写２０消安第２４９６号
平成２０年６月１８日

各都道府県知事
あて
独立行政法人農林水産消費安全技術センター理事長

農林水産省 消費・安全局長

組換えＤＮＡ技術応用飼料の検査方法の一部改正について「飼料及び飼料添加物の成分規格等に関する省令の一部を改正する省令等の施行について」（平成１５年４月１日付け１４生畜第８５９８号農林水産省生産局長・水産庁長官通知）別添３の組換えＤＮＡ技術応用飼料の検査方法を、別添新旧対照表のとおり改正したので、御了知されるとともに、貴管下関係者への周知徹底につき御協力をお願いします。

（別紙）「飼料及び飼料添加物の成分規格等に関する省令の一部を改正する省令の施行について」（平成１５年４月１日付け１４生畜第８５９８号農林水産省生産局長・水産庁長官通知）
新旧対照表（下線部分は改正部分）
改正後

現

１～６（略）

１～６（略）

別添１・別添２（略）別添１・別添２（略）別添３

組換え DNA 技術応用飼料の検査方法

1. 検体採取方法

別添３

組換え DNA 技術応用飼料の検査方法

1. 検体採取方法

（略）

行（略）

2. 安全性未確認の組換え DNA 技術応用飼料の検査方法

2. 安全性未確認の組換え DNA 技術応用飼料の検査方法

2.1. トウモロコシ（CBH351）の検査方法

2.1. トウモロコシ（CBH351）の検査方法

2.2. トウモロコシ（Bt10）の検査方法

（略）

（略）

2.3 トウモロコシ（DAS59132）の検査方法
2.3.1 トウモロコシ（DAS59132）の定性法
トウモロコシ穀粒について、リアルタイム PCR*を用いた定性
PCR 法で行う。なお、試料の準備は 2.1.1.1 に定めるところにより行う。

2.2. トウモロコシ（Bt10）の検査方法

（略）

（略）

2.3 トウモロコシ（DAS59132）の検査方法
2.3.1 トウモロコシ（DAS59132）の定性法
トウモロコシ穀粒について、リアルタイム PCR を用いた定性
PCR 法で行う。なお、試料の準備は 2.1.1.1 に定めるところにより行う。

*リアルタイム PCRリアルタイム PCR は、ABI PRISMTM 7700、ABI PRISMTM
7900HT 若しくは ABI PRISMTM 7500 又は同等の結果の得られるものを用いる。
2.3.1.1 プライマー対及びプローブ
2.3.1.1.1 トウモロコシ陽性対照用プライマー対及びプローブ

2.3.1.1 プライマー対及びプローブ
2.3.1.1.1 トウモロコシ陽性対照用プライマー対及びプローブ

トウモロコシ陽性対照用試験はトウモロコシに普遍的に存在
トウモロコシ陽性対照用試験はトウモロコシに普遍的に存在する内在性遺伝子として、スターチシンターゼ IIb（SSIIb）遺 する内在性遺伝子として、スターチシンターゼ IIb（SSIIb）遺伝子を用い、同遺伝子を標的とするプライマー対 SSIIb-3*とプ 伝子を用い、同遺伝子を標的とするプライマー対 SSIIb-3 とプ
ローブ SSIIb-Taq*を用いる。
ローブ SSIIb-Taq を用いる。
*トウモロコシ陽性対照用プライマー対 SSIIb-3 及びプローブ
SSIIb-Taq は、ニッポンジーン又はファスマックにて購入可能である。
2.3.1.1.2 DAS59132 検出用プライマー対
2.3.1.1.2 DAS59132 検出用プライマー対F-primer（32f）：5’-CCG CAA TGT GTT ATT AAG TTG
F-primer（32f）：5’-CCG CAA TGT GTT ATT AAG TTG
TCT AAG-3’
TCT AAG-3’
R-primer（32r）：5’-GGT GAA TGT CGC CGT GTG T-3’
R-primer（32r）：5’-GGT GAA TGT CGC CGT GTG T-3’
（各プライマーは水で溶解する。）（各プライマーは水で溶解する。）
2.3.1.1.3 DAS59132 検出用プローブ
2.3.1.1.3 DAS59132 検出用プローブ
5’-FAM-CAA TTT GTT TAC ACC AGA GGC CGA CAC
FAM-CAA TTT GTT TAC ACC AGA GGC CGA CAC
G-TAMRA-3’G-TAMRA（プローブは水で溶解する。）（プローブは水で溶解する。）
2.3.1.2 PCR 用反応液の調製
2.3.1.2 PCR 用反応液の調製
PCR 用反応液は 25μL/well として調製する。その組成は以下
PCR 用反応液は 25μL/well として調製する。その組成は以下のとおりである。Universal PCR Master Mix ＊ 1 12.5μL、対象 のとおりである。Universal PCR Master Mix ＊ 1 12.5μL、対象プライマー対溶液（各プライマー、10μmol/L）1.0μL ＊ 2、対象 プライマー対溶液（各プライマー、10μmol/L）1.0μL ＊ 2、対象プローブ溶液（10μmol/L）0.5μL を混合し、水で全量 20μL に プローブ溶液（10μmol/L）0.5μL を混合し、水で全量 20μL に調製後、10ng/μL DNA 試料液 5.0μL（50ng）を添加する＊3。PCR 調製後、10ng/μL DNA 試料液 5.0μL（50ng）を添加する＊3。分反応の陰性コントロールとして、必ずＤＮＡ試料液を加えず水で 注操作終了後、真上からシール＊ 4 し、完全にウェルを密閉する。
全量25μL としたものも同時に調製する。分注操作終了後、真上 このとき、しわが寄らないよう注意し、専用のシーリング用アからシール＊ 4 し、完全にウェルを密閉する。このとき、しわが プリケーターを用いて行う＊5。最後にウェルの底を観察し、底に寄らないよう注意し、専用のシーリング用アプリケーターを用 気泡がある場合は、プレートの縁を軽く叩いて気泡を抜いておいて行う＊5。最後にウェルの底を観察し、底に気泡がある場合は、 く。プレートの確認後、ABI PRISM Optical Cover Compression
プレートの縁を軽く叩いて気泡を抜いておく。プレートの確認 Pad ＊ 6 を茶色の面が上になるよう、プレートの上面にセットす
後、ABI PRISM Optical Cover Compression Pad ＊ 6 を茶色の る。試験は、1DNA 試料液あたり 2well 並行で行うものとし、PCR面が上になるよう、プレートの上面にセットする。試験は、1DNA 用反応試薬は 2well 分を同時に調製する。
試料液あたり 2well 並行で行うものとし、PCR 用反応試薬は2well 分を同時に調製する。

＊

1 Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems 社）
本試薬は粘性が高いため、混合操作を行う際には、混合が確実に行われるように注意する。不十分な場合には、PCR がうまくいかない場合がある。使う直前には必ずボルテックスミキサーを用いて 3 秒程度混合した後、軽く遠心し、溶液を試料管の底に集めておいてから使用する。また、ウェルに分注する際は、以後撹拌、遠心が困難なことを考慮し、ウェルの底に確実に入れる。
＊
2 対象プライマー対溶液量
トウモロコシ陽性対照用試験では各プライマー（25μmol/L）を用いる場合には 0.5μL を加えること。
＊
3 可能であれば、陽性対照として DNA 試料液の代わりに陽性対照プラスミドを用いた反応液を調製することが望ましい。
＊4 （ABI PRISMTM 7900、7500）96 ウェルプレート、シール及びシーリングアプリケーター
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate（ AppliedBiosystems 社）及び ABI PRISM Optical Adhesive Cover（Applied Biosystems 社）を使用する。シーリングの詳細については製品付属のマニュアルを参考のこと。
＊4 （ABI PRISMTM 7700）96 ウェルプレート及びプレートの蓋
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate（ AppliedB i o s y s t e m s 社 ） 及 び M i c r o A m p O p t i c a l C a p s、8caps/strips(Flat)（Applied Biosystems 社）を使用する。
＊
5 当該操作は ABI PRISMTM 7700 を使用する場合は必要ない。
＊
6 ABI PRISM Optical Cover Compression Pad
ABI PRISM Optical Cover Compression Pad（ AppliedBiosystems 社）を使用する。20 回以上の繰り返し使用は、定量結果に影響を及ぼす可能性があるため、避けること。なお、ABI
PRISMTM 7700 及び ABI PRISMTM7500 では、当該 Pad は使用しない。

1 Universal PCR Master Mix
本試薬は粘性が高いため、混合操作を行う際には、混合が確実に行われるように注意する。不十分な場合には、PCR がうまくいかない場合がある。使う直前には必ずボルテックスミキサーを用いて 3 秒程度混合した後、軽く遠心し、溶液を試料管の底に集めておいてから使用する。また、ウェルに分注する際は、以後撹拌、遠心が困難なことを考慮し、ウェルの底に確実に入れる。
＊2 対象プライマー対溶液量
トウモロコシ陽性対照用試験では各プライマー（25μmol/L）を用いる場合には 0.5μL を加えること。
＊
3 可能であれば、陽性対照として DNA 試料液の代わりに陽性対照プラスミドを用いた反応液を調製することが望ましい。
＊4 （ABI PRISMTM 7900、7500）96 ウェルプレート、シール及びシーリングアプリケーター
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate（ AppliedBiosystems 社）及び ABI PRISM Optical Adhesive Cover（Applied Biosystems 社）を使用する。シーリングの詳細については製品付属のマニュアルを参考のこと。
＊4 （ABI PRISMTM 7700）96 ウェルプレート及びプレートの蓋
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate（ AppliedB i o s y s t e m s 社 ） 及 び M i c r o A m p O p t i c a l C a p s、8caps/strips(Flat)（Applied Biosystems 社）を使用する。
＊
5 当該操作は ABI PRISMTM 7700 を使用する場合は必要ない。
＊
6 ABI PRISM Optical Cover Compression Pad
ABI PRISM Optical Cover Compression Pad（ AppliedBiosystems 社）を使用する。20 回以上の繰り返し使用は、定量結果に影響を及ぼす可能性があるため、避けること。なお、ABI
PRISMTM 7700 では、当該 Pad は使用しない。

2.3.1.3 プレート情報の設定

2.3.1.3 プレート情報の設定＊

反応に際しては、プレート情報の設定を行わなければならない。設定を行う項目は、検体の配置と種類及び、プローブ特性である。具体的には新規シート上で、調製したプレートの配置に対応するように気を付けながら、検体の種類（「UNKN」：DNA試料液）の設定を行う。またプローブ特性に関しては、トウモ
ロ コ シ 陽 性 対 照 用 、 DAS59132 検 出 用 と も に 、 Reporter が「FAM」、Quencher が「TAMRA」となるように設定する。なお、トウモロコシ陽性対照用、DAS59132 検出用ともに、PassiveReference を「ROX」と設定する。

反応に際しては、プレート情報の設定を行わなければならない。設定を行う項目は、検体の配置と種類及び、プローブ特性である。具体的には新規シート上で、調製したプレートの配置に対応するように気を付けながら、検体の種類（「UNKN」：DNA試料液）の設定を行う。またプローブ特性に関しては、トウモ
ロ コ シ 陽 性 対 照 用 、 DAS59132 検 出 用 と も に 、 Reporter が「FAM」、Quencher が「TAMRA」となるように設定する。なお、トウモロコシ陽性対照用、DAS59132 検出用ともに、PassiveReference を「ROX」と設定する。

2.3.1.4 PCR
装置にプレートをセットし、反応とデータの取り込みを開始する。反応条件は以下のとおりである。50 ℃、2 分間の条件で保持した後、95 ℃で 10 分間加温し、ホットスタート法で反応を開始する。その後、95 ℃ 15 秒、60 ℃ 1 分を 1 サイクルとして、40 サイクルの増幅反応を行う。Remaining time が 0 分となっていることを確認し、反応を終了させた後、測定結果の解析を行う。

2.3.1.4 PCR
装置にプレートをセットし、反応とデータの取り込みを開始する。反応条件は以下のとおりである。50 ℃、2 分間の条件で保持した後、95 ℃で 10 分間加温し、ホットスタート法で反応を開始する。その後、95 ℃ 15 秒、60 ℃ 1 分を 1 サイクルとして、40 サイクルの増幅反応を行う。Remaining time が 0 分となっていることを確認し、反応を終了させた後、測定結果の解析を行う。

（削除）

＊

2.3.1.5 結果の判定
トウモロコシ陽性対照用試験および DAS59132 検出用試験のいずれについても、結果の判定は、Amplification plot 上で指数関数的な増幅曲線と Ct 値の確認および multicomponent 上での対象色素由来の蛍光強度（FAM）の指数関数的な明確な増加の確認をもって行う。第一に目視で Amplification plot 上に指数関数的な増幅曲線が確認された場合に陽性を疑う。次いでベ－スライン（3 サイクルから 15 サイクル）の ΔRn のノイズ幅の最大値の上側で、安定した指数関数的な増幅曲線上で交わる
Th.Line を選択する。その Th.Line から Ct 値が得られるか否かを解析する。その後トウモロコシ陽性対照用試験およびDAS59132 検出用試験の両方において、38 未満の Ct 値が得られた場合に陽性と判定し、38 未満の Ct 値が得られない場合は陰性と判定する。なお、上記判定により陽性が判定された結果

2.3.1.5 結果の判定
トウモロコシ陽性対照用試験および DAS59132 検出用試験のいずれについても、結果の判定は、Amplification plot 上で指数関数的な増幅曲線と Ct 値の確認および multicomponent 上での対象色素由来の蛍光強度（FAM）の指数関数的な明確な増加の確認をもって行う。第一に目視で Amplification plot 上に指数関数的な増幅曲線が確認された場合に陽性を疑う。次いでベ－スライン（3 サイクルから 15 サイクル）の ΔRn のノイズ幅の最大値の上側で、安定した指数関数的な増幅曲線上で交わる
Th.Line を選択する。その Th.Line から Ct 値が得られるか否かを解析する。その後トウモロコシ陽性対照用試験およびDAS59132 検出用試験の両方において、38 未満の Ct 値が得られた場合に陽性と判定し、38 未満の Ct 値が得られない場合は陰性と判定する。なお、上記判定により陽性が判定された結果

ABI PRISMTM7500 については component を確認する。

について multicomponent を解析し、目視で FAM の蛍光強度の について multicomponent を解析し、目視で FAM の蛍光強度の指数関数的な増加が観察でき、ROX の蛍光強度の明確な下降や 指数関数的な増加が観察でき、ROX の蛍光強度の明確な下降やFAM の蛍光強度の緩やかな上昇がないことを確認する。
FAM の蛍光強度の緩やかな上昇がないことを確認する。
また、どちらか一方の抽出液において、トウモロコシ陽性対また、どちらか一方の抽出液において、トウモロコシ陽性対照用試験で 38 未満の Ct 値が得られない場合には、リアルタイ 照用試験で 38 未満の Ct 値が得られない場合には、リアルタイ
ム PCR を用いた定性 PCR 法以降の操作を行い、それでも 38 未 ム PCR を用いた定性 PCR 法以降の操作を行い、それでも 38 未満の Ct 値が得られない場合には、その抽出液での結果を無効と 満の Ct 値が得られない場合には、その抽出液での結果を無効とし、もう一方の抽出液の結果のみで判定する。２つの DNA 抽出 し、もう一方の抽出液の結果のみで判定する。２つの DNA 抽出液ともにトウモロコシ陽性対照用試験で 38 未満の Ct 値が得ら 液ともにトウモロコシ陽性対照用試験で 38 未満の Ct 値が得られない場合には、改めて 3 回目の DNA 抽出精製を行い、さらに れない場合には、改めて 3 回目の DNA 抽出精製を行い、さらにリアルタイム PCR を用いた定性 PCR 法以降の操作を実施して、 リアルタイム PCR を用いた定性 PCR 法以降の操作を実施して、判定を行う。再抽出（3 点目）の DNA 抽出液を用いた場合でも 判定を行う。再抽出（3 点目）の DNA 抽出液を用いた場合でもトウモロコシ陽性対照用試験で 38 未満の Ct 値が得られない場 トウモロコシ陽性対照用試験で 38 未満の Ct 値が得られない場
合には、本試料からのトウモロコシ（DAS59132）の検出は不可 合には、本試料からのトウモロコシ（DAS59132）の検出は不可能とする。判定例は、2.1.1.3.5 の判定例の表を参照のこと。（た 能とする。判定例は、2.1.1.3.5 の判定例の表を参照のこと。（ただし、確認用プライマーの欄は除く。）
だし、確認用プライマーの欄は除く。）