日大歯学 ，97（1），27-32，2023

原著

ヒト線維芽細胞 HeLa における interleukin-1 receptor type 2の decoy receptor
としての機能花

山真知子

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻応用口腔科学分野
日本大学歯学部病理学講座（指導：浅野正岳 教授，角田麻里子 助教）

要旨【目的】Interleukin（IL）-1 receptor（R）type 2（IL-1R2）は，リガンドである IL-1αや IL-1βの結合シグナルを伝達できない decoy receptor であるとされている。本研究では，IL-1R2がヒト子宮頸癌由来線維芽細胞である HeLa において，decoy receptor として機能するかについて検討した。
【 方 法 】HeLa ま た は HeLa の IL-1R1を 欠 失 し た CR-R1-4に，IL-1R1，IL-1R2ま た は precursor IL-1α（pIL-1α） をtransfection により強制的に発現させた。こうして作製した transfectant をヒトリコンビナント IL-1αないし IL-1βで刺激し，IL-8分泌増加の有無を ELISA によって確認した。また，HeLa における IL-1R2の強制発現による pIL-1αの分泌抑制についても ELISA により確認した。
【結果】HeLa に pIL-1αと IL-1R2を co-transfection したところ，pIL-1αの分泌は抑制された。HeLa への IL-1R2のtransfection は，ヒトリコンビナント IL-1αないし IL-1β刺激による IL-8分泌増加を抑制しなかった。CR-R1-4に IL-1R1と IL-1R2を co-transfection しても，ヒトリコンビナント IL-1β刺激による IL-8分泌増加は抑制されなかった。
【結論】線維芽細胞に強制発現させた IL-1R2は，細胞内においてのみ decoy receptor としての機能を発揮した。
キーワード：IL-1R2，IL-1R1，IL-1α，alarmin，IL-8

The decoy receptor function of interleukin-1 receptor type 2
in human fibroblastic cell line HeLa
Machiko Hanayama
Nihon University Graduate School of Dentistry
Major in Pathology
Department of Pathology, Nihon University School of Dentistry（Directors: Prof. Masatake Asano, Assist. Prof. Mariko Tsunoda）

Abstract【Purpose】Interleukin (IL)-1 receptor (R) type 2 (IL-1R2) is known as a decoy receptor and it can not transduce
the IL-1α/IL-1β binding signal. In the present study, IL-1R2 was introduced to HeLa by transfection and tested
whether it can function as a decoy receptor.
【Methods】HeLa-based IL-1R1 knockout cell line, CR-R1-4, was established. IL-1R1, IL-1R2 or precursor IL-1α (pIL-1α)
was forced expressed in HeLa or CR-R1-4 by transfection. Based on the fact that HeLa can augment IL-8 secretion
with IL-1α/IL-1β stimulation, the cells were stimulated with recombinant human (rh) IL-1α or IL-1β. The
responsiveness was evaluated by measuring the production of IL-8 by ELISA. The inhibitory effect of IL-1R2 on
pIL-1α secretion was also evaluated with ELISA.
【Results】Co-transfection of both pIL-1α and IL-1R2 to HeLa resulted in the reduction of pIL-1α secretion. The
forced expression of IL-1R2 in HeLa did not lose the responsiveness to rhIL-1β. Co-transfection of both IL-1R1 andIL-1R2 to CR-R1-4 still maintained the reactivity against rhIL-1β.
【Conclusion】In fibroblasts, forced expression of IL-1R2 exerts only intracellularly its function as a decoy receptor.
Keywords: IL-1R2，IL-1R1，IL-1α，alarmin，IL-8（受付：令和 5 年 1 月27日）
責任著者連絡先：花山真知子
日本大学歯学部病理学講座〒101-8310 東京都千代田区神田駿河台 1 ‒ 8 ‒13

TEL：03-3219-8124
FAX：03-3219-8340
E-mail：hanayama.machiko@nihon-u.ac.jp

27

日大歯学

緒

第 97 巻第 1 号

言Interleukin（IL）-1αの cDNA クローニングがなされて以来 1 ），IL-1 family に属する分子の同定が進み，現在では11
種類により構成されている 2 ）。類縁分子である IL-1βとIL-1αとの相同性は，アミノ酸レベルで僅かに27% である 3 ）。
しかし両者は，①共通のレセプターを介してシグナル伝達を行い，②細胞内で前駆体として産生されたのち，酵素的な処理を受けて成熟型分子として細胞外に分泌され，③
leader peptide を持たないため小胞体 - ゴルジ装置を経由せずに分泌されるなどの共通点を有している 4 , 5 ）。IL-1αは細胞が障害を受けた際に分泌される分子で，これらはalarmin と総称され 6 ），周囲の細胞・組織に，自身の置かれた危機的状況を知らしめる分子とされている。
precursor IL-1α（pIL-1α）は質量約31 kDa で，Ca2+ 依
存性タンパク質分解酵素であるカルパインなどにより分子のほぼ中央部分を切断され，N 末端側の propiece IL-1α（ppIL-1α）と C 末端側の mature IL-1α（mIL-1α）に分離
する 7 , 8 ）。こうして産生された ppIL-1αと pIL-1αは分子内

図1実験に用いた発現プラスミドの構造に nuclear localizing sequence を有しており，核内に認められる 4 ）。一方，細胞外に分泌された mIL-1αと pIL-1αは，癌細胞 HSC3（ヒューマンサイエンス研究資源バンク）は，

特異的なレセプターである IL-1 receptor（R）type I（IL-

10% FCS-Rosewell Park Memorial Institute（Gibco）培地

1R1）に結合し，さらに IL-1R3と呼ばれるアクセサリー受により培養した。細胞の刺激に用いたヒトリコンビナント

2）

容体との複合体を形成する 。IL-1R1と IL-1R3はシグナル

IL-1α（rhIL-1α）およびヒトリコンビナント IL-1β（rhIL-1β）

伝達に必須の toll-IL-1 receptor（TIR）ドメインを細胞質

は，Pepro Tech（Cranbury，NJ，USA）から購入した。

内に有しており，これによってシグナルを伝達する。これに対して IL-1R2は TIR ドメインを欠いており，シグナル2 ．発現 plasmid の構築と transfectionを伝達できないことから decoy receptor と呼ばれている 9 ）。

IL-1R1または IL-1R2の full length cDNA を含有するベク

本論文の著者は，これまでにヒト子宮頸癌由来線維芽細胞ターである pDNR-Dual-IL-1R1と pSPORT-IL-1R2は，理化（HeLa）の IL-1R1を欠失した細胞である CR-R1-4の樹立に学研究所バイオリソース研究センター（つくば）より購入

成功しており，この細胞が IL-1αおよび IL-1βのシグナルした。このうち，IL-1R1については発現ベクターpMKIT-を伝達しないことを報告した10）。そこで本研究では，HeLa

neo vector の EcoRI site に Gibson assembly kit（Newにおける IL-1R2の強制発現，または CR-R1-4における IL-

England BioLabs，Hitchin，UK）を用いて subcloning し

1R1と IL-1R2の強制発現が，IL-1R1へのリガンド結合後のた（ 図 1 ）。N 末 端 に HiBiT-tag，C 末 端 に histidine-tag

シグナルを遮断し得るかという点について検討した。

を付与した pIL-1α（HiBiT/His-pIL-1α）は Sata ら11）によって作製されたベクターを鋳型として Quick-change site-

材料および方法

directed mutagenesis kit（Agilent Technologies，Santa

1 ．細胞培養と試薬

Clara，CA，USA）により作製した（図 1 ）。

本 研 究 に は， ヒ ト 子 宮 頸 癌 由 来 線 維 芽 細 胞 HeLa

Transfection は，Lipofectamine 3000（Thermo Fisher（ヒューマンサイエンス研究資源バンク，大阪）およびScientific，Waltham，MA，USA）を用いて行った。Plasmid

HeLa の IL-1R1を欠失した細胞である CR-R1-4を用いた10）。

を OPTI-MEM（25 μｌ）に溶解し，3000 Reagent（0.75 μｌ）

培養は Dulbeccoʼs Modified Eagle Medium（DMEM，と混和した。一方，Lipofectamine 3000（0.75 μｌ）を OPTI-

Gibco，Waltham，MA，USA）に10% ウシ胎児血清（FCS）

MEM（25 μｌ）に溶解した。両溶液を混合し，室温で15分

および 1 % ペニシリン ‐ ストレプトマイシン（Sigma-

間反応させて培養液に添加し，細胞と共に18時間培養しAldrich，St．Louis，MO，USA）を添加したものを用いた。このようにして作製した細胞を transfectant とした。

て，37℃，5% CO2存在下で行った。それぞれの細胞を24well plate（イワキ，榛原）に 5 × 104 cells/well となるよ

3 ．ELISA による IL-1αおよび IL-8の定量

う播種し，transfection 実験に用いた。ヒト口腔扁平上皮

Transfectant への rhIL-1αまたは rhIL-1βによる刺激は，

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HeLa における IL-1R2の機能
表1

令和 5 年 6 月

各 Transfectantの培養とELISAによる分泌タンパクの測定の手順

図3B
CR-R1-4に18時間transfection（pcDNAまたはIL-1R2）↓
rhIL-1β（10，100，1,000 pg/ml）存在下または非存在下で 6 時間培養↓
培養上清中のIL-8分泌量をELISAにより測定

図 2 HSC3および CR-R1-4における IL-1R2の発現
HSC3および CR-R1-4の細胞溶解液中の IL-1R2（56 kDa）の発現をWB で確認した。内部コントロールとして GAPDH（37 kDa）の検出を行った。

図4
HeLaに18時間transfection（HiBiT / His-pIL-1αとpcDNAまたはIL-1R2）↓
培養液交換後さらに18時間培養↓
培養液中のpIL-1αをELISAにより測定
図5
HeLaに18時間transfection（pcDNAまたはIL-1R2）↓
rhIL-1αまたはrhIL-1β（それぞれ100 pg/ml）存在下または非存在下で 6 時
間培養↓
培養上清中のIL-8分泌量をELISAにより測定
図6
CR-R1-4に18時間transfection（IL-1R1単独，IL-1R2単独またはIL-1R1とIL-1R2を共に）↓
rhIL-1β（100 pg/ml）存在下または非存在下で 6 時間培養↓
培養上清中のIL-8分泌量をELISAにより測定

図3

HeLaと IL-1R1を強制発現させたCR-R1-4のrhIL-1βに対する反応性
A．HeLaをrhIL-1β（100 pg/ml）存在下または非存在下で 6 時間培
養後，培養上清中のIL-8分泌量をELISAにより測定した。
n = 7，＊ p ＜ 0.05
B．CR-R1-4にIL-1R1（灰色バー）またはコントロールとしてpcDNA（ 白 色 バ ー） をtransfectionし た。 そ の 後， 培 養 液 を 交 換 し，transfectantをrhIL-1β（10，100，1,000 pg/ml）存在下または非存在下で 6 時間培養した。培養後の培養上清中へのIL-8分泌量を
ELISAにより測定した。n = 5，＊ p ＜ 0.05

表 1 に示す条件で行った。IL-1αおよび IL-8の測定は，培養後，培養上清を回収し，遠心分離後（16,900 × g，1 分間），上清を新しいチューブに回収し，これをサンプルとして ELISA kit（Quantikine，R&D SYSTEMS，Minneapolis，
MN，USA）を用いて行った。
4 ．Western blot（WB）法HSC3お よ び CR-R1-4を phosphate buffer saline（PBS）
で 洗 浄 後， 細 胞 溶 解 液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150
mM NaCl，0.5% Triton X-100）によって処理し，遠心後サンプルを回収した。総タンパク質量を測定し，WB を行った。すなわち，両サンプル共に SDS sample buffer に溶解
し，95℃で 5 分間反応させ，10% sodium dodecyl sulfate-

図 4 IL-1R2によるpIL-1αの分泌抑制
HeLa に pcDNA ま た は IL-1R2 を，HiBiT/His-pIL-1αと 共 に cotransfectionした。培養液を交換した後，それぞれのtransfectantをさら に18時 間 培 養 し た。 培 養 後 の 上 清 中 のHiBiT/His-pIL-1α濃 度 を
ELISAにより測定した。n = 5，＊ p ＜ 0.05

polyacrylamide gel 電 気 泳 動 し た。 泳 動 後 Immobilon
Transfer Membrane（Merck，Darmstadt，Germany）に転写し，1 % BSA-PBS でブロッキングした。1 次抗体としては，マウス抗ヒト IL-1R2抗体（× 1,000; Santa Cruz，
Dallas，TX，USA）およびマウス抗ヒト GAPDH 抗体（×10,000，Santa Cruz）を，2 次抗体としては，horseradish

5 ．統計学的解析

peroxidase 標識ヤギ抗マウス IgG 抗体（× 5,000，Jackson

統計解析は，正規性を Shapiro-Wilk 検定，等分散性を

Immuno Research，West Grove，PA，USA）を用いた。

Levene 検定で確認した。その後，図 4 および図 6 につい

ECL Prime Western Blotting Detection Reagent（Cytiva，ては Studentʼs t-test を用い，図 3 および図 5 については，

Marlborough，MA，USA）によって化学発光させて検出

一元配置分散分析後の Tukey の多重比較を用いた。結果

し た バ ン ド を，iBright 1500（Thermo Fisher Scientific）

は，平均値 ± 標準偏差で表した，0.05未満の p 値は統計を用いて画像として取り込んだ。

的に有意であるとみなした。

29

日大歯学

図5

IL-1R2を強制発現させたHeLaのrhIL-1αおよびrhIL-1β対する反応性
HeLaにコントロールとしてpcDNA（白色バー）またはIL-1R2（黒色バー）をtransfectionした。それぞれのtransfectantは，rhIL-1α（100pg/ml），rhIL-1β（100 pg/ml）の存在下または非存在下（-）で 6 時間培養した。刺激後の培養上清中のIL-8分泌量をELISAにより測定した。n = 5，＊ p ＜ 0.05

結第 97 巻第 1 号

図6I L-1R1またはIL-1R2を強制発現させたCR-R1-4のrhIL-1βに対する反応性
CR-R1-4にIL-1R1単独（白色バー），IL-1R2単独（灰色バー）または
IL-1R1とIL-1R2の両者（黒色バー）をtransfectionした。その後，培養液を交換し，100 pg/ml rIL-1β存在下または非存在下で 6 時間培養した。培養後の上清中へのIL-8分泌量をELISAにより測定した。
n = 5，＊ p ＜ 0.05

この結果から，IL-1R2は HiBiT/His-pIL-1αの分泌に対して

果

抑制的に作用することが明らかとなった。そこで，IL-1R2

1 ．CR-R1-4における IL-1R2の発現を強制発現した HeLa における rhIL-1αまたは rhIL-1βのCR-R1-4における IL-1R2の発現について WB によって検刺 激 に 対 す る 反 応 性 を 確 認 し た。 そ の 結 果，IL-1R2

索した。その結果，図 2 に示したように，ポジティブコン

transfectant における IL-8の分泌量は，100 pg/ml rhIL-1α

トロールとして用いた HSC3で確認された56 kDa のバン

存在下では1.4 ± 0.1 ng/ml，100 pg/ml rhIL-1β存在下でドは，CR-R1-4においては検出できなかった。

は2.1 ± 0.1 ng/ml であり，pcDNA transfectant と同様にIL-8の分泌が増強された（図 5 ）。

2 ．CR-R1-4の rhIL-1βに対する反応性
HeLa は，rhIL-1β刺激に反応して IL-8産生を増強する

4 ．IL-1R2による rhIL-1β反応性の阻害

ことが明らかとなっている 。図 3 A に示した通り，HeLa

CR-R1-4では IL-1R2が発現していなかった（図 2 ）。一において100 pg/ml rhIL-1β存在下では1.8 ± 73.3 ng/ml

方，CR-R1-4への IL-1R1の強制発現は，rhIL-1βに対するの IL-8分泌が認められ，rhIL-1β非存在下の0.3 ± 0.1 ng/

反応性を回復したことから（図 3 ），CR-R1-4における IL-

ml と比較して有意な分泌増加が確認された。そこで，CR-

1R1および IL-1R2の共発現が，IL-1βに対する反応性に対R1-4に IL-1R1発現ベクターを transfection した後，rhIL-1

してどのような影響を及ぼすか検討した。その結果，IL-βに 対 す る 反 応 性 の 回 復 に つ い て 検 討 し た。IL-1R1

1R1単独の transfection では rhIL-1β非存在下に比べて100transfectant における IL-8分泌量は，rhIL-1β非存在下でpg/ml rhIL-1β存在下で443.8 ± 80.8 pg/ml と有意に IL-8

は129.2 ± 5.3 pg/ml であったが，10 pg/ml，100 pg/mlの分泌が増強された。一方，IL-1R2単独の transfection で

お よ び1,000 pg/ml の rhIL-1β存 在 下 で は， そ れ ぞ れ，は，rhIL-1β刺激に対して全く反応を示さなかった。さら490.0 ± 31.5 pg/ml，429.6 ± 9.7 pg/ml および442.6 ± 6.9に，両分子の共発現では100 pg/ml rhIL-1β存在下で492.3

pg/ml と有意に増加し，rhIL-1β刺激に対する反応性が認± 82.8 pg/ml と，非存在下に比べて有意に IL-8分泌が増められた。また，コントロールとして IL-1R1の配列を含有

強され，これは IL-1R1単独の transfection と同程度の増強

し な い pcDNA vector を transfection し た CR-R1-4で は，であった（図 6 ）。

12）

rhIL-1β刺激に対する反応は認められなかった（図 3 B）。

考

3 ．HeLa における IL-1R2の強制発現の効果

察

IL-1αは，生体内で ubiquitous に発現しているとされる

IL-1R2の細胞内での decoy receptor としての機能を確が，細胞死などに際して初めて細胞外に分泌される 5 ）。こ

認するため，HeLa に HiBiT/His-pIL-1αと IL-1R2を強制発のメカニズムについては以下の様に考えられている。すな

現し，HiBiT/His-pIL-1αの細胞外への分泌に対する影響を

わち，IL-1R2が pIL-1αと細胞内で複合体を形成しており，確認した。その結果，図 4 に示す通り，HiBiT/His-pIL-1α

グラム陰性菌の菌体外成分であるリポポリサッカライドな

単 独 の transfectant か ら 分 泌 さ れ た HiBiT/His-pIL-1αをどの刺激により細胞内の caspase が活性化されると，IL-100% としたときに，HiBiT/His-pIL-1αと IL-1R2の co-

1R2が分解される。その結果，この複合体が解消され，

transfectant では53.3 ± 19.6% と有意に分泌が低下した。

pIL-1αが細胞外に分泌されるというものである13）。そこで

30

HeLa における IL-1R2の機能

令和 5 年 6 月

本研究では，IL-1R2を有しない HeLa に HiBiT/His-pIL-1αで刺激した。結果は，HeLa と同様で，IL-1R2による IL-8と IL-1R2を co-transfection したところ，HiBiT/His-pIL-1αの分泌抑制効果は全く見られなかった。Shimizu ら17）は，の分泌が抑制された。このことは，HeLa においても IL-

コラーゲン誘導性関節炎を発症させた IL-1R2 knockout

1R2がこれまで報告されてきた細胞内における機能を発揮

mouse においては，IL-1に対する反応性の増強がマクロしていることを示すものであり ，HeLa 内で HiBiT/His-

ファージにのみに認められたことから，IL-1R2の decoy

pIL-1αと IL-1R2が結合した結果と考えられた。しかし，

receptor としての機能は，細胞種特異的であると結論しこの結合によって HiBiT/His-pIL-1αの分泌が抑制されるている。線維芽細胞において IL-1R2がシグナル伝達を抑メカニズムは明らかになっていない。IL-1R2は IL-1R1に制するという報告18）もあるが，ヒトの細胞においてはこの次ぐ第 2 のレセプターとして発見された分子であり14），細現象は確認されていない。本研究では，HeLa における胞外領域でリガンドと結合すると考えられている。しかIL-1R2の強制発現は，rhIL-1αおよび rhIL-1βに対する反応

し，細胞内での複合体形成によって HiBiT/His-pIL-1αが性を抑制することは無かったが，HiBiT/His-pIL-1αの分泌

細胞外に分泌されなくなるのであれば，細胞内領域またはは抑制した。このことは，HeLa において IL-1R2は，細胞細胞膜貫通領域が HiBiT/His-pIL-1αの分泌に対して抑制

質内での機能は維持しているものの，細胞膜上での機能は的な機能を有する可能性が考えられ，この点についてはさ

失われていることを示すものであった。HeLa におけるらなる検討が必要である。

IL-1R2の部分的な機能喪失がいかなる機序によるのかとい13）

一 方，IL-1R2の 細 胞 外 領 域 の 細 胞 膜 近 傍 は，matrix

う点については極めて重要であり，今後さらなる検討が必

metalloproteinase である a disintegrin and metalloprotease

要と考えられた。

domain 17により切断され ，細胞外領域のみが細胞外に15）結移行することにより，炎症に際して分泌された mIL-1αに論

結合し，その活性を低減させるとされている。本研究にお本研究では，IL-1R2の decoy receptor としての機能が，いても，HiBiT/His-pIL-1α-I と IL-1R2の複合体が細胞外

HeLa と HeLa の IL-1R1を欠失させた CR-R1-4においてもで形成され，ELISA による検出に影響した可能性が考え維持されているかという点について検討した。その結果，られることから，Hela の細胞外における両者の複合体の以下の結論を得た。

形成についてはさらに追究すべきものと考えている。

1 ．CR-R1-4においては，IL-1R2発現は確認できなかった。

IL-1R2は TIR- ドメインを欠く decoy receptor とされて

2 ．CR-R1-4においては，rhIL-1βに対する反応性は消失しおり，細胞質内領域はわずか29アミノ酸により構成されてていた。

いる 。TIR- ドメインとは，マクロファージや樹状細胞

3 ．HeLa における IL-1R2強制発現は，pIL-1αの分泌を阻

14）などの細胞表面に発現し，病原体関連分子パターンを認識害した。

する toll-like receptor（TLR）と IL-1R1の細胞質内に共通

4 ．HeLa における IL-1R2の強制発現は，rhIL-1αと rhIL-1して見られる配列である16）。TIR- ドメインを有するレセプβに対する反応を阻害しなかった。

ター同士が会合することによって，myeloid differentiation

5 ．CR-R1-4における IL-1R1の強制発現は，rhIL-1βに対factor 88や Toll/IL-1R domain-containing adaptor inducing

する反応性を回復した。

IFN-βなどのアダプターを誘導し，これによって転写因子

6 ．CR-R1-4における IL-1R1と L-1R2の強制発現は，rhIL-1

である nuclear factor κB，interferon regulatory factor なβに対する反応を阻害しなかった。

どを活性化させシグナルを伝達する 。

以上の結果から，HeLa および CR-R1-4に強制発現させ

16）IL-1αお よ び IL-1βの IL-1R1へ の 結 合 は，IL-1R3を IL-

た IL-1R2は，細胞内においてのみ decoy receptor として

1R1近傍に誘導し，両者の TIR ドメインが上記のメカニズ

機能することが明らかとなった。

ムでシグナルを伝達する。HeLa に IL-1βを作用させると本研究の推進にあたり，病理学講座

浅野正岳教授，角IL-8産生が増強されることが明らかとなっており12），この

田麻里子助教および講座員の皆様にご指導頂いた。ここにことは HeLa に IL-1R3が存在することを意味している。そ深甚なる感謝の意を表する。本論文に関して，開示すべき

こで，HeLa に IL-1R2を強制発現させることにより，rhIL-1

利益相反はない。

αまたは rhIL-1β刺激に対する反応性が低減するのではな

文

いかと考えた。しかし，IL-1R2を発現させた transfectant

献1）Auron PE, Webb AC, Rosenwasser LJ, Mucci SF, Rich A,
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においては，rhIL-1αおよび rhIL-1β依存性の IL-8分泌増強には何ら抑制的な効果を認めなかった。さらに，CR-R1-4
における IL-1R1の強制発現が，rhIL-1αおよび rhIL-1βに対する反応性を回復させた10）ことから，この細胞におけるIL-1R1および IL-1R2の co-transfectant を作製し，rhIL-1β

31

日大歯学

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