日大歯学 ，97（1），18-26，2023

原著

高濃度グルコースが成熟骨芽細胞の石灰化に与える影響
清

水

な

つ

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻

生
口腔構造機能学分野

日本大学歯学部歯科矯正学講座（指導：本吉満

教授，藤原恭子

准教授）

要旨【目的】過度の糖負荷が骨の形成過程における基質の石灰化を抑制し，骨の脆弱性を生むことは知られているが，その詳細な機序については不明な点が多い。本研究では高濃度グルコースを加えて培養した成熟骨芽細胞の石灰化抑制
メカニズムを解明することを目的とした。
【方法】ラット骨肉腫由来株化細胞の ROS17/2.8を異なるグルコース濃度を含む培地で 7 日間培養し，alkaline
phosphatase 染色と基質の石灰化を alizarin red 染色によって確認した。同時に染色した石灰化物をギ酸で溶解し，その吸光度を測定することによって石灰化レベルを数値化した。骨芽細胞関連因子の発現は quantitative PCR で検出し，細胞の生存レベルは WST8アッセイで評価した。ピロリン酸（PPi），モノリン酸（Pi）および ATP の濃度測定は市販のキットを利用した。
【結果】通常の5.5 mM グルコースを含む培地で培養した対照群と比べ，11 mM あるいは22 mM の高濃度グルコー
スを加えた実験群では石灰化の強い抑制が認められた。細胞の生存レベルは高く，またマンニトールを加えて対照群と実験群との浸透圧を同等にしても両群間の石灰化レベルは変化がなかったことから，高濃度グルコースによる石灰化 の 抑 制 は， 細 胞 死 あ る い は 浸 透 圧 の 上 昇 に は 起 因 し な い こ と が 明 ら か に な っ た。RUNX2，type I collagen，osteocalcin および osteopontin の遺伝子発現は対照群と比べて実験群で高く，5 日目に高濃度グルコースを含む培地に交換することで，石灰化を顕著に抑制できた。石灰化を阻害するピロリン酸（PPi）と石灰化の基質となるモノリン酸（Pi）の濃度を測定した結果，培養上清中に含まれる細胞外 PPi は実験群で増加し，反対に細胞内・外の Pi は減少した。この時に測定された同じ濃度の PPi を5.5 mM のグルコースを含む培地に加えたところ，石灰化は強く抑制された。さらに対照群に比べて実験群の細胞内 ATP は軽度に増加し，細胞外 ATP は減少した。
【結論】高濃度のグルコースを加えて培養した ROS17/2.8の石灰化抑制は，培養液中の PPi 濃度の増加によって生じた可能性が考えられた。
キーワード：高濃度グルコース，成熟骨芽細胞，石灰化，ピロリン酸，モノリン酸

Effect of high glucose concentration on mineralization in mature osteoblasts
Natsuo Shimizu
Nihon University Graduate School of Dentistry, Major in Orthodontics
Department of Orthodontics, Nihon University School of Dentistry（Directors: Prof. Mitsuru Motoyoshi and Assoc. Prof. Kyoko Fujiwara）

Abstract【Purpose】Excessive glucose is known to inhibit the mineralization during bone formation, leading to the bone
fragility in skeletal system. However, the exact mechanism how glucose prevents the mineralization remains
unclear. A purpose of this study is to define the inhibitory effect of high glucose concentration on mineralized
matrix formation in mature osteoblasts.
【Methods】A rat osteosarcoma-derived cell line ROS17/2.8 was cultured for 7 days in medium containing highglucose (11 or 22 mM), and normal glucose (5.5 mM) as a control. Mineralization was estimated by alizarin red
staining and absorbance of the solution eluted from AR-stained matrix. Gene expression of osteoblast specificmarkers was detected by quantitative PCR. Alkaline phosphatase activity and cell viability was measured by NT
staining and WST8 assay, respectively. In addition, concentration of pyrophosphate (PPi), monophosphate (Pi) andATP was detected by commercial assay kits.
【Results】High glucose clearly showed the decrease in mineralization, but ALP activity did not change between
the cells in high glucose and control. Since high glucose increased cell viability and adding high mannitol in control
did not inhibit mineralization, the influence of osmotic pressure was negligible in high glucose culture. High glucose
also increased the expression of osteoblast specific markers, RUNX2, type I collagen, osteocalcin and osteopontin.
（受付：令和 5 年 1 月20日）
責任著者：清水なつ生
日本大学歯学部歯科矯正学講座〒101-8310 東京都千代田区神田駿河台 1 ‒ 8 ‒13

TEL：03-3219-8105
FAX：03-3219-8365
E-mail：dena19014@g.nihon-u.ac.jp

18

日大歯学

第 97 巻第 1 号

During 7 days culture, the change in medium containing high glucose at day 5 strongly decreased mineralizationcompared to those at days 1 and 3. Furthermore, high glucose not only increased extracellular PPi, which preventsthe formation of calcium phosphate, but also decreased intra-and extra-cellular concentrations of Pi, which is a
substrate for mineralization. When sodium pyrophosphate was added in control at the concentration equal toextracellular PPi in high glucose culture, mineralization was remarkably inhibited. Nevertheless, high glucose
decreased extracellular ATP, which is a molecule required for PPi synthesis, although it slightly increased
intracellular ATP.
【Conclusion】These results suggest that inhibitory effect of high glucose on mineralization in ROS17/2.8 was inpart due to increasing extracellular PPi.
Keywords: high glucose concentration, mature osteoblasts, mineralization, pyrophosphate, monophosphate緒において重要な役割を持つことを意味している。

言

高濃度グルコースによる骨芽細胞分化や基質の石灰化に

歯科矯正治療では歯牙移動装置からの外力によって，歯与える影響については，マウス前骨芽細胞様株化細胞

槽骨の改変が誘導され，歯を目的の位置に移動させること

MC3T3-E1を使った培養系で研究されている。しかしながができる。この際，圧迫側の歯槽骨には破骨細胞分化の促ら，報告ごとに結果が異なり，一定の見解が得られていな進によって骨吸収が起こり，反対に牽引側では骨芽細胞のいのも事実である。例えば，11 mM から33 mM のグル機能が活性化され骨の添加が起こる。このような破骨細胞コースが MC3T3-E1の骨芽細胞への分化と石灰化を促進と骨芽細胞による骨の改変現象は，全身の骨の成長や骨のするという報告がある15-17）。一方，15.5 mM のグルコース

損傷治癒過程でも生じており，血中グルコース濃度が様々

は，MC3T3-E1の増殖や分化，石灰化を促進するが，25.5

な影響を与えることが知られている 。

mM または35.5 mM のグルコースでは，抑制的に機能する

1）

これまでに，高血糖が骨の脆弱性を生む報告が数多くな場合もある18）。MC3T3-E1は BMP-2を含む培地で 3 から 4されている。例えば糖尿病が骨粗鬆症のリスクファクター

週間培養することによって，石灰化能をもつ成熟骨芽細胞であることは良く知られている 2 - 5 ）。また，高濃度グルに分化するが，最初の 1 週間だけ高濃度グルコースを含む

コースによって活性酸素が産生され，骨芽細胞の機能阻害培地にするだけでも石灰化は促進する。しかし，最後の 1や破骨細胞の活性化が起こり 6 ），骨組織中のコラーゲンに週間のみを高濃度グルコースにしても変化は見られない19）。

非酵素的なグリコシル化が生じることも報告されている 。

すなわち，高濃度グルコースが，前骨芽細胞から骨芽細胞，

さらに，グルコースとタンパクの非酵素的な糖化反応にさらに成熟骨芽細胞へ分化する過程で異なる影響を及ぼす

よって生じる終末糖化産物の蓄積がインスリン様増殖因子

可能性があり，MC3T3-E1を利用した研究において，一定に対する骨芽細胞の反応性を低下させ，その結果，骨形成の見解が得られていない理由の一つであると考えられる。

の抑制が起きる報告もある 8 , 9 ）。しかし，高濃度グルコー

本研究では成熟骨芽細胞の性質をもつラット骨肉腫由来

スが骨形成を抑制する詳しいメカニズムは，いまだに解明

株化細胞 ROS17/2.8 20, 21）を使用して，高濃度グルコースがされていない。

基質の石灰化を抑制するメカニズムについて検討した。

7）

グルコースは骨芽細胞の主なエネルギー源であり，骨組材料および方法

織では活発なグルコースの取り込みが観察されている10）。
また，最近の研究から骨芽細胞の分化過程でグルコース代

1 ．細胞の培養

謝が大きく変化することも知られている。例えば，前骨芽

ラット骨肉腫由来株化細胞 ROS17/2.8（理化学研究所バ

細胞の増殖には解糖系が，また骨芽細胞への分化には解糖

イオリソースセンター，つくば）は alpha modified Eagleʼs系とミトコンドリア呼吸の両方が，そして成熟骨芽細胞へ

minimum essential medium（αMEM，富士フィルム和光

分化すると再び解糖系が主なグルコース代謝経路となって

純薬，大阪）に10% 牛胎児血清（FBS，ニチリョー，東いる。一方，初代骨芽細胞を利用した研究から，骨芽京），600 mg/L glutamine，100 IU/mL penicillin（Thermo

細胞の成熟過程において解糖系で機能するヘキソキナーゼ

Fisher Scientific，Waltham，MA，USA） と100 mg/mLやピルビン酸キナーゼ，グルコース輸送体である glucose

streptomycin（Thermo Fisher Scientific） を 添 加 し た 培transporter 1の発現が上昇することが知られている13）。さ

地で，湿度100%，37℃，5 % CO2の条件で培養した。ならに，骨芽細胞のグルコースの取り込みによって AMP-

お，通常の10% FBS が含まれたαMEM のグルコース濃度

activated protein kinase が活性化され，その結果，骨芽細は5.5 mM に設定されているため22），この培地で培養した胞分化関連転写因子の runt-related transcription factor 2細胞を対照群とし，終濃度が11 mM と22 mM になるよう（RUNX2）の発現が誘導され，骨芽細胞分化が促進する14）。

にグルコースを加えて培養した細胞を実験群とした。

11, 12）

これらの知見は，グルコース代謝の制御が骨芽細胞の分化

細胞は5 × 104個 /ml の密度で96ウェルプレートまたは19

高グルコース濃度による石灰化抑制

24ウ ェ ル プ レ ー ト に 播 種 し， 1 日 後 に10 mM の β

令和 5 年 6 月
表1

qPCRに使用したプライマー-glycerophosphate（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）

遺伝子と異なるグルコース濃度を含む培地に置換し，7 日間の培

RUNX2 forward

CAAGTGGCCAGGTTCAACGA養を行い，3 日目と 5 日目に培地交換を行った。

RUNX2 reverse

TGTGAAGACCGTTATGGTCAAAGTG

COL1A1 forward

CAGATTGAGAACATCCGCAGC

COL1A1 reverse

CGGAACCTTCGCTTCCATACTCOPN forward

GATGAACAGTATCCCGATGCC

OPN reverse

CCCTCTGCTTATACTCCTTGGAC

OCN forward

GACAAGTCCCACACAGCAACT

OCN reverse

GGACATGAAGGCTTTGTCAGA

B2M forward

CGAGACCGATGTATATGCTTGC

phosphate と0.4 mg/ml の nitro blue tetrazolium chloride

B2M reverse

GTCCAGATGATTCAGAGCTCCAを含む水溶液を加え，10分間室温でインキュベートした

COL1A1：type I collagen，OCN：osteocalcin，OPN：osteopontin，
B2M：beta-2-macroglobulin

2 ．Alkaline phosphatase（ALP）活性の評価
24ウェルプレートに播種した細胞から培地を除去し，
phosphate buffer saline（PBS） で 洗 浄 後，4 % パ ラ ホ ル
ムアルデヒドで，10分間固定した。各ウェルを超純水で4 回 洗 浄 し，0.19 mg/ml の5-bromo-4-chloro-3-indolyl-

後，超純水で 1 回洗浄し，発色したプレート面をスキャ

塩基配列（5ʼ - 3ʼ）ナー（LiDE400，キヤノン，東京）で撮影した。
6 ．Quantitative RT-PCR（qPCR）
3 ．石灰化の評価

RNA の抽出は RNeasy mini kit（Qiagen, Valencia, CA,

基質の石灰化は alizarin red（AR）染色と吸光度法にUSA）で，また RNA から cDNA の合成は iScript cDNA

よって調べた。24ウェルプレートに播種した細胞から培地

synthesis kit（Bio-Rad laboratories, Hercules, CA, USA）

を除去し，PBS で洗浄後，4 % パラホルムアルデヒドにを使用した。qPCR は SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（タカラよって10分間室温で固定した。その後，各ウェルを超純水

バイオ，草津）を利用した。骨芽細胞関連因子の検出に使で 1 回洗浄し，1 % AR 水溶液で10分間染色した。超純水用したプライマーの塩基配列を表 1 に示す。反応は95℃，で再度洗浄した後，プレート面をスキャナー（LiDE400）

30秒の前処理後，95℃，5 秒と58℃，30秒の反応サイクルで撮影した。さらに，石灰化レベルを数値化するために，を40回繰り返した。サーマルサイクラーは CFX Maestro

染色後の各ウェルに 5 % ギ酸500 μｌを加えて10分間振盪す（Bio-Rad laboratories）を使用し，測定はすべて 3 回ずつることで色素を溶出させた。そのうち100 μｌを96ウェルプ

行った。なお，cDNA を段階希釈して得られた標準曲線

レートに移し，波長425 nm の吸光度をプレートリーダー

から各遺伝子の相対的な発現レベルを求めた。この際，（SpectraMax ABS Plus, Molecular Devices, San Jose, CA,

beta-2-microglobulin（B2M）の値を内因性コントロール

USA）によって計測した。バックグラウンドは100 μ
ｌの

とした。

5 % ギ酸を使用し，測定値からバックグラウンドの吸光度を減じた数値を評価した。

7 ．ピロリン酸（PPi）濃度の測定

4 ．生存レベルの評価

Pyrophosphate Assay Kit（ab234040，Abcam，Cambridge，

96ウェルプレートに播種した細胞の PPi 濃度の測定は，細胞の生存レベルを評価するために WST8試薬（ナカUK）を利用した。培養上清を Microcon-10（Merck-Millipore，

ライテスク，京都）を使用した。96ウェルプレートに播種

Burlington，MA，USA） に 移 し，10,000 rpm，4 ℃ で10した細胞から培地を除去し，1/10濃度の WST8試薬を含分間遠心後，上清を回収した。得られた上清は測定バッ

む100 μｌの培地を加え，1 時間培養し，波長450 nm の吸光

ファーで10分の 1 に希釈し，細胞外 PPi の測定に使用し度を SpectraMax ABS Plus で計測した。バックグラウン

た。同時に細胞を100 μｌの測定バッファーに懸濁させ，遠ドは1/10濃度の WST8試薬を含む100 μｌの培地を使用し，

心後，上清を回収し，測定バッファーで10分の 1 に希釈し測定値からバックグラウンドの吸光度を減じた数値を生存たものを細胞内 PPi の測定に使用した。それぞれの上清かレベルとした。

ら得られた50 μｌの希釈液と50 μｌの検出試薬を96ウェルプ
レートのウェル中で混合し，37℃で30分間のインキュベー

5 ．マンニトールが石灰化に与える影響

ト後，波長570 nm の吸光度を SpectraMax ABS Plus で細胞浸透圧の変化が石灰化に影響を及ぼすか調べるた

計測した。PPi 標準液から検量線を作成し，その吸光度かめ，24ウェルプレートに播種した細胞を通常培地で 5 日間ら細胞内・外の PPi 濃度を求めた。さらに，測定に使用し培養した後に，終濃度が11 mM あるいは22 mM になるよ

なかったウェルで培養した細胞の DNA 量を計測し，PPi

うにマンニトールを加えて 2 日間培養した。その後，石灰濃度を補正した。

化を上述の 3 にしたがって調べた。

20

日大歯学

8 ．モノリン酸（Pi）濃度の測定

第 97 巻第 1 号

結

Pi 濃度は，ホスファC テストワコー（富士フィルム和果光純薬）によって定量した。96ウェルプレートに播種した

1 ．高濃度グルコースが ALP 活性と石灰化に与える影響

細胞の培養上清を回収し，遠心後，上清を蒸留水で10分の

通常の10% FBS が含まれたαMEM のグルコース濃度は1 に希釈して，細胞外 Pi 濃度の測定に使用した。同時に

5.5 mM であり，この値は正常なヒトの空腹時血糖にほぼ細胞を20 μｌの RIPA バッファー（Thermo Fisher Scientific）

等しい23）。一方，糖尿病患者では血糖値6.9 mM〜20 mMで溶解し，細胞内 Pi 濃度の測定に使用した。 5μｌの上清以 上 に ま で 上 昇 す る こ と か ら24, 25）， 今 回 は11 mM と22

希 釈 液 ま た は 細 胞 溶 解 液 と400 μｌの 検 出 試 薬 を1.5 ml

mM を高濃度グルコースとした。異なる濃度のグルコー

チューブ中で混合し，37℃で20分間インキュベートした。

スを含む培地で ROS17/2.8を培養し，7 日目に ALP 活性チューブを水冷後，100 μｌを96ウェルプレートの各ウェルと基質の石灰化を調べた。その結果，いずれのグルコースに 移 し， 波 長750 nm の 吸 光 度 を SpectraMax ABS Plus

濃度でも ALP 活性の変化は見られなかったが，5.5 mMで計測した。Pi 標準液で検量線を作成し，吸光度から細グルコースで培養した細胞（対照群）と比較して，高濃度

胞内・外の Pi 濃度を求めた。さらに，測定に使用しなかっグルコースを加えて培養した細胞では，石灰化の抑制が認たウェルで培養した細胞の DNA 量を計測し，Pi 濃度を補められた。AR 染色後の基質を 5 % ギ酸で溶解し，染色レ正した。

ベルを数値化した結果，この石灰化抑制は，対照群を 1 とした場合，11 mM グルコース添加群で0.53 ± 0.15（p <9 ．ピロリン酸ナトリウム（PPNa）が石灰化に与える影響

0.01），また22 mM グルコース添加群では0.13 ± 0.01（p24ウェルプレートに播種した細胞を 5 日間培養した後，< 0.01）となった（図 1 A）。

25，50，250 μM の PPNa（富士フィルム和光純薬）を含高濃度グルコースによる石灰化の抑制が，細胞浸透圧の上んだ培地と交換し，2 日間培養した。その後，上述の 3 に昇によって生じた可能性も否定できない。そこで，対照群従って石灰化を評価した。

に5.5 mM と16.5 mM のマンニトールを加え，浸透圧を11mM と22 mM グルコース添加群と同等にし，7 日間の培10．ATP 濃度の測定
細胞内 ATP 濃度は Intracellular ATP 測定キット Ver.2
IC2-100（東洋ビーネット，東京）によって定量した。96
ウェルプレートに播種した細胞を PBS で 1 回洗浄し，100 μｌの ATP 抽出バッファーをウェルに加えて，5 分間ゆっく
り振盪した。その後，20 μｌの抽出バッファーを回収し，200
μｌの ATP 発光試薬と反応後，ルミノメーター（Lu-Mini，Vitl Life Science Solutions，Ashland，VA，USA） で 発
光 量 を 計 測 し た。 さ ら に， 細 胞 外 ATP 濃 度 の 定 量 はExtracellular ATP 測定キット EX2-100（東洋ビーネット）を利用した。96ウェルプレートに播種した細胞から回収した100 μｌの培養上清と100 μｌの ATP 発光試薬を反応させた後，Lu-Mini で発光量を計測した。最終的に細胞内・外の ATP 濃度は，ATP 標準液の発光量から得られた検量線をもとに算出した。さらに，測定に使用しなかったウェ
ルで培養した細胞の DNA 量を計測し，ATP 濃度を補正

図 1 高濃度グルコースが石灰化に与える影響（A）ROS17/2.8を 7 日間培養し，5.5 mM グルコースを加えた群（対照群）と，11 mM あるいは22 mM グルコースを加えた群（実験群）との間の ALP 活性と石灰化の違いについて調べた。ALP 染色と AR染色を写真（上）で，また AR 染色後の溶解液の吸光度から得られた石灰化レベルをグラフ（下）で示す。（B）対照群の浸透圧を実験群と同じになるよう，対照群に5.5 mM と16.5 mM のマンニトールをそれぞれ加えて培養し，石灰化の違いを調べた。AR 染色の写真（上）と，AR 染色後の基質溶解液の吸光度から得られた石灰化レベルをグラフ（下）で示す。なお，（A）と（B）の吸光度から得られた石
灰化レベルは対照群とマンニトール非添加のものをそれぞれ 1 とした場合の割合で表した。計測値は，4 回の測定結果の平均値 ± SDで示す。＊＊ p < 0.01

した。
11．統計解析
サンプル間の有意差検定は one-way ANOVA と Turkey
検定で行なった。すべての統計解析は，統計解析ソフト
JMP バ ー ジ ョ ン11.2（SAS Institute，Cary，NC，USA）
を使用した。データは，すべて 3 回あるいはそれ以上の実験の平均値 ± standard deviation（SD）で表し，p 値0.05
以下を統計学的有意とした。

21

高グルコース濃度による石灰化抑制

令和 5 年 6 月

養を行った。AR 染色の結果，マンニトール添加群の石灰1.48 ± 0.06（p < 0.01），22 mM グルコース添加群では1.88

化抑制は認められなかった（図 1 B）。

± 0.04（p < 0.01）となった（図 2 ）。

2 ．高濃度グルコースが細胞の生存レベルと骨芽細胞関連

ぼす影響について検討した。図 3 に示すように高濃度グル

高濃度グルコースが骨芽細胞関連因子の遺伝子発現に及因子の遺伝子発現に与える影響

コース添加によって RUNX2，type I collagen（COL1A1），

高濃度グルコースによる石灰化抑制が，細胞の生存レベ

osteocalcin（OCN）の発現は顕著な増加を示した。RUNX2

ル の 低 下 に よ っ て 生 じ た も の か を 明 ら か に す る た め，の発現は対照群を 1 とした場合，11 mM グルコース添加

WST8アッセイを行った。その結果，生存レベルは対照群

群で2.14 ± 0.09（p < 0.01），22 mM グルコース添加群でと比較して11 mM と22 mM グルコース添加群で増加を示

は2.38 ± 0.12（p < 0.01），COL1A1は11 mM グルコース

し，対照群を 1 とした場合，11 mM グルコース添加群で添加群で1.91 ± 0.13（p < 0.01），22 mM グルコース添加
群では13.4 ± 0.38（p < 0.01）となった。また，OCN の発現は対照群を 1 とした場合，11 mM のグルコース添加
群で2.38 ± 0.73（p < 0.01），22 mM のグルコース添加群
で は2.97 ± 0.36（p < 0.01） と い う 値 を 示 し た。 一 方，osteopontin（OPN）の発現は対照群を 1 とした場合，11mM グルコース添加群で1.20 ± 0.06（p < 0.01）を示した
が，22 mM グルコース添加群では有意な差は認められなかった（図 3 ）。

図 2 高濃度グルコースが細胞の生存レベルに与える影響
ROS17/2.8を 7 日間培養し，細胞の生存レベルを調べた。11 mM と
22 mM グルコースで培養した細胞の生存レベルは，5.5 mM グルコースを加えた細胞の生存レベルを 1 とした場合の割合で表した。計測
値は 4 回の測定結果の平均値 ± SD で示す。＊＊ p < 0.01

3 ．高濃度グルコースを加えるタイミングが石灰化抑制に与える影響
7 日間の培養期間中，どのタイミングで高濃度グルコー
スを加えると石灰化が抑制されるか検討した。細胞播種後，表 2 のスケジュールに従って 1 ，3 ，5 日目に異なる濃度のグルコースを含む培地に交換し，7 日間の培養を行った。グルコース濃度は通常濃度である5.5 mM から高濃度の22 mM へ変化させ，培地交換の日時の違いから表2 に示す 8 つの実験群（# 1 〜# 8 ）に分けた。その結果，
図 4 に示すように5.5 mM のグルコースで 7 日間培養した対照群の # 1 と比較して，5 日目，3 と 5 日目，1 ，3 ，5日目，および 1 と 5 日目に22 mM グルコースを含む培地に交換した実験群（# 2 ，# 3 ，# 4 および # 8 ）の石灰化
が 強 く 抑 制 さ れ た。 数 値 的 に は，# 1 を 1 と し た 場 合，
# 2 は0.24 ± 0.01（p < 0.01），# 3 は0.09 ± 0.003（p <0.01），# 4 は0.12 ± 0.003（p < 0.01），# 8 は0.25 ± 0.004（p < 0.01）となり，それぞれの群で減少が見られた。また，1 と 3 日目，および 3 日目に22 mM グルコースを含む培地に交換した実験群（# 6 と # 7 ）でも石灰化の抑制
表2
日＊

図3

 濃度グルコースが骨芽細胞関連因子の遺伝子発現に与える
高影響
ROS17/2.8を 7 日 間 培 養 し， 骨 芽 細 胞 関 連 因 子 で あ る RUNX2，COL1A1，OPN，OCN の遺伝子発現について調べた。11 mM と22mM グルコースを加えて培養した細胞のそれぞれの遺伝子発現レベ
ルは，5.5 mM グルコースで培養した細胞の発現レベルを 1 とした場合の割合で表した。計測値は 3 回の測定結果の平均値 ± SD で示す。
すべての測定値は B2M の発現量で補正した。＊ p < 0.05，＊＊ p < 0.01

培地交換のスケジュール
グルコース濃度（mM）

#1

#2

#3

#4

#5

#6

#7

#8

1

5.5

5.5

5.5

22

22

22

5.5

22

3

5.5

5.5

22

22

5.5

22

22

5.5

5

5.5

22

22

22

5.5

5.5

5.5

22

ROS17/2.8の播種後，1 ，3 ，5 日目に5.5 mM あるいは22 mM のグ
ルコースを含む培地に交換した。# 1 はすべての期間5.5 mM グル
コースを含む培地で培養した細胞（対照群），また # 2 〜# 8 は異なるタイミングで5.5 mM グルコースあるいは22 mM グルコースを含む培地に交換して培養した細胞（実験群）を示す。
＊

22

日大歯学

高濃度グルコースを加えるタイミングの違いが石灰化に及ぼす影響
表 2 のスケジールに従って通常濃度の5.5 mM グルコースを含む培地から22 mM の高濃度グルコースを含む培地に交換して ROS17/2.8の石灰化に及ぼす影響を調べた。AR 染色の写真（上）と AR 染色後の基質溶解液の吸光度から得られた石灰化レベルをグラフ（下）で示す。それぞれの石灰化レベルは # 1 の吸光度を 1 とした場合の割合で表した。計測値は，4 回の測定結果の平均値 ± SD で示す。
＊＊
p < 0.01

第 97 巻第 1 号

図4

図 5 グルコース濃度の違いが PPi と Pi レベルに与える影響
ROS17/2.8を 7 日間培養し，PPi と Pi レベルの違いを調べた。（A）
細胞内・外の PPi レベルと，（B）細胞内・外の Pi レベルの変化を示す。11 mM と22 mM グルコースを加えて培養した細胞の PPi と Pi
レベルは，5.5 mM グルコースで培養した細胞の PPi と Pi 濃度をそれぞれ 1 とした場合の割合で表した。計測値は 3 回の測定の平均値± SD で示す。＊ p < 0.05，＊＊ p < 0.01が認められた。数値的には # 1 を 1 とした場合，# 6 は0.56± 0.01（p < 0.01），# 7 は0.58 ± 0.01（p < 0.01）であった。これらの結果から，5 日目に高濃度グルコースを含む

コース添加群で1.27 ± 0.03（p < 0.01），22 mM グルコー培地に交換すれば，1 日目と 3 日目のグルコース濃度の違

ス添加群では1.65 ± 0.06（p < 0.01）という値を示した

いに関係なく，石灰化の抑制が起きることが示された。し（図 5 A）。

かし，5 日目に通常濃度のグルコースに交換した場合は，

一方，Pi の濃度は細胞内・外ともに高濃度グルコース

1 と 3 日目あるいは 3 日目の培地に高濃度グルコースが含添加群で減少した。対照群の細胞内 Pi は0.74 ± 0.02 μ

まれていれば石灰化は抑制されたが，# 2 ，# 3 ，# 4 ，mol/μgDNA，11 mM グルコース添加群で0.53 ± 0.01 μ

および # 8 に比べると軽度であった。

mol/μgDNA，22 mM グルコース添加群では0.23 ± 0.01 μ
mol/μgDNA となり，対照群を 1 として比較した場合，114 ．高濃度グルコースによる PPi と Pi の濃度変化

mM グルコース添加群で0.73 ± 0.02（p < 0.01），22 mM

骨芽細胞が産生する PPi は基質内でリン酸カルシウム

グルコース添加群では0.31 ± 0.01（p < 0.01）となった。

の形成を阻害し，石灰化を抑制する 。そこで，高濃度グ

また，細胞外 Pi 濃度については対照群が0.52 ± 0.02 μ

ルコースを含む培地で 7 日間培養した ROS17/2.8が産生すmol/μgDNA，11 mM グルコース添加群で0.42 ± 0.01 μ

る PPi と，PPi の分解によって生じる Pi の濃度変化につ

mol/μgDNA，22 mM グルコース添加群では0.27 ± 0.01 μ

いて検討した。

mol/μgDNA となり，対照群を 1 として比較した場合，1124）

細胞内 PPi 濃度は，対照群が22.9 ± 2.1 nmol/μgDNA，

mM グルコース添加群で0.83 ± 0.03（p < 0.01），22 mM

11 mM グルコース添加群で20.9 ± 0.9 nmol/μgDNA，22グルコース添加群では0.52 ± 0.03（p < 0.01）という値をmM グ ル コ ー ス 添 加 群 で は18.4 ± 2.1 nmol/μgDNA で示した（図 5 B）。

あった。対照群を 1 として比較した場合，11 mM グルコー
ス添加群では有意差はなかったが，22 mM グルコース添

5 ．PPNa が石灰化に与える影響

加群では0.80 ± 0.09（p < 0.05）となり，減少が認められ

DNA 量で補正前の PPi 濃度は対照群が72.9 ± 2.2 μM，た。 逆 に 細 胞 外 PPi は， 対 照 群 が16.2 ± 0.5 nmol/μ11 mM グルコース添加群で127.8 ± 2.6 μM，また22 mM

gDNA，11 mM グ ル コ ー ス 添 加 群 で20.7 ± 0.4 nmol/μ

グルコース添加群では245.7 ± 9.6 μM であったことから，

gDNA，22 mM グルコース添加群では26.7 ± 1.1 nmol/μ

通常の5.5 mM グルコースを含む培地で培養した対照群に

gDNA と 増 加 し， 対 照 群 を 1 と し た 場 合，11 mM グ ル

25 μM，50 μM，250 μM の PPNa を 添 加 し，PPNa か ら

23

高グルコース濃度による石灰化抑制

令和 5 年 6 月

図 7 グルコース濃度の違いが ATP レベルに与える影響
ROS17/2.8を 7 日間培養し，細胞内（A）と細胞外（B）の ATP レ
ベルを調べた。11 mM と22 mM グルコースを加えて培養した細胞の ATP レベルは，5.5 mM グルコースを加えて培養した細胞から得られた ATP 濃度を 1 とした場合の割合で表した。計測値は 3 回の測定結果の平均値 ± SD で示す。＊ p < 0.05，＊＊ p < 0.01

図 6 PPNa が石灰化に与える影響
5.5 mM グルコースを含む培地で ROS17/2.8を培養し，5 日目に25，
50，250 mM の PPNa を加えて，石灰化に与える影響について調べた。培養 7 日目の AR 染色の写真（上）と AR 染色後の溶解液の吸光度から得られたグラフを示す（下）。グラフは PPNa 非添加の細胞から得られた吸光度を 1 とした場合の割合で表した。計測値は 4 回の測定結果の平均値 ± SD で示す。＊＊ p < 0.01

考察

成熟骨芽細胞である ROS17/2.8の石灰化は，11 mM お
よび22 mM の高濃度グルコースで培養することによって強く抑制されることが明らかになった。この現象は，高濃解離した PPi が石灰化にいかなる影響を及ぼすか検討し度グルコースによって生じる浸透圧の変化や細胞死によるた。細胞播種後 5 日目に PPNa を投与し，7 日目に AR 染

ものでなかったことから，過度の糖負荷が骨に脆弱性を与色を行った結果，PPNa による石灰化の抑制がみられた。

える原因として成熟骨芽細胞の石灰化抑制が深く関わって数値的には PPNa 非添加群（0 μM）の吸光度を 1 としていると考えられる。一方，高濃度グルコースは ROS17/2.8

比較した場合，25 μM の PPNa 添加群で0.83 ± 0.01（p <における骨芽細胞関連因子の RUNX2，COL1A1，OCN

0.01），50 μM の PPNa 添 加 群 で0.57 ± 0.01（p < 0.01），の遺伝子発現を増加させた。COL1A1や OCN はリン酸カ

250 μM の PPNa 添加群では0.08 ± 0.01（p < 0.01）となっ

ルシウム沈着の足場となる基質の形成に必要なタンパクでた（図 6 ）。

あり石灰化を促進する26）。しかし，今回，明らかにした高濃度グルコースの石灰化抑制作用は，基質の形成よりも細6 ．高濃度グルコースが ATP 産生に与える影響

胞外 PPi 濃度の増加が大きく影響していると思われる。ま

生体内の PPi は主に ATP の分解によって合成されるた

た，高濃度グルコースによって軽度に発現が促進した

め25, 26），高濃度グルコースが細胞内・外の ATP 濃度にど

OPN は，動脈硬化症における血管内皮へのカルシウム塩のような影響を及ぼすか調べた。その結果，対照群の細胞の沈着を阻害する働きをもつことが知られている27）。した

内 ATP 濃度は73.6 ± 3.9 pmol/μgDNA，11 mM グルコーが っ て 高 濃 度 グ ル コ ー ス に よ っ て OPN や matrix Gla

ス添加群で102.5 ± 29.9 pmol/μgDNA，22 mM グルコー

protein28） などの石灰化抑制タンパクが増加した可能性もス添加群では112.3 ± 13.6 pmol/μgDNA となり，対照群

否定できない。さらに，高濃度グルコースによって発現がを 1 として比較した場合，11 mM グルコース添加群では増加した RUNX2は，骨芽細胞における基質タンパクの発有意差は見られなかったが，22 mM グルコース添加群で現に必要な転写因子である29）。実際に，COL1A1や OCN

1.53 ± 0.18（p < 0.05）となり，有意な増加がみられたの遺伝子プロモーター領域に RUNX2の結合配列が存在す（図 7 A）。一方，細胞外 ATP 濃度については，対照群がることが知られており30, 31），高濃度グルコースによって発56.8 ± 28.2 pmol/μgDNA，11 mM グルコース添加群で現が増加した RUNX2が間接的に COL1A1や OCN の発現

21.2 ± 14.2 pmol/μgDNA，22 mM グルコース添加群ではを促進させた可能性も考えられ，高濃度グルコースと骨芽13.6 ± 5.6 pmol/μgDNA と減少を示し，対照群を 1 とし

細胞関連因子との関係について今後検討する必要がある。

て比較した場合，11 mM グルコース添加群で0.74 ± 0.01

ROS17/2.8の培養系に高濃度グルコースを加えるタイミ（p < 0.01）22 mM グルコース添加では0.53 ± 0.03（p <ングの違いが，石灰化抑制にどのような影響を及ぼすかを0.01）という値を示した（図 7 B）。

調べた。その結果，石灰化を強く抑制するには培養期間 7日のうち 5 日目にグルコースが高濃度である必要があること，また 5 日目にグルコース濃度が通常濃度であれば，そ

24

日大歯学

第 97 巻第 1 号

れ以前に高濃度グルコースを加えても石灰化の抑制は軽度因子の RUNX2，COL1A1，OCN および OPN の遺伝であることが確認できた。グルコースによる骨芽細胞の石子発現を増加させた。

灰化のタイミングを調べた研究は MC3T3-E1を使用した

3 ．7 日間の培養期間中，5 日目に高濃度グルコースにす報告以外に見当たらない19）。MC3T3-E1では，培養初期にることで，石灰化を抑制した。

高濃度グルコースに保たれていれば石灰化は促進するが，4 ．高 濃度グルコースは細胞外 PPi 濃度の上昇と，細胞培養後期ではグルコースを加えるタイミングを変えても石内・外 Pi の濃度の低下を誘導した。

灰化の促進効果は認められない 。一方，MC3T3-E1の125 ．PPNa は5.5 mM グルコースで培養した細胞の石灰化

19）

日間の培養系にリン酸カルシウムと親和性をもつ合成ペプを抑制した。

チド（VYKHLNQISQSY）を加えた場合，6 日以前に添加

6 ．高濃度グルコースは細胞内 ATP の濃度を軽度に増加するよりも，全期間あるいは 7 日目以降に添加することでさせ，細胞外 ATP を減少させた。

強い石灰化の抑制効果が認められている 。ROS17/2.8と以上のことから，高濃度グルコースを加えて培養した

MC3T3-E1はそもそも細胞特性が大きく異なり，両者を比ROS17/2.8にみられた石灰化の抑制は，細胞外 PPi 濃度の較することはできないが，一般的に骨芽細胞から最終分化上昇に起因することが示唆された。

32）を遂げた成熟骨芽細胞は，細胞増殖が終了してから石灰化

本研究遂行にあたり，格別なるご指導とご鞭撻を賜りました本
吉満教授，藤原恭子准教授ならびに日本大学歯学部歯科矯正学講
座，解剖学第Ⅰ講座の皆様に深く感謝致します。
本論文に関して，開示すべき利益相反はありません。

基質を産生する33）。したがって，高濃度グルコースをはじめとする石灰化抑制因子は石灰化基質を産生する培養後期に作用させた方が，強い効果が維持できると考える。
成熟骨芽細胞による石灰化は，その成熟過程で細胞外に文分泌した基質小胞中にカルシウムイオンや細胞外 Pi が取り込まれ，リン酸カルシウム結晶が形成されることで始ま

1）N apoli N, Chandran M, Pierroz DD, Abrahamsen B,
Schwartz AV, Ferrari SL (2017) Mechanisms of diabetes
mellitus-induced bone fragility. Nat Rev Endocrinol 13, 208219.
2）C hristodoulou C, Cooper C (2003) What is osteoporosis?
Postgrad Med J 79, 133-138.
3）Janghorbani M, Van Dam RM, Willett WC, Hu FB (2007)
Systematic review of type 1 and type 2 diabetes mellitus
and risk of fracture. Am J Epidemiol 166, 495-505.
4）Vestergaard P (2007) Discrepancies in bone mineral densityand fracture risk in patients with type 1 and type 2
diabetes--a meta-analysis. Osteoporos Int 18, 427-444.
5）Hamann C, Kirschner S, Günther KP, Hofbauer LC (2012)
Bone, sweet bone--osteoporotic fractures in diabetes mellitus.
Nat Rev Endocrinol 8, 297-305.
6）Manolagas SC (2010) From estrogen-centric to aging andoxidative stress: a revised perspective of the pathogenesis ofosteoporosis. Endocr Rev 31, 266-300.
7）Saito M, Fujii K, Mori Y, Marumo K (2006) Role of collagen
enzymatic and glycation induced cross-links as adeterminant of bone quality in spontaneously diabetic WBN/
Kob rats. Osteoporos Int 17, 1514-1523.
8）Terada M, Inaba M, Yano Y, Hasuma T, Nishizawa Y, Morii
H, Otani S (1998) Growth-inhibitory effect of a high glucose
concentration on osteoblast-like cells. Bone 22, 17-23.
9）McCarthy AD, Etcheverry SB, Cortizo AM (2001) Effect ofadvanced glycation endproducts on the secretion of insulinlike growth factor-I and its binding proteins: role inosteoblast development. Acta Diabetol 38, 113-122.
10）Zoch ML, Abou DS, Clemens TL, Thorek DLJ, Riddle RC(2016) In vivo radiometric analysis of glucose uptake anddistribution in mouse bone. Bone Res 4, 16004.
11）G u n t u r A R , L e P T , F a r b e r C R , R o s e n C J ( 2 0 1 4 )Bioenergetics during calvarial osteoblast differentiationreflect strain differences in bone mass. Endocrinology 155,
1589-1595.

る34）。結晶形成に必要な Pi は，ALP が細胞内・外の PPiを分解することで供給され，リン酸カルシウムの結晶形成を促進する35, 36）。今回，高濃度グルコースによる ALP 活
性の低下は明らかにできなかったが，高濃度グルコースによって細胞外 PPi が増加したこと，また5.5 mM グルコースを加えた培養系へ PPNa を加えると石灰化が顕著に抑制されたことから，細胞外 PPi 濃度の上昇が高濃度のグルコースによる石灰化抑制の直接的な原因の一つであることが強く示唆された。細胞外 PPi は主に細胞内・外の ATPが分解されることによって供給される35, 36）。しかし，22mM グルコースは細胞内 ATP を軽度に増加させたが，11mM グルコースでは対照群と比較して有意な差は認められなかった。11 mM と22 mM グルコースは細胞内 ATPを減少させたことから考えると，ATP 以外の因子が細胞外 PPi 濃度を増加させた可能性がある。実際に高濃度グルコースの培養系で ROS17/2.8が合成する細胞内・外 ATP
濃度の計測値は，20～100 pmol/μgDNA と非常に低く，細胞内・外 PPi の計測値（10～20 nmol/μgDNA）から考えると ATP が PPi の直接的な供給源となることは極めて少ない。今後は，脂肪酸など PPi の供給源について検討する必要がある。

結献論

高濃度グルコースによる ROS17/2.8の石灰化抑制メカニ
ズムを検討し，以下の結論を得た。
1 ．11 mM と22 mM の高濃度グルコースは ROS17/2.8の石灰化を抑制した。
2 ．高濃度グルコースは細胞の生存レベルと骨芽細胞関連25

高グルコース濃度による石灰化抑制

12）Shum LC, White NS, Mills BN, De Mesy Bentley KL, Eliseev
RA (2016) Energy metabolism in mesenchymal stem cells
during osteogenic differentiation. Stem Cells Dev 25, 114-122.
13）Yang J, Ueharu H, Mishina Y (2020) Energy metabolism: A
newly emerging target of BMP signaling in bonehomeostasis. Bone 138, 115467.
14）Wei J, Shimazu J, Makinistoglu MP, Maurizi A, Kajimura D,
Zong H, Takarada T, Lezaki T, Pessin JE, Hinoi E, Karsenty
G (2015) Glucose uptake and Runx2 synergize to orchestrateosteoblast differentiation and bone formation. Cell 161, 15761591.
15）Liu J , Yang J (2016) Uncarboxylated osteocalcin inhibitshigh glucose-induced ROS production and stimulates
osteoblastic differentiation by preventing the activation of
PI3K/Akt in MC3T3-E1 cells. Int J Mol Med 37, 173-181.
16）Dong K, Hao P, Xu S, Liu S, Zhou W, Yue X, Rausch-Fan X,
Liu Z (2017) Alpha-lipoic acid alleviates high-glucose
suppressed osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells via
antioxidant effect and PI3K/Akt signaling pathway, Cell
Physiol Biochem 42, 1897-1906.
17）Wang R, Gao D, Zhou Y, Chen L, Luo B, Yu Y, Li H, Hu J,
Huang Q, He M, Peng W, Luo D (2017) High glucose
impaired estrogen receptor alpha signaling via β -catenin in
osteoblastic MC3T3-E1. J Steroid Biochem Mol Biol 174, 276283.
18）Liu Z, Jiang H, Dong K, Liu S, Zhou W, Zhang J, Meng L,
Rausch-Fan X, Xu X (2015) Different concentrations of
glucose regulate proliferation and osteogenic differentiationof osteoblasts via the PI3 kinase/Akt pathway. Implant Dent
24, 83-91.
19）Takeno A, Kanazawa I, Tanaka K, Notsu M, Kanasaki K,
Oono T, Ogawa Y, Sugimoto T (2020) High glucose promotes
mineralization via bone morphogenetic protein 4-Smadsignals in early stage of osteoblast differentiation. Diabetol
Int 12, 171-180.
20）M anolagas SC, Spiess YH, Burton DW, Deftos LJ (1983)
Mechanism of action of 1,25-dihydroxyvitamin D3-induced
stimulation of alkaline phosphatase in cultured osteoblastlike cells. Mol Cell Endocrinol 33, 27-36.
21）Lohmann CH, Schwartz Z, Liu Y, Li Z, Simon BJ, Sylvia VL,
Dean DD, Bonewald LF, Donahue HJ, Boyan BD (2003)
Pulsed electromagnetic fields affect phenotype and connexin
43 protein expression in MLO-Y4 osteocyte-like cells and
ROS 17/2.8 osteoblast-like cells. J Orthop Res 21, 326-334.
22）富 士フイルム和光純薬株式会社．MEM α（L- グルタミン，
フ ェ ノ ー ル レ ッ ド 含 有 ） 組 成 表．https://labchem-wako.
fujifilm.com/jp/product_data/docs/00063419_doc01.pdf（2023
年1月5日アクセス）23）日本糖尿病学会（2019）糖尿病診療ガイドライン2019．南江堂，東京，5-19．

令和 5 年 6 月24）Havlin CE, Cryer PE (1987) Nocturnal hypoglycemia does
not commonly result in major morning hyperglycemia inpatients with diabetes mellitus. Diabetes Care 10, 141-147.
25）Bonucci E (2012) Bone mineralization. Front Biosci 17, 100128.
26）Ando K, Nishimura R, Tsujino D, Seo C, Utsunomiya K (2013)24-hour glycemic variations in drug-naïve patients with type2 diabetes: a continuous glucose monitoring (CGM)-based
study. PLoS One 8, e71102.
27）Speer MY, McKee MD, Guldberg RE, Liaw L, Yang HY,
Tung E, Karsenty G, Giachelli CM (2002) Inactivation of theosteopontin gene enhances vascular calcification of matrix
Gla protein-deficient mice: evidence for osteopontin as an
inducible inhibitor of vascular calcification in vivo. J Exp
Med 196, 1047-1055.
28）Luo G, Ducy P, McKee MD, Pinero GJ, Loyer E, Behringer
RR, Karsenty G (1997) Spontaneous calcification of arteries
and cartilage in mice lacking matrix GLA protein. Nature
386, 78-81.
29）K omori T (2002) Runx2, a multifunctional transcription
factor in skeletal development. J Cell Biochem 87, 1-8.
30）Harada H, Tagashira S, Fujiwara M, Ogawa S, Katsumata T,
Yamaguchi A, Komori T, Nakatsuka M (1999) Cbfa1
isoforms exert functional differences in osteoblast
differentiation. J Biol Chem 274, 6972-6978.
31）K ern B, Shen J, Starbuck M, Karsenty G (2001) Cbfa1
contributes to the osteoblast-specific expression of type I
collagen genes. J Biol Chem 276, 7101-7107.
32）Ramaswamy J, Nam HK, Ramaraju H, Hatch NE, Kohn DH(2015) Inhibition of osteoblast mineralization byphosphorylated phage-derived apatite-specific peptide.
Biomaterials 73, 120-130.
33）Rutkovskiy A, Stensløkken KO, Vaage IJ (2016) Osteoblast
differentiation at a glance. Med Sci Monit Basic Res 22, 95106.
34）Boonrungsiman S, Gentleman E, Carzaniga R, Evans ND,
McComb DW, Porter AE, StevensMM (2012) The role ofintracellular calcium phosphate in osteoblast-mediated boneapatite formation. Proc Natl Acad Sci USA 109, 14170-14175.
35）Terkeltaub R, Rosenbach M, Fong F, Goding J (1994) Causal
link between nucleotide pyrophosphohydrolase overactivity
and increased intracellular inorganic pyrophosphate
generation demonstrated by transfection of cultured
fibroblasts and osteoblasts with plasma cell membrane
glycoprotein-1. Relevance to calcium pyrophosphate
dihydrate deposition disease. Arthritis Rheum 37, 934-941.
36）Orriss IR, Arnett TR, Russell RGG (2016) Pyrophosphate: a
key inhibitor of mineralisation. Curr Opin Pharmacol 28, 5768.

26