日本大学歯学部紀要 32，49‑53，2004

性ステロイドホルモン RIA キットのオナガガモ血漿ホルモンに対する感度と精度佐藤恵酒井秀嗣

The sensitivity and precision of commercially available sex steroid
hormone radioimmunoassay kits in pintail
M egumi Satoand Hidetsugu Sakai

Abstract
Commercially available RIA kits have been employed for the measurement of avian sex
steroid hormones because of its uniformity in the reaction regardless of the difference in theexperimental species.This beneficial characteristic is sometimes hindered by the contents ofthe specimens. Using pintail (Anas acuta) the present author examined the specificity andaccuracy of RIA testing kits (testosterone; T and estradiole‑17β: E ) when the measurement of plasma neutral hormones was conducted.We also examined the accuracy of the new
testosterone kits because of the manufacturerʼs change from double antibody method to thesolid‑phase method in comparison with the conventional kits so far employed. Using theplasma samples, dose‑response lines were drawn to compare the standard curve and theanalysis of covariance, which resulted in negating the non‑parallelism thus proving that thesamples from pintail can safely and specifically be measured with the new kits.Comparisonof double antibody method and the solid‑phase method for the measurement ofT also showedthat the latter (minimum detection range has changed from 9pg/ml to 27pg/ml) present nodisadvantage,provided that the hormone dose of the samples is not extremely low.Yet,with
the intra‑assay coefficient of variation 2.25％, the solid method showed superior results to
those in the instruction manual and even when compared to double antibody method where
the intra‑assay coefficient of variation 2.80％,the results of the solid method stood comparison.
Key words: radioimmunoassay, pintail, testosterone, estradiol, precision,

緒いる。ステロイドホルモンはペプチドホルモン

言と異なって種による分子の違いはないため，ヒ放射免疫検定法（radioimmunoassay：RIA）

ト以外の動物でのステロイドホルモンの測定には強い親和性と良好な特異性を持つ抗体をリア臨床用キットが応用可能である。しかし，試料クターとして結合の競合阻害を利用した測定法

によっては含まれる夾雑物のために非特異的なで，臨床や研究において生理活性物質の測定に結合や標識化合物の結合阻害が起こり，測定が広く用いられ，様々な測定キットが市販されて妨害されることがある。そこで，野生のオナガ

日本大学歯学部生物学教室
日本大学歯学部総合歯学研究所機能形態部門

Department of Biology, Nihon University School ofDentistry
Division of Functional M orphology, Dental ResearchCenter, Nihon University School of Dentistry
1‑8‑13 Kanda‑Surugadai, Chiyoda‑ku, Tokyo 101‑8310, Japan〒 101‑8310 東京都千代田区神田駿河台１‑８‑13(受理：2004年９月 29日）

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日本大学歯学部紀要 32，49‑53，2004

ガモ（Anas acuta）の血漿試料を用いた場合，（B ）に対する割合である B/B （％）値を算出

市販のテストステロン（T），エストラジオールし，検定に用いた。この計算は石村 に基づき

‑17β（E ）の RIA キットで測定が可能かどうか（Microsoft）の関数をMicrosoft＠ Excel 2002を調べた。また，当研究室で使用してきた市販組み合わせて計算した。

２抗体法キットが固相法に変更されたため，そ４. 精度と感度測定内の変動係数（CV）の算出は，標識ホルれらの精度と感度を比較検討した。

モンの結合阻害が約 50％になる濃度（B/B ≒材料と方法50）の標準品を試料として行った。６重測定を行って得られた測定結果からホルモン濃度を算

１. RIA キット
T の測定に使用した RIA キットは固相法を出し，これらの値の平用いたテストステロンキット「シエーリング」割合として求めた。

（P 3093）（DiaSorin s.r.l.,SalugTESTO‑CTK

値に対する標準偏差の感度を表す値の１つである最小検出値は標準gia,Italy）で，添付説明書 によると，測定範囲曲線の濃度０（B ）の平値からその標準偏差は 0.05‑10ng/ml であった。T に対する交差率の２倍の結合阻害を起こすホルモンの濃度としは ５ α‑dehydrotestosterone が 6.9％，E お よて求めた 。

び progesterone は 0.01％未満であった。E の５. 回 収 率
回収率は血清などの試料に既知のホルモンをRIA キットは DPC・エストラジオール２抗体
I］RIA加えて測定した際，測定値に添加分がどれだけKit（Diagnostic Products Corporation, Los

正しく反映されるかによって与えられる。そこAngeles）で，添付説明書の方法を改変して使用で，オナガガモの血漿と３種類の濃度の標準品

した 。この測定可能範囲は 1.4‑500pg/ml で，を等量ずつ混ぜた溶液を試料として測定した。

estrone の E に 対 す る 交 叉 率 は 4.6％で，この際，オナガガモ血漿とそれぞれの標準品もprogesterone および T との交叉は検出されて同時に測定し，両者の値から混合液の測定値といない。

して期待される値を求めた。回収率はこの期待

２. 血液試料値に対する混合液の測定値の割合として算出しキット Double Antibody Estradiol［た。

2002年の２月から３月にかけて宮内庁埼玉鴨場で捕獲したオナガガモの血漿を用いた。血結液は翼下静脈より採取し，遠心分離して血漿を得，測定まで−80°C で保存した。

果

１. 平 行 性

３. 平行性の検定

平行性の検定の結果，キットに付属の標準品

T および E の両キットを用いて，４個体の血と４個体のオナガガモの血漿をそれぞれ段階希漿を１/２，１/４に希釈して原液とともに３重釈し，それらを試料として RIA によって測定し測定を行った。これにキットの標準品を含めてた。試料の濃度の対数値と各試料の放射能の測用量−反応直線の傾きが同一母集団に属してい定値から求めた B/B 値を共分散分析によってるか否かを共分散分析により検定した。RIA で検定した。この分析には標準品および試料からは抗体に結合した標識ホルモンの放射能を測定各６点計 30点の測定値を用いた。この結果，Tするが，それぞれの測定値から非特異的結合分の RIA では F ＝0.42となった。この値は Fを差し引いた値（B）のホルモン０の測定値の値(0.05)＝2.89よりも小さく，平行性は否定され50

性ステロイドホルモン RIA キットの感度と精度なかった。また，E ‑RIA においても F ＝0.57で，これも F

察(0.05)＝2.89よりも小さく，同様に平行性は否定されなかった。また，分散分

市販の RIA キットはヒトを対象とした臨床析の値から，各々の測定法の回帰係数 βの区間用に調整されており，動物実験等で濃度の低い推定を行った結果，95％信頼区間は T‑RIA で試料を測定するには何らかの措置が必要になるは−37.12≦β≦−32.12， E ‑RIA で は−ことがあった。我々は，市販の性ステロイドホ51.86≦β≦−40.71となった。

ルモンおよび甲状腺ホルモンの測定キットを一２. 感部改変し，試料の用量を減らしたり検出限界値

度

T‑RIA において標準品のホルモン０の試験を低くすることを試みた。その際，精度およ管の放射能の測定値の平 （B ）は，9469cpm

び感度の測定を行っている。いずれのキットでで，それらの標準偏差 236.2cpm の２倍を減じも，抗体と結合した標識ホルモンと結合していた値 8996.6cpm が与える T 濃度は 27.55pg/ないホルモンとを分離する B‑F 分離に第２抗ml で あった。同 様 に E ‑RIA の B の 平値体を用いる２抗体法が採用されていた。ところ

4888.25cpm から標準偏差 153.18cpm の２倍が，これらのうちテストステロンの RIA キットを 減 じ た 4581.89cpm が 与 え る E 濃 度 はは簡便な固相法に変更され，従来の変法が適用0.854pg/ml であった（表１）。

できなくなってしまった。そのため，改めて精３. 回 収 率度および感度の確認を行う必要が生じた。また，

TRIA ではオナガガモ血漿に濃度の異なる３ステロイドホルモンはペプチドホルモンと異種類の標準品を加えて測定した結果，回収率のなって分子の種差がないため，RIA においては平

値 お よ び 標 準 誤 差 は 100.46±2.49％で種特異性は問題にならなかった。しかし，試料あった。また同様に，E ‑RIA においても，３種に含まれる夾雑物が抗原―抗体反応に関与し類の標準品を用いて８試料を測定した。この回て，測定値を誤らせる可能性は十分に収率は 87.77±4.22％であった（表１）。

た。そこで，オナガガモの繁殖に関する研究を４. 精実施するにあたって，改めて感度，精度，特異度

えられ１回の測定において同一試料の６重測定を行性等を検証することにした。オナガガモ血漿をい，測定内の変動係数（CV）を求めた。T‑RIA

段階希釈して得られた用量―反応直線と標準直では 2.25％，E ‑RIA では 1.19％であった（表線は，共分散分析によって平行性が否定されず，１）。

結果的に平行性が認められた。２抗体法の場合
でも，脂質を多く含んだ試料では，測定が妨害される場合がある。また，抗体との親和性が低
表１

本研究によって得られた TRIA および E RIA の諸元値

B‑F 分離試料容積(μl)

最小検出値(pg/ml)

測定内の変動係数(％)

勾配の 95％信頼区間回収率(％)
平 値±SEA

T‑RIA

固相法

5027.55

2.25−37.12‑−32.12

100.46±2.49

E ‑RIA２抗体法

500.854

1.19−51.86‑−40.71

87.77±4.22

ａ：添付資料に基づく測定法
ｂ：佐藤・酒井（1996）の変法

51日本大学歯学部紀要 32，49‑53，2004とによって問題は残らないと思われる。

い妨害物質が夾雑している場合には，ホルモン濃度が低くなるとその影響が大きくなる。つま

測定系の精度を表す数値には，測定内およびり，血清や血漿を希釈していくと平行性が得ら測定間の変動係数と精度係数が用いられる。これなくなる可能性があるが，標準曲線が直線に

れらのうち精度係数は生物検定などで良く用い回帰する範囲であればさほどの支障はないと言られ，RIA では変動係数が用いられる傾向にあえる。

る。測定間の変動係数は，測定を繰り返すこと血漿にホルモンを加えた場合の回収率は，Tによって得られる。TRIA キットの使用は今回‑RIA の場合には 100％に近い値が得られておが初めてであったため，測定内の変動係数のみり，平行性とあわせて測定上 の支障がないこを算出した。とが示された。一方 E ‑RIA では回収率の平一方，感度はホルモン０の値（B ）に対してが 87.8％と低いことが判明した。一般にヘパリ有意にホルモンの存在を示すことができる濃度ンを使用すると測定値が低くなることが知られ（最小検出値），あるいは標識ホルモンの結合をており，添付説明書 にもその旨が述べられて50％阻害する濃度（50％阻害値）で示される。

いる。後述のように精度が十分で標準品との平本研究では前者を採用した。従来は，B の平行性も確保されていることから，厳密に絶対値値からその標準偏差の３倍を減じた測定値が与を必要とする場合には，測定値に係数を乗じるえるホルモン量と規定されていた。しかし，最ことによって解決されるものと近では３倍が２倍に変更されている。そこで，えられる。

本研究でも測定系の精度を表す数値には，測定内および２倍を採用した。その値は結果測定間の変動係数と精度係数が用いられる。こで報告したとおりである。２抗体法キットとのれらのうち精度係数は生物検定などで良く用い比較のため ， ３倍られ，RIA では主として変動係数が用いられる‑RIA は 38pg/ml で２抗体法での値 22pg/ml傾向にある。測定間の変動係数は，測定を繰りよりも感度が低下したことになる。また，E返すことによって得られる。TRIA キットの使‑RIA は本研究では 2.7pg/ml，同一キットでの用は今回が初めてであったため，測定内の変動過去の値は 3.2pg/ml でほぼ同じ結果を再現係数のみを算出した。この係数 2.25％は，同じしたと言える。の値も求めてみると，Tメーカーが製造していた２抗体法によるキット

本研究では，オナガガモ血漿のホルモン濃度の添付資料に示された９％未満よりも優れ，同が特異的にされていることが認められた。また，キットによる我々の実測値 2.35％とほぼ同じ

T‑RIA は２抗体法から固相法に変更されたが，であった。また，E ‑RIA の変動係数 1.19％は，同一抗体を使用しているためにホルモン特異性過去に同一キットで測定した 1.91％を凌いでに際立った変化はなく，従来のデータも継承さいることが判明した。血漿にホルモンを加えたれることが判明した。固相法の場合は，抗体が場合の回収率は，T‑RIA の場合には 100％に近塗布されているために試料を減らしたり感度をい値がえられており，平行性とあわせて測定上上げる変法を取ることが難しい。しかし，十分の支障がないことが示された。一方 E ‑RIA でな精度が得られ，感度も遜色ないことから，通は回収率の平が 87.8％と低いことが判明し常の試料であれば変法にこだわる必要もない。

た。後述のように精度が十分で標準品との平行特に，最小検出値を小さくしても，低濃度の領性も確保されていることから，厳密に絶対値を域で血液試料を測定した場合には妨害物質の影必要とする場合には，測定値に係数を乗じるこ響が現れる恐れがある。また，標準曲線の端で52

性ステロイドホルモン RIA キットの感度と精度オール二抗体キット，添付説明書は精度が低下するため，敢えてその領域で測定することは無意味である。現実的には固相法の２) 日本シエーリング㈱（2003）テストステロン測キットにおいても，十分な感度と精度を備え，定 用 RIA キット テ ス ト ス テ ロ ン キット「シエーリング」，添付説明書高い定量性が得られることが判明した。また，

３) 石村貞夫（1992）共分散分析．分散分析のはな

E ‑RIA キットにおいても，高い感度と精度がし．pp 248‑280東京図書，東京
４) 若林克己（1977）コンペティティブアッセイⅠ再確認され，血液試料の測定でも何ら問題が無いことが明らかになった。

謝理論，日本化学会編：生化学実験講座 16ホルモン上，pp 157‑171，東京化学同人，東京
５) 佐藤恵，酒井秀嗣（1996）市販の性ステロイド辞

本研究は平成 14年日本大学学術研究助成金

ホルモン放射免疫検定法キットの応用，日大歯紀要，24，49‑55

および平成 14年度日本大学佐藤奨学金研究費

６) 佐藤恵，酒井秀嗣（1997）市販の甲状腺ホルモによった。

ン放射免疫検定法キットの応用，日大歯紀要，
文

献25，86‑91

１) ㈱三菱化学ヤトロン（2003）DPC・エストラジ53