研究報告

DNA によるニッポンバラタナゴとタイリクバラタナゴの識別大井和之*

RFLP により両亜種を判別し，福岡県東部や長崎県

１．はじめにニッポンバラタナゴ（Rhodeus ocellatus kurumeus）などではタイリクバラタナゴが定着しているのに対は近畿，四国，九州地方の限られた場所に生息してし，福岡県筑後地方，佐賀県ではニッポンバラタナいる絶滅危惧種である。一方，1940 年代に利根川ゴの純系が多く残っていることを報告している。

で初めて確認された外来種のタイリクバラタナゴ

福岡県や佐賀県を調査地とする水路改修時の環境（Rhodeus ocellatus ocellatus）は，観賞用に流通して保全対策検討のような業務において，対象地に生息いることもあり，各地で野生化している。この 2 つするバラタナゴ類が貴重な在来種であるかどうかをは亜種の関係で容易に交雑するため，在来種の保全判定した上で保全対策を検討することが求められての観点から問題となっている。

いる。当協会でも，DNA 分析を実施してニッポンバ

ニッポンバラタナゴとタイリクバラタナゴは，本ラタナゴの生息地にタイリクバラタナゴが侵入して来，側線有孔鱗数や腹鰭前縁の白条で形態的に識別いるかどうか判定している。また，PCR-RFLP と分できる。しかし，タイリクバラタナゴが侵入した河川では交雑により中間的な個体も出現し，形態による識別が困難になっている。このように形態での区別が難しい生物の分類同定に，最近は DNA の分析による種の判定が行われるようになった。
バラタナゴ類の DNA 分析は 10 年以上前に方法が確立された。河村ら１）, ２）は各地のバラタナゴ類について，PCR 法で増やしたミトコンドリア DNA の一部領域を制限酵素で処理し，電気泳動のバンドパターンを比較（PCR-RFLP）することにより，ニッポンバラタナゴとタイリクバラタナゴを判別した。また，
Miyake ら ３） は，同じミトコンドリア DNA の別の領域の塩基配列を決定し，配列間の相違（塩基置換）の数によって類縁関係を推定する分子系統解析により，両亜種を判別した。
DNA 分析を用いたニッポンバラタナゴ生息地の調査も行われている。北部九州では，三宅ら ４） が46 地点から採集した 696 個体について形態と PCR*（財）九州環境管理協会

環境部

環境技術課

図 1 ニッポンバラタナゴ（上）とタイリクバラタナゴ（下）

研究員
54

表1

PCR の条件（制限酵素断片長多型 (RFLP) 分析）

子系統解析により，人為的な移入を検出するための表2

制限酵素処理地域型の判定に取り組んでいる。

２．材料と方法
２．
１DNA 抽出

標本は形態の計測を行ったのち，DNA 抽出を確実に行うために凍結または 99% エタノールで固定して保存した。標本の右側体側の背びれの下部分の筋肉 を 1 〜 10mg 切 り 取 り，QIAGEN 社 の DNeasy
Blood & Tissue kit を用いて，1 個体ごとに DNA を抽出した。DNA 抽出の過程の概略は以下の通りである。

かのタイプに分けることができるものの 1 つとして

（1） 筋肉細胞を界面活性剤とタンパク質分解酵素

ND1 領域を HaeIII という制限酵素で切断する方法を用いている。白井ら５）の報告によれば，ND1 領域によって溶かし，DNA を含む溶液とした。
（2）この溶液にアルコールなどを混ぜてシリカメを HaeIII で切断した場合のタイリクバラタナゴ型のンブレンフィルターに通し，DNA をフィル

バンドパターンはニッポンバラタナゴ型とは異なり，ターに捕捉して，ほかの不純物を除去した。

両亜種の識別が可能である。

（3）シリカメンブレンフィルターに吸着した DNA

ニッポンバラタナゴは，北部九州の他に四国，近は，洗浄したのち，アルコールを含まない水畿地方にも分布しているが，これらの地域型についで溶かしだして，DNA 溶液とした。ては，河村ら２）で DLoop 領域を ScrFI という制限酵素で切断したもの，ND1 領域を DdeI，ScrFI などで２．２

PCR-RFLP

切断したもののバンドパターンにより識別可能であ

河村ら １）, ２） は DLoop 領域と ND1 領域についてることを示している。

多くの制限酵素でバンドパターンのバリエーション

当協会では，DLoop 領域の PCR 産物を EcoRI とを調査している。その中から，三宅ら４）はタイリク

ScrFI，ND1 領 域 を DdeI，ScrFI，HaeIII で 切 断 す

バラタナゴ型とニッポンバラタナゴ型を識別する方る制限酵素断片長多型分析（PCR-RFLP）を実施し法として，ミトコンドリアの DLoop 領域を EcoRIた。分析手順は以下の通りである。という制限酵素で切断し，アガロースゲルで電気泳（1）抽出した DNA を鋳型として表 1 の通り，PCR法による DNA 増幅を行った。

動して断片長を分析する方法を採用している。また，（2）PCR 増幅した DNA 断片を表 2 の通り，制限白井ら ５） はニッポンバラタナゴ型の中でもいくつ55

酵素により処理した。反応液は各制限酵素にClustal W ソフトウェアにより整列（アライ添付のバッファーで調製し，PCR 産物を約ンメント）した。
（7） 整列した配列は MEGA ソフトウェアを用いて，200ng になるよう混合して 10 μ l とした。
（3） 制限酵素処理を行った反応液を，0.5 × TBE最節約法により系統樹を作成した。

バッファー・4% NuSieve 3:1 アガロースゲル
または 2% Takara LO3 アガロースゲルを用

３．結果

い，Mupid-exU 電気泳動装置で 100V の電圧３．１

電気泳動パターンの解析

PCR-RFLP の電気泳動像を図 1 に示した。プライで泳動した。泳動時間は想定される断片の長マー配列を 1 つ改変 (DloopFv2) した結果 PCR 増幅さにより 40 〜 80 分間に設定した。
（4） 電気泳動後のアガロースゲルはエチジウムブ

は良好で，いずれのサンプルでもはっきりとした泳ロマイドで染色し，紫外線を照射して写真撮動像を得ることができた（図２）。表 4 に示すように，影した。

分析した 5 つの組み合わせでは，どの領域と制限酵素の組み合わせにおいても，ニッポンバラタナゴ型

２．３(Rok) とタイリクバラタナゴ型 (Roo) を識別すること

DNA配列分析

PCR-RFLP では限られた塩基配列の違いのみを検ができた。

出しているため，塩基配列の相違の数から系統関係

河村ら５）によると，北部九州のニッポンバラタナを推定することはできない。分子系統解析を行うた

ゴは本分析と同様のバンドパターンを示し，当協会

めに，Miyake ら

５）の方法に従い，ミトコンドリアで分析した福岡県及び長崎県の標本からは，近畿型，DNA 上のシトクロム b 遺伝子の一部領域の塩基配列

四国型ニッポンバラタナゴのバンドパターンは出現を決定した。分析手順は以下の通りである。

しなかった。

（1） 試料から抽出した DNA（PCR-RFLP に使用３．２したものと同じ）を鋳型として，表３の通り，分子系統解析

標本の DNA から得られたシトクロム b 遺伝子部

PCR 法による DNA 増幅を行った。
（2）PCR 産 物 は QIAGEN 社 の QIAquick PCR

分塩基配列と，DNA 配列データベース（米国 NCBI

purification kit を用い，キットの説明書に従っ

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/） か ら ダ ウ ン ロ ー ドて精製した。

した塩基配列とをあわせて，系統解析ソフトウェア（3）精製 PCR 産物 20ng を 6.4pmol のプライマー

MEGA を用いて分子系統解析を行った。分子系統解(L14327v2 または H14780v2 のいずれか ) と析の方法には，2 つの配列間の塩基置換の数を距離混合して全量を 14 μ l とした。とみなし，各配列間の距離行列からクラスター分析（4） 蛍光標識 ddNTP を含む反応液を添加してサを行って樹形を得る距離法，ある系統関係を仮定しイクルシーケンス反応を行い，ABI 3730 シーたときに塩基置換数が最小となる樹形を探索する最ケンサーで塩基配列を読んだ。

節約法などがある。シトクロム b 遺伝子によるバラ（5） 配列データは BioEdit ソフトウェアを用いて，タナゴ類の分子系統樹の例として，最節約法による読み始めの不安定な部分やプライマー部分の系統樹を図３に示す。系統樹上では，ニッポンバラ配列を除いて，シトクロム b 遺伝子の部分塩タナゴ型とタイリクバラタナゴ型が別のまとまり（ク基配列を決定した。

ラスター）となる。標本の DNA から得られた塩基（6） NCBI Genbank からダウンロードしたバラタ配列が分子系統解析の結果どちらのクラスターに属ナゴ類（Rhodeus 属）のシトクロム b 遺伝子するかによって，ニッポンバラタナゴとタイリクバ

配 列 と 分 析 対 象 の 塩 基 配 列 を，BioEdit のラタナゴを判別することができた。
56

表3

PCR の条件（DNA 配列分析）

図2

PCR-RFLP 電気泳動像

Rok: ニッポンバラタナゴ，Roo: タイリクバラタナゴ，M: DNA 断片長マーカー（100bp ラダー）

表４DNA 断片長パターン

シトクロム b 遺伝子の解析では，ニッポンバラタる。バラタナゴ類のシトクロム b 遺伝子塩基配列はナゴ型とタイリクバラタナゴ型の間では 10 〜 13 個

近畿型はこの 1 例しか報告されておらず，四国型のの塩基が置換しているのに対し，ニッポンバラタナ報告はないため，系統解析からは地域型の判別は難ゴ型の中では 0 〜 5 塩基の置換しかない。このうち

しい。ただし系統樹上で下線で示した当協会の福岡

ほかのニッポンバラタナゴ型の配列との置換が 4 〜

及び長崎産の分析配列は，佐賀県など北部九州産の5 個と多い，DNA データベース登録番号 AB033737

個体の配列データにより近く，北部九州型と考えらのものは赤坂御所で系統保存されている大阪府八れる。

尾 市 産 と さ れ て お り， 近 畿 型 の も の と 考 え ら れ57

図3

バラタナゴ類のシトクロム b 遺伝子配列による分子系統樹
ナゴとタイリクバラタナゴは特に雌雄の別なく交雑

４．考察
ニッポンバラタナゴの生息地では，タイリクバラすると考えられており，交雑が起きている集団ではタナゴとの交雑が問題となっており，各地域で DNAタイリクバラタナゴ型のミトコンドリアを持つ個体の分析がなされている（近畿：河村 ，三宅ら ，四国：が出現する。一方，父親と母親から 1 組ずつ子ども

白井ら 5）,8）,9）,10），九州：三宅ら４））。これらの調査では，に伝わる細胞核の DNA は，交雑 1 世代目は必ずニッ

ミトコンドリア DNA の PCR-RFLP が，細胞核の遺ポンバラタナゴ型とタイリクバラタナゴ型の遺伝子伝子に比べて分析が容易であるため広く利用されてを両方もつ（ヘテロ）になるが，交雑 2 世代目以降いる。ミトコンドリア DNA は母親由来の遺伝子では片親の型の遺伝子だけをもつ（ホモ）確率が半分あるため個体レベルでは交雑を検出できないが，複ある。核遺伝子を分析してヘテロでなかったからと数個体を調べることにより調査地のバラタナゴ集団

いって交雑を否定することはできない。ミトコンドが交雑しているかどうかを判断できる。ミトコンド

リア遺伝子でも核遺伝子でも複数個体の遺伝子を分リアは母親から子どもへ伝わるが，ニッポンバラタ

析し，タイリクバラタナゴ型が出現するかどうかが

６）

７）

58

Rhodeus ocellatus (Cyprinidae) in Japan侵入の判定基準になる。
また，近畿の集団を調査した三宅ら

7）

Ichthyol Res 48: 105–110 (2001)

では核遺伝4 ）三宅琢也，中島淳，鬼倉徳雄，古丸明，河村功子の分析も行われているが，ミトコンドリア DNA

ミトコンドリア DNAと形態から見た九州でタイリクバラタナゴ型が出現していない集団で核一DNA でタイリクバラタナゴ型が出現したという例は地方におけるニッポンバラタナゴの分布の現状
日本水産学会誌 74: 1060-1067 (2008)

なく，ミトコンドリア DNA の分析で十分タイリク5 ）白井康子，伊藤英夫，池田滋

バラタナゴの侵入が検出できている。

ニッポンバラタ

1 つの地域集団の調査に際しては，純系のニッポ

ナゴ Rhodeus ocellatus kurumeusの遺伝子解析 (3)ンバラタナゴが生息している地域では 20 個体を目安−東讃地域で採捕されたバラタナゴの遺伝子解に DNA 分析を実施している。交雑が起こっている

析−集団では 10 個体の分析でもタイリクバラタナゴ型の53 (2008)香川県環境保健研究センター所報 7: 48–

DNA をもつ個体が出現しており，20 個体という数6 ）Kouichi Kawamura Low genetic variation

はタイリクバラタナゴの分布拡大を監視するのに十and inbreeding depression in small isolated

分な個体数と考えられる。分析コストを低減しつつ，

populations of Japanese rosy bittering,タイリクバラタナゴの侵入をいち早く発見し，ニッRhodeus ocellatus kurumeus Zoological Science

ポンバラタナゴ純系の系統保存などの保全対策に結

22: 517-524 (2005)
7 ）三宅琢也，河村功一，細谷和海，岡崎登志夫，

びつけていきたいと考えている。

北川忠生
タナゴ

５．おわりに奈良県内で確認されたニッポンバラ

魚類学雑誌 54: 139-148

8 ）白井康子，藤野恵美，池田滋

これまで形態では識別が困難であったニッポンバ

ニッポンバラタ

ラタナゴとタイリクバラタナゴの交雑状況について，

ナゴ Rhodeus ocellatus kurumeusの遺伝子解析

DNA 分析により識別できるようになった。国内移入(1) −香川県のニッポンバラタナゴの mtDNAのも含めて移入種の問題は形態では識別できない場合

PCR-RFLP分析結果−も多く，DNA 分析が有力な手法となっている。当協

ンター所報 5: 39–46 (2006)
9 ）白井康子，池田滋会でも様々な生物を対象に DNA 分析を実施してい香川県環境保健研究セニッポンバラタナゴ Rhodeus

ocellatus kurumeusの遺伝子解析 (2) −マイクロくことにしている。

サテライトマーカーによる亜種判別の可能性−
引用文献香川県環境保健研究センター所報 6: 23–28

1 ）K. Kawamura, et al. Genetic Introgression by(2007)

the Rose Bitterling, Rhodeus ocellatus ocellatus,

10 ）白井康子，池田滋 ニッポンバラタナゴ Rhodeus

into the Japanese Rose Bitterling, R. o.

ocellatus kurumeusの遺伝子解析 (4) −ニッポン

kurumeus (Teleostei: Cyprinidae) Zoological

バラタナゴ香川個体群の遺伝子モニタリング−

Science 18: 1027–1039 (2001a)

香川県環境保健研究センター所報 8: 33–36(2009)

2 ）K. Kawamura, et al. Genetic diversity in theJapanese rosy bitterling, Rhodeus ocellatus
kurumeus (Cyprinidae) Ichthyol Res 48: 369–ソフトウェア

378 (2001b)

BioEdit http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.
html3 ）K. Miyake, et al. Genetic variation of theMEGA http://www.megasoftware.net/

cytochrome b gene in the rosy bitterling,59