治 療 用 細 胞 と し て の 脱 分 化 脂 肪 細 胞 （ D F A T ）	Dediﬀeren(ated	   fat	   cells	   (DFAT)	   for	   therapeu(c	   cells	
医学部 機能形態学系 細胞再生・移植医学分野 教授 松本太郎	  Taro	  Matsumoto	  Department	  of	  Func(onal	  Morphology	  Division	  of	  Cell	  Regenera(on	  and	  Transplanta(on,	  Nihon	  University	  School	  of	  Medicine	
目的・背景 （Purpose and Background）	
近年、骨髄や脂肪組織の間質細胞より得られる間葉系幹細胞（MSC）が高い増殖能力と多分化能を有することが明らかにされ、MSCを用いた細胞治療の臨床試験が開始されている。MSCは不全臓器を根治できる可能性を秘めていることから大きな期待がかけられている。しかしながら、MSCにも様々な問題点が残ったままであり（図１）、再生医療を万人に適応できる一般的な治療方法にするためには、簡便かつ純度の高い細胞を大量調製できることが望まれる。	  
我々はヒトを含む様々な動物種の脂肪組織から単離した成熟脂肪細胞を天井培養という方法で体外培養することにより、得られる細胞群（脱分化脂肪細胞、Dedifferentiated fat cell：DFAT）が高い増殖能と多分化能を獲得することを明らかにした（図２）。	

培養BM-­‐MSC製剤	  (ProchymalTM)：	  ドナーの負担なし。製品の安全性が担保されており、急性疾患	  にも対応できるが、MHC不一致の他家移植となる。	  
バンキングシステムの構築は困難。	  
	  新鮮SVF細胞	  (ADRCs):	  	  自家移植可能で、培養を必要としないが、細胞の均一性が	  保てない。細胞数確保のため、ある程度侵襲性の高い操作	  (腰椎麻酔下250	  mlの脂肪吸引術）が必要となる。	

脱分化脂肪細胞	(DFAT)	

成熟脂肪細胞	
脱分化	細胞増殖活性	

低侵襲性・安全に採取調整でき、純度が高く、均質なMSC	  
自家移植にも他科移植（細胞バンク）にも対応できるMSC	  

骨	軟骨	

脂肪	

血管	

心筋	

図２．脱分化脂肪細胞（Dedifferentiated fat cell：DFAT）	

図１．現在のMSC治療の動向と問題点	

原理・方法 （Principles and Methods）	
脂肪組織中の脂肪細胞は毛細血管と直接接して栄養を受けていると言われており、脂肪組織は非常に毛細血管に富んだ組織である（図３左）。脂肪組織をコラゲナーゼ消化後、低速度の遠心分離を行なうことで、浮力の高い成熟脂肪細胞のみが溶液上部に集積することで容易に単離することが可能である（図３右）。	  
単離した成熟脂肪細胞を、培養液で満たし、培養面を天井にしたフラスコ内で培養すると、成熟脂肪細胞はフラスコ天井面に集まり、ここで徐々に脂肪滴が小さくなってくると共に接着性を獲得する。そして１週間後には線維芽細胞様の細胞が増殖し始める。このようにして得られたDFATは、フラスコを反転して増殖用培地で培養することにより、１週間ほどでコンフルエントに到達するまで増殖させることが可能である（図４，５）。	
皮下脂肪組織	
脂肪組織より単離した成熟脂肪細胞	
DFAT	

成熟脂肪細胞	

フラスコ反転	

脂肪組織(1-2g)	

コラゲナーゼ	処理	

Adipored	 / Hoechst	

低速度	
遠心分離	

IsolectinB4	 / Hoechst	

脱分化	増殖	

1 週間	

1 週間	

Day 3!

Adipose-derived stem	
cells (ASCs)	

Stromal vascular (SVF)	
fraction	Day 14!

Day 7!

図４．成熟脂肪細胞の単離と天井培養によるDFATの調整法	

図３．脂肪組織と成熟脂肪細胞	

図５．天井培養による成熟脂肪細胞の形態変化	

我々はDFATの治療用細胞としての特性解析を行なった。	
①同一脂肪組織からのDFATならびにASCsの作製効率②ドナー年齢間におけるDFATの多分化能解析③DFATと間葉系細胞との遺伝子発現差異の比較④DFATとASCsにおける純度解析（混入細胞の割合）	

結果・まとめ （Summary and the results）	
結果①：同一脂肪組織より調製したDFATならびにASCsそれぞれの細胞数において、DFATはASCsと比べて約25倍多く調製することができることを明らかにした。	

結果③：DNAマイクロアレイ法によるDFATの遺伝子発現パターンを間葉系細胞と比較した結果、DFATは、fibroblast, 骨髄MSC, preadipocyte, ASCsの順に遺伝子発現プロファイルが類似していることがわかり、ASCsの遺伝子発現プロファイルと99%identicalであるということを明らかにした。	

まとめ：DFATは少量の脂肪組織から効率よく大量調製が可能であり、ドナー年齢に関係なく多能性細胞が調製可能である。また、調製された
DFATは、脂肪組織より単離された成熟脂肪細胞のみからの由来となることから、他細胞の混入がほとんどない純度の高い細胞集団として得られる（図１０，１１）。これらのことから、全身状態不良の患者や高齢者など、いままで自己幹細胞移植が困難と考えられてきた患者に対する新規再生医療用ドナー細胞として有望であると思われる。	
培養DFAT	
脱分化脂肪細胞(DFAT)	

成熟脂肪細胞	

天井培養	

付着培養	

脂肪組織	

図６．同一脂肪組織からのDFATならびにASCsの作製効率	
平滑筋細胞	

結果②：我々はすでに３０例以上のドナーから脂肪組織の提供を受け、DFATを調製しているが、検討した範囲では、２歳から81歳に至るまですべてのドナーよりDFATが調製可能であり、またそのすべてが多分化能（脂肪細胞・骨細胞・軟骨細胞）を有していることを明らかにした。	
81歳・男性!

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組織マクロファージ	
付着培養	

図８．DFATと間葉系細胞との遺伝子発現差異の比較	

結果④：DFATとASCのfirst passageにおける混入細胞の比較では、ASCが18.6%の平滑筋細胞、約3%の血管内皮細胞、13.3%の単球がコンタミネーションしていた。これに対してDFATではこのようなコンタミネーションがほとんどなかった。		
DFAT!
ASC!
αSMA!

脂肪誘導 (Oil red-O)	

αSMA!

0.07%!

18.61%!

血管内皮細胞	

脂肪由来幹細胞(ASC)	

培養ASCs	

間質血管分画(SVF)細胞	

図１０．DFATとASCsにおける調製効率の比較	

約１gの脂肪組織から効率よく大量調製が可能	
MSC・ASCに比べ採取に伴う侵襲が少ない	
重症心不全、重度熱傷など全身状態不良の症例でも自家移植が可能		

ドナー年齢に関係なく多能性細胞が調製できる	高齢者・骨粗鬆症などに対する自家移植が可能		

骨誘導 (Alizarin-red S)	

CD45!

CD31!

CD45!

CD31!

0.03%!

0.03%!

12.75%!

2.69%!

CD11b!

CD34!

CD11b!

CD34!

0%!

0.03%!

13.26%!

1.48%!

他細胞の混入がほとんどない純度の高い細胞集団	
移植に伴うリスクが低い	継代早期に移植できる		

手術時に破棄される脂肪組織を利用したバンキングシステム	の構築が容易 	
他家移植への適応も有望（急性期疾患、遺伝性疾患など）	

軟骨誘導 (Pellet culture)	

図１１．治療用細胞としてのDFATの利点	

図７．ドナー年齢間におけるDFATの多分化能解析	
図９．DFATとASCsにおける純度解析（混入細胞の割合）	

応用分野・用途 （Applications）	
低コストの細胞治療・再生医療が可能となる	
（大規模なCPC, 増殖因子, 抗体選別など必要なし）		

万人に適応可能な未来の一般医療となる可能性	（高齢者、小児、全身状態不良の患者などに対する自家細胞治療が可能）		

高齢者の代謝変性疾患に対応し、QOLを改善	（骨粗鬆症や変形性関節症に伴う難治性骨折などを治癒させる能力）	

図１２．DFAT細胞治療のポテンシャル	

重症虚血性疾患（PAD, IHD)	

萎縮性膀胱による腹圧性尿失禁	

骨粗鬆症に伴う難治性骨折	

臍帯血移植の生着不全予防	重症熱傷に伴う創傷治癒促進	

造血幹細胞移植に伴うGVHD予防・治療		
図１３．DFAT細胞治療が期待できる疾患