1．研究題目
フェリチン２次元結晶の新機能材料への応用
A pplication offerritin tw o-dim ensionalcrystals forfunctionalm aterials
２．代表研究者名等
ShigekiTakeda,PhD
代表研究者
武田茂樹
A ssociate Professor
役職
助教授所属
群馬大学大学院 工学研究科 ナノ材料システム工学専攻
376-8515 群馬県桐生市天神町 1-5-1
D epartm entofN ano-M aterialSystem s,
G raduate SchoolofEngineering,G unm a U niversity
1-5-1 Tenjin-chyo,K iryu G unm a 376-8515 JA PA N
３．和文アブストラクト
新しい材料の開発に繋げる研究を目指したナノサイズの鉄を配列化する技術を確立するために、鉄を内包する蛋白質であるバクテリオフェリチンの２次元結晶の作製を試みた。組み換え体バクテリオフェリチンは、T7 プロモーターを含む発現ベクターにより形質転換した大腸菌を培養し、その菌体上清から精製した。これを D EA E-Toyopearlカラム、SephacrylS-300 ゲルろ過カラムによって精製した。精製したフェリチンで二次元結晶の作製を試み、透過型電子顕微鏡で観察したところ小さいながら２次元結晶が作製されたことが確認できた。また、蛋白質定量と鉄の定量の比より精製したバクテリオフェリチン 1 個あたりの鉄の含有量は約 290 原子であった。
４．英文アブストラクト
Production of 2-dim ensionalcrystals of bacterioferritin w as investigated to establish
the technology for nano-size particle array of iron and developing of new nanom aterials. Recom binantbacterioferritin w as expressed in E.coli using a T7 prom otersystem and purified using an ion-exchange colum n (D EA E-Toyopearl) and a gel
filtration colum n (Sephacryl S-300). W e obtained sm all 2-dim ensional crystal
dom ains of the purified bacterioferritin and observed the by electron m icroscopy. W ealso confirm ed thatthe content of the iron per each bacterioferritin particle w as about
400 atom s.

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５．本文

我々はこれまでに鉄を含まないウマのア

５−１．研究目的

ポフェリチンについては、２次元結晶を作

ナノテクノロジーの一環としての生物素成しさらにフェリチン間接触の境界面に変材による「バイオナノテクノロジー」が提異をもつフェリチンを用いてその結晶系を案され、期待されているが具体的な工業化

六方格子から斜方格子に変換することに成を念頭においた成果はまだほとんど報告さ功している。このようなフェリチンの性質れていない。一方でナノテクノロジーによを用いると基盤上に数 nm の金属粒子を規って解決できると思われる既存技術の問題則正しく配置することができる可能性があ点としては、たとえば半導体技術におけるる。

回路の高密度化がある。半導体回路設計に

本研究では生物化学工学をナノテクノロ

おけるは現在の手法の延長上には、さらなジーに応用する試みとして蛋白質を利用しる素子の小型化、高密度化に限界があるこてナノ粒子を作って配列化することを計画とが以前から指摘されており（ムーアの法した。これまで２次元結晶の作製に用いて則の破綻）、根本的に異なる技術による新しきたウマのアポフェリチンは大腸菌で容易い工作技術が模索されている。本研究によに作成できるが培養中に菌体内で鉄を内包り金属粒子を基盤上に配列化することが確させることができない。そこで大腸菌の培立できれば、現在の半導体加工技術の 10 倍養により鉄を内包させることができるバク以上の密度で単電子トランジスタや多論理テリオフェリチンを用いてこれを配列化す素子の開発などが可能になる。本研究は工ることにより、同時に内包された鉄を並べ、業化に繋がる本格的なナノテクノロジーの配列化された鉄粒子の特性を活かした新た第一歩として考えることができる。

なナノ材料の開発に繋げるための研究を行本研究で用いるフェリチンは 24 個のサブった。

ユニットが組み合わさって直径約 12 nm の粒子を形成し、その内腔に鉄を酸化物とし５−２．研究経過て内包することができる分子量約 45 万の鉄５−２−１．発現と精製貯蔵タンパク質であり、この内包されてい野生型バクテリオフェリチンのゲノムをる鉄粒子の直径は 4-7 nm である。この程度

PCR 法により増幅し、発現ベクターであるの大きさの金属粒子は量子効果を発揮するpET21a(+)に挿入した。この発現ベクターにことが期待できると考えられている。またより形質転換した大腸菌 BL21(D E3)pLysS

フェリチン内腔には鉄だけでなく、人工的を 2.5 L の LB 培地で振盪培養した。濁度がには各種の金属粒子を取り込ませることがO D 600 で 0.8 に達したところで IPTG を最終できることがこれまでに報告されており、濃度 0.1 m M になるように加えバクテリオ

こうしたナノサイズの金属微粒子は工業的フェリチンの発現を誘導し、さらに３時間価値が高いはずである。またフェリチンは培養した。その後遠心分離により集菌し、対称性が高いことも特徴の一つであり、２培地を除いて菌体を TE buffer(10 m M Tris-回軸、３回軸、および４回軸をもつ。

H Cl,1 m M ED TA )で懸濁して、プロテアーゼ2阻害剤 PM SF を最終濃度 1 m M となるようまた、ピーク付近の画分を SDS-PAGE したとに加えてから超音波破砕した。また大腸菌

ころ単一な精製標品であることが確認でき細胞膜と結合しているフェリチンを解離さた。

せるため界面活性剤 Tw een-20 を加えた。これを遠心した上清を 50 m M Tris-H Cl (pH 8.0)５−３−２．２次元結晶の観察で透析し、D EA E-Toyopearlカラムで精製し、透過型電子顕微鏡での観察により数十個

その後 Sephacryl S-300 ゲルろ過カラムによのバクテリオフェリチンからなる正方格子り精製した。に配列化された領域が見られた(Fig.1)。

５−２−２．二次元結晶の作製
2％ グルコース、150 m M N aCl、10 m M
CdSO 4,10 m M M ES (pH 5.7)の展開液をテフロン製のトラフに入れ、そこに 2 μl のフェリチン溶液(1.3 m g/m l)を注入した。グルコースとフェリチン溶液との比重差によりフェリチン溶液が浮上し、展開液表面で表面張力により展開する。その際に二次元結晶が作られる。作製された二次元結晶をカーボン蒸着した 200 メッシュの銅製グリッドに転写し、酢酸ウラニウムで負染色して
透 過 型 電 子 顕 微 鏡 (JEM -2010,加 速 電 流200kV )で観察した。

５−２−３．鉄の含有量の決定蛋白質定量(Lowry 法)を行い精製したフェリチン溶液 1 ml 中の蛋白濃度を求めた。
また、ferrozine-鉄錯体による発色からフェリチン溶液 1 ml 中の鉄の濃度を求めた。
Fig.1 透過型電子顕微鏡観察写真

それぞれの値の比からフェリチン 1 個当たりの鉄の含有量を求めた。

これまでウマのアポフェリチンで作成され５−３．研究成果た２次元結晶はほとんどが六方格子であっ５−３−１．バクテリオフェリチンの精製たので、両者の比較は多様なフェリチンのゲルろ過後の画分を蛋白質の吸収極大で２次元的配列化をデザインする上で非常にある 280 nm,ヘムの吸収極大である 420 nm重要である。おそらくウマのアポフェリチで吸光度測定し、それぞれのピークが重なンとバクテリオフェリチンのタンパク質構ることから精製できていることが分かった。

造の違いおよび粒子間の相互作用の違いが3六方格子に配列化できるか正方格子に配列ことができることを示しており、今後バク化できるかを決定していると考えられるた

テリオフェリチンの表面荷電をアミノ酸変め、これを解析すれば自在なフェリチンと異の導入により調節するなどして、多様なそこに内包された鉄粒子の配列化を実現で形の２次元結晶を作成していきたい。金属きると考えている。

粒子の並び方のことなるいくつかの２次元結晶が作成できれば材料としての応用範囲５−３−３．鉄の含有量の決定がより広がると期待している。

蛋白質定量と鉄の定量から得た値の比か
ら精製したフェリチン 1 個当たりの鉄の含５−４−３有量は約 290 個であることが分かった。こ

テリオフェリチンの調製れは約 3500 個程度の鉄を内包する天然ウマより多くの鉄を内包したバク今回調製したバクテリオフェリチンは約肝臓フェリチンの 1/12 の値となった。

290 個の鉄原子を内包しており、量子ドットを形成するには十分と考えられる。しか５−４．今後の課題と発展し内包されている酸化鉄から量子ドットと５−４−１して利用できるフェライト状態の鉄への変より大きな２次元結晶の作製

今回得られた２次元結晶は数十個のバク換や具体的な鉄粒子のもつ材料特性の解析

テリオフェリチンが配列化したもので、工にはさらに多数の鉄粒子が含まれている方業的に利用するには小さすぎると考えられが有利であると考えられる。そこでバクテる。２次元結晶化に用いるバクテリオフェ

リオフェリチンを発現させる時の大腸菌培

リチンの濃度や結晶化条件をより詳細に検養条件や発現にもちいる大腸菌の株を検討

2することにより、より多くの鉄を内包した程度からなる大きさの２次元結晶を得られバクテリオフェリチンの調製が可能かどうるようにしたい。一方で結晶化したドメイか検討していく。

討し、次年度には 100 個 x 100 個の 1µmンが得られた頻度はかなり高く、電子顕微鏡の視野に容易にみつかる程度であったの５−４−４で結晶化の成功率は高い。このことはバクや制御（X -Y 軸方向の電子移動）

コア金属間の電子移動の観察

テリオフェリチンが比較的２次元結晶の作

コア金属間における電子移動の可能性を製に有利なタンパク質であることを示して検討し、その実現を目指す。これらとコアいると考えられる。

金属−基盤間の電子移動とを組み合わせて数百の電子によって作動するトランジスタ

５−４−２

多様な２次元結晶の作製を実現したい。

今回得られた２次元結晶は正方格子を作っていて、以前に作成されたウマアポフェ

５−５．発表予定

リチンが形成する六方格子とは異なってい平成１６年度生物物理学会で発表予定

た。このことはわずかなタンパク質間相互作用の変化で多様な２次元結晶を作成する

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