機能性イメージングを実現する
次世代プローブ顕微鏡技術
6 mm

金沢大学 ナノ生命科学研究所 教授 高橋 康史1,2
1Kanazawa University, WPI NanoLSI, Japan.
2PRESTO, JST, Saitama 332-0012, Japan.

0 mm
512×512 points
20× 20 mm

ナノスケールの形状と化学物質の濃度プロファイルをリンク
静的な細胞の評価

動的な細胞の評価
Nanopipette

その場でのセンシング技術

局所刺激を行う“摂動技術”

120 nm

個々の情報の張り合わせ
ナノスケールでの連続的な形状測定技術

独自に開発している走査型プローブ顕微鏡による細胞の局所分析
2

100 nm

FEEDBACKlon

Normalized current

走査型イオンコンダクタンス顕微鏡（SICM）とは
1.05

Radius20 nm

10.95

Radius 50 nm

0.90.85
0+200 mV

50

100Distance [nm]umum
100 ×100 um
3微小空間におけるイオン電流計測方法と計測対象パッチクランプ
チャネルの開閉

ナノポアセンサー
検出物の通過FEEDBACK

lon+200 mV

SICM
イオンの移動しやすさ
位置の制御イメージングの分解能と測定環境

SICMとAFMの比較
カンチレバーの共振周波数

数MHz

電流計測

数kHz～数十kHz

高解像度化と高速化はトレードオフ
Jan Seifert, et al., Langmuir, 2015,31 (24), pp 6807–6813

（測定例）

SICMとAFMの比較

Jan Seifert, et al., Langmuir, 2015,31 (24), pp 6807–6813

阻害剤の評価（SICMによる測定例）

Actin filaments
polymerization
Cytochalasin D

Ruffling
Dynasor

EIPA
Na+H+Ruffle fusion
wortmannin

成長因子と形状の関係（SICMによる測定例）

control

A431
[mm]
5.1

7.5

3.2

0002.213.24.2000

EGF 100 ng/ml

2 mm

20 s/ image; 10×10 µm
H Ida, et al., Analytical chemistry 89, 2017, (11), 6015-6020.

細胞とペプチドの相互作用（SICMによる測定例）

Electrostatic interaction

SICM Imaging
R8 Alexa Fluor 488[mm]

Red: Scanning Area

Before treatment

Change the cell curvature

5 mm

20 mm

20 mm

After treatment

PyB

[µm]

1 mm

ol

R８の流入点（こぶ状の領域）を可視化
膜曲率の変化だけでなく微絨毛様の構造体が増加

1 mm
Angew. Chem. Int. Ed.
2017, 56, 7644.[µm]10ホッピングモード SICM
Korchev groupNature Meth (2009) 6: 279-281

My work

Phys.Chem.Chem.Phys.,(2010),12: 10012–10017.

ホッピングモードでは，ピペットと試料が接近しすぎないように，イオン電流の減少量に閾値を設定し，探針を引き上げる距離を調節することで，凹凸の激しい試料表面, 更には生きた細胞の動的観察も可能。

時間分解能の向上
Imaging time
20 minNat. Methods 2009, 6 (4), 279-281.

15 s/32×32 points=14.6 ms/point

J. Cell Biol. 2012, 197 (4), 499-508.

15 s/32×32 points=14.6 ms/point

Nano Lett. 2014, 14 (3), 1202-1207.

18 s/64×64 points=4.4 ms/point

Anal. Chem. 2017, 89 (11), 6015-6020.

Approach speed
50 nm/ms
500 nm/ms(a)Previous Hopping mode

New scanning method②①(b)1200nm/ms

Touch

Current

9 s/64×64 points=2.2 ms/point課題：凹凸の著しい計測
4000 nm
500 nmMicrovilli imaging

Neuron imaging

課題の解決法１

計測領域を絞ることで高速イメージングを実現
特許第6842750号
１回目

2回目

1,2回目のオーバ 1回目の画像に肉付け
プロット（変化領域をカバー）

Takahashi, et al., Anal. Chem. 2020, 92, 2, 2159-2167

2-4倍の高速化に成功
今後は、変化の起きる場所に重みを付けて連続的に高さを計測する

領域を絞った測定例

神経細胞内でのカーゴ輸送

Professor Hirokawa group

0.8 [um]

15×15 um, 3 min/Frame

02.2 [um]5 mm

0Neuron Volume 90, Issue 6, 15 June 2016, Pages 1215–1229

5×5 um, 1 min/Frame領域を絞った測定例

測定例神経細胞の連続イメージング

15×15 um, 4 min/Frame

5×5 um, 1 min/Frame

plasmalemmal precursorvesicles (ppvs)

16
Takahashi, et al., Anal. Chem. 2020, 92, 2, 2159-2167

課題の解決法２高速駆動可能なZ軸ステージ

Z

特願2020-137405
特願2020-137407
細胞形状をトレースするための可動域の長いピエゾ

細胞形状をトレースするための比較的長い可動域のピエゾステージ

X
高速でHoppingする可動域の短いピエゾ

微小電流計測器をZピエゾステージに近接できる一体型のデザイン

0.1-3 umのホッピングのみを行う
ピエゾステージ

微小電流計測器

セットポイントに電流が達した際に、試料から退避するためのピエゾス
テージ

細胞の機能性イメージングの戦略
SICM

Input (stimulation)
Ion ejection
Ligand(Agonist) ejection
Current
VoltageCell(target)
Ion channel
Neurotransmitter
Receptor
Active potentialSensing

Output(detection)
Patch clamp
Electrochemical detection
Fluorescent signal(FRET)SICMは形状イメージングツールにとどまらない生体センシングの可能性を有する

化学物質の局所投与
イオンチャネルのマッピング Nature Cell Biol 2, 616-619 (2000).
（SICM+パッチクランプ）受容体のマッピング Science 327, 1653-1657 (2010).
（SICM+FRET）①リガンドを局所投与②cAMPの濃度が変化③FRETシグナルの減少

19

他の分析との融合
表面共焦点イメージ

局所パッチクランプ

Neuron 79, 1067 (2013).

SICMに電極を搭載
ナノ電気化学顕微鏡

走査型電気化学顕微鏡（SECM）
Membrane permeability
1994

Enzyme Reaction

1996
FMA

NADH FMA+FMA

Nitric Oxide 1990
Embryos Respiration

2001

Gene Expression 2004

Membrane Protein 2009
e-Neurotransmitter 1983

Stimulant+0.3 vs. Ag/AgCl

05O

NH 2

NHGenePAPP

OPO 3

Alkaline
phosphatase

10row

OH

PAP

1520

Enzyme250NH 2S
EGFR

P

510152025

col2.50e-011
5.00e-011
7.50e-011
1.00e-010
1.25e-010_0613pUC191_b_gal_image_spm

21

SECMの利点
時間分解能が広範囲に及ぶ（ミリ秒から数日の事象を計測可）
O2

神経伝達物質数日秒～分ミリ秒

e-O2

タンパク質（酵素）の発現
day 0
光学画像
SECM像

呼吸活性

day 0 Day 0
ES細胞

ES細胞
未分化マーカー：高未分化マーカー：高day 4
day 4 Day 4

day 13

Takahashi, Y. et al.
Angew. Chem. Int. Ed.
50, 9638-9642 (2011).

Day 13day 13
未分化マーカー：低未分化マーカー：低薬物感受性
Anal. Chem. 2003,75 (9), 2154-2158.

Matsumae, Y., Takahashi, Y.
et al. Chem. Commun. 49,226498-6500 (2013).

電極作製① 金属を細線化する
半径 10,000 nm② ガスをカーボンにする
半径 100 nm
以下Takahashi, Y., et. al., Angew. Chem. Int. Ed. 50, 9638-9642 (2011)
特開2010-261923(P2010-261923A)

3分でナノ電極が簡便に作製可能

23

電極－試料間距離制御①従来法 “力”を利用
水晶振動子

ピエゾブザー
5 mm
50 mm

a電極

Anal. Chem., 77, 1111 (2005).

② “電流”を利用
MedMed+Electrochemical detection15 mm

3.5 mm

10 mm

Carbonナノ電極Probe-sample distance regulation
ナノピペットTakahashi, Y., et. al., Angew. Chem. Int. Ed. 50, 9638 (2011).
イオン電流を検出b

光で見るよりも鮮明
95 nm

24

SECMによる測定例

局所的な刺激と神経伝達物質の計測• Local K+ stimulation

a15 mmbAngew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 9638 –9642

ケミカルの検出の戦略
Electrochemicaldetection
eO2

Electron conductancedetectione500 nm

H2O

Sensitivity
Selectivity
Resolution
Response

Ion conductancedetection△◎◎◎Angew. Chem. Int. Ed. 2011,50 (41), 9638-9642.

Resolution
Sensitivity
Selectivity
Response×◎〇×Acs Nano 2016, 10 (3), 3214-3221.

Resolution
Sensitivity
SelectivityResponse◎◎△◎

Nat Commun 2019, 10 (1), 1-9.

新技術の特徴・従来技術との比較• これまでのプローブ顕微鏡のほとんどが構造を可視化するものであった。
• 新技術は化学物質の濃度変化等をとらえることができる。
• 更にこれらの技術を確立している
高速化技術（走査機構／画像処理）
ライブセルイメージング技術
試薬に対する応答を可視化

想定される用途
液中に存在するサンプルのナノスケールの構造変化や化学物質の濃度変化の計測（例）• 細胞表面の形状測定・代謝物測定• 蓄電材料の評価• 触媒材料の評価（今後）ナノピペットを用いた刺激・センシングと光学技術の融合により、シグナル伝達と形状変化の関係を評価

企業への期待• イメージング技術を取り扱っている企業は、本技術の導入が有効と思われる。

• 共同研究に関しても受け付けております。

本技術に関する知的財産権
特許１• 発明の名称 走査型イオンコンダクタンス顕微鏡• 出願番号
特願2020-137405• 出願人
国立大学法人金沢大学
• 発明者
高橋 康史

• 発明の名称• 出願番号
• 出願人
• 発明者

特許２
走査型イオンコンダクタンス顕微鏡
特願2020-137427
国立大学法人金沢大学
高橋 康史

本技術に関する知的財産権• 発明の名称• 特許番号
• 出願人
• 発明者

特許3
走査型プローブ顕微鏡及びその制御方法
特許第6842750号
国立大学法人金沢大学
高橋 康史

お問い合わせ先

金沢大学ティ・エル・オー
ＴＥＬ 076－264 －6115
ＦＡＸ 076－234 －4018
e-mail info@kutlo.co.jp