日本大学歯学部紀要 37，7‑14，2009

チタンイオンが骨芽細胞株（Saos‑２）の生細胞およびサイトカイン産生に及ぼす影響（第４報）
横瀬勝美

桑田文幸

Effects of titanium ion on cell viability, IL‑1α and IL‑6 production
by the human osteosarcoma cell line, Saos‑2
Katsumi Yokose and Fumiyuki Kuwata
Abstract
The present study investigated the effects of titanium ion on cell viability and productionof interleukin 1α (IL‑1α) and interleukin 6 (IL‑6) using the human osteosarcoma cell line,
Saos‑2. Cells were cultured in DM EM supplemented with 10% FBS and antibiotics for 24 h
before the addition of 0.1 mM of TiCl . Cell viability was assessed following incubation for
1, 2, 3 or 4 weeks by a colorimetric assay using a LDH cytotoxic test. In addition, theproduction of IL‑1αand IL‑6 by these cells was examined using ELISA.The addition of 0.1
mM titanium ion did not alter cell viability during 1 week,but induced cell did not death after
more than 2 weeks.M oreover,the addition of titanium ions had little effect on IL‑1αand IL‑6 production in these cells. These results indicate that additions of 0.1 mM titanium ion
induces osteosarcoma cell did not death rather than cytokine production.
Keywords: cell viability,IL‑1αproduction,IL‑6 production,osteosarcoma cell,titanium ion

緒ら浸出する体液・食べかすによる電解質の存

言

在・細菌が産出する酸や硫化水素・温度や酸素の濃淡などの変化・咬む力が働く部分の金属に歯科治療において歯が喪失した場合，歯科補綴修復物やインプラント治療により歯を補う。

起こる応力腐食や咬耗などがあり，各種の金

近年インプラント治療が普及し，歯科用金属は属がイオンとして溶出要因が共存していると言

生体中に長期間埋入される。このように金属材える。

料と生体は密接に接触するようになり，局所的チタンは歯科用イオンプラント材料として優為害作用に加え全身的為害作用までに至っていれた実績を有しており，有床義歯，架橋義歯やるとえられる。金属材料は口腔内で唾液や飲欠損補綴材料としても幅広く使用されている食物などが電解質として作用し，pH 変化や各が，そのような環境下で使用されている歯科用種イオン等による腐食性変化を生じる等，様々金属の中でも特に，生体親和性に優れている金な要因が複雑に絡み合い極めて過酷な環境にあ属の一つとしてよく知られている。しかし，そると言える。口腔内にはそれ以外にも，歯肉かのインプラント材として使用されている金属に

日本大学歯学部化学教室
日本大学歯学部総合歯学研究所機能形態部門〒 101‑8310 東京都千代田区神田駿河台１‑８‑13

Department of Chemistry, Nihon University School ofDentistry
Division of Functional M orphology, Dental Research(受理：2009年９月 30日）

Center, Nihon University School of Dentistry
1‑8‑13 Kanda‑Surugadai, Chiyoda‑ku, Tokyo 101‑8310, Japan7

日本大学歯学部紀要 37，7‑14，2009

よるアレルギーを訴える患者が近年増え，臨床５％CO の湿潤条件下で培養を行った。

報告も増加している

２. 細胞障害率（経時的変化）。

著者らは，先に歯科用金属の金属イオンが口生細胞へのチタンイオンによる経時的変化の腔軟組織，とくに上皮組織におよぼす影響を解影響を調べるために，６穴プレートに Saos‑２明する第一ステップとして，歯科補綴物の成分細胞１×10 個/cm を播種し，500μl の DMEMであるクロムおよびニッケル，歯科修復物の合（10％FBS および抗生物質を含有）で培養を開金中に存在する亜鉛について，ヒト口腔由来上始した。Saos‑２細胞播種後，24時間後にチタン皮細胞株（Ca 9‑22）の生細胞数および DNA 合イオン（TrCl ）を含む DMEM（10％FBS およ成能に及ぼす影響について報告した。また，び抗生物質を含有）に交換した。生細胞へのチチタンイオン高濃度，短時間における生細胞へタンイオン経時的変化の影響を調べるためにその経時的変化を調べた。チタンは歯科インの作用時間をそれぞれ１，２，３および４週間

プラントに代表されるような金属であり，深部として培養を行った。なお，培地中のチタンイ組織内に長期埋植する生体材料である。
しかし，オン（TiCl ）は終末濃度 0.1mM になるようにチタンの症例報告などから解るように，チタン添加した。チタンイオンを作用させた後，無血インプラント装着後数年してアレルギー症状が清の DMEM と交換し 24時間培養後，上清を回現れ，その多くが遅延型である。使用されてい収する。回収した上清は 3000rpm，５分遠心し，る金属は長期間深部組織内に埋入されることかLDH‑Cytotoxic Test（和光純薬）を用い細胞ら，本研究はヒト骨肉腫由来の株化骨芽細胞障害率を比色測定した。また，実験は２連で行（Saos‑２）を使用し，低濃度のチタンを５日間い，結果は平まで添加し，生細胞数への経時変化およびサイ化を比較するため，チタンイオン無添加の場合トカイン産生に及ぼす影響ついて検討を行っをコントロールとし，DMEM（10％FBS およびた抗生物質を含有）で４週間培養を行った。

。

値で示した。金属イオン経時変

３. IL‑1αおよび IL‑６産生

本研究ではチタンの影響をヒト骨肉腫由来の株化骨芽細胞（Saos‑２細胞）を使用し，更に長材料および方法の２. と同様に，６穴プレー時間添加し生細胞数への経時的変化およびイントに Saos‑２細胞を播種後，24時間後，チタンターロイキン‑1α（IL‑1α）およびインターロイオン（TiCl ）の濃度，0.1mM を含む DMEM

イキン‑６（IL‑６） の産生に及ぼす影響についに交換し，その作用時間をそれぞれ１，２，３て検討した。

および４週間として培養を行った。その後，無血清の DMEM と交換し，24時間後それぞれの材料および方法培養上清を回収後，IL‑1α定量用 ELISA キット（BioSource）お よ び IL‑６ 定 量 用 ELISA

１. 細胞培養
実験には骨芽細胞として理化学研究所細胞開キット（BioSource）を用いて上清中のサイトカ

発 銀 行 か ら 購 入 し た Saos‑２ 細 胞 を 使 用 い

イン量を定量した。コントロールは材料およびた方法の２. と同様である。

。Saos‑２細胞は，Dullbeccoʼ
s modified

４. Reverse transcription‑polymerase chain

Eagle medium（DM EM ，旭テクノグラス）に，reaction (RT‑PCR)

10％ウシ胎児血清（FBS，旭テクノグラス），50U/ml ペニシリンおよび 50μg/ml ストレプト

材料および方法の２. と同様に，６穴プレーマイシン（Sigma）を加えた培地を用い，37°
C，

トに Saos‑２細胞を播種後，24時間後，チタン8

骨芽細胞とチタンイオンイオン（TiCl ）の濃度，0.1mM を含む DM EM

４週間では 20.0％の細胞障害率であった。チタに交換し，その作用時間をそれぞれ１，２，３ンイオン添加後ではコントロールから徐々に細および４週間として培養を行った。その後，そ胞障害率が増加した。各週ごとに細胞状態をコ

れぞれ新たに無血清の DM EM と交換し，さらントロールとチタン作用時間（コントロール，に 24時間培養後，細胞層を回収し，全 RNA を１週間〜４週間）を比較し，細胞状態を図２〜９抽出した。得られた RNA から，cDNA を作成に示した。各週のコントロールとチタンイオン

後，IL‑６，IL‑６レセプター（IL‑6R）および添加を比較するとチタンイオン添加していると内部標準として GAPDH のプライマーを用い細胞の増殖がやや劣っている。て，サーマルサイクラー（PE Applied Biosys-

２. IL‑1α産生により，DNAtems: Gene Amp PCR System）

コンフルエントに達した後の Saos‑２細胞のの変性を 94°
C 30秒間，アニーリング 56°
C 30秒

IL‑1α産生におよぼすチタンイオン（TiCl ）間，プライマーの伸長を 72°
C 30秒間行い，これ0.1mM 濃度の経時的変化の影響を調べた結果を１サイクルとし，30〜40サイクル増幅した。

を第１表，第 10図に示した。

増幅した PCR 産物は，1.5％アガロースゲルをSaos‑２細胞の IL‑1α産生におよぼすチタ用いて電気泳動後，エチジウムブロマイドで染ンイオン（TiCl ）濃度の経時的変化の影響を調色後，紫外線照射下で写真撮影した。

成績

１. 細胞障害率（経時変化）
Saos‑２細胞にチタンイオン（TiCl ）0.1mM濃度を添加した影響を第１図（経時的変化（細胞障害率）に示した。
第１図では，チタンイオン（TiCl ）濃度 0.1mM ，作用時間１，２，３および４週間として培養を行った。チタンイオン添加により細胞障害率 は，コ ン ト ロール で は 5.8％，１ 週 間 で は第２図 Saos‑２細胞１週間後の control形態

6.7％，２週間では 18.5％，３週間では 19.8％，

第１図 Saos‑２細胞の細胞障害率に及ぼすチタンイオンの影響

第３図9

チタンイオン 0.1mM 1週間作用させたときの細胞形態日本大学歯学部紀要 37，7‑14，2009

べ た 結 果，IL‑1α産 生 量 は チ タ ン イ オ ン

用させ培養した場合は 1.03pg/ml，２週間で（TiCl ）濃度 0.1mM コントロールは測定検出

1.58pg/ml，３週間で 3.06pg/ml，４ 週 間 で限界以下のため測定不可であったが，１週間作2.94pg/ml，になり，徐々に増加した。

第７図

第４図 Saos‑２細胞２週間後の control形態

チタンイオン 0.1mM 3週間作用させたときの細胞形態

第５図

チタンイオン 0.1mM 2週間作用させたときの細胞形態

第８図 Saos‑２細胞４週間後の control形態

第６図 Saos‑２細胞３週間後の control形態

第９図

10

チタンイオン 0.1mM 4週間作用させたときの細胞形態

骨芽細胞とチタンイオン

第１表 Saos‑２細胞の IL‑1αの産生に及ぼす
チタンイオンの影響

第２表 Saos‑２細胞の IL‑６産生に及ぼすチタンイオンの影響

IL‑1α量（pg/ml)

IL‑６量(pg/ml)

作用時間
１week
２week
３week
４week

平値

作用時間

Cont. ＜0.80 ＜0.80 ＜0.80
0.801
1.259
1.03
Ti

１week
２week

Ti

Cont. ＜0.80 ＜0.80
1.564
1.588

1.58

0

Cont. ＜0.80 ＜0.80
3.234
2.88
Ti

3.06

Cont. ＜0.80 ＜0.80
2.99
2.89
Ti

02.94

0３week４week

第 10図 Saos‑２細胞の IL‑1αの産生に及ぼすチタンイオンの影響

平値

Cont. ＜0.80 ＜0.80
1.031
0.981
Ti

01.01

Ti

Cont. ＜0.80 ＜0.80
1.257
1.37

1.31Cont. ＜0.80 ＜0.80
1.483
1.707
Ti1.60Cont. ＜0.80 ＜0.80
2.99
2.89
Ti02.9400

第 11図 Saos‑２細胞の IL‑６産生に及ぼすチタンイオンの影響

３. IL‑６産生
Saos‑２細胞の IL‑６産生におよぼすチタンイオン（TiCl ）濃度の経時的変化の影響を調べた結果を第２表，第 11図に示した。
Saos‑２細胞の IL‑６産生におよぼすチタンイオン（TiCl ）濃度の経時的変化の影響を調べた結果，IL‑６産生量はチタンイオン（TiCl ）濃度 0.1mM ，１週間作用させ培養した場合で1.01pg/ml，２週間で 1.31pg/ml，３ 週 間 で第 12図1.60pg/ml，４週間で 2.94pg/ml となった。IL‑６産生量は時間と共に徐々に増加がみられた。

チタンイオン 0.1mM 作用させたときの遺伝子発現‑６，IL‑6R の遺伝子発現に及ぼす経時的変化

４. IL‑６，IL‑6R の遺伝子発現に及ぼす Tiのの影響を第 12図に示 し た。内 部 標 準 と し て影響

GAPDH を用いた。

Saos‑２細胞にチタンイオン（TiCl ）が IL
11日本大学歯学部紀要 37，7‑14，2009

ト骨肉腫由来の株化骨芽細胞（Saos‑２）を使用

チタンイオン添加後は IL‑６の遺伝子発現がし，長期間作用させた検討を行った。

見られた。また IL‑６レセプターの遺伝子発現生細胞数に及ぼす影響を生細胞障害率の測定が見られた。に は LDH 測 定 法 を 用 い た。本 測 定 の LDH

察‑Cytotoxic Test は細胞毒性を簡便に測定でき歯科治療には様々な歯科用金属が使用されてるばかりでなく，細胞が細胞膜に障害を受けているが，それらの多くは合金として歯科用修復細胞から遊離した LDH（乳酸脱水素酵素）活性物，補綴物，矯正用材料等に使われている。本を測定することができ，生理活性物質による細研究で使用したチタンは歯科治療や歯科技工技

胞障害や細胞性免疫による細胞障害，補体依存術の発展にともない歯科用金属として広く使わ性細胞障害，抗体依存性細胞障害の他，細胞のれるようになった。そして歯の硬組織への局所生存率にも利用できることからこの方法を用い的修復だけでなく，歯科インプラントに代表さた。コントロールは血清培地で４週間培養を行れるような深部組織内に長期埋植する生体材料い，上清を回収する前の 24時間を無血清培地ととして使用されるようになった。歯科において交換し上清を回収し測定を行った。同時に血清チタンは歯科用インプラント材として優れた実培地中で細胞状態を観察した。

績を有しているが，近年チタンインプラント材

細胞障害率は第１図に示したように，チタンが原因で発症したと思われる金属アレルギーのイオン添加後ではコントロールから徐々に細胞症例報告があり，生体適合性が優れている障害率は４週間までは増加した。チタン作用時チタンでも金属アレルギーを引き起こす患者が間後の細胞状態をコントロール，１週間〜４週増えている。口腔内の様々な要因が総補的に起間ごとの細胞状態（図２〜９）を示した。各週きている可能性があるが，そのメカニズムの一のコントロールとチタンイオン添加した状態とつとして，金属の一部がイオン化し，これが表を比較観察すると，チタンイオンを添加してい皮や粘膜上皮のケラチンなどのタンパクと結合ると細胞の増殖がやや劣っている。

することによって異質のタンパク（抗原）となサイトカイン産生に及ぼす影響をチタンイオり，マクロファージなどに取り込まれ，様々なンの経時的変化にあわせて検討した。インター免疫反応が起こり遅延型アレルギーとして発症

ロイキン‑1α（IL‑1α）は単核球が産生する歯すると報告されている。このようにチタン骨細胞刺激因子の主成分であることが明らかには生体親和性に優れているとされてきたが，金されて以来，IL‑1αの骨代謝・骨疾患との関連属アレルギーの症例報告も多く，チタンが生体が検討されて，最も強力な骨吸収促進因子の１内で様々な作用をしているとつである。IL‑1αはきわめて低濃度で，ヒト骨えられる。

著者らは，歯科用インプラント材として使用髄細胞より歯骨細胞を誘導する作用をもち，更されているチタンについて口腔由来上皮細胞株に骨芽細胞を介して間接的に歯骨細胞の活性化（Ca 9‑22）を使用しチタンの影響を検討し報告を促進する。一方，IL‑1αはヒト骨芽細胞のしたDNA 合成促進作用を示し，コラーゲン合成に。本研究ではチタンの影響が遅延型でもあり，歯科インプラ関しては少量で促進，大量で抑制作用を示すた

ントに代表されるような深部組織内に長期埋植め，チタンイオンが Saos‑２細胞の IL‑1αのする生体材料でもあるため，生細胞数への経時産生を促進するかどうか調べた。その結果，変化およびサイトカイン産生に及ぼす影響をヒSaos‑２細胞の IL‑1α産生におよぼすチタンあるという症例報告

12骨芽細胞とチタンイオンた結果，IL‑1α産生量は表１，第 10図に示した

biomaterials. Biomaterials 7, 163‑167２) 井上昌幸，山中秀夫編著（1993）歯科と金属ア

ように，各週コントロールは測定検出限界以下

レルギー．デンタルダイヤモンド社，東京

イオン（TiCl ）濃度の経時的変化の影響を調べ

３) 佐藤温重編（1997）歯科材料の副作用と安全性．のため測定不可であったが，１週間以降は徐々学健書院，東京に増加した。しかし，産生量は少なく 0.1mM４) John CW (2000) Biocompatibility of dentalの低濃度ではチタンの添加により，少量ではあえ併せ，casting alloys. Areview J Prosth Dent 83 (2),
223‑234

IL‑６産生量の測定を行った。IL‑６は B 細胞刺５) 五島孜郎，糸川嘉則（1994）生体内金属元素．

るが IL‑1α産生量があったことを激因子として純化されたサイトカインであるが，骨芽細胞

光生館，東京，155‑156

でも産生され，IL‑1α，TNF，

６) 不破敬一郎（1982）生体と重金属．講談社，東京，52‑53

PTH，などによりその産生が促進され間接的に破骨細胞の活性化をも促進するため，チタンイ

７) Bridgewater LC, Manning FC, Woo ES,

オンが Saos‑２細胞の IL‑６産生を促進するか

Patierno SR (1994) DNA polymerase arrese

どうかを調べた。その結果，Saos‑２細胞のチタ

by adducted trivalent Chromium. 9 (3), 122‑133ンイオン（TiCl ）添加による，IL‑６産生量は，
表２，第 11図に示したように IL‑６産生量は時

８) 横瀬勝美，桑田文幸（2001）口腔由来細胞株（Ca 9‑22）の生細胞数および DNA 合成能に及ぼす金属イオンの影響．日大歯紀９，37‑44間と共に徐々に増加がみられた。
Saos‑２細胞の IL‑６産生量はチタンイオン９) 横瀬勝美，桑田文幸（2002）亜鉛イオンが口腔低濃度（0.1mM ）添加後，IL‑1αが徐々に増加由来上皮細胞株（Ca 9‑22）の生細胞数，DNA合成能およびサイトカイン産生に及ぼす影響．

し，それに対処するように Saos‑２細胞の IL

日大歯紀 30，49‑58‑６産生量も僅かずつ増加した。
以上のことからチタンイオンによるヒト骨肉10) 横瀬勝美，桑田文幸（2003）クロムイオンが口腫由来の株化骨芽細胞への影響は，長時間チタ腔由来上皮細胞株（Ca 9‑22）の生細胞およびサイトカイン産生に及ぼす影響．日大歯紀 31，９ンを作用させた場合サイトカイン産生を増加さ‑16せた。炎症性サイトカインである IL‑1α，IL‑６11) 横瀬勝美，桑田文幸（2004）チタンイオンが口は破骨細胞性骨吸収の促進作用をもつため，骨腔由来上皮細胞株（Ca 9‑22）の生細胞およびサ吸収サイトカインともよばれていることから，イトカイン産生に及ぼす影響．日大歯紀 32，

本研究により Saos‑２細胞がチタンイオンによ25‑34

り産生された IL‑1α，IL‑６が破骨細胞に影響を及ぼす可能性が12) 横瀬勝美，桑田文幸（2005）チタンイオンが口腔由来上皮細胞株（Ca 9‑22）の生細胞およびサえられる。

イトカイン産生に及ぼす影響（第２報）．日大歯謝

辞紀 33，19‑2813) 横瀬勝美，桑田文幸（2006）チタンイオンが骨本研究の一部は平成 20，21年度日本大学歯学芽細胞株（Saos‑２）の生細胞およびサイトカイ部佐藤研究費によって行われたことを付記す

ン産生に及ぼす影響．日大歯紀 34，７‑14る。

14) 横瀬勝美，桑田文幸（2007）チタンイオンが骨文芽細胞株（Saos‑２）の生細胞およびサイトカイ

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