日大歯学 , Nihon Univ Dent J, 89, 49-55, 2015

低出力レーザー治療の骨再生に及ぼす影響―マイクロ CT および組織学的評価―
加藤岳詩

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻（指導：小木曾文内 教授，勝呂尚 助教）

要旨：近年，LLLT が骨折の治癒を促進する可能性があることが報告され，骨形成促進を目的とした LLLT が注目されている。しかしながら，LLLT に関しては臨床治験報告が先行しており，その効果について，基礎的検討に裏付けられた解釈は必ずしも十分ではない。本研究では，ラット下顎臼歯部の根尖付近に実験的に施術した骨欠損の治癒過程をモデルとし，同部の骨再生における LLLT の効果について検討を行った。マイクロ CT を用いた観察では，術後 14 日目でレーザー照射群，非照射群ともに明らかな骨再生が認められた。骨体積および骨密度は，7 〜
14 日目で急速に増加し，その後の 21，28 日目においても増加傾向を示した。14 日目以降の骨体積および骨密度は，レーザー照射群で有意に高かった。組織学的には，骨欠損部における再生骨の出現が，レーザー照射群においては7 日目に観察され，非照射群よりも早い時期に骨形成が生じることが示唆された。また，新生血管の増加も，レーザー照射群では非照射群よりも早いタイミングで生じると考えられた。以上のことから，LLLT は，受傷後の初期段階における細胞レベルでの賦活化を介して，骨欠損部における骨再生過程を促進させる可能性があると示唆された。
キーワード：低出力レーザー治療，骨再生，マイクロ CT，組織学的評価

緒

実験的に施術した骨欠損の治癒過程をモデルとし，同部言の骨再生における LLLT の効果について検討を行った。

歯内療法では，良好な治癒が困難な症例に対する根管再生にともなう変化の評価は，1）実験動物用 3 D マイク

治療と併用して，歯の保存を目的に根尖切除術が行われ

ロ CT（以後，マイクロ CT）による再生骨の観察，骨体積1）ている 。根尖切除後，歯肉粘膜創は 2 週間程度で安定と骨密度の経日的な定量評価，2）ヘマトキシリン・エオ

するが，骨欠損部の治癒については，病巣が大きければジン（以後，HE）染色標本による組織学的な観察，および，数ヶ月を要するといわれる。一方，低出力レーザー治療3）von Willebrand 因子（以後，vWF）の免疫染色による（以後，LLLT）は，消炎，鎮痛に加えて，創傷治癒促進血管増生の観察によって行った。

効果があると報告されている 2,3）。すなわち，創傷部にお材料および方法ける疼痛や腫脹を減少させ，急速な組織温度上昇を伴う
こ と な く 炎 症 を 鎮 め る 効 果 が あ る 4）。 ま た， 近 年 は，

1.

LLLT によって骨折の治癒が促進するとされ，供試動物
Wistar 系雄性ラット（8 週齢，体重 180-200 g）36 頭をの研究では LLLT が骨芽細胞の増殖と分化を誘導して骨使用し，飼育は動物飼育施設内（室温；22℃ , 湿度；55%，形成を促進するという報告がある 5,6）。さらに，骨形成で12/12-h 明暗サイクル）のケージで行った。なお，実験は重要な血管新生を LLLT が促進させる可能性も示唆され日本大学歯学部動物実験委員会の承認（AP12 D007）のも7）と，同委員会のガイドラインに沿って行った。ている 。

ペントバルビタール（ソムノペンチル ; 共立製薬）の腹LLLT に関しては臨床治験報告が先行しており，その効果について，基礎的検討に裏付けられた解釈は必ずし腔内投与（0.5 ml/kg 体重）によって全身麻酔を施した後，も十分ではない 8,9）。これは，実験に使用される照射条件手術部位を剃毛し，70% エタノールで清拭した。右側口や動物モデルのバリエーションにも起因している可能性

角部から下顎角に至る皮膚切開を行い，咬筋を切断，翻がある 10）。事実，これまで用いられた骨再生モデルには，転させ，右側下顎骨骨面を露出させた。ラットにおいて

11）

12,13）

14,15）などが多く，これらのは臼歯根尖の近傍に位置する切歯を避けるようにして，骨質や骨密度は一様でない。加えて，LLLT の効果に関右側下顎の第一および第二臼歯間の根尖付近に直径して顎骨を用いた骨再生研究の報告は皆無である。

1.8 mm のラウンドバーで円筒形の骨欠損を形成した（第大腿骨，頭蓋骨，脛骨

1 図 a, b）。その後，同部を滅菌生理食塩水で十分洗浄し，そこで，本研究では，ラット下顎臼歯部の根尖付近に（受付：平成 27 年 1 月 16 日）〒 101 8310 東京都千代田区神田駿河台 1 8 1349

口腔粘膜および皮膚を復位して 5-0 号絹糸で縫合した。

測した。

手術日を 0 日目とし，28 日目まで飼育した。

4.

2.

組織学的観察レーザー照射群（n ＝ 8），非照射群（n ＝ 8）のラットをレーザー照射
半導体レーザー照射装置（OSL-S；オサダ）を使用した。

7，14，21 および 28 日目にペントバルビタールの過剰投同装置は，近赤外線波長 810 nm の連続波照射でスポッ与にて安楽死させた後，右側下顎骨を摘出し，10% 中性

トサイズは 0.156 cm2 である。レーザー照射の条件は，照緩衝ホルマリンで 2 日間固定した。その後，K-CX（10%射出力 0.1 W，照射時間 40 sec，照射距離 13 mm とした。

ethylenediamine tetraacetic acid-5% 塩酸；ファルマ）

2

本条件下では，照射熱量 3.6 J，パワー密度 0.59 W/cm ，に室温で 1 週間浸漬して脱灰し，パラフィン包埋を行っエネルギー密度 23.5 J/cm2 である。この照射は Khadraた。頬側骨面と平行に作製した厚さ 6μm の連続切片にら12）HE 染色を施して光学顕微鏡（Leica DM 6000B；Leica）に 準 じ て， 術 直 後（0 日 目 ）に 開 始 し，1 日 1 回，6で観察した。一部の切片については，治癒組織内での血日目までの計 7 回行った。
3.

管新生を観察するために，抗 vWF ポリクローナル抗体

マイクロ CT 解析
マイクロ CT（R̲mCT；リガク）の撮影条件は，撮影倍（Dako）を用いた免疫染色を施した。すなわち，脱パラ率 6.7 倍（voxel サイズ : 30×30×30μm），管電圧 90 kV，フィン後，リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に浸漬した切片

管電流 120μA，撮影時間は 17 sec とした。レーザー照を通法に従って，PBS で調製した 1% ウシ血清アルブミ射群（n ＝ 10），非照射群（n ＝ 10）のラットから得られたン（BSA）に浸漬することで非特異的反応部位のブロッキ術直後（0 日目）から 28 日目に至るまでの 7 日毎の撮像

ン グ を 行 っ た 後，1% BSA-PBS で 100 倍 希 釈 し た 抗

データは，i-View-R（リガク）によって観察し，定性的なvWF 抗体と HRP 標識 2 次抗体（One-Step Polymer-HRP評価をした。また，骨欠損部に設定した円筒形の関心領

抗 体，BioGenex）と に 順 次 反 応 さ せ， 発 色 に は 3,域（直径 1.5 mm× 高さ 1.5 mm）について，骨再生にとも3ʼ-diaminobenzidine（シグマ）を用い，発色後にはヘマト

なう骨体積，骨密度の変化に注目した定量的な評価もキシリン溶液による核染色を施した。

行った。

5.
3

統計学的検定骨体積および骨密度についてのレーザー照射群−非照骨体積（mm ）は，周囲組織および明らかな硬組織（既存骨）それぞれの放射線吸収のピーク値を断層像から求射群間の統計学的検定には，Mann-Whitney

め，その中間値が再生骨による放射線吸収度の下限であ16.0 for Windows）を用い， ＜ 0.05 を有意とした。

るとして定量した。骨密度は，骨密度既知の骨塩ファン

結トムの撮影で得た volume データ値と骨塩量の検量線をもとに定量し，関心領域内の平均骨密度（mg/cm3）を算

1.

test（SPSS果

骨再生の経日的変化出した。実際の定量操作では，骨体積測定ソフトウェア

マイクロ CT 像の差分解析によって，骨欠損部におけ（北千住ラジスト歯科 I-view image center）を用いて，7，る骨添加と吸収の状態が 7 日目毎に可視化された（第 214，21 および 28 日目それぞれの撮像データ画像と 0 日図）。7 日目においてすでに，レーザー照射群では画像上目の撮像データ画像とを重ね合わせることで得られる差で検出可能なレベルでの骨の添加と吸収が認められた。

分（voxel 数）を骨体積あるいは骨密度の変化量として計

14 日目以降では，照射群・非照射群のいずれにおいても，第1図

骨欠損モデルとレーザー照射装置
ラット頭部右側面観の模式図（a）で，下顎第一臼歯（M1）と第二臼歯（M2）間の根尖付近に形成した径 1.8 mm の骨欠損（BD）の位置を示す。
b は，照射距離を一定に保つ上で有用な照射装置先端部のスペーサー（黒い部分）を示す。

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低出力レーザー治療の骨再生に及ぼす影響

骨の吸収に比べて明らかに有意な骨の添加・増生によるたが，14，21，28 日目での骨体積は，非照射群ではそれ欠損部再生像が観察された。

ぞれ 0.53，0.93，1.25 mm3 であったのに対して，レーザー

2.

照射群では 1.37，1.77，1.94 mm3 と有意に高かった（ ＜再生骨の体積および密度再生骨の体積変化は第 3 図のとおりであった。7 日目
30.05）。

3

では，レーザー照射群（0.06 mm ）と非照射群（0.03 mm ）再生骨の密度変化は第 4 図のとおりであった。7 日目の再生骨の体積はわずかで，有意な差も認められなかっでは，照射群（53.3 mg/cm3）と非照射群（48.8 mg/cm3）と第2図

第3図

レーザー照射群・非照射群における骨再生の経日変化
各群とも上段は骨欠損部を含む下顎骨の前頭断マイクロ CT 画像であり，図中の矩形部分（関心領域）における差分画像を下段に示している。緑：骨添加部，赤：骨吸収部

再生骨の体積変化
同日の異符号間で ＜ 0.05

第4図51

再生骨の密度変化
同日の異符号間で ＜ 0.05

3.の間に有意な差は認められなかった。その後の骨密度は，組織学的観察

レーザー照射群，非照射群ともに骨体積と同様なパター

骨欠損形成後 7 日目（第 5 図 a-d）においては，レーザーンでの増加傾向を示した。非照射群の骨密度は，14 日目

照射群，非照射群のいずれにおいても，欠損部内に出血で 193.9 mg/cm3，21 日 目 で 264.1 mg/cm3，28 日 目 でをともなった肉芽組織の増生や毛細血管の拡張と充血が3303.4 mg/cm であり，レーザー照射群の骨密度は，14観察された。レーザー照射群では，一部に幼弱な骨の形日目で 273.6 mg/cm3，21 日目で 367.6 mg/cm3，28 日目成が認められたが，非照射群ではそうした像は観察され3なかった。骨欠損形成後 14 日目（第 5 図 e-h）においては，で 411.2 mg/cm であった。

形成された当初の骨欠損の外形痕跡内に，レーザー照射

第5図

骨欠損治癒過程の組織学的変化
術後 7 日目（a-d）および 14 日目（e-h）のレーザー照射群（a, b, e, f）と非照射群（c, d, g, h）の HE 染色像を示す。点線は形成した骨欠損の外形痕跡。右の各図は対応する左図の拡大像。左図はどれも同倍率で図 a 中のスケールは 200μm。矢印；毛細血管の拡張像，矢頭印；再生骨梁52低出力レーザー治療の骨再生に及ぼす影響

群，非照射群のいずれの場合においても，既存骨から連分布状況が示された。骨欠損形成後 7 日目（第 6 図 a-d）

続した明らかな骨の再生像を認め，骨梁構造とその間をにおいては，レーザー照射群，非照射群のいずれにおい埋める結合組織が明瞭に観察された。骨欠損の形成後 21ても，内皮が vWF 陽性を示す血管が多数観察されたが，および 28 日目（図示せず）においての骨再生像は，レーレーザー照射群における新生血管数が非照射群よりも優ザー照射群，非照射群とも，14 日目の像と組織学的に顕位であった。しかし，骨欠損形成後 14 日目（第 6 図 e-h）著な差はみられなかった。

では，レーザー照射群における新生血管数は 7 日目に比べて減少する傾向を示し，非照射群における新生血管数

抗 vWF 抗体による免疫染色標本では，血管内皮細胞は 7 日目よりも増加する傾向が認められた。

が陽性反応を示し，欠損部内の組織における新生結果の第6図

骨欠損治癒過程での血管新生
術後 7 日目（a-d）および 14 日目（e-h）のレーザー照射群（a, b, e, f）と非照射群（c, d, g, h）での抗vWF 抗体免疫染色像を示す。右の各図は対応する左図の拡大像。左図はどれも同倍率で図 a 中のスケールは 200μm。右図において vWF 陽性の血管内皮を矢頭印で例示している。

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考は，レーザー非照射群に比べて照射群においてより豊富察である傾向が示された。こうした所見を，HE 染色標本

LLLT に関しては臨床治験報告が先行しており，そのでの観察結果と併せて考察すると，LLLT は血管新生を効果について，基礎的検討に裏付けられた解釈は必ずし加速させ，おそらくはコラーゲンの合成や線維芽細胞のも十分ではない

8,9）活性化なども促すことによって，創傷治癒ならびに骨再。一方，小動物を用いた組織形態学的生を積極的に促進されると考えられた。

研究では，マイクロ CT による定量的評価が注目されて
16），CT 画像データを活用した骨体積および骨密度

ラットの下顎臼歯部根尖付近に骨欠損を作成した後にの定量的評価の有用性は Ejima らによっても報告されて1 週間の低出力レーザー照射を行った本研究の結果は，いる 17）。

創傷治癒の初期段階での LLLT が，照射組織における血おり

そこで，本研究では，ラット顎骨に実験的に施術した管新生，線維性結合組織の形成を促し，その後の骨再生

骨欠損の治癒過程をモデルとし，LLLT が骨の再生，治に対して促進的な影響を及ぼす可能性を実験的に支持す癒に及ぼす効果について，マイクロ CT による定性的・るものだといえる。

定量的評価，HE 染色標本による組織学的検討，抗 vWF

結免疫染色による血管増生状態の観察を行った。照射条件論の重要性を指摘する報告 18,19）は多いが，理想的な照射条

ラット顎骨に実験的に施術した骨欠損部に 1 週間のみ

件については結論が得られていないため，頭蓋骨欠損部低出力レーザーを照射してその治癒過程を調べた結果，へのレーザー照射後の骨再生過程を報告している

以下の結論を得た。

Khadra ら

12）1.

が用いた照射条件に準じた。

マイクロ CT を用いた観察では，術後 14 日目でレー骨欠損部における骨再生は，欠損部周囲の既存骨からザー照射群，非照射群ともに明らかな骨再生が認め開始し，7 〜 14 日目の間で顕著に増加し，14 日目で円筒られた。骨体積および骨密度は，7 〜 14 日目で急速形の欠損のほぼ全周に骨が形成され，21，28 日目には骨に増加し，その後の 21，28 日目においても増加傾

体 積 お よ び 骨 密 度 が 増 加 し て い く 傾 向 が 観 察 さ れ た。

向を示した。14 日目以降の骨体積および骨密度は，レーザー照射群で有意に高かった。

14，21，28 日目のレーザー照射群での骨体積および骨密2.

度は，非照射群に比べて有意に高い値を示した。こうし組織学的には，骨欠損部における再生骨の出現が，20），レーザー照射群においては 7 日目に観察され，非照Ninomiya ら 21）が報告している創傷治癒初期段階での未射群よりも早い時期に骨形成が生じることが示唆さ

分化間葉系細胞や骨芽細胞の増殖や分化の促進，形成骨れた。また，新生血管も増加も，レーザー照射群での増大，破骨細胞数の減少などといった現象が，レーザーは非照射群よりも早いタイミングで生じると考えらた 骨 体 積 お よ び 骨 密 度 の 増 加 は，Ozawa られた。

照射の効果によって促進されたものと推測できる。
組織学的には，術後 7 日目にレーザー照射群で幼弱な以上のことから，LLLT は，受傷後の初期段階におけ骨梁が認められるようになり，14，21，28 日目へと経日る細胞レベルでの賦活化を介して，骨欠損部における骨的に，欠損部組織内で骨が占める割合が増加する傾向が再生過程を促進させる可能性があると示唆された。

みられた。加えて，そうした傾向は，レーザー非照射群
稿を終えるにあたり，終始懇篤なるご指導とご校閲を賜りました日本大学歯学部歯科保存学第Ⅱ講座 小木曾文内教授ならびに同講座 勝呂尚助教に深甚なる感謝の意を表します。また，本研究に対して多大なご助言を賜った本学部病理学教室 浅野正岳准教授をはじめ，歯科保存学第Ⅱ講座講座員，大学院生各位に深く感謝の意を表します。

よりも照射群において顕著であった。本研究では細胞活性についての検索は行っていないが，レーザー照射後にアルカリホスファターゼ活性が有意に上昇するとの報
告 22,23）もあることから，本研究で観察された組織学的所
見は，レーザーの照射効果が細胞レベルでの賦活化を促進していることを反映した結果だと考えることが可能で文ある。

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色では，レーザー照射群，非照射群のいずれにおいても，vWF 陽性の血管内皮からなる毛細血管を認め，それら

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低出力レーザー治療の骨再生に及ぼす影響

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