hon p.1 [100%]YAKUGAKU ZASSHI 128(8) 1203―1207 (2008)  2008 The Pharmaceutical Society of Japan1203―Regular Articles―

グルタチオンのメラニン合成阻害機構
松木光雄，渡部俊彦，小笠原綾子，三上健，松本達二

Inhibitory Mechanism of Melanin Synthesis by Glutathione
Mitsuo MATSUKI, Toshihiko WATANABE,Ayako OGASAWARA,
Takeshi MIKAMI, and Tatsuji MATSUMOTO
Department of Microbiology, Tohoku Pharmaceutical University,441 Komatsushima, Aoba-ku, Sendai 9818558, Japan(Received January 11, 2008; Accepted May 2, 2008)
Glutathione dose dependently inhibited melanin synthesis in the reaction of tyrosinase and L-DOPA. The inhibitionof melanin synthesis was recovered by increasing the concentration of L-DOPA, but not recovered by increasing
tyrosinase. Glutathione inhibited the binding between tyrosinase and L-DOPA. Although the synthesized melanin wasaggregated within 1 h, the aggregation was inhibited by the addition of glutathione. These results indicate thatglutathione inhibits the synthesis and agglutination of melanin by interrupting the function of L-DOPA.
Key words―glutathione; melanin; tyrosinase; 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine緒言害メカニズムについて解析を行ったので報告する．
方

グルタチオンは，グルタミン酸，システイン，グリシンからなるアミノ酸の一種で人間を含む動植物

1.

メラニン合成反応法
リン酸緩衝液（8.0 g/l

や微生物の組織内に含まれている物質である．グルNaCl, 0.2 g/l KCl, 2.9 g/l Na2HPO4・12H2O, 0.2 g/l

タチオンは，生体内で有害物質の解毒，1) 老化防KH2PO4, pH 7.2 ）を用いて各種試薬を溶解し， L-

止，過酸化物の生成抑制2)などを行っていることがDOPA (SIGMA-ALDRICH, 5,4-Dihydroxy-L-phenyl-

知られており，現在多くのサプリメントや基礎化粧alanine ）及びチロシナーゼ（ SIGMA-ALDRICH,品の成分として取り入れられている．

5370 units / mg ） 溶 液 を 調 整 し た ． L-DOPA 溶 液

メラニンは，紫外線から皮膚を守る防御因子とし（ ˆnal 0.5 mM ）とチロシナーゼ溶液（ ˆnal 53.7 u-て重要な役割を示す一方，しみ，そばかす，黒ずみnits / ml ）を， 96 穴プラスチックプレート（ Nun-の原因となることが知られている．生体内でのメラC で 30
clon Delta Surface, Nunc）内で混和後，37°ニンの生成は，血中から供給されたチロシンがチロ分間静置した．反応終了後，ImmnnoMini NJ-2300

シナーゼによって酸化されることから始まる．チロ( Inter Med, USA ） を 用 い て OD490 nm 値 を 測 定

シンは酸化され L-DOPA となり，さらに DOPA キし，これをメラニン生成量とした．

ノンへと代謝される．チロシナーゼはこの 2 つの反2.

応を触媒する酵素であり，この代謝はメラニン生成グルタチオン（還元型． Nacalai tesque ）は，リにおける律速反応として働く． DOPA キノンはそン酸緩衝液に溶解し実験に使用した．グルタチオンの後，自動酸化によりメラニンとなる．3) グルタチ溶液の段階希釈液を，L-DOPA 溶液（ˆnal 0.5 mM）

オンがメラニン合成を阻害することは知られているとチロシナーゼ溶液（ˆnal 53.7 unit /ml）の混液にが，4) そのメカニズムについては明らかにされてい加え，前述と同様の方法でメラニン生成量を測定しない．われわれは，グルタチオンのメラニン合成阻た．

東北薬科大学微生物学教室
e-mail: twatanabe＠tohoku-pharm.ac.jp

グルタチオンによるメラニン合成阻害効果

グルタチオンによるメラニン合成阻害に対する
L-DOPA の関与を検討するために，グルタチオン

hon p.2 [100%]1204

Vol. 128 (2008)

溶 液 （ ˆnal 0.8 mM ） と チ ロ シ ナ ー ゼ 溶 液 （ ˆnal53.7 unit/ml）の混液に，濃度の異なる L-DOPA 溶液を加えかく拌後，前述と同様の方法でメラニン生成量を測定した．
また，グルタチオンによるメラニン合成阻害に対するチロシナーゼの関与を検討するために，グルタチオン溶液（ ˆnal 0.8 mM ）と L-DOPA 溶液（ ˆnal0.5 mM ）の混液に，濃度の異なるチロシナーゼ溶液を加え，前述と同様の方法を用いてメラニン生成量を測定した．
3.

Fig. 1.

グルタチオンによるチロシナーゼ-L-DOPA結合阻害

グルタチオンの，チロシナーゼと L-DOPA に対する結合阻害効果を，水晶発振子マイ

EŠect of Glutathione on Melanin Synthesis

Glutathione was mixed with tyrosinase (ˆnal 53.7 units/ml) and L-DOC for 30 min. After incubation, thePA (ˆnal 0.8 m M), and incubated at 37°
amount of melanin was measured as described in Materials and Methods.
These results were shown as mean ±S.E. (n＝4).

クロバランス（ QCM ）生体分子間相互作用解析装置 A‹nix Q ( Initium ）を用いて検討した．すなわ
ち，チロシナーゼ溶液（0.1 mg/ml）2 ml をセンサー

タチオンには，メラニン合成を阻害する効果のあるチップ表面に固定化し，このセンサーチップをことが明らかになった．

A‹nex Q 本体に取り付けたのち， 10 ml のリン酸

2.

グルタチオンによるメラニン合成阻害機構の緩衝液中で周波数が安定するまで放置した．セン

解析

グルタチオンのメラニン合成阻害効果に，サーチップの周波数が安定したのち，「 0.5 mM L-グルタチオンによる L-DOPA の不活性化が関与しDOPA 10 ml 」 又 は 「 0.5 mM L-DOPA 10 ml 及 びているか検討を行った．グルタチオン（最終濃度0.3 mM グルタチオン 10 ml」をリン酸緩衝液中に滴0.8 mM ）を含むメラニン合成反応液に L-DOPA を下し，センサーチップに固定化されたチロシナーゼ過剰に添加し，グルタチオンによるメラニン合成阻との反応性を，周波数の変化から測定した．

害が回復するか否かを検討したところ，グルタチオグルタチオンによるメラニン凝集阻害効果

ンを含まない反応系では，メラニンの合成が認めら

L-DOPA 溶液（ ˆnal 0.5 mM ）とチロシナーゼ溶れたが（ Fig. 2, Positive control ），グルタチオン添液（ ˆnal 53.7 units / ml ）をエッペンチューブ内で加群では，メラニン合成が抑制された（ Fig. 2, L-混和し，37°C で 30 分間静置した．その後，グルタDOPA 最終濃度 0.8 mM ）．しかし，この抑制状態チオン溶液（ ˆnal 0.8 mM ）を添加，37°C で反応さは，反応液中の L-DOPA 濃度を増加させることでせ， 30 分毎に，この反応液の遠心上清中を回収し回復し，L-DOPA の最終濃度が 3.2 mM 以上で，メた．上清中の OD490 nm 値を測定し， OD490 nmラニン生成能が完全に回復した．また，グルタチオ値の減少から，メラニン凝集物の生成量を算出した．

ンによるメラニン合成阻害がチロシナーゼの過剰添

4.

5.

統計処理

実験結果は，Student's t-検定に反応液中のチロシナーゼ濃度を通常の反応濃度（ˆ-よる統計処理を行った．
結1.

加でも回復できるか否かについて検討を行ったが，果

グルタチオンによるメラニン合成阻害効果

nal 53.7 units/ml）の 10 倍量（ˆnal 537.0 units/ml）に増加させても，グルタチオンによるメラニン合成抑制状態は回復しなかった（data not shown）．

チロシナーゼと L-DOPA を混合したメラニン合

さらに，メラニンと L-DOPA の結合に及ぼすグ成反応液に，グルタチオンを加え，メラニン合成にルタチオンの影響を A‹nix Q を用いて検討したと及ぼす影響を検討した．その結果，グルタチオン添ころ，チロシナーゼを固定化させたセンサーチップ

加濃度依存的にメラニン合成量が減少し，グルタチに対し，グルタチオン非存在下では，1.61±0.25 ng

オン最終濃度が 0.8 mM 以上では，メラニン合成がの L-DOPA が結合したが，グルタチオン存在下で完全に抑制された（ Fig. 1 ）．この結果から，グルは，チロシナーゼ固定化センサーチップに対するhon p.3 [100%]

No. 81205

Fig. 3.
Fig. 2. EŠect of L-DOPA on Inhibition of Melanin Synthesis
by Glutathione
L-DOPA was mixed with glutathione (ˆnal 0.8 m M) and tyrosinase (ˆ-C for 30 min. After incubation, thenal 53.7 units/ml), and incubated at 37°
amount of melanin was measured as described in Materials and Methods.
These results were shown as mean±S.E. (n ＝4). Positive control: The melanin synthesis by the reaction of tyrosinase (ˆnal 53.7 units/ml) and L-DOPA(ˆnal 0.8 mM) without gluthatione.

EŠect of Glutathione on Melanin Aggregation

L-DOPA (ˆnal 0.5 m M) and tyrosinase (ˆnal 53.7 units/ml) were mixed

C for 30 min. Then, glutathione (ˆnal 0.8 mM) was added
and reacted at 37°
C for the indicated time. After reaction, theto the mixture, and reacted at 37 °supernatant was collected by centrifugation. The amount of melanin in thesupernatant was measured as described in Materials and Methods. Theseresults were shown as mean±S.E. (n ＝4).

類があり，皮膚の表皮最下層の基底層や毛髪の毛母
L-DOPA 付着量は， 0.10 ± 0.08 ng で，チロシナーなどにあるメラノサイト（色素細胞）で生成される．

ゼへの L-DOPA 親和性が有意に減少していた（ p＜メラニンは本来，紫外線による障害から皮膚を守る0.001, n＝3）．

役割をしているが，多量の紫外線を浴びるとメラニグルタチオンによるメラニン凝集阻害効果ンが過剰産生され，同時にメラノサイトの数も増加

本実験で行ったメラニン合成反応では，反応開始する．高齢化などによる新陳代謝の低下で表皮のメ直後から上清中の OD490 nm 値は上昇し，反応開ラニン排出能力が低下すると，メラニンが皮膚に沈始 30 分後で，その値はピークに達するが，その着し，しみ，そばかすを発生すると考えられている．

後，反応生成物であるメラニンが凝集・沈降するた

現在メラニン合成阻害作用を持つものとして，いめ ， 上 清 中 の OD490 nm 値 は ， 徐 々 に 低 下 す る

くつかのモノテルペノイドやグルコシド，5,6) アルブ（data not shown）．反応生成物の凝集・沈降と上清チン7) などが知られており，グルタチオンもメラニ中の OD490 nm 値の低下は相関することから，遠ン合成阻害効果のある物質の 1 つである．

3.

心上清中の OD490 nm 値を測定することで，メラ生体内におけるグルタチオンの生理活性は，グルニン凝集物の生成速度を測定した．メラニン合成反タチオン抱合として知られる解毒機構や抗酸化物質

応開始 30 分後にグルタチオンを添加し，添加後かとしての作用などが知られているが，グルタチオン

ら経時的に遠心上清中の OD490 nm 値を測定したがメラニン合成阻害を引き起こすメカニズムについところ，グルタチオン未添加群では，遠心上清中のては，明らかにされていない．本研究では，グルタOD490 nm 値は経時的に減少していたが，グルタチチオンがメラニン合成を阻害するメカニズムについ

オン添加群では，遠心上清中の OD490 nm 値の減て解析を行った．

少は認められなかった（ Fig. 3 ）．この結果から，メラニンは L-DOPA とチロシナーゼとの反応にグルタチオン添加群では，メラニン凝集物の生成がよって試験管内で合成することが可能で，メラニン抑制されていることが明らかになった．

合成反応が進行すると OD490 nm の値が上昇する

考察ことが知られている．8) メラニン合成反応液にグルタチオンを加え，OD490 nm の変化を測定したとこ

メラニンは，皮膚を構成する細胞内で形成されるろ，グルタチオン未添加群では，OD490 nm 値が上色素であり，黒褐色のユーメラニン（真性メラニン）昇することから，メラニン合成の進行が示唆されたと，橙赤色のフェオメラニン（亜メラニン）の 2 種（ Fig. 1）．一方，グルタチオン添加群では，OD490

hon p.4 [100%]1206

Vol. 128 (2008)

nm 値が，グルタチオン濃度依存的に抑制されてお液中でメラニン凝集物が生成されていることが明らり，グルタチオンがメラニン合成反応を抑制していかになった（ Fig. 3 ）．一方，グルタチオンを添加る事が明らかになった．さらに，グルタチオンによした反応液の遠心上清では，OD490 nm 値の減少はるメラニン合成阻害メカニズムを解析する目的で，認められず，メラニン凝集物の生成が，グルタチオグルタチオンによるメラニン合成阻害効果と反応液ンによって阻害されていることが明らかになった．

中 の L-DOPA 濃 度 と の 関 係 に つ い て 検 討 を 行 っL-システインやグルタチオンなどの含硫化合物た．その結果，Fig. 2 に示したように，グルタチオは，チロシンや L-DOPA がチロシナーゼを介してンによるメラニン合成阻害効果は，反応液中の L-生成される DOPA キノンに化学的に反応することDOPA 濃度を上昇させることで阻害され，メラニが知られており，9) グルタチオンが DOPA キノンにン合成の回復が認められた．また，グルタチオンに結合することによって，メラニンの生成を阻害してよるメラニン合成阻害が，反応液中のチロシナーゼいる可能性が示唆されるが，本研究では，その詳細濃度を上昇させることで回復できるか否かの検討をを明らかにすることはできなかった．

行ったが，メラニン合成反応液に含まれるチロシグルタチオンは，食品中から摂取する以外に，細ナーゼ濃度（53.7 units/ml）を 10 倍増加させても，胞内でも生合成される成分であるが，その体内生産

グルタチオンによるメラニン合成阻害状態は回復で量は加齢に伴い低下する．10) 高齢者では，しみ，そきなかった．これらの結果から，グルタチオンは，ばかすの発生部位が増加する傾向があるが，その原

メ ラ ニ ン 合 成 反 応 液 中 の L-DOPA に 作 用 し ， L-因の 1 つは，グルタチオン産生能の低下が関係してDOPA とチロシナーゼとの反応を阻害しているこいることが推察された．近年，人間の平均寿命が長とが推察された．そこで， L-DOPA とチロシナーくなり，若々しい容姿を保つことも健康的な生活をゼの結合性に及ぼすグルタチオンの影響を A‹nix

送る上で重要な項目となってきている．これまでは

Q を用いて解析した．その結果， L-DOPA とグル病気を治す医薬品の開発を目的とした研究が中心にタチオンの結合が，グルタチオンの存在下では 90行われてきたが，グルタチオン等のアンチエージン％以上阻害されることが明らかとなり，酵素と基質グに有効と思われる因子についても，精神衛生面のの親和性の低下がメラニン合成阻害の要因であるこ

健康増進を促す薬品として，今後検討されるべきでとが示唆された．

あると考える．

L-DOPA とチロシナーゼの反応では，ドーパキREFERENCESノンが生成され，これが酸化・重合することによりメラニンが生成される．本実験で使用したメラニン

1)

合 成 反 応 で も ， L-DOPA と チ ロ シ ナ ー ゼ を 混 和後，およそ 30 分後に反応液の OD490 nm 値はピークに達し，その後，黒色のメラニン凝集物が形成された（ data not shown ）．メラニン凝集物は，色素沈着によるしみ，そばかすの原因になることが予想

2)
3)

され，メラニン凝集を阻害することは，メラニン生成阻害と同様に，しみ，そばかすの発生を抑制する

4)

重要な作用と考えられる．そこで，グルタチオンのメラニン凝集阻害効果についても検討を行った．LDOPA とチロシナーゼによるメラニン合成反応の5)開始し，メラニン分子の重合が始まる段階（反応開始 30 分後）に，グルタチオンを添加し，メラニン

6)凝集物の生成状態を測定した．その結果，グルタチオン非存在下では，反応液を遠心して得られる上清中の OD490 nm 値が経時的に減少しており，反応7)

Fukui S., Uematsu K., Suzuki K., Hirayama
A., Ouma M., KANGAERU EISEIKAGAKU, Hirokawa Shoten Co., 2002, pp. 367
414.
Benathan M., Arch. Dermatol. Res., 289, 341
346 (1997).
Shimizu H., ATARASHI HIHUKAGAKU,
Nakayama Shoten Co., 2005, pp. 911.
Qiu L., Zhang M., Sturm R. A., Gardiner B.,
Tonks I., Kay G., Parsons P. G. J. Invest.
Dermatol., 114, 2127 (2000).
Kasemura K., Nomura M., Tada T., Fujihara
Y., Shimomura K., J. Oleo Sci., 51, 637642(2002).
Motoki Y., Fujita S., Fujihara Y., Okada O.,
Nomura M., J. Oleo Sci., 52, 495498 (2003).
Maeda K., Fukuda M., J. Pharmacol. Exp.
Ther., 276, 765769 (1996).

hon p.5 [100%]

No. 88)9)1207

Sato K., Takahashi H., Iraha R., ToriyamaM., Biol. Pharm. Bull., 31, 3337 (2008).
Naito K., Hatani T., Okada T., Tehara T.,
Biochem. Biophys. Res. Commun., 343, 152010)(2006).
Toroser D., Sohal R. S., Biochem. J., 405,583589 (2007).