日本大学歯学部紀要 39，21‑26，2011

亜鉛イオンが骨芽細胞株（Saos‑２）の生細胞およびサイトカイン産生に及ぼす影響（第２報）
横瀬勝美

中野善夫

桑田文幸

Effects of zinc ion on cell viability, IL‑1α and IL‑6 production
by the human osteosarcoma cell line, Saos‑2
Katsumi Yokose, Yoshio Nakano and Fumiyuki Kuwata
Abstract
The effects of zinc ions on cell viability and production of interleukin 1α (IL‑1α) andinterleukin 6 (IL‑6)using the human osteosarcoma cell line,Saos‑2,were investigated in thepresent study.Cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and antibiotics for
24h before the addition of 0.1mM of (CH COO) Zn ). Cell viability was assessed by a colorimetric assay using a LDH cytotoxic test following incubation for 1, 3, 5 or 7 day. The
production of IL‑1αand IL‑6 in Saos‑2 cells was examined using ELISA.The addition of 0.1mM zinc ions did not alter cell viability during 48h.Moreover,the addition of zinc ions had
little effect on production of IL‑6 in these cells.
Key words: cell viability, IL‑1α production, IL‑6 production, osteosarcoma cell, zinc ion緒の欠乏やその濃度によっては生体および局所的言な部分において代謝の変化をもたらすものとえられている 。

亜鉛はすべての生物の生命維持に必須であることが明らかである 。それは亜鉛が数多くの著者らは，先に金属イオンが口腔軟組織，と金属酵素（metallo‑enzyme）の構成成分であるくに上皮組織におよぼす影響を解明する第一ス

ことや，生体において細胞分裂やタンパク質合テップとして，歯科補綴物の成分であるチタン成に密に関係しており，DNA，RNA の生合成およびニッケル，歯科修復物の合金中に存在すに際しては，DNA polymerase,RNA polymer-る 亜 鉛 に つ い て，ヒ ト 口 腔 由 来 上 皮 細 胞 株

ase および thymidine kinase の構成成分とし（Ca 9‑22）のコンフルエント後の生細胞数およてその酵素活性に重要な役割を果たしているとび DNA 合成能におよぼす影響について報告しいうことである。さらに個々の細胞に対してはた 。本研究では，口腔内口臭予防薬中に含まれ酵素を介し，細胞膜構造に直接働きかけて細胞ている酢酸亜鉛を使用し，ヒト骨肉腫由来の株の機能を左右している。このように亜鉛は生化骨芽細胞（Saos‑２）を使用し，亜鉛を長時間体において微量必須元素である。そして，亜鉛添加し，生細胞数への経時変化に及ぼす影響に

日本大学歯学部化学教室
日本大学歯学部総合歯学研究所機能形態部門〒 101‑8310 東京都千代田区神田駿河台１‑８‑13

Department of Chemistry, Nihon University School ofDentistry
Division of Functional M orphology, Dental Research(受理：2011年９月 30日）

Center, Nihon University School of Dentistry
1‑8‑13 Kanda‑Surugadai, Chiyoda‑ku, Tokyo 101‑8310, Japan21

日本大学歯学部紀要 39，21‑26，2011

ついて検討を行った。さらに，インターロイキ

トに Saos‑２細胞を播種後，24時間後，亜鉛イン‑1α（IL‑1α）および IL‑6 の２種類のサイオン（(CH COO) Zn ）の濃度，0.1mM を含トカイン産生に及ぼす亜鉛イオンの影響も併せむ DMEM に交換し，その作用時間をそれぞれて検討した。

１，３，５および７日間として培養を行った。
なお，培地中の亜鉛イオン（(CH COO) Zn ）材料および方法は終末濃度 0.1mM になるように添加した。亜鉛イオンを作用させた後，無血清の DMEM と１. 細胞培養
実験には骨芽細胞として理化学研究所細胞開交換し 24時間培養後，上清を回収する。培養上発 銀 行 か ら 購 入 し た Saos‑２ 細 胞 を 使 用 い

清 を 回 収 後，IL‑1α 定 量 用 ELISA キットた。Saos‑２細胞は，Dullbeccoʼ
s modified（BioSource）および IL‑６定量用 ELISA キッ

Eagle medium（DM EM ，旭テクノグラス）に，ト（BioSource）を用いて上清中のサイトカイン10％ウシ胎児血清（FBS，旭テクノグラス），50

量を定量した。コントロールは材料および方法

U/ml ペニシリンおよび 50μg/ml ストレプトの２.と同様である。

マイシン（Sigma）を加えた培地を用い，37°C，５％CO の湿潤条件下で培養を行った。
２. 細胞障害率（経時的変化）

成績

１. 細胞障害率（経時変化）

生細胞への亜鉛イオンによる経時的変化の影

Saos‑２細胞に亜鉛イオン（(CH COO) Zn ）響を調べるために，24穴プレートに Saos‑２細0.1mM 濃度を添加した影響を第１図（経時的胞 １×10 個/cm を 播 種 し，500μl の DM EM変化（細胞障害率）に示した。

（10％FBS および抗生物質を含有）で培養を開

第１図では，亜鉛イオン（(CH COO) Zn ）始した。Saos‑２細胞播種後，24時間後に亜鉛イ

濃度 0.1mM ，作用時間１，３，５および７日間オン（(CH COO) Zn ）を含む無血清の DM EMとして培養を行った。亜鉛イオン添加により細（抗生物質を含有）に交換した。生細胞への亜鉛胞障害率は，コントロールでは 0.2％，１日ではイオン経時的変化の影響を調べるためにその作0.2％，３日では 5.1％，５日では 17.0％，７日用時間をそれぞれ１，３，５および７日間と継では 45.7％の細胞障害率であった。亜鉛イオン

続して培養を行った。なお，培地中の亜鉛イオ添加後ではコントロールからわずかに細胞障害ン（(CH COO) Zn ）は終末濃度 0.1mM になるように添加した。
亜鉛イオンを作用させた後，無血清の DM EM と交換し 24時間培養後，上清を回収する。回収した上清は 3000rpm，５分遠心し，LDH‑Cytotoxic Test（和光純薬）を用い細胞障害率を比色測定した。また，実験は２連で行い，結果は平値で示した。金属イオン

経時変化を比較するため，亜鉛イオン無添加の場合をコントロールとし，DM EM（10％FBS お
よび抗生物質を含有）で 24時間培養を行った。
３. IL‑1αおよび IL‑６産生

図１ Saos‑２細胞の細胞障害率に及ぼす亜鉛イオンの影響

材料および方法の２.と同様に，24穴プレー
22

骨芽細胞と亜鉛イオン

図２ Saos‑２細胞 48時間後の control形態

図３

亜鉛イオン 0.1mM １日作用させたときの細胞形態

図５

亜鉛イオン 0.1mM ５日作用させたときの細胞形態

図６

亜鉛イオン 0.1mM ７日作用させたときの細胞形態

ると亜鉛イオン添加していると細胞の増殖に大きな変化はなかった。
２. IL‑1α産生
コンフルエントに達した後の Saos‑２細胞のIL‑1α産 生 に お よ ぼ す 亜 鉛 イ オ ン（(CHCOO) Zn ）0.1mM 濃度の経時的変化の影響を調べた結果を第１表に示した。
Saos‑２細胞の IL‑1α産生におよぼす亜鉛
図４

イオン（(CH COO) Zn ）濃度の経時的変化の亜鉛イオン 0.1mM ３日作用させたときの細胞形態影響を調べた結果，コントロールおよび１〜７日においては測定検出限界以下のため測定不可率が増加した。各々の細胞状態をコントロールであった。と亜鉛イオン作用時間（コントロール，１日〜７３. IL‑６産生日）を比較し，細胞状態を図２〜６に示した。

Saos‑２細胞の IL‑６産生におよぼす亜鉛イ各週のコントロールと亜鉛イオン添加を比較す

オン（(CH COO) Zn ）濃度の経時的変化の影
23日本大学歯学部紀要 39，21‑26，2011

表１ Saos‑２細胞の IL‑1αの産生に及ぼす亜鉛イオンの影響
IL‑1α 量平ml，５日で 2.19pg/ml，７日で 2.65pg/ml と値

Cont.
Zn

＜0.80 ＜0.80 ＜0.80

3 day

Cont.
Zn＜0.80 ＜0.80 ＜0.80＜0.80 ＜0.80 ＜0.80

5 day

Cont.
Zn＜0.80 ＜0.80 ＜0.80

Cont.

＜0.80 ＜0.80 ＜0.80

Zn＜0.80 ＜0.80 ＜0.80

7 day

培養した場合で 1.14pg/ml，３日で 1.29pg/（pg/ml）

作用時間
1 day

響を調べた結果，IL‑６産生量は亜鉛イオン（(CH COO) Zn ）濃度 0.1mM ，１日作用させなった。IL‑６産生量は時間と共に徐々に増加がみられた。

＜0.80 ＜0.80 ＜0.80

察
亜鉛は必須金属元素であり，他の微量元素よりも高濃度で生体に広く分布し，人体では，肝＜0.80 ＜0.80 ＜0.80

臓，および筋肉に多く，全血液中には 900μg/dl含まれているといわれている

皮膚粘膜の肥厚や角化などを呈することが報告

表２ Saos‑２細胞の IL‑６産生に及ぼす亜鉛イオンの影響
IL‑６量

1 day
3 day
5 day
7 day

され，上皮の代謝にも重要な役割を担っていることが示唆される。また，亜鉛は，いろいろな（pg/ml）

作用時間Cont.

。亜鉛が欠乏するとラットにおいて発育遅延，脱毛症および平金属酵素の構成成分として，亜鉛フィンガー，

値

1.15
1.23

1.12
1.35

1.14
1.29

1.73
2.352.75

1.78
2.03
2.55

1.76
2.192.65

亜鉛クラスターおよび亜鉛ツィストの３種類の結合様式を形成し DNA などと結合していること ，また，亜鉛は癌の抑制効果からの研究がなされており ，紫外線が関与した活性酸素の生成による皮膚の細胞毒性,さらには発癌性を防御する効果があるという報告もある 。このよ
うに生体において微量必須元素でありながら，その濃度によっては生体および局所的な部分において悪影響を与えるとえられる金属イオンに亜鉛イオンがあげられる。
著者らは一般的な細胞毒性試験による金属イオンの生細胞数に及ぼす影響に加えて，より感度の高い DNA 合成に及ぼす影響も併せて検討した結果から，金属イオンに対するわずかな反応性も提える可能性を示唆することができたとえる 。本研究ではより詳細な検討を加える

図７ Saos‑２細胞の IL‑６の産生に及ぼす亜鉛イオンの影響ために，口腔内口臭予防薬中に含まれている酢酸亜鉛を使用し金属イオンを作用させる時間を変化させて骨芽細胞株（Saos‑２）に対する影響

響を調べた結果を第２表，第７図に示した。

を検討した。

Saos‑２細胞の IL‑６産生におよぼす亜鉛イ生細胞数に及ぼす影響を生細胞障害率の測定

オン（(CH COO) Zn ）濃度の経時的変化の影
24

骨芽細胞と亜鉛イオンに は LDH 測 定 法 を 用 い た。本 測 定 の LDH

IL‑６は B 細胞刺激因子として純化されたサイ‑Cytotoxic Test は細胞毒性を簡便に測定できトカインであるが，骨芽細胞るばかりでなく，細胞が細胞膜に障害を受けてれ，IL‑1α，TNF，PTH，などによりその産生細胞から遊離した LDH（乳酸脱水素酵素）活性が促進され間接的に破骨細胞の活性化をも促進

でも産生さを測定することができ，生理活性物質による細するため，亜鉛イオンが Saos‑２細胞の IL‑６胞障害や細胞性免疫による細胞障害，補体依存産生を促進するかどうかを調べた。その結果，性細胞障害，抗体依存性細胞障害の他，細胞のSaos‑２細胞の亜鉛イオン添加による，IL‑６産生存率にも利用できることからこの方法を用い

生量は，表２，第 11図に示したように IL‑６産た。コントロールは血清培地で 48時間培養を行

生量は時間と共に徐々に増加がみられた。

い，上清を回収する前の 24時間を無血清培地と以上のことから亜鉛イオンによるヒト骨肉腫交換し上清を回収し測定を行った。同時に血清由来の株化骨芽細胞への影響は，７日間亜鉛イ培地中で細胞状態を観察した。

オンを作用させた場合 IL‑６サイトカイン産生細胞障害率は第１図に示したように，亜鉛イ量をわずかに増加させた。炎症性サイトカイン

オン添加後ではコントロールから徐々に細胞障である IL‑1α，IL‑６への影響を見るためには害率は７日間まで徐々に増加した。亜鉛作用時亜鉛イオンをさらに長時間作用させる必要があ

間後の細胞状態をコントロール，１日間〜７日ると間ごとの細胞状態（図２〜６）を示した。亜鉛えられる。

謝

イオンを添加していると細胞の増殖がやや劣っているが，大きな変化はみられなかった。

辞本研究の一部は平成 21，22年度日本大学歯学サイトカイン産生に及ぼす影響をチタンイオ部佐藤研究費によって行われたことを付記す

ンの経時的変化にあわせて検討した。インターる。

ロイキン‑1α（IL‑1α）は単核球が産生する歯文

骨細胞刺激因子の主成分であることが明らかに献されて以来，IL‑1αの骨代謝・骨疾患との関連

１）Sommer AL Lipman CB (1926) Evidence onが検討されて，最も強力な骨吸収促進因子の１

the indispensable nature of zinc and born forhigher green plants.Plant physiol,1,231‑249

つである。IL‑1αはきわめて低濃度で，ヒト骨２）Williams RJP (1989) An introduction to the髄細胞より歯骨細胞を誘導する作用をもち，更biochemistry of zinc, Mills C F, Zinc in
human biology, Springr‑Velag, London 15に骨芽細胞を介して間接的に歯骨細胞の活性化を促進する。一方，IL‑1αはヒト骨芽細胞の‑31３）岡田正，高木洋治（1984）亜鉛と臨床，朝倉書DNA 合成促進作用を示し，コラーゲン合成に関しては少量で促進，大量で抑制作用を示すた

店

め，亜鉛イオンが Saos‑２細胞の IL‑1αの産４）Leccia MT,Richard MJ,Beani JC,Faure H,生を促進するかどうか調べた。その結果，SaosMonjo AM, Cadet J, Amblard J, Favier A‑２細胞の IL‑1α産生におよぼす亜鉛イオン(1993)Protective effect of selenium and zincon UV‑A damage in human skin fibrob-（(CH COO) Zn ）濃度の経時的変化の影響を

lasts.; Photochem Photobiol, 58(4), 548‑553５）横瀬勝美，桑田文幸（2001）口腔由来細胞株調べた結果，IL‑1α産生量は表１，に示したように，各週コントロールは測定検出限界以下のため測定不可であった。IL‑６産生量の測定は，25（Ca 9‑22）の生細胞数および DNA 合成能に及日本大学歯学部紀要 39，21‑26，2011

ぼす金属イオンの影響．研究紀要

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