日大歯学 , Nihon Univ Dent J, 90, 109-115, 2016

ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬が幼若期の欠損マウスの呼吸中枢機能に及ぼす影響
岩佐聡子

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻（指導：白川哲夫 教授）

要旨：レット症候群は MeCP2 をコードする遺伝子の異常が原因で発症する。レット症候群児は生後 12〜 18 ヵ月以降に退行，呼吸異常，てんかん発作，自閉症状，手の常同運動などを呈するが，これらがどのような機序で発現するかについては明らかでない。今回，を欠損した雄仔（hemi）マウスについて，ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬であるバルプロ酸ナトリウム（VPA）を幼若期に投与し，呼吸機能ならびに呼吸中枢でのヒストンアセチル化レベルへの影響を検討した。Hemi マウスおよび野生型雄仔（wild）マウスに VPA を腹腔内投与した後，無呼吸回数をカウントした。また延髄呼吸中枢の神経細胞について，リジン残基（H3K9，H3K14，H4K5，H4K8）でのヒストンアセチル化について検討した。その結果，VPA の投与により hemi マウスの無呼吸回数は減少した。また呼吸中枢でのヒストンアセチル化レベルは，H3K14 と H4K8 では VPA 投与後も影響を受けなかったが，H3K9 と H4K5 で wild マウス，hemi マウスともにアセチル化レベルが上昇した。
以上の結果より，hemi マウスの生後発達の早期における VPA の投与が無呼吸の改善に効果があることが示され，その効果は VPA による延髄呼吸中枢ニューロンにおける H3K9 と H4K5 でのアセチル化レベルの上昇と関連していることが示された。
キーワード：レット症候群，MeCP2，無呼吸，バルプロ酸ナトリウム，ヒストンアセチル化緒

して阻害薬として働くことが分かっているが 11），レット

言症候群のモデルマウスで VPA の効果を調べた研究に関レット症候群は約 1 万人に 1 人の確率で主に女児に発しては，既に症状が顕著に現れている 6 〜 8 週齢マウス症する，呼吸異常を含む様々な症状を伴う遺伝性疾患でに つ い て 行 わ れ た 一 報 の み で 12）， 発 達 期 の マ ウ ス であり，メチル化 CpG 結合タンパク 2（MeCP2）をコード

VPA の効果を調べた研究はまだない。臨床においては，する遺伝子の異常により発症することが知られレット症候群の患者の約 60％にてんかん発作がみられる

1-3）の異常は自閉症など他の発達障害でといわれており 13-15），それらの患者に対するてんかん発ている。

がヒトの精神機能の発作の治療薬として VPA が高い頻度で使われている 9）。

達にも何らかの役割を果たしていることが示されていさらに発達遅滞に随伴して間歇性過剰呼吸と無呼吸を呈る 4）。これまでにする Pitt-Hopkins 症候群の患者に対しては，VPA が呼もみられることがあり，と高い相同性を示すを吸異常の改善に効果的であったとする報告もある 16）。

欠失させたモデルマウスが作られ，レット症候群の患者と類似した症状がみられることが報告されている

5,6）。モVPA の薬理作用として，脳内の GABA 量を増加させの欠損が MeCP2 にることで神経細胞の過剰な興奮を抑制し神経症状を改善

よって転写の制御を受ける遺伝子の発現を変化させ，神すると報告されている 17）が，その機序については不明な経発達障害を引き起こすことが報告されており 7），また点も多い。最近では，VPA がヒストン脱アセチル化酵モデルマウスに正常量の MeCP2 を発現させると神経症素の阻害薬として様々な遺伝子の発現に影響することがデルマウスを用いた研究で，8）状が改善したとの研究報告もある 。しかし，ヒトにお明らかになっており，グルタミン酸脱炭酸酵素 1（GAD1）

いてレット症候群の病態を改善させる安全で効果的な治や Reelin な ど が そ の タ ー ゲ ッ ト と し て 挙 げ ら れ て い療法は今のところない。

る 18）。しかしながら，現在のところ VPA がバルプロ酸ナトリウム（VPA）は臨床において，てんか損した発達期のマウスにどのような効果を発揮するのかん発作ならびにてんかん発作に伴う性格行動障害への治療薬として使用されているを欠については明らかにされていない。

9,10）

本研究では，。VPA は多くの遺伝子のを欠損した 2 週齢のマウスに対する VPA の効果を，無呼吸回数を指標とする呼吸異常の発現を抑制するとされるヒストン脱アセチル化酵素に対（受付：平成 28 年 1 月 20 日）〒 101 8310 東京都千代田区神田駿河台 1 8 13

109

3.

改善の有無によって確認するとともに，ヒストン H3 お

VPA あるいは saline を投与した wild ならびに hemi

よび H4 のリジン残基のアセチル化への影響についてもマウスを生後 15 日に一匹ずつ全身型プレチスモグラフ検討した。

（Biosystem XA, Buxco Electronics）のチャンバーに入材料および方法
1.

無呼吸回数の測定

れ，空気流量センサーにより呼吸波形を検出した。測定開始の 1 時間前にマウスをチャンバー内に入れて測定環

実験動物/境に馴化したのち，10：00 〜 11：00 の 1 時間，呼吸波

J, STOCK#003890：Jackson Laboratory, Bar Harbor）

形を連続的に記録した。呼気の開始点（下向き波形がゼならびに C57BL/6J 野生型雄マウス（オリエンタル酵母）

ロレベルを横切った点）から次の呼気開始点までの時間

を購入後，交配を行いを呼吸間隔とし，呼吸間隔が 1 秒以上の場合を無呼吸とヘテロ欠損雌マウス（B6；129P2（C）-欠損雄仔（hemi）マウスを得た。また C57BL/6J 野生型雌マウスと同様に交配してして，無呼吸の回数をカウントした。

野生型雄仔（wild）マウスを得た。飼育環境は，明期 7：00

4.

延髄腹側呼吸中枢（VRG）でのヒストンアセチル化レ
ベルの測定〜 19：00， 暗 期 19；00 〜 7：00， 室 温 24±1℃， 湿 度

VPA あるいは saline を 7 日間投与した wild ならびに50±5％とした。出産後，飼育ケージ内で母親に授乳させ，生後 21 日で母仔を分離した。出生した仔の遺伝子

hemi マウスに sodium pentobarbital（50 mg/kg, i.p.）で型の判定は Jackson Laboratory プロトコールに従い全身麻酔を施し，4％パラホルムアルデヒドを用いて灌

生 後 7 日 に PCR 法 に て 行 っ た。PCR プ ラ イ マ ー は，流固定した。そののち脳を摘出し，15％および 30％スク

forward，5ʼ-ggtaaagacccatgtgaccc-3ʼ；reverse，5ʼ-ロース液にてスクロース置換を行い−80℃で保存した。

tccacctagcctgcctgtac-3ʼを使用した。食餌にはマウス・VPA あるいは saline を投与した wild ならびに hemi

ラット・ハムスター用飼料 MF（オリエンタル酵母）を用

マウスの脳試料 4 種について，クリオスタット（Leica,い，水と餌を自由に与えた。なお，本研究は日本大学遺CM1850）にて 25μm の厚さで前頭断連続切片を作製し伝子組換え実験安全委員会及び日本大学歯学部動物実験

0.01 M phosphate buﬀered saline（PBS）に回収した。浮

委員会の承認を得て実施し，実験動物の取扱いは同委員

遊標本を PBS で洗浄後，0.2％ Triton X，10％ヤギ血清会 の 指 針 に 従 っ て 行 っ た（ 承 認 番 号，2014 歯 001，を含むブロッキング溶液に入れ，室温で 60 分間，浮遊法

AP13D026-1）でインキュベートしブロッキングを行った。その後，ア2.

セチル化されたリジンに対するウサギ抗 H3K9，H3K14，

VPA の腹腔内投与
ヒ ス ト ン 脱 ア セ チ ル 化 酵 素（HDAC）阻 害 薬 で あ る

H4K5，H4K8 抗体（Epigentek）とマウス抗 NeuN 抗体

VPA（sodium 2-propylpentanoate, 2 mmol/kg, Sigma）（Millipore）を 含 む 反 応 液 中 で 4℃ に て 一 晩 イ ン キ ュと L- カ ル ニ チ ン（0.2 mmol/kg, Wako）を 生 理 食 塩 水

ベ ー ト し た。 用 い た 抗 体 と 希 釈 率 は 第 1 表 に 示 し た。

（saline）に溶解し，生後 8 日から 14 日まで毎日 18：00

その後 PBS で洗浄し，蛍光標識ヤギ二次抗体（抗マウスに wild な ら び に hemi マ ウ ス に 腹 腔 内 投 与 し た（VPAAlexa Fluor 546, 抗ウサギ Alexa Fluor 488, Abcam）

群）。マウスの体重当たりの溶液量は 1.0μl/g とした。まを含む反応液中で，室温，遮光下で 1 時間インキュベーたコントロールのマウスには同量の saline を腹腔内投与トした。その後 PBS で洗浄し，スライドガラスに張りした（saline 群）。なお L- カルニチンは VPA 投与によっ付け，DAPI を含む封入材（Fluoroshield with DAPI,て引き起こされることが知られているカルニチン欠乏にImmunoBioScience）とカバーガラスにて封入した。
マウスの脳アトラス 19）に基づき，延髄腹側呼吸中枢よる高アンモニア血症を予防する目的で用いた。

第1表

蛍光免疫組織染色に使用した抗体リスト

110

レット症候群の無呼吸に対する VPA の効果（VRG）を落射蛍光顕微鏡（Eclipse 80 , Nikon）で観察し，る。そこで比較するマウスの脳組織切片の作製と染色は

第 1 図に示す VRG 内の縦（背腹方向）420μm，横（左右それぞれ同日に同一条件で行い，スライドガラスへの切方向）520μm の範囲を高感度 CCD カメラで画像撮影し片の貼り付けと封入，ならびに画像撮影もそれぞれ同日た。そののち画像解析ソフトウエア（ImagePro 7.0）を用に行った。

いて NeuN 陽性細胞を選別し，それらについて DAPI の輝度を基準に各細胞でのアセチル化ヒストンの輝度の比を算出した。
5.

統計処理方法
データは平均値と標準誤差で示した。ANOVA にて有意差の検定を行った後，Bonferroni 法により群間比較を行った。

値が 0.05 未満の時に有意差ありとした。

結1.

果

2 週齢の wild ならびに hemi マウスの無呼吸回数への VPA の影響
Wild マウスと hemi マウスの呼吸波形を第 2 図に示した。Wild マウスは VPA 群，saline 群ともに安定した呼吸リズムを示し，無呼吸は比較的まれであったのに対し，saline 群の hemi マウスでは高い頻度で無呼吸が出現した。Saline 群の hemi マウスは wild マウスよりも有意に無呼吸回数が多く（ ＜ 0.001），その平均は saline 群のwild マウスで 13 回／時間，hemi マウスで 148 回／時間であった。VPA の投与により，hemi マウスでは無呼吸回数が有意に減少した（55 回／時間）が，wild マウスでは VPA 投与後も無呼吸回数に変化はみられなかった（第3 図）。
2.

VRG ニ ュ ー ロ ン の ヒ ス ト ン ア セ チ ル 化 に 対 す る
VPA の影響
VRG ニューロンにおけるヒストンアセチル化について，蛍光免疫組織染色により個々の細胞レベルで検討した。測定対象にしたアセチル化リジン残基のヌクレオ第2図

2 週齢の wild ならびに hemi マウスの呼吸に及ぼす VPAの影響（代表例）

第3図

VPA あるいは saline を投与した 2 週齢の wild ならびに
hemi マウスの 1 時間の無呼吸回数（mean±SEM）（ ）内は各群の匹数，* ＜ 0.05

ソーム上の位置，およびリジン残基のアセチル化と脱アセチル化の模式図を第 4 図に示した。アセチル化されたリジン残基の量的な違いを顕微鏡画像上で蛍光強度の変化として比較する際には，染色操作，プレパラート作製および観察時の条件を可能な限り一定にする必要があ

第1図

延髄腹側呼吸中枢（VRG）の解剖学的位置111

画 像 解 析 の 結 果，H3K14 と H4K8 で は VPA 投 与 を行った場合でも wild マウス，hemi マウスともに蛍光強度に変化はみられなかった（第 5 図 B, D および第 6 図 B,D）が，H3K9 と H4K5 では wild マウス，hemi マウスともにアセチル化レベルが上昇し，wild マウスでは H3 K9で＝ 0.011, H4K5 で＝ 0.034 といずれも VPA 群で有意な上昇を示した（第 5 図 A, C および第 6 図 A, C）。さらに hemi マウスでは H3K9，H4K5 ともに VPA 群で著明なアセチル化レベルの上昇を認めた（ ＜ 0.001）。

考察レット症候群の主症状の一つである呼吸異常は，呼吸リズムを形成している VRG を含む延髄の呼吸中枢，ならびに橋に位置し呼吸機能を調節している Kölliker-Fuse
核などの中枢の異常が原因と考えられている 20）。心臓と横隔膜を保存した状態で作製された脳幹灌流標本を用いた実験で，Stettner ら 21）は hemi マウスにみられる無呼吸が，吸気活動後の Kölliker-Fuse 核の神経興奮に伴っ第4図

第5図

A：ヌクレオソームの模式図
B：リジン残基のアセチル化と脱アセチル化
HAT：ヒストンアセチル基転移酵素
HDAC：ヒストン脱アセチル化酵素
Ac：アセチル基て発生していることを報告し，hemi マウスでの著明な無呼吸が吸気後のシナプス伝達とそれに関連する神経ネットワークの異常に起因するとの仮説を提唱している。また Medrihan 22）らは 7 日齢の hemi マウスの VRG

A，B：アセチル化 H3 K9，H3 K14 の蛍光免疫組織染色（代表例）
C，D：H3 K9，H3 K14 のアセチル化レベル（ ）内は細胞数，* ＜ 0.05 ** ＜ 0.01

第6図112

A，B：アセチル化 H4K5，H4K8 の蛍光免疫組織染色（代表例）
C，D：H4K5，H4K8 のアセチル化レベル（ ）内は細胞数，* ＜ 0.05 ** ＜ 0.01

レット症候群の無呼吸に対する VPA の効果

において，すでに興奮性シナプスと抑制性シナプスの活に 違 い が み ら れ な か っ た。 こ の こ と は， 必 ず し も動バランスが障害されていることを報告しており，このH3K14，H4K8 においてアセチル化反応が起きにくいこ

シナプス伝達のバランスの乱れがシナプス前 GABA 放とを意味しない。それぞれのアセチル化ヒストン抗体を出量の減少に起因すると結論づけている。

用 い た 本 研 究 で の 免 疫 蛍 光 染 色 の 結 果 か ら，H3K14，

MeCP2 の欠損が延髄の呼吸中枢にどのような病的変

H4K8 についても免疫陽性細胞が多数認められており，化を生じさせているかについて，hemi マウスの VRG を哺乳動物細胞のリジン残基でのヒストンアセチル化の順

対象に，GABA の合成酵素である GAD1 の遺伝子発現序から推測すると 27），H3K14，H4K8 では saline 群にお変化と無呼吸との関連を検討した研究がある

23）

いて既に高いレベルでアセチル化されていることが考え。GABAられる。

は抑制性神経伝達物質として呼吸リズムの調節に深く関与しており 24），mRNA の発現量は 2 週齢の hemi

遺伝子発現を制御しているエピジェネティックなメカ

23）

ニズムには，ヒストンのアセチル化あるいはメチル化にマウスで有意に低下していることが報告されている。

Hemi マ ウ ス の 無 呼 吸 回 数 の 増 加 が VRG のよる転写調節のほかに DNA のメチル化修飾が知られてmRNA の発現量の低下に起因する GABA 産生の低下にいる 3）。MeCP2 はメチル化した DNA に結合して下流によ る も の だ と す る と， 本 研 究 で 認 め た VPA 投 与 後 の位置する DNA の転写を主に抑制することが知られていhemi マウスの無呼吸回数の減少は，VPA が VRG を含る が，MeCP2 の ほ か に methyl CpG binding domain

む脳内の GABA 作動性ニューロンでの GABA 合成あるprotein 1 などの DNA 結合タンパクが DNA 上のメチル

いは放出量を増加させたこと 25）により，呼吸中枢でのシ化した CpG に結合して転写制御複合体を形成し，遺伝ナプス伝達のバランスが改善されたことが影響している

子発現を制御していることが分かっている 28）。と考えられる。

プロモーター領域の CpG メチル化に関して，バイサルのVPA がどのようなメカニズムで脳内の GABA 量を増ファイトシークエンス法を用いた研究により，hemi マ加させるのかについてはいくつかの報告があるが不明な

ウスでは wild マウスに比べ多くの CpG がメチル化され点も多い

17）ていることが報告されている 23）。このことは，hemi マ。最近では，VPA が酪酸などと同様にヒストン脱アセチル化酵素の阻害薬として働くことが明らか

ウスの無呼吸回数の増加にプロモーター領域のメにされ て お り， そ のターゲット遺伝子としてやチル化レベルの上昇が関与していることを示唆していな ど が 挙 げ ら れ て い る 18）。 本 研 究 に お い て，る。今回の結果と合わせると，HDAC の阻害薬であるVPA を投与したマウスの呼吸中枢ニューロンでヒストVPA の働きによってンのリジン残基 H3K9 と H4K5 にアセチル化レベルの上チン構造が変化し，それにより CpG が脱メチル化され昇を認めた。この結果は，腹腔内に投与された VPA がる方向に反応が進んだ，あるいは血液脳関門を通過し，延髄呼吸中枢のニューロンに作用域のメチル化 CpG での転写抑制複合体の形成が阻害さして H3K9 ならびに H4K5 のアセチル化を促進し，核内れて転写が亢進したことが無呼吸の改善につながった可クロマチン構造を変化させたことで能性がある。これらについてはなどの遺伝子プロモーター近傍のクロマプロモーター領の転写活性調節に

関 わ る 分 子 メ カ ニ ズ ム の さ ら な る 研 究 が 必 要 で あ り，の転写を活性化させたことを示唆する。

プロモーターでの DNA 脱メチル化とヒストンアヒストンでのリジンのアセチル化反応は，アセチル基セチル化の相互作用についても検討する必要がある。

をアセチル CoA からリジン残基に転移する反応であり，ヒストンアセチル基転移酵素（HAT）によってヒストンの現在のところレット症候群の病態そのものを改善する

N 末端テール領域のリジンで起こることが明らかになっ治療薬はなく，それぞれの患者の症状に合わせて抗てんている。ヒストンテール上のリジンがアセチル化される

かん薬や自律神経機能を改善する働きのある薬物などにと，リジン残基の正の電荷が弱まるためにヒストン−よる対症療法が行われている 29）。VPA は抗てんかん薬

DNA 間の相互作用が減弱し，ヘテロクロマチン構造がとしてレット症候群患者に限らず小児・成人ともに臨床緩むことで DNA 結合性転写因子が DNA 上に結合しやで広く用いられている薬である。現在のところ VPA のすくなり遺伝子発現が活性化される 26）。すなわち，VPA中枢作用の詳細なメカニズムについてはいくつかの説が投与によって HDAC 活性が抑制されたことで HAT を介あり見解が必ずしも一致していない 10）。しかし本研究でしたアセチル化反応によりヒストンアセチル化が促進さ

VPA が HDAC 阻害作用を通じてヒストンテール上の特れ，それにより呼吸中枢ニューロンでのなどの遺定のリジン残基のアセチル化レベルを上昇させることで伝子発現が増加したことが hemi マウスの無呼吸回数の呼吸を安定化させることが示されたことから，今後この減 少 に 結 び つ い た と 考 え ら れ る。 な お 本 研 究 で は機序をより詳細に検討することで，レット症候群患者のH3K14，H4K8 については wild マウス，hemi マウスい症状をより効果的に改善する薬物を見いだすことが可能

ずれにおいても VPA 群，saline 群でアセチル化レベルになると考えられる。

113

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論

Hemi マウスの呼吸異常に対する VPA の効果を無呼吸の改善の有無によって確認するとともに，ヒストンのリジン残基でのアセチル化への VPA の影響について検討する目的で，VPA を 7 日間投与した 15 日齢の hemi マ
ウスの無呼吸回数，VRG ニューロンにおけるヒストンアセチル化レベルを wild マウスと比較検討し，以下の知見を得た。
1.

Saline 群の hemi マウスでは wild マウスと比較し無呼吸回数が有意に多かったが，VPA 群の hemi マウスではその回数が有意に減少した。

2.

VRG ニューロンにおけるヒストンアセチル化レベルは，H3K9 と H4K5 について VPA 群の hemi およびwild マウスで有意に上昇し，hemi マウスではより著明な上昇を示した。
以上の結果より，hemi マウスの生後発達の早期における VPA の投与が無呼吸を改善することが示され，その効果は VPA による延髄呼吸中枢ニューロンにおけるH3K9 と H4K5 でのアセチル化レベルの上昇と関連していることが示された。
本研究遂行にあたり , 格別なる御指導御鞭撻を賜りました，日本大学歯学部小児歯科学講座の白川哲夫教授ならびに同病理学講座の浅野正岳教授に謹んで感謝申し上げます。また , 本研究にご協力いただきました小児歯科学講座ならびに病理学講座の皆様に感謝いたします。
本研究は , 日本大学大学院歯学研究科研究費（学生研究費）により実施しました。
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レット症候群の無呼吸に対する VPA の効果

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