マッチド抗体ペア・キットとPHERAstar® FSX を使用した
384 ウェルマイクロプレート
時間分解蛍光法（TRF）
イムノアッセイ
アプリケーションノート

Jamie Campbell［EMEA カスタムソリューション、ディレクター – アブカム（英国、ケンブリッジ）］

Oliver Carney［BMG LABTECH（英国、エールズベリー）］― 特異的かつ高感度で一貫性のある結果を実現するリコンビナント・モノクローナル
抗体ペア― 96 または 384 ウェルフォーマットの ELISA
および ELISA ベースのアッセイに最適― 高精度のプロトコールを用いた
PHERAstar® FSX で読取り

はじめに市販の抗体ペアのほとんどは、サンドイッチ ELISA 用にデザインされています。これらは、ハイスループット化のニーズに応えて、384 ウェル、さらには 1536 ウェルフォーマットまでミニチュア化できる柔軟性を備えています。アブカムのマッチド抗体ペアは特性が十分に評価されており、リコンビナント抗体を使用し、さまざまなターゲットをカバーする高感度試薬です。
マッチド抗体ペアは捕捉抗体（非標識）、ビオチン化検出抗体、タンパク質スタンダードで構成されています。

アッセイのパフォーマンスを向上させるため、別の測定技術やさまざまなラベルで標識した二次抗体を使用することができます。例えば、時間分解蛍光法（TRF）による検出では、励起後、より長時間（ナノ秒ではなくマイクロ秒）にわたって発光する長寿命の蛍光色素（ランタニド）を使用します。バックグラウンド・シグナルが減衰するまで測定の開始を遅らせることができるため、バックグラウンド・ノイズの低減が可能です。不可視光スペクトルを用いたシグナルの測定では、ダイナミックレンジが拡大できるため、飽和によってシグナルが同程度に制限されることはありません。

こちらでは、免疫応答の一部として細胞シグナル伝達に関与するタンパク質キナーゼ IRAK4の検出に、アブカムのマッチド抗体ペア・キットを 384 ウェル TRF イムノアッセイ（DELFIA®
TRF、Perkin Elmer 社）に使用し、PHERAstar® FSX で読み取る方法をご覧いただけます。
アッセイの原理

EU増強

DELFIAユウロピウムストレプトアビジン

320 nmまたは340 nm
EU615 nm

ビオチン化
検出抗体
捕捉抗体

DELFIA TRF図 1. DELFIA® TRF アッセイの概略図（出典：Perkin-Elmer 社）。DELFIA® TRF アッセイでは、マッチド抗体ペアがサンプル中の分析物に結合します。次に、これを HRP の代わりにストレプトアビジン - ユウロピウムとともにインキュベートします。
結合したストレプトアビジン - ユウロピウムを DELFIA® 増強試薬を使用して検出します。この増強試薬は結合したユウロピウムを遊離させ、ユウロピウム錯体のミセル化形成を促します。ユウロピウム錯体は 340 nm で励起され、615 nm で蛍光します。
PHERAstar® FSX では、キセノンフラッシュランプまたはレーザーを使用して読み取ることができます。このアプリケーション
ノートでは、アッセイシグナルと感度を最大化するためレーザーを使用しました。

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資材および方法― PHERAstar® FSX― ヒト IRAK4 マッチド抗体ペア・キット（ab218182）― DELFIA® 試薬― DELFIA® ユウロピウム標識ストレプトアビジン― DELFIA® アッセイ・バッファー― DELFIA® 増強試薬

― NUNC Maxisorp ™ 384 ウェルブラックプレート
実験手順

アッセイは、Nunc MaxiSorp 384 ウェルブラックプレートを用い、マッチド抗体ペアキットのプロトコール（1）に従って総量 50 µL で実施します。

プレートは、メーカーの推奨事項に従って、DELFIA® アッセイ・バッファーで希釈したスト
レプトアビジン - ユウロピウムと 30 分間インキュベートしました。
分解蛍光には DELFIA® 増強試薬 50 µL を使用しました。

プレートの読取りには、TRF レーザーを搭載した BMG LABTECH 社の PHERAstar® FSXを用い、最適化前と最適化後の両方で行いました。
機器の設定
光学設定
一般設定

時間分解蛍光法（TRF）

フィルター

フラッシュ数

励起：337 nm
蛍光：615 nm5（レーザーを使用）セトリング時間

0.0

積分時間

400

積分開始

400

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結果および考察

PHERAstar®FSX には、レーザー励起源と、TRF 測定用に赤色光まで検出可能なフォトンカウンティング検出器が装備されています。上下両方の光学系の Z 軸高さを最適化することで、さまざまなアッセイで優れたパフォーマンスと感度を実現します。PHERAstar® FSXに付属する MARS データ解析パッケージは、標準曲線を自動で生成し、その標準曲線から未知のサンプルの濃度を決定することができます。計算テンプレートはプロトコールに保存することもできるため、将来のテスト実行時のデータ解析を完全に自動化することができます。
IRAK4 標準曲線（ab218182）
384 ウェルフォーマット ユウロピウム検出

プレートリーダーの最適化前

TRF 615 nm

プレートリーダーの最適化後

IRAK4（pg/mL）

O.D.（450 nm）

図 2. PHERAstar® FSX で読み取った 384 ウェルフォーマットのヒト IRAK4 マッチド抗体ペアの標準曲線。蛍光測定に最適な焦点の高さは、サンプル使用量とマイクロプレートのサイズによって異なります。PHERAstar® FSX は、プレートを上部または下部から読み取る際に、光学系に最適な Z 軸高さを自動的に選択することができます。図 2 の曲線は、384 ウェルプレート用に Z 軸高さを最適化する前（青）と最適化した後（赤）にサンプルを読み取ったものです。この調整により、シグナルとシグナル対ブランクの両方が改善されました。

Human IRAK4 (pg/mL)

図 3. IRAK4 マッチド抗体ペア・キットを ELISA で使用した場合の標準曲線。ヒト IRAK4 マッチド抗体ペア・キットを用いた
TRF ベースのアッセイ（図 2）では飽和に達しなかったため、同じペアを ELISA アッセイ（図 3）で使用した場合と同様の作用範囲を示しています。

www.abcam.co.jp/kits/high-throughput-screening-elisa-based-solutions-ja4結論

アブカムのリコンビナント・マッチド抗体ペアは、プレートベースのイムノアッセイに柔軟性をもたらします。このアプリケーションノートでは、マッチド抗体ペアはミニチュア化されたTRF イムノアッセイに適しており、感度、特異性、結果の再現性が得られることを示しています。特に、マッチド抗体ペア・キットを 384 ウェルフォーマットと組み合わせると、ハイスループットスクリーニングに最適です。
当社の PBS-only の試薬を使用することで、さらに柔軟性の高い検出法を実現することができます。

The PHERAstar® FSX は、焦点の高さなどの読取り条件を最適化することができ、レーザーベースの励起源とフォトンカウンティング検出器の搭載により感度と検出範囲の最大化が可能です。このような最適化と機能は、ハイスループットスクリーニング用に 384 ウェルマイクロプレートにミニチュア化する場合に特に重要です。

参考文献

1. マッチド抗体ペア・キットの使用方法 - プロトコール

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