光エネルギー駆動型の CO2 能動輸送体による光合成促進の研究
Studies for Enhancement of Photosynthesis by Introduction of a Lightdriven CO2 Transporter
大西紀和、京都大学大学院生命科学研究科、研究員（科学研究）
Norikazu OHNISHI, Graduate School of Biostudies, Kyoto University, Post-doctoral fellow＜研究要旨＞
陸生植物は CO2 獲得能が低いため、CO2 の供給が光合成の律速段階となっている。しかしラン藻や緑藻は陸生植物には無い“CO2 濃縮機構”と呼ばれるシステムを持っており、空気条件下において CO2 や重炭酸イオン（HCO3-）を能動的に細胞内に濃縮して最大の光合成能を獲得している（右図）。緑藻クラミドモナスの CO2 能動輸送体の実体は 20 年来未解明のままであったが、近年我々は cDNA アレイ解析から光エネルギーにより駆動される CO2 輸送体の候補遺伝子を Lci1、
Lci6、
LciA、
LciB の 4 つにまで絞ってきた。本研究では、これらの遺伝子産物が光エネルギー駆動型の CO2 輸送体であること、遺伝子導入による植物の CO2 獲得能と光合成能の向上が可能であることを実証し、樹木への応用を目指す。

<Abstract>
The photosynthetic rate of land plants in their natural habitat is usually limited by the supply of CO2 ofwhich the concentration is usually lower than that required for the maximal carboxylase activity of Rubisco
in natural habitat. In contrast, a green alga, Chlamydomonas reinhardtii, is able to accumulate inorganiccarbon by active CO2 transport under low CO2 conditions and maintain an optimal CO2 concentration forphotosynthesis. Although active CO2 uptake by Chlamydomonas cells under low CO2 conditions has been
known for 20 years, CO2 transporters still remain to be identified. Recently, we identified four candidate of
CO2 transporters (Lci1, Lci6, LciA, and LciB) by cDNA macroarray analysis. In this study, we will clarify theidentity of the light-driven CO2 transporter(s) of Chlamydomonas and attempt to enhance photosynthesis inland plants by introduction of the CO2 transporter(s).
地球温暖化の軽減と共に、農作物などの生産量
1. 研究目的の向上にも繋がると期待される。一方、水圏環地球温暖化ガスとして近年注目を集めている境に生育するラン藻や緑藻は、陸生植物には無CO2 は、植物にとっては生き延びるための光合い“CO2 濃縮機構”と呼ばれるシステムを持っ成基質として必須である。大気中の CO2 濃度がており、淡水中では 5-30 mg CO2 L-1 と幅広く変上昇の一途を辿っている今日においても、陸生動する CO2 環境において CO2 が欠乏するような植物は CO2 獲得能が低いため自然界では CO2 の条件においても、無機炭素（CO2 や重炭酸イオ供給が光合成の律速段階となっている。そのたン）を能動的に細胞内に濃縮して最大の光合成め、最大の光合成能を発揮することは難しく、能を獲得している（図 1）。緑藻クラミドモナス

加えて CO2 の供給不足は光障害をももたらす。の無機炭素濃縮に関わる CO2 能動輸送体の実体

従って、植物の CO2 獲得能を向上させることはは 20 年来未解明のままであったが、近年我々-1-を含む空気を通気して培養）でアンモニウム塩、または硝酸塩存在下で生育させた細胞の CO2 輸送能を Open gas exchange system により測定した。
その結果、アンモニウム塩存在下で生育させた細胞に比べ、硝酸塩存在下で生育させた細胞は、より高い CO2 輸送活性を示した（図 2）。アン
モニウム塩存在下で生育させた細胞は 9.4 ± 0.4µml CO2 mgChl-1 h-1 の CO2 輸送活性を示したの

図 1. 緑藻クラミドモナスの CO2 濃縮機構のモデル図。緑藻クラミドモナスは空気条件下において CO2 濃縮機構を誘導し、CO2 や重炭酸イオンを細胞内に能動的に取り込む事が知られているが、輸送体の実体は不明のままである。

に対し、硝酸塩存在下で生育させ Lci1 の発現を誘導した細胞の CO2 輸送活性は 30.4 ± 1.3 µml
CO2 mgChl-1 h-1 であった。宿主として用いた lcr1株では、CO2 輸送活性は培地中の窒素源の影響は cDNA アレイ解析から光エネルギーにより駆動される CO2 輸送体の候補遺伝子を Lci1、Lci6、LciA、LciB の 4 つにまで絞ってきた。本研究では膜タンパク質をコードする Lci1 遺伝子を最終は受けなかった（表 1）。従って、Lci1 の発現誘導により CO2 輸送活性がおよそ 3 倍に上昇することが示された。

候補とし、この遺伝子産物が光エネルギー駆動型の CO2 輸送体であること、遺伝子導入による植物の CO2 獲得能と光合成能の向上が可能であることを実証し、樹木への応用を目指す。
2. 研究経過○Lci1 を導入したクラミドモナスは CO2 輸送能が向上した
CO2 輸送体の最終候補として Lci1 に注目し機能解析を行うために、Lci1 の発現誘導系を構築した。Lci1 遺伝子に硝酸塩誘導性のプロモーターを連結した DNA コンストラクトをゼオシン耐性を与える Ble 遺伝子と共に、Myb 転写因子 Lcr1を欠損した株（lcr1 株）に導入した。lcr1 株は、

図 2. Lci1 導 入 株 の CO2 輸 送 活 性 。 5 µg
chlorophyll mL-1 の細胞 20 mL に対して 50 ppm CO2
ガスを通気して、励起光（2,000 µmol photons m-2s-1 ）を 5 分間照射した時の測定液中の CO2 濃度の減少を、CO2 輸送活性とした。横軸は測定時間、縦軸は測定液中の CO2 濃度を示している。
アンモニウム塩で生育させた時と比較して、硝酸塩で生育させた細胞はおよそ 3 倍の CO2 輸送活性を示した。

Cah1、Lci1、Lci6 の発現を CO2 欠乏条件におい表 1. lcr1 株、Lci1 導入株の CO2 輸送活性strain
窒素源CO2 輸送活性ても誘導できなくなった株である。300 株のゼlcr1 株

オシン耐性株を選抜した結果、CO2 条件に関わらず培地中の窒素源をアンモニウム塩から硝酸塩に交換することによって Lci1 の発現を誘導でLci1 導入株

きる形質転換株を得た。CO2 余剰条件（5% CO2-2-NH4+

11.6 ± 0.9NO3-

15.0 ± 2.7NH4+9.4 ± 0.4NO3-30.4 ± 1.3

○Lci1 は低濃度の重炭酸イオン存在下でも高い

表 2. lcr1 株、Lci1 導入株の光合成活性
Vmaxstrain
窒素源(µmol O2 mgChl-1 h-1)

光合成活性を与えた
上記の形質転換株について、同様の条件で生育させた細胞について光合成活性の測定も行った。
測定液中の無機炭素（CO2 および重炭酸イオン）を枯渇させた状態から重炭酸ナトリウムの溶液

lcr1 株Lci1導入株

K1/2 値（µM）

NH4+166.6 ± 17.7

456.7 ± 51.3

NO3-195.7 ± 16.7445.0 ± 37.7

NH4+

167.1 ± 5.6

493.9 ± 30.4

-169.3 ± 25.6

256.3 ± 44.9NO3を光合成基質として加えていき、様々な濃度の。従って、Lci1 を発現させる無機炭素存在下における光合成活性を測定した。 けなかった（表 2）
その結果、硝酸塩存在下で生育させた細胞はよことにより、より低い濃度の CO2 でより高い光り低い濃度の重炭酸イオン存在下で高い光合成合成活性が得られることが示された。

活性を示した（図 3）。最大光合成活性（Vmax）○LCI1 タンパク質は葉緑体包膜に局在したの 50%の活性を得るために必要な重炭酸ナトリ

LCI1 タンパク質に対する特異抗体を作製し、クウムの濃度（K1/2 値）は、アンモニウム塩存在ラミドモナスの細胞における局在を調べた。5%下ではおよそ 450µM であったのに対し、硝酸

CO2 を含む空気、または空気（0.04% CO2 を含塩存在下では 250µM であった。飽和濃度（10む）を通気して培養した野生株の細胞について、mM）の無機炭素存在下における最大光合成活

間接免疫蛍光法による解析を行った。その結果、性は、いずれの株においてもアンモニウム塩、空気を通気して培養した細胞でのみ、クラミド硝酸塩存在下で大きな差は無かった（表 2）。まモナスの葉緑体に特徴的なカップ型のシグナル

た、宿主として用いた lcr1 株では、最大光合成が得られた。従って、LCI1 タンパク質は葉緑体活性（Vmax）、K1/2 値ともに窒素源の影響は受の包膜に局在していることが明らかになった。
3. 研究成果
以上の結果より、LCI1 タンパク質がクラミドモナスの葉緑体包膜の CO2 輸送系で働くことにより、CO2 濃縮に寄与していることが明らかとなった（図 4）。また、CO2 濃度の低い環境においても、Lci1 遺伝子の導入によってクラミドモナスに高い光合成能を与えることが可能であることが示された。真核光合成生物で CO2 輸送と光図 3. 光 合 成 活 性 の 無 機 炭 素 依 存 性 。 20 µg
chlorophyll mL-1 に調製した細胞懸濁液に対して、15 mM、150 mM、750 mM の NaHCO3 溶液を加えていき、各濃度における光合成活性を酸素発生活性で評価した。横軸は反応液中の無機炭素濃度（終濃度）、縦軸は飽和濃度の NaHCO3 存在下（10mM）における光合成活性を 100%とした時の相対値を示している。アンモニウム塩存在下で生育した細胞に比べ硝酸塩存在下で生育させた細胞の方が、より低い濃度の無機炭素濃度において最大光合成活性の 50%に達した。

合成能の向上に関わる遺伝子の発見は、今回が初めてである。
4. 今後の課題と発展
Lci1 を発現させることによって、CO2 輸送活性を向上することが可能であることが示された。
しかしながら、このタンパク質がどのようなメカニズムによって CO2 輸送に関わっているのか-3-はまだ理解に至っていない。今後は、LCI1 タン

大西紀和、小日向務、福澤秀哉

パク質の細胞内における存在様式や相互作用す

モナスの CO2 欠乏誘導性遺伝子 Lci1 は CO2 輸

るタンパク質を同定することにより、LCI1 によ送に関与するる CO2 輸送の活性制御を明らかにしていく必要

日本植物生理学会 2007 年度年会 愛媛大学がある。緑藻クラミドモナスにおける LCI1 を

北キャンパス 2007 年 3 月 28 日

中心とした CO2 輸送システムの全貌を解明する
ことにより、高等植物への応用が可能になり、光合成の促進と地球温暖化の解消へと繋がって行くと期待される。

図 4. LCI1 タンパク質の機能モデル。LCI1 は葉緑体包膜に局在しており、CO2 輸送系で働くことにより CO2 濃縮に寄与していると考えられる。

5. 発表論文リスト○学会発表
大西紀和、小日向務、福澤秀哉 緑藻クラミド
モナスの CO2 能動輸送体に関与する遺伝子 Lci1の機能解析
日本植物学会第 70 会大会 熊本大学
ャンパス黒髪キ2006 年 9 月 14 日

大西紀和、小日向務、福澤秀哉 CO2 欠乏誘導性遺伝子 Lci1 は緑藻クラミドモナスの CO2 輸
送系で機能する
日本農芸化学会 2006 年度（平成 18 年度）関西支部大会
ス

京都工芸繊維大学 松ヶ崎キャンパ

2006 年 10 月 1 日-4-

緑藻クラミド城