Myoridge Cell Manualwith CarmyA Medium UG

心筋細胞 解凍･培養マニュアル

株式会社マイオリッジ |info@myoridge.co.jp

ver.3.2

心筋細胞

解凍･培養マニュアル

Ver.3.2

心筋細胞 解凍･培養マニュアル
目次
1.

構成 .........................................................................................................................................................22.

関連製品 （表２参照）.......................................................................................................................33.

別途ご用意いただくもの.......................................................................................................................54.

心筋細胞の解凍フロー...........................................................................................................................6

5.

プレートのコート - 96 well plate （低面積：約 34 mm2） ............................................................7

6.

心筋細胞の解凍 ......................................................................................................................................7

1

心筋細胞

1.

解凍･培養マニュアル

Ver.3.2構成

心筋細胞解凍・培養マニュアル

クライオチューブ凍結心筋シングル細胞 CarmyA シリーズ（表１参照）

表１ クライオチューブ凍結心筋シングル細胞 CarmyA シリーズ
製品コード
H-011106
H-011107
G-011106
G-011107
M-011106

製品名

容量1.0×10⁶ cells / vial

CarmyAヒト iPS 細胞由来心筋細胞

1.0×107 cells / vial

CarmyA-GCaMP
ヒト iPS 細胞由来心筋細胞（GCaMP 導入株）
CarmyA-Monkey
サル iPS 細胞由来心筋細胞

1.0×10⁶ cells / vial
1.0×107 cells / vial
1.0×10⁶ cells / vial

■ CarmyA シリーズ
・細胞はドライアイスとともに梱包してお送りします。−80℃以下のフリーザー又は液体窒素等で保存してください。
・一か月以上保存する場合の推奨温度帯は−150℃以下です。
・細胞の解凍と維持には CarmyA®用播種・維持培地キットをご用意ください。
（2 関連製品参照）

2心筋細胞

2.

関連製品 （表２参照）

CarmyA®用播種・維持培地キット

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必要量は心筋細胞 1.0×10⁶ cells / vial 1 本につき 1 キットが目安です。
CarmyA®維持用培地 UG
CarmyA®用播種・維持培地キットの維持用培地 UG が追加で必要な場合はこちらをお求めください。

表２ CarmyA®専用培地
製品コード

商品名容量CarmyA®播種用培地-2TM 10 mL
CarmyA®播種用培地-TB 10 mL
ME-12A001KT CarmyA®用播種・維持培地キット CarmyA®維持用培地 UG 40 mL
２TM 専用サプリメント 1 本
維持培地 UG 専用サプリメント 1 本
CarmyA®維持用培地 UG 40 mL
ME-01A00241

CarmyA®維持用培地 UG

維持培地 UG 専用サプリメント 1 本■ CarmyA®維持用培地 UG
・40 mL 強入りです。
・解凍播種の翌日に使用します。
・CarmyA®維持用培地 UG と維持培地 UG 専用サプリメントを４℃で一晩または室温で数時間かけて解凍してください。
・維持培地 UG 専用サプリメントはボルテックスやタッピングを避けてスピンダウンしてください。

・培地は解凍後に転倒混和してから残渣を除去するために 300×g で 5 分間遠心分離して上清を 40 mL 回収し、維持培地 UG 専用サプリメント 1 本を添加して転倒混和により、培地をよく混ぜてご使用ください。
・培地の加温は必要量を分取しておこなってください。

・培地の保証保存期間は、−20 ℃以下で 6 カ月間、解凍して維持培地 UG 専用サプ
（再凍結・融解は不可）
リメントを添加した後は４℃で 2 週間です。

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Ver.3.2■ CarmyA®播種用培地-2TM・10 mL 入りです。
・解凍播種時に使用します。
・CarmyA®播種用培地-2TM と２TM 専用サプリメントを４ ℃で一晩または室温で数時間かけて解凍してください。
・サプリメントはボルテックスやタッピングを避けてスピンダウンしてください。

・培地は解凍後に転倒混和してから残渣を除去するために 300×g で 5 分間遠心分離して上清を 9.6 mL 回収し、２TM 専用サプリメント 1 本を添加して転倒混和により、培地をよく混ぜてご使用ください。
・培地の加温は必要量を分取しておこなってください。
・培地の保証保存期間は、−20 ℃以下で 6 カ月間、解凍して２TM 専用サプリメントを添加した後は４ ℃で 2 週間です。
（再凍結・融解は不可）■CarmyA®播種用培地-TB・10 mL 入りです。
・細胞の解凍播種時前にプレートをコートする際に使用します。
・CarmyA®播種用培地-TB を４ ℃で一晩または室温で数時間かけて解凍してください。

・培地は解凍後に転倒混和してから残渣を除去するために 300×g で 5 分間遠心分離して上清を 9.6 mL ほど回収してご使用ください。
・培地の保証保存期間は、−20℃以下で 6 カ月間、解凍後は４ ℃で 2 週間です。
（再凍結・融解は不可）

4心筋細胞

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Ver.3.2

3.

別途ご用意いただくもの−80℃フリーザー



−150℃ディープフリーザー又は細胞保存用液体窒素タンク（１カ月以上保存の場合）

−20℃フリーザー



20 μL ピペットマン、20 μL チップ、200 μL ピペットマン、200 μL チップ、1000 μL ピペットマン、1000 μL チップ



50 mL 遠沈管、15 mL 遠沈管

ウォーターバス 37℃

インキュベーター 37℃ 5 % CO2

ROCK Inhibitor （Y-27632）

接着因子（Fibronectin Sigma F0895）



血球計算盤、自動セルカウンター

トリパンブルー等

PBS（−）（富士フィルム和光純薬 164-23551）

5

心筋細胞

4.

心筋細胞の解凍フロー

図 1 解凍方法

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5.

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プレートのコート - 96 well plate （低面積：約 34 mm2）
5.1

CarmyA®播種用培地-TB を解凍して調製する。
（3 ページを参照）
コートするウェルの目安：1×106 cells1 本あたり 16-30 ウェル

5.2

0.1%の Fibronectin 溶液を 5.1 の CarmyA®播種用培地-TB で 100 倍希釈し、96ウェルプレート 1 ウェル対して 100 μL を添加して、37℃ 5 % CO2 インキュベー
ターで 1 時間または室温で 3-4 時間静置する。使用しないウェルには PBS またはミリ Q 水をいれておく。コート後、コート剤は抜かずに細胞播種に使用する。

6.

心筋細胞の解凍6.1. CarmyA®播種用培地-2TM を解凍して調製する。
（3 ページを参照）
6.2. 15 mL 遠沈管に２TM 専用サプリメントを添加した CarmyA®播種用培地-2TMを 8 mL とり､ROCK inhibitor（Y-27632, Ri）を 20 µM になるように添加し、ピペッティングにより混和する。これを解凍播種培地とし、室温に戻して使用する。
6.3. プレコートしておいた 96 ウェルプレートをインキュベーターから出し、15 分程度静置して室温に戻す。
6.4. 凍結心筋シングル細胞が入った１本のクライオチューブを 37℃のウォーターバ
スで３分間温め､解凍する（３分以上は温浴しない）。クリーンベンチ内で、1000μL チップを用いて､クライオチューブから細胞懸濁液を 50 mL 遠沈管にゆっくりと移す｡
注意：ピペッティングは行わない。
6.5. 用意した解凍播種培地 １mL を 1 滴/５秒の速度で 50 mL チューブの細胞懸濁液に添加し、緩やかに振り混ぜる｡

6.6. 再度 1 mL の解凍播種培地を 1 滴/ 2 秒で加え緩やかに振り混ぜる。
6.7. 細胞懸濁液からセルカウントを行う。細胞が沈降するため、6.6 で細胞懸濁液を振り混ぜた後、速やかにカウントを行う。
Note：生細胞密度はおよそ 0.3-1×106 cells/mL 又は 0.3-1×107 cells/mL ほどになる。
6.8. 適量の解凍播種培地を 1 滴/秒で加え緩やかに振り混ぜ細胞密度を調整する。
Note：推奨細胞濃度は 6×104 cells / 100 µL
6.9. 細胞懸濁液を緩やかに２-３回ピペッティングで混和し、6.3 のプレートに 100 μL
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添加して播種する｡
注意：プレートのプレコート液は除かずに細胞懸濁液を添加する。
6.10. 細胞接着の偏りをなくすため、クリーンベンチ内で 15 分間静置したのち、細胞を揺らさないようにゆっくりと 37 ℃の 5 % CO2 インキュベーターに移す｡
6.11. 播種した翌日、CarmyA®維持用培地UG を解凍して調製する。
（3 ページを参照）
必要量を分取して 37 ℃に温める。
（必要量 100 μL/well）
6.12. プレートの培地を 150 μL 除き、6.11 の培地を 100 μL/well 添加する。
6.13. 以降は 2-3 日ごとに、培地 130 μL を除き、6.11 で調製した CarmyA®維持用培地
UG を 130 μL 加える｡（培地は必要量を分取して 37℃に温めて使用する。
）

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