2021年度（第46回）学術研究振興資金

学

校名

安田女子

学術研究報告大学

研究所名等

研 究 課 題歯周病菌による脳・腸バリア破綻に基づくＡＤ型認知症
増悪機序
研究分野
－ジンジパイン−ＰＡＲ２シグナリングによる脳・腸バリア機能変容－

キーワード①歯周病 ②アルツハイマー型認知症 ③ジンジパイン ④プロテアーゼ活性化受容体２⑤脳・腸管バリア機能

医学○研究代表者
氏

名

所

中西 博

属
薬学部

職

名

教 授

役

割分

担

実験計画の立案・総括、免疫組織化学的解析、データ解析、論文作成○研究分担者
氏

名

所属

職

名

役

割分

担

野中 さおり薬学部

講 師

ジンジバリス菌ならびにマウス維持・管理、マウス認知機能の解析、腸内細菌叢のメタゲノム解析

北澤 健生

薬学部

准教授

脳・腸バリア機能に関する培養細胞ならびにマウス個体レベルでの解析

羽鳥 勇太

薬学部

講 師

脳血管内皮細胞ならびに腸管上皮細胞におけるジンジパイン-PAR2シグナルの解析、酸化ストレスの時空間的解析

歯周病菌による脳・腸バリア破綻に基づくＡＤ型認知症増悪機序－ジンジパイン−ＰＡＲ２シグナリングによる脳・腸バリア機能変容－
1．研究の目的(1) 歯周病がアルツハイマー型認知症を増悪する２つの経路が想定される。一つは全身循環経路で、歯肉血管より全身循環系に入った主要な歯周病菌のジンジバリス菌が脳内に侵入し、ミクログリア活性化により脳炎症を惹起し、認知機能を低下させる経路である（図１：全身循環ルート）。二つ目は唾液経路で、唾液と伴に飲み込まれたジンジバリス菌が腸内細菌叢の撹乱を起こし、変容した腸内細菌代謝産物が認知機能を低下させる経路である（図２：唾液ルート）。ジンジバリス菌が産生分泌する歯周破壊酵素であるジンジパインは、プロテアーゼ活性化受容体 2（PAR2）の活性化による密着結合タンパク質（ZO-1、オクルディンなど）の局在変化、あるいは密着結合タンパク質の直接的分解を行うことが考えられる。本研究では、ジンジパインが脳・腸バリア機能を変容させ認知機能低下を引き起こす可能性を解析し、歯周病がアルツハイマー型認知症の増悪因子となるメカニズムを明らかにする。一方、ジンジバリス菌は恒常的にジンジパインやリポ多糖類などほぼ全ての病原因子を含む外膜小胞（OMVs）を恒常的に分泌している。そこでジンジバリス菌に加え、OMVs の役割についても解析する。

2．研究の計画(1) ジンジバリス菌感染あるいはOMVs添加による脳・腸バリアの「細胞」レベルでのin vitro解析① ヒト脳血管内皮由来細胞（hCMEC/D3細胞）を用いた脳バリア機能変容ならびにそのメカニズムに関する解析② ヒト結腸腺がん由来細胞（Caco-2細胞）を用いた腸バリア機能変容ならびにそのメカニズムに関する解析(2) ジンジバリス菌感染あるいはOMVs添加よる脳・腸バリア機能ならびに認知機能変化のマウス「個体レベル」でのin vivo解析① 脳・腸バリア機能の解析② ステップスルー受動回避試験ならびに新奇物体探索行動試験を用いた認知機能の解析

3．研究の成果(1) ジンジパインの脳バリア機能変容メカニズムの解明① ジンジバリス菌感染あるいはジンジバリス菌培養上清の適応によりhCMEC/D3細胞の透過性が有意に増大した。この透過性増大はアルギニンジンジパイン（Rgp）阻害剤KYT1とリジンジンジパイン（Kgp）阻害剤KYT36の併用によりほぼ完全に抑制され、RgpならびにKgpの作用によりhCMEC/D3細胞の単層バリアの透過性が増大することが明らかとなった。

② ジンジバリス菌感染により、hCMEC/D3 細胞の密着結合タンパル質であるオクルディンならびに ZO-1 は有意に減少したが、VE-カドヘリンには変化は認められなかった。Kgp 欠損株の感染では、ZO-1 は有意に減少したがオクルディンには有意な変化は認められなかった。一方、Kgp/Rgp 欠損株の感染では、オクルディンならびに ZO-1 の有意な変化は認められなかった（図２）。ジンジバリス菌野生株、Kgp 欠損株
ならびに Kgp/Rgp 欠損株の培養上清を用いた実験でも、ほぼ同様の結果が得られた。
③ Kgp ならびに Rgp は hCMEC/D3 細胞の PAR2 を活性化
し、下流シグナル分子の ERK1/2 を活性化したが、PAR2 活性化ならびにその下流シグナルは Kgp と Rgp によるオクルディンならびに ZO-1 の分解に関与しないことが明らかとなった。
④ Kgp ならびに Rgp が直接的にオクルディンならびに ZO-1 を分解する可能性について検討した結果、Kgp は単独でオクルディンの直接的な分解に関与し、Kgp と Rgp の協調作用がZO-1 の直接的な分解に関与することが明らかとなった。
⑤ 抗ジンジパイン抗体を用いた免疫染色により、ジンジバリス菌感染あるいは OMVs の添加により Kgp ならびに Rgp は hCMEC/D3 の細胞質に局在することが分かった。
(2) ジンジパインの腸管バリア機能変容メカニズムの解明① ジンジバリス菌感染ではCaco-2細胞の透過性に変化は認められなかったが、OMVsのapical側への添加により透過性は有意に増大した（図３）。
また、Kgp/Rgp欠損株から調整したOMVsのapical側への添加では透過性増大は認められなかった。
② OMVs添加によりCaco-2細胞の密着結合タンパル質であるオクルディンならびにZO-1のタンパク質量の有意な変化は認められなかった。
以上の結果より、「ジンジバリス菌から分泌されたKgpならびにRgpを含むOMVsがヒト脳血管内皮細胞のhCMEC/D3細胞に取り込まれ、KgpならびにRgpが細胞内からオクルディンならびにZO-1を分解し、脳バリア透過性を増大する」という新知見が得られた。さらに、OMVsはヒト腸管上皮細胞のCaco-2細胞に取り込まれKgpならびにRgp依存的に透過性を有意に増大させた。しかし、オクルディンならびにZO-1の分解は認められなかった。このことから、「腸管上皮細胞において、KgpならびにRgpはPAR2活性化によりオクルディンならびにZO-1の内在化を誘導することで透過性を増大させた」可能性が考えられる。このように、KgpならびにRgpは異なったメカニズムで脳ならびに腸バリア機能を障害することが示唆された。

4．研究の反省・考察(1)「ジンジパインがPAR2活性化により脳・腸バリアの透過性を高める」という作業仮説に基づいて研究を開始した。ジンジパインは脳バリアでは密着結合タンパク質の直接的な分解、腸バリアではPAR2活性化による密着結合タンパク質の内在化という異なったメカニズムで透過性を増大しており、作業仮説にこだわり過ぎたためメカニズムを突き止めるのに時間を費やしてしまった。
① hCMEC/D3細胞の透過性がジンジパイン依存的に増大することが確認できた。しかし、「ジンジパインによるhCMEC/D3細胞のPAR2活性化は透過性増大には関しておらず、ジンジパインによる直接的な密着結合タンパク質（オクルディンならびにZO-1）分解で透過性が増大する」ことを突き止めた（Nonaka et al., Neurochem Int. 154:105282, 2022）。
② 一方、Caco-2細胞の透過性もジンジパイン依存的に増大することが確認でき、ジンジパインによる直接的な密着結合タンパク質（オクルディンならびにZO-1）分解で透過性が増大することが予想された。しかし、密着結合タンパク質（オクルディンならびにZO-1）分解は認められなかった。最近、PAR2活性化により密着結合タンパク質（オクルディンならびにZO-1）の内在化により透過性が増大することが示唆する実験結果が得られた（論文準備中）。
(2)培養細胞を用いた脳・腸バリア機能の解析は予定通り進んでいるが、マウス個体を用いた脳・腸バリア機能の解析の進行は予定より若干遅れている。
① 全浸循環ルート（マウス尾静脈内投与）：ジンジバリス菌ならびにOMVsのマウス尾静脈内投与の予備実験を行っているが、尾静脈内投与が予想外に難しく、安定的な尾静脈内投与ができていないため研究が遅れている。尾静脈注入用のシリンジならびにマウス固定器を用いることで成功率が上がってきている。
② 唾液ルート（マウス経口投与）：ジンジバリス菌ならびにOMVsのマウスへの経口投与の予備実験も開始している。
③ 認知機能解析：マウス個体を用いた実験では、脳・腸バリアの機能解析だけではなく、認知機能解析も行う予定のため認知機能解析装置（ステップスルー受動回避試験装置ならびに新奇物体探索行動装置）のセットアップを完了した。

5．研究発表(1)学会誌等① Nakanishi H, Ni J, Nonaka S, Hayashi Y. Microglial circadian clock regulation of
microglial structural complexity, dendritic spine density and inflammatory
response.
Neurochem Int. 142:104905, 2021.
② Tanaka J, Takahashi H, Yano H, Nakanishi H. Generation of CSF-1 independent
ramified microglia from leptomeninges in vitro.
Cells 10:24, 2021.
③ Ni J, Zhang X, Reinheckel T, Turk V, Nakanishi H. Cathepsin H deficiency decreases
hypoxia-ischemia-induced hippocampal atrophy in neonatal mice through attenuated
TLR3/INF-β signaling.
J. Neuroinflammation 18:176, 2021.
④ Hayashi Y, Kato H, Nonaka K, Nakanishi H. Stem cells from human exfoliated deciduous
teeth attenuate neuropathic tactile allodynia in mice through distinct fromsigrec-9/MCP-1-mediated tissue-repairing mechanism.
Sci Rep 11:20053, 2021.
⑤ Liu Y, Li H, Hu J, Wu Z, Meng J, Hayashi Y, Nakanishi H, Qing H, Ni J. Differential
expression and distinct roles of proteinase-activated receptor 2 in microglia andneurons in neonatal mouse brain after hypoxia-ischemic injury.
Mol Neurobiol. 59:717-730, 2022.
⑥ Xie Z , Meng J, Kong W, Wu Z, Lan F, Narengaowa, Hayashi Y, Qinghu Yang Q, Bai Z,
Nakanishi H, Qing H, Ni J. Microglial cathepsin E plays a role in neuroinflammation
and amyloid β production in Alzheimer’s disease.
Aging Cell, 00:e13565, 2022.
⑦ Nonaka S, Kadowaki T, Nakanishi H. Secreted gingipains from Porphyromonas
gingivalis induce increased permeability of human cerebral microvascularendotherial cells through intracellular degradation of tight junction proteins.
Neurochem Int. 154:105282, 2022.

(2)口頭発表なし(3)出版物なし