JP 5940985 B2 2016.6.29(57)【特許請求の範囲】【請求項１】
下記の(a)又は(b)のDNAからなるアミノベンゾエート デカルボキシラーゼ(aminobenzoa
te decarboxylase)活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、アニリン生産能を有する形質転換体。
(a)

配列番号16の塩基配列からなるDNA、配列番号19の塩基配列からなるDNA、配列番号22の塩基配列からなるDNA、配列番号25の塩基配列からなるDNA、配列番号28の塩基配列からなるDNA、配列番号31の塩基配列からなるDNA、又は配列番号34の塩基配列からなるDNA(b)

配列番号16、19、22、25、28、又は31の塩基配列と90％以上の同一性を有し、かつアミノベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA

10【請求項２】
宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである請求項１に記載の形質転換体。
【請求項３】
宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、コリネバクテリウム グルミカムR（FERM
P−18976）、ATCC13032、又はATCC13869である請求項２に記載の形質転換体。
【請求項４】
コリネバクテリウム グルタミカム ANI‑1（受託番号：NITE BP‑1001）形質転換体。
【請求項５】
アミノベンゾエート デカルボキシラーゼ(aminobenzoate decarboxylase)活性を有する

20

(2)

JP 5940985 B2 2016.6.29

酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、アニリン生産能を有する
形質転換体を、還元条件下、アミノ安息香酸、そのエステル、及び／又はその塩を含有す
る反応液中で反応させる工程と、反応培地中のアニリンを回収する工程とを含むアニリンの製造方法。
【請求項６】
反応工程において、形質転換体が実質的に増殖しない請求項５に記載のアニリンの製造方法。
【請求項７】
還元条件下の反応液の酸化還元電位が−２００〜−５００ミリボルトである請求項５又は６に記載のアニリンの製造方法。
【発明の詳細な説明】

10【技術分野】【０００１】
本発明は、アニリン生産技術に関する。さらに詳しくは、アニリン生産機能を付与するために特定の遺伝子操作が施されたコリネ型細菌の形質転換体、及びこの形質転換体を用いた効率的なアニリンの製造技術に関する。
【背景技術】【０００２】
地球温暖化、及び化石資源枯渇問題を背景に、再生可能資源を原料とした化学品の製造
は、バイオ燃料製造と並び、新産業バイオリファイナリーとして低炭素社会実現の重要な20方策であることが認識され、大きな注目が集まっている。
ここで、アニリンは、染料、タイヤの加硫促進剤や老化防止剤等のゴム製品材料のような化学製品；繊維、導電性ポリマーのような機能材料；農薬；医薬品などの原料として広く利用されている。
【０００３】
現在、アニリンは、原油を原料として化学的に生産されている。化学的アニリン製造方
法としては、ニトロベンゼンをスズまたは鉄と塩酸で還元する方法、銅、ニッケルなどの金属触媒を用いてニトロベンゼンに水素添加する還元法、高温高圧下にクロロベンゼンとアンモニアとを反応させる方法（アンモノリシス）などがあるが、いずれも溶剤類及び高熱エネルギーを必要とする、典型的な化学工業の高エネルギー消費型プロセスである。従30って、地球環境保全や温室効果ガス削減の観点から、二酸化炭素排出が少ない省エネルギ
ー型で、再生可能資源から製造でき、低廃棄物排出の環境調和型プロセスの開発、即ちバ
イオアニリン製造技術確立が急務となっている。
しかし、再生可能資源を原料としたバイオアニリン生産は、乳酸やエタノールの生産と比較して、原料となる糖類からの代謝反応段数が非常に多いために生産性が低い。また、生産物であるアニリンによる菌の増殖阻害や、アニリンによる細胞毒性等の難点がある。
このため、工業的生産は不可能とされている。
【０００４】
非遺伝子組換え菌によるアニリン生成技術として、具体的には、以下の方法が知られている。

40

例えば、非特許文献１は、マイコバクテリウム スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)を培養した後、洗菌した細胞に4‑アミノ安息香酸を添加すると、微量のアニリンが生成することを開示している。しかし、非特許文献１の方法はアニリン生産性が実用上十分ではない。なお、非特許文献１は、4‑アミノ安息香酸からのアニリン生成に関わる酵素、
その活性、及び活性を有する酵素遺伝子には言及していない。
また、非特許文献２は、病原性大腸菌エシェリキア コリ（Escherichia coli）O111の洗菌した細胞、又は細胞抽出液に、アントラニル酸（2‑アミノ安息香酸）、又は4‑アミノ安息香酸を添加すると、微量のアニリンが生成することを開示している。しかし、非特許
文献２の方法はアニリン生産性が実用上十分ではない。なお、非特許文献２は、アントラ
ニル酸、又は4‑アミノ安息香酸からのアニリン生成に関わる酵素、その活性、及び活性を

50

(3)

JP 5940985 B2 2016.6.29

有する酵素遺伝子には言及していない。
また、特許文献１は、ストレプトマイセス グリセウス（Streptomyces griseus）を、アニリン原料としてグルコースを含むTSB（Trypticase Soy Broth）培地で、好気条件下に4〜5日間培養することにより、培養液中にアニリンを生成させる技術を開示している。
しかし、特許文献１には、具体的なアニリンの生産量や、生産効率などが示されておらず、特許文献１の方法の実用性については不明である。
【先行技術文献】【特許文献】【０００５】【特許文献１】特開2008‑274225号公報

10【非特許文献】【０００６】【非特許文献１】The Journal of Biological Chemistry, Vol.193, 1951, 453‑458.
【非特許文献２】Journal of the American Chemical Society, Vol.79, 1957, 628‑630.
【発明の概要】【発明が解決しようとする課題】【０００７】
本発明は、アミノ安息香酸を原料として効率よくアニリンを製造できる微生物、及びアミノ安息香酸を原料として効率よくアニリンを製造できる方法を提供することを課題とす20る。
【課題を解決するための手段】【０００８】
上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、コリネ型細菌にアミノベンゾエー
ト デカルボキシラーゼ(aminobenzoate decarboxylase)遺伝子を導入した形質転換体は、効率よくアミノ安息香酸からアニリンを生産することを見出した。また、この形質転換体
は、還元条件下の反応液中で実質的に増殖しない状態で反応させる場合、特に、アニリン
生産効率が高いことを見出した。
【０００９】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の形質転換体及びアニリンの製造方法を提供する。
項１．

30

アミノベンゾエート デカルボキシラーゼ(aminobenzoate decarboxylase)活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、アニリン生産能を有する形質転換体。
項２．

アミノベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子

が、バチラス サブチリス（Bacillus subtilis）由来の遺伝子、ラクトバチルス ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）由来の遺伝子、ラクトバチラス ブレビス（Lactobac
illus brevis）由来の遺伝子、シュードモナス プチダ（Pseudomonas putida）由来の遺伝子、エシェリキア コリ（Escherichia coli）由来の遺伝子、サッカロマイセス セレビ
シエ（Saccharomyces cerevisiae）由来の遺伝子、又はエンテロバクター クロアカエ（Enterobacter cloacae）由来の遺伝子である項１に記載の形質転換体。
項３．

40

アミノベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が下記の(a)又は(b)のDNAである項１に記載の形質転換体。
(a)

配列番号16の塩基配列からなるDNA、配列番号19の塩基配列からなるDNA、配列番号22の塩基配列からなるDNA、配列番号25の塩基配列からなるDNA、配列番号28の塩基配列からなるDNA、配列番号31の塩基配列からなるDNA、又は配列番号34の塩基配列からなるDNA(b)(a)の何れかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアミノベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有するポリペ
プチドをコードするDNA
項４．

宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである項１〜３の何れかに記載の形質転換体。

50

(4)
項５．

JP 5940985 B2 2016.6.29

宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、コリネバクテリウム グルミカムR（FERM

P−18976）、ATCC13032、又はATCC13869である項４に記載の形質転換体。

項６．

コリネバクテリウム グルタミカム ANI‑1（受託番号：NITE BP‑1001）形質転換体。
項７．

項１〜６の何れかに記載の形質転換体を、還元条件下、アミノ安息香酸、そのエ

ステル、及び／又はその塩を含有する反応液中で反応させる工程と、反応培地中のアニリンを回収する工程とを含むアニリンの製造方法。
項８．

反応工程において、形質転換体が実質的に増殖しない項７に記載のアニリンの製

造方法。
項９．

還元条件下の反応液の酸化還元電位が−２００〜−５００ミリボルトである項７

10

又は８に記載のアニリンの製造方法。
【発明の効果】【００１０】
本発明の形質転換体を用いることにより、アミノ安息香酸、その塩、又はそのエステルからアニリンを高効率で製造することができる。
一般に微生物はアニリンのような溶剤の細胞毒性により生育が阻害されるため、微生物を用いてアニリンを製造することは困難であったが、本発明方法によれば、微生物を用いて、実用上十分に効率良くアニリンを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
20【００１１】【図１】実施例で用いたプラスミドの構成を示す図である。
【発明を実施するための形態】【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）アニリン生産能を有する形質転換体
本発明のアニリン生産能を有する形質転換体は、アミノベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された形質転換体である。
【００１３】

30

宿主
コリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔Bargeys Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974）〕に定義されている一群の微生物であり、通常の好気的条件で増殖するものならば特に限定されるものではない。具体例を挙げれば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アー
スロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、マイクロコッカス属菌等が挙げられる。コリネ型細菌の中ではコリネバクテリウム属菌が好ましい。
【００１４】
コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウム
リウム

グルタミカム、コリネバクテ

エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム

ニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム
Corynebacterium halotolerance）、コリネバクテリウム

アンモ

ハロトレランス（

40

アルカノリティカム（Coryneb

acterium alkanolyticum）等が挙げられる。
中でも、安全でかつアニリン生産性が高い点で、コリネバクテリウム
好ましい。好適な菌株として、コリネバクテリウム

グルタミカムがグルタミカム（Corynebacterium gl

utamicum）R株（FERM P‑18976）、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059
株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ‑233（FERM BP‑1497）、MJ‑233AB‑41（FERM BP‑1498）等が挙げられる。中でも、R株（FERM P‑18976）、ATCC13032
株、ATCC13869株が好ましい。
【００１５】50

(5)JP 5940985 B2 2016.6.29

なお、分子生物学的分類により、ブレビバクテリウム フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、
ブレビバクテリウム ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）、コリネバクテリ
ウム リリウム（Corynebacterium lilium）等のコリネ型細菌もコリネバクテリウム

グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に菌名が統一されている〔Liebl, W. et al.
, Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, "Brevibacterium flavum" DSM
20411, "Brevibacterium lactofermentum" DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns. Int J Sy
st Bacteriol. 41:255‑260. (1991)、駒形和男ら, コリネフォルム細菌の分類, 発酵と工10

業, 45:944‑963 (1987)〕。
旧分類のブレビバクテリウム

ラクトファーメンタムATCC13869株、ブレビバクテリウ

ム フラバムのMJ‑233株（FERM BP‑1497）、MJ‑233AB‑41株（FERM BP‑1498）なども好適な
コリネバクテリウム グルタミカムである。
ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス（Brevibact
erium ammoniagenes）（例えばATCC6872株）等が挙げられる。
【００１６】
アースロバクター属菌としては、アースロバクター

グロビフォルミス（Arthrobacter

globiformis）（例えばATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC3173
8株、ATCC35698株）等が挙げられる。
マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウム ボビス（Mycobacterium bovis

20）（例えばATCC19210株、ATCC27289株）等が挙げられる。
マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス

フロイデンライヒ（Micrococcus

freudenreichii）（例えばNo. 239株（FERM P‑13221））、マイクロコッカス

ルテウス（Micrococcus leuteus）(例えばNo. 240株（FERM P‑13222）)、マイクロコッカス ウレ
アエ（Micrococcus ureae）（例えばIAM1010株）、マイクロコッカス

ロゼウス（Microc

occus roseus）（例えばIFO3764株）等が挙げられる。
【００１７】
また、コリネ型細菌は、野生株の他に、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。例えば、ラクテート（乳酸）デヒドロゲナーゼ（lactate dehydrogenase：LDH）、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ（phosphoenolpyrvate carboxylase）

30、マレートデヒドロゲナーゼ（malate dehydrogenase）などの遺伝子の破壊株が挙げられる。このような遺伝子破壊株を宿主として用いることにより、アニリンの生産性を向上させたり、副生成物の生成を抑制したりすることができる。
中でも、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。この遺伝子破壊株は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されていることにより、ピルビン酸から乳酸への代謝経路が遮断されている。中でも、コリネバクテリウム グルタミカムの、特にR（FERM P‑18976）株のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。
このような遺伝子破壊株は、遺伝子工学的手法により常法に従い作製できる。例えば、WO2005／010182A1に、乳酸デヒドロゲナーゼ破壊株、及びその作製方法が記載されている
40。
コリネ型細菌は、他細菌に比べて、アニリンのような溶剤に対する耐性が高い。また、コリネ型細菌は、他の好気性細菌に比べて、実質的に増殖しない還元条件下で効率よく物質生産を行える。これらの点で、コリネ型細菌は本発明方法によるアニリン製造に好適である。
【００１８】
アミノベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素遺伝子
アミノベンゾエート デカルボキシラーゼは、アミノ安息香酸から炭酸を脱離させてアニリンを生成する反応、及びその逆反応を触媒する酵素である。
アミノベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の由来
は特に限定されないが、バチラス サブチリス（Bacillus subtilis）由来の遺伝子、ラク

50

(6)

JP 5940985 B2 2016.6.29

トバチルス ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）由来の遺伝子、ラクトバチラス
ブレビス（Lactobacillus brevis）由来の遺伝子、シュードモナス プチダ（Pseudomonas
putida）由来の遺伝子、エシェリキア コリ（Escherichia coli）由来の遺伝子、サッカ
ロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来の遺伝子、又はエンテロバク
ター クロアカエ（Enterobacter cloacae）由来の遺伝子が好ましい。中でも、バチラス
サブチリス由来の遺伝子、及びエンテロバクター クロアカエ由来の遺伝子が好ましい。
特に、アントラニル酸（2‑アミノ安息香酸）を基質とした場合はバチラス サブチリス由来の遺伝子が好ましく、4‑アミノ安息香酸を基質とした場合はエンテロバクター クロア
カエ由来の遺伝子が好ましい。
【００１９】

10

バチラス サブチリス由来の遺伝子としては配列番号16の塩基配列からなるDNAが挙げられ、ラクトバチルス ラムノーサス由来の遺伝子としては配列番号19の塩基配列からなるDNAが挙げられ、ラクトバチラス ブレビス由来の遺伝子としては配列番号22の塩基配列からなるDNAが挙げられ、シュードモナス プチダ由来の遺伝子としては配列番号25の塩基配列からなるDNAが挙げられ、エシェリキア コリ由来の遺伝子としては配列番号28の塩基配列からなるDNAが挙げられ、サッカロマイセス セレビシエ由来の遺伝子としては配列番号31の塩基配列からなるDNAが挙げられ、エンテロバクター クロアカエ由来遺伝子としては
配列番号34の塩基配列からなるDNAが挙げられる。
【００２０】
また、本発明では、配列番号16、19、22、25、28、31、又は34の塩基配列と相補的な塩20基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアミノベンゾエ
ート デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
本発明において「ストリンジェントな条件」は、一般的な条件、例えば、Molecular Cl
oning, A Laboratory Manual, Second Edition, 1989, Vol2, p11.45に記載された条件を指す。具体的には、完全ハイブリッドの融解温度(Tm)より5〜10℃低い温度でハイブリダ
イゼーションが起こる場合を指す。
【００２１】
アミノベンゾエート デカルボキシラーゼ活性は、J. Am .Chem. Soc., 79, 628‑630 (1957)に記載の方法を改変して測定できる。簡単に説明すると、コリネ型細菌を栄養培地で、18時間33℃で培養したものを、最少培地で２回洗菌した後、最少培地に再懸濁、Intact30

Cellとする。次に反応として、Intact Cell にHEPES(pH7.0)を緩衝液として25mＭ加え、基質としてアントラニル酸、又は4‑アミノベンゾエートを終濃度5ｍＭになるように添加する。33℃、200rpmで6時間振とう後、反応液を菌と上清に遠心分離し、上清を0.22μｍのフィルターで濾過したものをサンプルとする。生じたアニリン生成量をGC/MS、又はHPL
Cで定量できる。
また、本発明では、配列番号16、19、22、25、28、31、又は34の塩基配列と同一性が90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上の塩基配列からなり、かつアミノ
ベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
本発明において、塩基配列の同一性は、GENETYX ver.8（GENETYX 株式会社ゼネティッ

40クス製）により算出した値である。
【００２２】
配列番号16、19、22、25、28、31、又は34の塩基配列からなるDNAのホモログは、例えば、これらの塩基配列に基づき常法に従い設計したプライマー又はプローブを用いたPCR又はハイブリダイゼーションにより、他生物種のDNAライブラリーから選択することができ、これにより高確率でアミノベンゾエート デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプ
チドをコードするDNAが得られる。
【００２３】
形質転換のためのベクターの構築
PCRで増幅したアミノベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素をコードするDNAは、それ

50

(7)

JP 5940985 B2 2016.6.29

ぞれ、宿主で増幅できる適切なベクターにクローニングすればよい。
プラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内で自律複製機能を司る遺伝子を含むもの
であれば良い。その具体例としては、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）2256由来のpAM330〔特開昭58‑67699〕、〔Miwa, K. et al.,
Cryptic plasmids in glutamic acid‑producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:290
1‑2903（1984）〕 及び 〔Yamaguchi, R. et al., Determination of the complete nucl
eotide sequence of the Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330 and the anal
ysis of its genetic information. Nucleic Acids Symp. Ser. 16:265‑267（1985）〕、
コリネバクテリウム グルタミカム ATCC13058由来のpHM1519 〔Miwa, K. et al., Crypti
c plasmids in glutamic acid‑producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901‑2903

10（1984）〕及びpCRY30 〔Kurusu, Y. et al., Identification of plasmid partition fu
nction in coryneform bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 57:759‑764 （1991）〕、
コリネバクテリウム グルタミカム T250由来のpCG4〔特開昭57‑183799〕、〔Katsumata,
R. et al., Protoplast transformation of glutamate‑producing bacteria with plasmid DNA. J. Bacteriol.、159:306‑311 （1984）〕、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50〔特開昭62‑166890〕、pEK0、pEC5、pEKEx1 〔Eikmanns, B.J. et al., A family of Corynebacteri
um glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors for cloning, controlled gene expr
ession, and promoter probing. Gene, 102:93‑98 （1991）〕などが挙げられる。
【００２４】
好ましいプロモーターとしては、コリネバクテリウム グルタミカムR由来のグリセルア

20

ルデヒド3‑フォスフェートデヒドロゲナーゼA遺伝子(gapA)のプロモーターPgapA、マレー
トデヒドロゲナーゼ遺伝子（mdh）のプロモーターPmdh、ラクテートデヒドロゲナーゼA遺伝子（ldhA）のプロモーターPldhAなどが挙げられ、中でも、PgapAが好ましい。
好ましいターミネーターとしては、大腸菌rRNAオペロンのrrnB T1T2 ターミネーター、大腸菌のtrpA ターミネーター、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacte
rium lactofermentum）のtrp ターミネーターなどが挙げられ、中でも、rrnB T1T2 ター
ミネーターが好ましい。
【００２５】
形質転換
形質転換方法は、公知の方法を制限無く使用できる。このような公知の方法として、例30

えば塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン
介在トランスフェクション、電気穿孔法などが挙げられる。中でも、コリネ型細菌には、
電気パルス法が好適であり、電気パルス法は、公知の方法 〔Kurusu, Y. et al., Electr
oporation‑transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complemen
tation. Agric. Biol. Chem. 54:443‑447 （1990）〕 及び 〔Vertes A.A. et al., Presence of mrr‑ and mcr‑like restriction systems in Coryneform bacteria. Res. Microbiol. 144:181‑185 （1993）〕により行うことができる。
【００２６】
形質転換体は、微生物の培養に通常使用される培地を用いて培養すればよい。この培地としては、通常、炭素源、窒素源、無機塩類及びその他の栄養物質等を含有する天然培地

40又は合成培地等を用いることができる。
炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マンノース、マルトース、
マンニトール、キシロース、アラビノース、ガラクトース、澱粉、糖蜜、ソルビトール、
グリセリン等の糖質又は糖アルコール；酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸又はグルコン酸等の有機酸；エタノール、プロパノール等のアルコール等が挙げられる。また、所望によりノルマルパラフィン等の炭化水素等も用いることができる。炭素源は、１種を単独で使用でき、又は２種以上を混合して使用してもよい。培地中のこれら炭素源の濃度は、通常、約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アン
モニウム等の無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、

50

(8)

JP 5940985 B2 2016.6.29

硝酸カリウム等が挙げられる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ベプトン、NZ−アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、１種を単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。培地中の窒素源濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウ
ム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、又は炭酸カルシウム等が挙げられる。これら無機塩は、１種を単独で使用してもよく、また2種以上を混合して使用してもよい。培地中の無機塩類濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1（ｗ／ｖ％）とすればよい。

10

栄養物質としては、例えば肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、又は動植物若しくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地濃度は、使用する栄
養物質によっても異なるが、通常、約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、例えば、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
培地のｐＨは約5〜8が好ましい。
【００２７】
好ましい微生物培養培地としては、A培地〔Inui, M. et al., Metabolic analysis of20

Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen
deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182‑196 (2004)〕、BT培
地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde‑3‑phosphat
e dehydrogenase isoforms with opposite, ATP‑dependent regulation. J. Mol. Microb
iol. Biotechnol. 8:91‑103 (2004)〕等が挙げられる。
培養温度は約15〜45℃とすればよく、培養時間は約1〜7日間とすればよい。
【００２８】（ＩＩ）アニリンの製造方法
上記説明した本発明の形質転換体を、アミノ安息香酸、その塩、及び／又はそのエステ
ルを含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中のアニリンを回収する工程とを含む

30

方法によりアニリンを製造することができる。
微生物の増殖反応に先立ち、形質転換体を好気条件下で、温度約25〜35℃で、約12〜48時間培養して増殖させることが好ましい。
【００２９】
培養用培地
反応に先立つ形質転換体の好気的培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類およ
びその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地を用いることができる。
炭素源として、糖類（グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノ
ース、ガラクトースのような単糖；スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース

40、キシロビオース、トレハロースのような二糖；澱粉のような多糖；糖蜜等）、マンニト
ール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。
炭素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。
【００３０】
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アン
モニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウ
ム、硝酸カリウム等を使用できる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ−アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素

50

(9)

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源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。窒素源の培地中の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩
化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1（w/v％）とすればよい。
【００３１】
栄養物質としては、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、動植物又は微生物菌体のエキ10スやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地中の濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約0.1〜10（ｗ／ｖ％）とすればよい。
さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシ
トール、ニコチン酸等が挙げられる。
培地のpHは約6〜8が好ましい。
【００３２】
具体的な好ましいコリネ型細菌用培地としては、A培地〔Inui, M. et al., Metabolic
analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions
under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182‑196 (220004)〕、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde‑3‑phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP‑dependent regulation. J.
Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91‑103 (2004)〕等が挙げられる。これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。
【００３３】
反応液
反応液は、アニリン前駆体（アニリン原料）を含有する水、緩衝液、無機塩培地などを用いることができる。
前駆体としては、アミノ安息香酸、その塩、及び／又はそのエステルを用いることができる。アミノ安息香酸としては、2‑アミノ安息香酸(o‑アミノ安息香酸；アントラニル酸)

30、3‑アミノ安息香酸(m‑アミノ安息香酸)、4‑アミノ安息香酸(p‑アミノ安息香酸)の何れも使用できる。中でも、水溶性であるため反応に使用し易い点で、2‑アミノ安息香酸、4‑ア
ミノ安息香酸が好ましい。
塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、塩酸塩などが挙げられる。また、エステルとしては、炭素数１〜４のアルコールとのエステルなどが挙げられる。
反応液への溶解度が高くなる点で、塩が好ましい。前駆体は、１種を単独で、又は２種
以上を混合して使用できる。
反応液中のアミノ安息香酸、その塩、及び／又はそのエステルの濃度は、約0.1〜10（w/v％）が好ましく、約0.5〜7（w/v％）がより好ましく、約0.5〜5（w/v％）がさらにより好ましい。上記範囲であれば、効率良く、アニリンを製造できる。

40

緩衝液としては、リン酸バッファー、トリスバファー、炭酸バッファーなどが挙げられる。緩衝液の濃度は、約10〜150 mMが好ましい。
無機塩培地としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、
塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム
等の無機塩の１種又は２種以上を含む培地が挙げられる。中でも、硫酸マグネシウムを含む培地が好ましい。無機塩培地として、具体的には、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al.,Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde‑3‑phosphate dehydrogenase isoforms wit
h opposite, ATP‑dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91‑103 (2004)〕等が挙げられる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1（ｗ／ｖ％）とすればよい。

50

(10)

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反応液のｐＨは約6〜8が好ましい。反応中は、アンモニア水溶液、水酸化ナトリウム水溶液などを用いて、ｐＨコントローラー (例えば、エイブル株式会社製、型式：DT‑1023）で、反応液のｐＨを中性付近、特に約７にコントロールしながら反応させることが好ましい。
反応条件
反応温度、即ち反応中の形質転換体の生存温度は、約20〜40℃が好ましく、約25〜35℃がより好ましい。上記温度範囲であれば、効率良くアニリンを製造できる。
また、反応時間は、約1〜7日間が好ましく、約1〜3日間がより好ましい。
培養は、バッチ式、流加式、連続式の何れでもよい。中でも、バッチ式が好ましい。
10【００３４】＜還元条件＞
反応は、好気的条件で行ってもよく、還元条件で行ってもよいが、還元条件で行うことが好ましい。還元条件では、コリネ型細菌は実質的に増殖せず、一層効率的にアニリンを生産させることができる。
還元条件は、反応液の酸化還元電位で規定される。反応液の酸化還元電位は、約−200
mV〜−500 mVが好ましく、約−250 mV〜−500 mVがより好ましい。
反応液の還元状態は簡便にはレサズリン指示薬（還元状態であれば、青色から無色への脱色）で推定できるが、正確には酸化還元電位差計（例えば、BROADLEYJAMES社製、ORP

Electrodes）を用いて測定できる。
20【００３５】
還元条件にある反応液の調整方法は、公知の方法を制限なく使用できる。例えば、反応
液調製用の液体媒体として、蒸留水などの代わりに反応液用水溶液を使用してもよく、反応液用水溶液の調整方法は、例えば硫酸還元微生物などの絶対嫌気性微生物用の培養液調整方法（Pfennig, N. et al．（1981）：The dissimilatory sulfate‑reducing bacteria，In The Prokaryotes，A Handbook on Habitats，Isolation and Identification of Ba
cteria，Ed. By Starr，M.P. et al．p926‑940，Berlin，Springer Verlag．）や「農芸化学実験書第三巻、京都大学農学部

農芸化学教室編、1990年第26刷、産業図書株式会

社出版」などが参考となり、所望する還元条件下の水溶液を得ることができる。
具体的には、蒸留水などを加熱処理や減圧処理して溶解ガスを除去することにより、還元条件の反応液用水溶液を得ることができる。この場合、約10 mmHg以下、好ましくは約530mmHg以下、より好ましくは約3 mmHg以下の減圧下で、約1〜60分程度、好ましくは約5〜40分程度、蒸留水などを処理することにより、溶解ガス、特に溶解酸素を除去して還元条
件下の反応液用水溶液を作成することができる。
また、適当な還元剤（例えば、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオン、硫化ソーダ等）を添加して還元条件の反応液用水溶液を調整することもできる。
これらの方法を適宜組み合わせることも有効な還元条件の反応液用水溶液の調整方法である。
【００３６】
反応中も反応液を還元条件に維持することが好ましい。反応途中での還元条件を維持す40るために、反応系外からの酸素の混入を可能な限り防止することが望ましく、具体的には、反応系を窒素ガス等の不活性ガスや炭酸ガス等で封入する方法が挙げられる。酸素混入
をより効果的に防止する方法としては、反応途中において本発明の好気性細菌の菌体内の代謝機能を効率よく機能させるために、反応系のｐＨ維持調整液の添加や各種栄養素溶解
液を適宜添加する必要が生じる場合もあるが、このような場合には添加溶液から酸素を予め除去しておくことが有効である。
【００３７】
アニリンの回収
上記のようにして培養することにより、反応液中にアニリンが生産される。反応液を回収することによりアニリンを回収できるが、さらに、公知の方法でアニリンを反応液から

50

(11)

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分離することもできる。そのような公知の方法として、蒸留法、膜透過法、有機溶媒抽出法等が挙げられる。
【実施例】【００３８】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。
実施例1

アニリン生産遺伝子のクローニングと発現(1) 微生物からの染色体DNAの抽出
バチルス サブチリス（Bacillus subtilis）NBRC 14144からの染色体DNA抽出は、NBRC
Medium No.802培地 [polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO4・7H2O 1 gを蒸留水110Lに溶解] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。
【００３９】
ラクトバチルス ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）NBRC 3425からの染色体DNA
抽出は、NBRC Medium No.804培地 [polypeptone 5 g, yeast extract 5 g, glucose 5 g,
MgSO4・7H2O 1 gを蒸留水1 Lに溶解] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Ti
ssue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体か
20

ら染色体DNAを回収した。
【００４０】
ラクトバチラス ブレビス（Lactobacillus brevis）ATCC 367からの染色体DNA抽出は、
Lactobacilli MRS broth（ベクトン・ディッキンソン社製

BD 288130）に、白金耳を用

いて植菌後、対数増殖期まで30℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。
【００４１】
シュードモナス プチダ（Pseudomonas putida KT2440）ATCC 47054からの染色体DNA抽
出は、LB培地 [tryptone 10 g, yeast extract 5 g, NaCl 5 gを蒸留水1 Lに溶解] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽

30

出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。
【００４２】
エシェリキア コリ（Escherichia coli K‑12 MG1655）からの染色体DNA抽出は、LB培地[tryptone 10 g, yeast extract 5 g, NaCl 5 gを蒸留水1 Lに溶解] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。
【００４３】
サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）NBRC 10217からの染色体D40

NA抽出は、NBRC Medium No.108培地 [glucose 10 g, peptone 5 g, yeast extract 3 g,
malt extract 3 gを蒸留水1 Lに溶解] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで24℃
で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Ti
ssue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体か
ら染色体DNAを回収した。
【００４４】
エンテロバクター クロアカエ（Enterobacter cloacae）NBRC 13535からの染色体DNA抽
出は、NBRC Medium No.802培地 [polypeptone 10 g, yeast extract 2 g, MgSO4・7H2O 1
gを蒸留水1 Lに溶解] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isola

50

(12)

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tion Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。
【００４５】(2) クローニングベクターの構築
クローニングベクターpCRB22の構築
コリネバクテリウム

カゼイ JCM12072由来のプラスミドpCASE1のDNA複製起点（以降、pCASE1‑oriと記す）配列、及びクローニングベクターpHSG298（タカラバイオ株式会社製）をそれぞれ含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、pCASE1‑ori配列、クローニングベクターpHSG298をそれぞれクローン化するべく、配列番号1（pCASE1‑ori配列）、配列番号2（クローニングベクター−pHSG298）

10を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。
【００４６】
pCASE1‑ori配列増幅用プライマー（a‑1）；

5‑ AT AGATCT AGAACGTCCGTAGGAGC ‑3（配列番号3）（b‑1）；

5‑ AT AGATCT GACTTGGTTACGATGGAC ‑3（配列番号4）

尚、プライマー（a‑1）及び（b‑1）には、BglII制限酵素部位が付加されている。
クローニングベクターpHSG298増幅用プライマー（a‑2）；

5‑ AT AGATCT AGGTTTCCCGACTGGAAAG ‑3（配列番号5）（b‑2）；

5‑ AT AGATCT CGTGCCAGCTGCATTAATGA ‑3（配列番号6）20

尚、プライマー（a‑2）及び（b‑2）には、BglII制限酵素部位が付加されている。
【００４７】
鋳型DNAは、Japan. Collection of Microorganisms (JCM)より入手したコリネバクテリ
ウム

カゼイ JCM12072から抽出したトータルDNA及びクローニングベクターpHSG298（タカラバイオ株式会社製）を用いた。
実際のPCRは、サーマルサイクラー

GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシ

ステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
【００４８】
30

40【００４９】

(13)JP 5940985 B2 2016.6.29

10
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、pCASE1‑ori
配列の場合約1.4‑kb、クローニングベクターpHSG298の場合、約2.7‑kbのDNA断片が検出できた。
【００５０】
上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウム

カゼイ株由来のプラスミドpCASE1‑ori

配列含む約1.4‑kb DNA断片10μl及びクローニングベクターpHSG298を含む約2.7‑kb DNA断片10μlを各々制限酵素BglIIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液

1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製）1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションA液とした。

20

得られたライゲーションA液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 5
3, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラス
ミドを制限酵素BglIIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニング
ベクターpHSG298約2.7‑kbのDNA断片に加え、pCASE‑ori配列の約1.4‑kb DNA断片が認められた。
pCASE1‑ori配列を含むクローニングベクターをpCRB22と命名した。
30【００５１】
クローニングベクターpCRB207の構築
コリネバクテリウム グルタミカムR由来のグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナー
ゼ（glyceraldehyde‑3‑phosphate dehydrogenase）をコードするgapA遺伝子のプロモーター配列（以降、PgapAと記す）を含むDNA断片、及びクローニングベクターpKK223‑3（ファルマシア社製）由来rrnBT1T2双方向ターミネーター配列（以降、ターミネーター配列と記す）を含むDNA断片を以下の方法により増幅した。
PCRに際して、PgapA配列及びターミネーター配列をそれぞれクローン化するべく、配列
番号7（PgapA配列）、配列番号8（ターミネーター配列）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。

40【００５２】
PgapA配列増幅用プライマー(a‑3)； 5‑ CTCT GTCGAC CCGAAGATCTGAAGATTCCTG ‑3（配列番号9）(b‑3)； 5‑ CTCT GTCGAC GGATCC CCATGG TGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG ‑3（配列番号10）

尚、プライマー（a‑3）には、SalI制限酵素部位が、プライマー（b‑3）には、SalI、BamH
I及びNcoI制限酵素部位が付加されている。
ターミネーター配列増幅用プライマー（a‑4）；

5‑ CTCT GCATGC CCATGG CTGTTTTGGCGGATGAGAGA ‑3（配列番号11）50

(14)（b‑4）；

5

JP 5940985 B2 2016.6.29‑ CTCT GCATGC TCATGA AAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG ‑3（配列番号12）

尚、プライマー（a‑4）には、SphI及びNcoI制限酵素部位が、プライマー（b‑4）には、
SphI及びBspHI制限酵素部位が付加されている。
【００５３】
鋳型DNAは、コリネバクテリウム グルタミカム R (FERM P‑18976)から抽出した染色体DNA及びpKK223‑3プラスミド（ファルマシア社製）を用いた。
実際のPCRは、サーマルサイクラー

GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシ

ステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。

10【００５４】

20【００５５】

30

上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、PgapA配列の場合約0.6‑kb、ターミネーター配列の場合、約0.4‑kbのDNA断片が検出できた。
【００５６】
上記のPCRにより増幅したコリネバクテリウム グルタミカム R由来PgapA配列を含む約040.6‑kb DNA断片10μlとクローニングベクターpCRB22約4.1‑kbを各々制限酵素SalIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 D
NAリガーゼ10×緩衝液 1μl、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションB液とした。
得られたライゲーションB液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 5
3, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラス

50

(15)

JP 5940985 B2 2016.6.29

ミドを制限酵素SalIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベ
クターpCRB22約4.1‑kbのDNA断片に加え、PgapA配列）の約0.6‑kb DNA断片が認められた。
PgapA配列を含むクローニングベクターをpCRB206と命名した。
【００５７】
上記PCRにより増幅したpKK223‑3プラスミド由来ターミネーター配列を含む約0.4‑kb DN
A断片10μlを制限酵素NcoI及びBspHIで、上述のクローニングベクターpCRB206

2μlを制限酵素NcoIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液

1μl 、T4 DNAリガーゼ （タカラバイオ株式

会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、10結合させた。これをライゲーションC液とした。
得られたライゲーションC液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 5
3, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラス
ミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、クローニングベクターpCRB20
6約4.7‑kbのDNA断片に加え、ターミネーター配列の約0.4‑kb DNA断片が認められた。
rrnBT1T2ターミネーター配列を含むクローニングベクターをpCRB207と命名した。
【００５８】

20

クローニングベクターpCRB209の構築
コリネバクテリウム グルタミカムR由来のgapA（glyceraldehyde 3‑phosphate dehydrogenase A）遺伝子のプロモーター（以降、PgapAと記す）配列を含むDNA断片を以下の方法
により増幅した。
PCRに際して、pCRB207配列をクローン化するべく、配列番号13（pCRB207）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。
【００５９】
pCRB207配列増幅用プライマー（a‑5）； 5‑ CTCT CATATG CTGTTTTGGCGGATGAGAG ‑3（配列番号14）（b‑5）； 5‑ CTCT CATATG GTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG ‑3（配列番号15）

尚、プライマー（a‑5）及び（b‑5）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。
鋳型DNAは、gapAプロモーター及びrrnBT1T2ターミネーター配列を含有するクローニン
グベクターpCRB207を用いた。
実際のPCRは、サーマルサイクラー

GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシ

ステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（宝酒造株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
【００６０】

30

(16)JP 5940985 B2 2016.6.29

10【００６１】

20

上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、クローニン
グベクターpCRB207配列を含む約5.1‑kbのDNA断片が検出できた。
【００６２】
上記のPCRにより増幅したpCRB207由来遺伝子を含む約5.1‑kb DNA断片10μlを制限酵素N
deIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液

1μl 、T4 DNAリガーゼ（宝酒造株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲ
30

ーションD液とした。
得られたライゲーションD液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 5
3, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プ
ラスミドを制限酵素NdeIで切断し、制限酵素サイトの挿入を確認した。
PgapA配列及びrrnBT1T2ターミネーター配列を含むクローニングベクタ−をpCRB209と命名した。
【００６３】

40(3) アニリン生産遺伝子のクローニング
バチラス サブチリス由来のアニリン生産遺伝子のクローニング
バチラス サブチリス由来のアミノベンゾエート デカルボキシラーゼをコードするbsdB
CD（以降、dec/BSと記載）遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、dec/BS遺伝子をクローン化するべく、配列番号16（バチラス

サブチリスdec/BS遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシス
テムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。
【００６４】
dec/BS遺伝子増幅用プライマー（a‑6）； 5‑ CTCT CATATG AAAGCAGAATTCAAGCGTAAAG ‑3（配列番号17）50

(17)（b‑6）； 5

JP 5940985 B2 2016.6.29‑ CTCT CATATG GATCAAGCCTTTCGTTCCG ‑3（配列番号18）

尚、プライマー（a‑6）及び（b‑6）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
【００６５】
ラクトバチルス ラムノーサス由来のアニリン生産遺伝子のクローニング
ラクトバチルス ラムノーサス由来のアミノベンゾエート デカルボキシラーゼをコードするubiDX（以降、dec/LRと記載）遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、dec/LR遺伝子をクローン化するべく、配列番号19（ラクトバチルス

ラ

ムノーサスdec/LR遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バ
イオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer
10）」を用いて合成し、使用した。
【００６６】
dec/LR遺伝子増幅用プライマー（a‑7）； 5‑ CTCT CATATG ACAGCATCACCTTGGG ‑3（配列番号20）（b‑7）； 5‑ CTCT CATATG TCATCTTAACGACGCTCCATTC ‑3（配列番号21）

尚、プライマー（a‑7）及び（b‑7）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
【００６７】
ラクトバチルス ブレビス由来のアニリン生産遺伝子のクローニング
ラクトバチルス ブレビス由来のアミノベンゾエート デカルボキシラーゼをコードする
LVIS̲1987‑LVIS̲1986（以降、dec/LBと記載）遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により
20

増幅した。
PCRに際して、dec/LB遺伝子をクローン化するべく、配列番号22（ラクトバチルス

ブ

レビスdec/LB遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」
を用いて合成し、使用した。
【００６８】
dec/LB遺伝子増幅用プライマー（a‑8）； 5‑ CTCT CATATG GTAAATGATCCTTATGATTTACGAAAAG ‑3（配列番号23）（b‑8）； 5‑ CTCT CATATG CTAATCTCCCTCCCAACG ‑3（配列番号24）30

尚、プライマー（a‑8）及び（b‑8）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
【００６９】
シュードモナス プチダ由来のアニリン生産遺伝子のクローニング
シュードモナス プチダ由来のアミノベンゾエート デカルボキシラーゼをコードするubiD（以降、dec/PPと記載）遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、dec/PP遺伝子をクローン化するべく、配列番号25（シュードモナス

プ

チダdec/PP遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシ
ステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。
【００７０】
40

dec/PP遺伝子増幅用プライマー（a‑9）； 5‑ CTCT CATATG AACGGGCCGGAAC ‑3（配列番号26）（b‑9）； 5‑ CTCT CATATG TCAATCATCCACCCCGAAG ‑3（配列番号27）

尚、プライマー（a‑9）及び（b‑9）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
【００７１】
エシェリキア コリ由来のアニリン生産遺伝子のクローニング
エシェリキア コリ由来のアミノベンゾエート デカルボキシラーゼをコードするpurEK（以降、dec/ECと記載）遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、dec/EC遺伝子をクローン化するべく、配列番号28（エシェリキア

コリdec/EC遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バイオシステ
ムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用い

50

(18)

JP 5940985 B2 2016.6.29て合成し、使用した。
【００７２】
dec/EC遺伝子増幅用プライマー（a‑10）； 5‑ CTCT CATATG TCTTCCCGCAATAATCCG ‑3（配列番号29）（b‑10）； 5‑ CTCT CATATG TTAACCGAACTTACTCTGCGC ‑3（配列番号30）

尚、プライマー（a‑10）及び（b‑10）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
【００７３】
サッカロマイセス セレビシエ由来のアニリン生産遺伝子のクローニング
サッカロマイセス セレビシエ由来のアミノベンゾエート デカルボキシラーゼをコードするADE2（以降、dec/SCと記載）遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。

10

PCRに際して、dec/SC遺伝子をクローン化するべく、配列番号31（サッカロマイセス
セレビシエdec/SC遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・バ
イオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。
【００７４】
dec/SC遺伝子増幅用プライマー(a‑11)； 5‑ CTCT CCATGG ATTCTAGAACAGTTGGTATATTAG ‑3（配列番号32）(b‑11)； 5‑ CTCT CCATGG TTACTTGTTTTCTAGATAAGCTTCGTAAC ‑3（配列番号33）

尚、プライマー（a‑11）及び（b‑11）には、NcoI制限酵素部位が付加されている。

20【００７５】
エンテロバクター クロアカエ由来のアニリン生産遺伝子のクローニング
エンテロバクター クロアカエ由来のアミノベンゾエート デカルボキシラーゼをコードするECL̲04083‑ECL̲04082‑ECL̲04081（以降、dec/ECLと記載）遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、dec/ECL遺伝子をクローン化するべく、配列番号34（エンテロバクター
クロアカエdec/ECL遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを、アプライド・
バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「394 DNA/RNAシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。
30
dec/ECL遺伝子増幅用プライマー（a‑12）；

5‑ CTCT CATATG AGATTGATCGTGGGAATGAC ‑3（配列番号35）（b‑12）；

5‑ CTCT CATATG TTACAGCAATGGCGGAATGG ‑3（配列番号36）

尚、プライマー（a‑12）及び（b‑12）には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
【００７６】
鋳型DNAは、バチラス サブチリスは、NITE Biological Resource Center（NBRC）より入手したバチルス サブチリス

NBRC 14144から抽出した染色体DNAを用いた。ラクトバチ

ルス ラムノーサスは、NITE Biological Resource Center（NBRC）より入手したラクトバ
チルス ラムノーサス

NBRC 3425から抽出した染色体DNAを用いた。ラクトバチルス ブレ

ビスは、American Type Culture Collection (ATCC)より入手したラクトバチラス ブレビ
ス

40

ATCC 367から抽出した染色体DNAを用いた。シュードモナス プチダは、American Type Culture Collection (ATCC) より入手したシュードモナス プチダ

ATCC 47054から抽出した染色体DNAを用いた。エシェリキア コリは、エシェリキア コリ

K‑12 MG1655から抽出した染色体DNAを用いた。サッカロマイセス セレビシエは、NITE Biological Resour
ce Center（NBRC）より入手したサッカロマイセス セレビシエ

NBRC 10217から抽出した

染色体DNAを用いた。エンテロバクター クロアカエは、NITE Biological Resource Center（NBRC）より入手したエンテロバクター クロアカエ

NBRC 13535から抽出した染色体DN

Aを用いた。
【００７７】
実際のPCRは、サーマルサイクラー

GeneAmp PCR System 9700(アプライド・バイオシ

50

(19)

JP 5940985 B2 2016.6.29

ステムズ社製)を用い、反応試薬としてTaKaRa LA Taq（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。

10*) バチラス

サブチリスdec/BS遺伝子を増幅する場合はプライマー(a‑6) と (b‑6) の組み合わせ、ラクトバチルス

ラムノーサスdec/LR遺伝子を増幅する場合はプライマー(a‑7) と (b‑7) 、ラクトバチルス

ブレビスdec/LB遺伝子を増幅する場合はプライマー(a‑8) と (b‑8) の組み合わせ、シュードモナス

プチダdec/PP遺伝子を増幅する場合はプライマー(a‑9) と (b‑9) の組み合わせ、エシェリキア

コリdec/EC遺伝子を増幅する場合

はプライマー(a‑10) と (b‑10) の組み合わせ、サッカロマイセス

セレビシエdec/SC遺20

伝子を増幅する場合はプライマー(a‑11) と (b‑11) の組み合わせ、エンテロバクター ク
ロアカエdec/ECL遺伝子を増幅する場合はプライマー(a‑12) と (b‑12) の組み合わせで行った。
【００７８】

30

40【００７９】
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、バチラス サ
ブチリスdec/BS遺伝子の場合約2.3‑kb、ラクトバチルス ラムノーサスdec/LR遺伝子の場
合約2.1‑kb、ラクトバチルス ブレビスdec/LB遺伝子の場合約2.0‑kb、シュードモナス プ
チダdec/PP遺伝子の場合約0.6‑kb、エシェリキア コリdec/EC遺伝子の場合約1.6‑kb、サッカロマイセス セレビシエdec/SC遺伝子の場合約1.7‑kb、エンテロバクター クロアカエ
dec/ECL遺伝子の場合約2.3‑kbのDNA断片が検出できた。
【００８０】(4) アニリン生産遺伝子発現プラスミドの構築
アニリン生産遺伝子のpCRB207へのクローニング

50

(20)

JP 5940985 B2 2016.6.29

上記項(3)に示したPCRにより増幅したサッカロマイセス セレビシエ株由来 dec/SC遺伝
子を含む約1.7‑kbの DNA断片10μl及びPgapAプロモーターを含有するクローニングベクタ
ーpCRB2072μlを制限酵素NcoIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液
ゼ（タカラバイオ株式会社製）

1μl 、T4 DNAリガー

1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションE液とした。
得られたライゲーションE液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 5
3, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5
10% 寒天〕に塗布した。
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラス
ミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB207
約5.1‑kbのDNA断片に加え、サッカロマイセス セレビシエ株由来dec/SC遺伝子（ライゲー
ションE液）の場合、長さ約1.7‑kbの挿入断片が認められた。
サッカロマイセス セレビシエ株由来dec/SC遺伝子を含むプラスミドをpCRB207‑dec/SCと命名した（図1）。
【００８１】
アニリン生産遺伝子のpCRB209へのクローニング
上記項(3)に示したPCRにより増幅したバチラス サブチリス株由来dec/BS遺伝子を含む
約2.3‑kbの DNA断片、ラクトバチルス ラムノーサス株由来dec/LR遺伝子を含む約2.1‑kb

20の DNA断片、ラクトバチルス ブレビス株由来dec/LB遺伝子を含む約2.0‑kbの DNA断片、
シュードモナス プチダ株由来dec/PP遺伝子を含む約0.6‑kb のDNA断片、エシェリキア コ
リ株由来dec/EC遺伝子を含む約1.6‑kbの DNA断片、エンテロバクター クロアカエ株由来dec/ECL遺伝子を含む約2.3‑kbの DNA断片10μl及びPgapAプロモーターを含有するクローニ
ングベクターpCRB2092μlを各々制限酵素NdeIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液

1μl、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションF液、G液、H液、I液、J液及びK液とした。
【００８２】

30

得られた6種のライゲーションF液、G液、H液、I液、J液及びK液それぞれを、塩化カル
シウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリJ
M109を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵
母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
各々の培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpC
RB209約5.1‑kbのDNA断片に加え、バチラス サブチリス株由来dec/BS遺伝子（ライゲーシ
ョンF液）の場合、長さ約2.3‑kbの挿入断片が、ラクトバチルス ラムノーサス株由来dec/
LR遺伝子（ライゲーションG液）の場合、長さ約2.1‑kbの挿入断片が、ラクトバチルス ブ
レビス株由来dec/LB遺伝子（ライゲーションH液）の場合、長さ約2.0‑kbの挿入断片が、40

シュードモナス プチダ株由来dec/PP遺伝子（ライゲーションI液）の場合、長さ約0.6‑kbの挿入断片が、エシェリキア コリ株由来dec/EC遺伝子（ライゲーションJ液）の場合、長さ約1.6‑kbの挿入断片が、エンテロバクター クロアカエ株由来dec/ECL遺伝子（ライゲー
ションK液）の場合、長さ約2.3‑kbの挿入断片が認められた。
【００８３】
バチラス サブチリス株由来dec/BS遺伝子を含むプラスミドをpCRB209‑dec/BS、ラクト
バチルス ラムノーサス株由来dec/LR遺伝子を含むプラスミドをpCRB209‑dec/LR、ラクト
バチルス ブレビス株由来dec/LB遺伝子を含むプラスミドをpCRB209‑dec/LB、シュードモ
ナス プチダ株由来dec/PP遺伝子を含むプラスミドをpCRB209‑dec/PP、エシェリキア コリ
株由来dec/EC遺伝子を含むプラスミドをpCRB209‑dec/EC、エンテロバクター クロアカエ

50

(21)

JP 5940985 B2 2016.6.29

株由来dec/ECL遺伝子を含むプラスミドをpCRB209‑dec/ECLとそれぞれ命名した（図1）。
【００８４】(5) アニリン生産遺伝子導入株の構築
上述のプラスミド6種類pCRB209‑dec/BS、pCRB209‑dec/LR、pCRB209‑dec/LB、pCRB209‑d
ec/PP、pCRB209‑dec/EC、pCRB207‑dec/SC及びpCRB209‑dec/ECLを用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem.、Vol.54、443‑447(1990) 及び Res. Microbiol.、Vol.144、181‑185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカム R 株を形質転換し、カナマイシン 5
0μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プ
ラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記で作製のプラスミド

10

pCRB209‑dec/BS、pCRB209‑dec/LR、pCRB209‑dec/LB、pCRB209‑dec/PP、pCRB209‑dec/EC、
pCRB207‑dec/SC及びpCRB209‑dec/ECLの導入が認められた。
【００８５】
pCRB209‑dec/BSプラスミドを導入した株をコリネバクテリウム グルタミカム（Coryneb
acterium glutamicum）ANI‑1、pCRB209‑dec/LRプラスミドを導入した株をコリネバクテリ
ウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ANI‑2、pCRB209‑dec/LBプラスミドを導入した株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ANI‑3、
pCRB209‑dec/PPプラスミドを導入した株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebac
terium glutamicum）ANI‑4、pCRB209‑dec/ECプラスミドを導入した株をコリネバクテリウ
ム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ANI‑5、pCRB207‑dec/SCプラスミドを導20入した株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ANI‑6、pC
RB209‑dec/ECLプラスミドを導入した株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebact
erium glutamicum）ANI‑7と命名した。
【００８６】
コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ANI‑1は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2‑5‑8（郵便番号292‑0818）の独立行政法人製品評価技術基盤機
構

特許微生物寄託センターに寄託した（受託日：2010年11月16日、受託番号：NITE BP‑

1001）。
【００８７】
実施例２

コリネバクテリウム グルタミカム

アニリン生産遺伝子導入株のアントラニ30

ル酸からのアニリン生成実験
実施例１において作製したコリネバクテリウム グルタミカムANI‑1〜ANI‑7株を、カナ
マイシン50μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO 2g、(NH4)2SO4 7g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4
0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml
、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast ext
ract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、glucose 40 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに懸濁] に塗布し、33℃、20時間暗所に静置した。
【００８８】
上記のプレートで生育したコリネバクテリウム グルタミカムANI‑1〜ANI‑7株を、カナ
マイシン50μg/mlを含有したA液体培地10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて2400時間、好気的に振盪培養を行った。このようにして培養増殖されたそれぞれの菌体は、遠心分離 (4℃、15,000×g、10分) により菌体を回収した。得られた菌体を、10 ml のBT
液体培地〔(NH2)2CO 2g、(NH4)2SO4 7g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5
g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml〕で2回洗浄した後、OD610=10となる
ようにBT液体培地で懸濁した。この菌体懸濁液を容量15ml遠心管に入れ、還元条件下（酸化還元電位；‑450 mV）、基質としてアントラニル酸を25 mMとなるように添加し、33℃に保った水浴中で攪拌しながら6時間反応させた。サンプリングした反応液を遠心分離 (4℃、15,000×g、10分) し、得られた上清液を用いてアニリンをGC/MSによって定量した。
この結果、コリネバクテリウム グルタミカムANI‑1〜ANI‑7株は、還元条件下における

50

(22)

JP 5940985 B2 2016.6.29

反応において、下記表１のようにアニリンを生成していた。
【００８９】
【表１】

10

20

なお、カナマイシンを培地に添加しないこと以外は上記と同様の実験をコリネバクテリ
ウム グルタミカム野生株に対して行ったところ、アニリン生成は認められなかった。
【００９０】
実施例３

コリネバクテリウム グルタミカム

アニリン生産遺伝子導入株の4‑アミノベ

30

ンゾエートからのアニリン生成実験
実施例１において作製したコリネバクテリウム グルタミカムANI‑1〜ANI‑7株を、カナ
マイシン50μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO 2g、(NH4)2SO4 7g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4
0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml
、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast ext
ract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、glucose 40 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに懸濁] に塗布し、33℃、20時間暗所に静置した。
【００９１】
上記のプレートで生育したコリネバクテリウム グルタミカムANI‑1〜ANI‑7株を、カナ
マイシン50μg/mlを含有したA液体培地10mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて2400時間、好気的に振盪培養を行った。このようにして培養増殖されたそれぞれの菌体は、遠心分離 (4℃、15,000×g、10分) により菌体を回収した。得られた菌体を、10 ml のBT
液体培地〔(NH2)2CO 2g、(NH4)2SO4 7g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4.7H2O 0.5
g、0.06% (w/v) Fe2 SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4.2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml〕で2回洗浄した後、OD610=10となる
ようにBT液体培地で懸濁した。この菌体懸濁液を容量15ml遠心管に入れ、還元条件下（酸化還元電位；‑450 mV）、基質として4‑アミノベンゾエートを5 mMとなるように添加し、33℃に保った水浴中で攪拌しながら6時間反応させた。サンプリングした反応液を遠心分離(4℃、15,000×g、10分) し、得られた上清液を用いてアニリンをGC/MSによって定量し
た。

50

(23)

JP 5940985 B2 2016.6.29

この結果、コリネバクテリウム グルタミカムANI‑1〜ANI‑7株は、還元条件下における反応において、下記表２のようにアニリンを生成していた。
【００９２】
【表２】

10

20

なお、カナマイシンを培地に添加しないこと以外は上記と同様の実験をコリネバクテリ
ウム グルタミカム野生株に対して行ったところ、アニリン生成は認められなかった。
【産業上の利用可能性】【００９３】
本発明方法によれば、微生物を用いて実用的な効率でアミノ安息香酸からアニリンを製造することができる。

30

(24)
【図１】

【配列表】
0005940985000001.app

JP 5940985 B2 2016.6.29

(25)JP 5940985 B2 2016.6.29

フロントページの続き
審査官 濱田 光浩(56)参考文献 特開２００６−０５０９１４（ＪＰ，Ａ）(58)調査した分野(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ

１／２１

Ｃ１２Ｐ

１３／００

Ｃ１２Ｎ

１５／０９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

10