助成番号 2039

塩化物イオンによる甘味受容体やうま味受容体制御の構造生物学・生物物理学的検証

山下 敦子
岡山大学大学院医歯薬学総合研究科

概 要 塩味は，対イオンが塩化物イオンのときに最も強く感じられることから，塩化物イオンも何らかの形で味覚に関与していると考えられている。一方，味覚において塩化物イオンがどのように認識されているのかについての全貌は，未だ明確にされているとは言い難い。味蕾には，それぞれの味質を呈する味物質を認識する味覚受容体が存在するが，助成研究者らは，ヒトで甘味およびうま味受容を担う Taste receptor type 1（T1r）について，メダカ由来でアミノ酸受容体である，
T1r2a/T1r3 のリガンド結合ドメイン（LBD）の立体構造を，味覚受容体として初めて決定した。この構造解析の過程で，T1r3 サブユニットのアミノ酸結合部位のすぐ近傍に，塩化物イオンが特異的に結合していることを見出した。一方で，T1rに対する塩化物イオン結合が，甘味受容およびうま味受容に何らかの影響を与えるかどうかについては，これまでに報告がない。そこで本研究では，T1r の代表例として，唯一組換え発現および試料調製に成功し，構造解析系および生物物理学的機能解析系が確立できているメダカ T1r2a/T1r3LBD を利用し，塩化物イオンの同受容体への結合が，受容体タンパク質および受容体によるアミノ酸結合にどのような影響を与えるのかについて解析を行った。その結果，塩化物イオンが実際に T1r2a/T1r3LBD に結合を示すことを等温滴定カロリメトリーで立証するとともに，塩化物イオンの結合が，同タンパク質を熱安定化させることを明らかとした。一方，同タンパク質に対するアミノ酸結合の親和性や，アミノ酸結合が引き起こす受容体タンパク質構造変化の作用濃度域は，塩化物イオンの有無によっては差異が見られなかった。これらのことか
ら，T1r2a/T1r3 への塩化物イオンの結合は，同受容体の味物質であるアミノ酸への応答には顕著な影響を与えないことが示唆された。

１．研究目的の報告がされている(4, 5)。また，ENaC の立体構造も報告さ私たちは，食品に含まれるさまざまな成分を，甘味・うまれているが，構造中では，塩化物イオンの結合部位は同味・塩味・酸味・苦味の基本五味に分類し，味覚によって定されていない(6, 7)。さらに，生理学的・薬理学的な結果感知している。味覚では，口腔内に存在する味感覚器でからも，塩化物イオンは ENaC を介さない形で感知されてある味蕾の味細胞に存在する味覚受容体が，味を呈するいると考えられている(8)。これらの状況から，味覚において化学物質である味物質を結合することから始まる (1)。例え塩化物イオンがどのように認識されているかについての全ば，塩味は，ナトリウムイオンが塩味受容体である上皮性貌は，未だ明確にされているとは言い難い。

ナトリウムチャネル（ENaC）に結合することで引き起こされ味覚受容体は，塩味受容体以外にも，それぞれの味質る味と考えられている(2)。塩味は，対イオンが塩化物イオごとの味物質を認識する味覚受容体が存在する。この中ンのときに最も強く感じられることから(3)，塩化物イオンも何で，甘味およびうま味受容を担うのが，Taste receptor type

らかの形で味覚に関与していると考えられる。一方 ENaC1（T1r）である(9-11)。T1r はクラス C 型 G タンパク質共役型に対しては，塩化物イオンはむしろその活性を阻害すると受容体（GPCR）に属しており，T1r1 と T1r3 または T1r2 とT1r3 のヘテロ二量体が，ヒトではそれぞれうま味または甘味の受容体として機能している。T1r には大きな細胞外領域が存在し，そのリガンド結合ドメイン（Ligand-bindingdomain, LBD）において糖やアミノ酸などの主要な味物質を認識する。助成研究者らはこのうち，メダカ由来でアミノ酸受容体である，T1r2a/T1r3LBD ヘテロ二量体の構造を，味覚受容体として初めて決定した（Fig. 1）(12)。T1r の LBD
は Venus flytrap module と呼ばれる 2 つのサブドメインから構成される構造をとっており，T1r2a, T1r3 それぞれのサブユニットのサブドメイン間の隙間で，味物質であるアミノ酸を結合・認識していることを明らかとした。また，このアミノ酸の結合により LBD が構造変化すること，この構造変化が T1r によるシグナル伝達を誘起すると考えられることを報告した(13)。

Figure 1. Crystal structure of medaka T1r2a/T1r3LBD.
(PDB ID: 5X2M)

一方，構造解析の過程で，T1r3 サブユニットのアミノ酸結合部位のすぐ近傍に，塩化物イオンが特異的に結合していることを見出した（Fig. 1）。アミノ酸配列上の相同性から，この部位は，メダカ T1r3 だけでなく，ヒトも含めたほとん
どの T1r3 で保存されていると予想される（Fig. 2）。さらにこの部位は，同じクラス C 型 GPCR の他の受容体でも，イオン結合部位となっていることが報告されている。例えば，代謝型グルタミン酸受容体においても，当該部位に塩化物イオンが結合することが推測されており，塩化物イオンとグルタミン酸の結合に正の協同性が見られたことから，塩化物イオンがアゴニストに対する正のアロステリック・モジュレータとして機能することが報告されている(14)。また，カルシウム感知受容体においては，当該部位が同受容体のアゴニストであるカルシウムイオン結合部位の 1 つであると報告されている(15)。一方で，T1r に対する塩化物イオン結合が，甘味受容およびうま味受容に何らかの影響を与えるかどうかについては，これまでに報告がない。
T1r は組換え発現が困難なタンパク質であり，機能を保持したヘテロ二量体試料の組換え発現および試料調製

Figure 2. Amino acid sequence alignment of the chloride
binding region of T1r. The label ahead of each T1r
sequence indicates the source organism of the receptors,
such as mf, medaka; h: human; c, chicken; al, green anole.
The sequences for the other class C GPCRs with reported
crystal structures, such as rmglur1 (rat metabotropic
glutamate receptor 1), hCaSR (human calcium-sensingreceptor), hGBR1b (human GABAB receptor 1b), hGBR2(human GABAB receptor 2) are also shown.

が成功している例は，現時点で助成研究者らのメダカ
T1r2a/T1r3LBD の他に報告はない。そこで本研究では，ミノ酸の受容体への結合が，塩化物イオン結合により何らT1r の代表例として，唯一組換え発現および試料調製にかの制御を受けるかどうかについて，解析を行った。

成功し，構造解析系および生物物理学的機能解析系が２．研究方法確立できているメダカ T1r2a/T1r3LBD を利用し，塩化物イ等温滴定カロリメトリーおよび示差走査蛍光測定に用いるオンの同受容体への結合が同受容体にどのような影響をメダカ T1r2a/T1r3LBD 試料は，既報に基づき調製した(12, 13)。

与えるかを解析した。さらに，同受容体の味物質であるア

具体的には，既に構築しているメダカ T1r2a/T1r3LBD 安

定発現ショウジョウバエ S2 細胞の培養上清から，Antiindex とし，得られた値を Hill 式に fitting することで，EC50

FLAG M2 affinity gel（SIGMA）を用いたアフィニティーク値を算出した。

ロマトグラフィーにより試料精製を行った。

塩化物イオン非存在下でのメダカ T1r2a/T1r3LBD 結晶

等温滴定カロリメトリーによる塩化物イオンおよびアミノ化は，基本的には既報に基づき(12)，一部の緩衝液条件を酸の結合解析は，MicroCal iTC200（GE Healthcare）を用

変 更 す る こ と で 実 施 し た 。 具 体 的 に は ， kifunensine

いて，既報に基づき行った(13)。塩化物イオン結合解析に（Carbosynth） 存在下で培養した安定発現ショウジョウバ

おいては，試料の緩衝液成分を，20 mM HEPES-Tris,

エ S2 細胞の培養上清から，Anti FLAG M2 affinity gel を

300 mM Na gluconate, pH 7.5 とし，この試料に NaCl 溶液用いたアフィニティークロマトグラフィーにより発現タンパクを滴定することで，結合熱を測定した。また，アミノ酸結合質を回収し，Factor Xa（Enzyme Research Laboratories）を解析では，試料の緩衝液成分を，塩化物イオン存在下条用いた精製タグ切断，Endo H を用いた糖鎖切断を行うと件では，20 mM HEPES-Tris, 300 mM NaCl, pH 7.5，塩化ころまでの試料調製過程は，既報(12)と同様に行った。また，

物イオン非存在下条件では 20 mM HEPES-Tris，300 mM

抗 T1r2a モノクローナル抗体 16A からの Fab 断片（Fab16A）

Na gluconate, pH 7.5 とし，l-glutamine 溶液を滴定することも 既 報 (12) と 同 様 に 調 製 し た 。 得 ら れ た メ ダ カで，結合熱を測定した。いずれの条件においても，精製

T1r2a/T1r3LBD 試 料 と Fab16A を 混 合 し ， 20 mM

T1r2a/T1r3LBD 試料は，実験直前に透析により所定の条HEPES-NaOH, 300 mM Na gluconate, 2 mM Ca gluconate,

件への緩衝液交換を行い，測定に用いた。得られた結果

5 mM l-glutamine を 緩 衝 液 と し て ， HiLoad 16/60

から，Origin（Light Stone）を用いて，One site binding

Superdex200 prep grade（GE Healthcare）を用いたゲルろmode で計算することで解離定数 Kd 値を算出した。

過 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー を 行 う こ と で ， T1r2a/T1r3LBD–

示 差 走 査 蛍 光 測 定 に よ る 熱 変 性 解 析 は ， StepOne

Fab16A 複合体を精製した。得られた試料を限外ろ過濃縮

Real-Time PCR System （ Applied Biosystems ） お よ びすることで緩衝液交換を行い，試料中の HEPES-NaOH

Protein Thermal Shift Dye（Applied Biosystems）を用いて，を 10 mM まで，Na gluconate を 50 mM まで減少させた。

。上述の等温滴定カロリメトリーに得られた試料をもとに，既報(12)と同様に結晶化を行った。

よるアミノ酸結合解析と同様に，実験直前に透析により緩X 線回折強度データ収集は，SPring-8 の BL41XU にて，衝液交換を行って，塩化物イオン存在下および非存在下

波長 1 Å の X 線および検出器 EIGER16M（DECTRIS）をでの試料を調製し，測定を実施した。得られた結果から，用いて行い，得られたデータは XDS(17)により処理した。

Protein Thermal Shift Software（Applied Biosystems）を用

３．研究結果

既報に基づき行った(16)

いて Derivative Tm を求め，融解温度 Tm 値とした。

T1r に対する塩化物イオンの結合については，これまで蛍光共鳴エネルギー移動法による受容体タンパク質のに明確な報告はない。また，メダカ T1r2a/T1r3LBD への構造変化の解析は，Cerulean 融合 T1r2aLBD/ Venus 融

塩化物イオンの結合は，以前行った X 線結晶構造解析(12)合 T1r3LBD ヘテロ二量体安定発現ショウジョウバエ S2 細において，得られた電子密度や受容体タンパク質との結胞の培養上清から，Anti FLAG M2 affinity gel（SIGMA）合距離に基づいて同定したものであったが，生化学的あを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した試

るいは生物物理学的な検証はできていなかった。そこで，(12, 13)。得られた試料は，上述の等温滴

実際にメダカ T1r2a/T1r3LBD に対し塩化物イオンが結合

定カロリメトリーによるアミノ酸結合解析と同様に，実験直を示すどうかを調べるため，等温滴定カロリメトリーを用い前に透析により緩衝液交換を行って，塩化物イオン存在て，塩化物イオンを除いたメダカ T1r2a/T1r3LBD に対し塩下および非存在下条件とした。これらの試料に各種濃度化物イオンを滴定することで，結合熱が発生するかどうかの l-glutamine 溶液を添加し，励起波長 433 nm におけるを解析した。その結果，塩化物イオンの添加により，実際475 nm および 526 nm の蛍光強度を蛍光分光光度計に結合熱の発生が検出されたことから，同受容体タンパク

Fluoromax 4（堀場製作所）を用いて測定した。526 nm で質に対する塩化物イオンの結合を生物物理学的に立証の蛍光強度を 475 nm での蛍光強度で割った値を FRETすることができた。なお，得られた結合熱から算出された料を用いて行った

解離定数 Kd 値は，およそ数十~数百 µM のレベルである出できることを報告している(13)。本研究において，塩化物ことが明らかとなった。

イオン存在下または非存在下で蛍光タンパク質融合

次に，塩化物イオンの結合が，受容体タンパク質にどのT1r2a/T1r3LBD に l-glutamine を添加したところ，得られたような影響を与えるかを調べるため，示差走査蛍光測定

蛍光強度変化の EC50 値はほぼ一致し，等温滴定カロリメト法を用いて，塩化物イオン存在下および非存在下におけリーでの測定結果と矛盾のない結果が得られた。この結るメダカ T1r2a/T1r3LBD の熱安定性を比較した。助成研

果から，T1r2a/T1r3LBD への塩化物イオンの結合は，アミ究者らはすでに，塩化物イオンが存在する条件下でのノ酸の結合が引き起こす同受容体タンパク質の構造変化

T1r2a/T1r3LBD の融解温度 Tm 値を示差走査蛍光測定法にも影響を与えないことが示唆された。

を用いて解析した結果，53.0 Å ± 0.07 ˚C であることを報告

最後に，T1r2a/T1r3LBD への塩化物イオン結合が同受しており(16)，今回の緩衝液成分での塩化物イオン存在下容体に与える構造学的な影響を調べるため，塩化物イオ条件においても，同様の Tm 値が観測された。一方，塩化ン非存在下での T1r2a/T1r3LBD 結晶化を試みた。すでに物イオン非存在下では，塩化物イオン存在下と比較して，報告している T1r2a/T1r3LBD 結晶構造(12)は，塩化物イTm 値が大きく減少することが判明した。この結果から，オン存在下で精製・結晶化を行ったものであるが，今回のT1r2a/T1r3LBD への塩化物イオンの結合は，同タンパク研究において，塩化物イオン非存在下でも，質を熱安定化させることが示唆された。

T1r2a/T1r3LBD タンパク質と Fab16 との複合体を，存在下さらに，T1r2a/T1r3LBD への塩化物イオンの結合が，と同様に精製することができた。得られたタンパク質を結同受容体の味物質であるアミノ酸の結合に何らかの影響晶化した結果，塩化物イオン存在下とほぼ同様の条件下を与えるかどうかについて，等温滴定カロリメトリーを用いで，これまで得られていた結晶と形状がよく似た棒状の結て解析した。助成研究者らはすでに，塩化物イオンが存晶を得ることができた（Fig. 3）。一方，当該結晶は，短辺在する条件で等温滴定カロリメトリーを用いて解析したが数 µm，長辺でも 20 µm 程度と結晶サイズが極めて小さ

T1r2a/T1r3LBD に対する l-glutamine の Kd 値が 8.9 µM でかった。研究期間終了後，SPring-8 でのビームタイムを得(13)，今回の測定における塩化物イて，X 回折強度データ収集を試みたが，7 Å 分解能という，オン存在下での結果からも，同様の Kd 値が算出された。

構造解析には不十分な低分解能のデータしか得ることが一方，緩衝液中の塩化物イオンを，同受容体に結合を示できなかった。

あることを報告しておりさない 1 価アニオンであるグルコン酸に置換した，塩化物イオン非存在下における l-glutamine の Kd 値についても，塩化物イオン存在下とほとんど変わらない値が得られた。
このことから，T1r2a/T1r3LBD への塩化物イオンの結合は，アミノ酸結合には顕著な影響を与えないことが示唆された。
T1r2a/T1r3LBD へのアミノ酸の結合に対する塩化物イオンの影響をさらに検証するため，蛍光タンパク質融合体試料を用いて，アミノ酸結合に伴う受容体タンパク質の構造変化を蛍光共鳴エネルギー移動法で解析した。助成研
究者らは，T1r2a/T1r3LBD に対するアミノ酸結合に関して，等温滴定カロリメトリーで得られる Kd 値と，蛍光タンパク質融合体試料を用いて蛍光共鳴エネルギー移動法で観察される蛍光強度変化の EC50 値がほぼ一致することから，

Figure 3. Crystal of medaka T1r2a/T1r3LBD obtained in

アミノ酸結合に伴い T1r2a/T1r3LBD が構造変化をするこ

the absence of chloride ion.と，この構造変化を蛍光共鳴エネルギー移動法により検４．考 察おいて，T1r3 では，メダカ受容体で塩化物イオン結合に塩味におけるナトリウムイオンの感知は，主として ENaC関与するトレオニンと同じ部位に位置するアミノ酸残基としが担うと考えられている。一方，塩味は二面性のある味でて，トレオニンまたはセリンが保存されている（Fig. 2）。このあり，低濃度の塩化ナトリウムは快い味として感じられる一ことから，他の生物種においても T1r3 への塩化物イオン

方，高濃度では不快な味として感じられる。高濃度の塩に結合は保存されている可能性が考えられる。一方，T1r1

ついては，苦味と酸味という，元来不快な味として認識さまたは T1r2 の当該アミノ酸残基は，多くの場合バリンやア(18)。

ラニンなどに置換されている（Fig. 2）。これらは小型アミノ

一方，申請代表者らは，甘味やうま味の受容体である T1r酸であるため，ヒスチジンのような立体障害の要因にはなに，塩化物イオンの結合部位が存在することを見出していらないものの，いずれもイオン結合には不利な非極性アミた(12)。そこで，低濃度の塩化ナトリウム感知は，ENaC によノ酸である。ヒトも含めたメダカ以外の T1r1 または T1r2 にるナトリウムイオン感知に加え，甘味受容体やうま味受容ついて塩化物イオンの結合が見られるかどうか，また，そ体といった，元来快い味として感じられる味覚に関与するれらの味物質応答に何らかの影響を与えるかどうかにつ味覚受容体機能が塩化物イオンによって正に制御される

いては，今後検証の必要がある。また，塩化物イオンの形で合わせて感知されることで，快い感覚を生み出していT1r に対する結合そのものが何らかの形で味覚に関わるる可能性を作業仮説として考えた。本研究は，この可能性シグナル伝達を引き起こすかどうか，また，塩化物イオンを検証する第一歩として，分子レベルでの解析を行ったも結合による T1r の LBD 領域の熱安定化が味覚に関わるのである。

シグナル伝達の誘起に何らかの影響を与えるかどうかにれる 2 つの味覚経路で受容されることが報告されている

本研究によって得られた結果から，少なくともメダカ
T1r2a/T1r3 については，塩化物イオン結合は，その細胞ついても，今後検証の必要がある。
５．今後の課題

外領域に存在する LBD の熱安定性上昇を引き起こすも本研究では，塩化物イオン非存在下での結晶作製はのの，味物質であるアミノ酸への応答には顕著な影響を達成したものの，構造解析に十分な分解能の X 線回折強与えないことが示唆された。これは，同じクラス C 型 GPCR度データが得られなかった。塩化物イオン非存在下では，の代謝型グルタミン酸受容体において，塩化物イオンとグ塩化物イオン存在下で通常得ている結晶と比較すると，ルタミン酸の結合に正の協同性が見られた(14)こととは異な同じ結晶化条件においても，結晶が得られる確率が低く，る結果となった。T1r2a/T1r3LBD で観察された塩化物イオまた得られた結晶のサイズが小さかった。このことは，本研ンの結合部位は，T1r3 には存在する一方，T1r2a の同じ究課題で明らかになった，塩化物イオン非存在下での部位には確認されていない。これは，塩化物イオンの結T1r2a/T1r3LBD 試料の熱安定性の低さにも関連すると考合に関与している T1r3 のトレオニン残基が，T1r2a においえられる。今後，塩化物イオン非存在下での構造を明らかてはヒスチジンに置換されており（Fig. 2），側鎖であるイミにする上では，何らかの条件で試料を安定化させるなど，ダゾール環の立体障害により，塩化物イオンの結合がでさらなる結晶化条件の改善が必要になろう。

きなくなっているからと考えられる。T1r で構成される受容また，ヒトも含めたメダカ以外の T1r に対する塩化物イオ体において，T1r3 は共通の構成要素となっていることから，ン結合の有無とその味物質応答制御に関する解析につ受容体ごとの異なる味物質の識別には，それぞれの受容いては，構造生物学的および生物物理学的解析としては，体が独自に持つサブユニットである T1r1 または T1r2 側が現在これらの受容体タンパク質の組換え発現生産ができ

主 要 な 役 割 を 担 う こ と が 報 告 さ れ て い る (19) 。 今 回ないことがボトルネックとなっている。そこで，これらの試料

T1r2a/T1r3LBD における塩化物イオン結合によるアミノ酸生産条件の確立を進めるとともに，受容体を強制発現させ結合に対する影響が見られなかった理由としては，塩化た細胞を用いた受容体の細胞応答解析や，味神経の応物イオンの結合部位が，味物質識別には補助的な役割し答解析など，現在確立されている生理学的な解析手法をか果たさないと考えられている，T1r3 にしかなかったこと用いた解析を進める必要がある。これらの構造生物学的・にあるかもしれない。ヒトも含めた，メダカ以外の生物種に生物物理学的・生理学的な解析から得られる情報を統合

することで，塩化物イオンが味蕾細胞においてどのように9.

Nelson G, Hoon MA, Chandrashekar J, Zhang Y, Ryba

感知されるのかの一端を明らかにすることができると考え

NJ, Zuker CS. Mammalian sweet taste receptors. Cell.

る。

2001;106(3):381-90.

本研究課題は，岡山大学大学院医歯薬学総合研究科

10. Nelson G, Chandrashekar J, Hoon MA, Feng L, Zhao G,

安井典久准教授，大学院生伊藤千晶さん，同薬学部学

Ryba NJ, et al. An amino-acid taste receptor. Nature.

生高科百合子さん，新田純矢さん，光永朋樹さんの協力

2002;416(6877):199-202.

を得て実施しました。これらの方々に感謝いたします。ま11. Li X, Staszewski L, Xu H, Durick K, Zoller M, Adler E.

た，助成いただきました公益財団法人ソルト・サイエンス研

Human receptors for sweet and umami taste. Proc Natl

究財団に深謝いたします。

Acad Sci U S A. 2002;99(7):4692-6.
12. Nuemket N, Yasui N, Kusakabe Y, Nomura Y, Atsumi N,

６．文 献
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No. 2039

Structural and Biophysical Analysis of Sweet and Umami Taste Receptor
Regulation by Chloride Ion

Atsuko Yamashita
Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences, Okayama University
Summary
Since a salty taste is most strongly perceived with chloride as the counterion, it is considered that chloride isinvolved in taste sensation. However, how chloride is recognized in the taste system has been remained elusive.
In the taste buds, taste receptors play key roles in the recognition of taste substances. Among them, taste receptor
type 1 (T1r) is responsible for sweet and umami taste perceptions. Previously, we solved the crystallographic
structure of the ligand-binding domain (LBD) of T1r for amino-acid perception from medaka fish, T1r2a/T1r3. In
the structure, we found that a chloride ion specifically binds in the close vicinity of the amino-acid binding site in
the T1r3 subunit. Nevertheless, whether the binding of chloride ion to T1r has affects sweet or umami perception
is unknown. In this study, we analyzed the binding and action of chloride ion to T1r by use of medaka
T1r2a/T1r3LBD, a currently sole sample with successful recombinant protein preparation amenable to structuraland biophysical analyses, as a representative.

Firstly, we confirmed the binding of a chloride ion toT1r2a/T1r3LBD by isothermal titration calorimetry. Furthermore, the chloride binding was found to thermallystabilize the T1r2a/T1r3LBD protein. On the other hand, the affinity of an amino acid to the receptor protein andits effective concentration for the conformational change of the receptor protein concomitant with binding did notshow a significant difference in the presence or absence of chloride ion. These results suggest that the binding ofa chloride ion to T1r2a/T1r3 does not significantly affect the receptor responses to taste substance amino acids.