本記事は , 文部科学省ナノテクノロジープラットフォーム事業 秀でた利用成果について紹介するものです .

文部科学省ナノテクノロジープラットフォーム 令和２年度秀でた利用成果

光圧によるアミロイド線維の人工作製

台湾国立陽明交通大学 杉山 輝樹氏，奈良先端科学技術大学院大学 藤原 正裕氏，藤田 咲子氏，大野 智子氏に聞く（左）杉山 輝樹氏
（右）左から，大野 智子氏，廣田 俊氏，藤原 正裕氏．藤田 咲子氏

ナノテクノロジーに社会変革への貢献がもとめられて知症やパーキンソン病などの疾患と深く関係しており，いる．持続可能な社会，安心・安全なスマート社会実現「アミロイド線維の人工作製」はその疾病の原因の究明やのためのソリューション創出の鍵技術とみなされており，治療薬の創出への貢献が期待される．この研究では，奈応用分野の異分野融合の中で活かされて新技術を創出し，

良先端科学技術大学院大学（NAIST）のナノテクノロジー新製品，新サービスの新市場を生み出すことが期待されプラットフォーム（分子・物質合成プラットフォーム）ている．文部科学省ナノテクノロジープラットフォームの共用施設 [2] を利用しており，利用者は同大学と台湾国（NPJ）事業はそうした研究・開発に必要な諸設備共用や立陽明交通大学の共同研究チームで代表者は杉山 輝樹氏技術支援を行っている．

である．技術の詳細，成果達成の経緯等を伺うため，オNPJ 事業では，全国 25 拠点の 37 プラットフォーム

ンライン会議で，台湾国立陽明交通大学 理学院応用化学（NPJ は微細構造解析プラットフォーム，微細加工プラッ系 教授，兼 NAIST 先端科学技術研究科 客員教授

トフォーム，分子・物質合成プラットフォームに分類され，輝樹氏からアミロイド線維の人工製作技術や研究経緯な各拠点はこれらの 1 ～ 3 プラットフォームに参画していどプロジェクト全体の説明を，NAIST ナノテクノロジーる）の共用設備利用成果の中から毎年秀でたものを選定

プラットフォーム 技術専門職員

藤原 正裕氏，技術専門して表彰を行っている．表記「光圧によるアミロイド線職員

大野 智子氏からは本件維の人工作製」は令和 2 年度の 6 件の表彰の一つとして，について評価支援活動状況の説明を頂いた．なお，上記

2020 年 12 月 9 日に nano tech 2021 第 20 回国際ナノ集合写真中の廣田 俊氏（NAIST 先端科学技術研究科 教授）

テクノロジー総合展・技術会議のセミナー会場で表彰さは，杉山氏と共に本研究立ち上げの当初からの共同研究れた [1]．

者である．

藤田 咲子氏，技術補佐員

杉山

アミロイド線維が沈着することはアルツハイマー型認

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文部科学省ナノテクノロジープラットフォーム令和 2 年度秀でた利用成果 -1

勾配力により集光点内の電場の最も強い部分に引き寄せ

１．
１

１．背景られる．即ち粒子を集光部に捉えることができる．光圧

光圧とは！ 光ピンセットとは！

弱い力であるが，その力が粒子のブラウン運動に打ち勝はピコニュートン～フェムトニュートンといいう極めてつことにより，光ピンセットが機能する．

本研究の主役は光圧である．光圧は極めて弱い圧力で，光圧によって溶液中の粒子が集光点に捉えられる現象

人々の生活においてその存在は全く意識されることはなについては，次のように説明されている [10]．粒子の大い．しかし，光圧に関する議論の歴史は古く，17 世紀にきさが光の波長より大きい場合は，幾何光学的に理解でドイツの天文学者 Johannes Kepler（ヨハネス・ケプラー）きる．光線が粒子表面を通過する際に屈折しその運動量が彗星の尾のたなびきの説明に光圧の概念を用いたのがが変化すると，運動量保存則によりその反作用の力が粒最初と言われている．更に，20 世紀初頭には理論的にも，子に光圧として加えられる．集光レーザービームを用い実験的にもその存在が実証されている．その後，太陽光ることにより，屈折の反作用の合力は光集光点を向くこの光圧を帆で受けて宇宙を旅する帆船のイメージなどがとになる．一方，粒子の大きさが光の波長より十分に小発表されている．

さい場合は，粒子は一つの電子双極子とみなすことがで光圧を微小な物質・物体の運動を制御する技術としてきる．この電気双極子は光の電磁場からローレンツ力を取り上げ，新しい学術分野を拓いたのは，次の二つのノー

受け，粒子の屈折率が媒質の屈折率よりも大きいときにベル物理学賞を受賞した研究成果である [3][4][5][6][7][8]は光強度の最も強いところ（集光点）に引き付けられる．

[9]．

Ashkin 氏の光ピンセットの発明は 1986 年で，レーザー・1997 年ノーベル物理学賞：「レーザー光による原子の冷却と捕捉法の開発」Steven Chu（スティ－ブン・

ビーム（λ ＝ 514.5nm）を高い開口数の対物レンズで集光したものを，誘電体（ガラスや高分子）の微粒子を分テュー）（米国），Claude Cohen-Tannougji（クロード・散した水に照射し，微粒子を集光領域に捕捉することにコーエン - タヌージ）（フランス），William D. Phillips

成功している．この時の微粒子サイズは，10μm ～ 25nmを試みて成功している [5][10]．

（ウイリアム・ダニエル・フィリップス）（米国）・2018 年ノーベル物理学賞：「光ピンセットとその生物系への応用」Arthur Ashkin（アーサー・アシュキン）

この後 Ashkin 氏は生体組織に吸収が少ない近赤外光（λ＝ 1064nm）を用い，イースト菌，大腸菌，ヒト赤血球（米国）[10]などの補足に成功している [6][7]．光ピンセットは，微特に Ashkin 氏の光ピンセットは 1986 年の発明以来，小物を非接触で物理的に制御できるので，対象物を傷つ多くの注目を集め，物理やバイオの分野でその技術の研けることもない．画期的技術として，生物学やライフサ究，活用が盛んになった．

イエンスの分野で，多くの研究者が取り上げている．日

図 1 は光ピンセットの機能を説明する模式図で，強い本国内での研究活動がアクティブで，特に杉山氏の上司

レーザー光を対物レンズにより溶液中に強く集光させる．

であった増原 宏氏（元大阪大学教授，奈良先端大特任教

溶液中に予め粒子（図では例としてタンパク質）を分散授を経て現台湾国立陽明交通大学講座教授）は，1990 年させておくと，ブラウン運動で集光点内に入った粒子は頃からまだだれも手掛けていない光ピンセットの化学分野への応用に先鞭をつけている．また，国内では，2016年から科学研究費補助金 新学術領域「光圧によるナノ物質操作と秩序の創生」（領域代表：大阪府立大学 大学院工学研究科石原 一教授）の 5 年間のプログラムが行われており，本研究もこのプログラムに参加している．現
在，光圧による微小物質の操作や新構造・機能創出などの学術分野では日本が圧倒的にリードしていると杉山氏は語った．

１．２

本研究立ち上げの経緯

研究テーマ「光圧によるアミロイド線維の人工作製」の開始は 2009 年～ 2010 年に遡る．博士課程の時に結晶の研究をしていた杉山氏は，光圧の化学への応用の先駆者増原氏の下で光圧に興味を持ち，2007 年より光圧による結晶化の研究を始めた．即ち，「光圧」により溶液中の
図1

光ピンセットの模式図

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分子やクラスターを集光点に集め，局所濃度を高めて結文部科学省ナノテクノロジープラットフォーム令和 2 年度秀でた利用成果 -2

晶を生成する研究を行った．対象とする化合物には有機

ミロイド線維ではタンパク質が変性したあと凝集するこ化合物，無機化合物や高分子化合物などいろいろあるが，とである．変性とはタンパク質などを構成する高分子のその一つとして，タンパクも頭に入っていた．2008 年増

立体構造が壊れ高次機能が変化することで，変性して凝原氏と共に奈良先端大に移った杉山氏は，研究室が近い集したアミロイド線維は，疎水性が高く，高い均一性と廣田 俊氏と出会い同氏が手掛けているタンパクの話をよ剛直性を有している．金属並みに硬く，原子間力顕微鏡く聞くようになった．そうした話のなかで，廣田氏が扱っ（AFM）の探針に利用した例もあるとか．また，非常に安ているタンパク質を対象に柚山氏（現大阪市立大学 理学

定した物質で，一度生成されると容易に溶けない．人体部化学科 講師）とともに光圧実験を行うことになり，こでは，永い年月の間にアミロド線維が沈着して，アルツれまでに光圧実験では観測したことのない新しい構造体

ハイマー病，パーキンソン病，ハンチントン病，牛海綿を得た．多数のタンパク質が集まった場合に，タンパク状脳症（狂牛病），2 型糖尿病など多くの疾患と密接に関質が単に凝集しただけのものと結晶化するものがあるが，連している．

更にその他に，タンパク質が変性してアミロイド線維化

図２はアミロイド線維形成メカニズムの模式図である．

するものがあることを知った．しかも，そのアミロイド水溶性のタンパク質が密集して長い時間が経つ間に変性線維が，アルツハイマー認知症やパーキンソン病と深くしてアミロイド線維前躯体が形成され，それが積み重なっ関わっており，その生成メカニズムを究明することが急て不溶性のアミロイド線維が形成される．アミロイド線務であることを知った．そこで，杉山氏は廣田氏との共維生成過程を解明して，上記疾病に対応する医薬の開発同研究をさらに推し進めた．2009 年から 2010 年に替わに結び付けるため，図 2 の工程を実験室で行おうとするる頃である．と，容易なことではない．強いアルカリまたは酸性の溶

なお，上司の増原氏が 2008 年台湾国立交通大学（2021

液中で時には数日静置してようやくアミロイド線維前駆

年 2 月に台湾国立陽明交通大学に改名）に講座教授として体ができるほどである．さらに，これまでアミロイド線招聘された．2011 年には杉山氏も台湾に渡り．2015 年

維の生成場所と時間を予期したり，制御したりすることから同大学に移り，廣田氏との共同による本研究プロジェは不可能とされていた．これが，アミロイド線維形成メクトは国際共同研究に形は変わったが，杉山氏は奈良先端カニズム解明の障壁であった．

大の客員教授を兼務しており，継続して遂行された．

２．２

２．アミロイド線維の形成過程と人工作製
２．
１

アミロイド線維作製に光圧を利用杉山氏が廣田氏と共同で進める本研究は，上記形成メカニズム解明の障壁の打破への挑戦である．
図 3 に光圧によりアミロイド線維が形成される過程をアミロイド線維とは示す．タンパク質を分散させた溶液に，図 1 に示すようタンパク質の結晶とアミロイド線維の違いは，結晶のに強いレーザー光（強度 1W）を対物レンズを介して照射場合はタンパク質からそのまま成長するのに対して，アし図 3 左端のように溶液中に集光領域（面積当たりの光

図2

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アミロイド線維の生成過程

文部科学省ナノテクノロジープラットフォーム令和 2 年度秀でた利用成果 -3図3

光圧を用いたアミロイド線維の作製過程

強度は数百 W/cm2）を作る．使用したレーザー光は波長アミロイド線維化が困難なタンパク質と言われている．

1064nm の赤外光であり，生体系物体には損傷を与えな

シトクロム c は，図 4 に構造を示すように通常分子 1 個い．溶液中でブラウン運動しているタンパク質のうちレーの単量体の状態であるが，分子 2 個が組み込むように結ザー光の照射領域に入ったものは光ピンセットの原理で合した 2 量体を作ることができる．この両者について光3

約 1μm の集光領域に集められる（図 3 中央）．高密度に凝集した状態でタンパク質の変性が起こり，アミロイド圧によるアミロイド線維作製を試みた．シトクロム c 単線維の核となる図 2 のアミロイド線維前駆体が形成され量体の場合，レーザー照射で比較的早く 1μm 程度の集合体を形成できたが，それ以上には成長しなかった．一方，る（図 3 右端）．変性が起こる要因としては密度が高まる

2 量体の場合はその後もレーザー照射により成長を続けことによる応力とレーザー光の集中による若干の温度上た．その様子を図 5 に示す．

昇が考えられている．この核を基にアミロイド線維が成

図 5 でレーザー照射時間 23 分から急激に成長し，29長する．次に紹介する実験結果が示すように，この方式により，レーザー光の集光領域という設定領域に，30 分分では約 10μm のサイズに達している．この凝集体がアミロイド線維を含むかどうかを確認するために，アミロから 1 時間でタンパク質の集合・変性・アミロイド線維イド線維が存在すると蛍光を発する色素マーカーのチオを形成の工程を実行することが可能になり，アミロイドフラビン T（ThT）（図 6）を，凝集体を含む溶液中に混線維形成メカニズム解明に向けた道が拓けることになる．

入し 405nm 波長のレーザーを照射したところ，図 5 の過程の 23 分以降の凝集体において強い蛍光が確認された

２．
３（図 7）．その蛍光の強さは，集合体が大きくなる以上の割

実証実験

合で急激に高まっており，シトクロム c の変性が進みア

本方式の実証実験では，タンパク質としてシトクロム cを使用した．このタンパク質は心臓に多く存在し一般的ミロイド線維の成長が進んでいることを予想させるものであった．に研究に使われており，廣田氏の研究でも使用している．

図4

シトクロム c の単量体および 2 量体の構造（出典：参考文献 [12]）NanotechJapan Bulletin Vol. 14, No. 2, 2021

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図5

図6

光圧によるシトクロム c 2 量体の凝集体形成過程の CCD 像

アミロイド線維の色素マーカー

図7２．４ 透過電子顕微鏡（TEM）観察によるアミロイ
ド線維の確認：～ NAIST ナノテクノロジープラット
フォームの利用～

シトクロム c 2 量体の凝集体からの蛍光確認までをクリアに見ることができなかったが，電子染色法
では，添加色素の濃度を最適化することで，アミロイド線維の特徴を確認することができた．以下に色素添加によるアミロイド線維の確認過程を紹介する．

上述の通り光圧によるシトクロム c 2 量体の凝集体は

使 用 し た TEM は 日 本 電 子 社 製 JEM-3100FEF（ 図 8）

蛍光像によりアミロイド線維である可能性は高まったが，で，加速電圧 300kV，倍率 100 ～ 2,000,000 倍，解像度それだけでアミロイド線維であると断定はできない．杉0.19nm（格子像）である．

山氏，廣田氏の共同研究チームは，NAIST ナノテクノロ

アミロイド線維の構造上の特徴として図 9 の①長い枝ジープラットフォームに依頼して透過電子顕微鏡（TEM）

分かれのない線維の束，② 5 ～ 20nm の線維径，③線維により集合体の構造を観察し，構造的にアミロイド線維の高次よじれが挙げられており，TEM 観察の目的は作製の特徴を備えているかを確認することとした．

したシトクロム c 2 量体の凝集体がこの 3 条件を満たす

NAIST ナノテクノロジープラットフォームは，分子生かどうかの判断データを得ることであった．

物学領域のサンプル観察経験が豊富であり，上記ユーザー評価する凝集体は杉山氏が光圧により作製し，溶液に要求に対してクライオ電子顕微鏡法というサンプルを凍超音波振動を加えて凝集体を分解した状態で廣田氏に渡らせて観察する方法や，電子染色法を用いて染色剤添加され，廣田氏のところで必要に応じて超音波振動を追加濃度を振るなどの種々の方法を試みた．その結果，クラしてアミロイド線維を観察可能な状態にした．

イオ電子顕微鏡法による観察ではアミロイド線維の詳細

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NAIST では分子生物学領域の TEM 観察の豊富な経験を文部科学省ナノテクノロジープラットフォーム令和 2 年度秀でた利用成果 -5

活かして，染色法の検討を行った．染色剤としてリンタングステン酸（PTA）を採用し，その濃度を 2% から 0%の範囲で変えて最適濃度を求めることで，アミロイド線維を観察することができた．
図 10 は TEM 観察のサンプル作製の様子を示している．
ピンセット先で抓んだ朱色円形状のグリッド上に超音波で塊をほどいた試料を含む液を載せ，その上に染色剤（リンタングステン酸）を滴下し，1 分染色後，余剰液を濾紙で除去し，乾燥した状態で TEM に挿入した．試料作製は室温（20℃）で行った．
TEM 観察の結果を図 11 と図 12 に示す．図 11 は，染色剤濃度を一般的な 2% としたもので，模式図に示すような長くて枝分かれのない線維の束が確認された．しかし，この染色剤濃度では，超音波でよりばらした試料での線維の太さや supertwist した状況を確認することができなかった．図 12 に示すのは，染色剤濃度を 0.5% に薄めてよりばらした状態を観察したもので，線維に supertwistしているようなうねりが観察され，太さもそれらしい値を示している．以上の TEM 観察の結果から，作製した凝
図8

透過型電子顕微鏡 JEM-3100FEF

図9

集体がアミロイド線維の構造的特徴を有していることが

NAIST プラットフォームでの TEM 観察の目標

図 10

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TEM 用サンプル作製の様子

文部科学省ナノテクノロジープラットフォーム令和 2 年度秀でた利用成果 -6図 11

一般的な染色剤濃度（2%）でのアミロイド線維の束の TEM 像

図 12

薄い染色剤濃度（0.5%）でのアミロイド線維の TEM 像明らかとなった．前節で説明した色素マーカーによる蛍光試験の結果と合わせることで，光圧により作製された凝集体がアミロイド線維であることが実証された．

テップとして杉山氏は次の 2 点の検討を進めている．
1）シトクロム c 以外の種々のタンパク質に対象を広げて光圧活用の本方式によるアミロイド線維の作製をこの評価結果を踏まえて，光圧によるアミロド線維の試みている．

作製の成果を化学分野の最高位の国際論文誌 Angewandte

2）高密度なタンパク質の集合体およびその集合体に変Chemie International Edition に 発 表 し [11]，Hot paper性が起こっている状態を分光学的に調べて，物理化にも選出された．同時に NAIST からプレスリリースして学的観点から現象を議論する．
更に今後の展開としては，シトクロム c 2 量体の結合状いる [12]．

態を通常のイオン結合から共有結合に換えたり，結合の箇所を変えたりしてアミロイド線維ができる場合とできない場合の情報を集める．最終目標は，アミロイド線維３．その後の研究展開の生成を阻止する薬剤の創出に貢献することである．ま上述のようにシトクロム c 2 量体を用いて光圧によりアミロイド線維を作製できることが分かったので，次のス

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た，個人的には光圧の生物科学分野の進化への貢献を期待したいと杉山氏は語った．

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[5] A. Ashkin, J. M. Dziedzic, J. E. Bjorkholm & S. Chu,
“Observation of a single-beam gradient force optical

4．おわりにtrap for dielectric particles”, Opt. Lett., Vol. 11, p. 288

その昔，壮大な宇宙の果てで認識された光圧が，近年，真逆のミクロの世界で光ピンセットとして注目されてき（1986）[6] A. Ashkin & J. M. Dziedzic, “Optical trapping andた．米国ベル研究所アシュキン氏により発明されたその技

manipulation of viruses and bacteria”, Science, Vol.

術は，今では日本が一番積極的に研究に取り上げていると

235, p. 1517（1987）

杉山氏は語った．研究の主流は，物理あるいはバイオの分野で，微粒子の動きの制御にあった．杉山氏の元上司の増[7] A. Ashkin, J. M. Dziedzic & T. Yamane, “Opticaltrapping and manipulation of single cells using

原氏が化学分野への適用の先導者となり，杉山氏はその流

infrared laser beams”, Nature, Vol. 330, p. 769

れを継いで，溶液中に分散しているタンパク質などの粒子（1987）を，光圧により特定領域に凝集させ反応を起こさせるとい[8] S.Chu, L. Hollberg, J. Bjorkhol5gatu m, A. Cable, A.

う，効率の良い物質創出手法を提言し，廣田氏と共にアミAshkin, “Three-dimensional viscous confinement andロイド線維の人工作製に挑戦している．新物質創出手法のcooling of atoms by resonance radiation pressure”,

効率の良さは，タンパク質の種類や構造など取り換えた多Phys. Rev. Lett., Vol. 55, p. 48 (1985).

くの試行による情報収集を可能とする．新しい解を見つけだすチャンスを作り出すことになろう．これは当然 NAISTプラットフォームの支援あってのことである．不治の病への光明となることを期待したい．

[9] S.Chu, “The manipulation of neutral particles”, Rev.
Mod. Phys., Vol. 70, p. 685 (1998).
[10] 東海林 竜也，坪井 泰之，「ノーベル物理学賞 2018：アシュキン博士が開拓した光ピンセットとその科学」
科学，Vol. 89, No. 2, pp. 0138-0141 (2019).
http://www.sci.osaka-cu.ac.jp/chem/advanachem/
pdf/KAGAKU-iwanami.2019.89.2.138-141.pdf参考文献[11] K. Yuyama, M. Ueda, S. Nagao, S. Hirota, T. Sugiyama,[1] 物質・材料研究機構，「令和 2 年度「秀でた利用成果」

H. Masuhara, “A Single Spherical Assembly ofの発表について～文部科学省ナノテクノロジープ

Protein Amyloid Fibrils Formed by Laser Trapping”,ラットフォーム」，プレスリリース，2020.11.17.

Angewandte Chemie International Edition, 2017,https://www.nims.go.jp/news/Vol.56, p. 6739.

press/2020/11/202011171.html

https://doi.org/10.1002/anie.201702352[2] 奈良先端科学技術大学院大学，「NAIST[12] 奈良先端科学技術大学院大学，「アルツハイマー型認知Nanotechnology Platform 事業」，ホーム，ナノテク症などに関与するアミロイド線維を光により人工作製

ノロジープラットフォーム．

することに初めて成功」プレスリリース，2017. 5. 16.

https://mswebs.naist.jp/nanopla/

http://www.naist.jp/pressrelease/2017/05/003768.

[3] A. Ashkin, “Acceleration and Trapping of Particles byhtml

Radiation Pressure”, Phys. Rev. Lett., Vol. 24, p. 156
２．４ 節 の 図 は NAIST か ら， そ れ 以 外 は 図 4 を 除 い て（1970）[4] A. Ashkin, J. M. Dziedzic, “Optical Levitation by

杉山氏から提供された．

Radiation Pressure”, Appl. Phys. Lett., Vol. 19, p. 283（1971）（向井 久和）【お問い合わせ】
分子・物質合成プラットフォーム
奈良先端科学技術大学院大学☎ 0743-72-6185
E-mail nano-net@ms.naist.jp

ホームページ
https://mswebs.naist.jp/nanopla/

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