日本大学歯学部紀要 32，43‑48，2004

ビスフェノール A が次世代の性比に及ぼす影響について
酒井秀嗣

佐藤恵

村田浩一

塩谷正勝

杉森文夫

The influence of Bisphenol A on the sex ratioof the following generation of Japanese quail
Hidetsugu Sakai , M egumi Sato , Koichi Murata , Masakatsu Shioya and Fumio Sugimori

Abstract
The research at the wild‑duck netting place of the Imperial Household Agency conductedsince 1971 revealed the significant and continuous decrease in the ratio of male pintails.The
present author hypothesized that this might be caused by the pollution with endocrine
disrupting chemicals the pintailʼs breeding area in Syberia. He administered Bisphenol A(BPA)to female Japanese quail and examined the sex ratio oftheir offsprings,and found thatthe administration of BPA does not influence the ratio.Another observation among the BPA
administered quail was that their egg‑laying activities and fertilization rates showed asignificant decrease together with the increase of ricket‑like cases. The first two facts areascribable to the reaction to BPA similar to that to estrogen ; the last is yet to be ascertained
if it is directly associated with BPA administration.
Key words: Bisphenol A, egg‑laying activity, fertilization rate, pintail, ricket緒

131,931個体が記載された。これらのデータに言よると，1970年代には放鳥個体に占めるオスの埼玉県越谷市と千葉県市川市にある宮内庁鴨割合が 50％程度であったものが 1980年代には場では，捕獲した個体の足環の番号を記録する

40％代に低下し，1990年代には 30％代まで低下とともに，足環のない個体には標識調査用の金した。回帰分析の結果，この現象は有意である属製足環を装着して放鳥している。足環を装着ことが判明している。

する際には性別と幼鳥か成鳥かの区別を記録しオスの比率が減少し続けている原因の１つとており，山階鳥類研究所ではこれらの記録をして，オナガガモの主な繁殖地であるシベリアデータベース化して動向を解析している。鴨場が外因性内分泌撹乱物質（環境ホルモン）の汚で一番多く捕獲されたのはオナガガモ（Anas染地域であることが挙げられたacuta）で，1971年 11月から 2002年２月までに

境 ホ ル モ ン の １ つ で あ る ビ ス フェノール A

日本大学歯学部生物学教室
日本大学歯学部総合歯学研究所機能形態部門〒 101‑8310 東京都千代田区神田駿河台１‑８‑13
日本大学生物資源科学部動物資源科学教室〒 252‑8510 神奈川県藤沢市亀井野 1866

Department of Biology, Nihon University School ofDentistry。そこで，環Division of Functional M orphology, Dental ResearchCenter, Nihon University School of Dentistry
1‑8‑13 Kanda‑Surugadai, Chiyoda‑ku,Tokyo 101‑8310,Japan
Department of Animal Resource Sicence, College ofBioresource Sciences, Nihon University1866 Kameino, Fujisawa City, Kanagawa 252‑8510, Japan
Yamashina Institute for Ornithology
115 Takanoyama, Abiko City, Chiba 270‑1145, Japan

山階鳥類研究所〒 270‑1145 千葉県我孫子市高野山 115(受理：2004年９月 28日）

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日本大学歯学部紀要 32，43‑48，2004

４. 性 判 別（2,2‑ビス（４‑ヒドロキシフェニル）プロパン；BPA）を ニ ホ ン ウ ズ ラ（Coturnix coturnix

BPA の投与期間中に産卵された卵についてjaponica）に投与して，出生個体に性比の偏りがは，孵化後の雛の雌雄判定を行った。雛は孵化生じるか否かを調べることにした。

日またその翌日に雛は屠殺後解剖し，生殖腺の目視によって性別を判定した。また，解剖時に材料と方法
１. 動

心臓から採血して DNA を抽出し，PCR 法によって性染色体上の遺伝子を増幅させて性判別物

ブラウン系のニホンウズラを６週齢で購入しを行った。採取した血液 0.1ml を FTA マイク（東海有機，豊橋），オス１個体，メス４個体をロカード（Whatman）に滴下し，乾燥させて同一ケージ（14.2×68×32cm）に収容し，温度いったん保存した。この濾紙の血液部分をハリ22±２°
C，湿度 40±５％，照明時間 14L/10D

スマイクロパンチで打ち抜き，FTA 精製試薬で飼育した。餌はウズラマッシュ（埼玉実験動を用いて抽出を行った。PCR は Itoh et al. の物供給所，杉戸）を１日，１個体あたり 20g 与方法え，水とともに自由摂取させた。購入後，毎日（Amersham Pharmacia Biotech, USA）とプの産卵数を記録し，どのケージでも一定の産卵

ラ イ マー2550F（5ʼ‑GTTACTGATTCGT-に 準 じ，Ready‑To‑Go PCR Beadsが記録されるようになった８週目から実験を開）およびプライマー2718R（5ʼCTACGAGA‑3ʼ

始した。

‑ATTGAAATGATCCAGTGCTTG‑3ʼ）を用

２. BPA 投与いて行った。

飼育ケージ３つを１群とし，対照群（C 群），結高用量群（H 群），低容量群（L 群）の３群を構成した。H 群には BPA（和光純薬，大阪）をオ

１. 産果

卵

リーブ油に 0.5mg/ml に溶かした溶液，L 群に採卵した８週間で，C 群では 367，H 群ではは 0.05mg/ml の BPA 溶液，C 群にはオリー215個，L 群では 303個の卵が得られた。週ごと

ブ油のみをそれぞれ投与した。投与はメスにのの産卵数を分散分析で検定すると群間に有意なみ隔日に８週から 12週までの４週間に渡って差（p＜0.001）が認められ，C 群に対して H 群行い，腹部の皮下に 0.1ml ずつ注射した。
表１３. 卵の採取と孵卵採卵は BPA 投与開始の８週から始め，投与終了後４週まで８週間に渡って行った。卵は日各実験群での産卵数，異常卵数，受精卵数，孵化個体数および異常個体数（括弧内は頻度：％)
C 群

付とケージ番号を記録して 14°
C で保存し，１週間分をまとめて孵卵器に入卵した。孵卵温度は38°
C に保ち，１日に 20回の転卵を自動的に行い，入卵５日目に検卵を行って，胚の発生が確認できたものを受精卵，認められないものを未受精卵とした。また，軟卵，破卵等は異常卵と

H 群

L 群

産卵数
異常卵数
受精卵数

367
215
14( 3.8) 13( 6.0)339(96.0) 171(87.7)

303
22( 7.3)
248(88.3)

孵化個体数
異常個体数

124(35.1) 104(51.5)7( 5.6) 28(26.9)

121(43.1)
13(10.7)

ａ：括弧内は産卵数に対する頻度して，受精卵で孵化しなかった卵も死籠もりと

ｂ：括弧内は異常卵を除いた産卵数に対する頻度
ｃ：括弧内は孵化個体数に対する頻度：p＜0.05， ：p＜0.001

してそれぞれ記録した。

44

ビスフェノール A が次世代の性比に及ぼす影響について（p＜0.001）は有意に低いことが判明した。一１）。

方，L 群の産卵数は減少傾向にあったが，有意差２. 性 判 別は認められなかった。また，軟卵や破卵などの孵化した個体の性判別を，剖検と PCR 法に異常卵の発生率は，C 群 3.8％，H 群 6.0％，Lよる DNA 判定の２つで試みた（図１）。その結群 7.3％で投与群が高くなる傾向が見られた

果，両者で判断の異なった個体が，各群で７〜８が，統計的な差は認められなかった（表１）。

個体生じた。しかし，いずれの結果においても，孵卵５日目における検卵の結果，受精率は群C 群と H 群または L 群との間に違いは認めら間で差が認められた（p＜0.05）。毎週の受精率れなかった（表２）。また，発生が途中で停止しの平は C 群 96.0％に対し，H 群は 84.7％，Cた死籠もりについて，血液を採取して DNA 判群は 88.3％と両者とも有意（p＜0.05）に低下し定を試みた。この結果，各群とも 80％以上の個た。一方孵化率の平は，C 群 35.1％，H 群体で性判別を行うことができた（表２）。これら

51.5％，L 43.1％と投与群の方が高い傾向が見の値を孵化個体の測定値に合算した場合も，群られたが，検定では差は認められなかった。
（表間における性比の違いは認められなかった。
３. 剖

検実験終了後，卵巣，輸卵管，甲状腺，副腎，脾臓の重量を測定した。輸卵管中に卵がある場合はそれを除いた重量を測定した。分散分析の結果，いずれの器官も群間の違いは認められなかった（表３）。また，実験期間中に２週間毎に採血を行い，RIA によってエストラジオール

図１

DNA による性判別
オス（♂）とメス（♀）の血液から抽出し，増幅した DNA の電気泳動結果。609bp に Z 染色体，433
bp に W 染色由来のバンドが見られる。M はマー
カー，C は蒸留水を用いたネガティブコントロー‑17βの濃度を測定したが，排卵に関係すると思われる高い値が多数混じったため，検定を行わなかった。
４. 異常個体ル。

孵化した個体の中に，骨盤のところで脚が開

表２各群の孵化個体および死籠もり個体の，剖検と DNA による雌雄の個体数。括弧内は百分率

オ
C

群

孵化個体

剖ス

43(64.2)

検
メ

ス

オ

24(35.8)

死籠もり
合計
H

群

孵化個体

31(57.4)23(42.6)

死籠もり
合計
L

群

孵化個体

37(59.7)25(40.3)

死籠もり
合計

45

ス

D N A
メ ス

35(52.2)

32(47.8)40(39.8)75(47.8)42(43.0)74(47.1)

24(44.4)30(55.6)9(37.0)33(40.2)

15(46.3)
45(54.9)30(48.4)

32(51.6)23(36.8)53(43.4)24(44.3)
56(45.9)

合不計

明
67

8(17.2)8( 5.1)90
157
54

4(16.7)4( 4.9)33
87
62

13(18.9)
13(10.7)60
122日本大学歯学部紀要 32，43‑48，2004

表３

実験個体の解剖結果

C 群

H 群

L 群

体重(g)
卵巣重量(g)
輸卵管長(cm)
輸卵管重量(g)137.1 (6.1 )130.4 ( 4.5 )142.0 (3.7 )5.64(0.83)
20.2 (2.2 )8.04(0.69)

5.78( 1.11)
22.9 ( 1.2 )7.45( 0.47)

5.12(0.85)
23.7 (2.43)
8.22(0.52)

脾臓重量(mg)
甲状腺重量(mg)
副腎重量(mg)93.38(9.14)
12.22(1.75)
10.66(1.58)

76.11(11.81)
9.90( 0.77)
11.32( 1.80)

67.60(7.94)
11.66(1.28)
13.18(0.72)

平値（標準誤差）

BPA 投与の結果，産卵率および受精率の低下が認められた。また，統計的に有意ではなかったが，軟卵や破卵等の異常卵は投与量の増加に従って増加する傾向が認められた。これらの現象は，すでに BPA によってもたらされる作用として知られているもので ，それらの結果と矛盾しない。また，投与開始後１週間の H 群および L 群の受精率が C 群よりも高く，２週目以図２

くる病様の異常個体後に低下していることは，
BPA との関連を強く示唆するものである。

いた状態になり，立てない個体が出現した（図問題の性比は，剖検と DNA との間で結果が２）。出現率は，C 群 5.6％，H 群 26.9％，L 群異なったものの，BPA 投与の影響が認められな10.7％で，C 群に対して H 群（p＜0.001）L 群いことでは両者一致した。この２つの方法で性（p＜0.05）とも有意に高いことが判明した（表別の判定を行ったのは，いわゆる環境ホルモン１）。

によってオスがメス化する現象を懸念したためである察。この場合，性染色体はオスを示す

ZZ の構成になるが，生殖器はメス型になる。しいわゆる環境ホルモンの作用によってオナガかし，判定が一致しなかった個体はいずれも，ガモ個体群に占めるオスの比率が低下した，とDNA では ZW のメス型を示しながら，生殖器いう仮説を実験的に証明するため，メスに環境官の目視ではオス型と判断されたものである。

ホルモンの１つである BPA を４週間投与しまた，この不一致は，性分化の発生が期待された。これは，鳥類が ZW の性染色体を持ち，性ない C 群で最も多く生じた。これらの事実か別が卵細胞によって決定されるからである。卵ら，両者の不一致は性分化の異常ではなく，非母細胞から減数分裂によって卵細胞ができる

常に未発達な精巣の見落としによる判定の間違際，１つの卵細胞を除いて他の細胞は退化していではないかと推察される。よって，特定の性極体化する。この極体化が特異的に起きれば，染色体を持つ卵細胞に偏って排卵されるという特定の性染色体だけを持つ卵だけが排卵される可能性も否定された。また，死籠もりの DNA 判ことになる。

別の結果から，特定の性の胚だけが発生を停止
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ビスフェノール A が次世代の性比に及ぼす影響についてするという事実も認められなかった。

文

本研究では脚に異常のある雛が，BPA 投与群

１) 山階鳥類研究所（1998）渡り鳥アトラス：鳥類に有意に多く出現した。この症状は，ビタミン回収記録解析報告書（非スズメ目編 1961‑1995

D の欠乏によって引き起こされるくる病によく年），山階鳥研，我孫子

似ている 。カルシウム代謝が関係すると推察されることから，BPA の卵用との関連が

献２) 杉森文夫，尾崎清明，米田重玄，馬場孝雄，吉形成を阻害する作安京子，三田村あまね，川原田史治，前田琢，

え ら れ る。H 群 の ６ 個 体 が宮内庁埼玉鴨場，宮内庁新浜鴨場（2000）宮内

BPA 投与終了後２週目で産卵されたのを除く

庁鴨場で放鳥されたオナガガモの雌雄変動．日と，他は全て BPA を投与した４週間の間に産卵されている。BPA は体内に蓄積されにくく，

本鳥学会 2000年度大会講演要旨，p 42３) Eroschenko Vp, Palmiter RD (19 80)

比較的速く排出されるといわれていることと良Esteogenicty of Kepone In Birds and Mam-

く一致している。投与終了から４週間後に，投mals, In Estrogens In the Environment (ed.

与個体の器官重量を比較しても差が認められな

McLachlan J) Elsevier North Holland, Inc.
New York, pp305‑326.

かった。BPS のエストロゲン様作用によって生

４) FryDM, Toone CK, Speich SM, Peard RJ

殖器官等に差が見られることを期待したが，実(1987)Sex ratio skew and breeding patterns

際に差が生じたとしても同じ理由によって投与of gulls. Domographic and toxicologyicalconsiderations. Stud Avian Biol 10, 26‑43

終了後に解消したものと思われる。
以上のように，BPA 投与に関しては性比への５) Kubiak TJ, Harris HJ, Smith LM, Schwartz

影響は認められず，産卵率，受精率，異常卵等

TR,Starling DL,Trick JA,Sileo L,Dochertyの既に知られている現象が認められた。
しかし，DE, Erdman TC (1989) Microcont aminants

本研究における産卵率は 50％程度で，ニホンウズラの標準的な産卵率 の 70％に比べるかな

and reproductive impairment of the Forsterʼs tern on Green Bay, Lake Michigan‑1983.

り低い。また，孵化率も 50％未満であったこと

Arch Environ Contam Toxicol 18, 706‑727
６) Sonnenschein C, Soto AM (1998)An updatedから，飼育環境や孵卵条件の再確認が必要であ

review of environmental estrogen and an-る。これら，産卵率，孵化率の改善がなされた場合においても本研究の結果が再現されるの

drogen mimics and antagonists. J Steroid
Biochem Mol Biol 65, 143‑150

か，特にくる病様個体の発生が BPA 投与と因

７) Anna‑Karin F, Hans E (1999) A simple and果関係のある事象なのかについて十分な検証がuniversal method for molecular sexing ofnon‑ratite birds. J Avian Biol 30, 116‑121

必要とえる。

謝８) Itoh Y, Suzuki A, Ogawa I, Munechika K,

辞Mizuno S (2001)Identification of the sex of a

本研究は文部科学省平成 14年度科学研究費

wide range of Carinatae birds by PCR using

補助金（特定奨励費），平成 14年度日本大学学

primer sets selected from chicken EE0.6 andits related sequences. J Hered 92, 315‑321

術研究助成金奨励研究，平成 14年および平成

９) Ewins PJ, Postupalsky S, Hughes KD,15年日本大学歯学部佐藤研究費の助成を受け

W eseloh DVた。瀬戸香織，八木美千代両氏の協力に感謝す(19 9 9 ) Organochlorine

contaminant residues and shell thickness ofeggs from known‑age female ospreys (Pan-る。

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日本大学歯学部紀要 32，43‑48，2004

dion haliaetus)in M ichigan during the 1980s.
Environ Pollut 104, 295‑304

mental oestrogens are also anti‑androgens.J
Endocrinol 158, 327‑339

10) Elbrecht A, Smith RC (1992) Aromatase em-12) 田先威和夫（監訳）(1983）家禽栄養学，養賢堂，zyme activity and sex determination inchickens. Science 255, 467‑47013) 田嶋嘉雄（編）（1971）実験動物学各論，朝倉書東京店，東京11) Sohoni P,Sumpter JP (1998)Several environ-48