日大歯学 , Nihon Univ Dent J, 91, 59-64, 2017

顎関節炎によって惹起される咬筋機械痛覚過敏に対する三叉神経節内 TNF-α の関与
伊藤玲

央

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻（指導：祇園白信仁 教授，岩田幸一 教授，篠田雅路 准教授）

要旨：顎関節症（TMD）患者はしばしば , 顎関節（TMJ）や顎顔面領域に痛みを訴えて来院することがよく知られているが，その発症機序の詳細は不明である。そこで，本研究では TMJ 炎症発症時の三叉神経節（TG）におけるtumor necrosis factor-α（TNF-α ）伝達が咬筋機械痛覚過敏へいかに関与するかを明らかにすることを目的とした。
ラット左側 TMJ に炎症起因性物質である complete Freund's adjuvant（CFA）を投与し，咬筋に径の太いデジタルフォースゲージまたは径の細いフォンフライフィラメントにより機械刺激を加え，逃避反射閾値を経日的に測定し，咬筋の機械感受性の変化を解析した。また , TG 内 satellite glial cells（SGCs）の活性化と TNF- α の発現を免疫組織化学染色によって調べた。
その結果，TMJ に炎症が引き起こされたラットでのデジタルフォースゲージによる測定では，逃避反射閾値の有意な低下がみられた。一方，フォンフライフィラメントで測定した結果に有意な差はみられなかった。このことから，TMJ での炎症は咬筋そのものに機械痛覚過敏を引き起こしたことが示された。さらに，TMJ 炎症群の TG内を免疫組織化学的に検索した結果，SGCs の活性化と TNF- α 陽性細胞数が有意に増加していることが明らかになった。
以上の結果は，TMJ 炎症による持続的な咬筋機械痛覚過敏が TG 内 TNF- α シグナル伝達を介した SGCs-TGニューロン間の機能的相互作用によってもたらされることを示唆しており，TNF- α シグナル伝達の阻害が疼痛治療の標的となる可能性が示された。
キーワード：TNF-α ，satellite cells，顎関節，咬筋機械痛覚過敏，三叉神経

緒に進むといわれている 1,5）。

言

また，satellite glial cells（SGCs）は顎顔面の炎症また顎関節症（TMD）患者はしばしば，顎関節（TMJ）や顎は三叉神経損傷によって TG 内で活性化することが知ら顔面領域に痛みを訴えて来院することがよく知られていれ て い る 6,7）。TG 内 の SGCs と ニ ュ ー ロ ン が 互 い にる 1-3）。さらに，多くの TMD 患者では顎運動により顎顔10μm 以下で近接して分布していることから，SGCs と面領域全体にわたって疼痛が発症すること，また咀嚼やニューロンが強固な機能的相互作用を有する可能性があ嚥下のような口腔顔面機能の明らかな低下が現れるといる。SGCs は活性化に伴って細胞体の膨化や突起の短縮われている 2）。このようなことから，TMD により口腔な ど の 形 態 変 化 を 示 す こ と が 知 ら れ て い る 7）。活 性 型

顔面領域に引き起こされた運動機能障害は最終的に摂食

SGCs は glial fibrillary acidic protein（GFAP）免疫陽性障害を誘導し，患者の QOL の低下を招くと考えられてを示すことが知られ 6），また conexin43（Cx43）を介している。TMD に起因する顎顔面痛の適切な治療法を開発

SGCs の活性化が TG 内に広まることが明らかにされていするためには，TMD に関連する咬筋痛の発症メカニズる 8）。これらの報告は，活性型 SGCs がニューロンと同ムを解明することが重要である。

様に様々な分子を放出して TG 内の広い領域に分布する

TMJ の炎症は TMJ だけでなく咬筋にも慢性痛を引きニューロンの活動性に影響を与える可能性を示している。

起こす 2）。TMJ の炎症が長く続くと，TMJ を支配してTumor necrosis factor alpha（TNF- α ）は末梢の炎症いる三叉神経節（TG）細胞の興奮性は著しく増大するこ組織において産生される主要なサイトカインのひとつでとによって感作され，高頻度の活動電位が三叉神経脊髄あり 9,10），炎症部のマクロファージから放出される TNF

路核尾側亜核や上部頸髄などの上位中枢へ伝達される 4）。

は TNF-α ，TNF-β およびリンホトキシンβ の 3 つサブ

さらに，TMJ 領域に多くの免疫細胞が現れ，様々なサイタイプから構成されている 11）。TNF-α は TNF 受容体とトカインや炎症性メディエーターがこれらの免疫細胞か結合し，nuclear factor kappa B（NFκB）の核内移行にら放出される。その結果，一次求心性神経の感作がさら関与している。このことから TNF- α は，細胞免疫シス（受付：平成 29 年 1 月 26 日）〒 101 8310 東京都千代田区神田駿河台 1 8 1359

免疫組織化学染色

テムの重要な調節分子としての機能を有すると考えられ10）。TNF- α は神経節ニューロンからも放出され，グTMJ へ CFA を投与する 4 日前に，咬筋支配 TG 細胞リア細胞に発現する TNF 受容体と結合して神経細胞のを 標 識 す る た め， 生 理 食 塩 水 に て 溶 解 し た FG

興奮性に関与していることも明らかにされている 12）。

（Fluorochrome）30μl を左側咬筋に 27 ゲージの注射針をる

以上のことから著者は，① TMJ に炎症が引き起こさ用いて投与した。FG 投与後 3 日目に，TMJ 炎症群およれると，TG ニューロンの活動性が亢進して神経節内にび対照群のラットを深麻酔して生理食塩水で脱血し，次TNF- α の 放 出 が 促 さ れ る。 さ ら に， ② 放 出 さ れ た

いで 0.1 M PBS（phosphate buﬀered saline）で溶解した

TNF- α は SGCs の存在する TNF 受容体と結合すること

4% PFA（paraformaldehyde）にて灌流固定後，左側 TGによって SGCs の活性化を誘導する。③活性型 SGCs はを取り出した。さらに 20% スクロースに数日間浸漬した咬筋を支配する TG ニューロンの活動性をさらに増加さ後に Tissue Tek（Sakura Finetek）で包埋し，−20℃でせ，これによって咬筋の機械痛覚過敏が誘導されるとい保存した。TG を矢状断で 15μm の厚さに薄切し，組織う仮説を立てた。

切 片 標 本 を 作 成 し た。10 切 片 ご と に 1 切 片 を 取 り，
MAS - GP マイクロスライドグラス（Matsunami）に貼り材料および方法付けて室温で一晩乾燥させた後，GFAP および TNF- α

実験動物の発現を免疫組織化学的に解析した。

本研究は日本大学歯学部動物実験委員会の承認を得

GFAP の 免 疫 染 色 に は，mouse anti-GFAP（承認番号：AP15 D011）,また動物の処置は米国国立予防monoclonal antibody（1：1000；Merck Millipore），衛生研究所および国際疼痛学会のガイドラインに従ってTNF- α の免疫染色には，rabbit anti-TNF- α（1：200；行われた 13）。実験には，体重 200 g 〜 300 g の Sprague-Abcam）を 0.01 M PBS に 0.3% Triton X100 を加えた

Dawley 系雄性ラット（7 - 9 週齢）を用いた。実験動物は4% Normal goat serum（NGS-PBS）で希釈したものを一12 時間の明暗サイクルの環境下，恒温室（23℃）で食物お次抗体として用い，切片をそれぞれの抗体に 4℃にて 3よび水分摂取を制限することなく飼育した。

日間培養した。0.01 M PBS で洗浄後，一次抗体としてTMJ 炎症モデルの作製

rabbit anti-TNF- α を用いたものには Alexa Fluor 568

2.5 m g / k g b u t o r p h a n o l（M e i j i S e i k a P h a r m a），

anti-rabbit IgG（1：200；Thermo Fisher Scientiﬁc）を，0.375 mg/kg medetomidine（Zenoaq）および 2.0 mg/kg

一次抗体として mouse anti-GFAP monoclonal antibody

midazolam（Sandoz）を生理食塩水に溶解した三種混合麻を用いたものに対しては Alexa Fluor 488 anti-mouse

酔薬の腹腔内投与によってラットを深麻酔した。生理食IgG（1：200；Thermo Fisher Scientiﬁc）を用いて室温で塩 水 に 溶 解 し た 50％ complete Freund's adjuvant

2 時 間 培 養 し た。 切 片 を 0.01 M PBS で 洗 浄 後，（CFA）もしくは溶媒（生理食塩水）を頬骨弓後下方の皮膚mounting medium（Thermo Fisher Scientific）で封入

直 下 の 左 側 TMJ に 27 ゲ ー ジ の 注 射 針 を 用 い て 25μl

し，BZ-9000 system（Keyence）にて解析を行った。
各ラットの TG において GFAP あるいは TNF- α を発ゆっくりと注入した（TMJ 炎症群）。対照群は，溶媒を投与したものを用いた。

現した細胞数を算出した（SensiveMeasure，Mitani）。

咬筋機械刺激に対する頭部引っ込め反射閾値（HWT）

FG で標識された全細胞のうち，FG 標識細胞かつ GFAPにより細胞周囲 1/2 以上囲まれた細胞または TNF- α 陽

処置 5 日前からケージの前壁に設置した小孔からラッ8）

トが鼻先を 5 分間突き出していられるように訓練した 。

性細胞の割合を解析した。

その後，TMJ 炎症群ならびに対照群に対して先端が円形

統計解析

で 平 ら な プ ロ ー ブ の デ ジ タ ル フ ォ ー ス ゲ ー ジ（5 mm；

結果を平均値 ±SEM で表した。統計解析は，それぞAttonic）を用いて，左側咬筋へ機械刺激を与え HWT をれの結果に対して Student's -test または，二元配置分測定した。本実験では，ラットがいつでも刺激から逃避散分析を行った後に Bonferroni の多重比較検定を行っできる状況下で HWT の測定を行った。また，左側咬筋た。統計学的解析後， ＜ 0.05 の場合，有意差ありと判部を覆っている皮膚の機械刺激に対する HWT はフォン定した。

フライフィラメント（Touch-Test Sensory Evaluator，結North Coast Medical）を用いて測定した。咬筋と皮膚には 機 械 刺 激 を 5 分 間 隔 で 3 回 与 え，3 回 の 平 均 値 を果咬筋および顔面皮膚の機械刺激に対する HWT

HWT として算出した。すべての行動観察実験は盲検条咬筋の機械刺激には直径 5 mm の先端が円形のプロー件下で行われた。なお，使用したラットに運動障害はみブを用い，皮膚の機械刺激にはフォンフライフィラメンられなかった。

ト を 用 い た 14）。TMJ 炎 症 群 の 咬 筋 機 械 刺 激 に 対 す る
HWT は対照群と比較して 1 日目から 3 日目で有意に低60

顎関節炎による咬筋機械痛覚過敏下した（第 1 図 A）。一方，対照群においては，投与後かTMJ 炎症群と対照群において GFAP 陽性を示す FG 標

ら 7 日目まで咬筋刺激に対する HWT の値に有意な変化

識細胞数を比較すると，TMJ 炎症群の方が対照群に比べは認められなかった（第 1 図 A）。また，咬筋を覆う皮膚有意に多かった（第 3 図 G）。

への機械刺激に対する HWT は，TMJ 炎症群および対照考群どちらも変化はみられなかった（第 1 図 B）。
TMJ 炎症群および対照群の TG における SGCs 活性

察

多くの TMD 患者は TMJ の炎症，円板転移あるいは処置前に FG を咬筋に投与して，咬筋支配 TG 細胞を滑液の減少などが原因で顎関節痛を引き起こし，同時に標識し，咬筋を支配する TG 細胞を同定した。第 2 図 A

咬筋痛を有している 1,2）。本研究では TMJ の炎症によるおよび D に示すように FG を取り込んで青色に標識された多くの FG 標識細胞が TG に認められた。FG 標識細胞の多くは，核が抜けた円形の細胞体を有していた。また同時に，多くの GFAP 陽性細胞を認めたが，これらは網様の形態学的特徴を示し，細胞体を取り囲むように存在していた（第 2 図 B，C，E および F）。さらに，FG 標
識細胞の多くは GFAP 陽性細胞の中に埋め込まれていた（ 第 2 図 C お よ び F）。TMJ 炎 症 群 と 対 照 群 に お け る
GFAP 陽性細胞により囲まれた FG 標識細胞数を比較す
ると，TMJ 炎症群の方が対照群よりも有意に多かった（第 2 図 G）。
TG における TNF-α 発現
第 2 図に示したものと同様，TMJ 炎症群および対照群とも多くの FG 標識細胞が TG 内に認められた（A およびD の矢頭）。一方，TNF- α 陽性細胞は TMJ 炎症群において多数認められたのに対して対照群においてはほとんど検出されなかった（B：TMJ 炎症群，E：対照群）。第3 図 C および F には FG で標識された TNF- α 陽性細胞を示したが，TMJ 炎症群においては多くの FG 標識細胞が TNF- α 陽性を示した（第 3 図 C）。一方，対照群において FG 標識細胞は観察されるものの TNF- α 陽性を示

第１図

す FG 標識細胞はほとんど観察されなかった（第 3 図 F）。

第２図

咬筋および咬筋を覆う顔面皮膚への機械刺激に対する
HWT の経日的変化

三叉神経節における GFAP 陽性細胞に囲まれた FG 標識細胞の組織標本写真と発現数の比較

61

咬筋痛のメカニズムを究明するため，TMJ 炎症モデル

より囲まれた TG 細胞の発現数は対照群と比較して TMJ

ラットを用いて，SGCs 活性下における TNF-α の役割お炎症群で有意に増加していた。これらの結果は，TMJ 炎

よび SGCs との相互関連を調べた。

症が三叉神経の第 2，3 枝を覆う広域で SGCs の活性化を引き起こすことを示している。

本研究では咬筋を顔面皮膚上から刺激するため，先端直径が大きいプローブを用いた。一方，皮膚表面の刺激

TNF- α は，痛覚過敏を持続する一次神経の興奮性増には，その測定に適している先端直径の小さなフォンフ

強に関与する炎症性サイトカインとして知られていライフィラメントを用いた 14）。本研究では，TMJ 炎症る 10）。末梢神経損傷や組織炎症が起こると TNF- α はマ群における咬筋への機械刺激に対する HWT は対照群にイクログリアやマクロファージだけでなく感覚神経節細比較して有意に低下した。しかし，咬筋部表皮への機械胞においても発現が増加し，これらの細胞から放出され刺激に対する HWT では両群間に有意な差は認められなる と い わ れ て い る 9,11,19）。 グ リ ア 細 胞 か ら 放 出 さ れ た

かった。これらの結果は，TMJ 炎症は咬筋を覆う上皮でTNF- α は，感覚神経節細胞で TNF- α 受容体と結合し，はなく咬筋そのものに機械痛覚過敏が引き起こされたこ

これらのニューロンの活性化に関与を亢進する。さらに，とを示している。

培養した感覚神経節細胞においては TNF- α で処理する

TG ニューロンは，三叉神経損傷や口腔顔面の炎症時と transient receptor potential vanilloid 1（TRPV1）発。また，現が増加することが明らかになっている 12）。先行研究に

TG ニューロンの細胞体は三叉神経損傷や口腔顔面の炎

よって，TNF- α の局所投与は投与側に熱および機械痛16）。

覚過敏を引き起こすこと， また TNF- α 中和抗体による高頻度スパイク応答は TG の細胞体で起こり，その結果

TNF- α 阻害は熱痛覚過敏および機械痛覚過敏を軽減す

TG ニューロンはサブスタンス P，カルシトニン遺伝子

る こ と が 報 告 さ れ て い る 12,20,21）。 著 者 は，TG 内 で の関連ペプチド（CGRP），神経成長因子（NGF）あるいはア

TNF- α 発現と GFAP 陽性細胞発現の有意な増加を認め

デノシン三リン酸（ATP）などの分子を放出し，SGCs のた。これらの結果は，TMJ 炎症時に SGCs の活性化がに興奮性が増大することが報告されている6,7,15）症が生じるとスパイク発火頻度の著しい増加を示す

活性化を促す17,18）。活性型 SGCs は GFAP 免疫陽性を示

TG 内の広範囲で引き起こされ，炎症部位以外の非炎症し，TG ニューロンの細胞体周囲を取り囲むように存在部位を支配する広い領域に分布する TG ニューロンにお6）している 。また活性型 SGCs は，いくつかの神経伝達ける TNF- α 発現を増強することを示唆している。また，物質と ATP を放出し，それらの分子は TG ニューロン

TG ニューロンでの TNF-α シグナル伝達は SGCs のさら7）活動性の調節に関与することが知られている 。活性型なる活性化に関与する可能性もあると考えられる。
以上のことから，TNF- α シグナル伝達は，TMD に随

SGCs は舌神経の損傷，三叉神経第 3 枝の切断時にも，6）

第 2 枝領域を越えた TG の広範な領域でみられる 。著

伴して広い範囲で起こる口腔顔面の深部組織に生じた疼

者 は TMJ 炎 症 時 に 三 叉 神 経 第 2 枝 を 覆 う 広 い 領 域 で痛治療の標的となる可能性が示された。

GFAP 陽性細胞を確認した。さらに，GFAP 陽性細胞に第３図

三叉神経節における TNF-α 陽性を示した FG 標識細胞の組織標本写真と発現数の比較

62

顎関節炎による咬筋機械痛覚過敏結文論1）Hawkins JL, Durham PL（2016）Prolonged jaw opening
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TMJ 炎症モデルラットにおいて，咬筋および顔面皮膚への機械刺激に対する HWT，TG における SGCs 活性ならびに TNF- α 発現について検討し，以下の結論を得，
第 4 図にまとめた。
1.

TMJ 炎症群では対照群と比較して 1 日目から 3 日目まで咬筋への機械刺激に対する HWT は有意に低下した。

2.

TMJ 炎症群および対照群とも顔面皮膚への機械刺激に対する HWT に変化はみられなかった。

3.

3 日目において，TMJ 炎症群では対照群と比較してGFAP 陽性 TG 細胞数が有意に多かった。

4.

3 日目において，TMJ 炎症群では対照群と比較してTNF-α 陽性 TG 細胞数が有意に多かった。
以 上 か ら，TG で の TNF- α を 介 し た SGCs と TGニューロン間の機能的相互作用が TMJ 炎症に関連した咬筋痛覚過敏に極めて重要な役割を果たしていることが示唆された。
稿を終えるあたりに，本研究遂行に格別たるご指導ご鞭撻を賜りました日本大学歯学部歯科補綴学第Ⅰ講座の祇園白信仁教授に謹んで心より感謝申し上げます。
また，本研究を通じ多大なるご協力とご助言を賜りました，生理学講座の岩田幸一教授，篠田雅路准教授をはじめ，生理学講座，歯科補綴学第Ⅰ講座の皆様に深く感謝いたします。
なお，本研究の一部は，平成 24 - 26 年度日本大学大学院歯学研究科研究費（学生分）によってなされました。
本研究に関して，利益相反はありません。

第４図献

本研究結果のまとめ

63

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64