ImmunoTox Letter

日本免疫毒性学会：The Japanese Society of Immunotoxicology Vol. 9 No. 2（通巻18号）
2004
aa 目

次

第12回日本免疫毒性学会学術大会（JSIT 2005）
（予告１）

aa

第11回日本免疫毒性学会学術大会報告 ………１
日下幸則

日本免疫毒性学会の第12回学術大会を下記の要領で開催致しますので、予告１としてご案内申し上げます。
期日：2005年（平成17年）９月21日（火）-22日（水）第12回日本免疫毒性学会学術大会（予告１）…１
大沢基保

会

年会賞
３才児の食物並びに吸入アレルゲン特異的IgE抗体の実態調査 ………………………………………３
国立医薬品食品衛生研究所 手島玲子他

場：東京大学弥生講堂（農学部キャンパス内）
東京都文京区弥生1-1-1

東京大学農学部内（Tel. 03-5841-8205）（交通：メトロ東京南北線
下車

ICH免疫毒性試験ガイドライン案 ………………４
塩野義製薬株式会社 中村和市
国立医薬品食品衛生研究所 澤田純一

協東大農学部前

徒歩数分)

賛：日本トキシコロジー学会、日本薬学会ほか（予定）

サブテーマ：免疫毒性研究 - 個体、細胞、分子のクロストーク

都市大気中ナノ粒子の健康影響 …………………６
独立行政法人国立環境研究所 山元昭二

内容：特別講演、シンポジウム２件（ナノ粒子と免疫系、In Vitro immunotoxicologyなどの「免疫毒性試験プロトコール」第８回 …………８
Non-RI Local lymph node assay（Non-RI LLNA）
法（BrdU法）
財団法人化学物質評価研究機構 武吉正博

トピックスを検討中）、ワークショップ、
一般演題を予定
発表形式：一般演題は口演発表（ポスター展示発表も可能）

お知らせ（１）ImmunoTox Letterのホームページへの移行 …11（２）揮発性化学物質の生体影響ワークショップ …11

演題申込締切日：2005年７月４日（月）年会長（実行委員長）：大沢

基保（帝京大・薬）問 合 先：第12回日本免疫毒性学会学術大会・年会事
務局
FAX. 0426-85-3754

ddddddddddddddddddddd

TEL. 0426-85-3752(近日中に専用電話とホームページ開設予定)

第11回日本免疫毒性学会学術大会報告
日下幸則（学術大会会長）
授（福井大学医学部耳鼻咽喉科学）が、ミニレクチャー

本年度の学術大会は第44回日本産業衛生学会アレルギーとして中野ユミ子主任研究員（大阪府立公衆衛生研究所）

免疫毒性研究会と第35回日本職業・環境アレルギー学会が講演した。このほか、「アレルギー性化学物質に抗すとの三者協賛大会で2004年免疫毒性・アレルギー学会とる国際的予防体系を構築する」（６題）および「呼吸器して、９月10日(金)〜11日(土)に福井県国際交流会館で開アレルギーモデルのエヴィデンス」（５題）をテーマとしてシンポジウムを行った。「Non-RI使用代替免疫毒性催された。
本学術大会のメインテーマは「アレルギー性化学物質試験法」（５題）に関するワークショップが行われた。

に抗する国際的予防体系を構築する」である。招待講演

それ以外に一般口演も37題あり活発な討論が行われた。

は「ナノ粒子：粒子毒性学の最前線」のテーマでケネ学会の参加者は、県内外から180名余りの呼吸器専門

ス・ドナルドソン教授（英国

エジンバラ大学）が、特別講演は「環境と鼻アレルギー」のテーマで藤枝重治教

医・皮膚科専門医・衛生公衆衛生専門医・薬学研究者が集まり、学術的に大変有意義なものであった。

― 1 ―ImmunoTox Letter
中田三郎講師が生産者の立場から、環境監視研究所所長

１．招待講演
エジンバラ大学医学部呼吸器毒性学教授のケネス・ドの中地重晴講師が市民参加による化学物質管理を、福大ナルドソン講師から、「ナノ粒子：粒子毒性学の最前線」

医環境保健助教授の佐藤一博講師がGHSに準拠した感作の講演を賜った。環境中の粒子による健康被害は、近年

性化学物質リスト（提案）について、それぞれご自身の燃焼由来のナノ粒子であることが明らかになっている。

研究を含めて最近の知見を紹介した。

ご自身のナノ粒子に関する最先端の研究を紹介されるとともに、ナノ毒性学（Nanotoxicology）の重要性を講演

５．シンポジウムⅡされ非常に興味深い刺激的な内容であった。

「呼吸器アレルギー・モデルのエヴィデンス」
気道を介して曝露される微小粒子状物質の呼吸器系の細胞毒性の実験動物による研究が進んでいる。北里大医２．特別講演福井大学医学部耳鼻咽喉科・頭頚部外科学教授の藤枝衛生公衆衛生助教授の角田正史講師（第一発表者）が肺重治講師から、「環境とアレルギー性鼻炎」の講演を賜っ

胞マクロファージ由来MH-S細胞を用いた細胞毒性試験

た。近年アレルギー疾患が増えているが、中でもアレル法について、国立環境研究所のTin-Tin-Win-Shwe講師

ギー性鼻炎の増加が著しい。IgE産生亢進を認める大気（第一発表者）がマウスを用いたナノ粒子の気管内投与

汚染・内分泌撹乱物質・感染の３つの要因とアレルギーによる蛋白質産生とmRNA発現の修飾を、国立環境研究

性鼻炎との関連をご自身の研究を含めて紹介されるとと所主任研究員の山元昭二講師（第一発表者）がマウスをもに、アレルギー性鼻炎を予防できる方法を環境の面か用いたナノ粒子の気管内投与がグラム陽性菌リポテイコ

ら提案された。

酸による炎症に及ぼす影響について講演した。

３．ミニレクチャー

６．ワークショップ

大阪府立公衆衛生研究所生活環境部生活衛生課主任研「Non-RI使用代替免疫毒性試験法：LLNAとNK活性究員の中野ユミ子講師から、「皮膚感作モデルの分子生測定の代替法」のテーマでヤンセンファーマ牧栄二座長

物学：cDNAアレイ解析による感作性物質と化学物質過と国立医薬品食品衛生研究所の澤田純一座長で行われ敏症誘導物質の作用機構の比較検討」の講演を賜った。

た。三菱ウエルファーマ安全性研究所の筒井尚久講師は

近年増加しているアレルギー疾患の発症要因として、環「LLNA法に関する製薬協共同研究報告」を、7化学物質

境中の微量化学物質の増加やストレスとの複合影響が考評価研究機構日田事業所の武吉正博講師は「LLNA代替

えられている。ご自身の研究として、接触皮膚炎や化学法としてのBrdU法」を、ダイセル化学工業㈱評価・解物質過敏症様モデルマウスを作成し、近年発展して来た

析センターの山下邦彦講師は「Non-RI代替法としての

cDNAアレイ技術を用い局所での遺伝子発現変化の解析

LLNA-DA法」を、帝国臓器製薬安全性・代謝研究部のを紹介された。

柴田誠司講師（第一発表者）は「フローサイトメトリーを用いるNK細胞活性測定及びNK細胞数との相関性」を、４．シンポジウムⅠ

塩野義製薬㈱新薬研究所の永田雅史講師（第一発表者）「アレルギー性化学物質に抗する国際的予防体系を構築

は「蛍光色素を用いたNK細胞活性測定法」を報告した。

する」
世界には2,000万種以上の化学物質が存在し世界中で移７．一般講演

送・取引されているため、化学物質の有害性を分類し、今回は口頭発表のみの募集であった。42題集まったが、ラベルや安全性データシート（MSDS）による情報提供

内５題はシンポジウムⅡに変更依頼した。最終的に口頭をするため国際連合が提案する共通の統一されたシステ

発表37題となった。

ム（国際調和システム、GHS）が2003年７月国際連合よ３年目となった優秀発表に対する年会賞、奨励賞の表

り勧告出版された。基調講演として(独)産業医学総合研究

彰は今大会は次のように決定された。年会賞は国立医薬所研究企画官の宮川宗之講師がGHSの分類基準の現状を品食品衛生研究所の手島玲子氏の「３才児の食物並びに報告し、群大医呼吸器アレルギー内科臨床教授の土橋邦吸入アレルゲン特異的IgE抗体の実態調査」に、奨励賞

生講師が臨床家の立場から、大阪府立呼吸器アレルギー医は万有製薬安全性研究所の皆川療センター皮膚科部長の片岡葉子講師がアレルギー性化式にて、会長から副賞と共に賞状が授与された。

学物質による皮膚障害を、日本化学工業協会常務理事の― 2 ―愛氏に決まった。授与

Vol. 9 No. 2 (2004)

方法

年 会 賞

総IgE値については、蛍光酵素免疫測定法（FEIA）で定量し、アレルゲン特異的IgE抗体価は、食物アレルゲ

３才児の食物並びに吸入アレルゲン特異的
IgE抗体の実態調査

ン４種（卵白、牛乳、大豆、小麦）及び室内吸入アレル
ゲン３種（ネコ上皮、コナヒョウヒダニ、ハウスダスト）

晴代1
純一1
貴彦4

に対する特異的IgE抗体価につき、ELISAで半定量測定

国立医薬品食品衛生研究所、 食品薬品安全センター

つき、ELISA並びにAlaSTATで定量を行い、さらに総

手島
中村
小島

玲子1、高木加代子1、奥貫亮介1、蜂須賀暁子1、澤田
幸一2、大沢 基保3、吉田

1

2

3

帝京大学薬学部、4旭川医大を行った。室外吸入アレルゲンは、関東地区（東久留米市、多摩市、横浜市）ではスギ、旭川市ではシラカバにIgE抗体値との関連について検討した。

目的
小児での生活環境リスク評価のための免疫影響指標開結果

発の一環として、３歳児健診において得た血清中総IgE

総IgE抗体値を測定することができた３歳児血清は、値及びアレルゲン（抗原）特異的IgE抗体の測定を行っ

平成13年度187検体、平成14年度204検体、平成15年度た。本研究は、厚生労働科学研究費補助金「生活環境汚147検体であり、予備的調査を行った平成12年度74検体

染物質による小児の毒性評価のための免疫指標の開発にを合わせると総数612検体であった。これら血清につき、関する研究」（平成13-15年、主任研究者；吉田貴彦）の抗原特異的IgE抗体の測定も行い、これらの調査結果と

1)

一環で、行ったものである 。本研究で用いた検査項目は、

アンケート結果をもとに、総IgE抗体値と個々の抗原別

先行厚生省委託研究で免疫指標について動物実験で検討

IgE抗体価あるいは症状との関係、地域による違い、年した結果を踏まえ、人、特に小児での健康影響調査にお度による推移等を解析した。総IgE抗体値は全体では34.7

いて有用と思われる指標として選択された項目であり、IU/ml、関東地区で44.7 IU/ml、旭川市が22.5 IU/mlであ2)

先行して行った１年間を含め 、４年間にわたって行った

り、旭川市の方が幾分低い傾向が得られた（幾何平均）。

調査研究をまとめたものである。血清中IgE濃度はアト

また、図１に、関東地区と、旭川地区の３歳児の総IgE

ピー性アレルギー患者において有意に高値を示すので、値のヒストグラム（横軸：総IgE値対数目盛、縦軸：人

気管支喘息、皮膚炎、鼻炎などの場合、アトピー要素の数%）を示すが、旭川地区では、総IgE値10以下の人数の有無を調べるためにも用いられている。胎児のIgE産生

割合が高いことがわかった。特異的IgE抗体陽性率は、量は微量で、母体のIgEは胎盤を通過しないといわれて

旭川25.7%（58/226）、東久留米27.0%（54/200）、多摩

おり、生まれた直後は極めて低い値を示すが、健常な小33.3%（10/30）、横浜33.3%（52/156）、全体では28.4%

児では年齢とともに総IgE値は上昇し、10-15歳位に健常（174/612）であり、食物アレルギー陽性者の割合は、旭川

成人と同じ値を示すようになる3)。血清中総IgE値が非特3.5%（8/226）、東久留米7.0%（14/200）、多摩13.3%

異的IgE値と言われるのに対し、アレルゲン（抗原）に（4/30）、横浜9.6%（15/156）、全体では6.7%（41/612）

特異的なIgEを検出する特異的IgE検査法がある。アレルで、室内吸入アレルギー陽性者の割合は、旭川25.7%

ギー性疾患が疑われる場合は、総IgE値が基準値の範囲（58/226）、東久留米22.5%（45/200）、多摩23.3%（7/30）、

内であっても、アレルゲンに特異的なIgEの存在が確認

横浜30.8%（48/156）、全体では25.8%（158/612）であっされることもある。試料となる血清は、2000年度からた。また、総IgE値が80 IU/ml以上の群では何らかのア

2003年度にかけて、関東地区の３地点、東京都東久留米

レルゲン特異的IgE抗体を有する者が67.6%（123/182）

市、多摩市、神奈川県横浜市旭区、および北海道旭川市の４地点において、保健所・保健センターにおける３歳
児健診の機会を利用し、保護者の同意を得た上で、満３歳に達した総計612人から採血して調製された。採血はいずれの年度も10月から翌年１月にかけて行い、同時にアレルギー性疾患による受診歴、自覚症状等についてア
ンケート調査も実施した。
図１
― 3 ―

関東地区と旭川の３歳児の総IgE値のヒストグラム

ImmunoTox Letter
おいても室外吸入アレルゲンに、３歳児ですでに陽性となる例が、関東、旭川ともにみられ、室外抗原陽性の低年齢化がすすんでいるというデータを示すことができた。一般児、特に低年齢児を対象とする採血を伴う調査
は日本ではあまり例がないため、本研究で得られた結果
は、現時点における小児のアレルギー傾向を知る上で貴重な資料であると考えられる。

参考文献
1) 吉田貴彦（2004）：一般人集団に適応する免疫指標を用いた環境リスク検出の試み、ImmunoTox Letter 9(1)、5-72) 環境基本計画推進調査事業「環境リスク対策における予見的アプローチに関する調査研究（免疫影響）」平
成12年度委託事業結果報告書
図２

主任研究者

大沢基

保：

抗原特異的IgE陽性者率の年度別推移

3) 森川利夫（2001）：血清IgE値の基準値の検討、日本小と高い値を示した一方、総IgE値が40 IU/ml未満の群で児アレルギー学会誌15(5)、546-552

は6.6%（21/320）であったことから、総IgE値はアレル

4) Kulig, M., Klettke, U., Wahn, V., Forster, J., Bauer, C-

ギー状況のよい指標であることが確認された。食物アレ

P., Wahn, U（2000）: Development of seasonal allergic

ルゲン特異的IgE抗体陽性者率の内訳は、卵白5.6%、牛rhinitis during the first 7 years of life. J.Allergy Clin.

乳2.1%、大豆1.0%、小麦0.2%の順であった。室内吸入ア

Immunol., 106, 832-839

レルゲン特異的IgE抗体陽性者率の内訳は、ダニ23.2%、
ハウスダスト10.6%、ネコ上皮6.0%であった。また、ア
レルゲン特異的IgE抗体陽性者数の年度別推移を図２に示すが、年度による陽性者数に大きな違いはみられなかっ

ICH免疫毒性試験ガイドライン案

た。室外吸入アレルゲンでは、旭川の試料の内の高IgE群の50名中８名が陽性（シラカバ）と判定され、陽性率

澤田

中村 和市（塩野義製薬株式会社）
純一（国立医薬品食品衛生研究所）

は16.0%であった。また、精製したスギ花粉抗原を用いて関東地区全員を対象としたELISA法による抗原特異的

2003年11月11日に免疫毒性試験がICH（日米EU医薬品

IgE陽性者は15.6％であった。以上、食物抗原、室内型吸規制調和国際会議）の新規トピックS8として承認された。

入抗原に対するIgE抗体ばかりでなく、３歳児において

ICH S8（免疫毒性試験）の専門家作業部会（EWG）にも室外型の吸入抗原に対するIgE抗体の産生のみられる

おいては、その後、ICH免疫毒性調査のデータ解析を行ことが判明し、総IgE抗体値及び吸入アレルゲン特異的

うと同時に、ICH免疫毒性試験ガイドライン案の作成作

IgE抗体価が、環境リスクを評価する指標となることが業を進めてきた。今回、2004年11月15日から18日にかけ示された。なお、東京と旭川で、特異的IgE抗体陽性率て開催されたICH横浜会議において、S8 EWGが開かれには大きな違いは見られなかった。

たので、日本側出席者を代表して、その概要を報告した
い。会議の出席者は以下の通りである。
¡厚労省：澤田純一、笛木考察今回用いた総IgE値及びアレルゲン特異的IgE抗体価の修、山口光峰¡日本製薬協：中村和市、筒井尚久、久田 茂、佐神文郎

２つのアレルギー指標は、地域住民への環境リスク評価¡EU：Jan Willem van der Laan, Henk van Loverenのための予見的アプローチ手段として、実用面において¡欧州製薬協：Steven Spanhaak, Jennifer Sims

有効性が示された。また、Kuligらによればドイツにおけ¡FDA：Kenneth L. Hastings, James L. Weaver

る３歳児のカンバおよび草花粉による感作率が６-７%、¡米国製薬協：Thomas T. Kawabata, Stephen Durham

発症率が３%であるが4)、今回の調査において、わが国に¡Health Canada：Tibor I. Matula（オブザーバー）― 4 ―Vol. 9 No. 2 (2004)
今回の会議で、ICHのStep 2文書すなわちICH免疫毒性

カーを決めるうえでも有用であることが記載された。

試験ガイドライン案が作成された。以下、今回S8 EWG

原則として、免疫毒性試験における動物種、投与期間、において全会一致で合意に達し、主要６団体が署名した

用量及び投与経路は、免疫毒性所見の認められた一般投ICH免疫毒性試験ガイドライン案の概要について述べた

与毒性試験と同じにすべきである。一般的にはラットをい。

用いた１ヶ月経口投与試験となることが多いと予想されるが、非げっ歯類を用いることもできる。用量を決める

今回のガイドライン案においては、免疫毒性の範囲を、上での注意点としては、無毒性量からストレスのような低分子化合物の免疫抑制に限定し、免疫毒性評価の一般

間接的に免疫系に影響を及ぼすことのない用量の間で複原則を以下のように定めた。

数の用量を設定し用量相関性を調べることとされた。

1) すべての新規治験薬について、免疫抑制を起こす可能

免疫毒性試験で免疫毒性所見が認められなかった場合
は、さらにフォローアップ免疫毒性試験を実施する必要性を評価する。
2) 免疫抑制の試験方法には、標準的毒性試験と追加の免はないが、免疫毒性所見があった場合には、免疫毒性作

疫毒性試験が含まれる。免疫毒性試験を実施するか否

用を受ける細胞の特定や作用機序の検討が必要とされかについては、懸念事項の重大性を総合的に評価し決る。その際には、NK細胞活性試験、宿主抵抗性試験や定する。

マクロファージの機能試験などの実施を含めることができる。

免疫毒性試験の必要性の検討の対象となる懸念事項と免疫毒性試験を実施する場合は、多数の患者集団に投しては、まず初期スクリーニングとしての一般毒性試験

与される前に行うことが必要とされた。また、免疫抑制の結果で得られた知見がある。一般毒性試験における検状態にある患者集団に投与される場合は、その時期を早討項目としては(1) 血液学的所見、(2) 免疫系臓器の重量める必要がある。

及び病理組織学的所見、(3) 血清イムノグロブリン値、(4)またガイドライン案の付属文書には、免疫毒性試験に感染症の増加、(5) がんの発生があげられる。これらの項

関連する事項として、一般毒性試験における免疫毒性に目で見いだされた懸念事項を、統計学的および生物学的関する検査項目が記述され、さらに、Ｔ細胞依存性抗原

有意性、重篤度、用量依存性などの観点から勘案して、に対する特異抗体産生試験、白血球ポピュレーション等の免疫毒性試験の必要性を判断する。

検査、NK細胞活性試験、宿主抵抗性試験、マクロファー

また一般毒性試験の結果の他に、以下の４つの要素をジや好中球の機能検査、細胞性免疫に関する試験を実施する上での留意点が述べられている。

同時に考慮し、追加免疫毒性試験の必要性を決定する。
1) 化合物の薬理学的性質：化合物の薬理作用により、免

今回のガイドライン案作成に至る経緯に関して、簡単

疫抑制作用を引き起こす可能性。
2) 対象患者集団：免疫抑制状態にある患者さんに用いらにふれたい。これまでも、ICH免疫毒性調査の結果等をもとに、全ての新規医薬品の承認申請において、免疫毒れるか否か。
3) 既知免疫抑制化合物との構造的類似性：免疫抑制の知性試験を実施する必要はなく、一般毒性試験において免られている化合物と類似の化学構造を有するか否か。

疫毒性学的所見が認められた場合を中心に追加して免疫4) 薬剤の蓄積性：原体や代謝物が免疫系細胞や臓器に蓄毒性試験を実施すべきであるという考え方には、EWG内積するかどうか。

でもコンセンサスが得られていた。しかし、一般毒性試

上述のように、一般毒性試験の結果及び上記４つの要

験の結果の如何に関わらず免疫毒性試験を考えるべき条素の中から見いだされた懸念される要因に関して、その件に関しては、意見の相違があった。例えば、薬理作用重大性を評価する。このうち１つでも免疫毒性に関するとして、標的細胞と免疫系細胞に共通な受容体へ作用す重大な懸念を認めた場合には、免疫毒性試験を実施する

る薬剤、また、抗炎症剤等のように、一部の免疫系細胞

か、免疫毒性試験を実施しないときはその科学的な理由に作用する薬剤に対する考え方をどのようにするかにつを示さなければならない。

いては、会議前までに結論が得られておらず、今回の会

免疫毒性試験においては、免疫毒性の標的細胞が不明

議でも議論の焦点の一つであった。これらの点についてな場合はＴ細胞依存性抗原に対する抗体産生能を検討すは、最終的には、これら薬剤の薬理学的特性などの重要ることを推奨している。また化合物の各白血球ポピュレー

性を勘案した上で免疫毒性試験実施の必要性を決定する

ションに与える影響を調べることは臨床でのバイオマーことになった。

― 5 ―ImmunoTox Letter
またリンパ節の重量については、ばらつきが大きいこと

粒子の健康影響問題がクローズアップされてきた。ディーもあり測定項目に加えるかどうかが議論されたが、最終的

ゼル自動車の排出粒子の粒径分布では、その質量の大部に、必ずしも必須ではないオプションとする形となった。

分は粒径が0.1〜0.3μmの範囲（累積モード）にあるのに宿主抵抗性試験の意義についても議論があったが一つ

対して、個数分布では大部分が５〜50nmの範囲（核モーのエンドポイントとしてとりあげられた。なお、薬剤自ド）にあるとされ、核モード粒子すなわちナノ粒子の質

身が移植腫瘍の増殖に影響を与える場合などの注意点が

量濃度は全体の１〜20％に過ぎないが粒子個数は90％以盛り込まれた。

上を占めるとされている1, 2)。実際の大気中ナノ粒子の組成としては微小粒子やディーゼル排気微粒子の主要構成

ガイドライン最終化に至るまでの今後のスケジュール

成分である元素状炭素や有機炭素、無機塩類、金属、水を以下のように考えている。日本では本ガイドライン案等が含まれると推測されている。大きい粒子すなわち累の邦訳が必要とされるが、2004年12月には日米欧の製薬

積モードの粒子は前述の規制や対策の実施によって減少

企業に同案を配布し、2005年１月から４月にかけてパブしていくが、ナノ粒子については現在の対策ではその粒

リックコメントを求める。本ガイドライン案は、いずれ、子数の大幅な低減は期待できないと考えられナノ粒子に

国立医薬品食品衛生研究所等のホームページにも掲載さ

よる健康影響の問題は依然として残ったままである。昨れることになろう。2005年５月に開催予定のICH免疫毒

今、自動車由来のナノ粒子の問題とは別にナノテクノロ

性専門家作業部会会議ではパブリックコメントを検討

ジー（超微細技術）の進展に伴いエレクトロニクスや医し、ガイドライン案に反映させる作業を行う。そして薬等への応用が期待されるナノ材料による健康影響の可2005年11月には最終ガイドラインを公表する予定にして能性も危惧されているが、本稿では都市大気中ナノ粒子

いる。

の健康影響について特に呼吸器系への影響を中心に話題提供したい。

なお、今回の会議では、ICH免疫毒性調査報告書ついてもICH運営委員会に提出された。現在、S8 EWGで、２．ナノ粒子の生体影響

公表論文の形で公開するための作業を行っている。

これまでに報告された二酸化チタン（TiO2）やカーボ
ン粒子、都市大気中捕集粒子等による実験的研究で、ナノ粒子は累積モードの大きな粒子に比べて肺に炎症を強く惹起することが明らかにされており、その理由として、

都市大気中ナノ粒子の健康影響
山元

ナノ粒子は質量当たりの表面積が大きくなるため、細胞

昭二（国立環境研究所環境健康研究領域）

表面との反応性が高まり表面付着物質（活性酸素種、ラジカル、金属等）による毒性が強く発現すると考えられている。又、いくつかの疫学研究は、大気中のナノ粒子

１．はじめに
都市大気中の浮遊粒子状物質（PM10やPM2.5と呼ばれるがPM10やPM2.5と同様に、呼吸器系疾患や心臓血管系疾患

空気力学的粒径が10μm以下又は2.5μm以下の微小粒子）の罹病率や死亡率の増加と関連することを示している3, 4)。

の濃度上昇は、呼吸器系疾患や心臓血管系疾患の罹病率

Petersら3)の成人の喘息患者を対象とした大気中微小粒子や死亡率の増加と関連することが知られている。その大と呼吸器症状との関連についての調査では、ナノ粒子の気中濃度は火力発電所や工場等の固定発生源の近くを別方が0.1〜0.5μm粒子やPM10に比べて呼吸器症状の悪化やとすれば交通量の多い道路沿道で高値を示すため、我国最大呼気流量の低下をより強く引き起こす結果が示されでは自動車による大気汚染状況の厳しい地域（自治体）ている。

のトラック、バス、ディーゼル乗用車等を対象に窒素酸

一般に、吸入された粒子は鼻腔から肺胞にかけての各

化物のみならず粒子状物質についても排出基準が設定さ部位に慣性、沈降、拡散によって沈着するが、ヒトにおれ車種規制が行われている。又、ディーゼル自動車など

ける吸入粒子の沈着モデルでは、肺胞領域での沈着効率についてエンジン本体の改良や排気後処理装置による自は0.1μm以上の粒子で20％以下、５〜10nmの粒子で約20動車構造対策および燃料品質対策等の排出ガス・粒子低〜30％であるのに対して、20nm付近の粒子では50％に減対策も同時に進行している。道路沿道における自動車

達するとされており、それより大きい粒子または小さい

由来のPM10やPM2.5の濃度は低減化の方向へ進んでいると粒子に比べて肺胞での沈着効率が高いと予測されている5)。

されるが、近年、ナノ粒子と呼ばれる50nm以下の超微小この20nm付近の粒子サイズは、ディーゼル自動車排出― 6 ―Vol. 9 No. 2 (2004)
粒子の核モードの主画分でもある。吸入ナノ粒子の肺で連していると考えられている13)。

の沈着や移行、毒性等に関する初期の実験的研究では、
TiO2や二酸化ケイ素等が用いられているが、Ferinら6)は、

３．あとがき21nmと0.25μmのTiO2をラットに吸入暴露または気管内

都市大気中のナノ粒子はその毒性・影響・性状・環境投与して粒子の保持や移行について検討した結果、ナノ動態のいずれも未解明の部分が多く、また、肺のみなら粒子は大きな粒子に比べて肺の間質への広がりが大きくず全身への影響を持つ可能性がその体内動態から示唆さ

肺に長く保持されていたことを報告している。さらに、れている。独立行政法人国立環境研究所では、2003年よ

Oberdörsterら の同様の実験では、TiO2ナノ粒子の肺のり自動車排出ガスに起因するナノ粒子の生体影響研究が間質へのアクセスの増加と合わせて気管支肺胞洗浄開始され、その毒性・影響評価のみならずナノ粒子の物（BAL）液中の急性の炎症性パラメーターが高められ、理的・化学的性状、ガスからの粒子化プロセス、発生条

その増強は肺に保持された粒子の表面積と最もよく関連

件、環境中の動態等に関する研究が進行中である。

7)

している結果が示され、ナノ粒子による肺毒性の増強は一方、エレクトロニクスや医薬等への応用が期待されその広い表面積並びに肺の間質へのアクセスの増加に起る炭素などのナノ材料が脳などに蓄積して健康に悪影響因すると考えられた。一方、ラットに炭素同位体（13C）を及ぼす可能性があるとして、2004年から米国環境保護

8)

ナノ粒子を吸入させてその体内移行を調べた研究 では、庁のもとで12の機関がナノ材料の環境や健康への影響に

これらのナノ粒子は吸入後、短時間で肝臓でも検出され、ついて共同研究を開始した。また、英国王立協会及び王ナノ粒子が肺や消化管を通過し血流に乗って肺以外の臓

立工学アカデミーは、2004年７月に「ナノサイエンスと9)器にも移行する可能性を示唆した。同様の最新の研究 でナノテクノロジー：期待と不確実性」と題するナノテク

は、このナノ粒子が大脳や小脳、嗅球にも移行することノロジーに関する調査報告書を公開し、その中でナノテを報告し、特に嗅球のナノ粒子については鼻咽頭領域のクノロジーの健康と環境への影響については、特にナノ

嗅粘膜に沈着したナノ粒子が嗅神経を通って嗅球に移行

粒子やナノチューブの製造過程における吸入や環境汚染したのではないかと推察している。

が問題になるとして、安全性の事前の検討が必要である

都市大気中微小粒子の模擬粒子として用いられるカーと政府に勧告している。今後、自動車由来ナノ粒子の健

ボンブラック（CB）粒子のラットへの気管内投与で、康影響評価と合わせて、ナノテクノロジーの産業化で最14nmの粒子は0.3μm付近の大きな粒子に比べて肺の炎症

先端を走る日本でも、ナノ材料についての影響評価研究

10)や酸化ストレスが大きかったことが報告されている 。

が必要となると考えられる。

これ以外にも、CBナノ粒子は大きい粒子に比べて還元型
グルタチオン（GSH）がより減少することやフリーラジカ

文献

ルを多く生じること、マクロファージによる食作用の抑制

1) Kittelson, D.B. et al. (2002): Diesel aerosol samplingが大きいこと等がin vivoやin vitroの実験で明らかになっmethodology -CRC E-43: Technical summary andている。CB粒子の吸入暴露実験においてもナノ粒子は大conclusions. Coordinating Research Council,

きな粒子に比べて血中の白血球やBAL液中の好中球の増Alpharetta, GA. pp1-23.

加、ケモカインMIP-2のmRNAの発現増加等の炎症反応
11)2) Kittelson, D.B. (1998): Engines and nanoparticles: areview. J. Aerosol Sci., 29:575-588.

12)を引き起こしている 。Liら は、マウスのマクロファー
ジやヒトの気管支上皮細胞の培養細胞に粒径画分別に採3) Peters, A. et al. (1997): Respiratory effects are

取した大気中微小粒子を添加した系で、100nm以下の粒

associated with the number of ultrafine particles. Am.

子は大きい粒子に比べて酸化ストレスの誘導とミトコン

J. Respir. Crit. Care Med., 155:1376-1387.

ドリアの障害を強く引き起こし、それらはナノ粒子の有4) Wichmann H.E. et al. (2000): Daily mortality and fine

機炭素や多環芳香族炭化水素の高い含有量と関連したこand ultrafine particles in erfurt, germany part I: role ofとを報告している。以上のように、ナノ粒子は酸化スト

particle number and particle mass. Res. Rep. Health

レス及び前炎症性の応答を大きい粒子に比べて強く引きEff. Inst., 98:5-86.

起こすことが明らかにされているが、その酸化ストレス

5) ICRP (1994): Human respiratory tract model for

発生のメカニズムは完全に解明されていない。粒子表面

radiological protection. Ann. ICRP, 24(1-3), ICRP

は反応性の酸素種のソースでもあり何等かの方法で多数

publication 66.

の粒子又は大きな粒子表面積が酸化ストレスの増強と関

6) Ferin, J. et al. (1992): Pulmonary retention of ultrafine― 7 ―ImmunoTox Letterand fine particles in rats. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol.,

いることにより放射性化合物を使用しないLLNAの変法

6:535-542.

（Non-RI LLNA法）2)について概説すると共に本法を用い

7) Oberdörster, G. et al. (1992): Role of the alveolar

た化学物質の感作性強度推定法について紹介する。BrdU

macrophage in lung injury: studies with ultrafine

はDNAを構成する塩基のひとつであるthymidineの類似

particles. Environ. Health Perspect., 97:193-199.

物質であり、 3H-thymidineと同様に動物実験或いは in8) Oberdörster, G. et al. (2002): Extrapulmonary

vitro実験において細胞増殖に伴ってDNAに取り込ませ、

translocation of ultrafine carbon particles following

標識することができる。また、DNAに取り込まれたBrdU

whole-body inhalation exposure of rats. J. Toxicol.

は酵素免疫測定法（ELISA法）によって定量することがEnviron. Health A, 65:1531-1543.

可能である。Non-RI LLNA法（BrdU法）はLLNA標準法

9) Oberdörster, G. et al. (2004): Translocation of inhaled（RI法）における3H-thymidine投与をBrdU投与に、液体

ultrafine particles to the brain. Inhal. Toxicol., 16:437-

シンチレーションカウンタによる放射活性測定をELISA

445.

法による比色定量に置き換えたものであり、その原理は

10) Li, X.Y., et al. (1999): Short-term inflammatory

標準法に極めて近い。本法とLLNA標準法（RI法）とのresponses following intratracheal instillation of fine

Concordance（一致率）は極めて高く、モルモットを用

and ultrafine carbon black in rats. Inhal. Toxicol.,いた皮膚感作性試験成績との相関性も高い3)。さらに我々

11:709-731.

は化学物質のヒトにおける感作性強度を再現性良く推定

11) Gilmour, P.S., et al. (2004): Pulmonary and systemic

する方法としてLLNA相対比較法4)を開発した。本法はヒ

effects of short-term inhalation exposure to ultrafine

トにおける感作性強度が既知の化学物質を比較対照物質

carbon black particles. Toxicol. Appl. Pharmacol.,として用い、比較対照物質と同濃度に調製した被験化学

195:35-44.

物質の反応との間で相対比較を行うことにより感作性強12) Li, N. et al. (2003): Ultrafine particlulate pollutants

度を推定するものである。LLNA相対比較法を実施する

induce oxidative stress and mitochondrial damage.

ことにより、化学物質の感作性強度を迅速且つ効率的にEnviron. Health Perspect., 111:455-460.

分類・評価し、ヒトに対する感作性リスクを予想するこ

13) Donaldson, K. and Stone, V. (2003): Current
hypotheses on the mechanisms of toxicity of ultrafineとが可能となる。本法は今後、感作性物質の評価において有用な方法論になるものと思われる。

particles. Ann. 1st. Super Sanita, 39:405-410.

Ｂ．実験材料及び方法
実施方法の概略を図１に示す。

「免疫毒性試験プロトコール」第８回
Non-RI Local lymph node assay（Non-RI LLNA）法（BrdU法）
武吉

図１

正博（財団法人化学物質評価研究機構）
１．動

Non-RI LLNAの概略

物

雌性マウス、８-12週令のCBA/Ca或いはCBA/Jマ

Ａ．解説
Local lymph node assay（LLNA）は従来の皮膚感作性1)

ウスが推奨されている。

試験とは異なり、初回抗原刺激によるリンパ球の増殖反

日本国内ではCBA/Caは入手が困難であり、我々応を指標にしているため、短期間に化学物質の感作性をはCBA/JNを使用している。免疫学実験に汎用さ推定できる新しい皮膚感作性試験法である。しかし、3H-れているBALB/cAnN、Closed colonyのCD-1及びthymidine等の放射性化合物（RI）を使用しなければな

CBA/JNを用いて感作性物質として知られている

らず、特殊な実施施設を必要とし、放射能汚染、廃棄物

p-Benzoquinoneに対する応答性を比較した結果、処理の問題など実施上種々の制約を有する。今回、 H-

CBA/JNが最も応答性が高いことが確認されていthymidine の代わりにBromodeoxyuridine（BrdU）を用る5)（図２）。

3― 8 ―Vol. 9 No. 2 (2004)
５．BrdUの投与
最終感作の２日後（Day 4）にBrdU生理食塩液溶液（10mg/ml）を１匹当たり0.5ml腹腔内投与する。
６．リンパ節の採取
BrdU投与の翌日（Day 5）に動物を安楽死させた
後、頸部を切開し耳の直下にある耳介リンパ節を採取する。採取したリンパ節は直ぐに測定しない
場合は-20℃以下で保存可能であり、採材日以降に解凍して測定に供することも出来る。
７．BrdU取り込み量の測定
耳介リンパ節を１匹分毎にマイクロチューブ内で少量の生理食塩液と共にすりつぶし、セルストレーナ（FALCON 2350）で濾過した後、最終的に15mlの生理食塩液に分散する。この細胞分散液の0.1mlをマイクロプレートに移しBrdU取り込み量の測定に供する。測定には市販のBrdU測定キット（ベーリンガー･マンハイム社製のCell Proliferation
ELISA, BrdU colorimetric kit, Cat. No.1647 229等）

図２ p-Benzoquinone（pBQ）に対するマウスの応答差を用いる。

２．化学物質の調製

８．判定方法

化学物質の調製にはいくつかの媒体が推奨されて対照群（媒体のみ投与）のBrdU取り込み量に対いる。最も一般的に使われるものはアセトン・して化学物質を投与した群の取り込み量の比を

オリーブ油混液（v/v=4：1、AOO）であるが、Stimulation index（SI）と呼んでおり、OECD

他にN,N-dimethylformamide（DMF）、methyl

TG4296)やUS-EPAの皮膚感作性ガイドライン7)ではethyl ketone（MEK）、propylene glycol（PG）、実験を行ったいずれかの濃度においてSI値は３倍

dimethylsulfoxide（DMSO）なども使用することが以上を示した場合に感作性陽性と判定することとできる。化学物質は必ずしも溶解している必要はしている。LLNA相対比較法4)ではそれぞれ同一濃ないが、用量依存性が確認可能な濃度域で複数の度に調製した比較対照物質と被験物質との間でSI

用量段階を設けることが望ましい。

値を統計的に比較し、表１の基準によって化学物

３．対照群

質のヒトにおける感作性強度を推定する。

化学物質調製に用いた媒体のみを投与する陰性対表１

照群と試験系の感受性を確認するための陽性対照

Non-RI LLNA相対比較法による感作性強度の判定基
準（Takeyoshi et al., 2004b）

群を設けることが望ましい。我々の開発したLLNA相対比較法 4) では比較対照物質として２%
2 , 4 - d i n i t r o c h l o r o b e n z e n e （ D N C B ）、 1 0 %isoeugenol, 50% α-hexylcinnamic aldehyde（HCA）の３物質を用いることにより、被験物資のヒトにおける感作性強度を推定することが可能である。
４．感作
毎日ほぼ一定の時刻に、マウスの両耳介にマイクロピペッター等を用いて１耳介当たり25μlを塗布する。感作は初日をDay 0としてDay 2までの３日

Ｃ．相対比較法の実施例

間連続塗布する。

LLNA相対比較法4)は感作性強度が既知のヒト感作性物
質を比較対照物質として用い、被験化学物質の感作性強― 9 ―ImmunoTox Letter
度を推定する方法であり、比較対照物質として２% 2,4-cinnamic aldehydeのみが比較対照物質との比較においてdinitrochlorobenzene（DNCB、強度感作性物質、統計的差異を認めなかったことからisoeugenolと同等のHuman class 1）、10% Isoeugenol（IEUG、中等度感作性

human class 2と判定され、isoeugenolと比較して明らか物質、Human class 2）、50% α-hexylcinnamicaldehydeに強い反応を示した p -phenylenediamineなどの３物質（HCA、弱感作性物質、Human class 3）の感作性強度のは２%調製液による確認実験、isoeugenolと比較して異なる３種類の物質を用いる。表２に示すヒトに対する

明らかに弱い反応を示したcitralなどの５物質は50%調

8)

感作性強度が既知の化学物質 を図３のスキームに従って製液での確認試験に処された。２%調製液による確認実験 の 結 果 （ 図 ５ ）、 D N C B と 同 等 の 反 応 を 示 し た

Non-RI LLNAを実施し、感作性強度の推定を行った。
10%調製液によるスクリーニング実験（図４）ではdiphenylcyclopropenoneはHuman class 1、DNCBよりも明らかに弱い反応を示したp-phenylenediamineと

表２

Non-RI LLNA相対比較法による感作性強度推定結果

glutaraldehyde はHuman class 2に分類され、50%調製液
による確認実験の結果（図６）、HCAと同等或いはそれ以上の反応を示したcitral、eugenol、isopropyl myristate
はHuman class 3、HCAよりも明らかに弱い反応を示したpropylene glycol とhexaneはHuman class 4-5と判定され、殆どの化合物は報告されている感作性強度に分類された（表２）。
このようにLLNA相対比較法を実施することにより、化学物質をその感作性強度に従って正しく分類すること

図５

図３

２%調製液による確認実験の結果**: 比較対照抗原の反応に対して有意差あり（P<0.01, Dunnett
s test）
Abbreviations: AOO, acetone/olive oil (4:1); DNCB: 2,4dinitrochlorobenzene; PPD, p- phenylenediamine; GA,
glutaraldehyde; DP, diphenylcyclopropenone.

Non-RI LLNA相対比較法による効率的感作性強度推手順（実施例）*:各濃度の化学物質が示す反応値（SI）を同濃度の比較対照
抗原の反応値と比較する。結果は統計的手法、例えば
Dunnett's multiple comparison testなどによって判断する。
HCA: α-hexylcinnamicaldehyde, DNCB: 2,4-dinitrochlorobenzene.

図４

10%調製液によるスクリーニング実験の結果**: 比較対照抗原の反応に対して有意差あり（P<0.01, Dunnett
s test）
Abbreviations: AOO, acetone/olive oil (4:1); IEUG, isoeugenol;
PPD, p -phenylenediamine; CA, cinnamicaldehyde; GA,
glutaraldehyde; IPM, isopropyl myristate; PG, propyleneglycol;
DP, diphenylcyclopropenone.

― 10 ―

図６

50%調製液による確認実験の結果**: 比較対照抗原の反応に対して有意差あり（P<0.01, Dunnett
s test）
Abbreviations: AOO, acetone/olive oil (4:1); HCA: αhexylcinnamicaldehyde; PG, propyleneglycol; IPM, isopropyl
myristate.

Vol. 9 No. 2 (2004)
が可能である。また、比較対照物質は試験系の内標準とお知らせ（１）

して機能するため、再現性にも優れており、本法は化学
ImmunoTox Letterのホームページへの移行

物質の感作性を迅速且つ効率的に分類、評価する方法として極めて有用な方法である。

日本免疫毒性学会のホームページ（HP）の開設が行われました。場所は http://immtox.com/ です。それに伴Ｄ．参考文献

いまして、今後のImmunoTox Letterは原則的にHPから

1) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W., Basketter,

pdfファイルをダウンロードして頂くことになります。事

D.A. (1994). The local lymph node assay: developments

務局での印刷は、保管のためやHPアクセスできない会員

and applications, Toxicology, 93, 13-31.

のために少量の部数を印刷する予定です。限られた学会運

2) Takeyoshi M, Yamasaki K, Yakabe Y, Takatsuki M,

営費の中で、印刷費および郵送費を軽減して、その予算

Kimber I. (2001) Development of non-radio isotopic

でHPの充実を図るのが目的です。以前のImmunoTox

endpoint of murine local lymph node assay based on 5-

Letterのバックナンバーもダウンロード出来るように適宜

bromo-2 -deoxyuridine (BrdU) incorporation. Toxicol

していく予定です。また、今後のご連絡は、e-mailを利用

Lett. 119(3):203-8.

して行う機会が増えます。会員の皆様におかれましては、

3) Takeyoshi M, Noda S, Yamazaki S, Kakishima H,

以上の出版や連絡方法の変更に関するご理解をお願い申Yamasaki K, Kimber I. (2004a) Assessment of the skin

し上げます。しかし、種々の理由からImmunoTox Letter

sensitization potency of eugenol and its dimers using aの郵送をご希望される方は、事務局までご連絡下さい。

non-radioisotopic modification of the local lymph node
assay. J Appl Toxicol. 24(1):77-81.

まだまだHPの情報量が少なく物足りなく思われるかも

4) Takeyoshi M, Iida K, Shiraishi K, Hoshuyama S. (2004b)

しれませんが、これから皆さんの情報および意見の交換

Novel approach for classifying dermal sensitizingの場として更新をどんどん進めていきたいと思います。

potency of chemicals with non-radioisotopic更新し続けることが、HPの命ですので、皆さんからの投

modification of local lymph node assay, J Applied

稿を大いに期待しております。また、Free Talkへの書き

Toxicol. (In press)

込みもよろしくお願い申し上げます。ご意見をどんどん

5) Takeyoshi, M., Noda, S., Yamasaki, K. (2004c)

集約して、HPを改造していきたいと考えております。まDifferences in responsiveness of mouse strain against

た、HP委員会に参加して頂ける会員を募集致しておりま

p -benzoquinone by non-radioisotopic murine local

す。是非、若い会員の方も活発にご参加して下さること

lymph node assay. Exp. Anim. 53, 171-173

をお待ちしてお折ります。

6) Organization for Economic Corporation andDevelopment (OECD, 2002). Skin Sensitisation: Local

日本免疫毒性学会事務局

香山不二雄

Lymph Node Assay, TG-429 (Adopted: 24th April 2002),
Paris7) Environmental Protection Agency (EPA, 2003), Health
Effects Test Guidelines OPPTS 870.2600 Skin
Sensitization, Washington DC

おしらせ（２）
低濃度揮発性化学物質の生体影響に関する
ワークショップ

8) Basketter DA, Blaikie L, Dearman RJ, Kimber I, Ryan
CA, Gerberick GF, Harvey P, Evans P, White IR,

日時：平成17年１月24日（月）Rycroft RJ. (2000) Use of the local lymph node assay for

場所：独立行政法人国立環境研究所温暖化棟会議室

the estimation of relative contact allergenic potency.
Contact Dermatitis. 42, 344-348（茨城県つくば市小野川16-2）
目的：微量な化学物質による汚染が社会的な問題になりつつあり、科学的知見の集積が急がれています。
そのような状況の中、低濃度揮発性化学物質の免疫毒性も含めた生体影響に関する新たな知見、問題点、及び今後の展開を探るためにワークショッ
プを企画しました。

― 11 ―

ImmunoTox Letter
プログラム

編集後記

12：30−13：00

集合、受付

13：00−13：10

理事長開会挨拶
動物の嗅覚システムの解明で、今年のノーベル医学生

第１セッション−揮発性化学物質の現状−濃度・測定技術

理学賞がRichard Axel教授と Linda Buck教授に贈られ13：10−13：30

大気中の揮発性物質濃度た。最初に日本語で聞いたニュースでは、アクセル教授（武蔵野大学とバック教授で、車の前方と後方への動きを制御するま

安藤正典）

13：30−13：50 室内における揮発性物質の測定さにぴったりのコンビに驚いた。残念ながら、車のアク（国立環境研究所

セルは、Acceleratorの略であり、バックはBackである中島大介）

13：50−14：10 新たな測定技術（産業医科大学が。

14：10−14：20

日本免疫毒性学会のホームページがやっと本格的に動嵐谷奎一）

き出し、会員の皆様により多くの新しい情報が提供でき討論ると信じております。それに伴い、編集委員にも新たな特別講演―遺伝要因への影響探索のための新たな試み

会員に加わっていただき個性的なImmunoTox Letterに

14：20−15：00

変身する予定です。来年もよろしくお願い申し上げます。

京都大学大学院

白川太郎

（HF記）
第２セッション−ヒトへの影響研究
15：00−15：20 過敏症と個人曝露（東京大学大学院
15：20−15：40

柳沢幸雄）

過敏症と臨床（北里大学坂部

貢）

15：40−16：00 過敏症と疫学（京都大学大学院
16：00−16：20

内山巌雄）

討論

16：20−16：40

コーヒータイム

第３セッション−実験動物での影響研究
16：40−17：00

揮発性物質と免疫機能（国立環境研究所

17：00−17：20

藤巻秀和）

揮発性物質と嗅覚機能（東京都神経科学総合研究所

17：20−17：40市川眞澄）

揮発性物質と脳神経（大阪府立大学大学院

17：40−18：00

討論

18：00−18：10

閉会挨拶

佐々木文彦）

編集・発行：日本免疫毒性学会
発行日：平成16年12月

参加費は無料ですが、参加を希望される方はメールでの事前登録（氏名、所属、電話番号）を下記までお願いいたします。
申し込みおよび問い合わせ先：山元（snyamamo@nies.go.jp）or
藤巻（fujimaki@nies.go.jp）
世話人：独立行政法人国立環境研究所（藤巻秀和、後藤純雄）― 12 ―

編集発行責任者：大沢 基保
編集委員会：香山不二雄、中村 和市、
牧
栄二、藤巻 秀和
原稿送付先：fujimaki@nies.go.jp