Discovery of biomarkers by comprehensive gene expression analysis- A novel approach using KeyMolnet, an integrated platform for biological information ○Rie Taniguchi, Miki Fukuda, Atsushi Nogi, Yoko Inoue, Misa Ogura, Kyoko Nakanishi, Nakako Iwasaki, Makoto Shigetaka, Akiko Itai (IMMD Inc.)

網羅的発現データ解析によるバイオマーカー探索 − 生命情報統合プラットフォームKeyMolnetを用いて −○谷口理恵, 福田美紀, 乃木篤, 井上陽子, 小倉美佐, 中西京子, 岩崎奈可子, 重高誠, 板井昭子（株式会社 医薬分子設計研究所）< Introduction >Figure 4: tissue kallikrein ファミリーパスウェイに3種類の数値データをマッピング

現在アルツハイマー病のバイオマーカーとしてAβ42、総tau蛋白、リン酸化tauなどが用いられているが、より簡便で信頼性が高いバイオマーカーの探索が望まれている。
KeyMolnetは、研究員の手によって論文情報から分子のアノテーションと分子間のリレーションおよび疾患情報や医薬品情報などを収録している生命情報統合プラットフォームである1)。実験により得られた数値データをKeyMolnetに収録されているタンパク質間相互作用情報や転写因子による発現制御情報と組み合わせて解析することで、それらをより有機的に読み解くことが可能になる。
今回、アルツハイマー病患者と正常人で発現量に差がみられたDNAチップデータ(GSE1297、GSE4226)、microRNAデータ(GSE16759）およびプロテオミクスデータ 2) について
KeyMolnetを用いて解析した結果、いくつかのバイオマーカー候補分子を見出す事ができた。

海馬mRNA

末梢血単核球mRNA

0.500

脳脊髄液protein0.750

末梢血単核球

海馬

大脳皮質

脳脊髄液

種類mRNAmRNA

microRNA

proteinデータ
ソース

GSE4226
Alzheimer Disease
peripheral bloodmononuclear cellexpression

GSE1297Incipient Alzheimer's
Disease: Microarray
Correlation Analyses

GSE16759
mRNA and miRNA
expression in parietal
lobe cortex inAlzheimer's disease

Biomarker discovery inneurodegenerative
diseases: a proteomic
approach. Neurobiol Dis.
2009 Aug;35(2):157‑64.

Affymetrix Humanplatforms Genome U133A Array

解析使用
データ

Affymetrix Human
Genome U133A Array

4700 Proteomics Analyzer
USC/XJZ Human 0.9 K
with TOF/TOF OpticsTM
miRNA‑940‑v1.0(Applied Biosystems)

Figure 5: proteinの発現量が低下しているBDNFの発現制御因子
海馬mRNA

脳脊髄液protein

大脳皮質microRNA

KeyMolnet ver5.3
発現上昇< Results >Figure 1: アルツハイマー病患者組織でmRNAの発現が1.5倍以上発現上昇している分子が関与するパスウェイ
末梢血単核球mRNA

海馬mRNA正常人と比較してmRNAの発現が1.5倍以上に上昇した分子群の解析を行うと、アルツハイマー病患者末梢血単核球および海馬双方において、tissue kallikrein ファミリーパスウェイとの関連が深いことが示された。

発現変動分子リストと関連しているパスウェイ（KeyMolnetスコア表示）

相互関係検索

0.500

1.000
0.750

NIHが公開しているClinicalTrials.govにおいて、うつ病などのバイオマーカーとして測定されているBDNFに注目し、発現調節因子を検索した。

1.000
0.750

1.500

1.250

発現量比（アルツハイマー病/正常）

BDNF mRNAの発現は上昇しているが、proteinの発現は低下している。
一方でBDNFの発現を抑制しているmiR‑210の発現が上昇していることから、BDNFの翻訳レベルでの抑制が推測される。

Figure 6: BDNFを制御するmiR‑210の周辺ネットワーク

1.500

1.250

海馬mRNA発現量比（アルツハイマー病/正常）【検索条件】
下流方向、パス数1
Core[発現＋,発現−]Secondary[発現]

0.500

1.000
0.750

ネットワークと関連しているパスウェイ（KeyMolnetスコア表示）

0.500【検索条件】
上流方向、パス数1
Core[発現＋,発現−]Secondary[発現]KeyMolnetバイオマーカー情報

発現上昇

周辺検索

Figure 2: アルツハイマー病患者の海馬で1.5倍以上発現上昇している分子間の制御ネットワーク【検索条件】
パス数2
Core[直接＋,発現＋,直接−,発現−]Secondary[直接的, 発現]

発現低下

周辺検索

1．アルツハイマー病患者組織で発現上昇している分子の解析

正常人と比較してアルツハイマー病患者の海馬で1.5倍以上に上昇した分子間の制御ネッ
トワークからも、tissue kallikreinファミリーの関与が示唆された。

Figure 3: アルツハイマー病患者脳脊髄液でproteinの発現が1.5倍以上上昇している分子間の制御ネットワーク

ネットワークと関連している病態イベント（ KeyMolnetスコア表示）

1.500

1.250

脳脊髄液protein発現量比（アルツハイマー病/正常）

BDNFを制御しているmiR‑210は、HIFに制御されることにより低酸素症に関与している。
微細な脳梗塞による低酸素状態がアルツハイマー病の発症に関係しているという報告もあることから3）、miR‑210の発現量を測定する事によりアルツハイマー発症のリスクを予測できる可能性がある。

< Conclusion >1. アルツハイマー病の新たなバイオマーカー候補として5つの分子を見出した。

相互関係検索2. アルツハイマー病患者末梢血単核球および海馬組織mRNAの発現プロファイルおよび脳脊髄液のprotein発現プロファイルから、tissue kallikrein ファミリーシグナル伝達の関与が示唆され、共通した発現変動プロファイルを持つ、Kallikrein6、 Kallikrein2、IGF‑BP5、がバイオマーカー候補として示唆された。

【検索条件】
パス数3
Core[直接＋,発現＋,直接−,発現−]Secondary[直接的, 発現]0.500

発現量比（アルツハイマー病/正常）

1.250

2．mRNA、microRNA、protein発現プロファイルの比較

Table3 Proteins withNIA MGC, Mammalian
Normalization: RMA
Normalization: RMAchanges unique to AD, PD
Genome Collection
T‑test (Welch, unpaired) T‑test (Welch, unpaired) or DLB
T‑test (Welch, unpaired)
P値：0.05以下を利用
P値：0.05以下を利用（アルツハイマー病患者のP値：0.05以下を利用データのみ使用）

解析プログラム1.500

発現上昇が見られた分子の制御ネットワークに関連が深いtissue kallikrein ファミリーパスウェイに属する分子のうち、 KLK6、KLK2、IGF‑BP5は、海馬および末梢血単核球mRNA、脳脊髄液proteinで、共通の発現プロファイルを示すことから、アルツハイマー病の病態を反映していると考えられる。
これらの候補分子の発現変動を臨床サンプルを用いて解析する事により、バイオマーカーとしての可能性を検証できる。

< Materials & Methods >組織1.000

1.000
0.750

1.5001.250

脳脊髄液protein発現量比（アルツハイマー病/正常）

局在化表示

3. protein発現プロファイルと、mRNAおよびmicroRNA発現プロファイルの比較から、BDNFとmiR‑210がバイオマーカー候補として示された。miR‑210は、低酸素状態が引き起こすアルツハイマー病の発症に関連していると考えられ、また血清を用いて測定できることから、組織や脳脊髄液中のファクターよりも低侵襲性のアルツハイマー病発症予測バイオマーカーとして期待される。

< Reference >1) New approaches to mechanism analysis for drug discovery using DNA microarraydata combined with KeyMolnet. Curr Drug Discov Technol. 2005 Jun;2(2):89‑98.
ネットワークと関連しているパスウェイ（KeyMolnetスコア表示）

脳脊髄液で1.5倍以上に上昇した分子間の制御ネットワークからも、tissue kallikreinファミリーの関与が示唆された。

2) Biomarker discovery in neurodegenerative diseases: a proteomic approach.
Neurobiol Dis. 2009 Aug;35(2):157‑64.
3) Hypoxia and neurodegeneration. Ann N Y Acad Sci. 2009 Oct;1177:169‑77.