［医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス，PMDRS，46（10），681 〜 686（2015）］

SERIES

核酸医薬の非臨床安全性を考える（4）

核酸医薬品のオフターゲット作用の評価
ICH S6 対応研究班＊1

Considerations on the Preclinical Safety Assessment of off target
Effect of Oligonucleotide Therapeutics
Working Group for the ICH S6 & Related Issues＊1とする塩基配列と同一もしくは類似した他の配列に核酸医

1. はじめに薬品がハイブリダイズする懸念もあり，その結果として想アプタマーなどを除き，多くのオリゴヌクレオチド製剤（核酸医薬品）は，標的とする塩基配列にハイブリダイズ

定外の影響をもたらす場合，これを「狭義のオフターゲッ
ト作用」と呼びます（Fig. 1）．

することにより作用を発現します（オンターゲット作用）．

本稿では，核酸医薬品のオフターゲット作用による毒性

転写や翻訳といった遺伝子発現過程に直接作用することかに注目し，狭義のオフターゲット作用とその回避に向けたら，核酸医薬品のオンターゲット作用は極めて特異性の高方策について考えておくべきポイントを整理しました．まいものと期待されています．一方，こうしたオンターゲッ

た，「狭義」以外のオフターゲット作用についても概説しト作用以外の意図しない作用点もしくはメカニズムによるました．

作用は，オフターゲット作用と総称されます．特に，標的＊1

平成 27 年度日本医療研究開発機構研究費（医薬品等規制調和・評価研究事業）「医薬品の安全性および品質確保のための医薬品規制に係る国際調和の推進に関する研究」（研究代表者：西川秋佳）の分担研究「S6：バイオ／核酸医薬品の安全性に関する研究」＊2＊3
研究班（ICH S6 対応研究班），研究分担者：平林 容子（Yoko Hirabayashi） ，協力研究者：真木 一茂（Kazushige Maki） ，笛
＊3
＊3
＊4
＊5
木 修（Osamu Fueki） ，松本 峰男（Mineo Matsumoto） ，渡部 一人（Kazuto Watanabe） ，木下 潔（Kiyoshi Kinoshita） ，＊6＊7＊8
中澤 隆弘（Takahiro Nakazawa） ，小比賀 聡（Satoshi Obika） ，荒戸 照世（Teruyo Arato） ，オブザーバー：小野寺 博志＊3＊3（Hiroshi Onodera） ，篠田 和俊（Kazutoshi Shinoda）＊2
国立医薬品食品衛生研究所 東京都世田谷区上用賀 1 18 1（〒 158 8501）
National Institute of Health Sciences，1 18 1 Kamiyohga，Setagayaku，Tokyo 158 8501，Japan＊3
独立行政法人医薬品医療機器総合機構 東京都千代田区霞が関 3 3 2 新霞ヶ関ビル（〒 100 0013）
Pharmaceuticals and Medical Devices Agency（PMDA），Shin Kasumigaseki Building，3 3 2 Kasumigaseki，Chiyodaku，Tokyo 100 0013，Japan＊4
中外製薬株式会社 静岡県御殿場市駒門 1 135（〒 412 8513）
Chugai Pharmaceutical Co.，Ltd.，1 135 Komakado，Gotenbashi，Shizuoka 412 8513，Japan＊5
MSD 株式会社 東京都千代田区九段北 1 13 12 北の丸スクエア（〒 102 8667）
MSD KK.，Kitanomaru Square，1 13 12，Kudan Kita，Chiyodaku，Tokyo 102 8667，Japan＊6
アンジェス MG 株式会社 大阪府茨木市彩都あさぎ 7 7 15 彩都バイオインキュベータ 4 階（〒 567 0085）
AnGes MG，Inc.，4F，Saito Bio Incubator，7 7 15，Saito‒asagi，Ibaraki，Osaka，567 0085，Japan＊7大阪大学大学院薬学研究科 大阪府吹田市山田丘 1 6（〒 565 0871）
Graduate School of Pharmaceutical Sciences，Osaka University，1 6 Yamadaoka，Suitashi，Osaka 565 0871，Japan＊8
北海道大学大学院医学研究科 札幌市北区北 15 条西 7 丁目（〒 060 8638）
Graduate School of Medicine，Hokkaido University，Kita 15，Nishi 7，Kita ku，Sapporo，060 8638，Japan

Pharmaceutical and Medical Device Regulatory ScienceVol. 46 No. 10（2015）

681

［ICH S6 対応研究班：核酸医薬品のオフターゲット作用の評価］ற෷ୢఇષற෷ਛী峕૓ਟ

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核酸医薬品による作用の分類（医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス．46（8）. p.524, Fig. 1 を一部改変）

約 6700 万回に 1 回出現することになります．ヒトゲノム

2. 狭義のオフターゲット作用（約 30 億塩基対）において mRNA をコードする領域の割

まずハイブリダイゼーションに起因する作用を発現し合を 3% すなわち約 9000 万塩基対と仮定すると，ある特定の配列を有する 13 塩基のゲノム当たりの出現頻度は約うる塩基長の観点から考えてみます．
細胞や動物を用いた多くの試験成績より，狭義のオフ

9,000 万× 1 ／ 6,700 万となり，オンターゲットを含め約 1.3

ターゲット作用は完全又はほぼ完全に一致する塩基配列に回出現すると計算されます．つまり，13 塩基長もしくは対して生じ，その発現に必要な塩基長は核酸医薬品の作用それ以上の塩基長をもつ核酸医薬品のターゲット配列は，機序によって異なる，とされています．例えば，アンチセ

理論的には 1 ゲノムあたり標的遺伝子以外にオフターゲッ

ンスオリゴヌクレオチドであれば，連続した 12 塩基程度

ト遺伝子が一つあるかないかという頻度になると推測されの配列の一致により，RNaseH による翻訳機能阻害作用がます．ただし，1 塩基又は 2 塩基程度のミスマッチによる

1）

誘発されます ．実際，人工核酸を搭載したアンチセンス

ハイブリダイゼーションも可能と仮定すると，同じ塩基長

核酸では，13 塩基長の配列で優れた効果を示すものもあでもハイブリダイゼーション可能な mRNA 配列の理論値

2）ります ．塩基長にもよりますが，二つ以上のミスマッチ
はアンチセンス核酸の作用をほとんど，あるいは完全に消3）は増加するものと考えられます．また，塩基長が 1 塩基短
くなるごとに同じ配列が出現する確率は 4 倍ずつ増えるた

失する程度まで減弱させてしまいます ．また，人工核酸

め，13 塩基長より短いアンチセンスでは計算上，狭義のを用いた splice switching oligonucleotide においても 13

オフターゲットとなりうるハイブリダイゼーション可能な

塩基程度の長さで効果を発揮しますが，一つもしくは二つmRNA 配列がより多く存在することになります．

4）

このような潜在的な意図しないハイブリダイゼーショの変異によりその効果は損なわれます ．
他方，siRNA オリゴヌクレオチドについては，標的とンを回避する手段としては，in silico 解析や in vitro マイ

なる塩基配列にハイブリダイズする際にシード配列（5ʼ 末

クロアレイ解析をもとに，核酸医薬品の配列設計時におけ端から 2 8 塩基）の相同性が重要とされており，連続するるスクリーニング過程で排除すること，あるいは，毒性の11 塩基を含む 15 塩基の相同性でも標的以外の遺伝子発現

発現リスクをあらかじめ予測・評価することなどがあり，5）が有意に抑制されること ，2 塩基から 4 塩基のミスマッ
6）

これらによって，ある程度回避することができるものと考えられます（Fig. 2）．以下に，in silico 解析や in vitro マイ

チは許容されることが報告されています ．
次に，ヒトの体内で標的とする塩基配列と同じ配列が出現する確率について考えてみます．塩基配列に偏りがない

クロアレイ解析で考慮すべきポイントをまとめてみました．

ことを前提とすると，例えば上述したある特定の配列を有する 13 塩基長のアンチセンスについて，その相補的配列
13の出現する確率は 1 ／ 4 （塩基 4 種類の 13 乗）となり，
682

医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス

2.1 In silico 解析
ハイブリダイゼーション可能な配列を有し，オフター

Vol. 46 No. 10（2015）

［ICH S6 対応研究班：核酸医薬品のオフターゲット作用の評価］໭ଝ峘崒崽崧嵤崚崫崰
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Fig. 2

適切な臨床試験実施に向けた戦略：オフターゲット毒性の予測と従来型非臨床安全性評価

ゲット作用を引き起こす可能性のある遺伝子（オフターする手法の一つとして，in vitro マイクロアレイ解析があゲット候補遺伝子）を抽出するには，ヒト mRNA 情報をります．

もとにした in silico 解析が有用です．すなわち，適切なア

In vitro マイクロアレイ解析では，被験対象の核酸医薬

ルゴリズムを用いてデータベース検索を行うことで，ハイ候補品が細胞内で実際にオフターゲット候補遺伝子にハイブリダイズする可能性があるオフターゲット候補遺伝子をブリダイズして遺伝子発現を変化させるか確認すること

ある程度予測・回避することが可能と考えられます．

で，in silico 解析で抽出されたオフターゲット候補遺伝子

具体的には，例えば National Center for Biotechnology

群の中から，リスク評価が必要なオフターゲット候補遺伝

Information（NCBI）の Basic local alignment search tool

子を絞り込むことができます ．具体的には，オンターゲッ（BLAST；http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）などでト遺伝子及び in silico 解析で抽出されたオフターゲット候

検索することにより，標的配列を含む遺伝子（オンター

補遺伝子を発現しているヒト由来試料などに，核酸医薬候

ゲット遺伝子）とともにクロスハイブリダイゼーションが補品を作用させて，回収した mRNA をもとに網羅的な遺可能なオフターゲット候補遺伝子を，網羅的に抽出するこ

伝子発現解析を行います．また，in vitro マイクロアレイとが考えられ，この他にも目的に応じたデータベースを活解析では，このようなオフターゲット候補遺伝子の絞り込

7）1）用することができます ．このようなデータベースの検索

みの他にも，核酸医薬候補品に起因する下流の遺伝子の発時にヒットする遺伝子の数は，mRNA とハイブリダイズ

現の変動もあわせて評価できる可能性もあることから，こする塩基長やミスマッチ数の設定により大きく異なりまうした情報をリスク評価に活用できることが期待されます．条件設定の選択基準は核酸医薬のタイプに依存し，例

す．

えば，選択基準が厳しすぎるとオフターゲット遺伝子を取りこぼすリスクがあることなどに留意する必要がありま

2.3

す．

In silico 解析及び in vitro マイクロアレイ解析を通じて

リスク評価

現時点では目的に合致したデータベースの選定と検索選択されたオフターゲット候補遺伝子の生体内での発現変アルゴリズムの最適化を通して，細心の注意を払いながら化が，ヒトでの毒性（狭義のオフターゲット毒性）発現に解析を進める必要があると考えられます．

結びつく可能性については，綿密かつ総合的な検討が必要
です．

2.2 In vitro マイクロアレイ解析

In silico 解析と併せて有用なオフターゲット作用を予測

まず，当該オフターゲット候補遺伝子の機能を文献検索などにより，可能な限り調査することが必要です．例えば，

Pharmaceutical and Medical Device Regulatory ScienceVol. 46 No. 10（2015）683

［ICH S6 対応研究班：核酸医薬品のオフターゲット作用の評価］

8）

イオンチャネルに関連する遺伝子ならば，少しの発現変化

知られています ．これらの受容体により免疫系の活性化でも生体に大きな影響を与える懸念があることから，オフが引き起こされることから，核酸医薬品にとって TLR にターゲット作用に最大限の注意を払う必要があります．一

よる認識は回避すべきとされています ．TLR による認識方，生体機能にあまり重要と考えられないタンパクに関連を回避する手段として化学修飾が有効とされており，また，

9）する遺伝子ならば，多少の発現変化が起きても生体への影認識されやすいモチーフ（塩基配列の特徴）を避けること

響は少ないと予想されます．この時点で，当該オフターゲッ（例えば TLR9 の認識を回避するため CpG rich な配列をト候補遺伝子と毒性との関連性が明らかになる場合もある

避けたデザインにすることなど）も有効とされています．

と思いますが，文献調査などにおいてオフターゲット候補

TLR7 もしくは TLR8 はリガンドを認識すると Type 1 の遺伝子に起因する毒性が明らかにできない場合には，ヒトinterferon（ α , β）の発現を引き起こすため ，これを10）での当該遺伝子の発現パターンや遺伝子疾患に関する情報

指標に in vitro で形質細胞様樹状細胞などを用いて核酸医や，ヒト特異的ではない場合には遺伝子改変動物（トラン

薬品による TLR への影響を予測できると考えられます ．

スジェニック動物，ノックアウト動物）での解析結果に関

また，TLR を介した自然免疫系への影響の他に，核酸する情報が，有用な判断材料になると考えられます．

11）

医薬品でのハイブリダイゼーション非依存的オフターゲッ

以上の方策により，ヒトで狭義のオフターゲット毒性がト作用として知られているものには，血漿蛋白の結合に起生じる可能性が考えられた場合には，配列を最適化するこ因する急性かつ一過性の変化（aPTT 延長，補体活性化），とにより当該オフターゲット候補遺伝子とのハイブリダイ

高濃度分布臓器（肝臓，腎臓）への影響，血小板数減少な

ゼーションを回避することが可能と考えられます．このよどがありますうに核酸医薬品については，in silico 解析及び in vitro マ

human primate，NHP）よりげっ歯類で強く発現するなど

イクロアレイ解析を活用し，様々な情報源から得られる情種特異性が認められており ，毒性の発現強度については報も踏まえて綿密なリスク評価を行うことで，ヒトでのリヒトへの外挿性を考慮する必要があります．

12，13）．ただし，肝毒性はヒト以外の霊長類（non14）

スクを事前に予測・回避する戦略を取ることが可能になる

なお，アンチセンス核酸の非臨床安全性評価では，NHPことから，開発を進める上では大きなメリットと考えられの有用性が高いとの報告もありますが ，NHP の使用にます．核酸医薬品の開発現場では，過去の開発経験をもとあたっては，有用性と 3Rs とのバランスも考慮する必要に，既知の毒性や副作用発現に繋がりかねない意図しないがあるでしょう．

3）

ハイブリダイゼーションを減じるための，配列設計ノウハ
1）

ウが蓄積されつつあるものと考えられます ．

3.

4.

ハイブリダイゼーションに起因しないオフター
ゲット作用

オフターゲット毒性の事例
4.1 狭義のオフターゲット毒性について®

核酸医薬品として，これまで硝子体内投与の Vitravene®

（fomivirsen sodium；アンチセンス）及び Macugen（Pe-ハイブリダイゼーションに起因しないオフターゲット

gaptanib sodium； ア プ タ マ ー），並びに皮下投与の作用には，オリゴヌクレオチドの物性により惹起された効Kynamro（Mipomersen sodium；アンチセンス）が日本，

果や，様々な化学修飾に起因する効果が含まれます（Fig.

米国又は EU で承認されています．例えば，全身投与剤で1）．これらのオフターゲット作用に起因する毒性は，通常ある Kynamro ではハイブリダイゼーションに起因したの化学合成医薬品と同様に，実験動物を用いた従来型の毒オフターゲット毒性と考えられる明らかな所見は検出され性試験で評価することが可能です（Fig. 2）．

ておらず ，また，他に開発中の核酸医薬品においてもこ

®

®

15）

1）

オリゴヌクレオチドの物性により引き起こされる生体うした所見の報告はありません ．これは，2 章でも述べ

内反応としては，まず自然免疫系への影響が考えられます．

たように，適切なデータベース検索によりハイブリダイ

すなわち，ヒトを含む動物には外来病原体である細菌やウゼーション依存的なオフターゲット候補遺伝子が比較的容イルス等を認識して排除する生体防御機構として自然免疫

易に検出できることから，核酸医薬品の開発初期において，が備わっており，自然免疫を司る分子として DNA や RNA

in silico 解析及び in vitro マイクロアレイ解析等を活用すを関知する Toll 様受容体（Toll like receptor：TLR）が存ることで遺伝子配列の選別と最適化が図られ，ヒトでのリ在しています．ヒトでは 10 種類の TLR が確認されており，

スクが回避された結果であろうと考えられています．

そのうち TLR3 はウイルスの 2 本鎖 RNA を，また，TLR7/8
はウイルスの 1 本鎖 RNA を，更に TLR9 は細菌・ウイルス由来の DNA（非メチル化 CpG 配列）を認識することが684

医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス

Vol. 46 No. 10（2015）

［ICH S6 対応研究班：核酸医薬品のオフターゲット作用の評価］

4.2

ハイブリダイゼーションに起因しないオフター

捉することは，従来型の実験動物を用いた毒性試験では極ゲット毒性めて困難と考えられます．
®

全身投与剤である Kynamro を例にあげると，その開これまで狭義のオフターゲット毒性については，臨床で発時におけるマウス，ラット及び NHP の長期反復投与毒

明確に確認された例はありませんが，例えば，塩基配列に性試験で観察された主要な所見は，免疫刺激性・炎症性反対する親和性や細胞内への導入効率を著しく向上させた新応（リンパ組織球性浸潤，ケモカイン・サイトカインの増規核酸医薬品については，狭義のオフターゲット毒性が発加，IgG 増加など），aPTT 延長及び血小板数の変動，肝現する可能性も否定できません．このような場合には，in®

臓及び腎臓への影響（Kynamro の蓄積に起因する変化），

silico 解析や in vitro マイクロアレイ解析結果に加え，生赤血球数，ヘモグロビン及びヘマトクリット（赤血球系パ

体内での薬物動態，毒性試験成績，文献情報なども考慮しラメータ）の減少であり，NHP では補体活性化及び血管て，狭義のオフターゲット毒性発現の有無を注意深く評価

15，16）

傷害も認められました．また，臨床試験での主な副作用として，炎症性反応及び免疫原性，血液凝固・血小板への影響，肝臓への影響，並びに投与部位での反応及びインした上で，臨床における初回投与時のリスクマネジメントに活用すべきと考えます．
化学合成医薬品や生物製剤での開発経験と比較すると，核酸医薬品の開発経験はまだ乏しく，その毒性や副作用にフルエンザ様症状がみられました．
®

Kynamro の非臨床試験では，これまでに開発が進め関する情報もごく限られています．しかし，核酸医薬品にられてきた第一世代（phosphorothioate oligonucleotide）

ついては，従来の化学合成医薬品と比べて特段の安全性上及び第二世代（2ʼ MOE 修飾）オリゴヌクレオチドで共通の懸念を有するものではなく，これまで述べてきましたよ

してみられた変化，すなわち①血漿蛋白の結合に起因する

うに，むしろ現在の科学技術（in silico 解析及び in vitro

一過的変化：aPTT 延長，補体活性化，②高濃度分布臓器

マイクロアレイ解析等）を活用することで，ヒトへのリス（肝臓，腎臓）への影響：クッパー細胞の塩基性顆粒蓄積・

クを確度よく軽減化できるものと考えられます．今後，こ肥大，尿細管上皮細胞塩基性顆粒蓄積・空胞化，③炎症性のような核酸医薬品の開発を推進するためには，開発経験

反応：免疫系細胞活性化，サイトカイン・ケモカイン放出，を積み重ね，ヒト及び実験動物でのオフターゲット作用のリンパ組織球性浸潤，④血小板数減少などと，ほぼ同質の特徴，並びに非臨床及び臨床のオフターゲット作用のデー

12，15，16）変化が認められています．これらの知見より，第二®

世代アンチセンス核酸である Kynamro でみられた変化
は，ハイブリダイゼーションとは関連しないアンチセンス
注）

核酸に特異的な作用（class eﬀect ）であると考えられています．

5. おわりにハイブリダイゼーションに起因しない毒性は，通常の化
学合成医薬品と同様に，従来型の実験動物を用いた毒性試
験で評価することが可能です．一方，ハイブリダイゼーションに起因した狭義のオフターゲット毒性についても，insilico 解析及びヒト由来試料を用いた in vitro マイクロア
レイ解析により，特定した標的配列の種特異性が許容できれば実験動物で検出可能と考えられます．ただし，当該遺伝子の発現様式やそれが担う生物学的機能は，ヒトと動物
で必ずしも同一ではなく，更に核酸医薬品の体内動態についても異なる可能性もあることから，非臨床安全性試験成績をヒトへ外挿する際には注意が必要です．他方，標的配列がヒト特異的であれば，狭義のオフターゲット毒性を捕注）class eﬀect：あるカテゴリーの分子（薬剤）に共通してみられる副作用

タ相関性などについて，更に議論を深めることが有用と考
えます．
文

献

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Vol. 46 No. 10（2015）