日大歯学 , Nihon Univ Dent J, 94, 35-40, 2020

顔面皮膚の histamine 刺激によって活性化するミクログリアの動態
米本久史

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻（指導：岩田幸一 教授，篠田雅路 准教授）

要旨：顔面皮膚に histamine を皮下注射し，痒みモデルラットの三叉神経脊髄路核尾側亜核（Vc）および上部頸髄（C1/C2）から検出される活性型ミクログリア（Iba1 陽性細胞）の動態について検索した。その結果，histamine 注射後，Vc および C1/C2 に多くの活性型ミクログリアの集積を認め，その分布密度は生理的食塩液注射よりも有意に多かった。また，孤束核（NTS）においても histamine 刺激と生理的食塩液刺激においても多くの活性型ミクログリアを認めたが，吻尾方向の分布の広がりおよび密度に有意差はなかった。顔面皮膚に様々な痒みを引き起こす刺激が加えられると，無髄の C 線維が興奮し，活動電位が Vc および C1 の神経細胞へと送られることが報告されていることから，Vc および C1 神経細胞とミクログリアとが物質を介した情報伝達を行い，結果的にミクログリアの活性化が亢進する可能性がある。活性型ミクログリアからは様々な分子が放出され，Vc および C1 神経細胞の活動性はさらに亢進し，この興奮性は上位中枢へと送られ，顔面皮膚に痒みが引き起こされると考えられる。一方，NTS領域に出現した活性型ミクログリアはこの領域に存在するニューロン活動を変化させ，痒みによる自律神経系応答の変調に関与する可能性があると推察される。
キーワード：掻痒，三叉神経脊髄路核尾側亜核，histamine，ミクログリア，上部頸髄

緒刺激とが同一ニューロンによって活性化する可能性も示言されている 8）。以上から，痒みの情報処理において，三叉神経脊髄路核ニューロンは痒み特異的な応答を示すも痒みは非常に不快な感覚で，臨床的にも様々な薬物の副作用として引き起こされることが知られている

1,2）のと，痛覚と痒みの両方の情報処理に関係したものが存。し在する可能性があると考えられる。

かし，その発症メカニズムが不明であることから，痒みを取り除くために行われる処置は，原因療法ではなく対これまでの研究により，延髄を含む中枢神経系にはミ症療法が適応される場合が多い 3,4）。従来の研究では，痒

クログリア，アストロサイトおよびオリゴデンドロサイ

みは痛覚が弱まった時に起こる感覚であり，痛覚情報伝トの三種類が報告されている 9）。これらのグリア細胞は達に関与する無髄の C 線維と同様の神経線維によって伝ニューロンの構造的な支持細胞として，またニューロン

え ら れ る と 考 え ら れ て い た 5）。 し か し， 最 近 で はの栄養細胞としての機能を有すると考えられてきた 9）。

histamine 刺激によって特異的に活性化する C 線維が同しかし，最近の研究で，グリア細胞は直接ニューロンに定され，痛みと痒みが異なる神経機構で引き起こされる作用して，ニューロン活動を変調することが明かにされ6）た 10）。グリア細胞の中でも，特にミクログリアとアストことが明らかにされた 。
脊髄レベルにおいては，ネコ足裏への histamine 投与

ロサイトはニューロン活動に対して強い変調作用を示すにのみ応答し，機械および温度侵害刺激には応答しないことが知られている 11）。末梢神経損傷や組織に炎症が起視床投射ニューロンが存在することが報告され，脊髄レこると，一次ニューロンの中枢端から ATP が放出されベルにおいても histamine に特異的な応答を示すニューる。ATP はミクログリアの膜上に存在する P2X4 受容体ロンの存在が確かめられた 7）。このようなニューロンはに結合しミクログリアの活性化が誘導される。一方，ア受容野が不明瞭で，histamine の注入のみに反応するこ

ストロサイトは一次ニューロンの中枢端と二次ニューロとから，特異的侵害受容ニューロンや広作動域ニューロン間に存在するシナプス領域において，グルタミンを取ンと異なり，histamine 特異ニューロンとして分類されり込みグルタミン酸を合成して放出することにより，二ている。また，結合腕傍核に軸索を送る三叉神経脊髄路次ニューロン活動を強く亢進させることが報告されてい核ニューロンにおいて，histamine，chloroquine およびる 11）。また，ミクログリアとアストロサイトは活性時期

capsaicin を顔面皮下に注入することによって発現するが異なっている。末梢神経障害や末梢組織に炎症が惹きc-Fos タンパクを調べた研究において，侵害刺激と痒み起こされると，最初に活性化されるのはミクログリアで（受付：令和 2 年 1 月 17 日）〒 101 8310 東京都千代田区神田駿河台 1 8 1335

n i c k e l - c o b a l t 加 3.3ʼ - d i a m i n o b e n z i d i n e t e t r aあり，それに引き続いてアストロサイトが活性化される。
さらに，最近の研究では，活性型ミクログリア細胞からhydrochloride（DAB， Sigma Aldrich，St Louis, MO,transforming growth factor alpha や vascularUSA）染 色 を 施 し た。 ま ず， 厚 さ 50μm の 切 片 を 0.3%

endothelial growth factor が放出され，これらの分子がH 2O2 加 0.01 M PBS に 30 分間浸漬し，内因性ペルオキアスロトサイトの活性化に影響を与えることが報告されシダーゼを不活性化した後，0.01 M PBS にて 5 分間のており，これら二種類のグリア細胞は異なるメカニズム

洗 浄 を 3 回 行 っ た。 洗 浄 終 了 後，0.3% TritonX-100

で活性化し，ニューロン活動の変調に関与するにもかかdiluted in 0.01 M PBS with 5% normal goat serum

わらず，お互いに機能連絡を有することが明らかになっ（NGS）に 1 時間浸漬し，ブロッキングを行った。その後，

た 12）。このようなミクログリアやアストロサイトによる一次抗体である rabbit anti-rat Iba1 antibody（1：1000，二次ニューロンの活動性変調は疼痛に関係するニューロ

Wako, 大阪）に 4℃で 3 日間浸漬し，0.01 M PBS にて 10ンだけでなく痒み情報処理に関与する二次ニューロンに分間の洗浄を 3 回行った。次いで切片を二次抗体であるも変調をかける可能性が考えられる。しかし，活性型グ

biotinylated goat anti-rabbit IgG（H+L）（1：500，リア細胞がいかなるメカニズムで，痒み情報処理に関与

Vector Labs，Burlingame, CA, USA）に室温で 2 時間浸する二次ニューロン活動の変調に関与するかについては

漬 し た。 そ の 後 ABC kit（Vector Labs，Burlingame,不明な点が多く残されている。

CA, USA）を用いて室温で 1 時間，反応させた。0.01 M

そこで，本研究では痒みを誘発することが知られていPBS に よ る 10 分 間 の 洗 浄 を 3 回 繰 り 返 し た 後，0.01%

る histamine を顔面皮下に投与することによって発現すhydrogen peroxide 加 DAB を用いて反応産物を可視化る Iba1 陽性細胞の延髄における分布様式を検索し，痒し た。 次 い で， 切 片 を 0.01 M PBS に て 洗 浄 し，み感覚情報処理機構に対するミクログリアの役割の一端

MAS-GP（Matsunami，東京）でコートしたスライドガラを明らかにすることを目的とした。

スに貼り付け，室温にて乾燥させた後，アルコールとキシレンにより脱水および透徹を行い，封入した。また，材料および方法

Iba1 陽性細胞を DAB 反応させた切片を光学顕微鏡下で観察し，Vc および C1 領域の表層部および深層部の顕微本研究は，日本大学歯学部動物実験委員会の許可（承認番号：AP17 D038）を得，同委員会の指針および国際疼鏡写真を撮影し，Image J software（Reseach Sevices

痛学会の基準に従って行われた 13）。実験には Sprague-Branch, NIH, Bethesda, MD, USA）を用いて Iba1 陽性

Dawley 系雄性ラット 10 頭を用いた。

細胞密度の解析を行った。

1.

3.

Histamine 投与

統計学的解析

2% isoflurane に て 麻 酔 し， さ ら に sodium

デ ー タ は 平 均 ± 標 準 誤 差 で 表 し， 有 意 差 検 定 に はpentobarbital（80 mg/kg, i.p.）で深く麻酔したラットを保Mann-Whitney U test を用いた。また，有意水準は α ＝温パッド上に仰臥位にした状態で，0.9％生理的食塩液に0.05 とした。

溶解した histamine 溶液（10μl, 5μg/μl）を左側口ひげ結部皮下に静かに注入した。また，vehicle として 0.9％生
理的食塩液を同量，同部位に注入し，コントロールとし1.

た。Histamine 溶液あるいは vehicle 溶液を注入してか分布

果

延髄および C1 領域における Iba1 陽性細胞の形態とら 5 分 後 に 500 ml 生 理 的 食 塩 液 に て 脱 血 後，0.1 M

Fig. 1 は口ひげ部への histamine 注入後 Vc で検出さphosphate buffer にて希釈した 4% paraformaldehyde

れた Iba1 陽性細胞の強拡大組織標本写真を示している。

溶液（pH7.4, 4℃）500 ml を用いて灌流固定を行った。灌赤の矢印で示したように，Iba1 陽性細胞は，錐体型の細流固定終了後に延髄を含む全脳部位を摘出し，同様の固胞体を有する像として観察された。また，細胞体からは定液で 4℃にて 2 日間，後固定を行った。

周囲に複数の突起を出している。Fig. 2 には，histamine

2.の口ひげ部への注入 5 分後，延髄および上部頸髄領域で抗 Iba1 抗体による免疫染色
取り出した三叉神経脊髄路核尾側亜核（Vc）および上部認 め ら れ た Iba1 陽 性 細 胞 の 組 織 標 本 写 真 を 示 し た。

頸 髄（C1）領 域 を 含 む 脳 脊 髄 標 本 を 0.01 M phosphate

Histamine および生理的食塩液を口ひげ部へ注入した

buffered saline（PBS）にて希釈した 20% スクロース溶液

ラットにおいて，多くの Iba1 陽性細胞が延髄の三叉神（w/v, 4℃）に 2 日間浸漬した。その後，脳脊髄標本を経脊髄路核中間亜核（Vi），Vc および上部頸髄の C1 におO.C.T. compound（Sakura Finetek USA，Torrance,いて検出された。また，Iba1 陽性細胞は刺激と対側におCA，USA）で包埋してドライアイスで凍結し，三叉神経いても観察された。特に histamine 刺激と同側の Vc 表脊髄路核を含む延髄の連続切片標本（厚さ 50μm）を作製層では高い分布密度で Iba1 陽性細胞が検出された。まして 3 切片毎に 1 切片を取り出し，以下の方法によってた，この Iba1 陽性細胞の分布は Vc および C1 領域の背36

顔面皮膚の痒みとミクログリア側から腹側にかけてほぼ均一な密度を示しており，分布密度に偏りは認められなかった。
2.

Vc および C1 の表層における Iba1 陽性細胞の吻尾的広がり
Fig. 3 は Vc および C1 領域の表層における Iba1 陽性細胞の吻尾側方向の広がりを示している。Fig. 3 A に示したように，histamine 刺激と同側表層部で，obex から720 〜 1,440μm 尾側部において，生理的食塩液注入群に比べ有意に高密度の Iba1 陽性細胞発現を認めた。また，
そ れ よ り さ ら に 尾 側 の obex か ら 2,160μm 尾 側 部 で はhistamine 注入群の方がやや高い発現を認めたが，有意差はなかった。一方，histamine 注入および生理的食塩

50 m

液刺激と対側においては，obex から 720 〜 2,160μm 尾側部の範囲において Iba1 陽性細胞発現密度に有意差はFig. 1

認められなかった（Fig. 3 B）。

Vc 表層部に多くの Iba1 陽性細胞が出現した。赤矢印：典型的な Iba1 陽性細胞

AB

G

H

D

I

JFK

L

Vi100 mCVc

EC1Fig. 2

Relative density of Iba1
immuno-products (%)

Histamine 投与群：同側 Vi（A），対側 Vi（B），同側 Vc（C），対側 Vc（D），同側 C1（E），対側 C1（F），
Saline 投与群：同側 Vi（G），対側 Vi（H），同側 Vc（I），対側 Vc（J），同側 C1（K），対側 C1（L）

A

Histamine

32BSaline**21103-720-1440-2160

0-720-1440

Distance from the obex ( m)Fig. 3
A: 刺激と同側の行ける陽性細胞密度，B: 刺激と反対側における陽性細胞密度
刺激と同側の Vc 表層において有意に多くの Iba1 陽性細胞を認めた。
* ＜ 0.0537-2160

3.

度をみると，同側と対側，histamine と生理的食塩液刺Vc および C1 の深層における Iba1 陽性細胞の吻尾激共に有意な差は認められなかった。また，NTS におい的広がり
本研究では obex から 720 〜 2,160μm 尾側部の範囲にては非常に高密度な Iba1 陽性細胞発現が左右対称的において，深層部に発現した Iba1 陽性細胞密度に関して認められた（Fig. 5 E および F）。また，NTS においてもも解析を行った。深層部においては，histamine 刺激とhistamine 刺激と生理的食塩液刺激において，吻尾方向同側において，どのレベルにおいてもやや発現密度が高の分布密度の広がりに有意差は認められなかった

い傾向を認めたものの，有意差はなかった（Fig. 4 A）。

（Fig. 5 I）。

また，対側においても分布密度に有意差は認められな考かった（Fig. 4 B）。
4.

網様体および孤束核に発現した Iba1 陽性細胞

察

本研究は顔面皮膚に引き起こされる痒みの神経機構を解明するため，発痒物質である histamine を口ひげ部皮膚に注入することによって早期に活性化するミクログリている。Fig. 5 A 〜 D で示した RF においては histamine

アの発痒に対する役割を明らかにすることを目的に，免刺激および生理的食塩液刺激共に同側および対側で，ま疫組織学的手法を用いて，延髄および上部頸髄におけるばらな Iba1 陽性細胞発現を認めた。吻尾方向の分布密活性型ミクログリアの発現様式の解析を行った。その結Relative density of Iba1
immuno-products (%)

Fig. 5 は網様体（RF）および孤束核（NTS）において検出された Iba1 陽性細胞の吻尾側方向の分布密度を示し

AB

Saline33Histamine

22110-720-14400-2160-720-1440-2160

Distance from the obex ( m)Fig. 4AB
RF100 mCDEF
NTSCCCC

Relative density of Iba1 immuno-products (%)

A: 刺激と同側における Iba1 陽性細胞密度，B: 刺激と対側における Iba1 陽性細胞密度

G1H
Saline

1I4Histamine
0.80.830.60.60.40.40.20.200210Fig. 5
Histamine 投与群：同側 RF（A），対側 RF（B），NTS（E），Saline 投与群：同側 RF（C），対側 RF（D），NTS（F），
G：histamine 刺激と同側の RF における Iba1 陽性細胞の分布密度，H：histamine 刺激と対側の RF におけるIba1 陽性細胞の分布密度，I：NTS における Iba1 陽性細胞の分布密度，RF および NTS ともに Iba1 陽性細胞密度に有意な違いは認められなかった。
cc：中心管38顔面皮膚の痒みとミクログリア

果， Vi，Vc および C1 領域に多くの Iba1 陽性細胞発現れ，2 次ニューロン活動が増強され，これによって上位を認めた。また，RF および NTS においても Iba1 陽性中枢に痒みを引き起こすための情報が伝えられると考え細胞が検出された。

られる。

1.

3.

ミクログリアの活性化

RF および NTS におけるミクログリアの機能

従来の多くの研究により，神経損傷や組織における炎本研究では histamine 刺激により RF において弱いミ症により，脊髄後角において，強いミクログリアの活性クログリアの活性化，NTS には強いミクログリアの活性化が誘導されることが報告されている 11,14）。現在，ミク化が観察された。RF および NTS の両領域とも，自律神ログリアの活性化に関しては，ほとんどの研究者は形態経系応答に対して重要な役割を担う領域として知られて。すなわち，いる 17-19）。特に histamine 刺激に対して強いミクログリミクログリアは活性化すると，細胞体が膨化し細胞体かア活性を示した NTS は，口腔顔面領域からの侵害入力ら突出している突起が短くなる。本研究においても，顔を受けて，これによって自律神経系の反応を変化させる

面皮膚に histamine を注射して Vc および C1 領域で検出ことが知られている 18）。このことから，NTS 領域におされた Iba1 陽性細胞は Fig. 1 に示したように，比較的いて活性化したミクログリアはこの領域に存在する大型の細胞体と，細胞体から突出する複数の短縮した突ニューロン活動を変調させ，痒みによる自律神経系応答起を認めた。過去の研究と本研究結果から，顔面皮膚のの変調に関与する可能性があると想像される。一方で，histamine 刺激によって Vc および C1 領域から検出され自律神経系調節に関与すると考えられている RF 領域にた Iba1 陽性細胞は活性型ミクログリアであると判断でおいて活性化が認められたミクログリアは，活性化の程きる。

度が低いこと，また histamine と生理食塩水刺激に対し2.て活性化にほとんど違いが見いだせなかったことなどか学的な変化の有無によって判断している

15）

Vc および C1 領域におけるミクログリア活性化とニューロン活動

ら，RF 領域の神経活動の変調に関与する可能性は低い

ミクログリアは非常に数が多く，神経細胞と神経細胞と考えれらる。しかし，これら両領域から検出された活の間に隙間なく存在し，神経細胞に対して様々な作用を性型ミクログリアが histamine 投与により惹き起こされ及ぼすことが知られている 16）。また，活性化したミクロる痒み感覚と，これに関連する自律系応答に対してはほグリアは複数の突起を伸ばしたり，締めたりと活発に動とんど明らかにされていない。この点を解明するためにくことが知られており，これによって神経組織に対するはさらなる詳細な研究がなされる必要があると考えられ作用を発揮している

14）

る。

。ミクログリアの働きとして，神経細胞の構造的な維持，神経細胞の栄養，あるいは老廃結物の処理などが知られているが，最近の研究で，神経細論胞の活動性変調にも重要な働きを有することが明かにさFig. 6 には本研究とこれまでの研究結果から想定されれてきた 14）。末梢神経が損傷を受けると，損傷神経の興る痒みの発症機構を示した。本研究では発痒物質として奮が異常に亢進し，損傷神経の中枢端から ATP を初めhistamine を用いたが，顔面皮膚に様々な痒みを引き起とする様々な物質が放出され 2 次ニューロンに作用するこす刺激が加えられると，無髄の C 線維が興奮し，活動11）。特に ATP はミクログリア細胞電位が Vc および C1 の神経細胞へと送られる。これにに発現している P2X4 あるいは P2X7 受容体に結合し，ミよって，Vc および C1 神経細胞とミクログリアとが様々クログリア細胞の活性化を促す。活性化したミクログリな物質を介した情報伝達を行い，結果的にミクログリアアには形態学的な変化が誘導され，それに引き続き，活の活性化が促進する。活性型ミクログリアからは幾つか性型ミクログリアから様々な物質が放出される。このこの分子が放出され，Vc および C1 神経細胞の活動性はさとから，顔面皮膚への histamine 注射によって活性化さらに亢進し，この神経興奮は上位中枢へと送られ，顔面れたミクログリアは，顔面の皮膚を支配する神経の中枢皮膚に痒みが引き起こされると考えられる。しかし，本端から ATP が放出されたことによって誘導されたもの

研究では顔面皮膚の histamine 刺激によるミクログリアと想像される。さらに，histamine 注入によって活性化と神経細胞との情報のやり取りに関する直接的な証拠をしたミクログリアからは様々な物質が放出される可能性つかんでいない。痒みの神経機構の全貌を明らかにするが考えられる。これまでの報告では，活性型ミクログリためには，この点についてより詳細な研究がなされる必アからは Brain Deribed Neurotropic Factor（BDNF）や要があると考えられる。

ことが知られている

Tumor Necrosis Factor alpha（TNFα ）が放出され，直本論文の作成にあたり，日本大学歯学部生理学講座岩田幸一教授および篠田雅路准教授にご指導をいただきましたことに対して深く感謝いたします。また，実際に実験を推進するにあたって，接的に神経細胞の活動性を変調することが知られている 11）。おそらく，本研究で histamine 注射によって活性化したミクログリアからも，BDNF や TNF α が放出さ

39

itch
Microglial cells
Higher CNS

Histamine sƟmulus

Action potentials

Action potentials

Vc & C1neurons
Fig. 6本研究と過去の研究結果をまとめて，痒みの中枢神経メカニズムを表した模式図として示した。

多くのご助言とご指導をいただきました生理学講座の諸先生方および渋田郁子専修研究員に心から感謝の意を表します。
本研究に関して，開示すべき利益相反はありません。
文181-185.
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