技術資料

山口県産業技術センター

研究報告No.30 p18-25 (2018)

清酒製造工程における汚染微生物生育抑制技術
半明桂子 *Suppression Technology of Bacterial Contaminant for Sake Brewing
Keiko Hammyo
１．緒MRS 寒天培地(ペプトン 10g，肉エキス 10g，酵母エキス言

アルコールを含有する清酒は，腐敗しにくい印象を持た5g，K2 HPO 4 2g，クエン酸二アンモニウム 2g，グルコースれる食品である．しかし，変質に関する相談が年間10～2020g，tween80 1g，酢酸ナトリウム 5ｇ，MgSO 4 ・7H 2 O 0．

件程度あり，そのほとんどが「火落ち菌」と呼ばれるアル58g，MnSO 4 ・4H 2 O 0．28g，寒天 15g，水 1000ml)に MRS 培

コール耐性を持つ乳酸菌が関与した腐敗である．この「火地で 28℃，24 時間培養した火落ち菌を 100μl/100ml の濃落ち菌」対策として，熱湯や薬剤などによる器具類の殺菌度で添加した MRS 寒天培地を重層し，火落ち菌含有プレーが行われているが，隙間の多い木質器具を十分に殺菌するトを作成した．作成したプレートの火落ち菌含有層にパスことは難しく，かつ，多くの作業を床の水が跳ね返る低位ツールピペットで穴をあけ， MRS 培地で 28℃，24 時間培置で行うため新たな汚染が起こり，結果として，十分な効養した乳酸菌培養液 200μl を満たした後，28℃で 72 時間果が得られていない現場が多い．また，発酵に30日程度要培養した．培養後，乳酸菌培養液を満たした穴の周囲で火する清酒の製造は，複数の仕込みを時間差で行うため，製落ち菌の生育が抑制されたことにより発生するクリアゾー

造所内で「火落ち菌」による汚染が発生すると，共用するンの有無を，目視で確認した．火落ち菌は，市販清酒から器具などを媒介して複数の清酒へ拡大され，収束に時間が分離した火落ち-4 と酒類総合研究所から分譲された 7 菌株かかることが多い．

(SY-1～3，SY-7，SY-8，SY-12，SY-13)を使用した．乳酸菌

このように対策の難しい「火落ち菌」であるが，乳酸菌は当所保有の 16 菌株(AN-14～18，AN-20，K-13，J-16～18，が生産するペプチドである「バクテリオシン」によって殺A-12，C-1，C-3，C-5，G-2，H-25)と市販の山廃仕込み用株

菌されることが知られている 1) ．バクテリオシンには多く( L．sakei 以下，L)を使用した．この市販菌 L 株は，清酒の種類があり，いずれも人の腸管の消化酵素で分解される製造現場で既に使用されていることから，スクリーニングため，安全性の高い天然の保存料として期待されている．

した乳酸菌の各性質を比較する対照として，後述の試験にしかし，製剤として使用するためには，乳酸などの代謝物おいても使用した．

を除いて精製する必要があるため，食品添加物として販売

結果は図 1 および表 1 に示すとおり．試験に供した火落ち

2)されている精製品は1種類のみである ．また，バクテリオ菌に対して，クリアゾーンを形成する乳酸菌が多数あった．

シンを清酒製造所内に散布しても，影響を受けない微生物

一方，火落ち菌 SY-13 に静菌性を示す乳酸菌は少なかった．

により分解されてしまうと予想されるため，抗菌性の薬剤検討に使用した乳酸菌の記号は「分離源-番号」となっておとして使用することは難しい．

り，いくつかの静菌性のパターンと分離源が同じ菌株は同そこで，バクテリオシンを生産する乳酸菌を清酒製造所一の菌である可能性が高いと考えられた．そこで，分離源・内に存在させ，環境中でバクテリオシンを生産させながらクリアゾーンの形成パターン・菌株の外観が異なり，かつ，「火落ち菌」を抑制することを考えた．乳酸菌を生育させ多くの火落ち菌に静菌性を示した AN-14，AN-15，K-13，J-

れば，バクテリオシンを供給し続けることができるため，16，J-18，C-1 の 6 菌株を選抜した．

バクテリオシンの影響を受けない微生物により分解されるとしても，静菌効果が期待できる．また，乳酸菌を生育させることは，熱殺菌よりも火傷といった作業者への負担が少なく，更に薬剤殺菌のように清酒への薬品臭の移行や排水設備への負担を考慮しなくてもよいため，清酒製造所には適すると考えられる．これらの背景に基づき，「火落ち菌」のようなアルコール耐性などを持たず，かつ，静菌効果を有する乳酸菌の選抜と効果を検討したので報告する．
２．実験方法と結果
２・１

火落ち菌に対して静菌性を示す乳酸菌の 1 次ス

クリーニング
図1*

企業支援部食品技術グループ形成されたクリアゾーン

清酒製造工程における汚染微生物生育抑制技術

図2

19染色されたバイオフィルム

0.20

0.20
0.15

0.15

701

9E

OD590nm

OD590nm

0.10
0.10

0.05

0.05
0.00
AN-14 AN-15 K-13 J-16 J-180.00
AN-14 AN-15 K-13 J-16 J-18 C-1

L-0.05L-0.10-0.05
静菌性を示す乳酸菌
図3

C-1

乳酸菌を単独で培養した場合のバイオフィルム量

静菌性を示す乳酸菌
図4

乳酸菌を酵母と共培養した場合のバイオフィルム量

20

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２・２

火落ち菌に対して静菌性を示す乳酸菌の 2 次ス

研究報告No.30 (2018)

結果は図 3 に示すとおり，AN-14，AN-15，K-13，J-18 がクリーニング

バイオフィルムを形成したものの，清酒製造現場で使用さ火落ち菌に静菌性を示す乳酸菌を清酒製造所に存在させれている L の形成量より少なかった．

ると，清酒製造タンク内に混入する可能性が高くなる．さ２・２・３

らに，混入した乳酸菌がアルコール耐性を有すると，新た成試験な火落ち菌となる．また，乳酸菌は，単独もしくは酵母と2・2・2 で示した方法の最初の培養の際に酵母の前培養共培養することにより，洗浄が難しいバイオフィルムを形液を 5%添加し，共培養した場合のバイオフィルム形成試験成することが知られている 3，4) ．これらの理由から，清酒を行った．バイオフィルム量は，共培養した場合の吸光度製造所に存在する乳酸菌は，アルコールに弱く，バイオフから各菌株を単独培養した吸光度を引くことで，共培養にィルムを形成しない性質であることが重要である．そこで，より増加した量を評価した．酵母は山口県内で広く使用さ火落ち菌に静菌性を示す乳酸菌のアルコール耐性およびバれるきょうかい 701 号と山口県独自酵母 9E を使用した．

イオフィルム形成量を指標としたスクリーニングを行った．
２・２・１

アルコール耐性試験

アルコール濃度を 0，3，5，10，15%に調製した MRS 培地に乳酸菌前培養液を 2%の濃度で添加し，28℃で 6 日間培養結果は図 4 に示すとおり，701 号との共培養により J-16のバイオフィルム量がわずかに増加した．一方，9E との共培養において，K-13，J-16，J-18，C-1 のバイオフィルム量が増加したものの，L の増加量よりは少なかった．
２・２・４した．

酵母と共培養した場合のバイオフィルム形

2 次スクリーニングの結果

結果は表 2 に示すとおり，アルコール濃度 3 および 5%で火落ち菌に静菌性を示す 6 菌株のうち，アルコール耐性はいずれの菌株も 2～4 日でアルコール濃度 0%の培地と同が L と同程度であり，かつ，バイオフィルムの形成量が少程度に増殖した．アルコール濃度 10%では J-16 および J-なかった K-13，J-16，J-18 の 3 菌株が清酒製造現場へ存在

18 は増殖しなかった．AN-14，AN-15, K-13 は 1～2 日でわさせることに適すると考えられた．なお，酵母と共培養すずかに増殖し，それ以降，増殖しなかった．C-1 は 6 日目

ることによって形成されるバイオフィルム量については，に増殖した．アルコール濃度 15%ではいずれの菌株も増殖酵母による差が興味深かったため，きょうかい 7，9，901，しなかった．

11，14，1401 号を使用した試験も行った．バイオフィルム

２・２・２

乳酸菌のバイオフィルム形成試験

乳酸菌の前培養液を 0．1%添加した MRS 培地を 96 穴プレ形成の差には酵母の性質(泡の有無，K7 グループなど)が関与していると推測していたが，傾向を見出すことはできな

ートに 200μl 分注し，28℃で 72 時間培養した後，培地をかった．

除去し，各穴をイオン交換水 300μl で 2 回洗浄した．次２・３に，形成されたバイオフィルムを 0．1%ゲンチアナバイオール耐性

レット 100μl で 20 分間染色した．染色されたバイオフィ

2 次スクリーニングでは，乳酸菌前培養液を各アルコー

ルムは図 2 のとおり．更に各穴の染色液の除去とイオン交ル濃度の MRS 培地に添加してアルコール耐性を評価した．

換水 300μl による洗浄を 2 回行った後，ジメチルスルホ

しかしながらこの方法では，発酵によりアルコール濃度がキシド 350μl で 20 分間，バイオフィルムに吸着された色徐々に高くなる清酒タンク内におけるアルコール耐性を評

素を抽出，抽出液の吸光度(590nm)をバイオフィルム量とし価できていない．そこで，より実際の生育条件に近くなる

た5)．

火落ち菌に対して静菌性を示す乳酸菌のアルコよう，培地のアルコール濃度を段階的に上げた場合の増殖清酒製造工程における汚染微生物生育抑制技術
0.70.7K-130.6OD600nm

OD600nm0.50.4
0.3
0.2

0.4
0.3
0.2

0.1

0.1

000.750

100150
培養時間(時間)

0200050

100150200150200

培養時間(時間)
0.7J-160.6L0.60.5

OD600nm

0.5OD600nm

J-18

0.6

0.5

210.4
0.3

0.4
0.3

0.2

0.2

0.1

0.1
00050

100150020050

培養時間(時間)アルコール濃度(%)

34100

培養時間(時間)
5678910K-13，J-16，

図6 各アルコール濃度における乳酸菌の増殖

図7

アルコール濃度 9%の麹培地で各時間培養した Lの麹培地における増殖1.41.2

OD600nm1.00.80.60.40.20.0050100150200

培養時間(時間)
K-13
図8

J-16

J-18

アルコール濃度 10%の麹培地で 120 時間培養した
K-13,J-16 および J-18 の麹培地における増殖

図9

J-18

各アルコール濃度における乳酸菌の生存22

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研究報告No.30 (2018)を確認した．また微生物には，生育に適さない環境下ではにより，段階的にアルコール濃度が高くなる環境の試験と増殖を中止し，適する環境に変化することにより再度増殖した．アルコール濃度は 2･2･1 において全ての乳酸菌が生を開始する性質がある．清酒タンク内に混入した乳酸菌が存することを確認している 3%より開始し，10%まで高くし生存し続けると，同じタンクを使用して行う次回の製造にた．菌体量の変化は OD660nm の吸光度で確認した．生存は影響を及ぼす可能性があることから，増殖しなかったアル各アルコール濃度で培養した菌体をアルコール濃度 0%のコール濃度における乳酸菌の生存も確認した．

麹培地に添加・培養し，増殖の回復により確認した．増殖

２・３・１が回復しない場合は死滅したと判断した.

アルコール濃度を 3～10%に変化させた場合の増殖と生存増殖の結果は図 6 に示すとおり，K-13，J-16，J-18 はア

図 5 に示すとおり，低アルコール濃度の麹培地(乾燥麹

ルコールの濃度が 9%以上，L は 4%以上になると増殖しなか

360g に 1500ml の水を加え 55℃，5 時間糖化させたろ液を，った．L の生存の結果は図 7 に示すとおり，アルコールのボーメ 6．0 に合わせる)を用いて乳酸菌を 28℃，24 時間培濃度が 9%の麹培地で 48 時間培養すると死滅した．K-13，

養し，アルコール濃度を 1%高くした麹培地に植え継ぐことJ-16，J-18 の生存は図 8 に示すとおり，いずれもアルコー

K-13

L

火落ち-4

図 10

SY-1

SY-2SY-3

乳酸菌培養上清における火落ち菌の増殖

清酒製造工程における汚染微生物生育抑制技術

グルコース
図 11

エタノール

酸度

乳酸菌 J-16 株の添加量が異なる小仕込み

グルコース
図 12

エタノール

酸度

小仕込みにおける各成分濃度の変化

23

24

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研究報告No.30 (2018)

表4 生成酒の官能評価結果
上槽後1か月

上槽後9か月

コメント

菌株
-評価
2.6

4VG，酸浮く，苦味，麹臭

K-13

2.3

酸味，苦味，4VG，きれい，渋い，酸臭，汗臭

J-16
J-182.03.0

酸，苦味，生老，アセトアルデヒド，4VG，酢エチ
酸味強い，麹臭，4VG，酸臭，ジアセチル，汗臭K-132.32.3

麹臭，4VG，カビ，苦味，酸臭，生老，アルデヒド，味丸い紙臭，アルデヒド，酸味強い，甘い，渋味

J-162.5

酸味強い，苦味強い，アルデヒド，酸臭，酢エチ

J-182.8

酸味，酸臭，苦味，アルデヒド

ル濃度 10%・120 時間の培養では死滅しなかった．
２・３・２

アルコール濃度 10～15%環境下での生存

2・3・1 の補足として，アルコール濃度 10%以上の麹培地で生存していた乳酸菌が何日目で死滅するかを確認した．
結果は図 9 に示すとおり，K-13 はアルコール濃度 10%でれの仕込みもグルコースおよびエタノールの濃度，酸度の変化には差がなかった．
２・５・２

小仕込み試験

2・5・1 の結果を踏まえ，より過酷な条件となるよう，1．
0×10 7 個の乳酸菌を添加して試験を行った．

11 日以上，アルコール濃度 11%で 7 日以上，アルコール濃結果は図 12 に示すとおり，グルコースの減少とアルコ

度 12%以上で 1 日以上培養すると死滅することが分かった．

ールの増加から，いずれの仕込みにおいても，アルコールJ-16 および J-18 はアルコール濃度 10%で 15 日以上，アル発酵における差はみられなかった．一方，酸度の上昇につコール濃度 11%で 7 日以上，12%以上で 1 日以上培養するといては J-18 を添加した仕込みの上昇が早く，無添加区，K-死滅することが分かった．

13 および J-16 の生成酒の酸度が 4～5 であったのに対し，２・４静菌性を示す乳酸菌の特性9 であった．また，これら生成酒の官能評価を 4 名で行っ乳酸菌が示す静菌性は，乳酸などによる pH の低下と静た結果を表 4 に示す．乳酸菌に起因するオフフレーバー(ジ菌性ペプチドであるバクテリオシンによるものが知られてアセチルなど)について，上槽後 1 か月では J-18 を使用しいる．そこで，K-13，J-16，J-18 の示す静菌性がいずれにた酒に指摘があったが，9 か月では指摘されなかった．味よるものかを確認するために，0．20μm のフィルターでろについて K-13 および J-16 は，無添加と同様に酸味を指摘過した各乳酸菌株の麹培地培養上清に火落ち菌を添加し，され，J-18 は強い酸味を指摘された．

増殖を確認した．乳酸菌株の培養上清は pH が 4．0，4．5，３．結5．0，6．0 になるよう調製した．火落ち菌は属と被静菌効果が異なる 4 菌株(火落ち-4，SY-1，SY-2，SY-3)を使用し

言

火落ち菌に静菌性を示す乳酸菌をスクリーニングし，アルコール耐性およびバイオフィルム形成量を確認した．そた．
結果，K-13，J-16 および J-18 の培養上清は同様の傾向の結果，アルコール濃度 9%以上では増殖せず，きょうかいを示したため，図 10 のとおり K-13 のみを示す．いずれも

701 号酵母との共培養でバイオフィルムが増加しない K-13，pH 未調整(pH3．0)～5．0 で増殖せず，pH6．0 で増殖した．

J-16，J-18 が選抜された．これらの乳酸菌は乳酸による pH

L の培養上清については，pH 未調整(pH3．5)～4．0 で弱い低下とバクテリオシンの生産により，火落ち菌を静菌して増殖，pH5．0 以上で増殖が見られた．これらのことから，いると考えられた．

K-13，J-16，J-18 の静菌性は pH のみによるものではなく，バクテリオシンが関与していると推測された．
２・５

小仕込み試験

また K-13，J-16，J-18 は清酒製造時に麹などから混入する乳酸菌数以上の量を小仕込み試験に添加しても，アルコール発酵への影響はなかった．生成酒について，K-13，J-K-13，J-16，J-18 が清酒製造タンクに混入することを想

16 を使用したものについては乳酸菌に起因するオフフレ定し，小仕込み試験を行った．配合は表 3 のとおり．酵母ーバーの指摘がなく，コントロールと同程度の酸度であっはきょうかい 701 号を使用した．

た．一方，J-18 を使用したものについては上槽後 1 か月で２・５・１

火落ち菌に対して静菌性を示す乳酸菌の添

清酒の製造において，麹などから混入する乳酸菌数は 1．
3ジアセチルを指摘され，また，酸度 9 であったため，清酒製造現場での使用には適さないと考えられた．

加量の検討
6以上の検討により，火落ち菌に静菌性を示し，かつ，清0×10 ～1．0×10 個と言われている．そこで，J-16 の添加酒の製造に影響を与えない乳酸菌 K-13 および J-16 を分離

量 1．0×10 3 および 1．0×10 6 個小仕込みを行い，添加するした．この乳酸菌を殺菌の難しい清酒製造所内の床や排水乳酸菌の量を検討した．

溝に存在させることにより，製品，作業者および排水施設

結果は図 11 に示すとおり，乳酸菌を無添加と比べ，いずに負担をかけることなく火落ち菌のリスクを下げることが清酒製造工程における汚染微生物生育抑制技術可能になると期待される．
参考文献
1) 吉田和司：乳酸菌抗菌性ペプチド「バクテリオシン」の清酒醸造への利用，醸協，88(7)，p.512-516(1993)．
2) 指原紀宏，薗元謙二，石崎文彬：乳酸菌の生産するバクテリオシン，科学と生物，38(7)，p.439-446(2000)．

253) 野白喜久雄，百瀬洋夫：火落ちに関する研究(第 1 報)火落菌の分離，醸協，65(8)，p.715-719(1970)．
4) 森永康，平山悟，古川壮一：伝統発酵にみる微生物の共生と進化， Jpn．J．Lactic Acid Bact ，26(2)，p.101108(2015)．
5) 森川正章：バイオフィルムを調べてみよう，生物工学，90(5)，p.246-250(2012)．