㹝㹝㹝㹝 研究報告 㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝㹝B

環境 DNA を用いた生物調査方法の検討（一財）九州環境管理協会 環境部陸生生物調査課 大城戸博文

環境技術課 大井和之

水生生物調査課 柴田幸次

る。環境中に漂っている DNA は“環境 DNA”と呼ばれ、水１．はじめにや土壌などの試料から抽出される。このように対象となるフィールドで動物を調査する場合、対象とする種類によ生物を採集するのではなく、採取した水や土壌の分析からって調査方法や調査時期、時間帯などを適切に設定しなけ

調査地に調査対象生物が生息しているかどうかを特定すればならないため、そこにどのような種類が生息しているる”環境 DNA 分析”が新しい方法として注目されている 1)。

かを事前に予測する必要がある。この予測は、対象地域や生物調査に環境 DNA 分析を活用すると、①現地では試近隣地域で過去に実施された調査結果や地形、河川形態、料となる水や土壌の採取作業を行うだけでよいので、サン現地の踏査結果を元に行い、生息が予測される種類に応じプリングにかかるコストが小さい、多数の地点で試料を採て現地調査を計画する。

取して分布を把握することができる、②生息個体を採集す

水生動物調査を例に挙げると、実際の現地調査では投網る必要がないため、希少種を含む生息種を傷つけない、なや手網など生息する魚の種類に対応した様々な漁具を使どの利点が考えられる。その一方で、環境 DNA 分析は発用し、採集する。採集した生物の中には、成体の他十分に展途上の技術であり、試料の分析コスト，検出力や定量性成長していない仔魚や稚魚も含まれ、外見では種類の判別等，検証しなければならない課題も多い。

が困難な場合もある。卵であれば種類を特定することがさ

当協会ではこれまでも生物の糞や魚のヒレ等からのらに難しくなる。これまでの環境調査では、種まで判別でDNA 分析にあたり、効率的なプライマーの設計や実験手きない場合は、“○○科（属）の一種”と記録することが多々順の構築により DNA 分析のコスト削減や検出力の検証をあった。

行ってきた。環境 DNA 分析は短時間・少人数による試料

一方、生物は、体内に遺伝情報を記録した DNA（デオ採取のみで広範囲の生息種を把握できるなど優れた部分キシリボ核酸（Deoxyribo-nucleic Acid））を持っており、そがあることから、我々もこの分析に取り組み、環境調査への遺伝情報は種類により異なっている。近年は、分析キッ適用できるか検討を行った。

トの普及や分析器の進歩により、DNA 分析手法が一般的に浸透してきており、これを活用することにより、仔魚や稚魚、卵などのように外見では種類の判別が困難な場合でも、種類を判別することが可能となってきた。当協会でもDNA 分析を行い、種類を特定する機会が増えているが、分析にあたっては、まだ技術上の課題も多く、精度の高い同定技術の必要性を感じているところである。
生物が生息している環境中には、その生物から剥がれ落ちた皮膚の細胞や腸の粘膜を含む糞が漂っている。この浮遊物に DNA が含まれていれば、採集、分析して、そこに図１

どのような生物が生息しているか調べることが可能とな

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ヒナモロコ

ニュアルに従って DNA を抽出した。また、土試料は約２．材料と方法200 g を QIAGEN 社の QIAa

２．１ 研究対象種

DNA toolini kit を用いて同様に行った。

研究対象種はヒナモロコ( Aphyocypris chinensis )とした

DNA 抽出の過程の概略を以下に示す。

（図１）。本種は、コイ目コイ科の淡水魚で、環境省・福（1）フィルター上の懸濁粒子、標本切片や土を界面活性

岡県のレッドデータブックでいずれも絶滅危惧 IA 類、佐剤とタンパク質分解酵素によって溶かし、DNA を含

賀県のレッドデータブックで絶滅危惧 I 類とされているむ溶液を調製した。

希少種である。その生息は、博多湾流入河川と有明海流入河川で記録されているが、現在では生息地は極めて限定的（2）この溶液にアルコールなどを混ぜ、シリカメンブレとなっている。水中に生息しており採取が難しいため、生ンフィルターに通すことで DNA を捕捉し、不純物息調査に環境 DNA 分析を適用する意義がある種と判断しを除去した。
（3）シリカメンブレンフィルターに吸着した DNA をバて研究対象とした。

ッファー溶液で洗浄したのち、アルコールを含まな２．２ 試料の採取と保存い水で溶出させ分析溶液とした。

環境 DNA を採取する試料は、水試料 3 検体と土（底泥）
次に、得られた分析溶液に DNA が含まれているか検証

試料 1 検体とした。水試料は、平成 26 年 1 月 11 日に対象するため、DNA 濃度マーカーとともに 2%LO3 アガロース種が生息している人工池、生息していないと考えられる河ゲルを用いて 100V で 20 分間電気泳動を行い、エチジウ川、および対象種が飼育されている水槽から、それぞれ濁ムブロマイドで染色したのち、写真撮影した。っていない箇所の上澄み液 3L をポリ瓶に採取した。土試料は、同日に人工池の底泥（池泥）約 10g を薬さじを用い

２．３．２ ヒナモロコに特異的なプライマーのてポリ袋に採取した。採取した試料は、クーラーボックス設計で保冷して持ち帰った。
水試料は、採取当日に 1

研究対象としたヒナモロコのミトコンドリア DNA は、ガラス繊維フィルターで濾全配列が決定されている 2）。これらを参考に、ヒナモロコ過し、DNA を含んだ浮遊物をフィルター上に捕集した。

として判別可能な DNA の一部を特異的に増幅できるプラ捕集した浮遊物が他のものと混ざらないようにフィルタ

イマー ※を設計することとし、プライマー設計用 web プローを 1 つずつチャック付きポリ袋に入れ、DNA が分解せグラム「Pri er3 lus」を用いてヒナモロコのミトコンドリず長期間の保存に適しているとされる−20℃で DNA 分析を行うまで保存した。土試料はそのまま−20℃で保存した。

ア DNA 配列の中からプライマー候補配列を探した。探す際の留意点としては、プライマー候補配列が近縁の別種のこのほか、分析対照として用いるため、飼育しているヒDNA を増幅しないよう、ヒナモロコと同じ DNA 配列をナモロコのヒレの一部を切り取り、アルコールに浸漬し保有するコイ科のニッポンバラタナゴ、オイカワの DNA を存した。

比較し、ヒナモロコに特有の配列をプライマーとして採用

２．３ DNA 分析した。チトクローム b 遺伝子領域(cytb)と制御領域(CR)から合計 3 組のヒナモロコのプライマーを設計した。プライ２．３．１ DNA 抽出と電気泳動

マーの配列を表１に示す。
水試料は、浮遊物を捕集したフィルターを約 5四方

２．３．３ PCRに切り取ったものを、標本切片は約 5 g を切除したものを、QIAGEN 社の DNeasy Blood & Tissue kit を用いて、マ※PCR（Poly erase C ain Reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）

DNA 複製反応の起点となる 20 塩基程度の合成一本鎖 DNA 断片。

42

表１

設計したプライマーの塩基配列名称配列向きAc_cytb_1FCGGATTTTAACCGAGACCAA

順方向

Ac_cytb_1R

CCTCACGGAAGAACATAGCC

逆方向

Ac_cytb_2F

CCAAACTTATTAGGAGACCCAGA

順方向

Ac_cytb_2R

TCAGAACAAGAATTGAGTGATGG

逆方向の DNA から目的配列を大量に増幅できる可能性があった

Ac_CR_F

TTTGCCCTATTCCTCATCCTT

順方向

ため、他の試料同様に河川試料も PCR の対象とした。

Ac_CR_R

GGGATTAATCTATTTCCCAGGTC

逆方向

図３

分析試料（左側）と濃度マーカー（右側）３．２ PCR による増幅結果
今回作成したヒナモロコに特異的なプライマー3 組を用いて PCR 法で増幅した結果、飼育水槽の環境 DNA からヒナモロコの DNA が検出でき、その塩基長は標本切片と同じであった。その結果を図４に示す。一方、ヒナモロコが放流されている人工池の水と池泥の環境 DNA からは、いずれのプライマー組においてもヒナモロコの DNA は検出できなかった。ヒナモロコが生息していないと考えられていた河川の環境 DNA からも PCR で増幅は認められなかった。

図２

PCR のしくみ

また、図４に示す 3 つのプライマー間で輝度の違いはほとんどなく、今回作成したヒナモロコに特異的なプライマとは、プライマーと DNA、耐熱性 DNA 合成酵素などを混ー3 組の検出力は同等であった。

ぜた溶液を周期的に加熱・減熱し温度を変えることで、図２に示すように DNA の解離→プライマーの結合→相補鎖４．考察の伸長反応を繰り返して DNA の 1 対のプライマー配列にはさまれた特定の部位を増幅する方法である。今回は飼育水槽の環境 DNA からヒナモロコ DNA が検出（増94℃30 秒→57℃45 秒→72℃1 分を 1 サイクルとして、そ幅）できたことから、生体を捕獲・観察しなくても DNAれを 35 回繰り返し、対象とする部位を増幅させた。反応分析によって特定の生物の生息を確認できることがわか終了後、増幅された DNA を含む溶液の一部を取ってアガった。しかし、ヒナモロコが放流されている人工池の環境ロースゲル電気泳動を行い、目的の DNA 断片の増幅の有DNA では、電気泳動により DNA の存在が認められたも無を確認した。のの、PCR による増幅ではヒナモロコ DNA は検出されず、現時点ではプライマー設計が妥当であったかを含め、環境

３．結果

DNA 分析の検出力が十分とはいえないことがわかった。
ヒナモロコ DNA が検出された飼育水槽の環境 DNA 中の３．１ 分析溶液の電気泳動

DNA 濃度は、人工池の水や泥から得た DNA 濃度よりも分析溶液の電気泳動の結果、図３に示すように、濃度が低く（図３）、藻類など他の生物の DNA が混入しているこ

薄いものの、人工池の水試料（池水）、飼育水槽の水試料とが PCR 反応に悪影響を及ぼしている可能性がある。そ（水槽）、人工池の土試料（池泥）のいずれからも DNA がのため、採水量の不足や PCR 反応最適条件の未解明が課抽出されたことが確認できた。河川の浮遊物からは目視確題となった。今後、微量 DNA から確実に増幅が行われる認できる濃度の DNA が得られなかったが、PCR では微量ように適切な採水量や PCR 反応条件の検討を進めていき43

たい。一方、他のコイ科魚類が生息すると推定される河川ての DNA を分析するには、魚類一般に同じ塩基配列になの環境 DNA からも PCR 増幅がみられなかったことは、る領域をプライマーとして PCR を行い、その PCR 産物を他のコイ科魚類に反応して誤判定する可能性は低いこと

次世代 DNA シーケンサーで分析してどの種の塩基配列がを示している。

何%含まれるか明らかにする、という方法が考えられるが、今回、分析に用いた水試料は 3L で、1 枚のフィルター

現時点ではコストや分析精度の点で環境調査での実用にで浮遊物を捕集して分析に供したが得られた DNA の濃度は至っていない。

はかなり薄いものであった。分析の精度をあげるためには、広島大学や神戸大学などの研究者によって、環境 DNA1 地点の試料から複数回の分析を行う必要があるが、そのを用いた生物調査手法の確立に向けた研究が積極的に行ためにはろ過量を増やさなければならない。また、DNA 抽

われ、例えばため池の水中の DNA による外来種（ブルー出のコスト削減と効率化のためには、キットを使わずにフギル）の分布調査では目視観察よりも効率的に把握するこィルターから効率的に DNA 抽出を行う方法の確立が必要とができている 3）。このことは、捕獲が難しい水生動物のである。このように今後、環境 DNA からの対象種 DNA の分布を把握する上で、環境 DNA を用いた分析が有望な技検出効率を上げるために、サンプル量を増やして反復分析術であることを示している。当協会でも希少種や外来種のを行うこと、DNA 抽出および PCR 反応の方法を改良する動物調査における手法として、新しい技術の獲得や調査精ことや定量 PCR（ごく少量の DNA でも定量的に増幅でき度の向上に努めていきたい。

る PCR 法）を導入することを検討する。
今回試みた特定の水生生物の検出を目的とした環境

参考文献

DNA 分析では、サンプリングは 1 地点あたり十数分で済1）Mina oto T., et al. ur eillance o is s ecies co

み、多くの地点での調査を効率的に進めることができた。

ositionusing en iron ental DNA. Li nology 13(2), 193-197.

また、DNA 分析は同時に複数検体を処理することで効率(2012)的に進めることができ、20 検体程度であれば、DNA 抽出、

2)

PCR 反応と電気泳動によるチェックまで全て行って約 1.5

aito , .,etinterrelations i s o日の工程であった。1 河川の上流から下流まで、目視観察

Ostarioで 15 地点の調査を行うと少なくとも 10 人日以上の工程

al.,Mitogeno ice olution

andt e Cy rini or es (Actino terygiiysi) t e irst e idence toward resolution oig er-le el relations i s o t e world s largest res water is cladeになることを考えると、環境 DNA 分析によって非常に効

based on 59 w ole

率的に分布調査を行うことができる。特に、捕獲すること

itogeno e se uences, J. Mol. E ol., 63(6), 826-841 (2006).

が環境攪乱につながる希少種調査においては、生体を傷つ

3）Taka ara T., et al., sing en iron ental DNA to esti ate t e

けることなく生息確認できることは大きなメリットであdistribution o an in asi e is s ecies in onds, PLO ONE,る。

8(2), e56584 (2013).

なお、生物相を把握するためにその場に生息する魚類全図 4 PCR で増幅された DNA44