日大歯学 , 96（2）, 107-113, 2022

原著

母子分離ストレスによるマウス脳由来ゲノム DNA のメチル化変化
岡

野

雅

春

小

方

彩

乃

網

干

博

文

近

藤

真

啓

日本大学歯学部法医学講座

要旨：
目的 : ヒトの児童虐待被害によってゲノム DNA における CpG 配列のメチル化に変化が生ずることが報告され，虐待の存否を示すバイオマーカーとしての利用が期待されている。また，マウスの母子分離処置は，児童虐待スト
レスとメチル化変化との連関を検証するために有用な実験モデルである。本研究では，マウスの母子分離処置が，ヒト精神神経疾患関連遺伝子のマウスホモログである Myt1l，Grin1 および Slc6a4 のメチル化率および転写産物量に与える影響を明らかにすることを目的とした。
方法：C57BL/6J 妊娠マウスの同腹仔の半数について，出生日翌日から 2 週間，毎日 2 時間母子分離処置を行った。
その後，マウスの扁桃体に由来する DNA および mRNA を用いて，メチル化感受性高解像度融解分析法および
RT-qPCR 法により，メチル化率（Df 値）および転写産物量を測定した。
結果：仔マウスの体重について，実験群と対照群との間で有意差は認められなかった。解析を行った 3 遺伝子の
うち，Myt1l の Df 値は，対照群（−26.7±0.1）と比較して実験群（−25.3±0.4）で有意に高かった（p ＜ 0.05）。Myt1l，Grin1 および Slc6a4 の転写産物量は，両群間において有意差は認められなかった。
結論：Myt1l 遺伝子における CpG 配列のメチル化は，ヒトの虐待被害とマウスの母子分離ストレスとの間で共通して生じることが示唆された。
キーワード：マウス母子分離実験，DNA メチル化，MS-HRM 法，児童虐待

Altered DNA methylation in mouse brain following maternal separation stress
Masaharu Okano，Ayano Ogata，Hirofumi Aboshi，Masahiro Kondo
Department of Legal Medicine, Nihon University School of Dentistry

Abstract: Purpose: The methylation of CpG dinucleotides is an epigenetic modification that plays essential
roles in regulating gene expression. Recent studies have reported altered DNA methylation in several
human genes in neuropsychiatric disorders associated with child abuse, suggesting that DNA methylation isa biomarker candidate to estimate child abuse. Maternal separation (MS) in mice is an excellent
experimental model to elucidate the relationship between stress in child neglect and DNA methylation
status. In this study, we analyzed methylation levels (Df values) of 3 genes, Myt1l, Grin1, and Slc6a4,
associated with child abuse and neuropsychiatric disorders.
Methods: C57/BL6J litter mates were exposed to MS for 2 hours over 14 consecutive days (MS group), or
left undisturbed (control group). Methylation status of genomic DNA and transcription levels of mRNA
extracted from amygdala of mice in both groups were measured using the methylation-specific highresolution melting (MS-HRM) method and RT-qPCR method, respectively.
Results: Df value of Myt1l gene in the MS group (-25.3±0.4) was significantly higher than that in thecontrol group (-26.7±0.1, p<0.05). No significant difference in the transcription levels of 3 genes wasobserved between MS group and control group.
Conclusion: MS-dependent change of CpG methylation in Myt1l is useful as a biomarker for experienced
child abuse.
Keywords: maternal separation, DNA methylation, MS-HRM, child abuse（受付：令和 4 年 10 月 5 日）
責任著者連絡先：近藤真啓
日本大学歯学部法医学講座〒 101-8310 東京都千代田区神田駿河台 1-8-13

TEL：03-3219-8129
FAX：03-3219-8343
E-mail：kondou.masahiro@nihon-u.ac.jp

107

日大歯学

緒

第 96 巻第 2 号

CpG 配列のメチル化率の変化が報告されている。しかし，

言

ヒトの虐待被害にて報告された感受性領域について，マ

本邦における児童虐待の通告件数は年間 10 万件を超ウスモデルでメチル化解析が実施されたことはない。こえ，被虐待児が成人後に精神疾患を発症するまたは自殺れらのことから，本研究では，マウスの母子分離処置にする例も多数報告されている 。しかし，虐待被害の存よって生じる幼少期のストレスが，ヒト虐待被害感受性否の証明は，被虐待者の訴えや身体所見が確認できない

遺 伝 子 の マ ウ ス ホ モ ロ グ で あ る Myt1l，Grin1 お よ び

限り困難である 。このため，自殺遺体や幼児を含めたSlc6a4 遺伝子のメチル化率および転写産物量に与える影

被虐待者に対する客観的な評価法の開発が求められてい響を明らかにすることを目的とした。

1）

2）

る。

材料と方法

エピジェネティクスは，塩基配列の変化を伴わずに遺伝 子 の 発 現 を 調 節 す る 生 体 機 構 と 定 義 さ れ， ゲ ノ ム

1． 実験動物の母子分離処置

DNA に お け る CpG 配 列 の メ チ ル 化 な ど が 含 ま れ る。

C57BL/6J 妊娠マウス（日本エスエルシー，静岡）3 匹

CpG 配列のメチル化の特徴として，生育環境 3）および喫（dam A, B および C）が出産した仔マウス（4-6 g）を実験

煙 4）などの生活習慣が原因となって生じることが知られに用いた（表 1）。各母マウスの同腹仔をおよそ半数に群ている。また，一度生じた CpG 配列のメチル化は，細分けし，母子分離処置の実験群および対照群とした。実

胞分裂を経た娘細胞にも受け継がれるため長い期間維持

験群の仔マウスは，出生日の 1〜14 日後までの 2 週間，

され 5），表現型に様々な影響を与える。すなわち，遺伝

毎日 11〜13 時の 2 時間を母親とは別のケージに入れた

子上流のプロモーター領域にて CpG 配列のメチル化が（母子分離処置）。この際，仔マウスは，同腹仔ごとに同生じた場合は，遺伝子の転写を抑制する 6）。一方，遺伝一のケージで飼育し，保温材によって体温の低下を防い

子内部で起こる CpG 配列のメチル化は，遺伝子の選択だ。対照群の仔マウスは，常に母マウスと同じケージで的スプライシングによるバリアントの生成を変化させる飼育した。両群の一部の個体については，2 週間，隔日ことが報告されている 。このように CpG 配列のメチルに体重を測定した。母子分離処置を終えた生後 15 日齢

化は，生活環境や表現型と連関し，かつ保存性が高い特の仔マウス 19 匹は，イソフルラン（Mylan，PA，USA）

徴を有しているため，虐待の存否を証明するためのバイによる吸入麻酔後に，心臓から全採血によって安楽死処

オマーカーとしての特質を備えている。

置された。その後，脳を摘出し，扁桃体を採取した。なお，

7）

近年，網羅的な CpG 配列のメチル化解析により，中枢本研究に際して，所属施設の動物実験委員会の承認を得

神経系の主要なシナプス伝達に関わる遺伝子 glutamate

た（承認番号：第AP21DEN017-2号，承認年月日：2022

receptor, ionotropic N-Methyl-D-Aspartate（NMDA）1

年 2 月 25 日）。

（GRIN1）や 神 経 分 化 に 関 わ る 転 写 因 子 myelin

2． プライマーの設計
Weder ら 3）によって行われたヒトの虐待被害者を対象

transcription factor 1-like（MYT1L）近傍の CpG 配列のメチル化率が虐待被害者において亢進していることが明とした先行研究では，Infinium HumanMethylation450

らかにされた 3）。また，セロトニントランスポーターをBeadsChip（illumina，CA，USA）を用いて，MYT1L お

コードし，うつ病発症と関連する遺伝子 solute carrier

よび GRIN1 遺伝子近傍の CpG 配列に生ずるメチル化率

family 6 member 4（SLC6A4）8）のメチル化についても，の変化が明らかにされた。これに基づいて，マウスにお幼少期の生育環境の良不良との関連性が報告された 。

いて，相同遺伝子近傍の CpG 配列を同定し，メチル化9）

これらの報告は，CpG 配列のメチル化がバイオマーカー

感 受 性 高 解 像 度 融 解 分 析（Methylation-Specific Highとして有力な候補であることを示唆しているが，ヒトのResolution Melting, MS-HRM）15）の対象範囲とした。す

被虐待者の年齢および性別は多様であり，虐待の種類（ネなわち，我々はまず，先行研究においてメチル化変化がグレクトと身体的虐待など）やその被害の程度は個々の同 定 さ れ た ヒ ト の Infinium HumanMethylation450

事例によって異なる。バイオマーカーとして利用可能

10）

か，またその適応範囲について検討するには，一定数の表1

サンプルを用いた基礎的な研究が必要である。
マウスを用いた母子分離は，児童虐待のうちネグレク
トの実験モデルとされている 11）。現在までに，母子分離
ストレス実験によって，ストレスへの曝露の指標として
血中コルチゾール値の上昇 12），糖質コルチコイド受容体
遺伝子 glucocorticoid receptor（GR）（Nr3c1）13）や抗利尿ホルモン遺伝子 arginine vasopressin（AVP）14）における108使用したマウスの数

母子分離マウスのメチル化

令和 4 年 12 月

BeadsChip のプローブ配列を，HumanMethylation450

ヒトの SLC6A4 遺伝子とうつ病発症との関連性の報告を

v1.2 Manifest File16）か ら 取 得 し た。 ま た，National

参照して，マウス第 11 番染色体上の Slc6a4 遺伝子の塩

Center for Biotechnology Information（NCBI） のマウ

基 配 列 を 取 得 し た。 次 に，SEQUENCHER Ver. 5.0.1

スゲノム配列（Accession No. NC_000078）から，第 12（Gene Codes，MI，USA）を用いて，これら 3 つの遺伝

番染色体上の Myt1l および第 2 番染色体上の Grin1 遺伝

子 の 増 幅 領 域 内 に 複 数 の CpG 配 列 が 含 ま れ る よ う に子の塩基配列を取得した。Clustal Omega（EMBL-EBI）

MS-HRM 解 析 用 プ ラ イ マ ー を 設 計 し た（ 図 1 お よ びを用いて，ヒトプローブ配列とマウスゲノム配列とのア表 2）。設計したプライマーの位置，長さならびに含まれライメントを作成した（図 1）。また，Okada ら 8）による

る CpG 部位の数は表 2 に示した。

17）

図1

MS-HRM 解析の対象とした CpG 配列
図中の矢印は設計したプライマーの位置を示した。マウス塩基配列内の CpG は灰色に描出した。Myt1l（A）および Grin1（B）は，ヒトの Infinium HumanMethylation450 BeadChip のプローブ配列とのアライメントを示し，
ヒトプローブ配列の解析対象 CpG に丸を付した。
表2

使用したプライマー

109

日大歯学

第 96 巻第 2 号

3． 組織からの DNA 抽出およびバイサルファイト（BS）

Biosystems）を用いてサンプルのメチル化状態を同定し処理た。具体的には，各サンプルの融解曲線の推移から，0％dam A および dam B の仔マウス計 11 匹の扁桃体かメチル化 DNA の蛍光強度を 0 とした際の各サンプルのら NucleoSpin DNA Forensic（タカラバイオ，草津）を差異（Difference of Aligned Fluorescence（Df）値）を算用 い て，DNA を 抽 出 し た。 こ れ ら の DNA 溶 液 を EZ出した。

DNA Methylation Kit（Zymo Research，CA，USA）に

7． 組織からの RNA 抽出および RT-qPCR 解析

より，プロトコールに従い BS 処理を行った。すべてのdam C の仔マウス計 8 匹の扁桃体から Trizol Reagent

DNA は，BS 処理後の最終濃度が 20 ng/μL となるよう（Invitrogen，MA，USA）を用いて，total RNA を抽出に M-Elution Buffer へ溶出した。

した。その後，ReverTra Ace qPCR RT Master Mix

4． スタンダードメチル化 DNA の調製with gDNA Remover（東洋紡，大阪）を用いて，DNase

スタンダードメチル化 DNA の調製には，完全（100%）

I によりゲノム DNA を除去した後に，total RNA 1μg

メ チ ル 化 DNA で あ る Universal Methylated Mouseから逆転写酵素反応によって cDNA を合成した。Myt1l，

DNA Standard（Zymo Research）に 加 え て，Mouse

Grin1 および Slc6a4 遺伝子の転写産物量は，各遺伝子にGenomic DNA（Sigma Aldrich，Darmstadt，Germany）

設 計 し た RT-qPCR プ ラ イ マ ー と，PowerUp SYBRから REPLI-g Mini Kit（Qiagen，CA，USA）を用いて自Green Master Mix（Applied Biosystems）を 用 い てら作製した完全非（0%）メチル化 DNA を用いた。すなわ

QuantStudio 5 リアルタイム PCR システムにより実施しち，DNA テンプレートを 5μL，Buffer D1 を 5μL 加え，た。すなわち，cDNA を 5 ng，フォワードおよびリバー

室温で 3 分間インキュベートし，これに REPLI-g Mini

ス プ ラ イ マ ー（5μM）を 各 2μL，2×PowerUp SYBRReaction Buffer を 29μL お よ び REPLI-g Mini DNA

Green Master Mix を 10μL，滅菌蒸留水を加え，計 20

Polymerase を 1μL 加え，30 ℃で 15 時間インキュベー

μL の反応液を準備した。そして，95 ℃で 10 分間のプトした。65 ℃で 3 分間の熱処理により DNA 合成酵素を

レヒーティングの後，95 ℃で 15 秒，60 ℃で 1 分間の反失活させた溶液から，NucleoSpin DNA Forensic によ

応 を Grin1 お よ び Myt1l 遺 伝 子 で は 40 サ イ ク ル，

り DNA を抽出し，TE Buffer で溶出した。増幅後 DNA

Slc6a4 遺伝子では 45 サイクル実施した。すべての qPCRの濃度は，NanoDrop 1000（Thermo Fisher Scientific，

反応は 2 回繰り返して実施し，サイクリング反応の後にMA，USA）を用いて定量した。増幅後 DNA をテンプレー

解離反応によって各サンプルの増幅産物が単一サイズでトとして，上記の DNA 増幅工程をもう一度繰り返し，2あることを確認した。そして，QuantStudio Design and

回目に精製した DNA を 0% メチル化 DNA とした。次Analysis Software Ver. 1.5.1（Applied Biosystems）を用に，100% メチル化および 0% メチル化 DNA を上述の手

い て， 内 在 性 コ ン ト ロ ー ル と し た Glyceraldehyde-3-

順によって BS 処理した。

Phosphate Dehydrogenase（Gapdh）に対する各サンプル

5． ゲノム DNA の MS-HRM 反応の相対的遺伝子発現量を算出した。RT-qPCR に使用したプライマーは表 2 に示した。

ゲノム DNA のメチル化状態を解析するために，設計し た プ ラ イ マ ー と MeltDoctor HRM Master Mix

結（Applied Biosystems，MA，USA）による MS-HRM 反果

応 を QuantStudio 5 リ ア ル タ イ ム PCR シ ス テ ム

1.

（Applied Biosystems）を用いて実施した。まず，BS 処

実験群のマウスに削痩などの異常所見は認められな理 し た DNA テ ン プ レ ー ト（20 ng/μL） を 1μL，

かった。また，実験群と対照群の仔マウスの体重を 2 週

MS-HRM プ ラ イ マ ー（5μM）を 各 1.2μL，MeltDoctor

間，隔日に計測したところ，両群での差は認められなかっマウスの母子分離処置

HRM Master Mix を 10μL および滅菌蒸留水を 6.6μL

た（表 3）。

加え，計 20μL とした。そして，95 ℃で 10 分間のプレヒー2.

テ ィ ン グ の 後，95 ℃ で 15 秒，60 ℃ で 1 分 の PCR 反 応

配列とのアライメント

を 40 サ イ ク ル 行 っ た。 最 後 に，Melting 反 応 と し て

ヒト BeadsChip プローブ配列とマウスゲノム DNA
ヒ ト の MYT1L お よ び GRIN1 遺 伝 子 の Infinium

95 ℃ で 10 秒，60 ℃ で 1 分 保 持 し た 後，0.025 ℃ / 秒 で

HumanMethylation450 BeadsChip プローブ配列と，マ

95 ℃まで上昇させている間に解離する DNA から放出さウスゲノム DNA 配列とのアライメントを行った。この

れた蛍光強度の推移を記録した。すべての MS-HRM 反結果，マウス Myt1l 遺伝子の第 16 イントロンと Grin1

応は，2 回繰り返して行った。

遺伝子の第 6 イントロンに，ヒト BeadsChip プローブ配6． MS-HRM データの解析列との類似性が高い（82.3 および 89.3%）配列が認められMelting 反応において得られた各サンプルにおける融た。また，これらの領域において，ヒト BeadsChip プロー

解 曲 線 を も と に，HRM Software Ver. 3.2（Applied

ブ配列のメチル化検出対象の CpG 配列と近傍のマウス

110母子分離マウスのメチル化

令和 4 年 12 月の遺伝子領域に，CpG 配列が位置していた（図 1）。

相同遺伝子内の CpG 配列を含むようにプライマーを設3.

計し，MS-HRM 法による DNA メチル化解析を行った。

マウスゲノム DNA におけるメチル化状態
母子分離処置による仔マウスの扁桃体における Myt1l,

その結果，マウスの Myt1l 遺伝子において，母子分離ス

Grin1 お よ び Slc6a4 遺 伝 子 の メ チ ル 化 状 態 に つ い てトレスによって有意な DNA メチル化の亢進が認められ

MS-HRM 解析を行った（図 2）。この結果，Myt1l 遺伝子

た。実験群マウスは，分離時間中に母乳を摂取できておの Df 値 は， 対 照 群（−26.7±0.1）と 比 較 し て 実 験 群らず，低栄養状態であったことが DNA メチル化亢進に（−25.3±0.4）において有意に高かった（p ＜ 0.05）。また，影響を与えたことが考えられたが，対照群との間に体重Grin1 および Slc6a4 遺伝子の Df 値は両群間で有意な差の差は認められなかった。これらのことから，ヒトとマは認められなかったが，どちらも実験群の平均 Df 値がウスにおいて，Myt1l 遺伝子領域の相同な CpG 配列に，対照群よりも高い傾向にあった。

虐待ストレスによりメチル化変化が生ずることが示唆さ

4.

Myt1l, Grin1 および Slc6a4 遺伝子の転写産物量れた。しかし，Myt1l 遺伝子のわずか 1 カ所の CpG 配列

母子分離処置による仔マウスの扁桃体における Myt1l,であるため，当遺伝子の他の領域の CpG 配列や，頭数

Grin1 および Slc6a4 遺伝子の転写産物量を qPCR によりを増やすなどのさらなる解析が望まれる。今後は，本解解析した（図 3）。この結果，すべての遺伝子の転写産物

析法を用いて，ヒトの情報をもとにした他の候補遺伝子

量は，実験群と対照群との間に差が認められなかった。

での解析をマウスモデルにて実施し，複数遺伝子を利用考した虐待バイオマーカーを確立することが期待される。

察

CpG 配列のメチル化はゲノム DNA 上に付加された保存性の高い化学修飾であり，法医鑑定における年齢推
定 18,19）や体液の種類の同定 20）への利用が検討されている。このことから，児童虐待においても，被害の存否を
CpG 配列によって客観的に評価することが期待できる。
本研究は，ヒトの児童虐待とマウスの母子分離ストレスにおいて，塩基配列の比較から相同な感受性領域を推定
し，MS-HRM 法によりメチル化率を測定した初めての試みである。そして，両者に共通してメチル化率に変化が生ずる CpG 配列を 1 カ所見出した。
ヒトにおいて，幼少期に虐待被害を経験した自殺者での Infinium HumanMethylation450 BeadsChip を用いた
網羅的なゲノム DNA メチル化プロファイリングが試みられた。この結果，MYT1L および GRIN1 遺伝子など数種類の遺伝子にメチル化率の変化が認められている 3）。
本研究では，これら 2 種類の遺伝子について，マウスの表3

図2

3 遺伝子における CpG 配列のメチル化率（MS-HRM 解析）
welch の t 検定にて値の差異の有意性を検定した。
（＊ p ＜ 0.05）

図3

3 遺伝子における転写産物量（RT-qPCR 解析）

マウスの体重両群の体重に有意差は認められなかった。

111

日大歯学

第 96 巻第 2 号

存否を示す分子生物学的な指標の開発へつなげたい。

ヒトにおいて，MYT1L 遺伝子は Zinc Finger domainを複数有した転写調節因子のひとつであり，脳の発達，結

特に神経分化を促進する 21）。これまでに，MYT1L 遺伝
子の重複が知的障害および自閉スペクトラム症の，欠失論本研究でのマウスの母子分離実験から，以下の結論がが統合失調症の発症とそれぞれ関連することが報告され得られた。

ている 22,23）。本研究において，Myt1l 遺伝子の第 16 イン1.

塩基配列のアライメント解析により，ヒトの虐待被トロンに存在する CpG 配列のメチル化率が母子分離ス

害に感受性を示した MYT1L および GRIN1 遺伝子

トレスにより上昇していた。この部位は転写産物量の調

内の CpG 配列に相当する部位を，マウスの相同遺伝
子内に同定した。

節 に 関 わ る 遺 伝 子 上 流 の プ ロ モ ー タ ー 領 域 で は な く，
2.

RT-qPCR による解析において遺伝子の転写産物量に有母子分離処置によって，Myt1l 遺伝子の第 16 イント
ロンに存在する CpG 配列のメチル化率が有意に上昇

意差は認められなかった。一方で，Myt1l 遺伝子は，選した。

択 的 ス プ ラ イ シ ン グ を 受 け て， 複 数 の バ リ ア ン ト
3.

（Accession No. NM_001093775）を形成することが推定

母子分離処置によって，Myt1l，Grin1 および Slc6a4

されている興味深い分子である。今後は，Myt1l 遺伝子

遺伝子の転写産物量に変化は認められなかった。

の機能的な観点から，DNA のメチル化率に変化が生ず

Myt1l などの一部の遺伝子における CpG 配列のメチル

ることの生物学的な意義を検討する必要がある。また，化は，ヒトの虐待被害とマウスの母子分離ストレスとのその他の 2 種類の遺伝子はどちらも CpG 配列のメチル間で共通することが示唆された。

化率に変化は認められず，各々の転写産物量にも有意な差は認められなかった。母子分離処置の様々な条件を検なお，本研究は，JSPS 科研費 JP21K21124，令和 3 年度日本大学歯学部佐藤研究費および令和 4 年度日本大学歯学部総合歯学研
究所研究費（B）の助成を受けた。
本論文に関して，開示すべき利益相反はない。

討し，仔マウスが曝露されるストレス量を増やした場合には，これらの遺伝子の DNA メチル化率および転写産物量がどのように変化するのかの解明が期待される。
母子分離実験は，1 日当たりの母子分離時間の長さや文処置を行う発育段階など様々な実施方法が報告されている 24）。1 日当たりの分離時間は，10 分〜1 時間の短期間

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母子分離（Brief maternal separation）や 1〜8 時間の長
期間母子分離（Prolonged maternal separation）および哺乳 時 以 外 を 常 時 分 離 す る 母 子 剥 奪（Maternal
Deprivation）の 3 種類に分けられる。また，処置を行う
発 育 段 階 は，P0〜P12-14 を 低 反 応 性 期 間（Hyporesponsive period）および P12-14〜P21-28（離乳期）を高反応性期間（Hyper-responsive period）と定義されることがある。これらの条件の違いによって，仔マウスが曝露されるストレス量も変化すると考えられるが，母子分離
ストレスの程度と DNA メチル化量との関連についての情報はいまだ報告されていない。ヒトにおいて，DNAメチル化の変化量から被虐待児におけるネグレクト被害の重症度も評価できれば，極めて有用な分子生物学的指標となる。本研究では，1 日当たり 2 時間の長期間母子分離，なおかつ，P0〜P14 の低反応性期間に実施した。
この結果，有意差が認められた Myt1l 遺伝子において，母子分離処置によって生じた Df 値の差は 1.4 であった。
この Myt1l 遺伝子の Df 値の差は，他の母子分離条件下にて曝露されるストレス量で異なる可能性がある。今後
は，1 日当たりの母子分離時間の長さや処置を行う発育段階を検討し，ストレスの曝露量と DNA メチル化の変化量との相関の有無を明らかにすることで，DNA メチ
ル化率の変化に基づいたヒトにおけるネグレクト被害の112

母子分離マウスのメチル化

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