この使用説明書をよく読んでからご使用下さい。
＊2020 年 10 月改訂（第 2 版）
351159-2

2019 年 1 月作成（第 1 版）
細胞凍害保護液（cellular cryoprotectant）

®

研究用試薬

Ｈｉｇｈ Ｇｒａｄｅ－ 造血幹細胞の凍害保護液 －造血幹細胞の凍結保存時には、凍害防止剤としてジメチルスルホキシド（DMSO）

2. 細胞懸濁液の調製すべての操作は無菌的に⾏って下さい。必要に応じて、分離した細胞をリン酸緩衝が一般的に使用されています。
DMSO 単独で凍結保存する場合、プログラムフリーザーによる段階凍結法を⾏い、液体窒素中（-196℃）で保存を⾏う方法が一般的でしたが、1980 年代前半より、骨髄の造血幹細胞に対して、DMSO とヒドロキシエチルデンプン（HES）を用いること液（PBS）で洗浄し、以下の①、②のいずれかの方法により細胞懸濁液を調製して下さい 7, 11)。また、凝固防止剤（ヘパリン、ACD 液など）を適宜加えて下さい。
①分離した細胞に⽣理⾷塩⽔を加え、細胞密度 2×108 個/mL 程度に調によりプログラムフリーザーを使用しない簡易細胞凍結法の研究がおこなわれるようになりました 1, 2)。

整します。
②

本邦においては、DMSO と HES を用いた簡易細胞凍結法を末梢血幹細胞に適用した応用研究が進み、簡易細胞凍結法における HES と DMSO の濃度検討から⾄適

細胞懸濁液に⽣理⾷塩⽔を用いる場合

細胞懸濁液に RPMI1640 培地を用いる場合
分離した細胞に RPMI1640 培地を加え、細胞密度 2×108 個/mL 程度に調整します。

濃度が HES 6%、 DMSO 5% と決定されました。この簡易細胞凍結法により、段階凍結法を⾏わずに－80℃のフリーザーを用い、短期間（６ヶ月〜１年半）での安3. 凍結保存操作
すべての操作は無菌的に⾏って下さい。

定した凍結保存が可能となりました 3-8）。

1) 細胞懸濁液に、等量の HSA 加 CP-1® High Grade を少量ずつ加え、おだ【注意事項】

やかに混和します。本操作は氷浴中で⾏って下さい。（凍結バッグを利用する
場合、シリンジで HSA 加 CP-1® High Grade をバッグラインから少量ずつバッ

1.

本品は研究用試薬であり、医療用としては認可されておりません。

2.

使用に際しては、必ず本使用説明書をお読み下さい。

3.

本品を誤って飲み込んだりしないように十分注意して下さい。万一、飲み込んでグ内の細胞懸濁液に注入しながら、おだやかに等量混和します。）

しまった場合、すぐに吐き出して下さい。眼、皮膚等に付いた場合、すぐに洗浄し

2) 速やかに凍結保存用容器に分注し、 －80℃フリーザーで凍結して下さい。冷却速度は－2〜－3℃/分程度が目安です。
3) 凍結後、そのまま－80℃以下のフリーザーで保存して下さい（－80℃フリーザて下さい。異常が⾒られた場合、すぐに医師の診察を受けて下さい。

ーで凍結後、液体窒素中で保存すると、より安定しているとの報告 8）がありま【組成】す）。

組成（１ボトルあたり）

100 mL 用

50 mL 用HES（ヒドロキシエチルデンプン）1-11)

12 g

6g

DMSO（ジメチルスルホキシド）1-11)

10 mL

5 mL+ ⽣理⾷塩⽔

細胞使用時は 37〜40℃の恒温槽で急速融解して使用して下さい（2〜3 分程度で解凍を終了するのが目安となります）。

9)

Total

4. 解凍操作

68 mL

34 mL

【フローチャート】 9-11)
100 mL 用【使用目的】
造血幹細胞、その他細胞の凍害保護

1.

使用前に濁りや浮遊物がないことを目視で確認してから使用して下さい。

2.

すべての操作は無菌的に⾏って下さい。

3.

ヒト血清アルブミン（HSA）添加後、速やかに使用して下さい。

4.

CP-1

High Grade と HSA の混和時および、HSA 加 CP-1

12 g

6g

DMSO

10 mL

5 mL

68 mL

34 mL+ ⽣理⾷塩⽔【操作上の注意】®

50 mL 用HES®

High Gradeと細胞懸濁液との混和時に発熱を伴う場合があります。これらの混和の際には必ず、氷浴中で⾏って下さい。
【用法・用量（造血幹細胞の凍害保護方法）】

CP-1® High GradeTotal

HSA 加 CP-1® High Grade の調製

細胞懸濁液の調製

下記のように CP-1® High Grade に⽣理⾷塩⽔（もしくは RPMI1640

HSA を添加し混和する培地）で細胞懸濁液を調製

100 mL 用︓ HSA 32 mL 添加

細胞密度 2×10８個/mL 程度

50 mL 用︓ HSA 16 mL 添加
HES

12％

その他細胞の操作方法につきましては、 本品の技術情報ページ（下記 URL）にDMSO

10％

公開されておりますプロトコルをご参照下さい。

HSA

08％

https://ssl.kyokutoseiyaku.co.jp/cellculture/cellculture_product_list/

1. HSA 加 CP-1® High Grade の調製等量混合（氷浴中で操作）

本品のバイアルのゴム栓を消毒用アルコールなどで殺菌し、シリンジ等で HSA を少量最終濃度ずつ加え、おだやかに混和します。発熱を伴う場合があります。氷浴中で実施して下細胞密度さい。
（1）100 mL 用
25％ヒト血清アルブミン (HSA)※ 32 mL を加え、100 mL とします。
（2）50 mL 用
25％ヒト血清アルブミン (HSA)※ 16 mL を加え、50 mL とします。
※25％ヒト血清アルブミンは、20％ヒト血清アルブミンもしくは自己血漿（凍結する細胞と同一由来の血漿）で代用することができます。このとき、いずれの場合であっても添加量は同量として下さい。

速やかに－80℃で凍結－80℃以下で保存
37〜40℃の恒温槽で急速融解

1×10８個/mL 程度

HES

6％DMSO

5％HSA4％

【取扱い上または使用上の注意】

7) 平松靖史, 他．末梢血幹細胞採取・保存の効率化の検討．⽇本輸血1. 取扱い上の注意

学会雑誌．2000, 46 巻, 1 号, p. 1-6.

本品中の成分は人体に対して以下のような毒性を示すことがあります。

8) 牧野茂義. 末梢血幹細胞の保存方法. 医学のあゆみ. 1996, vol.176,

HES は、⽣体内に入った時の組織沈着性が指摘されています。腎・肝機能への影

No.9, p. 579-582.

響、皮膚のかゆみ、アレルギー反応などが起こることがあると報告されています（また、9) 岸野光司, 他. アフェレーシス幹細胞の簡易凍結保存法における造血幹一部の報告では、腎障害を引き起こす可能性があることも指摘されています）12, 13)。

細胞機能の保持に関する検討. 自治医科⼤学臨床検査技師年報.

DMSO は眼、皮膚を刺激し、⾼濃度の場合、意識低下を引き起こすことがあり、吸入すると頭痛、吐き気、経口摂取すると吐き気、嘔吐、嗜眠を引き起こし、眼に入1992, 16 号, p. 123-125.
10) Katayama Y. et al. The effects of a simplified method for

ると発赤、かすみ眼を起こします 14)。

cryopreservation and thawing procedures on peripheral bloodstem cells. Bone Marrow Transplantation. 1997, vol.19, No.3,DMSO 急性毒性 14)
動物種

p. 283-287.

経路

致死量

中毒量等11) 牧野茂義, 他. 末梢血幹細胞移植における凍害防止剤 CP-1 の有効性

ヒト

経皮TDLo1,800mg/kg

ラット

経口

LD5014,500mg/kg

12) ⾼折益彦. 代用血漿剤 HES. 克誠堂出版. 2010, p. 65-116.

ラット

経口

LD5017,400mg/kg13) Perner A. et al. Hydroxyethyl starch 130/0.42 versus Ringer's

マウス

経口

LD50

7,920mg/kg

マウス

経口

TDLo

10.91mL/kg

モルモット

経口

LDLo

＞11,000mg/kgと安全性に関する検討. 共済医報. 2012, 61 巻, 2 号, p. 223-226.

acetate in severe sepsis. The New England Journal of Medicine．
2012, vol.367, No.2, p. 124-134.
14) 環境省・環境リスク評価室．化学物質の環境リスク評価 第 13 巻 第１

イヌ

経口

LD50

＞10,000mg/kg

ラット

吸入

LCLo

＞1,400mg/m3(4hr)

ラット

経皮

LD50

40,000mg/kg

マウス

経皮

LD50

50,000mg/kg

編 2（Ⅱ）[6] ジメチルスルホキシド．環境省．2015, p. 9.
【謝辞】
本品の製品化にあたり、⻁の門病院の牧野茂義先⽣、九州⼤学の原田実根先⽣、および自治医科⼤学の岸野光司先⽣、室井一男先⽣を始めとする先⽣方に

2. 使用上の注意は、多くのご協⼒をいただきました。ここに深謝いたします。

（1）本品の無菌保証は開封前までです。開封後はすみやかに使用して下さい。
【問い合わせ先】（2）貯蔵方法を厳守して下さい。
（3）容器の破損が認められたもの、または容器内に異物が認められた場合は使用し極東製薬工業株式会社 営業学術部〒103-0024 東京都中央区⽇本橋小舟町 7-8

ないで下さい。
（4）本品は低温で保存すると成分が析出することがあります。

電話

03(5645)5664（5）使用後の残余物は、感染性廃棄物として処理した後に廃棄してください。廃棄FAX03(5645)5703

方法は自治体により異なるため、各自治体の指示に従って廃棄して下さい。
＊【貯蔵方法・有効期間】（1）貯蔵方法

室温保存（2）有効期間12 ヶ月【包装】
統一商品コード551-27206-2551-27207-9

品名

包装100mL 用×2

細胞凍害保護液 CP-1® High Grade

50mL 用×2
R ︓登録商標○【参考文献】
1) StiffPJ.

etal.

Unfractionatedhumanmarrowcell

cryopreservation using dimethylsulfoxide and hydroxyethylstarch. Cryobiology．1983, vol.20, No.1, p. 17-24.
2) Stiff PJ. et al. Autologous bone marrow transplantation using
unfractionated cells cryopreserved in dimethylsulfoxide andhydroxyethyl starch without controlled-rate freezing. Blood.
1987, vol.70, No.4, ｐ. 974-978.
3) 牧野茂義, 他. 骨髄および末梢血幹細胞の簡便凍結保存法. 医学のあゆみ．1989, vol.151, No.1, p. 65-66.
4) Makino S. et al. A simplified method for cryopreservation of
peripheral blood stem cells at -80 degrees C without
rate-controlled freezing. Bone Marrow Transplantation．1991,
vol.8, No.4, p. 239-244.
5) Takaue Y. et al. Comparative analysis of engraftment after
cryopreservation of peripheral blood stem cell autografts bycontrolled- versus uncontrolled-rate methods. Bone MarrowTransplantation．1994, vol.13, No.6, p. 801-804.
6) 角南一貴, 原田実根. CP-1 による幹細胞保存. 低温医学. 1998，24
巻, 4 号, p. 171-174.