別添４－２ 調査研究報告書（要旨）

早期離乳ストレスによる動物の異常行動のプロラクチンによる予防および矯正効果の検討― 伴侶動物の問題行動の予防と治療への応用を目的として ―Sutdies on the effect of prolactin on protection and remedy of unusual behaviorof animals by early weaning stress -Aiming at application to companion animals日本獣医生命科学大学応用生命科学部動物科学科

田中 実

Minoru Tanaka, Nippon Veterinary and Life Science University,
Faculty of Applied Life Science, Department of Animal Science
キーワード： プロラクチン、早期離乳、ストレス、異常行動
Keywords ： prolactin, early weaning, stress, unusual behavior
1. 目的

コントロールすることが容易である。プロラク

高齢化社会となりつつある我が国においてチンの分泌は授乳期のみならずストレス負荷には今後ますます犬、猫を初めとする伴侶動物のよっても増大し、分泌量が多いほどストレス耐需要が増加すると考えられる。こうした状況下性が強くなる 3）。したがってプロラクチンを動において、ブリーダーによる早期離乳や飼い主物の問題行動の予防および矯正に応用できる可による不適切な扱い等によるストレスのため異能性が大きい。

常行動をきたす伴侶動物も増加し、その対処法

本研究ではプロラクチンの脳神経系への作用が問題になってきている。しかし、訓練等によに着目し、実験動物のラットを用いて、早期離る動物の異常行動の矯正はきわめて難しく、ま乳ストレスにより引き起こされる成体期の情緒た、内科治療で用いられる向神経薬は種々の神安定性およびストレス耐性の低下に対するプロ経作用を引き起こすリスクが高く、依存症が生ラクチン投与の予防効果と軽減効果を調べ、伴じやすいため動物福祉の観点から最善の治療法

侶動物の問題行動の予防および矯正へのプロラではない。

クチン療法を確立するための基礎知見を得るこ動物の行動は神経系だけでなく内分泌系すとを目的とする。

なわちホルモンによっても制御されている。その中で乳汁分泌促進ホルモンとして知られるプ2. ウイスターイマミチラットの行動学的特性

ロラクチンは脳神経系にも作用し、母性行動のの検討誘導、ストレス耐性の増強にも働く。この作用はメスだけでなくオスにおいても生じる

ウィスターイマミチラットは日本獣医畜産大

1,2）

。ま

学（現日本獣医生命科学大学）の今道らによった、プロラクチンは脳下垂体で合成され血液中て、性質が温順であること、メスの性周期が 4に分泌された後、乳腺や神経細胞等の標的細胞日で安定し多産であること等、実験動物としてに存在する受容体を介して遺伝子に作用するた

優れた特性を有する系統として、ウイスターラめ、効果が急激に現れるものではなく、作用をットから選抜して確立された。そこでウィスタ
1

ーイマミチラットの温順性を行動学的に解析す

3.ウイスターイマミチラットの脳におけるプるため、ウィスターラットとウィスターイマミ

ロラクチン応答性の検討

チラットのオープンフィールドにおける移動活

脳下垂体前葉で産生され血液中に分泌された動量を比較解析した。オープンフィールド試験

プロラクチンは脳の母性行動中枢およびストレは、新奇環境での活動量の評価法として代表的ス中枢の神経細胞に作用して、母性行動やストな試験である。写真１にしめしたオープンフィレス耐性の誘導にも働く。この時、血中のプロールドのセンターにラットを置き、他区画へのラクチンは脳・血液関門を通過できないため、移動量を測定したところ、元来の特性としての脳内脈絡叢の上皮細胞に存在するプロラクチン温順な性質を反映し、ウィスターイマミチラッ受容体を介して脳脊髄液中に取り込まれた後、トの活動量はウィスターラットより低かった脳内の神経細胞に作用する。すなわち脈絡叢に（図１）。

おけるプロラクチン受容体の存在量が、脳におけるプロラクチンの感受性に影響する。
そこで、ウイスターイマミチラットの脈絡叢におけるプロラクチン受容体遺伝子の発育時期および授乳期における発現量をウイスターラットと比較解析した。受容体遺伝子の発現量すなわち mRNAの産生量はリアルタイム PCR により定量した。
２、４、８週齢の成長段階での脈絡叢における受容体 mRNA 量は、ウイスターイマミチラット
ではオス、メスともに成長とともに増加し、ウイスターラットでは２週齢に較べて４週齢と 8週齢ではやや増加が認められた（図２）。

図１ ウィスターイマミチラットのオープンフ

また、４週齢と８週齢のメスにおける発現量は、

ィールド試験における行動特性（ウィスターラウイスターイマミチラットのほうがウイスターットとの比較解析）ラットよりも約３倍程高い値を示した。一方、オープンフィールドでの 3 分間の移動区画数の成体期における発情休止期と授乳３日目におけ平均値で比較 8 週齢 N=５ 雌は膣垢検査にる受容体 mRNA 量は、ウイスターラットでは変より発情休止期に試験化がみられなかったが、ウイスターイマミチラ**：Ｐ＜0.01 ***：Ｐ＜0.001 Ｗ：ウィスタットでは授乳期で増加する傾向が見られ、発現ーラット，ＷＩ：ウィスターイマミチラット

量がいずれの時期においてもウイスターラットよりも数倍高かった（図３）。
したがってウイスターイマミチは脳のプロラクチン感受性が高く、本研究に適した実験動物と考えられる。

写真１ オープンフィールド試験装置

2

4. 早期離乳が子ラットの成長と成体期の情緒安定性に及ぼす影響
4-1. 早期離乳方法
３匹の母ラットそれぞれに、オスの乳子を８ないし９匹あてがい育てさせた。出生日を 0 日齢とし、１７日齢で各母親より半数の子を離乳し、早期離乳群とした。残る半数は３０日齢で離乳し、対照離乳群とした。離乳後は各群ともに単独飼育とし、飼育ケースに設置する給水筒は、長尺の吸い口（写真２下）を使用し自由給水とした。また、給餌容器を（写真３）を用い、細かく砕いた固形飼料を入れ自由給餌とした。

図２ ウィスターイマミチ（WI）とウィスター（W）の脈絡叢におけるプロラクチン受容体（PRLR）ｍRNA 発現量の成長に伴う変動
PRLR ｍRNA 量はクリセルアルデヒド 3 リン酸脱水素酵素（GAPDH）ｍRNA に対する相対値で示した。
*：Ｐ＜0.05，**：Ｐ＜0.01，***：Ｐ＜0.001

写真 2 早期離乳ラット飼育用
給水筒長尺吸い口（下）写真 3 早期離乳ラット飼育用
給餌器

図３ ウィスターイマミチ（WI）とウィスター（W）の脈絡叢におけるプロラクチン受容体（PRLR）ｍRNA の発情休止期（D）と授乳 3 日間（Lac-3）における発現量
PRLR ｍRNA 量はクリセルアルデヒド 3 リン酸脱水素酵素（GAPDH）ｍRNA に対する相対値で示した。
34-2. 成長への影響

レスは特定の外部音に対する恐怖心を増大させ早期離乳群と対照離乳群の１７日齢以後の体ていると思われる。

重を比較すると、早期離乳群では離乳後 2 日目と 3 日目にいったん体重減少が見られるが、その後は対照離乳群と同様に増加し、早期に母乳を断つことによる発育不全など、成長への身体的な影響は見られなかった（図４）。

図５ ウィスターイマミチラットの音に対する応答特性
金属製給水筒とケージの摩擦音に対する反応を 1 分間観察して硬直していた時間を平均値で比較 早期離乳群 N=13，通常離乳群 N=12
図４ ウィスターイマミチラットの成長過程に*：Ｐ＜0.05

おける体重増加に対する早期離乳の影響
早期離乳群 ▲ N=13，通常離乳群 ● N=12 の4-4.高架式十字迷路試験

平均値

早期離乳の情緒安定性に及ぼす影響を調べる
ため、8 週齢の両群ラットに対し高架式十字迷4-3.早期離乳が成体期の情緒安定性に及ぼす路試験を行った。高架式十字迷路試験は、写真

影響

４のような高架（高さ６０cm）の十字板の一方成長後の早期離乳群において、金属製ケージにガードをとりつけ、中央に置いたラットがガ蓋に刺した給水筒を引き抜く際の摩擦音に反応ードのないアームあるいはガードのあるアームし、硬直する現象が見られた。そこで 8 週齢時に移動する回数および滞在時間を測定する試験において、音を聞かせた後の身体を硬直させてである。ラット等の動物が本質的に有しているいる時間を測定した。硬直状態の定義は、頭・探索行動（好奇心）と不安や恐怖が動因となる身体・四肢等を動かさず、硬直している状態とした。その結果、早期離乳群において 13 匹中12 匹に硬直が見られたのに対し、対通常離乳群
では 12 匹中 4 匹であった。また、早期離乳群の硬直時間は対照離乳群より数倍長かった（図５）。
しかし、ネズミ用音波防除器（株式会社コンパル社製 周波数:３０kHz－６５kHz）の音には反応を示さなかった。したがって、早期離乳スト

写真４ 高架式十字迷路試験装置

4回避行動の均衡状態を調べる試験であり、不安8 週齢での高架式十字迷路での行動を 5 分間観度が大きいほど安全なガードのあるアームに頻察。A：オープンアーム、クローズドアームへ繁にいき、長くとどまる傾向がみられる。図６の侵入回数 B：オープンアーム、クローズドに示したように、オープンアームへの進入回数

アームでの滞在時間。■ 早期離乳群 N=13には両群に差は認められなかったが、ガードの□ 通常離乳群 N=12*：Ｐ＜0.05

あるアームへの進入回数は早期離乳群のほうが少なかった。ウイスターラットにおいてはスト

5. これまでの研究の総括と今後の課題

レス負荷により不安度が増し、ガードのあるア

本研究の最終目的は早期母子分離等のストレームへの進入回数が多くなることが報告されてスによる伴侶動物の問題行動の予防と治療へのいるが 4)、ウイスターイマミチラットでは逆のプロラクチンの応用の可能性を実験動物で検証結果となった。これはウイスターイマミチの低することである。犬をはじめとする伴侶動物は活動性が早期離乳ストレスにより強まったため気質の温和な種類が選ばれてきており、本研究と考えられる。今後、拘束ストレスを両群ラッで用いる実験動物として、性質が温和であり、トに負荷し、ストレス応答性をコルチコステロかつ脳へのプロラクチンの感受性が高いウィス

ンとプロラクチンの血液中濃度を指標に調べる

ターイマミチラットが適していると考えられる。

予定である。

本実験で行なった早期離乳条件では、離乳直後に一時的な体重増加の減少はみられたもののすぐに回復し、体格の成長には影響がみられなかった。したがって離乳による栄養不良の要因を排除できる離乳方法を確立することが出来た。
早期離乳ストレスにおける行動への影響を調べるための高架式十字迷路試験では、予想とは異なる結果となったが、早期離乳群では音に対して著しく敏感になるという新しい知見が得られた。予定していた、拘束ストレスに対する応答性を、ストレス応答ホルモンであるコルチコステロンとプロラクチンの血液中の分泌量を指標として解析する実験については、すでに早期離乳群と対照離乳群に拘束ストレスを負荷し、血液サンプルを採取済みであり、現在、両ホルモン濃度を測定するための予備試験を行なっているところである。その結果をふまえてさらに目的を達成すべく研究を展開してゆきたい。
6. 参考文献

図６ ウィスターイマミチラットの高架式十字1. Sakaguchi K, Tanaka M, Ohkubo T, Doh-ura

迷路試験における早期離乳の影響

K, Fujikawa T, Sudo S, Nakashima K.
Induction of brain prolactin receptor
5long-form mRNA expression and maternal
behavior in pup-contacted male rats:
promotion by prolactin administration andsuppression by female contact.
Neuroendocrinology 63, 559-568 (1996).
2. 田中 実、藤川隆彦 中島邦夫 プロラクチ
ンによる哺育行動誘導およびストレス性胃潰瘍予防作用の分子基盤 蛋白質・核酸・酵素
45, 346-354 (2000).
3. Fujikawa T, Soya H, Yoshizato H, Sakaguchi
K, Doh-Ura K, Tanaka M, Nakashima K.
Restraint stress enhances the gene
expression of prolactin receptor long form
at the choroid plexus. Endocrinology 136,5608-5613 (1995).
4. Ito A, Kikusui T, Takeuchi Y, Mori Y.
Effects of early weaning on anxiety andautonomic responses to stress in rats.
Behav. Brain Res. 171, 87-93 (2006).

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