日本大学歯学部紀要 35，49‑56，2007

糞中ステロイドホルモン抽出方法の比較

佐藤恵

柳沼千春

塩谷正勝

若林修一

酒井秀嗣

Comparison of extraction methods of steroid hormones in feces

M egumi Sato , Chiharu Yaginuma , Masakatsu Shioya ,Shuichi Wakabayashi and Hidetsugu Sakai
Abstract
The measurement of blood hormonal concentration is one of the indices used to evaluate
endocrinal regulatory functions. Improvements in the sensitivity and accuracy of various
measurement methods have enabled the precise measurement of hormones in feces,urine andsaliva,as well as blood.In wildlife research,noninvasive methods developed in the 1990s are
now widely accepted, and various hormonal extraction methods are now employed. We
compared five different methods, all of which employed organic solvents as the means ofextraction. Fecal specimens from the wild black‑tailed gull were obtained and the corticosterone and testosterone levels in the specimens were measured.The results indicated that theTwo‑step Extraction M ethod (ethanol and methanol)was the most efficient.
Key words: Black‑tailed gull, corticosterone, extraction methods, fecal steroid hormone,testosterone緒術革新が進んだ。より高感度の測定が可能に言なったことで，血中のホルモン濃度が高いときには糞1950年代に放射性同位元素の利用と抗原抗，尿 ，唾液 などからも検出されることが明らかになった。

体反応の応用とによって放射免疫検定法（RIA :がradioimmunoassay）案され，インスリンの特に，排泄物を試料として用いることができ微量測定が報告された。その後，RIA はホル

れば，野生動物であっても捕獲すること無しにモンの微量測定として普及するとともに，単一ホルモンの血中濃度の変動を推定することがでクローン抗体の案や酵素免疫検定法（EIA :きる。こうした非侵襲的手法は繁殖期のデリ

enzyme immunoassay）の開発などによって技

ケートな時期や捕獲が困難な個体に対しても応日本大学歯学部生物学教室
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1866 Kameino, Fujisawa, Kanagawa 252‑8510, Japan(受理：2007年９月 29日)

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日本大学歯学部紀要 35，49‑56，2007

抽出方法１

用が可能で，1990年代から次第に報告が増え，蒸留水とジエチルエーテルを用いた抽出で，現在では野生動物の内分泌調節を知る上で重要えられている。

秤量後の試料をガラス試験管に移し，２ml の蒸排泄物中のホルモンを測定するには，目的と留水を加えてホモゲナイズした。その後 20分間な手法の１つとするホルモン分画を抽出する必要があり，場合放置した懸濁液を４°C，3000rpm で 20分間遠によっては精製が求められる。ステロイドホル心し，上清を新しい試験管に移した。沈殿にはモンにおいても抽出の必要性は変わらないが，再度蒸留水２ml を加えて同様にホモゲナイズ

研究者各々が試行錯誤した経緯を踏襲した様々と遠心分離を行い，上清を合一した。この上清な抽出手法が採用されており，最も優れた方法に２ml のジエチルエーテルを加え，よく攪拌しに統一されているわけではない。そこで，本研た後に４°C，3000rpm で 20分間遠心し，エーテ

究では，それらの手法の一部について，どの様ル層をガラス試験管に移した。残った水層にはな違いがあるのかを比較してみた。

再びジエチルエーテルを加え攪拌の後，同様に遠心分離しエーテル層を合一し，ブロックヒー材料と方法
１. 材

ターを用いて，60°C で完全に蒸発乾固させた
後，0.5ml の PBS を加えて凝固物を再溶解さ料

青森県八戸市の蕪島はウミネコ（Larus cras-せ，測定の試料とした 。
抽出方法２sirostris）の国内の代表的な繁殖地の１つである。2006年４月 15日から 26日の間に同一の巣エタノールとメタノールを用いた抽出で，秤から成鳥の新しい糞を採取して試料とした。試量後の糞を試験管に移し，そこに 10ml の 90％料は１個ずつプラスチックバックに入れ，抽出エタノールを加えて 20分間加熱し，3000rpm

まで−20°C で冷凍保存した。解凍後試料を 60°
Cで 20分間遠心後，ガラス試験管に上清を移し，のオーブンで６時間乾燥させ抽出試料とした。

残った沈殿には再度 90％エタノールを加えて乾燥中に経時的に重量を測定し，４時間以降は振とうし，遠心分離して上清を合一した。窒素重量変化がほとんどないことを確認した。

を吹き付けながら上清を完全に蒸発乾固させ，２. 抽出方法

100％メタノールを１ml 加えて振とうし，再溶それぞれの乾燥試料を粉砕後，５つに分けて解した。これに PBS を 0.5ml 加え，水を張っ秤量し，表１の５つの方法によって抽出を行った超音波洗浄機に浸して 20分間振 と う し，た。抽出物は溶媒を蒸発させて乾固後，150mMPBS で希釈して測定の試料とした 。

NaCl を含むリン酸緩衝液 pH 7.5（PBS）0.5

抽出方法３
蒸留水とジエチルエーテルを用いた方法で，ml に再溶解して測定試料とした（表１)。
表１方法
１２３４５

調整方法と抽出溶媒

抽出溶媒

引用論文

蒸留水，ジエチルエーテル
エタノール，メタノール
蒸留水，ジエチルエーテル

Rogovin et al.
Larson et al.

Yamauchi et al.
リン酸緩衝液，ジエチルエーテル
Takahashi et al.
エタノール・アセトン，ジクロロメタン，メタノール Wasser et al.

50

糞中ステロイドホルモン抽出方法の比較

糞を秤量してガラス試験管に移し，２ml の蒸留同様に遠心分離し，上清を合一した。窒素を使

水を加えてホモゲナイズし，20分間放置後に懸用して 50°
C のブロックヒーターで有機溶媒層濁液を４°C，3000rpm で 20分間遠心分離し，上を蒸発させ，そこに１ml の蒸留水を加えて良く清を別のガラス試験管に移した。沈殿には再度攪拌した後，再度乾燥させた。乾燥中，試験管

蒸留水を加えて同様にホモゲナイズと遠心分離の溶液を約１ml 以下まで気化させた後，そこにを行い，上清を合一した。この上清に２ml のジジクロロメタンを約２ml 加え，４°C，3000rpm

エチルエーテル加えてよく攪拌した後，ドライで 20分遠心分離し，上清を分画した。残った沈アイス‑エタノールバスによってエーテル層を殿に同様の１ml のジクロロメタンを加え同様取り出した。残った沈殿は溶解し同様に攪拌，に再懸濁，遠心分離し，上清を分画した。２回再懸濁，遠心分離を経てエーテル層を取り出しの上清を併せ蒸発乾固させた後，１ml のメタた。２回分のエーテル層を合一し，ブロックヒーノールで再溶解し，PBS を 0.5ml 加え，超音波ターを用いてエーテル層を完全に蒸発乾個させで 20分間振とうし，PBS で希釈して測定の試た後，PBS を 0.5ml 加え，凝固物を再溶解さ料とした 。

せ，測定の試料とした 。

３. ホルモンの測定
コ ル チ コ ス テ ロ ン は Rat Corticosterone

抽出方法４
リン酸緩衝液（PBS）とジエチルエーテルを( I) Biotrak Assay System With Magnetic

用いた方法で，糞を秤量してガラス試験管に移Separation（Amersham Biosciences, Buck-し，150mM NaCl を含む 10mM リン酸緩衝液inghamshire）による RIA，テストステロンはpH 7.5を２ml 加え，ホモゲナイズした。その後

Testosterone EIA Kit（Cayman Chemical,20分間放置した懸濁液を４°C，3000rpm で 20MI）による EIA を用いてそれぞれ測定した。

分間遠心分離し，上清を別のガラス試験管に移４. 統計処理した。沈殿には再度 PBS を加えて同様にホモ糞から調整した試料の測定値は，二元配置分ゲナイズと遠心分離を行い，上清を合一した。

散分析，対応のある t‑検定，Kruskal‑Wallis のこの上清に２ml のジエチルエーテルを加え，よ検定法，Wilcoxon の符号順位検定法，符号検定

く攪拌した後，ドライアイス‑エタノールバスに法を用いて解析した。これらの検定には統計

よってエーテル層を取り出し，残った沈殿は溶パッケージ SPSS ver.8.0J（エス・ピー・エス・解し同様に攪拌，再懸濁，遠心分離を経てエーエス，東京）あるいはエクセル統計 2004（社会テル層を取り出した。次に，取り出したエーテ情報サービス，東京）を用いた。また，用量‑反ル層をブロックヒーターを用いて完全に蒸発乾応直線の平行性の検定には共分散分析を用い，固させた後，PBS を 0.5ml 加えて凝固物を再石 村 の 式 に 基 づ い て コ ン ピュータ ソ フ ト

溶解させ，測定の試料とした 。

Microsoft Office Excel 2003 SP 3（マイクロ抽出方法５ソフト，東京）上で行った。

エタノールとジクロロメタンを用いた方法

結で，糞を秤量してガラス試験管に移し，２ml のエタノールと１ml のアセトンを加え良く攪拌果

１. 抽出試料のホルモン測定した。その後，４°C，3000rpm で 20分間遠心分

ウミネコの糞を乾燥後，10個の糞を各々５つ離し，上清をガラス試験管に移した。一方，残っに分けて試験管に入れ，分け取った糞の重量をた沈殿には２ml のエタノールを加え再懸濁し，秤量した。５つに分けられた糞は，方法１から51

日本大学歯学部紀要 35，49‑56，2007

方法５のそれぞれ異なる方法でステロイドホル

これらの測定値の違いは，二元配置分散分析

モン分画を調整し，RIA によってコルチコステ（p＜001）でも Kruskal‑Wallis の検定法（p＝ロンを，EIA によってテストステロンの定量を0.001）も非常に高度に有意であった。さらに，行った。

方法間での測定値の違いを検定した結果，対応コルチコステロンの測定値は，試料８と試料のある t‑検定と Wilcoxon の符号順位検定法

10を除いて方法２によって調整された分画がでは全体を通して値が高かった方法２は他の４最も高く，他の調整方法による分画の測定値とつの方法すべてよりも有意に高いことが明らかは大きな隔たりがあった。また，試料８と試料になった。また，符号検定法では，方法５との10で最も高い値を示したのは５番の調整方法み有意差が認められなかった（表２）。

であったが，２番の方法も２番目に高い値を示

同様にテストステロンの測定結果は，方法２して，残りの３つの方法による分画の値とは大での測定値が最も高かったのは半分の５試料にきく異なっていた（図１)。

とどまり，測定値が他の方法と大きく異なっていたわけでもなかった。また，方法による測定値の順位は試料によって異なり，方法による顕著な違いは認められなかった（図２)。しかし，試料ごとに測定の高い方法から順位をつけてその平順位を求めると，方法２の値が最も小さく，1.7であった。
二元配置分散分析と Kruskal‑Wallis の検定
表２

コルチコステロン測定値による５つの調整方法の相互比較を３つの検定方法によって行った危険率（p）の一覧

調整方法
方法１

方法２

方法３

方法２

方法３

方法４

方法５

0.011

0.762

0.195

0.004

0.005
0.002

0.959
1.000

0.333
1.000

0.005
0.002

0.010

0.013

0.028

0.005
0.002

0.005
0.002

0.013
0.109

0.283

0.009

0.333
0.754

0.013
0.109
0.266

図１

方法４

ウミネコの 10個の糞を試料として各々５つの方法でステロイド分画を調整し，RIA によってコルチコステロン量を測定した結果。
ホルモン量は糞１g 当たりの含有量で表した。

上段：対応のある t‑検定
中段：Wilcoxon の符号順位検定法
下段：符号検定法

520.0590.210

糞中ステロイドホルモン抽出方法の比較

表３

テストステロン測定値による５つの調整方
法の相互比較を３つの検定方法で行った危険率（p）の一覧

調整方法

方法２＜0.001

方法１

方法２

0.005
0.002

方法３

方法４

方法５

0.093 ＜0.001

0.101

0.047
0.021

0.005
0.002

0.059
0.109

0.022
0.037
0.021

0.181
0.203
0.344

0.583
0.013
0.344

0.065
0.203
0.021

0.425
0.047
0.754

方法３

0.765
0.508

方法４0.344
上段：対応のある t‑検定
中段：Wilcoxon の符号順位検定法
下段：符号検定法行った。得られた分画を段階希釈して，コルチコステロンとテストステロンの定量を行った。
図２

ウミネコの 10個の糞を試料として各々５つの方法でステロイド分画を調整し，EIA によってテストステロン量を測定した結果。ホ
ルモン量は糞１g 当たりの含有量で表した。

この測定の際に得られた用量‑反応直線の傾き

法で試料全体のばらつきを検定すると，両者とめ，コルチコステロンのみ４試料の二重測定にもばらつきが有意であると判定された（p＜よる検定になった（図３，４)。

が標準品と平行であるか否かを，共分散分析によって検定した。ただし，これらの調整された分画の１つはコルチコステロン値が低かったた

コ ル チ コ ス テ ロ ン RIA の 結 果 で は，F ＝0.05，p＜0.01）。さらに方法間の差を検定した
ところ，t‑検定と Wilcoxon，符号順位検定法，2.05は F

符号検定法のいずれでも，測定値が平差は認められなかった。同様にテストステロンして最(0.25)＝3.48よりも小さく，有意も高かった方法２は方法１および方法３との間EIA に お け る F ＝2.81も Fに有意差があり，方法４および方法５との間によりも小さく，有意差は認められなかった。

は差がないことが判明した（表３)。

(0.25)＝2.90

察

２. 用量―反応直線の平行性
コルチコステロン，テストステロンとも方法

排泄物を利用してホルモン分泌の変動を解明

２で調整された分画が５つの方法の中で最も高する研究手法は，捕獲が困難な野生動物やハンい測定値を示したことから，改めて５つの糞をドリングによって繁殖を中断してしまう恐れの用いて方法２によってホルモン分画の調整をある状況の動物には非常に有効な手段であり，
53

日本大学歯学部紀要 35，49‑56，2007

ホルモンとの親和性や特異性の高い抗体やこれらの抗体を用いた測定キットが市販されるようになったことも，排泄物の利用が普及した一因と言える。しかし，抗体の特異性が向上しても，糞そのものを試料に用いることは不可能であるため，ホルモン分画の適切な抽出を行う必要がある。それには，ホルモンを特異的に抽出することが一義的に求められるが，抽出効率に優れていることも重要な要素である。本研究では，現時点で論文に認められるすべての方法を図３

方法２によって調整したホルモン分画のコ検証したわけではないが，方法間にどの程度のルチコステロン RIA における競合阻害直線（用量―反応直線）。コルチコステロン標準品（●）および調整された４つのホルモン分画。

差異があるかも含めて検証することができた。
コルチコステロン分画の調整にあたっては，メタノール抽出とジエチルエーテル抽出の２段階抽出を採用した方法２が，他の４つの方法に対して有意に高い測定値を示した。個々の試料について見ると，２つの試料では方法５によって調整された分画の方が高い値を示したが，方法２の分画の値も決して低かった分けではない。この結果から，抽出効率においては方法２が他の方法に比べて格段に優れていると判断される。また，テストステロンにおいても格別に高い値あるいは低い値を示す抽出方法はなかったが，順位の平図４

では方法２が最も優れており，方法１と方法３に対しては有意差が認められ方法２によって調整したホルモン分画のテストステロン EIA における競合阻害直線（用量―反応直線）。テストステロン標準品（●）

た。
２つのホルモンの測定結果から，抽出効率のおよび調整された５つのホルモン分画。

上では方法２が両者に共通の５つの中では最も研究報告も年々増加傾向にある。我々も，1990

優れた調整方法と言える。方法２で調整したホ年代前半から糞の利用を試みており

このルモン分画と標準品の用量―反応直線（競合阻手法の恩恵にあずかっている。特にヒメアマツ

害直線）の傾きを共分散分析で検定したところ，バメにおいては平重量が約 150mg の糞で５傾きの違いは有意ではなかった。つまり，「用量種 類 の ス テ ロ イ ド ホ ル モ ン の 定 量 を 行っ―反応直線の傾きは等しい」という帰無仮説がた。同様の情報を血中濃度の測定によって否定されなかったことにより，消極的ではある

得ようとすると，４m 以上の高さに巣を構えてが並行性が認められたことになる。RIA あるいいる個体を仮に捕獲できたとしても，５試料では EIA で競合阻害直線の傾きが標準品と等し0.5ml 以上の血液が必要になることから現実いということは，抗体に対して同じ親和性を持的には不可能である。

つ物質，延いては標準品と同じホルモンが測定
54

糞中ステロイドホルモン抽出方法の比較い。

されていることを示している。これは，調整されたホルモン分画に測定を妨害するような夾雑謝物が含まれていないことを示唆し，この調整法が有効であることを意味している。

辞本研究で用いたウミネコの糞の採集には大阪

方法２によって調整したホルモン分画のコル

市立大学大学院理学研究科の富田直樹氏の協力

チコステロンの測定値は２つの例外を除いて，を得た。本研究は平成 18年度日本大学歯学部佐他の方法で調整した分画の値と大きく隔たって

藤奨学金研究費の援助を受けた。

いた。しかし，テストステロンの測定値は，全体的には５つの方法の中で最も高い値であった

文が，コルチコステロンで見られたほどの差は認献められなかった。この結果は，同じ溶媒でもホ１) Berson SA,Yalow RS,Bauman A,Rothchild

ルモンによって抽出効率が異なることを示して

MA, Newerly K (1956) Insulin‑I131 metabolism in human subjects: Demonstration ofいるが，ステロイドホルモンの溶解度に関する詳しいデータを得ることはできなかった。
また，

insulin binding globulin in the circulation of

調整された分画の測定値の順位は 10の試料でinsulin treated subject. J Clin Invest 35, 170‑190

各々異なっており，抽出効率にばらつきがある

２) Berson SA, Yalow RS (1959) Quantitative

ことが示唆された。研究者によっては抽出前に排泄物に放射能で標識されたホルモンを加えてaspects of the reaction between insulin andinsulin‑binding antibody. J Clin Invest 38,

回収率を試料ごとに求めているが ，試料中の1996‑2016
３) Rogovin K,Randall JA,Kolosova I Moshkin

ホルモンと添加したホルモンとでは抽出過程にえにくい。

M (2003) Social correlates of stress in adult

また，トレサーを使用することは，脱放射能のmales of the great gerbil, Rhombomys

測定法である EIA の趣旨にも反することにな

opimus, in years of high and low population
densities. Horm Behav 43, 132‑139

おける動態が完全に一致するとはる。我々は，抽出効率による補正を行わず，十４) Sands J, Creel SR (2004) Social dominance,

分に丁寧な操作を行うことによって常に同一のaggression and faecal glucocorticoid levels

条件で調整された分画としてデータを評価する姿勢を採ってきた。方法２は，測定値の順位でin a wild population of wolves, Canis lupus.
Anim Behav 67, 387‑396

は他の方法を下回る試料があったが，極端に低５) Wasser SK, Hunt KE, Brown JL, Cooper K,

い値を示すことはなかった。このことから，方Crockett CM, Bechert U, Millspaugh JJ,

法２はほぼ一定の効率でホルモンの抽出をしてLarson S, Monfort SL (2000) A generalizedいるのではないかと推測される。

fecal glucocorticoid assay for use in adiverse array of nondomestic mammalian

本研究はウミネコの糞を試料として比較検討

and avian species.Gen Comp Endocrinol 120,260‑275を行った。動物によっては餌の違いや消化の違いによって糞の組成が大きく異なる。脂溶性の６) French JA, Koban T, Rukstalis M, Ramirez

物資を多く含む糞の場合，方法２による抽出でSM, Bardi M, Brent L (2004) Excretion ofurinary steroids in pre‑ and postpartum

は非常に多くの物質が抽出され，測定を妨害する恐れがあり，こうした試料では，抽出効率を

female baboons. Gen Comp Endocrinol. 137,
69 ‑77

犠牲にしても夾雑物が少ない方法の方が好まし
55日本大学歯学部紀要 35，49‑56，2007

７) Rey F, Chiodoni G, Braillard K, Berthod C,

Rapid extraction of faecal steroids for

Lemarchand‑Beʼraud T (1990)Free testoster-measuring reproductive cyclicity and earlypregnancy in free‑ranging yellow baboons

one levels in plasma and saliva as determined by a direct solid‑phase radioimmunoassay: a critical evaluation.Clin ChimActa. 191, 21‑3

(Papio cynocephalus cynocephalus). J Reprod
Fert 92, 415‑423
13) 石村貞夫（1992）共分散分析，石村貞夫著「分８) Rogovin K,Randall JA,Kolosova I M oshkin

散分析のはなし」．東京図書，東京，247‑285

M (2003) Social correlates of stress in adult

14) 酒井秀嗣，佐藤恵（1995）ヒメアマツバメの糞males of the great gerbil, Rhombomys

中ステロイドホルモン測定に関する研究．日大

opimus, in years of high and low population
densities. Horm Behav, 43, 132‑13915) 酒井秀嗣，佐藤恵，塩谷正勝（1997）糞中の性９) Larson S, Casson CJ, Wasser S (2003)

ホルモン比による鳥類の性別の推定．日大歯紀

歯紀 23，57‑62

25，79‑85

Noninvasive reproductive steroid hormone
estimates from fecal samples of captive16) 佐藤恵，竹脇千恵，難波亜希子，杉田平三，清female sea otters (Enhydra lutris).Gen Comp
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水勲，林裕美，酒井秀嗣，塩谷正勝（2000）希少鳥類の繁殖に関する内分泌学的研究．動物園
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56