ImmunoTox Letter

日本免疫毒性学会：The Japanese Society of Immunotoxicology Vol. 8 No. 2（通巻16号）
2003
aa 目

次

aa

第11回日本免疫毒性学会学術大会（予告１）

第10回日本免疫毒性学会学術大会報告 ………１

第11回日本免疫毒性学会学術大会を下記の要領で開催いたしますのでご案内申し上げます。尚、第35回日本職業・環境アレルギー学会と第44回日本産業衛生学会アレルギー免疫毒性研究会との三者協賛大会です。

第11回日本免疫毒性学会学術大会（予告１）…１
免疫毒性研究10周年記念シンポジウム

日
会

特別講演
微量元素の測定からの炎症発生メカニズム及び細胞内調整機構の探索 …………………………３
京都大学大学院医学研究科 中島加珠子、白川太郎
基調講演
免疫毒性研究の進展と課題−Analytical stageからMechanism-based stageへ …………………６
日本免疫毒性学会理事長 帝京大学薬学部 大沢基保
食物アレルギーの実験モデルとアレルゲン性評価
国立医薬品食品衛生研究所 手島玲子 ………………９

協 賛：日本トキシコロジー学会、日本薬理学会（予定）メインテーマ：アレルギー性化学物質に抗する国際的予防体系を構築するプログラム：
招待講演「呼吸器免疫毒性学の最前線」
ケネス・ドナルドソン
英国エジンバラ大学教授
特別講演「環境と鼻アレルギー」
藤枝重治 福井大学医学部耳鼻咽喉科教授

動物実験モデルを用いた環境化学物質の毒性評価
独立行政法人国立環境研究所

時：平成16年９月10日（金）〜11日（土）場：福井県国際交流会館
福井市宝永３丁目１番１号（〒910-0004）
TEL: 0776-28-8800, FAX: 0776-28-8818

藤巻秀和 ……………10

ワークショップ
Ⅰ「化学物質の感作性評価―その国際標準化システムを構築する―」
Ⅱ「医薬品の免疫毒性評価手順を検討するための共同研究」
シンポジウム「呼吸器免疫毒性学のアセスメントとサーベイランス」
市民公開シンポジウム「地産地消の長寿免疫学」
ランチョン・セミナー（９月10日（金）予定）

年会賞 ………………………………………………12
ヒ素の免疫毒性発現におけるグルタチオンの役割
東京薬科大学生命科学部 櫻井照明、藤原祺多夫
奨励賞 ………………………………………………14
経口感作および経口惹起によるマウスの食物アレ
ルギーモデル
食品薬品安全センター 新藤智子、金澤由基子他

一般演題：口頭またはポスター発表、口頭発表は一演
題当たり発表時間10分、討論時間 ５分

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演題講演要旨申込締切：６月30日（水）申込先：http://www.tokyukanko.com/conv/3404/ita_2004/（不具合が生じた時は、roentgen@fmsrsa.fukuimed.ac.jpまでご連絡下さい）

第10回日本免疫毒性学会学術大会報告
学術大会会長北條

博史

本年度の学術大会は平成15年9月25日（木）、９月26日（金）の両日、神奈川県相模原市のグリーンホール相模
大野（相模原市文化会館）で開催された。
今回は、本学会の前身である免疫毒性研究会が1994年に昭和大学で開催されてから10回目の節目に当たったた
め、過去を振り返り学会の新たな発展を展望する機会として、サブテーマ「免疫毒性研究10年−免疫毒性研究の新たな展開−」の下に、記念シンポジウム「免疫毒性研
究の進展と課題」が開催された。その他、特別講演、２つのシンポジウム、ワークショップ、一般講演と盛りだ― 1 ―第11回日本免疫毒性学会学術大会事務局
福井県吉田郡松岡町下合月23-3（〒910-1193）
福井大学医学部環境保健学内大会会長 日下幸則
Tel: 0776-61-8338, Fax: 0776-61-8107
E-mail: roentgen@fmsrsa.fukui-med.ac.jp※今回、シンポジウムを公募でも募集いたします。企
画案をお持ちの方は、日本免疫毒性学会事務局へ１月31日までにご連絡ください。
〒329-0498 栃木県河内郡河内町薬師寺3311-1
自治医科大学保健科学講座環境免疫学・毒性学部門
TEL：0285-58-7336
FAX：0285-44-8465

ImmunoTox Letter
くさんに企画され、２日間熱心な質疑が行われた。参加な症状が極めて少なく、発症機序も不明である。２名の者数は前回をやや上回り、会員105名、非会員53名であ演者は、化学物質過敏症やシックハウス症候群の典型的った。一般講演は５題増の28題でこれまでの大会で最も原因物質と考えられているホルムアルデヒドによる動物多かった。このように活発な大会になったのは皆様の多実験について発表した。旭川医科大学健康科学講座の吉大なるご協力の賜物であり、学会運営を担当させていた

田貴彦講師は「ホルムアルデヒドの免疫系への影響−マ

だいた事務局として、心から感謝する次第である。

ウスを用いた実験系による検討−」の発表において、ホ

総会では、日本免疫毒性学会会則および学会諸規定のルムアルデヒド暴露による体液性免疫亢進や他の免疫パ

大幅な変更が審議され、組織面からもこれからの学会をラメーターの変動の化学物質過敏症患者との類似性等を支える基盤が確立された。また、本学会の初めての名誉示唆し、東海大学医学部基盤診療学系の相川浩幸講師は会員として黒岩幸雄先生に対する表彰も行われた。

「ホルムアルデヒド周産期暴露学習行動への影響」において、シドマン型電撃回避学習試験による回避率95％以上のラットを用いた実験で、約0.09ppmというきわめて

１．特別講演京都大学大学院医学研究科健康増進・行動学分野教授

低濃度ホルムアルデヒドが自発行動の抑制や平衡感覚の白川太郎講師から、「遺伝要因と環境要因の相互作用：

乱れ、学習行動の低下など中枢神経機能に影響をきたす

アレルギー疾患をモデルに」の講演を賜った。アトピー

ことを示唆した。北里研究所臨床環境、北里大学大学院

遺伝子に関するご自身の最先端の研究を紹介され、アト医療系研究所の坂部貢講師は、ご自身の研究を含めて、

ピー遺伝子の詳細な解析結果及び金属や活性酸素などの環境化学物質の生体影響をアトピー要因との関連など、非常に興味深い刺激的な内能の破綻容であった。

学

恒常性維持に必要な生理機という広い視野から捉え、「 神経内分泌免疫からみた化学物質過敏症の最新動向」と題して最近の知見を紹介した。

２．記念シンポジウム「免疫毒性研究の進展と課題」

シンポジウム II「バイオ医薬品の毒性評価と副作用」

日本免疫毒性学会理事長の帝京大学薬学部教授大沢基さまざまなバイオ医薬品が臨床の場に登場しつつあ

保講師により基調講演が行われた。講演では免疫毒性研

り、これらの毒性評価と副作用問題は重要である。昨年

究の始まり、免疫毒性研究の進展、さらに今後の研究課の本学会でもバイオ医薬品の免疫毒性試験はワークショ

題となる毒性概念、試験法・毒性機序、リスク評価につップにおいてとりあげられたが、今回は臨床治療上の問いて、茫漠とした免疫毒性に関する研究は巧みに整理さ題点を明らかにすることを意図した。

れ解りやすく提示された。これを受けて3人の演者が引

まず、医薬品機構・治験指導部の西村多美子講師によき続いて免疫毒性の新たな課題について話された。ファり、「生物薬品の治験に望むもの−抗体医薬・受容体医

イザー株式会社中央研究所安全研究統括部の堀井郁夫講

薬を中心に−」の課題で、治験に関する指導及び助言の師は、「医薬品開発における免疫毒性評価の分子毒性学

立場から非臨床から臨床への移行の判断や治験概要書等

的アプローチ−トキシコパノミックス（トキシコプロ

について講演があった。千葉大学大学院医学研究院の横テオミクス、メタボノミクス）の免疫領域への展開−」

須賀収講師は、「肝炎に対するインターフェロン治療時について、国立医薬品食品衛生研究所機能生化学部の手の副作用とその対策」として、約300名のC型肝炎患者に

島玲子講師は「食物アレルギーの実験モデルとアレルゲ対し行ったインターフェロン治療の経験を基に、治療経ン性評価」について、国立環境研究所環境健康研究領域

過時期と副作用の発生状況、副作用の多彩性や重症度、の藤巻秀和講師が、「動物実験モデルを用いた環境化学

及びそれらの対応策について講演した。千葉大学大学院

物質の毒性評価」について、それぞれ医薬品開発、遺伝薬学研究院の上田志朗講師は、「モノクローナル抗体に子組換食品、環境化学物質研究の３分野からの最先端のよるリウマチ治療における問題点」として、現在使用さ発表であった。

れている６モノクローナル抗体製剤を紹介し、特に抗TNFα抗体であるインフリマキシブを中心に、タンパク製剤としての抗原性の問題とそれらの薬剤の免疫反応に

３．シンポジウム I「化学物質過敏症」

及ぼす免疫毒性の問題、またこの抗体製剤の適応拡大の微量化学物質の慢性暴露により発症する化学物質過敏可能性等を話された。

症が増加しているが、自覚症状が主で客観的に観察可能― 2 ―Vol. 8 No. 2 (2003)

４．ワークショップ

免疫毒性研究10周年記念シンポジウム

本学会の伝統的なワークショップは、今回は２つのセクションに分けて行った。
（１）「医薬品に関する免疫毒性評価法の国際調和」
国立医薬品食品衛生研究所機能生化学部の澤田純一講師

特別講演

は、「医薬品に関する免疫毒性試験ガイダンス（案）とICH」という演題で、日本における医薬安全総合研究「国際動向を踏まえた医薬品の新たな有効性及び安全性

微量元素の測定からの炎症発生メカニズム
及び細胞内調整機構の探索の評価に関する研究」の１つの「免疫毒性試験法の標準

Trial study of intracellular trace elements by using X-ray化に関する調査研究」班を代表して、免疫毒性試験法ガ

fluorescence analysis

イダンス案の紹介並びにICHに関する進行状況を報告された。帝国臓器製薬株式会社安全性・代謝研究部の久田中島加珠子、 白川太郎

茂講師は、「医薬品の免疫毒性試験国際調和ガイドライ

京都大学大学院医学研究科社会健康医学系専攻

ン作成のためのICH免疫毒性データ調査」として、EUと健康要因学講座健康増進・行動学分野

日本・米国間の不一致点を解決するために行ってきた理化学研究所

ICH免疫毒性データ調査結果を報告した。

横浜研究所

遺伝子多型研究センター

アレルギー体質関連遺伝子研究チーム（２）「抗原性試験の課題」
ヤンセンファーマ株式会社研究開発本部の牧栄二講師

はじめには、「医薬品開発における抗原性試験の問題点」の演題

金属は各種酵素の活性中心として、身体機能の維持にで、低分子医薬品の抗原性試験の必要性と実験方法の問

重要な役割を担っている。近年、生体内外の微量金属が、題点を論じた後、被験医薬品投与モルモットでのリンパ免疫反応の賦活化に役立っていることや、皮膚炎の病態

球幼若化試験やマウス膝下リンパ節試験による抗原性試に影響を与えていることが示唆されている。人体の中で験を行うことを提案した。三共株式会社安全性研究所の最も含有量の高い鉄は古くからその必要性が知られてい木村努講師は、「マウス膝窩リンパ節試験（PLNA）の抗たが、 Feだけでなく亜鉛やセレン等の金属製剤が昨今栄原性試験における実用性」の演題で、モデル薬物で誘起養補助食品として店頭で販売される事が増えてきておされたPLNA反応におけるPLNインデックス、リンパ球

り、微量金属の重要性が注目されつつ有る。

サブセット、Th1/Th2サイトカイン産生の変化等を紹介し、PLNA評価における留意点を明らかにした。

皮膚構造と含有元素

５．一般講演複雑な層を形成している。従来皮膚の分析では容積や含表皮は厚さおよそ120μmで様々な種類の細胞からなる
口頭発表とポスター発表の両方法での募集を行った

有成分は様々な側面から解析されていたが、多層構造はが、予想に反してポスター発表希望者が多かったため、混同して分析されていた。過去にも皮膚含有元素の分析

一部の発表者に変更依頼を行い、最終的には口頭発表14は行われていたが、どの層を解析しているかは研究によ

題、ポスター発表14題となった。

って異なっていた。古い研究では層は区別されておらず、昨年度から行っている優秀発表に対する年会賞、奨励層の違いによる情報はほとんど得られていなかった。近賞の表彰は今大会は次のように決定された。年会賞は、

年、種々の微量元素がセカンドメッセンジャーあるいは

東京薬科大学生命科学部環境衛生化学研究室の櫻井照明

調節因子として働く事が示され、微量元素の解析も注目

氏の「ヒ素の免疫毒性発現におけるグルタチオンの役割」

されつつある。例えばカルシウム(Ca2+)は、種々の細胞のに、奨励賞は、同点であたため、食品安全センター秦野

システムで非常に重要なシグナルを伝達する物質であ

研究所の金澤由基子氏と同所の新藤智子氏に決まった。

る。Ca2+は顆粒層と角皮層の分化のレベルで、アポトー

両氏は共同実験者でもあり、前者は「経口感作および経シスの機構に重要な役割を果たしている事が示唆されて口惹起によるマウスのアレルギーモデル（１）」、後者は、いる。アポトーシスにおけるCaとZnのバランスの重要性「経口感作および経口惹起によるマウスのアレルギーモ

は、様々な細胞の機構の中で明白に実証されている。乾デル（２）−消化管変化を特異的指標として−」の発表

癬の病巣におけるFeの喪失は20年以上前に示されている者であった。

が、臨床的に一見正常な乾癬患者の皮膚にもFeの消失が― 3 ―ImmunoTox Letter
生じている事が明らかになってから、新たな意味を持っトモグラフィ、屈折コントラスト・映像法による呼吸器たと言える。皮膚障壁機能の変化は、分化した表皮細胞系疾患の観察など臨床に即した利用といった様々な分野の生理学的状態と相互に関連すると考えられる。これまに利用されている。

では皮膚における生理学上重要な元素及び微量元素の量

我々はSPring8の分光分析ライン(BL37XU)を利用して、的勾配、そして高度に分化した組織を同時に分析する手

単一細胞において様々な元素を同時に測定する試みをは法がなかった。Particle probeやelectron microprobe及びじめた[機器略図 Fig１参照]。SPring8を利用した生細胞

scanning proton microprobeを利用して、病態生理学のの分析は過去に試みがない。現在我々はその測定システ

手法と同様に正常な皮膚の異なる生理学側面を分析する

ムを確立する為に様々な試行錯誤を行っている。生体内ことが可能になり、金属アレルギーの原因となる金属のの様々な微量元素は互いに影響を与えているとも考えら

浸潤も微量元素の解析で実証可能となった。正常状態とれ、その動きを同時に測定できる事は価値ある事と考え

病理状態の皮膚における生理学的研究のアプローチは、られる。個々の元素を染色等で同定する事は可能である細胞の免疫学的、生化学的な様々な技術に基づいていたが、試料を調整する事なく同時に複数の元素の分布及びデータの広い解釈を含めなければならない[1]。

化学状態を測定できる手法は他にないであろう。しかしながら、これまで単一細胞レベルでの測定はほとんど行
われていない。何故ならば機器の構造上、様々な問題が微量元素と皮膚状態
乾癬患者やアトピー性皮膚炎患者の皮膚は、正常な皮存在するからである。まずは含有量の問題である。組織

膚と比較してCaの分布が高いという結果が得られていでは無く、単一の細胞では各種元素は非常に微量な量しる。特にCa:Znの比は正常皮膚との間に大きな違いが見か含まれておらず、培地や固定液の影響を完全に取り除られ、乾癬ではCaの割合が減少し、アトピー性皮膚炎でく事は難しい。次にビームの精度である。浮遊細胞だと、はZnの割合が減少しており、動態は明らかに異なる。ま生かしたまま固定しなければならない。実験を進めて行2+た、Ca は細胞死(apoptosis)を制御している可能性も示

く中で明らかとなった問題も多く、システムの確立までされ[2]、皮膚の異常には細胞死のプログラム異常も関わっている事が示唆される。Ca2+は細胞表面のCl- channelの道は困難である。

をactivateさせることも知られており、金属のイオン化

Storage Ring

Solid-state detector

及び取込みにも関わっている可能性がある。角質細胞が正常にバリアを形成するためには、Ca2+の分布が重要であることが示され[3]、皮膚のバリア機能の障害と同時に
Slit

2+

上皮組織におけるCa 勾配の減少が観察されている[4]。

我々の試み

Multilayer
Monochromator

SPring-8 (Super Photon Ring 8GeV)は、日本が誇る世界最高性能のおよそ50億電子ボルト（5GeV）以上の加速エネルギーを有する第３世代の大型放射光施設である。

Ionization
Chamber

Forcusing Mirror
Kirkpatric-Beaz Optics

Ionization
Sample Chamber

X-Y-Z
Stage

Fig1. Experimental principle. The schematic drawing of the
set-up of BL37XU, Spring8 (Sayo, Japan).

放射光とは1947年に初めて電子シンクロトロンで観測さ細胞の中に含まれる様々な微量元素がどのような機構れた、 ほぼ光速で直進する電子が、進行方向を磁石などで生命活動の制御に関わっているかは未だ明確ではなによって変えられた際に発生する電磁波である。現在、い。各種タンパクの中に含まれ、活性中心として重要な

SPring-8は国内外の研究者に広く開かれた共同利用施設

働きを成しているものも数多くある。これら様々の様々として、物質科学、生命科学、環境科学だけでなく産業な炎症の発生機構の中で我々がまず注目したのは活性酸利用分野の研究にも利用されている。1997年の設立以来、

素による細胞障害である。外的刺激に対する反応としてタンパク質巨大分子の３次元構造解析、非結晶生体材料の活性酸素発生により、サイトカインの分泌や細胞障害の小角散乱、薬剤設計、新薬開発などの生命科学へ利用が誘導され、炎症の増悪に関係していると考えられる。

に留まらず、生体試料中の環境汚染微量元素の分析、高活性酸素の発生に関わっていると考えられている遷移金

性能電池材料の局所構造解析、環境浄化用触媒の分析な属の中でも特に生体内での含有量の高いFeに着目した。

どといった環境科学への利用にも応用されている。それ免疫反応に関わる細胞群及び病態を呈している患部の組ばかりではなく微小血管造影法による腫瘍血管の観察、織モデルを解析することによって、より簡便な診断方法― 4 ―Vol. 8 No. 2 (2003)を構築するための試みとして、体内に微量含まれ、しかく、多因子疾患であることは周知の事実である。環境要

しながら大きな働きを果たしている金属に注目し、その因、遺伝要因が様々に交絡し合って各々の疾患を生じて動態と疾患に同調性が見られないかどうかを検討する必いると考えられている。アレルギー疾患がもしも完全に要があると考えられた。

個体差によってばらばらな原因によって生じるのであれ

分光分析は試料を障害しない為元素解析のみならず、ば、治療の方策の立てようはない。しかしながら家系調

免疫染色などの生化学的な解析を同一の試料で行うこと

査で家族集積性が見られることや、双生児研究で一卵性が可能である。そこでまず我々はヒト前骨髄芽白血病細双生児に高い一致率が見られることから、遺伝子解析も

胞HL60を用いたトライアルを行った。HL60は薬物誘導

また必要である。様々なツールを用いてより早く適切な及び刺激によって容易に活性酸素種の一つであるスーパ
ーオキサイドアニオン(O2-)を発生させる事が知られてい診断をくだし、患者のQOLをいかにあげるかが今後の課題であろう。

る[5]。このHL60を用いた活性酸素の産生系においては、
8-hydroxydeoxyguanosine (8OHDG)を指標とするDNAダ

1.Forslind B: The skin barrier: analysis of physiologically

メージについての研究が鹿児島大学の竹内らによってなされ[6]、O2-とDNAダメージ量は相関する事が明らかに

important elements and trace elements. Acta Derm

なっている。このO 2- の発生経路にはFeからの電子の供

2.Forslind B, Werner-Linde Y, Lindberg M, Pallon J:

与が関係するfenton反応が考えられているが、実際に目Elemental analysis mirrors epidermal differentiation.

で見える形では確認できていない。これまでは各種試薬

Acta Derm Venereol (Stockh) 79(5): 12-17,1999.

Venereol Supp 208: 46-52, 2000.

の反応の結果から類推するのみであった。Feの重要性は

3.Vicanova J, Boelsma E, Mommaas AM, Kempenaar JA,

既に知られるところであるが [7]、この細胞系を用いてO 2- 発生時の細胞内での金属の動態を調べることで、O 2-

Forslind B, Pallon J, Egelrud T, Koerten HK, Ponec M:の発生に本当にfenton反応が関わっているのか、それとin reconstructed human epidermis is related toも別の体内の遷移元素が関わっているのか、又は全く別

improvement of terminal differentiation and stratumのメカニズムが働いているのかを目に見える形で証明でcorneum barrier formation. J Invest Dermatol 111(5):きると考えた。次に、現在までに得られた結果を述べる。
O2-を発生させると、測定したHL60の細胞内元素の中で97-106,1998.

Normalization of epidermal calcium distribution profile

4.Ahn SK, Hwang SM, Jiang SJ, Choi EH, Lee SH: The

はCa、Fe、Cuに増加が見られ、Cl、K、で減少が見られた。O2-の発生をSODの添加で抑えるとCl、Cu、Feのレchanges of epidermal calcium gradient and transitional

ベルは元に戻った。特にFeやZnは酸化ストレスを与えると細胞内に流入することが考えられる。O2-の消去のため

in the murine epidermis. J Invest Dermatol 113(6): 189-にはSODが必要であり、SODを活性化するのにはZnが消費される。O 2- を不均化した後、Znは細胞内に取り込ま

5.Takeuchi T, Morimoto K, Kosaka H, Shiga T: Spin

れるようである。これらの結果から分かることは、O2-のfrom human promyelocytic leukemia cell line, HL60.

発生にはFeだけでなく、他の遷移元素（特にZn）が関わ

Biochem Biophys Res Commun 194(1): 57-64, 1993.

っているということであろう[8]。また、価数の動態の変

6.Takeuchi T, Nakajima M, Morimoto K: Relationship

化をX線吸収端構造解析(XAFS)で行った[Fig 2]。PMAに

between the intracellular reactive oxygen species andて刺激を与えると若干２価へシフトする事がわかる。しthe induction of oxidative DNA damage in human

かしながらこれらのサンプルは細胞をmassとして見ていneutrophil-like cells. Carcinogenesis 17(8): 1543-1548,

る為、価数の片寄りが懸念される。

1996.

cells after prolonged occlusion following tape stripping
195,1999.

trapping of superoxide released by opsonized asbestos

我々はまたアレルギーの発症機構解明の為、SNP

7.Goswami T, Rolfs A, Hediger MA: Iron transport;(Single Nucleotide Polymorphisms: 一塩基多型)による個

emerging roles in health and disease. Biochem Cell Biol

体差を加味した遺伝子解析を行っている。Human

80(5): 679-89, 2002.

Genome Projectにおいてドラフトシークエンスが発表さ

8.Nakashima K, Shirakawa T, Ide-Ektessabi AM:

れて以来、様々な疾患関係遺伝子が発表されてきている。

Investigation of the relation of allergy and oxidative

経験的な知識に加え、遺伝子解析の観点からもアレルギ

damage by metallic elements using SR micro beam.

ーは一つの原因によって発生する単一原因疾患ではな

CAARI 2002 proceedings― 5 ―ImmunoTox Letter
時の基調講演の内容を要約したものです。研究会発足時の課題提起をもとに免疫毒性研究と学会の歩みを振り返り、これから重要度を増すであろう研究課題を中心にして、私見を述べてみました。
ある学問分野の発展過程は、特異な現象・事象の発見・整理とその分析の段階（Analytical stage）から、それらの機構の解析・理論化とそれに基づく特異的現象の理論的予測の段階（Mechanism-based stage）とに分けることができる。この２つの段階は、かつて用いられた
romantic era, academic eraに対応するように思えます。
免 疫 毒 性 の 研 究 は 、 こ の Analytical stageか ら
Mechanism-based stageへの発展過程にあると思われます。

１．免疫毒性研究の始まり
免疫系を標的とする毒性研究は、図１に示すように1970年代末に体系化され始め、immunotoxicologyと呼ばれるようになった。免疫毒性は1984年のWHO/IPCSの国際会議で、化学物質と免疫系との相互作用の結果として有害影響（生体防御能の低下、過敏症や自己免疫疾患）を生じるような事象として定義され、90年代にかけて化
学物質の過敏症も含め各種の免疫毒性の記載と、免疫毒Fig 2. Blue and redlies show the XANES spectra of FeSO4･
7H2O and Fe2O3 powder, respectively, as reference materials.
These are the comparison of Fe K-edge XANES spectra

性の試験法の整備とその評価の試みがなされてきた。そbetween the sample and the reference materials (FeSO4･7H2O[Fe2+], and Fe2O3[Fe3+]). (a)Control, (b)PMA stimulation. The
beam size was 0.25μm2, and the incident beam energy waschanged from 7.10 to 7.16 keV. The XANES spectrum of thesamples showed a substantial difference from those of the

御能に影響する免疫抑制であり、化学物質の免疫系に対

reference materials FeSO4･7H2O and Fe2O3.

ンセンサスを確立することと、免疫毒性試験法（とくにの主たる研究対象は、感染や発癌に対する宿主の生体防する直接的な影響と作用機構であった。
このような背景の中で、免疫毒性研究会は1994年に、
化学アレルギーも包含する免疫毒性の概念についてのコ
医薬品の前臨床試験法）の開発と普及を当面の目的として発足し、研究の進展に伴い2001年には学会へと改組さ

基調講演

れた。

免疫毒性研究の進展と課題−Analytical stageからMechanism-based
stageへ大沢基保

帝京大学薬学部・衛生薬学講座・環境衛生学教室

本学会の前身であった免疫毒性研究会が1994年６月に発足し、10月の第１回の研究会（於：東京・昭和大学薬学部）の開催により免疫毒性研究の集約の場ができてから今回で10回目の年会（於：相模原）となりました。そこで、今回は10年を一区切りとして、免疫毒性研究と学会の歩みおよび今後の課題を展望する記念シンポジウムが企画されました。本稿は私に宿題として課されたその― 6 ―Vol. 8 No. 2 (2003)
た。これらに関する課題は相互に関連しているが、次に２．免疫毒性研究の進展
国内外ともにこの10年の間に免疫毒性学は固有の研究分野として確立され、その研究対象も多様になっている。

課題例となるものを列挙すると、
１）毒性概念：免疫毒性は免疫系細胞を標的とする細化学物質や医薬品の免疫毒性について、WHOのTask胞レベルで特異的な毒性と考えられてきたが、その特groupにより直接的な免疫毒性（Direct immunotoxicity）

異性をさらに標的分子のレベルで捕らえるべき段階にとその評価法（Ref.1）と、アレルギー性過敏症と物質の入ってきた。化学物質の発がん性における標的分子で感作能の評価法（Ref.2）のまとめが公表されている。自あるDNAに対し、免疫毒性では免疫反応関連分子やそ

己免疫の誘発能についても作業が進行中で、免疫毒性のの受容体、さらにそれらの遺伝情報を担うDNA構成物

情報と試験法については著しく研究が進展している。私などが候補となりうるが、多種であることから、免疫は免疫毒性研究会の発足時に、当面する研究方法上の課

毒性の種類や機序によってそれらを分類整理すること

題として、1）免疫毒性試験項目の整理と標準化、2）薬が必要であろう。また、生物学的影響としての免疫毒物や化学物質による自己免疫やアレルギーの実験モデル

性は標的臓器の毒性概念でとらえにくいことがある。

系の開発と指標の選択、3）ヒトタンパク製剤の安全性

個々の免疫系細胞や組織への毒性のみならずシステム

評価のためのヒト細胞モデル系の確立、などの点をあげ全体への影響としてとらえる視点も必要である。すなた（Ref.3）。このうち、目標達成の目途がついているのわち、個々の免疫系細胞の機能障害とともに、免疫系

は1）の課題であり、他のものについては未だ実用的な細胞の機能バランス（例えば、Th1/Th2機能バランス）試験法が確立されていない。欧米では免疫毒性試験法ののかく乱が毒性発現の律速因子であれば、免疫毒性はガイドラインが、化学物質についてはNTP（米国）や神経毒性や内分泌かく乱作用などに共通して、生理的RIVM（オランダ）などにより、食品添加物については

毒性あるいはシステム毒性と言えるであろうか。このFDA（米国）などにより早くから提示されていた。医薬点に関連しては、局所の免疫毒性がどの程度全身の免品の免疫毒性試験法については、日本でも学会のワーク

疫毒性指標に反映されるか、検証する必要があろう。

ショップでの共同研究を基にガイダンス案（Ref.４）が２）試験法・毒性機序：

免疫毒性物質のスクリーニン

作成され、ICH会議の場に提出されたことは、学会活動

グ系としての試験系は、一応確立されている。しかし、の大きな成果の一つである。さらに、これまでの学会活

多数の動物を用いねばならない煩雑さのため、より簡

動からは、アナフィラキシー誘発物質を始めとするアレ

便で感度と特異性が高くかつ毒性機序のメカニズムにルゲン試験法の開発、ストレスと免疫能の関係（内分基づく信頼度の高い免疫毒性の検出系の開発が求めら泌−免疫系の相関）の解析と評価、化学物質過敏症の原れる。特異性の点からみると、免疫反応に特異的なサ因と機序（神経−免疫系相関）の解明、遺伝子組替え

イトカイン、抗体、表面受容体などの分子マーカーの(GM)食品や医薬品の免疫学的安全性の評価など新たな研活用が重要である。タンパク化学的な方法ではサイト

究課題が発掘されてきている。

カインや受容体の測定は測定感度面から難しいことも

免疫毒性研究は、対象物質により臨床（医薬品）、環あり、遺伝子発現量の測定などの分子生物学的方法が境（環境化学物質）、栄養（食品）などの免疫毒性学、必要である。さらに。これらマーカーがヒト免疫能をおよびそれらの基盤としての分子免疫毒性学とに分化し対象とする種々の試験系に適用できることも望まれていくと予想されたが、正にその方向に進展している。

る。

臨床分野では生物製剤や高分子薬剤の比重が増してそれ化学物質の暴露から健康障害の発症までの過程におによるアレルギーや免疫不調が、環境や栄養分野でも大けるバイオマーカーは、Exposure-Effect-

気や室内空気の汚染や食物環境の変化によるアレルギー

Susceptibilityの３段階のバイオマーカーに分けられやアトピー症状の増加や易感染状況が、各分野の免疫毒る。免疫毒性のバイオマーカーの問題をあげると、こ性研究の主要な関心事項になってきた。

れらの段階のうち、暴露と感受性のマーカーが今後重要になってこよう。暴露は通常暴露量に関するマーカーとして考えられるが、免疫毒性特にアレルギー反応

３．免疫毒性研究の今後の課題
免疫毒性研究の課題は、毒性概念、試験法、毒性機序、の誘発については、物質構造の質的な解析がクローズ

リスク評価などについて、多数の課題が存在する。これ

アップされよう。吸入接触アレルゲンと食物アレルゲ

らの課題において、これからは現象の分析段階からそのンの交差反応研究（例えば、シラカバ花粉とリンゴ・機構を考慮して解析することが必要な段階になってき

西洋ナシ・キウイなどの間の交差アレルギー）などか― 7 ―ImmunoTox Letter
ら、交差抗原の解析により抗原エピトープ部の類似性

３）リスク評価：

種々の毒性の意義は、実際のヒトにが示唆されている。このことは合成ペプチド医薬品やおけるリスクの有無、大きさによって評価される。そGM食品・医薬品の安全性評価においても考慮すべきのリスクは暴露量や健康影響の程度から評価される場事項であろう。実際に、一部の遺伝子組換え大豆とブ

合と、暴露を受ける集団側の感受性の大きさから評価

ラジルナッツの間にアレルゲンである2S-methionine-

される場合がある。後者の場合には、遺伝的素因の他

rich albuminが共通に検出されている。医薬品や化学に、加齢段階やホルモンバランスあるいはストレス状物質によるアレルギーの場合は、それら物質の感作能態などの生理的状態による免疫能の差も感受性に影響の予測が求められている。その予測を動物実験などかすると考えられ、免疫毒性においては感受性にかかわら求めるのではなく、アレルゲンの既知データから理るリスク要因を無視できない。近年アトピー体質者の論的に構造活性相関（QSAR）を求める試みがなされ、急増が指摘されている。これは、同一地域、同年齢期

接触性アレルゲンに関してはCase-Multicase system,の中学生集団のアトピー素因者率が経年的に増加する

DEREK skin sensitization rulebase、吸入アレルゲンにことから、生活環境因子の影響によると推測されてい関してはSARなどのデータベースが提案されている。

る。現在では、出生後の免疫機能の成熟過程では、複このようなデータベースからのメカニズム解析も有力

合的な生活環境因子は免疫学的ホメオスタシスに影響な手段となってこよう。

しうるものとして注目されている。内分泌かく乱と同

一方、感受性のマーカー解析のためには、genomics,

じく、免疫毒性物質についても胎児期〜幼児期は

metabonomics, proteomicsなどのToxicogenomicsの手Critical Windowと見なされており、この観点からの免法が、感受性の遺伝的因子の検索や感受性機構の解析

疫毒性研究が待望されている。さらに、内分泌かく乱に有望視されている。化学物質の中には、免疫疾患のとは異なり免疫毒性の場合は、免疫能の低下やバラン

感受性要因を有するHigh risk populationに対して免疫スの変化が生じてくる老齢期もまた感受性が高い時期

毒性を生じやすい場合がある。発がんのプロモーターと言え、老齢期集団の免疫毒性リスク評価は高齢化社に似て、必ずしも特異的な免疫毒性反応を引き起こさ会を迎えるに当たって緊要な課題である。

ないが、自己免疫やアレルギーなどの免疫異常の遺伝

また、世界的にも環境リスク評価において、化学物

的素因の発現を促進し、免疫障害を発症させる場合が質のヒトへの健康影響だけでなく生態系への影響の検ある。水銀やカドミウムなどの重金属がこのような免討が必須となり、それに対応して化審法も改正された。

疫毒性を示す。このような免疫毒性を誘発する因子を

このため、ヒト以外の生物における免疫毒性の試験系

検索することの意義は大きく、そのため種々の感受性の確立やそのメカニズム研究へのニーズが高くなる。

動物モデル（MRLマウス、NC/Ngaマウスなど）が用

これが、比較免疫毒性の研究として展開すれば、生体いられつつある（図２）。

防御における免疫分子の意義の解明や、毒性検索法における代替法の開発などへの応用も期待できる。
これら多数の課題について、視点を絞るためにあえて共通する点を挙げるとすれば、特異的な分子マーカーの開発と免疫毒性感受性の解析の問題の重要性が高いことを指摘できる。今後しばらくは、免疫毒性研究は産業衛生（Ref.5）や小児保健（Ref.6）などを始め応用分野に展開していく一方、これらの問題を中心として機構研究の面でも深化していくものと予想される。

［文献］
１．IPCS Task group (1996) Environmental HealthCriteria 180, p.1 - 390, WHO, Geneva.
２．IPCS Task group (1999) Environmental HealthCriteria 212, p.1 - 399, WHO, Geneva.
３．大沢基保（1994）第1回免疫毒性研究会要旨集, p.1― 8 ―Vol. 8 No. 2 (2003)
3., 免疫毒性研究会
４．澤田純一他（2003）ImmunoTox Letter, 8(1):アレルゲンとの一次配列の相同性の比較、(2)新規産生タ
3 - 8.

ンパク質の消化性並びに物理化学的処理に対する安定性

５．M.I.Luster, M.H.Karol, eds (2002) Int.

の検討、(3)特異的アレルギー患者血清中IgE抗体と新規

Immunopharmacol., 2: 161-325.

産生タンパク質の反応性が必須項目としてあげられ、動６．D.B.Peden (2000) Environ. Health Perspect., 108(Suppl): 475-482.

物モデルの使用は、標的血清スクリーニング、国際的血清バンクの構築、新規産生タンパク質のT細胞エピトープの解析とともに検討項目としてあげられている。

第10回免疫毒性学会記念シンポジウム報告
食物アレルギーの実験モデルとアレルゲン性評価

表１

組換えDNA植物由来食品の安全性評価の実施に関するガイドラインのアレルギー誘発性評価に関する添付資料

手島

2003年7月 Codex総会（ローマ）採択

玲子（国立医薬品食品衛生研究所機能生化学部）(1)既知のアレルゲンとの一次配列の相同性の比較 (全アミノ

食物アレルギーの実験モデルの開発は、粘膜免疫の機酸配列並びに連続した部分アミノ酸配列の相同性も含む)

能解析等を目的として、多くのグループで行われており、(2)新規産生蛋白質の消化性並びに物理化学的処理に対する安定性の検討また、近年の遺伝子組換え食品の開発・実用化の国際的広がりに対応し、新規産生タンパク質のアレルゲン性の(3)特異的血清中IgE抗体と新規産生蛋白質の反応性評価法としての動物モデルの必要性からも進められてい(4)上記1)-3)以外で、考慮すべき項目；標的血清スクリーニ

る。本シンポジウムでは、(1)遺伝子組換え食品のアレル

ング、国際的血清バンクの構築、動物モデルの使用、新ゲン性評価における動物実験の位置付け、(2)現在進めら

規産生蛋白質のT細胞エピトープの解析(5)アレルギー誘発性は、様々なデータ等に基づき総合的にれている動物モデルについて、(3)卵白アルブミン(OVA)判断することのマウスを用いる経口感作実験についての報告を行っ(6)上記draftの適用除外: 小麦等の穀物由来遺伝子産物で、た。

グルテン感受性消化管炎を促進する可能性のあるもの（1）
遺伝子組換え食品のアレルゲン性評価の概要
遺伝子組換え食品の安全性審査は、国内において、平成13年４月からは、「組換えDNA技術応用食品及び添加(2)食物アレルギー実験モデルの概要

物の安全性審査基準(http://www.mhlw.go.jp/topics/

食物アレルギーの動物モデルとしては、Helm博士2)ら

idenshi/anzen/tuuchi2.html)に基づき、義務化されていの総説に詳しく述べられているが、現在、動物モデルでる1)。この中で、遺伝子産物のアレルギー誘発性に関しては、被験タンパク質が、IgE抗体を産生しうるかどうか、は、遺伝子産物（通常はタンパク質）がアレルゲン（アまた、複数回の投与で、アレルギー反応が引き起こされレルギーを引き起こす原因物質）として知られているか、るかどうかが調べられている。感作のされやすさは、投既知のアレルゲンタンパク質と構造上類似しているか、与される抗原の濃度、投与方法、動物の年齢、遺伝的背人工胃腸液や加熱処理に対する安定性があるか等が調べ

景、アジュバントを用いるかどうかに左右されることがられるが、動物実験は義務づけられていない。また、国報告されており、IgE抗体産生能の高い動物としては

際的ガイドラインとして、1999年から2003年にかけて、

BALB/cマウス、BNラットが報告されている。また、イコーデックス食品規格委員会（国連食糧農業機関(FAO)

ヌ(Buchananら5))や 子豚を用いる食物アレルゲンによると世界保健機関(WHO)合同設立国際政府間組織）のバイ

感作方法も報告されている。イヌや子豚のような非げっ

オ食品特別部会で議論され、2003年７月にイタリアで開歯類を用いることは、人の食物アレルギーと似た症状を催されたコーデックス委員会で採択された呈するという観点で、有用であるが、投与期間が長いこ「組換えDNA植物由来食品の安全性評価のと、及び被験物質の量を多く必要とするという欠点があ

実 施 に 関 す る ガ イ ド ラ イ ン 」 が あ る

り、げっ歯類を用いる方法の方が、投与期間を短くでき(ftp://ftp.fao.org/codex/alinorm03/al03_34e.pdf)。この安るなど、汎用性のある方法と思われる。食物アレルギー

全性評価の中のアレルギー誘発性の部分（表１）には、モデルの具体例として、Dearmannら3)は、BALB/cマウ

主な評価項目として、(1)新規産生タンパク質と、既知のスへの感作が、ウシアルブミンより卵白アルブミン― 9 ―ImmunoTox Letter(OVA)の方が高いこと、また、ピーナッツアレルゲンの[文献]

IgE抗体産生能が、対照として用いた非アレルゲン

1) Teshima R. (2001) Bull.Natl.Inst.Health Sci. 119, 27-39,

potato acid phosphataseより高いことを報告している。

2) Helm R.M. (2002) Ann.N.Y. Acad.Sci., 964, 139-150,

また、BNラットモデルに関しては、Knipperら 4) の報告

3) Dearman R.J. et al. (2000) Food Chem.Toxicol. 38, 351-360,

があり、OVA，hen s egg, cow s milkタンパクによる感作

4) Knippels L.M.J.et al. (2002) Ann.N.Y. Acad.Sci., 964,
151-161,が報告されている。その他、イヌ(Buchananら )や 子豚
5)を用いる食物アレルゲンによる感作方法も報告されてい5) Buchanan B.B. et al. (2002) Ann.N.Y. Acad.Sci., 964,
173-183,る。現在、共通のアレルゲン及び非アレルゲン物質を用いて動物の感作を行うという国際バリデーション試験が

6) Okunuki H. et al. (2003) Biol. Phar.Bull.26, 1260-1265

推し進められている。
（３）卵白アルブミン(OVA)に対するマウスを用いる経口
感作実験

動物実験モデルを用いた環境化学物質の毒性評価

食物のアレルゲン性を動物を用いて評価するためには、経口投与でしかもアジュバントを用いることなく感作を行うことが望ましい。しかし、一般に経口的に投与され

藤巻秀和（独立行政法人国立環境研究所）

た食物抗原は様々なメカニズムによって寛容を誘導する
ので、食物アレルギーモデルとしては、寛容の誘導され１．はじめににくい条件下で、経口感作を成立させることが必要で、われわれの生活の質の向上とともに、身の回りに人工抗原の投与量や免疫継続期間、動物種の選択などの検討的な化学物質が増加しつつある。利便性の追求と共に正が必要となる。 私共は、マウスの種として、BALB/cマの相関を持って化学物質が増えていると考えられる。人ウス、B10Aマウス、INF-γノックアウト(INF-γ-KO)マ

体に害のない化学物質のみであれば一向に構わないが、

ウス、アトピー性皮膚炎モデルマウスであるNc/Ngaマ

塩や砂糖でもそうであるようにどんな化学物質も濃度がウス、マスト細胞欠損W/Wvマウスを用いて、OVAの経適度でないと毒性がみられる。環境化学物質の種類が増

口感作の条件を検討した。各種マウスに、９週間、OVAえる速度にその毒性評価、あるいは化学物質同士の相互を0.1 ないし１mg連日経口投与し、OVAに対する血液中作用などについての情報が追いつけず不足している状態

抗体価の上昇を検討した。IgG1抗体価の上昇で比較するである。環境化学物質の免疫毒性評価と実験モデルの今と、BALB/cマウスでは、0.1mgOVA/day、 ９週投与でを考えたい。

600程度であるが、B10A、INF-γ-KO, Nc/Ngaマウスで、それぞれ、4,400程度、600程度、2,200程度で、W/Wvマ

２．環境化学物質の毒性評価

ウスでは29,000程度と、顕著であった。OVA特異的IgE

一時の公害の時代から比較すると、大気はかなりきれ

抗体価は、各マウスとも、62から220程度であった。

いになっていると思われるし、実際の環境白書の中でもW/Wvマウスにおいて、経口感作後の抗原の腹腔内惹起大気汚染物質に関して少なくとも顕著に増加がみられる

により、急激な体温低下が認められ、また血漿中PAF濃ものはない。しかしながら、大気中の化学物質の種類は度の上昇が引き起こされ、ASA(active systemic analysis)

確実に増えており、とくに生活時間の長い室内におけるの誘導が認められた。 W/Wvマウスの粘膜免疫に関与す化学物質の生体への影響が懸念されている。大気汚染物

る細胞の解析結果から、W/W v マウスでは、wild type

質の免疫毒性については、これまでに喘息や花粉症など(+/+)マウスに比べ、腸管リンパ球(IEL)の中で、TCRγの発症との関連から、アレルギー反応にかかわる炎症性

δ-T細胞の割合が顕著に減少していることが観察され、細胞の局所への浸潤、炎症誘導や炎症時に働くサイトカ

このリンパ球の群の減少が、W/Wvマウスでの経口感作

イン･ケモカイン産生の増加、IgE抗体産生の亢進、好酸

6)のされやすさを反映している可能性が示唆された 。以上、球の活性化などが解析の対象とされた。とくに、大気中私達の行っている食物アレルギー動物モデルについて、の粒子状物質に含まれる化学物質の影響評価は、アジュ

結果を述べてきたが、W/Wvマウスが経口感作モデルマ

バント効果の機構についての解析が多く報告されていウスとして有用かどうかについては、OVA以外の他の抗る。しかしながら、最近では粒子でもなく従来のNO2や原の感作も行い汎用性について確認する必要があると考SO 2などのガス状物質でもない揮発性の有機化合物の影えている。

響が危惧されている。
― 10 ―

Vol. 8 No. 2 (2003)
神経系への影響、神経毒性の研究も同時に必要と考えら

３．低濃度域における刺激作用と毒性
化学物質のリスクを評価するときに量―反応関係を見れている。最近の基礎的な研究で、免疫担当細胞からのることは重要な研究の項目である。それぞれの化学物質

神経ペプチドや神経成長因子の産生、また、神経細胞かの使用に適した量を判定するのに、無影響量の値を見つ

らのサイトカイン類の産生など神経系と免疫系とのクロけることが必要だからである。しかしながら、従来よりストークが報告されており、生体内での恒常性の維持に低濃度域には毒性としての抑制作用のみでなく刺激作用

大きな役割を果たしていると考えられている。

が見られることがいくつかの報告で示唆されていた。いわれわれは、室内での揮発性有機化合物の神経―免疫

わゆる、U―字型、あるいは逆U―字型を示す反応曲線

軸への毒性をみるために、代表的な揮発性物質であるホである。Calabrese & Baldwin (1)が毒性学におけるルムアルデヒドを選んで低濃度長期曝露をマウスを用い

Hormesis―抑制的濃度以下の毒物の生体に対する刺激効て行い、その毒性評価を行った。その結果、WHOのガイ

果（医学英和大辞典、加藤勝治編、南山堂）の再考を提

ドライン値に近い値で、脳内でのいくつかの指標に過敏案したのが今年の春であるが、免疫毒性評価においてもな反応が誘導されることを見出した。また、ホルムアル

この刺激作用について討論するのが適当な時期かもしれデヒド、あるいはアレルゲン単独のマウスでは顕著な変ない。環境中の化学物質の曝露濃度は、急性毒性がみら化が見られないのに、アレルギーモデルマウスをホルムれるような高濃度ではなく低濃度で推移しているものがアルデヒドで曝露すると海馬における神経成長因子NGF

多くみられているので、刺激作用についてはその解析はの蛋白レベルでの増加，mRNAレベルでの発現増強が認重要な課題であろう。

められた。ところが、同じマウスの血漿中では、NGF量

最近のアレルギー疾患の増加には、環境化学物質によが顕著に抑制された。このような低濃度での変化が、どる免疫応答の亢進作用が関連するという報告は多い。そのような行動変化や症状に結びつくのか現時点では不明の一方で、揮発性をもち低濃度で室内に存在する化学物

であるが、環境濃度に近い低濃度で刺激作用を示す可能

質の生体影響についてはよく解析されていないのが現状性は示唆された。

である。近頃のシックハウス症候群や化学物質過敏症(MCS)などの原因不明の疾患とのかかわりが推測されて

６．これからの課題いるので、動物実験により揮発性有機化合物の生体影響

細菌やウイルスなどの異物に対してのみ反応すると考を明らかにすることは正しい化学的な知見の集積、ある

えられてきた免疫機構が、化学物質に対しても応答する

いは予防法の作成の意味でも大変重要である。MCSの患ことは金属アレルギーや職業アレルギーでは既知の事実者の中にはアレルギー性疾患の罹患率が高いことやシッであるが、その機構解析は不十分である。ホルムアルデ

クスクール症候群の症状には皮膚のかゆみがみられるな

ヒドについても、欧州のアレルギー専門家会議EAACIのどアレルギー反応の亢進が関与している可能性が考えら

報告(２)ではアレルゲンとして扱っているが、IgEの誘導れている。

についての議論はわかれている。化学物質に対する免疫

MCSの患者が実際にどのような化学物質に対して過敏

毒性をより深く掘り下げることが残されている課題の一な反応を示し、発症の誘導を示すのがどのような濃度レ

つであろう。そのためには、Hormesisを適切に評価でき

ベルかは現在不明である。WHOのガイドライン値や厚生る免疫毒性モデルの開発も重要と考える。

労働省の指針値以下でも過敏な人は反応するともいわれている。種々の関連が疑われる揮発性有機化合物に対し７．おわりにてヒトと動物でどのくらい感受性に差がみられるのかわ

日本免疫毒性学会が10年目を迎えたが、さらに10年後からない。動物実験では、あくまでも曝露した低濃度のにはどのように扱う物質、実験方法、動物モデルが推移

化学物質でどのような行動異常、反応がみられるのか解しているのか興味がある。免疫学において生物由来の異析するとともに、ヒトでの過敏な状態への誘導に関わるよ

物のみならず化学物質に対しての意義が増すにつれ、新うな要因解明の手がかりを提案することも可能である。

たな視点が必要なのかもしれない。

５．神経毒性と免疫毒性の相互作用

文

MCSやシックハウス症候群を考えるときに化学物質に692.

よる免疫毒性のみを解析しても全体への影響はわからず、とくにストレスとの関連も無視できないことから脳献(1) Calabrese E. J. & Baldwin L. A. (2003) Nature, 421,691(2) Johansson S. G. O. et al., (2001) Allergy, 56,813-824.

― 11 ―

ImmunoTox Letter
果は、無機ヒ素が肝細胞に対し μMレベルで強い細胞毒年 会 賞

性を示し、necrosisを引き起こして生体を炎症に導くのに対し、無機ヒ素が哺乳動物の体内でメチル化を受けたヒ素の免疫毒性発現におけるグルタチオンの役割

代謝産物であるDMAsVは、これらの細胞に対する毒性が非常に弱く、 mMレベルで細胞死を誘導するが、 それは炎症を伴わないapoptosisであり、従ってヒ素のメチル化

櫻井照明、藤原祺多夫
東京薬科大学,生命科学部,環境衛生化学研究室

代謝は生体を無機ヒ素による炎症反応の誘起から護る正の代謝反応である事を推測させた。Arseniteの細胞毒性
は各種細胞内GSH涸渇剤の添加で増大した。これに対し【目

DMAsVによるapoptosisは、細胞内GSH涸渇剤や、細胞内的】

アジア地域を中心に大規模に発生している慢性ヒ素中でGSHと基質を結合させる酵素であるglutathione S -毒では、患者に肝臓肥大や脾臓肥大などの炎症症状が高transferase（GST）に対する阻害剤の添加で阻害された。

い頻度で観察され、ヒ素が免疫反応を惹起していること

低濃度のGSH涸渇剤処理で細胞内GSH濃度を維持しながを推測させる。我々は既に、無機ヒ素が肝細胞やマクロらGSHの新合成だけを止めた状態の細胞にDMAsVを添加

ファージに対して強い毒性を示し、炎症性サイトカイン

したところ、apoptosisが誘導される前に細胞内GSHの消の放出を伴うnecrosisを誘導するのに対し、その最終代失が認められた。細胞に DMAs VとGSHを同時に添加し謝産物であるdimethylarsinic acid（DMAs V ）は専らた場合、これらは細胞外で容易に結合する事が分析化学

apotosisを誘導し、炎症性サイトカインの放出を抑制す

的及び生化学的手法により証明されたが、この結合体はる事を報告した。また、ヒ素による細胞毒性の発現は細分子量が大きすぎて細胞内には入る事ができなかった。

胞内還元型グルタチオン（GSH）により制御されており、また、DMAsVによるapoptosisはGSH-DMA複合体代謝酵

GSHは無機ヒ素によるnecrosisには防御的に働くが、素阻害剤やラジカル消去剤の添加により部分的に阻害さ

DMAs によるapoptosisには逆に誘導因子として働いていれ、GSH-DMA複合体代謝酵素阻害剤とラジカル消去剤

る事も明らかにしてきた。今回我々はラットの肝細胞をの同時添加でほぼ完全に阻害された。ESRによりDMAsV

用い、無機ヒ素によるnecrosis誘導とDMAs V による
apotosis誘導の分子機構をGSHを中心に詳細に検討し、がTRL1215細胞にapoptosisを起こし始める時にthiyl.
radical（RS ）が細胞内で発生する事が確認された。さ慢性ヒ素中毒時の免疫毒性発現における細胞内GSHの役

らに、DMAsVによるapoptosisは、apoptosisを直接起こ

割を考察したので報告する。1 - 7 )す酵素であるcaspase３に対する阻害剤の添加で完全に抑V制され、caspase３の上流に位置するcaspase８、及び【方

caspase９に対する阻害剤の添加で部分的に抑制された。

法】

ラット正常培養肝細胞TRL 1215は米国国立癌研究所のまた、細胞内caspase３活性は、 DMAsVの添加後18時間

Michael P. Waalkes博士より供与された。無機ヒ素（亜ヒ酸；arsenite）及びDMAsVは市販されているものを 2回再結晶処理をしてから用いた。細胞毒性はAlamarBlue法により測定した。細胞内caspase 3の活性化は市販のキットを用いて解析した。細胞内ラジカル反応はelectronic
spin resonance （ESR）により解析した。

【結果】

TRL1215細胞におけるarseniteの48時間培養におけるLC50値は35μMで、誘導された細胞死の大部分がnecrosisであった。それに対しDMAsVの細胞毒性は弱く、LC50値
は4.5 mMであり、誘導された細胞死は100% apoptosisであった。Arseniteは濃度依存的にTRL1215細胞からの炎症性サイトカインであるinterleukin 1α（IL-1α）の産生放出を増大させたが、 DMAs は逆に抑制した。この結V

Fig. Molecular mechanisms of arsenicals-induced
cytolethality― 12 ―

Vol. 8 No. 2 (2003)
をピークに著しく上昇し、この上昇は細胞内GSH涸渇剤

謝は猛毒な無機ヒ素を細胞外へ排出する為の解毒機構での添加により完全に抑制された。これらの実験結果より、あるとも言える。しかし、何らかの理由でDMAsVが細胞

DMAs Vによるapoptosisは、DMAs Vが細胞内に取り込ま外に蓄積しその濃度がmMに達すると、DMAsVは非能動れて細胞内GSHと結合する事を起点とし、続いて生成し的に細胞内にわずかに滲入し、nMの細胞内濃度でGST

たGSH-DMA複合体が細胞内で酵素的に代謝される過程

を介してGSHと結合し、きれいなapoptosisを誘導する。

で不安定なthiyl radical分子が生じ、それがcaspase

この様に、ヒ素のメチル化代謝の真の意義と、それにおcascadeを活性化して誘導されている事が推定されたけるGSHの役割がようやく明らかになってきた。今後更（Fig.）。この様なメカニズムでapoptosisを起す化学物質に研究を進め、ヒ素の毒性発現機構と、それに対する生は、 今のところDMAsV以外には報告されていない。

体側の防御機構をGSHを中心に解析し、例えばGSHを患者に投与するなどしてアジアの人々を慢性ヒ素中毒の脅【考威から救う事ができれば幸いである。更に、最近さかん

察】

無機ヒ素は免疫細胞や肝細胞に活性酸素の産生を介しに行われつつある、無機ヒ素の急性白血病治療への応用て主にnecrosisを誘導し、細胞内GSHはそれを防御してにも、我々の研究が、例えば抗白血病細胞作用の機序のいる。一方で無機ヒ素のヒトでの最終代謝産物である解明や副作用の緩和などの面で役立つ事ができれば甚大

DMAs は、専らapoptosisのみを誘導し、それには細胞内

である。

V

に取り込まれた DMAs がGSHと結合する事が必須であVる。アジア地域の慢性ヒ素中毒患者に観られる炎症や癌【謝辞】の発症は、微量な無機ヒ素を長期間摂取した事により、本研究をすすめるにあたり実験の補助に尽力頂きまし

生体の酸化還元反応などの恒常性のバランスが崩れて誘た稲沢浩子女史、落合将之氏、小島力氏、太田宇海氏を導されているものと推測される。そしてその鍵となるの

はじめとする本研究室の学生諸氏に心より感謝致しまが恐らく生体内のGSHである。実際に慢性ヒ素中毒患者す。また、毎年参加させて頂く免疫毒性学会において、の血液中GSH濃度は健常人に比べて低い事が報告されて企業の方々などの発表を聞く事により、私の研究も具体8)いる。 慢性ヒ素中毒により何らかの理由で生体内の的にヒトの為に役立たなければならないという思いを強GSH濃度が低下すると、猛毒である無機ヒ素の毒性や発くしており、いろいろな意味で免疫毒性学会には感謝致

癌性が高まり、さらに無機ヒ素の最終代謝産物である

しております。

DMAs によるapoptosis誘導も正常に働かなくなり、結果
V的にダメージを受けた異常な細胞が生き残ってしまうと文考えられる。GSHは無機ヒ素のメチル化代謝における重１) Sakurai, T., Kaise, T., Matsubara, C.,
Chem. Res. Toxicol., 11, 73 - 283 (1998).

要な補助因子でもあるので、GSHが不足すればヒ素のメチル化が上手く働かず、毒性の高い無機ヒ素が体内に貯献２) Sakurai, T.,

留してしまう可能性もある。即ち、生体内GSHレベルがBiomed. Res. Trace Elements, 13, 167 - 176 (2002).

低下すると、それぞれのヒ素代謝産物がそれぞれ異なっ

３) Sakurai, T., Qu, W., Sakurai, M.H., Waalkes, M.P.,
Chem. Res. Toxicol., 15, 629 - 637 (2002).

た毒性を示し、結果的に癌をはじめとする様々な慢性ヒ素中毒症状を発症させるのであろう。我々の最新の研究

４) Qu, W., Bortner, C.D., Sakurai, T., Hobson,

では、arseniteは細胞外濃度がμMレベルになると、リ

M.J.,Waalkes, M.P.,

ン酸transporterを通って細胞内に侵入し、細胞内濃度がCarcinogenesis, 23, 151 - 159 (2002).

nMに達すると活性酸素産生を介して細胞にnecrosisを誘

５) Sakurai, T.,
J. Health Sci., 49, 171 - 178 (2003).

導する事が明らかとなった。この時、細胞内GSH濃度が十分量（mMレベル）存在する場合は、GSTの働きで

６) Sakurai, T., Ochiai, M., Kojima, C., Ohta, T., Sakurai,arseniteとGSHが結合すると共にarseniteは酵素的なメチM.H.,

ル化代謝を受けDMAsに変換される。DMAsは細胞内にTakada, N., Qu, W., Waalkes, M.P., Fujiwara, K.,

留まる事が出来ず、恐らくMRPファミリーやP-糖タンパ

Toxicol. Appl. Pharmacol., in press.

ク質などの薬物transporterを介して速やかに細胞外に排７) Sakurai, T., Kojima, C., Ochiai, M., Ohta, T., Sakurai,

出される。一度細胞外に排出されたDMAsはもはや容易

M.H.,に細胞内へ入る事ができない。即ち、ヒ素のメチル化代

Waalkes, M.P., Fujiwara, K.,― 13 ―

ImmunoTox Letter
Toxicol. Appl. Pharmacol., in press.

OVA群(OVA/LL)を設定した。また、OVA/LL群の一部に

８) Pi., J., Kumagai, Y., Sun, G., Yamauchi, H., Yoshida,

は２回／週の頻度でサリチル酸ナトリウム（２mg／匹）

T., Iso, H.,を腹腔内投与した群(SA/OVA/LL)を設定した。

Endo, A., Yu, L., Yuki, K., Miyauchi, T., Shimojo, N.,①感作投与開始の３週間後に各群６匹について血清中のFree Radic.Biol.Med., 28, 1137 - 1142 (2000).

抗OVA抗体価を測定した。また、各群17〜20匹について、それぞれの群の感作時と同様の溶媒を用いて調製したOVAを100 mg／匹の割合で経口投与して惹起し、

奨 励 賞

全身性アナフィラキシー症状の観察を、さらに各群６匹について血漿中ヒスタミン濃度の測定を行った。全
身性アナフィラキシー症状は、無症状を０、立毛や鼻こすりを１、吐き気を２、努力呼吸やチアノーゼを３、経口感作および経口惹起によるマウスの
食物アレルギーモデル

死亡(24時間以内)を４としてスコアをつけて、発症の頻度と強度を評価した。

新藤智子 、金澤由基子 、斎藤義明 、
臼見憲司１、小島幸一１、手島玲子２
１

１

１②前日にOVAの経口投与によって感作の成立を確認した動物を用いて、以下の実験を行った。LL群、OVA/LL
群、SA/OVA/LL群の各群(n=６)の一組は経口、もう食品薬品安全センター

秦野研究所、一組は静脈内投与により再惹起して全身性アナフィラ

国立医薬品食品衛生研究所

機能生化学部

キシー症状の観察および血漿中ヒスタミン濃度の測定

１２を行った。また、再惹起を行わないLL群、OVA/LL群、
SA/OVA/LL群を対照として、再惹起後の各群の消化【はじめに】

管について、肉眼的観察および組織学的検索を行って遺伝子組換え食品の安全性の評価においては、導入さ変化を調べた。

れた組換え蛋白質のアレルギー惹起性の有無を調べることが重要である。我々は、動物を用いたアレルゲン性の評価試験系を確立することを目的として、経口投与によ【結る感作の成立および経口惹起によるアレルギー症状の発①３週間の感作投与後にS群、OVA/S群、LL群では全く現を満たす食物アレルギーモデルの開発を試みた。はじ抗OVA IgG１抗体価が認められなかったのに対して、

めに、ヒトの食物アレルギーにおける即時型のアレルギ

OVA/LL群(12±49)およびSA/OVA/LL群(47±39，

ー症状を増悪させる可能性のある因子を、臨床報告の中

p<0.05 vs LL群)においては抗OVA IgG１抗体価の上昇

果】

から検索した。ついで、オブアルブミン(OVA)を抗原とが認められた。経口惹起を行った結果(図１)、OVA/S

した経口投与の系に候補となる因子を併用投与し、抗体群やOVA/LL群に弱い全身性アナフィラキシー症状で価を指標としてアレルギー発症への影響をスクリーニン

ある鼻こすりや立毛が認められ、OVA/LL群では２つグした。その結果、食餌成分のリノール酸や鎮痛剤に使の症状を併発する個体数が増加した。一方、用されるサリチル酸化合物の併用が抗体価の上昇に影響していることが推察された。そこで、OVAを抗原としてリノール酸やサリチル酸化合物の併用による経口感作および経口惹起の成立条件の検討を行った。さらに、経口および静脈内惹起時の消化管を中心とした反応性の比較を行い、作製したモデルマウスの性質を調べた。

【方法】

７週齢の雌性BALB/cマウスにOVAを１mg／匹の割合
で５回／週、３週間経口投与して感作した。感作には、生理食塩液溶媒対照群(S)、生理食塩液を溶媒としたOVA
群(OVA/S)、リノール酸／レシチン(４：１) 混合液溶媒
対照群(LL)、リノール酸／レシチン混合液を溶媒とした― 14 ―

Vol. 8 No. 2 (2003)
SA/OVA/LL群には明らかに強い全身性アナフィラキ【考察】

シー症状であるチアノーゼや努力呼吸が認められ、そ

食物アレルギーの動物モデルにおいて経口投与によっのうち１例は死亡した。また、半数の個体が２〜４つて感作を成立させること、経口惹起によってアレルギーの症状を併発し、症状の認められなかった個体は20例反応を誘導することは、モデルでの反応をヒトへ外挿す

中２例であった。経口惹起30分後においてS群、る上で重要である。蛋白質抗原の通常の溶媒である生理

OVA/S群、LL群では血漿中へのヒスタミンの放出は食塩液に対して、リノール酸とレシチンの混合液を媒体

認 め ら れ な か っ た の に 対 し て (0.5〜 11.4 ng/mL)、

として抗原を経口投与することによって、OVA／LL群にOVA/LL群(0.5〜449 ng/mL)およびSA/OVA/LL群(3.3

示されたように特異抗体価の上昇、血漿中へのヒスタミ〜953 ng/mL)に放出量の多い個体が認められた。

ン放出および消化管の変化を伴う全身性アナフィラキシ②感作の成立を確認した動物を用いて異なる２経路で再ー症状を発現させることが可能となった。さらに、経口惹起した結果(図２)、OVA/LL群およびSA/OVA/LL群

感作時にサリチル酸を併用したSA／OVA／LL群では反において、静脈内惹起に比べて経口惹起で全身性アナ応が増強され、特に全身性アナフィラキシー症状においフィラキシー症状の頻度および強度とも高かった。まてはチアノーゼや努力呼吸、そして死亡といった重篤なた、血漿中へのヒスタミンの放出量も静脈内惹起に比症状を示した。これらのことから、SA／OVA／LL群はべて経口惹起で高い傾向にあった(表)。

食物アレルギーモデルとなり得ると考えられた。
しかし、即時型アレルギー反応において重要な働きをする抗OVA IgE抗体価はELISAにおいてもPCA反応においても認められなかった。全身性アナフィラキシー反応
はIgEノックアウトマウスにおいても認められることから、本モデルはIgEの関与しない反応である可能性が考えられた。一方、感作期間が3週間であることからIgE産
生量自体が少ない可能性、感作投与後半に数例の動物の死亡が認められたことから感作期間中にIgEが消費されている可能性等も考えられた。また、LL群において若干の全身性アナフィラキシー症状が認められたが、これは使用した卵黄由来レシチンに混入しているOVAを含めた蛋白質に起因しているものと考えられた。
一般的な動物試験における全身症状の発症は、静脈内に原因物質を投与した場合、最も強い反応が現れる。
ASA試験の陽性反応を得るためのプロトコールでも、惹起時には抗原を静脈内投与し、全身性アナフィラキシー
症状を観察する。これに反して、本モデル系では静脈内惹起に比べて、経口惹起での血清中へのヒスタミンの放出を伴う全身性アナフィラキシー症状の頻度および強度再惹起後の消化管の変化を調べたところ、肉眼的観が明らかに高かった。また、惹起によって発現する消化察では血管の明瞭化、腔の拡張といった所見が認めら

管の所見も静脈内惹起に比べて、経口惹起で増加した。

れた。また、小腸の病理学的観察では絨毛の短縮、粘これらのことから、本モデル系では惹起による全身性ア

膜固有層における形質細胞やリンパ球の増加、粘膜固ナフィラキシー症状の発現への消化管の関与が考えられ有層の毛細血管の拡張といった所見が認められたが、た。

いずれも軽度の所見であった。これらの所見は惹起を行わない対照の組ではいずれの群にも認められなかっ【まとめ】

た。肉眼的観察においては、経口惹起後の所見数がLL

動物を用いたアレルゲン性の評価試験系を確立するこ群２件、OVA／LL群５件、SA／OVA／LL群４件であとを目的として、経口感作および経口惹起によるマウスったのに対して、静脈内惹起後の所見数はLL群０件、の食物アレルギーモデルを検討した。サリチル酸の併用

OVA／LL群０件、SA／OVA／LL群３件であった。

下、リノール酸とレシチンの混合液を溶媒として経口感― 15 ―

ImmunoTox Letter
作および経口惹起を行う本試験系では全身性アナフィラ

編集後記

キシー症状の発現とそれに伴う消化管の変化が認められたことから、即時型の反応を示す食物アレルギーモデル

本号は免疫毒性研究10年の記念号として第10回日本免として利用できることが示唆された。

疫毒性学会学術大会の特別講演、記念シンポジウムでご国際学会情報講演いただいた先生方に講演では話さなかったこと、そ10th International Congress of Toxicologyの後の新たな情報などを含めてご投稿いただいたものを

11-15 July, 2004 ; Tampere, Finland

掲載しました。ImmunoTox Letterもより有益な情報をAbstract deadline: February 15, 2004

発信するため会員の皆様からの積極的なご提案を歓迎し

http://www.ictx.org/

たいと考えております。良いお年をお迎えください（HF記）

12th International Congress of Immunology
18-23 July, 2004; Montrèal, Canada
Abstract deadline: January 23, 2004
http://www.immuno2004.org

編集・発行：日本免疫毒性学会

ポスドク募集

発行日：平成15年12月
独立行政法人国立環境研究所環境健康研究領域分
子細胞毒性研究室（室長

編集発行責任者：大沢 基保
編集委員会：香山不二雄、中村 和市、
牧
栄二、藤巻 秀和
原稿送付先：fujimaki@nies.go.jp野原恵子）では免疫毒性に興味があり分子生物学的手法の技術を持っている
ポスドク１名を募集しております。詳しくは、野原（keikon@nies.go.jp）までお問い合わせください。

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