崧嵤崚崫崰1*6峘峉峫峘崷崌崾嵒崨崌崤嵤崟嵏嵛崕嵋崿崩嵋嵤崕崫崰
日本語ユーザーマニュアル
Version 5.03

June 2023

適用製品

myBaits Custom DNA-Seq
myBaits Custom RNA-Seq
myBaits Expert (Wheat Exome および Human Aﬃnities 以外)

その他のマニュアルは arborbiosci.com/mybaits-manual からダウンロードできます

本製品は研究用です。診断用には使用しないでください。

© Daicel Arbor Biosciences
5840 Interface Drive, Suite 101
Ann Arbor, MI 48103 (USA)+1 (734) 998-0751
info@arbor.daicel.com

MYBAITS is a registered trademark of Biodiscovery, LLC dba Arbor Biosciences. DAICEL ARBOR BIOSCIENCES is a registered trademark of Daicel Corporation. ION
TORRENT is a registered trademark of Life Technologies Corporation. DYNABEADS is a registered trademark of Thermo Fisher Scientific. MYONE is a trademark of
Thermo Fisher Scientific. NEXTERA, ILLUMINA, and TRUSEQ are registered trademarks of Illumina, Inc. KAPA is a registered trademark of Roche Molecular Systems, Inc.
IDT and XGEN are registered trademarks of Integrated DNA Technologies, Inc. PACBIO is a registered trademark of Pacific Biosciences of California, Inc. OXFORDNANOPORE TECHNOLOGIES is a registered trademark of Oxford Nanopore Technologies, Ltd.

崌嵛崰嵕崨崗崟嵏嵛
myBaits®は NGSライブラリーのためのターゲット濃縮システムです。Illumina®、Ion Torrent®、および直鎖状で、増幅ステップを含むどんなシーケンスライブラリーにも互換性があります。汎用の核酸合成技術を使用して、お客様のターゲット配列に相補的なビオチン化RNA「ベイト」を作成します。 NGSターゲット濃縮用のベイトおよびその他の試薬は、myBaitsキットに付属しています。myBaitsで濃縮した後、ライブラリーを前
述のプラットフォームでシーケンスするか、 PacBio®またはOxford Nanopore Technologies®シーケンス用にさらに調製することができます。

手順の概要
1. 増幅したシーケンスライブラリー、アダプターブ
ロッカー、その他のハイブリダイゼーション試薬を混合します。

2. ブロッカーをアダプターにハイブリダイズできるよ
うにライブラリーを変性させます。その後、ベイトを加えて数時間かけターゲットにハイブリダ
イズさせます。

3. ベイトとターゲットのハイブリッドをストレプトアビ
ジンコートされた磁気ビーズに結合させ、磁石で回収します。

4. ほとんどの非標的DNAが洗い流されます。
キャプチャーされたライブラリーを増幅し、直接シーケンスするか、さらに調整を行います。

myBaits® - Hybridization Capture for Targeted NGS - Manual v.5.03 June 20232

このマニュアルと互換性のある Daicel Arbor Bioscience 製品
このマニュアルは、現在販売中のmyBaits Custom DNA-Seq、Custom RNA-SeqおよびExpert kitに対応していますが、Custom Methyl-Seq、Expert Wheat ExomeおよびExpert Human
Affinities kitには対応していません。対応していない製品のマニュアルは、arborbiosci.com/mybaitsmanualでダウンロードするか、 reagents@primetech.co.jpにお問い合わせください。お客様のアプリ
ケーションに適したマニュアルは4ページで確認することができます。

myBaitsマニュアル バージョン5.02以降の変更点●

試薬キャップの色が変更されました（内容に変更はありません）。文章のマイナーチェンジを行いました。

myBaitsマニュアル バージョン4以降の変更点●

さまざまなアプリケーション用に3つの異なるmyBaitsプロトコルが含まれています（ページ4参照）。

●

Block AがBlock Xに代わり、特異性が改善されました。

●

精製後のビーズ再懸濁用にBuffer Eが添付されました。

リピーターのお客様へ︓バージョン4やそれ以前のキットに比べて、バージョン5の試薬はターゲット特異性（＝オンターゲットのリード率）が向上しています。

キットの内容と保存条件
Box

Box #1
Store at 4˚CBox #2
Store at -20˚C

Box #3
Store at -80˚C

Reagent

Cap color

Volume per kit

Lot# 23XXXX

Lot# 22XXXX

8 Reaction

16 Reaction

48+ Reaction

Hyb N
Hyb S
Beads
Binding Buffer
Wash Buffer
Hyb D
Hyb R
Block C
Block O
Block X
Buffer E

Red
Blue
Clear
Clear
Clear
Yellow
PurpleGreenBlue
Orange
Clear

Red
Teal
Clear
Clear
Clear
Yellow
PurpleDark GreenBlue
OrangeLight Green

400 µL
1500 µL
550 µL
12 mL
20 mL
140 µL
50 µL
50 µL
90 µL
5 µL
550 µL400 µL
1500 µL
550 µL
12 mL
20 mL
140 µL
50 µL
50 µL
90 µL
9 µL
550 µL

1000 µL
1500 µL
1600 µL
36 mL
60 mL
400 µL150 µL130 µL270 µL
27 µL
1600 µL

Baits

Clear

White

50 µL per 8 reactions

myBaitsキットは常温で出荷され、輸送中も安定しています。キットボックスが到着後、上記の温度で保管された場合、試薬の有効期限は到着した日から1年間となります。
凍結融解サイクルを最小限に抑えるために、ベイトを実験計画に適した反応サイズで分注して保存することを強く推奨します。
myBaits® - Hybridization Capture for Targeted NGS - Manual v.5.03 June 2023

3

重要実験前にお読みください
プロトコルの選択
このマニュアルには3つのmyBaitsプロトコルが含まれています。お客様のシーケンスライブラリーの特性により、下記のリストから適したプロトコルをお選びください。どのプロトコルを選べばよいのか不明な場合はreagents@primetech.co.jpにお問い合わせください。
最適なプロトコルは実験ごとに異なりますが、これらはその最適なプロトコルに最短で辿り着くための基準となるプ
ロトコルです。特定のベイトセットとライブラリーで濃縮するための最適のパラメーターを決定するには、試験と評価が必要になりますが、これらのプロトコルは、多くのベイトセットとライブラリーの組み合わせで機能しています。

スタンダード5ページ～

ほとんどのターゲットシーケンスアプリケーション

濃縮するNGSライブラリーが以下の条件の場合-

高品質のgDNAでライブラリーを作成し、ターゲットインサート長が80 – 1,000 bpである
ターゲット配列のGC含量の平均が25%以上である
ターゲットゲノムの割合が50%以上である
広範囲にわたって塩基置換（例、脱アミノ化やバイサルファイト置換）がない

高感度

17ページ～

高度に汚染されたサンプル、古代DNA、ベイトとターゲット配列がかなり異なる、あるいはターゲット配列が短い
濃縮するNGSライブラリーが以下のいずれかの条件にあてはまる場合-

外生DNAが高度に含まれている（例、宿主DNA中の病原体がターゲットの場合、古代
DNA、環境DNA）
ターゲット配列のほとんどが80 bp以下である
ターゲット配列のGC含量の平均が25%以下である
ターゲット配列がベイト配列と平均で25%以上異なっている

ロングインサート

29ページ～

インサートの長さが1-10 kbのNGSライブラリー

濃縮するNGSライブラリーが以下の条件の場合- ほとんどのインサートが1,000 bp以上であり、- プラットフォーム特異的なライブラリー調製（例、PacBioやNanopore用のライブラリー調製）の前にユニバーサルアダプタープライマーで増幅できる場合

myBaits® - Hybridization Capture for Targeted NGS - Manual v.5.03 June 2023

4

スタンダードプロトコル
ほとんどのシーケンスアプリケーション

目次
必要条件と推奨事項

ライブラリーのインプット
ブロッキングオリゴ
キット以外に必要な機器・消耗品・試薬

手順 パート1：ハイブリダイゼーションのセットアップ
S1.1
S1.2
S1.3
S1.4
S1.5

ハイブリダイズ温度の選択
必要な試薬と機器・消耗品
ハイブリダイゼーションミックスの調製
ブロッカーミックスの調製
反応

手順 パート2：結合と洗浄
S2.1
S2.2
S2.3
S2.4
S2.5
S2.6

洗浄温度の選択
必要な試薬と機器・消耗品
Wash Buffer Xの調製
ビーズの準備
ビーズとハイブリッドの結合
ビーズの洗浄手順 パート3：ライブラリーの再懸濁と増幅
S3.1
S3.2
S3.3

付録
SA1
SA2

6
6
7
8
8
9
9
10

11
11
11
12
12
12

必要な試薬と機器・消耗品
濃縮したライブラリーの回収ライブラリーの増幅

13
13
13

トラブルシューティング
myBaitsスタンダードプロトコルクイックガイド

15
16

5

૑ਏ૖੯峒௓တহඨ
嵑崌崾嵑嵒嵤峘崌嵛崿崫崰嵑崌崾嵑嵒嵤஄ૄ

myBaitsはPCRで増幅した、あるいは増幅可能なNGSライブラリーに用いることができます（例、Illumina Trueq®シリーズ、Illumina Nextera® Flexシリーズ、Ion Torrentやその他のユニバーサルア
ダプタープライミングサイトのあるライブラリー）。myBaitsをPCRフリーのライブラリーに用いることは推奨しません。さらに、myBaitsはオリジナルのNexteraあるいはNextera

XTライブラリー調製キットで調製したライブラリーや、ビオチンを含むライブラリーには互換性がありません。PCRがジャンプしてしまうことによるミスインデックスの危険性を減少させるため、ライブラリーのデュアルインデックス化を強く推奨します。
ઍ୤   

myBaitsのターゲット濃縮反応には、トータルで7 µlのNGSライブラリーを加えられます。多くの場合、ライブラリーをプールするには真空遠心分離や他の手段でライブラリーを濃縮する必要があります。このステップ
はmyBaitsの実験を始める前に行ってください。ライブラリーはヌクレアーゼフリーのバッファーか水に懸濁してください。
ସ୤す。しかし、100

myBaitsはナノグラムからマイクログラムまで、幅広い質量のライブラリーを濃縮することができま
ngかそれ以上の量で濃縮反応を行うと、最も良い結果が得られます。ライブラリー量の計測には染色アッセイや電気泳動でなく、qPCRを用いることを強く推奨します。ライブラリーのプールを行う際の推奨量は下をご参照ください。
崿嵤嵓    最適なプールパラメーター（ライブラリーの数とライブラリー総質量の両方の観点から）はライブラリーのタイプとベイトセットにより変わり、決定するには試行が必要ですが、多くの構成ではうまく機能するはずです。プールされたサンプル間のキャプチャパフォーマンスのばらつきを最小限に抑えるために、予想されるベイトとゲノム配列の同一性（分類群）、DNA品質、開始DNA量、ライブラリーインサートの長さ、および相対的なターゲットゲノム量とバックグラウンドに基づいて、同等なライブラリーのみをプールします。それぞれのライブラリーは同量ずつプールしてください。ゲノムサイズが5 Gb以下の生物種から調製されたライブラリーは1反応あたり8ライブラリーを1ライブラリーを250 ng
ずつ、計2 µgプールすることを推奨します。ゲノムサイズが5 Gb以上の場合、1反応あたり8ライブラリーを1ライブラリーを1 µgずつ、計8 µgプールすることを推奨します。

崾嵕崫崕嵛崘崒嵒崜
myBaitsキットをご注文の際は、濃縮するライブラリーの構成をお知らせください。キットに標準で添付するアダプターブ
ロッキング試薬（%ORFN;）はIllumina TruSeqシリーズかNexteraシリーズを用いて、シングルで6-12 bp、あるいはデュアルで6-12 bpのインデックス化を行ったライブラリーに対応しています。Ion TorrentフォーマットではBlock Aが添付します。その他のアダプター構成では、お客様のNGSライブラリーのアダプター配列用にCustom
IDT® xGen® Blocking Oligoを注文することを推奨します。myBaitsキットのBlock Xの代わりに、1 µg/ mLの濃度でどのカスタムアダプターブロッキングオリゴでも使用することができます。

myBaits® - Hybridization Capture for Targeted NGS - Manual v.5.03 - Standard Protocol June 2023

6崕崫崰ਰਗ峕૑ਏ峔ਃஓ嵣଎ራષ
Item

Notes

50 mL tubes

1 per 44 reactions

Microcentrifuge tubes (1.5, 1.7, or 1.8 mL)

2 per 8 reactions

0.2 mL PCR strips with attached lids

2 per 8 reactions (e.g., VWR Cat# 93001-118)

Pipettors and tips for 0.5 - 500 μL

Multichannel for 20 and 500 μL recommended✝

Thermal cycler with heated lid compatible with 0.2 mL strips

1 or 2Magnetic particle collector for microcentrifuge tubes

1 (e.g., ThermoFisher Cat# 12321D)

Magnetic particle collector for 0.2 mL strips

1 (e.g., Permagen Cat# S500)

Vortex mixer and mini-centrifuge for tubes and strips
Water bath or incubation oven at 65°C
Heat block for microcentrifuge tubes at 60°C†使用するサーマルサイクラーとPCRストリップチューブで、65℃オーバーナイトの反応で、30 µLの反応液の蒸発量が4 µL以下である
ことを確認してください。

キット以外に必要な試薬
Reagent

Notes

Nuclease-free (“NF”) water

900 µL per reaction

PCR primers to amplify sequencing libraries after capture, e.g.:
Illumina P5: AATGATACGGCGACCACCGA

2.5 uL @ 10 μM per reaction

Illumina P7: CAAGCAGAAGACGGCATACGA

2.5 uL @ 10 μM per reaction

PCR reagents for post-capture amplification

1 per reaction (e.g. Roche Cat# 07958927001)

PCR purification system, e.g., silica columns or SPRI beads

1 cleanup per reaction

myBaits® - Hybridization Capture for Targeted NGS - Manual v.5.03 - Standard Protocol June 20237

手順
崹嵤崰： 崷崌崾嵒崨崌崤嵤崟嵏嵛峘崣崫崰崊崫崿
シーケンスライブラリーをさまざまなブロッキングオリゴと混合し、変性し、その後ベイトを含むその他のハイブリダイゼーショ
ン試薬と混合します。 これらのハイブリダイゼーション反応液を数時間インキュベートし、ベイトが標的ライブラリー分子とハイブリダイズできるようにします。

S1.1

崷崌崾嵒崨崌崢ആ২ 7+ 峘৭උ

65°C

62°C

60°C

ベイトとターゲットで配列の違い

ベイトとターゲットで配列の違い

ベイトとターゲットで配列の違い

が10%以下と予想される場合

が10-15%と予想される場合

が15-25%と予想される場合

6૑ਏ峔૥ఇ峒ਃஓ嵣଎ራષ
Reagents

Equipment

Hyb N and Hyb S from Box 1

Nuclease-free microcentrifuge tubes (×2)

Hyb D and Hyb R from Box 2

0.2 mL strips with attached lids (×1 per 8 reactions)

Block C, Block O, and Block X from Box 2

Pipettors and tips; multichannel for 20 µL recommended

Baits from Box 3 KEEP ON ICE

Vortex mixer and mini-centrifuge for above tube types

Libraries or library pools in 7 µL per reaction

Heat block set to 60°C
Thermal cycler(s); 2 blocks recommended for 24 or more reactions

サーマルサイクラーのプログラム:
蒸発を最小限にするため、蓋の温度を各ステップの温度より5-10℃高く設定してください。

Step

Temperature

Time

1
2
3

95°C
TH
TH

5m
5m
∞

myBaits® - Hybridization Capture for Targeted NGS - Manual v.5.03 - Standard Protocol June 2023

8

6

崷崌崾嵒崨崌崤嵤崟嵏嵛嵇崫崗崡峘৹ଲ

1. Hyb試薬を融解し、ボルテックスで混合し、スピンダウンします。
Hyb NとHyb Sに融解後沈殿物がある場合、60℃で加熱し、沈殿物が溶解するまでボルテックスで混合してください。
2. マイクロ遠心(MC)チューブでハイブリダイゼーションミックスを調製し、短時間ボルテックスで混合し、スピンダウンします。下記はピペッティングエラーを考慮した容量です。

ComponentµL / Reaction

Hyb N

9.25

Hyb D

3.5

Hyb S*

0.5

Hyb R

1.25

Baits

5.5

TOTAL

20

* Hyb Sを加えると濁りますが、ステップ3でクリアになります。

3. ハイブリダイゼーションミックスを60℃のヒートブロックで10分インキュベートします。チューブ内に付着する凝縮物を回収するために時々ボルテックスで混合します。ヒートブロックから取り出し、5分間室温で静置します。
4. キャプチャー反応ごとに、18.5 µLのハイブリダイゼーションミックスを0.2 mLチューブに分注します。
この分注したハイブリダイゼーションミックスを“HYBs”としますS1.4

ブロッカーミックスの調製

1. 下記の表に基づき、ターゲット種に応じたブロッカーミックスを適切なチューブに加え、ピペッティングで混合します。下記はピペッティングエラーを考慮した容量です。
MOST TAXAPLANTSSALMONIDS

Component µL / Reaction

Component µL / Reaction

Component µL / Reaction

Block O

2.5

Block O

5.0

Block O-

Block C

2.5

Block C-

Block C

2.5

Block X

0.5

Block X

0.5

Block X

0.5

NF Water-NF Water-NF Water

2.5

TOTAL

5.5

TOTAL

5.5

TOTAL

5.5

2. キャプチャー反応ごとに、5 µLのブロッカーミックスを0.2 mLチューブに分注します。
3. 7 µL の一つのあるいはプールしたライブラリーをそれぞれブロッカーミックスに加え、ピペッティングで混合します。
このライブラリーとアダプターブロッカーミックスの混合物を“LIBs”とします
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96

ખૢആ২崿嵕崘嵑嵈峘ダブルチェックをしてください：

Step

Temperature

Time

蒸発を最小限にするため、蓋の温度を各

1
2
3

95°C
TH
TH

5m
5m
∞

ステップの温度より5-10℃高く設定してください
1. サーマルサイクラーに /,% チューブをセットし、蓋を閉じて、温度プログラムを開始します。

2. サーマルサイクラーがステップ 2 のハイブリダ
イズ温度に達したら、プログラムを一時停止します。サーマルサイクラーに +<% チューブをセットし、蓋を閉じて、プログラムを再開します。

3. プログラムのステップ 2 が完了したら、すべてのチューブをサーマルサイクラーに残したまま、
૚ /,% 峕  ¡/ 峘૚ +<% 峼ਸ岲峨峃岞
マルチチャンネルピペッターを使用すると、簡
単に作業できます。 5 回ピペッティングして穏やかに混合します。
4. +<% チューブを廃棄します。 /,% チューブを短時間スピンダウンした後、サーマルサイク
ラーに戻し、蓋を閉めてオーバーナイト（16-24 時間）でインキュベートしハイブ
リダイズさせます。
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10

パート2︓ 結合と洗浄（クリーンナップ）
ベイトとターゲットのハイブリッドをストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズと結合させます。続いて、温めたバッ
ファーで数回洗浄し、ほとんどの非ターゲットDNAを除去します。 この操作は通常、パート1完了の翌日に行
います。

S2.1

洗浄温度(TW)の選択(通常THと同じ)

65°C

62°C

60°C

ベイトとターゲットで配列の違い

ベイトとターゲットで配列の違い

ベイトとターゲットで配列の違い

が10%以下と予想される場合

が10-15%と予想される場合

が15-25%と予想される場合

6૑ਏ峔૥ఇ峒ਃஓ嵣଎ራષ
ハイブリダイゼーションを止める少なくとも90分前に開始してください。

Reagents
Hyb S (Box 1) *Binding Buffer (Box 1) *すべての試薬を室温にしておいてください。沈殿物がWash Buffer (Box 1) *ある場合、60℃で加熱し、沈殿物が溶解するまでボル

Beads (Box 1)

テックスで混合してください。

Nuclease-free (NF) Water (up to 900 µL per reaction)

Equipment
Water bath or incubation oven set to the TW (e.g., 65°C)
Receptacles for 50 mL tubes, 0.2 mL strips and microcentrifuge tubes compatible with above incubation device
Vortex mixer and mini-centrifuge for 0.2 mL strips and MC tubes
Magnetic particle collector(s) (MPC) for above strips and/or tubes
When using only amicrocentrifuge (MC) tube-compatible MPC
Nuclease-free 50 mL tube, 1 per 44 cleanups
Nuclease-free MC tubes, 1 per reaction
Heat block set to the TW
Pipettors and tips for 20 – 500 µL

When using a
0.2 mL tube-compatible MPC
Nuclease-free 50 mL tube, 1 per 68 cleanups
Nuclease-free 0.2 mL PCR strips withindividually-attached lids, 1 vessel per reaction
Thermal cycler set to TW
Pipettors and tips for 20 – 200 µL;
multichannel pipettor strongly recommended

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11

6

:DVK%XIIHU;峘৹ଲ

このステップは、マイクロ遠心（MC）チューブでの44反応の洗浄フォーマットに、0.2 mLチューブでの68反応の洗浄
フォーマットに十分なWash Buffer Xを作成します。必要に応じて作成量を調整してください。
1. Wash BufferとHyb Sを、それぞれ沈殿物を溶解させ完全に混合します。必要に応じて短時間温めます。
2.

400 µLのHyb Sと39.6 mLのNF水、および10 mLのWash Bufferを50 mLチューブに入れます。ボルテックスで完全に混合し、”Wash Buffer X”とラベルをつけておきます。
Wash Buffer Xは4℃で1か月間保存できます。

3.

S2.4

少なくとも使用前の30分間、ウォーターバスかインキュベーションオーブンでWash Buffer Xを洗浄温度（TW）で加熱します。

ビーズの準備

ビーズは使用直前に十分懸濁してください

1.

MCチューブにキャプチャー反応ごとに30 µLのビーズ溶液を入れます。

2.

MPCにチューブをセットし、ビーズがペレットとなり、溶液が透明になるまで静置します（1-2分）。
チューブをMPCに置いたまま上清を除去し廃棄します。

3.

200 µLのBinding Bufferをビーズペレットに加えます。ボルテックスでビーズを再懸濁し、スピンダウンします。
MPCにチューブをセットし、ビーズをペレット化させます。上清を除去し廃棄します。

4.

3.の工程を2回繰り返し、合計3回洗浄します。

5.

洗浄したビーズを70 µLのBinding Bufferで再懸濁します。 0.2 mLフォーマットで洗浄する場合は、PCRス
トリップチューブに再懸濁液を移します。

ヒント：ビーズはMCチューブを利用して、8（以下）の反応数（最大240 µL）で調製できます。 MCチューブ1本
ですべての反応数分の試薬を調製します。すなわち8反応分の場合、1.6 mLのBinding bufferで洗浄し、 560 µLのBinding Bufferで再懸濁し、70 µLの懸濁液を個々のチューブに分注します。

S2.5

ビーズとハイブリッドの結合1.

ビーズ溶液をTWで少なくとも2分間加熱します。

2.

各キャプチャー反応物（S1.5-4）を加熱したビーズ溶液に加え、ピペッティングで混合します。

3.

ライブラリーとビーズの混合物（S2.5-2）をヒートブロックかサーマルサイクラーで5分間インキュベートします。ビーズを攪拌された状態に保つために、2.5分経過したらチューブをフリックあるいは反転させ、その後短時間ピンダウンします。

S2.6
1.

ビーズの洗浄溶液が透明になるまで、MPCでビーズをペレット化します。 上清を除去し廃棄します。
TIP: この上清は、同じあるいは異なるベイトで再キャプチャーするためのバックアップとして保存することができます。

2.

加熱した375 µL（MCチューブフォーマット）あるいは 180 µL（0.2 mLチューブフォーマット）のWashing Buffer Xをビーズに加え、MPCから取り出し、ヒートブロックに15秒置いたのち、短時間のボルテックスあるいはピペッティングにより混合します。 チューブを短時間スピンダウンします。

3.

TWのヒートブロックあるいはサーマルサイクラーで5分間インキュベートします。2.5分経過したら軽くボルテック

4.

スすることによって攪拌し、短時間スピンダウンします。
1.から3.の工程をMCチューブフォーマットでは2回（合計3回）、0.2 mLチューブフォーマットでは3回（合計4回）繰り返します。最後の洗浄が終了したら、ビーズペレットには触れずに可能な限り溶液を取り除きます。

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12

パート3: ライブラリーの再懸濁と増幅ビーズに結合した濃縮ライブラリーをBuffer Eに懸濁し、増幅します。

S3.1 必要な試薬と機器・消耗品
Reagents

Equipment

Buffer E (Box 2)

Tubes appropriate for PCR master mix assembly

PCR primers for amplifying libraries (e.g., P5 and P7)

Tubes or strips for 50 µL PCR amplification

PCR reagents for post-capture amplification

Pipettors and tips capable of 5 – 100 µL volumes

PCR purification system, e.g., silica columns or SPRI beads

Vortex mixer and mini-centrifuge for above tube types

Nuclease-free (NF) Water

Thermal cycler

S3.2 濃縮したライブラリーの回収
1. 洗浄したビーズ（S2.6-4）に30 µLのBuffer Eを加え、ピペッティングにより完全に再懸濁します。次のステップは、お客様の用いるライブラリー増幅試薬により、下記のワークフローAあるいはBを選択してください。
ワークフローA︓KAPA HiFi HotStart あるいはNEB Ultra II Q5 polymerase を使用する場合

ワークフローB︓ワークフローA 以外のポリメラーゼシステムを使用する場合

2A. このビーズ懸濁液を増幅のテンプレートとして、
直接S3.3 に進んでください。

2B. ビーズ懸濁液を 95℃で 5 分間インキュ
ベートします。
3B. すぐに MPC でビーズをペレット化し、エンリッチされたライブラリーを含む上清を回収します。

S3.3 ライブラリーの増幅
下記はKAPA HiFi HotStart Ready MixおよびIlluminaのライブラリーで、キャプチャー後の増幅を行った例です。
1. 下記の PCR 反応液を準備します

Component

Final ConcentrationµL / Reaction

Sequence

NF Water-

5-

2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix

1X

25

-

P5 library primer (at 10 μM)

500 nM

2.5

AATGATACGGCGACCACCGA

P7 library primer (at 10 μM)

500 nM

2.5

CAAGCAGAAGACGGCATACGA

-

15 *

-

50

-

Enriched Library (on- or off-bead)

TOTAL* 残りのビーズに結合したライブラリーは-20℃で数か月保存できます。

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13

S3.3 ライブラリーの増幅（続き）
2. 以下のプログラムで反応を行います。

Step

Temperature

Time

1

98°C

2 minutes

2

98°C

20 seconds

3

60°C

30 seconds

4

72°C

45 seconds

5

72°C

5 minutes

6

8°C

∞

×8 to 14cycles**最低限のサイクルで行ってください。シーケンスプラットフォームによっては、必要なモル濃度を満たすに14サイクル以上になる可能性があります。

3. 増幅後、精製を行ってください。
− 反応溶液にビーズが含まれており、シリカカラムを用いて精製する場合、ビーズをペレット化したのちに上清のみを用いてシリカカラムで精製してください。
− 上記以外の場合、いずれかのPCR精製システム（シリカカラムやSPRIビーズなど）を使用して反応溶液を精製します。
これで、ライブラリーの濃縮は完了です。定量、品質チェックを行い、シーケンシングを行えます。

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14

付録
SA1: トラブルシューティング
ハイブリダイゼーション中にサーマルサイクラーの温度がハイブリダイズ温度より下がってしまいました。
完全に濃縮が失敗するわけではありませんが、温度が維持された場合に比べてオンターゲットのリード率とターゲットのリードの複雑さが下がることが予測されます。予備試験として浅くシーケンシングすることで、ターゲットが十分なカバ
レッジを得られるかどうか判断できます。
濃縮し、増幅したライブラリーが電気泳動（あるいは同様の装置）で観察できません
キャプチャーに成功したライブラリーは再増幅した後でも全量が数ngであることが多く、この量は電気泳動では観察することができません。これは特にターゲットが小さいか（100 bp以下）、出発材料中でのターゲットDNAの割合が低いか（例、分解・古代・環境DNA）、キャプチャー後のライブラリーの再増幅が少なかった場合に一般的にみられます。多くの場合、ライブラリー増幅をさらに数サイクル行うと、電気泳動で十分観察される濃度になります。あるいは、ライブラリーがシーケンスに十分な量かどうかをqPCRで定量することができます。PCRのプラトーに達する前にサイクルを止めた場合、電気泳動でqPCR産物の長さの分布を観察することができます。ライブラリーの濃度と量については、シーケ
ンスプロバイダーにご相談ください。
濃縮し、増幅したライブラリーが元のライブラリーよりかなり長いか、ピークが二つあります。
これは、ライブラリーが増幅されすぎたことで、テンプレートの伸長なしに変性-再生が起こり’daisy-chains’
あるいは’bubbles’と呼ばれる構造を形成した場合に起こります。これは通常のライブラリー増幅法でPCRを3サイクル行うことで元のライブラリーの状態に戻すことができます。
濃縮したライブラリーのシーケンスデータで、PCR重複が高い確率で見られました
シーケンスデータ中の重複率（つまり”clonalityあるいは”duplication rate”）は深く読むほど増加し、実験前にシーケンス深度が適正化されている場合にのみ実験間で正しく比較できます。得られた生シーケンスリードをX
軸に、ユニークリードをY軸にしてプロットすることで、ライブラリーがオーバーシーケンスされたかどうかを評価することができます。この’complexity curve’がプラトーに達しているが、十分なユニークリードを得られている場合、必要以上に深くシーケンスされたと考えられます。プロットが平らにならなかった場合、あるいはライブラリーの潜在的なユニークリードの収量を増やしたい場合、ライブラリー調製に用いるDNAの量を増やす、あるいはキャプチャー反応あたりのライブ
ラリー量を増やしてください。キャプチャー前にベイトを希釈しないでください。重度に汚染または損傷したDNAをターゲットとして用いる場合、キャプチャーの感度を改善するためにすべてのステップで温度を下げることを検討してください。
可能な場合、PCRサイクルを減らすことで、得られたシーケンス深度でのターゲットのカバレッジの均一性と複雑さを改善できる可能性があり、いくつかのケースでは重複率に非直接的な効果がある場合があります。NGSアプリケーションにおけるライブラリーの複雑さについてはDaley & Smith 2013 (doi: 10.1038/nmeth.2375)に情報があります。
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15

SA2: myBaitsスタンダードプロトコルクイックガイド
1. 反応ごとに、下記の試薬を調製します（ピペットエラーは調整済みです）
Hybridization Mix

Blockers Mix

Component

μL / Reaction

Component

μL / Reaction

Hyb N

9.25

Block X

0.5

Hyb D

3.5

Block C

2.5✝

Hyb S

0.5

Block O

2.5*

Hyb R

1.25

NF Water

0✝

Baits

5.5

TOTAL

5.5

TOTAL

20

Plants: 0; Salmonids: 2.5*Plants: 5.0; Salmonids: 0✝

2. ハイブリダイゼーションミックスを 60℃で 10 分間加熱したのち、1 反応あたり 18.5 µL のハイブリダイゼー
ションミックスをそれぞれのチューブに分注します（”HYBs”）。
3. 反応ごとに、5 µL のブロッカーミックスを分注し、7 µL のライブラリーを混合します（＝”LIBs”）。
4. 95℃のサーマルサイクラーで LIBs を 5 分間インキュベートし、ハイブリダイズ温度に下げます。ヒートリッドにしてください。
5. HYBs をサーマルサイクラーにセットし、ハイブリダイズ温度で 5 分間加熱します。
6. 18 µL の HYB をそれぞれの LIB に加えてピペッティングで混合し、16-24 時間インキュベートします。
7. 9.を行う 1.5 時間前に 400 µL の HybS と 39.6 mL のヌクレアーゼフリー水と 10 mL の Wash Bufferを
50 mL チューブで混合し、Wash Buffer X を作成します。ボルテックスで完全に混合し、ハイブ
リダイズ温度で少なくとも 45 分間加熱します。
8. 1 反応あたり 30 µL のビーズを 200 µL の Binding Buffer で 3 回洗浄し準備しておきます。70 µLのBinding Buffer でビーズを再懸濁し、少なくとも 2 分間ハイブリダイズ温度で加熱します。
9. 加熱したビーズとハイブリダイズ反応物を混合し、ハイブリダイズ温度で 5 分間インキュベートします。2.5 分経過したら懸濁します。
10. ビーズをペレット化し、上清を除去します。洗浄にマイクロ遠心チューブを使用する場合、375 µL の加熱したWash Buffer X で 3 回洗浄し、ハイブリダイズ温度で 5 分インキュベートします。0.2 mL チューブを使用する
場合 180 µL で 4 回洗浄します。
11. 30 µL の Buffer E でビーズを再懸濁し、このうち 15 µL を KAPA® HiFi あるいは NEB Ultra II Q5
polymerase システムでの 50 µL の系で増幅反応に使用します。その他のポリメラーゼシステムを使用する場
合、ビーズ懸濁液を 95℃で 5 分間インキュベートし、すぐにビーズをペレット化し、15 µL の上清を50 µL の系で増幅反応に使用します。
12. 増幅反応物をシリカカラムか SPRI ビーズで精製します。ビーズが増幅反応物に含まれていた場合、ビーズをペレット化し、上清のみを用いてシリカカラムで精製してください。
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16

高感度プロトコル

高度に汚染されたサンプル、古代DNA、ベイトとターゲット配列がかなり異なる、あるいはターゲット配列が短い

目次
必要条件と推奨事項

ライブラリーのインプット
ブロッキングオリゴ
二回濃縮プロトコルに関する特記事項

キット以外に必要な機器・消耗品・試薬

手順 パート1：ハイブリダイゼーション
H1.1
H1.2
H1.3
H1.4
H1.5

ハイブリダイズ温度の選択
必要な試薬と機器・消耗品
ハイブリダイゼーションミックスの調製
ブロッカーミックスの調製
反応

手順 パート2：結合と洗浄
H2.1
H2.2
H2.3
H2.4
H2.5
H2.6

洗浄温度の選択
必要な試薬と機器・消耗品
Wash Buffer Xの調製
ビーズの準備
ビーズとハイブリッドの結合
ビーズの洗浄手順 パート3：ライブラリーの再懸濁と増幅
H3.1
H3.2
H3.3
H3.4

付録
HA1
HA2

18
18
19
19

20
20
20
21
22

23
23
23
24
24
24

必要な試薬と機器・消耗品
濃縮したライブラリーの回収ライブラリーの増幅
2回目の濃縮

25
25
25
26

トラブルシューティング
myBaits高感度プロトコルクイックガイド

27
28

17

必要条件と推奨事項
ライブラリーのインプット
ライブラリー形式

myBaitsはPCRで増幅した、あるいは増幅可能なNGSライブラリーに用いることができます（例、Illumina Trueq®シリーズ、Illumina Nextera® Flexシリーズ、Ion Torrentやその他のユニバーサ
ルアダプタープライミングサイトのあるライブラリー）。myBaitsをPCRフリーのライブラリーに用いることは推奨しません。さらに、myBaitsはオリジナルのNexteraあるいはNextera XTライブラリー調製キットで調製したライブラリー
や、ビオチンを含むライブラリーには互換性がありません。PCRがジャンプしてしまうことによるミスインデックスの危険性を減少させるため、ライブラリーのデュアルインデックス化を強く推奨します。
容量

myBaitsのターゲット濃縮反応には、トータルで7 µlのNGSライブラリーを加えられます。多くの場合、ライブラリーをプールするには真空遠心分離や他の手段でライブラリーを濃縮する必要があります。このステップ
はmyBaitsの実験を始める前に行ってください。ライブラリーはヌクレアーゼフリーのバッファーか水に懸濁してください。
質量とプール

myBaitsはナノグラムからマイクログラムまで、幅広い質量のライブラリーを濃縮することができます。最適なプールパラメーター（ライブラリーの数とライブラリー総質量の両方の観点から）はライブラリーのタイプとベ
イトセットにより変わり、決定するには試行が必要ですが、多くの構成ではうまく機能するはずです。
分解しておらず、汚染のないDNAライブラリー（例、ベイトとターゲット配列が25%以上異なる）：
プールされたサンプル間のキャプチャパフォーマンスのばらつきを最小限に抑えるために、予想されるベイトとゲノム配列の同一性（分類群）、DNA品質、開始DNA量、ライブラリーインサートの長さ、および相対的なタ ーゲット
ゲノム量とバックグラウンドに基づいて、同等なライブラリーのみをプールします。それぞれのライブラリーは同量ずつプールしてください。ゲノムサイズが5 Gb以下の生物種から調製されたライブラリーは1反応あたり8ライブラリーを1
ライブラリー250 ngずつ、計2 µgプールすることを推奨します。ゲノムサイズが5 Gb以上の場合、1反応あたり8
ライブラリーを1ライブラリー1 µgずつ、計8 µgプールすることを推奨します。
分解しており、汚染されたDNAライブラリー：可能な限り1反応あたりのライブラリの数を少数にとどめ、キャプチャーはトータル12 µ gまでで可能な限り最大量のライブラリーをインプットしてください。プールする必要がある場合、各ライブラリーに含まれるターゲット量が同じになるように、ライブラリーの内生含量がバランスが取れていることを確認してください。例えば、2つのライブラリーをプールする際、ライブラリーAには20%の内生テンプレートが含まれており、ライブラリーBには10%だった場合、ライブラリーBをライブラリーAの二倍量用いてプールしてください。

ブロッキングオリゴ
myBaitsキットをご注文の際は、濃縮するライブラリーの構成をお知らせください。キットに標準で添付するアダプターブ
ロッキング試薬（Block X）はIllumina TruSeqシリーズかNexteraシリーズを用いて、シングルで6-12 bp、あるいはデュアルで6-12 bpのインデックス化を行ったライブラリーに対応しています。Ion TorrentフォーマットではBlock
Aが添付します。その他のアダプター構成では、お客様のNGSライブラリーのアダプター配列用にCustom IDT®
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18

xGen® Blocking Oligoを注文することを推奨します。myBaitsキットのBlock Xの代わりに、1 µg/ mLの濃度でどのカスタムアダプターブロッキングオリゴでも使用することができます。

二回濃縮プロトコルに関する特記事項:
高感度プロトコルでは二回の濃縮を行います。添付の試薬では足りなくなる可能性があるので、ベイトを含まない
myBaits試薬の購入が必要です。例えば、16反応すべてを高感度プロトコルで行った場合、追加で16反応分のmyBaits試薬が必要となります。myBaits試薬は16（カタログ番号300016.v5）あるいは48反応分（300048.v5）でご用意しております。

キット以外に必要な機器・消耗品
Item

Notes

50 mL tubes

1 per 44 reactions

Microcentrifuge tubes (1.5, 1.7, or 1.8 mL)

2 per 8 reactions

0.2 mL PCR strips with attached lids

2 per 8 reactions (e.g., VWR Cat# 93001-118)

Pipettors and tips for 0.5 - 500 μL

Multichannel for 20 and 500 μL recommended✝

Thermal cycler with heated lid compatible with 0.2 mL strips

1 or 2Magnetic particle collector for microcentrifuge tubes

1 (e.g., ThermoFisher Cat# 12321D)

Magnetic particle collector for 0.2 mL strips

1 (e.g., Permagen Cat# S500)

Vortex mixer and mini-centrifuge for tubes and strips
Water bath or incubation oven at 65°C
Heat block for microcentrifuge tubes at 60°C†使用するサーマルサイクラーとPCRストリップチューブで、65℃オーバーナイトの反応で、30 µLの反応液の蒸発量が4 µL以下である
ことを確認してください。

キット以外に必要な試薬
Reagent

Notes

Nuclease-free (“NF”) water

900 µL per reaction

PCR primers to amplify sequencing libraries after capture, e.g.:
Illumina P5: AATGATACGGCGACCACCGA

2.5 uL @ 10 μM per reaction

Illumina P7: CAAGCAGAAGACGGCATACGA

2.5 uL @ 10 μM per reaction

PCR reagents for post-capture amplification

1 per reaction (e.g. Roche Cat# 07958927001)

PCR purification system, e.g., silica columns or SPRI beads

1 cleanup per reaction

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手順
パート1︓ ハイブリダイゼーションのセットアップ
シーケンスライブラリーをさまざまなブロッキングオリゴと混合し、変性し、その後ベイトを含むその他のハイブリダイ
ゼーション試薬と混合します。 これらのハイブリダイゼーション反応液を数時間インキュベートし、ベイトが標的ライブラリー分子とハイブリダイズできるようにします。

H1.1

ハイブリダイズ温度(TH)の選択

63°C

60°C

55°C

DNAライブラリーのGC含量が低

ベイトとターゲットで配列の違い

ライブラリーのインサートの長さがい、あるいはベイトとターゲットで配が15-20%と予想される場合

myBaitsプローブの長さより短列の違いが15%以下と予測されいものがほとんどである、あるいはる場合

ベイトとターゲットで配列の違い
が25%以上と予想される場合

H1.2

必要な試薬と機器・消耗品
Reagents

Equipment

Nuclease-free Water (“H2O”)

Nuclease-free microcentrifuge tubes (×2)

Hyb N and Hyb S from Box 1

0.2 mL strips with attached lids (×1 per 8 reactions)Hyb D and Hyb R from Box 2

Pipettors and tips; multichannel for 20 µL recommended

Block C, Block O, and Block X from Box 2

Vortex mixer and mini-centrifuge for above tube types

Baits from Box 3 KEEP ON ICEHeat block set to 60°C

Libraries or library pools in 7 µL per reaction

Thermal cycler(s); 2 blocks recommended for 24 or more reactions

サーマルサイクラーのプログラム:
蒸発を最小限にするため、蓋の温度を各ステップの温度より5-10℃高く設定してください。

H1.3

Step

Temperature

Time

1
2
3

95°C
TH
TH

5m
5m
∞

ハイブリダイゼーションミックスの調製

1. Hyb試薬を融解し、ボルテックスで混合し、スピンダウンします。
Hyb NとHyb Sに融解後沈殿物がある場合、60℃で加熱し、沈殿物が溶解するまでボルテッ
クスで混合してください。

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20

2. マイクロ遠心(MC)チューブでハイブリダイゼーションミックスを調製し、短時間ボルテックスで混合し、スピンダウンします。下記はピペッティングエラーを考慮した容量です。
ComponentµL / Reaction

Hyb N

9.25

Hyb D

3.5

Hyb S*

0.5

Hyb R

1.25

* Hyb Sを加えると濁りますが、ステップ3でクリアになります。

H2O (round 1 / round 2)

1.1 / 4.4

濃縮1回目: 1.1 μL 2回目: 4.4 μL

Baits (round 1 / round 2)

4.4 / 1.1

濃縮1回目: 4.4 μL 2回目: 1.1 μL

TOTAL

20

3. ハイブリダイゼーションミックスを60℃のヒートブロックで10分インキュベートします。チューブ内に付着する凝縮物を回収するために時々ボルテックスで混合します。ヒートブロックから取り出し、5分間室温で静置します。
4. キャプチャー反応ごとに、18.5 µLのハイブリダイゼーションミックスを0.2 mLチューブに分注します。
この分注したハイブリダイゼーションミックスを“HYBs”とします

H1.4 ブロッカーミックスの調製
1. 下記の表に基づき、ターゲット種に応じたブロッカーミックスを適切なチューブに加え、ピペッティングで混合します。下記はピペッティングエラーを考慮した容量です。

MOST TAXAPLANTSSALMONIDS

Component µL / Reaction

Component µL / Reaction

Component µL / Reaction

Block O

2.5

Block O

5.0

Block O-

Block C

2.5

Block C-

Block C

2.5

Block X

0.5

Block X

0.5

Block X

0.5

NF Water-NF Water-NF Water

2.5

TOTAL

5.5

TOTAL

5.5

TOTAL

5.5

2. キャプチャー反応ごとに、5 µLのブロッカーミックスを0.2 mLチューブに分注します。
3. 7 µL の一つのあるいはプールしたライブラリーをそれぞれブロッカーミックスに加え、ピペッティングで混合します。
このライブラリーとアダプターブロッカーミックスの混合物を“LIBs”とします

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21

H1.5

反応

ആ২崿嵕崘嵑嵈峘ダブルチェックをしてください：

Step

Temperature

Time

蒸発を最小限にするため、蓋の温度を各

1
2
3

95°C
TH
TH

5m
5m
∞

ステップの温度より5-10℃高く設定してください

1. サーマルサイクラーに LIB チューブをセットし、蓋を閉じて、温度プログラムを開始します。

2. サーマルサイクラーがステップ 2 のハイブリダ
イズ温度に達したら、プログラムを一時停止します。サーマルサイクラーに HYB チューブをセットし、蓋を閉じて、プログラムを再開します。

3. プログラムのステップ 2 が完了したら、すべてのチューブをサーマルサイクラーに残したまま、各 LIB に 18 µL の各 HYB を加えます。
マルチチャンネルピペッターを使用すると、簡
単に作業できます。 5 回ピペッティングして穏やかに混合します。
4. HYB チューブを廃棄します。 LIB チューブを短時間スピンダウンした後、サーマルサイク
ラーに戻し、蓋を閉めてオーバーナイト（16-24 時間）でインキュベートしハイブ
リダイズさせます。

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パート2： 結合と洗浄（クリーンナップ）
ベイトとターゲットのハイブリッドをストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズと結合させます。続いて、温めたバッファーで数回洗浄し、ほとんどの非ターゲットDNAを除去します。 この操作は通常、パート1完了の翌日に行います。

H2.1

洗浄温度(TW)の選択(通常THと同じ)

63°C

60°C

55°C

ベイトとターゲットで配列の違い

ベイトとターゲットで配列の違い

ベイトとターゲットで配列の違い

が15%以下と予測される場合

が15-20%と予想される場合が25%以上と予想される場合

H2.2

必要な試薬と機器・消耗品
ハイブリダイゼーションを止める少なくとも90分前に開始してください。

Reagents
Hyb S (Box 1) *Binding Buffer (Box 1) *すべての試薬を室温にしておいてください。沈殿物がWash Buffer (Box 1) *ある場合、60℃で加熱し、沈殿物が溶解するまでボル

Beads (Box 1)

テックスで混合してください。

Nuclease-free (NF) Water (up to 900 µL per reaction)

Equipment
Water bath or incubation oven set to the TW (e.g., 65°C)
Receptacles for 50 mL tubes, 0.2 mL strips and microcentrifuge tubes compatible with above incubation device
Vortex mixer and mini-centrifuge for 0.2 mL strips and MC tubes
Magnetic particle collector(s) (MPC) for above strips and/or tubes
When using only amicrocentrifuge (MC) tube-compatible MPC
Nuclease-free 50 mL tube, 1 per 44 cleanups
Nuclease-free MC tubes, 1 per reaction
Heat block set to the TW
Pipettors and tips for 20 – 500 µL

H2.3

When using a
0.2 mL tube-compatible MPC
Nuclease-free 50 mL tube, 1 per 68 cleanups
Nuclease-free 0.2 mL PCR strips withindividually-attached lids, 1 vessel per reaction
Thermal cycler set to TW
Pipettors and tips for 20 – 200 µL;
multichannel pipettor strongly recommended

Wash Buffer Xの調製

このステップは、マイクロ遠心（MC）チューブでの44反応の洗浄フォーマットに、0.2 mLチューブでの68反応の洗浄
フォーマットに十分なWash Buffer Xを作成します。必要に応じて作成量を調整してください。

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23

H2.3

Wash Buffer Xの調製（続き）

1.

Wash BufferとHyb Sを、それぞれ沈殿物を溶解させ完全に混合します。必要に応じて短時間温めます。

2.

400 µLのHyb Sと39.6 mLのNF水、および10 mLのWash Bufferを50 mLチューブに入れます。ボルテックスで完全に混合し、”Wash Buffer X”とラベルをつけておきます。
Wash Buffer Xは4℃で1か月間保存できます。

3.

H2.4

少なくとも使用前の30分間、ウォーターバスかインキュベーションオーブンでWash Buffer Xを洗浄温度（TW）で加熱します。

ビーズの準備

ビーズは使用直前に十分懸濁してください

1.

MCチューブにキャプチャー反応ごとに30 µLのビーズ溶液を入れます。

2.

MPCにチューブをセットし、ビーズがペレットとなり、溶液が透明になるまで静置します（1-2分）。
チューブをMPCに置いたまま上清を除去し廃棄します。

3.

200 µLのBinding Bufferをビーズペレットに加えます。ボルテックスでビーズを再懸濁し、スピンダウンします。
MPCにチューブをセットし、ビーズをペレット化させます。上清を除去し廃棄します。

4.

3.の工程を2回繰り返し、合計3回洗浄します。

5.

洗浄したビーズを70 µLのBinding Bufferで再懸濁します。 0.2 mLフォーマットで洗浄する場合は、PCR
ストリップチューブに再懸濁液を移します。
ヒント：ビーズはMCチューブを利用して、8（以下）の反応数（最大240 µL）で調製できます。 MCチューブ1
本ですべての反応数分の試薬を調製します。すなわち8反応分の場合、1.6 mLのBinding bufferで洗浄し、560 µLのBinding Bufferで再懸濁し、70 µLの懸濁液を個々のチューブに分注します。

H2.5

ビーズとハイブリッドの結合1.

ビーズ溶液をTWで少なくとも2分間加熱します。

2.

各キャプチャー反応物（H1.5-4）を加熱したビーズ溶液に加え、ピペッティングで混合します。

3.

ライブラリーとビーズの混合物（H2.5-2）をヒートブロックかサーマルサイクラーで5分間インキュベートしま
す。ビーズを攪拌された状態に保つために、2.5分経過したらチューブをフリックあるいは反転させ、その後
短時間ピンダウンします。

H2.6
1.
2.

ビーズの洗浄溶液が透明になるまで、MPCでビーズをペレット化します。 上清を除去し廃棄します。
TIP: この上清は、同じあるいは異なるベイトで再キャプチャーするためのバックアップとして保存することができます。

加熱した375 µL（MCチューブフォーマット）あるいは 180 µL（0.2 mLチューブフォーマット）のWashing Buffer Xをビーズに加え、MPCから取り出し、ヒートブロックに15秒置いたのち、短時間のボルテックスあるいはピペッティングにより混合します。 チューブを短時間スピンダウンします。

3.

TWのヒートブロックあるいはサーマルサイクラーで5分間インキュベートします。2.5分経過したら軽くボルテック

4.

スすることによって攪拌し、短時間スピンダウンします。
1.から3.の工程をMCチューブフォーマットでは2回（合計3回）、0.2 mLチューブフォーマットでは3回（合計4回）繰り返します。最後の洗浄が終了したら、ビーズペレットには触れずに可能な限り溶液を取り除きます。

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24

パート3:

ライブラリーの再懸濁と増幅ビーズに結合した濃縮ライブラリーをBuffer Eに懸濁し、増幅します。

H3.1

必要な試薬と機器・消耗品

Reagents

Equipment

Buffer E (Box 2)

Tubes appropriate for PCR master mix assembly

PCR primers for amplifying libraries (e.g., P5 and P7)

Tubes or strips for 50 µL PCR amplification

PCR reagents for post-capture amplification

Pipettors and tips capable of 5 – 100 µL volumes

PCR purification system, e.g., silica columns or SPRI beads

Vortex mixer and mini-centrifuge for above tube types

Nuclease-free (NF) Water

Thermal cycler

H3.2
1.

濃縮したライブラリーの回収洗浄したビーズ（H2.6-4）に30 µLのBuffer Eを加え、ピペッティングにより完全に再懸濁します。次のス
テップは、お客様の用いるライブラリー増幅試薬により、下記のワークフローAあるいはBを選択してください。

ワークフローA︓KAPA HiFi HotStart あるいはNEB Ultra II Q5 polymerase を使用する場合

ワークフローB︓ワークフローA 以外のポリメラーゼシステムを使用する場合

2A. このビーズ懸濁液を増幅のテンプレートとして、
直接H3.3 に進んでください。

H3.3

2B. ビーズ懸濁液を 95℃で 5 分間インキュ
ベートします。
3B. すぐに MPC でビーズをペレット化し、エンリッチされたライブラリーを含む上清を回収します。

ライブラリーの増幅

下記はKAPA HiFi HotStart Ready MixおよびIlluminaのライブラリーで、キャプチャー後の増幅を行った例です。
一回目のH3.3ステップでは、1濃縮反応につき2つの反応を行ってください（それぞれ15 µLの濃縮ライブラ
リーをテンプレートにします）。二回目のステップでは、1反応を行います。

1. 下記のPCR反応液を準備します

Component
NF Water
2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix
P5 library primer (at 10 μM)
P7 library primer (at 10 μM)
Enriched Library (on- or off-bead)

Final ConcentrationµL / Reaction

Sequence

1X
500 nM
500 nM

5
25
2.5
2.5

-

-

15 *

-

50

-

TOTAL

AATGATACGGCGACCACCGACAAGCAGAAGACGGCATACGA* 残りのビーズに結合したライブラリーは-20℃で数か月保存できます。
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25

H3.3 ライブラリーの増幅（続き）
2. 以下のプログラムで反応を行います。

Step

Temperature

Time

1

98°C

2 minutes

2

98°C

20 seconds

3

60°C

30 seconds

4

72°C

45 seconds

5

72°C

5 minutes

6

8°C

∞

×14 or 8*濃縮1回目: 14cycles*

濃縮2回目: 8

3. 増幅後、精製を行ってください。
− 反応溶液にビーズが含まれており、シリカカラムを用いて精製する場合、ビーズをペレット化したのちに上清のみを用いてシリカカラムで精製してください。
− 上記以外の場合、いずれかのPCR精製システム（シリカカラムやSPRIビーズなど）を使用して反応溶液を精製します。

H3.4 2回目の濃縮反応
H3.3までを1回終了した場合(1/2回目) :1. 精製した増幅産物を混合し、7 µL に濃縮します。
2. 濃縮したテンプレートをサンプルとして、H1.1 から H3.3 までのステップを繰り返します。
H3.3までを2回終了した場合 :これで、ライブラリーの濃縮は完了です。定量、品質チェックを行い、シーケンシングを行えます。

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26

付録
HA1: トラブルシューティング
ハイブリダイゼーション中にサーマルサイクラーの温度がハイブリダイズ温度より下がってしまいました。
完全に濃縮が失敗するわけではありませんが、温度が維持された場合に比べてオンターゲットのリード率とターゲッ
トのリードの複雑さが下がることが予測されます。予備試験として浅くシーケンシングすることで、ターゲットが十分なカバ
レッジを得られるかどうか判断できます。
濃縮し、増幅したライブラリーが電気泳動（あるいは同様の装置）で観察できません
キャプチャーに成功したライブラリーは再増幅した後でも全量が数ngであることが多く、この量は電気泳動では観察することができません。これは特にターゲットが小さいか（100 bp以下）、出発材料中でのターゲットDNAの割合が低いか（例、分解・古代・環境DNA）、キャプチャー後のライブラリーの再増幅が少なかった場合に一般的にみられます。多くの場合、ライブラリー増幅をさらに数サイクル行うと、電気泳動で十分観察される濃度になります。あるいは、ライブラリーがシーケンスに十分な量かどうかをqPCRで定量することができます。PCRのプラトーに達する前にサイクルを止めた場合、電気泳動でqPCR産物の長さの分布を観察することができます。ライブラリーの濃度と量については、シーケ
ンスプロバイダーにご相談ください。
濃縮し、増幅したライブラリーが元のライブラリーよりかなり長いか、ピークが二つあります。
これは、ライブラリーが増幅されすぎたことで、テンプレートの伸長なしに変性-再生が起こり’daisy-chains’
あるいは’bubbles’と呼ばれる構造を形成した場合に起こります。これは通常のライブラリー増幅法でPCRを3サイクル行うことで元のライブラリーの状態に戻すことができます。
濃縮したライブラリーのシーケンスデータで、PCR重複が高い確率で見られました
シーケンスデータ中の重複率（つまり”clonalityあるいは”duplication rate”）は深く読むほど増加し、実験前にシーケンス深度が適正化されている場合にのみ実験間で正しく比較できます。得られた生シーケンスリードをX
軸に、ユニークリードをY軸にしてプロットすることで、ライブラリーがオーバーシーケンスされたかどうかを評価することができます。この’complexity curve’がプラトーに達しているが、十分なユニークリードを得られている場合、必要以上に深くシーケンスされたと考えられます。プロットが平らにならなかった場合、あるいはライブラリーの潜在的なユニークリードの収量を増やしたい場合、ライブラリー調製に用いるDNAの量を増やす、あるいはキャプチャー反応あたりのライブ
ラリー量を増やしてください。キャプチャー前にベイトを希釈しないでください。重度に汚染または損傷したDNAをターゲットとして用いる場合、キャプチャーの感度を改善するためにすべてのステップで温度を下げることを検討してください。
可能な場合、PCRサイクルを減らすことで、得られたシーケンス深度でのターゲットのカバレッジの均一性と複雑さを改善できる可能性があり、いくつかのケースでは重複率に非直接的な効果がある場合があります。NGSアプリケーションにおけるライブラリーの複雑さについてはDaley & Smith 2013 (doi: 10.1038/nmeth.2375)に情報があります。
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27

HA2: myBaits高感度プロトコルクイックガイド
1. 反応ごとに、下記の試薬を調製します（ピペットエラーは調整済みです）
Hybridization Mix

Blockers Mix

Component

μL / Reaction

Component

μL / Reaction

Hyb N

9.25

Block X

0.5

Hyb D

3.5

Block C

2.5✝

Hyb S

0.5

Block O

2.5*

Hyb R

1.25

NF Water0✝

Baits (round 1 / 2)

4.4 / 1.1

TOTAL

5.5

H2O (round 1 / 2)

1.1 / 4.4

TOTAL

20

Plants: 0; Salmonids: 2.5*Plants: 5.0; Salmonids: 0✝

2. ハイブリダイゼーションミックスを 60℃で 10 分間加熱したのち、1 反応あたり 18.5 µL のハイブリダイゼーションミッ
クスをそれぞれのチューブに分注します（”HYBs”）。

3. 反応ごとに、5 µL のブロッカーミックスを分注し、7 µL のライブラリーを混合します（＝”LIBs”）。
4. 95℃のサーマルサイクラーで LIBs を 5 分間インキュベートし、ハイブリダイズ温度に下げます。ヒートリッドにしてください。

5. HYBs をサーマルサイクラーにセットし、ハイブリダイズ温度で 5 分間加熱します。
6. 18 µL の HYB をそれぞれの LIB に加えてピペッティングで混合し、16-24 時間インキュベートします。
7. 9.を行う 1.5 時間前に 400 µL の HybS と 39.6 mL の ヌクレアーゼフリー水と 10 mL の Wash Buffer を

50 mL チュ ーブで混合し、Wash Buffer X を作成します。ボルテックスで完全に混合し、ハイブリダイズ温度で少なくとも 45分間加熱します。

8. 1 反応あたり 30 µL のビーズを 200 µL の Binding Buffer で 3 回洗浄し準備しておきます。70 µL のBinding Buffer でビーズを再懸濁し、少なくとも 2 分間ハイブリダイズ温度で加熱します。

9. 加熱したビーズとハイブリダイズ反応物を混合し、ハイブリダイズ温度で 5 分間インキュベートします。2.5 分経過したら懸濁します。

10. ビーズをペレット化し、上清を除去します。洗浄にマイクロ遠心チューブを使用する場合、375 µL の加熱したWash Buffer X で 3 回洗浄し、ハイブリダイズ温度で 5 分インキュベートします。0.2 mL チューブを使用する
場合 180 µL で 4 回洗浄します。

11. 30 µL の Buffer E でビーズを再懸濁し、このうち 15 µL を KAPA® HiFi あるいは NEB Ultra II Q5

polymerase システムでの 50 µL の系で増幅反応に使用します。その他のポリメラーゼシステムを使用する場合、
ビーズ懸濁液を 95℃で 5 分間インキュベートし、すぐにビーズをペレット化し、15 µL の上清を 50 µL の系で増幅反応に使用します。1 回目の濃縮では 2 つの反応を行います。2 回目の濃縮では 1 つの反応を行います。

12. 増幅反応物をシリカカラムか SPRI ビーズで精製します。ビーズが増幅反応物に含まれていた場合、ビーズをペレッ
化し、上清のみを用いてシリカカラムで精製してください。

13. ここまで 1 回目の濃縮が終了したら、キャプチャー後増幅物を混合し、7 µL に濃縮し、1-12 のステップを繰り返します。2 回目の濃縮が終了したら、ライブラリーの濃縮は終了し、品質チェックを行い、シーケンシングします。

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28

ロングインサートプロトコル
インサートの長さが1-10 kbのNGSライブラリー

目次
必要条件と推奨事項

ライブラリーのインプット
ブロッキングオリゴ
ロングインサートライブラリーの扱いに関する特記事項

キット以外に必要な機器・消耗品・試薬

30
30
30
31

手順 パート1：ハイブリダイゼーション
L1.1
L1.2
L1.3

ハイブリダイズ温度の選択
必要な試薬と機器・消耗品
ハイブリダイゼーションミックスの調製

手順 パート2：結合と洗浄
L2.1
L2.2
L2.3
L2.4
L2.5
L2.6

洗浄温度の選択
必要な試薬と機器・消耗品
Wash Buffer Xの調製
ビーズの準備
ビーズとハイブリッドの結合
ビーズの洗浄手順 パート3：ライブラリーの再懸濁と増幅
L3.1
L3.2
L3.3

付録
LA1
LA2

32
32
33

34
34
35
35
35
35

必要な試薬と機器・消耗品
濃縮したライブラリーの回収ライブラリーの増幅

36
36
36

トラブルシューティング
myBaitsロングインサートプロトコルクイックガイド

38
39

29

必要条件と推奨事項
ライブラリーのインプット
ライブラリー形式

myBaitsはユニバーサルアダプタープライムイングサイトを有し、PCRで増幅した、あるいは増幅可能なNGSライブラリーに用いることができます。ロングインサートライブラリーはWitek et al. 2016 (doi:
10.1038/protex.2016.027)の方法に従って調製することを推奨します。myBaitsをPCRフリーのライブラリーに用いることは推奨しません。さらに、myBaitsはオリジナルのNexteraあるいはNextera XTライブラリー調製キットで調製したライブラリーや、ビオチンを含むライブラリーには互換性がありません。PCRがジャンプしてしまうことによるミスイン
デックスの危険性を減少させるため、ライブラリーのデュアルインデックス化を強く推奨します。
容量

myBaitsのターゲット濃縮反応には、トータルで7 µlのNGSライブラリーを加えられます。多くの場合、

ライブラリーをプールするには真空遠心分離や他の手段でライブラリーを濃縮する必要があります。このステップは
myBaitsの実験を始める前に行ってください。ライブラリーはヌクレアーゼフリーのバッファーか水に懸濁してください。
質量

ロングインサートライブラリーのキャプチャーには、濃縮反応あたりトータルで250 ngのライブラリーを用いることを推奨します。インターカレート法によるダイアッセイ（例、Qubit）で定量してください。
プール

最適なプールパラメーター（ライブラリーの数とライブラリー総質量の両方の観点から）はライブラリーのタイプとベイトセットにより変わり、決定するには試行が必要ですが、多くの構成ではうまく機能するはずです。プールされたサンプル間のキャプチャパフォーマンスのばらつきを最小限に抑えるために、予想されるベイトとゲノム配列の同一性（分類群）、DNA品質、開始DNA量、ライブラリーインサートの長さ、および相対的なターゲットゲノム量とバックグラウンドに基づいて、同等なライブラリーのみをプールします。それぞれのライブラリーは同量ずつプールしてください。ロングインサートライブラリーのキャプチャーには、1反応あたり3ライブラリーを、1ライブラリーを83

ngずつ、計250

ngまでをプールすることを推奨します。

ブロッキングオリゴ
myBaitsキットをご注文の際は、濃縮するライブラリーの構成をお知らせください。キットに標準で添付するアダプターブ
ロッキング試薬（Block X）はIllumina TruSeqシリーズかNexteraシリーズを用いて、シングルで6-12 bp、あるいはデュアルで6-12 bpのインデックス化を行ったライブラリーに対応しています。Ion TorrentフォーマットではBlock Aが添付します。その他のアダプター構成では、お客様のNGSライブラリーのアダプター配列用にCustom
IDT® xGen® Blocking Oligoを注文することを推奨します。myBaitsキットのBlock Xの代わりに、1 µg/ mLの濃度でどのカスタムアダプターブロッキングオリゴでも使用することができます。

ロングインサートライブラリーの扱いに関する特記事項
ビーズ（MyOne C1あるいはSPRI）とロングインサートライブラリーの混合には、ボルテックスではなくピペッティングでおだやかに混合することで、機械的せん断を防ぎます。

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30

キット以外に必要な機器・消耗品
Item

Notes

50 mL tubes

1 per 44 reactions

Microcentrifuge tubes (1.5, 1.7, or 1.8 mL)

2 per 8 reactions

0.2 mL PCR strips with attached lids

2 per 8 reactions (e.g., VWR Cat# 93001-118)

Pipettors and tips for 0.5 - 500 μL

Multichannel for 20 and 500 μL recommended✝

Thermal cycler with heated lid compatible with 0.2 mL strips

1 or 2Magnetic particle collector for microcentrifuge tubes

1 (e.g., ThermoFisher Cat# 12321D)

Magnetic particle collector for 0.2 mL strips

1 (e.g., Permagen Cat# S500)

Vortex mixer and mini-centrifuge for tubes and strips
Water bath or incubation oven at 65°C
Heat block for microcentrifuge tubes at 60°C†使用するサーマルサイクラーとPCRストリップチューブで、65℃オーバーナイトの反応で、30 µLの反応液の蒸発量が4 µL以下である
ことを確認してください。

キット以外に必要な試薬
Reagent

Notes

Nuclease-free (“NF”) water

900 µL per reaction

PCR primers to amplify sequencing libraries after capture, e.g.:
Illumina P5: AATGATACGGCGACCACCGA

2.5 uL @ 10 μM per reaction

Illumina P7: CAAGCAGAAGACGGCATACGA

2.5 uL @ 10 μM per reaction

PCR reagents for post-capture amplification

1 per reaction (e.g. Roche Cat# 07958927001)

PCR purification system, e.g., silica columns or SPRI beads

1 cleanup per reaction

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31

手順
パート1： ハイブリダイゼーションのセットアップ
シーケンスライブラリーをさまざまなブロッキングオリゴと混合し、変性し、その後ベイトを含むその他のハイブリダイゼーショ
ン試薬と混合します。これらのハイブリダイゼーション反応液を数時間インキュベートし、ベイトが標的ライブラリー分子とハイブリダイズできるようにします。

L1.1

ハイブリダイズ温度(TH)の選択

65°C

62°C

60°C

ベイトとターゲットで配列の違い

ベイトとターゲットで配列の違い

ベイトとターゲットで配列の違い

が10%以下と予想される場合

が10-15%と予想される場合

が15-25%と予想される場合

L1.2

必要な試薬と機器・消耗品
Reagents

Equipment

Hyb N and Hyb S from Box 1

Nuclease-free microcentrifuge tubes (×2)

Hyb D and Hyb R from Box 2

0.2 mL strips with attached lids (×1 per 8 reactions)

Block C, Block O, and Block X from Box 2

Pipettors and tips; multichannel for 20 µL recommended

Baits from Box 3 KEEP ON ICE

Vortex mixer and mini-centrifuge for above tube types

Libraries or library pools in 7 µL per reaction

Heat block set to 60°C
Thermal cycler(s); 2 blocks recommended for 24 or more reactions

サーマルサイクラーのプログラム:
蒸発を最小限にするため、蓋の温度を各ステップの温度より5-10℃高く設定してください。

Step

Parameters

1
2
3
4

60°C, 10 minutes
95°C, 10 minutes
Reduce 0.1°C per second to TH
Hold at TH

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32

L1.3
1.

ハイブリダイゼーションミックスの調製
Hyb試薬を融解し、ボルテックスで混合し、スピンダウンします。
Hyb NとHyb Sに融解後沈殿物がある場合、60℃で加熱し、沈殿物が溶解するまでボルテックスで混合してください。

2.

下記の表に基づき、ターゲット種に応じたキャプチャーミックスをマイクロ遠心(MC)チューブで調製します。下記はピペッティングエラーを考慮した容量です。

MOST TAXAPLANTSSALMONIDS

Component µL / Reaction

Component µL / Reaction

Component µL / Reaction

Hyb N

9.25

Hyb N

9.25

Hyb N

9.25

Hyb D

3.5

Hyb D

3.5

Hyb D

3.5

Hyb S*

0.5

Hyb S*

0.5

Hyb S*

0.5

Hyb R

1.25

Hyb R

1.25

Hyb R

1.25

Block O

2.5

Block O

5.0

Block O-

Block C

2.5

Block C-

Block C

2.5

Block X

0.5

Block X

0.5

Block X

0.5

NF Water-NF Water-NF Water

2.5

Baits

5.5

Baits

5.5

Baits

5.5

TOTAL

25.5

TOTAL

25.5

TOTAL

25.5

*Hyb Sを加えると濁りますが、ステップ3でクリアになります。

短時間ボルテックスし、スピンダウンして溶液を回収します。
3. キャプチャー反応ごとに、23 µLのハイブリダイゼーションミックスを0.2 mLチューブに分注します。
4. 7 µLの一つのあるいはプールしたライブラリーをそれぞれキャプチャーミックスに加え、ピペッティング
でおだやかに混合します。
5. サーマルサイクラーにチューブをセットし、下記プログラムでオーバーナイトで反応させます。
蒸発を最小限にするため、蓋の温度を各ステップの温度より5-10℃高く設定してください

Step

Parameters

1
2
3
4

60°C, 10 minutes
95°C, 10 minutes
Reduce 0.1°C per second to TH
Hold at TH

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33

パート2： 結合と洗浄（クリーンナップ）
ベイトとターゲットのハイブリッドをストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズと結合させます。続いて、温めたバッファーで数回洗浄し、ほとんどの非ターゲットDNAを除去します。 この操作は通常、パート1完了の翌日に行います。

ロングインサートライブラリーでは、ボルテックスではなくピペッティングでおだやかに混合することで、機械的せん断を防ぎます。

L2.1

洗浄温度(TW)の選択 (通常THと同じ)

65°C

62°C

60°C

ベイトとターゲットで配列の違い
が10%以下と予想される場合

ベイトとターゲットで配列の違い
が10-15%と予想される場合

ベイトとターゲットで配列の違い
が15-25%と予想される場合

L2.2

必要な試薬と機器・消耗品
ハイブリダイゼーションを止める少なくとも90分前に開始してください。

Reagents
Hyb S (Box 1) *Binding Buffer (Box 1) *Wash Buffer (Box 1) *Beads (Box 1)* すべての試薬を室温にしておいてください。沈殿物がある場合、60℃で加熱し、沈殿物が溶解するまでボルテックスで混合してください。

Nuclease-free (NF) Water (up to 900 µL per reaction)

Equipment
Water bath or incubation oven set to the TW (e.g., 65°C)
Receptacles for 50 mL tubes, 0.2 mL strips and microcentrifuge tubes compatible with above incubation device
Vortex mixer and mini-centrifuge for 0.2 mL strips and MC tubes
Magnetic particle collector(s) (MPC) for above strips and/or tubes
When using only amicrocentrifuge (MC) tube-compatible MPC
Nuclease-free 50 mL tube, 1 per 44 cleanups
Nuclease-free MC tubes, 1 per reaction
Heat block set to the TW
Pipettors and tips for 20 – 500 µL

When using a
0.2 mL tube-compatible MPC
Nuclease-free 50 mL tube, 1 per 68 cleanups
Nuclease-free 0.2 mL PCR strips withindividually-attached lids, 1 vessel per reaction
Thermal cycler set to TW
Pipettors and tips for 20 – 200 µL;
multichannel pipettor strongly recommended

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34

L2.3

Wash Buffer Xの調製

このステップは、マイクロ遠心（MC）チューブでの44反応の洗浄フォーマットに、0.2 mLチューブでの68反応の洗浄フォーマットに十分なWash Buffer Xを作成します。必要に応じて作成量を調整してください。
1.

Wash BufferとHyb Sを、それぞれ沈殿物を溶解させ完全に混合します。必要に応じて短時間温めます。

2.

400 µLのHyb Sと39.6 mLのNF水、および10 mLのWash Bufferを50 mLチューブに入れます。ボルテックスで完全に混合し、”Wash Buffer X”とラベルをつけておきます。
Wash Buffer Xは4℃で1か月間保存できます。

3.

L2.4

少なくとも使用前の30分間、ウォーターバスかインキュベーションオーブンでWash Buffer Xを洗浄温度（TW）で加熱します。

ビーズの準備

ビーズは使用直前に十分懸濁してください

1.

MCチューブにキャプチャー反応ごとに30 µLのビーズ溶液を入れます。

2.

MPCにチューブをセットし、ビーズがペレットとなり、溶液が透明になるまで静置します（1-2分）。
チューブをMPCに置いたまま上清を除去し廃棄します。

3.

200 µLのBinding Bufferをビーズペレットに加えます。ボルテックスでビーズを再懸濁し、スピンダウンします。
MPCにチューブをセットし、ビーズをペレット化させます。上清を除去し廃棄します。

4.

3.の工程を2回繰り返し、合計3回洗浄します。

5.

洗浄したビーズを70 µLのBinding Bufferで再懸濁します。 0.2 mLフォーマットで洗浄する場合は、PCR
ストリップチューブに再懸濁液を移します。
ヒント：ビーズはMCチューブを利用して、8（以下）の反応数（最大240 µL）で調製できます。 MCチューブ1
本ですべての反応数分の試薬を調製します。すなわち8反応分の場合、1.6 mLのBinding bufferで洗浄し、560 µLのBinding Bufferで再懸濁し、70 µLの懸濁液を個々のチューブに分注します。

L2.5

ビーズとハイブリッドの結合1.

ビーズ溶液をTWで少なくとも2分間加熱します。

2.

各キャプチャー反応物（L1.3-5）を加熱したビーズ溶液に加え、ピペッティングで混合します。

3.

ライブラリーとビーズの混合物（L2.5-2）をヒートブロックかサーマルサイクラーで5分間インキュベートします。
ビーズを攪拌された状態に保つために、2.5分経過したらチューブをフリックあるいは反転させ、その後短時間
スピンダウンします。

L2.6

ビーズの洗浄1.

溶液が透明になるまで、MPCでビーズをペレット化します。 上清を除去し廃棄します。

2.

加熱した375 µL（MCチューブフォーマット）あるいは 180 µL（0.2 mLチューブフォーマット）のWashing Buffer Xをビーズに加え、MPCから取り出し、ヒートブロックに15秒置いたのち、短時間のボルテックスあるいはピペッティングにより混合します。 チューブを短時間スピンダウンします。

3.

TWのヒートブロックあるいはサーマルサイクラーで5分間インキュベートします。2.5分経過したら軽くボルテック

4.

スすることによって攪拌し、短時間スピンダウンします。
1.から3.の工程をMCチューブフォーマットでは2回（合計3回）、0.2 mLチューブフォーマットでは3回（合計4回）繰り返します。最後の洗浄が終了したら、ビーズペレットには触れずに可能な限り溶液を取り除きます。

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35

パート3:

ライブラリーの再懸濁と増幅ビーズに結合した濃縮ライブラリーをBuffer Eに懸濁し、増幅します。

L3.1

必要な試薬と機器・消耗品

Reagents

Equipment

Buffer E (Box 2)

Tubes appropriate for PCR master mix assembly

PCR primers for amplifying libraries (e.g., P5 and P7)

Tubes or strips for 50 µL PCR amplification

PCR reagents for post-capture amplification

Pipettors and tips capable of 5 – 100 µL volumes

PCR purification system, e.g., silica columns or SPRI beads

Vortex mixer and mini-centrifuge for above tube types
Thermal cycler

L3.2
1.

濃縮したライブラリーの回収洗浄したビーズ（L2.6-4）に30 µLのBuffer Eを加え、ピペッティングにより完全に再懸濁します。次のステップは、お客様の用いるライブラリー増幅試薬により、下記のワークフローAあるいはBを選択してください。

ワークフローA︓KAPA HiFi HotStart あるいはNEB Ultra II Q5 polymerase を使用する場合

ワークフローB︓ワークフローA 以外のポリメラーゼシステムを使用する場合

2A. このビーズ懸濁液を増幅のテンプレートとして、
直接L3.3 に進んでください。

L3.3

2B. ビーズ懸濁液を 95℃で 5 分間インキュ
ベートします。
3B. すぐに MPC でビーズをペレット化し、エンリッチされたライブラリーを含む上清を回収します。

ライブラリーの増幅

下記はKAPA HiFi HotStart Ready MixおよびIlluminaのライブラリーで、キャプチャー後の増幅を行った例です。
1.

下記の PCR 反応液を準備します

Component

Final ConcentrationµL / Reaction

Sequence

NF Water-

5-

2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix

1X

25

-

P5 library primer (at 10 μM)

500 nM

2.5

AATGATACGGCGACCACCGA

P7 library primer (at 10 μM)

500 nM

2.5

CAAGCAGAAGACGGCATACGA

-

10 *

-

50

-

Enriched Library (on- or off-bead)

TOTAL* 残りのビーズに結合したライブラリーは-20℃で数か月保存できます。

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36

L3.3

ライブラリーの増幅（続き）

2.

以下のプログラムで反応を行います。

3.

Step

Temperature

Time

1

98°C

3 minutes

295°C

30 seconds

3

62°C

20 seconds

4

68°C

10 minutes

6

8°C

∞

×25

cycles**最低限のサイクルで行ってください。シーケンスプラットフォームによっては、必要なモル濃度を満たすに25サイクル以上になる可能性があります。

増幅後、精製を行ってください。

-

反応溶液にビーズが含まれており、シリカカラムを用いて精製する場合、ビーズをペレット化したのちに上清のみを用いてシリカカラムで精製してください。

-

上記以外の場合、いずれかのPCR精製システム（シリカカラムやSPRIビーズなど）を使用して反応溶液を精製します。

濃縮したライブラリーを定量し、品質チェックを行い、必要があれば追加のサイズセレクションを行い、プラット
フォーム用にライブラリー調製を行い、シーケンシングを行います。
このライブラリー増幅でプラットフォーム（例、PacBio、Oxford Nanopore）用のライブラリーに量が満たない場合、残りの増幅されていないライブラリーを用いて追加の増幅を行ってください。

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37

付録
LA1: トラブルシューティング
ハイブリダイゼーション中にサーマルサイクラーの温度がハイブリダイズ温度より下がってしまいました。
完全に濃縮が失敗するわけではありませんが、温度が維持された場合に比べてオンターゲットのリード率とターゲットのリードの複雑さが下がることが予測されます。予備試験として浅くシーケンシングすることで、ターゲットが十分なカバ
レッジを得られるかどうか判断できます。
濃縮し、増幅したライブラリーが電気泳動（あるいは同様の装置）で観察できません
キャプチャーに成功したライブラリーは再増幅した後でも全量が数ngであることが多く、この量は電気泳動では観察することができません。これは特にターゲットが小さいか（100 bp以下）、出発材料中でのターゲットDNAの割合が低いか（例、分解・古代・環境DNA）、キャプチャー後のライブラリーの再増幅が少なかった場合に一般的にみられます。多くの場合、ライブラリー増幅をさらに数サイクル行うと、電気泳動で十分観察される濃度になります。あるいは、ライブラリーがシーケンスに十分な量かどうかをqPCRで定量することができます。PCRのプラトーに達する前にサイクルを止めた場合、電気泳動でqPCR産物の長さの分布を観察することができます。ライブラリーの濃度と量については、シーケ
ンスプロバイダーにご相談ください。
濃縮し、増幅したライブラリーが元のライブラリーよりかなり長いか、ピークが二つあります。
これは、ライブラリーが増幅されすぎたことで、テンプレートの伸長なしに変性-再生が起こり’daisy-chains’
あるいは’bubbles’と呼ばれる構造を形成した場合に起こります。これは通常のライブラリー増幅法でPCRを3サイクル行うことで元のライブラリーの状態に戻すことができます。
濃縮したライブラリーのシーケンスデータで、PCR重複が高い確率で見られました
シーケンスデータ中の重複率（つまり”clonalityあるいは”duplication

rate”）は深く読むほど増加し、実験前にシーケンス深度が適正化されている場合にのみ実験間で正しく比較できます。得られた生シーケンスリードをX
軸に、ユニークリードをY軸にしてプロットすることで、ライブラリーがオーバーシーケンスされたかどうかを評価することができます。この’complexity

curve’がプラトーに達しているが、十分なユニークリードを得られている場合、必要以上に深くシーケンスされたと考えられます。プロットが平らにならなかった場合、あるいはライブラリーの潜在的なユニークリードの収量を増やしたい場合、ライブラリー調製に用いるDNAの量を増やす、あるいはキャプチャー反応あたりのライブ
ラリー量を増やしてください。キャプチャー前にベイトを希釈しないでください。重度に汚染または損傷したDNAをターゲットとして用いる場合、キャプチャーの感度を改善するためにすべてのステップで温度を下げることを検討してください。
可能な場合、PCRサイクルを減らすことで、得られたシーケンス深度でのターゲットのカバレッジの均一性と複雑さを改善できる可能性があり、いくつかのケースでは重複率に非直接的な効果がある場合があります。NGSアプリケーションにおけるライブラリーの複雑さについてはDaley & Smith 2013 (doi: 10.1038/nmeth.2375)に情報があります。
myBaits® - Hybridization Capture for Targeted NGS - Manual v.5.03 - Long Insert Protocol June 2023

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LA2: myBaitsロングインサートプロトコルクイックガイド
1.

反応ごとに、ターゲット種に応じて下記のキャプチャーミックスを調製します（ピペットエラーは調整済みです）

MOST TAXA
ComponentµL / Reaction
Hyb N
9.25
Hyb D
3.5
Hyb S
0.5
Hyb R
1.25
Block O
2.5
Block C
2.5
Block X
0.5
NF Water
Baits
5.5
TOTAL
25.5

PLANTS
ComponentµL / Reaction
Hyb N
9.25
Hyb D
3.5
Hyb S
0.5
Hyb R
1.25
Block O
5.0
Block C
Block X
0.5
NF Water
Baits
5.5
TOTAL
25.5

SALMONIDS
ComponentµL / Reaction
Hyb N
9.25
Hyb D
3.5
Hyb S
0.5
Hyb R
1.25
Block O
Block C
2.5
Block X
0.5
NF Water
2.5
Baits
5.5
TOTAL
25.5

2.

キャプチャー反応ごとに、23 µL のキャプチャーミックスをチューブに分注します。

3.

それぞれのキャプチャーミックスに 7 µL のそれぞれのあるいはプールしたライブラリーを加えます。

4.

60℃のサーマルサイクラーで 10 分間反応溶液をインキュベートしたのち、95℃で 10 分間インキュベートし、ハイブ
リダイズ温度まで 1 秒に 0.1℃ずつ下げます。ヒートリッドにしてください。ハイブリダイズ温度で 16-24 時間イン
キュベートします。

5.

9.を行う 1.5 時間前に 400 µL の HybS と 39.6 mL の NF 水と 10 mL の Wash Buffer を 50 mL チュ ーブで混合し、Wash Buffer X を作成します。ボルテックスで完全に混合し、ハイブリダイズ温度で少なくとも 45分間加熱します。

6.

1 反応あたり 30 µL のビーズを 200 µL の Binding Buffer で 3 回洗浄し準備しておきます。70 µL のBinding Buffer でビーズを再懸濁し、少なくとも 2 分間ハイブリダイズ温度で加熱します。

7.

加熱したビーズとハイブリダイズ反応物を混合し、ハイブリダイズ温度で 5 分間インキュベートします。2.5 分経過したら懸濁します。

8.

ビーズをペレット化し、上清を除去します。洗浄にマイクロ遠心チューブを使用する場合、375 µL の加熱したWash Buffer X で 3 回洗浄し、ハイブリダイズ温度で 5 分インキュベートします。0.2 mL チューブを使用する場
合 180 µL で 4 回洗浄します。

9.

30 µL の Buffer E でビーズを再懸濁し、このうち 15 µL を KAPA® HiFi あるいは NEB Ultra II Q5
polymerase システムでの 50 µL の系で増幅反応に使用します。その他のポリメラーゼシステムを使用する場
合、ビーズ懸濁液を 95℃で 5 分間インキュベートし、すぐにビーズをペレット化し、15 µL の上清を 50 µL の系で増幅反応に使用します。

10. 増幅反応物をシリカカラムかSPRIビーズで精製します。ビーズが増幅反応物に含まれていた場合、ビーズをペレッ
ト化し、上清のみを用いてシリカカラムで精製してください。濃縮されたライブラリーを定量し、品質チェックを行い、シーケンシングを行います。
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