第32回日産科学振興財団 環境研究助成 研究成果報告書

水素エネルギー生産を目指した光合成の水分解機構の解明と改良
Analyses of Molecular Mechanisms of the Water Split
on Photosynthesis~For Application to Hydrogen Energy Manufacture~研究代表者： 大阪府立大学大学院 生命環境科学研究科 助教 杉浦 美羽
Department of Plant Biosciences, Osaka Prefecture University,
Assistant Professor Miwa SUGIURA
水素エネルギーは、排出物が水のみであるため、クリーンなエネルギーとして化石燃料に替わる新しいエネルギーとして注目されている。しかし、現在は水を電気分解して水素を取り出しているため、効率良いエネルギー生産方法ではない。
光合成生物に着目すると、彼らは太陽光エネルギーを用いて、まず、水から電子を引き抜き、酸素と水素イオンを作る。つまり、太陽光で電気分解と同様の反応を行っているのである。この初発の反応で生じた水素イオンを取り出し、還元して水素ガスにし、水素エネルギーとして利用すれば、効率良いエネルギー生産の方法になると考えられる。この時、より多く水素イオンを作る反応系を作る、つまり、より速く水を分解できる人工光合成システムを作れば、より効率的である。その為には、光合成の水の酸化機構について十分に知らなければならない。本研究では、光合成による有機太陽電池を目指して、光合成の基礎的研究を行う。

Fossil fuels are the main energy source today. However, well known problems are linked to thisuse: 1) the probable end of this source in a near future, 2) production of tremendous CO2 theincreasing amount of which in the atmosphere inducing a global warming. Because its use only
excretes water, "Hydrogen energy" is a remarkable new "clean energy" for the next generations. The
process of this energy manufacture, however, required actually much more electric energy than H2 canrelease. Therefore, we have to elaborate efficient new strategies.
By using solar energy, photosynthetic organisms generate protons (H+) and oxygen molecules
as secondary products by extracting electrons from water molecules, a free and unlimited compound.
In short, the first steps of the photosynthesis process carries out "electrolysis" with solar energy. In
addition, the organisms uptake CO2 from the earth to synthesize sugar. The photosynthetic process isa perfect model to produce both protons and electrons in a minimum cost, and to reduce CO2. We canexpect that biomimetic catalysts will have great advantages over the very expensive chemical catalyst
used actually to produce molecular hydrogen. If we succeed to construct genetic engineered
photosynthetic organism which is accompanied with production of H2, we are able to solve bothproblem of energy production and CO2 increasing. Although it is known that water molecule isoxidized by a cluster including Mn in Photosystem II reaction centre, the molecular mechanism
remains to be elucidated.
I have investigated about the structure and mechanism of water oxidation in molecular level. In
this study, I construct new photosynthetic organism which is invested the ability of reduction of H+ toH2 by introduction of dehydrogenase gene and try to produce hydrogen by the organism and solar
energy. Also, I try to accelerate water oxidation to release H+ for efficient H2 production. This
strategy can be resulting in ideal "bio-organic solar battery".

-1-と考えられる。このP680+/P680の酸化還元電位は推定+1.2 Vと推定されており、生物界で最も高い。
本研究では、熱安定なタンパク質を作る
好熱性ラン藻を材料に用いて遺伝子組換えによるアミノ酸置換を加え、P680 周辺のアミノ酸の水の酸化反応速度と P680 の酸化還元電位への役割について調べた。更に、水の酸化反応の触媒中心である Mn4Ca1 クラスターにおけるCa の機能における詳細な役割について調べるために、Ca を Sr に置換した組換え体を作製して、水の酸化反応の中間体をトラップして構造変化、水の酸化のキネティクス等を調べた。

１. 研 究目 的
植物や藻類による光合成は、人類のエネルギー源を作る重要な反応である。食物のみならず、我々の生活に欠かせないエネルギー源となる化石燃料もまた、光合成産物由来である。しかし、化石資源の枯渇の観点から、また、大気中のCO2 濃度の観点から、我々は水素エネルギーやバイオマス等のクリーンな新しいエネルギーを主なエネルギー源として実用化させる必要性に迫られている。
本研究では、近い将来、光合成生物を利用して太陽光のみのエネルギーで効率良く水素エネルギーを生産することを目指して、その基本反応である光合成の水の酸化機能を分子レベルで明らかにすることを目的とした。
光合成電子伝達系は植物の葉緑体チラコイド膜に局在し、太陽光エネルギーの化
学エ ネ ルギ ー への 変 換反 応 を行 っ てい る
（図1a）
。その初発の反応は、20サブユニットタンパク質と70以上のコファクターから成る650 kDaの巨大なタンパク質複合体である光化学系IIで行われる。この複合体に光が照射されると、2量体クロロフィル分子でできたP680が励起され、それが電荷分離されて電子を発生し、同時に、複合体の別の場所
では水を酸化して酸素を発生させ、この時に生じた電子を励起状態のP680* に伝達することでP680*は基底状態に戻る（図1b）。
ab

図1. 葉緑体チラコイド膜における光合成電子伝達系(a)および光化学系IIの電位に基づく電子伝達(b)。

水の酸化反応については、4原子のMnと1原子のCaから成るMn4Ca1 クラスターを触媒中心とした分子構造がようやく明らかにされつつあるだけで、分子機構、特に効率良く電子を引き抜く機構については不明である。
水の酸化反応速度はこのクラスター構造を含む触媒中心の反応のみによるものではな
く、ここから電子を受け取る2量体クロロフ
ィルP680 の極めて高い酸化力によるものだ-2-

２. 研 究経 過P680 クロロフィルおよび Mn4 Ca1 クラス
ターは、詳細の構造は分からないものの、光化学系 II 複合体タンパク質のコアとなる反応
中心タンパク質 D1 および D2 に局在していることが、これまでの研究により分かっている。
D1 をコードする遺伝子は psbA と呼ばれており、本研究の材料に用いた好熱性ラン藻
Thermosynechococcus elongatus のゲノム DNA
上には 3 つのホモログが、D2 遺伝子である
psbD は 2 つのホモログが存在する（参考文献1）。遺伝子工学的にアミノ酸を置換する際に1 つの遺伝子に変異を導入すると、別のホモログが発現することが分かっている（参考文献2）。そこで、本研究ではまず、T. elongatus ゲ
ノム DNA 上の別のホモログ遺伝子を抗生物質耐性遺伝子に置き換えることにより、1 つの遺伝子しか発現しない組換え体を作製し、これを宿主細胞に用いて、部位特異的変異を導入した。
私は 2004 年に P680 の近傍に存在する D2のレドックスアクティブな Tyr 残基(TyrD)の水の酸化反応および P680 の酸化還元電位への役割について報告しており（参考文献 2）、このアミノ酸の正電荷が光化学系 II の電子伝達速度に重要な役割を持つことを明らかにした。
この TyrD から約 3 Å の距離にある His 残基は、TyrD と水素結合して機能を保っていると推測できるものの、その証拠はなかった。本研究では、psbD2 をノックアウトした T. elongatusの psbD1 遺伝子に His を Leu に換えて TyrD と水素結合できなくなった部位特異的変異体を作製し、変異体細胞から精製した光化学系 II複合体を用いて、その性質について調べた。
一方、水の酸化反応は D1 と D2 にまたがって存在する Mn4Ca1 クラスターの触媒反応によって行われることは分かっており、エネルギー準位の異なる中間体 S0 、S1 、S2、S3 が存在することが知られている。これらの構造がどのように変化しているのかについては既に報告したが（参考文献 3）、Ca の機能への役割については不明である。本研究では、この役割について調べるために、クラスターのCa を Sr に置換した変異体を作製し、この光化学系 II における Ca の役割および酸化反応の中間体をトラップして構造を調べ、また、酸素放出のキネティクスなどを測定した。
３. 研 究成 果
3-1. D2 の Tyr D と His の構造と機能
D2 の His を Leu に置換した遺伝子組換え体 H189L から精製した光化学系 II 複合体は、
野 生 型 と 同 程 度 (~3,000 µmol O2/mg
chlorophyll/h) の高い水の酸化活性を持っていた。化学処理によって Mn4Ca1 クラスターを外した光化学系 II 複合体の TyrD•ラジカルの 9GHz EPR シグナルを測定すると、pH6.5 では
TyrD が酸化されず、全くシグナルを得ることができなかった（図 2a）。pH10 で測定するとTyrD は酸化され、野生型のシグナルとは少し異なった形ではあるが、強いシグナルを得ることができた（図 2b）。
aboth active and Mn-depleted PSII
pH6.5

3320

WT!
H189L

3340

3360

3380

Magnetic field (gauss)3400b
pH103320

3340

3360

3380

Magnetic Field (gauss)

図 2. 野生型(WT’:青)および His を Leu に置換した(H189L:オレンジ)光化学系 II 複合体の TyrD• の 9 GHz EPR シグナ
ル。(a) pH6.5 (b) pH10 で測定。

更に、TyrD とこの His の分子構造上での関係を調べるために、Tyr から生じる EPR シグナ
ルを 3 方向に分けるために高磁場(285 GHz)で測定したところ、図 3 に示すように、His をLeu に置換した光化学系 II では、野生型よりもずっと高磁場側の、これまでに報告のないgx 方向に高いバンドが現れた。

-3-

図 3. 285 GHz
EPR に お け る
TyrD•シグナル。

この結果は、His を Leu に置換することによって、TyrD の水酸基方向の周辺環境には全く水分子が無くなったことを示している。これらの結果から、野生型では、His は TyrD と水素結合を形成しており、TyrD の酸化は H+の放出に伴ってされることが初めて明らかになった（図 4）。
ab

図 4. TyrD 周辺の分子構造(a)と H+放出に伴う TyrD の酸化(b)。

3-2. Mn4Ca1 クラスターを Mn4Sr1 に置換した光化学系 II の水の酸化反応
水の酸化過程には S0 から S3 のエネルギー準位の異なる 4~5 つの反応中間体が存在することは既に分かっており、遷移に伴ってクラスターを構成する Mn の価数が変化し、クラスター構造も変わることが明らかになってきた（図 5a）。本研究では、クラスターにおける Ca の構造的および機能的な役割を調べるた
めに、水の酸化触媒中心の Mn4Ca1 クラスターの Ca を Sr に置換して光化学系 II を精製し、水の酸化中間体の分子構造変化を調べた。精製した光化学系 II 複合体における Mn は完全にインタクトであることを確認したが、定常光照射下での酸素発生活性は野生型の光化学系 II の約半分(~1,500 µmol O2/mg chlorophyll/h)であった。水の酸化キネティクスを測定するために、S0 状態にした光化学系 II に 100 ns の間隔で閃光を照射し、S3 状態から S0 状態に戻る際に生じる酸素の放出キネティクスを測定すると、野生型が t1/2=1-2 ms だったのに対し、Sr 置換した光化学系 II では t1/2=5-7 ms で、Srにすることにより 5 倍程度遅くなった（図 5b）。
aIb

I

ネルギーの有効利用”への応用研究に取り組みたい。
【参考文献】
1. http://bacteria.kazusa.or.jp/cyano/Thermo/index.html
2. Sugiura, M., Rappaport, F., Brettel, K., Noguchi, T.,
Rutherford, A.W., and Boussac, A. Site-directed mutagenesisof Thermosynechococcus elongatus photosystem II: the O2
evolving enzyme lacking the redox active tyrosine D,Biochemistry, (2004) 43, 13549-13563

1.00.50.00102030Time [ms]図 5. 水の酸化の中間体（S 状態遷移）(a)および S3 からS0 へ遷移するときに生じる酸素生成のキネティクス(b)。
水色は野生型、青は Ca を Sr に置換した触媒中心を持つ変異体。

更に、これらのそれぞれの中間体をトラップし、FTIR 差スペクトルによってそれらの分子構造変化を調べるする事に成功した（図 6）。

3. Noguchi, T., and Sugiura, M.
Flash-induced fourier transform infrared detection of thestructural changes during the S-state cycle of theoxygen-evolving complex in photosysytem II, Biochemistry(2001) 40 (6), 1497-1502

5. 発表 論文 リ スト
1. Un, S., Boussac, A. and Sugiura, M.
“Characterization of the tyrosine-Z radical andits environment in the spin-coupled S2 TyrZ·
state of Photosystem II from
Thermosynechococcus elongatus”
Biochemistry, (2007) 46, 3138-3150
2. Suzuki, H., Taguchi, Y., Sugiura, M., Boussac,
A. and Noguchi, T.
“Structural perturbation of the carboxylate
ligands to the Mn Cluster upon Ca2+/Sr2+
exchange in the S-state Cycle of Photosynthetic
oxygen evolution as studied by flash-induced
FTIR difference spectroscopy”
Biochemistry, (2006) 45, 13454-13464

図 6. S 状態遷移に伴う Mn クラスター
周辺構造の FTIR 差スペクトル（COO -伸縮振動領域）。青は野生型 Mn4Ca1 クラスター、赤は Mn4Sr1クラスター持つ光化学系 II。(a) S1→S2、(b) S2 →S3 、(c) S3 →S0 、 (d) S1 → S2 、 (e)dark-minus-dark。

４. 今 後の 課題 と 発展
本助成研究開始時の目的である、“熱安定なタンパク質を作る好熱性ラン藻を用いて遺伝子組換えによるアミノ酸置換を加え、水の酸化反応速度とP680+/P680 の酸化還元電位の関係を調べ、光合成の基礎研究に学問としての進歩をもたらす”ことを達成しつつある。次に、これらの結果を応用して、光合成を最大限に利用し、本助成の最終目的である“大気中のCO2 削減を目指した太陽エ-4-