●血管新生の基礎と臨床!!［ I ］血管新生の分子制御機構

2．動静脈形成の制御機構
須田年生＊

17 世紀ウィリアム・ハーヴィーによって，血液が循環することが明らかにされて以来，心―動脈―毛細血管―静脈という循環路は，形態学的・生理学的に詳細に検討されてきた．しかし，その成り立ちに関する研究は始まったばかりである．1998 年，デイビッド・アンダーソンらは，ephrin-B2 遺伝子破壊マウスを用いて，動脈の内皮細胞および平滑筋細胞は，ephrin-B2（結合因子）を，静脈の内皮細胞は EphB4（チロシンキナーゼ受容体）を発現していることを明らかにした．また，毛細血管は ephrin-B2 を斑状に発現している．
われわれは，これらの分子がいかに動静脈の形態形成に関わるかを in vitro およびin vivo で検討した．in vitro では，ephrin-B2 陽性細胞と EphB4 陽性細胞とを共培養する系を用いた．!ephrin-B2 陽性細胞は，EphB4 陽性細胞の増殖に対して抑制的に働くこと，またお互いに反発的に働き，接着を抑制し境界面を形成すること，"ephrin-B2 陽性細胞は血管の萌出を促進すること，さらに#平滑筋細胞のリクルートを促進することを見いだした．これらの現象は!動静脈の境界形成，"動脈の血管分岐，#動脈壁の形成を示唆するものと考える．
ephrin-B2 遺伝子を β-actin プロモーターで強制発現したトランスジェニックマウ
スでは，血管形成が異常となり，そのホモマウスでは，新生時期に大動脈解離がみられた．つぎに TIE2 プロモーターを用いて，血管内皮特異的に ephrin-B2 を発現させたところ，やはり，脳血管に出血がみられた．ephrin-B2 が，本来発現するべきでない静脈に発現していることが原因と考えられる．このように，動静脈の形成には，ephrin などの遺伝子の発現が適所に，至適な量で発現されることが重要と考えられる．

Role of ephrin-Eph signaling in Angiogenesis
TOSHIO SUDA Department of Cell Differentiation, Institute of Molecular Embryology and Genetics, Kumamoto University
すだ・としお：熊本大学発生医学研究センター造血発生分野教授．
昭和49年横浜市立大学医学部卒
業．昭和57年サウスカロライナ医科大学留学．昭和59年自治医科大学講師．平成４年現職．主研究領域／造血学，血管生物学．
＊

12 第 120 回日本医学会シンポジウム

Key words

血管新生
EphB!
ephrin-B2
両方向性シグナル伝達

はじめにうに密着配列しているものから，骨髄や肝臓のように有窓のものまであり，おそらく各血循環器系の形態が保たれ，酸素供給という管内皮細胞の発現する分子は異なると考えら機能が正常に作動することは生命維持にとっれる．血管自体も，動脈，静脈とそれをつなて最も基本的，かつ不可欠なことである．こぐ毛細血管と多様であり，それらの形成は特とに血管系は全長 10 万キロメートルにおよ徴的である．本稿では，受容体型チロシンキ

び，その基本構成細胞である血管内皮細胞がナーゼファミリーの一つである Eph とその覆う面積は 7,000 平方メートル，重量は 1 キ結合因子（リガンド）である ephrin の血管新ログラム，レンズや上皮などのわずかな例外生における役割について述べる．

を除き，体内のあらゆる部分に分布する人体最大の臓器と考えられる．その血管内皮細胞は 1,000 日以上の寿命がある．組織，器官の形

1．Eph!
Ephrin の特徴

成において，血管形成は，必要不可欠の事象

EphB4 （ erythropoietin producing humanである．しかし，胎生期とは異なり，成体にhematocellular carcinoma）は，少なくとも 14おいて，血管新生が観察されるのは，排卵過種のメンバーと 8 種の ephrin リガンドから程や創傷治癒あるいは腫瘍血管新生において構成されている．これらは構造的相同性と結である．

合特異性により，大きく A と B の 2 つのサブ

血管は，木の枝のごとく，あるいは葉脈のク ラ ス に 分 け ら れ て い る．ephrin-A は GPI

ように，一定の組織空間に分布する．空間にアンカー型のリガンドで，おもに EphA サブ

血管はいかに伸展し，またその伸展を止めるクラスのレセプターに結合し，おもに体全体のか，血管新生の促進と抑制の分子機構が興のパターン形成化や神経軸索誘導に関与して味深い．血管形成は，細胞レベル・組織レベいることが解明されている．一方，ephrin-B

ル・個体レベルでいくつかの事象に区分されは膜貫通型のリガンドで，おもに EphB サブ

る．一般に，血管内皮前駆細胞からの血管系クラスのレセプターに結合するが，各々のグの発生をいう Vasculogenesis（脈管形成）と，ループ内での結合様式は複雑であることが明それに引き続く既存の血管からの新しい血管らかとなってきている1）．Eph!
ephrin の特徴

枝の形成 Angiogenesis（血管新生）に区分されは，可溶型リガンドとしてはシグナルを伝達る．脈管形成においては，この血管内皮前駆できないこと，および受容体と結合すること細胞の分化，周囲細胞としてのペリサイトのによりリガンドである ephrin-B の細胞内ド動員・構築が課題となる．血管新生においてメインのチロシン残基がリン酸化され，レセは，血管内皮細胞の萌出（sprouting）・分岐プター側とリガンド側の両細胞にシグナルが（branching）
・融合（fusion）
・嵌入（intussus-2,3）
伝達することである（図 1）．

ception）
・退縮（pruning!
regression）という現象がテーマである．この血管の退縮と新生の繰り返しは，リモデリングとよばれる．血
管内皮細胞レベルでは，細胞の離解（detachment）・移動（migration）・接着（adhesion）という問題として捉えられる．
血管内皮細胞も多様で，動脈に見られるよ2．EphBs!
ephrin-B2 の 血 管 内 皮 細 胞における発現わ れ わ れ が 造 血 に お け る EphB 4 と ephrin-B2 のシグナルに注目し研究を展開していたのと同時期に，Anderson らにより EphB4
血管新生の基礎と臨床 13

Receptor-expressing cell(Eph)KinaseP P;

Ligand-expressing cell(ephrin)
P P

SignalKinaseKinaseKinaseP PSH2Signal

図1

P P

FN IIIIgephrin-B2!
EphB4 の両方向性シグナル

およびそのリガンドである ephrin-B2 の遺伝で死亡することも明らかにされた6）．このこ子破壊マウスがレポーター遺伝子であるとは，Eph!
ephrin シグナルは動―静脈間だけLacZ を挿入する形で作成された

4,5）．驚くべでなく血管内皮細胞とその周囲の壁細胞とのきことに，それぞれのヘテロ変異体を用いた相互作用にも関与し，血管新生を制御してい発現解析によりマウス胎生期の血管内皮細胞る可能性を示唆している．また，毛細血管でにおいて EphB4 が静脈内皮細胞に，ephrin-は ephrin-B2 が 斑 状 に 発 現 し て い る．し た

B2 が動脈内皮細胞に特異的に発現しているがって，毛細血管が特別な血管ではなく，動ことが明らかとなった（図 2）．EphB4 および脈の延長であることが示唆される．

ephrin-B2 の遺伝子破壊マウスは，その予想通り胎生 10.5 日に血管網形成不全により動静脈の両方に異常をきたし子宮内で死亡した．このことは，神経系で報告されていた

3．ephrin-B2 陽性周囲細胞の血管内細胞におよぼす作用

Eph!
ephrin の相反的発現パターンが血管系

われわれは，これらの分子がいかに動静脈にも存在し，血管系構築に重要な機能を果たの形態形成に関わるかを in vitro で検討 ししていることを示唆している．その後 Adams

た．ephrin-B2，EphB4 遺伝子をそれぞれ OP9らにより，血管系には ephrin-B2 が結合できストロマ細胞に導入し，各ストロマ細胞層のる 受 容 体 が EphB4 以 外 に EphB2，EphB3 が上で，胎児 AGM 領域より分離した血管内皮血管内皮細胞もしくはその周囲の細胞にも発前駆細胞を培養した．その結果，ephrin-B26）

現 し て い る こ と が 報 告 さ れ た ．さ ら に導入ストロマ細胞の上では，血管内皮細胞はEphB2，EphB3 の遺伝子破壊マウスは，それ強い sprouting と branching を示した．しかもぞれ単独では血管系に異常はきたさないもの

sprouting し て い る 内 皮 細 胞 は ephrin-B2 陽の，それぞれを交配して作成したダブル遺性細胞であった．一方，EphB4 導入ストロマ

伝 子 破 壊 マ ウ ス の 約 30％ は，ephrin-B2 や細胞の上では，内皮細胞の層状の増殖は見らEphB4 の遺伝子破壊マウスと類似の血管網れるものの，血管新生は抑制され，血管網のの構築に異常をきたし，胎生 10.5 日で子宮内形成はみられなかった．すなわち，!ephrin-14 第 120 回日本医学会シンポジウム

LacZ /PECAM-1

LacZ /a-SMA

ephrin-B2 ＋/−

adult mousewild typeephrin-B2 ＋/−E9.5 embryo

wild type

LacZ

図2

動脈・静脈での ephrin-B2 の発現

ephrin-B2 locus に LacZ 遺伝子を導入したヘテロマウスでの解析．動脈は，血管内皮細胞および平滑筋層に ephrin-B2 が発現していて，静脈にはまったく発現していない（Zhang 原図）．
（カラー 97 ページ）b0.40.2c2-F4-Fcn-Btroc2-F

図3hriep

hrin-B-Fc0hB4Epntrol-Fc00.6

ep20.8l-Fc41.0hB6

ephrin-B2−
1.2Ep

Relative adhesion cells（folds）

8Co

Relative adhesion cells（folds）

ephrin-B2＋Conaephrin-B2!
EphB4 のシグナル方向の違いによる細胞の接着と離解（a）ephrin-B2＋細胞は EphB4-Fc キメラ蛋白に結合するが，（b）ephrin-B2−細胞は ephrinB2-Fc 蛋白からは離解する．

血管新生の基礎と臨床 15

B2 陽性細胞は，EphB4 陽性細胞の増殖に対rin-B2-Fc および EphB4-Fc タンパクを培養皿して抑制的に働くこと，"ephrin-B2 陽性細上にコートし，FACS により分離した ephrin-胞は血管の萌出を促進すること，さらに#平B2 陽性細胞および ephrin-B2 陰性細胞（すな滑筋細胞のリクルートを促進することが明ら

わち EphB4 細胞）の接着能を検討した．その7）かとなった ．これらの現象は!動静脈の境結果，EphB4 細胞は ephrin-B2 コート面に接界形成，"動脈の血管分岐，#動脈壁の形成着できず，反発することが明らかとなった．

を示唆するものと考える．

反対に，ephrin-B2 陽性細胞は EphB4 コート面への強い接着を示した．このことより，この機構を解析するため，われわれは eph-bg

hwild

Tg / Tg

ijwildTg / Tg

Tg / Tg
WT
WT
WT
Tg /＋WT
Tg / Tg

adwildTg / Tg

efwildTg / Tgml

P＜0.01
P＜0.01NS12108642mm2kwild

Tg / Tg

wild

図4Tg /＋nRelative Cell Numbercwild
Tg /＋Tg / Tg

7654321Tg / Tg

1 37Dayephrin-B2 トランスジェニックマウスの大動脈構築

ephrin-B2 を CAG プロモーターで全身性に過剰発現（a）したマウスでは，上行大動脈の解離のため突然死を示した（b-f）．解離を起こす前のマウスの組織学的解析では，上行大動脈の平滑筋の部分的欠損が認められた（g-j）．その機序解析のため，血管平滑筋の培養をしたところ，平滑筋細胞自身の増殖には異常を認めず（n），神経堤細胞からのリクルート低下が考えられた（k-m）．

16 第 120 回日本医学会シンポジウム

12ephrin-B2"
EphB4 のシグナルは両方向性では動静脈の形成には ephrin などの遺伝子の発あるが，その向きによって細胞としては全く現が適所に，至適な量で発現されることが重異なる現象，細胞の解離と接着が起こること要と結論される．

がわかった（図 3）．

4．ephrin-B2 トランスジェニック（Tg）
マウス

まとめephrin"
Eph を介する刺激は，接着（adhesion），および反発（repulsion）という細胞機能に関与している．前交連，視交叉，菱脳のephrin-B2 の 血 管 構 築 へ の 関 与 検 討 の た区域形成に関与し，動脈，静脈の形成にも重め，CAG プロモーターで ephrin-B2 を全身に要な機能を果たすことが明らかにされつつあ強発現させた ephrin-B2 トランスジェニック

る．体組織の区域に設定に必要な細胞の集合（Tg）
マウスを作製した．このマウスは新生児離反が，複数の Eph とその結合因子である期に上行大動脈の解離のため死亡した（図ephrin によって重層的に制御されている．こ4）．解離前の組織学的検討で，この Tg マウスの Eph シグナルの解析により，動脈と静脈のの血管内皮細胞周囲の平滑筋細胞の不足を認伴行，毛細血管の形成などが説明されるだけ

8）めた ．さらに，ephrin-B2-Tg マウス由来のでなく，血管と神経の走行の異同についても血管の器官培養および平滑筋培養により平滑議論されるようになると予測される．

筋細胞の増殖能には問題がなく，上行大動脈部位の平滑筋細胞の祖先細胞（神経堤細胞）のリクルートの低下が推測された．神経堤細胞は神経系細胞（ニューロン，グリア）に分化す

謝辞
本研究成果は，尾池雄一・張秀琴・浜田浩一氏らとの共同研究によるものであることを付記する．

るほかに上行大動脈部位の血管平滑筋細胞に分化すること，また，すでに神経系細胞に分化する神経堤細胞の移動には Eph"ephrin シ
グナルがその移動を制御していることが知られている9,10）．以上のことより，Tg マウスの上行大動脈周囲の平滑筋細胞の不足は異所性に ephrin-B2 が発現しているため，上行大動脈部位への神経堤細胞の移動が障害されていることが推測された．また，この現象は異所性の ephrin-B2 の発現量に依存しており，神経系細胞の移動・遊走が Eph"ephrin の濃度勾配に依存することを考え合わせると興味深い所見である．
一方，TIE2 プロモーターで血管内皮細胞特異的に ephrin-B2 を強発現させた Tg マウス
でも，脳血管に出血がみられた．ephrin-B2が，本来発現するべきでない静脈に発現していることが原因と考えられる．このように，〔文献〕
1）Gale NW, Holland SJ, Valenzuela DM, et al. : Eph receptors and ligands comprise two major specificity
subclasses , and are reciprocally compartmentalized
during embryogenesis. Neuron 1996 ; 17 : 9―19.
2）Bru!ckner K, Pasquale EB, Klein R : Tyrosine phosphorylation of transmembrane ligands for Eph receptors.
Science 1997 ; 275 : 1640―1643.
3）Holland SJ, Gale NW, Mbamalu G, et al. : Bidirectinal
signaling through the EPH-family receptor Nuk and its
transmembrane ligands . Nature 1996 ; 383 : 722 ―725.
4）Wang HU, Chen ZF, Anderson DJ : Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonicarteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor EphB4. Cell 1998 ; 93 : 741―753.
5）Gerety SS, Wang HU, Chen Z-F, et al. : Symmetricalmutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development. Mol Cell 1999 ; 4 : 403―414.
6）Adams RH, Wilkinson GA, Weiss C, et al. : Roles ofephrinB ligands and EphB receptors in cardiovascular

血管新生の基礎と臨床 17development : demarcation of arterial !venous domains, vascular morphologenesis, and sprouting angiogenesis. Genes & Dev 1998 ; 13 : 295―306.
7）Zhang X-Q, Takakura N, Oike Y, et al. : Stromal cells
expressing ephrin-B2 promote the growth and sprouting of ephrin-B2+endothelial cells. Blood 2001 ; 98 :1028―1037.
8）Oike Y , Ito Y , Takeya M , et al. : Signaling throughephrin-B2, a ligand for the EphB receptors, builds thevascular system independently from angiopoietin signaling. Blood , in press.
9）Wang HU, Anderson DJ : Eph family transmembrane
ligands can mediate repulsive guidance of trunk neural crest migration and motor axon outgrowth. Neuron 1997 ; 18 : 383―396.
10）Smith A, Robinson V, Patel K, et al : The EphA4 andEphB1 receptor tyrosine kinases and ephrin-B2 ligand
regulate targeted migration of brachial neural crest
cells. Curr Biol 1997 ; 7 : 561―570.

しているということは十分考えられると思います．
そのほかにも今われわれも注目しているのですが，肥満細胞その他炎症細胞からもたくさんの血管新生因子が出て，血管新生と造血，炎症がリンクしてくる可能性は高いと思っています．
永井

造血は胎児期には肝臓でも行われますが，やはり幹細胞でもこれが発現しているのでしょうか．
座長

Eph に関しては幹細胞では発現 していません．白血球でも発現していなくて，赤血球の前駆細胞だけです．それがまた非常に特徴的だと思います．
渡部徹郎（東 京 大） ephrin-B2とEphB4が動脈，静脈それぞれの細胞に発現しているということですが，元は共通の血管内皮前駆細質

疑応

答胞が，その二つの集団に分かれて行く過程で，何かわかっているメカニズムがあれば教えて座長（須田） それではご質問がありました
らお願いいたします．

いただきたいと思います．
座長

それは非常に大事なご質問で，いつ永井良三（東 京 大） ephrin と Eph は 造 血

この ephrin-B2，EphB4，あるいは動静脈内皮幹細胞全体を見た時に，どの段階から発現しが分かれてくるかということは興味を持ってているものなのか，また発生，分化とともに研究しているのですが，今お示ししているのどのように発現が変わるかということを教えは E 12.5 などで，そのあたりでは完全に分かていただきたいと思います．

れ て い ま す．E 10.5，
E 9.5 ぐ ら い に さ か の座長

先生も序説でいわれたように，たしぼ っ て も，わ れ わ れ は ephrin-B2 と EphB4

かに今造血と血管内皮の interaction は注目

陽性細胞それぞれに見ることができるので，されています．
一つは幹細胞レベルで heman-もっと前ではないかと思います．ごく最近，gioblast というような細胞が造血細胞にもなゼブラフィッシュでグリドロックというようりますし，血管内皮細胞にもなり得るというな転写因子が ephrin-B2 陽性細胞だけを引きinteraction もあります．今ここでお示しして出すというようなことがあって，その転写因いるのは，赤血球に commit した細胞と血管子こそ動脈形成因子だというような報告がさ新生の関係です．とくに赤血球がよく作られれましたが，それはかなり早い時期ですね．ているのは，まだ骨髄の解析が進んでおりま

そのあたりは，こういう分子をマーカーとしせんが，小動脈側ではないかという話もありて検討できるのではないかと思っています．

ます，そういうところで赤血球の分化が亢進

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