Brain

Heart

タンパク質
Guide for Protein Analysis Services

受託解析カタログ

Lung

StomachIntestine

食品・生命科学研究所
プ ロ フ ェ ニ ッ ク ス 研 究 室〒559-8519
大阪市住之江区南港北1-24-22
TEL: 06-4703-2865
e-mail: proteome@ideacon.co.jp

目次

1. Outline
1-1 プロテオーム解析サービス概要

01

2. 2-D Electrophoresis
2-1 二次元電気泳動のご依頼について

02

2-2 二次元電気泳動用サンプル調製法

03

2-3 二次元電気泳動 Q&A

05

3. MS Analysis
3-1 タンパク質同定のご依頼について

06

3-2 質量分析計によるタンパク質同定のプロセス

07

3-3 タンパク質同定 Q&A

08

4. Focused Proteome
4-1 タンパク質相互作用(インタラクトーム)解析

09

DNA結合タンパク質の網羅的解析サービス
4-3 血清タンパク質の解析サービス
4-4 リン酸化タンパク質の網羅的解析
4-5 リン酸化サイト同定解析

10

4-2

11
12
13

5. Another Analysis
ウェスタンブロット解析
5-2 食品に含まれている食肉の生物種判定サービス
5-3 ペプチドプロファイリング(ClinProt )
5-1

TM

業績

14
15
16
17

1.Outline
1‑1

プロテオーム解析サービス概要
二次元電気泳動解析サービス
お客様からタンパク質溶液を送付していただ
き、当社にて等電点電気泳動(一次元)から
SDS-PAGE(二次元)を行い、複数サンプル間の比較解析を実施いたします。
18Ｘ20 cmもしくは24Ｘ20 cmのゲルを使用しますので、数千種類のタンパク質を分離することが可能です。
泳動像のスポットパターンを比較することで、ある生命現象に対応して特異的に変化するタ
ンパク質を発見できます。

タンパク質同定サービス
MALDI-MS/MSタイプの質量分析計を使用することで、エドマン法より高感度に解析することが可能です。
ゲルから切り出したバンドやスポットをお送りいただき、当社でのゲル内消化、ペプチド抽出を経て、質量分析による高精度のタンパ
ク質同定解析(MASCOTによる同定、内部配列解析)を行います。

解析サービスの流れ
二次元電気泳動からご依頼のお客様タンパク質同定をご依頼のお客様

プロフェニックス事業部

細胞・組織タンパク質溶液調製

Lysis Buffer送付
タンパク質定量
等電点電気泳動(1-D)
約1ヶ月
SDS-PAGE(2-D)

報告書確認

タンパク質精製報告書
ゲル片、溶液ゲル片切り出し
酵素消化
約2週間
質量分析
報告書確認

報告書

01

報告書確認

2. 2-D Electrophoresis

2-1

二次元電気泳動 の ご依頼 について
タンパク質の抽出 ※分解のリスクを避けるため、お客様側での調製をおすすめします
当社よりタンパク質抽出用の溶解溶液と抽出プロトコルをお送りしますので、サンプルの調製にご利用ください。当社にタンパク質抽出をお任せ頂く場合は、作業内容に応じて料金が設定されておりますのでお問合わせ頂けますようお願いいたします。
総タンパク質： 1 mg以上を推奨
サンプル濃度： 1～5 mg/mL※
塩濃度：
10 mM以下※感染性が疑われるサンプルの受け入れは、ウイルスチェッ
クを行って頂いた後になります。詳しくはお問合せください。
※イオン濃度が高いとスポットのフォーカスが悪くなります。
サンプル溶液の塩濃度は、10 mM以下(NaCl換算)でご調製ください。

二次元電気泳動の仕様
お預かりしたサンプルは、最初にタンパク質定量と電気伝導度測定を行います。タンパク質量が泳動の必要量に満たない場合はご連絡いたします。また、電気伝導度が高く、泳動を阻害する塩の混入が疑われる場合は、限外ろ過または有機溶媒沈殿による脱塩濃縮をご提案させて頂きます。
ゲルサイズ：
18Ｘ20 cm(標準), 24Ｘ20 cm(大型), 9Ｘ8 cm(ミニゲル)
等電点領域：
4-7, 3-10, 6-9, 6-11 ほか
分子量の分離レンジ： 10-200 kDaまで
アプライ量：
100-200 μg (18Ｘ20 cmゲルの場合)
染色：
SYPRO Ruby, Pro-Q Diamond, 銀, CBB など※等電点領域は、分離能と展開幅のバランスが良いpI 4-7と、広い領域をカバーするpI 3-10
をおすすめしております。

二次元電気泳動像の比較解析と報告書の返却
取得した二次元電気泳動像の比較解析を行います。大型ゲルによる高分解能の二次元電気泳
動像を解析する場合、サンプル間のスポットの比較を目視で行うには限界があります。膨大なスポット情報から有用な情報を引き出すため、画像解析ソフトウェアによる定量解析を行います。刺激の有無や経時変化に対応したスポットの出現・消失・増加・減少の情報を高い精度で得ることで、信頼性の高い解析結果をご提供いたします。
報告書は、閾値を超える濃度変化が起こったスポットに印を付けた分かりやすい体裁で納品いたします。報告書末尾には濃度差が大きいスポットを順に並べた同定候補リストを収載し、お客様とのディスカッションののちに質量分析のステージに進みます。

02

2‑2

サンプル調製法

二次元電気泳動用

接着性培養細胞

動物組織
1. 試薬

1. 装置と器具
セルスクレイパー◆タンパク質溶解溶液（Lysis Buffer）
左項参照

2. 試薬
※ヒト皮膚由来のケラチンの混入を防ぐため、実験操作の際

タンパク質溶解溶液（Lysis Buffer）◆には清浄な手袋をご着用ください。

6 M 尿素2 M チオ尿素
2% CHAPS
1% Triton X-100
1% DTT

2. 操作

分注して冷凍保存(短期では-20℃、長期では-80℃)◆

PBS(-)※ヒト皮膚由来のケラチンの混入を防ぐため、実験操作の際に1.

麻酔した動物から目的の臓器あるいは組織を採取します。

2.

必要であれば切除した臓器あるいは組織を氷冷PBS(-)
で脱血します。タンパク質の分解を防ぐため手早く行うように注意してください。

3. 組織をはさみで切り刻み、PBS(-)で洗浄します。

は清浄な手袋をご着用ください。

4.

組織の重さ(A g)の5倍量のタンパク質溶解溶液（5 x
A mL)を加え、ホモジナイズします(当社ではポリトロンを使用)。ガラスホモジナイザーを使った場合には、組織の残渣が見られる場合があるので、残渣が見られた場合にはソニケーターで可溶化させます。

5.

可溶化後、20,000 x g、20℃で30分間遠心し、上清を取って電気泳動のサンプルとします。溶解液は高濃度の尿素/チオ尿素を含むため、4℃で遠心操作を行うと析出しますのでご注意ください。冷凍保存(短期では20℃、長期保存では-80℃)のうえ、冷凍の宅配便で当社へご送付ください。

3. 方法（直径10 cmシャーレの場合）
1. 培養細胞の培地をアスピレーションで除き、PBS(-)10 mLを
すばやく入れます。通常は氷冷PBS(-)が推奨されますが、温度は実験の目的にあわせてご検討ください。PBS(-)を入れるときは、細胞がはがれないように注意しながらシャーレの側面から入れてください。はがれやすい細胞の場合にはPBS(+)のご利用をご検討ください。
2.

手で軽くゆらしながら、まんべんなく細胞表面を洗い、PBS(-)を捨ててください。この操作を3〜5回繰り返します。残ったPBS(-)はシャーレを傾け、アスピレーターも
しくはピペットを使って完全に除去します。PBS(-)は塩を含むので、なるべく残らないように気をつけてください。

3.

シャーレ1枚につきタンパク質溶解溶液0.5 mL加え、セル
スクレイパーでかき混ぜて細胞を溶解します。

4.

複数枚のシャーレを調製する場合は、まず枚数分のタン
パク質溶解溶液を最初のシャーレに加えます。2枚目のシャーレの細胞を洗浄後、最初のシャーレに加えたタンパク質
溶解溶液を2枚目に移していきます。

5.

チューブに回収後、遠心して不溶物を除去します（遠心20,000 x g、30分、20℃）。

6.

遠心後の上清をサンプルとし、ペレットを加えないように注意して新しいチューブに移します。冷凍保存(短期では-20℃、長期保存では-80℃)のうえ、冷凍の宅配便で当社へご送付ください。

※組織によって異なりますが、動物由来の組織では概算で湿重量の約2-8%がタンパク質となります。
参考文献
1. 「図説 動物実験の手技手法」、緒方 規矩雄ISBN 4-320-05255-2）
2．Rabilloud, T., Electrophoresis, 18, 307 (1997)

6※目安として、10 個のヒト真皮由来正常繊維芽細胞から、約0.5 mgのタンパク質が得られます。
参考文献
Rabilloud, T., Electrophoresis, 18, 307 (1997)

03

監、1981（共立出版,

植物組織／植物細胞

液体培養細菌
細菌の種類や培地によって最適な抽出法は異なります。一例をご紹介します。

植物の種類や組織によって最適な抽出方法は異なります。一例をご紹介
します。

1. 試薬

1. 試薬

◆ タンパク質溶解溶液（Lysis buffer）
前頁参照◆

タンパク質溶解溶液 (Lysis buffer)
前頁参照

10 mMリン酸バッファー(pH 7.4)
Na HPO ・12H O 1.77 g
NaH PO
0.27 g→MilliQ水で1,000 mLとする◆抽出Buffer
0.5 M Tris-HCl Stock
5.0 mL (50 mM)
EDTA
18.6 mg ( 1 mM)
100 mM PMSF Stock
0.5 mL ( 1 mM)
DTT
7.7 mg ( 1 mM)→MilliQ 水で50 mLとする◆

0.5 M Tris-HCl Stock
Tris base→HClでpH 7.5に調製→MilliQ水で50 mLとする

◆

2

4

2

2

4

※ヒト皮膚由来ケラチンの混入を防ぐため、実験操作の際には清浄な手袋をご着用ください。

2. 方法
1. 培養液を8,000 rpm、10 min、4℃で遠心分離を行い、菌体を※１,2ペレットにします。

◆ 100 mM PMSF Stock
PMSF
0.17 g→メタノール 10 mLに溶解する

2. 上清を完全に除いた後、培養液の半量の10 mMリン酸バッ
ファー(pH 7.4)を加えて菌体を再懸濁し、再び遠心分離でペレットにします。この操作を3回繰り返して洗浄を行いま※3す 。

※ヒト皮膚由来のケラチンの混入を防ぐため、実験操作の際には清浄な手袋をご着用ください。

3. 上清を完全に除き、タンパク質溶解溶液 1 mLを加え、ピペッティングまたはボルテックスで完全に懸濁して溶液を均一化させます。溶解液を20,000 x g、30 min、20℃で遠心分※4離し、不溶性物質を沈殿させます 。

2. 操作
1. 液体窒素を入れた乳鉢に試料組織(1〜2 g)を入れ、凍結状態で粉状になるまで破砕します。この際、3％ (w/v)になるよ
うにPVP (Polyvinylpyrolidone)を加えます。

4. 上清を回収して新しいチューブに移します。冷凍保存（短期では-20℃、長期保存では-80℃）のうえ、冷凍の宅配便で当社へご送付ください。
※1
※2
※3
※4

3.

2. 試料が溶け始める前に、氷冷した抽出Buffer(試料重量に対し10倍量)を添加してよく混和します。

集菌条件は、実験の目的にあわせてご検討ください。
培養液量は下記資料(3.菌体数とサンプル量について)を参考にしてください。
洗浄用バッファーの組成や温度は実験の目的にあわせてご検討ください。
冷却すると尿素等が析出しますので、室温で遠心してください。

3. 液状になったところでマイクロチューブ等に移し、20,000 x
g, 30 min, 4℃で遠心分離後、上清を回収します。
4. 得られた上清を0.45 μmフィルターもしくはミラクロスに通してろ過し、混入した残渣等を完全に除去します。

菌体数とサンプル量について

5. 上清を少量取ってタンパク質定量を行います。

二次元電気泳動に最低限必要な量は約100 μgですが、タンパク質定量やタンパク質同定分析、複数回の二次元電気泳動分析に備えるため、1 mg以上のタンパク質をご用意ください。

6. 泳動量ごとにチューブに分注し、等量の20％ (v/v) TCAを加えて混和後、氷上で30分間静置します。
7. 20,000 x g, 30 min, 4℃で遠心分離後、上清を除去します。

【1 mgのタンパク質の調製に必要な菌体数（大腸菌の場合）】

8. 得られた沈殿に冷アセトン1 mLを加え、軽くボルテックス
した後に20,000 x g, 15 min, 4℃にて遠心します。この操作をもう一度繰り返します。

-15

大腸菌細胞1個の体積：1x10 Liter,
細胞内タンパク質濃度：200〜320 mg/mL
991 mg protein ＝3.1×10 〜5.0x10 Cells

3.03 g※5

9. アセトンを除去した後、タンパク質溶解溶液適量に溶解します。

※5 カナダ アルバータ大学 Project Cyber Cell, E. coli Statisticsより
http://redpoll.pharmacy.ualberta.ca/CCDB/cgi-bin/STAT_NEW.cgi

10. 冷凍保存(短期では-20℃、長期保存では-80℃)のうえ、冷凍の宅配便にて当社へご送付ください。

04

2‑3

二次元電気泳動 Q&A

二次元電気泳動解析に関して、お客様から多く寄せられたご質問についてお答えいたします。

1. サンプルの量はどのくらい必要ですか？

7. サンプルや泳動したゲルは保管できますか？

二次元電気泳動の比較解析には、最低100μgのタンパク質が必要です。再現性の確認や、同定分析用のゲルを別に用意する場合に備えて、1 mg以上のサンプルをご用意ください。

残ったサンプル溶液は -80℃で保存します。銀染色やCBB染色
後のゲルは乾燥させて、SYPRO Ruby染色のゲルはシールバッ
クで保存します。保存期間は、泳動日より3ヶ月です。

2. サンプルの調製はどのようにするのですか？

8. 染色方法について教えてください。

当社からご送付するLysis bufferを用いてサンプルをご調製ください。培養細胞、組織、微生物からの抽出プロトコルをご用意しております。特殊なサンプルの場合はご相談ください。

二次元電気泳動の比較解析には、高感度かつダイナミックレンジが広く定量性が高いSYPRO Ruby染色で行います。タンパク質同定が目的の場合は、銀染色やCBB染色を行います。

3. サンプルの送付方法について教えてください。

9. リン酸化タンパク質の二次元電気泳動分析と冷凍の宅配便で平日18時までに弊社プロフェニックス研究室へは？
到着するようにお送りください。ドライアイスをご利用いただ
リン酸化タンパク質に結合する蛍光色素による染色(Pro-Q
くことをおすすめいたします。分析依頼書をお送りしますので、Diamond染色)を行います。リン酸基に対して色素が結合するたサンプルに同封するかFAX、e-mail添付でご返送ください。
め定量性がありませんが、定量性の高いSYPRO Rubyで二重染色することでサンプル間のリン酸化の程度を解析します。
〒559-8519
大阪市住之江区南港北1-24-22
10. 転写因子などの微量タンパク質は検出できま
いであ株式会社 食品生命科学研究所
すか？
プロフェニックス研究室
SYPRO Ruby染色の検出限界は1 ng程度です。60 kDaのタンパ
電話:06-4703-2865 FAX:06-4703-2856
10ク質を例にしますと、1ngは1.0 x 10 個のタンパク質分子にe-mail:proteome@ideacon.co.jp
3
相当します。微量タンパク質が1細胞に10 分子存在する場合は、
7
10 個の細胞(約 5 mg protein)を分析する必要があります。この場
4. サンプルの濃度はどのくらいが適当ですか？
合、1枚のゲルに泳動するのは難しいので、目的のタンパク質
サンプルのタンパク質濃度は1 mg/mL以上になるように調製しだけを部分精製するなどの処理が必要になります。
てください。濃度が0.3 mg/mL 以下ですとサンプルを濃縮する必要があります。

11. 異なる位置のスポットが同じタンパク質と同定されましたが、なぜですか？

5. どのpIレンジで泳動を行うべきでしょうか？
注目するpIレンジがない場合は、pI 4-7 かpI 3-10 をおすすめしております。pI 4-7 は泳動像の展開幅と再現性のバランスが良いレンジです。pI 3-10 はpI 4-7 に比べ分離能がやや劣りますが、酸性から塩基性まで幅広いスポット情報を得ることができます。

6. 二次元電気泳動像の定量的分析とは？
二次元電気泳動解析ソフトウェアによって電気泳動イメージからスポットを検出し、各スポット強度を数値化します。複数の泳動ゲルイメージを重ね合わせて各スポットのマッチングを行います。各スポット強度を表やグラフによって出力することができます。例えば、2倍以上の強度差を持つスポットなど、研究者の希望にそったスポット選出が可能です。

05

リン酸化や糖鎖付加などの翻訳後修飾や、配列が異なるアイソ
フォームなど、同じタンパク質でも等電点と分子量が異なる
variantsが存在します。等電点方向に並んでいるスポットはリン酸化の修飾などが、斜めに並んでいるスポットは糖鎖付加が考えられます。大きく異なる位置に分解産物のスポットが観察されることもあります。

12. スポット濃度に変化があったタンパク質の遺伝子発現を調べると、遺伝子の転写量に変化がないのですが、なぜでしょうか？
二次元電気泳動におけるスポットの変化は、タンパク質の存在量の変化だけを示すものではありません。リン酸化などの翻訳後修飾や部分的切断によってタンパク質の等電点と分子量が変化し、結果的にスポットの座標や濃度の変化として観察されます。
二次元電気泳動分析では、遺伝子解析では得られない情報にも着目されることをおすすめいたします。

3.MS Analysis
3‑1

タンパク質同定 の ご依頼 について

電気泳動についてお客様のご研究室で電気泳動を行う場合は、プレキャストゲルを使用されることをおすすめいたします。
器具類をよく洗浄しケラチンなどのコンタミネーションにご注意ください。特に冬季の乾燥する時期は、
静電気によるウール製品からのコンタミネーションにもご配慮ください。

染色キットについて
銀染色の場合、グルタルアルデヒド(架橋性固定剤)を含まない処方で固定・染色してください。質量分析に阻害的ではないキットには、ATTO EzStain Silver(AE-1360)、コスモ･バイオ 2D-銀染色試薬・Ⅱ(423413)、富士
フィルム和光 Negative Gel Stain MS Kit (293-57701)などがあります。CBB染色の場合、脱色が難しいほど染まっているスポットは同定成功率が低下します。長時間の染色はお避けください。

必要なサンプル量について確実な同定結果をお返しするため、CBB染色で染まる程度の量(1 pmole以上)をご用意いただくことをおすすめいたします。

ゲルから切り出す際の手順と注意
ヒトケラチンのコンタミネーションを防ぐために清浄な手袋を付け、泳動用ガラ
ス板、泳動槽、染色バットなどを充分に洗浄してください。
清浄なメスもしくはカミソリを用いて解析ご希望のバンドを切り出してください。
その際、余分なアクリルアミドゲルが存在しますとペプチドの抽出効率が下がりますので、できるだけ染色されたバンドのみを切り抜いてください。

A

B

サンプルのご送付(1)乾燥させたゲル片
微量遠心チューブに入れて室温でお送りください。
(2)ウェットなゲル片
ゲル片だけを微量遠心チューブに入れて、4℃の冷蔵宅配便でお送りください。
(3)液体のタンパク質溶液
微量遠心チ
ューブに入れていただき、輸送中の飛散防止のため-20℃の冷凍宅配便でお送りください。
※質量分析計による同定可能性をお見積もりしますので、サンプルの推定量と泳動像をお知らせください。

報告書の返却報告書は電子ファイル(PDF, HTMLなど)をeメールに添付してお返しいたします。
ファイルにはNCBInr等データベース検索の結果を掲載します。
de novo解析の場合は推定配列と根拠となるMS/MSスペクトル
データを掲載します。
情報漏えいのリスクについて
弊社の質量分析関連機器はクローズドLANで運営されております。
NCBInr等の配列情報は一度クローズドLAN内にデータをダウンロードして検索を行いますので、お客様の解析データが外部に漏れる心配はご
ざいません。

06

3‑2

質量分析計によるタンパク質同定のプロセス

タンパク質全体

酵素消化
トリプシン消化ペプチドの質量を測定

酵素消化ペプチド

Peptide Mass
Fingerprinting

タンパク質を酵素(トリプシンなど)で消化したときに生成する予想ペプチドのデータベース
上の質量リストと、得られた測定結果を比較します。

イオン強度

PMF

イオン質量

ペプチドの
単離と分解

ペプチド分解物の質量を測定

ペプチド結合をランダムな位置で崩壊させた分解物の質量を測定します。データベース上の予想ペプチド分解物の質量リストと測定結果を比較します。

イオン強度

MS/MS
Ion Search
ペプチド分解物

イオン質量※DNAデータベースがない場合
ペプチド分解物の質量ピーク差を計算

de novo
シーケンス

イオン数

当社ではMS/MS Ion Searchによる解析を標準で行っております。一部のサンプルにつきましては、PMF解析を併用することによって確実な同定結果をお返ししています。

K E G S

Y

イオン質量

07

MS/MS Ion search分析と同じス
ペクトルデータを使用します。
各ペプチド分解物の質量ピークの差はアミノ酸残基の質量と一致するため、そのピークの差を一つずつ確認することによってアミノ酸配列を決定していきます。

3‑3タンパク質同定 Q&Aタンパク質同定分析に関して、お客様から多く寄せられた事項についてお答えいたします。

1. サンプルの量はどのくらい必要ですか？

8. サンプル量が少ない場合は？

分析は100 fmol以上からお受けいたします。確実な同定結果を得
サンプル量が少ない場合は、複数のレーンから該当バンドを切り抜るために、1 pmol以上をご用意頂くことをおすすめします。特に、
くことによって量を確保してください。基本的には1レーンに泳動す
ゲノム解析が終了していない生物種の場合は、アミノ酸配列決定
る量を増やして濃いバンドをご用意いただけますようお願いいたしのためにS/N比の高いデータを取得する必要がありますので、サます。ゲルの体積が増えるとゲル由来の夾雑物も増えますので、5レーンプルはできるだけ多くご用意ください。
ンまでを目安にしてください。

2. サンプルの送付方法について教えてください。

SDS-PAGEによって分離されたバンドの染まっている部分だけ 9. 膜に転写しても大丈夫ですか？
を切り抜いてお送りください。切り出す時には、ケラチンの混 膜に転写されたサンプルも解析可能ですが、漏出ポリマーによる入にご注意ください。ゲル片は、1.5 mLのチューブに入れて、 悪影響が生じやすいため、ゲル片からの分析をおすすめします。
冷蔵の宅配便で平日の18時までに当社に到着するようにご手配
10. N末端/C末端の配列分析は可能でしょうか？
ください。液体のサンプルは冷凍してください。お送りした分
析依頼書に必要事項をご記入のうえ、サンプルに同封するかFAX、 タンパク質をトリプシン消化したあとに、C末やN末を含む消化ペプチドがイオン化して質量分析計で検出できれば可能です。しeメールでご返送ください。
かしながら、それらのペプチドの検出可能性を事前に推定することはできません。
3. PMF分析について教えてください。
PMF(ペプチドマスフィンガープリント)分析は、タンパク質を酵素(トリプシンなど)で消化した際に生成したペプチド群の質
量と、データベースの登録配列から予測した仮想消化ペプチドの質量とを照合してタンパク質を同定する手法です。

4. MS/MSイオンサーチ分析とは何ですか？
質量分析計内部で単離したペプチドをアルゴンガスに衝突させると、ペプチド結合の任意の位置で壊れるためアミノ酸配列に応じた分解物が得られます。登録配列から予測した分解物の予測質量と分解物の実測値を照合してタンパク質を同定する手法です。
PMF分析に比べると、同定の蓋然性が極めて高くなります。

5. アミノ酸配列決定分析とは何ですか？
ペプチド分解物を測定したマススペクトルのピーク幅と並びを読むことで、既知の配列データを必要とせずにアミノ酸配列を決定できます。このため、デノボ(de novo)解析とも呼ばれます。
配列の決定に際しては、S/N比の高いスペクトルを得る必要があり、充分なサンプル量(pmolオーダー)が必要になります。

6. MASCOTとは何ですか？
PMF分析やMS/MSイオンサーチ分析の際に実測値と予測値を照合させるためのソフトウェアで、Matrix Science社の製品です。
NCBInrやSWISS-PROT等の登録配列から計算した消化ペプチドやその分解物の質量の予測値と実測値を比較します。

7. Mowse Scoreとは何ですか？
MASCOT検索を行うと、レポート上部に"Mowse Score"が記載されています。これは実測配列と登録配列がどのくらい一致するかを
確率論的に表したものです。Mowse Scoreが高いほど、データの蓋然性が高まります。

08

11. 翻訳後修飾の解析は可能でしょうか？
修飾されたペプチドがイオン化して観察できれば、修飾基や修飾部位の特定が可能です。しかし、リン酸化修飾ペプチドなど
はイオン化しにくくなるため、修飾ペプチドだけを濃縮する操作が必要になります。

12. バンドに複数のタンパク質が含まれている場
合、解析できますか？
複数のタンパク質が含まれていても、各タンパク質の消化ペプ
チドのピークが観察されれば、それぞれ同定が可能です。しかし、複数のタンパク質のうち、どれが相対的に高濃度であったかは決定できません。

4.Focused Proteome

4-1

タンパク質 相互作用(インタラクトーム)解析

Pull-down法は特定のタンパク質に対して相互作用するタンパク質(interactome)を探索する技術として有効な解析手法のひとつです。タグペプチドを結合させたベイトタンパク質と相互作用するタンパク質を免疫沈降で分離し、得られたタンパク質を質量分析計を用いて同定します。

お客様
ベイトタンパク質

プロフェニックス
タグペプチドタンパク質複合体の形成(in vitro)※1

タグ付きタンパク質の作成

タンパク質複合体の分離（免疫沈降）
タンパク質溶液
M.W.
Large※1 タグ付きタンパク質の作製サー
ビスはお問合せください。
※2 分離されたタンパク質が多数存在する場合は、二次元電気泳動を用いた分離も可能です。

－

タンパク質の精製※2(SDS-PAGE)
＋

Small

質量分析計を用いたタンパク質の同定

特徴● タグ付きタンパク質の作製から質量分析による同定までトータルで実験をサポートします。
● 核内転写因子複合体などの解析にも最適です。
● 目的に応じてタンパク質の発現系（in vitro・大腸菌・真核細胞・カイコなど）を選択できます。
● 部分的なコース解析も選択可能です。

09

4‑2

D N A結 合タ ンパク質 の網羅的解 析サービス

DNA結合タンパク質の多くは、遺伝子の発現調節やクロマチンの高次構造形成に関与しており、細胞の機能や生理現象を研究する上で非常に重要な分子だと考えられています。このサービスでは細胞から核タンパク質を非変性条件で抽出し、DNAに親和性のあるタンパク質をDNA結合ビーズを用いて分離します。分離されたDNA
結合タンパク質は、高感度の質量分析計を用いて同定します。

お客様

プロフェニックス

培養細胞

タンパク質複合体の分離（免疫沈降）※1※2

核タンパク質の抽出

溶出7※1：ホ乳類培養細胞（マウス3T3細胞の場合）では10 個以上の細胞をご調製ください。抽出は非変性状態で
行います。

M.W.
Large

−

タンパク質の精製※3(SDS-PAGE)※2：結合タンパク質の溶出は高塩濃度バッファーを用いて行います。
※3：分離されたタンパク質が多数存在する場合は、二次元電気泳動を用いた精製（オプション）も可能です。

Small

＋

質量分析計を用いたタンパク質の同定

特徴● 核タンパク質の抽出から質量分析によるタンパク質の同定までトータルで実験をサポートします。
● 細胞内タンパク質の分画とDNA親和性に基づく濃縮の両方を行うため、低発現量タンパク質の解析にもご利用できます。
● それぞれのステップごとの解析も承ります。
● 標準プロトコルでは、ビーズに結合させるDNAにはウシ胸腺DNAを使用しますが、その他の特異的配列を有する
DNAも対応可能です。詳細はお問い合わせください。

10

4‑3

血 清 タン パク質 の解 析サー ビス

疾病の指標となるバイオマーカーは、創薬プロセスで重要な役割を果たします。血清にはタンパク質バイオマーカーが必ず含まれ、採取の際の侵襲性が低いことから研究・診断の対象となっています。しかし、アルブミンをはじめとする含量が極めて高いタンパク質の存在が分析の障害になってきました。このサービスでは、抗体カラムを用いて血清中の高含量タンパク質を取り除き、バイオマーカーとなる低発現タンパク質を解析します。処理後のサンプルは、高い分解能を持つ大型二次元電気泳動でプロファイルされ、微量のバイオマーカーの検出を可能にします。

お客様

プロフェニックス
血清

抗体カラム処理吸着画分(高含量タンパク質)

採血と血清処理

Albumin, IgG など

非吸着画分(低発現タンパク質)
タンパク質溶液に転溶

泳動条件
サンプル： 左 ヒト血清 (除去前)
右 ヒト血清 (除去後)サンプル量：10 μL (0.816 mg)
一次元：
pI 3-10, 18cm IPG strip gel
二次元：
18 cmアクリルアミド濃度勾配ゲル
染色：
SYPRO Ruby染色
番号タン パク質名

1
2
3
4
5
6
7
8
9

IgA S CHAIN
TRANSFERRINSERUM ALBUMIN
IgG HEAVY CHAIN
α1-ANTITRYPSIN
IgG LIGHT CHAIN
HAPTOGLOBIN
HAPTOGLOBIN α2 CHAIN
HAPTOGLOBIN α1 CHAIN

二次元電気泳動

解析例※ヒト由来サンプルの場合にはサンプルの安全性に関する情報提供をお願いします。

特徴● 抗体カラム処理を行うことにより、アルブミン、トランスフェリン、IgG、IgA、ハプトグロビン、アンチトリプシンなどの高含量タンパク質を血清サンプルから取り除きます。
● 処理後の血清サンプルはご指定の条件で二次元電気泳動分析いたします。
● 血清タンパク質の90%が取り除かれ、血清中の微量タンパク質を約10倍濃縮する効果が得られます。
● 血清以外にも関節液、脳脊髄液などの組織液への適用が可能です。
● 対応生物種は、ヒトおよびマウス・ラットとなります。他の生物種につきましてはご相談ください。

11

4‑4

リ ン 酸化 タンパ ク質 の 網羅 的解 析

リン酸化タンパク質を精製濃縮することで、細胞中に微量に発現したリン酸化タンパク質を網羅的に解析し
ます。

お客様

プロフェニックス
細胞抽出液

リン酸化タンパク質
濃縮カラム
溶出画分

タンパク質抽出

P

解析例

P

P

マウスES細胞は増殖因子の一種である
Leukemia inhibitory factor (LIF)の添加によって、多能性を維持した状態で培養が可能です。この機構にはJAK-STAT3シグナ
ル伝達系の活性化が重要であることがわ
かっていますが、それ以外のシグナル系も重要と考えられています。そこで、LIFを添加することでES細胞内のリン酸化タ
ンパク質がどのように変動するか、リン酸化タンパク質に親和性のあるカラムと二次元電気泳動・質量分析計を用いて、網羅的な解析をおこないました。

結合画分(リン酸化タンパク質)

PP

二次元電気泳動

ES LIF (+)

ES LIF (-)※カラム濃縮により全タンパク質の約10％がリン酸化タンパク質画分として回収されました。
※リン酸化タンパク質画分を二次元電気泳動
したところ、LIFの有無によって変動するスポットを多数検出することができました(右図○)。
※本研究は広島大学大学院理学研究科発生生物学研究室との共同で行われました。
(2002-2004年)
30 mg proteins, SYPRO Ruby染色, pI 4-7

特徴● リン酸化タンパク質と非リン酸化タンパク質を分離します。
● 濃縮することで、発現量の低いリン酸化タンパク質が検出可能です。
● 濃縮後は大型二次元電気泳動で網羅的に解析いたします。
● リン酸化サイトの決定に関しては、次頁をご覧ください。

12

4-5

リン酸化サイト同定解析

タンパク質は様々な翻訳後修飾を受けることによって本来の機能を発揮します。なかでも、リン酸化は細胞の増殖の調節や酵素の活性、細胞内シグナル伝達などに関わる重要な生命現象です。しかし、リン酸化のような翻訳
後修飾は遺伝子解析では推定することが出来ず、タンパク質を直接解析することが必要です。本サービスでは、
高感度質量分析計 ultrafleXtreme TOF/TOF (Bruker Daltonics社製)を用いて、リン酸化サイト同定解析を行います。

お客様

プロフェニックス
複数酵素で消化・切断

0

0

5

リン酸化カルシウム沈殿

リン酸化
タンパク質溶液
必要量：10 pmol以上

疎水性チップ処理

ultrafleXtreme TOF/TOF
解析例
結果１ 混合物のペプチドマス分析

結果２ リン酸化ペプチドの内部配列分析

精製前はBSA由来の非リン酸化ペプ
チドだけが検出され、β-casein由来のリン酸化ペプチドは検出されませんでしたが、精製後はリン酸化ペプ
チドのみが検出されました。

検出されたリン酸化ペプチドの内部配列を分析することにより、リン酸化されているアミノ酸を特定することがで
きました。

特徴
● リン酸化タンパク質を数種のタンパク質分解酵素（Trypsin、Asp-N、Glu-Cなど）で切断することにより、検出ペプチドのカバー率を高めます。
● リン酸化ペプチドの精製が成否のカギです。蓄積したノウハウを用いて、リン酸化ペプチドを多段精製します。
● 最適な解析プロセス（適切な濃縮精製ステップと酵素選択）をご提案するために、解析対象の配列情報を提供していただく必要がございます。守秘契約の雛形をご用意しておりますので、お問合わせください。

13

5.Another Analysis
5‑1ウェスタンブロット解析

ウェスタンブロット解析では、抗体濃度、S/N比、非特異的シグナルの判断などの条件検討が不可欠です。綿密な文献調査を行いますので、タンパク質抽出法や抗体の選定についてもご相談ください。

お客様

プロフェニックス
M.W.
Large

−

電気泳動
＋

Small

※3

ブロッティング※1

タンパク質溶液

Detect
2nd Ab

1st Ab1次抗体と反応
2次抗体と反応
※4

検出

※2

1次抗体

Protein※1 ヒトの未変性サンプルの場合は、感染性がないことを証明していただく必要があります。この場合、先にタンパク質濃度を測定し、SDS+DTTのボイル処理などで完全に失活させてあれば問題ありません。
※2 1次抗体はお客様でご用意ください。
※3 ブロッティングは転写効率の良いタンク式で行います。
※4 検出は化学発光法(ECL)を採用しております。
○解析料金はゲル1枚あたりの価格です。12検体まで同一料金で承ります。
○サンプル溶液と抗体のマッチングから、全ての実験系で検出が可能になるわけではないことをご了承ください。
○感度を上げるとS/N比が悪くなる場合があります。

特徴● ご用意いただくものは調製済みのタンパク質溶液と1次抗体です。
● 条件を変更しながら数度にわたり試験し、最適な条件を検討します。
● ラージゲルによる二次元電気泳動のブロッティングも可能です。

14

5‑2

食 品 に含 まれて い る 食肉 の 生物種 判定 サービス

近年の食肉部位偽装・産地偽装などに対応するべく、食品中の食肉の生物種を判定します。このサービス
は複数の解析法をご用意しておりますので、下記のいずれかをご選択いただけます。

お客様

プロフェニックス(1) PCRによる食肉動物種別DNA検査
Original

species-specific primer

1 cycle2 cycle食品(生肉、加工肉 など)

3,4,5,.....n cycles(2) ウェスタンブロットによる食肉動物種識別抗体検査
Detect
2nd Ab

1st AbElectrophoresis
Protein(3) プロテオーム解析による食肉動物種識別タンパク質検査

特徴(1) PCRによる食肉動物種識別DNA検査○超高感度、低コスト○ご指定生物種の混在確認（陰性／陽性）○偽装以外にも、生産設備共用あるいは動物由来油脂の使用などによる微量の混入が検出される可能性があります。
検出のエンドポイントについてはご相談ください。
(2) ウエスタンブロットによる食肉動物種識別抗体検査○高感度○ご指定生物種の混在確認（陰性／陽性）○内臓肉の判定も可能です。
(3) プロテオーム解析による食肉動物種識別タンパク質検査○高感度○事前の種の指定が不要です。検出した種の全てをリストアップできます。
○内臓肉の判定も可能です。

15

5-3

ペプチドプロファイリング(ClinProtTM)

ClinProt システム(Bruker Daltonics)を用いたバイオマーカーの探索サービスです。ペプチドに特化して多検体統計解析をすることで短時間でプロファイルを作成し、バイオマーカーとなるタンパク質を発見します。
TM
ClinProt 磁性ビーズは、特殊な機能表面を有する微粒子で、体液や組織、細胞培養液中にある目的のタンパク質やペプチドを物理的特性に基づいて選択的に結合します。結合した物質は、質量分析計(ultrafleXtreme
Tof/Tof)を用いて比較解析します。
TM

お客様

プロフェニックス
試料にClinProt

タンパク質溶液、血液、血清、体液、液体状の食品、環境水 などTM
磁性ビーズを添加

ビーズと複合体の形成

SS

ビーズ複合体の磁石による分離

N
N
SS

洗浄

N
N

溶出
質量分析計を用いた
プロファイリング特徴● ビーズ機能表面には、逆相（C8)、金属イオンアフィニティー(Cu)、イオン交換(弱陰イオン） のバリエーション
があり、様々な分画が可能です。
● 臨床検体のパターン解析・プロファイリングを始め、多彩な解析に応用できます。
● 多検体における統計的解析を専用ソフトウエアで実施します。

16

業

績
18. Sawada, T., Oofusa K., and Yoshizato, K. In vivo thyroid hormoneresponsiveness of a thyroid hormone response element-likesequence in 5ʼ- upstream promoter region of anuran MMP1 gene.
J. Endorinol. 169, 477-486, 2001.
19. Oofusa, K., Tooi, O., Kashiwagi, A., Kashiwagi, K., Kondo, Y.,
Watanabe, Y., Fujikawa, K., and Yoshizato, K. Expression of thyroid
hormone receptor beta A gene assayed by transgenic Xenopus
laevis tadpoles carrying its promoter sequences. Molecular andCellular Endocrinology, 181. 97-110. 2001.
20. Okuyama, H., Shimahara, Y., Kawada, N., Seki, S., Kristensen, D.B.,
Yoshizato, K., Uyama, N., Yamaoka, Y., Regulation of cell growth byredox-mediated extracellular proteolysis of platelet-derived growth
factor receptor beta. J. Biol. Chem., 276, 28274-28280, 2001.
21. Kawada, N., Kristensen, D.B., Asahina, K., Nakatani, K., Miyamato
Y., Seki, S., Yoshizato, K.,Characterization of a stellate cell
activation-associated protein (STAP) with peroxidase activity
found in rat hepatic stellate cells.J .Biol. Chem., 276, 25318-25323,
2001.
22. Kristensen, D.B., Kawada, N., Imamura, K., Miyamoto, Y., Tateno,C., Seki, S., Kuroki, T., Yoshizato, K.,Proteome analysis of rat
hepatic stellate cells. Hepatology, 32,268-277 , 2000.
23. Kristensen, D.B., Imamura, K., Miyamoto, Y., Yoshizato, K., Mass
spectrometric approaches for the characterization of proteins on
a hybrid quadrupole time-of-ﬂight (Q-TOF) massspectrometer.
Electrophoresis, 21,430-9, 2000.
24. Sato, H., Funahashi, M., Dan Bach Kristensen, Tateno, C., andYoshizato, K., Pleiotrophin as a Swiss 3T3 Cell-Derived Potent
Mitogen for Adult Rat Hepatocytes.Exp. Cell Res., 246, 152-164,
1999.
25. Kristensen, D.B., Inamatsu, M., Yoshizato, K.,Elution consentrationof proteins cut from two-dimensional polyacrylamidegels using
pasteur pipettes. Electrophoresis, 18, 2078-2084, 1997.

Original Papers
01. Yamazaki H, Suemizu H, Kazuki Y, Oofusa K, Kuribayashi S,
Shimizu M, Ninomiya S, Horie T, Shibata N, Guengerich
FP.Assessment of Protein Binding of 5-Hydroxythalidomide
Bioactivated in Humanized Mice with Human P450 3AChromosome or Hepatocytes by Two-Dimensional
Electrophoresis/Accelerator Mass Spectrometry. Chem Res
Toxicol. 2016 Aug 15;29(8):1279-81
02. Yamazaki H, Kuribayashi S, Inoue T, Honda T, Tateno C, Oofusa K,
Ninomiya S, Ikeda T, Izumi T, HorieT., Zone analysis for in vivo
protein bindings of idiosyncratic hepatotoxicant troglitazone andﬂutamide bioactivated in chimeric mice with humanized liver by
two-dimensional electrophoresis with accelerator mass spectrometry. Toxico. Res., 2015 Apr:4: 106-111.
03 Tateno C, Yamamoto T, Utoh R, Yamasaki C, Ishida Y, Myoken Y,
Oofusa K, Okada M, Tsutsui N, Yoshizato K., Chimeric Mice with
Hepatocyte-Humanized Liver as an Appropriate Model to Study
Human Peroxisome Proliferator-Activated Receptoralpha.Toxcologic Pathology. 2015 Feb;43(2):233-48.
04. Kobayashi T, Yokoyama T, Ito S, Kobayashi D, Yamagata A,
Okada M, Oofusa K, Narita I, Murasawa A, Nakazono K, Yoshie H.,
Periodontal and Serum Protein Proﬁles in Patients With Rheumatoid Arthritis Treated With Tumor Necrosis Factor Inhibitor
Adalimumab. J Periodontol. 2014 May 26:1-12.
05. Yokoyama T, Kobayashi T, Ito S, Yamagata A, Ishida K, Okada M,
Oofusa K, Murasawa A, Yoshie H., Comparative analysis of serum
proteins in relation to rheumatoid arthritis and chronic periodontitis. J Periodontol. 2014. 85(1):103-12.
06. Yokoyama T, Kobayashi T, Yamamoto K, Yamagata A, Oofusa K,
Yoshie H., Proteomic proﬁling of human neutrophils in relation to
immunoglobulin G Fc receptor IIIb polymorphism. J Periodontal
Res. 2010 Dec;45(6):780-7.
07. Kohta R, Kotake Y, Hosoya T, Hiramatsu T, Otsubo Y, Koyama H,
Hirokane Y, Yokoyama Y, Ikeshoji H, Oofusa K, Suzuki M, Ohta S.,
1-Benzyl-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline binds with tubulin beta, asubstrate of parkin, and reduces its polyubiquitination. J
Neurochem. 2010 Sep 1;114(5):1291-301.
08. Yamazaki H, Kuribayashi S, Inoue T, Tateno C, Nishikura Y,
Oofusa K, Harada D, Naito S, Horie T, Ohta S., Approach for invivo protein binding of 5-n-butyl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine
bioactivated in chimeric mice with humanized liver by twodimensional electrophoresis with accelerator mass spectrometry.
Chem Res Toxicol. 2010 Jan;23(1):152-8.
09. Kawase T, Okuda K, Kogami H, Nakayama H, Nagata M, Nakata K,
Yoshie H. Characterization of human cultured periosteal sheets
expressing bone-forming po-tential: in vitro and in vivo animalstudies. J Tissue Eng Regen Med. 2009 Mar 5;3(3):218-229.
10. Kayoko Ito, Saori Funayama, Yasumasa Hitomi, Shuichi Nomura,
Kouji Katsura, Mikiko Saito, Takefumi Hayashi, Noboru Kaneko,
Kaname Nohno, Atsuko Igarashi. Proteome Analysis of GelatinBound Salivary Proteins in Patients with Primary Sjogren's
Syndrome-Identiﬁcation of Matrix Metalloproteinase-9f. Clinica
Chimica Acta, In Press, Accepted Manuscript, Available online 18
March 2009.
11. Atsuko Igarashi, Kayoko Ito, Saori Funayama, Yasumasa Hitomi,
Akihiro Ikui, Minoru Ikeda, Shuichi Nomura. The salivary protein
proﬁles in the patients with taste disorders: The comparison ofsalivary protein proﬁles by two-dimensional gel electrophoresis
between the patients with taste disorders and healthy subjects.
Clinica Chimica Acta, Volume 388, Issues 1-2, February 2008,
Pages 204-206.
12. Bogdan I. Gerashchenko, Akira Yamagata, Ken Oofusa,
Katsutoshi Yoshizato, Sonia M. de Toledo, Roger W. Howell.
Proteome analysis of proliferative response to bystander cells
adjacent cells exposed to ionizing radiation. Proteomics, 7,p.2000-2008, 2007.
13. Yasushi Goto, Shigeyuki Kitamura, Keiko Kashiwagi, Ken Oofusa,
Osamu Tooi, Katsutoshi Yoshizato, Jin Sato, Shigeru Ohta, andAkihiko Kashiwagi, Suppression of Amphibian Metamorphosis by
Bisphenol A and Related Chemical Substances, J. Health Sci., 52(2), 160-168, 2006.

和文（総説を含む）
1. 大房健、戸笈修、柏木啓子、近藤育志、吉里勝利、”トランスジェニックカエルの作成方法” (分担執筆)、実験医学、18,795-801, 羊土社, 2000.
2. 吉里勝利. “肝臓再生のプロテオーム解析〜星細胞のプロテオーム〜”,遺伝子医学4,49-54, 2000.
3. 吉里勝利.“臓器再生のプロテオーム解析〜非活性化および活性化ラット肝星細胞を例として〜プロテオミクス・タンパク質の系統的・網羅的解析”,91-103, 中山書店, 2000.
4. 山縣彰、吉里勝利：プロテオーム解析技術、酵素工学ニュース, Vol. 46, 2001.
5. 山縣彰、吉里勝利：プロテオーム解析法、日本血栓止血学会誌, Vol. 12, 2001.
6. 山縣彰、朝比奈欣治、吉里勝利：第1章 基礎医学/生物学研究、5 幹細胞・再生研究、
34-40, フローチャートで見る先端バイオ研究の進め方、羊土社、2001.
7. 山縣彰：プロテオーム解析、細胞、特集・広島県組織再生プロジェクト-産官学連携の推進- (吉里勝利編) Vol. 34, No. 1, ニューサイエンス社、2002.
8. 山縣彰、吉里勝利：活性化肝星細胞のプロテオミクス、医学のあゆみ、Vol. 202, 2002.
9. 山縣彰、吉里勝利：活性化肝星細胞のプロテオーム解析、現代化学増刊42｢プロテオミ
クス --方法とその病態解析への応用-｣、東京化学同人、2002.
10. 妙見(宮本)夕佳、山縣彰：肝星細胞のプロテオーム解析、細胞、Vol. 34, ニューサイエ
ンス社, 2002.
11. 山縣彰、大房健：脱リン酸化酵素と二次元電気泳動によるリン酸化蛋白質の解析、｢プロテオミクスの最新技術｣ シーエムシー出版, 2002.
12. 大房健、山縣彰、吉里勝利：”遺伝子組み換えとプロテオミクス”、生化学 第76巻 第10号 pp.1283-1288, 2004.
13. 大房健、山縣彰、吉里勝利：｢ゲノムからプロテオームへ --ヒトプロテオミクスの目指すもの- ｣；｢遺伝子組み換えとプロテオミクス Proteome analysis of trans-formed cells andtransgenic animals.｣ 生化学会誌 ｢生化学｣、2004年10月号
14. 大房健、山縣彰、武田善子、妙見夕佳：『ポストゲノム時代のタンパク質解析 リン酸化プ
ロテオミクス』月間バイオインダストリー特集号 「バイオテクノロジーのイノベーション」
2004年12月号.
15. 大房健： 「電気泳動 (Electrophoresis)」日経バイオビジネス 2005年5月号
16. 大房健、吉里勝利：「プロテオミクス研究とそれに注目した動機及びその発展について」
細胞 The Cell,Vol.38, No.11, ニューサイエンス社、2006.
17. 安西尚彦、加国雅和、大房 健、遠藤 仁：「ヒト肝細胞キメラマウスにおける血中ヒトアルブミン値と血清尿酸値の相関性」Gout and Nucleic Acid Metabo-lism Vol.33, No.1,
2008.
18. 田澤立之、山本尚、阿部修一、山縣彰、大房健、中田光：｢GM-CSFの肺における機能とは？‐GM-CSF欠損マウス、GM-CSF過剰産生マウスの気管支肺胞洗浄液(BALF)のプロテオーム解析を通じてわかったこと｣分子呼吸器病、Vol. 67, 2009.

17

Kidney

SpleenSkeletal muscle

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