東京医療保健大学紀要

研究報告第7巻第1号

2013. 3. 1

マクロファージのＮＯ産生に及ぼすグルコサミンおよびレスベラトロールの影響
Effects of glucosamine and resveratrol on NO production from the RAW264.7 macrophage cell line

碓井之雄
Yukio USUI,

細田明美

Akemi HOSODA,清水雅富

Masatomi SHIMIZU

〈 研究報告 〉

マクロファージのＮＯ産生に及ぼすグルコサミンおよびレスベラトロールの影響
Effects of glucosamine and resveratrol on NO production from the RAW264.7 macrophage cell line

碓井之雄

細田明美

東京医療保健大学
Yukio USUI,清水雅富

医療保健学部

Akemi HOSODA,

医療栄養学科

Masatomi SHIMIZU

Division of Medical Nutrition, Tokyo Healthcare University, Tokyo, Japan要

旨：GlcN と Res をマクロファージのリポ多糖体刺激系に作用させ、両者の同時添加による一酸化窒素（NO）産生に及ぼす効果について検討を行った。GlcN はマクロファージの LPS 刺激時の NO 産生を濃度依存的に抑制することが示された。さらに LPS 刺激時の NO 産生を 2 mM GlcN 単独では 68％の有意な阻害、10 μ M Res 単独では 22％の有意な阻害に対して、10 μ M Res と 2 mM GlcN を同時に作用させたときは、LPS 刺激時のNO 産生を 83% 有意に阻害し、この結果は 20 μ M Res においても同様（ 84% の有意な阻害）であった。したがって、GlcN と Res の同時摂取は変形性関節症に有効であることが期待される。

Keywords：glucosamine,

resveratrol,

nitric oxide,

macrophage,

osteoarthritis

キーワード：グルコサミン、レスベラトロール、一酸化窒素、マクロファージ、変形性関節症
受付：2012 年 3 月 30 日

受理：2012 年 9 月 20 日

はじめに
変形性関節症は、加齢とともに関節軟骨が摩耗し、骨の変形と関節炎を来す疾患で、関節の運動時痛、安静時痛、運動時の礫音、関節可動域制限などの臨床症状を呈する。また、変形性関節症は高齢者の健康寿命に大きく影響し、そのうえ要介護状態への大きなリスク要因として注目されている。その変形性関節症の中で変形性膝関節症は、2009 年の時点で患者数は 2530 万人（男性 860 万人、女性 1,670 万人）、また変形性腰椎Fig.1. Chemical structure of glucosamine症においては、患者数 3,790 万人（男性 1,890 万人、女2-4 ）あるいは無効 ）の発表が 2 分しているが、GlcN には性 1,900 万人）と推定されている ）。
1グルコサミン（GlcN）はアミノ糖の一種で、グリコ5アセトアミノフェンのような非ステロイド性消炎鎮痛6,7 ）があサミノグリカン（ムコ多糖）の構成成分として自然界剤（NSAID）に見られるような様々な副作用に広く分布（Fig.1.）し、動物体内では、結合組織や軟まり無く、長期間の摂取においても高い安全性がある

骨組織に多く存在し、各器官の強度、柔軟性、弾力性ことから広く使用されている状況である ）。
8を維持することに寄与している。GlcN は関節軟骨の成その GlcN の有効性に関する研究には、関節軟骨にお分でもあることから、以前より、変形性関節症の症状けるグリコサミノグリカンの合成を亢進すること ）、の軽減の目的で、医薬品または栄養補助食品として広関節炎の病態に関与すると考えられている一酸化窒素く使用されている。しかしながら、その効果には有効（nitric oxide：NO）や炎症性サイトカインの合成を抑

9̶ 41 ̶

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碓井之雄

2011 年

制すること10 ）清水雅富

各実験結果における値は平均値±標準偏差で表示しなどが報告されている。
11 ）細田明美は、ブドウの果た。統計処理には、GraphPad Prism 4（Graph Pad

皮などに含まれ、自然界に存在する数少ないスチルベ

Software Inc., San Diego, USA）を使用した。分散分析

ン骨格を持つポリフェノール類として知られ、その作後、多重比較検定として、Dunnett 法を用い、LPS 単

また、レスベラトロール（Res）

用は、抗酸化作用12 ）、抗がん作用13 ）、寿命延伸効果

14 ）など多様な機能性が報告されており、我々は Res の抗炎症作用について報告した

独処理群を対照として各群との有意差検定を行った。
いずれも危険率 5% 未満を有意差ありとした。

15 ）

。

誘導性一酸化窒素合成酵素（iNOS）は、変形性関節結症において軟骨、滑膜に強く発現しており、合成され果る一酸化窒素（NO）は炎症性メディエーターとして作

RAW264.7 細胞に LPS 添加で培養すると、無添加用し、過剰産生された NO は組織細胞障害性に働いて時には 0.33 nmol/mL に対して 14.5 nmol/mL の著しい16 ）。前述したように、GlcN は、NO 産 生 の 亢 進 が 観 察 さ れ た。10 μM ま た は 20 μM

NO や炎症性サイトカイン産生に作用し、関節炎を抑濃度の Res を LPS と同時に添加すると、10 μM にお制する働きを持つことが知られており、Res は、強いい て は 11.3 nmol/mL（ 22% 阻 害 ）、20 μM に お い て抗酸化作用と抗炎症作用を有することが知られているは 9.9 nmol/mL（ 32% 阻 害 ） と な り、 濃 度 依 存 的 に12 ）。しかしながら、GlcN と Res を同時にマクロファー

LPS 刺激で亢進した NO 産生を有意に抑制した。また、ジのリポ多糖体刺激系に作用させた報告は見当たらな

0.1 mM、1 mM、2 mM 濃度の GlcN を LPS と同時添加い。そこで、本研究では、GlcN と Res の関節炎に対す

すると、0.1 mM では有意な NO 産生の抑制は見られなる有用性を明らかにすることを目的に、両者の同時投かったが、1 mM では 9.5 nmol/mL（ 35% 阻害）、2 mM与による抗炎症効果について検討を行った。

で は 4.7 nmol/mL（ 68% 阻 害 ） の NO 産 生 量 を 示 し、いると考えられている

GlcN 高濃度添加群において、NO 産生亢進が有意に抑方制された（Fig.2.）。

法

次に、Res と GlcN グルコサミンを同時にマクロファ（ 1 ） 細胞培養法ージに作用させ、LPS 刺激による NO 産生亢進に影響

RAW264.7 細胞を 10% fetal bovine serum（株式会社を及ぼすかどうかについて検討を行った。その結果、

ハナ・ネスコバイオ）、100 U/mL penicillinG（Sigma）、

1 mM GlcN と 10 μM Res の同時添加群（29% の有意な100 μg/mL streptomycin sulfate（Sigma） を 含 む阻害）、あるいは 1 mM GlcN と 20 μM Res の同時添加

Dulbecco’s modified Eagle’s medium（Sigma）

で、群（ 40% の有意な阻害）では、いずれも 1 mM GlcN の5%CO2 下、37℃で継代培養した。細胞を 4 × 10 cells/ml

単独添加群（ 35% の有意な阻害）とほぼ同程度の抑制に調製し、12 穴プレートデッシュに細胞懸濁液 2.0 mL効果であった。しかし、2 mM GlcN と 10 μM Res の同加え、5%CO2、37℃で 24 時間培養し、各濃度のグルコ時添加群において NO 産生は 2.41 nmol/mL（ 83% の有サミン（Sigma）およびレスベラトロール（Sigma）と意な阻害）、また、2 mM GlcN と 20 μM Res の同時添LPS（Escherichia coli , O55:B5, Sigma, 10 ng/mL）を加群において NO 産生は 2.38 nmol/mL（ 84% の有意な添加し培養した。グルコサミンは、滅菌水に、レスベ阻害）という結果が得られた（Fig.2.）。

5ラトロールは dimethyl sulfoxide（DMSO）に溶解し、フィルターにて濾過滅菌後、各濃度となるように調製考し細胞に添加した。また、各群 n=3 とした。培養上清察以上の結果から、従来報告されているは、NO 測定および TNF- α測定に供した。
（ 2 ） NO 産生量の測定

10 ）

ように GlcNはマクロファージの LPS 刺激時の NO 産生を濃度依存RAW264.7 細胞に LPS を添加して 24 時間培養した的抑制することが確認された（Fig.2.）。さらに、NO後、培養上清を回収し、NO 産生量の測定に供した。測産生を 2 mM GlcN 単独では 68％の有意な阻害、10 μM17 ）。上述の培養上清Res 単独では 22％の有意な阻害に対して、2 mM GlcN

250 ml に、グリース試薬Ⅰ（ 5% H₃PO₄、1% sulfanicと 10 μM Res を同時に作用させたときは、NO 産生をacid）250 mL 、グリース試薬Ⅱ（0.1%N-（1-naphthyl）

83% の有意な阻害をし、この結果は 20 μM Res におい-ethylenediamine）250 mL 、H₂O 250 mL を加え混合ても同様（84% の有意な阻害）であったことから、GlcNした後、554 nm における吸光度を測定した。と Res の同時摂取は炎症を相加的に抑制することが期（ 3 ） 統計処理待される。原ら定は、グリース法に準じて行った̶ 42 ̶18 ）は、膝関節痛自覚者を対象として、

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マクロファージのＮＯ産生に及ぼすグルコサミンおよびレスベラトロールの影響第1号

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20*NO (nmol/ml)

15*
*

10**

*

*

5*

*

0LPS(+)

Fig.2. The effects of resveratrol and glucosamine on LPS-induced NO production from RAW264.7 cells.

Values（mean ± SD）are representative of 3 independent experiments.
Fig.2.StatisticalThe effectsof resveratroland glucosamine on LPS-induced NO production from RAW264.7 cells.
analyses were performed by ANOVA with Dunnettʼs multiple comparison test. *p<0.05 compared with the LPS only group.

Values (mean±SD) are representative of 3 independent experiments.

ベラハーブリン配合
発酵グルコサミン食品を摂取
StatisticalanalysesTM
wereperformed by ANOVA with Dunnett’s multiple comparison test. *p<0.05

結した時の膝関節痛の低減効果を検討したところ、発酵
comparedwith the LPS only group.

論

RAW264.7 細胞に LPS 添加により著しい NO 産生のグルコサミン単独に比べて有意に膝関節痛の改善が認亢進が観察された。この LPS 刺激系による NO 産生をめられたと報告している。このベラハーブリンは、オ

次に、Res と GlcN グルコサミンを同時にマク作用させたときは、NO 産生を 83%の有意な阻害ロファージに作用させ、LPS 刺激による NO18 ） 産生をし、この結果は 20 μM Res においても同様

亢進に影響を及ぼすかどうかについて検討を行っとから、ベラハーブリン配合 TM 発酵グルコサミン食（84%の有意な阻害）であったことから、GlcN2とンを同時にマクロファージに作用させたところ、mM

添加群（29%の有意な阻害）、あるいは 1 mM GlcNが関わっている可能性が考えられる。

18)は、膝関節痛自覚者を対象と期待される。原ら
2.41 nmol/mL（ 83%阻害）、また、2 mM GlcN と 20 μMと 20一方、実験結果には示していないが、炎症性サイト
μM Res の同時添加群（40%の有意な阻害）

Res の 同 時 添 加 群 に お い て
NO発酵グルコサミン
産 生 は 2.38 nmol/mL
して、ベラハーブリン配合
TM

1 mM および 2 mM 濃度の GlcN はそれぞれ 35%、68%

オイタドリスプラウト抽出物であり、その成分の １ つとして Res を含んでいると記載されている。このこ

濃度依存的に阻害した。次に、Res と GlcN グルコサミ

Resの同時摂取は炎症を相加的に抑制することがGlcNと 10 μM Res の同時添加群において NO 産生はた。その結果、1GlcNと 10 μM Res の同時品の効果は GlcNmMと Res両者の抗炎症作用の相乗効果

カインである TNFαにおいては、GlcN
は 2 mM 濃度
では、いずれも1 mM
GlcN の単独添加群（35%（ 84% 阻害）という結果が得られた。以上の結果から、食品を摂取した時の膝関節痛の低減効果を検討しにおいても抑制作用は見られず、むしろ TNF- α産生

GlcN と Res の同時摂取は炎症を相加的に抑制するこの有意な阻害）とほぼ同程度の抑制効果であった。

たところ、発酵グルコサミン単独に比べて有意にしかし、2 mM GlcN と 10 μM Res の同時添加群膝関節痛の改善が認められたと報告している。こ19 （83%の有意なにおいてNO 産生は 2.41 nmol/ml傾向が見られた。Rajapakseら ）は、本研究と同様ののベラハーブリンは、オオイタドリスプラウト抽阻害）、また、2 mM GlcNとRAW264.7
20 μM Resの同時添NO系での実験から、LPS刺激細胞からの謝 辞出物であり、その成分の１つとしてRes を含んで加群において産生は 2.38 nmol/ml（84%の有産生と TNF-NOα産生の両方を化学修飾されたカルボキいると記載されている18)。このことから、ベラ本研究を遂行するにあたり、研究に従事した東京医シブチルグルコサミン（CGlcN）が有意に抑制するこ意な阻害）という結果が得られた（Fig.2）。

療保健大学医療保健学部医療栄養学科
渡部良輔氏にハーブリン配合
TM 発酵グルコサミン食品の効果が上昇傾向であった。また、Res の同時添加によってもとが期待される。

抑制効果は見られず GlcN 単独の作用と変わりがないは心から感謝申し上げます。
GlcN と Res 両者の抗炎症作用の相乗効果が関とを報告している。しかしながら、詳細に実験系を比較すると、用いた LPS の量や化学修飾された GlcN を考 察わっている可能性が考えられる。

用いている点が異なる。特に異なる点は、彼らは化学引用文献
一方、実験結果には示していないが、炎症性サ修飾 GlcN を LPS 添加の １ 時間前に細胞に添加していることである。以前、我々が今回と同様の実験系を用イトカインである
TNF-α においては、GlcN は21 ） 吉村典子 . 高齢者の運動器障害の疫学・現状. 診断と3 および 6 時間前に RES を細胞に処理しても、LPSを濃度依存的抑制することが確認された（Fig 2）。と2 ） 産生が上昇傾向であった。また、ResReginster JY, Deroisy R, Rovati LC, Lee RL, の同Lejeune
TNF-αRES の同時投与よりもNOGlcNや TNFα産生は抑制が弱さらに、NO産生を 2 mM
単独では68％のE, Bruyere O, et al. Long term effects GlcNof glucosamine
時添加によっても抑制効果は見られず
単独以上の結果から、従来報告されている 10)ようにGlcN
LPS 刺激時の NO添加する
産生
いてはマクロファージのRes の抗炎症作用を検討した際に、LPSmM 濃度においても抑制作用は見られず、むしろ治療 . 2010; 98:1767-71.

15 ）。今後、この違いにつかったことが観察されている
有意な阻害、
10 μM Res 単独では22％の有意な阻

randomized,の 作 用sulphateと 変 わonりosteoarthritis
が な い 傾progression:
向 が 見 らa れた。

害に対して、2 mM GlcN とRajapakse ら 19)は、本研究と同様の系での実験かいて詳細に検討する予定である。

placebo-controlled clinical trial. Lancet. 2001; 357:を同時に251-6.

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第1号

碓井之雄

2011 年

細田明美

清水雅富3 ） Drovanti A, Bignamini AA, Rovati AL. Therapeutic

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マクロファージのＮＯ産生に及ぼすグルコサミンおよびレスベラトロールの影響

東京医療保健大学 紀要

第1号

A b s t r a c t：Effects of glucosamine (GlcN) and resveratrol (Res) on the production of nitric oxide(NO) from the lipopolysaccharide(LPS)-stimulated RAW264.7 macrophages cell line
were investigated. The productions of NO from LPS-stimulated macrophages wereinhibited dose-dependently by GlcN treatments. Futhermore, the treatments of 2 mM
GlcN and 10 μM Res at the same time were shown to inhibit the NO production from
LPS-stimulated macrophages to the extent of 17% (83% inhibition) , compared to thatof non-treatment control, suggesting that taking GlcN and Res simultaneously would
be beneficial for the management of pain in osteoarthritis.

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2011 年