厚生労働科学研究委託費（革新的がん医療実用化研究事業）
委託業務成果報告
小児造血器腫瘍（リンパ系腫瘍）に対する標準治療確立のための研究
急性リンパ性白血病におけるフローサイトメトリー法による微小残存病変の診断の確立
担当責任者
研究要旨

出口隆生

三重大学医学部附属病院小児科講師

小児急性リンパ性白血病（ALL）におけるフローサイトメトリー法を用いた微小残存病変（FCM-MRD）検出システムを確立するため、小児白血病治療研究において FCM-MRD の測定を行った。平成 27 年 1 月までに再発 B 前駆細胞性（BCP）ALL 全国共同臨床試験 ALL-R08
では 80 例、のべ約 400 ポイントで、乳児 ALL 臨床試験 MLL-10 では 68 例、のべ約 230 ポイントの測定を実施し、１例のみ途中で測定不能となった症例を認めた。T 細胞性（T-）ALLおよび BCP-ALL の初発例に対する臨床試験 ALL-T11・ALL-B12 では４カラー法を改良した６カラー法を用いて解析を行い、平成 27 年 1 月までに各々49 例・171 例、各々約 190 検体・
約 680 検体の解析を行った。現在、順次解析中であり、今後 PCR とのデータ比較を行うことで相関を確認し、PCR 法が適用出来ない症例やポイントでの実施可能性を検討する。
Ａ．研究目的ALL 臨床試験 MLL-10 が、平成 24 年１月には小小児 ALL 治療における最も強力な予後因子

児・若年 T-ALL 臨床試験 ALL-T11 が、平成 24のひとつが微小残存病変（MRD）であることは、

年 11 月から小児 BCP-ALL 全国共同治療研究

ドイツの BFM グループやアメリカの St. Jude

ALL-B12 が、平成 25 年から小児 Ph 染色体陽性小児病院、イギリスの UKALL 等、欧米の治療研

ALL 臨床試験 ALL-Ph13 が開始されてきた。こ究により初発例・再発例で共に有用性が示されれらの臨床試験では MRD を積極的に測定し、我ている。しかし我が国における小児 ALL 全国共が国のデータを蓄積させることで将来の臨床同臨床試験では、未だ ALL 症例のごく一部で臨応用に備える目的がある。

床応用が開始されたのみであった。

MRD 測定にはフローサイトメトリー（FCM）

日本小児白血病リンパ腫研究グループと PCR による２つの方法があり、我々は FCM（JPLSG）を母体とした全国的規模での臨床研を用いた免疫学的手法の確立を目的としてい究・診断検討の普及により、平成 22 年度からる。すでに平成 14 年度から FCM-MRD 研究の先JPLSG が主体となって小児白血病の包括的診駆者である St. Jude 小児病院の Dr. Campana

断・検体保存に関する臨床研究が開始され、初らと協力し、予備的検討を行ってきた。これま期診断は体制がかなり整いつつあるものの、で BCP および T 細胞性（T-）ALL の初発例・再MRD 測定システムの確立は未だ十分ではなく、発例を中心に基礎的検討を行った上で、平成切迫した課題であった。

21 年度以降、前述の全国規模の小児白血病臨

平成 21 年 6 月の小児再発 BCP-ALL 治療研究

床試験の中で前向き研究を開始している。この

ALL-R08 に引き続き、平成 23 年 3 月には乳児分担研究は、我が国において全国規模でのFCM-MRD 測定を永続的な体制として確立するは 6 カラーによる改変法を用いて最大２種類ために必要な条件を明らかにすることが目的のサンプルを用いて測定した。

である。小児 ALL の大部分を占める BCP-ALL

6. 調整されたサンプルは BD Bioscience 社の臨床試験開始後は検体数が飛躍的に増加し、の FACS Calibur もしくは FACS Canto II FCM

費用面、運用面での問題点が明らかになりつつにてデータ収集を行い、MRD を解析した。

あるが、今後、臨床成績との関連を明らかにして我が国における実施可能性を検討する。

7.

解析された MRD の結果はデータベースに保存され、後の予後解析のために用いる予定である。ALL-R08 においてはすでに解析が終了

Ｂ．研究方法した PCR-MRD との間で相関を検討された。

平成 21 年 6 月から平成 27 年 1 月までの間に、三重大学医学部小児科・JPLSG/日本小児白血病（倫理面への配慮）研究会（JACLS）マーカー解析センターにて再すべての検体は各々の臨床試験によって番発診断を行った ALL-R08 登録例 80 例と、平成号化され、連結可能匿名化された状態で解析セ

23 年 1 月から平成 25 年 3 月までに MLL-10 にンターに送付された。臨床情報はデータセンタ

登録された 68 例、ALL-T11 に登録された 49 例、ーにて管理されている。

ALL-B12 に登録された 171 例において、発症時（BMA1）、day 8 末梢血（PB）、day15 骨髄（BMA2）、Ｃ．研究結果

寛解導入療法後（BMA3）、早期強化療法後（BMA4）（１）PCR-MRD と結果を比較検討した ALL-R08の各ポイントについて FCM-MRD の測定を行っ症例は 42 例であった。FCM-MRD は 0.00%〜た。

63.02%、PCR-MRD が 0.00%〜88.00%（8.8 x10E-1）

1.検体送付施設はプロトコールに指定されであった。BMA3 における移植適応判定に用いた検体依頼書を三重大学に事前に送付した上るカットオフ 0.1%（1.0 x10E-3）未満の症例で、ヘパリン加骨髄（BM）もしくは PB を宅配

数は、FCM-MRD で 19 例、PCR-MRD で 19 例であ便で送付した。

った。カットオフ値を挟んで判定が異なったう

2. 送付された BM・PB は洗浄の後、細胞濃度

ち の １ 例 は FCM が 0.08% 、 PCR が 0.10%を調整した上で全血法を用いた手法で JPLSG（1.0x10E-3）であり、値は非常に近かった。

診断パネル基づいて白血病の病型診断を受けもう一例は FCM-MRD が 19.3%であるにも関わらた 。 ま た 同 時 に MRD 診 断 パ ネ ル に 従 っ てず、PCR-MRD は陰性を示した。BMA3 での診断一FCM-MRD 用検体を調製した。

致率は約 89.5%、42 例全体での相関係数は3. 各々のプロトコールで規定された採取ポ0.8203 であった。なお、PCR で陰性であった症

イントの BM・PB を用いて MRD を測定した。フ

例のうち２例で FCM 陽性を示す症例があり、今ォローアップ検体は単核球分離を行った後、細後予後解析により、それらの臨床的意義が検討胞濃度を調整し、検体を調整した。

される。

MRD 測定はセントジュード小児病院か（２）FCM-MRD の測定上問題となった症例は、ら報告された４カラーFCM-MRD 測定法を基に正 常 細 胞 と 発 現 が 近 く 、 immunophenotypicカスタマイズしたパネルを用い、最大３種類のshift を来した症例が 1 例、およびもともと正サンプルで測定した。ALL-T11・B12 において常と発現のほとんど変わらなかった９例

4.

（MLL-10 4 例、T-ALL 2 例、BCP-ALL 3 例）をMRD 症例は継続的に MRD が陰性化していること除いた 358 例で MRD の評価可能であった。なお、が確認できた。さらには BMA3 で MRD が陽性で検体作成不可能であった症例がのべ 10 検体以も、その後 MRD が陰性化する症例を認めた。こ

上存在し、それらは凍結や高温などの要因によれらの症例が造血細胞移植でレスキューされって検体到着時、すでにダメージのあった症例る症例（およそ 20〜30%）と一致するかどうかのみであった。

は非常に興味深く、最終的な予後との相関の解(３)臨床経過との関係：ALL-R08 で MRD の析が待たれる。

Serial な解析結果を症例毎に検討した。臨床

ALL-R08 では PCR-MRD との相関を検討してきて上最も重要と考えられる BMA3 の測定を行ったいるが、一貫して良好であると考えられた。若59 例中、BMA３で MRD が陰性となった症例は 17

干 FCM-MRD が低い値を示す傾向があり、また 2例あり、その中で BMA5 の測定を行った 12 例全例において、PCR では陰性、FCM では陽性となてが MRD 陰性を維持していた。BMA3 で移植適る値を示した症例が存在したが、結果が全く乖応とならない 0.1%未満の MRD を検出した 13 例

離していることから、TCR/IgH 再構成バンドがでは、BMA5 を測定した 11 例中 10 例が BMA5 でポリクローナルであり、PCR プライマーとしてMRD が陰性化した。しかしながら BMA3 で 0.1%不適切なクローンを選択してしまった可能性

から 1%の MRD を検出した 12 例では、BMA5 を測が高いと考えられた。MLL-10 臨床試験では、定した 11 例中４例のみが MRD 陰性化したのみ

MLL 遺伝子再構成を有する乳児白血病特有のであった。また BMA3 で 1%以上の MRD を検出し表現型に合わせて、7.1(NG2)や CD133 などの検た 17 例では、BMA5 を測定した 11 例中 MRD が査項目を加えて検討を行ったが、平成 27 年 1陰性化したのは 2 例のみであった。

月までに検討を行った 42 例のうち 4 例で正常(4)BCP-ALL, T-ALL においては現在解析が進行

BCP と同様の抗原発現パターンのため、MRD の中であり、平成 27 年度中には解析を終了した評価が困難であった。核型の分析ではこれら 4上で、PCR-MRD との比較検討が行われる予定で例はすべて t(9;11)転座を有した CD34 陰性 ALLある。

であり、この疾病亜群における MRD 測定の改良が必要と考えられた。

Ｄ．考察

T-ALL では、TdT 陰性化による測定不能を避ALL-R08 臨床試験において平成 25 年 3 月までけるため、6-color 化および CD99 による検討に BMA3 までの解析が終了している 55 例では、を追加して解析を開始した。この 2 種の抗原解

引き続き再発診断時の表現型が、正常 B リンパ析でほとんどの症例は MRD フォローが可能で球前駆細胞に近い白血病も含まれていたものあったが、2 例においてターゲットの設定が困の、治療早期（BMA2〜BMA3）では免疫学的表現難でありフォロー不可能と判断した。この 2型が正常に近くても比較的容易に検出され、パ例はともにγδ型 T 細胞受容体が陽性である

イロット研究と同様の結果であった。MRD 量が特殊なタイプで、乳児における t(9;11)転座同多めの 1 例で判定が難しかったが、PCR 法の結様、この疾病群における測定系の改良が必要と果と比較することで、実際にはほとんど全てが考えられた。

MRD 細胞であると確認できた。
臨床経過との関係では、化学療法群となる低BCP-ALL では、4 カラーで検討していた CD38と CD58 などの抗原を複数組み合わせることで、検討項目数を減らす試みを行ったが、正常と表が移植によって救済された例であるかを臨床現型が似た症例の 3 例で継続的フォローが困的予後と検討する必要がある。

難であった。

4. T-ALL・BCP-ALL における 6 color 解析の

現在、T-ALL/BCP-ALL では、PCR-MRD との相関有用性が示され、全国規模で実施中である。

や他の検査施設との相関など QC 的な検討を行

5. 平成 25 年度に ALL の FCM-MRD を 7/8 カラった上、予後との検討を行っていく予定である。

ーパネル化への準備を終え、27 年度から変更

FCM-MRD の測定機器は年々改良が重ねられ、予定である。4/6 カラーで追跡が困難であったマルチカラー化が進んできたが、ここ数年は症例での改善が期待される。

St. Jude 小児病院では ALL は 7 カラー、AMLは 8 カラーでの検討が主体となっている。また
I-BFM では EuroFlow コンソーシアムによってＦ．研究発表1. 論文発表定められた 8 カラーパネルによって診断と MRD

1. Yano M, Imamura T, Asai D, Moriya-Saito

評価を一体化させている。現在、三重大学小児

A, Suenobu S, Hasegawa D, Deguchi T, Hashii

科では BCP-ALL では 7 カラー、T-ALL では 8 カ

Y, Kawasaki H, Hori H, Kosaka Y, Kato K,

ラーの St. Jude 小児病院と同一のパネルを使Horibe K, Yumura-Yagi K, Hara J, Matsumoto

用した解析の準備を終え、平成 27 年度中にはK, Kiyokawa N, Oda M, Sato A; Japan

移行予定である。

Association of Childhood Leukemia Study.

2014 年中に三重大学では診断検体も含め、

An overall characterization of pediatric

年間 1,400 検体余りの FCM 解析を行っているが、acute lymphoblastic leukemia with 2

今後、我が国の FCM-MRD 評価体系をどのようにoverexpression.

進めていくかは、医療を取り巻くインフラや診

Genes Chromosomes Cancer. 2014, 53(10):

療報酬体系の改革も必要である。多次元フロー815-823.

サイトメトリーによる小児白血病診断や、
FCM-MRD を保険収載された一般的な検査とま2. Kobayashi R, Takimoto T, Nakazawa A,

でするにはいまだいくつかの課題があるが、本Fujita N, Akazai A, Yamato K, Yazaki M,

研究によって確実に進捗を得られたと考える。

Deguchi T, Hashii Y, Kato K, Hatakeyama N,Horibe K, Hori H, Oda M; Lymphoma Committee,

Ｅ．結論
1. FCM を用いた MRD は、再発 ALL 臨床試験

Japanese Association of Childhood Leukemia
Study.

ALL-R08 で、治療選択への評価ポイントである

Inferior outcomes of stage III T

BMA3 では臨床試験に用いられている PCR-MRD

lymphoblastic lymphoma relative to stage IVと非常に高い相関を示した。

lymphoma and T-acute lymphoblastic

2. 従って再発 ALL における FCM-MRD 測定は

leukemia: long-term comparison of outcomes

PCR-MRD と同様に有用であることが我が国のin the JACLS NHL T-98 and ALL T-97 protocols.

再発例においても示唆された。

Int J Hematol. 2014, 99(6): 743-749.

3. R08 臨床試験では、BMA3 で高い MRD を示しても、その後陰性化する症例を認め、それら

3. Asai D, Imamura T, Yamashita Y, Suenobu

S, Moriya-Saito A, Hasegawa D, Deguchi T,Hashii Y, Endo M, Hatakeyama N, Kawasaki H,Hori H, Horibe K, Yumura-Yagi K, Hara J,Watanabe A, Kikuta A, Oda M, Sato A; Japan
Association of Childhood Leukemia Study(JACLS) & Children's Cancer and Leukemia
Study Group (CCLSG).
Outcome of TCF3-PBX1 positive pediatricacute lymphoblastic leukemia patients inJapan: a collaborative study of Japan
Association of Childhood Leukemia Study(JACLS) and Children's Cancer and Leukemia
Study Group (CCLSG).
Cancer Med. 2014, 3(3): 623-631.
2. 学会発表
1. Relationship between Immunophenotype andClinical Manifestations in Infant.
Takao Deguchi, Daisuke Tomizawa, NobutakaKiyokawa, Keizo Horibe, Yoshihiro Komada
第 56 回日本小児血液・がん学会学術集会（岡山）, 2014 年 11 月 29 日
Ｇ．知的財産権の出願・登録状況
1. 特許取得なし
2. 実用新案登録なし
3. その他なし