新学術領域研究「柔らかな分子系」ニュースレター

No. 15平成 26 年 11 月

業績紹介：タンパク質中のエネルギー散逸を時空間分解観測することに成功
水野 操 （阪大院理・A02 計画研究分担者）
石川 春人 （阪大院理・A02 計画研究分担者）
水谷 泰久 （阪大院理・A02 計画研究代表者）

し、エネルギー散逸の距離依存性を調べた。これらに加え、14 番目のトリプトファンを残した変異体、Trp14変異体についてもアンチストークススペクトルを測定した。前者 2 種の変異体は、大腸菌での発現量が著し

論 文 題 目 ： “Observing Vibrational Energy Flow in a

く低下し測定に必要な試料量が得られないという問題

Protein with the Spatial Resolution of a Single Amino Acidに直面したが、ベクターの交換、培養条件の最適化にResidue”

よって収量を約 10 倍に改善し、この問題を克服した。
3 種類の変異体の結果を比較した結果、熱源からの著者：Naoki Fujii, Misao Mizuno, Haruto Ishikawa, andYasuhisa Mizutani

距離が離れると、観測サイトでのエネルギーの伝達速雑誌巻号：J. Phys. Chem. Lett. 5, 3269–3273 (2014)

度が遅くなるということ、およびエネルギー量が低下することが明らかになった。これは、巨視的な熱拡散

巨視的には、エネルギーの散逸はフーリエの熱伝導の考え方と矛盾しない。しかし、3 種類の変異体の測の法則で記述される。では、系の空間スケールを原子定結果それぞれに、熱拡散方程式から得られた関数をの大きさまで小さくするとエネルギー散逸はどのよう当てはめると、同一のパラメーターでは表現できなかにみえるのだろうか？そんな素朴な疑問からこの研究った。これはナノメートル前後の微視的スケールでのはスタートした。

エネルギー伝達を考える際、巨視的な熱拡散方程式で原子の空間スケールでの伝導過程を調べるために、は、その挙動を適切に表現できないことを示している。

われわれは液相中で三次元構造を安定に保持している

本研究は、タンパク質内のエネルギー散逸をアミノヘムタンパク質を利用した。すなわち、熱源となる分酸残基の空間分解能で直接観測した初めての例であり、子としてヘムを、“温度”のプローブとしてタンパク質タンパク質分子内のエネルギーの流れを残基サイズのに含まれるトリプトファン残基のアンチストークスラ

空間分解能で研究する道を切り開いたものとして大きマンスペクトルを用いた。ヘムは可視領域に強い吸収な意義をもつ。次のステップとして、現在われわれは帯をもち、速い無輻射遷移を起こすために、光励起後エネルギー散逸の異方性について研究を行っている。

ピコ秒以内に吸収した光子エネルギーは振動エネルギーに変換される。このため、ヘムは非常に効率的なヒーター分子として働く。また、アンチストークスラマ
ン散乱は振動励起状態からのみ生じるため、分光学的な温度プローブとなる。
これまでにわれわれはチトクロム c を用いた原理検
証実験において、ヘムから放出されたエネルギーがタンパク質内を散逸する様子を実験的にとらえることに初めて成功し、この手法の有効性を示した 1。そこで次にわれわれは、異なる位置にトリプトファン残基をもつミオグロビン変異体を用いて、エネルギー散逸の時空間分解観測を試みた。試料に用いたマッコウクジ
ラ由来ミオグロビンにはトリプトファンが 2 残基含まれているため、まずこれらをラマン散乱強度の弱いチ

図 ヘムからの距離が異なるトリプトファン残基を用いてタンパク質内のエネルギー散逸を時空間分解観測した．

ロシン、フェニルアラニンに置換した変異体を作製した。そして、この変異体にプローブとなるトリプトファン残基を 1 残基導入した。ヘムから同じ方向で、か引用文献つ距離の異なった位置にトリプトファンを導入した変[1] N. Fujii; M. Mizuno; Y. Mizutani, J. Phys. Chem. B 115,

異体 2 種（Trp68 変異体および Trp28 変異体）を作製

13057-13064 (2011).

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No. 15平成 26 年 11 月

業績紹介：真正細菌由来のクロライドポンプ型ロドプシンの分光研究井上 圭一 （名工大・A03 計画研究連携研究者）
神取 秀樹 （名工大・A03 計画研究代表者）

実際に Fluvimarina pelagi 由来の Cl-ポンプ（FR）のアミノ酸の一致度は、HR と 23 %である一方、Na+ポンプとは 33 %と、機能の異なる Na+ポンプに近い配列を

論文題目：" Spectroscopic study of a light-driven chloride
ion pump from marine bacteria"
著 者 ： Keiichi Inoue, Faisal Hammad Mekky Koua,
Yoshitaka Kato, Rei Abe-Yoshizumi, and Hideki Kandori*
雑誌巻号：J. Phys. Chem. B 118, 11190-11199 (2014).

持っていた。そこで今回、我々は FR の分子論的な性質を機能測定や分光計測により解析した。
最初に FR のイオン輸送活性について調べたところ、
Cl-だけでなくほぼ同じ効率で Br-も輸送すること、効率は低いが I-や NO3-といった大きなアニオンも輸送す

微生物型ロドプシンは主に真正細菌や古細菌などのること、二価アニオンである SO42-は輸送しないことが単細胞微生物が持つ光受容型膜タンパク質であり、発わかった（図 2）。これらの性質は HR と同様であった

色団として all-trans レチナールを結合した 7 回膜貫通が、Cl-の結合能は Kd = 84 ± 4 mM と HR（Kd = 3 mM）型へリックス構造を持つ[1]。これまでに約 5,000 種をよりもかなり低いことが明らかになった。

超える微生物型ロドプシンが同定され、その大部分は次に過渡吸収測定により FR の光反応サイクルを調バクテリオロドプシン（BR）に代表される光駆動外向べたところ、サイクル中で長波長中間体である O 中間きプロトン（H+）ポンプである。BR ではレチナール体が最も多く蓄積することが分かった（図 3）。これはが光を吸収すると all-trans 型から 13-cis 型に光異性化

短波長中間体である L が主な中間体である HR と対照が起こり、それが引き起こすタンパク質の構造変化を的である。さらに O 中間体の生成時に Cl-が取り込ま通じて、細胞の内側から外側へ H+が輸送される。

れることも明らかとなった。通常レチナール Schiff 塩+以外のイオンをポンプするロドプシ基周辺に Cl-が結合すると短波長シフトが起こるが、こンとして長年知られているものに、高度好塩古細菌のの結果は O 中間体において Cl-がレチナールからかな光駆動クロライド（Cl-）ポンプ・ハロロドプシン（HR）り離れた部位に結合する事を示唆している。

その一方で H

以上の結果から、FR はアミノ酸配列的には HR よりがあり、HR は光を吸収すると細胞の外側から内側へ-を輸送する[1]。一方、海洋性細菌から数多くの新規も Na+ポンプに近いにも関わらず、HR と同じようなメロドプシンが見出される中、我々は昨年、ナトリウムカニズムで Cl-をポンプすることがわかった。この事実イオン（Na+）をポンプするロドプシンを報告した[3]。

は、シッフ塩基近傍に Cl-を結合させれば進化的に離れさらに今年になって HR とは異なるタイプの Cl-ポンプ

たタンパク質でも共通のメカニズムでポンプできるこClが報告された[3]。新規 Cl-ポンプは、BR において H+とを示唆しており、それは BR の Cl-ポンプへの機能転ポンプ機能に重要とされる Asp85 と Asp96 が Asn と換とも対応する[4]。今後は柔らかな分子系の研究課題である機能転換に挑戦したいと考えている。

Gln に置き換わった配列をしており（この配列は２つ[1][2][3][4]の残基の間に存在する Thr と合わせて NTQ モチーフと呼ばれ、Na+ポンプではさらに Thr が Asp へと変化した NDQ モチーフとなっている）、従来知られていたHR の TSA モチーフ型の配列とは大きく異なる（図 1）。

Ernst, O. P., et al. Chem. Rev. (2014), 114, 126.
Inoue, K., et al. Nat. Commun. (2013), 4, 1678.
Yoshizawa, S., et al. PNAS (2014), 111, 6732.
Sasaki, J., et al. Science (1995), 269, 73.

NaCl

pH (0.5 / div.)

CsCl
NaBr
NaI
NaNO3
Na2SO40100
Time / s200300

図 1. 真正細菌型（FR）と古細菌型（HR）
図 2. FR のアニオン輸送活性
クロライドポンプ77

図 3. FR の光反応サイクル

新学術領域研究「柔らかな分子系」ニュースレター

No. 15平成 26 年 11 月

藤井グループの芳川俊平さんが分子科学討論会優秀講演賞を受賞
宮﨑 充彦（東工大・A02 計画研究分担者）

り強い条件調整とスペクトル積算により、美しいスペクトルの測定に成功し、長年の課題に極めて分子科学

A02 班藤井グループ（東工大）の芳川俊平さん（修士的な解答を与えました。気相クラスターは、系を明確

課程 2 年生）が平成 26 年 9 月 21 日から 24 日まで広島に定義できる利点がある一方、化学反応の研究は進ん大学で開催された第 8 回分子科学討論会で優秀講演賞でいないのが実態であり、今回のような骨格振動の赤を受賞したことを報告いたします。

外分光による方法はこれからの発展が期待されます。

分子科学討論会は気相から固相、理論計算から最近
では生物系の現象まで化学現象全般の分子論を扱い、前身の分子構造総合討論会を含めると 1964 年から続いている由緒ある学会です。今回、芳川さんは口頭講演において丁々発止と質疑応答を交わし、優秀講演賞を修士 2 年にして受賞しました。講演タイトルは「1ナフトール・アンモニアクラスターの中赤外分光－プロトン移動反応のサイズ依存性－」です。
酸解離反応は最も簡単な化学反応のひとつであり、自然界においても非常に広範な重要性を持っていることから、その反応機構の理解は化学反応研究の最も基本となると考えられます。通常、酸分子であっても単量体では水素原子は共有結合、A–H で結合しています。
ここに塩基性の溶媒が加わると、徐々に分極が生じ、最終的にイオン性解離、A– + H+Bn に至ると考えられます。この際、単純だが最も分子科学的な疑問として、芳川さんと優秀講演賞の賞状。実験室にて。

「いくつの溶媒分子が酸解離に必要であるか」という問いがあります。一方で、酸分子を溶媒に溶かすと直ちに平衡に達する上に、反応には直接関与しない多数の溶媒分子の中から酸解離に必要な分子数を数えることは容易ではありません。
芳川さんは、この酸解離に要する溶媒数の特定を光励起により強酸になる１－ナフトールの気相アンモニア溶媒和クラスター（1-NpOH–(NH3)n）に対する励起状態赤外分光から明らかにしました。研究の要は骨格振動領域の赤外スペクトルに注目することで、プロトン移動反応に由来する 1-NpOH 分子の構造変化を明確に捉えることに成功しました。n = 0–4 では C–O 単結合の伸縮振動が 1350 cm−1 付近に徐々にブルーシフトしながら観測されますが、n ≥ 5 において消失し、変わってプロトン移動により生じる C=O 二重結合の（水素結合した）伸縮振動が 1500 cm−1 に現われます。他に
1-NpOH–(NH3)n (n = 0–7)の S1 状態の赤外スペクトルも共役の崩れたナフトール環の振動も観測できます。
この系は気相クラスター中の化学反応として最も初引用文献期に提案されたものですが[1]、以来 30 年ものあいだ[1] O. Cheshnovsky and S. Leutwyler, Chem. Phys. Lett.

決着が付いていなかった研究でした。芳川さんは、粘121, 1 (1985).

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No. 15平成 26 年 11 月

日仏合同シンポジウム招待講演及び欧州の研究室見学報告
浦島 周平 （理研・A02 計画研究協力者）頂いた。Bonn 教授の研究内容は多岐にわたるが、今回は空気/水界面といった界面研究の分野を中心に紹介本学術領域による若手研究者の研究促進のための旅して頂いた。
生憎 Bonn 教授が多忙を極めていたため、費支援を受け、2014 年 10 月 30 日から 11 月 9 日まで

当日はグループリーダーである Ellen Backus 博士が主の日程で日仏合同シンポジウムにおける招待講演、及体となって研究内容や装置の紹介に当たって頂いた。

び欧州のいくつかの研究室を訪問、見学する機会を頂また同じく Bonn 研究室で理論計算チームのグループいたので報告する。

リーダーを務める永田勇樹博士と、今後の界面研究の今回、パリ・サクレー研究所(CEA)に所属する浅見あり方や実験と理論の協奏の方向性について議論させ祐也博士の招待により、日仏合同シンポジウム(正式名て頂いた。

称：Japan-France Symposium on Biomolecular Structure

最後に訪問したのは、イギリス University of Eastand Function - Technical Fusion between Spectroscopy andAnglia、Stephan Meech 教授の研究室である。ここでは、Theory)にて、前所属（横浜市立大学・三枝研究室）に私の研究についてセミナーする機会を与えて頂き、前おける研究について口頭講演する機会を頂いた。この所属と現所属の研究の両方を簡単に紹介させて頂いた。

シンポジウムは孤立気相系における実験的・理論的研

Meech 教授は超高速分光測定の第一人者であるが、紹究が主軸となっており、日本人研究者 5 人、フランス介して頂いた中で最も大掛かりだったのは二次元可視の機関に属する研究者 5 人の講演が行われた。いずれスペクトルの測定装置である。この装置では、ビームの講演も 30 分というやや長い講演時間を与えられたスプリッターで 4 つに分けた極短パルスのそれぞれにが、それでも時間を超過して議論が続く場面が多く見ピエゾステージによる任意のディレイが掛けられ、そられた。私自身も途中設けられたコーヒーブレイクのれらがサンプルに集光される。特にピエゾステージの時間まで議論が白熱し、国内で口頭講演した際とは異一つは 50 アト秒という高精度で動作しており、質の高なる視点から研究を俯瞰することができた。本シンポい研究を行うための情熱を強く感じることができた。

ジウムの目的の一つとして日仏研究者の密な交流があ

また、この装置では一枚の二次元マップを得るのにわげられるが、その点において意見交換会は特に印象的ずか 1 分程度の測定時間しか要しないという点も衝撃であった。意見交換会は国内でよく見かける立食形式的であった。

ではなく、日仏の研究者が交互に座るよう定められた

最後に、シンポジウムへと招待して頂いた浅見博士、席につき、各々が雑談を交えながら和やかに議論を続研究室見学を快く受け入れて頂けた両教授とその研究けている姿は本シンポジウムを象徴する光景であった。

室のみなさん、そしてこのような貴重な機会に対するその後、ドイツ・マインツへと移動し、Max Planck旅費支援をして頂けた本学術領域に、この場を借りてInstitute にて Mischa Bonn 教授の研究室を見学させて心より御礼申し上げます。

Meech 教授、及び研究室の方々と日仏合同シンポジウムの参加者

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