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研究報告＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿_

環境 DNA 分析におけるプライマー設計（一財）九州環境管理協会 環境部環境技術課

大井 和之

す必要がある。

１．はじめに

環境調査において DNA 分析で調べたいことは大きく

DNA は生物の細胞内に普遍的に存在する物質であり，わけて 4 つある（図１）。調査対象によって分析方法はい個々の生物が固有の塩基配列を持っているため，適確なくらか異なるが，いずれの場合でも，試料から DNA を分析を行うことで多くの情報を得ることができる。しか抽出し PCR を行うという最初のステップは共通していし細胞内に存在する遺伝情報の総体である「ゲノム」をる。この PCR で用いられる「プライマー」とよぶ 20mer構成する DNA の塩基配列の長さは 107〜1011 塩基対の程度の合成 DNA（2 種類で 1 対）が分析対象となる領域オーダーであり，全長を解読することは技術的には可能を規定するキーとなる。

であるが非常なコストと時間がかかる。まずは 102〜104

プライマーの塩基配列の選択が分析の成否を左右する塩基対程度の長さの領域に対象を絞って分析するのが普にもかかわらず，プライマー設計に決定版のマニュアル通である。

がない。普遍的なプライマーが使える場合や調査対象にゲノムの塩基配列の大部分は個体間あるいは近縁な生ついてすでに論文等でプライマー配列が報告されている物種間では違いがない。ゲノムの 109 塩基対の百万分の場合は，まずその配列を試してみることになるが，本調1 しかない分析対象の 103 塩基対を選ぶ時に，もし調べ査の前に予備調査としてプライマーの検証が必要であり，たい生物と比較対象との間で相違が全く無い領域を選んプライマー設計の考え方を知らないといけない。本報告でしまったら情報量は 0 になってしまう。逆に配列の相では，プライマー設計の基礎的知識を整理し，これまで違が大きくなりすぎるとそもそも「相同」な領域を比較に筆者が実施したプライマー設計の実例を紹介する。理しているのかどうかわからなくなる。適確な分析のため論的，技術的な詳細は末尾の参考文献を参照していただには相同性が保証されていて変異が十分にある領域を探きたい。

図１

DNA 分析の調査対象と方法

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２．分子進化遺伝学の基礎
２．１

表１

塩基置換と挿入欠失ゲノムの種別およその進化速度

核〜 5×10-9(置換/座位/年)

ミトコンドリア〜50×10-9(置換/座位/年)

核〜10×10-9(置換/座位/年)

葉緑体〜 2×10-9(置換/座位/年)

ミトコンドリア〜0.5×10-9(置換/座位/年)

動物

親から子へと世代が引き継がれていく中で，DNA に突同義置換の平均的分子進化速度

然変異が起こり塩基配列が変化することがある。配列中の 1 つの塩基が別の塩基に換わることを塩基置換という。

植物

また，配列の一部分が欠落したり余計な塩基が付加したりすることを挿入欠失という。
DNA のうちタンパク質をコードしている遺伝子部分いる配列（short tandem repeat）があると，その繰り返し

では，DNA の 3 塩基がタンパク質を構成するアミノ酸の回数に変化が起きやすい（突然変異率が高い）ことも知種類 1 つを定めている（コドン）。タンパク質を構成するられている。

アミノ酸は 20 種類であり，3 塩基の組み合わせは 43=64種類あるため，塩基置換がおきた時にアミノ酸が変化す

２．２

配列の相同性とアライメントる場合と変化しない場合がある。アミノ酸が変化する塩
2 つの生物の共通祖先が持っていた 1 つの塩基配列が，基置換を非同義置換，変化しない置換を同義置換

世代を繰り返して変異を蓄積しそれぞれ異なった塩基配(synonymous substitution)とよぶ。非同義置換では，アミ列になった時，これを相同な配列という。実際には，過ノ酸が変化してタンパク質の機能が十分で無くなった場

去の生物の塩基配列を直接調べることはできないし，変合，変化していない個体に比べて生存に不利になって子異の蓄積過程を見ることもできなくて，現在の生物の塩孫を残しづらくなり，変異が集団から排除される可能性

基配列を分析して相同であるかどうか判断する。ゲノムが高い（機能的制約）。同義置換では作られるタンパク質上の遺伝子の並びは，大きな位置の変更（転座）がおこの構造は変わらないので，機能的制約を受けない進化的るので相同性の確認には使えない。現生の 2 つの生物のに中立な変異になる。中立な突然変異は，集団中のどの塩基配列を比較して，一部だけが異なっていて多くの部個体で発生した突然変異も 1/(集団サイズ)の確率で集団分が同一であればその領域は相同であると考えられる。

中に定着するため，集団サイズ（個体数）にかかわらず，特に遺伝子をコードしている領域では非同義置換が起こ突然変異率と同じ速度で変異が集団に定着する。すなわりにくいので，同一遺伝子を相同として取り扱う。

ち，同義置換の分子進化速度は DNA の突然変異率でき

2 つの塩基配列の長さが異なる場合は、配列のどこかまり，2 つの生物の塩基配列を比較した場合，共通祖先にギャップを入れて挿入欠失の位置を推定する必要があが古いほど配列の違いが多くなる。これを分子時計といる。これを塩基配列の整列（アラインメント）という。

う。同義置換の平均的な分子進化速度は表１のように生整列は 2 つの塩基配列の違いの大きさ（距離）を塩基置

物の種類と核ゲノムか細胞内小器官のゲノムかによって換数とギャップの数，ギャップの重み付け係数を用いて異なる。ただし，塩基置換の突然変異発生率は A,C,G,T表し，距離が最小になるギャップの位置を探索する。実のどれからどれに変化するかによっても異なり，配列上際に解析する際には，複数の塩基配列を同時に整列するの塩基の位置によってかなりばらつきがある。

マルチプルアラインメントも含めて，塩基配列を整列す

遺伝子がコードされていない部分では，挿入欠失がよるためのコンピュータプログラムが利用できる。

く見られる。遺伝子部分では挿入欠失が起こるとタンパク質のアミノ酸配列が大きく変化してしまうため有害な

２．３

保存領域と易変領域

突然変異となって変異が定着しないが，非コード部分で複数の生物から得た塩基配列を整列してみると，図２

は挿入欠失に機能的制約を受けない場合が多く変異が定のように塩基置換がたくさん起こっている領域とあまり着しやすい。また，1〜数塩基の並びが複数回繰り返して61起こっていない領域があることがわかる。タンパク質のDNA の間に 1〜数塩基のミスマッチがあっても，アニーアミノ酸配列にかかる機能的制約の大小によって非同義リング温度を下げると対合が起こる。このため，普遍的置換の起こりやすさが変わる。リボゾーム RNA 遺伝子なプライマーを使用する際はアニーリング温度を Tm よ

でも，RNA の立体構造に対応して変化しやすい領域とほりも 10℃程度低い 45〜50℃付近にすることが多い。一方，とんど変化しない領域がある。また，図 2 のように非コ特異的なプライマーを使用する際はアニーリング温度はード領域でも DNA 複製等の制約により配列に変化が起

Tm と同じ 60℃付近に設定する。

こりにくい部分がある。生物間で配列がほとんど違わな３．２い領域を保存的（conservative）といい，変化しやすい領定量 PCR

定量 PCR は，PCR で DNA 合成が行われる際に蛍光色域を variable という。
図１で示した「普遍的 universal なプライマー」は保存素を取り込ませ，1 サイクルの反応ごとに蛍光を測定し領域に設計されたプライマーである。保存領域の塩基配て反応で生成した DNA の量を測定するものである。反列は多くの生物に共通であるため，たとえ対象生物の塩応チューブの上から紫外線を照射し蛍光を測定すること基配列がわかっていなくても使用可能と考えられる。一ができる専用のサーマルサイクラーを使用する。開始時

方，「特異的 specific なプライマー」は対象生物ごとに特に反応液中に含まれる対象領域の DNA 量が多いと早い有の配列を見つけ出して設計する必要がある。

サイクルから蛍光が観測され，少ないと 20〜30 サイクルの後にようやく蛍光が観測される。一定強度の蛍光が観測されるサイクル数と DNA 濃度の対数が比例関係になることが知られている。

３． DNA 分析の方法
３．１

定量 PCR に用いるプライマーは検出対象とする生物

通常の PCRに特異的なもので，生成する DNA 断片が 200 塩基対程Polymerase Chain Reaction (PCR) 反応は，試料 DNA に度の長さになるように設計する。定量 PCR は病原微生物

耐熱性 DNA 合成酵素 (Taq polymerase)と 1 対の 20 塩基の検査にも使われ，プライマーを含む試薬が全てセット程度の合成 DNA（プライマー）を添加し，サーマルサイされたキットが市販されている。

クラーによって温度を変化させて，DNA2 本鎖の解離，３．３プライマーとの対合，相補 DNA 鎖の合成を連続的に行シーケンスうものである。30〜40 回温度変化を繰り返すことで 2 つ種の同定を行う際は，普遍的なプライマーで増幅したのプライマーと対合する部分に挟まれた DNA 断片だけDNA 断片の塩基配列を解析（シーケンス）する。種名がを試料 DNA の 100 万倍程度に増幅する。

明らかな参照標本がある場合は，参照標本からも同様に加熱されて 1 本鎖に解離した DNA は，配列固有の温シーケンスして比較し，配列が一致したものに同定する。

度（Tm）付近まで温度が下がるとプライマーと相補する参照標本がなくても，DNA データバンクに登録されていDNA が対合する（アニーリング）。プライマーと試料る配列を検索して同定することが可能である。塩基配列

図２

保存領域と易変領域

中型哺乳類のミトコンドリア DNA の D-Loop 領域（非コード部分）の一部を表示（大井(2013)を改変）

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情報を用いて種の同定を行うことを DNA バーコーディ
ングといい，参照用の塩基配列データベースが整備されつつある。
効率的な DNA バーコーディングを行うためには，普図３

真核生物リボソーム DNA の構造

遍的なプライマーで挟まれた易変領域の塩基配列情報が蓄積される必要がある。例えば真核生物のリボソーム
DNA は 18S-5.8S-28S という 3 つの保存性が高い機能部分

では，米国 NCBI のサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）の間に ITS という易変領域が含まれている（図３）。このを使用して検索し，特異性の異なるプライマー2 組を設ため，保存的な 18S リボソーム DNA 領域と 28S リボソ計した実例を紹介する。

ーム DNA 領域に設計された普遍的プライマーを使用し検索する際は，まずは学名を検索窓に入れて検索してて，多くの生物の易変領域の配列を調べることができる。

みると，対象種に関して登録されている配列の一覧が得

また，動物のミトコンドリアゲノムでは表１に示したとられる。例えばタテジマイソギンチャクの学名

おり塩基置換速度が速いため，近縁な種間でも塩基置換

Haliplanella lineata を検索すると 16 個の配列が登録されが起こりやすい。このミトコンドリアゲノムにコードさている。このうち，ミトコンドリアゲノムの塩基配列はれているチトクローム C 酸化酵素遺伝子（COI）は呼吸6 個であった（図４（ａ））。続いて，近縁な種から少しに必要な酵素で機能的制約が強いため，非同義置換がほ遠縁のものまで，対照種があれば種名で，なければ属名とんど起こらない保存的な領域に設計された普遍的なプや科名，目名で検索して，登録数の多い遺伝子領域を確ライマー（LCO1490 と HCO2198）で脊椎動物も無脊椎認する。イソギンチャク類ではミトコンドリアゲノムの動物も DNA を増幅でき，約 650 塩基のシーケンスが得

16S リボソーム DNA 遺伝子領域が様々な種から登録さられる。植物では，葉緑体ゲノムの遺伝子（matK と rbcL）れていた。図４（ｂ）はタテジマイソギンチャ クのが DNA バーコーディングに用いられるが，動物に比べ16SrDNA の登録配列を表示したところである。必要な塩て塩基置換速度が遅く，近縁種の区別が難しい場合もあ基配列データは，それぞれファイルをダウンロードしてる。（Ooi ら(1995)，日本バーコードオブライフ・イニシおく。

アティブ http://www.jboli.org/）

４．２

Primer 設計ツール

DNA データバンクからダウンロードした塩基配列から，定量 PCR で使用するための対象種特異的なプライマ

４．プライマー設計の手順
４．１

ー を 設 計 す る 。 プ ラ イ マ ー 設 計 に は Primer3Plus

DNA データバンク（http://primer3plus.com/）という Web アプリケーションを使用する（図４（ｃ））。

調査で DNA 分析を行う際には，まず先行研究や参照データの有無を確認する必要がある。研究で解析された

タ テ ジ マ イ ソ ギ ン チ ャ ク の 16SrDNA の 配 列 をDNA 配列はたいていの場合，論文公表時に DNA データ

Primer3Plus に入力し，定量 PCR による遺伝子の検出にバンクに登録することが義務づけられているため，DNA適した設定でプライマー候補を探索する。この際，データバンクを検索すれば確認できる。DNA データバン

Primer3Plus の探索条件はタカラバイオの「リアルタイム

クは，日米欧のデータが共通化されており，日本の DNA

PCR 実 践 編 − プ ラ イ マ ー 設 計 ガ イ ド ラ イ ン − 」

Data Bank of Japan (DDBJ) に 登 録 し た も の も 米 国 の（http://www.takara-bio.co.jp/prt/pdfs/prt3-1.pdf）などを参Genbank に登録したものも同じように検索できる。ここ考に設定する。

63図４

Genbank と Primer3Plus の使用例

探索の結果 5 組の候補が表示される（図４（ｄ））。候ることが予想される。一方で，対象種以外の種とは配列補配列の多くは重複しているので，Tm や GC 含量，末が異なれば，対象種に specific なプライマーとして使用端の塩基配列などを考慮して候補を絞り込む。また，できる。図５では 2 組のプライマー候補を表示している

Target 領域を変更して別の領域でもプライマー候補を探が，このうち赤色で表示した tatejima_F と tatejima_R の索する。

組はタテジマイソギンチャク特異的なプライマーである。

４．３

一方，青色で表示した isogin_F と isogin_R の組はタテジ

配列エディタとアラインメント

マイソギンチャクだけでなく，ウメボシイソギンチャク

DNA データバンクからダウンロードした対象種およ科の 7 種も配列が完全に一致しており，イソギンチャク

び 近 縁 種 の 塩 基 配 列 は ， 配 列 エ デ ィ タ BioEdit

目の中で足盤族というグループの多くの種がこのプライ（http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html）と配列エマーで増幅できる可能性が高い。

ディタから呼び出して使用するアラインメントアプリケ

４．４ーション（CLUSTAL W）で整列を行う。イソギンチャ

PCR による確認

ク類について 16SrDNA を整列した結果を図５に示す。

プライマーの特異性の検証には，DNA データバンクに整列した塩基配列にプライマー候補の位置をあてて，対登録されている配列の中から候補配列と一致する配列を象種以外の種にも塩基置換が少ない保存的な領域であっ検索する BLAST 検索を行う方法もあるが，野生生物のた場合は，そのプライマーは universal なプライマーにな検出や同定に用いる場合はまだまだデータバンクの登録64図５

整列した塩基配列とプライマー候補の位置数は少ない。最終的には候補となるプライマーいくつか

５．おわりにを，標本から抽出した DNA や環境試料から抽出したDNA でテストして，良い結果をあげたものを採用する。

海生生物で，成体はあまり移動しないが幼生の時期に表２の 2 組のプライマーで，海洋の動物プランクトンプランクトンとなって広く移動するものが多数ある。こ試料（70%エタノールで固定）から抽出した DNA を鋳型

れら浮遊幼生は形態的特徴が乏しいため，近縁な種類をに PCR 反応を行った結果を図６に示す。タテジマイソギ

顕微鏡下の観察で区別することは難しい。プランクトン

ンチャク特異的なプライマー（tatejima_F/R）では 7 月とネットを曳いて採集した試料から DNA を抽出し，種特8 月の試料からのみ検出されているのに対し，イソギン異的プライマーを用いた PCR により検出を行えば，形態チャク類一般のプライマー（isogin_F/R）では 6〜11 月とでは区別できない特定の種の幼生が出現しているかどう

1〜3 月と長い期間 DNA の増幅がみられている。プライかを判定することが可能になる。現在，ここで報告した

マーisogin_F/R で増幅される DNA 断片は約 200 塩基対とイソギンチャク類だけでなく，貝類や甲殻類等の定量短いが，図 5 で示したように易変領域を含んでいるので，PCR による分析方法の開発と検証に取り組んでいる。
DNA 分析は，プライマーの設計や分析方法の工夫で塩基配列を調べればウメボシイソギンチャク科であるか様々なことができる。課題に応じたプライマーの設計やどうか程度は判定できる。

分析手法の選択ができる高い技術力を磨いて，自然環境
表２

イソギンチャク類検出用のプライマー配列

Nametatejima_F
tatejima_R
isogin_F
isogin_R

調査に対する社会的要請に応えていきたい。

Se qu e n c e
TATGAATGGCATCACGAAGGCCAACTTGCATTCTCCCTACAAAGACGAAAAGACCCCATTG
CCCCAACCAAACTATCCAAC

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図６

イソギンチャク特異的 DNA の検出状況

参考文献1）大井和之(2013) “中型哺乳類の糞の DNA 分析” 環境
管理 42, 36-42.
2）Ooi, K. et al. (1995) “Useful primer designs to amplify
DNA fragments of the plastid gene matK fromangiosperm plants” J. Jpn. Bot., 70, 328-331.
3）根井正利（五条堀・斉藤訳）(1990) 「分子進化遺伝学」培風館
4）津村義彦・陶山佳久（編）(2012)「森の分子生態学２」
文一総合出版
5）井鷺裕司・陶山佳久(2013)「生態学者が書いた DNAの本」文一総合出版

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