新学術領域研究「柔らかな分子系」ニュースレター

No. 6

平成 26 年 2 月

業績紹介：ヘテロダインESFGによる帯電脂質／水界面のpHの決定
A. Kundu（理研・A02計画研究連携研究者）
山口 祥一 （理研・A02計画研究分担者）
田原 太平 （理研・A02計画研究代表者）

ペクトルのバルクpH依存性をHD-ESFGによって測定し，界面で酸と共役塩基が等濃度となるときのバルクpHを決定した．このバルクpHは，プローブ分子の界面でのpKaに，界面とバルクのpHの差を加えたものに等

論文題目："Evaluation of pH at Charged Lipid/Water

しい．プローブ分子の界面でのpKaは，プローブ分子のInterfaces

共役塩基の溶媒和発色をもとにして決定した．その結byHeterodyne-DetectedElectronicSum

Frequency Generation"

果，界面とバルクのpHの差は，DPTAPでは+3.6（つま著者：A. Kundu, S. Yamaguchi, and T. Tahara

りDPTAP／水界面の水素イオン濃度はバルクの10–3.6

雑誌巻号：J. Phys. Chem. Lett. 5, 762-766 (2014).

倍），DPPGでは–1.5（つまりDPPG／水界面の水素イオン濃度はバルクの101.5倍）であることが分かった．

脂質膜近傍の水素イオン濃度指数（pH）は，膜に埋

この結果は，下の模式図によって簡単に理解するこめ込まれたタンパク質，膜の表面に吸着した分子，膜とができる．まずDPTAP／水界面では，正帯電の親水を横断するイオンや分子などの構造とダイナミクスを基によってプロトンは斥けられる．そのため，界面の左右する重要な因子である．しかし，膜近傍のpHはい水素イオン濃度はバルクよりも低くなり，界面のpHはまだ精確に評価されていない．しばしば蛍光プローブ

バルクよりも（3.6だけ）高くなる．逆にDPPG／水界による脂質膜のpH測定がなされているが，これは精確面では，負帯電の親水基によってプロトンは引きつけな評価ではない．蛍光強度はプローブ分子の基底状態られる．そのため，界面の水素イオン濃度はバルクよと励起状態の両方における酸解離指数（pKa）に依存すりも高くなり，界面のpHはバルクよりも（1.5だけ）低るが，（バルク水中とは異なる）膜近傍でのそれら2つくなる．のpKaの値を決めることは困難であり，蛍光強度から膜細胞膜を構成する脂質としては，帯電脂質だけでな近傍のpHを決定することは実はほぼ不可能である．

く，両性イオン性および非イオン性の中性脂質が重要

ヘテロダイン検出電子和周波発生（HD-ESFG）分光である．同じpH評価法を中性脂質／水界面にも適用し，法は，界面の分子の“吸収スペクトル”を与える方法

親水基の電荷とプロトンの間のクーロン相互作用以外である[1]．
“吸光度”（HD-ESFGスペクトルの縦軸の値）にどのような因子が中性脂質／水界面のpHを決めては，プローブ分子の基底状態のpKaのみに依存する．膜いるのか，現在研究を進めている．

近傍でのプローブ分子の基底状態のpKaを何らかの方法で決定すれば，その値とHD-ESFGスペクトルから膜DPPGDPTAP近傍のpHを決定することができる．この考え方に基づいて，一昨年我々は空気／水界面のpHを評価し，空気／水界面はバルクよりもpHが1.7低い，つまり空気／水とを報告した[2]．

H+

H+

今回我々は，脂質膜のモデルとして帯電脂質／水界

H+

H+

H+

その結果，帯電脂質／水界面のpHは，脂質の親水基の正または負の電荷とプロトンとの間のクーロン斥力ま図

H+

H+

H+H+面を取り上げ，そのpHを同じ方法を用いて評価した．

+
H+ H+
H+ H+
H+ H
++ H+H+ H+
H+ H H+ H

H+

H+

界面はバルクよりも水素イオン濃度が101.7倍大きいこ

H+

H+
H+

H+

H+H+

H+

H+

H+

帯電脂質／水界面のpHを理解するための模式図．

たは引力を考えれば簡単に理解できることを見出した．
用いた脂質は，親水基が正に帯電したDPTAPと，負引用文献に帯電したDPPGである．それらを水面上に展開して[1] S. Yamaguchi and T. Tahara, J. Chem. Phys. 129,脂質／水界面を用意した．プローブ分子は，アルキル

101102 (2008).

鎖を有するヒドロキシクマリン（とその共役塩基）で[2] S. Yamaguchi, A. Kundu, P. Sen, and T. Tahara, J. Chem.

ある．脂質／水界面に吸着したプローブ分子の電子ス

Phys. 137, 151101 (2012).

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No. 6

平成 26 年 2 月

神取グループの井上圭一さんが光科学技術研究振興財団 平成 25 年度研究表彰を受賞
神取 秀樹（名工大・A03 計画研究代表者）

合できても他の陽イオンの結合は不可能であり、したがって Na+ポンプはありえないと明快に説明していま

A03 計画班神取グループ（名工大）連携研究者の井した。今回の発見は、このような分野（と私自身）の上圭一さんが、光科学技術研究振興財団 平成 25 年度常識を覆す驚くべきものでした。

研究表彰を受賞しました。光科学技術研究振興財団は、昨年 Nature Communications 誌に発表した論文[1]の光科学技術に関する基礎的な調査・研究、研究への助第一著者である井上さんは、大学院生の大野君、伊藤成及び表彰等を行うことにより、光科学技術の高度化君、博士研究員の吉住さんとともに、生細胞での機能と新しい科学の創造に貢献するとともに、光科学技術測定から大腸菌懸濁液での活性測定、吸収スペクトルの振興を図り、科学技術と産業経済の発展に寄与する測定、HPLC、フラッシュフォットリシス測定、全反ことを目的として 1988 年に設立されました。そして今

射赤外分光測定を、野生型だけでなく変異体まで含め回、井上さんが受賞した研究表彰は、毎年、光科学にて包括的に行い、単なる新機能の発見に留まらず、「レ関する基礎的な研究または光科学技術の向上に役立つチナールからのプロトン移動が Na+の輸送を実現する研究の中でも、独創的な研究を行った 35 歳以下の研究「Na+こと」、「Na+結合部位は細胞外側領域にあること」

者 2∼3 名を対象に授与されます。

結合は輸送機能に必須ではないこと」など、メカニズ受賞対象となった井上さんの研究テーマは「光駆動ムに関わる重要な知見を明らかにしました。

型ナトリウムポンプの発見」です。井上さんは神取グ

今回の受賞に際し井上さんは、その性格通り、共同ループにおいて東大大気海洋研との共同研究の中で、研究者に対する感謝の気持ちなどを誠実にコメントし海洋性細菌のゲノムから新たに光駆動型の膜タンパクています（名工大 HP のニュース参照）。私はこれまで質であるナトリウムポンプ型ロドプシン（NaR）を発ハードワーカーと呼べる研究者を何人も見てきました

見しました。さらに種々の分光測定によってその機能が、井上さんはその中でも飛び切りです。これも彼がメカニズムを明らかにするとともに、オプトジェネ

学生、ポスドク時代を過ごした京大院理･寺嶋正秀教授、ティクスへの応用の可能性も示し、光科学技術への貢東工大資源研･藤井正明教授のご指導の賜物でしょう。

献が評価され今回の受賞へと繋がりました。

NaR が関わる機能創成は本領域の重要な研究テーマでナトリウムイオンを輸送するロドプシンの発見あり、彼の背中を追いかけるラボ内外の若きハードナトリウムポンプ型ロドプシンは、真正細菌や古細ワーカーたちと一緒に、井上さんが今後、何を明らか菌など微生物に広く見られる微生物型ロドプシンの一にされるか、私自身がいちばん楽しみにしています。

種です。代表的な微生物型ロドプシンには水素イオンおめでとうございます。

+）ポンプ型を細胞の内から外へ輸送するプロトン（H[1] Inoue, K.; Ono, H; Abe-Yoshizumi, R.; Yoshizawa, S.;

ロドプシンがあり、その他に細胞の内側へクロライド

Ito, H.; Kogure, K.; Kandori, H. (2013) Nature Commun. 4,イオン（Cl-）を運ぶロドプシンや、様々なカチオンをArticle number:1678

濃度勾配に従って受動的に輸送するチャネルロドプシンなどが知られていました。我々ヒトはイオン輸送性ロドプシンを持ちませんが、脳機能解明に期待を集めるオプトジェネティクスの誕生は、微生物型ロドプシンの研究に新たな展開と熱気をもたらしています。
興味深いことに Cl-ポンプは Br-, I-, NO3-なども輸送できるにも関わらず H+ポンプは H+しかポンプできません 。海洋中に 多量に含まれる ナトリウム イオン（Na+ ）など陽イオンを輸送するロドプシンは見つかっていなかったのです。私はかつて高校生から「なぜ Na+ポンプがないのですか？」と尋ねられたとき、ロドプシン中で光を吸収するレチナールはプロトン化

写真：光科学技術研究振興財団「研究表彰」をして正電荷を帯びているため、プロトン自身や Cl-を結受賞した井上さん

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No. 6

平成 26 年 2 月

Taiwan Academia Sinica 滞在報告齊藤雅嵩 (東北大院理・A02 計画研究協力できました。ユビキチンの発現・精製の一連の操作を行ったことは、今後タンパク質を扱う上で良者 M2)い経験になったと思います。
発現・精製に加えて、精製したタンパク質の蛍私は、2013 年 11 月 7 日から 16 日まで台湾に滞光色素標識も行いました。今回の手法では、二つ在し、中央研究院・生物化学研究所(IBC, Academiaの異なる蛍光色素を、露出表面積の異なる二つのSinica)の Rita P.-Y. Chen 博士の研究室で測定試料のシステイン残基に標識しました。それぞれの色素作成と研究に関する議論を行いました。私は、ユ標識の反応条件を変えることで、部位特異的に標ビキチンの折り畳みを、サブミリ秒の高時間分解識することができます。標識する残基の場所を選能で一分子 FRET 測定することで、そのダイナミぶことで、部位特異的な標識を簡便に行うことがクスを研究しています。測定に用いるユビキチンできるため、素晴らしい手法だと感じました。

変異体とその蛍光色素標識体は、Rita P.-Y. Chen 博士の研究グループに提供していただいたものです。
今回は、私が台湾の研究室に滞在し、タンパク質私が不安に感じていた英語に関してですが、Academia Sinica の学生は、普段から英語で議論していることもあり、流暢な英語で会話しておりまの発現・精製、蛍光色素の標識をポストドクターした。私は、その様子に、研究者としてやっていの Hsin-Liang Chen 博士(Eric)に指導していただきく上での英語の重要性を実感し、とても刺激を受ました。今回の滞在に際して、本新学術領域からけました。一方で、彼らとの会話や Rita P.-Y. Chen

旅費を支援していただき、まことにありがとうご博士へ研究の報告をした際に、流暢ではないものざいました。の、自分の主張を何とか伝えることができたと感

私は海外を訪問することが初めてでした。そのじました。これは、私にとってとてもうれしい経ため、英語を聴き取ることができるのか、自分の験で、今後研究を続ける上での自信となりました。

主張を伝えることができるのか、そもそも交通機今回の知識と経験を、これからの研究に存分に活関を利用できるかなど、不安が多々ありました。

かしたいと思います。

しかし、Eric さんが滞在期間中の面倒を見てくださったために、到着後は安心して生活することができました。
Rita 博士は、タンパク質の折り畳みとプリオン病やアルツハイマー病に関連するタンパク質のミスフォールディングについて研究されております。
Rita 博士は非常に気さくな方で、食事をご一緒させていただいたときに、私の今後においてとても参考になるアドバイスを下さいました。また、研究室のメンバーは、博士研究員の方が Eric さんを含めて 2 人、博士後期課程の学生が 1 人、博士前期課程の学生が 4 人、技術補佐員の方が 2 人で、と左から 1 番目が Eric さん、その隣が私、そして Rita博士の研究室のメンバー。ても良い雰囲気の研究室でした。
Academia Sinica の研究施設は、とても充実しており、研究室所有の装置に加えて、共通機器も多数ありました。そのため、実験を円滑に進めることができ、滞在期間中に充実した日々を送ることができました。私は、タンパク質の発現・精製を行った経験が無かったのですが、Eric さんや学生の方々が親切に教えて下さり、理解を深めることが21