表１．検査プロセス別にみた循環血中の腫瘍由来DNA（circulating tumor DNA; ctDNA）検査のための留意事項
測定技術

検査工程
大分類

検査前

小分類

検査前の確認

作業項目

検査適応の検討

リアル Digit
NGS タイム al
PCR PCR●●●

適切な検査の選択

コメント
参考資料等

留意事項

作業内容

●検査薬添付文書の対象症例を確認して不適合患者を検査対象外とする。
●複数回測定として承認が取れている検査は、現時点ではOncoBEAM RAS CRCキットのみである。
●cell free DNA (cfDNA) 中のctDNAは微量なことが多く、検査薬の選択時には検出感度や組織検査との一致率等の性能がどの程度か留意が必要である。
リキッドバイオプシーで、モニタリング検査を目的とした体外診断用医薬品、医療機器プログラムは、現時点では●ctDNAの割合が低い場合、コピー数変化の検出が難しい場合がある。
ない。
●化学療法等により腫瘍組織量が減少した状況では、ドライバー遺伝子バリアントの検出感度が低下する可モニタリング検査では、ctDNAそのものを腫瘍マーカーとして検出する。モニタリング検査には残存病変バリアント能性がある。ctDNAの絶対量も減る場合がある。
モニタリングのように検出すべきバリアントが既知の場合と、獲得耐性バリアントのように検出すべきバリアントが未●腫瘍量や臓器(原発巣および転移巣)によって、検出感度が異なる場合がある。
知の場合がある●腫瘍の種類によってctDNA検出が難しいと想定される場合がある。例えば脳腫瘍では脳血管関門（BBB）が存在するため血中のctDNA量が少ない可能性がある。
(1)クローン造血によるバリアント、(2)遺伝子バリアントを伴う良性腫瘍、(3)体細胞バリアントと類似する脱アミノ化による見かけ上のバリアント（5メチルシトシンの脱アミノ化によるシトシンからチミンへの変異）による偽陽性について考慮しておく必要がある。

*JCCLS標準採血法ガイドライン:https://www.jccls.org/active/public2/●JCCLS標準採血法ガイドライン*に従う
静脈採血

血液採取１採血●●

使用採血管の選択●採血した全血を安定化、直ぐに搬送可能な真空採血管、血液凝固・細胞溶解を防ぎ有核細胞およびcfDNAを保存する効果をもつこと、検体搬送時の安定性、安全性と耐久性ある材質であることが要求される。 (参考) OncoBEAM RAS kitではStreck採血管とBD バキュテイナ® 採血管(K2-EDTA)を推奨●検査薬添付文書で指定・推奨されたセルフリーDNA（cfDNA）採血管を使用する(参考) FoundationOne Liquid CDx では、「本品は「セルフリーDNA 抽出用採血管」と併用する」と記載
専用のcfDNA抽出用採血管の例: PAXgene® ccfDNA 採血管（BD)、セルフリーDNA抽出用採血管 されている。
（ロシュ）、Streck 採血管（Cell-Free DNA BCT CE）●専用採血管がなければ、抗凝固剤としてEDTAを含む採血管を選択する。ヘパリンはライブラリー調製反応を ●採血管の比較表は表3-1を参照
阻害するため、使用しない。

採血量●癌種により血中ctDNA量が異なるため、必要採血量も癌種または検査薬によって異なる。
●検査薬添付文書、検査案内書等に記載されている採血量に従う●

採血後①-1 採血後(病院●内)●●

血漿分離および保管①-2 集荷／輸送(輸送業者)

●

●

● 輸送

血液採取２①cfDNA専用
採血管使用時

検体仕分け
分析前
プロセス
①-3 検体前処理(検査センター)

●

●

●

血漿分離
遠心条件
DNA抽出までの保管

採血後②-1 採血後(病院●内)●●
血漿分離および保管

血液採取２②EDTA採血
管使用時②-2 集荷／輸送(輸送業者)②-3 検体前処理(検査センター)

●

●

●

●

溶血とctDNAの関係:溶血→cfDNA上昇→腫瘍由来のctDNA割合が減る●溶血するとゲノムDNAが混入してctDNA検出感度が低下するので、溶血を最小限に抑えるように採血する
Nishimura, F. et al. The Effect of In Vitro Hemolysis on Measurement of Cell-Free DNA.
ことが重要
J. Appl. Lab. Med. 4, 235–240 (2019).

● 輸送●採血直後に 8～10 回転倒混和し、内容物を攪拌する。
●各採血管はcfDNAを安定化させるだけでなく、有核血球および全血中に見られる循環上皮細胞（腫瘍細胞）に存在する細胞ゲノムDNAの保存等、多彩な機能がある。
●各採血管には、液体培地に抗凝固剤K3EDTAおよび細胞保存剤を含有され、6℃から37℃の温度範囲で最大14日間安定した状態が保たれるとされている。
●採血管の添付文書を確認し、使用すること。

●cfDNA専用採血管の場合、病院内で血漿分離しない。
●全血の状態に輸送まで採血管の添付文書で指定された温度にて一時保管。
●凍結で保管することは絶対に避けること。
●cfDNA専用採血管の場合、冷蔵保管すると凍結する恐れがあるので、室温での保管が望ましい。
●輸送前に臨床検査室の確認を経ることが望ましい。
●検体採取/提出元医療機関と検体処理および解析機関が異なる場合は、外部委託先の集配システムや運送業者に検体の搬送を委託する。
●検体の保存温度に準ずる環境下のもと、適切に移送を行う。
●cfDNA専用採血管の場合、冷蔵での輸送は避ける。
(参考) FoundationOne Liquidでは、採血と同じ日に発送することを推奨している。
●搬送する際の対象となる検体に関する情報に加え、複数検体を移送する場合は、検体数、検体種、保存温度等についても記録する。また、作業担当者、委託先担当者、搬送日時等、検体授受に関しても検体受領搬送作業日誌といった法定帳票等を用いて記録する。これらの取扱いについては、各施設にて作成した検体受領標準作業書や検体搬送標準作業書に従う。

●検体の保存温度が適正に維持されているかを確認する。
●検体数や検体量の過不足等を最低限目視レベルで確認する。
●依頼内容に対し、指定された材料か否か、保存温度の適正、検体破損の有無等、受領時の検体の状態について確認を行う。
●施設情報、患者名あるいは匿名化ID、年齢、性別、検体採取日、採取時刻、保管温度、保管状況など依頼情報について記録する。受領対象となる検体に関する情報に加え、複数検体を受領した場合は、検体数、検体種、保存温度等についても記録する。また、作業担当者、委託先担当者、搬送日時等、検体授受に関しても検体受付及び仕分作業日誌といった法定帳票等を用いて記録する。これらの取扱いについては、各施設にて作成した検体受付及び仕分標準作業書に従う。

●検査薬添付文書記載方法に従って血漿を分離する●溶血はゲノムDNAの混入によりバックグラウンド増加を引き起こすため、溶血の程度を溶血チャート(色見本)等を用いて確認する。
●血漿が溶血等により不適合な場合、再採血を考慮する●検査においては直ちにcfDNAを血漿から分離する。すぐにDNA抽出が難しい場合、血漿状態での保存可能の期限は検査薬添付文書または採血管添付文書に従う●速やかに血漿を分離する。血漿分離までの許容時間は各検査薬の添付文書に従う。
●溶血はゲノムDNAの混入によりバックグラウンド増加を引き起こすため溶血を最小限に抑える●検査薬添付文書記載方法に従って速やか血漿を分離する●溶血はゲノムDNAの混入によりバックグラウンド増加を引き起こすため、溶血の程度を溶血チャート(色見本)等を用いて確認する。
●血漿が溶血等により不適合な場合、再採血を考慮する●血漿分離後、輸送まで-80℃冷凍庫にて保管する●血漿の分離時に白血球の混入を最小限にすることが重要。白血球はシークエンスライブラリ調製を妨げる高分子DNAを含むため、血漿を新しいチューブに回収する際はバフィーコートを乱さないようにする。

●輸送前に臨床検査室の確認を経ることが望ましい。
●検体採取/提出元医療機関と検体処理および解析機関が異なる場合は、外部委託先の集配システムや運送業者に検体の搬送を委託する●冷凍に準ずる環境下のもと、適切に移送を行う。
●搬送する際の対象となる検体に関する情報に加え、複数検体を移送する場合は、検体数、検体種、保存温度等についても記録する。また、作業担当者、委託先担当者、搬送日時等、検体授受に関しても検体受領搬送作業日誌といった法定帳票等を用いて記録する。これらの取扱いについては、各施設にて作成した検体受領標準作業書や検体搬送標準作業書に従う。

検体仕分け●検体の保存温度が適正に維持されているかを確認する。
●検体数や検体量の過不足等を最低限目視レベルにて確認する。
●依頼内容に対し、指定された材料か否か、保存温度の適正、検体破損の有無等、受領時の検体の状態について確認を行う。
●施設情報、患者名あるいは匿名化ID、年齢、性別、検体採取日、採取時刻、保管温度、保管状況など依頼情報について記録する。受領対象となる検体に関する情報に加え、複数検体を受領した場合は、検体数、検体種、保存温度等についても記録する。また、作業担当者、委託先担当者、搬送日時等、検体授受に関しても検体受付及び仕分作業日誌といった法定帳票等を用いて記録する。これらの取扱いについては、各施設にて作成した検体受付及び仕分標準作業書に従う。

血漿分離
遠心条件
DNA抽出までの保管●すでに血漿状態であるため、DNA抽出まで-80℃冷凍庫にて一時保管する。
●保存可能の期限は検査薬添付文書または採血管添付文書に従う●(参考) FoundationOne Liquid CDxやGaurdant360 CDxは採血管2本分の採血を推奨

1(参考) コバスEGFRでは採血後8時間以内で血漿を分離すると記載されている。
(参考) OncoBEAM RAS CRCキットでは採血後4時間以内で血漿分離すると記載されている

表１．検査プロセス別にみた循環血中の腫瘍由来DNA（circulating tumor DNA; ctDNA）検査のための留意事項
測定技術

検査工程
大分類

小分類

作業項目

リアル Digit
NGS タイム al
PCR PCR

前処理

cfDNA抽出

●

●

●

方法

抽出試薬

分析前プロセス

核酸抽出

濃度

抽出量（収量）

抽出核酸の定量/品質確認

●

●

●

純度(タンパク質の混入)

全般(参考) OncoBEAM RAS kitでは抽出DNAの定量や品質管理の規定はなく、最終結果のQCによりインプットDNA量の品質を担保している●ライブラリ調製
品質確認方法

品質指標●

分析プロセスシークエンシング
シークエンシング●

シークエンシング後の●品質チェック

増幅

デジタルPCR

BEAMing法●使用するNGS解析法により測定手順や使用する測定試薬が異なるため、適切なライブラリ調製方法を選択する。
●ライプラリ調製に際しては、試薬添付文書の仕様等に準じて実施する。
●核酸を含まないサンプルによる汚染の確認や、陽性対照と陰性対照を検体と同時にライブラリ調製しシークエンスデータ解析まで行うなど、内部精度管理を実施することが望ましい。
●ライブラリ調製は作業工程が煩雑なため、サンプル調製や試薬の分注時は可能な範囲で自動化機器等を使用することが望ましい。
●ctDNA検査ではバリアント頻度が0.1%以下のこともあるので、「分子バーコード付加・ターゲット領域増幅」(参考)FoundationOne liquid CDxはキャプチャー法
以降のプロセスからのコンタミネーションが結果に影響を与えることがある。そのため、PCR前後のプロセスは別室(参考)AcherMETはアンプリコン法で行う、使い捨てグローブ、シューズカバー等のコンタミネーション防止措置を施すことが望ましい。またSwabテス
ト等で定期的に検査室のDNAコンタミネーションのモニターを考慮する。
●分子バーコード(UMI, Unique molecular identifier)の使用。ハイブリダイゼーション法かアンプリコン法かによるエラー率の相違がある。
●cfDNAの超低頻度バリアント検出の問題では、コンタミネーションもさることながら、シークエンシング装置とそのシークエンシング原理に依存したシークエンスエラー頻度が問題となる。通常の分子バーコードでこうしたエラー除去は可能であるが、どの程度の低頻度エラーまで除去できるかは実験条件と用いるエラー除去方法に依拠するため、血液からのcfDNA回収から超低頻度バリアント検出までの精度管理されたトータルシステムを利用することが重要である。
(参考) がん遺伝子パネル検査の品質・精度の確保に関する基本的考え方（第2.1版）
3-1. ライブラリ調製とシークエンス解析
DNAの断片化、アダプターライゲーションとバーコード付加（ライブラリ調製）、ターゲット濃縮などによる解析用ライブラリ調製およびシークエンスリードを生成するまでの方法を規定する。注意事項も付記する。
例:・コンタミネーションを防ぐために、アダプターライゲーションおよびバーコード（インデックス）付加までの作業とPCR増幅前後の作業は別の場所で行う。
・使用するシークエンス試薬の特性を理解し、結果として得られる偽陽性、偽陰性に対応する。
3-2. ライブラリの品質基準●ライブラリ濃度、ライブラリサイズ、電気泳動ヒストグラムにおけるサンプルピークの形状、ピークトップ/ピークテイ
ライブラリ調製後、適切な品質チェックを行い、シークエンス解析に進んで良いかどうかを判断する。予め指標をルのサイズを確認し、ライブラリ調製の成否を判定する。アンプリコン法によりライブラリ調製を行った場合は、複数設定する。指標として、DNA量、フラグメントサイズを用いる。のピークが検出される場合がある。最適なピーク形状や断片⾧はNGS解析方法や試薬、NGSの機種等により品質指標の例:異なるため、注意が必要である。また、ライブラリ濃度の定量は蛍光法による測定でも可能であるが、リアルタイ
DNA量フラグメントサイズ断片のピーク⾧ムPCRによる測定が推奨される。
ライブラリ調製後
500 ng以上
250-400 bp
濃縮後（解析用ライブラリ）2 nM以上
300-450 bp●マイクロチップ型キャピラリ電気泳動やリアルタイムPCR法、蛍光法を用いた濃度測定等により、品質確認を行う。
●検査薬添付文書に記載された方法、項目、規格値に従って、ライブラリ品質を確認する

標準物質

測定条件

●検査薬添付文書記載の測定条件に従う

品質確認方法※実際に品質確認できるのは、解析後であるため、分析後プロセスの『データレビュー』の項を参照(1) 測定手順の確認(2) 使用試薬の確認(3) 使用機器の確認
検出●抽出されたDNAの品質項目と規格値は検査薬添付文書に従う●分析段階では、理想的には既知の患者検体を用いるのが望ましいが、患者由来の検体は量が限られるため、現実的には難しい。LODを厳密に評価しておく必要がある。このため、バリアントのあるDNAをバリアントのな (参考)SeraCare社、Thermo Fisher Scientific社、Horizon Discovery社からcfDNAを模した市販いものに一定割合で添加し用いること等が想定される。対象遺伝子にバリアントのある細胞株から抽出した標準物質を購入可能である。別タブに標準物質情報を記載。
DNAを用いることも考慮される。

●リアルタイムPCR●検査薬の添付文書に従い適切な核酸抽出キットを用いてcfDNA抽出、精製を行う。
●カラム法（シリカメンブレン使用）、磁気ビーズ法等により、核酸抽出を実施する。アッセイの目的や用途、検(参考) がん遺伝子パネル検査の品質・精度の確保に関する基本的考え方（第2.1版）
体量に応じ適宜、用手法、自動核酸抽出装置等の利用を選択する。核酸抽出の際には、検体採取容器か
https://www.jpclt.org/common/upload_data/websta00000301/file/%E3%80%90%E7
ら検体を核酸抽出チューブに移し替える作業が発生するため、ID情報等の紐付けを確実に行う。
%A2%BA%E5%AE%9A%E7%89%88%E3%80%91%E5%9F%BA%E6%9C%AC%E7%
9A%84%E8%80%83%E3%81%88%E6%96%B9_ver2.1.pdf
2-4. 核酸の抽出
FFPE切片、血液からの核酸（DNA、RNA）の抽出・精製法（核酸抽出・精製試薬（キット名を表●市販されている核酸抽出キットを用いて、試薬添付文書の仕様に従いDNAを抽出する。
●体外診断薬（システム）等については、推奨されている核酸抽出キット等がある場合は、それを用いることと 記））、品質確認を行う方法を規定する。抽出した核酸（DNA、RNA）の品質基準を設定し、この基準をし、診療での使用に適していることが当該診断薬メーカー等で検証された市販核酸抽出キットの使用が望まし 満たすことを確認し、次工程であるライブラリ調製に進む。品質基準を満たさなかった場合、SOPに定めた方法で対応する。
い。
2-5. 抽出核酸の品質基準抽出した核酸の量および品質について基準を定める。ゲノム診療用病理組織検体取扱い規程に記載の指標●Qubit等の一本鎖、二本鎖核酸を識別できる蛍光法、あるいはNanoDrop等によるA260やA280の比色 を参考にする。なお、抽出核酸の定量は、蛍光測定法（Qubit、Picogreen法など）で行い、核酸の品質により核酸濃度を測定する。 DNAについては蛍光法（Qubitなど）によるdsDNA濃度の測定を行い、分光 （主に断片化の程度を評価）は、ΔCt値（ΔΔCq）、DIN値、Q-value、DV200で評価する。
品質基準の例:腫瘍組織
光度計で測定したDNA濃度と比較することで dsDNA比率の評価を行う。
量
品質DNA
200 ng以上 ΔΔCq 2以下
RNA
500 ng以上DV200値 30%以上●蛍光法による測定値やNanoDrop等によるA260やA280の測定値から、核酸抽出量（収量）を算出
2-6. その他の注意事項
し、十分な核酸量が確保できているか（量不足等はないか）を確認する。
抽出した核酸を直ぐに分析に供しない場合、DNAは冷蔵または冷凍、RNAは-80℃以下で保存する。
増幅前の核酸はコンタミネーションを避けるため、遺伝子増幅産物とは別の場所に保管する。
●分光光度計等によりA260/A280比を測定し、核酸の純度について評価する。 純度の目安としては、
抽出核酸の収量が限られているので、品質管理のために使い切ってしまうことのないよう、実際に採取可能なA260/A280比が1.8～2.0（DNAは1.8、RNAでは2.0）の範囲であり、低値を示す場合はタンパク質等の 総量とそれぞれのステップで使用可能な量についても考慮すること。
混入が考えられ注意を要する。他の混入物の確認のためA260/A230 比やA220～A320 間のスキャンにより確認することで、核酸抽出工程の成否を判定するのが望ましい。

(参考) Gaurdant360 CDx と FoundationOne liquid CDx、共に TapeStationで抽出後のDNA品質チェックを実施しており、DNAサイズからゲノムDNAの混入割合を推定している。

＜アンプリコン法＞
1)分子バーコード付加とターゲット領域増幅2)DNA精製
3)インデックスバーコード付加とライブラリ増幅4)DNA精製5)定量・サイズ確認

ライブラリの品質確
認●沈殿物および残渣を除去するために血漿サンプルを1,800 x gで5 min遠心。チューブの底にある細胞片は吸わないようにする。この細胞片由来の高分子DNAが最終的な溶出液に混入すると、その後のアッセイパフォーマンスに影響が及ぶ可能性がある。

分解度/核酸品質確認●Ct値/⊿Ct値、DIN、Q-Valueといった品質指標をもとに抽出核酸の品質を確認する。
/DNAサイズ(ゲノムDNA●DNAサイズを検証することで、cfDNA量と混入したゲノムDNA量を推定できる。の混入の有無)＜キャプチャー法＞
1)末端修復とdA付加2)アダプター付加・精製
3)ライブラリ増幅・精製
4)ハイブリダイゼーション・DNA回収5)ライブラリ増幅・精製
6)定量・サイズ確認
ターゲット領域濃縮コメント
参考資料等

留意事項

作業内容

●

(1) 測定手順の確認● (2) 使用試薬の確認(3) 使用機器の確認

低頻度のバリアントを検出するために、十分なリードデプスを確保する必要がある。

●適切なPCR条件の設定、プライマーダイマー形成を避けたプライマーの設定、検出系の増幅感度の確認。
●検体由来成分によるPCR阻害反応が確認できるように内部コントロール物質の設定。測定系のコンタミネー
品質指標についてションの確認のための陰性コントロール検体の同時測定。
＜ＰＣＲ＞
1．特異性の評価
目的の遺伝子のみを特異的に増幅できているかを確認●使用する試薬、機器類、試験操作は検査薬添付文書に従う。
2．内部精度管理●血漿検体から回収できるDNAは微量であることや流路への吸着やピペット操作でのターゲットのロス、より早 ➀精度管理物質による精度管理・・・アッセイの評価
期診断に応用する場合など必要に応じてプレ増幅を行う。
・陰性コントロール（コンタミネーションの有無を確認）●使用試薬のロット間差、試薬メーカー差等、相違点がある。
・陽性コントロール（PCR反応の確認）●PCR産物からのコンタミネーションを防止する目的で、Pre-PCR部屋とPost-PCR部屋に分けることを推奨す ②内部標準遺伝子による精度管理・・・サンプルの質の評価る。
●希釈以降の工程はPost-PCR部屋で実施する。汚染を防止するために、工程ごとに場所（ベンチやキャビ ＜定量ＰＣＲ＞ネットなど）を分けることを推奨する。
1. スタンダードの評価➀ 増幅曲線の評価
確認事項●使用する試薬、機器類、試験操作は検査薬添付文書に従う。
・指数関数的増幅領域・増幅曲線の間隔・Ct値・バラツキ●検査開始前にメーカーから十分なトレーニングを受け、充分な理解のもとに実施する。
② 検量線の評価●OncoBEAMは高感度バリアント遺伝子検出であるため、検体のクロスコンタミネーション、陽性コントロールに・スロープの確認よる汚染には細心の注意を払う。
2．内部精度管理● PCR陽性ドロップレットと陰性ドロップレットの両方につき、ある程度の個数が検出されるよう対象核酸配列の➀ 精度管理物質による精度管理・・・アッセイの評価
濃度を適正に希釈する。また、発現量解析時にハウスキーピング遺伝子を内在性コントロールとして定量し、試・陰性コントロール（コンタミネーションの有無を確認）
料間で適正に補正する。
・陽性コントロール（PCR反応の確認）●PCR産物からのコンタミネーションを防止する目的で、Pre-PCR部屋とPost-PCR部屋に分けることを推奨す② 内部標準遺伝子による精度管理・・・サンプルの質の評価る。
●希釈以降の工程はPost-PCR部屋で実施する。汚染を防止するために、工程ごとに場所を（ベンチやキャビネットなど）分けることを推奨する。

2

表１．検査プロセス別にみた循環血中の腫瘍由来DNA（circulating tumor DNA; ctDNA）検査のための留意事項
測定技術

検査工程
大分類

小分類

作業項目

リアル Digit
NGS タイム al
PCR PCR

作業内容

コメント
参考資料等

留意事項

●FoundationOne liquid CDxは米国のラボにて実施されるため詳細不明。
●ArcherMETは、クラウド上の自動解析であるため詳細不明。

解析/分析

バリアント解析
CGP

全般●

バリアント解析●全般

シークエンシング後の●品質チェック

データレビュー

分析後プロセス

レポート作成

結果報告

検査結果報告書の病院内検査室承認●血漿からのcfDNA精製からバリアント検出解析までの全工程が、低頻度バリアント検出感度に影響するため、検査システムとして精度管理を実施することが重要である。
●CHIPに関してFoundationOne liquid CDx 添付文書に以下の注意事項あり●germlineバリアントやCHIPバリアントの可能性を考慮する。
(9) 本品の解析結果には、血中循環腫瘍DNA（ctDNA）、生殖細胞由来の変異のほか、クローン性造血●参照ゲノムのバージョンを明示する。他のシステムの結果と比較する際にバージョンが異なるとポジション置換が（CHIP）に伴う変異のような非腫瘍性の体細胞変異が含まれる。CHIP に伴う変異を有する可能性のある発生する危険性があるため。
遺伝子として、ASXL1, ATM, CBL, CHEK2, DNMT3A, JAK2, KMT2D (MLL2), MPL, MYD88,
SF3B1, TET2, TP53, U2AF1 があるが、これに限るものではない。これらの非腫瘍性の体細胞変異を検出することの有用性は確認されていない。

(参考) Cluster density, Percentage of clusters passing filter, Quality socre 等が主なシークエ
ンス品質チェック項目となっている(参考) がん遺伝子パネル検査の品質・精度の確保に関する基本的考え方（第2.1版）
NGS解析から得られるデジタルデータであるFASTQファイル情報を解析することは dry-lab processではあるが、wet-lab processが適正に行われたかの品質・精度を確保するための根拠でもある。従って、以下の項目を参考に予め基準値を設定し、wet-lab processがその基準を満たしているかどうかを確認する。
なお、NGSは迅速に効率よく広範囲のDNA配列を読むのに便利であるが、その正確性は、リード⾧、ヒトゲノム●シークエンス品質確認検査項目、規格値は検査薬添付文書記載内容に従う。
参照配列へのシークエンスリードのマッピング率などによって影響され、特に単調で同一の塩基の繰り返しやGC含量の多い配列では読み落としや読み間違いが起きやすいことを認識しておくべきである。研究レベルでは許容●ctDNA検査の場合、組織検査よりも多くの読み取り深度が必要となる。
されるレベルであっても、患者の診断・治療に直結するクリニカルシークエンスでは、十二分にその正確性と再現●ctDNA検査の場合、ライブラリ調製時の検体DNA投入量に依存して感度が異なる。
性を担保し、以下の品質指標に関して妥当性を確認しておくべきである。また、これらの品質指標は内部精度●ctDNA検査ではバリアント頻度が0.1%以下のこともあるので、シークエンス間のキャリーオーバーに注意する。
管理にも利用することができる。それぞれの説明は『基本的考え方（第2.1版）別添資料（４）』を参照されたい。
⁃Depth of coverage（カバレッジ（標的領域）のデプス（読み取り深度）●論文では、全シークエンス既知の複数ヒトリファレンスゲノムDNAを品質管理のために必要な混合比で調製し⁃Uniformity of coverage （カバレッジ（標的領域）の均一性・網羅性）て、それで得られた定量的なバリアント頻度のデータを用いて解析系の品質基準とされている（参考文献⁃GC bias （GCバイアス）
９）。
⁃Transition/transversion ratio (Ti/Tv比)⁃Base call quality scores （ベースコール品質スコア）⁃Mapping quality （マッピングの品質）⁃Duplicate read success rate and removal of duplicate reads （重複リードの割合と除去）⁃First base read success （リードの１塩基目の成功率）⁃Decline in signal intensity（シグナルインテンシティの減衰）⁃Strand bias（DNA鎖間のバイアス）

●

●

●

●FFPE標本と異なり、腫瘍細胞割合を基にしたVAFの評価ができない。
●DNAフラグメント⾧が短いため、Gene rearrangementの検出感度は劣る。
●腫瘍量に対して血中に存在するctDNAの比率は非常に少なく、平均して 10 mL の血液あたり数十分子程度しか ctDNAが存在しない。
●組織を用いたがん遺伝子パネル検査では小杉班の２次所見（遺伝性腫瘍など）をエキスパートパネルで指摘している。ctDNA解析では２次所見をエキスパートパネルで議論（患者さんに返却）するのか議論が必要。

(参考) がん遺伝子パネル検査の品質・精度の確保に関する基本的考え方（第2.1版）
4-3. 検査の結果報告
NGS解析が適正に行われ、バイオインフォマティクス解析に適合するVCFファイルが作成されている場合、引き続いて行われるエキスパートパネルでの決定の際に判断しやすく、かつ十分な情報を含む結果報告書を作成することが望ましい。以下に報告書の内容を例示する。
①患者の匿名化番号、性・年齢、臨床情報、依頼医師名②検体種別（血液）③検体採取の時期（初発時か再発時か）④病理診断名⑤病理検体番号⑥DNAの量と質⑦受付日、報告日⑧検査名⑨NGS解析のQC（カバレッジのデプス・均一性、ベースコール品質スコア、マッピングの品質、重複率など）⑩遺伝子変異の種類、臨床的意義注２）（病的変異、VUS） データベースの種類およびそのバージョン⑪生殖細胞系列遺伝子変異（二次的所見（SF）の有無）⑫遺伝子変異の詳細情報（分子機能、疾患との関連、薬剤感受性、参考資料）

レポートの確認●

エキスパート エキスパートパネ エキスパートパネル
パネルル会議への参画

標準的なNGSデータ解析のプロセスを以下に示す。
1)ベースコール2)デマルチプレキシング
3)アダプタートリミング4)参照ゲノム配列へのマッピング、アライメント
5)PCR重複の除去（分子バーコードのグループ化など）
6)バリアント検出(バリアント探索、検査対象バリアント判定、生殖細胞由来のバリアントを除去 ）7)生殖細胞由来のバリアントを除去
8)アノテーション
9)目視確認(BAM)● レポートの確認

CGP●検査センターのレポートの確認と責任医師の承認●QCレポート など 追加●検出されたバリアントの臨床的意義の確認は、既存のがんプロファイリング検査と同様に実施。dbSNP,ClinVar, COSMIC, CIViCなどで臨床的意義の評価を行う。
●自動判定のため、報告時のダブルチェック等が必要●責任医師の承認

エキスバートパネルに検体検査関連スタッフが参画し、検査結果報告内容を報告する。

3●検査室の検査医の役割としては品質レポートの確認がある●組織あるいはcfDNAを用いたがん遺伝子パネル検査は、通常の臨床検査や病理検査と異なり、再検査が不可能な検査である。そのため、第三者機関による検査性能の確認が重要と思われる。（例）CLIA/ISO15189●組織を用いたがん遺伝子パネル検査では小杉班の２次所見（遺伝性腫瘍など）をエキスパートパネルで指摘している。ctDNA解析における２次所見は、アレル頻度が体細胞バリアントと一般的に大きく異なるため、判別はつきやすい。組織と同様に、エキスパートパネル会議で議論すべきであろう。