日大歯学 , 95（2）, 97-102, 2021

原著

In vitro transcription/translation 法により作製した mature interleukin-1α とpropiece interleukin-1α の機能比較高田礼央

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻 口腔健康科学分野（指導：白川哲夫 教授，浅野正岳 教授）

要旨
目的：in vitro transcription/translation 法で作製した recombinant mature interleukin-1α（rmIL-1α ）とrecombinant propiece interleukin-1α（rppIL-1α ）のサイトカイン産生誘導能について検討した。
方法：発現ベクター pcDNA-mIL-1α 及び pcDNA-ppIL-1α を用いて rmIL-1α と rppIL-1α を作製し，rmIL-1α
は enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）及び western blot 法で，rppIL-1α は western blot 法で産生を確認した。ヒト肺腺癌由来 A549 細胞を用いて rmIL-1α 及び rppIL-1α のサイトカイン産生誘導能を比較した。
結果：ベクターの形状にかかわらず，ほぼ同量の rmIL-1α が産生された。rmIL-1α 及び rppIL-1α は，それぞれ19 kDa 及 び 18 kDa の 単 一 バ ン ド と し て 確 認 さ れ た。A549 細 胞 に 対 す る IL-8 産 生 誘 導 能 を 調 べ た と こ ろ，rmIL-1α でのみ誘導能が観察され，rppIL-1α では確認されなかった。
結論：作製した rmIL-1α 及び rppIL-1α は，A549 細胞によるサイトカイン産生に対して異なる効果を有し，rmIL-1α のみが IL-6 と IL-8 両方の産生誘導能を有していた。
キーワード：interleukin-1α ，in vitro transcription/translation 法，recombinant タンパク質

Functional comparison between mature and propiece interleukin-1α generated
by in vitro transcription/translation method
Leo Takada
Nihon University Graduate School of Dentistry, Major in Applied Oral Sciences(Director: Prof. Tetsuo Shirakawa and Prof. Masatae Asano)

Abstract
Purpose: The cytokine production-inducing ability was compared between recombinant matureinterleukin-1α (rmIL-1α ) and recombinant propiece interleukin-1α (rppIL-1α ) prepared by the in vitrotranscription/translation method.
Methods: Employing pcDNA-mIL-1α and pcDNA-ppIL-1α vectors, rmIL-1α and rppIL-1α were produced
and confirmed subsequently by enzyme-linked immunosorbent assay/western blot method and western blot
method, respectively. Using A549 cells derived from human lung adenocarcinoma, the cytokine productioninducing ability of rmIL-1α and rppIL-1α was compared.
Result: No significant difference was observed between the cyclic and linearized pcDNA-mIL-1α vectors interms of the amount of recombinant protein produced with them. rmIL-1α and rppIL-1α were identified as
bands of 19 kDa and 18 kDa proteins, respectively. Induction of IL-8 was observed when A549 cells werestimulated with rmIL-1α but not with rppIL-1α .
Conclusion: It was clarified that rmIL-1α and rppIL-1α produced by the in vitro transcription/translation
method had different effects on the induction of IL-6 and IL-8 and that rmIL-1α but not rppIL-1α had anability to induce both IL-6 and IL-8 in A549 cells.
Keywords: interleukin-1α , in vitro transcription/translation method, recombinant protein（受付：令和 3 年 2 月 4 日）
責任著者連絡先：高田礼央
日本大学歯学部 小児歯科学講座〒 101-8310 東京都千代田区神田駿河台 1-8-13

TEL：03-3219-8106
FAX：03-3219-8353
E-mail：galonleo@gmail.com

97

日大歯学緒第 95 巻第 2 号

Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）に，10％言

ウシ胎児血清（FCS; Biosera, Nuaille, France），1％ non-

障害を受けた細胞が，自らの置かれた危機的な状況をessential amino acid
（Merck, Darmstadt, Deutschland）

周 囲 に 知 ら し め る た め に 放 出 す る 物 質 は danger-

及び 1％ L-glutamine-penicillin-streptomycin（Merck）
をassociated molecular patterns または alarmin と総称さ添加した 10％ FCS-DMEM を用いた。

れる 1,2）。Alarmin には，Interleukin（IL）-1α ，IL-33 や・発現 plasmid と in vitro transcription/translation

high-mobility group box-1 などの分子が含まれている。

Sata ら 8）に よ り 作 製 さ れ た 発 現 ベ ク タ ー pcDNA-

その中で IL-1α は約 34 kDa の前駆体 precursor IL-1α

mIL-1α 及び pcDNA-ppIL-1α（図 1）の供与を受けて，in（pIL-1α ）として細胞内で産生され ，Ca

依存性タンパvitro transcription/translation 法によって recombinant

ク質分解酵素であるカルパイン 4）や，好中球などが産生タンパク質を作製した。作製にあたっては，TNT Quick

する granzyme B（GzmB） などによって分子のほぼ中央

Coupled Transcription/Translation System（Promega,3）2+5）部分を切断され，N 末端側の propiece IL-1α（ppIL-1α ）Madison, WI, USA）を用いて，plasmid 1μg に 1 mMと C 末端側の mature IL-1α（mIL-1α ）が生じる。従って，methionine 1μL 及び in vitro transcription/translation

IL-1α 分子には pIL-1α ，mIL-1α 及び ppIL-1α の 3 分子

mixture を 40μL 加え，30℃で 90 分間反応させた。コ

種 が 存 在 す る。 こ の 中 で ppIL-1α は 分 子 内 に nuclear

ントロール反応では pcDNA を用いた。それぞれの発現localizing sequence（NLS）が存在し，主に核に局在するベクターを用いることで得られた recombinant タンパクとされ，機能的には遺伝子発現に関与する可能性が報告

質 を rmIL-1α 及 び rppIL-1α と し た。 ま た，pcDNA-されている 。しかし，その詳細は全く不明である。

mIL-1α を制限酵素 Xho I により直鎖化して同様の反応

6）

本研究では，in vitro transcription/translation 法を用を行い，環状 DNA を用いた場合の rmIL-1α 産生とともいて recombinant mIL-1α（rmIL-1α ）及び recombinantに作製されたタンパク質について検討した。rmIL-1α にppIL-1α（rppIL-1α ）を作製した。肺腺癌由来の A549 細ついては Quantikine Human IL-1α ELISA kit（R&D

胞を用いた先行研究 7）では，mIL-1α 刺激によって同細systems, Minneapolis, MN, USA）により定量を行った。

胞が IL-6 及び IL-8 を産生することが報告されているたrppIL-1α については，100 mg/mL のウシ血清アルブミ

め ，本研究では，作製した rmIL-1α 及び rppIL-1α にン（BSA; 富士フイルム和光純薬，大阪）の段階希釈溶液7）より A549 細胞を刺激し，これらサイトカインの産生誘とともに，10％ sodium dodecyl persulfate ポリアクリ導能の有無を検証した。

ルアミドゲル（10％ SDS-PAGE; BIO-RAD, Berkeley,CA, USA）にて電気泳動し，Coomassie Brilliant Blue

材料および方法（CBB; BIO-RAD）染色を行った。バンド濃度を Image J（National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA）で・細胞
ヒト肺腺癌由来上皮細胞である A549 細胞は，JCRB 細計測し，段階希釈した BSA のバンド濃度から作成した

胞 バ ン ク（ 茨 木，大 阪 ）より入 手 し た。 細 胞 培 養 に は，検量線をもとに，rppIL-1α のタンパク質濃度を求めた。

Du l becco's m i n im u m essen t ia l med i u m（DMEM;

図1

発現ベクター pcDNA-mIL-1α および pcDNA-ppIL-1α
Xho l：直鎖化に用いた制限酵素98

IL-1 α 分子種の機能比較

・Western blotting

令和 3 年 12 月

結合成反応終了後の in vitro transcription/translation
反応液を 5μL 採取し，sample buffer と混和し，95℃で果・rmIL-1α の産生3 分間反応させた後，10％ SDS-PAGE により電気泳動

pcDNA-mIL-1α を 制 限 酵 素 Xho I に よ り 直 鎖 化 し，した。泳動後，Immobilon Transfer Membrane（Merck）

アガロースゲル電気泳動を行い，直鎖化していないものに転写し，1％ BSA- リン酸緩衝生理食塩水により非特と比較した結果を図 2 に示す。直鎖化したものは 6.2 kb異的反応部のブロッキングを行った。1 次抗体としてウの位置に 1 本のバンドを確認したのに対し，直鎖化してサギ抗ヒト IL-1α 抗体（500 倍希釈 ; Abcam, Cambridge,いないものでは 6.2 kb に加えて 7.2 kb，7.3 kb の位置にUK），2 次抗体として horseradish peroxidase 標識のヤバンドが確認できた。環状及び直鎖化した発現ベクター

ギ 抗 ウ サ ギ IgG 抗 体（5,000 倍 希 釈；Jackson Immunoを用いて in vitro transcription/translation を行い，そResearch, West Grove, PA, USA） と 反 応 さ せ，の 反 応 産 物 1μL に つ い て 抗 IL-1α 抗 体 を 用 い てEnhanced chemiluminescence western blotting

western blot を行った。その結果，ベクターの直鎖化のsubstrate kit（GE Healthcare, Chicago, IL, USA）を用い有無に関わらず，19 kDa の位置に IL-1α 陽性バンドが検て 発 光 さ せ た。 画 像 の 取 り 込 み は ChemiDoc XRS

出された（図 3）。

imaging system（BIO-RAD）によって行った。

環状及び直鎖化したベクターにより産生された・細胞の刺激

rmIL-1α を ELISA にて定量した結果，鋳型 DNA 100 ng

合成反応終了後の in vitro transcription/translation

に対して産生されたタンパク質量は，環状ベクターでは反応液を，10％ FCS-DMEM により 100 倍，1,000 倍及

6.1 ± 0.2 ng/μL（n ＝ 3），直鎖化したベクターでは 5.4 ±び 10,000 倍に希釈した。これらの希釈液 400μL を用い0.8 ng/μL（n ＝ 3）で，平均 5.8 ± 0.6 ng/μL であった。て A549 細胞（1 × 10 /well，24-well plate）を 18 時間培・rppIL-1α の産生5養した。pcDNA を用いたコントロール反応液を同様にrppIL-1α を rmIL-1α と同様の方法で作製し，段階希100 倍に希釈し A549 細胞の培養に用いた。培養後の上釈した反応産物を western blot にて検討した。その結果，清を回収し，14,000 × g で 2 分間遠心し，上清をサンプ

図 4 に示した通り，rppIL-1α は 18 kDa の単一の IL-1α

ル と し た。 サ ン プ ル に お け る IL-6 及 び IL-8 濃 度 は，陽性バンドとして検出され，希釈に伴うバンド濃度の減Q u a n t i k i n e H u m a n I L -6，I L -8 E L I S A k i t（R & D少が認められ，これによって，in vitro transcription/systems）により測定した。

translation 法による rppIL-1α 産生が確認できた。そこ

・統計学的解析で段階希釈した BSA を利用して作成した検量線をもと

Jarque-Bera 検定で正規性を確認した後に，Tukey-に rppIL-1α の定量を行い，以下の実験に供した。

Kramer 法により有意差を検定した。P ＜ 0.05 を有意差ありとした。

図2

pcDNA-mIL-1α の直鎖化の確認
発現ベクター pcDNA-mIL-1α を Xho l により直鎖化したもの（cut）および直鎖化していないもの（un-cut）を 0.8% アガロー
スゲル電気泳動により展開した。

99図3

rmIL-1α の western blot
発現ベクター pcDNA-mIL-1α を直鎖化したもの（cut）と直鎖化していないもの（un-cut）を用いて in vitro transcription/translation を行った。反応産物 1μL を 10% SDS-PAGE により展開し，抗ヒト IL-1α 抗体を用いて western blot を行った。

図4

ppIL-1α の産生確認
In vitro transcription/translation 反 応 に よ り 作 製 し た
rppIL-1α を，段階的に希釈して 10% SDS PAGE に展開し，抗ヒト IL 1α 抗体により western blot を行った。

日大歯学

第 95 巻第 2 号

・rmIL-1α 存在下での A549 細胞による IL-6，IL-8 産生た。ベクターの形状の変化がタンパク質産生量に及ぼす作製した rmIL-1α がサイトカイン産生に及ぼす効果に影響について検討したところ，制限酵素によるベクターついて，肺腺癌由来の A549 細胞を用いて検討した。段の直鎖化が，反応効率に影響を及ぼさないことが明らか

階 希 釈 し た rmIL-1α を A549 細 胞 に 作 用 さ せ，ELISAと な っ た。 そ こ で， 本 研 究 で の rmIL-1α な ら び にによって IL-6 及び IL-8 産生量を測定した（図 5）。その結rppIL-1α の産生は，直鎖化しないベクターを用いて行う

果，IL-6，IL-8 の産生量は，いずれも rmIL-1α 濃度依存こととした。

的に，コントロールと比較して有意に増加した（図 5）。

得られた recombinant タンパク質の確認は western

IL-6 産生量は，rmIL-1α 100 倍希釈において 486 ± 25

blot 法と ELISA 法を用いたが，これまでに市販されてきpg/mL（n ＝ 5），IL-8 産生量は，6.4 ± 0.4 ng/mL（n ＝ 5）

た抗 IL-1α 抗体は，大部分のものが rmIL-1α を免疫原とであった。すなわち，rmIL-1α 刺激を受けた A549 細胞して得られたものであり，ppIL-1α に対する特異抗体はで産生される IL-8 は，IL-6 に比べてより高濃度であった。

ほとんど存在しない。このため，作製された rppIL-1α の・rppIL-1α 存在下での A549 細胞による IL-8 産生濃度を正確に測定するための ELISA system は存在しない。そこで本研究では，同じ plasmid 量を用いて得た反rppIL-1α 刺激を受けた A549 細胞による IL-8 産生量は，rmIL-1α 刺激による IL-8 産生量（4.1 ± 0.2 ng/mL,応産物を，同じ希釈倍率で培養液に添加して A549 細胞n ＝ 5）と比較して極めて低値であり，その量は，無刺激を刺激することによって実験を行った。mIL-1α は多くののネガティブコントロールあるいは insert を含まない機能を有するサイトカインであるとされるが 9），ppIL-1αpcDNA による合成反応溶液での値とほぼ同程度であっの機能についてはごく一部が判明しているに過ぎない 6）。

た（図 6）。すなわち，A549 細胞は，rmIL-1α 刺激によっ

一方，細胞内で産生された pIL-1α は，分子内に存在て IL-8 を産生したが，rppIL-1α 刺激による IL-8 産生誘する NLS によって核内に局在するとされるが，細胞膜導は認められなかった。に局在するとの報告もなされている 10,11）。pIL-1α を切断考する酵素にはカルパイン 4,12）や thrombin13）などが知られ察ており，GzmB の様に細胞外でも酵素活性を示すものも本研究では，in vitro transcription/translation 法にある 5）。こうした事実は，細胞膜に局在する pIL-1α ，まよって作製した rmIL-1α 及び rppIL-1α を用いてサイト

たは細胞外に分泌される pIL-1α が，細胞外において切カイン産生誘導能の違いについて検討した。タンパク質断される可能性があることを示している。こうした酵素の発現には哺乳類細胞で発現を誘導できる plasmid とし的切断が細胞外で起こった場合に生じる ppIL-1α が，細て pcDNA を用いた。このベクターでは T7 RNA ポリメ胞外において何らかの活性を示す可能性は否定できなラーゼによる転写開始が可能であり，本実験においてはい。しかし，これまで ppIL-1α 自体の機能を追究した報

効率よく recombinant タンパク質を作製することが出来告は皆無であり，その点に焦点をあてた IL-1α の機能検図5

A549 細胞に対する rmIL-1α の IL-6，IL-8 産生誘導能
肺腺癌由来 A549 細胞に対して，in vitro transcription/translation 反応により作製した rmIL-1α を段階的に希釈し，作用させた。産生された IL-6 および IL-8 の濃度を ELISA により測定した（n ＝ 5/column）（。-）
はコントロールで rmIL-1α で刺激していない A549 細胞の培養上清とした。＊ P ＜ 0.05

100

IL-1 α 分子種の機能比較

3.

索の意義は大きいと考える。本研究ではこうした背景に基づき検討を行ったが，rppIL-1α 刺激は A549 細胞にお令和 3 年 12 月

ヒト肺腺癌由来の A549 細胞に対する rmIL-1α 刺激
は，IL-6 及び IL-8 産生を濃度依存的に誘導した。

4.

ける IL-8 産生を誘導しなかった。
Kim ら 7）は大腸菌で作製した recombinant mIL-1α 及A549 細胞において rppIL-1α 刺激は IL-8 の産生誘導を惹起しなかった。

び recombinant pIL-1α を用いた研究により，両者がと以上のように，in vitro transcription/translation 法

もに A549 細胞に対して IL-1 Receptor type 1 を介してによって得られた rmIL-1α 及び rppIL-1α は，IL-1α 関

IL-6 及び IL-8 産生を誘導し得ることを確認している。本連分子の生理活性や機能分析のための培養実験に供する研究では，rppIL-1α が A549 細胞における IL-6 産生をことができるほか，特異抗体の作製における免疫原とし誘導しないという結果であったが，このことは，IL-6 産ても活用が可能と考えられた。

生誘導の活性が，pIL-1α の N 末端領域に依存するものではない可能性を示唆するものであり大変興味深い。一導能の有無は，今後も検討継続する必要があると考える。

本論文の作成にあたり，小児歯科学講座 白川哲夫教授および日本大学病理学講座 浅野正岳教授にご指導いただきました事を心より感謝申し上げます。また，実際に実験を推進するにあたって多くのご助言とご指導をいただきました両教室の諸先生方に厚くお礼申し上げます。
本論文に関して，開示すべき利益相反はありません。

なお，ppIL-1α に対する特異的抗体が存在しない状況下

文献

方で，本研究で得られた rppIL-1α 濃度は極めて低く，培養液への添加量が IL-8 産生を誘導できる濃度レベルでなかった可能性もある。ppIL-1α のサイトカイン産生誘で，rppIL-1α の in vitro transcription/translation 法に

1）Oppenheim JJ, Yang D (2005) Alarmins: chemotactic
activators of immune responses. Curr Opin Immunol 17,359-365.
2）Rider P, Voronov E, Dinarello CA, Apte RN, Cohen I(2017) Alarmins: Feel the stress. J Immunol 198, 13951402.
3）Di Paolo NC, Shayakhmetov DM (2016) Interleukin 1αand the inflammatory process. Nat Immunol 17, 906-913.
4）K o b a y a s h i Y , Y a m a m o t o K , S a i d o T , K a w a s a k i H ,Oppenheim JJ, Matsushima K (1990) Identification ofcalcium-activated neutral protease as a processing
enzyme of human interleukin l α . Proc Natl Acad Sci
U S A 87, 5548-5552.
5）Afonina IS, Tynan GA, Logue SE, Cullen SP, Bots M,Lüthi AU, Reeves EP, McElvaney NG, Medema JP,Lavelle EC, Martin SJ (2011) Granzyme B-dependent
proteolysis acts as a switch to enhance theproinflammatory activity of IL-1α . Mol Cell 44, 265-278.
6）W e r m a n A , W e r m a n - V e n k e r t R , W h i t e R , L e e J K ,Werman B, Krelin Y, Voronov E, Dinarello CA, Apte RN(2004) The precursor form of IL-1 alpha is an intracrine
proinflammatory activator of transcription. Proc NatlAcad Sci U S A 101, 2434-2439.
7）Kim B, Lee Y, Kim E, Kwak A, Ryoo S, Bae SH, Azam
T , K i m S , D i n a r e l l o C A (2013) T h e i n t e r l e u k i n -1 αprecursor is biologically active and is likely a key
alarmin in the IL-1 family of cytokines. Front Immunol
4, 391.
8）Sata E, Takada L, Kaetsu R, Fukasawa M, Ohtsu M,
Motoyoshi M, Asano M (2020) A new enzyme-linked
immunosorbent assay system against the N-terminal
propiece of interleukin-1α . J Oral Sci 62, 340-343.
9）Dinarello CA (2009) Immunological and inflammatory
functions of the interleukin-1 family. Annu Rev Immunol
27, 519-550.
10）Brody DT, Durum SK (1989) Membrane IL-1: IL-1 alphaprecursor binds to the plasma membrane via a lectinlike interaction. J Immunol 143, 1183-1187.

よる調製は，より多くの recombinant タンパク質の生成を実現し，ppIL-1α 特異的なモノクローナル抗体の作製や，ppIL-1α 定量系の確立などの可能性にもつながると考える。

結論

本研究では in vitro transcription/translation 法によって作製した rmIL-1α 及び rppIL-1α について以下の結論を得た。
1.

in vitro transcription/translation 法による rmIL-1αタンパク質の産生は，環状あるいは直鎖状という発現ベクターの形状には影響を受けなかった。

2.

得 ら れ た rmIL-1α 及 び rppIL-1α は， そ れ ぞ れ 19kDa 及び 18 kDa の単一バンドとして検出された。

図6rmIL-1α および rppIL-1α による IL-8 産生誘導能の比較
A549 細胞に対して，in vitro transcription/translation 反応により作製した rmIL-1α および rppIL-1α を作用させ，IL-8の産生量を ELISA により測定した（n ＝ 5/column）。無刺激の
細 胞 培 養 上 清。pcDNA：コントロール ベクターを 用いた，in vitro transcription/translation 反応産物を加えた細胞培
養上清。＊ P ＜ 0.05101日大歯学11）Stevenson FT, Bursten SL, Fanton C, Locksley RM,
Lovett DH (1993) The 31-kDa precursor of interleukin 1alpha is myristoylated on specific lysines within the16-kDa N-terminal propiece. Proc Natl Acad Sci U S A
90, 7245-7249.
12）Carruth LM, Demczuk S, Mizel SB (1991) Involvementof a calpain-like protease in the processing of themurine interleukin 1 alpha precursor. J Biol Chem 266,

第 95 巻第 2 号

12162-12167.
13）Burzynski LC, Humphry M, Pyrillou K, Wiggins KA,Chan JNE, Figg N, Kitt LL, Summers C, Tatham KC,
M a r t i n P B , B e n n e t t M R , C l a r k e M C H (2019) T h ecoagulation and immune systems are directly linked
through the activation of Interleukin-1α by thrombin.
Immunity 50, 1033-1042.

102