9/9/2020

ブドウウイルスワークショップ：
ブドウウイルスの概要と日本における調査について
バージニア工科大学
荷田瑞穂（にた みずほ）

Ph.D.

（准教授）

信州大学特任准教授

質問の仕方
1. チャットボックスを使う：チャットを全員、もしくはNitaに向けて使ってください。
2. マイクを使う：マイクのミュートを解除し、話してください。
回線を維持するために、全員のカメラを切り、マイクはミュートしてあります。

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バージニア州は東海岸の中程に位置している

ニューヨーク太平洋

ワシントンDC
バージニア州

カリフォルニア

3

バージニア州におけるワイン産業


植民地時代の1619年におけるブドウ園を植える法律が記録に残っている。



1800年代初頭には第三代大統領のジェファーソンが現在のシャーロッツビル近辺にブドウ園を始めるも、病気（黒腐病）とフィロキセラの影響で⾧くは続かなかった。
 その後は40ヘクタールを超える大きなブドウ園ができるなど、ワイン産業は存在したものの、生産地としての規模は大きくならなかった。



1970年代中ごろから、現在の産業の元になるいくつかのワイナリーが設立される。

https://www.loc.gov/resource/ppmsca.31158/

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300件以上のワイナリー、350件以上のブドウ農家
約4000エーカー（1400Ha、平均的なサイズは2Ha）
年間収穫量：8000トン：全米６−７位：主にワシントンDC近郊、そして州の中心部にあるシャーロッツビル近辺にワイナリーが集中している。

車で約1時間
車で約2時間ウインチェスター

年間平均気温＝12.3C

年間降水量＝958mm

松本

年間平均気温＝11.8C

weatherspark.com

年間降水量＝1,031mm

3

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バージニア州における主な品種
ボルドー系が主に育てられています。

赤





カベルネ・フランカベルネ・ソーヴィニヨン
プチ・ベルドー
メルロー
白





シャルドネ
ソーヴィニヨン・ブラン
ヴィヨニエ（州のワイン）
プティ・マンサン
各種ハイブリッド

シャンブルサン（赤）ヴィダール（白）シャルドネル（白）ブドウに感染するウイルスは70種以上知られているが、大きな被害を出すものは限られている。
 リーフロール病
 レッドブロッチ病
 ルゴースウッドコンプレックス
 フレック トマト輪転ウイルス
 Grapevine vein clearing virus ベインクリアリング
 ピノグリウイルス84

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リーフロール病

感染リスク:高い感染後の影響:高い 日本を含めた各国のぶどうの産地で発見されている
 数種のウイルスが同じような症状を引き出す (Grapevine Leafroll Associated Viruses, GLRaVs) GLRaV-1, GLRaV-2, GLRaV-3
 頻繁に見受けられる
 GLRaV-1, -3は同じ媒介虫によって広がる 大きな被害を出すことで知られる。

 GLRaV-4 (複数の似通った種が認められている), GLRaV-7

Fuchs, M.F. (2007). Grape leafroll disease:
Grapevine leafroll-associtaed viruses.

 比較的少ない頻度で発見されているリーフロール病 （味無果病）• 葉が丸まる• 全般的な育成の遅れ• 樹勢が弱くなる•

房につく粒の数が減り、糖度が上がらなくなる。

•赤の場合は色つきが悪くなる•

30−50%の収穫の被害も5

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リーフロール病の糖度、色付きへの影響
ピノノワールSlides courtesy of Dr. Mark Fuchs, Cornell University
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リーフロール病、日本での状況• 日本ではすべてのGLRaVが確認されている。GLRaV-3の発生が多い。
• 日本ではクワコナカイガラムシによる伝播が確認されている

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http://www.naro.affrc.go.jp/

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レッドブロッチ病

感染リスク:不明
感染後の影響:高い 日本での発症例は報告されていない模様
 他のぶどうウイルスはRNAだが、レッドブロッチは DNA ウイルスであるため、近年まで発見されていなかった。
 媒介虫はアルファルファ（ムラサキウマゴヤシ）につくヨコバイの一種と考えられている。
 カリフォルニアなどの地域では媒介虫による伝播が認められているが、ほかの地域では広がりが抑えられているので、ほかの媒介虫との関連も考えられている。
 苗についてきていることが多い

BugGuide.net

レッドブロッチ病
Grapevine Red Blotchassociated virus
A.K.A. Red leaf or Cab franc-associated virus

 症状はリーフロールにとても似通っている 品種に寄る違い大きなは見受けられない 糖度が4−5度下がる
 果粒の生育が遅れ気味になる
Dr. Mark Fuchs (Cornell University)7

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Grapevine vein clearing virus（ベインクリアリングウイルス）


葉脈が白くなる

葉、新梢の発達が妨げられる

樹勢が弱まり、収穫量に影響が出る

レッドブロッチと同じく、DNAウイルス

米国中西部では大きな被害を出している
 Cab. Sauvignon, Chardonnay, Chardonel, Cab. franc, Riesling, Vidal blanc,
Corot noir
 Norton、Chambourcinには症状が出ない。Vignoles、Traminetteにも出にくい。
 ハダニによって媒介されるのではといわれていたが、現在では接ぎ木による伝播が主な

Grapevine Pinot gris virus（ピノグリウイルス）

感染リスク:不明
感染後の影響:高いNcpngrapes.org
ハイブリッド品種にも症状が出る

感染リスク:不明
感染後の影響:高い 主にヨーロッパで確認されている。イタリアのピノグリで発見されたのが初めのケース。
 ピノノアール、Traminerでも罹患が認められている
 近年アメリカでも数件の発症例が報告された。
 収穫量が47％の下がったというデータも上がっている。
房の数、房の重さに影響を与える。
 他のウイルスと同様、無症状の木も多数存在している。

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Grapevine fleck virus（フレック:味無果病）

感染リスク:高い感染後の影響:リーフロール病に因る

 症状(in V. rupestris)
 アメリカぶどうの一種では
 葉脈が白く見える
 葉の形が悪くなる V. viniferaへの単独感染では症状が出ないことが多い

https://www.wineaustralia.com/

 GfkV とGLRaV-3 の混合接種により味無果病となる(Kovacs et al.,2001)

感染リスク:高い感染後の影響:低い
Rugose Wood Disease Complex（ルゴースウッドコンプレックス）

 接ぎ木の不整合と関わりが深い コーキーバークも病害の一つ
 代表的なウイルス：Rupestris stem-pitting-associatedvirus-1, Grapevine Virus A, Grapevine Virus B
 Also, GVE and GVF (稀に見つかる) 日本では巨峰やピオーネで症状が出るケースが報告されている

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Rugose Wood Diseases
症状が出るのがとても遅く、重要な病気とは捉えられていない。
 このウイルスは大きな被害を出さないので、米国のウイルス検査に近年まで含まれていなかった。

リーフロール病の一部と同じくコナカイガラムシに寄る伝播が確認されている。



リールロール病と共に媒介が行われたときに伝播が起きやすい傾向にある(Blaisdell et al. 2020)バージニア州の調査でもGVAがGLRaV-3とともに発見されるケースが多かった(Jones and Nita 2019) 混合感染のケースでは大きな影響は見られなかった。

感染リスク:高い？
感染後の影響:高いえそ果病
Grapevine berry inner necrosis virus (GINV) 日本固有のウイルス
 ベインクリアリングウ
イルスと同じように新梢の委縮、新葉のモザイク病斑が典型的な病症
 ブドウハモグリダニが媒介虫であるといわれている。

http://news7a1.atm.iwate-u.ac.jp/~plvirus/kenkyunaiyou.htm
岩手大学農学部農業生命科学科植物病理研究室

2010

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Tomato Ringspot Virus

感染リスク:低い
感染後の影響:低い（トマト輪転ウイルス）一部の品種（Vidal blanc)では果粒に大きなばらつきが出たりするが、その他の症状についてはデータが少ない。
 一般的に自根のVidalは15年程度を境に急に生産力が落ちるので、トマト輪転ウイルスが原因ではないかと考えられている。
 ルゴースと同じくグラフトの接合面に悪影響を与えるともいわれている。



土中に住む線虫によって媒介され、ブドウだけではなくたんぽぽなど多くの宿主を持っている。

Dr. Mark Fuchs (Cornell University)

 現在多く使われて入る101-14, 3309等は線虫に対してある程度の抵抗性を持っているので、比較的安全かと思われる。
eExtension.org

リーフロール病の影響

光合成、葉呼吸の影響 クロロフィルの減退

エネルギー

 二酸化炭素をうまく取り入れられなくなる (Montero et al. 2017)
 糖分を作りにくくなる


植物の防衛機能を常時使っているような形になり、エネルギー消費量が多くなる



品種によっても違いが大きい

罹患してからの年月が⾧いほうがより大きな影響を表す傾向にある（Montero et al.
2016）

酸素二酸化炭素

糖分

水分2211

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混合感染の影響の例（単年のデータ）
 GLRaV-3単体感染
 Brix（糖度）, pH（酸度）, anthocyanin（アントシアニン色素）の減少
 GRBaV（レッドブロッチ）単体感染
 糖度、酸度、アントシアニンの減少、TA（舌で感じる酸度）の増加
 GRBaV とGLRaV-3の複合感染（シラー）
 単体感染よりも大幅な糖度とアントシアニンの減少, YAN（イーストが利用する窒素）も減少
 GRSPaV（ルゴースウッドの一部） はGLRaV-3,GRBaVと複合感染を起こしていても大きな影響を与えない。

ウイルス検査：なぜ知ることが大切なのか？
 現状把握のため
 例:樹勢が弱くなったり、糖度が上がりが悪かったり、葉の色に変化ができるのはウイルスを含め、栄養素、ほかの病気等、様々な要因で起こりうる。
 媒介虫が圃場で確認された際、それへの対策をするのかどうかの判断材料になる。
 圃場の将来の指針にするため
 ウイルスの病症は環境や他の要因からその程度が変化するため、ウイルスに罹患したからと言って、その木が生産できなくなるというわけではないが、木が年を取るにつれ、病症の程度が大きくなるともいわれている。
 何時ウイルスに罹患した木を植え替えるかの判断材料になる。
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ウイルスの診断を症状に頼るのはとても危険。
= DNAを使った同定法が必須

なぜ遺伝子を用いた同定法が必要なのか：病症とGLRaV-3による感染の関係

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サンプルから遺伝子を抽出、RT-PCR/PCR同定法
でウイルスの遺伝子を視覚化する

葉柄を砕く
DNAを抽出*Positive and negative controls used in all tests

PCR検査

PCRによる遺伝子の同定（簡単な説明）• そのウイルス固有の分子配列を用い、DNA もしくはRNA （ウイルスによって異なる）の一部を増殖させる• そのウイルス固有のターゲットを用いるので正確• 増殖させた遺伝子をその性質（マイナス荷電）を利用して視覚化する• 電極上にあるゲル状の培地の上にのせてしばらく電流を流し、指標となるラダー（左端）と比べることにより理論上の遺伝子の⾧さと実際のものを比べることができる

このラインに並ぶものはリーフロール３
このラインに並ぶものはリーフロール２
ラダー（指針）14

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ELISA（イライザ）法は？
 ELISA法は主にたんぱく質をターゲット抗原としてターゲットにして、特殊抗体で捕捉、酵素反応を利用して視覚化する方法です。
 特殊な機械が必要ないこともあり、便利ですが正確性を比べるとPCR法に敵いません。
 例：我々のサンプルではELISAを使った際にPCRと比べて30％ほどの取りこぼしがありました。
 ELISAのみで同定可能でPCRではできないというケースはありませんでした。（逆はある）
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バージニア州でのウイルス調査（2009−2013）では州内で数種のウイルスの広い伝播が確認された


2009年にはウイルスの状況は不明。

5年間をかけ100以上ののワイナリーをめぐり、 700以上のサンプルを採取：25%のサンプルが、grapevine leafroll virus（リーフロール）22％が Red blotch virus（レッドブロッチ）に感染していることを確認 ルゴースウッドコンプレックスは58％

野生種のぶどうには感染は認められず
 ウイルスは外から持ち込まれた

90％以上の農家が何らかの形でウイルスに感染している葡萄の木を栽培

Jones, Rayapati, and Nita (2012)
Jones and Nita (2019)15

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ブドウウイルス病まとめ
 ウイルス病は収穫(量、品質)、樹勢に大きな影響を与えることがある。
 圃場での剪定鋏を介しての媒介はない。
 症状が常に出るとは限らず、判断の基準にはならない。
 媒介虫の数を減らすことはできるが、効率はとても悪い。
 一度感染してしまうと、ウイルスを取り除くことはできない。
 ウイルス検査済みの苗を植えることが一番の近道。
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日本におけるウイルス感染の現状を調べるための調査を始めています。
 北海道、山形、⾧野を中心にgrapevine leafroll virus（リーフロール（二種類））、 Red blotch virus（レッドブロッチ）の調査を進める予定です。
 2019−2021年の研究費用が科研費から出ています。

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9/9/20202018年度の結果
⾧野県を中心に、41サンプルを採取。
 リーフロール2 (GLRaV-2)：９％
 リーフロール3 (GLRaV-3)：１５％
 レッドブロッチ (GRBaV)：０％
 参加者には近日中に結果をお知らせします。（メールを送ってくださると助かります！）
2019年に集めた山形県を中心としたサンプルは今年の秋に新しい解析方法で検査します。
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ウイルス検知までの工程
プロトコル作成済み

サンプル
キット作成

キット配布

キットを受け取る

DNA/RNA抽出(市販のキットを使用)

定量PCRを用いたウイ
ルス検定

結果を報告

定量PCRではゲルの代わりにターゲットのDNAに付着する特殊な染料を使い、センサーによってそれを検知しますので、ゲルを流す時間と、それに伴うコンタミネーションのリスクを低減することができます。
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ブドウウイルスサンプルキットの中身
ペーパーナプキン：２枚

竹ひご：２本
剃刀の刃：２枚
ジップロックバッグ：２枚

バッファー液：２本

プラスティックのコップ(３０ml）：２個

サンプル採取用紙：１枚

手袋：１ペア

返信用封筒：１枚

ウイルスプロジェクト：抽出キットの制作• 特殊な紙（膜）とバッファー剤を農家に送り、葉柄や葉から樹液を紙に移してもらう• ２−３ヶ月は常温保存可能• その後RT-PCR, qRT-PCR, もしくはELISAで、診断。

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日本語での使用方法ビデオ
 https://www.youtube.com/watch?v=Yyes0YPY-Fs
 今回のサンプル採取に参加してくださる方は、是非ご連絡ください。
 前回参加してくださった方で、他の品種を調べたい方も是非どうぞ。

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将来的なその他の検知方法(その1) 現在ポータブルな定量PCRを試験導入しています。一度に検査をできるサンプル数は少ないですが、DNA抽出が可能であれば、数時間で検査結果を知ることができます。
 ブドウのサンプルではDNA抽出にいくつか持ち運びしにくい機材を使うので、改善方法を模索しています。

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将来的なその他の検知方法(その2)

今回のようにPCRを用いず、手のひらサイズのシークエンサーを使用することによって、直接DNAもしくはRNA情報を解析することも可能になってきました。
 DNA抽出も現場でできるシステムがいくつか登場しています。

現在共同研究者とともにブドウでこのシステムが使えるのかを模索しています。

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将来的なその他の検知方法(その3) リーフロール病はHyperspectral Imagingを用いることにより、罹患したカベルネソーヴィニヨンを特殊なカメラで検知できるというデータが出ています。(McDonald et al. 2016)
 紫外-可視-近赤外線域で波⾧毎のバンド情報を分光イメージング出来る技術です。通常のブロードバンドでは得られない波⾧バンド毎情報を測定・解析することができます。

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JVA関連：ブドウ用防カビ剤検索サイト
oこのサイトの目的はワイン用ブドウ栽培に使う抗カビ剤（殺菌剤）の情報を効率よく検索し、農薬の使い方、使用時期、対象病気などの情報をお届けするというものです。
oサイト情報は年に２回（2020年9月現在で4月と10月を予定）製造元の情報をもとに更新する予定です。
oこのサイトはJVAの会員のためのサイトです。
o今年中にお届けできるように準備をしています。

初期画面

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商品名をクリックすると詳細な情報が表示されます

漏斗のアイコンをクリックするとFRACグ
ループ、もしくは対象病気名で製品を選別するメニューが出ます。

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晩腐病で選択し、リスト表示を行った例

スマホ画面の場合

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Acknowledgement

2019-20 荷田ラボメンバー

Morgan Gannon
Abdullah Nahiyan

Amanda Bly and Diana Scorpio

Mikako Gomyo(Japan Ministry of Taxation)

Akiko Nita
Dr. Diana McHenry
Redbubble.com

Akiko Mangan

Robert Burgholzer

Dr. Jungkwan Lee(Dong-A Univ., Korea)

質問等がございましたら、
nita24@vt.eduまで。
www.grapepathology.org/Japan24