本記事は , 文部科学省ナノテクノロジープラットフォーム事業 技術スタッフ表彰について紹介するものです .

文部科学省ナノテクノロジープラットフォーム 平成 27 年度技術スタッフ表彰 若手技術奨励賞

クライオ電子顕微鏡法を用いた技術支援～卓越した凍結技術と TEM 観察技術を用いて生体脂質膜の機能解明に貢献～
受賞者 奈良先端科学技術大学院大学 物質科学教育センター 藤田 咲子氏に聞く
文部科学省ナノテクノロジープラットフォーム事業 [1] は，26 の大学・研究機関が有する最先端のナノテクノロジー設備を，全国の産学官の研究者に対して利用機会を提供し，イノベーションにつながる研究成果の創出を目指している．設備の活用には，豊富な技術・ノウハウを持った技術スタッフの支援が欠かせない．このため平成 26 年度より技術スタッフ表彰が行われ，平成 27 年度「若手技術奨励賞」に奈良先端科学技術大学院大学（以下 NAIST）藤田 咲子氏の「クライオ電子顕微鏡法を用いた技術支援」が選ばれた [2]．この技術の内容，支援の経緯などを伺うべく，奈良県生駒市（けいはんな学園都市）の NAIST
物質科学教育センターに受賞者の物質創成科（左）若手技術奨励賞受賞の奈良先端科学技術大学院大学（右）副賞のバッジ 若手技術奨励賞

藤田 咲子氏学技術区／教育研究支援部 研究協力課 技術
職員 藤田 咲子（ふじた さきこ）氏を訪ねた．また，NAIST ナノテクノロジープラットフォーム連携マネージャー
戸所 義博（とどころ よしひろ）氏が同席され，NAIST のナノテクノロジープラットフォームについて説明された．

小・ベンチャー企業等に広く門戸を開いていることであ

１．NAIST ナ ノ テ ク ノ ロ ジ ー プ ラ ッ トフォーム
文部科学省のナノテクノロジープラットフォーム事業

る．平成 27 年度の学外への支援件数は 57 件であった（内訳は，大学・公的機関 36，企業 21．協力研究 31，技術代行 20，機器利用 6）．さらに，技術・ノウハウを広める
各種セミナを開催している．

は，微細構造解析，微細加工，分子・物質合成の 3 分野から成る [1]．NAIST ナノテクノロジープラットフォーム[3] は，分子・物質合成プラットフォームの一つの拠点として活動しており，学内における位置付けを図 1 に示す．
支援内容には，①技術相談，②協力研究，③技術代行，

２． ク ラ イ オ 電 子 顕 微 鏡 法 に よ る自己組織化集合体の観察④機器利用の 4 種がある．主な支援機器は透過電子顕微

界面活性剤に代表される両親媒性分子を水に分散する鏡をはじめ 9 機種，他に支援試行機器として二次イオンと自己組織化集合体を作りその形態はミセル，ベシクル，質量分析装置をはじめ約 20 設備を共用に提供している．

リボソーム等多様であり，それぞれに特徴ある機能を持っ

NAIST の支援の特徴は，①全教員参加による協力研究ており，これらを透過電子顕微鏡（以下 TEM）で観察し制度，②高度な専門技術を持つ技術職員・技術支援員，詳細な形態・構造を突き止めようとする動きが盛んであ③連携・技術調査を専門とする連携マネージャー，及びる．表彰の対象になったクライオ TEM 法が活躍している

リーズナブルな利用料金により，新材料創成とものづく

NAIST ナノテクノロジープラットフォームには，図 2（a）りに貢献し，アカデミアだけではなく，産業界，特に中に示す 300KV の TEM がある．これとクライオ TEM 法

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平成 27 年度技術ｽﾀｯﾌ表彰（若手技術奨励賞）-1

図1

図2

NAIST ナノテクノロジープラットフォーム支援体制

透過型電子顕微鏡とクライオ TEM 法のための装置及び試料作製手順と観察結果

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のための装置（図 2（c））と組み合わせて上記ミセルや易度が高いため，支援を提供できる機関は少ない．この

ベクシル及び生体材料の TEM 観察を行っている．ところ

ような中にあって，NAIST はクライオ TEM 支援を通してで，これ等観察対象物は有機分子と水から構成されてい多くの大学や企業の研究開発に貢献している．

る．このことは，電子線をプローブとする TEM にとって2 つの大きな問題となる．1 つは構成元素が C，N，O 等の軽元素であり，低コントラストの像しか得られない．2

３．クライオ TEM 法による支援例

つ目は TEM 内部は高真空にしなければならないが，水があってはそれは叶わない．これを克服する手法としてあみ出されたのが，試料溶液ごと凍結して観察するクライ３．１

支援例 1：光照射で開口するベシクルを撮影

オ TEM 法である．サンプル作製の手順は図 2（d）に示

奈良工業高等専門学校 宇田准教授への協力研究でなさすように，①サンプル溶液をグリッド上に載せる，②余れたものであり，両親媒性分子が形成するミセルやベシク剰液を除去する，③液化エタンに浸漬し急速凍結させる

ルなどの分子集合体の形態を光で制御することで物質の（水の結晶化を防ぐために 10,000K/S の急速凍結とする），取り込みや取り出しをコントロールできることを確認し，④クライオトランスホルダー（図 2（b，c））を用い凍結ドラッグデリバリーシステムへの展開の可能性を示した

したまま TEM 観察する（-130℃で水の再結晶が起るたものである．図 3（左）に示すように，光照射によってイめ常に液体窒素温度で保持する）．なお，ここで液体窒素オン化し両親媒性を生じる Malachite Green（MGL）を合を用いず液体エタンを用いるのは，窒素は融点（-210℃）成し，これを両親媒性分子レクチン（phosphatidylcholine）と沸点（-196℃）の差が 14℃と小さく，サンプル表面でと混合し，MGL を含んだベシクルを形成する．これに光気化する可能性があるからであるのに対し，エタンは融を照射すると図 3（右）に示すように形態変化を起す．光点（-183.6℃）と沸点（-89.0℃）の差が 94.6℃と大きく照射前のベシクルは球状である（図 a の矢印，以下同様）
が，気化の心配がないからである．観察結果は，乾燥サンプ

光を照射すると球状ではなくなる（b，c）．小さなベシク

ルが乾いて変形するのに対し，急速凍結サンプルは生のルを巻き込んで筒状にもなる（d），最外周の膜がちぎれままの球状である（図 2（e））．

るのもある（e），そしてベシクルの一部が溶出してベシ

このようにクライオ TEM 法は，試料作製・観察に専用クルが口を開いた状態にもなる（f）．これは，ベシクルのの装置が必要で，試料作製にも熟練した技術を要し，ま中に閉じ込めておいた薬剤を望みの場所で望む時に取りた試料調整や TEM へのセッティングに時間がかかる等難出すことができるドラッグデリバリー機能を持つことを

図3

MGL が混入されたレクチンのベシクル：MGL の濃度と光照射によって形状制御（バー＝ 100nm）[4]NanotechJapan Bulletin Vol. 9, No. 3, 2016

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示している．これらの形態は混入する MGL の濃度によっン（ドロップレット）ができる（図 4（c）の左端）．沼田て制御可能である．

氏らは，これを加熱して DCE を除去していくとドロップ

この支援では，サンプルを如何に薄くするかがポイン

レットは収縮し，そして急に球状からロッド状に変形す

トであり，そのために余分な液を除去するのに使用するることを見いだした [5]．そして Chl-4Py の割合が多いと濾紙の接触角度と時間に工夫と試行錯誤が必要であった．

そのロッドはシングルウオールからマルチウオールに変この支援を通して藤田氏は幅広い技術・ノウハウを新たわり，かつ長くなる．ここで創出した新規な超分子シスに身につけることができたとのことである．このようにテムは，ナノからマイクロスケール超分子化学に新たなして依頼者の研究と成果発表に貢献し，論文は藤田氏へ展開をもたらすものになると期待される，とのことであの謝辞とともに Langmuir 2010, 26(8), pp.5444-5450 [4]る．
図 5 は，この変化をクライオ TEM 法で追跡したものでに掲載されている．

ある（実際は，この観察結果から図 4 のモデルが導出さ

３．２ 支援例 2：加熱処理によって球状からチューブ状に変形するベシクルを観察れた）．
この支援で藤田氏が工夫したことは，ドロップレットの中が揮発性の DCE なので，泡立ちが問題になった．こ

京都府立大学 沼田准教授との協力研究においてなされれを防ぐために電流値を下げ電子線を暗くした．そうすたものであり，図 4（a）に示す嵩高いテトラエチレング

るとコントラストが下がってしまうが，適当なデフォーリコール（TEG）のシッポを持った Zn- クロロフイルベーカスを設定することで位相コントラストを最大にして対ス の 両 親 媒 性 分 子（Chl-4Py） の DCE（dichloroethane）処した．また，本件は短時間で撮影を行わなければなら溶液を水中で分散させると，直径約 250nm のエマルジョなかった．

図4

Chl-4Py と DCE で形成されるベシクルの加熱処理よる形状変化（モデル図）[5]a）Chl-4Py の分子構造，右はモデル化した図形．b，c）左端は，直径約250nm のドロップレット．右は加熱によりドロップレット中の DCE が飛散するとドロップレットが収縮し，ある径になると一次元配向しロッド状になる．Chl-4Py の濃度によって一次元ロッドの形態が変わる．

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図 5 Chl-4Py と DCE で形成されるベシクルの加熱処理よる形状変化（クライオ TEM 写真）[5]a）濃度 12.5mM の Chl-4Py で出来たドロップレットで熱処
理 な し， 球 状 で あ る．b）a） の 拡 大 図．c） 濃 度 2.5mM のChl-4Py で出来たドロップレットを熱処理してできたロッド，45nm 長，20nm 径．右上の挿入は拡大図．d）濃度 7.5mM，60nm 長，25nm 径．e）濃度 12.5mM，200nm 長，45nm 径．
f）e）の拡大図．

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３．３ 支援例 3：2 種の界面活性剤の混合比で多様な形態の自己組織化集合体の生成を観察
奈良工業高等専門学校 林講師と協力研究で支援した

４．おわりに：藤田 咲子氏の活躍と今後の抱負ものである．林氏らは，図 6 に示す両親媒性の界面活性

藤田氏は大阪大学大学院理学研究科を終了後，1 年間の剤 Span20 と Tween20，Span40 と Tween40 が， そ の民間企業勤務を経て NAIST の技術職員として入職し，以混合比を変えることによって球状ミセル，球状ベシクル，来クライオ TEM 法を担当し 6 年目である．先輩の指導やチューブ状ベシクル，レンズ形ベシクル，多面ベシクル等，自身の創意工夫により高度で豊富な技術・ノウハウを身多様な自己組織化構造体を形成することを見いだした（図につけている．平成 24 ～ 26 年の 3 年間に 35 件の支援

7，各写真の右下は集合体の立体模式図を示す）[6]．これ（協力研究 28 件，技術代行 5 件，非公開支援 2 件）を行

ら自己組織化構造体の形成方法および物理化学的性質のい，内 179 サンプルがクライオ TEM 観察である．また，

データベース化は，テーラメードドラッグキャリヤーの超分子化学の教科書 Supramolecular Chemistry の電子顕ような将来のバイオマテリアルのデザインに役立つと期微鏡項の執筆に協力している [7]．さらに学生研修「リポ待されている．

ソームの作製とクライオ TEM 実習」の実習手引書を作成

本支援はサンプルの数が多くかつ短時間で処理する必しかつ実習主担当を勤め，また医薬・生体材料 イメージ要があったため大変であったことが思い出されるとのこ

ングセミナー「クライオ TEM の基礎と観察事例」の実習とであった．

主担当を勤めるなどを通して，クライオ TEM 技術を他機

図6

図7

Span 系，Tween 系界面活性剤の分子構造 [6]Span 系，Tween 系界面活性剤の混合比による自己組織化集合体の形状制御 [6]NanotechJapan Bulletin Vol. 9, No. 3, 2016

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関に伝承，後進の指導に貢献している．

分子・物質合成プラットフォーム 奈良先端科学技術

藤田氏は，「難しい測定依頼内容で申し訳ないと言う研

大学院大学：http://mswebs.naist.jp/nanopla/

究者もいますが，それがかえって勉強になるのでありが[4] Ryoko M. Uda, Eri Hiraishi, Ryo Ohnishi, Yoshio

たく，また測定結果がユーザの研究推進に役だったこと

Nakahara, and Keiichi Kimura, "Morphologicalに充足感を覚えます」，「今後は，例えば今年度から稼働

Changes in Vesicles and Release of an Encapsulated

した Cryo-Tomography システムを使いこなすなどして，Compound Triggered by a Photoresponsive Malachiteより高度な測定でお役に立てることを楽しみにしている」

Green Leuconitrile Derivative", Langmuir 2010,とユーザに対し無理難題を言ってほしい，そしてそれによりより専門的な要求に応えられるよう技術ノウハウをさらに修得したいとの抱負を述べられた．

26(8), pp.5444-5450[5] Munenori Numata, Daiki Kinoshita, Nobuko
Taniguchi, Hitoshi Tamiaki, and Akio Ohta,"Self-

そしてこれまで同様，ユーザが希望するときはユーザ

Assembly of Amphiphilic Molecules in Droplet

立ち合いのもとで測定し，サンプル全体の状況を把握しCompartments: An Approach Toward Discreteてもらいながら細かい測定希望に添えるようにし，さらSubmicrometer-Sized One-Dimensional Structures",に必要に応じて像解釈の基本的な内容を伝え，ユーザのAngew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, pp.1844 -1848

判断の手助けを行っていくとのことである．このような[6] Keita Hayashi, Hidek Iwai, Toshinori Shimanouchi,

ユーザ満足度・信頼度の高い支援を通し，ますます高度

Hiroshi Umakoshi,Tomoyuki Iwasaki, Ayako Kato,な技術・ノウハウを身につけ，イノベーション創出に寄

Hidemi Nakamura, "Formation of lens-like vesicles

与されることを期待する．

induced via microphase separations on a sorbitanmonoester membrane with different headgroups",
Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 135 (2015),
pp.235-242

参考文献[7] Jun-ichi Kikuchi, Kazuma Yasuhara, Supramolecular[1] 文部科学省「ナノテクノロジープラットフォーム事

Chemistry: From Molecules to Nanomaterials 2(2012), pp.633-645

業」：http://nanonet.mext.go.jp/about/[2] 技術スタッフ表彰：http://nanonet.mext.go.jp/award/※本文中の図は NAIST 藤田氏，戸所氏より提供されたもhttp://nanonet.mext.go.jp/research_support_award/のである．

H27_Award_4.pdf[3] 文部科学省「ナノテクノロジープラットフォーム」

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文部科学省ﾅﾉﾃｸﾉﾛｼﾞｰﾌﾟﾗｯﾄﾌｫｰﾑ（真辺 俊勝）

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