日大歯学 , Nihon Univ Dent J, 91, 41-46, 2017

舌乾燥により延髄に発現する c-Fos 陽性細胞の分布様式
鎌倉聡

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻
日本大学歯学部生理学講座（指導：岩田幸一 教授，篠田雅路 准教授）

要旨：舌を 7 日間乾燥させたラットの舌への侵害機械刺激を加えることにより舌ひっこめ反射（TWT）と Vc および C1-C2 領域に発現する c-Fos 陽性細胞の発現様式を解析した。TWT は sham 群に比較して舌乾燥群で有意に低い値を示した。舌乾燥群においては Vc，C1-C2， RF および NTS に多数の c-Fos 陽性細胞が確認された。Vc において c-Fos 陽性細胞は，両側性に背側部の表層部を中心に深層に向かって分布していた。舌乾燥群において sham群より有意に多くの c-Fos 陽性細胞が延髄および上部頸髄から検出された。c-Fos 陽性細胞は obex 付近と obex から 2880μm 尾側部にピークを有する 2 峰性の分布を示した。
以上の結果から舌乾燥に伴う舌痛発症には Vc および C1-C2 領域に存在する侵害受容ニューロンが重要な働きを有する可能性が示された。また，これらの領域に分布する c-Fos 陽性細胞は 2 峰性の分布を示したことから，舌痛症における侵害情報処理は吻側部領域と尾側部領域では異なるメカニズムが存在する可能性があると推察された。
キーワード：三叉神経，三叉神経脊髄路核，上部頸髄，口腔乾燥，舌痛

緒されるニューロンがこの領域から多数検出される可能性言がある。

口腔乾燥症は，口呼吸や唾液腺疾患あるいはシェーグ

しかし，これらの研究では舌乾燥後に侵害機械刺激をレン症候群や糖尿病のような全身疾患によって引き起こ初めとする様々な侵害刺激を与えて検索を行うため，純される口腔特有の疾患である 1-3）。様々な原因によって引粋に乾燥のみによってどの程度のニューロンが活性化すき起こされる口腔乾燥症であるが，多くの場合，舌に痛るかは不明である。これまでの多くの研究により，三叉みを発症する。これまでの舌乾燥モデルラットを用いた神経損傷や口腔顔面領域に炎症が引き起こされると，Vc研究によると，舌乾燥によって舌には機械痛覚過敏が発および C1-C2 領域から検出される侵害受容ニューロン症するが，熱痛覚過敏は引き起こされないことが明らか

は，侵害刺激に対する応答性の増加だけでなく，高頻度になっている。また，三叉神経脊髄路核尾側亜核（Vc）かの自発放電を示すことが知られている 7-10）。おそらく舌ら記録した舌感覚入力を受ける侵害受容ニューロンは，を乾燥することによって駆動されるニューロンも高頻度

侵害機械刺激に対して有意な高頻度の spike 応答を示すの自発放電を示すものと想像される。従来の研究によっ4）ことも報告されている 。さらに，このような舌を乾燥て，c-Fos は侵害刺激を与えてから 2 時間をピークに活したモデルラットにおいては，舌そのものには全く炎症性化したニューロンの核内に発現が認められることが明4）

所見が見られないことも明らかにされている 。このよらかにされており，比較的ゆっくりした反応性変化を検うに，舌の乾燥による舌痛は炎症などの器質的変化がな出するのに適したニューロンの活性化マーカーであるといにもかかわらず発症するが，そのメカニズムが明らか考えられている 11）。にされていない。一方，乾燥舌への侵害機械刺激によっ

本研究では，舌の乾燥のみによって Vc および C1-C2て，Vc および上部頸髄（C1-C2）領域に多くのリン酸化領域に存在するニューロンの自発活動が変調するか否か

extracellular signal-regulated kinase（ERK）発現が誘導を解明するため，c-Fos 陽性細胞発現を指標に，舌乾燥4）されることが明らかにされている 。これらの Vc およによって活性化される延髄ニューロンの発現様式についび C1-C2 領域には舌の侵害情報を受ける侵害受容ニューて詳細な解析を行い，舌乾燥によって引き起こされる舌ロンが存在し，舌の侵害情報処理を担っているものと考痛覚過敏の発症機構の一端を解明することを目的とした。

えられる。さらに，舌からの侵害情報は Vc や C1-C2 領

材料および方法

域だけでなく，孤束核（NTS）にも入力することが知られている 5,6）。NTS においても多くのニューロンが舌乾燥

1.

によって活性化する可能性が高く，舌乾燥によって駆動

動物
本研究は，日本大学歯学部動物実験委員会の許可（承（受付：平成 29 年 1 月 16 日）〒 101 8310 東京都千代田区神田駿河台 1 8 1341

TB（pH7.4）に室温で 5 分間インキュベーションした。免

認番号：AP15 D034-1）を得，同委員会の指針および国際12）。動物は自由に水お疫反応後，MAS-coated slide（Matsunami）にマウントしよびエサを摂取することができる環境下で，12 時間ごとて，脱水，脱アルコールを行ない封入した。また，染色に明暗が変化するように設定された恒温（23℃）の部屋でされた c-Fos 陽性細胞は切片を光学顕微鏡下で観察し，飼育された。実験には Sprague-Dawley 系雄性ラット 20Neuro-Lucida（Micro Bright Field Bioscience）を用いて匹を用いた。

描画した。

2.

5.

疼痛学会の基準に従って行われた

舌乾燥モデルラットの作製

統計学的解析

ラットを 2% イソフルラン（Mylan）と空気が還流する

データは平均 ± 標準誤差（SE）で表し，有意差検定にプラスチック容器内に保持し浅麻酔後，舌を口腔外へ突は Studentʼs -test を用いた。また， ＜ 0.05 の時に有意出させ，毎日 2 時間，計 7 日間舌を乾燥させ（舌乾燥群），差ありと判定した。

舌の侵害機械刺激に対する逃避反射閾値の測定および免結疫組織学的解析に用いた。同様に浅麻酔下で舌を出さずに 毎 日 2 時 間， プ ラ ス チ ッ ク 容 器 内 に 7 日 間 放 置 し た

1.

ラットを sham 群とした。
3.

果逃避反射閾値の比較本研究では舌へ機械刺激を与えるために，舌乾燥群お舌の侵害機械刺激および熱刺激に対する舌ひっこめ

よび sham 群をイソフルランによって浅麻酔した。その反射閾値の測定ため，本実験で得られた TWT は舌の侵害刺激に対する舌乾燥または sham 処置を 7 日間行った後，2% イソ逃避行動ではなく舌のひっこめ反射閾値を示している。

フルランによる浅麻酔下にて，舌の左半側（舌先端よりラットに浅麻酔を施しているため，本研究で得られた3 mm）へ徐々に加えた機械刺激に対する舌のひっこめ反TWT は覚醒動物を用いて測定したこれまでの様々な逃射が生じた刺激強度を反射閾値（TWT）とし，舌乾燥群避閾値に比較して SE が非常に小さな値を示した。第 1（n ＝ 4）と sham 群（n ＝ 4）において計測した。先端が平図に示したように，麻酔ラットの舌へ侵害機械刺激を与坦 な 攝 子（4 mm square；PAnlabs）を 用 い て 機 械 刺 激

え誘発される TWT は舌乾燥群の方が sham 群に比べ有（0-150 g，10 g/s）を与えた。機械刺激は 10 g/s の刺激速意に低い値を示した（舌乾燥群：83.8±2.0 g，sham 群：度を手動で制御し，0 g から反射閾値まで連続的に加え108.1±2.1 g，各 n ＝ 4）。

た。舌乾燥および sham 群とも，乾燥処置後 2 時間経過

2.

延髄および C1-C2 領域で検出された c-Fos 陽性細胞した時点で測定を行った。また，舌乾燥および sham 処

従前の研究により，c-Fos タンパクは神経細胞の核に置前に機械刺激に対する TWT のベースラインを測定し発現することが明らかにされている 11）。舌乾燥群ではた。

Vc，C1-C2，延髄網様核（RF）および孤束核（NTS）にお4.

いて，核が c-Fos 陽性反応を示す多数の神経細胞が確認

c-Fos 陽性細胞の免疫組織染色および陽性細胞数の解析
ラットを sodium pentobarbital（80 mg/kg，i.p.）で深く 麻 酔 し，500 ml 生 理 食 塩 液 に て 脱 血 後，0.1 M
phosphate buffer にて希釈した 4% paraformaldehyde溶液（pH7.4，4℃）500 ml を用いて灌流固定を行った。舌乾燥あるいは sham 群（各 n ＝ 6）の延髄および上部頸髄を取り出し，厚さ 50μm の連続凍結切片を作製し，0.01
M リン酸緩衝液（PBS）で洗浄した後 10% normal goat
serum および 3% Triton-X100 を含む 0.01 M PBS に 2時間インキュベーションした。次に，rabbit anti-c-Fos
polyclonal antibody（1：10000，Ab5，Calbiochem）に室温で 24 時間インキュベーションした。0.01 M PBS で洗浄 し た 後 biotinylated goat anti-rabbit IgG（1：600，Vector Labs）に 37℃で 2 時間インキュベーションした。
次に，HRP-avidine（1：100，ABC，Vector Labs）に室温で 2 時間インキュベーションした。0.01 M PBS で洗浄後さらに 0.05 M Tris buﬀer（TB）で洗浄し，0.035% 3，第1図

3ʼ -diaminobenzidine-tetra HCl（DAB，Sigma），0.2%
nickel ammonium，0.05% peroxide を 加 え た 0.05 M

42

舌乾燥ラットとシャムラットの舌機械刺激に対する頭部ひっこめ反射閾値の比較**： ＜ 0.01

舌乾燥による延髄ニューロンの活動性変調

4.

された。Vc において c-Fos 陽性細胞は，両側性に背側部

Vc および C1-C2 領域における c-Fos 陽性細胞数の比較の 表 層 部 を 中 心 に 広 く 分 布 し て い た（ 第 2 図 A お よ びB）。また，Vc の強拡大像をみると，神経細胞の核に c-Fos

舌乾燥群の Vc および C1-C2 領域に発現した全 c-Fos

免 疫 陽 性 反 応 が 観 察 さ れ た（ 第 2 図 C）。C1 領 域 で は，陽性細胞数と sham 群の c-Fos 陽性細胞数を比較した（第Vc 領域に比べ少数ではあるが，背内側部の表層から深層にかけて c-Fos 陽性細胞が検出された（第 2 図 D および E）。さらに，RF においても，両側性に少数の発現を認めた（第 2 図 F および G）。NTS においては比較的多くの c-Fos 陽性細胞が両側性に観察された（第 2 図 H）。
第 3 図 に は 舌 乾 燥 群 お よ び sham 群 の 延 髄 お よ び
C1-C2 領域に発現した c-Fos 陽性細胞を Neuro-Lucidaを用いて描画した像を示した。舌乾燥群および sham 群のどちらも c-Fos 陽性細胞は左右差がなく両側性に分布していた。また，NTS および RF においては舌乾燥群とsham 群においてほぼ同様の分布パターンを示していた（第 3 図 A および B）。
3.

Vc および C1-C2 領域における c-Fos 陽性細胞の吻尾側方向の広がり
第 4 図に舌乾燥群および sham 群の Vc および C1-C2から検出された c-Fos 陽性細胞の吻尾方向における分布を示した。本研究ではそれぞれのレベルにおいて 3 枚ずつの切片上において検出された c-Fos 陽性細胞数の平均値を吻尾方向に配列した。発現数は obex（0μm）付近とobex から 2880μm 尾側部にピークを有する 2 峰性の分布を示した（第 4 図）。
第3図

第2図

C-Fos 陽性細胞が検出された切片のニューロルシーダ描画像

C-Fos 陽性細胞が検出された延髄領域の顕微鏡写真
A：右側の三叉神経脊髄路核尾側亜核（Vc），左側の Vc，C：A の四角で囲まれた領域の強拡大像，D：右側の C1，E：左測の C1，F：右側毛様体（RF），G：左測 RF，cc：中心管，スケー
ルバー：100μm43第4図

舌乾燥ラットとシャム処置ラットの Vc および C1-C2 領域に発現した c-Fos 陽性細胞の吻尾方向における分布*： ＜ 0.05，**： ＜ 0.01

症するだけでなく，咀嚼や嚥下あるいは発話などの口腔が有する様々な機能を障害し，患者の QOL を著しく低下させることが知られている 1）。本研究では舌の乾燥によって引き起こされる舌の異常疼痛の神経機構を解明し，舌乾燥に起因する舌痛の新たな治療法に対する基礎データを集積することを目的とした。
1.

舌乾燥群の侵害機械刺激に対する反射応答
本研究で用いた舌乾燥モデルラットは侵害機械刺激には痛覚過敏を発症した。従前の研究から，侵害機械刺激に 対 す る 受 容 体 と し て transient receptor potentialankyrin 1（TRPA1）あるいは TRP vanilloid 4（TRPV4），熱刺激に対する受容体として TRP vanilloid 1（TRPV1）
や TRP vanilloid 2（TRPV2）が知られている 13）。これらの受容体はともに無髄の C 線維あるいは細径の有髄神経線維である Aδ神経線維の末梢終末である自由神経終末部に発現し，侵害機械および熱刺激を受容するといわれ第5図ている 14）。本研究結果とこれまでの研究で得られたデー

舌乾燥ラットとシャム処置ラットの Vc および C1-C2 領域に発現した c-Fos 陽性細胞の比較**： ＜ 0.01

タから考察すると，舌を乾燥することによって末梢神経系では侵害機械刺激に対する受容体，すなわち TRPA1あるいは TRPV4 の活性化が誘導された可能性があると考えられる。
2． c-Fos 発現と舌の機械痛覚過敏5 図）。本研究ではそれぞれの群の表層から深層にかけて従来の研究から，immediate early gene として知られ分布している c-Fos 陽性細胞数を比較した。その結果，ここに示したように舌乾燥群の方が sham 群に比べ有意ているに多くの c-Fos 陽性細胞を認めた。

び深層に存在するニューロンの核内に発現するのに，タ考は，末梢組織侵害刺激後に脊髄の表層およンパクである c-Fos は約 2 時間でピークに達することが察分かっている 14）。また，c-Fos は侵害刺激に対して，刺口腔乾燥症やシェーグレン症候群などの様々な疾患で激強度依存的に陽性細胞数が増加することから，興奮し舌が乾燥状態にさらされると，舌の異常疼痛が引き起こた侵害受容ニューロンの指標として用いることができるされることが知られている

1-3）と考えられている 15）。

。舌が乾燥すると疼痛が発44舌乾燥による延髄ニューロンの活動性変調

側部にピークを有する 2 峰性の分布を示した。

c-Fos 発現は侵害刺激を加えてから 2 時間を経過しているので，c-Fos 陽性細胞は興奮後に様々なタンパク合成が進行している状態であると考えられる。また，刺激以上の結果から舌乾燥に伴う舌痛発症には Vc および後 2 時間が経過すると末梢入力を直接受けるニューロン

C1-C2 領域に存在する侵害受容ニューロンが重要な働きだけでなく介在ニューロンも興奮するため，投射ニューを有する可能性が示された。また，これらの領域に分布ロンと介在ニューロンの両方が c-Fos 陽性を示すと考えする c-Fos 陽性細胞は 2 峰性の分布を示したことから，られる。おそらく本研究で検出された c-Fos 陽性細胞は舌痛症における侵害情報処理は吻側部領域と尾側部領域

舌の侵害入力を受ける投射ニューロンと介在ニューロン

では異なるメカニズムが存在する可能性があると推察さの両方の活性化を捉えたもので，細胞内において様々なれた。

タンパク合成が進行した状態を示しているものと推察さ
本研究遂行に当たり，格別なるご指導を賜りました日本大学歯学部生理学講座の岩田幸一教授，篠田雅路准教授および片桐綾乃助教に対し心より感謝の意を表します。尚，本論文に関して，開示すべき利益相反はない。

れる。
3． Vc および C1-C2 における c-Fos 陽性細胞の分布様式
これまでの様々なモデル動物を用いた研究で，Vc お
よび C1-C2 領域には口腔顔面領域の侵害入力を受ける侵文

害受容ニューロンが多数存在することが報告されている 7,8）。口腔顔面領域からの侵害受容ニューロンの分布を

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調べた研究から，Vc および C1-C2 領域の背側部には三叉神経第Ⅲ枝，腹側部領域には第Ⅰ枝領域から，また中間部には第Ⅱ枝領域からの入力が投射するといわれている 11,16）。本研究で対象とした舌の領域は三叉神経第Ⅲ枝領域であることから Vc および C1-C2 領域の背側部に入力投射がある。このことから，舌の侵害刺激によって発現した c-Fos 陽性細胞も Vc および C1-C2 領域の背側部に偏った分布を示したものと考えられる。また，これまでの研究では口腔顔面の侵害刺激によって発現する
c-Fos 陽性細胞は吻尾側方向に 2 峰性のピークを有する発現様式を示すことが報告され，これら 2 つのピークを示す領域に存在するニューロンは異なる機能を有する可能性が報告されている 17）。本研究においても，舌の侵害刺激によって発現する c-Fos 陽性細胞は 2 峰性の分布様式を示していた。これら 2 つのピークを示す領域に存在する舌入力を受ける c-Fos 陽性細胞は舌の侵害情報処理において異なる働きを担っているものと推察される。

結論

麻酔ラットの舌を 7 日間乾燥させたラットの舌への侵害機械刺激を加えることにより舌ひっこめ反射と Vc お
よび C1-C2 領域に発現する c-Fos 陽性細胞の発現様式を解析し，以下の結論を得た。
1.

TWT は sham 群に比較して舌乾燥群で有意に低い値を示した。

2.

舌乾燥群においては Vc，C1-C2，RF および NTS に多数の c-Fos 陽性細胞が確認された。

3.

Vc において c-Fos 陽性細胞は，両側性に背側部の表層部を中心に深層に向かって分布していた。

4.

舌乾燥群において sham 群より有意に多くの c-Fos陽性細胞が延髄および上部頸髄から検出された。

5.

献

c-Fos 陽性細胞は obex 付近と obex から 2880μm 尾4510）Kiyomoto M, Shinoda M, Honda K, Nakaya Y, Dezawa
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