50

飼料研究報告 Vol. 48 (2023)

5 とうもろこしジスチラーズグレインソリュブル中のアフラトキシン，
ステリグマトシスチン及びゼアラレノンの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による分析法の検討
渡辺 ちとせ *1，林菜月 *2,3

Study of Determination Method of Aflatoxin, Sterigmatocystin and Zearalenone
in Corn Dried Distillers Grains with Solubles by LC-MS/MS
WATANABE Chitose *1 and HAYASHI Natsuki*2, 3( *1 Sendai Regional Center, Food and Agricultural Materials Inspection Center (FAMIC) (Now National
Livestock Breeding Center),*2 Fertilizer and Feed Inspection Department, FAMIC,*3 Institute of Food Research, National Agriculture and Food Research Organization)

We have studied a quantitative determination method of the concentration of aflatoxin (AFB1, AFB2,
AFG1 and AFG2), sterigmatocystin (STC), and zearalenone (ZEN) in brans and food processing byproducts, and oil seed meal using a liquid-chromatograph electrospray-ionization tandem mass
spectrometer (LC-ESI-MS/MS).
AFs, STC and ZEN were extracted with acetonitrile-water (21:4), and the extracted solution wascentrifuged. The supernatant (10 mL) was transferred to another centrifuge tube, added withmagnesium sulfate and sodium chloride, and shaken. Organic layer was purified with two types ofcolumns (Captiva EMR-Lipid, Agilent Technologies, Inc.; CA, US and MultiSep #226 AflaZon+,
Romer Labs Division Holding GmbH; Getzersdorf, Austria), and injected into LC-MS/MS todetermine the concentration of AFs, STC and ZEN. LC separation was then carried out on an ODS
column (ZORBAX Eclipse XDB-C18, 2.1 mm i.d. × 150 mm, 1.8 µm, Agilent Technologies Inc.)
with a gradient of 0.5 mmol/L ammonium acetate-0.1 % formic acid aqueous solution and 0.5mmol/L ammonium acetate-0.1 % formic acid methanol solution as a mobile phase. In the MS/MS
analysis, the positive mode electrospray ionization (ESI+) was used for AFs and STC, while thenegative mode electrospray ionization (ESI-) was used for ZEN.
Corn dried distillers grains with solubles was used as an analytical sample to confirm theconcentration of each mycotoxin in the effluent fraction from MultiSep 226 AflaZon+. As a result,good recoveries were obtained with 0-0.5 mL for AFs, and with 0.5 mL or more for STC and ZEN,
whereas ionization suppression due to matrix effect was observed for AFG1. The necessity to
reduce the matrix effect was thus suggested.
Key words: aflatoxin; sterigmatocystin; zearalenone; liquid-chromatograph tandem mass
spectrometer (LC-MS/MS); electrospray ionization (ESI); brans and food processing byproduct; oil seed meal; corn dried distillers grains with solubles*1

独立行政法人農林水産消費安全技術センター仙台センター，現ター*2

独立行政法人農林水産消費安全技術センター肥飼料安全検査部*3

国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構食品研究部門

独立行政法人家畜改良セン

とうもろこしジスチラーズグレインソリュブル中のアフラトキシン，ステリグマトシスチン及びゼアラレノンの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による分析法の検討

51

キーワード：アフラトキシン；ステリグマトシスチン；ゼアラレノン；液体クロマトグラ
フタンデム型質量分析計；エレクトロスプレーイオン化法；そうこう類；植物性油かす類 ；とうもろこしジスチラーズグレインソリュブル

1

緒

言

現在，独立行政法人農林水産消費安全技術センターでは，かび毒のうちアフラトキシン，ステリ
グマトシスチン及びゼアラレノンの分析は，飼料分析基準 1)第 5 章第 3 節 1 の「かび毒の液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による一斉分析法」（以下「かび毒一斉法」という．）を中心に実施している．しかし，そうこう類及び植物性油かす類の中にはかび毒一斉法において，飼料分析
基準別表 3「試験法の妥当性確認法ガイドライン」による真度等の目標値を満たさないものがあることから 2) ，他の分析法により分析を実施している，もしくは分析を実施していない成分がある．
そうこう類及び植物性油かす類のかび毒の基準値は設定されていないものの，アフラトキシン及びゼアラレノンは配合飼料等で基準値 3) が設定されており，ステリグマトシスチンは農林水産省の「サーベイランス・モニタリング中期計画」で調査対象として取り上げられている．従って，そうこう類及び植物性油かす類中のアフラトキシン，ステリグマトシスチン及びゼアラレノンについて，
効率的な分析の実施及び分析を実施していない成分への対応のため，新規分析法を確立する必要がある．
そうこう類及び植物性油かす類中のかび毒分析が困難である要因は，それぞれの特異なマトリックスに由来する測定の妨害であると考えられる．この問題を解決する方法として，同位体標識された内標準物質を用いる方法があり，飼料中のかび毒分析法にも応用されているが 4)，かび毒一斉法において各分析対象の内標準物質を用いると分析コストの増加に加え，市販されている内標準物質が限定されていることから実用性にも欠ける．また，標準液の溶媒に試料マトリックスを用いるマ
トリックスマッチング法 5)があるが，そうこう類及び植物性油かす類はかび毒汚染のないブランク
試料の入手が困難である．
近年，迅速かつ簡便にマトリックスを分離する方法として急速に普及している QuEChERS 法 6)
は，かび毒分析にも適用されており，固相抽出法を取り入れた方法も報告されている 7)．そこで，
そうこう類及び植物性油かす類中のアフラトキシン，ステリグマトシスチン及びゼアラレノンについて，QuEChERS 法による粗精製後に固相抽出により精製し，液体クロマトグラフタンデム型質量分析計（以下「LC-MS/MS」という．）により定量する方法を検討したので報告する．なお，検討にはマトリックスが複雑であると考えられるとうもろこしジスチラーズグレインソリュブル（以下「DDGS」という．）を用いた．
参考にアフラトキシン，ステリグマトシスチン及びゼアラレノンの構造式等を Fig. 1 に示した．

52

飼料研究報告 Vol. 48 (2023)

Aflatoxin B1

Aflatoxin B2(6aR,9aS)-2,3,6a,9a-Tetrahydro-4-(6aR,9aS)-2,3,6a,8,9,9a-hexahydro-4-

methoxycyclopenta[c]furo[3',2':4,5]furo

methoxy-cyclopenta[c]furo[3',2':4,5]furo[2,3-h][2,3-h][1]benzopyran-1,11-dione[1]benzopyran-1,11-dione

C17H12O6

MW: 312.06

CAS No.: 1162-65-8

C17H14O6

MW: 314.08

CAS No.: 7220-81-7

Aflatoxin G1

Aflatoxin G2(7aR,10aS) -3,4,7a,10a-tetrahydro-5-Methoxy-(7aR,10aS) -3,4,7a,9,10,10a-hexahydro-5-Methoxy-

1H, 12H-furo[3',2':4,5]furo[2,3-h]pyrano

1H,12H-furo[3',2':4,5]furo[2,3-h]pyrano[3,4-c][1]benzopyran-1,12-dione[3,4-c][1]benzopyran-1,12-dione

C17H12O7

MW: 328.06

CAS No.: 1165-39-5

C17H14O7

MW: 330.07

CAS No.: 7241-98-7

Sterigmatocystin

Zearalenone(3aR-cis)3a,12c-dihydro-8-hydroxy-6-methoxy-7H-(4S,12E)-15,17-dihydroxy-4-methyl-3-

furo[3',2':4,5]furo[2,3-c]xanthen-7-one

oxabicyclo[12.4.0]octadeca-12,15,17,19-tetraene-2,8dione

C18H12O6

MW: 324.28

Fig. 1CAS No.: 10048-13-2

C18H22O5

MW: 318.36

CAS No.: 17924-92-4

Chemical structures of aflatoxins, sterigmatocystin and zearalenone

53

とうもろこしジスチラーズグレインソリュブル中のアフラトキシン，ステリグマトシスチン及びゼアラレノンの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による分析法の検討

2
2.1

試

実験方法

料

DDGS を目開き 1 mm のスクリーンを装着した粉砕機で粉砕し，分析用試料とした．
2.2

試

1)

薬

塩化ナトリウムは試薬特級を用いた．アセトニトリルは LC/MS 用（関東化学製又は富士フ
イルム和光純薬製）を用いた．ギ酸，酢酸及びメタノールは LC/MS 用（富士フイルム和光純薬製）を用いた．硫酸マグネシウムは鹿特級（関東化学製）を用いた．1 mol/L 酢酸アンモニ
ウ ム は 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 用 （ 関 東 化 学 製 ） を 用 い た ． 水 は Milli-Q Advantage（Merck Millipore 製）により精製した超純水（JIS K0211 の 5218 に定義された超純水）を用いた．

2)

アフラトキシン標準原液
市販のアフラトキシン（B1，B2，G1，G2）混合標準液（各アフラトキシン 25 µg/mL，富士
フイルム和光純薬製）をアフラトキシン標準原液とした．

3)

ステリグマトシスチン標準原液
ステリグマトシスチン標準品（富士フイルム和光純薬製，純度 98.7 %）2.5 mg を量って 10
mL の全量フラスコに入れ，アセトニトリルを加えて溶かし，更に標線までアセトニトリルを加えてステリグマトシスチン標準原液を調製した（この液 1 mL は，ステリグマトシスチンとして 250 µg を含有）．

4)

ゼアラレノン標準原液
ゼアラレノン標準品（富士フイルム和光純薬製，純度 99.7 %）10 mg を量って 50 mL の全量
フラスコに入れ，アセトニトリルを加えて溶かし，更に標線までアセトニトリルを加えてゼア
ラレノン標準原液を調製した（この液 1 mL は，ゼアラレノンとして 200 µg を含有）．

5)

かび毒混合標準液
各かび毒標準原液の一部を混合し，アセトニトリルで正確に希釈しかび毒混合標準原液を調製した．
使用に際して，かび毒混合標準原液の一部を，アセトニトリル－水－酢酸（20.5+78.5+1）
で正確に希釈し，Table 1 に示す濃度範囲の検量線作成用かび毒混合標準液を調製した．
Table 1

Mycotoxin

Concentration of mycotoxin mixed standard solution
Concentration of standard solution (ng/mL)

#1

#2

#3

#4

#5

#6

#7

#8

#9

#10

#11

Aflatoxin B1

0.25

0.5

1

2

3

4

5

10

15

20

25

Aflatoxin B2

0.25

0.5

1

2

3

4

5

10

15

20

25

Aflatoxin G1

0.25

0.5

1

2

3

4

5

10

15

20

25

Aflatoxin G2

0.25

0.5

1

2

3

4

5

10

15

20

25

Sterigmatocystin

0.5

1

2

4

6

8

10

20

30

40

50

Zearalenone

2

4

8

16

24

32

40

80

120

160

200

6)

添加用かび毒混合標準液
各かび毒標準原液をアセトニトリルで正確に希釈し，1 mL あたりアフラトキシン B1，B2，
G1 及び G2 として 6.25 ng，ステリグマトシスチンとして 12.5 ng 及びゼアラレノンとして 50 ng

54

飼料研究報告 Vol. 48 (2023)

を含む添加用かび毒混合標準液（以下「添加用混合標準液①」という．）， 1 mL あたりアフ
ラトキシン B1，B2，G1 及び G2 として各 2.5 µg，ステリグマトシスチンとして 5 µg 及びゼアラ
レノンとして 20 µg を含む添加用かび毒混合標準液（以下「添加用混合標準液②」という．）
を調製した．また，添加用混合標準液②をアセトニトリルで正確に 10 倍希釈し，添加用混合標準液③を調製した．
2.3

装置及び器具1)

粉砕機： ZM 200

Retsch 製（1 mm スクリーン，使用時回転数 14000 rpm）

2)

振り混ぜ機：レシプロシェーカーSR-2W タイテック製（使用時振動数 300 rpm）

3)

定容用チューブ：Digi TUBEs

4)

脂質吸着機能付きポリマーカラム（以下，「脂質除去用カラム」という．）：Captiva EMRLipid（充てん剤量 600 mg）

15 mL

ポリプロピレン

SCP Science 製

Agilent Technologies 製

5)

多機能カラム：MultiSep 226 AflaZon+

Romer Labs 製

6)メンブランフィルター：DISMIC-13HP（孔径 0.45 µm，直径 13 mm，親水性 PTFE） 東洋濾
紙製

7)

LC-MS/MS：
LC-MS/MS 1：
LC 部：Nexera X2
MS 部：LCMS-8040

島津製作所製島津製作所製

LC-MS/MS 2：

2.4
1)

LC 部：Nexera X2

島津製作所製MS 部：QTrap 4500

AB Sciex 製

定量方法
抽

出

分析試料 25 g を量って 300 mL の共栓三角フラスコに入れ，アセトニトリル－水（21+4）
100 mL を加え，60 分間振り混ぜて抽出した．抽出液を共栓遠心沈殿管に入れ，1700×g で 5 分
間遠心分離した．
2)

塩析

上澄み液 10 mL を 15 mL プラスチック遠沈管に正確に入れ，塩化ナトリウム 0.25 g 及び無水
硫酸マグネシウム 1 g を加え，直ちに手で振り混ぜた後，ボルテックスミキサーで 1 分間かき混ぜた．1700×g で 5 分間遠心分離し，上澄み液全量を定容用チューブに入れ，酢酸 100 µL を加えた後水で 10 mL に定容し，カラム処理 I に供する試料溶液とした．
3)

カラム処理 I
脂質除去用カラムの下に 10 mL のガラス試験管を置き，試料溶液を脂質除去用カラムに入れ，全量流出させ，カラム処理 II に供する試料溶液とした．

4)

カラム処理 II
多機能カラムにストップコックを連結し，その下に 10 mL のガラス試験管を置き，多機能カ
ラムに試料溶液を入れてコックを開け，流出液を試験管にとった．流出液の一部を水で正確に希釈し，メンブランフィルターでろ過し，LC-MS/MS による測定に供する試料溶液とした．

とうもろこしジスチラーズグレインソリュブル中のアフラトキシン，ステリグマトシスチン及びゼアラレノンの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による分析法の検討

5)

55

LC-MS/MS による測定
試料溶液及び各検量線作成用かび毒混合標準液各 5 µL を LC-MS/MS に注入し，選択反応検出（以下「SRM」という．）クロマトグラムを得た．各装置の測定条件を Table 2 及び 3 に示した．
Table 2-1

Operation conditions of LC-MS/MS 1

ColumnZORBAX Eclipse XDB-C18 (2.1 mm i.d. × 150mm, 1.8 µm), GL Sciences

Mobile phase

0.5 mmol/L ammonium acetate 0.1 % formic acid aqueous solution 0.5 mmol/L ammonium acetate 0.1 % formic acid methanol solution (4:1) →8 min → (1:4) 9 min → (0:10) (hold for 5 min) → (4:1) (hold for 5 min)Flow rate

0.2 mL/min

Column temperature

40 °C

Detector

Quadrupole mass spectrometer

Ionization

Electrospray ionization (ESI)

Nebulizer gas

N2 (3 L/min)Drying gas

N2 (15 L/min)Interface temperature

350 °C

Heat block temperature

400 °C

Desolvation line temperature

250 °C

Collision gas

Ar (230 kPa)

Table 2-2
TargetMode

MS/MS parameters of LC-MS/MS 1
Precursor
Product ion
ion
Quantifier
Qualifier(m/z )(m/z )(m/z )

Aflatoxin B1+

313

Aflatoxin B2+

315

Aflatoxin G1+

329

Aflatoxin G2+

331

Sterigmatocystin+

325

Zearalenone-

317

Collisionenergy
(eV)

241

-

41

-

285

24

287

-

28

-

259

31

243

-

29

-

200

42

245

-

31

-

313

25

281

-

39

-

310

26

175

-

25

-

131

31

56

飼料研究報告 Vol. 48 (2023)

Mobile phase

Table 3-1
Operation conditions of LC-MS/MS 2
ZORBAX Eclipse XDB-C18 (2.1 mm i.d. × 150mm, 1.8 µm), GL Sciences
0.5 mmol/L ammonium acetate 0.1 % formic acid aqueous solution 0.5 mmol/L ammonium acetate 0.1 % formic acid methanol solution (4:1) →8 min → (1:4) 9 min → (0:10) (hold for 5 min) → (4:1) (hold for 5 min)Flow rate

0.2 mL/min

Column temperature

40 °C

Detector

Quadrupole mass spectrometer

Ionization

Electrospray ionization (ESI)

Ion source temperature

600 °C

Curtain gas

N2 (40 psi)

Cone gasAir (80 psi)

Turbo gasAir (80 psi)

Collision gas

N2 (8)

Capillary voltage

4500 V

ColumnTable 3-2
Target6)ModeAflatoxin B1+

Aflatoxin B2+

Aflatoxin G1+

Aflatoxin G2+

Sterigmatocystin+

Zearalenone-

計

MS/MS parameters of LC-MS/MS 2
Precursor
Product ion
ion
Quantifier
Qualifier(m/z )(m/z )(m/z )
241
313
285
287
315
259
243
329
200
189
331
313
310
325
281
175
317
131

Collisionenergy
(eV)
49
31
35
39
35
51
53
33
33
47
32
38

算

得られた SRM クロマトグラムからピーク面積を求めて検量線を作成し，試料中の各かび毒量を算出した．
なお，定量法の概要を Scheme 1 に示した．

とうもろこしジスチラーズグレインソリュブル中のアフラトキシン，ステリグマトシスチン及びゼアラレノンの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による分析法の検討

57

Sample 25 g (300 mL Erlenmeyer flask)
added 100 mL of acetonitrile - water (21:4) and shook for 60 min
centrifuged for 5 min at 1700×g
transferred 10 mL of supernatant to centrifuge tube
added 0.25 g of sodium chloride and 1 g of magnesium sulfate
immediately shook by hand and agitated for 1 min by vortex mixer
centrifuged for 5 min at 1700×g
transferred supernatant to 15 mL volumetric tube
added 100 µL of acetic acid and filled up to 10 mL with water
Captiva EMR-Lipid (600 mg/6 mL)
placed a receiver (10 mL test tube)
applied sample solution
MultiSep 226 AflaZon+
placed a receiver (stoppered 10 mL test tube)
applied sample solution
collected some of the effluent
diluted part of the effluent with water
filtered through hydrophilic PTFE membrane filter (pore size: 0.45 µm)
LC-MS/MS

Scheme 1

Analytical procedure for aflatoxins, sterigmatcystin and zearalenone incorn distillers dried grains with solubles (DDGS)

2.5
1)

脂質除去用カラムからの流出画分の確認
添加用混合標準液①を脂質除去用カラムに入れ，流出液を 2 mL ごとに分取した．分取した流出液のうち 200 µL をそれぞれ正確にとり，これらに水 600 µL を正確に加え，メンブランフ
ィルターでろ過し，LC-MS/MS 2 に供する試料溶液とした．得られた試料溶液を 2.4 の 5)及び6)に従い定量し，回収率を求めた．

2)

DDGS を 2.4 の 1)に従って抽出，遠心分離し，上澄み液 10 mL を 15 mL プラスチック遠沈管に正確に分取し，添加用混合標準液②25 µL（各アフラトキシンとして 0.025 mg/kg 相当量，ス
テリグマトシスチンとして 0.05 mg/kg 相当量及びゼアラレノンとして 0.2 mg/kg 相当量（最終試料溶液中にアフラトキシン B1，B2，G1 及び G2 として各 1.56 ng/mL，ステリグマトシスチン
として 3.13 ng/mL，ゼアラレノンとして 12.5 ng/mL 相当量））を添加した（以下「添加試料溶液」という．）．これとは別に，上澄み液 10 mL を 15 mL プラスチック遠沈管に正確に分取した（以下「無添加試料溶液」という．）．添加試料溶液及び無添加試料溶液について，2.4の 2)及び 3)に従い操作し，カラム処理 I における流出液を 2 mL ごとに分取した．分取した添
加試料溶液の流出液 200 µL をそれぞれ正確にとり，これらに水 600 µL を正確に加え，メンブ
ランフィルターでろ過し，添加回収率を求めるための試料溶液とした．また，分取した無添加試料溶液の流出液 195 µL をそれぞれ正確にとり，添加用混合標準液③5 µL（最終試料溶液中の各かび毒濃度は同上）を添加した後，水 600 µL を正確に加え，メンブランフィルターでろ過し，マトリックス効果を求めるための試料溶液とした．得られた試料溶液を 2.4 の 5)及び 6)に従い LC-MS/MS 2 を用いて定量し，回収率を求めた．

58

飼料研究報告 Vol. 48 (2023)

2.6

多機能カラムからの流出画分の確認
DDGS を 2.4 の 1)に従って抽出，遠心分離し，上澄み液 10 mL を 15 mL プラスチック遠沈管に正確に分取し， 2.5 の 2)と同様に添加試料溶液及び無添加試料溶液を調製した．添加試料溶液及び無添加試料溶液について，2.4 の 2)から 4)に従い操作し，カラム処理 II における流出液を 0.5
mL ごとに分取した．分取した添加試料溶液の流出液 300 µL をそれぞれ正確にとり，水 900 µL
を正確に加え，メンブランフィルターでろ過し，添加回収率を求めるための試料溶液とした．また，無添加試料溶液の流出液 195 µL をそれぞれ正確にとり，添加用かび毒混合標準液③5 µL（最終試料溶液中の各かび毒濃度は同上）を添加した後，水 600 µL を正確に加え，メンブランフィ
ルターでろ過し，マトリックス効果を求めるための試料溶液とした．得られた試料溶液を 2.4 の5)及び 6)に従い LC-MS/MS 2 を用いて定量し，回収率を求めた．

3
3.1

結果及び考察検量線
2.2 の 5)により調製した各かび毒混合標準液各 5 µL を LC-MS/MS 2 に注入し，得られた SRM

クロマトグラムからピーク面積及び高さを用いて検量線を作成した．
得られた検量線の一例は Fig. 2 のとおりであり，アフラトキシン B1，B2，G1 及び G2 はそれぞれ 0.25~25 ng/mL（注入量として 0.00125~0.125 ng 相当量）の範囲で，ステリグマトシスチンは0.5~50 ng/mL（同 0.0025~0.25 ng 相当量）の範囲で，ゼアラレノンは 2~200 ng/mL（同 0.01~1 ng相当量）の範囲で直線性を示した．
なお，当該検量線の濃度範囲は，アフラトキシン B1 ，B2 ，G1 及び G2 をそれぞれ 0.004~0.4
mg/kg，ステリグマトシスチンを 0.008~0.8 mg/kg，ゼアラレノンを 0.032~3.2 mg/kg 含有する分析用試料を本法に従い調製した最終試料溶液中の各かび毒濃度範囲に相当する．
200000y = 108367x + 8943.5
R² = 0.9999

2500000

Peak height／arb. units

Peak area / arb. units

3000000

2000000
1500000
1000000
5000000y = 7058.8x + 808.62
R² = 0.9996

150000100000
50000
0

0

5

10

15

20

25

Concentration of aflatoxin B1 / [ng/mL]

Fig. 2-1

30

0

5

10

15

20

25

Concentration of aflatoxin B1 / [ng/mL]

Calibration curves of aflatoxin B1 by peak area (left) and peak height (right)30とうもろこしジスチラーズグレインソリュブル中のアフラトキシン，ステリグマトシスチン及びゼアラレノンの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による分析法の検討

350000y = 197653x + 23825
R² = 0.9998

5000000

Peak height／arb. units

Peak area／arb. units

6000000

4000000
3000000
2000000
1000000
0
0

5

10

15

20

25

y = 12249x + 1745.1
R² = 0.9996

300000250000200000150000100000
50000
0

30

0

Concentration of aflatoxin B2 / [ng/mL]

Fig. 2-230

100000y = 53761x + 6318.1
R² = 0.9999

1200000

Peak height／arb. units

Peak area／arb. units

5
10
15
20
25
Concentration of aflatoxin B2 / [ng/mL]

Calibration curves of aflatoxin B2 by peak area (left) and peak height (right)

1600000

800000400000y = 3360x + 659.07
R² = 0.9993

80000
60000
40000
20000
0

0
0

Fig. 2-3

5
10
15
20
25
Concentration of aflatoxin G1 / [ng/mL]

030

100000Peak height／arb. units

y = 53761x + 6318.1
R² = 0.9999

1200000
800000400000
0
0

5

10

15

20

25

Concentration of aflatoxin G2 / [ng/mL]

Fig. 2-4

5
10
15
20
25
Concentration of aflatoxin G1 / [ng/mL]

30

Calibration curves of aflatoxin G1 by peak area (left) and peak height (right)

1600000
Peak area／arb. units

5930

y = 3360x + 659.07
R² = 0.9993

80000
60000
40000
20000
0
0

5
10
15
20
25
Concentration of aflatoxin G2 / [ng/mL]

Calibration curves of aflatoxin G2 by peak area (left) and peak height (right)

30

60

飼料研究報告 Vol. 48 (2023)
1200000
y = 239341x + 46530
R² = 0.9998

12000000

Peak height／arb. units

Peak area／arb. units

14000000
10000000
8000000
6000000
4000000
2000000

800000600000400000200000
0

0

0

0
10
20
30
40
50
60
Concentration of sterigmatocystin / [ng/mL]

Fig. 2-5

10
20
30
40
50
60
Concentration of sterigmatocystin / [ng/mL]

Calibration curves of sterigmatocystin by peak area (left) and peak height (right)

12000000

1000000
y = 49036x + 31916
R² = 0.9998

10000000

Peak height／arb. units

Peak area／arb. units

y = 19102x + 4820.2
R² = 0.9998

1000000

8000000
6000000
4000000
2000000

600000400000200000

0
0

50

100

150

200

y = 3846.3x + 2121.5
R² = 0.9999

8000000250

0Concentration of zearalenone / [ng/mL]

Fig. 2-6
3.2

50

100

150

200

250

Concentration of zearalenone/ [ng/mL]

Calibration curves of zearalenone by peak area (left) and peak height (right)

脂質除去用カラムからの流出画分の確認
2.5 の 1)により脂質除去用カラムからの流出画分を確認した．その結果は Table 4 のとおり，各

かび毒の混合標準液を脂質除去用カラムに入れ，流出させた場合，各かび毒は 91.5 %以上流出した．また，マトリックスの有無が各かび毒の流出に及ぼす影響を確認するため，2.5 の 2)により流出画分を確認した．なお，脂質除去用カラムのみでは精製が不十分であると考えられたため，同時にマトリックス効果を求めるための試料溶液を測定し，得られた流出画分の各かび毒の回収率をこれで除すことでマトリックス効果を補正した．その結果は Table 5 のとおり，各かび毒の流出液の回収率は 80.5 %以上であり，マトリックスを含む場合，脂質除去カラムからの各かび毒の回収率が低下する傾向が見られた．
Table 4

Elution pattern of aflatoxins, sterigmatocystin and zearalenone
from Captiva EMR-Lipid (standard solution)

Recovery(%)

n=1

Mycotoxins

Fraction(mL)

Aflatoxin B1

Aflatoxin B2

Aflatoxin G1

Aflatoxin G2

Sterigmatocystin

Zearalenone

0－2

95.1

97.9

97.3

103

95.4

99.1

2－4

97.3

95.9

97.9

102

97.7

97.7

4－6

91.5

100

99.8

99.4

96.2

97.0

6－8

94.4

100

97.4

101

95.8

98.1

8－10

94.8

99.5

98.7

105

99.1

98.8

とうもろこしジスチラーズグレインソリュブル中のアフラトキシン，ステリグマトシスチン及びゼアラレノンの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による分析法の検討

Table 561

Elution pattern of aflatoxins, sterigmatocystin and zearalenone
from Captiva EMR-Lipid (matrix spike)

Fraction(mL)

Mycotoxins
Aflatoxin B1

Aflatoxin B2

Aflatoxin G1

Aflatoxin G2

Sterigmatocystin

Zearalenone

0－2

73.5

59.8

71.0

88.3

98.6

88.2

Matrix

2－4

69.6

55.8

79.6

91.1

89.3

84.6

a)

4－6

72.6

58.3

77.2

91.8

87.8

83.4

6－8

67.5

57.0

77.2

87.6

87.0

85.8

8－10

71.2

56.3

78.5

88.2

85.9

85.0

0－2

59.7

50.7

69.9

77.9

79.4

77.3

2－4

62.2

51.8

66.3

77.4

75.0

73.0

4－6

59.9

49.0

64.0

78.7

72.4

71.7

6－8

57.1

48.4

64.8

74.8

72.9

71.5

8－10

58.0

48.9

64.2

80.6

72.2

74.8

0－2

81.2

84.7

98.5

88.3

80.5

87.7

Corrected

2－4

89.4

92.8

83.3

85.0

83.9

86.2

b)

4－6

82.5

84.1

83.0

85.7

82.4

85.9

6－8

84.6

85.0

83.9

85.3

83.8

83.3

8－10

81.4

86.8

81.8

91.4

84.0

88.0

effect(%)

Recovery(%)

recovery(%)n=1a) Ratio of peak area of mycotoxins in the presence of matrix to that in the absence of matrixb) 100×recovery / matrix effect
3.3

多機能カラムからの流出画分の確認
2.6 により多機能カラムからの流出画分の確認を実施した．その結果は Table 6 のとおり，各ア

フラトキシンは 0~0.5 mL の画分で 91.4 %以上，ステリグマトシスチン及びゼアラレノンは 0.5
mL 以降の範囲で 86.1 %以上の流出を認めた．
また，アフラトキシン B1，B2 及び G2 は 0~0.5 mL の範囲でマトリックス効果が 80.6 %以上だ
ったが，アフラトキシン G1 はすべての流出画分で 80 %を下回り，マトリックス効果を低減するための検討が必要と示唆された．なお，ステリグマトシスチン及びゼアラレノンは，試料マトリックスの影響をほぼ受けずに測定が可能であった．

62

飼料研究報告 Vol. 48 (2023)

Table 6

Elution pattern of aflatoxins, sterigmatocystin and zearalenone
from MultiSep 226 AflaZon+a)Matrix effect(%)

Recovery(%)

Mycotoxins

Fraction(mL)

Aflatoxin B1

Aflatoxin B2

Aflatoxin G1

Aflatoxin G2

Sterigmatocystin

Zearalenone

0－0.5

83.2

86.8

79.4

80.6

97.5

94.1

0.5－1

69.8

59.8

68.5

85.6

98.6

91.6

1－1.5

54.7

41.3

55.4

67.1

80.5

73.1

1.5－2

67.4

53.0

66.9

88.0

100

95.0

2－2.5

66.2

52.5

66.8

83.8

103

94.2

2.5－3

66.2

53.8

65.7

87.0

101

94.4

3－3.5

65.0

55.9

66.7

82.4

103

99.7

3.5－4

57.2

52.2

62.1

79.2

103

94.8

4－4.5

57.7

52.4

63.6

75.9

101

99.2

4.5－5

55.8

50.9

60.3

73.3

99.2

95.9

0－0.5

93.1

94.2

91.4

94.4

67.0

49.4

0.5－1

67.8

55.0

60.9

80.6

86.1

98.7

1－1.5

62.3

47.9

58.0

77.6

91.6

100

1.5－2

58.3

49.5

60.7

77.7

94.6

96.3

2－2.5

57.7

49.9

60.2

78.2

92.9

93.3

2.5－3

57.7

48.7

60.4

77.4

94.5

91.0

3－3.5

56.0

50.3

58.7

76.1

93.3

91.2

3.5－4

50.7

45.6

55.4

70.5

92.5

92.3

4－4.5

50.0

43.1

51.4

65.9

88.3

91.6

4.5－5

48.7

44.0

50.9

61.2

88.0

91.1

n=1
a) Ratio of peak area of mycotoxins in the presence of matrix to that in the absence of matrix
3.4

妨害物質の検討
DDGS 1 検体を用い，本法により調製した試料溶液を LC-MS/MS 1 に注入し，得られた SRM ク

ロマトグラムを確認したところ，アフラトキシン B2，G1，G2 及びステリグマトシスチンについては定量を妨げるピークは認められなかったが，アフラトキシン B1 及びゼアラレノンについて
は，試料において標準液と同じ保持時間にピークが認められた．これらのピークについて，定量
イオンと確認イオンの比を確認したところ，標準液と同等であったことから，アフラトキシン
B1 及びゼアラレノンであると判断した．
なお，得られた SRM クロマトグラムの一例を Fig. 3 に示した．

63

とうもろこしジスチラーズグレインソリュブル中のアフラトキシン，ステリグマトシスチン及びゼアラレノンの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による分析法の検討

A

2

Intensity / arb. units

6000

3

4

50000

Intensity / arb. units

A
5000
4000

1

3000
2000
1000

5

30000
20000
10000
0

0
7

7.5
8
Retention time / min

10

8.5

B

B
5000
4000

3

3000

4

2

1

2000
1000

11.5

5
40000
6

30000
20000
10000
0

0
7

Fig. 3

10.5
11
Retention time /min

50000

Intensity / arb. units

6000

Intensity / arb. units

6

40000

7.5
8
Retention time / min

10

8.5

10.5
11
Retention time / min

11.5

Typical selected reaction monitoring chromatograms of aflatoxins, sterigmatcystin andzearalenone in standard and blank sample solutions(LC-MS/MS conditions are shown in Tables 3 and 4.

Arrows indicate the retention times of

1: aflatoxin G2, 2: aflatoxin G1, 3: aflatoxin B2, 4: aflatoxin B1, 5: zearalenone and 6:
sterigmatocystin.

The baselines were shifted for display.)

A: Standard solution (aflatoxins: 0.25 ng/mL each, sterigmatocystin: 0.5 ng/mL, zearalenone:
2.0 ng/mL),
B: Sample solution of DDGS

4まとめDDGS 中のアフラトキシン，ステリグマトシスチン及びゼアラレノンについて，QuEChERS 法による粗精製後に固相抽出により精製し，LC-MS/MS により定量する方法を検討したところ，以下の結果が得られた．
1)

検量線について，アフラトキシン（B1 ，B2 ，G1 及び G2 ）は各 0.25~25 ng/mL（注入量として0.00125~0.125 ng 相当量），ステリグマトシスチンは 0.5~50 ng/mL（同 0.0025~0.25 ng 相当量），
ゼアラレノンは 2~200 ng/mL（同 0.01~1 ng 相当量）の範囲で直線性を示した．なお，当該検量線の濃度範囲は，アフラトキシン B1，B2，G1 及び G2 を各 0.004~0.4 mg/kg，ステリグマトシスチ
ンを 0.008~0.8 mg/kg，ゼアラレノンを 0.032~3.2 mg/kg 含有する分析用試料を本法に従い調製した最終試料溶液中の濃度範囲に相当する．

2)

脂質除去用カラムからの流出画分の確認をした結果，マトリックスを含む場合，脂質除去カラ
ムからの各かび毒の回収率は低下する傾向が見られた．

64

飼料研究報告 Vol. 48 (2023)

3)

多機能カラムの流出画分を確認した結果，アフラトキシン B1 ，B2 ，G1 及び G2 の回収率は0~0.5mL の画分で，ステリグマトシスチン及びゼアラレノンは 0.5 mL 以降の画分で十分に流出した．

4)

DDGS のマトリックス効果を確認した結果，アフラトキシン G1 は多機能カラムの全ての流出
画分においてマトリックスによる影響が認められ，マトリックス効果を低減するための検討が必要と示唆された．

5)

DDGS について，本法に従って得られたクロマトグラムには各かび毒の定量を妨げるピークは認められなかった．

謝

辞

本研究に協力していただいた国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構食品研究部門及び基盤技術研究本部高度分析研究センターにおける関係者各位に感謝の意を表します．

文
1)

献

農林水産省消費・安全局長通知：飼料分析基準の制定について，平成 20 年 4 月 1 日，19 消安
第 14729 号 (2008).

2)

鈴木 知華，名塚 英一，加藤 耕一，青山 幸二：かび毒の液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による一斉分析法の植物性油かす類に対する妥当性確認，飼料研究報告，41，118-121(2016).

3)

農林水産省畜産局長通知：飼料の有害物質の指導基準及び管理基準について，昭和 63 年 10 月
14 日，63 畜 B 第 2050 号 (1988).

4)

Jackson LC, Kudupoje MB, Yiannikouris A: Simultaneous multiple mycotoxin quantification in feed
samples using three isotopically labeled internal standards applied for isotopic dilution and datanormalization through ultra-performance liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass
spectrometry, Rapid Commun. Mass Spectrom., 26, 2697–2713 (2012).

5)

Dzuman Z, Zachariasovan M, Lacina O, Veprikova Z, Slavikova P, Hajslova J: A rugged high-throughput
analytical approach for the determination and quantification of multiple mycotoxins in complex feedmatrices, Talanta, 121, 263-272 (2014).

6)

Anastassiades M, Lehotay S J: Fast and Easy Multiresidue Method Employing Acetonitrile Extraction/
Partitioning and “Dispersive Solid-Phase Extraction” for the Determination of Pesticide Residues in
Produce, J. AOAC Int., 86 (2), 412-431 (2003).

7)

田村 昌義，中川 博之，宇山 敦生，望月 直樹：ペンタフルオロフェニルカラムを用いたトリ
コテセン系カビ毒の LC-MS/MS 高感度一斉分析法，食品衛生学雑誌，55 (1)，19-24 (2014).