日大歯学 , Nihon Univ Dent J, 91, 21-26, 2017

痒み刺激により延髄および上部頸髄ニューロンに誘導される
extracellular signal-regulated kinase のリン酸化
越前谷

澄

典

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻
日本大学歯学部生理学講座（指導：岩田幸一 教授，篠田雅路 准教授，片桐綾乃 助教）

要旨：麻酔ラットの口ひげ部皮下へ histamine を投与したラットの延髄では，Vc の背側部と Vc 腹側部の RF お
よび NTS に pERK 陽性細胞発現を認めた。Histamine 投与ラットの Vc および C1-C2 において刺激と同側で多くの pERK 陽性細胞発現を認めたのに対し，NTS および RF においては，発現数において左右差は認められなかった。
pERK 陽性細胞は histamine 投与群で投与と同側において，obex から 1800μm 尾側部（1800μm）の部位にピークを示す分布を示していた。また，obex の 600μm 尾側からその 1800μm 尾側までの範囲においては，vehicle 投与群よりも histamine 投与群の方が有意に多くの pERK 陽性細胞を認めた。Vc および C1-C2 領域において検出された pERK 陽性細胞数は histamine 投与と同側および対側ともに，投与群の方が vehicle 投与群より有意に多かった。
以上から，顔面領域の痒み情報処理は obex からやや尾側部の Vc および C1-C2 の表層に分布するニューロンによって行われ，その中でも大型のニューロンは上位中枢へ痒み情報を送るのに対し，小型のニューロンは局所回路を形成して痒み情報調節に関与している可能性が示された。
キーワード：ヒスタミン，三叉神経脊髄路核尾側亜核，顔面皮膚，pERK緒

ニ ュ ー ロ ン に お い て，histamine, chloroquine お よ び

言capsaicin を顔面皮下に投与することによって発現する

痒みは非常に不快な感覚として知られているが，そのc-Fos タンパクを調べた研究において，侵害刺激と痒み

詳細な発症機構に関しては不明な点が多く残されてい刺激とが同一ニューロンによって活性化する可能性も示る。これまでの多くの研究により，痒みの発症には C-されている 8）。以上の結果から，痒みの情報処理において，線維の末梢端を形成している自由神経終末の膜上に存在

三叉神経脊髄路核ニューロンは痒み特異的な応答を示す

する histamine 受容体が関与することが報告されていものと，侵害情報と痒み情報の両方の情報処理に関係し

る

1-4）

。一方で，C- 線維の末端部を構成する自由神経終たものが存在する可能性があると考えられる。これまで

末には，痒みだけでなく transient receptor potentialの複数の研究で用いられてきた c-Fos 発現は，刺激後 1-2（TRP）チャンネルや ATP 受容体などの侵害受容に関与

時間がピークであることから，Vc における様々な介在する受容体が多く存在することから，痛みと痒みは同様

ニューロンの興奮が引き起こされた後の結果しか見るこ

5）のメカニズムで引き起こされると考えられていた 。しとがでず，刺激後の早い時間に起こる現象の解析には適かし最近，histamine の刺激に対して特異的に反応するさない。一方，ニューロンに発現する Mitogen-activated

C- 線維が同定され，痛みと痒みの情報処理は異なる末梢protein kinase ファミリーの一つとして知られている神経機構による可能性が考えられるようになってきた 6）。

extracellular signal-regulated kinase（ERK）は，興奮後脊髄レベルにおいては，ネコ足裏への histamine 投与に数分以内にリン酸化されることがわかっており，リン酸

のみ応答し，機械および温度侵害刺激には応答しない視化 ERK（pERK）は興奮マーカーとして用いられている。

床投射ニューロンが存在することが報告され，脊髄レベ

口腔顔面領域を支配する C- 線維刺激によって数分以ルにおいても histamine に特異的な応答を示すニューロ

内 に Vc お よ び C1-C2 に 分 布 す る ニ ュ ー ロ ン に お い てンの存在が確かめられた 7）。このようなニューロンは受ERK のリン酸化が始まると報告されている 9）。また，抗容野が不明瞭で，histamine の投与のみに反応すること

pERK 抗体に対して陽性を示す細胞（pERK 陽性細胞）数から，特異的侵害受容ニューロンや広作動域ニューロン

は刺激強度依存的に増加することが明らかにされていと異なり，histamine 特異ニューロンとして分類されてる。このようなことから，pERK 陽性細胞は口腔顔面の C-いる。また，結合腕傍核に軸索を送る三叉神経脊髄路核

線維入力を受けて興奮したニューロンである可能性が高（受付：平成 29 年 1 月 16 日）〒 101 8310 東京都千代田区神田駿河台 1 8 13

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saline（PBS）にて希釈した 20% スクロース溶液（w/v）にいとされている。

移し換え，2 日間，4℃に保存した。

そこで，本研究では，痒み刺激によって早期に活動するニューロンを視覚化する手段の一つとして，リン酸化

その後，脳標本を O.C.T. Compound（Sakura Finetek，

ERK を指標とし，痒みを誘発することが知られている

Torrance，CA，USA）で包埋してドライアイスで凍結し，

histamine を顔面皮下に投与することによって発現する

三 叉 神 経 脊 髄 路 核 を 含 む 延 髄 の 連 続 切 片 標 本（ 厚 さpERK 陽性細胞の延髄における分布様式を検索し，痒み50μm）を作製して 3 切片毎に 1 切片を取り出し，以下の感覚情報処理機構の一端を明らかにした。

方 法 に よ っ て nickel-cobalt 加 3,3ʼ -diaminobenzidine
tetra hydrochloride（DAB， Sigma，St Louis，MO，材料および方法
1.

USA）染 色 を 施 し た。 ま ず， 厚 さ 50μm の 切 片 を 0.3%
H2O2 加 0.01 M PBS に 30 分間浸漬し，内因性ペルオキ動物
本 研 究 は， 日 本 大 学 歯 学 部 動 物 実 験 委 員 会 の 許 可

シダーゼを不活性化した後，0.01 M PBS にて 5 分間の（AP16 D008）を得，同委員会の指針および国際疼痛学会

洗浄を 3 回行った。洗浄終了後，0.3% Triton X 100/5%の基準に従って行われた 10）。実験には Sprague-Dawley

normal goat serum（NGS）-PBS に 1 時間浸漬し，ブロッ

系雄性ラット 10 匹を用いた。

キングを行った。その後，一次抗体である rabbit anti-2.

phospho-p44/42 MAP kinase antibody （1：1000，Cell

Histamine 投与
2% isoﬂurane にて麻酔し，さらに sodium pentobarbital

Signaling Technology, U.S.A）に 4℃で 3 日間浸漬し，（80 mg/kg, i.p.）で深く麻酔したラットを保温パッド上に0.01 M PBS にて 10 分間の洗浄を 3 回行った。次いで切仰 臥 位 に し た 状 態 で，0.9％ 生 理 食 塩 液 に 溶 解 し た片を二次抗体である biotinylated goat anti-rabbit IgG

histamine 溶液（10μl，5μg/μl）を左側口ひげ部皮下に静（H+L）（1：500，Vector Labs，Burlingame，CA, USA）

かに注入した。また，vehicle として 0.9% 生理食塩液をに 室 温 で 2 時 間 浸 漬 し た。 そ の 後 ABC kit （Vector

同量，同部位に注入し，コントロールとした。HistamineLabs，Burlingame，CA, USA） を用いて室温で 1 時間，

投 与 5 分 後，500 ml 生 理 食 塩 液 に て 脱 血 後，0.1 M反応させた。0.01 M PBS による 10 分間の洗浄を 3 回繰phosphate buffer にて希釈した 4% paraformaldehyde

り返した後， 0.01% hydrogen peroxide 加 DAB を用い溶液（pH7.4, 4℃）500 ml を用いて灌流固定を行った。灌て反応産物を可視化した。次いで，切片を 0.01 M PBS

流固定終了後に延髄を含む全脳部位を摘出し，同様の固にて洗浄し，MAS-GP （Matsunami，Tokyo，Japan）で定液で 4℃にて 2 日間，後固定を行った。

コートしたスライドガラスに貼り付け，室温にて乾燥さ3.

せた後，アルコールとキシレンにより脱水および透徹を抗 pERK 抗体による免疫染色

行い，封入した。また，pERK 陽性細胞を DAB 反応さ取り出した脳脊髄標本を 0.01 M phosphate buffered

第1図

pERK 陽性細胞が検出された延髄領域の顕微鏡写真
A：Histamine 投与と同側の Vc，B：Histamine 投与と対側の Vc，C：Histamine投与と同側の網様体（RF），D：Histamine 投与と対側の RF，E：A の強拡大写真，
F：Histamine 投 与 と 同 側 の C1，G：Histamine 投 与 と 対 側 の C1，NTS，H：
Histamine 投与ラットの RF，cc：中心管，矢印：線維状構造物，スケールバー：
100μｍ

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痒み入力を受ける延髄および上部頸髄ニューロン

せた切片を光学顕微鏡下で観察し，Neuro-Lucida（Micro

本研究では，細胞質および核が黒色に濃染された細胞

Bright Field Bioscience，Williston，VT，USA）を用いを免疫陽性細胞と判断して顕微鏡下で検出し，Neuro-て描画し，pERK 陽性細胞の分布状態および細胞数の解Lucida で 描 画 し パ ー ソ ナ ル コ ン ピ ュ ー タ 上 に 表 し て析を行った。

pERK 陽性細胞の分布様式および発現数を算出した。第4.

2 図には Neuro-Lucida にて切片を描画した分布図を示し

統計学的解析
データは平均値 ± 標準誤差で表し，有意差検定にはた。この分布図から明らかなように，histamine およびStudentʼs -test を用いた。また，有意水準は ＜ 0.05 とvehicle 投与ラットともに，Vc において両側性に分布しした。

ていたが，同側においてより多くの陽性細胞を認めたの

結に対し，NTS および Vc 腹側部の RF においては刺激測

果でやや多い傾向を認めたが有意な左右差はなかった。
2.

本研究では麻酔ラットの口ひげ部皮下に histamine を

Vc および C1-C2 領域における pERK 陽性細胞の吻
尾側方向の広がり微量投与し，Vc を含む延髄および C1-C2 領域のニューロンにおける ERK のリン酸化について検索した。その本研究ではさらに，多くの pERK 陽性細胞発現を認め

結果，Vc，RF，C1-C2 および NTS から多くの pERK 陽た Vc について， pERK 陽性細胞数の吻尾側方向の分布性細胞が検出された。

様 式 に つ い て 解 析 を 行 っ た。 第 3 図 に 示 し た よ う に，

1.

延髄および C1-C2 領域における pERK 陽性細胞発現

pERK 陽性細胞は histamine 投与群で投与と同側におい第 1 図 に は， 口 ひ げ 部 皮 下 に histamine あ る い はて，obex から 1800μm 尾側部（−1800μm）の部位にピー

vehicle を微量投与して 5 分経過したラットの延髄におクを示す分布を示していた（第 3 図の矢印）。また，特にいて，Vc および孤束核（NTS）で観察された pERK 陽性

obex の 600μm 尾側からその 1800μm 尾側においては，細胞の代表例を示した。pERK 陽性細胞数は Vc と NTS

histamine 投与群の方が vehicle 投与群に比べ有意に多くに多く，他の領域においては少数であった。また，本研の pERK 陽性細胞を認めた。これに対し，histamine 投究で観察された pERK 陽性細胞は細胞質および核が共に与の反対側においては，第 4 図に示したように，吻側か黒色に濃染された小型の円形を呈するものと，第 1 図 Eに示したように線維状の構造物を有し比較的大型の楕円形の細胞体を有するものが観察された。

第2図

pERK 陽性細胞が検出された切片の Neuro-Lucida 描画像

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第3図

Histamine 注入と同側の Vc および C1-C2 において検出された pERK- 陽性細胞の吻尾側方向における分布
矢印：ピーク，*： ＜ 0.05，**： ＜ 0.01

第4図

Histamine 注入と対側の Vc および C1-C2 において検出された pERK- 陽性細胞の吻尾側方向における分布*： ＜ 0.05

ら尾側にかけて，pERK 陽性細胞数の分布に明らかな偏両方に反応する WDR ニューロンが認められ，深層にはりは認められなかった。また，histamine 投与の同側とWDR ニューロンと低閾値機械受容ニューロンが存在す

対 側 に お け る pERK 陽 性 細 胞 の 発 現 数 を 比 較 す る と，ることが知られている 14）。これまでの脊髄後角の侵害受

obex か ら 300μm 吻 側 部 か ら 600μm 尾 側 の 範 囲 お よ容 ニ ュ ー ロ ン 活 動 を 解 析 し た 研 究 で は， 多 く の WDRび，obex から尾側へ 2400μm から 3300μm の範囲ではニューロンは histamine の足底部皮下への投与に対して左右差は認められなかった。一方，vehicle 投与群ではspike 応答を増加させ，これらは脊髄表層だけでなく深吻側から尾側にかけて一様な分布を示した（第 3 図およ層からも検出されたと報告されている 15）。また，これらび第 4 図）。

の WDR ニューロンは histamine 投与によって受容野が3.

Vc および C1-C2 領域における pERK 陽性細胞数の拡 大 し た と 報 告 さ れ て い る 16）。 一 方， 本 研 究 で は比較

histamine の口ひげ部皮下への投与によって検出された

Vc および C1-C2 領域において検出された pERK 陽性

pERK 陽性細胞は Vc および C1-C2 領域の表層のみから細胞数の違いを第 5 図に示した。本研究では Vc および検出された。従って，histamine 投与によって興奮する

C1-C2 領域において検出された pERK 陽性細胞数を加算

Vc および C1-C2 ニューロンは主に顔面皮膚の C- 線維入して，histamine 投与群と vehicle 投与群とで発現数を比力を受ける可能性があると考えられる。また，histamine較した。その結果，同側および対側とも，histamine 投投与に反応する WDR ニューロンは C- 線維の入力だけ与群の方が vehicle 投与群より有意に多かった（同側： ＜でなく，有髄の A- 線維入力を受けた介在ニューロンか

0.01，対側： ＜ 0.05）。

ら間接的に入力を受ける可能性が高い。

考1.

また，本研究で検出された pERK 陽性細胞の形態をみ察ると，第 1 図 E に示したように，小型の細胞体を有する

顔面皮膚の痒みに対する Vc および C1-C2 ニューロ

ものと，矢印で示した線維状の構造物を有する大型の細ンの働き胞も多数検出された。これまでの，脊髄後角ニューロン

従前の研究から Vc および C1-C2 領域には口腔顔面領の形態を解析した研究から，上位中枢へと投射軸索を送域からの侵害情報を含む様々な感覚情報が投射すると報る投射ニューロンの多くは脊髄後角の表層に分布し，そ。これらの領域は構造的に細胞が層構造の細胞体は扁平で大型であるといわれている 17）。一方で，をなして配列しており，表層部には無髄の C- 線維が深局所介在ニューロンは小さな細胞体を有する円形の細胞

層 に は 有 髄 の Aβ- 線 維 が 投 射 し て い る。Vc 領 域 はで あ る こ と が 明 ら か に さ れ て い る。 以 上 の こ と か ら，

C1-C2 と同様の構造を有することから延髄後角とも呼ば

histamine 投与によって発現した pERK 陽性細胞には投告されているれている11）

12,13）

射ニューロンと介在ニューロンの両方が含まれると考え。また，第一層には強い侵害刺激にのみ反られる。おそらく，histamine 感受性の投射ニューロン

応を示す NS ニューロンおよび侵害刺激と非侵害刺激のは痒み情報を直接上位中枢へ伝えるのに対し，介在ニューロンは痒み感覚の変調に関与していると推察される。
こ れ ま で の 口 腔 顔 面 の 侵 害 入 力 を 受 け る Vc お よ び
C1-C2 ニューロンにおける pERK 陽性細胞発現パターンを調べた研究では，口ひげ部皮下への capsaicin 注入によって検出される pERK 陽性細胞は obex よりやや尾側部を中心とした領域であるといわれている 9）。本研究で検出された pERK 陽性細胞の分布領域も，これまでに報告された口ひげ部への capsaicin 投与によって pERK 陽性細胞発現が認められた領域とほぼ一致していた。このことから，histamine 投与によってこの領域に発現した
pERK 陽性細胞は，histamine によって活性化した C- 線
維入力だけでなく，皮膚の侵害情報を伝える C- 線維や A線維からの入力も受けている可能性があると考えられる。histamine によって駆動される Vc および C1-C2 侵害受容ニューロンの多くは皮膚の侵害情報処理に対して第5図も重要な役割を担っている可能性がある。

Histamine 投与ラットおよび vehicle 投与ラットの，Vc
において検出された pERK 陽性細胞数の比較*： ＜ 0.05，**： ＜ 0.0124痒み入力を受ける延髄および上部頸髄ニューロン

2.

NTS および RF の顔面皮膚の痒み情報処理に対する文

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本研究では Vc および C1-C2 領域だけでなく NTS や
RF においても口ひげ部皮下への histamine 投与によって pERK 陽性細胞発現を認めた。従来の研究から NTS
および RF は自律神経系調節に密接にかかわっていることが知られている 18）。特に NTS は嚥下や味覚など口腔の運動や感覚情報処理に対して重要な役割を有する核として知られており 19），histamine 刺激によって活性化し
pERK を発現したニューロンは痒みの感覚情報処理だけ
でなく，痒み感覚に随伴した自律神経系の調節にも関与する可能性が考えられる。また，RF は自律神経系の調節だけでなく，全身の侵害入力を受けるニューロンが存在することが知られている 20）。従って，histamine 刺激
によって駆動され pERK を発現したニューロンは痒み感
覚情報処理と同時に全身の痛覚情報処理にも関与する可能性がある。

結論

麻酔ラットの口ひげ部皮下への histamine 投与によって，延髄および上部頸髄における pERK 陽性細胞発現様式について詳細な検討を加え，以下の結論を得た。
1.

口ひげ部皮下へ histamine を投与したラットの延髄
では，Vc の背側部と Vc 腹側部の RF および NTS に
pERK 陽性細胞発現を認めた。

2.

Histamine 投与ラットの Vc および C1-C2 において刺激と同側で多くの pERK 陽性細胞発現を認めたのに対し，NTS および RF においては，発現数において左右差は認められなかった。

3.

pERK 陽性細胞は histamine 投与群で投与と同側において，obex から 1800μm 尾側部（1800μm）の部位にピークを示す分布を示していた。また，obex の600μm 尾側からその 1800μm 尾側までの範囲においては，vehicle 投与群よりも histamine 投与群の方が有意に多くの pERK 陽性細胞を認めた。

4.

献

Vc および C1-C2 領域において検出された pERK 陽性細胞数は，同側および対側ともに，histamine 投
与群の方が vehicle 投与群より有意に多かった。
以上から，顔面領域の痒み情報処理は obex からやや尾側部の Vc および C1-C2 の表層に分布するニューロン
によって行われ，その中でも大型のニューロンは上位中枢へ痒み情報を送るのに対し，小型のニューロンは局所回路を形成して痒み情報調節に関与している可能性が示された。
本研究遂行に当たり，格別なるご指導を賜りました日本大学歯学部生理学講座の岩田幸一教授，篠田雅路准教授および片桐綾乃
助教に対し心より感謝の意を表します。尚，本論文に関して，開示すべき利益相反はない。

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