羊水中の16S rDNAコピー数測定による子宮内感染状態の評価法

福岡大学 福岡大学病院
講師 漆山 大知

産婦人科

2022年12月8日
1

新技術説明会
COI開示
発表者

漆山大知

本発表に関連し、筆頭発表者ならびに筆頭発表者の配偶者、一親等の親族及び生計を共にする者に、開示すべき利益相反（ＣＯＩ）関係にある企業などはありません。
2

早産と子宮内感染と子宮内炎症
炎症

早産
前期破水

感染
Romero R, et al. Science. 2014 reviewより，一部改変

感染

炎症

胎児感染
Fetal infection

胎児炎症
FIRS

羊膜内（羊水）感染
Intra-amniotic infection

羊膜内炎症
Intra-amniotic inflammation

子宮内感染
Intrauterine infection

子宮内炎症・絨毛膜羊膜炎
Intrauterine inflammation＜子宮内感染・炎症と関連する新生児疾患＞•••••

胎児炎症反応症候群
新生児髄膜炎新生児慢性肺疾患
脳室周囲白質軟化症
脳性麻痺など•子宮内感染は前期破水・早産など、妊娠経過に重大な影響を及ぼす
妊娠中の診断は困難 （羊水培養検査と臨床的CAMは低感度）
診断・治療の遅れは児に重大な影響を及ぼすため、的確な診断が求められる•
細菌性腟症
Bacteria vaginosis

細菌性腟炎Bacterial vaginitis

Urushiyama D et al. J Infect Dis Ther 2022 review (in Press)より, 一部改変

•

中枢神経系
呼吸器系

3

子宮内で検出される細菌•

週数の早い早産例ほど、羊水中の細菌検出率は高い[培養法：28w未満は20-60%、28-32wは10-25%]• 正常胎盤や胎便も無菌とは限らない• 正期産の5%で羊水からウレアプラズマが検出された

表. 主な4つの羊水研究報告から算出した羊水中の細菌検出率
文献
対象
培養法またはc16S解析法で検出した割合
培養法で検出した割合
c16S解析法で検出した割合培養法でのみ検出した割合
c16S解析法でのみ検出した割合

Combsら2014
早産 (305)
10% (31)
8% (25)9% (26)
2% (5)
2% (6)

DiGiulioら
2010
前期破水 (204)
50% (101)
34% (70)
45% (92)
4% (9)
15% (31)

Hanら
2009
早産・前期破水 (46)46% (21)35% (16)
46% (21)0% (0)
11% (5)

DiGiulioら2008
早産 (113)22% (25)
14% (16)
17% (19)
5% (6)
8% (9)

c16S解析：クローニング法を用いた16S rRNA遺伝子解析、括弧内は症例数＜既報告のまとめ＞• 検出率は未破水で10-22 %、破水例で50 %程度• 属レベルで40種類に及ぶ多彩な菌種が検出• 検出法の違いによる不一致が2-15 %• 正期産時の正常羊水も無菌とは限らない

既報告は、いずれも特有のバイアスがあり、定性的網羅的かつ定量的解析が必要
4羊水中の細菌由来DNAを網羅的かつ定量的に調べて絨毛膜羊膜炎を診断する方法（先行研究）

漆山大知1,2, 須田亙3, 大西英理子1, 清島千尋2,倉員正光2, 讃井絢子2, 四元房典2, 鍋島一樹2,安永晋一郎2, 齋藤滋4, 野見山亮5, 服部正平3,6,
宮本新吾2, 秦健一郎11)
2)
3)
4)
5)
6)

国立成育医療研究センター研究所
福岡大学
東京大学
富山大学
国立病院機構佐賀病院
早稲田大学
5

目的
1. 羊水の網羅的かつ定量的な細菌組成解析を行い、絨毛膜羊膜炎例の羊水中の細菌組成を同定すること
2. 羊水の細菌組成で絨毛膜羊膜炎を診断可能か検証すること
感染炎症

胎児感染
Fetal infection

胎児炎症
FIRS

羊膜内（羊水）感染
Intra-amniotic infection羊膜内炎症
Intra-amniotic inflammation

子宮内感染
Intrauterine infection

子宮内炎症・絨毛膜羊膜炎
Intrauterine inflammation

細菌性腟症
Bacteria vaginosis

細菌性腟炎Bacterial vaginitis

先行研究

Urushiyama D et al. J Infect Dis Ther 2022 review (in Press)より, 一部改変

6対象
• 福岡大学と佐賀病院の79症例（羊水検査と胎盤病理）• 絨毛膜羊膜炎の重症度分類（Blanc分類）で3群に分けた• コントロール羊水として妊娠初期の羊水、実験ネガティブコントロールとして精製水を置いた•

統計学的検定では、連続変数にはMann-WhitneyのU検定、質的変数にはFisherの正確検定、細菌組成の群間比較にはPERMANOVAを用い、P値（両側正確有意確率）<0.05を有意差ありとした

各群の数と胎盤の組織学的分類

羊水腔（胎児側）

グループ名

定義（Blanc分類）

試料数Stage III

絨毛膜羊膜炎(Stage III)

32

Stage II

絨毛膜炎(Stage II)

27

Stage 0-I

絨毛膜下炎(Stage I)
炎症細胞浸潤なし

20

Normal AF

正常妊娠の羊水（16.1±0.6週）

18

Blank

実験で使う精製水

24

羊膜

絨毛膜

炎症性細胞の浸潤
Blanc WA. Williams & Wilkins. 1981より引用改変7

細菌組成解析法
無菌的に羊水を採取（羊水検査の残余・帝王切開時）
24時間以内に急速冷凍、-80℃で凍結保存
溶菌（ビーズ破砕法）：羊水試料1 mLを溶菌DNA抽出：QIAamp® UCP Pathogen mini Kitで無菌的にDNA抽出

NGSのライブラリー作製•

Illumina社推奨プロトコールに従って16S rRNA遺伝子のV1V2領域をターゲットとした

Droplet Digital PCRTMによる絶対定量• 16S解析と同じプライマーを使用、EvaGreen法• 付属のソフトで解析

Fastqファイルのマージ
クオリティチェック
プライマー配列の除去
ランダムに1300リードを選出
16S rRNA遺伝子解析（網羅的・半定量的）※NGS：次世代シークエンサー

服部正平，実験医学Vol.32 (2014) より引用

8

各試料中の細菌量16S rRNA遺伝子のユニバーサルプライマーを使ってデジタルPCRで、各試料1 mL中の16S rDNAコピー数を絶対定量した【方法】***P <0.001**P <0.01*P <0.05

Urushiyama D, et al. Sci Rep、2017より引用【結果】• Stage III群とStage II群はStage 0-I/Normal AF/Blank群より有意に高く、Normal AF群はBlankよりも有意に高かった【考察】• 胎盤の炎症と羊水中細菌量は相関する
9

“miCAM”（microbiomic chorioamnionitis）

右の11菌種のいずれかが組成の最上位だった場合を「miCAM」と定義した
グループ名
Stage III
Stage II
Stage 0-I
Normal AFBlank

miCAM(n=40)
308200Non-miCAM(n=39)
219182833

これまでの羊水検査との比較

Ureaplasma parvum
Streptococcus agalactiae
Gardnerella vaginalis
Streptococcus anginosus
Sneathia sanguinegens
Eikenella corrodens
Prevotella bivia
Lactobacillus jensenii
Bacteroides fragilis
Porphyromonas endodontalis
Mycoplasma hominis

CAM (Stage III) の診断精度

感度： 94% (30/32)： 79% (37/47)

感度

特異度

特異度

白血球数

57 %

78 %

糖57 %

74 %

陽性的中率 ： 75% (30/40)

IL-6

81 %

75 %

Romero R, et al. AJOG 1993;169(4):839–51.

陰性的中率 ： 95% (37/39)
Urushiyama D, et al. Sci Rep、2017より引用改変

分娩前に高い精度で子宮内感染を診断できる可能性が示された
10

先行研究のまとめ
【総括】

••
•

羊水で網羅的かつ定量的な細菌組成解析を行った
絨毛膜羊膜炎（Stage III）による早産の多くは複合感染である可能性が示
された
羊水の細菌組成解析によって高い精度で絨毛膜羊膜炎（Stage III）を予測できる可能性が示され、母子の不良なアウトカムとも相関した【結論】•子宮内感染による早産例の羊水細菌組成を網羅的・定量的に同定し、分娩前に高い精度で絨毛膜羊膜炎を診断できる可能性が示された

11

目的

【先行研究の問題点】• 羊膜内（羊水）感染の評価法がない• 臨床の現場では迅速な診断が求められる• 羊膜内（羊水）感染と妊娠転帰との関連が不明であり、妊娠終結に関するエビデンスがない【目的】• 羊膜内（羊水）感染と妊娠転機との関連を明らかにすること• 臨床の現場で有用な羊膜内（羊水）感染の評価法を提唱すること

12対象
妊娠24週以降34週未満に切迫早産で入院管理中に、子宮内感染を疑って羊水穿刺を行い、胎盤・臍帯の組織学的検索を行った69症例を対象とした。
••

先行研究より79例（ネガコン32検体）のデータあり
その後、57例追加データあり

136例
子宮内感染疑いの羊水穿刺でない：25例（羊水除去術、染色体検査、分娩時採取など）
105例
羊水穿刺時に妊娠24〜34週でない：36例
69例
Table 1. 対象の内訳
Total(69例)
31未破水（43例）
16破水（26例）
15Stage 2（絨毛膜炎）

25196Stage 1（絨毛膜下炎）

853

Stage 0 (炎症所見なし）

532

CAM（Blanc分類）
Stage 3（絨毛膜羊膜炎）

Blanc WA. Williams & Wilkins. 1981より引用改変

13羊水中細菌定量解析の方法
無菌的に羊水を採取（生化学検査や培養検査に提出）

検体採取から判定まで4-5時間

1mLの羊水試料を実験室へ移動（氷冷）

低速遠心分離：大きな細胞や胎脂を除去
溶菌（ビーズ破砕法）：羊水試料1mlを溶菌DNA抽出：QIAamp® UCP Pathogenmini Kitで無菌的にDNA抽出50μLで抽出する

DNA試料を段階希釈する（原液、20倍、400倍、8000倍など）
DNA抽出時とdPCR実験時にネガティブコントロールを置く（ネガティブコントロール：DNA抽出溶液）
複数回計測すみのDNA試料をポジティブコントロールとする

Droplet Digital PCRTMによる絶対定量：16S解析と同じプライマーを使用，EvaGreen法：付属のソフトで解析1μLをインプットしドロップ
レット作製時に22μLに希釈す
る
測定結果を1100倍(22x50倍)すると羊水1mLあたりのコピー数を算出できる

服部正平，実験医学Vol.32 (2014) より引用改変

14

各試料中の細菌量***P <0.001**P <0.01*P <0.05

Urushiyama D, et al. Sci Rep、2017より引用改変【結果】• Stage III群とStage II群はStage 0-I/Normal AF/Blank群より有意に高く
Normal AF群はBlankよりも有意に高かった【考察】• 先行研究の結果と矛盾なし
15

出生直後の新生児で抗菌薬投与された症例••

Copy numbers of 16S rDNA (/mL)*

Copy numbers of 16S rDNA (/mL)

*

*

*

Copy numbers of 16S rDNA (/mL)

Copy numbers of 16S rDNA (/mL)

出生直後の新生児の白血球数が2万 /μL以上
Copy numbers of 16S rDNA (/mL)

24時間以内の分娩*

Copy numbers of 16S rDNA (/mL)

妊娠転帰と羊水中16S rDNAコピー数の関連*

48時間以内の分娩

出生直後の新生児のCRP値が0.1 mg/dL以上

臍帯炎と組織学的に診断された症例【結果】いずれの項目でも有意差あり【考察】

羊水中16S rDNAコピー数は妊娠転帰と関連する
16各試料中の細菌量に基づくGrading

Grade 3
Grade 2
Grade 1

Grade 0

CAMの程度(Blanc分類）

デジタルPCRで16S-rDNAコピー数を定量しGradingする

羊水感染の程度を診断
17

16S rDNAコピー数に基づくGradingと転機の関連
CAM (Stage III)CAM (Stage > II)
Termination < 24hTermination < 48hnWBC > 20000 /μL
nCRP > 0.1 mg/dL
Antibiotics for newborn
Funisitis

CAM (Stage III)CAM (Stage > II)
Termination < 24hTermination < 48hnWBC > 20000 /μL
nCRP > 0.1 mg/dL
Antibiotics for newborn
Funisitis••••Grade3(N=30)

Grade1-2(N=22)

Grade0(N=17)

ajusted P-value
G3 vs G1-2

ajusted P-value
G3 vs G0

ajusted P-value
G1-2 vs G0

25 (83%)29 (97%)21 (70%)25 (83%)
10/25 (40%)
16/25 (64%)
17/18 (94%)
24 (80%)6 (27%)
17 (77%)14 (64%)19 (86%)
6/19 (32%)
9/19 (47%)
10/15 (67%)
10 (45%)0 (0%)
10 (59%)3 (18%)
6 (35%)
1 (6%)
1/16 (6%)
7 (41%)
1 (6%)<0.001
0.108
0.767
1.000
0.753
0.361
0.105
0.017

<0.001
0.006
0.003
0.003
0.048
<0.001
0.003<0.001

0.027
0.299
0.012
0.003
0.138
0.015
0.178
0.017

P-value

Grade2(N=12)

Grade1(N=10)

G2 vs G1

5 (42%)
10 (83%)7 (58%)
10 (83%)
4/10 (40%)
5/10 (50%)
7/8 (88%)
7 (58%)

1 (10%)
7 (70%)
7 (70%)
9 (90%)
2/9 (22%)
4/9 (44%)
3/7 (43%)
3 (30%)

0.162
0.624
0.675
1.000
0.628
1.000
0.119
0.231

Funisitis（臍帯炎）は胎児感染を示唆する病理学的所見
G2 vs G1はNが少ない
Adjusted P-value were calculated using
Fisher's exact test and the BenjaminHochberg procedure.

Grade3は高い確率で、短期間で分娩となり、重度の絨毛膜羊膜炎や臍帯炎をきたしていた
Grade1は高い確率で、重度の絨毛膜羊膜炎を来した症例はなく、臍帯炎例も6%と低かった
Grade 1-2は高い確率で48時間以内に分娩となり、臍帯炎例は約半数
Grade 1よりもGrade 2の方が、重度の絨毛膜羊膜炎の頻度は32%, 臍帯炎の頻度は24%上昇したが有意差なし

デジタルPCRで16S-rDNAコピー数を定量しGradingする

羊水感染の程度を診断

胎児感染のリスクを評価
18

まとめ

• ドロップレットデジタルPCRを用いて、羊水中細菌定量解析を行った• 羊水中の細菌量（16S rDNAコピー数）が多いほど、絨毛膜羊膜炎や臍帯炎や胎児の炎症所見が見られる頻度が上昇した• 特に、Grade 3の羊水感染は、妊娠延長の見込みが非常に乏しく、高頻度で胎児感染を来たしているため、早期の妊娠終結が望ましい状態と考えられた

19

絨毛膜羊膜炎治療の課題と我々の研究成果（１） 原因菌に対する抗菌薬は何がよいか？
羊水感染例の細菌組成解析で起炎菌の同定に成功、理想的な抗菌薬を同定
特許出願済、漆山ら Sci Rep 2017（２） 治療効果はどのように判定すべきか？妊娠終結の基準は？
羊水中16S rDNAコピー数解析で羊水感染状態の評価に成功（本開発）
特許出願済、論文投稿準備中（３） 予防的治療の対象例はどう選別すべきか？
次世代シークエンサーを用いた腟細菌叢解析でハイリスク症例の選別に成功
特許出願済、海外出願中、漆山ら Sci Rep 2021

（４） 炎症を抑える治療薬は何がよいか？

治療薬の候補あり（非公開）

絨毛膜羊膜炎発症ハイリスク切迫早産症例を対象とした治療的抗菌剤投与による第Ⅱ相臨床研究（臨床研究責任医師：福岡大学産婦人科 宮本 新吾）
20

絨毛膜羊膜炎発症ハイリスク切迫早産症例を対象とした
特定臨床研究：絨毛膜羊膜炎を伴う切迫早産への抗菌剤投与
治療的抗菌剤投与による第II 相臨床研究（臨床研究責任医師：福岡大学産婦人科 宮本 新吾）

選択基準1.
2.
3.
4.
5.

6.

妊娠34週未満の切迫早産例
前期破水の所見なし
主要臓器障害なし（血液検査）
年齢18歳以上
腟細菌叢解析で陽性（PCAMスコアもしくはmodified PCAMスコア）と診断
羊 水 16S rDNA コ ピ ー 数 が 106
copies/mL未満

福岡大学病院

三重大学
附属病院

臨床dataと自己学習機能を搭載したmodified PCAMス
コアで判定

岩手医科大学附属病院

昭和大学
江東豊洲病院

切迫早産例

福岡大学医学部産婦人科

腟細菌叢解析

国立成育医療研究センター
周産期病態研究部

陽性（24例）

陰性

除外基準
1.
2.
3.
4.

体温38度以上
HR 120/分かつWBC 20000/μL以上
臨床的絨毛膜羊膜炎（Lenckiらの基準）
重篤な合併症（コントロール不良の精神疾患・DM・感染症・悪性腫瘍・妊娠高血圧腎症など）
5.
AZMやMEPMに薬剤過敏性の既往
6.
NGSやdPCRが稼働しなかった場合
7.
研究責任者や分担者が不適当と判断した
場合
羊水検査結果が報告される前に娩出された症例は、登録から除外する。

主要評価項目
2回目の羊水中16S rDNA量

羊水中16S rDNA定量（１回目）
割り付け因子＃ 妊娠週数福岡大学医学部公衆衛生学（割付センター）

羊水16S rDNAコピー数が106
copies/mL以上となれば中止し、妊娠終結を検討する
AZM内服抗菌剤投与（12例）

MEPM点滴+AZM内服抗菌剤投与（12例）

羊水中16S rDNA定量（2回目）

羊水16S rDNAコピー数が106
copies/mL以上となれば中止し、妊娠終結を検討する

2022年1月に臨床研究審査委員会の承認を受け、jRCT登録済（jRCTs071210114）、2022年4月より登録開始

21

CAM特定臨床研究の進捗状況（2022年9月10日時点）
CAM特定臨床研究の進捗状況＜研究期間＞
福岡大：2022年4月から５ヶ月間
昭和大江東豊洲：2022年8月から１ヶ月間

選択除外基準を満たす症例 21例（福大 19例、豊洲 2例）
同意 12例（福大 11例、豊洲 1例）
陰性 7例（福大 6例、豊洲 1例）
正期産（37週） 1例
早産（28週） １例
未分娩
4例
離脱１例

MEPM＋AZM群
完了

1例

正期産（37週） 1例

非同意 9例（福大 8例、豊洲 1例）

陽性 5例（以下、福大のみ）
登録

5例 ＜目標2４例＞

2例 ＜目標12例＞
離脱

11/5時点11例
達成率4-5割

1例

正期産（37週） 1例

AZM群
完了

3例 ＜目標12例＞

2例

正期産（37週） 1例
早産（34週） １例

離脱

1例

早産（36週）１例

22今後の展望
胎児感染例の減少
母子の予後向上迅速NGSの活用
適切な抗菌薬投与
適切なモニタリングなど

管理法の改善治療法の開発羊水・腟内

細菌叢を迅速かつ網羅的定量的に同定可能となった！

医療費削減
社会保障費削減
産後の社会復帰率向上
妊娠への安心感向上
出生数増加

予防法の開発A.I.

感染性早産の減少（特に早い時期）

適切な抗菌薬投与
プロ/プレバイオティクス
洗浄・細菌叢移植など

安価で迅速にNGS解析可23従来技術とその問題点
既に実用化されている子宮内感染の検出法としては、
グラム染色法、羊水細菌培養検査等があるが、• 難培養菌（特にマイコプラズマ・ウレアプラズマなど）は検出困難• 定量性がなく感染の程度が不明• 検査の実施が予後の改善にはつながらない等の課題があり、広く利用されるまでには至っていない。

24

新技術の特徴・従来技術との比較• 本技術の開発によって、従来技術の課題であった低感度・定量性の欠如の解決、迅速性の向上に成功した。
• 一般診療で現在の羊水検査を行う施設は少ないが、本技術は検出感度と迅速性が高く、定量性に基づく評価法であるため、一般臨床での実用が可能となった。
• 本技術の適用により、羊膜内（羊水）感染を定量的に評価でき、早産に関連する予後を改善しうるため、早産関連コスト（主に新生児治療と社会保障費）を大幅に削減できることが期待される。

25

想定される用途• 本技術を産科の一般診療（主に周産期センター）に適用することで周産期医療レベルの向上・医療費削減・医療ミス削減できるメリットは大きい。
• 上記以外に、新生児予後改善や出生数の増加、女性が望めば産後早期の社会復帰も期待される。
• また、達成された細菌量を定量化するという点に着目す
ると、敗血症や肺炎といった他の感染症に展開することも可能と思われる。

26

実用化に向けた課題• 現在、一般診療での実施が可能なところまで開発済みであり、実際に特定臨床研究（前向き介入研究）を実施している。しかし、子宮内感染症の治療法と予防法の開発は未解決である。
• 本技術を一般臨床に適用する場合の薬事上の条件設定が必要である。そのために、引き続き特定臨床研究や後方視的症例対照研究などでエビデンスを創出する。
• 実用化に向けて、本技術の臨床的意義をさらに明らかにする必要がある。そのために、症例数を増やし、Gradingのカットオフ値の再検討を重ね、本技術の精度の向上を図る。
27

企業への期待• 前述の未解決課題は、特定臨床研究の完遂とその後の研究により克服できると考えている。
• 臨床検査技術を持つ企業との共同研究を希望している。
• 細菌量定量技術を開発中の企業、医療や環境衛生分野に展開している企業には、本技術の導入を検討していただきたい。

28

本技術に関する知的財産権• 発明の名称：胎児感染の検出方法• 出 願 番 号 ：特願2022-054362• 出 願 人：学校法人福岡大学、国立研究開発法人国立成育医療研究センター• 発 明 者

：宮本新吾、漆山大知、秦健一郎

29

お問い合わせ先
福岡大学

研究推進部

ＴＥＬ

092-871-6631

ＦＡＸ092-866-2308

産学官連携センターe-mail sanchi@adm.fukuoka-u.ac.jp30