島根県産業技術センター研究報告報第46号（2010）

文

ゼオライトを用いた簡便迅速なプラスミド調製法の開発
Development of simple and rapid preparation method of plasmid using zeolite.

永田

＊

善明

ゼオライトの陽イオン交換作用を応用し，大腸菌からのプラスミド調製操作を大幅に簡略化・迅速化する方法（ゼオライト法）
を開発した．ゼオライト法は，大腸菌を NaOH-SDS 溶液により溶解してラ（Mn+）
および H+ をゼオライ
イセートとした後，ドデシル硫酸と反応して不溶性沈殿を生じる陽イオン
トの陽イオン交換作用により供給し，大腸菌ライセートの SDS 除去と中和を行うことを原理とする．
ゼオライト法に用いる Mn+ およびゼオライト種について検討を行った結果，Ba2+ 型島根県産硬質モル
デナイトと H+ 型島根県産硬質モルデナイトの組み合わせ，または Ba2+ 型島根県産精製クリノプチロ
ライトと H+ 型島根県産硬質モルデナイトの組み合わせが適していた．ゼオライト法によりプラスミドを調製したところ、大腸菌ライセートからの SDS 除去率は 99.5% となり，得られたプラスミドは制限
酵素処理，PCR 反応に適用可能な品質であった．ゼオライト法の所用時間は，培地からの大腸菌回収
操作を含めて 15 分以内であり，現時点では最速のプラスミド調製法と考えられた．

るのが，アルカリ SDS 法 1）である．アルカリ SDS 法の操作

1．はじめには，図 1-A の通りである．①プラスミド DNA を保持していプラスミドとは，バクテリア細胞内に存在する数千塩基

る大腸菌を培養後，遠心分離によりペレットとして回収す対の染色体外環状 DNA である．プラスミドはバクテリア

る．②大腸菌ペレットを緩衝液に縣濁する．③ NaOH −ド

細胞内で自律的に複製するため，マルチクローニングサイ

デシル硫酸ナトリウム（sodium dodecyl sulfate，以下 SDS

トや薬剤耐性遺伝子の導入等，人為的に改変された種々のと略す）
溶液を添加し，大腸菌を溶解させてライセートとす

プラスミドが開発され，遺伝子のクローニング，タンパク

る．④酢酸−酢酸カリウム溶液を添加する．これにより，質の発現，DNA 塩基配列の決定など，様々な目的に用いライセート中のドデシル硫酸はクラフト点の高い K+ 塩となられる．通常，プラスミドの増幅は大腸菌を宿主として行り、沈殿を生じる．また，ライセートの弱酸性化および塩

うため，大腸菌からのプラスミド調製操作は，遺伝子工学

析効果により，大腸菌由来の染色体 DNA，タンパク質は凝の最も基本的な実験と言える 1）．

集し不溶性の沈殿となるが，プラスミドは分子量が小さい

大腸菌からのプラスミド調製法として広く用いられてい①培地を遠心分離し、大腸菌を回収↓②大腸菌を緩衝液に縣濁
↓③NaOH-SDS溶液を添加、転倒混和↓④酢酸−酢酸カリウム溶液を添加、転倒混和
↓
⑤遠心分離
↓
⑥上清回収
↓
⑦フェノール・クロロホルム抽出↓⑧エタノール沈殿↓⑨沈殿のTEへの溶解（プラスミド取得）
A

ために溶液中に留まる．⑤溶液を遠心操作により固液分離↓⑦核酸結合担体へのプラスミド結合↓⑧核酸結合担体の洗浄↓⑨核酸結合担体からのプラスミドの溶出（プラスミド取得）

SDS

B．バインド・エリュート法

図1

プラスミド調製法の操作の比較＊

環境技術グループ− 17 −↓④Mn+ 型ゼオライトを添加し、撹拌
↓⑤H+ 型ゼオライトを添加し、撹拌
↓
⑥遠心分離
↓
⑦上清回収
（プラスミド取得）

C．ゼオライト法永田：ゼオライトを用いた簡便迅速なプラスミド調製法の開発

する．⑥プラスミドを含む上清を回収する．⑦上清には不でに添加した溶液に含まれる塩がほぼそのまま残存するた純物としてタンパク質が含まれているため，フェノール・

め，⑧エタノール沈殿による溶液交換と脱塩をしない限り

クロロホルム抽出によるタンパク質除去を行う．⑧エタノ

各種反応に用いることはできない．一方ゼオライト法では，ール沈殿を行う．遠心分離によりプラスミド沈殿をペレッ

Mn+ および H+ をイオン交換により大腸菌ライセートに供トとして回収する．⑨ペレットを TE（Tris-HCl，EDTA給するため，最終的に得られるプラスミド試料には，原理緩衝液）に溶解し，プラスミド溶液とする．このようにア上②の緩衝液由来の成分以外は残存しないこととなり，こルカリ SDS 法は操作段階が多く煩雑であり，有害物質でれらは特に阻害成分とはならないので，そのまま各種反応あるフェノール，クロロホルムを使用する必要がある．そに供することができる．

こで，操作の簡略化や有害物質の使用量削減を目的として，

このゼオライト法について，プラスミド調製条件を最適

DNA 結合担体を用いたバインド・エリュート法（Boom 特化するためにゼオライト種，交換性陽イオン種を検討する

2）

3）

許 ，Qiagen 特許 など）が開発された．バインド・エリ

とともに，得られたプラスミドの品質を各種酵素処理など

ュート法の操作は図 1-B の通りである．バインド・エリュ

により検証したので報告する．

ート法は，アルカリ SDS 法における⑥の上清回収以降を

2．試料および方法

核酸結合担体によるプラスミドの選択的結合と洗浄，溶出操作に置き換えたもので，遺伝子導入品質の高純度プラス

2.1

ゼオライト試料ミドを得ることができる．現在，多くのバイオ試薬メーカ

試験には，島根県産硬質モルデナイト（以下モルデナイ

ーからバインド・エリュート法を採用したプラスミド調製

トと称す），島根県産精製クリノプチロライト（以下クリノキットが発売されているが，培地からの大腸菌回収からプ

プチロライトと称す），合成 A 型ゼオライト A-3（以下ゼオ

ラスミド取得までの所用時間は短いものでも 30-45 分であライト A と称す），合成 X 型ゼオライト F-9（以下ゼオライ

り，多量の試料を処理する必要があるプラスミド構築時のト X と称す）の 4 種を用いた．

スクリーニング実験においては，さらなる所用時間の短縮と簡便さが望まれている．

モルデナイトは，粒径 2-5mm の粗砕試料を遊星ボールミ
ル（FRITSCH 製 P-5，250mL メノウポット，φ10mm メノ

このような既存法の欠点を解消するため，ゼオライトのウボール）を用いて湿式粉砕し，目開き32µm のふるい通過持つ陽イオン交換作用を応用し，アルカリ SDS 法の操作を分を水簸して平均粒径が 10-30µm となるよう分級したもの

大幅に簡略化するとともに，所用時間約 15 分でプラスミドを試料とした．クリノプチロライトは，粉末状のものを入を調製する方法（以下ゼオライト法と称す）を開発した．ゼ手時の状態で試料とした．ゼオライト A およびゼオライト

オライト法の操作は図 1-C の通りである．①から③の操作

X は，東ソー製の粉末を入手時の状態で試料とした．

はアルカリ SDS 法と同様である．③では，大腸菌ライセー

2.2

ゼオライトの陽イオン交換処理

ト中には大腸菌由来の染色体 DNA，プラスミド，タンパク

3.2 項に記載のモルデナイトの陽イオン交換処理は，次質，緩衝液に含まれるグルコース，Tris-HCl，EDTA，おの方法で行った．0.1N の KCl，RbCl，CaCl2，SrCl2，BaCl2，

よび大腸菌溶解液に含まれる NaOH，SDS が含まれている．

HCl 各溶液 1L に各々モルデナイト 25g を入れ 80℃，16 時④大腸菌ライセートに，ドデシル硫酸と反応して不溶性の間浸漬し，陽イオン交換を行った．陽イオン交換終了後，n+を交換性陽イオ
沈殿を生成する陽イオン（以下 M と称す）
n+ンとして保持するゼオライト（以下 M 型ゼオライトと称

各モルデナイトを超純水約 1L で 5 回洗浄した後 110℃で乾燥させ，試験に供した．

す）を添加する．これにより，大腸菌ライセート中の SDS お+n+

3.3 項に記載のゼオライトの陽イオン交換処理は，次の方

よび NaOH に由来する Na がゼオライト中の M と交換し法で行った．0.1N の KCl，SrCl2，BaCl2，HCl 各溶液 1L にn+てライセート中に溶出し，M がドデシル硫酸と反応して各々ゼオライト試料 50g を入れ 80℃，24 時間浸漬する処理

沈殿を形成することで大腸菌ライセートより除去される．

を 1 サイクルとし，1 サイクル毎に新たに調製した各溶液⑤ H+ を交換性陽イオンとして保持するゼオライト（以下 H+に交換しながら，この操作を 12 回繰り返した．また，陽イ型ゼオライトと称する）
を添加する．これにより，工程④にオン交換の進行状況をモニターする目的で，24 時間浸漬後

おいて大腸菌ライセート中のドデシル硫酸と反応しなかっの各溶液中の Na，K
（KCl 溶液によるイオン交換試料を除

n+

+

n+

た M が H と交換し，大腸菌ライセートの中和，M の除く），Mg，Ca の濃度を，偏光ゼーマン原子吸光光度計（日去が行われる．工程④⑤により，大腸菌ライセートに含ま

立製 Z-6000）により測定した．陽イオン交換終了後，各ゼれる変性状態の染色体 DNA およびタンパク質は凝集不溶

オライトを超純水約 1L で 5 回洗浄した後 110℃で乾燥させ，化し，ゼオライト粒子間に捕捉される．また，ゼオライト

試験に供した．

によるタンパク質の吸着もおこる．⑥遠心分離により固液2.3

分離を行う．⑦プラスミドを含む上清を回収する．

モルデナイトの陽イオン交換率の測定

3.1 項に記載のモルデナイトの陽イオン交換率は，次の方アルカリ SDS 法では，図 1-A ④の段階において，それま法で求めた．まず，陽イオン交換処理を行っていないモル− 18 −

島根県産業技術センター研究報告第46号（2010）

デ ナ イ ト 試 料 約 2.5g を 1N CH3COONH4 溶 液 1L に 80 ℃，

植菌し，37℃ 16 時間震盪培養したものを試験に供した．

16 時間浸漬した後，CH3COONH4 溶液に溶出した Na，K，

2.6.2

アルカリ SDS 法によるプラスミド調製試験

アルカリ SDS 法によるプラスミド調製試験は，文献 1）に

Mg，Ca の濃 度を偏光ゼーマン原子吸 光 光 度 計（日立 製
Z-6000）により測定した．4 種の陽イオンの溶出量（当量）を記載のアルカリ -mini prep 法を参考に，次の方法で行った．

合計し，陽イオン交換容量 1.373meq/g を算出した．次に，

なお遠心分離操作には，全てクボタ製小型冷却遠心機 3700

2.2 項に記載の陽イオン交換処理終了後，浸漬に用いた塩溶を用いた．大腸菌培養液 1mL を 1.5mL サンプルチューブに液中に含まれる Na，K，Mg，Ca の各濃度を，同様に測定し分注し，15000rpm，4℃，1 分遠心分離した．遠心後上清をた．なお，KCl 溶液による陽イオン交換では，CH3COONH4取り除き，2.5 項と同一組成の大腸菌懸濁用緩衝液 100µL を溶液による溶出 K 量を，陽イオン交換前のモルデナイト中

添加し，ボルテックスミキサーで十分に撹拌した．次に，+に保持されている交換性 K 量とした．また，CaCl2 溶液にNaOH-SDS 溶 液（0.2M NaOH，1 ％ SDS）
200µL を 添 加 し，よる陽イオン交換では，CH3COONH4 溶液による溶出 Ca 量

静かに転倒混和し，氷上で 2 分静置した．次に，大腸菌ラを，陽イオン交換前のモルデナイト中に保持されている交（v/v）
CH3COOH）
イセート中和液（3M CH3COOK，11.5%

換性 Ca2+ 量とした．各陽イオンの溶出量
（当量）
の合計値を

150µL を添加し，転倒混和して氷上に 5 分静置した．次に，陽イオン交換容量 1.373meq/g で除し，陽イオン交換率と15000rpm，4℃，10 分遠心分離し，上清を新しい 1.5mL サ

した．

ンプルチューブに移した．この上清に 400µL のイソプロパ

2.4

ノールを加えて転倒混和し，室温で 20 分静置した．次にゼオライトの陽イオン保持量の測定
n+

+

2+

3.2 項に記載の M 型ゼオライトが保持する K ，Sr ，15000rpm，20℃，10 分遠心分離し，上清を取り除いた．サ

2+

Ba 量は，次の方法で求めた．2.2 項に記載の陽イオン交

ンプルチューブ内のペレットを 70% エタノールで 2 回洗浄

換終了後のゼオライト試料約 0.5g を 1N NH4NO3 溶液 50mLした後乾燥させ，300µL の 1/10TE（1mM Tris-HCl pH8.0，に 80℃，16 時間浸漬した．次に，遠心機（日立製 CT5DL）

0.1mM EDTA）に溶解してプラスミド試料とした．

により 3000rpm，10 分遠心分離し，上清を回収した．この

2.6.3

上清について，K は偏光ゼーマン原子吸光光度計（日立製

ゼオライト法によるプラスミド調製試験

ゼオライト法によるプラスミド調製試験は，次の方法でZ-6000）により，Sr，Ba は ICP 発光分光光度計（島津製作行った．遠心分離操作には，全てクボタ製小型冷却遠心機

所製 ICPS-7500）
により溶出量（当量）を測定し，各陽イオン

3700 を用いた．大腸菌培養液 1mL を 1.5mL サンプルチュの保持量を算出した．

ーブに分注し，15000rpm，4℃，1 分遠心分離した．遠心++

3.2 項に記載の H 型ゼオライトの H 保持量は，次の方法

後上清を取り除き，2.5 項と同一組成の大腸菌懸濁用緩衝で求めた．ゼオライト試料約 0.5g を 1N KCl 溶液 100mL に

液 100µL を添加し，ボルテックスミキサーで十分に撹拌し80℃ 16 時間浸漬した．次に，遠心機（日立製 CT5DL）によた．次に，NaOH-SDS 溶液（0.2M NaOH，1％ SDS）
200µL

り 3000rpm，10 分遠心分離し，上清を回収した．この上清を添加し，静かに転倒混和し，氷上で 2 分静置した．このについて，pH7.0 を終点として 0.1N NaOH 溶液で滴定し，大腸菌ライセートに，2.2 項で調製した Mn+ 型ゼオライト+

滴定に要した NaOH 溶液量から H 保持量を算出した．

0.2g を添加し，撹拌した．次に，2.2 項で調製した H+ 型ゼ2.5

オライト 0.2g を添加し，撹拌した．次に，15000rpm，4℃，

SDS 除去に用いる陽イオン種の検討

陽イオン溶液は各無機塩を超純水に溶解し，1M 水溶液

1 分遠心分離し，上清を新しい 1.5mL サンプルチューブにとした．SDS と反応して不溶性沈殿を生じる陽イオンの判移した．これを再度 15000rpm，4℃，1 分遠心分離し，上定 は， 大 腸 菌 懸 濁 に 用 い る 緩 衝 液（0.9% グ ル コ ー ス，

清を新しい 1.5mL サンプルチューブに移し，プラスミド試

10mM Tris-HCl（pH8.0），5mM EDTA）
1mL，1% SDS料とした．

2mL を試験管に分注し，ここに各陽イオン溶液 0.1mL 加え

2.7て撹拌し，沈殿生成を目視により確認した．水酸化物沈殿

プラスミド試料に含まれる SDS 濃度の測定

プラスミド試料に含まれる SDS 濃度の測定は，メチレンを生じる陽イオンの判定は，前記と同一組成の緩衝液 1mL，

ブルー吸光光度法 4）により行った．

0.2M NaOH 2mL を試験管に分注し，ここに各陽イオン溶

2.8

プラスミド試料の制限酵素処理

プラスミド試料の制限酵素処理は，次の方法で行った．

液 0.1mL 加えて撹拌し，沈殿生成を目視により確認した．
試験は室温
（22℃）
で行った．

制限酵素は SibEnzyme 社製のものを用いた．酵素反応条

2.6

件はメーカー推奨条件に従った．反応溶液は，プラスミド

2.6.1

プラスミド調製試験

試料 15µL，酵素添付の 10 ×バッファー 2µL，制限酵素 1U

大腸菌試料

プラスミド調製試験用の大腸菌には DH5α（東洋紡製）とし，超純水で合計 20µL とした．この反応溶液をメーカを用いた．この大腸菌にプラスミド pBluescript II SK+

ー推奨温度で 1 時間反応させた後，1% アガロースによる（STRATAGENE 社製）を導入し，グリセリンストックと電気泳動，臭化エチジウム染色を行ってプラスミド消化のした．試験の前日にグリセリンストックを LB 培地 3mL に有無を確認した．

− 19 −

永田：ゼオライトを用いた簡便迅速なプラスミド調製法の開発

2.9

よる電気泳動，臭化エチジウム染色を行って DNA 増幅のプラスミド試料を鋳型とした PCR

プラスミド試料を鋳型とした PCR は，次の方法で行った．

有無を確認した．

PCR 用耐熱性 DNA ポリメラーゼは BIOLINE 社製 HybriPol

3．結

DNA ポリメラーゼを用いた．PCR 用反応液は，HybriPol
DNA ポリメラーゼ1U，DNA ポリメラーゼ添付の10×リアク

3.1

果SDS 除去に用いる陽イオン種の検討

ションバッファー 2µL，2.5mM MgCl2，10mM dNTP Mix，

アルカリ SDS 法では，大腸菌ライセートの SDS 除去に

M13 プ ラ イ マ ー（TGTAAAACGACGGCCAGT）10pmol，

酢酸カリウム由来の K+ を用いる．ゼオライト法では，⑴Reverse プライマー（GGAAACAGCTATGACCATG）
10pmol，

SDS と反応して不溶性沈殿を生成する，⑵大腸菌ライセー

プラスミド試料 1µL とし，超純水で計 20µL とした．反応溶

トは pH12.5 のアルカリ性であるため，この条件下で水酸液をサーマルサイクラー（アステック製プログラムテンプ

化物沈殿を生じない，これら 2 つの条件を満たせば Mn+ はコントロールシステム PC-812）にセットし，温度プログラム
94℃ 15 秒，55℃ 10 秒，72℃ 60 秒を 1 サイクルとして 35 サ
イクルの増幅反応を行った．反応終了後，1% アガロースに
表1

M

C

K

Rb

Ca

Sr

Ba

SDS 溶液への添加により沈殿を生じる陽イオン
塩

陽イオン種

SDS 沈殿水酸化物沈殿

LiCl

Li

+

-

-

NaCl

Na+

-

-

KCl

K

+

+

-

RbCl

Rb+

+

-

CsCl

+

Cs

-

-

MgCl2

Mg

2+

-

+

CaCl2

Ca2+

+

-

SrCl2

Sr

2+

+

-

BaCl2

Ba2+

+

-

LaCl3

La

3+

+

+

Ce（NO3）3

Ce3+

+

+

2+

-

+

Fe

3+

+

+

Co

2+

-

+

Mn+

SDS 濃度（mg/L）SDS 除去率
（%）

+

MnSO4
FeCl3
CoCl2

Mn

図 2 K+，
Rb+，
Ca2+，Sr2+，Ba2+ 型モルデナイトと H+ 型モル
デナイトによるプラスミド調製結果（ゼオライト法）
M：500bps ラダー，
C：アルカリ SDS 法，K：K+ 型モルデナイ
ト，Rb：Rb+ 型モルデナイト，
Ca：Ca2+ 型モルデナイト，
Sr：
2+
2+
Sr 型モルデナイト，Ba：Ba 型モルデナイト．
表3

プラスミド試料の SDS 濃度および SDS 除去率

NiCl2

Ni

2+

-

+

K

4842

27.4

CuSO4

Cu2+

-

+

Rb+

5880

11.9

AgNO3

+

+*

2+

6650

0.3

2+

Ag

-

Ca

ZnSO4

Zn

2+

-

+

Sr

1760

73.6

AlCl3

Al3+

+

+

Ba2+

194

97.1

SnCl2

2+

-

+

アルカリ SDS 法

48

99.3

Sn

*Tris-HCl に由来する AgCl が含まれる．

表2
交換液

モルデナイトの陽イオン交換率

溶出イオン（meq/g）

溶出イオン合計（meq/g）

交換率
（%）

0.198

1.373

100

Na+

K+

Mg2+

Ca2+

1N CH3COONH4

0.897

0.351

0.053

0.1N KCl

0.765（0.351）

0.066

0.115

1.206

87.8

0.1N RbCl

0.802

0.250

0.042

0.028

1.087

79.1

0.1N CaCl2

0.422

0.087

0.023

（0.198）

0.620

45.1

0.1N SrCl2

0.532

0.098

0.022

0.092

0.687

50.0

0.1N BaCl2

0.601

0.137

0.026

0.096

0.799

58.2

0.1N HCl

0.544

0.113

0.003

0.008

0.662

60.9

− 20 −

島根県産業技術センター研究報告第46号（2010）

K+ である必要はない．そこで，この 2 条件を満たす陽イオ

するモルデナイトを用いた試験では，コントロールのアルンを検討するため，20 種の金属イオンについて 2.5 項に記載

カリ SDS 法による場合と同一位置にバンドが確認され，プ++の試験を行い，結果を表 1 に示した．試験の結果，K ，Rb ，
2+

2+

n+

ラスミドを調製できることが分かった．プラスミド調製量

Ca ，Sr ，Ba が SDS 除去に用いる M として使用できは，K+ 型＜＜Sr2+ 型＜Ba2+ 型＜アルカリ SDS 法であった．

る可能性が示唆された．Ca2+，Sr2+ は通常アルカリ条件下

これは，表 3に示した SDS 除去率の順位と一致しており，では水酸化物沈殿を生じるが，本試験で沈殿を生じなかっ

SDS 除去率が高いほどプラスミド調製量が多くなる傾向

た理由として，検液に含まれる Tris-HCl，EDTA が影響をが見られた．SDS 除去率が低い Rb+，Ca2+ を Mn+ としたモ

およぼした可能性がある．

ルデナイトではプラスミドが得られなかった．

3.2

2+

陽イオン種がプラスミド調製に及ぼす影響の検討
+

+

2+

2+

3.3

2+

ゼオライト種がプラスミド調製に及ぼす影響の検討

3.1 項の結果を基に，K ，Rb ，Ca ，Sr ，Ba を交換

3.2 項の結果をふまえて，K+，Sr2+，Ba2+ を交換性陽イオ

性陽イオンとして保持する Mn+ 型モルデナイトおよび H+ンとして保持する Mn+ 型モルデナイトおよびクリノプチロ

型モルデナイトを調製し，これらを用いてゼオライト法に

ライト，K+ を交換性陽イオンとして保持する Mn+ 型ゼオ

よるプラスミド調製試験を行った．表 2 に試験に用いた各

ライト A およびゼオライト X，H+ 型モルデナイトを新規

モルデナイトの陽イオン交換率を，図 2 に各モルデナイトに調製し，プラスミド調製試験を行った．表 4 に試験に用を用いたプラスミド調製試験によるプラスミド試料のアガいた各ゼオライト試料の Mn+ または H+ 保持量を，図 3 にプ

ロース電気泳動像を，表 3 に各プラスミド試料中の SDS 濃

ラスミド調製試験によるプラスミド試料のアガロース電気度と SDS 除去率を示した．調製したプラスミド pBluescript

泳動像を，表 5 に各プラスミド試料中の SDS 濃度と SDS 除II SK+ は 2961bps のプラスミドだが，調製直後はスーパ

去率を示した．

ーコイル構造をとっているためにアガロース電気泳動では

図 3 レーン 1 から 6 に示したように，Mn+ 型ゼオライトに早く泳動され，約 2300bps のバンドとして検出される．

モルデナイト，クリノプチロライトを用いた試験では K+ 型

図 2 に示したように，K+，Sr2+，Ba2+ を Mn+ として保持表4

量が多かった．これは表 5 に示したように，前項と同様

ゼオライトの陽イオン保持量

SDS 除去率の順位にほぼ一致していた．Mn+ が同一であれ

ゼオライト試料保持量（meq/g）

K+ 型モルデナイト

1.718

Sr2+ 型モルデナイト

1.214

2+

Ba 型モルデナイト

1.348

+

2.204

2+

1.746

K 型クリノプチロライト
Sr 型クリノプチロライト
2+

Ba 型クリノプチロライト

ば、モルデナイト，クリノプチロライトの間で調製量の差は見られなかった．

M

1

2

3

M

4

5

6

C

7

8

1.816

+

4.430

+

4.032

+

0.905

K 型ゼオライト A
K 型ゼオライト X
H 型モルデナイト

表5＜ Sr2+ 型＝ Ba2+ 型＜アルカリ SDS 法の順にプラスミド調製

ゼオライト種と SDS 除去量および SDS 除去率

ゼオライト試料

残存 SDS
濃度（mg/L）

SDS
除去率
（％）

K+ 型モルデナイト

4720

29.2

2+

162

97.6

2+

Ba 型モルデナイト

31.4

99.5

+

K 型クリノプチロライト

5700

37.3

Sr2+ 型クリノプチロライト

159

98.3

Ba 型クリノプチロライト

46.2

99.5

K+ 型ゼオライト A

Sr 型モルデナイト

2+

731

92.0

+

K 型ゼオライト X

472

94.8

アルカリ SDS 法

39.1

99.5

図 3 ゼオライト種がプラスミド調製に与える影響
M：500bps ラダー，1：K+ 型モルデナイト，
2：Sr2+ 型モルデナ
2++イト，3：Ba 型モルデナイト，
4：K 型クリノプチロライト，
5： Sr2+ 型クリノプチロライト，6：Ba2+ 型クリノプチロライ
ト，
C：アルカリ SDS 法，
7： K+ 型ゼオライト A，8：K+ 型ゼオ
ライト X．
− 21 −

永田：ゼオライトを用いた簡便迅速なプラスミド調製法の開発

本試験では SDS 除去率が 3.2 項の試験結果と比較して向おり 5），また表 4 に示すように K+ 保持量は約 4meq/g であ上しており，Mn+ が Ba2+ の場合，モルデナイト，クリノプることから，K+ 型ゼオライト A 及び K+ 型ゼオライト X をチロライトともに除去率 99.5% でアルカリ SDS 法と同等，

プラスミド調製に用いた場合，高い SDS 除去率が期待され

2+

Sr の場合，モルデナイトが 97.6%，クリノプチロライトがた．しかし，プラスミド調製量では Sr2+ 型，Ba2+ 型天然ゼ

98.3% の除去率であった．これは，Mn+ 型ゼオライトの調製

オライトによる試験と同程度の結果が得られたが，SDS 除n+

時に溶液交換を12 回行い，M 保持量を高めているために去率は Sr2+ 型，Ba2+ 型天然ゼオライトによる試験およびア

Mn+ 供給量が増加したためと考えられた．一方，Mn+ が K+

ルカリ SDS 法に及ばなかった．

の場合は，モルデナイトの場合 1.718meq/g，クリノプチロ

3.4

2+

2+

得られたプラスミドの制限酵素処理への適用

ライトの場合 2.204meq/g と Sr ，Ba 型のゼオライトより

3.3 項において SDS 除去率の高かった Ba2+ 型モルデナイ

保持量が高いにもかかわらず，SDS 除去率は低かった．こトおよび Ba2+ 型クリノプチロライトを用いて調製したプラれを反映するように，図 3 レーン 1，レーン 4 に見られる

スミドについて，制限酵素処理を行った．表 6 に処理に用バンドは薄く，プラスミド調製量が少ないことが分かる．

いた 7 種の制限酵素とその反応溶液組成を，図 4 に制限酵

これは，モルデナイト，クリノプチロライトともに K+ に対素処理後のプラスミドのアガロース電気泳動像を示した．

++

する選択性が Na よりも高く，大腸菌ライセート中の Naと十分交換されなかったために，SDS 除去に十分な量のA

K+ が供給されなかったためと考えられた．
次に，アルカリ SDS 法と，Mn+ を Ba2+ とするゼオライ

B

M 1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4 5 6 7 8ト法について，プラスミド調製量と SDS 除去率を比較した．SDS 除去率は両法ともに 99.5% で同程度であるにもかかわらず，図 3 に示したようにプラスミド調製量はアルカ
リ SDS 法が多い．これは，ゼオライト法による調製操作
中に，プラスミドの一部が失われたためと考えられる．試験に用いた天然ゼオライトは，粘土分をできるだけ除くよう水簸等で高度に精製されている．しかし，本試験のゼオライト法では，大腸菌ライセート 300µL に対してゼオラ
イトを合計 0.4g 添加するため，わずかに残る粘土分によりプラスミドが吸着されたと考えられる．
合成ゼオライトを用いた試験については，図 3 レーン 7に K+ 型ゼオライト A を，レーン 8 に K+ 型ゼオライト X を用いた場合のプラスミド調製量を示した．ゼオライト A，

図 4 Ba2+ 型ゼオライト +H+ 型モルデナイトにより調製したプラスミド試料の制限酵素処理結果
Ａ：Ba2+ 型モルデナイト +H+ 型モルデナイト
Ｂ：Ba2+ 型クリノプチロライト +H+ 型モルデナイト
Ｍ：500bps ラダーマーカー，1：Kpn I，2：BamH I，3：Psp124B
I，4：Pst I，
5：Xba I，6：Apa I，7：EcoR I，
8：コントロール（未処理，スーパーコイル型）．

ゼオライト X の陽イオン選択性はともに K+<Na+ とされて
表6

制限酵素および反応溶液組成

制限酵素

反応溶液組成Kpn I

BamH I，Psp124B I

M

1

2

3

10mM Tris-HCl（pH7.6），10mM MgCl2，1mM DTT
10mM Tris-HCl（pH7.6），50mM NaCl，1mM DTT
50mM Tris-HCl（pH7.6），

Pst I，Xba I

100mM NaCl，10mM MgCl2，
1mM DTT
33mM Tris-Acetate（pH7.9），Apa I

66mM K-Acetate，10mM Mg-Acetate，
1mM DTT
100mM Tris-HCl（pH7.6），

EcoR I

50mM NaCl，10mM MgCl2，
1mM DTT

図 5 Ba2+ 型ゼオライト +H+ 型モルデナイトにより調製したプラスミド試料の PCR 増幅結果
Ｍ：500bps ラダーマーカー，
1：Ba2+ 型モルデナイト +H+ 型
モルデナイト，2：Ba2+ 型クリノプチロライト +H+ 型モルデナイト，
3：アルカリ SDS 法．

− 22 −

島根県産業技術センター研究報告第46号（2010）

今回用いた制限酵素は，いずれも pBluescript II SK+ を一

心による固液分離 5 分の合計 15 分である．これは，現在市ヶ所のみ切断する酵素である．制限酵素処理を行っていな

販されているプラスミド調製キットと比較した場合，最速

いプラスミドはスーパーコイル構造をとっているため，レーと考えられる．

ン 8に見られるように約 2300bps のバンドとして観察される．

ゼオライト法と操作性が類似するプラスミド調製キット

一方，制限酵素処理により切断されたプラスミドはリニア型

として，nexttec 社のクリーンカラムがある．このキットは疎となるため，本来の長さである約 3000bps にバンドが観察さ水性基を付与した担体により不純物を吸着除去する方法 6）

れる．図 4に示したように，全ての酵素処理においてバンドであり，実操作時間は約15 分でゼオライト法と同等である．

が約 3000bps に観察され，プラスミドが切断されていること

しかし，非常に高価であり，特殊な溶液を使用するためにが確認できた．制限酵素は種類によって反応溶液の組成が吸光法による DNA 濃度測定ができないという問題がある．

異なり，特に Kpn I のような低塩濃度条件を必要とする酵

ゼオライト法では，Mn+ に Ba2+ を使用する場合，必要な材

素の場合，プラスミド試料からの持ち込み塩類が酵素活性料は天然ゼオライト，陽イオン交換に要する BaCl2，HCl のに大きな影響を与える．本試験では反応液の 75% までプラみである．また調製操作において吸光法による DNA 濃度測

スミド試料を持ち込んでも酵素反応に影響を与えないこと

定に影響を与える試薬は使用しない．よって，nexttec 社のが示され，ゼオライト法で調製したプラスミドが制限酵素キットよりもコスト的，プラスミド試料の濃度評価の面で有処理に適用可能な精製度であることが示された．

利であると考えられる．

3.5

ゼオライト法の操作は，本報告では大腸菌ライセートに得られたプラスミドの PCR への適用

次に，3.4 項で用いたプラスミド試料を鋳型として PCR

ゼオライトを直接添加する方法をとった．しかし，より簡を行った．PCR 産物のアガロース電気泳動像を図 5 に示し

単に操作するためにはゼオライト充填カラムの開発が望また．今回増幅したのは，pBluescript II SK+ のマルチクロ

れる．ゼオライト法は，大腸菌ライセートにまず Mn+ 型ゼーニングサイトを M13 プライマー，Reverse プライマーでオライトを接触させ，次いで H+ 型ゼオライトを接触させる

はさんだ領域約 200bps である．PCR は，反応液中の界面という2 段階方式をとる必要がある．従って，カラム操作

活性剤，イオン強度，イオン種，pH に影響を受ける．図 5を行う場合，大腸菌ライセートをまず Mn+ 型ゼオライトカ

2+

2+に示したように，Ba 型モルデナイト，Ba 型クリノプチ

ラムに通液し，次にフロースルーを H+ 型ゼオライトカラム

ロライトともに増幅が確認できたが，増幅産物量はモルデに通液することになる．

ナイト < クリノプチロライト = アルカリ SDS 法であった．

4.2

今回反応液に持ち込んだプラスミド試料は 5% だが，Ba2+

ゼオライトの陽イオン選択性がプラスミド調製に与える影響

型モルデナイトで増幅量が少なかったことから，モルデナ

ゼオライト法では，大腸菌ライセートの SDS 除去およびイトにより調製した試料は PCR に適用するためには精製度

中和を，まずゼオライト中の Mn+ と大腸菌ライセート中のが低いことが示唆された．一方，Ba2+ 型クリノプチロライ

Na+ が交換することでライセート中に Mn+ が溶出し SDS をトの増幅量はアルカリ SDS 法と同等であり，プラスミドは沈殿させる．続いて大腸菌ライセート中に溶出した余剰のPCR 適用に十分な精製度で調製されていると考えられた．

Mn+ がゼオライト中の H+ と交換し，ライセートを中和する

4．考という2 段階の工程で行う．従って，大腸菌ライセートに察おける陽イオン交換率を可能な限り高め，最終的に得られゼオライト法と市販プラスミド調製キットとの比較

るプラスミド試料の精製度を高いものとするためには，使

現在市販されているプラスミド調製キットは，そのほと用するゼオライトの陽イオン選択性と Mn+ の組み合わせがんどが核酸結合担体を用いたバインド・エリュート法によ重要となる．ゼオライト法におけるゼオライトの理想的なるものである．各製品とも，核酸結合担体を充填したカラ

陽イオン選択順位は，H+ ＜ Mn+ ＜ Na+ である．

4.1

ムや試薬をパッケージ化することで，プラスミド調製に要

モルデナイトでは，大森らの研究により多くの陽イオン

する時間の短縮を図ろうとしており，所用時間の短いものに対する選択性が明らかとなっており，Mg2+ ＜ Ca2+ ＜ Na+としてキアゲン社の HiSpeed Plasmid Midi kit（45 分），プ＜ Sr2+ ＜ Ba2+ ＜ K+ ＜ Rb+ ＜ Cs+ である 7）〜10）．モルデナイト

ロメガ社の PureYield Plasmid Midiprep System（30 分）がの H+ 選択順位は明らかとなっていないが，文献 10）および予あげられる．しかし，バインド・エリュート法はその原理上，備試験から Na+ ＜ Sr2+ ＜ H+ ＜ Ba2+ と考えられる．このこと

図 1-B に示した操作ステップを省略することはできず，こから，Ba2+ 型モルデナイトと H+ 型モルデナイトの組み合わ

れ以上の所用時間短縮の余地は極めて少ない．ゼオライト

せによるプラスミド調製では，使用する陽イオンの選択順位

法では，大腸菌ライセートからの染色体 DNA 除去，SDS

Na+ ＜ H+ ＜ Ba2+ により，プラスミド試料中に Na+ が残留す除去，タンパク質除去，脱塩，中和をゼオライト添加による結果となる．実際にプラスミド試料で 10-20mM 程度の Na

り 1 ステップで完了できるため，実質的な所用時間は菌体を検出している．この濃度は 3.4 項に示したように，制限回収 3 分，菌体溶解 2 分，ゼオライトとの接触撹拌 5 分，遠酵素処理には影響を与えないことが分かった．しかし，3.5− 23 −

永田：ゼオライトを用いた簡便迅速なプラスミド調製法の開発

項の PCR では増幅量がアルカリ SDS 法や Ba2+ 型クリノプチ

スミド調製法である「ゼオライト法」を開発した．ゼオ

ロライトによるプラスミド試料に比較して少なく，脱塩が不ライト法は，既存法であるアルカリ SDS 法の大腸菌ライ十分であると考えられる．モルデナイトを用いたプラスミド

セート中和，除 SDS 工程をゼオライトとの接触操作に置調製における脱塩促進法としては，大腸菌溶解液に NaOH

き換えることにより，操作時間約 15 分でプラスミドを調と SDS に代えて CsOH とドデシル硫酸セシウムを使用する

製することができる．

n+

+

+

ことが考えられる．この場合，M を K とすれば H ＜＜ K

⑵ゼオライト法の実施には，Ba2+ 型クリノプチロライトと＜ Cs+ となり，陽イオン交換が促進される可能性がある．たH+ 型モルデナイトの組み合わせが適していた．これは，

だし，CsOH は高価であり，ドデシル硫酸セシウムも市販さ

ゼオライトの陽イオン選択性が関係しているためと考えられていないことからコストはかなり上昇すると考えられる．

れた．

2+

+

2+

クリノプチロライトの場合，陽イオン選択性は Sr ＜ Ca
2+

+

+

＜ Mg ＜ Na ＜ K である

7）
〜10）

⑶ゼオライト法により調製されたプラスミドは，制限酵素

2+

処理，PCR に適用可能な品質であった．

．クリノプチロライトでは Baの選択順位が不明であるが，表 4 に示す Ba2+ と Sr2+ 保持量

謝の比較から Sr2+ ＜ Ba2+，金属イオンの水和半径と交換吸着の強弱の関係 9）から Ba2+<Na+ と考えられる．従って，Ba2++

辞

本報告は，平成 19 年度シーズ発掘試験「イオン交換性型クリノプチロライトと H 型モルデナイトの組み合わせに鉱物を用いた 1step プラスミド調製法の開発」による研究

よるプラスミド調製では，使用する陽イオンの選択順位が成果の一部である．本研究を支援していただいた，独立行

2+

2+

+

1 段階目の Ba 型クリノプチロライト添加では Ba ＜ Na ，++

政法人科学技術振興機構に深く感謝いたします．

2+

2 段階目の H 型モルデナイト添加では H ＜ Ba となり，

文

理想的な陽イオン交換が起こると考えられる．これは，3.5
項の PCR 試験に示したように，Ba2+ 型クリノプチロライ

1） 藤本明子 , 大杉美穂 , 山本雅 .

よりも多いという結果にも反映されている．

核酸の調製. バイオマニュア

ルシリーズ 1 遺伝子工学の基礎技術 . 山本雅 編 , 羊土社 , 1993,

トによるプラスミド試料の増幅率がアルカリ SDS 法の試料とほぼ等しく，Ba2+ 型モルデナイトによるプラスミド試料

献

p.19-76.
2） Willem R. Boom, Henriette M. A. Adriaanse, Tim Kievits,
Peter F. Lens. Process for Isolating Nucleic Acid. United

合成ゼオライト A，合成ゼオライト X は陽イオン交換
容量が 3-4meq/g と天然ゼオライトの 2 倍以上であり，まStates Patent 5234809. 1993-8-10.
3） クイアジェン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・
ハフツング . 核酸の単離及び精製方法並びにその装置 . 特許第た文献 5）によると陽イオン選択順位は合成ゼオライト A でCs+ ＜ Li+ ＜ Rb+ ＜ K+ ＜ Na+，合成ゼオライト X で Li+ ＜Cs+ ＜ Rb+ ＜ K+ ＜ Na+ であることから，K+ 型合成ゼオラ+

イトと H 型モルデナイトを組み合わせて使用することにより理想的な陽イオン交換が進行すると考えられた．しかし，今回の試験では SDS 除去率が天然ゼオライトに及ば3527884 号 . 2004-5-17.
4） JIS K 0102:1998. 工場排水試験法 . 30.1.1 陰イオン界面活性剤 メ
チレンブルー吸光光度法 .
5） 上松敬禧 .

Yarshevskaya, Vitali Pavlovich Zubov, Dmitry Valerievich
Kapustin, Elena Jurievna Yagudaeva. Use of A Composite
Polymer-coated Sorbent for Separation, Purification, Desalting

分な理由としては，合成ゼオライトからの K+ の供給不足

and Concentration of Biopolymers. United States Patentが考えられるが，仮に合成ゼオライトの Na+，K+ 選択性
トの Mn+ を Rb+ とすることによって SDS 除去率が向上する可能性がある．ただし，Rb+ は陽イオン交換に使用する
RbCl が非常に高価であるため，ゼオライト法の商品化を. イオン交換 高度分離の基

6） Robert-Matthias Leiser, Lutz Plobner, Elena Marcovnaず，本目的には適さない結果となった．SDS 除去が不十の差が大きくないことが原因であるならば，合成ゼオライ

3.2 ゼオライトの化学

礎 . 妹尾学 , 阿部光雄 , 鈴木喬 . 講談社 , 1991, p.82-95.

7018538, 2006-3-28.
7） 大森保幸．島根県産ゼオライトの有効利用に関する研究（第1報）．
島根県立工業技術センター報告．1976，
vol．
13，
p．
47-54．
8） 大森保幸 . 島根県産ゼオライトの有効利用に関する研究（第 2報）. 島根県立工業技術センター報告 . 1977, vol.14, p.60-69.
9） 大森保幸 , 野田修司 , 川谷芳弘 , 板倉雅之 , 赤木和夫 . 天然ゼオ
ライトの基礎的性質に関する 2, 3 の考察 . 島根県立工業技術セ

考えた場合には使用は難しい．

ンター研究報告 . 1980, vol.17, p.84-88.
10）大森保幸．島根県産ゼオライトの有効利用に関する研究（第5．まとめ⑴ゼオライトの陽イオン交換作用を用いた簡便迅速なプラ− 24 −

3 報 ）． 島 根 県 立 工 業 技 術 セ ン タ ー 研 究 報 告．1978, vol.15,
p.76-81.