日大歯学 ，97（1），33-41，2023

原著

MeCP2変異ヒト歯髄細胞および MeCP2欠損マウス
迷走神経背側運動核ニューロンについての免疫組織化学的研究
星まなみ

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻

口腔健康科学分野

日本大学歯学部小児歯科学講座（指導：白川哲夫 教授，菊入崇 准教授）

要旨【目的】メチル化 CpG 結合タンパク質 2（MeCP2）をコードする遺伝子 MECP2の変異は，重度の発達異常を呈す
るレット症候群（RTT）を引き起こす。本研究では MECP2の 1 塩基変異により発症した RTT 女児の永久歯から幹細胞を分離し特性の解析を試みた。また，MeCP2欠損が延髄の機能にどのような影響を及ぼしているかを検討するた
めに，Mecp2欠損（Mecp2-/y）マウスを用いて，迷走神経背側運動核（DMV）におけるチロシンヒドロキシラーゼ（TH）およびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）免疫陽性（IR）ニューロンの数と分布を調べた。
【方法】10代の RTT 女児および健常女児の抜去歯から歯髄組織を採取し実験に供した。歯髄細胞での未分化マー
カーの発現について RT-PCR にて確認するとともに，MeCP2および幹細胞マーカーの発現と細胞内の局在を免疫蛍光染色で調べた。続いて，Mecp2-/y および野生型（Wt）マウスの DMV での TH-IR および ChAT-IR ニューロンの分
布を DAB 染色あるいは免疫蛍光二重染色で検討した。
【結果】健常女児由来細胞（CONT）では MeCP2が核内に局在していたのに対し，RTT 女児由来細胞（RETT）では核とともに細胞質にも局在を認めた。Ki-67発現はともに核内に限局していたが，陽性率は CONT に比べ RETT で低かった。STRO-1，SSEA3の発現は両細胞で差異はなかった。DMV における TH-IR ニューロン数は Wt マウスに比べ Mecp2-/y マウスで有意に多かったが，ChAT-IR ニューロン数には違いがなかった。また Mecp2-/y マウスについて TH および ChAT が共発現するニューロンが多く観察された。
【結論】RETT では変異 MECP2の転写が活性化している細胞が一定の割合で含まれていると考えられ，Ki-67の陽性率が CONT より有意に低かったことから MECP2の変異が RETT の増殖能を低下させている可能性が考えられた。
また DMV における TH-IR ニューロン数，ならびに TH と ChAT の共発現に Mecp2-/y と Wt マウスで違いがみられたことから，MeCP2の欠損が DMV ニューロンの活動を変化させ，消化管運動を調節している副交感神経の働きに影響を及ぼしていることが示唆された。
キーワード：メチル化 CpG 結合タンパク質 2，レット症候群，歯髄幹細胞，迷走神経背側運動核

Immunohistochemical studies of MeCP2-mutated human dental pulp cells
and the dorsal motor nucleus of the vagus neurons in Mecp2-deficient mice
Manami Hoshi
Nihon University Graduate School of Dentistry, Major in Oral Health Sciences
Department of Pediatric Dentistry, Nihon University School of Dentistry（Directors：Prof. Tetsuo Shirakawa, Assoc. Prof. Takashi Kikuiri）

Abstract【Purpose】Mutations in MECP2, the gene encoding methyl-CpG-binding protein 2 (MeCP2), cause Rett syndrome(RTT) that presents severe developmental abnormalities. This study attempted to isolate and characterize dental
pulp stem cells from a RTT girl affected with a single-nucleotide mutation in MECP2. In addition, to investigate
how MeCP2 deficiency affects visceral motor functions, the expression of tyrosine hydroxylase (TH) and choline
acetyltransferase (ChAT)-immunoreactive (IR) neurons in the dorsal motor nucleus of the vagus (DMV) was
examined in Mecp2-deficient (Mecp2-/y) mice.
【Methods】Pulp cells were obtained from extracted permanent teeth of a RTT girl and a healthy girl. The
expression of undifferentiated cell markers was examined by RT-PCR, and the expression and localization of MeCP2
and stem cell markers were investigated by immunofluorescence staining. Subsequently, the number and（受付：令和 5 年 1 月30日）
責任著者連絡先：星 まなみ
日本大学歯学部小児歯科学講座〒101-8310 東京都千代田区神田駿河台 1 ‒ 8 ‒13

TEL：03-3219-8106
FAX：03-3219-8353
E-mail： dema19026@g.nihon-u.ac.jp

33

日大歯学

第 97 巻第 1 号

distribution of TH-IR and ChAT-IR neurons were examined in DMV of Mecp2-/y and wild-type (Wt) mice by DAB
staining and immunofluorescence double staining.
【Results】In the pulp cells derived from the healthy girl (CONT), MeCP2 was localized in the nucleus. However,
MeCP2 was localized in both nucleus and cytoplasm of the pulp cells derived from the RTT girl (RETT). Ki-67 was
expressed in the nucleus in both CONT and RETT, but the positive rate of Ki-67 was significantly lower in RETT.
No difference was seen in the expression of STRO-1 and SSEA3 between CONT and RETT. The number of TH-IR
neurons in DMV was significantly larger in Mecp2-/y mice than that in Wt mice, while no difference was seen in
the number of ChAT-IR neurons between Mecp2-/y and Wt mice. In addition, neurons co-expressing TH and ChAT
were observed abundantly in Mecp2-/y mice but not in Wt mice.
【Conclusion】In RETT, mutated MECP2 was transcriptionally activated at a certain rate, which might havelowered the positive rate of Ki-67 and reduced proliferation ability of the cells. The increase in the number of TH-IR
neurons and co-expression of TH and ChAT in DMV of Mecp2-/y suggest that MeCP2 deficiency may alter
neuronal activities in DMV and affect the parasympathetic control of visceral functions.
Keywords: methyl-CpG-binding protein 2, Rett syndrome, dental pulp stem cells, dorsal motor nucleus of the vagus

緒スは，生後早期に RTT 患者に類似した神経症状を呈し，

言

野生型マウスに比べて著しく寿命が短く，生後 8 〜12週でX 染色体上にあってメチル化 CpG 結合タンパク質 2

死亡する 8 , 9 ）。MeCP2は脳由来神経栄養因子（BDNF）や（MeCP2）をコードする遺伝子 MECP2の変異は，重度のγ−アミノ酪酸（GABA）など様々な遺伝子の転写を調節

発達異常を呈するレット症候群（RTT）を引き起こすこ

しており，Mecp2の欠損によりそれらの発現が変化することが知られている 1 , 2 ）。RTT は約 1 万人に 1 人の割合で主とから10, 11），Mecp2が欠損した雄モデルマウス（Mecp2-/に女児に発症し，1 歳 6 か月以降で精神発達遅滞 3 ）のほか

y）は RTT にみられる病態の原因を探索するうえで有用

様々な全身的症状が発現する。RTT の主要な診断基準とである。

して，合目的的な手の機能の喪失，音声言語コミュニケー

Mecp2-/y の脳幹では，孤束核ならびに青斑核でのノルションの喪失，失調性歩行，手の常同運動が挙げられておアドレナリン神経伝達の異常が報告されている12, 13）。しかり 4 ），そのほか消化管運動異常や便秘 5 ），歯科領域では咀

し，MeCP2の欠損が副交感神経を経由して内臓の運動を

嚼機能の低下および歯列不正が高率で認められる 4 ）。また

制御している迷走神経背側運動核（DMV）でのアセチル

著明なブラキシズムを示す場合もある 。さらに MeCP2

コリン神経系14）にどのように影響を与えているのかは明らの異常は RTT 以外の中枢神経系の疾患においても認めらかにされていない。そこで本研究では，RTT 女児歯髄由れることがあり，MeCP2の異常が複数の疾患の発症に重来細胞の解析に加え，実験Ⅱとして，8 週齢の Mecp2-/y4）

要な役割を果たしていることが示唆されている 。

マウスについて，DMV でのチロシンヒドロキシラーゼ

3）

RTT 患者から試料を採取して実施する研究では，人を（TH）免疫陽性（IR）ニューロンおよびコリンアセチル

対象とする医学系研究に必要な倫理的要件を満たすことがトランスフェラーゼ（ChAT）免疫陽性（IR）ニューロン

必須であり，また試料採取に伴う被験者への侵襲を最小限の数と分布を調べ，野生型マウスと Mecp2-/y マウスで比に留める必要がある。歯科領域において日常的な医療行為較した。また DMV ニューロンでの TH と ChAT の共存として抜歯処置が行われているが，医療上の必要性に基づの有無についても調べた。

き抜去された歯を試料とする研究は，今日では国内外で広材料および方法

く行われている。特に歯髄組織については，幹細胞を含む
多種の細胞が存在することから研究材料として有用性が高1 ．実験Ⅰい1 ）対象者。抜去歯から得られた歯髄の細胞を活用する研究は，

6,7）

RTT の病態を細胞レベルで解明するうえでも大きな意義

ヒト歯髄由来細胞を用いる実験は，日本大学歯学部倫理があるが，現在のところ，RTT 患者の永久歯の歯髄を用委員会の承認を得て実施した（倫許 EP18D011）。歯髄組

いた研究は見当たらない。そこで本研究では，実験Ⅰとし織の供与について同意の得られた10代の RTT 女児 1 名，て，MECP2の 1 塩基変異により発症した RTT 女児の永および同年代の健常女児 1 名より抜去された永久歯計 2 歯

久歯から幹細胞を分離し，特性の解析を試みた。

を実験に用いた。

RTT の主要な原因遺伝子が MECP2であることが報告
2 ）歯髄採取された後，MeCP2をコードする遺伝子 Mecp2を欠失させたモデルマウスが作られ，ヒトと同様にモデルマウスにお対象歯を通法に従って抜去した後，根尖部を滅菌バーでいても神経発達障害が引き起こされることが報告されてい1 〜 2 mm 削合し，根管治療用ファイルを歯髄腔に挿入しる 8 , 9 ）。特に MeCP2を完全に欠損している雄モデルマウて歯髄組織を採取した。滅菌シャーレ上で歯髄組織をメス

34

MeCP2が変異したヒト歯髄細胞とマウス神経細胞についての免疫組織学的研究にて 3 mm 程に細切し，組織片を培養皿に静置し培養を

表1

行った。
3 ）細胞培養RTT 女 児 由 来 歯 髄 組 織 に つ い て，20% fetal bovine
serum（FBS, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,USA），1 % penicillin streptomycin（Thermo Fisher
Scientific）を含むα-Minimum Essential Medium（α-MEM，
富士フィルム和光純薬，大阪）を用いて培養を行い，37℃，
5 % CO2にてインキュベーター内で静置培養し，歯髄組織
片から細胞をアウトグロースさせた。アウトグロースした細胞を Cellartis MSC Xeno-Free Basal Medium（タカラ

RT-PCRで用いたプライマーおよび増幅産物のサイズ

Primers Sequences

Product size
（bp）

c-Myc

F 5’-TCC TGG GAA GGG AGA TCC G-3’
R 5’-ACG TTG AGG GGC ATC GTC-3’

328

Sox2

F 5’-GGA AAT GGG AGG GGT GCA AA-3’
R 5’-TTG CGT GAG TGT GGA TGG G-3’

150

Nanog

F 5’-TTG GAA GCT GCT GGG GAA G-3’
R 5’-GAT GGG AGG AGG GGA GAG GA-3’

193

Oct4

F 5’-GGA GGG GAG GAG CTA GGG-3’
R 5’-CTT CCC TCC AAC CAG TTG CC-3’

137

Klf4

F 5’-ATC GTG GCC CCG GAA AAG-3’
R 5’-TGT AGT GCT TTC TGG CTG GG-3’390β-actinF 5’-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3’
R 5’-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA A-3’

186

バイオ，滋賀）にて培養し，実験に供した。健常女児由来

表2

歯髄組織については，RTT 女児由来歯髄組織と同様の手

令和 5 年 6 月

免疫組織化学染色に用いた抗体

抗体

免疫種 メーカー名

＊

MeCP2

RabbitNovus Biological

1：200

20% fetal bovine serum を含むα-MEM（富士フィルム和Ki-67

Rabbit

Abcam

1：200

光純薬）を用いて培養を行った。

SSEA3

Mouse

IBL

1：100

STRO-1

Mouse

Novus Biological

1：100

4 ）歯髄細胞での未分化マーカーの発現

TH

RabbitProtos Biotech

1：100
1：1000（DAB染色）

ChAT

RabbitMillipore

1：1000（DAB染色）

ChAT

Goat

Millipore

1：100

VMAT2

RabbitPhoenix pharmaceuticals 1：100
1：1000（DAB染色）

Alexa Fluor 594

Rabbit

Abcam

1：500

Alexa Fluor 488

Mouse

Abcam

1：500

Alexa Fluor 546

Goat

Invitrogen

1：1000Alexa Fluor 488

RabbitInvitrogen

1：1000順で，Cellartis MSC Xeno-Free Basal Medium または健常女児歯髄由来細胞（CONT）および RTT 女児歯髄由来細胞（RETT）から RNeasy mini kit（QIAGEN，Hilden，Germany）を用いて全 RNA を精製し，Recombinant RNase
Inhibitor（タカラバイオ），5×PrimeScript Buffer（タカラバイオ），PrimeScript Reverse Transcriptase（タカラバイオ），dNTP Mixture（タカラバイオ），ならびに Random
Primer（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA） と 反 応 さ せることにより cDNA 合成を行った。ThermalCycler（Bio-

希釈率＊ DAB 染色以外は免疫蛍光染色での希釈率を記載

Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）を用いて，表1 に示す未分化マーカーに対するプライマーを使用してImmunoBioScience，Mukilteo，WA，USA） に て 封 入 しRT-PCR を行った。増幅した PCR 産物について 2 % アガ

た。作製した標本について，20×対物レンズと CCD カメ

ロースゲルにて電気泳動を行い，バンドを確認した。βラを備えた蛍光顕微鏡（ECLIPSE 80i，ニコン，東京）を-actin を RT-PCR 解析の内在性コントロールとして使用し使用して画像化した。

た。
6 ）免疫陽性歯髄細胞数の計測
5 ）歯髄細胞での MeCP2ならびに幹細胞マーカーの発現

MeCP2と Ki-67の陽性細胞に関しては，蛍光光源の励起

歯髄細胞での MeCP2の発現と細胞内局在，および幹細強度を常に一定にして組織像をカラー画像として保存した胞マーカーの発現を調べる目的で免疫組織化学染色を行っ後，陽性細胞数を計測した。画像は，CONT と RETT にた。CONT および RETT を8 well Lab-Tek Chamber Slide

ついて，MeCP2と Ki-67の陽性細胞を各々 6 ウェルずつ撮（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）上で影した。

1.0×10 個 /well で播種して24時間培養後，4 % パラホル
4

ムアルデヒドで固定し，1 %TritonX-100にて透過処理を室

2 ．実験Ⅱ

温で10分間行い，1 % BSA−PBS で室温にて30分間ブロッ

1 ）実験動物および飼育条件

キングを行った。続いて，表 2 に示す一次抗体を含む溶液

ヘテロ接合型の Mecp2欠損雌マウス（B6.129P2（C）-

中で 4 ℃にて一晩反応させた。その後 PBS で洗浄し，蛍Mecp2tm1.1Bird/ J; Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME,

光標識ヤギ二次抗体（抗マウス Alexa Fluor 488，抗ウサ

USA）8 , 11） ならびに C57BL / 6J 野生型雄マウス（三協ラギ Alexa Fluor594）を含む溶液中で，室温，遮光下で 1

ボサービス，東京）を購入後，本学動物実験施設にて飼育時間反応させた。その後 PBS で洗浄し，DAPI を含む封および交配を行い，生後 7 日目に Mecp2について遺伝子入材（Fluoroshield Mounting Medium with DAPI;型 の 判 定 を 行 っ た。Mecp2欠 損 が な い 野 生 型 雄 同 腹 仔

35

日大歯学

第 97 巻第 1 号（Wt） を 対 照 と し て 使 用 し た。 マ ウ ス は， 温 度（24 ±546 ロバ抗ヤギ IgG および Alexa Fluor 488 ロバ抗ウサギ

1 ℃），湿度（55 ± 5 %）で制御された飼育室にて，12 h：

IgG を使用した。封入には Fluoroshield（ImmunoBioScience）

12 h の明暗サイクル（07：00に点灯）下で，餌と水を自を用いた。染色した組織標本は60×油浸対物レンズを備え由に摂取させて飼育した。動物実験は全て日本大学遺伝子たレーザー走査型共焦点顕微鏡 C1（LSCM; ニコン，東京）

組換え実験安全委員会（2020歯004-2）で承認され，日本で観察し，ChAT-IR ニューロンと TH-IR ニューロンある大学動物実験委員会の指針にしたがって実施した

いは VMAT2-IR 神経終末様構造の蛍光画像を取得した。

（AP22DEN008-1，AP22DEN019-1）。
3 ．統計解析2 ）脳切片の免疫組織化学染色

統計解析には，SPSS Statistics ver.22（SPSS，Chicago，

マウスを 5 % イソフルラン吸入で深麻酔し，氷冷生理

IL，USA）を用いた。値は平均値±標準誤差として表記

食塩水で経心的に灌流した後，4 % パラホルムアルデヒド

した。統計的有意差は，すべての解析で P < 0.05に設定しにて灌流固定した。直ちに脳を摘出し，4 ℃で一晩固定後，た。培養歯髄細胞における免疫陽性の比率についての 2 群

30% スクロースに置換したのち‒80℃で凍結保存した。続間の比較は Mann-Whitney U test を用いた。TH-IR ニュー

いてクライオスタット（CM1850; Leica，Wetzlar, Germany）

ロン数ならびに ChAT-IR ニューロン数の Mecp2-/y マウ

を用いて連続冠状切片（厚さ25 μｍ）を作製し，浮遊法にスと Wt マウス間の比較には二元配置分散分析を用い，両て免疫組織化学染色を行った。切片を，表 2 に示すウサギ

マウス間で有意差が認められた場合には，吻尾側的に同じ

抗 TH ポリクローナル抗体，またはウサギ抗 ChAT ポリ

位置で計測した 2 群間の数値を t 検定を用いて比較した。

クローナル抗体を用いて 4 ℃で24時間反応させたのち，ヒ結

ストファインシンプルステイン MAX PO（R）（ニチレイ，
東京）と室温で60分間反応させた。染色には Vectastain

果

1 ．実験ⅠDAB Substrate Kit（Vector Laboratories，Burlingame，

対象の RTT 女児の MECP2の変異部位は，主治医らにCA，USA）を使用し，硫酸ニッケル強化ジアミノベンチ

よって c. 473C > T, p. T158M であることが確認されておジン（DAB）にて切片を処理し発色させた。Mecp2-/y マ

り， 本 変 異 は MECP2の メ チ ル 化 DNA 結 合 ド メ イ ンウスおよび Wt マウスは各 4 頭使用した。

（MBD）内に位置している。この MBD 内の変異により，
MeCP2のメチル化 CpG との結合が著しく低下することが3 ）TH-IR および ChAT-IR ニューロン数の計測明らかにされており16），その下流に位置する遺伝子の発現

DMV での TH-IR ニューロン数ならびに ChAT-IR ニュー調節に異常が生じると考えられている16）。本研究の実施にロン数の計測には，20×対物レンズと CCD カメラを備え

あ た り，RETT な ら び に CONT か ら 抽 出 し た ゲ ノ ム

た光学顕微鏡（ニコン）を使用し，照明強度を常に一定にDNA を試料として，変異部位を切断する制限酵素である

して組織像をカラー画像として保存したのち，左右側の各

Nla Ⅲを用いて RETT の変異部位を再確認したのち実験

ニューロン数を計測した。DMV の境界は，連続切片からを行った。

別途作製したニッスル染色標本を用いて決定した。TH-IR
および ChAT-IR ニューロン数は，吻尾側方向に100 μｍ間1 ）歯髄細胞における未分化マーカーの発現隔で計測した。Mecp2-/y マウスの脳の大きさが Wt マウ

RT-PCR の結果，CONT および RETT で，未分化マースよりやや小さいことから ，Mecp2-/y マウスと Wt マ
15）

ウスの脳部位の前後的位置の判定はニッスル染色標本と照合しながら行った。
4 ）ChAT と TH または小胞モノアミントランスポーター
2 の免疫蛍光二重染色
クライオスタットにて連続冠状切片（厚さ25 μｍ）を作製し，ChAT と TH または ChAT と小胞モノアミントラ
ンスポーター 2（VMAT2）の免疫蛍光二重染色を行った。
浮遊切片を，表 2 に示すウサギ抗 TH 抗体およびヤギ抗ChAT 抗体，またはウサギ抗 VMAT2抗体およびヤギ抗ChAT 抗体を含む溶液とともに 4 ℃で一晩反応させた。

図 1 歯髄細胞における未分化マーカーの発現
CONTおよびRETTともに未分化マーカーc-Myc，Sox2，Oct4，Klf4の発現を認めたが，両細胞ともNanogの発現はみられなかった。

次に，切片を二次抗体とともに室温で60分間反応させ，ス
ライドガラスに貼り付けた。二次抗体として Alexa Fluor

36

MeCP2が変異したヒト歯髄細胞とマウス神経細胞についての免疫組織学的研究

令和 5 年 6 月

図 2 MeCP2の免疫蛍光染色画像と陽性率
A：CONTでは，全細胞においてMeCP2陽性反応（緑）が主に核に局在していたのに対し，RETTではMeCP2が主に核に局在している細胞の他に，細胞質と核がほぼ同レベルで陽性反応を示した細胞が認められた。DAPIの蛍光シグナルを青で示す。赤矢印はMeCP2の核のみが陽性、黄矢印は核と細胞質が免疫陽性の細胞を示す。B：
RETTでは，細胞質が核に近いレベルで免疫陽性反応を示した細胞が26.6%認められた。＊ P < 0.01

図 3 Ki-67の免疫蛍光染色画像と陽性率
A：Ki-67陽性反応（緑）はCONTおよびRETTともに核内に限局していた。画像中の破線で囲む部分の拡大図を右下の四角内に示す。
青はDAPIの蛍光シグナルで，赤矢印はKi-67の免疫反応が陰性の細胞を示す。B：陽性率はCONTで93.7%であったのに対し，RETTでは82.3%と有意に低かった。＊ P < 0.01

カーである c-Myc，Sox2，Oct4，Klf4の遺伝子発現が認比べ RETT で有意に低かった（P < 0.01）（図 3 ）。多能性

められたが，ともに Nanog の発現は認められなかった（図幹 細 胞 マ ー カ ー で あ る SSEA3の 発 現 は，CONT お よ び

1）。

RETT ともに弱く，主に核周囲及び細胞表面に局在しており，両細胞で違いはみられなかった（図 4 Ａ）
。間葉系幹

2 ）歯髄細胞における MeCP2ならびに幹細胞マーカーの細胞マーカーである STRO-1は，CONT および RETT と発現もほとんど発現がみられず，CONT において細胞膜の一CONT および RETT において MeCP2の陽性率を調べ部に弱い免疫陽性反応がみられたのみであった（図 4 Ｂ）。

たところ，CONT で100%，RETT で94.8% であった。それらのうち，CONT では全細胞で MeCP2がほぼ核に局在2 ．実験Ⅱしていたのに対し，RETT では細胞質と核がほぼ同レベ

1 ）マウスの DMV における TH-IR ニューロンの発現ルで免疫陽性反応を示した細胞が26.6 ± 5.7% 認められ，TH-IR ニューロンの数は Wt マウスと比較して Mecp2-/

CONT と RETT の比較で，核のみが免疫陽性の細胞の比y マウスの方が多く，有意差が認められた（n= 8, P <率，ならびに核と細胞質ともに免疫陽性の細胞の比率につ0.001）（図 5 ）。Mecp2-/y マウス，Wt マウスともに閂かいて有意差が認められた（P < 0.01）（図 2 ）。また増殖能ら吻側に100 μｍの位置で最も細胞数が多かった（図 5 A）。

のマーカーである Ki-67についての免疫蛍光染色で，Ki-67

Mecp2-/y マウスにおいて，TH-IR ニューロンはおもには核内に限局して陽性反応を示し，陽性率の平均は CONTDMV の中央から内側に分布していた（図 5 B）。

で93.7 ± 1.3％，RETT では82.3 ± 1.3％であり，CONT に

37

日大歯学

第 97 巻第 1 号

2 ）マウスの DMV における ChAT-IR および TH-IR ニュー
ロンの局在
ChAT-IR ニ ュ ー ロ ン は DMV 全 体 に 分 布 し て お り，
Mecp2-/y マウスと Wt マウスとの比較で ChAT-IR ニュー
ロンの数に違いはみられなかった（図 6 ）。免疫蛍光二重
染 色 を 行 っ た 切 片 に つ い て，ChAT と TH の 局 在 を
LSCM により調べたところ，Mecp2-/y マウスの DMV において二重標識されたニューロンが多く確認され，それらは DMV の中央から内側に位置していた（図 7 ）。一方，
Wt マウスでは ChAT と TH が共存するニューロンはほとんど認められなかった（図 7 ）。
3 ）DMV における ChAT-IR ニューロンおよび VMAT2IR 神経終末様構造の局在
Wt マウスの DMV では，ChAT-IR ニューロンの周囲に
VMAT2-IR 神経終末様構造が多数存在した（図 8 ）。一方，
Mecp2-/y マ ウ ス の DMV で は VMAT2-IR 神 経 終 末様構
造はわずかしか認められなかった（図 8 ）。

考察

CONT ならびに RETT では，いずれの細胞においても未分化マーカー遺伝子である c-Myc，Sox2，Oct4，Klf4の発現を認めた。また，Nanog については両細胞ともに発現が認められなかった。佐藤ら 7 ）による報告では，永久歯歯髄 由 来 の 間 葉 系 幹 細 胞 で は， 未 分 化 マ ー カ ー の う ち
c-Myc，Sox2，Oct4，Klf4が発現していたのに対し，乳歯

図 4 SSEA3（A）とSTRO1（B）の免疫蛍光染色画像
SSEA3およびSTRO-1の発現は，CONTとRETTで差異はみられなかった。

歯髄由来の間葉系幹細胞では c-Myc の発現が認められなかった。一方で，前者には Nanog が発現していなかった

図 5 DMVにおけるTH-IRニューロン
A：TH-IRニューロンの数は，WtマウスよりもMecp2-/yマウスで有意に多かった。グラフの横軸は閂からの距離を示し，尾側方向はマイナス（-）で示す。B：TH-IRニューロンの局在を示す。Mecp2-/y
マウスではWtマウスに比べ，TH-IRニューロンが多く認められ，それらはDMVの中央から内側に位置していた。いずれも閂から吻側200 μｍの画像を示す。

図 6 DMVにおけるChAT-IRニューロン
A：MeCP2-/yマウスおよびWtマウスのChAT-IRニューロンの数に差はみられなかった。B：閂から吻側200 μｍの領域でのChAT-IR
ニューロンを示す。DMVと同様に舌下神経核にも多くのChAT-IR
ニューロンを認めた。

38

MeCP2が変異したヒト歯髄細胞とマウス神経細胞についての免疫組織学的研究

令和 5 年 6 月

れた，細胞質にも明らかな MeCP2の免疫陽性反応を認めた細胞は，MECP2の変異アレルが活性化した細胞である可能性が高い。これらの RETT では，MeCP2の核内でのDNA 結合能が低下しているために核内に留まることができず細胞質に移行したものと推測される。理論的には RETTのうち MECP2が変異した細胞の比率は50％であるが，継代培養によってその比率が変化した可能性は否定できな
い。Ki-67に対する免疫蛍光染色で，CONT に比べ RETT
で Ki-67の 陽 性 率 が 有 意 に 低 か っ た こ と は，RETT がCONT に比べ増殖能が低いことを示唆している。その違いが変異 MeCP2の転写調節機能の低下による Ki-67発現

図 7 DMVにおけるChAT-IRおよびTH-IRニューロンの発現
A,D：ChAT-IRニューロン。B,E：TH-IRニューロン。C：Wtマウス
において，ChATおよびTHの共発現はみられなかった。F：Mecp2-/
yマウスにおいて，複数のニューロンでChATおよびTHの共発現を認めた。閂から吻側200 μｍの画像を示す。

への直接の影響なのか，それとも MeCP2の変異による細胞増殖能全般への負の影響によるものなのかは今後検討する必要がある。
マウスを用いたこれまでの研究で，Mecp2-/y マウスでは Wt マウスに比べ，脳の複数の部位でノルアドレナリン量が低下していること18），また TH を発現する A1/C1および A2/C2細胞群のニューロン数が減少していることが報告されている12）。本研究では，Mecp2-/y マウスの DMVにおける TH-IR ニューロンならびに ChAT-IR ニューロンの数および分布について詳細に調べることとし，観察時に励起光源の安定性や蛍光強度変化の影響を受けやすい免疫蛍光染色ではなく，繰り返し安定した観察や計測が可能な
DAB 染色を採用した。Wt マウスとの比較で，Mecp2-/y
マウスの DMV では TH-IR ニューロンが多く認められた。
また免疫蛍光二重染色で ChAT との共存について検討した と こ ろ，Mecp2-/y マ ウ ス の DMV の 多 く の ChAT-IR

図8

DMVにおけるChAT-IRニューロンおよびVMAT2-IR神経終末様構造
A,D：ChAT-IRニューロン。B,E：VMAT2-IR神経終末様構造。C,F：
WtマウスではChAT-IRニューロンの周囲にVMAT2-IR神経終末様構造が多数認められたが，Mecp2-/yマウスではわずかしか認められなかった。閂から吻側200 μｍの画像を示す。

ニューロンが TH を共発現していることを確認した。DMVでは孤束核と同様に，摂食行動後に Fos 免疫陽性細胞数が増加することが報告されている19）。これらの知見は，
DMV において副交感神経の制御に関与しているコリン作
動性ニューロンが，Mecp2-/y マウスにおいては TH の共のに対し，後者では発現が確認されている。本研究結果は発現によってカテコールアミン産生能を増強させているこ

佐藤らの結果と一致しており，RETT は健常者の永久歯とを示しており，それにより胃などの消化管に分布する副歯髄由来の間葉系細胞と同様に，幹細胞としての性質を有交感神経の機能に変化が生じていることが示唆される。
現在のところ，Mecp2の欠損と DMV での TH-IR ニュー

していることが強く示唆された。
RTT では一対の X 染色体の片方の MECP2に変異があ

ロン数の増加あるいはコリン作動性ニューロンでの THり，変異 MECP2が活性化している細胞において転写制御の共発現の増加が，Mecp2-/y マウスにおいて DMV の機機構に異常をきたしていることが考えられる。RETT に能をどのように変化させるかについては不明である。これ生じた MECP2の変異は 1 塩基置換であり，MeCP2の三までの研究で，延髄の神経細胞での TH の発現に対する長次構造にはわずかな変化しか生じないことから17），RETT期の低酸素暴露の影響が報告されている。低酸素暴露は，の MeCP2は CONT の MeCP2と同様に今回使用した抗体

A 2 細 胞 群 で の TH 活 性 と mRNA 発 現 を 増 加 さ せ20, 21），に対する抗原性を維持していた。本研究において，CONT

孤束核と DMV での TH 量の増加を誘発した21）と報告されの全細胞で MeCP2が核に局在していたのに対し，RETTている。成体期の Mecp2-/y マウスは呼吸中枢の機能が著では細胞質と核がほぼ同レベルで免疫陽性反応を示した細しく不安定化し，無呼吸が頻発するなどの重度の呼吸異常

胞 が26.6% 認 め ら れ，CONT と RETT を 比 較 し た 場 合，を示す。また本研究に用いた生後 8 週の Mecp2-/y マウス

核のみが免疫陽性の細胞の比率ならびに核と細胞質ともにでは慢性的なチアノーゼを呈する個体が認められた。以上

免疫陽性の細胞の比率に有意差が認められた。今回観察さの報告や所見から，成体期の Mecp2-/y マウスにおける持

39

日大歯学

第 97 巻第 1 号

続的な低酸素状態が，DMV ニューロンの TH 合成経路をていること，MeCP2の欠損が DMV ニューロンの活動を活性化している可能性が考えられる。さらに DMV での変化させ，消化管運動を調節している副交感神経の働きに

VMAT2-IR 神経終末様構造と ChAT-IR ニューロンとの関影響を及ぼしていることが示唆された。

係について免疫蛍光二重染色により観察したところ，Wt

本研究遂行にあたり，格別たるご指導およびご校閲を賜りました日本大学歯学部小児歯科学講座 白川 哲夫教授，菊入 崇准教授に謹んで深く感謝を申し上げます。また，本研究を通じ，多大なるご協力を賜りました日本大学歯学部小児歯科学講座の皆様に感謝申し上げます。
なお，本研究では開示すべき利益相反はない。

マウスでは ChAT-IR ニューロンの周囲に多数の VMAT2IR 神経終末様構造が観察されたのに対し，Mecp2-/y マウ
スでは VMAT2-IR 神経終末様構造はほとんど観察されなかった。VMAT2は，主にセロトニン，ドパミン，ノルア
ドレナリンあるいはアドレナリンなどのモノアミン作動性
ニューロンに発現することから22），Mecp2-/y マウスの文

DMV ではモノアミン作動性神経入力を介した機能調節に

1）Amir RE, Van den Veyver IB, Wan M, Tran CQ, Francke U,
Zoghbi HY (1999) Rett syndrome is caused by mutations in
X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2.
Nat Genet 23, 185-188.
2）Neul JL, Zoghbi HY (2004) Rett syndrome: a prototypicalneurodevelopmental disorder. Neuroscientist 10, 118-128.
3）N eul JL (2012) The relationship of Rett syndrome and
MECP2 disorders to autism. Dialogues Clin Neurosci 14,
253-262.
4）白川哲夫，秋山茂久，堤香奈子，森崎市治郎，田村文誉，保
母妃美子，菊谷 武，玄 景華，武井浩樹，髙森一乗（2017）
レット症候群患者の口腔機能障害の把握と歯科医療支援．障害者歯38，140-147.
5）原 宗嗣（2015）便秘・消化管運動異常．レット症候群診療ガイドブック．青天目信，伊藤雅之，大阪大学出版会，大阪，
183-188.
6）H onda MJ, Watanabe E, Mikami Y, Saito Y, Toriumi T,
Shirakawa T, Shimizu N, Watanabe N, Isokawa K (2013)
Mesenchymal dental stem cells for tissue regeneration. Int J
Oral Maxillofac Implants 28, 451-460.
7）佐藤桃子，石田千晶，岩佐聡子，武井浩樹，本田雅規，白川哲夫（2014）乳歯および永久歯歯髄組織由来間葉系細胞の特性の比較 . 小児歯誌 52，417-424.
8）Guy J, Hendrich B, Holmes M, Martin JE, Bird A (2001) A
mouse Mecp2-null mutation causes neurological symptoms
that mimic Rett syndrome. Nat Genet 27, 322-326.
9）Chen RZ, Akbarian S, Tudor M, Jaenisch R (2001) Deficiencyof methyl-CpG binding protein-2 in CNS neurons results in a
Rett-like phenotype in mice. Nat Genet 27, 327-331.
10）Chang Q, Khare G, Dani V, Nelson S, Jaenisch R (2006) The
disease progression of Mecp2 mutant mice is affected by thelevel of BDNF expression. Neuron 49, 341-348.
11）Ishiyama M, Tamura S, Ito H, Takei H, Hoshi M, Asano M,
Ito M, Shirakawa T (2019) Early postnatal treatment withvalproate induces Gad1 promoter remodeling in the brain
and reduces apnea episodes in Mecp2-null mice. Int J Mol Sci
20, 5177.
12）Viemari JC, Roux J, Tryba AK, Saywell V, Burnet H, Peña F,
Zanella S, Bévengut M, Barthelemy-Requin M, Herzing LB,
Moncla A, Mancini J, Ramirez JM, Villard L, Hilaire G (2005)
Mecp2 deficiency disrupts norepinephrine and respiratory
systems in mice. J Neurosci 25, 11521-11530.
13）Z h a n g X , S u J , R o j a s A , J i a n g C ( 2 0 1 0 ) P o n t i n e
norepinephrine defects in Mecp2-null mice involve deficient
expression of dopamine beta-hydroxylase but not a loss ofcatecholaminergic neurons. Biochem Biophys Res Commun

何らかの異常が生じていることが示唆される。
現在まで，MeCP2により転写が抑制または活性化されている遺伝子の探索が行われているが，実際に MeCP2の標的として RTT の機能異常との関連が判明している遺伝
子は BDNF などに限られている10）。また，MeCP2の異常がどのような経路でモノアミン作動性ニューロンのシナプ
ス形成を阻害しているのかは明らかではない。現在まで
RTT の病態を改善させる安全で効果的な治療法は開発されておらず，モデルマウスを用いる基礎研究は，候補となる治療用薬物を研究するうえでヒトの細胞を対象とする研究と同様に重要である。
DMV を含めて，RTT 患者の脳幹における TH の発現やモノアミン作動性神経伝達を促進する薬物の開発，あるいは中枢神経系において変異 MeCP2の機能を補完することが可能な治療法の開発は，RTT 患者で観察される種々の病態の改善に役立つものと考えられた。

結

献

論

実験Ⅰにて，継代培養した CONT および RETT について特性を比較，解析するとともに，実験Ⅱにて，Mecp2-/y
マウスと Wt マウスの DMV における TH-IR および ChATIR ニューロンの発現を検討した結果，以下の結論を得た。
1 ．CONT および RETT では，ともに未分化マーカー遺伝子の c-Myc，Sox2，Oct4，Klf4の発現を認めた。
2 ．CONT では全細胞で MeCP2がほぼ核に局在していたのに対し，RETT では核に加えて細胞質にも免疫陽性反応を示した細胞が26.6% 認められた。また Ki-67の陽性率は CONT に比べ RETT で有意に低かった。
3 ．RETT では変異 MECP2が活性化した細胞が一定の割合で存在しており，MECP2の変異が MeCP2の細胞内局在に影響を及ぼすとともに細胞の増殖能を低下させている可能性が示された。
4 ．Wt マウスとの比較で，Mecp2-/y マウスの DMV では ChAT-IR ニューロンの数に差はみられなかったがTH-IR ニ ュ ー ロ ン の 数 が 多 く， ま た ChAT お よ び
TH を共発現するニューロンが多く認められた。
以上より，MECP2の変異が RETT の増殖能を低下させ

40

MeCP2が変異したヒト歯髄細胞とマウス神経細胞についての免疫組織学的研究

394, 285-290.
14）G uo JJ, Browning KN, Rogers RC, Travagli RA (2001)
Catecholaminergic neurons in rat dorsal motor nucleus ofvagus project selectively to gastric corpus. Am J Physiol
Gastrointest Liver Physiol 280, 361-367.
15）Belichenko NP, Belichenko PV, Li HH, Mobley WC, Francke
U (2008) Comparative study of brain morphology in Mecp2
mutant mouse models of Rett syndrome. J Comp Neurol 508,
184-195.
16）Brown K, Selfridge J, Lagger S, Connelly J, De Sousa D,
Kerr A, Webb S, Guy J, Merusi C, Koerner MV, Bird A(2016) The molecular basis of variable phenotypic severity
among common missense mutations causing Rett syndrome.
Hum Mol Genet 25, 558-570.
17）Ghosh RP, Horowitz-Scherer RA, Nikitina T, Gierasch LM,
Woodcock CL (2008) Rett syndrome-causing mutations inhuman MeCP2 result in diverse structural changes that
impact folding and DNA interactions. J Biol Chem 283,

令和 5 年 6 月

20523-20534.
18）Ide S, Itoh M, Goto Y (2005) Defect in normal developmental
increase of the brain biogenic amine concentrations in the
mecp2-null mouse. Neurosci Lett 386, 14-17.
19）Emond MH, Weingarten HP (1995) Fos-like immunoreactivity
in vagal and hypoglossal nuclei in different feeding states: aquantitative study. Physiol Behav 58, 459-465.
20）S oulier V, Dalmaz Y, Cottet-Emard JM, Kitahama K,
Pequignot JM (1995) Delayed increase of tyrosinehydroxylation in the rat A2 medullary neurons upon longterm hypoxia. Brain Res 674, 188-195.
21）Pépin JL, Lévy P, Garcin A, Feuerstein C, Savasta M (1996)
Effects of long-term hypoxia on tyrosine hydroxylase protein
content in catecholaminergic rat brainstem areas: aquantitative autoradiographic study. Brain Res 733, 1-8.
22）Eiden LE, Weihe E (2011) VMAT2: A dynamic regulator ofbrain monoaminergic neuronal function interacting withdrugs of abuse. Ann N Y Acad Sci 1216, 86-98.

41