日大歯学 ，97（1），7-11，2023

原著

Propiece IL-1αの核内への輸送機構と核内機能石山雄一

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻

応用口腔科学分野

日本大学歯学部病理学講座（指導：浅野正岳 教授，角田麻里子 助教）

要旨【目的】precursor（pIL-1α）の N 末端側は propiece IL-1α（ppIL-1α）と呼ばれる。本研究では，ppIL-1αの核内への輸送機構と核内機能について検討した。
【方法】緑色蛍光タンパク質（GFP）タグ付き IL-1αを導入した HeLa 細胞を用いて，ppIL-1α，pIL-1α，mIL-1αの細胞内局在を観察した。ppIL-1αの核への輸送機構は importin β阻害薬を用いて検索した。また，ppIL-1αの核内機能は，IL-8 mRNA の発現変化を real-time PCR によって検討した。
【結果】蛍光顕微鏡による観察の結果，mIL-1αは細胞質にびまん性に，pIL-1αと ppIL-1αは主に核に局在していることがわかった。ppIL-1α transfectant に importin β阻害薬を作用させても，ppIL-1αの核局在に何ら影響を及ぼさなかった。HeLa 細胞における ppIL-1αの強制発現は IL-8 mRNA の発現を増強した。
【結論】ppIL-1αの核輸送は，importin β非依存的であることが解った。また，ppIL-1αは核内で IL-8遺伝子発現の増強に寄与していることが明らかとなった。
キーワード：propiece IL-1α（ppIL-1α），alarmin，IL-8

The mechanism of ppIL-1α nuclear transport and its function
Yuichi Ishiyama
Nihon University Graduate School of Dentistry, Major in Applied Oral Sciences
Department of Pathology, Nihon University School of Dentistry（Directors: Prof. Masatake Asano, Assist. Prof. Mariko Tsunoda）

Abstract【Purpose】N-terminal domain of precursor (p) IL-1α is designated as propiece (pp) IL-1α. The purpose of thisstudy was to elucidate the mechanism of ppIL-1α nuclear transport and its function.
【Methods】Subcellular localization of ppIL-1α, pIL-1α, and mIL-1α was observed in HeLa cells transfected withgreen fluorescent protein (GFP) -tagged IL-1α. ppIL-1α nuclear transport mechanism was investigated using importin
β inhibitor. ppIL-1α nuclear function was examined by measuring the IL-8 mRNA expression using real-time PCR.
【Results】Microscopic examination revealed diffuse cytoplasmic localization of mIL-1α. On the other hand, pIL-1α
and ppIL-1α were localized mainly in the nucleus. Incubation of ppIL-1α transfectant with importin β inhibitor did
not affect its nuclear localization. Forced expression of ppIL-1α enhanced IL-8 mRNA expression.
【Conclusion】Inhibition of importin β did not affect the transport of ppIL-1α into the nucleus. In addition, ppIL-1α
contributes to enhancing IL-8 mRNA expression in the nucleus.
Keywords: propiece IL-1α (ppIL-1α), alarmin, IL-8緒

Interleukin（IL）-1αは，細胞が低酸素状態，酸化ストレス言や熱刺激などに晒されたときに放出される代表的な
1）

Alarmin は損傷した細胞から放出される分子であり ，alarmin であり 2 ），血管新生や創傷治癒など様々な反応に周囲の組織に炎症反応を誘導し，生体の自然免疫系や獲得関与している。IL-1αは細胞質で31 kDa の precursor IL-1α

免 疫 系 を 活 性 化 す る 警 告 信 号 と し て 機 能 し て い る。

（pIL-1α）として産生された後，Ca2+ 依存性タンパク質分（受付：令和 4 年12月21日）
責任著者連絡先：石山雄一
日本大学歯学部病理学講座〒101-8310 東京都千代田区神田駿河台 1 ‒ 8 ‒13

TEL：03-3219-8124
FAX：03-3219-8340
E-mail：deyu18002@g.nihon-u.ac.jp7

日大歯学

第 97 巻第 1 号

した。
2 ．プラスミド構築
3 種 類 の IL-1αの DNA テ ン プ レ ー ト お よ び pcDNAppIL-1α ベクターは Sata ら16）の方法を用いて作製した。
各 IL-1αは pEGFP-C3 ベクター（Clontech，San Jose，CA，USA）に挿入し，N 末端の緑色蛍光タンパク質（GFP）

図 1 IL-1αの構造
IL-1αは前駆体 IL-1α（pIL-1α）として細胞内で産生される（ 1 -271）。
pIL-1αは酵素的に切断されて ppIL-1α（N 末端 1 -112）と mIL-1α（C末端113-271）が生成される。核局在配列（NLS）は79-86に位置する。
数字はアミノ酸の位置を示す。

タグに融合した（GFP-pIL-1α，GFP-mIL-1α，GFP-ppIL-1α
ベクター）（ 図 2 ）。Transfection のために，各プラスミド（250ng）と Plus 試薬（0.75μｌ）および Lipofectamin 3000
（0.75μｌ（）Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）を，それぞれ25μｌOPTI-MEM（GE Healthcare，Chicago，IL，USA）に溶解した。両溶液を混合し，室温で15分間反応させた後，培養液に添加し37℃で18時間培養した。以上のように処理した細胞を transfectant として，その後の実験に供した。
3 ．cover slip 実験
HeLa 細胞（ 5 ×104/well）を24well プレートに入れたcover slip（直径10mm：松波硝子工業，東京）上に播種した。37℃，18時間培養後，上記方法によって GFP-pIL-1α，図2

 験に使用した発現ベクターと transfectant におけるそれぞ実れの発現（A） 3 種類の IL-1αの DNA 断片を pEGFP-C 3 ベクターにライゲーションして GFP と融合させた。（B）それぞれのベクターによるtransfectant から，細胞溶解液を回収して，WB でタンパク質発現を確認した。

GFP-mIL-1α，GFP-ppIL-1αを transfection し た。 細 胞 を37℃に加温したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し，4 ％パラホルムアルデヒドで固定した。さらに PBS で洗浄後，DAPI-Fluoromount-G（Southern Biotech，Birmingham，AL，USA）を用いて cover slip をスライドガラスに封入，granzyme B や thrombin などの酵素によっした。観察および画像の撮影には，オールインワン蛍光顕て切断される。酵素切断の結果，N 末端の propiece IL-1α微鏡（BZ-X810，キーエンス，大阪）を使用した。また，（ppIL-1α）と C 末端の mature IL-1α（mIL-1α）が生成されエネルギー依存性の ppIL-1α核内輸送の有無を調べるためる（ 図 1 ）8 , 9 ）。pIL-1αと mIL-1αは 細 胞 外 に 分 泌 さ れ，に，importin βの 阻 害 薬 で あ る importazole（10 nM,IL-1 receptor type I を介してシグナル伝達し機能を発揮

Cayman Chemical，Ann Arbor，MI，USA）の存在下ます る10）。 さ ら に，pIL-1αと ppIL-1αは 核 局 在 配 列（NLS）

たは非存在下で37℃，6 時間培養し，観察を行った。

解酵素3-5）

6）7）の存在により核に輸送され ，標的遺伝子の転写制御に寄
11）4 ．real-time polymerase chain reaction（real-time PCR）

与するとされている 8 , 12）。また，pIL-1αは核クロマチン13）
14, 15）や他の核内タンパク質に結合することが報告されている。

HeLa 細胞（ 1 ×105/48 well plate）に，pcDNA またはしかしながら，ppIL-1αの核内輸送のメカニズムや核内機pcDNA-ppIL-1αを transfection した。18時間後，RNeasy

能は完全には解明されていない。そこで，本研究では，

mini kit（Qiagen，Hilden，Germany）を用いて total RNA

ppIL-1αの核内輸送メカニズムの解明を目指すとともに，を精製した。相補的 DNA は，Superscript Ⅲ逆転写酵素

核内における遺伝子発現への関与について検討した。

（Invitrogen，Waltham，MA，USA）を用いて合成した。

材料および方法

表1

1 ．細胞
ヒト子宮癌由来の線維芽細胞（HeLa 細胞）は医薬基
盤・健康・栄養研究所 JCRB 生物資源バンク（大阪）から入手した。細胞は，10％ウシ胎児血清（FCS），50μｇ/ml
ストレプトマイシン，50U/ml ペニシリン（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA）を添加した Dulbecco’ Modified
Eagle’s Medium（DMEM）で37℃，5 ％ CO2存在下で培養

8プライマーの配列

propiece IL-1αの核内輸送と機能

令和 5 年 6 月

real-time PCR は，CFX 96 real-time system（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）で TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（タカラバイオ，草津）を用いて行った。本研究で使用したプライマーを表 1 に示す。pcDNA transfectant および ppIL1 transfectant における IL-8の遺伝子発現を内在性コントロール（β-actin）に対する比としてΔΔCT 法で算出した。前者の値を 1 とした時の，これに対する ppIL-1α transfectantにおける遺伝子の増幅量をデータとして示した。
5 ．ウェスタンブロッティング（WB）
作製した transfectant を PBS で 2 回洗浄し，500μｌの細

図 3 IL-1αの細胞内局在（A）HeLa 細 胞 に GFP-pIL-1α，GFP-mIL-1α， お よ び GFP-ppIL- 1を transfection した。transfection 後，細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
核は DAPI で染色した（scale bar：10 μｍ）。（B）GFP-ppIL-1αtransfectant から核抽出液を調製し，WB に供した。核内部コントロールとして Lamin B を用いた。

胞溶解液（50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，0.5％Triton X-100）を用いて溶解させた。BioRad protein assaykit（Bio-Rad）を用いて総タンパク濃度を測定し，40ng のタンパクを12％ sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelを用いて電気泳動した。WB は Omagari ら17）の方法に従って行った。一次抗体として，マウス抗 GFP 抗体（Proteintech，Rosemont，IL，USA; ×10,000）を 1 ％ BSA diluted in 0.1%
Tween-20/PBS（ 1 % BSA-PBST）で希釈し，室温で 1 時間反応させた。二次抗体として，horseradish peroxidase（HRP） 標 識 ヤ ギ 抗 マ ウ ス IgG（H+L） 抗 体（JacksonImmunoResearch，West Grove，PA，USA; ×8,000） を用い，室温で 1 時間反応させた。なお，核抽出液は NEPER™ Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents（Thermo Fisher Scientific）で精製し，WB に供した。核図 4 ppIL-1αの核への輸送
GFP-ppIL-1α transfectant を，importin β阻害薬である importazole（10 nM）存在下（＋：下段）または非存在下（−：上段）で 6 時間培養した（scale bar：10 μｍ）。その後，細胞内 GFP-ppIL-1αの局在変化を蛍光顕微鏡で観察した。の内在性コントロールには Lamin B を用いた。一次抗体としてウサギ抗ヒト Lamin B 抗体（Proteintech; ×1,000）
および二次抗体として HRP 標識ヤギ抗ウサギ IgG（H+L）
抗体（Jackson ImmunoResearch; ×6,000）を使用した。
6 ．統計学的解析
統計解析は，正規性を Shapiro-Wilk 検定，等分散性をLevene 検定で確認した後に Studentʼs t-test を用いた。結果は，平均値±標準偏差で表した。0.05未満の p 値は統計的に有意であるとみなした。

結果

1 ．IL-1αの細胞内局在
GFP-pIL-1α，GFP-ppIL-1α，GFP-mIL-1αの 3 種 類（ 図2A）の分子の発現について WB で確認したところ，GFPpIL-1αは60 kDa，GFP-mIL-1αは43 kDa，GFP-ppIL-1αは42 kDa の単一のバンドとして検出された（図 2 B）
。次に，IL-1α分 子 の 細 胞 内 局 在 に つ い て 検 索 し た。 そ の 結 果，

図 5 ppIL-1αによる IL- 8 mRNA の発現増強
HeLa 細胞に pcDNA（contorol）または pcDNA-ppIL-1αベクターをtransfection し，18時 間 培 養 し た。 そ の 後，total RNA を 精 製 し，real-time PCR により IL- 8 mRNA の発現量を測定した。内在性コントロール（β -actin）の発現量を 1 として，これに対する ppIL-1αtransfectant における IL- 8 発現量を比で表した。プライマー配列を表 １ に示した。＊＊p ＜ 0.01（n = 5 ）。

mIL-1αは細胞質にびまん性に分布し，pIL-1αと ppIL-1αは主に核に局在していた（図 3 A）
。この結果を確認するために，transfectant から核抽出液を調整し WB により検討したところ，ppIL-1αのバンドが検出された（図 3 B）。

9日大歯学2 ．ppIL-1αの核への輸送

第 97 巻第 1 号により発現させた細胞では，IL-1αが脂質 2 重膜である核

ppIL-1αの核への局在は，核と細胞質との間の受動拡散膜を通過できずに細胞質に拡散した結果である可能性も考によるものではないことが Kudo ら により確認されていえられる。ppIL-1αの核内への輸送については今後さらにる。そこで、エネルギー依存的核輸送に必須の importin β検討を加える必要がある。

18）の関与について，importin β阻害薬である importazole の一方，核に輸送された ppIL-1αは，どのようなメカニズ存在下および非存在下で ppIL-1α transfectant を培養するムで核局在しているのであろうか。ppIL-1αに結合する分ことにより確認した。その結果，核における ppIL-1αの局子としては，これまでに HAX-1や Necdin などが報告され在には何ら変化が認められなかった（図 4 ）。ている14, 15）。この中で，アポトーシスに関連する分子としての HAX-1は，pIL-1αの N 末端側に結合部位が存在する

3 ．ppIL-1αによる IL-8 mRNA の発現増強とされている14）。しかし，細胞内局在や機能が多様である

ppIL-1αは，核において IL-8遺伝子発現を増強することことから，pIL-1αの核局在に果たす役割については未だ不が 報 告 さ れ て い る19）。 そ こ で，HeLa 細 胞 に お い て も明である。マウスのマクロファージでは，pIL-1αが核クロ

ppIL-1αの強制発現が IL-8 mRNA 発現を増強させるかとマチンに結合しているとの報告もあるが13），ヒトにおいていう点について検討した。その結果，IL-8 mRNA 発現レベはこの事実は確認されていない。pIL-1αは，細胞膜貫通タ

ルは，ppIL-1αの組み込まれていない pcDNA transfectant

ンパク質や分泌タンパク質が有するシグナルペプチドを欠に比べて ppIL-1α transfectant で8.9±0.91倍に増加していいており24），一般的なタンパク質の産生ルートである小胞た（図 5 ）。

体―ゴルジ体輸送を経由しないとされている。従って，細考

胞外への分泌メカニズムも解決されておらず，多くの疑問察点が残されている。

GFP タグ付き IL-1α発現ベクターを用いた本研究では，ppL-1αは，様々なタンパク質の遺伝子発現に寄与してmIL-1αは細胞質にびまん性に分布し，pIL-1αと ppIL-1αはいることが示されている12）。なかでも，IL-8遺伝子の発現主に核に局在することが確認された。これまでの研究かに対する機能は着目されている。これは IL-8が，炎症増悪

ら，pIL-1αの N 末端および C 末端へのタグの付与は，そとともに，血管新生など創傷治癒にも寄与するなど多彩な

12）の機能に何ら影響を及ぼさないことが報告されており ，機能を有するためである25）。本研究によって，線維芽細胞

これら分子の核局在は，従来の報告と一致するものであっである HeLa 細胞においても，ppIL-1αの過剰発現が IL-8た。また，これらの分子の核局在には，NLS が極めて重mRNA の発現を増大させることが明らかとなった。この要であり，NLS を欠失させることにより細胞質への移行ことは，ppIL-1αが IL-8遺伝子発現を転写レベルで増強さを促すことが知られている18）。NLS は，importin αまたはせ，その分泌を促進し，炎症反応または血管新生反応を拡

importin βなどの核移行を担う分子によって認識される配大していく機能を有するものと考えられた。

列であり20），IL-1αが NLS を有していること自体がエネル

本研究の結果，ppIL-1αの核への輸送は importin β非依ギー依存性に核移行することを示唆している。しかし，存性であり，核内では，IL-8などの遺伝子発現に転写レベIL-1αの核内輸送のメカニズムについては Luheshi ら21）のルで関与している可能性が示唆された。

報告があるのみで，低分子量 G タンパク質である Ran に結依存する核内輸送とされている。そこで，importin βの阻論害薬である importazole 存在下での ppIL-1α transfectant

本 研 究 で は，3 種 類 の IL-1α（pIL-1α，mIL-1αお よ びの培養は ppIL-1αの核局在に変化を及ぼすものと予測し

ppIL-1α）を HeLa 細胞に transfection することで，各 IL-1αた。しかし本研究の結果，ppIL-1αが NLS を有しながらも，の細胞内における局在および ppIL-1αの核内輸送や核内機importazole による影響を受けなかったことから，ppIL-1α能について検討した。その結果，以下の知見を得た。の核局在は importin β非依存性であることが示唆された。

1 ．細胞内で，mIL-1αは細胞質に拡散的に分布し，pIL-1α

これまで importin αは，核内輸送される分子と importin βと ppIL-1αは主に核に局在した。との結合を仲介するアダプター分子と考えられてきたが20），

2 ．ppIL-1αの核局在は，importin βに依存しなかった。

近年の研究で，importin αのみによって核内輸送される機

3 ．ppIL-1αは IL-8遺伝子発現に転写レベルで関与してい構があることが判明している22）。当研究室のこれまでの実た。

験で，pIL-1αが importin αと結合することを免疫沈降実験

以上の結果から，ppIL-1αは核内において，IL-8の発現により確認している。また，IL-1α分子内に存在する NLS増強を介して，炎症反応を拡大することが示唆された。

配列を，細胞膜を通過できない分子に融合させると，この本研究の推進にあたり，病理学講座 浅野正岳教授，角田麻里子助教および講座員の皆様にご指導頂いた。ここに深甚なる感謝の意を表する。本論文に関して，開示すべき利益相反はない。

分子が脂質 2 重膜を通過することが知られている23）。従って，NLS を欠失した IL-1αを細胞に transfection すること10

propiece IL-1αの核内輸送と機能文

令和 5 年 6 月

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