KEK×CRYO-EM
ACTIVITY REPORT
VOL.2

2021年10月〜2022年3月

K E KP ×A GCER Y|O0- 1E M

KEKクライオ電子顕微鏡
名称：Talos Arctica G2

加速電圧 ：200kV
電子銃

：XFEG

ステージ ：AutoGrid挿入型サイドエントリーステージ
位相板：Volta Phase Plate

旧検出器 ：Falcon 3EC（*92k=1.13Å/px, 120k=0.88Å/px, 150k=0.69Å/px）
検出器１ ：Falcon 4 （*92k=1.08Å/px, 120k=0.84Å/px, 150k=0.66Å/px）
検出器２ ：Ceta 16M
制御ソフト：EPU, EPU-D
グリッド凍結装置
名称 ：Vitrobot Mark IV
親水化装置
名称：PIB-10
電流値：soft mode = ~7mA, hard mode = ~11mA

お知らせ
2022年4月にクライオ電顕実験棟が新設されました。
2022年度中に300kVクライオ電子顕微鏡を設置予定です。

KEK×CRYO-EM
ACTIVITY REPORT
VOL.2

KEK
Structural Biology Research Center

We, at the Structural Biology ResearchCenter (SBRC), are studying about themechanisms of biological phenomena,
based on 3-D structure information. We
are always looking for new students andcollaborators.

P A×GCER|Y O
02
KEK-EM

KEKクライオ電顕の利用統計

装置利用状況（稼働日のみ）
2021年度年間（266 days）

装置利用状況
2021年度年間（365 days）
移設
6.6% (24 days)

内部利用12.4% (33 days)

休止
9.3% (34 days)

企業
24.8% (66days)

メンテナンス
11.2% (41 days)

内部利用
9.0% (33 days)

アカデミア
45.8% (167 days)
アカデミア
62.8% (167 days)

企業
18.1% (66 days)

地域別利用ユーザー数（2021年度）

装置稼働日におけるマシンタイム配分の推移（2018年度下半期〜2021年度）
Days

団体
216251 13231※年間算出のためVol.1の数字も含まれています。

PAGE |03

KEK × CRYO-EM

学会参加報告PROTEIN
STRUCTURE
DETERMINATION IN
INDUSTRY
2021年11月8日〜11月10日
オンライン開催

2021 29th

PSDI
ここでは、各セッションについて簡単にまとめていきます。
1) Cryo-EM (facilities, sample preparation, datacollection and processing):
スウェーデンの国立研究所ScilifeLabのCryo-EMセンターとNovartis、またAstexやLeadXproより、各機関、各社の実験手法や解析フローについての発表

PSDIはヨーロッパ大手製薬企業のStructure basedがありました。特に印象に残っているのは、

drug discovery （ SBDD ） を 行 う 研 究 者 の 有 志 達

Novartis に は ク ラ イ オ 電 顕 を 持 つ 研 究 所 が 4 つ あが、研究推進のためnon-competitiveな研究領域にり、各サイトで(主にGlaciosを用いて)スクリーニンついての情報シェアとネットワーキングを目的に開グしたサンプルをBaselにあるEMヘッドオフィスに始 さ れ た ミ ー テ ィ ン グ で す 。 1993 年 に Zeneca( 当送 り 、 Titan で デ ー タ を 測 定 し て い ま し た 。

時)がホストし第一回大会が開催されて以来今回でCryoFLAREの開発者であるA. SchenkがNovartisに29回目となりました。参加する主要製薬会社が持ち異動し、自身の開発したソフトを用いたライブ解析回りでホストを務め毎年11月上旬頃にヨーロッパのとデータ管理やJobの重さによって解析ワークステどこかで行われます。前年はコロナ感染症のため、ーションを自動で振り分けるシステム構築を行な半日ミーティングでの短縮開催となりました。今回

い、構造解析を行っていました。

は通常の3日間開催でスケジュールされましたが、膜タンパク質をメインのターゲットとする

引き続き感染症の影響を考慮し、開催ホストである

LeadXPro

Merck、EMBL（グルノーブル）、ESRFが中心とな

Macrobody(nanobody+MBP) を 使 用 し 、 標 的 タ ンりオンラインでの開催となりました。

パク質との複合体の構造解析に成功した例を発表し1) クライオ電顕施設 2) AIを取り入れたSBDD 3)結晶ていました。

構造解析の自動化 4)Integrative Structural Biology

Cambridge の Cryo-EM Phamaceutical コ ン ソ ー シ5) Big dataのマネージメント6)創薬研究のケースス

アムの一員であるAstexは、Cryo-EM単粒子解析でタディの6つのメインセッションで構成され、それもX線結晶構造解析に匹敵するようなスピード感でに加えてスポンサーによる新技術や施設の紹介セッFBDDを行うため、オフラインでグリッドやホールションがありました。また各セッション後にスピー選びを行い、測定キューに入れる事でスピードアッカーとチェアーを含めたパネルディスカッション

プを図っているようです。

や、ネットワークのためのオンライン交流会が設け

SciLifeLabは企業支援の仕組みやCryo-ETの解析ソられるといった構成の3日間でした。

フトsubTOMについての開発状況について発表を行はっていました。

約50kDaのPro-

PAGE | 04

KEK × CRYO-EM

2) AI opportunities in SBDD:

4) Integrative Structural Biology:

製薬会社10社の化合物ライブラリーのデータを各社

マ ッ ク ス プ ラ ン ク 研 究 所 に 異 動 し た J. Briggs は 、で秘匿状態を維持しながら、コンソーシアム間で機Cryo-ETを用いた解析により、ウイルス研究におい械学習に利用することができる、ヨーロッパのIMIて新たにどのような発見があったのかをSARS-CoV2の創薬コンソーシアムのプログラムの一つ”Melody”とHIVウイルスを例にとり発表しました。の学習モデルについて紹介し、プライバシーの保護

コロナウイルスについては、Spikeタンパク質が膜と情報の無記名化また効率的な情報の収集についてに吸着する際に様々な結合様式(膜に対しての発表しました(AstraZeneca)。

orientation angle)を取ることを発表しました。まGSKは自社のAIシステムGEMINIを活用し、慢性閉塞たHIVウイルスにおいては、感染細胞の細胞膜で集性肺疾患（COPD)を例にとり、ワクチン候補である合しウイルスとして成長する段階でGagタンパク質

抗原タンパク質の立体構造と機能をAIで探索し、その 一 部 を 構 成 す る MA ド メ イ ン が 膜 に 結 合 す る 際の分子の生化学的評価をフローチャートと共に発表に、成熟型と未成熟型で異なる形の6量体を再構成していました。

することも明らかにしました。

またAstraZenecaの有志によりDrug targetとなるタ

AstraZenecaからは、DNAの二本鎖の切断を修復すンパク質の発現について、発現・実験条件を最適化

る Non-homologous end joining (NHEJ) の 反 応 機するアルゴリズムの確立を目指すPre-competitive

構 の 解 明 に つ い て 、 単 粒 子 解 析 と HDX-MS のなコンソーシアムの設立についても提案がありましinteraction mapを用いてこれまで解析されていなた。

かった相互作用を確定し、どのようなタンパク質が続けて基調講演として、EMBL-EBIのA.Leach より関与して複合体を形成していくかを明らかにしていAlphafold2(AF2)の出現や現時点でのAF2の課題とそました。の応用、またAF2の結果を活用した細胞レベルでのEMBLハンブルクのSvergunからは、市販インシュ構造解析プロジェクトなど、その波及効果と今後のリン製剤の濃度に依存した多量体の検証や、脂質と展開について考察がありました。

ポリマーのハイブリッドナノ粒子を作製しmRNAの3)

トランスフェクションに利用するプロジェクトにつAutomation and Method Development inCrystallography:

いて紹介し、Integrative Structural Biologyにおい

最初にヨーロッパの構造生物学の支援基盤プロジェてSAXSを用いた物性解析がどのように役立つのかクトである第二期iNEXT - 名称iNEXT discovery（日を発表しました。

本でのBINDS構造解析ユニット支援事業に相当）に

他 に も J. Rappsilber は Cross-linking MS を 中 心 について、その発足と今後の企業利用について指針とCryo-ET、単粒子解析を組み合わせて、転写・翻訳事業紹介がありました。EMBLグルノーブルとALPを行うM. pneumoniaeのexpressome（RNAP、リからは、結晶化のセットアップからデータ測定までボソーム、転写伸長因子等で構成される複合体）のを統合的に管理するCRIMSシステムを用いて、これ細胞内構造を決定しました。その結果から、翻訳をまで困難であったLCP法で結晶化した膜タンパク質

阻害するとexpressomeが分離し、転写を阻害するのsoakingを可能にしたことをアディポネクチン受とexpressomeが停滞・再配置するといった細胞内容体2(AdipoR2)の構造を例にとって明らかにしていでの複合体形成について明らかにしました。

ました。またEMBLハンブルグでは1 injectionにつき〜75pL溶液まで調整できるスプレーを開発し、時分割測定を行う研究例の紹介、またESRFからは全自 動 ビ ー ム ラ イ ン Massif-1 の 紹 介 、 APS か ら はIMAT-CAT よ り 企 業 利 用 の BT に つ い て の 紹 介 が あり、これまで上市された薬剤にどのように各ビームラインが貢献してきたかを発表していました。

2021 29thPSDI

PAGE | 05

KEK × CRYO-EM5) Scientific data management in the era of bigdata:
これまでヨーロッパでは放射光施設のデータ管理にISPyBが用いられてきましたが、施設利用の際だけでなく、各研究室でのデータの管理や自動データ処理にも活用できるよう改良し、一括管理できるシステム構築について提案がありました (EMBLグルノー

2021 29th

ブルとGlobal phasing)。
R. JoostenからはPDBの構造モデルを検証し、改良するプログラムPDBredoの活用と応用例について発PSDI表がありました。実例として、PDBに登録された相同性のあるタンパク質の立体構造情報を組み合わせて、嘗てはモデルの組めなかったループ領域についても、モデル構築が可能になったと紹介がありました。
MBL-EBIのM.Varadiからは立体構造だけでなく関連する生物学的注釈まで含めたデータベース(PDBeKB)についての紹介がありました。
6) Case studies:J. Steyaert は こ れ ま で 構 造 解 析 に 利 用 し て き た

3日間通して、Drug discoveryにおけるクライオ電Nanobody(約15kDa)を、単粒子解析を行う際、よ顕による構造解析（単粒子解析、Cryo-ET共に）のり 大 き な 目 印 に な る 様 に 大 き な タ ン パ ク (HopQ-確立と、AF2を含むAIを今後どのように活用してい45kDa, YgjK-86kDa)を結合させたMegabodyを作成

くのか？また複雑な生命現象、Big dataをどのようし、単粒子解析の構造解析に成功している例を紹介に処理するのか？という課題が、2021年においてはし ま し た 。 Diamond Light Source(DLS) の F. Delft

製薬会社でのホットな話題であるという印象を受けは FBDD を よ り 効 率 的 に 行 う た め に 作 ら れ た DLSました。（次回はSanofiとThermo fisherがホスト

Xchem facilityとI04ビームラインをベースにしたプ

し、2023年10月23日〜25日にオランダのアイント

ラットフォームについて、イギリスで進行中のフォーヘンにて開催予定であることが発表されましCOVIDムーンショット計画の途中経過と共に発表した。）

ました。
ICRのR. Montfortはびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫において、高頻度の転座、変異を生じるドライバー遺伝子であるBcl6の阻害剤の獲得に向けて、化合物の最適化について発表がありました。結果として 24b(CCT368682, CCT369260) は degrader と し て働く事が明らかになりました。
最 後 は Discoidin domain receptor family の DDR1について、DDR1とDDR2の選択制を持つ阻害剤の発見 に つ い て 発 表 が あ り 、 DELT screening (DNAencodeした低分子スクリーニング) についてもその概要が話されました。

田辺 幹雄
たなべみきお /高エネルギー加速器研究機構
構造生物学研究センター
特任准教授

興味ある研究分野
細菌が引き起こす感染症や薬剤耐性のメカニズム

KEK × CRYO-EM

PAGE | 06

KEKクライオ電顕を利用して出版された論文
2021年10月から2022年3月まで
KEK

ユーザーとの共同研究の成果

・ C-Glycoside metabolism in the gut and in nature: Identification, characterization, structural analyses anddistribution of C-C bond-cleaving enzymes.

Mori, T., Kumano, T., He, H., Watanabe, S., Senda, M., Moriya, T., Adachi, N., Hori, S., Terashita, Y., Kawasaki,M., Hashimoto, Y., Awakawa, T., Senda, T., Abe, I., and Kobayashi, M. Nature Commun. 12, 6294 (2021).
EMDB-30808@2.85Å (PDB:7drd)
EMDB-30809@2.54Å (PDB:7dre)
東京大学 阿部＆森グループとの共同研究。化学的に安定なC-グリコシド結合を切断する腸内細菌由来の脱グリコシル酵素について、クライオ電顕単粒子解析とX線結晶解析それぞれによって得られたタンパク質の立体構造を合わせて発表しました。クライオ電顕では2種類の酵素について 2.85 Åおよび2.54Åという高分解能のマップが得られ、結晶構造との違いを詳細に比較することが出来ました。

・Non-conventional octameric structure of C-phycocyanin.

Minato, T., Teramoto, T., Adachi, N., Hung, N.K., Yamada, K., Kawasaki, M., Akutsu, M., Moriya, T., Senda, T.,
Ogo, S., Kakuta, Y., and Yoon, K.S. Commun. Biol. 4, 1238 (2021).
EMDB-31090@3.06Å (PDB:7eh8) (EMPIAR-11079)
EMDB-31089@3.71Å (PDB:7eh7) (EMPIAR-11079)
九州大学 角田グループ・尹グループとの共同研究。シアノバクテリアの光合成色素タンパク質フィコシアニン(CPC)は、結晶構造から6量体であることが知られていましたが、日本の温泉から単離したシアノバクテリア
CPCの結晶構造は8量体でした。そこでKEKクライオ電顕で確認したところ6量体と8量体が混在することが分かりました。その後6量体の結晶構造解析にも成功し、クライオ電顕単粒子解析とX線結晶解析それぞれによって得られたタンパク質の立体構造を合わせて発表することが出来ました。同一試料に含まれる複数の構造を分離して解析できるクライオ電顕の強みが発揮されました。

KEK

ユーザーによる施設利用の成果

・Syntheses and aggregation properties of new squalene receptors bearing open chain ligands.

Linh, N.T., Arimura, T., Tominaga, K., Kigoshi, H., and Isoda, H. Supramolecular Chemistry 33, 194-201 (2021).
産総研 有村グループの研究成果。新規スクアレン受容体が自己集合して出来るベシクル構造について、KEKクライオ電顕を用いて確認しました。ベシクルサイズが0.1-0.4 μmと大きいため、通常の単粒子解析よりも倍率を下げてグリッドのホール全体が映るようにし、位相板を使って測定を行いました。

PAGE | 07

KEK × CRYO-EM

クライオ電子顕微鏡

KEK 構造生物学研究センター(SBRC)

KEKクライオ電子顕微鏡施設は以下3点をミッションとして、Thermo Fisher Scientific社の200kVクライオ電子顕微鏡 Talos Arctica G2 (Falcon 4) を運用しています。
1. アカデミア/企業ユーザーへのマシンタイム提供（年間200日以上）
2. グリッド凍結/データ測定の支援（必要に応じた単粒子解析支援）
3. クライオ電顕を用いた実験に関する技術導入の支援

１週間の流れ月:メンテナンス
火:1日枠（スクリーニング&本測定800枚）
水:1日枠（スクリーニング&本測定800枚）
木:1日枠（スクリーニング&本測定800枚）
金土日: 3日枠（スクリーニング&本測定3000枚）

１日の流れ
9:30
集合・Grid-prepに関する打ち合わせ
9:45
実験開始
午前
グリッド凍結（6枚以内）
午後
スクリーニング測定（1枚あたり約1時間）
18:00頃〜 overnight/over weekendの測定開始
解散
翌日以降 KEKスタッフがデータをコピーして返送

KEK SBRC

CRYO-EM

当日の持ち物
サンプル
希釈用buffer
4〜8TBのHDD

PAGE | 08

KEK × CRYO-EM

KEKクライオ電顕利用の流れ
KEKクライオ電顕の利用は、アカデミアユーザーはBINDS経由で、企業ユーザーは共同研究契約・学術指導契約などの枠組みで可能です。
アカデミアユーザーの初回利用までの流れは「事前打ち合わせ→BINDS課題申請→支援開始→マシンタイ
ム配分→マシンタイム当日」が一般的です。実験の進捗に合わせて必要となる撮影日数が異なるため、マシンタイム配分はメールベースで行っています。
2ヶ月に1回程度、KEKからユーザー宛にマシンタイム希望日の打診メールを送り、第一から第三候補までを挙げていただき、日程調整をした上でマシンタイムを配分しています。配分は各グループあたり1-2ヶ月に1枠で、透明性を高める目的で全ての予定をKEKクライオ電顕のweb siteで公開しています。

ユーザー

KEKスタッフ

KEK事務

事前打ち合わせマシンタイム予約

BINDS課題申請

実験の進捗に合わせて必要な撮影日数が異なるため、マシンタイム配分はメールベースで行っています。2ヶ月に1回程度、マシンタイム希望日の打診メールを送り、第一から第三候補までを挙げていただき、日程調整をした上で配分しています。
配分は各グループあたり1-2ヶ月に1枠で、透明性を高める目的で全ての予定をweb上のカレンダーで公開しています。

支援開始
マシンタイム予約
メールでやりとり

施設利用申請書
測定日決定案内と共に申請書
フォーマットをメール送付

施設利用申請書
マシンタイムの 10 日前までにKEK事務へメール提出（PDF形式）

施設利用許可書発行
電子媒体にてユーザーへ送付

マシンタイム当日
9:30 集合
午前 グリッド凍結（6枚以内）
午後 スクリーニング測定（1枚あたり約1時間）
夕方 終了
18:00頃 overnight / over weekendの測定開始
実験終了後
利用時間報告書に必要事項を記入（PDFデータ）提出（メール）※なお、KEKでマップを得た後、さらに高分解能のマップを得たい場
合は、クライオ電顕ネットワークの枠組みを通して300kVクライオ電顕を有する他施設への受け渡しを行っています。

利用にあたり1日に使う消耗品が、グリッド6セット24,000円、液体窒素10,000円など高額であるため、ユーザーには施設利用料をご負担いただいております。アカデミアユーザーは消耗品実費相当で48,000円/日、企業ユーザーは消耗品・保守費・スタッフ付添費などで480,000円/日をご負担いただいております。

マシンタイム翌日以降HDDにデータをコピーし郵送

単粒子解析（ユーザー自身 and/or KEK スタッフ）

請求書
発行
電子媒体にてユーザーへ送付

PAGE | 09

KEK × CRYO-EM

クライオ電顕利用料金
アカデミア
データ測定

<1日枠>2,000円 x 9h または 24h = 18,000円 または 48,000円<3日枠>2,000円 x 72h = 144,000円

企 業
データ測定

<1日枠>10,000円 x 24h = 240,000円<3日枠>10,000円 x 72h = 720,000円

測定解析補助・指導業務
30,000円x 8h = 240,000円

初期解析（オプション）
125,000円 x 日数

詳細解析（オプション）
250,000円 x 日数

アカデミア以外の測定利用合計

KEK×CRYO-EM
ACTIVITY REPORTVOL.2

KEK IMSS
Structural Biology Research Center<1日枠>480,000円<3日枠>960,000円

We, at the Structural Biology ResearchCenter (SBRC), are studying about themechanisms of biological phenomena,
based on 3-D structure information. We
are always looking for new students andcollaborators.

PAGE | 10

KEK × CRYO-EM

KEK
クライオ電顕メンバー

KEK×CRYO-EMACTIVITY REPORT

千田 俊哉
川﨑 政人
守屋 俊夫
安達 成彦（〜2022.03）
池田 聡人
久保田 孝幸中山 友希子
山本 美里
山田 悠介
篠田 晃
鮏川 理恵子
増田 千穂

編集後記
KEK×CRYO-EM ACTIVITY REPORTをお手に取っていただき、ありがとうございます。
KEKクライオ電顕に特化した冊子のVOL.2が出来上がりました。この冊子が何号も継続して皆様にお届けできるように制作していきたいと思っております。
継続するといえば、私はハワイやフラ（ダンス）が好きで、フラを始めてからは12年が経ちました。私にとってハワイやフラは、なくてはならない自分の一部になっています。この冊子が皆様にとって、なくてはならないものになるのには時間がかかるかもしれませんが、お役に立てたら嬉しいです。
そして、この場を借りて制作に協力して下さった皆様にお礼を申し上げます。
次号は、2022年4月に新設されたクライオ電顕実験棟の特集となります！お楽しみに。
今後ともKEKクライオ電顕を宜しくお願いいたします。
A HUI HOU!(ハワイ語でまた会いましょうの意味です)増田KEK×CRYO-EM
ACTIVITY REPORT
VOL.2

2021年10月〜2022年3月

高エネルギー加速器研究機構
物質構造科学研究所
構造生物学研究センター(SBRC)〒305-0801
茨城県つくば市大穂1-1
https://www2.kek.jp/imss/sbrc/beamline/cryoem.html