●血管新生の基礎と臨床!!［III］血管新生の臨床応用

10．遺伝子を用いた血管新生療法
森下竜一＊

遺伝子治療はすでに 10 年におよぶが，未だその有効性が証明された試みは多くない．その中で数少ない成功例が，血管再生を利用した遺伝子治療であり，閉塞性動脈硬化症の画期的な治療になりうるものと期待されている．まず血管内皮特異的増殖因子（VEGF）プラスミドの筋肉内投与による遺伝子治療が開始され，良好な成績が報告された．われわれは，VEGF に変わりうる血管新生因子として肝細胞増殖因子 HGF
遺伝子導入により，ラットおよびウサギ下肢虚血モデルで血管新生と血流増加を明らかにした．興味深いことに，内因性血管壁 HGF は閉塞性動脈硬化症患者の血管では正常血管に比べ減少していることも明らかになった．以上の結果に基づき，われわれは「HGF 遺伝子プラスミドを用いた末梢性血管疾患（慢性閉塞性動脈硬化症・ビュルガー病）の治療」に関する試験計画書を提出し，平成 13 年 5 月に厚生労働・文部科学両省より承認を得た． 6 人の患者に投与を実施した（2002 年 1 月現在）
． 現在までに，アナフィラキシーなどのアレルギー反応は見られていない．同様の血管新生は虚血性心疾患においても期待されており，VEGF 遺伝子による血管新生による心筋梗塞治療は良好な成績が明らかにされている．われわれも平成 13 年 1 月に「HGF 遺伝子プラ
スミドを用いたカテーテルデリバリーを基盤とした重症虚血性心疾患の治療のための遺伝子治療臨床研究」を大阪大学遺伝子治療臨床研究審査委員会に申請した．遺伝子を利用した血管新生は，少量の血管新生因子を持続的に筋肉細胞特異的に発現させることにより，血管新生をターゲットにした新規遺伝子医薬品開発への期待がもたれている．

Application of Gene Therapy Using Therapeutic Angiogenesis toTreat Cardiovascular Disease
RYUICHI MORISHITA Division of Gene Therapy Science, Osaka University
もりした・りゅういち：大阪大学
大学院医学系研究科遺伝子治療学
助教授．平成３年大阪大学大学院医学系研究科老年病学卒業．平成３年スタンフォード大学循環器科研究員．平成８年大阪大学医学部
老年病医学助手． 平成10年現職．
主研究領域／分子生物学，遺伝子治療学，老年病学，循環器学．
＊

74 第 120 回日本医学会シンポジウム

Key words

遺伝子治療
血管新生
閉塞性動脈硬化症
肝細胞増殖因子療法はなく，外科的治療も高齢者では対象とはじめにならないことが多い．近年，末梢性血管疾患

閉塞性動脈硬化症による下肢切断は著しいの画期的な治療法として，組み換え型血管新QOL 悪化をもたらすが，手術不能例において生因子による側副血行路形成の可能性が示さは現在治療法がない．欧米を中心に血管新生れた．

因子である VEGF 遺伝子の筋肉内投与によVEGF などの内皮細胞増殖因子は極めて重り閉塞性動脈硬化症の治療が可能であること要な役割を果たしており，血管新生療法におが明らかにされた．血管新生を利用した遺伝ける主役である．すでに米国タフツ大学 Isner

子治療は，心筋梗塞や脳梗塞の治療として有らを中心に，VEGF 遺伝子を用いた閉塞性動効である可能性も報告されており，外科的治脈硬化症に対する遺伝子治療が始まってお療の対象となり得ない老年者に対する低侵襲り，良好な成績をあげている1）．彼らはウイの治療法として期待される．

ルスなどのベクターは使用せず，筋肉注射にて VEGF 遺伝子をプラスミドの形で筋肉内1．末梢性血管疾患に対する遺伝子治療に導入している（図 1）．VEGF などの内皮細胞増殖因子のプラスミドを筋肉内に投与する

ビュルガー（バージャー）
病や閉塞性動脈硬と，血管新生因子が産生され，血管が再生さ化症に代表される末梢性血管疾患の患者は，れることがウサギ下肢虚血モデルで明らかに間歇性跛行，安静時疼痛，下肢の組織障害（潰された．そこで彼らは ASO 患者下肢に VEGF

瘍・壊死）などの臨床症状を呈す．しかし，現遺伝子プラスミドを筋肉注射し，著明な血流在までに壊死を示す患者に対しては有効な治改善効果を報告した．ABI あるいは TPI は著遺伝子導入前

遺伝子導入後血管新生因子DNA

血管再生Muscle

図1筋肉内への遺伝子導入による血管再生血管新生の基礎と臨床 75

新生血管control

図2

HGF

HGF 遺伝子導入による血管新生ウサギ ASO モデル

明に上昇し，難治性潰瘍の改善も認め，従来の治療では不十分な重症虚血肢に有効な治療であることを示した．VEGF 遺伝子による治療的血管新生療法は，Buerger 病においても効果が報告されている2）．また，コーネル大学のグループは，アデノウイルスベクターに組み込んだ VEGF121 遺伝子を用いた末梢性動脈疾患の遺伝子治療を開始している．しかし，合併症として下肢の浮腫が報告されているが，利尿薬で改善している．
われわれは，本邦で発見された HGF（肝細胞増殖因子）が強力な血管新生作用を有していることを明らかにし，2001 年 6 月より閉塞性動脈硬化症およびバージャー病に対する

図3

ヒト HGF プラスミド DNA

HGF 遺伝子を用いた臨床研究（TREAT-HGF）を開始した．対象は閉塞性動脈硬化症あるいはバージャー病で，安静時痛または虚血性潰例に投与しており（図 2，3）
，全例で ABI 増加瘍・壊死を有する患者である．罹患肢筋肉にや疼痛改善，潰瘍改善などを認めている．

HGF 遺伝子プラスミドを 4 ヵ所注入するが，2002 年 1 月より間歇性跛行（フォンテーン 2b）

まず予備量を投与し副作用の有無を検討し，の患者を含むステージ 2 が開始された．

問題がなければ治癒量を投与する．現在，676 第 120 回日本医学会シンポジウム

ウイルスベクターの安全性が未だ確立して図4

カテーテルを用いた虚血性心疾患の HGF 遺伝子治療

遺伝子導入時にはカテーテル先端より針が出て，心室壁内に導入できるいない現状では，ウイルスを用いた遺伝子投治療法が見いだされていない心筋梗塞におい与は実際の臨床においては使用しにくいたても応用されている．とくに高齢者では手術め，プラスミドの形でも遺伝子を導入しうる侵襲が大きいため，保存的治療で推移するこ筋肉は，現段階で最も遺伝子治療に適していとが多く，QOL が障害されている．このようると考えられる．VEGF や HGF は分泌蛋白でな患者に対して，低侵襲のカテーテル治療であるので，すべての細胞に遺伝子が導入され血管再生が可能であれば，福音となることはる必要がなく，部分的に導入されるだけでも容易に想像できる．したがって，現在多くの局所濃度を上げることが可能である．

グループが治療的血管新生を検討している．
すでに，動物実験において VEGF や FGF など

2．虚血性心疾患に対する遺伝子治療
同様の治療的血管新生療法は，未だ有効なの血管新生遺伝子の導入により心筋梗塞後の心機能改善が明らかにされている．そこで，閉塞性動脈硬化症の臨床試験において VEGF
血管新生の基礎と臨床 77

組み換え型HGF

HGF遺伝子未治療

図5

HGF 遺伝子導入による血流増加（脳梗塞モデル）

HGF 遺伝子導入により脳表面の血流増加が見られる（白色部で最も血流が多い）

プラスミド導入の安全性を確認した Isner ら

全性を証明した4）．しかし，心筋内への遺伝は，VEGF 遺伝子による心筋梗塞治療の臨床

子導入は簡単であるが，手術侵襲を伴い望ま試験開始の許可を FDA より得ることに成功

しくないとする意見もあり，現在カテーテル3）し，重症心不全患者に投与した ．最初彼らによる心臓への遺伝子導入が試みられているは，肋骨の間をわずかに切開するミニ開胸術（図 4）．すでに Isner らは，先端に針のついたを行い，遺伝子を直接心筋内に注射する方法

カテーテルを用いた心不全患者の心筋内へを用いた．心筋壁への VEGF プラスミドの導VEGF 遺伝子を導入しており，外科的な方法入により，血流の増加と狭心症症状の改善が同様良好な成績を報告している．最近カリ認められている．驚くべきことに，遺伝子治

フォルニア州立大学の Hammond らは，FGF-療開始前は全例 NYHA
（ニューヨーク心臓協

5 遺伝子をアデノウイルスベクターで冠動脈会分類）4（ベッド上安静で，苦痛なしにいか内へ投与し，重症心不全の症状が改善したこなる身体活動もできない状態）であったが，とを明らかにした．現在，臨床試験が行われ90 日後には半分の症例で NYHA 1（日常生活ており，2004 年にも米国での市販が予定され可能）に回復し，一部の症例ではニトログリセている．今後，慢性心不全を含む虚血性心疾リンの使用を中止できた．また，このような患に対する遺伝子治療の効果が期待される．

重症心不全患者は通常 1 年生存率が 80％ 程

一方，HGF の血管新生作用は狭心症に対し度であるが，VEGF 遺伝子治療を受けた患者ても有用である．ラット冠動脈結紮モデルにでは 72 人中 2 人が死亡したのみである．従おいて，局所 HGF 濃度は低下しているが，来このような心不全の症状を大きく改善させ

HGF 遺伝子導入による補充は著明な血管新る薬は知られておらず，画期的な治療法とな生を誘導する5）．HGF 遺伝子導入により，血る可能性がある．

管内皮細胞に一致して PCNA で染色される

また，コーネル大学の Crystal は VEGF ア細胞が確認され，PCNA 陽性染色内皮細胞はイソフォーム 121 遺伝子を，アデノウイルス8 倍に増加する．新生血管は非常に小さい mi-ベクターを用いて CABG と同時に心筋内へcrovascular から，microvascular が融合した中投与する臨床試験を開始し，フェーズ 1 で安小血管も確認される．Microsphere で血流を78 第 120 回日本医学会シンポジウム測定すると，HGF による血管新生によってデノウイルスベクターを用いて健常 rat の大50％ 程度血流量が増える．HGF 過剰発現時槽より投与することにより，脳血管新生が可には血管新生に必須な転写因子 ets の活性化能であることも報告された．われわれはラッも認められ，ets を介した血管新生が示唆さ

ト脳低灌流モデルにセンダイウイルスと脂質れている．ブタにおいても，HGF による血管を混合したハイブリッドベクターを用いて新生が一種のバイパスのようになって，末梢HGF 遺伝子を大槽から投与することにより，血管への血流増大に貢献していることが明ら血管新生がおこり脳血流の改善が得られるこかになっている．すでに，これらの結果をもとを確認している（図 5）．さらに，スナネズミとに 2000 年 4 月大阪大学第一外科澤らは，を用いた検討では，同様の方法で遅発性神経重度狭心症および心不全患者を対象とした開細胞死（delayed neuronal death）が抑制でき胸術時の HGF 遺伝子導入による臨床研究をることを報告している6）．脳血管における血申請している．われわれも 2001 年 1 月には管新生療法は，新生血管における易出血性のカテーテルを用いた心不全への HGF 遺伝子有無，blood brain barrier の形成の有無，血管導入による臨床研究を申請しており，2003新生による神経症候の改善の有無など検討す

年度には実施可能であろう．

べき点はあるが，今後の展開が期待される．

おわりに
3．虚血性脳血管障害における遺伝子治療

本稿では，治療的血管新生を用いた遺伝子治療の臨床試験の現状について解説した．治老年病に対する遺伝子治療として今後最も療的血管新生を用いた遺伝子治療の応用は，期待されるものは，虚血性脳血管障害に対す若年者に比べ手術不適例が多いなど待機的なる治療であろう．治療的血管新生は理論上応治療が行われていた老年者に福音をもたらす用は可能であり，最近熱い期待が寄せられてと考えられる．

いる．
脳への遺伝子の delivery は，他臓器に比較して困難ではあるが，大槽からベクターを投与することにより，髄液を介した脳への遺伝子導入がある程度可能である．また，最近
では脳血液関門に特異的に発現するレセプターに対する抗体をベクターに付加することにより，静脈投与での脳への遺伝子導入も試みられている．最近のラット脳梗塞モデルを用いた検討では，梗塞後に生じる細血管新生による側副路の発達が ischemic border の血流を回復し，機能回復を促している可能性が報告されており，積極的な血管新生の必要性が報告されている． すでに Rosenstein らは，VEGF 組み換え蛋白を rat の皮質内へ持続注入することにより，脳での血管新生が可能で〔文献〕
1）Baumgartner I, Pieczek A, Manor O, et al. : Constitutive expression of phVEGF 165 after intramusculargene transfer promotes collateral vessel developmentin patients with critical limb ischemia . Circulation
1998 ; 97 : 1114―1123.
2）Isner JM, Baumgartner I, Rauh G, et al. : Treatment ofthromboangiitis obliterans（Buerger s disease）by intramuscular gene transfer of vascular endothelial
growth factor : preliminary clinical results . J VascSurg 1998 ; 28 : 964―973 ; discussion 973―975.
3）Losordo DW, Vale PR, Symes JF, et al. : Gene therapyfor myocardial angiogenesis : initial clinical resultswith direct myocardial injection of phVEGF 165 assole therapy for myocardial ischemia . Circulation
1998 ; 98 : 2800―2804.
4）Rosengart TK, Lee LY, Patel SR, et al. : Angiogenesis
gene therapy : phase I assessment of direct intramyocardial administration of an adenovirus vector ex-あることを報告した．また，bFGF 遺伝子をア
血管新生の基礎と臨床 79

pressing VEGF 121 cDNA to individuals with clinicallysignificant severe coronary artery disease . Circulation 1999 ; 100 : 468―474.
5）Aoki M, Morishita R, Taniyama Y, et al. : Angiogenesis
induced by hepatocyte growth factor in non-infarcted
myocardium and infarcted myocardium : up-regulation of essential transcription factor for angiogenesis, ets. Gene Ther 2000 ; 7 : 417―427.
6）Hayashi K , Morishita R , Nakagami H , et al. : Genetherapy for preventing neuronal death using hepatocyte growth factor : in vivo gene transfer of HGF tosubarachnoid space prevents delayed neuronal deathin gerbil hippocampal CA 1 neurons . Gene Ther
2001 ; 8 : 1167―1173.

2 回投与していますが，1 回目の投与の時点
ではそのへんがよくわかりませんでしたので，先生が言われるように上と下に打つような形で行っていたのですが，実際に行ってみますと，やはり下のほうではなかなか生えないということがわかりまして，今はできるだ
け伸ばす血管の近くに打つような形で行っております．実際に後半ではかなり反応がよくなっています．
服部豊（慶 應 大） 質 問 が 二 つ ご ざ い ます．
血清中の HGF の濃度を測られていましたが，血小板にたくさん含まれていますので，やはりプラズマで測らなければ正確なことはいえないのではないかと思います．

質疑応答

森下

その点に関して，実は当初は HGFの測定をみなさん血清で行われた方が多かっ座長（永井） ありがとうございました．今た上に，われわれも普通の臨床例では血清と話題の HGF による血管新生遺伝子療法のおプラズマがほとんど違いがないということを話でしたが，いかがでしょうか．

見つけていまして，血清中濃度を採用したの

田代秀夫（慈恵医大） 足の病変部がありまです．しかし，先生が言われたような意見もすね．指先が necrosis になって，薬を筋肉内非常に多くの方から言われて，後半ではプラに打つ場所ですが，これはかなり距離があるズマも測定しようと考えています．

ところだと思うのです．打つ場所によって作服部

治療効果のメカニズムとして，骨髄用がずいぶん変わってきてしまうような気がか ら の endothelial progenitor の mobilization

するのですが，何かそこで決めておられるの可能性はいかがでしょうか．

protocol がありましたら教えていただきたいと思います．
森下

森下

VEGF ではすでに報告が出ています

ので，われわれもあり得るかと思っているの先生がいわれましたように，どこにですが，ただ私どもの場合は VEGF と異なっ打つかということは非常にむずかしい問題て血清中の濃度が全然変化していないので，だったのですが，今の私どもの経験から申し骨髄からの動員がどこまで起きているかといますと，やはり donor artery と申しますか，伸うことは，正直なところよくわかりません．

ばすところの血管が必要ではないかと思いま

今その測定を行おうということで準備はしてす．要するに血管が何もないところに打っているのですが，臨床試験に伴って患者さんにも血管ができるわけではなくて，やはり栄養かなり負担がかかるような検査が多いので，がなければよい血管再生は見られないというそれ以上に加えて研究目的というのは，最初印象を持っています．ですから，今われわれの 6 名の方ではやりにくかったので，現在まが行っていますのは，既存の血管ができるだでのところできておりません．後半のほうでけ伸びているところの下に，イメージ的にそ改めて informed concent を取り直して，そのの血管を伸ばすような形で投与しています．

ような実験を行いたいと思っています．

80 第 120 回日本医学会シンポジウム片桐秀樹（東北大） いくつか基本的なこと

ら，5 mm とか 1 cm 伸ばせばよいということを伺いたいと思います．まず plasmid で入れであればかなり効果は早く出てくるのではなていらっしゃるということですが，筋肉で導いかというように思います．現状では症状が入され，筋肉で作られるということでしょうか．

取れるのも，半分以上の方が 2 回目以降です森下Plasmid DNA は筋肉細胞以外には入ので，かなりゆっくりとした反応だと思ってりませんので，おそらく 1％ 以下の筋肉細胞います．

しか発現していないのではないかと思ってい片桐

で発現が消えるということであれば，もっとます．
片桐

それで promoter は，筋肉 specific なpromoter ですか．
森下Plasmid の場合，入れてから 1 ヵ月

CMV の promoter です．これはアメ細かく，期間を短くして打つというほうがよいのではないでしょうか．
森下

先生のご指摘の可能性はあるのです

リカでやっている VEGF の臨床試験が CMVが，安全性の点がやはり重要ですから，1 回なの promoter ですので，それに合わせたといくなって，それでどの程度再生されたかを見う形で，今回は CMV を使っています．

たうえで足したほうが，安全性という観点で片桐

罹患肢に 4 ヵ所プラスミドを 注 入はより優れているのではないかと思います．

すると伺いました．筋肉は長い細胞なので，要するに足して行きますと，コントロールが注射部から少し離れたところでも HGF がつできない promoter ですから，必要以上に出くられるため，そのくらい注入部位が離れてた場合に止めることができませんので，そういても大丈夫と理解してよろしいでしょうか．

いった意味でいけば，ある程度完全になく森下距離が離れているのは非常に不利だなったような時期に足すほうが，われわれとと思っています．血管再生はかなり時間がかしては安全性の面で優れているのではないか

かるのです．1 ヵ月後の造影でハッキリ見えということです．ただし今の protocol 上は fix

る方というのは決してそう多くはなくて，（こされていますので 2 回しか打てなくて，実際れも実際に新生血管なのか，既存の細い血管上はもう 1 回打てばよさそうだという患者が arteriogenesis を起こして増えているのかさんもおられるのですが，その投与はできなは，正直な話なかなか判定はむずかしいのでいので，ある意味では既存の治療と何らかのすが）やはり 2 回目のほうがハッキリ見えま形で併用ということも必要になるのではない

す．1 回目の段階で見える方もいらっしゃい

かと思います．

ますが，決して数は多くないので，やはり時もう一つは，血管の run off がよくなります

間は非常にかかるのではないかと思います．

から，そこで外科的な手術に持ち込むというこれもあくまでも血管がないところに生じることも可能になると思うのです．ですからやのではなくて，既存の血管が伸びてくるようはり遺伝子治療単独というよりも，集学的なな，（あるいはそこで vasculogenesis が起こっ治療を構築しなければいけないのではないかているのかもしれませんが）いずれにしろと思っています．

donor artery は必須だと私どもは思っていま

片桐

血管新生を目的とした場合は，発現す．そういった意味でいけば，足のように側が少しでも十分の効果を得られるので plas-

副血管がもともと潰れているような方に関しmid で大丈夫ということですが，それ以外のて言いますと，時間がかかるのではないかと遺伝子治療で，plasmid で実際に行われてい思います．心臓であれば非常に小さいですかるようなことというのはありますか．
血管新生の基礎と臨床 81森下ほかに私が知っている範囲では，す．申し忘れたのですが，実は今回の患者さmelanoma などいくつかのがんではされていんは適応委員会で外科的な適応はないというますが，やはり発現系が多量に必要な治療でことを判定された方です．あの方はビュルすから，plasmid で行けるというのは，このよ

ガー病で，graft ができないという方です．わうな虚血領域の治療がメインといいますか，れわれの判定委員会は外部の方が，血管外科ほとんどだと思います．の先生を含めて半数以上加わっていまして，関井浩義（済生会和歌山病院） 私は血管外その方々全員で適応はないと認められた方だ

科が専門なのですが，症例 3 で見せていただけが対象となっていますので，先ほどの方もい た よ う な target artery の あ る よ う な 症 例

通常の外科的な手法では無理だということ

は，いちおう今はバイパスの適応かなというで，加わっています．

ように思っています．先生は，ご発表の中で先生がいわれますように，非常にうまくつABI の改善が 0.1 ないし 0.2 とおっしゃったながりますと，外科的治療はすぐ改善するののですが，バイパスの場合には完璧に 1.0 にですが，先ほどいったような方は graft 適応なることも期待できますので，後に間欠性跛がないという方ですので，通常の外科的治療行を残さないなど，そのようなメリットが外ができなかったという方です．ぜひご紹介い科的処置にはあるかと思います．実際に行っただきたいと思いますが，私どもはホームていますと，target artery のない症例というページを作っておりまして，よろしければそのがありまして，ぜひ先生の protocol に参加

ちらのほうからもご紹介できるようになってさせていただきたい症例が 2 例ほどあるのおります．http: !
!
go.to!
idenshi で入りますのですが，どのようにしたらよいか伺いたいとで，よろしければ見ていただければと思います．

思います．
森下

ぜひご紹介いただきたいと思いま

82 第 120 回日本医学会シンポジウム

座長

どうもありがとうございました．