10
10-minute
minute IHC for Frozen
rozen Tissue: Step by Step Procedure1) Fixation- After frozen tissue is cut onto slideslides,, immediately fix for 1 minute in Novodiax ihc
Fixative or reagent grade acetone(Alternative
lternative fixative solution
solutionss can be used based on user preferencepreference)- Place slides to soak in wash buffer until ready to proceed2) Blocker- 1st wash (wash buffer) – Use spray bottle to wash tissue on the slides- Wipe off excess wash buffer around the tissue with paper towel or Kim Wipe
- Apply blocker (covering entire tissue) and iincubate
ncubate for 1 minute
DO NOT WASH OFF BLOCKER- Hold slide vertical on a hard surface and tap off blocker onto a paper towel- Wipeipe off excess blocker around the tissue with paper towel or Kim Wipe
3) Antibody- Shake/mix antibody thoroughly before use- Apply antibody (covering entire tissue) and incubate for 3 minutes- 2nd wash (wash buffer) – Use spray bottle to wash tissue on the slides- Wipe off excess wash buffer around the tissue with paper towel or Kim Wipe
4) DAB- Preparerepare DAB working solution (1 drop Chromogen to 1 ml Diluent) using provided
supplies
supplies: Before opening DAB chromogen shake or tap down fluid to thebottom of vial to ensure that it is not in the cap.
- Use a plastic transfer pipette to dispense 1 ml of Diluent into an E
Eppendorf
ppendorf tube
- Use a plastic transfer pipette to dispense 1 drop ((equalequal to 30 µl) of Chromogen- Mix/invertix/invert well before use- Apply DAB working solution (covering entire tissue) and incubate for 3 minutes- 3rd wash (DI or distilled water) -- Use spray bottle to wash tissue on the slides- Wipe off excess water around the tissue with paper towel or Kim Wipe5) Hematoxylin and Coverslip- Apply Hematoxylin (by drop or ssoak)oak) and incubate for a time range of 15 seconds up
to 1 minute (time depends on strength of user
user’s Hematoxylin dye)th
- 4 wash (DI or distilled water) – Use spray bottle to wash off Hematoxylin- Wipe off excess water around the tissue with paper towel or Kim Wipe
- Apply mounting medium (a(aqueousqueous or permanent) and Coverslip of user preference凍結切片での 10 分 IHC：ステップバイステッププロトコール
1） 固定-

薄切した凍結切片をスライド上に乗せ、直ちに Novodiax ihc Fixative またはアセトン（試薬グレード）
で 1 分間固定する（ユーザーの好みに基づいて代替の固定液も使用可能）-

準備が整うまで洗浄バッファーにスライドを浸しておく

2） ブロッカー-

1 回目の洗浄（PBS-T） - スプレーボトルを使用してスライド上の組織を洗浄する-

ペーパータオルまたはキムワイプで組織周辺の余分な洗浄バッファーを拭き取る

-

切片全体を覆うようにブロッカーを滴下し、1 分間インキュベートする
ブロッカーを洗い流さない-

スライドを垂直にしっかりと持って作業台の上のペーパータオルにタップし、ブロッカーを落とす-

ペーパータオルまたはキムワイプで組織周りの余分なブロッカーを拭き取る

3） 抗体
-

使用前に抗体をしっかりと振り、混ぜる-

切片全体を覆うように抗体を滴下し、3 分間インキュベートする-

2 回目の洗浄（PBS-T） - スプレーボトルを使用してスライド上の組織を洗浄する-

ペーパータオルまたはキムワイプで組織周りの余分な緩衝液を拭き取る

4） DAB-DAB 反応液を作成する（1ml の希釈液に発色基質 1 滴）：DAB 基質は量が少ないため、蓋を開ける前にバイアルをタップまたは振り、蓋に DAB 基質が残らないようバイアルの底まで DAB 液を落とす-

マイクロチューブに希釈液 1 ml をピペット等で分注し、その中に DAB 基質液 1 滴（30μl）を加える-

使用前によく混合/撹拌する-

切片全体を覆うように DAB 反応液を滴下し、3 分間インキュベートする-

3 回目の洗浄（DI または蒸留水） - スプレーボトルを使用してスライド上の組織を洗浄する-

ペーパータオルまたはキムワイプで組織周りの余分な水分を拭き取る

5） ヘマトキシリンおよび封入-

ヘマトキシリンを（滴下または浸漬して）塗布し、15 秒〜1 分間インキュベートする（時間は使用者のヘマトキシリン色素の強度に依存する）-

4 回目の洗浄（DI または蒸留水） - スプレーボトルを使用してヘマトキシリンを洗い流す-

ペーパータオルまたはキムワイプで組織の周りの余分な水分を拭き取る

-

マウントメディア（水性等）とカバーガラスで封入する

参考
Novodiax ihc Fixative 組成： 375mL メチルアルコール、100ｍL 37％ホルムアルデヒド、25ｍL 氷酢酸

201805