［医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス，PMDRS, 54（4），295〜299（2023）］

特集

mRNA 医薬―技術開発と求められる評価科学―

mRNA 医薬の製造と課題
峰野 純一＊ 1，辻畑 茂朝＊ 2, ＊ 3

Manufacturing Process and Its Issues of mRNA Therapeutics
Junichi MINENO ＊ 1 and Shigetomo TSUJIHATA ＊ 2, ＊ 3に 3ʼUTR 配 列，poly A 鎖 長 と そ の 下 流 配 列 な ど，1. はじめに開発時に十分検討する必要がある．

COVID‑19 パンデミックにより，mRNA ワクチ

例 と し て，3ʼUTR 配 列 を 変 え て 蛍 光 タ ン パ ク

ンは開発期間の短さと液性免疫／細胞性免疫を誘導

ZsGreen1‑DR 遺伝子を搭載する mRNA を作製し，できる有効性が認められ，ジカ熱やサイトメガロウ

正常ヒト樹状細胞に導入した際の発現量の差に関す

イルス感染症など他の感染症に対するワクチンや，る 実 験 結 果 を Fig. 1 に 示 す． タ ン パ ク 発 現 量 はがん免疫治療のプラットフォームとして研究開発が3ʼUTR 配列に依存するが，他の細胞や他の遺伝子1, 2）加速している．

では異なる結果となったため，開発段階で相性の良実用化に関しては，細胞におけるToll Like Receptor

い 3ʼUTR 配列を検討しておかなければならない．

応答による炎症反応の抑制のためのウリジンの置換，並びに生体内での分解からの保護や細胞への侵2.2mRNA 原薬の製造入効率の向上のための脂質ナノ粒子への封入等のデFig. 2 に mRNA 原薬製造工程の模式図を示す．

リバリー技術の開発が大きく寄与しており，それぞ鋳型プラスミド DNA の直鎖化，転写合れ原薬と製剤に応用されており，最も新しいモダリ成，キャッピング，及び各工程の後の精製工程からティとして製造手法の開発も盛んに行われている．

なり，精製工程はイオン交換，アフィニティー，分

本稿では mRNA 医薬の原薬と製剤，それぞれの子 ふ る い 等 の ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー と Tangential

基本技術や製造方法，課題に関して述べる．

Flow Filtration（TFF）を組み合わせて実施する．
2.2.1

poly A 鎖配列の下流を制限酵素で切断して，環2. mRNA 原薬の製造と課題
2.1

鋳型プラスミド DNA の直鎖化

状 プ ラ ス ミ ド DNA の 直 鎖 化 を 行 う． 制 限 酵 素
BspQ1 など Type IIS 制限酵素を使用することで，mRNA の構造細胞内で効率良く抗原タンパクを発現させるため

poly A 下流の残存塩基数をゼロにすることが可能に mRNA の構造は重要で，コドン最適化，5ʼ 並びになり発現量は最も高くなるが，3〜5 塩基が残存＊1＊2＊3

タカラバイオ株式会社 滋賀県草津市野路東 7 丁目 4 番 38 号（〒 525‑0058）
Takara Bio Inc., 7‑4‑38, Nojihigashi, Kusatsu‑city, Shiga 525‑0058, Japan
富士フイルム株式会社 バイオサイエンス＆エンジニアリング研究所 神奈川県足柄上郡開成町牛島 577（〒 258‑8577）
FUJIFILM Corporation, Bio Science & Engineering Laboratories, 577, Ushijima, Kaisei‑machi, Ashigarakami‑gun, Kanagawa 258‑8577, Japan
富士フイルム富山化学株式会社 東京都中央区京橋 2‑14‑1（〒 104‑0031）
FUJIFILM Toyama Chemical Co., Ltd., 2‑14‑1, Kyobashi, Chuo‑ku, Tokyo 104‑0031, Japan

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18000
16000140000),

12000
10000
8000
6000
4000
20000AFig. 1BCDE(-)

3ʼUTR によるタンパク発現量の差

3ʼUTR 配列を変えて蛍光タンパク ZsGreen 遺伝子を搭載する mRNA を作製し，正常ヒト樹状細胞に導入，24 時間後並びに 48 時間後の蛍光強度をフローサイトメーターで測定した．
Cap，5ʼUTR 配列並びに poly A 鎖長は全て同一．
A〜E：各種 3ʼUTR 配列，（‑）：3ʼUTR 配列なし，MFI：平均蛍光強度
24 時間後（白バー），48 時間後（黒バー）の平均蛍光強度をそれぞれ示す．

pDNA┤㙐໬⢭〇 1IVT཯ᛂ⢭〇 2Capping⢭〇 3䝥䝷䝇䝭䝗 ไ㝈㓝⣲䛻䜘䜛ษ᩿
䞉PlasmidDNA䜽䝻䝬䝖䜾䝷䝣䜱䞊
TFFmRNA䛻㌿෗ྜᡂ䞉┤㙐໬DNA
䞉T7 polymerase
䞉IPP
䞉RNase Inhibitor
䞉Reaction Buffer䞉ATP, GTP, CTP,
䝅䝳䞊䝗䜴䝸䝆䞁

Clarification
TFF䜽䝻䝬䝖䜾䝷
䝣䜱䞊
TFFCapping཯ᛂ䞉Vaccinia Capping
Enzyme䞉2’-OMethyltransferase
䞉RNase Inhibitor
䞉S-adenosyl-Lmethionine (SAM)䞉GTP䞉Capping Buffer

TFF䜽䝻䝬䝖䜾䝷䝣䜱䞊
TFF
Filtration

䞉Type IISไ㝈㓝⣲
BspQ1
䞉BufferFig. 2

ཎ⸆mRNAmRNA 原薬製造工程

しても発現量が大きく下がることはないことを我々

UTP の代わりにシュードウリジンを使用する3）．

は確認している．

IVT 反応終了後 DNase I 処理を行い，不要となった

2.2.2 in vitro 転写合成（in vitro transcription：鋳型プラスミド DNA を分解する．
2.2.3IVT）

キャッピング

直鎖化したプラスミド DNA を精製 1 工程（クロマ

真核生物の mRNA 分子の 5ʼ 末端は，リン酸結合をトグラフィー，TFF 濃縮・バッファー交換）を実施介してグアノシンが結びついて 5ʼ‑5ʼ 結合した 5ʼ‑Capして鋳型とし，T7 RNA ポリメラーゼなどを用いた構造になっており，細胞内での Exonuclease からの転写で一本鎖 mRNA を合成する．IVT 反応分解回避やタンパク合成時の Ribosome による認識で生じるピロリン酸による反応阻害やピロリン酸とに寄与する．グアノシンのグアニン塩基の 7 位がメマグネシウムイオンによる沈殿を防ぐために，反応チル化したものを Cap 0，更に mRNA の最初の塩基系にピロホスファターゼを加え，RNase インヒビ一つがメチル化したものを Cap 1と呼び，真核細胞ターを加えて RNA の分解を防ぐ．

では Cap 0 は外来 RNAと認識されやすく，Cap 1 はまた，mRNA ワクチンを投与した時の細胞にお真核生物 mRNAとして認識されるため，mRNA 原

け る Toll Like Receptor 応 答 抑 制 の た め， 基 質 に薬の製造では Cap 1 キャッピングを行う4）．IVT 反応296

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後の反応液を精製工程 （2 清澄化，TFF 濃縮，クロマいため，品質試験に関しては工夫が必要である．

トグラフィー，TFF 濃縮・バッファー交換）を行った
後，GTPと ‑adenosyl‑ L ‑methionine（SAM）存在
下で Vaccinia Capping Enzyme（VCE）による Cap 0付加と，2ʼ‑ ‑Methyltransferase（2ʼ‑ ‑MTase）に5）

よる Cap 1 変換を行う ．

3. mRNA 製剤の製造と課題
3.1

脂質ナノ粒子（LNP）の設計

mRNA の製剤としては，封入する mRNA，標的キャッピングには2種類の方法があり，先に示した反応とする臓器や細胞，投与方法を踏まえて，様々な技はEnzymatic cappingであるが，IVT反応時にキャッ術開発がなされてきた．その中でも，新型コロナウピングを同時に行うCo‑transcriptional cappingとい

イルスに対するワクチンにも応用された LNP が第う方法も用いられている．後 者は，IVT 反 応液に一選択肢となる．

Anti‑Reverse Cap Analogを 加 え てCap 0を 付 加 し

LNP は，主に pH 応答性カチオン脂質（pH 応答脂SAMと2ʼ‑ ‑MTaseによりCap 1変換を行う方法と，質，イオン化脂質），中性リン脂質（ヘルパー脂質），IVT 反応時にTrilink 社のCleanCap® Reagent AG をコレステロール，ポリエチレングリコール（PEG）加えて Cap 1 付加を行う方法がある．SARS‑CoV‑2脂質から構成される．これらの脂質の中でも pH 応

ワクチンでは，Pfizer / BioNTech（BNT162b2）は答脂質は，LNP の性能を特徴づける成分である．

CleanCap® を用いた Co‑transcriptional capping で，pH 応答脂質は特定の pH 域においてカチオン化す

Moderna（mRNA‑1273）は Enzymatic capping でそることで，粒子形成時は mRNA の LNP への封入，れぞれ製造されている．

細胞内ではエンドソーム脱出に寄与する．その基本

2.2.4

構造は 3 級アミノ基を有するヘッドと炭化水素鎖か品質試験キャッピングを行ったmRNAを精製工程 3（TFF 濃らなる嵩高いテールから構成され，pKa や cLogP

縮，クロマトグラフィー，TFF バッファー交換，無菌ろ値，更には生分解性等を考慮して分子設計されてい過，濃度調整）を実施して原薬とし，品質試験を実施する．LNP の新規開発においては，これらの pH 応答る．Pfizer/BioNTech と Moderna の SARS‑CoV‑2脂質に関する数多くの特許が存在していることに留mRNA ワクチン原薬の品質試験項目はほぼ同じで，意が必要である．

試験方法や純度試験の項目が異なる．詳細はこれらの審査報告書を参照されたい．mRNA 特有の試験

3.2

LNP の製造プロセス

項 目とし て は，キ ャ ッピ ン グ 効 率，poly A 鎖 長，LNP の製造工程は，粒子形成，精製・濃縮，滅RNA 完全性，二本鎖 RNA 含量，等が挙げられる．

菌，充塡の各工程からなる．まず，pH 応答脂質を含む複数の脂質をエタノールなどの溶媒に溶解した

2.3

後，mRNA を含有する酸性のバッファーと速やか

原薬製造における課題

以下に，原薬製造における課題を列挙する．に混合することで，LNP が形成される．そのメカ・分解：mRNA は物理的に分解されやすい．TFF

ニズムとしては，負電荷を有する mRNA と酸性条による濃縮・バッファー交換工程は原理的にシェ

件で正電荷を帯びた pH 応答脂質のイオンコンプアストレスがかかるので分解の要因になり得るた

レックスが形成されるとともに，エタノール濃度のめ，バッファー組成・温度・濃縮度などの条件を低下により，コレステロール等の脂質が析出し，こ検討し，分解を最低限に抑える必要がある．

れらの成長による自己組織化で，LNP の一次粒子・酵素・資材：mRNA 原薬を製造するための酵素やが形成される．その後，中性のバッファーを添加す資材の供給元が海外メーカーに依存しているたることで，酸性条件で正電荷を帯びていた粒子は電め，調達には十分気を付けなければならない．

荷を失って粒子の合一が進行する．最終的に表面が我々は mRNA 製造用の GMP 酵素に関して，国産PEG 脂質で安定化されることで，LNP が形成され品として提供すべく開発を進めている．

ると考えられている（Fig. 3）6）．

・標準品：品質試験においてキャッピング効率や粒子形成の過程は，前述のとおり速度論的な自己poly A 鎖長など，mRNA 特有の標準品がまだな組織化現象であり，これを再現性良く製造すること

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䠄䜶䝍䝜䞊䝹┦䠅⬡㉁䜶䝍䝜䞊䝹୰ᛶ䝞䝑䝣䜯䞊䠄Ỉ┦䠅㼙㻾㻺㻭㓟ᛶ䝞䝑䝣䜯䞊
Fig. 3LNP 形成過程の模式図がプロセス設計上の課題である．粒子径分布を制御

安定性が低いため，孔径 0.2μm のフィルターを用するには，粒子の成長する時間を制御する，すなわいた濾過滅菌が用いられる．そのため，濾過工程にち pH 及び脂質の溶媒（エタノール）濃度を制御し供 す る LNP の 粒 子 径 分 布 の 管 理 と， 粒 子 に よ るなければならない．そのため，粒子形成にはマイクフィルターへの吸着や閉塞挙動を考慮して，最適なロ流路等を用いて水相とエタノール相の混合速度を濾過条件を設定しなければならない．

精密に制御することが求められ，T‑junction mixer

更に，LNP は激しい攪拌などでせん断力が加わに加え，Staggered herring bone mixer（SHM）やる こ と で， 粒 子 が 凝 集 す る 現 象 が 認 め ら れ て いToroidal mixer，Baffle mixer などが設計されている8）．このことは，全ての製造工程を通じても留意

る7）．いずれも流路形状の工夫により，マイクロ流路すべき点である．製造工程中の攪拌や送液，キャビ内で対流を強制的に発生させ，流体の接触面積を増テーションの発生についても注意深く観察し，製造加させることで LNPの製造に適した精密混合を実現プロセスを仕上げていくことが肝要である．

させている．更に，ジェット流によりマクロでの迅速混 合 が 可 能 なImpingement jet mixer，Turbulent

3.3

LNP の品質管理

jet mixer なども開発されている．これらの中から，mRNA 内包 LNP の品質管理には，有効性と安全製造スケールや粒子物性に応じて最適なミキサーが性に影響を与えうる重要品質特性を明らかにし，そ選択される．

れらの品質特性を評価するための試験法を設定する

精製・濃縮工程に関して，処方検討段階における必要がある．品質管理項目としては，無菌注射剤に実験室レベルの調製では，カセット型の透析キット求められる試験項目及び mRNA 原薬に由来する試や 遠 心 式 の 限 外 濾 過 キ ッ ト な ど を 用 い て， バ ッ

験項目に加え，mRNA 内包 LNP に特徴的な試験項ファー交換や濃縮を行うのが一般的である．一方目がある．例えば，粒子径・粒子径分布，RNA 封入で，GMP 製造の場合は TFF による限外濾過によ率，RNA 完全性（完全長 RNA の割合）などである．

り，連続的に精製・濃縮を実施する．したがって，粒子径・粒子径分布は一般に動的光散乱法により精製・濃縮のプロセス開発では，探索段階の処方と測定され，ナノ医薬品の品質管理として標準的な手のギャップが生じやすい．TFF のプロセス設計に法である．開発段階においては，動的光散乱のみでおいては，使用する限外濾過膜の形状や材質，分画は差異を検出できない粒子径分布が生じることがあ分子量や膜面積を考慮し，最適な循環流速や膜間差り，この場合はクライオ TEM による形態観察や圧などの条件設定が必要となる．LNP の場合は特フィールドフローフラクショネーション（FFF）をに，粒子濃度やバッファー組成，pH が工程の進行組み合せることが有効である．特に，FFF ではよとともに変動するため，プロセス設計が不適切な場

り詳細に異なる流体力学的体積を持つ成分を物理的合，膜の目詰まりだけでなく，粒子の凝集が発生に分離することができ，製造プロセス上の潜在課題

し，安定製造を実現できない．

を検出することができる．

滅菌工程に関して，mRNA 及び LNP はともに熱298

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RNA 完全性試験には，主にキャピラリー電気泳Vol. 54 No. 4（2023）

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動が用いられる．LNP 製剤化の過程で，mRNA の2023, 618, p.144‑150. doi: 10.1038/s41586‑023‑06063‑y.

低分子画分の増加が認められることがあり，製造プ

2）Lorentzen, C.L.; Haanen, J.B.; Met, Ö.; Svane, I.M.

ロセスによりその程度も異なる．特に，分子量の大きい mRNA でその傾向は顕著になる．製造工程中の温度や時間の影響を受けるため，RNA 完全性試
験は製造再現性の指標となりうる．

Clinical advances and ongoing trials on mRNA
vaccines for cancer treatment.

. 2022, 2300372‑2.
（10）, e450‑e458. doi: 10.1016/S1470‑2045（22）3）Karikó, K.; Buckstein, M.; Ni, H.; Weissman, D.
Suppression of RNA recognition by Toll‑like receptors:
the impact of nucleoside modification and theevolutionary origin of RNA.

4. 終わりに. 2005, 23（2）,p.165‑175. doi: 10.1016/j.immuni.2005.06.008.

mRNA 医薬は，感染症ワクチンに留まらず，がんワクチンや遺伝子疾患の治療薬，更にはゲノム編集などへの応用が広がっていくと期待される．

4）Hyde, J.L.; Diamond, M.S. Innate immune restrictionand antagonism of viral RNA lacking 2ʼ‑methylation.

. 2015, 479‑480, p.66‑74. doi: 10.1016 / j.
virol.2015.01.019.

この広がりにより，製造に対してもスケールを含5）Fernández, S.L.; Lacroix, C.; Exposito, J.Y.; Verrier, B.

めて様々なニーズが生じると考えられる．mRNA

Tailoring mRNA vaccine to balance innate/adaptive

医薬の開発スピードに対して，mRNA 及び LNP のimmune response.

製造のプロセス設計はノウハウや専用の製造設備が多く，新規に立ち上げるには時間を要する．ただし，これらの製造技術は mRNA の配列に依らず共通する要素も多いことから，汎用展開できるプラッ. 2020, 26（3）, p.311‑323. doi: 10.1016/j.molmed.2019.10.002.
6）Buschmann, M.D.; Carrasco, M.J.; Alishetty, S.; Paige,M.; Alameh, M.G.; Weissman, D. Nanomaterial delivery
systems for mRNA vaccines.

. 2021, 9, 65.

doi:10.3390/vaccines9010065.

トフォーム技術となりえる．そのため，mRNA や7）Shepherd, S.J.; Issadore, D.; Mitchell, M.J. Microfluidic

LNP に特化した技術と設備を有する医薬品受託開

formulation of nanoparticles for biomedical

発製造企業（CDMO）を活用した，水平分業体制にapplications.

よる開発が重要な選択肢となってくる．国内でも複数 の CDMO が 立 ち 上 が っ て お り， 今 後 こ れ ら の. 2021, 274, 120826. doi:10.

1016/j.biomaterials.2021.120826.
8）Kamiya, M.; Matsumoto, M.; Yamashita, K.; Izumi, T.;
Kawaguchi, M.; Mizukami, S.; Tsurumaru, M.; Mukai,CDMO が，国内発の mRNA 医薬の開発を支援する

H.; Kawakami, S. Stability study of mRNA‑lipid

役割を担うことと期待される．

nanoparticles exposed to various conditions based on
the evaluation between physicochemical properties

文1）Rojas, L.A.,

献

and their relation with protein expression ability.

. Personalized RNA neoantigen

vaccines stimulate T cells in pancreatic cancer.

.

. 2022, 14, 2357. doi:10.3390/
pharmaceutics14112357.

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