90 分で結果が得られる
ハイスループット ELISA：
384 ウェル SimpleStep
ELISA® と PHERAstar® FSXの連携

アプリケーションノート

Jamie Campbell［EMEA カスタムソリューション、ディレクター – アブカム（英国、ケンブリッジ）］

Oliver Carney［BMG LABTECH（英国、エールズベリー）］― 高い感度、特異性、再現性が得られる
洗浄ステップ 1 回の 90 分プロトコールの ELISA― ハイスループット化のニーズに応えて384 ウェルフォーマットに対応― 高精度のプロトコールを用いた
PHERAstar® FSX で読取り

はじめに酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）は、さまざまな生体サンプル中のタンパク質やその他の分析物の検出・定量化において最も信頼性の高い測定法のひとつであり、40 年以上もの間、ゴールドスタンダードのアッセイと考えられてきました。
従来の ELISA 法では、複数回の洗浄ステップと結果が出るまで比較的長い時間（3 ～ 5 時間）を必要とし、サンプル使用量も多いため、ハイスループット化が困難でした。

アブカムの SimpleStep ELISA® では、プロセスをセミホモジニアスな形式に合理化することで、洗浄 1 回のシンプルな 90 分プロトコールを実現しました (1)。ハイスループット化のニーズに応えるため、SimpleStep ELISA® を 384 ウェルフォーマットにミニチュア化し、同じ時間で最大 4 倍のサンプル数を処理できるようになりました。さらに、BMG LABTECH 社のPHERAstar® FSX の使用により各ウェルを 1 秒未満で読み取れるため、高い感度を維持しつつ、ハイスループット化が可能となりました。BMG LABTECH 社の MARS データ解析パッケージにより、定量標準曲線の自動生成と未知のサンプルの定量化が可能です。

こ​ ちらでは、薬物動態試験や免疫療法薬の安全性試験において重要なヒト IgG とヒト IFN- γの 2 つのターゲットについて、384 ウェルフォーマットの SimpleStep ELISA® と PHERAstar®
FSX を連携させた定量方法をご覧いただけます。
アッセイの原理

サンドイッチ ELISA は、分析物の異なる部位に結合する抗体ペアを使用します。1 つの抗体（捕捉抗体）がウェルの底に固相化され、分析物を捕捉します。捕捉した後、必要な洗浄を行い、検出抗体を加えます。さらに洗浄を行い、検出を行うことができます。

図 1 は、SimpleStep ELISA® の原理を示しています。固相化抗体を加えることでサンドイッチELISA をセミホモジニアスに実施でます。
384 ウェルフォーマットで実施する場合も、シンプルな 90 分プロトコールは同じです。

HRP
抗原
抗タグ
抗体

サンプルと抗体カクテルを添加

1時間

TMB
基質

10分

洗浄 + TMB基質を添加

反応停止液を添加 + 読取り

90分

図 1. SimpleStep ELISA® キットのアッセイプロセスの概略図。サンプルは、捕捉抗体と検出抗体の混合物とともに添加されます。抗原、捕捉抗体、検出抗体のサンドイッチ複合体が溶液中に形成されます。複合体は、捕捉抗体上のアフィニティタグを介して固相化抗体に結合します。1 回の洗浄後、発色させ、吸光度を測定できます。

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資材および方法― PHERAstar® FSX （BMG LABTECH）― SimpleStep ELISA® キット（アブカム）― ヒト IgG ELISA キット（ab195215）― ヒト IFN- γ ELISA キット（ab174443）― 384 ウェル SimpleStep ELISA® マイクロプレート（ab203359）
実験手順

すべてのキットにおいて、384 ウェルフォーマット（サンプル総量 50 µL）の使用説明に従ってサンプルを取り扱いました (2)。384 ウェルプレートのすべてのウェルを測定するには、96ウェル SimpleStep ELISA® キットが 2 つ必要です。すべてのテストにおいて、2 連または 3 連のサンプルを用いた 7 点希釈系列に基づいて標準曲線を作成しました。

プレートは、ヒト IgG の場合は 10 分間、ヒト IFN- γの場合は 5 分間、TMB とインキュベートしました。プレートの読取りには、PHERAstar® FSX を使用し、高精度のプロトコールを用いて、以下の設定で行いました。
機器の設定
光学設定

吸光度、エンドポイント

一般設定

フラッシュ数波長

セトリング時間

450 nm220.2 秒www.abcam.co.jp/kits/high-throughput-screening-elisa-based-solutions-ja

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結果および考察

各プレートを PHERAstar® FSX で読み取った後、データを MARS で解析して標準物質をプロットし、曲線フィッティングを適用しました。

ヒト IgG の測定は、抗体発現の研究において重要な指標となっています。ヒト IgG
SimpleStep ELISA® キットは、血清、血漿、細胞培養上清、組織ライセートで検証済みです。
特に薬物動態試験に有用です。
384 ウェルフォーマットのヒト IgG SimpleStep ELISA®（ab195215）を OD 450 nm で検出

OD（450 nm）

1.000

0.100

1.000

濃度（ng/mL）

10.000

図 2.384 ウェルフォーマットのヒト IgG SimpleStep ELISA® キット（ab195215）の 4 パラメータ適合標準曲線（r2 0.9999）。
高精度なプロトコールを用いて PHERAstar® FSX で読取り。

O.D.（450 nm）

10

10.1

0.01

0.1

1IgG（ng/mL）10

図 3. 96 ウェルフォーマットのヒト IgG SimpleStep ELISA® キット（ab195215）の一般的な標準曲線

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ヒト IFN- γは、T 細胞応答を評価するための重要な因子であり、その多くは、がんやがん免疫において重要性の高い免疫シナプスに関連しています。このようなアッセイには、混合リンパ球反応（MLR）アッセイ、T 細胞共刺激アッセイ、リコールアッセイなどがあります。
ヒト IFN- γ SimpleStep ELISA® キットは、血清、血漿、細胞培養上清で検証済みです。
384 ウェルフォーマットのヒト IFN- γ SimpleStep ELISA®（ab174443）を OD 450 nm で検出

OD（450 nm）

1.000

0.100

1.000濃度（ng/mL）

10.000

図 4.384 ウェルフォーマットのヒト IFN- γ SimpleStep ELISA® キット（ab174443）の 4 パラメータ適合標準曲線（r2 0.9993）。
高精度のプロトコールを用いて PHERAstar® FSX で読取り。

OD（450 nm）

10.1

0.01

0.1

1

IFN- γ（ng/mL）10

図 5. 96 ウェルフォーマットのヒト IFN- γ SimpleStep ELISA® キット（ab174443）の一般的な標準曲線

図 2 および図 4 は、テストしたいずれの SimpleStep ELISA® キットについても、384 ウェルマイクロプレートフォーマットで良好な標準曲線が得られていることを示しています。これらの曲線は、96 ウェルフォーマットの同じキットで得られた標準曲線（図 3 および図 5）と同等です。

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結論

SimpleStep ELISA® キットを 384 ウェルマイクロプレートフォーマットで使用することで、最大 4 倍のサンプル数を処理でき、より少ないサンプル使用量（50 µL）で、90 分で結果が得られます。384 ウェルフォーマットで使用しても、SimpleStep ELISA® で期待される高い感度、特異性、再現性は変わりません。時間もコストも削減できるため、ハイスループット
ELISA の理想的なソリューションとなります。

PHERAstar® FSX の分光計ベースの吸光度測定では、1 ウェルあたり 1 秒未満で 1 つ以上の波長を測定できます。また、BMG LABTECH 社の MARS データ解析パッケージによる標準曲線の自動生成と未知のサンプルの再計算によりワークフローがシンプルになり、時間が短縮します。

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参考文献

1. アッセイ時間 90 分の高感度 ELISA：SimpleStep ELISA® キットと SPECTROstar® Nano
- アプリケーションノート
2. 384 ウェル SimpleStep ELISA® マイクロプレートのプロトコール

3. Huse M, et al . T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.  
Nat Immunol . 2006 Mar;7(3):247-55.

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