西南女学院大学紀要 Vol.21, 2017

原著

糠床への浸漬による野菜に付着する微生物叢の変化
古田吉史

田中貴絵

＜要旨＞

甲斐達男

米糠を自然発酵させて調製する糠床に、種々の野菜を漬け込んで造る糠漬けは日本の伝統的発酵食品の一つである。糠床の微生物叢に関する研究は多いものの、糠漬け野菜の微生物叢とその変化についてはほとんど報告されていない。本研究では、85 年以上経過した熟成糠床３種と新たに調製した糠床１種にナスとキュウリを漬け込み、それら野菜に付着する微生物叢の変化を調べた。まず糠床中の微生物叢を調べたところ、今回使用した４種の糠床間で乳酸菌数と酵母数、その割合に大きな違いが見られた。浸漬野菜（糠床に 18 時間浸漬後、水洗いした野菜）に関しては、コントロール（水洗いした野菜）と比べて、何れの糠床に浸漬した場合でも、一般細菌数は著しく減少し、乳酸菌・酵母数は増大した。付着した乳酸菌・酵母数は全体的にキュウリと比べてナスの方が多く、また糠床自体の乳酸菌・酵母数が多いほど付着菌数も多いと思われた。糠床中の乳酸菌数を高く維持すること等により、糠漬け野菜のプロバイオティクスとしての利用が今後期待される。
キーワード：糠床、糠漬け、微生物叢、乳酸菌、プロバイオティクス

Ⅰ．諸 言

山・園元らを中心とする九州大学のグループが次世代米糠を自然発酵させて調製した「糠床」に、種々の型シーケンサーを用いた遺伝子解析により、糠床中に野菜を漬け込むことで作製する「糠漬け」は我が国特生息する乳酸菌の菌種レベルでの網羅的な解析を行っ有の伝統的発酵食品の一つであり、その独特の香味はている

８-10）

。

他の漬物には見られない複雑さがある。糠床は、通常、しかしならが、これまでの研究の多くは糠床そのも米糠に塩と水を混ぜ、食用としない所謂“捨て野菜”のに関するものであり、浸漬した野菜に着目した研究、を漬け込み、撹拌（床返し）を行うことで調製されるが、特にその微生物学的調査については行われていない。

熟成した香味を形成するためには数ヵ月間を要するこ

通常、糠床に浸漬した野菜を食するには、糠床の風味

１）とが知られている 。また、熟成を繰り返せば繰り返があまり落ちない程度に軽く水洗いをした後に食する

すほどに風味に深みが加わっていくため、福岡県を中場合が多いが、その際に糠床から付着した微生物が浸心とする九州北部には、数十年さらには小倉城城主小漬野菜に残存していることが予想される。野菜に残存笠原忠真公の時代から引き継がれる糠床に代表されるする菌数、特に有用菌として一般的である乳酸菌数等ような数百年という熟成期間を経た究極とも呼べる糠が多ければ、乳製品等に代表されるプロバイオティク床も多く存在する。

スとしての機能も将来的には期待される。そこで本研糠床に関する研究としては、これまでに今井らが糠

究では、熟成糠床への浸漬による野菜に付着する微生床中の菌叢の推移と糠床成分およびフレーバー成分変物叢（一般細菌、酵母、乳酸菌）と微生物数の変化に１-３）化との関連性について、並びに酵母フローラの消ついて検討を行った。

４）

長について 、支倉らが糠床中のビタミン B 群の増加や風味向上を目的としたタンパク質分解酵素の添加効
５-７）

果等について報告している。さらに近年では、中西南女学院大学保健福祉学部栄養学科– 145 –

糠漬け野菜の微生物叢の変化

Ⅱ．方 法

13

さらに滅菌した生理食塩水で 10 ～ 10 倍希釈したものを微生物検査用のサンプル希釈液として用いた。

１．使用糠床

また、糠床中に生息する微生物を検出するために、熟成糠床として、少なくとも 85 年以上経過していA ～ D の各糠床 10g を試料としてストマッカー袋にるとされる北九州市内で市販されている A 糠床と B

封入後、上記と同様に９倍量の滅菌した生理食塩水を糠床、百年以上経過していると思われる築上郡の民家加えてストマッカーにかけ、得られた溶液を 10 ～ 10より貰い受けた C 糠床、および新鮮な米糠から新たに倍に希釈したものをサンプル希釈液として用いた。

作製した D 糠床の４種を用いた。新たに作製した糠床２）使用培地および培養方法

15

一般細菌測定用として日水製薬株式会社製の標準寒の調製法を以下に記した。

天培地を、酵母測定用に 0.01% クロラムフェニコール
２．糠床の調製を添加した YPD 寒天培地（１% 酵母エキス、２% ポ無農薬の生糠：１kg、粗塩：200g、ミネラルウォー

リペプトン、１% グルコース、1.5% 寒天）を、乳酸菌

ター：1.2L、山椒：50g、昆布：５g、赤唐辛子：５～

測定用に１% 炭酸カルシウムと 0.005% シクロヘキシ６本を４L 容のプラスチックバケツ（蓋付）に入れ十ミドおよび 0.001% アジ化ナトリウムを添加した MRS分に混合した。その後、２週間までは毎日１回撹拌（床寒天培地（BD 社製）を使用した。ストマッカー後の返し）を行いつつ、カブの葉、キャベツ、ナス、キュ各サンプル希釈液をそれぞれの培地に 100μl 塗布し、ウリ、ニンジン、ハクサイ、サツマイモ等の野菜を「捨一般細菌については 35℃で 48 時間、酵母についてはて野菜」として漬け込み、それを２日毎に取り換えた。

25℃で 72 時間、乳酸菌については 30℃で 72 時間培

２週間後から３ヶ月までは、１週間に１回捨て野菜を養を行った後に形成されたコロニー数をカウントし、漬け込み（漬け込み時間は上記と同じく２日）、２日各試料１g 当たりの生菌数を算出した。に１回のペースで撹拌を行いながら 25℃の部屋で糠床
４．糠床の理化学検査を熟成させた。

１）水分量
３．微生物検査

各糠床約５g を 105℃で６時間常圧乾燥し、水分量

本実験は同一条件で４回（野菜の微生物検査については野菜のせん断・浸漬からストマッカー、微生物数を測定した。
２）pH および酸度（乳酸として）測定に至るまでの操作を別々に４回、糠床の微生物検各糠床約５g を 95ml の蒸留水に混和後、pH を測査については糠床の採取からストマッカー、微生物数定した。その後、0.1 N の水酸化ナトリウムで pH 8.3

測定に至るまでの操作を別々に４回）実施し、平均値になるまで中和し、その滴定量から酸度を算出した。
酸度 %（w/ w）＝滴定量（ml）× 0.9 / 糠重量（g）を算出した。

３）塩分濃度

１）野菜の浸漬およびサンプル調製
野菜への微生物のコンタミに十分配慮しつつ消毒した包丁でナスおよびキュウリの中央部を輪切りにして作製した 10g の野菜切片（皮つき）を、A ～ D の各糠床中に含まれるナトリウム量を原子吸光光度法により求め、食塩相当量に換算した。
食塩相当量＝ナトリウム量（g）× 2.54

熟成糠床それぞれに約 18 時間浸漬した。滅菌したピンセットで糠床から浸漬野菜を取り出し、野菜表面に付着した糠が肉眼で見えなくなる程度に水道水でⅢ．結 果

水洗いした後（実際の食形態に近い状態）、ストマッカー袋に無菌的に封入した。また、コントロールとし１．各糠床の理化学検査および微生物検査の結果て、糠床に浸漬していない 10g のナスおよびキュウ

各糠床の理化学的性質および微生物検査の結果をまリについても同様に水洗いした後にストマッカー袋にとめたものを表１に、微生物検査の具体例として A 糠無菌的に封入した。その後、滅菌した９倍量の生理食

床のプレート写真（サンプル 10 倍希釈液）を図１に塩水をストマッカー袋に加え、120 秒間ストマッカー示した。また、表１には各糠床の官能的な評価についⓇ3（BagMixer , interscience 社製）にかけてホモジナては記載していないが、各糠床を入れたプラスチックイズした。得られた溶液（サンプル原液）と、これを容器の蓋を開けた瞬間に糠床表層から 10cm 程度に鼻– 146 –糠漬け野菜の微生物叢の変化を近づけて立ち上ってくる香りを嗅いだところ、A と上に酵母および乳酸菌に由来すると思われる（コロD 糠床は酸味が少なくマイルドな風味を、B 糠床は柑ニーと呼べない程度の）微小で非常に色の薄いコロ

橘系の酸味を、C 糠床は非常に酸味が強くスパイシーニーらしきものが多数見られた。

な風味を有していた。

一方、各糠床の酵母数と乳酸菌数および両者の比率

まず理化学的性質について、水分量と pH に関してには大きな違いが見られた。A 糠床には酵母もある程は、水分量：59.2 ～ 63.1%、pH：4.2 ～ 4.8 と糠床間度存在するものの乳酸菌数が 2.2 × 10 cfu/g と非常で大きな違いは見られなかったが、酸度と塩分に関しに多かった。B 糠床では酵母と乳酸菌数が共に約５×ては、酸度：4.0 ～ 5.6%、塩分：4.4 ～ 6.5% と比較的10 cfu/g で同程度であった。C 糠床については、酵母大きな差が見られた。

はほとんど存在せず乳酸菌が約 10 cfu/g 存在した。熟867１）

次に、微生物検査の結果については、今井らの報告

成期間の短い D 糠床については、逆に乳酸菌に比べてにもあるように、何れの糠床も主要微生物は乳酸菌お酵母数の方が多かった（100 倍程度）。また、今回使用よび酵母で、後述する図２に示すような明瞭な一般細した４種の糠床の中で、乳酸菌と酵母を合わせた生菌菌はほとんど検出されなかった。但し、図１のプレー数が最も多い A 糠床については、他の糠床と比べて水ト写真上では確認できないが、一般細菌用のプレート分量が高く、酸度が低い傾向にあった。

表１．各糠床の理化学的性質と微生物数の比較＊

各微生物数は 4 回の実験の平均値
colony forming unit
1＊＊＊
最低希釈倍率（10 ）のサンプル希釈液で顕著なコロニーが検出されなかったことを示す＊＊≪ 一般細菌 ≫≪ 酵母 ≫≪ 乳酸菌 ≫3

図１．A 糠床の微生物検査プレート写真（サンプル 10 倍希釈液）＊

乳酸菌測定用培地には炭酸カルシウムが含まれているため、乳酸菌が生育すると生成された酸により炭酸カルシウムが溶けてコロニーの周囲にクリアゾーンが形成される– 147 –＊

糠漬け野菜の微生物叢の変化

２．糠床への浸漬によるナスおよびキュウリに付着する微生物数の変化

3

10 cfu/g レベル若しくはそれ以下となり、糠床への浸漬により一般細菌数は 1/1000 程度に減少した。一方、各糠床へ浸漬した際の微生物数の変化について、表一般細菌数がそれほど多くないナスについては、コン

２にナスの結果を、表３にキュウリの結果を示した。

トロールの一般細菌数が 10 cfu/g レベルであったもの

それぞれの表中のコントロールは、ナスおよびキュウが、浸漬後水洗いした状態では 10 cfu/g レベル若しく

リを糠床へ浸漬せずに水洗いした場合に検出される微はそれ以下となり、1/100 程度に減少した。

42

生物数を示している。また図２に、微生物検査結果の次に、酵母および乳酸菌に関しては、ナスとキュウ

具体例として、ナスのコントロールのプレート写真とリどちらの場合も、（元々酵母数が少ない C 糠床浸漬A 糠床への浸漬後のプレート写真を比較して示した。

後の酵母数を除き）各糠床に 18 時間浸漬することで、まず特筆すべきは、一般細菌数の変化である。先のそれぞれの菌数はコントロールと比べて顕著に増大し11）にもあるように、栽培・加工・流通た。ナスにおける付着した乳酸菌数の最大値は A 糠床等の過程で野菜類には元々多くの細菌が付着し（菌数

浸漬後の 4.3 × 10 cfu/g、酵母については D 糠床浸漬は野菜の種類や栽培条件、季節等により変動するもの

後の 4.3 × 10 cfu/g、同じくキュウリにおける付着しと思われる）、水洗い程度ではあまり除去されずに野た乳酸菌数の最大値は A 糠床浸漬後の 7.0 × 10 cfu/g、近江らの報告6555

菜表面に残存する。今回用いた何れの糠床の場合でも、酵母については D 糠床浸漬後の 1.0 × 10 cfu/g であ糠床への 18 時間の浸漬中に、野菜に付着した一般細り、全体的にキュウリと比べてナスの方が付着菌数は菌の多くが消失した。特に一般細菌数が多いキュウリ多かった。また先の表１に示した結果と照らし合わせ

6については、コントロールの一般細菌数が 10 cfu/gると、糠床自体の乳酸菌・酵母数が多いほど、ナス・キュレベルであったものが、浸漬後水洗いした状態ではウリそれぞれへの付着菌数も多い傾向にあった。

表２．各糠床への浸漬によるナスの微生物数の変化

コントロール；ナスを水洗いした後に微生物数を測定
A ～ D 糠床浸漬後；Ａ～ D 糠床にナスを浸漬後、水洗いした後に微生物数を測定＊
各微生物数は 4 回の実験の平均値＊＊
colony forming unit＊＊＊
ストマッカー後のサンプル原液で顕著なコロニーが検出されなかったことを示す
表３．各糠床への浸漬によるキュウリの微生物数の変化

コントロール；キュウリを水洗いした後に微生物数を測定
A ～ D 糠床浸漬後；Ａ～ D 糠床にキュウリを浸漬後、水洗いした後に微生物数を測定＊
各微生物数は 4 回の実験の平均値＊＊
colony forming unit– 148 –糠漬け野菜の微生物叢の変化≪ 一般細菌 ≫≪ 酵母 ≫≪ 乳酸菌 ≫コントロール

浸漬後

図２．A 糠床へのナス浸漬前後の微生物検査プレート写真
1（サンプル 10 倍希釈液）
コントロール；ナスを水洗いした後に微生物数を測定
浸漬後；A 糠床にナスを浸漬後、水洗いした後に微生物数を測定

Ⅳ．考 察

まりリセットされ）、糠床自体の微生物叢に置換されるということをはじめて裏付けたデータの一つとして考まず、本研究で使用した４種類の糠床 A ～ D 間でえられる。

は香りが大きく異なっていたが、これは恐らく、糠床

さらに、糠床への浸漬後水洗いした野菜に付着・残を熟成する際に香味の付与のために添加する山椒の実存する乳酸菌・酵母数が糠床自体に生息するそれらにや唐辛子、生姜、陳皮、柚子の皮等の量や種類が各糠ある程度比例するという結果から、今後糠漬け野菜の床で異なっていることが大きな要因として考えられプロバイオティクスとしての利用を模索する上では、た。

糠床自体の菌数をどれだけ高く維持することができる

次に、図１の一般細菌用のプレート上に多数見らかが重要となる。しかしながら、表１に示したようれた微小で非常に色の薄いコロニーらしきものに関しに、今回使用した４種の糠床間でも乳酸菌・酵母数にて、図１に示した３種のプレートには同一のサンプル大きな差がある。特に A ～ C 糠床は、各メーカーや希釈液を塗布している。細菌の生育阻害剤であるクロ家庭で経験的な手法により長い年月をかけて熟成されラムフェニコール、真菌の生育阻害剤であるシクロヘたものであり、その差を考察するための科学的データキシミド、好気性微生物の生育阻害剤であるアジ化ナに乏しいのが現状である。また、近年の報告

トリウムを全く含んでいない一般細菌用の標準寒天培

は、小野らが香辛料の添加や発酵温度、塩分濃度が糠地上には、酵母や乳酸菌も生育するものと予想される床菌叢に及ぼす影響について検討しているが、主に遺が、恐らくは栄養要求性の違いやそれに伴う増殖速度

伝子解析により糠床から検出される乳酸菌の種類に差の違いから、これらの酵母や乳酸菌が一般細菌用のプが生じるかに焦点を当てたものであり、乳酸菌や酵母レート上ではコロニーとして検出可能なレベルにまで等の生菌数に着目したものではない。一般的には、糠

生育できなかったのではないかと推察された。

床中に生息するその他の細菌類・真菌類が優勢となら

12, 13）

でまた、表２および表３に示した糠床への浸漬前後ない程度に、高水分・低酸度・低塩分濃度に維持したにおけるナス・キュウリに付着する微生物数変化の結方が、乳酸菌や酵母の生育にも好都合であると考えら

果は、野菜の糠床への浸漬により、糠床が熟成されるれる（今回使用した４種の糠床の中で、乳酸菌と酵母ことにより形成された乳酸菌や酵母を中心とした所謂を合わせた生菌数が最も多い A 糠床の水分量が比較的“堅牢な微生物叢 ”への接触、あるいは比較的高い酸高く、酸度も低いことからもこの傾向が若干見られる）。

度や塩分濃度、低い pH の環境下に置かれることで、しかしながら、糠床に関して、これらのファクターが野菜に付着していた初発の微生物の多くが消失し（つ与える影響について科学的に立証したデータ（特に同– 149 –糠漬け野菜の微生物叢の変化

一の糠床間で）はほとんど報告されていない。そこで

３） 今井正武：糠みそ床の香気成分の生成に関する微生物

今後は、糠床の水分量・酸度・塩分濃度あるいは撹と温度の影響 . 日本食品低温保蔵学会誌 . 21：161-178,

拌（床返し）の頻度等が、糠床中の乳酸菌・酵母の生1995菌数に及ぼす影響について詳細な検討を行いたいと考４） 今井正 武 , 後藤昭二 , 平野 進：糠 床熟成中の酵母フえている。糠漬け野菜のプロバイオティクスとしてのローラの消長と分離菌株の同定 . 日本農芸化学会誌 .

機能性を模索するという目的だけではなく、糠床中の58：545-551, 1984

乳酸菌や酵母の生菌数が多いということは、つまり『糠

５） 支倉さつき：糠味床の発酵力が強い＝糠床が元気である』という証拠でもあり、より風味豊かな糠漬け野菜を造ることにも寄与できるのではないかと期待している。

漬のビタミン B２に関する研究 . 生

活科学 . 10：15-29, 1974
６） 支倉さつき , 川上いつゑ：糠味 漬におけるビタミン B1の移行とその組 織化学的検索 . 家政学雑誌 . 31：252-

さらに近年、島根県特産の津田かぶ漬けから、胃酸・257, 1980

胆汁酸耐性を有し、ヒトの腸管まで生きて届く可能性

７） 支倉さつき , 小野克枝 , 白形英代：糠味 漬の質的向のある植物性乳酸菌が分離されたことが報告されてい上に関する研究 -5 — 酸性プロテアーゼの利用について .

14）

る 。今後は、糠床中の特に浸漬野菜に付着・残存す

生活科学 . 7：119-128, 1967

る乳酸菌の中から、このようなヒトの胃酸・胆汁酸に

８） Nakayama J, Hoshiko H, Fukuda M, Tanaka H,耐性を示す乳酸菌の分離を試みたいと考えている。さSakamoto N, Tanaka S, Ohue K, Sakai K and15）

で増Sonomoto K：Molecular monitoring of bacterial

殖させた後に糠床へ添加し、糠床の風味への影響・浸community structure in long-aged nukadoko：

漬野菜への付着性等について検討を行う予定である。

Pickling bed of fermented rice bran dominated

らに、その分離株を食品グレードの培地素材

by slow-g row ing Lactobacilli. J Biosci Bioen.
104：481-489, 2007

Ⅴ．結 言

９） S a k a m o t o N , Ta n a k a S , S o n o m o t o K a n dNakayama J：16S rRNA pyrosequencing-based

本研究で得られた結果から、糠床への野菜の浸漬に

i nve st igat ion of t he b acter i a l com mu n it y i n

より、野菜表面に付着した初発の一般細菌の多くが消nukadoko, a pickling bed of fermented rice bran.

失し、乳酸菌や酵母を中心とした糠床中の微生物叢にInt J Food Microbiol. 144：352-359, 2011

置換されることが示された。今後は、糠床中の生菌数を高めるための発酵条件（特に水分量や塩分濃度）の10） 坂本直茂 , 中山二郎：糠床のミクロフローラと乳酸菌の共生 . 生物工学会誌 . 8：482-485, 2011

検討、並びに糠床中からヒトの胃酸・胆汁酸耐性を有11） 近江雅代 , 青木るみ子 , 古田宗宜 , 藤田守：大量調理する乳酸菌を探索すること等により、糠漬け野菜のプにおける生食用野菜の殺菌方法の有効性についての検ロバイオティクスとしての利用の可能性を探求してい討 . 西南女学院大学紀要 . 20：67-75, 2016

きたいと考えている。また、このような研究を通じて、

12） O n o H , N i s h i o S , Ts u r i i J , K a w a m o t o T,

九州北部に古くから伝わる糠床・糠漬け野菜の高付加

S o n o m o t o K a n d N a k a y a m a J：E f f e c t s o f

価値化とその文化の継承に貢献していきたいと考えてJapanese pepper and red pepper on the microbialいる。

c o m mu n it y du r i n g nu k a d o ko fe r m e nt at io n .
Biosci Microb Food Health. 34：1-9, 201513） 小野浩 , 西尾翔子 , 釣井隼 , 河本哲宏 , 園元謙二 , 中文 献

山二郎：発酵温度および塩分濃度が糠床菌叢に及ぼす影響 . 第 67 回日本生物工学会大会講演要旨集 . p300,

１） 今井正武 , 平野進 , 饗場美恵子：糠床の熟成に関する研究 — 熟成中の菌叢および糠床成分の変化 —. 日本農芸化学会誌 . 57：1105-1112, 1983

201514） 麻生祐司：機能性乳酸菌の探索と高付加価値食品への応用 . 食品加工技術 . 34：7-13, 2014２） 今井正武 , 平野進 , 饗場美恵子：糠床の熟成に関する

15） 古田吉史 , 丸岡生行 , 中村彰宏 , 大森俊郎 , 園元謙二：研究 — 熟成中のフレーバー成分の変化 —. 日本農芸化

乳酸菌を利用した焼酎蒸留粕の高付加価値素材への転学会誌. 57：1113-1120, 1983

換プロセスの構築 . 生物工学会誌 . 88：114-120, 2010

– 150 –糠漬け野菜の微生物叢の変化

Changes in Microbiota Adherent to Pickled Vegetables
during Nukadoko Fermentation
Yoshifumi Furuta, Yoshie Tanaka, Tatsuo Kai＜Abstract＞‘Nukazuke’, pickling vegetables in ‘nukadoko’, is one of Japanese traditional fermented foods.
Nukadoko is prepared by natural fermentation of rice bran. To the best of our knowledge, there
are no previous reports regarding changes in microbiota adherent to pickled vegetables, despite
numerous reports regarding changes in the microbiota of nukadoko itself. We investigated changes in
microbiota adherent to eggplants and cucumbers pickled in three different long-aged nukadoko (morethan 85 years) and a newly prepared nukadoko. There was a significant difference in the numberof lactic acid bacteria and yeast, and their ratio between four different nukadoko used in this study.
The number of general bacteria adherent to pickled eggplants and cucumbers (rinsed by water after
18 hours of pickling) in any type of nukadoko decreased remarkably, compared to those adherent tothe control (just rinsed by water). On the other hand, the number of lactic acid bacteria and yeast
adherent to pickled eggplants and cucumbers increased, presumably concomitant with an increase in
those in nukadoko. These results suggested that nukazuke might be used as probiotics by controllingthe number of lactic acid bacteria in nukadoko at a high level.
Keywords: nukadoko, nukazuke, microbiota, lactic acid bacteria, probiotics

Department of Nutritional Sciences, Faculty of Health and Welfare, Seinan Jo Gakuin University– 151 –