平成20年度廃棄物学会研究討論会「アスベスト廃棄物処理に係る光学顕微鏡と電子顕微鏡の測定法の共通化について」
廃棄物試験・検査法部会

透過型電子顕微鏡法(TEM)(独)国立環境研究所
循環型社会・廃棄物研究センター
山本貴士

透過型電子顕微鏡(TEM)とは透過型電子顕微鏡(transmission electron microscope, TEM)：
高電圧(数十～数百kV)で加速した電子を試料に当て、透過した電子によって試料像を得る電子顕微鏡
 TEMの特徴


高倍率、高分解能である→通常のTEMで分解能は0.2nm前後
 電子線回折(electron diffraction, ED)の観察が可能→試料の結晶構造の把握
 特性X線のエネルギー分散型X線分光装置(EDS)等による分析が可能→試料の元素組成の把握「表面分析技術選書 透過型電子顕微鏡」
日本表面科学会編、丸善 (1999)
平成20年度研究討論会(2008/6/11、東京)

2

アスベスト分析におけるTEM法の長所

微細繊維まで観察できる

スタントン－ポッツの仮説では、発がん性の最も強い繊維は幅0.25µm以下の繊維とされる。この幅の繊維は光学顕微鏡での観察は困難

アスベストの同定の精度が高い


クリソタイル

クリソタイルの単繊維(幅数十nm)は管状構造を有するが、TEMにより管状構造の観察が可能
EDパターンの観察から、クリソタイル、角閃石系アスベスト、その他の繊維状物質の判別が可能
EDS分析により元素組成比を求めることで、アスベストの同定が可能

0.02µm(単繊維)
0.5µm

クリソタイル

アモサイト

繊維サイズの計測から重量濃度を推定可能

クリソタイルは円柱、角閃石系アスベストは角柱とみなして繊維の体積を求め、これに密度を乗じることで重量濃度を推定できる

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3

TEMによるアスベストの主な公定分析法
大気試料




水試料




JIS K3850-2(=ISO 10312)：アスベストを捕集したフィルターからそのままTEMグリッドを作製し、測定する(直接法)JIS K3850-3(=ISO 13794)：アスベストを捕集したフィルターを灰化後、溶媒に分散してろ過し、TEMグリッドを作製して測定する(間接法)
USEPA AHERA：アスベスト除去後のモニタリング法。直接法。5µmより長い繊維と短い繊維の繊維数濃度を求める
NIOSH 7402：間接法。作業環境空気を対象とする「水道とアスベスト」：アスベストをろ過したフィルターを灰化し、溶媒中に分散してろ過し、TEMグリッドを作製して測定する
EPA Method 100.1, 100.2：水中のアスベストをフィルターでろ過し、そのままTEMグリッドを作製して測定する。Method 100.2は長さ10µm以上のアスベストのみを対象とする固体(建材)試料

EPA 600/R93/116：偏光顕微鏡で繊維の同定が困難な場合や特に精度が必要となる場合のみ。水に分散してろ過し、TEMグリッドを作製して測定する
ISO 22262(策定中)
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TEMと光学顕微鏡による分析結果の比較（大気粉塵中のアスベスト）
高尾真一ら、環境中アスベストの光学顕微鏡法及び電子顕微鏡法による分析の比較、国立環境研究所研究報告、第131号(R-131-‘93)、37-48(1993)

クリソタイル解綿工程付近の大気粉塵中アスベストをPCM法とTEM法で計数
試料

位相差顕微鏡(PCM)

直接TEM注1

間接TEM注1
T(f/L)注2)

T/PCM

T1/PCM注2)

T(f/L)

T/PCM

T1/PCM注2)

1

118

1670

14.2

4.8

1519

12.9

2.42282

1634

5.8

2.4

1115

4.0

1.5

3117

1216

10.4

2.8

1250

10.7

3.1

4255

3558

14.0

3.8

1731

6.8

2.752782142

7.7

3.01538

5.51.8※単位はいずれもf/L
注１） 間接TEM：JIS法に採用されている方法で、セルロースメンブランろ紙を灰化後溶媒に分散させ、ポリカーボネートろ紙でろ過する。直接TEMとは、高尾らがOrtizらの方法を参考に採用した方法で、メンブランフィルターを直接TEMグリッドに載せる方法
注２） Tはアスベスト繊維（単繊維、束状、クラスター状、マトリックス状）で0.25µm以下も含む総数、T1は0.25µm以上の単繊維と束状繊維の総数•TEM法による繊維数濃度はPCM法の4～14倍•PCM法で観察可能な繊維幅で比較すると、直接TEMの値はPCM法の値と近くなる
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TEMと光学顕微鏡での観察面積の違い
300µm

80µm

PCM法：グレーティクルの大円(直径300µm)を1視野とし、100視野あるいは繊維数が200本に達する視野まで計数→観察面積は約7.1mm2

TEM法：200メッシュのTEMグリッドの目開き(一辺約80µm)を最低4目開き計数→観察面積は約0.026mm2

TEMでの観察面積は光学顕微鏡(PCM)の約270分の1•同一試料を分析した場合に、TEM法では(見かけの)検出下限が高くなる•フィルター上での繊維分布の均一性の影響をより強く受ける

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アスベスト含有廃棄物処理と確認試験法


アスベスト含有廃棄物の適正処理の必要性
アスベスト含有廃棄物の大量発生：アスベスト建材のストック約4000万ト
ン、年間発生量約100万トン、今後数十年発生が継続
 埋立処分困難：残余容量不足、跡地利用等による再飛散のおそれ 今後の方針：国の認定制度に基づく無害化処理(高温溶融等)を拡大


現行の無害化処理物の確認試験法(JIS A1481準拠)の問題点
X線回折法：定量下限が0.1%と高い
 位相差顕微鏡による分散染色法：細い繊維(<1µm)は観察できない アスベスト以外の繊維状物質をどう評価するか

高感度・高精度の無害化処理物の確認試験法が必要
固体の無害化処理物に適用可能
 アスベスト(クリソタイル)の単繊維まで確認できる
 アスベスト繊維が他の繊維と確実に判別可能
 繊維数に加えて重量濃度の情報が得られる


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無害化処理に係る試料群のTEMによる確認試験
方法の提案
無害化処理物（固体）に適用できる前処理法として水分散法を提案
前処理標準操作法

無害化処理物•粗粉砕(<5mm)•5g•無害化処理物中のアスベスト繊維の最大飛散可能量（風化、飛散）を水分散で代替•土壌・底質や集じんダスト等の前処理にも適用可能
水分散
•無じん水
•50ml(L/S=10)•200rpmで6h振とう

粗大粒子ろ別•篩(目開き75µm)•無じん水50mlで洗浄希釈•負荷量が50mg/filterとなるように調整

TEMグリッド

吸引ろ過•カーボン蒸着(20-30nm厚)•PCフィルター(孔径0.2µm, 47mmφ) •TEMメッシュ(200メッシュ, Cu)に載せる•溶媒でフィルターを溶解

透過型電子顕微鏡法(TEM法)における操作手順の詳細検討
・最小繊維幅、最短繊維長の決定
長さ0.5µm、幅0.05µm、アスペクト比3以上、繊維数、サイズ測定

ED（結晶構造）

TEM（繊維形状）

・繊維形状の記述方法
管状構造の有無、単繊維か繊維束の分類

0.02µm(単繊維)・アスベスト繊維の同定手順の明確化
ED(パターンの有無、アスベスト標準との比較)
EDS(主要元素(Mg、Fe、Si、Na、Ca)の組成比、他元素の有無)

0.5µm

・繊維数から重量濃度への換算方法∑各繊維の体積X密度(クリソタイル2.55、アモサイト3.43、クロシド
ライト3.37g/cm3)

Mg

クリソタイル標準

EDS（化学組成）

Si・記載方式の統一（繊維数と重量濃度）・定量限界：106f/g、µg/gオーダー
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keV

8

TEMによる繊維計数の妥当性の検討


目的：TEMによる計数のばらつき、重量換算濃度の妥当性の確認
方法：




クリソタイル標準物質(日測協)0.04mgを無じん水に懸濁してポリカーボネー
トフィルター(47mmφ、孔径0.2µm)に吸引ろ過 (A～Cの3枚作製)
カーボン蒸着後、フィルター小片を切り出してTEMメッシュ(Ni製、200メッシュ)に載せ、フィルターをクロロホルムで溶解してTEMグリッドを作製(3個)TEM(JEOL JEM-2010)で倍率10000倍でTEMグリッドを観察、クリソタイル繊維をサイズごとに計数(3目開き)長さ（µm)：＜1、1～3、3～5、5～10、10～20、＞20の6水準
 幅（µm) ：＜0.1、0.1～0.25、0.25～0.5、＞0.5の4水準


繊維数濃度(本/g)：C=N×Af÷(k×Ag×w)

N:繊維本数、Af:フィルター有効面積(=1200mm2)、k:観察した目開き数(=3)、Ag:目開
きの面積(=0.0064mm2)、w:試料の重量(=0.04×10-3g)


重量濃度(g/g)：クリソタイル繊維を円柱とみなし、各水準でのクリソタイル体積を求める。これにクリソタイルの密度(2.55g/cm3)をかけて算出
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9繊維計数の妥当性の検討－繊維数濃度
f/g

123

平均SD

RSD(%)

A－

5.9×1012

9.1×1012

7.5×1012－－

B

4.7×1012

1.1×1013

1.0×1013

8.8×1012

3.6×1012

41C

4.4×1012

5.9×1012

8.9×1012

6.4×1012

2.3×101236•繊維数濃度:6.4～8.8×1012
本/g。相対標準偏差は36～
41%

4035
30%

25

フィルター間のばらつきとメッシュ間のばらつきは同程度

2015105>0.5
0.25～0.5
0.1～0.25<0.10<1

1～3
Length(μm)

3～5

5～10
10～20>20

Width(μm)

平成20年度研究討論会(2008/6/11、東京)•サイズ分布：長さ3µm未満、幅0.25µm未満の繊維が大多数
10繊維計数の妥当性の検討－重量濃度mg

123

平均SD

RSD (%)

添加量比

A－

0.030

0.044

0.037

－－0.92

B

0.026

0.097

0.052

0.058

0.036

621.4

C

0.039

0.017

0.051

0.036

0.017

490.85•重量濃度：0.058～0.036mg、相対標準偏差は49～62%、添加量比は0.85～1.42520%

15105>0.5
0.25～0.5
0.1～0.25
Width (μm)
<0.1

0
<11～3

3～5

Length (μm)

5～10 10 20～>20

平成20年度研究討論会(2008/6/11、東京)•サイズ分布：長さ1～20µm、幅0.1～0.5µmの繊維の寄与が大きい。繊維数濃度で多かった幅0.1µm未満の繊維の寄与は少ない
11

TEM分析の共同分析によるバリデーション•目的：無害化処理物の試験法として提案した水分散TEM法について、試験法としての妥当性や分析精度について、共同分析により検証する•方法：スラグ溶出物、関東ローム土にアスベスト標準を添加した共通試料を作製、計数方法や繊維同定方法、重量換算方法を統一した上で複数機関によりTEM分析を行う
共通試料作製方法
溶融スラグ•軽く粉砕(<0.5mm)•5g

関東ローム土•篩がけ(<2mm)•5g

アスベスト添加•アスベスト懸濁液添加•超音波分散クリソタイル1.65µg
アモサイト2.84µg
クロシドライト1.86µg

水分散

粗大粒子ろ別•無じん水50mL(L/S=10)•200rpmで水平振とう•6時間•ふるい(目開き75µm)•無じん水50mLで洗浄

希釈• フィルター当たり負荷量がスラグで50mg、土壌で5mgとなるように無じん水で希釈•超音波分散参加機関で実施
吸引ろ過• ポリカーボネートフィルター(0.2µm,47mmφ)• デシケーター中で風乾• 1/2枚を配布

TEMグリッド• カーボン蒸着(厚さ20～30nm)• TEMメッシュ(Ni製、200メッシュ)に乗せる• フィルターを溶解

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TEM測定•倍率10000倍相当で3～4目開きを観察•長さ0.5µm, 幅0.05µm,アスペ
クト比3以上の繊維を計数

12バリデーションの結果－繊維の計数値
クロシドライト
標準のみ
51本/目開き

452
151
機関A
(NIES)
機関B

140
120
100

125
99

スラグ溶出物
30本/目開き

73

80
60

51

アスベスト標準品

スラグ溶出物

00

6

アモサイト

クロシドライトクロシドライト

アモサイト

クリソタイル

0

アモサイト

00

19

クリソタイル1515

23
13
クロシドライト

33
24 30
17

無添加

40
20

クリソタイル

180
160

185
172

無添加

目開き当たり繊維数200

関東ローム土
23本/目開き関東ローム土•アスベスト標準の計数値は2機関でよく一致した•スラグ溶出物、関東ローム土では計数値に最大3倍のばらつきがあった(試料調製の不均一)•目開き当たり繊維数はアスベスト標準品＞スラグ溶出物＞関東ローム土の順に減少する傾向があった(マトリックスによる目開きの被覆)
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バリデーションの結果－重量濃度
200220

極端に大きい数本の繊維のため過大評価

120

100

81808060

この2本を除くと、重量濃度は29.9µg/g(設定値比80.4%)となる

3530254640203622

繊維数201510重量の大き い繊維

50

アスベスト標準品

スラグ溶出物

関東ローム土-4-4-3-3-2-2

3×10

8×10

5×105×10

4×10

7×10

8×100×100×10

1.

2.

6.

1.

3.

7.

1.

4.

4.

＜＜＜＜＜＜＜＜＞-2-55×10
5.

＜-3-54×10
2.

＜-51×101.
＜

クロシドライト

アモサイト

クリソタイル

クロシドライト

アモサイト

クリソタイル

クロシドライト

アモサイト

クリソタイル0-4

重量換算濃度
設定値比(%)

140120410

166

180
160

繊維重量(ng)

スラグ溶出物+クロシドライト試料の繊維重量分布•重量濃度はアスベスト標準では設定値の80～166%と比較的よく一致したが、スラグ溶出物と関東ローム土でばらつきが大きかった•極端に大きな繊維の影響を除くと、スラグ溶出物や関東ローム土試料の重量濃度は、設定値より小さくなった(マトリクスによる目開きの被覆)
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スラグ溶出物のTEM像と計数
スラグ溶出物のTEM像(目開き)フィルターへの負荷量50mgでこの写真の通り。負荷量を増やすと、スラグ粒子による被覆面積が増え、繊維状物質の確認が困難になる

繊維状物質の計数
目開きを10000倍でくまなく観察し、長さ0.5µm以上、アスペクト比(長さと幅の比)3以上の繊維状物質を計数する
繊維状物質(長さ6.42µm、幅0.61µm)
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スラグ溶出物中のアスベストの分析結果
集計表

結果
繊維数濃度 (Mf/g)*

繊維数(f)

試料

総繊維

アスベスト

総繊維

アスベスト

SKS-1

73

040

<2

SKS-5110060<2

繊維数濃度(f/g)：
C=N×Af÷(k×Ag×w)
N:繊維本数、Af:フィルター有効面積(mm2)、k:観察した目開き数、Ag:目開きの面積(mm2)、w:試料の重量(g)*Mf/g: 106本/g
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分析法間で試料の前処理法及び計数法の共通化を図るための共同分析
共通試料
作製方法：スラグ水溶出物にクリソタイル標準懸濁液を添加し、フィルター(ポリカーボネート製、孔径0.2µm)でろ過して作製 アスベスト濃度：0.01%(w/w)、0.01mg/g
 配布形態：フィルターを配布


TEM分析
参加機関数：2
 測定方法：長さ0.5µm、幅0.05µm、アスペクト比3以上のクリソタイル繊維を計数。観察目開き数は1


結果
繊維数濃度、重量濃度ともに約3倍の開きがあった 重量濃度は設定値とオーダーは一致


機関 計数値

繊維数濃度(Mf/g)

重量濃度(%)

A246

1470

0.041

B

72

400

0.012

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まとめ


TEM法によるアスベストの分析


無害化処理関連試料のTEMによる試験方法の検討






クリソタイル標準を用いた計数の妥当性の検討において、TEMグリッド間での繊維数濃度のばらつきはRSDで36～41%、重量濃度のばらつきは49～62%。重量濃度の設定値に対する比は、0.85～1.4と妥当な値であった
共同分析(2機関)によるバリデーションにおいて、繊維数、重量濃度ともにアスベスト標準ではよく一致したが、マトリックスのある試料ではばらつきが大きい。繊維数、重量濃度とも、マトリックスのある試料では過小評価する傾向にあった
アスベスト含有廃棄物を処理したスラグ中のアスベストが、定量下限2Mf/gで分
析可能であった

分析法間で前処理法及び計数法の共通化を図るための共同分析

TEM法は微小繊維の観察が可能、繊維の結晶構造や化学組成からアスベストの同定が確実、重量濃度が得られる等、優れた分析方法である
反面、装置が高額、操作に熟練が必要、観察試料の作製や観察に手間を要するなど、分析コストは高い
光学顕微鏡と比較して観察可能な面積が小さく、単純に分析感度を比較した場合に光学顕微鏡より悪くなる、分析の再現性に難があるといった問題がある

2機関の間で繊維数濃度、重量濃度に約3倍の開き、重量濃度は設定値とオーダーは一致

今後の課題



TEM分析法の普及、操作手順の明確化(規格化)、精度管理データの蓄積確認試験法の必要とされる局面や媒体に応じた試験方法の選択
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参考：アスベストの種類
アスベスト

鉱物名

化学組成式

蛇紋石属(Serpentines)
クリソタイル(温石綿・白石綿)
Chrysotile

クリソタイル
Chrysotile

Mg6Si4O10(OH)8角閃石属(Amphiboles)
アモサイト(茶石綿)
Amositeカミングトン－グリュネ閃石
Cummingtonite-Grunerite(Mg<Fe2+)7Si8O22(OH)2

クロシドライト(青石綿)Crocidolite

リーベック閃石(曹閃石)Riebeckite

Na2(Fe2+>Mg)3(Fe3+)2Si8O22(OH)2

アンソフィライト
Anthophyllite

直閃石
Anthophyllite(Mg>Fe2+)7Si8O22(OH)2

トレモライトTremolite

透角閃石
Tremolite

Ca2Mg5Si8O22(OH)2アクチノライト
Actinolite

陽起石
Actinolite

Ca2(Mg,Fe2+)5Si8O22(OH)2

WHOの定義では、クリソタイル、アモサイト、クロシドライトの繊維で、長さが5µm以上、幅が3µm未満、アスペクト比(長さと幅の比)が3以上
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参考：TEM測定によるアスベストの同定フロー (JIS K3850)

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参考：アスベストの鉱物学的データ「アスベストモニタリングマニュアル(改訂版)」(環境庁、1993)

JIS K3850-2 附属書D
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参考：各種アスベストのEDSスペクトル「アスベストモニタリングマニュアル(改訂版)」(環境庁、1993)平成20年度研究討論会(2008/6/11、東京)

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