TOKAI UNIVERSITY
THE INSTITUTE OF MEDICAL SCIENCES

創薬・病態解析研究部門
肝臓・腎臓病学研究部門「腎臓病に伴う骨・ミネラル代謝異常の病態解明」【研究概要】
腎臓は副甲状腺，骨とともに，生体のミネラルバランスの維持に重要な役割を担っている。
このため，腎臓病患者では骨・ミネラル代謝異常が出現し，骨病変のみならず，血管石灰化を介して生命予後に深刻な影響を及ぼす。
このような病態において重要な役割を担っているのがFGF23-Klotho系である。

Col1a1

Cre

loxP

STOP

loxP

KlothoX

FGF23は骨細胞により産生されるホルモンで，腎尿細管を主な標的臓器とし，尿中へのリン排泄および活性型ビタミンD産生を抑制する。
Col1a1-Cre mouse

FGF23がその生理作用を発揮するためには，標的細胞にFGF受容体とともに膜蛋白Klothoが共受容体として必要となる。FGF23は副甲状腺にもKlotho-loxP mouse

作用し，副甲状腺ホルモン（PTH）の産生を抑制するが，腎不全患者では異常高値を示すFGF23によってもPTH分泌は抑制されない。われわれは腎不全患者ではFGF受容体とともにKlothoの発現が低下していることを発見し，これによるFGF23抵抗性のため，異常高値を示すFGF23によってもPTH分泌が抑制されないという病態をこれまで明らかとしてきた。
しかしながら，FGF23-Klotho系の詳細は未だ完全には解明されていない。骨細胞におけるFGF23産生に関して，近年，骨細胞にも僅かに発現するKlothoが関与している可能性が示されているが，未だ確定的ではない。
また，FGF23は近位尿細管を主たる標的臓器とし，尿中へのリン排泄および活性型ビタミンD産生を抑制するが，近位尿細管よりも遠位尿細管の方がKlothoは強く発現しており，近位尿細管のKlothoがFGF23作用にどのように関与しているかは明らかではない。
そこで本プロジェクトでは，骨組織，あるいは近位尿細管に特異的にKlothoを過剰発現するマウスを作製し，FGF23-Klotho系の解明を目指す。

プロジェクトリーダー：駒場大峰Bone-Komaba Hirotaka
医学部医学科内科学系 腎内分泌代謝内科学 領域主任教授
腎・血液透析センター センター長

図1．Cre-loxP部位特異的組換え法を用いた骨組織特異的Klotho過剰発現マウスの作製
ROSA26領域にCAG-loxP-STOP-loxP-KlothoをノックインしたKloth-loxPマウスを作製し，このマウスに骨組織特異的にCreを発現するCol1a1-Creマウスを交配させる。骨組織においてCre-loxP部位特異的組換えによりSTOP配列が切除され，骨組織特異的にKlothoを過剰発現するマウスが誕生する。

さらに腎臓病患者を対象とするコホート研究のデータを用いて，腎臓病におけるFGF23-Klotho系の役割の解明を目指す。

【研究成果】
骨組織特異的Klotho過剰発現マウスを，Cre-loxP部位特異的組換え法を用いて作製するため，われわれはまずKlotho-loxPマウス（ROSA26領域にCAG-loxP-STOP-loxP-Klothoがノックインされたマウス）を作製した。
このKlotho-loxPマウスをCol1a1-Creマウス（B6.FVBTg(Col1a1-cre)1Kryマウス）と交配し，骨組織特異的Klotho過剰発現マウス（Col1a1-Cre;Kl-Tg）を得ることに成功した。本マウスは対照マウス（

石岡 千草Cre;KK
l-Tl-Tgg

203210a1-

Klotho/GAPDH mRNA

深川 雅史

40

ol1

中のFGF23濃度も上昇することを見出した。阻害薬を用いた検討により，Klotho過剰発現によるFGF23の発現亢進は，FGFR依存的なMAPK経Ohtsuka Masato
分子生命科学 教授

60

Cく死亡することが明らかとなった。Kl-Tgマウスより骨芽細胞を単離・培養し，この細胞を分化成熟させると，FGF23発現が著しく上昇し，培養液

Col1a1-Cre;Kl-Tg

さらにこのマウスを解析したところ，FGF23産生が著明に亢進していることを見出した。
また，著明な全身の骨石灰化障害を呈し，生後間もな

大塚 正人

Nakagawa Yosuke
腎内分泌代謝内科学 講師

80

Kl-TgKl-Tg）と比較し，骨組織のKlotho発現が著しく亢進していることをRT-PCT，免疫染色，Western Blotにより確認した（図2）。

中川 洋佑

路の活性化によって媒介されることが確認された。
またFGF23投与により，Egr-1発現が亢進することを確認した。以上の結果より，膜型KlothoはFGF23-Klotho-FGFRシグナル複合体を介した正のフィードバックループを形成することにより，骨細胞におけるFGF23産生を刺激するものと考えられた。
次いで，Klotho-loxPマウスをSlc34a1-Creマウス（Slc34a1tm1(EGFP/cre/ERT2)Bhum）と交配させ，近位尿細管特異的Klotho過剰発現マウ

図2．骨組織におけるKlotho発現
骨組織特異的Klotho過剰発現マウス（Col1a1-Cre;Kl-Tg）は対照マウス（Kl-Tg）と比較し，骨組織のKlotho発現が著しく亢進していることが確認される。

スを作製した。生化学データの解析では，リン・ビタミンD代謝に大きな変化は認められなかったが，FGF23の有意な抑制を認めた。近位尿細Fukagawa Masafumi
腎内分泌代謝内科学 客員教授

管でのKlotho過剰発現により，FGF23に対する感受性が亢進していることが示唆される結果であった。
さらに現在，血液透析患者を対象とするコホート研究の保存血清を用いて，近年，FGF23産生に関与することが示されたグリセロール3-リン酸（G-3-P）との関連性を検討している。血清G-3-P値の上昇は血清リン値の上昇と強く関連しており，さらにこの関連性とは独立して血清FGF23値の上昇と関連していることが明らかとなった。透析患者においてG-3-Pがリン上昇に伴って上昇し，FGF23産生の調節に関与する可能性が示唆された。

【今後の展望】
骨組織特異的Klotho過剰発現マウス，近位尿細管特異的Klotho過剰発現マウスを用いた検討により，FGF23-Klotho系の詳細が解明されることが期待される。
また，Klotho過剰発現による低リン血症性くる病の疾患モデルとして，治療薬開発の基盤となることも期待される。近年，腎不全患者で著明に上昇するFGF23は多面的な毒性を示す可能性が示されており，この観点からもFGF23分泌制御につながる本研究成果は，臨床的に重要な知見を提供するものである。
さらに今後，Klotho-loxPマウスをさまざまな組織特異的Creマウスと交配させることにより，他の臓器におけるKlothoの役割に関しても検討を進めたい。

Ishioka Chigusa
腎内分泌代謝内科学 研究技術員

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