日大歯学 , Nihon Univ Dent J, 89, 15-21, 2015

チタン表面の親水性が骨芽細胞に及ぼす効果
池

田

善

之

日本大学歯学部歯科補綴学第Ⅰ講座（指導：祇園白信仁 教授）

要旨：インプラント体表面が親水性に変化することは，インプラント体全面に血液が行き渡り易い状態にあり，細胞接着と細胞増殖および細胞分化に何らかの影響を与えることが推察される。埋入初期のインプラント体周囲に多くの骨芽細胞が接着し，その細胞が増殖および分化して骨を形成することは，骨のインプラント接触率および力学的強度を向上させ，さらに，早期の osseointegration が可能となる。そこで，本研究はチタン表面の親水性が骨芽細胞に与える影響について明らかにすることを目的とし，グレード 2 の純チタンディスクおよびラット骨芽細胞をもちいて実験を行った。履歴特性を利用した水中保存は，接触角および接触面性において親水性を示した。3 時間および 24 時間培養における骨芽細胞の細胞接着は親水性ディスクが疎水性ディスクより有意に高く，confocal
画像においても細胞数の差が認められた。培養 3 時間および 24 時間後の細胞形態は両ディスク間で有意差を認めなかった。培養 2 日および 4 日後における細胞増殖は，両ディスク間で有意差を認めなかった。ALP 活性およびカルシウム量は，いずれの培養期間においても両ディスク間で有意差を認めなかった。以上の結果からチタン表面の親水性は細胞の初期接着の確率を高めることによって，チタン表面構造が本来持っている osseointegration 能力を向上させる可能性が示唆された。
キーワード：親水性，チタン表面，骨インプラント結合

緒

決策としてチタン表面へ紫外線照射することでインプラ言

ント体の表面構造を作製直後の状態と同等の炭素付着

歯科インプラント体は，新しい表面性状を持ったもの

量，同等かそれ以上の細胞接着と細胞増殖および早期のが毎年のように開発され，そのたびに osseointegration

高い骨結合強度を得ることが判明した 10,11,13-16）。また，イ（骨インプラント結合）が改善されたと提唱されている。

ンプラント体作製直後にインプラント体を生理食塩水中

チタンの表面構造は，細胞接着，増殖および分化誘導をに密封することによって，チタン表面への炭素の付着を促進する重要な役割を果たしているため酸処理，サンド防ぐ方法も開発されている 17,18）。いずれの方法においてブラスト処理，酸処理とサンドブラスト処理の組み合わもチタン表面の炭素量は減少するとされているが，視覚せなど種々の表面修飾法が導入されてきた

1,2）

。近年では

的に確認できる現象としてチタン表面の親水性度の変化

ミクロサイズの粗面が開発され，骨のインプラント接触がある。通常チタン表面は疎水性であり，大気中に保存率の向上とともに，osseointegration の力学的強度も増するインプラント製品も疎水性の状態にある 7,18）。しか加されると考えられている 3-7）。しかし，いずれのインプ

し，紫外線照射や水中保存を行った場合，インプラント

ラント体においてもインプラント骨接触率は 100% には

体は親水性となる 7,9-16）。

ならず，長期の治癒期間でも 50 〜 65% 6）あるいは 45±

紫外線照射によるチタンの親水性への変化は，以前か

16% 8）と報告されている。酸処理等のチタン表面処理直ら知られており 19），現在では，汚染浄化システムや車の後と処理後時間が経過したチタンを比較した研究では，ミラーの曇り止めなどに応用されている 20,21）。しかし，

において時間経過したチタンで，細胞の接着お疎水性から親水性への変化の機序については炭素など有よび増殖の減少が認められ，において骨結合速機化合物が除去されたことによるもの，チタン表面の化

度の遅延と骨結合強度の減少が認められた 9-13）。これら

学的変化によるもの，その両者によるものなど研究者にの結果からチタンの時間経過による老化現象がインプラ

よって意見が分かれている 22）。また，チタン表面は酸処

ント骨接触率を低下させる原因であると考えられてい理などの処理直後では親水性であるが短時間で疎水性へ9-13）と変化していく 12）。処理直後に水中保存など，外気に接チタン老化現象の原因として，チタン表面への炭素な触しない環境下では，チタン表面に炭素などの有機化合

どの有機物質の付着があり，時間の経過とともにチタン物が付着しにくく，さらに親水性を保った状態となってる。

表面の炭素量が増加することが知られている

12）

いる 7,17）。しかし，親水性を保つ機序については，有機。その解（受付：平成 26 年 11 月 18 日）〒 101 8310 東京都千代田区神田駿河台 1 8 1315化合物がチタン表面に付着していないためなのか，親水定した。測定は WST-8（Cell Counting kit-8，同仁化学性の履歴特性 23）によるものなのか明らかでない。さらに，研究所）を 3 時間および 24 時間培養後の各プレートに市販されているほとんどの歯科インプラント体は疎水性

100μl 添加し，37℃で 4 時間インキュベート後，マイクであるため，疎水性と親水性のみに着目した研究を行っ

ロプレートリーダー（Molecular Devices）にて，420 nmてこなかった。したがって，親水性が osseointegration

で吸光度を測定した。細胞増殖の評価は，12 穴プレートにどのような影響を与えているか明らかとなっていなに設置したチタンディスク上に細胞を播種し，2 日間おい。インプラント体表面が親水性に変化することは，イ

よび 4 日間後に細胞増殖能を測定した。測定は各プレー

ンプラント体全面に血液が行き渡り易い状態にあり，細トに BrdU を添加後 24 時間インキュベートし，マイク

胞接着と細胞増殖および細胞分化に何らかの影響を与え

ロプレートリーダーにて，370 nm で吸光度を測定した。

ることが推察される。埋入初期のインプラント体周囲に4． 細胞形態
チタンディスク上に播種した骨芽細胞の形態は，3 時

多くの骨芽細胞が接着し，その細胞が増殖および分化して骨を形成することは，骨のインプラント接触率および間および 24 時間培養後，共焦点レーザー走査型顕微鏡

力学的強度を向上させ，さらに，早期の osseointegration（confocal laser scanning microscopy，SP-1，Leica）をが可能となる。

用いて測定した。測定試料は培養後 10% ホルマリンにてそこで，本研究ではチタン表面の親水性が骨芽細胞に固定し，ﬂuorescent dye rhodamine phalloidin（Eugene）

与える影響について明らかにすることを目的としていにてアクチンフィラメントを染色した。さらに，ビンキュる。

リンの発現および局在を観察するために一次抗体として
mouse anti-vinculin monoclonal antibody（Abcam）およ

材料および方法

び二次抗体として FITC-conjugated anti-mouse secondary antibody（Abcam）を用い染色した。染色後アクチン

1． チタン試料

フィラメントおよびビンキュリン陽性部位の面積，周径，グ レ ー ド 2 の 純 チ タ ン を 直 径 20.0 mm， 厚 さ 1.5 mmのディスク状に成型し，表面は machined surface としフェレ経を ImageJ にて測定した。

た。試料のチタンディスクは distilled water（DW）を用

5． アルカリホスファターゼ活性い超音波洗浄を行い，滅菌処理後 15 週間遮光下にて保骨芽細胞のアルカリホスファターゼ（ALP）活性は 5 日管した。その後，親水性を持つディスクを作成するため間及び 10 日間培養後に測定した。チタンディスク上でに DW に浸漬し 1 週間遮光下にて保管した。チタンディ

培養された細胞を DW で数回洗浄後 - ニトロフェニル

スクの親水性度は DW 10μl をチタンディスク表面に滴リン酸錠を基質溶解液（2.0 mmol/L 塩化マグネシウム含下 し， 写 真 撮 影 後 に 接 触 角 お よ び 接 触 面 積 を ImageJ

有 0.1 mol/L 炭酸塩緩衝液 pH9.8，Wako）で溶解した溶Ver. 1.43 u（NIH）にて測定した。

液を 250μl ずつ添加した。その後 37℃で 15 分間インキュ2． 細胞培養

ベートし，マイクロプレートリーダーにて，405 nm で吸光度を測定し ALP 活性値を求めた。

骨芽細胞は，8 週齢の雄 Sprague-Dawley ラットの骨6． カルシウム量

髄から採取した。採取は大腿骨を摘出し，骨の両端を切培養 10 日目および 20 日目に細胞層を PBS で洗浄後，1断した後に培養液を満たしたシリンジを用い押し出すこと で 行 っ た。 採 取 し た 細 胞 は 増 殖 培 地［α -Minimum

M HCl を 1 ml 添加して室温で 24 時間脱灰処理を行い，

essential medium（α -MEM，Wako），15% ウシ胎児血清

その後 DW を 50μl ずつ加え 2 時間静置した。この検体（FBS, SIGMA），1% ペニシリン−ストレプトマイシン

液とカルシウム E テストワコー（Wako）を用いて検体（標溶液（Wako）］を用いて，37℃，5%CO2 存在下で培養した。

準液 50μl，緩衝液 2 ml，発色試薬 1 ml）と，標準（標準培 養 4 日 目 後 に 100 mm セ ル カ ル チ ャ ー デ ィ ッ シ ュ

液 50μl，緩衝液 2 ml，発色試薬 1 ml）を調整し，マイク（TPP）に 付 着 し た 細 胞 の み を 0.5% Trypsin-EDTA

ロプレートリーダーにて，610 nm で吸光度を測定した。

（Gibco）にて分離，継代を行った。継代培養は硬組織誘得 ら れ た 値 か ら カ ル シ ウ ム 濃 度［（mg/dl）＝ 検 体 / 標

導培地（増殖培地に 50μg/ml アスコルビン酸（Wako），

準 ×10］を算出した。

10 mm β- グリセロリン酸（Sigma），10−8 M デキサメタ

7． 統計学的解析

ゾン（Sigma）を添加）にて行った。なお本研究は日本大学

親水性度，細胞接着，細胞増殖，ALP 活性およびカル

歯学部動物実験指針（AP14 D008）に従い行った。

シウム量は各群（疎水性ディスクおよび親水性ディスク）

3． 細胞接着および増殖能

3 枚の異なるディスクを用いその結果を分析した（n ＝3）。細胞形態測定は各群 9 個の細胞を用いてその結果を細胞接着の評価は，12 穴プレートに設置したチタン
4

2

ディスク上に細胞を播種（3.0×10 cells/cm ）し，3 時間分析した（n ＝ 9）。分析は Student -test を用い有意水準

および 24 時間後にチタンディスクに接着した細胞を測

は 5% とした。

16

チタン表面の親水性が骨芽細胞に及ぼす効果

結2． 細胞接着および細胞増殖能

果

3 時間および 24 時間培養における骨芽細胞の細胞接着は 親 水 性 デ ィ ス ク が 疎 水 性 デ ィ ス ク よ り 有 意 に 高 く，

1． チタンディスクの親水性度

confocal 画像においても細胞数の差が認められた（第 2疎水性ディスクおよび親水性ディスク表面に 10μl の図）。

DW を滴下した画像から明らかなように，疎水性ディス

しかし，培養 2 日および 4 日後における細胞増殖は，

クでは水が球体を形成しており，親水性ディスクではディスク表面に広がっていた。接触角は疎水性ディスク

両ディスク間で有意差を認めなかった（第 3 図）。

が 5 倍以上有意に大きく，接触面積は親水性ディスクが3． 細胞形態
Confocal 画像から培養 3 時間および 24 時間後の細胞8 倍有意に大きかった（第 1 図）。

第1図

第2図

チタンディスクの親水性度

骨芽細胞の細胞接着17

形態は両ディスク間でほぼ同様の形態および大きさであり，ImageJ を用いた測定結果においても面積，周径，フェレ経で有意差を認めなかった。また，アクチンおよびビ
ンキュリンの発現においても有意差を認めなかった（第 4図）。
4． ALP 活性
培養 5 日および 10 日後の ALP 活性は，親水性ディス
クが疎水性ディスクより高い傾向を示したが，有意差は認められなかった（第 5 図）。
5． カルシウム量

第5図

骨芽細胞の ALP 活性

第6図

骨芽細胞のカルシウム量

培養 10 日および 20 日後のカルシウム沈着量は両ディスク間で有意差を認めなかった。
（第 6 図）第3図

骨芽細胞の細胞増殖

第4図

骨芽細胞の細胞形態a-1）:培養 3 時間後の抗アクチン confocal 画像，a-2）: 抗ビンキュリン confocal 画像，a-3）: a-1），a-2）の重ね合わせb-1）:培養 24 時間後の抗アクチン confocal 画像，b-2）: 抗ビンキュリン confocal 画像，b-3）: b-1），b-2）の重ね合わせ18

チタン表面の親水性が骨芽細胞に及ぼす効果

考

本研究では親水性の影響のみを明確にするため，細胞察分化などに影響を与える凹凸の大きな粗面ではなく，粗チタン表面は絶えず有機化合物を吸収することが知らさは持つが平滑面に近い機械研磨面ディスクを使用しれている 24-26）。歯科インプラントに使用されるチタン表た。このチタンディスクを使用して細胞接着試験を行っ面においても同様で，インプラント体が製作されてからたところ，細胞接着は培養 3 時間および 24 時間におい臨床で使用するまでの間に炭化水素によって汚染されたて親水性ディスクが疎水性ディスクを有意に上回る結果

7,14）。製品化されたインプラント体のとなった。細胞接着実験に用いた WST-8 は，主成分でチタン表面炭素比は多くが 35 〜 55% の範囲にあるが，あるテトラゾリウム塩を細胞内の酵素がフォルマザンに

最大で 75% に達しているものもある 17,27-29）。このチタン

分解することを利用した試薬で，得られる吸光度は細胞

表面炭素比は時間の経過とともに増加し，それに伴いチ数と強く相関するといわれている 30）。本試薬による結果

タン表面の親水性度の低下，骨芽細胞の接着量，増殖能は，細胞の酵素活性に左右されるため，何らかの理由でおよび ALP 活性や石灰化度の低下が認められるように細胞の酵素活性が高い場合は，実際の細胞数よりも高値なる。また，時間経過に伴いインプラントの骨結合強度を示す可能性がある。そこで，弱拡の confocal 画像で視が低下することから，インプラントの時間経過は生物学

覚的に確認したところ，親水性ディスクにおいて細胞数的な機能低下を引き起こしていると考えられる 9-13）。こが多いことが確認でき，このことからチタンの親水性はの機能低下の解決方法として開発された紫外線照射およ初期細胞接着に有利な影響を与えることが示唆された。

び水中保存法は，未処理の時間経過したインプラントと

しかし，この初期接着細胞数の差は，これまで報告され比較して，チタン表面上の細胞活性が高まることから，ている紫外線照射処理した親水性チタンディスクと疎水

有機化合物の除去がインプラント体の osseointegration

性チタンディスクとの結果 10,11,13-16）よりも差が少ない。こに有用であることが多くの研究でも明らかにされていの理由として，紫外線処理における有機物除去や化学的状態となっているる

7,9-13）。しかし，紫外線照射および水中保存法は常にチ変化の影響に加え，本実験でのチタンディスクが親水性

タン表面の親水性を獲得させるにも関わらず，チタン表であったのに対し紫外線照射チタンディスクの親水性が面の親水性が osseointegration に如何なる影響を及ぼす

接触角 0 であったことも影響している可能性も考えられかについては明らかにされてこなかった。

た。

チタン表面の親水性が与える影響の有無や，その役割

BrdU を用いた細胞増殖測定では，両者に差が認めらを明らかにすることは，次世代のインプラント体開発のれなかった。BrdU は細胞の S 期に取り込むチミジンの方向性を決定する上で重要であると考えられる。本研究代わりにピリミジンアナログである BrdU を取り込まはチタン表面の親水性が担う役割について明らかにする

せ，これを測定することで，DNA 合成期の細胞増殖をことを目的としているため，紫外線照射処理やチタン表

定量する方法である 31-33）。したがって，両者に差がない

面作製直後の生理食塩水保存などのチタン表面処理にことは，チタンディスクの親水性は細胞の増殖能に影響

よって得られる親水チタンディスクではなく，親水性のを与えないことを示している。

履歴特性を利用した親水性チタンディスクを用いて実験

初期に細胞が接着した際の細胞形態，アクチンおよびを行うこととした。その結果，機械研磨チタン表面は遮ビンキュリンの発現を検討したところ，全ての項目で差光保存では接触角度 74.36（±2.9）で疎水性であるのに対を認めなかった。形態に差がなくアクチンおよびビンして水中保存では 7.39（±1.6）と親水性となり，接触面積

キュリンの発現に差がないことからチタンディスクの親は約 8 倍となった。したがって，履歴特性を利用した水

水性は細胞の接着力に影響しないことが判明した。この中保存においてもチタン表面を親水性とすることが可能

ことから親水性はチタンディスク上への細胞接着を強固であることが明らかとなった。

にしているのではなく，初期接着の確率を高めていると接触角（θ）は固体表面の親水性度を表す指標であり，考えられた。

平滑な固体表面での接触角は単位面積あたりの表面張力

ALP 活性およびカルシウム量は細胞の骨芽細胞分化のの釣り合いできまり，Young の式：cosθ ＝（γsl - γsg）/

マーカーであるため，この両者に有意差がないことは，

γlg として表される。γsl は固体 / 液体，γsg は固体 / 気体，

親水性は骨芽細胞の分化に影響しないと考えられた。

γlg は液体 / 気体の単位面積あたりの表面張力である。

臨床に用いるインプラント体は，通常粗面処理が行わ

固体の表面に粗さ r がある場合はγsl，γsg がそれぞれ r

れているため水中保存されている場合および紫外線照射

倍されるため，接触角 cosθx は Wenzel の式：cosθx ＝で親水性が高くなる 22,23）。さらに，インプラント表面の（r γsl - γsg）/ γlg ＝ rcosθ として表される。すなわち，粗表面積が増すことから，親水性によって高まる細胞接着

さのある表面において平滑面での接触角が疎水性の場合の確率は本実験より大きくなることが予想される。チタはより大きく，親水性の場合はより小さくなる 22,23）。

ン表面の粗面構造は複雑な形態をしているため，疎水性19

稿を終えるにあたり，本研究に際し終始懇篤なるご指導およびご校閲を賜りました日本大学歯学部祇園白信仁教授，また専攻の立場からご指導賜りました日本大学歯学部鈴木直人教授，石上友彦教授および高橋富久教授に深く感謝の意を表します。また本研
究に対し日頃，ご助言ご鞭撻を頂きました本学歯科補綴学第Ⅰ講
座医局員各位に深く感謝の意を表します。本研究の一部は，平成
26 年度日本大学歯学部佐藤研究費，平成 26 年度日本大学大学院
歯学研究科研究費（学生研究費），平成 26 年度科学研究費補助金「基盤研究（C）」および平成 26 年度総合歯学研究所研究費（一般研
究 B）の助成により行われた。

のままでは最深部や微細な表面に血液が侵入できない。
血液が接触していない表面に細胞は接着できず，結果として骨が形成されないことになる。このことから，本実験において示された，親水性チタンディスクの初期細胞
接 着 の 向 上 は， チ タ ン 表 面 構 造 が 本 来 持 っ て い る
osseointegration 能力を発揮するための重要な因子の一つであると考えられる。
紫外線処理によるチタン表面での生物学的活性は主として有機化合物の除去により直接チタン表面と細胞が接触できることに加え，チタン表面の電荷の変化などが細文

胞 を チ タ ン 表 面 に 引 き つ け る 結 果， 早 期 に 強 いosseointegration を獲得すると言われている 9-16）。紫外線

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照射ではチタン表面が他の物質を介在することなく親水性になるため，チタン表面と細胞が直接接触できる。したがって，本研究結果は，紫外線照射による細胞の初期
細胞接着の確率を高め，osseointegration の向上につながることを強く示唆するものである。
一方，表面処理後水中保存されたチタンを直ちに有機物質の付着を防止する方法で保管した場合は，親水性を獲得したチタンの細部まで細胞が到達することが可能となり，その結果強い osseointegration が得られると言われている 7,17）。チタン表面の有機物質を除去した状態での細胞接着は，紫外線処理の場合と同様の考え方であるが，効果の要因の一つとして親水性を挙げている点が異なっている。親水性であることで表面構造の細部に細胞が到達する確率が上がることは，本実験の結果からも予想できるが，チタン表面に直接細胞が接着するという点において，チタン表面と細胞間に介在する水分が不利になる可能性も考えられる。
今後，酸処理表面やサンドブラスト処理表面などの強い粗面をもつチタンを用い親水性の影響を検討すること
で，より詳細な親水性の効果が明らかになると考えられ
る。

結

論

親水性の履歴特性を利用した親水性チタンディスクおよび骨芽細胞を用いてチタン表面の親水性が細胞に与える影響を検討したところ，以下の結論を得た。
1.

親水性は細胞の初期接着の確率を高めた。

2.

親水性は細胞増殖および細胞形態に影響しなかっ
た。

3.

献

親水性は細胞分化に影響しなかった。
以上のことから，チタン表面の親水性は細胞の初期接着の確率を高めることによって，その後の細胞増殖や細胞分化の促進に繋がり，チタン表面構造が本来持っている osseointegration 能力を向上させる可能性が示唆された。

20

チタン表面の親水性が骨芽細胞に及ぼす効果

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