Vol. 97 No. 1 June 2023

日大歯学

Nihon University Dental Journal

日 本 大 学 歯 学 会
NIHON UNIVERSITY SOCIETY OF DENTISTRY

日大 歯 学
Nihon Univ.
Dent. J.

ISSN 0385-0102

日

大第 97 巻 １ 号
目
原

歯

学

令和 ５ 年 ６ 月
次著

日本大学歯学部付属歯科病院における最近5年間の患者動向とアンカースクリュー使用状況について

増

山

萌

子ほか

1

Propiece IL-1αの核内への輸送機構と核内機能

石

山

雄

一

7

IL-1 receptor type 2による細胞内pIL-1αの細胞外分泌抑制

定

村

正

之

12

高濃度グルコースが成熟骨芽細胞の石灰化に与える影響

清

水

なつ生

18

ヒト線維芽細胞HeLa におけるinterleukin-1 receptor type 2のdecoy receptorとしての機能

花

山

真知子

27

MeCP2変異ヒト歯髄細胞およびMeCP2欠損マウス
迷走神経背側運動核ニューロンについての免疫組織化学的研究

星

ま

な

み

33

急性期病院における誤嚥性肺炎患者の生命予後に関連する因子について

渡

邉

真

央

42

日本大学歯学会会則
日本大学歯学会表彰規定「日大歯学」投稿の手引き−投稿申込用紙，確認書，チェックリスト，承諾書−

Nihon University Dental Journal
Vol.97, No.1

June 2023

CONTENTS
Original Article
Five-year trends in the demographics of orthodontic patients and anchor-screw use
at Nihon University School of Dentistry Dental Hospital 

Moeko Masuyama and others

1

Yuichi Ishiyama

7

Masayuki Sadamura

12

Natsuo Shimizu

18

Machiko Hanayama

27

and the dorsal motor nucleus of the vagus neurons in Mecp2-deficient miceManami Hoshi

33

Factors associated with life prognosis in patients with aspiration pneumonia in an acute care hospital

Mao Watanabe

42

The mechanism of ppIL-1α nuclear transport and its function
Inhibition of pIL-1α extracellular secretion by intracellular IL-1 receptor type 2
Effect of high glucose concentration on mineralization in mature osteoblasts
The decoy receptor function of interleukin-1 receptor type 2
in human fibroblastic cell line HeLa
Immunohistochemical studies of MeCP2-mutated human dental pulp cells

Nihon University Dental Society Constitution
Nihon University Society of Dental Award Regulations" Nihon University Dental Journal " Submission Guide-Submission Application Form, Confirmation, Checklist, Consent Form-

日大歯学 ，97（1），1-6，2023

原著

日本大学歯学部付属歯科病院における最近5年間の患者動向とアンカースクリュー使用状況について
増

山

萌

子1

馬

谷

原

琴
1

2

枝 1,2

稲

葉

瑞

樹 1,2

本

吉

満 1,2

日本大学歯学部歯科矯正学講座

日本大学歯学部総合歯学研究所臨床研究部門

要旨【目的】日本大学歯学部付属歯科病院歯科矯正科における矯正治療受診患者動向及び診療動態を調査，検討すること
で，地域歯科医療へ一層の貢献のため今後の対応に生かすことを目的とした。
【方法】当科の2016年度から2020年度までの 5 年間における初診患者を調査対象とし，治療開始登録患者（登録患者）数，男女比率，年齢別分布，治療内容，アンカースクリュー使用状況について調査を行った。
【結果】 5 年間に当科を受診した初診患者数は2739名で，年間平均初診患者数は547.8名であった。 5 年間の登録患者率は平均53.7% であり，2019年では57.5%，2020年では58.6% と増加していた。登録患者の男女比は 1：1.5であり，治療開始登録年齢は男女ともに学童期と青年期の 2 度ピークを示していた。また，治療内容分布においては保険治療の割合が36.8% であった。治療内容においては，自費診療で叢生が最も多く診断され，次いで上顎前突，下顎前突であり，保険診療では下顎前突が最も多かった。 5 年間のアンカースクリュー使用率は26.3% であり，アンカースク
リュー植立部位は上顎歯槽部が50.0% を占めており，次いで下顎歯槽部が36.2% であった。
【結論】2016年から2020年までの 5 年間は2009年から2003年までの 5 年間に比べて，初診患者数，登録患者数共に増加していた。前回調査と比較すると，男女比はほとんど変わらず保険診療の割合が増えていた。アンカースクリューは，上顎歯槽部に最も多く植立されていた。
キーワード：矯正歯科治療患者，実態調査，歯科矯正用アンカースクリュー

Five-year trends in the demographics of orthodontic patients and anchor-screw
use at Nihon University School of Dentistry Dental Hospital
Moeko Masuyama 1 , Kotoe Mayahara 1,2 , Mizuki Inaba 1,2 , Mitsuru Motoyoshi 1,2
12

Department of Orthodontics, Nihon University School of Dentistry

Division of Clinical Research, Research Institute of Comprehensive Dentistry, Nihon University School of Dentistry

Abstract【Purpose】To aid in the development of policies for community healthcare, we investigated demographic trends
among new orthodontic patients who visited the Nihon University School of Dentistry Dental Hospital.
【Methods】Data were obtained from patients who visited the Department of Orthodontics, Nihon University
Dental Hospital between 2016 and 2020. We compared the male-to-female ratio, age distribution, treatment details,
and anchor-screw use between our patients and previous surveys.
【Results】Over the 5-year study period, 2,739 patients visited our department for the first time (annual average:
547.8). The percentage of registered patients who initiated treatment during the 5-year study period was 53.7%,
increasing to 57.5% in 2019 and 58.6% in 2020. The male-to-female ratio of the patients was 1:1.5, with peaks in theage distribution for school children and adolescents. The percentage of patients who received treatment covered bynational health insurance was 36.8%. Crowding was the most common malocclusion type, followed by maxillary
protrusion and mandibular protrusion in self-funded treatment. Mandibular protrusion was the most commonly
treated condition covered by national health insurance. Orthodontic anchor screws were used in 26.3% of patientsover the 5-year study period. The most frequent region of orthodontic anchor-screw placement was the maxillary
alveolar region (50.0%), followed by the mandibular alveolar region (36.2%).
【Conclusion】The number of first-time patients and the percentage of registered patients who initiatedtreatment in our department increased in the 5-year study period (2016–2020) compared to a previous 5-year period(2009–2003). The male-to-female ratio in the present study and the previous survey was similar, whereas thepercentage of patients covered by national health insurance increased. Orthodontic anchor screws were mostcommonly placed in the maxillary alveolar region.
Keywords: orthodontic treatment patients, survey, orthodontic anchor screw（受付：令和 4 年12月16日）
責任著者：馬谷原琴枝
日本大学歯学部歯科矯正学講座〒101-8310 東京都千代田区神田駿河台 1 ‒ 8 ‒13

TEL：03-3219-8105
FAX：03-3219-8365
E-mail：mayahara.kotoe@nihon-u.ac.jp
1

日大歯学

緒

第 97 巻第 1 号

A

言

C

B

日本大学歯学部付属歯科病院は大正 6 年に開院し，昭和53年に矯正歯科が標榜追加され，その後昭和57年から唇顎口蓋裂患者，平成 2 年から顎変形症患者の術前術後の矯正

図1

歯科治療が保険適用となった。平成 7 年に学校歯科検診に不正咬合の診査項目が追加され，その後，数回にわたる保歯科矯正用アンカースクリューの植立部位
A：口蓋正中部，B：上下顎頬側歯槽部，C：頬棚（人）
700

険診療報酬改定によって保険診療の対象となる先天性疾患等の適応症が拡大した。さらに，平成26年には歯科矯正用

初診患者数
登録患者数

600

アンカースクリュー（以下，アンカースクリュー）が保険

500

診療において使用可能となり，矯正歯科治療を受けやすい

400

環境へ変化してきている。

300

当病院における矯正歯科治療患者の実態調査は，受診す200る患者の概要を的確に把握し分析することで，今後の施設100の改善や患者対応の改善につながると考えられる。またア

0

2016

ンカースクリューの使用については，自費および保険診療共に使用可能となったことにより，その使用頻度や部位を初診患者数（人）検討することで治療の選択肢の変化が明らかになると考え

529

登録患者数（人）271

登録率（％）られる。

図2

そこで，当科における診療動態を確認し，地域歯科医療

51.2

2017

2018

2019

525

475

614

257

49

242

50.9

353

57.5

2020 （年）
596

349

58.6

合計

2739

1472

53.7

初診患者数と登録患者数における年次推移および登録率

へ一層の貢献のため今後の対応に生かすことを目的として，平成28年度から令和 2 年度までの 5 年間に当病院歯科

男性
⼥性

矯正科（以下，当科）を受診した患者の実態を調査し，過去のデータ 1 ）と比較検討を行った。

36.8%

資料および方法

63.2%

平成28年度（2016年）から令和 2 年度（2020年）までの5 年間に，当科を受診した患者2739名（初診患者）を調査対象とした。
1 ．調査資料

図3

図3

調査に用いた資料として初診時における氏名，年齢，性5 年間の登録患者の男女比

５年間の登録患者の男女比別，来院日，主訴などが記録された問診票および精密検査（MTM）に分類した。アンカースクリュー植立部位分布

後の分析資料および治療計画書を用いた。今回の実態調査

はアンカースクリューを使用し全顎的治療を行った患者をでは初診患者のうち，歯科矯正用アンカースクリュー植立対象とした。アンカースクリュー植立部位は，上顎は小臼依頼のみの患者を除外し，治療を開始した患者を登録患者

歯または大臼歯間の頬側歯槽骨と口蓋正中部，下顎は小臼と表記することとした。本研究は，日本大学歯学部倫理委

歯または大臼歯間の頬側歯槽骨と頬棚に分類した。
（図 1 ）

員会の承認を得て実施した。
（許可番号：倫許2014-15）

結2 ．調査項目
上記の患者について，以下の項目について調査を行っ

果

1 ．初診患者および登録患者数の年次推移（図 2 ）た。

2016年から2020年までの 5 年間に当科を受診した初診患

1 ）初診患者数および登録患者の年次推移および登録率

者数は2739名で，年間平均初診患者数は547.8名であった。

2 ）登 録患者における（1）男女比，（2）年齢別分布，

2018年で減少しその後，2019年では614人，2020年は596人（3）治療内容分布，（4）不正咬合分布となり2018年と比較すると，約150人増加していた。 5 年

3 ）アンカースクリュー使用状況について（1）使用率，間の登録率は平均53.7% であり，2019年では57.5%，2020（2）アンカースクリュー植立部位分布

年において58.6% と増加していた。

年齢別分布には初診時年齢を用い，治療内容はⅠ期治2 ．登録患者における調査

療，自費による全顎的矯正歯科治療（自費診療），保険を1 ）男女比（図 3 ）使用した全顎的矯正歯科治療（保険診療），部分矯正治療

登 録 患 者 の う ち 男 性546人（36.8%） で， 女 性939人

25 年間の歯科矯正患者実態調査

A

A（人）
60
50

0

20

40

60
（％）

叢⽣

Ⅰ期
自費
保険
MTM

男性

40

上顎前突
下顎前突

30

上下顎前突

20

開咬
過蓋咬合

10

空隙⻭列

0

5

10

B（人）

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

交叉または鋏状咬合

70
（歳）

その他

60
50

0

Ⅰ期
自費
保険
MTM

女性

40

B

10

20

30

40

50

60（％）

下顎前突
上顎前突

30

開咬

20

顔⾯⾮対称

10

その他

0

5

図4

A

令和 5 年 6 月

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70
（歳）

図6

登録患者における年齢別分布
A：男性，B：女性
B

6.3%
10.2%

⾃費
保険
Ⅰ期

6.3%
8.7%

12.8%
42.9%

46.7%
36.8%

アンカー使⽤(26.3%)

C

6.4%

図6 不正咬合別分布
不正咬合別分布
A：自費診療，B：保険診療
A：自費診療，B：保険診療

36.1%

アンカー使⽤無し(73.7％)

⾃費診療(17.0％)

MTM
48.9%

保険診療
(8.6%)

37.9%

MTM(0.01%)

図5

図7

治療内容分布図5 治療内容分布
A:全体, B:男性, C:女性
A：全体，B：男性，C：女性

5 年間のアンカースクリュー使用率
第7図
5年間のアンカースクリュー使用率
図7 5年間のアンカースクリュー使用率

保険治療36.1%，Ⅰ期治療8.7%，MTM6.3%
で，男性と比23（63.2%）であった。男女比は約 1：1.5で女性の方が多かっ較すると自費診療の割合がやや高かった。（図 5 ）た。

自費診療の内訳は，叢生38.3%，上顎前突23.8%，下顎前2 ）登録患者の年齢別分布（図 4 A, B）

突7.7%，上下顎前突6.4%，開咬7.3%，過蓋咬合3.3%，空隙5 年間で男性は 6 歳から72歳が，女性では5歳から69歳

歯列4.9%，交叉または鋏状咬合2.7%，その他（咬合不全，が登録患者となっていた。男性は 9 歳で33人，18歳で37

埋伏歯等）5.6% であった。保険診療の内訳は下顎前突人，女性は 8 歳で38人，18歳で54人の登録患者数となり，56.8%，上顎前突14.6%，開咬9.5%，顔面非対称12.4%，そ男女ともに学童期と青年期と 2 度のピークを示していた。

の他（先天性疾患や 6 歯以上の先天性欠損等）6.7% であっ

学童期ではⅠ期治療患者が68.2%，青年期では保険治療患た。（図 6 ）者が62.6% と高い割合を占めていた。さらに，男女ともに3 ．アンカースクリュー使用状況

高齢になるに従い，MTM 患者が増加し一方で全顎的治療

1 ）アンカースクリュー使用率（表 1 ，図 7 ）である自費治療や保険治療の患者割合は減少する傾向を示

登録患者数1484人のうち，アンカースクリューの使用人していた。

数 は 5 年 間 で 合 計390人 で あ り，26.3%
がアンカースク243 ）治療内容分布（図 5 ，6 ）リューを使用し治療を行っていた。アンカースクリュー使

22

治療内容分布は，自費診療46.7%，保険診療36.8%，Ⅰ期用患者のうち65.7% が自費診療（登録患者の17.0%），32.7%

治療10.2%，MTM6.3% で自費診療が約半数を占めていた。

が保険診療（登録患者の8.6%），1.6%（登録患者の0.01%）

男女別では，男性は，自費診療42.9%，保険診療37.9%，Ⅰが MTM であった。（図 7 ）期治療12.8%，MTM6.4% であり，女性は，自費治療48.9%，

治療内容別のアンカースクリュー使用率は，自費診療で

3

日大歯学
表1

表1

治療内容別アンカースクリュー使用率

第 97 巻第 1 号

省の平成29年と令和 2 年患者調査の比較からは 1 日あたり

治療内容別アンカースクリュー使用率
全治療

保険診療

⾃費診療

MTM

アンカースクリュー使⽤患者/登録患者数(５年間合計)の矯正初診患者が800人から2900人へと大幅に増加してお

26.3%

23.4%

36.2%

10.3%

り 2 , 3 ），患者数の増加は当病院のみならず全国的なもので

2016年

18.9%

20.2%

24.6%

5.9%

2017年

34.0%

36.7%

41.7%

20.0%

2018年

36.2%

28.1%

54.4%

9.1%

2019年

20.8%

23.7%

25.8%

0.0%

2020年

25.1%

14.9%

38.4%

14.3%

流行によって，当初数か月間歯科治療は一時敬遠されていたが，その後マスク着用期間が長くなることが想定され，これまで矯正装置が見えることを理由に治療を躊躇していた人が治療を希望したことによるものと考えられた（図 2 ）。

2.0%

登録患者数の年次推移について，当科では2016年から上顎⻭槽部

2020年の 5 年間では初診患者のうち約53.7% が登録患者で

下顎⻭槽部

11.3%

⼝蓋正中部

あり 1 ），また各年の登録率を比較すると2019年，2020年に

頬棚

50.0%

36.7%

あったと考えられる。これは2020年の新型コロナウイルス

おいて60% 弱が登録患者となっており登録率が増加傾向にあると考えられた。以前と比較し，インターネット等で矯正歯科治療の情報が容易に入手でき治療が身近なものと

図8
図8

表2

合計

ネット等で患者本人が前もって情報を得たうえで来院してアンカースクリュー植立部位分布いるためと考えられる。

表2 治療内容別アンカースクリュー植立部位分布

治療内容別アンカースクリュー植立部位分布
保険診療

男性
⼥性

なっていること，また当病院ウェブサイトも含めインター

アンカースクリュー植立部位分布

上下顎
10.9％
6.2％
7.7％

上顎
23.5％
13.5％

下顎
7.6％
9.6％

16.6％

今後も審美的な目的だけでなく顎機能改善を必要とする

⾃費診療

9.0％

上下顎
21.0％
28.1％
25.9％

上顎
26.9％
34.6％

32.2％

患者が増加すると考えられることから，的確な診断，およ

下顎
10.1％
8.1％

び治療を提供することで登録率を増加させることができると考えられる。

8.7％

1 ）男女比（図 3 ）26は36.2%，保険診療では23.4%，MTM では10.3% であった。

登録患者数の男女比は約 1：1.5であり，この傾向は2016

年度ごとの使用率は各年に差があるが，すべての年におい年の当病院での報告 1 ）や他の医療機関における結果 4 , 5 ）とて保険診療と比較し自費診療におけるアンカースクリュー同様であるが，2010年の当院の報告 1：2.4 6 ）と比較すると使用率が高かった。
（表 1 ）

男性の割合が増加しており，男性の歯並びに対する関心の2 ）アンカースクリュー植立部位（表 2 ，図 8 ）高まりや受療意識の向上がうかがえた。また，女性の方がアンカースクリューを使用し全顎的な治療を行った患者多いのは，年齢別分布（図 4 ）でも示されている通り，男を対象に調査を行ったところ，保険診療および自費診療と性に比べると高齢になっても矯正治療を行う人が多く幅広もに上顎のみにアンカースクリューを使用した患者が最もい年齢層での矯正治療への関心が高い事が推測された。矯多かった。また保険診療と比較すると自費診療ではアン

正歯科治療の必要性に男女差はないが，男性よりも女性のカースクリューを上下顎に使用する割合が高いことが示さ

方が審美性の改善に対する要求が高いものと考えられた。
2 ）年齢別分布（図 4 ）れた（表 2 ）。
25
植立部位については，上顎歯槽部が50.0%を占めており，

治療開始登録年齢は男女ともに学童期と青年期にピーク

続いて下顎歯槽部（36.7%），口蓋正中部（11.3%）となり，が見られた。これは，学童期のピークは前歯の永久歯交換最も少ない部位は頬棚（2.0%）であった（図 8 ）。

と第一大臼歯が萌出完了し永久歯交換に伴い歯列不正が発考見されやすい時期であり，またⅠ期治療開始のタイミング察である 7 ）。また青年期のピークは保険診療の割合が高く，顎変形症の治療可能時期と考えられる。これらの傾向は他

1 ．初診患者数および登録患者の年次推移および登録率の医療機関 8 , 9 ）においても同様であった。また，今回の調（図2−4）
1）

2009年から2013年の 5 年間の初診患者2555人と比較し ，査では 6 歳から72歳までと幅広い年齢層で矯正歯科治療が27

2016年から2020年までの 5 年間に当科を受診した初診患者行われており，当科の2016年の調査では 1 ）60歳以上の患者数は2739名，年間平均初診患者数は547.8名であり，増加はいなかったのに対し今回の調査では 7 名であった。歯科傾向を示した。また2019年，2020年において初診患者数お疾患実態調査においても平成28年の60歳から65歳までで20よび登録患者数は増加しており，これは，2018年10月に本本以上自分の歯を有する人の割合は85.2% となり増加傾向

格稼働となった当病院の新病院建設に伴う一時的な患者数を示している10）。高齢者においても有する歯数が増えたこの減少とその後の新病院における診療再開や環境面改善にとにより矯正歯科治療の対象者が増加していること，成人

よる患者数の増加があったと考えられる。また，厚生労働においても矯正治療が可能であるという啓発活動による認45 年間の歯科矯正患者実態調査

知度の増加により，より広い年齢層において矯正歯科治療

令和 5 年 6 月

定源としての使用頻度が高かったと考えられる。

が行われるようになったと示唆された。また年齢が高くな

アンカースクリュー植立部位について，上顎歯槽部がるにしたがって補綴物，歯周病等も増加することから，成50.0%，下顎歯槽部が36.7% となっており歯槽部が大部分

人の矯正歯科治療については，今後より一層他科との連携を占めていた。これは両隣在歯歯根との間に十分なスペーを行うことが必要であると考える。

スがあることや術野の確保が容易，操作の容易性から植立3 ）治療内容別分布（図 5 ，6 ）部位として選択されることが多いと思われる17）。また口蓋

自費診療と保険診療の割合は56：44（698人：548人）とは11.3% となり歯槽部に比べると使用割合は少ないが，歯なり当科の以前の報告 1 ）では自費診療：保険診療の割合は根間距離が不足している場合や遠心移動，圧下等のために

66：34と比較すると，保険治療の割合が顕著に増加してい使用されておりその多様性からも今後幅広い治療法としてた。これは患者本人の外科的矯正治療の情報，知識の向使用される可能性があり，今後さらにアンカースクリュー

上，咬合や顔貌の改善への意識が高くなっていること，まの植立部位と使用目的を詳細に検討することでより確実なた周囲の人の顎変形症に対する理解が高くなり治療を進め

治療メカニクスが確立すると考えられる。

やすい環境となっているのではないかと考えられる。

結不正咬合別分布では，自費診療においては叢生が約40%と最も多く，次いで上顎前突が約20% となっていた。この論

平成28年度から令和 2 年度の 5 年間に日本大学歯学部付

傾向はこれまでの当病院の報告 や他医療機関の報告

属歯科病院歯科矯正科を受診した患者の実態調査を行ったに類似していた。歯科疾患実態調査においても12歳から20

結果，以下の結論が得られた。

歳では叢生は約26%，4 mm 以上のオーバージェットは約

1 ．5 年間の初診患者総数は2739人，登録患者総数は1472

40%10）であり，叢生や上顎前突が不正咬合であるとの認識

人，登録率は53.7% であり，当科の以前の報告と比較

7）

11, 12）が高く，また矯正歯科治療により歯並びの改善や口元の突し増加していた。

出感の改善が可能であるということが周知されてきている

2 ．年齢別では学童期と青年期に相当する年齢層が多く，と考えられた。一方で下顎前突は保険診療において最も割

当科の以前の報告と比較しより高齢患者の増加を認め

合が高く約60% を示していた。反対咬合は症状が明瞭でられた。

あり患者は顔貌の改善を強く望むため多くの患者が骨格的3 ．治 療内容別では保険診療患者の割合は36.9% となり，改善を希望していると考えられた。

当科の以前の報告と比較し2.6% のわずかな増加を認

2 ．アンカースクリュー使用状況についてめた。

1 ）使用状況（表 1 ，図 7 ）4 ．アンカースクリューの使用率は登録患者の26.3% であ登録患者のうちアンカースクリューを使用して治療した

り，内訳として自費診療の使用率が17.0%，保険診療患者は26.3% であり，うち自費診療が17.0%，保険診療がの使用率が8.6%，MTM の使用率が0.01% であった。

8.6% であった。これは他大学病院における2004年から10

5 ．アンカースクリュー植立部位は上顎歯槽部50.0%，下年間の平均アンカースクリュー使用患者割合9.1% と比較

顎歯槽部36.7% であり，歯槽部への植立が大多数を占し，かなり高い値を示していた13）。この要因としては2014めていた。

年からアンカースクリューが保険収載され，健康保険が適本論文に関して，開示すべき利益相反はない。

応となる顎変形症や多数歯欠損等においても使用できるよ
うになり治療対象が拡大したこと，またアンカースク

文リューに対する知識，研究および臨床データの蓄積により

献

1）小川麻衣，髙橋康代，伏木怜奈，堀貫恵利，馬谷原琴枝，清水典佳（2016）日本大学歯学部付属歯科病院歯科矯正科における実態調査―来院患者数及びその分布について―．日大歯学90，53-60.
2）厚 生労働省．平成29年患者調査 上巻（全国），上巻第54表，
歯科診療所の推計患者数，初診－再来×性・歯科分類別．
https://www.e-stat.go.jp/dbview?sid=0003 318613（2022年11月26日アクセス）3）厚生労働省．令和 2 年患者調査 全国編，閲覧（報告書非掲載表）第109表，歯科診療所の推計患者数，初診－再来×性・歯 科 分 類 別．https://www.e-stat.go.jp/stat-search/files?page=1&layout=datalist&toukei=00450022&kikan=00450&tstat=000001031167&cycle=7&tclass1=000001166809&tclass2=0000
01166811&tclass3=000001166812&tclass4=000001166814&res
ult_page=1&tclass5val=0（2022年11月26日アクセス）4）金澤成美，山本隆昭，高田賢二，藤井元太郎，石橋抄織，佐アンカースクリューを使用した治療が一般的な治療方法となっていること，さらに患者側もネット等を通じて容易に情報が得られるようになったことが考えられる。
2 ）アンカースクリュー植立部位（表 2 ，図 1 ，8 ）
5 年間のアンカースクリュー使用率は26.3% であるが，各年ともに保険診療と比較し自費診療における使用率が高
く，診療内容別に見てみると自費診療保険診療ともに上顎骨におけるアンカースクリュー使用率が最も高くこれは、
他医療機関の報告14, 15）と同様な結果であった。これは自費診療においては叢生と上顎前突が多く（図 6 A）トータル
ディスクレパンシーが大きい患者が多いこと，また，上顎は下顎と比較しアンカーロスが生じやすいため16）大臼歯固

5

日大歯学

藤嘉晃，原口直子，今井 徹，中村進治（1998）北海道大学
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14）川崎五郎，馬場信行，柳本惣市，山田慎一，吉冨 泉，河野俊広，水野明夫，梅田正博（2013）当科において植立した矯
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（1）
，7-11，2023

原著

Propiece IL-1αの核内への輸送機構と核内機能
石

山

雄

一

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻

応用口腔科学分野

日本大学歯学部病理学講座（指導：浅野正岳 教授，角田麻里子 助教）

要旨【目的】precursor（pIL-1α）の N 末端側は propiece IL-1α（ppIL-1α）と呼ばれる。本研究では，ppIL-1αの核内への輸送機構と核内機能について検討した。
【方法】緑色蛍光タンパク質（GFP）タグ付き IL-1αを導入した HeLa 細胞を用いて，ppIL-1α，pIL-1α，mIL-1αの細胞内局在を観察した。ppIL-1αの核への輸送機構は importin β阻害薬を用いて検索した。また，ppIL-1αの核内機能は，
IL-8 mRNA の発現変化を real-time PCR によって検討した。
【結果】蛍光顕微鏡による観察の結果，mIL-1αは細胞質にびまん性に，pIL-1αと ppIL-1αは主に核に局在していることがわかった。ppIL-1α transfectant に importin β阻害薬を作用させても，ppIL-1αの核局在に何ら影響を及ぼさなかった。HeLa 細胞における ppIL-1αの強制発現は IL-8 mRNA の発現を増強した。
【結論】ppIL-1αの核輸送は，importin β非依存的であることが解った。また，ppIL-1αは核内で IL-8遺伝子発現の増強に寄与していることが明らかとなった。
キーワード：propiece IL-1α（ppIL-1α），alarmin，IL-8

The mechanism of ppIL-1α nuclear transport and its function
Yuichi Ishiyama
Nihon University Graduate School of Dentistry, Major in Applied Oral Sciences
Department of Pathology, Nihon University School of Dentistry（Directors: Prof. Masatake Asano, Assist. Prof. Mariko Tsunoda）

Abstract【Purpose】N-terminal domain of precursor (p) IL-1α is designated as propiece (pp) IL-1α. The purpose of thisstudy was to elucidate the mechanism of ppIL-1α nuclear transport and its function.
【Methods】Subcellular localization of ppIL-1α, pIL-1α, and mIL-1α was observed in HeLa cells transfected withgreen fluorescent protein (GFP) -tagged IL-1α. ppIL-1α nuclear transport mechanism was investigated using importin
β inhibitor. ppIL-1α nuclear function was examined by measuring the IL-8 mRNA expression using real-time PCR.
【Results】Microscopic examination revealed diffuse cytoplasmic localization of mIL-1α. On the other hand, pIL-1α
and ppIL-1α were localized mainly in the nucleus. Incubation of ppIL-1α transfectant with importin β inhibitor did
not affect its nuclear localization. Forced expression of ppIL-1α enhanced IL-8 mRNA expression.
【Conclusion】Inhibition of importin β did not affect the transport of ppIL-1α into the nucleus. In addition, ppIL-1α
contributes to enhancing IL-8 mRNA expression in the nucleus.
Keywords: propiece IL-1α (ppIL-1α), alarmin, IL-8

緒Interleukin（IL）-1αは，細胞が低酸素状態，酸化ストレス

言や熱刺激などに晒されたときに放出される代表的な
1）

Alarmin は損傷した細胞から放出される分子であり ，

alarmin であり 2 ），血管新生や創傷治癒など様々な反応に周囲の組織に炎症反応を誘導し，生体の自然免疫系や獲得関与している。IL-1αは細胞質で31 kDa の precursor IL-1α

免 疫 系 を 活 性 化 す る 警 告 信 号 と し て 機 能 し て い る。

（pIL-1α）として産生された後，Ca2+ 依存性タンパク質分（受付：令和 4 年12月21日）
責任著者連絡先：石山雄一
日本大学歯学部病理学講座〒101-8310 東京都千代田区神田駿河台 1 ‒ 8 ‒13

TEL：03-3219-8124
FAX：03-3219-8340
E-mail：deyu18002@g.nihon-u.ac.jp

7

日大歯学

第 97 巻第 1 号

した。
2 ．プラスミド構築
3 種 類 の IL-1αの DNA テ ン プ レ ー ト お よ び pcDNAppIL-1α ベクターは Sata ら16）の方法を用いて作製した。
各 IL-1αは pEGFP-C3 ベクター（Clontech，San Jose，CA，USA）に挿入し，N 末端の緑色蛍光タンパク質（GFP）

図 1 IL-1αの構造
IL-1αは前駆体 IL-1α（pIL-1α）として細胞内で産生される（ 1 -271）。
pIL-1αは酵素的に切断されて ppIL-1α（N 末端 1 -112）と mIL-1α（C末端113-271）が生成される。核局在配列（NLS）は79-86に位置する。
数字はアミノ酸の位置を示す。

タグに融合した（GFP-pIL-1α，GFP-mIL-1α，GFP-ppIL-1α
ベクター）（ 図 2 ）。Transfection のために，各プラスミド（250ng）と Plus 試薬（0.75μｌ）および Lipofectamin 3000
（0.75μｌ（）Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）
を，それぞれ25μｌOPTI-MEM（GE Healthcare，Chicago，IL，USA）に溶解した。両溶液を混合し，室温で15分間反応させた後，培養液に添加し37℃で18時間培養した。以上のように処理した細胞を transfectant として，その後の実験に供した。
3 ．cover slip 実験
HeLa 細胞（ 5 ×104/well）を24well プレートに入れたcover slip（直径10mm：松波硝子工業，東京）上に播種した。37℃，18時間培養後，上記方法によって GFP-pIL-1α，

図2 験に使用した発現ベクターと transfectant におけるそれぞ
実
れの発現（A） 3 種類の IL-1αの DNA 断片を pEGFP-C 3 ベクターにライゲー
ションして GFP と融合させた。（B）それぞれのベクターによる
transfectant から，細胞溶解液を回収して，WB でタンパク質発現を確認した。

GFP-mIL-1α，GFP-ppIL-1αを transfection し た。 細 胞 を37℃に加温したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し，4 ％パラホルムアルデヒドで固定した。さらに PBS で洗浄
後，DAPI-Fluoromount-G（Southern Biotech，Birmingham，AL，USA）を用いて cover slip をスライドガラスに封入，granzyme B や thrombin などの酵素によっした。観察および画像の撮影には，オールインワン蛍光顕て切断される。酵素切断の結果，N 末端の propiece IL-1α

微鏡（BZ-X810，キーエンス，大阪）を使用した。また，（ppIL-1α）と C 末端の mature IL-1α（mIL-1α）が生成されエネルギー依存性の ppIL-1α核内輸送の有無を調べるためる（ 図 1 ）8 , 9 ）。pIL-1αと mIL-1αは 細 胞 外 に 分 泌 さ れ，に，importin βの 阻 害 薬 で あ る importazole（10 nM,

IL-1 receptor type I を介してシグナル伝達し機能を発揮

Cayman Chemical，Ann Arbor，MI，USA）の存在下ます る10）。 さ ら に，pIL-1αと ppIL-1αは 核 局 在 配 列（NLS）

たは非存在下で37℃，6 時間培養し，観察を行った。

解酵素

3-5）

6）

7）

の存在により核に輸送され ，標的遺伝子の転写制御に寄
11）4 ．real-time polymerase chain reaction（real-time PCR）

与するとされている 8 , 12）。また，pIL-1αは核クロマチン13）
14, 15）や他の核内タンパク質に結合することが報告されている。

HeLa 細胞（ 1 ×105/48 well plate）に，pcDNA または

しかしながら，ppIL-1αの核内輸送のメカニズムや核内機

pcDNA-ppIL-1αを transfection した。18時間後，RNeasy

能は完全には解明されていない。そこで，本研究では，

mini kit（Qiagen，Hilden，Germany）を用いて total RNA

ppIL-1αの核内輸送メカニズムの解明を目指すとともに，を精製した。相補的 DNA は，Superscript Ⅲ逆転写酵素

核内における遺伝子発現への関与について検討した。

（Invitrogen，Waltham，MA，USA）を用いて合成した。

材料および方法

表1

1 ．細胞
ヒト子宮癌由来の線維芽細胞（HeLa 細胞）は医薬基
盤・健康・栄養研究所 JCRB 生物資源バンク（大阪）から入手した。細胞は，10％ウシ胎児血清（FCS），50μｇ/ml
ストレプトマイシン，50U/ml ペニシリン（Sigma-Aldrich，
St. Louis，MO，USA）を添加した Dulbecco’ Modified
Eagle’s Medium（DMEM）で37℃，5 ％ CO2存在下で培養

8プライマーの配列

propiece IL-1αの核内輸送と機能

令和 5 年 6 月

real-time PCR は，CFX 96 real-time system（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）で TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（タカラバイオ，草津）を用いて行った。本研究で使用したプライマーを表 1 に示す。pcDNA transfectant および ppIL1 transfectant における IL-8の遺伝子発現を内在性コント
ロール（β-actin）に対する比としてΔΔCT 法で算出した。前者の値を 1 とした時の，これに対する ppIL-1α transfectant
における遺伝子の増幅量をデータとして示した。
5 ．ウェスタンブロッティング（WB）
作製した transfectant を PBS で 2 回洗浄し，500μｌの細図 3 IL-1αの細胞内局在（A）HeLa 細 胞 に GFP-pIL-1α，GFP-mIL-1α， お よ び GFP-ppIL- 1
を transfection した。transfection 後，細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
核は DAPI で染色した（scale bar：10 μｍ）。（B）GFP-ppIL-1αtransfectant から核抽出液を調製し，WB に供した。核内部コントロールとして Lamin B を用いた。

胞溶解液（50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，0.5％
Triton X-100）を用いて溶解させた。BioRad protein assay
kit（Bio-Rad）を用いて総タンパク濃度を測定し，40ng のタンパクを12％ sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelを用いて電気泳動した。WB は Omagari ら17）の方法に従って行った。一次抗体として，マウス抗 GFP 抗体（Proteintech，
Rosemont，IL，USA; ×10,000）を 1 ％ BSA diluted in 0.1%
Tween-20/PBS（ 1 % BSA-PBST）で希釈し，室温で 1 時
間反応させた。二次抗体として，horseradish peroxidase（HRP） 標 識 ヤ ギ 抗 マ ウ ス IgG（H+L） 抗 体（Jackson
ImmunoResearch，West Grove，PA，USA; ×8,000） を用い，室温で 1 時間反応させた。なお，核抽出液は NEPER™ Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents（Thermo Fisher Scientific）で精製し，WB に供した。核図 4 ppIL-1αの核への輸送
GFP-ppIL-1α transfectant を，importin β阻害薬である importazole（10 nM）存在下（＋：下段）または非存在下（−：上段）で 6 時間培養した（scale bar：10 μｍ）。その後，細胞内 GFP-ppIL-1αの局在変化を蛍光顕微鏡で観察した。

の内在性コントロールには Lamin B を用いた。一次抗体としてウサギ抗ヒト Lamin B 抗体（Proteintech; ×1,000）
および二次抗体として HRP 標識ヤギ抗ウサギ IgG（H+L）
抗体（Jackson ImmunoResearch; ×6,000）を使用した。
6 ．統計学的解析
統計解析は，正規性を Shapiro-Wilk 検定，等分散性を
Levene 検定で確認した後に Studentʼs t-test を用いた。結果は，平均値±標準偏差で表した。0.05未満の p 値は統計的に有意であるとみなした。

結果

1 ．IL-1αの細胞内局在
GFP-pIL-1α，GFP-ppIL-1α，GFP-mIL-1αの 3 種 類（ 図2A）の分子の発現について WB で確認したところ，GFPpIL-1αは60 kDa，GFP-mIL-1αは43 kDa，GFP-ppIL-1αは42 kDa の単一のバンドとして検出された（図 2 B）
。次に，
IL-1α分 子 の 細 胞 内 局 在 に つ い て 検 索 し た。 そ の 結 果，

図 5 ppIL-1αによる IL- 8 mRNA の発現増強
HeLa 細胞に pcDNA（contorol）または pcDNA-ppIL-1αベクターをtransfection し，18時 間 培 養 し た。 そ の 後，total RNA を 精 製 し，real-time PCR により IL- 8 mRNA の発現量を測定した。内在性コン
トロール（β -actin）の発現量を 1 として，これに対する ppIL-1αtransfectant における IL- 8 発現量を比で表した。プライマー配列を
表 １ に示した。＊＊p ＜ 0.01（n = 5 ）。

mIL-1αは細胞質にびまん性に分布し，pIL-1αと ppIL-1αは
主に核に局在していた（図 3 A）
。この結果を確認するために，transfectant から核抽出液を調整し WB により検討したところ，ppIL-1αのバンドが検出された（図 3 B）。

9

日大歯学

2 ．ppIL-1αの核への輸送

第 97 巻第 1 号により発現させた細胞では，IL-1αが脂質 2 重膜である核

ppIL-1αの核への局在は，核と細胞質との間の受動拡散膜を通過できずに細胞質に拡散した結果である可能性も考によるものではないことが Kudo ら により確認されていえられる。ppIL-1αの核内への輸送については今後さらにる。そこで、エネルギー依存的核輸送に必須の importin β

検討を加える必要がある。

18）の関与について，importin β阻害薬である importazole の一方，核に輸送された ppIL-1αは，どのようなメカニズ

存在下および非存在下で ppIL-1α transfectant を培養する

ムで核局在しているのであろうか。ppIL-1αに結合する分ことにより確認した。その結果，核における ppIL-1αの局子としては，これまでに HAX-1や Necdin などが報告され在には何ら変化が認められなかった（図 4 ）。

ている14, 15）。この中で，アポトーシスに関連する分子としての HAX-1は，pIL-1αの N 末端側に結合部位が存在する

3 ．ppIL-1αによる IL-8 mRNA の発現増強とされている14）。しかし，細胞内局在や機能が多様である

ppIL-1αは，核において IL-8遺伝子発現を増強することことから，pIL-1αの核局在に果たす役割については未だ不が 報 告 さ れ て い る19）。 そ こ で，HeLa 細 胞 に お い て も明である。マウスのマクロファージでは，pIL-1αが核クロ

ppIL-1αの強制発現が IL-8 mRNA 発現を増強させるかとマチンに結合しているとの報告もあるが13），ヒトにおいていう点について検討した。その結果，IL-8 mRNA 発現レベはこの事実は確認されていない。pIL-1αは，細胞膜貫通タ

ルは，ppIL-1αの組み込まれていない pcDNA transfectant

ンパク質や分泌タンパク質が有するシグナルペプチドを欠に比べて ppIL-1α transfectant で8.9±0.91倍に増加していいており24），一般的なタンパク質の産生ルートである小胞た（図 5 ）。

体―ゴルジ体輸送を経由しないとされている。従って，細考

胞外への分泌メカニズムも解決されておらず，多くの疑問察点が残されている。

GFP タグ付き IL-1α発現ベクターを用いた本研究では，

ppL-1αは，様々なタンパク質の遺伝子発現に寄与して

mIL-1αは細胞質にびまん性に分布し，pIL-1αと ppIL-1αはいることが示されている12）。なかでも，IL-8遺伝子の発現

主に核に局在することが確認された。これまでの研究かに対する機能は着目されている。これは IL-8が，炎症増悪

ら，pIL-1αの N 末端および C 末端へのタグの付与は，そとともに，血管新生など創傷治癒にも寄与するなど多彩な

12）の機能に何ら影響を及ぼさないことが報告されており ，機能を有するためである25）。本研究によって，線維芽細胞

これら分子の核局在は，従来の報告と一致するものであっである HeLa 細胞においても，ppIL-1αの過剰発現が IL-8

た。また，これらの分子の核局在には，NLS が極めて重mRNA の発現を増大させることが明らかとなった。この要であり，NLS を欠失させることにより細胞質への移行

ことは，ppIL-1αが IL-8遺伝子発現を転写レベルで増強さを促すことが知られている18）。NLS は，importin αまたは

せ，その分泌を促進し，炎症反応または血管新生反応を拡

importin βなどの核移行を担う分子によって認識される配大していく機能を有するものと考えられた。

列であり20），IL-1αが NLS を有していること自体がエネル

本研究の結果，ppIL-1αの核への輸送は importin β非依

ギー依存性に核移行することを示唆している。しかし，存性であり，核内では，IL-8などの遺伝子発現に転写レベIL-1αの核内輸送のメカニズムについては Luheshi ら21）のルで関与している可能性が示唆された。

報告があるのみで，低分子量 G タンパク質である Ran に結

依存する核内輸送とされている。そこで，importin βの阻論害薬である importazole 存在下での ppIL-1α transfectant

本 研 究 で は，3 種 類 の IL-1α（pIL-1α，mIL-1αお よ びの培養は ppIL-1αの核局在に変化を及ぼすものと予測し

ppIL-1α）を HeLa 細胞に transfection することで，各 IL-1αた。しかし本研究の結果，ppIL-1αが NLS を有しながらも，の細胞内における局在および ppIL-1αの核内輸送や核内機

importazole による影響を受けなかったことから，ppIL-1α能について検討した。その結果，以下の知見を得た。

の核局在は importin β非依存性であることが示唆された。

1 ．細胞内で，mIL-1αは細胞質に拡散的に分布し，pIL-1α

これまで importin αは，核内輸送される分子と importin βと ppIL-1αは主に核に局在した。

との結合を仲介するアダプター分子と考えられてきたが20），

2 ．ppIL-1αの核局在は，importin βに依存しなかった。

近年の研究で，importin αのみによって核内輸送される機

3 ．ppIL-1αは IL-8遺伝子発現に転写レベルで関与してい構があることが判明している22）。当研究室のこれまでの実た。

験で，pIL-1αが importin αと結合することを免疫沈降実験

以上の結果から，ppIL-1αは核内において，IL-8の発現により確認している。また，IL-1α分子内に存在する NLS

増強を介して，炎症反応を拡大することが示唆された。

配列を，細胞膜を通過できない分子に融合させると，この本研究の推進にあたり，病理学講座 浅野正岳教授，角田麻里
子助教および講座員の皆様にご指導頂いた。ここに深甚なる感謝の意を表する。本論文に関して，開示すべき利益相反はない。

分子が脂質 2 重膜を通過することが知られている23）。従って，NLS を欠失した IL-1αを細胞に transfection すること10

propiece IL-1αの核内輸送と機能

文

令和 5 年 6 月

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11

日大歯学 ，97（1）
，12-17，2023

原著

IL-1 receptor type 2による細胞内 pIL-1αの細胞外分泌抑制
定

村

正

之

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻

応用口腔科学分野

日本大学歯学部病理学講座（指導：浅野正岳 教授）

要旨【目的】Interleukin-1（IL-1）receptor（IL-1R）family の一員である IL-1R type 2（IL-1R2）は，マクロファージ内において precursor IL-1α（pIL-1α）と結合して，その分泌を抑制することが知られている。本研究では，ヒト子宮頸癌由来線維芽細胞である HeLa 細胞においても，この抑制効果が維持されるか，その効果に細胞膜貫通領域の関与があるのかという点について検討した。
【方法】HeLa 細胞に，pIL-1αおよび IL-1R2を単独または co-transfection し，pIL-1αの細胞外分泌量を ELISA にて測定した。また，IL-1R2の細胞膜貫通領域を欠失した mutant（ΔTM）を作製し，同様に pIL-1α細胞外分泌量を測定した。それぞれの分子の細胞内局在を蛍光免疫染色により確認した。また，pIL-1αと IL-1R2の結合を免疫沈降実験とこれに続く western blot により検出した。
【結果】HeLa 細胞において，pIL-1αは核に，IL-1R2は細胞質に拡散して存在した。IL-1R2存在下では，pIL-1αの細胞外分泌を抑制した。また，ΔTM は wild type IL-1R2よりも pIL-1αの細胞外分泌を強く抑制した。さらに，pIL-1αとIL-1R2は HeLa 細胞内で結合していることが確認された。
【結論】HeLa 細胞において，IL-1R2は pIL-1αと細胞内で結合し，pIL-1αの細胞外分泌を抑制していることが示唆された。また，IL-1R2の細胞膜貫通領域の存在は，pIL-1α分泌に対して促進的に作用する可能性が考えられた。
キーワード：IL-1α，IL-1R2，decoy receptor，細胞膜貫通領域

Inhibition of pIL-1α extracellular secretion by intracellular IL-1 receptor type 2
Masayuki Sadamura
Nihon University Graduate School of Dentistry, Major in Applied Oral Sciences
Department of Pathology, Nihon University School of Dentistry（Director: Prof. Masatake Asano）

Abstract【Purpose】Interleukin-1 (IL-1) receptor type 2 (IL-1R2) is a member of the IL-1R family. IL-1R2 was shown tobind with precursor IL-1α (pIL-1α) in macrophage and inhibit its extracellular secretion. Using the human uterine
cervical cancer-derived fibroblastic cell line (HeLa cell), the inhibitory function of IL-1R2, especially thetransmembrane region, on pIL-1α extracellular secretion was examined.
【Methods】HeLa cells were transfected with pIL-1α, IL-1R2 or in combination with both plasmids and the pIL-1α
concentration in the culture supernatants were measured by ELISA. In addition, the plasmid containing the mutant
IL-1R2 lacking the transmembrane region (ΔTM) was constructed and examined as well. Intracellular localization of
pIL-1α and IL-1R2 was examined by immunofluorescence staining. The binding between pIL-1α and IL-1R2 wasdetected with immunoprecipitation followed by western blot.
【Results】pIL-1α was localized mainly in the nucleus. On the other hand, IL-1R2 was localized diffusely in thecytoplasm in HeLa cell. Intracellular IL-1R2 inhibited the extracellular secretion of pIL-1α. The ΔTM much highly
suppressed pIL-1α extracellular secretion. Moreover, both pIL-1α and IL-1R2 bind each other and made an
intracellular complex in the cytoplasm.
【Conclusion】Intracellular IL-1R2 inhibits the extracellular secretion of pIL-1α by binding directly withintracellular pIL-1α in the HeLa cell. The transmembrane region of IL-1R2 may have enhancing effect on pIL-1α
extracellular secretion.
Keywords: IL-1α, IL-1R2, decoy receptor, transmembrane region（受付：令和 5 年 1 月13日）
責任著者連絡先：定村正之
日本大学歯学部病理学講座〒101-8310 東京都千代田区神田駿河台 1 ‒ 8 ‒13

TEL：03-3219-8124
FAX：03-3219-8340
E-mail：dema18018@g.nihon-u.ac.jp

12

日大歯学

図 2 Transfection に用いたベクター
ベクターの Xho1，Xba1間に IL-1R2を挿入した pCMV-SPORT 6 IL-1
receptor type 2（pCMV-R2）を鋳型として transmembrane 領域（黒矢印）である344-369のアミノ酸配列を欠失させたΔ transmembrane
IL-1R2（ΔTM）を作製した（左図）。pcDNA の EcoR1間へ N 末端に HiBiT-tag が付与されている pIL-1αを挿入した HiBiT-pIL-1αの C
末端に histidine-tag を付与した HiBiT/His-pIL-1αを作製した（右図）。

図 1 pIL-1αの processing
IL-1αは pIL-1αと し て 細 胞 質 内 で 産 生 さ れ た の ち，calpain や
granzyme B などの酵素により分子のほぼ中央部で切断され，N 末
端側の ppIL-1αと C 末端側の mIL-1αに分離する。ppIL-1α側に nuclear
localization sequence（NLS）配列が存在する 2 ）。

緒

第 97 巻第 1 号

言材料および方法

細胞が障害を受けたときに放出される分子は alarmin と1 ．細胞

総称される 。Interleukin-1（IL-1）αは代表的な alarmin

本研究には，ヒト子宮頸癌由来線維芽細胞である HeLaとして知られている。IL-1αは細胞内で約31 kDa の前駆体細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンク，大阪）を用

precursor IL-1α（pIL-1α）として産生され，図 1 に示すよいた。培養は Dulbeccoʼs Modified Eagle’s Medium（Thermo

うに calpain や granzyme B などの酵素によって propiece

Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）に10％ ウシ胎児（pp）IL-1αと mature（m）IL-1αに切断される 。

血清（Thermo Fisher Scientific）および 1％ ペニシリン‐

1）2）IL-1αの主要な受容体サブユニットとして，IL-1 receptor

ストレプトマイシン（Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany）

type 1（IL-1R1）と type 2（IL-1R2）が知られている。IL-を添加したものを用い，インキュベータ（37℃，5% CO2）

1R1はシグナルを伝達できるのに対し，シグナル伝達に必で行った。HeLa 細胞を24-well plate に 5 ×10⁴ cells/well

須の配列である Toll/IL-1 Receptor（TIR）ドメインを欠となるように播種した。

く IL-1R2はシグナル伝達できない。このことから，IL1R2は decoy receptor と呼ばれている 3 ）。IL-1R2は，IL-1α2 ．Plasmid の構築と transfection

および IL-1βと直接結合することでシグナル伝達を阻止す

HeLa 細胞への IL-1R2の強制発現には，pCMV-SPORT

るだけでなく，IL-1 receptor accessory protein（IL-1RAcP）

6 IL-1R2（pCMV-R2, 理研 BRC，つくば）を用いた。このとも複合体を形成し，IL-1α結合に伴うシグナル伝達を抑ベクターを鋳型として細胞膜貫通領域の26アミノ酸残基制する 3 , 4 ）。IL-1R2ノックアウトマウスの解析から，IL-（ASSTFSWGIVLAPLSLAFLVLGGIWM） を 欠 失 さ せ た

1R2の上記のような decoy receptor としての特性はマクロΔ transmembrane IL-1R2（ΔTM plasmid）を，Quick

ファージにおいて機能していることが明らかとなっている

change site-directed mutagenesis kit（Agilent

が，マクロファージ以外の細胞における IL-1R2の機能はTechnologies，Santa Clara，CA，USA）により作製した

未だ不明な点が多い 4 ）。

（図 2 ）。また，Kudo ら 6 ）が作製した HiBiT-pIL-1αの C- 末

Zheng ら 5 ）は，IL-1R2は細胞膜上または細胞外で decoy

端 に histidine-tag を 同 kit で 挿 入 し， こ の ベ ク タ ー をreceptor と し て 機 能 し て い る だ け で な く， 細 胞 質 内 で

HiBiT/His-pIL-1αとした。ΔTM 作製時に使用した primer

pIL-1αと結合して pIL-1αの細胞外分泌を阻害することによ

配列は次の通りである（forward 5’-CAC CAC AGT CAA

り，無菌性炎症を抑制することを報告した。また，リポポ

GGA ACA CAG ACG GTG CAA AC-3’

リサッカライド（LPS）刺激による caspase 活性化を介し

TGC ACC GTC TGT GTT CCT TGA CTG TGG TG-3’）。

た細胞質内の IL-1R2分解は，pIL-1αと IL-1R2との結合を作製したすべての plasmid は，DNA sequence 解析（ファ切断して pIL-1αの細胞外分泌を促進するとも報告していスマック，厚木）によって DNA 配列に間違いがないことる 。本研究では，ヒト子宮頸癌由来線維芽細胞であるを確認した。なお，pCMV-R2の transfection によって発HeLa 細 胞 に IL-1R2と pIL-1αを 強 制 発 現 さ せ， 同 様 に現する IL-1R2を wild type IL-1R2とした。

5）

reverse 5’-GTT

pIL-1αの細胞外分泌抑制が起きるのかという点について検Transfection は，Lipofectamine 3000 reagent kit

討を行った。また，IL-1R2の細胞膜貫通領域の pIL-1α細（Thermo Fisher Scientific）を用いて，次のように行った。

胞外分泌に対する役割についても解析した。

それぞれの plasmid（250 ng）を OPTI-MEM（25 μ
ｌ; GE

13

pIL-1αの細胞外分泌抑制
表1

令和 5 年 6 月

pIL-1αとIL-1R2の複合体の検出のための免疫沈降とwestern blotの条件

沈殿物

IPに用いたreagent

容量

WB検出reagent

検出物

図①pIL-1αNickel-agarose beads

30 μｌ

Nano Glo HiBiT

pIL-1α

図6A

Nickel-agarose beads

30 μｌmouse anti-human IL-1R2 monoclonal 抗体

IL-1R2

図6B

mouse anti-human IL-1R2 monoclonal 抗体

30 μｌmouse anti-HiBiT 抗体

pIL-1α図6C②IL-1R2

免疫沈降実験において使用したbeadsおよび抗体を示す。
表2

pIL-1α量（%）

pIL-1α + pcDNA100

pIL-1α + wild type IL-1R2

47.0 ± 0.2＊

pIL-1α + ΔTM

26.4 ± 0.1＊

Healthcare，Chicago，IL，USA） に 溶 解 し， 同 kit に 含
まれる3000 Reagent（0.75 μｌ）と混和した。つぎに，同 kit
中の Lipofectamine 3000（0.75 μｌ）を OPTI-MEM（25 μｌ）に溶解した。両溶液を混合し，室温で15分間反応させた。

wild type IL-1R2およびΔTMのpIL-1α分泌抑制
transfectant

pIL-1α transfectantにおける細胞外pIL-1α分泌量を100%とし，wild
type IL-1R2またはΔTMとのco-transfectantにおける細胞外pIL-1α分泌量を示した。5 サンプルを測定し，結果を平均値±標準偏差で示した。＊: p < 0.05 vs. pIL-1α + pcDNA

反応後，混合液を培養液に添加し，細胞と共に18時間培養した。培養後の細胞を transfectant として実験に用いた。
3 ．蛍光免疫染色
HeLa 細胞（ 5 ×104 cell/well）を24-well plate 中に置いク 量 を 定 量 し，40 ng の タ ン パ ク を12% sodium dodecyl

たカバースリップ（10 mm diameter，松浪硝子工業，大sulfate-polyacrylamide gel を 用 い て 電 気 泳 動 し た。

阪）に播種し，18時間培養した。培養後，pIL-1αおよびImmobilon Transfer Membrane（Merck，Darmstadt

IL-1R2を transfection し，更に18時間培養した。上清を吸Germany）に泳動後のタンパクを転写し，1% BSA-PBS

引除去し，カバースリップを0.01 M リン酸緩衝生理食塩

でブロッキングした。IL-1R2の検出には，1 次抗体として水（PBS）で洗浄後，2% パラホルムアルデヒドにて室温

mouse anti-human IL-1R2 monoclonal 抗体（×500希釈，で10分間固定した。再び PBS にて洗浄し，1% Triton-X

Santa Cruz），2 次抗体として horseradish peroxidase

100/PBS を加え，室温で10分間処理した。PBS で洗浄し，（HRP）標識 goat anti-mouse IgG 抗体（×5,000希釈，1% BSA/PBS にて室温で10分間非特異的反応のブロッキ

Jackson Immuno Research，West Grove，PA，USA） をングを行った。蛍光免疫染色には，一次抗体として mouse用いた。pIL-1αの検出は，1 次抗体として mouse anti-

anti-histidine monoclonal 抗体（×100希釈，Proteintech，

HiBiT monoclonal 抗体（×1,000希釈，Promega Madison，

Rosemont，IL，USA），mouse anti-human IL-1R2

USA），2 次抗体として HRP 標識 goat anti-mouse IgG

monoclonal 抗体（×100希釈，Santa Cruz，Dallas，TX，抗体（×5,000希釈，Jackson Immuno Research）を使用

USA）を，二次抗体として FITC 標識 goat anti-mouse

した。

IgG monoclonal 抗体（×100希釈，Proteintech）を用いた。核染色は，DAPI-Fluoromount-G（Southern Biotech，

6 ．免 疫沈降（IP）と WB による pIL-1αと IL-1R2の複合

Birmingham，AL，USA）を用いて行った。細胞像は，オー体の検出

ルインワン蛍光顕微鏡（BZ-X810，キーエンス，大阪）を

pIL-1αと IL-1R2の 複 合 体 形 成 の 有 無 に つ い て，IP と用いて観察し，撮影した。

WB により確認した。pIL-1αの IP は，His-tag に特異的に結合する Nickel-agarose beads（タカラバイオ，草津）を

4 ．ELISA による pIL-1αの定量用いた（表 1 ）。また，IL-1R2の IP は，mouse anti-humanTransfection 後に培養液を交換し，3 ，6 ，9 および12

IL-1R2 monoclonal 抗体（Santa Cruz）と protein G

時間後に回収した培養上清を遠心分離し（16,900×g，1 分

sepharoseTM 4 Fast Flow（GE Healthcare）を用いた。そ間），抽出した上清をサンプルとした。Quantikine human

れぞれの IP 後の WB による pIL-1αおよび IL-1R2の検出

IL-1α ELISA kit（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）

は，表 1 に示した抗体または検出試薬を用いた。このうを用いて pIL-1αを定量した。

ち，HiBiT-tag の検出は，HiBiT に特異的に結合する Lg-

5 ．Western blot（WB）法（Promega）を用いた。

BiT に HRP を結合させた Nano Glo HiBiT blotting system
Transfectant を PBS で洗浄後，細胞溶解液（50 mM
Tris-HCl，150 mM NaCl，0.5% Triton X-100，pH 7.5）に

7 ．統計学的解析て細胞を溶解した。溶解液を遠心分離し，抽出された上清

データの正規性を Shapiro-Wilk 検定，等分散性を Levene

を回収してサンプルとした。BioRad protein assay kit

検定で確認した。表 2 は一元配置分散分析後 Tukey の多（BioRad Hercules，USA）を用いてサンプルの総タンパ

重比較を用いて解析した。図 5 は ANOVA の分散分析法

14

日大歯学

図 3 Transfectant における pIL-1αおよび IL-1R2の発現
pIL-1αは31 kDa の単一のバンドとして，IL-1R2は59 kDa と51 kDaの 2 本のバンドとして検出された。Control HeLa 細胞ではバンドが検出できなかった。

第 97 巻第 1 号

図 5 pIL-1α分泌量の経時的変化
同じ実験を 5 回繰り返し，それぞれのサンプルを triplicate で測定した。平均値 ± 標準偏差でデータを示した。＊：p < 0.05 vs. 3 時間後の pIL-1α濃度

11.7 pg/ml，6 時 間 で287.0±27.9 pg/ml，9 時 間 で414.8±
27.0 pg/ml，12時間で461.9±8.6 pg/ml となり，経時的に
培 養 上 清 中 の pIL-1α濃 度 は 上 昇 し た（ 図 5 ）。 一 方，
insert の 入 っ て い な い コ ン ト ロ ー ル ベ ク タ ー で あ る
pcDNA transfectant では pIL-1α量は検出限界以下であった。以上の結果から，培地交換後 6 時間で，培養上清中に
ELISA によって検出可能な量の pIL-1α分泌が認められたことから，以下の実験では，培地交換 6 時間後の培養上清

図 4 Transfectant における pIL-1αおよび IL-1R2の細胞内局在
pIL-1αまたは IL-1R2を transfection した HeLa 細胞を蛍光顕微鏡で観察した。

中の pIL-1α濃度を測定することとした。
3 ．IL-1R2による pIL-1αの分泌抑制
IL-1R2が pIL-1αの分泌にどのような影響を及ぼすのかを用いて解析した。結果は，平均値±標準偏差で表した。

検討するために，IL-1R2存在下および非存在下で培養上清

0.05未満の p 値は統計学的に有意であるとみなした。

中の pIL-1α量を測定した。その結果，pIL-1αをコントロー

結

ルベクター pcDNA と共に co-transfection した細胞におけ果る pIL-1α量を100% としたとき，IL-1R2と pIL-1αの co-

1 ．pIL-1αおよび IL-1R2の細胞内局在

transfectant した細胞では，pIL-1α量は47.0±0.2% に低下

Transfectant における pIL-1αおよび IL-1R2の発現を WBした（表 2 ）。次に，IL-1R2の細胞膜貫通領域の pIL-1α分

により確認した。その結果，pIL-1αは31 kDa の単一のバ泌に対する影響を確認するために，IL-1R2の細胞膜貫通領ンドとして，また IL-1R2は59 kDa と51 kDa の 2 本のバン域を欠失させたΔTM plasmid を pIL-1αと共に transfection

ドとして検出された（図 3 ）。一方，pcDNA transfectant

し，培養上清中の pIL-1α量を測定した。その結果，pIL-1α

で は， バ ン ド は 検 出 さ れ な か っ た。 以 上 の 結 果 か ら，

量は，pIL-1αのみ transfectant した細胞と比較して，26.4±

HeLa 細胞においては内在性の pIL-1αおよび IL-1R2は存在

0.1% にまで低下した（表 2 ）。この結果から，細胞膜貫通領しないことが明らかとなった。次に，それぞれの分子の細域を欠失した IL-1R2は，wild type IL-1R2よりも，pIL-1α

胞内局在について免疫蛍光染色により確認したところ，分泌に対する抑制効果が高いことが明らかとなった。

pIL-1αは主に核に局在し，IL-1R2は核および細胞質に拡散して存在することが明らかとなった（図 4 ）。

4 ．pIL-1αと IL-1R2の結合の確認
pIL-1αと IL-1R2の細胞内での結合の有無について，IP

2 ．pIL-1α分泌量の経時的変化とこれに続く WB により確認した。その結果，表 1 に示

pIL-1α transfectant の培養上清中の pIL-1α量を，ELISA

す①上段の条件で，pIL-1α単独および pIL-1αと IL-1R2のを用いて経時的に測定した。培地交換後，3 時間で149.7±

co-transfectant の両者において31 kDa の pIL-1αのバンド

15pIL-1αの細胞外分泌抑制

令和 5 年 6 月

きないため，シグナルが伝達されない 8 , 9 ）。また，IL-1
family に属する分子である IL-1R2は IL-1αまたは IL-1βと結合し，さらに IL-1RAcP との複合体を形成するにも関わらず，細胞内領域に TIR ドメインを持たないため，シグナルを伝達できない 4 , 8 ）。このように IL-1αシグナルの抑制系が複数存在することは，炎症制御の多様性を示すもの
であるが，これに加えて Zheng ら 5 ）は，I 型の膜貫通膜タンパクである IL-1R2が細胞質内で pIL-1αと結合し，pIL-1αの細胞外分泌を抑制するという新たなメカニズムを発見した。これによると，HeLa 細胞と同様に内因性の IL-1R2の発 現 が 見 ら れ な い 血 管 平 滑 筋 細 胞 に 対 し て，IL-1R2をtransfection し，LPS と ATP を作用させると mIL-1α分泌が 促 進 さ れ た 5 ）。 こ れ は，LPS と ATP に よ る 刺 激 がinflammasome を活性化させ，その構成成分である caspaseを活性化させることにより，基質である IL-1R2を分解することによるものであった。これによって pIL-1αと IL-

図 6 pIL-1αと IL-1R2の結合
pcDNA 単独，IL-1R2単独，pIL-1α単独および pIL-1αと IL-1R2の cotransfectant の細胞溶解液を調整し，表 2 の方法によって IP およびWB を行った。A：表 1 ①の方法で IP を行い，Nano Glo HiBiT により
pIL-1αを検出した。B：表 1 ①の方法で IP を行い，mouse anti-human
IL-1R2 monoclonal 抗体で IL-1R2の検出を行った。C：表 1 ②の方法
で IP を行い，mouse anti-HiBiT 抗体で pIL-1αの検出を行った。

1R2との結合が解消され，pIL-1αが細胞内で calpain による分解を受け，生成された mIL-1αを細胞外に分泌するとされた 5 ）。
本研究では，HeLa 細胞においても pIL-1αの細胞外分泌抑制メカニズムが機能するのかという点について検討した。その結果，HeLa 細胞においてもマクロファージなどが検出された（図 6 A）
。また，同じメンブレンを抗 IL-と同様に，pIL-1αと IL-1R2との結合に起因した pIL-1αの1R2抗体にて WB を行ったところ（表 1 ①下段）
，pIL-1α細胞外分泌抑制が見られた。さらに，IL-1R2の細胞膜貫通と IL-1R2の co-transfectant においてのみ，IL-1R2のバン

領域を欠失したΔTM では，wild type IL-1R2よりもさらド（59 kDa および51 kDa）が検出された（図 6 B）
。また，に高い抑制効果を示した。

抗 IL-1R2抗体で IP したものでは（表 1 ②の条件），pIL-1α

また，IL-1R2は IL-1αの第 2 のレセプターとしてクローと IL-1R2の co-transfectant に お い て の み，pIL-1αの バ ン

ニングされ，細胞膜表面で機能すると考えられている10）。

ド（31 kDa）が検出された（図 6 C）
。以上の結果から，

IL-1R2は，細胞膜外で matrix metalloprotease である

pIL-1αと IL-1R2が，細胞質内で結合していることが明ら

a disintegrin and metalloproteinase domain-containing

かとなった。

protein 17（ADAM17）によって切断される11）。これまで

考の 研 究 か ら，IL-1R2 をHeLa 細 胞 に 強 制 発 現 さ せ る と，

察

IL-1R2断端が細胞外領域に遊出されることを確認していpIL-1αは，processing の結果 ppIL-1αと mIL-1αに分断さる。このような切断された IL-1R2の細胞外領域はリガン

れるが，これら 3 種類の分子のうち pIL-1αおよび mIL-1αド結合部を含んでおり，血液中や細胞外液中に放出されるのみが機能的分子であるとされる 2 ）。また，サイトカインと IL-1αおよび IL-1βと結合し，IL-1αおよび IL-1βの作用をとしての活性は後者の方が高いとされ ，細胞内で抑制することで炎症を終息させる12-14）。これも，pIL-1αの効

processing されることによってより活性の高い mIL-1αが果を減弱させるメカニズムの一つと考えられる。さらに，

細胞外に分泌され，効率的に炎症を惹起するものと考えら

pIL-1αのみ transfection された HeLa 細胞から，非常に多れている。活性は異なるものの，pIL-1αおよび mIL-1αは

くの pIL-1αが放出されていた。従って，細胞外に分泌さ細胞外に分泌され，細胞膜表面で両者ともに IL-1R1に結れた pIL-1αが，HeLa 細胞の細胞膜表面に発現された IL-合する。その後，アクセサリータンパクである IL-1RAcP

1R2 に結合する可能性がある。あるいは，放出された pIL-が会合し，複合体を形成することでシグナルが伝達され1αが，細胞膜表面から酵素的に切断された IL-1R2 の細胞る。これによって転写因子 NF-κB や AP-1カスケードが外領域と結合する可能性も考えられる。さらに，こうして活性化され，種々のサイトカインが産生されるなどして炎形成された pIL-1αと IL-1R2 複合体は，本研究で用いた症反応が進行する 。IL-1 family には，構造的に類似した

ELISA では検出不可能であったのかもしれない。このこ

11種類の分子があるが，この中で IL-1 receptor antagonistとは，IL-1R2が細胞質内で pIL-1α細胞外分泌を抑制しては，IL-1R1に結合した後，IL-1RAcP との複合体を形成でいるという解釈とは相容れない現象であることから，本研

7）

2）

16

日大歯学

究で得られた IL-1R2による pIL-1αの細胞外分泌抑制メカ

Ikarashi T, Horai R, Kakuta S, Watanabe T, Iwakura
Y (2015) IL-1 receptor type 2 suppresses collageninduced arthritis by inhibiting IL-1 signal on
macrophages. J Immunol 194, 3156-3168.
5）Z heng Y, Humphry M, Maguire JJ, Bennett MR,
Clarke MC (2013) Intracellular interleukin-1 receptor
2 binding prevents cleavage and activity ofinterleukin-1α，controlling necrosis-induced sterile
inflammation. Immunity 38, 285-295.
6）Kudo Y, Tamagawa T, Nishio K, Kaneko T, Yonehara
Y, Tsunoda M (2022) Nuclear localization of propieceIL-1α in HeLa cells. J Oral Sci 64, 151-155.
7）Kim B, Lee Y, Kim E, Kwak A, Ryoo S, Bae SH, Azam
T, Kim S, Dinarello CA (2013) The interleukin-1α
precursor is biologically active and is likely a key
alarmin in the IL-1 family of cytokines. Front
Immunol 4, 391.
8）Schlüter T, Schelmbauer C, Karram K, Mufazalov IA(2018) Regulation of IL-1 signaling by the decoy
receptor IL-1R2. J Mol Med, 96, 983-992.
9）Boraschi D (2022) What is IL-1 for? The functions ofinterleukin-1 across evolution. Front Immunol 13,
872155.
10）Liu C, Hart RP, Liu XJ, Clevenger W, Maki RA, De
Souza EB (1996) Cloning and characterization of analternatively processed human type II interleukin-1
receptor mRNA. J Biol Chem 271, 20965-20972.
11）U chikawa S, Yoda M, Tohmonda T, Kanaji A,
Matsumoto M, Toyama Y, Horiuchi K (2015) ADAM17
regulates IL-1 signaling by selectively releasing IL-1
receptor type 2 from the cell surface. Cytokine 71,
238-245.
12）Conti P, Panara MR, Porrini AM, Gambi D, Barbacane
RC, Reale M, Bongrazio M, Dempsey RA (1992)
Inhibition of interleukin-1 (alpha and beta), interleukin-2
secretion and surface expression of interleukin-2
receptor (IL-2R) by a novel cytokine interleukin-1
receptor antagonist (IL-1ra). Scand J Immunol 36, 2733.
13）P eters VA, Joesting JJ, Freund GG (2013) IL-1
receptor 2 (IL-1R2) and its role in immune regulation.
Brain Behav Immun 32, 1-8.
14）Molgora M, Supino D, Mantovani A, Garlanda C (2018)
Tuning inflammation and immunity by the negative
regulators IL-1R2 and IL-1R8. Immunol Rev 281, 233247.

ニズムの詳細についてはさらに検討する必要がある。
IL-1R2による IL-1αの細胞外分泌制御は，炎症反応の調節にも深く関係していると考えられる。IL-1R2による IL-1αの細胞外分泌機能調節メカニズムの解明は多くの病態の改善や治療法の開発にも貢献しうる可能性があり，今後更なる研究を行う必要があると考える。

結論

IL-1R2および pIL-1αを transfection した HeLa 細胞を用いて，以下の結論を得た。
1 ．HeLa 細胞において，細胞内 IL-1R2は pIL-1αの細胞外分泌を抑制した。
2 ．Transmembrane 領域を欠失した IL-1R2は，wild typeIL-1R2よりもさらに高い pIL-1αの細胞外分泌抑制効
果を示した。
3 ．HeLa 細胞内で IL-1R2と pIL-1αは結合し，複合体を形成していた。
以 上 の こ と か ら，HeLa 細 胞 内 に 存 在 す る IL-1R2は，
pIL-1α細胞外分泌抑制効果を維持していることが示唆された。しかし，IL-1R2による pIL-1α細胞外分泌抑制の詳細なメカニズム解明には，さらなる研究が必要であると考えられた。
本研究の遂行にあたり，病理学講座 浅野正岳教授および講座
員の皆様にご指導いただいた。ここに深甚なる感謝の意を表する。
本論文に関して，開示すべき利益相反はない。

文第 97 巻第 1 号

献1）Jiang L, Shao Y, Tian Y, Ouyang C, Wang X (2020)
Nuclear alarmin cytokines in inflammation. J Immunol
Res 2020, 7206451.
2）Chiu JW, Binte Hanafi Z, Chew LCY, Mei Y, Liu H(2021) IL-1α processing, signaling and its role incancer progression. Cells 10, 92.
3）Supino D, Minute L, Mariancini A, Riva F, Magrini E,
Garlanda C (2022) Negative regulation of the IL-1
system by IL-1R2 and IL-1R8: relevance inpathophysiology and disease. Front Immunol 13,804641.
4）Shimizu K, Nakajima A, Sudo K, Liu Y, Mizoroki A,

17

日大歯学 ，97（1）
，18-26，2023

原著

高濃度グルコースが成熟骨芽細胞の石灰化に与える影響
清

水

な

つ

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻

生
口腔構造機能学分野

日本大学歯学部歯科矯正学講座（指導：本吉満

教授，藤原恭子

准教授）

要旨【目的】過度の糖負荷が骨の形成過程における基質の石灰化を抑制し，骨の脆弱性を生むことは知られているが，その詳細な機序については不明な点が多い。本研究では高濃度グルコースを加えて培養した成熟骨芽細胞の石灰化抑制
メカニズムを解明することを目的とした。
【方法】ラット骨肉腫由来株化細胞の ROS17/2.8を異なるグルコース濃度を含む培地で 7 日間培養し，alkaline
phosphatase 染色と基質の石灰化を alizarin red 染色によって確認した。同時に染色した石灰化物をギ酸で溶解し，その吸光度を測定することによって石灰化レベルを数値化した。骨芽細胞関連因子の発現は quantitative PCR で検出し，細胞の生存レベルは WST8アッセイで評価した。ピロリン酸（PPi），モノリン酸（Pi）および ATP の濃度測定は市販のキットを利用した。
【結果】通常の5.5 mM グルコースを含む培地で培養した対照群と比べ，11 mM あるいは22 mM の高濃度グルコー
スを加えた実験群では石灰化の強い抑制が認められた。細胞の生存レベルは高く，またマンニトールを加えて対照群と実験群との浸透圧を同等にしても両群間の石灰化レベルは変化がなかったことから，高濃度グルコースによる石灰化 の 抑 制 は， 細 胞 死 あ る い は 浸 透 圧 の 上 昇 に は 起 因 し な い こ と が 明 ら か に な っ た。RUNX2，type I collagen，osteocalcin および osteopontin の遺伝子発現は対照群と比べて実験群で高く，5 日目に高濃度グルコースを含む培地に交換することで，石灰化を顕著に抑制できた。石灰化を阻害するピロリン酸（PPi）と石灰化の基質となるモノリン酸（Pi）の濃度を測定した結果，培養上清中に含まれる細胞外 PPi は実験群で増加し，反対に細胞内・外の Pi は減少した。この時に測定された同じ濃度の PPi を5.5 mM のグルコースを含む培地に加えたところ，石灰化は強く抑制された。さらに対照群に比べて実験群の細胞内 ATP は軽度に増加し，細胞外 ATP は減少した。
【結論】高濃度のグルコースを加えて培養した ROS17/2.8の石灰化抑制は，培養液中の PPi 濃度の増加によって生じた可能性が考えられた。
キーワード：高濃度グルコース，成熟骨芽細胞，石灰化，ピロリン酸，モノリン酸

Effect of high glucose concentration on mineralization in mature osteoblasts
Natsuo Shimizu
Nihon University Graduate School of Dentistry, Major in Orthodontics
Department of Orthodontics, Nihon University School of Dentistry（Directors: Prof. Mitsuru Motoyoshi and Assoc. Prof. Kyoko Fujiwara）

Abstract【Purpose】Excessive glucose is known to inhibit the mineralization during bone formation, leading to the bone
fragility in skeletal system. However, the exact mechanism how glucose prevents the mineralization remains
unclear. A purpose of this study is to define the inhibitory effect of high glucose concentration on mineralized
matrix formation in mature osteoblasts.
【Methods】A rat osteosarcoma-derived cell line ROS17/2.8 was cultured for 7 days in medium containing highglucose (11 or 22 mM), and normal glucose (5.5 mM) as a control. Mineralization was estimated by alizarin red
staining and absorbance of the solution eluted from AR-stained matrix. Gene expression of osteoblast specificmarkers was detected by quantitative PCR. Alkaline phosphatase activity and cell viability was measured by NT
staining and WST8 assay, respectively. In addition, concentration of pyrophosphate (PPi), monophosphate (Pi) andATP was detected by commercial assay kits.
【Results】High glucose clearly showed the decrease in mineralization, but ALP activity did not change between
the cells in high glucose and control. Since high glucose increased cell viability and adding high mannitol in control
did not inhibit mineralization, the influence of osmotic pressure was negligible in high glucose culture. High glucose
also increased the expression of osteoblast specific markers, RUNX2, type I collagen, osteocalcin and osteopontin.
（受付：令和 5 年 1 月20日）
責任著者：清水なつ生
日本大学歯学部歯科矯正学講座〒101-8310 東京都千代田区神田駿河台 1 ‒ 8 ‒13

TEL：03-3219-8105
FAX：03-3219-8365
E-mail：dena19014@g.nihon-u.ac.jp

18

日大歯学

第 97 巻第 1 号

During 7 days culture, the change in medium containing high glucose at day 5 strongly decreased mineralizationcompared to those at days 1 and 3. Furthermore, high glucose not only increased extracellular PPi, which preventsthe formation of calcium phosphate, but also decreased intra-and extra-cellular concentrations of Pi, which is a
substrate for mineralization. When sodium pyrophosphate was added in control at the concentration equal toextracellular PPi in high glucose culture, mineralization was remarkably inhibited. Nevertheless, high glucose
decreased extracellular ATP, which is a molecule required for PPi synthesis, although it slightly increased
intracellular ATP.
【Conclusion】These results suggest that inhibitory effect of high glucose on mineralization in ROS17/2.8 was inpart due to increasing extracellular PPi.
Keywords: high glucose concentration, mature osteoblasts, mineralization, pyrophosphate, monophosphate緒において重要な役割を持つことを意味している。

言

高濃度グルコースによる骨芽細胞分化や基質の石灰化に

歯科矯正治療では歯牙移動装置からの外力によって，歯与える影響については，マウス前骨芽細胞様株化細胞

槽骨の改変が誘導され，歯を目的の位置に移動させること

MC3T3-E1を使った培養系で研究されている。しかしながができる。この際，圧迫側の歯槽骨には破骨細胞分化の促ら，報告ごとに結果が異なり，一定の見解が得られていな進によって骨吸収が起こり，反対に牽引側では骨芽細胞のいのも事実である。例えば，11 mM から33 mM のグル機能が活性化され骨の添加が起こる。このような破骨細胞コースが MC3T3-E1の骨芽細胞への分化と石灰化を促進と骨芽細胞による骨の改変現象は，全身の骨の成長や骨のするという報告がある15-17）。一方，15.5 mM のグルコース

損傷治癒過程でも生じており，血中グルコース濃度が様々

は，MC3T3-E1の増殖や分化，石灰化を促進するが，25.5

な影響を与えることが知られている 。

mM または35.5 mM のグルコースでは，抑制的に機能する

1）

これまでに，高血糖が骨の脆弱性を生む報告が数多くな場合もある18）。MC3T3-E1は BMP-2を含む培地で 3 から 4されている。例えば糖尿病が骨粗鬆症のリスクファクター

週間培養することによって，石灰化能をもつ成熟骨芽細胞であることは良く知られている 2 - 5 ）。また，高濃度グルに分化するが，最初の 1 週間だけ高濃度グルコースを含む

コースによって活性酸素が産生され，骨芽細胞の機能阻害培地にするだけでも石灰化は促進する。しかし，最後の 1や破骨細胞の活性化が起こり 6 ），骨組織中のコラーゲンに週間のみを高濃度グルコースにしても変化は見られない19）。

非酵素的なグリコシル化が生じることも報告されている 。

すなわち，高濃度グルコースが，前骨芽細胞から骨芽細胞，

さらに，グルコースとタンパクの非酵素的な糖化反応にさらに成熟骨芽細胞へ分化する過程で異なる影響を及ぼす

よって生じる終末糖化産物の蓄積がインスリン様増殖因子

可能性があり，MC3T3-E1を利用した研究において，一定に対する骨芽細胞の反応性を低下させ，その結果，骨形成の見解が得られていない理由の一つであると考えられる。

の抑制が起きる報告もある 8 , 9 ）。しかし，高濃度グルコー

本研究では成熟骨芽細胞の性質をもつラット骨肉腫由来

スが骨形成を抑制する詳しいメカニズムは，いまだに解明

株化細胞 ROS17/2.8 20, 21）を使用して，高濃度グルコースがされていない。

基質の石灰化を抑制するメカニズムについて検討した。

7）

グルコースは骨芽細胞の主なエネルギー源であり，骨組材料および方法

織では活発なグルコースの取り込みが観察されている10）。
また，最近の研究から骨芽細胞の分化過程でグルコース代

1 ．細胞の培養

謝が大きく変化することも知られている。例えば，前骨芽

ラット骨肉腫由来株化細胞 ROS17/2.8（理化学研究所バ

細胞の増殖には解糖系が，また骨芽細胞への分化には解糖

イオリソースセンター，つくば）は alpha modified Eagleʼs系とミトコンドリア呼吸の両方が，そして成熟骨芽細胞へ

minimum essential medium（αMEM，富士フィルム和光

分化すると再び解糖系が主なグルコース代謝経路となって

純薬，大阪）に10% 牛胎児血清（FBS，ニチリョー，東いる。一方，初代骨芽細胞を利用した研究から，骨芽京），600 mg/L glutamine，100 IU/mL penicillin（Thermo

細胞の成熟過程において解糖系で機能するヘキソキナーゼ

Fisher Scientific，Waltham，MA，USA） と100 mg/mLやピルビン酸キナーゼ，グルコース輸送体である glucose

streptomycin（Thermo Fisher Scientific） を 添 加 し た 培transporter 1の発現が上昇することが知られている13）。さ

地で，湿度100%，37℃，5 % CO2の条件で培養した。ならに，骨芽細胞のグルコースの取り込みによって AMP-

お，通常の10% FBS が含まれたαMEM のグルコース濃度

activated protein kinase が活性化され，その結果，骨芽細は5.5 mM に設定されているため22），この培地で培養した胞分化関連転写因子の runt-related transcription factor 2細胞を対照群とし，終濃度が11 mM と22 mM になるよう（RUNX2）の発現が誘導され，骨芽細胞分化が促進する14）。

にグルコースを加えて培養した細胞を実験群とした。

11, 12）

これらの知見は，グルコース代謝の制御が骨芽細胞の分化

細胞は5 × 104個 /ml の密度で96ウェルプレートまたは19

高グルコース濃度による石灰化抑制

24ウ ェ ル プ レ ー ト に 播 種 し， 1 日 後 に10 mM の β

令和 5 年 6 月
表1

qPCRに使用したプライマー-glycerophosphate（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）

遺伝子と異なるグルコース濃度を含む培地に置換し，7 日間の培

RUNX2 forward

CAAGTGGCCAGGTTCAACGA養を行い，3 日目と 5 日目に培地交換を行った。

RUNX2 reverse

TGTGAAGACCGTTATGGTCAAAGTG

COL1A1 forward

CAGATTGAGAACATCCGCAGC

COL1A1 reverse

CGGAACCTTCGCTTCCATACTCOPN forward

GATGAACAGTATCCCGATGCC

OPN reverse

CCCTCTGCTTATACTCCTTGGAC

OCN forward

GACAAGTCCCACACAGCAACT

OCN reverse

GGACATGAAGGCTTTGTCAGA

B2M forward

CGAGACCGATGTATATGCTTGC

phosphate と0.4 mg/ml の nitro blue tetrazolium chloride

B2M reverse

GTCCAGATGATTCAGAGCTCCAを含む水溶液を加え，10分間室温でインキュベートした

COL1A1：type I collagen，OCN：osteocalcin，OPN：osteopontin，
B2M：beta-2-macroglobulin

2 ．Alkaline phosphatase（ALP）活性の評価
24ウェルプレートに播種した細胞から培地を除去し，
phosphate buffer saline（PBS） で 洗 浄 後，4 % パ ラ ホ ル
ムアルデヒドで，10分間固定した。各ウェルを超純水で4 回 洗 浄 し，0.19 mg/ml の5-bromo-4-chloro-3-indolyl-

後，超純水で 1 回洗浄し，発色したプレート面をスキャ

塩基配列（5ʼ - 3ʼ）ナー（LiDE400，キヤノン，東京）で撮影した。
6 ．Quantitative RT-PCR（qPCR）
3 ．石灰化の評価

RNA の抽出は RNeasy mini kit（Qiagen, Valencia, CA,

基質の石灰化は alizarin red（AR）染色と吸光度法にUSA）で，また RNA から cDNA の合成は iScript cDNA

よって調べた。24ウェルプレートに播種した細胞から培地

synthesis kit（Bio-Rad laboratories, Hercules, CA, USA）

を除去し，PBS で洗浄後，4 % パラホルムアルデヒドにを使用した。qPCR は SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（タカラよって10分間室温で固定した。その後，各ウェルを超純水

バイオ，草津）を利用した。骨芽細胞関連因子の検出に使で 1 回洗浄し，1 % AR 水溶液で10分間染色した。超純水用したプライマーの塩基配列を表 1 に示す。反応は95℃，で再度洗浄した後，プレート面をスキャナー（LiDE400）

30秒の前処理後，95℃，5 秒と58℃，30秒の反応サイクルで撮影した。さらに，石灰化レベルを数値化するために，を40回繰り返した。サーマルサイクラーは CFX Maestro

染色後の各ウェルに 5 % ギ酸500 μｌを加えて10分間振盪す（Bio-Rad laboratories）を使用し，測定はすべて 3 回ずつることで色素を溶出させた。そのうち100 μｌを96ウェルプ

行った。なお，cDNA を段階希釈して得られた標準曲線

レートに移し，波長425 nm の吸光度をプレートリーダー

から各遺伝子の相対的な発現レベルを求めた。この際，（SpectraMax ABS Plus, Molecular Devices, San Jose, CA,

beta-2-microglobulin（B2M）の値を内因性コントロール

USA）によって計測した。バックグラウンドは100 μ
ｌの

とした。

5 % ギ酸を使用し，測定値からバックグラウンドの吸光度を減じた数値を評価した。

7 ．ピロリン酸（PPi）濃度の測定

4 ．生存レベルの評価

Pyrophosphate Assay Kit（ab234040，Abcam，Cambridge，

96ウェルプレートに播種した細胞の PPi 濃度の測定は，細胞の生存レベルを評価するために WST8試薬（ナカUK）を利用した。培養上清を Microcon-10（Merck-Millipore，

ライテスク，京都）を使用した。96ウェルプレートに播種

Burlington，MA，USA） に 移 し，10,000 rpm，4 ℃ で10した細胞から培地を除去し，1/10濃度の WST8試薬を含分間遠心後，上清を回収した。得られた上清は測定バッ

む100 μｌの培地を加え，1 時間培養し，波長450 nm の吸光

ファーで10分の 1 に希釈し，細胞外 PPi の測定に使用し度を SpectraMax ABS Plus で計測した。バックグラウン

た。同時に細胞を100 μｌの測定バッファーに懸濁させ，遠ドは1/10濃度の WST8試薬を含む100 μｌの培地を使用し，

心後，上清を回収し，測定バッファーで10分の 1 に希釈し測定値からバックグラウンドの吸光度を減じた数値を生存たものを細胞内 PPi の測定に使用した。それぞれの上清かレベルとした。

ら得られた50 μｌの希釈液と50 μｌの検出試薬を96ウェルプ
レートのウェル中で混合し，37℃で30分間のインキュベー

5 ．マンニトールが石灰化に与える影響

ト後，波長570 nm の吸光度を SpectraMax ABS Plus で細胞浸透圧の変化が石灰化に影響を及ぼすか調べるた

計測した。PPi 標準液から検量線を作成し，その吸光度かめ，24ウェルプレートに播種した細胞を通常培地で 5 日間ら細胞内・外の PPi 濃度を求めた。さらに，測定に使用し培養した後に，終濃度が11 mM あるいは22 mM になるよ

なかったウェルで培養した細胞の DNA 量を計測し，PPi

うにマンニトールを加えて 2 日間培養した。その後，石灰濃度を補正した。

化を上述の 3 にしたがって調べた。

20

日大歯学

8 ．モノリン酸（Pi）濃度の測定

第 97 巻第 1 号

結

Pi 濃度は，ホスファC テストワコー（富士フィルム和果光純薬）によって定量した。96ウェルプレートに播種した

1 ．高濃度グルコースが ALP 活性と石灰化に与える影響

細胞の培養上清を回収し，遠心後，上清を蒸留水で10分の

通常の10% FBS が含まれたαMEM のグルコース濃度は1 に希釈して，細胞外 Pi 濃度の測定に使用した。同時に

5.5 mM であり，この値は正常なヒトの空腹時血糖にほぼ細胞を20 μｌの RIPA バッファー（Thermo Fisher Scientific）

等しい23）。一方，糖尿病患者では血糖値6.9 mM〜20 mMで溶解し，細胞内 Pi 濃度の測定に使用した。 5μｌの上清以 上 に ま で 上 昇 す る こ と か ら24, 25）， 今 回 は11 mM と22

希 釈 液 ま た は 細 胞 溶 解 液 と400 μｌの 検 出 試 薬 を1.5 ml

mM を高濃度グルコースとした。異なる濃度のグルコー

チューブ中で混合し，37℃で20分間インキュベートした。

スを含む培地で ROS17/2.8を培養し，7 日目に ALP 活性チューブを水冷後，100 μｌを96ウェルプレートの各ウェルと基質の石灰化を調べた。その結果，いずれのグルコースに 移 し， 波 長750 nm の 吸 光 度 を SpectraMax ABS Plus

濃度でも ALP 活性の変化は見られなかったが，5.5 mMで計測した。Pi 標準液で検量線を作成し，吸光度から細グルコースで培養した細胞（対照群）と比較して，高濃度

胞内・外の Pi 濃度を求めた。さらに，測定に使用しなかっグルコースを加えて培養した細胞では，石灰化の抑制が認たウェルで培養した細胞の DNA 量を計測し，Pi 濃度を補められた。AR 染色後の基質を 5 % ギ酸で溶解し，染色レ正した。

ベルを数値化した結果，この石灰化抑制は，対照群を 1 とした場合，11 mM グルコース添加群で0.53 ± 0.15（p <9 ．ピロリン酸ナトリウム（PPNa）が石灰化に与える影響

0.01），また22 mM グルコース添加群では0.13 ± 0.01（p24ウェルプレートに播種した細胞を 5 日間培養した後，< 0.01）となった（図 1 A）。

25，50，250 μM の PPNa（富士フィルム和光純薬）を含高濃度グルコースによる石灰化の抑制が，細胞浸透圧の上んだ培地と交換し，2 日間培養した。その後，上述の 3 に昇によって生じた可能性も否定できない。そこで，対照群従って石灰化を評価した。

に5.5 mM と16.5 mM のマンニトールを加え，浸透圧を11mM と22 mM グルコース添加群と同等にし，7 日間の培10．ATP 濃度の測定
細胞内 ATP 濃度は Intracellular ATP 測定キット Ver.2
IC2-100（東洋ビーネット，東京）によって定量した。96
ウェルプレートに播種した細胞を PBS で 1 回洗浄し，100 μｌの ATP 抽出バッファーをウェルに加えて，5 分間ゆっく
り振盪した。その後，20 μｌの抽出バッファーを回収し，200
μｌの ATP 発光試薬と反応後，ルミノメーター（Lu-Mini，Vitl Life Science Solutions，Ashland，VA，USA） で 発
光 量 を 計 測 し た。 さ ら に， 細 胞 外 ATP 濃 度 の 定 量 はExtracellular ATP 測定キット EX2-100（東洋ビーネット）を利用した。96ウェルプレートに播種した細胞から回収した100 μｌの培養上清と100 μｌの ATP 発光試薬を反応させた後，Lu-Mini で発光量を計測した。最終的に細胞内・外の ATP 濃度は，ATP 標準液の発光量から得られた検量線をもとに算出した。さらに，測定に使用しなかったウェ
ルで培養した細胞の DNA 量を計測し，ATP 濃度を補正

図 1 高濃度グルコースが石灰化に与える影響（A）ROS17/2.8を 7 日間培養し，5.5 mM グルコースを加えた群（対照群）と，11 mM あるいは22 mM グルコースを加えた群（実験群）との間の ALP 活性と石灰化の違いについて調べた。ALP 染色と AR染色を写真（上）で，また AR 染色後の溶解液の吸光度から得られた石灰化レベルをグラフ（下）で示す。（B）対照群の浸透圧を実験群と同じになるよう，対照群に5.5 mM と16.5 mM のマンニトールをそれぞれ加えて培養し，石灰化の違いを調べた。AR 染色の写真（上）と，AR 染色後の基質溶解液の吸光度から得られた石灰化レベルをグラフ（下）で示す。なお，（A）と（B）の吸光度から得られた石
灰化レベルは対照群とマンニトール非添加のものをそれぞれ 1 とした場合の割合で表した。計測値は，4 回の測定結果の平均値 ± SDで示す。＊＊ p < 0.01

した。
11．統計解析
サンプル間の有意差検定は one-way ANOVA と Turkey
検定で行なった。すべての統計解析は，統計解析ソフト
JMP バ ー ジ ョ ン11.2（SAS Institute，Cary，NC，USA）
を使用した。データは，すべて 3 回あるいはそれ以上の実験の平均値 ± standard deviation（SD）で表し，p 値0.05
以下を統計学的有意とした。

21

高グルコース濃度による石灰化抑制

令和 5 年 6 月

養を行った。AR 染色の結果，マンニトール添加群の石灰1.48 ± 0.06（p < 0.01），22 mM グルコース添加群では1.88

化抑制は認められなかった（図 1 B）。

± 0.04（p < 0.01）となった（図 2 ）。

2 ．高濃度グルコースが細胞の生存レベルと骨芽細胞関連

ぼす影響について検討した。図 3 に示すように高濃度グル

高濃度グルコースが骨芽細胞関連因子の遺伝子発現に及因子の遺伝子発現に与える影響

コース添加によって RUNX2，type I collagen（COL1A1），

高濃度グルコースによる石灰化抑制が，細胞の生存レベ

osteocalcin（OCN）の発現は顕著な増加を示した。RUNX2

ル の 低 下 に よ っ て 生 じ た も の か を 明 ら か に す る た め，の発現は対照群を 1 とした場合，11 mM グルコース添加

WST8アッセイを行った。その結果，生存レベルは対照群

群で2.14 ± 0.09（p < 0.01），22 mM グルコース添加群でと比較して11 mM と22 mM グルコース添加群で増加を示

は2.38 ± 0.12（p < 0.01），COL1A1は11 mM グルコース

し，対照群を 1 とした場合，11 mM グルコース添加群で添加群で1.91 ± 0.13（p < 0.01），22 mM グルコース添加
群では13.4 ± 0.38（p < 0.01）となった。また，OCN の発現は対照群を 1 とした場合，11 mM のグルコース添加
群で2.38 ± 0.73（p < 0.01），22 mM のグルコース添加群
で は2.97 ± 0.36（p < 0.01） と い う 値 を 示 し た。 一 方，osteopontin（OPN）の発現は対照群を 1 とした場合，11mM グルコース添加群で1.20 ± 0.06（p < 0.01）を示した
が，22 mM グルコース添加群では有意な差は認められなかった（図 3 ）。

図 2 高濃度グルコースが細胞の生存レベルに与える影響
ROS17/2.8を 7 日間培養し，細胞の生存レベルを調べた。11 mM と
22 mM グルコースで培養した細胞の生存レベルは，5.5 mM グルコースを加えた細胞の生存レベルを 1 とした場合の割合で表した。計測
値は 4 回の測定結果の平均値 ± SD で示す。＊＊ p < 0.01

3 ．高濃度グルコースを加えるタイミングが石灰化抑制に与える影響
7 日間の培養期間中，どのタイミングで高濃度グルコー
スを加えると石灰化が抑制されるか検討した。細胞播種後，表 2 のスケジュールに従って 1 ，3 ，5 日目に異なる濃度のグルコースを含む培地に交換し，7 日間の培養を行った。グルコース濃度は通常濃度である5.5 mM から高濃度の22 mM へ変化させ，培地交換の日時の違いから表2 に示す 8 つの実験群（# 1 〜# 8 ）に分けた。その結果，
図 4 に示すように5.5 mM のグルコースで 7 日間培養した対照群の # 1 と比較して，5 日目，3 と 5 日目，1 ，3 ，5日目，および 1 と 5 日目に22 mM グルコースを含む培地に交換した実験群（# 2 ，# 3 ，# 4 および # 8 ）の石灰化
が 強 く 抑 制 さ れ た。 数 値 的 に は，# 1 を 1 と し た 場 合，
# 2 は0.24 ± 0.01（p < 0.01），# 3 は0.09 ± 0.003（p <0.01），# 4 は0.12 ± 0.003（p < 0.01），# 8 は0.25 ± 0.004（p < 0.01）となり，それぞれの群で減少が見られた。また，1 と 3 日目，および 3 日目に22 mM グルコースを含む培地に交換した実験群（# 6 と # 7 ）でも石灰化の抑制
表2
日＊

図3

 濃度グルコースが骨芽細胞関連因子の遺伝子発現に与える
高影響
ROS17/2.8を 7 日 間 培 養 し， 骨 芽 細 胞 関 連 因 子 で あ る RUNX2，COL1A1，OPN，OCN の遺伝子発現について調べた。11 mM と22mM グルコースを加えて培養した細胞のそれぞれの遺伝子発現レベ
ルは，5.5 mM グルコースで培養した細胞の発現レベルを 1 とした場合の割合で表した。計測値は 3 回の測定結果の平均値 ± SD で示す。
すべての測定値は B2M の発現量で補正した。＊ p < 0.05，＊＊ p < 0.01

培地交換のスケジュール
グルコース濃度（mM）

#1

#2

#3

#4

#5

#6

#7

#8

1

5.5

5.5

5.5

22

22

22

5.5

22

3

5.5

5.5

22

22

5.5

22

22

5.5

5

5.5

22

22

22

5.5

5.5

5.5

22

ROS17/2.8の播種後，1 ，3 ，5 日目に5.5 mM あるいは22 mM のグ
ルコースを含む培地に交換した。# 1 はすべての期間5.5 mM グル
コースを含む培地で培養した細胞（対照群），また # 2 〜# 8 は異なるタイミングで5.5 mM グルコースあるいは22 mM グルコースを含む培地に交換して培養した細胞（実験群）を示す。
＊

22

日大歯学

高濃度グルコースを加えるタイミングの違いが石灰化に及ぼす影響
表 2 のスケジールに従って通常濃度の5.5 mM グルコースを含む培地から22 mM の高濃度グルコースを含む培地に交換して ROS17/2.8の石灰化に及ぼす影響を調べた。AR 染色の写真（上）と AR 染色後の基質溶解液の吸光度から得られた石灰化レベルをグラフ（下）で示す。それぞれの石灰化レベルは # 1 の吸光度を 1 とした場合の割合で表した。計測値は，4 回の測定結果の平均値 ± SD で示す。
＊＊
p < 0.01

第 97 巻第 1 号

図4

図 5 グルコース濃度の違いが PPi と Pi レベルに与える影響
ROS17/2.8を 7 日間培養し，PPi と Pi レベルの違いを調べた。（A）
細胞内・外の PPi レベルと，（B）細胞内・外の Pi レベルの変化を示す。11 mM と22 mM グルコースを加えて培養した細胞の PPi と Pi
レベルは，5.5 mM グルコースで培養した細胞の PPi と Pi 濃度をそれぞれ 1 とした場合の割合で表した。計測値は 3 回の測定の平均値± SD で示す。＊ p < 0.05，＊＊ p < 0.01が認められた。数値的には # 1 を 1 とした場合，# 6 は0.56± 0.01（p < 0.01），# 7 は0.58 ± 0.01（p < 0.01）であった。これらの結果から，5 日目に高濃度グルコースを含む

コース添加群で1.27 ± 0.03（p < 0.01），22 mM グルコー培地に交換すれば，1 日目と 3 日目のグルコース濃度の違

ス添加群では1.65 ± 0.06（p < 0.01）という値を示した

いに関係なく，石灰化の抑制が起きることが示された。し（図 5 A）。

かし，5 日目に通常濃度のグルコースに交換した場合は，

一方，Pi の濃度は細胞内・外ともに高濃度グルコース

1 と 3 日目あるいは 3 日目の培地に高濃度グルコースが含添加群で減少した。対照群の細胞内 Pi は0.74 ± 0.02 μ

まれていれば石灰化は抑制されたが，# 2 ，# 3 ，# 4 ，mol/μgDNA，11 mM グルコース添加群で0.53 ± 0.01 μ

および # 8 に比べると軽度であった。

mol/μgDNA，22 mM グルコース添加群では0.23 ± 0.01 μ
mol/μgDNA となり，対照群を 1 として比較した場合，114 ．高濃度グルコースによる PPi と Pi の濃度変化

mM グルコース添加群で0.73 ± 0.02（p < 0.01），22 mM

骨芽細胞が産生する PPi は基質内でリン酸カルシウム

グルコース添加群では0.31 ± 0.01（p < 0.01）となった。

の形成を阻害し，石灰化を抑制する 。そこで，高濃度グ

また，細胞外 Pi 濃度については対照群が0.52 ± 0.02 μ

ルコースを含む培地で 7 日間培養した ROS17/2.8が産生すmol/μgDNA，11 mM グルコース添加群で0.42 ± 0.01 μ

る PPi と，PPi の分解によって生じる Pi の濃度変化につ

mol/μgDNA，22 mM グルコース添加群では0.27 ± 0.01 μ

いて検討した。

mol/μgDNA となり，対照群を 1 として比較した場合，1124）

細胞内 PPi 濃度は，対照群が22.9 ± 2.1 nmol/μgDNA，

mM グルコース添加群で0.83 ± 0.03（p < 0.01），22 mM

11 mM グルコース添加群で20.9 ± 0.9 nmol/μgDNA，22グルコース添加群では0.52 ± 0.03（p < 0.01）という値をmM グ ル コ ー ス 添 加 群 で は18.4 ± 2.1 nmol/μgDNA で示した（図 5 B）。

あった。対照群を 1 として比較した場合，11 mM グルコー
ス添加群では有意差はなかったが，22 mM グルコース添

5 ．PPNa が石灰化に与える影響

加群では0.80 ± 0.09（p < 0.05）となり，減少が認められ

DNA 量で補正前の PPi 濃度は対照群が72.9 ± 2.2 μM，た。 逆 に 細 胞 外 PPi は， 対 照 群 が16.2 ± 0.5 nmol/μ11 mM グルコース添加群で127.8 ± 2.6 μM，また22 mM

gDNA，11 mM グ ル コ ー ス 添 加 群 で20.7 ± 0.4 nmol/μ

グルコース添加群では245.7 ± 9.6 μM であったことから，

gDNA，22 mM グルコース添加群では26.7 ± 1.1 nmol/μ

通常の5.5 mM グルコースを含む培地で培養した対照群に

gDNA と 増 加 し， 対 照 群 を 1 と し た 場 合，11 mM グ ル

25 μM，50 μM，250 μM の PPNa を 添 加 し，PPNa か ら

23

高グルコース濃度による石灰化抑制

令和 5 年 6 月

図 7 グルコース濃度の違いが ATP レベルに与える影響
ROS17/2.8を 7 日間培養し，細胞内（A）と細胞外（B）の ATP レ
ベルを調べた。11 mM と22 mM グルコースを加えて培養した細胞の ATP レベルは，5.5 mM グルコースを加えて培養した細胞から得られた ATP 濃度を 1 とした場合の割合で表した。計測値は 3 回の測定結果の平均値 ± SD で示す。＊ p < 0.05，＊＊ p < 0.01

図 6 PPNa が石灰化に与える影響
5.5 mM グルコースを含む培地で ROS17/2.8を培養し，5 日目に25，
50，250 mM の PPNa を加えて，石灰化に与える影響について調べた。培養 7 日目の AR 染色の写真（上）と AR 染色後の溶解液の吸光度から得られたグラフを示す（下）。グラフは PPNa 非添加の細胞から得られた吸光度を 1 とした場合の割合で表した。計測値は 4 回の測定結果の平均値 ± SD で示す。＊＊ p < 0.01

考察

成熟骨芽細胞である ROS17/2.8の石灰化は，11 mM お
よび22 mM の高濃度グルコースで培養することによって強く抑制されることが明らかになった。この現象は，高濃解離した PPi が石灰化にいかなる影響を及ぼすか検討し度グルコースによって生じる浸透圧の変化や細胞死によるた。細胞播種後 5 日目に PPNa を投与し，7 日目に AR 染

ものでなかったことから，過度の糖負荷が骨に脆弱性を与色を行った結果，PPNa による石灰化の抑制がみられた。

える原因として成熟骨芽細胞の石灰化抑制が深く関わって数値的には PPNa 非添加群（0 μM）の吸光度を 1 としていると考えられる。一方，高濃度グルコースは ROS17/2.8

比較した場合，25 μM の PPNa 添加群で0.83 ± 0.01（p <における骨芽細胞関連因子の RUNX2，COL1A1，OCN

0.01），50 μM の PPNa 添 加 群 で0.57 ± 0.01（p < 0.01），の遺伝子発現を増加させた。COL1A1や OCN はリン酸カ

250 μM の PPNa 添加群では0.08 ± 0.01（p < 0.01）となっ

ルシウム沈着の足場となる基質の形成に必要なタンパクでた（図 6 ）。

あり石灰化を促進する26）。しかし，今回，明らかにした高濃度グルコースの石灰化抑制作用は，基質の形成よりも細6 ．高濃度グルコースが ATP 産生に与える影響

胞外 PPi 濃度の増加が大きく影響していると思われる。ま

生体内の PPi は主に ATP の分解によって合成されるた

た，高濃度グルコースによって軽度に発現が促進した

め25, 26），高濃度グルコースが細胞内・外の ATP 濃度にど

OPN は，動脈硬化症における血管内皮へのカルシウム塩のような影響を及ぼすか調べた。その結果，対照群の細胞の沈着を阻害する働きをもつことが知られている27）。した

内 ATP 濃度は73.6 ± 3.9 pmol/μgDNA，11 mM グルコーが っ て 高 濃 度 グ ル コ ー ス に よ っ て OPN や matrix Gla

ス添加群で102.5 ± 29.9 pmol/μgDNA，22 mM グルコー

protein28） などの石灰化抑制タンパクが増加した可能性もス添加群では112.3 ± 13.6 pmol/μgDNA となり，対照群

否定できない。さらに，高濃度グルコースによって発現がを 1 として比較した場合，11 mM グルコース添加群では増加した RUNX2は，骨芽細胞における基質タンパクの発有意差は見られなかったが，22 mM グルコース添加群で現に必要な転写因子である29）。実際に，COL1A1や OCN

1.53 ± 0.18（p < 0.05）となり，有意な増加がみられたの遺伝子プロモーター領域に RUNX2の結合配列が存在す（図 7 A）。一方，細胞外 ATP 濃度については，対照群がることが知られており30, 31），高濃度グルコースによって発56.8 ± 28.2 pmol/μgDNA，11 mM グルコース添加群で現が増加した RUNX2が間接的に COL1A1や OCN の発現

21.2 ± 14.2 pmol/μgDNA，22 mM グルコース添加群ではを促進させた可能性も考えられ，高濃度グルコースと骨芽13.6 ± 5.6 pmol/μgDNA と減少を示し，対照群を 1 とし

細胞関連因子との関係について今後検討する必要がある。

て比較した場合，11 mM グルコース添加群で0.74 ± 0.01

ROS17/2.8の培養系に高濃度グルコースを加えるタイミ（p < 0.01）22 mM グルコース添加では0.53 ± 0.03（p <ングの違いが，石灰化抑制にどのような影響を及ぼすかを0.01）という値を示した（図 7 B）。

調べた。その結果，石灰化を強く抑制するには培養期間 7日のうち 5 日目にグルコースが高濃度である必要があること，また 5 日目にグルコース濃度が通常濃度であれば，そ

24

日大歯学

第 97 巻第 1 号

れ以前に高濃度グルコースを加えても石灰化の抑制は軽度因子の RUNX2，COL1A1，OCN および OPN の遺伝であることが確認できた。グルコースによる骨芽細胞の石子発現を増加させた。

灰化のタイミングを調べた研究は MC3T3-E1を使用した

3 ．7 日間の培養期間中，5 日目に高濃度グルコースにす報告以外に見当たらない19）。MC3T3-E1では，培養初期にることで，石灰化を抑制した。

高濃度グルコースに保たれていれば石灰化は促進するが，4 ．高 濃度グルコースは細胞外 PPi 濃度の上昇と，細胞培養後期ではグルコースを加えるタイミングを変えても石内・外 Pi の濃度の低下を誘導した。

灰化の促進効果は認められない 。一方，MC3T3-E1の125 ．PPNa は5.5 mM グルコースで培養した細胞の石灰化

19）

日間の培養系にリン酸カルシウムと親和性をもつ合成ペプを抑制した。

チド（VYKHLNQISQSY）を加えた場合，6 日以前に添加

6 ．高濃度グルコースは細胞内 ATP の濃度を軽度に増加するよりも，全期間あるいは 7 日目以降に添加することでさせ，細胞外 ATP を減少させた。

強い石灰化の抑制効果が認められている 。ROS17/2.8と以上のことから，高濃度グルコースを加えて培養した

MC3T3-E1はそもそも細胞特性が大きく異なり，両者を比ROS17/2.8にみられた石灰化の抑制は，細胞外 PPi 濃度の較することはできないが，一般的に骨芽細胞から最終分化上昇に起因することが示唆された。

32）を遂げた成熟骨芽細胞は，細胞増殖が終了してから石灰化

本研究遂行にあたり，格別なるご指導とご鞭撻を賜りました本
吉満教授，藤原恭子准教授ならびに日本大学歯学部歯科矯正学講
座，解剖学第Ⅰ講座の皆様に深く感謝致します。
本論文に関して，開示すべき利益相反はありません。

基質を産生する33）。したがって，高濃度グルコースをはじめとする石灰化抑制因子は石灰化基質を産生する培養後期に作用させた方が，強い効果が維持できると考える。
成熟骨芽細胞による石灰化は，その成熟過程で細胞外に文分泌した基質小胞中にカルシウムイオンや細胞外 Pi が取り込まれ，リン酸カルシウム結晶が形成されることで始ま

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る34）。結晶形成に必要な Pi は，ALP が細胞内・外の PPiを分解することで供給され，リン酸カルシウムの結晶形成を促進する35, 36）。今回，高濃度グルコースによる ALP 活
性の低下は明らかにできなかったが，高濃度グルコースによって細胞外 PPi が増加したこと，また5.5 mM グルコースを加えた培養系へ PPNa を加えると石灰化が顕著に抑制されたことから，細胞外 PPi 濃度の上昇が高濃度のグルコースによる石灰化抑制の直接的な原因の一つであることが強く示唆された。細胞外 PPi は主に細胞内・外の ATPが分解されることによって供給される35, 36）。しかし，22mM グルコースは細胞内 ATP を軽度に増加させたが，11mM グルコースでは対照群と比較して有意な差は認められなかった。11 mM と22 mM グルコースは細胞内 ATPを減少させたことから考えると，ATP 以外の因子が細胞外 PPi 濃度を増加させた可能性がある。実際に高濃度グルコースの培養系で ROS17/2.8が合成する細胞内・外 ATP
濃度の計測値は，20～100 pmol/μgDNA と非常に低く，細胞内・外 PPi の計測値（10～20 nmol/μgDNA）から考えると ATP が PPi の直接的な供給源となることは極めて少ない。今後は，脂肪酸など PPi の供給源について検討する必要がある。

結献論

高濃度グルコースによる ROS17/2.8の石灰化抑制メカニ
ズムを検討し，以下の結論を得た。
1 ．11 mM と22 mM の高濃度グルコースは ROS17/2.8の石灰化を抑制した。
2 ．高濃度グルコースは細胞の生存レベルと骨芽細胞関連25

高グルコース濃度による石灰化抑制

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日大歯学 ，97（1）
，27-32，2023

原著

ヒト線維芽細胞 HeLa における interleukin-1 receptor type 2の decoy receptor
としての機能花

山真知子

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻応用口腔科学分野
日本大学歯学部病理学講座（指導：浅野正岳 教授，角田麻里子 助教）

要旨【目的】Interleukin（IL）-1 receptor（R）type 2（IL-1R2）は，リガンドである IL-1αや IL-1βの結合シグナルを伝達できない decoy receptor であるとされている。本研究では，IL-1R2がヒト子宮頸癌由来線維芽細胞である HeLa において，decoy receptor として機能するかについて検討した。
【 方 法 】HeLa ま た は HeLa の IL-1R1を 欠 失 し た CR-R1-4に，IL-1R1，IL-1R2ま た は precursor IL-1α（pIL-1α） をtransfection により強制的に発現させた。こうして作製した transfectant をヒトリコンビナント IL-1αないし IL-1βで刺激し，IL-8分泌増加の有無を ELISA によって確認した。また，HeLa における IL-1R2の強制発現による pIL-1αの分泌抑制についても ELISA により確認した。
【結果】HeLa に pIL-1αと IL-1R2を co-transfection したところ，pIL-1αの分泌は抑制された。HeLa への IL-1R2のtransfection は，ヒトリコンビナント IL-1αないし IL-1β刺激による IL-8分泌増加を抑制しなかった。CR-R1-4に IL-1R1と IL-1R2を co-transfection しても，ヒトリコンビナント IL-1β刺激による IL-8分泌増加は抑制されなかった。
【結論】線維芽細胞に強制発現させた IL-1R2は，細胞内においてのみ decoy receptor としての機能を発揮した。
キーワード：IL-1R2，IL-1R1，IL-1α，alarmin，IL-8

The decoy receptor function of interleukin-1 receptor type 2
in human fibroblastic cell line HeLa
Machiko Hanayama
Nihon University Graduate School of Dentistry
Major in Pathology
Department of Pathology, Nihon University School of Dentistry（Directors: Prof. Masatake Asano, Assist. Prof. Mariko Tsunoda）

Abstract【Purpose】Interleukin (IL)-1 receptor (R) type 2 (IL-1R2) is known as a decoy receptor and it can not transduce
the IL-1α/IL-1β binding signal. In the present study, IL-1R2 was introduced to HeLa by transfection and tested
whether it can function as a decoy receptor.
【Methods】HeLa-based IL-1R1 knockout cell line, CR-R1-4, was established. IL-1R1, IL-1R2 or precursor IL-1α (pIL-1α)
was forced expressed in HeLa or CR-R1-4 by transfection. Based on the fact that HeLa can augment IL-8 secretion
with IL-1α/IL-1β stimulation, the cells were stimulated with recombinant human (rh) IL-1α or IL-1β. The
responsiveness was evaluated by measuring the production of IL-8 by ELISA. The inhibitory effect of IL-1R2 on
pIL-1α secretion was also evaluated with ELISA.
【Results】Co-transfection of both pIL-1α and IL-1R2 to HeLa resulted in the reduction of pIL-1α secretion. The
forced expression of IL-1R2 in HeLa did not lose the responsiveness to rhIL-1β. Co-transfection of both IL-1R1 andIL-1R2 to CR-R1-4 still maintained the reactivity against rhIL-1β.
【Conclusion】In fibroblasts, forced expression of IL-1R2 exerts only intracellularly its function as a decoy receptor.
Keywords: IL-1R2，IL-1R1，IL-1α，alarmin，IL-8（受付：令和 5 年 1 月27日）
責任著者連絡先：花山真知子
日本大学歯学部病理学講座〒101-8310 東京都千代田区神田駿河台 1 ‒ 8 ‒13

TEL：03-3219-8124
FAX：03-3219-8340
E-mail：hanayama.machiko@nihon-u.ac.jp

27

日大歯学

緒

第 97 巻第 1 号

言Interleukin（IL）-1αの cDNA クローニングがなされて以来 1 ），IL-1 family に属する分子の同定が進み，現在では11
種類により構成されている 2 ）。類縁分子である IL-1βとIL-1αとの相同性は，アミノ酸レベルで僅かに27% である 3 ）。
しかし両者は，①共通のレセプターを介してシグナル伝達を行い，②細胞内で前駆体として産生されたのち，酵素的な処理を受けて成熟型分子として細胞外に分泌され，③
leader peptide を持たないため小胞体 - ゴルジ装置を経由せずに分泌されるなどの共通点を有している 4 , 5 ）。IL-1αは細胞が障害を受けた際に分泌される分子で，これらはalarmin と総称され 6 ），周囲の細胞・組織に，自身の置かれた危機的状況を知らしめる分子とされている。
precursor IL-1α（pIL-1α）は質量約31 kDa で，Ca2+ 依
存性タンパク質分解酵素であるカルパインなどにより分子のほぼ中央部分を切断され，N 末端側の propiece IL-1α（ppIL-1α）と C 末端側の mature IL-1α（mIL-1α）に分離
する 7 , 8 ）。こうして産生された ppIL-1αと pIL-1αは分子内

図1実験に用いた発現プラスミドの構造に nuclear localizing sequence を有しており，核内に認められる 4 ）。一方，細胞外に分泌された mIL-1αと pIL-1αは，癌細胞 HSC3（ヒューマンサイエンス研究資源バンク）は，

特異的なレセプターである IL-1 receptor（R）type I（IL-

10% FCS-Rosewell Park Memorial Institute（Gibco）培地

1R1）に結合し，さらに IL-1R3と呼ばれるアクセサリー受により培養した。細胞の刺激に用いたヒトリコンビナント

2）

容体との複合体を形成する 。IL-1R1と IL-1R3はシグナル

IL-1α（rhIL-1α）およびヒトリコンビナント IL-1β（rhIL-1β）

伝達に必須の toll-IL-1 receptor（TIR）ドメインを細胞質

は，Pepro Tech（Cranbury，NJ，USA）から購入した。

内に有しており，これによってシグナルを伝達する。これに対して IL-1R2は TIR ドメインを欠いており，シグナル2 ．発現 plasmid の構築と transfectionを伝達できないことから decoy receptor と呼ばれている 9 ）。

IL-1R1または IL-1R2の full length cDNA を含有するベク

本論文の著者は，これまでにヒト子宮頸癌由来線維芽細胞ターである pDNR-Dual-IL-1R1と pSPORT-IL-1R2は，理化（HeLa）の IL-1R1を欠失した細胞である CR-R1-4の樹立に学研究所バイオリソース研究センター（つくば）より購入

成功しており，この細胞が IL-1αおよび IL-1βのシグナルした。このうち，IL-1R1については発現ベクターpMKIT-を伝達しないことを報告した10）。そこで本研究では，HeLa

neo vector の EcoRI site に Gibson assembly kit（Newにおける IL-1R2の強制発現，または CR-R1-4における IL-

England BioLabs，Hitchin，UK）を用いて subcloning し

1R1と IL-1R2の強制発現が，IL-1R1へのリガンド結合後のた（ 図 1 ）。N 末 端 に HiBiT-tag，C 末 端 に histidine-tag

シグナルを遮断し得るかという点について検討した。

を付与した pIL-1α（HiBiT/His-pIL-1α）は Sata ら11）によって作製されたベクターを鋳型として Quick-change site-

材料および方法

directed mutagenesis kit（Agilent Technologies，Santa

1 ．細胞培養と試薬

Clara，CA，USA）により作製した（図 1 ）。

本 研 究 に は， ヒ ト 子 宮 頸 癌 由 来 線 維 芽 細 胞 HeLa

Transfection は，Lipofectamine 3000（Thermo Fisher（ヒューマンサイエンス研究資源バンク，大阪）およびScientific，Waltham，MA，USA）を用いて行った。Plasmid

HeLa の IL-1R1を欠失した細胞である CR-R1-4を用いた10）。

を OPTI-MEM（25 μｌ）に溶解し，3000 Reagent（0.75 μｌ）

培養は Dulbeccoʼs Modified Eagle Medium（DMEM，と混和した。一方，Lipofectamine 3000（0.75 μｌ）を OPTI-

Gibco，Waltham，MA，USA）に10% ウシ胎児血清（FCS）

MEM（25 μｌ）に溶解した。両溶液を混合し，室温で15分

および 1 % ペニシリン ‐ ストレプトマイシン（Sigma-

間反応させて培養液に添加し，細胞と共に18時間培養しAldrich，St．Louis，MO，USA）を添加したものを用いた。このようにして作製した細胞を transfectant とした。

て，37℃，5% CO2存在下で行った。それぞれの細胞を24well plate（イワキ，榛原）に 5 × 104 cells/well となるよ

3 ．ELISA による IL-1αおよび IL-8の定量

う播種し，transfection 実験に用いた。ヒト口腔扁平上皮

Transfectant への rhIL-1αまたは rhIL-1βによる刺激は，

28

HeLa における IL-1R2の機能
表1

令和 5 年 6 月

各 Transfectantの培養とELISAによる分泌タンパクの測定の手順

図3B
CR-R1-4に18時間transfection（pcDNAまたはIL-1R2）↓
rhIL-1β（10，100，1,000 pg/ml）存在下または非存在下で 6 時間培養↓
培養上清中のIL-8分泌量をELISAにより測定

図 2 HSC3および CR-R1-4における IL-1R2の発現
HSC3および CR-R1-4の細胞溶解液中の IL-1R2（56 kDa）の発現をWB で確認した。内部コントロールとして GAPDH（37 kDa）の検出を行った。

図4
HeLaに18時間transfection（HiBiT / His-pIL-1αとpcDNAまたはIL-1R2）↓
培養液交換後さらに18時間培養↓
培養液中のpIL-1αをELISAにより測定
図5
HeLaに18時間transfection（pcDNAまたはIL-1R2）↓
rhIL-1αまたはrhIL-1β（それぞれ100 pg/ml）存在下または非存在下で 6 時
間培養↓
培養上清中のIL-8分泌量をELISAにより測定
図6
CR-R1-4に18時間transfection（IL-1R1単独，IL-1R2単独またはIL-1R1とIL-1R2を共に）↓
rhIL-1β（100 pg/ml）存在下または非存在下で 6 時間培養↓
培養上清中のIL-8分泌量をELISAにより測定

図3

HeLaと IL-1R1を強制発現させたCR-R1-4のrhIL-1βに対する反応性
A．HeLaをrhIL-1β（100 pg/ml）存在下または非存在下で 6 時間培
養後，培養上清中のIL-8分泌量をELISAにより測定した。
n = 7，＊ p ＜ 0.05
B．CR-R1-4にIL-1R1（灰色バー）またはコントロールとしてpcDNA（ 白 色 バ ー） をtransfectionし た。 そ の 後， 培 養 液 を 交 換 し，transfectantをrhIL-1β（10，100，1,000 pg/ml）存在下または非存在下で 6 時間培養した。培養後の培養上清中へのIL-8分泌量を
ELISAにより測定した。n = 5，＊ p ＜ 0.05

表 1 に示す条件で行った。IL-1αおよび IL-8の測定は，培養後，培養上清を回収し，遠心分離後（16,900 × g，1 分間），上清を新しいチューブに回収し，これをサンプルとして ELISA kit（Quantikine，R&D SYSTEMS，Minneapolis，
MN，USA）を用いて行った。
4 ．Western blot（WB）法HSC3お よ び CR-R1-4を phosphate buffer saline（PBS）
で 洗 浄 後， 細 胞 溶 解 液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150
mM NaCl，0.5% Triton X-100）によって処理し，遠心後サンプルを回収した。総タンパク質量を測定し，WB を行った。すなわち，両サンプル共に SDS sample buffer に溶解
し，95℃で 5 分間反応させ，10% sodium dodecyl sulfate-

図 4 IL-1R2によるpIL-1αの分泌抑制
HeLa に pcDNA ま た は IL-1R2 を，HiBiT/His-pIL-1αと 共 に cotransfectionした。培養液を交換した後，それぞれのtransfectantをさら に18時 間 培 養 し た。 培 養 後 の 上 清 中 のHiBiT/His-pIL-1α濃 度 を
ELISAにより測定した。n = 5，＊ p ＜ 0.05

polyacrylamide gel 電 気 泳 動 し た。 泳 動 後 Immobilon
Transfer Membrane（Merck，Darmstadt，Germany）に転写し，1 % BSA-PBS でブロッキングした。1 次抗体としては，マウス抗ヒト IL-1R2抗体（× 1,000; Santa Cruz，
Dallas，TX，USA）およびマウス抗ヒト GAPDH 抗体（×10,000，Santa Cruz）を，2 次抗体としては，horseradish

5 ．統計学的解析

peroxidase 標識ヤギ抗マウス IgG 抗体（× 5,000，Jackson

統計解析は，正規性を Shapiro-Wilk 検定，等分散性を

Immuno Research，West Grove，PA，USA）を用いた。

Levene 検定で確認した。その後，図 4 および図 6 につい

ECL Prime Western Blotting Detection Reagent（Cytiva，ては Studentʼs t-test を用い，図 3 および図 5 については，

Marlborough，MA，USA）によって化学発光させて検出

一元配置分散分析後の Tukey の多重比較を用いた。結果

し た バ ン ド を，iBright 1500（Thermo Fisher Scientific）

は，平均値 ± 標準偏差で表した，0.05未満の p 値は統計を用いて画像として取り込んだ。

的に有意であるとみなした。

29

日大歯学

図5

IL-1R2を強制発現させたHeLaのrhIL-1αおよびrhIL-1β対する反応性
HeLaにコントロールとしてpcDNA（白色バー）またはIL-1R2（黒色バー）をtransfectionした。それぞれのtransfectantは，rhIL-1α（100pg/ml），rhIL-1β（100 pg/ml）の存在下または非存在下（-）で 6 時間培養した。刺激後の培養上清中のIL-8分泌量をELISAにより測定した。n = 5，＊ p ＜ 0.05

結第 97 巻第 1 号

図6I L-1R1またはIL-1R2を強制発現させたCR-R1-4のrhIL-1βに対する反応性
CR-R1-4にIL-1R1単独（白色バー），IL-1R2単独（灰色バー）または
IL-1R1とIL-1R2の両者（黒色バー）をtransfectionした。その後，培養液を交換し，100 pg/ml rIL-1β存在下または非存在下で 6 時間培養した。培養後の上清中へのIL-8分泌量をELISAにより測定した。
n = 5，＊ p ＜ 0.05

この結果から，IL-1R2は HiBiT/His-pIL-1αの分泌に対して

果

抑制的に作用することが明らかとなった。そこで，IL-1R2

1 ．CR-R1-4における IL-1R2の発現を強制発現した HeLa における rhIL-1αまたは rhIL-1βのCR-R1-4における IL-1R2の発現について WB によって検刺 激 に 対 す る 反 応 性 を 確 認 し た。 そ の 結 果，IL-1R2

索した。その結果，図 2 に示したように，ポジティブコン

transfectant における IL-8の分泌量は，100 pg/ml rhIL-1α

トロールとして用いた HSC3で確認された56 kDa のバン

存在下では1.4 ± 0.1 ng/ml，100 pg/ml rhIL-1β存在下でドは，CR-R1-4においては検出できなかった。

は2.1 ± 0.1 ng/ml であり，pcDNA transfectant と同様にIL-8の分泌が増強された（図 5 ）。

2 ．CR-R1-4の rhIL-1βに対する反応性
HeLa は，rhIL-1β刺激に反応して IL-8産生を増強する

4 ．IL-1R2による rhIL-1β反応性の阻害

ことが明らかとなっている 。図 3 A に示した通り，HeLa

CR-R1-4では IL-1R2が発現していなかった（図 2 ）。一において100 pg/ml rhIL-1β存在下では1.8 ± 73.3 ng/ml

方，CR-R1-4への IL-1R1の強制発現は，rhIL-1βに対するの IL-8分泌が認められ，rhIL-1β非存在下の0.3 ± 0.1 ng/

反応性を回復したことから（図 3 ），CR-R1-4における IL-

ml と比較して有意な分泌増加が確認された。そこで，CR-

1R1および IL-1R2の共発現が，IL-1βに対する反応性に対R1-4に IL-1R1発現ベクターを transfection した後，rhIL-1

してどのような影響を及ぼすか検討した。その結果，IL-βに 対 す る 反 応 性 の 回 復 に つ い て 検 討 し た。IL-1R1

1R1単独の transfection では rhIL-1β非存在下に比べて100transfectant における IL-8分泌量は，rhIL-1β非存在下でpg/ml rhIL-1β存在下で443.8 ± 80.8 pg/ml と有意に IL-8

は129.2 ± 5.3 pg/ml であったが，10 pg/ml，100 pg/mlの分泌が増強された。一方，IL-1R2単独の transfection で

お よ び1,000 pg/ml の rhIL-1β存 在 下 で は， そ れ ぞ れ，は，rhIL-1β刺激に対して全く反応を示さなかった。さら490.0 ± 31.5 pg/ml，429.6 ± 9.7 pg/ml および442.6 ± 6.9に，両分子の共発現では100 pg/ml rhIL-1β存在下で492.3

pg/ml と有意に増加し，rhIL-1β刺激に対する反応性が認± 82.8 pg/ml と，非存在下に比べて有意に IL-8分泌が増められた。また，コントロールとして IL-1R1の配列を含有

強され，これは IL-1R1単独の transfection と同程度の増強

し な い pcDNA vector を transfection し た CR-R1-4で は，であった（図 6 ）。

12）

rhIL-1β刺激に対する反応は認められなかった（図 3 B）。

考

3 ．HeLa における IL-1R2の強制発現の効果

察

IL-1αは，生体内で ubiquitous に発現しているとされる

IL-1R2の細胞内での decoy receptor としての機能を確が，細胞死などに際して初めて細胞外に分泌される 5 ）。こ

認するため，HeLa に HiBiT/His-pIL-1αと IL-1R2を強制発のメカニズムについては以下の様に考えられている。すな

現し，HiBiT/His-pIL-1αの細胞外への分泌に対する影響を

わち，IL-1R2が pIL-1αと細胞内で複合体を形成しており，確認した。その結果，図 4 に示す通り，HiBiT/His-pIL-1α

グラム陰性菌の菌体外成分であるリポポリサッカライドな

単 独 の transfectant か ら 分 泌 さ れ た HiBiT/His-pIL-1αをどの刺激により細胞内の caspase が活性化されると，IL-100% としたときに，HiBiT/His-pIL-1αと IL-1R2の co-

1R2が分解される。その結果，この複合体が解消され，

transfectant では53.3 ± 19.6% と有意に分泌が低下した。

pIL-1αが細胞外に分泌されるというものである13）。そこで

30

HeLa における IL-1R2の機能

令和 5 年 6 月

本研究では，IL-1R2を有しない HeLa に HiBiT/His-pIL-1αで刺激した。結果は，HeLa と同様で，IL-1R2による IL-8と IL-1R2を co-transfection したところ，HiBiT/His-pIL-1αの分泌抑制効果は全く見られなかった。Shimizu ら17）は，の分泌が抑制された。このことは，HeLa においても IL-

コラーゲン誘導性関節炎を発症させた IL-1R2 knockout

1R2がこれまで報告されてきた細胞内における機能を発揮

mouse においては，IL-1に対する反応性の増強がマクロしていることを示すものであり ，HeLa 内で HiBiT/His-

ファージにのみに認められたことから，IL-1R2の decoy

pIL-1αと IL-1R2が結合した結果と考えられた。しかし，

receptor としての機能は，細胞種特異的であると結論しこの結合によって HiBiT/His-pIL-1αの分泌が抑制されるている。線維芽細胞において IL-1R2がシグナル伝達を抑メカニズムは明らかになっていない。IL-1R2は IL-1R1に制するという報告18）もあるが，ヒトの細胞においてはこの次ぐ第 2 のレセプターとして発見された分子であり14），細現象は確認されていない。本研究では，HeLa における胞外領域でリガンドと結合すると考えられている。しかIL-1R2の強制発現は，rhIL-1αおよび rhIL-1βに対する反応

し，細胞内での複合体形成によって HiBiT/His-pIL-1αが性を抑制することは無かったが，HiBiT/His-pIL-1αの分泌

細胞外に分泌されなくなるのであれば，細胞内領域またはは抑制した。このことは，HeLa において IL-1R2は，細胞細胞膜貫通領域が HiBiT/His-pIL-1αの分泌に対して抑制

質内での機能は維持しているものの，細胞膜上での機能は的な機能を有する可能性が考えられ，この点についてはさ

失われていることを示すものであった。HeLa におけるらなる検討が必要である。

IL-1R2の部分的な機能喪失がいかなる機序によるのかとい13）

一 方，IL-1R2の 細 胞 外 領 域 の 細 胞 膜 近 傍 は，matrix

う点については極めて重要であり，今後さらなる検討が必

metalloproteinase である a disintegrin and metalloprotease

要と考えられた。

domain 17により切断され ，細胞外領域のみが細胞外に15）結移行することにより，炎症に際して分泌された mIL-1αに論

結合し，その活性を低減させるとされている。本研究にお本研究では，IL-1R2の decoy receptor としての機能が，いても，HiBiT/His-pIL-1α-I と IL-1R2の複合体が細胞外

HeLa と HeLa の IL-1R1を欠失させた CR-R1-4においてもで形成され，ELISA による検出に影響した可能性が考え維持されているかという点について検討した。その結果，られることから，Hela の細胞外における両者の複合体の以下の結論を得た。

形成についてはさらに追究すべきものと考えている。

1 ．CR-R1-4においては，IL-1R2発現は確認できなかった。

IL-1R2は TIR- ドメインを欠く decoy receptor とされて

2 ．CR-R1-4においては，rhIL-1βに対する反応性は消失しおり，細胞質内領域はわずか29アミノ酸により構成されてていた。

いる 。TIR- ドメインとは，マクロファージや樹状細胞

3 ．HeLa における IL-1R2強制発現は，pIL-1αの分泌を阻

14）などの細胞表面に発現し，病原体関連分子パターンを認識害した。

する toll-like receptor（TLR）と IL-1R1の細胞質内に共通

4 ．HeLa における IL-1R2の強制発現は，rhIL-1αと rhIL-1して見られる配列である16）。TIR- ドメインを有するレセプβに対する反応を阻害しなかった。

ター同士が会合することによって，myeloid differentiation

5 ．CR-R1-4における IL-1R1の強制発現は，rhIL-1βに対factor 88や Toll/IL-1R domain-containing adaptor inducing

する反応性を回復した。

IFN-βなどのアダプターを誘導し，これによって転写因子

6 ．CR-R1-4における IL-1R1と L-1R2の強制発現は，rhIL-1

である nuclear factor κB，interferon regulatory factor なβに対する反応を阻害しなかった。

どを活性化させシグナルを伝達する 。

以上の結果から，HeLa および CR-R1-4に強制発現させ

16）IL-1αお よ び IL-1βの IL-1R1へ の 結 合 は，IL-1R3を IL-

た IL-1R2は，細胞内においてのみ decoy receptor として

1R1近傍に誘導し，両者の TIR ドメインが上記のメカニズ

機能することが明らかとなった。

ムでシグナルを伝達する。HeLa に IL-1βを作用させると本研究の推進にあたり，病理学講座

浅野正岳教授，角IL-8産生が増強されることが明らかとなっており12），この

田麻里子助教および講座員の皆様にご指導頂いた。ここにことは HeLa に IL-1R3が存在することを意味している。そ深甚なる感謝の意を表する。本論文に関して，開示すべき

こで，HeLa に IL-1R2を強制発現させることにより，rhIL-1

利益相反はない。

αまたは rhIL-1β刺激に対する反応性が低減するのではな

文

いかと考えた。しかし，IL-1R2を発現させた transfectant

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における IL-1R1の強制発現が，rhIL-1αおよび rhIL-1βに対する反応性を回復させた10）ことから，この細胞におけるIL-1R1および IL-1R2の co-transfectant を作製し，rhIL-1β

31

日大歯学

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inhibiting IL-1 signal on macrophages. J Immunol 194, 31563168.
18）Re F, Sironi M, Muzio M, Matteucci C, Introna M, Orlando S,
Penton-Rol G, Dower SK, Sims JE, Colotta F, Mantovani A(1996) Inhibition of interleukin-1 responsiveness by type II
receptor gene transfer: a surface “receptor” with antiinterleukin-1 function. J Exp Med 183, 1841-1850.

32

日大歯学 ，97
（1）
，33-41，2023

原著

MeCP2変異ヒト歯髄細胞および MeCP2欠損マウス
迷走神経背側運動核ニューロンについての免疫組織化学的研究
星まなみ

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻

口腔健康科学分野

日本大学歯学部小児歯科学講座（指導：白川哲夫 教授，菊入崇 准教授）

要旨【目的】メチル化 CpG 結合タンパク質 2（MeCP2）をコードする遺伝子 MECP2の変異は，重度の発達異常を呈す
るレット症候群（RTT）を引き起こす。本研究では MECP2の 1 塩基変異により発症した RTT 女児の永久歯から幹細胞を分離し特性の解析を試みた。また，MeCP2欠損が延髄の機能にどのような影響を及ぼしているかを検討するた
めに，Mecp2欠損（Mecp2-/y）マウスを用いて，迷走神経背側運動核（DMV）におけるチロシンヒドロキシラーゼ（TH）およびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）免疫陽性（IR）ニューロンの数と分布を調べた。
【方法】10代の RTT 女児および健常女児の抜去歯から歯髄組織を採取し実験に供した。歯髄細胞での未分化マー
カーの発現について RT-PCR にて確認するとともに，MeCP2および幹細胞マーカーの発現と細胞内の局在を免疫蛍光染色で調べた。続いて，Mecp2-/y および野生型（Wt）マウスの DMV での TH-IR および ChAT-IR ニューロンの分
布を DAB 染色あるいは免疫蛍光二重染色で検討した。
【結果】健常女児由来細胞（CONT）では MeCP2が核内に局在していたのに対し，RTT 女児由来細胞（RETT）では核とともに細胞質にも局在を認めた。Ki-67発現はともに核内に限局していたが，陽性率は CONT に比べ RETT で低かった。STRO-1，SSEA3の発現は両細胞で差異はなかった。DMV における TH-IR ニューロン数は Wt マウスに比べ Mecp2-/y マウスで有意に多かったが，ChAT-IR ニューロン数には違いがなかった。また Mecp2-/y マウスについて TH および ChAT が共発現するニューロンが多く観察された。
【結論】RETT では変異 MECP2の転写が活性化している細胞が一定の割合で含まれていると考えられ，Ki-67の陽性率が CONT より有意に低かったことから MECP2の変異が RETT の増殖能を低下させている可能性が考えられた。
また DMV における TH-IR ニューロン数，ならびに TH と ChAT の共発現に Mecp2-/y と Wt マウスで違いがみられたことから，MeCP2の欠損が DMV ニューロンの活動を変化させ，消化管運動を調節している副交感神経の働きに影響を及ぼしていることが示唆された。
キーワード：メチル化 CpG 結合タンパク質 2，レット症候群，歯髄幹細胞，迷走神経背側運動核

Immunohistochemical studies of MeCP2-mutated human dental pulp cells
and the dorsal motor nucleus of the vagus neurons in Mecp2-deficient mice
Manami Hoshi
Nihon University Graduate School of Dentistry, Major in Oral Health Sciences
Department of Pediatric Dentistry, Nihon University School of Dentistry（Directors：Prof. Tetsuo Shirakawa, Assoc. Prof. Takashi Kikuiri）

Abstract【Purpose】Mutations in MECP2, the gene encoding methyl-CpG-binding protein 2 (MeCP2), cause Rett syndrome(RTT) that presents severe developmental abnormalities. This study attempted to isolate and characterize dental
pulp stem cells from a RTT girl affected with a single-nucleotide mutation in MECP2. In addition, to investigate
how MeCP2 deficiency affects visceral motor functions, the expression of tyrosine hydroxylase (TH) and choline
acetyltransferase (ChAT)-immunoreactive (IR) neurons in the dorsal motor nucleus of the vagus (DMV) was
examined in Mecp2-deficient (Mecp2-/y) mice.
【Methods】Pulp cells were obtained from extracted permanent teeth of a RTT girl and a healthy girl. The
expression of undifferentiated cell markers was examined by RT-PCR, and the expression and localization of MeCP2
and stem cell markers were investigated by immunofluorescence staining. Subsequently, the number and（受付：令和 5 年 1 月30日）
責任著者連絡先：星 まなみ
日本大学歯学部小児歯科学講座〒101-8310 東京都千代田区神田駿河台 1 ‒ 8 ‒13

TEL：03-3219-8106
FAX：03-3219-8353
E-mail： dema19026@g.nihon-u.ac.jp

33

日大歯学

第 97 巻第 1 号

distribution of TH-IR and ChAT-IR neurons were examined in DMV of Mecp2-/y and wild-type (Wt) mice by DAB
staining and immunofluorescence double staining.
【Results】In the pulp cells derived from the healthy girl (CONT), MeCP2 was localized in the nucleus. However,
MeCP2 was localized in both nucleus and cytoplasm of the pulp cells derived from the RTT girl (RETT). Ki-67 was
expressed in the nucleus in both CONT and RETT, but the positive rate of Ki-67 was significantly lower in RETT.
No difference was seen in the expression of STRO-1 and SSEA3 between CONT and RETT. The number of TH-IR
neurons in DMV was significantly larger in Mecp2-/y mice than that in Wt mice, while no difference was seen in
the number of ChAT-IR neurons between Mecp2-/y and Wt mice. In addition, neurons co-expressing TH and ChAT
were observed abundantly in Mecp2-/y mice but not in Wt mice.
【Conclusion】In RETT, mutated MECP2 was transcriptionally activated at a certain rate, which might havelowered the positive rate of Ki-67 and reduced proliferation ability of the cells. The increase in the number of TH-IR
neurons and co-expression of TH and ChAT in DMV of Mecp2-/y suggest that MeCP2 deficiency may alter
neuronal activities in DMV and affect the parasympathetic control of visceral functions.
Keywords: methyl-CpG-binding protein 2, Rett syndrome, dental pulp stem cells, dorsal motor nucleus of the vagus

緒スは，生後早期に RTT 患者に類似した神経症状を呈し，

言

野生型マウスに比べて著しく寿命が短く，生後 8 〜12週でX 染色体上にあってメチル化 CpG 結合タンパク質 2

死亡する 8 , 9 ）。MeCP2は脳由来神経栄養因子（BDNF）や（MeCP2）をコードする遺伝子 MECP2の変異は，重度のγ−アミノ酪酸（GABA）など様々な遺伝子の転写を調節

発達異常を呈するレット症候群（RTT）を引き起こすこ

しており，Mecp2の欠損によりそれらの発現が変化することが知られている 1 , 2 ）。RTT は約 1 万人に 1 人の割合で主とから10, 11），Mecp2が欠損した雄モデルマウス（Mecp2-/に女児に発症し，1 歳 6 か月以降で精神発達遅滞 3 ）のほか

y）は RTT にみられる病態の原因を探索するうえで有用

様々な全身的症状が発現する。RTT の主要な診断基準とである。

して，合目的的な手の機能の喪失，音声言語コミュニケー

Mecp2-/y の脳幹では，孤束核ならびに青斑核でのノルションの喪失，失調性歩行，手の常同運動が挙げられておアドレナリン神経伝達の異常が報告されている12, 13）。しかり 4 ），そのほか消化管運動異常や便秘 5 ），歯科領域では咀

し，MeCP2の欠損が副交感神経を経由して内臓の運動を

嚼機能の低下および歯列不正が高率で認められる 4 ）。また

制御している迷走神経背側運動核（DMV）でのアセチル

著明なブラキシズムを示す場合もある 。さらに MeCP2

コリン神経系14）にどのように影響を与えているのかは明らの異常は RTT 以外の中枢神経系の疾患においても認めらかにされていない。そこで本研究では，RTT 女児歯髄由れることがあり，MeCP2の異常が複数の疾患の発症に重来細胞の解析に加え，実験Ⅱとして，8 週齢の Mecp2-/y4）

要な役割を果たしていることが示唆されている 。

マウスについて，DMV でのチロシンヒドロキシラーゼ

3）

RTT 患者から試料を採取して実施する研究では，人を（TH）免疫陽性（IR）ニューロンおよびコリンアセチル

対象とする医学系研究に必要な倫理的要件を満たすことがトランスフェラーゼ（ChAT）免疫陽性（IR）ニューロン

必須であり，また試料採取に伴う被験者への侵襲を最小限の数と分布を調べ，野生型マウスと Mecp2-/y マウスで比に留める必要がある。歯科領域において日常的な医療行為較した。また DMV ニューロンでの TH と ChAT の共存として抜歯処置が行われているが，医療上の必要性に基づの有無についても調べた。

き抜去された歯を試料とする研究は，今日では国内外で広材料および方法

く行われている。特に歯髄組織については，幹細胞を含む
多種の細胞が存在することから研究材料として有用性が高1 ．実験Ⅰい1 ）対象者。抜去歯から得られた歯髄の細胞を活用する研究は，

6,7）

RTT の病態を細胞レベルで解明するうえでも大きな意義

ヒト歯髄由来細胞を用いる実験は，日本大学歯学部倫理があるが，現在のところ，RTT 患者の永久歯の歯髄を用委員会の承認を得て実施した（倫許 EP18D011）。歯髄組

いた研究は見当たらない。そこで本研究では，実験Ⅰとし織の供与について同意の得られた10代の RTT 女児 1 名，て，MECP2の 1 塩基変異により発症した RTT 女児の永および同年代の健常女児 1 名より抜去された永久歯計 2 歯

久歯から幹細胞を分離し，特性の解析を試みた。

を実験に用いた。

RTT の主要な原因遺伝子が MECP2であることが報告
2 ）歯髄採取された後，MeCP2をコードする遺伝子 Mecp2を欠失させたモデルマウスが作られ，ヒトと同様にモデルマウスにお対象歯を通法に従って抜去した後，根尖部を滅菌バーでいても神経発達障害が引き起こされることが報告されてい1 〜 2 mm 削合し，根管治療用ファイルを歯髄腔に挿入しる 8 , 9 ）。特に MeCP2を完全に欠損している雄モデルマウて歯髄組織を採取した。滅菌シャーレ上で歯髄組織をメス

34

MeCP2が変異したヒト歯髄細胞とマウス神経細胞についての免疫組織学的研究にて 3 mm 程に細切し，組織片を培養皿に静置し培養を

表1

行った。
3 ）細胞培養RTT 女 児 由 来 歯 髄 組 織 に つ い て，20% fetal bovine
serum（FBS, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,USA），1 % penicillin streptomycin（Thermo Fisher
Scientific）を含むα-Minimum Essential Medium（α-MEM，
富士フィルム和光純薬，大阪）を用いて培養を行い，37℃，
5 % CO2にてインキュベーター内で静置培養し，歯髄組織
片から細胞をアウトグロースさせた。アウトグロースした細胞を Cellartis MSC Xeno-Free Basal Medium（タカラ

RT-PCRで用いたプライマーおよび増幅産物のサイズ

Primers Sequences

Product size
（bp）

c-Myc

F 5’-TCC TGG GAA GGG AGA TCC G-3’
R 5’-ACG TTG AGG GGC ATC GTC-3’

328

Sox2

F 5’-GGA AAT GGG AGG GGT GCA AA-3’
R 5’-TTG CGT GAG TGT GGA TGG G-3’

150

Nanog

F 5’-TTG GAA GCT GCT GGG GAA G-3’
R 5’-GAT GGG AGG AGG GGA GAG GA-3’

193

Oct4

F 5’-GGA GGG GAG GAG CTA GGG-3’
R 5’-CTT CCC TCC AAC CAG TTG CC-3’

137

Klf4

F 5’-ATC GTG GCC CCG GAA AAG-3’
R 5’-TGT AGT GCT TTC TGG CTG GG-3’390β-actinF 5’-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3’
R 5’-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA A-3’

186

バイオ，滋賀）にて培養し，実験に供した。健常女児由来

表2

歯髄組織については，RTT 女児由来歯髄組織と同様の手

令和 5 年 6 月

免疫組織化学染色に用いた抗体

抗体

免疫種 メーカー名

＊

MeCP2

RabbitNovus Biological

1：200

20% fetal bovine serum を含むα-MEM（富士フィルム和Ki-67

Rabbit

Abcam

1：200

光純薬）を用いて培養を行った。

SSEA3

Mouse

IBL

1：100

STRO-1

Mouse

Novus Biological

1：100

4 ）歯髄細胞での未分化マーカーの発現

TH

RabbitProtos Biotech

1：100
1：1000（DAB染色）

ChAT

RabbitMillipore

1：1000（DAB染色）

ChAT

Goat

Millipore

1：100

VMAT2

RabbitPhoenix pharmaceuticals 1：100
1：1000（DAB染色）

Alexa Fluor 594

Rabbit

Abcam

1：500

Alexa Fluor 488

Mouse

Abcam

1：500

Alexa Fluor 546

Goat

Invitrogen

1：1000Alexa Fluor 488

RabbitInvitrogen

1：1000順で，Cellartis MSC Xeno-Free Basal Medium または健常女児歯髄由来細胞（CONT）および RTT 女児歯髄由来細胞（RETT）から RNeasy mini kit（QIAGEN，Hilden，Germany）を用いて全 RNA を精製し，Recombinant RNase
Inhibitor（タカラバイオ），5×PrimeScript Buffer（タカラバイオ），PrimeScript Reverse Transcriptase（タカラバイオ），dNTP Mixture（タカラバイオ），ならびに Random
Primer（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA） と 反 応 さ せることにより cDNA 合成を行った。ThermalCycler（Bio-

希釈率＊ DAB 染色以外は免疫蛍光染色での希釈率を記載

Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）を用いて，表1 に示す未分化マーカーに対するプライマーを使用してImmunoBioScience，Mukilteo，WA，USA） に て 封 入 しRT-PCR を行った。増幅した PCR 産物について 2 % アガ

た。作製した標本について，20×対物レンズと CCD カメ

ロースゲルにて電気泳動を行い，バンドを確認した。βラを備えた蛍光顕微鏡（ECLIPSE 80i，ニコン，東京）を-actin を RT-PCR 解析の内在性コントロールとして使用し使用して画像化した。

た。
6 ）免疫陽性歯髄細胞数の計測
5 ）歯髄細胞での MeCP2ならびに幹細胞マーカーの発現

MeCP2と Ki-67の陽性細胞に関しては，蛍光光源の励起

歯髄細胞での MeCP2の発現と細胞内局在，および幹細強度を常に一定にして組織像をカラー画像として保存した胞マーカーの発現を調べる目的で免疫組織化学染色を行っ後，陽性細胞数を計測した。画像は，CONT と RETT にた。CONT および RETT を8 well Lab-Tek Chamber Slide

ついて，MeCP2と Ki-67の陽性細胞を各々 6 ウェルずつ撮（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）上で影した。

1.0×10 個 /well で播種して24時間培養後，4 % パラホル
4

ムアルデヒドで固定し，1 %TritonX-100にて透過処理を室

2 ．実験Ⅱ

温で10分間行い，1 % BSA−PBS で室温にて30分間ブロッ

1 ）実験動物および飼育条件

キングを行った。続いて，表 2 に示す一次抗体を含む溶液

ヘテロ接合型の Mecp2欠損雌マウス（B6.129P2（C）-

中で 4 ℃にて一晩反応させた。その後 PBS で洗浄し，蛍Mecp2tm1.1Bird/ J; Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME,

光標識ヤギ二次抗体（抗マウス Alexa Fluor 488，抗ウサ

USA）8 , 11） ならびに C57BL / 6J 野生型雄マウス（三協ラギ Alexa Fluor594）を含む溶液中で，室温，遮光下で 1

ボサービス，東京）を購入後，本学動物実験施設にて飼育時間反応させた。その後 PBS で洗浄し，DAPI を含む封および交配を行い，生後 7 日目に Mecp2について遺伝子入材（Fluoroshield Mounting Medium with DAPI;型 の 判 定 を 行 っ た。Mecp2欠 損 が な い 野 生 型 雄 同 腹 仔

35

日大歯学

第 97 巻第 1 号（Wt） を 対 照 と し て 使 用 し た。 マ ウ ス は， 温 度（24 ±546 ロバ抗ヤギ IgG および Alexa Fluor 488 ロバ抗ウサギ

1 ℃），湿度（55 ± 5 %）で制御された飼育室にて，12 h：

IgG を使用した。封入には Fluoroshield（ImmunoBioScience）

12 h の明暗サイクル（07：00に点灯）下で，餌と水を自を用いた。染色した組織標本は60×油浸対物レンズを備え由に摂取させて飼育した。動物実験は全て日本大学遺伝子たレーザー走査型共焦点顕微鏡 C1（LSCM; ニコン，東京）

組換え実験安全委員会（2020歯004-2）で承認され，日本で観察し，ChAT-IR ニューロンと TH-IR ニューロンある大学動物実験委員会の指針にしたがって実施した

いは VMAT2-IR 神経終末様構造の蛍光画像を取得した。

（AP22DEN008-1，AP22DEN019-1）。
3 ．統計解析2 ）脳切片の免疫組織化学染色

統計解析には，SPSS Statistics ver.22（SPSS，Chicago，

マウスを 5 % イソフルラン吸入で深麻酔し，氷冷生理

IL，USA）を用いた。値は平均値±標準誤差として表記

食塩水で経心的に灌流した後，4 % パラホルムアルデヒド

した。統計的有意差は，すべての解析で P < 0.05に設定しにて灌流固定した。直ちに脳を摘出し，4 ℃で一晩固定後，た。培養歯髄細胞における免疫陽性の比率についての 2 群

30% スクロースに置換したのち‒80℃で凍結保存した。続間の比較は Mann-Whitney U test を用いた。TH-IR ニュー

いてクライオスタット（CM1850; Leica，Wetzlar, Germany）

ロン数ならびに ChAT-IR ニューロン数の Mecp2-/y マウ

を用いて連続冠状切片（厚さ25 μｍ）を作製し，浮遊法にスと Wt マウス間の比較には二元配置分散分析を用い，両て免疫組織化学染色を行った。切片を，表 2 に示すウサギ

マウス間で有意差が認められた場合には，吻尾側的に同じ

抗 TH ポリクローナル抗体，またはウサギ抗 ChAT ポリ

位置で計測した 2 群間の数値を t 検定を用いて比較した。

クローナル抗体を用いて 4 ℃で24時間反応させたのち，ヒ結

ストファインシンプルステイン MAX PO（R）（ニチレイ，
東京）と室温で60分間反応させた。染色には Vectastain

果

1 ．実験ⅠDAB Substrate Kit（Vector Laboratories，Burlingame，

対象の RTT 女児の MECP2の変異部位は，主治医らにCA，USA）を使用し，硫酸ニッケル強化ジアミノベンチ

よって c. 473C > T, p. T158M であることが確認されておジン（DAB）にて切片を処理し発色させた。Mecp2-/y マ

り， 本 変 異 は MECP2の メ チ ル 化 DNA 結 合 ド メ イ ンウスおよび Wt マウスは各 4 頭使用した。

（MBD）内に位置している。この MBD 内の変異により，
MeCP2のメチル化 CpG との結合が著しく低下することが3 ）TH-IR および ChAT-IR ニューロン数の計測明らかにされており16），その下流に位置する遺伝子の発現

DMV での TH-IR ニューロン数ならびに ChAT-IR ニュー調節に異常が生じると考えられている16）。本研究の実施にロン数の計測には，20×対物レンズと CCD カメラを備え

あ た り，RETT な ら び に CONT か ら 抽 出 し た ゲ ノ ム

た光学顕微鏡（ニコン）を使用し，照明強度を常に一定にDNA を試料として，変異部位を切断する制限酵素である

して組織像をカラー画像として保存したのち，左右側の各

Nla Ⅲを用いて RETT の変異部位を再確認したのち実験

ニューロン数を計測した。DMV の境界は，連続切片からを行った。

別途作製したニッスル染色標本を用いて決定した。TH-IR
および ChAT-IR ニューロン数は，吻尾側方向に100 μｍ間1 ）歯髄細胞における未分化マーカーの発現隔で計測した。Mecp2-/y マウスの脳の大きさが Wt マウ

RT-PCR の結果，CONT および RETT で，未分化マースよりやや小さいことから ，Mecp2-/y マウスと Wt マ
15）

ウスの脳部位の前後的位置の判定はニッスル染色標本と照合しながら行った。
4 ）ChAT と TH または小胞モノアミントランスポーター
2 の免疫蛍光二重染色
クライオスタットにて連続冠状切片（厚さ25 μｍ）を作製し，ChAT と TH または ChAT と小胞モノアミントラ
ンスポーター 2（VMAT2）の免疫蛍光二重染色を行った。
浮遊切片を，表 2 に示すウサギ抗 TH 抗体およびヤギ抗ChAT 抗体，またはウサギ抗 VMAT2抗体およびヤギ抗ChAT 抗体を含む溶液とともに 4 ℃で一晩反応させた。

図 1 歯髄細胞における未分化マーカーの発現
CONTおよびRETTともに未分化マーカーc-Myc，Sox2，Oct4，Klf4の発現を認めたが，両細胞ともNanogの発現はみられなかった。

次に，切片を二次抗体とともに室温で60分間反応させ，ス
ライドガラスに貼り付けた。二次抗体として Alexa Fluor

36

MeCP2が変異したヒト歯髄細胞とマウス神経細胞についての免疫組織学的研究

令和 5 年 6 月

図 2 MeCP2の免疫蛍光染色画像と陽性率
A：CONTでは，全細胞においてMeCP2陽性反応（緑）が主に核に局在していたのに対し，RETTではMeCP2が主に核に局在している細胞の他に，細胞質と核がほぼ同レベルで陽性反応を示した細胞が認められた。DAPIの蛍光シグナルを青で示す。赤矢印はMeCP2の核のみが陽性、黄矢印は核と細胞質が免疫陽性の細胞を示す。B：
RETTでは，細胞質が核に近いレベルで免疫陽性反応を示した細胞が26.6%認められた。＊ P < 0.01

図 3 Ki-67の免疫蛍光染色画像と陽性率
A：Ki-67陽性反応（緑）はCONTおよびRETTともに核内に限局していた。画像中の破線で囲む部分の拡大図を右下の四角内に示す。
青はDAPIの蛍光シグナルで，赤矢印はKi-67の免疫反応が陰性の細胞を示す。B：陽性率はCONTで93.7%であったのに対し，RETTでは82.3%と有意に低かった。＊ P < 0.01

カーである c-Myc，Sox2，Oct4，Klf4の遺伝子発現が認比べ RETT で有意に低かった（P < 0.01）（図 3 ）。多能性

められたが，ともに Nanog の発現は認められなかった（図幹 細 胞 マ ー カ ー で あ る SSEA3の 発 現 は，CONT お よ び

1）。

RETT ともに弱く，主に核周囲及び細胞表面に局在しており，両細胞で違いはみられなかった（図 4 Ａ）
。間葉系幹

2 ）歯髄細胞における MeCP2ならびに幹細胞マーカーの細胞マーカーである STRO-1は，CONT および RETT と発現もほとんど発現がみられず，CONT において細胞膜の一CONT および RETT において MeCP2の陽性率を調べ部に弱い免疫陽性反応がみられたのみであった（図 4 Ｂ）。

たところ，CONT で100%，RETT で94.8% であった。それらのうち，CONT では全細胞で MeCP2がほぼ核に局在2 ．実験Ⅱしていたのに対し，RETT では細胞質と核がほぼ同レベ

1 ）マウスの DMV における TH-IR ニューロンの発現ルで免疫陽性反応を示した細胞が26.6 ± 5.7% 認められ，TH-IR ニューロンの数は Wt マウスと比較して Mecp2-/

CONT と RETT の比較で，核のみが免疫陽性の細胞の比y マウスの方が多く，有意差が認められた（n= 8, P <率，ならびに核と細胞質ともに免疫陽性の細胞の比率につ0.001）（図 5 ）。Mecp2-/y マウス，Wt マウスともに閂かいて有意差が認められた（P < 0.01）（図 2 ）。また増殖能ら吻側に100 μｍの位置で最も細胞数が多かった（図 5 A）。

のマーカーである Ki-67についての免疫蛍光染色で，Ki-67

Mecp2-/y マウスにおいて，TH-IR ニューロンはおもには核内に限局して陽性反応を示し，陽性率の平均は CONTDMV の中央から内側に分布していた（図 5 B）。

で93.7 ± 1.3％，RETT では82.3 ± 1.3％であり，CONT に

37

日大歯学

第 97 巻第 1 号

2 ）マウスの DMV における ChAT-IR および TH-IR ニュー
ロンの局在
ChAT-IR ニ ュ ー ロ ン は DMV 全 体 に 分 布 し て お り，
Mecp2-/y マウスと Wt マウスとの比較で ChAT-IR ニュー
ロンの数に違いはみられなかった（図 6 ）。免疫蛍光二重
染 色 を 行 っ た 切 片 に つ い て，ChAT と TH の 局 在 を
LSCM により調べたところ，Mecp2-/y マウスの DMV において二重標識されたニューロンが多く確認され，それらは DMV の中央から内側に位置していた（図 7 ）。一方，
Wt マウスでは ChAT と TH が共存するニューロンはほとんど認められなかった（図 7 ）。
3 ）DMV における ChAT-IR ニューロンおよび VMAT2IR 神経終末様構造の局在
Wt マウスの DMV では，ChAT-IR ニューロンの周囲に
VMAT2-IR 神経終末様構造が多数存在した（図 8 ）。一方，
Mecp2-/y マ ウ ス の DMV で は VMAT2-IR 神 経 終 末様構
造はわずかしか認められなかった（図 8 ）。

考察

CONT ならびに RETT では，いずれの細胞においても未分化マーカー遺伝子である c-Myc，Sox2，Oct4，Klf4の発現を認めた。また，Nanog については両細胞ともに発現が認められなかった。佐藤ら 7 ）による報告では，永久歯歯髄 由 来 の 間 葉 系 幹 細 胞 で は， 未 分 化 マ ー カ ー の う ち
c-Myc，Sox2，Oct4，Klf4が発現していたのに対し，乳歯

図 4 SSEA3（A）とSTRO1（B）の免疫蛍光染色画像
SSEA3およびSTRO-1の発現は，CONTとRETTで差異はみられなかった。

歯髄由来の間葉系幹細胞では c-Myc の発現が認められなかった。一方で，前者には Nanog が発現していなかった

図 5 DMVにおけるTH-IRニューロン
A：TH-IRニューロンの数は，WtマウスよりもMecp2-/yマウスで有意に多かった。グラフの横軸は閂からの距離を示し，尾側方向はマイナス（-）で示す。B：TH-IRニューロンの局在を示す。Mecp2-/y
マウスではWtマウスに比べ，TH-IRニューロンが多く認められ，それらはDMVの中央から内側に位置していた。いずれも閂から吻側200 μｍの画像を示す。

図 6 DMVにおけるChAT-IRニューロン
A：MeCP2-/yマウスおよびWtマウスのChAT-IRニューロンの数に差はみられなかった。B：閂から吻側200 μｍの領域でのChAT-IR
ニューロンを示す。DMVと同様に舌下神経核にも多くのChAT-IR
ニューロンを認めた。

38

MeCP2が変異したヒト歯髄細胞とマウス神経細胞についての免疫組織学的研究

令和 5 年 6 月

れた，細胞質にも明らかな MeCP2の免疫陽性反応を認めた細胞は，MECP2の変異アレルが活性化した細胞である可能性が高い。これらの RETT では，MeCP2の核内でのDNA 結合能が低下しているために核内に留まることができず細胞質に移行したものと推測される。理論的には RETTのうち MECP2が変異した細胞の比率は50％であるが，継代培養によってその比率が変化した可能性は否定できな
い。Ki-67に対する免疫蛍光染色で，CONT に比べ RETT
で Ki-67の 陽 性 率 が 有 意 に 低 か っ た こ と は，RETT がCONT に比べ増殖能が低いことを示唆している。その違いが変異 MeCP2の転写調節機能の低下による Ki-67発現

図 7 DMVにおけるChAT-IRおよびTH-IRニューロンの発現
A,D：ChAT-IRニューロン。B,E：TH-IRニューロン。C：Wtマウス
において，ChATおよびTHの共発現はみられなかった。F：Mecp2-/
yマウスにおいて，複数のニューロンでChATおよびTHの共発現を認めた。閂から吻側200 μｍの画像を示す。

への直接の影響なのか，それとも MeCP2の変異による細胞増殖能全般への負の影響によるものなのかは今後検討する必要がある。
マウスを用いたこれまでの研究で，Mecp2-/y マウスでは Wt マウスに比べ，脳の複数の部位でノルアドレナリン量が低下していること18），また TH を発現する A1/C1および A2/C2細胞群のニューロン数が減少していることが報告されている12）。本研究では，Mecp2-/y マウスの DMVにおける TH-IR ニューロンならびに ChAT-IR ニューロンの数および分布について詳細に調べることとし，観察時に励起光源の安定性や蛍光強度変化の影響を受けやすい免疫蛍光染色ではなく，繰り返し安定した観察や計測が可能な
DAB 染色を採用した。Wt マウスとの比較で，Mecp2-/y
マウスの DMV では TH-IR ニューロンが多く認められた。
また免疫蛍光二重染色で ChAT との共存について検討した と こ ろ，Mecp2-/y マ ウ ス の DMV の 多 く の ChAT-IR

図8

DMVにおけるChAT-IRニューロンおよびVMAT2-IR神経終末様構造
A,D：ChAT-IRニューロン。B,E：VMAT2-IR神経終末様構造。C,F：
WtマウスではChAT-IRニューロンの周囲にVMAT2-IR神経終末様構造が多数認められたが，Mecp2-/yマウスではわずかしか認められなかった。閂から吻側200 μｍの画像を示す。

ニューロンが TH を共発現していることを確認した。DMVでは孤束核と同様に，摂食行動後に Fos 免疫陽性細胞数が増加することが報告されている19）。これらの知見は，
DMV において副交感神経の制御に関与しているコリン作
動性ニューロンが，Mecp2-/y マウスにおいては TH の共のに対し，後者では発現が確認されている。本研究結果は発現によってカテコールアミン産生能を増強させているこ

佐藤らの結果と一致しており，RETT は健常者の永久歯とを示しており，それにより胃などの消化管に分布する副歯髄由来の間葉系細胞と同様に，幹細胞としての性質を有交感神経の機能に変化が生じていることが示唆される。
現在のところ，Mecp2の欠損と DMV での TH-IR ニュー

していることが強く示唆された。
RTT では一対の X 染色体の片方の MECP2に変異があ

ロン数の増加あるいはコリン作動性ニューロンでの THり，変異 MECP2が活性化している細胞において転写制御の共発現の増加が，Mecp2-/y マウスにおいて DMV の機機構に異常をきたしていることが考えられる。RETT に能をどのように変化させるかについては不明である。これ生じた MECP2の変異は 1 塩基置換であり，MeCP2の三までの研究で，延髄の神経細胞での TH の発現に対する長次構造にはわずかな変化しか生じないことから17），RETT期の低酸素暴露の影響が報告されている。低酸素暴露は，の MeCP2は CONT の MeCP2と同様に今回使用した抗体

A 2 細 胞 群 で の TH 活 性 と mRNA 発 現 を 増 加 さ せ20, 21），に対する抗原性を維持していた。本研究において，CONT

孤束核と DMV での TH 量の増加を誘発した21）と報告されの全細胞で MeCP2が核に局在していたのに対し，RETTている。成体期の Mecp2-/y マウスは呼吸中枢の機能が著では細胞質と核がほぼ同レベルで免疫陽性反応を示した細しく不安定化し，無呼吸が頻発するなどの重度の呼吸異常

胞 が26.6% 認 め ら れ，CONT と RETT を 比 較 し た 場 合，を示す。また本研究に用いた生後 8 週の Mecp2-/y マウス

核のみが免疫陽性の細胞の比率ならびに核と細胞質ともにでは慢性的なチアノーゼを呈する個体が認められた。以上

免疫陽性の細胞の比率に有意差が認められた。今回観察さの報告や所見から，成体期の Mecp2-/y マウスにおける持

39

日大歯学

第 97 巻第 1 号

続的な低酸素状態が，DMV ニューロンの TH 合成経路をていること，MeCP2の欠損が DMV ニューロンの活動を活性化している可能性が考えられる。さらに DMV での変化させ，消化管運動を調節している副交感神経の働きに

VMAT2-IR 神経終末様構造と ChAT-IR ニューロンとの関影響を及ぼしていることが示唆された。

係について免疫蛍光二重染色により観察したところ，Wt

本研究遂行にあたり，格別たるご指導およびご校閲を賜りました日本大学歯学部小児歯科学講座 白川 哲夫教授，菊入 崇准教授に謹んで深く感謝を申し上げます。また，本研究を通じ，多大なるご協力を賜りました日本大学歯学部小児歯科学講座の皆様に感謝申し上げます。
なお，本研究では開示すべき利益相反はない。

マウスでは ChAT-IR ニューロンの周囲に多数の VMAT2IR 神経終末様構造が観察されたのに対し，Mecp2-/y マウ
スでは VMAT2-IR 神経終末様構造はほとんど観察されなかった。VMAT2は，主にセロトニン，ドパミン，ノルア
ドレナリンあるいはアドレナリンなどのモノアミン作動性
ニューロンに発現することから22），Mecp2-/y マウスの文

DMV ではモノアミン作動性神経入力を介した機能調節に

1）Amir RE, Van den Veyver IB, Wan M, Tran CQ, Francke U,
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何らかの異常が生じていることが示唆される。
現在まで，MeCP2により転写が抑制または活性化されている遺伝子の探索が行われているが，実際に MeCP2の標的として RTT の機能異常との関連が判明している遺伝
子は BDNF などに限られている10）。また，MeCP2の異常がどのような経路でモノアミン作動性ニューロンのシナプ
ス形成を阻害しているのかは明らかではない。現在まで
RTT の病態を改善させる安全で効果的な治療法は開発されておらず，モデルマウスを用いる基礎研究は，候補となる治療用薬物を研究するうえでヒトの細胞を対象とする研究と同様に重要である。
DMV を含めて，RTT 患者の脳幹における TH の発現やモノアミン作動性神経伝達を促進する薬物の開発，あるいは中枢神経系において変異 MeCP2の機能を補完することが可能な治療法の開発は，RTT 患者で観察される種々の病態の改善に役立つものと考えられた。

結

献

論

実験Ⅰにて，継代培養した CONT および RETT について特性を比較，解析するとともに，実験Ⅱにて，Mecp2-/y
マウスと Wt マウスの DMV における TH-IR および ChATIR ニューロンの発現を検討した結果，以下の結論を得た。
1 ．CONT および RETT では，ともに未分化マーカー遺伝子の c-Myc，Sox2，Oct4，Klf4の発現を認めた。
2 ．CONT では全細胞で MeCP2がほぼ核に局在していたのに対し，RETT では核に加えて細胞質にも免疫陽性反応を示した細胞が26.6% 認められた。また Ki-67の陽性率は CONT に比べ RETT で有意に低かった。
3 ．RETT では変異 MECP2が活性化した細胞が一定の割合で存在しており，MECP2の変異が MeCP2の細胞内局在に影響を及ぼすとともに細胞の増殖能を低下させている可能性が示された。
4 ．Wt マウスとの比較で，Mecp2-/y マウスの DMV では ChAT-IR ニューロンの数に差はみられなかったがTH-IR ニ ュ ー ロ ン の 数 が 多 く， ま た ChAT お よ び
TH を共発現するニューロンが多く認められた。
以上より，MECP2の変異が RETT の増殖能を低下させ

40

MeCP2が変異したヒト歯髄細胞とマウス神経細胞についての免疫組織学的研究

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41

日大歯学 ，97（1）
，42-49，2023

原著

急性期病院における誤嚥性肺炎患者の生命予後に関連する因子について
渡

邉

真

央

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻

口腔健康科学分野

日本大学歯学部摂食機能療法学講座（指導：植田耕一郎

教授，中山渕利准教授）

要旨【目的】誤嚥性肺炎は，近年の日本における死因の上位の疾患である。先行研究において，栄養状態が誤嚥性肺炎患者の入院中の生命予後に影響する可能性があることが報告されているが，誤嚥性肺炎発症後の転帰には他にも複数の要因が関係すると考えられる。本研究では，誤嚥性肺炎で入院した患者の入院時の栄養状態，日常生活動作（ADL），
嚥下機能および口腔内環境と入院中の生命予後との関連性を調べることを目的とした。
【方法】対象は急性期病院に2019年 4 月から2021年 1 月までの期間に誤嚥性肺炎が原因で入院した患者96名（平均86.9 ± 9.7歳，男性57名，女性39名）とした。調査項目は入院時の年齢，性別，基礎疾患，functional independence
measure（FIM），血清アルブミン値（Alb），body mass index（BMI），Eichner 分類，歯数，口腔乾燥値，口腔内細菌レベル，兵頭スコアおよび藤島の摂食嚥下能力グレード（嚥下グレード）とした。生存退院群と死亡退院群の 2 群に分けて群間比較を行った後，有意差のあった項目を説明変数，入院中の死亡を従属変数としてロジスティック回帰分析を行った。
【結果】生存退院群は70人（平均87.2 ± 9.2歳，男性40名，女性30名），死亡退院群が26名（平均86.2 ± 11.2歳，男性17名，女性 9 名）であった。2 群間の比較では，Alb，BMI，FIM，口腔内細菌レベル，兵頭スコア，嚥下グレードに有意差を認めた。また，ロジスティック回帰分析の結果，上記すべての項目に有意差を認め，的中率は74.0% であった。
【結論】誤嚥性肺炎で入院した患者のうち入院中に死亡した患者は，入院時の栄養状態の不良，ADL と嚥下機能の低下，口腔内細菌数の増加といった特徴があり，これらが生命予後に影響する可能性が示唆された。
キーワード：誤嚥性肺炎，栄養状態，ADL，嚥下機能，口腔内細菌数

Factors associated with life prognosis in patients withaspiration pneumonia in an acute care hospital
Mao Watanabe
Nihon University Graduate School of Dentistry, Major in Oral Health Sciences
Department of Dysphagia Rehabilitation, Nihon University School of Dentistry（Directors: Professor Koichiro Ueda and Associate Professor Enri Nakayama）

Abstract【Purpose】Aspiration pneumonia has been one of the leading causes of death in Japan in recent years. Previous
studies have reported that nutritional status may affect the survival prognosis of patients with aspiration pneumonia
during hospitalization, but other factors may also be involved. Therefore, this study aimed to clarify the factors
related to life prognosis during hospitalization among patients admitted with aspiration pneumonia.
【Methods】The study included 96 patients (average age 86.9 ± 9.7 years; 57 males, 39 females), who wereadmitted to an acute care hospital due to aspiration pneumonia between April 2019 and January 2021. Survey items
were age, gender, medical history, functional independence measure (FIM), serum albumin level (Alb), body massindex (BMI), Eichner index, number of teeth, degree of oral dryness, oral bacterial level, Hyodo score, andFujishima’s swallowing ability grade (swallowing grade). The patients were divided into two groups: the surviving
discharge group and the death discharge group. After comparison between the groups, a logistic regression analysis
was performed using items with significant differences as explanatory variables and death during hospitalization asa dependent variable.
【Results】The number of patients discharged alive was 70 (mean age 87.2 ± 9.2 years; 40 males, 30 females) andthe number of those discharged dead was 26 (mean age 86.2 ± 11.2 years; 17 males, 9 females). A comparison
between the groups showed significant differences in Alb, BMI, FIM score, oral bacterial level, Hyodo score, andswallowing grade. Logistic regression analysis showed significant differences in all above items, with a hit rate of 74.0%.
【Conclusion】Patients hospitalized for aspiration pneumonia who died during hospitalization were characterized
by poor nutritional status on admission, poor activities of daily living, poor swallowing function, and increased oral
bacterial counts, suggesting that these factors may affect life prognosis.
Keywords: aspiration pneumonia, nutritional status, ADL, swallowing function, oral bacterial count（受付：令和 5 年 1 月30日）
責任著者連絡先：渡邉真央
日本大学歯学部 摂食機能療法学講座〒101-8310 東京都千代田区神田駿河台 1 ‒ 8 ‒13

TEL：03-3219-8198
FAX：03-3219-8203
E-mail：mao.w0907@gmail.com
42

日大歯学

緒

第 97 巻第 1 号

言

2021年の厚生労働省の統計によると，主な死因疾患のうち肺炎は5.1% の第 5 位であり，そのうち誤嚥性肺炎での死亡率は40.3% と高い割合を示している 1 ）。また，70歳以上の肺炎のうち 8 割以上を誤嚥性肺炎が占めているとされており，今後も我が国では高齢化率の進展に伴い，誤嚥性肺炎の罹患率や死亡率の増加が予測されている 2 ）。
誤嚥性肺炎に関連する因子については，これまで多くの研究が報告されており，加齢，免疫力の低下，脳血管障害や慢性呼吸器疾患等の基礎疾患，認知症，食道疾患，脱水・低栄養状態，口腔内の衛生状態の不良，多種類の内服
薬による嚥下機能低下などがリスク因子にあげられる 3 - 8 ）。
しかし，誤嚥性肺炎患者の入院中の生命予後に影響する因子についての報告は少ない。
誤嚥性肺炎患者の生命予後について調べた研究では，禁図1

食期間を設けた群で入院期間が延長したと報告されてい調査対象者の選定から評価の流れ

図1る 9 ）。また，誤嚥性肺炎に罹患した高齢患者を准高齢群（65〜74歳），高齢群（75〜89歳），超高齢群（90歳以上）の 3 群に分けて生命予後を追跡調査した研究では，栄養状態の指標である血清アルブミン値，body mass index およ

図2び mini nutritional assessment short-form がいずれの群で

口腔水分計ムーカス

も生命予後に最も関連し，さらに年代別の比較では，超高齢群において入院日数が有意に短かったと報告している10）。
しかし，誤嚥性肺炎患者の生命予後には，栄養状態の他にも複数の因子が関連すると考えられる。本研究では，栄養状態に加えて日常生活動作（ADL），嚥下機能および口腔内環境に着目し，誤嚥性肺炎で入院した患者の入院中の生命予後との関連性を明らかにすることを目的とした。

材料および方法
1 ．対象
対象者は，2019年 4 月から2021年 1 月の間に彦根市立病院に入院し，歯科口腔外科に嚥下機能評価依頼があった患者のうち，主疾患が誤嚥性肺炎であった患者96名（平均

図386.9 ± 9.7歳，男性57名，女性39名）とした（図 1 ）。
調査を行った病院では，誤嚥性肺炎患者のうち摂食嚥下

口腔内細菌カウンタ NP‐BCM01‐A

された。

機能の低下が疑われる患者に対して，主治医が歯科口腔外科に嚥下機能評価を依頼している。歯科口腔外科初診日に2 ．調査項目および評価方法

口腔内診査，嚥下スクリーニング検査，嚥下機能評価が行わ診療記録から，対象者の年齢，性別，基礎疾患，入院時れる。急性期患者は検査室への搬送が難しいため，ベッド

11）の functional independence measure（FIM），入院日かサイドにて嚥下内視鏡検査（videoendoscopic examination

ら歯科口腔外科初診日までの期間，入院時の血清アルブミ

of swallowing：VE）による嚥下機能評価が行われる。VE

ン値（Alb）および body mass index（BMI）を収集した。

後に歯科医，主治医および言語聴覚士（speech therapist：

さらに，歯科口腔外科医による初回嚥下評価時に咬合支持ST）らで治療方針について協議して，歯科医が口腔ケア

12）域（Eichner 分類），歯数，口腔水分計（口腔水分計ムーや義歯調整等を行い，ST が摂食嚥下リハビリテーション

カス第 4 世代，ライフ，埼玉）（図 2 ）を用いた口腔乾燥を実施する。本調査対象者は全員，経験年数10年以上の歯値13），微生物定量分析装置（口腔内細菌カウンタ NP‐

科医が VE を行い，治療およびリハビリテーションが実施

BCM01‐A，パナソニック，東京）（図 3 ）による口腔内43

誤嚥性肺炎患者の生命予後の関連する因子
表1

細菌カウンタによるレベル分類14）

良好群

やや不良
不良群

レベル 1

10万個未満レベル 2

10万個～100万個未満

レベル 3

100万個～316万個未満

レベル 4

316万個～1000万個未満

レベル 5

1000万個～3160万個未満

レベル 6

3160万個～ 1 億個未満

レベル 7

1 億個以上表2

令和 5 年 6 月

表3
Ⅰ重症
経口不可
Ⅱ中等症
経口と補助栄養
Ⅲ軽症
経口のみ

兵頭スコア

15）

Ⅳ正常

① 喉頭蓋谷や梨状陥凹の唾液貯留
0：唾液貯留がない
1：軽度唾液貯留あり
2：中等度の唾液貯留があるが，喉頭腔への流入はない
3：唾液貯留が高度で，吸気時に喉頭腔へ流入する

藤島の摂食嚥下能力グレード16）

1

嚥下困難または不能，嚥下訓練適応なし

2

基礎的嚥下訓練のみ適応あり

3

条件が整えば誤嚥は減り，摂食訓練が可能

4

楽しみとしての摂取は可能

5

一部（ 1 ～ 2 食）経口摂取可能

63 食経口摂取プラス補助栄養7嚥下食で，3 食とも摂取可能

8

特別に嚥下しにくい食品を除き，3 食経口摂取9

常食の経口摂取可能，臨床的観察と指導を要する

10

正常の摂食嚥下能力表4

対象者の基本属性

生存退院群（n = 70） 死亡退院群（n = 26）② 声門閉鎖反射や咳反射の惹起性
0：喉頭蓋や披裂部に少し触れるだけで容易に反射が惹起される
1：反射は惹起されるが弱い
2：反射が惹起されないことがある
3：反射の惹起が極めて不良

87.2 ± 9.2

86.2 ± 11.2

0.732

性別（n
（%）
，男/女）

40（57.1）/30（42.9）

17（65.4）/9（34.6）

0.312

歯科初診までの期間（平均 ± SD 日）

4.79 ± 4.80

5.46 ± 4.54

0.352

4（5.7）
15（21.4）5（7.1）
16（22.9）40（57.1）

3（11.5）6（23.0）0（0）8（30.8）9（34.6）

基礎疾患（n（%））
脳血管疾患
呼吸器疾患
神経筋疾患
循環器疾患
その他

③ 嚥下反射の惹起性
0：着色水の咽頭流入がわずかに観察できるのみ
1：着色水が喉頭蓋谷に達するのが観察できる
2：着色水が梨状陥凹に達するのが観察できる
3：着色水が梨状陥凹に達してもしばらくは嚥下反射が起きない

p値

年齢（平均 ± SD 歳）

0.278

ルや耐久性を考慮した上で，対象患者の食事摂取の実行状
態に応じて10段階で評価し，経口摂取不可が Gr. 1 ～ 3 ，④ 着色水嚥下による咽頭クリアランス

経口摂取と代替栄養が Gr. 4 ～ 6 ，経口摂取のみが Gr. 7

0：嚥下後に着色水残留なし
1：着色水残留が軽度あるが，2 〜 3 回の空嚥下でwash outされる
2：着色水残留があり，複数回嚥下を行ってもwash outされない
3：着色水残留が高度で，喉頭腔に流入する～ 9 ，正常が Gr.10と判定する（表 3 ）。
3 ．統計学的分析
対象者を生存退院群と死亡退院群に分け，各変数の正規

総計の点数（①＋②＋③＋④）＝性を確認した後に間隔尺度は t 検定，順序尺度は Mann細菌レベル14）（表 1 ）を調べた。Eichner 分類は，使用可

Whitney の U 検定，名義尺度はカイ二乗検定を使用して能な義歯を所持していた場合は義歯を含めて評価を行っ

2 群比較を行った。また，死亡退院のリスク因子の検討はた。口腔乾燥値は，舌背部の先端から10 mm 後方の部位

ロジスティック回帰分析を用いた。有意水準は 5 % とし，で一定の測定圧（200 g 以上）で口腔水分計を 2 秒間圧接

統計処理は統計ソフト（IBM SPSS Statistics Ver.26，日

した値を 3 回測定し，その平均値を算出した13）。口腔内細本アイ・ビー・エム，東京）を使用した。

菌レベルは，舌背中央部を滅菌綿棒を用いて擦過圧20 gf
にて 1 cm 間隔を 3 往復，擦過後，細菌カウンタに擦過後4 ．倫理的配慮の綿棒をセットして細菌数を 3 回計測し，その平均値を算

対象者に対し，研究内容の説明を書面にて行い，本人お出した 。口腔乾燥値，口腔細菌レベルともに，朝食後によび家族の同意書を得た後に実施した。なお，本研究は日行われる病棟看護師による口腔ケア後，2 時間経過した口

本大学歯学部倫理委員会の承認（許可番号 EP19D002），

腔内の舌背で測定した。さらに，初回嚥下評価時の VE の彦根市立病院倫理委員会の承認（承認番号2109-02）を得結果から，兵頭スコア15）と藤島の摂食嚥下能力グレードて実施された。

14）（嚥下グレード） を収集した。兵頭スコアは VE の評価法
16）

結の 1 つであり，安静時の咽頭内の唾液の貯留量，喉頭蓋の感覚，嚥下反射の惹起のタイミング，咽頭クリアランスの果

1 ．対象者の基本属性

4 項目を 0 点から 3 点の 4 段階で評価し，各項目の合計点

生存退院群は70名（平均87.2 ± 9.2歳，男性40名，女性（合計スコア）で経口摂取の可否を判断する方法であり，30名）であり平均入院日数は37.1日，死亡退院群は26名

合計スコアが 8 点以上であれば経口摂取困難と判定される（平均86.2 ± 11.2歳，男性17名，女性 9 名）で，平均入院（表 2 ）。一方，嚥下グレードは，VE 所見に加え意識レベ

日数は34.7日であった。年齢，性別，入院日から歯科口腔

44

日大歯学

第 97 巻第 1 号

生存退院群■ 生存退院群■ 死亡退院群■ 生存退院群■ 死亡退院群*

⻭科初診までの期間⻭数

図4

年齢，性別，歯科初診までの期間における生存退院群と死亡
退院群との比較
年齢，性別：カイ二乗検定
初診までの期間：t 検定
図4

Eichner分類

⼝腔乾燥値

外科初診日までの期間および対象者の基礎疾患の保有割合に有意差は認められなかった（表 4 ，図 4 ）。
2 ．栄養状態，ADL，口腔内環境および嚥下機能
生存退院群と死亡退院群の栄養状態，ADL，口腔環境

⼝腔内細菌レベルおよび嚥下機能に関する各評価指標の比較を表 5 ならびに兵頭スコア

図 5 に示す。Alb と BMI はそれぞれ死亡退院群が生存退院群に比べて有意に低かった。FIM については，運動項
目と認知項目のいずれも死亡退院群が生存退院群に比べて有意に低かった。歯数，Eichner 分類および口腔乾燥値に有意差はなかったが，口腔内細菌レベルについては，死亡
退院群が生存退院群より有意に高かった。また兵頭スコア

嚥下グレードは死亡退院群が生存退院群に比べて有意に高く，嚥下グ
レードは死亡退院群が生存退院群より有意に低かった。
さらに，2 群比較で有意差のあった Alb，BMI，FIM，
口腔内細菌レベル，兵頭スコア，嚥下グレードを説明変数とし，死亡退院を従属変数としてロジスティック解析を行った結果を表 6 に示す。モデル 1 は診療記録から得られ

図図55 栄 養状態，日常生活動作，口腔内の状態および嚥下機能に関する各指標における生存退院群と死亡退院群との比較
BMI，Alb 値，口腔内細菌数レベル，歯数：t 検定
Eichner 分類，兵頭スコア，嚥下グレード：Mann-Whitney の U 検定
BMI：body mass index，Alb： 血 清 ア ル ブ ミ ン，FIM：fanctional
independennce measure＊p < 0.001

た情報のみを用いたモデルで，BMI，Alb，FIM のいずれも有意な関連性を認め，判別的中率は25.0% であった。モ
デル 2 は歯科口腔外科初診時に得た情報を加えたモデル
で，いずれも有意な関連性を認め，判別的中率は74.0% であった。歯科初診時に得られた情報を含めることで判別的
中率の大幅な向上が認められた。

考した患者に限定していたことに加えて，対象者のほとんど

察が後期高齢者であり，年齢層が狭かったことが関係してい誤嚥性肺炎患者の中長期的生命予後について調査した先ると考えられる。本調査は対象を高齢者に限定したわけで行研究では，誤嚥性肺炎患者の半数以上が 1 年以内に死亡はないが，誤嚥性肺炎が高齢者に多い疾患であるとともし，生命予後を悪化させるリスク因子として高齢，男性，に，本調査を行った病院が高齢者の多い地域であったこと

嚥下機能低下，BMI 低下を挙げている 。本研究では，も対象者の年齢層に影響したと考えられる。

17）

生存退院群と死亡退院群の比較において年齢と性別に有意入院患者に対して歯科介入および摂食嚥下リハビリテー

差は認められなかった。これは本調査が急性期病院に入院

ションを早期に開始することで，誤嚥性肺炎のリスクの低45

誤嚥性肺炎患者の生命予後の関連する因子
表5
BMI（平均 ± SD kg/m²）

令和 5 年 6 月

生存退院群と死亡退院群との比較
生存退院群（n = 70）

死亡退院群（n = 26）

p値

18.51 ± 3.50

15.68 ± 2.00

＜0.001＊

Alb値（平均 ± SD g/dl）

3.00 ± 0.53

2.59 ± 0.57

＜0.001＊

FIM合計（中央値,［四分位範囲］）

23［18‐33］

18［18‐18］＜0.001＊

FIM運動（中央値,［四分位範囲］）

15［13‐21.5］

13［13‐13］＜0.001＊

FIM認知（中央値,［四分位範囲］）

8.5［5‐17］5［5‐13］＜0.001＊歯数（平均 ± SD 本）

11.1 ± 9.2

11.88 ± 9.3

0.854

1.4/ 1.4 / 1.4 / 1.4 / 0 / 4.3 / 5.7 /4.3 / 8.6 / 15.7

0 / 11.5 / 0 / 7.7 / 7.7 / 19.2 / 0 /7.7 / 7.7 / 38.5

0.453

Eichner分類（%，A1/A2/A3/B1/B2/B3/B4/C1/C2/C3）

22.0［12.6‐27.9］

14.4［5.0‐27.8］0.286

口腔内細菌数レベル（中央値,［四分位範囲］）

口腔乾燥値（中央値,［四分位範囲］）

4［3‐5］

5［4‐6］＜0.001＊

兵頭スコア（中央値,［四分位範囲］）

6［5‐8］

8［7‐9］＜0.001＊

嚥下グレード（中央値,［四分位範囲］）

6［4‐7］

3［2‐3］＜0.001＊

BMI：body mass index，Alb：血清アルブミン，FIM：functional independence measure＊p < 0.01
表 6 死亡退院を従属変数としたロジスティック回帰分析
説明変数

偏回帰係数

p値

オッズ比

BMI

0.036

0.007＊

Alb

0.194

0.012＊

FIM

0.008

BMI
Alb

95%の信頼区間
下限

上限

0.270

1.168

1.807

0.246

1.671

9.620

0.041＊

0.203

1.049

1.574

0.373

＜0.001＊

1.453

1.168

1.807

1.389

0.002＊

4.010

1.671

9.620

FIM

0.251

0.016＊

1.285

1.049

1.574

口腔内細菌数‒0.913＊＜0.001

0.401

0.256

0.629

兵頭スコア

‒0.565＜0.001＊

0.568

0.422

0.764

嚥下グレード

0.963＜0.001＊

2.620

1.737

3.951

モデル 1

モデル 2

BMI：body mass index，Alb：血清アルブミン，FIM：functional independence measure＊p < 0.05

減と在宅復帰率の向上が認められる18）。本研究では，生存頭スコアと嚥下グレードを用いた。兵頭スコアは VE 所見

退院群と死亡退院群との比較において歯科介入までの期間

から咽頭期を中心とした嚥下機能における感覚入力や嚥下に有意差は見られなかった。これは，本調査の対象者に介中枢，運動出力の各機能を包括的に評価したスケールであ入開始が遅れた例がほとんどなかったことを示すと考えらる。一方で，嚥下グレードは，評価時点の摂食嚥下障害患れる。

者の栄養摂取方法を評価するため，患者の嚥下機能のみな歯数については，長期的には歯数が多い方の生命予後がらず認知機能や意識状態，耐久性等も評価に影響する。実

良いことが報告されている 。欠損歯数が多くなることで，際に今回の対象者の中には，経口摂取可能な摂食嚥下機能

食物繊維やタンパク質，ビタミンおよびミネラルの摂取量を有していたが，全身状態を考慮して経口摂取が見送られが減少し，栄養状態が不良になることでサルコペニア

たことで評点が低くなったケースもあった。誤嚥性肺炎患

24）

あるいはフレイルに移行しやすくなるといわれている 。

者の中長期的な生命予後に関係する因子を調べた先行研究

ただし，本研究では調査期間が短期間であったことに加では，摂食嚥下機能の評価スケールの一つである摂食嚥下

え，栄養不足は経管または輸液で補える環境にあったた障害臨床的重症度分類のみを用いて評価されている17）。今

め，歯数の影響は少なかったと考えられる。

回の調査で兵頭スコアと嚥下グレードのいずれも生命予後

19）20-23）

口腔乾燥は，緩和ケア受療がん患者の生命予後との関連と関連性を認めたことから，全身状態も含めた複合的な経性について報告されているが25），今回の研究では有意差を口摂取能力の低下が誤嚥性肺炎患者の生命予後に悪影響を認めなかった。これは対象者の主疾患の違いによるものと及ぼすことが示唆された。

考えられる。ただし，口腔乾燥は日内変動があるうえに，摂食嚥下障害を有する高齢患者の生死に関連する因子を対象者の精神状態の影響も受けるため ，今後さまざまな調査した研究において，入院時に低栄養がある場合，予後測定条件のもとで検討することが必要である。

不良となる可能性が高いことが報告されている10）。さらに，

26）

嚥下機能の低下については，本研究では VE を用いて兵別の調査では高齢者の肺炎の重症化に関わるリスク因子と

46

日大歯学

第 97 巻第 1 号

して，栄養摂取不良と免疫能の低下が報告されている27）。

可能性が考えられる。調査を行った病院では，経口摂取の本研究では栄養状態の指標として BMI と Alb を測定し有無や全身状態にかかわらず，自力清掃困難な患者に対した。Alb の基準値は3.9 g/dL 以上とされており，3.5 g/dLて看護師が 1 日 3 回の口腔ケアを行っているが，生存退院

以下は低栄養の疑いがある。本研究において，BMI と群と死亡退院群で口腔内細菌レベルに有意な差が認められ

Alb のいずれも死亡退院患者は生存退院患者に比べて低値た。これまでに，ADL や嚥下機能が低下している患者でであったことから，栄養状態の不良が誤嚥性肺炎による入は，口腔清掃状態が不良になりやすいことが報告されてい院患者の短期的な生命予後に影響を及ぼすことが示唆される37）。また，誤嚥性肺炎患者の口腔内細菌と栄養状態とのた。

間に有意な関連性があることが報告されている38）。つまり，

さらに本調査では，死亡退院群において入院時の FIM

ADL や嚥下機能が低下した患者や栄養状態が不良な患者の低値が認められ，ADL が生命予後と関連していること

では，口腔衛生状態も不良になりやすいと考えられる。本が示唆された。先行研究でも，急性期病院に誤嚥性肺炎で研究で用いた細菌カウンタは，ベッドサイドで簡便かつ迅入院した患者の退院時転帰に，入院時の ADL が関連する

速に検査が行えるため，口腔衛生状態を把握するのに有用ことが報告されている 。また，ADL と摂食嚥下機能の低である。そのため，細菌カウンタを活用して定期的に口腔下は，誤嚥性肺炎の発症に影響する因子とされている29）。

内細菌レベルを評価し，リスクの高い患者には歯科衛生士

ADL は摂食嚥下機能に影響を及ぼし，とくに座位能力のによる専門的口腔ケアを徹底して行うことが必要と考えら

獲得は，体幹と頭頸部を安定させ，摂食嚥下運動に有利にれる。地域包括ケアを推進する急性期病院の歯科は，誤嚥働くと考えられている30）。本調査において，死亡退院患者

性肺炎患者の口腔内環境を改善する役割を担うとともに，の入院時の FIM は有意に低く，摂食嚥下機能に悪影響を入院初期から多職種と連携して栄養状態や ADL の維持・与えた可能性が考えられる。そのため，誤嚥性肺炎患者に回復に注力し，嚥下機能評価のもとリハビリテーションに対しては，摂食嚥下リハビリテーションに加えて，早期か積極的に介入していくことが重要である。ただし，本調査

ら ADL の改善のために理学療法および作業療法も行う必は急性期病院入院期間内での検討であり，退院後の死亡リ要があると考えられる。

スク因子について検討できていない。そのため，誤嚥性肺28）

本研究で行ったロジスティック回帰分析の結果では，栄炎で入院した患者が，転院もしくは退院後にどのような経養状態，ADL，経口摂取能力を調整しても口腔内細菌レ過をたどるかについては，今後の検討が必要である。

ベルに有意な関連性が認められた。そのため，口腔内細菌

結数が死亡退院のリスク因子となることが示唆された。過去論に Yoneyama ら31）が行った高齢者施設での介入研究にお誤嚥性肺炎患者の生命予後に影響する因子を明らかにすいて，専門的口腔ケアを行った群で発熱や肺炎発生率が有る目的で，誤嚥性肺炎が原因で入院した患者を生存退院群

意に減少したことが報告された。それ以降，我が国では専と死亡退院群に分け，年齢，性別，入院時の FIM，入院

門的な口腔ケアを行うことが肺炎予防に効果的であること

日から歯科口腔外科初診日までの期間，入院時の Alb 値が一般的に知られるようになった。その後，要介護者の口と BMI，咬合支持域，口腔乾燥値，口腔内細菌レベル，

腔内プラークの66% に肺炎起因菌が検出されたという報兵頭スコア，および嚥下グレードを比較した。その結果，

告や肺炎により禁食対応となった患者の口腔内からは肺炎

以下の結論を得た。

起因菌の Pseudomonas aeruginosa が高い頻度で検出され

1 ．Alb と BMI は，死亡退院群は生存退院群に比べて有たことが報告された。 さ ら に， 歯 周 病 細 菌 で あ る意に低かった。

32, 33）Porphyromonas gingivalis や Prevotella intermedia の産生

2 ．FIM は，運動項目と認知項目のいずれも死亡退院群したタンパク質分解酵素が咽頭粘膜のウイルスレセプターは生存退院群に比べて有意に低かった。

を露出させることで，呼吸器感染症を引き起こす可能性が3 ．口腔内細菌レベルは，生存退院群に比べて死亡退院群あることが報告されており34），近年では口腔内細菌が肺炎が有意に高かった。

の原因になると考えられている。板橋 は，誤嚥性肺炎を4 ．嚥下機能を評価した兵頭スコアは，死亡退院群は生存発症した高齢者には嚥下機能の低下が根底にあり，肺炎発

退院群に比べて有意に高く，嚥下グレードは，生存退35）症後も微量の誤嚥（microaspiration）を繰り返す症例で予院群に比べて死亡退院群が有意に低かった。

後不良になりやすいと述べている。また，Kikuchi ら36）は，

5 ．年齢，性別，基礎疾患の保有割合，入院日から歯科口肺炎に罹患した高齢者の71% が睡眠中に不顕性誤嚥を起腔外科初診日までの期間，歯数，咬合支持域，口腔乾こしていたことを報告している。本研究において，入院中

燥値には有意差は認められなかった。

に死亡した患者は嚥下機能の低下に加えて口腔内細菌が多以上のことから，誤嚥性肺炎で入院した患者のうち，入い と い う 特 徴 が あ っ た こ と か ら， 口 腔 内 細 菌 の院中に亡くなった患者は入院時の栄養状態の不良，ADL

microaspiration を繰り返したことで生命予後に影響したの低下，歯科初診時の嚥下機能の低下，口腔内細菌数の増47

誤嚥性肺炎患者の生命予後の関連する因子

加といった特徴があり，これらが生命予後に影響する可能247-257.
18）稲次基希，戸原 玄，古屋純一，沼沢祥行，三木一徳，泉山肇，水口俊介，前原健寿（2018）脳卒中急性期から慢性期までの一貫した歯科介入体制構築の試み . Neurosurg Emerg
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19）Watanabe Y, Okada K, Kondo M, Matsushita T, Nakazawa S,
Yamazaki Y (2020) Oral health for achieving longevity.
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20）N owjack-Raymer RE, Sheiham A (2003) Association ofedentulism and diet and nutrition in US adults. J Dent Res
82, 123-126.
21）Nowjack-Raymer RE, Sheiham A (2007) Numbers of natural
teeth, diet, and nutritional status in US adults. J Dent Res 86,
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22）Sahyoun NR, Lin CL, Krall E (2003) Nutritional status of theolder adult is associated with dentition status. J Am Diet
Assoc 103, 61-66.
23）Ervin RB, Dye BA (2009) The effect of functional dentition
on Healthy Eating Index scores and nutrient intakes in anationally representative sample of older adults. J Public
Health Dent 69, 207-216.
24）Senoo S, Iwasaki M, Kimura Y, Kakuta S, Masaki C, Wada T,
Sakamoto R, Ishimoto Y, Fujisawa M, Okumiya K, Ansai T,
Matsubayashi K, Hosokawa R (2020) Combined effect of poor
appetite and low masticatory function on sarcopenia incommunity-dwelling Japanese adults aged
75 years: A
3-year cohort study. J Oral Rehabil 47, 643-650.
25）寺田 泉，松山美和，山田博英，大野友久（2020）緩和ケア
受療がん患者の生命予後予測と口腔内状況 . 老年歯医 35，7582.
26）福 島洋介，依田哲也，荒木隆一郎，堀 直子，古株彰一郎，
坂田康彰，小林明男（2009）健常者における口腔粘膜湿潤度の時間的変動に関する実験的検討 . 日口腔粘膜会誌 15，15-21.
27）本田一陽，桜井 誠，千田圭二，阿部憲男，清水 博（2002）
高齢者肺炎の重症化・難治化に関わる臨床要因，医療 56，
200-204.
28）千葉佐保子，小磯秀夫，三ツ村隆弘，石渡康夫（2020）高齢者における肺炎の予後に対する誤嚥リスクと誤嚥性肺炎治療
後の自宅退院不能例に関する因子の検討 . 日呼吸ケアリハ会
誌 29，341-345.
29）三 谷有司，沖 侑大郎，藤本由香里，山口卓巳，山田洋二，
山田莞爾，岩田優助，石川 朗（2019）医療介護関連肺炎における発症要因と時間解析の検討 . 日呼吸ケアリハ会誌 28，108-112.
30）若尾 勝，福光英彦，田中勇治，徳村拓哉，星 虎男（2014）
座位能力，摂食嚥下機能および尿失禁の関連性についての検討 . 理療科 29，377-381.
31）Yoneyama T, Yoshida M, Matsui T, Sasaki H (1999) Oralcare and pneumonia. Oral Care Working Group. Lancet 354,515.
32）角 保徳，譽田英喜，道脇幸博，砂川光宏，佐々木俊明（2003）
要介護高齢者のプラーク内の肺炎起炎菌 . 老年歯医 17，337341.
33）前田惠利，中本幸子，池田 匠，西村直子，芦立典子，平松喜美子（2011）高齢在宅療養者の口腔内微生物―経口摂取群と非経口摂取群における検討―. 日看科誌 31，34-41.
34）奥田克爾（2006）Porphyromonas gingivalis 感染と歯周病および全身疾患の発症 . 化療の領域 22，585-596.
35）板橋 繁（2006）高齢者の誤嚥性肺炎とその対策 . 日摂食嚥
下リハ会誌 10，193-206．

性があることが示された。
稿を終えるにあたり，本研究に際し終始懇篤なるご指導およびご校閲を賜りました日本大学歯学部摂食機能療法学講座の植田耕一郎教授および中山渕利准教授に深く感謝の意を表します。あわせて日頃ご助言ご鞭撻頂きました本学部摂食機能療法学講座員各
位に深く感謝致します。
本論文に関して，開示すべき利益相反はありません。

文

令和 5 年 6 月

献1）厚 生労働省 . 令和3年（2021）人口動態統計月報年計（概数）の 概 況 . https://www.mhlw.go.jp/toukei/saikin/hw/jinkou/
geppo/nengai21/dl/gaikyouR3.pdf（2022年11月30日アクセス）2）T eramoto S, Fukuchi Y, Sasaki H, Sato K, Sekizawa K,
Matsuse T ; Japanese Study Group on Aspiration Pulmonary
Disease (2008) High incidence of aspiration pneumonia incommunity- and hospital-acquired pneumonia in hospitalized
patients. A multicenter, prospective study in Japan. J Am
Geriatr Soc 56, 577-579.
3）藤島一郎，清水一男（2002）口から食べる嚥下障害 Q&A. 第3版，中央法規出版，東京，52-61．
4）藤島一郎，柴本 勇（2004）摂食・嚥下リハビリテーション .
中山書店，東京，10-21．
5）聖隷三方原病院嚥下チーム（2001）嚥下障害ポケットマニュ
アル . 医歯薬出版，東京，25-122．
6）小山珠美（2005）経口摂取標準化ガイド . 日総研出版，名古屋，127-305．
7）勝田芙紗，平岡 崇，椿原彰夫（2008）摂食・嚥下障害と誤嚥性肺炎 . 歯臨研 5，29-37.
8）才 藤栄一，植田耕一郎，出江紳一，鎌倉やよい，熊倉勇美，
弘中祥司，藤島一郎，松尾浩一郎，山田好秋（2016）摂食嚥
下リハビリテーション . 第 3 版，医歯薬出版，東京，252-256.
9）Maeda K, Koga T, Akagi J (2016) Tentative nil per os leads
to poor outcomes in older adults with aspiration pneumonia.
Clin Nutr 35, 1147-1152.
10）坂口紅美子，原 修一（2018）高齢な誤嚥性肺炎患者の生命予後に関連する因子 . 日摂食嚥下リハ会誌 22，136-144.
11）Koyama T, Matsumoto K, Okuno T, Domen K (2005) A new
method for predicting functional recovery of stroke patientswith hemiplegia; logarithmic modelling. Clin Rehabil 19, 779789．
12）鳥巣哲朗（2017）歯の喪失ならびに口腔機能低下が高齢者の健康状態に及ぼす影響 . 日補綴歯会誌 9，285-290.
13）齊 藤 美 香， 小 野 由 起 子， 北 村 信 隆， 山 口 雅 庸， 齊 藤 力（2008）高齢者の口腔粘膜水分量に関する研究 第 1 報 口腔水分計の測定精度の評価 . 老年歯医 23，90-96.
14）大口景子，大下尚克，岸本崇史，金田桂典，冨士谷盛興，千田 彰（2013）歯垢内細菌数測定器の臨床的有用性―口腔の清潔程度の評価―. 日歯保存誌 56，588-599.
15）兵頭政光，西窪加緒里，弘瀬かほり（2010）嚥下内視鏡検査におけるスコア評価基準（試案）の作成とその臨床的意義 .
日耳鼻 113，670-678.
16）藤 島一郎，谷口 洋（2017）脳卒中の摂食・嚥下障害 . 第 3版，歯薬出版，東京，72.
17）塚谷才明，小林沙織，金原寛子，山本美穂，長東菜穂，酒井尚美，中村さおり，小林孝行，兼田美紗子，牧野桜子，赤田拓子，岡部克彦，小森 岳，高塚茂行（2020）誤嚥性肺炎患者の中長期的生命予後と予後因子 . 日摂食嚥下リハ会誌 24，

48

日大歯学

36）Kikuchi R, Watabe N, Konno T, Mishina N, Sekizawa K,
Sasaki H (1994) High incidence of silent aspiration in elderly
patients with community-acquired pneumonia. Am J Respir
Crit Care Med 150, 251-253.
37）N akayama E, Tohara H, Sato M, Abe K, Kimura M,
Watanabe M, Iida M, Ueda K (2020) Relationship between

第 97 巻第 1 号

oral intake level and oral health assessment tool scores in
the convalescent ward. J Oral Sci 63, 79-82.
38）篠原治征，杉浦 正，笹谷賀子，大澤幸治，堀川直樹（2017）
急性期病院における誤嚥性肺炎患者の口腔内細菌叢と栄養状態に関する研究 . 日静脈経腸栄会誌 32，1334-1339.

49日本大学歯学会会則
（名称）
第１条

本学会の名称は，日本大学歯学会（Nihon University Society of Dentistry）とし，その事務局を日本大学歯学部内に置く。

（目的）
第２条

本学会は，歯科医学及びこれに関連する学術領域の進歩を図り，もって国民の健康に寄与することを目的とする。

（事業）
第３条

本学会は，次の事業を行う。

①

会員の研究成果を発表するため，学術大会を原則として年１回開催する②

会員の研究成果を公表するため，機関誌「日大歯学」を発行し，会員に配布する③

本学会の対象とする学術領域における研究業績に対し表彰を行う。ただし，表彰規定は別に定める④

その他，本学会の目的を達成するために必要な事業を行う（会員の構成）
第４条①

本学会は，次の会員で構成する。

正会員

第２条の目的に賛同する個人で，理事会において承認された者（日本大学歯学部の教員，研究講座員，研究生，研究員ならびにポスト・ドクトラル・フェロー等）②

学生会員

第２条の目的に賛同する学生で，理事会において承認された者。

ただし，学生会員に関わる必要事項は別に定める③

法人会員

第２条の目的に賛同し，理事会において承認された法人または団体

④

名誉会員

本学会の活動に特に功労があった理事経験者で，常任理事会で推薦され，理事会において承認された者（入会の手続き）
第５条

本学会に入会を希望する者は，所定の申込書に必要事項を記入し，本学会事務局に申し込むものとする。

（退会等の手続き）
第６条

会
 員が退会を希望する場合または会員の姓名，連絡先等の届出事項に変更が生じた場合は，すみやかに本学会事務局に届け出るものとする。

２

日本大学大学院歯学研究科の大学院生の在学中の退会は認めない。

３

退会者には，納入済の当該年度会費を返還しない。

（会員資格の喪失）
第７条

正会員，学生会員及び法人会員は，次の各号のいずれかに該当する場合は，理事会で審議の上，その資格を取り消すことができる。

①

退会届を提出し，受理された場合②

１年間以上会費を未納した場合③

第２条の本学会の目的に反する行為を行い，本学会の名誉を傷つけた場合（役員の構成）
第８条

本学会の運営を円滑にするため，次の役員を置く。

①

会長

１名

②

副会長

１名

③

常任理事

若干名

④

理事

若干名

⑤

監事

若干名

⑥

評議員

若干名

⑦

幹事

若干名

（役員の職務）
第９条

役員の職務は以下の各項による。

２

会長は，本学会を代表し，会務を統括する。

３

副会長は，会長を補佐し，会長に事故あるときは，その職務を代行する。

４

常任理事は，総務，集会，会計，編集の各会務を担当する。
①

総務担当常任理事は，会員の入退会に関する事項，総会ならびに役員会に関する事項，その他，本学会の運営全般に関わる会務を担当する②

集会担当常任理事は，総会ならびに学術大会の運営に関する会務を担当する③

会計担当常任理事は，本学会の予算・決算に関する会務を担当する④

編集担当常任理事は，編集委員会を招集し，機関誌「日大歯学」の編集・刊行に関する事項を担当する

５

理事は，本学会の会務に関する重要事項を審議する。

６

監事は，本学会の各事業および会計を監査する。

７

評議員は，理事会から提案された案件について，評議，決定する。

８

幹事は，常任理事の担当する会務を補佐する。

（役員の委嘱）第 10 条役員の委嘱は次のとおりとする。

①

会長は，歯学部長がこれに当たる②

副会長は，会長が委嘱し，総会において承認する③

常任理事は，会長が委嘱し，総会において承認する④

理事は，会長が専任教授に委嘱し，総会において承認する⑤

監事は，会長が専任教授に委嘱し，総会において承認する⑥

評議員は，会長が専任教授及び専任准教授，若しくは当該講座の代表１名に委嘱し，総会において承認する⑦

幹事は会長が委嘱する（役員の任期）
第 11 条

役員の任期は，次のとおりとする。

①

会長の任期は，学部長在任期間と同一とする。

②

常任理事および監事の任期は1年とする。ただし，副会長，編集担当常任理事および監事については再任を妨げない。

③

会計・集会・総務担当常任理事については，この順序で同一の理事が１年ずつ続けて担当する。任期は最長で計3年とする。

④

理事，評議員，および監事の任期は1年とする。ただし，再任を妨げない。

（会議）
第 12 条

本学会は第２条の目的を達成するため，次の会議を開催する。

①

総会

②

役員会

③

編集委員会

（総会・学術大会）
第 13 条総会・学術大会は，会長の招集により，年１回５月に開催する。ただし，会長が必要と認めたときは，臨時総会を開催することができる。

（役員会）
第 14 条２

役員会は，常任理事会，理事会及び評議員会とし，第８条に定める役員をもって構成する。

常任理事会，理事会及び評議員会は，会長が随時召集し，総務担当常任理事がその議長を務める。

（編集委員会）
第 15 条２

編集委員会は，投稿原稿の査読，雑誌の編集および刊行，投稿規定の作成，その他の機関誌編集に関する業務を担当する。

編集委員会は，常設委員会とし，その委員は編集担当常任理事が推薦し，会長が委嘱する。

（経費）
第 16 条本学会の経費は，会費，寄付金およびその他の帰属収入をもって支弁する。

（会費）
第 17 条会費は，正会員

年額 5,000 円，学生会員

年額 2,000 円とし，年度当初に納入する。ただし，研究講座員については入室時に一括して 100,000 円を納入する。なお，名誉会員の会費は免除する。
２

日本大学口腔科学会の会員は当日会費 3,000 円をもって，本学会において発表することができる。

（会計）第 18 条２

本学会の予算・決算は，理事会及び評議員会の議決を経て，総会の承認を得なければならない。

本学会の会計年度は，毎年４月１日から翌年３月３１日までとする。

（会則の変更）第 19 条

この会則を改正する場合は，理事会及び評議員会の議を経て，総会の承認を得なければならない。

附則
改正年月日
昭和 32 年 ４ 月 １ 日

制定（昭和 32 年 ４ 月 １ 日 施行）

平成 ６ 年 ５ 月 22 日

一部改正 （平成 ７ 年 １ 月 １ 日 施行）

平成 ８ 年 ５ 月 26 日

改正

（平成 ８ 年 ４ 月 １ 日 施行）

平成 13 年 11 月 25 日

改正

（平成 13 年 11 月 25 日 施行）

平成 14 年 ５ 月 18 日

改正

（平成 14 年 ５ 月 18 日 施行）

平成 15 年 ５ 月 18 日

改正

（平成 15 年 ５ 月 18 日 施行）

平成 16 年 ５ 月 22 日

改正

（平成 16 年 ５ 月 22 日 施行）

平成 18 年 ５ 月 20 日

改正

（平成 18 年 ５ 月 20 日 施行）

平成 19 年 ５ 月 19 日

改正

（平成 19 年 ５ 月 19 日 施行）

平成 22 年 ５ 月 15 日

改正

（平成 22 年 ５ 月 15 日 施行）

令和 ５ 年 ５ 月 21 日

改正

（令和 ５ 年 ５ 月 21 日 施行）

日本大学歯学会表彰規定
平成 ８ 年 ５ 月 26 日制定
令和 ４ 年 ６ 月 20 日改正
第１章
第１条

総則

日本大学歯学会会則第３条第３項に基づく，学術領域における研究業績に対する表彰または奨励（以下選奨という）に関する事項は，この定めによる。

第２条

選奨は次のとおりとする。
日本大学歯学会奨励賞（以下奨励賞という）第３条

前条の選奨の候補者を選考するため，選考委員会を置く。

第４条

選奨の受賞者は選考委員会の議を経て，理事会において決定する。また，受賞者の所属，氏名，演題名を翌年の総会で公表
する。

第５条

選奨は副賞を総会その他の適当な機会において贈呈する。
第２章

第６条

日本大学歯学会奨励賞

奨励賞は，優れた若手研究者を育成する目的で, 本学会総会・学術大会において優秀な発表を行い，かつ，次の各号に該当する者に授与する。
①

選考の時期に本学会員である者②

講演の時期において 35 歳以下の者③

過去に奨励賞を受賞していない者

第７条

奨励賞の受賞者は原則５名以内とする。ただし，理事会の議決により受賞者数を変更することができる。

第８条

選考の対象となる演題は，表彰の時期の前年の本学会総会・学術大会において発表されたものに限る。

第９条

奨励賞は副賞として 20,000 円を贈呈する。
第３章

選考委員会

第 10 条

第３条による選考委員会は，奨励賞選考委員会とする。

第 11 条奨励賞選考委員会の委員は，会長が理事の中から若干名を指名した後，理事会の承認により決定する。

第 12 条奨励賞選考委員会は, 理事会において選奨の受賞者が決定したときをもって解散する。
第４章

第 13 条

規定の改正

この規定を改定する場合は, 理事会において決定し，総会に報告することとする。
附則

この規定は，令和４年４月１日から施行する。
平成 ８ 年 ５ 月 26 日制定

平成 ８ 年 ４ 月 １ 日施行

平成 19 年 ５ 月 19 日改正

平成 19 年 ５ 月 19 日施行

平成 22 年 ５ 月 15 日改正

平成 22 年 ５ 月 15 日施行

令和 ２ 年 ５ 月 ７ 日改正

令和 ２ 年 ４ 月 １ 日施行

令和 ４ 年 ６ 月 20 日改正

令和 ４ 年 ４ 月 １ 日施行

「日 大 歯 学」投 稿 の 手 引 き

2022 年（令和４年）４月

日 本

大

学

歯

日大歯学編集委員会

学会

「日大歯学」投稿の手引き
日大歯学への投稿にあたっては本誌の投稿規定ならびにこの手引きに従う。

１. 論文の形式

1）原著論文は原則として和文と英文の表紙，和文と英文の要旨，本文（緒言，材料および方法，結果あるいは成績，考察，結論），文献，図（写真）・表の説明文の順とし，表紙から通しページ番号をつける。原著論文以外の総説，
症例報告なども，原則としてこれに準ずる。
2）原稿は A4 判用紙を用い，1 頁当たり 40 字× 20 行，12 ポイントの文字で印字する。余白は天地左右 25 mm 程度とする。
3）論文の形式は最新号の雑誌を参照すること。

２. 倫理規定1）人（資料・情報を含む）を対象とする臨床研究，疫学研究に関しては「人を対象とする医学系研究に関する倫理指針」に従ったものでなければならない。研究対象者および患者からインフォームドコンセントを得ていること，また所属機関の倫理委員会の承認を得ていること（承認年月日，承認番号を含む）を明記しなければならない。また，発表資料等から研究対象者が特定されることがないように，匿名化されている情報（特定の個人を識別することができないものであって，対応表が作成されていないものに限る）にするなど，個人情報の保護を徹底すること。
2）ヒトゲノムあるいは遺伝子解析に関する研究の場合には，「ヒトゲノム・遺伝子解析研究に関する倫理指針」および「遺伝子治療臨床研究に関する指針」に従ったものでなければならない。研究対象者および患者からインフォー
ムドコンセントを得ていること，また所属機関の倫理委員会の承認を得ていることを明記しなければならない。
投稿にあたり被験者全員の同意文書を添付する。また，発表資料等から研究対象者が特定されることがないように，匿名化されている情報（特定の個人を識別することができないものであって，対応表が作成されていないものに限る）にするなど，個人情報の保護を徹底すること。
3）動物を対象とする研究の場合には，「動物の愛護及び管理に関する法律」等を遵守した上で，各研究機関が定める
ガイドラインに従って，動物実験等を適正に実施しなければならない。本文中に所属機関および実施機関の動物実験委員会等の承認を得ていること（承認年月日，承認番号を含む）を明記しなければならない。

３. 表紙1）和文表紙には，中央上段から表題，著者氏名，所属機関名，責任著者連絡先，40字以内のランニングタイトルを記載する。
2）英文表紙には，中央上段から表題，著者氏名，所属機関名，責任著者連絡先，10 words以内のランニングタイト
ルを記載する。
3）表題は，研究の主題を具体的かつ簡潔に表現する。また，論文を数報に分けて発表するときは，その研究の主題の次に内容を具体的に表す副題を付ける。英単語は固有名詞・略語等を除き，小文字で表記する。
4）英文表題は冠詞，前置詞，接続詞などの付属語ならびに慣用の特殊語を除き，単語の先頭文字を大文字，以下を小文字で記す。また，ハイフンでつながる複合語の場合，ハイフンの後は小文字で記す。
5）著者名の表記（旧字，異体字）は著者自身が指定する。また，著者の所属機関が異なる場合は氏名の右肩に数字を付け，所属の左肩にも数字を付ける。指導者が共著者に含まれない場合は（指導：）として別に表記することができる。英文では（Director(s):   ）とする。
6）責任著者連絡先は，和文・英文とも著者1名の氏名，所属機関，住所，TEL，FAX，e-mail を記載する。

４. 要旨およびキーワード1）和文の要旨は，1,000 字以内とし，目的，方法，結果（成績）および結論に分け，各見出しを付ける。最後に，研究の主題を的確に表現するキーワードを５個以内を記載する。
2）英文の Abstract は 400 words 以内とし，Purpose，Methods，Results，Conclusion に分け，各見出しを付ける。
最後に Key words ５つ以内を記載する。
3）Abstract は投稿者が十分に吟味し，必要に応じて英文校正者（歯科医学の専門知識を有することが望ましい）によるネイティブチェックを受けてから投稿すること。

５. 本文

1）構成
（1）本文：原則として緒言，材料および方法，結果，考察，結論の順に記述し，付番はしない。症例報告は原則として緒言，症例の概要，治療内容と経過，考察の順に記述する。各項目の中で付番する場合は 1.・2.・3.……，
1）・2）・3）……，（1）・（2）・（3）……，①・②・③……，a.・b.・c.……，の順とする（2）緒言：研究の背景や新規性，目的および研究の意義を簡潔に記述する。
（3）材料および方法は研究に用いた材料，方法，手順を，同一の方法で追試が行えるように詳細に記述する。製品
名，製造者名を原語で示す必要があれば，単語の先頭文字を大文字，以下を小文字とする。原則として，和文による論文では「一般名（製品名，会社名，海外製品は国名）」，英文による論文では「一般名（製品名，会社
1

名，都市名，（米国は州名，）国名）」のように記載する。なお，®やTMなどの商標登録表示は不要。
（4）結果（成績）：客観的事実のみを記述し，著者の主観を交えたような表現を避ける。図表を含めてわかりやすく
示し，使用する図表は必要最小限にとどめる。
（5）考察：研究から得られた結果を検討し，新知見，問題点，今後への展開などを明解に述べる。緒言との重複や結果の繰り返しの記載は避ける。
（6）結論：得られた結論のみを正確かつ簡潔に記述する。
2）表記（1）本 文はひらがなまじりの口語文章体（いわゆる「である体」）とし，常用漢字，現代仮名遣いを用いる。代名
詞，接続詞，副詞，助動詞などは仮名書きとする。
（2）和文では，句読点にはカンマ（ ，）とマル（ 。
）を使用する。英文では，カンマ（ , ）とピリオド（ . ）を使用する。
3）用語・単位等（1）学術用語は「文部省 学術用語集 歯学編（増訂版）」および各学会制定の用語を使用する。数字はアラビア数
字（算用数字）を用いる。ただし，数字を含む名詞などは漢字とする。
例）十二指腸，二次元，第一大臼歯（2）単位は原則として国際単位系（SI）を使用する｡（3）外国語の人名は，姓のみを記す。
（4）国名および地名は本文中では原則としてカタカナ，文献欄では原綴のままとする。外国語の書名は日本語に訳さず，原綴のままとする。
（5）学名二名法のものは，属名の単語の先頭文字を大文字，以下を小文字とし，イタリックで記す．たびたび使用する場合は，2 回目以後では属名を省略し，単語の先頭文字で表してさしつかえない。
例）Streptococcus mutans → S. mutans
4）謝辞，その他の特記事項および利益相反（1）研究補助金についての記載，謝辞およびその他の特記事項は結論の末尾に付記する。
（2）利 益相反（COI）状態が存在する場合，文献の前に利益相反と項目立てその旨を記載する。COIがない場合も「本論文に関して，開示すべき利益相反はない。」などと記載する。
5）英文による論文
英文による論文には，英文校正者（歯科医学の専門知識を有することが望ましい）によるネイティブチェックを受けたことを示す英文校正証明書を添付する（書式は問わない）。

６. 文献

1）文献は本文中の引用箇所に右肩上付きで引用番号を付け，引用順に本文末尾に所定の形式で記載する。
2）複数の文献をまとめて同一箇所に引用する場合は，年代の古い順に記載する。
3）やむを得ず，学会発表の抄録などを引用する場合は末尾に（抄録），発行前の雑誌論文を引用する場合は（印刷中），また英文の場合には（in press）と明記する。
4）本文中の文献呼び出しは，片括弧で，文の右肩に付す．2 つ引用する場合は「，」で，3 つ以上の場合は「-」でつなぐ。
例：「著者ら3）は」「〜ことが報告されている7,8）」「過去の研究10-15）では」＜雑誌＞

著者（発行年）表題. 掲載誌巻, ページ．

1）小川麻衣，高橋康代，伏木怜奈，堀貫恵利，馬谷原琴枝，清水典佳（2016）日本大学付属歯科病院歯科矯正科における実態調査−来院患者数およびその分布について−. 日大歯学90, 53-60.
2）Kurokawa H, Takamizawa T, Rikuta A, Tsubota K, Miyazaki M (2015) Three-year clinical evaluation ofposterior composite restorations placed with a single-step self-etch adhesive. J Oral Sci 57, 101-108.
＜単行本＞
著者（発行年）書名. 巻, 版, 出版社, 出版地, ページ.
分担執筆者（発行年）分担執筆表題，書名，巻，版，編者または監修者，出版社，出版地，ページ．
1）矢田純一（1997）医系免疫学. 改訂5 版, 中外医学社, 東京, 236-263.
2）宮崎真至（2015）MIの理念と接着. 接着歯学. 2版, 日本接着歯学会編, 医歯薬出版, 東京, 4-5.
3）Clark WG, Brater DC, Johnson AR (1992) Goth's medical pharmacology. 13th ed, Mosby, St Louis, 584-591.
4）Kaugars G (1991) Benign fibro-osseous lesions. In Oral & Maxillofacial Radiology. Miles DA, Kaugars GE,
Van Dis M, Lovas JGL eds, Saunders, Philadelphia, 125-153.
＜翻訳書＞
原著者（原綴りで）（原書の出版年）原書名巻，原書の版，原書の出版社，原書の出版地：翻訳者名
訳（出版年）翻訳書名翻訳書の巻または版．翻訳書の出版社，出版地，ページ．
21）White GE (1993) Osseointegrated dental technology. Quintessence, London: 前田芳信訳（1995）ホワイトのインプラント上部構造. クインテッセンス出版, 東京, 47-60.
その他の記述形式＜電子ジャーナル＞
原則として通常の雑誌論文と同様とするが，通巻ページが不明な場合はDOIなどを明記する。
1）Tsujimoto A, Barkmeier WW, Takamizawa T, Watanabe H, Johnson WW, Latta MA, Miyazaki M (2016)
Influence of duration of phosphoric acid pre-etching on bond durability of universal adhesives and surface
free-energy characteristics of enamel. Eur J Oral Sci, doi: 10.1111/eos.12284.
＜インターネットウェブサイト＞
発行元．記事名．ウェブサイトアドレス（アクセス日）.
1）厚 生労働省．平成23年歯科疾患実態調査現在歯数および1人平均値歯種・年齢別（5歳以上・永久歯）．
http://www.mhlw.go.jp/toukei/list/dl/62-17c23-l.pdf（2012年12月20日アクセス）

７. 図（写真）および表1）図（写真）および表は本文と別にし，図の場合は下方に，表の場合は上方にそれぞれ図表番号（例：図1，Fig. 表
1，Table 1）と表題を付記し，別に説明文（英文でも可）を作成する。
2）図（写真）および表はそのまま製版できるように鮮明なものを用意し，縮小率を指定する。図をカラー印刷希望の場合にはカラーデータを，モノクロ印刷希望の場合にはモノクロデータを添付する。また，データ形式は可能な限りjpgとし，画像サイズはレイアウトに対応する大きさとする。画面解像度については写真の場合 300 dpi 以
上，線画の場合1,200 dpi 以上にすること。
3）図中に挿入する文字などは縮刷後も判読できる大きさで記入し，判読できるよう注意する。
4）顕微鏡写真および被写体の大きさを明示する必要がある場合はスケールを写真に入れる。
5）個人の顔写真を掲載する場合は「目隠し」を施すなど，その人物が特定できないよう配慮する。

８. ファイル作成上の注意

1）英字・数字（英文中の「,」「.」を含む）はすべて半角，漢字・仮名・句読点は全角で入力する。
2）本文中の数字と単位記号（「°
C」「%」は除く）の間は半角分のスペースを空ける。
3）図表データを添付する場合は，作成に際して用いたソフト名およびバージョンを記載する。
4）ファイルを分割して作成した場合は原稿の記載順に，ファイル名に連番を付ける。

９. 投稿原稿の送付

・原稿と電子記録媒体による投稿の場合
1）投稿原稿は投稿申込用紙等，表紙，要旨，本文，文献の順に重ね，表紙から通しページ番号をつける。
2）図および表は番号順に重ね，それぞれ別に綴じる。
3）投稿論文はオリジナルを１部（図，表，写真を含む）送付する。写真については原図とする。
4）送付にあたっては図，表，写真，F電子記録媒体を損傷しないように十分に注意する。
5）投稿原稿は学会事務局へ提出あるいは郵送する。
6）掲載された投稿原稿は返却しない。
・電子投稿（e-mail）による場合
1）原稿（表紙，要旨，本文，文献）は，Microsoft Office Word（以下 Word）形式とする。
2）図は，jpg または pdf 形式とする。
3）表は，Microsoft Office Excelまたは Word 形式とする。
4）ファイル名は，和文で「著者名」_「講座名」_「原稿・図・表・投稿申込用紙」_ そしてファイル種類を表す「.拡張子」とする。 例）日大太郎 _ 歯科保存学Ⅰ_原稿.doc
5）e-mail の件名（Subject）は，日大歯学投稿論文とする。
6）pdf 形式にした投稿申込用紙，確認書，チェックリスト，承諾書，そして投稿原稿と図および表（英文による論
文では英文校正証明書）は日大歯学編集委員会の e-mail アドレス（de.shigakukai@nihon-u.ac.jp）に送付する。
・投稿申込用紙，確認書，チェックリスト，承諾書は，日本大学歯学会のHP「日大歯学」からダウンロードしてください。

3日大歯学投稿申込用紙

日大歯学編集委員長 殿
種類
○原著
		
		
		
表題

・学位論文 １
（主論文）
・〃 （総括論文）
・副論文
・上記以外

年

月

○総説
○症例
○その他

著者（共著者もすべて会員であること）
所属
投稿・校正責任者〒
氏名㊞

請求書送付先
〒
氏名

TEL
FAX
E-mail

（
（

）
）

TEL
FAX
E-mail

（
（

）
）

【提出物】

【提出方法】

本文

ファイル
枚 図表の
形式
（jpg）
等

図表（カラー）

枚 図表
（白黒）

枚

確認書

枚 チェックリスト枚

原稿と電子記録媒体
電子投稿（E-mail）【掲載証明書】
要・ 不要

どちらかに〇をつけてください【学位論文の場合】
学位論文は予備審査終了後に受け付けます。また，研究科分科委員会の審査終了後，修正があれば直ちに再提出をお願いいたします。学位論文に係る以下の日付をご記入ください。
予備審査終了日
年月
日
研究科分科委員会書類受理日
年月日
研究科分科委員会審査予定日
年月日＊＊＊ ＊＊＊ ＊＊＊ ＊＊＊ 以下は事務局で使用します ＊＊＊ ＊＊＊ ＊＊＊ ＊＊＊
受 付 日
掲載予定
日大歯学会事務局

年

月
巻 .

日
号

受付番号

Ｎ

―

会費納入状況

備考〒101-8310東京都千代田区神田駿河台1-8-13
日本大学歯学部研究事務課内		
E-mail: de.shigakukai@nihon-u.ac.jp

T e l: 03-3219-8060
Fax: 03-3219-8324

日日大歯学編集委員会

御中
確

認

書

「日大歯学」への投稿に際して，以下の内容に関して間違いがないことを証明するとともに，申告内容に虚偽があった場合には,いかなる責任をも負うことを確認いたします。
１．人を対象とする臨床研究，疫学研究に関しては「人を対象とする生命科学・医学系研究に関する倫理指針」に従ったものであること。研究対象者および患者からインフォーム
ドコンセントを得ていること，また所属機関の倫理委員会の承認を得ていること（承認年月日，承認番号を含む）を明記すること。投稿にあたり被験者全員の同意文書を添付し，発表資料等から研究対象者が特定されることがないように，特定の個人を識別することができないように個人情報を加工し，復元できないようにするなど，個人情報の保護を徹底すること。
２．ヒトゲノムあるいは遺伝子解析に関する研究の場合には，「人を対象とする生命科学・医学系研究に関する倫理指針に従ったものであること。研究対象者および患者からイン
フォームドコンセントを得るとともに，所属機関の倫理委員会の承認を得ていることを明記すること。投稿にあたり被験者全員の同意文書を添付するとともに，発表資料等か
ら研究対象者が特定されることがないように，特定の個人を識別することができないよ
うに個人情報を加工し，復元できないようにするなど，個人情報の保護を徹底していること。
３．動物を対象とする研究の場合には，「動物の愛護及び管理に関する法律」等を遵守した上で，各研究機関が定めるガイドラインに従って，動物実験等を適正に実施していること。本文中に所属機関及び実施機関の動物実験委員会等の承認を得ていること（承認年月日，承認番号を含む）を明記すること。
４．本論文はオリジナルであること，他の機関の著作権（著作財産権 copyright）も侵害しないこと，全著者が本投稿最終原稿を読み，投稿への承認を得ていること。
５．利益相反の有無を本文の最後に明記すること。利益相反のある場合には，関係した企業・団体名と具体的内容も明記すること（筆頭著者・共著者，全員が対象）。
論 文 表 題：年

筆 頭 著 者 氏 名：

  

月

日

㊞

チェックリスト
投稿原稿が投稿規定，投稿の手引きに沿ったものであるかを確認のうえ，左欄に「レ」
印を入れて下さい。

投稿者チェック□

著者はすべて本学会員で，年会費は納入していますか。

□

他誌に未発表・未掲載ですか。

□

表題，著者氏名，所属機関を記載していますか。

□

ランニングタイトルを記載していますか（和文40字，英文10word以内）。

□

著者連絡先は明記されていますか。

□

和文要旨（1,000字以内）を添付していますか。

□

英文Abstract（400word以内）を添付していますか。

□

キーワード（5個以内）を付記していますか。

□

A4版用紙に1頁当たり40字×20行，12ポイントの文字で印刷されていますか。

□

原稿には表紙から通しでページ番号がはいっていますか。

□

図（写真）および表はA4用紙を用い，縮小率が指定されていますか。

□

図（写真）および表には，図の場合は下方に，表の場合は上方にそれぞれ図表番
号（例：図1，Fig 1，表1，Table 1）と表題を付記し，別に説明文をつけていますか。

□

文献の表記は規定に沿って，引用順に記載されていますか。
論 文 表 題：年
筆 頭 著 者 氏 名：

月

日
㊞

承

諾

書

日本大学歯学会
日大歯学編集委員会

御中

年

月

日

下記に署名，捺印した著者は，下記表題の投稿原稿が「日大歯学」に掲載された際には，同誌の投稿規定により，そのすべての著作権（著作財産権 copyright）を貴学会へ譲渡することを承諾いたします。

表題：

氏名：

印		

印

印		

印

印		

印

印		

印

印		

印

印		

印

印		

印

掲載論文の複写複製および転載複製について

日本大学歯学会では，複写複製および転載複製に係る著作権を学術著作権協会に委託しています。
本誌に掲載された著作物を複写したい方は，同協会より許諾を受けて複写して下さい。但し（社）日本複写権センター（同協会より権利を再委託）と包括複写許諾契約を締結されている企業の社員による社内利用目的の複写はその必要はありません。（社外頒布用の複写は許諾が必要です。）
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日大歯学編集委員会
委

員

長

宮崎真至

副委員長

髙橋富久

委

米山隆之

鈴木直人

本吉

武市

員

満

今井健一

収

池田貴之

近藤真啓
幹

日大歯学

第 97 巻

第 １ 号

事

佐藤安希

http://www2.dent.nihon-u.ac.jp/nusdj/

令和 ５ 年 ６ 月 30 日 発 行

編集兼発行人
発

行

所

本田 和也
日本大学歯学会〒 101-8310 東京都千代田区神田駿河台 1-8-13

事務

日本大学歯学部内所 日本大学歯学部研究事務課

印

刷

電話 03（3219）8060
所 ヨシダ印刷株式会社〒 130-0014 東京都墨田区亀沢 3-20-14
電話 03（3626）1301

日大歯学投稿規定
平成26年12月24日制定
令和５年４月14日施行
１．本誌
 本誌は，研究成果の論文発表による発信を通して，歯科医学の発展に寄与することを目的として，
日本大学歯学会が発行する学術雑誌である。
２．投稿資格 本誌へ投稿する著者（共著者も含む）は，原則として日本大学歯学会の会員に限る。ただし，日大
歯学編集委員会（以下，編集委員会という）が特に認めたものはこの限りではない。
３．投稿論文の種類
 原著論文，総説，症例・臨床報告およびその他とし，過去に他誌に掲載のもの，あるいは投稿予定の無いものに限る。ただし，編集委員会が認めた場合はこの限りではない。編集委員会は総説論文等（総説，報告，研究紹介，学会報告，招待論文，特許，社会活動，臨床ノート，フォーラム）の投稿を依頼することができる。
４．倫理的配慮 投稿論文は，ヒトを対象とする場合はヘルシンキ宣言（以後の改定，補足事項を含む）およびその他の倫理規定を遵守し，動物実験は関係法令や基本指針等を踏まえ，動物実験等の具体的な実施方法等を定めた研究機関内規定に基づいて倫理的に行われたものでなければならない。
５．利益相反 論文の内容に関する利益相反をすべて申告すること。
６．投稿論文の採否
 投稿論文の査読後，その採否および掲載順序を編集委員会が決定する。なお，編集委員会は文意に変化を来さない範囲において字句の改訂を行うことができる。
７．投稿論文の形式
 投稿論文の作成にあたっては，「投稿の手引き」に従いＡ4 判横書きで作成し，表紙から文献まで通しページをつける。原著論文の形式は，原則として要旨，緒言，材料および方法，結果あるいは成績，考察，結論，文献の順に記載する。原著論文以外の論文も，原則としてこれに準ずる。
８．校正
 著者による校正は，原則再校までとする。その際には，字句の著しい変更，追加あるいは削除などは認めない。
９．著作権
 本誌に掲載された論文，抄録などの著作権は日本大学歯学会に帰属する。
10．掲載料 著者は掲載料を負担する。編集委員会から依頼する原稿についてはこれを除く。
11．規定にない事項
 この規定にない事項は，別に編集委員会で決定する。
12．投稿論文の送付先
 所定の投稿申込用紙に必要事項を記入のうえ，下記へ送付する。
 〒101-8310 東京都千代田区神田駿河台1-8-13
日本大学歯学部研究事務課気付
日大歯学編集委員会
TEL：03-3219-8060，FAX：03-3219-8324
E-mail：de.shigakukai@nihon-u.ac.jp（日本大学歯学会専用のアドレス）

Nihon University Dental Journal
Vol. 97 No. 1 June 2023
原著

日本大学歯学部付属歯科病院における最近5年間の患者動向とアンカースクリュー使用状況について
増

山

萌

子ほか

1

Propiece IL-1αの核内への輸送機構と核内機能

石

山

雄

一

7

IL-1 receptor type 2による細胞内pIL-1αの細胞外分泌抑制

定

村

正

之

12

高濃度グルコースが成熟骨芽細胞の石灰化に与える影響

清

水

なつ生

18

ヒト線維芽細胞HeLa におけるinterleukin-1 receptor type 2のdecoy receptorとしての機能

花

山

真知子

27

MeCP2変異ヒト歯髄細胞およびMeCP2欠損マウス
迷走神経背側運動核ニューロンについての免疫組織化学的研究

星

ま

な

み

33

急性期病院における誤嚥性肺炎患者の生命予後に関連する因子について

渡

邉

真

央

42

日本大学歯学会会則
日本大学歯学会表彰規定「日大歯学」投稿の手引き―投稿申込用紙，確認書，チェックリスト，承諾書―

NIHON UNIVERSITY SOCIETY OF DENTISTRY

http://www2.dent.nihon-u.ac.jp/nusdj/zasshi/j-zas00.html