日大歯学 , Nihon Univ Dent J, 89, 7-13, 2015

光線力学療法モデルにおける口腔癌細胞のアポトーシスとオートファジーの調節
松

江

彦

兆

日本大学歯学部病理学講座（指導：小宮山一雄 教授，松本直行 助教）

要旨：光線力学療法（PDT）は，光感受性物質を腫瘍細胞に取り込ませた後，励起光の照射で発生する reactive
oxygen species により腫瘍細胞を障害する治療法である。本研究は光感受性物質に 5-aminolevulinic acid（ALA）
を用いた
ALA-PDT モデルを作製し，口腔癌細胞に対するアポトーシスとオートファジー誘導を解析した。
舌扁平上皮癌細胞株である HSC-3 細胞は，ALA-PDT 後に，萎縮や膨化などの形態変化を示した。ALA-PDT 後，
経時的にアポトーシスが増加した。またアポトーシス促進およびオートファジー抑制に働く c-Jun の遺伝子発現量は， ALA-PDT 後 1 時 間 で 急 増 し， そ の 後 3 時 間 で 減 少 し た が， 依 然 と し て 高 値 を 示 し た。 免 疫 細 胞 化 学 でmicrotubule-associated protein 1A/1B-light chain 3（LC3）陽性のオートファゴソーム形成が確認された。またオー
トファジーを起こしている細胞の割合は，経時的に増加した。さらにオートファゴソーム形成時に切断される LC3Ⅱの発現増加を Western blot で検出した。
以上の結果から，ALA-PDT は口腔扁平上皮癌に対してアポトーシスおよびオートファジーを誘導することが明らかとなり，口腔癌の新規治療方法として臨床応用可能であると考えられた。
キーワード：光線力学療法，口腔癌細胞，オートファジー，活性酸素緒とが報告されている 15）。Agarwal らはアルミニウムフタ言ロシアニンを用いた PDT が，マウスリンパ腫細胞にア

光線力学療法（photodynamic therapy, PDT）は，光感

ポトーシスを誘導することを 16），また津田は ALA を用

受性物質を病変部組織に取り込ませた後，励起光の照射いた PDT で，ヒト口腔癌細胞にアポトーシスを誘導すで発生する reactive oxygen species（ROS）によって腫ることを報告している 17）。しかしその後，多くの種類の瘍を構成する細胞を障害する治療法である。このときに光感受性物質と腫瘍細胞の検討が進み，PDT による細胞生成される ROS は一重項酸素，ヒドロキシラジカル，

死は光感受性物質と腫瘍細胞の組合せによって異なるう

スーパーオキサイドラジカルおよび過酸化水素であり，えに，必ずしも PDT 後の細胞死はアポトーシスによる

これらが細胞膜，ミトコンドリアおよび DNA を傷害しものだけではないことが判明した 15,18）。一般に細胞死はて細胞を死に至らしめると考えられている 1）。

ネクローシスとアポトーシスに大別されてきたが，近年

PDT は呼吸器，上部消化管，子宮頚部に発生する慢性では形態学的にアポトーシスと，非アポトーシス細胞死

炎症性疾患や腫瘍の治療や，眼科領域では加齢黄斑変性であるオートファジーおよびネクローシスに分類されて2）症の治療に応用されつつある 。皮膚科領域では，難治いる 19）。オートファジーは細胞のバルク分解系の一種で性炎症性疾患，前癌病変および表在性悪性腫瘍の治療に，あり，細胞質内に存在する異常タンパク質や，損傷を受光感受性物質の一つである 5-aminolevulinic acid（ALA）

けた細胞内小器官が脂質二重膜で構成されるオートファを用いた PDT が臨床応用されている 3-7）。ALA は，正ゴソームによって分画され，リソソームと融合すること

常細胞では速やかにプロトポルフィリン IX，次いでヘムで，細胞内小器官の消化が生じる。オートファジーは一に代謝されるが，腫瘍細胞ではプロトポルフィリン IX

般的には栄養飢餓条件によって活性化されるが，発生，の代謝酵素活性が低いため，プロトポルフィリン IX が分化，神経変性疾患，ストレス，感染などの生理的，病選択的に蓄積される 8-10）。プロトポルフィリン IX は光に理的な状態で生じることが示された 20-22）。しかし PDT励起されると ROS を発生させ，酸化ストレスによってによるオートファジー誘導については未だ不明な点が多細胞死が起こる

11,12）

いため 23,24），本研究では。そのため，ALA-PDT は腫瘍細胞

ALA-PDT モデルによ13,14）。

る，口腔扁平上皮癌細胞に対するアポトーシスおよびPDT を行うと，アポトーシスによる細胞死を誘導するこ

オートファジー誘導と，アポトーシス促進およびオートを選択的に傷害する治療として注目されている（受付：平成 26 年 11 月 17 日）〒 101 8310 東京都千代田区神田駿河台 1 8 13

7

ファジー抑制に働く c-Jun の遺伝子発現を検討した。

PDT）をおこなった。なお ALA 濃度 0 mM かつ LED 照射を行わないものをコントロールとして用いた。

材料および方法
1．

3． TdT-mediated dUTP nick end labeling（TUNEL）
ALA-PDT によるアポトーシス誘導を TUNEL（TdT-

PDT システム
PDT システムを作製して実験をおmediated dUTP nick end labeling）で測定した。4 穴

こなった。本システムは，発光ダイオード（LED）光源

チャンバースライド（旭テクノグラス）の 1 ウェルに 1×（LXHL-FD3 C，LUMILEDS），直流安定化電源ユニット

104 個 の 細 胞 を 播 種 し，48 時 間 後 に ALA-PDT を お こ（PMC18-2， 菊 水 電 子 ）と デ ジ タ ル タ イ マ ー（LT4 H，なった。ALA-PDT の 3 および 24 時間後に細胞を PBS

Panasonic 電工）で構成される。LED 光源から細胞培養

で 3 回洗浄し，チャンバースライドを風乾した。その後，用の直径 35 mm ディッシュ底面までの距離が 30 mm と氷冷した 4% パラホルムアルデヒドを加え，60 分間静置

なるように塩化ビニルパイプを設置した（第 1 図）。光照

した。内因性ペルオキシダーゼを不活化するため，細胞

射 エ ネ ル ギ ー 量 を 30 W 広 域 帯 パ ワ ー エ ネ ル ギ ー メ ーを 3% 過酸化水素溶液で 5 分間の処理をおこなった。細ター（メレスグリオ）で測定し，出力のキャリブレーショ

胞を PBS で洗浄した後，ウサギ抗ヒトサイトケラチン抗ンをおこなった。

体（Dako）を，次いでローダミンイソチオシアネート標識

口腔癌の2． ALA-PDT モデル
ALA-PDT モデルは津田の方法

抗ウサギ IgG 抗体（Millipore）をそれぞれ室温で 1 時間反
17）に従いおこなった。

応させた。PBS で細胞を洗浄した後，0.1% クエン酸ナト

ヒト口腔癌由来扁平上皮癌細胞株である HSC-3 細胞はリウム，0.1% Triton X-100 水溶液を加え，氷上で 2 分

JCRB 細胞バンクから購入した。HSC-3 細胞の継代は，間静置した。PBS で洗浄した後に，10%（v/v）仔ウシ血清（Gibco BRL），1% ペニシリン - ス

detection kit POD（Roche Applied Science）を用いて，トレプトマイシン溶液（10 unit/ml Penicillin G，10 mg

TUNEL をおこなった。HSC-3 細胞にフルオレセイン標

Streptomycin sulfate，Gibco BRL）を含む RPMI1640 培

識された核酸とターミナルトランスフェラーゼを混合し養液（Gibco RBL）を用いておこなった。対数増殖期にあた TUNEL 反 応 液 を 37˚C で 60 分 間 反 応 さ せ た。

5cell deathる 1×10 個 の 細 胞 を 直 径 35 mm デ ィ ッ シ ュ（BD

TUNEL によって核が標識された細胞をアポトーシスがFalcon）に播種し 37˚C で 48 時間，5% CO2 条件下で培養

生 じ て い る 細 胞 と し， 蛍 光 顕 微 鏡 シ ス テ ム（Leica

した。これらの細胞を培養液で 3 回洗浄した後，培養液

Microsystems）を用い，対物レンズ 40 倍で写真撮影をおに 2 mM の ALA（コスモバイオ株式会社）を加え，遮光こなった。一視野に観察される細胞のうちアポトーシス

条件下で 2 時間培養をおこなった。細胞を RPMI1640 培の生じている細胞数を計測し，アポトーシス誘導率を算

養液で 3 回洗浄した後，励起波長 638±5 nm の LED を

出した。

2

4． c-Jun mRNA 発現

用 い 光 エ ネ ル ギ ー 量 と し て 100 J/cm の 照 射（ALA-

ALA-PDT が c-Jun の発現におよぼす影響を検討するために，realtime-PCR で，c-Jun 発現を検討した。直径
35 mm ディッシュに 1×105 個の HSC-3 細胞を播種して接着させ，ALA-PDT をおこなった。ALA-PDT 後，0.5 〜
3 時間後に細胞を回収し，RNeasy Mini-prep kit（Qiagen）
で，全 RNA を抽出した。全 RNA 濃度を NanoDrop-1000（Thermo Fisher Scientific）
で計測し，500 ng の全 RNAを realtime-PCR に 供 し た。 全 RNA か ら PrimeScript
RT reagent（Takara Bioscience）
を用い cDNA を作製し，その 2μl をテンプレートとして，SYBR Premix Ex Taq（Takara Bioscience）と c-Jun の特異的プライマー（sense;5ʼ-GCTTACCAAAGGCTAGTGCGATG-3ʼ，antisense;
5ʼ-GCCACCAATTCCTGCTTTGAG-3ʼ）を用いて，c-Junの発現量を半定量的に解析した。ハウスキーピングジー
第1図

ンには，glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

PDT システムの概略
電源供給時間をデジタルタイマーで調節し，LED を点灯
さ せ た。LED か ら の 光 は 塩 化 ビ ニ ル パ イ プ を 通 じ て，
35 mm ディッシュの底面に播種した培養細胞に到達する。
なお PDT 実験時には黒色のカバーをかぶせ，環境光を遮断した。

（GAPDH, sense; 5ʼ-GAGTCAACGATTTGGTCGT-3ʼ，antisense; 5ʼ-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3ʼ）を用い，GAPDH に対する相対的な c-Jun 遺伝子発現量を計測した。なお ALA-PDT による GAPDH の発現量は変動

8

口腔癌 PDT モデルによる細胞死を認めないことを，あらかじめ確認している。

reagent（東洋紡）で処理した後，1 次抗体のウサギ抗 LC3

5． 免疫細胞化学

ポリクローナル抗体（MBL）と反応させた。次いで，2 次

オートファジーの指標となるオートファゴソームを検

抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギ IgG 抗出するために，ALA-PDT 後の培養細胞に対して免疫細体（Santa Cruz Biotechnology）と反応させ，免疫複合体

胞化学をおこなった。直径 35 mm ディッシュ底面に滅を E C L p l u s d e t e c t i o n s y s t e m（G E H e a l t h c a r e

菌カバーグラスを設置し，1×105 個の HSC-3 細胞を播種

Biosciences）を使用して，Kodak Biomax フィルム（GEして接着させた。上記の条件で細胞に ALA-PDT をおこ

Healthcare Biosciences）上に検出した。さらに現像したなった後に，氷冷した 4% パラホルムアルデヒド PBS でフィルムをスキャナー（CanoScan 8800 F, Canon）でデジ

5 分間固定し，続いて PBS で 3 回洗浄をおこなった。細

タル画像化して TIF ファイル（Tagged Image File）に保胞にオートファジーが起こり形成されるオートファゴ

存した後に，LC3Ⅰと LC3 Ⅱの発現量を ImageJ（National

ソームを，そのマーカーである microtubule-associatedInstitutes of Health）で 3 回測定し，総 LC3 発現レベル

protein 1 A/1 B-light chain 3（LC3）タンパクを対象としに対する LC3 Ⅱ発現レベルの割合（LC3 Ⅱ/LC3 比）を半て免疫細胞化学で検出した。ALA-PDT 後，カバーグラ

定量的に測定した。

ス上の細胞に 1 次抗体のウサギ抗 LC3 ポリクローナル抗7． 統計処理体（MBL バイオサイエンス）を室温で 1 時間反応させた。

ALA-PDT 後のアポトーシス誘導率，c-Jun 遺伝子発

充分に細胞の洗浄をおこない，2 次抗体としてビオチン

現量，オートファジー陽性細胞率および LC3 Ⅱ/LC3 比

標識ヤギ抗ウサギ IgG 抗体（Vector Laboratories）を反の有意差検定を non-repeated ANOVA 検定でおこない，応させた後，免疫複合体を FITC 標識ストレプトアビジ

ポストホックテストとして SNK 検定で検証した。 値がン（Vector Laboratories）で可視化した。

0.05 未満を有意差有りとした。

LC3 の免疫細胞化学によって，細胞質内で微細顆粒状結に陽性を示したオートファゴソームを指標として，オートファジーが惹起された細胞数を計測し，オートファ

果

1． TUNEL によるアポトーシス誘導の検討

ジー陽性細胞率を算出した。

TUNEL を用いて，ALA-PDT によるアポトーシス誘

6． Western blot

導率を検索した（第 2 図）。ALA-PDT3 時間後では 6.7%

細胞溶解液［50 mM Tris（pH7.5）, 150 mM NaCl, 1%の細胞にアポトーシスを認め，24 時間後では 25.1% まで

Triton X-100, 1/100 protease inhibitor cocktail］で細胞増加した。一方，コントロールではいずれの時間でもを処理し，Western blot に供した。細胞溶解液のタンパ

1.0% の細胞にアポトーシスを認めるのみであり，ALA-

ク量を Bradford 法で測定した後，40μg を 10% のポリア

PDT によって有意にアポトーシスが誘導される結果とク リ ル ア ミ ド ゲ ル で 電 気 泳 動 し，polyvinylidene

なった（ <0.01）。

difluoride （PVDF）膜に転写した。PVDF 膜を blocking

2． ALA-PDT が口腔癌細胞株の c-Jun 発現におよぼす
影響
ALA-PDT が c-Jun の mRNA 発現レベルにおよぼす
影響を realtime-PCR で検討した。ALA-PDT 後 0.5 時間
で c-Jun 発現は 3.7 倍に上昇し，1 時間後では 7.5 倍に急激な増加を示した。また 3 時間後では発現レベルが 2.2倍に減少したものの，依然としてコントロールと比べて有意な増加を示した（第 3 図）。
3． 免疫細胞化学によるオートファジー誘導の検討
抗 LC3 抗 体 を 用 い た 免 疫 細 胞 化 学 に よ っ て，ALAPDT によるオートファジー誘導を検索した（第 4 図）。コ
ントロールと比べて，ALA-PDT 後 1 時間では有意な変化は認めないが， 6 時間および 24 時間では細胞質に細顆粒状の陽性を示すオートファゴソームを認めた。オート

第2図

ファゴソーム形成を指標として，オートファジー陽性細

ALA-PDT によるアポトーシス誘導率
TUNEL に よ っ て ア ポ ト ー シ ス 陽 性 細 胞 率 を 検 討 し た。
ALA-PDT をおこなった 3 時間後では 6.7% の細胞にアポトーシスを認め，24 時間後では 25.1% まで増加した。一方，コントロールではいずれの時間でも 1.0% であった。
（** ＜
0.01）

胞率を算出し比較したところ，コントロール群は 1.1％であるのに比べ，ALA-PDT 後，6，12 および 24 時間ではそれぞれ，9.4%，14.3% と 25.3% であり，オートファジー
陽性細胞率の有意な増加を示した（ <0.05）（第 5 図）。

9

第4図

第3図

ALA-PDT によって誘導されたオートファジーa）コントロールおよび，b）1 時間後では，ALA-PDT 処理をした細胞に著変は見られない。c）ALA-PDT 後，6 時間では，細胞質に細顆粒状のオートファゴソーム形成が見られ，さらに d）24 時間後では細胞の膨化および細胞質のオートファゴソーム形成の増加がみ
られた。

第6図

ALA-PDT による LC3 Ⅱ発現
LC3 Ⅰはコントロールおよび ALA-PDT 後 0.5 時間から 24時間に発現を認めた。一方で，LC3 Ⅱは ALA-PDT 後，6
時間から発現が検出され，経時的に発現量の増加を認めた。

第7図

ALA-PDT による LC3 Ⅱ/LC3 比の変化
総 LC3 発 現 レ ベ ル に 対 す る LC3 Ⅱ 発 現 レ ベ ル の 割 合（LC3 Ⅱ/LC3 比）は，ALA-PDT 後，3 時間まではコント
ロールと同様の値であったが，6 時間後から経時的に増加
し，24 時間後では 57.2% まで増加した（** ＜ 0.01）。

ALA-PDT による c-Jun 発現の変化
ALA-PDT 後 0.5 時間で c-Jun 発現はコントロールに比べて 3.7 倍に上昇し，1 時間後では 7.5 倍に急激な増加を示した。また 3 時間後では発現レベルが 2.2 倍に減少したものの，依然としてコントロールと比べて有意な増加を示した。
（* ＜ 0.05，** ＜ 0.01）

4． Western blot
Western blot で LC3 Ⅰおよび LC3 Ⅱタンパクの発現量を検討した。LC3 Ⅰ（18-kDa）の発現はコントロールお第5図

よび ALA-PDT 後 0.5 時間から 24 時間にかけて検出さ

ALA-PDT によるオートファジー陽性細胞率
ALA-PDT を行わないコントロール群と，ALA-PDT 後，
6 時間，12 時間および 24 時間後のオートファジー陽性細胞率を検討した。コントロール群では 1.1% であるのに対し，ALA-PDT 後，6，12 お よ び 24 時 間 で は そ れ ぞ れ，
9.4%，14.3% と 25.3% であり，オートファジー陽性細胞率の有意な増加を示した。
（* ＜ 0.05，** ＜ 0.01）

れ た。 一方，LC3 Ⅱ（14-kDa）は ALA-PDT 後 3 時 間 ま
では検出されなかったが，6 時間後から 24 時間にかけて徐々に増加した。
（第 6 図）LC3 Ⅱ/LC3 比を半定量的に解析したところ，ALA-PDT 後，6，12 および 24 時間では，
LC3 Ⅱが全 LC3 発現に占める割合はそれぞれ，32.8%，
39.5% と 57.2% であり LC3 Ⅱ発現レベルの有意な増加を示した（ <0.01）（ 第 7 図）。これらの結果は，ALA-PDT

10口腔癌 PDT モデルによる細胞死によってオートファジーが誘導されることを示し，免疫後時間で 9.4% であったものが，24 時間で 25.3% となっ

細胞化学およびオートファジー陽性細胞率のデータを裏た。Western blot では，オートファゴソーム形成に中心付けるものとなった。

的役割を果たす，LC3 Ⅱの発現が，ALA-PDT 後 6 時間

考より検出され，経時的に発現量が増加した。この LC3 Ⅱ

察の結果は，オートファジー抑制に働く c-Jun 遺伝子発現が ALA-PDT 後 3 時間でピークを迎え，以後，減少する

PDT 後に起こる細胞死は，細胞内における光感受性物

結果を反映しているものと考えられた。

質の分布，光感受性物質の種類と，標的となる細胞の種15）。本研究では，光近年，オートファジーと腫瘍の発育・成長の関係が注

感受性物質に ALA を用い，口腔扁平上皮癌細胞を対象目されている。オートファジーは細胞質内の異常タンパとした類によって異なると考えられている

ALA-PDT モ デ ル を 作 成 し た。ALA-

ク質や，損傷を受けた細胞内小器官を分解するため，正PDT をおこなった HSC-3 細胞におけるアポトーシス誘

常細胞および早期の発癌過程にある細胞では腫瘍抑制性導率を TUNEL で検討したところ，ALA-PDT 後 3 時間に働くが，腫瘍細胞に対しては生存経路として働くとのでは 6.7% であり，24 時間では 25.1% まで増加した。ア

報告がある 23,30-32）。また Takamura ら 33）は，オートファ

ポトーシスは death receptor を介する経路と，ミトコン

ジー機能を欠損させたマウスでは，肝臓に多発性の良性

ドリアを介する経路の 2 つが主要な役割を果たしてい腫瘍が発生することを報告している。そのメカニズムは，る。ミトコンドリアを介する経路では caspase-3 および -9

発癌過程の初期では機能が消失した異常ミトコンドリアが活性化し，ミトコンドリアの膜電位の低下によって細がオートファジーによって分解されないため細胞質内に胞質への cytochrome

放出が生じ，アポトーシスが生蓄積し，その結果として酸化ストレス，それに引き続く

じる 25）。Inoue らはラットにグリオーマ細胞を接種した

DNA の不安定化が起こり，腫瘍が生じると推定してい

ALA-PDT モデルを用いた実験で，caspase-3 おる。一方，癌化した組織では急激に腫瘍細胞が増殖する

よび -9 が活性化しアポトーシスが誘導されることを報告ために充分な血管新生が伴わず，低酸素状態や低栄養状している 26）。また津田は HSC-3 細胞を用いた ALA-PDT

態に暴露される。このような条件下では一般的にアポ

後に，活性型 caspase-3 の発現が上昇し，ALA-PDT 後

トーシスの誘導や壊死が生じるが，オートファジーに

3 時間で 5.7%，24 時間で 24.6% の細胞にアポトーシスがよって分解された細胞内小器官の再構成や ATP の再利。これらの値は，今回用が起こり，腫瘍細胞が生存するとの考えもある 34,35）。

の実験で観察された 6.7％および 25.1% とほぼ同等の値

しかし津田は， HSC-3 細胞を用いて ALA-PDT をおこなであった。

い，細胞死誘導をトリパンブルー色素排除法で検討した誘導されたことを報告している

17）

ALA-PDT 後 0.5 時間で c-Jun 発現は 3.7 倍に上昇し，

ところ，24 時間で 84.5% の細胞が細胞死をきたしたと報

1 時間後では 7.5 倍に急激な増加を示した。また 3 時間

告している 17）。同じ HSC-3 細胞を用いた今回の実験結後では発現レベルが 2.2 倍に減少したものの，依然とし果と併せると，口腔癌では ALA-PDT によって生じたてコントロールと比べて有意な増加を示した。c-Jun はオートファジーは細胞生存経路ではなく，むしろ細胞傷

オートファジー経路を抑制し，アポトーシス経路を促進

害性に働いていると考えられた。

する 27-29）。Yogev らは発現ベクターを用いて c-Jun を強口腔粘膜に発生する白板症，紅板症や早期癌などの腫制発現させた実験系で，子宮頚癌細胞（HeLa），ヒト胎

瘍性病変に対する治療の第一選択は外科的切除である児腎細胞（HEK293）およびマウス胎児線維芽細胞では，が，術後に構音・咀嚼・嚥下機能や審美性の回復が困難

低栄養下で引き起こされるオートファジーが c-Jun にとなることがある。しかし，PDT による治療では術後によって抑制されることを報告している 29）。一方で，c-Jun

生じる後遺症が軽度であることから，試験的に臨床応用の過剰発現とそのリン酸化が，interleukin 1β-convertingの報告がある 36-38）。

enzyme による α -fodrin の分解を促進しアポトーシスを

PDT は光感受性物質を経口投与する方法と，病巣局所27, 28）。以上の結果から，に塗布する方法とがある。経口投与は病変が広範囲に及

ALA-PDT を用いた口腔癌細胞のアポトーシスとオート

ぶ場合に用いられるが，光感受性物質投与後の光暴露にファジーの調節には c-Jun の発現が関与していることがよって皮膚に炎症症状が生じる可能性があるほか，吐き示唆された。

気や一時的な肝機能障害を生じる報告がある 5）。口腔粘誘導することが報告されている

オートファゴソーム形成を，免疫細胞化学で経時的に膜病変における ALA-PDT では，主に病巣に光感受性物

検討したところ，LED 照射後 6 時間で，細胞質に細顆粒質を塗布した後に，励起光照射を行う方法が試みられて状のオートファゴソームが確認された。またオートファ

いる 36-38）。また Kaneko ら 39）は耳下腺腫瘍細胞をラット

ゴソーム形成を指標として，オートファジー陽性細胞率

皮 下 に 接 種 し て 直 径 5 mm の 腫 瘍 を 作 製 し た 実 験 的を検討すると経時的に陽性細胞率が増加し，ALA-PDT6

PDT モデルに対して，光感受性物質である NPe6 を経口

11

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投与し体表面から励起光照射する実験をおこなった。その結果，腫瘍組織の広範囲にアポトーシスを検出した。
以上の結果から，ALA-PDT は口腔扁平上皮癌に対してアポトーシスおよびオートファジーの細胞死を誘導する
ことが実験的に明らかとなり，口腔癌の新規治療方法として臨床応用の可能性が示唆された。

結論

光感受性物質として ALA を用いた PDT による口腔癌治療を検討のため，実験系を用い口腔癌細胞

HSC-3 に対するアポトーシスおよびオートファジー誘導の解析をおこない，以下の結果を得た。
1． ALA-PDT 後，HSC-3 細胞の細胞形態は膨化ないし萎縮し，ALA-PDT 後 24 時間では有意なアポトーシ
ス誘導を認めた。
2． c-Jun の遺伝子発現は，ALA-PDT 後 1 時間で急激に増加し，その後 3 時間まで有意な増加を示した。
3． ALA-PDT 後 6 時間からオートファゴソーム形成がみられ，オートファジー誘導率は LED 照射後，経時的に増加した。
4． LC3 Ⅱの発現量を Western blot で検討したところ，
ALA-PDT 後 6 時間から LC3 Ⅱの発現がみられ，経時的に LC3 Ⅱ発現レベルが増加することが明らかになった。
以上のことから，ALA-PDT は口腔扁平上皮癌に対してアポトーシスおよびオートファジーを誘導することが実験的に明らかとなり，口腔癌の新規治療方法として臨床応用の可能性が示唆された。
稿を終えるに当たり，懇切なる御指導と御高閲を賜りました本
学病理学講座小宮山一雄教授，研究を直接御指導いただいた松本
直行助教と，照射機の開発にご助言をいただいた口腔外科学教室
第 1 講座西村敏助教に謹んで感謝の意を表します。また，本研究に対して御協力いただいた病理学講座員各位に深く感謝申し上げ
ます。
文

献

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