光学顕微鏡法によるアスベスト分析の現状と課題
元 兵庫県健康環境科学研究センター
小坂 浩

（大気環境中アスベスト濃度測定における）PCM法の精度向上のために検討すべき事項
・除去工事現場測定の場合は、処理される「素材」を事前に把握する・電子顕微鏡の活用（PCM法とのデータの比較）
・偏光顕微鏡の活用
・定期的なクロスチェックによる機関内・機関間の精度管理
・新しい分析者のトレーニングプログラムの確立

電子顕微鏡による計数ルール
TEM
・ISO 13794（間接法）、ISO 10312（直接法）「すべてのアスベスト繊維」、「長さ：＞5μm」、「PCM等価アスベスト繊維（径は0.2μm＜ｄ＜3μm)」

・NIOSH 7402
NIOSH7400(PCM)と同じルール（長さ：＞ 5μm、AR：＞3：1）
で径は＞0.25μm(NIOSH7400では径の上限はない）

SEM
・ISO 14966
PCM等価アスベスト繊維（長さ：＞ 5μm、AR：＞3：1 、径：0.2μm＜ｄ＜3μm）

クロスチェックについて目的或いは効果・①分析機関内（分析者複数の場合）、②分析機関間、③国際的、の3つの精度管理。

これまでのクロスチェックの問題点
・繊維濃度の真値がわからない。→全体の平均値或いは中央値を基準に評価していた。
・同じスライドを使っても視野を再現出来なかった。→
視野の違いによるデータのばらつき
・アスベスト標準試料によるスライドの作製（実大気のサンプルではなく、妨害繊維がない。）

繊維密度がPCM計数値に及ぼす影響
フィルター上の繊維密度が計数値に及ぼす影響を検証。熟練
分析者に様々な密度のサンプルを計数させたところ
1)高密度サンプル（＞2000本／mm2）では過小評価（多数の繊維の妨害による）
2)低密度サンプル（＜100本／mm2）では過大評価（背景の模様を繊維と誤判定して）作業環境サンプリングでは繊維密度が100～1000本／mm2になるように採気量を調節することを提案。
100本／mm2とは；グレイティクルの300μmの円内に繊維が7本存在する状態。
Cherrie, et al; Am.Ind.Hyg.Assoc.J., 47, pp465-474, 1986

透明化処理による繊維の移動の検証（1）
粉じん面を下向きにして透明化した場合（アモサイト）②②③③①①④④

SEM像×1500（透明化前）

位相差像×400（透明化後）

透明化前後で繊維の位置に変化がないことがわかる

透明化処理による繊維の移動の検証（2）
粉じん面を下向きにして透明化した場合（アモサイト）

SEM像×500（透明化前）

位相差像×400（透明化後）粉じん面を下向きにした透明化では繊維は移動しなかったが、粉じん面を上向きにして透明化した場合繊維が元の位置から移動することが確認された。

SEMとPCMとの計数値比較の一例(単位：本／L)
SEM>0.1μm

PCM

解体現場クリソタイル
79.2 175.7
解体現場アモサイト
169.9284.6
解体現場クロシドライト 48.4 126.1
標準クリソタイル
141.1 2170.1
標準アモサイト218.1 677.9
標準クロシドライト5.460.89.4254.3151.0486.6457.8118.0>0.5μm

上記の6種類のサンプルのフィルターをそれぞれSEM用・PCM用に分けて計数した。SEMとPCMで同一の場所を計数したデータではない。

分散染色法の原理
・粒子は浸液に浸されていて、粒子と浸液の屈折率が右図の関係にある場合を例にとって説明する。

屈折率

・マッチングポイント（n1=n2）より短波長側ではn2＞n1、長波長浸液の屈折率（n2）側ではn1＞n2だから波長に応じて下図のような屈折が起こる。
屈折率のマッチングポイント

浸液（n2）

粒子の屈折率（n1）

粒子（n1）

入射光と物質の面が直角になる場所では光は直進し分散は生じない。

白 色 光
・この例では緑の光は対物レンズのマスクで遮られ観察者には赤と青の光が届くが加法混色により粒子の色はマゼンダを呈する。
・粒子の色合いはマッチングポイントの波長に依存する（光の3原色について例を示した加法混色の図を参照）。

青545nm（緑）赤

波長

屈折率の波長依存性
n1・n2の差が大きいことと、可視光線の波長域内にマッチングポイントがあることがきれいな発色を得るための必要条件。

加法混色（光の3原色での例。分散染色法ではカットされる波長が連続スペクトルの一部なので混色はもっと複雑になる。）

分散染色法では、マッチングポイントの波長の光は直進する。位相差顕微鏡の場合
対物レンズの前焦点面にセットされたリング状のコンデンサ絞りを通った入射光（直進光）は絞りの像（リング状）を後ろ焦点面に結像する。その結像位置にマスクを重ね合わせると直進光は遮られる（この方式をセントラル・ストップと呼ぶ）。遮られる光の波長（＝マッチングポイントの波長）によって粒子の色は上図のように変化する。

分散染色法は大気サンプルに応用出来るか？
サンプル作製法(1)吸引ビン中でクリソタイルを発じんさせフィルターに捕集↓フィルターをスライド上で透明化後低温灰化(2)アスベストを水分散させフィルターにろ過↓フィルターをスライド上で透明化後低温灰化(3)アスベストを水分散させ懸濁液を一滴スライド上に滴下して乾燥させる

空気分散クリソタイル

位相差像×400

低温灰化後浸液なしで観察。

左の視野の分散染色像
位相差像中央のクリソタイルが発色しない。（矢印の粒子はそれぞれ位相差像の矢印の粒子に対応）

水分散クリソタイル（ろ過後低温灰化）

位相差像×100

低温灰化後浸液なしで観察。高密度のクリソタイル。左右の繊維が黒く見えるのは光が透過していないため。

左の視野の分散染色像 x100
位相差像で黒く見える左右の太い繊維が発色。高密度の細い繊維は発色しない。

水分散アモサイト（スライド上で乾燥）

位相差像×100

左の視野の分散染色像 x100
位相差像中の繊維のうちの数本だけが発色。

クリソタイル SEM像（試料を80°傾斜）
クリソタイルを分散させた懸濁液をカバーグラス上で乾燥

細い繊維は下地に密着しているが、太い繊維は、例えば矢印の部分のように、下地から浮き上がっていることがわかる。

SEM像と位相差像との対比
SEM像を撮影後、フィルターを透明化しPCMでSEM像の繊維を探す。

100μm

SEM像

位相差像 X100
分散染色用浸液を滴下する前の観察

分散染色像 全体（細い繊維は発色しない）

分散染色像

位相差像 X400

前図の内の拡大

分散染色像
位相差像中の細い繊維は発色しない。

SEM像と位相差像との対比（アモサイト その1）

50μm

SEM像

位相差像 X400
分散染色用浸液を滴下前の観察

分散染色像（アモサイト その1）
分散染色用浸液の屈折率：1.69

位相差像×400

分散染色像、アナライザ抜き
位相差像の一部の繊維しか発色しない。色合いは繊維中の光の振動方向（2方向）別の分散色が「加法混色」によって混合した色になっている。

分散染色像（アモサイト その1）
（アナライザ使用。色合いの変化は繊維が複屈折性を持つことを示す）

n∥

アナライザを矢印の方向に合わせた。アモサイトの屈折率はn∥＞n⊥で、黄色の発色はマッチングポイントが青の波長域であることを示す。

n⊥

アナライザを矢印の方向に合わせた。繊維と浸液との屈折率のマッチングポイントが長波長側になり、赤や緑の光がカットされるので青が勝る色合いになる。

SEM像と位相差像との対比（アモサイト その2）

50μm

SEM像

位相差像

X400

分散染色用浸液滴下前の観察

分散染色像（アモサイト その2）

位相差像

×400

分散染色像 アナライザ使用
位相差像で確認出来る繊維の一部しか発色しない。

アスベスト繊維が発色しない理由
スライドガラスと繊維の密着状態が影響すると考えられる。
観察結果との整合性：

・バルクサンプルは発色する←繊維は浸液に浸された状態・密着したクリソタイルは発色しない。非常に太い繊維は一部または全部がガラス面から浮いており、発色する。

・針状のアモサイトは密着しない繊維があり、一部の繊維は発色する。

PCM：その限界と適用範囲
限界：「分解能」、「形態観察のみ」
利点：「簡便・迅速」（on-site分析も可）、「低価格」、「リスク評価の基礎データ」
PCMの適用範囲：
繊維径の分布が極端に細いものに偏っていなければ飛散監視等に使えるのではないか？

漏えいクロシドライトの繊維サイズ計測した繊維数：281本、径が＞1μmの繊維数：20本（7％）
60
50
L≦5μm
5＜L≦10μm
10＜L≦20μm
L＞20μm

本数40120（≦5μm：12%）

20

100

1080

03＜ ≦
35＜ ≦
56＜ ≦
67＜ ≦
78＜ ≦
89＜ ≦
910 ≦＜ 10≦2020＜6040

アスペクト比200
繊維長：μm54
本数

105≦1＜015 ≦＜ 1520 ≦＜ 2025 ≦＜ 2530 ≦＜ 3035 ≦＜ 3540 ≦＜ 4045 ≦＜ 4550 ≦＜ 5055 ≦＜ 55≦
6060＜65＜ ≦

本数30

3210

径が1μm超の繊維の長さ別分布5＜ ≦1010＜≦2020＜≦3030＜≦4040＜≦5050＜
繊維長：μm観察対象物質によって使い分けが必要な対物レンズ

対象物質と媒質との位相差の程度に応じて位相差顕微鏡のレンズは使い分けられる。位相板で直接光の吸収率を上げるとコントラストは強くなるが背景は暗くなり物体の縁の光のにじみ（ハロー）も強くなる。コントラストの強さはDM(medium)＞DL(low)＞DLL(lowlow)の順。我が国ではアスベスト分析にはDLLまたはDLレンズが使われている。

PCM対物レンズの違いによるコントラストの差
クリソタイル

DLLレンズDMレンズ

アスベスト繊維の計数ルール「繊維」の定義の由来
英国のアスベスト企業が設立したAsbestosis ResearchCouncilが作業環境測定データの統一のために幾何学的定義を定める(1958)。アスペクト比「＞3：1」に科学的根拠はない。
幾何学的定義の適用範囲
作業環境測定に適用する合理的根拠はある。
アスベストの存在が不明な条件下での適用はどうか？
一般環境、解体工事現場、室内環境、産廃処理施設周辺、溶融処理後の無害化確認 etc

アスベストと非アスベストの分別計数
WHOの気中濃度測定法(1997)
PLM・電顕を使った分別計数を認める。（計数は熟練分析者が行なうことという但し書き付き）

英国のMDHS 87「PCMによる繊維数計数」と「PLM・蛍光顕微鏡・電顕を使ったアスベスト繊維の分別」の組み合わせ

米国ASTMのDiscriminatory Counting
PCMとTEMによる段階的分析法

アスベストとへき開粒子
トレモライトの3種の形態

柱状(prismatic)

針状(acicular)

アスベスト(asbestiform)

アモサイトの断面（SEM像）単繊維（fibril）がat randomな向きで束（bundle）になっている。この構造が「へき開粒子」との光学的特性の違いを生じさせる。

アスベストとへき開粒子の分別に有効な偏光顕微鏡
アスベストは直消光

アスベスト-トレモライトの消光角

へき開トレモライト（単結晶）

偏光顕微鏡像 X400

偏光顕微鏡による多色性（Pleocroism）の観察
クロシドライトとアモサイトの判別が可能

クロシドライトアモサイト

対角位を右上がりから左上がりに変えると繊維の色合いが黄→dark blueになる

どちらの対角位（矢印）になっても繊維の色合いは黄色で変わらない海外での光学顕微鏡法の精度管理
英国：PCM法・アスベスト分別計数法・含有率分析について認証機関が実施
米国：PCM法・含有率分析についてAIHA及びNISTが実施。ニューヨーク州は含有率分析について独自に実施。
フランス・ベルギー・スペインでも精度管理を実施。

Relocatable Slideと「合意基準」
・Pangが視野を正確に再現出来るスライドを開発。
Am.Ind.Hyg.Assoc.J., 61, pp529-538(2000)
・Harper等は、多くの分析機関の合意によって各視野の繊維数を決定しその値を「合意基準」とすることを提案。
Am.Ind.Hyg.Assoc.J., 64, pp283-287(2003)

アモサイトのRelocatableSlide。円の直径は100μmで顕微鏡下でWalton-Beckett
グレイティクルと一致する。

グレイティクルの比較改良の余地がある我が国のグレイティクル。目盛りが計数の邪魔にならないか？

欧米で使われているWalton-Beckett
グレイティクル（100μmφ）

我が国で普及しているグレイティクル（100μmφと300μmφを有する）

クロスチェック成績評価シートの一例（Relocatable Slideを使ったNIOSH-AIHAのクロスチェック試
験プロジェクトで使われている）
PROFICIENCY EVALUATION OF PCM FIBRE COUNTING
Round 1
SLIDE NUMBER
ANALYST NAME
# OF "VERIFIED" FIBRES =# OF FIBRES REPORTED (RF) =# OF DISCREPANCIES =SCORE =FIELDNUMBER#1#2#3#4#5#6#7#8#9#10GRID #112
105
60

NORMALISED D+NORMALISED DSUM OF NORMALISED D+ + | D-|NORMALISED RF

0.219-0.2900.509
0.929

46.43 ****FIELD ID
1 F-1
1 F-2
1 F-3
1 F-4
1 F-5
1 F-6
1 F-7
1 F-8
1 F-9
1 F-10VERIFIED REPORTEDFIBRES FIBRESVFRFRF -VF
1.5
0.5
11
3.5
2.5
2.5
142.5

35
114
0.5
2.5
212.5

1.5
4.5
000.5
-201-30DISCREPANCIES************************************************POSITIVE
NEGATIVEDISCREPANCIESDISCREPANCIES
D+
D1.5
4.5
0.5
1--2-3-TOTALDISCREPANCIES
D+ + | D-|
1.5
4.5
00
0.5
20
1
30

SCORE＝100ー［ 100 （# total discrepancies／# verified fibers）］。
正解値（）と報告値（ ）の差はわずか7でこの分析者の精度はよさそうだが、数え過ぎ（D+）と見落とし（｜D-｜）の総和でスコアを出すと50点以下で計数精度は悪い。総繊維数だ
けの比較では個人の精度を正しく評価出来ない。

クロスチェック結果の国際比較（2006年）（仮に Score60点以上をproficient（熟練者）とする）

・カナダ
アモサイト・スライド：46名中6名が60点以下（13％）
クリソタイル・スライド：50名中12名が60点以下（24％）
・日本（約30の公的研究機関、約60名参加）
アモサイト・スライド：58名中5名が60点以下（8.6％）
クリソタイル・スライド：56名中38名が60点以下 （67.9％）
アモサイトに比べるとクリソタイルは日・加どちらの国の分析者も成績が悪く計数が難しいことがわかる。

まとめ
1.光学顕微鏡法の簡便性・迅速性はアスベスト分析に有効である。
2.PCMの限界を補う他の手法を組み合わせた重層的分析手法が開発され発展しつつある。
3.PLMは「へき開粒子」や「角閃石粒子（ホルンブレンド等）」とアスベストを分別出来る。
4.電顕の活用法（光顕との使い分け・光顕の補完等）の検討が必要である。
5.光顕法には精度管理システムの確立が必須である。（系統誤差の最小化）