共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いる顕微吸光度分析
宮崎大学 工学部教育研究支援技術センター
松本 朋子
はじめに新規機能性材料の開発と関連して，マイクロビーズ，微粉体，マイクロカプセルなどの数十から数百ミクロンの大きさの微小固体材料が注目されており，これらの微小材料の定量分析技術の開発が重要となっている．
今までに，FT-IR および UV–vis 分光，反射分光１)，および蛍光解析 2）などによるマイクロビーズの表面解析およびその破砕物の定性分析が報告されているが，定量分析についての報告が少ない．特に，顕微可視分光光度計が普及していないために，微小領域の可視吸光度分析の報告例が少ない．
我々は，共焦点レーザー走査型顕微鏡(Confocal Laser Scanning Microscope: CLSM)において，付属する透過照明装置を利用して吸光度分析が行えるのではないかと考え，CLSM を用いる微小領域での吸光度分析法の開発を目指している 3-4)．CLSM によって光透過性の微小材料の吸光度および光路長を正確に測定できれば，溶液における吸光度分析と同様の原理で微小材料中の特定の発色団の濃度を決定することができると考えられる．
そこで，本論文では，ミクロンオーダーの球状シリカゲル(SiO2)にアンチモンポルフィリン錯体を吸着させてマイクロビーズを調製し，これを試料として用いて CLSM による顕微吸光度分析の精度および適応範囲等について検討を行ったので報告する 5)．
キーワード：共焦点レーザー走査型顕微鏡 吸光度分析 顕微分光 シリカゲルマイクロビーズ アンチモン
ポルフィリン錯体
1 実験
1･1 試薬マイクロビーズの調製に必要なジヒドロオキソ(テトラフェニルポルフィリナト)アンチモン臭化物錯体(1; C44H30N4O2SbBr, 分子量 M= 848.4)は，既報にしたがって合成した 6)．1 の紫外可視吸収スペクトルをアセトニトリル中で測定し，Soret 帯および Q 帯の極大吸収波長である 417 nm および 547 nm におけるモル吸光係数(ε 417 およびε 547)をそれぞれ5.62×105 dm3 mol-1 cm-1 および 2.14×104 dm3 mol-1 cm-1 と決定した．
マイクロビーズの調製には，平均粒径（bav）50 μm（SiO2-a と略）および 150 μm（SiO2-b）の二種類の球状 SiO2（富士シリシア化学，CARiACT Q-10）を用いた(図 1)．濃度計算に必要な SiO2 の粒子比重(ρ)は，石英の比重(2.2)および細孔容積(P)を用いて式(1)によって算出した(表 1)．

えた溶液Ⅰ中に含まれる 1 の重量（W1 / mg）を式 2 で求めた．各濃度のマイクロビーズの調製に必要な V1 とV2 の量を表 2 に示す．
Ph OH
Ph+

N SbN
NN

SiO2Ph

Ph OH
N SbN
PhN
N-PhBr-PhBr

HO Ph+

SiO2 OH12

図 1.SiO2 に１を吸着させたマイクロビーズ(2)表 1. SiO2 の特性bavP b)ρ c)
3 -1(cm g )( g cm-3 )(μm)
541.170.616
1501.190.608a)

SiO2-aSiO2-b表面積d)2 -1(m g )300285a) 平均粒径 (bav). b) 細孔容積 (P). c) 式1 により算出された粒

ρ = 1/(2.2 + P)
–1

(式. 1)

1･2 マイクロビーズ(2)の調製
メスフラスコ（250 cm3）に 1（12.7mg または 12.5 mg）を入れ，メタノール（50 cm3）を加え，トルエンでメスアップして溶液 I を調製した．また別にトルエン
メタノール（4:1）混合溶媒（溶媒Ⅱ）を用意した．
次に，ナスフラスコに重量 W0（100 mg）の SiO2 を入れ，溶媒Ⅱを V2 cm3 および溶液Ⅰを V1 cm3 加えた．加子比重 (ρ). d) 表面積.

次に，エバポレーターでナスフラスコからメタノールを留去し，次に冷却管を付けて 18 時間還流した．還流後，室温まで冷却し，マイクロビーズをろ別し，アセトン（5 cm3）で洗浄して，ろ液と洗浄液を回収した．
回収したろ液および洗浄液をエバポレーターで濃縮してメスフラスコ（10 cm3）に移し，メタノールでメスアップして溶液Ⅲとした．溶液Ⅲの吸光度(A)を 417 nm

で測定し，SiO2 に吸着されなかった 1 の重量（W2 / mg）をε417 および M を用いて式 3 から求めた．
SiO2 に吸着した 1 の重量（W3 / mg）を(4)式によって算出し，マイクロビーズ中の 1 の重量百分率（C 1w/wt%）およびモル濃度（C 1m / M）をそれぞれ式 5 および式 6 によって求めた．調製したマイクロビーズはデシケーターに入れて真空乾燥させて，CLSM 分析に用いた．表 2 に調製したマイクロビーズの C1w および C1mを示す．ここで，マイクロビーズは，用いた SiO2-a（bav=54 μm）および SiO2-b（bav= 150 μm）によって，それぞれ 2a および 2b と表し，括弧内の数値は W1 の値を示している．

CLSM は，本体(Olympus FV-300)に分光器(STFL 250,Seki Technotron)をガラスファイバーでつなぎ，画像解析だけでなく蛍光および吸収スペクトルの測定を行うことができる．吸光度分析では顕微鏡の透過照明装置のハロゲンランプを光源として用い，試料を透過した透過光は，対物レンズで集光され，ピンホールおよびファイバーを通り，分光器および検出器(PMT)で検出される (図 2)．吸光度分析における試料の測定領域は，対物レンズの倍率(x)およびピンホールの直径(h)またはファイバーコアの直径(f)によって決められる円形内となる． f を 100 μm，h を 300 μm に設定して測定を行った場合，d は 2.14 μm と計算された．d は 2 の粒径(b)に比べて狭い範囲になっているので，光路長は測定領域内ではほぼ一定と見なされ，また，ビーズ外の領域からの漏光は完全に排除されている．

W1 = 12.5 V1/250(式 2)

W2 = MA/(100ε417)(式 3)

W3 ＝W1 – W2

(式 4)

d = h/(3.5x)(式 7)

C1w ＝100 W3/W0(式 5)

d = 3 f /(3.5x)(式 8)

C1m = 1000C1wρ /(100M)(式 6)

2. 結果および考察
2･1 CLSM の測定範囲
CLSM は，一般的にレーザー光をガルバノミラーおよび対物レンズによって試料上を走査し，試料の表面および内部の焦点面から発した蛍光を対物レンズおよび共焦点に位置するピンホールを経て検出し，空間分布をコンピュータ処理によって画像に変換する顕微鏡である．特に，深さ方向の分解能がきわめて高く，高画質な画像解析を行うことができる．本研究に用いた

また，d を 2.14 μm とした場合，2 の粒径 b が 4.9 μm以上であれば，測定範囲での光路長の誤差は 10%以内に抑制でき，光路長は測定領域内ではほぼ一定と見なすことができる．対物レンズの倍率を 40 倍に設定した
場合，CLSM の画像で測定できる b の最大値は 350 μmとなっている．したがって，本法で測定できる 2 の bの範囲は 4.9～350 μm となる．測定の波長範囲は，光源の波長領域および検出器のフィルターで決められ，本装置では 488 nm 以下はフィルターでカットされ，検出器の長波長側の限界は 775 nm であるので，488～775nm の領域が可視光吸光度分析の波長範囲となる．

表 2. マイクロビーズの調製 (2).
22a (0.1)
2a (0.2)
2a (0.3)
2a (0.4)
2a (0.5)
2b (0.1)
2b (0.2)2b (0.3)
2b (0.4)
2b (0.5)

SiO2 a)SiO2-aSiO2-aSiO2-aSiO2-aSiO2-aSiO2-b
SiO2-b
SiO2-b
SiO2-b
SiO2-bV1 b)

V2 c)

W1 d)

W2 e)

(cm3)
24
68
1024
6810(cm3)
13119751311975(mg)
0.102
0.203
0.305
0.406
0.508
0.100
0.200
0.300
0.399
0.499

(mg)
0.002
0.005
0.007
0.014
0.014
0.002
0.003
0.005
0.006
0.009

W3(mg)
0.100
0.198
0.2980.392
0.494
0.098
0.197
0.295
0.393
0.490

2 中の 1 の量C1w f)
C1m g)
(wt%)
(mM)
0.100
0.730.198
1.440.298
2.160.392
2.85
0.494
3.59
0.098
0.70
0.197
1.41
0.295
2.110.393
2.82
0.490
3.52a) SiO2 100 mg の重量(W2). b) 溶液 I の体積（cm3）. c) 溶液 II の体積（cm3）. d) 式 2 から算出された 1 の量(mg).
e) 式 3 から算出された溶液に関する 1 の量(mg). f) 式 5 から算出された重量% . g) 式 6 から算出された 1 のモル濃度.

PMT0.8

吸光度 (A)

スペクトルA0.6A0.4

ファイバー (φ= f)0.20

ピンホール (φ= h)

500

55 060 0

6 50

Wa vele ngth / nm

画像

対物レンズ
(倍率= x)
測定範囲 (φ= d)
MB ( φ= b)
Wavelength/nm

光源

図 3. 2b (0.2)の吸収スペクトル.

図 2. CLSM による吸光度分析
A= bε547C2(式 9)

C2= A/(bε547)(式 10)

2･2 CLSM による顕微吸光度分析の方法
2 の吸光度(A)は，溶液の吸光度分析の場合と同様にLambert-Beer 則によって，光路長，ε 547，および 1 のモル濃度(C 2 / Μ)の積で表すことができる． 1 をシリカゲルに担持させても、極大吸収波長がメタノール中のものとほとんど変わらないことから，シリカゲルの影響は小さいものと思われ、マイクロビーズでの 1 のε 547はメタノール中の値を用いた．また，A を 2 の中心線で測定した場合，光路長は 2 の粒径（bcm）と同じになることから，A は式 9 で表され，さらに式 9 は C2 を表す式 10 に変換できる．
顕微吸光度分析は次のように行った．CLSM のステm a)

2C1(mM)2b (0.2)

1.41ージに置いたスライドガラス上に数十個の 2 を置き，その上にカバーガラスを乗せて固定した．同時に、スライドガラス上に 1 を固定化していない同じ粒径のSiO2 数個を置き、吸光度分析のブランクとして用いた．
無作為に 5 個の 2 を選んで，ステージを移動させて顕微鏡の視野の中心に 2 の中心線が来るようにした．
吸収スペクトルを 500～650 nm の範囲で測定し，2 の極大吸収波長の 547 nm における A を測定した．例として 2b(0.2)の吸収スペクトルを図 3 に示す．
2･3 顕微吸光度分析の分析範囲と精度分析範囲を検討するために，2a-b の顕微吸光度分析
によって求めた A の値を C1m に対してプロットを行った（図 4）．b に分布があるために各 C1m における A の値にはバラツキが見られるが，2a の場合，A は全体的に C1m に対して良好な直線関係を示している．一方，
2b では C1m が 3.5 mM の点において A が頭打ちになっている．これらのことから，顕微吸光度分析は，

表 3. マイクロビーズ（2）の CLSM-分析
Ab)bc)
A/bC2d)(mM)(cm-1)
(μm)
0.380
0.428
0.484
0.507
0.509

149.8
163.1
167.7
159.4
167.1

25.4
26.2
28.9
31.830.5a) 調製した 2 中の 1 の濃度(C1m) 吸光度(A) は CLSM おいて 551 nm で分析した b)

1.19
1.23
1.35
1.49
1.42C2av e)(mM)(STDf))

1.34(0.11)

CLSM で分析したビーズの直径(b) c) 式 10にしたがって CLSM によって求めた 1 の濃度(C2). d) 平均の C2 値(C2av). e) 標準偏差 (STD)= [(nΣC22 – (ΣC2)2)/n(n-1)]1/2; n= 5.

A が C1m に対して比例関係にある約 0.8 以下で行うことが求められる．2a-b の顕微吸光度分析から求めたモル濃度(C2)，５つの C2 を平均した平均モル濃度(C2av)，および標準偏差(STD)を表 3 に示す．次に、C2av と C1m の

1.2

4.2

3.5

C2av/mmol dm-3

同等性を検証するために， C2av を C1m に対してプロットを行った（図 5）．2a の場合，相関係数(r2)0.991 で良好な直線関係が得られ，その傾きが 0.979 であった．
2b の場合は，直線からずれた 2b(0.5)の点を除いた４点の直線の傾きは 0.936 (r2＝0.990)であった．これらのことから C2av は C1m にほぼ等しいことを示しており，標準偏差 0.11-0.73 の精度で 2 中の 1 の定量分析ができることを示している．

2.8

2.1

1.4

0.7

0.8

0A

1.0

00.7

1.4

2.1

2.8

3.5

4.2

C1m/mmol dm-30.6

図 5. C2av の C1m に対する相関関係：2a (○)と 2b (●):
2a での傾き= 0.979 (r2= 0.991)、2b での傾き= 0.936 (r2=0.990) . 次の直線関係が得られた：C2av = C1m.

0.40.2

表 4. 微小領域の CLSM 吸光度分析.a)

0.000.7

1.4

2.12.83.54.2

C 1m /mmol dm -3
図 4. A の C1m に対する依存性： 2a (○) and 2b (●).
表 4 に示す顕微吸光度分析の分析条件および適応範囲から，CLSM を用いた顕微吸光度分析は数十から数百ミクロン程度までの光透過性の微小材料中の成分濃度を定量するために有効な方法であることを示している．マイクロビーズは有機合成における触媒，吸着剤，固相合成のための担体，バイオセンサーなどに活用されており 7)，本法は，この分野の研究への貢献が期待される．
3. 結言
共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)を用いた顕微吸光度分析の精度および適応範囲などを検証するために，粒径が 50 および 150μm の二種類の球状シリカゲ
ルにジヒドロオキソ(テトラフェニルポルフィリナト)アンチモン臭化物錯体(1)を 0.70- 3.59 mM のモル濃度(C1m) で吸着させてマイクロビーズ(2)を調製した．
CLSM での試料の測定領域は、対物レンズの倍率およびピンホールの直径またはファイバーコアの直径によって決められる直径が 2.14 μm の円形内であることがわかった．さらに分析範囲，測定範囲などの分析条件

測定波長範囲488～775 nm

ビーズ直径の測定範囲 (b)4.9 ～352 μm

測定範囲(d)2.14 μm

最大吸光度 (A)

0.8

精度b)

0.11-0.73a) 測定条件：対物レンズ倍率(x): 40, ガラスファイバーコアの直径(f ): 100μm, ピンホールの直径 (h): 300 μm, 光源: ハロゲンランプ.
b) 図５から算出.した標準偏差(STD)を検討した結果，4.9～350 μm の球状試料について測定波長が 488～775 nm で分析可能であることが分かった．そこで，CLSM に付属する透過照明装置を利用して可視光吸光度分析を行い分析精度について検討を行った．その結果，吸光度(A)から求めた 2 中の 1 のモル濃度(C2av)は C1m と標準偏差 0.11-0.73 で良い一致を示した．しかし，A が 0.8 以上のサンプルでは，直線からのずれが確認され，A の測定範囲は 0.8 以下であることが分かった．以上の様に，CLSM を用いる顕微吸光度分
析は，ミクロンオーダーの光透過性の微小材料中の成分濃度を定量するために有効な方法であることが分かった．
4. 今後の展開
今回色素として用いたポルフィリン誘導体は、生体親和性色素として多用され，光線力学療法(PDT)薬剤への応用の観点から，高い生体親和性のある水溶性ポルフィリンの開発に関心が集められている 8)．生体親和性の評価のためには，細胞内の水溶性ポルフィリン色素量を正確に求めることが重要であるが，生きた菌体内の色素の分析方法についての報告が少ない．そこで、現在、開発した CLSM 吸光度分析法を応用して、生体親和性色素の菌体への吸着量の定量の検討を開始している。
参考文献
1) E. Pere, H. Cardy, O. Cairon, M. Simon, S. Lacombe:
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2) H. Yamasaki, S. Hirayama, M. Okamoto: J. Photochem.
Photobiol. A: Chem., 51 237–244 (1990).
3) J. Matsumoto, T. Fuchikawa, Y. Komiya, Y. Fueda, T.
Matsumoto, T. Shiragami, M. Yasuda: Chem. Lett., 34,1484-1485 (2005).
4) J. Matsumoto, T. Matsumoto, Y. Senda, T. Shiragami,
M. Yasuda: J. Photochem. Photobiol. A: Chem. 197,101-109 (2008).
5) 松本朋子，白木隆一，松本 仁，白上 努，保田昌秀, 分析化学, 57, 819-824 (2008)
6) Y. Andou, T. Shiragami, K. Shima, M. Yasuda: J.
Photochem. Photobiol. A: Chem., 147, 191-197 (2002).
7) F. Z. Dorwald: “Organic Synthesis on Solid Phase:Supports,Linkers,Reactions”,seconded.,(Wiley-VCH), Weinheim, New York, 2002.
8) 松本朋子，中原卓郎，松本仁，白上努，保田昌秀、
分析化学、58, 357-361 (2009)