AMCoR
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蛋白質・核酸・酵素 (1998) 43(12):1910-1621.
カルシウムイオンとシグナル伝達 細胞内Ca2+ホメオスタシス Ca2+動員,排出機構
Ca2+ポンプ 形質膜と小胞体

鈴木裕

、
Ｂ、Ｃａ?+動員，排出機構

Ca2+ポンプ形賃膜と小胞体
鈴木裕

形質膜と小胞体膜に存在するCa2÷ﾎﾟﾝﾌﾟはCa2f排出系のなかでCa群に対する親和性が最も高く，細胞休止時における低鯛胞貿Ca2+レベルを設定し,細胞質Caaレベルの麟圏な制御に貢献する。これらの実体はCa2ﾔｰATPaseで,ATP分解によって得られるｴﾈﾙ
ｷﾞｰを利用したCa2余轍茜を行なう｡最近CD分子生物学的研究CD進展とともに，これら2種のCa2f-ATPaseの分子116造とそれに立脚したＩ耐送機鬮の理解が急速に深まっている｡また両者を繍成する各ｱｲｿﾌｵｰﾑOD機能と制iilにおける差異がしだいに明らかになり，細胞Ca2f代謝闘節における各アイソフォームの役割が推定されるようになってきた。
￣【Ca2.-ATPase】【Ca2余ポンプ】【形質膜】【小胞体】
はじめに形質膜Ｃａ2+‐ＡＴＰａｓｅ（plasmamembrane
Ca2+－ATPase；ＰＭＣＡ）と小胞体Ｃａ2.-ＡＴＰａｓｅのγリン酸基がＡｓｐ残基に転移したリン酸化中間体を形成するＰ型カチオン輸送ATPaseのメンパーである。

[sarco(endo)plasmicreticulumCa2.-ＡＴＰａｓｅ；

一方，両者の制御機櫛は顕著に異なり，ＰＭＣＡはカルＳＥRCA]はそれぞれ単一ポリペプチドからなる膜蛋白質で，高親和性Ｃａ2牛輸送部位をもち，ＡＴＰの加水分解に共役してＣａ群を細胞質から細胞外あるいは細胞内

モデュリン(CaＭ)，酸性リン脂質，各種プロテインキ

パンによる制御を受ける。本稿では本誌増刊号『カルCaa＋ストアである小胞体（ER）に汲み上げるＣａ…ポシウムイオンと細胞機能」（1988)以後の最近の発展にナーゼで制御され，ＳＥRCAの場合，心筋でホスホランンプである。この働きにより細胞質Ｃａ2＋は約l0-7HIに注目して，ＰＭＣＡとＳＥRCAの分子綱造と機能についまで低下し，それぞれの膜を介した浪度勾配は約10.000て整理を試みた。

倍にも達する。ＰＭＣＡは形質膜櫛成全盃白質のわずか

約0.1％にしかすぎない。骨格筋や心筋の場合ＳＥRCA
は主要な小胞体膜綱成盃白質で，迅速な筋弛緩を可能

Ｌアイソフオームと分布にしている。ＰＭＣＡとＳＥRCAは異なる迫伝子群によＰＭＣＡ（分子通127～145Ｋ）は相同性の高い（75～ってコードされ，さらに週択的スプライシングにより85％）４種類の異なる遺伝子1～４にコードされ．さら多数のアイソフォームを形成する。両者は，そのアミに部位Ａ,Ｃにおける選択的スプライシング（図１）にノ酸配列全体の相同性は約30％と低いが，柵造上多くより少なくとも２６柧類のアイソフォームを形成する')。

の共通点をもち，Ｃａ2＋輸送を可能にする共通のドメイ

部位ＡではＰＭＣＡ２～4で選択的スプライシングが起ン綱造を形成する。両者は，輸送サイクルにおいてＡＴＰ

こる。ＰＭＣＡ２では全長l35bpの選択的スプライシン

llirmhiSuzuki・旭Ⅱ|医科大学医学部医学科生化学第二銅座（〒078-8510旭111市西神楽四線５号3-】1）［DepaTtmentofBiochemis・

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1610

Ca2.ポンプ９１'よ骨格筋の遅筋と心筋の主要なアイソフォームで，また平滑筋でも発現する１Ｍ２１．ウサギ
SERCA2aは９９７アミノ酸残基からなり，Ｎ末端から９９３残基までの配列はSERCA2bと共通である。クラス２～４

図ｌ形質膜Ｃａ2.-ATPaseの選択的スプライシング部位（A，Ｃ）と槻能部位

ｍＲＮＡはいずれもSERCA2b

1～１０：腰貫通へリックス．Ｐ：アシルリン酸化部位，Ｆ：FITC楓湿部位［PMCA1bではそれぞをコードする。ＳＥＲＣＡ２ｂはれAsp475(P)およびLys601(F)ｌＰＬ：酸性リン脂質結合領錘ＣａＭ：ＣａＭ鯖合ド〆イン(SＡSERCA2aより４５(ヒト)』3)～

ＳＢ：サプドメインＡおよびＢ)．１．ｒ：自己抑制領壇の結合部位。［文献２より改変］

4９（ニワトリ）'4)残基長い゜
ＳＥＲＣＡ２ｂのｍＲＮＡはぽグにより４種類のアイソプオームを，PMCA3および４

とんどの細胞で確認されており，平滑筋や非筋細胞ででは４２および36ｂｐの挿入の有無によりそれぞれ２種は主要なアイソプォームでハウスキーピングＥＲＣa2.-類のアイソプォームを形成する。部位Ｃにおいて，ATPaseとして機能すると考えられている。999アミノ

PMCＡ１～3ではそれぞれ全長154,227.242ｂｐの選択酸残基（ラット）からなるＳＥＲＣＡ３はやはり非筋細胞的スプライシングにより５麺類，３狐類，７種類のアイで発現する'5)。常にSERCA2bとともに発現するが，ソフォームを，PMCA4では178ｂｐの挿入の有無によ

SERCA2bとは異なり発現レベルは顕著に組織に依存し，り２柧類のアイソプォームを形成する。ＰＭＣＡ１と４は小脳プルキンエ細胞，結腸のおそらく分泌件-k度細胞，

ほとんどの細胞で発現するのでハウスキーピングアイ

肺および気管上皮細胞，リンパ系細胞などＣａ2+取り込

ソプォームと考えられ，他方ＰＭＣＡ２と３は脳，骨格み･放出活性の高い細胞やＣａ2．シグナルが機能翻節に筋，心筋などで発現するIふ4)。ＰＭＣＡはＣａ2+移動力起とくに厳密に関与する細胞で高レベルに発現するU`)。

こる細胞面に局在することがさまざまな細胞で観察さ

SERCA2bと３がどのように役割を分担するのか，細胞れているs)。Fujimotoらは抗体標瓢法により，PMCAo）

内局在とともに興味深い問題である。なお，ＳＥRCAとと２４０Ｋイノシトールー1,4,5-三リン酸（IP3）レセプ

PＭＣＡからなるキメラの解析から，強い小胞体残留シ

ター槻盃白質7)がともにカベオラに局在することを血管

グナルがＳＥRCAのＮ末端85残基内に存在することが内皮細胞や平滑筋細胞などさまざまな細胞で明らかに示唆されている'7)。

し，カペオラがＣａ2+の排出と流入の役割を担うことを示唆した。この結果はまた，シグナルとしてのＣａ２．のＩＬ反応機構温度変化が最も必要とされる部位にカペオラが移動することによって，Ｃａ群の流入と排出の部位の変化がもたらされうることを意味し興味深い。
ＳＥRCA(分子迅105～115Ｋ）は相同性の高い(75～

図２(a)は筋小胞体(SR)Ｃａ塵十一ATPase(SERCA1a）を用いた多くの研究によって明らかにされているCaa＋

輸送機柳である。生理的基質はＭｇ･ＡＴＰ複合体であ85％）３$､類の異なる週伝子1～３にコードされ，さらるが，とくに断らないかぎり図および本文でもＡＴＰとに組Iiilあるいは分化段階に依存した遡択的スプライシ

略した。

ングを受ける。SERCA1a（成体型）と１ｂ（新生咀刑）Ｃａ２．に対する親和性からみると，サイクルにおいては骨格筋の速筋で発現するアイソフォームである&，'・ウ

酵素は高親和性（E川ＥＩ',ＥｌＰ）と低親和性（E2E3P）

サギSERCA1aは1.001アミノ酸残基からなり，そのの２つの状態をとる旧)。問親和性輸送部位へのＣａ週.結Ｃ末端残基がSERCA1bでは８残基に皿換されている。

合[pH7で解離常数(ka)＝0.3～0.5浜Ｍ，Hill係数＝SERCA2遺伝子からは組織に依存した選択的スプライ2]によって酵素が活性化され(ステップl)，続いて触シングにより４１Ⅲ類のｍＲＮＡ(クラスｌ～4)が生成す

媒部位に結合したＡＴＰ(Ｋ』＝4～5〆Ｍ)のγリン酸基

るｕｏｌｏクラス１ｍＲＮＡによりコードされるＳＥＲＣＡ２ａがAsp351Dj'-2])に転移してリン酸化中間体(EP)が形
1６１１

9２蛋白質核菌酵累Vol43No､1２（1998）

Ｃａ2十一ATPase活性のＡＴＰ温度依存性は単純なミカ(a）ＡＴＰ…岩…囑蔚…卿癖筈:…

エリスーメンテン型でなく高温度（～ｍＭ）のＡＴＰで活性は増大し23)，ステップ130)，ステップ53i)，および…|,，，鋤ﾄ．."＆￣ツー…－鼎一屋，て促進される。このサイクルは可逆的で，Ｃａ2+非存在
下，酵素はＰＩとMg2〒によってリン酸化され…5)，さ(b）

らに高溜度Ｃａ２．とＡＤＰを加えるとＡＴＰを生成す￣￣ (1)

薯アヴ
。､弓

○一一

ａ

●一一

□

る１s)。なお，Ｅ２Ｐ形成に伴い触媒部位は顕著に疎水性になることを示す結果とリン酸基転移の熱力学的考察
から，ＥＰの触媒部位における水の排除がＡＤＰ感受性

Ｓ

消失の本質であると示唆されている30)。
ステップ１におけるＣａ2+結合は協同的に作用する２|;|師｡ﾙ.。

０
Ｐ

ステップ6～732)が低親和性のＡＴＰ結合(後述)によっ～Ｐ－７ﾋﾞﾗ石Ｉ（

つの部位に逐次的に起こり(図２ｂ)，第１部位へのＣａ2＋結合により第２部位のＣａ2+親和性力電明に増大し，また第２部位へのＣａ2+結合で第１部位のＣａ器はきわめてはずれにくい状態となる37~3．)。２個のＣａ2+の内腔側への放出については，逐次的(fhnSt-in-HrSt-OUt)４０)か，
あるいはＣａ2+閉塞を解除する律速の榊造変化に続いて

●

(5)

_〆

図２筋小胞体Caz･-ATPaseの反応機楢（a）と輸送サイク
ルにおけるCar＋と輸送部位の挙動（ｂ）(a）outは細胞質側，ｉｎは小胞体内腔側を示す。（b）●，○：
Ca２．．－：Ｃａ2.の配位子を示す。［文献41より改変］－相性に起こる（図２ｂｗ`2)か議鎗が続いている。他
方，最近Ｃａ2+放出が二相性に起こる条件で，閉塞されている２個のＣａ2＋が２つの部位間で交換可能であることを示唆する結果も観察されている３，１。
ＰＭＣＡについては主として赤血球膜(主要なアイソ

フォームはPMCA4b)からＣａＭ親和性カラムを利用して輔製された酵素について反応機榊が調べられてきたLsl。Ｃａ2+輸送槻榊は基本的にはＳＥRCAと同榔だ成される(ステップ2～4)。このリン酸基転移にはステが，ＰＭＣＡでは細胞外に輸送されるCaa＋はＡＴＰ１分

ップ３で触媒部位に起こる榊造変化が必須である（後子あたり１個であるns)。またＰＭＣＡはＣａＭ結合(Ka＝述)。形成したＥＰはＡＤＰ感受型リン酸化中間体

10～100,Ｍ，ストイキオメトリーは１：１)により活性(EIP）で，そのアシルリン酸結合は高エネルギーリン

化され，Ｃａ2.の八ｍは１０～20浜Ｍから0.3～0.5/ｚＭに酸結合の一種であり，ＡＤＰを加えると速やかに逆反応低下し，輸送のI/h1oxは５～10倍埴大する。ＣａＭはによってＡＴＰを生成する慾2-241。ＥＩＰ形成に伴い輸送部ＥＰの形成と分解を促進し，またEj-E2平衡をＥ,側に位のＣａ2＋は膜の両側からアクセスできない閉塞状態とシフトさせると示唆されている。

なる23-27)。Ｅ`Ｐは焼いてＡＤＰ非感受型(低エネルギー型）リン酸化中間体（E2P）に椣造転移する（ステップ

IIL分子樹遣5)。この過程でＣａ2+輸送部位は内腔側を向き，同時に親和性が数千分の１に低下してＣａ2.が放出される。最１．２次構造予測と立体櫛造

後にアシルリン酸結合が加水分解され（ステップ6,7）

SERCA1aと２ａの疎水性度プロファイルに基づいた輸送の１サイクルが終了する。Ｃａ…放出に伴いＣａ2+１

２次榊造予測から，分子は疎水性の高い１０カ所のαヘ個あたり1個のＨ､がＥＰに内腔側から結合し、次のサリックス（Ｍ１～Ｍ10）で膜を貫通すると考えられていイクルでＣａ2+が再び結合する際，細胞質側に放出される８．Ｍ)（図３ａ)。Ｍ２からＭ３にかけて（Ｍ２/Ｍ３)およる28.20)。

びＭ４/Ｍ５には長い親水性細胞質領域があり，ヘリッ

1６１２

Ca2.ポンプ９３

る``)。ＰＭＣＡの疎水性度プロファイルもＳＥRCA1,2a，
３にほとんど等しく，同様の10回膜貫通ドメイン櫛造が予想されている(図１)1.2,s)。ＰＭＣＡのＣ末端細胞質

領域はとくに長く（SERCA1aでは２０残基に対し，ＰＭＣＡ４ｂでは160残基)，活性制御に関与する（後述)。

Ｍ４/Ｍ５ループにはアシルリン酸化部位（Asp351）
やＡＴＰアナログで親和標識される残基(後述)があり，
Ｐ型カチオン輸送ATPaselUlで保存されているいくつかの領域とＡＴＰ結合部位に特徴的なαヘリックスとβ楠造の規則的なくり返しがある。そこでヌクレオチド

結合部位の立体櫛造が，ホスホグリセレートキナーゼ，(b）

ヘキソキナーゼなどのドメイン柵造を参考に予想された（図３ａ)`ｱ)。ＡＴＰ結合部位はＮ,Ｐ,Ｈドメインから柵成され，ＡＴＰのγリン酸基がＰ,Ｈドメインに達する様子がわかるように頭部上端に描いてある。
SRCa2+‐ATPaseはＣａ3.非存在下パナジン酸により小胞体膜上でらせん状に配列してチューブ状結晶を形成
し，他方，界面活性剤で可溶化したSRCa2.-ATPase

は高濃度Ｃａ２．と脂質存在下で配列して平面を形成しＡ２

図３筋小胞体Ca2.-ATPaseのド〆イン棡追予測（ａ）と３次元樽造モデル化）(a）細胞質領域はＴ（トランスダクションハＰ(リン酸化)．Ｎ(ヌクレオチド結合LＨ（ﾋﾝｼﾞ)の各ﾄﾞﾒｲﾝを形成し，S(ｽﾄｰｸ）部分によりＭ（肌貫通）ドメインに接睨される。Ｐ．：アシル
リン酸化怒位（Asp351)．●Ｆ：ＦＩＴＣ標匝部位（Lys515)。各讃日

さらにそれが亜なりあった３次元結晶を形成する48)。

前者のチューブ状結晶を用いて，低温電子顕微鏡法
により14Ａの分解能でＣａ2+-ATPaseの３次元榊造が再檎成された(図３b)`，)。分子[120(高さ)×50×80Ａ］の形状は膜に対し著しく非対称で，その特徴は柳造予
測によく対応づけることができる。鳥の頭と首に似た細胞質部分の体積は全体の約70％を占め，内腔側領域の体積はわずか５％にすぎない。膜の厚さは３２Ａ，首通へリツクスの始まりと侭わりの残基番号を示した。［aは文献の部分（ストーク）は高さ約25Ａで２つのセグメント

47.ｂは文献49より改変］からなる。膜表面から約50Ａ上方，藩に相当するところに３つの塊に囲まれたくぼみが存在する。非加水分

クス構造のストークによって膜貫通へリックスに接続

解ＡＴＰアナログのβ,γ-bidentatechromium（Ⅲ）

される。Ｍ２/Ｍ３ループはＴ（SERCA1aではＡ１32‐

ＡＴＰ（Cr-ATP）を結合させた結晶では，このくぼみ

Ｑ238)ドメインを，Ｍ４/Ｍ５ループはＰ(N330-R505ハが埋まってみえるso)。この距離は蛍光エネルギー移動法

Ｎ（R505-P681)，およびＨ（P681-S741）ドメインをによりＡＴＰ結合部位と膜面との距醗として見祇もられ形成する。Ｎ末端とＣ末端にも親水性領域があり細胞た値51)にほぼ一致している。膜内領域は３つのセグメ

質側に露出している。この２次榊造モデルは抗体や盃

ントＡＢ,Ｃからなる。Ａはさらに細胞質側のストー

白質分解酵素などを利用したいくつもの実験結果によクに直結するＡｌと，内腔側の塊によりＢと結合するって支持されている0…。なお，SERCA2bの長いＣ末

Ａ２とに分けられる。これらのセグメントの櫛成につい端領域は疎水性が高く，１１番目の膜貫通へリックスをて現時点では次のように推察されている。Ｃａ違.輸送部形成することが予測され，実際SERCA2bのＣ末端は位形成に璽要なＭ４～Ｍ6,Ｍ８(後述)は太いＡに含ま

ＥＲ内腔側に存在することが抗体標識法で観察されていれ，ストークに直結するＭ２～Ｍ５はＡ１を，Ｍ6,Ｍ８
1６１３

9４蛋白質核酸酵緊ＶｏＬ４３Ｎｏ１２（1998）

IまＡ２を綱成する。細胞質側に比較的長いＮ末端領域

Lys297は内腔へのＣａ群放出のゲートとして５７)，Ｍ６／をもつＭ１は細胞質側の比較的大きな密度につながる

Ｍ７ループはCaa+力輸送部位へアクセスするための(あＣを，ほかの膜貫通へリックスより長く，しかも内腔側

るいはＣａ2+閉塞のための)ゲートとして機能することで長いループによりＭ８につながるＭ７はＢを綱成すが示唆されている88)。またＭ４とＭ５の細胞質側あるいる4…)。よりよい結晶の高分解能による解析でＣａ2.-は内腔側の膜表面近傍に存在する残基への変異導入はATPaseの構造が明らかにされることが待たれる。

ＡＴＰ分解とＣａ2+輸送の脱共役をひき起こす…7)。

２．Ｃａ2+輸送部位

3．触媒部位

ＡＴＰによるＥＰ形成やＣｒ－ＡＴＰによるＣａ2.閉塞G2）

SRCa野一ATPaseでＡＴＰ結合部位を柳成する残基には第１と第２の両部位へのＣａ群結合が必要であり，と結合部位の綱造の詳細が化学（親和）修飾を利用し他方ＰIからのＥＰ形成は第１部位へＣａ2+が結合するだて明らかになってきた。ＡＴＰのアデノシン部分の占めけで阻害されること，また正の協同性により第２部位

る領域に結合するフルオレセイン5-イソチオシアネー

へのCaz､結合は商親和性になることなどを指標にして，ト(FITC)はLys515を親和標識する(図３ａ)5,.60)。ア

SERCA1aの部位特異的変異により，Ｃａ量.の配位子とデノシン三リン酸ピリドキサールはＣａ2+存在下でして機能する残基の同定と識別が行なわれた翠-50)。そLys684を61)，Ｃａ2.非存在下でLys684とLys492をの結果，Ｍ４のＧＩu309,Ｍ５のＧｌｕ７７ＬＭ６のAsn796，

標識する")。Lys492はまた，２'､3'-0-(2,4,6-トリニト

Thr799,Ａｓｐ８０ｑＭ８のＧ】u908がＣａ３.結合に関与す

ロフェニル)-8-アジドーＡＭＰ(TNP-8-アジドーＡＭＰ）

ること，さらにGIu309とAsn796は第２部位の配位子，および-ＡＴＰ63)や７－アミノー4-メチルクマリン-3-酢酸

GIu771とThr799は第１部位の配位子であり，Asp800

サクシニミジルエステル`4)で標識される。８－アジドーＡＤＰは配位子として両部位に関与すること，GIu908は輸送

はThr532とThr533を標識する“)。

部位形成のための周辺残基としての役割をもつことがYamagataらはLys492がピリドキサール5'一リン酸示唆されている。このようにＣａ2+の配位子が複数の膜で修飾さ払その結果触媒部位へのＡＴＰ結合が阻害さ貫通へリックスに存在することは，これらのヘリックれることを見いだし，ＡＴＰやそのアナログによる修飾

スの適切な配向力塙親和性Ｃａ2+結合部位の形成に必須

抑制と酵素の保睡を解析して，Lys492は触媒部位に結で，また細胞質ドメインにおけるＡＴＰ分解と共役した合したＡＴＰのαリン酸基の占める領域に位画すると配向性の変化によってＣａ雪.輸送が起こることを意味す結論した｡`)。YamasakiらはLys492が3'-0-(5-プルる。これらのヘリックスに変異導入されたシステイン

オロー2,4-ジニトロフェニルルＡＴＰで親和修飾される残基11Mの架橋実験から，Ｍ４とＭ６は40.の角度で右巻ことを見いだし，Lys492は触媒部位に結合したＡＴＰきスーパーコイルを形成し，Glu309,Asn79aAsp800のリポース部分の3'－０Ｈ基側でｂｃｒ－リン酸基の近傍にはＭ４とＭ６の接触面に，Thr799はその側面に位圃す

位皿すると結講したoｱDoCa2+輸送の基質となるアセチることが示唆された`s)。そしてＭ５のGIu771をＭ６のルリン酸の分解活性やＰ,からのＥＰ形成をこれらの修Thr799に面して配団することにより，２つのＣａ群結合飾は阻害しないので，Lys492は触媒には必須でな部位が(膜中で上下にⅢなるのではなく)，横に並んで

い6oo67Dc

位回したモデルが提出されている…5)。ＰＭＣＡでは，

Kimuraらは1,2-シクロヘキサンジオン（ＣＨＤ）修Glu7710Thr799oGlu908はそれぞれAlaoMet，Ｃｌ、飾により，ATg489とArg678は)独媒部位に結合したに、襖されている。これらの皿換が，あるいはまたＭ５

ＡＴＰの三リン酸部分（おそらくはα-リン酸基）の占には荷賊残基のないことが，ＰＭＣＡでは輸送されるめる領域に，Arg505はアデノシン部分の占める領域のＣａ２．がＡＴＰ1個あたり1個である原因なのかもしれな

ごく近傍に存在すること，１次綱造上離れたこれらの領い。ＰＭＣＡでも保存されているG1u309，Asn796，

域からＡＴＰ結合部位が形成されると結論した63)。アセ

Asp800に相当する残基へ変異を導入すると，やはりチルリン酸からの正反応によるＥＰ形成やＰ$からの逆ＡＴＰからのＥＰ形成と輸送活性は消失する5`)。なお，

反応によるＥＰ形成は，これらの残基の修飾によりほと

SERCA1aでの変異導入により，Ｍ４の内腔側端のんど阻害されなかった。MclntoshらはLys492と1６１４

Ca2.ポンプ９５

Arg678がＡＴＰ結合部位の中で近接していることを，(Lys397-Val402)がこの制御に必須であることが示さ

グルタルアルデヒドによる架橋実験で示唆している６，)。

れている80)。

これらＰ,Ｎ,Ｈドメインに存在しＡＴＰ結合部位を榊成する残基のいくつかやＰ型カチオン輸送ＡＴＰａｓｅ

1V．Ｃａ群鰯送と構造変化間で保存されている残基について，変異導入により役割が推定されている52．ｱ･･71)。最近Lys492とその近傍残輸送部位へのＣａ’十結合はどのようにして触媒部位を基の変異体についての詳細な解析により，Ｐ型カチオン

活性化し，触媒部位はどのように挙助することによっ

輸送ATPaseiIHで非常に保存性の高いPhe487,Lys4I92てＡＴＰからエネルギーを取り出し，このエネルギーを

は基質ＡＴＰ結合(高親和性ＡＴＰ結合）と調節部位へ輸送部位に伝運するのであろう。ＡＴＰ分解とＣａ9.輸のＡＴＰ結合(低親和性ＡＴＰ結合)に必須の役割を果送が異なるドメインで，しかも離れた位固で共役する

たすことが明らかにされたね)。またこの解析により，のは，触媒部位と輸送部位が榊造変化を介したIong

Lys492は結合したＡＴＰのα-リン酸基のごく近傍に位

rangeの相互作用を行なうことによると考えられている。

皿するというYamagataら``)とYamasakiら67)の結Ｃａ2+輸送に伴う分子櫛造の変化についての解析が鎗が強く支持された72)。

SRCaz+-ＡＴＰａｓｅで進んでいる。酵素のトリプトファ

ＴドメインとＮ末端細胞質領域の役割はいままでほン蛍光は２個のＣａ2.の逐次的な結合（ステップ1）に

とんど理解されていなかった。最近SaiｎｏらはArgl98

伴い二相性に咽大する帥)。この変化は，脂質-蛋白質界がＣＨＤで修飾されＰ,とMg2＋からのＥＰ形成が阻害面に結合し，エネルギー移動によって膜内やそのごくされること，ＰＩとＭ9群からのＥＰ形成の遷移状態ア近傍のトリプトファン残基の蛍光を選択的に消光する

ナログを形成するＦ-＋Mgz+ね~７５)やパナジン酸＋Ca2＋イオノブォアA23187によって消失するので，輸Mg2+76,77)はこの修飾を抑制して酵素を保護することを送部位近傍の榊造変化を反映する82)。この二相性の変見いだした78)。Yamasakiらは，これらの遷移状態アナ化に対応して，Lys515を標識したFITC83)やＡＴＰ結

ログがHis5のジエチルビロカルポン酸修飾を著明に抑合部位近傍のCys674を標識した」V-アセチルーハノ'‐(５－制し，ＰＩとMg2＋からのＥＰ形成のこの修飾による阻

スルフォー1-ナフチル)エチレンジアミン(EＤＡＮＳ)84）

害から酵素を保麺することを見いだしたｱ，)。これらの残の蛍光もＣａ2.によりそれぞれ二相性に減少およびln大基の修飾はアセチルリン酸からのＥＰ形成を阻害しない。

する。高温度のA23187は，膜貫通ドメインのおそらく一方，アセチルリン酸から形成したＥＰの加水分解を著

深部のトリプトファン残基近傍に潜り込むことによっ明に抑制することがHis5修飾酵素で示された。以上よて，このＦ１ＴＣ蛍光の二相目の変化と酵素の活性化をりArgl98とＨｉｓ５は，ＰＩとＭ92.からのＥＰ形成(スブロックするo…)。このようにＣａ2+結合によって誘起テップ6)の遷移状態では触媒部位の一部を形成するかされる膜貫通ドメイン，さらに触媒部位の逐次的な綱

あるいはそのごく近傍に位画することが強く示唆され造変化に伴って酵索は活性化する。ＥＤＡＮＳ蛍光の増た。部位特異的変異によりこれらの残基およびその領大は定常状態蛍光異方性の増大を伴うので，Cys674近域の役割が明砲になると期待される。

傍の構造はＣａ2.結合によって迦励性がより束縛された状態になるa`)。他方，Cys344/Cys364領域の迦動性の4．制御部位制限はＣａ２．結合である種度解除されることが示唆されＰＭＣＡの長いＣ末端細胞質領域には．ＣａＭ結合ドている37)。アデノシン三リン酸ピリドキサールの標識部

メイン，自己抑制領域，プロテインキナーゼによって位がＣａ2＋で変化すること(前述)や，Ｈ,Ｔドメイン中リン酸化される残基が存在し，活性制御に関与する(後の特定部位のトリプシン38)やV8QO)切断に対する感受性述)。またＰＭＣＡのＭ２/Ｍ３ループには酸性リン脂質がＣａ群で変化することは上記の観察とともに，輸送部

結合領域が存在し，やはり活性制御に関与する。一方位へのＣａ2+結合による櫛造変化がＰ,Ｎ,Ｈ,Ｔの各ド

SERCAはこれらの制御部位をもたないが，心筋メインに及ぶことを示している。

(SERCA2a)ではホスホランパンによる制御を受け，ア

筆者らはCys674を標識したＥＤＡＮＳの蛍光変化とシルリン酸化部位（Asp351）のＣ末端側の特定配列ＥＰ形成の速度鏑的解析から，ステップ３のＣａz/酵素／1６１５

9６盃白質核酸酵累Ｖｏｌ４３Ｎｏ１２（1998）

基質複合体において，以後の反応の生起に必須な柵造

するＫ+'０１)の非存在下で，しかもKawashimaらが変化が触媒部位に起こることを明らかにした…｡)。さらE2P分解の選択的阻害剤として働くことを見いだしてに蛍光のスペクトルと異方性の解析から，この綱造変いた高浪度のlasalocid1o2j存在下)，ＥＩＰ→Ｅ２Ｐに伴化の結果Cys674近傍の椒造はより親水性で級んだ状態

いトリプトファン蛍光がさらに減少することを示した’03)。

になること，この状態はＥＩＲＥ２Ｐを通して保たれる

これらの変化はA23187によって消光された。以上より，ことが示された80)。Ｋｕｂｏらは基質分子の柳造のうちアステップ３で触媒部位において以後のステップの生起

デニン部分と触媒部位の特異的相互作用が，ステップに必須の櫛造変化が起こり，ステップ４と５で触媒部

３の榊造変化を著明に促進して迅速なＣａ2.輸送を行な

位の鯛造変化が逐次膜賃通ドメインに伝達され，輸送うために必須であることを明らかにした'0)。Daihoと部位の楢造を変化させてＣａ2+の閉塞と内腔側への放出

Kanazawaは特異的ジスルフィド結合のジチオスレイをひき起こすことが強く示唆されたICO)。

トールによる開裂にはＣａ2/酵紫/基質複合体の形成が必

部位特異的変異を導入するとＥｌＰ→Ｅ２Ｐの抑制をも須であること，そしてこの開裂はＥｎＰ→Ｅ２Ｐのブロッ

たらす残基が各細胞質ドメインやＭ4,Ｍ8,ｓ4,ｓ１な

クをもたらすことを見いだした９２)。Ｃａ2/酵素/基質複合

ど広範囲に存在する`2．…7)。またＴドメイン中の特定体における楢造変化はＴドメインやＨドメインにも及部位のトリプシン切断はＥｌＰ－Ｅ２Ｐの阻害をひき起こ

ぶことが，これらのドメイン中の特定部位がＣａ2＋とす88)。Asp351を囲むCys344とCys364の両方をjV-エ

ＡＭＰ－ＰＮＰの共存下でトリプシン切断から保護される

チルマレイミドで修飾するとＥｌＰ→Ｅ２Ｐは抑制され､o`)，ことによって示されている88)。

またCys344を標識したプロープの蛍光はＥＩＰ→Ｅ２Ｐで筆者ら93)およびObaraら,帥はさらに，触媒部位近傍変化するjos)。あらかじめＣａ2.で活性化した酵素に高浪の櫛造はリン酸基転移（ステップ4)，ＥｌＰ－且Ｐ（ス

度のA23187を加えると，A23187は膜貫通ドメインのテップ5）で逐次的に変化することをＥＤＡＮＳ標識酵

おそらく深部に潜り込みＥｌＰ－Ｅ２Ｐを選択的にブロッ素を用いて明らかにした。ステップ４をステップ３かクする0s)。このようなさまざまな観察は，上記の筆者らら分離して追跡することは，リン酸基転移が非常に速の結果とともに，分子の広範囲にわたる領域がＥ１Ｐ→

いＭｇ・ＡＴＰの代わりにＥＰ形成が著明に遅いＣａ・

E2Pの柵造転移に関与することを示している。またＭ４，

ＡＴＰ'３．，`)を利用することにより可能となった。またこ

Ｍ5,Ｍ6中の残基あるいはＳ５中のLys784への変異導の実験から，ステップ３の柵造変化は基質メタルイオ

入が，Ｅ２Ｐ分解の抑制３２.…？)あるいは促進Uo6)をもたらンの柧類によらず非常に速いが，ステップ４では生理

すことは，ステップ6～7でも膜貫通ドメインと触媒部

的基質メタルイオンであるＭｇ率が迅速な綱造変化とリ位との間に1ongrangeの相互作用が存在することを示

ン酸基転移を可能にすることが明らかとなった。ステ唆している。このように構造変化の相互伝達には分子

ップ４のリン酸基転移に水分子は直接関与しないことの広範囲の領域が関与すると示唆されているが，輸送が立体化学的解析によって証明されている，?)が，証者サイクルにおけるドメイン間の相対的動きは蛍光エネ

らは水分子はこの反応の活性化エネルギーを下げ，迅ルギー移動法で検知できるほど大きくないようであ

速なリン酸基転移を行なうために重要であることを強る４８．５１)。触媒部位で起こる榊造変化力細胞質ドメイン間く示唆した'8)。

のわずかなずれをひき起こし，さらにそれがストーク

このように触媒部位の構造はステップ3～5で連続して変化していく。これらの櫛造変化はどのステップでを介して膜貫通へリックスの配向性の変化を誘起するのかもしれない。

輸送部位に伝達され，その榔造を変化させるのだろうか。Ｃａエーで活性化した酵素にＡＴＰを加えるとトリプ

V、機龍単位

トファン蛍光は１～2％減少する３町。NakamuraらはＥＩＰが薪領する条件で，トリプトファン蛍光はＣａ2/酵

前述のようにSRCa2.-ATPaseのいくつかの反応ス

素/基間複合体では変化しないがＥｌＰ形成に伴い減少す

テップは低親和性のＡＴＰ結合によって促進される。殴ることを観察した'０｣CCI。次に笠者らはＥｚＰが選択的に近の部位特異的変異を利用した結果は，この鰯節部位

蓄積する条件下(E2P分解を促進してＥ２Ｐ蓄碩を抑制と触媒部位が１次榊造上は同一のものであることを強1６１６

Ca3.ポンプ９７<示唆している7通り(前述)。そしてこの鋼節部位はＣａ富.－ATPaseの分子間相互作用によって生じたことを示唆する多くの結果joｱ､108)やＳＲ膜上でＣａ2十一ATPaseは実際に２量体を形成していることが観察されている48’100)。

く示唆した。今後，Ｃａ2+-ATPaseの分子間相互作用の櫛造上，機能上の実体をさらに理解することがＣａ群

輸送とＡＴＰによる調節の機柵を明らかにするうえで必須である。

Nakamuraらは，分子間相互作用の結果Ｃａ群結合の速度論的性質が異なる２種類の分子が形成することを示唆している'１０．１$')。一方，界面活性剤で可溶化した単V1．活性制御と各ｱｲｿﾌｫｰﾑのi鱸特性、体でも正常なＣａ2+-ATPase反応が進行すること，調節部位は(ステップ４でＡＤＰを遊睡した)触媒部位で１．ＰＭＣＡあることを示唆する結果も提出されていてl1all3D，Ｃａ３＋のないＰＭＣＡ４ｂでは約28残基配列からＣａＭ結合ド輸送の機能単位が２m体か単遍体かについて意見は一致していない。

機能単位を明らかにするにはＡＴＰやＰ,でリン酸化される触媒部位,低親和性ＡＴＰ結合部位およびCa2+‐

選択的スプライシング部位Ｃにおけるペプチド挿入
メインが形成される(図l)n．5)。ＣａＭ結合ドメインはまた自己抑制領域を楠成する。プロテアーゼ処理や遺伝子操作によりこのＣ末端領域を除去するとＣａＭ結合と同様の活性化が起こり，これにＣａＭ結合ペプチド

ATPaseポリペプチド鎖のストイキオメトリーをまず(CaＭ結合ドメイン配列の合成ペプチド）を加えると確定することが必須である。筆者らはＳＲ小胞のＴＮＰ－

nativeな酵素のＣａＭ非存在下とほ１３吋司様の抑制されたＡＴＰ結合とそのＡＴＰによる阻害を解析し，Ｃａ2.-

活性が回復する１．s)。Ｃ末端領域を除去したＰＭＣＡ４ｂとATPaseにはＡＴＰでリン酸化される触媒部位１モルあＣａＭ結合ペプチドとの架栃実験から，ＣａＭ結合ドメ

たり１モルの高親和性ＡＴＰ結合部位(触媒部位）と１

インはリン酸化部位(Asp465)の前後，Ｔドメイン220

モルの低親和性ＡＴＰ結合部位が存在することを示し

番残基領域とＮドメイン540番残基領域に結合して自た''４)。さらにNakamuraらは，Ｃａ2.-ＡＴＰａｓｅｌ分子あたりＦＩＴＣ標鍛部位（Lys515）は１個であり，この親和標識はＡＴＰですべて抑制されること，さらにＡＴＰ己を抑制し，ＣａＭはこの結合を解離させると結諭されている(図１)。Ｎａ+,Ｋ+-ＡＴＰａｓｅのαサプユニットとトリーは０．５：１であることを示した`'5)。これらの結果

ＰＭＣＡのＣ末端165残基からなるキメラがＣａＭ感受性をもつという観察は，ＰＭＣＡの自己抑制領域と相互作用する領域がＰ型カチオン輸送ATPase間で保存さはＣａを十一ATPasel分子には１次綱造上１つのＡＴＰ結れている可能性を示唆している''０１．ＰＭＣＡの全アイソ合部位が存在すること，このうち半数がＡＴＰやＰ,でフオーム間でＣａＭ結合ドメインのＮ末端側18残基配リン酸化される触媒部位であること(haIf-of-the-sites
reactivity）を示し，輸送の機能単位がＣａ2十一ＡＴＰａｓｅ

列（SA，図l）はほとんど等しいが，そのＣ末端の部
位Ｃにおける選択的スプライシングはＣａＭ結合ドメイの２量体であることを強く支持するものである。

ンと自己抑制領域の櫛造を変化させる。ＰＭＣＡ４ｂは4ａやＰ,によるリン酸化とこのＦＩＴＣ楓識のストイキオメ

DaihoとKanazawaはＳＲ小胞のＣａ群-ATPaseのに比べ顕著に高いＣａＭ親和性をもち，ＣａＭ非存在

全システイン肚からＣａ2+-ATPaseポリペプチド鎖ｉｎを下では自己抑制領域との顕著に強い相互作用によって見積もることにより，リン酸化部位はやはりＣａ2+－
ATPase分子の半数であることを示した'２１。Daihoら731

活性はより強く抑制されている3.117)。除去するＣ末端領域の長さを変えた変異体の解析から。ＰＭＣＡ４ａのとＫｕｂｏｔａら?４１はさらに，Ｐ,とＭｇ３゛によるＥＰ形成

CaＭ結合ドメインは，４ｂよりさらに２１残基憂い配列の避移状態アナログを形成するＦ-＋Ｍｇ群の酵素へのから櫛成され，他方４ａの自己抑制領域はこのドメイン結合を解析し，ＳＲ小胞に存在するＣａ2+-ATPase分子内に存在するが，４ｂではＣａＭ結合ドメインとそのＣのうち半数のみが触媒的に活性（ＡＴＰやＰ,でリン酸末端側にある第２の領域から榊成されることがわかっ化される状態）でほかの半数は不活性（ATPやＰ,でた''７)。ＰＭＣＡ１の部位Ｃにおけるペプチド挿入はＣａＭ

リン酸化され）ｂＥい状態）であること，また活性な分子

親和性のｐＨ依存性に著明な変化をもたらす】，。

と不活性な分子は１Ｍg野と２F－の結合(および遊離）

ホスファチジルイノシトールー4,5-二リン酸(PIP2ハにおいて速度論的に等しく均一なものであることを強ホスファチジルイノシトール〈PIハホスファチジルセ
1６１７

９８蛋白質核酸酵素Ｖｏｌ､４３Ｎ０．１２（1998）

リンなどは，酸性リン脂質結合領域（図１，ＰＭＣＡ４ｂ

２．ＳＥＲＣＡ

ではLys339-Leu368）と相互作用してＰＭＣＡのＣａ'十ＣＯＳ細胞で発現したＳＥRCA各アイソプォームの機に対する親和性と輸送の脇血を増大させる1.5)。ＩP3や能特性が比較された'２，)。非筋細胞のハウスキーピング

ジアシルグリセロールはこの効果をもたない。部位Ａ

アイソフォームと考えられているSERCA2bはほかのにおける選択的スプライシングは脂質による活性制御

アイソフォームの約1/２の低いターンオーパー値をもを調節する可能性があるが，これらの制御がi〃DjDoでつ。SERCA2b変異体の解析からＣ末端12残基がこのＣａz+渡度調節にどのように貢献するかは明らかでない。

特性に亜要であることが明らかにされた'28)。限られたＣキナーゼにより平滑筋１１０)，心筋lll)，赤血球12｡)な

非筋細胞で高レベルに発現するSERCA3(前述)はほか

どのＰＭＣＡはリン酸化され，Ｃａ2+親和性と活性が増のアイソフオームに比べ，Ｃａ２．に対し有意に低い親和大する。赤血球膜Ｃａ2十一ATPaseにおいてＣキナーゼ

性でｂ輸送活性の至適ｐＨが高く，またパナジン酸によでリン酸化される残基の１つはＰＭＣＡ４ｂのＣａＭ結合

る阻害に対し感受性が高い。SERCA3と２aからなるキ

ドメイン中央のThrllO2であり，このリン酸化は自己

メラの解栃ｳﾊら，SERCA3のＮ/ＨドメインがＭ５/Ｍ１０

抑制領域の簡難をひき起こすこと，およびＣａＭ結合をの膜貫通領域との相互作用によって低Ｃａ選十親和性をも抑制することが示唆された'2．)。このThr残基はすべてたらすと結誼された'２，)。またSERCA3はSERCA2やのアイソフォームで保存されているが，Ｃキナーゼでほ１とは異なりホスホランパンに非感受性であり，ホスホ

とんどリン酸化されないアイソフォーム(PMCA2b,3b）

ランパンによる制御にはアシルリン酸化部位のＣ末端も見いだされている'3ID。さらにＰＭＣＡ２ａ,3ａおよび4ｂ側の特定配列が必須であることが示されている(前述)80)。

においてＣキナーゼで最も容易にリン酸化される残基

なお，心筋小胞体Ｃａ2.-ATPase(SERCA2a)のSer38

はこのThrでなくＣａＭ結合ドメインあるいは第２自は内在件睡結合Ca2VCaM依存性プロテインキナーゼ

己抑制領域中のほかの残基であり，しかもリン酸化のでリン酸化される'3｡)が，これにより輸送活性は増大す

効果もまったく異なることが観察され，初期に示唆さるj3j)か影孵されない!"･'33)か意見は一致していない。

れたThrllO2のリン酸化の意義は明確ではなくなってきた12】)。

ＳＥRCAの各アイソフォームを特異的に強く阻害し，PＭＣＡやほかのＰ型カチオン輸送ATPaseF1-

Ａキナーゼにより赤血球膜Ｃａ2.-ATPaseのＣａ2.親ATPase，イオンチャンネルなどには顕著な影轡を与え和性と活性が増大する。リン酸化された残基はない阻害剤としてタプシガーギン''0~u３６)，シクロピアゾ

PMCA1bにのみ存在するSerll78と同定されたl2zj。

ン酸03ｱ)，および2,5-ジー(タートープチル)-1-4-ペンゾ

ｃＧＭＰによって培饗ラット血管平滑筋細胞のＰＭＣＡに

ヒドロキノン（tBuBHQ)t38)が見いだされている。一

よるCaz､排出が促進され､23)，またウシ血管平滑筋から方，ＰＭＣＡの特異的阻害剤はみつかっていない。タプ糖製したＰＭＣＡはＧキナーゼでリン酸化されCa2+親シガーギンはＥ２状態のＳＥRCAに１：１のストイキオ

和性と輸送活性がjW大することが報告されている'2`)。一

メトリーで結合して(八.＝2pM13D】)dead-endcompIex

方，ｃＧＭＰによるブタ血管平滑筋のＰＭＣＡの活性化はを形成する。ＳＥＲＣＡ１とＮａ+Ⅸ.-ATPaseからなる

分子且240Ｋの蛋白質のリン酸化に伴って起こるとも

キメラの解析'４０．１“)とタプシガーギンアジド誘導体によ報告されているjzs)。チロシンキナーゼpp60症で血小板る標識実験'42)から，Ｓ３/Ｍ３にタプシガーギンの結合部や赤血球のＰＭＣＡを処理すると，また血小板のトロン位があることが示唆されている。シクロピアゾン酸やピン処理により，ＰＭＣＡ４ｂのTyrll76がリン酸化ざれ

ｔＢｕＢＨＱに対するＳＥRCAの親和性はタプシガーギン

酵素は著明に抑制される'２０)。他方，pp60…によりよりかなり低くＫｈは１浬Ｍ程度である。平滑筋細胞､PMCＡ１のTyT590がリン酸化されている可能性もある。

神経鴎星状細胞，下垂体細胞などでｂＥＲにはこれらの細胞Ｃａ2.代謝調節におけるＰＭＣＡの各柧キナーゼに阻害剤に対し非感受性のＣａ…ストアコンパートメント

よるリン酸化の愈義を明確にするには各アイソフォーが存在することが観察されている043.Ｗ)。またタプシガ

ムについて，またiDTDiDoでさらに情報を蓄積する必要ーギン存在下で生育できるようになった細胞のＣａ2＋スがある。

トアにはタプシガーギンでは阻害されないＣａ2.-ＡＴＰａｓｅが発現している145)。これらはＣａ2.-ATPase分子極の1６１８

Caa,ポンプ，，

ＥＲ膜状での分布や発現劉節などの点からも興味深い。

１６）ＷｕＫ､－，，Lee，Ｗ・-ｓ.，Wey，』.，BungardD.，
Lytton,〃Ａ腕.｣跡ysjbﾉ.,269,C775-C784（1995）

１７）Foletti,、.,Guerini,、,CarafOli,Ｅ､：“SEBノ.,9,
670-680（1995）

おわりにＡＴＰ分解とＣａ2+輸送の共役機柵について

１８）ｄｅＭｅｉｓ,Ｌ､､ViannaoA.Ｌ､：AJU"".Ｒ“.Bibdbc7".，

さらに深く理解するために本稿で述べたような課題が１９）Degani,Ｃ,,Boyer.Ｐ､、.：ＬＢＵｂＬＣＵｉｃ７18.,248,8222-

残されている。また細胞Ｃａ2.代謝調節にＰＭＣＡと48,275-292（1979）
８２２６（1973）

SERCAの各アイソフォームがどのように役割を分担し２０）Bastide，Ｆ,UMeissner,Ｇ，FIeischer,Ｓ,，Post，Ｒ、

貢献するのか，各アイソフォームの分布，発現調節，機能特性と制御などについての解析がさらに進展するこ

２１）Allen,Ｇ,Green,Ｎ､Ｍ､：Ｆ五ＢＳＬe".,錨,】88-192とによって理解されると期待する。最近植物でＮ末端

Ｌ､：ｊａｂＬＣ１ｈ”・’248,8385-8391（1973）（1976）

22）Makinose，Ｍ,：lう?lIgu漏Ａ冗力．Cesuz腕陀PhysmL/Ｉ化7TsUlbe〃７１℃７℃)294,R82-R83（1967）

細胞質領域にＣａＭ結合ドメインをもつＣａ2.-ＡＴＰａｓｅ23）Yamamoto,Ｔ､,Tonomura,Ｙ､:ノBibdhUjp3.,62,が同定されたM`)。植物あるいは酵母などでもＰＭＣＡや24）KanazawaT.，Yamada，Ｓ，Tonomum，Ｙ､：j

SERCAタイプの高親和性Ｃａ2+輸送ＡＴＰａｓｅについて

このように佃報が蓄積しつつあるが，本稿では紹介できなかった。

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