日大歯学 , Nihon Univ Dent J, 91, 65-70, 2017

硫化水素が ROS17/2.8 細胞の細胞外マトリックスタンパク分解酵素とその内因性阻害剤の発現に及ぼす影響
山

中

一

浩

日本大学歯学部衛生学講座（指導：前野正夫 教授，川戸貴行 教授，中井久美子 助教）

要旨：歯周炎における歯槽骨吸収は，嫌気性の歯周病原菌が産生する病原性因子や宿主細胞が産生する炎症性因
子が，歯槽骨代謝の骨形成と骨吸収の均衡を破綻させて吸収系を優位にすることによって起こる。骨芽細胞は，
matrix metalloproteinases（MMPs）および plasminogen activators（PAs）などのタンパク分解酵素とそれらの内因性阻害剤である tissue inhibitor of metalloproteinases（TIMPs）および plasminogen activator inhibitor（PAI）を産生し，osteoid 層の細胞外マトリックス（ECM）タンパク代謝を調節している。一方，歯周ポケット内プラーク中の嫌気性菌が産生する硫化水素は口臭の原因となるだけでなく，歯周炎における組織破壊にも関与する。
本研究では，歯周ポケット内プラーク中の嫌気性菌が産生する硫化水素が，歯肉上皮を透過して歯槽骨の骨芽細胞の機能に影響を及ぼすことを想定し，ROS17/2.8 を骨芽細胞のモデルとして，NaHS を硫化水素のドナーとして
用 い て，NaHS が ROS17/2.8 の MMPs，PAs，TIMPs お よ び PAI-1 発 現 に 及 ぼ す 影 響 を 調 べ た。 そ の 結 果，
ROS17/2.8 の MMP-2，MMP-3 および MMP-9 発現は NaHS 刺激で有意に増加した一方で，TIMP-3 発現は有意に低下した。MMP-13，MMP-14，TIMP-1，TIMP-2，tissue PA，urokinase PA および PAI-1 発現には NaHS 刺激の影響が認められなかった。これらの結果から，硫化水素は，骨芽細胞の MMP-2，MMP-3 および MMP-9 産生を促進する一方で TIMP-3 活性を抑制し，osteoid 層の ECM タンパク代謝の分解系を優位にすることが示唆された。
キーワード：骨芽細胞，硫化水素，matrix metalloproteinases，tissue inhibitor of metalloproteinases

緒

周組織の病態変化にも密接に関わっている 12,13）。硫化水言

素とメチルメルカプタンは，歯肉線維芽細胞によるコ

歯周炎における歯槽骨吸収は，嫌気性の歯周病原菌がラーゲン合成を抑制するとともにコラゲナーゼ産生を増産生する病原性因子や宿主細胞が産生する炎症性因子が，加させて，コラーゲン代謝の分解系を優位にする 14,15）。

歯槽骨代謝の骨形成と骨吸収の均衡を破綻させて吸収系

また VSC は，線維芽細胞および単球による炎症性サイを優位にすることによって起こる

1,2）。骨芽細胞は高いアル

トカインやプロスタグランジン E2 などの主要な炎症性因

カリフォスファターゼ（ALPase）活性を有し，コラーゲン

子の産生を誘導する 16,17）。VSC が骨代謝に及ぼす影響と性および非コラーゲン性の細胞外マトリックス
（ECM）
タン

しては，硫化水素が破骨細胞分化を促進することや 18,19），

3-5）

。

骨 芽 細 胞 に お け る ALPase 活 性 と 非 コ ラ ー ゲ ン 性 のまた，骨芽細胞は，破骨細胞分化調節因子を産生して単球 /ECM タンパク産生抑制を介して，石灰化物形成能を低マクロファージ系の破骨細胞前駆細胞の破骨細胞への分下させることが報告されている 20）。つまり，歯周ポケッ化を調節するとともに 6,7），matrix metalloproteinases

ト内プラーク中の嫌気性菌が産生する VSC は，歯槽骨（MMPs）および plasminogen activators（PAs）などのタ

代謝の均衡を骨吸収優位にすると考えられるが，VSC がパクを産生して，骨形成の中心的な役割を担っている

ンパク分解酵素とそれらの内因性阻害剤

8,9）

骨芽細胞による osteoid 層の ECM タンパク分解調節機を産生し，破能に及ぼす影響については明らかにされていない。

骨細胞が骨表層に吸着するプロセスで重要となる osteoid
10,11）。すな

骨芽細胞が産生する MMPs は中性の pH 領域で活性化

わち，骨芽細胞は，骨形成だけでなく骨吸収においてもされ，osteoid 層のコラーゲン，プロテオグリカンおよ

重要な役割を担っている。

び非コラーゲン性タンパクなどの ECM タンパクを分解層の ECM タンパク分解の調節にも関与する

硫化水素とメチルメルカプタンは，呼気中の揮発性硫する 21,22）。一方，PAs は，不活性型のプラスミノーゲン化物（volatile sulfur compound；VSC）の約 90% を占めを活性型のプラスミンに変換する。プラスミンは，基質る口臭の主要な原因物質である。VSC は，歯周病の重症特異性が広いセリンプロテアーゼであり，osteoid 層の度に伴ってその濃度が増加することが知られており，歯多くの非コラーゲン性タンパクを分解する 23,24）。MMPs（受付：平成 29 年 5 月 8 日）
〒 101 8310 東京都千代田区神田駿河台 1 8 13

65

お よ び PAs の 活 性 は， そ れ ら の 内 因 性 阻 害 剤 で あ る

リセルアルデヒド 3- リン酸脱水素酵素（GAPDH）の増幅

tissue inhibitor of metalloproteinases（TIMPs）および量で補正した値を mRNA 発現量とした。

plasminogen activator inhibitor（PAI）によって , それぞ3.

れ調節される

8,9）

SDS-PAGE および Western blotting
培 養 後 の 細 胞 は，0.05% Triton X-100，10 mM。

本研究では，歯周ポケット内プラーク中の嫌気性菌がβ-mercaptoethanol および protease inhibitor（Sigma

産生する硫化水素が歯肉上皮を透過して歯槽骨の骨芽細Aldrich）および 25 mM Tri-HCl（pH7.4）を含む溶液に溶胞の機能に影響を及ぼすことを想定し，硫化水素が骨芽解した。細胞溶解液を超音波処理した後，12,000 rpm，4℃細胞による ECM タンパク分解調節機能に及ぼす影響をで 5 分間遠心して上清を回収した。細胞内タンパク 20μgで検討した。具体的には，骨芽細胞のモデルと含む培養上清を 4-20% ポリアクリルアミドゲルを用いてして ROS17/2.8 を，硫化水素のドナーとして NaHS を用

Laemmli 26）の方法に準じて SDS-PAGE を行った。ゲル内

いて，ROS17/2.8 を NaHS で刺激し，ROS17/2.8 が産生のタンパクを Trans-blot SD Semi-Dry Electrophoretic

する MMPs，TIMPs，PAs および PAI-1 の遺伝子発現

Transfer Cell
（Bio-Rad Laboratories）
を用いて polyvinylideneに及ぼす影響を mRNA レベルで調べた。また，遺伝子

difluoride 膜（Merck Millipore）に転写した後，BSA（和発現に変化が認められた MMP-2，MMP-3，MMP-9 お

光 純 薬 ）で 非 特 異 的 な 抗 体 反 応 を ブ ロ ッ キ ン グ し た。

よ び TIMP-3 発 現 に つ い て は， タ ン パ ク レ ベ ル で もWestern Blotting 法は，1 次抗体としてウサギ免疫の抗NaHS 刺 激 の 影 響 を 調 べ， 硫 化 水 素 が 骨 芽 細 胞 に よ る

MMP-2 抗体，（Santa Cruz Biotechnology），ヤギ免疫のosteoid 層の ECM タンパク分解調節機能に及ぼす影響を

抗 MMP-3 抗体，抗 MMP-9 抗体，抗 TIMP-3 抗体（Santa

考察した。

Cruz Biotechnology），または，マウス免疫の抗 β-actin
抗体（Santa Cruz Biotechnology）を用いて，2 次抗体と材料および方法
1.

してビオチン標識されたロバ免疫の抗ヤギ抗体（Merck
Millipore），ヤギ免疫の抗ウサギ抗体（Zymed），ヤギ免細胞培養
本研究には，骨芽細胞としてラット骨肉腫由来の株化疫の抗マウス抗体（Abcam）を用いて行った。さらに，ペ

骨芽細胞 ROS17/2.8 を用いた。ROS17/2.8 の培養には，ルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン溶液（Zymed）を

10% ウシ胎児血清（FBS；HyClone Laboratories）と 1%

加えた後，ECL Western blotting detection regents（GEペニシリン−ストレプトマイシン溶液を含む α -minimal

Healthcare Bio-Sciences）で化学発光反応を行って X 線

essential medium（α -MEM）を 培 養 液 と し て 用 い て，フィルム（富士フィルム）に感光させた。

37℃，5% 炭酸ガス存在下で行った。ROS17/2.8 を刺激

4.

すべての実験は 3 回繰り返し，遺伝子発現の結果は平

す る 際 に 用 い る 硫 化 水 素 の ド ナ ー に は NaHS を 用 いた

20,25）

3

統計学的分析

2。ROS17/2.8 を 6 穴プレートに 5×10 個 /cm の密度で播種し，Kimura ら 20）の報告を参考にして 0（コント ロ ー ル ），10 −4 M お よ び 10 −3 M の NaHS を 加 え，5

第1表

日間培養した。
2.

Real-time polymerase chain reaction（real-time

PCR）
培養後の細胞から NucleoSpin RNA（Takara Bio）を用
い て 全 RNA を 抽 出 し た。RNA の 濃 度 は，NanoDrop1000（ND-1000；Thermo Fisher Scientiﬁc）を用いて測定し た。Prime Script RT reagent kit（Takara Bio）でmRNA か ら complementary DNA（cDNA）を 作 成 し，
SYBR Green I を用いたインターカレーター法で realtime PCR を行った。第 1 表に使用した上・下流のプライ
マー配列を示す。遺伝子の増幅は Smart Cycler（Cepheid）
を用い，SYBR Premix（Takara Bio）
を cDNA に加え 95℃，10 秒間加熱した後，95℃で 5 秒間の denaturation，60℃で 20 秒間の annealing/extension を 1 サイクルとして 35 サ イ ク ル 行 っ た。 結 果 の 解 析 は Smart Cycler
Software version 2（Cepheid）を用いて行った。あらか
じめ作成した検量線をもとに遺伝子の増幅量を求め，グ66

プライマー配列

硫化水素は骨芽細胞の MMPs 発現を促す

2.

均値と標準偏差で表した。統計処理は，一元配置分散分

ROS17/2.8 を 10 −4 M および 10 −3 M の NaHS 刺激また析（ANOVA）後，Tukey の多重比較検定を用いて行い，
危険率 5% 未満を統計的な有意差とした。

結1.

PAs および PAI-1 の遺伝子発現に及ぼす NaHS の影響

は非刺激（コントロール）の培地で培養し，培養 5 日目のtissue PA（tPA），urokinase PA（uPA）および PAI-1 の果遺伝子発現を real-time PCR 法を用いて調べた（第 3 図）。
tPA，uPA お よ び PAI-1 の 発 現 は， コ ン ト ロ ー ル と

MMPs および TIMPs の遺伝子発現に及ぼす NaHS

10 −3 M あるいは 10 −4 M の NaHS 刺激の間で有意差が認の影響
ROS17/2.8 を 10

−4

M お よ び 10

−3

められなかった。

M の NaHS 刺 激 ま

たは非刺激（コントロール）の培地で培養し，培養 5 日目の M M P -2，M M P -3，M M P -9，M M P -13，M M P -14，
TIMP-1，TIMP-2 および TIMP-3 の遺伝子発現を realtime PCR 法を用いて調べた（第 1 図および第 2 図）。
MMP-2，MMP-3 および MMP-9 の発現は，コントロー
ル に 比 べ て 10 −3 M の NaHS 刺 激 で， そ れ ぞ れ 1.78，
1.29 お よ び 1.80 倍 有 意 に 増 加 し た が，MMP-13 とMMP-14 の発現には NaHS 刺激の影響が認められなかった。 一 方，TIMP-3 の 発 現 は， コ ン ト ロ ー ル に 比 べ て
10 −3 M と 10 −4 M の NaHS 刺 激 で， と も に 0.79 倍 有 意に減少したが，TIMP-1 と TIMP-2 の発現には NaHS 刺激による影響が認められなかった。

第2図

TIMPs の遺伝子発現に及ぼす NaHS の影響＜ 0.05（NaHS vs. control）＊

第1図

MMPs の遺伝子発現に及ぼす NaHS の影響＜ 0.05, ＊＊ ＜ 0.01（NaHS vs. control）

＊

第3図

67

PAs および PAI-1 の遺伝子発現に及ぼす NaHS の影響

3.

MMP-2，MMP-3，MMP-9 および TIMP-3 のタンパ

活性ならびに ECM タンパク発現が低下したと報告してク発現に及ぼす NaHS の影響

い る。 そ こ で， こ れ ら の 報 告 を も と に， 本 研 究 で はROS17/2.8 を 10 −3 M の NaHS 刺激または非刺激（コンROS17/2.8 を 10 −3 M お よ び 10 −4 M の NaHS で 刺 激 しト ロ ー ル ）の 培 地 で 培 養 し， 培 養 5 日 目 の MMP-2，て，コラゲナーゼである MMP-13，ゼラチナーゼである

MMP-3，MMP-9 お よ び TIMP-3 の タ ン パ ク 発 現 を

MMP-2 と MMP-9，ストロムライシンである MMP-3 おWestern blotting 法で調べた（第 4 図）。

よび膜型 MMP である MMP-14，ならびに内因性阻害剤

MMP-2，MMP-3 および MMP-9 の発現は，10−3Mのの TIMP-1，TIMP-2 お よ び TIMP-3 の 発 現 を 調 べ た。

NaHS 刺激で増加した。一方，TIMP-3 の発現は，10 −3 M

そ の 結 果，10 −3 M あ る い は 10 −4 M の NaHS 刺 激 で，の NaHS 刺激で減少した。

MMP-2，MMP-3 および MMP-9 発現が上昇し，TIMP-3

考発現は低下した。

察

Ⅰ型コラーゲンは，コラゲナーゼによって 3:1 の長さ

本 研 究 で は， 骨 芽 細 胞 の モ デ ル と し て 株 化 細 胞の断片に分解されゼラチン化する。ゼラチナーゼは，ゼROS17/2.8 を，硫化水素のドナーとして NaHS を用いて，ラチン化したコラーゲン断片を分解する 8,22）。また，ス

硫化水素が骨芽細胞の ECM タンパク分解酵素とその内トロムライシンは，プロテオグリカンのコアタンパクお因性阻害剤の発現に及ぼす影響を検討した。

よ び 非 コ ラ ー ゲ ン 性 タ ン パ ク を 分 解 す る 22,33）。 一 方，Nakai ら27）

は，ROS17/2.8 の MMPs，TIMPs，PAs

TIMP-3 は ECM タンパクに結合して，本研究で調べたおよび PAI-1 発現が培養 5 日目にピークを迎え，7 日目

サブタイプを含む複数の MMPs 活性を阻害する 22,33）。こには減少したと報告している。また，Kimura ら 20）は，れらの知見と本研究結果から，硫化水素の刺激を受けた

ROS17/2.8 の骨形成機能に及ぼす NaHS の影響は培養 3歯槽骨では，骨芽細胞による TIMP-3 産生低下に伴い相日目から認められたと報告している。そこで，これらの対的に MMPs の活性が高くなるとともに，ゼラチナー

報告をもとにして，遺伝子およびタンパク発現の分析はゼである MMP-2 と MMP-9，ならびにストロムライシン

培養 5 日目に限定して行った。

である MMP-3 の産生増加によって ECM タンパク代謝の分解系が優位になる可能性が示唆された。

MMPs は，その基質特異性に基づいてコラゲナーゼ，
ゼラチナーゼ，ストロムライシン，マトリライシン，膜PAs には tPA と uPA の 2 種類が存在し，それらの酵型 MMP およびその他の MMP に分類される 28,29）。また，

素活性は PAI-1 によって阻害される 9）。tPA と uPA は，

MMPs の内因性阻害剤である TIMPs は，哺乳類におい不活性型のプラスミノーゲンを活性型のプラスミンに変ては 4 種類の TIMPs（TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 および換する。プラスミンは，セリンプロテアーゼ様の作用を

TIMP-4）がクローン化されている

30-32）。一方，骨芽細胞

示し，ECM 中の非コラーゲン性タンパクを分解する 23）。

においてマトリライシンに関する報告はなく，ROS17/2.8

さらに，プラスミンは不活性型 MMPs を活性化させるこには MMP-1 と TIMP-4 の遺伝子発現が認められなかったとで，間接的に ECM タンパク分解にも関与する 34）。本と報告されている 27）。さらに，Kimura ら 20）は，10 −3 M

研究では，ROS17/2.8 における tPA，uPA および PAI-1

および 10 −4 M の NaHS の刺激で ROS17/2.8 の ALPaseの発現は，NaHS 刺激で変化しなかった。これらの結果
から，硫化水素は，骨芽細胞によるプラスミノーゲン /プラスミン経路には影響を及ぼさないと考えられた。
Katono ら 35）は，本研究と同様に歯周病の病態を想定し，グラム陰性桿菌の菌体内毒素である lipopolysaccharide（LPS）で骨芽細胞を刺激して MMPs，TIMPs，PAs お
よび PAI-1 の発現を調べ，複数の MMPs と tPA の発現
が LPS 刺激で増加したと報告している。Katono ら 35）の報告と本研究結果から，LPS と硫化水素はともに細菌由来であるが，骨芽細胞の tPA 発現に及ぼす影響は異なる
ことが明らかとなった。さらに，Katono ら 35）は，環境面における歯周病の増悪因子である喫煙を想定して，骨芽細胞をニコチンと LPS で同時に刺激すると，それぞれの単独刺激に比べて MMPs と tPA の発現が顕著に増加したと報告している。歯周病は多因性の疾患であり，歯第4図

周組織は歯周病原菌が産生する病原性因子だけでなく，

MMP-2, MMP-3, MMP-9 および TIMP-3 のタンパク発現に及ぼす NaHS の影響

タバクに含まれるニコチンや宿主細胞が産生する炎症性68

硫化水素は骨芽細胞の MMPs 発現を促す

因子によっても障害される。また，VSC については，歯生を増加させる一方でそれらに対する内因性阻害剤

周病の重症度に伴い硫化水素に対するメチルメルカプタ（TIMP-3）の産生を抑制し，破骨細胞の骨表面への吸着

ンの産生割合が上昇することから 12,13），今後は，VSC とに重要となる osteoid 層の ECM タ ン パ ク 分 解 を 促 し，しては硫化水素だけでなくメチルカプタンについても着破骨細胞の骨基質への付着を容易にして歯周炎における目し，LPS やニコチンと VSC の同時刺激が，骨芽細胞

歯槽骨破壊に関与する可能性が示唆された。

の ECM タンパク分解調節機能に及ぼす影響について検本研究遂行にあたり，格別たるご指導ご鞭撻を賜りました日本
大学歯学部衛生学講座の前野正夫教授および川戸貴行教授に謹ん
で心より感謝申し上げます。
また，本研究を通じ多大なるご協力を賜りました同講座の中井久美子助教および田中秀樹助教に深く感謝致します。
本研究に関して，利益相反はありません。

討する必要がある。
硫化水素が骨芽細胞に及ぼす影響を検討したこれまでの報告では，硫化水素が骨芽細胞の ALPase 活性，骨シアロタンパクおよびオステオポンチン産生低下を介して石灰化物形成能を抑制することや 20），破骨細胞分化促進因子である receptor activation of nuclear factor-κB

文献

ligand 発現増加を介して破骨細胞の分化誘導を促進させること 19）が明らかにされている。これらの知見と本研究

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結果から，硫化水素は，骨芽細胞の骨形成に関連する機能を抑制するだけでなく骨吸収に関連する機能を促進
し，骨代謝の均衡を吸収系優位にすると考えられた。
以上のことから，歯周ポケット内プラーク中の嫌気性菌が産生する硫化水素は，歯肉上皮を透過して結合組織内に入り，歯槽骨に存在する骨芽細胞によるゼラチナー
ゼ（MMP-2，MMP-9）とストロムライシン（MMP-3）の産生を増加させる一方でそれらに対する内因性阻害剤（TIMP-3）の産生を抑制して osteoid 層の ECM タンパク
分解を促し，破骨細胞の骨基質への付着を容易にする可能性，すなわち歯周炎における歯槽骨破壊に関与することが示唆された。

結論

歯周ポケット内プラーク中の細菌が産生する硫化水素が，歯肉上皮を透過して歯槽骨の骨芽細胞の機能に影響を及ぼすことを想定し，ROS17/2.8 を骨芽細胞のモデルとして，また，NaHS を硫化水素のドナーとして用いて，NaHS が ROS17/2.8 の ECM タンパク分解酵素（MMP-2，
MMP-3，MMP-9，MMP-13，MMP-14，tPA，uPA）とその内因性阻害剤（TIMP-1，TIMP-2，TIMP-3，PAI-1）の発現に及ぼす NaHS の影響を調べ，以下の結果および結論を得た。
1.

MMP-2，MMP-3 および MMP-9 発現は NaHS 刺激で有意に増加したが，MMP-13 および MMP-14 発現は変化しなかった。

2.

TIMP-3 発 現 は NaHS 刺 激 で 有 意 に 低 下 し た が，
TIMP-1 および TIMP-2 発現は変化しなかった。

3.

tPA，uPA および PAI-1 発現は，NaHS 刺激で変化しなかった。
以上の結果から，歯周ポケット内プラーク中の嫌気性菌が産生する硫化水素は，歯肉上皮を透過して結合組織内に入り，歯槽骨に存在する骨芽細胞によるゼラチナー
ゼ（MMP-2，MMP-9）とストロムライシン（MMP-3）の産

69

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