ISSN 1341-1594
CODEN: JIKEFKV O LU M E 22
NUMBER 1

2014
日本血液代替物学会 会誌
http://www.blood-sub.jp/

第21回年次大会プログラム
総説：わが国の血友病止血治療薬の進歩と展望
トピックス：
脳虚血再灌流傷害に対するLiposomeEncapsulated Hemoglobinの経動脈的投与による治療戦略
事務局たよりThe 21st Annual Meeting Program
Review:
Recent Progress and Perspectives ofHemostatic Therapeutics in Patients with
Hemophilia in Japan
Topics:
Therapeutic Stratey against Cerebral
Ischemia-Reperfusion Injury by Using
Trans-Arterial Administration of
Liposome-Encapsulated Hemoglobin

The Society of Blood Substitutes, Japan

New Concept!!

RHPLC ラピッドセパレーションシステム

新たな高速分離システムの誕生 !!
EXTREAMA ラピッドセパレーションシステムは、粒子径 5 〜 10µm のコンベンショナル HPLC カラムから、粒子径
2 〜 3µm 充填剤やコアシェル充填剤カラムまで使用可能な HPLC システムです。
次世代の主流になると予想される「RHPLC」を実現する「耐圧性能」
「高感度」
「高精度」
「高速応答」を兼ね備えたハードウェ
ア性能をリーズナブルな価格で実現しています。

ラピッドセパレーションクロマトグラフィー(RHPLC) システムによる分析例
移動相：A; Water, B; Acetonitrile リニアグラジエント
流 速：0.8mL/min
カラム：Uniﬁnepak C18 (3.0mmI.D. x 100mm, 1.9µm)
カラム温度：40℃
検出波長：254nm
サンプル：アルキルフェノン類 9 成分

LC System/ 高速液体クロマトグラフ

人工血液第 22 巻目

第1号

2014 年 11 月

次
第 21 回年次大会プログラム
大会長挨拶…………………………………………………………………………………
お知らせとお願い…………………………………………………………………………
大会日程表…………………………………………………………………………………
交通案内図…………………………………………………………………………………
プログラム…………………………………………………………………………………
抄録………………………………………………………………………………………
総説

わが国の血友病止血治療薬の進歩と展望………………………………………………………………… 吉岡 章 38
トピックス 脳虚血再灌流傷害に対する Liposome-Encapsulated Hemoglobin の経動脈的投与による治療戦略…………………………………………………………… 鐙谷 武雄 他
事務局たよりARTIFICIAL BLOOD
Contents

Vol. 22

No. 1

November, 2014……………………………………………………………
………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………

………………………………………………………………
㷅……………………………………………………

第21回日本血液代替物学会年次大会
The 21st Annual Meeting of the Society of Blood Substitutes, Japan「血液代替物（人工血液）開発の新戦略」

大会長：小松晃之（中央大学理工学部 応用化学科教授）

会期：平成26年12月 8 日（月）、 9 日（火）会

場：中央大学理工学部（後楽園キャンパス） 3 号館 3 階小ホール（東京都文京区春日1‑13‑27）【年次大会事務局】
中央大学理工学部 応用化学科 小松研究室内〒 112‑8551 東京都文京区春日1‑13‑27
Tel & Fax：03‑3817‑1910
e-mail：sbsj21@tamacc.chuo-u.ac.jp

2

人工血液 Vol. 22 , No.1, 2014

大会長挨拶

この度、中央大学理工学部（後楽園キャンパス）において、第21回日本血液代替物学会年次大会を開催させて頂くこととなりました。日本血液代替物学会は、昨年設立20周年を迎え、記念大会を奈良で成功裏に実施致しました。今年は第21回、つまり次のステージへの新たな一歩を踏み出す重要な大会となります。
現在日本では、輸血用血液の85％が50歳以上の患者さんに使用されています。今後少子高齢化が進み、輸血を必要とする高齢者の数が増え続け、献血者層（若年層）人口が減少すると、13年後の2027年には万人分の血液が不足する

年間100と予測されています（日本赤十字社推計、政府広報）。さらに先の大震災以降、危機管理の主要施策として血液代替物の実現がますます強く望まれる状況になってきました。
我国における人工赤血球の開発は、安全性と有効性の確認されたヘモグロビン小胞体が臨床試験体制の確立を急ぐ段階にきています。人工血小板の開発は、H12‑（ADP）リポソームの非臨床データが着実に蓄積されています。そのような時期に少し視野を広げ、新しい応用／物質／技術を積極的に提案・議論することは、次の扉を開く重要な鍵となるのではないでしょうか。そこで本大会は、主題を『血液代替物（人工血液）開発の新戦略』とし、人工血液の用途展開のさらなる拡充、新しい化合物の可能性にも焦点をあてながら、血液代替物研究の裾野を拡げる企画を盛り込みました。産官学の研究者・医師たちが横断的に実用化の具体策や次世代物質に関する意見交換を行うことにより、これまでとは少し違った切り口から血液代替物の最新動向と今後を展望したいと思います。是非皆様方の活発な討論により、本大会が実り多きものになるよう願っております。

第21回日本血液代替物学会年次大会
大会長

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 22 , No.1, 2014小松晃之

（中央大学理工学部 応用化学科教授）

3

お知らせとお願い■会員・参加者の皆様へ●会場
中央大学理工学部（後楽園キャンパス）3 号館 3 階小ホール（東京都文京区春日 1‑13‑27）●受付
平成 26 年 12 月 8 日（月） AM 8：30 より
平成 26 年 12 月 9 日（火） AM 8：30 より
クロークは受付と同じフロア（3 階）にあります．
●参加登録
一般：10,000 円，学生：3,000 円
事前参加登録は行いませんが，本年次大会ホームページ（http://www.blood-sub.jp/kaikoku.php）より参加申込書（pdf ファイ
ル）をあらかじめダウンロード，印刷して頂き，必要事項を御記入の上，当日年次大会受付にお持ちください．
参加登録費は，当日年次大会受付にて現金でお支払ください（クレジットカードは使用できません）．参加登録後，ネームカー
ドをお渡ししますので，所属・氏名を御記入ください．会期中，ネームカードは会場内で必ず御着用ください．
●入会受付
受付にて日本血液代替物学会の入会手続きも行っております．会費は，正会員 10,000 円，購読会員 6,000 円，学生会員 5,000 円
です．
●年次大会予稿集
第 21 回年次大会の予稿集（会誌「人工血液」2014 年号に含まれる）は，発表者の方には事前送付させて頂いております．当日
はお忘れなくお持ちください．また，年次大会受付にて一部 1,500 円で販売しております．
●懇親会について懇親会を開催いたします．ふるってご参加ください．
参加費：2,000 円（年次大会受付にて，参加登録費と一緒に現金でお支払い下さい．）
日 時：平成 26 年 12 月 8 日（月）17：45 頃より
会

場：中央大学理工学部（後楽園キャンパス）3 号館 10 階 31008 室（同じ建物の 10 階）■発表者の皆様へ●発表時間
基調講演，特別講演，トピックス，海外招待講演
教育講演

45 分
40 分

大会長講演
シンポジウム講演
一般演題

30 分
発表 15 分＋討論 4 分（交代 1 分）
発表 10 分＋討論 4 分（交代 1 分）

計 20 分
計 15 分

発表は時間厳守でお願いいたします．
発表と討論における使用言語は日本語または英語とします．
■発表者へのお願い
1 ．発表形式は，液晶プロジェクターを用いたプレゼンテーションのみとします．発表内容は，PowerPoint 等のプレゼンテー
ションソフトを使用して御用意ください．OHP は準備しておりません．
2 ．発表時に使用するパーソナルコンピューター（PC）は各自で御準備ください．発表者は，事前の休憩時間に御自分の PC

4

人工血液 Vol. 22 , No.1, 2014

を指定された端末に接続し，液晶プロジェクターから問題なくに投影されることを必ず確認願います．
3 ．念のため事務局で PC（Windows 7，PowerPoint2007，2010，2013 対応）を用意しますが，あくまでも予備となります．
4 ．PC のトラブルに備えて，発表原稿ファイルを USB メモリ等の一般的なメディアにバックアップして御持参ください．
5 ．プロジェクター画面の解像度は XGA（1,024×768 ピクセル）ですので画面の設定を XGA に合わせてください．
6 ．動画ファイルは Windows Media Player で再生できるものでお願いします．事前に再生できるか御確認ください．
7 ．御使用いただく PC は mini D-sub 15 pin のモニター出力端子が必要です．この端子がない PC を御使用の場合は，必ず別途変換コネクタを御持参ください．
8 ．Mac を使用される発表者は必ず外付けのコネクタを御持参ください．
9 ．スクリーンセーバー，ならびに省電力設定は予め解除してください．
■学生講演賞について
本年次大会では「学生講演賞」を設けて，優れた講演を顕彰します．
選考方法：審査委員の審査結果をもとに，審査委員会において選考・決定する．
選考基準：発表内容，プレゼンテーション，質疑応答などにおいて優れた講演であり，講演者の今後の一層の研究活動発展の可能性を有すると期待されるもの．
授与：賞状を授与．賞状は本年次大会の閉会時に大会長から本人に授与する．
■各種会議日程
理 事 会：平成 26 年 12 月 8 日（月） 12：00〜12：40
評議員会：平成 26 年 12 月 8 日（月） 12：40〜13：10
総会：平成 26 年 12 月 8 日（月） 13：15〜13：45

3 号館 10 階 31000 会議室
3 号館 10 階 31000 会議室
3 号館 3 階小ホール■大会事務局〒 112-8551 東京都文京区春日 1‑13‑27
中央大学理工学部 応用化学科 小松研究室内TEL ＆ FAX 03‑3817‑1910
E-mail：sbsj21@tamacc.chuo-u.ac.jp

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 22 , No.1, 20145

大会日程表12/8（月）3 号館 3 階小ホール

12/9（火）3 号館 3 階小ホール

受付

8：30〜

受付

8：30〜

9：00
9：25‑ 9：30 開会の辞
9：30 9：30‑10：15 基調講演

（小林紘一）

9：30‑10：50 シンポジウム3 人工血小板製剤のフロンティア
酒井宏水（奈良医大）「人工赤血球（ヘモグロビン小胞体）製剤の特 9：30‑ 9：50（武岡真司）
S11 武岡真司（早稲田大）
徴と実用化に向けた試み」
9：50‑10：10（木下 学）
S12 橋本麻衣（熊本大）

準備（ 5 分）

10：10‑10：30

10：00

S13 鈴木英紀（日本医大）
S14 萩沢康介（防衛医大）（ヘモグロビン小胞体）
製剤の効能 10：30‑10：50
10：20‑12：00 シンポジウム1 人工赤血球
10：30
と安全性
休憩（10分）
10：20‑10：40（酒井宏水）

11：00 10：40‑11：00（堀之内宏久）

S1 東寛（旭川医大）

11：00‑11：45 トピックス

S2 田口和明（崇城大）（秋山元英）

中村遊香（共立製薬㈱）「獣医療における輸血と代替物への期待」

S3 高瀬凡平（防衛医大）

11：00‑11：20

11：30 11：20‑11：40

S4 河野光智
（慶応大）
S5 荒木

11：40‑12：00

12：00 12：00‑12：40 理事会

淳
（東京大）

（10階 31000会議室）

11：45‑13：00 昼

食（10階 31008室）

12：30
12：40‑13：10 評議員会

（10階 31000会議室）

13：00

13：00‑13：40 教育講演

（佐藤高彰）

13：15‑13：45 総会
13：30

準備（ 5 分）
13：45‑14：15 大会長講演

14：00

木平清人
（JAXA）「国際宇宙ステーション・「きぼう」を利用した高品質タンパク質結晶生成及び構造解析」（東 寛）
14：15‑15：55 シンポジウム2

小松晃之
（中央大）
「人工酸素運搬体 HemoAct™

13：45‑15：00 一般演題2の開発」

13：45‑14：00（高折益彦）

G3 松田信作（慶応大）

人工酸素運搬体の新物質戦略

14：00‑14：15

G4 鐙谷武雄（北海道大）

14：30 14：15‑14：35（小松晃之）

S6 根矢三郎（千葉大）

14：15‑14：30

G5 丸山

徹
（熊本大）

14：35‑14：55（丸山S7 北岸宏亮（同志社大）

14：30‑14：45

G6 大柿

徹
（熊本大）

S8 春木理沙（中央大）14：45‑15：00

G7 佐藤高彰（信州大）

徹）

15：00 14：55‑15：15

S9 Yao‑Tong Lai（東京大）15：15‑15：35

15：30 15：35‑15：55

S10 垣内健太（早稲田大）

休憩（10分）
15：10‑15：55 海外招待講演（小松晃之）
休憩（10分）
16：00 16：05‑16：35 一般演題1
16：05‑16：20（田口和明）

16：30 16：20‑16：35
16：35‑17：20 特別講演
17：00

（武岡真司）

16：00

G1 山田佳奈（中央大）
G2 迫田

黄

宇彬
（中国科学院）「Development of Hemoglobin‑Loaded
Polymer Assemblies and Recent
Situation of Artiﬁcial Blood in China」

学生講演賞発表
閉会の辞

龍（神奈川工大）

Takashi Yonetani（Univ. of Pennsylania）「How Does Hemoglobin (Hb) Regulate
its Oxygen‑Affinity and Coopera‑
tivity?」17：30
17：45‑19：45 懇親会 （10階 31008室）
18：00

6

人工血液 Vol. 22 , No.1, 2014

交通案内
中央大学への交通アクセス

中央大学理工学部（後楽園キャンパス）へのアクセス
東京メトロ丸ノ内線・南北線『後楽園駅』出口 4 から徒歩 5 分
都営三田線・大江戸線『春日駅』出口 6 から徒歩 7 分
JR 総武線『水道橋駅』から徒歩 15 分
住所：〒112-8551
東京都文京区春日 1-13-27
TEL：03‑3817‑1711⮳ ᚋᴦᅬ㥐䚸᫓᪥㥐z 䜻䝱䞁䝟䝇䜈䛿᫓᪥㏻䜚
キャンパスへは䠄ᮾ㛛䠅䛛䜙䛚ධ䜚䛟䛰䛥䛔䚹

春日通り
（東門）

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からお入り下さ䠄༡ഃ䠅䛾䜶䝺䝧䞊䝍䞊䛷䠏㝵䜎䛷䛚ୖ䛜䜚ୗ䛥䛔䚹い。

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ARTIFICIAL BLOOD Vol. 22 , No.1, 2014

年次大会会場：３号館 3 階
中央大学高等学校小ホール
３号館に入りましたら奥（南側）のエレベー
ターで 3 階までお上がり下さい。
懇 親 会 会 場：３号館 10 階31008 室ᾂӭ᫾7

第 1 日目

平成26年12月8日(月)

9 ：25
開会の辞
9 ：30‑10：15 基調講演［司会：小林 紘一（慶応義塾大学）］
人工赤血球（ヘモグロビン小胞体）製剤の特徴と実用化に向けた試み
酒井 宏水（奈良県立医科大学）＝準備 5 分＝シンポジウム 1「人工赤血球（ヘモグロビン小胞体）製剤の効能と安全性」［司会：酒井 宏水（奈良県立医科大学），堀之内 宏久（さいたま市立病院）］
10：20‑10：40 S1 人工赤血球（ヘモグロビン小胞体）を構成する脂質 2 重膜のもつ免疫調節効果について
東 寛（旭川医科大学）
10：40‑11：00 S2 病態モデル動物におけるヘモグロビン小胞体の体内動態と安全性評価
田口 和明（崇城大学）
11：00‑11：20 S3 出血性ショックにおける致死性不整脈発生機序とリポソーム封入人工酸素運搬体の効果に関する実験的検討
高瀬 凡平（防衛医科大学）
11：20‑11：40 S4 外科周術期出血モデルにおけるヘモグロビン小胞体投与の効果と安全性
河野 光智（慶応義塾大学）
11：40‑12：00 S5 ラット後肢移植モデルを用いた人工赤血球の有用性に関する検討荒木 淳（東京大学）

10：20‑12：00

12：00‑12：40 理事会（10 階 31000 会議室）
12：40‑13：10 評議員会（10 階 31000 会議室）
13：15‑13：45 総会
13：45‑14：15 大会長講演［司会：東 寛（旭川医科大学）］
人工酸素運搬体 HemoAct™ の開発
小松 晃之（中央大学）
14：15‑15：55 シンポジウム 2「人工酸素運搬体の新物質戦略」［司会：小松 晃之（中央大学），丸山 徹（熊本大学）］
14：15‑14：35

S6

ミオグロビンを用いた人工酸素運搬体の開発戦略
根矢 三郎（千葉大学）
完全合成化合物による酸素錯体の形成とその薬物動態

14：35‑14：55

S7

14：55‑15：15

S8

HemoAct™ の血液適合性および安全性評価
春木 理沙（中央大学）

15：15‑15：35

S9

Size Eﬀect of Hemoglobin‑Albumin Microspheres on Cellular Uptake and Cell Viability
Yao‑Tong Lai（東京大学）

15：35‑15：55

S10 酸素マイクロ・ナノバブル分散液を用いた完全液体換気への応用
垣内 健太（早稲田大学）

北岸 宏亮（同志社大学）

16：05‑16：35
16：05‑16：20
16：20‑16：35

16：35‑17：20

17：45‑19：45

8＝休憩 10 分＝
一般演題 1［司会：田口 和明（崇城大学）］
G1 （ヘモグロビン ‑ アルブミン）クラスター HemoAct™ の分子構造調節
山田 佳奈（中央大学）
G2 ポリリン酸修飾ヒアルロン酸ゲルを用いた新規局所止血材の開発
迫田 龍（神奈川工科大学）
特別講演［司会：武岡 真司（早稲田大学）］
How Does Hemoglobin (Hb) Regulate its Oxygen‑Aﬃnity and Cooperativity?
Takashi Yonetani（Univ. of Pennsylvania）
懇親会（10 階 31008 室）

人工血液 Vol. 22 , No.1, 2014

第 2 日目

平成26年12月 9 日（火）9 ：30‑10：50 シンポジウム 3「人工血小板製剤のフロンティア」［司会：武岡 真司（早稲田大学），木下 学（防衛医科大学）］
9 ：30‑ 9 ：50 S11 人工血小板／ H12 (ADP) リポソームの製造工程・品質の管理
武岡 真司（早稲田大学）

10：10‑10：30

血小板減少状態における血小板代替物 H12 (ADP) リポゾームの体内動態解析
橋本 麻衣（熊本大学）
S13 人工血小板／ H12 (ADP) リポソームの超微形態的検討─ in vitro および in vivo における人工血小板の挙動に関する電顕的観察─
鈴木 英紀（日本医科大学）

10：30‑10：50

S14

9 ：50‑10：10

S12

出血性ショック時の蘇生輸血（赤血球：血小板：血漿の 1：1：1 輸血）と血液代替物使用の可能性
萩沢 康介（防衛医科大学）＝休憩 10 分＝
11：00‑11：45 トピックス［司会：秋山 元英（中央大学）］
獣医療における輸血と代替物への期待
中村 遊香（共立製薬㈱）11：45‑13：00 昼

食（10 階 31008 室）

13：00‑13：40 教育講演［司会：佐藤 高彰（信州大学）］
国際宇宙ステーション・「きぼう」を利用した高品質タンパク質結晶生成および構造解析
木平 清人（宇宙航空研究開発機構（JAXA））＝準備 5 分＝
13：45‑15：00 一般演題 2［司会：高折 益彦（東宝塚さとう病院）］
13：45‑14：00 G3 ラット肺切除周術期出血モデルにおけるヘモグロビン小胞体投与後の循環動態
松田 信作（慶応義塾大学）
14：00‑14：15
14：15‑14：30

G4

脳虚血再灌流傷害に対する人工酸素運搬体の経動脈的投与による治療戦略鐙谷 武雄（北海道大学）
G5 CD68+CD206+ クッパー細胞選択的ナノ抗酸化剤のポリチオール付加マンノースアルブミンは急性肝障害を抑制する
丸山徹（熊本大学）

14：30‑14：45

G6

横紋筋融解症誘発急性腎障害に対するアルブミン ‑ チオレドキシン融合体の治療効果と機序解明

14：45‑15：00

大柿 滋（熊本大学）
G7 小角・広角 X 線溶液散乱法によるヘモグロビンの立体構造再構築と濃厚ヘモグロビン溶液中の蛋白質間相互作用に対する pH 効果の精密評価
佐藤 高彰（信州大学）＝休憩 10 分＝
15：10‑15：55 海外招待講演［司会：小松 晃之（中央大学）］
Development of Hemoglobin‑Loaded Polymer Assemblies and Recent Situation of Artiﬁcial Blood in China
黄宇彬（中国科学院 長春応用化学研究所）
16：00
学生講演賞発表
閉会の辞

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 22 , No.1, 2014

9

基調講演
人工赤血球（ヘモグロビン小胞体）
製剤の特徴と実用化に向けた試み酒井宏水
奈良県立医科大学 医学部 化学教室
日本の献血・輸血システムの安全性は世界最高水準にあり，現行の医療に多大の貢献をしている．しかし，少子高齢化社会により献血液の需給バランスが崩れることが懸念されているし，緊急時や大規模災害時の救命医療においては，血液型検査，感染の可能性，短い保存期限などが，危機管理体制の不安要素になりうる．人工赤血球（Hb 小胞体）は感染源を含まず，血液型が無く，長期間の備蓄ができ，現行の輸血治療を補完する技術として期待されている．更に，脆弱な赤血球と比べ化学的に安定で，物性値の調節が可能なので，輸血では対応のできない疾患の治療や外科的治療への可能性も検討されている．
Hb 小胞体の特徴は，①日赤から提供された NAT 検査済み非使用赤血球を原料とし，加熱処理（ウィルス不活化）とナノフィルトレー
ション（ウィルス除去）を経た高純度 Hb を用いている（ウシ，ブタ由来 Hb の使用も可能），②粒子表面の PEG 修飾と脱酸素化により保存期間中の化学的安定性を確保できる，③細胞型構造により内因性 NO との反応を抑制し血管収縮と血圧亢進を生起しない，血管外漏出の防止など，裸の Hb の毒性をカプセルで遮蔽できる，④血液適合性が高く，老化赤血球と同様に最終的に細網内皮系に捕捉され支障なく分解，排泄される，⑤微粒子（250 nm）のため血漿層に均一に分散して流動し，赤血球が通過しにくくなった毛細血管なども通過でき，脳梗塞や有茎皮弁の虚血性領域，腫瘍組織にも酸素を運搬出来ること，⑥高い Hb 濃度（10 g/dL）により，出血性ショック，ある
いは制御不能出血に対する投与では赤血球輸血と同等の酸素運搬効果（蘇生効果）を示す，他方，⑦ CO 結合 Hb 小胞体の投与では，COの徐放により細胞保護効果を示す，⑧摘出小腸や切断下肢などの酸素運搬灌流液として有効である．これらの効能，大量投与時の安全性について，膨大な非臨床成績が蓄積され，ほぼ全てが学術誌などに公表されている．製造法もここ数年で簡略化が進んでいる．これまでアカデミア中心で研究を進めてきた Hb 小胞体製剤は，いよいよ次の段階に進むべき医薬品の候補物質であると考えている．
日本には半世紀以上に及ぶ「人工血液」開発の歴史があるが，未だ十分な性能のものは実用化されていない．人工赤血球は特定生物製剤に分類されることもあり実用化までのハードルが高いものの，人工赤血球が必要であることは明白であり，関連諸機関の協力も得て，是非とも日本発の医薬品として実用化に繋げたい．
【謝辞】
本研究の推進にあたり，実に多くの諸先生のご協力を頂いている．本研究は，厚生労働科学研究費補助金（創薬基盤推進研究事業）を受けて推進されている．
【関連文献】
1. 酒井宏水，土田英俊．人工赤血球の過去，現在，未来．ファルマシア 2009;45:23-8.
2. Sakai H, Takeoka S, Kobayashi K. Gas bioengineering using hemoglobin-vesicles for versatile clinical application. Curr Pharmaceut Design
2011;17:2352-9.
3. 酒井宏水，堀之内宏久，東寛，小田切優樹，小林紘一．輸血代替としての人工赤血球（ヘモグロビン小胞体）製剤の安全製試験．人工血液 2013;21:36-48.
4. 酒井宏水．人工赤血球の開発状況と将来展望．Anesthesia Network 2014;18:37-41.
5. 高折益彦．細胞型人工酸素運搬体の治験，第１相計画．人工血液 2011;19:3-11.

10

人工血液 Vol. 22 , No.1, 2014

大会長講演人工酸素運搬体 “HemoAct™” の開発小松晃之
中央大学理工学部 応用化学科
少子高齢化により献血者層（若年層）人口が減少すると，安定した血液の備蓄が難しくなる．日本赤十字社の推計によれば，平成 39
年（13 年後）には年間 100 万人分の血液が不足すると予測されている．血液型に関係なくいつでも使用できる人工酸素運搬体の実現が，危機管理の主要施策としてはもちろん，輸血治療を補完するための医療対策の一環として強く望まれる状況になってきている．1980
年代以降，人工酸素運搬体研究の主力であった修飾 Hb 製剤は，米国で臨床試験が Phase III まで進んだが，副作用（血圧上昇）や有効性に問題があり実用化には至っていない．
ごく最近，我々は Hb の分子表面に 3 個のヒト血清アルブミン（HSA）を共有結合したコア‑シェル型の（ヘモグロビン‑アルブミン）クラスター（Hb-HSA3，図 1，製剤名 “HemoAct™”）を合成し，それが新しい赤血球代替物として機能することを見い出した 1，2）．Hb を
HSA で包み込むことにより，安全性と有効性を兼ね備えた製剤，つまり 酸素輸送能を持った血漿タンパク質 ができるに違いないという着想に基づいて設計されたユニークな人工酸素運搬体である．クラスター状分子を合成する上で最も難しい点は，いかに 1 つのHb に複数個の HSA をつなぎとめるかにある．我々は HSA に存在する唯一の還元型システイン（Cys-34）に着目し，それと Hb 表面のリシン（Lys）を選択的に結合させることで，目的のクラスター構造を収率高く合成することに成功した．AFM 像には三角形分子がはっきりと見られ
（図 1 A），予想通りの形状であることがわかった．さらに，電子顕微鏡写真（図 1 B）をもとに三次元再構成を行い，クラスターの立体構造を明らかにした．
HemoAct™の特筆すべき特徴の一つは，等電点（pI＝5.1）が低いことである．そのため HemoAct™は血中滞留性に優れ，血圧上昇を起こさない．HemoAct™の酸素親和性は赤血球に比べ高いが（P50＝9 Torr），窒素雰囲気で調製すると低酸素親和性の製剤（P50＝27 Torr）も得られる．粒径は約 10 nm で赤血球
（8 μm）の 1/800 以下．梗塞部位にも入り込み酸素を運ぶことがきるので，酸素治療薬としても有用である．原料は Hb（分解能 1.1 Å で X 線結晶構造解析が可能なほど純度が高い），HSA，架橋剤のみ．製造工程は 2 ステップと少なく（コストの高い試薬は一切不要），特殊な装置も必要ない．HemoAct™の赤色溶液（［Hb］＝5 g/dL）の粘度は 2.8 cP（全血液は 4.0 cP），
血液適合性もよく，動物実験から安全性を確認している．
また，HSA は様々な疎水性分子を結合する能力を持つため，外側の HSA ユニットに機能性分子を包接することができる．例えば，活性酸素消去能を有する分子を結合させると，自動酸化が大きく抑制されることがわかった 3，4）．これは虚血性組織に血流が戻った際，活性酸素が放出されても中心 Hb 部位は酸化されないことを意味する．
HemoAct™は既存製剤で指摘されている欠点を持たず，しかも多くの機能を付与することができる新しい人工酸素運搬体である．赤血球代替物の㻌
実現がまもなく我々が直面する深刻な血液不足の図
1
HemoAct™：
（A）
AFM
像，
（
B）
TEM
像，
（
C）
三次元再構成により得た立体構
㻌
危機を乗り超えるための切り札になることを願（D）ガラス瓶に入った赤色の製剤
ᅗ 㻝㻌 造，い，現在 HemoAct™の実用化に向けた展開を急ピッチで進めている．
【文献】
1）D. Tomita, T. Kimura, H. Hosaka, Y. Daijima, R. Haruki, K. Ludwig, C. Böttcher, T. Komatsu, Biomacromolecules 2013, 14, 1816.
2）小松晃之 , 化学と工業 , 2014, 67, 677.
3）H. Hosaka, R. Haruki, K. Yamada, C. Böttcher, T. Komatsu, PLOS ONE 2014, 9, e110541.
4）Y. Daijima, T. Komatsu, Chem. Commun. 2014, 50, 14716.

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特別講演
How Does Hemoglobin (Hb) Regulate its Oxygen-Aﬃnity and Cooperativity?
○ Takashi Yonetani（米谷1隆）1, Kenji Kanaori（金折賢二）2

Univ. of Pennsylvania, Perelman School of Medicine, 2 Kyoto Inst. of Technology, Bioengineering.

Introduction: The widely-held mechanism of allostery of hemoglobin (Hb) has been that the changes from the R-quaternary/tertiary structures of oxyHb to the T-quaternary/tertiary structures of deoxy-Hb exert certain constraints on the coordination structure of the heme group, leading to a lower
oxygen-affinity of the hemes and thus that of Hb [1]. However, we found that there is no causal correlation between the static T/R-quaternary
structure and the oxygen-af¿nity of Hb [2]. We explore an alternative mechanism of the regulation of the ligand-af¿nity and cooperativity in Hb.
Results and Discussion: The oxygen-af¿nities of free Fe[II]- and Co[II]-protoporphyrins in organic solvents are very low (P50 > 102 ~ 103 torr),
whereas the apparent oxygen-affinities of these metalloporphyrins, which are incorporated in proteins such as apo-myoglobin, apo-Hb, serum
albumin, etc., increase substantially to P50 < 10-1 ~ 101 torr, though their coordination structures are apparently unchanged [3]. Such substantial
increases in the apparent ligand-af¿nities of metalloporphyrin-containing proteins are accomplished by preventing/interfering with the dissociation of
the ligand by protein matrix, since the interior of globin is nearly fully packed by protein matrix. In Hb and Co-substituted Hb (Co-Hb), thedissociation process of the ligand proceeds through the “caged” state [4-6], which can be produced by cryogenic photolysis of the ligated-states at
4.2 K and in which the metal-ligand bond is broken and the un-bonded ligand is trapped near the bonding site within the globin moietiy. This “caged”
state has spectral features distinct from those of either deoxy- or ligated states of the respective hemoproteins. The apparent ligand-af¿nities of Hband Co-Hb are regulated by heterotropic effectors without detectable changes in either static quaternary/tertiary structures of the globin moiety or thecoordination/electronic structures of the metalloporphyrin moiety and thus the ligand-affinity of the metalloporphyrins themselves [7-9]. The
reduction of the apparent ligand-af¿nities of Hb and Co-Hb may be caused by increase in the dissociation rate of ligands from the “caged” state,
resulting from the effector-linked, enhanced high-frequency thermal Àuctuations which increase the transparency of the globin matrix toward small
diatomic ligands such as oxygen, CO, and NO [7-9], which may concomitantly reduce the rate of geminate-recombination of the ligand to themetalloporphyrins.
Conclusion: The ligand-af¿nity of Hb is regulated through protein dynamics by heterotropic effectors, rather than static quaternary/tertiary structuralchanges, as proposed by Perutz [1]. Thus, the “caged” state of Hb acts as a critical transition state in regulation of the af¿nity for small diatomic
ligands in Hb and Co-Hb [9].
References:[1] M.F. Perutz, Nature 1970 228, 726; [2] T. Yonetani, et al., JBC 2002 277, 34508; [3] H. Yamamoto et al., Bioinorg. Chem. 1977 7, 189; [4] T.
Iizuka, et al., BBA 1974 351, 182; [5] Iizuka, et al., BBA 1974 371, 126; [6] T. Yonetani, et al., JBC 1974 249, 2168; [7] T. Yonetani, M. Laberge,
BBA 2008 1784, 1146; [8] M. Laberge, T. Yonetani, Biophys. J. 2008 94, 2737; [9] T. Yonetani, K. Kanaori, BBA 2013 1834,1873.

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人工血液 Vol. 22 , No.1, 2014

トピックス
獣医療における輸血と代替物への期待
中村遊香
共立製薬株式会社 営業技術部
犬と猫に対する日常診療における輸血療法の適用頻度は年々増加傾向にあるが，血液型や血液の供給を始めとして，人の医療との相違点を一つ一つ克服しながらの治療を強いられている．そこで，我が国における，飼育犬および猫の現況と，犬と猫の輸血療法における基礎（血液型，ドナー動物の選択基準，ドナーからの採血方法）
を概説し，供血液の人工代替物が期待される現状を説明する．
1 ．血液型
1）犬血液型：国際的に認知された犬赤血球抗原（Dog Erythrocyte Antigens）を用いるが，輸血療法では DEA1 型のサブタイプである
DEA1.1 型か否かを鑑別する．DEA1.1 陽性犬の出現頻度は，犬種によらず概ね 70％前後で，残り 30％程度が陰性犬である．
2）猫血液型：A，B，AB の３種から成る AB システムを使用している．猫の輸血療法では，初回の輸血時には既に自然発生の同種異型抗体を有していることに注意する必要がある．国内の研究などにおいて，90％近くが A 型，残り 10％の殆どは B 型であり，対立遺伝子として存在する AB 型は非常に稀な血液型であることが知られている．
2 ．ドナーの選択基準
1）犬では DEA1.1 陰性が適しており，出血性ショックの危険性を勘案すると，体重 10 kg（≒90 mL/kg×10 kg×25%＝225 mL）以上の犬が，体格の最低条件であると思われる．
2）猫では他の血液型に対する自然抗体の存在が知られているため，同種血液型のみがドナーと成り得る．猫の血液量は約 65 mL/
kgBW であり，体重 5 kg の猫からは約 80 mL（≒65 mL/kg×5 kg×25%）の採血が限度であると思われる．
3 ．採血法1）器具：新鮮全血をそのまま短時間で輸血する場合は，特殊な器具は不要であるが，供血液を保存して使用する場合は人血用の保存バッグ（全血用 CPDA 液，テルモ株式会社）を使用する．採血針は可能な限り太いもの（犬：18 G，猫：21 G）を使用し，溶血させな
いように留意する．
2）採血：採血部位を毛刈りし，外科手術野と同様に消毒処置する．重力による自然落下で採血バッグに採血できるようにバッグは術台下に確保しておく．
【参考データ】
1. 犬の飼育頭数：1,087 万頭 猫の飼育頭数：974 万頭（ペットフード協会調べ，H25 年度）
2. 小動物診療施設数：11,032 病院（平成 25 年 12 月末現在，農林水産省発表）

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教育講演
国際宇宙ステーション・「きぼう」を利用した高品質タンパク質結晶生成および構造解析○木平清人，山田貢，和田理男，太田和敬，松本邦裕，田崎一行，三好寛

宇宙航空研究開発機構 有人宇宙ミッション本部 宇宙環境利用センター
宇宙航空研究開発機構（JAXA）
は国際宇宙ステーション（ISS）の「きぼう」日本実験棟の船内実験室を利用して「高品質タンパク質結晶生成実験（JAXA PCG）
」を行っている．
宇宙空間では，溶液を密度の違いによって上下左右に流れさせる対流や，重いものを沈下させる沈降がない．このためタンパク質の分子が規則正しく並び，高品質な結晶が生成すると考えられている．高品質な結晶から得られる精密なタンパク質立体構造の情報は，生命現象の理解を深めるとともに，応用面においても医薬品・産業用酵素等の研究開発に利用されている．
JAXA では，国際宇宙ステーションのロシアのサービスモジュールを利用して，2003 年からタンパク質結晶生成実験を行い，宇宙で高品質なタンパク質結晶を生成する技術の開発を進めてきた．
「きぼう」打上げ後の 2009 年からは，引き続き高品質結晶生成技術の獲得を推進するとともに，打上げ／回収時ならびに「きぼう」において適切な温度管理のもと実験を行う技術を確立しながら，ロシア
連邦宇宙局との協力に基づき，定常的にタンパク質試料を国際宇宙ステーションに向けて打ち上げている．
本講演では，まずタンパク質結晶構造解析について簡単に解説し，次いで「きぼう」利用高品質タンパク質結晶生成実験についての概要をこれまでの経緯，宇宙実験の現状，研究成果事例などを踏まえて紹介させて頂きたい．さらには，人工酸素運搬体の結晶構造解
析に関する期待についてもお話したい．

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海外招待講演
Development of Hemoglobin-Loaded Polymer Assemblies and Recent Situation of Artificial Blood in
China
Yubin Huang
Changchun Institute of Applied Chemistry, Chinese Academy of Sciences, 5625 Renmin Street, Changchun, P.R.China
Due to the feasibility and safety issues of clinical blood transfusion, a blood substitute with high safety, high eﬃcacy and largescale production is needed. However, the severe adverse effects of hemoglobin-based oxygen carriers (HBOCs) during clinicalstudies highlight the importance of the cellular structure of RBCs in regulation of oxygen delivery, metabolism and functions oforgans. Carriers with micro/nanostructures show great potential to be applied as next generation of artiﬁcial oxygen carriers dueto the superior properties, such as adjustable diameters, versatile functions, avoidance of the contact of Hb with blood and long
circulation time in vivo.
With the advantage of biodegradability, non-antigenic nature and ease of scale up, aliphatic polyesters are promising materials forconstruction of sustained release system. The extension of polymeric systems into HBOCs can endow the carriers with superior
performance. Generally, hemoglobin can be immobilized within polymeric systems through chemical conjugation and physicalencapsulation. By optimization of the material structure and loading process, the HBOCs can be fabricated with high Hb content
and well-preserved bioactivity. Preclinical studies have revealed the safety and eﬀectiveness of the Hb/polymer systems on animal
ischemia models.

Hb-conjugated micelles

Hb-loaded particles

Hb-encapsulated vesicles

Figure Different types of Hb-loaded polymer assemblies

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シンポジウム 1 S1
人工赤血球（ヘモグロビン小胞体）を構成する脂質２重膜のもつ免疫調節効果について○東1

寛 1，酒井宏水 2

旭川医科大学，2 奈良県立医科大学

我が国の人工酸素運搬体は，脂質２重膜（リポソーム）にヒトヘモグロビンを内包した，いわゆる細胞型人工赤血球で，Hemoglobin
vesicle (HbV) と呼称されている．その酸素運搬能は，ヒト赤血球のそれと遜色がない．実際に脱血モデル動物を用いた実験では血液代替物として安全に使用できることが示されている．しかしながら，赤血球輸血の代替となるには，リポソーム製剤での投与量を遥かに越える量のリポソームを投与することになる．そのために，大量投与に伴う生体反応が様々な角度から検討されてきた．その結果，生命に危険を及ぼす重大な副作用や，軽微であっても長期に持続する無視できない副作用は観察されておらず，そのすぐれた生体適合性が示されてきた．一方で，一般にリポソームは，細網内皮系に速やかに取り込まれることから，特に大量投与した場合に，免疫応答に
何らかの影響を与える可能性がある．この観点からリポソーム大量投与が脾細胞の免疫応答へ与える影響について詳細に検討を行ってきた．その結果 1）HbV あるいは空リポソームを投与後の脾細胞は Con A 刺激に対する増殖が抑制されている．2）リポソームを貪食した脾マクロファージが T 細胞の増殖を抑制する機能を一過性に獲得する．3）T 細胞の増殖抑制にはマクロファージと脾 T 細胞との接触が必要である．4）増殖抑制にはマクロファージの産生する NO が関与している．5）HbV の投与は in vivo に於ける抗体産生反応を抑制しないこと等を明らかにしてきた．これらは，主として，T 細胞の増殖に焦点をおいた解析であり，サイトカイン・ケモカインの産生動態がいかなる影響を受けるのかについての詳細な検討はなされてこなかった．そこで，脾細胞の Con A 刺激下での培養中に反応系に分泌されてくるケモカイン・サイトカインの動態がリポソーム投与後にどのように影響を受けるのかについて詳細に検討を加えた．その結果，一部のサイトカイン・ケモカインは，リポソームの投与後に，産生量が増加するという結果を得た．さらに，IL-1 bの産生量を指標にして，脾細胞の LPS 刺激に対する反応性に与えるリポソームの影響も検討したが，LPS に対する反応性はリポソー
ム投与により変化しないという結果が得られた．これらの結果から，リポソームにより，T 細胞の増殖は一過性に抑制を受ける可能性がある一方で，サイトカイン・ケモカインの産生の観点からは，少なくとも産生の低下はなく，かつ，自然免疫系の過剰な反応が誘導される可能性は低いと推定される．

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人工血液 Vol. 22 , No.1, 2014

シンポジウム 1 S2病態モデル動物におけるヘモグロビン小胞体の体内動態と安全性評価○田口和明 1，丸山
1

徹 2，酒井宏水 3，小田切優樹 1

崇城大学薬学部，2 熊本大学薬学部，3 奈良県立医科大学【緒言】 人工酸素運搬体であるヘモグロビン小胞体（HbV）は大量出血時の他，外科的手術中の血液補充としての利用が期待されている．そのため，HbV は万人へ安全かつ有効に使用することが必要不可欠であると考えられる．これまでに我々は，HbV の体内動態における基盤情報と臨床使用状況下でのデータを構築し，HbV の安全性・有効性を評価してきた．本講演では，病態モデル動物を用いた HbV の体内動態特性と安全性について紹介する．
【実験】 出血性ショックモデルラットは全血液量の 40% を脱血することで作製した．四塩化炭素誘発慢性肝障害モデルラットは，ミネラルオイルに溶解した四塩化炭素（CCl4：mineral oil＝1：4）を週 3 回，8 週間腹腔内投与し作製した．高脂血症モデルマウス（ApoE
欠損マウス）は九動より購入した．体内動態の検討は，HbV の内部ヘモグロビンを標識した 125 I-HbV または脂質膜を標識した 3 H-HbVを用い評価した．
【結果と考察】 出血性ショック時における HbV の体内動態を評価したところ，主要分布臓器や排泄経路は健常時と同様のプロファイ
ルを示し，生体蓄積性も確認されなかった．四塩化炭素誘発慢性肝障害モデルラットにおいて体内動態評価を行ったところ，肝障害が悪化するにつれて，肝臓への分布量及び Kupffer 細胞の貪食能低下が生じる結果，血中クリアランスは低下し，また，肝実質細胞が障害を受けることで，排泄量の低下が起こることが示唆された．このような体内動態の変動は生体に悪影響を及ぼす可能性が懸念されるため，生化学的及び病理組織学的検討を行ったところ，HbV 投与により一時的な血漿パラメータの変動や臓器へのヘモジデリンの沈着はあるものの，著しい悪影響は確認されなかった．さらに，高脂血症モデル動物として ApoE 欠損マウスを用い HbV の体内動態，
生化学的及び病理組織学的検討を行った結果，HbV 投与により一時的な脂質関連の血漿パラメータの変動が起こるものの，HbV は十分な代謝排泄性を有していることが確認された．
【結論】 以上，体内動態特性解析の結果より，HbV は健常時のみならず，代謝・排泄能が低下した状態や出血性ショック時においても，十分な代謝・排泄性を有しており，生体蓄積性はないことが示唆され，様々な臨床使用条件下においても安全に使用できると考えられた．
【文献】
1）Taguchi K et al. J Control Release. 2009, 136, 232-9.
2）Taguchi K et al. Toxicol Appl Pharmacol. 2010, 248, 234-41.
3）Taguchi K et al. J Pharm Sci. 2011, 100, 775-83.
4）Taguchi K et al. Drug Metab Rev. 2011, 43, 362-73.

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シンポジウム 1 S3
出血性ショックにおける致死性不整脈発生機序とリポソーム封入人工酸素運搬体の効果に関する実験的検討○高瀬凡平，田中良弘，東村悠子，木下学

防衛医科大学校集中治療部，救急部，免疫微生物学
出血性ショック心臓では致死性不整脈が発生しやすい．その機序検討するとともにリポソーム封入人工酸素運搬体（Hemoglobinの効果を実験的に検討した．
Encapsulated Liposome [LHb]）【方法】 1）SD rat に 85% 脱血致死性出血性ショック状態を作成し，洗浄赤血球（RBC）蘇生した群（n=14）と，5% アルブミン（5%Alb）
蘇生した群（n=14）
及び LH ｂ群（n=14）で蘇生した群の 3 群間で心拍変動指標（LF, HF, LF/HF）
及び血中 norepinephrine (NE) を測定した．
2）SD rat に 30% 再出血性致死性ショックを作成し，RBC 群（n=14），5%Alb 蘇生群（n=14）及び LH ｂ群の 3 群間の摘出心で Optical
Mapping System (OMP）の興奮伝播・Action potential duration dispersion (APDd)，致死性催不整脈性を検討した．
【結果】 1）RBC 群及び LHb 群では LF/HF・NE が正常に対し 5%Alb 群では上昇し，全例死亡した．2）5%Alb 群では OMP で左心室伝導遅延と burst pacing による心室細動が全例で誘発され APDd 値が増大した．RBC 群及び LH ｂ群では認めなかった．
【結語】出血性ショック心臓では，自律神経活動異常・細胞的心筋催不整脈性増大から致死性不整脈が誘発されると示唆された．また，リポソーム封入人工酸素運搬体（LHb）は洗浄赤血球と同様の効果が期待される可能性が考えられた．

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人工血液 Vol. 22 , No.1, 2014

シンポジウム 1 S4
外科周術期出血モデルにおけるヘモグロビン小胞体投与の効果と安全性○河野光智 1，神山育男 1，松田信作 1，渡辺真純 1，堀之内宏久 1，2，酒井宏水 3，小林紘一 11慶應義塾大学医学部呼吸器外科，2 さいたま市立病院呼吸器外科，3 奈良県立医科大学医学部化学教室【緒言】 人工酸素運搬体として開発されたヘモグロビン小胞体（HbV）はヘモグロビンを内包させたリポソームで，輸血用ヒト赤血球よりヘモグロビンを抽出，精製，ウィルス不活化を行った後，リポソームに内包，膜表面を PEG 修飾して粒径を 250 nm，P50 は 32 Torrに調製した粒子である．血液中で酸素運搬体として機能することは，動物の交換輸血試験で確認され，出血性ショックの蘇生に用いた場合も良好な成績が得られている．将来，手術中出血に対する臨床応用も見込まれている．
【目的】 肺切除周術期に大量出血する動物モデルとして，マウスに 40％交換輸血を行い，同時に左肺全摘術を行うモデルを作成した．
保存血などと比較して HbV 投与の有効性と安全性を検討した．また，ラットに対して肺切除術を行い，同時に循環血液量の 30％を脱血するモデルでは，観血的動脈圧モニタリングを行い，HbV が循環動態に及ぼす影響を評価した．
【実験】 マウスで循環血液量の 40％を試料溶液で交換した後，人工呼吸器下に左肺全摘術を施行する．輸血，輸液を替え以下の 4 群を作成する．（1）Lactate Ringer 溶液（LR）群，（2）5% アルブミン生食液（rHSA）群，（3）マウス保存血液（sRBC）群，（4）ヘモグロビン
小胞体分散液（HbV）群：HbV を 5% アルブミンに分散した液体．Hb 濃度は 8.6 g/dl に調整する．術後 7 日目まで観察を行い，血中のサイトカイン測定を行った．主要臓器での低酸素誘導因子 (HIF)-1 alpha の発現を免疫染色で評価した．ラットモデルでは頚動脈にカ
ニューレを挿入後，人工呼吸器に接続して左肺を切除する．カニューレより循環血液量の 30％を脱血する．脱血量と等量の HbV を頸静脈ラインから輸液する．その間，動脈圧の連続モニタリングを継続し記録する．閉胸し手術を終了して人工呼吸器から離脱する．血圧モニタリングは術後 1 時間まで継続した．
【結果と考察】 マウスモデルの LR 群は全例が死亡した．rHSA 群は生存率が 50％であったのに対し，sRBC 群と HbV 群では全例が生存した．sRBC 群や HbV 群では体重の減少率が低く，回復が早い傾向を認めた．TNF-alpha などの炎症性サイトカイン濃度は，HbV 群と sRBC 群とで同等であった．HbV 群では肝臓および腎臓での HIF-1 alpha の発現が sRBC 群と同等に抑制された．肺切除後のラットの平均血圧は 105±30 mmHg であった．30％の脱血により 45±1 mmHg まで低下したが，HbV の投与により速やかに血圧は上昇し回復した．投与後 10 分での血圧は 120±20 mmHg であった．その後も血圧は 1 時間以上維持され，閉胸して手術を終了し，人工呼吸器からの離脱も可能であった．
【結論】 マウス及びラット左肺全摘モデルにおける呼吸機能低下状態でも HbV が有効に機能した．外科的侵襲からの回復過程に深刻な影響を与えず，明らかな炎症の惹起も認められなかった．HbV 投与は肺切除手術での出血に対しても有効であると考えられた．

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シンポジウム 1 S5
ラット後肢移植モデルを用いた人工赤血球の有用性に関する検討○荒木1

淳 1，酒井宏水 2，武内

大 1，加賀谷優 1，内藤宗和 3，光嶋

勲1

東京大学医学部形成外科，2 奈良県立医科大学医学部化学教室，3 愛知医科大学解剖学【緒言】 外傷による切断四肢の再接着手術を行う際，切断されてから再接着されるまでの虚血時間や保存状態が，その生着の成否や術後の機能予後に大きくかかわってくる．また，切断部位が近位であり，切断端に筋肉が多く含まれる場合には，血流再開時の再灌流障害が大きな問題となる．これに対し現在は冷却保存しておくしか対処法がないため，我々は人工赤血球「ヘモグロビン小胞体（HbV）」
を用いた新たな組織保存法の開発を目指し，共同実験を進めている．
【実験】 ラット後肢の大腿動静脈および大腿神経を温存しつ大腿骨幹部レベルで完全切断し，切断端の大腿動脈より従来の臓器保存液「ET-Kyoto」および HbV を用いた組織保存液を潅流した．大腿静脈からの還流液を採取し，血液ガス分析を行った．一定時間潅流保存を行った後，顕微鏡下に大腿動静脈および大腿神経を吻合し，切断肢再接着術を施行し，総虚血時間が 8 時間となるように血液を再灌流した．また手術後 3 か月までの生着と機能を評価した．
【結果と考察】 大腿静脈還流液の血液ガス分析において，潅流前よりも pO2 が著明に減少し溶存酸素が組織内で使われており，また「ET-Kyoto」よりも HbV において有意に pO2 は低値を示した．また，虚血時間 4，5，6 時間の時点において Lactate も HbV において有意に低値であり，HbV を用いると好気的代謝が保たれていると考えられた．長期的な生着に成功したのは HbV を用いたもののみであり，3 か月後の機能回復も良好であった．
【結論】 人工赤血球の組織保存液としての応用の可能性が示唆された．今後，従来の臓器保存液との比較や再接着後の長期機能予後の検討などを行っていく必要がある．本法は，肝・腎・心・肺・小腸・顔面・四肢・喉頭・子宮などの同種移植医療にも応用が可能であり，使用用途はますます広がっていくものと思われる．
【文献】
1) Araki J, Sakai H, Takeuchi D, Kagaya Y, Naito M, Mihara M, Narushima M, Iida T, Koshima I. Normothermic preservation of the rat hind limb
with arti¿cial oxygen-carrying hemoglobin vesicles. Transplantation, in press (TPA-2014-0748).

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人工血液 Vol. 22 , No.1, 2014

シンポジウム 2 S6
ミオグロビンを用いた人工酸素運搬体の開発戦略○根矢三郎 1，川口
1

章 2，Takashi Yonetani3

千葉大学薬学研究院，2 東海大学医学部，3 University of Pennsylvania, School of Medicine.

【緒言】 高齢化社会を迎えて医療現場での血液需要は増加している．一方，若年層人口は減るとともに献血率は年々低減している．そのため，ヘモグロビン（Hb）以外にも酸素運搬物質を広く求めることは有意義である．ミオグロビン（Mb）の酸素親和性は高く，酸素運搬体として機能しない．私たちは Mb の酸素親和性を下げて酸素運搬体に変換するために，ヘム分子構造を多様に変える試みを続けている．ヘムの化学修飾は容易で，遺伝子工学によるグロビンの化学修飾に比べて費用もかからない．また，分子構造が簡単な Mb は
Hb よりも安定であり，長期保存にも向いている．ここでは酸素親和性を変えるヘム構造因子の解明と Mb を用いた人工酸素運搬体の開発について述べる．
【結果と考察】 Mb の酸素親和性を変えるため，ヘムを入れ替えた三種類の再構成 Mb 類を調べて以下の結果を得た．
1）ヘム‑グロビン接触の大幅な改変 Mb ヘムポケット中のヘムはグロビンに取り囲まれ，百か所余りのヘム‑グロビン接触で固定されている．ヘム側鎖を小さくしてグロビンとの接触減らすと，ヘムは Mb 内部で鉄‑ヒスチジン結合まわりに動的回転する現象を見つけた1）．すなわち，小さいヘムは揺らいで安定性を失う．しかし，揺らぐヘムと安定したヘムをもつ二種類の Mb で酸素親和性を比較したところ，酸素親和性はほとんど違わないと判明した．
2）ヘム分子形の改変 ヘムはピロール四分子からなる正方形分子である．ピロール環の配列を正方形から長方形・台形・不等辺四角形などに変えたさまざまなポルフィリン異性体をつくった．それらの鉄錯体を Mb に組み込んだところ，酸素親和性は 100 万倍以上の範囲で変動した．とくに，台形ヘム（鉄コルフィセン）Mb 類の場合，P50 = 7 Torr および 37 Torr が得られた．これらの Mb の酸素運搬能
力は赤血球のものと同様であり，Mb にもとづく酸素運搬体創製への素材となる2）．
3）コバルト Mb 鉄をコバルト（Co）に置換したコバルトヘムは，ヘム自身が有機溶媒中でも可逆的に酸素結合する．Co（II）ヘムを組み込んだコバルト Mb の酸素親和性は P50 = 50 Torr と低く，酸素放出能力が天然 Mb よりも格段に向上している．生理的条件での酸素放出能力は 23% と赤血球なみに大きい．Co(II)Mb のもうひとつの特徴は，一酸化炭素（CO）と結合しないことである．ヘム分解でできる CO は生体内でシグナル伝達分子として機能する．生理的濃度の CO を消去しない Co(II)Mb は，この点でも優れた特性をもつ3）．
【結論】 ヘムを置換した再構成 Mb は人工酸素運搬体として有望である．とくに台形ヘムやコバルトヘムでは Mb の酸素運搬能が赤血球なみに向上する．
【文献】
1) S. Neya; N. Funasaki, J. Biol. Chem. 1987, 262, 6725-6728.
2) S. Neya, Molecules 2013, 18, 3168-3182.
3) S. Neya; T. Yonetani; A. T. Kawaguchi, Arti¿cial Organs 2014, 38, 715-719.

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 22 , No.1, 201421

シンポジウム 2 S7完全合成化合物による酸素錯体の形成とその薬物動態○北岸宏亮，加納航治
同志社大学理工学部
1973 年，J. P. コールマンらによって酸素分子を可逆的に結合する初のミオグロビンモデル錯体 ピケットフェンスポルフィリンが合成され，それ以来，様々なポルフィリン鉄（II）錯体を用いた酸素錯体がつくられてきた．しかしながら，既報のモデル錯体はいず
れも無水の有機溶媒中でのみ酸素を結合し，生体内と同じ環境である水を媒体とした成功例は，現在までにほとんど報告されていない．
水分の混入により，中心鉄（II）の自動酸化反応が著しく加速されることが原因である．天然のグロビンタンパク質と同じように，水中で中心鉄（II）
周辺にミクロな疎水環境を構築することは極めて困難であった．
メチル化シクロデキストリン（CD）は水中においてポルフィリン鉄（II）錯体を包接し，ポルフィリン環周辺に強い疎水場をつくり出す．我々の研究グループでは，この現象に注目し，配位子を組み込んだ CD ダイマー
（Py3 CD，下図）を用いて，水中・室温で可逆的に酸素を結合するモデル錯体 hemoCD の合成に成功した（下図）1）．現在までに，この hemoCD の分子構造に改変を施すことによって，さまざまな特徴を有する酸素錯体を構築してきた1-5）．本講演では，hemoCD およびその類縁体の酸素親和性，一酸化炭素親和性，自動酸化速度，ラットを用いた薬物動態などのデータを示し，最近の研究の進捗状況について紹介する．

Figure 1. Structure of Py3 CD and its inclusion complex, hemoCD.
【文献】
1）K. Kano, H. Kitagishi, M. Kodera, S. Hirota, Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 435.
2）北岸宏亮，加納航治，人工血液 ，2009, 17, 160.
3）H. Kitagishi, S. Negi, A. Kiriyama, A. Honbo, Y. Sugiura, A. T. Kawaguchi, K. Kano, Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 1312.
4）K. Kano, S. Chimoto, M. Tamaki, Y. Itoh, H. Kitagishi, Dalton Trans. 2012, 41, 453.
5）K. Karasugi, H. Kitagishi, K. Kano, Bioconjugate Chem. 2012, 23, 2365.

22

人工血液 Vol. 22 , No.1, 2014

シンポジウム 2 S8
HemoAct™ の血液適合性および安全性評価○春木理沙 1，神山育男 2，松田信作 2，河野光智 2，田口和明 3，永尾紗理 4，丸山
1

徹 4，小田切優樹 3，小松晃之 1

中央大学理工学部，2 慶應義塾大学医学部，3 崇城大学薬学部，4 熊本大学薬学部【緒言】 我々はヘモグロビン（Hb）の分子表面に複数個のヒト血清アルブミン（HSA）を結合させたコア‑シェル型の（ヘモグロビン‑アルブミン）クラスター（Hb-HSA3，製剤名 HemoAct™ ）を開発し，新しい人工酸素運搬体としての実用化を目指した研究を進めている1-4）．
本報では HemoAct™の血液適合性および安全性評価を実施したので報告する．
【実験】 高純度 bovine Hb と HSA を二官能性架橋剤 Succinimidyl-4[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate（SMCC）で結合した後，を単離した（[Hb]=5 g/dL）
ゲルろ過クロマトグラフィー（Superdex 200 pg）により Hb-HSA（HemoAct™）．Hemox Analyzer を用いて酸素結
3（v/v））混合溶液の溶液粘度，赤血球
合解離曲線を測定，酸素親和性の指標である P50，Hill 係数（n）を決定した．HemoAct™／血液（1/1（RBC）数，白血球（WBC）数，血小板（PLT）数，活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT），プロトロンビン時間（PT）から血液適合性を評価した．また，Wistar 系雄性ラットに HemoAct™を投与（6 mL/kg）
した後の血圧変化を観測，状態観察（7 日間）と血液生化学的検査
1256（2.0×10 cpm/ 匹）
し，血中濃度の推移を観測した．
を実施した．さらに I 標識した HemoAct™を Wistar 系雄性ラットに投与【結果と考察】 HemoAct™の P50 は 9 Torr，n は 1.5 であった．自動酸化速度定数（kox）は 0.035 h-1 であり，酸素錯体の安定度は native Hb-1より増大した．一般に修飾 Hb 製剤の kox は native Hb より高くなるが，HemoAct™では中心 Hb が HSA で覆われているた（kox = 0.037 h ）め，ヘム鉄の酸化が抑制されていると考えられる．
HemoAct™／血液（1/1（v/v））混合液のずり速度‑粘度曲線は非ニュートン性を示し，ずり速度 230 s-1 における粘度は 3.3 cP であった．
RBC，WBC，PLT 数は混合比に依存して変化し，混合 6 時間後まで一定値を保った．また，APTT，PT にも変化は見られず，血液凝固能にも影響はないことがわかった．
HemoAct™投与直後に一過性の血圧変化が見られたものの，10 分以内には HSA（20 g/dL）投与群と同等値を示した．投与後 7 日間の体重増加量，7 日後の血液生化学的検査の結果は，未投与群，HSA 投与群と同等であった．HemoAct™の血中半減期（t1/2=18.5 h）は HSAよりも長く，高い血中滞留性が明らかとなった．
（t1/2=11.0 h）【結論】 HemoAct™の粘度測定，血球数測定，血液凝固能検査から，高い血液適合性が明らかとなった．また血液生化学的検査，血圧測定から HemoAct™の安全性が明らかとなった．
【文献】
1) D. Tomita, T. Kimura, H. Hosaka, Y. Daijima, R. Haruki, K. Ludwig, C. Böttcher, T. Komatsu, Biomacromolecules 2013, 14, 1816.
2) H. Hosaka, R. Haruki, K. Yamada, C. Böttcher, T. Komatsu, PLOS ONE 2014, 9, e110541.
3) Y. Daijima, T. Komatsu, Chem. Commun. 2014, 50, 14716.
化学と工業 ，2014，67，677.
4) 小松晃之，

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 22 , No.1, 201423

シンポジウム 2 S9Size Eﬀect of Hemoglobin-Albumin Microspheres on Cellular Uptake and Cell Viability（ヘモグロビン／アルブミンマイクロスフィア型人工酸素運搬体の細胞取り込みと生体適合性に与えるサイズの影響）○ Yao-Tong Lai1，太田誠一 2，赤松憲樹 3，中尾真一 3，酒井康行 4，伊藤大知 1，2
1
3

東京大学大学院工学系研究科，2 東京大学大学院医学系研究科，工学院大学環境エネルギー化学科，4 東京大学生産技術研究所

Introduction Arti¿cial hemoglobin-based oxygen carriers (HBOCs) are required for regeneration of large 3 D tissues in vitro. However, cytotoxicity
may occur due to the cellular uptake of nano-sized HBOCs [1]. Shirasu Porous Glass (SPG) membrane emulsification technique is an efficientmethod to fabricate uniform emulsions due to the narrow pore size distribution feature. In this study, we apply this technique to prepare uniform
micron-sized hemoglobin-albumin (Hb-BSA) microspheres with different diameters, and investigate the size effect on cellular uptake and cell
viability.
Materials and methods The disperse phase (2 mL, contain 10 wt% Hb and 10 wt% BSA) was pressurized by N2 through the SPG membrane (poresize: 0.5 - 10 m) to the continuous phase (20 mL kerosene with 1% TGCR), subsequently cross-linked with 10 L glutaraldehyde (25%). The size
distribution was determined by WinROOF software. Oxygen dissociation curve and Hill plots were measured by Hemox analyzer. Raw264.7, HepG2and HUVEC cells were used for the following experiments. Cellular uptake study was performed by flow cytometry by measuring theautoÀuorescence from Hb. Cells were loaded with hydroxyphenyl Àuorescein then treated with microspheres to perform the reactive oxygen species(ROS) assay. The biocompatibility of the microspheres was examined by MTT assay.
Results and discussion Uniform Hb-BSA microspheres were successfully fabricated with diameters ranged from 1.2 to 18.3 m, CV values were
below 13%. The P50 values and Hill coef¿cients of each size of microspheres were around 9.5 mmHg and 1.4, respectively. Raw264.7 phagocytosis
microspheres below 5 m as well as the detection of corresponding ROS; while HepG2 and HUVEC cells do not uptake micro-sized microspheres.
Size dependency of the microspheres was observed in viability of the three cell lines. Therefore, the effect of the microspheres from the outside of thecells such as lipid oxidation might play an important role in interaction between cells and the present microspheres.
Reference
1) K. Montagne, H. Huang, K. Ohara, K. Matsumoto, A. Mizuno, K. Ohta, Y. Sakai, J. Biosci. Bioeng., 2011, 112, 485.

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人工血液 Vol. 22 , No.1, 2014

シンポジウム 2 S10
酸素マイクロ・ナノバブル分散液を用いた完全液体換気への応用○垣内健太 1，松田兼一 2，針井則一 2，青木順子 2，武岡真司 1
1

早稲田大学大学院生命医科学研究科，2 山梨大学医学部救急集中治療学講座【緒言】 肺炎や胸部外傷により引き起こされる急性呼吸窮迫症候群（ARDS）は，現在人工呼吸管理による治療がなされているものの未だ 4 割という高い死亡率を有する疾患である．既往研究として高い酸素溶解能を有する人工化合物 perÀuorocarbon（PFC）を用いた完全液体換気（TLV）が進められたが，材料自体の問題により現在研究全体が縮小傾向にある．そこで，我々はその微小サイズ効果による水中での高い滞留性から生理食塩水中の酸素含量の向上が期待されるマイクロ・ナノバブル（MNB）に注目し，MNB 分散液を PFC の代替液として TLV への応用を目指した．今回は，MNB 液の有用性をガス運搬能及び TLV からの復帰を目指して評価した．
【方法】 重力差を利用した TLV システムを構築し，in vitro 試験ではモデル肺を，in vivo 試験ではモデルラットをそれぞれ使用した実験を行った．
（実験Ⅰ）
in vitro 試験としてモデル肺への流入部位より得た液体の酸素含量を測定した．具体的にはヘモグロビンへの酸素結合率から，気相状態で存在する酸素を含めた新規酸素含量測定法を開発し，液中酸素含量を算出した．
（実験Ⅱ）in vivo 試験では構築した TLV システムを用いて TLV 試験を行った．A line よりモニタリングした血圧および心拍数よりラットの状態を確認し酸素富化
液の酸素含量と生存時間との関係を評価した．
（実験Ⅲ）6 分間以上の TLV を行いその後人工呼吸器に付け替えを行い TLV からの復帰を試みた．実験Ⅱで用いた評価項目に加え A line より採血した血液のガス分析を行った．
【結果および考察】 実験Ⅰから，酸素マイクロ・ナノバブル分散液は生理食塩水の約 7 倍もの酸素含量を持つことが明らかとなった．
実験Ⅱ試験から，TLV モデルラットの 40 分間以上の生存を達成した（生理食塩水では 6 分のみ）
．また，酸素含量と生存時間に正の相関が認められたことから酸素含量のさらなる増加により生存時間の延長が期待される．実験Ⅲから TLV 復帰後人工呼吸器による呼吸管理で血中酸素飽和度および血圧の回復が確認できた，しかし，二酸化炭素分圧および pH を正常値まで回復させることができなかった．これは，肺内部の液体が完全には除去されなかったため換気障害が生じたと考えられる．
【結論】 酸素マイクロ・ナノバブル分散液は肺内部でも酸素キャリアーとして機能することを確認できた．TLV 後の肺には生理食塩水が残存しているため酸素ガスは拡散するものの二酸化炭素の拡散に障害が残ることが分かった．肺内部から液体を効率よく除く工夫が今後必要となる．

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 22 , No.1, 201425

シンポジウム 3 S11
人工血小板／ H12 (ADP) リポソームの製造工程・品質の管理武岡真司
早稲田大学理工学術院【緒言】 我々は，合成ペプチド（H12）を表面に担持し，ADP を内包させた H12（ADP）リポソームを，止血能を有するリポソーム製剤として開発してきた．本リポソームは，異なる機能を有する 6 種類の分子が集合して特定の集合構造を形成することによって成る製剤である．そのため定められた方法によって得られた試料の構造の確認や成分の定量を厳密に行い，規格範囲内にあることを確認した上で種々の試験に供されなければならない．今回は，大学の 1 研究室内の限られた条件の中でリポソーム製剤の製造工程・品質の管理をするためのシステムの構築について報告する．
【方法】 本リポソーム製剤の調製工程は，H12 結合 PEG 脂質の有機合成，混合脂質の調製，ADP 内包リポソームの調製ならびに未内
包 ADP の除去と濃度の調整，の大きく 3 工程からなる．スケールアップを鑑みて，大型エクストルーダーと限界ろ過膜を導入した．
各工程は標準操作手順書（SOP）として文書化し，更にこれを実施する際のチェックリストを整備した．
本リポソーム製剤の仕様は，粒子径とその分布（動的光散乱法），ゼータ電位
（ゼータサイザー），脂質組成（NMR），H12 の定量（蛍光），内包 ADP ／未内包 ADP の定量（HLPC）によって求め暫定版として定めた．各測定においても SOP を定め，チェックリストならびに生データーをエクセル上にて管理し，各項目が自動計算によって仕様表に反映される様にした．これらの SOP やチェックリスト，エク
セルデーターはクラウド上で管理され，複数によるチェックならびに確定するプロセスを整えた．
【結果および考察】 大学の研究室は担当学生の入れ替わりが激しく，また個々の研究テーマには創造的なものが求められる．従って，
既に確立された試料の大量製造を管理するためには，誰でも行える様な分かり易い SOP の構築が必要である．経験値の異なる複数の学生に SOP とチェックリストを使ってもらい，ヒアリングを重ねて誤解の生ずる余地をできるだけ排除し，画像や動画を取り込んだ
分かり易い SOP を構築することができたと思われる．また，チェックリストも紙媒体から電子媒体へと移行し，その管理体制を構築した．あらゆるレベルの失敗を共有し，解決策を確定できたら文書化し，SOP やチェックリストを随時バージョンアップできる体制を重視した．この様な変更は管理上望ましくないとの考えもあるが，大学の性格上創造的な活動による課題解決と文書による共有化は意義があると考えた．
【結論】 大学の研究は兎角研究者個人のスキルや能力に依存する場合が多いが，共同研究者に試料を配布したり企業に技術移転する段階になると製造工程や品質の管理が重要となり，個人に依存する体制には無理がある．そのために分かり易い SOP やチェックリストの構築による大学の技術の標準化は今後益々重要となると思われる．

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人工血液 Vol. 22 , No.1, 2014

シンポジウム 3 S12
血小板減少状態における血小板代替物 H12 (ADP) リポゾームの体内動態解析○橋本麻衣 1，田口和明 2，大柿小田切優樹 2，丸山 徹 1
1

滋 1，異島優 1，渡邊博志 1，西川可穗子 3，木下

学 3，武岡真司 4，池田康夫 4，半田誠 5，

熊本大学薬学部，2 崇城大学薬学部，3 防衛医大，4 早稲田大学理工学術院，5 慶応義塾大医学部【緒言】 H12 (ADP) リポソームは，ヒト血小板に匹敵する止血効果を発揮することから，血小板代替物としての臨床応用が期待されている．薬物の体内動態は，非臨床試験及び初期の臨床試験において必須な情報であり，臨床適用で想定される種々の条件下で，血中滞
溜性，臓器分布，代謝性及び臓器蓄積性を評価する必要がある．実際，ナノ医薬品の開発に関する厚生労働省 / 欧州医薬品庁の共同リ
フレクションペーパーにも，安全性の観点から体内動態解析の重要性が明記されている．このような背景のもと，H12 (ADP) リポゾー
ムの体内動態解析に取り組んできた1，2）．今回は，H12 (ADP) リポゾームの適応症を考慮し，血小板減少状態における体内動態について検討した．
【実験】 血小板減少症モデル動物として，ブスルファン誘発血小板減少症ラットと希釈性血小板減少症ラットを用いた．H12 (ADP) リ
ポゾームの体内動態は，脂質膜部分のコレステロールを 3 H で，内封した ADP を 14 C で標識化し，放射活性をモニタリングすることで解析した．
【結果と考察】 血小板減少症時における H12 (ADP) リポゾームの体内動態を解析したところ，健常時と比べて，血中滞溜性が若干低下していたものの，主に肝臓と脾臓に分布して代謝された後に，脂質膜は糞中へ，内包された ADP は尿中へ排泄された．また，臓器蓄積性も認められなかった．繰り返し投与したところ，健常動物では，PEG 化リポゾーム製剤の臨床応用における課題の一つである
Accelerated Blood Clearance（ABC）現象 が観察されたものの，血小板減少状態では，ABC 現象の原因となる IgM 抗体の産生亢進が減弱化し，顕著な ABC 現象は認められなかった．
【結論】 H12 (ADP) リポゾームは，適応症である血小板減少状態でも，血小板代替物として求められる体内動態特性を保持していた．
また，繰り返し投与時においても，ABC 現象を引き起こしにくい可能性を見出すことができた．これからの知見は，H12 (ADP) リポゾー
ムの臨床応用を視野に入れる場合，有用な基礎的情報になると思われる．現在，サル及びヒトにおける体内動態解析の実施で必要とされる放射活性に依存しない新たな評価法の確立を試行している．
【文献】
1) Pharmacokinetic study of the structural components of adenosine diphosphate-encapsulated liposome coated with fibrinogen γ-chain
dodecapeptide as a synthetic platelet substitute, Drug Metab Dispos, 41, 1584-91 (2013).
2) Pharmacokinetic study of adenosine diphosphate-encapsulated liposome coated with ¿brinogen γ-chain dodecapeptide as a synthetic platelet
substitute in an anticancer drug-induced thrombocytopenia rat model, J Pharm Sci, 102, 3852-9 (2013).

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 22 , No.1, 201427

シンポジウム 3 S13
人工血小板 /H12（ADP）
リポソームの超微形態的検討
─ in vitro および in vivo における人工血小板の挙動に関する電顕的観察─
○鈴木英紀 1，萩沢康介 2，木下
1
3

学 2，武岡真司 3，半田誠4

日本医科大学共同研究センター・形態解析共同研究施設，2 防衛医科大学，
早稲田大学理工学術院，4 慶應義塾大学医学部輸血・細胞療法センター【緒言】 フィブリノゲン g 鎖Ｃ末端のドデカペプチド（H12）を結合させた人工血小板 H12-リポソームは，ヒト血小板浮遊液のコラーゲ
ンおよび ADP により惹起される血小板凝集を促進させることを報告してきた．今回，トロンビン刺激凝集または非凝集時におけるH12-リポソームの挙動および ADP を内包させた H12（ADP）リポソームのウサギ肝出血モデルでの人工血小板の分布を電顕的に観察した．
【方法】 1）in vitro の検討は，3.8％クエン酸ナトリウムを抗凝固剤として健常人ボランティアの肘静脈から採血し，遠心して多血小板
血漿（PRP）を得て，さらに遠心してペレットを HEPES-Tyrode 液で洗浄した血小板浮遊液を用いた．これに H12-リポソーム（最終濃度
2 mg/ml）を加え，トロンビン（最終濃度 0.1 U/ml）を加えて 37℃で撹拌または非撹拌で，10，30 秒および 5 分間静置し，固定後，電顕試料とした．凍結超薄切片を作製し，ウサギ抗 H12 抗体，さらにコロイド金標識二次抗体を使う免疫電顕法で観察した．一部は急速凍結レプリカ法で観察した．2）in vivo の検討では，血小板数を 19.5±5.8×104/ml ~ 5±0.6×104/ml に減少させたウサギで行った．すなわ
ち，右大腿動脈および左大腿静脈にカニュレーションを行い，動脈は脱血と動脈圧測定用，静脈は輸液および輸血用とし，脱血と低分
子デキストラン液および洗浄赤血球の輸血を繰り返し，血小板数を減少させた．この後，ウサギを開腹し，肝臓の一葉に Derma punch（直径 5 mm）を刺して貫通，損傷させ，oozing 出血を持続させた．バルーンカテによる圧迫止血を行いながら，直ちに H12-（ADP）リポ
ソームを体重当たり 20 mg/kg 投与した．同時に，損傷 0 分から 5 分経過後，および 5 分から 10 分経過後の出血量を測定し，止血を確認できたものは閉腹し，臓器出血量と 24 時間の生命予後について比較した．このようなウサギの一部は肝出血部を切り出し，電顕検索試料とした．
【結果】 1）H12-リポソームを凍結超薄切片法で観察すると，直径 100〜400 nm 前後の粒子状を示し，リポソームに特徴的な二重膜も観察された．免疫電顕法では，H12 の存在を示す金粒子がリポソーム上に特異的に分布した．凍結レプリカ法では，リポソームは球状に観察された．血小板に H12-リポソーム，さらにトロンビンを加えて撹拌すると凝集が起こる．血小板間には大きな隙間が見られた．
この隙間には免疫電顕法で観察すると金粒子でラベルされたリポソームが分布していた．急速凍結エッチングレプリカ法では，血小板間にリポソームが多数観察され，大部分のリポソームは楕円体を示した．非凝集の血小板では，リポソームは血小板表面および開放小管系中に見られた．2）肝損傷部では多くの赤血球，少数の白血球が見られ，損傷部からやや遠い部位にフィブリンに囲まれた血小板凝集塊が観察された．凝集塊中には in vitro の凝集塊と同じように隙間が見られ，この中にリポソームが多く観察された．
【考察】 in vitro および in vivo の実験で，人工血小板のリポソームはともに血小板凝集塊に巻き込まれることを観察した．これらの結果は，人工血小板が血小板減少状態であっても，血小板凝集塊を大きくすることによって生体の止血に強く関与するものと考えられた．

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人工血液 Vol. 22 , No.1, 2014

シンポジウム 3 S14
出血性ショック時の蘇生輸血（赤血球：血小板：血漿の 1：1：1 輸血）と血液代替物使用の可能性○萩沢康介 1，木下
西田育弘 1
1
7

学 2，西川可穗子 3，柳川錬平 4，多喜川真人 5，土井麻美 5，武岡真司 5，半田誠 6，斎藤大蔵 7，関修司 2，

防衛医科大学校生理学講座，2 免疫微生物学講座，3 救急部，4 防衛医学講座，5 早稲田大学先進理工学部，6 慶應大学医学部，
防衛医科大学校・防衛医学研究センター外傷研究部門【緒言】 我々は低血小板状態で進行する出血に対して，H12 (ADP) リポソーム投与が血小板輸血と同等の止血救命効果を発揮し，血小板代替物として機能することを報告してきた 1 ．一方で最近，出血性ショックの蘇生には赤血球：血小板：血漿を 1：1：1 でバランス良く投与することが推奨されている．今回は易出血性病態における出血性ショックが血小板のみならず赤血球輸血が必要となるような重篤な出血病態を作製し，この救命対策に着目したモデル開発を紹介する．
【実験】 2 kg の家兎で脱血と，血小板・血漿成分を遠心分離し赤血球のみの返血を繰り返し，循環血液量のほぼ 2 倍となる 400 ml の血液交換を行う．この過程で Hb 値が 6 g/dl を下回った場合に，あらかじめドナー家兎から用意した濃厚赤血球を輸血する（平均投与量8 ml）．400 ml の血液交換終了後に，肝臓に臓器損傷を作成し臓器出血を起こさせる．出血部位に damage control（圧迫止血）を行いながら，血小板・凝固因子の輸血（補充）を行ない，急性期予後を比較する．
【結果と考察】 400 ml の脱血返血で，平均血圧（MAP）
36 mmHg，Hb 5.7 g/dl，血小板数 44×103/µL に低下した．赤血球輸血後は Hb 7.3 g/
dl まで上昇した．肝損傷部の出血量（損傷から 10 分間）は平均 25 ml となり，凝固因子（＋赤血球輸血）のみ補充した群では止血不能で全例が数時間以内に出血死した．血小板補充（凝固因子＋赤血球輸血）群は平均 25 分で止血され 75% が救命できた．今後は赤血球：血小板：血漿の蘇生輸血を各代替物で置換できるかを検討していく予定である．
【文献】
1) Hagisawa K, Nishikawa K, Yanagawa R, Kinoshita M, Doi M, Suzuki H, et al. Treatment with ¿brinogen γ-chain peptide-coated, adenosine
5ʼ-diphosphate-encapsulated liposomes as an infusible hemostatic agent against active liver bleeding in rabbits with acute thrombocytopenia.
Transfusion. 2014 Aug 22. doi: 10.1111/trf.12829. [Epub ahead of print]

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 22 , No.1, 201429

一般演題 1 G1
（ヘモグロビン‑アルブミン ) クラスター HemoAct™ の分子構造調節○山田佳奈 1，春木理沙 1，田口和明 2，永尾紗理 3，丸山
1

徹 3，小田切優樹 2，小松晃之 1

中央大学理工学部，2 崇城大学薬学部，3 熊本大学薬学部【緒言】 ヘモグロビン（Hb）の分子表面に複数個のヒト血清アルブミン（HSA）を共有結合した（ヘモグロビン‑アルブミン）クラスター（Hb-HSA3，製剤名 HemoAct™ ）を開発し，人工酸素運搬体製剤としての実用化を目指した研究を進めている1-3）．本報では，従来のHb-HSA3 に加え，HSA 結合数を増やした Hb-HSA4，さらには Hb の Cys-93(E) を分子内架橋した EEHb-HSA3 を新たに合成し，その構造と酸素結合能を明らかにしたので報告する．また，これら 3 種の製剤をラットに投与した後の血中滞留性についても評価したので併せて報告する．
【実験】 高純度 bovine Hb の PBS 溶液（[Hb]=0.1 mM）に架橋剤 Succinimidyl-4-[N-maleimido- methyl]cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) を加え，Hb の分子表面にマレイミド基を構築した後，過剰量の HSA ([HSA]/[Hb]=40 (mol/mol)) と反応させることにより Hb-HSA4 を合成した．また，二官能性架橋剤 1,11-Bis(maleimido)triethyleneglycol [BM(PEG)3] を用いて Hb の E 鎖にある Cys-93 を分子内架橋した EEHbを作成し，それをコアとした EEHb-HSA3 を合成した．Hb 定量／蛋白質定量から平均 HSA 結合数を決定，等電点電気泳動から pI 値を測定した．酸素親和性の指標である P50 及び Hill 係数（n）は Hemox Analyzer を用いて決定した．また 125 I 標識した Hb-HSA3，Hb-HSA4，（8 週令）に投与（2.0×106 cpm/ 匹）し，血中濃度の経時変化を観測した．
EEHb-HSA3 を Wistar 系雄性ラット【結果と考察】 SMCC 及び HSA の添加量を従来法の 2 倍にすることで，Hb-HSA4 を合成することができた（Hb1 分子当たりの平均
よりも HSA（pI=4.9）に近づき，酸素親和性は Hb-HSA3 と同値（P50＝9 Torr）であっ
HSA 結合数は 4.2）
．等電点
（pI=5.0）
は Hb-HSA（pI=5.1）
3
た．一方，SDS-PAGE から Cys-93(E) が分子内架橋した EEHb の生成を確認．この EEHb をコアとして合成した EEHb-HSA3 の等電点．
（pI=5.1）
は Hb-HSA3 と同等であり，酸素親和性，酸素錯体安定度は Hb-HSA3 よりやや増大した（P50＝6 Torr）（t1/2）
はそれぞれ 18.5 h，19.1 h，13.8 h であり，HSA（t1/2=11.0 h）
よりも長いことがわかっ
Hb-HSA3，Hb-HSA4，EEHb-HSA3 の血中半減期た．これは大きな分子サイズによるものと考えられる．
【結論】 HSA 結合数を増やした Hb-HSA4，Hb の Cys-93(E) を分子内架橋した EEHb-HSA3 を合成し，その特徴，酸素結合能を明らかにした．ラット投与後の血中濃度推移から Hb-HSA3，Hb-HSA4 および EEHb-HSA3 の t1/2 を測定，いずれも高い血中滞留性を有することがわかった．
【文献】
1) D. Tomita, T. Kimura, H. Hosaka, Y. Daijima, R. Haruki, K. Ludwig, C. Böttcher, T. Komatsu, Biomacromolecules 2013, 14, 1816.
2) H. Hosaka, R. Haruki, K. Yamada, C. Böttcher, T. Komatsu, PLOS ONE 2014, 9, e110541.
化学と工業 ，2014，67，677.
3) 小松晃之，

30

人工血液 Vol. 22 , No.1, 2014

一般演題 1 G2ポリリン酸修飾ヒアルロン酸ゲルを用いた新規局所止血材の開発○迫田
1

龍 1，穂積卓朗 2，金子誠 3，太田誠一 4，市村重俊 1，矢冨裕 3，伊藤大知 2，4

神奈川工科大学大学院工学研究科，2 東京大学大学院工学系研究科，3 東京大学医学部附属病院，4 東京大学大学院医学系研究科【緒言】 現在，臨床現場では酸化セルロースやフィブリン糊などが外科用局所止血材として使用されるが，炎症の増大や感染症のリス[ ] [ ]
（HA）を用いた 2 液混合型のゲルであクがある 1 ，2 ．このため我々は，これら副作用の可能性が低い生体親和性に優れたヒアルロン酸[ ]る HAX ゲルと，止血作用を示す材料であるポリリン酸（PolyP）に注目した 3 ．HAX は HA の一部にヒドラジド基を修飾した HA-ADHとアルデヒド化した HA-CHO から成り，両者を混合することで架橋が形成され，局所で速やかにゲルを作製できる．また PolyP は，血小板の濃染顆粒に存在し，出血時に放出されて血液凝固カスケードの複数のステップに関与し，止血効果を示すことが近年明らかになりつつある．本研究では，PolyP で修飾した HAX ゲルを作製し，2 液混合型の新規局所止血材の開発を目指した．
【実験】 HA-ADH（HA 分子量 800 kDa，修飾率 56.3%）のヒドラジド基の一部に対し，イミダゾールで活性化したヘキサメタリン酸（重合度 13）を用いて，PolyP 修飾 HA（HA-PolyP）を合成した．FT-IR にて合成の確認を行い，モリブデンブルー法によるリンの滴定によって，PolyP の修飾率を算出した．そして，止血効果を検討するためにヒト標準血漿（コアグトロール N：シスメックス製）と凝固により形成されるフィブリン塊の弾性変化を継時的に測定可能なソノクロット（IMI 社）を用いて，活性化剤が存在しない系でフィブリン塊の弾性変化を評価した．
【結果と考察】 PolyP が ADH に対して 7.06%，HA 全体のカルボキシル基に対しては 3.97% 修飾された HA-PolyP の合成に成功した．
血漿を用いた止血効果を検証した結果，HA-PolyP の添加による弾性率の上昇が確認された．よって，HA-PolyP の一部がフィブリン繊
維形成時に取り込まれてフィブリン架橋を補強することが示唆され，クロット弾性率上昇が加速し，最終的に弾性率が増加していると考えられた．以上より HA-PolyP を用いた 2 液混合型の新規局所止血材としての利用が期待される．
【文献】[1] Jean E. Bjorenson et al., Journal of Endodontics, 1986, 12 (7), 289-292.
[2] Hardean E. Acheck et al., Annals of Surgery, 2010, 251 (2), 217-228.
[3] Stephanie Smith, James H. Morrissey et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2006, 103 (4), 903-908.
【謝辞】 ソノクロット装置をお貸しいただいた IMI 株式会社に感謝致します．

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 22 , No.1, 201431

一般演題 2 G3ラット肺切除周術期出血モデルにおけるヘモグロビン小胞体投与後の循環動態○松田信作 1，神山育男 1，河野光智 1，渡辺真純 1，堀之内宏久 1，2，酒井宏水 3，小林紘一 11慶應義塾大学医学部呼吸器外科，2 さいたま市立病院呼吸器外科，3 奈良県立医科大学医学部化学教室【緒言】 血液代替物として開発されたヘモグロビン小胞体（HbV）はヘモグロビンを期限切れのヒト赤血球から精製濃縮し，リン脂質小胞体に内包した小球粒子（直径 250 nm）である．血液型がなく，ウィルスなどの感染源を排除し，室温で 2 年以上の保存が可能であり，
これまでに動物実験において酸素運搬体として機能する事が確認され，出血性ショック蘇生液としての効果と安全性が実証されている．我々は手術中の大量出血に対する投与により，赤血球輸血の回避が可能となると期待されている．これまでに肺切除術中に大量出血する動物モデルとして，マウスに 40％交換輸血を行い，同時に左肺全摘術を行うモデルを作成し HbV 投与の有効性と安全性を確認しているが，本実験ではラットに対して肺切除術を行い，同時に循環血液量の 30％を脱血する肺切除周術期出血モデルを作成した．
観血的動脈圧モニタリングを行い，ヘモグロビン小胞体投与が循環動態に及ぼす影響を評価し，ヘモグロビン小胞体投与の有効性と安全性を検証する．
【実験】 Wistar ラット（雄性，8 週齢，体重 250〜300 g）に麻酔をかけた後，頚動脈と頸静脈にカニューレを挿入する．動脈圧連続モニ
タリングを開始する．経口挿管し，人工呼吸器に接続して一回換気量 10 ml/kg body weight，呼吸回数 80/min，PEEP 2〜3 cmH2 O，FiO2
0.21，セボフルレン 0.5〜1.0% で維持する．第 5 肋間開胸し，肺門を一括結紮した後，左肺を切除する．血圧の変動に注意し，頸動脈
カニューレより全循環血液量の 30％を脱血する．脱血量と等量のヘモグロビン小胞体分散液を頸静脈ラインから輸液する．その間，動脈圧の連続モニタリングを継続し記録する．閉胸し手術を終了する．人工呼吸器を止め，自発呼吸を確認後，抜管する．血圧モニタ
リングは術後 1 時間まで継続する．
【結果と考察】 肺切除後のラットの収縮期血圧は 100 mmHg 前後であった．30% の脱血により 30〜50 mmHg 程度の血圧低下を認めたが，ヘモグロビン小胞体の投与により速やかに血圧は上昇し回復し，投与後 10 分での血圧は 110 mmHg 前後であった．その後も血圧は 1時間以上維持され，閉胸して手術を終了し，人工呼吸器からの離脱も可能であった．
【結論】 ラット肺切除周術期出血モデルを作成し，ヘモグロビン小胞体の投与により血圧が維持され循環動態が安定した．ヘモグロビ
ン小胞体投与は外科的侵襲に加え，呼吸機能が低下する肺切除手術時の出血においても有効である可能性が示唆された．

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人工血液 Vol. 22 , No.1, 2014

一般演題 2 G4
脳虚血再灌流傷害に対する人工酸素運搬体の経動脈的投与による治療戦略○鐙谷武雄，新保大輔，七戸秀夫，中山若樹，数又研，宝金清博
北海道大学脳神経外科【緒言】 我々はラットの一過性中大脳動脈閉塞モデル（tMCAO）
を用いて，虚血再灌流（I/R）傷害の治療目的で人工酸素運搬体 Liposomeencapsulated hemoglobin（LEH）を再灌流領域に経動脈選択的に投与し，良好な脳保護効果を得ることが出来た1）ので，その機序の考察も含めて報告する．
【実験】 雄の SD ラットで糸栓子による tMCAO（2 時間）を行い，通常の再灌流をする群（control 群），再開通内頚動脈より LEH を灌流する群（LEH 群），生理食塩水を灌流する群（vehicle 群）を作成した．LEH は Hb 濃度が 6 g/dl のものを 20 ml/kg で投与した．投与速度の違いで，①白血球の流入抑制に重きを置いた 2 時間投与実験，②酸素投与に重きを置いた 15 分投与実験の二つのシリーズの実験を行った．各ラット群とも 24 時間後に神経障害度を評価した後，脳組織を摘出して，脳梗塞，浮腫の範囲を TTC 染色で評価し，好中球の脳内浸潤を myeloperoxidase (MPO) の Western blotting で評価し，MMP-9 の発現，活性を Western blotting，Zymography で評価し，脳血液関門（BBB）の破綻を Evans Blue の脳内浸潤量で評価した．LEH と自己赤血球の組織灌流の状態を検討するため，それぞれヒト Hb 抗体とラット Hb 抗体で免疫染色を行い，その灌流範囲を比較検討した．
【結果と考察】 神経障害度は LEH 群で control 群より有意に軽く，脳梗塞体積は control 群，vehicle 群に対して，LEH 群で有意に縮小し，また脳浮腫も LEH 群で縮小した．MPO の発現，MMP-9 の発現と活性も LEH 群で抑制された．また LEH の投与により BBB の破綻も減少した．これらの脳保護効果は 2 時間投与実験と 15 分投与実験でほぼ同等であった．Hb の免疫染色の結果では，I/R 領域微小血管内において LEH の方が自己赤血球に比べて，より微小な血管を灌流しており，LEH は病的に狭窄を来した微小血管においても効果的に灌流する可能性が考えられた．
【結論】 今回の検討から，経動脈的 LEH 投与が白血球の流入を部分的には抑制し，また，より微小な血管に効果的に酸素を運搬することにより，脳保護効果を発揮していると考えられた．血管再開通後に虚血再灌流傷害の可能性のある重症脳梗塞に対しては，このLEH 投与が新たな治療戦略の一つの候補になりうるものと考えられた．
【文献】
1) Shimbo D, Abumiya T, Shichinohe H, Nakayama N, Kazumata K, Houkin K. Brain Res. 2014, 1554, 59.

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 22 , No.1, 201433

一般演題 2 G5
CD68+CD206+クッパー細胞選択的ナノ抗酸化剤のポリチオール付加マンノースアルブミンは急性肝障害を
抑制する
○丸山
1

徹 1，前田仁志 1，田口和明 2，異島

優 1，渡邊博志 1，木下

学 3，小田切優樹 2

熊本大学薬学部，2 崇城大学薬学部，3 防衛医大

【緒言】 近年，クッパー細胞由来の活性酸素種が種々の肝疾患の発症や進展において重要な役割を果たしていることが明らかとなって
1）
いる．本研究では，クッパー細胞表面のマンノース受容体に着目し，マンノース残基を有する組換え型ヒト血清アルブミン（Man-HSA）に，ラジカル消去基としてチオールを導入したクッパー細胞指向型ナノ抗酸化剤を新たに作製し，その治療効果と作用機序を急性肝障
害モデルマウスを用いて検討した．
【実験】 Man-HSA はピケア酵母発現系より調整した．Man-HSA を 2- イミノチオランで SH 修飾することで，SH-Man-HSA を作製した（SH 付加度：7.5 mol SH/ mol Man-HSA）．1）コンカナバリンA（Con-A）誘発肝炎マウスの作成は Con-A（0.25 mg/mouse）を静脈内単回投与して，2）アセトアミノフェン（APAP）
誘発肝炎マウスの作成は APAP（300 mg/kg）
を腹腔内単回投与して作成した．
【結果と考察】 SH 基を導入したことで，SH-Man-HSA のラジカル消去能は著しく亢進した．SH-Man-HSA の体内動態を検討した結果，静脈内投与された SH-Man-HSA は速やかに血中から消失し，肝臓に分布すること，また肝臓内では大部分がマンノース受容体を介してクッパー細胞に移行することが明らかとなった．興味深いことに，SH-Man-HSA はクッパー細胞（KC）の中でも CD68+/CD206+ 細胞に選択的に分布していた．致死性 Con-A 肝炎マウスに，SH-Man-HSA を静脈内投与したところ，その生存率を有意に改善した．SHMan-HSA は，Con-A 肝炎マウスの肝障害を有意に抑制したが，その構成要素である HSA，Man-HSA 及び SH-HSA では十分な保護効
果が認められなかった．このことから，SH-Man-HSA の場合，SH 基とマンノース残基の両方が肝保護効果に必須であることを確かめることができた．その際，SH-Man-HSA は肝臓中の酸化ストレスマーカーを顕著に抑制していた．フローサイトメトリーにより，
F4/80+ROS+KC 由来の ROS 量を測定したところ，Con-A 処理により陽性細胞の割合と ROS 量が増加したものの，SH-Man-HSA はそれらの増加を有意に抑制した．SH-Man-HSA は，APAP 肝炎マウスに対しても，Con-A 肝炎と同様な機序で肝保護効果を発揮した．最後に臨床応用を考慮して，後投与での治療効果を検討したところ，標準薬として繁用されている N-アセチルシステイン（NAC）とは対照的に，SH-Man-HSA は Con-A 及び APAP 投与後の 4 時間目に投与しても優れた肝保護効果を発揮した．これらの結果から，SH-ManHSA は CD68+CD206+KC へ選択的に分布し，それより産生される ROS を効率よく除去することで，優れた肝保護効果を発揮することを明らかにした．
【結論】 今回の検討から，個々の急性肝疾患で病態発症機序あるいは初期段階における進展機序は異なるものの，CD68+CD206+KC 由
来の ROS が肝障害の進展において重要な役割を果たしている可能性を見出すことができた．クッパー細胞指向型ナノ抗酸化剤である
SH-Man-HSA は，この CD68+CD206+KC 由来の ROS を効率よく除去することができるため，種々の急性肝障害に対する治療薬としての応用が期待される．
【文献】
1) Genetically engineered mannosylated-human serum albumin as a versatile carrier for liver-selective therapeutics, J Control Release 2010, 145,
9-16.

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人工血液 Vol. 22 , No.1, 2014

一般演題 2 G6
横紋筋融解症誘発急性腎障害に対するアルブミン‑チオレドキシン融合体の治療効果と機序解明〇大柿1

滋 1，田口和明 2，西田健人 1，小玉あずさ 1，渡邊博志 1，異島

優 1，深川雅史 3，小田切優樹 2，丸山徹１

熊本大学薬学部，2 崇城大学薬学部，3 東海大学医学部【緒言】 横紋筋融解症に伴う急性腎障害（AKI）は，横紋筋の融解に伴う大量の活性酸素種の産生と炎症により誘発される予後不良な酸化ストレス疾患である．しかしながら，現在の治療法は対症療法のみで未だ有効な治療戦略の確立はない．最近，我々は抗酸化・抗炎症蛋白質であるチオレドキシン（Trx）とヒト血清アルブミン（HSA）を融合し，優れた血中滞溜性を有した融合蛋白質（HSA-Trx）を作製した．本研究では，横紋筋融解症 AKI に対する HSA-Trx の治療効果と機序解明について，グリセロール誘発横紋筋融解症 AKI マウスを用いて評価した．
【実験】 HSA-Trx は Pichia 酵母発現系より作製した．横紋筋融解症 AKI モデルは 24 時間絶水したマウスに 50% グリセロール（10 mL/kg）を筋肉内投与することで作製した．致死性 AKI モデルでは 50% グリセロールを 13 mL/kg で投与した．グリセロール投与直前に，
PBS，HSA，Trx 及び HSA-Trx を尾静脈投与し，腎機能，腎組織，腎組織中酸化ストレスに加え，炎症性サイトカイン発現量を評価した．
また，FITC 標識 HSA-Trx の静注後の腎切片を用いて腎臓内局在を検討した．
【結果と考察】 生食投与群では，グリセロール誘発横紋筋融解症に合併する AKI の発症を反映して，血清尿素窒素（BUN）及び血清ク
レアチニン（Cr）の有意な上昇と，クレアチニンクリアランス（CCr）の有意な低下が観察された．一方，HSA-Trx 投与群では，それらパラメータの変動が健常レベルまで改善していた．その際，腎機能の回復を反映して，HSA-Trx 投与群では，尿量の正常化と，横紋筋融解症 AKI に特徴的な褐色尿の軽減化が認められた．これとは対照的に，HSA 及び Trx 単独投与群では腎機能の回復は観察されなかった．
このことから，HSA-Trx による保護効果は，HSA と Trx の融合化によることが判明した．腎組織学的評価から，生食投与群では，尿細管の核脱落，円柱の形成，TUNEL 陽性細胞の増加に加えて腎組織中の酸化ストレスが亢進していたが，HSA-Trx の投与はこれらの変動を有意に抑制した．また，HSA-Trx 投与群では，生食投与群で認められる炎症性サイトカインの産生増加を有意に抑制していた．
さらに，致死性 AKI モデルを用いて 10 日間の生存観察を行ったところ，生食投与群に比べて，HSA-Trx 投与群の生存率は有意に上昇
した（20% vs 57%）．最後に，FITC-HSA-Trx を投与して融合体の腎臓内動態について検討した結果，投与 1 時間後において，尿細管上皮細胞に FITC 由来の蛍光が観察された．ここで抗 HSA 抗体及び抗ヒト Trx 抗体を用いた検討から，この蛍光が HSA-Trx に由来することを確認した．従って，HSA-Trx は血液及び間質側で生物活性を発揮するだけでなく，一部は腎尿細管上皮細胞に取り込まれ，細胞内からも作用するものと推察された．本研究では，HSA-Trx が，血中及び腎臓内の両面で，Trx の有する抗酸化・抗炎症及び抗アポトー
シス作用を持続的に発揮する結果，横紋筋融解症 AKI に対する治療薬としての可能性を見出した．

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 22 , No.1, 201435

一般演題 2 G7
小角・広角 X 線溶液散乱法によるヘモグロビンの立体構造再構築と濃厚ヘモグロビン溶液中の蛋白質間相互作用に対する pH 効果の精密評価○佐藤高彰 1，酒井宏水 2
1

信州大学繊維学部，2 奈良県立医科大学医学部【緒言】 酸素運搬を担う球状蛋白質であるヘモグロビン（Hb）は，赤血球細胞質液の主成分であり，300 mg mL-1 という例外的な高濃度で機能する．一般に，蛋白質間相互作用の変調は，蛋白質凝集に起因する疾病発生に関与する重要な問題である．疾病ヘモグロビン（HbS）の繊維形成による鎌型赤血球症はその一例である．我々は，小角散乱法を用いて濃厚 Hb 溶液中の Hb 間相互作用の解明に取り組み，生理条件（150 mM PBS，pH 7.4）の水溶液中では，300 mg mL-1 以上の高濃度であっても Hb は疑似的な剛体球のように振る舞うことを示唆してきた．本研究では，pH を 6.0~8.0 の範囲で変化させた際の Hb 間相互作用の変調について詳細に議論する．
[ ]【実験】 蛋白質試料には，日本赤十字社より提供された期限切れ血液から，ヘモグロビン小胞体（HbV）調整 1 と同様の手法で精製した
Hb を用いた．溶媒には 150 mM PBS 溶液（pH 7.4）を用い，少量の HCl または NaOH を加えることで，溶液 pH の調整を行い，pH 6.0，7.0，
7.4，8.0 の 4 つの溶液条件で Hb 溶液を調整した．重篤なケトアシドーシスでは血液の pH が 7.0 を下回ることも起こりえるため，本検
討は生理学的にも意味がある．Hb の濃度範囲は，c = 487 mg ml-1 まで拡張した．小角・広角 X 線散乱測定には，Anton Paar 社の（q は散乱ベクトル）を網羅する絶対強度測定を実現した．
SAXSess カメラを用い，0.08  q/nm-1  28
[ ]【結果と考察】 仮想的アミノ酸残基の集合体を最適化して溶液散乱データから蛋白質立体構造を再構築する手法 2 に対し，干渉性散乱の効果を解析的に除去した濃厚系の散乱曲線を積極的に利用したり，希薄系と濃厚系の散乱関数を異なる q-range で融合させて分析に用いる等，新しい適用法を提案した．これにより，溶液中の Hb は結晶構造と極めて近い立体構造を維持していることを証明した．pH
変化に伴い（微差ではあるが）測定精度から十分判別可能な特徴的な差異を小角領域に観測した．しかし，既存の分析法では，これを定で決定した形状因子 P (q)exp で除して実験
量的に説明することは困難であった．そこで，規格化した散乱強度 I (q)/c を低濃度
（5 mg ml-1）
[ ]
eff
eff
（SQ-IFT 法）3的構造因子 S (q) を求め，これにポテンシャルモデルを一切仮定せず二体相関関数 g (r) を算出する逆フーリエ変換分析法を適用して，pH 変化を反映した Hb 間相互作用の変調を可視化することに成功した．溶液 pH を 7.4 から Hb の pI に近い 7.0 へと低下
されると，静電反発の無効化により Hb 分子間の最近接距離は接触距離近くまで減少し，
g (r)eff の第一ピークが有意に鋭くなる．その際，第一配位殻は収縮し，配位数は 15％程度低下する．同時に浸透圧縮率に比例する S (q→0) の値は僅かに増加する．このように，pH 変化に対し，Hb 間相互作用は変調されるが，なおも剛体球相互作用に近い状態を維持しており，多くの蛋白質が等電点（pI）付近で，凝集体を形成したり，沈殿を生じるのと対照的である．このような分子間相互作用の ʻ 堅牢さ ʼ が恒常性維持に重要な役割を果たしていると予想される．
【文献】[1] H. Sakai, H. Horinouchi, M. Yamamoto, E. Ikeda, S. Takeoka, M. Takaori, E. Tsuchida, K. Kobayashi, Transfusion 46, 339 (2006).
[2] D.I. Svergun, M.V. Petoukhov, and M.H. J. Koch, Biophys. J. 80, 2946 (2001).
[3] T. Fukasawa and T. Sato, PCCP 13, 3187 (2011).
【謝辞】 本研究の一部は池谷科学技術振興財団による助成を受けて実施されたものである．

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人工血液 Vol. 22 , No.1, 2014

第 21 回日本血液代替物学会年次大会の開催につきましては、各企業、財団法人よりご支援をいただいております。ここに社名、法人名を記して謝意を表します。
The 21st Annual Meeting of the SBSJ is partially supported by the following
companies and foundation.

エーザイ 株式会社

一般財団法人 化学及血清療法研究所

共立製薬 株式会社

旭光通商 株式会社

島津サイエンス東日本 株式会社株式会社 十條合成化学研究所

株式会社 高長

日本分光 株式会社

後援：中央大学

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 22 , No.1, 2014

37

総

説

わが国の血友病止血治療薬の進歩と展望
Recent Pro㷅ress and Perspectives of Hemostatic Therapeutics
in Patients with Hemophilia in Japan吉岡章

Akira Yoshioka

和文抄録
血友病治療の歴史は，その「光」である止血治療薬（補充療法剤）の進歩と「影」であるヒト免疫不全ウィルス・肝炎ウィルスの感染および高額医療費の中で大きな変遷を遂げてきた．本稿では，第Ⅷ因子・第Ⅸ因子製剤の進歩について，血漿やクリオプレ
シピテートから最近のモノクローナル抗体精製製剤や遺伝子組換え型製剤までレビューするとともに，増大する止血治療薬の使用量とその高額医療費に言及した．止血治療薬の重要な合併症であるインヒビターの発生について，インヒビター用の止血治療薬は有効ではあるが高額であることを述べ，その使用ガイドライン（日本血栓止血学会）を紹介した．加えて，次世代の血友病止血治療薬の展望について解説した．

Abstract
The history of hemophilia treatment has drastically changed with regard to prognosis in patients with hemophilia, namely, novel
therapeutics for hemostatic replacement therapy (“light”) on one hand, and infections from human immunodeﬁciency virus andhepatitis B/C viruses as well as enormous costs (“shadow”) on the other hand. Biomedical technologies have developed factors
Ⅷ and Ⅸ concentrates from plasma/cryoprecipitate to monoclonal antibody-puriﬁed products/recombinant products. The
quantitative use of these products has recently been on the marked increase. Inhibitor development is one of the severe
complications in hemophilia treatment. The characteristics of inhibitor-bypassing agents are useful, but extremely costly andtreatment guidelines designated by the Japanese Society on Thrombosis and Hemostasis are revealed. In addition, hemostatic
therapeutics in the next generation of hemophilia treatment with or without inhibitor are discussed.

Keywords
hemophilia, hemostatic therapeutics, factor Ⅷ concentrates, factor Ⅸ concentrates, inhibitor-bypassing agentsⅠ．緒言

血友病は X 連鎖劣性遺伝性の血液凝固障害症で，第Ⅷ因子（FⅧ）遺伝子異常による血友病 A と第Ⅸ因子（FⅨ）遺伝子異常による血友病 B とに大別される．その頻度は男子出生 1
万人に 1〜2 人で，わが国の生存患者数は A：約 4000 人，B：
約 1000 人である．FⅧ凝固活性（FⅧ：C）または FⅨ凝固活性（FⅨ：C）の欠如〜低下は生涯にわたる重篤な出血症状をもたらす．主な症状は，反復性の皮下，関節，筋肉出血で，適切な止血治療が行われないと，歩行障害などの肢体運動機能障害を来す．時に，頭蓋内出血や消化管出血，尿路出血など致命的な出血や後遺症をもたらすこともある．
奈良県立医科大学名誉教授・前学長 〒 634-8521 奈良県橿原市四条町 840
Emeritus Professor, Former President, Nara Medical University
論文受付 2014 年 8 月 29 日 論文受理 2014 年 9 月 3 日

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血友病の止血治療の根幹は欠乏する FⅧ（FⅨ）の経静脈的補充療法である．その歴史は，「光」である止血治療薬の進歩と「影」である止血治療薬によるヒト免疫不全ウィルス（HIV）
や肝炎ウィルス（HBV／HCV）などの感染症および高額医療費であり，これら光と影の歴史の中で大きな進歩を遂げてきた1）．
本稿では，主に，止血治療薬（補充療法剤）の進歩の歴史と今後の先進的治療薬開発の展望について解説する．

Ⅱ．止血治療薬の進歩
1 ．血友病 A 止血治療薬の変遷（表 1）
止血治療薬の変遷は血友病の医学・医療の進歩の歴史であNara Medical University, 840 Shijo-cho, Kashihara, Nara 634-8521, Japan

人工血液 Vol. 22 , No.1, 2014

る 2）．現在，国内で市販されている治療薬を表 2 に示す．

表 1．第Ⅷ因子製剤の純度の変遷

1 ）Cohn 分画 I，クリオプレシピテート製剤
1970 年 代 に 初 め て Cohn 分 画 I や Pool & Shanonn（1964）のクリオプレシピテート（以下，クリオ製剤）が凍結乾燥された市販品として登場し，それ以前の全血輸血や血漿輸注に代わって画期的な変革をもたらした．しかし，クリオ製剤（2 単位（U）/mL，1 単位とは正常血漿中の FⅧ：C 量である）には大量のフィブリノゲンなどの夾雑蛋白が存在し，純度は FⅧの比活性で 0.25 U/mg 程度であった．実際の治療現場では注射筒（当時はガラス製が主流）が進まないほど粘稠で，点滴輸注が必要場合も多かった．アナフィラキシー反応の他，頻回反復投与を必要とする大出血や手術では循環血漿量の増大や高フィブ
リノゲン血症もしばしばみられた．なお，本剤は 2 人以下の国

承認
（年）

製剤

第Ⅷ因子活性（U/mL）

比活性（U/mg）

1

0.012〜0.015

血漿
クリオ製剤

1970

2

0.25

濃縮製剤

1979

25

0.41〜0.86

加熱濃縮製剤

1985

25

0.52〜1.015

モノクローナル抗体精製製剤

1988

25，50，100，200〜3,000＊

遺伝子組換え型製剤

199362.5〜750〜3,000＊＞22,500＊＊＊＊＊

ヒトアルブミン添加前
ヒトアルブミン無添加

内有償ドナー由来であったことから HIV 感染はなかった．

2 ）FⅧ濃縮製剤
1979 年 に は ク リ オ 製 剤 の 欠 点 を 補 う 形 で，FⅧ 濃 縮 製 剤（25 U/mL，比活性 0.41-0.86 U/mg）が承認，販売された．濃縮度が高いことから，少用量投与で患者血中の FVIII：C を短
時間のうちに正常化することが可能となり，大出血や手術時の止血管理を確実なものにした．また，本製剤によって 1983 年
以降自己注射（家庭注射）療法が本格化し，血友病患者のQOL は飛躍的に改善した（光）．
本製剤は，FⅧと von Willebrand 因子（VWF）の複合体製剤で，クリオ製剤よりは少なくなったものの，なお，フィブリ
ノゲンや抗 A・抗 B 凝集素（溶血性貧血の原因）などの混在もあった．また，本剤は輸入品または輸入された大量プール血漿（数千〜数万人規模）を原材料として製造された非加熱製剤（当時は加熱処理技術が未開発）であった．その結果，1970 年
代後半から 1980 年代前半にかけて HIV や B 型・C 型（当時は非 A 非 B）肝炎ウイルスの混入があり，その後のエイズや慢性活動性肝炎や肝硬変・肝がん発症の原因となった．このこと
は血友病診療の最も深刻な悲劇となった（影）．

3 ）加熱等ウイルス不活化 FⅧ濃縮製剤
ヒト血漿由来ウイルスによる感染症対策として 1985 年には加熱処理法（凍結乾燥前または後）が導入された．加熱以外にも蒸気加熱や S/D（有機溶媒 / 界面活性剤）処理などが施され，以後，上記ウイルス感染は皆無となった．しかし，一部の耐熱性ウイルスや外殻（envelope）を持たないウイルスに対する殺ウイルス効果は乏しかった．現在市販中のこの種の FⅧ/VWF
製剤（コンファクト F/ 化血研・アステラス，コンコエイト
HT/ 日本血液製剤機構）はスクリーニング検査（ウイルス核酸増幅検査，NAT）によって厳選された国内献血血漿を材料に製造されており，ナノフィルトレーションでさらなるウイル

表 2．国内で市販されている血友病止血治療薬（2014 年）
血友病 A
血漿由来

血友病 B

インヒビター保有
血友病

クロスエイトMC
ノバクトM
ファイバ（日本血液製剤機構）（化血研／アステラス）（バクスター）
コンファクトF1）
クリスマシン M
バイクロット 5）（化血研／アステラス）（日本血液製剤機構）（化血研）
コンコエイトHT1）
PPSB-HT3）（日本血液製剤機構）（ニチヤク）

遺伝子組換 コージネイトFS バイ ベネフィックス
え型
オセット（ファイザー）（バイエル）
アドベイト（バクスター）

ノボセブン HI
（ノボノルディスク
ファーマ）

オルプロリクス 4）（バイオジェン・アイ
デック・ジャパン）ノボエイト（ノボノルディスク
ファーマ）
合成

デスモプレシン注2）（協和発酵キリン）

1）FⅧ/VWF 複合体製剤，VWD にも有効
2）軽症型（一部中等症）血友病 A および VWD type 1 に有効
3）第Ⅱ，Ⅶ，Ⅸ，Ⅹ因子複合体
4）rFⅨFc 領域融合タンパク質製剤（市販予定）
5）活性型第Ⅶ因子と第Ⅹ因子の配合製剤（市販予定）

現在まで安全に使用されてきている．この製剤は最終添加のヒ
トアルブミンや残存の少量 VWF 以外にはほとんど夾雑蛋白はなく，FⅧ：C 25-200 U/mL，比活性約 3,000 U/mg と飛躍的に向上したものである．ナノフィルトレーション（現クロスエイ
ト MC は 19 nm）などウイルス不活化・除去処理も行われており，過去 25 年間みるべき副作用の報告はない．

ス除去が図られており，安全である．

3）5 ）遺伝子組換え型 FⅧ製剤（rFⅧ）

4 ）モノクローナル抗体精製 FⅧ製剤

1993 年には，Chinese hamster ovary（CHO）細胞や Chinese
hamster kidney（CHK）細胞に正常ヒト FⅧ遺伝子を導入して製造された rFⅧ製剤が承認された．本製剤は基本的には血従来の欠点をほぼ全て克服しうる画期的な血漿由来製剤として，1988 年に抗 FⅧモノクローナル抗体精製製剤（ヘモフィル M/ バクスター，1992 年からクロスエイト M/ 日赤，2013
年からは現クロスエイト MC/ 日本血液製剤機構）が導入され，ARTIFICIAL BLOOD Vol. 22 , No.1, 2014

漿由来製剤の問題点を完全に克服し，かつ，高純度（FⅧ：C
62.5‑750 U/mL，比活性；3,000‑22,500 U/mg 以上）の全く新し39

い概念の止血薬である．その後，最終工程でのヒトアルブミン
無添加のコージネイト FS バイオセット / バイエルや製造工程におけるヒト・動物由来蛋白無添加の製剤（アドベイト / バク（×103 単位）スター）が開発され，市販されている．rFⅧ製剤の導入によって，インヒビター（後述）発生率が上昇する可能性といった新しい課題が危惧されたが，これまでのところ血漿由来製剤と大差なく，安全に使用されている4）．

6 ）デスモプレシン注
合成バゾプレシン（1-diamino-8-D-arginine vasopressin）で，視床下部―脳下垂体系を介して FVIII/VWF の貯蔵部位からFVIII と VWF を放出させ，血中濃度を 2〜4 倍上昇させるので中等症〜軽症血友病 A および von Willebrand 病（VWD）
type 1 に有効である．
図 1．血液凝固第Ⅷ因子製剤の供給量および献血由来製剤比率の推移

2 ．血友病 B 止血治療薬の変遷
1 ）FⅨ複合体製剤（表 2）1972 年からは血漿由来の FⅨ複合体製剤（非加熱）が使用されていたが，1985 年には加熱処理製剤が導入された．現在市販中のものには PPSB‑HT（ニチヤク）がある．本製剤中には FⅨ以外にビタミン K 依存性凝固因子（FII，FVII，FX）と抗血栓因子（PC，PS）のほか，微量の活性型凝固因子（FIIa，
FVIIa，FIXa，FXa）も含有している．

（日本血液製剤調査機構）（×103 単位）2 ）モノクローナル精製 FIX 製剤（表 2）1993 年にノバクト M/ 化血研とクリスマシン M/ 日本血液製剤機構（FIX：C 50‑100 U/mL）が認可され，安全性や至便性が大きく改善した．後者は筆者が作成した FIX モノクロー
ナル抗体を用いている 5）．

3 ）遺伝子組換え型 FIX 製剤（表 2）
欧米ですでに使用されていた rFIX 製剤（ベネフィックス /ファイザー）（FIX：C 100‑400 U/mL）のわが国での承認・販
売は 2010 年と遅れた．本製剤は，血漿由来（pd）FIX に比べて生体内回収率が低いことから，投与量は pdFIX 製剤の約

図 2．血液凝固第Ⅸ因子（複合体を含む）製剤の供給量の推移（日本血液製剤調査機構）

表 3．患者一人あたりの年間製剤使用量と製剤費の算定（2009 年度，吉岡）

1.3‑1.5 倍量を要する．その原因は CHO 細胞内での FIX 遺伝
子翻訳後の分子修飾がヒトの場合と異なることに起因すると推定されている．

3 ．止血治療薬の使用量と高額医療費（表 2）
FVIII，FIX 製剤の使用量（供給量）は，年度ごとに右肩上がりである．FVIII 製剤では pdFVIII 製剤のシェアが 20% 以下と減少してきている（図 1，図 2）．患者数（2009 年）が血友病 A 4,317 人，同 B 933 人であることと各止血治療薬の供給量の集計から，血友病 A，B およびインヒビター患者数と6）
製剤使用量および製剤費を算定した（表 3）．患者一人当たりの製剤費のみで，A で年間 600 万円超，B で 300 万円超，インヒビター患者では 2,500 万円超となっている．これらの使用量
は，EU の主要国や米国，カナダに比較すると低い．使用量の増加は，患者の安全と QOL の改善や社会進出，社会貢献に大きく寄与してきている点は大きな成果である．しかし，ほぼ全額が公費負担であるわが国では，極めて高額な医療費が投入さ

40

患者数
使用量
製剤費
単位/人
（人） （×103 単位）（千円/人/年）
血友病 A

4,317

369,540

85,600

6,180

血友病 B

933

46,79650,2003,170

インヒビター保有患者
＊
（A＋B）

330
164,000

497,000

10,230

ファイバ＊＊＊＊

ノボセブン

56,344（mg） 171（mg）

15,40025,630＊

A：4317（ 人）×6.5（%）＋B：933（ 人）×5.2（%）≒A：281（ 人）
＋B：49
（ 人）
＝330
（人）
＊＊
血友病インヒビター患者の他に後天性血友病患者への使用も含む

れている点は問題意識をもって直視しなければならない．特に，市販後一定期間が経過した遺伝子組換え型製剤については
薬価引き下げが妥当であると考えられる．

人工血液 Vol. 22 , No.1, 2014

4 ．On demand 補充療法と定期補充療法

表 4．インヒビター保有血友病患者用バイパス止血製剤（2014 年）

出血時に，欠乏する因子を補充して早期止血を図り，関節症などの出血に伴う後遺症を食い止めることが補充療法の目的で

製剤名
（会社名）

1 バイアル（薬価）

使用量・使用法

備考

7）ある．これを on demand 治療（出血時補充療法）という ．
この場合，可能な限り早期の補充が止血のコツである．この考
え方を進化させたものとして自己注射療法（家庭治療）（1983年）があり，2007 年の調査では血友病 A 患者の 73% が実施しファイバ
（バクスター）

500 単位
50〜100単位/kg（106,991 円） 8〜12 時間毎
1000 単位（205,823 円）ている8）．
さらに，出血を待たずに一定量の補充を継続する，いわゆる定期補充療法がある．その目標は標的関節（target joint）の回避と重篤出血の予防である．生涯にわたって行われるため膨大な医療費を要するが，その費用対効果が期待されている．すでに欧米では，著しい効果のあることが報告されている．わが国の 2007 年度時点の実施率は 36% であったが，その後増加傾向である8）．

Ⅲ．インヒビター患者の止血療法
1 ．インヒビターとは200 単 位/kg/日
を越えないこと，
トラネキサム酸との併用は避ける，既往免疫反応あり

トラネキサム酸
ノボセブン HI
1 mg
初回 90㎍ /kg，
（ノボノルディスクファ（98,024 円） その後60‑120㎍/kg との併用が有効（腎尿路出血をーマ）
を 2〜3 時間毎
2 mg
除く）
，既往免疫
（189,000 円）
反応なし
5 mg
（450,177 円）
バイクロット（MC710）＊ 市販予定
（化血研）＊

（FⅦa＋FⅩ）配合製剤

主として重症血友病患者に FVIII（FIX）補充療法を反復す
ると，血友病 A 患者の 20〜30% に，B 患者の 3〜5% にインヒビターである同種中和抗体（IgG4 主体）の発生することがある．インヒビター力価の高いハイレスポンダー（HR，≧ 5 ベ
テスダ単位（BU/mL））とローレスポンダー（LR，<5 BU）とに分類されるが，一旦インヒビターが発生すると，従来の補充療法による止血効果は著明に減退〜消失し，以後の止血管理が困難となる9）．
なお，一旦発生したインヒビターは一定期間 FVIII（FIX）
製剤を使用しないとその力価は低下するが，HR では製剤の再投 与 に よ っ て 4〜7 日 後 に は 再 上 昇 す る 既 往 免 疫 反 応（anamnestic response）がみられる．

2 ．インヒビター患者用止血治療薬
現在市販中の製剤を示した（表 4）．1984 年に血漿由来の活性型プロトロンビン複合体製剤であるファイバ（バクスター）が導入された．第 II，VII，IX，X 因子の他，活性型の各因子を含有していることから，FVIII（FIX）をバイパスした止血機序を利用して止血を図るものである．遺伝子組換え型活性型
第 VII 因子（rFVIIa）であるエプタコグ アルファー（ノボセブン / ノボノルディスクファーマ）の止血機序は，損傷血管部位に露出，出現した組織因子（TF）が FVIIa と複合体を形成し，これが血小板を活性化し，FXase とプロトロンビナー
ゼ活性を亢進させ，爆発的なトロンビン形成をもたらすというものである．
インヒビター患者の止血管理ガイドライン（改訂版）が日本
血栓止血学会学術標準化委員会の血友病部会から提唱されており，有用である10）．

充療法を可能にさせる目的で，FVIII 製剤を反復投与する免疫寛容導入（immune tolerance induction，
ITI）療法が行われる．
1970 年代に Bonn 大学の Brackmannら12）によって開発された．
ITI の奏効率は，著者らが参加した国際 ITI 研究13）を含め，血友病 A では 70〜80％であり，行うべき価値があるが，血友病
B では奏効率が低いうえ，アナフィラキシーやネフローゼ症候群といった危険な合併症もあり，推奨的ではない．

Ⅳ．次世代止血治療薬
FVIII，FIX の生体内半減期（T1/2）を延長する目的で，既存の FVIII，FIX 製剤に化学修飾や遺伝子改変を施すことで，いわゆる長時間作用型とした製剤が精力的に開発されている．
これらは利便性で優れ，医療経済的にも期待できるが，分子構造の改変による新しい抗原基の出現，すなわち，新しいインヒ
ビター出現のリスクなど未解決の問題も多い．FIX 製剤では有力な製剤が出現しつつあるが，FVIII 製剤については現時点
では革新的とまでは言えない状況である．

1 ．化学修飾による長時間作用型製剤
表 2 の血友病 B 止血治療薬のうち，rFIX と遺伝子組換え
IgG1 Fc 部分を融合させた糖蛋白（MW 約 10,9000）エフトレ
ノナコグ アルファー（オルプロリクス，
rFIXFc ／バイオジェ
ン・アイデック・ジャパン）は製造販売承認を取得済みである．T1/2 E は 82.1 時間と既存の rFIX の 33.8 時間に比べて約 2.5倍と著明に長い．トラフレベル 1％への低下に要する日数はrFIXFc は 11.2 日で，rFIX5.1 日に比べて 2 倍強である．なお，
この製剤はヒト胎児由来腎細胞により産生されている14）．他のPEG 修飾やアルブミン融合製剤は開発中である．

11）

3 ．インヒビター患者の免疫寛容導入療法（ITI）

一旦発生したインヒビターを消失〜低下させ，再び通常の補ARTIFICIAL BLOOD Vol. 22 , No.1, 201441

2 ．遺伝子改変による長時間作用型製剤
FVIIa，FVIII，FIX について各社が試作しているが，未成功である．新規抗体（インヒビター）産生の可能性が危惧される．

3 ．インヒビター患者用新規止血治療薬1 ）MC710
FVIIa と FX の配合剤である MC710（バイクロット，化血研）
は FVIIa 単独よりも止血効果に優れているとの考えから，血漿由来 FVIIa プラス FX の配合製剤としてわが国で開発され，治験を終了し製造販売承認を取得済みである15）．

2 ）ACE910
FVIII の 持 つ 血 液 凝 固 補 因 子 作 用 を 代 替 す る ヒ ト 化
bispeciﬁc 抗体（ACE910）を最近中外製薬と奈良医大小児科が開発した16）．この抗体は FVIII がリン脂質膜上で演じる FIXaと FX の橋渡しによる FXase 作用を，本モノクローナル抗体（2本の Fab のそれぞれが FIXa 結合作用と FX 結合作用を保有）が代替して行うことにより，FVIII の非存在下に血液凝固が進行するという全く新しい概念に基づくものである．従って，インヒビターの有無にかかわらず，1 週間に 1 回程度の皮下注射
で出血抑制効果〜止血効果があり，定期補充療法薬としても，また，インヒビター患者用止血治療薬としても期待されている．AC910 は従来の FVIII 製剤の持つ止血治療上の問題点，
すなわち，頻回の静脈内投与とインヒビター産生のリスクを同時に回避しうる画期的な製剤で，国際的にも大きな注目を浴びている．すでに，前臨床試験は終了し，ex vivo での血液凝固改善機能は十分である．次いで，第 I 相臨床試験（二重盲検個
体間容量漸増試験）が終了しており，有望である．

謝辞

本総説論文の概要は，第 20 回日本血液代替物学会年次大会（2013 年 12 月 6‑7 日，奈良市）の特別講演 1 として講演した．
指名いただいた大会長酒井宏水奈良医大化学教室教授に深謝い
たします．

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42

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章，血友病 B の Translational research ─私の血友

人工血液 Vol. 22 , No.1, 2014

トピックス

脳虚血再灌流傷害に対する Liposome-Encapsulated Hemoglobin の経動脈的投与による治療戦略
Therapeutic Strate㷅y a㷅ainst Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury by
Usin㷅 Trans-Arterial Administration of Liposome-Encapsulated Hemo㷅lobin鐙谷 武雄，新保 大輔
Takeo Abumiya, Daisuke Shimbo

和文抄録
脳梗塞治療では血管を再開通させることが治療の第一歩であるが，再開通が得られても，虚血が深く長い場合は，虚血再灌流（ischemia reperfusion：I/R）傷害を引き起こす．I/R 傷害は微小血管レベルの傷害がその病態の主体であり，no-reﬂow 現象，透過性亢進，壁構造破綻などがみられる．これらの微小血管傷害の形成には白血球の働きが大きく，白血球を抑制することで梗塞縮小効果が得られることが動物モデルで明らかになっている．しかし，白血球の全般的な機能抑制は感染症のリスクを上げる懸念がある．そこで，我々は白血球の流入抑制を目的として，血球成分を含まない人工酸素運搬体である liposome-encapsulated
hemoglobin（LEH）を再灌流領域へ経動脈的に選択的に灌流するという治療戦略を着想した．ラットの一過性中大脳動脈閉塞モデル（2 時間虚血 /24 時間再灌流）において，再灌流開始時に LEH を再灌流領域へ局所選択的に 2 時間灌流することで，I/R 障
害を軽減できるかを検討した．その結果，LEH を投与することで，神経症状の改善，脳梗塞体積の減少，好中球マーカーのmyeloperoxidase（MPO），MMP-9 の減少を認めた．これらの結果から，LEH 投与が白血球の再灌流領域での組織浸潤を抑え，
MMP-9 発現を抑制して，脳保護効果を発揮したものと考えられた．次いで，白血球の流入抑制効果がより低いと考えられる LEHの 15 分間投与モデルの実験も行った．15 分間 LEH 投与でも，2 時間投与とほぼ同等の神経・血管保護効果を認め，LEH が自己赤血球に比較してより微小な血管に流入している所見を認めた．今回の検討から，経動脈的 LEH 投与が白血球の流入を部分的には抑制し，より微小な血管に効果的に酸素を運搬することにより，神経・血管保護効果を発揮していると考えられた．血管再開通後に虚血再灌流傷害の可能性のある重症脳梗塞に対しては，この LEH 投与が新たな治療戦略の一つの候補になりうるものと考えられた．

Abstract
Revascularization of the occluded artery is the primary step in treatment of cerebral infarction. Despite successful
revascularization, reperfusion after prolonged severe ischemia causes ischemia reperfusion (I/R) injury. I/R injury is thought tobe caused mainly by microvascular disorders consisting of no-reﬂow phenomenon, hyperpermeability, and loss of vascular wall
integrity. Many studies have shown that systemic suppression of leukocytes attenuated I/R injury in animal transient ischemic
models. However, systemic leukocyte suppression may increase the risk of infection. We therefore developed a new therapeuticstrategy to infuse liposome-encapsulated hemoglobin (LEH), an artiﬁcial oxygen carrier without blood cells, intra-arterially intoI/R region for inhibition of leukocyte inﬂux. We examined whether 2-hour intra-arterial LEH infusion at the beginning ofreperfusion could reduce I/R injury in a rat transient middle cerebral artery occlusion (2-hour ischemia/24-hour reperfuson)
model. Two-hour intra-arterial LEH infusion mediated neurological improvement, decrease of infarct volume, and lowering of
MPO and MMP-9 protein levels. These results suggest that the LEH infusion can reduce I/R injury through reducing leukocyte
北海道大学大学院医学研究科 脳神経外科 〒 060-8638 札幌市北区北 15 条西 7 丁目
Department of Neurosurgery, Hokkaido University Graduate School of Medicine, North 15 West 7, Kita, Sapporo 060-8638, Japan.
論文受付 2014 年 8 月 29 日 論文受理 2014 年 9 月 18 日

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 22 , No.1, 201443

inﬁltration with MMP-9 production. Thereafter, we examined the therapeutic eﬀects of 15-minute intra-arterial LEH infusion
which would be less eﬀective in terms of inhibition of leukocyte inﬂux. Fifteen-minute intra-arterial LEH infusion showedapproximately similar neuro- and vascular-protective eﬀects as 2-hour intra-arterial LEH infusion. Compared with erythrocytes,
LEH was infused more into the narrow microvessels. These results suggest that intra-arterial LEH infusion suppress leukocyte
inﬁltration partially and supply oxygen to smaller microvessels eﬀectively, resulting in neuro- and vascular-protective eﬀects.
This therapeutic strategy may be a promising candidate to prevent I/R injury after revascularization.

Keywords
artiﬁcial oxygen carrier, ischemia reperfusion injury, cerebral microvessel, leukocyte, ICAM‑1, MMP‑9

はじめに
脳梗塞治療では血栓もしくは塞栓による血管閉塞を解消する
こ と が 治 療 の 第 一 歩 で あ り， 血 管 再 開 通 の 目 的 で tissue
plasminogen activator（tPA）の点滴投与や血栓除去デバイスを用いた血管内治療が行われる．これらの治療によって再開通が得られた場合，再開通までの時間が短いと虚血に伴う変化は可逆的であるが，その時間が長いと再開通が得られても不可逆的な組織傷害が生じる1）．tPA では 4.5 時間まで，血管内治療では最大 8 時間までがそれぞれの治療のタイムリミットであるが，脳血流低下が大きい程，また，再開通までの時間が長くかかる程，これらの治療による脳組織のレスキューが難しくなる．特に，主幹動脈閉塞による重症脳梗塞においては再開通が得られても予後不良となる症例が少なくなく，未だ治療に困難を極めている．

虚血再灌流傷害とは組織の可逆性が失われた状態で再開通があることで逆に組織傷害の悪化を来す現象を虚血再灌流（ischemia-reperfusion：
I/R）傷害と呼ぶ．I/R 傷害は一過性脳虚血の動物モデルで詳
細に研究されているが，活性酸素の産生亢進による脳組織内での細胞レベルの傷害の他に，微小血管レベルの傷害がその病態の主体であると考えられている2）．この微小血管傷害のメカニズムとしては，no-reﬂow 現象，透過性亢進，壁構造破綻があり，それらが複合して循環不全を来し，さらなる梗塞の拡大，重篤な脳浮腫，出血を引き起こす．
no-reﬂow 現象は，1990 年代初めに動物モデルを用いた電子顕微鏡による検討で，脳微小血管内に白血球が固着し，さらに血栓が形成されて血管が閉塞する像として認められた3）．その後の分子生物学的な検討では，この画像所見を裏付ける実験結果として，血管内皮細胞において白血球の接着分子である
ICAM‑1 の発現亢進4）や血液凝固のイニシエーターである組織
5‑6）因子の発現亢進 を微小血管レベルで認めている．一方，近年の電子顕微鏡の形態学的な検討では，上記以外の別な要因による微小血管閉塞の所見も得られている．これは虚血後の再灌
流 3〜6 時間において微小血管周囲に存在するアストロサイトの終足が一過性に膨化して微小血管を狭小化，もしくは閉塞さは，血管内皮細胞増殖因子である VEGF の細胞増殖以外の機能としての血管透過性亢進作用によるものと考えられている．
I/R 傷害において VEGF を急性期に投与すると脳浮腫の悪化8）や出血変化の悪化9） が生じ，一方，抗 VEGF 抗体を投与すると浮腫や出血の程度が軽減されることが報告されている10‑11）．
壁構造の破綻については，基底膜の構成蛋白であるコラーゲン
type IV の消失が認められ，この変化には白血球から産生されるマトリックスメタロプロテアーゼ MMP‑9 が作用している12）．
これらの壁構造の崩壊は血液成分の漏出，すなわち出血の出現に関与する．これらの微小血管傷害の形成をまとめると炎症性変化としての白血球の働きが大きいことが分かる．

脳 I/R 傷害に対する治療戦略
上記の I/R 障害の発生メカニズムから，動物実験では，遺伝 子 改 変， も し く は 特 異 的 中 和 抗 体 を 用 い て ICAM‑113），
MMP‑912）を単独で，もしくは白血球14）を抑制することで梗塞縮小効果が得られることが明らかになっている．しかしながら，この治療戦略をヒトで応用する場合，白血球の全般的な機能抑制につながる可能性があり，感染症のリスクを上げる懸念がある．そこで我々は，I/R が生じる部位に限局して物理的に白血球を流入させないようにできれば，全身の免疫能の低下をみることなく同じような梗塞縮小効果が期待できると考え，血球 成 分 を 全 く 含 ま な い 人 工 酸 素 運 搬 体 で あ る liposomeencapsulated hemoglobin（LEH）を再灌流領域へ局所選択的に灌流するという治療戦略を着想した．ラットの一過性中大脳動脈閉塞モデルにおいて，再開通後の内頚動脈から LEH を灌流することで，白血球の流入を抑制して I/R 障害を軽減できるか検討した15）．

人工酸素運搬体としての LEH の特性
人工酸素運搬体として，酸素運搬の効率の良さや安全性から
ヘモグロビンを基剤とするものが長年に渡り研究されてきた．
その中で LEH は高濃度の精製ヘモグロビンをリポソームに内封させたカプセル型の人工酸素運搬体である．我々の使用した
LEH はテルモ社で開発されたもので，期限切れの赤血球製剤せる現象である7）．このアストロサイト終足膨化の病態はまだより抽出・精製したヒトヘモグロビンを平均粒子径が 200〜
250 nm の liposome 内に封入したものである16）．製剤化された十分に解明されていないが，水分子の移動に関わるアクアポリ
ン 4 の関与の可能性が考えられている．透過性亢進について

状態でヘモグロビン濃度が 6 g/dL，P50（O2）が 40‑50 torr であり，生体内でも良好な酸素運搬能を発揮することが各種動物実験で

44

人工血液 Vol. 22 , No.1, 2014

LEH（ヒト Hb 免疫染色）の分布

自己赤血球（ラット Hb 免疫染色）の分布

図 1．LEH と自己赤血球の I/R 領域での分布証明されている．特に LEH は粒径が赤血球の 1/30〜40 程度であることより，微小循環領域において赤血球に比べてより効
果的に酸素を供給できると考えられている．この特性が脳虚血に対して治療効果を生むものと期待され，全脳虚血モデル17‑19），
局所脳虚血モデル20‑24）に対して LEH の投与実験が行われ，その有効性が報告されている．

脳 I/R 傷害に対する LEH の治療効果の検討
糸栓子によるラットの一過性中大脳動脈閉塞モデル（2 時間
虚血 /24 時間再灌流）を用いて，脳 I/R 傷害に対する LEH の治療効果の検討を行った．2 時間の虚血後に糸栓子を抜いて再灌流を図った後，内頚動脈に選択的カニュレーションをして，そこから LEH を再灌流領域へ局所選択的に投与した（LEH
群）．LEH の 溶 媒 で あ る 生 理 食 塩 水 の み を 投 与 し た も の（Vehicle 群），通常の再灌流のみを行ったもの（Control 群）も作成し，LEH 群と比較した．
白血球の流入を抑制して I/R 障害を軽減できるかを検討する実験では，LEH の投与時間は安定した麻酔管理を行い得る限度から判断し，2 時間と設定して投与量と速度は 10 ml/kg/hとした15）．LEH 投与中の I/R 領域の LEH の灌流の程度を蛍光
免疫染色で検討したが，自己赤血球より良好に微小血管内を灌流していることが確認できた（図 1）．自己赤血球の灌流が抑制されていることより，目的とした白血球の物理的な流入抑制もされているものと考えられた．再灌流 24 時間後の評価で，LEH
群では Vehicle 群，Control 群と比較して，神経症状の有意な改善があり，さらに脳梗塞体積（大脳半球体積に対する％表示）の有意な減少（LEH 群：34.3±7.9％，Vehicle 群：51.4±5.2％，
Control 群：49.6±6.4％，p<0.01）を認めた（図 2）．また，ウエスタンブロッティングによる患側半球の蛋白定量の検討におcontrolvehicleLEH

図 2．LEH 投与による脳梗塞体積の減少

MMP‑9
D‑tubulin
患側
control

健側

患側

健側

患側

vehicle健側
LEH

図 3．LEH 投与による MMP‑9 発現の減少を抑え，さらには MMP‑9 発現を抑制して，微小血管の機能形態が維持することにより，脳保護効果を発揮するものと考えら
れた15）．
本実験モデルは，再灌流領域への白血球の物理的流入抑制を意図するものであったが，LEH の灌流時間は 24 時間続く再灌

い て，LEH 群 で 好 中 球 の マ ー カ ー で あ る myeloperoxidase（MPO），蛋白分解酵素の MMP‑9 の蛋白量が他の 2 群と比較して有意に減少しており（図 3），また，ザイモグラフィーによる MMP‑9 活性の検討でも LEH 群で有意な活性低下を認め

流の中の最初の 2 時間のみであること，側副血流流入の可能性もあることより（図 1 の免疫染色の結果でも自己赤血球の流入は完全に消失しているわけではない），白血球流入が完全に抑制されているモデルとは言い難かった．すなわち，白血球の流入抑制以外に LEH 自体が持つ脳保護効果についても検討する必要があると考えられた．この目的で白血球の流入抑制効果がた．これらの結果より，LEH を経動脈的に再灌流領域へ選択的に 2 時間投与することは，白血球の再灌流領域での組織浸潤より低くなると考えられる LEH の 15 分間投与モデルの実験を次に行った．

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 22 , No.1, 2014

45

引用文献
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図 4．I/R 領域内の Hb が存在した 5μm 以下の微小血管の数

15 分間投与モデルでは LEH を同じ方法で 80 ml/kg/h で 15分間投与した．2 時間投与モデルと同様に，LEH 群，Vehicle 群，
Control 群の 3 群を設けて比較検討した．まず，LEH 群で他の2 群と比較して，神経症状の改善，脳梗塞と浮腫体積の減少を認めた．また LEH 群で患側半球の MPO の蛋白量の低下を認め，また，MPO の免疫組織染色でも他の 2 群で認められた好中球浸潤をほとんど認めなかった．Evans Blue 色素の脳内への漏出量は LEH 群で低く，微小血管の壁構造の破綻が抑制されていると考えられた．また LEH 群で MMP‑9 の発現と活性の減少，ICAM‑1 の発現の減少を認めた．これらの所見は 2時間投与モデルとほぼ同等の神経・血管保護効果と言えた．15
分間投与終了後のラット脳を用いて，Hb の免疫染色を用いて微小血管の灌流の程度を各群で比較してみると，他の 2 群の自己赤血球の灌流している微小血管と比較して，LEH 群では血管径のより小さい微小血管にまで LEH が灌流していることが明らかとなった（図 4）．これらの結果から，LEH が虚血再灌
流傷害の no-reﬂow 現象でみられるような内腔が狭小化している微小血管の場合でも，効果的に酸素を運搬することにより，内皮細胞障害が抑えられて，ICAM‑1 発現抑制→白血球の接着活性化抑制→ MMP‑9 発現抑制という一連の現象が生じ，最終的に神経・血管保護効果を発揮している可能性が考えられた．

vascular response by oxidative stress following cerebral
ischemia-reperfusion injury. Curr Med Chem. 2008; 15: 1-14
3. del Zoppo GJ, Schmid-Schönbein GW, Mori E, Copeland BR,
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4.

5.

6.

7.

8.

おわりに
我々の今回の検討からは，I/R 時の LEH の経動脈的投与は，選択的カニュレーションによる投与中は白血球の再灌流領域への流入をある程度部分的には抑制し，投与終了後も LEH が径の縮小した微小血管を循環し続け，効果的に酸素を運搬していると考えられた．これらの LEH による効果が，微小血管の構造機能を維持し，ひいては神経・血管保護効果を発揮したものと考えられた．一方，過去の報告では経静脈投与でも脳保護効
果が示されており，今後，いずれの方法がより効果的であるか検討が必要と考えられる．いずれにしても，tPA 点滴治療も
しくは血管内治療後に，虚血再灌流傷害の可能性のある重症脳梗塞症例に対しては，この LEH 投与が新たな治療戦略の一つの候補になりうるものと考えられた．

46

9.

following middle cerebral artery occlusion and reperfusion
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ischemic stroke in nonhuman primates: longitudinalobservation. Artif Organs. 2013; 37: 904-912.

47

●事務局たより

日本血液代替物学会
1 ．日時：
平成25年12月 6 日（金）13：00〜

2 ．場

所：
奈良県新公会堂（ 2 階会議室）〒630‑8212

3 ．議

総会
題：① 第20回年次大会の報告② 会員動向③ 平成24年度事業報告④ 平成24年度会計報告⑤ 平成25年度事業計画（経過報告）奈良県奈良市春日野町101

以下審議内容を略記します。

④平成24年度収支決算報告が行なわれ承認された。

① 年次大会の開催状況として下記事項が報告された。
1 ）事業名 第20回日本血液代替物学会年次大会（大会長 酒井 宏水）2 ）開催年月日 平成25年12月 6 日（金）・ 7 日（土）3 ）開催場所 奈良県奈良市春日野町101 奈良県新公会堂
会議室 3 ・ 44 ）参加範囲 日本血液代替物学会会員、臨床医学・理工学
研究者、国内の大学および医療機関臨床医、
血液センター関係者② 会員状況は以下の通り
1 ）維持会員： 1 社
2 ）賛助会員： 3 社3 ）正 会 員：86名
4 ）購読会員： 3 箇所
③ 平成24年度事業報告（平成24年 4 月 1 日〜平成25年 3 月31日）が行なわれ各々承認された。
1 ）定期総会の開催
平成24年10月25日（木）旭川市大雪クリスタルホールにて開催。
2 ）第19回年次大会の開催（大会長 東 寛）
平成24年10月25日（木）・26日（金） 於 旭川市大雪ク
リスタルホール
3 ）会誌「人工血液」の発行：第19巻 3 号、20巻 1 号

48

平成24年度（自 平成24年 4 月 1 日

収
摘
要
前期繰越金
正会員会費
入
会
金
維 持会 員会 費賛 助会 員会 費購 読会 員会 費
学 生会 員会 費
雑
収
入
利
息
計

入
金
額
7,403,935
580,000
25,0004,000,000※ 600,000
30,0000
1,382,139
2,944
14,024,018

収支決算
至 平成25年 3 月31日）

支
出
摘
要
金
額
会誌出版費
1,436,620
集会・委員会費
884,143
年会補助金2,000,000
ホームページ維持費
918,750
謝金
20,000
事務費（消耗費）202,549
事務費（通信費）
71,010
雑 役 務 費57,343
次期繰越金
8,433,603
計
14,024,018※賛助会員からの平成23年度年会費（200,000円）の振込が、平成24年 4 月10日であったため、平成24年度会計に繰り入れた。
⑤平成25年度事業（経過報告）
1 ）定期総会の開催
平成25年12月 6 日（金）13：00〜13：30
於 奈良県新公会堂（会議室 3 ・4）
2 ）第20回年次大会の開催（大会長：酒井 宏水）
平成25年12月 6 日（金）・ 7 日（土）於 奈良県新公会堂（会議室 3 ・4）3 ）会誌「人工血液」の発行：第21巻 1 号

人工血液 Vol. 22 , No.1, 2014

051̲コピーライト 14.11.10 10:54 ページ49

人工血液日本血液代替物学会会誌

Artificial Blood
The Official Journal of The Society of Blood Substitutes, Japan
日本血液代替物学会
会長 武岡 真司 殿
To: Dr. Shinji Takeoka
President
The Society of Blood Substitutes, Japan

日本血液代替物学会

会誌「人工血液」に投稿した論文

表題
Manuscript Title:につきまして，倫理規定に準拠した内容であること，また，共著者の全員が内容を確認していることを誓約いたします．なお，掲載された論文の著作権は，貴学会に帰属することを認めます．
I attest that the content of the above manuscript, submitted for publication in Artificial Blood,
the journal of the Society of Blood Substitutes, Japan, conforms to ethical standards and has
been confirmed by all coauthors. We acknowledge that copyright will be held by the Society.
平成

年

月

日

Date:

代表著者（署名）
Corresponding Author（Signature）
連絡先
Contact Address:（本用紙はコピーしたものを使用されても結構です．
）
This form may be photocopied for use.

〒634-8521

日本血液代替物学会 会誌「人工血液」編集部
奈良県橿原市四条町840 奈良県立医科大学医学部化学教室内
E-mail：artificial-blood@naramed-u.ac.jp
Artificial Blood Editorial Office
The Society of Blood Substitutes, Japan
Dcpartment of Chemistry Nara Medical University
840 Shijo-cho, Kashihara, Nara 634-8521, Japan
E-mail：artificial-blood@naramed-u.ac.jp

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 22 , No.1, 201449

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8）Abbreviations should be spelled out on their first appearance.
The names of drugs, medical drugs, laboratory equipment, andso on should be given. The type, distributor（manufacturer）andthe address should also be indicated.
Example: Rhodamine B（Sigma-Aldrich, St. Louis, USA）
Polygraph system（LEG-1000; Nihon Kohden Corporation,
Tokyo）.
9）The English fonts should be Times, Helvetica, Courier, orSymbol. Text should be typed in lower-case one byte characters.
However, sentences and proper nouns should begin with an
upper-case letter.
10）Figures should be expressed in Arabic numerals. Weights
and measurements should be expressed in units such as thefollowings: m, cm, mm, μm, L, mL, μL, mol, g, mg, μg, ng, pg,
fg, N/10.
11）Figures and tables should be numbered in order of citation,and it should be clearly indicated where they are to appear in
the main text. The title, legends and description in tables andfigures should be written in English. Figures will be printed bydirect offset printing. Tables will be inputted by the Editorials
as originals.
12）References should be cited numerically in order of appearance
in the text using superscript letters as follows: 2）, 3-5）, 1, 4-6）, etc.
References should be listed using the Vancouver style as follows:
Names of all authors. Title of paper. Title of journal. Year of
publication; volume number: inclusive page numbers.
Abbreviations of journal names should be in accordance with
Index Medicus. References to books should be given as follows:
Names of all authors. Title of paper. Name of editor（s）. Booktitle. Place of publication: Publisher, year; inclusive page
numbers.
References to electronic sources should be given as follows:

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 22 , No.1, 2014

Name of website.
Address on new line（month and year of last access）.
Examples:
１. Wong NS, Chang TM. Polyhemoglobin-fibrinogen: a novel
oxygen carrier with platelet-like properties in a hemodiluted
setting. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol 2007; 35:
481-489.
２. Natanson C, Kern SJ, Lurie P, Banks SM, Wolfe SM. Cell-freehemoglobin-based blood substitutes and risk of myocardial
infarction and death: a meta-analysis. J Am Med Assoc 2008;
299: 2304-2312.
３. Sakai H, Sou K, Takeoka S, Kobayashi K, Tsuchida E.
Hemoglobin vesicles as a Molecular Assembly. Characteristicsof Preparation Process and Performances or Artificial
Oxygen Carriers. In: Winslow RM, ed. Blood Substitutes.
London: Academic Press（Elsevier）, 2006; 514-522.
４. Department of Chemistry, Nara Medical University, Japan.
http://www.naramed-u.ac.jp/〜chem/ENGLISH̲PAGE/e̲
invest̲blood. html（last accessed Nov. 2013）13）In the case of citation or reproduction of previously
published figures or tables and other content, the permission of
the copyright holder（s）must first be obtained. Copyright in the
published papers shall belong to the Society.
14）Regarding secondary use and copyright in works publishedin the Journal, secondary use may be made of the Journal, in
whole or in part, via media such as CD-ROM or the Internet.
Reproduction rights, translation rights, film rights, dominion, andpublic transmission rights（including the right to make theworks transmittable）are transferred to the Society by theauthor's submission of the aforementioned Copyright Transfer
Agreement. This clause shall not restrict reuse by the author
himself/herself, but the Editor-in-Chief must be informed in theevent of reuse.
15）No publication fee is charged for publication in the Journal,
and the author（s）shall receive as a gift 30 offprints of theircontributions. Authors will be charged for copies in excess of
this number（approximately 100 yen per copy）. Authors wanting
prints of color photos or on art paper, etc. must pay the actual
cost of such prints.
16）Address for manuscripts to be sent:
Prof Hiromi Sakai
Editor of Artificial Blood
Department of Chemistry
Nara Medical University
840 Shijo-cho, Kashihara, Nara 634-8521, Japan
E-mail：artificial-blood@naramed-u.ac.jp51054-054̲和文投稿規定 14.10.29 17:51 ページ52

投稿規定（平成25年11月20日改訂）
本誌は，血液を構成するあらゆる成分について，その代替物を開発する研究に貢献する論文，関連する情報，学会会員のための会報，学会諸規定等を掲載するが，形式にはこだわらず創
意ある投稿を広く集める．本誌への投稿者は本学会会員であることが望ましいが，投稿を希望する者は誰でも投稿することが出来る．原稿掲載の採否は，査読結果に従って編集委員会が決定する．原著論文について，他誌に既発表あるいは投稿中の論文は掲載しない．
共著者がいる場合には，共著者全員の承諾を得てから投稿する．論文の版権は本学会に譲渡しなければならない．このため，
著者の代表者は，本誌に添付の著作権譲渡同意書（CopyrightTransfer Agreement）或は，本会のホームページサイト（http://www.blood-sub.jp）からダウンロードしたものに署名
捺印の上，郵送，Fax，またはpdfファイルとしてE-mailにて編
集委員会宛に提出する．
ワープロを用いて作製した原稿の投稿を原則とする．ただし，手書き原稿による投稿でも受け付ける．欧文による投稿を歓迎する．
１）原稿の種類は，「原著論文」，「総説」，「学会報告」，「トピックス」，「オピニオン」，「海外文献紹介」から選び，これを第１頁の右肩上に明記すること．これらに該当しない原稿も受け付ける．査読意見によっては種類が変更される場合がある．次のいずれかの方法により，送付状（任意のフォーマット）を添
えて編集委員長宛に投稿する．

５）「原著論文」，「総説」，「トピックス」，「オピニオン」については，第2頁以降に和文抄録，Keywords（英文で6個程度）
を付け，最終頁または別紙に英文抄録を付けること．
６）投稿論文に記載の研究が公的助成を受けて実施された場合に は ， 謝 辞 に そ の 旨 を 記 載 す る こ と ． ま た ， Conflict ofInterests（例えば，論文に記載された薬品を販売する企業と著者との利害関係: 雇用，コンサルタント，研究助成，株式，特許など）があれば，これを第１頁の脚注，謝辞などに記載する
こと．
７）ヒトを対象とした研究結果，および動物実験の結果を掲載する場合には，各研究機関のガイドラインに従って実施したことを方法等に明記すること．
８）論文中の略語は初出の際に省略しないこと．薬品，医薬品，測定装置等は，外国語名の場合は言語のまま用い，日本語化しているものはカタカナとする．型式，販売（製造）元とその所在地も記入すること．
（例） Rhodamine B（Sigma-Aldrich, St. Louis, USA）
, ポリグラフシステム（LEG-1000; 日本光電工業, 東京）
９）句読点はコンマ（，）ピリオド（．
）とする．

i）文章と図表の電子ファイルをE-メールで送付する（使用したソフトを明記すること）．文章・表のファイル形式は，doc, txtが好ましい．図は，ppt, jpg, tiffが好ましい．

10）文中の英語に使用するフォントは，Times, Helvetica,
Courier, Symbolを原則とし，英文半角小文字とする．ただし，文頭および固有名詞は大文字で書きはじめること．

ii）ハードコピー4部を郵送する．

11）数字はアラビア数字を使い，度量衡の単位はm, cm, mm, μm,
L, mL, μL, mol, g, mg, μg, ng, pg, fg, N／10などを用いる．

２）投稿論文の査読は，編集委員長が選んだ人工血液分野の研究者に依頼する．査読意見によっては，原稿の修正を求める場合がある．修正論文（Revised Manuscript）の投稿に際しては，送付状に「査読意見に対する回答」を添え，意見に対して一つ一つ回答をするとともに，修正箇所がある場合にはこれを明記する．
３）掲載決定通知の後，著者は採択論文の文章・図表のファイ
ルを電子媒体として，指定する宛先に送付すること（使用したソフトを明記すること）．文章・表のファイル形式は，doc, txtが好ましい．図は，ppt, jpg, tiffが好ましい．
４）原稿はA4版の大きさとし，第1頁には表題，英文表題，著

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者名，全著者所属，英文著者名，英文著者所属，続いて連絡の取れる著者（corresponding author）の住所，英文住所を記入する．手書き原稿の場合はＢ5版，1行20字，20行とする．

12）FigureとTable：引用順にそれぞれ番号を付けること．表
題，説明，図表中文字は，全て英文とすることが好ましい．本
文中に挿入箇所を明記すること．Figureは直接オフセット印刷とする．Tableは編集部にて入力し原図とする．
13）文献：本文に引用した順序に番号を付け，文中では2），3-5），1，4-6）などとする．文献の記載法はthe Vancouver styleに従う．全
著者名．論文題名．誌名 西暦発行年；巻数：頁〜頁．とし，誌名の省略は医学中央雑誌またはIndex Medicus に準拠する．
単行本の場合は全著者名．題名．編集者名．書名．発行地：発行書店，年号；頁〜頁．の順とする．電子文献の場合は，ホームページ名．改行してアドレス（引用した西暦年月）とする．

人工血液 Vol. 22 , No.1, 2014

054-054̲和文投稿規定 14.10.29 17:51 ページ53（例）
１. 高折益彦. 人工酸素運搬体:その将来への期待. 人工血液2007;15:90-98.
２. 橋本正晴. 単回投与毒性試験. 野村 護, 堀井郁夫, 吉田武美編. 非臨床試験マニュアル. 東京: エルアイシー, 2001;3748.
３. Wong NS, Chang TM. Polyhemoglobin-fibrinogen: anovel oxygen carrier with platelet-like properties in ahemodiluted setting. Artif Cells Blood Substit Immobil
Biotechnol 2007; 35: 481-489.
４. Natanson C, Kern SJ, Lurie P, Banks SM, Wolfe SM.
Cell-free hemoglobin-based blood substitutes and risk of
myocardial infarction and death: a meta-analysis. J Am
Med Assoc 2008; 299: 2304-2312.
４. Sakai H, Sou K, Takeoka S, Kobayashi K, Tsuchida E.
Hemoglobin vesicles as a Molecular Assembly.
Characteristics of Preparation Process andPerformances or Artificial Oxygen Carriers. In: Winslow
RM, ed. Blood Substitutes. London: Academic Press（Elsevier）, 2006; 514-522.
５. Department of Chemistry, Nara Medical University, Japan.
http://www.naramed-u.ac.jp/〜chem/ENGLISH̲PAGE/e̲
invest̲blood. html（last accessed Nov. 2013）14）既発表の図表，その他を引用，転載する場合には，あらか
じめ版権所有者の許可を得ること．また，掲載論文の著作権は本学会に帰属する．
15）二次掲載について．本誌は，他の言語ですでに掲載された論文を和文で二次掲載することは二重投稿ではなく正当な掲載と認めるが，著者は以下の事項を遵守する．
ａ）すでに掲載された論文であること．
ｂ）著者は両方の雑誌の編集者より許可を得ていること．二ARTIFICIAL BLOOD Vol. 22 , No.1, 2014

次掲載する編集者に最初に掲載されたもののコピー，別刷，もしくは原稿のいずれかを添付すること．
ｃ）論旨を変えないこと．執筆者は同一（順不同）であること．
ｄ）二次掲載版のタイトル・ページに掲載される脚注には，その論文の全体もしくは一部分がすでに掲載されている旨を明記し，更に初出文献も示すこと．適切な脚注の例を以下に示す．「This article is based on a study firstreported in the［...雑誌タイトル（完全な典拠情報を添えたもの）...］（訳：この論文記事は，［...］に最初に報告された研究に基づくものである）」．
これらの要件を満たしている場合は，その旨を明記して，総説
または論文記事（二次掲載）として投稿する．
16）本誌掲載著作物の二次利用および著作権について．本誌の一部，もしくは全部をCD-ROM，インターネットなどのメディ
アに二次利用する場合がある．本誌に掲載する著作物の複製権・翻訳権・上映権・譲渡権・公衆送信権（送信可能化権を含む）は，著者が上述の著作権譲渡同意書を提出することにより，本学会に譲渡される．本項は，著作者自身の再利用を拘束する
ものでは無いが，再利用する場合は，編集委員長に通知をする
こと．
17）掲載料．掲載料は無料とし，論説，総説，原著，報告等については別刷り30部を贈呈する．それを越える分についての費用は著者の負担とする（およそ1部100円）．カラー写真掲載・
アート紙希望などの場合は，著者の実費負担とする.
18）原稿の送付先〒634-8521
奈良県橿原市四条町840
奈良県立医科大学化学教室内「人工血液」編集委員長 酒井宏水 宛
E-mail：artificial-blood@naramed-u.ac.jp

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人工血液 Vol. 22 , No.1, 2014

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 22 , No.1, 2014

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編集委員
●酒井 宏水（委員長），東寛，武岡 真司，堀之内 宏久，棟近 公司，村田日本血液代替物学会 会誌■発行 日本血液代替物学会■編集・制作「人工血液」編集委員会■印刷 株式会社

研恒社

満，渡辺 真純●

人工血液 vol.22（1） 2014年11月20日発行〒162‑8480 東京都新宿区若松町2‑2 Twins 2 F
早稲田大学先進理工学部生命医科学専攻
生体分子集合科学／ナノ医工学研究室内TEL ＆FAX（03）5369‑7324〒634‑8521 奈良県橿原市四条町840
奈良県立医科大学化学教室内
TEL ＆FAX（0744）29‑8810〒102‑0073 東京都千代田区九段北1‑1‑7
TEL（03）3265‑8961 FAX（03）3264‑1995

日本血液代替物学会
http:www.blood-sub.jp/