日産科学振興財団助成研究

特別研究課題イオン液体を用いたバイオマスからのエネルギー抽出

成果報告書 要約
2008~2010

研究代表者
大野弘幸
国立大学法人 東京農工大学 大学院工学府

1. 研究背景
二酸化炭素の排出削減や再生可能エネルギーへの転換などの社会的背景をうけ、植物を原料とするエネルギー生産が注目を集めている。しかし、可食性デンプンからバイオエタ
ノールなどを生産する安易な政策が様々な問題を引き起こしている。世界的な穀物価格の高騰などの懸念から、食糧資源との競合の無い非可食性バイオマス、特に、天然に存在する最大量のバイオマスであるセルロースが注目されている。セルロースは、グルコースが

-1,4 結合でつながった多糖類である。そのため、セルロースからグルコースやセロビオー
スなどの有用な物質を生産し、各種エネルギー源として利用することが可能となる。しかし、天然状態でのセルロースはリグニンやヘミセルロースと高分子複合体を形成しているため、溶解、抽出、更に単位糖への変換は容易ではない。これまで報告されている方法論の多くは、高温、高圧での処理や、強酸、塩基などを使用するなど、処理に費やされるエ
ネルギーコストや環境負荷等の問題が指摘されている。これを大幅に改善できれば、資源の有効活用が可能となる。
本研究は、イオン液体と生体高分子の相互作用に関する知見を基礎とし、イオン液体を
マトリックスとするバイオ燃料電池作成のための物理化学的な知見を集積することを最終目標としている。これまでセルロースを溶解するいくつかの溶媒系が提案されている。多くは極性溶媒に塩を溶解させ、極性を高めた溶媒系である。これらセルロースを溶解させるために溶媒に要求される項目を満たす溶媒として、我々はイオン液体に注目した。イオ
ン液体とは、100 °C 以下でも液体として扱うことのできる有機塩であり、構成イオンの設計によって、室温以下でも溶融しているイオン液体も数多く報告されるようになった。また、構成イオンの多様性やデザインの可能性を巧みに使うことによって、イオン液体への機能賦与や、物性制御を行うことが可能となる。バイオマス処理に用いることのできるイ
オン液体の分野は、R. D. Rogers などが先駆的な研究を報告し、その後研究例が増えてきている。しかしながら、これまでの検討では特定のイオン液体を用いた検討にとどまっており、目的に合致する様にイオン液体をデザインする検討はほとんどなされていなかった。
我々は、様々なイオンを合成し、イオン構造とイオン液体の諸物性との相関関係を整理し、セルロースの溶解のみならずその後の処理に適したイオン液体の創製を行っている。
本特別研究では、①バイオマスからの有用多糖類の省エネルギー抽出、②セルロースのイオン液体中での分解、③グルコースなどの単位糖から電気エネルギーの抽出の 3 項目に焦点をあて、各項目に最適なイオン液体や方法論の確立を目的とした検討を行った。

研究成
成果の概要
2. 天
天然バイオマスを非加熱で処理できる
る新規イオン
ン液体の創製
製
我々々はイオン液液体の極性にに着目し、極極性やその他
他の物理化学
学的性質とイイオン構造ととの関連性について検討討を行った。
。これまで我
我々は、アルルキルイミダダゾリウムカカチオンとギ
ギ酸な
カルボン酸アアニオン、ままたはリン酸酸誘導体アニニオンを組みみ合わせたイ
イオン液体がが、低
どのカ
熱エネ
ネルギーでセセルロースをを溶解するこことを明らかかとした。特特に、我々がが提案した種
種々のリン酸酸誘導体塩はは、1 段階のの反応で高純純度品が得られ、優れた安安定性を有しし、低粘性のの液体となることが特徴徴である。そそこで、これれらのイオン
ン液体を基礎
礎として、物
物理化学的なな特性
善することにによって、ババイオマスかからセルローースなどの有有用多糖類を
を高効率に抽抽出でを改善きる系系が構築でききるものと期期待した。
我々々は、カルボボン酸アニオオンの側鎖構構造によってて粘性や極性
性が大きく異異なり、セル
ルロー
スの溶
溶解性も異ななることを見見いだしていいる。そこででメチル亜リリン酸アニオオンのエステテル部
位を改改変した種々々のイオン液液体 (図 1) を作製し、バイオマス処
バ
処理用の溶媒
媒として検討した。

Figure 1.
1 Chemical sstructure of allkyl phosphon
nate salts

作製
製したイオン
ン液体は、全全て室温で液液体であったた。それらのの熱物性を表表 1 に示す。示差
走査熱
熱量測定の結結果、得られれたイオン液液体はガラス
ス転移温度(TTg)のみを示し
し、常温で安
安定な
過冷却
却状態となっっていることとが明らかととなった。ままた、いずれれのイオン液液体も、250 °C 程
度まででは加熱してても重量損失失が見られずず、熱安定性性に優れた液液体であるこ とも認められた。

Tablee 1. Thermal properties off 1-ethyl-3-m
methylimidazo
olium salts
AnionsTg / °C
C

Tdec / °C[[(MeO)(H)PO
O 2]

-86

2788

[(EtO)(H)PO
O2]

-79

2666

[
[(i-PrO)(H)PO
O2]

-71

2566

[((n-BuO)(H)P
PO2]

-77

2599

に、作製したたイオン液体体の極性、特特に水素結合合能を Kamleet-Taft パラメ
メータによりり評価
次にした((表 2)。得られたイオン液体はいずれれも高い水素
素結合受容性性 () を示しした。また、水素
結合供供与性 ()ははいずれのイ
イオン液体ももほぼ同等のの値であった。また双極性性(*)はアニニオン

の側鎖鎖構造によっって異なり、、アニオンのの側鎖長の伸伸長に伴ってて低下した。 これはイオ
オン密度の低低下に起因すするものと考考えられる。
Table 2.
2 Kamlet-Tafft parameters of 1-ethyl-3--methylimidaazolium salts
A
Anions







[(MeO)(H)PO2]

0.552

1.00

1.006

[(EtO
O)(H)PO2]

0.555

1.02

1.002

[(i-PrrO)(H)PO2]

0.555

1.03

1.000

[(n-BuuO)(H)PO2]

0.556

1.06

0.997

温、短時間でで、効率よくくセルロース
スを溶解するる際には、イ
イオン液体のの粘度も重要要な因
低温
子にななる。今回新
新規に作製ししたイオン液液体の粘度はは、アニオン
ン側鎖のアルルキル鎖長のの伸長に伴いい増大した。
。 (図 2)。

Fig
gure 2. Viscossity of a seriees of ionic liquids

いで作製した
たこれらのイ
イオン液体をを用いたバイ
イオマスから
らの多糖類抽抽出を試みたた。バ次い
イオマ
マスとしてはは主に小麦外外皮(ブラン )を用いて検検討を行ったた。イオン液液体(1.9g)とブブラン
粉 末 (0.1g) を 窒 素 雰 囲 気 下 で 混 合 し 、 所 定 温 度 で 所 定 時 間 の 攪 拌 を 行 っ た 。 ま ず
H)PO2]にブラランを 5 wt%%となるように混合し、50 °C で攪拌拌を行った。ブラ[C2miim][(MeO)(H
ン粉末
末を完全に溶溶解することとはできなかかった(図 3-2)。ブラン粉
粉末はセルロ
ロース、ヘミミセル
ロース
ス、及びリグ
グニンの高分分子複合体でである。これれらの成分中中、リグニン
ンは難溶性でであるため、、均一透明なな溶液を得る
ることができきなかったもものと考えらられる。そここで、グラススフィ
ルター
ーを用いて不不溶部分を濾
濾別し、回収収したイオン
ン液体溶液(X
Xg)(図 3-3)にに過剰量の温温エタ
ノール
ルを添加し、、攪拌した。その結果、 白色沈殿のの析出が見らられた(図 3-44)。析出した
た成分

を濾過
過により回収
収し、繰り返
返し温エタノ
ノールで洗浄浄した。回収収した粉末を
を減圧下、80 °C で12 時
時間加熱真空乾燥した後、、重量(Yg)をを測定した。抽出率(Deggree of extraaction)は以下
下の式
より求
求めた。
Degree of extractione(%%) = [Y/(X-Y))×1.9]/0.1×10
00

Fiigure 3. Extraaction of polyysaccharides from bran wiith ionic liquiids
1) IL/bran mixture 2) A
After heating 3) Filtrate 4) Precipitate

収した沈殿物
物を乾燥後、重量を測定定し、多糖類のの抽出率を算算出した。結結果を図4に示示す。
回収ブランからの多糖
糖類抽出率はは用いたアニニオン種によ
よって異なり、低粘性ののイオン液体
体ほど

高い抽
抽出率を示
示す傾向が見見られ、今回
回用いた中でで最も低粘性の[C2mim][((MeO)(H)PO
O2]では50 °C、30分でで29 %の多糖糖類を抽出でできた。

Figure 4. DegreeDof exttraction of po
olysaccharides from bran
witth a series of ILs

連の検討で得得られた傾向向から、よりり低粘性のイ
イオン液体をを作製すれば
ば、多糖類をを更に一連
効率よく抽出でききるものと期期待された。
。そこで、ププロトンを側側鎖に有するる次亜リン酸酸アニ
オン液体(図 5)を新規に作作製した。
オンを用いてイオ

Figurre 5. Chemic al structure ofo [C2mim][H
H2PO2]

製した[C2miim][H2PO2]はは融点が 17 °°C の室温でで液体の塩として得られたた。また、2260 °C作製
程度ままで熱安定性性を有するこことも明らかかとなった。また、作製製した次亜リリン酸塩の水
水素結合能等等を算出したた結果、新規規に作成したた[C2mim][H2PO
P 2]は、他のの亜リン酸誘誘導体塩と比較し、水素結結合受容性がが若干低下ししていた。ここれは、側鎖鎖構造の電子子供与性の違違いに起因すするものと考考えられる。
。しかしなががら、値が 0.97 と一般的なイオン液
液体と比較しして高く、セセルロースを溶解する際際には十分なな水素結合受受容性有してていることがが明らかとな
なった。

Table 3. Physico-chemPmical propertiees of 1-ethyl--3-methylimidazolium phoosphinate
Ionicc liquid

Tm

Tdec







[C2mimm][H2PO2]

17

260

0.52

0.97

1.09

Unit foor Tm and Tdecc is oC.

今回評価したたイオン液体体の中で最も低く、室温温においても約 65[C2mim][H2PO2]の粘性は今cP でであった(図 6)。極性の発6発現は相互作作用の発現を伴伴うため、一
一般的にイオオン液体の粘粘性は増大すする。そのたため、このイ
イオン液体は
は極性が高いい割には低粘粘度のイオン
ン液体に分類
類される。

Figgure 6. Viscoosity of [C2mim][Hma2PO2] and[C2miim][(MeO)(H
H)PO2]

以上
上の結果から
ら、新規に作
作製した[C2m
mim][H2PO2]は、従来系よよりも低熱エエネルギーでで多糖類を抽抽出できるとと期待されたた。そこで次次に、次亜リン酸塩を用い
いて 50 °C ででブランから
らの多糖類抽抽出を検討しした。その結結果、[C2mimm][H2PO2]の抽抽出能はこれれまで最も高高い多糖類抽抽出能を示した[C2mim]][(MeO)(H)P
PO2]よりも高高く、30 分のの攪拌で 32 %、2%時間のの攪拌では 41 %も糖類が抽出でできた(図 7))。次に、これれら 2 種類ののイオン液体体を用い、非非加熱下でのの多糖の多糖類抽出出を試みた。
。検討の結果果、これらののイオン液体体も常温常圧
圧でブランかから 10 %以上
上の多糖類を抽出する能能力を有してていることがが確認できたた。特に[C2miim][H2PO2]はは 14%もの抽抽出率
したように、[C2mim][H
H2PO2]が他ののイオン液体体よりも低いい粘性を示すため、を示した。前述し率よく分散しし、短時間内
内により多く
くの多糖類がが溶解できたたものと考ええられ
ブラン粉末が効率る。

Figure 7.
7 Extraction of polysacch
harides from branb with[C2mim][Hmm][(MeO)(H)P
PO2]
2PO2] and [C2mim

セルロースの酵素加水分解
解3. セ
ルロースは、、グルコーススがβ-1,4 結結合でつながった多糖類である。こののセルロース
スを加セル
水分解
解できれば、、デンプンかから得るのとと同様にグル
ルコースが得得られる。ししかしながらら、セルロー
ースは、分子
子内、分子鎖鎖間で形成ししている多重重の水素結合合により、強強固な結晶構構造、集合構
構造を形成ししているため
め、セルロー
ースの抽出とと加水分解はは容易ではなない。

我々は前項で述べたようにセルロースを均一溶解できる極性イオン液体を開発し、それらを用いて天然バイオマスから多糖類を穏和な条件で抽出できることを明らかにしてきた。
これらのイオン液体を溶媒として用いると、セルロースを誘導体化せずに溶解でき、セル
ロースの結晶構造も乱すことができる。そのため、イオン液体中でのセルロースの加水分解反応が行えれば、エネルギー抽出に大いに寄与する。本研究では、i) 再生セルロースを作製し、酵素反応させる方法及び、ii) 直接セルロース溶液に酵素を添加する方法でセルロースの酵素分解を試みた。

3-1. 再生セルロースの加水分解
我々が新規に開発した 1-ethyl-3-methylimidazolium methylphosphite ([C2mim][(MeO)HPO2])は誘導体化、分子量低下を伴わずにセルロースを溶解できる。前述したように、イオン液体に溶解したセルロースはアルコール類などの貧溶媒を添加することによって容易に析出させることができる。イオン液体溶液から再生させたセルロースの X 線結晶解析を行った
結果、溶解前に見られたセルロース I 型の結晶構造が再生後には見られず、アモルファスな状態になっていることを認めた。そこで、この再生セルロース(10 mg)をリン酸バッファー(0.5 ml)に分散させ、セルラーゼ(3 mg)を添加して加水分解を試みた。反応は 50 °C にて 90分間行った。生成グルコース濃度は GOD-ムタロターゼ法によって求めた。
イオン液体で再生したセルロース粉末の分解効率は、再生前のセルロースと比較して大幅に向上し、1.5 倍以上のグルコース生成が見られた(表 4)。

Table 4. Glucose concentration obtained by the hydrolysis of regenerated cellulose
Solvents used for pretreatment

Glucose concentration [mg/dL][C2mim][(MeO)(H)PO2]

36.1

Buffer19.1

同様に、 [C2mim][(MeO)(H)PO2]を用いて植物バイオマスを前処理し、抽出したセルロー
ス成分の分解を行い、生成グルコース濃度の測定を行った。
Table 5. Generated glucose concentration; Effect of pretreatment with ionic liquids
SampleGlucose concentration [mg/dL]

Regenerated cellulose

26.1

Untreated bran

2.31

検討の結果、未処理のブラン粉末と比較し、イオン液体で前処理(溶解・再生)を行うこと
で、10 倍以上のグルコースを生成させることができた(表 5)。本研究により作製したイオン
液体は、低温、場合によっては非加熱でバイオマス中のセルロースを抽出できるため、従来の酸処理や爆砕処理などの前処理方法と比較し、低コスト、高効率なバイオマス処理系の構築につながるものと期待できる。

3-2. イオン液体/水混合溶媒中でのセルロースの酵素糖化
前述したようにセルロースはイオン液体中で分子分散した状態で溶解することが明らかとなっている。そこで、セルロースをイオン液体に溶解した後、イオン液体溶液中で酵素反応させることができれば、より効率的なセルロースの処理系が構築できる。加水分解には水が必要なので、イオン液体に水を添加した系において、セルラーゼを用いた酵素糖化を試みた。
各種イオン液体に所定量のクエン酸バッファーを添加し、イオン液体濃度を 10〜90wt%となるように調整した。反応溶液(0.5ml)にセルロースパウダー(10mg)及びセルラーゼ(3mg)を添加し、50 ºC にて 90 分間反応を行った。生成グルコース量は GOD-ムタロターゼ法により決定した。
[C2mim][(MeO)(H)PO2]を用い、水添加系でのセルロースの糖化を試みた。残念なことに、
イオン液体濃度の上昇に伴って生成グルコース量が低下した。[C2mim][(MeO)(H)PO2] と同様にセルロース溶解能を有する[C2mim]Cl を用いて検討したところ、[C2mim][(MeO)(H)PO2]を用いた場合と同様に、イオン濃度の増加に伴って酵素活性が低下する傾向が見られた。
一方、水素結合受容性(値)が低く、セルロースを溶解しない N-エチル-N’-メチルイミダゾ
リウム メチル硫酸塩([C2mim][MeOSO3])を用いて検討したところ、[(MeO)(H)PO2]塩及び Cl
塩と比較して高い酵素活性を示した。セルロースの溶解には、セルロース分子内および分子間で形成される水素結合を切断する必要があるため、イオン液体に高い値が必要となる。
そのためセルラーゼに対しても強く水素結合し、酵素活性発現に不可欠な高次構造が乱れ活性が低下したものと考えられる。
また、カチオン構造がセルラーゼ活性に及ぼす影響について検討した(図 8)。検討の結果、カチオン構造によってもセルラーゼ活性に差異が見られた。イオン液体濃度の増加に伴っ

て酵素素活性が減少少したもののの、 [C2mimm][(MeO)(H)P
PO2]を用いたた場合のみイ
イオン液体のの含有率が 90wt%の場合合に生成グル
ルコース濃度度の増大が見見られた。 [C[ 2mim][(MeeO)(H)PO2]をを用い
合には、水を
を 10%程度添加した系 においてもセセルロースがが溶解する。 そのため、セルた場合
ロース
スの結晶性がが低下し、セセルラーゼのの残存活性にによる分解がが起こった可可能性がある
る。作
製した
たイオン液体体のうち、セセルロース溶溶解能を持たたない[P4444][[(MeO)(H)PO
O2]を用いた場合、他のイ
イオン液体と比較してセセルラーゼ活
活性が低下しした。そのたため、イオン
ン液体溶液中
中でのセルロースの加水
水分解には、適切なカチチオン構造のの設計も重要
要であること が示唆された。

Figure 8. Glu
ucose converrsion in a seriies of ionic liq
quid solutionnsのように、ネネイティブののセルラーゼ
ゼを用いてイ
イオン液体中中で加水分解解を行った際
際に、以上のイオン液体濃度のの上昇によっってセルラーーゼ活性の低低下が見られれた。そこで
でセルラーゼ
ゼを担
イオン液体中中での安定化化を試みた。セルラーゼ
ゼの固定化担担体としてア
アクリ
体に固定化し、イポリマービーーズ及びセララミックビーーズの3種を用用いた。セル
ルラーゼの固固定化は、いいずれ
ル系ポ
も固定定化担体及びびセルラーゼ
ゼのアミノ基基と架橋剤でであるグルタタルアルデヒヒドのアルデデヒド
基とののSchiff塩基
基生成反応を利用して行 った。
含水
水率 10 wt%%の[C2mim][((MeO)(H)PO
O2]を用い、50 °C にて 3 時間、セルロ
時
ロースの加水
水分解
反応を行った。表表 6 に各担体体に固定化さされたセルララーゼ 1 mg あたりが生成
あ成するグルコ
コース
及び固定化ししていない未未修飾セルララーゼ 1 mg の酵素活性を 1.0 とした
た場合の相対対活性濃度及を示した。一方、、セラミッククビーズ、ア
アクリルビーーズに固定化
化したセルララーゼを用いいた場
イオン液体にに 10wt%の水を添加したた混合溶液中中において、固定したセセルラーゼはは未修
合、イ飾セル
ルラーゼと比比較して 9 倍の酵素活性性を示した。
。このことかから、担体にに固定化するること

でイオ
オン液体中ににおけるセル
ルラーゼの安安定性を向上上させ、イオオン液体へ溶
溶解した結晶晶構造が乱れれたセルローースの加水分
分解反応を進進めることがが期待できるる。

R
activiity of immobiilized cellulase in IL/Wateer (90/10 [w/ww])
Table 6. Relative
Carriiers

GlucoseGconccentration (mg/dl)

RelativeR
activiity

Acryl beads
b

2.3

9.2

Ceramicc beads

1.4

5.6

Free (unmmodified)

0.25

1.0

に、作製したた固定化セル
ルラーゼの安
安定性に関しして検討を行行った。バッ
ッファー及びび含水
次に率10w
wt%のイオン
ン液体0.5mL
Lにアクリル
ルビーズ固定化セルラーゼ
ゼ10mgを添添加し、25 ºC
Cにて
1.5、6、12及び244時間攪拌しした。その後後、純水及びクエン酸バッファーで洗洗浄し、吸引引濾過
ルラーゼを取取り出した。得られた固固定化セルララーゼを各溶溶液に再び添加し、により固定化セル
間反応させたた。反応後、グルコースC
C IIテストにによりセルロース10mggを加えて50 ºCで1.5時間
グルコース濃濃度を測定しし、セルラーーゼ活性を評評価した。図
図9に、セルロ
ロース添加前前に攪生成グ
拌を行行っていないい場合の活性性を100とし た時のセルラーゼの残存存活性を示しした。

Figgure 9. Stability of immobbilized cellulase at 25 ºC in
i buffer (○) aand
IL/w
water mixturee (□).

討の結果、ア
アクリルビーーズ固定化セセルラーゼはは、バッファ
ァー中では時
時間と共にセセルラ
検討
ーゼ活
活性が低下すするのに対しし、イオン液液体/水混合溶
溶液中では 24
4 時間後も 990%以上の活活性を保持していることが明らかととなった。両両者の比較かから、水系ににおけるセル
ルラーゼ活性性の低下は、主にセルラーゼと担体とを結合する架橋剤のグルタルアルデヒドが加水分解を受け、セルラーゼが脱離することが主な原因であろう。

4. イオン液体を展開溶媒とした液体クロマトグラフィーの開発
セルロースの加水分解反応を評価する際には、加水分解によって生成したグルコースやセロビオースなど溶媒に可溶な成分を HPLC によって解析する方法や、生成したグルコー
スをムタロターゼ・GOD 法を用いて解析する方法が用いられている。しかしながら、グル
コース等の低分子化合物の生成のみを追跡する方法では、セルロースの分子量変化についての詳細な情報を得ることができない。高分子量のセルロースを分析する方法論として、
分子性液体に可溶なセルロース誘導体を作製し、HPLC で用いられる溶媒に溶解させて測定する方法や、セルロースを溶解することが報告されているジメチルアセトアミド/LiCl を展開溶媒とした HPLC を用いて解析する方法が提案されている。しかしながら、これらの既知の方法では、イオン液体中での反応後、生成物を分離して誘導体化する操作や、各種塩溶液に再溶解するという煩雑な操作を必要とする。そのため、イオン液体中でのセルロー
スの分子量変化をダイナミックに測定する方法論として適切ではない。イオン液体を HPLCの移動相として用いることができれば、イオン液体中でセルロースを分解し、分子量変化をダイレクトにモニタリング可能である。しかしながら、イオン液体を HPLC の移動相として用いる検討はこれまで行われておらず、イオン液体を移動相とした場合のサイズ排除
効果や装置のセットアップ、測定条件などの詳細な情報は全くないのが現状である。そこで本研究では、セルロース溶解能を有するイオン液体を HPLC の移動相とした HPLC シス
テム(以下 HPILC と省略)をセットアップし、セルロースの分子量を解析する新たな方法論の確立に向けた基礎知見の集積を行った。
イオン液体を展開溶媒とする際には、①セルロースを温和な条件で溶解できるイオン液
体、②低粘性のイオン液体、③高純度のイオン液体を簡便に作成できること、④セルロー
スを化学的に変性させないとこが求められる。この様な要求を満たすことのできる溶媒として、今回は、1-ethyl-3-methylimidazolium methylphosphonate ([C2mim][(MeO)(H)PO2])を選択した。このイオン液体の粘度は室温で約 100 cP であり、一般的な HPLC の測定で用いられている分子性液体と比較すると高粘度である。そこで、市販されている各種 HPLC システ
ムの中で高耐圧システムを選択した。それでも室温での送液は現状のシステムの耐圧と送液速度の限界から不可能であった。そこで、ポンプからカラムまでを 55 °C に保ち、RI 検
出器を 40 °C で保温したところ、送液速度を 0.01 ml/min に設定することで、イオン液体でも送液可能であることを実証した。この系では適切な操作で試料を除けばイオン液体を再利用できる(図 10)

Figurre 10. Flowchhart of HPILC
C used in thiss study

れている標準準物質を用いいて、イオン
ン液体を展開開溶媒とした
た時もカラムムのサ
次に、汎用され排除効果が出出現するのかか確認を行っった。本検討討で用いたイ
イオン液体(IIL1)はセルロ
ロース
イズ排
のみな
ならず様々な
な種類の多糖糖類を溶解すすることがでできる。そここで、一般的的な HPLC の測定ので用いいられている
る標準物質のの中から、今
今回はプルラランを選択しした。まず、 分子量の異異なる
種々ののプルランススタンダードドを 0.5 wt%%となるように混合し、室室温付近で撹
撹拌した。そその結果、いいずれの分子
子量のプルラランも溶解でできることをを確認した。

Figurre 11. SEC
C elution paatterns and calibration curve
cof puullulan
standdards in IL 1.
オン液体へ溶溶解させていいる間に分解解などが起ここる可能性ももある。そこ
こでプルラン
ンの分イオ
子量にに及ぼす影響
響に関して検検討した。ププルランが溶
溶解しているるイオン液体体溶液を室温温で 50
日間保保存し、そのの後、エタノ
ノールを過剰
剰量添加する
ることで溶解解しているププルランを析
析出させた。
。得られたプ
プルラン試料
料を水に溶解
解させ、水を
を移動相としした HPLC をを用いて分子子量分布の測測定を行ったた。イオン液液体溶液から
ら再生したプ
プルラン試料
料は、溶解前前のピークとと比較し変化化が無く、イ
イオン液体へへ溶解させ、2 ヶ月程度保保存してもププルランの分分子量に影響響は与えず、、プルランを
を標準試料ととして用いる
ることができきることを確確認した。

次ににイオン液体
体を移動相ととした HPLC
C で、プルランのイオン
ン液体溶液をを解析した。その結果、、プルランのの分子量に応応じてピーク
クがよく分離離し、分子量量の大きいもものほど短時時間で溶出した(図 11)。これは、水ななどの分子性性溶媒を用いいた HPLC で解析した場で場合と同様であり、動相とした場場合であっててもサイズ排排除効果によよるサンプルルの分離が可可能でイオン液体を移動れた。
あることが示され各種セルローースをイオン
ン液体に溶解
解させ、イオン液体を移動動相とする HPLC
H
そこで次に、各テムを用いてて解析した。
。検討の結果果、用いたセセルロース試
試料の分子量
量に応じて溶溶出体
システ
積が異異なり、プルルランの場合合と同様にサ
サイズ排除効効果によるセセルロース分分子量の解析
析が可能でああることが示示された(図 12)。

Figgure 12. SE
EC elution patterns of a series off cellulose aandcelllulose/glucose mixtures.
ースの加水分
分解のモデル
ルである高分
分子セルローースとグルコ
コースの混合合組成
さらに、セルロー
作製し、HPIILC で解析をを行った。検検討した結果果、図 12 と図図 13 に示すすようを変えた試料を作

Figu
ure 13. Relaationship betw
tween peak areasaand thee compositioon ofcelluulose/glucosee.

に、ピーク面積と組成比の間間に良い相関関関係が見らられ、混合試
試料の解析がが行えることとも併明らかとしたた。
せて明以上上の結果から、セルローースなどの多多糖類溶解能能を有する極極性イオン液液体を移動相相として用いいた本 HPIL
LC システムは、セルロ ース類の分析
析のみならずず、加水分解解などのダイイナミ
ックなな解析にも利利用できるこことが期待さされる。

ースの酵素酸酸化5. イオン液体中でのグルコー々はこれまで
でに、極性イ
イオン液体をを設計し、植植物バイオママスからセルルロースなどどの多我々
糖類を抽出し、セセルラーゼをを用いた酵素
素加水分解をを試みてきたた。加水分解
解により得らられたのままイオン
ン液体中で酸
酸化することとができれば
ば、植物バイ
イオマスを投投入すグルコースをそのネルギーを生
生成するバイ
イオ燃料電池池の構築につつながる。本
本研究では、第 3
るだけで電気エネの課題を達成成させるため
めに重要なグ
グルコース酸酸化電極の設設計を行ったた。グルコーース酸番目の化触媒
媒としては、、酵素や、金
金ナノ粒子がが考えられる。今回はグル
ルコースオキキシダーゼ(GOD)に着目し高濃度 IL 中でのグ
グルコース酸化化を行った。
。一般的に、極性 IL のセ
セルロース溶溶解能と低下するがが水が少ないい条件では、GOD が触媒
媒活性を失っってしまう。そこ
は水を添加するとでも GOD が活性を維持が持できる極性性イオン液体の設計をを行った。ままず、で、 低含水率でmidazolium methylphosphmhonate ([C2mim][(MeO)(H
H)PO2])が、室室温でセルロロース
1-ethyyl-3-methylimの溶解解性を示すことに着目しし、アニオン
ンをメチル亜亜リン酸に固固定し、種々々のカチオン
ンを有するイ
イオン液体をを作製した(図 14)。これ らのイオン液液体を用いてて含水量をでできるだけ少少なくできる条件下で GOD の活性性を維持するるカチオン構構造の探索を行行った。

Figuree 14. Chemicaal structure ofo ILs evaluated here々のイオン液液体と pH7.0
0 の 0.05 M リン酸緩衝液
液を所定の比比率で混合しし、メディエエータ
種々ーとして p-toluquuinone、基質
質の D-glucosse、酵素であある GOD をそれぞれ
を
1 mM、100 mM、5m
ml となるように溶解させせた。作製しした溶液をセセルに入れ、作用極に PPFC 電極、対
対極に
mg/m

Pt 線、参照極に Ag 線を用い
いて CV 測定定を行った。
いた際にはイ
イオン液体のの 1 イオンペペアに対してて水を 8 分子子水和
[C2mim][(MeO))HPO2]を用いさせた
た系においてて明瞭な酸化
化還元電位がが観測された
たものの、水水を 7 分子水
水和した状態
態(含水率 422％)では GO
OD 活性が観観測されなか った。一方でで、イミダゾ
ゾリウムカチチオンの側鎖鎖に水酸基を導入した[[C2OHmim]塩塩を用いた際 には 1 イオンペアに対しして 4 分子のの水を添加しした時
水率 25％)におおいても GOOD によるグ
グルコースの酸化が観測された。以上
上の結果から
ら、イ(含水
オン構
構造に水酸基
基を導入するることによっって、より低低含水率時においても GO
OD の酵素活
活性が維持されることがが強く示唆さされた。セルルロースの溶溶解性を考慮
慮すると、よより低含水率率の条
おいて GOD
D の活性が保保持される系
系が望ましい。そこで、水水酸基を導入入した他のカカチオ
件におンを用用いてイオン
ン液体を作製製し、カチオオン構造が GOD
G
活性に及及ぼす影響にについて検討討を行った。
。
水酸
酸基を 1 つ有有するコリンン塩([Ch][(MMeO)HPO2])、、及び 3 つのの水酸基を有有するトリエエタノール メチルアン
ンモニウム塩塩([TEAM][(MMeO)HPO2]) を作製し、これらのイイオン液体中中でのルコースの酸酸化を行ったたところ、[Chh][(MeO)HPO2]では 1 イ
イオンペアにに対し
GOD によるグル％)で活性を示示したのに対
対し、[TEAM
M][(MeO)HP
PO2]をて 7 分子の水を添加した系((含水率 39％た場合は 3 分子の水を加分加えた状態(含含水率 17％))においても GOD の活性性を維持でききるこ
用いたとが明
明らかとなっった。
メチ
チル亜リン酸酸アニオンをを有する種々々のイオン液液体を作製しし、カチオン構
構造と GODD が活性を維維持できる最最少含水率をを評価した結結果、複数のの水酸基を導導入した[TEA
AM]カチオン
ンを用いた系
系で低含水率率時においてても GOD がが活性を示すすことが明ららかとなったた。そこで次次に、[TEAAM]カチオン
ンと種々のアニオンを組組み合わせたイ
イオン液体((図 15)を作製製し、アニオオン種が GO
OD 活性にあ
あたえる影響
響について検検討を行った。

Figuree 15. Chemicaal structure ofo ILs evaluated here

EAM]はカチチオン内に 3 個の水酸基 を有し、水素素結合の寄与与により粘性性が高い。そそのた[TEめ 通 常 の CV 測 定 で は 明 確 な 応 答 を 追 跡 す る こ と は 難 し い 。 そ こ で 今 回 は

2,6-diichloroindophhenol sodiumm (DCIP)を用用いて GOD
D の活性を評評価した。DCCIP は酸化体
体では青色でで最大吸収波波長を 600nm
m 付近に示 すが、電子を受け取ってて還元体にななると無色にになる(図 16)。従って GOD によりりグルコース
スが酸化されれれば、600n
nm 付近の吸吸光度が低下する。
P、GOD、D--glucose をそそれぞれ 10m
mM、1mM、100mM となるよう溶解
解させ、UVV 測定
DCIPから GOD の活性性評価を行っった。

Reaction scheeme of DCIP
Figure 16. R

規に作製したた 3 種のカルルボン酸塩及及びメチル亜亜リン酸塩をを溶媒としてて用い、GOD
D によ
新規るグル
ルコースの酸酸化を行った
た結果、いず
ずれのカルボボン酸塩も 1 イオンペア
アに対して水
水を 1
分子水
水和した系((含水率: 酢酸酸塩(8wt %) 、グリコール
ル酸塩(7 wt%%)、安息香酸酸塩(6 wt%)))においても GOD によ
よる酸化が見見られた。こ の結果から、カルボン酸酸塩を用いるることで、よより低率の条件(100wt%以下)ででも、GOD のの活性が確認認できた。含含水量 10 wt %%以下のイオオン液
含水率
体中ででのグルコーース酸化反応
応を酵素によよって行うこことができた
た例は今まででになく、ワ
ワンポ
ット発
発電システムムを支える新新規イオン液液体の開発ののための当初初の計画を達達成することとができた。
。

6. まとめ
生可能な植物
物バイオマス
スの有効利用用、特に化石石燃料に代わわる新たなエエネルギー資資源と再生してのの利用は、221 世紀で最最も注目され るべきテクノロジーであある。本特別別研究では、イオン液体体の設計を通通じ、植物ババイオマスをを低熱エネルルギーで処理理できる極性性イオン液体体の新規開発
発に成功したた。更に、溶溶解したセルルロースをイ
イオン液体中中で穏和な条条件で処理しし、グルコーースなどの有有用物質へのの変換を実証証した。セル
ルロース類のの分析のみな
ならずセルロロースの加水
水分解を解析
析する新たなな方法論としして、イオン
ン液体を展開開溶媒としたた HPLC シスステムも併せせて提案したた。また、イ
イオン液体中中でグルコーースの酵素酸
酸化反応によより電子を抽抽出できる系系の構築を示示唆する新規規イオン液体体群の開発にに至った。イ
イオン液体のの特徴は構造造の多様性でである。本特特別研究の推推進により得得られた様々々な基礎知見見をもとに、 溶解のみなならず
その後後の反応に供供するためのの構造要件のの解明を進めめることによより、イオン
ン液体を用いいたバ
イオマ
マス変換シス
ステムの構築築も可能でああろう。