日大歯学 , Nihon Univ Dent J, 91, 71-75, 2017

ラット下顎角骨欠損モデルにおけるosteogenic protein-1 添加コラーゲン膜の骨再生に及ぼす効果
尾 崎 愛中 嶋美1
昭 3,6

髙 山 忠 裕 2,6
鈴 木 直 人 4,7
1

本野崇
正申1
夫 5,7

小佐

澤 康 正1
藤 秀 一 2,6

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻応用口腔科学分野
2

日本大学歯学部歯科保存学第Ⅲ講座
3

6

山前

日本大学歯学部歯科矯正学講座
4

日本大学歯学部生化学講座

5

日本大学歯学部衛生学講座

日本大学歯学部総合歯学研究所高度先端医療研究部門
7

日本大学歯学部総合歯学研究所機能形態部門

要旨：現在，骨再生誘導（guided bone regeneration；GBR）法は，臨床において広く応用されている。しかし，その再生した骨量や適応症，治療期間について改善点が多く残されている。今回，従来の GBR 法に用いられるコラーゲン膜に成長因子である osteogenic protein-1（OP-1）を添加し，骨再生を促進する新規システムを考案するためにラット下顎角骨欠損モデルを用いて，骨再生に及ぼす影響について検討した。10 週齢の雄性近交系ラット（F344/jcl）の下顎角に，内径 4.0 mm のトレファインバーを用いて，下顎角骨欠損モデルを作製した。欠損のみ（control 群），欠損をコラーゲン膜で被覆（collagen membrane；CM 群），CM に OP-1 を低用量（low；L）0.5μg 添加（OP-1［L］群），もしくは高用量（high；H）2.0μg 添加（OP-1［H］群）し，欠損を被覆した群に分けた。術後 8 週において，実験動物用 3 D マイクロ CT（マイクロ CT）によるエックス線学的観察を行った。その結果，control 群，CM 群と比較し，OP-1［L］群，OP-1［H］群で骨欠損部に骨様組織の再生を認めた。以上のことから，ラット下顎角骨欠損モデルにおいて，OP-1 添加コラーゲン膜（CM/OP-1）は骨再生を顕著に促すことが示唆された。
キーワード：osteogenic protein-1，コラーゲン膜，ラット下顎角骨欠損モデル，骨再生緒

ラーゲンスポンジを成長因子と組み合わせ，より効果的言な骨再生療法を検討する研究が行われている 5-7）。

現在，欠損部位への補綴処置として歯科インプラント

Kowalczewski ら 5）は，ラット下顎角に直径 5 mm の円治療を選択することが以前と比較し増加している。歯科形骨欠損を作製し，bone morphogenetic protein（BMP）-2

インプラント治療を計画するにあたり，適切な位置にイを含むコラーゲンスポンジの効果をマイクロ CT を用いンプラントを埋入する際に，骨量の不足から骨形態の改て術後 8，16 週の体積，骨密度および術後 16 週の組織善が必要となる場合があり，骨再生誘導（guided bone

学的観察によって検討を行った。その結果，BMP-2 を含regeneration；GBR）法を応用する機会が多い

1,2）

むコラーゲンスポンジ群はコラーゲンスポンジ単体群と。この比較し，有意な骨再生を認めたと報告している。

方法は遮蔽膜を用い，欠損部位への歯肉上皮や歯肉結合

Yamano ら 6）は，コラーゲン膜に growth/diﬀerentiation

組織の遊走を防ぎ，歯槽骨由来細胞を選択的に誘導する方法であり，その一つとしてコラーゲン膜がある。

factor-5（GDF-5）および platelet-derived growth factor

コラーゲン膜は吸収性膜であり，膜除去のための二次（PDGF）を添加し，その効果をおよび手術の必要がないことから，外科的侵襲が軽減される。の両面から比較検討している。

では，マウス頭また，コラーゲンは止血能力を有すること，血餅形成を蓋冠由来骨芽細胞様細胞（MC3 T3-E1 細胞）を用いて，細促進すること 3），創傷部位への線維芽細胞を遊走させ治胞為害性，細胞増殖，alkaline phosphatase（ALP）
活性，骨癒を早めること 4）が知られている。さらに，加工成形し芽細胞分化関連転写因子として runt-related transcription

やすく取り扱いに優れている点も日常臨床で広く使用さfactor 2（Runx2）およびオステオカルシンの遺伝子発現れている理由である。また，近年ではコラーゲン膜やコについて検討を行った。また，（受付：平成 29 年 10 月 6 日）
〒 101 8310 東京都千代田区神田駿河台 1 8 1371

では，ラット下顎角に直径 4.0 mm の円形骨欠損を作製し，マイクロ CT実験委員会の承認（承認番号 AP14 D035，AP16 D031）のによる体積，骨密度，新生骨の割合および組織学的解析下で，同委員会のガイドラインに沿って行い，実験動物を行った。その結果，の苦痛軽減および使用動物数の低減に努めた。

において，いずれの群に2.

おいても細胞為害性に有意差はなく，細胞形態の変化もラット下顎角骨欠損モデル作製方法認めなかった。また，細胞増殖，ALP 活性，Runx2 お

ラットにイソフルランによる吸入麻酔を行った後，3よびオステオカルシンの遺伝子発現は，コラーゲン膜単種混合麻酔を腹腔内注射し全身麻酔を施した。出血のコ独（collagen membrane；CM）群と比較し，GDF-5 添加

ントロールと追加の局所麻酔として 1/80,000 希釈リドカ

コラーゲン膜（CM/GDF-5），PDGF 添加コラーゲン膜

インを 0.5 ml 注射した。手術野の下顎骨相当部を剃毛し（CM/PDGF）群で有意な増加を認め，さらに CM/GDF-5無菌的に実験が行えるよう準備した。口角部から下顎角は CM/PDGF より有意に増加した。

においてもに至る皮膚切開を行い，咬筋を切断，翻転させ，下顎骨と同様に術後 4 週で体積，骨密度，新生骨の割骨面から露出させた。下顎角より内側の骨が厚い部位に合および組織学的解析において CM/GDF-5 群が最も有内径 4.0 mm のトレファインバーを用いて骨欠損を作製

意な増加を認めた。そのため，CM/GDF-5 は骨再生を有した。BioMend®（コラーゲン膜，白鵬）を 5 mm×15 mm意に促進すると報告している。

サイズに調整し，recombinant human OP-1（rhOP-1，7）

その他にも，Takayama ら は，stromal cell-derived

R&D）を実験直前に添加した。骨欠損作製後，術野を生

factor-1（SDF-1）添加コラーゲン膜（CM/SDF-1）の効果を理食塩水にて洗浄し，欠損のみ（control 群），欠損をコおよびラーゲン膜で被覆（collagen membrane；CM 群），欠損にて検討した。その結果，CM 群と比較し，CM/SDF-1 群は細胞増加を促進し，ALP 活性，を CM に rhOP-1 を低用量（low；L）0.5μg 添加（OP-1［L］

コラーゲンⅠ，Runx2，オステオポンチン，msh homeobox群），rhOP-1 を高用量（high；H）2.0μg 添加（OP-1［H］群）

2（MSX2），distal-less homeobox 5（Dlx5），C-X-C

し被覆した 4 群に分けた（第 1 図，第 2 図）。欠損部施術

chemokine receptor 4（CXCR4），CXCR7 の遺伝子発現後，咬筋および皮膚を 5-0 吸収生縫合糸のオペポリックを有意に増加した。

スにて縫合し，手術日を 0 日とし，8 週まで飼育した。

においては，Yamano らの

報告 6）と同様の術式および解析を行った結果，CM 群と3.

マイクロ CT 解析
ラットにイソフルランによる吸入麻酔を施し，0 日と比較し CM/SDF-1 群は有意な骨再生を認めた。
そこで，我々はさらなる骨再生の改善量や治癒期間の8 週 に 実 験 動 物 用 3 D マ イ ク ロ CT（ マ イ ク ロ CT，R̲

短 縮 を 高 め る た め に， 新 た な 成 長 因 子 の 模 索 を 行 い，mCT，リガク）を用いて当該部位の撮影を行った。撮影

osteogenic protein-1（OP-1）に着目した。OP-1 は，別名

条件は，管電圧 90 kV，管電流 100μA，照射時間 17 秒，8）

BMP-7 と呼ばれ，骨と軟骨に強い活性を示す 。また，

voxel size 30×30×30μm とした。得られたデータは，において MC3 T3-E1 細胞の ALP 活性およびオi-View-R（リガク）を用いて 3 次元画像の構築および定量ステオカルシンの遺伝子発現を用量依存的に増加させ 9），的評価を行った。骨体積は，周囲組織および明らかな硬未分化間葉系細胞のマウス株化筋芽細胞（C2 C12 細胞）組織（既存骨）の放射線吸収度のピーク値をそれぞれ求を骨芽細胞へ誘導する 10）。さらに，OP-1 は医科領域でめ，その中間値が再生骨の放射線吸収度の下限であるとは骨折治療において臨床応用されている11,12）して定量した。実際の定量操作では，骨体積測定ソフト。

以上の背景を踏まえ，CM に OP-1 を添加することでウェア（北千住ラジスト歯科 I-view image center）を用骨再生を促進する可能性を想定した。そこで，本研究はいて，8 週のそれぞれの撮像データ画像と 0 日の撮像デー

OP-1 添加コラーゲン膜（CM/OP-1）がラット下顎角骨欠タ画像とを重ね合わせることで得られる差分（voxel 数）

損モデルにおける骨再生に及ぼす影響についてエックスを骨体積の変化量として計測した。

線学的に評価した。

4.

データは平均値と標準誤差で示した。ANOVA にて有材料および方法
1.

統計学的分析

意差の検定を行った後，Tukeyʼs test により群間比較を行った。 値が 0.05 未満のときに有意差ありとした。

実験動物実験には，Fischer ラット 8 匹（雄性 10 週齢，日本ク結レア）を使用し，恒温恒湿（22-23℃，55%RH），午前 7 時点灯，12 時間明暗サイクルの飼育室において飼育を行っ

1.

果

臨床所見

た。また，飼育期間中ラット・マウス用 MF 固形飼料（オすべてのラットの施術部位に感染や炎症は認めず，術リエンタル酵母工業）と水道水は自由に摂取させ，ラット後の経過は良好であった。また，飼育中の成長による体の全身状態が健康であることは，1 週間の予備飼育を行っ

重増加は，いずれの群においても有意差は認められなて確認した。実験プロトコールは，日本大学歯学部動物かった（第 3 図）。

72

OP-1 添加コラーゲン膜の骨再生の効果

2.

マイクロ CT の観察所見
術後 8 週において，control 群，CM 群と比較し，OP-1添加群において骨欠損部に骨様組織の再生が認められた。また，OP-1［L］群に比べ，OP-1［H］群において，顕著な骨欠損の改善を認めた（第 4 図）。
新 生 骨 量 に 関 し て も，control 群，CM 群 と 比 較 し，
OP-1 添加群において有意な新生骨の増加が認められた。
また，OP-1［L］群に比べ，OP-1［H］群において，新生骨の増加を認めた（第 5 図）。

考察
第3図

ラットの体重変化

第4図

マイクロ CT 像（bar ＝ 1 mm）

第5図

新生骨量

ラット下顎角骨欠損モデルを用いて CM/OP-1 の骨再生に及ぼす影響についてエックス線学的に観察した。その結果，CM/OP-1 は骨再生を促進し，OP-1 の用量依存的に骨再生を促すことが示唆された。
Girard ら 13）は， ラ ッ ト 頭 蓋 冠 に 異 な る 方 法 で 直 径1.3 mm の円形骨欠損を作製し，それぞれの群をポロキ

第1図

ラット下顎角骨欠損モデルの作製方法

第2図

ラット下顎角骨欠損モデル73

以 上 の こ と か ら， エ ッ ク ス 線 学 的 に CM/OP-1 はサマージェルに OP-1（1.5μg）投与群と未投与群に分け，骨欠損作製方法および OP-1 投与による骨再生の影響にcontrol 群や CM 群と比べ，骨再生を促進し，OP-1［H］ついて術後 3，6，9，および 12 週におけるマイクロ CT群において有意差を認め，また用量依存的に骨再生を促による体積，骨欠損閉鎖率によって評価を行った。そのすことが示された。このことから，CM/OP-1 は今後新た結果，骨欠損作製方法に関わらず，OP-1 投与群は未投与な骨再生誘導法として臨床応用が期待される。

群と比較し，骨再生を促進したと報告している。

結Hyun ら 14）は，ラット頭蓋冠に直径 8 mm の骨欠損を論作製し，コラーゲンスポンジに BMP-2，4，7 をそれぞラット下顎角骨欠損モデルにおける CM/OP-1 の骨再れ 2.5μg 添加し，その骨再生の効果の違いを術後 2，8生の影響についてエックス線学的に検討し，以下の結論

週においてマイクロ CT による体積，骨密度，骨欠損閉を得た。

鎖率および組織学的観察によって比較検討を行った。そ

1.の結果，BMP-2，4，7 に差は認められず，術後 8 週におCM/OP-1 は，control 群，CM 群と比較して，骨様組織や新生骨量の増加を認めた。

いて全ての群で 97% 以上の骨欠損部の閉鎖を認めたと報2.

OP-1 は用量依存的に骨再生を促す傾向を示した。

告している。
本研究では，ラット下顎骨に直径 4.0 mm の円形骨欠以上のことから，CM/OP-1 はラット下顎角骨欠損モデ損を作製し，control 群，CM 群，CM に OP-1 を低用量ルにおいて，骨再生を顕著に誘導することが示唆された。

として 0.5μg（OP-1［L］群），高用量として 2.0μg（OP-1
本研究遂行にあたり，格別たるご指導ご鞭撻を賜りました日本大学歯学部歯科保存学第Ⅲ講座 佐藤秀一教授ならびに同講座 髙山忠裕助教に謹んで心より感謝申し上げます。
また本研究を通じ多大なるご協力とご助言をいただきました日
本大学 前野正夫特任教授，日本大学歯学部生化学講座 鈴木直人教授，病理学講座 浅野正岳教授，矯正学講座 中嶋昭専任講師，放射線学講座 新井嘉則特任教授に深く感謝申し上げます。
最後に本研究にご協力を頂いた日本大学歯学部歯科保存学第Ⅲ講座の皆様に感謝致します。
なお，本研究は平成 27 年度日本大学歯学部佐藤研究費（研究）および平成 28 年度日本大学総合歯学研究所研究費（B）の補助によってなされました。
本研究に関して，開示すべき利益相反はありません。

［H］群）添加し，骨再生の効果を検討した。その結果，マイクロ CT 像から control 群，CM 群と比べ，OP-1［L］群，OP-1［H］群において骨様組織の増加を認め，新生骨量においても有意な増加を認めた。また，OP-1［H］群では，骨欠損部は骨様組織によって完全に閉鎖しており，OP-1［L］群より骨再生を促進した。
本研究は，Girard 13）や Hyun 14）の頭蓋冠骨欠損モデルと比較し，下顎角骨欠損モデルを使用したため，筋肉の走行など実際の歯科臨床に近い環境での OP-1 の効果を検討できた。また，骨欠損の大きさや部位は異なるが，本研究においても OP-1［H］群において骨欠損部の完全な閉鎖を認めたため，OP-1 投与量は至適用量であったと考文えられる。さらに，OP-1［L］群は低用量であったが，骨再生を促進したのは，Ozaki らのによる報告 15）

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6）Yamano S, Haku K, Yamanaka T, Dai J, Takayama T,Shohara R, Tachi K, Ishioka M, Hanatani S, Karunagaran

から CM/OP-1 は 14 日間に約 85% の OP-1 を徐放するとあるように，

献下でも OP-1 が CM から徐々に放出されたためと考えられる。
OP-1 は，TGF-β スーパーファミリーの一つであり，BMP の局所投与と同様に合併症として腫脹が挙げられる。腫脹は BMP の用量が多いほど増大し，適応外使用としてヒトに行われた前頸部脊椎融合術後に生じた腫脹によって気道の閉塞が生じた報告がある 16）。そのため，
本研究で用いたラット下顎骨での OP-1 使用においても注意を要した。本研究において，実験飼育中に気道閉塞に よ る 死 亡 は 認 め ず，control 群，CM 群 と 比 較 し，
OP-1［L］群，OP-1［H］群の施術部位の腫脹の変化に違いはなかった。さらに，ラットの体重増加はいずれの群においても有意差は認めなかった。このことから，本研究で用いた OP-1 の用量は妥当な範囲内と考えられる。また，CM との併用により気道部分への OP-1 の流動を防ぐことができたと考えられる。

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OP-1 添加コラーゲン膜の骨再生の効果

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