運動ニューロン特異的遺伝子組み換え法の開発とその応用
The Establishment of Motoneuron Specific Recombination System
研究代表者

岡崎国立共同研究機構 生理学研究所

助手

竹林 浩秀

National Institute for Physiological Sciences
Okazaki National Research Institutes
Research Associate, Hirohide Takebayashi
和文アブストラクト
basic helix‑loop‑helix型転写因子のOlig2は、機能発現実験および機能喪失実験により、運動ニューロン・オリゴデンドロサイトの発生に必須の分子であることが示されている。本研究では運動ニューロンとオリゴデンドロサイトの発生機構をさらに詳細に解析するため、Olig2遺伝子座にタモキシフェン依存性Creリコンビナーゼ（CreER™）を挿入したマウスと、loxP配列における組み換えによりマーカー遺伝子（lacZ）を発現するレポーターマウスのダブルトランスジェニックマウスを作製し、Olig2陽性細胞において、時期特異的組み換えを誘導することを試みた。胎生期にタモキシフェンを投与することにより、このダブルトランスジェニックマウスでは、Olig2を発現している細胞で遺伝子組み換えを起こすことを証明した。このレポーター遺伝子発現は分裂後の細胞にも受け継がれるため、組み換え標識された細胞から派生した細胞も恒久的にラベルされる。現在、このマウスにおいて特定の時期に組み換えを起こし、Olig2陽性細胞からどのような細胞種が生み出されるかについて詳細に検討している。

Abstract
Gain-of-function

andloss-of-function

experiments

demonstrated

thatabasic helix-loop-helix transcriptional factor, Olig2 is indispensable for generation of motoneurons andoligodendrocytes. In this study, to elucidate mechanism of motoneuron- and oligodendrocyte-development
more precisely, we generated double-transgenic mouse by intercrossing Olig2 heterozygote mice,
whose Olig2 locus was replaced with a fragment encoding tamoxifen-inducible Cre recombinase (CreER™),
and reporter mice, in which lacZ reporter gene is expressed by Cre-mediated recombination, and thenattempted to induce time-specific recombination in Olig2-expressing cells. In these double-transgenic mice,
wegenestages.

demonstrated
expression
Since

via

that

administration

Cre-mediatedrecombination

thisrecombination

ofonlyisintamoxifen

inducedOlig2-expressing

cells

inheritable

event,

reporteratembryonic
reportergene expression permanently persists in the progeny of recombinated cells. We are analyzing what kinds ofcells are derived from Olig2-expressing progenitors by inducing recombination at various stages.

1Olig2 遺伝子座に CreER™遺伝子を挿入したノック1.研究目的
Olig ファミリーは、申請者のグループと外国の研インマウスとして作製した。Cre リコンビナーゼは究 グ ル ー プ が 独 立 に 同 定 し た 新 し い

P1 バクテリオファージ由来の遺伝子組み換え酵素

basic helix-loop-helix 型転写因子である。Olig1, Olig2で、loxP という特定の遺伝子配列で挟まれた DNAは当初オリゴデンドロサイト特異的な遺伝子としを切り出し、その前後の配列をつなぎ合わせることて報告されたが、我々は Olig2 遺伝子が、運動ニュが知られている。この活性はマウスのゲノム上に人ーロンとオリゴデンドロサイトが発 生してく為的に導入した loxP 配列に対しても同様に働く。今る pMN ドメインに発現していること、発現時期が回は、この Cre リコンビナーゼの C 末に変異型エスオリゴデンドロサイトの発生時期よりも早く発現

トロゲンレセプターのリガンド 結合ドメイン を融し、それが運動ニューロンの発現時期に一致するこ合した CreER™を使用した。この CreER™はエストと、などから運動ニューロンの分化にも関わっていロゲンアンタゴニストのタモキシフェン存在下でる可能性を見い出した。実際、ニワトリの神経管にのみ活性化されるという特徴を持つ。この Olig2 ノおいて Olig2 を異所性に発現させると運動ニューロックインマウスのヘテロ接合体と、Cre による組みンが産生されることを示した。また、我々は Olig2換えを受けると lacZ 遺伝子が発現するレポーターノックアウトマウスを作成し、その解析をおこなっマウスを交配することによって、ダブルトランスジたところ、ノックアウトマウスの脊髄では運動ニュェニックマウスを作製した（図１）。

ーロンおよびオリゴデンドロサイトが産生されず、出生直後に死亡することを発見した。このことから、Olig2 は運動ニューロンとオリゴデンドロサイトの発生に必須の因子であることが証明された。また、転写因子の発現パターン解析や異所性発現実験により、Olig2 はまず Ngn2 とともに働くことにより運動ニューロンを産生し、発生が進むと Nkx2.2 などの他の転写因子と共に働くことによりオリゴデンドロサイトを産生する、つまり、Olig2 遺伝子はニューロンとグリアへの分化スイッチの役割をもつことが明らかとなった。
我々は、運動ニューロン・オリゴデンドロサイト

図 1. 細胞系譜特異的・時期特異的組み換え機構

分化の分子メカニズムをさらに 詳細に解析するた

ダ ブ ル ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ スの Olig2 発 現 細 胞

めに、CreR™/loxP システムを用いて、任意の時期にで CreERTM が発現する。CreERTM はタモキシフェンと結合しOlig2 陽性細胞特異的な遺伝子組み換えを誘導するて活性化し、レポーターアリルの loxP 配列で挟まれたシステムを確立することを試みた。

chloramphenicol acetyltransferase (CAT)遺伝子を切除する。組み換え後、マーカーの lacZ 遺伝子が発現する（レポーターマ

2.研究経過ウス／CAG-CAT-Z は大阪大学・宮崎純一先生より供与され2.1.ダブルトランスジェニックマウスの作製た）。

我々は Olig2 ノックアウトマウスを作製する際、2このマウスでは Olig2 を発現する細胞で CreER™

フェンによる誘導性は厳密に保たれていることがが発現するが、そのままの状態では組み換え酵素活わかった。

性をもたず、レポーターアリルは CAT 遺伝子を発現する。CreER™はタモキシフェンと結合すると活性化し、レポーターアリル 上の loxP 配列で挟まれた CAT 遺伝子を切り離す。その結果、マーカーの lacZ 遺伝子が発現する。今回用いた 4-水酸化タモ
キシフェンの生体内での半減期は約 48 時間以内と言われており、限られた期間内で Olig2 を発現している細胞のみで組み換えをおこすことが可能である。組み換わったレポーターアリルは分裂後細胞にも受け継がれるので、タモキシフェン投与時の Olig2陽性細胞や、そこから生じた娘細胞は恒久的に lacZ遺伝子を発現する。また、これらの細胞は X-gal 染

図 2. 時期特異的遺伝子組み換え色により容易に識別できる。

（上段）タモキシフェンを投与されたダブルトランスジェニ
ックの胎児

点線:脊髄の輪郭, 矢印:pMN ドメイン, 矢頭:脊2.2.胎生期におけるタモキシフェン誘導性時期特異髄前角 （左下）タモキシフェンを投与していないダブルト的遺伝子組み換え

ランスジェニックマウス （右下）タモキシフェン投与のスケジュール

次に我々は、胎生期におけるタモキシフェン誘導性遺伝子組み換えが、実際に起こるかどうかを検討

3.研究成果した。ダブルトランスジェニックマウスのオスを、野生型のメスと交配し（４分の１の確率でダブルト時期特異的 に遺伝子組み換えをおこランスジェニックの胎児が得られる）、胎生 10.5 日

す CreER™/loxP システムを用いて、Olig2 発現細胞に母体にタモキシフェンを 1.5mg 腹腔内投与し、２特異的にラベルできる実験系を確立した。

日後にその胎児を取り出して、whole mount X-gal 染Olig2 遺伝子の細胞系譜解析としては、別のグル色をおこなった（図２）。

ープによる Olig2 遺伝子座にノックインした GFP を運動ニューロンは胎生 9.5 日頃より、Olig2 陽性マーカーとして使用した短期的な細胞系譜追跡実の pMN ドメインの脳室層から生じ、腹外側の前角験があるが、本研究のような、恒久的に細胞をラベに移動して集団を形成し、そこで成熟することが知ルする長期的な細胞系譜追跡実験はなされていなられている。タモキシフェンを投与した胎児では、い。オリゴデンドロサイトとアストロサイトの共通予想通り pMN ドメインと、運動ニューロンが存在の前駆細胞（glia restricted progenitor）の in vivo でのする脊髄前角の運動ニューロンカラムが X-gal 陽性存在の有無が大きな論争になっているが、その問題に染色された。一方、タモキシフェンを投与されてに答えるためにも 本システムを確立した意義は大いないダブルトランスジェニックの胎児では、X-gal

きい。

陽性の細胞は認められなかった。つまり、タモキシ

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4.今後の課題と発展

5.発表論文リスト
1. The basic helix-loop-helix factor Olig2 is essential for

本研究により、胎生期で遺伝子組み換えを起こす

developmentofmotoneuron

andことを示したが、今後は、成体を含め、さらに発生

oligodendrocyte lineages. Takebayashi H., Nabeshima Y.,の進んだ段階での陽性細胞の解析を行い、Olig2 陽Yoshida S., Chisaka O., Ikenaka K., Nabeshima Y.

性細胞から最終的にどのような 細胞が生じてくる

Current Biology, 2002 12: 1157-1163.のかを解明したいと考えている。タモキシフェンの

2. Lineage-tracing experiments on Olig2-positive cells.

投与時期を変更することにより、ラベルされる細胞

Masahira N., Takebayashi H., Ding L., Shimizu K.,

種の変化を調べ、特定の時期における Olig2 陽性細Nabeshima Y., Ikenaka K.

胞の in vivo での分化能を明らかにできる。さらに、

in preparation

Olig2 ノックアウトマウスの脊髄では、運動ニューロンとオリゴデンドロサイトが全く存在しないが、本来それらになるはずであった 細胞は死滅するわけではなく、アストロサイトなど別の細胞種に運命転換することがわかっている。このダブルトランス
ジェニックマウスを、Olig2 ヘテロ接合体と掛け合わせることにより、Olig2 ノックアウトマウスでの pMN ドメインの細胞系譜解析を行うことも可能である。
また、上記の細胞系譜追跡実験以外にも、任意の時期に遺伝子組み換えを起こすことができるこのシステムの特徴を利用して、発生の初期に致死となる遺伝子の働きを解析する際に、ある程度発生が進んだ段階で、細胞系譜特異的・時期特異的に遺伝子ノックアウトを行うといった利用法も考えられる。
これらの実験を通して得られた知見から、運動ニューロンやオリゴデンドロサイトの発生機構 の解明に近づくことができれば、筋萎縮性側索硬化症や多発性硬化症といった運動ニューロンやオリゴデンドロサイトの異常が原因となる難治性疾患の治療や、神経再生への手掛かりをつかめるものと期待している。

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