［医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス，PMDRS, 54（4），300〜311（2023）］

特集

mRNA 医薬―技術開発と求められる評価科学―

mRNA 医薬の品質評価項目と分析手法
山本 武範＊，内田 恵理子＊，井上 貴雄＊Quality Evaluation Points and Analytical Methods for mRNA-based Therapeutics
Takenori YAMAMOTO ＊ , Eriko UCHIDA ＊ and Takao INOUE ＊1. はじめに究所において筆者らが実施しているウェット研究かmRNA 医薬は，目的遺伝子をコードした長鎖の題についても併せて紹介する．

ら明らかになってきた品質評価に関する留意点と課

一 本 鎖 RNA で あ る「mRNA」 を 有 効 成 分 と し，mRNA から発現するタンパク質の作用により疾患の予防や治療を行う医薬品である．低分子医薬品やmRNA 医薬の構造・製造工程と2. 品質評価項目

バイオ医薬品，核酸医薬品とは分子構造や製造法が異なることから，品質評価の観点で特有の考慮事項

現在臨床開発されている mRNA 医薬の多くは，mRNA が脂質ナノ粒子（lipid nanoparticle: LNP）にが存在する．
このため，mRNA 医薬の分析については新規性封入された構造を有する．原薬である mRNA は一の高い手法 ･ 技術が求められる場面が多く，評価科

般に数千塩基の一本鎖 RNA からなり，5′末端から学の観点から，その分析能力，限界，再現性，堅牢

非翻訳領域，翻訳領域，3′
非翻順に 5′
キャップ，5′性などの検証が求められる．現時点では，mRNA

訳領域，100 塩基程度のポリ A より構成される（Fig.

医薬の標準的な評価法として認知された試験法は存1）．mRNA を構成する塩基（A・G・C・U）につい在しない。しかし，参考となる海外の規制関連文書ては，天然型 RNA のみで構成される mRNA を投与としては，感染症予防用 mRNA ワクチンに関するした際に生じる過剰な免疫応答を回避するため，多世界保健機構（World Health Organization：WHO）

くの場合，U（ウリジン）をのガイドライン1）

及び米国薬局方の品質試験手順2）

書 ，また，国内の規制関連文書として，新型コロ
ナウイルス mRNA ワクチンの審議結果報告書

3, 4）

並

5）

びに生物学的製剤基準（生物基） がある．

1

‑ メチルシュードウ

リジン等に置換した mRNA が用いられている．
mRNA 原薬の RNA 鎖は，直鎖化したプラスミド
DNA 等を鋳型とするインビトロ転写により合成され，更にキャップ化酵素などによるキャップ付加反

本稿では，mRNA 医薬の構造と製造工程並びに応を経て製造される（Fig. 2：インビトロ転写時に同考えられる品質評価項目を概説したうえで，上記の時にキャップを付加する製造法もある）．このため，規制文書に記載されている品質評価項目及び分析手

mRNA の品質評価項目として，mRNA の一次構造法を整理・解説した．また，国立医薬品食品衛生研（塩基配列），含量，全長 mRNAの含有率，5′
キャッ＊ 国立医薬品食品衛生研究所遺伝子医薬部 神奈川県川崎市川崎区殿町 3‑25‑26（〒 210‑9501）
Division of Molecular Target and Gene Therapy Products, National Institute of Health Sciences, 3‑25‑26 Tonomachi, Kawasaki‑ku,
Kawasaki City, Kanagawa 210‑9501, Japan300

医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス

Vol. 54 No. 4（2023）

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［山本ら：mRNA 医薬の品質評価項目と分析手法］

mRNA࢟ࣕࢵࣉ 5ƍ㠀⩻ヂ㡿ᇦཎ⸆〇๣࣭ࣜ࣎ࢯ࣮࣒ࡢ⤖ྜ࣭ච␿཯ᛂࡢᅇ㑊⩻ヂ㡿ᇦ3ƍ㠀⩻ヂ㡿ᇦ┠ⓗࢱࣥࣃࢡ㉁ࢆࢥ࣮ࢻ

⬡㉁ࢼࣀ⢏Ꮚ
(Lipid nanoparticle
㸸LNP)

Fig. 1

࣏ࣜA

mRNAࡢ
Ᏻᐃ໬

mRNA

mRNA 医薬の構造

キャップ付加反応㸸ホ౯ࡀᚲせ࡞ရ㉁㡯┠Fig. 2㸨㸸ྛ〇㐀ᕤ⛬࡛⏝࠸ࡿ㓝⣲㸦ṧ␃ࢱࣥࣃࢡ㉁㸧

mRNA 医薬の製造工程と評価が必要な品質項目

プ構造とその付加率，3′
ポリ A の鎖長とその付加率

鋳型 DNA 及び鋳型 DNA の製造時に混入する大腸などが考えられる．

菌 DNA/ タンパク質，RNA ポリメラーゼ等の酵素

また，製造工程において生成する可能性がある二本鎖 RNA（double‑stranded RNA：dsRNA）は炎などの残留が考えられ，これらが評価項目になると思われる．

症反応を惹起する可能性があることから，dsRNA

現在の主流である LNP‑mRNA 製剤については，の含量についても評価が必要と思われる．製造工程

上記の過程で製造された mRNA 原薬を pH 感受性脂由来不純物の観点では，インビトロ転写で使用する

質，ポリエチレングリコール（polyethylene glycol：

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301［山本ら：mRNA 医薬の品質評価項目と分析手法］

PEG）修飾脂質，ヘルパー脂質（リン脂質及びコレ

COVID‑19 パンデミックを契機に，WHO の生物学

ステロール）で構成される脂質成分の中に封入する

的 製 剤 の 標 準 化 に 関 す る 専 門 委 員 会（Expert

ことにより製剤化される．LNP はヌクレアーゼにCommittee on Biological Standardization：ECBS）

よる分解から mRNA を保護するとともに，mRNAに お い て 作 成 さ れ た も の で あ る． ド ラ フ ト 版 がを標的細胞に送達する役割があり，十分な有効性を2020 年 12 月に公開され，2021 年 7 月の修正案を経保持するためには，製剤としての種々の品質特性をて，2021 年 12 月に発出されている．

確認する必要がある．まず，製剤中の mRNA の一

COVID‑19 予防用 mRNA ワクチンの緊急開発を次構造，含量，全長 mRNA 含有率については，原支援するため，mRNA ワクチンの製造，品質管理，薬と同様に重要な品質特性であり，評価項目になる

非臨床及び臨床試験の一連の項目について規制上のと考えられる．これらに加えて，製剤に特有の評価

留意事項が整理され，取りまとめられている．

項目として，LNP を構成する脂質の含量，LNP へ

本文書の対象は，感染症の「予防」を目的としたの mRNA 封入率，粒子径とその分布（多分散性）が「ウイルスタンパク質（抗原）をコードする mRNA

挙げられる．更に，生物学的評価として，培養細胞を封入した LNP 製剤」に限定されている．mRNA

において目的タンパク質の発現を確認することも重原薬については，通常の mRNA に加えて，自己増要と考えられる．

殖型 mRNA も対象に含まれる．一方，疾病の「治療」を目的とする mRNA 医薬は本文書の対象外であ

規制関連文書に記載されている品質
3. 評価項目とその分析手法

り，モノクローナル抗体をコードする mRNA など
感染症の治療を目的とする mRNA 医薬も同様に対象外である．本文書には mRNA ワクチンの原薬及本項では，WHO から発出された感染症予防用び製剤の品質評価・管理に重要となる品質特性とそmRNA ワクチンに関するガイドライン「Evaluationの評価法が記載されており，概要としては「同一性，of the quality, safety and efficacy of messenger

純度，品質，安全性などを示すために包括的な分析

RNA vaccines for the prevention of infectiousを実施した後に，品質管理のために限定された試験

diseases: regulatory considerations, Annex 3, TRS,を設定することが適切である」としている．

No. 1039」1）， 並 び に 米 国 薬 局 方（United States

以下に，原薬及び製剤の双方について，本文書にPharmacopeia: USP）の品質試験手順書「Analytical

記載された品質評価項目と分析法の概要を述べる

procedures for mRNA vaccines quality（ドラフト（Table 1，2：WHO）
．

2）

初版）
」 を取り上げ，これらの文書に記載されている品質評価項目とその分析手法を概説する．

3.1.1

原薬

本文書に記載されている mRNA 原薬の品質評価

また，国内の文書として，ファイザー社及び武田 /モデルナ社の mRNA ワクチン（コミナティ筋注及び3, 4）

項目と評価に関する考え方は，以下のとおりである．

，並び

同一性：分子設計と原薬の同一性を確認するたに，これらの報告書に共通する規格試験が示された

め，mRNA の塩基配列を確認する試験が必要とさ

生物基〔コロナウイルス修飾ウリジン RNA ワクチ

れる．分析手法としては，逆転写産物のサンガー

スパイクバックス筋注）の審議結果報告書

5）ン（SARS‑CoV‑2）〕 について，提示された品質評

シーケンスに加えて，逆転写を行わず mRNA の配価項目と試験法を解説する．

列を直接読み取ることができる RNA シーケンス等が挙げられている．

3.1

感 染 症 予 防 用 mRNA ワ ク チ ン に 関 す る

定量・物性：mRNA 原薬における RNA 含量を定WHO ガイドライン

量する手法については，紫外分光法が例として挙げ

本文書（Evaluation of the quality, safety andられている．mRNA の構造の完全性 注 1 は重要品質

efficacy of messenger RNA vaccines for the

特性とされており，全長 mRNA と mRNA 断片の割

prevention of infectious diseases: regulatory合（全長 mRNA 含有率）
，5′
キャップ付加率，3′ポリ

1）considerations, Annex 3, TRS, No. 1039） は302

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A 付加率又は鎖長，混入する dsRNA の割合についVol. 54 No. 4（2023）

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Table 1

WHO，USP，生物基における原薬の品質特性項目と分析手法

WHO 1）項目

評価項目

USP 2）
分析法の例

項目

特

生物基 5）

性分析法

ダイレクト RNA
シーケンス
同一性

塩基配列確認サンガーシーケンス

mRNA 定量

試験名

分析法（記載なし）（記載なし）RNA 含量試験

紫外分光法

NGS
同一性

塩基配列確認サンガーシーケンス

NGS

RT‑PCR

紫外分光法

RT‑qPCR/
RT‑dPCR定量

RNA 含量

紫外分光法
定量
物性

全長 mRNA とmRNA 断片の割合，
dsRNA の割合
（全長 mRNA 含有率）
5′キャップ付加率

ゲル電気泳動，PCR，
クロマトグラフィー

純度

qPCR

未利用 NTPs，
キャップ，酵素，
mRNA 断片，dsRNA

クロマトグラフィー

キャピラリーゲル
電気泳動，
ゲル電気泳動RNA 完全性試験

キャピラリーゲル
電気泳動，LC

5′キャップ
付加率

IP‑RP‑HPLC

5′キャップ試験LC

3′
ポリA 付加率

IP‑RP‑HPLC

ポリ A 鎖試験

PCR，LC

鋳型 DNAqPCR

鋳型 DNA 試験

qPCR

dsRNA

イムノブロット

完全性

3′ポリ A 付加率・鎖長
鋳型 DNA

全長 mRNA
含有率

純度

RT‑PCR: 逆転写 PCR，NGS: 次世代シーケンス，qPCR: 定量 PCR，dPCR: デジタル PCR，IP‑RP‑HPLC: イオンペア逆相 HPLC，NTPs: ヌク
レオチド三リン酸，dsRNA: 二本鎖 RNA

Table 2
WHO
項目

WHO，USP，生物基における製剤の品質特性項目と分析手法

1）

評価項目

USP 2）
分析法の例

生物基 5）
試験名

分析法

確認試験

RT‑PCRRNA 含量試験

蛍光分光法
クロマトグラフィー

mRNA 完全性

キャピラリーゲル
電気泳動又は LC（記載なし）（記載なし）

脂質の種類・含量

脂質含量試験

HPLC

粒子径

粒子径及び
多分散性

動的光散乱法mRNA と脂質の比率（記載なし）（記載なし）mRNA 封入率mRNA 封入率

蛍光強度
又は吸光度

ダイレクト
RNA シーケンス
同一性

塩基配列確認サンガーシーケンス
NGS

含量mRNA 含量

紫外分光法

純度mRNA 由来不純物
脂質由来不純物（記載なし）

力価

インビトロ力価測定

トランスフェク
ション，
無細胞アッセイ

追加
管理
項目

多分散性

（記載なし）（記載なし）

注 1：mRNA 原薬における「完全性（integrity）」とは，mRNA の構造が欠落せずに全体として保持されていることを概念的に示す用語であり，これを確認するための評価項目としては，一般には，全長 mRNA 含有率，5′キャップ付加率，3′ポリ A 付加率（あるいは 3′ポリA 鎖長）の三つが想定されるケースが多い．

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303［山本ら：mRNA 医薬の品質評価項目と分析手法］て評価が必要とされる．多くの場合，3′
ポリ A は鋳子が関わっている．このため，力価の評価手法とし型 DNA にコードされ，インビトロ転写時に付加さては，培養細胞に製剤を添加する評価法（トランスれるが，インビトロ転写後にポリ A を付加する場

フェクションによる発現解析）及び無細胞タンパク

合にはポリ A 鎖長が多様になるため，特に慎重な質合成システムを利用した評価法（インビトロ翻訳）

評価が必要とされている．これらの分析法としてが挙げられている．これらの手法を用いたタンパク

は，ゲル電気泳動，PCR，クロマトグラフィーが挙質発現 / 翻訳のデータと臨床試験の結果の関連を精げられているが，個々の品質項目に対応する分析手

査することにより，選択した力価試験で品質管理を

法は明示されていない．

行うことの適切性を説明する必要があるとされてい

純度：鋳型 DNA や mRNA に組み込まれなかったる．

未利用ヌクレオチド及びキャップ，製造工程で用いその他の品質特性：そのほかに評価が必要とされる種々の酵素，mRNA 断片，dsRNA について評価

る品質特性として，外観，pH があり，浸透圧や粘が必要とされる．残留する鋳型 DNA は定量 PCR

性 等 も 時 と し て 重 要 で あ る と し て い る． 更 に，（quantitative PCR：qPCR），それ以外の不純物はク

LNP‑mRNA ワクチンに特有の追加管理項目としロマトグラフィーによる分析が推奨されている．

て，脂質の種類・含量，粒子径，多分散性，mRNA

安全性及びその他の品質特性：Table 1 に記載しと脂質の比率，mRNA の LNP への封入率の確認，た項目以外にも，安全性に関連する試験として，無及び LNP‑mRNA の構造が凍結により変化しないこ菌試験，微生物限度試験，エンドトキシン試験が挙と等の確認も必要としている．

げられ，発熱性物質試験が実施されることもあると記載されている．また，その他の品質特性として，
外観，pH，場合によっては粘性等が管理項目にな

安全性：安全性に関しては原薬に準じた試験が必要とされている．
以上のように，WHO ガイドラインには感染症予るとされる．

防用 mRNA ワクチンの原薬及び製剤に必要と考え

3.1.2

られる品質評価項目が挙げられている．一方で，分製剤

製剤（LNP‑mRNA）の品質評価項目としては，原析手法については，一部の評価項目で例示されてい薬と同じく，同一性，含量，純度，安全性等が挙げるに過ぎず，また分析法の詳細も示されていない．

られ，更に力価の評価が必要とされる．以下に各項目の概要を述べる．

3.2

米国薬局方（USP）の品質試験手順書

同 一 性： 原 薬 と 同 様 に， ワ ク チ ン に 含 ま れ る

USP は 米 国 連 邦 食 品 医 薬 品 化 粧 品 法（Federal

mRNA についても塩基配列の確認が必要とされる．

Food, Drug, and Cosmetic Act: FD & C Act）によ

含量：mRNA ワクチンは mRNA 含量に基づき投り認められている公定書であるが，日本薬局方と異与量が決定されるため，mRNA の定量が必要とさなり，非政府団体である USP Convention により発れる．特に混合ワクチンや多価ワクチンなど複数の行されている．本文書（Analytical procedures formRNA が 含 ま れ る ワ ク チ ン に つ い て は， 各 々 のmRNA vaccines quality：ドラフト初版）2）は，USPmRNA 量を定量し，比率を確認する必要があるとConvention が 2022 年 3 月に発出した mRNA ワクチ

している．

ンの原薬に焦点を当てた品質試験手順書で，評価す

純度：ワクチンの主たる構成要素である mRNA 及べき品質特性とその具体的な品質評価法に関して，

び脂質に由来する不純物，またワクチンの酸化や劣使用機器から試薬の組成に至るまでの実験条件や留化により生じる不純物について，mRNA の完全性，

意点などの詳細な情報が収載されている．

粒子径，脂質等の不純物などの観点から試験を検討すべきとされている．

本文書では，mRNA 原薬の品質特性を同一性，純度，含量，物性（完全性）に分類し，各品質特性

力価：適切な定量性を有する手法で力価を決定すの評価手法の詳細が示されている（Table 1：USP）．

る必要があるとされている．投与された mRNA ワ

製剤については示されていないものの，ここで取り

ク チ ン の 免 疫 原 性 の 獲 得 に は， 標 的 細 胞 へ の上げている品質評価法が LNP‑mRNA から抽出した

mRNA の送達やタンパク質への翻訳など複数の因

mRNA にも適用できるとされている．本ドラフト

304

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は，一般公開されている情報源から転用されているて，イオンペア逆相液体クロマトグラフィー（ion‑

方法を含み，産官学の代表者を含む USP の生物製

pair reversed‑phase high performance LC：IP‑RP‑

剤に関する科学専門委員会によって審査・発出されHPLC）解析を行い，キャップ付加体とキャップ欠たものである．

落体の量比を算出する方法が挙げられている．5′
末

以下に，本文書に収載されている個々の品質評価項目に対する分析手法の記載について概説する．
3.2.1

端領域の切断反応の条件及び IP‑RP‑HPLC の分離条件が示されている．
3′
ポ リ A 付 加 率： キ ャ ッ プ 付 加 率 と 同 様 に，

同一性同一性を確認するための分析手法として，次世代mRNA 原薬を切断して得たポリ A 領域を含む RNA

シーケンスとサンガーシーケンスによる塩基配列確

断片を IP‑RP‑HPLC に供し，ポリ A 付加体とポリ

認，及び reverse transcription PCR（RT‑PCR）がA 欠落体等を分離分析することで，ポリ A 付加率

挙げられている．次世代シーケンスについては，断を算出する方法が挙げられている．切断反応の条片化した mRNA 原薬の逆転写産物ライブラリーの件，LC での分離条件等が示されている．

作製法から，シーケンスデータの解析法まで各工程

3.2.4

純度

の手順と留意点が示されている．サンガーシーケン

原薬の純度試験として，製造工程由来不純物としスと RT‑PCR に関しても，各酵素反応の詳細な条ては残留鋳型 DNA，目的物質由来不純物としては件が示されている．

dsRNA の試験法が挙げられている．

3.2.2

残 留 鋳 型 DNA： 混 入 す る 鋳 型 DNA に つ い て，

定量

mRNA 原薬の含量の定量法として，mRNA を逆qPCR を用いた分析手順が示されている．

転写した後，得られた cDNA のコピー数を qPCR 及dsRNA：炎症誘導の可能性がある dsRNA についびデジタル PCR（digital PCR：dPCR）で測定するて は 管 理 の 必 要 性 が 記 載 さ れ て い る も の の，手法を挙げ，逆転写及び dPCR の反応条件が示されdsRNA の生成は mRNA の設計や製造工程に依存すている．また，紫外分光法によるモル吸光係数を用るため，特性評価に該当する可能性についても言及いた RNA 濃度の定量法については，定量の際の原されている．抗 dsRNA 抗体を用いたイムノブロッ

薬の希釈に用いる溶液組成や正確な定量のための留トによる dsRNA 検出の手順が示されている．
本文書（Analytical procedures for mRNA

意点が示されている．
3.2.3

2）
については，2023
vaccines quality：ドラフト初版）

完全性

mRNA 原 薬 の 完 全 性 と し て， 全 長 mRNA 含 有

年 4 月 30 日にドラフト第二版 6）が公開された．第二率，5′キャップ付加率，3′
ポリ A 付加率の三つにつ版では，原薬の品質評価として，トランスフェク

いて分析手法が示されている．

ション試薬を用いて培養細胞におけるタンパク質発

全長 mRNA 含有率：全長を保持した目的 mRNA

現を確認する力価試験，残留 T7 RNA ポリメラーと断片化された RNA をキャピラリーゲル電気泳動

ゼを含む複数の製造工程由来不純物に対する分析法により分離し，各ピークの面積比から mRNA の含等が追加されている．また，原薬に加えて，プラス有率を算出する分析手法を挙げている．具体的に

ミド DNA と製剤に関しても，品質特性と試験法がは，代表的な二つのキャピラリーゲル電気泳動装置追加されており，mRNA ワクチン開発の品質評価〔Fragment Analyzer（アジレント・テクノロジー

において，網羅的な品質試験手順書となっている．

社）及び PA 800 Plus（サイエックス社）〕について，
それぞれの装置を用いた場合の分析手順と泳動条件

3.3mRNA ワクチンの審議結果報告書が記載されている．また，変性アガロースゲルを用

本邦では，コミナティ筋注（ファイザー社）及びいた電気泳動による分離分析法に関しても，ゲル組

ス パ イ ク バ ッ ク ス 筋 注（ 武 田 / モ デ ル ナ 社 ） が成を含めた詳細な実験条件が示されている．

COVID‑19 予防用 mRNA ワクチンとして特例承認

5′
キャップ付加率：mRNA 原薬の 5′末端領域を，

を取得しており，それぞれの審議結果報告書 3, 4）が液体クロマトグラフィー（LC）での分離に適した鎖公開されている．これらの文書から両製品における長になるよう切断して得られた RNA 断片に対し品質評価の概要を読み取ることができる（Table 3）．

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305［山本ら：mRNA 医薬の品質評価項目と分析手法］

原薬の特性解析においては，mRNA の塩基配列試験，貯法及び有効期限の各項が記載されており，に関して，両社ともオリゴヌクレオチドマッピン

当 該 品 目 の 本 質 及 び 性 状 の 項 目 に は， 対 象 が

注2や次世代シーケンスを用いた解析を実施して「SARS‑CoV‑2 のスパイクタンパク質をコードする

いる．また，5′キャップ及び 3′ポリ A 鎖の構造にmRNA を含む懸濁液」であることが示されている．

ついて，IP‑RP‑HPLC‑MS を用いた解析を実施し製法の項目では，原材料，原液及び最終バルクにている．mRNA は分子内の非共有結合により高次分類して，鋳型 DNA，mRNA 原薬，LNP 化した製構造を形成していると考えられるが，この高次構造剤の製法がそれぞれ概説されている．試験の項目はについて，円偏光二色性スペクトル解析や示差走査

コミナティ筋注とスパイクバックス筋注に共通する

熱量測定による解析を実施している．以上のよう品質規格として規定されており，原液（原薬）に対に， 両 社 と も 先 駆 的 な 分 析 手 法 も 導 入 し て，する試験として，鋳型 DNA 試験，5′キャップ試験，mRNA の品質特性を詳細に解析している．

ポリ A 鎖試験，RNA 完全性試験，RNA 含量試験がグ

規格試験の評価項目に関しては両者で共通性が高挙げられている．また，小分製品（製剤）に対するいが，分析手法については異なる点がある．例え試験として，RNA 完全性試験，封入 RNA 試験，pH

ば，全長 mRNA 含有率の分析手法について，コミ

試験，エンドトキシン試験，無菌試験，RNA 含量

ナティ筋注ではキャピラリーゲル電気泳動を用いて試験，脂質ナノ粒子径及び粒子の多分散性試験，脂いるのに対して，スパイクバックス筋注では逆相

質含量試験，表示確認試験の概要が記されている．

HPLC を 用 い て い る． ま た，dsRNA に 関 し て は，
コミナティ筋注では規格として設定されているが，スパイクバックス筋注では設定されていない．これmRNA 原薬の品質評価に関する

4. ウェット検証の例

は，モデルナ社は独自の T7 RNA ポリメラーゼの開発 7）などにより，dsRNA の混入を低減した製法

以上，mRNA ワクチンの規制関連文書に記載さを確立したことにより，dsRNA に関する評価を規れた品質に関する評価項目と分析法の例を概説し格試験から除外したためと推察される．

た．今回取り上げた文書の間では，評価項目については共通点が多いものの，項目によっては対応する

3.4

分析手法が異なっていたり，複数の分析手法が挙げ

生物学的製剤基準（生物基）

本邦では，ワクチン等の生物学的製剤は，保健衛られていた．これを踏まえ，今後は各分析手法の分

生上特に注意を要する医薬品であるため，製造販売

析能力，限界，再現性，堅牢性等についてウェット承認を受けた後も製造ロットごとに国立感染症研究

検証を行い，各分析手法を mRNA 医薬に適用した所（感染研）が実施する国家検定に合格しなければ際の特性を明らかにするとともに，どのような場面

市場に出荷できない．生物基

5）は，「医薬品，医療機器等の品質，有効性及び安全性の確保等に関するでどの分析手法を用いるのが妥当であるかについて，整理していくことが重要と考える．

法律」に基づいて制定されたワクチン等の生物学的以降では，筆者らが実施している mRNA 原薬の製剤の製法，性状，品質，貯法等に関する基準集で品質評価に関する検討（Fig. 3）の一例を紹介し，あり，これを基に，感染研における国家検定が実施

ウェット研究から明らかになってきた品質評価におされる．生物基は，通則，医薬品各条，一般試験法

ける留意点と課題について述べる．

からなり，COVID‑19 予防用 mRNA ワクチンの承認申請を受け，2021 年 2 月，
「コロナウイルス修飾
ウリジン RNA ワクチン（SARS‑CoV‑2）
」が医薬品

4.1

全長 mRNA 含有率の評価手法

mRNA 原薬は翻訳領域のみならず，5′キャップ，
3′ポリ A などを含む mRNA としての完全な構造（完各条に収載された（Table 1, 2：生物基）．
生物基の医薬品各条には，本質及び性状，製法，

全性）を保持することが目的タンパク質の発現に必

注 2：断片化した RNA フラグメント群の塩基配列を IP‑RP‑HPLC 連結 MS/MS（タンデム質量分析）により同定し，目的 mRNA の塩基配列上にマッピングすることによって mRNA の塩基配列を直接解析する手法．

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［山本ら：mRNA 医薬の品質評価項目と分析手法］

Table 3
項目

mRNA ワクチンの承認品目における品質特性項目と分析手法
分析手法

試験

スパイクバックス筋注
塩基配列解析
（サンガー法），オリゴヌクレオチドマッピング a），次世代シーケンス

5′キャップ構造

IP‑RP‑HPLC‑UV/ESI MS b）

IP‑RP‑HPLC‑UV/ESI MS b）

ポリ A 鎖IP‑RP‑HPLC‑UV/ESI MS b）

高次構造

円偏光二色性スペクトル

RNA 配列
一次構造
原薬

特性解析

コミナティ筋注
オリゴヌクレオチドマッピング a）；
次世代シーケンス

高次構造

物理化学的性質（記載なし）

生物学的性質（記載なし）

塩基配列（記載なし）mRNA 完全性
目的物質由来不純物

RT‑PCR（非開示）

原薬

免疫ブロット

d）

qPCR

qPCR

qPCR

d）

鋳型 DNA逆相 ‑HPLC（試験なし）

規格試験

LC

逆相 ‑HPLC

逆相 ‑HPLCd）

PCR 又は LC

ddPCR

逆相 ‑HPLC

d）

mRNA

分光光度計

紫外可視吸光度測定法

塩基配列 d）

RT‑PCR

脂質（記載なし）mRNA 完全性 d）
目的物質由来不純物
純度試験
脂質不純物
生物活性
封入 RNA

粒子径及び多分散性

d）

d）

mRNA
脂質

キャピラリーゲル電気泳
動又は LC（記載なし）d）（非開示）

RT‑PCR

（非開示）

HPLC

逆相 ‑HPLC/CAD g）

キャピラリーゲル電気泳動

逆相 ‑HPLCHPLC

逆相 ‑HPLC/CAD（記載なし）d）

含量

スパイクバックス筋注

免疫ブロット f）

ポリ A

製
剤

コミナティ筋注

キャピラリーゲル電気泳動

5′キャップ

確認試験

翻訳，SDS‑PAGE，ウェスタンブ
ロット

キャピラリーゲル電気泳
動又は LC

二本鎖 RNAf）

含量

紫外吸光係数生物学的製剤基準

d, e）

純度試験

円偏光二色性スペクトル，示差走査熱量測定

分析手法

試験 c, d）
確認試験

（非開示）

（非開示）

In vitro 翻訳，SDS‑PAGE

蛍光強度又は吸光度

蛍光分析

（非開示）

動的光散乱法

動的光散乱法

動的光散乱法

蛍光強度又は LC

蛍光分析

イオン交換 ‑HPLC

HPLC

HPLC

逆相 ‑HPLC/CAD

a）

分析原理に関しては本文中で記載．
イオンペア ‑ 逆相 ‑HPLC‑ 紫外 / エレクトロスプレーイオン化質量分析
c）
性状，pH，エンドトキシン，微生物限度，浸透圧，不溶性異物，不溶性微粒子，採取容量，無菌の項目は表中に記載していない．
d）
現行の生物学的製剤基準（厚生労働省告示第 93 号，令和 5 年 3 月 27 日）5）に記載されている試験を示す．
e）
本文中における全長 mRNA 含有率を指す．
f）
生物学的製剤基準（厚生労働省告示第 42 号，令和 3 年 2 月 14 日）でのみ記載．
g）
荷電化粒子検出器b）

要である．このため，製造工程において mRNA の

相 ‑HPLC（スパイクバックス筋注）を用いて全長末端領域に軽微な分解が生じただけでも薬効の低下

mRNA 含有率の評価が行われている（Table 3）．

につながる可能性があり，全長 mRNA の含有率を

全長 mRNA 含有率の評価に当たっては，軽微な管理することが重要である．上述のように，国内で分解が生じた mRNA を全長 mRNA と区別して検出

承 認 さ れ た 二 つ の mRNA ワ ク チ ン に つ い て も，する分離条件を設定することが望ましいが，数千塩

キャピラリーゲル電気泳動（コミナティ筋注）や逆基に及ぶ mRNA をキャピラリーゲル電気泳動や LC

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307［山本ら：mRNA 医薬の品質評価項目と分析手法］

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国立医薬品食品衛生研究所で取り組んでいる mRNA 医薬の品質評価法

で分離した事例はほとんどなく，分離条件に影響を

売当初より同社の mRNA 分析用試薬キット・泳動条

及ぼす要因の詳細は不明である．筆者らは，特に件を用いることを前提としてシステムが構築されてキャピラリーゲル電気泳動における mRNA の分離いるため，分離条件の最適化を目的としたカスタマに影響を与える分析上のパラメータの整理を進めてイズには向いていないが，12〜96 検体の安定的なおり，以下にその概要を紹介する．

同時分析を可能としている．一方で，PA 800 Plusは自作したゲルや試薬が使用可能であることから，

4.2

キャピラリーゲル電気泳動法によるmRNA

多くの分析条件をユーザーが変更できるという特徴の分離に影響を与える因子があり，分離条件の最適化が可能である．PA 800

キ ャ ピ ラ リ ー 電 気 泳 動 法 は 内 径 100μm 以 下 のPlus は多検体の同時分析には対応していないが，キャピラリー内を電場として，この中を荷電試料がサイエックス社はよりスループット性を高めた機種

移動することに基づく分析法である．特に分子ふるとして，8 検体を同時分析可能な BioPhase 8800 のい効果を持つゲルを充塡したキャピラリー内で分離販売を開始しており，筆者らも活用している．

を行う手法をキャピラリーゲル電気泳動法と呼び，核酸を分子量に応じて分離することができる．
以 下， キ ャ ピ ラ リ ー ゲ ル 電 気 泳 動 を 用 い て

以下では，分析条件のカスタマイズに長けた PA
800 Plus を用いて取得したデータを基に，mRNAの分離条件を最適化するうえでの留意点を整理す

mRNA を分離する際に影響を与える分析上の要因

る．

について述べる．

4.2.2

4.2.1

ゲル担体

現時点で mRNA 分離に適した標準的なゲル担体

分析装置の特性mRNAの分離分析を目的としたキャピラリー電気は確立されていないが，古くはリボソーマル RNA

泳動装置として，現時点では Fragment Analyzerの 分 離 分 析 を 目 的 と し て， 直 鎖 状 高 分 子 で あ る（アジレント・テクノロジー社）と PA 800 Plus（サpolyvinylpyrrolidone（PVP）がゲル担体として用い

イエックス社）が広く用いられており，USP のドラられてきた 8）．USP の品質試験手順書においても，

フトにもそれぞれの装置を用いた場合の分析条件がPA 800 Plus を用いた分離条件のゲル担体に PVP が2）

詳細に記載されている ．Fragment Analyzer は販308

医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス

用いられている2）．また近年では，長鎖 RNA の分

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［山本ら：mRNA 医薬の品質評価項目と分析手法］

離 を 目 的 と し た 他 の ゲ ル 担 体 も 検 討 さ れて い る
9）に急冷する条件が用いられることが多い）．

が ，この論文では独自に内部修飾を施したキャピ

筆者らの検討では，泳動前に熱処理を行わない場

ラリーを用いているため，今後市販のキャピラリー

合には，その後，十分な変性剤を含むゲル溶液を用を用いて各ゲル担体の特性を検証する必要がある．

いてキャピラリーゲル電気泳動に供したとしても，

4.2.3

長鎖長の RNA のピーク幅が広くなり分離能が低下

ゲル濃度mRNA 試料をキャピラリーゲル電気泳動に供すすることを見出している．このことは，mRNA のると，試料に含まれる RNA はキャピラリー内で鎖高次構造の一部は尿素等の変性剤のみでは十分に変長に従って分離され，核酸塩基の紫外吸収等に基づ性しないことを示しており，熱処理との併用によっきピークとして検出される．市販の RNA ラダーて分離条件の最適化を図ることが重要と考える．

（様々な鎖長の RNA の混合物）を用いた筆者らの検

4.2.6

泳動温度

討では，ゲル濃度が低い場合には各ピークが近接し上述のように，mRNA が形成する高次構造の多分離が不十分になる一方で，ゲル濃度が高すぎる場

様性は加熱により低減させることができることか

合には，特に 4000 塩基長を超える長鎖 RNA のピー

ら，電気泳動中の温度も分離に影響すると考えられ

ク幅が広くなり分離能が低下する傾向が認められてる．サイエックス社のキャピラリーゲル電気泳動装いる．このようなデータを考慮すると，キャピラ

置（PA 800 Plus 及び BioPhase 8800）は，キャピラ

リーゲル電気泳動法のゲル濃度については，目的

リー温度を制御することが可能である．そこで，こmRNA の塩基長付近の分離能が高くなる条件に最の機能を用いて泳動時の温度を検討したところ，

適化することが重要である．

35℃の条件では 25℃と比較してより高い分離能を4.2.4示すことが確認された．このことは，泳動温度の適

変性剤

長鎖の一本鎖核酸である mRNA は，分子内において部分的に相互作用（非共有結合）することによ

度な上昇は RNA の分離能の向上に有効であることを示している．

り多様な高次構造を形成していると考えられる．高次構造の多様性は電気泳動で検出されるピーク幅を

4.3

キャピラリーゲル電気泳動による mRNA

広くし，目的 mRNA と塩基長がわずかに異なる不の分離限界

純物 RNA のピークを分離・検出することを困難に筆者らは，以上の留意点を踏まえ，「キャピラする．尿素等の変性剤は分子内に形成される非共有

リーゲル電気泳動の各分析パラメータを最適化した結合を解離させることにより高次構造をほどき，構条件で mRNA をどこまで分離できるのか」について

造の多様性を低下させる作用を有する．

検証を行っている．具体的には，コミナティ筋注及筆者らの検討では，尿素濃度が不十分な条件でびスパイクバックス筋注の mRNA 原薬の塩基長には，特に 3000 塩基以上の長鎖の RNA についてピー

近 い 約 4000 塩 基 長 の mRNA を 用 い て 検 証 を 行 っク幅が広くなり，分離能が低下する傾向が認められた．その結果，塩基長の約 5% にあたる 200 塩基以ている．このことから，長鎖の mRNA を分離する

上が欠損している場合には分離可能であるが，それ場合には特に十分量の変性剤を含むゲル溶液を使用より小さい軽微な欠損については評価が難しいことすることが重要である．

を見出している．

4.2.5

泳動前の熱処理

熱処理は RNA 分子内に形成される非共有結合を4.4mRNA の完全性評価における課題

解離させるため，一本鎖核酸の高次構造の多様性を

上述のように，mRNA 原薬は 5′キャップ，翻訳低下させることができる．このため，電気泳動の前領域及び非翻訳領域，3′ポリ A から構成されてい処理として，mRNA 試料に熱処理を施すことが分るため，mRNA の完全性の評価においてはこれら離能の向上に有効である．一方で，RNA は高温にの要素が評価される．キャップ付加率は mRNA のより分解が促進されるため，特に長鎖の mRNA に5′末端から 20 塩基程度の位置を配列特異的に切断

対して熱処理を施す場合には，分解の影響がない条して得られた RNA 断片を HPLC により分離し，得件を検討する必要がある（60〜70℃で短時間処理後られたクロマトグラムにおけるキャップ付加体とPharmaceutical and Medical Device Regulatory ScienceVol. 54 No. 4（2023）

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キャップ欠落体のピーク面積比から評価できる2）．

になる文書として，感染症予防用 mRNA ワクチン

ポリ A 鎖長に関しては，ポリ A 以外の領域を消化・に関する三つの規制文書及び本邦で承認された二つ精製して得たポリ A を LC‑MS 解析により評価できの mRNA ワクチンの審議結果報告書を挙げ，それ10）る ．一方で，全長を保持した mRNA に関しては，らの品質評価に関する記載を概説した．ここで示さキャピラリーゲル電気泳動で評価した場合には，例れた品質評価項目とその評価法は感染症を対象とす

えば全長が 4000 塩基長程度の mRNA の場合には，る mRNA ワクチンに限定したものではなく，今後，200 塩基以下の欠損は評価が難しい．

急速な進展が期待される治療用の mRNA 医薬にお以上の試験で評価可能な配列領域を総合すると，いても共通すると考えられる．

5′末端領域の一部（5′末端から 20〜200 塩基の領

また，本稿ではこれらの文書で挙げられている品域），又は 3′末端領域の一部（コミナティ筋注のポ質評価手法の一例として，キャピラリーゲル電気泳

リ A 鎖長を例にすると，3′末端から 110〜200 塩基動による全長 mRNA 含有率の測定法を取り上げ，の領域）の分解により生じる不純物は，いずれの試筆者らのウェット検証から得られた知見の一部を紹験でも評価できないことになる（Fig. 4）．

介した．キャピラリーゲル電気泳動や HPLC は他の今後，これら各試験法の守備範囲の伱間に当たる

モダリティの品質評価・管理においては，確立され領域をカバーできる評価手法の開発が必要と考えらた手法として汎用されているが，多様な高次構造をれ，一例として，LC‑MS/MS を用いたオリゴヌク

有する長鎖一本鎖核酸である mRNA を分析対象とレオチドマッピング（3.3．を参照）のような網羅的する場合には，その特有の物理的化学的性質を考慮

11）な RNA 配列・構造の分析手法が挙げられる ．本法した条件検討及び最適化が必要である．

に関しては，mRNA を LC‑MS/MS 解析に適した鎖

今後，候補となる各分析手法について，それらの長に断片化する必要があるが，現時点ではこの断片分析限界を明らかにするとともに，適切な分析のた化工程を十分に制御できていないため，今後最適なめの留意点を抽出・整理していくことが求められる．

断片化工程の確立が必要である．

また，既存の分析手法に加え，オリゴヌクレオチド
マッピングや RNA シーケンスなどの新しい技術を導入した分析手法についても，その特性を踏まえ

5. 終わりにて，十分に検証を行う必要があろう．

本稿では mRNA 医薬の品質評価を行う際に参考

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200 ሷᇶ
Fig. 4310

200 ሷᇶmRNA に対する各試験法の分析可能領域

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