日本大学歯学部紀要 34，7‑14，2006

チタンイオンが骨芽細胞株（Saos‑２）の生細胞およびサイトカイン産生に及ぼす影響

横瀬勝美

桑田文幸

Effects of titanium ions on cell viability and cytokine production
by the human osteosarcoma cell line, Saos‑2

Katsumi Yokoseand Fumiyuki Kuwata
Abstract

The present study investigated the effects of titanium ions on cell viability and interleukin
1α (IL‑1α) and IL‑6 production by the human osteosarcoma cell line, Saos‑2. Cells weremaintained in DM EM supplemented with 10% FBS and antibiotics.After culturing cells for24h, 0.1mM of TiC was added. After incubation for 1, 2, 3, 4, or 5 days, cell viability wasassessed by colorimetric assay using a LDH cytotoxic test.In addition,the production of IL‑1αand IL‑6 by these cells was examined using specific ELISA kits.The addition of 0.1mM
titanium ions did not alter cell viability during 2 days of incubation. However, 0.1mM
titanium ions induced cell death after incubation for more than 4 days. The addition oftitanium ions had little effect on IL‑1α and IL‑6 production by these cells. These results
indicate that the addition of 0.1mM titanium ions induces osteosarcoma cell death rather thancytokine production.
Keywords: cell viability,IL‑1αproduction,IL‑6 production,osteosarcoma cell,titanium ion

緒と言えられている。そのため歯科治療で使用されている金属材料は口腔内において様々な要因

歯科治療において歯が喪失した場合，従来でが複雑に絡み合い極めて過酷な環境にあると言は歯科補綴修復物が主流であったが，近年インえる。口腔内にはそれ以外にも，各種の溶出要プラント医療が普及し様々な金属材料や骨補塡因が共存しており，歯肉から浸出する体液，食材としての生体材料の開発が進んでいる。それ

べかすによる電解質の存在，細菌が産出する酸ら金属材料は口腔内で唾液や飲食物などが電解や硫化水素，温度や酸素の濃淡などの変化，咬質と作用し，pH 変化や各種イオン等によってむ力が働く部分の金属に起こる応力腐食や咬耗腐食性変化を生じ，長時間のうちに溶出されるなどの要因がある

日本大学歯学部化学
日本大学歯学部総合歯学研究所機能形態部門

Department of Chemistry, Nihon University School ofDentistry
Division of Functional M orphology, Dental ResearchCenter, Nihon University School of Dentistry
1‑8‑13 Kanda‑Surugadai, Chiyoda‑ku, Tokyo 101‑8310, Japan〒 101‑8310 東京都千代田区神田駿河台１‑８‑13(受理：2006年９月 29日）

7。このような口腔内におけ日本大学歯学部紀要 34，7‑14，2006

る作用を受け，歯科用インプラント金属材料は，Eagle medium（DMEM ，旭テクノグラス）に，長期間埋入され生体との接触は密接であり，局10％ウシ胎児血清（FBS，旭テクノグラス），50

所的為害作用に加え全身的為害作用までに至っ

U/ml ペニシリンおよび 50μg/ml ストレプトているとマイシン（Sigma）を加えた培地を用い，37°C，えられる。

５％CO の湿潤条件下で培養を行った。

近年，歯科用イオンプラント材料として優れ２. 細胞障害率（経時的変化）た実績を有しているチタンは，有床義歯，架橋義歯や欠損補綴材料としても幅広く使用されて生細胞へのチタンイオンによる経時的変化のいるが，そのような環境下で使用されている歯影響を調べるために，24穴プレートに Saos‑２

科用金属の中でも特に，生体親和性に優れてい細胞１×10 個/cm を播種し，500μl の DMEMる金属の一つとしてよく知られている。
しかし，（10％FBS および抗生物質を含有）で培養を開そのインプラント材によるアレルギーを訴える始した。Saos‑２細胞播種後，24時間後にチタン患者が近年増え，臨床報告も増加している。

イオン（Ti ）を含む DMEM（10％FBS およびイオンプラントに使用されているチタンはフィ

抗 生 物 質 を 含 有）と チ タ ン イ オ ン 無 添 加 のクスチャーとして歯槽骨に埋め込まれ長期間埋DMEM（10％FBS および抗生物質を含有）に交入されているため，口腔軟組織や硬組織に影響換した。生細胞へのチタンイオン経時的変化のを与えているとえられる。

影響を調べるためにその作用時間をそれぞれ

著者らは，先に歯科用金属の金属イオンが口１，２，３，４，および５日間として培養を行っ腔軟組織，特に上皮組織におよぼす影響を解明た。なお，培地中のチタンイオン（Ti ）は終末する第一ステップとして，歯科補綴物の成分で濃度 0.1mM になるように添加した。チタンイあるクロムおよびニッケル，歯科修復物の合金オンを作用させた後，無血清の DMEM と交換中に存在する亜鉛について，ヒト口腔由来上皮し 24時間培養後，上清を回収する。回収した上細胞株（Ca 9‑22）の生細胞数および DNA 合成

清は 3000rpm，５分遠心し，LDH‑Cytotoxic能におよぼす影響について報告した

Test（和光純薬）を用い細胞障害率を比色測定。また，チタンの影響を調べるために他の金属と同様チした。また，実験は２連で行い，結果は平タンイオン高濃度，短時間における生細胞へので示した。金属イオン経時変化を比較するため，経時的変化を調べた

金属イオン無添加の場合をコントロールとして。本研究では歯科用イオンプラント材に多く使用されているチタンに比較した。

ついてヒト骨肉腫由来の株化骨芽細胞（Saos３. IL‑１αおよび IL‑６産生

値‑２細胞）への経時的変化を低濃度，長時間の影材料および方法の２. と同様に，24穴プレー響を調べ，さらに，インターロイキン‑１α（ILトに Saos‑２細胞を播種後，24時間後，チタン‑１α）およびインターロイキン‑６(IL‑６) のイオン（Ti ）の濃度，0.1mM を含む DMEM産生に及ぼす影響も検討した。

および無添加の DMEM に交換した。その作用時間をそれぞれ１，２，３，４，および５日間材料および方法として培養を行った。その後，無血清の DMEMと交換し，24時間後それぞれの培養上清を回収

１. 細胞培養
実験には骨芽細胞として理化学研究所細胞開後，IL‑１α定量用 ELISA キット（BioSource）

発 銀 行 か ら 購 入 し た Saos‑２ 細 胞 を 使 用 いおよび IL‑６定量用 ELISA キット（BioSour-たce）を用いて上清中のサイトカイン量を定量し。Saos‑２細胞は，Dullbeccoʼ
s modified8

骨芽細胞とチタンイオン

１日，２日，３日，４日，５日）ごとの細胞状た。

成態を図２〜７に示した。３日間まではチタンの績

１. 細胞障害率（経時変化）
Saos‑２細胞にチタンイオン（Ti ）0.1mM濃度を添加した影響を第１図（経時的変化（細胞障害率））に示した。
第１図は，チタンイオン（Ti ）濃度 0.1mM ，作用時間１日，２日，３日，４日および５日間培養を行った。チタンイオン添加により細胞障害率は，１日では 2.1％，２日では 4.5％，３日では 9.5％，４日では 22.8％，５日では 47.2％であった。細胞障害率は作用時間に依存して３第３図日まで僅かずつ増加していき，４日後では急激チタンイオン 0.1mM １日間作用させた
ときの細胞形態に増加した。チタン作用時間（コントロール，

第１図 Saos‑２細胞の細胞障害率に及ぼすチタンイオンの影響

第４図

第２図 Saos‑２細胞 control形態（チタンイオン作用時間，０分)

第５図

チタンイオン 0.1mM ２日間作用させた
ときの細胞形態

9チタンイオン 0.1mM ３日間作用させた
ときの細胞形態

日本大学歯学部紀要 34，7‑14，2006

第６図

第７図

チタンイオン 0.1mM ４日間作用させた
ときの細胞形態

第８図

チタンイオン 0.1mM ７日間作用させた
ときの細胞形態

第９図 Saos‑２細胞の IL‑１αの産生に及ぼすチタンイオンの影響

チタンイオン 0.1mM ５日間作用させた
ときの細胞形態

第１表 Saos‑２細胞の IL‑１αの産生に及ぼすチタンイオンの影響影響が少ないが４日間作以後では細胞の萎縮が見られ，５日間ではその萎縮が広がって行き細IL‑１α量（pg/ml)

胞死が起こり，一週間後も継続的に観察したが作用時間細胞数の減少が明白なため細胞障害率は表示し

Cont.
１day
２day
３day
４dayていない（細胞形態，図２〜８）。
２. IL‑１α産生
コンフルエントに達した後の Saos‑２細胞のIL‑１α産生におよぼすチタンイオン（Ti ）５day

0.1mM 濃度の経時的変化の影響を調べた結果

測定値

平値

＜0.70＜0.70＜0.70＜0.70＜0.70
＜0.70

＜0.70
0.78
1.24＜0.70
0.72
1.11

＜0.70
0.75
1.17

1.32

1.14

1.23を第１表，第９図に示した。
Saos‑２細胞の IL‑１α産生におよぼすチタ下，１日間作用させ培養した場合で 0.70pg/ml

ンイオン（Ti ）濃度の経時的変化の影響を調べ

以下，２日間で 0.70pg/ml 以下，３日間で 0.75

た結果，IL‑１α産生量はチタンイオン（Ti ）g/ml，４日間で 1.17pg/ml，５日間で 1.23pg/

濃度 0.1mM コントロールでは 0.70pg/ml 以ml になった。１日，２日間までは産生量は測定
10骨芽細胞とチタンイオン

範囲以下あるがそれ以後は徐々に増加した。

察

３. IL‑６産生
コンフルエントに達した後の Saos‑２細胞のチタンとその化合物は腐食性に優れているたIL‑６産生におよぼすチタンイオン（Ti ）濃度

めさまざまな医療材料に使用されており，またの経時的変化の影響を調べた結果を第２表，第皮膚病の治療薬，化粧品，食品添加物としも使10図に示した。Saos‑２細胞の IL‑６産生にお用されているため，安全性についての試験がいよぼすチタンイオン（Ti ）濃度の経時的変化の

くつかなされている。そして毒性は低いとの報影響を調べた結果，IL‑６産生量はチタンイオ告が数多く成されている。しかし，発癌性にン（Ti ）濃度 0.1mM コントロールでは 3.76

関する経気道的暴露実験では，ラットに二酸化pg/ml，１日間作用させ培養した場合で 4.30

チタン（TiO ）を吸入，暴露した結果，肺癌がpg/ml，２日間で 4.44pg/ml，３ 日 間 で 4.99検出されたという報告もされている 。さらにpg/ml，４日間で 5.67pg/ml，５ 日 間 で 6.62

四塩化チタンについても同様な結果が報告されpg/ml に なった。時 間 と 共 に IL‑６ 産 生 量 はている 。微量金属は，生体に必須な金属であっ徐々に増加がみられた。てもそれ自信や環境化学物質との共存下で発癌性を示し，活性酸素を生成させ DNA を損傷させることにより発癌に関する危険性があるとえられる。その反面微量金属の発癌における防御的作用として，細胞の恒常性を維持すると同第２表 Saos‑２細胞の IL‑６産生に及ぼすチタンイオンの影響

時に遺伝子の損傷を修復することにより癌化の抑制に関与している。微量金属が，癌化またはIL‑６量（pg/ml)
作用時間
Cont.
１day
２day
３day
４day
５day

測定値

平

癌抑制のどちらに作用するかは，その種類，量値

3.76
4.44

3.77
4.17

3.76
4.30

4.44
4.99
6.21
7.57

4.44
4.99
5.12
5.67

4.44
4.99
5.67
6.62

および環境化学物質との共存などにより大きく異なるため，DNA 損傷を検出することにより微量金属による発癌の危険性の評価を簡易に行うことは，癌の初期予防に貢献するだけでなく，薬理作用を検証するうえでも非常に重要なことであるといえる。
歯科治療には様々な歯科用金属が使用されているが，それらの多くは合金として歯科用修復物，補綴物，矯正用材料等に使われている。歯科治療の技術の発展にともない歯科用金属は歯の硬組織への局所的修復だけでなく，歯科インプラントに代表されるような深部組織内に長期埋植する生体材料が使用されるようになった。
歯科においてチタンは歯科用インプラント材として優れた実績を有し，有床義歯，架橋義歯など欠損補綴材料として幅広く使用されている

第 10図 Saos‑２細胞の IL‑６産生に及ぼすチタンイオンの影響が，近年チタンインプラント材が原因で発症し11日本大学歯学部紀要 34，7‑14，2006たと思われる金属アレルギーの症例報告が増加

細胞から遊離した LDH（乳酸脱水素酵素）活性しているのも事実である。チタンインプラントを測定することができ，生理活性物質による細を２本植立した際，１年半後同部頰粘膜に白色胞障害や細胞性免疫による細胞障害，補体依存病変（扁平苔癬）が見られ，組織像からも表皮性細胞障害，抗体依存性細胞障害の他，細胞の直下に細胞浸潤が見られ症状がした患者や，顎生存率にも利用できることからこの方法を用い骨の再建にチタンプレートを使用し痛みを訴えた。コントロールはチタン作用をしないで無血た患者の組織内には慢性肉芽腫性炎が観察さ清培地として培養を行い，上清を回収するまでれ，インプラント周囲特に血管周囲に多くのリの 24時間をさらに無血清培地を交換してある。

ンパ球とマクロファージの浸潤があり，この症

チタンを作用させた細胞はチタン作用後同様に状のある患者の組織内には金属片沈着を見るこ

無血清飢餓状態 24時間行い，上清を回収し測定とができるなど，生体適合性が優れているチタを行なった。
LDH 活性測定において，コントロールの場

ンでも金属アレルギーを引き起こす患者が増。口腔内の様々合 1.98％の障害率を示し，その後チタン作用時な要因が総補的に起きている可能性があるが，間の細胞障害率はコントロール（作用時間０分）

そのメカニズムの一つとして，金属の一部がイと比較して，１日間，及び２日間まで大きな変オン化し，これが表皮や粘膜上皮のケラチンな化はなく，３日間以降は細胞障害率が増加した。

どのタンパクと結合することによって異質のタ細胞形態の図２〜８からわかるように４日間以ンパク（抗原）となり，マクロファージなどに上は細胞衰退が起こっているようで，プレート取り込まれ，様々な免疫反応が起こり遅延型ア内に存在する細胞数が減少しているため，上清

レ ル ギーと し て 発 症 す る と 報 告 さ れ て い中の測定である細胞障害率が減少したとるれる。これはチタンを長時間作用したために細え，症例報告がされている。このようにチタンは生体親和性に優れえらているとされてきたが，チタンが生体内で様々胞死の誘発起こった可能性がな作用をしているとンの症例報告などから解るように，チタンインえられる。

えられる。チタ

本研究では歯科用金属の中で，近年歯科用イプラント装着後数年してアレルギー症状が現れンプラント材として使用されているチタンにつるがその多くが遅延型であり，チタン作用時間いて検討を行った。前報では口腔由来上皮を長期にして観察したが，低濃度では３日間以細胞株（Ca 9‑22）を使用しその影響を検討した

降では細胞障害率が徐々に増加し，細胞萎縮がが，本研究ではチタンの影響が遅延型であると始まる傾向が予期される。４日間になると細胞いう症例報告もあり，歯科インプラントに形態に作用し始め，５日間以上ではプレート内代表されるような深部組織内に長期埋植する生の生細胞数が減少し細胞死が誘発されている。

体材料でもあるため，ヒト骨肉腫由来の株化骨サイトカイン産生に及ぼすチタンイオンの経芽細胞（Saos‑２）における生細胞数への経時変時的変化にあわせて検討した。インターロイキ化およびサイトカイン産生に及ぼす影響ついてン‑１α（IL‑１α）は単核球が産生する歯骨細胞検討を行った。

刺激因子の主成分であることが明らかにされて生細胞数に及ぼす影響を生細胞障害率の測定

以来，IL‑１αの骨代謝・骨疾患との関連が検討に は LDH 測 定 法 を 用 い た。本 測 定 の LDH‑

されて，最も強力な骨吸収促進因子の１つであCytotoxic Test は細胞毒性を簡便に測定できる。IL‑１αはきわめて低濃度で，ヒト骨髄細胞るばかりでなく，細胞が細胞膜に障害を受けてより歯骨細胞を誘導する作用をもち，更に骨芽12

骨芽細胞とチタンイオン細胞を介して間接的に歯骨細胞の活性化を促進

６は破骨細胞性骨吸収の促進作用をもつため，する。一方，IL‑１αはヒト骨芽細胞の DNA 合骨吸収サイトカインともよばれていることか成促進作用を示し，コラーゲン合成に関してはら，本研究により Saos‑２細胞がチタンイオン少量で促進，大量で抑制作用を示す。このようにより産生された IL‑１α，IL‑６が破骨細胞にな作用があるため，チタンイオンが Saos‑２細影響を及ぼす可能性が胞の IL‑１αの産生を促進するかどうか調べ

胞への影響はさらに詳細に検討する予定であた。その結果，IL‑１α産生量はチタンイオンる。

（Ti ）濃 度 0.1mM コ ン ト ロール で は 0.70

謝pg/ml 以下，１日間作用させ培養した場合で0.70pg/ml 以下，２日間で 0.70pg/ml 以下，３

辞本研究の一部は平成 18年度日本大学佐藤研

日間で 0.75g/ml，４日間で 1.17pg/ml，５日究費によって行われたことを付記する。

間で 1.23pg/ml になった。１日，２日間までは文

産生量は測定範囲以下あるがそれ以後は徐々に

献１) Brune D (1986) Metal release from dental

増加した。

biomaterials. Biomaterials 7, 163‑167
２) 井上昌幸，山中秀夫編著（1993）歯科と金属ア

しかし，産生量は少なく 0.1mM の低濃度ではチタンの添加により，少量ではあるが IL‑１α産生量があったことをえられるため，破骨細レルギー，デンタルダイヤモンド社，東京

え併せ，IL‑６産生

３) 佐藤温重編（1997）歯科材料の副作用と安全性，量の測定を行った。IL‑６は B 細胞刺激因子と学健書院，東京

して純化されたサイトカインであるが，骨芽細４) John CW (2000) Biocompatibility of dental

胞でも産生され，IL‑１α，TNF，PTH，などによりその産生が促進され間接的に破骨細胞のcasting alloys. Areview J Prosth Dent 83(2),223‑234

活性化をも促進するため，クロムイオンが Saos５) 五島孜郎，糸川嘉則（1994）生体内金属元素，
光生館，東京，155‑156‑２細胞の IL‑６産生を促進するかどうかを調

６) 不破敬一郎（1982）生体と重金属，講談社，東べた。その結果，Saos‑２細胞の IL‑６産生量は

京，52‑53

チタンイオン（Ti ）濃度 0.1mM コントロー

７) Bridgewater LC, Manning FC, Woo ES,

ルでは 3.76pg/ml，１日間作用させ培養した場

Patierno SR (1994) DNA polymerase arrese

合で 4.30pg/ml，２日間で 4.44pg/ml，３日間で 4.99pg/ml，４日間で 5.67pg/ml，５日間でby adducted trivalent Chromium. 9(3), 122‑133

6.62pg/ml になった。時間と共に IL‑６産生量

８) 横瀬勝美，桑田文幸（2001）口腔由来細胞株

は徐々に増加がみられた。チタンイオン低濃度（0.1mM ），３日以降，IL‑１αが徐々に増加し，（Ca 9‑22）の生細胞数および DNA 合成能に及ぼす金属イオンの影響，日大歯研紀 29，37‑44

Saos‑２細胞の IL‑６産生量も僅かずつ増加し

９) 横瀬勝美，桑田文幸（2002）亜鉛イオンが口腔由来上皮細胞株（Ca 9‑22）の生細胞数，DNA合成能およびサイトカイン産生に及ぼす影響，た。
以上のことからチタンイオンによるヒト骨肉日大歯研紀 30，49‑58

腫由来の株化骨芽細胞への影響は，長時間チタ10) 横瀬勝美，桑田文幸（2003）クロムイオンが口ンを作用させた場合サイトカイン産生を増加さ腔由来上皮細胞株（Ca 9‑22）の生細胞およびサせ，細胞死の誘導をも左右する可能性が示唆さイトカイン産生に及ぼす影響，日大歯研紀 31，

れた。炎症性サイトカインである IL‑１α，IL‑13日本大学歯学部紀要 34，7‑14，200619) 今井敏夫，岩上徳志，白川正順（2003）骨芽細９‑1611) 横瀬勝美，桑田文幸（2004）チタンイオンが口胞の細胞増殖機構に及ぼすチタンの影響につ腔由来上皮細胞株（Ca 9‑22）の生細胞およびサいて，Biomed Rse Trace Elements 14，
374‑376

イトカイン産生に及ぼす影響，日大歯研紀 32，20) 井上孝，秦暢宏，才藤純一，下野正基（2000）

25‑34

インプラントと金属アレルギーの12) 横瀬勝美，桑田文幸（2005）チタンイオンが口科評論 101‑110

腔由来上皮細胞株（Ca 9‑22）の生細胞およびサイトカイン産生に及ぼす影響

察，日本歯21) 細川隆司，赤川安正（2002）チタンインプラン

第２報，日大歯トも対する金属アレルギーのリスク，広大歯誌

研紀 33，19‑2834，１‑５13) Spyrou p, Papaioannou S, Hampson G,BrandyK, Palmer RM , M cdonald F (2002)
Cytokine release by osteoblast‑like cell22) 長島義之，吉永修，森永博臣，岡松加恵，山本

cultuered on implant discs of varying alloy

他院で埋入後経過不良のためインプラントをcomposliions,cline Oral Implants Res 13,623‑630

撤去した症例の臨床的検討および撤去後の補

勝巳，森田雅之，城戸寛史，松浦正朗（2004）

綴処置について，日口腔インプラント誌 17，31‑3814) Fogh J, Wright WC, Loveless JD (1977) Absece of HeLa Vell contamination in 169 cellline derived from human tumors,J Nat Cancer Inst 58, 209 ‑21415) Davidovitch Z,NicolayOF,Ngan PW,Shan-23) Katou F, Andou N, Motegi K, Nagura H(1996) Immuno‑inflammatory responses inthe tissue adjacent to titanium miniplates

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