［医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス，PMDRS，47（4），250 〜 253（2016）］

SERIES

核酸医薬の非臨床安全性を考える（7）

核酸医薬品の遺伝毒性評価
ICH S6 対応研究班＊1

Consideration on the Preclinical Safety Assessment of Genotoxicity of
Oligonucleotide Therapeutics
Working Group for the ICH S6 & Related Issues＊1

違いを解説した ICH S6（R1）ガイドラインの遺伝毒性の項

1. はじめにには，「従来の医薬品について通常実施されてきた遺伝毒

ICH S6（R1）ガイドライン「バイオテクノロジー応用医1）性試験の範囲と種類は，バイオ医薬品に対しては適切なも薬品の非臨床における安全性評価」の適用範囲の項には，のでなく必要とされない．
」と記載されています．これは「本ガイドラインに示される原則はオリゴヌクレオチド製生体に対する影響が化成品とは異なることがその理由と剤にも適用されうる．
」との記載があり，当該ガイドライなっています．即ち，バイオ医薬品の構成成分であるタンンは核酸医薬の安全性評価を考える上で，重要な指針とパク質が，細胞内に取り込まれず，DNA や他の染色体成なっています．従来から行っている遺伝毒性試験は，薬理分に直接作用する可能性が極めて低いため，遺伝子変異が作用の如何に関わらず DNA の突然変異や染色体異常誘発生じにくいことに基づいています．

能について検出する試験系です．化成品とバイオ医薬品の一方，核酸医薬を構成するオリゴヌクレオチドは，細胞＊1

平成 27 年度日本医療研究開発機構研究費（医薬品等規制調和・評価研究事業）「医薬品の安全性および品質確保のための医薬品規制に係る国際調和の推進に関する研究」（研究代表者：西川秋佳）の分担研究「S6：バイオ／核酸医薬品の安全性に関する＊2研究」研究班（ICH S6 対応研究班），研究分担者：平林 容子（Yoko Hirabayashi） ，協力研究者：真木 一茂（Kazushige＊3＊3＊3＊4Maki） ，笛木 修（Osamu Fueki） ，松本 峰男（Mineo Matsumoto） ，渡部 一人（Kazuto Watanabe） ，木下 潔（Kiyoshi＊5＊6＊7＊8Kinoshita） ，中澤 隆弘（Takahiro Nakazawa） ，小比賀 聡（Satoshi Obika） ，荒戸 照世（Teruyo Arato） ，藤阪 朱紀（Aki＊3，7＊3＊3
Fujisaka） ，オブザーバー：小野寺 博志（Hiroshi Onodera） ，篠田 和俊（Kazutoshi Shinoda）＊2
国立医薬品食品衛生研究所 東京都世田谷区上用賀 1‑18‑1（〒 158‑8501）
National Institute of Health Sciences，1‑18‑1 Kamiyohga，Setagayaku，Tokyo 158‑8501，Japan＊3
独立行政法人医薬品医療機器総合機構 東京都千代田区霞が関 3‑3‑2 新霞ヶ関ビル（〒 100‑0013）
Pharmaceuticals and Medical Devices Agency（PMDA），Shin‑Kasumigaseki Building，3‑3‑2 Kasumigaseki，Chiyodaku，Tokyo 100‑0013，Japan＊4
中外製薬株式会社 静岡県御殿場市駒門 1‑135（〒 412‑8513）
Chugai Pharmaceutical Co.，Ltd.，1‑135 Komakado，Gotenbashi，Shizuoka 412‑8513，Japan＊5
MSD 株式会社 東京都千代田区九段北 1‑13‑12 北の丸スクエア（〒 102‑8667）
MSD KK.，Kitanomaru Square，1‑13‑12，Kudan‑Kita，Chiyodaku，Tokyo 102‑8667，Japan＊6
アンジェス MG 株式会社 大阪府茨木市彩都あさぎ 7‑7‑15 彩都バイオインキュベータ 4 階（〒 567‑0085）
AnGes MG，Inc.，4F，Saito Bio‑Incubator，7‑7‑15，Saito‒asagi，Ibaraki，Osaka，567‑0085，Japan＊7大阪大学大学院薬学研究科 大阪府吹田市山田丘 1‑6（〒 565‑0871）
Graduate School of Pharmaceutical Sciences，Osaka University，1‑6 Yamadaoka，Suitashi，Osaka 565‑0871，Japan＊8
北海道大学大学院医学研究科 札幌市北区北 15 条西 7 丁目（〒 060‑8638）
Graduate School of Medicine，Hokkaido University，Kita 15，Nishi 7，Kita‑ku，Sapporo，060‑8638，Japan250

医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス

Vol. 47 No. 4（2016）

［ICH S6 対応研究班：核酸医薬品の遺伝毒性評価］

Table 1 ᪤ᢎㄆࡢ᰾㓟་⸆ရ࡛ᐇ᪋ࡉࢀࡓ㑇ఏẘᛶヨ㦂ྡ⛠Fomivirsen sodium✀㢮ᢞ୚⤒㊰࢔ࣥࢳࢭࣥࢫ ║ෆ

Pegaptanib sodium࢔ࣉࢱ࣐࣮

║ෆ

Mipomersen sodium ࢔ࣥࢳࢭࣥࢫ ⓶ୗ㐺ᛂCMV ᛶ⥙⭷⅖ᐇ᪋ࡉࢀࡓ㑇ఏẘᛶヨ㦂Ames㸪CHO ⣽⬊ᰁⰍయ␗ᖖ㸪࣐࢘ࢫࣜࣥࣇ࢛࣮࣐⣽⬊✺↛ኚ␗㸪࣐࢘ࢫ㦵㧊ᑠ᰾ຍ㱋㯤ᩬኚᛶAmes㸪࣐࢘ࢫࣜࣥࣇ࢛࣮࣐ TK㸪SHE ⣽⬊ᙧ㉁㌿᥮㸪࣐࢘ࢫ㦵㧊ᑠ᰾ᐙ᪘ᛶ㧗ࢥࣞࢫࢸ࣮ࣟࣝ⾑⑕ Ames㸪࣐࢘ࢫࣜࣥࣇ࢛࣮࣐⣽⬊✺↛ኚ␗㸪࣐࢘ࢫ㦵㧊ᑠ᰾内あるいは核内に入り込んで作用することを目的として設計されるものが多く，その構造上の特性から，DNA 等へ直接作用し，意図する標的以外の DNA や染色体に影響を与える可能性が否定できません．また，化学物質による修飾や代謝物・分解物，類縁物質（n‑1 mer 等）による遺伝毒性への懸念も想定されます．
したがって，核酸医薬品の遺伝毒性評価については，ICH S6（R1）ガイドラインの原則を適用することは困難であり，核酸医薬品の特性を考慮した遺伝毒性評価を行う必要があります．

2.

既承認の核酸医薬品における検討
日米 EU の三極のいずれかで承認実績のある核酸医薬品

は，現時点では Table 1 に示す三品目のみです．そのうち，Fig. 1

Triplex

Fomivirsen と Pegaptanib は眼局所における適用ですが，Mipomersen については，全身曝露される点が大きく異なります．

性，及び（2）オリゴヌクレオチドが DNA と Fig. 1 に示す
注）

これらの核酸医薬品の承認申請のために実施された遺ような Triplex（三重鎖） を形成し，それに起因する突然伝毒性試験を審査報告書等から調査したところ，いずれの変異を誘発する可能性の二つの懸念について検討されてい品目でも ICH S2（R1）ガイドラインに沿った通常の低分子ます．

医薬品で実施されているのと同様の遺伝毒性試験が実施さ

まず，（1）の可能性について，21mer のホスホロチオエーれております．その評価の範囲では遺伝毒性に特段の懸念トについて行われた試験結果では，細胞内への取り込みをは認められておらず，臨床試験及び市販後の安全性調査に確認した上で，全ての結果が陰性を示したことから突然変おいても遺伝毒性から危惧される発がん性等について，現異を生じないと結論されています．ただし，他の論文では，在まで問題となる報告はありません．

突然変異を生じたとする報告 もあり，今後の解析に注目

4）する必要があるものと考えられます．なお，何らかの修飾

3.

核酸医薬品によって生じる可能性のある遺伝毒性核酸医薬品については，遺伝毒性が生じる可能性は低いとする報告

2，3）がある一方で，核酸医薬品やその代謝物・4）分解物に起因する突然変異誘発も報告されており ，遺伝毒性に関する何らかの評価は必要と考えられます．
2）

EMEA が 2005 年に発出したリフレクションペーパー

では，（1）分解物であるホスホロチオエート・モノヌクレオチドが DNA に取り込まれて突然変異を誘発する可能

核酸を用いる場合には，そのものがモノヌクレオチドを生成し，DNA に取り込まれて突然変異を惹き起こす可能性

注） Triplex（三重鎖）について：
本稿では二重鎖 DNA の major groove（主溝）に配列特異的に結合するように設計された一本鎖の核酸（三重鎖形成核酸 ,しばしば TFO とも呼ばれる）により形成される三重鎖構造を指しますが，自然界でも DNA 配列中にプリン塩基が連続する領域が存在する場合には形成しうる構造です．遺伝子の働きを転写レベルで阻害したり，DNA 修復の機能を有することが示されています．

Pharmaceutical and Medical Device Regulatory ScienceVol. 47 No. 4（2016）251

［ICH S6 対応研究班：核酸医薬品の遺伝毒性評価］

について考慮する必要が生じるものと考えられます．一方，という特徴を有しています．そのため，核酸医薬品の開発バイオ医薬品と同様，天然型の核酸成分のみから構成されにおいてはこの点を改善するために様々な試みが行われてる場合には，このような DNA 中への取り込みに伴う突然います．その一つは核酸の修飾であり，脂溶性を高くし，変異の誘発の可能性を考慮する必要はありません．

膜透過性を向上させるという開発も行われています．また，

次に（2）の可能性について，DNA と Triplex を形成す

リポソーム等のナノ技術を活用したドラッグデリバリーシ

る 30mer のオリゴヌクレオチドが標的遺伝子に対して 13ステム（DDS）による膜透過の技術も多方面で開発されて倍の頻度で突然変異を惹き起こしたこと，これらの変異はいます．このような DDS 技術によって膜透過性を向上さ

従来の試験バッテリーでは検出できず，標的遺伝子特異的せた品目の場合，核酸医薬単体（原薬）で遺伝毒性評価をな 遺 伝 子 変 異 の 検 出 法（RFLP [Restriction Fragment行ったとしても，臨床使用条件下における細胞内・核内へLength Polymorphism，制限酵素断片長多型 ] など）の適の曝露を下回る場合があるものと考えられ，むしろ DDS用が考慮されるべきであることなどが記載されています．

製剤や，何らかの導入試薬を用いる等，適切な遺伝毒性評他にも，Triplex を形成するように設計されたオリゴヌク価のための工夫が必要と考えられます．また，このようなレオチドによって誘発される突然変異に関する報告がなさ

DDS に用いられるキャリア自体に遺伝毒性を誘発するポテ

5~7）れており，このような性質を持つオリゴヌクレオチドについては，評価法を含めた検討が必要と考えられます．

10）

ンシャルを有するものもあることが報告されてきており ，その点に関する注意も必要です．

以上 2 点の懸念点以外に，核酸医薬品の投与によって生また，核酸医薬品はヒトの遺伝情報を元にデザインされじる可能性のある遺伝毒性の原因物質としては，核酸成分ており，実験動物とはその標的配列が異なることの方がむ以外の不純物等が考慮されます．ただし，不純物に起因すしろ多いことが想定されます．当該核酸医薬品が核内へ移る遺伝毒性については，ICH S2（R1）ガイドラインに準拠

行し，配列特異的な遺伝毒性を引き起こす懸念があるのでした従来型の遺伝毒性試験で検出可能であると考えられる

あれば，ほ乳類培養細胞を用いる in vitro 遺伝毒性試験にことから，特別の考慮をする必要性は低いものと思われま

おいて，ヒト細胞を用いることによって適切に遺伝毒性のす．

評価ができる可能性もあります．
核酸医薬品に用いられる核酸成分には，生体内における4.

分解や免疫系における認識を避ける等の目的で様々な修飾遺伝毒性評価の実施時期が行われた修飾核酸が用いられることが多くなっていま

核酸医薬品の遺伝毒性に関する評価時期については，
8）す．抗がん剤として活用されている核酸アナログはその薬

ICH M3（R2）ガイドライン に準拠すること，即ち，初回効として，DNA に取り込まれ，遺伝子構造の変化や機能の臨床試験前に遺伝子突然変異に関する検討とほ乳類の試修飾等の遺伝毒性を介して細胞死を引き起こしますが，核験系を用いた染色体異常誘発性の検討を行うのが適切で，酸医薬品に用いられている修飾核酸がモノマー（モノヌク標準的な組み合わせの遺伝毒性試験を第Ⅱ相試験の開始前レオチド）まで分解された後に，一部が核酸プールに移行に完了すべきでしょう．ただし，核酸医薬品の遺伝毒性にし，ホストの DNA に取り込まれ，同様の作用を引き起こ

ついては，まだ知見が不足しており，懸念がある場合には，す可能性も否定できないものと考えられます．このような試験の種類とその実施のタイミングは，適宜，検討する必作用は，核酸医薬品の塩基配列に起因するものではなく，要があります．

修飾核酸の構造によるものと考えられますので，修飾核酸
9）

なお，ICH S9 ガイドライン に適応する疾患を対象とのタイプごとに一度詳細な検討が行われ，リスク予測が可する場合は，ICH S9 ガイドラインに準じ，遺伝毒性評価能と判断されれば，以後，同一の修飾核酸に関する検討のは承認販売申請時までに実施することで差し支えありませ必要性はないものと考えられます．また，このような代謝・ん．

分解産物の評価を行うにあたって，in vitro 評価を行う際の代謝活性化や分解物の生成のために，従来から用いられ5.ている S9mix は利用可能か，あるいはそれだけで十分な遺伝毒性の評価手法に関する考察のか，又はヌクレアーゼ等を用いた系を考慮すべきか，モ

核酸医薬品の多くは細胞内や核内に移行して作用するノヌクレオチド等を強制添加した系で評価すべきかなどとことを目的としており，効率よく膜を透過する性質が求めいうことも，今後更なる知見を収集し，総合的な判断を行られますが，オリゴヌクレオチドは負の電荷を帯びた高分う必要があります．

子化合物であるという物質的特性から，膜透過性に乏しい

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医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス

Vol. 47 No. 4（2016）

［ICH S6 対応研究班：核酸医薬品の遺伝毒性評価］

6. まとめ核酸医薬品の遺伝毒性評価については，ガイドラインが存在しないことに加え，細胞内への移行性が低いという性質や，配列特異的な遺伝子への影響を生じうる等の他の医薬品には見られない特性を有しており，従来の遺伝毒性評価法を用いること自体についても検討すべき課題を有しているものと考えられます．核酸医薬品の開発経験は現状ではまだまだ少ないとはいえ，世界的には既に 100 件ほどの臨床試験が行われています．全身曝露を前提とした承認薬も今後加速的に増えていくでしょう．これらの経験を蓄積・活用し，遺伝毒性評価の本来の目的である造腫瘍性評価や後世代への遺伝的影響の評価に資する，核酸医薬品に適切な遺伝毒性評価を行うための新規試験法の開発を含め，考え方を整理していくことが必要と考えられます．
文献1） 厚生労働省医薬食品局．厚生労働省医薬食品局．バイオテクノロジー応用医薬品の非臨床における安全性評価について．薬食審査発 0323 第 1 号，平成 24 年 3 月 23 日．
2）EMEA. 2005. CHMP SWP Reflection paper on the assessment of the genotoxic potential of antisense oligodeoxynucleotides. http://www.ema.europa.eu/docs/ en̲GB/document̲library/Scientific̲guideline/2009/09/

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3）Levin, AA.; Henry, SP. 2008. Toxicology of oligonucleotide therapeutics and understanding the relevance ofthe toxicities. In Preclinical Safety Evaluation of Biopharmaceuticals, ed. Cavagnaro, JA: p.537‑574. Hoboken,
New Jersey: John Wiley & Sons, Inc.
4）Reshat, R.; Priestley, CC.; Gooderham, NJ. Mutagenesisby an antisense oligonucleotide and its degradation product. Toxicol Sci. 2012, 130（2）, p.319‑327.
5）Vasquez, KM.; Narayanan, L.; Glazer, PM. Speciﬁc mutations induced by triplex‑forming oligonucleotides inmice. Science. 2000, 290（5491）, p.530‑533.
6）Knauert, MP.; Glazer, PM. Triplex forming oligonucleotides: sequence‑speciﬁc tools for gene targeting. HumMol Genet. 2001, 10（20）, p.2243‑2251.
7）Mukherjee, A.; Vasquez, KM. Triplex technology in studies of DNA damage, DNA repair, and mutagenesis.
Biochimie. 2011, 93（8）, p.1197‑1208.
8）厚生労働省医薬食品局．医薬品の臨床試験及び製造販売承認申請のための非臨床安全性試験の実施について．薬
食審査発 0219 第 4 号，平成 22 年 2 月 19 日 .
9）厚生労働省医薬食品局．抗悪性腫瘍薬の非臨床評価に関するガイドラインについて．薬食審査発 0604 第 1 号，平成 22 年 6 月 4 日．
10）Shah, V.; Taratula, O.; Garbuzenko, OB.; Patil, ML.; Savla,R.; Zhang, M.; Minko, T. Genotoxicity of diﬀerent nanocarriers: possible modiﬁcations for the delivery of nucleicacids. Curr Drug Discov Technol. 2013, 10（1）, p.8‑15.

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