日大歯学 , Nihon Univ Dent J, 90, 131-136, 2016

舌癌により発症する舌痛覚過敏に対するマイクログリア P2X7 受容体の関与
玉

川

崇

皓

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻（指導：米原啓之 教授，岩田幸一 教授，篠田雅路 准教授）

要旨：口腔癌性疼痛がいかなるメカニズムで発症するかを明らかにする目的で，舌癌疼痛モデルラットを作成し，三叉神経脊髄路核尾側亜核（Vc）におけるマイクログリア P2X7 受容体の発現機構を形態学的に解析した。扁平上皮癌（SCC）細胞をラット舌の側縁に接種したものを SCC 群，溶媒である 0.1 M phosphate buffer saline（PBS）を接種したものを PBS 群として実験を行った。浅麻酔下においてラット舌へ機械刺激を加え，それらに対する機械頭部引込め反射閾値（MHWT）を測定した。また，SCC 接種 14 日後に Vc における活性化マイクログリアと P2X7 受容体の発現を，免疫組織化学的に検索した。選択的 P2X7 受容体アンタゴニスト（A-438079）を持続的に髄腔内投与した SCC ラットについても MHWT の解析を行った。SCC 接種 14 日後にマイクログリアの顕著な活性化が認められた。一方，A-438079 を髄腔内投与したラットでは SCC 接種 3 日後まで MHWT の低下およびマイクログリア活性化の有意な抑制が認められたが，14 日後では再び MHWT の低下およびマイクログリアの活性化を認めた。以上のことから，舌の癌性疼痛の初期段階では P2X 7 受容体を介して Vc に存在するマイクログリアが活性化し，さらに何らかの作用によって Vc の侵害受容ニューロン活動が亢進し，腫瘍が発育・増大するに従って病的な舌に異常疼痛が発症する可能性が示された。
キーワード：P2X7 受容体，マイクログリア，舌扁平上皮癌，延髄，舌痛緒

キナーゼ B（TrkB）と結合し，これらのニューロンの過言

興奮を引き起こすことが知られている 12,13）。以上の研究

口腔癌は咀嚼や嚥下などの重要な機能を低下させ，そ

結果を勘案すると，舌の腫瘍が増大するとともに Vc にれらの機能が欠如することにより患者の QOL は著しくおけるマイクログリアの活性化が亢進し，このメカニズ損なわれる 1）。口腔癌に伴う痛みで苦しむ患者に適切なムによって Vc 侵害受容ニューロンの中枢感作が誘導さ治療と QOL の向上の為に口腔癌に起因する病的疼痛のれ，結果的に舌の痛覚過敏が引き起こされる可能性があ発症メカニズムを明らかにすることは極めて重要であると考えられる。

2）

る 。神経障害性あるいは炎症性疼痛のメカニズムが口P2X7 受容体はアデノシン三リン酸（ATP）受容体ファ

3）腔の癌性疼痛に関与していることは広く知られている 。

ミリーの一つとして，情報伝達に対する重要な機能を持っ口腔領域に炎症が引き起こされる，あるいは三叉神経がており，SDH における様々な細胞の中で ATP と結合す

傷害を受けると，三叉神経節（TG）ニューロンは強く活ることにより活性化する 14）。最近の報告ではマイクログ

性化して興奮性が異常に増加し，末梢神経系が過敏状態

リアに発現する P2X7 受容体が坐骨神経損傷後あるいは

に陥る

4,5）

骨癌において SDH におけるマイクログリアの活性化に。

顔面領域の炎症または三叉神経損傷に引き続き，TG

関与することが知られている 15,16）。しかしながら，P2X7

ニューロンには高頻度の活動電位が発生し，さらに，高受容体を介した情報伝達がどのように癌性疼痛の発症メ

頻度の活動電位は中枢神経系に伝えられ，三叉神経脊髄

カニズムに関与するかは完全には理解されていない。

路核尾側亜核（Vc）の侵害受容ニューロンの興奮性増強を

そこで本研究ではラットの舌に扁平上皮癌（SCC）細胞

誘導し，Vc 侵害受容ニューロンの中枢性感作を引き起を接種して舌癌モデルラットを作製し，舌への機械刺激こすことが知られている 6-8）。顔面領域の炎症，三叉神経により引き起こされる頭部引込め反射閾値（MHWT）を傷害や口腔癌モデルラットの Vc において，マイクログ

解析することにより機械痛覚過敏を行動学的に明らかにリアとアストロサイトが活性化することが知られていした。さらに Vc に存在するマイクログリアに着目し，

9-11）。これまでの脊髄後角（SDH）をターゲットにした活性型マイクログリアおよび P2X7 受容体の発現状態を研究では，活性化したマイクログリアは brain-derived

解析し，P2X7 受容体を介したメカニズムが口腔の癌性疼

neurotrophic factor（BDNF）を 放 出 し， 放 出 さ れ た痛に関係しているかどうかを解明することを目的とし

BDNF は SDH ニューロンにおける tropomyosin 受容体

た。

る（受付：平成 28 年 1 月 27 日）〒 101 8310 東京都千代田区神田駿河台 1 8 13131

goat anti-ionized calcium-binding adaptor molecule-1

材料及び方法1.

（Iba1）polyclonal antiserum（1:500; Wako Chemicals）,

実験動物

rabbit anti-glial fibrillary acidic protein（GFAP）

実験には Fischer 系雄性ラット 6 週齢（n ＝ 118）を用

antibody（1:1000; Chemicon）または mouse anti-NeuN

いた。ラットは 12 時間明暗サイクルで恒温恒湿の環境

monoclonal antibody（1:1000; Millipore）に 24 時間イン下におき，十分な飼料と水で飼育した。実験に際し，動キュベートさせた。0.01 M PBS で 10 分間 3 回洗浄し，物の苦痛を最少限にするよう配慮し，動物数は必要最少

二次抗体 Alexa Fluor 488 anti-rabbit IgG（1:200 in 0.01

限とした。本実験は日本大学歯学部動物実験委員会の承M PBS; Invitrogen）, Alexa Fluor 568 anti-goat IgG認を受け（承認番号：AP15 D0024），実験動物の取り扱（1:200 in 0.01 M PBS; Invitrogen）and/or Alexa Fluor

いは国際疼痛学会の指針に従った 17）。

568 anti-mouse IgG（1:200 in 0.01 M PBS; Invitrogen）

2.

に 2 時間，切片を遮光下に常温でインキュベートした。

舌癌モデルの作製

0.01 M PBS で 10 分間 3 回洗浄後，切片を封入して二重Sodium pentobarbital（50 mg/kg,i.p.）でラットを麻酔し，開口させ舌を引き出した後に SCC 細胞（SCC-158，

標識細胞を蛍光顕微鏡（BZ-9000, Keyence）にて観察しJCRB）の 懸 濁 液（SCC 細 胞 5×106 を 0.1 M phosphate

た。Noma らの報告 20）により舌の侵害刺激一次ニューロ

buﬀer saline（PBS）に攪拌したもの）を 30μl 26 G 針で舌ンが投射する Vc 領域は特定されているので，本研究で左側縁部，先端から 5 mm 後方の位置に接種した（SCC

はこの領域に注目し，各切片の舌投射領域に，313.37×群）。対照として 0.1 M PBS を vehicle として用い，同3133.69μm2 の 範 囲 を 設 定 し， そ の 範 囲 内 に 発 現 し た様の方法で行った（PBS 群）。

Iba1 陽 性 細 胞 の 密 度 を， 画 像 解 析 ソ フ ト（Image J

3.

1.37 v, NIH）を用いて解析した。

舌の MHWT の測定
Isofulurane 2%（Mylan）浅麻酔下において，機械刺激

5.

A-438079 の持続髄腔内投与を舌左側縁部，先端から 5 mm 後方の接種部位にデジタ

ラットを sodium pentobarbital（50 mg/kg,i.p.）で麻酔

ルピンチを用いて加え，それらに対する MHWT の測定

し，頭頂部から尾側へ 20 mm の皮膚切開を加え，後頭を行った 18,19）。Isoﬂurane 2% を吸入させた後に側臥位に骨 を 露 出 し 直 径 2 mm の 小 孔 を 開 け， ポ リ エ チ レ ン

寝かせ，麻酔深度を左側後肢のピンチ刺激により弱い屈チューブ（直径 0.8 mm，ナツメ）を髄腔に挿入して髄腔曲反射が生じるレベルとし，実験中はこのレベルを維持

内に薬剤の連続投与を行った。選択的 P2X 7 受容体アンした。また，機械刺激強度は 0-150 g（cutoﬀ 値 150 g）としタゴニスト（A-438079, 5 mM, 0.5μl/day, Tocris）を 0.01

た。ラットの舌を口腔外に引き出し，機械刺激強度を徐々M PBS に 溶 解 さ せ， 浸 透 圧 ミ ニ ポ ン プ（Alzet modelに増加させ，頭部引込め反射が見られた所で刺激を止め，

2002, Durect Corporation）を用いて SCC 接種 14 日後ま

この時の刺激強度を MHWT とした。同一個体で接種前，で持続髄腔内投与を行った。A-438079 を投与した SCC

接種 3，14，21 日後において各 3 回ずつ計測を行い，そ群 MHWT の測定は前述の方法と同様に行った。

の平均値を MHWT として算出した。

6.

4.

全てのデータは平均値 ± 標準誤差で表し，有意差の検

免疫組織学的染色統計解析

Naïve ラット，SCC あるいは vehicle を接種後 3，14

定には Studentʼs -test, one-way or two-way repeated-

日後のラットを sodium pentobarbital（50 mg/kg,i.p.）でmeasures analysis of variance（ANOVA）followed by

麻 酔 し， 生 理 的 食 塩 水（500 ml）で 脱 血 後 に 0.1 M

Bonferroniʼs multiple-comparison test を用いた。有意phosphate buﬀer（PB）に溶解した 4% paraformaldehyde

水準は＜ 0.05 とした。

固定液（pH 7.4）で灌流固定を行った。その後，延髄を摘結出し，4% paraformaldehyde にて 4℃で 48 時間浸漬し後固定を行った。その後標本を 12 時間 20% スクロース

1.

果舌の MHWTに 浸 漬 し た 後 に −80℃ 環 境 下 で， ク ラ イ オ ス タ ッ ト

SCC 群 あ る い は PBS 群 は， 共 に 接 種 3 日 後 に は（CM1850, Leica）を用いて obex から ±1 mm の部位で

MHWT の 有 意 な 低 下 を 示 し た。 ま た，SCC 群 の30μm の間隔で連続凍結切片を作製し，5 切片毎に 1 切

MHWT は接種 14 日後以降でも有意に低下していたのに片取り出し，以下の方法に従って免疫組織学的染色を対し，PBS 群では接種後 14 日を経過すると，有意な回行った。

復を示していた（第 1 図）。

70℃で抗原を賦活化させた後に 0.3% TritonX-100 in2.

Vc における P2X7，Iba1，GFAP および NeuN 発現

0.01 M PBS containing 4% normal donkey serum にて

本研究では Iba1 をマイクログリアの活性化マーカー

ブロッキングを行い，4℃下にて一次抗体として rabbitとして用いた。SCC 接種後 3 日を経過すると，Vc 背側anti-P2X7R polyclonal antibody（1:100; Abcam）および部の比較的限局した領域に多数の Iba1 陽性細胞集団お132舌癌による痛覚過敏に対する P2X7 受容体の関与

よ び GFAP 陽 性 細 胞 集 団 が 認 め ら れ た（ 第 2 図 B, E）。
NeuN 陽性細胞は切片全体に一様に多数分布していた（第2 図 H）。さらに，それぞれの陽性細胞において，Iba1，
GFAP および NeuN と P2X7 の共存性について検索した。
その結果，Iba1 と P2X7 が Vc において多数の細胞で共存を示した。また，NeuN 陽性細胞の中には Iba1 陽性を
示 す 細 胞 が 少 数 で は あ る が 認 め ら れ た。 こ れ に 対 し，
GFAP と P2X7 が共存する細胞は全く検出されなかった（第 2 図 C，F，I の白色矢印で示した細胞）。
3.

Vc における P2X7，Iba1，GFAP および NeuN 陽性
細胞数の比較
SCC 群 に お い て は， 接 種 後 3 日 目 お よ び 14 日 目 で，naïve に比べ有意な Iba1 陽性細胞の平均領域の増大を認めた。一方，vehicle を接種した群では，接種後 3 日目には naïve 群に比べ有意な Iba1 陽性細胞の平均領域の増大を認めたのに対し，14 日目においては naïve と比較して有意差は認められなかった（第 3 図 A）。P2X7 のアン
タゴニストである A-438079 投与の髄腔内投与により，
SCC 接種後 3 日目においては，Iba1 陽性細胞の平均領域

第2図SCC 接種 14 日後の Vc における P2X7 受容体（A，D，G），
Iba1 陽性細胞（B），GFAP 陽性細胞（E），NeuN 陽性細胞（H），およびそれぞれの Merge（C，F，I）の組織標本写真

第3図

SCC，vehicle（PBS）接種 3，14 日後および naïve の Vc における Ibal 陽性細胞が占める領域の比較（A）
SCC を接種し，A-438079 あるいは vehicle（PBS）を 14 日間持続髄腔内投与したモデルの Vc における Ibal 陽性細胞が占める領域の比較（B）

は有意に減少したのに対し，14 日目においては SCC 接
種後 3 日目と比較して発現領域は有意に増大していた。
SCC 接種群のラットに vehicle を投与しても，接種後 3日および 14 日の両日で有意な差は認めなかった。PBS
群 に vehicle を 投 与 す る と，3 日 目 に 比 べ 14 日 目 に は
Iba1 陽性細胞の平均領域は有意に減少していた。
（第 3 図B）
4.

A-438079 投与の機械痛覚過敏に対する影響
A-438079 投与により SCC 接種 3 日後の MHWT の低下は有意に抑制されたが，14 日後では vehicle を投与した SCC ラ ッ ト と 同 程 度 の 値 を 示 し た（ 第 4 図 ）。 ま た，
vehicle を投与した PBS 群においては，MHWT は 3 日
後では接種前と比較し有意に低下したが，14 日後には有意な低下は認められなかった。

第1図

ラットの舌に SCC，vehicle（PBS）を接種する前（Pre），接種後 3，14，21 日目の舌の MHWT133

Vc においてマイクログリアやアストログリアの活性化が亢進することが報告されている 9, 22-25）。これらの報告によれば，マイクログリアの活性化はアストログリアに比べ非常に早く，受傷後 2 日目には多くの活性型マイク
ログリアが出現するといわれている 24）。また，マイクロ
グリアは一度活性化されると長期間にわたって活性化状態が続くことも明らかにされている。本研究においても，
マイクログリアの活性化マーカーである Iba1 は，SCC
接種後 3 日目には有意な発現増加を認め，14 日を経過しても活性化は継続しており，舌癌モデルにおいてもその第4図

PBS 接種し vehicle（PBS）を 14 日間持続髄腔内投与した
モ デ ル（PBS ＋ Veh），SCC 接 種 し，A-438079 あ る い は
vehicle を 14 日 間 持 続 髄 腔 内 投 与 し た モ デ ル（SCC ＋
A-438079，SCC ＋ Veh）の直前（Pre）および接種後 3，14
日目の舌の MHWT

時間経過は炎症や神経傷害モデルにおける研究結果と同様であると考えられる。
また本研究結果では，SCC あるいは vehicle を接種したどちらの群も，ともに接種 3 日後に Iba1 陽性細胞の有意な平均領域は増大し，同時にどちらの群においても

考1.

有意な MHWT の低下を認めた。さらに，PBS 群では接察

種 14 日後に MHWT の有意な回復および Iba1 陽性細胞の平均領域の有意な減少を示したのに対し，SCC 群では舌癌モデル
舌癌は口腔癌の中で最も多く見られるもので，患者の接種 14 日後においても，MHWT の有意な低下およびQOL を著しく低下させる。その一因として癌性疼痛が挙Iba1 陽性細胞の平均領域の有意な増大が認められた。こげられるが，その原因として腫瘍の増大による周囲組織のような結果から，おそらく PBS 群では，接種後 3 日目

への浸潤による炎症あるいは神経傷害が関与しているとに局所の炎症が引き起こされ，機械刺激に対する過敏化考えられている。また，一般に舌癌の多くは扁平上皮癌

および Iba1 陽性細胞の発現増加が誘導された可能性がであり，非常に悪性度が高く，舌の深部組織への強い浸あると考えられる。一方，SCC 群においては接種後 3 日

潤を示す癌として知られている 1,3）。そこで，本研究では，目においては炎症が引き起こされ，接種後 14 日を経過

ヒトの舌癌に近い細胞として知られる SCC-158 をラット

すると，癌の浸潤による組織破壊や神経損傷が誘導され，の舌に接種して舌癌モデルラットを作製し，舌の癌性疼

MHWT の低下が持続したものと思われる。

痛の発症メカニズムの一端を解明することを目的とし

3.

舌の癌性疼痛に対する P2X7 受容体の役割た。

末梢神経傷害や末梢組織の炎症により，脊髄後角に存2.

在するマイクログリアが活性することが知られてい舌の癌性疼痛に対するマイクログリアの働き
中枢神経系にはマイクログリア，アストロサイト，オる 26-28）。このマイクログリアの活性化には ATP の受容リゴデンドロサイトなどのグリア細胞が存在することが体である P2X 受容体が関与すると報告されている 29）。

知られている，その中でもマイクログリアは中枢神経系

P2X 受容体はイオン透過型受容体として知られているのマクロファージとして存在しており，脊髄後角ニューが，この受容体の中でも特に P2X7 受容体は炎症性疼痛

13）。

や神経障害性疼痛に関与していることが知られてい近年，中枢や末梢組織の損傷に応答してマイクログリア

る 15,29）。しかし，この受容体が癌性疼痛に関与しているロンの保護，栄養供給の役割があると言われているが活性化し，活性型マイクログリアの作用によって，二かは明らかにされていない。そこで本研究では，P2X7 受

次ニューロンの活動性が亢進して異常疼痛が引き起こさ容体が舌の癌性疼痛の発症に関与するかどうか，また関れることが報告されている 15）。不活性時のマイクログリ

与するなら，いかなるメカニズムで関与するかについて

アは分岐の多い突起を伸ばしたラミファイド型を有して解析を行った。
本研究結果では，SCC モデルラットの Vc には多くのいるが，活性時には太く短い突起を伸ばしたアメボイド
21）。これまでは活性型マイクログリア数を

Iba1 陽性細胞発現が認められ，さらに P2X7 受容体アン算定した研究が多くみられたが，形態が複雑であるため，

タゴニストである A-438079 を 14 日間持続髄腔内投与し活性型グリア細胞数の正確な算出が不可能であると考えたところ，SCC 接種後初期の Iba1 発現抑制だけでなくられる。そこで，本研究では，活性型マイクログリアの低下した MHWT が有意に回復した。これらの結果は，マーカーである Iba1 陽性細胞の出現領域の面積を解析

舌癌に起因する舌痛には Vc における P2X7 受容体を介した。

したマイクログリアの活性化が関与する可能性を示して型に変化する

末梢神経の傷害や組織の炎症によって，脊髄あるいはいる。このように，舌の癌性疼痛には炎症性疼痛および134舌癌による痛覚過敏に対する P2X7 受容体の関与

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神経障害性疼痛が関与している可能性が考えられるが，
SCC 接種後のどの段階から炎症や神経傷害による疼痛から癌細胞そのものに起因した舌痛に移行するのか，ある
いは炎症や神経損傷と癌細胞の働きが共同して舌痛が生じるのかを判断する明確な基準が不明なため，舌における癌性疼痛の詳細な発症機構を明らかにするためには，
今後さらなる検討が必要であると思われる。
以上により，舌の癌性疼痛の初期段階では P2X7 受容体を介して Vc に存在するマイクログリアが活性化し，さらに何らかの作用によって Vc の侵害受容ニューロン
活動が亢進し，腫瘍が発育・増大するに従って病的な舌に異常疼痛が発症する可能性が示された。

結論

舌癌モデルラットにおいて，舌の MHWT，Vc におけるマイクログリアの活性化およびマイクログリアにおける P2X7 受容体発現について詳細に検討し，以下の結論を得た。
1.

舌癌モデルラットの舌の MHWT は SCC 接種により

2.

SCC 接種により Vc における活性型マイクログリア

有意に低下した。
発現が有意に増大した。
3.

P2X7 受容体アンタゴニストの持続髄腔内投与により舌癌モデルラットの舌の MHWT は，舌癌の初期では有意な低下の抑制を認めたが後期には有意な変化は認められなかった。

4.

舌癌モデルラットの Vc には多くの活性型マイクログリアが発現したが，この細胞のほとんどには P2X7受容体が共発現した。

5.

P2X7 受容体アンタゴニストの持続髄腔内投与により舌癌モデルラットの Vc における活性型マイクログ
リアは初期では増大の抑制が認められるのに対し，後期では有意な変化は認められなかった。
以上から，SCC 接種による舌癌モデルラットの舌に生じる初期の癌性疼痛は活性型マイクログリアに発現した
P2X7 受容体が関与することが示された。
本研究の一部は日本大学歯学部佐藤研究費，日本大学歯学部上村安男・治子研究費，日本大学歯学部総合私学研究所一般研究 Bの補助により行われた。
文

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