（4）や抗菌活性をた．特に生物発光反応の酸素濃度依存性に注目して研究できるだけ抑制し，タンパク質分解活性のみが大きく向上を進めた．結果，生理的な細胞内酸素濃度変化に鋭敏

した ADEP1 誘導体（5）の創製に成功した 3）．

に応答し発光強度を変調させる変異酵素を取得した．現最後になりますが，本研究を支援して頂いた公益財団法

在，細胞内酸素分圧可視化プローブ技術への応用を進め

人日本応用酵素協会に深謝致します．

ている．

30

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成【考察】あることが明らかになりつつある．本課題では，AdipoR

酸素は地球上の生物にとって最も重要で身近な分子でを中心とした PAQR ファミリー分子の新しい機能として，あるが，生体内における酸素分子を計測する技術に乏し

加水分解活性メカニズム，さらにシグナル伝達機構を解く，個体内で起こる生命現象と酸素の直接的な関連性は明することを目的とする．

あまり理解されていない．本技術は生体内酸素動態を可【方法】

視化する強力な技術となる可能性が高く，論文発表に向（１）PAQR ファミリー 分 子の糖・ 脂 質 代 謝における細けてデータを取得中である．

胞 内シグナル伝 達 機 構の解 明：AdipoR を中 心とした

【文献】

PAQR ファミリー分子の基質特異性，さらに代謝産物に

1）Iwano S, Sugiyama M, Hama H, et al, Single-

関して，代謝産物の組成及び変化を網羅的に解析する．

cell bioluminescence imaging of deep tissue

さらに，AdipoR を中心とした PAQR ファミリー分子におin freely moving animals, Science, 359, 935-

ける基質特異性および代謝産物の関連性を明らかにし，

939, 2018

糖・脂質代謝における新規の細胞内シグナル伝達機構を2 ） N a k a s h i b a T, O g o h K , I w a n o S , e t a l ,解明する．

Development of two mouse strains（２）PAQR ファミリー分子の変異体マウスを用いた病態

conditionally expressing bright luciferases

生 理 的 意 義の検 討：CRISPR/Cas9 システムを用いて，with distinct emission spectra as new tools for

亜鉛イオンが結合できなくなった PAQR ファミリー分子のin vivo imaging, Lab Animal, 2023

変異体マウスの作製を既に完了しており，全身の糖・脂質代謝の検討を進める．さらに，AdipoR を中心とした
PAQR ファミリー分子の変異体マウスの各臓器における代膜受容体による加水分解活性と代謝性疾患制御

謝産物の変化を解析し，臓器特異的な加水分解活性にメカニズムの解明

ついて明らかにする．

岩

部

美

紀

（東京大学大学院医学系研究科糖尿病・代謝内科）【結果】（１）PAQR ファミリー 分 子の糖・ 脂 質 代 謝における細胞 内シグナル伝 達 機 構の解 明：AdipoR を中 心とした

【目的】

PAQR ファミリー分子の基質特異性，さらに代謝産物に

これまでに，当研究室では，肥満に伴って生理活性関して網羅的に解析した 3）（未発表）．また，AdipoR を物質アディポネクチンが低下することが，生活習慣病・中心とした PAQR ファミリー分子の活性化により，マウス

メタボリックシンドローム・糖尿病激増の主要な原因に個体レベルでの糖・脂質代謝が改善することを示した 4）なっていることを示し，アディポネクチンの受容体として（未発表）．さらに，PAQR ファミリー分子の活性化によっ

AdipoR1 および AdipoR2 を同定した 1）．非常に重要なて，代謝に重要な各組織における代謝産物の組成及び変点は，AdipoR は，亜鉛イオンが結合しており，G タン

化を解析することにより，PAQR の新規のシグナル伝達機

パク質共役受容体（GPCR）とは逆の膜トポロジーを持

構の一部を明らかにした 5）（未発表）．

つ新規の 7 回膜貫通型の受容体であり，G タンパク質と（２）PAQR ファミリー分子の変異体マウスを用いた病態は共役しておらず，構造学的・機能学的にも前例のない

生 理 的 意 義の検 討：CRISPR/Cas9 システムを用いて，受容体であることである 2）．AdipoR は，Progesterone

亜鉛イオンが結合できなくなった PAQR ファミリー分子変and AdipoQ Receptor（PAQR）ファミリー分子の一つ異体マウスを作製し，個体レベルでの糖・脂質代謝を解である．これらの発見を手がかりとして，PAQR ファミリー析した．さらに，各臓器における代謝産物の変化を解析

分子が新規の逆向き 7 回膜貫通型の受容体であるだけでした（未発表）．

なく，受容体でありながら，亜鉛イオンを結合し，加水分【考察】

解活性を有する全く新規のユニークな受容体ファミリーで本課題の成果により，PAQR ファミリー分子の多様性と普31

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成

遍性の理解がより深まり，生物界における未知の受容体素を同定し，緑膿菌の薬剤耐性と GlcN-PG の関係を明

活性化メカニズムが存在する可能性も示唆され，学術的らかにすることを⽬的とした．

貢献・意義も極めて高いと考えられる．

【⽅法】

【文献】

P.aeruginosa PAO1 株 の ゲノムから PG に GlcN を1 ） Ya m a u c h i T, K a m o n J , I t o Y, e t a l . :転移する糖転移酵素を探索したところ，脱アセチル化酵

Cloning of adiponectin receptors that

素とオペロンを形成する糖転移酵素を⾒出した．そこで，mediate antidiabetic metabolic effects,

GlcN-PG は N - アセチルグルコサミン（GlcNAc）が転Nature.423,762-769 (2003)

移された後に GlcNAc が脱アセチル化されることで⽣成

2）Tanabe H, Fujii Y, Okada-Iwabu M, et al.:

されると仮定して，糖転移酵素と脱アセチル化酵素の候

Crystal structures of the human adiponectin

補配列をそれぞれ，PaGlcNAcT，PaGDAC と名付けて

receptors, Nature.520,312-326 (2015)

クローン化した．次に，PaGlcNAcT 遺伝⼦の単独もしく

3）Tanabe H, Fujii Y, Okada-Iwabu M, Iwabu M,

は，PaGlcNAcT と PaGDAC 遺伝⼦の両⽅をそれぞれKano K, Kawana H, et al. Human adiponectin

発現ベクターに組み込んで，⼤腸菌 BL21 株を⽤いて発

receptor AdipoR1 assumes closed and open

現させた．各遺伝⼦を発現させた⼤腸菌の脂質を液体ク

structures. Commun Biol. 3,446 (2020)

ロマトグラフ質量分析計（LC-MS）により分析した．さら

4）Iwabu M, Okada-Iwabu M, Tanabe H, et al.:に，緑膿菌の PaGlcNAc-T ⽋損株（KO 株）を作製して，AdipoR agonist increases insulin sensitivity

KO 株と野⽣株（WT 株）の脂質組成を薄層クロマトグラ

and exercise endurance in AdipoR-humanizedフ（TLC）および LC-MS で⽐較した．加えて，KO 株とmice, Commun Biol. 4, 45 (2021)

WT 株の薬剤耐性試験を微量液体希釈法とディスク法に5）Ohn J, Been KW, Kim JY, et al.: Discovery ofより実施した．

a transdermally deliverable pentapeptide for【結果・考察】activating AdipoR1 to promote hair growth,
EMBO Mol Med.13,e13790 (2021)

PaGlcNAcT を発現させた⼤腸菌の脂質を LC-MS で
解 析 すると，PG に GlcNAc が 転 移 した GlcNAc-PG
が 合 成されていた．さらに PaGlcNAcT と PaGDAC を
同 時 に発 現させると，GlcNAc が GlcN に脱アセチル

緑膿菌の薬剤耐性に関わる糖脂質合成酵素の機能化された GlcN-PG が 合 成されていた．また， 緑 膿 菌

解析

PaGlcNAcT の KO 株と WT 株の脂質を TLC と LC-MS
沖野

望（九州大学大学院農学研究院生命機能科学部門海洋資源化学分野）で解析したところ，GlcN-PG が完全に消失していた．このことから，PaGlcNAcT と PaGDAC は GlcN-PG の合成 責 任 酵 素 であり，PaGlcNAcT が PG に GlcNAc を【⽬的】

転移し，PaGDAC が転移された GlcNAc を脱アセチル

緑 膿 菌 Pseudomonas aeruginosa は⽇和⾒感 染 症

化することが強く⽰唆された．⼀⽅，薬剤耐性試験ではの原因菌として知られるグラム陰性細菌であり，多剤耐性

PaGlcNAcT の KO 株は WT 株と⽐較して，特にアミノグ

緑膿菌は世界中で問題になっている．細菌の薬剤耐性機

リコシド系の抗⽣物質に対する感受性が⾼まっていた．こ構の⼀つに細胞膜の修飾が知られている．緑膿菌にはホのことは，GlcN-PG が緑膿菌のアミノグリコシド系の抗スファチジルグリセロール（PG）にグルコサミン（GlcN）

⽣物質に対する耐性に関与していることを⽰唆している．

が 結 合したグルコサミニルホスファチジルグリセロール（GlcN-PG）が存在し，緑膿菌の薬剤耐性に関与していることが推測されるが，GlcN-PG の合成酵素に関する報告はない．本研究では緑膿菌が持つ GlcN-PG の合成酵

32

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成

かの炎症を惹起する CD8 陽性 T 細胞が浸潤しているとい
自己免疫性疾患における組織局在リンパ球再活性化の機序
勝うことになる．
本研究の目的は，山惠

①この血中と局所での CD8 陽性 T 細胞のフェノタイプの理（岡山大学学術研究院 保健学域 検査技術科学分野）

違いの同定②血中と局所臓器（特に腎臓）での CD38 高発現 CD8【背景】

陽性 T 細胞の遺伝子的・細胞的機能変化の解析を行

全身性エリテマトーデス（Systemic Lupus Erythematosus：
SLE）は，若い女性に多い難治性の自己免疫性疾患でうこととした．
【方法】

ある．申請者は SLE 患者由来 CD4 陽性 T 細胞に関し

SLE 患者 41 名 vs 健常者 17 名の末梢血由来単核球て，microRNA-200a-3p による制 御 機 構 ，カルシウを比較したシングルセル RNA-seq のデータ 3）を再解析しムシグナルを介した ER ストレスの機 序（申請 者 筆 頭，

た．363,083 細胞の末梢血単核球における CD8 陽性 T

underreview）について報告した．

細胞をサブクラスタリングし，CD38 発現状況を検討した．

1）

SLE を含む自己免疫性疾患の T 細胞機能として，CD4

再解析は理化学研究所のヒト免疫遺伝研究チームに委

陽性 T 細胞の機能解析が進む一方，CD8 陽性 T 細胞

託した．また，岡山大学病院，腎・免疫内分泌代謝内では感染や癌における細胞障害能以外に，免疫機能とし科で施行したループス腎炎患者の腎組織を用い，CD38てはいまだ未知である．そこで申請者は，健常者と SLEの免 疫 染 色を行った．同時に， 活 動 性 SLE 患 者の尿患者の T 細胞を比較した RNA-seq の結果，SLE 患者で沈査のフローサイトメトリーを行い，CD8 陽性 T 細胞のCD38 の高発現していたという既報に基づき，CD38 高CD38 発現を検討した．

発現 CD8 陽性 T 細胞の病的意義の解明にも着手してい【結果】

る．CD38 は活性化マーカーとして知られると同時に，細末梢血単核球は 37 にサブクラスタリングすることがで

胞内の nicotinamide adenine dinucleotide（NAD+）

きた．その中で CD8 陽性 T 細胞は 93,097 細胞同定でを分解する NAD グリコヒドラ―ゼである．申請者の報告き，さらにナイーブ分画，セントラルメモリー分画，グラン

では，CD38 が SLE 患 者の CD4 あるいは CD8 陽 性 T

ザイム B または K 陽性の細胞障害性 CD8 陽性 T 細胞分細胞で有意に上昇していた．さらに CD8 陽性 T 細胞で画など，16 にクラスタリングが可能であった．しかしそのは CD38 高 発 現が NAD+ 依 存 性 酵 素である Sirtuin1

中で CD38 高発現に代表されるクラスターは同定できなを介して細胞障害能に重要な RUNX3 などの転写因子をかった．また，シングルセル RNA-seq では CD38 自体抑制し，SLE 患者における細胞障害能の低下と，実臨床を同定することができなかった．そこで健常者 150 人との感染症を増加させることを報告した 2）．これにより既存

SLE 患者 372 人の 27 種類の免疫タイプ別の細胞をバルの活性化マーカーとしての CD38 の新たな病的意義を見

ク RNA-seq で解析した結果を確認したところ，CD8 陽出した．

性 T 細胞における CD38 発現は健常者と比較しても有意

本研究ではさらなる展開として，CD38 が血中と障害臓器に浸潤した CD8 陽性 T 細胞のフェノタイプの違いに関に上昇しており，さらに SLE の活動性が上昇するにつれてその発現も上昇していることが確認できた 4）．

与するとの仮説を立て，これを解明することを目的とした．

SLE 患 者 から採 取した 尿 中 の CD8 陽 性 細 胞 上 の

この着想は，患者末梢血で増加している CD38 高発現CD38 の発現においては，尿で同定できるリンパ球数がCD8 陽性 T 細胞は，炎症性サイトカインを産生できない少ないため，より活動性の高い腎炎患者の尿検体を回収にも関わらず，既報では尿中 CD8 陽性 T 細胞は，非活中である．

動性と比較し，活動性ループス腎炎により多く見られると【まとめと考察】

いう矛盾から得ている．つまり，血中では CD8 陽性 T 細CD38 はリンパ球が活 性 化した際に細 胞 表 面に発 現胞の細胞機能は低下しているが，実際の腎組織では何らし，形質細胞にも多く発現している一般的な表面分子で33

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成ある．しかし本研究の試みから，予想と異なりシングルセ

richsplicing factor 1（SRSF1） の ア イソ フ ォ ー ム

ル RNA-seq では CD38 が同定できないと判明した．本SRSF1-3 が必須であることを見出している．SRSF1-3 は

結果のように，フローサイトメトリーなどでは容易に検出可

抗体遺伝子に集積し，AID と結合して AID の核内への能な分子もシングルセル RNA-seq では同定できないとい

蓄積や AID の活性制御に関与する．本研究は，スプライ

った，解像度の問題はいまだシングルセル RNA-seq のンシング因 子 SRSF1-3 による，DNA 編 集 酵 素 AID の課題である．今後は，十分な細胞数が確保できる場合は，DNA 編集活性の調節機構およびその抗体遺伝子特異性

バルク RNA-seq を用いる．あるいはより高精度のシングを決定する機構を明らかにすることを目的とする．

ル RNA-seq により CD38 高発現発現集団の機能解析を【方法と結果】

計画する．

（1）体細胞高頻度変異における SRSF1-3 の機能部位

1 ） Katsuyama E, Yan M, Watanabe KS et al.,の同定

Downregulation of miR-200a-3p, Targeting CtBP2

SRSF1 転写産物の選択的スプライシングにより生成すComplex, Is Involved in the Hypoproduction of

る SRSF1-3 は，SRSF １とは異なる C 末領域を有する．

IL-2 in Systemic Lupus Erythematosus-Derived T

SRSF1­3 特有の C 末領域の欠失変異体を作製し，抗体

Cells. J Immunol. 2017 Jun 1;198(11):4268-4276.

遺伝子の高頻度突然変異を誘導可能な B 細胞株に導入

2 ） Eri Katsuyama, Abel Suarez-Fueyo, Sean J

した．SRSF1-3 の C 末欠失変異体は変異誘導能力を保Bradley et al. The CD38/NAD/SIRTUIN1/EZH2

持しており AID タンパク質への結合も N 末領域だけで十Axis Mitigates Cytotoxic CD8 T Cell Function and分であった．SRSF1-3 と共 通の N 末 領 域を有している

Identifies Patients with SLE Prone to Infections.

SRSF1 も同様に変異誘導能力を示し，SRSF1 と AID もCell Rep. 2020 Jan 7;30(1):112-123.e4.

結合することが示された．

3）Nehar-Belaid, D., Hong, S., Marches, R.:
Mapping systemic lupus erythematosus
heterogeneity at the single-cell level, Nat
Immunol.,21(9):1094-1106 (2020).

（2）SRSF1 の C 末 RS ドメインリン酸化状態による体細胞高頻度変異の活性制御
SRSF1-3 とは異なる SRSF1 の C 末領域は，アルギニ
ンとセリンに富み（RS ドメイン），高度にリン酸化される．

4）Masahiro Nakano , Mineto Ota , Yusuke

高頻度突然変異を誘導する RS ドメインの高リン酸化模倣

Takeshima et al., Distinct transcriptome

変異体（RD 変異体），脱リン酸化模倣変異体（RA 変architectures underlying lupus establishment異体）を作製し，B 細胞株に導入した．RA 変異体を導and exacerbation., Cell. 2022 Sep入した細胞では，野生型 SRSF1 と比較してより強い変異

1;185(18):3375-3389.e21.

誘導能を示した．一方，RD 変異体を導入した細胞では，変異誘導能が全くなかった．どちらの変異体も AID とのスプライシング因子によるDNA編集酵素の活性調結合能力に違いはなかった．

節機構の解明

【考察】

金

山

直

本研究により，RS ドメインが脱リン酸化された SRSF1

樹（岡山大学）

は，SRSF1-3 と同様に AID による高頻度突然変異を誘導する能力を有することとが示された．C 末領域を欠損す【目的】

る SRSF1-3 および SRSF1 は共通の N 末領域を有し，と抗体遺伝子の体細胞高頻度突然変異には DNA 編集

もに変異誘導能力が残存していたことから，変異誘導に酵素 Activation induced cytidine deaminase（ AID）

必須な機能部位は SRSF1 および SRSF1-3 の N 末領域が必須である．我々は，DNA 編集酵素 AID の活性発に存在することが示唆された．一方，C 末 RS ドメインは

現およびそれによる高頻度突然変異の誘導に必須な因SRSF1 および SRSF1-3 の変異誘導能を最大化するため子の一つとして，スプライシング因子 Serine/arginine-の調節領域となっていると考えられる．

34

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成

異があると分子内切断が亢進することが分かった．
小胞体膜貫通型転写因子OASISの切断制御による活性化機構解析金本聡

OASIS との相互作用分子の同定実験においては光クロ
スリンクにより OASIS と結合すると思われる結果が得られ自（広島大学大学院医系科学研究科）

た．
OASIS の膜貫通ドメイン直後の領域に作用する因子の結合によって分子内切断が制御されることが示唆される．

【背景・目的】Old Astrocyte Specifically Induced Substance

今後，質量分析を用いて相互作用分子の同定を進めてい
きたい．

（OASIS, 別名 CREB3L1）は通常状態では小胞体膜上に局在する 1 回膜貫通型の転写因子である．細胞が飢餓状態に陥ったり，細胞内カルシウム濃度が攪乱されるな
ど，細胞にとって不利益な環境になると OASIS は小胞体からゴルジ体へ輸送され，そこで Site-1 protease および

プロテオリシスを介した精子成熟メカニズムの解明
淨

住

大

慈

（科学技術振興機構さきがけ、名古屋大学環境医学研究所）

Site-2 protease の 2 種類のプロテアーゼによって段階的に切断を受けた後，アミノ末端側がゴルジ膜から遊離して【目的】

転写因子として機能するようになる．OASIS は骨形成や，生物の生殖では，排卵や精子形成，受精などの過程でがん細胞の細胞周期停止に関与することが報告されておプロテオリシスが重要な役割を果たしている．哺乳類におり，OASIS の活性化制御は骨関連疾患やがんの治療標

いても精子の機能的な成熟にプロテアーゼやプロテオリシ的としての可能性が期待できる．しかし，OASIS が活性スが関わるという知見が見出されつつあり，プロテオリシ

化されるに至る詳細な分子機構は完全には明らかとなってスを理解し制御できれば生殖を人為的に制御できる可能いない．本研究では，OASIS 活性化にあたり分子内切断性がある．そこで本研究では，プロテオリシスによって精を制御する詳細な分子機構を明らかにする目的で研究を子の成熟がどのように制御されているかを明らかにする．

行った．

【方法】

【方法】

精子成熟に関わる器官である精巣上体の形成や機能発

翻訳後修飾による OASIS の切断への影響を検討する

現に注目しながら，プロテオリシスによる精子成熟に関わため，質量分析を用いて翻訳後修飾サイトを検討する．

る遺伝子や制御メカニズムを検討した．特に応募者が同

一方，OASIS の分子内切断を制御する領域を同定するた

定した，精巣上体の機能を制御する分泌シグナル伝達でめに，変異型 OASIS の発現プラスミドを作成し，ヒト胎ある「ルミクリン」に注目しながら，精子成熟を担うプロ児腎臓由来細胞株 HEK293 で強制発現させ，分子内切テオリシスを上位制御するルミクリン機構，ルミクリンによ

断への影響をウェスタンブロッティングで解析する．また，って制御されるプロテオリシス関連因子の同定を試みた．

OASIS に直接作用し切断に関わる分子が存在しないか検【結果】討するために，光クロスリンク法を用いて相互作用分子の精子成熟を担うプロテアーゼの発現制御因子を探索

同定を試みる．

し，精巣由来分泌タンパク質 NICOL を同定した．Nicol【結果・考察】

ノックアウトマウスでは精巣上体の上皮組織の分化不全が質量分析による OASIS の翻訳後修飾サイトの解析で認められた．これに伴って精子成熟に関わる分泌プロテア

は，アセチル化やメチル化の候補サイトが得られたものの，ーゼである OVCH2 の発現が消失し，精子 ADAM3 の厳密に同定するまでには至らなかった．

プロセシングも異常となった．さらに Nicol ノックアウトマ

種々の変異型 OASIS 発現プラスミドによる強制発現系

ウスに認められる雄性不妊の表現型はトランスジーンによを用いたウェスタンブロット解析では，OASIS の膜貫通ドって精巣特異的に Nicol を発現させるだけでレスキューさ

メイン直後の領域に存在する 3 か所のアミノ酸残基に変れた．これらの結果から NICOL は精巣に由来して経管35

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成

腔的に精巣上体の分化や遺伝子発現を制御する「ルミク【考察】

リン因子」であることが明らかとなった．また NICOL は

これまでにルミクリン因子として NELL2 を同定したが，既知のルミクリン因子である NELL2 と強く相互作用する

NICOL もまた精巣に由来するルミクリン因子であること，ことがわかった（以上図 1）．

NELL2と相互作用することでリガンド複合体を形成すること，精子成熟に関わるプロテアーゼ OVCH2 の発現や精子 ADAM3 のプロテオリシスを制御していることが明らかとなった．

図 1. 精 巣に由来する分 泌タンパク質 NICOL はルミクリン因 子として機 能する．A, 新 規なルミクリン因 子

NICOL の構造と発現．B, Nicol ノックアウトマウスで認められる精巣上体上皮の分化不全．C, Nicol ノック

アウトマウスでは精子成熟に関わるプロテアーゼの発現が低下する．D, Nicol ノックアウトマウスの精子ではADAM3 のプロセシングに異常が生じる．E, NICOL は既知のルミクリン因子である NELL2 と相互作用する．

36

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成

【文献】

【方法】

Kiyozumi D. & Ikawa M.: ADGRG2 is dispensable

実験には，ラットの経血管灌流標本を用い，横隔神経for lumicrine signalling regulating epididymalと迷走神経より中枢性の呼吸出力を記録した．硫化水素

initial segment differentiation and gene合 成 酵 素である cystathionine β -synthase（CBS），

expression, Biol Reprod ., 109, 474-481 (2023).

cystathionine γ -lyase（CSE）の抑制薬または活性化

Kiyozumi D.: Lumicrine signaling: Extracellular

薬の全身投与は，灌流液中へ投与することにより実施しregulation of sperm maturation in the male

た．呼吸中枢内の脳領域特異的な硫化水素合成抑制ま

reproductive tract lumen, Genes Cells ., 28, 757-

たは神経伝達抑制は，脳内に刺入したガラス管を用いた

763 (2023).

CBS 抑制薬または神経伝達物質受容体遮断薬の脳内微Kiyozumi D., Shimada K., Chalick M.et al.:量投与により実施した．

A small secreted protein NICOL regulates【結果】

lumicrine-mediated sperm maturation and male

脳内にその発現が認められている硫化水素合成酵素でfertility, Nat Commun ., 14, 2354. (2023).

ある CBS に対する抑制薬の全身投与は，吸息相，後吸Kiyozumi D.: New insights into lumicrine

息相，呼息相からなる３相性の正常な呼吸運動の出力パ

secreted signalling that regulates the function

ターンを吸息相のみからなる単相性の出力パターンへとof the mammalian male reproductive tract, Dev

変化させた．一方，脳以外の臓器にその発現が認められBiol ., 503, 111-112. (2023).

ている硫化水素合成酵素である CSE に対する抑制薬やKiyozumi D. & Ikawa M.: Proteolysis in

CBS 活性化薬の全身投与は，３相性の正常な呼吸運動

Reproduction: Lessons From Gene-Modifiedの出力パターンに影響を与えなかった．さらに，呼吸中枢

Organism Studies, Front Endocrinol ., 13, 876370を構成する脳領域への局所性の CBS 抑制薬局所投与は，(2022).

薬物を投与した脳領域に依存した呼吸出力変化をもたらした．一方で，神経伝達物質受容体遮断薬の脳内微量投与は，CBS 抑制薬の脳内微量与による呼吸出力変化を，薬物を投与した脳領域依存的に，増強または抑制した．

呼吸運動の神経性調節における脳内硫化水素合成
酵素の機能解析小金澤【考察】
以上の結果から，脳内の CBS を介して合成された硫

禎史

化水素は，正常な呼吸運動のパターンを形成する神経回（筑波大学医学医療系神経生理学）

路の機能維持に重要な役割を果たしているものと考えられる．特に，呼吸中枢においては，CBS より合成される硫【目的】
硫化水素は腐った卵や温泉などから発生する特徴的な化水素は，シナプス伝達調節作用を介して，脳領域に依存した呼吸運動の出力調節を行っていることが示唆され刺激臭を伴った生体にとって有毒なガスとして有名である．

た．

しかしながら，近年，硫化水素は生体内でも合成されて【文献】

おり，この生体ガスとしての硫化水素は，細胞保護作用，

O k a z a k i , M . , U o z u , S . , S a t o , Y. , e t a l . .

血管運動調節作用など様々な生理機能を有していること

Endogeneous hydrogen sulfide maintains eupnea

が明らかになってきた．特に，脳ではシナプス伝達調節なin an in situ arterially perfused preparation of

どを介して，脳機能の調節に役立っているものと考えられ

rats. Commun. Biol., 3(1), 58 (2020).

ている．本研究では，呼吸運動に着目し，脳内の硫化水素が中枢神経系による呼吸運動の形成と調節に果たす役
割を明らかにすることを目的とした．

37

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成

新奇な阻害機構に基づくプロテインホスファターゼ
阻害剤の創製と低毒性がん転移阻害剤への応用
茂

里

【結果】
遊 走 能 の 異 なる 三 種 の 乳 が ん 細 胞 株 MDA-MB231,T47D,MCF-7 の遊走能と細胞抽出液の CaMKP 活
性は良く相関していたが，比活性には有意な差が認めら

康（和歌山県立医科大学）れなかった．次に遊走・浸潤活性の高い MDA-MB-231
細 胞 を， 細 胞 毒 性 を 示 さな い 30µM の ANS または【目的】

ANDS で処理すると，細胞遊走が顕著に阻害されたが，CaMKP（別名 POPX2/PPM1F）は 1998 年にラット

化学構造が類似しているものの CaMKP 阻害活性のない脳より，CaM キナーゼⅡの自己リン酸化部位を脱リン酸

ナフチオン酸では，遊走阻害は示さなかった．ANS で処化する酵素として，申請者らの研究グループによって発見

理後 MDA-MB-231 細胞の形態観察を行ったところ，細された PPM ファミリーに属するセリン／スレオニンプロテ

胞 極 性の著 明な低 下が観 察された．MDA-MB-231 細インホスファターゼである 1）．近年，CaMKP とがん細胞胞で高発現している CaMKP の酵素活性が，ANS またの遊走・浸潤との関連が相次いで報告されるようになっは ANDS 処理によって阻害されているかどうかを確認すた．すなわち CaMKP の遺伝子発現は，がん細胞の悪るため，CaMKP 基 質 の 1 つ である CaMKI を 過 剰 発性度と相関することが報告されており，本酵素の発現抑現させ，そのリン酸化レベルを評価したところ，ANS ま

制／過剰発現は，がん細胞の遊走・浸潤をそれぞれ抑たは ANDS 処理によって CaMKI のリン酸化レベルが顕制・促進する．従って CaMKP 特異的阻害剤は，がん著に増加したので，これらの阻害剤が，実際に細胞内の転移抑制剤として機能することが期待される．これまでのCaMKP 活性を阻害していることが裏付けられた．

研究では，CaMKP の酵素活性に焦点を当てた報告例【考察】が皆無であるので，本研究ではまず，乳がん細胞におけ

遊 走 能 の 高いほど， 乳 がん 細 胞 株 の CaMKP 活 性

る CaMKP のホスファターゼ活性の測定系を確立し，遊が高かったが，これは主として CaMKP の発現量により走能の異なる各種乳がん細胞株で，CaMKP 活性を比較

調 節されていると考えられる．CaMKP 阻 害 剤により，した．ついで，以前報告したアミノナフトール系 CaMKPCaMKP 活性を抑制すると，乳がん細胞の遊走能が顕著

阻害剤，1-amino-8-naphtol-4-sulfonic acid（ANS）に抑制された事から，細胞遊走の過程に CaMKP が重要

及び 1-amino-8-naphtol-2,4-disulfonic acid（ANDS）

な役割を果たすと考えられる．CaMKP 阻害剤処理により，2）を用いて，がん細胞の遊走や形態に与える影響を評価

細胞の極性が顕著に低下したことから，CaMKP が細胞した．

の極性形成に重要な役割を果たしており，酵素活性が阻【方法】

害されることで極性が低下して細胞遊走が阻害されるとい

乳がん細胞の抽出液を抗ヒト CaMKP 抗体と磁気ビーう機構が考えられる．ANS や ANDS は，遊走阻害を示ズを用いて免疫沈降し，磁気ビーズを十分洗浄した後，す濃度では，細胞毒性を全く示さなかった事から，これら

リン酸化ペプチド基質とインキュベートし，基質から放出の阻害剤は毒性の低い新規がん転移抑制剤創製のためのされる無機リン酸を定量することによってホスファターゼ

リーディング化合物となることが期待できる．CaMKP を

活 性を測 定した． 乳 がん細 胞の遊 走 能は，transwell

ターゲットとする低毒性の特異的阻害剤は，がん細胞を

migration assay により，血清で誘引されてボイデンチャ

殺さないが転移浸潤のみを抑制するような新たなタイプのンバーのインサート膜下面に遊走してくる細胞数をカウン

副作用の少ないがん治療薬として，特に高齢者医療におトすることによって測定した．阻害剤による CaMKI のリ

いて有用かも知れない 3）．

ン酸化レベルの影響は，一過性に CaMKI を発現させた【文献】

MDA-MB-231 細胞を阻害剤で処理した後，細胞を可溶

1）Ishida, A., Kameshita, I., Fujisawa, H.: A novel

化し，抗リン酸化 CaMKI 抗体でウエスタンブロットを行

protein phosphatase that dephosphorylates

うことで評価した 3）．

and regulates Ca 2+ /calmodulin-dependent38

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成

protein kinase II, J. Biol. Chem., 273, 1904
(1998).

【結果】
セノメタボライトのうち TMAO に着目し検討した結果，

2）Sueyoshi, N., Takao, T., Nimura, T., et al.:TMAO が心臓のミトコンドリア機能を抑制し心不全の病

Inhibitors of the Ca 2+/calmodulin-dependent

態を増悪することが明らかとなった．心不全モデルマウス

protein kinase phosphatase family (CaMKP

では TMAO が血液中で上昇すること，その機序として褐

and CaMKP-N). Biochem. Biophys. Res.

色脂肪不全が心不全時に生じることが重要であることが明Commun., 363, 715 (2007).

らかになった．TMAO 投与マウスで骨格筋におけるミトコ

3）Akizuki, K., Shimoda, N., Ozaki, H., et al.:CaMK phosphatase (CaMKP/POPX2/PPM1F)

ンドリアの形態異常が生じ，トレッドミル検査で筋力低下が生じた．

inhibitors suppress the migration of human

TMAO がミトコンドリア機能不全を惹起する機序としてミbreast cancer MDA-MB-231 cells with loss

トコンドリア複合体 IV を構成するシトクローム c オキシダ

of polarized morphology. Biochem. Biophys.

ーゼサブユニット 1 の発現がタンパクレベルで低下することRes. Commun., 639, 1 (2023).

が重要であることもわかった．東北メディカル・メガバンク
機構が保有する 1000 名以上の血液サンプルにおいても，加齢とともに TMAO のレベルが上昇することがわかった．

老化促進代謝物質産生酵素による加齢同期メカニ
ズムの解明
清

水

【考察】
本研究課題により TMAO が老化及び心不全に伴い血逸平（国立循環器病研究センター研究所 心血管老化制御部）

液中で上昇することがわかった．TMAO はアルツハイマー病（AD），パーキンソン病（PD）患者の血液及び脊髄液で上昇することが報告されている．これらの疾患は，【目的】

セノメタボライトにより病態が増悪するセノメタボライト関本研究課題において老化促進代謝物質（セノメタボラ

連 疾 患（Senometabolite Related Disease（SRD））

イト）による加齢同期メカニズムの解明に挑んだ．加齢とと包括的に定義できる可能性がある．セノメタボライトに

共に血液中で上昇し老化形質を促進する分子をセノメタ

よる加齢同期メカニズムの解明及び加齢性疾患に対するボライト（Senescence+Metabolite）と新しく定 義し，

次世代の治療法開発を今後も目指してゆく予定である．

心不全やサルコペニアの病態が促進する機序を明らかに【文献】することを目指した．

1 ） Yo s h i d a Y * , S h i m i z u I * , * * , S h i m a d a A ,【方法】

Nakahara K, Yanagisawa S, Kubo M, Fukuda

1. セノメタボライトの探索

S, Ishii C, Yamamoto H, Ishikawa T, Kano

心不全モデル・老化モデルマウスの血漿や臓器を用い

K, Aoki J, Hayashi Y, Ikegami R, Katsuumi

たメタボローム解析に加え，東北メディカル・メガバンク

G, Suda M, Ozaki K, Kashimura T, Izumi

が保有するメタボロームデータを用いた解析を行った．

D, Yoshida Y, Okuda S, Ohta S, Okamoto

2. セノメタボライトが増加するメカニズムの探索

S , M i n o k o s h i Y, O d a K , S a s a o k a T, A b e

加齢と共に血液中で上昇する代謝物質のうち，病的意

M, Sakimura K, Kubota Y, Yoshimura N,

義を有する可能性が高い代謝物質に特に着目した検討を

K a j i m u r a S , Z u r i a g a M , Wa l s h K , S o g a

行った．特にトリメチルアミン -N- オキシド（TMAO）にT** and Minamino T**. Brown adipose

着目した検討を行った．

tissue dysfunction promotes heart failure

3. セノメタボライトが老化形質を促進するメカニズムの探索

via a trimethylamine N-oxide-dependent

心不全モデルマウス，老化モデルマウスに TMAO を投

mechanism. Sci Rep . 2022 Sep 1;12(1):14883.

与し心機能や骨格筋機能を評価した．

*Co-first author, **Co-corresponding author

39

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成

質量分析イメージングを用いた神経伝達物質阻害系
殺虫剤によるアセチルコリン合成・分解酵素活性変化に関する研究
新

間

秀

一

（大阪大学大学院 工学研究科 生物工学専攻）【目的】
既存農薬の副反応を分子レベルで考察するために，昆虫体内における代謝酵素変動の二次元的解析を行える分析系が強く求められている．したがって，質量分析イメー
ジング（MSI）を用いた新しい酵素活性二次元可視化法
で神経伝達物質阻害を作用機序とするネオニコチノイド系
農薬がアセチルコリン合成（ChAT）
・分解酵素（AChE）
活性に与える影響を解明することに資する分析系を構築することを本研究の目的とした．
【方法】
様々なネオニコチノイド系農薬が D.melanogaster 体
内の酵素反応に与える影響を解析した．本研究では，ネ
オニコチノイドを摂取させた D.melanogaster の切片表面

図 1. IMI 投与による AChE 反応の変化．

未投与個体と比較して低下する傾向が見られた．
特に頭部と胸部での低下が顕著であった．

へ基質を供給し，酵素反応で得られた分子を MSI による直接検出で分布情報を得る．基質として重水素ラベル体を用いることで，酵素反応で得られたコリンおよびアセチ
ルコリンとして検出することが可能となる．
【結果】

D.melanogaster 体内における AChE 反応をイミダク
ロプリド（IMI）の投与の有無で可視化するとともに，得られた強度分布をバーグラフにした結果から，AChE の反応は IMI 未投与サンプルと比較して低下する傾向を示した（ 図 1）．また，D.melanogaster における ChATの反応の可視化についても世界で初めて成功した（図２）．
図２に示す通り頭部において ChAT 反応が起きているが，投与未投与で比較すると頭部では反応が低下する一方，胸部と腹部では亢進する傾向があることがわかった．

図 2. IMI 投与による ChAT 反応の変化．

未投与個体と比較して頭部では低下する傾向が見られ，腹部と胸部では亢進する傾向が見られた．

40

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成【考察】

Caspase-11 の量が著減する．本研究では，15d-PGJ2

本研究を通して，IMI の摂取の有無における AChE お

は Caspase-11 を標的とする抑制性の生体分子として働よび ChAT 反応の可視化への道が拓けた．今回得られいていると予想し，その作用機序と影響を解析することで，た結果より，IMI は全身の酵素について作用するよりは，

Caspase-4，5 を中心とする炎症応答の制御について理

特定の部位における酵素に対して作用することが示唆され解し，ひいては敗血症治療に資することを目的とした．

た．本研究を今後進めるにあたり，課題も明らかとなった．

【方法】

その課題とは D.melanogaster の個体間におけるばらつ

15d-PGJ2 による Caspase-11 活性化抑制機序を調べきの大きさである．この原因は，今回の実験系では餌にるため，15d-PGJ2 で標識したビーズと Caspase-11 組

農薬を混合し，それを経口で与えている点にあると考えら

換えタンパク質を混合し，プルダウンアッセイした．また，れる．すなわち，餌を食べる量をコントロールすることが15d-PGJ2 の存在・非存在下で，LPS で標識したビーズ

非常に困難であることがばらつきの原因であると考えられと Caspase-11 組換えタンパク質を混合し，プルダウンア

る．現状，餌を与える前の状況を揃え，餌に暴露する時ッセイした．さらに，15d-PGJ2 の抗炎症効果を生体で間もコントロールしていることから，これを解決する方策と確認するため，15d-PGJ2（1mg/kg）を皮下投与したマ

しては検体数を増やすことが最良ではないかと考えている．

ウスに LPS を投与し，生存率への影響を調べた．
【結果】
プルダウンアッセイの結果，15d-PGJ2 は Caspase-11

炎症性Caspaseを抑制する新規免疫制御機構のに結 合すること，また 15d-PGJ2 の存 在 下では LPS と解明

Caspase-11 の結合が抑えられることが分かった（図１）．
武

村

直

紀

（大阪大学 大学院薬学研究科 生体応答制御学分野）

また，15d-PGJ2 を皮下投与したマウスでは，LPS を投与した後の生存率が有意に上がった（図２）．

【目的】
Caspase は細胞死を誘導するプロセスで中心的な役割を果たすプロテアーゼファミリーであり，免疫応答に深く関わる．病原体感染時に誘導される細胞死の 1 つである
パイロトーシスは，細胞が膨潤・破裂して死に至る過程
で種々の炎症誘発分子を放出することが特徴であり，その引き金 を担う Caspase-1，4，5 は 炎 症 性 Caspaseと呼ばれる（ヒトの Caspase-4，5 のマウス相同分子はCaspase-11）．Caspase-4，5 はグラム陰性細菌のリポ多糖（LPS）を認識し，同分類に属する病原性細菌に対する防御応答を担う．一方で，敗血症の際に LPS が原因で起きるショック反 応においては，Caspase-4，5 を引き金とする炎症応答が過度に誘導され，組織障害をもたらす．敗血症は高齢化が進む先進国や衛生管理が十分ではない新興国においては，深刻な問題となっている．
我々は，生理活性脂質である Prostaglandin（PG）J2類の 15d-PGJ2 が Non-canonical インフラマソームを抑制する予備的知見を得ている．マウスマクロファージを
LPS で刺 激する際に 15d-PGJ2 で処 理すると， 活 性 化

図 1. 15d-PGJ2 は LPS と Caspase-11 の結合を阻害する

41

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成

架橋酵素反応を検出する新規バイオセンサー開発と
制御剤探索
辰

川

英

樹

（名古屋大学大学院創薬科学研究科）【目的】
架橋酵素トランスグルタミナーゼ（TGase）はタンパク質中の特定のグルタミンおよびリジン残基間にイソペプチ
ド結合を形成し，基質の性状や機能変換に関わる．哺乳 類では 8 種のアイソザイム（TG1–7,FXIIIa）が存 在
し，種々の生命現象（血液凝固や皮膚表皮形成，細胞死，免疫応答，線維化，糖尿病，癌など）に重要な反応を担うが，各 TGase アイソザイム特異的な活性化機構
や有用な制御薬剤の開発は不十分である．これを解決するため，申請者はこれまでに主要な TGase アイソザイム
である TG1とTG2 が特異的に認識する基質ペプチド配列（pepK5,pepT26 配列をそれぞれ同定）を同定し，これを活性検出のための分子プローブとして利用して 4），TG1と TG2 の活性を特異的に解析してきた 1–3）．本研究では，
未だコストと感度に問題があるこれまで開発したタンパク
図 2. 15d-PGJ2 はリポ多糖誘導性の致死性ショックを抑える

質性の分子プローブ 4）を低分子化し，薬剤スクリーニン
グに有用な簡便かつ高感度に架橋活性を測定できる新規
分子プローブを開発することを目的とする．

【考察】

【方法】

15d-PGJ2 は Caspase-11 に 直 接 結 合 し，LPS と本申請者がこれまでに同定した各 TGase により特異

Caspase-11 の結合を阻害することで，Caspase-11 の自的に架 橋されるペプチド配 列 情 報に基 づき，グルタミ

己活性化を防いでいると予想された．また，LPS を投与

ン（Q）およびリジン（K） 残 基を含むペプチドを蛍 光

したマウスの生存率が 15d-PGJ2 の投与で改善したこと

標識したプローブを合成した．FITC 標識の Q 側配列とから，15d-PGJ2 は生体内でも同様の作用機序で LPS に

Rhodamine 標識の K 側配列が TGase により架橋されよる炎症応答を抑えると予想された．今後，15d-PGJ2

ると，2 つの蛍光分子の距離が近接して蛍光共鳴エネル

を中心とする炎症抑制機構について，さらに理解を深めてギー移動（FRET）が起こり，蛍光波長が変化する．こいきたい．

の波長の変化を捉えることにより各 TGase による架橋反応を簡便に定量できる（図１）．

42

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成

identification and analysis of isozymespecific possible substrates crosslinked
by transglutaminases using their substrate
peptides in mouse liver fibrosis. Sci Rep .
7:45049, 2017.
図１.TG1 特異的に活性を検出するバイオプローブの設計例

2）Tatsukawa H*, Otsu R, Tani Y, et al.: Isozymespecific coprehensive characterization of

各ペプチド配列に蛍光分子を標識し，高効率に FRETtransglutaminase-crosslinked substrates inが起こる分子設計について，基質ペプチドやリンカー長，kidney fibrosis. Sci Rep . 8(1):7306 (16 pages),

蛍光分子の標識位置を検討することにより最適化した．プ

2018.

ローブ比率や濃度，反応条件，TGase 濃度，類似酵素3 ） T a k e u c h i T, T a t s u k a w a H * , S h i n o d a Y,による反応特異性を検証した．さらに培養細胞や組織抽

et al.: Spatially resolved identification of

出液による検討，生細胞への導入により生体内 TGase のtransglutaminase substrates by proteomics

架橋活性の検出能や感度を評価した．分子プローブの作

in pulmonary fibrosis. Am J Respir Cell Mol

製後，本学所有の化合物ライブラリーを用いて各 TGase

Biol . 65(3):319-330, 2021.

特異的な架橋反応を制御する化合物の探索を行った．
【結果】
FITC 標識した Q 残基を含む基質配列と Rhodamine
標識した K 残基を含む基質配列が各 TGase アイソザイム

4）Tatsukawa H*, Liu HH, Oba Shota, et al..:
FRET-based detection of isozyme-specificactivities of transglutaminases. Amino Acids .
49(3):615-623, 2017.

により架橋されると蛍光分子の距離が接近するため，蛍5）Tatsukawa H*, Aoyama R, Hitomi K.:

光共鳴エネルギー移動（FRET）が起こる．480nm のDevelopment of peptide-based biosensors for

励 起による FITC の蛍 光 が Rhodamine の励 起に使わ

detecting cross-linking and deamidation of

れて減弱すると共に，580nm の蛍光強度が増加するこtransglutaminases. Amino Acids . 55(6):807-とを期待した．しかしながら，実際にプローブを作製して819, 2023.

測定したところ，期待どおり 480nm の励起による FITCの蛍 光 強 度は減 少したものの，580nm の蛍 光の増 加は観察されなかった．種々の検討結果により，FITC と癌転移に関わるチオールメチル化酵素標的因子のRhodamine の近接はクエンチング効果を誘導することを網羅的同定

見出し，同プローブの消光作用を利用して，組織や細胞

谷の粗抽出液であっても TG1 と TG2 の各架橋活性を測定

上

賢

瑞

（東京大学アイソトープ総合センター）

できることを示した．さらに，同プローブを用いて化合物
ライブラリーから TGase 活性を制御する化合物のスクリーニングに成功した．
【考察】

【目的】
メチル化は，核酸・タンパク質・脂質など様々な基質にメチル基が結合・置換することであり，基質の発現量開発したプローブはこれまで TGase のアイソザイム特異や機能，代謝等に深く関わっている．また，メチル化制的な活性測定が煩雑であった問題を解決し，プローブを御機構の破綻が様々な疾患の原因になるが，破綻が生じ加えるだけで簡便かつ再現性よく架橋活性を測定できる

る分子機構と生理的意義については十分には明らかにな

有用なツールとなりうる 5）．

っていない．申請者は癌細胞における DNA/ ヒストンメチ【文献】

ル化制御が，増殖・腫瘍形成能獲得に寄与し，治療や

1）Tatsukawa H*, Tani Y, Otsu R, et al.: Global

診断の対象になることを明らかにしてきた 1-4）．申請者は，

43

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成

研究をさらに発展させ，膵癌組織で高発現しているメチ

UHRF1. Proc Natl Acad Sci U S A 113, 1273-

ル化酵素を探索し，膵癌細胞への影響を確認したところ，

8 (2016)

メチル化酵素 X が膵癌細胞の増殖に重要であることを明3）Taniue K, Hayashi T, Kamoshida Y, et al.:らかにした．本課題では，メチル化酵素 X が膵癌で高発

UHRF1-KAT7-mediated regulation of TUSC3

現しているメカニズムとメチル化酵素 X のメチル化標的を

expression via histone methylation/acetylation

明らかにし，メチル化酵素 X が膵癌に与える影響を明ら

is critical for the proliferation of colon cancer

かにすることを目的とした．

cells. Oncogene 39, 1018-1030 (2020)【方法と結果】

4 ） S h i m i z u D , T a n i u e K * , M a t s u i Y, e t a l . :カルチャーインサートによる創傷治癒アッセイやヌードマ

Pan-cancer methylome analysis for cancer

ウスを用いた転移能アッセイを行い，野生型膵癌細胞とdiagnosis and classification of cancer cell of

比較してメチル化酵素 X ノックアウト膵癌細胞における移origin. Cancer Gene Ther 29, 428-436 (2022)

動・転移能が低下することが確認された．次に申請者は，*correspondence

メチル化酵素 X が膵癌で高発現している機構の探索を行った．ChIP-seq データ及び膵癌組織における発現デー
タを統合解析し，HNF4 ファミリーがメチル化酵素 X のアラキドン酸リポキシゲナーゼALOX15のフェロ発現を制御していることを見出した．さらに申請者は，タ

トーシス感受性制御機構の解明

ンパク質や代謝産物などを対象として，メチル化酵素 X

鳥のメチル化活性を調べた．既にメチル化酵素 X がチオー

居

征

司

（群馬大学 食健康科学教育研究センター）

ルをメチル化する機能を有することが報告されていることか
ら，複数のチオール脂質やチオールアミノ酸であるシステ【目的】

イン，グルタチオンなどを基質に用いて，メチル化酵素 X

フェロトーシスは脂質過酸化を特徴とする新規形態の細のメチル化活性を調べた．結果，メチル化酵素 X は 18-

胞死で，耐性癌治療戦略の一つとして注目されている．ア

MOA などのチオール脂質をメチル化することを見出した．

ラキドン酸リポキシゲナーゼは多価不飽和脂肪酸の酸化【考察】

酵素で，そのうち ALOX15 はヒト癌細胞のフェロトーシス

本研究では，膵癌組織で発現が亢進し，膵癌細胞の感受性制御に関わることが示された．我々は，ALOX15

増殖・移動・転移能を制御する因子として，メチル化酵の一部が細胞膜に在留することに着目し，ALOX15 のフ

素 X を同定し，当該メチル化酵素がチオール脂質をメチェロトーシス活性化機能における細胞膜局在化の役割をル化することを見出した．今後は，メチル化酵素 X による明らかにすることを目的に本研究を行った．

細胞内でのチオール脂質のメチル化反応を詳細に解明す【方法】

る．本課題で得られた知見が，メチル化酵素 X の阻害

1. 細胞膜局在化 ALOX15 の解析剤開発などを通じて，膵癌の治療・診断に応用されるこ

細胞膜局在の重要性を示すため，ALOX15 に細胞膜とが期待される．

ターゲットシグナルを付加したコンストラクト（ALOX15-【文献】

PM）を作成し，これを癌細胞に発現させてフェロトーシス

1）Taniue K, Oda T, Hayashi T, et al.: A member

活性化機能（野生型を上まわるフェロトーシス感受性亢o f t h e E T S f a m i l y, E H F, a n d t h e AT P a s e進機能）を確認する．

RUVBL1 inhibit p53-mediated apoptosis

2. ALOX15 相互作用タンパク質の同定

EMBO rep 12, 682-689 (2011)

これまでに ALOX15 と複合体を形成するタンパク質は得

2）Taniue K, Kurimoto A, Sugimasa H, et al.:られていないため，本研究では，一過性に相互作用して膜Long noncoding RNA UPAT promotes colon

局在化を仲介するタンパク質の存在を仮定し，BioID 法（近tumorigenesis by inhibiting degradation of

位依存性ビオチン標識）による結合分子の探索を行う．

44

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成

【結果】

【方法】

1. ALOX15 に細胞膜ターゲットシグナルを連結した２種

リコンビナント BST1 タンパク質を用いて，その酵素活類のコンストラクトを作成し，HT1080 細胞に発現さ性について詳細に解析した．また，BST1 欠損細胞，もしせたところ，細胞膜への有意な局在が観察された．こくは BST1 ノックアウトマウスを用いて，細胞内，個体でれらの安定発現株を樹立してフェロトーシスの感受性の機能を解析した．

を解析した結果，いずれの発現株も野生型 ALOX15【結果】

発現細胞よりわずかに高い感受性を示した．

CD38 は酸化還元反応の補酵素である NAD+（ニコチ2. 野生型 ALOX15 と（細胞膜局在化しない）変異体

ンアミドアデニンジヌクレオチド）に対して加水分解活性に AirID を連結したコンストラクトを作成し，それぞおよびサイクラーゼ活性をもつことが知られている．そのたれの発現細胞株を作成した．細胞をビオチンで標識しめ，BST1 も CD38 と同様の酵素活性を持つと考えられた後に，回収したライセートから精製したビオチン化タてきたが，実際は，NAD + に対する分解活性およびサイク

ンパク質のプロテオミクス解析を行った結果，野生型

ラーゼ活性活性はほとんど示さず，BST1 は NAD+ では

ALOX15 に結合する膜タンパク質の候補を得た．

なく，NAD+ の前駆物質である NR（ニコチンアミドリボ【考察】シド）に対する非常に強い加水分解活性を持つことを明ら

ALOX15-PM による研 究 結 果から， 癌 細 胞におけるかにした．また，BST1 の新たな酵素活性として，NR に

ALOX15 のフェロトーシス感受性亢進機能は，細胞膜へ対する base-exchange 活性（塩基交換活性）を見出した．

の局在化が必要であることが示唆された．以前に報告さこれは，NR の塩基部分であるニコチンアミドをニコチンれた結合タンパク質 PEBP1 は小胞体に局在するが，我々酸（NA）と交換し，ニコチン酸リボシド（NAR）と呼ばが共免疫沈降実験を行ったところ，ALOX15 との相互作

れる新たな NAD 前駆体を作り出すユニークな酵素活性用は確認できなかった．今後は，得られた候補タンパクであった．近年，NAD+ やそのシグナルが老化やさまざ

質と ALOX15 の相互作用を明らかにし，その機能の詳細

まな加齢に伴う炎症性疾患に深く関与していることが報告を調べるつもりである．

され，注目を集めている．そこで，BST1 と炎症，老化の関係を調べたところ，マクロファージ，特に炎症で誘導される M1 型マクロファージに高発現し，肥満などでは数十倍の発現誘導が見られることを見出した．また，加齢によ

BST1による炎症制御機構の解明
中川崇（富山大学学術研究部医学系分子医科薬理学）ってもマクロファージで BST1 の発現が上昇することがわ
かった．
【考察】
肥満や LPS 誘導性の炎症では，NAD+ レベルが低下【目的】

することが知られており，NR のマウスやヒトへの投与はBST1（Bone marrow stromal antigen 1）は，関NAD + レベルを上昇させ，肥満などの加齢関連疾患に予節リウマチ患者由来の骨髄細胞に高発現するタンパク質と防・治療効果を示すことが多数報告されている．つまり，

して見出された．BST1 は，主に細胞表面に発現するエク

マクロファージなどの炎症性細胞に発現する BST1 は炎トエンザイムであり，GPI アンカータンパク質ファミリーに症病態において何らかの役割を担っている可能性があるし属することが知られている．BST1 は CD38 の遺伝子重かしながら，BST1 の酵素活性と炎症がどのように関係し複で生じたパラログであり，CD38 とは高いアミノ酸相同ているか今後の検討課題となる．

性を示す．しかしながら，BST1 の機能の詳細については良く分かっていなかった．本研究では BST1 の機能について，特に炎症制御機構での役割について明らかにする目的とした．

45

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成

ステロールの異常蓄積が確認された．メカニズムは不明
イノシトールリン脂質キナーゼによる膜接触部位

だが，ORP9 の脂質交換輸送機能とコレステロール制御の制御機構が関連する可能性が示唆された．PI4K2a はコレステロー

中

津

史

（新潟大学大学院医歯学総合研究科神経生化学）

ルにより活性化されることが知られており，ORP9 は何らかのメカニズムにより PI4K2a 活性制御および膜接触部位の形成制御にも関与する可能性が示唆された．

【目的】
小胞体は，細胞膜やオルガネラと部分的に接することで膜接触部位を形成する．私達は，この膜接触部位が「脂ニトロ化タンパク質の脱ニトロ化・還元酵素の同定

質の交換輸送の場」であることを明らかにしてきた．最近，と機能解析

私達はオキシステロール結合タンパク質・ORP10 が小胞

那須野

体―エンドソーム膜接触部位において脂質交換輸送を制亮（神戸大学・先端バイオ工学研究センター）

御することを見出した（JCB 2022）．この脂質交換輸送に
は ORP10 だけでなくORP9 も関与し，これがエンドソー【背景と目的】

ム局在型 PI-4 キナーゼ PI4K2a を制御している可能性がシグナル分子である一酸化窒素（NO）に依存的なタン示唆された．そこで，本研究では，ORP9 の機能を明ら

パク質翻訳後修飾の一つであり，チロシン（Tyr）残基

かにすることで，イノシトールリン脂質キナーゼによる膜接をニトロチロシン（NT）残基に変換するニトロ化（Protein

触部位の制御機構の解明を目指す．

Tyrosine Nitration; PTN）修飾は，脱修飾に酵素反【方法】

応が必要と考えられるが，酵素は同定されていない．一方，

PI4 キナーゼ PI4K2a 及び脂 質 交 換 輸 送タンパク質

微生物に広く保存されるニトロレダクターゼ（NR）は，様々

ORPs 等の局在や動態は，共焦点レーザー顕微鏡によりなニトロ化合物のニトロ基を還元することが知られている．

解析した．ORP9 の脂質交換輸送活性は，in vitro 脂

本研究では，酵母 Saccharomyces cerevisiae を用

質交換輸送アッセイ系を用いて検証した．細胞機能解析

い，PTN シグナルの消去経路として，NT 残基を Tyr 残は，FKBP/FRB を用いたラパマイシン依存的２量体化法

基へ変換する脱ニトロ化酵素（DNTase），アミノチロシンによる機能獲得法，および CRISPR/Cas9 によるノックア（AT）残基へ還元する NT 還元酵素（NTred）を同定

ウト機能喪失法により解析した．

することを目的とした．特に，DNTase 候補としては，日【結果】

本応用酵素協会誌 No.56（2021）にて NT 結合タンパ

精製 ORP9 を用いた in vitro 脂質交換輸送測定実験

ク質として報告した還元酵素 R に，NTred 候補としては，から，ORP9 は PI4P を輸送することが判明した．先行研

酵母 NR である Hbn1, Frm2 に着目し，解析を行った．

究から示唆されていたコレステロールについて検討したとこ【方法】

ろ，ORP9 はコレステロールに対する輸送活性は示さなか

酵母 DNTase 活性の測定：最少培地で培養した酵母った．一方，ORP9 は PS に対しては強い輸送活性を示

S.cerevisiae の抽出液を透析したものを粗酵素液とし，したことから，ORP9 は PI4P と PS の脂質交換輸送を制NADPH, NADH, FMN, FAD, ATP, GTP, MgSO 4,

御する可能性が示唆された．そこで ORP9 ノックアウト細CaCl2 の存在下，1mM 遊離 NT をモデル基質として反胞のエンドソームの PI4P および PS レベルを測定したとこ

応させた後，QTRAP4500 質 量 分 析 計（AB SCIEX）

ろ，PI4P の異常蓄積と PS の減少が確認された．しかしを用いた LC/MS/MS に供し，Tyr および AT を定量した．

ながらコレステロールも異常蓄積していることが判明した．

タンパク質分解に由来する Tyr と区別するため，培養の【考察】

際の炭素源，窒素源として，13C- グルコース（ 13C 培養），

ORP9 は予想に反して PI4P と PS を輸送することが判明した．しかし，ORP9 欠損細胞のエンドソームではコレ

4615N- 硫酸アンモニウム（ 15N 培養）を用いた．
酵 母 NO 応 答 の 解 析：NO ドナ ーである MAHMA

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成

NONOate，もしくは酸性環境下で亜硝酸塩を添加することにより，酵母を NO 処理し，スポット試験により NO 毒性に対する耐性を，RT-qPCR により遺伝子発現応答を，
抗 NT 抗体を用いたウェスタンブロットにより細胞内 PTN
レベルを，それぞれ解析した．
組 換え Hbn1 の酵 素 活 性の測 定： 大 腸 菌を用いた組 換え精 製 酵 素として Hbn1 を調 製し，FMN を補 因子，NADPH を電 子 供 与 体とし，モデル 基 質として遊図 1 酵母 NR 依存的な NO 耐性

酵母 NR 遺伝子（FRM2,HBN1）破壊株は，野生株に比べて NO ストレスに感受性を示した．

離 NT に対する活 性を測 定した．また，Hbn1, FMN,
NADPH, 蛍光 NO プローブ DAF-FM を含む反応溶液に，NO ドナー NOC-5（ 半 減 期 25 分 ）を添 加し， 蛍
光強度（Ex：495nm, Em：515nm）を経時的に測定することで，NOC-5 由来の NO による経時的な蛍光上昇の阻害の程度から，Hbn1 による NO 消去活性を評価した．
【結果】
これまでに 15N 培 養した酵 母 抽 出 液 から， 還 元 酵
素 R および NT 依 存 的な 14N-Tyr 合 成 活 性を検 出し，
DNTase 活性の可能性を示した．しかし， C 培養した
13

酵母抽出液を用いて同様の解析を行ったところ， 14N-Tyr
合成活性は検出されなかった．このことから，NT 依存的な Tyr 合成は，DNTase 活性ではなく NT を基質としたトランスアミナーゼ活性によると結論付けた．

図 2 精製 Hbn1 による消去活性NO ドナーから放出される NO と蛍光 NO プローブの反応による蛍光上昇は，Hbn1 および NADP
依存的に阻害された．

【考察】
本研究では，これまでに見出した酵母 DNTase 活性を

続いて，酵母 NR が NTred として機能するか解析した．

より詳細に解析した結果，トランスアミナーゼ活性によるNO 処理した酵母を RT-qPCR に供したところ，HBN1 ,擬陽性である可能性が示された．これは，サンプル中に

FRM2 ともに NO に応答して誘導された．また，NR 遺存在する微量のα - ケト酸によって引き起こされたと考えら

伝子破壊株は NO ストレスに感受性を示した（図 1）．しれる．

かし，NO 処理した酵母細胞内の PTN レベルは，NR 遺本研究では，酵母 NR 遺伝子が NO に応答して誘導伝子の有無で変化しなかった．また，精製 Hbn1 は遊離されること，NO 耐性に寄与することを示し，NR の一つ

NT に対する還元活性を示さなかった．これらのことから，

Hbn1 が還元的に NO を分解することを示唆する結果をNR は NTred 以外の機能を発揮し，酵母の NO 耐性に得た．アミノ酸配列の類似性（Identity：59%）や遺伝関与する可能性が考えられた．

子発現の NO に対する応答性などから，Hbn1 と Frm2

そこで，精製 Hbn1 が NO そのものを分解するか検証は同様の機能を担う可能性が高い．これらのことから，した．その結果，Hbn1 および NADPH 依存的に，NO

酵母 NR は NO を還元的に分解することで NO 耐性には 明 確 に消 去され た（ 図 2）．また，Hbn1 依 存 的 な寄与すると結論付けた．還元反応の生成物は未同定であNO 消去反応は，系内の溶存酸素濃度を上昇させること

るが，既知の NO 還元酵素と同様に亜酸化窒素（N2O）

で阻害された．以上のことから，Hbn1 が NO を還元的を生成すると予想される．微生物に広く保存される NOに分解すると結論付けた．

耐性機構であるフラボヘモグロビン（FHb）は，好気的条件において NO を硝酸（NO3-）に酸化する．このことから，NR が嫌気的条件における還元的分解，FHb が47

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成

好気的条件における酸化的分解と，状況に応じて使い分分泌量を増加できることが判明した．また，二量体化によけられている可能性が考えられる．

り安定化されることが判ったが，酸性条件下では不可逆

本研究では，DNTase，NTred の同定はできなかった的に失活することも判った．さらに，東京都臨床医学研が，NR による NO 分解という新たな NO 耐性機構を発究所の丸山千秋博士のグループとの共同研究で，発生期見した．微生物特異的な NO 耐性機構は抗菌薬標的との大脳サブプレート直下で発現する ADAMTS-2 が TGF-

して注目されており，本研究成果は，基礎微生物学のみ

βシグナルを制御し，これが神経細胞の形態変化（多極ならず医薬分野へも波及効果をもたらす．

性から双極性への移行）に関わる可能性を見出した．
【考察】
従来，ADAMTS ファミリーのプロドメインはフォールデ

分泌型メタロプロテアーゼADAMTSによる神経ィングや局在制御に寄与する例が知られていたが，今回，機能制御

ADAMTS-2 と ADAMTS-3 のプロドメインは発現と分泌

服

部

光

治

（名古屋市立大学大学院薬学研究科・病態生化学分野）に関与することが明らかとなった．今後の安定化及び大量取得，構造解析に進むための重要な知見であると考えられる．本研究をもとに，ADAMTS-2/3 の基質特異性【研究の背景】
我々は 脳 の 形 成と機 能 発 現 に必 須 の 分 泌タンパク
質リーリンが 分 泌 型プロテアー ゼ ADAMTS-3 およびと生理的意義の全貌の解明が進み，さらには阻害化合物が創製できれば，精神神経疾患の新規治療薬開発につながると期待される．

ADAMTS-2 によって分解・不活化されることを見出した．
リーリンの機能低下は様々な疾患に関与するので，これらの酵素の阻害剤はリーリンの機能低下を防ぎ，精神神経感染症を重症化させる炎症誘導性タンパク分解疾患の改善に役立つ．本研究では阻害剤創製に向けた

酵素の特定ADAMTS-3 の精製及び安定化法の確立と，脳における原

ADAMTS-3 および 2 のリーリン分解以外の機能の解明

英樹（旭川医科大学医学部感染症学講座微生物学分野）を目指した．
【方法】【目的】

ADAMTS-3 と ADAMTS-2 はともに下 図に示すような病原体は特有のリガンドを多く発現しており，感染する構造を持ち，相同性は極めて高いが，発現量と分泌量はと様々な炎症応答を惹起する．多くの炎症応答は感染防ADAMTS-2 のほうが高い．両者のキメラタンパク質を各種御に寄与するなかで，われわれはインフラマソーム応答を作成して分泌量や酵素活性を検討した．さらに，構造解析介した炎症応答が感染病態を悪化させることを見出した．

に供するための安定化方法および精製法について検討した．

そこで本研究では，インフラマソーム応答を介した炎症応答に関わるタンパク分解酵素および炎症シグナル関連酵素の特定を試みた．
【方法】
初代マクロファージにリステリアなどの病原菌を感染させ，インフラマソーム応答の指標として培養上清中の IL-1
β濃度を測定した．各酵素は特異的な阻害剤で細胞を処理することで炎症応答への関与を調べた．また各酵素の【結果】
プロドメインの変換および 550 番目の残基より C 末端
側を欠失させることにより，酵素活性を維持したまま発現・

48

活性化はウエスタンブロット法で活性型タンパクを検出することで評価した．

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成【結果】確立されていない．Cu/Zn- スーパーオキシドディスムター

リステリアをマクロファージに感染させると IL-1 βが産ゼ（SOD1）は生体内で抗酸化酵素として働いているが，生され，カスパーゼ 1 および Gsdmd を阻害することで抑点変異や欠失変異は家族性 ALS を引き起こすことが既に制された．また，リン酸化酵素である Syk およびキナー

明らかになっている．SOD1 はサブユニットあたり 153 個

ゼ X を阻害することでも抑制された．Syk を阻害した細のアミノ酸からなるホモダイマーで，現在までに 200 個

胞にリステリアを感染させるとキナーゼ X の活性化が低下

以上もの ALS 変異が報告されている．変異 SOD1 は野することから，キナーゼ X は Syk の下流であることが示さ

生型 SOD1 に比べて不安定で凝集しやすい性質があり，れた．我々は以前に JNK もインフラマソーム応答に関わ

ALS 患者の病変部位には SOD1 免疫陽性の凝集体が観ることを報告しているが，その下流シグナルとしてキナーゼ

察されている．また，SOD1 を欠損させたマウスは ALS

Y が活性化することも突き止めた．

を発 症しないが， 変 異 SOD1 を強 発 現させたマウスは【考察】

ALS を発症する．従って，変異 SOD1 による ALS 発症は，

カスパ ー ゼ 1 は IL-1 β産 生 を制 御しているが， 近

酵素活性の低下は関係なく，変異 SOD1 タンパク質の年 の 報 告 か らカス パ ー ゼ 1 は pyroptosis だ け で な

ミスフォールディングや凝集体形成が関与する「gain of

く PANoptosis に も 関 わ る こと が 提 唱 さ れ て い る．

toxic function」と考えられている 1）．そのため，SOD1

Pyroptosis 特異的な制御因子として Gsdmd を阻害したの凝集化やアミロイド化の研究が行われ，SOD1 アミロイ

ところ IL-1 β産生はほとんど確認されなくなった．このこド形成に重要なコア配列が複数報告されてきた．これらとから，リステリアは PANoptosis ではなく pyroptosisのコア配列を含むペプチドのアミロイド化実験によると，N

依存的に IL-1 βの分泌を誘導していることが判明した．

末端側の 1-55 と C 末端側の 80-153 はアミロイド化する

また，インフラマソームの活性化にはチロシンおよびセリン

が，24-79 と 56-118 はアミロイド化しないことが報告さ

キナーゼ経路が関与しており，下流の分子としてキナーゼ

れた 2）．この結果は，クライオ電子顕微鏡による SOD1

X および Y を同定した．これらのキナーゼを阻害すること

アミロイドの構造解析で「3-55 と 86-153 がアミロイドをでインフラマソーム応答を抑制できることから，治療手段

形成し互いに向かい合っていた」という報告 3）と矛盾しなが限られる感染症治療への応用が期待される．

い．しかし，これらの配列が実際に細胞内で凝集体を形

以上のような研究の進展に大いなる援助をいただいた

成するかどうかの検証はなされておらず，SOD1 の凝集機

公益財団法人日本応用酵素協会に心より感謝申し上げま

構は未だ解明されていない．そこで，本研究では，SOD1す．

の細胞内凝集機構を解明するために，先行研究で得られたアミロイドのコア配列と細胞内凝集に関与する配列が一致するのかどうかを検証し，細胞内凝集に重要となる配列

ALSを引き起こす抗酸化酵素「SOD1」の凝集機を特定することを目的とした．

構解明

【方法】

藤

原

範

SOD1 の C 末端に緑色蛍光タンパク質（EGFP）を融子（兵庫医科大学・医学部）合させた配列を HEK293 細胞に発現させる従来法では，
ALS 変異 SOD1 と野生型 SOD1 との違いを見出すこと【背景と目的】ができなかった． 一 方，protein X を SOD1-EGFP の筋萎縮性側索硬化症（ALS）を含む神経変性疾患では，

N 末端側に導入した発現プラスミドを細胞に発現させる

原因タンパク質のミスフォールディングや凝集・アミロイド

方法では，ALS 変異 SOD1 の凝集体形成が著しく促進化が発症や病態に関与すると考えられているが，その詳細され，凝集体を容易に観察することができることを見出しは未だに不明である．ALS は運動ニューロンが特異的にた．そこで，この protein X 融合法を活用して，既報 2）

障害されて筋萎縮と筋力低下を来し，最終的には呼吸筋でアミロイド化した SOD1 部分配列が細胞内で凝集体を麻痺で死に至る疾患で，発症機構が未解明で治療法も形成するかどうかを検討した．さらに，SOD1 の C 末端49

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成側を順次欠損させた protein X-SOD1 ペプチド（1-120，

団法人日本応用酵素協会に深謝いたします．

1-90，1-60 など）-EGFP を発現させて凝集体の有無を【文献】

観察し，SOD1 の細胞内凝集に必要な N 末端配列とアミ

1） 藤 原 範 子： 銅・ 亜 鉛 - スーパーオキシドディスムタ

ノ酸残基の決定を行った．

ー ゼ - 脳 科 学 辞 典 DOI：10.14931/bsd.9795,【結果】(2021)

アミロイド化する SOD1 部 分 配 列（1-55 と 80-153）

2）Furukawa Y, Kaneko K, Yamanaka K et al.:のうち，1-55 は細 胞 内でも凝 集 体を形 成したが，80-

Mutation-dependent polymorphism of Cu,Zn-

153 は凝集体を形成しなかった．一方，アミロイド化しな

superoxide dismutase aggregates in theい配列（24-79 と 56-118）のうち，24-79 では凝集体

familial form of amyotrophic lateral sclerosis.

をほとんど観察できなかったが，56-118 は凝集体を形成

J Biol Chem. 285(29):22221 (2010)することがわかった．1-55 が凝集体を形成したこと，
また，

3）Wang LQ, Ma Y, Yuan HY et al.: Cryo-EM

C 末端側を欠損する家族性 ALS 変異が存在することから，

structure of an amyloid fibril formed by full-

SOD1 の C 末端側を順次欠損させていき，凝集体形成

length human SOD1 reveals its conformationalの有無を検討した．その結果，1-34 は凝集体を形成しな

conversion. Nat Commun.;13(1), 3491 (2022)

いが，1-35 よりも長い SOD1 ペプチドを含むと凝集体を形成することが明らかになった．そこで，1-35 ペプチドにおいて，ヒト SOD1 の 35 番目のアミノ酸である I35 を他

小胞体出芽部位ER exit siteの形成と機能に関与のアミノ酸に置換し，凝集体形成の有無を検討した．I35

する酵素因子群の機能解析

を他の分枝鎖アミノ酸に置換した 1-35 ペプチド（I35Lと I35V）は凝集体を形成したが，親水性アミノ酸であ

前

田

深

春

（秋田大学大学院医学系研究科 情報制御学・実験治療学講座）

るセリン（I35S）やリシン（I35K）に置換すると凝集体を形成しなかった．さらに，凝集体を形成する ALS 変異【⽬的】

SOD1（A4V や G93A）に I35S の変異を加えると，凝インスリンやコラーゲンなど⽣体分⼦のおよそ 3 割は細集体の形成は著しく低下した．以上の結果より，SOD1

胞外に分泌されて機能する．これらのタンパク質は⼩胞体の凝集体形成に必要な N 末端側の最小配列が 1-35 でで翻訳された後、⼩胞体上の特殊な領域である ER exit

あること，I35 が凝集体形成に重要な役割を果たしているsite において形成される COPII ⼩胞に詰め込まれ、ゴルことが明らかになった（論文投稿中）．

ジ体へ輸送される．ER exit site は通常，細胞あたり数【考察】百個存在するが，哺乳細胞では栄養状態や⼩胞体ストレ

I35 は 哺 乳 類 の SOD1 では 広く保 存されているが，ス等に応じて ER exit site の数や⼤きさを変化させること

I35 に変異をもつ家族性 ALS 患者は未だ報告されていなで，⼩胞体からの分泌量を積極的に調節していることがい．つまり，孤発性 ALS を含め，全ての ALS 患者が有最近明らかになってきた．しかし，ER exit site が⼩胞する SOD1 には凝集体形成に重要な I35 が存在すること

体上のどこに，どのような分⼦メカニズムで形成されるかとなり，SOD1 の凝集体形成が ALS 発症に関与しているは不明である．

ことが示唆される．従って，I35 を新たなターゲットとして昨年度我々は，ER exit site における低分⼦量 G タン

凝集体形成を阻害すれば ALS 発症を抑制できる可能性

パク質（GTP 加⽔分解酵素）Sar1 の活性化をライブイ

がある．今後は，変異 SOD1 の凝集体と共凝集している

メージングで可視化できる細胞を CRISPR/Cas9 システム

タンパク質を明らかにし，凝集体形成を抑制する方法のを⽤いて構築し，この細胞を⽤いて，さまざまな状態にお開発を進めていく予定である．

ける Sar1 GTPase の活性を定量的に評価した．

【謝辞】

【⽅法】

本研究を遂行するにあたり，ご支援を賜りました公益財50

我々は split GFP の⼀部分を Sar1 にノックインするこ

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成とによって，活性化してはじめて GFP シグナルが検出されゲノム編集技術を用いて，Pex19 の N 末端にオーキシる細胞株を樹⽴した．この細胞株に各種 COPII 因⼦群

ンデグロンタグをノックインした酵母株を作製した．オーキの発現抑制および薬剤添加等を⾏い，その際の GFP シ

シンを添加し，Pex19 を分解させた後に，PMPs を発現

グナルの強度および FRAP による回復率を測定すること

させ，PMPs の局在を蛍光顕微鏡を用いて観察した．ミで，Sar1GTPase のターンオーバー率を測定した．

トコンドリアに誤 配 送された PMPs については，Msp1【結果・考察】依存的な配送のやり直しをタイムラプス観察によって検証

Sar1 の活性化因⼦である Sec12 を発現抑制した細胞においては，Sar1GTPase の輝度が著しく低下した．ました．
【結果および考察】

た，Sar1 の GTPase 活性化因⼦（GAP）である Sec23

クライオ電顕解析の結果，Msp1 は各サブユニットがを発現抑制した細胞においても，Sar1 の活性化が抑制

右巻きのらせん階段状に集合したホモ６量体のリング構造されている．Sec23 は Sar1, 積み荷と共に pre-buddingを形成していた．Msp1 の各サブユニット間には ATP のcomplex の形成を担い，この complex が安定化するこ結合が確認された．また，Msp1 ６量体のリング中心にとで，積み荷の濃縮に寄与する．本結果は，Sec23 はそ

は基質を模倣したペプチドが結合していた．基質との結合のままでは GAP としての機能よりもむしろエフェクターとしに関わる Trp166，Tyr167，そして ATP との結合に関て Sar1 GTPase の安定化に寄与することを⽰唆している

わる Arg247，Arg248 は Pex15 Δ 30 の分 解に必 須と考える．

なアミノ酸残基であることを明らかにした．基質ペプチド
は，Msp1 のらせん階段構造に沿うように把捉されていたことから，Msp1 が基質を掴んだまま一方向に移動させる

膜引き抜きATPアーゼを介した細胞内タンパク質ことで，誤配送 TA タンパク質を膜から引き抜くモデルが配送の校正機構の解明考えられる．

松

本俊介（九州大学大学院 農学研究院 生物機能分子化学講座 生物化学分野）

オー キシン 添 加 によって，Ant1，Bna4，Pex11，
Pex15 がミトコンドリアに誤配送されることを明らかにした．タイムラプス観察により，Pex15 は Msp1 と Pex19【⽬的】
本研究は，クライオ電子顕微鏡を用いた構造生物学的に依存して，ミトコンドリアからペルオキシソームに移動することを明らかにした．

解析により，ミトコンドリア外膜に局在する AAA 型 ATP
アーゼ Msp1 による誤配送テイルアンカー型（TA）タン
パク質の認識および膜引き抜き機構の解明，出芽酵母を変異型RNaseを用いた酵素集合体“META body”

用いてペルオキシソーム膜タンパク質（PMPs）の Msp1形成に寄与するRNA分子の探索

依存的な配送やり直しの検証とその分子メカニズムの解明

三浦を目的とした．

夏子（大阪公立大学大学院農学研究科）【方法】
Msp1 は，N 末端に 1 つの膜貫通配列と 1 つの AAA【背景と目的】ドメインを持つ膜タンパク質である．Msp1 の膜貫通配列

細胞質内でタンパク質が集合することで形成される “ 膜を欠失させ，AAA ドメインの walker B モチーフに変異のないオルガネラ ” は，細胞の翻訳コストを抑えながら細を導入した可溶性の Msp1（E193Q）を調製した．得

胞内で酵素を集積化する巧妙な仕組みとして注目を集めてられた電顕画像から，3 次元マップを作製し，原子構造いる 1）．我々は 2013 年に出芽酵母において，低酸素条モデルを構築した．msp1 欠損出芽酵母株に Msp1 変異

件下で解糖系酵素を含む 20 以上の代謝酵素が集合し，体を発 現させ，Msp1 のモデル基 質 Pex15 Δ 30 の分

糖代謝を調節している可能性を初めて示した 2）．この集合

解活性を分析した．

体は 2017 年に他の酵母株や一部のヒト培養細胞でも形

51

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成成されることが報告され，“Glycolytic body（G-body）”

酵素群の動態に加えて，複数の解糖系酵素についてよりあるいは “Glucosome” と名 付けられた． 近 年， 低 酸

詳細な動態を得ることができ，META body 形成時期が素条件下で集合する酵素として新たに purine 合成系のMETA body に含まれる酵素の種類によって分割できるこ

酵素も見出されるなど，低酸素条件下において予想されとが示唆された．

ていた以上にダイナミックな酵素集合体が形成され，細2. RNaseA 変異体の構築と出芽酵母における META

胞の代謝を制御している可能性が示唆されている．申請

body への局在化

者らはこうした集合体をまとめて “Metabolic Enzymes

ウシ膵臓由来 RNaseA の触媒二残基にアラニン置換

Transiently Assembling（META）body” と 名 づ け，を導入した RNaseA 変異体（RNaseAmut）を設計し，これまでに，集合体の形成に関わるシグナル伝達経路に

N- 末端に META body 局在化シグナルと赤色蛍光タン

加え，集合体を形成する酵素のアミノ酸配列から，～ 30

パク質を付加して，低酸素条件下で出芽酵母内においてアミノ酸からなる集合体形成配列を見出した．しかし誘導発現させた．緑色蛍光タンパク質を解糖系酵素に付ながら，META body 形成の直接的なトリガー分子は不加することで META body の局在を可視化するレポータ

明なままである．

ー酵母を用いたところ，META body 形成初期の時点で2,3）

細胞内でタンパク質の液 - 液相分離により形成される

RNaseA, RNaseAmut それぞれが META body と共局

ストレス顆粒や P-body 等の集合体では，集合体形成に在していることが示された．また，このとき RNaseAmut

RNAとタンパク質の相互作用が関与することが知られていを 発 現 し た 酵 母 で は，RNaseA 発 現 酵 母 に 比 べ てる．META body でも，2021 年に，解糖系酵素の一つ

META body を形成している酵母の割合が有意に減少しである phosphofructokinase（PFK）と RNase を細胞

た． すなわち，RNaseA による RNA の 切 断 が META

内で融合発現すると，低酸素条件下で集合体形成を阻害

body 形成を阻害することが示唆された．今後，in vitro

することが示された．一方で，この効果が RNase による系等も併用しながら，さらに検証を進めていく予定である．

RNA の切断によるものか，あるいはサイズ効果による集【考察】

合体形成阻害であるのかは不明である．また，集合体形

本研究では，これまで検証されてきた META body 形

成に寄与する RNA 配列は特定されていない．さらに，申成後期に加えて，初期段階でも低酸素条件下における集請者らの最近の研究により，PFK の集合は他の解糖系酵合体の形成・維持に RNA が寄与している可能性を示し素に比べて集合が遅いことが明らかになっており 4）［Akai

た．本研究の結果と新たに開発した META body 含有

et al., in preparation］，META body 形成のトリガー

酵母の大量培養法 5），in vitro 系等を組み合わせ，さらとなる分子を同定するためには PFK が不適である可能性なる解析を進めることで，RNA による酵素集合体形成へが示唆された．

の寄与について，その詳細を明らかにできると期待できる．

本研究では META body 形成酵素群に由来する集合【文献】

体形成ドメインに，RNase あるいは触媒残基を変異させ

1）Miura N. Condensate formation by metabolic

た RNase 変 異 体を融 合させ， 低 酸 素 条 件 下で META

enzymes in Saccharomyces cerevisiae .

body と共局在させることで，RNA の META body 形成

Microorganisms, 10(2), 232 (2022).

への寄与について検証することを目指した．

2）Miura N, Shinohara M, Tatsukami Y, et al.

【方法と結果】

Spatial Reorganization of Saccharomyces

1. 小スケール低酸素培養系における META body 形成c e r e v i s i a e E n o l a s e To A l t e r C a r b o n

動態の確認

Metabolism under Hypoxia. Eukaryot. Cell,

低酸素条件下における META body の形成時期を初

12(8), 1106–1119 (2013).

期・中期・後期に分割するために，以前に構築した小ス

3）Utsumi R, Murata Y, Ito-Harashima S, et al.

を用いて，様々な解糖系酵素群

Foci-forming regions of pyruvate kinase andの経時的な動態を追跡した．その結果，以前に報告した

enolase at the molecular surface incorporate

ケール低酸素培養系

52

4）

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成

proteins into yeast cytoplasmic metabolic

用の制御は生命維持に重要であるが，未だ再利用の頻度

e n z y m e s t r a n s i e n t l y a s s e m b l i n g ( M E TA )や機構は不明である．なぜなら，化学的にも物理的にもbodies, PLOS ONE, 18(4), e0283002 (2023).

完全に同じ状態に戻る再利用過程は，現在，如何なる手

4）Yoshimura Y, Hirayama R, Miura N, et al.

法でも追跡困難であるためである．

Small-scale hypoxic cultures for monitoring

このような背景のもと，本研究は，再利用が加水分解

the spatial reorganization of glycolytic

反応であることに着目し，酸素の安定同位体を用いた，

enzymes in Saccharomyces cerevisiae . Cell

再利用の直接観測法「18O 標識法」を考案した 2）．すでBiol. International, 45(8), 1776–1783 (2021).

に試験管内において，酸素同位体の取込んだユビキチン

5）Murata Y, Hirayama R, Miura N, et al. Large-

分子の量を定量し，再利用に関わる酵素反応を速度論的

scale preparation of yeast strains expressingに求めることで，再利用頻度を定量することに成功していcondensates derived from a glycolytic enzyme

る 2）．本研究では，独自に開発した 18O 標識法をヒト細via controlled dissolved oxygen levels under

胞に適用し，細胞内の再利用頻度を定量することを目的と

hypoxia. Lett. Appl. Microbiol., in press.

する．さらに，細胞内環境の変動が再利用にどう影響するのか定量的に解析する．再利用はユビキチン化酵素お
よび DUB の活性に鋭敏に影響される．酵素発現量が異可逆的酵素反応によるユビキチンの細胞内再利用なる細胞種や，酵素活性への影響がある薬剤や刺激を与の定量的分析

え，細胞内の再利用が影響されるか調べる（図 1）．

森

本

大

智

（京都大学大学院工学研究科分子工学専攻）【目的】
ヒトの体内では，毎日 200 グラムのタンパク質が合成されると同時に，同量の 200 グラムが分解されている．数分から数週間と，合成と分解の頻度はタンパク質によって千差万別であり，各々のターンオーバーは細胞の恒常性維持のため，厳密に管理されている．だが，細胞内タン
パク質であるユビキチンのターンオーバーは合成と分解だ

図１. ユビキチンの細胞内ターンオーバー

けではない．
ユビキチンは，基質となるタンパク質に共有結合し，基【方法】

質の分解や活性を制御する．ユビキチン化酵素群（E1

基質タンパク質からユビキチンを脱離する反応は加水分

酵素，E2 酵素，E3 リガーゼ）の一連の酵素反応により，解反応である．つまり，ユビキチンは再利用される度に溶

ユビキチンは基質に共有結合する．一方，基質からユビ媒の水由来の酸素原子を分子内に取り込む．したがって，キチンを脱離させる脱ユビキチン化酵素（以降 DUB）も酸素の安定同位体で標識した水を用いれば，再利用によ

細胞内に存在するため，役目を終えたユビキチンは切断さってユビキチン分子内に最大 2 つまで同位体を取り込むこれ，再び利用される．

とができる（図 2 上）．同位体を取込んだ分子数は，再細胞内エネルギー源の ATP を使う生合成よりも，ATP

利用の頻度によって経時的に変化し，理論的には逐次反を必要としない酵素反応である再利用は圧倒的にコストパ応式に従う（図 2 下）．同位体を 1 つあるいは 2 つ取込

フォーマンスが良い（図 1）．しかし，再利用しすぎてもしんだ分子は，定量的質量分析によって正確に分離して定なさすぎても良くない．事実，再利用を担う DUB の異常量できるため，本研究では本手法を用いてヒト細胞内のユは，がんや心疾患，神経変性疾患の発症を招く 1）．再利

ビキチンの再利用の頻度を定量する．

53

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成

でユビキチンの再利用頻度を定量し，再利用の制御不全が招く疾患の発症機構の解明につなげたい．
【文献】
1）Park C.W. & Ryu K.Y.,: Cellular ubiquitin pool
dynamics and homeostasis, BMB Rep., 47(9),475-482 (2014)
2）Tanaka Y., Morimoto D., Walinda E, et al.:Quantitative monitoring of ubiquitination/
deubiquitination reaction cycles by18

図 2. ユビキチン再利用の速度論的解析【結果】
18

O 標識した培地で細胞を培養し，18O 原子を取込ん

O-incorporation, Biochem. Biophys. Res.

Commun., 529(2), 418-424 (2020)

細胞接着・遊走制御機構に関わる細胞膜脂質反転だ細胞内ユビキチンを定量することに成功した．しかし，酵素の解析

単に 18O 標識培地で培養するだけでは生合成によっても

米

18

田

敦

O 原子を取込んでしまうことがわかった．再利用による子（東京薬科大学）

取込みと生合成による取込みを区別するため，13C,15N 標
識培地で細胞を一過的に培養し，その後， 18O 標識培地

【目的】

で培養した．その結果，細胞内ユビキチンの生合成と区

脂質２重層からなる細胞膜の外側（外葉）と細胞質

別して，再利用を O 原子の取込量として定量できた．

側（内葉）では脂質組成が異なるが，アポトーシス時の18

再利用を媒介する DUB の発現量により再利用頻度はホスファチジルセリンの外葉への露出のように一過的に反大きく異なるため，本研究ではモデル細胞であるヒト胎児

転し，重要な機能をなす例が知られている．最近我々は，

腎細胞 293 と脱ユビキチン化酵素の発現量が異常な状内葉にのみ存在すると長年考えられてきたホスファチジルイ

態にある子宮頸がん由来細胞である HeLa 細胞内のユビノシトール 4,5- 二リン酸（PIP2）が細胞膜外葉にも存在

キチンの再利用頻度の経時変化を定量した．加えて，ヒし，がん細胞の接着，遊走に働くことを報告した 1）．本ト細胞破砕液内のユビキチン再利用頻度も定量した．そ研究では，がん細胞の接着・遊走を制御する PIP2 反転の結果，細胞種ならびに細胞破砕の有無で優位に再利酵素を同定することで，外葉 PIP2 による新規細胞接着・用頻度が異なることがわかった．さらに，細胞内のユビ遊走様式の分子機構解明を目的とした．

キチンの再利用量は，生合成量や分解量と均衡を保つよ【方法】

うに調整されていると考えられているため，生合成阻害剤

1）外葉 PIP2 量が異なる細胞株間の遺伝子発現比較か

cycloheximide や分解阻害剤（プロテアソーム阻害剤

ら候 補となった外 葉 PIP2 増 加 酵 素を， 外 葉 PIP2

MG-132）を細胞に添加することによって，生合成量や分量の多い細胞で発現抑制し，当該脂質を減少させる

解量を変化させた細胞内の再利用頻度も調べた．

酵素を探索した．当該酵素を外葉 PIP2 量の少ない【考察】

細胞で過剰発現し，当該脂質が増加するか検討した．

本研究により，試験管内のユビキチン再利用の直接観測法 18O 標識法をヒト細胞に適応することができ，実際ヒ2）外葉 PIP2 近傍タンパク質の同定から，候補酵素の同定を試みた．

ト細胞内の再利用頻度を定量することに成功した．ユビキ

3）外葉 PIP2 減少酵素の関与を検討した．各種細胞株

チンの再利用は細胞内環境の違いで変動することがわかでの遺伝子発現を解析し，候補となった酵素の発現

り，今後，がんや神経変性疾患を模擬した細胞内環境下抑制を行い，外葉 PIP2 量が増加するか検討した．

54

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成【結果】

ゴと NADH を用いた．藍染め実験にはインジゴ還元顆粒

1）酵素 A の発現抑制により外葉 PIP2 量が減少し，過を 0.1% に希釈することで染色液として使用した．酵素の剰発現により当該脂質が増加した．
2）外葉 PIP2 量の多い細胞を用い，外葉 PIP2 近傍タン
パク質を同定したが，候補となりうる酵素は検出され立体構造解析は高エネルギー加速器研究機構で，ドッキ
ングシミュレーションは AutoDock Vina を用いた．
【結果・考察】インジゴを用いた活性測定では，ツンベルク管付きキュなかった．
3）酵素 B を発現抑制したところ，外葉 PIP2 量が増加しベットを用いアスピレーターで脱気後活性測定を行った．

た．

しかし，この方法は溶存酸素の除去が不十分であり，酵【考察】

素活性を検出することができないことが判明した．アスピ

本研究から，酵素 A と B が外葉 PIP2 量を調節でき，レーターで簡単に溶存酸素の除去が可能であれば，酵素

当該脂質が高度に調節されていることが示唆された．本を使用した藍染めにも N2 ガスではなく，脱気という簡便研究の成果は外葉 PIP2 による新規細胞接着・遊走の機な方法が使用できる可能性がある．藍染めには染色の有構解明とその阻害薬開発に繋がる．

無が目視で判断できる 0.1% のインジゴ還元顆粒を使用【文献】

した．酵素反応による染色を 70℃で 10 分間，N2 ガス

1 ） Yo n e d a , A . e t a l . , P h o s p h a t i d y l i n o s i t o l

存在下で行った結果，酵素有りの方がより青く染色できる

4,5-bisphosphate is localized in the plasma

ことを明らかにした．

membrane outer leaflet and regulates cell

本酵素の耐熱化機構を検証した結果，ダイマー形成に

adhesion and motility, Biochem Biophys Res

重要な役割をする F105 が重要であることを実証した．まCommun. 527, 1050 (2020).

た，ドッキングシミュレーションによりインジゴカルミンとの結合モデルを明らかにし，基質結合に関わるアミノ酸および，反応機構を推定することができた．

超耐熱性インジゴ還元酵素の「藍染め」への応用
利用
米

本研究の進展において，公益財団法人日本応用酵素協会からの多大なるご支援に心から感謝申し上げます．

田

一

成

【関連する発表論文】（東海大学 農学部 食生命科学科）

1）米田 一成 , 櫻庭 春彦 , 大島 敏久：ジャパン・ブルーとインジゴ還元酵素 , 化学と生物 ,61,9-11（2023）.

【背景・目的】2）米田 一成 , 吉岡 観沙 , 山下 秀次 , 山口 浩 , 荒木

日本の伝統的な産業である藍染めは，タデ科植物であ朋洋：インジゴ還元酵素を利用した酵素化学実験のる藍の葉を発酵させた「スクモ」を材料として使用し，常教材化 , 海大学紀要 農学部 41,9-15（2022）.

温でかつ高アルカリ条件下で行われる発酵還元過程を経て製造される．古くから微生物によるスクモの還元が行われてきたが，その具体的なメカニズムは不明のままであり，

非コードRNAによるダイレクトな蛋白キナーゼ活

職人たちは経験と勘に頼って作業を行ってきた．本研究

性調節メカニズムとシナプス形成におけるその生では 100℃でも失活しない熱安定性の高いインジゴ還元

理的意義の解明

酵素に着目して酵素の機能解析，熱安定化機構の解明および，藍染めへの応用を行った．

若

月

修

二

（国立精神・神経医療研究センター 神経研究所 疾病研究第五部）【方法】

Bacillus smithii 由来インジゴ還元酵素を大腸菌を用【目的】

いて大量発現した．活性測定にはモデル基質である水溶

機能不明のリボ核蛋白質複合体 Vault とともに神経突性インジゴのインジゴカルミン，本来の基質であるインジ起内を輸送される非コードな vtRNA が MEK に直接作用

55

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成

して MAPK シグナルをダイレクトに調節することで，シナ示唆されている．本研究の成果は，シナプス形成が正しプス形成を促進することを見出した（1）．発達期のシナ

くできないために発症するさまざまな神経発達障害の病態

プス形成では，MAPK シグナルは中心的な役割を担うこ

理解に資すると考えられる．

とが知られる．本研究では非コード RNA による MEK 活【文献】

性調節メカニズムとその神経生理学的意義の解明を目指

1）Wakatsuki, S., Takahashi Y., Shibata M., et

して開始された．

al.: Small non-coding vault RNA modulates
synapse formation by amplifying MAPK
signaling, J. Cell Biol., 220, e201911078,
2021.

環状ペプチド修飾酵素の機能解析と応用展開
脇

本

敏

幸
（北海道大学大学院薬学研究院）

図 vtRNA は MEK を介して MAPK シグナルを活性化する【目的】
天然物には大環状骨格を有するペプチドが多数存在し，【方法】

それらは生合成酵素によって効率的に合成されている．従1. Aurora-A の活性化と MVP のリン酸化メカニズムって，これらの天然物の生合成酵素は，中分子ペプチド

Vault の構 造は Aurora-A による MVP のリン酸 化を骨格を効率的に合成する生体触媒として有望である．そこきっかけに解離する．培養シナプス形成モデルを用いて，で，本研究では自然界に存在するペプチド修飾酵素の機Aurora-A 活性化ならびに Vault の構造解離につながる

能解析と応用展開を目指した．

MVP リン酸化サイトを調べた．

【方法】

2. vtRNA による MEK1 の活性調節メカニズム

我々はこれまで放線菌の非リボソームペプチド生合成経

vtRNA による MEK の活性化を，vtRNA との結合に路より，新規ペプチド環化酵素であるペニシリン結合タン

よる MEK の構造変化に帰着するため，HITS-CLIP 法な

パク質型チオエステラーゼ（PBP-type TE）を見出して

どの蛋白質 –RNA 相互作用検出法により vtRNA の結合

きた 1）．本研究では，surugamide 類の生合成において，領域を調べた．

ペプチド環化反応を担う PBP-type TE（SurE）の基質【結果】

選択性を明らかにするために，エチレングリコールを脱離

シナプス領域におけるレドックス反応を介して翻訳後修基として用いた鎖状基質ペプチドの効率的な合成方法を飾された Aurora-A が自己リン酸化して活性化すること，開発した（図１a）2）．

MVP の 2 つのセリン残基が Aurora-A によりリン酸化さ【結果】れることで Vault の構造が解離すること，などが明らかと検討の結果，SurE は，N 末端残基および，側鎖配列，なった．また，vtRNA-MEK 複合体の結晶構造解析に

鎖長に対して寛容な選択性を有することが判明した 2）．一着手した．

方で C 末端には厳密な選択性を示し，アキラルなグリシ【考察】

ンや電荷を有する極性残基を持つ基質を環化できないこ

近年，シナプス形成の障害が自閉症などの神経発達障とが明らかになった．そこでホモログ酵素を検証した結果，害の発症や病態に大きな影響を与えることが注目されていWolJ が SurE と相補的な基質選択性を示した．これら環る．本研究で着目した MAPK（ERK）ならびに MVP 遺化酵素を利用して複数種の環状ペプチドを高収率で合成

伝子欠損が神経発達障害の発症と深く関連する可能性がした（図１b）．

56

酵素の応用研究および生命科学に関する研究助成

【考察】

【文献】

PBP-type TE は寛容な基質選択性を示すことから，マ1）Kuranaga, T., et al.: Total synthesis of a

クロラクタム化生体触媒として有望な酵素ファミリーであnon-ribosomal peptide surugamide B and

る．特に，エチレングリコールを脱離基に用いた化学―酵

identification of a new offloading cyclase

素合成法によって，多様な配列を有する環状ペプチドのfamily. Angew. Chem. Int. Ed., 57, 9447

並列合成が可能になった．本技術は創薬研究のみならず，(2018).

様々な機能性を有する新規環状ペプチドの創製研究に有用である．

2）Kobayashi, M., et al.: Streamlined
chemoenzymatic synthesis of cyclic peptides
by non-ribosomal peptide cyclases. J. Am.
Chem. Soc., 145, 3270 (2023).

図１ 本研究で開発した環状ペプチドの化学酵素合成法

57

研究報告

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成（TMFC）

肥満に伴う高インスリン血症における肝臓が及ぼす影響とその機序の探索浅井洋一郎（東北大学大学院医学研究科 糖尿病代謝内科学分野）

６．加齢マウスに対し，X の阻害薬を投与し，肝臓のイン
スリンクリアランスについて評価を行った．
【結果】
１．高脂肪食群，老化マウスでは，いずれも肝臓のインス
リンクリアランスが低下することがわかった．
２．肝臓における IDE,DEACAM1 の遺伝子発現・タン【目的】
肥満・脂肪肝，また老化では，肝臓におけるインスリ
ン分解が低下することが報告されている．そのため，高インスリン血症が助長され，肥満がさらに加速する悪循環が考えられる．脂肪肝における肝臓でのインスリン分解

パク発現は高脂肪食群で低下していた．一方，加齢マウスにおいてはこれらの遺伝子発現・タンパク発現に変化はなかった．
３．肥満モデル・老化モデルにおいて，類洞内皮細胞の篩板孔の減少が観察された．

低下の機序はこれまで十分に明らかとなっておらず，本研

４．肥満モデル・老化モデルにおいて，類洞内皮細胞では，

究では肥満・脂肪肝モデルマウス．加齢マウスを用いて，炎症に関わる遺伝子群が上昇していることがわかった．

肝臓でのインスリン取り込み / 分解が低下する機序の検討

５．血管内皮特異的に炎症を抑制する遺伝子改変マウスを行った．

では，肥満モデル・老化モデルで肝臓のインスリンクリ【方法】

アランスの低下が改善していることがわかった．またそ１．野生型マウスに対し高脂肪食の負荷を行い，肥満とれに伴い，類洞内皮細胞の篩板孔の減少についても改脂肪肝を形成させ，ブドウ糖負荷試験における血中イン
スリンと血中 C ペプチドとのモル比の測定を行うことで肝臓のインスリンクリアランスを評価した．また，同様の検討について，老化マウスを用いても評価した．

善していた．
６．X の阻害薬により，加齢マウスにおける肝臓のインス
リンクリアランスが改善することがわかった．
【考察】

２． 肝 臓におけるインスリン分 解に関 与するインスリン高脂肪食負荷マウス・加齢マウスにおいて肝臓のインス

分 解 酵 素（IDE:Insulin degrading enzyme）,

リンクリアランスの低下を認めた．高脂肪食負荷では，イ

CEACAM1（carcinoembryonic antigen-related

ンスリン分解に関わる分子の発現が低下していたが，加cell adhesion molecule 1）について遺伝子発現・齢では変化を認めなかった．類洞内皮細胞の篩板孔の減タンパク発現を評価した．

少は肝臓におけるインスリン取り込み低下に関与すること

３．肥満モデル・老化モデルにおいて，走査型電子顕微が報告されており，両モデルにおける肝臓インスリンクリア

鏡を用いて類洞内皮細胞の形態学的評価を行った．

ランス低下の原因の一つである可能性が考えられた．ま４．MACS（Magnetic-activated cell sorting）を用いた，高脂肪食・加齢モデル，いずれの類洞内皮細胞におて特異的に類洞内皮細胞を単離し，RNA sequence

いても炎症に関わる遺伝子群が増加していた．血管内皮による網羅的遺伝子解析を行った．

特異的に炎症を抑制する遺伝子改変マウスにおける実験

５．血管内皮特異的に炎症を抑制する遺伝子改変マウス

では，肥満モデル・老化モデルで観察された肝インスリンを用いて，肥満モデル，老化モデルで肝臓のインスリンクリアランス低下や類洞内皮細胞の篩板孔の減少が改善

クリアランス，走査型電子顕微鏡による類洞内皮の形していることがわかり，篩板孔の減少に炎症が寄与してい態学的評価を行った．

ることが推察された．炎症において誘導されるＸの阻害薬

58

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成を投与したところ，加齢による肝インスリンクリアランス低1 型糖尿病モデルとして，DBA/2J マウスに膵β細胞毒下が改善することもわかり，同分子の関与が示唆された．

性を持つストレプトゾトシンを投与する．また，2 型糖尿今後，肥満や老化に伴う高インスリン血症における肝臓病モデルとして，BKS.Cg+Leprdb/Leprdb マウス（db/の役割をさらに明らかにすることで，肥満を予防するため

db マウス）を利用する．DKD モデルマウスに，RAGE ワの治療につながることが期待される．

クチンを隔週で計 3 回投与し，尿中アルブミン排泄測定，光学顕微鏡解析（メサンギウム基質面積，糸球体径），

免疫学的アプローチによる腎臓病に対する新規治療戦略の開発畔

上

電子顕微鏡解析（糸球体基底膜厚）を行う．
2.CTGF ワクチンによる CKD 治療・予防効果の検討
腎線維化モデルとして片側尿管結紮（UUO）マウスを，

達彦（慶應義塾大学保健管理センター/慶應義塾大学医学部腎臓内分泌代謝内科）

腎不全モデルとしてアデニン負荷マウスを利用する．マウスに，CTGF ワクチンを隔週で計 3 回投与し，両モデル
マウスの腎間質線維化を光学顕微鏡で評価し，さらにア【背景・目的】
慢性腎臓病（CKD）は末期腎不全や脳心血管疾患のデニン負荷マウスの血清クレアチニン，尿中アルブミン排泄を測定する．

発症・死亡のリスク因子で，患者数は本邦で 1330 万人，【結果】

世界で 8 億 5000 万人にのぼる．CKD，末期腎不全や1.RAGE ワクチンによる DKD 治療・予防効果の検討

その合併症の治療に要する医療費は，医療保険財源を逼

RAGE ワクチン接種群で，尿中アルブミン排泄は少なく，迫する一因となるが，CKD に対する根本的な治療法は確
立していない．したがって，CKD に対する新たな治療戦

1 型糖尿病モデル

略を構築することは，患者個人の生命予後，健康寿命の観点だけでなく，医療経済的な側面からも，喫緊かつ重要な医療課題であると考えられる．
CKD を制御するために，本研究では，原因として最多である糖 尿 病 性 腎 臓 病（DKD）と， 進 展 機 序の final
common pathway である間質線維化に着目した．特にDKD の発症・進展に深く関与する終末糖化産物受容体（RAGE）と， 線 維 化の key factor である connective
tissue growth factor（CTGF）を治療標的に選択した．
CKD は一般に，慢性の経過で進行するため治療が長2 型糖尿病モデル

期間に及ぶ．ワクチン接種により，標的分子の機能を阻害する抗体を誘導することができれば，少ない投薬回数
で長期間にわたる治療効果を得ることが可能となり，医療費の軽減や治療アドヒアランスの向上に寄与することができる．
このような背景を踏まえ，本研究では，アンメット・メ
ディカル・ニーズの高い CKD に対して，RAGE，CTGFを標的とした治療ワクチンの開発に取り組み，腎臓領域における新たな治療戦略の構築を目指している．
【方法】
1.RAGE ワクチンによる DKD 治療・予防効果の検討

Azegami T et al. Diabetes. 2021; 70（9）: 2147-2158

59成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

糸球体腫大・メサンギウム基質拡大が軽減され，DKDに対する腎保護効果が示された．また，in vitro 検討で，百寿者の腸内細菌解析による長寿メカニズムの解明

ワクチン接種後の IgG 抗体が，RAGE 機能を直接的に新阻害することが示された．

（慶應義塾大学 医学部 微生物学・免疫学教室）

幸二

2.CTGF ワクチンによる CKD 治療・予防効果の検討【目的】
慢性腎不全モデル

長寿に関与する腸内細菌の探索のため，健康高齢者の代表である百歳以上の百寿者の便サンプルの解析を行った．百寿者は，年齢と比較して認知機能が維持されている割合が高く，糖尿病の有病率も低く，また activity ofdaily life（ADL）も高く維持されていること，また百寿者の特徴の一つとしてポジティブシンキングが知られてい腎線維化モデルる．そのため，百寿者の百寿者たる所以を明らかにすることで，健康寿命の延伸・健康長寿社会への実現につながると考えられる．そこで，慶應義塾大学百寿総合研究センターと共同で百寿者の便サンプルの採取を行い，百寿者，高齢者（平均 85 歳），若者（平均 30 歳）の腸内Nakayama T, Azegami T*（*corresponding author）et al. Sci Rep. 2022; 12（1）: 10933

細菌叢の比較および腸内細菌由来代謝物の比較を行い，CTGF ワクチン接種群で，アデニン負荷マウスの腎機能を目指した．

障害が軽減した．また，アデニン負荷マウス，UUO マウ

百寿者特異的に存在する腸内細菌種および代謝産物の解析を通して百寿者の長寿の秘訣の一端を明らかにすること【方法】

スにて，腎間質線維化が軽減され，CKD に対する腎保百寿者，高齢者，若者から提供いただいた便サンプル

護効果が示された．また，in vitro 検討で，ワクチン接から DNA 抽出を行い，16S rRNA 解析，メタゲノム解

種後の IgG 抗体が，CTGF 機能を直接的に阻害すること

析により腸内細菌叢の比較解析を行った．また同時に便が示された．

サンプルから代謝物を抽出し質量分析計（GC-MS，LC-【考察・今後の展望】

MS/MS）を使用して便中の短鎖脂肪酸・胆汁酸を測定

上記の検討結果にて，抗 RAGE ワクチン，抗 CTGF

した．その後，百寿者に特徴的に存在していた二次胆汁

ワクチンの腎保護効果が確認された．現在，特許を出酸について検討を行うため，便サンプルから細菌株の培願し，審査に向けて準備中である．最終的に臨床応用

養・単離を行い，in vitro における責任細菌の同定・責できるように， 検 討を進めていく方 針である．また， 今任遺伝子の同定，および機能解析を行った．

後 の 展 開として「 炎 症・ 線 維 化・ 過 凝 固 」 の 制 御を【結果】

目 的 に， 新 た に plasminogen activator inhibitor-1

細 菌 叢 解 析の結 果， 高 齢 者・ 若 者と比 較して百 寿（PAI-1）を標 的とするワクチンを作 成し， 現 在， 敗 血者で 有 意に多く存 在して腸 内 細 菌 種として，Neglecta症 モデルでの 効 果を検 討し報 告した（Nakayama T,

timonensis，Clostridium scindens，Parabacteroides

Azegami T*[*:corresponding author]et al. Sci Rep.

merdea などの細 菌 種を特 定した（ 図 1）．これらの細2023; 13（1）: 3103.）．次に，腎臓病を中心に Non-

菌のうち，C. scindens はこれまで二 次 胆 汁 酸 代 謝に

communicable disease での効果を検討する．

関与していることが報告されていたため，便中の二次胆汁酸組成に違いがある可能性が考えられた．そこで，百寿者の便中の胆汁酸定量を行うため，53 種の胆汁酸化

60

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

合物を LC-MS/MS を用いて測定できる系を構築し測定を行ったところ，isoalloLCA や 3-oxoalloLCA などの
allo 体（5alpha） 二 次 胆 汁 酸が百 寿 者の便中で有 意に増 加していた（ 図 2）．このことから，isoalloLCA や
3-oxoalloLCA が長寿に関与している可能性が考えられた．そこで次に，この isoalloLCA や 3-oxoalloLCA を合成できる細菌種を探索するため百寿者の便から細菌株を単離し，in vitro において基質と考えられる一次胆汁 酸であるケノデオキシコール酸（CDCA）やヒト便中に豊富に存在する二次胆汁酸の一種であるリトコール酸（LCA）， 中 間 産 物と考えられる 3-oxo- Δ 4-LCA を加図1

腸内細菌叢解析

図2

便中胆汁酸組成の比較

図3

胆汁酸代謝酵素の同定

図4

isoalloLCA の抗菌作用

えそれぞれの細菌株を培養し，どのような細菌種が百寿
者特異的な二次胆汁酸の変換を行うことができるかを検討した．培養 48 時間後の培養上清を回収し，LC-MS/
MS により胆汁酸量を測定したところ，CDCA や LCA か
らは isoalloLCA, 3-oxoalloLCA ともに 検 出され な かったが，3-oxo- Δ 4-LCA を培 養 液に加えた場 合にはParabacteroides merdae や Odoribacteraceae な どの細菌株が isoalloLCA を産生できることが明らかになった．そこで，3-oxo- Δ 4-LCA から isoalloLCA への 変
換にどのような酵素が関与しているかを同定するため，ゲノム配列から胆汁酸代謝に関与すると想定される遺伝子を探索し，P. merdae の遺伝子欠損株を作成した．その結果． 遺 伝 子 番 号 3086 欠 損 株は 3-oxo- Δ 4-LCA から3-oxoalloLCA へ の 変 換，3805 欠 損 株 は 3-oxoLCA
か ら 3-oxo- Δ 4-LCA へ の 変 換，3804 欠 損 株 は3-oxoalloLCA から isoalloLCA への変換に障害がある
ことが明らかになった（図 3）．以上のことから百寿者で有意に増加していた isoalloLCA の産生を行う腸内細菌の同定とその代謝に関与する酵素の同定を行うことができた．最後に，二次胆汁酸である LCA や isoLCA がグラ
ム陽性の病原性細菌の増殖を抑えることが知られていたため，isoalloLCA も同様の機能を有しているのかを解析した．その結果，LCA や isoLCA と比較して isoalloLCA
は 約 1/10 程 度 の 低 濃 度 で Clostridium difficile や
VRE，MRSA などのグラム陽性菌の増殖を抑えることが明らかになった（図 4）．電子顕微鏡写真の結果から，
isoalloLCA 処理後の C. difficile は細胞壁や細胞膜の萎縮が見られ，isoalloLCA は界面活性作用や膜内外のpH 調整破綻作用などを有していると考えられた．

61

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成【考察】

チとして伝達物質やホルモンの放出，細胞増殖，細胞死

本 研 究では， 百 寿 者に特 徴 的な二 次 胆 汁 酸を特 定など様々な細胞機能を制御することで，組織発生などのし，長寿に関与すると想定される腸内細菌種の同定を行

高次機能をも規定している．そのため，細胞内 Ca2+ シグ

った．その結果，百寿者の便中に有意に多く存在していたナルの動態や制御分子機構を理解することは，その破綻

isoalloLCA が腸内細菌によって産生され，グラム陽性病

により発症する疾患病態の解明や新たな治療法の提案に原性細菌の増殖を抑えることが明らかになった．このことか資する．

ら isoalloLCA 産生する腸内細菌が増加することで長寿に我々は，小胞体膜に分布するイオンチャネル Tric-b 欠

つながる可能性が想定された．また，胆汁酸は宿主の受損マウスの表現型解析をきっかけとして，骨の生理機能を容体である FXR や TGR5 などを介し，コレステロール代謝

調節する細胞内 Ca 2+ シグナルの研究を推進してきた．本や糖代謝に関与していることが知られていることから，今後

年度は，Tric-b 欠損が非典型的な軟骨細胞死を引き起は isoalloLCA の宿主への影響を解析していく予定である．

こす分子メカニズムについて解析した．

同時に胆汁酸代謝を行う腸内細菌がステロイドホルモンの【目的】

代謝も行っていることも見出しており，腸内細菌がステロイ

本研究の目的は，TRIC-B の骨の生理機能調節におけドホルモンの代謝を調整することで長寿へ関与していること

る生理的役割を解明し，関連するヒト疾患における病態も示唆される．そこで，今後は長寿につながる腸内細菌の分子機序を明らかとすることである．

同定とその作用機序について，胆汁酸代謝とともにステロイ【方法】

ド代謝にも注目し解明を行って行きたいと考えている．

Tric-b 欠損マウス大腿骨骨端軟骨組織について，病【文献】

理組織学染色，電子顕微鏡解析，免疫組織学的解析を

1）Johansen J, Atarashi K, & Plichta DR.:行った．細胞死に至る経路について遺伝子発現やリン酸

Centenarians have a diverse gut virome with

化経路等総合的に解析した．軟骨細胞内 Ca 2+ イメージ

the potential to modulate metabolism andングにより細胞内 Ca2+ ハンドリング異常を評価した．

promote healthy lifespan. Nat Microbiol. 8（6）【結果】

:1064-1078.（2023）

Tric-b 欠損は軟骨細胞の小胞体 Ca2+ ハンドリングを

2）Sato Y, Atarashi K, Plichta DR, & Honda K.

障害し，II 型コラーゲン細胞外分泌を阻害することで小Novel bile acid biosynthetic pathways are

胞体ストレスを誘導し，主として PERK 経路の活性化か

enriched in the microbiome of centenarians.

らカスパーゼ 12，カスパーゼ 3 を活性化し，軟骨組織

Nature. 599（7885）:458-464.（2021）

中の一部の細胞において非典型的な細胞死を引き起こす

3）Atarashi K, Suda W, & Honda K. Ectopic

ことが一連の研究により解明された （Cell Death andcolonization of oral bacteria in the intestine

Disease , in press）．

drives TH1 cell induction and inflammation.

【考察】

Science. 358（6361）:359-365.（2017）

TRIC-B 遺伝子変異はヒト骨形成不全症のみならず軟骨内骨化障害を伴う胎児骨格異形成症の原因として報告

骨の生理機能を調節する細胞内Ca2+シグナルの
理解と制御
市

村

されている．TRIC-B 遺伝子変異による重篤な TRIC-B
チャネルの機能障害が推定されており，マウスモデル系での観察と同様の病態メカニズムが想定される．Tric-b 欠

敦彦

損マウスは，これらの希少疾患治療のみならず，骨密度（京都大学大学院薬学研究科）

改善薬などの開発に向けて有用なモデル実験系を提供することが期待される．

【背景】
細胞内 Ca2+ 濃度の上昇は多彩な生理的応答のスイッ

62成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

DNA損傷応答に着目した心不全・心筋症治療法の開発【文献】
1）Higo T, Ito M et al. Nat Commun . 2017 Apr
24;8:15104

伊

藤

正

道

（東京大学大学院医学研究科先端臨床医学開発講座）

2）Nomura S, Ito M et al. Nat Commun . 2018
Oct 30;9（1）:4435
3）Ko T, Ito M et al.JACC Basic Transl Sci . 2019

【背景】

Sep 25;4（6）:670-680

心不全は心臓の機能異常によって全身循環の失調を来した状態である．所属研究室では，心臓でメカニカルスト
レスや酸化ストレスの結果生じる「DNA 損傷応答の亢進」
が重要な心機能の低下の原因であることを報告してきた．しかし，これを抑制する介入方法は開発されていない．

1-3）

【目的】

転写調節因子・エピゲノム制御因子に着目した心不全の病態解明と新たな心不全治療法の開発
稲

住

英

明

（東京大学大学院医学系研究科循環器内科学）

心筋細胞の DNA 損傷応答を軽減する方法を確立することで，新たな心不全の治療薬の開発を目指す．

【目的】【方法・結果】①転写調節因子 NRSF ならびにそのスプライシングバリア

・LMNA 変 異（p.Q353R） を有 する心 不 全 患 者 から
iPS 細胞を作成し心筋細胞に分化させた．患者由来細ントの発現量の心不全発症進展における意義ならびにその調節機構の解明

胞の該当変異を修復した isogenic control 株を対照と② NRSF と複合体を形成している各エピゲノム調節因子

した．

（HDAC1,2, LSD1, G9a）の心不全発症進展におけ・変異株では核の高度な変形，収縮力の低下を認めた．
また変異株では DNA 二重鎖切断マーカーγ H2AX の発現増加を認めた．
・変異株細胞を用い，γ H2AX の集積を軽減させる化合物のスクリーニングを行った．その結果，vitamin D2

る意義の解明③ NRSF が転写調節する G α o の発現上昇が心筋表面
細胞膜の L 型カルシウムチャネルを選択的に活性化させるメカニズムの解明を通して心不全病態の理解を更に進め，新たな治療標的の同定を目指す．

（VD2）が変異株の DNA 損傷を有意に軽減させるこ【方法 / 結果】とが判明した．RNA-seq の結果，VD2 は疾患株で低①心筋における NRSF の発現をウエスタンブロッティング

下している DNA 修復酵素の発現を回復させた．
・プロテインアレイを用いた検討の結果，変異 LMNA タで評価したところ，加齢に伴い心室筋における NRSFの発現量が低下していることが明らかになった．

ンパクは vitamin D 受容体（VDR）との結合性がと野

心 筋 特 異 的に，タモキシフェン投 与により後 天 的に生型と比較して亢進しており，変異株で VDR の転写活

NRSF の発現を抑制できる NRSFicKO を作成し表現性が低下していることが分かった．

系の評価を行ったところ，ただ NRSF の発現を抑制し・VD2 analog は圧負荷心不全モデルマウス，Lmna ナ

ただけでは明らかな表現系の変化を示さなかった一方

ンセンス型変異心筋症モデルマウスの 2 つのモデルでで，横行大動脈縮窄による圧負荷を加えるとコントロー

DNA 損傷の蓄積を軽減させ，心機能を改善させた．

ルと比較した生存率の低下や心機能の低下を示すこと【考察】が明らかになった．

VD2 はすでに安全に使用しうる薬剤であり，本研究で② 心 筋 特 異 的に，タモキシフェン投 与により後 天 的にLMNA 変異ヒト心筋細胞の異常表現型を是正できること

HDAC1/2 の発現を抑制できる HDAC1/2 icKO を作が判明した．Drug repositioning を目指した臨床試験

成し表現系の評価を行ったところ，オスのマウスでは明が期待される．

らかな表現系の変化を示さなかった一方で，メスのマウ

63

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

スでは著明な心機能の低下，心拡大，心筋の線維化

ポトーシスと，炎症性の細胞死が知られる．特に，高度を示すことが明らかになった．

脂肪肝で発症する炎症性細胞死は，急性肝障害や非ア③ G α o の心筋特異的過剰発現マウスの心筋細胞で免

ルコール性脂肪肝炎（NASH）の発症・増悪と密接に関疫染色での評価を行ったところ，G α o は T 管構造に与する．

はほとんど存在せず，主に細胞表面膜に限局することが【目的】

明らかになった．

高度脂肪肝で発症する炎症性細胞死の様式を同定し，【考察】

その制御メカニズムの解明を行う．

転写制御因子 NRSF は発生途上のみならず，成体にお【方法】

いても心筋の恒常性維持に寄与していること，また加齢に急性肝障害モデルとして，高脂肪食誘導性の中等度ま伴いその発現が減少していることが明らかになり，加齢にたは高度脂肪肝 70％肝切除マウスを用いた．慢性肝障

伴い心機能が低下しやすくなる原因の一端を担っている可害モデルとして，メチオニン・コリン欠損餌（MCD）誘能性が示唆された．

導性の NASH マウスを用いた．これらモデルマウスにおいエピゲノム制御因子である HDAC1/2 の心筋恒常性維て，血中パラメーター解析，肝細胞死解析，遺伝子発現

持における役割の性差が示され，メスにおいてはかなり重解析，タンパク発現解析を行った．さらに，ヒト NASH

要な役割を担っている可能性が示唆された．

の肝生検組織を用いた免疫組織学的解析を行った．

G α o の発現上昇に伴い心筋表面細胞膜の L 型カル【結果・考察】シウムチャネル電流が選択的に増加するメカニズムとして，

高度脂肪肝では，中等度脂肪肝と比べ，肝切除後のG α o 自身の局在の違いが関与している可能性が示唆さ

細胞死が増加しただけでなく，肝組織中に巣状細胞死がれた．

発生し，肝障害が悪化した．肝切除後に発症する細胞死の様式は，中等度脂肪肝ではアポトーシスのみであった

脂肪肝再生障害に対する肝細胞死制御の有用性の解明

が，高度脂肪肝ではアポトーシスに加え，炎症性細胞死が発症した．その際，高度脂肪肝では，炎症性細胞死であるネクロプトーシスの制御因子 Ripk3 の発現と，ス

稲

葉

有

香

トレス誘導性転写因子 Atf3 の発現が誘導された．肝細（金沢大学 新学術創成研究機構）

胞 Ripk3 ノックダウンによる検討から，高度脂肪肝で発症した炎症性細胞死がネクロプトーシスであることを明ら【背景】

かにした．さらに，ATF3 欠損・過剰発現による検討か

肝細胞内脂肪蓄積は，その多寡により，異なる様式のら，高度脂肪肝でのネクロプトーシス発症に，ATF3 が細胞死を誘導する．細胞死の様式として，非炎症性のア

重要な役割を果たす可能性を見出した．培養肝細胞への64

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

ATF3 過剰発現による検討を行い，ATF3 が Ripk3 プロ

スク上昇の程度）における異質性を評価した．マッチング

モーター領域に結合し，Ripk3 発現を誘導することで，された 3,348 人の平均年齢は 62 歳，女性は 52％であネクロプトーシスを誘導することを明らかにした．MCD 誘った．CAC による CVD リスク上昇の程度は個人レベル

導 性 NASH では， 細 胞 死の増 加， 肝 Atf3・Ripk3 発

でばらつきが強いことが，因果フォレストモデルから明らか

現の増加を呈した．Atf3・Ripk3 は高頻度で同一細胞となり，10 年後 CVD リスクと用量反応関係が認められた．

に発現した．さらに，肝 ATF3 欠損が，MCD 負荷後の10 年後 CVD リスクが低い集団においても，70% の個人

Ripk3 発現を抑制し，NASH を改善させた．ヒト NASH

が CAC によって CVD リスクが大きく上昇することが示さ

症例の肝生検組織においても，肝細胞障害・線維化の高れ，その傾向は男性で強く認められた．

度な症例で，ATF3・RIPK3 陽性細胞数が増加し，これ【考察】らが高頻度で同一細胞に発現した．

本研究において CAC と CVD 発症の関連には個人ごと【結語】のばらつきがあることが示された．例え絶対的な 10 年後

高 度 脂 肪 肝で発 症する炎 症 性 細 胞 死が，RIPK3 依

CVD リスクが低くても，CAC によって CVD リスクが上昇

存的ネクロプトーシスであり，その制御メカニズムとしてする個人が一定数いることが明らかとなり，今後そのよう

ATF3 が中心的役割を担うことを明らかにした．本研究成な患者にも冠動脈 CT スクリーニングが行き届くような仕果は，ATF3 誘導性 RIPK3 発現が，急性・慢性肝障害

組みが必要である．本研究結果は，絶対的な CVD リスの新規治療標的として有用である可能性を示唆している．

クのみならず CAC によりどの程度 CVD リスクが上昇するかを個人レベルで考えることの重要性を示唆しており，

社会経済因子が生活習慣病及び合併症を引き起こす機序の疫学的解明
井上浩

適切な医療資源の分配からも重要である．2023 年度は，研究課題テーマである社会経済因子とのかかわりを紐解くことで，社会格差への影響も検討する予定である．

輔（京都大学）【文献】
Inoue, K., Seeman, T. E., Horwich, T., Budoff,
M. J., & Watson, K. E.（2023）. Heterogeneity in【背景・目的】the association between the presence of coronary

冠動脈石灰化（CAC）は，心血管疾患（CVD）の重artery calcium and cardiovascular events: a

要な予測因子である．冠動脈 CT の限られた資源を考え

machine-learning approach in the MESA study.

ると，CT スクリーニングによって CAC を検出することでCirculation , 147（2）, 132-141.

最もベネフィットを受ける個人を特定することが喫緊の課題となっている．しかし，CAC が CVD に与える負担が，複合的な個人特性によって異なるかどうかについては，いまだエビデンスが乏しい．そこで本研究では，多民族コ
ホートの縦断観察データに因果フォレストを用いることで，原発性アルドステロン症の病態解明と新規診断法
の確立
馬

越

洋

宜

（九州大学病院 内分泌代謝・糖尿病内科）

個人レベルの CAC による CVD 発症リスクの上昇度を推定し，どのように冠動脈 CT スクリーニングの対象集団を選定するべきかを明らかにすることを目的とした．
【方法・結果】【背景】
原 発 性アルドステロン症（primary aldosteronism:

具体的には Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis

PA）は，代表的な二次性高血圧の成因の 1 つであり，という心血管系疾患のない 45 歳以上の成人を対象とし疾患頻度に加えて臓器障害頻度も高率である．PA は，

た縦断コホートに，傾向スコアマッチング及び因果フォレス

その成因によりアルドステロン産生腺腫と副腎過形成に大トを応用し，CAC と CVD の関 連（CAC による CVD リ

きく分類される．両者は治療方針および重症度が大きく

65

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成異なるため病型の鑑別は重要であり，PA におけるさらな

a u t h o r ） , O g a t a M , Wa d a N , I c h i j o T,

る治療成績の向上には早期診断・治療を可能とする医療

Sakamoto S, Watanabe T, Ishihara Y, Tagami

基盤の確立が求められている．

T, I w a h a s h i N , F u k u m o t o T, Te r a d a E ,【目的】

Katsuhara S, Yokomoto-Umakoshi M, Matsuda

１）
機械学習を用いた PA の病型・治療予
本研究では，

後予 測モデルの確 立とY, Sakamoto R, Ogawa Y*:

PA の成因であるアルドステロ

Machine learning-based models for predicting

ン 産 生 細 胞 群（APCC:Aldosterone Producing Cell

clinical outcomes after surgery in unilateral

Clusters）の発生過程をシングルセル RNA シークエンス

primary aldosteronism.

（scRNA-seq）を用いて明らかにすることを目的とした．

Sci. Rep. 12（1）:5781, 2022.

２）【方法・結果】

3）Iwahashi N*, Umakoshi H* （equal to 1st

１）ランダムフォレスト法を用いて，かかりつけ医レベル

author）, Seki T, Gomez-Sanchez CE, Mukai

で測定可能な 18 種類の検査項目において，血中ナトリウ

K, Suematsu M, Umezawa Y, Oya M, Kosaka

ム，カリウム，アルドステロンの 3 項目のみでアルドステロ

T, Seki M, Suzuki Y, Horiuchi Y, Ogawa Y,

ン産生腺腫を高率（精度 89%）で診断可能なモデルを

Nishimoto K: Characterization of aldosterone-

開発した．次に機械学習モデル解釈手法を用いて，術後

producing cell cluster （APCC） at single-cell

治癒に関わる因子の寄与度の差異を個人間で明らかにしresolution.

た．

J. Clin. Endocrinol. Metab. 107（9）:2439-

２）ヒト成 人 副 腎 2 個 から 2928 個 の 副 腎 細 胞 の2448, 2022.

scRNA-seq データを取得し，教師なしクラスタリングと

4）Iwahashi N, Umakoshi H* （corresponding

マーカー 遺 伝 子の発 現に基づいて APCC を同定した．

author）, Ogata M, Fukumoto T, Kaneko H,

RNA velocity 解析により，副腎皮質球状層細胞からへ

Terada E, Katsuhara S, Uchida N, Sasaki K,の発生方向が推定された．多くの CYP11B2 陽性細胞が，Yokomoto-Umakoshi M, Matsuda Y, Sakamoto

コルチゾール産生には必須だがアルドステロン産生には必R, Ogawa Y*: Whole transcriptome profiling

須でない CYP11B1 および / または CYP17A1 に陽性でof adrenocortical tumors using formalin-fixed

あることが判明した．

paraffin-embedded samples.

【結語】

Front. Endocrinol.（Lausanne）. 13: 808331,

機械学習技術を用いて，PA の病型・予後予測モデルを確立した．さらに，PA の成因である APCC を１細胞レ2022.
5）Kaneko H, Umakoshi H* （corresponding

ベルから特徴づけた．

author）, Fukumoto T, Wada N, Ichijo T,【文献】

Sakamoto S, Watanabe T, Ishihara Y, Tagami

1）Kaneko H, Umakoshi H* （corresponding

T, Ogata M, Iwahashi N, Yokomoto-Umakoshi

author）, Ogata M, Wada N, Iwahashi N,

M, Matsuda Y, Sakamoto R, Ogawa Y*:

Fukumoto T, Yokomoto-Umakoshi M, Nakano

Do multiple types of confirmatory tests

Y, Matsuda Y, Miyazawa T, Sakamoto R,

improve performance in predicting subtypes

Ogawa Y*:of primary aldosteronism?

Machine learning based models for prediction

Clin. Endocrinol. （Oxf）. 98（4）:473-480,

of subtype diagnosis of primary aldosteronism

2023.

using blood test.
Sci Rep. 11（1）: 9140, 2021.
2）Kaneko H, Umakoshi H* （corresponding66成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

抗酸化物質キヌレン酸増加の分子機構とその意義
大

橋

一

登

原発性アルドステロン症における病型診断・病態解明に関する基礎及び臨床の双方向性研究岡本（群馬大学生体調節研究所附属拠点研究支援センター）健太郎（京都大学 糖尿病・内分泌・栄養内科）【背景および目的】
キヌレン酸（KA）はトリプトファン（Trp）代謝化合物【背景】の一つであり，KA の増加は 2 型糖尿病やうつ病で認め原発性アルドステロン症（PA）には，主に片側性であられ，近年では，炎症によって KA が増加することも報告

るアルドステロン産生腺腫（APA）と，両側性である特されている．KA は AMPA 受容体や NMDA 受容体のア

発性アルドステロン症（IHA）という 2 病型があり，両者

ンタゴニスト，GPR35 や AHR のアゴニストとして知られはその病態も治療法も異なる．臨床においては副腎静脈ており，病態との関連が示唆されている．しかし，KA とサンプリングによって両者を鑑別しているが，侵襲性のあ

上記の病態の因果関係はいまだに不明であり，KA の機る検査であり，より低侵襲な鑑別法の開発が期待されて能や作用機序についての知見が不足していると考えられいる．

る．そこで，KA が単細胞生物でも生合成されることに着【目的】

目し，真核生物のモデル細胞である出芽酵母を用いて細本研究では，循環血液中の miRNA に着目し，鑑別に胞内における KA の機能を調べてきた．その結果，KA は有用な新規バイオマーカーを開発するとともに，APA や

過剰な Trp の分解で生じた排泄物の一種と考えられ，過IHA の病態における循環血液中 miRNA の意義について

剰な Trp が有害であることが示された（Ohashi et al .,も検討することを目的とする．

Sci. Rep.,2017）．この 結 果 を 受 けて，KA の 増 加 は【方法】

Trp の蓄積と関連があると推測し，Trp の細胞毒性につ

昨 年 度までに， 背 景 因 子をマッチングさせた各 群 5

いて解析を行なった．

例 ず つの 副 腎 静 脈 血 において qPCR パネルを用いた【方法と結果】

miRNA 網 羅 的 発 現 解 析を行い， 両 群 間 で 数 種 類 のこれまでに，過剰な Trp による生育抑制は，トリプトン

miRNA の発現量が異なっていることを見いだした．その（タンパク質分解物）の添加によって回復することを偶然

結果を踏まえ，各候補 miRNA について，症例数を増やに見出した．この結果から，過剰な Trp の毒性は，摂取して副腎静脈血および下大静脈血で同様の発現差がみらするアミノ酸に極端な偏りがあると生育が抑制されるアミれるかを確認する．また，多数症例において発現差が確

ノ酸インバランスという現象に関係があると考えられた．そ認された miRNA に対し，ヒト副腎由来細胞を用いたトラ

こで，出芽酵母の栄養要求性に着目し，過剰な Trp に加ンスフェクション実験を行い，細胞増殖能やアルドステロ

えて Trp と同濃度の Leu を添加すると，Trp によって抑ン産生能などに与える影響を評価する．

制された出芽酵母の生育が回復した．しかし，メタボロミ【結果】

クス解析では，過剰な Trp を与えても，細胞内 Leu はほ症 例 数を各 群 14 例ずつに増 やしたバリデーション

とんど減少していないことも分かった．このことから，過剰検 討 に お いて，2 種 類 の miRNA（miRNA-A およびな Trp は Leu の要求量を増加させたと考えられた．
さらに，

miRNA-B）は，各群の副腎静脈血で発現量が異なって

KA の添加によっても Leu の要求量が増加することが分かいることが 確 認された．また，このうち miRNA-A につってきた．KA 増加に伴う Leu 要求量の増加がヒトや高いては，下大静脈血においても発現量が有意に異なって等動物で認められれば，2 型糖尿病やうつ病の理解に貢いた（IHA 群よりも APA 群で発現量が高かった）．さら

献する可能性が考えられる．

に，miRNA-A の作 用を模 倣する mimic およびその作
用を抑制する inhibitor をヒト副腎由来細胞にトランスフェクションしたところ，mimic では細胞生存能が上昇し，67

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

inhibitor では細胞生存能が低下した．

性が考えられる．

【考察】

【文献】

miRNA-A は下大静脈血においても APA 群で発現量

1）Becher, T., Palanisamy, S., Kramer, DJ.,が有意に高く，in-vitro において副腎細胞の生存能を上Eljalby, M., Marx, SJ., Wibmer, AG., Butler,

昇させることが示唆された．バイオマーカーとしての有用SD., Jiang, CS., Vaughan, R., Schöder, H.,

性はさらに症例数を増やして検証しなければならないが，Mark, A., & Cohen, P.: Brown adipose tissue

APA の病態に一部関与している可能性が考えられる．

is associated with cardiometabolic health, Nat
Med., 27, 58

ここまでの結果について，論文として投稿準備中である．

加齢に伴う熱産生脂肪減少メカニズムの解明
小

栗

靖

生

（京都大学大学院農学研究科 食品生物科学専攻 栄養化学分野）（2021）

食品由来シグナルによる視床下部の摂食調節ホルモンの感受性変容
金子賢太朗（明治大学農学部農芸化学科栄養生化学研究室）【目的】
熱産生脂肪細胞（褐色脂肪細胞，及び，ベージュ脂【目的】肪細胞）は，熱産生を行うことにより，エネルギー消費の視床下部の食欲中枢機能は栄養情報を脳に伝える摂増大に寄与する．また熱産生脂肪の発現は年齢と負の相

食調節ホルモンにより制御されている．しかし，高脂肪食

関を示すことが報告されている 1）．これらのことから，加摂取等の過栄養状態においては，視床下部における摂食

齢に伴う熱産生脂肪の減少が，糖尿病や肥満症などの生抑制ホルモンであるレプチンやインスリンの感受性が障害

活習慣病の発症に関与すると示唆される．

され，過食や過体重が誘導される．私たちはこれまで，

本研究では，ベージュ脂肪細胞の前駆細胞における増肥満状態において腸管由来のインクレチンホルモン GIP

殖機構を明らかにすることを目的とする．これにより，加の分泌増大が視床下部の GPCR/Rap1 の活性化を惹起

齢による熱産生脂肪の減少メカニズムの一端を明らかにすすることにより，レプチンやインスリンの感受性障害を誘ると共に，肥満，糖尿病をはじめとする生活習慣病の新導する新しいホルモン感受性制御機構を解明し，視床下たな介入法の開発の端緒とする．

部のホルモン感受性が腸脳連関を介した内因性・外因性【方法】の GPCR リガンドの制御下にあること示した（Cell Rep

野 生 型 マウスの 皮 下 脂 肪 組 織より，magnetic cell
separation（MACS）法，および，fluorescence-activated2016, J Clin Invest 2019, Endocrinology 2020,

JCI Insight 2021）．

cell sorting（FACS）法を用いることで，常法に従い，ベさらに最近，食品由来成分（緑葉タンパク質由来ペプージュ脂肪前駆細胞を単離し，同細胞の増殖に関わる制チド）を肥満マウスに経口投与することにより，視床下部

御因子を探索した．

レプチン感受性を増強し抗肥満効果を発揮すること，その【結果】

作用は脳の Rap1 活性化の抑制によることを明らかにした前駆細胞の増殖能は，特定の栄養成分により亢進する
ことが明らかとなった．
【考察】（Sci Rep 2022）．
上述した通り，高脂肪食摂取によりホルモン感受性障
害が誘導される．しかし，どのような脂質摂取により個

ベージュ脂肪前駆細胞の増殖能は特定の栄養成分によ体のホルモン感受性が変容されるのか不明である．そこり制御されることから，栄養学的な介入は，加齢に伴うで本研究では，代表的な自然界油脂を複数種類選定し，ベージュ脂肪細胞の減少を防ぐ有効なツールとなる可能

動個体におけるエネルギー代謝やレプチン感受性，糖代68成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

謝への影響を検討した．

T 細 胞の除 去についても発 表した（Hojo et al., Nat.

【方法】

Commun., 2019）．

さまざまな自然 界 油 脂を原 料とした特 殊 高 脂 肪 食

当該年度は，がんに起因する肝臓ニコチンアミド代謝（45kcal%Fat ）を作製した．マウスに給餌し，個体のエの変容（Mizuno et al., Nat. Commun., 2022），がネルギー代謝，糖代謝，行動，認知学習，運動，睡眠んによる肝 臓の空 間 機 能の破 綻（Vandenbon et al.,といった生体機能に対する自然界油脂の影響を解析した．

Commun. Biol., 2023）， 肝 臓における急 性 期 応 答と【結果・考察】炎症の関係性（He et al., Front. Immunol., 2023），

脂質組成が類似している２種の脂質を使った高脂肪食

肝 細 胞における NNMT の機 能 解 析（Yoda et al., J.

をマウスに給餌したところ，体重増加が異なることを明ら

Biochem., 2023）を報 告した．Mizuno et al., Nat.

かにした．そこで体重一致条件下において，小動物総合

Commun., 2022 については昨年度の報告書に詳細を記

モニタリングシステム（CLAMS）を用いて抗肥満効果の載したので，本報告書ではそれ以外の３件の論文につい原因を解析したところ，暗期摂食量の違いや呼吸商の違て内容をまとめる．

いを見出した．次に糖代謝を確認したところ，空腹 / 満

肝臓の遺伝子発現には空間的なパターンがあることが腹時の血糖値，耐糖能，インスリン感受性についても違知られている．例えば，アルブミンの発現は門脈付近のいが認められた．さらに，レプチンの脳室内投与による抗肝細胞において高い．門脈付近では血液中の酸素濃度や肥満（体重減少 / 摂食抑制）作用と視床下部の細胞内

栄養素の含有量が高く，代謝を活発に行える環境だから

レプチンシグナルについても２種の高脂肪食で差異を確認であると考えられている．一方，酸素や栄養に乏しい血液した．

にさらされる中心静脈付近の肝細胞では解毒系代謝経路

以上の実験結果より，体重や食欲，グルコースバラン

が活発である．このような区分けを肝臓のゾネーションとスの正常維持に貢献しやすい脂質，ホルモン感受性に正いい，肝臓の正常な機能発現にとって極めて重要である．

負の影響を及ぼす脂質が存在する可能性を明らかにし，本研究では，乳がんをもつマウスの肝臓におけるゾネー

肥満や糖尿病の制御に有用な脂質が存在する可能性を示

ションを空間トランスクリプトーム解析によって調べた．そした．

の結果，がんをもつマウスともたないマウスの肝臓では，今後の検討により，脳機能の正常維持に最適な油脂を生物学的経路ごとに異なるゾネーションの破綻が認められ紐解くとともに，脂質の質による抗肥満・健康長寿戦略

た．例えば，アスパラギン酸代謝経路は門脈付近で活発の提示を目指していきたい．

であるが，このパターンは担がんマウスの肝臓でもある程度維持されていた．一方，解毒系代謝経路の中心静脈付がんによる宿主生理変容のメカニズム
河

岡

慎

平

（東北大学加齢医学研究所・京都大学医生物学研究所）

近への偏りは，がんの存在によってほぼ失われていた．また，急性期応答が門脈付近の肝細胞に偏って活性化されていることも発見した．肝細胞がエネルギー代謝から急性期応答へとその役割を切り替えたのだと考えている．これまでに，担がん個体の肝臓に多量の好中球が浸潤するこ根治不能となったがんは個体に様々な悪影響を引き起とを見出している（Hojo et al., Oncotarget; Enya et

こす．研究代表者は，TMFC の支援を受けながら，がんal., Dis. Model. Mech., 2018）．この好中球の浸潤にが宿主個体に与える悪影響についての研究をおこなっていもパターンがあることがわかった．以上の結果から，乳がる．これまでに，がんによる肝臓概日リズムの破綻（Hojoet

んが肝臓のゾネーションを様々な様式で撹乱することがわ

al., Oncotarget, 2017），後腸のがんによる肝臓コレス

かった（Vandenbon et al., Commun. Biol., 2023）．

テロール代謝の破綻と炎症の関係性（Enya et al., Dis.

担がん個体の肝臓では急性期応答が活性化する．急Model. Mech., 2018），を報 告してきた．また，この性期応答とは，感染などに応じて肝細胞における急性期

間， 細 胞 系 譜 特 異 的なエンハンサーによる自己反 応 性

応答タンパク質（C 反応性タンパク質や血清アミロイドα69

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成など）の発現が亢進し，これらのタンパク質の血中濃度を介して AML12 における中性脂質の代謝を制御しているが高まることをいう．この反応は免疫系の活性化に重要ことを報告した（Yoda et al., J. Biochem., 2023）．

であると考えられている．また，担がん個体の肝臓では炎

以上，がんがどのように個体の恒常性を破綻させるのか症が起こる．急性期応答と炎症が同時に観察されることという情報が蓄積してきた．今後は特にヒト検体に対するから，この二つには密接な関係があると考えられており，解析を行い，これまでの発見がヒトに通用するのかどうか，

実際，膵臓がんではそのような報告がある（Lee et al.,

また，ヒト独自の現象を見出すことができるか，を明らか

Nature, 2019）．本研究では，この観察の一般性を調べにしていきたい．

るべく，乳がんモデルにおける炎症と急性期応答の関係【参考文献】性を調べた．

1）Mizuno, R., Hojo, H., Takahashi, M., Kashio,

具体的には，血清アミロイドα 1-2 を同時に欠損させた

S., Enya, S., Nakao, M., Konishi, R., Yoda,

マウスを作出し，その炎症への影響を調べた．乳がんのM., Harata, A., Hamanishi, J., Kawamoto, H.,

発生によって血清アミロイドα 1-2 の肝臓における発現がMandai, M., Suzuki, Y., Miura, M., Bamba,

増加するが，血清アミロイドα 1-2 の欠損によって当該タT., Izumi, Y., and Kawaoka, S*. （2022）.

ンパク質は全く検出されなくなった．興味深いことに，血Remote solid cancers rewire hepatic nitrogen

清アミロイドα 1-2 が存在しなくても，乳がんに依存的な

m e t a b o l i s m v i a h o s t n i c o t i n a m i d e -N -肝臓の炎症に変化はなかった．以上のことから，少なく

methyltransferase. Nat Commun 13, 3346.

ともこのモデルでは血清アミロイドα 1-2 に非依存的に炎Featured in Editor ’s highlights .

症が起こるものと考えられた．膵臓がんモデルとの結果の2）Vandenbon, A#*., Mizuno, R#., Konishi,

相違が興味深く，おそらく，がんの種類によって，炎症のR#., Onishi, M#., Masuda, K., Kobayashi Y.,

惹起に血清アミロイドα 1-2 を必要とするものとそうでない

Kawamoto, H., Suzuki, A., He, C., Nakamura,

ものがあると考えられた（He et al., Front. Immunol.,Y., Kawaguchi, K., Toi, M., Shimizu, M.,2023）．

Tanaka, Y., Suzuki, Y*., and Kawaoka, S*.

ニコチンアミドメチル基転移酵素（NNMT）は S- アデ（2023）. Murine breast cancers disorganize

ノシルメチオニンからニコチンアミドへとメチル基を転移さ

hepatic transcriptome in a zonated manner.

せ，メチルニコチンアミドを生成する酵素である（Mizuno

Commun Biol. 6, 97

et al., Nat. Commun., 2022）．これまでに NNMT が3）He, C#., Konishi, R#., Harata, A., Nakamura,

がんに起因する肝臓の異常の一端に関わることを示した

Y., Mizuno, R., Yoda, M., Toi, M., Kawaguchi,

が，その分子機能については未解明の点が多く残されてK*., and Kawaoka, S*. （2023）. Serum

いた．そこで本研究では，マウスの AML12 肝細胞培養

amyloid alpha 1-2 are not required for liver

株を用いて，NNMT の機能解析を行った（Yoda et al.,inflammation in the 4T1 breast cancer model.

J. Biochem., 2023）．AML12 において NNMT をノッ

Front Immunol. 14, 300.

クダウンしたところ，S- アデノシルメチオニンが蓄積し，メ4）Yoda, M., Mizuno, R., Izumi, Y., Takahashi,

チルニコチンアミドが減少した．また，この条件では，中M., Nakao, M., Bamba, T., and Kawaoka, S*.

性脂肪が減少した．中性脂肪の減少にどちらの代謝物の（2023）. Nicotinamide-N-methyltransferase

変動が重要なのかを調べたところ，S- アデノシルメチオニ

regulates lipid metabolism via SAM andンの合成阻害剤であるシクロロイシンの処理によって S- ア

1-methylnicotinamide in the AML12

デノシルメチオニンの蓄積を阻害すると，中性脂肪の減少

hepatocyte cell line. J Biochem. 174, 89-98.

がレスキューされることがわかった．また，メチルニコチ
ンアミドにも中性脂肪を蓄積させる活性があった．以上，
NNMT が S- アデノシルメチオニンとメチルニコチンアミド70

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

成体における社会的行動異常に関与する大脳形成不全の原因の解明
川口

大

おいてみられる特徴である神経活動のバランス異常（E/I
バランス異常）が観察された．また，興奮性ニューロンと抑制性ニューロンの構成比に異常が見られる可能性も示地（東京大学大学院薬学系研究科）

唆された．
興味深いことに，異なる Cre 発現マウスラインを用いてニューロンに分化してから FGF 因子をノックアウトしても【目的】

前頭前野の肥大や行動異常はみられなかった．これらの自閉スペクトラム症（以下，自閉症）は社会的コミュニケ

結果から，胎生期の特定の時期および場所における FGF

ーションの障害や限定された興味などを主徴とする神経発シグナルの異常が脳肥大を引き起こすことで自閉症発症に達症であり，罹患率は子供の 50-100 人に 1 人と高く，社つながる可能性が示唆された．

会的にも大きな問題となっている．しかし，その発症原因にさらに，ノックアウトマウスの胎生期脳において，どのよ

ついて多くは不明であり，治療法も確立していない．これまうな分子的な異常が見られるのかを調べるため，single

でに，数割にのぼる多くの自閉症児について脳の局所（前cell RNAseq 解析を行った．その結果，大脳領野形成

頭前野など）における肥大が起こることが報告されている．

に関わるモルフォジェンのシグナル伝達に関与する遺伝子

また近年，新生児の脳局所肥大パターン解析が早期自閉群に発現変動が見られた．組織学的な解析からも，脳局症診断に利用できる可能性が提唱されている．前頭前野は所においてこのモルフォジェンのシグナル伝達が変化して言語機能や社会的行動の調節などを担う領域であり，前頭いることが観察された．現在，このモルフォジェンによるシ前野肥大化が自閉症発症に関与する可能性が十分に考えグナル伝達が，生後の前頭前野肥大および行動異常に関られるが，その関連は明らかになっていない．そこで本研究与するのかを調べている．

では，局所肥大を起こす分子メカニズムを明らかにすること【考察】を目指している．これにより，多くの自閉症患者に共通する

本研究の結果から，局所脳肥大を伴う自閉症の発症メ

疾患発症メカニズムの解明に繋がることを期待している．

カニズムの一旦として，胎生期（脳発生初期）における近年，自閉症患者に特徴的な遺伝子変異を網羅的に

脳局所の FGF シグナルの異常が関与する可能性が示唆探索する試みが活発に行われており，複数の FGF シグナ

された．自閉症研究は主に生後の自閉症症状を担う分子

ル関連因子が自閉症原因候補遺伝子として挙げられていメカニズムの解析が中心となってきたが，本研究により胎る．FGF シグナルは発生過程において細胞増殖を制御し生期（脳発生初期）において既に発症に関わる異常が引て組織のサイズ決定に関与することが知られており，申請き起こされている可能性が考えられる．今後は，脳発生者はこのシグナルの異常が自閉症児にみられる前頭前野

初期に，いかなる細胞においけるいかなる分子メカニズム

肥大化に関与する可能性を考え解析を進めている．

の破綻により生後の表現型が表出するのかについて，そ【方法と結果】の詳細を明らかにしたい．

自閉症リスク因子に挙げられている FGF シグナル関連
因子のマウス大脳発生における発現パターンを調べたとこ
ろ，脳発生初期の大脳前方の限局した領域に一過的に発現することを見出した．そこで，この時期および場所依存的な FGF 因子を独自に開発した Cre マウスラインを用いて特異的にノックアウトしたマウスを作製した結果，生後腹内側核PACAP発現細胞の双方向性摂食調節メ
カニズムの解明と肥満症への関与
神

戸

悠

輝

（鹿児島大学大学院・医歯学総合研究科・生体情報薬理学）に前頭前野が肥大すること，また，成体においてノックア
ウトマウスが自閉症様行動を示すことを見出した．

【序論】

このノックアウトマウスの前頭前野において，電気生理

厚 生 労 働 省「 国 民 健 康・ 栄 養 調 査 報 告 」によると，的手法により神経活動状態を調べた結果，自閉症患者に20 歳以上の人の肥満の割合は男性で 33.0％，女性で71

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

22.3％と報告されている．肥満は単なる過剰体重だけでせた．この腹内側核 PACAP 過剰発現マウスの摂食量は，なく，心血管疾患，糖尿病，脂肪肝，肝硬変などの原

コントロールの腹内側核緑色蛍光タンパク質過剰発現マ因となることが知られている．この事から，新しい抗肥満

ウスと比較して，明期に減少傾向を示し，暗期に有意に薬の開発あるいは創薬ターゲットの探索は社会的に強く増加した．視床下部弓状核には，アグーチ関連ペプチド

求められている．肥満の基準である BMI の遺伝率は約（AgRP，摂食亢進ペプチド）およびプロオピオメラノコ

40-70% と高いことが知られている．このような遺伝要因

ルチン（POMC，摂食抑制ペプチド）が発現し，食欲をは主に視床下部に存在する摂食を調節する種々の神経中心的に制御することが広く受け入れられている．そこで，

ペプチドおよびその受容体と考えられており，本研究で腹内側核 PACAP 過剰発現マウス弓状核におけるこれら

注目した下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド

神経ペプチドの発現を，明期あるいは暗期に分けて測定（PACAP）もまた，視床下部に高発現する神経ペプチド

すると，明期では POMC の，暗期では AgRP の発現がで，体温調節あるいは摂食などエネルギー収支のバラン有意に増加することを見出した．一方で，過剰発現させたスを制御する因子である事が報告されている．しかしなが

PACAP は明期・暗期問わず増加傾向であった．すなわち，ら，PACAP による摂食調節メカニズムはそれぞれの報告

腹内側核 PACAP は，弓状核 AgRP あるいは POMC をで異なっており，詳細な解析が必要であった．

介して，個体の状態依存的（今回の研究では明期と暗期）【方法と結果】に摂食を調節する可能性が明らかとなった．近年，弓状

そこでまず， 我々は PACAP-KO マウスを用いて， 同

核の AgRP 発現細胞あるいは POMC 発現細胞に接続さマウスの摂食量の検討を行った．その結果，10 週齢時れるグルタミン酸含有細胞が，摂食を制御するホルモンでにおいて PACAP-KO マウスは，同腹仔のワイルドタイプ

あるレプチン（明期に高値）の作用によって比較的短時（WT）マウスと比較し，体重に顕著な差は観察されなか間において，接続相手を両細胞間でスワップすることが報ったにも関わらず，1 日の摂食量は有意に少なかった．さ

告されている．一方，我々は PACAP が主にグルタミン酸

らに，2 日間絶食したそれぞれのマウスに対して餌を再度含有神経細胞に共存することを明らかにしている．そこで，提示し，摂食量を測定すると，PACAP-KO マウスは WT

腹内側核 PACAP 発現細胞による明期・暗期間におけるマウスと比較して，摂食量が有意に少なかった．すなわち，双方向性の摂食調節メカニズムとして，腹内側核 PACAP

PACAP は摂食を促進する神経ペプチドであると考えられ発現細胞から弓状核の AgRP 発現細胞あるいは POMC

た．続いて，摂食を促進する作用のある PACAP が発現

発現細胞への神経投射先がスワップすると仮説した．そこする脳領域を探索するため，絶食下のマウスの脳標品にで，PACAP プロモータの制御下で Cre リコンビナーゼを

対し PACAP を認識する RNA プローブを用いた in situ発現するノックインマウスの腹内側核に，Cre 依存的にシハイブリダイゼーションを実施すると，PACAP の mRNA

ナプトフィジン EGFP キメラタンパク質（軸索末端を緑色

発現は，絶食に伴って視床下部腹内側核で顕著に増加し蛍光で標識）を発現させ，腹内側核 PACAP 発現細胞

た．さらに，in situ ハイブリダイゼーションの結果は，定から弓状核 AgRP 発現細胞への神経投射をシナプトフィ

量的 PCR によっても確認された．すなわち，視床下部腹ジン EGFP の蛍光強度により定量化すると，明期と比較

内側核における PACAP は摂食促進作用を示すことが明して暗期では神経投射が有意に多い事が明らかとなった．

らかになった．

以上の結果から，腹内側核 PACAP 発現細胞は，明期・しかし興味深いことに，1 日の摂食量をマウスの休息

暗期で神経投射をダイナミックに変えることで，明期では期である明 期，あるいは活 動 期である暗 期に分けて計

摂食抑制的，暗期では摂食促進的に作用する可能性が測 すると，WT マウスと比 較して PACAP-KO マウスで明らかになった（Kambe Y et al., 2020）．

は，明期の摂食量は増加傾向を示し，暗期の摂食量は

この解剖学的に観察された現象の機能的評価を試み有意に減少した．また，上述の様に視床下部腹内側核のた．AgRP あるいは POMC プロモータの下流で RCaMPPACAP は絶食に伴って増加することから，アデノ随伴ウイあるいは GCaMP（赤色あるいは緑色のカルシウムセンサ

ルス（AAV）によって腹内側核に PACAP を過剰発現さータンパク質）を発現する AAV を開発し，PACAP-Cre72

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

マウスの弓状核に感染させた．さらに，腹内側核 PACAP

すると，ガラニンの発現は増加あるいは減少した．すなわ

発 現 細 胞の活 動を特 異 的に調 節するために，PACAP-

ち，ガラニンは腹内側核 PACAP の下流シグナルと推察さCre マウスの腹内側核に，Cre 依存的に hM3D（人工れる．そこで，背内側核のガラニンをノックダウンする目

リガンド CNO で特異的に活性化される Gq 共役型受容的で，背内側核にガラニンに対する shRNA を発現させる体）を発現する AAV を感染させた．その後，CNO 投与と，明期の摂食量は増加し，暗期あるいは絶食後の摂食後の弓状核における赤色あるいは緑色の蛍光をファイバー量は減少した．これは，PACAP-KO マウスのフェノタイプ

フォトメトリーで計測すると，腹内側核 PACAP 発現細胞と全く同じだった（Kambe Y, et al., 2023）．

を活性化したときにおける，POMC あるいは AgRP 発現【考察】

細胞の神経活動を同時に，自由行動下のマウスから測定以上の解析から，夜間に腹内側核 PACAP 発現細胞できる．この実験系を利用して，夜間に CNO を投与しを活性化させると，摂食抑制系の弓状核 POMC 発現細た後，グレリンを脳室内投与した後において，POMC あ

胞を抑制する可能性が明らかとなった．申請者らはこれま

るいは AgRP 発現細胞の神経活動を計測した．夜間にでの報告において，腹内側核 PACAP 発現細胞は夜間にCNO を投与しても，GCaMP 蛍光強度の変化は観察さ摂食亢進作用を惹起する可能性を示唆しており，その結れなかったものの，RCaMP 蛍光強度の減弱が観察され果をサポートする重要なデータである．今回は，ファイバ

た．すなわち，夜間に腹内側核 PACAP 発現細胞を活性ーフォトメトリー法を用いて，AgRP 発現細胞の神経活動化させると，弓状核 POMC 発現細胞の活動を抑制するを記録することが出来なかったが，AgRP プロモータの配可能性が示された．さらに，同様の処置をしたマウスの列を最適化したことで，GFP の蛍光を観察することができ脳室内にグレリンを投与すると，弓状核 AgRP 発現細胞

た．今後は，この AAV を用いたファイバーフォトメトリーの発現する GCaMP 蛍光強度の変化は観察されなかった法を適用し，AgRP 発現細胞が上記と同条件において活ものの，弓状核 POMC 発現細胞の発現する RCaMP 蛍

性化することが確認できれば，非常に興味深い結果とな

光強度の増強が観察された．この結果は，グレリンによるる．一方で，グレリンは摂食亢進ホルモンであることから，

POMC 発現細胞の活性化を示唆する．一方，RCaMP

グレリンの投与によって摂食を抑制する働きのある POMC

および GCaMP を発現しているマウスを灌流固定し，組発現細胞を活性化したことは意外であった．この理由は織学的な解析に供すると，光ファイバーが挿入されていた不明であるが，今後詳細に解析していく予定である．また，部位において RCaMP 陽性神経細胞が多数検出されたの腹内側核 PACAP の下流シグナルとして，背内側核のガに対して，GCaMP 陽性の細胞はほとんど観察されなかっラニンを見出した．背内側核ガラニンもまた，腹内側核

た．このことが，GCaMP の蛍光の増減が観察出来なかった理由と推察される．そこで，AgRP-GCaMP のプロモータ領域を最適化し，マウスに感染後，発現細胞を観察

本研究のまとめ

すると，弓状核の POMC-RCaMP を発現しない細胞にお腹 内 側 核

いて，緑色蛍光が観察された．

PACAP は 弓 状

一方で，腹内側核 PACAP 発現細胞は視床下部背内核 AgRP/POMC

側核にも非常に強く投射していた．非常に興味深いことに，

あるいは 背 内 側

背内側核もまた摂食調節において双方向性が報告されて

核 ガラニンの 視いる領域である．背内側核は神経ペプチド・ガラニンが

床 下 部 神 経ペプ

高発現する領域であることから，ガラニンの発現を検討す

チドネットワ ーク

ると，絶食によって増加し，この増加は PACAP-KO マウを介し， 個 体 のスでキャンセルされた．続いて，ガラニン発現制御におけ

状態依存的に摂る腹内側核 PACAP の重要性を検討した．その結果，腹食を調節する．

内側核において PACAP を過剰発現あるいはノックダウン

73成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

PACAP と同様に双方向性の摂食制御を示すことが明らか

免疫疾患，がん研究やデュプイトラン拘縮など様々な疾患となった．

に応用することで微小炎症制御法の確立を目指す．

PACAP およびガラニンは摂食を促進する神経ペプチド【結果】である可能性があり，同シグナルを抑制する分子は抗肥

ライトシート蛍光顕微鏡は高速に三次元画像を取得す

満薬となりうる．加えて，PACAP およびガラニンによる摂ることが可能な顕微鏡であるが，撮影可能なサンプルサイ

食調節は，“ 状態依存的 ” な可能性がある．すなわち，

ズは光学設計の制限により限られていた．久保田らはオー

食事は個体の生命活動に必須であり，過度な食欲の抑制

プントップ型のライトシート蛍光顕微鏡を開発することによは逆に健康を害すると考えられるが，PACAP およびガラってこれまで一度に撮影することが困難であったヒト脳断

ニンは食への渇望が強い場合にのみ，摂食促進作用を発面（12x7.5x1cm）に蓄積するアミロイドプラークの可視揮するかもしれない．この特徴をうまく利用すれば，肥満化（図１），マウス脳転移モデルマウスにおける脳転移巣症患者の食物の過剰摂取のみを抑制できる安全な抗肥満の定量的マルチスケール解析（図 2）に成功した 1）．

薬の創薬ターゲットになる可能性がある．

また同時に蛍光プローブの開発 2）や画像解析手法の開発 3）を行うことで，神経免疫連関の解明に必要な要素技

全身全細胞解析技術を用いた微小炎症制御機構の解明術を確立した．開発した手法はがんの治療効果の定量的評価 4）や炎症性疾患の病態解析に応用されている 5）．
【考察】

久保田

晋平

（北海道大学遺伝子病制御研究所分子神経免疫学分野•特任講師）

微小炎症の制御方法を確立するためには病態を可視化することにより時空間的多様性・遷移状態を定量評価することが重要である．時空間的多様性・遷移状態を定量【目的】
多細胞生命システムは自律的に機能する神経細胞ネッ

評価する実験系として single cell RNAseq なども取り入れながら研究を進めていく．

トワーク • 免疫細胞ネットワークによりその恒常性が維持【文献】

されているが，この恒常性維持機構の破綻に起因する疾

1）Glaser A K, Bishop K W, Bar ner L A, Susaki

患発症機構は技術的な困難から，その多くが不明である．

EA, Kubota SI, （20名略）, Liu JTC: A hybrid

加齢 • ストレスは神経免疫連環により維持されている恒常

open-top light-sheet microscope for multi-scale

性を破綻させることにより制御不能な慢性炎症を誘導し，

imaging of cleared tissues. Nature Methods, 19,

関節リウマチや炎症性腸疾患などの自己免疫性疾患だけ

613–619,でなく，動脈硬化に起因する血管障害，さらに脳機能障

2）Nai m F, Ha seb e R , Hojyo S , S h ich ibu Y,

害である認知症など近年の長寿社会で大きな問題となる

Tanaka Y, Tainaka K, Kubota SI, Konishi

疾患，病態を引き起こす．慢性炎症性疾患の予防法を開K, Murakami M: Gold-nanocluster-mediated

発するためには，疾患の基本単位となる微小炎症の時空

microinflammation detection by using a tissue-

間的多様性・遷移状態の背景に存在する神経免疫連関

clearing method, bio-protocol, 2023

機構に介入することによる微小炎症の制御方法を確立す

3）Takahashi K, #Abe K, #Kubota SI, #Fukatsu

る必要があると考え，微小炎症の発生・消滅・増幅・定N, （7名略）, Shimamura T, Miyazono K: An

着機構を担う神経免疫連関機構の解明に取り組んだ．

a na lysis moda l it y for vascu la r st r uct u re s

【方法】

combin ing t issue - clear ing tech nolog y and久保田らは微小炎症の発生・消滅・増幅・定着機構

topological data analysis.

を担う神経免疫連関機構を定量的に解析することを可能

Nature Communications, 13, 5239, 2022 #equalにするために，ライトシート蛍光顕微鏡，蛍光プローブ，

contribution

画像解析手法の開発に取り組んだ．開発した手法を自己

744 ） Z h a i T, M i t a m u r a T, Wa n g L , K u b o t a

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

S I , M u r a k a m i M , T a n a k a S , Wa t a r i H :Iwasaki N, Hashimoto S, Tanaka Y, Murakami

Combination therapy with bevacizumab

M, Dupuytren’s contracture-associated SNPs

and CCR2 inhibitor for women with ovarian

increase SFRP4 expression in nonimmune cells

cancer: in vivo validation study, Cancer

including fibroblasts to enhance inflammation

medicine, 22, 2023

development, Int Immunol., 31 January 2023

5）Kida H,（9 名略）, Kubota SI, Hojyo S,

図１. アルツハイマー病患者死後脳断面（12x7.5x1 cm）に蓄積するアミロイドプラークの可視化

図 2. マウス脳転移モデルマウスにおける脳転移巣の定量的マルチスケール解析

a. オープントップ型ライトシート蛍光顕微鏡を用いたマルチスケール解析の流れ．b.6匹分の全脳をガラスプレートにセットしイメージングを行う．c.高倍率で撮影する領域を決定するために低倍率で全脳イメージング．d.ROIを指定した後にサブミクロン解像度でイメージン
グ．e-g.乳がん脳転移巣のイメージング画像．i.乳がん脳転移巣と腎がん脳転移巣脳の体積-表面積比．j.乳がん脳転移巣に異なる細胞密度を呈する領域が存在した．
スケールバーの長さは以下の通り：b,c, 1 cm; d, 100 μm; e, 1 mm; f, 500 μm; g,h, 100 μm．

75

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

骨格筋再生を主導する多細胞間相互作用ネットワ
ークの解析
小

池

筋幹細胞との相互作用を in vitro で検証した．その結果，再生中の骨格筋組織に含まれるマクロファージの中で一つのマクロファージ亜集団が増殖している骨格筋幹細胞と

博

之密接に相互作用していることを示唆した．
（東京医科歯科大学）【目的】
サルコペニアは，骨格筋の再生が正常に機能しないこと
により起こる疾患である．骨格筋の再生は，骨格筋幹細胞の活性化，増殖，筋分化という大きく 3 つのステップ

グレリン分泌細胞におけるGPCR発現解析および新規調節因子の探索
小

山

博

之

（名古屋市立大学大学院医学研究科 消化器代謝内科学）を経て，連続的に行われる．この骨格筋再生過程の調節に中心的な役割を果たす細胞の一つがマクロファージである．本研究では，マクロファージが骨格筋幹細胞の増殖【背景】
サルコペニアは筋力と筋量の低下により QOL 低下や死を制御するシグナルを明らかにすることを試みた．

の転帰を辿りうる疾患であり，早期診断と積極的な薬物【方法】

介入は健康寿命を延伸し社会への貢献につながる．筆者

骨格筋再生におけるマクロファージの亜集団とその機はこれまで，グレリン細胞株を用いた網羅的遺伝子発現能を解析することを目的とし，カルジオトキシンによるマウ解析を行い高発現 GPCR を同定し，トリプトファンなどのス骨格筋再生モデルから骨格筋組織を回収し，シングル

栄養分子がグレリン分泌におよぼす影響および細胞内シセル RNA シークエンス解析を実施した．さらに，この経

グナル伝達経路の解明を行ってきた．ヒトにおいて複数の路に関与するマクロファージ亜集団の機能を解析するため疾患でグレリン投与は食欲や骨格筋量を増やすことが報に，シングルセル RNA シークエンスデータからフローサイ

告されており (Nagaya et al. Circulation. 2004 など )，トメトリーでの単離に用いることが可能な細胞膜タンパク

サルコペニアに対する薬物治療としてグレリンは有望視さ質を探索した．マクロファージ亜集団が骨格筋幹細胞とれている．

相互作用しながら再生を促進している可能性を検証するた薬物を含めた治療介入の効果・作用機序の解析にはモめ，オルガノイド評価系を用いた．

デルマウスが有用であるが，マウスはヒトと遺伝学・組織【結果】

学的に相同性が高く加齢プロセスも類似するため，サルコ

再生過程のマウス骨格筋のシングルセル RNA シークエ

ペニアモデルとして老化マウスが多く用いられている．しかンス解析により，再生骨格筋組織中のマクロファージがし，長期間飼育すると個体差が大きくなり，統計学的解

様々なサブタイプ（亜集団）に分類されることを確認した．

析が困難になる問題点が存在する．一方，骨格筋量やリガンド・レセプター解析の結果，これらのマクロファー

筋力が低下する遺伝子改変マウスも数多く報告されている

ジ亜集団の 1 つが，他の亜集団よりも増殖中の骨格筋幹が，正常な加齢とは異なる外観や表現型を呈するためヒト細胞と密接に相互作用していることが示唆された．このマへの外挿性に乏しい欠点がある．

クロファージ亜集団の機能を詳細に調べるには，マクロフ【目的】

ァージ集団全体からこの亜集団を分画することが必要で

SAMP1 マウスのサルコペニアモデルマウスとしてのある．そこで，シングルセル RNA シークエンス解析で得Proof of Concept 確立を目指す．

られた遺伝子発現情報をもとに，フローサイトメトリーに【方法】

使用できる表面抗原マーカーの検証を行った．その結果，

18 週齢の SAMP1 マウスおよび対照マウス (SAMR マ

このマクロファージ亜集団が高い頻度で濃縮される条件

ウス ) を通常餌にて飼育し，運動介入 ( 回転かごによる自を見出すことに成功した．骨格筋再生モデルマウスからフ発運動 ) を 8 週間おこなった．投与期間中は体重，骨格

ローサイトメトリーでマクロファージ亜集団を分取して骨格

筋量，四肢握力，トレッドミル試験を用いて評価した．

76

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成【結果】
18 週齢の SAMP1 マウスは対照マウス (SAMR) と比較して，サルコペニアの診断 (AWGS2019 サルコペニア
診断ガイドライン ) に必須の筋量・筋力・身体機能の低下を認めた．さらにヒトサルコペニアと共通する複数の表
現型 ( 低栄養・耐糖能異常・テストステロン低下 ) を有していた．また，SAMP1 の血中デスアシルグレリンおよびIGF-1 は有意な上昇を認めた．また，自発運動量はマウスにより個体差が大きく，自発運動量と身体機能改善は正の相関を認めた．

次に，18 週 齢の SAMP マウスを① 回転かごを置いたケージで飼 育した Exercise 群， ② 回 転 かごを置 かな い Sedentary 群 に 分 け，8 週 間 飼 育 した． 結 果，
Exercise 群は有意にヒラメ筋重量，トレッドミル試験走
行距離が増加していた．

77

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

次に SAMP1 マウスの耐糖能を評価するため，16 週齢

これまでの研究結果から，SAMP1 マウスは加齢に伴うの時点で腹腔内ブドウ糖負荷試験（ipGTT,1g/kg) を行っ

サルコペニア，耐糖能異常を模したよいモデルであることがた．その結果，血糖値の推移は 2 群間に大きな差異を認示唆された．今後，本モデルを用いて，近年次々に登場すめなかったが，負荷 30 分後の血中インスリン濃度を測定

る新規糖尿病治療薬の骨格筋への影響や，新規サルコペ

すると SAMP1 マウスは約 2 倍の有意な増加を認めていた．

ニア治療薬の開発などに利用していきたいと考えている．

オレキシン1受容体作動薬の創製斉藤毅（筑波大学医学医療系/国際統合睡眠医科学研究機構）【目的】
オレキシンは，G タンパク質共役型受容体である 2 種類のオレキシン受容体（OX1R,OX2R）に作用することで睡眠覚醒や情動を制御する神経ペプチドである 1）．オレキ
シン /OX 2R 系の機能不全が睡眠障害ナルコレプシーを引き起こすことが明らかになって以降 2），OX2R 選択的作動薬はナルコレプシー治療薬として精力的な開発が進められている．一方で，ナルコレプシーはオレキシン欠損により引き起こされることから，OX 1R を介する経路も不全となっているものの，ナルコレプシーにおける OX1R の治療標的【考察】としての有効性の検証は十分に進んでいない．本研究で2 型糖尿病患者は骨格筋や肝臓・脂肪組織でのインスは，OX 1R の機能解明研究の一層の加速に貢献すべく，

リン抵抗性が病態の大きな要因であり，とくに骨格筋は世界でも未だ報告のない OX 1R 選択的作動薬の創製に取インスリンによって促進される血糖利用の大半を担っていり組んだ．

る．糖尿病とサルコペニアは双方向性に影響を与えており，【方法】

骨格筋量減少は骨格筋への糖取り込み能低下 ( ≒骨格筋

我々は， 独自に見出した OX 2R 選 択 的 作 動 薬 YNT-におけるインスリン抵抗性 ) につながる．また，サルコペ

185 の活性立体配座探索の過程で，柔軟なエチレンジア

ニアにより身体機能が低下していると，糖尿病治療に重要

ミン側鎖の配向をテトラリン骨格により屈曲型に固定したな運動療法が十分に行えず骨格筋での糖・脂質代謝が誘導体を合成したところ，活性が 10 倍向上した OX2R

さらに低下する．一方，糖尿病が存在するとインスリン作

選 択 的 作 動 薬（S ）-YNT-2655 に加え，OX1R にも強用の減弱により異化が亢進し骨格筋量が低下してしまう．

い作 動 活 性を示すデュアル性 作 動 薬（R ）-YNT-2655

SAMP1 マウスにおいても血中総コレステロールやアルブを見出した（EC50=13.5 nM for OX1R, OX2R/OX1R=

ミン値は低栄養を反映しているのか有意な低下を認めた

0.043)3）．この結果は，アミノテトラリン骨格の 1 位炭素が，血中中性脂肪は逆に有意に上昇し，骨格筋 ( ヒラメの立体化学が OX1R 作動活性の発現に重要であることを筋 ) における中性脂肪蓄積量も増加している傾向を有して示唆していた．
そこで本研究では，（R ）-YNT-2655 を元に，いた．原水らの報告によると，SAMP1 マウスでは，血中OX1R 作動活性を維持しつつ OX2R 作動活性を減弱させレプチン濃度上昇・アディポネクチン濃度低下というアディ

る分子構造の探索を行った．

ポカインレベルの変化が認められ，体重は SAMR と変わ【結果】

らないがインスリン抵抗性の存在が示唆されている．

78

構造活性相関により，ビフェニルアミド基の片方の芳香成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

環を除去することで OX 2R 作動活性が顕著に減弱するこ尿病によるβ細胞サイズ・数の変化 4）を検討してきた．

とを見出した．芳香環の代替として様々な長さの炭化水【方法】

素鎖を導入した結果，アクリルアミド構造を付与した際に膵癌患者における糖尿病の有病率は非常に高く，特にOX1R 選択的な作動活性が発現することを発見した．さ

新規発症の糖尿病症例が多いことが知られており，膵癌

らに，アミド基上の置換基を最適化したところ，末端にと糖尿病には密接な関係がある 1）．我々は，膵癌による水素結合受容基を配置することで劇的に活性が向上する

β細胞量・α細胞量の変化を検討するため，膵癌が原因ことを見出し， 世 界 初となる OX 1R 選 択 的 作 動 薬（R ）で死亡した 30 例の剖検例と，年齢と BMI をマッチさせ-YNT-3708（EC50=7.48 nM for OX1R, OX2R/OX1R=

た 31 例の膵癌でない剖検例を比較した．腫瘍のない部

22.5）の創製に成功した 4）．得られた（R ）-YNT-3708

位の膵切片をインスリンとグルカゴン染色を行い，分画βを用いてマウスにおける in vivo 薬理評価を行ったところ，
テールフリック試験において顕著な鎮痛活性を示すことを
見出し，また条件場所嗜好性試験においてはコカインよりは弱いものの薬物強化作用を示すことを見出した．これら作用は，OX1R を欠損したマウスでは確認されなかったことから，（R ）-YNT-3708 は OX1R を介してこれら作用を発現していることが示唆された．
【文献】
1）T. Sakurai et al. Cell 92, 573−585（1998）.
2）M. Mieda et al. PNAS. 101 , 4649−4654（2004）.
3）T. Saitoh and T. Sakurai Peptides 167, 171051（2023）.
4）K. Iio et al. J. Med. Chem. 66 , 5453–5464（2023）.

β細胞保護を主眼とする2型糖尿病治療実現に向けたヒトβ細胞量の調節因子の検討佐々木裕伸（慶應義塾大学医学部 予防医療センター 特任助教）【目的】
β細胞の総量（β細胞量）は境界型糖尿病の段階から減り始め，2 型糖尿病は，正常耐糖能と比較してβ細胞量が 20 ～ 65%も減少する不可逆的な病態である 1）．しかし，β細胞量を維持・保護するような早期介入を行えば，2 型
糖尿病の発症や進展を防ぐことができる可能性がある．以上より，外科手術や剖検で得られたヒト膵組織を用いて，患者の臨床的背景からヒトβ細胞量の調節因子を検討することを本研究の目的としている．我々は，以前に出生体重 2）
や DPP-4 阻害薬使用 3）に伴う膵島形態の変化，2 型糖

図：膵癌の有無における BCA（図 a），ACA（図 b）

および ACA/BCA 比（図 c）5）79

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

細胞面積（BCA）とα細胞面積（ACA）を定量化した 5）．
【結果】

モデル魚類を用いた網膜変性疾患の研究

膵癌患者の BCA は，対照群と比較して有意差はなか

佐った（図 a:1.53±1.26％ vs 0.95±0.42％，p = 0.07）．

藤恵太（岡山大学）

しかし，ACA および ACA/BCA 比は，対照群と比較して膵癌患者において有意に高かった（図 b:2.48±2.39％
vs 0.53±0.26 ％および 図 c:1.94±1.93vs 0.59±0.26【目的】
網膜色素変性症（RP）は遺伝性・進行性の網膜変性％，いずれも p ＜ 0.001）5）．

疾患で，EYS は東アジア，欧州で高頻度な RP の原因遺【考察】

伝子である．そのオーソログはモデル動物であるマウスや膵癌患者における ACA の上昇や BCA に対する ACA

ラットのゲノム上から失われているため，同じ脊椎動物で，比率の上昇は，α細胞量の増加やα細胞量に対する相対ヒトと同様の網膜層構造，視細胞構造を持つ魚類メダカ

的なβ細胞量の減少を示唆している．これら比率の変化

を用い，EYS を原因とする RP の分子病理の理解を目指に伴う血漿グルカゴン濃度の上昇やグルカゴン / インスリ

した．

ン濃度比率の上昇などが，膵癌患者における耐糖能悪化【方法】
ゲノム編集により eys KO メダカを作出し，稚魚の光にに寄与している可能性がある 5）．
【文献】

対する応 答， 網 膜 視 細 胞における外 節タンパク質の発

1）Sasaki H, Saisho Y, et al.: Revisiting regulators

現パターン変 化， 視 細 胞 微 細 構 造の変 化を観 察した．

of humanβ -cell mass to achieve

β -cell-

TUNEL 法により細胞死を検出し，網膜における酸化スト

centric approach toward type 2 diabetes, J

レス・細胞死・オートファジー等に関連する遺伝子発現

Endocr Soc, 5, bvab128（2021）.

レベルの変 化を qPCR と in situ hybridization により

2）Sasaki H, Saisho Y, et al.: Associations ofbirthweight and history of childhood obesitywith beta cell mass in Japanese adults,
Diabetologia, 63, 1199-1210（2020）.

観察した．
【結果】

eys KO メダカ稚魚では WT と比較して光応答が減弱した．通常視細胞外節に局在する視物質やペリフェリン

3 ） S a s a k i H , S a i s h o Y, e t a l . : D i p e p t i d y l

２が eys KO では内節やシナプス終末など誤った位置に

peptidase-4 inhibitors and beta cell mass in

局在する例が見られ，外節長は短縮した．透過電子顕微Japanese adults with type 2 diabetes, Endocr

鏡（TEM）観察により，eys KO メダカ視細胞外節の一Pract, 28, 563-564（2022）.

部でラメラ構造の乱れが見られた．また一部の細胞でオ4）Sasaki H, Saisho Y, et al.: Reduced beta cell

ートファジーを示す構造が見られた．WT と eys KO の視

number rather than size is a major contributor

細胞層厚には 8 ヶ月齢でも差がなく，細胞死の亢進，酸

to beta cell loss in type 2 diabetes,

化ストレス・細胞死関連遺伝子発現レベルにも変化はな

Diabetologia, 64, 1816-1821（2021）.

かった． 一 方，オートファジー 関 連 遺 伝 子 gabarap と5）Tsuchiya T, Saisho Y, Inaishi J, Sasaki H, etal.: Increased alpha cell to beta cell ratio inpatients with pancreatic cancer, Endocr J, 69,
1407-1414（2022）

sqstm1 が視細胞特異的に発現亢進した．
【考察】
メダカ eys KO ではヒト RP と同様，視細胞の形態的・機能的な変化があるが，細胞死や網膜の進行性変性は見られない．eys KO メダカの視細胞でオートファジー関連遺伝子が発現亢進し，オートファジーを示す TEM 観察像が見られたことから，メダカ視細胞は eys KO により
異常な局在を示す外節タンパク質等をオートファジーによ80成人病の病因・病態の解明に関する研究助成って処理し，ストレスを低減して細胞死を抑制し，生存を維持する可能性が考えられる．

[ アリ ]
社会性昆虫は，一つの巣の中では遺伝的にほぼ同一で【文献】ありながら，生後の環境によって，もしくは成体になったあ

Sato, K., Liu, Y., Yamashita, T., & Ohuchi,とに受ける社会的な入力によって，役割の分担を行う．ト

H.: The medaka mutant deficient in eyes shut

ゲオオハリアリは遺伝的に極めて均質であるにも関わらず，

homolog exhibits opsin transport defects and後天的な闘争により女王，巣の世話を行うナース，採餌enhanced autophagy in retinal photoreceptors,を行うフォレ―ジャーに役割が分担される．更に各役割

Cell Tissue Res ., 391, 249-267（2023）の中でもカーストが存在している．申請者はこれまでの予備実験で，トゲオオハリアリの巣内に四種類以上の睡眠

睡眠覚醒サイクルにおける遺伝的な制御と環境的な制御の統合機構に関する研究
史蕭逸（筑波大学国際統合睡眠医科学研究機構）

表現型の種類があることを見出しており，特にナースとフォレ―ジャーにおける睡眠表現型の違いは，ドーパミンによる可能性が高いことを見出している．本研究では，このような睡眠表現型の多様性を生み出す分子・細胞的な基盤について調査する．
【方法】

【目的】

本研究では，組織透明化と免疫染色法，蛍光 in situ

睡眠覚醒サイクルは神経系を持つ生物に幅広く保存さハイブリダイゼーション法を組み合わせることで，睡眠覚れる生命現象である．生物種によって 1 日の睡眠時間や醒サイクルに伴う神経細胞・グリア細胞の可視化を行う．

睡眠覚醒サイクルの構造が異なり，同種内の個体は近し

その初めてとして，まずは透明化および染色法の開発を行い睡眠時間と構造を示すことから，遺伝的な制御がそのなった．

背後に潜んでいると考えられる．近年，シナプスタンパク【結果】

質のリン酸化を通じた睡眠覚醒サイクルの制御メカニズム

[ マウスにおけるグリア細胞の染色およびイメージング ]が明らかになりつつある．一方で，例えば，発熱時には睡眠時間が上昇することや，性周期などの内分泌系の変化による過眠や不眠の誘導といった内外の環境変化によ図 1. グリア細胞の全脳染色

る睡眠覚醒サイクルの構造変化に関する説明はまだ不十分である．そこで，本研究では 2 種類の動物を用いて，環境変化による睡眠覚醒サイクルの構造変化に迫る．
[ マウス ]
近年，アストロサイトによる細胞外イオン濃度の調節が睡眠覚醒サイクルの制御に寄与することが報告された（Ding et al., 2016; Clasadonte et al., 2017）．特に，睡眠覚醒サイクルの重要な側面である睡眠恒常性（1 日の睡眠時間が一定に保たれるメカニズム）に関して，アス
トロサイトの機能を薬理的に阻害すると断眠後のリバウン
ド睡眠が観察されないことが報告されたことは（Blum etal., 2021），睡眠覚醒サイクルの制御におけるグリア細胞の重要性を強く支持した．そこで本研究では，グリア細胞のマウス睡眠における役割を理解することを目指す．

図２. トゲオオハリアリの組織透明化（左）図３. アリの全脳イメージング（右）（a）全脳（b）キノコ体（c）LX 側部複合体（d）ME 延髄の PI 染色81

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

これまでの成果として，グリア細胞の全脳染色に成功している．ミクログリア，アストロサイト，オリゴデンドロサイ
トの細胞マーカーである Iba1，GFAP，Olig2 といったタ
ンパク質の抗体染色と一細胞解像度のイメージングを全

膵β細胞高血糖毒性感受性遺伝子の新規同定と解析
下脳レベルで実現した．また，データ解析に関しても脳領域

直樹（和歌山県立医科大学 内科学第一講座）

ごとにシグナル陽性細胞の数や，シグナルの強さを定量することが可能となった（Mano et al., 2022）．
[ アリにおける全身・全脳透明化手法の開発 ]アリの外骨格は水溶性の透明化手法では透明にできなかったため，疎水性の手法を用いた．

【背景】
2 型糖尿病における慢性的な高血糖は膵β細胞機能障
害を引き起こすことが示されており，高血糖毒性として知られている．一方，糖尿病治療による膵β細胞機能の改条件検討を行った結果，アリの全身および全脳の透明善も経験されるが，このような機能変化に関わる分子機序化に成功し，核（ヨウ化プロピジウム ,PI）染色によるキノの全容は明らかでなく，未知の因子の関与が想定される．

コ体などの特異的な構造を可視化することに成功した．

【目的】

【考察】
核染色・抗体染色によるマウス，アリのイメージングに成功したので，今後は蛍光 in situ ハイブリダイゼーション

高血糖毒性に対する感受性が高く，膵β細胞機能において重要な役割を果たす新規因子を同定し解析する．
【方法・結果】

法の開発を行う．特にアリのような非モデル動物においては，

我々は，過食 2 型糖尿病モデルの db/db マウスに対適切な抗体を見つけ，購入することは容易ではなく，RNAする 1 週 間の SGLT2 阻 害 薬 投 与により， 高 血 糖 毒 性の配列からイメージングプローブがデザイン可能な蛍光 inを選択的に軽減し得ることを報告している（Shimo N etsitu ハイブリダイゼーション法が好ましいと考えられる．

al., 2015）．今回，本系の治療群と非治療群の膵島由【文献】

来 mRNA を用いて microarray 解析を実施し，非治療

1）Ding, F. et al. , Changes in the composition of

群に比べ治療群で 2 倍以上の有意な高発現を示す 43 因brain interstitial ions control the sleep-wake子を抽出した．高血糖毒性に対し感受性の高いこれら遺cycle. Science （2016） doi: 10.1126/science.

伝子の中には，膵β細胞機能における役割は未知だが，

aad4821

GWAS において 2 型糖尿病疾患感受性遺伝子として報2）Clasadonte, J. et al., The special

告（TabassumR et al., 2013）されている Tmem163

relationship: glia–neuron interactions inが含まれており，ヒトの糖尿病病態との関連性を想定し，

the neuroendocrine hypothalamus. Nat.

同因子の解析を開始した．マウス膵組織の免疫染色およR e v. E n d o c r i n o l . （ 2 0 1 8 ） . d o i : 1 0 . 1 0 3 8 /び免疫電顕での解析により，膵β細胞インスリン分泌顆

nrendo.2017.124

粒（SG）の顆粒膜への高度の限局が示唆された．膵β3）Blum, I., et al., Astroglial Calcium Signaling

細胞特異的 Tmem163 ノックアウトマウス（KO）の経口

Encodes Sleep Need in Drosophila. Curr. Biol.

ブドウ糖負荷試験において，血糖値は対照群に比べ有意（2021）. doi: 10.1016/j.cub.2020.10.012

な低値を，血漿インスリン値は有意な高値を示した．単4 ） M a n o , T. e t a l . , C U B I C - C l o u d p r o v i d e s

離膵島のグルコース応答性インスリン分泌（GSIS）も対

an integrative computational framework

照群に比べ有意な高値を示した．また電顕での解析にて，toward community-driven whole-mouse

対照群に比べ SG の未成熟性が認められた．さらに対照

brain mapping. Cell. Rep. Meth.（2021）doi:

群に比べ KO では，免疫染色にてインスリンの前駆体で10.1016/j.crmeth.2021.100038

あるプロインスリンの分布が核周囲から細胞質全体へと変化しており，定量評価では膵島プロインスリン含量が増加傾向を示した．加えて定量的 PCR にて，KO ではインス82成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

リン生合成および小胞体ストレスの増大が示唆された．

ューロペプチド B/W はこれまでに痛みの制御，自律神経【考察】系の調節などに関わることが知られているが，その生理的Tmem163 は，SG の成熟を介して膵β細胞からの適役割は不明な点が多い．ニューロペプチド B/W の受容体

切な GSIS 制御に関わるとともに，その発現低下は膵βであるニューロペプチド B/W １受容体（Npbwr1）は情細胞への負荷となり得るものと推察される．これら GSIS

動応答に重要な役割を果たす扁桃体中心核（CeA）の亢進や膵β細胞負荷は 2 型糖尿病の初期の病態に合致

GABA 作動性ニューロンにおいて顕著な発現を示すことすることから，本因子の 2 型糖尿病における意義を明らを確認した．さらに，Npbwr1 欠損マウスを独自に作成し，かにすべく，今後も解析を継続する．

様々な行動テストを行った結果，このマウスは初めて対峙する相手に対して社会的接触時間が非常に長く，執拗な追尾行動を示すことが明らかになった．この時の心拍数，

ソーシャルディスタンスを制御する神経回路とそ

血圧を測定したところ，対照群に比べ顕著かつ持続的なの分子の探索上昇が見られた．また，恐怖記憶の形成に障害が観察さ

征

矢

晋

れた 1）．また，これまでに Npbwr1 を発現するニューロン

吾（筑波大学医学医療系、国際統合睡眠医科学研究機構 ）（Npbwr1 ニューロン）の神経活動が新規個体との接触時に亢進することを確かめている．Npbwr1 を手がかりと【目的】

して Npbwr1 が発現するニューロン（Npbwr1 ニューロ

本研究では，ソーシャルディスタンスを制御する神経基ン）の生理的役割を神経回路レベルで探索することで個盤を探索するためニューロペプチド B/W に注目した．ニ

体間距離を制御する分子・神経基盤の描出を試みる．

図 3．Npbwr1 ニューロンのカルシウムイメージング

83成人病の病因・病態の解明に関する研究助成【方法・結果】【文献】

a）Npbwr1-iCre の CeA に AAV-DIO-jRGECO1a と1）Nagata-Kuroiwa, R. et al . Critical role of

AAV-DIO-F1-EYFP ま た は AAV-DIO-Y1-EYFP

neuropeptides B/W receptor 1 signaling in

を混 合したものを投 与した． 免 疫 抗 体 染 色によりsocial behavior and fear memory. PLoS One

jGCaMP7c および EYFP 陽性細胞を CeA において6, e16972（2011）

可視化した（スケールバー：100 μ m）．
b）新規の雄マウスに対する社会的接触前後（±2 秒）の
Npbwr1 ニューロンのカルシウム動態2 ） Wa t a n a b e , N . e t a l . A s i n g l e n u c l e o t i d epolymorphism of the neuropeptide B/W
receptor-1 gene influences the evaluationc）社会的接触前後（±2 秒）における平均最大蛍光強度．

of facial expressions. PLoS One 7, e35390d）既知の雄マウスに対する社会的接触前後（±2 秒）の（2012）

Npbwr1 ニューロンのカルシウム動態e）社会的接触前後（±2 秒）における平均最大蛍光強度．
f）３チャンバー社会行動テストおよび社会相互作用テストの概要．

メタボリックシンドロームにおけるURAT1のインスリン抵抗性の制御機構の解明

g）新規マウス周辺における滞在時間．

田

中

祥

朗

h）新規マウス周辺における滞在時間を示したヒートマッ（東京慈恵会医科大学 内科学講座 循環器内科）

プ図および Discrimination index．
i）社会相互作用テストにおける新奇マウスに対するソー
シャルディスタンスの変化．
j）社会相互作用テストにおける新奇マウスに対する接触時間の変化．
【考察】【背景】
尿酸トランスポーター URAT1 は腎臓近位尿細管に発現して，尿酸の再吸収を行うトランスポーターである．我々は，URAT1 が肝臓や褐色脂肪組織に発現して慢性炎症や酸化ストレスを介してインスリン抵抗性を惹起している事

Npbwr1 の生理的役割を明らかにするため，これまでを報告した（Tanaka Y et al Mol Metab 2022）．しかに情動応答の変化が報告されているヒト Npbwr1 遺伝子

し，メタボリックシンドロームの心臓組織，心筋細胞におの SNP2 を含む AAV（AAV-DIO-F1-EYFP） および 正

ける URAT1 の病態生理学的意義に関しては不明な点が常な Npbwr1 を発 現する AAV（AAV-DIO-Y1-EYFP）

多いのが現状である．

を作成した．Npbwr1-iCre の homo 接合マウスを用い【目的】て F1 および Y1 を発現させた結果，Y1 投与群では３チインスリン抵抗性，メタボリックシンドローム下における

ャンバー社会行動テストおよび社会相互作用テストにお心臓組織，心筋細胞における URAT1 の病態生理学的

いて社会性の低下およびソーシャルディスタンスの増加

意義を明らかにする事．

を示した．F1 投与群においてはコントロール（Npbwr1-【方法】

iCre ,homo 接 合マウス） 群と比較して変 化は見られな

In vivo：8 週齢で購入した C57/BL6 マウスモデルにかった．このことから，CeA に発 現する Npbwr1 が 機

対して 16-20 週間，通常食もしくは高脂肪食を投与した．

能低下型の SNP によってその生理的機能を失うことで，更に URAT1 選択的阻害薬であるドチヌラドを 50mg/kg/

Npbwr1 ニューロンの活動を脱抑制させることにより社会day を 4 週間投与した．4 週間投与後の心機能評価を性の増加およびソーシャルディスタンスの減少を引き起こ

経胸壁心臓超音波検査，線維化の評価を行った．

すことが示唆される．今後は，新奇個体の接触により活In vitro：仔ラットの心筋培養細胞を用いて，尿酸，動が増加する CeA の Npbwr1 ニューロンの経時的変化

パルミチン酸を用いて 24 時間刺激した際の心筋細胞のを観察することで，新奇と既知の個体を識別する神経メカ

URAT1 の発現量を mRNA で検討した．

ニズムの解明を試みる．

84

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成【結果】にドチヌラド（HFD+Doti 群 ）を投 与した群では HFD

マウスの心臓組織において免疫染色，ウエスタンブロ

群と比 較して 心 機 能 は 改 善してい た（ 図 1）． また，ット法により URAT1 の 発 現 が 確 認された． 通 常 食マ

Massontrichrome 染色では HFD 群で認めた線維化のウス群（NFD 群 ）と比 較して高 脂 肪 食 群 では（HFD

領域が HFD+Doti 群で有意に減少していた（図 2）．更に，

群 ）， 経 胸 壁 心エコーで心 機 能は低 下していた．HFD

心臓組織の炎症性サイトカインは HFD 群で NFD 群と比較して増加していたが，HFD+Doti 群で HFD 群と比較し

図 1：4 群間での心機能評価て低下していた．
更に，In vitro の検討では，100 μ M，200 μ M の濃度のパルミチン酸で刺激した際に心筋細胞の URAT1の mRNA 発現が濃度依存的に増加した事を確認した（図3）．一方で高血糖，尿酸，インスリン刺激では URAT1の発現の増加は確認されなかった．
【考察】
URAT1 選択的阻害薬を用いて，HFD 群での線維化や心機能を改善した可能性が考えられた．また，パルミチン酸投与により心筋細胞で URAT1 の発現が増加している事からは，パルミチン酸により URAT1 の発現や機能が制御されている可能性が示唆された．

図 2：4 群間での心臓組織像【文献】
Y. Tanaka, T. Nagoshi, H. Takahashi, Y. Oi,
A. Yoshii, H. Kimura, K. Ito, Y. Kashiwagi,
T.D. Tanaka, M. Yoshimura, URAT1-selective
inhibition ameliorates insulin resistance byattenuating diet-induced hepatic steatosis andbrown adipose tissue whitening in mice, Mol
Metab 55（2022）101411.

図 3 パルミチン酸（PA）刺激の際の心筋細胞
URAT1 の発現レベル（mRNA）

ブタLESにおいて神経型ニコチン受容体刺激が引き起こす弛緩反応の機序
田

中

義

将

（九州大学病院 肝臓・膵臓・胆道内科）【目的】
嚥下時の LES 弛緩反応は迷走神経に由来する壁内神
経叢のニコチン性アセチルコリン受容体（nAChR）及びカハールの介在細胞（ICC）により調節されていると推測され，我々は当初上記研究課題に対して，ブタ LES において，nAChR 刺激による弛緩反応には，主に ICC/ 過分極因子が関与する機序を詳細に薬理学的に明らかに85成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

し Otsuka Y and Tanaka Y et al. Eur J Pharmacol
2021 にて報告した．その後さらに消化管機能に関する研

ノンターゲットマルチオミクスによる生活習慣病

究として排便を制御する中枢神経の局在と役割について未の理解だ不明な部分が多く，光遺伝学的手法等を用いて解明す津ることとした．

川裕

司（東京農工大学グローバルイノベーション研究院）【方法】
排便中枢の同定のために複数のシナプスに逆行性感染【目的】

する仮性狂犬病ウイルス（pseudorabies virus; PRV）

生活習慣病は代謝システムの破綻による「代謝性疾患」

を肛門及び遠位結腸に注射し，脳内に標識される PRVと考えられる．ヒトの三大栄養素とは糖質，脂質，タンパを評価した．次に，これにより得られた排便中枢候補部

ク質であり，その分解・産生の分子機構を網羅的に理解位の機能を評価するために VGluT2-cre マウス，CRH-

することは代謝性疾患の背後に潜む動作原理を理解する

cre マウス，TH-cre マウスを用意し，これらマウスに対し上で必須である．本研究では，代謝物の多様性（メタボて光遺伝学的手法等を用いて排便に関する各種評価を行ローム）を捉えるノンターゲット解析を基軸としたデータ

った．

駆動型研究により，加齢に伴う代謝変容とその生物学的【結果】重要性を明らかにする研究を行う．

PRV を用いたトレーシング実験においては橋に存在す【方法】

るバリントン核（Bar） や青 斑 核（LC）において PRV

2 ヶ月齢，12 ヶ月齢，19 ヶ月齢，そして 24 ヶ月齢

標 識 ニューロンが 確 認された．Bar や LC に存 在するのマウスに関して，腸内細菌の有無および雌雄差を区別

VGluT2 陽性ニューロンに対する光遺伝学的手法による

し，液体クロマトグラフィータンデム型質量分析（LC-MS/

光刺激と連動して遠位結腸内圧上昇を引き起こし，BarMS）を用いたノンターゲットリピドミクスデータの解析をに存在する CRH 陽性ニューロンに対する光刺激は時間実施した．肝臓，腎臓などを含む合計 13 臓器を計測に差があるが遠位結腸内圧上昇を引き起こした．いずれもビ供した．特にメタボローム変容が大きかった腎臓に関して

ーズ排出時間や排便量の増加を認めた．一方で，LC には，RNA-seq を実施し，統合解析を試みた．

存在する TH 陽性ニューロンに対する光刺激は control【結果】

群と比較し有意な遠位結腸内圧変化やビーズ排出時間の大 規 模メタボローム解 析の結 果より， 多くの臓 器で短縮を引き起こさなかった．

ドコサ ヘ キサエン 酸 を 含 む bis（monoacylglycerol）【考察】

phosphate（BMP）が 加 齢に伴い増 加していることがBar に存在する VGluT2 陽性ニューロン，CRH 陽性わかった．また多変量解析手法により，腎臓メタボロー

ニューロンが排便に関与し，排便に対して異なるメカニズ

ムが加齢に伴い最も変動する臓器として同定された．そムで寄与する可能性を初めて明らかにした．これらの更なこで，腎臓メタボロームを詳細に解析したところ，スフィる役割の追求が，便秘症の亜型である便排出障害の病態

ンゴ脂質代謝に顕著な雌雄差があることがわかった．特の理解および病型に合わせた治療法の創出につながるこに雄マウスでは，糖を 2 つ以上含むグロボシドが加齢にとが期待される．

伴い増加していることがわかり，雌マウスではほとんど検【文献】

出されていなかった．RNA-seq データからスフィンゴ脂

1）Otsuka Y, Bai X, Tanaka Y et al.: Involvement

質代謝に関連する遺伝子発現データを探索したところ，

of interstitial cells of Cajal in nicotinic

セラミドにガラクトースを付与する代謝反応を担う UDP

acetylcholine receptor-induced relaxation of

glycosyltransferase 8a（UGT8a： ヒト で は UGT8）

the porcine lower esophageal sphincter, Eur Jが雄に高発現していることがわかった．

Pharmacol. 5:910:174491 (2021).

【考察】
UGT8 の遺伝子発現結果から，雄特異的な加齢変容

86成人病の病因・病態の解明に関する研究助成を示すグロボシドはガラクトースを持つものである可能性

所注入した上で慢性社会挫折ストレスに供し，ミクログリが高い．現在，グロボシドの糖異性体を識別する手法

アを FACS にて分取した後に RNAseq 解析を実施した．

を開発することで詳細な構造解析を実施している．また，

また，前頭前皮質の神経細胞活動を二光子顕微鏡観察

UGT8 の阻害剤を使用した介入実験を現在行なっており，で調べた．

老化に伴う慢性炎症などの表現型と糖脂質発現変容の関【結果と考察】係について今後解析を進める．
【文献】

前頭前皮質の中央代謝系正常化によって，慢性社会ストレスによるミクログリア活性化や神経細胞の活動減弱

Hi ro sh i T su gawa, To mo aki Is hi hara, Kot aが抑制できることが分かった．これまで，ストレス病態にO g a s a , S e i g o I w a n a m i , Ay a H o r i , M i k i k o

おける脳代謝変容や脳内炎症は独立に論じられてきたが，

Takahashi, Yutaka Yamada, Aki Minoda, Makoto

これらの知見は代謝変容が脳内炎症の引き金になること

Arita. A lipidome landscape of aging in mice.

を示唆する．今後は，代謝変容が脳内炎症を導く機序に

Research Square （preprint） 2022. https://doi.

ついて検討する予定である．また，並行して実施した解析

org/10.21203/rs.3.rs-2139359/v1

で，慢性ストレス後に前頭前皮質や側坐核において脂質代謝物の変動が生じ，特に側坐核の 12-LOX 代謝物蓄社会ストレスによる脳組織の超微細な細胞生物学
的変化とその機序・役割の解明
永

井

裕

崇

（神戸大学大学院医学研究科薬理学分野）

積がストレスレジリエンスと関連することを見出した．
【文献】
1）Akiyama S, Nagai H , Oike S, Horikawa I,
Shinohara M, Lu Y, Futamura T, Shinohara
R, Kitaoka S, Furuyashiki T. Chronic social
defeat stress increases the amounts of【目的】

12-lipoxygenase lipid metabolites in the

社会や環境より受けるストレスは抑うつや不安亢進など

nucleus accumbens of stress-resilient mice.

情動変容を誘発し，うつ病など精神疾患のリスクとなる．

Sci Rep, 2022, 12, 11385. DOI: https://doi.

うつ病患者やマウスのストレスモデルにおいて前頭前皮質

org/10.1038/s41598-022-15461-7

神経細胞の機能形態変化が情動変容に重要であること

2）Kawashima Y, Nagai H , Konno R, Ishikawa M,が示唆されているが，その分子機序は未だに不明である．

Nakajima D, Sato H, Nakamura R, Furuyashiki

これまで，慢性ストレスがミトコンドリア過剰分裂を伴う樹T, O h a r a S . S i n g l e - s h o t 1 0 K p r o t e o m e

状突起退縮を生じること，また，シナプスミトコンドリアを

approach: Over 10,000 protein identifications

含むシナプス特異的にシナプス構造退縮を生じることを明by data-independent acquisition based

らかにしてきた．その分子基盤を調べるべくプロテオミクス

single-shot proteomics with ion mobility

解析やメタボロミクス解析を実施し，シナプス特異的に糖

spectrometer. J Proteome Res , 2022, 21,

輸送体や解糖系を担う酵素の発現亢進が生じること，さ6, 1418-1427 https://doi.org/10.1021/acs.

らに解糖系中間代謝物質の蓄積が生じ，その程度がうつjproteome.2c00023

様行動と相関することを見出してきた．本研究においては，ストレスによる中央代謝系変容の実態と意義を明らかにすることを目的とする．

心臓圧負荷時におけるp22 phox の分子メカニズム

【方法】

の解明

発現亢進の認められた中央代謝系を担うタンパク質について，その遺伝子発現を抑制する人工マイクロ RNA を

中

田

康

紀
（奈良県立医科大学 循環器内科）

発現するアデノ随伴ウイルスを両側の内側前頭前皮質に局87

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成【目的】

量分析で p22 phox と結合するタンパクを調べたところ，心NADPH オキシダーゼ（NOX）は，体内の活性酸素種

筋筋小胞体 Ca2 ＋ -ATPase（SERCA2a）が最も多い（ROS）の主要な供給源である 1）．NOX ファミリーの 7結果であった．そこで，p22 phox -cKO マウスの SERCA2a

つのメンバーのうち，NOX2 および NOX4 は心筋細胞での発現量を調べたところ，興味深いことにコントロールマ

も豊富に発現しており 2），NOX1-4 は膜貫通タンパク質

ウスと比較して SERCA2a の mRNA の発現量に差を認めである分子量 22kDa の p22なかったが，SERCA2a のタンパク発現量は有意に減少

phoxと 1：1 の複合体を形成している 3）．p22 phox の主な生理学的役割は，NOX と形していた（図 2）．

成するヘテロダイマーの安定化であり，さまざまな臓器での ROS 産生に関与しているとされる．しかしながら，心筋細胞における p22

phoxの正確な役割は未だ解明されておらず，本研究では心臓における内因性 p22

phox

図 2 P22phox-cKO マウスでの SERCA2a 発現（ウエスタンプロット）の役割を明らかにすることを目的とした．
【方法と結果】
はじめに，ヒトの心臓サンプルで p22 phox の発現を確認したところ，心不全患者では健常者に比較して，p22 phoxの 発 現 が 有 意に増えており（ 図 1），マウスの 心 臓 圧
負荷モデルである胸部大動脈狭窄（TAC）後も同様に

p22 phox の発現が有意に増えていた．
そこ で， 心 臓 特 異 的 p22 phox ノックア ウトマ ウス（p22 phox -cKO） を 作 成 し，TAC を 施 行 し たところ，

p22 phox -cKO マウスではコントロールマウスに比較して，有意に心収縮能の低下を認め，肺重量も増加していた．

そ こ で，p22 phox -cKO マ ウ ス の 心 機 能 低 下 に

このことから，心不全において，p22 phox は代償的に増加

SERCA2a が 関 与しているかを確 認するために AAV9-

し，心保護的に働いていることが予想された．次に，質SERCA2a を用いて，p22 phox -cKO マウスに SERCA2aの 補 充を行った．その 結 果，TAC4 週 間 後 において，

図 1 ヒト心不全患者（HFrEF）の心臓サンプルでのウエスタンプロット

p22 phox -cKO マウス＋ AAV9-SERCA2a では心収縮力が保たれる傾向があり，肺重量の増加も抑えられる結果であった（図 3）．
【考察・結論】

p22 phox は ROS の産生に関わるだけでなく，心筋細胞において SERCA2a の安定化に関与し，心不全時に心保護的な役割を担っていることが示唆された．
【文献】
1）Maejima Y, Kuroda J, Matsushima S, Ago T
and Sadoshima J. Regulation of myocardial
growth and death by NADPH oxidase. J Mol

Cell Cardiol . 50, 408-16.（2011）2）Schulz E and Munzel T. NOX5, a new "radical"
player in human atherosclerosis? J Am Coll

Cardiol . 52, 1810-1812.（2008）88成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

3）Bedard K and Krause KH. The NOX family of

要なことに，bantam の過剰発現細胞は細胞競合の勝者

ROS-generating NADPH oxidases: physiologyとなるが，TOR シグナルを活性化しただけの細胞は細胞

and pathophysiology. Physiol Rev . 87, 245-

競合を引き起こさなかった．そこで本研究では，bantam

313.（2007）の下流で周囲の正常細胞に細胞死を引き起こすのに必要

図 3 AAV9-SERCA2a 投与後の左室収縮能（LVEF）と肺重量なシグナル（図１の ” ？ ”）を明かにすることを目的とした．

図 1 Yki 活性化による細胞競合メカニズム【方法】

bantam 過剰発現をモデルとし，細胞競合を制御する
因子を見つけるための遺伝学的スクリーニングを行った．
具体的には，ショウジョウバエ複眼原基に bantam 過剰発現細胞集団と正常細胞集団をモザイク状に誘導し，正常細胞側にのみ CRISPR-Cas9 ノックアウト変異を一つ一つ誘導していった際に，複眼の腫瘍形成が抑制される系統を探索した．得られた変異系統に関してさらなる遺伝学
細胞競合を介した腫瘍形成機構の遺伝学的解析
永

田

理

奈

（京都大学大学院 生命科学研究科）

的解析を進めた．
【結果】
スクリーニングの結果，bantam 過剰発現による腫瘍形成を抑制する変異３系統を同定することに成功した．このうち，最も強い表現型を示した YL-1 遺伝子の変異を【目的】誘導した際の遺伝学的解析を進めた．その結果，YL-1

細胞競合とは，組織中の適応度の高い細胞（勝者）変異の誘導により，bantam 過剰発現細胞の周囲の正常が適応度の低い細胞（敗者）に細胞死を誘導して排除す細胞で引き起こされる細胞死やオートファジーが抑制される現象であり，がんの制御に重要であることがわかっていた．一方，bantam 過剰発現細胞内の TOR シグナルのる．例えば，転写共役因子 Yki/YAP が活性化した細胞活性化やタンパク質合成能の上昇は抑制されなかった．

は，自身が増殖するだけでなく周りの正常細胞に細胞死【考察】を誘導し，細胞競合の勝者となることが知られている．我々

bantam 過剰発現細胞内の YL-1 の機能が周囲の正常はこれまでに，Yki 活性化細胞では Yki のターゲットであ細胞のオートファジー依存的な細胞死誘導に必要であるこる miRNA bantam を介して TOR シグナルが活性化し，とがわかった．一方，bantam 過剰発現細胞内の TOR

これが周りの正常細胞のオートファジー依存的な細胞死

シグナル活性やタンパク質合成能には影響を与えなかっを誘導することで腫瘍を拡大することを見いだした 1）．重たことから，YL-1 は TOR シグナルとは別のシグナルを制89

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成御することで細胞競合を引き起こすことがわかった．YL-1【結果】はヒストンアセチル化酵素複合体の構成因子であることか

ヒトデータを用いたゲノムワイド関連解析およびフェノム

ら，今後はこの変異によって発現変動する遺伝子群を解ワイド関連解析から精神系形質，代謝系形質に共通する

析することで，細胞競合に必要な勝者細胞内のシグナル

分 子として Sema6D を同 定した（ 図 1）．Sema6D 欠を明らかにできる可能性が高い．

損マウスを用いて行動試験を行ったところ，神経細胞の【文献】

Sema6D 欠 損（Sema6d cKO-Tau ） により不 安 様 行 動 の1）Nagata, R et al ., Yorkie drives supercompetition

増強を認めた（図 2）．次に高脂肪食負荷を行ったとこ

by non-autonomous induction of autophagy

ろ，Sema6d cKO-Tau マウスでは肥満抵抗性を認めた（図via bantam microRNA in Drosophila. Current3）．また， 肝 臓，内臓 脂 肪， 皮 下 脂 肪， 褐 色 脂 肪 へ

Biology 32,1064-1076（2022）.

の脂肪沈着が抑制された．高脂肪食はミエロイド系血球の造血を亢進させることが知られているが，Sema6dcKOTau

神経ガイダンス因子による神経-免疫-代謝連関メ
カニズムの解明中西由

マウスでは高脂肪食負荷下において著明な好中球増加を認めた（図 3）．さらに，Sema6D 欠損マウスにおいて Adrb3 を欠損させると肥満抵抗性の改善を認めた

光（図 4）．次に情動と自律神経応答を制御する Sema6D（大阪大学大学院医学系研究科 呼吸器・免疫内科学）

シグナルの主座同定を行った．Sema6D は脳に高発現していることから，まず Spatial transcriptomics を用【目的】

いて脳の構造的変化を遺伝子発現レベルで検討したが，神経 - 免疫 - 代謝連関形成を担う分子の同定および機Sema6D 欠損による構造変化は認めなかった．情動と自能解析

律神経応答をともに制御する部位として大脳辺縁系の扁【方法】

桃体が知られており，in situ hybridization を行ったと

ゲノムワイドアプローチを用いてヒトにおける精神系形

ころ，扁桃体の抑制性ニューロンが Sema6D を高発現

質，代謝系形質に共通する分子の探索を行った．次にしていた（図 5）．そこでマウス扁桃体を用いて snRNA-

同定した分 子であるセマフォリン 6D（Sema6D）の機

seq を行ったところ，Sema6D 欠損による興奮性ニューロ

能解析をマウスモデルで行った．Sema6D 欠損マウスをンのシナプス機能異常，抑制性ニューロンの GABA シグ

用いて行動試験を行い，Sema6D を介した中枢神経応

ナル異常が示唆された．実際，ゴルジ染色で Sema6D

答を評価した．さらに，同マウスを用いて高脂肪食負荷欠損マウスの興奮性ニューロンでは異常スパインの増加を肥満モデルを行い，脂肪組織，肝臓における代謝及び認め，質量分析イメージングで Sema6D 欠損マウス扁桃

骨髄における造血への Sema6D の関与を検討した．ま体の GABA 産生低下を認めた（図 6）．

た， 交 感 神 経 系 の 関 与を検 討 するため，Sema6D 欠【考察】

損マウスにおいてβ 3 アドレナリン受 容 体（Adrb3）を以上の結果から，扁桃体の抑制性ニューロンに発現す

欠 損させ， 高 脂 肪 食 負 荷 肥 満 モデルを行った． 次 にる Sema6D は GABA 産生およびスパイン形成制御を介

Spatial transcriptomicsと single nucleus RNA-

して情動と自律神経応答を共役させることが明らかとなっseq（snRNA-seq） の 統 合 解 析 を 行 い， 脳 内 におけた．Sema6D は神経細胞，免疫細胞を含む多様な細胞る Sema6D の 機 能 探 索 を 行 っ た． さら に，in situに発現している．また他のセマフォリン分子とは異なり，

hybridization による Sema6d 発 現 評 価および質 量 分

class A Plexin のリガンドとしても，受容体としても機能析イメージングによる神経伝達物質定量評価を行うとともすることが知られている．我々は先行研究で免疫細胞由に，ゴルジ染色による神経細胞樹状突起の形態評価を行来 Sema6D の逆行性シグナルが細胞内代謝制御を介しった．

て抑制性マクロファージ分化を促進することを明らかにした．今回の我々の知見から神経細胞由来 Sema6D の神90

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

経，免疫，代謝応答における新たな機能が明らかとなった．
これらの結果から，複数の細胞腫に由来する Sema6Dがそれぞれ異なる機序で炎症応答制御に関与することがわかった．一方で神経細胞における Sema6D の順行性

再生医療技術を用いた新規治療薬の開発に向けて西尾美和子（東京医科歯科大学 大学院医歯学総合研究科 血液・生体システム解析学分野 ）シグナルと逆行性シグナルのどちらが GABA 産生およびスパイン形成制御を担うのかは不明であり，今後検討す1. ヒト多能性幹細胞由来褐色脂肪細胞を用いた新規糖る予定である．

尿病治療薬の開発【結論】

近年，メタボリックシンドロームの新規治療標的として

扁 桃 体 の 抑 制 性 ニューロンに発 現する Sema6D は

褐色脂肪組織（Brown Adipose Tissue; BAT）が注目

GABA 産生を介して情動と自律神経応答を共役させる．

されている．私達はヒト多能性幹細胞（ES/iPS 細胞）か

図 1 Sem6D に関するフェノムワイド関連解析

図 3 神経細胞由来 Sema6D は全身代謝および造血を制御する

図 4 Sema6D は交感神経応答を抑制する

図 2 神経細胞由来 Sema6D は不安応答を抑制する

図 5 Sema6D は扁桃体中心核の抑制性ニューロンに高発現する

図 6 Sema6D はスパイン形成および GABA 産生を
制御する

91

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

ら高機能性褐色脂肪細胞（Brown adipocyte; BA）をいった栄養素の消化・吸収に不可欠であると共に，短鎖高純度に作製するための技術を開発した（Nishio. M et

脂肪酸や胆汁酸などの代謝物を介した全身の恒常性維持

al. Cell Metab .16（3）: 394-406. 2012.）．これまで機構において重要な役割を果たしている．腸内細菌の種「BA に特異的に発現するタンパク質」は知られていなか

類，局在，数量および多様性に影響を及ぼす主要因としったが，「ヒト多能性幹細胞由来 BA」を免疫源として「ヒて腸管運動機能が注目されてきたことは理にかなうことでト BA を特異的に認識するモノクローナル抗体」を作製すあるが 1），最近の研究にて，腸内細菌自体が宿主の腸管ることに挑戦し，2 株の「ヒト ES 細胞由来 BA を特異的

神経の発達や維持に必須の役割を果たし，逆に腸管運動に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ

機能を制御している可能性が示唆されたが詳細は不明で細胞」を得ることができた．現在，これらの抗体が認識ある．すなわち，腸内細菌叢変化が腸管運動機能異常をする抗原分子の同定を進めている．主には（国研）国立病態とする慢性便秘症，過敏性腸症候群さらには慢性特国際医療研究センター研究所にて行った仕事であり，本発性偽性腸閉塞症の原因となることを示すものである 2）．

学に異動後に継続して進めている．

本研究の目的は，腸内細菌を標的とする腸管運動機能異2. 慢性活動性 EB ウイルス感染症の新規治療薬の開発

常に起因する疾患群の新規治療薬の開発を目指して，腸に向けて内細菌が腸管運動機能に及ぼす影響とその機序を解明す

慢 性 活 動 性 Epstein-Barr virus 感 染 症（Chronic

ることである．

active EBV infection: CAEBV）は，EB ウイルスに感【方法】

染した T 細胞もしくは NK 細胞がクローナルに増殖，多通 常 の 腸 内 細 菌を有 するマウス（SPF）， 無 菌マウ

臓器に浸潤し，感染細胞の活性化が生じて，全身臓器ス（GF）， 単 一 菌 種 定 着ノトバイオートマウス（EC：の慢性炎症が生じる重篤な疾患である．現在の治療法はE.coli 或 は LB：Lactobacillus ） に，in vivo 消 化 管

造血幹細胞移植のみであり，有効な薬剤はない．炎症と運動機能，ex vivo 腸管平滑筋収縮機能，Nanostring

腫瘍の 2 つの性質を合わせ持つため，両者の制御を目的による腸管組織遺伝子発現，蛍光免疫染色による筋間神とした治療を行う必要がある．本研究グループは本学に経叢の蛋白質発現評価を行った．

CAEBV 専門外来を有し，CAEBV 研究，治療の中心的【結果】役割を担ってきた．2015 年厚労省研究班により作成さ

胃排出機能は各群間に有意な差を認めなかった．腸管れた診断基準で診断し，同意を取得した CAEBV 患者の運動機能は，GF 群でその他の群と比較して有意に低下し末梢血単核細胞からセンダイウイルスベクターを用いて初た（図 1）．腸神経のアセチルコリン産生酵素（ChAT）

期化 4 因子を遺伝子導入し，疾患 iPS 細胞を 8 株作製の発現は各群間に有意な差を認めなかったが，それと共した．これら細胞を用いて各種細胞に分化誘導することで局在する神経に Vasoactive intestinal peptide（VIP）

希少疾患である CAEBV の in vitro モデル，創薬スクリの発現は腸内細菌が存在する 3 群は GF 群のそれと比較

ーニングシステムを構築中である．本学に異動後に始めた

して有意に強い発現を認めた（図 2）．VIP 発現量は腸研究であり，新しいアプローチから基礎研究を進め，臨管運動機能と有意な正の相関を認め，腸内細菌が腸神経床に還元できるよう引き続き遂行する．

の発達を制御することが示唆され，腸管自然免疫の関与が考えられた．TLR 経路が活性化されない MYD88- / -腸内細菌が腸管運動機能に及ぼす影響とその機序
白暁

TRIF-/ - マウスを用いて，無菌条件，SPF 環境条件下における VIP 発現量と腸管運動機能を評価した．MYD88 / -TRIF-/ - マウスは無菌条件，SPF 条件のいずれも VIP鵬（九州大学病院肝臓膵臓胆道内科）

発現量と腸管運動機能の低下を示している．
【考察】【研究背景】
腸内細菌は，宿主における糖質，脂質およびビタミンと92

VIP 発現量は腸管運動機能と有意な正の相関を認め，
腸内細菌が腸神経の発達を制御することが示唆された．

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

さらに，TLR 経路が活性化されない MYD88-/- TRIF-/ -p. 140-7. 2011.

マウスには無菌条件，SPF 環境条件下の腸管運動及び2 ） B a r b o r a , W. , G u t m i c r o b i o t a - m o t i l i t y

VIP 発現量が低下し，腸管自然免疫の関与が示唆されてinterregulation: insights from in vivo, ex vivo

いる．

and in silico studies. Gut Microbes. 14（1）:【文献】

1997296. 2022.

1 ） Q u i g l e y, E . M . , M i c r o f l o r a m o d u l a t i o n o fmotility. J Neurogastroenterol Motil, 17（2）:93成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

経時的一細胞RNA-seqを用いた多発性骨髄腫が持つ薬剤反応性遺伝子の同定
土師正二郎（九州大学病院 内分泌代謝・糖尿病内科）率を比較したところ，高発現する患者において生存率が有意に高いことを確認した．さらに PELI2 を欠損あるいは過剰発現させた骨髄腫細胞株を樹立しこれらの PI への感受性を細胞毒性アッセイにより検討したところ，PELI2発現が PI 感受性を高めることを見出した（図 1） 1）．
同様の手法を用い，治療前後のみでなく寛解期の骨髄【はじめに】

サンプルも対象とした解析を行い，薬剤耐性遺伝子を検

多発性骨髄腫（Multiple Myeloma: MM）は高齢者索している．経時的に初発時から新規薬剤抵抗性となるに多くみられる難治性血液悪性腫瘍であり，今後の超高経過を追う事が出来，さらに治療が奏功し寛解となった

齢化社会において患者数の更なる増加が予想される．近時点での骨髄検体も取得できている症例を対象として経年 Proteasome inhibitors（PI）などの新規薬剤が登場

時的 scRNA-seq 解析を行った．寛解期の骨髄中にごくし治療成績は飛躍的に向上したが，ほとんどの症例で薬少数存在する MM 細胞は薬剤抵抗性が高く，これらが剤耐性を生じ再発するため，治癒をもたらすことは依然困治療奏功時にも残存することが再発の一因と考えられてい難である．新規薬剤耐性獲得の分子機構の解明とそれをる．寛解時に残存する耐性細胞集団において特異的に発踏まえた最も有効な薬剤選択指標の確立は喫緊の課題で現する耐性遺伝子の同定を目的とし，下記検討 1 を進め

あるが，薬剤耐性に関与する遺伝子の同定が進んでおらた．

ず，耐性獲得の分子基盤は不明な点が多い．

検討 1：経時的 scRNA-seq 解析による新規薬剤抵抗耐性遺伝子の同定が困難な要因として MM の腫瘍内不性遺伝子の同定

均一性が知られている．MM では初期に発生に関わる遺骨髄検体より，BD FACS MelodyTM セルソーターを伝子異常が起こり，さらに一部クローンにおいて増幅に有用い，CD38 ++CD45-CD19- の MM 細 胞を， 患 者 1 検

利な遺伝子異常が加わる “ 枝分かれ的 ” な腫瘍進展を示体あたり 960 細胞を目標としてプレートに 1 細胞ずつソーすため，ゲノム異常パターンの異なる大小複数のクローン

ティングを行った．CEL-Seq2 法によってライブラリーをが存在する．このため従来の細胞集団全体を対象とした

作 成し，1 細 胞当たり 50 万リードを想 定し，Illumina

解析では，MM 幹細胞などのマイナークローンに存在する

HiSeq 1500 sequencers でペアエンドシークエンスを行耐性遺伝子を同定することが困難であり，single cell レった． 解 析 結 果は，GRCh38 human reference を用

ベルでの解析が望まれている．一方，MM は治療経過中

いてマッピングを行った．

にもゲノム異常が蓄積し薬剤耐性を獲得するため，診断時得られたリードカウント情報を解析用ツール Seurat でサンプルの解析のみでは治療関連の獲得耐性に関連する

解 析し，UMAP plot とクラスター 毎の variable gene

遺伝子異常を同定できない．以上より，MM に出現する

list を作成した．臨床経過と照らし合わせ，治療奏功時

薬剤耐性遺伝子の網羅には，同一患者の経時的なサンプにその比率が増大するCluster2，3，4を同定した（図 2）．

ルを対象とした single cell RNA-sequencing（scRNA-

現在，P2 で細胞数比率が上昇する cluster2，3，4seq）解析によるクローンの追跡と解析が不可欠である．

に特異的に発現する遺伝子のうち p < 0.05 の遺伝子リス【結果】トを作成中であり，この中から薬剤抵抗性遺伝子の候補

ごく最近我々は，同一患者の治療前後のサンプルを対を同定する．さらに今後検討 2-3 を行う予定である．

象とした scRNA-seq 解析を行い，PI 投与により速やか

検討 2：同定した候補遺伝子を欠損・強発現する骨髄に消失する細胞集団（cluster）のみに強く発現する遺腫細胞株の樹立伝子 PELI2 を PI 感受性に関与する候補遺伝子として同

データベースより候補遺伝子を持たない骨髄腫細胞株を定した． 遺 伝 子の多 寡により MM を 2 群 化し， 各々の検索する．該当するものがない場合は CRISPR-Cas9 シ

PI 投与時の予後を検索することができる共用 database

ステムを用い，候補遺伝子を欠損した骨髄腫細胞株を樹（PRECOG）を用い，PELI2 発 現の多 寡による全 生 存

立する．

94

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

さらに欠損株に，候補遺伝子を含む発現ベクターをト共に添加し，細胞生存・増殖率に与える影響を解析し，ランスフェクションし高発現株を作製する．遺伝子欠損・新規治療薬としての有用性を検討する．

高発現株を対象とした細胞増殖アッセイや RNA-seq 解【考察】

析を行い，これらの遺伝子が増殖など細胞機能に与える

寛 解 期に残 存する MM 細 胞は微 小 残 存 病 変と言わ影響を解析する．

れ，再発・予後と関連することが予想されるがその希少検討 3：樹立した細胞株における新規薬剤反応性の評性から詳細な解析はこれまでのバルク解析では困難であ価と新規治療法の探索った．本研究では scRNA-seq 解析を用いることで，寛検討 2 で樹立した細胞株の，新規薬剤への感受性を細胞毒性アッセイにより検討する．

解期の骨髄細胞のうち 0.2% しか存在しない MM 細胞のトランスクリプトを解析することが可能であった．また同定

具体的には各濃度の新規薬剤添加 24，48 時間培養

した「寛解期に拡大する細胞集団」のうち cluster4 は後に細胞生存率を評価し IC 50 を算出する．また，検討 1

cytotrace 解析の結果，より未分化な細胞集団であるこにて同定された遺伝子に対し阻害作用の報告がある薬剤とが示唆されており再発の原因となりうる MM 幹細胞のが存在する場合，高発現細胞株にその薬剤を新規薬剤と同定につながる可能性がある．本研究により，微小残存図 1. 経時的 scRNA-seq 解析とデータベース解析，in vitro 解析の統合的手法による PI 感受性遺伝子の同定

95

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

病変が持つ耐性遺伝子が同定できれば，新規予後指標

果，寛解期に拡大する細胞集団を同定でき，現在これらや新規治療法の開発につながると考えられる．

の細胞集団が持つ耐性遺伝子の同定を進めている．

【要約】

【文献】

MM が持つ腫瘍内・腫瘍間多様性を克服し薬剤反応

1）Masuda T*, Haji S*, 他（*: contributed性遺伝子を同定しうる統合的手法を先行研究において樹equally, 13 名 中 2 番 ⽬ ）. Identification of

立したことから ，本研究では再発時のみならず寛解期のa drugresponse gene in multiple myeloma

サンプルも対象とし同様の解析を行うことで寛解期に残存

through longitudinal single-cell transcriptome

する耐性細胞が持つ耐性遺伝子の同定を試みた．その結sequencing. iScience. 2022 in press 査読有1）

図 2. 寛解期に割合が増大する cluster の同定

寛解期を含む骨髄サンプルを対象とした scRNA-seq 解析を行った．

（A）寛解期（P2）を含む骨髄サンプルを得られた症例を対象とした．P2 では MM 細胞の比率は 0.2% とごくわずかであった．

（B）全サンプルより得られたリードカウント情報を解析用ツール Seurat で解析し，UMAP plot を作成したところ 7 つの cluster に分けることができた．

（C）細胞の成熟度を推定できるアルゴリズムである Cytotrace を用いて解析を行った
ところ，cluster4 に未熟な細胞が多くみられることがわかった．

（D）（B）で作成した UMAP plot を採取ポイント毎に分割した．

（E）採取ポイント毎の各 cluster の細胞数比率を積み上げグラフとして表示した．
Cluster2，3，4 が寛解期である P2 で増加することが判明した．

96

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

また，高炭水化物食を摂食した D. melanogaster の栄養への応答と代謝恒常性を支える全身性および精巣では，H3K9 HMT と TGF-b/Activin シグナリング

エピジェネティック制御機構の解明を介して精巣特異的に発現する遺伝子などが発現上昇す服部佑佳子（京都大学 大学院 生命科学研究科）

ることを見出している．この遺伝子発現調節は，精巣での代謝産物量の調節に機能しており，交配したメス体内に保持される精子の数や次世代数の向上に役割を担うこと【背景・目的】
栄養環境は，個体の成長のみならず，成体や次世代にまで影響を与える．しかし，様々な栄養環境に動物がどのを明らかにした．
【考察】
今 後，D. melanogasterで の Activin 経 路 とように応答し適応しているかには，不明な点が多い．我々

H3K9HMT との関係などの詳細な分子機構を明らかにすはこれまでに，ショウジョウバエ近縁種群のマルチオミクス

るとともに，D. sechellia では，それらの機構にどのようによる比較解析を行ってきた．そして，自然界で様々な果な異常が生じているか，そして，そのような種間の違いを物を食べるキイロショウジョウバエ（D. melanogaster ）生み出す分子基盤の解明を目指す．

の幼虫では，全身性の TGF-b /Activin シグナル伝達経路（Activin 経路）を介した遺伝子発現の抑制が，高炭水化物食下での幼虫期の成長に寄与することを見出した．一方，自然界で低炭水化物の果物しか食べないセイ

一次繊毛における中枢性摂食受容体の機能解析
濱

シェルショウジョウバエ（D. sechellia ）では，そのよう

本

明

恵

（広島大学大学院統合生命科学研究科）

な制御が働かず，高炭水化物食に適応できないことを明らかにした（Watanabe et al., Cell Reports, 2019）．

【目的】

本研究課題では，ヒストン修飾酵素によるクロマチン構造

一次繊毛は，微小管から構成される非運動性の繊毛で，の制御が，高炭水化物食への適応に果たす意義とその分ほとんどの細胞が一本のみ持つ細胞小器官である．その子機構について解析を行う．加えて，オス成熟個体の生機能不全は腎嚢胞，肥満など様々な症状を呈する繊毛病

殖細胞における Activin 経路が，高炭水化物食下でのを引き起こし，一次繊毛は周辺環境を感知する細胞のア生殖機能に果たす役割の解明を目指す．

ンテナだと考えられている．一次繊毛膜には肥満に関与す【方法・結果】

るメラニン凝集ホルモン受容体 1 をはじめとした限られた

１）高炭水化物食下での個体成長を支えるクロマチン制

種類の G タンパク質共役型受容体（GPCR）が局在する御機構の解析

ことが報告されたが，繊毛局在型 GPCR の機能や生理

D. melanogaster の野 生 型および 変 異 体，そして，的役割については未解明な部分が多い．報酬系，運動

D. sechellia を用いたマルチオミクス解 析の結 果，D.

機能，認知機能に関与するドーパミン（DA）受容体 5 型

melanogaster では，H3K9 ヒストンメチル基転移酵素（DR5）も繊毛局在型 GPCR のひとつであるが，解析は（H3K9 HMT）と Activin 経 路 が H3K9me3 修 飾 制あまり進んでいない．そこで，今回は DR5 陽性繊毛に対御を介して遺伝子発現を抑制的に制御することにより，高する DA の作用とそのシグナル経路を解析した．

炭水化物食への適応を支えていることを見出した．一方，【方法】

D. sechellia では，そのような機構が働かず，栄養環境

DR5 を一過性または安定発現させたマウス腎集合管由の変化に対してヘテロクロマチンが不安定になり，高炭水来細胞（mIMCD3）に DA を添加し，DR5 陽性一次繊

化物食条件下で遺伝子が過剰に発現し，発生率が低下

毛の変化を細胞免疫染色法で観察した．また，薬理学的することが示唆された．

解析により細胞内シグナルを調べた．

２）高炭水化物食下での生殖機能を支える Activin 経【結果・考察】路の解析

DR5 陽性一次繊毛に DA を添加すると，一次繊毛の97

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

長さは保持したまま DR5 陽性繊毛を保有する細胞の割合【方法・結果】

が約 60% 低下し，DR5 が一次繊毛膜上から排出（exit）

SYNTAX 試験は，重症冠動脈病変を有する患者に対されることを初めて見出した．この現象は，DA 添加時間する冠動脈血行再建術として，経皮的冠動脈形成術と冠および DA 濃度に依存的であり，EC50 値は生理的濃度

動脈バイパス手術を比較したランダム化試験であり，10に近い 0.69µM であった．また，ヒト網膜色素上皮細胞

年間の生存率がフォローされている．

（hRPE1）においても同様の現象が認められた．通常，

この試験の，患者背景，10 年間の生存率のデータに一次繊毛は LiCl により伸長するが，DR5 が排出された

機械学習モデルを適応させることで，血行再建術前の心繊毛では LiCl に対する感受性が低下し，繊毛機能の変

身の健康（36-Item Short Form Health Survey（SF-化を示した．次に，DR5 は Gs，G12/13 共役型 GPCR36））が術後 10 年後の生存率と関連することを見出した．

で あ る こと か ら，PKC，PKA，ROCK，Epac，Akt，

そのため，心身の健康データをもとに予後解析をおこなっ

JNK 阻 害 剤を用いて DR5 排出現 象を制 御する細 胞内たところ，心身ともに健康である患者においては，経皮的シグナルを検討した結果，2 種類の Epac 阻害剤により冠動脈形成術よりも冠動脈バイパス手術による冠動脈血

DR5 排出現象が有意に抑制された．加えて，シクロヘキ

行再建術を行ったほうが予後が良かった 1）．

シミドによっても本現象が有意に抑制されたことから，DR5【考察】の排出現象はタンパク質翻訳を介していると考えられる．ま統 計 学 的アプローチをもとに患 者 個々の経 皮 的冠 動

た，KD 実験等から受容体インターナリゼーション関連因子

脈形成術と冠動脈バイパス手術の選択基準を提示する（クラスリン，ダイナミン 2，βアレスチン 2 等）の関与も

SYNTAX Score II 2020 が提示されていた．機械学習示唆された．本研究により，一次繊毛における DR5 の機を適応させることで，SYNTAX Score II 2020 において能が明らかになり，いまだ謎が多い一次繊毛および DR5は組み込まれていなかった予後予測因子「心身の健康」の生理的意義の解明に繋がることが期待される．

が明らかとなった．今後，機械学習を用いることでより精密なリスク予測モデルを確立することが望まれる．

虚血性心疾患に対する精密医療の推進原弘

典（東京大学医学部附属病院 循環器内科）【文献】
1）Ono M, Serruys PW, Hara H, et al. Effectof Patient-Reported Preprocedural Physicala n d M e n t a l H e a l t h o n 1 0 -Ye a r M o r t a l i t y
After Percutaneous or Surgical Coronary【背景・目的】
高齢化に伴い虚血性心疾患が増加，患者背景も多様

Revascularization. Circulation. 2022;146（17）:1268-1280

化しつつあり，患者個人に応じた最適な治療を提供することが求められている．しかし，患者背景の多様化により，ランダム化比較試験の結果が最適な治療として適応できない状況も増えている．患者ごとのリスクを予測する様々なモデルが提唱されているが，リスクの層別化にとどまり，高齢者急性腎障害におけるDNA修復因子を介したアニオントランスポーター制御機構の役割の解明
菱最適な治療の提供にまでは至らないことも多い．そのため，

川

彰

人

（慶應義塾大学医学部腎臓内分泌代謝内科）

ランダム化比較試験のデータを基に，患者ごとに最適な治療を提供できる治療選択決定モデルの創出が求められ【目的】ている．機械学習を用いることで，重症冠動脈病変を有慢 性 腎 臓 病（Chronic kidney disease, CKD）

する患者に対する最適な冠動脈血行再建術を，患者背景は 加 齢 を 背 景として 世 界 的 に 増 加しており，CKD とに応じて提供する治療選択決定モデルの作成を目指す．

非 ア ル コ ー ル 性 脂 肪 性 肝 疾 患（Nonalcoholic
fatty liver disease, NAFLD） を は じ め と す る 他

98成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

臓 器 の 代 謝 変 容との 関 連 が 報 告 されているが， 腎

腎臓の DNA 損傷に関連した全身の代謝変容の分子機

臓 における DNA 損 傷 が 直 接 の 誘 因となりうる 可 能序の解明を目指す．

性や臓器連関の詳細な分子機序は明らかになっていない．

【結果】

本研究では，近位尿細管における DNA 損傷修復が腎臓は分裂能の異なる多種多様な細胞種で構成されて全 身の代謝変容連関にどのように関わっているのか明

おり，それぞれの細胞種における DNA 損傷修復の腎臓らかにすることを目的とした．これまで，腎臓病における病病態に果たす役割を解明するため，申請者らは細胞種

DNA 修復因子の病態生理学的意義を報告してきた（Cell

特 異 的に non-mutsagenic な DNA 損 傷を惹 起するマ

rep 2019, iScience 2021）が，近位尿細管に直接的

ウスモデルを作成して検討を開始した．ポドサイト特異的に DNA 損傷を誘発するモデルマウスを新規に作成し，にホーミングエンドヌクレアーゼ I-PpoI を発現させたマウ
スでは，尿蛋白および急激な腎機能悪化とともに腎臓に

図 1：糖尿病性腎症における KAT5 を介し DNA
損傷応答とエピゲノム変化形成

CD11b 陽性マクロファージの浸潤を認め，腎不全により半年程度で死亡し，ポドサイトにおける DNA 損傷修復の重要性が示唆された（図 2）．そして，近位尿細管特異的に I-PpoI を発現させたマウス（I-PpoI マウス）を作成したところ，16 週齢の時点で体重が有意に減少しており，臓器重量を評価したところ，腎臓，肝臓，脂肪重量が減少していることが明らかとなった．特に長期飼育により，I-PpoI マウスでは野生型と比べて有意な脂肪肝の所見を示すことを見出した（図 3）．すなわち，近位尿細管における DNA 損傷が他臓器の代謝変容に影響を及ぼす可能

図 2：ポドサイト特異的 I-PpoI マウスは CD11b+
細胞浸潤を認め，腎不全で死亡性が想起された．現在，近位尿細管細胞と他臓器の変化を媒介する因子を同定する基礎的検討を進めている．

概日リズム障害発症メカニズムの理解に向けた睡眠リズム制御機構の解明
平

野

有

沙
（筑波大学医学医療系）【目的】
図 3：近位尿細管特異的 I-PpoI マウスは体重減少，脂肪肝を⽰す睡眠覚醒を制御する神経核は複数同定されているが，その中でも視床下部外側野（LH）に存在するオレキシン
産生ニューロンは覚醒の維持に重要な役割を果たす．一方，視床下部腹側視索前野（VLPO）は睡眠の導入に必要であると考えられている．本研究では，オレキシン産
生ニューロンと腹側視索前野との解剖学的，機能的な関係を明らかにし，睡眠覚醒制御に関わる神経メカニズムの解明を目指す．
【方法】
経シナプス性神経トレーサーである改変型狂犬病ウイル

99成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

スを用いることで特定の神経の上流神経をラベルすること【背景】が可能である．本研究では，オレキシン産生神経に神経

GPI アンカ ー 型 膜 タンパク質 で ある T- カドヘリン

接続する VLPO 神経をラベルし，in situ hybridization（T-cad）は，脂肪細胞特異的に分泌されるアディポネク

により各種神経マーカーの発現を解析した．さらに光遺チン（APN）と非常に高い特異性と親和性で結合する．

伝学を用いて LH に神経投射する VLPO の GABA 作動

APN は血中にμ g/mL オーダという，一般的なホルモン

性神経の睡眠覚醒制御における機能を調べた．

やサイトカインと比べて非常に高い濃度で存在する．また【結果】

APN は三量体，六量体，多量体構造をとり，特に多量オレキシン産生ニューロンに神経投射する VLPO ニュ

体 APN と 2 型糖尿病や冠動脈疾患の関連が臨床疫学ーロンの大多数は GABA 作動性神経であった．さらに的に示されているが，この多量体 APN と生理的濃度域

LH に投射している VLPO の GABA 作動性神経の上流で結合するのは T-cad のみである．しかし T-cad は GPIを調べたところ，多くの脳領域からの入力が認められ，そアンカー型膜タンパク質であり細胞内ドメインを持たないの多くが視索前野内であった．一方，LH からの入力もので，それ単体では細胞内シグナル伝達に関与することは観察されたことより，LH と VLPO の間に解剖学的なルー困難である．

プ構造があると考えられた．光遺伝学を用いて VLPO の

我々は最近，APN が T-cad と結合し，エクソソームのGABA 作動性神経の LH にある軸索を刺激したところ，合成分泌を促進することが臓器保護効果に重要であること

マウスにおいて覚醒時間が有意に上昇した．

を報告した．一方で，血中にも T-cad 分子が検出される【考察】という報告があったが，その分子形態や臨床的意義，生VLPO から LH への神経投射は覚醒を促進することが明らかになった．一方，同じ VLPO の GABA 作動性神経でも乳頭核（TMN）への神経投射は睡眠を促進する

理病態学的意義は不明であった．
【目的】
血中可溶型 T-cad の分子形態ならびに臨床的意義・こと，LH と TMN へ 神 経 投 射 する VLPO の GABA 作

生理病態学的意義を明らかにする．

動性神経は大部分が異なることから VLPO は不均一な神【方法１】

経集団で構成されており，投射先や入力元による機能的T-cad に対する新規モノクローナル抗体を取得し，ヒト

差異が生まれていると考えられた．これらの研究成果は論血中の T-cad 分子を精製し解析する．

文に発表した．

【結果１】

【文献】

ヒト血中には 130kDa 体，100kDa 体，30kDa 体のProkofeva K, Saito YC, Niwa Y, Mizuno S,

合計 3 種類の T-cad 分子が存在した．ゲルろ過解析で

Takahashi S, Hirano A*, Sakurai T*. （*co-それぞれの T-cad は予測分子量の所に溶出され，いわゆ

corresponding） Structure and Function of

るエクソソームに係留された膜型ではなく，アディポネクチ

Neuronal Circuits Linking Ventrolateral Preoptic

ンとも結合していない，可溶型として存在することを明ら

Nucleus and Lateral Hypothalamic Area. J

かにした．さらにこの新規抗体を用いて 3 種類の可溶型

Neurosci. 43, 4075-4092（2023）

T-cad 分子を測り分ける ELISA を確立した 1）．
【方法２】
T-cad ELISA を用いて，健常者や患者における血中

生理的アディポネクチン受容体・T-カドヘリンのT-cad 濃度を検討する．

血中可溶型フォーム(可溶性T-カドヘリン)の生理【結果２】

病態学的意義福田

2 型糖尿病患者の血中 T-cad 濃度は，メタボリックシ
士郎（大阪大学大学院医学系研究科 内分泌・代謝内科学 助教 ）ンドロームに関連する複数の臨床パラメータと相関した 1）．
また心筋梗塞患者では発症から経時的に血中 T-cad 濃度が大きく変動した 2）．

100

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

また，人間ドック施設を有する他院と共同研究を行い，T-Cadherin Concentrations and Its Association

連続症例で 1000 余名の人間ドック受診者の検査結果デw i t h C r e a t i n e K i n a s e - M B L e v e l s i n S T-

ータならびに残余血清を取得した．これらの血中 T-cad

Segment Elevation Myocardial Infarction, J.

濃度を測定し，現在健常者の T-cad 濃度ならびに基準

Atheroscler. Thromb., 29, 1823-1834, 2022

値について検討中である．
【方法３】
血中 T-cad が生体内で作用を持つかどうか，野生型マ
ウスもしくは T-cad 欠損マウス，疾患モデルマウスを用い

3）Okita, T., Kita, S., Fukuda, S., et al.: Soluble
T- c a d h e r i n p r o m o t e s p a n c r e a t i c b - c e l lproliferation by upregulating Notch signaling,
iScience, 25, 105404, 2022て検討する．
【結果３】
STZ 投 与による高 血 糖モデルマウスにおいて， 血中
T-cad 濃度が上昇することを見出した．T-cad 欠損マウ

直鎖状ユビキチン鎖が惹起する疾患の検索と制御
戦略

スに STZ を投与すると，野生型マウスと比べさらに著しい

藤

田

宏

明

血糖上昇をきたすが，外因性に可溶型 T-cad を投与して（京都大学 大学院医学研究科 細胞機能制御学）

おくとその血糖上昇は緩和された．また，高脂肪食負荷
T-cad 欠損マウスに可溶型 T-cad を投与すると，対照群

新奇のタンパク質翻訳後修飾である直鎖状ユビキチン鎖と比較して膵β細胞における BrdU 取り込み率が上昇し，（直鎖）を特異的に生成する唯一の酵素である LUBAC

可溶型 T-cad は膵β細胞の増殖促進作用を示すことが明

ユビキチンリガーゼ（E3）は，催炎症性転写因子である

らかとなった 3）．

NF-kB 活性化，細胞死の抑制に関与する．LUBAC は【考察】

直鎖生成の活性中心を有する HOIP，アクセサリー分子以上より T-cad は，APN と結合しエクソソーム合成に関与する膜型だけでなく，血中に可溶型として存在し，様々である HOIL-1L，SHARPIN の三者複合体から構成される（図 1）．

な病態で変動することを明らかとした．また基礎実験レベ

これまでに我々は LUBAC の 3 サブユニット全てを欠ルであるが，血中可溶型 T-cad は膵β細胞への増殖促損させた細 胞を樹 立し，NF-kB 活 性 化， 細 胞 死 の 制

進作用を有することも明らかとした．最近は心圧負荷モデ

御に必 須な LUBAC のドメインを探 索した．その結 果，ルに対する可溶型 T-cad の保護的作用も見出しつつあり（未発表），様々な臓器にまたがる有益な作用を示す可能性がある．
今後，可溶型 T-cad の産生細胞・臓器の同定および産生メカニズムの解明，臨床的意義（基準値の設定と疾患マーカーとして有用性）の解明，そして臓器保護効果メカ

図１ LUBAC リガーゼの模式図

ニズムの解明ならびに治療応用の可能性を検討していく．
【文献】
1）Fukuda, S., Kita, S., Miyashita, K., et al.:Identification and Clinical Associations of 3
Forms of Circulating T-cadherin in Human
Serum, J. Biol. Chem., 106（5）, 1333-1344,20212）Iioka, M., Fukuda, S., Maeda. N., et al.:Time-Series Change of Serum Soluble

図 2 LUBAC 三量体形成 部位の構造101

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

LUBAC の 3 量体形成に必要な HOIP の 2 つの UBA ド③劇症 1 型糖尿病患者を含む糖尿病患者における新規メインと HOIL-1L と SHARPIN に存 在する UBL ドメイ

血中グルカゴン測定系による空腹時グルカゴン値の意義

ンを欠損させると，LUBAC が不安定化・著減し，直鎖を明らかにする．

状ユビキチン鎖生成活性が顕著に減弱することで NF-kB【方法・結果】

活性化の減弱，細胞死が惹起されることを見出した．と① 劇 症 1 型 糖 尿 病 iPS 細 胞 3 クローンをインスリン陽りわけ，HOIL-1L の UBL と HOIP との結合がより重要

性 細 胞に分 化 誘 導させ，TNF- α，IL-1 β，IFN- γであるとの知見を得て，HOIL-1L の UBL 欠損マウスをを投与しアポトーシスを誘導した．ここに 25HC を投作成したところ，LUBAC 複合体が消失し，活性中心の与した群では投 与しない群に比し有 意に Caspase-3

HOIP を欠失したマウスと同時期に胎生致死になることを

活 性 の 低 下 および イン スリン 陽 性 細 胞 に 占 める

見出した．また LUBAC の 3 サブユニットの結合に必要なCleavedcaspase-3 陽性細胞率の低下を認め，アポト

領域の共結晶構造解析に成功し，詳細な LUBAC の結ーシスが抑制された．

合様式を明らかにした（図 2）．

② 抗 PD-1 抗 体 投 与 後に 1 型 糖 尿 病を発 症した 3 例，

現在，LUBAC 間の結合を阻害する低分子化合物の開発症しなかった 3 例，コントロール 7 例の膵組織を免発を行なっている．これまで LUBAC 間の結合をモニター

疫組織学的に比較検討した．抗 PD-1 抗体投与後にする FRET を構築し，小分子化合物のスクリーニングを

1 型糖尿病を発症した群においては，β細胞面積は有行ってきたが，現在は取得した LUBAC3 サブユニットの意に低値であるとともに，CD68 陽性マクロファージ数

結晶構造から AI 技術を用いて LUBAC 間の結合を阻害は有 意に高 値であった．さらに， 抗 PD-1 抗 体 投 与する化合物の in silico スクリーニングを進めている．In

後に 1 型糖尿病を発症した群においては膵島における

silico で同定した化合物に関しては，実際に結合を阻害

PD-L1 発現陽性細胞は有意に低値であり，このことがするか上 記で樹 立した FRET を用いて 2nd screening

抗 PD-1 抗体投与後の 1 型糖尿病発症に寄与することを行い，有望な化合物に関しては細胞に処理し LUBACが示唆された．

を不安定化するか解析を行う．

③大阪大学医学部附属病院糖尿病・内分泌・代謝内科

上記に加え，別の角度から LUBAC の機能を阻害するに血糖コントロール目的に入院した糖尿病患者で，入薬剤の探索を行なっている．LUBAC の NF-kB 活性化に

院 直 後に早 朝 空 腹 時においてサンドイッチ ELISA 法

重要な領域の探索より，その領域の機能を阻害する薬剤を用いて血中グルカゴン値を測定し，各種臨床指標とを小分子化合物スクリーニングにより同定した．得られたの関係を検討した．急性発症 1 型糖尿病患者（14±

化合物に関して NF-kB 活性化を抑制するかなど

10pg/ml）では 2 型糖尿病患者に比し空腹時グルカゴを含め詳細な検討を進めている．

ン値（29±15pg/ml）は有意に低値であった．劇症 1型糖尿病患者（11±2pg/ml）では急性発症 1 型糖尿劇症1型糖尿病発症メカニズムの解明
細

川

吉

弥

（大阪大学大学院医学系研究科内分泌・代謝内科学 大阪大学感染症総合教育研究拠点企画室）

病患者と同程度に空腹時グルカゴン値は低値であるいっぽう，緩徐進行 1 型糖尿病患者の空腹時グルカゴン
値（25±15pg/ml）は 2 型糖尿病患者に近い値であった．糖尿病患者における空腹時グルカゴン値は空腹時血糖値とは相関しない一方，2 型糖尿病患者におい【目的】ては空腹時 C ペプチド値と有意な正相関を示した．多①劇症 1 型糖尿病患者 iPS 細胞由来インスリン陽性細胞

変量解析においても空腹時 C- ペプチド値は空腹時グルにおける 25-hydroxycholesterol（25HC）の効果を明らかにする．
②免疫チェックポイント阻害薬投与後の 1 型糖尿病発症
機序を免疫組織学的に明らかにする．

102

カゴン値の有意な説明変数であった．
【文献】
・Kawata S, Hosokawa Y, et al.: Inflammatory
C e l l I nf i l t r a t i on i nt o I s l e t s w i t h out PD -L1

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

Expression is Associated with the Development

与後 10 時間で認められることを明らかにしている．以上

of Immune Checkpoint Inhibitor-Related Typeより，グルカゴンによるタンパク質に対する食欲の制御は，

1 Diabetes in Genetically Susceptible Patients.

グルカゴンの脳への直接作用，もしくは，他の臓器を介しDiabetes , 72, 511-9（2023）

た間接作用の可能性が考えられる．そこで，Gcgr を多く

・Hosokawa Y, et al.: Pathogenesis of Fulminant

発現する臓器を中心に，それらの Cre マウスと Gcgr-flox

type 1 diabetes: genes, viruses and the immune

マウスを掛け合わせて，各臓器特異的 Gcgr ノックアウト

mechanism, and usefulness of patient-derived

マウスを作製し，グルカゴンによるタンパク質に対する食iPS cells for future research. Mini Review. J

欲制御を担う標的臓器を明らかにする．本研究では，まDiabetes Investig , 10, 1158-64（2019）

ず UCP-1-Cre（褐色脂肪組織）マウスと Gcgr-flox マ・ H o s o k a w a Y, e t a l . : P o s i t i v e c o r r e l a t i o n

ウスを交配させ，褐色脂肪組織特異的 Gcgr 欠損（UCP-

between fasting plasma glucagon and serum

1 Gcgr-KO）マウスを作製し，食事嗜好性試験（普通食

C-peptide in Japanese patients with diabetes.

（NC）vs. 高タンパク質食（HPD））を行った．

Heliyon , 5, e01715（2019）【結果】

・Yoneda S, Hosokawa Y, et al.:T lymphocyte

0.9 ％生 理 食 塩 水（NaCl） および 1 mg/kg のグル

infiltration to islets in the pancreas of a

カゴンを Gcgr-flox マウスと UCP-1 Gcgr-KO マウスに

patient who developed type 1 diabetes

腹 腔内投 与し， 食 事 嗜 好 性 試 験を行った．その結 果，

after administration of immune checkpoint

NaCl の投与では，両方のマウスで食行動に変化は認め

inhibitors. Diabetes Care , 42, e116-8（2019）られなかったが，グルカゴンの投与により HPD の摂食量が減少した（図 1）．

グルカゴンをツールとしたタンパク質嗜好性制御
機構の解明
松

居

【考察】
グルカゴン投与によりタンパク質の摂食量が減少する
が，その効果を得るためには約 10 時間を要することから，

翔（京都大学大学院農学研究科食品生物科学専攻栄養化学分野）

脳への直接作用ではなく，他臓器を経由してタンパク質の食欲を制御していることが予想される．しかしながら，褐
色脂肪細胞の Gcgr を欠損させても，グルカゴンの効果を【目的】

打ち消すことはできなかった．そのため，グルカゴンによるタンパク質に対する食欲は，エネルギー摂取とは別個にタンパク質の食欲抑制効果は，Gcgr の発現が最も多くア調節されているが，その調節機序は全く未解明である．こミノ酸代謝の主臓器である肝臓や，アディポカインを分泌れまでに申請者は，野生型マウスにグルカゴンを投与する

する白色脂肪組織を介していることが考えられる．2023

ことで，タンパク質の摂食量が減少することを見出している．なお，グルカゴンの投与は，炭水化物や脂質の摂食量には影響しないことを確認している．そこで 2022 年度の研究では，グルカゴンがどの臓器に作用し，タンパク質の食欲を制御しているのかについて明らかにすることを目
的とした．
【方法】
グルカゴン受容体（Gcgr）は，食欲調節を担う脳においても広範囲に発現しているのに加えて，各種の代謝臓器にも発現している．また，グルカゴンのタンパク質に対する食欲抑制効果は，2021 年度の研究結果から，投図１ 褐色脂肪組織特異 Gcgr 欠損マウスに対するグルカゴンの投与はタンパク質の摂食量が減少する

103

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

年度は，Albumin-Cre （肝臓特異的），Adiponectin-

培養ポドサイトを用いた免疫染色により，BioID で同Cre （白色脂肪組織）マウスと Gcgr-flox マウスを交配定された GIT2 蛋白の 細 胞 内 局 在を評 価した．RNAi

させ，肝臓特異的 Gcgr 欠損マウス，白色脂肪特異的により GIT2 欠 損（KD） ポド サイトを 樹 立し，Rac1

Gcgr 欠損マウスを作製し，食事嗜好性試験を行う予定

活 性， 細 胞 面 積および 接 着 斑 構 成 蛋白のリン酸 化をである．

対 照 群 と 比 較 し た．CRISPR/Cas9 に よ り GIT2 欠損（KO）マウスを作 製し，ポドサイト傷 害 薬 剤である

慢性腎臓病の治療を目指したポドサイトにおけるRac1制御機構の解明
松田

Lipopolysaccharide（LPS）投与後の尿蛋白およびポド
サイトの足突起幅を対照群と比較した．
【結果】

潤（大阪大学大学院医学系研究科 腎臓内科学講座）

Rho GTPase の活性化因子として知られる ARHGEF7や， 同 不 活 化 因 子として 知られる ARHGAP31 の 他，
GDP/GTP 交換能を持たない GIT2 がポドサイトの Rac1

【背景・目的】関連蛋白として同定された．

我が国では透析や腎移植にかかる費用が医療経済を圧GIT2 は接着斑構成蛋白であるパキシリンと共局在して迫しているが，慢性腎臓病の進行に歯止めをかける有効いた．GIT2KD ポドサイトでは対照細胞と比較して Rac1な治療手段の確立には至っていない．それは，腎機能低活性の有意な上昇を認めた．KD 細胞の面積は対照細胞

下の主な原因である糸球体障害の機序が明らかになってと比較して有 意に増 加し，Rac1 阻 害 剤 NSC23766 投いないためである．

与により有意に減少した（対照群 5427±309µm 2,KD 群

ポドサイト（糸球体上皮細胞）は，アクチン線維に富む

8958±806µm2, KD+NSC 群 4337±363 µm2）．さら特徴的な足突起を有し，血管内皮細胞および糸球体基底に KD 細胞ではパキシリンのチロシン残基 118 で有意な膜とともに濾過バリアを形成することで，蛋白の尿への漏

リン酸 化を認めた．GIT2KO マウスでは，LPS 投 与 48出を防いでいる．このアクチン線維の調節に関わるのが，時間後に対照マウスと比較して有意な尿蛋白の増加（対20 種類から成る Rho GTPase と呼ばれる蛋白群である．

照

Rho GTPase は GTP 結合型（活性型）とGDP 結合型（不gCr）およびポドサイト足突起幅の延長（対照群 441.1±

活化型）の 2 形態をとる分子スイッチである 1,2）．遺伝子

9.7nm, KO 群 500.5±14.1 nm）を認めた．

改変マウスや蛋白尿を呈する患者の腎検体を用いた既存【考察】

群 77.6±11.2mg/gCr, KO 群 129.9±26.8 mg/

研究から，ポドサイトにおける代表的な Rho GTPase で

ポドサイトの GIT2 は接着斑に局在し，細胞形態と糸球ある Rac1 の活性異常が糸球体病変や蛋白尿に関与す

体濾過バリアの維持に重要な役割を担っていると考えられることが分かってきた．しかし，ポドサイトでどのような機た．GIT2 による Rac1 制御機構は，慢性腎臓病におけ序によって Rac1 活性が制御されているかは不明であっる新規の治療標的となる可能性がある．

た．そこで本研究では，ポドサイトにおける Rac1 の活性【文献】

化 / 不活化機構を解明すべく，近位依存性ビオチン標識1 ） A s a n o - M a t s u d a K , I b r a h i m S , T a k a n o T,法（BioID）を用いて Rac1 と相互作用する蛋白を網羅

Matsuda J. Role of Rho GTPase Interacting

的に同定した．

Proteins in Subcellular Compartments of【方法】

Podocytes. Int J Mol Sci . 22:3656,2021.

Rac1 配列を含む pSTV6 ベクターを培養ポドサイトにト2 ） M a t s u d a J , A s a n o - M a t s u d a K , K i t z l e r T,

ランスフェクションした．ドキシサイクリンとビオチンを培地

Takano T. Rho GTPase regulatory proteins inに加えることで，Rac1 と相互作用する蛋白をビオチンリガ

podocytes. Kidney Int . 99:336-345,2021

ーゼにより選択的にビオチン化した後，ビオチン化蛋白を
ストレプトアビジンで回収し質量分析に供した．

104

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

血糖変動と認知機能の関連の解明のための前向き観察研究
松

HbA1c， 診 察 室 血 圧， 抑うつ・ 意 欲の変 化， 炎 症マーカーを登録時，1 年後，2 年後に，脳血管病変の変化（頭部 MRI/MRA で評価），頚動脈の内中膜厚（IMT）

原

正

樹

を登 録 時，2 年 後に，また観 察 期 間中の心 血 管イベン
（奈良県立医科大学）

ト，腎イベントの発症をそれぞれ評価し，得られた血糖変動指標もしくは認知機能試験スコアとの関連を解析する

糖尿病患者では，アルツハイマー型認知症，血管性ことにした．MCI は認知症の前駆段階として知られ年間認知症の発症リスクがそれぞれ 1.5 倍，2.5 倍に増大す

約 10％が認知症に移行する集団であり，2 年間の観察ることが知られている（Intern Med J . 42（5）, 484-

期間において認知機能の変化が生じやすいと考えられた

91 2012）．糖尿病患者における認知機能低下や認知ためにエントリー基準に組み込んだ．またサンプルサイズ症の病 態については， 高インスリン血 症， 慢 性 的な高は，横断研究の既報（Diabetes Care 2010 33:2169-

血糖， 低 血 糖， 脳細小血管障害，終末糖化産物の蓄2174，PLoS One . 2014 9（1）:e86284）と照らし合積など多くの要 因が示 唆されているが未 解 明な部 分がわせて，α -level=0.05, power=0.90 or 0.95 で計算多く，また認知症予防のための血糖管理指標も明らかとを行ったところ n=76 or 92 であり，本研究が経時デーな って い な い（Nat Rev Endocrino l. 2011 7（2）,タであり 20% の脱落を考慮しても n=95 or 110 となり十108-14）．近年，血糖持続測定（continuous glucose

分な登録数が得られたと考えられた．なお本縦断研究のmonitoring:CGM）機器の登場により糖尿病患者の血protocol については論 文 化している（Diabetes Ther .

糖プロファイルを評価する事が可能となり，横断研究で2020 11:2729-2737）．現在，得られた結果についてのはあるが血糖変動と認知機能の関連を示唆する報告がな

解析を行っており，併せて論文投稿を予定している．そのされるようになった（Diabetes Care . 2010 33（10）ため，現時点で得られた登録時での解析結果について以:2169–74，
PLoS One . 2014 9（1）:e86284）．そこで，下で述べる．

糖尿病患者の血糖変動と認知機能の関連を縦断的に解2 型糖尿病患者において，心筋梗塞，脳卒中などの析することで糖尿病患者が認知機能低下に至る病態を解動脈硬化性疾患（ASCVD）が増加するが，ACCORD

明し，また糖尿病患者における認知症予防のための新規（Lancet Neurol . 2011 10（11）:969–77）に代表さ血糖管理指標を探索することを目的として以下の研究を行れる大規模臨床研究では，HbA1c を管理目標とした厳った．

格な血糖コントロールを行っても心筋梗塞，脳卒中などは2019 年 2 月から 2020 年 6 月までに， 国 立 循 環 器

減少せず，ASCVD と重症低血糖や血糖変動との関連が病研究センター通院中の Mild Cognitive Impairment

注目されるようになってきた．血栓性脳梗塞のリスクであ（MCI） を 認 める 高 齢（65-85 歳 ）2 型 糖 尿 病 患 者る頭蓋内動脈狭窄についても，空腹時血糖値や HbA1c

109 名をエントリーし，CGM（リブレ Pro），認知機能との関連は報告により異なり一定した見解が得られてい試 験（Montreal Cognitive Assessment：MoCA），

ないが，CGM を用いて評価した血糖変動と冠動脈疾患

Alzheimer's Disease Assessment Scale：ADAS）（Circ. J . 2016, 80, 202–210），あるいは上腕 – 足首を登 録 時，1 年 後，2 年 後に行い， 得られた血 糖 変 動

脈波伝播速度との関連（Cardiovasc Diabetol . 2021

指標と認知機能試験スコアの変化との関連を主要評価

20（1）15）が報告されているが，我々の知る限り頭蓋項目とした．また副次評価項目として，空腹時血糖値，内動脈狭窄との関連は報告されていない．そこで血糖変動と頭蓋内動脈狭窄との関連を明らかにするために，本研究の登録患者全 109 例中 103 例を対象に，登録時の 血 糖 値，HbA1c，CGM から得られ た SD， ％ CV，mean amplitude of glycemic excursions（MAGE）と， 頭 部 MRA で Warfarin － Aspirin Symptomatic105成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

Intracranial Disease 法（WASID）法（AJNR Am J

Neuroradiol. 2017 38（5）:986-990）で評価した血管狭窄との関連をロジスティック回帰分析にて解析を行った．その結果，WASID 法で 70% 以上の高度狭窄がみLong non-coding RNAから翻訳される新規ポリペプチドの解析による疾患の病因解明松本有樹修（名古屋大学）られた 8 例は全て内頚動脈サイフォン部の狭窄であり，高度狭窄のない 95 例と比較し，SD 53±12 mg/dl vs.39±10 mg/dl，％ CV 36±7 % vs.29±6 %，MAGE 114【目的】±18 mg/dl vs. 90±23 mg/dl といずれも有意に高値でLong noncoding RNA（lncRNA）はタンパク質をあった（p<0.01）．またロジスティック回帰分析では，性翻訳しない RNA と定義されているが，われわれは一部の別で調整した高度狭窄群のオッズ比（OR）は SD（OR,lncRNA が翻訳されてポリペプチドを産生していることを

3.00; 95% confidence interval（CI）, 1.32-6.84），

明らかにした [Matsumoto A. et al., Nature（2017）％ CV（OR, 5.55; 95% CI, 1.23-25.2），MAGE（OR,]．そこでこれまでに，このような新 規ポリペプチドを複

1.52; 95% CI, 1.06-2.19）と有 意 であった． 以 上よ数 解 析して，それら機 能を明らかにしてきた [Nita A.

り，頭蓋内内頚動脈狭窄は血糖変動指標である SD，％

et al., PLoS Genet.（2021）, Mise S. et al., Nat.

CV，MAGE との関連を認め，頭蓋内血管狭窄病変の同Commun.（2022）]．また，これら機能を解析するに定にあたり血糖変動指標に注目することが有用である可

つれて，どのような RNA が翻訳され，どのような RNA

能性が示唆された．なお上記結果については論文化したが翻訳されないのかを理解するためには，タンパク質翻（Nutrients . 2021 13（7）:2379）．

訳機構を理解することが重要であると考えるようになってきた．近年，タンパク質翻訳を担うリボソームにおいて，い＊ WASID 法（C が狭窄部の場合，（（②－①）／②）×

くつかのリボソームタンパク質のパラログは組織特異的に100%，もし②にも狭窄がみられる場合は（（③－①）／③）

発現していることが知られてきている．しかし，組織特異×100%）

的なリボソームタンパク質が翻訳にどのように影響するのか，またなぜ特定の組織でのみ必要とされるのかは不明なままであった．そこでわれわれは，組織特異的リボソー
ムの解析を行うことにした．
【方法と結果】
われわれは，RPL3 のパラログである RPL3L が心臓と骨格筋に特異的に発現していることを見出した．すなわち，心臓や骨格筋では RPL3 が RPL3L に入れかわった横紋筋特異的なリボソームが存在しており，われわれはこれを
Myo-ribosome と名付けた．次に Myo-ribosome の機能を解明するために，RPL3L ノックアウトマウスを作製したところ，RPL3L を含むリボソーム（Myo-ribosome）
が 欠 損すると心 臓の収 縮力が 低 下することを見いだした．さらに分子機能を明らかにするために，Ribo-seq やDisome-seq 解 析 を 行 ったところ，Myo-ribosome はRPL3 を含む canonical ribosome に比べて翻訳伸長ダ
イナミクスが異なっており，これが心臓における適切な翻訳に重要であることがわかった．Myo-ribosome の欠損
は転写産物全体の翻訳伸長ダイナミクスを変化させたが，106

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

その影響は心筋収縮と拡張型心筋症に関連する転写産物

フェロトーシス（Ferroptosis）は 2012 年に新規細胞で最も顕著であった．さらに，それら心収縮に関わるタン死概念として報告された，非アポトーシスの制御性細胞死

パク質の存在量も Myo-ribosome の欠損により減少しての一種であり，細胞内における過酸化脂質の蓄積をトリガ

いた [Shiraishi C. et al., Nat. Commun.（2023）]．

ーとして発動する細胞死である．種々の急性臓器障害（虚【考察】

血再灌流含む），神経変性疾患，がん細胞における抗が以 上 の 結 果 より， 心 臓 や 骨 格 筋 特 異 的 に Myo-

ん薬感受性に寄与するため，フェロトーシスの制御機構のribosome という特殊なリボソームが存在しており，Myo-

解明はこれら病態の新規治療法への展開が期待されていribosome は心筋収縮と拡張型心筋症に関連するタンパ

る．生体は，過剰な脂質酸化によるフェロトーシスに対抗

ク質の効率的な翻訳に重要であることがわかった．Myo-

する制御機構としてGlutathione peroxidase-4（GPX4）

ribosome を欠損したマウスは心収縮力の低下を示したや CoQ10-Ferroptosis suppressor protein 1（FSP1）

が，ヒトの拡張型心筋症の患者で RPL3L の変異が報告

経路，内因性抗酸化ビタミンとしてのビタミン E を備えてされている．Myo-ribosome の理解は心疾患の治療へとおり，これらはフェロトーシスの主要な内因性防御機構とつながる可能性が期待される．

して働く 1）．

【文献】

我々は，フェロトーシス抑制能を有する新規内因性代Kito Y † , Matsumoto A.* †（corresponding

謝物を探索した結果，血液凝固作用がよく知られているビ

and equally first author）, Ichihara K, Shiraishi

タミン K が強力なフェロトーシス抑制能を有していることを

C, Tang R, Hatano A, Matsumoto M, Han P,同定した．そのフェロトーシス抑制機序として，i）通常のIwasaki S, Nakayama KI.*: The ASC-1 complex

存在様式である酸化型ビタミン K 自体に抗酸化能は認め

pr o m o te s tra n s lati o n i n i ti ati o n by s canni ng

ないものの，還元型ビタミン K が脂質ラジカルを捕捉する

ribosomes. EMBO J. Jun 15;42（12）:e112869

抗酸化物質として作用してフェロトーシスを抑制すること，（2023）.

ii）これまで CoQ10 還元酵素として知られていた FSP １

Shiraishi C † , Matsumoto A.* †（correspondingが，フェロトーシス抑制に必要なビタミン K の還元を担う

and equally first author）, Ichihara K,酵素であることを同定した．さらに FSP1 は，血液凝固作

Yamamoto T, Yokoyama T, Mizoo T, Hatano A,

用に必要なビタミン K サイクルにおいてこれまで正体が未Matsumoto M, Tanaka Y, Matsuura-Suzuki E,

同定であったワルファリン非依存性のビタミン K 還元酵素

Iwasaki S, Matsushima S, Tsutsui H, Nakayama

でもあることを明らかにした．この FSP1 によるビタミン K

KI . : R P L 3L -c o ntai n i n g ri bo s o mes d eter m i neの還元経路がわかったことは，臨床的に抗凝固薬としてtranslation elongation dynamics required for

頻用されるワルファリンの中毒時になぜビタミン K が解毒

cardiac function. Nat Commun. Apr 20;14（1）剤となるのかの分子機序を解明したものである 2,3）．

:2131（2023）.

また，ジヒドロオロト酸脱水素酵素（DHODH）阻害

Ichihara K, Nakayama KI, Matsumoto A.*:薬の一種が，がん細胞のフェロトーシス感受性を高めるこ

Identification of unannotated coding sequencesとで，がんに対する抗がん薬感受性を高めることが他グル

and their physiological functions. J Biochem.

ープから報告されていた（Mao et al, Nature 2021）．

Mar 31;173（4）:237-242（2023）

我々は，この機 序について検 討した結 果，ブレキナー
ルなどの DHODH 阻 害 薬は， 本 来 の 薬 剤 標 的である

フェロトーシス細胞死を標的とした病態解明と治DHODH ではなく，オフターゲット効果として，フェロトー

療薬開発

シス制御に関わる分子である FSP1 を高濃度では阻害す

三

島

英

換

（ヘルムホルツセンターミュンヘン、東北大学大学院医学系研究科）

ることで，がん細胞のフェロトーシス感受性を高めていることを明らかにした 4）．
最 後 に， 長 期 にわたり研 究 を支 援していただいた

107成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

TMFC および日本応用酵素協会の財団関係者の皆様に，深く感謝を申し上げます．

【結果】
NF：2188 個，APA：3993 個 の 計 6181 個 の 核 が【文献】解析できた．NF と APA を比較し，アルドステロン合成1）Mishima E, Conrad M. Nutritional and

酵素遺伝子（CYP11B2 ）をマーカーとする APA に特異

Metabolic Control of Ferroptosis. Annu Rev

的な複数のクラスターを同定した．擬似時系列解析によNutr. 2022;42:275-309

り，それらのクラスター間の関係は，ステロイド合成酵素

2）Mishima E et al. Diverse biological functionsの発現量に応じた腫瘍内細胞集団の分化度を反映していof vitamin K: from coagulation to ferroptosis.

ると推定された．核集団の分化度が高まると共に，アルNat Metab. 2023;5:924-932

ドステロン合 成に直 接 寄 与する CYP11B2 や HSD3B2

3）Mishima E et al. A non-canonical vitaminといった遺伝子のみならず，むしろコルチゾール合成を誘K cycle is a potent ferroptosis suppressor.

導 する CYP11B1 や CYP17A1 などのステロイド 合 成Nature. 2022;608:778-783

酵素遺伝子の発現量上昇も伴っていることが特徴であっ

4）Mishima E et al. DHODH inhibitors sensitize

た．また，分化度が低い集団では，WNT シグナル経路

to ferroptosis by FSP1 inhibition. Nature.

や AMPK シグナル伝達経路に含まれる遺伝子がマーカー

2023;619:E9-E18.

として含まれていた．さらに APA37 症例の bulk RNAseq のデータを使用し，snRNA-seq のデータに基づいた

腫瘍内不均一性に着目した原発性アルドステロン症の病態解析
村上

deconvolution 解析によって各症例のクラスター構成を推定したところ，KCNJ5 体細胞変異を有する APA 間でもクラスターの構成に不均一性があることが示された．

正憲（東京医科歯科大学病院 糖尿病・内分泌・代謝内科）【考察】
腫瘍検体を用いた snRNA-seq により，APA の腫瘍内，並びに腫瘍間不均一性の評価をすることが出来た．腫瘍【背景・目的】近年のオミクス解析の発展に伴い，アルドステロン産生

内の分化経路を規定する因子を同定することで，APA 発症メカニズムを解明できる可能性がある．

腺腫（APA）の分子生物学的特徴の理解が進んでいる．
ステロイド合成酵素の免疫染色の結果から，APA 組織内
におけるアルドステロン合成酵素の不均一な分布が観察されており，腫瘍内を構成する副腎皮質由来細胞の不均一性が予想されている．APA の腫瘍内不均一性の評価
は，発症メカニズムを理解する上で重要と考えられるが，過剰発現マウスからみた甲状腺ホルモン脱ヨード酵素の生理的意義
山

内

一

郎

（京都大学大学院医学研究科 糖尿病・内分泌・栄養内科学）

従来の bulk RNA-seq によるアプローチでは詳細な解析が困難であった．今回，Single Nucleus RNA-seq 解析（snRNA-seq）を行い，APA 特 異 的なクラスター 核 集【背景と目的】3 種の甲状腺ホルモン脱ヨード酵素（以下 D1，D2，団の抽出とその特徴を解析した．

D3）は，組織において局所の甲状腺ホルモン作用を調【方法】

節することが良く知られている．しかし，臨床的には臓器

非 機 能 性 副 腎 腫 瘍（NF），APA の 2 種 類の凍 結 腫における脱ヨード酵素の活性は，血中甲状腺ホルモン濃度

瘍検体より核抽出を実施し，FACS で精製を行った．BD（甲状腺機能）から推測せざるをえない．ノックアウトマ

Rhapsody で核とバーコード付きビーズを結合し，逆転

ウスを用いた検討では酵素学的特性から推測される結果

写の後に TAS-Seq によるライブラリー調整およびシーケンと乖離がある．本研究では甲状腺機能への脱ヨード酵素

シング解析を行い，Seurat で解析を実施した．

の影響を追究するため，肝臓特異的に D1，D2，D3 を108

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

過剰発現するマウスを開発し解析する．
【方法】
ヒト D1，D2，D3 配列をクローニングした pcDNA3.1
ベクターを HEK293T 細胞に導入し，発現タンパクの分子量，発現量，酵素活性を評価したところ，酵素活性が低い非完全長蛋白の発現が主であった．コーディング配列の下流にセレノシステイン挿入配列を付加することで，完全長蛋白の発現と十分な酵素活性が得られた．この付加ベクターから，マウス肝臓での遺伝子発現に適した
pLIVE ベクターにサブクローニングし，ハイドロダイナミッ
ク法を用いて雄 C57BL/6J マウスに導入した．
【結果】
D1，D2，D3 の各過剰発現マウスにおいて，肝臓特異的に脱ヨード酵素が発現し，甲状腺，下垂体でも有意な発現を認めないことを確認した．D1 過剰発現マウスでは血清甲状腺ホルモン濃度の変化を認めなかったが，D2過剰発現マウスでは血清 fT3 濃度の有意な上昇が見られた．D3 過剰発現マウスでは血清 fT3・fT4 濃度が低下する一方，血清 rT3・TSH 濃度は増加した．ただ肝臓内で過剰発現による消費に起因すると思われる T4 の減少が見られ，レボチロキシン給水投与により肝 T4 量を維持したマウスを追加解析した．血清では D1，D2，D3 過剰発現マウスとも同様の変化を認め，D2 過剰発現マウス
では D1 過剰発現マウスより肝 T3 標的遺伝子群の発現が増強する傾向にあった．
【考察】
過剰発現マウスのフェノタイプはヒト遺伝子多型による変化とも概ね矛盾せず，脱ヨード酵素の甲状腺機能に対する生理的意義は次のように特徴づけることができると考えた．D1 は rT3 のクリアランスと弱いながら T3 への変換を行う．D2 は細胞内のみならず体循環へも T3 を供給する．D3 は rT3 を産生しながら甲状腺機能を低下させ，作用過剰により消費性甲状腺機能低下症に至る（FASEB
J.2022; 36: e22141）．

109

研究報告

Vascular Biology Innovationに関する研究助成という事実を見出した 1）．大動脈をはじめ主要な動脈の血管リモデリング進展過程における血管周囲脂肪多くは周囲に脂肪組織を伴っており，血管周囲脂肪組織

褐色化の病態生理学的意義の解明（perivascular adipose tissue; PVAT）として 知られ

安

達

裕

助

（東京大学大学院医学系研究科 循環器内科）ている 2）．本研究では，AAD の大動脈 PVAT においても，
急性血管炎症に伴う性質的変化が生じているのではない
かと仮説のもと臨床研究を実施し，CT 検査から求められ【背景と研究目的】

る大動脈の脂肪減衰指数測定により AAD を高感度で検本邦における心筋梗塞，脳卒中，大動脈疾患を中心と出できることを見出した（論文投稿中）．さらに，人工知する動脈硬化性疾患の死亡率は，がん全体とほぼ同等の能を用いた大動脈自動認識プログラムの開発を行い，非高い水準を示している．この状況を打破するためには，動造影 CT から血管炎症を可視化するプログラムの構築に

脈硬化の原因となるメカニズムの深い理解が欠かせない．

成功した（特開 2023-038720）．

1976 年に Ross らによって提唱された「動脈硬化は血管【考察】

内皮の傷害を起点として発生する」との仮説（傷害反応

これらの研究成果は，動脈硬化の発症や進行に関連す仮説）は，現代の動脈硬化研究における基盤となっている細胞間の相互作用や分子メカニズムの詳細な解明に寄るが，疾患の完全な克服には至らず，問題解決の課題は与している．これらの知見を基に，新しい治療ターゲット

残っている．申請者らは，本研究助成のもと，上記の課の同定や先進的な医療技術の開発を進めていく予定であ

題を解決すべく取り組みを進め，本年度においても一定のる．

研究進展を確認している．

【文献】【方法と結果・進捗状況】

1）Adachi Y, Ueda K, Nomura S, Ito K, Katoh M,①血管内の細胞ネットワークの解明

Katagiri M, Yamada S, Hashimoto M, Zhai B,

単一細胞解析技術の進歩により，動脈硬化の詳しい

Numata G, Otani A, Hinata M, Hiraike Y, Waki

病態が徐々に明らかとなってきている．申請者らはこの

H, Takeda N, Morita H, Ushiku T, Yamauchi

技術を活用し，血管炎症応答を制御する脂肪細胞由来

T, Takimoto E and Komuro I. Beiging of

因 子（Neuregulin4） を 同 定 し た（Adachi Y. Nat

perivascular adipose tissue regulates its

Commun 2022）1）．ただし，この技術は細胞の空間的inflammation and vascular remodeling. Nat

関係性を維持できないため，別のアプローチとして空間的Commun . 13, 5117 (2022).

網羅的解析を取り入れ，血管組織の空間的挙動や免疫

2）Adachi Y, Ueda K, Takimoto E. Perivascular細胞との相互作用の解明を進めている．

adipose tissue in vascular pathologies-a novel②動脈硬化性疾患の臨床サンプルに基づく研究

therapeutic target for atherosclerotic disease?

動脈硬化性疾患の中でも，急性大動脈解離（acuteaortic dissection; AAD）は緊急性が高く，迅速な診断が 求められる．申請 者らは， 動 物 実 験と AAD 患 者
剖検検体による検討を組み合わせて，AAD 発症時には強い炎症が大動脈自体のみならずその周囲組織において生じ，炎症細胞は血管の外側から内側へと浸潤していく

110

Front Cardiovasc Med . 10:1151717 (2023).

Vascular Biology Innovationに関する研究助成

Betsholtz C., Fukuhara S., Koltowska K.
ペリサイトにおけるATP依存性カリウムチャネル

Proper migration of lymphatic endothelialの心・脳における機能解析

cells requires survival and guidance cues from

安

藤

康

史

（国立循環器病研究センター研究所・心臓再生制御部）【目的】
近年，脳と脊髄を覆う髄膜に走行するリンパ管が見出
され，脳内のクリアランスや免疫細胞の動員への関与が注目されている．この髄膜を走行するリンパ管は中間髄膜

arterial mural cells. eLife . 2022; doi: https://doi.org/10.7554/eLife.74094

ドキソルビシン心毒性におけるフェロトーシス
誘導の分子機序の解明
池動脈に並走するように形成され，両者の相互作用が予想田昌

隆（九州大学病院循環器内科）

された．本年度は K-ATP チャネルによって制御がなされる動脈壁の壁細胞が，血管とリンパ管を繋ぐ可能性を検証することで，中枢における新たな機能の提唱を目指した．
【結果・考察】【目的】
ドキソルビシン心毒性では，鉄依存性に生じる脂質過酸化により誘導される細胞死・フェロトーシスがミトコンド

血管壁細胞の発生を観察することにより，我々はマウス

リアを契機に生じており，また心毒性の主たる病態生理での髄膜リンパ管で見られるように，ゼブラフィッシュの体幹もある 1-2）．しかしながら，ドキソルビシン（doxorubicin,部のリンパ管が動脈周囲に形成された血管壁細胞に近接DOX）によりフェロトーシスが誘導される分子機序は明らして形成されていることを見出した．血管壁細胞を欠損さかではない．DOX は鉄と複合体を形成し，脂質過酸化

せると，その後の分節間リンパ管や胸管の形成が抑制さを引き起こす 3）．本研究は，「心筋細胞のミトコンドリアにれることが明らかとなった．更に，血管壁細胞の発現遺mtDNA 量依存性に DOX が集積，DOX がヘム合成経

伝子解析などから，血管壁細胞から分泌される cxcl12路を阻害することでミトコンドリア内に鉄が蓄積し，集積や vegfc,CCBE1 がリンパ管形成時のガイダンスや生存シ

した DOX と鉄が協調してフェロトーシスを誘導する」とのグナルとして機能することが示唆された．これらの結果か仮説を検証することを目的とした．

ら，血管壁細胞が適切な血管形成だけでなく，リンパ管【方法】

形成にも重要な役割を担っていることが示唆された．

心筋細胞において mtDNA helicase である Twinkle

以上のように，本研究において動脈血管によって血管を siRNA にて silencing することにより mtDNA を減少

壁細胞への運命決定がなされ，これらの血管壁細胞がそさせ，フェロトーシスを評価した．心筋細胞においてヘムの後に動脈周辺のリンパ管形成が誘導されることが見出さ

合成経路の律速酵素である ALAS1 をアデノウイルスによれ，生体内における時空間的に協調した血管・壁細胞・り過剰発現，もしくは ALAS1 が合成するアミノ酸である

リンパ管形成の多細胞間コミュニケーションが明らかにな

5-aminolevulinic acid（5-ALA） を添 加 することで，っ た．（Di,Ando et al., eLife . 2022）． 今 後，ATPDOX により生じる鉄の蓄積およびフェロトーシスを評価し依存性カリウムチャネルにより誘導される血管壁細胞機能

た．5-ALA 投与による DOX 心筋症モデルマウスの心毒

異常とリンパ管形成を解析することにより，本チャネル異性の抑制効果を検証した．

常により誘発される中枢神経障害に対するリンパ管の関与【結果】を明らかにすることで，より詳細な病態形成機構の解明に心筋細胞への DOX 添加により，DOX はミトコンドリ

迫る．

アに集 積した．Twinkle の silencing により心 筋 細 胞【文献】の mtDNA の量は約 30% 程 度 低 下し， 一 致してミトコ

1）Peng D., Ando K (Co-corresponding author),

ンドリアへの DOX の集 積は低 下， 脂 質 過 酸 化およびGloger M., Skoczylas R., Mochizuki N.,

フェロトーシスが 抑 制された． 一 方で， 心 筋 細 胞 への111

Vascular Biology Innovationに関する研究助成

DOX 添 加により，ALAS1 の発 現，中間 代 謝 物である
protoporphyrin IX およびヘム合成は低下し，ミトコンド

心不全おけるERADによるオルガネラ機能制御

リア鉄は増加した．ALAS1 過剰発現および 5-ALA 添加機構の解明と新規治療法の開発

により，DOX によるミトコンドリア鉄，脂質過酸化の増加

池田

宗一郎

およびフェロトーシスが抑制された．DOX 心筋症モデル（ラトガース大学）

マウスへの 5-ALA の投与は DOX による心収縮能の低下を抑制した．
【考察】【目的】
心不全患者は増加しており，心不全の病能基盤の解明

悪 性 腫 瘍 の 細 胞 増 殖 を 抑 制 することで 抗 腫 瘍 効および新規治療法の開発が必要である．近年，不全心果 を 示 す DOX が， 細 胞 増 殖 能 の な い 心 筋 細 胞筋においてミトコンドリアと ER 間のオルガネラ相互作用

優 位 に 心 毒 性 を 誘 導 する 分 子 機 序 は 長 らく不 明 でが細胞機能維持において重要であることが明らかとなってあ っ た． 本 研 究 で は，mtDNA 量 が 豊 富 な 心 筋

きた．また，ER ストレスにおいて小胞体関連分解（ER-

細 胞 に DOX が 集 積 し， ま た DOX により ヘ ム 合 成associated degradation:ERAD） が 注 目されている．

経 路 が 阻 害 さ れ ることで 鉄 が 蓄 積 す る， という 二

ERAD は ER ストレスや酸化ストレスなどにより活性化されつの現象が協調して心筋細胞優位に心毒性を示していた．

異常タンパク質を小胞体から細胞質へ逆輸送してユビキチ

本研究では，5-ALA が DOX による鉄の蓄積およびフェン化により分解することで ER ストレスを軽減する極めて重ロトーシス，そして心筋症の発症を抑制することも明らか要な機構である．また，homocysteine-responsive ERにしており，今後は 5-ALA を用いた DOX による心毒性

resident ubiquitin-like domain 1（HERPUD1） は予防法の開発が期待される 4）．

ERAD の構成因子としてその機能維持に必須であること【文献】が知られている．本研究は不全心筋における ERAD およ1）Tadokoro et al. Mitochondria-dependent

び HERPUD1 の役割を解明することを目的とした．

ferroptosis plays a pivotal role in doxorubicin【方法】

cardiotoxicity. JCI insight 2020;5:e132747

心筋細胞において RNA 干渉法を用いた HERPUD1 の2）Fang et al. Ferroptosis as a target for

ノックダウンを行い，過酸化水素投与下での小胞体ストレ

protection against cardiomyopathy. Proc.

ス関連遺伝子の発現の確認を行った．また，左前下行枝

Natl. Acad. Sci . 2019;116:2672-2680の結禁による心筋梗塞モデルマウスにおいて HERPUD1

3）Miura et al. Lipid peroxidation of ratの homozygous KO マウスに対して作成し心筋梗塞を作

erythrocyte membrane induced by

成し，梗塞後心筋における小胞体ストレス関連遺伝子のA d r i a m y c i n - F e 3+ P h a r m a c o l & T o x i c o l

発現の確認を行った．

1991;69:296-300【結果】4）Abe et al. Doxorubicin causes ferroptosis

昨年度は梗塞後心筋において HERPUD1 のタンパク量and cardiotoxicity by intercalating intoが有意に増加すること，また心筋細胞に対しての過酸化mitochondrial DNA and disrupting Alas1-

水素刺激で HERPUD1 のタンパク量が増加することを報

dependent heme synthesis. Sci Signal

告した．また，HERPUD1 の homozygous KO は野生2022;15:eabn8017

群と比較し心筋梗塞後の左室駆出率を低下させた．心筋細胞における RNA 干渉法を用いた HERPUD1 のノックダウンは，小胞体ストレスのマーカーである PERK の発現を増加し，過酸化水素投与下で心筋細胞死を増加した．
梗塞後心筋を用いた解析では，非梗塞部心筋において心筋細胞と同様に PERK の発現を増加させ，TUNEK 陽性

112

Vascular Biology Innovationに関する研究助成

細胞数を増加させた．
【考察】

図1

以上より，内因性の HERPDU1 は酸化ストレス環境下
で小胞体ストレスを軽減することにより心筋細胞死の抑制に関与している可能性が示唆された．
図2

プラコフィリン2変異による心筋収縮力低下の
機序の解明
井

上

裕

之

（スタンフォード大学 心臓血管研究所）【背景】

2）サルコメア収縮の生細胞イメージング

遺伝性拡張型心筋症患者では，デスモゾーム関連遺伝

我々は，PKP2 ヘテロ変異患者から樹立したアイソジェ

子の変異を高頻度に認めることが報告され，プラコフィリ

ニック iPS 細胞に対し，デスモゾームを構成する蛋白質のン 2 をコードする PKP2 の変異が最多である．このことか一つである DSG2 に対し遺伝子編集を用いた蛍光蛋白標

ら，PKP2 変異による心筋収縮力低下の機序を理解する

識を行い，報告した 1）．今回は，デスモゾーム・サルコメことが重要である．

アの同時生細胞イメージングによる PKP2 変異によるサル【目的】

コメア構造・機能の評価を目指し，サルコメアの構成蛋白

iPS 細胞由来心筋細胞を用いて，PKP2 変異による心質に対して蛍光蛋白標識を行った．CRISPR/Cas9 を用

筋収縮力低下機序の解明することいた遺伝子編集により，PKP2 アイソジェニック 3 株のサ【方法・結果】

ルコメア蛋白質に対して同様に EGFP で標識することに成

1）3 次元組織を用いた収縮不全モデルの作成

功し，心筋分化誘導が可能であることを確認した（図 3）．

我々は，PKP2 ヘテロ変異患者より樹立したアイソジェ

今後は，心筋細胞において，EGFP 標識蛋白質と WT 蛋

ニック iPS 細胞由来心筋細胞を用いて，心筋分化誘導早白質がアイソジェニック間で同等に発現していることを確認期において，PKP2 変異による収縮力障害をモーションベ

する予定である．三株において両者の発現比が同等であ

クトル解析により検出し得る，2 次元収縮モデルを報告しれば，EGFP の局在による株間での構造・機能の比較がた 1）．また，立体臓器に近い状態での心筋収縮力を直接可能であると考えられる．

評価し，2 次元収縮モデルでは測定が不可能であるスティ

また，我々はハイスループットイメージングとカルシウム

フネスの評価も行うため，3 次元組織リングを作成し報告

動態イメージングを組み合わせて，個別の心筋細胞ごとにした 2）（図 1）．文献 2 では，重症心不全を発症したベッカルシウム動態を解析する手法を報告した 3）（図 4）．本カー型筋ジストロフィー女性患者より樹立したアイソジェニ

手法を PKP2 変異株に応用することにより，デスモゾーム

ック iPS 細胞を用い，筋ジストロフィーの原因遺伝子であの構成異常と，カルシウム動態やサルコメア機能の関連

る DMD 変異に加えて，コラーゲン合成に関わる遺伝子が明らかになる可能性が期待される．

の一つである PLOD3 変異が加わることで収縮不全とスティフネスの低下が顕在化し，心不全発症に関与していることを示した（図 2）．今後は，文献 2 で用いた手法を本研究課題にも応用し，PKP2 変異による収縮力，スティフネスの評価を行う予定である．

113

Vascular Biology Innovationに関する研究助成

図3

reduced contractility and impaired
desmosome assembly due to plakophilin-2
deficiency using isogenic iPS cell-derived
cardiomyocytes; Stem Cell Reports, 17(2):337351(2022)
2）Kameda S, Higo S, Shiba M, Kondo T, Li J,
Liu L, Tabata T, Inoue H, Okuno S, Ogawa S,
Kuramoto Y, Yasutake H, Lee JK, Takashima

図4

S, Ikeda Y, Hikoso S, Miyagawa S, Sakata
Y. : M o d e l i n g R e d u c e d C o n t r a c t i l i t y a n d
Stiffness Using iPSC-Derived Cardiomyocytes
Generated from Female Becker Muscular
D y s t r o p h y C a r r i e r, JAC C : B a s i c t oTranslational Science, 8(6):599-613 (2023).
3）Tabata T, Masumura Y, Higo S, Kunimatsu
S, Kameda S, Inoue H, Okuno S, Ogawa S,
T a k a s h i m a S , Wa t a na b e M , M i y a g a wa S,
Hikoso S, Sakata Y; Multiplexed measurementof cell type-specific calcium kinetics using
high-content image analysis combined withtargeted gene disruption: Biochemical and3）細胞骨格蛋白質の評価方向性

Biophysical Research Communications,

一方向性ナノファイバー（ANF）を施した培養プレートに637:40-49(2022).

心筋細胞を播種することにより，心筋細胞の成熟を促進する方法が当研究室の共同研究者より報告された（Li etal. Stem Cell Reports 2017）．同方法を本アイソジェ

睡眠時間歇的低酸素モデルを用いたNon-dipper

ニック iPS 細胞由来心筋細胞にも応用し，免疫染色にお型血圧発症腎機序の解析

いて細胞骨格蛋白質の局在の評価を行っている．

上

【考察】

田

浩

平

（国際医療福祉大学医学部生理学）

収縮不全を再現するモデル，個別の細胞ごとに詳細なカルシウム動態を評価する実験系を確立した．今後はこれ【背景】

らのモデルと実験系を駆使，さらに発展させ，細胞骨格・ストレスホルモンである GR リガンドが低カリウム血症をサルコメア構造の 2 点に焦点をあてて，引き続き本研究を介して高血圧を発症する機序について報告したが 1），同推進する予定である．

時に血圧の概日リズム異常（Non-dipper）も呈すること【文献】

を本研究会で報告した．Non-dipper は睡眠時無呼吸症

1）Inoue H, Nakamura S, Higo S, Shiba M,

候群にしばしば合併し，強力な心血管病リスク因子である

Kohama Y, Kondo T, Kameda S, Tabata T,

ことが知られている．

Okuno S, Ikeda Y, Li J, Liu L, Yamazaki S,【目的】

Takeda M, Ito E, Takashima S, Miyagawa
S, Sawa Y, Hikoso S, Sakata Y.; Modeling114

睡眠時間歇的低酸素が Non-dipper 型血圧を発症す
る機序を明らかにする．

Vascular Biology Innovationに関する研究助成【方法】

外科的な人工血管置換術，もしくは腹部大動脈ステントグ

C57Bl/6 マウスを 明 暗 条 件 下， 明 期 中 に 8 時 間

ラフト内挿術（EndoVascular Aneurysm Repair）の（ZT1-ZT9），3 分毎に酸素濃度が緩徐に室内気（21%）

選択肢しかなく，5cm 以下の小さい状態で発見されてもから 5% まで低下するケージ内で 2 週間飼育した（睡眠有効な治療法が存在しない 1）．ヒトの検体のシングルセル

時間歇的低酸素（IH）モデル）．テレメトリを用いて連続解析から動脈硬化プラークが腹部大動脈瘤を形成させる

的に頚動脈血圧を計測し，明期・暗期に分けて日内変動

メカニズムを明らかにし，マクロファージをターゲットとすを解析した．最終日 ZT4 に通常酸素対照群（NX）と共る治療薬を開発する．

に IH モデルの腎臓を採取し，超遠心法を用いた膜分画【方法】

蛋白と mRNA 発現量を比較した．
【結果】

腹部大動脈瘤で人工血管置換術適応となった患者について，瘤中心部とその中枢側で断端に近い組織を採取し，NX 群マウスの血圧は明期よりも暗期に有意に高かった

コラゲナーゼ処理，FACS ソーティングで CD45 陽性細が，IH 群のマウスでは明期・暗期で有意な差は認められ胞を回収し，10X Chromium にてシングルセル化し，解なかった．腎試料膜分画においてリン酸化 Na+-Cl- 共輸析を行った．

送 体（NCC）と Na+-K+-Cl- 共 輸 送 体（NKCC2） の1，瘤中心部（5 例）2，瘤中枢側断端部（3 例）3，発現が有意に増加していた．Sgk1，Gilz，Per1/2，お健常大動脈（公開データ 3 例） 2）で比較検討した（図１

よび Cry1/2 の遺伝子発現レベルは，IH モデルにおいて参照）．

有意に増加し，Bmal1 および Clock の遺伝子発現レベ
ルは減少した．
【結論と考察】睡眠時間歇的低酸素により Non-dipper 発症の機序として腎 NCC・NKCC2 活性化の重要性が示唆された．
また，その活性化機序として GR 関連遺伝子や時計遺伝子の関連が示唆された．腎 NCC・NKCC2 の活性化機序を明らかにするために阻害剤やノックアウトマウスを用いた解析を予定している．
【文献】
1）Ueda, K., Nishimoto, M., & Hirohama, D.:
Renal Dysfunction Induced by Kidney-Specific
Gene Deletion of Hsd11b2 as a Primary
Cause of Salt-Dependent Hypertension,
Hypertension., 70(1):111-118.(2017).

腸-骨髄連関から動脈硬化を制御する
江

本

拓

央

図 1 ヒト大動脈瘤の CT 画像（上）と EVG 染色（下）（神戸大学大学院医学研究科 内科学講座循環器内科学分野）
【結果】
【目的】

全体の細胞の UMAP を描き，annotation を行うとコ腹部大動脈瘤は無症状で瘤径が大きくなり，破裂する

ントロールにおいてはほとんど認めなかった B 細胞が大動と半数以上の人が命を落とす疾患である．現在のところ，

脈瘤断端部，中心部ともに著明に増加していることが分か

115

Vascular Biology Innovationに関する研究助成った（図２）．マクロファージや単球にのみ絞って UMAP

考えられる．ヒトの研究だけでは因果関係が分からないのを当てて解析を行うと，瘤中心部では，単球の浸潤が起で，reverse translational research として，動脈硬化

こっていること，また，TREM2formy マクロファージがマウスにタバコの煙を吸わせるタバコ大動脈瘤モデルを用存在しているが，単球の増加に比べ，その割合が増えていて，TREM2KO マウスを APOEKO マウスと掛け合わいないということがわかる（図３）．

せマウスを用いてタバコを吸わせた時の大動脈瘤形成に与える影響を解明すると同時に，アルツハイマー病で臨床研究が行われている，TREM2 刺激薬をタバコ大動脈瘤モデルに投与することで治療法となるか検討したい．また，
B 細胞が集積する理由を調べ，B 細胞が大動脈瘤に影響を与える可能性を検討したいと考えている．
【文献】
1）Raffort J, Lareyre F, Clement M, HassenKhodja R, Chinetti G, Mallat Z. Monocytes

図 2 全体の UMAP

and macrophages in abdominal aortic
aneurysm. Nat Rev Cardiol . 2017;14:457-471.
doi: 10.1038/nrcardio.2017.52
2）Li Y, Ren P, Dawson A, Vasquez HG, Ageedi
W, Zhang C, Luo W, Chen R, Li Y, Kim S, etal. Single-Cell Transcriptome Analysis Reveals
Dynamic Cell Populations and Differential
Gene Expression Patterns in Control andAneurysmal Human Aortic Tissue. Circulation .
2020;142:1374-1388. doi:10.1161/
CIRCULATIONAHA.120.046528

統合オミクス解析による心不全の遺伝的基盤解明と精密医療の実現
円

山

信

之

（理化学研究所生命医科学研究センター
図 3 Monocyte，Macrophage のみで UMAP

循環器ゲノミクス・インフォマティクス研究チーム）
【目的】

【考察】

心不全患者は増加しており，治療法の発展にも関わら瘤中心部では，エラスチン構造が破壊されていると同ずその予後は不良であるため病態解明が急務である．過時に陳旧性の血栓が付着しており除去できない状態にな去の心不全ゲノムワイド関連解析（GWAS）では発見さっていることから，マクロファージの機能不全が想定されれた疾患感受性遺伝子は僅か 11 に留まり 1），心不全発る．TREM2 は脳においてβ -Amyloid を除 去するのに症メカニズムの全貌は明らかにされていない．今回は日本必須のパターン認識受容体であり，大動脈瘤では血栓や人の心不全ゲノムワイド関連解析による病態解明を目的と動脈硬化プラークの除去に不可欠の分子である可能性が

した．

116

Vascular Biology Innovationに関する研究助成【方法】
1000 ゲノムプロジェクトと日本人 3,256 名の全ゲノムシ

シングルセル分子病理解析によるサルコイドーシス

ークエンスデータによりリファレンスパネルを構築した．バの病態解明

イオバンクジャパン 1 期・2 期に参画しマイクロアレイでタ

片桐

美香子

イピングされた症例に対し，同一人物・主成分解析外れ（東京大学大学院医学系研究科）

値・性別齟齬・Call rate 低値除外などのクオリティコン
トロールを行った．先のリファレンスパネルを用いてインピ【目的】ュテーションを行った．心不全ゲノムワイド関連解析を行

サルコイドーシスは，原因不明の全身性肉芽腫性疾患

い，欧州人・アメリカ人・アフリカ人のサマリ統計量とメであり難病に指定されている．肉芽腫の形成には，マクロタ解析を行った．

ファージや T 細胞，それらから放出される様々なサイトカ【結果】

インが関与することが報告されているが，その詳細な機序

クオリティコントロール後にバイオバンクジャパン 1 期はは解明されていない．サルコイドーシスの心臓病変は心不181,715 例，2 期は 78,078 例が得られた．心不全症例

全や致死的不整脈をきたし，本疾患の主な死因となって15,550 例，コントロール 190,945 例に対して，ゲノムワイ

いる．しかし，心筋生検による診断陽性率は 15 〜 20%

ド関連解析を行い 3 つの新規感受性座位を同定した．欧と非常に低い．ステロイド治療により予後が改善するため

州人・アメリカ人・アフリカ人のサマリ統計量との民族横断

早期診断が重要であり，病態解明が早期診断に繋がると的メタ解析により 4 つの新規感受性座位を同定した（図）．

考えられる．
本研究の目的は，心臓サルコイドーシス患者の末梢血液中単核細胞（PBMC）を用いたシングルセル解析と心臓組織を用いた空間トランスクリプトーム解析を用いて，組織における肉芽腫の形成機序や臓器機能低下の機序を明らかにすることである．
【方法・結果】
患者の血液から PBMC を単離して，10xChromium

図 民族横断的メタ解析結果（10xGenomics） を 用 い て single cell RNA/TCRseq 解析を行った．これまで病態の中心と考えられていた【考察】

CD4 T 細 胞でなく，CD8 T 細 胞において Naïve 分 画

日本人の情報を加えることで新規感受性座位を同定するこの減少と Effector Memory 分画の増加といった細胞集とが可能であった．近年，HFrEF，HFpEF など左室駆団の変化と細胞活性化を認めた．また，CD8 T 細胞で出率で層別化した解析も行われており 2），今後はそちらのTCR レパトアのクローン増殖を認め，CD4 T 細胞では同解析も進める予定である．

様のクローン増殖は認めなかった．単球においては，炎【文献】

症性シグナルに関係する経路が活性化し，ステロイド治療

1）Shah S,Henry A,Roselli C et al.Genome-wideにより改善していることが分かった．

association and Mendelian randomisation

次に，この PBMC の変化が組織における免疫細胞とanalysis provide insights into the pathogenesis

関連しているか検討するため，心臓組織を用いて空間的of heart failure. Nat Commun 11,163(2020)

解析を行った．30 種類以上のタンパクマーカーを同時に

2）Joseph J,Liu C,Hui Q et al.Genetic

観察可能な CODEX（co-detection by indexing）を

architecture of heart failure with preserved

用いたマルチプレックス Spatial 解析では，肉芽腫の中versus reduced ejection fraction. Nat Commun

心部には CD68 陽性のマクロファージが存在し，その周

13,7753 (2022)

囲に CD4 T 細胞，外側に CD8 T 細胞が認められ，ほ117

Vascular Biology Innovationに関する研究助成

とんどの免疫細胞は活性化した状態で増殖していた．一

雌雄 BALB/c マウスに，生理食塩水，カンデサルタン，

切片上で網羅的に mRNA を検出できる GeoMx Whole

TRV027 を継続投与した．腎組織を回収後，免疫・化Transcriptome Atlas（Nanostring）を用いて，心臓学組織染色を行い，腎皮質，髄質の形成およびネフロン

組織の空間的トランスクリプトーム解析を行ったところ，サ数について評価を行った．

ルコイドーシスの肉芽腫部分では免疫細胞が複数のケモ【結果】

カインを強く発現しており，肉芽腫以外の部分では代謝にマウス腎病理切片の解析の結果，生後 15 日目のカン

関連する因子が増加していた．この肉芽腫におけるケモカ

デサルタン投与群において，小葉間動脈の血管平滑筋のインの発現増加は，Visium CytAssist（10xGenomics）

顕著な肥厚，および皮質の異常なレニン産生細胞の増加でも観察された．

が明らかとなった．これらの現象は，生後 5，10 日目で【考察】は認められなかった．さらにカンデサルタン投与群では髄本研究により，心臓サルコイドーシスにおける免疫細胞質の萎縮が確認された．尿細管各部位の特異的マーカーの活性化と，組織中の局在の変化が観察された．今後は，による免疫組織染色を行ったところ，近位尿細管やヘンT 細胞や単核球系細胞を用いて，疾患に関連するサイト

レループの形態的な異常が確認された．これらの所見は，カインの同定と組織における代謝経路の変化を中心とした

生理食塩水群，TRV027 群では見られなかった．なお，

心機能低下の機序を検証していく．

皮質におけるネフロン数については，投与薬物による顕著な影響は確認されなかった．

Developmental Origins of Health and Disease【考察】
以上の結果から，哺乳類の後腎発生において，AngII-としてのAT 1 受容体による腎脈管・血管形成誘導

AT1R/ βアレスチン経路が，尿細管や血管の形成・成熟メカニズムの解明に重要な役割を持つことが示唆された．本研究は継続中

川

岸

裕

幸

（国立医薬品食品衛生研究所安全性生物試験研究センター薬理部第三室）

であり，今後は発達段階ごとの詳細な解析を進めることで，後腎発生における AT 1R/ βアレスチン経路の作用時期や作用部位の同定を目指す．

【目的】
本研究では，哺乳類の後腎発生における尿細管・血管形成過程でのアンジオテンシン II（AngII）の作用メカ

一細胞解析とin vivo CRISPR/Cas9システムの融合

ニズムを解明し，子宮外後腎形成誘導法の開発を目指す

による心不全リプログラミング因子スクリーニングことを目的としている．AngII は，アンジオテンシン 1 型受容体（AT 1R）に結合することで作用し，G タンパク質

候

聡

志

（東京大学大学院医学系研究科 循環器内科学講座）

経路とβアレスチン経路を介して細胞機能を調節しているが，後腎発生におけるこれらの経路の特異的な作用につ【背景と研究目的】

いては不明な点が多い．これまでに我々は，G タンパクscRNA-seq 解析は近年急速に普及しつつあるが，得質，βアレスチンの両経路を抑制する「AT1R 逆アゴニスト」

られた膨大なデータを如何に処理し，有用な情報を抽出

カンデサルタンを生後 1 日目から投与することで，離乳期（新規心不全治療ターゲットの探索）するのかが課題とまでに深刻な腎障害が誘導されることを見出している．一

言える．申請者らは本研究助成を受け，本年主に以下の方，G タンパク質経路を抑制しβアレスチン経路を活性化

二つの課題に取り組み，一定の成果を得た．

する「βアレスチンバイアス AT1R アゴニスト」TRV027【方法及び結果】

は腎毒性を示さなかった．

（1）シングルセル解析と空間的遺伝子発現解析の統合【方法】
後 腎 形 成 が 進 行する出 生 1 日目から 14 日目までの118

シングルセル解析の欠点の一つとして，細胞を単離する過程で，その細胞が元いた位置情報が失われる点が挙げVascular Biology Innovationに関する研究助成られる．この問題を解決するため，組織標本切片上で網（2）シングルセルマルチオミクス解析

羅的に mRNA プロファイルを調べていく方法（Spatial

近年では scRNA-seq のみならず，他の階層のオミクス

transcriptome 解析）を心臓に応用し，健常及び梗塞情報の解析も盛んに報告されるようになった．我々は重症後の心臓組織標本を “ 数細胞レベル ” の細かい解像度の家族性拡張型心筋症の原因となる LMNA Q353R 変で空間的遺伝子発現プロファイルの解析を行うことに成功

異を同定し，その患者由来 iPS 心筋細胞や変異を再現しした．これを scRNA-seq と統合解析した結果，心筋梗たノックインマウスを作成して scRNA-seq 及び scATAC-

塞後急性期に梗塞周辺領域の心筋細胞にのみ見られる，

seq（オープンクロマチン領域を同定するエピゲノム解析のCsrp3 に代表されるようなメカノストレス応答遺伝子の発一種）を行った．その結果，LMNA Q353R 変異心筋

現増加という事象を見出した．AAV9 を用いたメカノスト

細胞においては転写因子である TEAD1 の働きが弱くなる

レス応答遺伝子の過剰発現及びノックダウンによる検証のせいで心筋成熟化に関連する遺伝子の転写制御が損なわ結果，こうした梗塞後急性期の梗塞周辺領域におけるメカ

れ，未熟な心筋細胞となることが分かった．その原因をノストレス応答遺伝子の発現増加は心保護的に働き，将調べるため健常型及び変異型ラミンと各種タンパクとの結来的な梗塞後リモデリングを抑制することを見出した 1）（下合力を網羅的に解析した結果，変異型ラミンは TEAD1

図参照）．

との結合力が亢進し，さらに画像解析から TEAD1 が核

119

Vascular Biology Innovationに関する研究助成

ラミナに強く結合してトラップされていることが分かり，そCUT&RUN（Skene et al. eLife . 2017）を心筋細胞の結果本来の転写因子としての働きが損なわれることがの解析に応用することもできた．最後に，変異が引き起判明した 2）．また，クライオ電子顕微鏡撮影により，疾こす分子病態が明らかになったため，TEAD1 の転写活患モデルマウスや患 者 iPS 心 筋 細 胞ではこれに合 致す

性を上げる TT-10（Hara,Komuro et al. JACC Basic

る細 胞内小 器 官や核形態の異常を明らかにした他，こTransl Sc i. 2018）という薬剤が LMNA Q353R 変異の研究過程で少数細胞に対するエピゲノム解析法であるの治療薬となり得ることも明らかにした（下図参照）．

【本研究助成により報告した論文】

M, Toyooka K, Umezawa A, Yamanishi Y,1）【文献】

Nitta R, Aburatani H, Komuro I. TEAD1

Yamada S, Ko T (co-first author), Hatsuse S,

trapping by the Q353R-Lamin A/C causes

Nomura S, Zhang B, Dai Z, Inoue S, Kubota

dilated cardiomyopathy. Sci Adv. 2023; 9(15):M, Sawami K, Yamada T, Sassa T, Katagiri M,

eade7047.

Fujita K, Katoh M, Ito M, Harada M, Toko H,3）Yamada S, Ko T (co-first author), Katagiri

Takeda N, Morita H, Aburatani H, Komuro I.

M, Morita H, Komuro I. Recent Advances in

Spatiotemporal transcriptome analysis reveals

Translational Research for Heart Failure in

critical roles of mechano-sensing genes at

Japan. J Card Fail. 2023; 29(6): 931-938.

the border zone in remodeling following4）Ko T, Morita H. Molecular Genomic Autopsy

myocardial infarction. Nat Cardiovasc Res.

―Clues to Preventing Further Tragedy?―

2022; 1: 1072-1083.

. Circ J. 2022; 87(1): 120-122. doi: 10.1253/

2）【文献 2】
Yamada S, Ko T (co-first author), Ito M, Sassa

5）Ko T, Nomura S. Manipulating Cardiomyocyte

T, Nomura S, Okuma H, Sato M, Imasaki T,

Plasticity for Heart Regeneration. Front Cell

Kikkawa S, Zhang B, Yamada T, Seki Y, Fujita

Dev Biol. 2022: 10: 929256

K, Katoh M, Kubota M, Hatsuse S, Katagiri M,
Hayashi H, Hamano M, Takeda N, Morita H,
Takada S, Toyoda M, Uchiyama M, Ikeuchi

120

circj.CJ-22-0513.

Vascular Biology Innovationに関する研究助成②これまでに動物実験は，KO（NBL1:-/-）マウスと WT
糖尿病性腎症の進展における新規BMP拮抗分子の（NBL1:+/+）マウスを使用し，マウスの右 腎 臓を摘

機能解析

除後に，高脂肪餌を負荷し，STZ を腹腔内投与して

小

林

洋

輝

（日本大学医学部 腎臓高血圧内分泌内科）

糖尿病群のマウスを作成した．また STZ を投与せず普通餌で飼育する KO マウスおよび WT マウスをコントロール群とし，４週ごとに体重および血糖値，尿蛋白等【序論】の測定を行い，糖尿病発症後２４週まで飼育し，検体

申請者は糖尿病患者を対象に，血漿中蛋白を網羅的にを採取した．飼育期間中のコントロール群，糖尿病群

解析し，その中から NBL １が糖尿病性腎症の進展においのマウスにおいて，それぞれ KO マウスと WT マウスのて重要な役割を担うことを明らかにした．昨年度に引き続間に体重，血糖値の差は認められなかったが，腎臓でき，本研究において，NBL １が腎線維化にどのように関は WT マウスの糖尿病群で，コントロール群より NBL

与するかについて検討した．

１mRNA の発現が増加していた．現在，腎組織にお【方法】

いて，線維化に関する蛋白の発現や組織染色による障①ヒト近 位 尿 細 管 細 胞（HK- ２細 胞 ） に，NBL １の害の程度についての解析を行っている．

siRNA を導入し，腎線維化に関連する蛋白の発現の変化について検討した．

【考察】
培 養 細 胞において，siRNA で NBL １を抑 制すると，② NBL １ノックアウトマウスに対して，ストレプトゾトシン

α SMA や fibronectin の発現が低下し，TGF β１の刺（STZ）にて糖 尿 病を誘 導し， 尿 蛋白や腎 線 維 化の激においても，その発現は negative control と比べて抑程度を評価し，糖尿病性腎症における NBL １の役割制されていた．今後は，NBL １の発現機序について検討について検討した．

する．

【結果】
① 昨 年 度までに，HK- ２細 胞を無 血 清 培 地 で serum
starvation 後，リコンビナント NBL １や TGF β１で

ヒトiPS細胞由来心臓予定領域および心筋細胞の２４時間刺激すると，コントロールに比べてα SMA や作り分け

fibronectin などの mRNA が 上 昇することが わかっ

斎

藤

幸

弘

た．そこで今年度は，HK- ２細胞に NBL １の siRNA（岡山大学病院）を導入し，これらの蛋白の発現について検討を行った．
HK- ２細胞に１０nM の siRNA をリバーストランスフェ
クションした後に，serum starvation を行い，TGF β【目的】
ヒト iPS 細胞由来左室型心筋細胞と右室型心筋細胞の１で２４〜４８時間刺激した．siRNA 導入細胞におい違いについて検討を行った．

て，NBL １mRNA は，negative control siRNA の【方法】

１/ １０以下に発現が抑制され，この NBL1 抑制下にヒト iPS 細胞から左室型心筋細胞と右室型心筋細胞をおいて，α SMA と fibronectin mRNA は，negative

別々に誘導し，細胞の各種特徴を比較した．

control siRNA より発現が有意に低下していた．TGF【結果】

β 1 による刺激を行うと negative control siRNA で右室型心筋細胞は左室型心筋細胞に比べて，細胞のは，α SMA と fibronectin mRNA の発現が増加した

サイズ（面積）が有意に大きく（図１），サルコメア密度

が，NBL1 siRNA では，これらの増加が抑制された．

が疎であった（図２）．収縮開始から弛緩終了までの時

一方，TGF β 1 刺激４８時間後の蛋白の発現について

間は右室型心筋細胞のほうが有意に長かった．自律拍動も，negative control で は， α SMA と fibronectin

数は，右室型心筋細胞のほうが有意に少なく，Ca2+ トラの増加が認められたが，NBL１siRNA では抑制された．

ンジェントの立ち上がり速度は右室型心筋細胞のほうが121

Vascular Biology Innovationに関する研究助成

有意に遅かった．脂肪酸代謝に関連する遺伝子 84 個の【考察】

発現は，全体的な明らかな偏りはないものの，心臓で高同じ iPS 細胞由来心室筋細胞でも様々な性質の違いを発現する脂肪酸代謝関連遺伝子については右室型心筋認めた．TBX5 をノックアウトした iPS 細胞由来心筋細胞

細胞のほうが多く上昇していた（図３）．

も，細胞サイズが大きくサルコメア構造が疎であることから 1），右室型心筋細胞の特徴が TBX5 の低発現によるものであることが示唆される．脂肪酸代謝関連遺伝子群については，成体の右室心筋細胞が左室・心房心筋細胞に比べて発現が高い 2）．iPS 細胞由来右室型心筋細胞と左室型心筋細胞には様々な違いがみられ，疾患の表現型や治療ターゲットの探索に iPS 細胞由来心筋細胞を用いるときにはサブタイプを区別して研究することが重要であると考えられる．
【文献】
1）Kathiriya, I.S., et al. Modeling Human TBX5
Haploinsufficiency Predicts Regulatory
Networks for Congenital Heart Disease, Dev

図 1 ヒト iPS 細胞由来左室型心筋細胞（LV）と右室型心筋細胞（RV）のサイズの比較

Cell, 56, 292-309 (2021).
2）Gandhi, S., et al.: Evolutionarily conserved
transcriptional landscape of the heart defining
the chamber specific physiology, Genomics,
113, 3782-3792 (2021).

神経-免疫ネットワークを介して高血圧の臓器障害を抑制するニューロモデュレーション治療の開発
朔啓

太（国立循環器病研究センター 循環動態制御部）
図 2 ヒト iPS 細胞由来左室型心筋細胞と右室型心筋細胞の電子顕微鏡像【目的】
本研究は，「高血圧に対しての電気的ニューロモデュレーションは，神経 - 炎症ネットワークを介し，慢性炎症を是正することで降圧と臓器保護効果を誘導する．」という仮説のもとに，高血圧および高血圧性心不全ラットに植え込み型自律神経刺激装置を用いることで，降圧作用を超えた遠隔期アウトカム改善（ラットの生命予後改善や心肥大抑制）をもたらすことを明らかにするとともに，各臓器における炎症制御機序を検証することを目的とした．しかし

図 3 ヒト iPS 細胞由来左室型心筋細胞と右室型心筋細胞の脂肪酸代謝関連遺伝子の発見の違い

122ながら，申請者の施設移動やコロナ禍による刺激装置調達が不可能となり，研究計画を変更せざる得ない状況が発生した．ニューロモデュレーション治療の可能性を見出Vascular Biology Innovationに関する研究助成

すことがもっとも大きなテーマであったことから，2019 年

VNS カテーテルは急性心不全モデル犬において，血行動〜 2023 年に事業期間においては，薬物的ニューロモデ

態を悪化させることなく，心拍数と MVO2 を抑制させるこュレーションを用いた高血圧モデルラットの効果検証やデとができた．本機器は不安定な血行動態における過剰なバイスを用いたニューロモデュレーションによる心保護効

心臓負荷の抑制に寄与する可能性がある．

果の検証に計画を変更した．

【考察】【方法・結果】
研究①：薬理学的迷走神経刺激治療の高血圧性心不全
モデルラットモデルへの効果

迷走神経刺激治療は徐脈などの生理的反応とともに炎症を介した心血管保護効果を有する．特に炎症が明確な
急性期病態においては明確な効果を示す一方，慢性的な方法・結果：ダール食塩負荷ラットにおける薬物的副モデルでは，明らかな効果を認めないこともある．よって交感神経活性化（ドネペジル）の効果を検証した．ダー

デバイスへの展開は急性デバイスをターゲットにした方が

ル食塩負荷ラットは 6 週令より塩分負荷を行うことで，血早期の臨床応用が可能となると考えられた．高血圧のよう圧上昇を認め，12 週令で定常となった．17 週令までのな慢性病態において治療戦略として迷走神経刺激を応用

観察期間で 10 匹中 5 匹が死亡し，全てのラットで 14 週

するには，効果のある病態・病期を関するさらなる検討が令以降に左室短縮率の低下を認めた．また，14 週令か必要である．

らのドネペジル塩酸塩投与では，血圧，心エコー所見お【謝辞】

よび生存率を改善させない一方で，活動性低下による体2020 年に九州大学から国立循環器病研究センターへ

重減少を認めた．一方，ドネペジルは，ダール食塩負荷の移動があり，さまざまな環境を一旦リセットする必要性

ラットでは明らかな血圧低下や心不全改善を認めず，投が出ましたが研究関連機材・資料の移動にかかる費用を与タイミングや容量に最適化が必要であった．

VBIC にてご支援いただきました．また，同年よりコロナ研究②：薬理学的迷走神経刺激治療の肥満性高血圧＋が始まり，当初の研究計画を継続することが非常に難しく

心不全ラットモデルへの効果なりました．研究計画の変更や支出方法などについて財方 法・ 結 果： 薬 理 学 的 迷 走 神 経 刺 激 治 療（ドネ団にさまざまな問合せをさせていただきましたが，一貫しペジル）を用い， 肥 満 性 高 血 圧＋心 不 全を示すラットて，励ましのお言葉と寛大なご配慮をいただきました．必モデルへの効 果を検 証した．ドネペジル群では心 筋 梗ず，今困っている患者さんに財団より頂いた御恩をお返し

塞 後， 有 意 に心 機 能 が 保 たれていた（ 心 係 数：91±

したいと思います．関係者の皆様，本当にありがとうござ

4 vs. 73±9ml/min/kg, P ＜ 0.01; 左 心 室 拡 張 末 期

いました．

圧 :11±1 vs. 20±2mmHg, P ＜ 0.01）． ま た， 血 中【文献】のカテコラミン，BNP，AngII および CRP はいずれも有研究推進の過程で得られた成果論文で特に関連する 5

意 に 低 下 して い た．Early donepezil monotherapy

つを以下に示します．

or combination with metoprolol significantly

1）Yoshida K, Axelsen J, Saku K, Andersen A,

prevents subsequent chronic heart failure in

S. de Man F, Sunagawa K, Noordegraaf A,

rats with reperfused myocardial infarction. The

Bogaard H. How to Incorporate Tricuspid

Journal of Physiological Sciences. 2022,72(12). とRegurgitation in Right Ventricular-Pulmonary

して報告した．

Arterial Coupling. Journal of Applied

研究③：迷走神経刺激カテーテルの開発

Physiology. 2023, 35: 53-59.

方法・結果：上大静脈に留置したバスケットカテーテ

2）Kawada T, Yokoi A, Nishiura A, Kakuuchi

ルを介して右迷走神経を刺激できる静脈内留置型 VNS

M, Shohei Yokota S, Hiroki Matsushita H, Li

カテーテル（JOHAKU）を開発した．急性心不全状態

M, Uemura K, Saku K. Dynamic accentuatedにおいて，JOHAKU が心拍数，心筋酸素消費（MVO2），antagonism of heart rate control during

血行動態に与える影響について大動物を用いて検討した．

different levels of vagal nerve stimulation

123

Vascular Biology Innovationに関する研究助成

intensity in rats. Am J Physiol Regul Integr

遺伝子改変マウスを作製し，治療効果や分子生物学的機Comp Physiol. 2023, 1; 324: R260-R270.

序を検討する．

3）Yoshida K, Saku K, Jan Bogaard H, Abe【結果】

K , S u n a g a w a K , T s u t s u i H . Va g a l n e r v e

1. 前年度に開発したリプログラミング遺伝子発現を時期・

stimulation preserves right ventricular function

細胞特異的に制御できる CAG-CAT-MGTH2A Tg マ

in a rat model of right ventricular pressure

ウスを用いて，陳旧性心筋梗塞内の心臓線維芽細胞

overload. Pulm Circ. 2022, 1; 12: e12154.

特異的に心筋リプログラミング遺伝子を発現させたとこ

4）Li M, Zheng C, Kawada T, Uemura K, Inagaki

ろ，梗塞領域 - 境界領域を中心に 2-3% の線維芽細

M, Saku K, Sugimachi M. Early donepezil

胞が心筋細胞へと転換した．

monotherapy or combination with metoprolol

2. 陳旧性心筋梗塞における心筋直接リプログラミングによsignificantly prevents subsequent chronic heartって，成熟した瘢痕組織面積が減少した．心筋再生と，

failure in rats with reperfused myocardial

抗線維化作用によって，心筋梗塞によって失われた心

infarction. The Journal of Physiological

臓収縮能が改善した．

Sciences. 2022,72(12).

3. さらなる心機能改善のメカニズムを明らかにするため，

5）Toyama T, Hosokawa K, Saku K, Oga Y, Tsutsui

対照群とリプログラミング群の心臓における非心筋細H, Sunagawa K. Smart baroreceptor activation

胞のシングルセル解析を行った．リプログラミング因子

therapy strikingly attenuates blood pressureを発現したが心筋へと再生しなかった線維化促進性のvariability in hypertensive rats with impaired

遺伝子を多く発現する悪玉線維芽細胞が，これらの遺baroreceptor. Hypertension. 2020, 75:885-892.

伝子発現が抑制された健常な善玉線維芽細胞へと転換する事を見出し，Circulation 誌に報告した 1，2）．

心筋リプログラミングによる革新的心不全治療法
の開発
貞廣

【考察】
心筋直接リプログラミングが心筋再生と共に，強力な抗線維化作用をあわせもつ，心臓再生医療である可能性が威太郎（筑波大学医学医療系循環器内科）

ある．現在は，これらのマウス心臓のシングルセル解析によって，線維芽細胞以外の非心筋細胞への影響や機序の解明を目的として，更なる解析を続けている．

【目的】

【文献】

慢性心不全には心移植を除いては根本的な治療法はな

1）Tani H*, Sadahiro T*, Yamada Y, Isomi M,

く，心臓再生医療の応用が望まれている．我々は，心臓

Yamakawa H, Fujita R, Abe Y, Akiyama T,

線維芽細胞に心筋特異的遺伝子を導入し，体内で直接Nakano K, Kuze Y, Seki M, Suzuki Y, Fujisawa

心筋細胞を誘導して心臓を再生する「心筋直接リプログ

M, Sakata-Yanagimoto M, Chiba S, Fukuda

ラミング法」を開発し，マウス急性心筋梗塞モデルにおい

K, Ieda M: Direct reprogramming improvesて心筋再生と心臓機能の改善に成功している．本研究でcardiac function and reverses fibrosis in

は，新規治療が熱望される慢性心不全に対し，心筋直接

chronic myocardial infarction. Circulation

リプログラミングによる革新的治療法の確立を目的とする．

2023; 147: 223-238. *Equal contributors.

【方法】

２） Y a m a d a Y * , S a d a h i r o T * , I e d a M :陳旧性心筋梗塞の慢性心不全マウスを作製し，心筋直Development of direct cardiac reprogramming

接リプログラミングによる心臓再生を検討する．心臓線維for clinical applications. J Mol Cell Cardiol

芽細胞特異的に心筋リプログラミング遺伝子を発現させる

2023; 178: 1-8. *Equal contributors.

ため，タモキシフェン投与により遺伝子発現を制御できる

124

Vascular Biology Innovationに関する研究助成

成し， 移 植 後の大 動 脈 弁を病 理 学 的に評 価し，RNA大動脈弁狭窄症の時空間的病態解明と重症化予防

seq 及び single cell RNA-seq 解析を実施する．また，のための治療標的の探索

大動脈弁のマクロファージをフローサイトメトリーで回収

白

川

公

亮
（慶應義塾大学医学部循環器内科）

し，RNA-seq 解 析 を 行う．さらに，B6.KOR/StmSlcApoeshl に Spp1 -EGFP Knock-in（KI）reporter マウス（Spp1 Egfp/wtt KI reporter マウス）の骨髄を移植【目的】

した後に AS モデルマウスを作成し，Spp1-EGFP 陽性細本研究は，大動脈弁狭窄症（AS）の時空間的病態を胞をフローサイトメトリーで回収し，RNA-seq 解析を行う．

解明し，AS 重症化予防の治療標的を解明することを目的

AS 治療のハイボリュームセンターである慶應義塾大学とした．AS は，心不全や狭心症を引き起こすことで健康

病 院の大 動 脈 弁 硬 化 及び AS（ 軽 症・中等 症・ 重 症 ）寿命を著しく損なうが，有効な予防策が見出されていない患者の症例登録をし，超音波専門医・心エコー図専門

重要な循環器病である．本邦における 60 歳以上の AS医である研究者が，2D 及び 3D 心臓超音波画像のデー

患者は約 300 万人で，医療経済的にも大きな社会問題とタ解析を行い，大動脈弁の開放角や変性の程度を評価

なっており，AS を予防する標的の探索が求められている．

する．また，慶應義塾大学病院で病理解剖を受けた大動AS の治療標的探索の先行研究として，大動脈弁のゲノム

脈弁硬化から AS が併存する病理検体の情報を統合する．

解析や単細胞遺伝子発現解析などの様々なアプローチが【結果】行われてきたが，極度に変性しきった大動脈弁全体を解【大動脈弁狭窄症（AS）患者の大動脈弁において Spp1

析する研究が主体であり，弁変性過程や大動脈弁特異的遺伝子を発現する細胞はマクロファージだった】変性部位に注目していないため有望な治療標的は未だに解明されていない．

研究者は公共データベースにある AS 患者大動脈弁とコントロール患者の単細胞遺伝子解析データを再解析す研究者は，過去の AS 研究背景を踏まえて，大動脈

ると，AS でのみ Spp1 遺伝子を発現する細胞が出現し，弁変性機序を，①重症度の進行に応じた時系列的変性

その細胞がマクロファージであることを解明した．また，マと，②弁輪と弁尖の空間的変性に分けて病態を理解する

クロファージの特定のサブセットでのみ Spp1 遺伝子の発ことが AS の進行を抑制する治療標的の探索につながる

現が上昇していることが明らかになった．

と考えている．最近，遺伝子共発現ネットワーク解析によ【AS モデルマウスの確立とオステオポンチン産生マクロフ

り，炎症性蛋白オステオポンチン（OPN）が大動脈弁のァージの局在の確認】

変性機序の鍵分子であることが報告された（Cao et al.,

研 究 者は自然 発 症 ApoE 欠 損 高 脂 血 症マウス（B6.

BMC Med Genomics. 2021）．本研究では，OPN 産

KOR/StmSlc-Apoeshl）に，60% 高 脂 肪 食とアンギオ

生免疫細胞を追跡できる独自に開発した AS モデルマウス

テンシンⅡを皮下植え込み型シリンジポンプで 6 週間持続を用いて，大動脈弁変性過程における OPN の時空間的皮下注した AS モデルマウスを開発した．このマウスは弁役割と変性した大動脈弁特異的に出現する OPN 産生マ

輪部を中心とした肥厚・線維化と微小な石灰化を認め，

クロファージの機能を解明し，大動脈弁の変性を予防す心臓超音波検査でもコントロールマウスと比較して，大動る治療標的を探索することを目的とした．

脈弁通過血流速度の有意な上昇を認めた．

【方法】

研 究 者 は，B6.KOR/StmSlc-Apoeshl に Spp1 の自 然 発 症 ApoE 欠 損 高 脂 血 症 マ ウス（B6.KOR/

EGFP ノックインレポーターマウスの骨髄を移植すること

StmSlc-Apoeshl）に，60% 高脂肪食とアンギオテンシ

で，OPN 産生免疫細胞を追跡・回収 AS モデルマウスをンⅡを皮下植え込み型シリンジポンプで 6 週間持続皮下作成した．この大動脈弁の Flow cytometry では，ヒト

注した AS モデルマウスを作 成する．B6.KOR/StmSlc-

大動脈弁狭窄症患者の単細胞遺伝子解析の結果と同様

Apoeshl に OPN をコードする Spp1 遺 伝 子のノックアに，OPN 転写活性が上昇する細胞はマクロファージであウトマウスの骨 髄を移 植した後に AS モデルマウスを作った．また，このマウスの変性した大動脈弁の蛍光免疫

125

Vascular Biology Innovationに関する研究助成

染色では，OPN 産生マクロファージが肥厚変性した弁輪学病院で大動脈弁置換術を受けた被検者の大動脈弁の部を中心に局在していた．この結果は，OPN が弁輪を中炎症性遺伝子・蛋白の発現を，重症度と変性部位に分け心とした局所の変性を惹起することが AS 発症初期段階て，RNA シーケンス，質量分析を用いて解析する計画での原因となる可能性を示唆した．

ある．

【マクロファージのオステオポンチンは大動脈弁変性機序【考察】に重要であった】

AS モデルマウスを用いた実験により，マクロファージ

B6.KOR/StmSlc-Apoeshl マ ウ ス に Spp1 ノック アのオステオポンチンが大動脈弁変性に与える影響を解明

ウトマウスの骨髄を移植した AS モデルマウスを作成し，した．また，ヒトの心臓超音波検査データから大動脈弁

Wild-type の骨髄を移植した AS モデルマウスと比較するの空間的変性機序の存在が明らかになった．今後，ヒト

ことで，マクロファージの産生する OPN が弁の変性に与AS 患者大動脈弁を弁輪と弁尖の部位別に分別し，弁のえる影響を解析した．Spp1 ノックアウトマウスの骨髄移RNA シーケンス，質量分析及び ATAC シーケンスのデ植群では Wild-type に比して心臓超音波検査での大動ータを統合し，今までの研究とは異なるアプローチから大脈弁通過血流の圧較差が有意に抑制された．また，病動脈弁変性機序を時空間的に解析する予定である．また，理学的には弁輪部を中心とした肥厚変性が軽減し，Von

B6.KOR/StmSlc-Apoeshl に Spp1 の EGFP ノックイン

Kossa 染色での微細な石灰化も軽減した．定量 PCR 検

レポーターマウスの骨髄を移植した AS モデルマウスを用

査では，Col1a1 をはじめとした線維化の遺伝子発現が，いて Spp1 -EGFP 陽 性 及び陰 性マクロファージを Flow

Spp1 ノックアウトマウスの骨髄移植群で抑制されていた．

cytometry で回収し，bulk RNA-seq 解析と質量分析

現在，各 AS モデルマウスの大動脈弁の RNA-seq 及びを統合したマルチオミクス解析を実施し，AS 弁特異的に単細胞遺伝子解析を実施中であり，マクロファージのオス出現する OPN 産生マクロファージのより詳細な機能を解

テオポンチンが大動脈弁変性に与える詳細な機序を解明明する．さらに，ATAC シーケンスを実施し，bulk RNA

する予定である．また，各 AS モデルマウスからマクロファ

シーケンス解析のデータと統合して，OPN 産生誘導に必ージをフローサイトメトリーによりソート済みであり，現在

要な転写因子を推定し，OPN の発現調節機序を明らかRNA-seq 解析を実施している．

にする予定である．

【心臓超音波検査による AS 患者大動脈弁変性の時系列【文献】

的変化の解明】

Shirakawa K and Sano M. Drastic transformation

大動脈弁は，空間的に弁輪・弁腹・弁尖に分かれる．

of visceral adipose tissue and peripheral

大動脈弁変性過程には，これらの空間的要素だけではな

C D 4 T c e l l s i n o b e s i t y. F r o n t I m m u n o l .

く，重症化過程の時系列的な要素が存在する．しかし，2022;13:1044737.

現状，大動脈弁の時空間的変性に関する研究は乏しい．
慶應義塾大学病院の弁硬化から重症までの患者の心臓超音波検査を解析したところ，大動脈弁は硬化の時点で興奮転写連関を介した血管リモデリング形成機構

既に弁輪部の可動性が低下しており，軽症，中等症，重の解明症と進行するにつれて弁尖部へと変性が進行していくこと鈴が分かった．このことは，大動脈弁には重症度の進行に

木

良

明

（名古屋市立大学 大学院薬学研究科 細胞分子薬効解析学分野）

応じた時系列的変性に加えて，弁輪・弁腹・弁尖の空間的変性が存在することを強く支持する結果であった．

【背景・目的】

そこで研究者は．AS の診断を受け，大動脈弁置換術を動脈に対するストレス負荷は，マクロファージ（M Φ）

受けた被検者の大動脈弁の遺伝子・蛋白発現と病理学の集積と炎症により，血管平滑筋細胞（VSMC）の脱的評価を臨床データに統合し，大動脈弁変性機序の鍵分分化・増殖を促して血管リモデリングを誘発する．我々子と治療標的の探索を実施する予定である．慶應義塾大は，VSMC の細胞内 Ca2+ 濃度（［Ca 2+］i）上昇が，興126

Vascular Biology Innovationに関する研究助成

奮 - 転写連関（E-T coupling）を介して，M Φの集積とVSMC の脱分化・増殖を促して血管リモデリングを「発生」させることを見出した（Suzuki ら PNAS ,2022）．脱分化した増殖型 VSMC（pVSMC）では，Ca 2+ シグナルは増殖や遊走を促進し，病変が「成熟」する．しかし，
pVSMC における E-T coupling の存在やその役割については不明な点が多い．そこで本研究では，血管リモデ
リングの発生・成熟に対する E-T coupling の役割の解明と，それに基づく血管リモデリング疾患治療薬の開発を目的とした．
【方法】
ゲノム編集法により CaMKK2-KO を作製した．腸間膜動脈結紮（ML）モデルを作製して，血管リモデリングを
誘発した．
【結果】
1. CaMKK2-KO マウスを用いた血管リモデリング発生に対する CaMKK2 の寄与の解明
CaMKK2-KO マウスを用いて， 脱 分 極 刺 激 誘 発 性
E-T coupling に対する CaMKK2 の役割を調べた．その結 果，CaMKK2-KO 由来の細 胞・ 組 織において，E-T
coupling が抑制された．ML モデルから腸間膜動脈を単離して，リモデリングを評価したところ，CaMKK2-KO においてリモデリング形成が減少した（図１）．
2. Junctophilin（JP）-2 の血管リモデリングの成熟に対する役割の解明
ラット由来 pVSMC において，JP2 と caveolin（cav）-1 が 細 胞 膜 - 筋 小 胞 体 間 の 結 合 膜 構 造 に 共 局 在して，Ca 2+release-activated Ca2+（CRAC） チャネ ル ‐AKAP5‐ カルシニューリン（CaN）から成る Ca

2+

マイク

ロドメインを形成することを見出した（図２）．CRAC チャ
ネル阻害薬や JP2 ノックダウンにより転写因子 NFAT の核移行や増殖が抑制された．

図 1 CaMKK2-KO マウスを用いた血管リモデリ
ング発生に対する CaMKK2 の寄与の解明（A）ML モデルより腸間膜動脈を採取して HE 染

色により携帯観察をした．HP: 圧負荷をかけた血管．CTR: 正常圧血管．

（B）血管中膜の断面積の変化をプロットした（未発表データ）．

127

Vascular Biology Innovationに関する研究助成

慢性心不全におけるスクシニル-CoAに基づくエネルギー代謝機能障害
髙

田

真

吾1

絹川

真太郎2

（1 北翔大学生涯スポーツ学部スポーツ教育学科）（2 九州大学大学院医学研究院循環器内科学 ）心不全（HF）は死亡や入院を繰り返す主な原因であり，
しばしば心臓ミトコンドリア機能障害を伴う 1）．しかし，その基礎となるメカニズムはほとんど解明されていない．ここでは，冠動脈結紮により心筋梗塞（MI）を誘発したマ
ウスモデルを用いて，慢性心不全におけるミトコンドリア
機能障害の代謝的基盤を明らかにする．
冠動脈結紮の 4 週間後，心筋梗塞マウスは心筋のスク
シニル -CoA レベルの有意な減少を示し，この減少はミト
コンドリアの酸化的リン酸化（OXPHOS）能力を低下させた．心筋梗塞マウスでは，ヘム合成とケト分解，およびこれらの現象でスクシニル -CoA を消費するいくつかの酵
素のタンパク質レベルが増加し，α - ケトグルタル酸とグ
図 2 Junctophilin（JP）-2 の血管リモデリングの成熟に対する役割の解明（A）ラット由 来 p V S M C に G G E C O - J P 2 と
mCheryy-Orai1 を 共 発 現 さ せ，TIRF 顕

微鏡で JP2 近傍の［Ca ］cyt と PM 上の2+

Orai1 の局 在を可 視 化した．Orai1 を介した Ca 2+ 流入により，GGECO シグナル（右図）
が上昇し，両者の蛍光シグナルの局在は一致した（左図）．

（B&C）Proximity Ligation Assay（PLA）
により Orai1-STIM1（B）Orai1-AKAP5，Orai1-CaN（C）複合体を可視化した．JP2 のノックダウンにより複合体形成は減少した．（未発表データ）

ルタミン酸からスクシニル -CoA を合成する酵素も増加した．さらに，スクシニル -CoA 合成酵素の ADP 特異的サ
ブユニットは減少し，GDP 特異的サブユニットはほとんど変化しなかった．スクシニル -CoA からヘム合成への経路の中間体である 5- アミノレブリン酸の投与は，スクシニ
ル -CoA レベルと OXPHOS 能力を著しく回復させ，心筋梗塞マウスの HF 進行を予防した．以前の報告では，HF患者の心筋におけるスクシニル CoA 代謝異常の存在も示唆されていた．
我々の結果は，ミトコンドリアエネルギー産生系のさま
ざまな代謝におけるスクシニル -CoA の使用量の変化が慢性 HF に特徴的であることを明らかにした 2）．同様の変化は，激しい運動時など健康な状態でも起こることが知ら【考察】れているが，慢性 HF ではしばしば不可逆的に起こり，ス

CaMKK2 が E-T カップリングを介した血 管リモデリ

クシニル -CoA の減少につながる可能性がある．従って，ング形成に重要であることが示唆された．また，JP2 はサクシニル -CoA の消費を補う栄養学的介入は，HF のCRAC チャネルを起点とした E-T coupling によりリモデ治療戦略として有望であると期待される．

リングの成熟に関わると考えられた．

1. Maekawa S, Takada S, Nambu H, Furihata T,
Kakutani N, Setoyama D, Ueyanagi Y, Kang D,
Sabe H, Kinugawa S. Linoleic acid improves
assembly of the CII subunit and CIII2/CIV

128

Vascular Biology Innovationに関する研究助成

complex of the mitochondrial oxidativeった．さらに，E-RAMP2 Tg の抗 PD-1 抗体投与群では，

phosphorylation system in heart failure. Cell

Control マウスの抗 PD-1 抗体投与群よりも生存率が向Commun Signal . 2019;17:128. doi: 10.1186/

上した．

s12964-019-0445-0【考察】

2. Takada S, Maekawa S, Furihata T, Kakutani

これらの結果から，AM-RAMP2 系は HEV の適切なN, Setoyama D, Ueda K, Nambu H, Hagiwara

機能に不可欠であり，HEV の恒常性を維持し，リンパ球

H, Handa H, Fumoto Y, et al. Succinyl-CoA-の動員に寄与することで，リンパ節転移を抑制する新しいbased energy metabolism dysfunction in

治療法の開発につながる可能性が示された．血管の恒常chronic heart failure. Proc Natl Acad Sci U

性制御は，循環器疾患だけでなく，癌治療の標的となる

S A . 2022;119:e2203628119. doi: 10.1073/

ことが期待される．

pnas.2203628119
ヒトiPS由来三次元心組織を用いた心臓病に対するアドレノメデュリン-RAMP2系による血管恒常性制御機構による腫瘍転移抑制薬の開発
田中

病態解明と新規治療法の開発
谷英典（慶應義塾大学医学部 循環器内科）

愛（信州大学）【目的】【目的】

申 請 者 はこれ まで にヒト iPS 由 来 細 胞 心 筋 細 胞

アドレノメデュリン（AM）は血管拡張ペプチドとして同（hiPSC-CM） を 用 い て Engineered Heart Tissue

定されたが，それ以外にも様々な作用を有することが明ら（EHT）という配列化したマイクロ三次元心筋組織を作かとなっている．私はこれまで，AM とその受容体活性調

製するにあたって，心臓由来コラーゲンを用いることで節タンパク RAMP2 が，血管の恒常性維持に必須である

成熟度の高い心臓組織を開発し，細胞外基質としてのコこと，誘導型の血管内皮細胞特異的 RAMP2 ノックアウ

ラーゲンの重要性，心臓由来コラーゲンの特性を示した

トマウス（DI-E-RAMP2-/-）では， 血 管の傷 害が 転 移（Tani et al., Biomaterials. 2023）． 本 研 究ではこ前土壌形成を促進し，癌細胞の血行性転移を亢進させるの EHT を用いて線維芽細胞，血管内皮細胞などの非心ことを報告した．昨年度の報告では，癌細胞のリンパ節筋細胞を組み合わせた三次元の心臓組織を作製し，従転移の検討を行い，DI-E-RAMP2-/- ではリンパ節転移

来の hiPSC-CM 単独では明らかにならなかった心臓病のが亢進することを見出した．本年度は，血管内皮細胞特病態を解明し，新規治療法を開発することが目的である．

異的 RAMP2 過剰発現マウス（E-RAMP2 Tg）を用いて，具体的には薬物添加や培地・培養条件の負荷によって拡同様のリンパ節転移の検討を行った．

張障害モデルを作製し，心臓組織における心筋細胞以外【結果】の要素，相互作用にも着目して収縮様式や遺伝子発現，DI-E-RAMP2-/- とは 逆 に，E-RAMP2 Tg で はリン
パ節転移が抑制され，リンパ節内 HEV 数は増加してい上清培地中に分泌されるエクソソームの解析を行う．
【方法・結果】

た．それに伴い，転移リンパ節内の CD4+，CD8+T 細先行研究の際にはブタの心臓線維芽細胞を用いてい胞も有 意 に 増 加してい た．HEV は CCL21，CCL19，

たが，本研究を進めるにあたって同じヒト iPS 由来の細CXCL12 などのケモカインや，ICAM-1，MadCAM-1 と胞である方が 望ましいと考え，まず非 心 筋 細 胞の混 入

いった接着因子を産生し，T リンパ球をリンパ節内に引き条件を検討した．既存のプロトコル（Nature protocol

込むことが知られている．E-RAMP2 Tg のリンパ節では，

2017,STAR protocol 2022）に準じて高純度の心外膜

これらの遺伝子発現がすべて有意に上昇することがわか細胞，線維芽細胞を誘導して心筋細胞と混入して EHT

129

Vascular Biology Innovationに関する研究助成を作製し，ブタ心臓線維芽細胞の条件と比較したところ，
ヒト iPS 由来心外膜細胞と心臓線維芽細胞を用いた場合に早期から強い収縮力を示し，成熟関連の遺伝子発現が上昇することを確認した（図 1）．心外膜細胞は増殖能がよく，心臓線維芽細胞の誘導には心外膜細胞よりも時間とコストを要することから，非心筋細胞として心外膜細胞の混入を用いた．ここにヒト iPS 由来血管内皮細胞を混入させて EHT を作製した．
この実験系では EHT の移動距離や速度を測ることで，非侵襲的に組織の収縮力と収縮時間，拡張時間を測定することで拡張能も評価が可能である．我々は条件 X において EHT の収縮力は変化せずに，相対的な拡張時間が有意に延長することを確認した（図 2）．こうした拡張能の低下は心臓コラーゲンや血管内皮細胞を含有しな
い EHT モデルでは小さく，心臓由来コラーゲン（特にtype3）と血管内皮細胞の混入が重要であった．さらに既知の拡張障害の pathway は本実験系においても再現されることを遺伝子，タンパクレベルで確認した．今後は治療薬での評価を進めるとともに，網羅的な解析を進

図 2 HFpEF モデルの拡張機能低下を確認

めて未だ十分に解明されていない治療薬による改善の機序を解明し，新規の治療薬のスクリーニングを進めていく
方針である．
多能性幹細胞における代謝機構に基づく細胞作製と心臓再生医療への応用
遠

山

周

吾

（慶應義塾大学医学部循環器内科）【要旨】
ヒト多能性幹細胞は心筋細胞を含む様々な細胞に分化する能力を有するため，心臓再生医療への応用が期待されている．一方で，ヒト多能性幹細胞を用いた心臓再生医療における臨床応用を実現化するためには多くの課題を克服する必要がある．その最も重要な課題の１つは，分化後に残存する未分化幹細胞を取り除き，効率よく心筋細胞のみを作製する技術の確立であった．我々はこれらの課題に対して，ヒト多能性幹細胞と分化心筋細胞の代
謝プロファイルを詳細に解析することにより，培養環境によ
図 1 ブタ CF/hiPSC-Epi/hiPSC-CF を用いた
EHT の遺伝子発現比較

130

り分化後に残存する未分化幹細胞を取り除き，分化心筋細胞のみを効率よくかつ大量に純化精製するという画期的手法を構築することにより克服することに成功した 1-3）．

Vascular Biology Innovationに関する研究助成

さらに，我々は多能性幹細胞特異的な代謝機構に着目すており 11），創薬研究や疾患の病態解明研究を発展させることにより，残存する未分化幹細胞を特異的に除去するていきたいと考えている．

手法を確立し 4,5），これまで確立してきた培養液による純【謝辞】

化精製法との組み合わせによりさらに安全な心筋細胞の作製が可能となった．

私は 2012 年に VBIC に入会させていただき，以降 10年という長期に渡って，研究をご支援いただきました．ましかしながら，依然として課題が存在する．それは，ヒた，毎年行われる夏の研究会においていただけるご質問

ト多能性幹細胞を用いた再生医療における臨床応用さらやご意見が研究を発展させる活力となっておりました．こには産業化を実現化するためには，大量の細胞を作製すの場を借りまして，日本応用酵素協会および VBIC のオー

る必要があり，それに伴い多くのコストが発生することでガナイザーの先生方に深謝申し上げます．

ある．この課題を克服するためには，ヒト多能性幹細胞を【文献】

安価かつ効率よく作製する必要がある．一方で，ヒト多能性幹細胞における従来の培養液は，未分化維持および増殖において最適な条件ではなかった．そこで，我々はヒト
多能性幹細胞の増殖に最適な培養条件を探索し，必須ア
ミノ酸の１つとして知られるトリプトファン代謝を制御する
ことにより，ヒト多能性幹細胞の増殖が促進されることを

1）Tohyama S, et al. (2013) Cell Stem Cell 12,127-137.
2）Tohyama S, et al. (2016) Cell Metabolism
12, 663-674.
3）Tohyama S, et al. (2017) Stem Cell Reports .
9,1406-1414.

見出した 6,7）．本研究成果は，安価に大量のヒト多能性4）Tanosaki S, Tohyama S (Corresponding

幹細胞および分化心筋細胞を作製することに繋がるため，

author), et al. (2020) iScience 23, 101535.

再生医療における臨床応用あるいは産業化の推進に貢献

5）Tanosaki S, Tohyama S (Corresponding

することが期待できる．
また，再生医療の産業化を推進するためには，従来のauthor), et al. (2022) STAR Protocols 3,101360.

ように作製した目的細胞を用いて flow cytometry や免6）Someya S, Tohyama S (Corresponding

疫染色，QPCR 等で評価する手法ではなく，簡便に心筋

author), et al. (2021) iScience 24, 102090.

の分化効率や成熟度，残存未分化幹細胞等をチェックす7）Kameda K, Tohyama S (Corresponding

る品質評価システムの確立が望まれてきた．そこで，申請

author), et al. (2022) STAR Protocols 3,

者らは培養液中の miRNA を網羅的に解析し，簡便に心101341.

筋の分化効率や成熟度，残存未分化幹細胞等をチェックするシステムを開発することに成功した 8）．
作製したヒト iPS 細胞由来心筋組織球をラットあるいは

8）Sekine O, Tohyama S (Corresponding
author), et al. (2023) Stem Cell Reports
accepted

ブタの心不全モデル心臓に移植し，心機能が有意に改善

9）Tabei R, Kawaguchi S, Tohyama S, et al.

することを確認している 9,10）．また，最近では臨床グレー(2019) J Heart Lung Transplant 38, 203-214.

ドのヒト iPS 細胞から臨床グレードの培養液を用いて心10）Kawaguchi S, Soma Y, Tohyama S, et al.

筋細胞を製造し，サルの心不全モデルに移植することで，(2021) JACC-BTS 6, 239-254.

3 か月間移植細胞が生着・成熟し，心機能が有意に改11）Tani H, Tohyama S, (Corresponding author),

善することを確認している（in revision）．これらの技術

et al. (2023) Biomaterials 299, 122174.

を用いて作製した臨床グレード心筋組織球を虚血心筋症
患者へ移植する企業治験を開始している．
さらに，最近では，ブタの心臓由来のコラーゲンを用いることで，皮膚由来のコラーゲンを用いた従来の方法と比べて，成熟度の高いヒト人工心筋組織の作製にも成功し

131

Vascular Biology Innovationに関する研究助成

む変数（例：退院時 BNP は約 64％の欠測）については，
DPCデータおよびAIを活用した心不全患者のその他の変数から値を補完しながら予測を行うことができ

リスク層別化モデルの構築と心不全治療の最適化

るため，実臨床においても適応しやすいモデルと言える．

遠

山

岳

詩

（九州大学 先端医療オープンイノベーションセンター）

AI モデルは，心不全の予後予測因子として，心不全自体の重症度（BNP）の他，ADL（Barthel index），栄養状態（アルブミン，BMI）が重要であることを改めて示した．

【目的】
本研究の目的は，わが国における心不全患者の予後予測をより高精度に実現する AI モデルを開発するとともに，

核内受容体RXRに関連した肺高血圧血管リモデ

その因子を解析することで，データに基づいた新たな心不リングの機序解明とそれに関連した治療薬の開発

全治療の最適化を目指すことである．

沼

【方法】

（東京大学大学院医学系研究科 循環器内科）

田

玄

理

JROADHF に登録された心不全患者のうち，長期予後情報が取得された 11120 人を対象とし，レジストリデ【背景・目的】ータから臨床背景情報および予後情報と，DPC から入院

肺高血圧症（PH）は肺血管リモデリングを特徴とする

基本情報やレセプト情報を取得した．これらのデータを用

難治性疾患であり，種々の肺血管拡張薬によって予後改いて，患者背景から退院後の予後を予測する機械学習モ

善が得られてきたが，現行使用されている血管拡張薬にデルを構築した．欠測値については，ベイジアンリッジに反応しない患者や血管拡張薬による合併症のために使用より補完し，ランダムサバイバルフォレストによる予後予測困難な患者も存在する．ゆえに PH の新規メカニズムのモデルを構築した．予測性能は 5 分割交差検証における解明及びそれに基づいた肺血管リモデリング改善を主たる

Harrell's C-index で評価を行った．また，予後予測に効果とする治療法の開発が望まれている．PH の進展には重要な因子については，Permutation Importance によ

核内受容体が関与し，レチノイド X 受容体α（RXR α）って評価を行った．

は様々な核内受容体関連シグナルを調節することが知られ【結果】ているが，RXR αと PH との関連は明らかではない．本レジストリおよび DPC データからは患 者 背 景となる研究は RXR αと関連した PH メカニズムの解明および治153 因子を抽出した．全因子を利用したランダムサバイバ

療⽅法の開発を⽬指すものである．

ルフォレストは，C-index が 0.75±0.01 であった．なお，【方法】

既存の心不全リスクモデルである MAGGIC の C-index

RNA 網 羅 的 解 析の公 共データを用いて PH 患 者 肺は 0.68±0.01 であった．ランダムサバイバルフォレストにRXR α mRNA 発 現を解 析した．また， 肺 動 脈 性 PH

おいては，年齢，退院時 BNP，Barthel index（ADL（PAH） および 強 皮 症 PH マウスモデル（SSc-PH）に指標），アルブミン，BMI の順に重要視していることが明

対する RXR α刺激薬（Acyclic retinoid:ACR）の効果

らかとなった．

を生理学的，組織学的，分子生物学的手法で検討した．

【考察】

さらにマウス単離肺内皮細胞およびヒト内皮細胞を用い，今回，心不全患者予後予測 AI モデルを構築した．既報の心不全予後予測の AI モデルは 1 年生存割合など，

内皮間葉転換（EndMT）と RXR αの関連を解析した．
【結果】

固定期間での予後予測モデルであり，早期打ち切りとな

公共データ（GSE113439）解析により PH 患者肺でった患者については解析の対象外となりバイアスの原因とRXR α mRNA が低下していることが確認された．また，なっていた．一方で，本モデルでは，そのような症例も全

PAH および SSc-PH マウスにおいて RXR α刺激薬 ACRて利用した解析となり，よりバイアスを取り除いたモデルでは肺血管抵抗を改善し，EndMT の抑制および肺血管リある．本モデルにおいては，機械学習手法により欠測を含バースリモデリングを起こすことが確認された．

132

Vascular Biology Innovationに関する研究助成

また単離内皮細胞において RXR αは p53 の活性化を介して間葉内皮転換（MEndT）を誘導した．
【考察】

認できず，胎生致死であることが示唆された（図 1）．
また， 器 官 形 成 期 の 胎 仔 シングル セル 解 析 4） でZfp281 は個体において遍在的に発現している事が確認さ

RXR α刺激薬 ACR は肺血管内皮細胞において p53

れた（図 2）．そのため，Zfp281 欠損が心臓の発生よりを介して MEndT を誘導し，マウス PH モデルおよび培養

早い原腸形成期等に影響を及ぼしている可能性が否定で細胞における EndMT を改善した．

きなかった．

RXR α -p53 経路と関連した MEndT による PH の治

よって， 次 に Zfp281flox マウスを作 製し，Mesp1-

療メカニズムに関する報告はこれまでなく，RXR α -p53

Cre マウスと Zfp281flox マウスを交配することにより心経路は PH の新規治療標的として期待される．

臓中胚葉特異的 Zfp281cKO マウスを作製した（図 3）．
その結果，Zfp281cKO マウスの産仔が認められず，胎リプログラミング法を利用した新たな心臓形成
転写ネットワークの探索
橋

本

寿

之

（慶應義塾大学医学部 循環器内科）

生 9 日目頃より発達異常や胎生致死を認めた（図 3,4）．
また，Zfp281cKO マウス胎仔を解析すると，心臓に様々な心奇形を認め，特に右室流出路系の形成不全が多く観察された（図 5）．
この表現型の分子機序を解明するために胎生 9.5 日目の胎仔心臓を用いて RNA-seq 解析を行った．その結果，【目的】

興味深い事に Zfp281cKO マウスの心臓においては野生

心臓発生に重要な複数の転写因子を強制発現させる型と比較して様々な非心臓系統の運命決定に寄与する転ことにより線維芽細胞を心筋様細胞に直接分化転換する

写因子の発現が上昇していることが判明した（図 6）．よことができる 1）．最近我々はリプログラミングと心臓発生って，Zfp281 は中胚葉において非心臓系統を誘導するの間にはエピジェネティックなプロセスにおいて多くの共転写因子群の発現を抑制することにより心臓形成に寄与し通点があることを見出した 2）．このような知見から，今度ていることが示唆された．

は逆にリプログラミングの研究成果を参考にして，心臓発生を司る新たな転写制御機構を解明できるのではないかと考えた．よって，我々は先行研究結果 3）において最も強く心筋分化転換効率を改善した転写因子 ZNF281/
Zfp281 に着目し，ZNF281 の司る心臓発生の新たな転写制御機構を解析することを目的として，研究計画を立案した．
【方法】
本 研 究 で は CRISPR/Cas9 シ ス テ ム を 用 い て
Zfp281KO_ES 細 胞 及 び マウスを 作 成し，Zfp281 の発現量が心筋分化効率に及ぼす影響を解析する．また，
Zfp281 を心臓特異的に KO したマウスラインを樹立し，Zfp281 が心臓発生に必須の遺伝子かを明らかにする．
【結果】

図 1 Zfp281KO マウスの作製及び解析

我々は CRISPR/Cas9 システムを用いて Zfp281KO_
ES 細胞を作製した．そして Zfp281KO-ES 細胞では心筋分化誘導を行っても心筋細胞が誘導されない事を確認した．同様に Zfp281KO マウスを作製したが，産仔が確133

Vascular Biology Innovationに関する研究助成【考察】
我 々の 遺 伝 子 改 変 モ デ ル マウス 解 析 結 果 か ら，
ZNF281 は心臓発生に必須の因子である事が明らかとなった．今後はマルチオミクス解析及びタンパク質間相互解
析を用いて ZNF281 がどのように非心臓系統の遺伝子群
図 2 原腸形成期（胎生 6.5-8.5 日）のシングルセル解析の発現を調整しているかを明らかにする予定である．
【参考文献】
1）Ieda, M. et al:

Direct reprogramming offibroblasts into functional cardiomyocytes bydefined factors. Cell, 142, 375-386, (2010).
2）Hashimoto, H. et al: Cardiac Reprogramming
Factors Synergistically Activate Genome-wide
Cardiogenic Stage-Specific Enhancers. Cell
Stem Cell, 25, 69-86 e65, (2019).
図 3 心臓中胚葉特異的 Zfp281cKO マウスの作製及び解析

3）Zhou, H. et al:

ZNF281 enhances cardiac

reprogramming by modulating cardiac andinflammatory gene expression. Genes &development, 31, 1770-1783, (2017).
4）Pijuan-Sala, B. et al: A single-cell molecularmap of mouse gastrulation and earlyorganogenesis. Nature, 566, 490–495 (2019).

図 4 Zfp281cKO 胎児マウスの解析及び胎生致死の表現型

オミクス解析を用いた遺伝子関連全身血管病の病態解明と新規創薬ターゲットの探索
平

出

貴

裕

（慶應義塾大学医学部 難治性循環器疾患病態学寄付研究講座 特任助教）【研究の背景と目的】
難病疾患に指定されている血管病には，肺動脈疾患や図 5 Zfp281cKO マウスにおける心奇形の表現型

脳動脈疾患，大動脈疾患などがあり，本邦での推定患者数は併せて 2 万人を超える．しかし発症原因の多くは特定されておらず，根本的な治療法に乏しい．肺動脈性
肺高血圧症（PAH）は妊娠可能年齢の女性に好発する，
生命予後不良の指定難病である．申請者の研究チームは特発性 PAH 患者検体の次世代シークエンサー解析を施行し，日本人 PAH 患者特有の発症原因遺伝子候補として Ring finger Protein 213（RNF213 ）遺伝子の多図 6 Zfp281cKO マウス心臓の RNA-seq 解析

型変異（R4810K）を同定した．RNF213 R4810K は従来の治療に反応性が乏しく予後不良であり，PAH の根

134

Vascular Biology Innovationに関する研究助成

本的治療法の開発が望まれる患者群であることを報告し

および 10% 低酸素下で 3 ヶ月間飼育したところ，常酸素

た（Hiraide T, et al.2021）．RNF213 はもやもや病や環境下（Nx）
では PAH の発症は両群とも認めなかったが，末梢性肺動脈狭窄症など，複数の難治性血管病において低酸素環境下で飼育した Rnf213 R4810K ヘテロマウス

関連があり，RNF213 関連血管病という新規疾患概念を（hetero+Hx） は 野 生 型（wild+Hx）と比 較して， 有提唱した（図 1）．これら疾患を網羅的に解析することで，意な右室収縮期圧の上昇，および肺血管中膜肥厚を認め

新規発症機序の解明や創薬が期待できる．

た．右室および肺動脈のリモデリングが確認され，低酸素負荷により PAH が惹起された（図 2）．

図1

図2

肺 動 脈 性 肺 高 血 圧 症（pulmonary arterial

実臨床でも Rnf213 R4810K は発症感受性遺伝子とhypertension:PAH）は妊娠可能年齢の女性に好発す

して報告されており，Rnf213 バリアントという内的要因

る，生命予後不良の指定難病であり，「告知番号 86」とに， 低 酸 素負荷（ 外 的 要 因 ）が 加わる second hit にして指定されている．PAH 難病登録患者数は本邦では約より PAH が 発 症したと考えられた．マウス肺 組 織から3700 名で，PAH 患者の背景疾患として結合組織病や先RNA を抽出し，マイクロアレイ解析を施行したところ，低天性心疾患などがあるが，全体の約 3/4 は原因を特定で酸 素 負 荷 を行 った Rnf213 R4810K ヘテロマウスは，きない「特発性 PAH」である．PAH は肺血管壁細胞が低 酸 素負荷をした野 生 型マウスと比較して，Cxcl12 や異常に増殖することで，肺血管の内腔が狭窄し，肺血管

Cdk19 など細胞増殖シグナルを促進する因子の上昇を認抵抗の上昇によって右室の圧負荷が増大し，右心不全をめた（図 3）．既報で癌細胞の増殖との関連性が報告さ呈する疾患である．有効な治療法がなかった時代，診断れている Cxcl12 に着目し，受容体である Cxcr4 の阻害からの平均余命は約 2.8 年と極めて予後不良な疾患であ薬（AMD3100）を追加で腹腔内投与すると，低酸素負った．PAH は遺伝子型因子と環境因子が関わる多因子

荷をしたヘテロマウスでの PAH が軽症になることを確認疾患であるが，PAH 発症に至る分子機構の大半は不明

した．Cxcl12-Cxcr4 シグナルが Rnf213 R4810K マウ

であり，根本的な治療方法は確立していない．

スの PAH 発症に関連していることが示唆された（論文未【実験方法と結果】

発表データ）．今後は Cxcl12 や Cxcr4 の局在を免疫染ヒトでの RNF213 R4810K 病的バリアントは現行の肺色やシングルセル RNA 解析等で確認し，PAH 発症に関

血管拡張薬への治療抵抗性がある予後不良因子であり，わる詳細なメカニズムを解明していく．Cxcl12-Cxcr4 シ

また複数の血管病に関連していることから，疾患発症にグナルが新規根治療法のターゲットになる可能性があり，関連する分子メカニズムの解明が求められる．申請者の実臨床への応用に向けて検証を進めていく．

研究チームは CRISPR-Cas9 システムを用いて，Rnf213【ヒト肺組織での検証】

R4810K バリアントのノックインマウスの作製に成功した．

RNF213 R4810K バリアントに関しては，患者肺を用

野生型および Rnf213 R4810K ヘテロマウスを常酸素下，いた免疫染色を行った．マウスでは炎症性ケモカインであ135

Vascular Biology Innovationに関する研究助成

る CXCR4 は肺動脈の内皮，及び肺動脈と気管支の間（間質領域）の細胞に高発現していたが，重症肺高血圧症をミネラロコルチコイド受容体経路を標的とした呈したヒト患者肺においても，同様の所見を認めた（図 4，

糖尿病性腎症の新規治療法開発

論文未発表データ）．マウスで確認した事象をヒトにおい

広浜

大五郎

ても再現性があるかを確認できるのは，臨床および基礎（University of Pennsylvania）の両面から研究を行ってきた本施設にしかできない優位【背景・目的】性がある．

糖尿病に伴う腎障害（糖尿病性腎臓病，DKD）は腎不全の原疾患として最も多いが，根本的な治療法は未確立である．これまで DKD に対する治療法開発を妨げていた要因の一つとして，ヒトの病態と類似するモデル動物の欠如があげられる．申請者らは，低分子量 G 蛋白質
Rac1 がミネラロコルチコイド受容体（MR）転写活性化を促進し，この経路が生活習慣病に伴う腎障害の病態に
図3関与する可能性を明らかにしてきたが（Shibata et al.

Nat Med 2008, Shibata et al. JCI 2011, Hirohama
et al. Int J Mol Sci 2020），DKD における意義は未解明である．本研究は（1）ヒト DKD と類似した病態を示すマウスモデルを確立すること（2）確立したマウスモデル
を用い，主に MR に焦点をあてて DKD 進行の分子基盤の一端を解明することが目的である．
【方法】
図4

肥満 2 型糖尿病モデルの db/db マウスに対して 4 週齢で片腎摘出を施行後，10 週間高食塩食を投与し（UNxHS db/db マウス），その表現型を評価した．db/m マウ【出口戦略】
肺動脈性肺高血圧症の根治療法開発に向けて，分子スに同様の処置を行った群をコントロール群とした．MR
拮抗薬，Rac1 阻害薬を UNx-HS db/db マウスに投与

標的薬や抗体薬，mRNA 治療などの開発を行い，実臨し効果を検討した．

床への応用を目指したい．RNF213 R4810K 陽性マウス【結果】で PH の発症を抑制した CXCR4 阻害薬は，投与方法に

UNx-HS db/db マウスは高アルドステロン血症を認め，関する追加の検証を必要とするが，化合物としては別の疾

上皮性 Na+ チャネル活性化，低 K 血症，高血圧を呈した．

患（血液疾患）においてすでに薬事承認を得ているもの

UNx-HS db/db マウスは顕著なアルブミン尿に加え，糸もあり，実臨床への橋渡しが比較的容易なシグナル経路

球体結節性病変，糸球体障害も認めた．UNx-HS db/

であると考える．ヒトの肺組織での検証では肺動脈と気管db マウスの腎皮質と単離糸球体で，Rac1 活性化，MR支の間に炎症性サイトカインの関与があるため，従来の静標的遺伝子 Sgk1 発現の上昇を認めた．これらの結果か

脈注射よりも吸入薬の方が効果を期待できる．新規吸入ら遠位ネフロン，糸球体両者での Rac1-MR 経路活性化薬の化合物を企業または薬学研究室と連携し，知的財産が示唆された．MR 拮抗薬，Rac1 阻害薬によりこれらのの取得を目指したい．

所見は改善された．
【考察】
本 研 究 を通して DKD の 新 たなモデルマウスとして136

Vascular Biology Innovationに関する研究助成

UNx-HS db/db マウスを確立した．UNx-HS db/db マ

呈するものの有意な右室圧上昇はきたさなかった．そのウスは，これまで一般的な糖尿病マウスでは認められな

ため PAH モデル の 確 立 のため，BMPR2 Y247X/+ マウス

かった高血圧を呈し，顕著なアルブミン尿，DKD に特徴

において肺血管内皮細胞特異的に PGC-1 αを欠損させとされる糸球体結節性病変を伴っていたため，ヒト DKD（BMPR2 Y247X/+ ; Alk1-Cre ; Pgc1 α fl/fl ）， 評 価を行っに近い病態を示している可能性が考えられた．UNx-HS

た．このマウスでは通常大気下で右室圧は有意に上昇し，db/db マウスを用いた検討により，糸球体での Rac1-MR

PAH を発症したと考えられた．また血管中膜肥厚に加え経路活性化が，遠位ネフロンでの Rac1-MR 経路活性化て内膜の異常増殖，特に PAH 病理所見のうち最重症でによってもたらされる血圧上昇と協力して，DKD の進行にある叢状病変の出現を認めた．また三次元可視化システ

重要な役割を果たしていることが明らかとなった．

ムにより，叢状病変の三次元可視化に成功した．

【文献】

この新規 PAH モデルマウスの発症機序を探索すべく，

Hirohama, D. et al.: Hypertension 2021; 78: 82-

シングル核 RNA シーケンスを施行したところ，細胞老化

93に関する遺伝子群の発現上昇を認め，病態への関与が示唆された．
またヒト PAH 患者の肺検体採取（移植時）の施行につ

時空間的イメージングシステムを用いた肺動脈性いて倫理審査を通過し，すでに 3 例の PAH 患者の肺検

肺高血圧症の病態解明およびその治療応用

体の採取を行っている．

藤

原

隆

行

（東京大学医学部附属病院循環器内科）【考察】

BMPR2 単独の変異導入ではマウスにおいて PAH は発症しなかったが，肺血管内皮細胞特異的 PGC-1 α欠損【目的】

により通常大気下で PAH を誘導することに成功した．こ

肺動脈性肺高血圧症（PAH）基礎研究における課題

れは PAH 発症メカニズムで提唱されているセカンドヒッ

である（1）従来の病理組織学的評価では複雑な血管のトセオリーに合致するものであり，また病理像もヒト重症形態描出が困難であること，（2）PAH 動物モデルの多く

PAH 病変と類似しており，生理的な PAH モデルの確立

は人為的誘発モデルであること，（3）PAH では肺生検はに成功したと言える．またシングル核 RNA シーケンスによ禁忌であり，ヒト組織を用いた実証が難しいこと，を解決

り，細胞老化が病態に関与していることが示唆されたため，し，PAH 新規治療薬開発につながる研究を展開する．

今後は老化細胞除去薬による治療介入を推し進めていく【方法】

予定としている．さらにヒト肺検体を用いた病態の検証を申請者が開発した三次元可視化システム 1）を用いて得行っていく．

られた，低酸素負荷 PAH モデルにおける肺血管内皮細【文献】

胞 PGC-1 αの代償的血管新生 2）について効能検証を行1 ） F u j i w a r a T, T a k e d a N , H a r a H , I s h i i S ,うため，CRISPR-Cas9 を用いてヒト重症 PAH 家系におNumata G, Tokiwa H, Maemura S, Suzuki

ける遺伝子変異（BMPR2 Y247X/+ ）をマウスに導入し，よT, Takiguchi H, Kubota Y, Seo K, Sakata A,

り生理的な動物モデルとしての実証を進めたのちに，肺内Nomura S, Hatano M, Ueda K, Harada M,

皮細胞 PGC-1 αの役割について検討する．またヒト PAH

Toko H, Takimoto E, Akazawa H, Nishimura

患者の肺移植時における摘出肺の採取を行い，遺伝子・S, Komuro I. Three-Dimensional Visualization

タンパク発現や三次元解析における動物モデルとの共通

o f H y p o x i a - I n d u c e d P u l m o n a r y Va s c u l a r

点・差異について検討し，モデル動物における現象の検Remodeling in Mice. Circulation, 144, 1452-

証を推し進めていく．

1455 (2021)【結果】

BMPR2 Y247X/+ マウスは通常大気下で血管中膜肥厚を2 ） F u j i w a r a T, T a k e d a N , H a r a H , I s h i i S ,Numata G, Tokiwa H, Katoh M, Maemura S,

137

Vascular Biology Innovationに関する研究助成

Suzuki T, Takiguchi H, Kubota Y, Nomura【考察・進行状況】

S, Hatano M, Ueda K, Harada M, Toko H,

リンパ管欠損マウスでは当初，胚発生期の解析結果か

Takimoto E, Akazawa H, Morita H, Nishimura

らリンパ管数は減少するかと思われたが，心臓では 8 週

S, Komuro I. PGC-1 α -mediated angiogenesis

齢では拡張したリンパ管の過形成を認めた．またリンパ球

prevents pulmonary hypertension in mice. JCI

循環障害による異所性リンパ組織を様々な臓器で認めた．

Insight, 2023;8(17):e162632.

このリンパ管欠損マウスで心筋炎を引き起こすと心筋炎が劇症化する．さらに Prox1 をノックダウンした場合にはリ
ンパ管内皮細胞でのケモカイン，接着分子の発現が変化

リンパ管新生による炎症収束を介した心臓病治療丸山和

しており，リンパ管内皮細胞と炎症細胞のインタラクションが変化している事が推察された．したがってリンパ管内皮晃（三重大学修復再生病理学）

細胞が心臓の炎症を制御している可能性が示唆される．
【文献】

【背景】
心筋炎は心筋を主座とする炎症性疾患である．心筋炎

1）*Kazuaki Maruyama（ 責 任 著 者 ）, Kyoko
Imanaka-Yoshida (*corresponding)は自然免疫系による過剰なサイトカインの産生，獲得免疫

The Pathogenesis of Cardiac Fibrosis: A

系による心筋細胞の障害，炎症反応の消退といった過程

Review of Recent Progressをたどり，臨床的には炎症反応をいかに抑制するかと自International Journal of Molecular Sciences,

然軽快までの血行動態維持が重要な課題である．心筋炎

23(5) 2617-2617 2022 年 2 月の病因は未解明で，治療法も好酸球性心筋炎に対するス

2）*Kazuaki Maruyama（ 責 任 著 者 ）, Kazuaki

テロイド以外に有効なものがない．したがって臨床的，社

N a e m u r a , Y u i c h i r o A r i m a , Ya s u n o b u

会的にも心筋炎の病態解明や新規治療法の探索はニーズ

Uchijima, Hiroaki Nagao, Kenji Yoshihara,が高い．

Manvendra K. Singh, Akiyoshi Uemura, Fumio【目的】

Matsuzaki, Yutaka Yoshida, Yukiko Kurihara,

リンパ管は過剰な間質液や炎症細胞回収を通じ組織微Sachiko Miyagawa-Tomita, *Hiroki Kurihara

小環境を制御する（業績 1,2）．本研究はリンパ管新生にSemaphorin3E-PlexinD1 signaling in coronaryよりマクロ分子や炎症細胞動態などの微小循環制御に着artery and lymphatic vessel development with

目し心臓におけるリンパ管の機能解析を行い心臓病の治

clinical implications in myocardial recovery.

療法開発を目指すものである．

iScience, 24(4) 102305-102305 2021 年 4 月【方法】

3）*Kazuaki Maruyama（ 責 任 著 者 ）, Sachiko

我々は血管内皮細胞でリンパ管発生に重要な転写因Miyagawa-Tomita, Yuka Haneda, Mayuko

子であるホメオボックス型タンパク Prox1 をノックアウト

K i d a , F u m i o M a t s u z a k i , Ky o k o I m a n a k a -し，心臓リンパ管欠損を引き起こせる事を見出した（業績

Yoshida, *Hiroki Kurihara3,4）．本研究では Tie2-Cre，CDH5-CreERT2 の 2 種

The cardiopharyngeal mesoderm contributes

類のマウスで心臓リンパ管の形成を阻害し，心筋炎モデ

to lymphatic vessel development eLife 11

ルを作成し，炎症・線維化・浮腫の状態などを解析する．

2022 年 10 月 5 日

さらに臨床応用を見据え，リンパ管新生を促進する血管

4）Kazuaki Maruyama, Sachiko Miyagawa-Tomita,

内皮細胞増殖因子（VEGF）-C を同モデルに投与し，リKaoru Mizukami, Fumio Matsuzaki, Hiroki

ンパ管による心臓保護効果を確認する．また，リンパ管内

Kurihara. Isl1-expressing non-venous cell lineage

皮細胞で Prox1 をノックダウンし，遺伝子解析をする事

contributes to cardiac lymphatic vessel development

でリンパ管内皮細胞の生体内での機能を予測する．

Developmental Biology, 452(2) 134-143 2019 年 8 月

138Vascular Biology Innovationに関する研究助成検討で明らかにしている．成獣期における GLP-1 はイン
腸内環境変化に着目した肥満症に関する基礎的クレチンや摂食調節などの作用が明らかにされているが，研究

胎児期などの作用については詳細には明らかにされていな

宮

本

潤

基

（東京農工大学 大学院農学研究院）

い．2022 年度に検討において，胎児期における肝細胞の分化において，GLP-1 シグナルが何らかの影響を及ぼす結果，成長に伴う肝細胞（あるいは肝臓）の正常な発【目的】

達が阻害される結果，高脂肪食誘導性肥満に対して，抵

これまでの研究で，食用油由来腸内細菌代謝物群が腸抗性を示したことが考えられる．すなわち，本来は高脂肪管ホルモンでインクレチンの一つである GLP-1（glucagon

食によって体重増加することが正常な生体応答であるにもlike peptide-1）の分 泌 亢 進を介して， 生 体エネルギ

かかわらず，GLP-1 受容体を欠損したことで，体重増加

ー代謝調節に関与することを明らかにした．その過程で，の抑制，正常な臓器の発達に何らかの影響を及ぶしてい

GLP-1 受容体遺伝子改変マウスは，高脂肪食誘導性肥る可能性が示唆された．今後，より詳細に胎児期におけ満に対して抵抗性を示すことを見出した（unpublished

る GLP-1 シグナルを解明することを目的に検討を進める．

data）．しかしながら，GLP-1 受容体の欠損が，どのような分子機構によって高脂肪食誘導性肥満モデルに対して抵抗性を示すかは不明なままである．そこで，2022 年度

遺伝性大動脈瘤・解離症の病態生理の探索と創薬

では，GLP-1 受容体遺伝子改変マウスの高脂肪食誘導に向けたトランスレーショナルリサーチ

性肥満モデルマウスにおける肥満抵抗性が胎児期や乳児期における組織発達遅滞の関与を明らかにすることを目的

八

木

宏

樹

（東京大学医学部附属病院 循環器内科）

とした．
【方法】

マルファン症候群（MFS）は，フィブリリン 1 をコード同腹仔で比較検討を行うために GLP-1 受容体遺伝子する FBN1 の異常により全身の結合組織の構造や機能

改変マウスのヘテロ交配を行い，妊娠 18 日目（E18.5）が変化し，大動脈（洋ナシ状の大動脈基部拡大：大動で解剖し，腸管，肝臓，心臓，膵臓および肺を単離し脈弁輪拡張症）や骨格，目，肺，皮膚などの全身の多た．解剖した胎児は，Genotyping PCR によって遺伝子臓器に障害が生じる常染色体顕性遺伝の難治性疾患で型を確定した．単離した各種臓器から RNA 抽出およびある．大動脈弁輪拡張症の進行に伴う大動脈瘤破裂や逆転写を行い，各遺伝子型における臓器発達マーカーを大動脈解離は若年の突然死の原因となるため，早期から

qRT-PCR によって mRNA 発現を検討した．

の大動脈基部拡大に対する介入が重要である．アンジオ【結果】

テンシン II 1 型 受容体阻害薬（ARB）であるロサルタ

E18.5 における肝臓の臓器発達に関連する遺伝子のンは大動脈瘤の進展抑制効果が期待されたが，無作為mRNA 発現を解析した結果，肝臓マーカーは野生型とホ化比較対照臨床試験ではβ遮断薬を上回る効果が得られモ型で有意な差は観察されなかったことから，E18.5 にず，依然として大動脈瘤の増大を確実に抑制する治療薬

おける肝臓は正常に発達していると判断した．一方，肝はない．我々は今日までに MFS の病態解明と創薬を目

細胞の分化マーカーは野生型と比較してホモ型で顕著に的とした基礎研究を行い，MFS モデルマウスとヒト大動減少した．また，GLP-1 分泌臓器である大腸組織におい脈組織を用いて，血管内皮キサンチンオキシドレダクターては，腸管マーカー及び分化マーカーなどに大きな変化

ゼ（XOR）を標的とした治療（XOR 阻害剤：フェブキソは観察されなかった．

スタット（フェブリク（R）: 商品名））によって MFS の大【考察】

動脈瘤形成を抑制できる可能性を明らかにした（ATVB

これまでの検討によって，成獣期よりも胎児期などでin revision）．そこで標準治療（ARB やβ遮断剤）と既GLP-1 の発現や分泌が顕著に亢進することをこれまでの存の尿酸降下薬である XOR 阻害剤フェブキソスタットの139

Vascular Biology Innovationに関する研究助成併用による MFS 患者の大動脈基部拡大の抑制効果につ績が得られた際には，全国の医療機関と連携・協力し，いて，探索的に検討する特定臨床研究（非盲検・単群）

医師主導治験を立ち上げ，MFS に対するフェブキソスタッを構想した（図 1）．本研究の対象患者，組み入れ基準，

トの薬事承認を目指す予定である．本研究の成果をきっ

除外基準，主要・副次評価項目とその解析法，スケジュ

かけに，将来的に全国の MFS の若年患者の QOL や生ール，観察期間，目標症例数などの設定，プロトコール

命予後を向上させることが期待される．

骨子の作成に取り組んだ．この特定臨床研究で良好な成

図 1 特定臨床研究の研究デザイン

血管内皮特異的欠損マウスにおいて血液脳関門（BBB）
生体膜リン脂質の“質”制御による血管内皮機能が著しく破 綻することを見出している． 今 年 度は新たに

調節戦略

Cdh5-Cre ERT2 マウスとの交配により，タモキシフェン誘導

柳

田

圭

介

（国立国際医療研究センター 脂質生命科学研究）

型の血管内皮特異的脂質 Z 合成酵素欠損マウスを作出
し，脂質 Z が BBB の分化 / 樹立に関わるのか，あるいは BBB 維持 / 恒常性に関わるのかについて検証を行った．

【目的】

【結果】

本研究では，マウスにおいて生体膜リン脂質脂肪酸組

誘導型の血管内皮特異的脂質 Z 合成酵素欠損マウス

成および様々な脂質クラスを遺伝学的に in vivo レベルでにおいて，成熟後にタモキシフェン投与後，時系列を追操作し，その血管機能検証を通じて，血管内皮細胞の脂って BBB 機能をエバンスブルー漏出にて検証したところ，質の “ 質 ” の違いが血管機能に関わる可能性について検投与後 4 日目から脳でのエバンスブルー漏出が認められ，証することを目的とする．

5 日目にはさらに著しい漏出が認められた．単離脳血管内【方法】

皮細胞のリピドミクス解析を行ったところ，脂質 Z はタモ

昨年度までの研究により，脂質クラス Z が脳の血管内皮細胞に特徴的に多いこと，脂質クラス Z 合成酵素の140

キシフェン投与後 4 日目より時間依存的に減少することが明らかとなった．

Vascular Biology Innovationに関する研究助成【考察】に，D1R を介した心不全の新規治療法の開発に繋げるこ

脂質 Z は BBB の維持 / 恒常性に関わることが明らかとなった．また脳血管内皮細胞において脂質 Z の生合成 /とである．
【方法・結果】

分解のターンオーバーが著しく速いことが明らかとなった．

心不全時の心臓 D1R 増加するメカニズムの解明のた

さらに，脂質 Z は量依存的に BBB の強固さを担保していめに転 写 因 子モチーフ解 析を行ったところ，NF-kB がる可能性が示唆された．

心不全時の心臓 D1R 増加を制御している可能性がある【研究全体の総括】

ことが示唆された．この結果を受け，我々は，心不全時

本研究全体を通じ，血管内皮細胞のリン脂質脂肪酸の心臓には小胞体ストレスがかかるとされていることに着組成が血管新生に影響しうること，特定の脂質クラスが目し，本研究で用いている圧負荷モデルマウスの不全心

BBB 維持 / 恒常性に関わることを新たに明らかにした．

において，小胞体ストレスの上昇及び NF-kB pathway

今後，脂質の ” 質 ” がこれらの血管機能に影響する分子の活性化が生じていることを確認した．その上で，ラットメカニズムに迫るとともに，糖尿病や認知症などの病的なの培養心筋細胞を用い，小胞体ストレスを誘導したとこ

背景において血管の脂質の “ 質 ” が如何に変動するかをろ，D1R の発現が上昇し，かつこの発現上昇は NF-kB

明らかにし，脂質の “ 質 ” をターゲットとした疾患治療戦

pathway を抑制することにより抑制されることを確認した．

略の開発へとつなげていきたい．

以 上の結 果から， 心 不 全 時の D1R の発 現 上 昇は， 小胞体ストレスを介した NF-kB pathway が寄与していることが示唆された．これらの研究成果について取りまとめ，

ドパミンシグナルを介した心不全の新規病態生理2022 年 Biochemcal and Biophysical Researchの解明と治療法の開発

Communications 誌において報告した．

山

口

敏

弘

（東京大学医学部附属病院予防医学センター）【考察と今後の展望】
本年度の学術研究において，心不全時の心臓 D1R の発現上昇に，小胞体ストレスを介した NF-kB pathway【背景】

が寄与していることを国際学術誌に報告することができた

従来の心不全の基礎研究では「モデル動物とヒトとのが，これまでの検討においては，小胞体ストレスを介し

種差及び心不全の病態の差異」が臨床応用を妨げる重た NF-kB pathway の活性化が特定の限られた心筋細要な課題となってきた．我々は，ヒト心不全及び圧負荷モ胞においてのみ生じるのか，また生じるとすればその機序

デルマウスのいずれの心臓においても発現が著増する共通はどのようなものであるのかについては明らかにできておらの遺伝子としてドパミン受容体 D1（D1R）を同定した上で，ず，また，なぜ心不全において D1R が発現増加する心同 D1R がヒト，マウスのいずれにおいても心不全時の致筋細胞は一部の細胞に限局するのかについても未だ不明

死的心室性不整脈の発症に寄与していることが示唆されである．今般，心臓基礎研究領域において心筋細胞のることを明らかとしてきた．しかし，心不全において心臓

heterogeneity が注目されており，D1R に着目した本研D1R が発現上昇をきたしているメカニズムは不明であり，究においても，引き続きその機序の解明に努めていきたい．

先行研究において，心不全において D1R が発現増加している心筋細胞は一部の心筋細胞に限局しているが，どのような心筋細胞において D1R の発現増加するのか，その血管壁の機械刺激応答と病態形成を誘導する機序も不明であった．

シグナル分子の解析【目的】
本研究の目的は，種を超えた心不全の本質的な病態形

山

城

義

人
（国立循環器病研究センター）

成に心臓 D1R が寄与するという仮説のもと，心不全の病
態生理におけるドパミンシグナルの役割を解明するととも

2022 年 9 ⽉（第 17 回研究発表会）で卒業させて頂141

Vascular Biology Innovationに関する研究助成

きましたので，以下，本報告書はこれまでの総括的な内

わらず，細胞外に Thbs1 を分泌し外から接着斑を制御す容とさせて頂きます．

るシステムが存在する，という事象を⾒つけたことです．こ私どもの研究室（採択当時：筑波⼤学・柳沢裕美研

れは，細胞外マトリクスを介した細胞機能制御という研究究室）では，⼤動脈瘤の⾃然発症マウスを⽤いて，⼤動概念を創出するに⾄り，今現在に⾄るまでの研究基盤と脈瘤の形成メカニズムや薬理介⼊の分⼦標的を探索するなる成果となりました．

ことを⽬的に研究を進めておりました．そこで，⼤動脈瘤

⼤ 動 脈 瘤に関 連する成 果として，Thbs1 の発 現 が，形成の初期に，細胞⾻格を制御する cofilin の脱リン酸

細 胞 膜にあるプロテアーゼ活 性 化 型 受 容 体 PAR1 によ化やそれを制御するフォスファターゼ Slingshot-1 の活って制御されていることを⾒出しました（Shin. ATVB .,性化を⾒出し，cofilin を介した⾎管リモデリングの抑制

2020）．機械刺激応答性の転写因⼦ Egr １の⽋損は⼤が⼤動脈瘤発⽣の抑⽌につながる可能性を⾒出しました

動脈瘤の発症を部分的に抑制すること，PAR1 が胸部⼤（Yamashiro. Sci. Signal ., 2015）． 次 いで， 横 ⾏ 動

動脈瘤の臨床検体において⾼発現すること，伸展刺激に脈縮窄術（TAC）後の⾎管壁で⾼発現する分⼦として，

伴う MMP-9 の活性化が PAR1 を活性化すること，活性Angiotensin-converting enzyme（ACE）や，細胞外化した PAR1 が Egr1 や Thbs1 の発現亢進に関与するこマトリクス Thrombospondin-1（Thbs1），機械刺激応とを明らかにしました．

答性の転写因⼦ Early growth response 1（Egr1）を直近の成果として，⾎管の内腔⾯を構成する⾎管内同定し，これから⾎管壁のメカニカルストレス応答分⼦と⽪ 細 胞 が ⾮ 上 ⽪ 系の間 葉 細 胞 へと分 化 転 換するプロ

して定義しました．Thbs1 はマウスの⼤動脈瘤⾎管壁や，セ スで ある 内 ⽪ 間 葉 転 換（EndMT:Endothelial-to-

胸部⼤動脈瘤の臨床検体においても⾼発現することから，

Mesenchymal Transition） は， ⾎ 管リモデリングに

⼤動脈瘤形成にメカニカルストレス応答が寄与する可能性

おいて重 要な役 割を担うことを報 告しました． ⼀ 般 的を⾒出しました．また，マウスにおける Thbs1 の⽋損は，な EndMT は， サ イトカ イン TGF- β（transforming

⼤動脈瘤の形成を完全に抑⽌できることを⾒出しました．

growth factor-beta）の働きが活性化することで⽣じる

これらの知⾒は，メカニカルストレスに応答する細胞外マ

不可逆的な変化だと解釈されていますが，可逆的な状態

トリクスの発⾒とその抑⽌が，病態形成の抑制に効果的としての部分的内⽪間葉転換（partial EndMT）が治であることを⽰しており，当該分野のトップジャーナルに掲

療介⼊点になりうる状態として注⽬され始めています．しか載されました（Yamashiro. Circ. Res ., 2018）．

し，partial EndMT の分⼦メカニズムについては不明な

次の疑 問は，Thbs1 がどのようにメカニカルストレス

点が多く，⾎管病態への関与も分かっていません．また，応答に関与するのか？ということでした．私どもは，ラッ

⾎管狭窄の原因となる新⽣内膜肥厚機構や，新⽣内膜形

ト⾎管平滑筋細胞を⽤いて，細胞をシリコン製チャンバ

成時の⾎管リモデリング機構の詳細については，さまざま

ーに播種し，⼀軸⽅向に伸展（ストレッチ）させることな報告がされており，統⼀された⾒解がないのが現状でで⾎ 管 壁のメカニカルストレス応 答を模 倣するシステム

す．

を構築しました．ストレッチ刺激に伴って Thbs1 は分泌

まず，8 週齢のマウスに頸動脈結紮を施⾏し，⾎流をされ，integrin α v β 1 に結合し細胞接着斑を活性化停⽌させ，結紮部より中枢側の狭窄進展部位の新⽣内膜することを⾒つけました．また，低分⼦量 G タンパク質形成による⾎管狭窄のプロセスを経時観察しました．狭Rap2 の不活性化とメカニカルストレス応答性の転写調

窄初期の術後 1 週間では，⾎管内⽪細胞に，間葉系細節因⼦ YAP の核内移⾏を制御する知⾒を⾒出しました

胞のマーカータンパク質であるα -SMA と⾎管内⽪細胞（Yamashiro. PNAS ., 2020）． さ ら に，Thbs1/YAPのマーカーである細胞接着分⼦ PECAM が共発現するとシグナル伝達経路は，⾎管圧負荷における⾎管壁のリモともに，⾎球細胞マーカーである CD45 が発現していま

デリングや，⾎管狭窄時の新⽣内膜形成に重要な働きをした．狭窄が起き始める術後 2 〜 3 週になると，新⽣内⽰すことを報告しました．興味深いことに，YAP の核内移

膜細胞に，α -SMA と PECAM の両⽅が発現しました．

⾏は細胞内の Rap2 を制御するだけでも調整できるにも関

また，結紮した頸動脈では，TGF- βの働きが活性化し

142

Vascular Biology Innovationに関する研究助成ていることから，EndMT が新⽣内膜の形成に寄与してと不整脈を来たす予後不良の疾患である．DCM 患者のいる可能性が⽰されました．次に，新⽣内膜細胞の起源

中でラミン遺伝子（LMNA ）変異を有する患者群は特にと⾎管内⽪細胞との関連性を精査するために，⾎管内⽪予後不良である．そこで，ラミン変異 DCM の分子病理

細胞系譜解析システム（VE-Cadherin（Cdh5 ）-BAC-

学的機序の解明を目的とした．

CreERT2-LSL-EGFP マウス）を⽤いて頸動脈結紮を⾏い，【方法・結果】

蛍光標識された⾎管内⽪細胞が狭窄のプロセスでどこに当 院 に 通 院 する DCM 患 者より同 定され た LMNA

局在するのかを解析しました．その結果，新⽣内膜細胞

Q353R 変 異を CRISPR/Cas9 システムを用いてマウス

が EGFP で標識されることから，⾎管内⽪細胞が新⽣内に導 入した． 電 子 顕 微 鏡 解 析により，Lmna 変 異マウ膜に寄与しており，⾎管狭窄の原因であることが強く⽰唆

スでは心臓組織において核の異形およびサルコメア構造されました．

の異常を認めることを明らかにした．また，変異マウスは

さらに，⽣体での⾎流停⽌，すなわち内⽪細胞への低DCM 患者と同様に心拡大を認め，胎生致死となった．

酸素状況による影響を調べるために，ヒト動脈内⽪細胞

胎仔マウスにおいて心臓組織のシングルセル RNA-seq

を⽤いて低 酸 素 状 態を誘 導すると，CD45 発 現を伴う解析を行ったところ，Lmna 変異マウスにおいて成熟した

EndMT が引き起こされることが分かりました．加えて，心筋細胞集団が減少することが分かった．次に，シング

CD45 の脱リン酸化酵素活性依存的に，細胞膜上の細ルセル ATAC-seq 解析を行ったところ，それらの成熟心胞接着分⼦ integrin α 11 の発現誘導と，integrin b1

筋細胞集団の遺伝子発現は転写因子 Tead ファミリーの内因性阻害タンパク質である SHARPIN との複合体形成

制御を受けるとことが分かった．これらのことより，Lmnaが促進されることで，⾎管内⽪細胞同⼠の接着が維持さ

変異マウスでは心筋細胞の成熟不良を認めるが，それはれ，partial EndMT の保持に重要な役割を担っているこ

転写因子 Tead ファミリーの制御不全が関与していることとを明らかにしました．⾎管内⽪細胞特異的な Hif1 α ⽋が考えられた．Tead ファミリーには Tead1~4 までの転損マウスでは，新⽣内膜形成が抑制されることから，⾎写因子が存在するが，Tead1 の発現が心筋細胞におい管狭窄の発症に低酸素応答シグナルが関与していると考えて最も高く，表現型への影響が大きいと考え，Tead1 にられます．

注目して以下の実験を行った．

これらの知⾒により，⾎管狭窄の原因となる新⽣内膜患者由来の iPS 細胞から，遺伝子変異を修正して心筋の形成に関わる細胞が，⾎管内⽪細胞由来であることを細胞に分化させた細胞株（コントロール株）および遺伝明らかにし，EndMT が⾎管狭窄時の⾎管リモデリング

子変異を修正せずに心筋細胞に分化させた細胞株（変異に寄与することを⽰しました（Yamashiro. Cardiovasc.

株）を作成した．同細胞株において転写因子 TEAD1 のRes ., 2022）．

ChIP-seq 解析を行ったところ，コントロール株において末筆となりましたが，⻑きに渡りご⽀援頂き，誠にあり認める心筋細胞成熟遺伝子群の近傍のピークの一部を変がとうございました．財団関係者の⽅々，VBIC の運営に異株において認めないことが分かった．さらに，結合タン

関わる先⽣⽅に厚く御礼申し上げます．

パク質のスクリーニングや免疫染色により，TEAD1 は変異ラミンタンパクと強く結合し，核膜付近に局在することを明らかにした．これらのことより，ラミン変異心筋細胞にラミン変異特発性拡張型心筋症の分子病理学的おいては，転写因子 TEAD1 が変異ラミンタンパクにトラ機序の解明ップされ，機能不全となり，心筋細胞成熟遺伝子の発現

山田

臣太郎

を制御できず，心筋細胞が未熟な状態となると考えられた．

（東京大学医学部附属病院 循環器内科）

さらに，YAP-TEAD 活性促進剤である化合物 TT-10 を変異 iPS 由来心筋細胞株に投与したところ，病的な表現【目的】
特発性拡張型心筋症（DCM）は進行性の心機能低下型の改善を一部認めた．
これらの結果はScience Advances 誌に報告しました 1）．

143

Vascular Biology Innovationに関する研究助成【文献】

NLRP3 インフラマソーム・炎症性サイトカインの過剰な

1）Yamada S, Ko T, Ito M, Sassa T, Nomura

活性化をきたしていることが確認された．変異免疫細胞に

S, Okuma H, Sato M, Imasaki T, Kikkawa

おける機能異常がマウスの⼼臓傷害につながることが⽰唆

S, Zhang B, Yamada T, Seki Y, Fujita K,

された．これらの知⾒を論⽂報告した．

Katoh M, Kubota M, Hatsuse S, Katagiri M,【考察】

Hayashi H, Hamano M, Takeda N, Morita H,

本研究により DNA 損傷応答遺伝⼦変異によるクロー

Takada S, Toyoda M, Uchiyama M, Ikeuchi

ン性造⾎が，⼼臓機能障害を引きおこす可能性が⽰唆さ

M, Toyooka K, Umezawa A, Yamanishi Y,

れた．がん治療により増強するクローン性造⾎が，治療

Nitta R, Aburatani H, Komuro I. TEAD1

関連⼼⾎管合併症の発症に関わる可能性を⽰したことで，trapping by the Q353R-Lamin A/C causes

この病態の新たな治療に繋がる道が開かれた．今後は詳

dilated cardiomyopathy. Sci Adv. 2023 Apr

細なメカニズムの解明や他病態に与える影響について研14;9(15):eade7047.

究が期待される．
【文献】
Yura Y, Cochran J., Walsh K. Therapy-related

クローン性造血が心血管病に与える影響の解明
由

良

義

充

（名古屋大学医学部附属病院循環器内科）

clonal hematopoiesis: A new link between cancer
and cardiovascular disease. Heart Fail Clin.
8(3):349-359. (2022)
Yura Y, Miura-Yura E, Katanasaka Y, et al. The【⽬的】

cancer therapy-related clonal hematopoiesis

⾼齢者に⾼頻度に確認されるクローン性造⾎という現driver gene Ppm1d promotes inflammation and

象は，近年明らかになった⼼⾎管疾患の新規危険因⼦でnon-ischemic heart failure in mice. Circ Res.

ある．クローン性造⾎はがん治療を受けた患者にも⾼頻129(6):684-698. (2021)

度に認められ，がん治療関連クローン性造⾎と呼ばれているが，⼼⾎管疾患に与える影響は不明であった．我々はがん治療関連クローン性造⾎に特徴的な DNA 損傷応

分岐鎖ケト酸とその代謝酵素に着目した肥満症に

答遺伝⼦ PPM1D に注⽬し，変異を有する免疫細胞が⽣対する新規治療薬の開発

体に与える影響について検討した．
【⽅法】

吉

田

尚

史

（Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School）

免疫細胞における PPM1D 変異が⼼臓⾎管病に与える影響を解析するために，レンチウイルスと CRISPR/Cas9

昨 年までの研 究により， 褐 色 脂 肪 組 織におけるマクシステムを⽤いて，Ppm1d クローン性造⾎モデルマウス

ロファージが，同組織の分岐鎖アミノ酸 / 分岐鎖ケト酸を作 成した．このマウスにアンジオテンシン II 負荷によ

（BCAA/BCKA）代謝を制御し，肥満形成に強く関与しる⼼不全を発症させてその表現型を確認した．加えて，ている事を明らかとした 1）．そこで本年度以降は，褐色脂Ppm1d 変異を有するマクロファージ細胞株を作成し，そ肪組織における BCAA/BCKA 利用がどのように制御されの細胞機能を解析した．

ているのか，特に未だ未同定な BCKA のミトコンドリアト【結果】

ランスポーターの解明も含めて，その全容を明らかとする

Ppm1d クローン性 造 ⾎モデルマウスは，アンジオテ
ンシン II 刺激に対してコントロール群と⽐較して⾼度のリモデリングを来した．Ppm1d 変異マクロファージを⽤いた細胞実験においては，DNA 損傷応答が抑制され，

144

事とした．
【目的】
BCKA のミトコンドリアトランスポーターを解明する事．

Vascular Biology Innovationに関する研究助成【方法】
過 去 の 報 告 2） から，BCKA のミトコンドリアトラン
スポ ー タ ーと BCKA のミトコンドリア 代 謝 酵 素 で ある Branched Chain Amino Acid Transaminase 2（BCAT2）が近接しているという仮説を立てた．そこで，ラット心筋細胞株 H9c2 を用いた近接依存性標識法により，BCAT2 に近接しているタンパク / トランスポーターを同定し，トランスポーター候補を抽出した．近位依存性ビ
オチン化酵素として TurboID を用いた．
【結果】
プロテオミクスにより，H9c2 の BCAT2 に近接するタンパクが 1200 個同定された．そのうちペプチド数が 5以上のタンパクは 276 個であった．この内，コントロール（empty vector）と比 べて TurboID 群 で 3 倍 以 上 検出されたタンパクは 150 個であった．
【考察】
今後は，この 150 個の中からトランスポータータンパクだけを抽出し，過去の文献とも見比べながら，BCKA のトランスポーター候補となり得るものを 5 つ程度選定する．
その後候補タンパクをコードする遺伝子をノックアウト / ノックダウンした H9c2 細胞を作成し，BCKA の取り込みを評価する予定としている．
【文献】
1）Yoshida N, Yamashita T, Osone T, Hosooka
T, Shinohara M, Kitahama S, Sasaki K, Sasaki
D, Yoneshiro T, Suzuki T, Emoto T, Saito Y,
Ozawa G, Hirota Y, Kitaura Y, Shimomura
Y, Okamatsu-Ogura Y, Saito M, Kondo A,
Kajimura S, Inagaki T, Ogawa W, Yamada T,
Hirata KI.: Bacteroides spp. promotes BCAA
catabolism in brown fat and inhibits obesity.
iScience. 24(11); 103342 (2021).
2）S M Hutson, T R Hall.: Identificationof the mitochondrial branched chainaminotransferase as a branched chainalpha-keto acid transport protein. J Biol
Chem.268(5): 3084-91 (1993).

145

研究報告

全身性炎症疾患の病因・病態の解明に関する研究助成

サルコイドーシス患者における硝子体液を用いた網羅的miRNA解析による新規バイオマーカーの
探索
朝

蔭

正

樹

（東京医科大学臨床医学系眼科学分野）【目的】
サルコイドーシスは全身に肉芽腫性病変を生じる疾患であり，眼科領域においてはぶどう膜炎の原因として最も頻度が高い．しかし，同様の肉芽腫病変を示しながら，全身の所見が無いためにサルコイドーシスの診断に至らない症例も少なくない．マイクロ RNA（miRNA）はヒトでは既に 2,600 種類以上の miRNA が同定され，多くの疾患でバイオマーカーとして注目されている．今回，サルコ
イドーシスに特異的なバイオマーカーを探索するために，硝子体中の miRNA を解析したので報告する．
【方法】
東京医大病院眼科を受診し，硝子体混濁を呈したサル
コイドーシス患者 7 例を対象とした．硝子体手術の際に採取された硝子体から RNA を抽出し，マイクロアレイを用いて miRNA の発現を網羅的に解析した．対照として非炎症性疾患 24 例，原因不明ぶどう膜炎 5 例の硝子体を用い，本症に特異的な miRNA とパスウェイの同定を
試みた．
【結果】
非炎症性疾患と比較した場合，サルコイドーシスではまた，発現減弱 miRNA を用いたパスウェイ解析では

1,353 種類の miRNA の発現が有意に上昇し，22 種類

いずれの疾患群との比較でも TGF- βなどのパスウェイのの miRNA の発現が有意に低下していた．原因不明ぶ関連が示唆された．

どう膜炎との比較では 616 種類の発現が有意に上昇し，18 種類の発現が有意に低下していた．これらの miRNAを用いたクラスター解析ではサルコイドーシスはクラスターを形成した．

146

全身性炎症疾患の病因・病態の解明に関する研究助成導されたエピジェネティック変化が，炎症寛解後も残存し，
腸管免疫機構が炎症性に傾くことが IBD 再燃に寄与するという仮説を立てた．そこで，慢性炎症によって腸管マクロフ
ァージに生じるエピジェネティック変化を評価し，エピジェ
ネティック変化の持続性および腸管マクロファージの機能に及ぼす影響を解析することを目的とした本研究を立案した．
【方法】
デキストラン硫酸ナトリウム (DSS) 誘導性慢性腸炎モデ
ルマウスを用いた．慢性腸炎時における評価として比較①を実施するため，Group1：DSS 誘導性慢性腸炎群，Group2：Group1 の対照群を作成した．また炎症改善後について評価するため，3 週間の回復期をおいた比較②を実施した．比較②のために Group3：DSS 誘導性慢性腸炎改善後群，Group4：Group3 の対照群を作成した．さらに，Group1 と Group3 により慢性腸炎後の回復期間で生じる変化を比較した（比較③）（図１）．
各 Group のマウス腸管から磁気ビーズ法を用いて腸管マ
クロファージとして CD11b 陽性細胞を回収し，ビーズア
レイ法により DNA メチル化を評価した．
【結論】
硝子体液の miRNA を網羅的に解析することで，サルコイドーシスに特異的な miRNA を同定した．サルコイドーシスでは他の疾患と異なるプロファイルを示し，その発現の解析は診断マーカーになる可能性がある．

慢性腸管炎症により生じる腸管マクロファージの持続的エピジェネティック変化が免疫機能へ及ぼ

図 1 マウス実験デザイン

す影響についての検討
小

栗

典

【結果】

明
（杏林大学消化器内科学）

各 Group の DNA メチル化プロファイルを UMAP plot により示す（図２）．慢性腸炎を生じている Group1 とその対

【目的】

照群である Group2 の比較①において，DNA メチル化の構

網羅的なエピゲノム解析によって炎症性腸疾患（IBD）

成は両群で異なった分布を示した．3 週間後の比較②におの発症，病態，予後に関連した DNA メチル化が報告さいて，慢性腸炎改善後の Group3 の DNA メチル化は対照れている．腸管マクロファージは IBD 病態において重要群である Group4 とは異なっていた．Group1 と Group3 のな役割を果たしていると考えられている．また，DNA メ

メチル化プロファイルは類似していた（比較③）．DNA メチ

チル化などのエピジェネティック変化は細胞分裂後も継承

ル化遺伝子の個別解析では，比較①で Group2 に生じたされうる．我々は慢性炎症により腸管マクロファージに誘DNA メチル化変化の一部は Group4 でも持続を認めた．

147

全身性炎症疾患の病因・病態の解明に関する研究助成

し，腸炎が自然完治する感染 6 週間後に，バロスタット法（図 1）によって内臓知覚を定量評価した．

図 2 DNA メチル化構成の UMAP plot

【考察】
本研究において，慢性腸炎により腸管マクロファージの
図1

DNA メチル化に変化が生じ，慢性腸炎改善後も，健常な対照群と異なったまま炎症時のプロファイルに類似することが示唆された．今後，慢性炎症に伴って生じたエピジ【結果】ェネティック変化による腸管マクロファージの機能変化を

C.rodentium 未感染状態では生じなかったが，TLR9KO

評価するために，上記 Groups1-4 から得られた腸管マクマウスに感染させると，直腸内バルーン刺激に対する顕著

ロファージの炎症性刺激時のサイトカイン産生能を比較検な知 覚 過 敏を認めた（ 図 2）． 一 方，WT，TLR2KO，討する予定である．

TLR4KO マウスでは感染後においても知覚過敏は生じなかった（図 2）．この結果から，生来の TLR9 シグナル欠
損と病原細菌感染の両者が内臓知覚過敏誘発に必要で感染性腸炎後に誘発されるPI-IBSの病態に関わるあると考えられた．次に，この現象に関わる腸管組織の遺自然免疫受容体シグナルの解明

伝子群を microarray 解析したところ，感染後 TLR9KO

古

谷

聡

史

（島根大学医学部附属病院消化器内科）

マウスでは WT マウスと比較して，疼痛を誘導するブラジキニン受容体の一つである BDKRB2 の発現量が有意に増加しており，内臓知覚過敏の一因と考えられた．そこ【目的】

で PI-IBS を発症した TLR9KO マウスに対して BDKRB2

過敏性腸症候群 (IBS) は，器質的異常がないにも関わ選択的拮抗薬（HOE140）を投与して IBS 症状緩和にらず腹痛や排便異常を生じる症候群である．その IBS の効果があるか検討した．結果，バロスタット法の直前になかで，重篤な腸炎回復後に生じる post-infectious IBS

HOE140 を腹腔内投与することによって，内臓知覚過敏（PI-IBS）という病態が知られている．われわれは，大は顕著に抑制された（図 3）．

規模な食中毒患者の追跡調査で，Toll 様受容体（TLR）【考察】-9 の SNPs が PI-IBS 発症に有意な相関を示した報告にTLR9 シグナル欠損に腸管感染が加わることが PI-IBS

着目し，「TLR9 シグナル異 常と PI-IBS の病 態の関 連，

発 症 のトリガーになると考えられた．PI-IBS の 病 態にさらに TLR9 pathway をターゲットとした治療が可能か」

BDKRB2 の関与が示唆され，その拮抗薬は有効な治療についてマウスモデルを用いて検討することを目的とした．

法になる可能性があると考えられた．

【方法】
マ ウス 天 然 病 原 菌 で あ る Citrobacter rodentium（C.rodentium ）を野生型（WT），TLR2KO，TLR4KO，および TLR9KO マウスに経口投与して感染性腸炎を誘発

148

全身性炎症疾患の病因・病態の解明に関する研究助成

FXR の内因性アゴニストである CDCA が IBD の大腸上皮機能に与える影響について検証する．
【方法】
IBD 患者における CDCA 代謝異常を確認するため，
IBD 患者の便検体を用いて，液体クロマトグラフィ質量
分 析（LC-MS）による CDCA の定 量を行った．また，
IBD 患者の便検体より抽出した DNA を用いて CDCA 代謝に関わる腸内細菌の 16SrRNA 予測メタゲノム解析を行った．続いて，大腸上皮細胞株である Caco2 細胞にCDCAを投与しTransendothelial electrical resistance（TEER）により大腸上皮透過性を評価した．
図2

【結果】

図1

図3

Crohn's disease（CD）患者および Ulcerative colitis（UC）
患者では便中 Chenodeoxycholic acid（CDCA）量が有意に高値であったFarnesoid X receptor（FXR）アゴニストが炎
症性腸疾患の大腸上皮に与える影響の解明
澁

谷

尚

希

（東京慈恵会医科大学 消化器・肝臓内科）【目的】
過脂質代謝と腸内細菌に密接な関わりがある胆汁酸は

図2

CDCA を Caco2 細胞に投与すると Transendothelial electricalresistance（TEER）が有意に低下した

炎症性腸疾患（IBD）の病態に関与していると考えられる．
胆汁酸の受容体である Farnesoid X receptor（FXR）

IBD 患者では non-IBD（NIBD）患者よりも有意に便は IBD の大腸上皮にも発現しており，胆汁酸のうち FXR

中 CDCA 量が 高かった（ 図 1）．また，IBD 患 者ではと親和性が最も高いケノデオキシコール酸（CDCA）は

CDCA からリトコール酸に変換する腸内細菌の存在量がIBD の大腸上皮機能に関与している可能性がある．しか低下していた．続いて，Caco2 細胞に CDCA100µM をし，その詳細については不明瞭な点が多い．本研究では，投与すると，24 時間後の TEER が有意に低下した（図 2）．

149

全身性炎症疾患の病因・病態の解明に関する研究助成【考察】② LAP1 欠損マウスの DSS 誘導性潰瘍性大腸炎モデル

本研究では，IBD の腸管内では内因性の FXR アゴニの解析ストである CDCA 量が増加し大腸上皮機能を障害するこ

8 週齢の LAP1 欠損マウス及び野生型対照群に自由飲とを示した．しかし，人工的に生成した FXR アゴニストで水にて 2.5% のデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を投ある obeticholic acid では IBD の上皮障害性を改善し与し，１週間に渡り病態形成を観察した．その後，安楽たとも報告されており ，CDCA の上皮障害作用が FXR

死させ病理解析を実施した．

を介したものであるのかその機序についてさらなる検証が【結果】必要と考えた．

①【文献】

スに対する脆 弱 性を示した．また，LAP1 欠 損 MEF と

１）Gadaleta RM, van Erpecum KJ, Oldenburg

LAP1 欠損Δ Ub-MEF ではネクロプトーシスに対する感

B. Farnesoid X receptor activation inhibits

受性に有意な差が認められなかったことから，LUBAC/

inflammation and preserves the intestinal

LAP1 による RIPK1 の Ub 化はネクロプトーシスを抑制す

barrier in inflammatory bowel disease. Gut.

ることが示唆された．

2011 Apr;60(4):463-72.

② LAP1 欠損マウスでは下痢・血便スコアが有意に悪１）

Δ Ub-MEF は野生型 MEF に比べてネクロプトーシ

化するという結果が得られた．また大腸の病理組織学的解析を行ったところ，LAP1 欠損マウスでは粘膜上皮のユビキチン修飾系によるネクロプトーシス制御に脱落が激しく，炎症細胞浸潤の増大も観察された．

立脚した炎症性腸疾患発症機構の解明

【考察】

清

水

康

平

（大阪公立大学大学院医学研究科医化学）

LAP1 は LUBAC と協調して RIPK1 に複合型の Ub 鎖を形成することでネクロプトーシスを抑制していることが考えられた（図 1）．また，LAP1 欠損マウスは DSS 誘導【目的】
我々が 新 規 LUBAC 結 合 因 子として同 定した LAP1（LUBAC associated protein 1）は，炎症シグナルに性潰瘍性大腸炎モデルに脆弱になることが確認できた．
現在，この脆弱性がネクロプトーシスに依存しているかマ
ウス遺伝学にて解析中である．

応答して LUBAC に結合し，RIPK1 に複合型ユビキチン（Ub）鎖を形成することで炎症誘導性細胞死であるネク
ロプトーシスを抑制していることが明らかになりつつある．
そこで本研究では，LUBAC/LAP1 による複合型 Ub 鎖形成を介したネクロプトーシス制御機構を詳細に解析し，ネクロプトーシスが病態形成に関与するとされる炎症性腸疾患（IBD）との連関を究明することを目的とした．
【方法】① LUBAC/LAP1 による RIPK1 の Ub 化の意義の解析
質 量 分 析により LUBAC/LAP1 が 標 的とする RIPK1の Ub 化 部 位 を同 定し， 当 該 Ub 化 部 位 の 点 変 異 体（Δ Ub 変異体）にて再構成したマウス胚性線維芽細胞（MEF）を樹立した．野生型 MEF とΔ Ub 変異体発現
MEF（Δ Ub-MEF）にネクロプトーシスを誘導し感受性を比較した．

150

図1

全身性炎症疾患の病因・病態の解明に関する研究助成

プラスミノーゲン活性化阻害因子-1に着目した非感染性ぶどう膜炎治療効果の検討
鈴

木

佳

代

（北海道大学大学院 医学研究院 眼科学教室）【考察】
本研究では，ぶどう膜炎患者において PAI-1 の硝子体液中濃度が上昇していること，EAU の網脈絡膜組織において PAI-1 の mRNA 発 現が 亢 進していること，そして PAI-1 阻 害により EAU の臨 床 的 重 症 度 が 低 下す
ることが 示された．PAI-1 は low-density lipoprotein【背景と目的】

receptor-related protein を介したマクロファージの遊非感染性ぶどう膜炎の治療には，主としてステロイド薬，

走 に関 与 すること (Ichimura, et al ., 2013; Park, et

免疫抑制薬や tumor necrosis factor 阻害薬などが用い

al ., 2020) や，toll like receptor-4 を介してマクロファられている．しかしながら，これらの治療薬でも重篤な視ージを活性化すること (Gupta, et al ., 2016) が報告され力障害に陥る症例がみられ，新薬の開発が今も強く望まており，これらの機序が炎症を軽減させた要因として考えれている．そこで新たな治療標的として，plasminogenられる．以上のことから，PAI-1 がぶどう膜炎に対する新

activator inhibitor(PAI)-1 に着目した．PAI-1 は線 溶

たな治療標的となる可能性が示された．

系の生理的阻害因子の一つであるが，近年，PAI-1 は活【文献】

性化マクロファージの遊走に不可欠なタンパクとして機能

Ichimura, A, Matsumoto, S, Suzuki, S, Dan, T,

していることが明らかとなり，炎症と線維化を呈する疾患

Yamaki, S, Sato, Y, et al. : A small moleculeの新たな治療標的分子として注目されている．そこで，本

inhibitor to plasminogen activator inhibitor 1

研究では PAI-1 の眼炎症病態への関与について検討する

inhibits macrophage migration. Arterioscler

ことを目的とした．

Thromb Vasc Biol, 33, 935-942 (2013).

【対象と方法】

Park, HJ, Chi, GY, Choi, YH, Park, SH. : Lupeol

特発性ぶどう膜炎患者 16 名（ぶどう膜炎群），非炎症

suppresses plasminogen activator inhibitor-1-

性眼疾患患者 16 名（対照群）を対象とし，硝子体手術

mediated macrophage recruitment and attenuates

時に採取された硝子体液中の PAI-1 のタンパク濃度を測

M2 macrophage polarization. Biochem Biophys

定した．実験的自己免疫性ぶどう膜網膜炎 (EAU) マウス

Res Commun, 527, 889-895 (2020).

を用いた検討では，免疫後，11，16，21 日目の EAU マ

Gupta, KK, Xu, Z, Castellino, FJ, Ploplis, VA.

ウスの網脈絡膜組織から，PAI-1 の mRNA 発現を測定し，: Plasminogen activator inhibitor-1 stimulates

対照群と比較した．EAU マウスに対する PAI-1 阻害の効m a c r o p h a g e a c t i v a t i o n t h r o u g h To l l - l i k e

果を検討するため，PAI-1 阻害剤もしくは溶媒のみ（対照Receptor-4. Biochem Biophys Res Commun, 477,

群）を免疫の 3 日後から 20 日目まで連日投与した群を作

503-508 (2016).

製し，臨床的重症度を経時的（3-4 日毎）に観察した．
【結果】
硝子体液中の PAI-1 はぶどう膜炎群において対照群と比べ，有意に高値を示した (p<0.05)．EAU マウスを用いた検討では，免疫後 16 日目の網脈絡膜組織において，
EAU 群で PAI-1 の mRNA 発現が対照群と比べて有意

多能性幹細胞由来浮遊腸オルガノイドによる炎症性腸疾患に対する再生医療基盤技術の開発
髙

橋

純

一

（東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科消化器病態学）に亢進していた (p<0.05)．EAU マウスの臨床的重症度は，
PAI-1 阻害剤投与群では対照群と比較して，免疫後 14，
17，21 日目で有意に低下した (p<0.05)．

【目的】
近年の炎症性腸疾患の増加に伴い，あらゆる薬剤に抵抗性を示す難治例も増加している．そのような症例では高度炎症や狭窄，線維化により広範な腸管切除を余儀なく151

全身性炎症疾患の病因・病態の解明に関する研究助成

され短腸症候群に陥る危険性を有する．短腸症候群の根本的治療である腸管移植は，生着率の低さやドナー不足
から一般治療としては確⽴していない．多能性幹細胞由来の腸オルガノイド（HIO）は全層性の腸管構造が再現可能であり腸管再生医療への応用が期待されるが，従来の誘導法は培養効率の低さや不均質性，大型化が困難といった問題から，臨床応用に向けた課題が指摘されていた．本研究では腸再生医療への実用化を見据え，均質な HIO の効率的な培養法の確⽴及び HIO の大型化を目指した．
【方法】
ヒト iPS 細胞から誘導した中・後腸細胞を単一細胞化
し，マイクロウェルを多数有する低接着プレート上に播種しスフェロイド化を試みた．スフェロイドの最適な浮遊培養の条件検討を行い，HIO へと分化誘導した．浮遊状態で誘導された HIO を免疫不全マウスの腸間膜へ移植
し，体内での組織構築を検討した．
【結果】
中・後腸細胞は速やかに凝集しスフェロイド（s-Spheroid）

全身性強皮症における新たな治療：抗フラクタル
カイン抗体の実用に向けて長谷川

巧（福井大学医学部附属病院）

を形 成した．s-Spheroid は腸 前 駆 体としての性 質を有し，形態や遺伝子発現において高い均一性を示した．マ
イクロウェル径や播種細胞数を調整することで，大型の【目的】

s-Spheroid が 作 成 可 能であった．s-Spheroid は低 濃

全身性強皮症は免疫異常を背景に皮膚や内臓に線維度の細胞外基質を含有する培地での浮遊培養が可能で化や血管病変をきたす膠原病であるが，その病態は明らあり，大型の s-Spheroid はバイオリアクター内での回転かでない．また，ケモカインを標的としたヒトにおける抗浮遊培養で効率的に成熟した HIO へと分化した．浮遊体治療は確立されていない．強皮症患者の血清中ではフ状態で誘導した HIO はマウスへの移植を経て成熟した上ラクタルカイン（FKN：別名 CX3CL1）が著明に上昇し

皮，粘膜下層及び筋層を伴う腸組織を構築した．

ており，そこで FKN を標的とした中和抗体を全身投与す【結語】

ることで炎症および線維化を緩和できるのではないかと考HIO の浮遊状態での培養法を樹⽴した．また回転浮
遊培養を用い HIO の大型化に成功した．均質かつ安定

え，検討することとした．
【方法】

的な HIO 誘導が可能な本法は腸管再生医療の基盤技術

放射線を照射した BALBc 背景のマウスに D10B2 背としての応用が期待される．本研究成果は下記の通り学

景のマウスの骨髄を移植し，GVHD による全身の皮膚や術誌１）, に報告した．

肺の線維化を誘導し，これらを抗 FKN 抗体投与群，コ【⽂献】

ントロール Ig 投与群，Syngeneic の３群に分けて効果

１）Takahashi J, et al: Suspension Culture in aを検討した．各群の間で皮膚硬化による脱毛の面積をス

Rotating Bioreactor for Efficient Generation

コア化し，皮膚，肺の線維化の程度を組織学的な検討，

of Human Intestinal Organoids. Cell Reports

組織中のコラーゲン定量，筋線維芽細胞の数などから評

Methods, Volume.2, Issue.11, 2022

価した．また免疫染色にて浸潤する炎症細胞の組織浸潤の評価を行った．

152

全身性炎症疾患の病因・病態の解明に関する研究助成

さらに組織中のサイトカインについて RNA シークエンスで興味深いことに Il1r1 は腸管 M φのみに発現し，他臓器網羅的に，そして ELISA 法を用いて蛋白レベルで測定した．

の M φには発現していないことから，腸管 M φの特殊性【結果】を規定していると仮説を立てた．また，マウス M φ由来

GVHD 群では皮膚，肺ともに著明な線維化が誘導され，抗 FKN 抗体投与群で濃度依存性に抑制された．

細胞株を用いて IL-1R1 過剰発現株を作製し，IL-1 β刺激を行ったところ IL-10 の発現および産生が観察された．

免疫染色では皮膚，肺ともに GVHD 群でリンパ球や本研究では IL-1R 拮抗薬の投与によってマウスの IL-10

マクロファージの組織浸潤が多くみられたが，抗体投与が低下し IBD を発症するのか，マウス腸炎モデルが同様により抑制された．さらに蛍光免疫染色では GVHD 群に増悪するのかについて検討する．さらにヒト IBD 患者

で，CX3CL1 の特異的レセプターである CX3CR1 陽性において IL-1R の発現と IL-10 の産生について検討し，のリンパ球やマクロファージの組織浸潤が著明にみられた

IBD の病態解明および治療の一助になることを目的とする．

が，抗体投与により CX3CR1 陽性細胞の割合が低下し【方法】

た．皮膚と肺の組織抽出液において，皮膚では IL-4,6，１）マウスへの IL-1R 拮抗薬投与

TNF- α， 肺では TNF- αが GVHD で増 加したが 抗 体

Recombination activating gene 2 knockout

投与により抑制された．皮膚の RNA シークエンスでは（Rag2KO） マウスに Isotype control および Anti-IL-

M1,2 マクロファージの指標となる iNOS と Arg1，炎症

1R1 抗体を腹腔内投与した．腸管から粘膜固有層単核や線維化に重要な IL-6，炎症を抑制する IL-10，線維細胞（LPMC）を回収し，MACS で CD11b ＋の腸管 M化に重要な TGF- βや Spp1，炎症性サイトカインである

φを分離し，Il10 の発現を qPCR で評価した．

TNF- α，CX3CR1 陽性 non-classical monocytes の２）腸炎モデルを用いた検討

マスター制御因子である Nr4a1 の遺伝子発現が GVHDDSS を経口投与した Rag2KO マウスに対して，上記とにより増加したが，抗体投与で抑制された．

同様に抗体を投与し，腸管長にて炎症を評価した．

【考察】3）ヒト病理組織を用いた検討

GVHD モデルにおいて，抗 FKN 抗体は CX3CR1 陽性

IBD 患 者と正 常 の 大 腸 組 織 切 片を用いて，CD68，

単球マクロファージ，T 細胞の浸潤を抑制した．そしてそれ

IL-1R1 の蛍光二重免疫染色を行い，腸管 M φに発現す

らの細胞による炎症，線維化を引き起こすサイトカインの産る IL-1R1 を検討した．

生が抑制され，さらに線維芽細胞からの細胞外マトリック

４）ヒト手術検体を用いた検討

ス産生が低下することで線維化が抑制されると考えられた．

IBD 患 者の手 術 検 体の炎 症・ 非 炎 症 部 位および大腸 癌 患 者 の 正 常 部 位 から LPMC を回 収し，MACS にて CD3 －，CD33 ＋の腸管 M φを分離し，IL1R1 および腸管免疫の恒常性と破綻におけるIL-1R経路のIL10 の発現を検討した．

役割の解明

【結果】

日

比

則

Isotype control および Anti-IL-1R1 投与群では，腸孝（北里大学北里研究所病院）

管 M φにおける Il10 の発現に統計学的な差は認められなかった（図 1）．さらには DSS 投与腸炎モデルを用い【背景と目的】
腸管マクロファージ（M φ）は IL-10 を恒常的に産生た検討では，Anti-IL-1R1 抗体投与群で腸管長は短いが統計的な差は認めなかった（図 2）．

することで，外来抗原に対する過剰な免疫応答を抑え，腸管の恒常性維持に重要な役割を果たしている．我々はこれまで腸管 M φの恒常的な IL-10 産生が腸内細菌非依存的かつ MyD88 依存的であることを見出し，その経路として IL-1 β /IL-1R が関与している可能性を考えた．

153

全身性炎症疾患の病因・病態の解明に関する研究助成

conditional knockout マウスによる IL-1R-KO マウスを作製し観察を行い，さらにはヒト IBD 患者のサンプル数を増やし検討を行う予定である．

図 1 Anti-IL-1R1 による Il10 の発現量

図 3 ヒト腸管 M φによる IL1R1 の発現量

図 2 腸炎モデルにおける腸菅長（cm）
また，ヒト病 理 組 織では腸 管 M φでの IL-1R1 の発現は認めたものの陽性細胞の判断が難しく比較が困難であった．手術検体を用いた検討では IL1R1 の発現に差

図 4 ヒト腸管 M φによる IL10 の発現量は認めなかったが，クローン病（CD）の非炎症部ではIL10 の発現が上昇する傾向がみられた（図 3，4）．
【考察】
マウスを用いた Anti-IL-1R1 抗体投与で Il10 の発現【文献】
１）Kobayashi T et al. IL-10 regulates Il12bは抑制されなかった．また，腸管の炎症は改善しなかった．

expression via histone deacetylation:

IL-1 β /IL-1R 経路以外の経路による代償的な IL-10 のimplications for intestinal macrophage

活性化が影響している可能性が考えられた．病理組織でhomeostasis. J Immunol, 189(4), 1792-は IL-1R1 の発現はみられたが，非特異的な蛍光のため

1799(2012).

比較が困難であり，さらなる条件検討は必要と考えられ

２）Shubhra S et al. IL-1 α Mediates Innate

た．また，ヒト腸管 M φでは IL1R1 の発現に差は認め

and Acquired Resistance to Immunotherapyていなかった．ただし，各検体でバラツキがあるため，患in Melanoma. J Immunol, 206(8), 1966-

者背景や病理組織も含めた検討も必要と考えた．今後は1975(2021)．

154

全身性炎症疾患の病因・病態の解明に関する研究助成

イメージングサイトメトリーを利用した全身性強皮症でのB細胞形態異常に関する検討
松

田

和

樹
（東京大学医学部附属病院皮膚科）【結果】
全 B 細胞のデータを使用して「Day3 HC 刺激あり vsDay3 HC 刺激なし」の分類器を作成し，Day0 の各サ
ンプルで評価したところ（アプローチ③），教師あり学習モデルである support vector machine（SVM）スコアの陽性率が SSc heavy > SSc mild > HC の順となった【目的】（図 2）．SVM スコア陽性と判断された Day0 の各検体

全身性強皮症（systemic sclerosis; SSc）の病態にでは，CD27/CD86 high の細胞が enrich されていたが，は B 細胞が大きく寄与することが分かっている１）．しかし，

CD27/CD86 low の細胞も一定数含まれていた（図 3）．

患 者の B 細 胞の中で正 常 B 細 胞と病 原 性 B 細 胞を明さらに教師なし学習によるアプローチとして，Day0 HC，

確に識別できる優れた表面マーカーは見つかっていない．

Day0 SSc mild，Day0 SSc heavy，Day3 HC 刺激あり，

本試験では，イメージングサイトメトリー技術の一つである

Day3 HC 刺激なしの測定データを Uniform Manifold

ghost cytometry（GC）を用いて２），細胞形態情報にApproximation and Projection（UMAP）により展開基づいた正常 B 細胞と SSc 患者の異常 B 細胞の判別をしたところ（アプローチ④），SVM スコアが高い B 細胞試みた．

の局在が認められた（図 4）．

【方法】
健常人（healthy control; HC），SSc 軽症患者（SScmild）および SSc 重症患者（SSc heavy）の末梢血（全血）を，10mL ずつ採血した．密度勾配遠心により末梢血単核球を単離後，untouched isolation により B 細胞を単離した．機械学習の教師用ラベルおよび細胞プロファ

図 2 教師あり学習による異常 B 細胞の検出

イル解析のために細胞を免疫染色したのち，2 ドナー由来の B 細胞を混合し，GC で測定を行った．異常 B 細胞を分類するための機械学習モデルのトレーニングを行う目的
で，HC の B 細胞については，刺激あり / なしの条件で培養し，3 日間の培養後にも GC で測定を行った．測定データを用いて，教師あり学習（①②③），および教師なし
学習のアプローチ（④）で，SSc 患者の異常 B 細胞の分類を検討した（図 1）．

図 3 教師あり学習により異常 B 細胞と判定された細胞集団の marker profile

図 4 教師なし学習による異常 B 細胞集団の可視化
図 1 実験の概要

155

全身性炎症疾患の病因・病態の解明に関する研究助成【考察】

作成元の審良研究室との共同研究により使用する．これ

細胞表面マーカーでは分類できない細胞サブセットの違らのマウスにブレオマイシンを背部皮下に 4 週間連日皮下

いを GC が捉えている可能性が示唆された．GC により選注を行い，組織学的に皮膚の線維化や各種遺伝子発現

別される異常 B 細胞の病態生理学的な意味を検討するに量の検討を行う．

は，セルソーティングにより異常 B 細胞を分取し，さらに【結果と考察】解析する必要があると考えられた．

Regnase-1 過剰発現マウスは IL-6 の産生を抑える事【文献】

が示されており，ブレオマイシンによる線維化の抑制を期

１）Yoshizaki A. “Pathogenic roles of B lymphocytes

待して実験を開始した．しかし，背部皮膚に紅斑を自然

in systemic sclerosis” Immunol Lett ., 2018,

発症することが判明し，組織学的にも野生型と比較して195:76-82.

表皮肥厚と真皮へのリンパ球を主体とした炎症細胞浸潤

２）Ota S et al ., “Ghost cytometry” Science ., 2918,
360:1246-1251.

が見られることが明らかになった．背部皮膚から行った
RNA sequencing では，野生型と比較して，ケラチン遺伝子群の有意な上昇が見られたが，病態に関与していると考えられるサイトカインやケモカインの遺伝子発現は有全身性強皮症の病態における Regnase-1 の関与
森

坂

広

行

大阪大学大学院医学系研究科皮膚科学教室（現所属:大阪大学大学院医学系研究科 幹細胞遺伝子治療学共同研究講座）

意差が見られなかった．今後再検討を予定している．線
維芽細胞特異的 Regnase-1 KO マウスは現在作成中であり，作成でき次第ブレオマイシン誘発強皮症モデルにて検討予定である．

【目的】
全身性強皮症は皮膚と内臓での線維化，血管障害を特徴とする自己免疫性疾患である．線維化は主に皮膚ぶどう膜炎における眼局所と腸内細菌の関連につに起こり，皮膚硬化と血管障害による難治性皮膚潰瘍

いての検討

は重 篤になることが多い． 全身性 強 皮 症の病 態は未だ山

不 明 な 点 が 多 い．Regnase-1 は RNase 活 性 を 持 ち，

名

智

志

（九州大学大学院医学研究院眼科学）

IL-1 や IL-6 といったサイトカインあるいはケモカインなどの mRNA を分解することで炎症の制御に関わっている．

【目的】

我々はこれまでに，表皮における Regnase-1 が皮膚慢

自己免疫性ぶどう膜炎は眼組織に発現する分子に対す性炎症において抑制因子としての役割を持つことを報告しる炎症反応により，失明を起こしうる自己免疫性疾患であた．皮膚における Regnase-1 が強皮症の病態に関連しる．申請者らは，メラノサイトを標的とする自己免疫性ぶどていることが予想される．本研究では，強皮症におけるう膜炎である Vogt・小柳・原田病（VKH）患者の検体

Regnase-1 の関与を解明するために，線維芽細胞特異および実験的自己免疫性ぶどう膜炎マウスモデル（EAU）

的 Regnase-1 KO マウス，Regnase-1 過剰発現マウスを用いた解析により，Mucosal associated invariant Tを用いて，ブレオマイシン誘発強皮症モデルにおいて皮膚（MAIT）細胞の活性化が臨床症状の改善と視機能回復

線維化について検討する．

に関わることを明らかにした１）．MAIT 細胞は，腸内細菌【方法】

を含む細菌や真菌にのみ存在するビタミン B2 合成経路の線維芽細胞特異的に Cre を発現するマウス（Col1a2.

中間体を認識する T 細胞サブセットである２）．そこで本研

CreER） と Regnase-1 flox マ ウ ス より 線 維 芽 細 胞

究では，自己免疫性ぶどう膜炎における MAIT 細胞の活特 異 的 に Regnase-1 を KO し た マ ウス を 作 出 す る．

性化機構を明らかにするため，腸内細菌の関与を検討す

Reganse-1 flox マウス，Regnase-1 過剰発現マウスはることを目的とした．

156

全身性炎症疾患の病因・病態の解明に関する研究助成【方法】
異なる抗 菌スペクトラムを持つネオマイシン（グラム
陰 性 細 菌 特 異 的 抗 生 剤 ）， バンコマイシン（グラム陽性細菌特異的抗生剤）を用いてマウスの腸内細菌を除去 後， 実 験 的自己 免 疫 性 ぶどう膜 炎（Experimental
Autoimmune Uveitis : EAU）を誘 導し， 誘 導 後 7，
10，14，17，21 日目に眼炎症の重症度を評価した．また，抗原認識に伴い GFP を高感度に発現する MAIT レポー
ター細胞を用いて，各種抗生剤を投与したマウスの腸管から採取した腸内細菌由来代謝産物による MAIT 細胞活性化能を評価した．
【結果】
ネオマイシン投与群では，抗生剤未投与群と比較し，
EAU の臨床症状が増悪する傾向にあった．バンコマイシ
ン投与群では抗生剤未投与群，ネオマイシン投与群と比較し，EAU 誘導後 14 日目，17 日目，21 日目で EAU の臨床症状が有意に軽減した．バンコマイシン投与群の腸内細菌由来代謝産物は，ネオマイシン投与群，抗生剤未投与群と比較し，MAIT 細胞活性化能が有意に高かった．
【考察】
本研究助成のサポートを受け，自己免疫性ぶどう膜炎においてグラム陰性細菌由来代謝産物が，MAIT 細胞の増殖・活性化を誘導し，病態改善に関わることを明らかにすることができた．今後，この発見を基盤として，さらに MAIT 細胞認識抗原の同定，MAIT 細胞の病態制御のメカニズムの解明を目指し研究を発展させていきたい．
【参考論文】
１）Yamana S, et al . Mucosal-associated invariant
T cells have therapeutic potential against
ocular autoimmunity. Mucosal Immunol .
15(2):351-361 (2022).
２）C o r b e t t A J , e t a l . T- c e l l a c t i v a t i o n b ytransitory neo-antigens derived from distinct
microbial pathways. Nature . 509(7500):361-5(2014).

157

研究報告

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成

高脂肪食負荷に対する全身代謝応答における骨格筋でのリジン脱メチル化酵素LSD1の役割
荒

木

裕

貴

熊本大学大学院生命科学研究部代謝内科学講座（熊本大学発生医学研究所 細胞医学分野）【目的】

腹筋重量の増加，さらに空腹時血糖値の有意な低下及びGTT での血糖上昇の抑制傾向を認めた．一方，mKO マ
ウスではリボフラビンによる体重や筋重量の有意な変化や
空腹時血糖値の有意な改善は認めず，また GTT での血糖上昇の抑制は野生型と比較し減弱した．
【考察】
骨格筋の LSD1 欠損により骨格筋，肝臓重量，さらに栄養は骨格筋の筋線維組成や代謝表現型に影響を及

糖代謝も変化したことから，高脂肪食に対する骨格筋でのぼす環境刺激の一つだが，その応答を制御するエピジェ

代謝応答の制御に LSD1 が関わる可能性が示唆された．

ネティックな機構は十分に解明されていない．そこで，高また，高脂肪食負荷時のリボフラビン投与による骨格筋

脂肪食負荷時の骨格筋環境応答において，最近骨格筋

重量変化，体重減少及び糖代謝の改善が LSD1-mKOにおいて環境ストレス応答を緩和し過剰な環境適応を防ぐ

マウスでは認められないことから，リボフラビンが骨格筋役割が報告された１），LSD1 が果たす役割を明らかにする．

の LSD1 を介して代謝表現型を改善しうる可能性が示唆

また，LSD1 の補酵素である FAD 合成の元となるリボフ

された．

ラビンの投与が高脂肪食負荷時の骨格筋表現型に影響す【文献】

るか評価し，LSD1 を標的とした代謝疾患等の治療の可

１）Araki H,et al. LSD1 defines the fiber type-能性に関して検討する．

selective responsiveness to environmental【方法】

stress in skeletal muscle. eLife 12: e84618,

7 週齢の野生型マウス及び骨格筋特異的 LSD1 KO マ

2023.

ウス（LSD1-mKO マウス）に通常食及び高脂肪食を 17
週間負荷し，糖負荷試験（GTT）やインスリン負荷試験（ITT），骨格筋や他の代謝臓器の重量測定，骨格筋のqRT-PCR 等を行なった．
また，食餌負荷後の 10−17 週に飲水中にリボフラビン
を加え，同様の評価を行なった．
【結果】
高脂肪食を与えた野生型マウスでは通常食を与えたマ

膵β細胞におけるMEK/ERKシグナルの役割の解明とその治療応用
生

島

芳

子

（University/BHF Centre for Cardiovascular Science,
The University of Edinburgh）【概要】

ウスと比較し，LSD1 発現が腓腹筋では上昇，ヒラメ筋

2021 年度より，骨髄脂肪に焦点を当てた新たな研究では低下した．また，高脂肪食を負荷した mKO マウスはを展 開している．カロリー 制 限（Caloric restriction:

野生型と比較し，ヒラメ筋，肝臓重量の増加を認め，空CR）下で認められる血中 Adiponectin の濃度上昇に骨腹時血糖値の有意な低下，GTT や ITT の改善傾向を認

髄脂肪から分泌される Adiponectin の増加が寄与していめた．しかし，ヒラメ筋の qRT-PCR では筋線維型，代ることから，現在は主に Adiponectin の CR 下での役割

謝遺伝子の有意な発現変化は認めなかった．

の検討を行っている．昨年度は，本プロジェクトに関連しリボフラビンを与えた野生型高脂肪食群では，リボフラ
ビン非投与群と比べ体重の有意な減少，前脛骨筋，腓

158て，CR 下におけるエネルギー代謝の雌雄差について新たな知見を得ることができた．

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成【結果と考察】食欲やエネルギー代謝を調節している．グレリンと LEAP2

以前に所属したポスドクらにより，CR 時に，雄マウスの糖尿病や肥満の病態との関連を明らかにする目的で，

では体脂肪率の低下と血糖値の改善が顕著に認められる

LEAP2 とグレリンの発現と分泌調節機構を解析した．

一方で雌ではこの効果が低いことが確認されていたが，こ【方法】の分子的背景は明らかでなかった．

糖質あるいは脂質を経口負荷したマウスの血中と臓器研究者らは，まず，皮下脂肪サンプルにおいて，脂肪の LEAP2 とグレリンを測 定した．また，マウス初 代 培

分解 (lipolysis) に働く酵素 HSL のリン酸化が，雄での養肝細胞を，栄養素やサイトカイン，ホルモンで刺激しみ CR 下で有意に亢進していることを見出した．

LEAP2 の発現量を調節する因子を同定した．

また，肝臓サンプル RNA-seq の GSEA 解析を行った【結果】

結果，CR 下において，雄の肝臓では雌に比べて，酸化マウスの肝静脈血の LEAP2 は門脈血より高く，経口糖的リン酸化，クエン酸回路関連遺伝子群の発現が有意に負荷によりさらに上昇した．Corn oil やパルミチン酸を経集積していることを見出した．加えて，CR 下の雄の肝臓口投与したマウスでも，同じように血中 LEAP2 濃度は上では，通常食マウスの雄の肝臓に比べてもこれらの遺伝

昇した（図 1）．LEAP2 は肝臓から分泌されていて，糖子群の発現が有意に集積していた．さらに，血中ケトンや脂肪の負荷がさらに LEAP2 分泌を刺激すると考えられ

値測定の結果，特に CR 下では雄より雌で血中ケトン値

た．マウスに，ブドウ糖あるいは corn oil を経口投与するが高いことが確認された．血中ケトン値は肝臓のアセチルと，3 時間あるいは 6 時間後に肝臓の LEAP2 発現量がCoA のバイオマーカーであり，肝臓アセチル CoA は糖新増加した．初代培養肝細胞をブドウ糖あるいはパルミチン

生を亢進させる作用がある．以上から，CR 下において，酸で刺激すると LEAP2 発現量が増加した．

雄の肝臓ではアセチル CoA をクエン酸回路に利用する一方で，雌においては肝臓アセチル CoA が蓄積しこれが糖新生を促進するため，雌では CR 時の血糖値改善効果が雄に比べて低いという可能性が考えられた（Suchacki etal. eLife , 2023）．
【文献】
Suchacki KJ*, Thomas BJ*, Ikushima YM* etal. The effects of caloric restriction on adipose
tissue and metabolic health are sex- and agedependent. eLife. 2023 Apr 25;12:e88080.

グレリン受容体の内因性アンタゴニストliver-expressed antimicrobial peptide 2（LEAP2）の糖尿病と肥満における生理的役割の解析
イスラム

エムディヌルル（宮崎大学 医学部 生体制御医学研究講座）

図1

【考察】
肝臓が LEAP2 を分泌して血中 LEAP2 濃度を規定する責任臓器と考えられる．また糖や脂質などの栄養素は，肝臓からの LEAP2 分泌を刺激するとともに，肝臓でのLEAP2 発現も刺激した．摂食時にはこのような LEAP2の分泌と発現量の変化が食欲やエネルギー代謝を調節し【目的】て，次の摂食に備える環境を整備している．しかし，長期

肝臓や腸管に高発現する LEAP2 は，摂食亢進，血糖間，過栄養が持続すると，LEAP2 高値から炎症の惹起

上昇，体温低下などのグレリン作用を抑制する．グレリン

やグレリン抵抗性を生じて，体重増加やインスリン抵抗性と LEAP2 は，摂食時・絶食時に反対の血行動態を示して，の一因となる可能性があり今後の検討課題としたい．

159

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成

ユビキチン様修飾因子UFM1の膵β細胞における病態生理学的意義の解析
鵜

澤

博

嗣

（順天堂大学大学院 医学研究科 代謝内分泌内科学講座 助教）【考察】UFM1-ϐKO マ ウ ス の 耐 糖 能 悪 化 の 背 景 として，
UFMylation 不 全によって膵 ϐ 細 胞 死の増 加とα細 胞など他の膵 内 分 泌 細 胞 へ 分 化 転 換 が 生じている可 能
性 が 示 唆された．これまでの電 子 顕 微 鏡 観 察により，
UFM-ϐKO マウス膵島では ER 形態異常を観察しており，【目的】

UFMylation 不全によって ER ストレスが適切に処理でき

ユビキチン様修飾因子（UFM1）による翻訳後修飾でなくなった結果，これらの表現型を呈している可能性があある UFMylation は，小胞体（ER）ストレス応答やオーる．今後は，その分子メカニズムの詳細を細胞生物学的トファジーとの関連が注目されている．一方で，その病態手法により明らかにしていきたい．

生理学的意義は未解明な点が多い．膵 ϐ 細胞は大量のインスリン産生に伴う恒常的ストレスに晒されている細胞であり，特に 2 型糖尿病発症に先行すると考えられるインスリン抵抗性の増大によってインスリン分泌需要が増大することは，膵 ϐ 細胞に対して過酷な負荷がかかることを意味する．従って，膵 ϐ 細胞はそれらのストレスに対する応

副腎由来ホルモンの多様性に基づいた糖尿病および慢性合併症進展機構の解明
馬

越

真

希

（九州大学大学院医学研究院病態制御内科学分野）

答システムを発達させており，細胞内恒常性維持のための ER ストレス応答やオートファジー機構の重要性は我々主要な内分泌臓器である副腎は，内外のストレスに応も以前から指摘している．我々は，これらの恒常性維持

答してホルモンを分泌し，生体の恒常性を維持している．

機構の制御に UFMylation が関与していることに注目し，副腎は 3 層構造を呈する皮質と髄質より構成され，皮質UFMylation は膵 ϐ 細胞の恒常性維持にも重要な役割をでは層特異的にステロイドホルモン（ミネラルコルチコイド，

果たすという仮説を提示するに至った．本研究ではこの仮グルココルチコイド，副腎アンドロゲン）が産生され，髄説を検証するために，膵 ϐ 細胞特異的 UFM1 欠損マウ

質ではカテコールアミンが産生される．ホルモン過剰状態

スを中心に解析を行い，膵 ϐ 細胞において UFMylation

では，ストレス応答性が破綻し，糖尿病などの様々な加が持つ病態生理学的意義を解明することを目的とする．

齢性疾患を引き起こす．我々は既に，「副腎由来ホルモン【方法】

過剰モデル」である副腎腫瘍患者での検討より，代表的Ins1 制 御 下 に Cre-ERT を 発 現 する Ins1 -Cre-ERT

なグルココルチコイドであるコルチゾール過剰に加えて，ア

マウスおよび Ufm1 flox/flox マウスを交配し，タモキシフェン

ルドステロン過剰や副腎アンドロゲンが加齢性疾患と関連（TM） 誘 導 性に膵 ϐ 細 胞 特 異 的 Ufm1 欠 損が 可 能なすることを報告した 1,2）．更に，生理的条件下での血中コ

Ufm1 flox/flox :Ins1 -Cre-ERT（UFM1-ϐKO） マウスを 作

ルチゾール濃度の高値は，高血糖を介してサルコペニア

製した．これまでの検討により UFM1-ϐKO マウスでは耐の進展に影響することを明らかにした３）．一方，近年，ス糖能が悪化することが明らかになったため，本年はそれら

テロイドホルモンのみならず，その代謝産物が代謝疾患のの膵 ϐ 細胞の組織学的検討を行なった．

発症・進展に関連することが示唆されている．今年度は，【結果】

LC/MS/MS 法を用いたステロイドミクス解析により，副UFM1-ϐKO マウスでは対照群と比較して ϐ 細胞容積

腎腫瘍患者を対象として，副腎由来ステロイド代謝産物が減少していることが明らかとなった．その理由として膵 ϐと代謝疾患との関連を検討した．その結果，特に閉経前細胞死や膵 ϐ 細胞の分化転換が関与している可能性が考

女性のコルチゾール産生副腎腫瘍患者では，特徴的なス

えられたため，これらを検討したところ，UFM1-ϐKO マウ

テロイドプロファイルを呈しており，副腎腫瘍はグルココル

スでは TUNEL 陽性膵島の増加および，膵島内のグルカ

チコイドに加えてミネラルコルチコイド代謝産物（11- デオ

ゴン陽性領域の増大を認めた．

キシコルチコステロン）を産生し，これは骨量低下に関与

160

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成すること，グルココルチコイド過剰は付随副腎を萎縮させて副腎アンドロゲン産生は抑制し，これは骨質劣化に関

血管内皮におけるO-GlcNAc修飾による糖尿病合与することが示唆された．一方，女性の主要なアンドロゲ

併症進展機構の解明

ンである副腎アンドロゲンは，標的組織で活性型に変換されて非活性化されるため，活性型アンドロゲンの主要な

大

橋

夏

子

（滋賀医科大学 内科学講座 糖尿病内分泌・腎臓内科）

不活性代謝産物であるアンドロステロン・グルクロニドは標的組織での副腎アンドロゲン作用を反映する指標となると考えられた４）．今後は血糖関連指標との関連を検討し，【目的】
糖尿病や肥満の世界的な急増は克服すべき重要な臨健常者における検証を実施する．

床課題である．それらの疾患では高血糖やインスリン抵抗【文献】

性に伴う高インスリン血症により，全身の血管の内皮機能(*, equally contributed; #, corresponding author)

障害から様々な臓器障害が惹起される．O-GlcNAc 修飾

１）Yokomoto-Umakoshi M, Sakamoto R, Umakoshi

は，全身の血管障害により引き起こされる糖尿病合併症

H#, Matsuda Y, Nagata H, Fukumoto T,の成因進展機構の一つとして着目されてきた．しかし，内Ogata M, and Ogawa Y#; Q-AND-A study

皮細胞における O-GlcNAc 化の役割，特に肥満と内皮group. Unilateral primary aldosteronism as an細胞との関係については未だ不明である．そこで，血管

independent risk factor for vertebral fracture.

内皮 細 胞における O-GlcNAc 修 飾の生 理 学 的 役 割と，Clin. Endocrinol. 92 (3) :206-213, 2020.

糖尿病及び肥満状態における病態生理に与える影響に関

２） Yo k o m o t o - U m a k o s h i M # , U m a k o s h i H ,Iwahashi N, Matsuda Y, Kaneko H, Ogata M,

して検討する．
【方法】

Fukumoto T, Terada E, Nakano Y, Sakamoto

タモキシフェン誘導性血管内皮細胞特異的 Cre 発現マR, and Ogawa Y#. Protective role of DHEAS in

ウス（VEcad-BAC-CreERT2 マウス）と Ogt -flox マウ

age-related changes in bone mass and fractureスとの交配を行い，タモキシフェンを腹腔内投与し血管内risk. J. Clin. Endocrinol. Metab. 106(11):皮細胞特異的 Ogt 欠損（Ogt -ECKO）マウスを作製した．

e4580-e4592, 2021.

通常食モデル，高脂肪食摂餌による肥満モデルを作製し，

３） K a t s u h a r a S , Yo k o m o t o - U m a k o s h i M # ,Umakoshi H, Matsuda Y, Iwahashi N, Kaneko

その表現型を解析した．
【結果】

H, Ogata M, Fukumoto T, Terada E, Sakamoto

通常食モデルにおいて，Ogt -ECKO マウスは対照マウ

R, and Ogawa Y#. Impact of cortisol on muscle

スと比較し体重増加の抑制を認めたが空腹時血糖や耐strength and mass: A Mendelian randomization

糖能，インスリン感受性などに有意な差を認めなかった．

study. J. Clin. Endocrinol. Metab. 107(4):高 脂 肪 食モデルにおいて，Ogt -ECKO マウスでは体 重e1477-e1487, 2022.

増加が顕著に抑制され，白色及び褐色脂肪組織の肥大

４）Nakao H*, Yokomoto-Umakoshi M*#, Nakatani化が抑制されていた．基礎代謝は両群に差を認めなかっK*, Umakoshi H, Ogata M, Fukumoto T,

た．経口での脂質投与では血中 triglyceride（TG）増Kaneko H, Iwahashi N, Fujita M, Ogasawara

加が有意に低下していたが経静脈での脂質投与では差がT, Matsuda Y, Sakamoto R, Izumi Y, Bamba

なく，Ogt -ECKO マウスの便中 TG が有意に増加していT, OgawaY#. Adrenal steroid metabolites

たことから，Ogt -ECKO マウスでは腸管からの脂質吸収and bone status in patients with adrenalが低下することが示された．走査電子顕微鏡（TEM）でincidentalomas and hypercortisolism.

腸管を観察したところ，小腸絨毛リンパ管内皮細胞間結

eBioMedicine. 2023, in press.

合が Ogt -ECKO マウスにおいて強 固な zipper type へ
変化していた．そのため摂取した脂質がリンパ管内へ移行

161

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成

できず排泄され，高脂肪食による肥満に抵抗性を示すと考えた．リンパ管の透過性の調節には VEGFR の関与が弾性線維関連蛋白Fibulin-5によるインスリン抵

報告されており，Ogt -ECKO マウス内皮細胞の VEGFR3

抗性制御機構の解明の発現が低下していた（図 1）．VEGFR3 の下流に NO

奥産生系があるため血清 NO 濃度を測定したところ，Ogt -（横浜市立大学医学部 内分泌・糖尿病内科学）

山

朋

子

ECKO マウスで 有 意に血 清 NO 濃 度 が 低 下していた．
NO donor（DETA NONOate）を投 与し血 清 NO 濃【目的】

度を増加させたところ，低下していた腸管からの TG 吸収

細胞外弾性線維関連蛋白 Fibulin-5（Fbln5）を介しが control 群と同等まで改善した（図 2）．TEM で観察

た糖代謝およびエネルギー代謝の制御機構を解明する．

すると zippering していたリンパ管内皮細胞間結合が開【方法・結果】

大し，カイロミクロンのリンパ管内への移動が確認できた．
【考察】

Fbln5 欠 損マウス（Fbln5KO）および野 生 型マウス
（WT）における通常食 / 高脂肪食負荷における代謝表

Ogt -ECKO マウスは絨毛リンパ管内皮細胞間結 合が現型の解析により，Fbln5 欠損による体重非依存性のイ変化することにより腸管からの脂質吸収が抑制され，高ンスリン感受性の亢進，体重増加の抑制，高脂肪食誘導

脂肪食による肥満に抵抗性を示す．脂質吸収抑制は体内性の肥満・肝脂肪蓄積・脂肪細胞肥大化の抑制を認め

NO 濃度の増加によりキャンセルされることも示された．

た．グルコースクランプを用いた解析では Fbln5 欠損による全身のインスリン感受性亢進が示唆された．Fbln5KOでは弛緩性皮膚を認めるが，同時に皮脂腺の萎縮を認め，
寒冷刺激に対する体温低下が顕著であった．一方で脂肪組織における熱産生・脂肪酸燃焼に関連する遺伝子群の発現は亢進しており，代償性変化と考えられた．通常食
下で Fbln5KO の酸素消費量は WT と同等であったが活動量は顕著に低下していた．30℃飼育環境下でも検証したが，Fbln5KO では体重増加が抑制され，インスリン感
受性の亢進は残存した．
弾 性 線 維 は 血 管 にも 豊 富 に 発 現 す ること か ら，
Fbln5KO における血 管を介したインスリンの組 織 移 行
性への影響についても検証した．下大静脈からの標識

図1

インスリン投 与 後の肝 臓におけるインスリン取り込みはFbln5KO で亢進した．Fbln5 欠損によるインスリン感受性亢進の責任臓器を同定するため，Fbln5-floxed マウス
を用いてこれまでに肝細胞特異的 Fbln5KO，脂肪細胞
特異的 Fbln5KO，皮膚（表皮）特異的 Fbln5KO，血管平滑筋特異的 Fbln5KO，血管内皮特異的 Fbln5KO，骨格筋特異的 Fbln5KO，血管内皮 / 血管平滑筋両特異的 Fbln5 欠損マウスを樹立したが，いずれにおいてもインスリン感受性や体重はコントロールマウスと同等であった．
【考察】

図2

弾性線維関連蛋白 Fbln5 による，皮膚を介したエネル
ギー代謝制御や血管を介したインスリン移行性の制御の

162

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成存在が示唆され，Fbln5 欠損によるインスリン感受性亢

皮 細 胞を用いて PDPK1 をノックダウンすると cleaved

進や体重変化は臓器連関や組織周辺環境，細胞外 - 細

caspase3 の発現が有意に増加し，血管増殖に重要な役

胞内作用を介した間接作用である可能性が示唆された．

割を果たす VEGFR2 の発現は有意に低下していた．電子顕微鏡による評価では，骨格筋のミトコンドリア構造の血管内皮PDK1の病態生理学的役割の解明
小

畑

淳

史
医療法人仁聖会 小畑醫院 内科（川崎医科大学 特任研究員）【背景】

乱れや脂肪の蓄積が確認された．以上から血管内皮特異的 PDPK1 欠損マウスは STZ 誘導性高血糖下では骨格筋の vascularity を低下し，さらには mitochondria
biogenesis を低 下することで 骨 格 筋においてインスリン抵 抗 性を惹 起することが 明らかになった． 血 管内皮PDPK1 の発現については db/db マウス及び高脂肪食負我々は血管内皮特異的に PDPK1 を欠損させることで，

荷 C57BL/6J マウスにおいては有意に発現が低下してお生理的または高脂肪食負荷条件下では，主に脂肪組織にり，一方で STZ 誘導高血糖モデルでは有意に発現が増おける血管新生が抑制され，脂肪の縮小に伴うアディポカ

加していた．

イン発現の改善に伴い，全身でのインスリン抵抗性が改【結論】

善することを明らかにした．一方で，血管内皮特異的に血管内皮 PDPK1 欠損は STZ 誘導性高血糖下では骨PDPK1 を欠損させることで，膵β細胞における血流が低格筋でのインスリン抵抗性が惹起される．また，様々な条下し，血管内皮構造の構築の乱れを生じ，膵β細胞機能

件により血管内皮 PDPK1 の発現は「恒常的ではない」が低下することを明らかにした．これらの研究は主に生理ことが明らかになった．

的条件または高脂肪食負荷下での表現型であり，高血糖状態での血管内皮 PDPK1 が果たす役割は明らかにされていない．また，これまで「恒常的に発現している」とさ

肥満時の癌発症・進展におけるM2マクロファーれていた PDPK1 は，ヒト大動脈血管内皮では肥満に相ジの役割関して発現が低下していることも明らかにしている．

角

【目的】

朝

信

（富山大学医学部附属病院第一内科）

高血糖状態における血管内皮 PDPK1 の役割を解明すること，及び血管内皮における PDPK1 の発現制御のメカニズムを明らかにする．
【方法】

【目的】
肥満は乳癌，大腸癌，子宮体癌など数種の癌リスクを増加させる．しかしながら，肥満がどのように癌発症・進

血管内皮特異的 PDPK1 欠損マウスを用いて，STZ で展に関与するか根本的な機序は充分に解明されていない．

高血糖を誘発し，全身の糖代謝に及ぼす影響を解明する

肥満者は世界的に増加傾向であり，肥満がどのように癌こと，及び様々なモデルを用いて血管内皮 PDPK1 の発発症・進展に関与するか根本的な機序が解明できれば社現がどのように制御されているかを明らかにする．

会的な貢献は大きいものと考えられる．血管新生や免疫【結果】抑制を介して癌細胞の増殖や転移に寄与するマクロファー

STZ によって高 血糖を誘発すると，血管内皮特 異 的ジが存在する（Cell.141:39-51,2010.）．乳癌，肺癌，

PDPK1 マウスではインスリン抵 抗 性が 惹 起された．まメラノーマ等の数種類の癌においてマクロファージの浸潤

た Akt のリン酸 化を評 価したところ，その 主たる臓 器が高度であるほど予後が悪いことが知られ，マクロファー

は骨格筋であることが明らかになった．骨格筋におけるジを標的とした癌治療が有望である可能性が指摘されてvascularity は PDPK1 欠 損マウスで有 意に低 下しておいる．マクロファージは細胞表面マーカーを用いて M1 マ

り，TUNEL assay でも有 意 に 血 管 内 皮 の apoptosis

クロファージ，M2 マクロファージに大別して解析されてきの亢進が確認された．In vitro でもヒト臍帯動脈血管内た．しかしながら，それぞれのマクロファージが癌の発症・

163

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成

進展にどのような役割を果たしているか，in vivo モデル

Nishida Y, Yamamoto S, Sasahara M, Imura

での検討は充分に行われておらず分子機構についても未J, Mori H, Matzuk MM, Kudo F, Manabe I,

だ明確ではない．本研究の目的は １）CD206+M2 マク

Uezumi A, Nakagawa T, Oishi Y, Tobe K.

ロファージが癌発症・進展を促進していないか．２）肥

Depletion of CD206 + M2-like macrophages

満による CD206+M2 マクロファージの表現型や細胞数

induces fibro-adipogenic progenitorsの変化が，癌の発症・進展を促進していないかを解明す

activation and muscle regeneration. Nat

ることである．

Commun. 21;13(1):7058. 2022.

【方法】

２）Nawaz A, Nishida Y, Takikawa A, Fujisaka S,

乳癌を発症する遺伝子改変マウスを高脂肪食群と通常

K a d o T, A m i n u d d i n A , B i l a l M , J e e l a n i

食群に分けて，腫瘍の発生時期や，重量，体積，数をI , A s l a m M R , N i s h i m u r a A , K u w a n o T,

測定．摘出した腫瘍を FACS，MACS，IHC，qPCR な

Watanabe Y, Igarashi Y, Okabe K, Ahmed

どを用いて解析した．独自に作製した乳癌マウスモデルでS, Manzoor A, Usui I, Yagi K, Nakagawa T,

CD206+M2 マクロファージの数を減らした際の癌の発Tobe K. Astaxanthin, a Marine Carotenoid,症・進展への影響を評価した（腫瘍の発生時期，腫瘍

Maintains the Tolerance and Integrity of

重量，腫瘍体積）．摘出した腫瘍について組織学的評価，

Adipose Tissue and Contributes to Its Healthy

遺伝子発現解析，FACS などを行った．

Functions. Nutrients. 6;13(12):4374. 2021.

【結果】

３）Bilal M, Nawaz A, Kado T, Aslam MR, Igarashi

高脂肪食負荷で腫瘍の発生が早まり，腫瘍の重量・Y, Nishimura A, Watanabe Y, Kuwano T,

体積・数が増加した．PD-1+CD8+T 細胞の遺伝子発Liu J, Miwa H, Era T, Ikuta K, Imura J, Yagi

現を解 析すると PD-1−CD8+T 細 胞と比 較して Opn を

K, Nakagawa T, Fujisaka S, Tobe K. Fate of

高発現し，細胞障害性の指標となる Ifng，Gzmb は低adipocyte progenitors during adipogenesis発現であった．免疫組織化学でも PD-1+ 細胞が OPN

in mice fed a high-fat diet. Mol Metab.

を高発現していた．独自に作製した乳癌マウスモデルで

23:101328,2021.

CD206+M2 マクロファージの数を減らすと癌の発症，進展は抑制された．摘出した腫瘍について組織学的評価，
遺伝子発現解析（qPCR，RNA seq），FACS などを行い，グルコース応答性高分子ゲルを用いた自律型インCD206+M2 マクロファージの減少による癌周囲微小環境

スリン投与デバイスの開発の変化について確認した．
【考察】

木村

真一郎

（名古屋大学環境医学研究所分子代謝医学分野）

高脂肪食による肥満で細胞障害性が低く，OPN を発現し癌細胞増加促進作用をもつ PD-1+CD8+T 細胞が【目的】

腫瘍内で増加した．肥満による CD8+T 細胞の疲弊の加インスリン療法は糖尿病治療の根幹を成すが，QOL を速が癌発症・進展促進と関連することが示唆された．また，損なう上，低血糖の危険を有する．また近年では，平均CD206+M2 マクロファージの数を減らすと癌の発症，進血糖の高値に加えて，血糖変動が糖尿病血管合併症のリ展は抑制されることが明確となった．今後，その機序のスクになることが報告されている．そのため，血糖応答性解明を進めると同時に臨床応用を目指した基礎研究を行にインスリンを放出する人工膵臓様デバイスの開発が求めう予定である．

られている．そこで我々は，グルコース濃度に応答して物

１）Nawaz A, Bilal M, Fujisaka S, Kado T, Aslam

理的性質が劇的に変化するフェニルボロン酸を含む高分

MR, Ahmed S, Okabe K, Igarashi Y, Watanabe

子ゲル（ゲル）を利用して，エレクトロニクスフリーで操

Y, Kuwano T, Tsuneyama K, Nishimura A,

作が簡便な，人工膵臓様デバイスを開発した．本研究で164

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成

は，デバイスの効果と安全性を評価するとともに，臨床応用の可能性について検討した．
【方法・結果】【目的】
GLP-1 による膵 ϐ 細胞増殖制御における新規経路を同定する．

既に我々は，ゲルとシリコンカテーテルを融合させて，【方法・結果】

マウスを用いた機能実証に成功した．今回，臨床応用を

GLP-1 受 容 体 作 動 薬 の Liraglutide（Lira）を添 加

見据え，インスリン放出の有効表面積を拡大するために，したマウス単離膵島の定量プロテオミクス解析を行った．

血液透析用中空糸を融合した次世代型デバイスを開発しLira 添 加により膵 島において 13 個 のタンパク質 が 有

た．マウスの 10 倍の体重を有するラットの皮下にデバイ意（>2 倍，P <0.05）に上 昇し，9 個 が 膵 腺 房 細 胞にスを留置したところ，血糖依存的なインスリン放出と血糖発 現する外 分 泌 酵 素 関 連タンパク（ex．Amy2，Cel，低下作用および，良好な生体適合性を認めた．また，1

Prss2）であり，膵 ϐ 細胞増殖因子の Lithostathine-1

型糖尿病モデルを用いた検討では，平均血糖の低下のみ（Reg1）の上 昇も認めた（2.77 倍 ）．Lira により膵 島

ならず，夜間活動期の血糖上昇がデバイス留置群で有意周囲に付着する腺房細胞が増加し，GLP-1 は膵島と腺に抑制され，血糖日内変動が改善された．さらに我々は，房細胞の接着を促進することが示された．単離膵島と膵ブタを用いて検討を行い，1 型糖尿病ブタにラット用のデ

腺房細胞の共培養系を確立し，Lira 添加により膵島へ

バイスを 8 個挿入することで，血糖依存的なインスリン放の腺房細胞の付着が増加し，膵島において Reg1 および出と，血糖低下を認めが，臨床応用に向けては更なるス

P-Cad や Cx26 等の細 胞 接 着 因 子の発 現が上 昇した．

ケールアップの必要性と，侵襲性の改善が必要と考え，

Reg1 欠損マウスでは Lira 皮下注による膵 ϐ 細胞増殖促

マイクロニードル技術を応用することを着想した．マウスや進が消失した．野生型マウス（WT）単離膵島と WT 腺

ブタに装着し，血糖依存性のインスリン放出を確認してい房細胞との共培養では，Lira により膵 ϐ 細胞増殖は促進るが，臨床応用に向けては，皮膚への刺入性および機能され たが（1.51 倍，P =0.04），WT 単 離 膵 島と Reg1の持続性について改善が必要であり，課題に取り組んで欠損マウス（KO）腺房細胞との共培養では Lira によるいる．

膵 ϐ 細胞増殖は促進を認めなかった．一方，KO 単離【考察】

膵島と WT 腺房細胞の共培養では，Lira により膵 ϐ 細

血液透析用中空糸を融合した次世代型デバイスにより，胞 増 殖 は促 進された（1.60 倍，P =0.03）．これより，大幅なスケールアップに成功し，安全性を確認するとともLira により誘導された腺房細胞由来の Reg1 が膵 ϐ 細胞に，グルコース応答性のインスリン放出特性により，平均増殖を促進していることが示された．マウス単離膵島にリ血糖のみならず血糖日内変動が改善することを示した．さコンビナント Reg1 を添加すると膵 ϐ 細胞増殖は促進されらに我々は，臨床応用を見据え，マイクロニードルを融合（2.05 倍，P =0.01），Lira 添加による膵 ϐ 細胞増殖のした新たなインスリンデバイスの開発を進めている．本デ増大は認めなかった．膵腺房細胞には Glp1r 発現を認

バイスにより，インスリン療法の早期導入の促進，およびめず，腺房細胞の単独培養では Lira により Reg1 発現は糖尿病合併症の発症・進展抑制に重点を置いた新たなイ

変化しなかった．一方，Lira 添加膵島の培養上清で刺ンスリン治療を提案できると考える．

激した腺房細胞では Reg1 の発現が上昇した．
【考察】
Lira は膵島の GLP-1R に作用し，膵島からの液性因膵島と腺房細胞の相互作用によるGLP-1を介した
膵β細胞制御機構の解析
京

原

麻

由

（横浜市立大学大学院 医学研究科 分子内分泌・糖尿病内科学）

子を介して，腺房細胞で Reg1 が誘導され，腺房細胞由来の Reg1 が膵 ϐ 細胞増殖を促進するという，膵島と腺房細胞との接着因子や分泌因子を介した連関が想定された．GLP-1 による膵 ϐ 細胞増殖作用において，膵島と腺房細胞の相互作用による，Reg1 を介した新規経路の存在が示唆された．

165

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成

エピゲノムを介した肥満・糖尿病遺伝機構の解明と応用

胎盤における刷り込み異常が胎児の糖代謝にどのような影響を及ぼすのか今後検討していきたい．
【文献】

小塚

智沙代

（理化学研究所生命医科学研究センター）

Matoba S, Kozuka C (Co-first author), et al .
Noncanonical imprinting sustains embryonicdevelopment and restrains placental overgrowth.

【目的】

Genes Dev 36:483-494 (2022)

胎盤は妊娠中の母子間の物質交換を選択的輸送によってコントロールしている．胎盤における選択的輸送の異常は出生後のこどもの代謝に長期的な影響を及ぼす．これ

糖尿病患者のミトコンドリア機能とインスリン抵抗

までに我々の研究から，胎盤特異的なゲノム刷り込みが性・インスリン分泌能や血管合併症との関連の解明

胎盤の正常な形成に重要であることがわかっている．ゲノ

小森田

ム刷り込みは父親と母親のどちらの由来の遺伝子であるか祐二（九州歯科大学総合内科学分野）が記憶される現象であり，胎盤特異的なゲノム刷り込みでは，遺伝子発現を抑制する機能をもつヒストン修飾である【目的】

H3K27me3 が受精後に母方染色体にのみ維持されるこミトコンドリア機能異常は，糖尿病発症，増悪，合併とで，父方染色体のみから遺伝子発現が起こる．そこで症進展の全ての段階に関与している．近年，末梢血中の本研究では，どの遺伝子のゲノム刷り込みが胎盤の形成

Fibroblast Growth Factor 21（FGF-21）が，全身のに寄与しているのかを明らかにすることで，肥満や糖尿病

ミトコンドリア機能を反映することが不明であるが，狭義の疾患素因が形成される機序解明や予防法確立に繋げるのミトコンドリア糖尿病患者を含む糖尿病患者における臨ことを目標とした．

床的意義，インスリン抵抗性・分泌能・合併症との関連【方法・結果】

は不明である．本研究期間においては，外来通院中の糖H3K27me3 により制御される胎盤特異的ゲノム刷り込

尿病患者において，血中 FGF21 濃度と糖尿病病型，イ

みのうち，妊娠末期まで維持されるのは 9 個の遺伝子のンスリン指標との関連を検討した．

みである．これらの遺伝子は本来であれば父方染色体の【方法】

みから発現するが，卵子における H3K27me3 をなくす

九州歯科大学付属病院，小倉第一病院外来に通院中ことで胎盤において両親性発現（2 倍量発現）を示すよの糖尿病・非糖尿病患者に対して研究内容の説明，文うになり，胎盤は過形成する．9 個の遺伝子それぞれに書による同意取得し，静脈採血（FGF21，乳酸，ピルビ

ついて，ヘテロ欠損させることで片親性発現（1 倍量発ン酸，クレアチニンキナーゼ），患者背景（糖尿病病型，

現）に戻し，どの遺伝子が胎盤の正常発生に関与してい性別，年齢，家族歴，既往歴，飲酒歴，喫煙歴，体重

るのかを調べた．その結 果，Chromosome 2-miRNA歴），身長，体重，血圧，薬剤情報，一般血液検査データ，

cluster（C2MC），solute carrier 38 member 4

尿検査データを収集を行い，各糖尿病病型と血 FGF21（Slc38a4）のヘテロ欠損により，胎盤過形成の改善がとの関連を検討した．

認められた．一方で，その他の遺伝子のヘテロ欠損では，【結果】胎盤の改善は認めなかった．
【考察】
C2MC は胎盤に高発現するマイクロ RNA クラスターであり，Slc38a4 は胎盤におけるアミノ酸輸送を担うアミノ酸トランスポーターである．胎児においてはアミノ酸がイン
スリン分泌を制御しているという報告もあり，Slc38a4 の166

ミトコンドリア糖 尿 病 患 者 3 名において， 血 清 中のFGF21 が高値であることが確認された（図 1）．一方でFGF21 とインスリン分泌能には関連はみられなかった．

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成よる膵内分泌細胞量やホルモン分泌制御には不明な点が多い．一方，グルカゴンは肝臓でのアミノ酸代謝に重要な役割を担い，蛋白質を主体とする栄養環境ではグルカ
ゴンの要求性が高まると考えられる．しかし，このような栄養環境での膵α細胞の挙動は不明であり，本研究はその解明を目的とする．
【方法・結果】
低 炭 水 化 物 / 高 蛋 白 質 食（P:F:C=70:22:8%kcal，
Low Carbohydrate/High Protein; LCHP）
を 8 週齢雄性
横棒は平均値．FGF21, fibroblast growth factor 21

図 1 各糖尿病病型における血中 FGF21 濃度

C57BL/6J マウスに 10 日間摂餌させ標準食（P:F:C=22:
22:56%kcal）と比 較した． 血 糖 値には変 化 がないものの，LCHP 摂餌マウスでは血中グルカゴン上昇とインスリ【考察】

ン低下および血中総アミノ酸濃度低下を認めた．肝臓でこれまでにも FGF21 はミトコンドリア機能障害に反応

は，LCHP 摂餌によるグリコーゲン含量低下とともにアミノして増加することが知られていたが，血清 FGF21 値は 2

酸異化および糖新生亢進を認めた．膵組織を観察したと型糖尿病，全身性酸化ストレス，肥満と正の相関がある

ころ膵管近傍にグルカゴン陽性細胞クラスター出現を伴いことが報告されており，ミトコンドリア糖尿病と他のタイプ

α細胞数増加が観察された．クラスターを構成する細胞はの糖尿病との鑑別における血清 FGF21 値の有用性は不Glucagon+;Pax6+;MafB- であり膵管近傍に存在する前駆

明なままであった．しかし，本研究では，ミトコンドリア

細胞から分化新生したα細胞であることが推察された．さら糖尿病患者の血清 FGF21 は，他の糖尿病患者よりもはに，α細胞新生・増加は交感神経の分布と一致していた．

るかに高い可能性があることを示した．ごく少人数での検そこで，α細胞新生と交感神経の関連を明らかにするために討であり一般化にはより大規模な研究が必要であるが，6-hydroxydopamine を用いて薬理学的に交感神経の除FGF21 は，ミトコンドリア糖尿病の診断にも有用である可神経を行ったところ，LCHP 摂餌で誘導されるグルカゴン陽能性を示唆した．

性細胞クラスター出現とα細胞数増加が抑制された．また，【発表論文】LCHP 摂餌マウスでは，求心性迷走神経の中枢投射先であ１） K o m o r i t a Y, S h i r o o z u A , N a k a m u r a H .

る延髄孤束核および交感神経起始核である淡蒼縫線核におFibroblast growth factor 21 as a candidate of

いて神経活性化マーカーである FosB 陽性細胞の著明な増

a novel serum biomarker for mitochondrial

加が観察された．そこで，細胞新生に基づくα細胞増加を

diabetes J Diabetes Investig. 14(8): 1009-1010,

惹起する生理メカニズムとして肝臓 - 脳 - 膵臓連関を想定し，

2023

迷走神経肝臓枝切断術を施術したマウスに同様に摂餌させたところ，α細胞新生・増加が完全に抑制された．

低炭水化物/高蛋白質食で惹起される神経ネットワークを介した膵α細胞量調節の解明
椎木【結論】
蛋白質を主に利用する栄養環境下で自律神経を介した
α細胞量調節が示唆され，肝臓 - 中枢神経 - 膵α細胞で幾久子の臓器間ネットワークの存在が明らかとなった．今後は神（山口大学医学部分子代謝制御学講座）

経ネットワーク惹起に関連する肝臓での代謝変化およびグルカゴン分泌への影響の解明に取り組む予定である．

【目的】
グルコース，アミノ酸および脂肪酸は膵内分泌ホルモン
分泌の制御因子であるが，膵島細胞への直接作用以外に

167

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成

脂肪組織量規定因子の同定とそのメカニズムの解明
Shin Jihoon （シン ジフン）
（大阪大学大学院 医学系研究科 内分泌代謝内科学）

カニズムとして，HSP47 はシステミックな栄養状態に応じて，その発現の調節し，脂肪細胞外のコラーゲンマトリッ
クスのフォールディングや分泌を制御し，細胞膜インテグ
リンとの結合，その下流の細胞内 FAK シグナルを誘導し，PPARγを安定化させることで，脂肪組織量を規定してい【目的】
脂肪組織はエネルギーの貯蔵や代謝制御に特化した臓ることが分かりつつある．
【考察】

器であり，ヒトの健康や病態に密接に関係している．ヒト

脂肪組織のコラーゲンマトリックスは病態的な繊維化因の脂肪組織量は個人差が大きく，生理的，環境的，病子としてよく知られていたが，その生理的意義や重要性に態的，遺伝的要因が総合的に関与する．しかし，様々なついては解明されていなかった．本研究ではヒトやマウス

要因・要素に全般的に関わる因子やそのメカニズムは不で脂肪組織に高発現し，脂肪組織量を規定する因子とし明である．本研究で脂肪組織量を規定する因子とそのメて HSP47 を同定した．HSP47 は栄養・病態・遺伝的カニズムを解明すること目的とする．

環境により発現が制御され，脂肪細胞外のコラーゲンマト【方法】

リックスのタンパクの恒常性を変化させることで脂肪組織

脂肪組織量に関わる生理的，環境的，病態的，遺伝的な環境のトランスクリプトームの解析から，それぞれの量を規定していることが分かった．現在その詳しい分子メ
カニズムを解明中である．

遺伝子リストを作成し，相互的な解析を行い，脂肪組織量の規定因子を探索した．脂肪組織量を来てする可能性の高い因子として，HSP47 を見出し，その生理的意義と臨床情報、ゲノム情報を活用した2型糖尿病のサブメカニズムを，遺伝的／薬剤的機能阻害モデルを作成し，

タイプ分類

脂肪組織量への寄与を調べた．また，In vitro の細胞モ

鈴

木顕（The University of Manchester）

デルを樹立し，詳しいメカニズムを調べた．
【結果】
脂肪組織量に関わるトランスクリプトームの総合的な【目的】

解析から可能性の高い因子として，HSP47 を同定した．

2 型糖尿病に関連するバリアントを同定し，2 型糖尿病

HSP47 は ER に局在するコラーゲンタンパクに特異的なのリスク因子である心血管・代謝形質に与える影響に基シャペロンタンパクとして知られており，コラーゲンのフォづき，特徴付けを行う．一細胞アトラスを用いてバリアン

ールディングや分泌に重要な役割を果たす．HSP47 は脂トの詳細な細胞特異性を評価し，糖尿病合併症への効肪組織に高発現し，脂肪が蓄積する環境の摂食や過食，果を検証する．

肥満では発現が増加し，逆に脂肪組織量が低下する絶食【方法】

や運動，肥満外科治療，Cachexia では発現が低下した．

136 のゲノムワイド関連研究（GWAS）のデータを使い，遺伝的な変異による HSP47 遺伝子発現の増加はヒトのヨーロッパ系，東アジア系，アフリカ系，混血アメリカ系，

脂肪組織量の増加と相関しており，逆にマウスの HSP47

南アジア系の集団を対象にメタ解析を行った．心血管・阻害や欠損モデルでは脂肪組織が低下した．欠損モデル

代謝関連形質に対する関連プロファイルに基づいて 2 型の脂肪組織では脂肪蓄積のマスターレギュレーターであ

糖尿病関連シグナルをクラスタリングした．2 型糖尿病関

る PPARγのタンパク発現が低下しており，遺伝子発現に連シグナルを 222 種類の細胞種の一細胞 ATAC-seq デは影響ないことから，PPARγタンパク発現制御の可能性

ータとの統合解析を行い，各クラスターの細胞種特異性が示唆された．3T3-L1 脂肪細胞を用いた実験でも同様を評価した．各クラスターごとに 2 型糖尿病シグナルのリに，HSP47 のノックダウン及び阻害により PPARγの遺スクアリル数をリスク上昇効果で重みづけして足し合わせ伝子発現には影響なく，タンパク発現が低下した．そのメ

た polygenic risk score（PRS） を 算 出し，GWAS と168

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成は独立した各民族集団のコホートで糖尿病合併症との関

メタボローム解析を用いた脂肪細胞分化・褐色化連を評価した（図 1）．

制御に関する研究【結果】

高2 型糖尿病に関連する 611 領域（内，145 は新規領

橋

春

弥

（京都大学大学院農学研究科 食品生物科学専攻
食品生理機能学分野）

域），1,289 の独立した関連シグナルが同定された．クラスターの分類を評価する指標を最適化したところ，8 つ【研究背景・目的】のクラスターが同定された．5 つのクラスターは以前に報告されたものであり，関連シグナル全体の 35.8％を占め

脂肪組織は生命維持に必要なエネルギーを脂肪としてた．残りの 3 つのクラスターは以前に報告された特定の蓄積する役割に加え，アディポカイン分泌等を介した生体

心血管・代謝プロファイルと一致せず，新たなメカニズム

恒常性維持にも重要な役割を担う．脂肪組織を構成するが示唆された．一細胞 ATAC-seq アトラスを用いた細胞細胞の中で，脂肪細胞の機能についてはこれまでの多く

特異性解析では 2 型糖尿病関連シグナルは 20 種類の細の先行研究において多面的に解析されており，特に脂肪胞種で有意に濃縮された．2 つのβ細胞クラスターとその細胞の分化過程，及び熱産生能を有するベージュ脂肪細他の血糖クラスターは胎児・成人膵島細胞に濃縮してい胞への変換（褐色化）過程は，主に遺伝子やタンパク質

た．β細胞・プロインスリン低下クラスターは成人腸管内発現制御に関する知見に基づくメカニズム解析が盛んで分泌細胞にも濃縮していた．脂肪異栄養症クラスターはある．他方，これらの過程における低分子代謝物の挙動

成人脂肪細胞に，肥満クラスターは膵島細胞と副腎細胞，についての知見は限られており，低分子代謝物の量的・

メタボリック症候群クラスターは血管周皮細胞，内皮細胞

質的変化の全体像については不明確な点が多く存在する．

に濃縮していた．クラスター PRS 解析では，冠動脈疾患

そこで，本研究では低分子代謝物の網羅的解析手法のと，脂肪異栄養症と肥満クラスターに正の関連があった．

一種であるメタボローム解析を活用し，本年度は特に，末期糖尿病性腎臓病と肥満クラスターが正の関連を示し，脂肪細胞の分化過程に関与する低分子代謝物の機能及β細胞・プロインスリン増加クラスターは負の関連を示し

びメカニズム解明を目的とし，研究を行った．

た．また，増殖糖尿病網膜症は糖尿病シグナル全体から【方法】

算出した PRS と最も強い正の関連を示した．

培養脂肪細胞の分化誘導期に代謝物 A を添加し，脂【考察】

肪細胞分化関連遺伝子の mRNA 発現量及び中性脂肪

心血管・代謝形質による 2 型糖尿病関連シグナルのク蓄積量を解析した．また，代謝物 A が作用する受容体 R

ラスタリングおよびクラスター PRS は 2 型糖尿病のリスクの阻害剤，及び siRNA 処理による受容体 R の機能阻害評価，特徴付けに有用であると考えられる．

時の脂肪細胞分化関連遺伝子の mRNA 発現量及び中

図1

169

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成

性脂肪蓄積量を解析した．

glucose homeostasis. NMU has two receptors, NMU【結果・考察】receptor 1 (NMUR1) and NMUR2, both of which

これまでの研究において，メタボローム解析を中心としare G-protein-coupled receptors (GPCRs). Only

たこれまでの研究結果より，脂肪細胞の分化過程におい

NMUR1 is expressed in mouse islets and ϐ cell-て，脂肪細胞中の代謝物 A 量が増加し，当該代謝物量

derived MIN6-K8 cells, implying NMU regulatesと Pparγ mRNA 発現量に正の相関関係が存在すること

insulin secretion via NMUR1. In addition to NMU,を明らかにしていた．培養脂肪細胞の分化誘導期に代謝

preproNMU also produces NMU precursor-related

物 A を添加することにより，脂肪細胞分化関連遺伝子のpeptide (NURP). ICV administration of NURP to

mRNA 発現量が増加し，中性脂肪蓄積量も増加すること

mice increased their metabolic rate and causedを見出した．他方，受容体 R の阻害剤，及び siRNA 処a short-term (~4 h) increase in feeding. However,

理による受容体 R の機能を阻害することにより，脂肪細NURP cannot activate the two NMU receptors. This

胞分化関連遺伝子の mRNA 発現量が減衰し，中性脂

study is to investigate the possible involvement肪蓄積量も減少することを見出した．これらの結果より，

of NMU and NURP in the ϐ cell maintenance and代謝物 A は受容体 R を介して，脂肪細胞の分化制御に

function and the regulating mechanisms.

重要な役割を果たしていることが示唆された１）．
【文献】
１）Takahashi H, Nishitani K, Kawarasaki S,
Martin-Morales A, Nagai H, Kuwata H, Tokura
M, Okaze H, Mohri S, Ara T, Ito T, Nomura
W, Jheng H-F, Kawada T, Inoue K, Goto
T. Metabolome analysis reveals that cyclic【方法】

adenosine diphosphate ribose contributes

We first confirmed the expressing patterns ofto the regulation of differentiation in mice

NMU and NURP in the mouse islets, and exploredadipocyte. FASEB J . 38(1), e23391 (2024).

their potential on insulin secretion and glucose
homeostasis. To investigate how they affect

ニューロメジンUが膵β細胞機能に与える影響とその分子機序の解析張維

東（宮崎大学医学部医学科生体制御医学研究講座）

insulin, we studied the intracellular signaling andϐ cell maintenance with these peptides.
【結果】
We reported that NMU produced in ϐ cells
suppresses GSIS and causes ϐ-cell failure via
NMUR1 １, ２）. NMU was upregulated both after chronic【目的】

palmitate treatment and in diabetic db/db mice

Neuromedin U (NMU) is a highly conserved

islets, and then participated in ϐ-cell dysfunction

23–25-amino acid neuropeptide in mammals,

and development of diabetic pathogenesis via

which was first isolated from the spinal cord of

induction of mitochondrial dysfunction andpigs in 1985, and later from other species. It is

endoplasmic reticulum (ER) stress ２） . All types

widely expressed in the central nervous system

of G α proteins are expressed in ϐ cells and are

and peripheral tissues and has emerged as a

involved in the regulation of insulin secretion.

new player in regulating appetite control, stress

Given that only NMUR1 is expressed in ϐ cells,

response, energy metabolism, inflammation, andand NMU suppresses intracellular calcium

170

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成

mobilization and possesses insulinostatic action,【考察】

we hypothesized that NMUR1 might use Gα

Collectively, NMU acts directly on ϐ-cells

for signal transduction in ϐ cells. Using ϐ

through NMUR1 coupled with Gαi2/o. NMU causes

cell–derived MIN6-K8 cells, isolated mousemitochondrial dysfunction and induces ER stress.

and human islets, and single islet cells, we

Decreased intracellular ATP and calcium influx

identified the molecular mechanisms by whichhamper GSIS to cause ϐ-cell dysfunction, which may

NMU and NMUR1 regulate insulin secretion in ϐ

lead to further pathological development of type 2

cells ３）. We showed that NMUR1 in ϐ cells uses G

diabetes. Understanding more about endogenous

αi/o signaling to mediate the detrimental effects

G-proteins opens the door to pharmaceuticallyof NMU on insulin secretion. Pretreatment withtargeting their activation, which would have major

the Gα i/o inhibitor Bordetella pertussis toxin

therapeutic potential in diabetes and obesity.

(PTX) abolished NMU-induced suppression of

Although the mechanisms underlying the involvement

glucose-stimulated insulin secretion and calciumof Gαi and Gαo signaling in NMU inhibitory effects

response in ϐ cells. Knockdown of Gαi2 and Gαo in

on insulin secretion require detailed investigation,

ϐ cells counteracted NMU-induced suppression

including studies at the structural level, our findingsof insulin secretion and gene alterations related

provide important leads regarding the endogenous

to mitochondrial function and dynamics, ER

NMUR1 transduction pathway.

i/ostress, intracellular ATP level, and mitochondrial

Knowledge of the NMU signaling cascades,

membrane potential. NMU decreased forskolin-

NMU–NMUR1–Gαi2 and Gαo –cAMP–calcium–insulin,

stimulated intracellular cAMP in both mousethe further identification of cognate receptor forand human islets. We concluded that upon NMU

NURP, and functional interactions between NMU

binding, NMUR1 coupled to PTX-sensitive G α i2

and NURP may provide new insight into ϐ-cell

and Gαo proteins in ϐ cells, reduced intracellularbiology and the pathogenesis of diabetes.

C a 2+ i n f l u x a n d c A M P l e v e l w h i c h i n t u r n
suppresses insulin secretion, thereby causing
ϐ-cell dysfunction and impairment.
In addition, I also published an article todiscuss the current findings of NURP in energy
homeostasis and its possible interaction withNMU ４） . Intriguingly in our study, NURP wasfound to expressed in α cells not as expected in
ϐ cells of mouse islets. We further confirmed that
NURP suppressed GSIS in both isolated mouse【文献】

islets and MIN6-K8 cells. In MIN6-K8 cells,１）Zhang W, Sakoda H, Miura A, Shimizu K,

NURP was also found to reduce intracellular Ca2+

Mori K, Miyazato M, Takayama K, Hayashi

influx, and impaired mitochondrial OCR. NURP

Y, Nakazato M. : Neuromedin U suppresses

suppressed GSIS via Gαi proteins and the binding

glucose-stimulated insulin secretion in

assay showed NURP had a dose-dependentpancreatic ϐ cells. Biochem. Biophys. Res.

binding ability in MIN6-K8 cells. Peripheral

Commun. 493, 677-683 (2017).

NURP increased metabolic rate in mice.

２）Zhang W, Sakoda H, Nakazato M. : Neuromedin

171

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成

U suppresses insulin secretion by triggering【結果】

mitochondrial dysfunction and endoplasmic

グレリン投与により，摂餌量と体重の減少が抑制された．

reticulum stress in pancreatic ϐ-cells. FASEB

また，骨格筋重量，脂肪重量の低下はグレリン投与によJ. 34,133-147 (2020).

り軽減された．骨格筋中の IL-6 ，Atrogin-1 ，MuRF-1

３） Zhang, W, Sakoda, H, Nakazato, Y, Islam,の発現はグレリン投与により抑制された．老齢マウスへの

MN, Pattou, F, Kerr-Conte, J, Nakazato, M. :LPS 気管内投与により REE は強力に抑制されたが，グレNeuromedin U uses Gα i2 and Gα o to suppress

リン投与群では LPS コントロール群より早期に REE 値がglucose-stimulated Ca 2+ signaling and insulin

基準値に復帰した．また，グレリン投与群では LPS 気管

secretion in pancreatic ϐ cells. PLoS ONE .,内投与後の自発運動量の低下が抑制された．

16, e0250232 (2021).

【考察】４）Ueno, H, Zhang, W, Nakazato, M. : Regulation of

本邦では高齢化が進行し，高齢者における肺炎後のfeeding and therapeutic application of bioactive

ADL の低下が問題となっている．グレリンシグナルの活性化

peptides. Pharmacol Ther., 239, 108187 (2022).

により，肺炎後の骨格筋萎縮を抑制することが期待できる．

交感神経過活動によるグレリンの発現の低下と疾摂食時の正常な腸管免疫応答を維持する新規肥満治

患との関連の検討

療の検討

坪

内

拡

伸

戸田

（宮崎大学医学部内科学講座 呼吸器・膠原病・感染症・脳神経内科学分野）【背景・目的】郷太郎（東京大学医学部附属病院）【目的】

グレリンは胃から分泌される生理活性物質であり，摂食免疫細胞の食後の反応が肥満時に破綻するメカニズム

亢進作用と強力な抗炎症作用を有する．我々は，グレリを検討するため，今年度は腸管内短鎖脂肪酸が代謝機

ンの投与が強力な抗炎症作用を発揮し，肺炎症や線維化能に及ぼす影響を解析した．

を強力に抑制することを見出した．また，これまでの検討【方法】

により，内因性グレリンシグナルの欠損は，マクロファー

飲料水を介して肥満に対し保護的だと報告されている腸ジの好気的呼吸→解糖系へのシフトを障害し，LPS に対内細菌が産生する酪酸を投与し，糖代謝を解析した．またする炎症応答を抑制することが明らかになった（Biochem

食物が早期に流入する小腸のリンパ組織であるパイエル板

Biophys Res Commun 2022）． 高 齢 者ではグレリン

で，絶食時，摂食後に１細胞レベルで明らかになった遺伝の産生が低下するが，肺の炎症時におけるグレリン値の子発現変化をもとに，siRNA を用いて機能解析を行った．

変動がどのように炎症病態に関与するのかは不明である．

【結果】

今回我々は，グレリンの投与が肺炎症における代謝障害，

これまで Bulk RNA-seq による検討で小腸パイエル板

骨格筋萎縮を改善させるのかを検討した．

では食 後，Hsp70 の発 現 が 増 加し，scRNA-seq では【方法】

骨髄系細胞，B 細胞，T 細胞で食後の発現が確認され18 カ月齢 の C57BL6 マウスに，リポポリサッカライ

た．発現変化が見られる遺伝子の転写開始点近傍のモチド（LPS）4mg/kg の 気 管 内 投 与による急 性 肺 損 傷モーフ解析では NF-κB，Fos:Jun など急性期応答を促進

デルを作 成した． 摂 餌 量， 体 重 変 化， 安 静 時 Energyすると考えられる転写因子に対応するモチーフが複数の遺Expenditure（REE），骨格筋における筋蛋白質合成系 /伝子で共通していた．RT-PCR で同様のサンプルを解析

分解系の分子の発現を，グレリン投与（40nmol/ 頭）のすると，IL-1 β，IL-10 などいずれも NF-κB により発現有無で検討した．

誘導される因子の発現が増強していた．酪酸の存在下で，172

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成

食後に増強するシグナルである LPS，インスリン刺激下での原因遺伝子として同定された転写因子 RFX6 に着目し，

IKBαの RNA 発現は減少しない一方で蛋白量が減少した

内胚葉発生における RFX6 の機能解明を目指している．

ことから同蛋白の分解が促進されている可能性が考えられ【方法】

た．同じ条件で siRNA により Hsp70 を knockdown す

RFX6 ヒト iPS 細胞ノックインレポーター株 RFX6 +/eGFP

ると LPS とインスリンによる分解が障害されたことからこ及び RFX6 eGFP/eGFP ノックイン・ノックアウト株を用いて，の応答は Hsp70 依存的なプロセスだと考えられた．高脂in vitro での胚性内胚葉を経由した原始腸管への分化誘肪食を給餌し肥満状態となった野生型マウスに飲料水を導を用い，原始腸管レベルにおける上流，下流遺伝子制

介して酪酸を投与すると，経口ブドウ糖負荷試験，また食御機構についての検討を行った．

後の高インスリン状態が改善し，血糖降下傾向が見られ【結果】たことから，特に食後のインスリン抵抗性を改善する因子

RFX6 eGFP/eGFP 株において原始腸管発生段階においてであると考えられた．RT-PC R での解析では肥満状態で

PDX1 及び CDX2 の発現低下が認められたが，胚性内障害される小腸パイエル板のサイトカイン発現増加が酪酸

胚葉から原始腸管への成熟段階の day-by-day での追投与下で部分的に見られるようになった．

跡により，RFX6 の発 現 上 昇タイミングから 2-3 日後に【考察】

PDX1 や CDX2 の発現上昇が認められることを確認した．

NF-κB の活性化は肥満状態で障害される，腸管免疫

これまで不明であった RFX6 の上流制御機構については，の正常な応答と考えられた．肥満状態では短鎖脂肪酸に誘導で用いた 3 種の低分子化合物因子の一つが決定的により促進される IκBα蛋白の Hsp70 依存的な分解およびRFX6 発現上昇を引き起こす因子であることを，基礎培地

NF-κB の活性化が障害されることにより免疫細胞の機能への添加実験，完全培地からの除去実験，およびアゴニ

異常をきたす可能性がある．肥満状態で障害される小腸ストを用いた用量依存性の反応の検討により確認できた．

パイエル板のサイトカイン発現増加が酪酸投与下で部分【考察と展望】

的に見られるようになったことから，細胞レベルで確認さ内胚葉発生早期の段階において，これまで膵前駆細胞れる蛋白分解促進などのプロセスが全身の代謝を維持す

以降の分化段階で知られていた RFX6 と PDX1 の制御る可能性が考えられた．正常な短鎖脂肪酸が IKBα蛋白関係と異なった上流下流関係を持っていることが示されの分解プロセスを維持し肥満状態で介入可能な因子を明た．また，今回 RFX6 発現上昇を引き起こす上流の因子

らかにするため解析を進める予定である．

を同定したが，この因子は生体内で合成される物質であり，合成に関与する遺伝子の欠損胎仔マウス体幹においヒトiPS細胞レポーター株を用いた新生児糖尿病原因遺伝子RFX6 の膵・腸管発生成熟機構に関する役
割の解明
中て Rfx6 発現が低下したとの支持的な既報もあり，今後
さらなる上流制御機構の解明を行っていきたいと考えている．また，上記株を用いた腸管オルガノイドの作成，腸管内分泌細胞の分化制御機構の解明についても並行して行村聡っていく予定である．

宏（京都大学）【背景・目的】インスリン依存型糖尿病に対して，将来的に幹細胞由来
細胞移植が期待されている．幹細胞から内分泌組織を誘導していく過程を模倣するにあたっては，ヒトにおける膵・腸

Unveiling the Role of CD206 M2-like Macrophage
Depletion in Activating Fibro-Adipogenic Progenitorsand Enhancing Myogenesis During Tissue Recovery

管を含めた内分泌臓器発生分化過程のメカニズムの解明がAllah Nawaz, Kazuyuki Tobe

重要である．我々は，膵形成不全，腸管形成不全を伴う（University of Toyama, Toyama, Japan）

新生児糖尿病を主徴とする Mitchell-Riley 症候群（MRS）

173

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成【Abstract】

proinflammatory M1 macrophages into anti-

Macrophages play a pivotal role in tissue

inflammatory M2 macrophages to promote

homeostasis and repair, regulating various cellular

muscle growth. Although, proinflammatory

processes. This study investigates the effects of

M1 macrophages reportedly have a negative

depletion of CD206 M2-like macrophages on theeffect on the repair process, the role of M2-like

activation of fibro-adipogenic progenitors andmacrophages is currently unknown. We previously

myogenesis during the recovery process. In thisreported that CD206-derived TGFϐ1 inhibited thestudy, we employed a CD206DTR mouse model,

proliferation of adipocyte progenitors in adipose

characterized by diphtheria toxin injections fortissue (Nawaz A, et al., Nature Communications,conditional depletion of CD206-expressing cells.

2017). These mesenchymal stem cell (MSC)-

Subsequently, we administered cardiotoxin to

like progenitors also reside in muscle and are

induce muscle injury in both CD206DTR andcalled fibro-adipogenic progenitors (FAPs), which

wild-type (WT) mice. The recovery process was

may regulate muscle recovery following injury.

analyzed 7-days post-injury to investigate and

FAPs are multipotent cells that contribute tocompare the regenerative response between

tissue repair by participating in adipogenesis,

the two groups. Our findings reveal that the

fibrogenesis, and myogenesis. Therefore, we

depletion of CD206 M2-like macrophages

presumed that the depletion of CD206 M2-likepromotes a shift in the microenvironment,

macrophages might enhances the activation

leading to the activation of fibro-adipogenicof FAPs in muscle after injury. In this study,

progenitors and subsequently enhancing the

we investigated the role of CD206 M2-like

myogenic differentiation process. This researchm a c r oph a g e s i n t h e a c t i va t i on of FAPs a n dsheds light on the complex interplay between

their impact on myogenesis during the recovery

macrophages and progenitor cells, offering

process.

potential therapeutic targets for promoting tissue【Methods】

repair and regeneration.
【Introduction】

CD206DTR and FAP-derived follistatin KO micemodel of skeletal muscle injury and regeneration

Tissue repair and regeneration are intricate

was utilized. The model involved inducing

processes involving various cell types andacute muscle injury through administration

molecular signals. Macrophages, as key

o f c a r d i o t o x i n a n d s u b s e q u e n t r e c o v e r y.

components of the immune system, exhibit a

Administration of tamoxifen selectively deleted

range of functional phenotypes that modulate

FAP-derived follistatin. Muscle samples weretissue healing. Macrophages indeed play acollected at 7-days post-injury. Histologicalcritical role in the muscle recovery process after

analysis, immunofluorescence staining, and gene

injury. Among these, M2-like macrophages,

expression profiling were conducted to assesscharacterized by CD206 expression, arechanges in tissue architecture, macrophageassociated with anti-inflammatory andpopulations, FAP activation, and myogenesis.

t is su e re mo d e li n g acti v i ti es . Du ri n g m us c l e【Results】

regeneration, proinflammatory M1 macrophages

We r e p o r t e d t h a t d e p l e t i o n o f C D 2 0 6

are recruited to the injury site and remove

M2-like macrophages led to a shift in the

necrotic debris, followed by a switch fromtissue microenvironment, characterized by174

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成

altered cytokine expression and immune cell

depletion of CD206 M2-like macrophages triggers

composition. We also reported that depletiona shift in the tissue microenvironment. This shiftof CD206 M2-like macrophages resulted in theis characterized by altered cytokine expression

activation of FAPs within the injured tissue, as

patterns and changes in the composition ofevidenced by increased expression of activatedimmune cell populations within the injured

FAPs-related marker genes including follistatin,

tissue. Depletion of CD206 M2-like macrophages

F s t l 1 , C C L 7 , D P P 4 e t c . T h e a c t i v a t e d FA P s

may disrupt the finely tuned balance of pro-exhibited an increased capacity for myogenic

inflammatory and anti-inflammatory signals,

differentiation, contributing to accelerated muscle

potentially influencing the activation of various

fiber regeneration. Molecular analysis (Total

resident cell types involved in tissue repair.

RNA sequence analysis of muscle and isolated

The most notable outcome of CD206 M2-like

FAPs, qRT-PCR) revealed upregulation of factors

macrophages depletion is the activation of FAPs

associated with FAP activation, myogenesis, andwithin the injured tissue. The activation of FAPs

tissue remodeling in response to CD206 M2-likein response to CD206 M2-like macrophages

macrophage depletion. We further determined

depletion suggests a potential cross-talkthat deletion of FAP-specific follistatin resulted in

between immune cells and progenitor cells.

the downregulated expression levels of activated

The upregulation of myogenic markers and the

FAP-related marker genes, myogenesis-related

accelerated muscle fiber regeneration observed

marker genes, and increases fibrosis, thereby

in response to CD206 M2-like macrophages

d e l a y i n g t h e r e c o v e r y p r o c e s s . A l t o g e t h e r,

depletion provide compelling evidence of thefollistatin deletion resulted in a reduction in

direct involvement of FAPs in this process. Thesethe expression of key myogenic markers andresults show that the activated FAPs may act as a

impaired muscle fiber regeneration.

source of myogenic precursor cells, contributing【Discussion】

to the efficient generation of new muscle fibers

The findings of this study underscore theduring tissue recovery.

intricate interplay between CD206 M2-like

It is possible that the altered tissue

macrophages, FAPs, and myogenesis during

microenvironment, resulting from the absence

tissue repair and regeneration. Depletion ofof CD206 M2-like macrophages, provides cues

CD206 M2-like macrophages appears to trigger

that promote FAP activation. This activationa cascade of events leading to FAP activation

could be driven by changes in cytokine

and subsequent enhancement of myogenic

profiles, extracellular matrix composition, ordifferentiation. These results suggest a potential

other signaling molecules that influence FAP

therapeutic avenue for promoting tissue repair

behavior. Targeting CD206 M2-like macrophagesby targeting macrophage phenotypes andor modulating their activity could be a viable

manipulating their interactions with progenitor

strategy to manipulate the activation of FAPs andcells. CD206 M2-like macrophages are known for

subsequently enhance myogenesis in situations

their anti-inflammatory and tissue remodelingof tissue injury. Further research is warranted toproperties, often associated with the resolution

elucidate the signaling pathways and molecularphase of inflammation and tissue repair. Our

mechanisms that underlie the interaction

results align with this notion, revealing that the

between CD206 M2-like macrophages and FAPs.

175

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成【Conclusion】(JSPS) Fellow (18F18102 to T.N. and A.N.). This

In conclusion, this study provides novel insights

work was also supported by JSPS KAKENHI

into the role of CD206 M2-like macrophages in(Grant numbers 20K22733, and 22K16408 to

tissue repair and regeneration. Depletion of theseA.N.). Additional support was provided by theCD206 M2-like macrophages activates FAPs andDaiichi Sankyo Foundation for Life Scienceenhances myogenesis, offering potential strategies

Research, AMED-FORCE (Development offor enhancing tissue healing in various clinicalTreatment for Obesity in Humans Targeting NFIA

contexts (Fig.１). Further research is warranted toin Adipocytes), Tamura Science and Technology

elucidate the underlying mechanisms and explore

Foundation (2021) to K.T. and Cell Science

the translational implications of these findings.

Foundation (to A.N.).
【References】
１）Nawaz A, Bilal M, Fujisaka S, Kado T, Aslam
MR, Ahmed S, et al. Depletion of CD206+ M2like macrophages induces fibro-adipogenic
progenitors activation and muscle regeneration.
Nature Communications. 2022 Nov; 13: 7058,

Figure 1: Depletion of CD206 M2-likemacrophages enhances activation of FAPs

to secrete Fst, thereby promoting recovery
of muscle following acute injury【Acknowledgments】
We a c k n o w l e d g e t h e s u p p o r t o f f u n d i n gagencies and the dedicated efforts of thedoi:10.1038/s41467-022-34191-y.
２）N a w a z A . , F u j i s a k a S . , K a d o T. e t a l .
Heterogeneity of adipose tissue-resident
macrophages-beyond M1/M2 paradigm.
Diabetology International. 2023 April; 14,
125–133. https://doi.org/10.1007/s13340023-00624-2.

research team members who contributed to this３）Bilal M, Nawaz A, Kado T, Aslam M. R,

study. This work was supported by the JapanI g a r a s h i Y, N i s h i m u r a A , Wa t a n a b e Y,

Foundation for Applied Enzymology (a grant for

Kuwano T, Liu J, Miwa H, Era T, Ikuta K,

Front Runner of Future Diabetes Research to

Imura J, Yagi K, Nakagawa T, Fujisaka S,

A.N.), and Young Research Grant from the Japan

Tobe K. “Fate of adipocyte progenitors during

Diabetes Society (to A.N). This research was

adipogenesis upon high-fat-diet. Molecularsupported by Moonshot R&D (Grant numbers

Metabolism. 2021 Sep 23;101328.

JPMJMS2021, and JPMJMS2023). This work４）Giordani, L. et al. High-dimensional single-

was also supported by JSPS KAKENHI (Grant

cell cartography reveals novel skeletal

numbers 20H03730 to K.T., and 20K08882 tomuscle-resident cell populations. Mol. Cell

S.H. and K.T.), The Mitsubishi Foundation /74, 609–621.e606 (2019).

Research Grants in the Natural Science (2019),

５）Joe, A. W. et al. Muscle injury activates resident

Grant from Japan Diabetes Foundation (2020),

fibro/adipogenic progenitors that facilitate

Research Activities of First Bank of Toyama

myogenesis. Nat. Cell Biol. 12, 153–163 (2010).

Scholarship Foundation (2020). This work was６）Uezumi, A. et al. Fibrosis and adipogenesis

additionally supported by Grants-in-Aid fromoriginate from a common mesenchymal

the Japan Society for the Promotion of Science

progenitor in skeletal muscle. J. Cell Sci. 124,

176

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成

3654–3664 (2011).

Okamura T, Tokuyama K, Ando A, Matsumoto７）Uezumi, A., Fukada, S., Yamamoto, N., Takeda,

M , M o r i H , N a k a g a w a T, K o b a y a s h i

S. & Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors

N , S a e k i K , U s u i I , F u j i s a k a S , To b e K .

distinct from satellite cells contribute to ectopic

CD206+ M2-like macrophages regulate

fat cell formation in skeletal muscle. Nat. Cellsystemic glucose metabolism by inhibiting

Biol. 12, 143–152 (2010).

proliferation of adipocyte progenitors. Nature

８）Wosczyna, M. N. et al. Mesenchymal stromal

Communications. 2017 Aug 18; 8(1):286.

cells are required for regeneration and15）Nawaz A, Mehmood A, Kanatani Y, Kado T,

homeostatic maintenance of skeletal muscle.

Igarashi Y, Takikawa A, Yamamoto S, Okabe

Cell Rep. 27, 2029–2035.e2025 (2019).

K, Nakagawa T, Yagi K, Fujisaka S, Tobe K.

９）Ratnayake, D. et al. Macrophages provide a

Sirt1 activator induces proangiogenic genes intransient muscle stem cell niche via NAMPT

preadipocytes to rescue insulin resistance insecretion. Nature 591, 281–287 (2021).

diet-induced obese mice. Scientific Reports.

10）Tidball, J. G. & Villalta, S. A. Regulatory

2018;8(1):11370.

interactions between muscle and the immune16）Ono Y, Nagai M, Yoshino O, Koga K, Nawazsystem during muscle regeneration. Am. J.

A, Hatta H, Nishizono H, Izumi G, Nakashima

Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 298,

A, Imura J, Tobe K, Fujii T, Osuga Y, Saito

R1173–R1187 (2010).

S. CD11c+ M1-like macrophages (MΦs) but

11）Nawaz A, and Tobe K. M2-like macrophages

not CD206+ M2-like MΦ are involved inserve as a niche for adipocyte progenitors

folliculogenesis in mice ovary. Scientificin adipose tissue. Journal of Diabetes

Reports. 2018 May 25; 8(1):8171.

Investigation. 2019 Nov; 10(6):1394-1400.

17）Takikawa A, Mahmood A, Nawaz A, Kado T,12）Takikawa A, Usui I, Fujisaka S, Tsuneyama

Okabe K, Yamamoto S, Aminuddin A, Senda

K, Okabe K, Nakagawa T, Nawaz A, Kado T,

S, Tsuneyama K, Ikutani M, Watanabe Y,

Jojima T, Aso Y, Hayakawa Y, Yagi K, Tobe K.

Igarashi Y, Nagai Y, Takatsu K, Koizumi K,

Macrophage-specific hypoxia-inducible factor-1

Imura J, Goda N, Sasahara M, Matsumoto M,

α deletion suppresses the development of liver

Saeki K, Nakagawa T, Fujisaka S, Usui I, Tobetumors in high-fat diet-fed obese and diabetic

K. HIF-1α in Myeloid Cells Promotes Adipose

mice. Journal of Diabetes Investigation.

Tissue Remodeling Toward Insulin Resistance.

2019 Nov; 10(6):1411-1418.

Diabetes. 2016 Dec; 65(12):3649-3659.

13）Igarashi Y, Nawaz A, Kado T, et al. Partial18）Fujisaka S, Usui I, Nawaz A, Takikawa A, Kado

depletion of CD206-positive M2-like

T, Igarashi Y, Tobe K. M2 macrophages inmacrophages induces proliferation of

metabolism. Diabetol Int. 2016; 7(4):342-351.

beige progenitors and enhances browning
after cold stimulation. Scientific Reports.
2018;8(1):14567.
14）Nawaz A, Aminuddin A, Kado T, Takikawa
A, Yamamoto S, Tsuneyama K, Igarashi Y,
Ikutani M, Nishida Y, Nagai Y, Takatsu K,

新規レポーターマウスを用いた膵α細胞新生・分化
機構の解明
氷

室

美

和
（順天堂大学代謝内分泌内科学）

Imura J, Sasahara M, Okazaki Y, Ueki K,

177

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成【目的・方法】
近 年， 膵α細 胞 の 可 塑 性 が 明らかとなってきており，α細 胞の分 化 機 構を明らかにすることは，α -to-ϐ
reprogramming を介した ϐ 細胞再生医療へと繋がる可NFIAが褐色脂肪細胞分化を制御するメカニズム及び全身代謝への影響の解明
平

池

勇

雄
（東京大学保健・健康推進本部）

能性がある．我々はα細胞分化を時間軸に沿って解析するため，レポーターコンストラクト eGFP-IRES-mRFP を
proglucagon gene に挿入した “Gcg-Timer マウス ” を【背景】作製した．本マウスでは IRES の影響により eGFP の緑

肥満や 2 型糖尿病などの生活習慣病は全世界に蔓延

色蛍光と mRFP の赤色蛍光との検出にタイムラグが生じ，している．また現 存する肥 満の薬 物 治 療， 外 科 治 療は内分泌前駆細胞から分化したばかりの新生α細胞は緑色

全て「エネルギー摂取の抑制」を意図しているが，エネ

蛍光，より分化したα細胞は緑色および赤色蛍光を呈す

ルギー収支を平衡させるためには「エネルギー消費の促る細胞として標識されるため，共焦点レーザー顕微鏡及進」というアプローチも考えられる．褐色脂肪細胞はミト

び flow cytometry を用いてα細胞を経時的に観察できコンドリアにおける uncoupling protein-1（Ucp1）のる．本マウスを用いて「α細胞がいつ・どこで生まれるの機能を介して熱を産生しエネルギーを消費する機能を有か？」を明らかにするとともに，α細胞新生・分化過程にし，既に BMI と褐色脂肪細胞の活性が負に相関するこおける遺伝子発現プロファイルの変化を解析する．

と，加齢に伴い褐色脂肪細胞の活性が低下することが報【結果】告されている．申請者らは褐色脂肪細胞の分化を制御す

Gcg-Timer マウス膵を共 焦 点レー ザ ー 顕 微 鏡 及びる鍵因子である転写因子 nuclear factor I-A（NFIA）

flow cytometry を用いて観察した結果，緑色蛍光を呈をゲノムワイドなオープンクロマチン解析で同定し解析してする新生α細胞は胎生期及び生後 7 日未満の新生仔期にきた（Hiraike Y. et al. Nature Cell Biology 2017,

おいてのみ観察された．胎生 17.5 日膵切片の膵管・血Hiraike Y., et al. PLoS Genetics 2020, Hiraike Y.,

管を免疫染色した結果，新生α 細胞は膵管のみでなく血et al. iScience 2022）．更に我々は台湾 biobank の解管にも接しており，またどちらにも接していない新生α細胞

析からもっとも代表的な肥満感受性 SNP のひとつであり褐は認めなかった．内分泌前駆細胞は膵管周囲から生じる

色脂肪細胞の機能を介して作用する FTO 遺伝子近傍のとされているが，この結果は既報にある新生 ϐ 細胞が血

rs1421085 と定期的な運動習慣の間に追跡期間中の体管周囲にも認められるという結果と合致している．同時期

重増加に対する遺伝子環境相互作用を同定した（Hiraikeのマウス膵を用いて非α細胞・新生α細胞・より分化した

Y. et al. The Journal of Clinical Endocrinology

α細胞に FACS で sorting 後 RNA sequencing を行っ& Metabolism 2021）．

た．分化したα細胞群と比し，新生α細胞群で増加してい本研究は NFIA を標的として褐色脂肪細胞の数や働きる遺伝子群には血管新生に関わる遺伝子群も抽出されてを高めることで「エネルギー消費の促進」に基づく生活習

おり，上記新生α細胞と血管との関連性を支持する結果

慣病の治療を実現するための理論的基盤の提供を目指すと考えられた．

ものである．

【考察および今後の展望】【結果】

胎生期マウス膵の免疫染色や FACS・トランスクリプトーム

我々は最近，脂肪細胞特異的 NFIA トランスジェニッ

解析により，新生α細胞の特性を明らかにすることができた．

クマウス（NFIA-Tg）の解析から NFIA の抗肥満作用，

これまでに得られた，α細胞新生時期，場所（膵管と抗糖尿病作用を明らかにした．NFIA-Tg の白色脂肪細血管との位置関係），関連する遺伝子変化（トランスクリ胞では予想通り褐色脂肪細胞特異的遺伝子群およびミト

プトーム解析），そして成体マウスにおけるグルカゴンシグ

コンドリアにおける酸化的リン酸化に関与する遺伝子群

ナル抑制下のα細胞新生誘導の結果をもとに，さらに詳が正に制御されていた一方，炎症を促進する遺伝子群は細なデータ解析を行い，論文化に取り組んでいる．

予想外に負に制御されていた．NFIA は脂肪細胞から分178

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成

泌され全身の炎症を促進し肥満や糖尿病を増悪させる因Proceedings of the National Academy of

子として良く知られる Monocyte chemotactic protein

Sciences of the United States of America

1（MCP-1）の発 現を抑 制し， 結 果として脂 肪 組 織の2023; 120(31): e2308750120.

慢性炎症を改善させた．すなわち NFIA はミトコンドリア*Corresponding authorの活性化ならびにエネルギー消費の亢進作用と抗炎症

２）GBD 2021 Diabetes Collaborators. Global,

作用の双方を介して肥満や糖尿病に保護的に作用する

regional, and national burden of diabetes

ことを明らかにした（Hiraike Y., et al. Proceedings

from 1990 to 2021, with projections ofof the National Academy of Sciences of theprevalence to 2050: a systematic analysis forUnited States of America 2023）．また我々の研究グ

the Global Burden of Disease Study 2021.

ループの基 盤 技 術である脂 肪 細 胞のクロマチン免 疫 沈

The Lancet 2023; 402(10397): 203-234.

降およびマウス白色脂肪組織からの stromal vascular３）Saito K, Hiraike Y*, Oguchi M and Yamauchi

fraction（SVF） の 単 離と脂 肪 細 胞 へ の 分 化 誘 導 に

T. Semi-Automated Isolation of the Stromal

つ いて method 論 文 を 発 表 した（Hiraike Y. STAR

Vascular Fraction from Murine White Adipose

Protocols 2023, Saito K., Hiraike Y., et al.

Tissue Using a Tissue Dissociator. Journal of

Journal of Visualized Experiments 2023）．更にVisualized Experiments 2023; (195): e65265.

また Global Burden of Disease (GBD) Collaborator*Corresponding author

Network Member として様々な疾病，外傷ならびにそ

４）Hiraike Y*. Chromatin immunoprecipitation

れらのリスク因子が死亡と障害に与える影響のメタ解析

with mouse adipocytes using hypotonic bufferにも取り組んでおり，糖尿病による全世界的な疾病負荷

to enrich nuclear fraction before fixation.

の現状と将来展望について解析し発表した（GBD 2021

STAR Protocols 2023; 4(1): 102093.

Diabetes Collaborators, Hiraike Y., et al. The*Corresponding author

Lancet 2022）．
【今後の展望】
褐色脂肪細胞における NFIA が全身代謝に及ぼす影
響及び作用メカニズムの全貌が明らかになれば，「エネル
ギー消費の促進」に基づく新たな生活習慣病の治療法のアディポネクチンの組織修復機構の解明
藤

島

裕

也

（大阪大学大学院医学系研究科 内分泌・代謝内科学）

開発に結実することが期待される．また褐色脂肪細胞の活性が体重や血糖，心血管イベント等に与える影響をバ

脂肪細胞特異的分泌蛋白・アディポネクチン（APN）

イオバンクの大規模データで検証し特に遺伝子環境相互は，肥満・特に内臓脂肪蓄積により血中濃度が低下し，作用に注目して解析することにより，遺伝リスクに基づい

メタボリックシンドロームの病態に重要な役割を果たす．

た最適な生活指導という形で生活習慣病領域における精我々は APN が GPI アンカー型膜蛋白である T-cadherin

密医療の実現につながることが期待される．

（Tcad）への特異的な結合を介して，心血管組織や骨【文献】

格筋に集積・存在していることを見出した１）．特に血管構

１）Hiraike Y*, Saito K, Oguchi M, Wada T, Toda

成細胞において APN は，大動脈や網膜細動脈の血管内

G, Tsutsumi S, Bando K, Sagawa J, Nagano

皮細胞や動脈硬化巣の増殖型平滑筋細胞，腎細管周囲

G, Ohno H, Kubota N, Kubota T, Aburatani

微小血管の血管周皮細胞（pericyte）に Tcad 依存的

H, Kadowaki T, Waki H and Yamauchi T.

に集積しており，動脈硬化症や糖尿病性網膜症，虚血再NFIA in adipocytes reciprocally regulates

灌流後の急性腎障害に対し保護的に作用することを示し

mitochondrial and inflammatory geneた２－４）．そして，このような APN の多彩な臓器保護作用

program to improve glucose homeostasis.

を説明しうるメカニズムとして，APN/Tcad がエクソソー

179

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成

ムの生成・分泌を強く促進し，細胞内に蓄積したセラミド

S, Mori T, Fukuda S, Sekimoto R, Yamaoka

をはじめとする不要物質の細胞外への放出を介した自身のM, Obata Y, Kita S, Nishizawa H, Funahashi

細胞の恒常性維持や，エクソソームそのもを介した組織

T, Ranscht B, Shimomura I. Adiponectin

修復に寄与することを明らかとした３－６）（図 1）．

association with T-cadherin protects against

また現在は，Tcad flox マウスを，Ubiquitin-CreERT2マウスや VEcadherin-CreERT2 マウスおよび PDGFR αneointima proliferation and atherosclerosis.
FASEB J. 2017 31:1571-1583-CreERT2 マウスと交配させることで，タモキシフェン誘

３）Tsugawa-Shimizu Y, Fujishima Y**, Kita S,

導的に全身性あるいは，血管内皮細胞および pericyte/

Minami S, Sakaue TA, Nakamura Y, Okita

体性幹細胞・特異的に T-cad を欠損させるマウスをすでにT, Kawachi Y, Fukuda S, Namba-Hamano T,

樹立している．Preliminary な検討ではあるが，全身性・Takabatake Y, Isaka Y, Nishizawa H, Ranscht

Tcad 欠損マウスにタモキシフェンを投与し Cre を誘導する

B, Maeda N, Shimomura I. Increased vascularと，血中 APN 濃度は経時的に約４倍程度まで上昇する一

permeability and severe renal tubular

方で，血管内皮細胞あるいは pericyte/ 体性幹細胞・特damage after ischemia-reperfusion injury

異的な Tcad 欠損マウスでは，Cre 誘導後に血中 APN は

in mice lacking adiponectin or T-cadherin.

いずれも２倍程度に上昇し，これらを合わせると全身性・

Am J Physiol Endocrinol Metab . 2021 Feb

Tcad 欠損マウスと同等の血中 APN 濃度となる結果が得ら

1;320(2):E179-E190.

れた．このことから，
これら２つの血管構成細胞の Tcad が，

４）Sakaue TA, Fujishima Y**, Fukushima Y,

心筋細胞や骨格筋細胞といった血管外の Tcad 発現組織

T s u g a w a - S h i m i z u Y, F u k u d a S , K i t a S ,への APN の移行や分布，さらにはその全身作用をも強く

Nishizawa H, Ranscht B, Nishida K, Maeda

規定するのではないかと想定し研究を進めている．

N, Shimomura I. Adiponectin accumulationin the retinal vascular endothelium and its
possible role in preventing early diabetic
microvascular damage. Sci Rep . 2022 Mar
9;12(1):4159.
５）Obata Y, Kita S, Koyama Y, Fukuda S, Takeda
H , T a k a h a s h i M , F u j i s h i m a Y, N a g a o H ,Masuda S, Tanaka Y, Nakamura Y, Nishizawa
H, Funahashi T, Ranscht B, Izumi Y, Bamba T,

図1

Fukusaki E, Hanayama R, Shimada S, Maeda
N, Shimomura I. Adiponectin/T-cadherin【文献】

system enhances exosome biogenesis and１）Matsuda K, Fujishima Y, Maeda N, Mori T,

decreases cellular ceramides by exosomal

Hirata A, Sekimoto R, Tsushima Y, MasudaS,

release. JCI Insight . 3(8):e99680, 2018.

Yamaoka M, Inoue K, Nishizawa H, Kita

６）Nakamura Y, Kita S, Tanaka Y, Fukuda S,

S , R a n s c h t B , F u n a h a s h i T, S h i m o m u r a

Obata Y, Okita T, Nishida H, Takahashi Y,

I. Positive feedback regulation between

Kawachi Y, Tsugawa-Shimizu Y, Fujishimaa d i p o n e c t i n a n d T- c a d h e r i n i m p a c t s

Y, Nishizawa H, Takakura Y, Miyagawa S,

adiponectin levels in tissue and plasma of

Sawa Y, Maeda N, Shimomura I. Adiponectinmale mice. Endocrinology . 2015;156:934-46.

Stimulates Exosome Release to Enhance２）Fujishima Y*, Maeda N, Matsuda K, Masuda

Mesenchymal Stem-Cell-Driven Therapy of180

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成

Heart Failure in Mice. Mol Ther . 2020:S1525-

退縮効果に影響を与えなかった．ICI 投与により同マウ

0016(20)30316-6.

スに種々の自己免疫疾患が誘発されることが知られており，MSC 投与が全般的な自己免疫疾患症状の発症を抑免疫チェックポイント阻害薬投与により誘発される
１型糖尿病への間葉系幹細胞投与効果の検討
堀

谷

恵

美

（大阪大学大学院医学系研究科 内分泌・代謝内科学）【背景・目的】近年，免疫チェックポイント阻害薬（ICI）が種々の悪性腫瘍に対して適応拡大され，副作用としての急性発症 /劇症 1 型糖尿病が増加しつつあるが，未だ有効な治療法が確立していない．間葉系幹細胞（MSC）は抗線維化，制するかどうかについても検討を進めている．③エクソソームが投与細胞の Quality control に有用であるかを確認するために，T-cadherin ノックダウン MSC を作製し，
NOD/ShiJcl マウスのモデルを用いてコントロール MSCとの薬効を比較する予定である．

Irs2 アンチセンスRNA/PPARγ経路制御による新たなNAFLD/NASH治療法の開発
松

下

真

弥

（国立国際医療研究センター 分子糖尿病医学研究部）

組織再生，及び免疫調節に機能するとされており，ICI に誘発される 1 型糖尿病に対する MSC の投与効果の検討【背景】

を進めている．我々は，雄性 NOD/ShiJcl マウスに，抗NAFLD/NASH は糖尿病の併存疾患として罹患率も高

PD-L1 抗体を投与することで，1 型糖尿病が発症し，同く，我が国の肝臓癌の原因として 40％近くを占めるように時にヒト脂肪由来 MSC（hAD-MSC）を週 3 回計 6 回なっており，その正確な病態形成メカニズムや有効な治投与することで糖尿病発症を抑制すること，血中 MSC 由療法の開発が求められている．

来 exosome は顕著に増加し，MSC の効果に影響してい我々のゲノムの 90％以上の領域は何らかのレベルで転る可能性を報告した．さらに，PD-L1 抗体投与により膵写され RNA を産出しており，その様な転写産物の多くは島内の CD3 陽性 T 細胞と Cxcl9 陽性 MΦが有意に増タンパク質をコードしない non-coding RNA（ncRNA）に加し，MSC 投与群では有意に減少したことを報告した．

分類される．これまでの研究で我々は，代謝関連遺伝子と，また，ICI 投与により劇症 1 型糖尿病を発症したヒト症例

そのイントロンやアンチセンス鎖から産生される ncRNA との膵島においても，CD3 陽性 T 細胞および Cxcl9 陽性がしばしば協調的に制御され代謝作用を持ちうるということ

MΦの存在を認めた．臨床化に向け，① MSC の投与量，に着目し，新たな代謝関連 ncRNA を同定してきた１）．

投与回数の最適化，② MSC の腫瘍免疫に対する作用，直近の研究において我々は，主要なインスリンシグナル③投与細胞の Quality Control，臨床非臨床を繋ぐバイ

伝達分子の一つ Irs2 のアンチセンス鎖からこれまで未解

オマーカーの課題を解決することを目的としている．

析のアンチセンストランスクリプトである ncRNA（ASIrs2 ）【方法】

が転写され，その発現が栄養状態によって大きく変化する① NOD/ShiJcl マウスのモデルを用いて，1 回の投与こと，ASIrs2 の発現抑制によって肝脂肪蓄積関連遺伝子

でも薬効が示されるか検討した．② B6 マウス由来大腸が有意に低下し，肥満モデルマウスの脂肪肝が著明に改

癌細胞株 MC38 を B6.MRL-Faslpr/J マウスに移植して善することを示した．また，ASIrs2 の結合タンパクとして固形癌を形成させた後，抗 PD-1 抗体・抗 CTLA4 抗体

ミトコンドリアタンパク HARS2 が同定され，この HARS2

および MSC を投与することで，MSC が ICI の抗癌作用が脂質代謝に関わる未知の機能を持ちうることを示した 2）．

に与える影響を検討した．
【結果と展望】① MSC の投与回数を 1 回に減らしても 1 型糖尿病発症を有意に抑制できた．② MSC 投与群でも ICI の腫瘍

181

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成

NASH スコアと有意に相関しており，ヒト AL162497.1
が マウス ASIrs2 の orthologue である可 能 性 が ある．
しかしながら，そのヒトにおける機 能 およびその 作 用
機 序については改めての検 証が 必 要である．ここでは

AL162497.1 がマウス ASIrs2 と相同の機能をもつことを想定し，ヒト肝細胞を用いた pull down assay やヒト肝細胞で AL162497.1 を抑制した検証を行う．
２）Hars2 はどのようなメカニズムで Pparg を制御してい
図1
【目的】

るか調べる
マウスの肝細胞特異的に Hars2 をノックダウンした組織
では Pparg の上昇を認めた．Hars2 をノックダウンした組

近年の遺伝解析手法の進歩により多くのノンコーディン

織において RNA シークエンスで網羅的に解析する．そこでグ RNA が同定され，一部のものについては代謝に関わる

コントロール群と比較して変化のあった遺伝子を脂質関連ことが報告されてきている．現時点でこうしたノンコーディ

遺伝子中心に確認し，Hars2 から Pparg へと至るシグナル

ング RNA を治療標的とした臨床応用可能な治療薬は報伝達経路を明らかにし，新たな治療標的として提案する．

告されていないが，RNA 医薬品は肝臓へのアクセスが容

３）チアゾリジン系薬剤との併用効果を調べる

易であり，実際に複数の siRNA 医薬が臨床応用されつ

チアゾリジン系薬剤は血糖降下作用と抗動脈硬化作用つある．先述の通り，これまでの研究で我々は，マウスのを示す一方で，副作用として骨粗鬆症や浮腫，心不全のIrs2 遺伝子座のアンチセンス鎖から産生されるノンコーデ

増悪などのリスクを有するとともに，その肝臓への直接作

ィング RNA である ASIrs2 が，HARS2（histidyl-tRNA

用は肝脂肪蓄積の亢進を含む肝毒性が懸念される．一方

synthase mitochondria）との結合を介して PPARg ので，ASIrs2 の抑制は，脂肪肝の改善につながるものの，発現を誘導し，肥満に伴う脂肪肝の形成に重要な役割を

むしろマウスの糖代謝は悪化した 2）．これらの治験を踏ま持つことを解明した．ヒトでもマウスの場合と同様に IRS2

え，今回 db/db マウスにロシグリタゾンと ASIrs2 のノッ

遺 伝 子 の 対 側に AL162497.1 というノンコーディング

クダウンを併用することで，脂肪肝の改善効果やロシグリ

RNA が存在し，その発現レベルはヒトの脂肪肝の程度やタゾン必要量の減少とともに，糖代謝の改善が併せて得NASH スコアと正に相 関することから２），AL162497.1

られることを期待し，実験を行った．

がマウスの ASIrs2 の orthologue であり，ヒトの脂肪肝の病態形成に重要な役割を果たしている可能性がある．
本研究ではこれらの知見を踏まえ，AL162497.1 の代謝作用の解析，また ASIrs2-HARS2 を軸とした脂肪肝の病態
メカニズムの更なる解析と，その臨床的な応用を目的とする．
【方法】
１）ヒト肝細胞系の培養細胞を用いて AL162497.1 が実際にどの様な作用を持つかを検証する．
ヒトの IRS2 遺 伝 子 座 に は ASIrs2 の Orthologue（AL162497.1 ） が 存 在 する．AL162497.1 は マウス

ASIrs2 と比較して配列の相同性は 50-60％程度と低い
ものの，そのゲノム上の配置は似通っており，一般的なncRNA の性質として両者の機能が保存されている可能性が高い．実際 AL162497.1 の発現は内臓脂肪蓄積や

182

図2

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成【結果・考察】１）ヒト肝細胞系の培養細胞を用いて AL162497.1 が実際にどの様な作用を持つかを検証する．
初め我々は Human primary hepatocytes を用い，Human Hepatocytes Care Manual を参 照の上 複 数の LNA で AL162497.1 を抑制した際の遺伝子発現変化を確認したが，Off Target が多いためか一貫した結果にならなかった．Hep3B 細胞では AL162497.1 の発現が確認されたため，これを複数の方法で発現抑制したが，マウス肝癌細胞の系とは異なり Pparg の発現に差が見られなかった．
２）Hars2 はどのようなメカニズムで Pparg を制御しているか調べる

Hars2 を肝 臓 特 異 的 に抑 制したマウスの 肝 組 織 でRNA-seq を行ったところ，mitoUPR 関連の遺伝子発現

図3が増加していた．実際に，qPCR も同様の結果が得られた．
マウス由来の肝癌細胞を用いて ATF4 を抑制したとこ
ろ，ATF4 の抑制により Trib3 や Nupr1 など mitoUPR
遺伝子の誘導は完全に抑制された一方，Pparg1 の発現は逆に上昇した．
ミトコンドリア DNA（mtDNA）にコードされるタンパ
ク質の発現を阻害するクロラムフェニコールをコントロール

図4

において再度確認したところ，Hars2 の変化によって下流の Pparg に変化はなかった．

ATF よ り も 上 流 の Gcn2 ， ま た ATF3 ，ATF5 の【考察】

siRNA を確認．またこれ以外の pathway として JNK の

初め我々は Human primary hepatocytes を用い，リン酸化を Western blot で確認したが，そちらも刺激の

複数の LNA で AL162497.1 を抑制した際の遺伝子発有無で明らかな差は見られなかった（未公開データ）．

現変化を確認したが，Off Target が多いためか一貫し

３）チアゾリジン系薬剤との併用効果を調べるた結果にならなかった．そこでヒト肝癌由来細胞株である

ロシグリタゾンと shASIrs2 を併用することで，少量のHepG2 や Hep3B を用いることとした．この中で Hep3B

ロシグリタゾンで血糖改善効果が見られた．また，体重細胞では AL162497.1 の発現が確認されたため，これを増加に関してもロシグリタゾン単剤で治療するよりも増加

複数の方で発現抑制したが，マウス肝癌細胞の系とは異が乏しく，ロシグリタゾンによる脂肪蓄積関連遺伝子の発なり Pparg の発現に差が見られなかった．AL162497.1

現誘導は，ASIrs2 の発現抑制によりほぼ完全にキャンセの作用と ASIrs2 の作用とが異なるものであるか否かはルされ，これに伴い肝臓の炎症マーカー遺伝子の発現も更なる検証が必要であるが，一方でその結合蛋白として抑制された．

ASIrs2 の 下 流で 作 用する Hars2 については，その 作
用は種間で保存されている可能性が高い．そこで並行して，HARS2 の作用機序についても以下の検討を行った．

HARS2 はヒスチジンの tRNA 合成酵素であるが，既報でも飢餓などで tRNA とアミノ酸が結合しない状況下で183

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成

は，tRNA の結 合により GCN2 が 活 性 化され，その下【計画】

流で mitoUPR が 惹 起されると共に，Pparg の 発 現 増

当 初 予 定 し て い た IRS2 遺 伝 子 座 の ASirs2 と加や脂 肪 肝 形 成は報 告されている３）．GCN2 の下 流でAL162497.1 との相同性の確 認を目的として， 次 年 度

mitoUPR を活性化する主要転写因子として ATF3 ,ATF4

は IPS 細 胞由来の幹 細 胞をつかった検 討をする．またおよび ATF5 が知られている．そこで，マウス由来の肝GCN2 の阻 害 薬を使 用した場 合に，in vivo で Hars2

癌細胞を用いて ATF4 を抑制した．ATF4 の抑制によりの変化や Pparg ，脂肪肝などにどのような変化が生じる

Trib3 や Nupr1 など mitoUPR 遺伝子の誘導は完全にかを解析する．

抑制された一方，Pparg1 の発現は逆に上昇した．

【引用文献】

これらのことから，１，Pparg の 誘 導 は ATF4 では

１）Aw a z a w a M e t a l , A m i c r o R N A s c r e e n

ない 別 の pathway の 下 流である２，その pathway は

reveals that elevated hepatic ectodysplasin

ATF4 が無い条件下ではおそらく代償性に活性化されてA expression contributes to obesity-induced

いるという二つの可能性が考えられた．今後，in vivo でinsulin resistance in skeletal muscle, Nat

更なる検討を進める予定である．また，ロシグリタゾンとMed,23;1466-1473(2017).

shASIrs2 を併用することで，少量のロシグリタゾンで血２）Awazawa M & Maya Matsushita et al. An

糖改善効果が見られた他，体重増加に関してもロシグリタ

antisense transcript transcribed from Irs2

ゾン単剤で治療するよりも増加が乏しく，ロシグリタゾンに

locus contributes to the pathogenesis of

よる脂肪蓄積関連遺伝子の発現誘導は，ASIrs2 の発現

hepatic steatosis in insulin resistance.

抑制によりほぼ完全にキャンセルされ，これに伴い肝臓のChembiol,29;680-689(2021).

炎症マーカー遺伝子の発現も抑制された．このことから，

３）J Dong et al. Uncharged tRNA activates

ASIrs2 の抑制と少量のチアゾリジンとの併用は，肥満にGCN2 by displacing the protein kinase moiety

伴う脂肪肝および糖代謝異常に対する有効な治療であるfrom a bipartite tRNA-binding domain.Mol

可能性が示唆された．

Cell,6;269-279(2000).

新規代謝物を起点とした、褐色脂肪組織の分化制
御機構の解明および糖尿病・肥満症へ治療応用
南

野

寛

人

（京都大学大学院医学研究科 糖尿病・内分泌・栄養内科学）【目的】
我々は，これまでの研究で，代謝物：テトラヒドロビオ
プテリン（BH4）が，褐色脂肪組織（Brown adipose
tissue:BAT）の分化に不可欠な因子であることを，遺伝子改変マウスや細胞実験系を用い明らかにし，代謝物レベルでの BAT 制御が生体内で重要であることを示してきた．
しかし，詳細な制御機構や，BAT 分化に関与するその他の代謝物についての知見は非常に乏しいのが現状である．
本研究課題では，これまでに同定した，BAT 分化を制
図5

御する代謝物：BH4 の下流シグナルや代謝物を明らかにすることを目的とした．

184

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成【方法・結果】に分化するのを促進する．細胞障害性 T 細胞はインター

野生型マウス，BAT 分化障害を来す BH4 欠乏マウス（Hph-1），ならびに BH4 の補 充を行った BH4 欠 乏マ

フェロン（IFN）やパーフォリンを分泌してβ細胞を破壊する．

ウス由来の BAT を採取し，RNA-seq を用いた網羅的遺助成者は既に，転写因子 FoxO1 が 1 型糖尿病モデル

伝子発現解析を行った．その結果，BH4 欠乏下で遺伝（NOD）マウス由来の CD8+T 細 胞の細 胞 分 化に重 要子発現が大きく減損し，BH4 補充による回復する遺伝子な働きを担っていることを見出しており，FoxO1 阻害薬に群をパスウェイ解析により複数同定した．同定された一部より CD8+T 細胞の分化並びに IFNγの分泌が抑制されの候補について詳細な実験を行うため，褐色脂肪細胞株

ることを確認している．

を用いた in vitro の検討を行い，BH4 と各パスウェイの本 研 究では，1 型 糖 尿 病において FoxO1 が CD8+T阻害薬の共投与実験を行った．結果，一酸化窒素 - グア細胞の分化を制御するメカニズムを明らかにし，FoxO1 阻

ニル酸シクラーゼ -cGMP の経路が BH4 由来の褐色脂害が 1 型糖尿病の病態を改善させるか否かを検証する．

肪分化に大きく寄与することが明らかとなった．

【方法】

上記実験と並行し，上述の BAT 試料を用いメタボロミ

１）CD8+T 細胞の RNA-seq 解析

クス解析を行い，網羅的な代謝物の挙動の変化を調査す

2 種類の FoxO1 阻害薬を用いて CD8+T 細胞を前処ることを試みている．サンプル抽出条件などの予備的な検置後に，抗 CD3/CD28 抗体で T 細胞を刺激して 24 時

討を本年度既に行い，現在データを取得・解析中である．

間 後に細 胞を回収した．RNA 抽出をおこない，RNA-【考察および今後の展開】

seq 解析を施行した．

本年度の課題の遂行により，代謝物：BH4 による BAT２）NOD マウスへの FoxO1 阻害薬投与

分化の制御機構に寄与する遺伝子群を同定し，その一部

6 週 齢 の 雌 性 NOD マウスに 浸 透 圧 ポンプ（Alzetの経路に関して細胞実験系において BAT 分化に寄与する

1004）を植え込み，FoxO1 阻害薬を 4 週間持続投与しことを明らかになった．本研究では，メタボロミクスによるた．経時的に血糖値を測定し，糖尿病の発症・進展が網羅的代謝物解析も同時に施行している．今後はヒト応用抑制されるか否かを検討した．投与終了後に膵臓組織をへの基盤構築を見据え，京都大学が保有するヒトにおい採取し，残存β細胞面積と炎症細胞浸潤を評価した．

て BAT が同定可能な FDG-PET/CT を含む臨床データベ【結果】ースと照合しながら，ヒトでも同定可能な，BAT 制御に関

１）CD8+T 細胞の RNA-seq 解析

与する新規の代謝物探索も並行して行う予定である．

主 成 分 分 析（PCA）から，2 種 類の FoxO1 阻 害 薬
群と対照群が分かれた．PCA rotation でのパスウェイ

1型糖尿病におけるCD8+T細胞の分化制御機構の解明

解析により，上位に細胞死，翻訳，酸化的リン酸化のパ
スウェイが抽出された（図１）．次に，変動発現遺伝子解析を行ったところ，上位 100 遺伝子の中に 1 型糖尿

宮

地

康

高

（九州大学病院 内分泌代謝・糖尿病内科）

病 の GWAS 関 連 遺 伝 子 が 8 個（PTPN22，BACH2，
TRIB2，CD69，RASGPR1，PTPRC，IRF1，IRF4）
含まれており，特に BACH2 は，2 種類の FoxO1 阻害薬【目的】
1 型糖尿病は，膵島炎を病理学的特徴とする自己免の前処置により有意に減少することが明らかとなった（図２）．
２）NOD マウスへの FoxO1 阻害薬投与

疫疾患であり，CD8+T 細胞は膵島炎において最も多く

4 週間の FoxO1 阻害薬（高用量，低用量）投与中認められる炎症細胞である．樹状細胞などの抗原提示に対照群を含め糖尿病を発症する個体はいなかった．ま細 胞は膵 島自己抗 原を取り込み，CD4+T 細 胞が認 識

た，いずれの容量でも FoxO1 阻害薬により，体重増加する．CD4+T 細 胞はヘルパー 細 胞（Th1）に分 化し，に影響はなかった．投与終了後に肝臓および膵臓を摘出

CD8+T 細胞が細胞障害性 T 細胞（エフェクター T 細胞）

し，それぞれ遺伝子発現と免疫染色を行い，FoxO1 阻

185

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成

害薬の作用を検証した．肝臓の遺伝子発現解析では，用【背景・目的】

量依存的に糖新生関連酵素 G6Pase の減少を認め，膵

膵島移植は 1 型糖尿病の有用な治療法である．しか臓の組織解析では，β細胞の残存面積ならびにリンパ球し，移植後生存膵島量の維持・保護に関しては課題が多（CD3，CD4，CD8）の浸 潤に明らかな差は認めなかく，インスリン治療からの離脱の維持など長期成績の更った．以上から，4 週間の FoxO1 阻害薬投与に忍容性なる向上には，移植後生存膵島量の非侵襲的評価法のがあることが確認された．

確立が重要である．近年，我々は，111 インジウム（In）
標 識 exendin-4 プ ロ ー ブ を 用 い た Single photon
emission tomography（SPECT） による非 侵 襲 的 な膵β細胞量評価法を開発した．具体的には，Glucagon
like-peptide-1（GLP-1） 受 容 体に特 異 的に結 合する
Exendin-4 を骨格とした放射性同位元素標識プローブを用いた非侵襲的膵β細胞イメージング技術を開発し，

図 1 主成分分析とパスウェイ解析

Positron emission tomography（PET）や SPECT での生体マウス膵描出，同法を用いた膵β細胞量の縦断的評価が可能であることを複数の糖尿病モデルマウスで示した．本研究では，生体の膵臓におけるβ細胞量評価法である 111In-exendin-4 SPECT/CT を用い， 移 植 後 生 存膵島量の非侵襲的評価を試みた．
【方法】
ストレプトゾトシン誘発糖尿病マウスに同系統マウスか

図 2 発現変動遺伝子と BACH2ら単離した異なる数の膵島を経門脈的に移植し， 111Inexendin-4 プローブを尾静注した．その凍結肝切片を用【考察】

いて，インスリン免疫染色とオートラジオグラフィを行っ

1 型 糖 尿 病 モデルマウスの CD8+T 細 胞 において，た．次に，切除肝臓全体における 111In-exendin-4 プロ

FoxO1 が細胞分化を制御するメカニズムは不明であっーブ集積値，及び肝内インスリン含有量を測定した．また． 本 研 究 で，RNA-seq 解 析 から BACH2 を FoxO1

た，生きた膵島移植マウスの 111In-exendin-4 SPECT/の標的分子として同定した．BACH2 は，1 型糖尿病のCT を撮像し，SPECT/CT 画像上の 111In-exendin-4 プ

GWAS 関連遺伝子であるが，これまでに B 細胞，NK 細ローブ肝集積値，およびインスリン免疫染色による病理学

胞，CD4+T 細胞，CD8+T 細胞の細胞分化に重要で，的に算出した肝内β細胞量を評価した．

幾つかの細胞では FoxO1 が BACH2 を直接制御してい【結果】ることが報告されている．今後は，１型糖尿病の病態で同系統マウスの膵島を経門脈的に移植したストレプトゾ

FoxO1 並びに BACH2 が CD8+T 細胞の分化と機能をトシン誘発糖尿病マウスでは，その凍結肝切片オートラジ

どのように制御しているかについての解析をすすめる．

オグラフィにおける放射能シグナル像はインスリン免疫染
色による蛍光シグナル像と一致した．また，切除肝臓全体

非侵襲的膵β細胞イメージング技術を用いた、膵β
細胞量を標的とした糖尿病の予防・治療法の開発
村

上

隆

亮

（京都大学医学部附属病院 糖尿病・内分泌・栄養内科）における 111In-exendin-4 プローブ集積値は移植した膵
島数が多いほど高値であり，肝内インスリン含有量の結果とも一致した．また， 111In-exendin-4 SPECT/CT では
肝内移植膵島を描出可能であった．さらに，SPECT/CT
画像上の 111In-exendin-4 プローブ肝集積値は移植した膵島数が多いほど高値であり，組織学的手法により算出

186

Front Runner of Future Diabetes Researchに関する研究助成された肝内膵β細胞量と正の相関を示した．

る in vivo BioID の確立に取り組んだ．USP46-BioID-【結語】

KI マウスを交配し，母体に対し，出産日から７日間の高ビIn-exendin-4 SPECT/CT を用いて非 侵 襲 的に移オチン含有餌を投与した．その結果，ミルクを介したビオ

植後生存膵島の描出，肝内生存膵β細胞量の評価が可チンの移行により，仔 KI マウスの脳において USP46 の近能であった．

位タンパクのビオチン化を誘導できることが判明した．

【文献】

３）USP46 変異マウスの作製

111

Botagarova A*, Murakami T*, Fujimoto H, Fauzi

USP46 と高い相同性を有する USP12 は，脱ユビキチ

M, Kiyobayashi S, Otani D, Fujimoto N, Inagaki

ン化活性非依存的な機能をもつ．Usp46 欠損マウスの表

N. Noninvasive quantitative evaluation of

現型が酵素活性依存的であるか検証するため，Cofactor

viable islet grafts using 111In-exendin-4 SPECT/

である WDR48 との 結 合 能 を 失 った USP46-Q236A,

CT. FASEB J. 2023;37(4):e22859. doi: 10.1096/

E237A 変異マウスを樹立した．若齢マウスの体重測定を

fj.202201787RR. (* Equal contribution)

行ったところ，全身性 Usp46 欠損マウスと同様に，この変異マウスも低体重を示すことが判明した．

うつ様行動制御遺伝子USP46によるエネルギー代
謝制御に関する研究村田知【今後の展開】
新 規 開 発 中 の Cre マウスを 用 いて， 神 経 特 異 的

Usp46 欠損マウスを作製し，代謝表現型，行動解析を実施する．また，in vivo BioID の質量分析解析により，弥（筑波大学 医学医療系）

若齢期マウス脳における USP46 の相互作用因子を同定
する．

【目的】
脱 ユビキチン化 酵 素 USP46 は 神 経 系 に高 発 現し，

Usp46 欠損マウスはうつ様行動をほとんど示さない．我々は培養細胞を用い，近位依存性ビオチンラベリング（BioID）
によるタンパク質相互作用の解析を行い，USP46 がエネ
ルギー代謝関連因子と相互作用することを見出した．本研
究では，USP46 とエネルギー代謝の関連の解明を目指し，

Usp46 欠損マウスの解析と USP46-BioID ノックイン（KI）
マウスを用いた in vivo BioID を実施する．
【結果】
１）脳特異的 Usp46 欠損マウスの解析
全身性 Usp46 欠損マウスは若齢期に低体重を示す．
この体重低下が神経系の USP46 機能喪失によるものか
検 証するため， 神 経 幹 細 胞 特 異 的 Cre（Nestin -Cre）
マウスと Usp46 flox マウスを交 配した．しかし，Nestin Cre の生殖細胞系列における異所性組換えが頻発し，脳特異的 Usp46 欠損マウスを得られなかった．そこで現在，
新規神経特異的 Cre マウスを開発中しており，樹立次第，

Usp46 flox マウスとの交配を進める．
２）USP46-BioID-KI マウスを用いた in vivo BioID
全身性 Usp46 欠損マウスが低体重を示す若齢期におけ187

日本応用酵素協会誌

奥野

直樹

第58号

2024 年３月１日発行