日大歯学 , Nihon Univ Dent J, 91, 27-33, 2017

ニッケル投与による血管新生阻害を介した口腔扁平上皮癌増殖の抑制
太田裕

崇日本大学大学院歯学研究科歯学専攻（指導：佐藤秀一 教授，浅野正岳 教授）

要旨：ニッケルは歯科用合金の組成物の一つであるが，その癌細胞増殖抑制のメカニズムは明らかにされていない。本研究では，癌の進展に関与する matrix metalloproteinase 9（MMP9）に注目し，ヒト口腔扁平上皮癌由来培養細胞（HSC3）とヌードマウスを用いて，細胞における MMP9 発現および口腔扁平上皮癌（OSCCs）の転移や増殖に対するニッケルイオンの影響について検討した。塩化ニッケル（NiCl2）を HSC3 に作用させると，MMP9 mRNA（）発現が抑制された。また，Luciferase assay の結果，発現が転写レベルで抑制された。そこで，
OSCCs モデルマウスを作製し，NiCl2 を添加した水で飼育（ニッケル刺激群）し，MMP9 発現の変化について免疫染色により検索したところ，MMP9 発現が著明に低下した。腫瘍組織の病理組織学的観察では，ニッケル刺激群で癌組織の内部に広範な壊死組織が確認され，これは CT 画像において腫瘍内部の高度な X 線透過領域として観察された。これらの変化が，血管新生因子の分泌減少によることを確認するために，IL-8 mRNA（）および VEGFmRNA（）発現について検討したところ，ニッケル刺激群で有意な減少が認められた。さらに，所属リンパ節への転移について，ヒトβグロビン遺伝子の検出によって比較したところ，ニッケル刺激群では有意に癌細胞の転移が抑制された。以上のように，本実験の結果からニッケルイオンは，腫瘍細胞の増殖や進展を抑制する作用を有する可能性が示唆された。
キーワード：ニッケル，口腔扁平上皮癌，血管新生，MMP9，NF-κB

緒から 11-13），OSCC における MMP2 と MMP9 の発現等に言ついて広く研究されている 15,16）。さらに，MMPs 発現は，そ の 一 部 が NF-κB に 依 存 し て い る こ と が 判 明 し て い

口腔に最も多く発生する悪性腫瘍は，口腔扁平上皮癌（OSCCs）である 1）。OSCCs の進展には多くの因子が関与る 17）。

しており，なかでも NF-κB は最も重要な転写因子の一

そこで本研究では，ニッケルイオンが NF-κB 活性をつとされている 1）。NF-κB は，5 つのファミリー分子（p50

抑制することで MMPs 発現に及ぼす影響について，さ（NFKB1），p52（NFKB2），p65（RELA），c-Rel（REL），

らに血管新生因子である IL-8 および VEGF の産生に及RelB（RELB））のうちの 2 分子によって形成された 2 量ぼす影響について検討することによって，癌の転移や浸体によって構成されており 2），炎症や免疫反応に関連す潤を抑制する可能性について考察を加えた。

3）

る多くの因子の発現に関与している 。NF-κB 活性は前材料および方法

癌病変から OSCCs へと移行するにつれて増加することから，癌の増殖に重要な影響を及ぼすと考えられてい1.

試薬および抗体る 4-7）。 こ れ ま で Shionome ら 8）は， ニ ッ ケ ル イ オ ン が試薬としてのニッケルイオンは，塩化ニッケル（NiCl2，NF-κB p50 サブユニットに直接結合し，核移行を阻害す

シグマアルドリッチジャパン）を用いた。抗体としては，ることにより IL-8 分泌を抑制することを報告した。

抗 ヒ ト MMP9 抗 体（Santa Cruz）お よ び horse radish

Matrix metalloproteinases（MMPs）は，細胞外マトperoxidase（HRP）標識ヤギ抗ウサギ IgG 抗体（Jackson

リックスのリモデリングにとって重要な役割を担っておImmuno Research）を用いた。

り，現在まで 20 種類以上のファミリー分子の存在が明2.

らかにされている9,10）

細胞培養とニッケルイオン刺激。MMPs は，亜鉛依存型エンドペ細胞として，ヒト口腔扁平上皮癌由来培養細胞（HSC3）

プチダーゼファミリーに属し 9,10），主な機能の一つに基およびそのサブクローンである HSC3-M3 18）（ヒューマン底膜の分解がある 11-13）。癌細胞の浸潤増殖は基底膜の破サイエンス研究資源バンク）を用いた。細胞の培養には，壊に始まることから 14），MMPs 発現の制御は癌治療の指こ れ ら と ス ト レ プ ト マ イ シ ン 50μg/ml， ペ ニ シ リ ン13）

。なかでも MMP2 と MMP9 は，基底膜50 U/ml を添加した 10% ウシ胎児血清加 Roswell Parkの主な成分であるⅣ型コラーゲンを基質としていること

Memorial Institute 1640 培地（10% FCS-RPMI）を用い標となり得る（受付：平成 29 年 1 月 16 日）〒 101 8310 東京都千代田区神田駿河台 1 8 1327た。細胞は，通法に従って 5% CO2，37℃のインキュベー

チジャパン）発色基質（50 mM トリス塩酸緩衝液 pH7.6，

タ ー 内 で 培 養 し た。 ニ ッ ケ ル イ オ ン 刺 激 は， 細 胞 を0.01% 過酸化水素，0.02% DAB）を用いて 7 分間反応さ24-well plate（2×105 個 /well）に播種し，これに 1 mMせ，PBS で洗浄後，核染色し，光学顕微鏡（BH2，オリNiCl2 を添加することにより行った。また，ニッケル刺ンパス）で観察した。

激を行わないものを対照群とした。

5.

3.

発現

リアルタイム PCR

原発巣および転移巣におけるヒトβグロビン遺伝子

Total RNA は，RNeasy mini kit（キアゲン）を用いて精HSC3-M3（5×105 個 /35μl）を雄性 6 週齢のヌードマウ製した。cDNA は Superscript Ш reverse transcriptase

スの舌右側縁に接種し，接種 1 週間後に腫瘍塊の形成を（Invitrogen）により合成し，リアルタイム PCR で分析し確認後，1 mM NiCl2 を含有する水または未含有の水を 7た 19）。リアルタイム PCR は SYBR green（タカラバイオ）〜 14 日間与え，原発巣と頸部リンパ節を取り出した。そを用い，Light Cycler nano（ロシュ・ダイアグノスティッの後，検体を半割し，組織学的および分子生物学的に検クス）を用いて行った。なお，この研究で用いたプライマー討した。転移の評価は，組織からゲノム DNA を抽出し，を第 1 表に示す。

ヒトβグロビン遺伝子を nested-PCR により検出するこ4.とで行った 20）。

癌細胞の接種と免疫組織染色
HSC3（5×105 個 /35μl）を，6 週齢の雄性ヌードマウス

6.

遺伝子の 5'- 非翻訳領域のクローニング（クレア）の舌に接種した。接種 1 週間後に腫瘍塊の形成遺伝子の非翻訳領域（5ʼ-untranslated region,を確認後，1 mM NiCl2 を含有する水または未含有の水を5ʼ-UTR）626 bp（-626 から -1（+1 は ATG 翻訳開始コドン

7 〜 14 日間与えた。なお，本実験は日本大学歯学部動物の A に相当）断片を，第 1 表のプライマーを用いて増幅実験委員会の承認を得ている（承認番号 AP14 D030-1）。

した。増幅した断片を，pGL4-basic ベクター（プロメガ）所定の飼育期間が経過した後，イソフルラン吸引およの Hind Ⅲと Kpn Ⅰ site にサブクローニングし（pGL4-び三種混合薬を腹腔内投与し，10% 中性緩衝ホルマリン）， ル シ フ ェ ラ ー ゼ ア ッ セ イ に 用 い た。 な お，の非翻訳領域の構造を第 1 図に示す。

で灌流固定した。目的の組織を採取し，パラフィンに包7.

埋後 4μm の薄切切片を用いて免疫染色を行った。切片ルシフェラーゼアッセイ

を 0.3％ H2O2 加メタノール中で室温で 20 分間反応させ，HSC3（1×105 個 /well）を，48-well plate に播種した。

内因性ペルオキシダーゼ活性を不活化させた。さらに，細胞を，OPTI-MEM（サーモフィッシャーサイエンティ

10 mM のクエン酸緩衝液（pH6.0）中で 98℃，20 分間加フィック）で 2 回洗浄し，Lipofectamin（Invitrogen）を用熱した後，ブロッキングは 1% ウシ血清アルブミン加リ

いて pGL4-ン酸緩衝生理食塩水（1% BSA-PBS）中で 1 時間反応させトランスフェクション後，細胞を 10% FCS-RPMI で洗た。その後，1% BSA-PBS で 50 倍に希釈した抗 MMP9

浄し，1 mM のニッケルイオン刺激下あるいは非刺激下抗体を作用させて室温で 1 時間反応させた。ネガティブ

で 12 〜 24 時 間 さ ら に 培 養 し た。 そ の 後， 細 胞 を 1×を 5 時間トランスフェクションした。

コ ン ト ロ ー ル に は 1% BSA-PBS を 用 い た。 次 い で，passive lysis buffer（プロメガ）を用いて溶解し，細胞溶

HRP 標識ヤギ抗ウサギ IgG（500 倍に希釈）で 1 時間室温

解 液 を 回 収 し た。 ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン 効 率 は pRL/

で 反 応 さ せ た。PBS に よ る 洗 浄 後，3,3ʼ -diamino

CMV ベクター（プロメガ）との同時トランスフェクショ

benzidine tetrahydrochloride（DAB，シグマアルドリッンにより，ウミシイタケのルシフェラーゼ活性を測定す

第1表

各プライマーの塩基配列28

ニッケルによる口腔扁平上皮癌増殖の抑制ることで補正した。測定には Dual-Luciferase Reporterニッケルイオン非刺激下 12 時間後のルシフェラーゼ活Assay System（プロメガ）を用い，蛍光強度をルミノメー性を 1 として比較したところ，ニッケルイオン刺激下でター（Lumat LB 9507, Berthold Technologies）を用いては 0.75 とわずかに減少し（第 3 図 A），24 時間後ではニッ測定した。

ケルイオン非刺激下では 1.87 に増加し，ニッケルイオン8.

刺激下では 0.73 に減少した（第 3 図 B）。

CT 撮影およびヘマトキシリン・エオジン（HE）染色3.

CT 撮影には，実験動物用 3 D マイクロ CT（R̲mCT，
5免疫染色
ニッケルイオン刺激が MMP9 発現に及ぼす影響ついリガク）を用いた。HSC3-M3（5×10 個 /35μl）を接種した実験では，CT 撮影に際してイソフルラン吸引を行って，モデルを用いて検討した。すなわち，腫瘍た 後， ヌ ー ド マ ウ ス の 尾 静 脈 に 注 射 針 付 き シ リ ン ジ

組織のおける MMP9 発現の変化を免疫染色により比較（26 G，テルモ）を用いて造影剤（オプチレイ 320，マリンした。その結果，ニッケル非刺激群では，腫瘍細胞は高クロットジャパン）を 0.5 ml 注入し，仰臥位にて撮影し度の MMP9 発現を示したのに対し，ニッケル刺激群でた。撮影条件は，管電圧 90 kV，管電流 100μA，照射時は，MMP9 発現は著明に減少した（第 4 図右）。

間 2 分間とした。

4.

CT および組織像

撮影後に舌を採取し，10% 中性緩衝ホルマリンによっ

ニッケルイオン刺激の有無が腫瘍増殖に及ぼす影響つて固定後，パラフィン包埋して，4μm の薄切切片を作いて，HSC3-M3（5×105 個 /35μl）をヌードマウスの舌に製し，HE 染色を行った。

接種し，接種 2 週間後に CT 像を撮影した。ニッケル非9.

刺激群では，境界明瞭な腫瘍塊が観察され，癌領域はボー統計学的解析
データは平均値と標準偏差で示した。有意差検定にはル・イン・ハンド像を呈していた（第 5 図 A 左）。一方，ニッStudentʼs -test を用い，有意水準を 5% とした。

結1.

ケル刺激群では，癌領域中により高い透過領域が認められた（第 5 図 A 右）。

果接種 2 週間後で採取した検体の HE 染色による組織学的検索では，ニッケル非刺激群では充実性の腫瘍胞巣が発現発現に対するニッケルイオンの影響について，形成されていた（第 5 図 B 左）のに対して，ニッケル刺激リアルタイム PCR を用いて検索した。その結果，ニッ群では腫瘍胞巣中に非刺激群に比べ広範な壊死領域が観ケルイオン非刺激下での発現を 1 とした時， ニッケルイ察された（第 5 図 B 右）。

オン刺激下では2.

発現は 0.2 に低下した（第 2 図）。

ルシフェラーゼアッセイ
ニッケルイオンによる発現低下が，転写レベルで調節されていることを確認するため，遺伝子の 5'-UTR を用いたルシフェラーゼアッセイを行った。

第1図

遺伝子の非翻訳領域の構造

第3図
第2図

ニッケルイオン刺激が（*P ＜ 0.05）

発現に及ぼす影響29

ニッケルイオン刺激がルシフェラーゼ活性に及ぼす影響
Ａ）12 時間後のルシフェラーゼ活性Ｂ）24 時間後のルシフェラーゼ活性（*P ＜ 0.05）

5.

および

により比較した。その結果，ニッケル非刺激群を 1 とし発現て比較したところ，ニッケル刺激群の組織像でみられた壊死領域の形成は，血管新生の低下減少し（第 6 図），によるものである可能性があり，両群における血管新生因子である

第4図

および発現をリアルタイム PCR

ニッケルイオン刺激が第5図発現に及ぼす影響（：50μm）

腫瘍内の透過像領域：1 mm，実線：癌領域，点線：壊死領域）
Ａ）ヌードマウス CT 像（正面像）（：500μm，実線：腫瘍部，点線：壊死部）
Ｂ）ヌードマウス舌組織像（HE 染色）（30

発現は 0.01 に発現は 0.63 に減少した（第 7 図）。

ニッケルによる口腔扁平上皮癌増殖の抑制

6.

protein-1（AP-1）など他の転写因子の活性もヒトβグロビン遺伝子発現発現に関与している可能性が考えられる。

ニッケルイオンの転移抑制効果について，所属リンパ次に，1 mM NiCl2 を飲み水に添加することにより，節におけるヒトβグロビン遺伝子を nested-PCR を用いて検出することで比較検討した。その結果，原発巣では，においてもニッケルイオンの効果が発揮されるか否ヒトβグロビン遺伝子は両群とも同程度検出された（第 8かについて検討した。まず，ヌードマウスに移植した図 A）。一方，リンパ節ではニッケル非刺激群と比較して，

HSC3 における MMP9 発現の変化を免疫染色によって比ニッケル刺激群で著明にヒトβグロビン遺伝子発現量が較したところ，ニッケル刺激群ではその発現が著明に低減少した（第 8 図 B）。

下した。さらに，MMP9 発現の抑制が癌の増殖や転移に考

ど の よ う な 影 響 を 与 え て い る か を 確 認 す る た め に，察

HSC3 接種後のヌードマウスに造影剤を注射し，CT 撮癌細胞の増殖と浸潤は，間質が分解されることによっ影を行った。その結果，ニッケル非刺激群のヌードマウて 進 展 し， こ れ に は MMPs の 存 在 が 重 要 と さ れ て いスの舌は，癌領域の周囲の血管が不透過像となり，いわ21）の プ ロ モ ー タ ー は NF-κB

ゆるボール・イン・ハンド像を呈していた。これに対し結合部位を有している 22）とともに，ニッケルイオンはてニッケル刺激群では，癌領域中により高い透過領域がる。MMPs の う ち8）

NF-κB を不活性化することから ，ニッケルイオンはみられた。また病理組織学的観察からは，ニッケル刺激

NF-κB 活性の抑制を通じて群では腫瘍胞巣中に非刺激群と比較して，より広範な壊発現を阻害する可能

死領域が確認された。このことは，HSC3 による血管新性が示唆された。
発現生因子の分泌低下によって，血管新生が阻害されたことを有意に抑制したが，この効果は 24 時間後のルシフェによる組織壊死の可能性を示すものと考えられた 23）。すラーゼ活性の結果から転写レベルで調節されていること

なわち，HSC3 における NF-κB の恒常的な活性化がニッが示唆された。しかし，ニッケルイオンによっても完全ケルイオン刺激により抑制され，これによって血管新生に因子の分泌が阻害され，低酸素環境の形成と細胞の壊死

本研究の結果からは，ニッケルイオンが，発現が抑制されなかったことから，activationを誘導した可能性がある。そこで，血管新生因子である

第6図発現（*P ＜ 0.05）

第8図
第7図発現（*P ＜ 0.05）31

ヒトβグロビン遺伝子の発現Ａ）原発巣における発現Ｂ）転移巣におけるリンパ節での発現（*P ＜ 0.05）

および

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発現を確認したところ，両者ともニッケル刺激群において有意な減少が認められた。したがって，上述した仮説が裏づけられたものと考えられた。
さらに，転移抑制効果について，所属リンパ節におけるヒトβグロビン遺伝子発現量の違いによって検討した
ところ，ニッケル刺激群で著明にヒトβグロビン遺伝子発現量が低下したことから，ニッケル刺激がリンパ節への転移を著明に抑制することが示唆された。
Shionome ら 8）は，ニッケルイオンが NF-κB の p50 サ
ブユニットに直接結合することによってその活性を抑制することを示しているが，癌細胞がどのようなメカニズ
ムでニッケルイオンを取り込むのかは明らかとなっていない。ニッケルイオンは 1）細胞膜拡散，2）イオンチャネ
ル，および 3）貪食という 3 つの異なる経路を介して取り込まれると考えられている 24,25）。このうち，ニッケル イオン輸送が大腸癌由来細胞（Caco-2）において Fe2+ 存在下で阻害されるという報告 26）は 3）の可能性を示唆するものである。最近では，プロトン結合二価陽イオントランスポーター（DCT1，NRAMP2）の関与も示唆されている 27,28）。一方，ある種の細菌において，ニッケルイオンは増殖に必須の因子であり，これには細胞質へのニッケルイオンの能動輸送のシステムとしてニッケルオペロンが備わっていると報告されている 29-31）。しかし，ヒトではこのシステムの存在は確認されていない。近年，ヒト
Toll 様受容体 4（TLR4）の細胞外領域内のヒスチジン残基にニッケルイオンが結合することも報告されているものの 32），ニッケルイオンの取り込み経路についてはさらに検討する必要があると考えられる。
これまでに，ニッケル化合物の抗腫瘍活性は報告されているものの 33,34），ニッケルイオン そのものの抗癌作用は報告されていない。ニッケルイオンが NF-κB 不活性化を通じて腫瘍の増殖・進展を抑制するのであれば，ニッケルイオンを癌治療薬として応用できる可能性があり，その作用メカニズムの詳細を検討する必要がある。
稿を終えるにあたり，懇切なるご指導およびご高閲を賜りました日本大学歯学部佐藤秀一教授，浅野正岳教授に謹んで心より感謝申し上げます。なお，本論文に関して開示すべき利益相反はない。
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