胞子を作らないのに100℃で死なない微生物
疎水性環境に暴露されることで誘導される
Rhodococcus属細菌の熱耐性とその応用を目指して

日本大学・生物資源科学部・応用生物科学科
准教授 岩淵 範之
2022年12月20日

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Rhodococcus 属細菌
 高G＋C含量，グラム陽性細菌，コリネ型細菌

 土壌，海洋など

ごくありふれた環境に生息

産業的有用性

微生物学的特徴

1）難分解性物質の分解・資化
PCB
石油など

1）高い細胞表面の疎水性
ミコール酸2）有用物質の生産
アクリルアミド
EPSなど

2）コロニー形態変化EPS
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細胞外多糖（ＥＰＳ）

ミコール酸膜グラム陽性菌でありながら陰性菌のような表層構造
細胞壁
細胞膜
細胞膜

細胞壁

アラビノガラクタン

ポリン

ガラクタン
タンパク質

細胞外多糖
ミコール酸

ミコール酸含有菌の細胞表層構造モデル

3多くのRhodococcus細菌は、培地／アルカン二相培養系で、アルカン相に移行して増殖する。

大腸菌

Rhodococcus細菌
アルカン大腸菌の細胞

水相

 水相に菌体を摂取
 水相で増殖する
 アルカンにより一部生育阻害

 水相に菌体を摂取
 アルカン相へ移行→増殖する
 疎水性環境下で生育できる極めて特徴的な細菌
4炭素数により、細胞の存在位置を変える
C6

油C8C10C12C14水

油

水C16C19C30水

水
油

油

生育

生育しない

外側

内側
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アルカン中のRhodococcus細菌の細胞は、シャペロニンを高発現して、アルカン耐性を獲得している。
 毒性緩和 ストレス応答

アルカン
毒性

シャペロニン発現量
無添加

表面

内部
シャペロニン
19.795

5.045

5.405

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胞子を作らないのに100℃で死なない微生物
一般に高い耐熱性を有する微生物は超好熱菌と呼ばれており、Methanopyrus属などの古細菌やThermus属などの真性細菌が知られています。また、Bacillus属などの胞子を有する場合も高い耐熱性を有することが知られています。
しかし、胞子も作らず、普段は25℃程度で生育する細菌が、突然100℃に耐えきれる耐熱性を獲得することはありません。もしあったら、それは微生物学界の常識を変える大発見です・・・ですが、それがあったんです。しかも、それは研究室での何気ない会話から生まれました。ここでは、この発見とその経緯をご覧ください。
78実際に100℃で10分間煮沸してみると・・・・

栄養培地

＋アルカン

熱処理前

栄養培地

＋アルカン

熱処理後

熱処理の＋アルカンが生えている
これじゃあ試験管洗えない・・・
9一方で、見方を変えると、この現象は・・・・
アルカン無添加添加

アルカンの中に細胞が入り込むことによって、通常では発現しない「熱耐性」の能力が誘導された、とも考えられる。

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より定量的な実験で確認・・・・

熱処理条件
100℃
10 minアルカン内の細胞は、加熱しても死滅しない

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実際にLIVE/DEAD染色をしてみると・・・

赤：死んだ細胞

黄色：生きている細胞の上に死んだ細胞がある状態

緑：生きている細胞

生きている細胞が観察された12ロドコッカス属細菌の培養方法及び高温耐性を有するロドコッカス属細菌の製造方法（特願2021-132730）
 Rhodococcus 属細菌の約70％が、水/疎水性液体の二相培養系において、細胞が水相から有機相に移行して、有機相で増殖する。
 有機相で増殖したRhodococcus 属細菌の細胞は、100℃で10 min以上加熱しても死滅しない。
 水/疎水性液体の二相培養系は、耐熱性の向上したRhodococcus 属細菌を製造するために有効である。
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他のアルカンでの効果
1.0E+10

熱処理前

1.0E+09

熱処理前

1.0E+08
1.0E+07

熱処理前

熱処理後

1.0E+06

熱処理後

1.0E+05
1.0E+04
1.0E+03
1.0E+02
1.0E+01
1.0E+00

熱処理後
IB2

IB2+C13IB2+C16

IB2培地にC13、C16を含む二相培養系で培養されたR. erythropolisNBRC100887株の細胞を用いた、熱処理の生菌数への影響☞他のアルカンでも同様の効果が見られた。

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加熱時間の影響
1.0E+08
1.0E+07

C13C16

1.0E+06
1.0E+05
1.0E+04
1.0E+03

0 min

5 min

10 min20 minIB2培地およびそれにC13、C16を含む二相培養系で培養されたR.
erythropolis NBRC100887株の生菌数に対する加熱時間の影響☞影響はほぼなかった。
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温度に対する影響
1.00E+10IB2
C13C16

1.00E+09
1.00E+08
1.00E+07
1.00E+06
1.00E+05
1.00E+04
1.00E+03

before

30℃

60℃

100℃

IB2培地およびそれにC13、C16を含む二相培養系で培養されたR.
erythropolis NBRC100887株の生菌数に対する加熱温度の影響☞60℃以上で大きな効果が見られた。
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各種Rhodococcus属細菌の他の疎水性溶媒に対する効果を見るための実験手順

IB2培地(+疎水性溶媒)で定常期まで培養。100℃で10加熱した後、プレートに植菌。位相差顕微鏡で細胞の位置を確認。
生育は++、+、±、-の4段階で定性的に評価。

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他の疎水性溶媒の効果
C13 C16 サラダ油 コーン油 オリーブ油 米油 紅花油 綿実油

Rhodococcus erythropolis ATCC47072 ++ ++ ++++

++

++

++

++

Rhodococcus erythropolis++

++

++

++

++

ATCC15076 ++ ++ ++++

++

++

++

++

ATCC170391 ++ ++ ++++

++

++

++

++

Rhodococcus rhodochrous ATCC12674 ++ ++ ++++++

++

++

++

Rhodococcus rhodochrous S-1++ ++ ++++++++++++

Rhodococcus rhodochrous R-2++ ++ ++++++++++++

Rhodococcus globerulus
Rhodococcus opacus

NBRC100887++ ++ ++
（PR4株）

供試した限り、菌株、アルカンや油の種類に関係なく、油の中（アルカン、食用油など）存在することで熱耐性を獲得した。

☞多くのRhodococcus属細菌に共通した性質
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競合技術との比較

多くの競合技術は、石油分解に特化したRhodococcus属細菌の性質を規定しているものであるが、本発明は対象の株に高温耐性を付与する技術であるため、基本的に異なり、また付加的要素として、従来技術の高度化も期待できる。

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想定される用途
 高温発酵への利用：細胞を転移させ培養させる油の種類が広範囲であること、熱耐性を誘導可能なRhodococcus属細菌の種類が広いことから、これまで 高温下では難しい／効率の悪い発酵生産や環境浄化の実現、効率化が可能になる。例えば、高温における発酵生産は、冷却設備費や冷却のためのランニングコストの削減，雑菌混入の抑制などのメリットがある。
 微生物製剤への利用：中小規模の食堂等のグリーストラップは、その運用の仕方で問題となっている場合が多い。Rhodococcus属細菌が食用として使われる油に対しても、転移して増殖した後、熱耐性が誘導されることから、これらの性質を利用すれば（温度をかけて運用することが可能なので）、グリーストラップを対象とした有効な微生物製剤が開発できる可能性が高い。

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想定される用途

続き

 耐熱性の高いシャペロニンの利用：シャペロニンは、変性したタンパク質のリフォールディングに関与す るタンパク質であるが、薬剤、遺伝子などを目的地（医療用の場合 は疾患のある場所）まで包み込んで運ぶためのカプセルとしての利用が期待されている（ドラッグデリバ
リーシステム、DDS）。油と熱は、菌にとって同様のストレスである。
これまでのRhodococcus属細菌の対溶媒性、耐熱性はこのシャペロニンの高発現によるものであり、同菌の性質からPR4株の（あるいはRhodococcus属細菌の）シャペロニンは、他の細菌のものよりも熱耐性が高いことが期待される。DDSでは、運ぶだけでなく、放出の場所、時期等も制御する必要があり、その調節に温度は重要な因子となっている。DDSでは様々なタイプの運搬装置が求められていることから、本シャペロニンは有効な素材であると考えられる。

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企業の皆様への要望
ここまで話したように、本技術開発では、
 高温下での発酵生産
 高温であっても油分分解が可能な微生物製剤（バイオレメデーション、グリーストラップなどへの適用）
 新たな特徴を持つシャペロニンタンパクの発見及びドラッグデリバリーシステムのキャリアとしての利用などの可能性を模索しております。この方向性で一緒に研究して頂ける方々を求めています。
また社会実装に向け、本性質の用途探索(従来技術の高度化含む)を一緒にして頂ける方々を求めています。
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お問い合わせ先
日本大学産官学連携知財センター(NUBIC)TEL：03－5275－8139
FAX：03－5275－8328
e-mail：nubic＠nihon-u.ac.jp
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