研究報告

中型哺乳類の糞の DNA 分析
大井１．序論和之 ＊確実さが残る糞の種同定の精度を向上することがで野生の哺乳類は容易に姿を確認できないものも多い。そのため，生息状況調査ではトラップ等を用いきれば，有効な野外調査データが増えて調査の効率化にもつながる。

た捕獲，センサーカメラによる写真撮影，糞や足跡

糞には，餌生物や腸内微生物だけでなく，腸壁かなどの痕跡（生息痕，フィールドサイン）調査など

ら剥がれ落ちた粘膜の細胞などの落とし主の動物のにより対象種が生息していることを把握している。

DNA も含まれている。糞から DNA を抽出し，特特に調査範囲が広い場合，調査者が対象地をくまな定の生物の DNA だけを増幅して分析すれば，落とく踏査して得られる痕跡の情報量は，他の調査手法し主の種類を識別することができる。既に，中型には代え難いものがある。

哺乳類の食肉目（ネコ目）でも糞の DNA 分析が実痕跡調査で難しいのは，その痕跡を残した種の同施されており，①種特異的 Primer の使用，② PCR-定である。特に，糞では，形や大きさ，残された場RFLP（制限酵素断片長多型），③塩基配列決定，の所，内容物が植物質か動物質かなどで判断するが，3 つの方法が主に使われている（増田ら（2009））。

熟練しないと判定は難しい。さらに，在来種のイタ

糞中 DNA の分析では，通常の筋肉片等から抽出

チ（Mustela itatsi）と外来種のチョウセンイタチ（M.

した DNA の分析とは異なり，以下の点に注意が必sibirica）のように，形態による判別がほぼ不可能要である。（1）糞が採集されるまで数日間屋外に放な場合もある。イタチ類の糞（図 1）は細くねじれ置されていた可能性もあり，DNA の断片化によった形で，路傍などの開けたところで見つけることがて長い DNA 断片の PCR 増幅は難しい場合がある。

できるが，同じイタチ科のテン（Martes melumpus）

PCR 増幅は 200 ～ 400 塩基対程度が良好である。
（2）

も同じような細長い形の糞をするため，テンの糞を糞は餌生物など多数の生物の DNA が混在した試料イタチの糞と誤認する可能性もある。このように不であり，糞の落とし主の種同定には分析したい分類群に特化したプライマーを用いる必要がある。
日本のイタチ類では，Masuda and Yoshida（1994）
がイタチ，チョウセンイタチ，テンの 3 種の標本から得た DNA についてミトコンドリアの cytochromeb 遺伝子領域の塩基配列を決め，各種間の塩基配列の違いの程度を明らかにした。これ以来，これら 3種の識別は，同領域の塩基配列を決めてデータベー

チョウセンイタチの糞

テンの糞てきた。ただし，前述のとおり糞試料では餌生物

図１ イタチ類の糞＊一般財団法人九州環境管理協会

スに登録されている配列と比較する方法が用いられ

環境部― 36 ―

（例えばアカネズミ）の DNA が含まれている可能群であるイヌ科のキツネやタヌキへの適用可能性も性があり，哺乳類全般の汎用プライマーではなく，検証した。

Namba ら（2007）で用いられたようなイタチ類に２．方法特化したプライマーを用いる必要があった。
最近，Sekiguchi ら（2010）が，ミトコンドリア

２．
１

試料の採取と保存の D-Loop 領域の塩基配列からイタチ，チョウセン

糞は，開けた場所の土の上や道路上などで形の崩イタチ，テンのそれぞれに特異的なプライマーを設れていないものを採取した。糞を見つけたら，写真計した。しかし，PCR 増幅の有無だけで判定する

撮影や位置の記録をした後，使い捨ての割り箸を使方法は簡便であるが，糞試料では，反応条件によっ用して，1 つずつ新しいチャック付きビニール袋へてどのプライマーセットでも増幅されないなど，判入れた。これらの道具は滅菌しておく必要はないが，定ができない場合がある。

試料の汚染防止のため必ず毎回新しいものを使っ

そこで，アガロースゲル電気泳動だけで判定できた。試料袋に日付や採取地等を記入し，DNA 抽出て，塩基配列決定を行うよりも低コスト分析法を開まで冷蔵又は冷凍で保存した。試料は少々古くて乾発した。これは，特異的プライマーを用いるよりも燥していても分析可能だが，新鮮な糞を持ち帰って確実な判定ができる PCR-RFLP 法で，九州北部のすぐに DNA 抽出した方が，確実に PCR 増幅ができ環境調査でよく出現する中型哺乳類を識別することる試料が得られた。増田ら（2009）は，糞をエタノーができる。食肉目（図 2）の中で，イタチ，チョウル液中に保存する方法がよいとしているが，糞試料

センイタチ，テンの 3 種で良好に増幅し，餌であるが液に分散してしまい，抽出作業を行いにくい場合ネズミや鳥類の DNA では増幅されないようなプラがあったため，冷蔵保存した試料を用いて，採取後イマーを設計し，系統的にイタチ類から少し離れた2 ～ 3 週間以内に DNA 抽出を行った。
２．２

ＤＮＡ抽出

糞からの DNA 抽出は QIAGEN 社の QIAamp DNA
Stool Kit を用い，マニュアルにしたがって実施した。
抽出に用いる試料は，保存していた糞から植物の種等をあまり含まないように，およそ 200mg（5mm角程度の大きさ）を使い捨ての割り箸や爪楊枝を用いてチューブに入れ，キット付属の溶解液に懸濁した。懸濁液は，夾雑物を除いたのち，タンパク質分解酵素で細胞を分解し，DNA を含む水溶液を得た。
この液にエタノールを添加して専用のフィルターを通して，DNA だけをフィルターに吸着し，不純物を流し去った。最後にエタノールを含まない水でフィルターから DNA を溶出して DNA 溶液を得た。
２．３

PCR および塩基配列の分析

Polymerase Chain Reaction（PCR） 反 応 は， 試 料

図２

食肉目のDNA分析による系統関係(Flynnら (2005)をもとに作成)

DNA に耐熱性 DNA 合成酵素 Ex Taq（TaKaRa）と1 対の 20 ～ 25 塩基程度の合成 DNA（プライマー）― 37 ―

表１

PCR反応液の組成

図３
表２

分析に使用したプライマー

表３

PCR反応の温度条件

プライマーの位置を添加し，サーマルサイクラー（TaKaRa）によっ列に基づき，D-Loop 領域の一部を挟む 200 ～ 500て温度を変化させて，DNA2 本鎖の解離，プライマー塩基離れた位置で組になり，Tm が 60℃程度になるとの対合，相補 DNA 鎖の合成を連続的に行うもの

一対の配列を，探索ソフト “primer3plus” を用いてである。1 本鎖に解離した DNA は，配列固有の温探索した。ミトコンドリアゲノム上の遺伝子の配置度（Tm）付近でプライマーと相補する鎖と対合する。とプライマーの位置関係は図 3 に示した。

本研究で新たに設計したプライマーは，DNA Data

PCR 反応液の組成，プライマーの塩基配列，反Bank に登録されているチョウセンイタチの塩基配応の温度条件は表 1 ～ 3 にまとめた。糞から抽出― 38 ―

した DNA には反応を阻害する物質が含まれるため，考えられるサンプル 3 ～ 6 でも薄く増幅がみられ，反応液には Bovine Serum Albmine（BSA）を添加した。

テンのプライマー（MMF1-MUR1）では，テンと反応の温度条件は，プライマーの Tm によって，ア考えられるサンプル 3，4 の他にイタチの標本 DNAニーリング温度 57℃と 52℃に使い分けた。

から増幅がみられた。なお，このプライマーで増幅

PCR 産 物 は 0.5 × TBE バ ッ フ ァ ー 中 で 2% LO3

される cytb 領域では，イタチとチョウセンイタチ

アガロース（TaKaRa）ゲル電気泳動を行い，臭化の塩基配列の違いが少ないため，両種を識別するた

エチジウムで染色し，紫外線を照射して赤色の蛍光

めには MIF1-MUR1 の PCR 産物の塩基配列を決定を観察した。プライマー DL2F-DL2R の PCR 産物は，する必要がある。

塩基配列の違いを分析するため，PCR 産物 4 μ L を，

D-Loop 領域のイタチ，チョウセンイタチ，テン10 ×制限酵素バッファー 1 μ L と滅菌水 5 μ L，制限特 異 的 プ ラ イ マ ー（Sekiguchi ら（2010）） で 増 幅

酵素 0.1 μ L を含む液と混合し，37℃に 60 分以上おいし，PCR 産物を電気泳動した結果は図 4（左上・て制限酵素処理を行ったのち，低分子量の分解能が左下・右上）に示した。DNA が増幅されたプライ

よい 4% NuSieve 3:1 アガロース（Seakem）ゲルでマーの組み合わせから，サンプル 2 がチョウセンイ電気泳動を行った。使用した制限酵素を表 4 に示タチ，サンプル 3 と 4 がテンであることがわかったした。

が，サンプル 1 はイタチで弱い増幅がみられるもの

一 部 の PCR 産 物 は QIAquick PCR purification kitの，この泳動像だけでイタチであると断定することを用いて精製し，DNA シーケンサーによって塩基は難しかった。増幅が弱くなったのは，プライマー配列を解析した。

itatsiLd と itatsiLr の Tm が低く，相同配列に結合し表４づらいためと考えられる。また，チョウセンイタチ

分析に使用した制限酵素

特異的プライマーでは，非特異的に短い DNA 断片が見えるが，これは sibiricaLd と sibiricaLr の Tm が7℃異なるため，ゴーストが発生したものと考えられる。このように，種特異的なプライマーでは，糞DNA の状態や反応の温度条件によってバンドが出たり出なかったりすることがあり，種の識別が不確実になることがあった。

３．結果と考察

３．２

塩基配列の決定とプライマーの設計

種特異的プライマーによる種同定の検証

D-Loop 領域についてプライマー部位探索ソフト

九州内で採集したイタチ類の糞 4 検体（サンプルウェアで得たプライマー候補配列のうち，約 400 塩

1 ～ 4），イタチとは異なる「ため糞」から採集した基の DNA を増幅する DL1F と DL1R の組ではイタ2 検体（サンプル 5，6）の DNA を用い，対照として，チ，チョウセンイタチ，テン，アナグマの試料で増別に同定済みの標本から得たイタチとチョウセンイ幅が確認され，塩基配列解析を行った。得られた塩

タチの DNA を使用して，先行研究で用いられた種基配列に，データベース上のキツネ，タヌキの塩基特異的プライマーによる種同定について検証した。

配列を加えて整列する（図 5）と，DL2F と DL2R

Cytochrome b 領域のプライマー（Namba ら（2007））の組ではこれらの種も増幅可能であることがわかは，原論文の 67℃よりも低い 57℃のアニーリングる。実際にキツネとタヌキの糞から得た DNA で温度条件で PCR を行った（図 4 右下）。イタチのプPCR を行うと，イタチ類より若干長い DNA 断片のライマー（MIF1-MUR1）では，イタチ類でないと良好な増幅が確認できた（図 6 左）。

３．
１― 39 ―

図４

種特異的プライマーでのPCR産物の泳動像

図 5 に示した 6 種の塩基配列を比較すると，塩6 中）では，39 塩基の短い断片が確認しづらいた

基配列の欠失があるため，チョウセンイタチに比べめテンとキツネが類似したパターンになるものの，てイタチは 5 塩基，テンは 7 塩基，アナグマは 9 塩他の 4 種はそれぞれ種ごとに異なったパターンと基短い。しかし，アガロースゲル電気泳動ではこのなった。キツネについては別途 BstUI 処理して電気長さの違いを判別することは困難である。そこで，泳動する（図 6 右）ことで，他種と区別が可能であっ塩基配列解析ソフト（BioEdit）で，6 種の塩基配列た。

について各種の制限酵素の切断位置を探索したと
ころ，DdeI でチョウセンイタチ特異的な切断部位，４．まとめ

ScrFI でアナグマ特異的な切断部位とイタチ，チョ哺乳類の生息分布域を把握するために行う調査

ウセンイタチに特異的な切断部位，BstUI でキツネで，対象種の直接観察が困難な場合に，痕跡調査は特異的な切断部位が見つかった。

重要な手段であるが，糞の形態等では種の同定が困難な場合も少なくなかった。糞中の DNA 分析は，

３．
３

このような場合に有効であるが，分析にコストと時アガロースゲル電気泳動による判定

DL2F-DL2R の PCR 産物を制限酵素処理した後の間がかかることが課題であった。

電気泳動像を図 6（中，右）に示した。全ての検体

種特異的なプライマーによる PCR 増幅の有無にで数十塩基～約 250 塩基の長さの DNA 断片が 1 なよる検出は，最も簡便で，コスト，時間ともに抑えいし 2 本確認できた。塩基配列から想定される断片ることができるが，試料によってはうまく増幅でき長（表 5）のとおり，DdeI と ScrFI の同時処理（図ない場合や，プライマーと温度条件によっては本来― 40 ―

図５

図６
表５

D-Loop領域の塩基配列とプライマー、制限酵素切断位置

DL2F-DL2RのPCR産物の制限酵素処理前後の電気泳動像

計算上のDNA断片長― 41 ―

増えないはずの試料で増幅がみられる場合もあり，的としたサンプリング法，遺伝子分析技術，結果の安定性に課題があった。一方，塩基配列の違遺伝情報の解析法及び研究事例 ” 哺乳類科学

いを直接シーケンスする分析には，検体数に比例し49(2), 283-302.て高いコストがかかった。

2） Masuda, R. & Yoshida, M.C. (1994) “Nucleotide se-

今回新たに開発したプライマー DL2F-DL2R は，

quence variation of cytochrome b genes in three spe-

食肉目イヌ亜目に含まれる複数種で，良好に PCR

cies of weasels Mustela itatsi, Mustela sibirica, and増幅ができることを確認した。また，PCR 産物のMustela nivalis, detected by improved PCR product-

長さは約 240 塩基と短いが，種間の塩基配列の変異

direct sequencing technique” J. Mamm. Soc. Japan,が大きい領域であり，3 種の制限酵素を使用して 619(1), 33-43.

種の識別が可能であった。

3） Namba, T. et al. (2007) “A new method for the iden-

今回開発した糞中 DNA の PCR- 制限酵素処理に

tification of Martes melampus in Honshu by a multi-

よる分析法は，1 つの PCR 産物を制限酵素で処理

plex PCR for fecal DNAs” Mammal Study 32, 129-

して電気泳動するだけで，痕跡調査で頻出する 6 種

133.の識別が可能であり，低コストで糞の種同定に有効

4） Sekiguchi, T. et al. (2010) “New methods for speciesと考えられる。今回対象とした種の他にも，分布拡

and sex determination in three sympatric Mustelids,大が問題となる外来種のアライグマなどについてもMustela itatsi, Mustela sibirica and Martes melam-

適応可能かどうか検討中であり，引き続き環境調査pus” Molecular Ecology Resources 10, 1089-1091

での活用を進めていくこととしている。

5） Flynn, J.J. et al. (2005) “Molecular Phylogeny of theCarnivora (Mammalia): Assessing the Impact of In-

引用文献

creased Sampling on Resolving Enigmatic Relation-1） 増田隆一ら（2009）“ 食肉目の遺伝子分析を目ships” Syst. Biol. 54, 317–337― 42 ―