人工血液第 17 巻 第 2 号 2009 年 8 月

目

次
会告
総説

……………………………………………………………………

54

Translational Advances in Second and Third Generation
Hemoglobin Based Oxygen Carriers: One Research
Team s Perspective ……………………Jonathan S. Jahr他

56

Semibiology（半生物学）と哺乳動物の臓器保存・蘇生・移植の最前線 …………………関 邦博

他

63

高分子型ベシクルを用いた新しい生体材料の創製：
リポソーム代替材料としてのポリマーソームと革新的ナノ・マイクロカプセル ピクソーム（PICsome）……………………………………………………岸村 顕広 他

73

ヒト血清アルブミンを用いた機能分子・材料の創製……………………………………………………小松 晃之

他

82

Announcement from the Society …………………………………………

54

Review：Translational Advances in Second and Third Generation
Hemoglobin Based Oxygen Carriers: One Research
Team s Perspective …………………Jonathan S. Jahr, et al.

56

Recent Topics on Semibiology for Organ Preservation,
Resuscitation, and Transplantation in Mammals.
………………………………………………Kunihiro Seki, et al.

63

PICsome Technology: Polymeric Vesicles toward
Biomedical Applications ……………Akihiro Kishimura, et al.

73

Synthesis of Functional Molecules and Materials Based on
Human Serum Albumin ……………Teruyuki Komatsu, et al.

82

ARTIFICIAL BLOOD
Vol. 17 No. 2 Aug, 2009

Contents

会 告第16回日本血液代替物学会年次大会
テーマ：世界をリードする血液代替物会期：平成21年10月16日（金），17日（土） 午前 9 時−午後17時

会

場：慶應義塾大学医学部 信濃町キャンパス内医学情報センター 北里講堂

参 加 費：¥ 8,000（懇親会費を含む）
シ ン ポ ジ ウ ム：細胞型人工酸素運搬体をつくる 平成21年10月16日
早稲田大学理工学部

酒井宏水先生

Hb溶液から包埋粒子まで

ニプロ株式会社研究部

横江淳一先生創薬領域でのペグ化と将来への展望

ベネシス株式会社研究部

柚木幹弘先生生物製剤の安全性確保と製品の無菌化

テルモ株式会社開発部

金田伸一先生LEHの工業生産への道−その障害を乗り越えて

特別発言：東京大学生産技術研究所
防衛医科大学酒井康行先生

石原雅之先生

特 別 講 演：人工血小板の過去，現在，未来 平成21年10月17日
慶應義塾大学医学部

半田

誠 先生

：微小循環系でのナノ粒子の不思議な流れ 平成21年10月17日
横浜国立大学大学院工学研究院

百武

特別発言：慶應義塾大学神経内科

冨田：獣医医療における血液代替物の意義
酪農大学獣医学部

徹 先生
裕 先生
平成21年10月16日

萩原克郎先生

特別発言：麻布大学獣医学

並河和彦先生：将来の細胞型酸素運搬体とGiant Liposome 平成21年10月17日
三重大学工学部

湊元幹太先生以上，シンポジウム，特別講演の演題名は現在なお仮題です．正式演題名は人工血液

第17巻 3 号，または 8 月下旬に更新されますホームページをご覧願います．
一般演題の発表予定
平成21年10月16日（午前，午後），10月17日（午前）
評 議 員 会：平成21年10月16日 正午頃

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人工血液 Vol. 17 , No.2, 2009

総会：平成21年10月17日 ランチョンセミナー終了後

ランチョンセミナー：平成21年10月17日 正午頃
代用血漿剤HES

埼玉医科大学医療センター

宮尾秀樹 先生（主催：フレゼニウス・カービ・ジャパン株式会社）懇

親会：平成21年10月16日 17：30−20：00
慶應義塾大学病院新館11階 パレスホテル・オアシス
会費は参加費に含まれております．

会員の方々，いまだ入会されておられない方，本学会の研究テーマにご興味をお持ちの方，ならびに関係分野でご研究の方々のご参加，ご発言を心からお待ちいたしております．なお未入会の方は学会当日
以前にご入会願います．詳細は下記ホームページを御参照下さい．プログラムは 人工血液 第17巻 3 号（平成21年 9 月末に発刊予定）に掲載されます．ただし大体の時間割などは8月下旬に更新されます日本
血液代替物学会ホームページ

http://www.blood-sub.jp/にも掲載いたしますのでこれをご参照下さい．
平成21年 8 月18日
第16回日本血液代替物学会年次大会
会長〒665‐0873

高折益彦

兵庫県宝塚市長尾町2番地1号

Tel：0797‐88‐2200

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.2, 2009

東宝塚さとう病院

Fax：0797‐88‐5782

55

総

説

Translational Advances in Second and Third Generation Hemoglobin
Based Oxygen Carriers: One Research Team s Perspective
Jonathan S. Jahr (1), Bernd Driessen (2), Robert A. Gunther (3), Fedor Lurie (4),Jennifer C. Lim (5), Anthony T.W. Cheung (6)Keywords
Hemoglobin Based Oxygen Carriers, Oxyglobin, Hemopure, Hemolink, Oxyvita, Hemorrhage, Hypovolemia, Shock, Resuscitation,
Circulating Blood Volume, Methemoglobinemia, Intravital Microscopy

Introduction
In our translational laboratories, large and small animal
experiments have been important to delineate productefficacy of oxygen delivery and safety in four Hb-based
oxygen carriers（ HBOCs）from three manufacturers
independently.
This review will highlight four main areas of research:hemorrhagic shock or hypovolemia and resuscitation using
different strategies and resuscitants, validation of alllaboratory equipment used in the above experiments tocapture hemodynamic, hemotologic, and chemistry values
against a gold standard whose values will have nointerference from solubilized hemoglobin, and various otherlaboratory models and the various associated models to test
theories regarding calculations of circulating blood volume
and understanding issues with methemoglobinemia.
Original abstracts from each of the studies have been
reproduced here with full references.

１．HBOC and Perfusion
The objective of this investigation was to study the effectsof the first marketed hemoglobin-based oxygen carrier（ HBOC）, Hemoglobin glutamer-200（ bovine）（ HB-200）®
（Oxyglobin ）on splanchnic perfusion and oxygenation in acanine model of acute hypovolaemia. Twelve anaesthetizeddogs（ 30.8 ± 1.4 kg body weight）were instrumented forrecordings of heart rate（HR）, mean arterial pressure（MAP）,
central venous pressure（CVP）, cardiac output and cranial
mesenteric arterial（CMA）and venous blood flows（CMV）.
Total and plasma hemoglobin（Hb）, oxygen content andsaturation, lactate concentration, pH and blood gases wereanalysed in arterial, mixed venous and mesenteric venous
blood samples. Measurements were made before（baseline）
and after 1 h of hemorrhage, after which animals were
resuscitated with either shed blood（controls）or HB-200 until
HR, MAP and CVP returned to prehemorrhage levels.
Recordings were repeated immediately and 3 h aftertermination of fluid resuscitation, after which organ
specimens were obtained for microscopic examination.
Hemorrhage（average 32 mL/kg）reduced MAP to 50 mm Hg,
increased HR and systemic vascular resistance（SVR）, and
was accompanied in both the systemic and the splanchnic
circulation by significant decreases in blood flow, Hb content
and oxygen delivery（DO2）, and lactic acidosis. In controls, allvariables recovered to baseline after isovolaemic resuscitation
with shed blood. In dogs resuscitated with a small volume of
HB-200（10 mL/kg）, HR, MAP, CVP and CMA and CMV
blood flows returned to baseline. However, cardiac output,
total Hb, oxygen content and systemic and mesenteric DO2
remained depressed while SVR increased further. Mesentericand systemic acid-base status recovered in both groups, andthere was no difference in microscopic tissue damage（1）Deparment of Anesthesiology, David Geffen School of Medicine at University of California Los Angeles, CHS 56-122, 757 Westwood
Plaza, Suite 3325, Los Angeles, CA 90095-7403（2）Department of Clinical Sciences, New Bolton Center, University of Pennsylvania, College of Veterinary Medicine, Kennett Square, PA（3）Department of Surgery, University of California Davis School of Medicine, Davis, CA（4）Department of Surgery, John Burns School of Medicine, University of Hawaii, Honolulu, HI（5）College of Letters and Science, University of California Los Angeles, Los Angeles, CA（6）Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of California Davis School of Medicine, Sacramento, CA
論文受付 2009 年１月７日 論文受理 2009 年１月 24 日

56

人工血液 Vol. 17 , No.2, 2009

between groups. Thus, HB-200 reconstituted splanchnic
perfusion and oxidative metabolism in spite of pronounced
systemic vasoconstriction and insufficient restoration of CO
and DO2 ; it may improve diffusive oxygen transport in the
microvasculature by virtue of hemodilution and its highefficiency in the uptake and release of oxygen1）.

２．HBOC and Microcirculation
We sought to correlate in vivo microvascular, systemic
function, hemodynamic, and oxygenation changes in
autologous shed blood（n = 4）and HB-200（n = 4）resuscitations in hypovolemic dogs. Hemorrhage（〜 40 ％ bloodloss）reduced mean arterial pressure to 〜 50 mm Hg andcaused significant（ P < 0.01）decreases in hematocrit, total Hb,mean pulmonary arterial pressure, cardiac output, andoxygen delivery and significant（ P < 0.01）increases in heartrate, systemic vascular resistance, and lactic acidosis.
Significant（ P < 0.01）changes in conjunctival microvascularvariables also occurred, including a 19 ％ decrease in venular
diameter and 79 ％ increase in average blood flow velocity.
Shed blood resuscitation returned microvascular, systemic
function, hemodynamic, and oxygenation variables toprehemorrhagic baseline values. In contrast, HB-200 failed torestore hematocrit, total Hb, cardiac output, oxygen delivery
index, and systemic venous resistance to baseline, but it
restored other systemic functions and all hemodynamic andmicrovascular changes. In addition, HB-200 resuscitation in
hypovolemic dogs（〜 40 ％ blood loss）did not cause extreme
hemodilution or fatal outcome. This study confirms that realtime（in vivo）microvascular studies, which were conducted
only in small rodent models in the past, can be performed
simultaneously with systemic function, hemodynamic, andoxygenation studies in a large animal model for relevant data
correlation2）.

３．HBOC and Oxygen Delivery
The object of this study was to compare effects of 6 ％hetastarch（Hextend）and HB-200 on hemodynamics, arterial
oxygen content, and systemic oxygen delivery in a canine
hemorrhagic shock model.
Twenty-four anesthetized healthy, adult, mongrel dogs（28± 1 kg; 7 female, 17 male）were instrumented for determinations of heart rate, arterial, central venous, pulmonary
arterial, and pulmonary arterial occlusion pressures, andcardiac index. Total solids, colloid oncotic pressure, arterial
oxygen content, Hb, lactate, pH, and blood gases wereanalyzed in blood samples. Recordings were made before,
after 1 hr of hemorrhagic shock, and immediately and 3 hrs
after infusion of either 30 mL/kg hetastarch（group 1）, 10

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mL/kg Hb-200 + 20 mL/kg hetastarch（group 2）, 20 mL/kg
HB-200 + 10 mL/kg hetastarch（group 3）, or 30 mL/kg HB200（group 4）.
Hemorrhage（35 ± 1 mL/kg）reduced mean arterialpressure to 50 mm Hg and caused significant decreases intotal Hb, mean pulmonary arterial pressure, cardiac index
and systemic oxygen delivery, increases in heart rate andsystemic vascular resistance, and lactic acidosis. In group 1,
hetastarch infusion was accompanied by increases of
pulmonary arterial pressure, cardiac index, and blood oxygen
extraction above baseline, and decreases of systemic vascular
resistance, total Hb, total solids, arterial oxygen content, andsystemic oxygen delivery below baseline（ P < 0.05）. Other data
returned to baseline. In groups 2 to 4, hemodynamic functions（except pulmonary arterial pressure）recovered, yet neither
total Hb（i.e., plasma and red blood cell Hb）nor arterial
oxygen content increased despite increases in plasma Hb of 2
to 5 g/dL and proportionate increases in total solids. Systemic
oxygen delivery improved dose-dependently with HB-200 but
did not return to baseline（ P < 0.05）, reaching values
comparable to hetastarch group only at 30 mL/kg Hb-200. In
all groups, oxygen extraction remained above baseline.
Metabolic acidosis and lactatemia resolved significantly fasterin groups 2 to 4, and colloid oncotic pressure after
resuscitation was greater in groups 2 to 4 than in controls（ P< 0.05）.
Thus, HB-200 infusion may not improve oxygen delivery
more than hetastarch, likely due to hemodilution caused byits high colloid oncotic pressure, but may facilitate diffusive
oxygen transport to tissues.
HBOCs are solutions of cell-free Hb that have beendeveloped for replacement or augmentation of bloodtransfusion. They combine plasma expanding with oxygen
carrying properties, thus may prove superior to traditional
plasma expanders（e.g., hydroxyethyl starch solutions）fortreatment of hemorrhagic shock.
HB-200 is an ultrapure solution of highly polymerizedbovine Hb approved for treatment of anemia in dogs. It
shares most properties with Hb glutamer-250（bovine;
Hemopure［formerly HBOC-201］, Biopure）, which is currently
in phase III clinical trials and approved for use in humans inSouth Africa. Previous studies with low doses of Hb-200 and
HBOC-201 revealed an improvement of hemodynamic
functions, yet a significantly smaller increase in arterial
oxygen content and oxygen delivery after HBOC infusion
than expected based on the amount of Hb administered.
Therefore, in the present study, our primary goal was toanalyze whether infusion of HB-200 will dose-dependently andto a greater extent than conventional plasma expanders

57

increase systemic oxygen delivery and tissue oxygenation indogs subject to isovolemic resuscitation after acute blood
loss3）.

４．HBOC and Resuscitation
To test the hypothesis that low-volume resuscitation with
HB-200 improves hemodynamic function and tissue
oxygenation, whereas arginine vasopressin resuscitation
improves blood pressures more than low-volume saline orhemoglobin glutamer infusion but compromises systemic andmuscle blood flow and oxygenation.
Dogs were instrumented to determine heart rate; arterial,
central venous, pulmonary arterial, and pulmonary arterial
occlusion pressures; cardiac output; and quadriceps muscle
blood flow and oxygen tension（PMo2）. Total and plasma Hb,
oxygen content, lactate, pH, standard base excess, andarginine vasopressin levels were determined, and systemic
oxygen delivery（Do2I）and extraction ratio were calculated.
Measurements were made before and 30 mins following
hemorrhage. Dogs were resuscitated over 60 mins with saline（8.5 mL/kg）, arginine vasopressin（0.4 IU/kg bolus plus 0.08
IU/kg/min）, or 1:1 diluted hemoglobin glutamer-200.
Recordings were then repeated. Subsequently, animals
received 30 mL/kg shed blood（60 mL/kg/hr）, and recordings
were repeated immediately and 1 hr later.
Hemorrhage（〜 52 mL/kg）caused characteristic changes
in hemodynamic, hematologic, systemic PMo2, and acid-basevariables. Saline resuscitation increased both Do2I and muscle
perfusion by 42 ％ and 51 ％, while arginine vasopressin
treatment reduced heart rate by 31 ％ and increased meanarterial pressure by 22 ％ but not cardiac output, Do2I, or
muscle blood flow, resulting in a further decrease of PMo2 by
68 ％ and worse metabolic acidosis. Hemoglobin glutamer-200
infusion caused systemic and pulmonary vasoconstriction,
however, without deterioration of cardiac output, Do2I, muscle
blood flow, or PMo2 despite lack of oxygen content increase.
Blood transfusion restored most variables.
Including use of vasopressin, we concluded that lowvolume crystalloid or HB-200 resuscitation posthemorrhage
may improve（but not restore）macro- and microvascularfunctions and tissue oxygenation, while arginine vasopressin
infusion may only improve blood pressures and result in
lower overall systemic perfusion compared with low-volume
saline or HB-200 treatment and worsening of anaerobic
conditions in skeletal muscle4）.

５．HBOCs and Circulating Blood Volume
HBOC may be ideal for monitoring circulating plasma
volume（CV-P）and circulating blood volume（CV-B）. We used58

an HBOC（Hemoglobin glutamer-200［bovine］, Oxyglobin ® ;Biopure, Cambridge, MA）as an indicator for relative CV-B in
the rabbit model. Accuracy of the technique was determinedby comparison with the Evans blue dye（EBD）dilution
technique in 19 anesthetized female New Zealand rabbits
weighing 2.0 to 10.6 kg. The measurements were performed
at baseline, after hemorrhage（1/3 of CV-B）, normovolemic
hemodilution（replacement of 1/3 CV-B by Hextend® ; Abbot
Laboratories, North Chicago, IL）, and hypervolemic
hemodilution（additional infusion of Hextend ® in a volume
equal to 1/3 of CV-B）. Hb concentration was measured by®
using a HemoCue photometer（HemoCue AB, Angelholm,
Sweden）. EBD concentration was analyzed by using linear
regression to estimate Time 0 concentration; Time 0 was
defined as EBD injection time. The difference between CV-P
values determined by EBD and HBOC dilution was
independent from the magnitude of the CV-P value. The
relative bias was 1.29 mL, and the precision（one SD）was 2.82
mL. The difference did not reach statistical significance.
In an attempt to use HBOCs to estimate circulating blood
volumes, we concluded that circulating plasma volume andcirculating blood volume may be accurately estimated byusing plasma hemoglobin concentration measurements after
HBOC infusion5）.

６．Verification of Circulating Blood Volume Measurements
Using HBOC
Direct determination of the CV-B is clinically desirable,
especially when hemodynamic parameters such as bloodpressure and heart rate are pharmacologically altered andmay not be used with confidence for monitoring of CV-B. In a
rabbit model, we demonstrated that small volumes of HBOCs
may be used for measuring of CV-B with the indicatordilution technique. This study aimed to verify the techniquein a canine hypovolemia model with varying concentrationsof infused HBOC.
Twenty-four healthy mongrel dogs were anesthetized andanesthesia maintained with isoflurane in 21 ％ oxygen andsufentanil infusion. All animals were mechanically ventilated.
After splenectomy and insertion of arterial, venous, andballoon-tipped pulmonary arterial catheters and recording ofbaseline values of total and plasma hemoglobin（Hb）,
hematocrit, and major hemodynamic parameters, dogs were
bled（average 36.6 ± 5.8 mL/kg）to a mean arterial pressureof 50 mm Hg and maintained hypovolemic for 1 hour.
Thereafter, measurements were repeated, and dogs were
resuscitated. Animals in group 1 were resuscitated with 30
mL/kg of 6 ％ hetastarch solution（HES）. Animals in othergroups received either 10 mL/kg of Hb glutamer-200（Hb-200;

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Oxyglobin）plus 20 mL/kg HES（group 2）, 20 mL/kg Hb-200
plus 10 mL/kg HES（group 3）, or 30 mL/kg Hb-200（group 4）.
Solutions were infused at 30 mL/kg/hr. Measurements wererepeated immediately after volume resuscitation. Plasma Hbconcentration was determined after centrifugation using the
HemoCue. Lactated Ringer's solution was infused in all
subjects at 5 mL/kg/hr for maintenance. CV-B at baseline
was estimated as 85 mL/kg. CV-B values immediately
posthemorrhage were calculated by subtracting the volume
of withdrawn blood from the baseline value. On the basis of
the assumption that hemorrhage and subsequent volume
resuscitation would not cause any hemolysis（as confirmed ingroup 1）, all plasma Hb was considered to represent infused
HBOC. The calculation of CV-B using HBOC as an indicator
was performed as previously published by Kasuya et al. CV-B
values derived from measured HBOC concentrations inplasma were compared with calculated（based on an original
CV-B of 85 mL/kg and withdrawn blood volume）values of
CV-B using the Bland-Altman analysis and by linear
correlation. Agreement between the methods was analyzed
by calculating the bias estimated by the mean difference andthe standard deviation of the difference.
Calculated and measured CV-B values were highly
correlated（r = 0.97）. The difference between indicator
dilution-derived and calculated values of CV-B did not exceed
4 ％ of calculated CV-B in 97 ％ of the measurements. The
mean difference between measured and calculated values of
CV-B was 72 ± 16 mL and did not vary significantly amonggroups 2, 3, and 4（at varying concentrations of HBOC
infused）.
In a canine hypovolemia model, knowing both the HBOC
volume infused and the HBOC concentration measured inplasma allows for reliably determining the CV-B. Our data
verify the indicator-dilution technique with HBOC as an
appropriate and clinically valuable method for monitoring CVB in treatment of hypovolemia6）.

７．HBOC and Magnetic Resonance Oximetry
The authors tested whether noninvasive magnetic
resonance（ MR）oximetry is accurate in the in vivo
measurement of oxygen saturation in a stroma-free HBOC.
A central venous catheter was placed in the inferior vena
cava（IVC）of 10 New Zealand white rabbits（weight range,
2.5 - 3.2 kg）. Each rabbit underwent removal of 20 ％ of blood
volume followed by resuscitation with 10 mL/kg of bovine
HB-200. Oxygen saturation of the blood mixture wasmeasured in vivo at the IVC with MR oximetry, withseparate in vitro calibration for each animal. Blood drawn
from the IVC was measured with ex vivo oximetry, which

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was used as the standard of reference. The in vivo and exvivo measurements were compared.
There was no significant difference（ p > 0.1）between
measurements obtained with MR oximetry and ex vivo
oximetry. The results with in vivo MR oximetry
demonstrated excellent correlation with those from ex vivo
oximetry（r = 0.99）over a wide range of physiologic oxygen
saturation values（16.7 - 74.9 ％）in venous blood.
Noninvasive in vivo magnetic resonance measurement ofoxygen saturation is valid for whole blood mixed withstroma-free Hb. Therefore, magnetic resonance oximetry
may be clinically useful for assessing oxygenation status inpatients resuscitated with an HBOC 7）.

８．HBOCs and Coagulation
Because hetastarches have deleterious effects on
coagulation that increase with molecular weight（MWt）, riskof coagulopathy associated with a high MWt HBOC wasstudied.
Experiments simulated hemodilution during clinicalresuscitation of hemorrhagic shock with varying doses of
HBOCs. Coagulopathy related to 1:11, 1:5, 1:2, or 1:1 dilution ofwhole blood with normal saline, 6 ％ hetastarch（670 KDa）,
Hb-200, or OxyVita（OXYVITA Inc, New Windsor, NY）（a
new-generation, zero-link polymerized bovine hemoglobinbased oxygen carrier, 33 megadaltons）were analyzed.
At 2 lower levels of hemodilution, hetastarch, HB-200, andOxyVita produced equivalent reductions in maximum clot
strength（TEG-MA and TEG-G）that reached statisticalsignificance compared with whole blood and normal saline. At
2 higher dilutions, OxyVita and Hb-200 impaired maximum
clot strength compared with whole blood, normal saline, andhetastarch. Dilution with hetastarch had a greater effect onclot propagation（K and α）than either HBOC.
OxyVita and Hb-200, HBOCs with different MWt, had
similar effects on coagulation as measured by TEG. The
impairment of coagulation by HBOCs and hetastarchoccurred at doses corresponding to 12 mL/kg or a blood
volume replacement of 17 ％. The use of HBOCs at doses
corresponding to 23 mL/kg or a blood volume replacement of
33 ％ significantly decreased coagulation to levels associatedwith increased clinical bleeding in this preliminary study.
Minimal coagulopathic effects are expected with use of
OxyVita at the manufacturer's anticipated effective dose of 10
g or 2 to 3 mL/kg 8）.

９．HBOC and Coagulation
Polymerized bovine hemoglobin is currently underinvestigation as an alternative to blood-banked human red

59

blood cells. Because of the dark red hemolyzed appearance ofhemoglobin-based oxygen carrier（HBOC）-201, we sought todescribe the effects of HBOC-201 on coagulation analyzers
that perform prothrombin times, activated partial
thromboplastin times, fibrinogen, and antithrombin. Pooled
normal plasma was combined with HBOC-201 to achieve
plasma hemoglobin levels of 1.4, 2.6, 3.8, 4.8, and 6.2 g/dL.
Results for each test using HBOC-201-prepared plasma werecompared with results using saline-matched controls. Twoconsecutive absolute result differences of >10 ％ between
saline controls and HBOC-201 samples were used for
determining interference in test accuracy by theconcentration of HBOC-201. Mechanical detection methods（fibrometer, STA, CS-190）and the MDA-180 method wereless affected by increasing levels of HBOC-201 than opticaldetection devices for all test parameters9）.

10．HBOC and Hemoglobin
The accuracy of the HemoCue® Plasma/Low Hemoglobin
System was validated in vitro with low levels of HBOCs.
Repeated measurements were performed on 50 samples ofcanine plasma, each mixed with three different HBOCs atvarying small concentrations（ a total of 150 samples）, byusing plasma samples without HBOCs as controls. Twotechnicians performed the measurements and randomly
tested each sample 10 times. The results were analyzed forcorrelation, and analysis of variance was used to evaluate
statistical significance, with a P value of ≤0.05 consideredsignificant. Hb concentrations determined with the bedsidephotometer were not significantly different from known
values of Hb concentration in the samples. There was no
significant difference between values obtained by two
independent observers for the same samples. This was true
for all three tested HBOCs and for all tested concentrations.
The mean bias of the measurement expressed as apercentage of sample concentration was 0.1 ％ for HB-200（bovine）, 0.58 ％ for hemoglobin glutamer-250（bovine）, and
0.19 ％ for hemoglobin-raffimer. The mean error was <8 ％ for
all three HBOCs. Both intraobserver and interobserver
reliabilities were high and statistically significant. The
HemoCue ® Plasma/Low Hemoglobin System is a reliable
instrument for detecting and measuring small concentrationsof three different HBOCs in plasma.
This study evaluated a new bedside blood-measuring
device for low levels and found that it rapidly measured low
levels accurately for three blood substitutes10）.

11．HBOC and Oximetry
The validity of arterial and mixed venous oxygen

60

saturation measurements in a canine hemorrhage model after
resuscitation with varying concentrations of HBOC wasdetermined. We concluded that the administration of thisoxygen therapeutic may interfere with the values of somemonitors.
In this study, we evaluated the validity of saturation
measurements in mixed venous and arterial blood during
posthemorrhagic anemia and resuscitation with varying
levels of HB-200. Nineteen anesthetized, splenectomized,
mixed-breed dogs were anesthetized（two were excluded
from the data because they did not survive theexsanguination, supporting the validity of the model）. Their
pulmonary arteries were cannulated with the Abbott QVUE
Oximetrix 3 catheter. An 18-gauge catheter was placed in thefemoral artery, and a reusable Nellcor probe was applied tothe tongue. Mixed venous and arterial samples were drawn
at baseline, after 40 ％ hemorrhage（to keep arterial pressure
at 50 mm Hg）, and postresuscitation with 30 mL/kg of 6 ％hetastarch in lactated Ringer's solution（n = 4）
, 10 mL/kg of
Hb-200, 20 mL/kg of hetastarch（n = 6）
, 20 mL/kg of Hb-200,
and 10 mL/kg of hetastarch（n = 7）
. Samples were comparedwith oxygen content from the LEXO2CON-K oxygen
analyzer, and oxygen content was calculated for all values
from the monitors. Results were compared by using analysis
of variance. There was good correlation（0.97 ≥ r ≥ 0.92）forthe measured versus calculated Hb oxygen saturation values
at baseline. After resuscitation, the correlation between
calculated and measured values of oxygen content wassignificantly smaller for all tested instruments. The values ofoxygen content calculated from the oxygen saturation
monitor and from the oximetric pulmonary artery can
deviate by as much as 20 ％ from directly measured values.
We conclude that the administration of this oxygentherapeutic may interfere with the values of some monitors.
This study evaluated oxygen saturation monitors in acanine model of acute blood loss and resuscitation with ablood substitute and found that these may interfere with themonitors' results in a dose-dependent way 11）.

12．HBOC and Lactate
Lactate measurements with three HBOCs were evaluated,and based on the samples tested in this study, results
indicate true lactate levels in the presence of HB-200 may beconsistently underestimated when measured in a
spectrophotometry-based lactate analyzer, especially athigher lactate concentrations. The clinical implications of thisstudy are that with increasing levels of an HBOC in humanplasma, lactate interpretation may become inaccurate whenmeasured by a spectrophotometric lactate analyzer, causing

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underestimation of "true" lactate values and possible undertreatment of the patient. Therefore, caution must be
exercised when interpreting lactate results from theSynchron LX® 20 when a HBOC is present in plasma.
We sought to determine whether HBOCs, HB-200, andhemoglobin raffimer（HemolinkTM）interfere with the accuracyof lactate measurements. Combinations of concentrated Llactate solution, HBOC, and blood or plasma with added
PlasmaLyte-ATM were added to sample tubes to make a linear
and constant increase in lactate concentration in consecutive
samples. Sample lactate concentrations ranged from 5-110
mg/dL（0.6-12 mm）（ physiological reference range: 5-20
mg/dL［0.56-2.2 mm］）
. Comparisons were made between
machine measured lactate concentrations and calculated
lactate concentrations. For Hb glutamer-250, the average
difference between measured and calculated lactate
concentrations was -5.1 mg/dL（-0.57 mm）（ LX-20 ® ）, withgreater underestimation at larger lactate concentrations. For
Hb raffimer, the average difference was -2.2 mg/dL（-0.24 mm）（LX-20 ® ）. The veterinary product, Hb glutamer-200, wastested on 3 analyzers（LX-20® , YSI 1500, and YSI 2300）. The
YSI 1500 was the most accurate instrument with the meandifference between measured minus calculated lactate being+1.3 mg/dL versus -2.6 mg/dL（YSI 2300）and -8.4 mg/dL（LX-20® ）. The clinical implications of this study are that withincreasing levels of an HBOC in plasma, lactate interpretation
may become inaccurate, especially at larger lactate
concentrations, causing underestimation of measured lactate
values and possible under-treatment of the patient. Therefore,
caution must be exercised when interpreting lactate results
when a HBOC is present in plasma12）.

13．Methemoglobin and Lactate
In this study, we validated the accuracy of lactate
measurements（ YSI 2700 SELECTTM glucose/lactate
analyzer）in the presence of methemoglobin from an oxidized
bag of hemoglobin-based oxygen carrier（ Met-HBOC）,
hemoglobin glutamer-200（Oxyglobin® ; Biopure Corp）.
Different combinations of concentrated l-lactate solution,
pooled canine plasma, and Plasmalyte ATM were added to 4
sample groups（ 1 ％, 10 ％, 20 ％, and 40 ％ Met-HBOC［1.3g/dL］）to yield linear increases in lactate concentration inconsecutive samples. The mean difference between measured
and calculated lactate was -5.1 mg/dL（1 ％ Met-HBOC）, -5.8mg/dL（10 ％ Met-HBOC）, -4.6 mg（20 ％ Met-HBOC）, and -8.5
mg/dL（40 ％ Met-HBOC）. The root mean square error was
6.5 mg/dL, 7.4 mg/dL, 6.8 mg/dL, and 10.3 mg/dL,
respectively. The Bland-Altman correlation（r）was r = -0.94（P= 0.01）, r = -0.91（ P < 0.001）, r = -0.90（ P < 0.001）, and r =ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.2, 2009

-0.94（ P < 0.001）, respectively, where r = 0 for perfectagreement between measured and calculated values. Results
indicate that true lactate levels in the presence of Met-HBOC
are underestimated when measured by an YSI 2700 analyzer
independent of the amount of Met-HBOC present 13）.
Methemoglobin concentration increases in patients
receiving HBOCs. When interpreting lactate concentrations
from a patient with an HBOC present in plasma,
underestimation of true lactate levels may occur unrelated tomethemoglobin concentrations.

14．Methemoglobin and TEG
The thrombelastogram（TEG）is a point of care coagulation
monitor evaluating qualitative platelet function; this may beaffected by oxidation. HBOCs oxidize Hb, increasing
methemoglobin（MetHb）levels. We hypothesize that HBOCs,
if they create methemoglobinemia, may cause coagulopathy.
This ex vivo model studies dose response coagulation changes
with TEG to increasing levels of MetHb from oxidized HB200.
After IRB approval for laboratory study of donated bloodand patient consent, the effects on coagulation of increasing
concentrations of HBOCs in whole blood of two donors were
quantified using a TEG® 5000（Haemoscope Corp., Niles, IL）（1）. Blood samples simulated hemodilution during clinicalresuscitation of hemorrhagic shock with varying doses of HB200. Coagulopathy related to 1:11（Low）, 1:5（Med）, 1:2（High）
and 1:1（Very High）dilution of whole blood with HB-200 high
MetHb（65 ％）concentrations and HB-200 low MetHb（1 ％）concentrations were analyzed. For each sample R, K, MA and
G were quantified（ANOVA, P ≤ 0.05 considered significant）.
Progressive dilution of HB-200（Low Met）and HB-200（HighMet）produced increases in R［P = 0.04］and K［P < 0.0001］,
and decreases in α
［P = 0.003］, MA［P < 0.0001］and G［P <0.0001］. Analysis effects of treatment on coagulation showed［P = 0.0004］, MA［P = 0.005］and G［P =that K［P = 0.01］, α
0.0009］are changed in HB-200（High Met）compared to HB200（Low Met）
. Very High dilutions of both HB-200（Low Met）
and HB-200（High Met）increased R［Low Met P = 0.04］and［High Met P = 0.04］compared to Low dilutions.
High methemoglobin concentrations in Oxyglobin cause
additive coagulation impairment that likely results from theeffects of oxidative substances on platelet function andcoagulation proteins. Oxidative products adversely react withcoagulation factors and modify redoxsensitive sites in theplatelets. Therefore, if methemoglobinemia occurs as a resultof HBOC administration and if the levels are significantly
elevated（greater than 10 ％）, impairment of coagulation is
14）
possible .

61

Summary
Work on HBOCs is presented, providing independentvalidation of safety and efficacy, crucial for FDA and otherregulatory registration for any product, and increased
acceptance. Independent investigation, regardless ofoutcome, is critical for good science to prevail.

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人工血液 Vol. 17 , No.2, 2009

総説Semibiology（半生物学）と哺乳動物の臓器保存・蘇生・移植の最前線
Recent Topics on Semibiology for Organ Preservation,
Resuscitation, and Transplantation in Mammals.
関 邦博，小嶋 智弘，吉田 優，畑山 直之
Kunihiro Seki, Tomohiro Kojima, Yu Yoshida, Naoyuki Hatayama

和文抄録
生物の世界では，乾燥保存は自然に営まれている現象である．これらの細胞内は乾燥状態になっているため，翌春には動植物は蘇ることは毎年恒例の自然現象である．例えば，シベリアのツンドラ地帯では真冬は−60 ℃以下まで低下し動植物は冷凍状態となる．我々は，この自然現象のメカニズムが哺乳類の臓器の保存と蘇生法を適用することができるのではないかと考え臓器の乾燥保存法の研究を行ってきた．自動車が故障し修理して再び乗れるようになるのは，設計図と部品と修理技術があるからである．ヒトの場合，自動車のように設計図（解剖図），修理技術（外科手術）は既に完成している．ただし，部品（臓器）がない．現在，部品はヒトの脳死者からの供給に頼っている状態であるが，臓器の最大保存期
間は 24 時間である．私たちの炭酸ガスを使用した臓器保存蘇生技術は，部品（臓器）の保存時間を 24 時間から 72 時間に伸ばすことに成功した．臓器の保存期間が１年間以上になると，半導体のようにヒトの寿命も半永久的になる．本研究の著者の一人である Seki et al.（1998）は体内の水分量を減少させた状態のクマムシが perfluorocarbon（PFC）の中で 6000
気圧の超高圧下におかれても蘇生しうることを示した．生命体がこのように体内の水分量を減少させて代謝を低下させ，乾燥，低温などの極限環境に適応することは cryptobiosis とよばれているが，北極圏の植物の乾燥休眠や，多くのバクテ
リアが，相対湿度が 60 ％以下になると休眠状態になる現象など自然界で広範囲に見られる現象で，細菌の場合は乾燥保存法として実用化もされている．この現象の一つの特徴は細胞内の水の一部が失われるのであるが，生体高分子表面を保護する結合水は残り，自由水が減少し，それに伴って細胞内の代謝が蘇生可能な限界内で低下することと考えられる．ラットの摘出臓器保存にも PFC 液を用いながら水分量を減少させ蘇生させる実験を行い，時には良い結果を得たが再現性には乏しかった．その後，CO2 ガスが生体に対して麻酔作用，代謝抑制作用を持つことに着目し水分量減少と高分圧（200hPa）の環境下で心臓保存の実験を行い再現性が見られる結果を得たが，再現性が見られた最大保存時間は 72 時間であった．
我々は，乾燥保存蘇生法を用いてラットの摘出臓器内の自由水をガス乾燥法により除去し長期間の保存が可能であることを示した．二酸化炭素や一酸化炭素は，無極性のガスで水を構造化することが知られ，穀物の長期間保存に使用されている．炭酸ガスや一酸化炭素ガスを用いることによりラットの摘出臓器を乾燥させ半永久的に保存させることが可能であると推察し，ラットの摘出心臓を高分圧の炭酸ガス，一酸化炭素ガス，ヘリウムガスの環境下に曝露し最大 120 時間まで保存後，レシピエントのラットの右頸部への異所性心移植を行い蘇生させた研究成果について報告する．
Abstract
When automobiles break down, they can be repaired and driven again, because there are blueprints and specifications, spareparts and repair techniques. In the case of humans, like automobiles there are blueprints（anatomical charts）, repair techniques（surgical operations）, but spare parts（organs）are not easily available. They are provided by brain dead donors, but they can bepreserved for only 24 hr at the maximum. The technique of organ preservation and resuscitation with the use of CO 2 gas
extended this preservation time from 24 hr to 72 hr. With the development of the semibiology techniques, it may some day bepossible to preserve human organs for more than 1 year, and therefore human life could in the future become semi-permanent
in a manner similar to that of automobiles. We succeeded in an experiment in which tardigrades were desiccated using
perfluorocarbon（PFC）, an inert fluid that has been used in liquid breathing and as artificial blood for mammals since about the
神奈川大学理学部〒 259-1293

神奈川県平塚市土浦 2946

神奈川大学 理学部

Kanagawa University Faculty of Science, 2946, Tsuchiya,

Hiratsukashi, 259-1293 Japan
論文受付 2009 年３月 14 日 論文受理 2009 年５月７日

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.2, 200963

1960s, and then they were exposed to high pressure at 600MPa for resuscitation. We decided to work on an experiment topreserve an isolated mammal organ by immersing it in this desiccated PFC. It was thus demonstrated that after an isolated rat
heart was dry-preserved for 24 hours in an environment with 400 hPa of partially compressed CO2 within a hyperbaric
environment compressed at 2000 hPa and then was resuscitated, it could be heterotopically transplanted into a recipient rat, andthe reproducibility thereof was verified. When the isolated rat heart was aeration-dried at 100 hPa of partial pressure CO2 after
being immersed in PFC, the preservation time could be extended to 72 hours. To the gas mixture of CO, O2 and He, CO2wasadded to provide its preservative properties. Diverse levels of partial pressure for each constituent gas were tested and a goodresult with 120 hr preservation and resuscitation was obtained with a mixture of CO, CO2 , O2 , and He（PCO=400 hPa, P CO2=100hPa, PO2=900 hPa, PHe=5600 hPa）
. On going experiments are presently investigating a diversity of partial pressures for eachcomponent gas. In the scientific world of physics and chemistry, CO is used daily, but in the field of biology CO is known as
poisonous and has not been used. The present experiments proved that CO could be used profitably for the preservation andresuscitation of organs.
Keywords
semibiology, CO, CO 2 , Isolated rat heart, perfluorocarbon（PFC）, desiccation, preservation, resuscitation, heterotrophic
transplantation.

Ⅰ

はじめに

ヒトの肺，心臓，肝臓，腎臓，膵臓などの臨床移植治療は，既に実用化され日常化している 1）．年々増加する移植待機患者に対して提供される臓器の不足の問題が深刻化している．現在
ヒトの移植用臓器の保存は低温保存が主流であり，４から 24
時間が保存限界である 2）．臓器が長時間保存できない理由としては，摂氏 4 度の低温や虚血により細胞膜が傷害をうける等の問題点が指摘されている 3-5）が，何らかの方法で，臓器を赤血球や微生物のように長時間保存することができれば，臓器の供給体制を相当改善させることができるだろうと考えられ，長時間の臓器保存のための技術の確立が要望されている 2）．現在までの試みを概観すると，まず臨床的に汎用されている保存液への単純浸漬法では University of Winsconsin Solution（UWS）
が使用されているが，保存時間は，ラット，ウサギ，ヒヒ，ヒトの摘出心臓の低温保存･蘇生において４から 18 時間が限界である 6-7）．摂氏０度近くの低温下でも生体組織はわずかに代謝しており，それによる老廃物を除去する観点から組織を灌流する方法も試みられており，単純浸漬法に比べて保存時間の延長が報告されているが，装置が大掛りとなり一般化に至っていない．
また灌流により血管内皮が傷害されるという指摘もある 5）．同様に低温下での組織代謝に着目してこれを改善させるため保存液や灌流液に酸素を供給する試みもあり保存時間の延長が報告されている 8）．このような試みの中で Kuroda et al（1995）らは心腔内に UWS 液をみたし酸素を多量に溶かすことのできる不活性液体の perfluorocarbon（PFC）液に混合ガス（PCO2=50hPaと PO2=950hPa）を供給しながら浸漬保存し，24 時間（100 ％）から 48 時間（５匹中４匹）とする結果を得ている 9）．
Seki et al.（1998）は，生命体が体内の水分量を減少させて代謝を低下させ，乾燥，低温などの極限環境に適応するcryptobiosisに着目し，このような状態にあるクマムシが超高圧下におかれても蘇生しうることを示した 10）．Seki et al.（1998）は，ラットの摘出臓器保存にも PFC 液を用いながら水分量を減少させ蘇64

生させる実験を行い，時には良い結果を得たが再現性には乏しかった．その後 CO2 ガスが生体に対して麻酔作用，代謝抑制作用を持つことに着目し水分量減少と高分圧（200hPa）の環境下で心臓保存の実験を行い再現性が見られる結果を得たが，再現性が見られた最大保存時間は 72 時間であった 11）．
ラットから摘出した心臓を高分圧の炭酸ガスや一酸化炭素ガ
スと酸素とともに７気圧に曝露し，摂氏４度の冷蔵庫に 72 時間
保存後，レシピエントラットの頚部に異所性心移植を行い蘇生させ，12 週間後も異所移植した心臓が機能し続けていることを心電図を記録することにより実証した研究成果について報告する．

Ⅱ

生物の乾燥保存

Seki et al.（1998）は，クマムシが 600MPa の極限の高静水
圧環境に暴露後も蘇生し生存していることを実証し，多細胞生物の保存に応用できることを示した．クマムシは約 40,000 個の細胞で構成されており神経細胞も持っている多細胞生物である．クマムシの保存・蘇生の生理的メカニズムを哺乳動物の臓器保存に応用することを考えた．哺乳動物の構成する細胞の中でも，血液，精子，卵子のような単細胞のみが長期間の保存･蘇生についての技術は開発され実用化されている．細胞の集まりである組織や幾つかの組織からなる器官（臓器）の保存技術が実用化されている時間は最大 24 時間以内である 2）．哺乳動物の臓器保存で問題となるのは，臓器の保存後，組織が生存しているかどうか検証しなければならない．その手法として，組織
解剖学的手法か，実際に移植して検証する移植法か，電気生理学的手法などがある．本実験室では，ラット摘出心臓の蘇生の検証方法としてラット頚部異所性心移植法を用いて実証した．
異所性心移植は心臓から血を送り出す働きはしないが，大きなメリットとして，他の臓器と違って心臓が生着していることを
外部や心電図の記録を通して客観的に判断できるところにある．二酸化炭素ガスや一酸化炭素ガスが生体に対して麻酔作用，代謝抑制作用を持つことに着目し，水分量減少と PCO2 ＝

人工血液 Vol. 17 , No.2, 2009

400hPa の環境下において心臓保存蘇生の実験を行い再現性が見られる結果を得た 11）．この臓器保存蘇生技術は，生命活動を停止させ再び蘇えさせる semibiology（半生物学）という新分野を誕生させた．
自動車が故障し修理して再び乗れるようになるのは，設計図と部品と修理技術があるからである．ヒトの場合，自動車のように設計図（解剖図），修理技術（外科手術）は既に完成している．ただし，部品（臓器）がない．現在，部品はヒトの脳死者からの供給に頼っている状態であるが，臓器の最大保存期間
は 24 時間である．私たちの炭酸ガスを使用した臓器保存蘇生
技術は，部品（臓器）の保存時間を 24 時間から 72 時間に伸ばすことに成功した．臓器の保存期間が１年間以上になると，半導体のようにヒトの寿命も半永久的になる．自然界の植物や動物が毎年のように自ら乾燥休眠し，翌年の春に覚醒している自然現象は，既に植物や動物の細胞，組織に応用され実用化が図られている．我々は，この自然界で毎年のように繰り替えされている現象を，哺乳動物の摘出臓器に応用できることを実験で示すことを目標に掲げ日々研究に取り組んできた．ラットの摘出心臓は，0.2MPa の高圧環境下に曝露しておくと徐々に摘出
心臓の水分が喪失し乾燥状態に至る．この時，乾燥に使用するガスにより蘇生率も変化することが分かった．二酸化炭素は，
本実験結果から乾燥保存蘇生に適したガスの一つであることが判った．本実験成果は，今後，二酸化炭素ガスが他の哺乳動物
やヒトの臓器保存蘇生に応用できる可能性を示唆するものであった．現在，この保存方法を用い保存蘇生が可能な保存時間の更なる延長を目指し研究中である．

Ⅲ

Fig. 1. The isolated hearts were exposed to mixed gas（PCO2 = 150 hPa
and PO2 = 850 hPa）
, and the blood was removed from them inKrebs-Henseleit（KH）solution cooled to 4 ℃, which was theninfused as a preservative. The hearts were then exposed to mixedgas（PCO2 = 150 hPa and PO2 = 850 hPa）, and immersed in PFC
cooled to 4 ℃. During the preservation period, the hearts were
continuously exposed to CO2 at 35 ml/min（A, glass）.

臓器保存と二酸化炭素ガス（CO2）

本実験で使用したラットは，日本 SLC 株式会社で拒絶反応を発現させないように移植用に開発された Wistar Lewis ラット，
近交系の LEW/SsN Slc（♂，６週齢）を使用した．
始めにドナー操作において説明する．ラットにジエチルエー
テル吸入麻酔を行った後，ヘパリンナトリウム 100 単位を添加した生理食塩水 1.0 ml を静脈投与した．術部を剃毛し，75 ％エタノールで術部を消毒後，正中切開にて開胸，左右肋骨部を背側に切開し，胸壁を頭側へ反転させ，心臓部を露出させた．
心臓を摘出後，ヘパリン添加生理食塩水（４度）で満たしたシ
ャーレに移した．上行大動脈，肺動脈を，できる限り長めに切
離後，ヘパリン添加生理食塩水（４度）を用いて，上行大動脈
断端より心臓を脱血灌流した．その後，上大静脈，下大静脈を結紮切離した．肺静脈と気管支を一塊として結紮後，肺を除去した．その後，混合ガス（PCO2=150hPa と PO2=850hPa）で曝気させた４℃の KH 液（Krebs-Henseleit）にて脱血，さらに保存液として注入した．KH 液には抗生物質，ワーファリンを加え，グルコースは通常の４倍溶解させたものを用いた．あらか
じめ混合ガス（PCO2=150hPa と PO2=850hPa）で曝気し，４℃に冷やした PFC 液に摘出心臓を浸漬させた．保存中の摘出心臓に混合ガス（PCO2=150hPa と PO2=850hPa）を毎分 80ml で曝気し続けた（Fig. 1）．この方法で 48，72 時間保存を行った．

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Fig. 2. The isolated hearts were exposed to mixed gas（PCO2 = 150 hPa
and PO2 = 850 hPa）
, and the blood was removed from them inKrebs-Henseleit（KH）solution cooled to 4 ℃, which was then infused
as a preservative. The inside continued doing perfusion of KH
liquid at speed of 0.1ml/h from the aorta of the extraction heart ofthe donor rat for a during the preservation period, and the hearts
were then exposed to mixed gas PCO2=150hPa and PO2=850hPa
with 80ml/min and immersed in PFC cooled to 4 ℃.
（A, glass）.

65

また 96，120 時間の保存においては上記の方法に，保存中，灌流法を加えた．PFC 液に浸漬させた摘出心臓へ KH 液（改良型）
を毎時 0.1ml の速度で大動脈から灌流し続けた．それぞれ 96，
120 時間保存した（Fig. 2）．
次にレシピエント操作について説明する．ラットにジエチル
エーテル吸入麻酔を行った後，右頚部を広く剃毛，75 ％エタノールで術部を消毒後，約３ cm 縦切開した．皮下の結合組織を電気メスで焼落し，外頚静脈，総頚動脈を長く露出させた．外頚静脈の中枢側をマイクロクリップで遮断後，外頚静脈の末梢側を結紮切離した．続いて，総頚動脈の中枢側をマイクロクリ
ップで遮断後，総頚動脈の中枢側を結紮切離した．外頚静脈，
総頚動脈のサイズに合った cuff をそれぞれ装着後，ヘパリン添
加生理食塩水で血管内腔をフラッシュした．保存してあるドナー心臓を PFC 液から取り出し，生理食塩水に一時的に浸漬した後，レシピエントラットの総頚動脈と外頚静脈，ドナー心臓の大動脈と肺動脈をそれぞれ端々吻合した．外頚静脈，総頚動
脈のマイクロクリップを外して血液を通し，移植心臓への血流を再開させ，ドナー心臓が活動を開始するかどうか確認した．
その後，頚部の切開皮膚を縫合した．レシピエントラットに抗生物質を溶解させた飲用水を与え，飼育室にて事後観察を行った．その後，レシピエントラットとドナーラットの心臓の拍動を心電図で記録した．
炭酸ガス（150hPa）を曝気させ続けた４℃の PFC 液にて 48
から 120 時間保存後，20 例の異所性心移植を実施し蘇生させた．
48 時間保存では５例異所性心移植を行い蘇生させ，５例は心拍動を確認した．また移植してから 10 週間後，心電図にて移植心臓の拍動を記録できた．
72 時間保存では５例異所性心移植を行い蘇生させ，５例は心拍動を確認した．また移植してから 10 週間後も心電図にて移植心臓の拍動を記録できた．
96 時間保存では５例異所性心移植を行い蘇生させ，５例は心拍動を確認した．また移植してから 24 時間後，移植心臓の拍動は確認できなかった．
120 時間保存では５例異所性心移植を行い蘇生させ，４例は心拍動を確認した．また移植してから 24 時間後，移植心臓の拍動は確認できなかった．
それぞれ対照実験として供給するガスに純酸素，純ヘリウム，
標準空気を用い，他は同一条件として保存蘇生実験を実施した．
純酸素，不活性ガスである純ヘリウム，標準空気をそれぞれ個別に毎分 80ml を曝気した後，異所性心移植を実施したが，各５例の全てのドナー心臓の拍動は見られなかった（Table 1）．
摘出心臓移植後のレシピエントラットの心電図を Fig. 3 に示した．
Kuroda et al.（1995）は，ラットの心腔内に UW 液を満たし摘出した心臓全体を PFC 液に浸漬し，PFC 液を通じて酸素を供給することにより，摘出心臓を最大 48 時間保存後，蘇生させ異所性心移植を行い６週間生存（4/5 ＝ 80 ％）させたことを報告した 12）．今回，我々は上記の方法を改変し，ラットの摘出
心臓を PFC 液に浸漬し，酸素に加えて炭酸ガスを分圧 100hPa

66

Table 1. Hearts exposed to CO2 gas in PFC solution are indicated by 1A,
1B, 1C, 2A, 2B, 3, 4, 5, and 6 in the table.
Hearts exposed to pure O2 , pure He, and standard air in PFC
solution are indicated by 3, 4, 5, and 6, respectively.
The resuscitation rate following heterotopic transplant after
preservation of the heart and the 10-week survival rate areshown for each heart.
Tests of significance using one-way analysis of variance（ANOVA）were conducted for the control experiments
1A, 1B, 2A, 2B, and 3, 4, 5, and 6 with preservation by CO2
exposure, respectively.（★ = P<0.05）
Group

Preservation
methodPerfusion
speed

Preservation
timenResuscitationrate（％）

Ten-weekssuvival rate（％）

1A

KH/PFC+CO（150hPa）
2

―

48

5

5/5（100）★

5/5（100）

1B

KH/PFC+CO（150hPa）
2

―

72

5

5/5（100）★

5/5（100）

1C

KH/PFC+CO（150hPa）
2

―

96

5

0/5（0）

0/5（0）2A

KH/PFC+CO（150hPa）
2

0.1ml/h96

5

5/5（100）★

0/5（0）

2B

KH/PFC+CO（150hPa）
2

0.1ml/h120

5

4/5（80）★

0/5（0）

3

KH/PFC+O2

―

48

5

0/5（0）

0/5（0）

4

KH/PFC+He

―

48

5

0/5（0）

0/5（0）

5

KH/PFC+Air

―

48

5

0/5（0）

0/5（0）―

05

5/5（100）

5/5（100）

6control

Fig. 3. An isolated heart of a donor rat（RA-1656）was preserved for 72
hr, after which it was heterotopically transplanted to the recipient
rat and resuscitated. An ECG was recorded after 12 weeks.
Preservation was started on August 18, 2006, the heart washeterotopically transplanted on August 21, 2006, and the ECG wasrecorded on November 15, 2006. Heading above figure:ECG after
12 weeks survival of a heart preserved for 72 hr; donor rat（RA1656）.

で曝気供給しながら摘出心臓を保存した．この結果 72 時間以上保存した心臓を，レシピエントラットの右頸部に異所性心移植を実施し，24 週間以上生存させることができた．CO2 濃度以外の変更点として本実験では，UW 液の代わりに KH 液を用いた．UW 液を用いて 72 時間以上の保存を試みたが，蘇生において心房の一部の細動しか見られなかった．一方，KH 液においては良い結果が得られた．KH 液が最善とする理由はなく，最適の保存液については今後とも探求していくが，UW 液の高粘性が長時間の保存には適さないように思われる．また，摘出した心臓が PFC 液から浮き上がらないように心臓に付着する血管を長めに採取しそれを容器にひもでくくりつけた．心臓を上からネットで押さえつけると組織の一部が多少とも傷害される可能性があるが，我々の方法ではあたかも風船のように摘出心人工血液 Vol. 17 , No.2, 2009

が PFC 液の中に浮かんでいて機械的な組織傷害の可能性はな
い．また，心臓が生着していることが外から判断できる異所移植法として頚部異所性心移植を用いた．
本研究の最も重要な点は，摘出心臓を PFC 液を通じてやや高い濃度の環境下で保存したことである．CO2 は容易に組織に拡散するため摘出心臓の組織全体が高い濃度の CO2 環境下にあると考えられる．CO2 は多くの生物的実験では O2 を混合して，
buffer との併用下で O2 /CO2 ＝ 95 ％/５％（大気圧下５％の CO2
は，ほぼ生体内の CO 2 濃度 35mmHg と同等）として使用される．一方，高濃度の CO2 ＝ 15 〜 20 ％以上では麻酔作用，代謝抑制作用をもち 13-14），実験動物の麻酔 15），穀物の保存，魚の輸送保存にも商業的に使われている 16-17）．このような CO2 の効果の機序については蛋白質の生体高分子の表面に吸着して保護するという説 18），CO2 同様に麻酔作用 19），代謝抑制作用 20），植物の保存 9）に使われる Xe 等の不活性ガスと同様に生体内の水分子の集合体をなんらかの意味で構造化する 21）ことが効果の主因ではないかとする説もある．しかし，CO2 溶解に伴って起こる
pH の低下の影響も関与していると考えられ，詳細はいまだに不明である．
本研究の著者の一人である Seki et al.（1998）は体内の水分量を減少させた状態のクマムシが perfluorocarbon（PFC）の中で 6000 気圧の超高圧下におかれても蘇生しうることを示した 10）．
生命体がこのように体内の水分量を減少させて代謝を低下させ，乾燥，低温などの極限環境に適応することは cryptobiosisとよばれているが，北極圏の植物の乾燥休眠や，多くのバクテ
リアが，相対湿度が 60 ％以下になると休眠状態になる現象など自然界で広範囲に見られる現象で，細菌の場合は乾燥保存法
として実用化もされている．この現象の一つの特徴は細胞内の水の一部が失われるのであるが，生体高分子表面を保護する結合水は残り，自由水が減少し，それに伴って細胞内の代謝が再生可能な限界内で低下することと考えられる．このことから組織または細胞内の構造化された水を残し，自由水を組織や細胞に傷害を与えず再生可能な方法で取り除けば，代謝の低下が起
こり組織の長期間保存ができる可能性があると考え，哺乳動物の摘出臓器を保存する実験に取り組んだ．1998 年から現在まで
PFC 液を用いながら水分量を減少させ蘇生させる実験をラットとブタで多数行い，時には良い結果を得たが再現性には乏しかった．その後 CO2 ガスが上記のごとく生体に対して麻酔作用，代謝抑制作用を持つことに着目し水分量減少と高濃度（20 ％）の環境下で心臓保存の実験を行い一定の結果を得た．2005 年には 2 気圧の高圧下で CO2 分圧が 400hPa の環境下でラット摘出心臓を，24 時間水分を減少させながら保存した後，蘇生させ，レシピエントラットに異所性心移植できることを再現性をもって示した 11）．生体内の結合水を保持し自由水の水分量を減少させるのと同様に CO2 ガスは自由水を構造化させることを示唆したが，生物物理学的にそのことを立証するのは今後の課題である．
このように，我々の研究は，臓器を乾燥させ水分量を減少させたり，CO2 ガスにより組織の代謝を抑制させたりすることを

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.2, 2009

主眼としていた．今回，組織への O2 の供給に着目した Kurodaの実験に CO2 濃度の変更を試み，より良い結果を得ることができた．CO2 の効果に着目した組織保存の実験としては，我々のもの以前には Ohta et al. 13，22）のものがあり，Modified EuroCollins 液に CO2 を付加して犬の血管の保存について良い結果を得ているが，同様の実験をラット心臓について行ったところ，
48 時間以内でも蘇生は見られなかった．これは心筋がより多くの O2 供給を必要とするためと考えられ，PFC 液使用下では O2の供給が改善して保存時間が延長できたと考えている．また，組織内の自由水の濃度の測定は困難であるが，PFC 液浸漬下での O2，CO2 ガス曝露は組織水分量を減少の方向に傾けることが考えられ，自由水の減少と組織保存効果の関係も今後の検討課
題である．
我々の研究は水分量の減少や CO2 ガスにより組織の代謝を抑制し保存時間を延長しようとするものであった．あたかも人工的に組織を冬眠に導くことと考えられる．一方で電子伝達系の酵素の阻害 22）や低温暴露 23）をして生命活動そのものを，その後蘇生できるような形で一時的に停止させる方法で臓器保存を行おうとする考え方もあり suspended animation といわれている．いずれも生命あるものと物質のごとき状態を自由に行き来できることを目指す技術的試みであり，これらを総合してsemibiology と呼ぶことを提案したい．
我々は，さらなる保存時間の延長を目指して研究中であり，心筋細胞の休眠状態を維持するための最適の炭酸ガス分圧と浸漬液，保存液の選択または作成，特に CO2 に伴う pH の低下を防ぐための Modified Euro-Collins 液 22）に準じた緩衝液を用いた実験を施行中である．また実用段階を目指して，より大型の動物の心臓に応用できるように灌流法の併用も試みている．また
CO 2 の効果に関する基礎的な研究とともに，保存組織の ATP
濃度や顕微鏡的組織像からの研究も検討している．
酸素と炭酸ガスの混合ガス環境下や PFC 液下で臓器を保存すると乾燥が進行する．時間の経過と共に摘出臓器の重量が実験前と比較し，−30 ％以上乾燥させるとほとんど蘇生できなかった．この原因は，摘出心臓を４℃の低温下で保存しても，非常に代謝が減少するにも関わらず，心臓自体が酸素代謝を行っていたためであると考えられる．

Ⅳ 臓器保存と一酸化炭素ガス（CO）
本実験では，日本 SLC 株式会社で臓器移植用に開発された近交系のラット LEW/SsN Slc（♂,６週齢）をドナーとレシピエン
トとして使用した．CO2 ガスによる乾燥保存時用いたドナー操作を使用した．7ATA の高圧チェンバー内にラットの摘出心臓を CO（400hPa）と CO 2（100hPa）と O 2（900hPa）と He（5600hPa）による高圧チェンバー内に保存後，冷蔵庫（４℃）
内に置いた．KH 液には抗生物質，ワーファリンを加え溶解させたものを用いた（Fig. 4）．
高圧チェンバー内は蒸留水を満たしたビーカーを置き，チェ
ンバー内湿度を 90 ％以上に保持した（Fig 1）．24 時間後，CO2による保存蘇生法時に用いた異所性心移植法により心臓への血67

Table 2. An isolated rat heart was preserved in a hyperbaric chamber of
2 ATA of a mixture of CO and O2, with predetermined level of
CO partial pressure. After 24 hr preservation, it washeterotopically transplanted. This table indicates the rate ofresuscitation immediately after the transplantation and the rateof survival 10 weeks later.

Group Preservation method

Preservation The number Resuscitation

Ten weekstime（ hr）

of hearts

rate（ %）

survival rate（ %）1A

O（1800hPa）+CO（200hPa）
2

24

5

3/5（ 60）

3/5（ 60）

1B+CO（400hPa）
O（1600hPa）
2

24

5

5/5（ 100）

5/5（ 100）

1C

O（1400hPa）+CO（600hPa）
2

24

5

5/5（ 100）

3/5（ 60）

1D

O（1200hPa）+CO（800hPa）
2

24

5

1/5（ 20）

1/5（ 20）

1E

O（1000hPa）+CO（1000hPa）
2

24

5

1/5（ 20）0/5（ 0）2

control

010

10/10（ 100）

10/10（ 100）

Fig. 4. A hyperbaric chamber was used for the preservation of isolatedheart. A beaker filled with distilled water was placed inside thechamber to maintain the humidity at over 90 ％. The heart wasfilled with KH solution into which antibiotics and warfarin sodium
were dissolved and it was hung as shown in the illustration.
［Section 1］The mixture of CO and O2 was pressurized from 2
ATA to 7 ATA and the chamber was put in a refrigerator andstored at 4 ℃ for 48 hr.
［Section 2］The mixture of O2, CO2, CO and He was pressurized
up to 7 ATA and the chamber was put in a refrigerator andstored at 4 ℃ for 72 hr.

流を再開させ，ドナー心臓が活動を開始するかどうかを確認した．その後，頚部の切開皮膚を縫合した．手術後，レシピエン
トにヘパリンナトリウム 100 単位を添加した生理食塩水 1.0 mlを静脈投与し，移植心臓における血栓予防を行った．その後，１週間ごとに移植心臓の心電図を記録した．レシピエントラッ
トに抗生物質を溶解させた飲用水を与え，飼育室にて事後観察を行った．10 週間後，レシピエントラットとドナーラットの心臓の拍動を心電図で記録した．
2ATA の高圧チェンバー内に酸素と一酸化炭素の混合ガスで加圧した 24 時間保存後蘇生させたラット摘出心臓をレシピエ
ントラットの総頚動脈と大動脈，外頚静脈と肺動脈をそれぞれ端々吻合し，33 例の異所性心移植を行い，移植直後に拍動を心電図で記録できたものは 14 例であった．その内，心室･心房まで蘇生が見られたのは 11 例，心房のみの蘇生が見られたのは３例であった（Table 2）．８週間後に拍動を確認し，心電図を記録できたものは 11 例であった（Fig. 5）．対照実験として純酸素，
純ヘリウム，標準空気，He と CO の混合ガス，（PHe ＝ 1400hPa，
PCO=600hPa），CO 2 と CO の混合ガス（PCO2=1400hPa，
PCO=600hPa）を用いて同一条件で保存蘇生実験を実施した．
He と CO の混合ガス（PHe ＝ 1400hPa+PCO=600hPa）で保存
したもののみわずかな蘇生（心房の拍動：４体/５体）が見ら68

Fig. 5. An isolated rat heart was put into a hyperbaric chamber which
was pressurized to 2 ATA with PO2=1600 hPa+PCO=400 hPa.
After 24 hr of preservation, the preserved heart washeterotopically transplanted to the neck of a recipient rat and wasresuscitated. Ten weeks later on October 12, 2007 this ECG wasrecorded for the donor rat heart and the recipient rat heart.

れたが，残りの対照実験の各５例の全てのドナー心臓の拍動は見られなかった．
7ATA にラットの摘出心臓を CO（400hPa），CO2（100hPa），
O2（900hPa），He（5600hPa）にて 72 時間曝露保存後，レシピ
エントラットの右頚部に異所性心移植をし，３ヶ月間以上生存させることができた．72 時間保存し異所性心移植後 10 週間後に拍動を確認し，心電図を記録できたものは８例であった（Fig. 6-7，Table 3-4）．対照実験として使用した加圧ガスとして純酸素，純ヘリウム，標準空気を用い，他は同一条件として保存蘇生実験を実施し，異所性心移植を実施したが，各５例の全てのドナー心臓の拍動は見られなかった．
Anthony（1961）は，９から 10cm の金魚の水槽に CO を溶解（0.3ml/L）させて生存時間を観察する実験を行った 24）．摂氏５，
1 5 ， 3 0 ℃ の 環 境 に F C O = 8 0 , F O 2= 2 0 の 混 合 ガ ス で 毎 分

人工血液 Vol. 17 , No.2, 2009

Table 3. Isolated rat heart was preserved 48 hr in a hyperbaric chamberof 7 ATA pressurized by CO and O2 with their respective levelof partial pressure. The resuscitation rate immediately after
transplantation and the survival rate 10 weeks after theoperation are indicated here.

Group Preservation method

Fig. 6. Isolated rat heart was put in a hyperbaric chamber and kept
there for 48 hr at 7 ATA（PO2=3000 hPa + PCO=4000 hPa）andthen was transplanted heterotopically to the neck of a recipient
rat and was resuscitated. This ECG was recorded on May 7, 2008
from the donor heart and recipient heart.

Fig. 7. Isolated rat heart was placed in a hyperbaric chamber and wascompressed with PCO=400 hPa+PCO 2 =100 hPa+PO 2 =900
hPa+PHe=5600 hPa. After 72 hr of preservation, the heart wastransplanted heterotopically to the neck of the recipient rat andwas resuscitated. Ten weeks after resuscitation, on July 1, 2008,
this ECG was recorded from the donor rat heart and the recipient
rat heart.

100ml/min 曝気して金魚は 48 時間生存することを観察している．CO により Hb を不活化した金魚で観察したところ 30 ℃で
24 時間以内に死んだのに対して，より低温では長時間生存したことを観察した．Anthony によれば，COHb 化が進行すれば哺乳動物や鳥類は急速に死を招く．多くの変温動物は一酸化炭素の中毒から生き延びることができる．その理由として多くの変温動物は酸素代謝から他の代謝に切り替えができるためと推測している 24）．Fenn と Cobb（1932）は，FCO=79,FO2=21 の混合ガスにカエルを曝露すると筋肉が 1.5 から３倍の濃いローズ
色に変化する事を報告している．また呼吸商の変化から CO が

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.2, 2009

Preservation The number Resuscitation

Ten weekstime（ hr）

of hearts

rate（ %）

survival rate（ %）55/5（ 100）

4/5（ 80）

1A

O（3000hPa）+CO（4000hPa）
2

48

1B

O（2500hPa）+CO（4500hPa）
2

48

4

4/4（ 100）

3/4（ 75）2control

010

10/10（ 100）

10/10（ 100）

Table 4. Record of an Experiment, After 72 hr of preservation, the heart
was transplanted heterotopically to the neck of the recipient rat
and was resuscitated.

CO2 に置換すると推察したが，その後，C14 や C11 の炭素同位体を用いた研究を行い CO が生体内で CO2 に酸化することは現在否定されている 25）．
一酸化炭酸ガスは，シトクロム酸化酵素の Fe2+ と結びついて，この酵素の活性を抑制する作用がある．この酵素はブドウ糖からエネルギーを産出させるために不可欠な酵素であり，生体はこの酵素なしでは生きていくことはできない．一酸化炭素は，ラットの摘出心臓の細胞内の代謝を低下させ壊死を防止する効果があり，移植用のドナー心臓の長時間の保存が可能になったものと示唆された．異所性心移植後も心拍動が見られたことか
らもこのことが裏付けられた．結論として我々はラットの摘出
心臓を一酸化炭素分圧 400hPa に 24 時間曝露し保存後蘇生させ，移植後も移植心臓が活動し再現性がある新しい保存技術を開発することに成功した．なお PCO を 1000hPa から 2000hPaまでの高分圧の一酸化炭素環境下に 24 時間以上曝露する 40 例
以上の実験を実施したがいずれも蘇生はみられなかった．
大気中に存在する一酸化窒素（NO ： nitrogen monoxide）
は，酸素と同じようにラジカルである．NO は大気を汚染して69

いる窒素酸化物の一つであり，今まで悪玉分子として扱われてきた．しかし，Furehgott と Zawadzki（1980）は，体内で NOが血管を拡張したり筋肉を弛緩させたりする物質として最初に報告後，飛躍的に研究が進み NO は生命活動に必須の善玉分子であることを示す実験結果が示されてきた 26）．NO は生体内で作られるが呼吸器を通して血液の Hb や Mb と親和性を示し
NOHb や NOMb になるが，NOHb は Hb を守る機構によりすぐ元の Hb に戻ることが確かめられている．血液中の Hb と親和性を示す CO も NO と同様に生体内で作られ，神経伝達，血管拡張に役立っている報告もされるようになってきた 27-28）．
CO は，Bernard（1857）の研究以来 CO 中毒として悪玉分子にとして位置づけられている 29）．CO の生体への作用のメカニ
ズムは未だ不明であるが精力的に基礎や応用研究されている 30-32）．
CO は生体内のヘム蛋白質との親和性が大変高く，ヘム蛋白質の機能を阻害する．ヘム蛋白質には血中ヘモグロビン，筋ミオ
グロビン，シトクロム，カタラーゼ，ペルオキシダーゼなどであり，これらは酸素運搬，電子伝達，酵素作用により酸素代謝に関係している．このうち一酸化炭素とヘモグロビンが結合したものを，一酸化炭素ヘモグロビン（カルボニルヘモグロビン，COHb）という．一酸化炭素に対するヘモグロビンの親和力は，酸素のそれに比べて 250 〜 300 倍と大きく，血液中に一酸化炭素が侵入すると，ヘモグロビンは酸素と結合していても一酸化炭素によって置換され，酸素運搬能力が失われてしまう．
COHb は一酸化炭素と結合していないヘモグロビンの酸素親和性を高める作用があり，末梢組織において酸素がヘモグロビンから遊離しなくなる．また，他のヘム蛋白質も一酸化炭素との親和性が高く，一酸化炭素と結合して酸素代謝が阻害される．
このように一酸化炭素の作用により，生体内において酸素運搬能力が障害をうけ，細胞組織が貧血性低酸素症となった状態を
一酸化炭素中毒という．一酸化炭素の毒性は大変に強く，ヒト
では一酸化炭素の大気中濃度が 0.01 ％（100ppm）であっても中毒症状が発現する．0.08 〜 0.12 ％になると，昏睡，呼吸不全，
心不全になることがある．濃度が 0.08 ％（800ppm）の時には，
血中ヘモグロビンの 50 ％は COHb となる．一酸化炭素濃度がさらに上昇して 0.15 ％になると死亡する可能性が出てくる．さらに 0.19 ％（1900ppm）になると，短時間に死亡する 31）．
ラットの摘出心臓を長期間保存するために，一酸化炭素ガスを使用したのは以下のような理由があるからである．今回，この O 2 との混合ガス中の CO 2 に変わり，動的平行（dynamic
equilibrium）の関係にある CO を加えてみた．一酸化炭素分圧
600hPa で 24 時間曝露し保存したラットの摘出心臓をレシピエ
ントラットの右頸部に異所性心移植蘇生後，蘇生した移植心臓を約３ヶ月以上生存させることができた．蘇生した原因として，一酸化炭素ガスはブドウ糖からエネルギーを産出させるために生体にとって不可欠な酵素であるシトクロム酸化酵素の Fe2+ と結びついて，この酵素の活性を抑制する作用があることで知られている 33）．また，この酵素は，一酸化炭素ガスが細胞内代謝を抑制し壊死を防止したのではないかと考えられる．エントロ
ピー増大の法則により，崩壊する構成成分をあえて先回りして70

分解し，このような乱雑さが蓄積するよりも早く，常に再構築を行うことができ，すべての分子が高速で入れ替わっているという動的平衡論が知られているが，この仕組みが高圧内における保存心臓内の細胞･組織において，酸素と一酸化炭素の動的平衡が成り立ち，シトクロム酸化酵素の Fe2+ と結びつくことによりこの酵素の活性を抑制していることにより細胞内代謝を抑制し壊死を防止したのではないかと考える 34-35）．0.2MPa の高圧環境下の一酸化炭素と酸素の混合ガス中の一酸化炭素分圧を400hPa で保存すると最も蘇生率が高いことがわかり，100 ％濃度の一酸化炭素で摘出心臓を乾燥保存させると移植直後，拍動は見られたが，生着まで至るものはなかった．また不活性ガスのヘリウムや二酸化炭素と，一酸化炭素ガス（600hPa）を混合し，摘出心臓を保存したが，移植蘇生直後の拍動は見られたが生着まで至るものはなかった．

Ⅴ

まとめ

ラットの摘出心臓を CO ガス（PCO=2000hPa，ヒトの致死量の 2500 倍の分圧）に曝露する実験を行ったところ，24 時間
以上経過しても水分の喪失は起こらなかったことで明らかとなった．反対に CO2 ガス（PO2=2000hPa）に摘出心臓を 24 時間
曝露すると，−30 ％の水分喪失が生じることが明らかとなった．
高分圧の CO は，酸素代謝を完全に抑制する効果があり水分喪失が生じないことが示唆された．高分圧の二酸化炭素は，嫌気性バクテリアを増殖させ，高分圧酸素は好気性バクテリアを増殖させることが知られている．今回の PCO=400hPa という高分圧の一酸化炭素は，好気性バクテリアと嫌気性バクテリアの自己複製を抑制する作用があり，72 時間という長時間の保存が可能になったものと思われた．物理学や化学の世界では，COは使用されていたが，生物学の世界では CO は使用されていなかった．本実験の成果は，今後，一酸化炭素や二酸化炭素が他の哺乳動物やヒトの臓器の保存蘇生が応用できる可能性を示唆するものであった．哺乳動物の摘出臓器を長期間保存蘇生できるパラメーターは，保存ガス分圧，圧力自体，温度，湿度，酸素分圧などをうまくコントロールすれば長期間の臓器保存が可
能になることが示唆された．我々の開発した摘出臓器を乾燥させる保存蘇生技術は，生命活動を停止させ再び蘇えらせる
semibiology（半生物学）という新分野を誕生させた．自動車が故障し修理して再び乗れるようになるのは，設計図と部品と修理技術があるからである．ヒトの場合，自動車のように設計図（解剖図），修理技術（外科手術）は既に完成している．しかし，部品（臓器）がない状態である．部品は，ヒトの脳死者
からの供給に頼っているが，臓器の最大保存期間は 24 時間である．私たちの臓器保存蘇生技術は，部品（臓器）を 24 時間
から 72 時間に伸ばしたことである．20 世紀は導体の世界から
半導体の世界に入った．Semibiology の技術が発展し，臓器の保存期間を１年間以上に延長させることができた場合，半導体のようにヒトの寿命も半永久的になるものと思われる．自然界の植物や動物が毎年のように自ら乾燥休眠し，翌年の春に覚醒している自然現象は，既に植物や動物の細胞･組織に応用され人工血液 Vol. 17 , No.2, 2009

保存方法としての実用化が図られている．我々は，この自然界で毎年のように繰り替えされている生物の覚醒休眠現象を，哺乳動物の摘出臓器に応用できることを本実験で示すことができ，しかも再現性があることを示すことができた．

Ⅵ

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人工血液 Vol. 17 , No.2, 2009

総説

高分子型ベシクルを用いた新しい生体材料の創製：
リポソーム代替材料としてのポリマーソームと革新的ナノ・マイクロカプセル ピクソーム（PICsome）
PICsome Technology: Polymeric Vesicles toward Biomedical
Applications
岸村 顕広（1），片岡 一則（1，2，3）
Akihiro Kishimura (1), Kazunori Kataoka (1,2,3)

和文抄録
人工赤血球やドラッグキャリアに用いるカプセル基剤として開発が進むリポソームに代わる材料として，最近，合成高分子化合物を基盤とするベシクル ポリマーソーム の開発が進んでいる．これらの大部分は両親媒性のブロック共重合体からなるリポソーム類似の分子集合体であるが，ポリマーならではの堅牢性，およびポリマーの分子設計に基づく生体適合性や生体吸収性をうまく組合せることでリポソームを越える機能を持つに至っている．一方で，両親媒性高分子の利用とは全く異なるコンセプトの下に開発されたのがピクソームである．ピクソームは，ポリイオンコンプレックス形成を利用したベシクルであり，正・負の反対荷電を有するポリマーの水溶液を用いて極めて簡便な手法で得ることができる．
得られたピクソームは，特有の物質透過性，及び pH 応答能を示した他，水溶性高分子を簡便に封入可能であった．その他，既存の両親媒性ポリマーを用いるシステムでは考えられない特異な挙動を示し，既存の手法とは異なるサイズや構造を制御したベシクル形成法を見出すに至った．本稿では，一般のポリマーソームの基本的性質とその応用，及びピクソー
ムの基本原理とその可能性について概観する．
Abstract
Polymersomes（polymeric vesicles）have attracted great attentions considering potential utilities for biomedical andpharmaceutical applications. Most of polymersomes are composed of amphiphilic block copolymers, like a scaled-up lipid .
Compared with liposomes, polymersomes show better mechanical and physical properties and much more useful properties forbiomedical applications using biocompatible or biodegradable polymers. On the other hand, PICsomes, one of new families ofpolymeric vesicles, have been developed utilizing a pair of oppositely charged block copolymers. PICsomes can be obtained
directly in an aqueous media in a very simple manner and show quite unique and important characters, such as encapsulationof proteins, semipermeability, pH-sensitivity, and so on. Very recently, exclusive methods to control sizes and structures of
PICsomes have been established. In this article, recent advances of polymersomes and PICsomes have been reviewed especiallyfrom the viewpoint of biomedical applications.
Keywords
Polymeric Vesicles; Supramolecular Chemistry; Self-assembly; Bottom-up Technology; Drug Delivery System; Artificial
Organelle; Artificial Cells.

（1）東京大学大学院 工学系研究科 マテリアル工学専攻 生体機能材料学講座 〒 113-8656

東京都文京区本郷 7-3-1 Department of Materials

Engineering, Graduate School of Engineering, The University of Tokyo, 7-3-1 Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo 113-8656 Japan（2）東京大学大学院 医学系研究科 疾患生命工学センター 臨床医工学部門 Division of Clinical Biotechnology, Center for Disease Biology andIntegrative Medicine, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo（3）東京大学 ナノバイオインテグレーション研究拠点 Center for NanoBio Integration, The University of Tokyo
論文受付 2009 年５月 13 日 論文受理 2009 年６月 23 日

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.2, 200973

１．はじめにボトムアップテクノロジーとの関連から，自己組織化を利用したものづくりが注目を浴びているが，分子集合体の制御技術はその中核を成すものと言える．古くは，生体膜の構成成分である脂質や界面活性剤が中心であったが，いわゆる超分子化学が定着して以降，種々のタンパク質構造体や核酸などを模倣・応用した分子設計がなされ，材料応用が検討されている．1995
年，A. Eisenberg らが高分子型ベシクル（自己組織化中空粒子）を最初に報告してからは 1），合成ポリマーの集合体の研究が飛躍的に発展した．中でも，生体適合性で知られるポリマーを用いた集合体は，ドラッグデリバリーシステム（DDS）のキャリ
アやバイオマテリアルのスキャホールドとして様々な応用が検討されはじめ，いつしか『ポリマーソーム（Polymersome）』という名で定着した（最初に用いられたのは 1999 年の Science
誌掲載の論文と思われる 2））．本稿では，人工赤血球をはじめとする医療応用を見据えたリポソーム代替材料としての高分子型
ベシクルについて最近の動向を紹介する．特に後半では，筆者らが最近開発した新型の高分子ベシクル『ピクソーム（PICsome）』について，その詳細を解説する．

２．自己組織化型高分子ベシクル：ポリマーソーム
リポソームを構成する脂質分子からの簡単な類推ではあるが，疎水的な部分と親水的な部分を併せ持つ両親媒性のポリマーを作ることができれば，ポリマーでもベシクルが作ることが可能だと考えられる．この目的に合致したのが，いわゆるブロ
ック共重合体であった．典型的な両親媒性ブロック共重合体は，一つないしは二つの親水性ブロックと一つの疎水性ブロックを有する（Fig. 1）．これらの分子を水中などの極性の高い環境でFig. 1. Schematic representation of the formation of a polymersome
through the self-assembly of amphiphilic block copolymers.

集合化させることで，ポリマーソームを作ることができる 3，4，5）．
実際には，疎水性ブロックが集まって膜構造を形成し，さらに閉じることで小胞を与えるが，この時重要になるのが，親水部と疎水部のボリューム（分子量）のバランスである．あまりに
親水部が大きいとミセル（コアのある微粒子）形成が支配的になり，ベシクルを得ることができない．Fig. 2 にポリマーソー
ムを作るのに用いられた構成成分の例を示す．これら構成成分の種類や組成（つまり分子量）を変えることで，膜の厚みや物
質透過性をコントロールすることができる．例えば，PEG（ポリエチレングリコール）と PBD（ポリブタジエン）の組み合
わせのジブロック共重合体について，分子量をコントロールすることで，膜の厚みを約 10-21 nm の範囲で制御できる 6）．また，
疎水性ブロックの極性や厚みを変えることで，水の浸透性をある程度制御できる 7）．これらは，リポソームでは実現が難しい技術であり，ポリマーを用いる大きな動機づけとなる．また，ポリマーソームは巨大分子を用いて作るため概して疎水層の厚Fig. 2. Representative chemical structures of the polymers which are used as a building block of polymersomes.

74

人工血液 Vol. 17 , No.2, 2009

みが増しており，脂質膜に比べて堅牢な膜を形成し，機械的な強度や安定性も上昇している 2，3）．一方で，これら両親媒性ポリ
マーは所詮巨大な脂質類縁体に過ぎない部分もあり，特に調製法に関してはリポソーム同様の手法が使える反面，その弱点もそのまま受け継いでしまっていると言える．この点に関しては後述するが，ここでは調製法の類似点のみ指摘しておく．即ち，ポリマー薄膜に水和させた後に，あるいは，ポリマーの有機溶
媒溶液の溶媒置換を行った後に，超音波処理やエクストルーダー
処理を施すことで，ポリマーソームに物質を充 し成形加工する（サイズを制御し膜数を一枚に揃える）ことができる．興味深い例として，純粋な水系ではなくなってしまうところに難があるが，有機溶剤を用いて溶媒の組成をコントロールすること
で，得られる一枚膜ベシクルの粒径を制御することができる 8，9）．
細かい物性のチューニングが可能な点も魅力ではあるが，バイオマテリアルへの応用を考えた場合，さらに大きな利点がある．それは，生体適合性や生分解性・生体吸収性が知られているポリマーを用いてベシクルを設計できる点である．実際，Fig.
2 にも示したコンポーネントなどを用いて，種々のポリマーソームが調製されている．特に，PEG を用いたものは報告例が多い．最も重要な点は，安定性を犠牲にすることなく十分な PEG
化が可能な点である．一般の PEG 化リポソームは約 5mol ％の脂質のみが PEG 化されているが，これは主にリポソームが不安定化されることなどにより，上限が決まってしまっているのが実情である．これに対して PEG 含有ポリマーソームは，全てのポリマーがおのおの PEG 鎖を有しているため，PEG 化率
は 100 ％となる（この時の PEG の重量分率はおよそ 30 ％程度）．
実際，PEG-PBD ブロック共重合体を用いたポリマーソームについて，一般的な PEG 化リポソームに比べて表面 PEG 密度が約 10 倍になっており，ラットにおける血中半減期がおよそ２倍の 28 時間に上昇したという報告がある 10）．この長期血中循環性を応用した例として，人工赤血球，つまり，ヘモグロビンを内包したポリマーソームの報告がある．Palmer らは，以前より PEG 化リポソームを用いた研究をしていたが，PEG-PBD 薄膜形成後にヘモグロビン水溶液を水和させることでポリマーソ
ームにヘモグロビンを封入することに成功した．また，ポリマ
ーソームを構成する膜は脂質二重膜に比べて厚いものの，P50，
cooperative coefficient，methemoglobin level などを評価した
結果，既存の PEG 化リポソームやヒト赤血球と比べて遜色のない酸素運搬能を示すことも明らかにした 11）．その後，彼らは，肝臓や脾臓など細網内皮系に捉えられた後に効率的に分解されるように，PEG-PCL 及び PEG-PLA を用いた人工赤血球を作ることに成功し，その一方でポリマー濃度を高めることで封入効率を改善する手法も開発した 12）．
ところで，先の PLA や PCL などのポリエステル類の生分解性を応用したポリマーソームの研究は，Discher のグループにより先駆的な研究がなされている．彼らは，ブロック共重合体として PEG-PLA（ポリ乳酸）や PEG-PCL（ポリカプロラクトン）を用いてポリマーソームを調製し，制がん剤や遺伝子・核酸のキャリアへ展開している．一般的にポリエステル類の加水

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分解は，酸性条件下で加速されるが，細胞内消化器官であるエンドソームが酸性環境（pH 5.0 〜 6.5）であるため，治療用ナノデバイスに適した素材であると言える．即ち，エンドサイト
ーシス経路を細胞内取り込み経路と想定した場合，細胞内にこれらナノキャリアが侵入した時にのみ薬剤放出が起こる，という仕掛けである．実際には，既存のリポソームに比べて，これらのポリマーソームはより安定なベシクル壁を有するため，疎水的な薬剤をより安定にベシクル壁に充 することができる．
このままでは運ぶだけで適切に徐放できず，むしろ弱点になってしまうが，この場合には壁が生分解性であるため，生態環境下で徐放を開始することができる．さらに面白いことに，これらの構成ポリマーはエンドソーム内の局所ポリマー濃度に対応する濃度において脂質膜を破壊する活性を示し，実際，エンドソームから脱出して細胞質に分布する能力にも優れていた 13）．
また，ドキソルビシンを内水相に，タキソールを殻に充 した
ベシクルを構築し，二つの薬剤を同時デリバリーした結果，マウスを用いた in vivo 実験において相乗的な抗腫瘍効果が得られたことを示している 14）．彼らは最近，生分解性ポリマーソー
ムのこれらの特性を活かしたオリゴ核酸・ siRNA デリバリーの成果も挙げている 15）．一方で，生分解性ポリマーを素材に用いると，その保存安定性が懸念されるところであるが，４℃で保存すれば，一ヶ月後であっても封入物は 95 ％以上保持される，即ちベシクルが安定に保存可能なことが同じく Discher ら
により報告されている 13）．
一方，ポリアミノ酸を用いて pH に応答するポリマーソームを作ることができる．Lecommandoux らの研究グループは，
ポリグルタミン酸-ポリリシンのブロック共重合体を用いて，酸性条件下（pH<4），あるいは塩基性条件下（pH>10）それぞれでベシクルを作り上げることに成功している（Fig. 2）16）．グ
ルタミン側鎖の低 pH 領域でのプロトン化，ポリリシンの高 pH
領域での脱プロトン化により，片方のブロックに疎水的なへリックスの形成が誘起され，最終的にベシクルが形成される．従って，この系においては中間領域の pH でベシクルは形成されない．一方，Deming らは，ポリリシン誘導体からなる非荷電性親水ブロックとポリロイシンとポリリシンのランダム共重合体からなるブロックのブロック共重合体を用いてポリマーソー
ムを作り，pH 応答的に内部に封入した水溶性物質をリリースできる機能があることを見出している 17）．また，ポリリシンの代わりにポリアルギニンを用いた場合（Fig. 2 ; ラベル化ポリア
ルギニン- b -ポリ（L-ロイシン）），ポリマーソームが毒性を示さずに細胞へ効率的に取り込まれることも報告している 18）．
この他，生体内の酸化・還元環境を利用するのも面白い．
Hubbel らは，PEG とポリプロピレンスルフィド（PPS;酸化しうるポリマー）からなるブロック共重合体を用いて，酸化されることで不安定化するポリマーソームを開発している 19，20）．これらは，生体内の H 2O 2 や酸化剤発生酵素であるグルコースオ
キシダーゼの存在を考慮に入れると，非常に有用な材料であると言える．さらに，PEG ブロックと PPS ブロックの連結部位にジスルフィド結合を導入した PEG-SS-PPS を開発し，細胞質

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の還元環境（多くはグルタチオンによる）に応答するシステムを構築している 21）．このように種々の生体内環境に応答するス
マートポリマーソームが開発されているが，さらに最近，外部からのコントロールを狙って，光に応答する系の開発も目立ってきている 5）．今後のさらなる展開に興味が持たれる分野である．
ポリマーソームの最後の話題として，人工オルガネラやナノ
リアクターとしての応用例を紹介したい．親水的なポリメチル
オキサゾリン（PMOXA）あるいはポリエチルオキサゾリン（PEOXA）と疎水的な PDMS からなる ABA 型トリブロック共重合体を用いたポリマーソームのポリマー壁に種々のタンパク質を埋め込み，人工オルガネラやナノリアクターを構築することができる．Montemagno らは，PEOXA-PDMS-PEOXA を用い，自己組織化後に生じる PDMS 層に ATP シンターゼ（合成酵素）とバクテリオロドプシン（BR）を埋め込み，光を当てることで ATP を生産することができるシステムを開発した（Fig. 3a）22）．Meierらの研究グループは PMOXA-PDMS-PMOXA
を用い，PDMS 層内でチャネルタンパク質を再構成し，内水相に酵素を封入することに成功している（Fig. 3b）23，24，25）．その結果，チャネルタンパク質を介した基質分子の透過が可能となり，内部でプロドラッグを活性のあるドラッグに変換したり，基質
を化学構造の変換の後に光らせることができるナノリアクターを構築することに成功した．これらの成果は，単に薬剤をデリバリーするだけのカプセルを越えた，新しい治療法や診断手法を提供するバイオナノデバイスとして大きく期待できる．

Fig. 3. Examples of nanoreactors based on polymersomes integrated withproteins. a）An artificial organelle consisting of ABA-triblock
copolymer, ATP synthase, and bacteriorhodopsin（BR）. ATP
synthase utilizes an electrochemical proton gradient generated by
BR to synthesize ATP. b）A nanoreactor composed of apolymersome, channel protein OmpF that is integrated into avesicle wall, and enzymes encapsulated inside the vesicle. Inactive
prodrugs can be converted to an active form in this nanoreactor.

３．静電相互作用利用型高分子ベシクル（PICsome）

ピクソーム

これまで見てきたように，両親媒性高分子型ポリマーソーム
は，リポソームで培われた様々な手法をそのまま応用できるだ
けでなく，構造的な安定性，血中安定性などがリポソームに比76

べて著しく改善されている点，生分解性などの環境応答性を組み込める点で非常に魅力的な材料である．しかしながら，リポ
ソームのポリマー版でしかない点では発展性の無さを露呈しているとも言える．例えば，これらのベシクルは調製時に有害な有機溶媒を必要としたり，加温や超音波処理などを必要とするなど調製に煩雑な操作が必要となる．また，粒子サイズを揃えるのに繰り返しフィルタを通す操作（エクストルーダー法）も必要となってくる．従って，作製時に施設やコストの面で種々の制限が発生することが予想される．また，これら一連の操作は，非常に繊細な立体構造を有するタンパク質の封入を考えた
場合などには失活などが懸念され，特に大きな障害となると考えられる．さらに，高度に疎水的なことで特徴づけられるベシ
クル壁が，水溶性物質はおろか，水やイオンすらほとんど通さないことは，安定なキャリアにはなりえても，治療に向けて内部に詰めた物質を放出したり，環境応答的に診断を行うのには難があることを示している．一部の弱点は，既に上で述べたよ
うな手法により改善されているが，もっと単純で抜本的な解決法はないだろうか．そこで筆者らが生み出したのが『ピクソーム（PICsome）』である．
PICsome は，両親媒性ポリマーからなるポリマーソームとは一線を画するコンセプトで作られたベシクルである．即ち，静電相互作用を自己組織化の駆動力とするポリイオンコンプレッ
クス形成を利用したポリマー型ベシクルなのである 26-32）．高分
子鎖上に水溶液中でイオン化しうる多数の官能基を有しているものを高分子電解質というが，特に，プラス電荷，マイナス電
荷それぞれ一方の電荷を有している高分子電解質は，反対符号の電荷を有する高分子と遭遇すると直ちに多点の静電相互作用を生じ，エントロピー的な有利さとあいまって速やかに複合体を形成する．これがポリイオンコンプレックス（PIC）である．
PICsome は，生体適合性の PEG 鎖とポリアミノ酸由来のカチオン性連鎖，あるいはアニオン性連鎖からなるブロック共重合
体をそれぞれ別の水溶液として準備し，各々の荷電数が釣り合うように混合し，たった２分間ボルテックスミキサーで撹拌するという非常に簡便な手法で得ることができる（Fig. 4）．Fig. 4に示したポリマーのうち，PEG-PAsp と PEG-P（Asp-AP）を用いたものが最初に見出された第一世代型の 1st-G PICsome である．1st-G PICsome は，生理条件（10 mM Tris-HCl; pH 7.4;
150 mM NaCl）で得ることができ，直径２μm を中心とする粒度分布を示すマイクロカプセルだが，室温で３ヶ月後でも存在し，かつ血清存在下でも安定であった 26）．一方，PEG-PAsp とPEG 鎖を有さないホモ型ポリカチオン homo-P（Asp-AP）を用いたものが第２世代型の Nano-PICsome であり，サブミクロンの領域でサイズと構造が制御できる 31，32）．これまでの検討から，
PICsome を得るには，PEG 鎖とポリイオン連鎖の長さのバラ
ンス 26），さらに，PEG 含有率や添加塩濃度が重要であることが分かってきている 27，28）．このような PICsome には，非常に単純な手法により水溶性の溶質を内部に封入することができる．あらかじめ目的とする被封入物質をどちらか一方の荷電性ポリマ
ー溶液に溶かしておき，前述と同じ要領で混合するだけで終わ人工血液 Vol. 17 , No.2, 2009

Fig. 4. Chemical structures of charged polymers for PICsome（top）, and schematic representation of the formation of PICsome（bottom）.

Fig. 5. Schematic drawing of the preparation of a Myoglobin-loaded-PICsome and its characteristic property.

りである．この手法により，既に多糖やタンパク質の封入に成功している 26，29）（Fig. 5）．しかしながら，PICsome 内への物質
封入は確率的にしか起こらないため，封入効率の向上が今後の課題である．
物性面で，最も PICsome に特徴的であるのは，ポリイオン

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.2, 2009

コンプレックス膜に由来する半透性であろう．1st-G PICsome
に関して言えば，分子量４〜７万程度の分子は安定に内部に保持されるが，数百程度の低分子は，内外を容易に出入りすることが可能である 26）．この性質を活かした例として，人工赤血球の構築を視野に入れた酸素運搬タンパク質であるミオグロビン

77

を封入した 1st-G PICsome がある．ミオグロビン封入後，PICsome 外部に還元剤ジチオナイト（Na 2S 2O 4）を加えると，直ちに活性中心の鉄イオンを還元することができる．これはPIC 膜が高いイオン透過性を持つことに起因する．次に，この溶液に酸素ガスを通じると，ミオグロビンは酸素を結合する．
さらに溶存酸素を取り除くために Ar ガスを通気すると酸素は脱離し，吸脱着を繰り返すことができた（Fig. 5）29）．この時，ミオグロビンは PICsome の内部に安定に保持されており，たとえ外部にタンパク質消化酵素であるトリプシンを加えても失活せず，カプセルとして保護機能を示すことも実証した．これは巨大分子を通さない PIC 膜の性質をうまく利用した例といえる．また，この 1st-G PICsome のサイズは細胞に近いμ m スケールであるが，非常に柔軟性の高い構造体のため，殻がかたい
ポリマーソームやリポソームに比べて人工赤血球の素材として有利になる可能性がある．
先にも少し述べたが，生体内の特定の環境，例えば，胃をはじめとする消化管，細胞内消化器官であるエンドソーム，多くのがん組織などは程度の差こそあれ低 pH 環境であるため，この環境変化に応答するベシクルはドラッグデリバリーのキャリ
アとして非常に有望である．最近，我々は，1st-G PICsome 自身が pH 応答性を示すことを見出した 30）．1st-G PICsome は，構成材料の一部であるポリアスパラギン酸のカルボキシレート側
鎖が低 pH 環境になると徐々にプロトン化されるため，
PICsome 形成のドライビングフォースである静電相互作用に変化が生じる．pH が６付近まで下がると前述の物質透過性に変化が生じ，分子量１万〜７万のデキストラン分子が外側から内側へと浸透できるようになった．さらに低い pH では PICsomeの形態自身に変化が起き，細かな粒子に分裂する様子が観察さFig. 6. pH-senstive behaviors of 1st-G PICsomes. Immediately after the
addition of HCl solution, micron-sized PICsomes underwent
fragmentation. Subsequent neutralization resulted in the reformation of micron-sized PICsomes.

78

れた（Fig. 6）．この変化は可逆的であり，再度 pH を上げると直径数μm のサイズの PICsome が再生した．環境応答性キャリ
アとしての応用の他，この再生能を利用して細胞内の情報を取得するデバイスへの応用などが期待される．
これら 1st-G PICsome の研究と関連して，最近，新しいセル
28）
サイズ PICsome の調製法を発見した（Fig. 7）．ポリカチオン
である PEG-P（Asp-AP）と homo-P（Asp-AP）を，バッファーを
10 mM Tris-HCl（pH 7.4, 150 mM NaCl）としてカチオン荷電数が同じになるように混合して用い，その後に同一荷電数を含むポリアニオン溶液と混合し，直径数ミクロン程度の PIC 粒子（コアセルベート；ポリマー濃縮相）を得た．この PIC 粒子に集束した赤外線レーザーを照射して捕捉し（光ピンセット効果），粒子内の直径１μm 程度の領域を局所加熱したところ，
水膨れ様構造が粒子表面にでき（Fig. 7a-c），みるみるうちに粒子が膨らんで，最終的に薄膜殻（ユニラメラ；一枚膜）を有するセルサイズベシクルが生成した（Fig. 7 右下）．興味深い
ことに，生じるベシクルのサイズは膨らむ前の初期体積に１対１に対応しており，この結果からも得られたセルサイズ
PICsome がユニラメラでできあがっていることが分かる．膨らむ原因は外部からの水の流入であるが，これは局所加熱により粒子内部に水が汲み入れられた効果によるものと考えている（Fig. 7a -c ）．実際，レーザー照射を中断して加熱を中止すると，10 分以内に元と同一サイズのコアセルベートに収縮した．
今後は，これらの性質を利用した物質の内包，あるいは，コア
セルベートの濃縮力を利用した物質の封入などへの展開と合わ
せ，サイズ・構造の制御された新しいマイクロ粒子の製造法として工学的方向から，あるいは人工細胞モデルとして基礎科学的な方向からも研究を進める予定である．
ものづくりの視点からみて，これら PICsome のサイズを幅広い領域に渡って制御するのは重要な課題である．一方で，ナノバイオテクノロジーの観点から，サブミクロンスケール領域でのサイズ制御は，デリバリーキャリアの性能のチューニング，
あるいは，人工オルガネラへの応用を考える上で非常に重要である．しかしながら，フィルタを通して制御する既存の エク
ストルーダー法 などの煩雑な手法ではなく，既に述べてきた『混ぜるだけ』のような単純な手法での制御が望ましい．我々は既に，PEG-PAsp と homo-P（Asp-AP）の組み合わせを用いてPEG 含有率を減らし，さらにできる限り添加塩濃度を低めた条件で PIC 形成を行うことで直径約 100 nm で粒径分布の狭い
PICsome を得ることに成功している（Nano-PICsome）31）．このNano-PICsome は４℃では２週間以上にわたり安定に保存できる．また，ポリマーの仕込み濃度を変えるだけで同様の構造を有するがサイズの大きな PICsome を単分散な粒子として得る手法も確立した．さらに最近，この PICsome を安定化する手法も開発し，添加塩濃度の高い生理条件下で安定に使えることを見出した 32）．また予備的な実験からマウスに投与可能なことも確かめている．今後の医療応用が強く期待される素材である．

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Fig. 7. Formation of a cell-size vesicle from a PIC coacervate triggered by local heating with focused IR laser. Phase
separation（red arrow）took place at the laser focus（intersection of white dashed lines）and resulted in theblister（black arrow）（a-c）. Finally, the blister expanded to a uni-lamellar vesicle. Laser irradiation can force
the polymer-rich phase（P-phase）to move to the surface of PIC coacervate（a , b ）. Then, local heating may
drive transfer of water from outside to inside to maintain polymer concentration in the P-phase（c ）. Theformation of a unilamellar vesicle is completd when all the polymers in the P-phase are consumed. All the
micrographs were obtained using a phase contrast microscope.

４．おわりに
ここまで，ブロック共重合体を用いて種々のベシクル構造を作製する手法について述べてきた．リポソームに比べて様々なメリットを有する点で，今後の医療応用が大いに期待される．
その一方で，ここ数年，より複雑な構造体を，さらに精密に設計された高分子を用いて作製する手法が発展してきている 3）．
微粒子のサイズや形状，表面構造や堅さなどが，ナノデバイスの生体内での機能の点でどのように意義づけられるか，について評価する科学も急速に進んでいることからも 33-38），今後，新しいポリマー構造体が思わぬところでブレイクすることがあるかもしれない．読者諸兄には，これらのボトムアップ的 ナノ
造形 の発展を温かく見守っていただくことを願ってやまない．

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81

総

説

ヒト血清アルブミンを用いた機能分子・材料の創製
Synthesis of Functional Molecules and Materials Based on
Human Serum Albumin
小松 晃之（1，2），屈雪（1），土田 英俊（1），中川 晶人（1）Teruyuki Komatsu (1, 2), Xue Qu (1), Eishun Tsuchida (1), Akito Nakagawa (1)

和文抄録
筆者らはヒト血清アルブミン（HSA）の多分子結合能を利用して，その内部に機能性分子を包接させる方法や，さらには HSA と高分子電解質の交互積層膜を多孔性膜の細孔内で作成する方法により，自然界には見ることのできないユニー
クな機能分子・材料を創製してきている．HSA に鉄テトラフェニルポルフィリン誘導体（FeP）を包接させた HSA-FeP
複合体は生理条件下で酸素を可逆的に結合解離できる人工酸素運搬体となり，遺伝子組換えアルブミン（rHSA）にヘモ
グロビンの活性中心である鉄プロトポルフィリン（heme）を結合させた rHSA-heme 錯体も酸素吸脱着のできる人工ヘム
蛋白質となる．一方，HSA −亜鉛プロトポルフィリン錯体は水の光還元による水素発生反応の増感剤として作用し，
HSA −カルボキシフラーレン複合体は一重項酸素生成の光増感剤として腫瘍光線力学療法への応用が期待されている．さらに，多孔性ポリカーボネート膜をテンプレートとした鋳型内交互積層法により，HSA からなる中空シリンダー構造のナ
ノチューブが合成できる．これらの新機能分子・材料の特徴と応用展開について，最近の話題を紹介する．
Abstract
We have synthesized unique functional molecules and materials based on human serum albumin（HSA）, which have never seen
in nature, by means of incorporation of functional ligands into the protein or fabrication of layer-by-layer assembly in thenanoporous membrane. HSA incorporating iron（II）tetraphenylporphyrin derivative（FeP）（HSA-FeP）is an artificial O2 carrier
which can reversibly binds and release O2 under physiological conditions. Recombinant HSA complexed with a natural iron（II）
protoporphyrin IX（heme）（rHSA-heme）also acts as O2 transport hemoprotein. On the other hand, HSA complexed with a zinc（II）protoporphyrin IX functions as a photosensitizer for H2 evolution from water, and HSA-carboxy fullerene hybrid produces
singlet O2 by visible light irradiation; it may be used as a sensitizer in photodynamic cancer therapy. Furthermore, HSA
nanotubes are prepared by layer-by-layer deposition technique using porous polycarbonate membrane template. We highlightrecent development and applications of these functional molecules and materials.
Keywords
Human serum albumin, albumin-heme, oxygen carrier, red blood cell substitute, photosensitizer, nanotubes

１．はじめにヒト血清アルブミン（HSA）は血清蛋白質の約 60 ％を占める補欠分子族を持たない単純蛋白質（分子量： 66,500）であり，血流中ではコロイド浸透圧維持のほか，各種内因性・外因性物
質（脂肪酸，ヘミン，ビリルビン，金属イオン，ホルモン，
NO，薬物）の運搬・貯蔵，pH 緩衝作用，エステラーゼ活性など の 役 割 を 担 っ て い る 1 - 3 ）． 1 9 9 2 年 ， 米 国 国 立 航 空 宇 宙 局（NASA）の Carter らは HSA の高分解能 X 線結晶構造解析（分解能： 2.8 Å）に成功し，その三次元構造の全容を明らかにした 4）．585 個のアミノ酸からなる一本鎖ポリペプチドは 17 個のジスルフィド結合を介してハート形に折りたたまれ（長径：約８ nm，厚み：約３ nm），相同性の高い３つのドメイン I 〜 III（1）早稲田大学 理工学術院 総合研究所（理工学研究所） 〒 169-8555

東京都新宿区大久保 3-4-1

Research Institute for Science andEngineering, Waseda University, 3-4-1 Okubo, Shinjuku-ku, Tokyo 169-8555, Japan（2）科学技術振興機構さきがけ 〒 332-0012 埼玉県川口市 本町 4-1-8 PRESTO, Japan Science and Technology Agency（JST）, 4-1-8 Honcho,
Kawaguchi-shi, Saitama 332-0012, Japan
論文受付 2009 年５月７日 論文受理 2009 年５月 22 日

82

人工血液 Vol. 17 , No.2, 2009

Fig. 1. Structure of HSA with seven myristic acids（PDB 1e7g）. The
protein secondary structure is shown schematically and thedomains are colored（I; red, II; green, III; blue）. The A and B
subdomains are depicted in dark and light shades, respectively.
The fatty acid binding sites are represented from FA1 to FA7 in
italics.

を構成している（各ドメインはさらに２つのサブドメイン A，
B に分けられる．Fig. 1）．Sudlow らが提唱した古典的な HSA の
薬物結合サイト I（ワルファリン，インドメタシンなど）はサ
ブドメイン IIA，薬物結合サイト II（ジアゼパム，イブプロフ
ェンなど）はサブドメイン IIIA に相当する 5）．
一方，HSA は遺伝子組換え技術により大量発現が可能な蛋白質である 6）．近年，その多分子結合能と高い生産性に注目が集まり，HSA に金属錯体を包接させた人工蛋白質の構築が盛んになってきている．例えば，Gross らは HSA にマンガンコロ
ールを結合させた複合体を調製し，スルフィドの立体選択的酸化触媒として利用した 7）．また，Reetz らは HSA に銅フタロシ
アニンを結合させた複合体が，Diels-Alder 反応に有用である
ことを明らかにした 8）．
本稿では，酸素運搬体，光増感剤から，蛋白質ナノチューブ
まで，著者らが進めている HSA を利用した新しい機能分子・材料の創製と応用について最近の話題を紹介したい．

２．アルブミン−脂肪酸複合体の結晶構造解析
HSA の最もよく知られたリガンドに脂肪酸がある．1998 年，
Curry らは HSA −脂肪酸複合体の X 線結晶構造解析に初めて成功し，中・長鎖脂肪酸の結合サイト（FA サイト）を特定した 9，10）．HSA には全ての脂肪酸に共通する７個のサイトがあり（Fig. 1）
，FA サイト１，４，５，７は各サブドメインの中央に，
FA サイト２，３は二つのドメインの境界面に，そして FA サ
イト６は二つのサブドメインの境界面に位置する．FA サイト
１−５では，脂肪酸の末端カルボキシル基が塩基性または極性アミノ酸残基と相互作用することによりしっかりと固定されている．これら５つのうちどこが最も親和性の強い部位なのか，

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.2, 2009

Fig. 2. Chemical formula of typical FeP molecules that can be incorporated
into HSA to form HSA-FeP hybrid.

結晶構造からは判定できない．組換え HSA の詳細な 13 C-NMR
スペクトル測定から，FA サイト２，４，５が親和力の強いサイトであることが明らかにされた 11）．７つの FA サイト全てに脂肪酸が結合すると，HSA 全体の分子形態はダイナミックに変化する．特にドメイン間に存在する FA サイト２，３への結合は，ドメイン II を軸として大きな形態変化を誘起した．HSAの二次構造はα-へリックスが 67 ％，β構造が０％である．古くから脂肪酸などのリガンド結合により HSA の二次構造が変化するという報告があるが，リガンド結合後も二次構造に変化はないことが結晶学的に示された．Curry らはその後も各種
HSA −リガンド複合体の結晶構造解析を系統的に進め，多くの複合体について構造を解明している 12-14）．現在 Protein Data
Bank（PDB）に登録済みの HSA −リガンド複合体のデータ 47
件のうち，37 件は Curry らによるものである．

３．アルブミン−合成ヘム複合体（人工酸素運搬体）
我々は独自の分子設計により合成した鉄テトラフェニルポル
フィリン誘導体（合成ヘム： FeP）を HSA に包接させたアルブミン−ヘム（HSA-FeP）複合体が，生理条件下でヘモグロ
ビン（Hb）と同じように酸素を吸脱着できることを見出した 15-18）．これまでに約 30 種類以上の FeP（Fig. 2）を合成し，その酸素結合能とヘム構造の相関を整理してきている 19-22）．酸素
錯体の安定度は天然のミオグロビン（Mb）を上回り，酸素親和性（P50）は 0.1 Torr から 230 Torr まで所望の値に揃えることができる．つまり，適用に応じた製剤の選択が可能となっている．HSA-FeP 溶液の血液適合性は高く，血液凝固系，補体系，血小板の活性化に対しても影響を及ぼさない 23）．室温で２年以上の棚置保存が可能で，その間酸素結合パラメーターに変83

化はない 24）．脱血交換試験（ラット，ビーグル犬）から出血シ
ョック状態からの蘇生効果，生体内における酸素輸送能が証明されている 25，26）．体内投与後も修飾 Hb 製剤に見られるような血管内皮細胞からの漏出，一酸化窒素捕捉に伴う血管収縮，血圧亢進は全く観測されない 27）．これは HSA の表面電荷が負に帯電しているため血管から漏れ出しにくいことに起因すると考えられており，本製剤の最大の利点となっている．
一般に悪性腫瘍は放射線療法や化学療法に抵抗性を示し，その原因の一つとして腫瘍組織内低酸素細胞（hypoxic cell）の存在があげられる．細胞の異常な増殖により新生血管の生成が追いつかない湿潤性腫瘍細胞では，十分な血流および酸素化が得られず，それが治療の妨げとなっている．HSA-FeP 溶液を
腫瘍組織の患部近傍へ投与し，腫瘍組織内低酸素細胞の酸素化を試みたところ，患部の酸素分圧は投与前の 2.5 倍に増大した 28）．
これは，従来報告されている修飾 Hb 製剤を用いた処置に比べて格段に高く 29），粒子径の小さい HSA-FeP が腫瘍内部へ容易に到達できるためと考えられる．実際に放射線療法と併用した
結果，HSA-FeP 投与による抗癌作用の顕著な増強効果が認められた 30）．また，HSA-FeP の分子表面をポリ（エチレングリ
コール）で被覆すると，血中滞留時間が大幅に延長されることも明らかにされている 31，32）．

４．遺伝子組換えアルブミン−プロトヘム錯体（人工酸素運搬体）
アルブミン−合成ヘム複合体の酸素結合部位は，精密に分子設計された鉄テトラフェニルポルフィリン誘導体（FeP）であり，得られた HSA-FeP 複合体が酸素を可逆的に結合解離できることは，錯体化学的に見れば設計通りの機能発現といえる．
HSA を用いた人工酸素運搬体開発における究極の挑戦は，やはり Hb の酸素結合部位であるヘム鉄［鉄プロトポルフィリン
IX（プロトヘム，heme）］（Fig. 3a）を用いた製剤の確立であろう．2004 年，我々は遺伝子組換え技術を用いてアミノ酸の一部を改変した組換え HSA（rHSA）に heme を包接させた
rHSA-heme 錯体が，水中で酸素を吸脱着できることを見出した 33）．
溶血により血中に放出されたメト Hb から解離した鉄（III）

プロトポルフィリン IX（hemin）は，通常ヘモペキシンと呼ばれる糖蛋白質に捕捉されるが 34），ヘモペキシンの血中濃度は約17μM と低いため，遊離 hemin の多くは一旦 HSA に結合し肝臓へと運ばれる．Hemin が HSA に捕捉されることは昔から知られていた．1938 年，Fairely は hemin と相互作用する血清蛋白
質が HSA であることを発見し，その複合体を hemalbumin と名付けた 35）．それ以来，この HSA-hemin 錯体は，何らかの生理作用があるのではないかと研究者達の関心の的となってきた．1975 年，Muller-Eberhard らにより HSA-hemin 錯体の吸収スペクトルが報告され，hemin の中心鉄にアミノ酸残基が軸配位した高スピンヘム錯体構造が推定された 36）．また，1980 年には Berman らが HSA と hemin の結合定数（K ： 1.1 × 10 8 M -1）
を決定 37），この値は脂肪酸に比べて約 100 倍高く，hemin がHSA に強く結合することが明確となった．
2002 年，Carter と我々のグループは独立に HSA-hemin 錯体の X 線結晶構造解析に成功し，hemin が HSA のサブドメイン
IB 内の疎水ポケットに結合していることを明らかにした 38，39）．
この部位は，脂肪酸の FA サイト１に相当する．hemin の中心
鉄にはチロシン（Tyr）-161 のフェノレート酸素が軸配位し，二つのプロピオン酸残基は，三つの塩基性アミノ酸残基（リシン，ヒスチジン，アルギニン）と相互作用していることがわかった（Fig. 3b）．よく知られているようにMb のへムポケット内
では，へム中心鉄にヒスチジン（His）-93 が軸配位し，そのトランス側（第６配位座）に酸素分子が結合する（Fig. 3c）．さらに，配位酸素側にはもう一つの His-64 が遠位塩基として存在し，酸素錯体を安定化している．ここで両者を見比べてみると，誰もがその構造類似性に気づくであろう．しかし，残念ながら
HSA-hemin 錯体の中心鉄を鉄（Ⅱ）に還元して酸素を吹き込んでみても，酸素錯体は得られない 33）．それは軸配位子が Hisではないためである．HSA-hemin 錯体が血中で何らかの役割をはたしているのではないかという期待とは裏腹に，むしろHSA は hemin 分子の活性を巧みに抑え込んでいたのである．
しかしながら，heme が疎水的な分子空間に配置された構造は
Mb のヘムポケットと共通しているので，それならば HSA の場
合でもヘム鉄の配位圏内（サブドメイン IB）に His が存在すれば，酸素錯体ができるのではないかと考えた．そこで遺伝子組Fig. 3.（a）Chemical formula of iron（II）protoporphyrin IX（heme）. Heme pocket structures of（b）HSA-hemin complex（PDB 1o9x）and（c）oxy-Mb（pdb 1mbo）.

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人工血液 Vol. 17 , No.2, 2009

換え技術を用いて，イソロイシン（Ile）-142 位置へ近位塩基として働く His を変異導入し，さらに中心鉄に軸配位している
Tyr-161 を疎水性アミノ酸（ロイシン（Leu））に変換したとこ
ろ，その組換え HSA-heme［rHSA（I142H/Y161L）-heme］錯体は，室温で酸素を吸脱着することができた 33，40）．rHSA とheme から構成される酸素輸送人工ヘム蛋白質の初めての例である．そこで，酸素結合パラメーターを詳細に解析した．
rHSA（I142H/Y161L）-heme 錯体の P1/2 は 18 Torr（22 ℃）であり，Hb，Mb，ヒト赤血球の値に比べて高い（酸素親和性は低い）．rHSA（I142H/Y161L）-heme 錯体の低い酸素親和性は，速度論的には大きな解離速度定数（koff）に起因した 33，40）．rHSAの中では heme を取り巻く分子環境が疎水的であるために koff が高く，酸素親和性が低く抑えられているのである．
このように酸素錯体は得られたものの，実際に rHSA
（I142H/Y161L）-heme 錯体を人工酸素運搬体として利用するた
めには，その酸素親和性を Hb や赤血球の値に近づけなければならない．そこで，第三の変異を導入することにより，酸素親和性を上げる工夫を行った．前述したように，Hb や Mb のヘ
ムポケット内には酸素配位座側に His-64 が遠位塩基として存在
し，酸素親和性の増大に寄与している 41，42）．我々は rHSA の場
合も，酸素配位座側の適当な位置に遠位塩基を導入すれば，酸素親和性が上昇するのではないかと考えた．分子シミュレーシ
ョンの結果から配位酸素直上の Leu-185 を選定し，そこへ遠位塩基としてのアスパラギン（Asn）を導入した［rHSA（I142H/Y161L/L185N）］43）．rHSA（I142H/Y161L/L185N）heme 錯体（Fig. 4）の可視吸収スペクトルは，窒素雰囲気下では鉄（II）５配位高スピン錯体の形成を示し，そこへ酸素を通気すると速やかに酸素錯体型へと移行した．P 1/2 は 1 Torr
（22 ℃）となり，酸素親和性はもとの二重変異体に比べて 18 倍も上昇した．Asn の導入によりヘムポケットの極性が増大しkoff が減少した結果，酸素親和性が上がったものと考えられる．
rHSA（I142H/Y161L/L185N）-heme 錯体は，Hb と同等の酸素親和性を有する人工ヘム蛋白質となった．つまり我々は，本来補欠分子族すらもたない単純蛋白質の HSA に，酸素結合能をFig. 4. Structural model of the heme pocket in rHSA（I142H/Y161L/
L185N）-heme complex.

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付与することに成功したばかりでなく，ヘムポケットの微小空間を部位特異的アミノ酸置換により最適化することで，酸素親和性のコントロールを実現したのである．
ごく最近，酸素配位座側にあるアルギニン（Arg）-186 を疎
水性アミノ酸に変換すると，酸素親和性がヒト赤血球と同等値に調整できることを見出した 43）．rHSA-heme 錯体は天然のプ
ロトヘムを活性中心とする，いわば 酸素輸送のできる赤色の血清蛋白質 である．臨床利用可能な赤血球代替物として，現在実用化に向けた努力が進められている．

５．アルブミン−亜鉛プロトポルフィリン錯体（水素発生の光増感剤）
ポルフィリン化合物の最大の魅力は，その中心金属を変えることにより多彩な機能を発揮できる点にある．特に可視光領域に大きな吸収帯を持つ特徴を生かして，光反応の増感剤として広く利用されている．しかし，鉄ポルフィリン錯体は光励起状態の寿命がきわめて短いため，一般的には光反応の増感剤には適さず，励起寿命の長い亜鉛錯体が用いられる．
水素（H2）は二酸化炭素排出のない近未来のクリーンエネルギーである．Grätzel らは亜鉛テトラメチルピリジニウムポル
フィリンをメチルビオロゲン（MV2+）／白金コロイド／ EDTA
水溶液に加え可視光照射すると，水の光還元反応が進行し水素が得られることを見出した 44）．もしプロトポルフィリン IX（PP）が水の光還元に利用できれば，天然物質を増感剤とした
水素発生システムが確立できることになる．しかし，亜鉛プロ
トポルフィリン IX（ZnPP）は水に不溶で，そのまま使用することは難しい．そこで，ZnPP を HSA に包接させることにより
HSA-ZnPP 錯体とし，水の光還元反応への応用を試みた ．
HSA-ZnP 錯体水溶液に MV 2+ を加え，アルゴン雰囲気下でレー
ザーフラッシュ（532 nm）を照射すると，ZnP の励起三重項状態から MV 2+ への電子移動反応が観測された 45）．続いて，白金コロイド，犠牲試薬としてのトリエタノールアミンを加え可視光照射してみると，速やかに水の還元が起こり溶液中から水素が発生した（Fig. 5）．水素発生効率は亜鉛テトラメチルピリ
ジニウムポルフィリンを用いた場合よりも高い．つまり，
HSA-ZnPP 錯体は水の光還元反応における有効な増感剤として機能する．
この結果は，アルブミン−ポルフィリン錯体においてポルフ
ィリンの中心金属を変えることにより，様々な機能を持った人
工蛋白質が創製できることを示唆している．

Fig. 5. Reaction scheme of photoreduction of water to hydrogen using
HSA-ZnP complex.

85

６．アルブミン−フラーレン複合体（光線力学療法の増感剤）
金属ポルフィリン以外の機能性分子でも HSA に包接させれ
ば，新しい人工蛋白質が合成できるはずである．そこで，HSAにフラーレン誘導体を包接させたアルブミン−フラーレン複合体を調製し，その構造，光物性，光線力学療法（photodynamic
therapy: PDT）における増感剤としての可能性について検討した．現在，よく知られている PDT の光増感剤には，ヘマト
ポルフィリンの誘導体であるフォトフリン 46，47），プロトポルフ
ィリンの前駆体である５-アミノレブリン酸 48），またクロリン誘導体であるビスダイン 49）などがある．これらのポルフィリン誘導体に比べ，フラーレン C60 は高い光安定性を持ち，一重項酸
素生成の量子収率が高いことから，PDT の新しい増感剤として期待されている 50-52）．
HSA にカルボキシフラーレン（CF，Fig. 6a）を包接させた
HSA-CF 複合体はきわめて安定で，その水溶液は調製２年後でも沈殿・凝集など全く認められなかった（Fig. 6b）53）．可視吸収スペクトル，HPLC，質量分析の結果から，HSA と CF が１：１で結合していること，さらに小角 X 線散乱測定から，CF 結合
後も HSA の分子径，表面電荷に変化はないことがわかった 53）．

Fig. 6.（ a）Chemical formula of carboxy-C 60-fullerene,（ b）red coloredsolution of aqueous HSA-CF, and（c）living cell numbers of LY80
with HSA-CF and PBS after visible light irradiation（20 mW cm-2,
2 h, 36 ± 1 ℃）
. Each value represents the mean ± SD（n = 4）.

一般に色素分子を光励起すると，まず励起一重項状態を形成
し，そこから項間交差により励起三重項状態へと遷移する．一重項酸素生成の有効な光増感剤となるためには，この励起三重項状態が安定でなければならない．HSA-CF 複合体の励起三重86

項寿命は 46 μs と長く，それは CF が蛋白質内部に固定されているため，励起種どうしによる消光が抑えられることによる．
系内に酸素を共存させると，励起三重項状態から酸素分子へのエネルギー移動が観測された．生成する一重項酸素は 1270 nmに蛍光を示すので，その強度から一重項酸素生成の量子収率が算出できる．HSA-CF 複合体の量子収率は 0.46 であり，HSAPP 複合体やメチレンブルーと同程度であったことから 54），本化合物が一重項酸素生成の有効な光増感剤として作用することがわかった．
続いてこの製剤の細胞毒性について検証した．腫瘍細胞（LY80）に HSA-CF 水溶液を加え，まず暗所下でそれ自身に細胞毒性がないことを確認．その後ハロゲンランプを用いて光照53）
射（２ hr）すると，細胞数は 43 ％にまで減少した（Fig. 6c）．
この結果は HSA-CF 複合体が PDT の光増感剤として有効であることを示している．

７．アルブミンナノチューブ（分子捕捉剤，薬物運搬体，
ナノリアクター）
ピキア酵母を用いた遺伝子組み換え体の量産体制が確立して以来，HSA は臨床利用はもちろんバイオマテリアルの有用な素材としても注目を集めている 6）．我々は最近，鋳型内交互積
層法により HSA からなる中空シリンダー構造のナノチューブを合成することに成功した 55- 57）．HSA の等電点は 4.8 と低く，
生理条件下では分子表面が負に帯電している．上述したように
HSA が Hb に比べて血管外へ逸脱し難いのは，血管内皮細胞の外側にある基底膜との静電反発による．そこでまず正電荷を有する高分子電解質（例えば，ポリ-L-アルギニン（PLA）などのポリアミノ酸やポリエチレンイミンなど）を多孔性ポリカー
ボネート（PC）膜の細孔内に通過させ，続いて HSA 水溶液を通過させる．この操作を繰り返しながら，細孔内壁に HSA の多重積層膜を作成し，最後に PC 膜を溶解除去すると，HSA か
らなる均一で柔軟なナノチューブが得られる．孔径 400 nm の
PC 膜に PLA と HSA を各３回ずつ通過させて作成した計６層構造からなるナノチューブの外径は約 400 nm，内径は約 300
nm，管壁厚は約 50 nm となる（Fig. 7）．鋳型内交互積層法（テンプレート合成）の利点は，① 電荷を有する水溶性分子（蛋白質，生体分子，高分子電解質など）であれば，ナノチューブの素材になり得る（分子設計の自由度が高く，構成分子の選択範囲が広い）② 鋳型となる多孔性膜の孔径および厚みの調節により，チューブの外径および長さを均一に制御することができる③ 積層膜数の調節により，チューブの内径をナノメートル
スケールで制御することができる④ 複数の機能性分子を任意の順序で積層することにより，管壁構造を自由に分子設計できる⑤ 他のナノチューブ合成法に比べ，調製が簡便，再現性が高く，低コスト，大型化が容易などである．
得られたナノチューブの最大の特徴は，同重量の球状構造体

人工血液 Vol. 17 , No.2, 2009

（分子生物学）を機能性アルブミン開発の分子設計に取り入れ，
新しい方法論として定着させた．最近はアルブミンからなる中空シリンダー構造のナノチューブを合成し，その機能展開に力を入れているが，ここでもアルブミンの高い構造安定性が大きく貢献している．ウイルス捕捉，標的薬物の結合・放出，ナノリアクター，ナノバイオデバイスなど，多くの応用展開が期待される．

謝Fig. 7. SEM images of protein nanotubes comprised of（PLA/HSA）3 .
Schematic illustration of the protein nanotubes prepared bytemplate synthesis using layer-by-layer deposition technique.

に比べて比表面積が大きいことにある．HSA ナノチューブの水分散液に HSA のリガンド（薬物など）を添加すると，ナノチューブ管壁に効率よく結合し，水中から速やかに除去される．
HSA に結合しない分子は全く取り込まれないので，いつまでも水中に存在する．Hb や Mb を構成成分としてナノチューブを作成することもできるし 57），HSA-FeP からなるナノチュー
ブは酸素を可逆的に吸脱着する 55）．また，最終層成分の選定だ
けで内孔に合目的な特性を付与することができるので，例えば最内層に加水分解酵素を配置した HSA ナノチューブでは，内孔壁表面で基質の加水分解が進行する．逆に酵素合成により新物質を創り出すこともできる．まさにナノサイズのリアクター
である．この場合，内孔以外の管壁を構成する蛋白質が HSAであることが肝要である．他にも鉄イオンの捕捉・貯蔵を担う
球殻状蛋白質フェリチンからなるナノチューブも合成され，バイオナノデバイスとして磁化特性，半導体特性が検討されている．
管壁のみならず，チューブの一次元内孔空間にウイルスやリ
ポソームなどの大きな生体超分子をサイズ選択的に捕捉することも可能である．中空シリンダーの両端開口部が自由に開閉できれば，従来のミセルやリポソームとは全く違う新しいドラッ
グキャリアの誕生にもつながるであろう．

８．おわりに筆者らはヒト血清アルブミンの多分子結合能に着目し，その内部に機能性分子を取り込ませる方法により，数々の人工蛋白質を創製してきている．当初は酸素運搬体に焦点を絞った展開であったが，合成ヘムのみならず他の機能性分子も効率よく包接できることがわかり，水の還元による水素発生や一重項酸素
生成の光増感剤となるアルブミンを開発した．実は多分子結合能のみならず，きわめて高い水溶性や光・熱に対する安定性といった血清蛋白質アルブミンならではの特徴が，これらの新物
質系において重要な役割を果たしている．さらに，遺伝子組換え技術を駆使してアルブミンのアミノ酸配置を少しだけ変えてやると，機能制御が可能になることも明らかにした．X 線結晶構造解析（生物物理学）にもとづいた部位特異的アミノ酸置換

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.2, 2009

辞

本総説は，日本学術振興会科学研究費補助金，科学技術振興
機構戦略的創造研究推進事業 さきがけ ，厚生労働省科学研
究費補助金の支援により推進された研究の成果である．遺伝子
組換え蛋白質の合成，X 線結晶構造解析は Prof. Stephen Curry（Imperial College London）の協力のもと行われた．動物実験は小林紘一教授（慶大医），堀之内宏久准教授（慶大医）の協力を得て実施された．また，試料調製・生化学実験は小林 直（早大理工研），寺田裕美（早大理工研）が担当した．ここに記して謝意を表する．

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himself/herself, but the Editor-in-Chief must be informed in theevent of reuse.
15）No publication fee is charged for publication in the Journal,
and the author（s）shall receive as a gift 30 offprints of theircontributions. Authors will be charged for copies in excess of
this number（approximately 100 yen per copy）. Authors wanting
prints of color photos or on art paper, etc. must pay the actual
cost of such prints.
16）Address for manuscripts to be sent:
Attn: Kenkou-sya Corp. Artificial Blood Publishing office.
2F Casa-kudan, 1-1-7 Kudan-kita, Chiyoda-ku, Tokyo 102-0073,
Japan
Tel: +81-3-5286-3122 Fax: +81-3-3205-4740
E-mail: kita@kenkousya.jp91

投稿規定（平成20年9月30日改訂）
本誌は，血液を構成するあらゆる成分について，その代替物を開発する研究に貢献する論文，関連する情報，学会会員のための会報，学会諸規定等を掲載するが，形式にはこだわらず創
意ある投稿を広く集める．本誌への投稿者は本学会会員であることが望ましいが，投稿を希望する者は誰でも投稿することが出来る．原稿掲載の採否は，査読結果に従って編集委員会が決定する．原著論文について，他誌に既発表あるいは投稿中の論文は掲載しない．
共著者がいる場合には，共著者全員の承諾を得てから投稿する．論文の版権は本学会に譲渡しなければならない．このため，
著者の代表者は，本誌に添付の著作権譲渡同意書（CopyrightTransfer Agreement）或は，本会のホームページサイト（http://www.blood-sub.jp/home/index.html）からダウンロードしたものに署名捺印の上，郵送，Fax，またはpdfファイル
としてE-mailにて編集委員会宛に提出する．
ワープロを用いて作製した原稿の投稿を原則とする．ただし，手書き原稿による投稿でも受け付ける．欧文による投稿を歓迎する．
１）原稿の種類は，「原著論文」，「総説」，「学会報告」，「トピックス」，「オピニオン」，「海外文献紹介」から選び，これを第１頁の右肩上に明記すること．これらに該当しない原稿も受け付ける．査読意見によっては種類が変更される場合がある．次のいずれかの方法により，送付状（任意のフォーマット）を添
えて編集委員長宛に投稿する．

５）「原著論文」，「総説」，「トピックス」，「オピニオン」については，第2頁以降に和文抄録，Keywords（英文で6個程度）
を付け，最終頁または別紙に英文抄録を付けること．
６）投稿論文に記載の研究が公的助成を受けて実施された場合に は ， 謝 辞 に そ の 旨 を 記 載 す る こ と ． ま た ， Conflict ofInterests（例えば，論文に記載された薬品を販売する企業と著者との利害関係: 雇用，コンサルタント，研究助成，株式，特許など）があれば，これを第１頁の脚注，謝辞などに記載する
こと．
７）ヒトを対象とした研究結果，および動物実験の結果を掲載する場合には，各研究機関のガイドラインに従って実施したことを方法等に明記すること．
８）論文中の略語は初出の際に省略しないこと．薬品，医薬品，測定装置等は，外国語名の場合は言語のまま用い，日本語化しているものはカタカナとする．型式，販売（製造）元とその所在地も記入すること．
（例） Rhodamine B（Sigma-Aldrich, St. Louis, USA）
, ポリグラフシステム（LEG-1000; 日本光電工業, 東京）
９）句読点はコンマ（，）ピリオド（．）とする．

i）文章と図表の電子ファイルをE-メールで送付する（使用したソフトを明記すること）．文章・表のファイル形式は，doc, txtが好ましい．図は，ppt, jpg, tiffが好ましい．

10）文中の英語に使用するフォントは，Times, Helvetica,
Courier, Symbolを原則とし，英文半角小文字とする．ただし，文頭および固有名詞は大文字で書きはじめること．

ii）ハードコピー4部を郵送する．

11）数字はアラビア数字を使い，度量衡の単位はm, cm, mm, μm,
L, mL, μL, mol, g, mg, μg, ng, pg, fg, N／10などを用いる．

２）投稿論文の査読は，編集委員長が選んだ人工血液分野の研究者に依頼する．査読意見によっては，原稿の修正を求める場合がある．修正論文（Revised Manuscript）の投稿に際しては，送付状に「査読意見に対する回答」を添え，意見に対して一つ一つ回答をするとともに，修正箇所がある場合にはこれを明記する．
３）掲載決定通知の後，著者は採択論文の文章・図表のファイ
ルを電子媒体として，指定する宛先に送付すること（使用したソフトを明記すること）．文章・表のファイル形式は，doc, txtが好ましい．図は，ppt, jpg, tiffが好ましい．
４）原稿はA4版の大きさとし，第1頁には表題，英文表題，著

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者名，全著者所属，英文著者名，英文著者所属，続いて連絡の取れる著者（corresponding author）の住所，英文住所を記入する．手書き原稿の場合はＢ5版，1行20字，20行とする．

12）FigureとTable：引用順にそれぞれ番号を付けること．表
題，説明，図表中文字は，全て英文とすることが好ましい．本
文中に挿入箇所を明記すること．Figureは直接オフセット印刷とする．Tableは編集部にて入力し原図とする．
13）文献：本文に引用した順序に番号を付け，文中では2），3-5），1，4-6）などとする．文献の記載法はthe Vancouver styleに従う．全
著者名．論文題名．誌名 西暦発行年；巻数：頁〜頁．とし，誌名の省略は医学中央雑誌またはIndex Medicus に準拠する．
単行本の場合は全著者名．題名．編集者名．書名．発行地：発行書店，年号；頁〜頁．の順とする．電子文献の場合は，ホームページ名．改行してアドレス（引用した西暦年月）とする．

人工血液 Vol. 17 , No.2, 2009

（例）１. 高折益彦. 人工酸素運搬体:その将来への期待. 人工血液2007;15:90-98.
２. 橋本正晴. 単回投与毒性試験. 野村 護, 堀井郁夫, 吉田武美編. 非臨床試験マニュアル. 東京: エルアイシー, 2001;3748.
３. Wong NS, Chang TM. Polyhemoglobin-fibrinogen: anovel oxygen carrier with platelet-like properties in ahemodiluted setting. Artif Cells Blood Substit Immobil
Biotechnol 2007;35:481-489.
４. Natanson C, Kern SJ, Lurie P, Banks SM, Wolfe SM.
Cell-free hemoglobin-based blood substitutes and risk of
myocardial infarction and death: a meta-analysis. J Am
Med Assoc 2008;299:2304-2312.
４. Sakai H, Sou K, Takeoka S, Kobayashi K, Tsuchida E.
Hemoglobin vesicles as a Molecular Assembly.
Characteristics of Preparation Process andPerformances or Artificial Oxygen Carriers. In: Winslow
RM, ed. Blood Substitutes. London: Academic Press（Elsevier）, 2006;514-522.
５. 早稲田大学酸素輸液プロジェクト．
http://www.waseda.jp/prj-artifblood/index-ja.html（2008年9月現在）
14）既発表の図表，その他を引用，転載する場合には，あらか
じめ版権所有者の許可を得ること．また，掲載論文の著作権は本学会に帰属する．
15）二次掲載について．本誌は，他の言語ですでに掲載された論文を和文で二次掲載することは二重投稿ではなく正当な掲載と認めるが，著者は以下の事項を遵守する．
ａ）すでに掲載された論文であること．
ｂ）著者は両方の雑誌の編集者より許可を得ていること．二ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.2, 2009

次掲載する編集者に最初に掲載されたもののコピー，別刷，もしくは原稿のいずれかを添付すること．
ｃ）論旨を変えないこと．執筆者は同一（順不同）であること．
ｄ）二次掲載版のタイトル・ページに掲載される脚注には，その論文の全体もしくは一部分がすでに掲載されている旨を明記し，更に初出文献も示すこと．適切な脚注の例を以下に示す．
「This article is based on a study
first reported in the［...雑誌タイトル（完全な典拠情報を添えたもの）...］（訳：この論文記事は，［...］に最初に報告された研究に基づくものである）」．
これらの要件を満たしている場合は，その旨を明記して，総説
または論文記事（二次掲載）として投稿する．
16）本誌掲載著作物の二次利用および著作権について．本誌の一部，もしくは全部をCD-ROM，インターネットなどのメディ
アに二次利用する場合がある．本誌に掲載する著作物の複製権・翻訳権・上映権・譲渡権・公衆送信権（送信可能化権を含む）は，著者が上述の著作権譲渡同意書を提出することにより，本学会に譲渡される．本項は，著作者自身の再利用を拘束する
ものでは無いが，再利用する場合は，編集委員長に通知をする
こと．
17）掲載料．掲載料は無料とし，論説，総説，原著，報告等については別刷り30部を贈呈する．それを越える分についての費用は著者の負担とする（およそ1部100円）．カラー写真掲載・
アート紙希望などの場合は，著者の実費負担とする.
18）原稿の送付先〒102-0073 東京都千代田区九段北1-1-7
カーサ九段２階（株）
研恒社「人工血液」編集係 宛
電話: 03-5286-3122, FAX: 03-3205-4740
E-mail: kita@kenkousya.jp

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●編集後記●私ごとであるが、実はここ数年間、献血が出来ない状態になってしまった…。理由は、今から20年前、学生の時に語学研修と銘打ってイギリスに二週間程度滞在した、ただそれだけである。ヨーロッパでクロイツフェルトヤコブ病の感染が拡大したので、当時狂牛病に感染した牛の肉を食べた可能性が否定できない？のである。これに配慮をして日赤がある一定期間に渡航歴のある人の献血規制をしているのである。しかし、最近になって、この措置を緩和することの是非について検討を開始したという。H1N1インフルエンザウィルス感染の拡大のため、献血者数の減少に拍車がかかっているらしく、献血者数を確保するための措置とのこと。新興伝染病の蔓延は、かくも献血事業に多大の影響を与える厄介なものである。人工血液が実現すれば、このような煩わしさは解消されるのだろう。
さて本号では先ず、昨年慶大で開催された国際会議Current
Issue on Blood Substitutes Researchに招聘したUCLAのDr.
Jahrが総説を寄稿してくださった。Dr. Jahrらは学界でNeutral
な立場を堅持し、幾つかの企業のHBOCsの投与実験を行い客観的評価をしている。各社の製品の性質について非常に詳しい。
神奈川大学の関邦博先生からは、"Semibiology"という分野について、総説をご寄稿いただいた。極限状態においても細胞、あるいは摘出臓器が生命活動を維持できる現象を見出し、これを臓器保存、臓器移植に応用しようとのお考えである。ガスバイ
オロジーに繋がる多くの知見をお持ちであり、人工血液の新しい利用法開拓のヒントになりそうである。東京大学の岸村顕広
先生からは、ピクソームという新しいカプセル素材についての話題提供である。合成高分子電解質を積層して形成したリポソームに代わる素材として期待される。ミオグロビンを内包した粒子を作成し、人工赤血球としての物理化学的評価までを実施している。今後の動物投与実験の結果が期待される。早稲田大学の小松晃之先生からは、アルブミンを用いた人工酸素運搬体、ならびにこれを応用したナノチューブなど様々な新材料についてご寄稿頂いた。遺伝子組換えアルブミンが認可され大量に生産されるようになったので、今後新しい機能材料の素材として世の中に出てくるのではないかと思われる。
本誌は、Bilingual Journalです。和文、英文どちらの原稿も受け付けます。皆様からの話題提供を期待しております。
（酒井 宏水）編集委員会●酒井 宏水（委員長），東 寛，大谷 渡，武岡 真司，堀之内 宏久，村田 満，渡辺 真純●日本血液代替物学会 会誌■発行

日本血液代替物学会■編集・制作「人工血液」編集委員会

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人工血液

vol.17（2） 2009年 8 月18日発行〒160−8582 東京都新宿区信濃町35
慶應義塾大学医学部呼吸器外科内TEL（03）5363−3493 FAX（03）5363−3499〒169-8555 東京都新宿区大久保3−4−1 55号館S棟703号室
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