［医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス，PMDRS, 54（5），439〜454（2023）
］

▲

投 稿

原著

複数種の液体クロマトグラフ質量分析計を用いたモデル核酸
医薬品の分析データの比較
廣瀬 賢治＊1,†，吉田 徳幸＊2,†，寺崎 真樹＊1，瀬崎 浩史＊3，唐澤 薫＊4，岩崎 了教＊4，高原 健太郎＊5，
滝口 直美＊6 ，関口 光明＊7，南海 浩一＊8，斎藤 恵美＊8，佐藤 秀昭＊9，大澤 昂志＊10，山口 卓男＊10，
伊藤 浩介＊11，川上 純司＊12，小比賀 聡＊10, ＃，井上 貴雄＊2, ＃（受付：令和 5 年 2 月 27 日，受理：令和 5 年 7 月 3 日）

Comparison of Analysis Data of Model Oligonucleotide Therapeutics Obtained with Different
Types of Liquid Chromatograph-Mass Spectrometers
Kenji HIROSE ＊1, †, Tokuyuki YOSHIDA ＊2, †, Maki TERASAKI ＊1, Hiroshi SEZAKI ＊3,
Kaoru KARASAWA ＊4, Noriyuki IWASAKI ＊4, Kentaro TAKAHARA ＊5, Naomi TAKIGUCHI ＊6,
Mitsuaki SEKIGUCHI ＊7, Hirokazu NANKAI ＊8, Emi SAITO ＊8, Hideaki SATO ＊9,
Takashi OSAWA ＊10, Takao YAMAGUCHI ＊10, Kosuke ITO ＊11, Junji KAWAKAMI ＊12,
Satoshi OBIKA ＊10, # and Takao INOUE ＊2, #Summary
In evaluating the quality of oligonucleotide therapeutics, it is necessary to pay close attention to the presence of＊1

日本ウォーターズ株式会社 東京都品川区北品川 1‑3‑12 第 5 小池ビル（〒 140‑0001）
Nihon Waters K. K., Koike No.5 building, 1‑3‑12, Kitashinagawa, Shinagawa, Tokyo 140‑0001, Japan＊ 2 国立医薬品食品衛生研究所 神奈川県川崎市川崎区殿町 3‑25‑26（〒 210‑9501）
National Institute of Health Sciences, 3‑25‑26 Tonomachi, Kawasaki‑ku, Kawasaki, Kanagawa 210‑9501, Japan＊ 3 アジレント・テクノロジー株式会社 東京都八王子市高倉町 9 番 1 号（〒 192‑8510）
Agilent Technologies Japan, Ltd., 9‑1 Takakura‑cho, Hachioji, Tokyo 192‑8510, Japan＊ 4 株式会社エービー・サイエックス 東京都品川区北品川 4‑7‑35 御殿山トラストタワー21F（〒 140‑0001）
K.K. AB SCIEX, Gotenyama Trust Tower 21F, 4‑7‑35 Kitashinagawa, Shinagawa‑ku, Tokyo 140‑0001, Japan＊ 5 サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社 神奈川県横浜市神奈川区守屋町 3‑9（〒 221‑0022）
Thermo Fisher Scientific Inc., 3‑9 Moriya‑cho, Kanagawa‑ku, Yokohama, Kanagawa 221‑0022, Japan＊ 6 住友ファーマ株式会社 大阪府吹田市江の木町 33‑94（〒 564‑0053）
Sumitomo Pharma Co., Ltd., 33‑94 Enoki‑cho, Suita, Osaka 564‑0053, Japan＊ 7 塩野義製薬株式会社 兵庫県尼崎市杭瀬寺島 2‑1‑3（〒 660‑0813）
Shionogi & Co., Ltd., 2‑1‑3 Kuise Terajima, Amagasaki, Hyogo 660‑0813, Japan＊ 8 味の素バイオファーマサービス株式会社ジーンデザイン 大阪府茨木市彩都あさぎ 7‑7‑29（〒 567‑0085）
Ajinomoto Bio‑Pharma Services, GeneDesign, Inc., 7‑7‑29 Saitoasagi, Ibaraki, Osaka 567‑0085, Japan＊ 9 ルクサナバイオテク株式会社 大阪府吹田市山田丘 2‑8 テクノアライアンス C 棟 C907（〒 565‑0871）
Luxna Biotech Co., Ltd., C907 Bldg. C, Techno‑Alliance Complex, 2‑8 Yamadaoka, Suita, Osaka 565‑0871, Japan＊ 10 大阪大学大学院薬学研究科 大阪府吹田市山田丘 1‑6（〒 565‑0871）
Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Osaka University, 1‑6 Yamadaoka, Suita, Osaka 565‑0871, Japan＊ 11 独立行政法人医薬品医療機器総合機構 東京都千代田区霞が関 3‑3‑2 新霞が関ビル（〒 100‑0013）
Pharmaceuticals and Medical Devices Agency, Shin‑Kasumigaseki Building, 3‑3‑2 Kasumigaseki, Chiyoda‑ku, Tokyo 100‑0013, Japan＊ 12 甲南大学フロンティアサイエンス学部（FIRST）生命化学科 兵庫県神戸市中央区港島南町 7‑1‑20（〒 650‑0047）
Faculty of Frontiers of Innovative Research in Science and Technology, Konan University, 7‑1‑20 Minatojima‑minamimachi, Chuo‑ku, Kobe, Hyogo 650‑0047, Japan† 共同第一著者 Co‑first authors# 責任著者 Corresponding author

Pharmaceutical and Medical Device Regulatory ScienceVol. 54 No. 5（2023）

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439

［廣瀬ら：複数種の LC‑MS を用いた核酸医薬の分析データ比較］

oligonucleotide impurities. As an analysis method, LC / MS, combining liquid chromatography (LC) and mass
spectrometry (MS), is generally used for quality assessment. However, since the physicochemical properties of active
pharmaceutical ingredient (API)-derived impurities are likely to be similar to those of the API, there are technicallimitations on their separation and purification. Therefore, it is important to be aware of such limitations and tounderstand the capabilities of the analytical techniques used in evaluating the quality of oligonucleotide therapeutics withdue consideration of the characteristics of the oligonucleotides and their manufacturing processes.
In order to achieve this, we analyzed model oligonucleotides using several different types of commercial liquid
chromatograph-mass spectrometers (LC-MS). We investigated the LC separation of impurities from the parent
oligonucleotide, the relative quantification of impurities, the characterization of the parent oligonucleotide, and theidentification of impurities. In the LC separation of the impurities from the parent oligonucleotide, none of the LC-MS
analyses achieved complete separation (Rs > 1.5) of all the major impurities. However, almost complete separations wereobserved between the parent oligonucleotide and three or more nucleotide-deleted oligonucleotide impurities. The relative
quantification of impurities was not consistent among the LC-MS instruments tested here, and inconsistent ion
suppressions or enhancements were observed. For the characterization of the parent oligonucleotide, the accuracy of
deconvoluted mass was demonstrated to be within 3 ppm for all LC-MS analyses, and MS/MS sequence analysis showed
100% coverage in more than half of the cases. For the structural estimation of impurities, the mass accuracy was within 2
ppm for all LC-MS analyses when impurities were spiked at 0.1% or more, and the MS/MS sequence coverage was 76%
or more when the spiked amounts of impurities were 1% or more. These results indicate that generally used LC/MS
methods could provide reliable information for estimating the composition of impurities present at a level of 1% or more.
Key words
Oligonucleotide therapeutics, Quality evaluation, Impurities, Liquid chromatography, Mass spectrometry

1. 緒言

製造過程や品質管理においては，不純物として混入

近年，アンチセンスや siRNA に代表される核酸

留意が必要である．具体的には，N 塩基長のオリゴ

医薬品の実用化が急速に進んでおり，2023 年 8 月まヌクレオチドにおいて，N‑1, N+1 塩基長などの鎖でに日米欧のいずれかで承認された核酸医薬品は，長の異なるオリゴヌクレオチド（ヌクレオチド欠損

アンチセンス医薬品 10 品目，siRNA 医薬品 5 品目

体 / 付加体）や，一部の塩基が変化したオリゴヌク

を含む 17 品目にのぼる．核酸医薬品は「核酸（ヌク

レオチド（塩基部変換体）がオリゴヌクレオチド類

レオチド）が十数〜数十塩基連結したオリゴヌクレ

縁物質として混入する．また，これら以外にも特にオチド」を有効成分とする医薬品であり，その分子アンチセンス医薬品で多く用いられている S 化オリ

量は数千から数万に及ぶ．また，ヌクレオチド間のゴヌクレオチド〔リン酸ジエステル結合部におけるリン酸ジエステル結合部に負電荷が存在することか

非結合酸素原子（O）の一つを硫黄原子（S）に置換

ら，分子全体としてポリアニオンの性質を有する

したホスホロチオアートオリゴヌクレオチド〕につ（ただし，電荷を持たないホスホロジアミデート結

いては，一部の S が O に変換されたオリゴヌクレオ合で構成されるモルフォリノ核酸はこれにあたらなチド（PSPO 変換体）が類縁物質として混入する 1, 2）．

い）．このような特徴から，核酸医薬品は低分子医

オリゴヌクレオチドは一般的に固相合成で製造され薬品や抗体医薬品などの既存の医薬品とは分離分析るため精製の機会が少なく，また，有効成分（原薬）における特性が異なり，特有の考慮事項が存在すであるオリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチド類

る．

縁物質は物理的化学的性質が類似していることかする「オリゴヌクレオチド類縁物質」の評価に特に核酸医薬品は化学合成により製造されるが，その440

医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス

ら，分離 / 精製には技術的な限界が存在する．このVol. 54 No. 5（2023）

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［廣瀬ら：複数種の LC‑MS を用いた核酸医薬の分析データ比較］ことから，核酸医薬品は一般的な化学合成医薬品と核酸医薬品の品質評価の在り方を議論する際には，比較して，不純物の含量（割合）が高い傾向にある．

核酸医薬品の分析技術の現状を把握することが望ま

核酸医薬品の品質評価の手法としては，低分子医れる．しかしながら，オリゴヌクレオチドの分離分

薬 品 や 抗 体 医 薬 品 と 同 様 に， 液 体 ク ロ マ ト グ ラ

析に関する知見については，解析対象であるオリゴ

フィー（LC）と質量分析（MS）を組み合わせた分

ヌクレオチドの構造（長さ，修飾核酸の種類 ･ 配置）

離分析法（LC/MS）が中心的に用いられる．核酸医や 解 析 に 用 い る 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ 質 量分析計

薬品の分離分析においては，LC については超高性（LC‑MS）の種類が各論文で異なっており，分離分

能液体クロマトグラフィー（Ultra‑High Performance

析の原理，機器のグレード，データ解析のアルゴリ

Liquid Chromatography : UHPLC あるいは UPLC）

ズム，分離分析の条件なども論文により異なる 4）．

が汎用されている．従来の HPLC が粒子径 5μm 程

したがって，核酸医薬品の分析技術の現状について

度のカラム充塡剤を用いるのに対し，UHPLC は

統一的な見解が得られておらず，また，分析技術の2μm 以下のカラム充塡剤を用いて，より高い線流

現状 ･ 限界を積極的に把握するための試みも行われ速で高い分離能を得ることを目的に開発された分離ていない．

技術であり，2004 年に市販機が販売されてから急以上の背景を踏まえ，本研究では，同一のモデル

速に普及した．原理や実用例については既報の論文

オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を 解 析 対 象 と し， 複 数 種 のに詳しく記載されているのでここでは省略する

LC‑MS で分離分析データを取得した．具体的には，

3）が ，HPLC と比較して分析時間が約 10 分の 1 とな

国内で LC‑MS を取り扱うアジレント社，サーモ

り，かつ数倍の分離能が得られる性能を有してい

フィッシャーサイエンティフィック社，エービー・

る．特に近年では，核酸医薬専用の種々の分離モー

サイエックス社，日本ウォーターズ社の 4 社においドの市販カラムが増え，UHPLC は核酸医薬品の品て，既承認の核酸医薬品であるミポメルセン及びヌ質評価のための汎用的な分離分析技術として定着しシネルセンの配列を元に作製したオリゴヌクレオチている．MS については，近年の著しい機器性能向ドについて，同じ試験項目を実施し，これらの分離

上と上述の UHPLC の組み合わせにより，医薬品開分析データを比較した．解析に用いる LC‑MS シス

発のあらゆるステージにおいて，中心的な分析技術

テムについては，実際に核酸医薬品の品質評価 ･ 品として活用されている．核酸医薬品の特性解析にお質管理に汎用されている機器とし，LC については

いては，特に精密質量情報から化合物組成を推定す

4 社全てが UHPLC を採用し，質量分析計タイプとる定性分析能力が重要となり，質量確度が数 ppm

しては 3 社が Q‑Tof で 1 社がキングドントラップ型

程度となるような高い性能が求められる（＊計算精を使用した（なお，ここでは UHPLC と MS の組み合

密質量と計測値の差の絶対値，又は百万分率 ppm

わせについても広義の LC/MS として略記していで表す）．また，分子量が数千を超える核酸医薬品

る）．分離分析の条件については統一せず，各社がを測定するためには幅広い質量範囲が必要で，更適切と考える条件を採用することとした．本研究でに，分子構造を推定するために実施する MS/MS 法

は，オリゴヌクレオチドの分離分析に関する最先端によるフラグメント解析機能や，不純物含量や純度技術（各社において最も性能が高い機種）を用いたといった量的評価に関する能力（定量性，ダイナ

わけではなく，あくまで，核酸医薬開発において現ミックレンジ，感度）も必須要件となる．これらを実的に採用可能な機器・手法を用いた点にご留意頂満たす代表的な質量分析計タイプとして，四重極飛きたい．

行時間型（Quadrupole‒Time of Flight : Q‑Tof）やキングドントラップ型があり，核酸医薬品の品質評
価の現場で汎用されている．
以上に述べた背景から，核酸医薬品の品質評価に

2. 実験方法
2.1

分析検体

あたっては，オリゴヌクレオチドの製造上の特性や本研究では，分析対象のモデル核酸医薬品とし物理化学的特性を踏まえた上で，技術的限界を意識て，既承認のアンチセンス医薬品であるミポメルセ

しながら分離分析を行っていく必要がある．また，

ン及びヌシネルセンと同一の配列 ･ 構造を有するオ

Pharmaceutical and Medical Device Regulatory ScienceVol. 54 No. 5（2023）

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441

［廣瀬ら：複数種の LC‑MS を用いた核酸医薬の分析データ比較］

リゴヌクレオチド（以下，本稿ではこれらをミポメ

ヌシネルセン：ルセン及びヌシネルセンと表記する）を用いた．ミ

5ʼ‑TmCAmCTTTmCATAATGmCTGG‑3ʼ

ポメルセンはオリゴヌクレオチドの両端の各 5 ヌク

ヌシネルセン 1 ヌクレオチド欠損体 5ʼ‑

レオチドに 2ʼ‑ ‑methoxyethyl（2ʼ‑MOE）を導入しm

た 20 塩基長の gapmer 型アンチセンスである．一

CAmCTTTmCATAATGmCTGG‑3ʼ
小文字：DNA方，ヌシネルセンは全てのヌクレオチドに 2ʼ‑MOE

大文字：2ʼ‑ ‑methoxyethyl（2ʼ‑MOE）を導入した 18 塩基長のアンチセンスである．ミポm

メルセンとヌシネルセンはともに，全てのリン酸ジmC：2ʼ‑MOE̲5‑methylcytosine
c：DNA̲5‑methylcytosine

エステル結合部にホスホロチオアート修飾を有する
S 化オリゴヌクレオチドである．不純物の相対定量

2.2

試薬

の解析においては，モデル不純物として各アンチセ

LC の移動相に用いたメタノール，アセトニトリ

ンスの 5ʼ 末端の 1 塩基を欠損させたオリゴヌクレオ

ル，トリエチルアミン（TEA）， , ‑ ジイソプロピ

チド（1 ヌクレオチド欠損体）を用いた．各オリゴ

ルエチルアミン（DIPEA），1,1,1,3,3,3‑ ヘキサフルオ

ヌクレオチドは味の素バイオファーマサービス株式

ロ ‑2‑ プロパノール（HFIP）は市販の LC グレード

会社ジーンデザインにて合成を行った．配列の詳細

あるいは LC/MS グレードを用いた．

を以下に示す．
ミポメルセン：5ʼ‑GmCmCTmCagtmctgmcttmcGmCAmm

C C‑3ʼ
mm

ミポメルセン 1 ヌクレオチド欠損体：5ʼ‑ C CT Ca
m

装置及び分析条件

各社が用いた LC‑MS システム及び分析条件を
m

m

2.3

m

m

m

m

gt ctg ctt cG CA C C‑3ʼ

Table 1 にまとめた．分析条件は，現時点で各装置において，今回のモデル核酸医薬品の分析に適してTable 1

各社の使用 LC‑MS システムと分析条件

液体クロマトグラフ

質量分析計

アジレント・ 1290 Infinity II LC
テクノロジー （Agilent）
社

6545XT
AdvanceBio
LC/Q‑TOF（Agilent）

Poroshell 120
HPH‑C18（Agilent）

A: 16 mM TEA, 400 BioConfirm（Agilent）
mM HFIP in Water MassHunter
Qualitative Analysis
B: Methanol（Agilent）
OligoSearch（Agilent）
Oligonucleotide
Sequencer（Agilent）

Prominence UFLC
エービー・
サイエックス XR（Shimadzu）
社

TripleTOF®
Kinetex® EVO C18
6600+ system （Phenomenex）（SCIEX）
ACQUITY UPLCTM
Oligonucleotide BEH
C18（Waters）

A: DIPEA, HFIP in SCIEX OS（SCIEX）
Water
PeakView®（SCIEX）
B: DIPEA, HFIP in Molecule Profiler
Acetonitrile/Water （SCIEX）

Q ExactiveTM
Plus Orbitrap
MS（Thermo
FisherScientific）

A: 15 mM TEA, 400 BioPharma FinderTM
mM HFIP in Water （Thermo Fisher
B: 15 mM TEA, 400 Scientific）
mM HFIP in 50%
Methanol/Water

サーモフィッ VanquishTM Flex
シャーサイエ UHPLC（Thermo
ンティフィッ Fisher Scientific）
ク社

分離カラム

DNAPacTM RP（Thermo Fisher
Scientific）

ACQUITY UPLCTM XevoTM G2‑XS ACQUITY UPLCTM
日本
ウォーターズ H‑class Bio Plus
QTof
Oligonucleotide BEH
社（Waters）（Waters）
C18（Waters）

442

医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス

移動相

データ解析ソフトウェア＊試薬，溶媒の濃度は測定項目ごとに最適化した

A: 15 mM TEA, 400 MassLynxTM（Waters）
mM HFIP in Water MaxEnt1TM（Waters）
B: 15 mM TEA, 400 TargetLynxTM
mM HFIP in 50%（Waters）
Methanol/Water
Promass for MassLynx（Novatia）

Vol. 54 No. 5（2023）

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［廣瀬ら：複数種の LC‑MS を用いた核酸医薬の分析データ比較］

Table 2
分離モード

核酸医薬の液体クロマトグラフィーで用いられる分離モード

分離原理

利点

欠点

MS 検出

分子サイズ

• 目的物とは異なる分子サイズを有する
不純物の分離（凝集体，分解物など）• 短鎖長から長鎖長まで対応• 分離能が高くない• 分子サイズの近い不純物は分離できない• 移動相に高濃度の塩を使用

原則不可• 短 い オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド（<20〜25
イオン交換電荷mer）で良好な分離
クロマトグラフィー（鎖長・修飾）• PSPO 変換体の分離に汎用（IEC）• 鎖長が長くなるほど分離能は低下• 移動相に高濃度の塩を使用

原則不可

逆相
クロマトグラフィー（RPC）• 保護基の有無を効果的に分離• 核酸塩基の弱い疎水性が保持の不規則性を引き起こす
可能性がある• 特に長いオリゴヌクレオチ
ドで分離能が低下する

可電荷・疎水性（鎖長）• 逆相カラムを用いるため分離能が高い• リン酸基由来の電荷数に基づき分離す
るため，鎖長の異なる不純物に有効（N‑1, N+1 体など）
• 揮発性のイオンペア試薬を用いればLC/MS 分析に適用できる• 鎖長が同じ場合は分離が困難（PSPO 変換体）
条件付可• 移 動 相 の 調 製 法 が 複 雑 で，保存安定性が低い

親水性
親水性相互作用クロマトグラフィー （塩基の種類
・修飾）（HILIC）• 目的物と同じ鎖長で塩基の違いにより分離できることもある• 不揮発性の塩を用いないので LC/MS
分析に適用• 鎖長の異なる不純物の分離への応用に期待• カラム種によって挙動が異なる• 逆相よりも分離能は高くない

サイズ排除
クロマトグラフィー（SEC）

イオンペア逆相
クロマトグラフィー（IP‑RPC）

疎水性

いると考えられる条件を各社が選択・採用した．

可長のミポメルセンについては、リン原子が 19 存在するため，2 19 ≒ 52 万種のオリゴヌクレオチドの混合物となる．このため，S 化オリゴヌクレオチドは3. 結果・考察
3.1

LC におけるピークがブロード化し，S 化されていないオリゴヌクレオチドと比べ，不純物との分離が目的物と不純物の LC 分離

核酸医薬品の品質評価を実施するためには，有効困難になる特徴を有する 5）．一般にオリゴヌクレオ成分（目的物）を不純物とできるだけ分離すること

チドの不純物は目的物よりも短鎖長の不純物の割合がまず重要である．この際，分離対象となる不純物が高いが，これら鎖長の異なる不純物を分離するにの構造によって適切な LC の分離モードが選択されは，カラム担体とオリゴヌクレオチドのリン酸基とることになる（Table 2）．例えば，目的物と分子サの保持効率を改善する目的で，逆相クロマトグラ

イズが大きく異なる凝集体や分解物を分離する場合

フィー（RPC）にイオンペア試薬（アミン類）を添

ではサイズ排除クロマトグラフィー（Size Exclusion

加するイオンペア逆相クロマトグラフィー（IP‑Chromatography : SEC）が用いられ，また，S 化オ

RPC）が汎用されている．この際の検出方法としてリゴヌクレオチドにおいて PSPO 変換体を分離識別

は，目的物と不純物のピーク面積比から純度を算出

す る 場 合 に は， イ オ ン 交 換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ーする場合には UV 検出が必要となり，目的物の確認（IEC）が選択される．本研究で測定検体として用いや不純物構造の推定，並びにピーク未分離の不純物

るミポメルセン（20 塩基長）及びヌシネルセン（18の量的な評価をする場合には MS 検出も必須とな

塩基長）はいずれも S 化オリゴヌクレオチドであるる．そのため，LC/MS のイオン化法であるエレク

ことから，リン原子（P）の立体異性に由来するジトロスプレーイオン化法（ESI）と相性の良い揮発アステレオマーの混合物となる．例えば，20 塩基性のイオンペア試薬や pH 調整用の添加剤を使用しPharmaceutical and Medical Device Regulatory ScienceVol. 54 No. 5（2023）

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443

［廣瀬ら：複数種の LC‑MS を用いた核酸医薬の分析データ比較］て，これら検出器を直列で組み合わせて用いる場合

ミポメルセンの MS データから各社で共通して確が多い．本節の解析では，ミポメルセン及びヌシネ

認された短鎖長の五つの不純物ピーク（①から⑤）

ルセンの純度が 90‑95％（LC 分離したオリゴヌクレに注目し，分離度，含量（％）を Table 3（a）にまオチドの UV 面積値を基に算出した純度：以降，LC

とめて比較した．なお，ここでは日本薬局方での計純度）となるように精製したものを測定検体として算方法に準じて分離度（Rs）を算出しており，Rs が用い，IP‑RPC の UV 検出クロマトグラムから目的

1.0 以上であれば二つのピークを十分に識別可能，物を含むピークと不純物ピーク，並びに不純物間の1.5 以上であればピークが完全分離しているとみな

ピークの分離度を評価した．また，各ピークの面積

し，データを評価している．Table 3（a）を見ると，百分率（％）を算出し，汎用的な品質評価試験法をピーク①から⑥の溶出順は各社で一致していた．

見据えて現状と改善点を把握すべく考察した．

Rs について見てみると，ほとんどの場合で 1.0 以上

ミポメルセンの IP‑RPC クロマトグラムの一例をを示しており，ピーク同士を識別するには十分な結

Fig. 1 に示した．目的物を含む主ピーク（⑥）前後果となった．各社の Rs を比較したところ，目的物に複数の不純物ピークが観測されており，このうちを含むピーク⑥と⑤については A 社と D 社は完全

ピーク⑥より前に検出されているピーク①〜⑤につ分離を達成したが，C 社では Rs=1.4 と完全分離にいては，短鎖長の不純物（5ʼ 末端から 2 塩基欠損体

至らず，B 社では未分離であった．その他の不純物（N‑2）から同 6 塩基欠損体（N‑6））が主要成分であピーク間の Rs を見ると，A 社，D 社ではピーク①ることを同時に取得した MS データ解析から確認しと②が完全分離していなかった．一方で，B 社と Cている（Table 3）．また，1 塩基欠損体（N‑1 体）の社では A 社，D 社と比較して，不純物ピーク②とピークは確認できておらず，ピーク⑥に含まれると③，並びにピーク③と④間の Rs が比較的大きく各考えられる．A 社から D 社の 4 社を比較した際，概社で差異がみられた．各ピークの面積百分率（％）

ねクロマトグラムのパターンに共通性は確認できるをみてみると，目的物を含むピーク⑥は各社ともが，用いたカラム，移動相組成，グラジエントなど

96％以上で得られており，3 社（A 社，B 社，D 社）

LC 条件はそれぞれ異なるため，データ細部においで 98％台と共通していた．また，不純物①から⑤ては差異も見られた．

の面積百分率は各社とも 1％未満で共通していた．

ᣑ኱
⋇

⋋

⋌

⋊
⋉
⋈

Fig. 1

目的物と不純物の LC 分離例

ミポメルセンの IP‑RPC クロマトグラム（UV 検出，B 社のデータ）を示す．

444

医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス

Vol. 54 No. 5（2023）

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［廣瀬ら：複数種の LC‑MS を用いた核酸医薬の分析データ比較］

Table 3

目的物と不純物の分離度及び面積百分率（a）ミポメルセン
ピーク 主要成分

A社

B社

C社

D社

R.T.

分離度

%

R.T.

分離度

%

R.T.

分離度

%

R.T.

分離度

%

①

5ʼ N‑6

1.29

‑

0.12

8.35

‑

0.96

7.63

‑

0.34

4.24

‑

0.18

②

5ʼ N‑5

1.47

1.19

0.43

9.11

1.758

0.07

8.17

1.94

0.15

4.47

1.29

0.22

③

5ʼ N‑4

1.96

1.62

0.20

10.30

2.988

0.34

8.83

3.12

0.36

4.80

2.41

0.24

④

5ʼ N‑3

2.87

2.12

0.45

11.83

3.684

0.45

9.38

2.61

0.47

5.15

2.26

0.35

⑤

5ʼ N‑2

4.03

2.19

0.10

‑

‑

‑

9.84

2.28

0.37

5.40

1.75

0.37

⑥

FLP

5.06

1.91

98.70

13.33

2.855

98.10

10.31

1.40

96.53

5.71

1.61

98.52

（b）ヌシネルセン
ピーク 主要成分

A社

B社

C社

D社

R.T.

分離度

%

R.T.

分離度

%

R.T.

分離度

%

R.T.

分離度

%

①

5ʼ N‑9

1.57

‑

0.05

7.42

‑

0.13

6.50

‑

0.17

3.58

‑

0.13

②

5ʼ N‑8

2.29

1.37

0.11

8.79

2.215

0.15

7.61

2.53

0.12

4.04

2.17

0.11

③

5ʼ N‑7

2.98

1.34

0.07

9.31

0.818

0.16

8.33

2.3

0.13

4.33

1.33

0.1

④

5ʼ N‑6

4.01

1.77

0.10

10.54

2.233

0.19

8.93

2.33

0.23

4.72

1.58

0.15

⑤

5ʼ N‑5

4.88

1.82

0.09

11.56

2.188

0.29

9.39

1.84

0.29

5.02

1.32

0.21

⑥

5ʼ N‑4

5.51

1.57

0.17

12.44

1.997

0.42

9.83

1.76

0.48

5.26

1.23

0.3

⑦

5ʼ N‑3

6.07

1.53

0.22

12.69

0.578

0.39

10.17

1.47

0.46

5.41

1.03

0.45

⑧

FLP

7.32

2.85

99.08

14.2

3.072

96.18

11.05

2.40

98.13

5.97

2.70

98.19

FLP：Full Length Product（目的物），R.T.：Retention time（保持時間 , 単位は分），% : 面積百分率
表中の分離度は該当ピークの前のピークとの分離度を示している．また，分離度 1.5 未満のピークについて，グレーでハイライトした．

ただし数値のばらつきは見られ，例えば A 社と B 社

96％以上，3 社（A 社，C 社，D 社）で 98％以上でではピーク①の面積百分率が B 社で 8 倍高かったのあった．不純物①から⑦の面積百分率は各社ともに対し，ピーク②では A 社で 6 倍以上高いという結

0.5％未満で共通していた．数値のばらつきは 3 倍程果であった．なお，Table 3（a）ではピーク①から度が見られたものの，ピーク⑥と⑦の面積百分率が⑤以外の不純物ピークの面積値を記載していないた

高い点で各社共通していた．

め，面積百分率の合計が 100％にはならない点に注意されたい．

4 社の LC 分離条件は，IP‑RPC モードで pH 調整用の酸として HFIP を用いている点で共通している

同様にヌシネルセンのデータを Table 3（b）にまが，カラム種やグラジエント条件は異なる．特に Aとめた．ミポメルセンと比較して多くの短鎖長不純社と D 社では目的物ピークが 10 分以内に溶出する物ピーク（N‑3 から N‑9）が各社共通で確認された．

条件で測定している．これはピーク分離よりもス

N‑1 体，N‑2 体については，目的物を含む主ピーク

ループット性を重視したためであるが，より長いカ⑧との分離ができていないため確認できなかったと

ラム長（150 mm 程度）の使用，あるいは移動相グラ考えられる．ここでもそれぞれのピーク間の Rs は

ジエントの調整，並びにアミンや酸の変更などの検各社で差異が見られ，ミポメルセン同様に Rs が 1.5

討により，ピーク分離は改善できると予想される．

以上を示したピーク対が半数以上であり，一部を除

しかしながら，オリゴヌクレオチドの製法上，鎖長き Rs は 1.0 以上であった．各ピークの面積百分率の異なる多様な不純物が完全にはピーク分割されず（％）
については，目的物を含むピーク⑧は各社ともに連続的に溶出するクロマトグラムになることは避Pharmaceutical and Medical Device Regulatory ScienceVol. 54 No. 5（2023）

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445［廣瀬ら：複数種の LC‑MS を用いた核酸医薬の分析データ比較］

けられず，更にホスホロチオアート修飾した場合に塩基欠損体を主成分として，そのリン酸付加体，及は 1 箇所につき 1 対のジアステレオマーが生じてび 3ʼ 末端の 2 塩基欠損体の存在が示唆された（Table

ピークがブロードになるため分離能が下がる．加え

4（b））．つまり，低分子医薬品と核酸医薬品の違いて今回のデータでは，面積百分率 1％以下の不純物として，UV クロマトグラムのピーク面積から純度

ピーク面積の比率が各社で異なる結果が示された

算出や不純物の含量を算出する際には，他の類似不が，UV クロマトグラムの複雑さや分離能の限界に純物が共存している可能性が高いという点に留意すよるものと考えられる．全ての不純物ピークをクロべきである．そのような場合には，より分解能が高マトグラフィーだけで完全に分離するのは困難であく，質量の違いで各成分を分離識別できる MS スペ

るため，MS 検出を併用して，マススペクトル上でクトルのイオン強度により定量を行うのが一般的で不純物を分離識別する方法が現実的であると考えらある．Table 4 には各成分のイオン強度とそこかられる．

算出した相対比率を示している．各成分の ESI 法に

次に，UV クロマトグラム上の各ピークを構成す

よるイオン化効率は厳密には同等ではなく，またイる成分に注目し，質量分析のデータを解析した．

オン化の際に競合が起こることは周知の事実ではあ

IP‑RPC では主として鎖長に応じて保持力が決まる

るが，これらのイオン強度の数値は各成分の存在量ため，同じ保持時間帯に複数の成分が同時溶出するを反映しているとみなされている．これらの数値かことがある．Table 4 にミポメルセン分析時に得ら

ら相対定量することの妥当性については次の節で述れた代表的な解析結果を示した．目的物（計算精密

べる．

質量 7172.0916）のピーク⑥が溶出する 5.71 分には，質量の異なる成分が複数種確認され，そのうち 2 種

不純物の相対定量（イオン化抑制 / 促進に

3.2

は 5ʼ 末端並びに 3ʼ 末端の 1 塩基欠損体であった．まついて）たそれ以外にも 2 種のピークが明確に帰属でき，そ

品質評価試験の重要項目として，不純物の定量分

れ ぞ れ の 質 量 か ら PSPO 変 換 体（ 計 算 精 密 質 量

析がある．代表的な不純物の一つとしてヌクレオチ

7156.1144）及びシアノエチル基付加体（計算精密質

ド欠損体（N‑1 体）があげられるが，前節でも示し

量 7225.1181）であると推定された（Table 4（a））．

たようにスループット性を重視した汎用的な IP‑

同様にピーク⑤が溶出する 5.40 分には，5ʼ 末端の 2

RPC で は 全 長 の 目 的 物 と は ピ ー ク 分 離 で き な い

Table 4

同一保持時間を示す不純物の質量分析例（ミポメルセン , D 社）（a）ピーク⑥目的物（5.71 分）
計算精密質量（Da） 測定精密質量（Da）

質量確度

イオン強度

相対比率

配列

7172.0916

7172.107

0.0154 Da（2.1 ppm）

2.20E+09100

目的物（全長）6779.0156

6779.024

0.0084 Da（1.2 ppm）

1.41E+070.64

3ʼ 末端の 1 塩基欠損体

6753.0252

6753.032

0.0068 Da（1.0 ppm）

9.36E+06

0.42

5ʼ 末端の 1 塩基欠損体

7156.1144

7156.1290.0146 Da（2.0 ppm）

7.42E+06

0.34

目的物の PSPO 変換体

7225.1181

7225.122

0.0039 Da（0.5 ppm）

2.55E+06

0.12

目的物のシアノエチル基付
加体

質量確度

イオン強度

相対比率

配列

（b）ピーク⑤ N‑2（5.40 分）
計算精密質量（Da） 測定精密質量（Da）
6359.9492

6359.954

0.0048 Da（0.8 ppm）

6.81E+06100

5ʼ 末端の 2 塩基欠損体

6455.8927

6455.897

0.0043 Da（0.7 ppm）

8.40E+04

1.23

5ʼ 末端の 2 塩基欠損体のリン酸基付加体

6385.9397

6385.947

0.0073 Da（1.1 ppm）

7.56E+04

1.11

3ʼ 末端の 2 塩基欠損体

D 社の分析条件で取得したデータを示す．

446

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［廣瀬ら：複数種の LC‑MS を用いた核酸医薬の分析データ比較］

ケースもあり，UV クロマトグラムのピーク面積かる典型的な不純物の相対定量分析法として，LC/ら量的評価をすることに限界点もある．そこで LC/MS の問題点を把握する目的でイオン化抑制，イオMS により，質量スペクトルのイオン強度や抽出イン化促進の実際について検討する．検体として，全

オンクロマトグラムのピーク面積から相対定量を行

長のミポメルセン及びヌシネルセン（純度 95％超）

うことが多いが、鎖長の違いなどによるイオン化効に，それぞれに混入しうる不純物を想定し，5ʼ 側の5）率の違いを考慮する必要がある ．また，一般的に1 塩基欠損体（純度 95％超）を一定割合（0.1％から

は，LC で分離されていない成分の MS による定量

10％の 7 濃度ポイント）で添加し，質量スペクトル分析においてはマトリックス効果を考慮する必要がのイオン強度から添加量を評価した．実施方法としある．マトリックス効果とは，共存する成分間でイて，各社にて LC/MS，並びに LC 分離を伴わないオン化の競合が起こることによりイオン化効率が変フローインジェクション法（FIA）を用いた分析を化してイオン強度等の定量結果に影響する現象であ行い，両者を比較した．

り，特に ESI によるイオン化ではしばしばみられる．

結果を Fig. 2 に示す．ここでは，マトリックス効

本節では，オリゴヌクレオチドの合成時に生じう果の状況について，イオン化抑制を青色，イオン化

㸦a㸧LC/MS 㸦࣑࣏࣑ࣝࢭࣥ㸧㸦b㸧FIA㸦࣑࣏࣑ࣝࢭࣥ㸧

ῧຍ㔞%

A♫

B♫

C♫

D♫

ῧຍ㔞%

0.1

0.1

0.2

0.2

0.5

0.5

1

1

2

2

5

5

10

10

㸦c㸧LC/MS 㸦ࢾࢩࢿࣝࢭࣥ㸧
ῧຍ㔞%

A♫

B♫

A♫

B♫

C♫

D♫

C♫

D♫

㸦d㸧FIA㸦ࢾࢩࢿࣝࢭࣥ㸧
C♫

D♫

ῧຍ㔞%

0.1

0.2

0.2

0.5

0.5

1

1

2

2

5

5

10

A♫

B♫

10

Fig. 2࢖࢜ࣥ໬ᅇ཰⋡ᢚไ/ಁ㐍࡞ࡋ

100%ᢚไ

80%௨ୖ100%ᮍ‶ᢚไ

50%௨ୖ80%ᮍ‶

ᢚไ

50%ᮍ‶

ಁ㐍

100%㉸㐣120%ᮍ‶ಁ㐍

120%௨ୖ200%ᮍ‶ಁ㐍

200%௨ୖ

不純物の相対定量におけるマトリックス効果のヒートマップ（a）LC/MS（ミポミルセン）（b）FIA（ミポミルセン）（c）LC/MS（ヌシネルセン）（d）FIA（ヌシネルセン）

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［廣瀬ら：複数種の LC‑MS を用いた核酸医薬の分析データ比較］促進を赤色で示し，それらの程度を色の濃淡で表現

では，今回の解析条件においては，不純物の添加量している．回収率は，目的物に不純物を添加した場や機器システムに依存しない結果となった．また，合に得られるイオン強度を，不純物単独で測定した

LC/MS で分析対象物をカラム分離して保持時間に場合のイオン強度に対する割合（％）として算出し差を出すことで，これらのマトリックス効果を軽減

た．ミポメルセンの LC/MS の結果を Fig. 2（a）にできることを予測して本検討を実施したが，それを示した．各社の結果に共通性が見られず，A 社，C

示す結果は得られなかった．

社及び D 社ではイオン化抑制がみられたのに対し，

このような結果に至った原因について考察する．

B 社は全ての測定ポイントでイオン化促進が確認さまず，各社が使用した汎用型の質量分析計は少なくれた．また，イオン化抑制を示した 3 社においてもとも 1,000 倍のスペクトルダイナミックレンジを有

その程度はさまざまであり，C 社では全ての測定ポする市販機であるため，不純物の添加量が 0.1％以

イントにおいて回収率 80％以上（添加量 0.2％では回上の相対定量分析を安定的に実施できる能力に疑問

収率 100％）でイオン化抑制としては弱い程度ではない．また，今回の検討において添加回収率の算あったのに対し，D 社では回収率 50％未満と強い出方法は各社で異なり，ア）マススペクトル上の全イオン化抑制がみられた．また，データは示さないての関連イオン（電荷数の異なるイオンや同位体イ

が，4 社中 2 社で別日に同一条件で 2 回目の測定をオン）の強度の合算，イ）最も存在率の高い電荷数実施したところ，1 回目とは異なる傾向でイオン化の同位体イオンの強度の合算，及び，ウ）最も存在

抑制あるいはイオン化促進が様々な程度で起こり，率の高い電荷数のイオンによる抽出イオンクロマト

日間再現性は見出せなかった．同じサンプルの定量

グラムのピーク面積の三つに大別されるが，いずれを FIA で実施した結果を Fig. 2（b）に示した．LC/の方法で算出するにしても結果の傾向には大きな影

MS の結果と同様に各社の結果に共通性は見られ響を与えるものではないと考えられる．各社が用いず，イオン化抑制あるいはイオン化促進が様々な程た LC 及び FIA の移動相の組成はそれぞれ完全に一度で起こっており，添加量に依存的な傾向も見られ致はしないものの，オリゴヌクレオチド分析で一般なかった．また，FIA でも同様に 2 回目の測定を実的に用いられる試薬を用いている点で共通してい施したが，日間再現性は見出せなかった．以上の検る．つまり，水と有機溶媒の混液にイオンペア試薬

証から LC/MS と FIA を比較した場合，結果に共通としてのアミンと pH 緩衝用の HFIP を添加して用性があるとは言えず，マトリックス効果の程度についている．このイオンペア用移動相については，調

いてもどちらがより強いという判断ができる結果は製から測定までの時間経過により，MS 感度の低下

得られなかった．

や，金属アダクトイオンの生成が一般的に知られて同様の検討をヌシネルセンについても実施し，そおり，できるだけ用時調製することが望ましい．まの結果を Fig. 2（c）及び（d）に示した．各社の LC/

た，調製方法の僅かな差異が結果に影響することもMS の結果 Fig. 2（c）をミポメルセンの結果と比較考えられ，調製手順の詳細を統一することも必要としたとき，同様の傾向を示す結果とはならなかっ考えられている．このことが，今回の結果の要因とた．例えば D 社はミポメルセンでは強いイオン化なったかについては追加の検証が必要と考える．ま抑 制 を 示 し て い た が， ヌ シ ネ ル セ ン で は 添 加 量

た，各社のグラジエントやカラム長といった分離条

0.5％以上でむしろイオン化促進を示す結果となっ件については，前節でも考察したように，目的物とた．また，ヌシネルセンの LC/MS 結果を各社で比N‑1 体が最大限に分離できる条件というよりもス較した場合にも共通の傾向があるとは言えず，イオ

ループット優先の条件ともいえ，マトリックス効果

ン化抑制あるいは促進が様々な程度でみられた．

を抑えるための改善検討は可能と考えられる．目的

FIA の結果も同様であり，ミポメルセンの結果との物と不純物が混在している状態で不純物の相対量を比較，各社の比較をしても，共通性や規則性はみら

MS のイオン強度から直接的に評価可能であるか，れなかった（Fig. 2（d））．

あるいは LC で分離してマトリックス効果を軽減さ

当初予想したように，FIA でマトリックス効果がせるべきか，今回の検討では結論を出すことはでき観察されたが，イオン化の抑制あるいは促進の観点なかった．今後，この課題を追加検討するためのよ448

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［廣瀬ら：複数種の LC‑MS を用いた核酸医薬の分析データ比較］に質量へと変換する計算過程（デコンボリューショ

り包括的な後続研究が必要になると考えられる．

ン）が加わることとなり，最終的に得られる質量の3.3

目的物の特性解析（精密質量測定，MS/

確度は低分子の場合よりも低くなることが一般的でMS 配列解析）ある．また，更に高度な同定法として内部構造に関

本節では，目的物の同定のための特性解析につい連する情報を得るために MS/MS を行うことが多て述べる．LC/MS を用いた化合物の同定法として，

い．MS/MS の解離法のうち，多くの市販機に搭載

まず精密質量の確認がある．現在市販されている汎され最も使用されている手法は衝突誘起解離（CID）

用型の高分解能質量分析計の性能は，質量が 500である．低分子化合物ではこの手法により官能基レ

Da 程度の低分子化合物の場合，質量確度が 2 ppm

ベルの情報が得られることから構造推定のための手以 内 で あ る と さ れ る． こ れ は 絶 対 値 で 示 す と 1

法として汎用されている．また，ペプチドにおいて

mDa レベルの確度ということになる．一方，オリは，CID により主にペプチド結合（C‑N 結合）が選

ゴヌクレオチドを考えた場合，質量が 5,000 Da 以上

択的に切断されて特異なイオン種（b イオン及び yであり，ESI‑MS ではリン酸基の脱プロトン化が複イオン）を生成することから，アミノ酸一つ分の質数個所で起こることにより電荷数の異なる複数のイ

量差を判別することができ，配列の確認や翻訳後修/ （相対質量電荷数比）500〜2500 程度の領域に観測され，それらの / を基飾が起こったアミノ酸の特定に利用される．

オン（多価イオン）が以上を踏まえ本節では，現実的な質量確度の確認

࣐ࢫࢫ࣌ࢡࢺࣝ
ࣜࣇ࢓ࣞࣥࢫ໬ྜ≀

7-

3-

8-

6-

9-

5-

4-

ࢹࢥ࣮ࣥ࣎ࣜࣗࢩࣙࣥᚋ

7170

7175

7180

7185

7190

Deconvoluted Mass (Da)Fig. 3

目的物の特性解析例

ミポメルセンのマススペクトル（A 社のデータ）を示す．
上図：フルスキャン測定による多価イオンマススペクトルの生データ（横軸は質量と電荷数の比 : m/z）
．各多価イオンの価数（n‑）をピーク上部に付記した．
下図：上図の生スペクトルをデコンボリューション処理した後のスペクトル（横軸は質量：Da）．モノアイソトピック質量を赤矢印で示した．

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449

［廣瀬ら：複数種の LC‑MS を用いた核酸医薬の分析データ比較］を行い，更に，MS/MS による配列確認の実用性

次に MS/MS による配列確認について述べる．ま

（配列カバレージがどの程度か）を検証した．モデル

ずは一般的に実施されているオリゴヌクレオチドの配列として，ミポメルセン全長（LC 純度 90‑95％）

MS/MS フラグメンテーションでは，リン酸ジエスとヌシネルセン全長（LC 純度 90‑95％）を用いた．

テル結合の 4 か所で主要な切断が起こることが知ら

ミポメルセンのマススペクトルを Fig. 3 に示す．上れており，生じたプロダクトイオンの命名について

段が多価イオンのスペクトルで， / 796.56 からは McLuckey らにより，5ʼ 側を a，b，c，d イオン，2391.02 にわたり，9 価から 3 価までの多価イオンが3ʼ 側を w，x，y，z イオンとすることが提唱されて連続的に検出されている．これをデコンボリュー

いる 6）． 配列確認の方法は各社の解析ソフトウェア

ションしたのが下段となるが，横軸が質量となり 1の仕様によりそれぞれ詳細は異なるが，MS/MS に

Da ずつ異なる同位体が分離して観測される．このより生じた各プロダクトイオンの質量を確認し，理うち矢印で示したのが主同位体のみからなる精密質

論計算される質量との一致から配列確認する点で共量（モノアイソトピック質量）であり，計算精密質

通している．全塩基数により配列確認できた塩基数

量と照らして化合物の同定に用いられる．各社からを除してカバレージを百分率（％）で表し，検出さ得られた測定精密質量の結果，並びに計算精密質量

れたイオン種とともにその強度を色分け表示することの差異及び百万分率（ppm）を質量確度としてとで，その確からしさを視覚的に判断できるよう工

Table 5 に示した．各社とも，ミポメルセン，ヌシ

夫されている．Table 5 に示した通り，配列カバ

ネルセンの両サンプルにて質量確度 3 ppm 以内の結レージ（％）はミポメルセンでは 2 社で 100％，他の果となった．今回，各社が測定に使用した機器の性2 社でも 95％，ヌシネルセンでは 3 社で 100％，残能は，前述の通り低分子の質量確度で 2 ppm 以内とる 1 社も 94％と高い結果が得られた．ここで，各社

高性能であるが，多価イオンのデコンボリューショが選択した MS/MS のプリカーサーイオン（前駆イ

ン処理を伴うオリゴヌクレオチドにおいても 3 ppm

オン）の価数は必ずしも同じではなく，また CID にの確度が得られたことから，ソフトウェアの解析能使用する衝突ガスの種類や印加する衝突エネルギー

力も含めオリゴヌクレオチドの目的物を同定するた値も異なるが，各社の適正条件で CID を実施すれめの必要十分な性能を有しているといえる．オリゴ

ば良好な結果が得られることがわかった．生体高分

ヌクレオチドと同程度の分子サイズで，同じくデコ子鎖の中でも，特にペプチドは CID による配列確

ンボリューションを伴う LC/MS 品質試験法として認が長く活用され，技術的にも成熟している．一方

バイオ医薬品のペプチドマッピングがあるが，ペプのオリゴヌクレオチドは，上述の通り一つの結合のチド同定の指標とされる質量確度は 5 ppm 程度とさ開裂で生じるイオンが 8 種あるいは脱塩基イオンなれていることに鑑みると，今回の結果は十分に高いども含めてそれ以上の多種になり，また，二次開裂確度であると評価できる．

も起きやすいことが知られている 7）．このためスペ

Table 5

目的物の精密質量測定と MS/MS 配列解析

ミポミルセン
計算精密
質量

ヌシネルセン
測定精密
質量

質量確度
（ppm）

MS/MS
配列カバレージ（%）

1007122.298

3.0

100

2.5

100

7122.2861.4

1007172.1031.6

957122.2891.8

947172.0980.9

957122.296

2.8

100

測定精密
質量

質量確度
（ppm）

A社

7172.112

2.7

B社

7172.109

C社
D社

MS/MS
計算精密
配列カバレージ（%）
質量7172.0916

450

7122.2762

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［廣瀬ら：複数種の LC‑MS を用いた核酸医薬の分析データ比較］

ることが必要」と示されている 1）．

クトルは複雑で，強度が分散することからシグナル
ノイズ比（S/N）が小さいスペクトルとなる．した

まず不純物として全長のミポメルセン及びヌシネ

がって各イオンの帰属が難しいと予想されたが，近ルセン（LC 純度 95％超）にそれぞれ 5ʼ 側の 1 ヌクレ

年のデータ解析ソフトウェアの機能向上により，本オチド欠損体（LC 純度 95％超）を一定割合（0.1％

法をオリゴヌクレオチドの目的物同定法として汎用から 50％の 9 濃度ポイント）で添加し，LC/MS 分析

的に使用できることが確認できたと考えている．

を行った．どの程度の含有量であれば正確な質量測定が可能か，また，構造同定のための MS/MS 配列

不純物の構造推定（精密質量測定，MS/

3.4

確認ができるかについて検証した．なお，ミポメル

MS 配列解析）

センについては 3 社（B 社，C 社，D 社）の機器，ヌ

前節では目的物の同定のための LC/MS 特性解析

シネルセンについては 2 社（B 社，D 社）の機器を用について，現状の技術レベルで得られる情報についいて実施し，解析は各社推奨のソフトウェアを用いて述べた．本節では，含有量のより少ない不純物をて行った．Table 6 にミポメルセンの結果を示し

対象に本分析技術の検討を行った．オリゴヌクレオ

た．各社共通して，添加量 0.1％以上で正確な質量

チドの不純物については，Oligonucleotide Safety

が 測 定 可 能 で あ っ た． 質 量 誤 差 は 多 く の 場 合 でWorking Group（OSWG）が 2017 年に発表したホワ

1 ppm 未満，最大の場合でも 1.3 ppm と高い質量確

イ ト ペ ー パ ー（WP） で，1.0 ％ を 構 造 決 定度が得られることが確認できた．MS/MS 配列カバ

（identification）の必要な閾値とする考え方を提起しレージについては，添加量 0.1％でも 94％という2）ている ．一方，国内における不純物管理の考え方

ケースもあるが，各社共通としては，添加量 1％以として，2020 年に関口らが AMED 医薬品等規制調

上でカバレージ 78％以上が確認できており，添加和・評価研究事業「アンチセンス医薬品の品質及び量を増やすに従いカバレージも高くなる傾向にあっ

安全性評価に関する研究」班の見解を記載している

た．また，データは示さないが，ヌシネルセンでもが，そこでは構造決定の必要な閾値については明確

同 様 の 結 果 が 得 ら れ て お り， 質 量 誤 差 は 添 加 量

な数値レベルは示しておらず「LC‑UV/MS により技

0.1％以上であれば 2 ppm 以内であり，MS/MS カバ

術的に達成可能なレベルである」こと，並びに「適レージは添加量 1％以上で 76％以上であった．

切に設定された安全性確認の閾値よりも十分に低い

WP が構造決定の必要な閾値を 1.0％と提案してこと，及び不純物の管理戦略が適切に構築されていいることと照らしてみると，質量確度は計算精密質

不純物
N‑1
添加量
（％）

Table 6

添加不純物の精密質量測定と MS/MS 配列解析（ミポメルセン）

B社

C社

D社

MS/MS
MS/MS
MS/MS
計算精密 測定精密 質量確度
計算精密 測定精密 質量確度
計算精密 測定精密 質量確度
配列カバ
配列カバ
配列カバ
質量
質量
（ppm）
質量
質量
（ppm）
質量
質量
（ppm）
レージ（%）
レージ（%）
レージ（%）

0.1

6757.039

1.2

846753.0260.1

946753.018

‑1.0

10

0.2

6757.029

‑0.3

100

6753.023‑0.3

836753.025

0.0

10

0.5

6757.026

‑0.7

100

6753.024‑0.1

946753.026

0.1

36

1

6757.0320.2

1006753.021‑0.6

836753.024

‑0.1

78

2

6757.0307 6757.032

0.2

100

6753.019‑0.9

896753.021

‑0.6

89

5

6757.0370.9

1006753.021‑0.6

896753.023

‑0.3

100

10

6757.0310.0

1006753.023‑0.3

896753.025

0.0

100

20

6757.026

‑0.7

100

6753.0250.0

896753.034

1.3

100

50

6757.029

‑0.3

100

6753.0280.4

896753.033

1.2

1006753.025

6753.025

質量の確認は，B 社は最もイオン強度の高い第 5 アイソトープイオン，C 社と D 社はモノアイソトープイオンを使用

Pharmaceutical and Medical Device Regulatory ScienceVol. 54 No. 5（2023）

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［廣瀬ら：複数種の LC‑MS を用いた核酸医薬の分析データ比較］量に対して 2 ppm 以下であり，また，配列の 70％

上でカバレージ 100％を示し，最も低い場合で以上を MS/MS スペクトルから確認できたこととなも 94％であった．各社装置の適正な測定条件

る．不純物の構造決定の閾値については現状では明にてデータを取得し，それに適応したソフト

確な指針はないが，今回の結果は汎用的 LC/MS がウェアと組み合わせてデータ解析することによ

構造決定に必要となる重要な情報を提供する試験法

り，高い質の特性解析ができることが確認できの一つとして十分な能力を有することを示唆するとた．これらの再現性を担保するため，今後，各考えられる．

社より評価法の標準的操作手順の文書化が望まれる．
4） 不純物の構造推定については，添加量 0.1％以

4. 結論

上で質量確度が 2 ppm 以内，添加量 1％以上で本研究では，核酸医薬品の分析技術の現状・限界

MS/MS 配列カバレージが 76％以上であった．

を把握する目的で，同一のモデルオリゴヌクレオチ

この結果より，汎用的 LC/MS にて，1％以上

ドを対象に四つの評価項目（第 3 項）について複数の不純物の組成を高い確度で推定できることが種の汎用的な LC‑MS を用いて分離分析を行い、結確認できた．今後は，MS/MS 配列カバレージ

果を比較することで下記の結論を得た．

を更に高いレベルに上げるため，現行の CID

1） IP‑RPC モードによる LC/MS にて，ミポメル以外の解離法の検討が期待される．

セン，ヌシネルセンの目的物と不純物の分離を

核酸医薬品の品質管理に関しては国内外で閾値設

4 社で比較したところ，全ての主要不純物を完定の議論もあるが，前述の WP で提案されている閾

全分離できるデータはいずれからも得られな

値は主に分離・定量分析の技術的限界を考慮して設かった．一方で，N‑3 以上の欠損体同士のピー

定されている．今回行った検討は緒言でも述べた通ク分離度は概ね Rs 1.5 以上を示し，鎖長に応じり，LC/MS の一般ユーザーが現実的に実施可能なた不純物の分離法として有用であることが確認条件を想定して行ったものであるが，LC だけではできた．今後，更なる分離向上のために IP‑

主要不純物の完全分離を実現することが困難であっ

RPC では，より長いカラムの選択，移動相にた．つまり，特に目的物ピークに重なる不純物含量

用いるアミンや酸の種類，濃度の検討が必要とについては MS 定量の必要性が示された．MS 解析

な る． ま た， 親 水 性 相 互 作 用 ク ロ マ ト グ ラ

においては質量確度と構造推定ではほぼ満足できる

フィー（HILIC）などイオンペア試薬を用いな結果を与えた一方で，相対定量は再現性・回収率とい分離モードの適用可能性の検討が課題となもに十分とは言い難いものであった．この問題は，

る

4, 8, 9）．

再現性・回収率に乏しい結果を招いた原因を追求す

2） LC/MS による不純物の添加回収の評価においることで解決できると期待される．今回の検討ではては，ミポメルセン，ヌシネルセンともに各社

各社の測定装置において適切であると考えられる分で共通した結果とはならず，不規則なイオン化

析条件をそれぞれ採用したことも，検出限界に近い抑制やイオン化促進が認められ，今後の検討課

微量分析での定量結果に影響を及ぼした可能性があ

題として，移動相の調製法に起因する差異を排る．各社の測定装置に固有の特性を踏まえ，今後，除するため，同一の組成を共通の手順で調製し不純物含量が厳密に制御された同一性の高い試料をたうえで比較検討する必要がある．また，定量用い，移動相等の組成や調製方法まで統一した条件計算に用いる質量スペクトルのデータ抽出法やで解析を行うことが必要であろう．

バックグラウンド減算の方法などの比較検討も必要となる．

加えて，今回採用した汎用法以外の新しい分析技
術の積極的検討により，核酸医薬の分析技術の向上

3） 目的物の精密質量測定では，ミポメルセン，ヌを 図 る こ と が 重 要 と 考 え る． 例 え ば， 上 述 し た

シネルセンいずれにおいても各社から 3 ppm 以

HILIC のような分離モードの採用や，それを現行の内の確度でデコンボリューション後の質量が確

IP‑RPC と組合わせた 2 次元 LC により分離能は大幅認できた．また，MS/MS 配列解析では半数以に向上すると期待できる 10）．更には不純物分離の目452

医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス

Vol. 54 No. 5（2023）

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［廣瀬ら：複数種の LC‑MS を用いた核酸医薬の分析データ比較］

的では，気相中で衝突断面積の違いで分離するイオ

4）Hannauer, F.; Black, R.; Ray, AD.; Stulz, E.; Langley, GJ.;

ンモビリティースペクトロメトリーを MS と組み合

Holman, SW. Advancements in the characterisation of

わせる技術も注目を集めている 11）．不純物の相対定

oligonucleotides by high performance liquid量については，施設間や分析者間，及び日間差の再現精度を向上させるため，解析ソフトウェアの機能

chromatography‑mass spectrometry in 2021: A shortreview.

2022, 3（3‑4）,

p.90‑102. doi.org/10.1002/ansa.202100066.

改善並びに移動相調製等を自動化するロボットの導5）Pourshahian, S. Therapeutic oligonucleotides,

入などの技術革新が望まれる．MS/MS 配列解析に

impurities, degradants, and their characterization by

ついては，電子捕獲のエネルギーにより解離させる

mass spectrometry.

ETD（Electron Transfer Dissociation） 及 び EAD

p.75‑109. doi.org/10.1002/mas.21615.

（Electron Activated Dissociation）や紫外線照射により解離させる UVPD（Ultraviolet Photodissociation）
を用いた実例が報告されており，今後の発展を推し進めるべきである 12, 13, 14）．

2021, 40（2）,6）McLuckey, SA.; Van Berkel, GJ.; Glish, GL. Tandem
mass spectrometry of small, multiply charged
oligonucleotides.

1992, 385019‑G.
（1）, p.60‑70. doi: 10.1016/1044‑0305（92）7）Santos, IC.; Brodbelt, JS. Recent developments in thecharacterization of nucleic acids by liquid謝辞chromatography, capillary electrophoresis, ion mobility,

本研究は日本医療研究開発機構（AMED）医薬品等規制
調和・評価研究事業「アンチセンス医薬品の品質及び安全性

and mass spectrometry（2010‑2020）
.

2021,

44（1）
, p.340‑372. doi: 10.1002/jssc.202000833.

評価に関する研究」班（課題番号：JP19mk0101119），
並びに

8）Lobue, PA.; Jora, M.; Addepalli, B.; Limbach, PA.

AMED 次世代治療・診断実現のための創薬基盤技術開発事業

Oligonucleotide analysis by hydrophilic interaction「核酸医薬品の製造・精製・分析基盤技術の開発」班（課題liquid chromatography‑mass spectrometry in the

番号：JP21ae0121022, JP21ae0121023, JP21ae0121024）の支援

absence of ion‑pair reagents. .

を受けて実施したものである．

.

. 2019,1595, p.39‑48. doi: 10.1016/j.chroma.2019.02.016.
9）H u a n g , M . ; X u , X . ; Q i u , H . ; L i , N . A n a l y t i c a l

おことわりcharacterization of DNA and RNA oligonucleotides by

本稿の著者に PMDA の職員が含まれるが，PMDA の公式

hydrophilic interaction liquid chromatography‑tandem

見解を示すものではない．

mass spectrometry. .

.

. 2021, 1648,

462184. doi: 10.1016/j.chroma.2021.462184.
利益相反10）Roussis, SG.; Cedillo, I.; Rentel, C. Two‑dimensional

全ての著者に開示すべき利益相反はない．

liquid chromatography‑mass spectrometry for thecharacterization of modified oligonucleotide impurities.

文

献. 2018, 556, p.45‑52. doi: 10.1016 / j.

1）関口光明，伊藤浩介，齊藤隼，滝口直美，製薬協核酸

ab.2018.06.019.

医薬品質評価タスクフォース，吉田徳幸，小比賀聡，

11）Omuro, S.; Yamaguchi, T.; Kawase, T.; Terasaki, M.;

井上貴雄．核酸医薬品に含まれる不純物の管理に対す

Hirose, K.; Obika, S. Physicochemical property

る考え方．医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス．

evaluation of modified oligonucleotides by traveling‑

2020，51（1），p.11‑21.

wave ion mobility mass spectrometry.

2）Capaldi, D.; Teasdale, A.; Henry, S.; Akhtar, N.; den
Besten, C.; Gao‑Sheridan, S.; Kretschmer, M.; Sharpe,
N.; Andrews, B.; Burm, B.; Foy, J. Impurities in
Oligonucleotide Drug Substances and Drug Products.
2017, 27（6）,p.309‑322. doi: 10.1089/
nat.2017.0691.

. 2022, 36（10）, e9279. doi: 10.1002/rcm.
9279.
12）Smith, SI.; Brodbelt, JS. Electron Transfer Dissociationof Oligonucleotide Cations.

. 2009,283（1‑3）, p.85‑93.doi: 10.1016/j.ijms.2009.02.012.
13）Karasawa, K.; Duchoslav, E.; Baba, T. Fast Electron3）Gilar, M.; Neue, UD. Peak capacity in gradient

Detachment Dissociation of Oligonucleotides inreversed‑phase liquid chromatography of biopolymers

Electron‑Nitrogen Plasma Stored in Magneto Radio‑

Theoretical and practical implications for the

Frequency Ion Traps.

separation of oligonucleotides. .

.

2007,

1169（1‑2）,p.139‒150. doi: 10.1016/j.chroma.2007.09.005.

. 2022, 94（44）,p.15510‑15517. doi: 10.1021/acs.analchem.2c04027.
14）Santos, IC.; Lanzillotti, M.; Shilov, I.; Basanta‑Sanchez,

Pharmaceutical and Medical Device Regulatory ScienceVol. 54 No. 5（2023）

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［廣瀬ら：複数種の LC‑MS を用いた核酸医薬の分析データ比較］

M.; Roushan, A.; Lawler, R.; Tang, W.; Bern, M.;

Oligoribonucleotides.

Brodbelt, JS. Ultraviolet Photodissociation and
Activated Electron Photodetachment Mass

, 2022, 33（3）, p.510‑520. doi:
10.1021/jasms.1c00340.

Spectrometry for Top‑Down Sequencing of Modified

454

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