分子クローニング

テクニカルガイド

NEB AR App
Owl Blinking
1クローニングの概要

目次

分子クローニング— 過去、現在、そして未来へ

はじめに

2 クローニングの概要

4 クローニング・ワークフロー
8 クローニングのヒント
9 オンラインツール

分子クローニングとは組換え DNA 分子の作成を指し、生命科学の進歩の礎となって

Traditional Cloning

的かつ特異的に切断する酵素にあり、リガーゼの発見や PCR の開発によって、用途

12 核酸精製いる技術である。その発端は 1970 年代の制限酵素の発見、つまり DNA 分子を選択と精巧さの両面において飛躍的な成長を遂げている。現在では遺伝子のクローニン

グは非常に簡単かつ効率的に行えるようになり、リガーゼを使った基本的なクロー

ニング（Traditional Cloning） だけでなく、相同配列 を 使用 した DNA アッセンブル（DNA Assembly：NEBuilder®）、それに異なるプラスミド間で簡単に遺伝子をスワップできる 方法（DNA Assembly：Golden Gate） などの 次世代型 クローニング（Seamless

Cloning）も簡便かつ効率的な方法となっている。特に後者は合成生物学に該当する技術であるが、in silico で設計したあらゆる DNA コンストラクトを in vitro で化学合成できることを意味すると共に、DNA クローンの構築と組換えが迅速になり、遺伝
子治療ベクターや組換えタンパク質生産プロセス、新しいワクチンの開発などに応用されている。

基本的なクローニングワークフロー

10 クイックガイド（Traditional Cloning）
16 DNA 増幅（PCR）
18 cDNA 合成
20 DNA 切断
26 末端修飾

28 ライゲーション
30 形質転換
32 確認

DNA Assembly（Seamless Cloning）
34 DNA Assembly 概要

36 NEBuilder Assembly

分子クローニングとは組換え DNA の作成を指すことを先述したが、得られたクローンは遺伝子配列の解析やその遺伝子がコードするタンパク質の発現、そのタンパ

ク質の機能解析などに使用できる。またクローンに変異を導入することで、その遺伝子とタンパク質の機能解析にも応用できる。最も基本的なクローニングのワー

クフローとしては以下 4 ステップになる。

1. 対象 DNA を単離する

38 Golden Gate Assembly
付録
40 トラブルシューティングガイド
43 DNA 定量

50 オーダーインフォメーション

2. 対象 DNA（インサート）をクローニングベクターに挿入し、リコンビナント分子（プラスミド）を作成する
3. リコンビナントプラスミドを増幅ホスト（主に大腸菌）に形質転換する

4. 目的のリコンビナントプラスミドを持つホストをスクリーニング／セレクション
する

それぞれの 方法 は 1960 年後半 から 1970 年前半 に 開発 され、 その 後 の 組 み 合 わせと最適化によりこのようなワークフローが完成したのである（次項：クローニン

グの歴史を参照）。特に 2 の工程では様々な方法が編み出させているが、4 および

5 ページにて比較紹介をする。

www.nebj.jp/re/Cloning
•
•
•

•
•

クローニングの概要とワークフロー
様々なクローニング方法の説明

Traditional Cloning と DNA Assembly の各ステップの詳細を説明

技術資料、動画など満載熟練した NEB テクニカルサポートが研究を支援※左画面は英語版だが日本語版も公開

2

クローニングの概要

クローニングと合成生物学
Clone with Confidence

クローニングにおいては、対象 DNA とベクターの準備に加えて、これらの DNA の連結が重要である。この連結方法に基づいて様々なクロー

ニング方法が考案されているが、NEB では大きく 2 つに分けている。

1）Traditional Cloning2）DNA Assembly（Seamless Cloning）

Traditional Cloning は最も一般的に採用されている方法であり、その DNA 連結は T4 DNA Ligase によって行われる。DNA Assembly は様々な連結酵素（複数のこともある）を使用した比較的新しい方法である。これらのクローニング方法により既存の遺伝子の解析だけではなく、それを人為的に設計・操作・改変・作成することで、より深く生命現象への理解を深めたり、有用物質やエネルギーの生産、廃棄物処理、疾病診断・治療など、
実に様々な分野に応用がされており、そのための学問領域が合成生物学と呼称されている。この合成生物学は特に DNA Assembly の発明により飛躍的進歩を遂げたのである。
NEB からは Traditional Cloning と DNA Assemnly の各ステップに関する個々の酵素から、ワークフロー全体をカバーできる製品を提供している。
1970 年代に NEB が設立されて以降、NEB は分子クローニング技術の発展を支える一幹であり続け、ともに成長をしてきた。これは絶え間ない基礎研究と製品開発、品質管理に裏付けされたものであり、本誌を読めば Clone with Confidence の意味がご理解いただけるだろう。

クローニングの歴史
1952-53

1970

バクテリオファージの感染における制限酵素の発見

1975

初の TypeII 制限酵素（HindII/HindIII）の精製と特徴付け

1965-68

1971-73

生化学的解析

マッピング

TypeI 制限酵素のSV40 DNA のREBASE（Restriction Enzyme Database）の公開

1973-74

1975

EcoRI と DNA ligase による世界初のプラスミド構築（pSC）

Restriction Fragment Length
Polymorphism（RFLP）の開発

1978

1982

1983

1988

>100

クローニング

神経成長因子前駆体の制限酵素を発見

制限酵素の発見数がPstI のヒト／マウスのcDNA がクローニング

1978

1983-88

制限酵素の発見と組換え DNA の技術確立により、
Werner Arber、Daniel Nathans、Hamilton O. Smith がノーベル生理学・医学賞を受賞

1990-PRESENT

1996

クローニングが広く使用

開発

PCR、制限酵素、リガーゼを使用した

1,000 以上のPCR が開発

Zine finger nucleases（ZFN）が

1995

1997

Amplification Fragment Length
Polymorphism（AFLP）が開発

Methylation-sensitive amplified
polymorphism（MSAP）が開発

2000-PRESENT

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNs）と改変型メガヌクレアーゼ（MN）による遺伝子欠損と挿入が成功

2008

Golden Gate 法が開発
（38 ページ参照）

2009

2009

2011

2012

世界初のゲノム編集により
T 細胞の CCR5 を欠損

開発

販売

発見

ZFN を用いた

2009

TALEN エフェクターのDNA 認識コードを同定

Gibson Assembly が2010-PRESENTTALEN ゲノム編集によりモデル生物の遺伝子挿入を欠損

5-hmC/5-mC 解析キットを

4,000 以上の制限酵素を

2012

Cas9 による
RNA ガイドゲノム編集が開発

3

クローニング・ワークフロー

主なクローニングワークフロー

ここでは主に使われている 5 種類のクローニング方法を図解する。本誌では 1 つ目の Traditional Cloning（RE Digestion & Ligation）と2 つ目の PCR クローニング（TA ＆ Blunt-End）を広義に Traditional Cloning として扱う。
目的 DNA（インサート）の調製
出発材料

RNA
OR

OR

ゲノム DNA

プラスミド

Traditional Cloning（RE Digestion & Ligation）

OR

PCR Cloning（TA & Blunt-End）

制限酵素で切断60 分間（標準）
5～15 分間（Time-Saver）

DNA 調製

アニールしたオリゴ

PCR 産物OR

cDNA 合成

OR

OR

cDNA

DNA Assembly（Seamless Cloning）

PCR
90 分間

OR

LIC（Ligation
Independent Cloning）

PCR
90 分間

OR

Reco
（Gateway® /

PCR
90 分間

P

2 本鎖 DNA
（1）

OR

P

P

OR
A

P

脱リン酸化
平滑化
（オプション）

DNA 末端修飾

OR
A

A

精製
15 分間

リン酸化
（オプション）30 分間

10～30 分間P

2 本鎖 DNA
（2） P

OR

P
P

OR

P
P

DNA 精製（ゲル抽出／カラム精製）

ベクターと
DNA の連結75 分間

ライゲーション
～15 分間

OR

A

A

精製
15 分間

精製
15 分間

5´→ 3´エキソヌクレアーゼによる相同配列突出末端の
作成
30 分間

3´→ 5´エキソヌクレアーゼによる相同配列突出末端の
作成
30 分間

アッセンブル
本反応は上記と同一溶液中、連続して行われる

アニーリング
30 分間

P
A

A

P

ライゲーション
15 分間

T
A

OR

OR
A

A
T

OR

組換えプラスミド
調製時間 *

1 時間 20 分～ 3 時間

Holding vector

2 時間～ 2 時間半* 出発材料がプラスミドで、その中の DNA を他のベクターにクローニングするときの調製時間を記す。出発材料がゲノム DNA の場合、2 時間が加算される。この調製時間には形質転換は含まれていない** 翌日に 70 分間の組換え反応を行う

4

組換え部位

2 時間 15 分

2 時間 45 分

形質転換

3 時間

クローニング・ワークフロー

各ステップの説明＆プロトコール

12
16
18
20
26
28
30
32
34

ベクターの調製
Multiple cloning site
(MCS)

出発材料

プラスミド

制限酵素での切断

ombinational
Creator / Univector）

P

精製
15 分間

cDNA 合成
DNA 切断末端処理

ライゲーション
形質転換
確認

DNA Assembly

PCR
2 時間

精製
15 分間

P

P

DNA 増幅（PCR）

PCR

制限酵素で切断60 分間（標準）
5～15 分間（Time-Saver）

ベクターの
直鎖状化

PCR
90 分間

OR

核酸精製

P

OR

直鎖状ベクター

制限酵素切断60 分間（標準）
5～15 分間（Time-Saver）

T

T

OR

部位特異的組換え反応
60 分間
Proteinase K 処理
10 分間

T 付加
1.5 時間精製 15 分間 または
ゲル抽出＆カラム精製 75 分間

+

精製
15 分間

脱リン酸化（オプション）
10～30 分間DNA 末端修飾

直鎖状ベクター
調製時間

20 分～ 2 時間 25 分

3 時間 45 分

70 分間**

最終ベクター

15 分～ 5 時間 20 分

プラスミド精製確認

タンパク質発現OR

制限酵素切断パターン

遺伝子機能検証

OR

コロニー PCR

シーケンス

部位特異的
変異導入

5

クローニング・ワークフロー

NEB の主なクローニング・ワークフロー

一般的な 5 種類のクローニング方法のうち（前項参照）、NEB では Traditional Cloning と DNA Assembly（Seamless Cloning）を主として用いている。ここではTraditional Cloning

Nucleic acid purification
核酸精製
材料となる DNA を精製する。ベクターのミニプレップ、PCR のテンプレートに使うゲノム DNA、PCR 産物などが含まれる。
フェノール／クロロホルム精製やアルカ
リプレップ法、ビーズ法など様々な方法があるが、NEB ではカラム精製を推奨している。

Monarch カラム精製（P. 12 ～ 15）

PCR / amplification

Restriction enzyme digestion End modification

DNA 増幅（PCR）
目的 DNA を増幅する。プライマーには特異的配列に加えて制限サイトと足場配列（ ランダムな 6 塩基） を 付加 したものを使用する。増幅時のエラーを防止するため、校正機能がある高正確性ポリメラー
ゼを使用するとよい。

Q5 DNA Polymerase（P. 16 ～ 19）

DNA 切断ベクターおよび PCR 産物 を 制限酵素 で切断する。方向性の維持と効率的なライゲーションのため、異なる末端を生じる
2 種類の制限酵素を用いるのがよい。
新・制限酵素の基礎知識

NEB 制限酵素（P. 20 ～ 25）

必要 に 応 じて 末端修飾
飾とはインサートの 5´
ターの 脱 リン 酸化、 イ
ベクターの 平滑化 をこ

NEB 修飾酵素（P. 26

DNA Assembly

Nucleic acid purification
核酸精製
上記フローと同様、材料となる DNA を精製する。ベクターのミニプレップ、PCRのテンプレートに 使 うゲノム DNA、PCR
産物などが含まれる。詳細は各アッセン
ブルキットのマニュアルを参照する。

Monarch カラム精製（P. 12 ～ 15）

6

DNA Preparation

Assembly

DNA 準備DNA Assembly においては、その方法によってインサート DNA とベクターの準備方法が異なる。例えば NEBuilder の場合、ベクターとの相同配列を付加したプライマー
でインサート DNA を 増幅 する。各 キットのマニュアルなどを参考にして、推奨
方法で DNA を準備する。
DNA 増幅＆切断（P. 16 ～ 25）

アッセン

目的 DNA（インサート DNA）とベクターを連結する。アッセンブル方Golden Gate Assembly を取り上げて紹介する。前者はエキソヌクレアーゼ
ブル方法、後者は Type IIS 制限酵素と T4 DNA Ligase を用いた方法であり、ンプルなアッセンブルはもちろん、複数のインサート DNA とベクター
Assembly の特長である。さらに自由度が高くアッセンブルできること

DNA Assembly（P. 34 ～ 39）クローニング・ワークフロー

それぞれの実験的ワークフローを図解すると共に、各ステップの説明を記す。個々のステップの詳細は記載されているページを参照する。

DNA ligationn末端修飾をする。末端修
リン 酸化、 ベク
ンサートおよびこでは示す。

～ 27）

Transformation

ライゲーション
インサートとベクターを T4 DNA Ligase でライゲーション（連結）する。最も重要なステップの 1 つであり、適切な反応条
件と高品質のリガーゼが求められる。

T4 DNA Ligases（P. 28 ～ 29）

センブル

法によって原理は異なるが、ここでは NEBuilder HiFi Assembly とと DNA ポリメラーゼ、ニック修復リガーゼを用いたアッセン、各ページを参照する。1 種類のインサート DNA とベクターのシのアッセンブルもシングル反応で短時間に完了することが DNAから、合成生物学の基盤となる技術である。

DNA analysis
確認

形質転換
ライゲーションしたプラスミドベク
ターをホストに形質転換する。一般的には大腸菌ホストを使用するが、クローニ
ングする目的 DNA の特性に応じて、適切な大腸菌株を選択することがポイントである。

得られたクローンを確認して、目的 DNAが含まれるポジティブクローンを選別する。ここでは簡単・迅速なコロニー PCR
を推奨している。

NEB コンピテントセル（P. 30 ～ 31）

OneTaq & NEB DNA Ladders（P. 32 ～ 33）

Transformation
形質転換

DNA analysis
確認

ライゲーションしたプラスミドベク
ターをホストに形質転換する。アッセン
ブル方法（キット）で推奨されているコ
ンピテントセルを選択・使用することがポイントである。

得られたクローンを確認して、目的 DNAが含まれるポジティブクローンを選別する。ここでは簡単・迅速なコロニー PCR
を推奨している。

NEB コンピテントセル（P. 30 ～ 31）

OneTaq & NEB DNA Ladders（P. 32 ～ 33）

7

始める前に：クローニングのヒント

クローニングを始める前に：効率向上のためのヒント
ここではどのようなクローニング 方法 においても 重要 な 効率向上 のためのヒントを示す。

しっかりと事前に計画を練る
1.	

材料 のインサート DNA とベクターから目的クローンを得るための計画をする。特にインサートとベクターの連結部分、つまり末端形状に注意して制限

サイトの選定、プライマー設計をする（NEBcutter.neb.com を推奨）
。タンパク

質発現を最終目的とする場合はコドン

フレームにも注意する。ホストの薬剤感受性とベクターの薬剤マーカーも十分確認しておく。

2.

DNA 精製と使用量使用する DNA を十分に精製し、ヌクレ

アーゼや非特異的酵素活性が混入していないことを確認する。一般的には市販 されている DNA 精製 スピンカラム（NEB #T1030S） を 用 いる。精製途中 で使用 したフェノール、 クロロホルム、

エタノールなどが 残存 しないように注意する。また制限反応や PCR の阻害を防ぐため、塩を含まないバッファー

中に DNA を保存する。各反応によって使用する DNA 量が異なるため、適切なDNA 量を確認する。制限反応の場合は0.2 ～ 1.0 µg であり、PCR の場合には数ng で十分である。

3.

制限酵素による DNA 切断

下流の実験に合わせて反応容量を設定する。 例 えば 電 気 泳 動 解 析 を 行 う 場

合 にはアプライ 量 を 基準 に 設定 する。
多 くのクローニングにおいては 20 ～50 µl を使用する。反応に使用する制限酵素は全容量の 10％以下とし、スター活性を防ぐためにグリセロール濃度が5 ％以下 となるようにする。 また PCR
産物はできる限り精製をしてから切断
をする。

8

4.

末端処理

制限処理した DNA 末端には 5´ リン酸、

ライゲーション
7.	

使用 するリガーゼのガイドラインに

3´ OH 基 が 付加 されているため、 その
ま ま ラ イゲーションに 使 用 できる。
ただし末端形状があっていない場合には平滑化などを行う必要がある。

Taq DNA Polymerase（NEB #M0273）の PCR
産物は 3´A である。Q5 DNA Polymerase（NEB #M0491）のような高正確性ポリメ
ラーゼの PCR 産物は平滑末端を生じる。
ポリメラーゼによって産物の形状が異なることに留意する。一般的に市販されているプライマーはリン酸化されていないため、PCR 産物 は 5´ リン 酸化されない。脱リン酸化したベクターにライゲーションする 場合、5´ リン 酸
化プライマーを用いて PCR を行うか、Kinase で PCR 産物をリン酸化する必要がある。

ライゲーション前の DNA 精製
5.	

ベクターおよびインサートを電気泳動あるいはカラムで精製する。この操作により 未切断 のベクターや 非特異的

PCR 産物 などを 取 り 除 き、 ライゲー
ション効率が向上できる。

まず 切断 した DNA をアガロースゲル

で確認する。もし切断 DNA がシングル
バンドを示すようであれば、カラム精製を行う。複数のバンドを示すのであれば、モナーク・ゲル抽出キット（NEB#T1020）や β-Agarase I（NEB #M0392）を使用 してゲルを 切 り 出 して 精製 を 行う。この際、長波長（365 nm）の紫外線を使用して DNA 分解を最小限に留める。

DNA 定量6.	

下流の実験に最適な DNA 量を使用する

ため、電気泳動か吸光度系（NanoSpec ®

など）にて定量を行う。43 ～ 49 ページの DNA 定量（核酸濃度、純度測定）を参照する。

従って反応を行う。もしインサート：

ベクター ＝ 3：1 のモル 比 が 推奨 されている場合、これを用いるとよい。これはモル 比 であって 質量比 でないことに 注意 する。 オンラインツール：

NEBioCalculator を使用して計算するとよい。通常のクローニングでは短時間でライゲーション 反応 が 進行 するが、ライブラリー作製などでは反応時間を
延長する。

8.

コンピテントセル

自作のコンピテントセルは市販されているものよりも形質転換効率が低いことが多い。市販されているコンピテン

トセルを使用することで、結果として

時間短縮、サンプルロスの回避、成功率向上が可能となる。

9.

確認

コロニー PCR を行う場合、クルードサ
ンプルに適した PCR ポリメラーゼを使用する。

オンラインツール

オンラインツール

ウェブサイト上の「NEB ツール」より各種オンラインツールが利用できる（www.neb.com/nebtools）。

NEBioCalculator

DNA Sequences and Maps Tool

PCR Selector

Tm Calculator

DNA および RNA の濃度などを簡単に計算できる。質量からモルへの変換や、A260 吸光度からの核酸濃度変換、さらにリアルタイム PCR 用の検量線作成や濃度計算ができる。
目的の PCR に最適なポリメラーゼを検索できる。増幅NEB のベクターの他、プラスミド、ウイルスおよび
バクテリオファージベクターなどの一般的に使用される DNA の配列と地図が掲載されている。

プライマー配列、濃度、それに使用する PCR 酵素を
入力 することで、簡単 に Tm 値 およびアニーリング
温度を求めることができる。

領域の長さ、複雑性、GC 含量やシングルコピー中の存在から目的に合致したポリメラーゼが選択できる。

Enzyme Finder

制限酵素の名称や認識配列、オーバーハングや特長か

NEBcutter v3.0

調べたい DNA 配列をペーストまたはインポートして制限部位を表示、検索できる。Type II あるいは Type III

ら制限酵素を検索できる。配列を入力することで目的に適した制限酵素を簡単に検索することができる。

Double Digest Finder

ダブルダイジェストを行う際の最適バッファーと推酵素を選択することで絞り込み検索も可能である。さらに各酵素の制限部位数やメチル化感受性情報も表示できる。

REBASE

奨反応条件 を 簡単 に 検索 できる。最適 バッファーを

Enzyme DataBASE）には全ての制限酵素および関連するタンパク質の情報が集約されている。

使用することにより、スター活性やサンプルの分解を防ぐことが可能である。

Competitor Cross-Reference Tool

市販試薬の NEB 同等品を検索するためのツールであ制限酵素 データベースである。REBASE（Restriction

NEBaseChanger

Q5 Site – Directed Mutagenesis Kit（E0554）を使用して変異導入を行う際のプライマーの 設計を行うためのツールである。アニーリング温度の最適条件 の検索も可能である。

る。製品名や製品番号を選択して簡単に検索できる。

NEBuilder Assembly Tool

NEB Golden Gate Assembly Tool

NEBeta（Ligase Fidelity Tools）

NEBcloner

NEBuilder HiFi Assembly および Gibson Assembly を行うた
めのプライマー設計ツールである。アッセンブルしたい配列と使用するポリメラーゼを入力することで、最適なプライマーがデザインできる。

Golden Gate Assembly の使用を前提としたリガーゼと各末端形状＆配列の正確性解析ツール。正確性を可視化（Ligase Fidelity Viewer）、そのデータに基づいて推奨結合部を 提案（GetSet）、 アッセンブル 配列 をデザインできる（SplitSet）。

Golden Gate Assembly のプライマーとコンストラクトを設計ツール。使用する Type IIS 制限酵素とオーバーラップを選択して簡単に設計できる。

目的に合致したクローニング各ステップ（DNA 切断、末端修飾、ライゲーション、形質転換）のプロトコー

ルおよび推奨製品を検索できる。

モバイルアプリ

iPhone®、iPad® または Android ™用 NEB アプリ

最 も 人気 があるオンラインツールは iPhone、iPad またはAndroid でも使用することができる。

9

クイックガイド（Traditional Cloning）

クイックガイド（Traditional Cloning）
インサートおよびベクターの調製
インサートを別のプラスミドから調製する場合• 目的 DNA を切り出すための適切な制限酵素を使用する。ベクターと末端形状があっていれば、切り出した DNA をそのままライゲー
ションに使用できる。
インサートを PCR で調製する場合• 目的 DNA の両末端に適切な制限サイトと足場配列を加えてプライマーを設計する。
• 足場配列はランダムな 6 塩基

• PCR 酵素は校正機能が高いものがよい（Q5 High Fidelity DNA Polymerase、
NEB #M0491）。
• PCR 条件と最適化は 17 ページを参照。

• PCR 産物はアガロースゲル電気泳動からのゲル抽出、もしくはカラムで精製する（15 ページ参照）。

• 必 ずしも 必要 ないが、 ベクターを 脱 リン 酸化 することでセルフ
アニーリングを完全に抑制できる。
• Quick CIP（NEB #M0525）は熱失活できるため、脱リン酸化後の精製は必要なく便利である。また、制限酵素バッファー：NEBuffer 中で使用できるため、制限反応に対添加するだけでよい。

Quick CIP による DNA の 5´ 末端の脱リン酸化
DNA
10X rCutSmart Buffer*
Quick CIP
ヌクレアーゼフリー水
反応

熱失活* 他の NEBuffer も使用可能

1 pmol of DNA ends
2 µl
1 µl
to 20 µl
37℃で 10 分間
80℃で 2 分間• 精製した PCR を用いて以下のように切断する（末端処理）。

平滑化

DNA
10X NEBuffer• 校正機能を有する PCR 酵素（Q5 など）を使用する場合、その産物は平滑末端であるため、平滑化は必要ない。

DNA 切断プロトコール（標準制限酵素）
制限酵素

ヌクレアーゼフリー水
反応時間
反応温度

1 µg
5 µl（1X）
1 µl（あるいは 10 units）
to 50 µl
1 時間 *
酵素の推奨温度* Time-Saver 酵素であれば時間短縮が可能

DNA 切断プロトコール（Time-Saver 制限酵素）
DNA
10X NEBuffer
制限酵素（Time-Saver 酵素）
ヌクレアーゼフリー水
反応時間
反応温度

1 µg
5 µl（1X）
1 µl
to 50 µl
5 ～ 15 分間 *酵素の推奨温度* オーバーナイト反応しても問題なし（スター活性を生じない）

インサートを合成オリゴのアニーリングで調製する場合• 特に短い DNA を挿入する場合に効果的である（プロモーターやポリリンカーなど）。

• 適切な 5´ あるいは 3´ 突出末端を持つように設計すれば、アニー
リング後にそのままライゲーションに使用できる。

• 5´ リ ン 酸 オ リ ゴ と し て 合 成 す る の が よ い が、 合 成 後 で も T4
Polynucleotide Kinase（NEB #M0201）でリン酸化できる。

標準アニーリング反応
オリゴ 1
オリゴ 2
10X NEBuffer r2.1
ヌクレアーゼフリー水
反応

ベクター

20 µM（終濃度）20 µM（終濃度）5 µl
to 50 µl
95℃で 5 分間、その後ゆっくりと室温にする• 適切な制限酵素で切断して直鎖状にする。2 種類の制限酵素を使うことでセルフアニーリングを予防できる。

10

脱リン酸化

• 平滑末端が必要な場合、インサートとベクターを平滑化する。

• T4 DNA Polymerase（NEB #M0203）あるいは Klenow（NEB #M0210）で平滑化できる（5´ 突出の埋め込み、3´ 突出の除去）。
• Quick Blunting Kit（NEB #E1201）で平滑化と 5´ リン酸化が 30 分以内にできる。
• アガロースゲル電気泳動をする際、紫外線による DNA ダメージを最小限にするため、できる限り長波長（365 nm など）を用いる。
平滑化プロトコール（Quick Blunting Kit）
DNA
Blunting Buffer
dNTP Mix (1 mM)
Blunt Enzyme Mix
ヌクレアーゼフリー水
反応

熱失活

Up to 5 µg
2.5 µl
2.5 µl1 µl
to 25 µl
、または
室温で 15 分間（制限酵素切断 DNA）
室温で 30 分間（PCR 産物）*
70℃で 10 分間* PCR 産物の場合、必ず精製をしてから平滑化を行う

クイックガイド（Traditional Cloning）

リン酸化• ライゲーションのためには少なくとも一方の DNA 末端（ベクターもしくはインサート）が 5´ リン酸化されている必要がある。
• プライマーは 通常 リン 酸化 されていない。 そのため PCR 産物 は
5´ リン酸化されていないので、ベクターを脱リン酸化する場合はリン酸化プライマーを注文するとよい。
• 制限処理した DNA は 5´ リン酸化されている。

• PCR 産物や DNA 断片は T4 Polynucleotide Kinase（NEB #M0201）でリン酸化できる。

T4 PNK によるリン酸化反応
DNA（20 mer）
10x T4 PNK Buffer
10 mM ATPT4 PNK
ヌクレアーゼフリー水
反応

up to 300 pmol of 5´ termini
5 µl
5 µl（1 mM 終濃度）
1 µl（10 units）
to 50 µl
37℃で 30 分間

ベクターおよびインサートの精製• ベクターおよびインサートを電気泳動で確認し、切れ残りや非特異的バンドが無い場合、スピンカラムで精製する（NEB #T1030）。
• 切 れ 残 りや 非特異的 バンドがある 場合、 アガロースゲルからのDNA 抽 出 キ ッ ト（NEB #T1020） や、LMP ア ガ ロ ー ス と β-Agarase I（NEB #M0392）を使用して精製する。

• ゲルの観察や切り出しを行う際、DNA の分解を防ぐために長波長（365 nm など）の紫外線を使用する。

ベクターとインサートのライゲーション• ベクター：インサート＝ 1：3 のモル比を基準とする。

• T4 DNA Ligase（NEB #M0202）あるいは Quick Ligation Kit（NEB #M2200）を使用する場合、室温で完全にライゲーションバッファーを融解してから使用する。Ligase Master Mix は保存温度下で溶液であるため、融解の必要はない。
• Quick Ligation Kit（NEB #M2200）は突出末端および平滑末端のライゲー
ションに適している。
• Instant Sticky-end Ligase Master Mix（NEB #M0370）は突出末端のライゲー
ションに特化しており、インキュベーションは不要である。

• Blunt/TA Ligase Master Mix（NEB #M0367）は平滑末端 /TA のライゲーションに特化したリガーゼ・ミックスであり、特別な配合によりライゲーション効率を飛躍的に向上している。
• ライゲーション後は速やかに氷上に移して形質転換を行う。

• Quick Ligation Kit および Ligase Master Mix を使用した場合、熱による不活性化は形質転換効率を低下させる恐れがあるため、これを控える。

Quick Ligation Kit によるライゲーション反応
ベクター DNA（3 kb）
インサート DNA（1 kb）
2X Quick Ligation Buffer
Quick T4 DNA Ligase
ヌクレアーゼフリー水

50 ng
50 ng
10 µl
1 µl

全容量が 20 µl となるように加える
室温で 5 分間反応

Instant Sticky-end Ligase Master Mix によるライゲーション反応
ベクター DNA（3 kb）
インサート DNA（1 kb）
Master Mix
ヌクレアーゼフリー水

50 ng
50 ng
5 µl

全容量が 10 µl となるように加える反応

不要

Blunt/TA Ligase Master Mix によるライゲーション反応
ベクター DNA（3 kb）
インサート DNA（1 kb）
Master Mix
ヌクレアーゼフリー水

50 ng
50 ng
5 µl

全容量が 10 µl となるように加える
室温で 15 分間

反応

形質転換

• NEB Turbo Competent E. coli （NEB #C2984）を使用すれば 8 時間でコロニーが得られる。

• 相同組換 えを 低減 するためには RecA – 株 である NEB 5-alpha（NEB#C2987）もしくは NEB 10-beta Competent E. coli （NEB #C3019）を使用する。
• 5 kb 以上 のプラスミドのクローニングには NEB 10-beta CompetentE. coli （NEB #C3019）を推奨する。

• エレクトロポレーションを 行 う 場合、NEB 5-alpha ElectrocompetentE. coli （NEB #C2989）あるいは NEB 10-beta Electrocompetent E. coli （NEB
#C3020）を使用する。
• プレーティング前に培地を予め培養温度に温めておく。

• 適切なコロニーを得るため、SOC で 10 倍ずつの希釈系列をプレー
ティングする。

NEB 5-alpha Competent E. coli による形質転換DNA
コンピテントセル

DNA 1 ～ 5 µl
（1 pg ～ 100 ng プラスミド DNA 含む）
50 µl

反応

氷上で 30 分間反応（Outgrowth）

氷上で 5 分間950 µl の室温 SOC を添加
37℃で 60 分間の振とう培養

ヒートショック

42℃で 30 秒間• エレクトロポレーションを行う場合、精製作業は一切不要、ライ
ゲーション産物をそのままエレクトロポレーションできる
ElectroLigase（NEB #M0369）を推奨する。

11

核酸精製（Traditional Cloning & DNA Assembly）

核酸精製

最適化のヒント

クローニングにおいては、高純度の DNA（および RNA）を使用することが最重要
事項 の 1 つである。 ケースとしては、細胞 や 組織 からのゲノム DNA 抽出、大腸菌からのプラスミド精製、反応溶液中の DNA 精製（PCR やライゲーションなど）、

アガロースゲルからの DNA 抽出が挙げられる。それぞれに最適な DNA 精製方法があるが、スピンカラムタイプの Monarch 核酸精製キットは包括的に使用できるキットである。以下表を参考にして Monarch キットを選択するとよい。

Monarch 核酸精製キット
製品

Monarch Genomic
DNA Purification Kit（NEB #T3010）

アプリケーション細胞、血液、組織などからの
ゲノム DNA 抽出および精製特長• 幅広いサンプルに対応• 難しいサンプルでも高収量（脳や筋組織など）• > 50 kb のゲノム DNA を精製• 残存 RNA が最小限（< 1％）

Monarch Plasmid
Miniprep Kit（NEB #T1010）

Monarch PCR & DNA
Cleanup Kit（NEB #T1030）

Monarch DNA Gel
Extraction Kit（NEB #T1020）
Monarch Total RNA
Miniprep Kit（NEB #T2010）

Monarch RNA
Cleanup Kits
（NEB #T2030, T2040,
T2050）

大腸菌からのプラスミド精製（～ 20 µg）

• 最小 30 µl で溶出

酵素反応溶液から DNA を
クリーンアップ（～ 5 µg）

アガロースゲルからの DNA
精製（バンド切り出し）
血液、細胞、組織、植物、バクテリアなど様々なサンプルからのトータル
RNA 精製（～ 100 µg）

RNA のクリーンアップと濃縮• RNA 抽出溶液（TRIzol 抽出など）• in vitro transcription 反応産物
• 酵素反応後の RNA

www.nebj.jp/re/Monarch• カラム 洗浄 ではカラム 先端 を 素通 り 画分 に 触 れないこと。もし触れたらもう一度クイックスピンをする。
• > 10 kb の DNA を精製する場合、50℃に温めた溶出液を使用するとよい。分子量が大きい DNA は強くカラムに結合しているためである。
プラスミド・ミニプレップ

大腸菌を使いすぎない（OD < 15 にする）
：少なめの
•	
方が溶菌度が高くカラムのつまりを予防でき、結果として純度が高いプラスミドが精製できる。

完 全 に 溶菌 する： プラスミド 回収率 を 最大限 にする•	
ため、大腸菌を完全に懸濁、推奨温度で溶菌する。

 菌後はボルテックスをしない：ボルテックスをする• 溶とゲノム DNA が断片化、それが夾雑する。

R Nase 処理をしっかりとする：RNA 処理ステップを•	
スキップしたり時間を短くしない。

洗 浄 をしっかりとする：洗浄回数 に 注意 する。洗浄•	
工程で細胞夾雑物、エンドトキシン、塩が除去される。

• カラムデザインの最適化により液残りを防止

ゲノム DNA 抽出＆精製• バッファーに RNase A が添加済
• 最小 6 µl で溶出

サ ンプル 量 は 推奨範囲内：多 く 入 れすぎると 溶解 が•	しにくく、カラムが詰まって収量と純度が低下する。

• オリゴや小分子 DNA もクリーンアップ可能（オプションプロトコール）

ゲル抽出（バンド切り出し）• 色付けされたバッファーにより精製ステップの間違い防止• ゲル電気泳動

12• 粗精製ゲノム DNA の完全精製も可能

DNA 精製• カラムデザインの最適化により液残りを防止• 最小 6 µl で溶出• カラムデザインの最適化により液残りを防止• 全 RNA を精製可能、オプション
プロトコールにより miRNA や small
RNA（> 20 nt）も精製• DNase I、gDNA 除去カラム、Proteinase K、RNA 安定化剤が付属• RNA 分画や粗精製 RNA のクリーンアップも可能• 5 分間でクリーンアップ完了• RNA 量に応じた 3 種類のキット• 夾雑物の残存がほぼゼロ• NTPs も除去

サンプルをカラムにリロードしない（アプライ回数•	
は 1 回だけ）：2 回以上のサンプル（溶解液）のロード
によりメンブレンが剥離する危険がある。

サンプルの破砕・溶解：はじめにしっかりとサンプル•	を破砕・ホモジェナイズしておく。

ゲ ルカットは 最小限 にする：大 きく 切 りすぎると•	
ゲルの溶解残りやゲル成分の夾雑リスクが高くなる。

UV 観察は手早く：ゲル観察・切り出し時の UV は DNA•	を 損傷 するため、短時間 にする。 またできる 限 り 長
波長を使用するとよい。

ゲ ルを 完全 に 溶解 する：DNA はゲルの 内側 にあるこ•	とが多いので、しっかりと溶解する。

RNA 抽出＆精製

サンプル中の RNase を失活させる：サンプル採取中・•	
後にもその中の RNase が働くため、失活が必要不可欠である。採取は手短に行う。液体窒素での瞬間冷却や、RNA 保護液なども効果的である。
サ ンプル 量 は 推奨範囲内：多 く 入 れすぎると 溶解 が•	しにくく、カラムが詰まって収量と純度が低下する。
サンプルの破砕・溶解：はじめにしっかりとサンプル•	を破砕・ホモジェナイズしておく。

核酸精製（Traditional Cloning & DNA Assembly）

ゲノム精製：Monarch Genomic DNA Purification Kit

クローニングにおいて、目的 DNA をゲノム DNA（gDNA）から PCR で増幅・単離することは多い。この時、PCR を成功させるためには精製度が高いゲノムをテンプレートとすることが重要である。

モナーク・ゲノム DNA 精製キットは幅広いサンプルから高収量でゲノム DNA を精推奨製品

Monarch Genomic DNA Purification Kit（NEB #T3010）

特長

製するためのキットである。動物培養細胞、血液、哺乳類組織など様々な生物学的• 幅広いサンプルに対応（ウェブサイト参照）

限にできる。さらに、オプションプロトコール（前処理）を行うことにより、破• 残存 RNA が最小限（< 1％）の gDNA 精製

試料から、ピークサイズが 50 kb 以上の長い DNA を精製する。また残存 RNA も最小砕が困難な細菌や酵母細胞からも gDNA を精製することができる。

臨床的に重要な唾液や口腔スワブからの gDNA 精製や、フェノール／クロロホルム

抽出など抽出済 gDNA のクリーンアップ方法などのオプションプロトコールも用意されている。クローニングのための PCR はもちろん、qPCR、次世代シーケンス（NGS）用ライブラリー調製などのテンプレートゲノム調製に最適である。

ヒト鮮血

N

Q

ブタ凍結血液 HeLa細胞

N

Q

N

Q

マウス尻尾

マウス肝臓

マウス脳

マウス筋肉

N

N

N

N

Q

Q

Q

• 精製 DNA のピークサイズは > 50 kb、ロングリード
シーケンスに最適• 抽出済の gDNA のクリーンアップも可能• 迅速なプロトコール、効率的な溶解ステップ、最小限のハンズオン• NGS ライブラリー調製、PCR、qPCR などに最適• カラム、バッファーの個別購入が可能

幅広いサンプルで高収量かつ長い gDNA の精製が可能
N = NEB
Q=Q社• 難しいサンプルでも高収量（脳や筋組織など）

特性• 推奨サンプル量：サンプルによる（ウェブサイト参照）

Q• DNA 結合能：30 µg gDNA

bp

48,50015,000
7,000
4,000
3,000
2,500
2,000
1,500
1,200
900

• ゲノムサイズ：ピークサイズは > 50 kb（唾液や口腔粘膜スワブからの精製 gDNA はやや小さくなる）• 溶出液量：≥ 35 µl（100 µl を推奨）

600

• 純度：A260/280 ≥ 1.8、A260/230 ≥ 2.0

400
250

• RNA 含有量：< 1％（RNase A 処理ステップを入れた場合）

100

インプット量

ピークサイズ100 µl1 x 10 6 cells

100 µl

10 mg

10 mg

10 mg

• アプリケーション：PCR、qPCR、NGS 用 DNA ライブ
ラリー作製

10 mg

54

28

50

27

57

54

>60

28

59

20

51

25

57

26

DIN

9.1

8.0

8.7

7.9

8.8

8.2

8.3

7.4

9.0

7.2

8.9

7.6

9.2

7.8

A 260/A 280

1.85

1.82

1.83

1.85

1.84

1.89

1.85

1.87

1.85

1.88

1.86

1.90

1.87

1.87

A 260/A 230

2.19

7.00

2.40

1.21

2.33

1.91

2.36

1.98

2.43

1.31

2.47

1.52

2.40

1.57

Agilent Technologies® 4200 TapeStation Genomic DNA ScreenTape により、各サンプルから Monarch Genomic DNA
Purifcation Kit と Q 社キットを使って精製した gDNA を測定した。溶出は 100 µl で行い、100 倍希釈した精製 DNA を測定に用いた。モナークで精製した gDNA のピークサイズは 50 ～ 70 kb で、DIN = 9 前後であったが、Q 社キットで精製した gDNA はおよそ < 30 kb、DIN = 7 ～ 8 であった。また、Q 社キットでは凍結
血液サンプル、肝臓、脳、筋肉において収量と A260/230 が低かった。

ゲノム DNA 抽出・精製ワークフロー

1Lyse+ 200 µl sample & Lysis Buffer+ 10 µl Proteinase K+ 3 µl RNase A*†

2 Bind3 Wash (2X)

+ 400 µl gDNA

Binding Buffer* 組織サンプルでは Proteinase K 処理後に添加†

線維性組織におけるデブリス除去のステップも含む

Wash Buffer

モナーク・ゲノム精製キットの使い方（英語）

4 Elute+ 35–100 µl gDNA

Elution Buffer (60°C)

www.nebj.jp/re/monarchDNA_movie1

Discard

Blood/cells: 5 min. (56°C)
Tissue: 60 min. (56°C)+ 500 µl gDNA

DNA 精製のヒント（動画）

3 min. (1,000 xg)

ゲノム精製に使用する
組織サンプルの調製および保存のヒント（英語）Reuse

1 min. (max. speed)

1 min. (max. speed)

1 min. (max. speed)

No ethanol required* 組織サンプルでは Proteinase K 処理後に添加†
線維性組織におけるデブリス除去のステップも含む

Only 1 spin needed

www.nebj.jp/re/monarchDNA_movie2

13核酸精製（Traditional Cloning & DNA Assembly）

プラスミド・ミニプレップ：

推奨製品

Monarch Plasmid Miniprep Kit

クローニング・ワークフローにおいてはプラスミド（ベクター）を大腸菌から精製するステップが複数ある（ケースによる）。すなわち骨格となるベクターの準備、

インサート DNA の 準備、最後 のポジティブクローン 選別後 の 組換 えプラスミドの精製である。このように大腸菌からプラスミド（ベクター）を精製する工程をプラスミド・ミニプレップと呼び、アルカリ溶出法が一般的である。

NEB の Monarch Plasmid DNA Miniprep Kit は、大腸菌培養液から高品質プラスミド DNA
を 迅速 かつ 確実 に 精製 することができるカラムタイプのキットである。 プロト
コールは標準的な細胞再懸濁、アルカリ溶解、中和のステップからなり、さらにカラーインジケーターにより反応をモニターすることができる。独自の洗浄バッ
ファーにより、塩、タンパク質、RNA、細胞成分などを確実に除去するため、最小溶出液量は 30 µl、濃縮された高純度 DNA を精製することができる。得られた DNA は、
クローニングにおける骨格ベクターはもちろん、様々な酵素処理、DNA シーケン
シング、PCR 反応など、多彩なアプリケーションに使用できる。

モナークは少ない液量で溶出できるため高濃度で DNA を溶出可能
2.7 kbN

5.2 kb

Q

N

N

特長

• 独自の形状により低容量（高濃度）で DNA を溶出• カラムデザインの最適化により液残りを防止• 簡単、迅速なプロトコール• 色付けされたバッファーにより精製ステップをモニ
タリング• バッファーに RNase A が添加済

• カラム表面のつや消し加工によりラベリングが容易• カラム、バッファーの個別購入が可能

特性• 大腸菌培養液量：1 ～ 5 ml（O.D. 値 15 以下）• DNA 結合能：最大 20 µg• プラスミド DNA サイズ：最大 25 kb• 一般的回収率：最大 20 µg（プラスミドのコピー数、宿主株、培養量、増殖条件に

10 kb
Q

Monarch Plasmid Miniprep Kit（NEB #T1010）

Q

依存）• 溶出液量：≥ 30 µl

10.0• 純度：A260/280、A260/230 いずれも≥ 1.8

5.2• プロトコール時間：遠心とインキュベーションで10 分 30 秒

N – NEBQ – Q社

2.7

Conc. (ng/µl)

334.9

202.2

384.2

216.4

607.6

351.0

Total yield (µg)

10.0

10.1

11.5

10.8

18.2

17.6

A260/280

1.9

1.9

1.9

1.9

1.9

1.9

A260/230

2.4

2.3

2.4

2.4

2.3

2.4

• アプリケーション：制限酵素 やその 他 の 酵素 を 使用
する様々な実験、形質転換、毒性に強い細胞へのトラ
ンスフェクション、DNA シーケンシング、PCR 反応、
ラベリング、セルフリータンパク質合成など

大腸菌（ オーバーナイト 培養、1.5 ml）から 各社 キットでプラスミド DNA を 精製、

HindIII-HF（NEB #R3104）の消化産物を電気泳動した。

環境に配慮した製品デザイン *have up to

could eliminate

less plastic

tons of plastic
each year

44%

>140

use

recyclable
packagingmaterials

プラスミド精製のヒント
1. 使用細胞数が過剰にならないよう注意（培養液の O.D. 値 15 以下）使用する細胞数を適正にすることで破砕効率が向上し、細胞デブリスによるカラム目詰まりの心配がなくなる。

2. 細胞を完全に溶解する
プラスミド DNA の回収率を高めるためには全細胞を溶解する。細胞ペレットを完全に懸濁し、インキュベーション時間はプロトコールに従う。
3. 細胞の溶解後はボルテックスしない
ボルテックスにより 宿主 の 染色体 DNA が 剪断 さ
れ、gDNA が混入する可能性がある。

useboxes made from100%
post-consumerpaper* 詳細は NEBMonarchPackaging.com を参照

14

4. RNase による RNA の除去
RNase 添加済 の 中和 バッファーでインキュベー
ションすることで、RNA の残存を防止できる。
5. 洗浄工程を省かない
適切 な 洗浄処理 により 細胞 デブリスや 塩 などが除去される。

6. プラスミド DNA サイズが大きい場合は加熱した
溶出バッファーを使用
大分子量の DNA はカラムマトリックスに強く結合するが、加熱した溶出バッファーを使うことで溶出が容易になり、回収率が向上する。

核酸精製（Traditional Cloning & DNA Assembly）

ゲル精製＆ DNA クリーンアップ

クローニングの 一部工程 では DNA をしっかりと 精製（ クリーンアップ ）することが重要 である。特 に 目的 DNA（ インサート DNA） を PCR で 増幅 した 後、 それにベクターを制限酵素で切断した後などが挙げられる。このクリーンアップでは DNA をロスすることなく、夾雑物を取り除いた高純度 DNA を回収することがポイントである。
エタノール沈殿などでもよいが、NEB からはカラムタイプのキットを推奨する。

Monarch DNA Gel Extraction Kit

アガロースゲル 電気泳動 のバンドから DNA を 抽出 するためのカラムキットである。

50 bp ～ 25 kb の DNA を高効率で回収できる。

Monarch PCR & DNA Cleanup Kit

本キットは酵素反応溶液中の DNA をクリーンアップするためのカラムキットである。

クローニングにおいて、PCR 産物中に非特異的増幅がない場合の精製（プライマー除去）や修飾反応後などに使用する。DNA Wash Buffer は、酵素、プライマー（≦ 25 nt）、
界面活性剤、さらに低分子量のヌクレオチド、DMSO、ベタインなどを除去する。クロー

ニングにおいてはほぼ必要ないが、オプションプロトコールにより、small DNA やオ
リゴヌクレオチドの精製も可能である。

独自のカラムとフィルター形状により液残りを防止
NEB

Q社
液残り

モナークカラムは o- リングを使用していないため、バッファーの液残りがない。

推奨製品

Monarch DNA Gel Extraction Kit（NEB #T1020）

Monarch PCR & DNA Cleanup Kit（NEB #T1030）

特長• わずか 6 µl で溶出が可能• 独自のカラムデザインによりバッファーの液残りによる塩の残存を防止• 簡単・迅速なプロトコール• オプションプロトコールでオリゴ DNA や small DNA
断片も精製可能• 構成品を単品販売• カラム、バッファーの個別購入が可能

特性• DNA 結合能：最大 5 µg

• DNA サイズ：約 50 bp ～ 25 kb
オプションプロトコール（NEB #T1030）で≧ 15 bp（dsDNA）、≧ 18 nt（ssDNA）• 回収率：
70 ～ 90％ / 50 bp ～ 10 kb DNA
50 ～ 70％ / 11 ～ 25 kb DNA）NEB #T1030）
70 ～ 85％ / ≧ 18 nt（ssDNA）& ≧ 15 bp（dsDNA（• 溶出液量：≧ 6 µl

• 純度：A260/280 ≧ 1.8• プロトコール時間：
DNA ゲル抽出：10 分（遠心とインキュベーション）
PCR & DNA クリーンアップ：5 分• アプリケーション：ライゲーション、制限酵素処理、ラベリング、その他の酵素反応、ライブラリー調製、DNA シーケンシングなど

DNA ゲル抽出のためのヒント
1. アガロースゲルをできるだけ小さく切り出す
アガロースが 少 ないほど 抽出効率 が 高 くなる。
アガロースが多いと溶解時間が長くなり、必要なバッファー量も多くなる（結果、塩がサンプルと一緒に溶出される）。160 mg より大きいゲル切片
ではアガロースとバッファーとの 総量 がカラムの 容量（800 µl） を 超過 するため、 カラムへの 添加を 2 回に分ける必要がある。
2. UV 曝露を最小限にする
DNA 損傷を防ぐため、観察はできる限り長波長とし、ゲル切りは短時間にする。
3. アガロースを完全に溶解する
アガロースの溶解が不十分な場合、DNA がゲル中にトラップされるため溶出効率が低下する。

4. 大きい DNA 断片の場合は溶出バッファーを加熱する
大きい DNA 断片はゲルに強く結合する。溶出バッ
ファーを温めることで、溶出効率が改善する。

15

DNA 増幅（PCR）（Traditional Cloning & DNA Assembly）

DNA 増幅（PCR）

推奨製品

クローニングにおいて、インサート DNA を特異的に、効率よく、正確に PCR 増幅す
ることが重要ポイントの 1 つである。PCR 用の DNA ポリメラーゼには大きく 2 つのタイプが存在する。

1）高正確性ポリメラーゼ（アーキア由来）
校正機能（3´ → 5´ エキソヌクレアーゼ 活性） を 有 するポリメラーゼであり、正確性 に 加 えて、増幅力 と 特異性 も 高 いことが 特長 である。 クローニングのインサート増幅にお薦めの酵素で、NEB では Q5 DNA Polymerase が挙げられる。
PCR 産物は平滑末端である。
2）汎用ポリメラーゼ（Taq ベース）
好熱性バクテリア由来の一般的な PCR 酵素である（Taq ベースのブレンド型を含む）。リーズナブルなコストで、PCR 産物には 3´A が付加されるため、TA ク
ローニングによく使用される。ただしエラーが導入されやすいことに注意が必要である。NEB では特殊な PCR の他、クローニング最後のコロニー PCR にお薦めの OneTaq ® DNA Polymerase を提供している。

インサート DNA の増幅：
Q5 DNA Polymerase（NEB #M0491）※ TA クローニングの場合には OneTaq DNA Polymerase

コロニー PCR（クローニングの確認）：
OneTaq DNA Polymerase（NEB #M0480）

技術情報
NEBPCRPolymerases.com• NEB のポリメラーゼの全リスト• FAQs とトラブルシューティング• オンラインツール（Tm や正確性計算）• 動画（オンラインチュートリアル）

いずれの酵素を使用する場合でも、ライゲーションに突出末端を利用する際にはPCR プライマーに 制限 サイトを 付加 しておく。 また、 ベクターを 一周 PCR して（Inverse PCR）直鎖状することにも使用できる。

インサート DNA の PCR 用ポリメラーゼ

インサート DNA の PCR には正確性が高い Q5 DNA Polymerase をお薦めするが、用途

動画：GC リッチ DNA の増幅のヒントに応じて以下表を参考に適切なポリメラーゼを選択するとよい。
ルーチン PCR高正確 PCR
超高正確

特徴

Q5/Q5
Hot Start

Phusion（1）/Phusion（1）Flex

OneTaq /OneTaqHot Start

特殊 PCRTaq /Hot Start Taq

ロング PCR

dU の取り込み

LongAmp/
LongAmp
Hot Start Taq

Q5U

正確性（ vs Taq ）~280X（3）

> 39X

2X

1X

2X

ND

伸長時間

≤ 20 kb≤ 20 kb< 6 kb≤ 5 kb≤ 30 kb

app-specific

6 kb/min4 kb/min

1 kb/min

1 kb/min1.2 kb/min

2 kb/min3´ → 5´ exo

Blunt

Blunt

3´ A/Blunt

3´ A

3´ A/Blunt

Blunt

Yes

Yes

Yes

No

Yes

Yes

No

No

Yes

Yes

Yes

No

1.0

1.0

1.25

1.25

5.0

1.0

Tm 3

+

Tm 3

+

Tm 5

–

Tm 5

–

Tm 5

–

Tm 3

l

l

l

l

増幅サイズ
産物形状

5´ → 3´ exo

Units/50 µl Reaction

アニーリング温度

アプリケーション
ルーチン PCR
コロニー PCR
正確な増幅

超高正確な増幅高収量

短時間の PCR

ロング PCR

GC リッチ領域の増幅
AT リッチ領域の増幅
ハイスループット
マルチプレックス
PCR

DNA ラベリング

部位特異的変異導入

キャリーオーバー

*
*
*
*
*
*
*

l

*
*
*

l

l

*

l

l

*
*

l

l

l

l

l

l

*

l

l

l

l

l

（2）

*
*

仕様（通常仕様以外）

16

*
*

ホットスタートll

マスターミックス

l

l

l

l

* indicates recommended choice for application**

USER クローニング

クイックロード

Fisher Scientific. This product is manufactured by New England Biolabs, Inc.
under agreement with, and under the performance specifications of Thermo Fisher
Scientific.
（2）Use Multiplex PCR 5X Master Mix.
（3）Due to the very low frequency of misincorporation events being measured, the error
rate of high-fidelity enzymes like Q5 is challenging to measure in a statisticallysignificant manner. We continue to investigate improved assays to characterize
Q5's very low error rate to ensure that we present the most robust accurate fidelity
data possible (Popatov, V. and Ong, J.L. (2017) PLoS One, 12(1):e0169774.
doi 10.1371/journal. pone. 0169774).

l

防止

キット

（1）Phusion DNA Polymerase was developed by Finnzymes Oy, now a part of Thermoll• 酵素によって産物の末端が異なる（平滑 or 3´A）

–

l

l

• 用途に合わせて PCR 酵素を選択

l

l

l

l

l

l

l

l

l

l

l

l

l

Q5 DNA Polymerase の利点

詳細は裏表紙を参照

DNA 増幅（PCR）（Traditional Cloning & DNA Assembly）

PCR プロトコール（Q5 DNA Polymerase）
25 µl
REACTION

50 µl
REACTION

5X Q5 Reaction Buffer*

5 µl

10 µl

1X

10 mM dNTPs

0.5 µl1 µl200 µM

1.25 µl

2.5 µl

0.5 µMvariablevariable< 1 µgto 25 µl

to 50 µl0.25 µl

0.5 µl

10 µM primers（forward and reverse）
テンプレート DNA

ヌクレアーゼフリー水Q5 High-Fidelity DNA Polymerase**

終濃度

0.02 units/50 µl rxn* 増幅困難なテンプレートの場合、付属の Q5 High GC Enhance を添加する** > 6 kb の増幅の場合、2 units/50 µl rxn まで増やすことができる

初期熱変性
変性

アニーリング

伸長

最終伸長

ホールド

25 µl
REACTION

50 µl
REACTION

OneTaq Standard 5X Reaction Buffer

5 µl

10 µl

1X

10 mM dNTPs

0.5 µl1 µl200 µM

0.5 µl1 µl

0.2 µMvariablevariable< 1 µgto 25 µl

to 50 µl0.125 µl0.25 µl

テンプレート DNA

ヌクレアーゼフリー水

OneTaq DNA Polymerase*

終濃度

1.25 units/50 µl rxn* 詳細な使用酵素量は製品プロトコールを参照

最適化のヒント

Q5 DNA Polymeraseを使用する際に特に注意する点：• Taq とはアニーリング温度が異なるため、オン
ラインツールで確認（TmCalculator.neb.com）• 変性温度は 98℃• プライマー濃度は高め• サイクル反応は短め
DNA テンプレート• 高品質の精製済み DNA テンプレートを使用する。コロニー PCR は 32 ページ参照。

• 複雑性の低いテンプレート（プラスミド、ラムダ、BAC DNA など）を使用する場合には、反応容量 50 µl あたり 1 pg ～ 10 ng の DNA を 使用する。

• 複雑性の高いテンプレート（ゲノム DNA など）
を 使用 する 場合 には、反応容量 50 µl あたり
1 ng ～ 1 µg の DNA を使用する。
• DNA テンプレートの濃度が高くなると、増幅
産物 の 特異性 が 低下 する。特 にサイクル 数 が多いほど顕著となるため、テンプレート濃度
をふって最適化するとよい。
プライマー• 通常 20 ～ 40 nt のプライマーを用いる。
• 理想的な GC 含量は 40 ～ 60％である。

• Tm 値は NEB の Tm Calculator を用いて計算する（TmCalculator.neb.com）。

1

30

1
1

温度

98℃
98℃

50 ～ 72℃ *
72° C
72° C

4 ～ 10℃

時間

30 秒間

5 ～ 10 秒間

10 ～ 30 秒間

1 kb あたり
20 ～ 30 秒間
2 分間* Tm 値はオンラインツール：（TmCalculator.neb.com）で計算

PCR プロトコール（OneTaq DNA Polymerase）

10 µM primers（forward and reverse）

サイクル数

初期熱変性
変性

アニーリング

伸長

最終伸長

ホールド

サイクル数

1

30

1
1

温度

時間

94℃

30 秒間

45 ～ 68℃ *15 ～ 60 秒間

94℃

68℃
68℃

4 ～ 10℃

15 ～ 30 秒間
1 kb あたり
5 分間
5 分間

Tm 値はオンラインツール：（TmCalculator.neb.com）で計算• プライマーペアの Tm 値の差は 5℃以内とする。
• 各プライマーが 2 次構造（ヘアピン構造など）を形成しない、およびプライマー同士が二量体を形成しないように設計する。
• プライマーに制限サイトを入れる場合、切断部位の外側に 6 塩基を付加する。
酵素濃度• 反応液中 の 最適酵素濃度 は 各 ポリメラーゼによって異なる。詳細は各製品情報を参照する。
• 一般的に酵素量が過剰の場合、増幅が失敗しやすい。特 に 長 い 領域 の 増幅 を 行 う 場合 に 顕著である。
マグネシウム濃度• 大部分の PCR ポリメラーゼの至適 Mg2+ 濃度は1.5 ～ 2.0 mM である（バッファーに添加済）。

• Mg2+ 濃度をさらに最適化する必要がある場合
は、0.2 ～ 1 mM ずつ増加させる（最大 6 mM）。
デオキシヌクレオチド（DNTPS）• 一般的な dNTP 濃度は各 200 µM。

• プライマーやテンプレート、デオキシヌクレ
オチド溶液中にウラシルが存在する場合、Q5Uを使用する。

反応のセットアップ• 反応成分は全て氷上で調製する。ホットスター
ト酵素はこの必要がない。
• ポリメラーゼを最後に加える。

• サーマルサイクラーを 予 め 変性温度 に 加熱しておく。ホットスタート酵素はこの必要はない。
変性• 高 GC 含量 のテンプレートを 用 いる 場合 を 除
き、推奨以上の長時間または高温を避ける。
• NEB のホットスタート 仕様 の 酵素 はアプタ
マーに基づいているため、酵素活性化のための変性ステップは必要ない。
アニーリング• プライマーの Tm 値は NEB の Tm Calculator を用いて計算する（TmCalculator.neb.com）。
• 特異的増幅がみられた場合、プライマーの再設計かアニーリングの最適化、ホットスター
ト酵素の使用で改善できる。
伸長• 伸長速度は PCR ポリメラーゼによって異なる。
一般的には 1 kb あたり 15 ～ 60 秒である。
• 伸長反応 を 推奨時間 よりも 長 く 行 った 場合、エラー率が上がり、非特異的増幅が増え、増幅収量が低下することがある。

17

cDNA 合成

cDNA 合成推奨製品

RNA を逆転写して cDNA を合成、それをテンプレートにして PCR 増幅を行うこと
により、間接的に RNA のクローニングが可能である。以下チャートを参照にして
cDNA 合成キットまたは逆転写酵素を選択するとよい。

cDNA 合成キット／酵素 選択チャート
cDNA SYNTHESIS
キット

ProtoScript II First Strand
cDNA Synthesis Kit（NEB #E6560）
ProtoScript First Strand
cDNA Synthesis Kit（NEB #E6300）

特長• > 10 kb の cDNA を合成、cDNA クローニングに最適• M-MuLV よりも耐熱性が向上（～ 50℃）、RNase H 活性を低減

ProtoScript II Reverse
Transcriptase（NEB #M0368）
An alternative to SuperScript® II
M-MuLV Reverse
Transcriptase（NEB #M0253）
AMV Reverse Transcriptase（NEB #M0277）

WarmStart® RTx Reverse
Transcriptase（NEB #M0380）• 高純度の RNA サンプルを精製することが成功の鍵である。
• RNA サンプル中の DNA を除去しておく（DNase I 処理など）。

• 基本的 にはトータル RNA を 使用 して 逆転写 を 行 う。
mRNA も使用できる。この場合は Magnetic mRNA Isolation
Kit（NEB #S1550）で精製をするとよい。

• dNTPs、オリゴ dT プライマーおよびランダムプライマー

製品の選択

付属

• M-MuLV Reverse Transcriptase 付属
付属• マスターミックス（ランダムヘキサマー、オリゴ dT プラ
イマー、dNTPs、Murine RNA Inhibitor、Luna 逆転写酵素）• ピペッティング、分注ミスを低減する青色のマスターミックス• わずか 13 分のプロトコール• テンプレート・スイッチ反応に最適化された酵素とバッファー（5' RACE）• 逆転写酵素ミックスには RNA 阻害剤も含有• 微量 RNA からも高効率で逆転写 — シングルセルまたは
2 pg ヒト・トータル RNA から cDNA を合成• 5´ Rapid Amplification of cDNA Ends（RACE）法に最適

単品酵素

RNA サンプル• > 5 kb の cDNA を合成• 逆転写時に合成 cDNA の 3´ 末端に universal adaptor sequenceを付加
Template Switching
RT Enzyme Mix（NEB #M0466）

cDNA 合成のヒント• cDNA 合成（逆転写）に必要な RNA 量は、サンプル中の 目的 RNA の 存在量 によって 異 なる。 トータル RNAの場合は 1 ng ～ 1 µg、mRNA の場合は 0.1 ～ 100 ng で最適化するとよい。

• dNTPs、オリゴ dT プライマーおよびランダムプライマー• 2-Step の RT-qPCR の cDNA 合成に最適
LunaScript RT Master Mix Kit（Primer-free）（NEB #E3025）

ProtoScript II First Strand cDNA Synthesis Kit（NEB #E6560）• 第 2 鎖 cDNA 合成に必要な転写産物の 5´ 末端を維持• RNase H– 型 M-MuLV 逆転写酵素• RNase H 活性が低減• 37 ～ 50℃で反応可能• 野生型 M-MuLV 逆転写酵素• 37 ～ 45℃の反応温度• 37 ～ 52℃の反応温度を有する力強い逆転写酵素• ProtoScript II First Strand cDNA Synthesis Kit（NEB #E6560）がお薦め。
• その外用途に応じて左表を参考にして選択する。

効率• ProtoScript II Reverse Transcriptase およびこれが含まれたキット（NEB #E6560) は 通常 42 ℃ で 逆転写 を 行 うが、
48 ℃ まで 上 げて RNA の 二次構造 を 乖離 することで、
10 kb 以上の逆転写ができる。
• 酵素量 と dNTPs 量 を 2 倍 にすることで 収量向上 がで
きる。

添加物

• 逆転写後に PCR を行う場合（RT-PCR）、RNase H 処理は
基本的に不要である。ただしうまく増幅できない場合には 2 units の E.coli RNase H を逆転写産物に添加、37℃
で 20 分間インキュベーションをするとよい。

cDNA 合成（逆転写）プロトコール（#E6560）• 高温での反応が必要なテンプレートに最適

Total RNA

• 高い特異性と反応性

ヌクレアーゼフリー水• 50 ～ 65℃の反応温度• RT-LAMP に最適

d(T)23 VN (50 µM)

変性

1 ～ 6 µl (up to 1 µg)

2 µl

to a total volume of 8 µl

反応65℃で 5 分間
スピンダウンして氷上に保存

Denatured RNA

8 µl

Reaction Mix

10 µl

Enzyme Mix

2 µl

反応

熱失活

逆転写（CDNA 合成）

42℃で 1 時間
80℃で 5 分間※ –20℃で保存可能※ PCR テンプレートに使用（1/10 以下の持ち込みとする）

18

cDNA 合成

cDNA 合成のための RNA 精製：
Monarch Total RNA Miniprep Kit

推奨製品

Monarch Total RNA Miniprep Kit（NEB #T2010）特長

モナーク・トータル RNA 精製キットは、培養細胞、血液、哺乳類の組織など様々• 様々なサンプルに対応

なサンプルに対応しており、サンプルの保存、溶解、gDNA の除去を含んだトータ

ル RNA 精製 の 包括的 ソリューションである。 さらにオプションプロトコールに• miRNA や small RNA（> 20 nt）を含む全 RNA を精製可能

より、細菌、酵母、植物 などからも RNA 精製 ができる。 また、酵素反応後 の RNA• DNase I、gDNA 除去カラム、Proteinase K、RNA 安定化剤が付属や TRIzol 試薬で抽出した RNA のクリーンアップも可能である。精製される RNA は• 価格を抑えたオールインワンキットで、コストを節約

A260/280 および A260/230 が≥ 1.8 で、RIN スコアが高く（分解度が低く）、残存 DNA が極めて少なく、高品質である。さらに結合条件を変えることで（オプションプロトコール）、200nt より小さい Small RNA（miRNA、5S rRNA、tRNA など）の精製など、RNA の選択的精製も可能であり、完全長 rRNA からインタクトな miRNA までの精製をカバーしている。精製された RNA は、RT-qPCR、cDNA 合成、ノーザンブロッティング解析、
NGS ライブラリー調製など多くのアプリケーションに最適である。

• カラム、バッファーの個別購入が可能

特性• RNA サイズ：≧ 20 nt• RNA 結合能：100 µg• 純度：A260/280、A260/230 いずれも通常 ≧ 1.8• 最大サンプル量：細胞 1 x 107、組織 50 mg*• 回収率：サンプルによる• 溶出液量：30 ～ 100 µl• アプリケーション：NGS 用ライブラリー調製、
RT-PCR、RT-qPCR、ノーザンブロットなど* 詳細は www.nebj.jp/re/RNA-guide を参照

NGS ライブラリー調製や RT-qPCR 用などの RNA 調製に最適

B. RNA ライブラリー調製、ラット肝臓

A. RT-PCR、Hela 細胞

C. RT-qPCR、トマト葉

1500
1000
700
500

3

400
300

1

[FU]
150

3000

100

2000

50
0

200

0.5

2500
RFU

kb
10

40

150

50

60

70

80

1500
1000
50

90 100 110 120 [s]

0
0

100

0.1

10

20
Cycles40

B. cereus（グラム陽性菌）

30

S. cerevisiae（酵母）

E. coli（グラム陰性菌）

トウモロコシ葉
7.9

9.9

トマト葉

9.2

ラット脾臓

ラット肝臓

7.6

マウス心臓

PBMC

8.0

マウス筋肉

ヒト全血

9.8

ラット腎臓

NIH 3T3

9.8

ラット脳

HeLa

50
15

6000
4000

2000
1000
500
200
25

RIN

8.8

8.6

9.4

8.9

9.2

8.0

9.8

10

A260/280 2.01 2.08 2.04 2.04 2.06 2.07 2.04 2.06 2.09 2.06 2.10 2.09 2.05 2.11 2.11
A260/230 2.21 2.23 2.11 2.35 2.07 2.18 2.14 2.22 2.41 2.25 2.38 2.30 2.36 2.41 2.46
Monarch Total RNA Miniprep Kit（NEB #T2010）で様々なサンプルからトータル RNA を精製したところ、全てにおいて分解がなく高品質な RNA が得られた。また A（RT-PCR）、B（NGS
ライブラリープレップ）、C（RT-qPCR）において良好な結果が得られることを確認した。精製した RNA は Agilent Bioanalyzer® 2100 および Nano 6000 RNA chip（植物では plant Nano
assay を使用）で測定を行った。それぞれで使用した試薬は A：Protoscript II Reverse Transcriptase（NEB #M0368）/LongAmp Taq DNA Polymerase（NEB #M0323）、B：NEBNext Ultra II RNA Library
Prep Kit（NEB #E7760）、C：Luna One-Step RT-qPCR Reagents（NEB #E3005）

19

DNA 切断（Traditional Cloning）

DNA 切断（制限酵素）

I 社 EcoRI

NEB EcoRI-HF

0

Traditional Cloning においては、制限酵素 でベクター 切断（直鎖状化） と PCR 増
幅したインサート DNA の末端処理を行うことが基本である。また DNA Assembly（Seamless Cloning）でも制限酵素でベクター切断（直鎖状化）を行うことが多い。
本稿および別冊「NEB 新・制限酵素の基礎知識」を参考にして効率的かつ特異的な切断を行う。

1

3

5

10

M

0

1

3

5

10

µl

非特異的
切断
（スター
活性）

NEB は約 300 種類の制限酵素を提供している。切断効率と特異性、使いやすさの点から様々な工夫がされている。ハイフィデリティー（HF）制限酵素は野生型
酵素にアミノ酸変異を導入することにより、非特異的切断（スター活性）を大きく抑制できる（右図）。また反応バッファーも工夫されており、約 80％の酵素がrCutSmart Buffer を最適とするため、ダブルダイジェストがしやすい。

NEB の EcoRI-HF と 他社 EcoRI で Lambda DNA を 切断 した 結果、NEB のEcoRI-HF はオーバーナイト反応、過剰な酵素量でもでスター活性を生じないことが示された。

また、各社から制限酵素が市販されており、いずれも良好に DNA を切断できるが、

夾雑ヌクレアーゼ量が大きく異なる（下図参照）。場合によっては完全に切断されているように観察されても、末端構造が損なわれている（突出末端が平滑化
するなど）ことがある。NEB の制限酵素は最適化された精製方法と厳密な品質管理により、夾雑ヌクレアーゼが最小限であり、それゆえ切断効率だけではなくクローニング効率も高い。

Single-stranded

Double-stranded blunt top
Double-stranded blunt bottom

3´ Overhang top
3´ Overhang bottom

14

100

Overhang

120

16

120

5´ Overhang top
5´ Overhang bottom

100

60

40

10

Degradation (%)

80

Degradation (%)

Degradation (%)

12

8
6

80

60

40

4
20

0

20

2

EcoRI

EcoRI-HF

NEB EcoRI

A

B

C

D

Competitor EcoRI

0

NotI

NotI-HFA

NEB NotI

B

C

Competitor NotI

D

0BamHI BamHI-HF

NEB BamHI

A

B

C

D

Competitor BamHI

各社の制限酵素の夾雑ヌクレアーゼを調べた結果、NEB の制限酵素が最も少ないことが示された。EcoRI、NotI、BamHI について、蛍光標識した平滑末端、5´ 突出末端、3´ 突出末端を基質として、推奨条件で反応、キャピラリー電気泳動で分解度を測定した。この測定は 1 塩基レベルの解像度である。夾雑ヌクレアーゼが多いということは、切断後に末端が損なわれてしまい、ライゲーション効率の低下を引き起こすことを意味する。

• HF 酵素を使えばスター活性を回避• 切断効率だけではなく、夾雑による末端分解の少なさが重要• 詳細は「新・制限酵素の基礎知識」を参照（ウェブサイトで公開、依頼）

20

DNA 切断（Traditional Cloning）
最適化のヒント酵素• フリーザーから酵素を出したら、常に氷上で保持する。
• 酵素は最後に加える。

• 混合 はピペット 操作 かタッピングにて 行 い、
微量遠心分離機でチューブ内の溶液をスピンダウンさせる。ボルテックスによる混合は控える。
• 通常は 1 時間の反応において、1 µg の DNA に対して 5 ～ 10 units の酵素の使用を推奨する。
ゲノム DNA の場合には 10 ～ 20 units を使用する。
スター活性• 以下のような条件下ではスター活性（非特異的切断）を生じることがある：– 酵素量が過剰– 長時間反応– 最適バッファー以外を使用– 5％以上のグリセロール濃度• ハイフィデリティー 制限酵素 を 使用 すればスター活性を低減できる。あるいは反応時間の短縮、Time-Saver 品質酵素の使用、全反応溶液を増やすことで低減できる。

バッファー• 各制限酵素には 10 倍濃度の最適バッファーが付属しているが、反応時には 1X 濃度に希釈して使用する。

• NEBuffer r1.1、r2.1、r3.1 および rCutSmart バッ
ファーには既にアルブミンが含まれているので、反応セットアップ時に BSA 添加は不要で
ある。
反応容量

• 1 µg の基質 DNA を分解する場合、50 µl の反応
容量 を 推奨 する。容量 が 少 ない 場合 にはミニ
プレップ DNA 中に残存している塩が影響を与える場合がある。

• 添加 する 酵素量 は 全反応容量 の 10 ％ とする。
これはスター活性を防ぐために、グリセロー
ル濃度を 5％未満にするためである。
• 反応容量が少ない場合（50 µl 未満）、酵素溶液中に含まれる塩やグリセロール、あるいはサン
プル DNA 溶液中 に 含 まれる EDTA や 残存 アルコールなどが酵素活性の低下やスター活性の増加 などを 引 き 起 こす 可能性 があるため、注意 する。小 スケールにおける 反応条件 では、目安として下記表を参考にされたい。

DNA• DNA は、フェノール、クロロホルム、アルコー
ル、EDTA、界面活性剤、過剰 な 塩 などが 混入していないものを用いる。DNA サンプル調製
時に追加の洗浄作業を行うことを推奨する。
• 制限酵素のメチル化感受性と DNA のメチル化
状況を確認する。

• 50 µl 反応溶液あたり、1 µg を超える DNA を切断 する 場合 には 切断効率 が 低下 することがある。この場合、1 µg DNA/50 µl となるようにス
ケールアップをして反応を行う。

DNA

10X
NEBUFFER

1 unit0.1 µg

1 µl

25 µl rxn

5 units

0.5 µg2.5 µl

50 µl rxn

10 units

1 µg

5 µl

10 µl rxn**

制限酵素 *

反応時間• 通常は 1 時間で行う。Time-Saver 酵素を用いる
場合、5 ～ 15 分間で行う。
• Time-Saver 酵素については
https://www.nebj.jp/f/961 を参照。

• 多くの酵素においては、酵素量を少なくして
16 時間まで反応時間を延長できる。
保存• 大半の制限酵素は、–20℃で保存する。ただし一部 の 酵素 については、30 日以上保存 する 場
合、–70 ℃ で 保存 することが 推奨 されている。
酵素 の 保存条件 に 関 しては、製品 に 同封 されているデータシートまたは本カタログの各製品の情報を参照。
• 10X NEBuffer についても –20℃で保存する。

• 消費期限 はチューブラベル 上 に 印字 されている。

• –20℃以上における酵素の保存は最大限控える。

* 微量酵素を使用する場合、反応直前に 1x バッファーで希釈する** 10 µl の系の場合、1 時間以上の反応は避ける

PCR 産物の切断

PCR 産物を制限処理する機会は多い。この時、PCR 産物をエタノール沈殿、ビーズ精製、カラム精製などで精製してから制限反応を行うことを推奨する。しかしながら、ステップ簡略化のため、PCR 産物を精製せずに直接制限反応を行う場合もある。この際、PCR バッファー中の因子が制限酵素に影響する。影響度（阻害度）は制限酵素によって異なるため、下記表と最適化のヒントを参照にして最適化するとよい。

PCR 産物の直接切断プロトコール

右表を参考にセットアップする。PCR 産物を精製せずに切断したい場合、カラムなどで精製したものをコントロールとして設けるとよい。

PCR 産物切断の最適化のヒント• できる限り制限反応を阻害しない PCR 酵素とバッファーを選択して PCR を行う• PCR 溶液の影響を受けにくい制限酵素を選択する• 極力 PCR 溶液の持ち込みを少なくして制限反応をセットアップする。少ないほどよい• PCR の持ち込みを 2、5、10、25 µl のように変えて最適化する

制限酵素

10 units（通常は 1 µl を使用する）

10X NEBuffer

5 µl

10 µl など（～ 1 µg）

PCR 産物

ヌクレアーゼフリー水
全反応容量up to 50 µl
50 µl• 精製した PCR 産物をコントロールにする• 持ち込み量を極力少なくする• PCR 産物を精製したものをコントロールにする21

DNA 切断（Traditional Cloning）

プライマーに制限サイトを入れる場合

制限部位をプライマーなどに組み込む場合など、DNA 末端付近で制限反応を行う• とにかく 6 bp を付加すればよい

場合、ほとんどの制限酵素は制限部位の外側に数塩基を必要とする。これは制限酵素が DNA に結合して切断するために、“足場” を必要とするためである。足場の長さ（付加する配列数）によって切断効率が変わる。6 bp 以上付加すれば 100％の切断効率が得られるため、どの制限酵素でも 6 bp 以上を付加することを推奨している。またその付加配列はランダムなものがよい。

AciI の場合（認識配列：CCGC）
5´-TCCGCNNN…NNN-3´

5´-CATCCGCNNN…NNN-3´

5´-GCATCCGCNNN…NNN-3´

5´-ATGCATCCGCNNN…NNN-3´

3´-AGGCGNNN…NNN-5´

3´-GTAGGCGNNN…NNN-5´

3´-CGTAGGCGNNN…NNN-5´

3´-TACGTAGGCGNNN…NNN-5´

切断効率：0％切断効率：0 ～ 20％

切断効率：20 ～ 50％

切断効率：50 ～ 100％

0 or 1 bp

2 or 3 bp

4 bp

5 or > 6 bp

DNA 断片の末端付近における制限酵素活性

下記表は、5´FAM 標識オリゴ DNA をアニールした 2 本鎖 DNA に対して、各種制限酵素（10 units/1 pmol オリゴ）を添加し、推奨条件下で 60 分
間インキュベーションしたときの切断効率を示す。切断効率は、TBE アクリルアミドゲルを用いた電気泳動と蛍光イメージ検出によって評価した。2 本鎖 DNA は各認識配列の上流に 1 ～ 5 bp、下流に 12 bp を付加してある。非対称な切断が観察される場合があるが、その場合は切断されないものとして扱った。非対称な切断は付加する塩基数を増やすほど減少する傾向にあった。

メモ：表中に記載がない制限酵素の場合、効率的に切断するためには認識部位の末端のいずれか一方に 6 塩基対付加する必要がある。付加する塩基配列はパリンドローム配列やプライマーダイマーを形成しないように設計する。多くの場合、特定の配列を付加する必要はない。
酵素

AciI
AgeI
AgeI-HF
AluI
ApaI
AscI
AvrII
BamHI
BamHI-HF
BbsI-HF
BclI-HF
BglII
BmtI
BmtI-HF
BsaI
BsaI-HFv2
BsiWI
BsiWI-HF
BsmBI
BsrGI
BssHII
BstZ17I-HF
ClaI
DdeI
DpnI
DraIII-HF
EagI
EagI-HF
EcoRI
EcoRI-HF
EcoRV
EcoRV-HF
Esp3I
FseI
HindIII
HindIII-HF
HpaI
KpnI
KpnI-HF
MfeI
MfeI-HF
MluI
MseI

22

– 0％

末端への付加塩基数

1 bp

2 bp

3 bp

4 bp

5 bp

–
+++
++
–
+++
+++
++
+
+
+++
–
++
+++
+++
+++
+++
++
+++
+++
+++
+
+
–
+++
–
+++
++
+
+
+
++
+
+++
+
–
–
+++
+
+
+
+
+
+++

+
+++
+++
+++
+++
+++
++
++
+
+++
–
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
–
+++
++
+++
+++
+++
+
+
++
++
+++
++
+
+
+++
+++
+++
++
++
++
+++

+
+++
+++
+++
+++
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+++
+++
+++
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+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+
+++
++
+++
+++
+++
++
++
++
++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++

++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
NT
+++
+++
+++
++
+++
++
++
+++
+++
+++
+++
+++
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+++
NT
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++

+ 0 ～ 20％

+ + 20 ～ 50％+ + + 50 ～ 100％

nt not tested

酵素

NcoI
NcoI-HF
NdeI
NheI
NheI-HF
NlaIII
NotI
NotI-HF
NsiI
NspI
PacI
PciI
PmeI
PstI
PstI-HF
PvuI
PvuI-HF
PvuII
PvuII-HF
RsaI
SacI
SacI-HF
SacII
SalI
SalI-HF
SapI
Sau3AI
SbfI
SbfI-HF
ScaI-HF
SfiI
SmaI
SpeI
SpeI-HF
SphI
SphI-HF
SspI
SspI-HF
StuI
StyI
StyI-HF
XbaI
XhoI
XmaI

末端への付加塩基数

1 bp

2 bp

3 bp

4 bp

5 bp

–
+
+
+
++
++
++
++
+
–
+++
+++
+++
+
++
+++
+++
++
–
+
–
–
+++
–
–
+++
+++
++
++
+
+++
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+
+
+++
++
+
+
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+
+
++
++
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++
++
+
++
++
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++
++
+
–
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+
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++
++
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+
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++
++
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+
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++
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++
++
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++
++
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+++
+++
++
+++
+++

表にない酵素：1 ～ 5 bp では低活性（6 bp 付加を推奨）

DNA 切断（Traditional Cloning）

環状 DNA（ベクター＆プラスミド）の切断

制限酵素は基質 DNA の種類によって異なる切断効率を示す。一般的に、比較的短い直鎖状 DNA は切断されやすく、環状 DNA は切断されにくい。

このような切断されにくい環状 DNA を切断する場合、1 µg DNA あたり、10 ～ 20 units の制限酵素を使用するとよい。

環状 DNA の切断プロトコール
下表に従って反応を調製する。

酵素の推奨温度下、1 時間でインキュベーションする。切断しにくい場合、オーバーナイト反応を行う。

環状 DNA

10X NEBuffer

ヌクレアーゼフリー水
全反応容量*

ネガティブコントロール

反応—（入れない）10 ～ 20 units*

制限酵素

最大 1 µg

最大 1 µg

ポジティブコントロール

10 ～ 20 units
1 µg

5 µl

5 µl

5 µl

Up to 50 µl

Up to 50 µl

Up to 50 µl

50 µl

50 µl

50 µl

制限酵素によって酵素濃度（1 µl あたりのユニット数）が異なることに注意

環状 DNA の切断のヒント• プラスミド・ミニプレップでは、アルコールや塩が残りやすいので十分注意する• 反応系への DNA 溶液の持ち込みを少なくする、また全反応容量を 50 µl にすることで、夾雑物の影響を少なくできる• メチル化感受性を確認しておく• 1 µg 以上の DNA を切断する場合、反応全体をスケールアップする。高濃度反応は効率低下を招くリスクがあるため推奨しない• 環状 DNA をダブルダイジェストする場合、それらの認識配列が十分離れている（切断末端間が 6 塩基以上）ことを確認する。距離が短い場合、
新・制限酵素の基礎知識（弊社ウェブサイト申し込み可能）の 68 ページを参照する• ネガティブコントロールを使用して、電気泳動でのバンドシフトを確認する

環状 DNA の切断に必要な酵素ユニット数

あくまでも参考であるが、以下に標準的な反応条件下における環状 DNA（pBR322、pUC19 および pLITMUS）を完全に切断するために必要な酵素量を示す。各 DNA ベクターの切断部位を 1 つずつ試験しているが、複数のデータがあった場合には平均値を示している。またコントロール

として直鎖状 DNA である Lambda DNA を用いた（ほとんどの酵素が 1 unit で切断できる）。
酵素

AatII
AflIII
AhdI
AccI
Acc65I
AflII
AgeI
AlwNI
ApaI
ApoI
AseI
AvaI
AvrII
BaeI
BamHI
BanII
BglII
BpmI
BsaI
BsaAI
BsaXI
BsiWI
BsgI
BsmI
BspDI
BspEI
BspMI
BspQI
BsrFI
BsrGI

プラスミド切断に必要なユニット数

3
1
1
4
1
2
1
2
1
1
0.3
10
1
3
3
1
8
1
2
20
2
3
1
1
1
1
**
3
2
1

** 切断のためには 2 か所の認識配列が必要

酵素

BssHI
BtgI
ClaI
EagI
EcoO109I
EcoNI
EcoRI
EcoRV
HincII
HindIII
KasI
KpnI
MluI
NarI
NcoI
NdeI
NgoMIV
NheI
NruI
NsiI
PciI
PsiI
PstI
PvuI
PvuII
SacI
SalI
SapI
ScaI
SmaI

プラスミド切断に必要なユニット数

4
5
5
10
8
3
3
1
4
5
4
2
2
10
1
3
2
5
1
1
3
3
1
2
2
5
10
1
20
1

酵素

SnaBI
SpeI
SphI
SspI
StuI
StyI
TliI
TspMI
Tth111I
XbaI
XhoI
XmnI

プラスミド切断に必要なユニット数

1
1
3
4
3
4
2
1
2
2
10
5

23

DNA 切断（Traditional Cloning）

メチル化感受性

制限酵素の多くはメチル化感受性を有する。ゲノム DNA や大腸菌で調製したプラスミド／ベクター DNA にはホストのメチル 化パターンがDNA に反映されるため、制限酵素で切断する際には十分確認をする。以下に確認方法を記す。

1）制限酵素のアイコンや説明書などでメチル化感受性を確認する。感受性がないものはサンプルを問わず切断できる。
2）感受性があった場合、その内容に応じて確認をする。PCR 産物はメチル化を反映しないため、問題なく切断できる。
制限酵素

CpG メチル化感受性

Dam メチル化感受性
Dcm メチル化感受性

真核生物ゲノム

バクテリアゲノム

切断できる

切断できない切断できない大腸菌ミニプレッププラスミド／

ベクター

切断できる

切断できる

PCR 産物

切断できる

切断できない切断できる

3）上記表にて切断できないに該当する場合、以下を検討する。
• イソシゾマーでメチル化感受性がないものを探す• 大腸菌ミニプレッププラスミド／ベクターの場合、Dam/Dcm 欠損株でプラスミドを調製する（NEB #C2925）など• PCR で増幅してから切断する• 他のサイトを検討する

メチル化感受性の詳細確認方法

下記表は NEB 制限酵素のメチル化感受性について要約したものである。メチル化部位が認識配列とオーバーラップした場合の Dam メチル化、

Dcm メチル化、または CpG メチル化による切断の可否や影響を示してある。詳細な情報や具体的事例、または目的 DNA の切断確認に関しては、
以下を参照する。
REBASE（制限酵素データベース）：rebase.neb.com/rebase/
各酵素のメチル化感受性の詳細な情報が掲載（実際の切断効率など）• メチル化感受性の詳細は
新・制限酵素の基礎知識を参照• 詳細は REBASE を参照するとよい

NEBcutter（オンラインツール）：nc3.neb.com/NEBcutter/

DNA 配列を入力、制限マップと各酵素のメチル化感受性を表示
記号の説明
●

感受性なし

◆

□ ol

オーバーラップするメチル化配列によってブロックされる◇ scol オーバーラップするメチル化配列の組み合わせによっては影響を受ける■

ブロックされる◇ ol□ scol オーバーラップするメチル化配列の組み合わせによってはブロックされる影響を受ける

オーバーラップするメチル化配列によって影響を受ける

制限酵素のメチル化感受性リスト（一例、完全な表はウェブサイトもしくは新・制限酵素の基礎知識を参照）
酵素

AatII
AbaSI
AccI
Acc65I
AciI
AclI
AcuI
AfeI
AflII
AflIII
AgeI
AgeI-HF
AhdI
AleI-v2
AluI
AlwI
AlwNI
ApaI
ApaLI
ApeKI
ApoI
ApoI-HF

24

配列

GACGT/Cm
C(11/9)
GT/MKAC
G/GTACC
CCGC(-3/-1)
AA/CGTTCTGAAG(16/14)
AGC/GCT
C/TTAAG
A/CRYGT
A/CCGGT
A/CCGGTGACNNN/NNGTCCACNN/NNGTG
AG/CT
GGATC(4/5)
CAGNNN/CTG
GGGCC/C
G/TGCAC
G/CWGCR/AATTY
R/AATTY

Dam

Dcm

CpG

●

●

●

●
●

●
●

●

□ scol

●

●

●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
■
●
●

■

●

●

●
●
●
●
●
●
●

■
■
●
●
■
■

◇ scol◇ scol

●

●

□ ol
□ ol

●

●
●

●

●

●

□ ol
□ scol

●

●
●

■

●
●

●

□ ol
□ ol
□ ol

●
●

塩基表記： R = A or G

Y = C or T
M = A or C
K = G or T
S = C or G
W = A or T
H = A or C or T（not G）
B = C or G or T（not A）
V = A or C or G（not T）
D = A or G or T（not C）
N = A or C or G or T

DNA 切断（Traditional Cloning）

rCutSmart Buffer 中での修飾酵素の活性

制限酵素と他の DNA 修飾酵素を利用したワークフローを作成する際、反応間で DNA クリーンアップを行うことなく、同一溶液中で反応を行うことが求められることが多い。以下表に制限酵素バッファーの 1 つである rCutSmart Buffer 中における DNA 修飾酵素の活性を示す。
rCutSmart
バッファー中の活性修飾酵素

Antarctic Phosphatase+++

Bst DNA Polymerase+++

CpG Methyltransferase (M. SssI)+++DNA Polymerase I+++

DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment–

必須因子

Requires Zn2++++

DNA Polymerase Klenow Exo+++

DNase I (RNase free)+++

Requires Ca2+

E. coli DNA Ligase+++

Requires NAD

Endonuclease III (Nth)+++Endonuclease VIII+++

Exonuclease I+++

Exonuclease III+++

Exonuclease VII+++

Exonuclease V (Rec BCD)+++

Requires ATP

GpC Methyltransferase (M. CviPI)+

Requires DTT

Hi-T4 DNA Ligase+++

Requires ATP

Lambda Exonuclease

++

McrBC

+++

Micrococcal Nuclease+++

Nuclease Bal-31+++

phi29 DNA Polymerase+++

Quick CIP+++

Requires Ca2+
Requires DTT

RecJf

+++

Salt-T4® DNA Ligase+

Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)+++

T3 DNA Ligase+++

Requires ATP + PEG

T4 DNA Ligase+++

Requires ATP

T4 DNA Polymerase+++

T4 Phage β-glucosyltransferase (T4-BGT)+++

T4 Polynucleotide Kinase+++

Requires ATP + DTT+++

Requires ATP + DTT

T4 PNK (3´ phosphatase minus)
T5 Exonuclease+++

T7 DNA Ligase+++

T7 DNA Polymerase (unmodified)+++

T7 Exonuclease+++

Thermolabile ExoI+++

USER Enzyme, recombinant++++ + + full functional activity+ + 50–100% functional activity

Requires ATP

Requires ATP + PEG+ 0–50% functional activity25末端修飾（Traditional Cloning）

DNA 末端修飾

5´ リン酸化の推奨酵素

Traditional Cloning において、インサート DNA とベクターの制限酵素切断が完了したらライゲーション可能である。ライゲーションには 5´ モノリン酸基と 3´ 水酸基が必要であるが、制限酵素で切断した DNA は既にこの形状になっているためである。
しかしながら 5´ モノリン酸を持たない場合にはリン酸化、あるいはベクターのセ
ルフアニーリングを予防する際には脱リン酸化、またはインサート DNA とベクターの末端形状が異なる場合には平滑化といったように DNA の末端修飾が必要である。

リン酸化

制限処理をしたベクターとインサート DNA は末端修飾の必要がないが、PCR 産物をそのまま使う場合（平滑末端ライゲーションなど）、5´ リン酸化が必要である。
これは一般的には PCR プライマーは 5´ リン酸化されていないためである。この場合、T4 Polynucleotide Kinase（T4 PNK, NEB #M0201）で簡単にリン酸化できる。ある

いはプライマー注文時にオプションで 5´ リン酸化をすればよい。

5´ リン酸化プロトコール
10X Polynucleotide Kinase Buffer

標準プロトコール

5 µl（1 mM final concentration）

ヌクレアーゼフリー水

全量が 50 µl になるように

T4 Polynucleotide Kinase（PNK）

インキュベーション

ウンドが減少してポジティブクローンが得られやすくなる。ベクターを脱リン酸化した場合には、インサートの 5´ リン酸化が必須であることに注意する。なお、

ライゲーション後は片方の鎖にニックが入っている状態になるが、これは形質転換後に大腸菌内で修復されて完全な 2 本鎖プラスミドになって複製される。

ホスファターゼ選択チャート

安定性

NEBuffer 中での活性
補因子

5 分間／ 65℃

2 分間／ 80℃

Quick CIP

26

• ベクターを制限酵素で切断した後、熱失活をしてからホスファターゼを追添加 して 脱 リン 酸化 をする。熱失活できない制限酵素を使用した場合、NEB #T1030 で精製してから脱リン酸化する。

• 表中 の 3 種類 のホスファターゼを 使用 する 場合、脱リン酸化後は熱失活をする。DNA 精製の必要はなく、そのままライゲーションに使用できる。
添加物• AP は Zn2+ が必須である。それ以外は NEBuffer 中に添加するだけでよい。

l

l

l

l

l
l

l

(Zn2+)
l

標準プロトコール

1 pmol of ends（末端のモル数）
2 µl

動画：脱リン酸化のメカニズム• 末端のどちらかに 5´ リン酸があればよい

• ベクターの脱リン酸化でセルライゲーションを防止できる

1 µl

ヌクレアーゼフリー水

全量が 20 µl になるように

熱失活

80℃、2 分間

インキュベーション

添加物

2 分間／ 80℃l

脱リン酸化プロトコール（Quick CIP）
10X rCutSmart Buffer• 5´ 陥没末端のリン酸化を行う場合、DNA 溶液を 70℃
で 10 分間インキュベーション、氷上で急冷してからバッファーと酵素を入れるとよい。

Recombinant Shrimp
Antarctic
Alkaline Phosphatase Phosphatase（AP）
Quick CIP（rSAP）（NEB #M0371） （NEB #M0289）（NEB #M0525）

クイックプロトコール

DNA

阻害）

酵素

セルフライゲーションを防止するための修飾である。この処理によりバックグラ

活性• T4 PNK は以下で阻害される：150 mM NaCl（50％阻害）、
7 mM リン酸（50％阻害）、7 mM 硫酸アンモニウム（75％

脱リン酸化のヒント

37℃、30 分間

脱 リン 酸化 は、 ベクターを 1 種類 の 制限酵素 だけで 切断 した 場合 に 起 こりうる

熱失活条件

• T4 PNK（NEB #M0201）と T4 DNA Ligase（NEB #M0202）
は同一バッファー中で使用できる。T4 DNA Ligase Buffer
でリン酸化を行い、そのままベクターとリガーゼを添加するとよい。

Quick CIP（NEB #M0525）

1 µl（10 units）

脱リン酸化

特徴

酵素

脱リン酸化の推奨酵素

5 µl

10 mM Adenosine 5´-Triphosphate（ATP）

5´ リン酸化のヒント• PEG8000（終濃度 5％以下）をいれると脱リン酸化効率が向上する。

1 ～ 2 µg

DNA

T4 Polynucleotide Kinase（NEB #M0201）

37℃、10 分間

脱リン酸化の説明

末端修飾（Traditional Cloning）

平滑化＆末端修復

基本的には突出末端ライゲーションがよいが、丁度よい末端がない場合、平滑末

端ライゲーションを行うことが多い。もし制限処理後の末端が突出末端であれば、

5´ 突出の埋め込み（アンチセンス鎖の伸長）と 3´ 突出の削り込みにより平滑化
を 行 う。 この 反応 は 下表 にあるように DNA Polymerase I Klenow Fragment か T4 DNA
Polymerase、Quick Blunting Kit で行うことができる。あるいは 5´ 突出を除去したい
場合、Mung Bean Nuclease を使用する。いずれにせよ、フレームシフトや制限部位の消失と新たな制限部位の産生が起こることに留意する。

平滑化酵素＆キット選択チャート

アプリケーション

5´ 突出の埋め込み
3´ 突出の除去

DNA Polymerase I,
Large (Klenow)
T4 DNA
Quick Blunting Mung Bean
Fragment
Polymerase*
Kit
Nuclease（NEB #M0203） （NEB #M0210） （NEB #E1201）（NEB #M0250）
l

l

l

l

l

l

5´ 突出の除去ll* T4 DNA Polymerase は強い 3´ → 5´ エキソヌクレアーゼ活性を有する

DNA 平滑化プロトコール（Quick Blunting Kit）
DNA

標準プロトコールup to 5 µg

10X Blunting Buffer

2.5 µl

1 mM dNTP Mix

2.5 µlBlunt Enzyme Mix

1 µl

ヌクレアーゼフリー水

to 25 µl

熱失活

70℃、10 分間

インキュベーション

平滑化の推奨酵素

Quick Blunting Kit（NEB #E1201）

平滑化のヒント酵素• DNA 末端の平滑には適切な酵素を選択する。
左表：平滑化酵素＆キットを参考にする。

• T4 DNA Polymerase および DNA Polymerase I, Large（Klenow）
Fragment は全ての NEBuffer 中で使用できる。この場合、dNTPs を添加して使用する。
精製• 制限反応後に平滑化を行う場合、制限酵素が熱失活できるのであれば 精製 なく 平滑化 できる。制限酵素 が
熱 で 不活性化 できない 場合、平滑化前 に DNA 精製 を行うことを推奨する。

• PCR 産物 を 平滑化 する 場合、 ヌクレオチドとポリメ
ラーゼを除去するために DNA 精製してから平滑化を行う。
• 平滑化後に脱リン酸化を行う場合、DNA 精製を行う。
温度• Mung Bean Nuclease で平滑化を行う場合、室温での反応を推奨する。37℃などで反応を行った場合、DNA 末端がさらに 削 られて 突出末端 となることがある。酵素
量とインキュベーション時間を最適化するとよい。

熱による不活性化• 制限反応産物の場合：室温、15 分間• 断片化 DNA/PCR 産物：室温、30 分間 *• Mung Bean Nuclease は熱による不活性化を推奨しない。
不活性化自体はできるが、不活性化前に DNA 末端がさらに削られて突出末端となったり、非特異的な分解が起こることがあるためである。フェノール／クロロ
ホルム精製もしくはエタノール精製、スピンカラム
精製を推奨する。

* PCR 産物を平滑化する場合、精製をしたものを使用する（カラム精製：NEB #T1030、ゲル精製：NEB #T1020、またはフェノール／クロロホルム抽出など）

DNA 平滑化のチュートリアル動画を公開中
www.nebj.jp/re/traditional-cloning27

ライゲーション（Traditional Cloning）

DNA ライゲーション

ライゲーションを始める前に

Traditional Cloning におけるライゲーションにおいて、その効率を最大限にするためには、反応溶液中のインサー
ト DNA とベクターの 量比 が 極 めて 重要 である。一般的にはインサート：ベクター＝ 3：1 のモル比がよい。ここでは質量比（ng）ではなく、モル比（mol）であることに注意が必要である。オンラインツールを使用すれば簡単にモル比が計算できる。

ベクターと DNA の連結

DNA のライゲーションは Traditional Cloning の鍵ステップであることに加えて、非ク
ローニング用途の最新の分子生物学ワークフローにも多く使用されている。この反応は DNA Ligase によって触媒され、主として 2 本鎖 DNA の末端の連結および 2 本
鎖 DNA 上のニックの連結が行われる。連結は DNA の 5´ リン酸末端（5´P）と 3´ 水
酸末端（3´OH）のホスホジエステル結合の形成によって成されるが、細かく見ると以下の 3 ステップからなる。

NEBioCalculator.neb.com

技術情報1）溶液中のフリーの ATP によりリガーゼ自身がアデニル化する。

2）リガーゼ内のアデニル基をドナー DNA の 5´P 末端に転移する。

NEBStickTogether.com• NEB のリガーゼ製品リスト

3）アデニル 化 されたドナー DNA の 5´ 末端 とアクセプター DNA の 3´OH 末端 でホスホジエステル結合を形成する。この時 AMP が遊離する。

• FAQs• 動画（ライゲーションの原理と反応セットアップ）

またあらゆる生物において、DNA 複製と DNA 修復に DNA リガーゼは必須である。

分子クローニングは組換え DNA を単離・増幅する方法であることは先に述べたとおりであるが、具体的には目的 DNA（インサート DNA）とベクターをライゲーショ

ンして環状 DNA を作成、これを微生物ホスト（多くは大腸菌）内でホストゲノムとは別に自律的に増幅する。特にライゲーションにおいてはインサート DNA とベクターの末端形状をそろえる必要があり、5´P 末端を有する突出末端もしくは平滑

最高純度の NEB T4 DNA Ligase で確実にライゲーション

末端が使用できる。インサート DNA とベクターのそれぞれの末端がライゲーショ

M

NEB
NEB
Lot 101 Lot 102A

SUPPLIER
BC

D

ンされてホスホジエステル結合（共有結合）が形成され、環状 DNA が作成される。
この環状 DNA こそがホストバクテリアに形質転換して複製できる形状なのである。
こうして作成された組換え DNA を持つベクターは「組換えプラスミド（リコンビ

ナントプラスミド）」としてホスト内で保存される。またそこから精製したリコ

ンビナントプラスミドはシーケンスやタンパク質発現、遺伝子発現、機能解析など様々な実験の起点材料となる。

古くから使用されている DNA リガーゼであるが、近年、NEB はその正確性に着目して研究を実施、連結部分の配列によって正確性に差が生じることを明らかにした。特に Golden Gate 法などの DNA Assembly において重要であり、また DNA リガー

ゼを使用した新規アプリケーション開発にも重要な情報となりうるため、ウェブ

サイトを参照されたい（www.neb.com/GoldenGate）。

また耐塩性が高いものやユニークな特異性をもつリガーゼも提供、下記チャートに示す。

各メーカーの T4 DNA Ligase を SDS-PAGE に供して銀染色を行った結果、NEB のリガーゼには 夾雑 バンドがなく、最 も 純度 が 高 いことが示された。夾雑成分はヌクレアーゼであることが多く、インサー
ト DNA やベクターの末端を分解、ライゲーション効率の低下やミスを引き起こすことがある。

ll

ll

lll

ll

ll

l

lll

ll

ll

lll

ll

l

lll

ll

ll

ll

l

lll

ll

突出末端だけをライゲーション

2 本鎖 DNA 上のニック修復

クローンライブラリーの作成

Hi-T4 DNA Ligase（NEB #M2622）

ll

Salt-T4 DNA Ligase（NEB #M0467）

T7 DNA Ligase（NEB #M0318）

lll

HiFi Taq DNA Ligase（NEB #M0647）

T3 DNA Ligase（NEB #M0317）

エレクトロポレーション

Quick Ligation Kit（NEB #M2200）

T/A ライゲーション

T4 DNA Ligase（NEB #M0202）

平滑末端のライゲーション

ElectroLigase（NEB #M0369）

突出末端のライゲーション

Blunt/TA Ligase
Master Mix（NEB #M0367）

アプリケーション

Instant Sticky-end
Ligase Master Mix（NEB #M0370）

クローニング用リガーゼ選択チャート

l

ll

ll

ll

ll

l

ll

ll
ll

lll
ll

ll

ll

lll

ll

ll

ll

ll

lll

ll

3

3

3

3

3

3

ll

ll

ll

lll

3

3

3

lll

ライゲーションの推奨酵素

突出末端（> 2 bp）：
Instant Sticky-end Ligase Master Mix（NEB #M0370）

平滑末端 &1 塩基突出末端：
Blunt/TA Ligase Master Mix（NEB #M0367）

汎用：

Quick Ligation Kit（NEB #M2200）

エレクトロポレーション用：
ElectroLigase（NEB #M0369）

特性

耐塩性（T4 DNA Ligase の 2 倍以上）

15 分間以下のライゲーション
マスターミックス仕様

3
3

3

3

ll

耐熱性

28

3
3

3

KEY
lll

熱安定性

リコンビナント酵素

3

3

3

3

3

3

3

3

3

l

最適、そのアプリケーションに推奨される
リガーゼ

そのアプリケーションで良好に使用可能

そのアプリケーションに使用できるが、推奨せずライゲーション（Traditional Cloning）

ライゲーションプロトコール
仕様

ベクター（3 kb）

Kit

Quick Ligation Kit（NEB #M2200）

50 ng

インサート DNA（1 kb） 50 ng

T4 DNA Ligase

Enzyme（NEB #M0202）

Instant Sticky-end Master Mix（NEB #M0370）

Blunt/TA Master Mix（NEB #M0367）

Master Mix

Master Mix

50 ng

50 ng

50 ng

50 ng

50 ng

50 ng

バッファー

2X Quick Ligation Buffer

T4 DNA Ligase Reaction Buffer

5 µl (Master Mix)

5 µl (Master Mix)

ヌクレアーゼフリー水

1 µl

1 µl

N/A

N/A

to 20 µl

to 20 µl

to 10 µl

リガーゼ

インキュベーション

25℃、5 分間* 突出末端の場合（> 2 bp）、反応時間を 25℃、10 分間に短縮可能

to 10 µl

インキュベーションの25℃、2 時間（または 16℃、オーバーナイト）* 必要なし

25℃、15 分間

ライゲーションのメカニズム、反応のヒントはウェブサイトを参照：

NEBStickTogether.com

ライゲーションのヒント
反応バッファー

• T4 DNA Ligase Buffer（NEB #B0202）は氷上または 掌 で 融解 する。37 ℃ で 融解 しない（ATP が壊れるため）。
• 融解度は速やかに氷上で保存する。

• T4 DNA Ligase は 4 種類の制限酵素バッファー（NEBuffer）および T4 PNK バッファー中で活性を示す。この際、終濃度 1 mM ATP を添加する。
• NEB のライゲーションバッファーには ATP が含まれているが、別途必要な場合は ATP（NEB#P0756）を使用する。dATP はライゲーションを阻害するため使用しない。
DNA• 脱リン酸化をした際は必ず失活または精製しておく。

• 反応溶液中のトータル DNA 濃度は 5 ～ 10 ng/µlがよい。
• ベクター：インサート＝ 3：1 のモル比を基準とし、 インサートサイズに 応 じて 1：1 から
1：10 までで 最適化 する。 インサートサイズ
が小さいほどモル比を大きくする。

• 複数 のインサートを 一度 にライゲーション
する場合、Traditional Cloning ででは効率が得られにくいため、DNA Assembly：NEBuilder（NEB#E2621）を使用するとよい。

• 1 ～ 5 µl のライゲーション溶液を使用する。

リガーゼ• 大 きなサイズの 場合（> 10 kb）、 エレクトロ
ポレーションが 効果的 であることが 多 い。
ElectroLigase を使用するか、他の場合は精製してから行う。

• もし DNA 濃度が不明な場合、いくつかの量を試す。

• 突出末端をライゲーションする場合、T4 DNA
Ligase か Instant Sticky end Ligase Master Mix、Quick
Ligation Kit のいずれかがよい。
• 平滑末端および 1 塩基突出末端の場合、Blunt/
TA Ligase Master Mix がよい。
• エレクトロポレーションで形質転換をする場
合、EectroLigase がよい。
• T4 DNA Ligase（NEB #M0202）は 65℃、20 分間
で熱失活できる。

• Quick Ligation Kit とマスターミックスは熱失活できない。した場合には形質転換効率が低下
する。

形質転換

• PEG はライゲーション 効率 を 向上 できるが、形質転換効率を下げるため、使用する場合は適切な濃度を探す。

• 末端形状によってライゲーションの効率が異なる• 平滑末端と 1 塩基突出末端はややライゲーションが困難

ライゲーションの概要

29

形質転換（Traditional Cloning & DNA Assembly）

形質転換

推奨製品

形質転換とは、クローニングにおいてはバクテリアホスト（主に大腸菌）へライ

ゲーションした環状プラスミドを入れて増幅する操作を指すが、生物学的にはある生物が外来 DNA を獲得することを指し、自然あるいは人為的に起こりうる。自然形質転換は環境中の細胞外 DNA の取り込みによってなされる。遺伝子の水平伝
播が代表例である。対して人為形質転換は、その名のとおり人為的に外来 DNA を細胞に取り込ませる方法である。一般的なクローニングでは大腸菌がホストとして使用され、大腸菌の膜透過性を低下させることがポイントであり、大腸菌コン

ピテントセルと呼ばれる。これには以下 2 つがある。

• 二価カチオン（Ca2+ など）で処理して作成されたケミカルコンピテントセル• 電気刺激で穴をあけて DNA を導入するためのエレクトロコンピテントセル

こうしたコンピテントセルを使用することで、プラスミド DNA を大腸菌内の細胞汎用：NEB 5-alpha Competent E. coli（NEB #C2987）

大きなサイズ：
NEB 10-beta Competent E. coli（NEB #C3019）

形質転換のヒント

コンピテントセルの融解• 氷上で融解する。

• 溶液が 0℃以上になると効率が低下するため、室温や掌での融解は推奨しない。
• 融解後は速やかに DNA を加える。

質まで入れることができる。その後、専用の Outgrowth 培地で前培養を行って細胞DNA

遺伝子はホストは持たず、プラスミド上に存在）、目的のプラスミド DNA を保有• 最大 10 µl を加えてもよいが、形質転換効率自体は半分程度になる。

膜を修復、プレートに植菌して薬剤マーカーで選択培養をすることで（薬剤耐性する大腸菌クローンを得ることができる。

インキュベーション＆ヒートショック

高い形質転換を示す NEB のコンピテントセル• DNA を 加 えた 後、軽 くタッピングなどでよく 混 ぜ、氷上で 30 分間インキュベーションする。
• インキュベーション 時間 を 10 分短 くする 毎 に 形質転換効率が半分になる。

2.0• ヒートショックは 通常 42 ℃ で 30 秒、 ただし 厳密 にはセルの容量とバイアルチューブの種類によって異
なる。

1.5
1.0

0

• BL21（NEB #C2530）は例外的に 42℃で 10 秒がよい。

NE

予備培養（Outgrowth）

3

le

bl

ab

St
社
T

T

T

NE

社

B

M

St

ac

Tu
r
B

h

bo

B
NE

B

社

10

DH

-b

10

et

1
-T
NE

DH

5α

alp
5-

• 37℃で 1 時間がよい。

T

社

B

a

0.5

ha

形質転換効率（x109）（cfu/µg pUC19）

2.5• 15 分間短くする毎に形質転換効率は半分になる。

各株について、NEB と同等品の形質転換効率を測定した。

植菌（プレーティング）

コンピテントセル選択チャート

特徴

汎用性

• プレートは暖かくても冷たくても、また湿っていても乾いていても、形質転換効率には影響しない。

NEB 5-alpha NEB Turbo NEB 5-alpha F´ NEB 10-beta dam –/dcm – NEB StableqCompetent Competent I CompetentCompetent Competent CompetentE. coliE. coliE. coliE. coliE. coliE. coli（NEB #C2987）（NEB #C2984）（NEB #C2992）（NEB #C3019）（NEB #C2925）（NEB #C3040）l

早い成長（< 8 時間）ll

毒性遺伝子のクローニングl

大きなサイズのクローニングl

注意すべき DNA コンタミネーション
夾雑物

界面活性剤

フェノール

PEG

l

レトロ／レンチウイルス
ベクターのクローニング–• ただしコロニー形成速度に影響するため、暖かく乾いたプレートを使うのがよい。

エタノール、
イソプロパノールlDam/Dcm フリーのプラスミド調製

recA• 通常は DNA 溶液（ライゲーション溶液）を 1 ～ 2 µl 加
える。

除去方法

エタノール沈殿

クロロホルム抽出とエタノール

沈殿

エタノール沈殿中の乾燥時間の延長

カラム精製（NEB #T1020）またはフェノール／クロロホルム抽出

l

l

l

l

l

l

l

仕様

ケミカルコンピテントセルlエレクトロコンピテント
セル
サブクローニング

96 穴ウェル

384 穴ウェル

12 x 8 チューブストリップ

30

l

l

l

l

l
l
l
l

l

動画：形質転換の原理とヒント
www.nebj.jp/re/traditional-cloning

形質転換（Traditional Cloning & DNA Assembly）

形質転換プロトコール（NEB 5-alpha Competent E.coli ）1） コンピテントセルを –80℃の冷凍庫から取り出し、氷上で融解する（約 10 分間）。
氷の粒が完全になくなることを確認する。
2） 小分けにする場合、ゆっくりとピペッティングして別チューブに移す。

3） 1 ～ 5 µl のライゲーション溶液を加える（通常 1 pg ～ 100 ng のプラスミド DNA を含む）。この時、形質転換確認用のコントロール DNA（一般的には pUC19、製品に付属）も使用してポジティブコントロールも行う。
4） 4 ～ 5 回タッピングして混ぜる。ボルテックスはしないこと。
5） 氷上で 30 分間静置。

6） 42℃、30 秒間ヒートショックをする。
7） 氷上で 5 分間静置。

8） 950 µl の SOC 培地を添加する。SOC 培地はあらかじめ室温にしておく。
9） 37℃、60 分間振とう培養をする（250 rpm）。

10）37℃に温めておいたプレートに、50 ～ 100 µl を植菌する。

11）37℃でオーバーナイト培養する。あるいは 30℃で 24 ～ 36 時間、25℃で 48 時間
でもよい。

5 分間クイック形質転換プロトコール（NEB 5-alpha Competent E.coli ）1） 時間短縮ができるが、形質転換効率は 10％に低下することに留意する。
2） 上記 1 ～ 4 と同じ。
3） 氷上で 2 分間静置。

4） 42℃、30 秒間ヒートショックをする。
5） 氷上で 2 分間静置。

6） 950 µl の SOC 培地を添加、よく混ぜた後、プレートに 50 ～ 100 µl を植菌する。

7） 37℃でオーバーナイト培養する。あるいは 30℃で 24 ～ 36 時間、25℃で 48 時間
でもよい。

31

確認（Traditional Cloning & DNA Assembly）

確認：コロニー PCR

形質転換後にプレート上にコロニーが確認されたら、それらのいくつかを確認し推奨製品て目的 DNA を有するポジティブクローンを選別・取得する。最も簡便かつ広く採用されている方法としては、コロニー PCR である。目的 DNA の増幅に使用したプ

OneTaq Quick-Load 2x Master Mix（NEB #M0486）

ライマーペアを 使用 すればインサート DNA の 有無 を 確認 できる。 あるいはベク

コロニー PCR のヒント

ター中の配列（インサートの外側）のプライマーペアを使用すれば、その増幅サ
イズからインサート DNA を有するか否かが判別できる。または一方をインサート

コロニーのピックアップ

特異的、もう一方をベクター配列のプライマーにすれば、サイズに加えてインサー• 直径 1 ～ 2 mm の早くに出現したコロニーを選ぶ。

トの方向性も確認できる。いずれにせよ簡単かつローコストでできる PCR 酵素を• サテライト（大きなコロニーの周りにある小さいコロニー）をピックアップしない。

使うのがよい。あるいはサイズに加えて配列を確認する場合、正確性が高い PCR
酵素を使用して、その産物をダイレクトシーケンスする。

PCR

コロニー PCR 酵素（OneTaq ）選択チャート
PCR 酵素• 爪楊枝を長時間漬けず、短時間にする。

• 爪楊枝を空のチューブに入れて取り出した後、PCR 溶
液を入れる方法もある。

特長• コロニー PCR でのサイズ確認に最適

OneTaq DNA Polymerase（NEB #M0480）

コロニーの保存• < 6 kb を増幅、30 ～ 80％ GC 領域の増幅が可能• プレートをそのまま 4℃で保存してもよい。

• 正確性は Taq の 2 倍• リーズナブルな価格（約 20 円～／ 50 µl 反応）• M0480 のホットスタート仕様

OneTaq DNA Polymerase（NEB #M0481）• 室温でセットアップ可能• M0480 のマスターミックス仕様

OneTaq Quick-Load 2x MasterMix with Standard Buffer（NEB #M0486）• プライマーと水を入れるだけで簡単にセットアップ• 電気泳動用色素も入っているため、PCR はすぐにゲルにアプライ可能コロニー PCR プロトコール

1）PCR 溶液を調製してチューブに分注する。

OneTaq （M0480/M0481）

OneTaq MM（M0486）

25 µl
REACTION

50 µl
REACTION

OneTaq Standard 5X Reaction Buffer

5 µl

10 µl

1X

10 mM dNTPs

0.5 µl1 µl200 µM

0.5 µl1 µl

0.2 µM

10 µM primers（forward and reverse）
ヌクレアーゼフリー水

OneTaq DNA Polymerase

to 25 µl

to 50 µl0.125 µl0.25 µl

終濃度

1.25 units/50 µl rxn

OneTaq Master Mix
10 µM primers（forward andreverse）

ヌクレアーゼフリー水

2）滅菌した爪楊枝やチップなどでコロニーをピックアップ、コロニーに附番しておく。

25 µl
REACTION

50 µl
REACTION

12.5 µl

25 µl

1X

0.5 µl1 µl

0.2 µM

12 µl

24 µl

終濃度

3）オプションとして別のプレートにストリーク（レプリカ作成）、そのまま PCR チューブに差し込む。溶液が少し濁ったら爪楊枝もしくはチップを取り出す。これを 3 ～ 5 ml の LB 培地にいれてミニプレップの準備をしておく。
4）以下のサイクル条件で PCR を開始する。
サイクル数

温度

時間

初期熱変性

1

94℃

30 秒間

アニーリング30

45 ～ 68℃ *15 ～ 60 秒間

最終伸長

1

68℃

変性

伸長

ホールド

1

94℃

68℃

4 ～ 10℃

15 ～ 30 秒間
1 kb あたり 1 分間
5 分間

* Tm 値およびアニーリング温度はオンラインツール：TmCalculator.neb.com で計算

32

確認（Traditional Cloning & DNA Assembly）

確認：電気泳動

コロニー PCR や一番初めの目的 DNA の PCR 増幅において、アガロースゲル電気泳動で PCR 産物の確認を行う。この時、目的サイズに応じたマーカーを選択する。また、UV 観察時の影による視認低下を防ぐため、目的サイズに重複しない分子量のダイを選択することもポイントであるが、NEB の DNA マーカー／ラダー（Purple）には影を生じないダイが使われているので、この点は気にする必要はない。アガロース電気泳動においては、泳動後染色と泳動中染色、泳動前染色があるが、後者 2 つは泳動と UV 観察を阻害しない染色剤を使うのがよい。また PCR 産物は、DNA マー
カー／ラダー製品に付属している NEB Purple Dye（6X）を使用する。コロニー PCR ではほぼ必要がないが、バンド強度からある程度の DNA 量を推測できる。各製品のウェブサイトに各バンドの質量が記載されている。

Quick-Load Purple DNA Ladders
kb
10.0
8.0
6.0
5.0
4.0
3.0

bp
1,350

kb
10.0
8.0
6.0

2.0

4.0

1,200

3.0

1.5
1,000
1.2

2.0

0.6

500/517

0.5

400

400

250

1.5

200
150

1 kb DNA Ladder*,***（NEB #N3232）
0.8% TAE agarose gel.
Quick-Load Purple Format（NEB #N0552）

50 bp DNA Ladder***（NEB #N3236）
3.0% TBE agarose gel.
Quick-Load Purple Format（NEB #N0556）*** サンプル用ローディングダイが付属

400
300
200

Can be used with E-Gels

150

bp
766

100

15

kb
10.0
5.0
3.0

kb
10.0
8.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0

500

1.2
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5

2.0
1.5

300

1.0
0.766

1.5
25

0.5

Low Molecular Weight
DNA Ladder***（NEB #N3233）3.0% TBE agarose gel.
Quick-Load Purple Format（NEB #N0557）

Quick-Load 1 kb Extend DNA Ladder（NEB #N3239）0.6% TBE agarose gel.
Mass values are for 0.5 µg/lane.

注目製品• SDS が 入 っているため、酵素 ー DNA を 乖離、正確 にDNA を泳動• EDTA が入っているため、多くの酵素反応を停止• 特殊なダイは UV で影を生じないのでクリアな観察が可能• Ficoll によりバンドがシャープ• アガロースゲルと非変性ポリアクリルアミドゲルに使用可能• SDS が含まれていないダイも別途販売（NEB #B7025）

0.500
150
0.300

light blue

0.4

0.150

0.3
0.2
0.1

0.050

red/pink
50

10

TriDye Ultra Low Range DNA
Ladder（NEB #N0558）
20% polyacrylamide gel.

1.0

一部の制限酵素は DNA 切断後も強く結合して複合体を形成、電気泳動が正しく行われないことがある。そのため、泳動前には制限酵素と DNA をしっかりと乖離しておく必要がある。本製品は制限反応に適したローディングダイ
である。もちろん一般的な DNA 電気泳動にも使用できる。

bp
700
650

35

1.5

（NEB #B7024）
Gel Loading Dye, Purple（6X）

Additional DNA Ladders from NEB

50

100

50

100 bp DNA Ladder*,***（NEB #N3231）
1.3% TAE agarose gel.
Quick-Load Purple Format（NEB #N0551）

プレミックス

75

2.0

0.5

0.1

* 他の仕様もあり

150

25

100

Quick-Load Purple Format（NEB #N0550）

3.0

50

0.2

1 kb Plus DNA Ladder*,***（NEB #N3200）
1.0% TBE agarose gel.

4.0

75

100

200

5.0

200

300

0.3

6.0

300

1.0

0.4

8.0

350

250

700

0.7

500

300

800
600

766
700
650
600
550
500
450
350

900

1.0
0.9
0.8

bp
766

916

5.0
bp
1,517

kb
40.0
20.0
15.0
10.0

1 kb Plus DNA Ladderfor Safe Stains（NEB #N0559）
1.0% TBE agarose gel.

PCR Marker***（NEB #N3234）
1.8% TBE agarose gel.

Fast DNA Ladder（NEB #N3238）
1.2% TBE agarose gel.

Gel Loading Dye,
Purple (6X)

Gel Loading Dye,Blue (6X)

ダイフロントの様子

33

DNA Assembly（Seamless Cloning）

DNA アッセンブリ

DNA アッセンブリとは色々な種類と数の DNA をつなぎ合わせることであり、近年では合成生物学の根幹をなす技術である。クローニングに
おいては、制限酵素と T4 DNA Ligase を鍵酵素として使用する Traditional Cloning とは異なり、制限酵素部位に依存することなく自由に組換えプラ
スミド DNA を構築でき、短時間かつ高効率でクローニングができるため、次世代型クローニングともいえる。さらに連結部分も自由に設定できるため、Seamless Cloning（シームレス・クローニング）とも呼ばれる。DNA Assembly（Seamless Cloning）にはいくつかの方法があるが、共通する特長は以下になる。
• 制限酵素部位に依存することなく、自由にインサート DNA をベクターに挿入できる（自由に組換えプラスミドが作成できる）• 複数断片でも同時にクローニングできる• インサート DNA を PCR で増幅した際、その産物を制限酵素で切断しておく必要がない• 1 本鎖 DNA でもクローニングできる（NEBuilder の場合）
• クローニング時間が短い

DNA Assembly（Seamless Cloning）の開発の歴史を見ると、Type IIS 制限酵素を用いる方法が初めに開発された。これを発展したものが NEB Golden
Gate Assembly である。また T5 エキソヌクレアーゼと高熱性ポリメラーゼ、Taq DNA Ligase を組み合わせた Gibson Assembly（これを発展させたものが NEBuilder）や、強い 3´ → 5´ エクソヌクレアーゼ活性を持つ DNA ポリメラーゼを用いた In-Fusion 法、大腸菌の祖抽出液を使用するだけのSliCE 法など、現在では様々な方法がある。本誌では NEBuider と Golden Gate Assembly 法に焦点を当てて紹介する。

NEBuilder HiFi DNA Assembly①

3 種類の酵素、すなわち 5´ → 3´exonuclease、DNA Polymerase、Taq
DNA Ligase を使用するアッセンブル法である。DNA 末端にもう一方 の DNA との 相同配列 を 付加 しておく（右図、茶色 と 水色部分）
。通常 は 15 bp、PCR プライマーに 付加 しておけばよい。
50℃の反応中、以下のように反応が進行する：②① 5´ → 3´exonuclease が DNA 末端から 5´ → 3´ 方向に分解する③ 突出末端中の相同配列がアニーリングする⑤ Taq DNA リガーゼがニックを埋めて DNA を連結する

5´

BsaI-HFv2

3´

5´

DNA ポリメラーゼがギャップを埋める

Golden Gate

5´ GGTCTCNNNNN 3´
3´ CCAGAGNNNNN 5´

GGTACC
CCA C T C
A G GGGA N
N GCTCT
GN N
N
N NN
N
N
Destination
vector

N
NN N

①

+

P1
5´

GGTCTCNNNNN

NNNNNGAGACC 3´

3´

CCAGAGNNNNN

NNNNNCTCTGG 5´②
BsaI-HFv2digested vector+③
Assembled
DNA product34

相同配列がアニーリング(or BsmBI-v2)② 設計した 1 本鎖突出が産生される部分を T4 DNA Ligase が連結する

5´

ニック修復リガーゼが DNA を完全に連結① Type IIS 制限酵素がベクターおよびインサート DNA を切断する③ ベクターとインサートの 1 本鎖突出がアニーリング、その3´N
N N NNN

Type IIS 制限酵素 と T4 DNA Ligase を 利用 するアッセンブル 法 である。Type IIS 制限酵素は認識配列の外側を距離に依存して切断するため、DNA 切断後に産出される 1 本鎖突出末端の配列を自由 に 設計 できる（右図 では BsaI-HF v2 を 示 す ）。 さらに 認識配列をベクターの切断部位の内側（不要な方）、それとインサート DNA の外側に配置することで、制限酵素切断後は制限部位が残 らず、 シームレスなプラスミドが作製 できる。 シンプルな
クローニングにおいては、37℃で以下の反応が進行する：

3´⑤

結果 として 1 反応 でギャップやニックがない、完全 な 2 本鎖

NEB Golden Gate Assembly Kit

3´④④ DNA ポリメラーゼがギャップを埋める

5´→ 3´ エキソヌクレアーゼが 5´ 末端を分解5´③② 40 ～ 80 bases の 3´ 突出末端が産生される

DNA が産生される。なお制限酵素で切断して直鎖状にしたベク
ター末端は速やかに 5´ → 3´exonuclease で分解されるため、再環状化はほとんど起こらない。また Taq DNA Ligase は T4 DNA Ligaseと異なり、2 分子の DNA をライゲーションしない。

5´
3´

NEBuilder3´
5´※ BsaI 認識配列はベクター、
インサートに残らない

P2

DNA Assembly（Seamless Cloning）

NEB の DNA アッセンブリキット

NEB からは大きく 4 種類のアッセンブリキットを提供している。以下選択チャートを参考にしてクローニングに用いるキットを選択する。基本的はクローニングには NEBuilder HiFi DNA Assembly をお薦めする。

DNA Assembly 選択チャート
NEBuilder HiFi
DNA Assembly

NEB Golden Gate USER Enzyme
Assembly Kit（NEB #M5505）（BsaI-HFv2,（NEB #E2621） （NEB #E5510）
Thermolabile
BsmBI-v2）（NEB #E5520） （NEB #E2611）
USER II Enzyme（NEB #E2623）（NEB #E1601）（NEB #E1602） （NEB #M5508）

特長

5´ および 3´ 末端のミスマッチ除去
連結部分の正確性

連結部分にリピート配列がある場合
完全連結（ニックがない）

1 本鎖 DNA と 2 本鎖 DNA の連結
微量 DNA のアッセンブリ

オーバーラップ配列の柔軟性
アプリケーション

2 断片のアッセンブル（インサート DNA とベクター）
3 ～ 6 断片のアッセンブル

7 ～ 11 断片のアッセンブル

12 ～ 35 断片のアッセンブル 1（ ）In vitro 翻訳のテンプレート調製
全ゲノムの人工構築

部位特異的変異導入（複数）クローンライブラリーの調製
代謝経路のエンジニア

TALENs短鎖ヘアピン RNA のクローニング（shRNA）

ゲノム RNA のクローンライブラリー調製

大きなサイズの DNA のクローニング（> 10 kb）

小さいサイズの DNA のクローニング（< 100 bp）
制限部位の消失

GibsonAssembly

***
***
*
***
***
***
***

*
**
*
***
**
**
***

***
***
***
*
***
***
***
***
***
**
***
***
***
***
***

***
***
**
*
***
*
**
***
**
**
**
**
***
*
*

N/A

N/A

***
***
***

***
***

NR

NR

**
*

**
**

***
***
***
***
***
*
**
***
***
***
*
*
***
***

***
***
***

NR

NR

NR

***
*
**
**
***
**
*
*
**
***
*

KEY

*** 最適、そのアプリケーションに推奨** そのアプリケーションで良好に使用可能* そのアプリケーションに使用できるが、推奨せず（1） ウェブサイト：www.neb.com/GoldenGate を参照

N/A 使用できない
NR 推奨しない

35

DNA Assembly（Seamless Cloning）

NEBuilder HiFi DNA Assembly

3 種類の酵素、すなわち 5´ → 3´exonuclease、DNA Polymerase、Taq DNA Ligase を使用
するアッセンブル法である。DNA 末端にもう一方の DNA との相同配列を付加しておく。通常は 15 bp、PCR プライマーに付加しておけばよい。50℃、15 分間で DNAのアッセンブルが完了する。

NEBuilder HiFi DNA アッセンブリーのワークフロー
DNA の準備
• PCR

直鎖状
ベクター

• 制限酵素切断• 合成 DNA（gBlok など）• 1 本鎖 DNA

+

C

B

A

15～40 bp のオーバーラップを有する
DNA インサート（PCR 産物）

NEBuilder
アッセンブルA• エキソヌクレアーゼが 5´→3´ に消化、
長い 3´ 突出を産生• 3' 突出の相同配列がアニーリング• ポリメラーゼが 5´→3´ に DNA を伸長
してギャップ修復• DNA リガーゼがニックをシール

NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit（NEB #E5520）

NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix（NEB #E2621）

NEBuilder HiFi DNA Assembly Bundle forLarge Fragments（NEB #E2623）

特長• 15 ～ 60 分間でアッセンブル• 平滑末端、5´/3´ 突出末端 DNA をアッセンブル• 末端が揃っていなくともシームレス（余分な配列を残さず）にクローニング• 6 本以上の複数 DNA 断片の一括アッセンブル

B

1 ステップ反応

製品

C
AssembledDNA• 1 本鎖 DNA と 2 本鎖 DNA をアッセンブル

技術情報
www.nebj.jp/re/Assembly

50℃、15～60 分間• オンラインチュートリアル（アッセンブル＆プライ
マーデザイン）• アプリケーションノート（sgRNA コンストラクトの
作成など）

形質転換

• オンラインツール：NEBuilder Assembly tool

DNA 解析

OR
制限反応

OR
コロニー PCR

シーケンス

NEBuilder Assembly はシンプルなクローニング（2 断片のアッセンブル）だけではなく、様々なクローニングに応用ができる。
2 断片のアッセンブル

1 本鎖オリゴと 2 本鎖 DNA のアッセンブル

2 断片のアッセンブル：最もシンプルなアッセンブルである。インサー
ト DNA の両末端に 15 bp のベクターとの相同配列を入れておく。120 bp 以

上のインサート長が必要である。

4 断片アッセンブル：複数断片（4 断片）をアッセンブルできる。それぞれ
4 断片アッセンブル
15-bp overlap

アニーリングしたオリゴのアッセンブル

25-bp overlap
Sticky end

Blunt endの相同配列を付加しておく。

6 断片アッセンブル：複数断片（6 断片）をアッセンブルできる。それぞれの相同配列を付加しておく。

12 断片アッセンブル：複数断片（12 断片）をアッセンブルできる。それぞれの相同配列を付加しておく。

High efficiency

6 断片アッセンブル

3'/5' ミスマッチを除去してアッセンブル *1 本鎖オリゴと 2 本鎖 DNA のアッセンブル：ベクターに 1 本鎖 DNA をアッセンブルできる。この際、相同配列は 30 bp 以上と長くする。

アニーリングしたオリゴのアッセンブル：複数の合成オリゴと 2 本鎖ベクターをアッセンブルできる。オリゴはそれぞれがオーバーラップするように設計する。
12 断片アッセンブル **部位特異的アッセンブル
Multiple sites

3´/ 5´ ミスマッチを除去してアッセンブル：ベクター末端に余分な倍列があった場合、これを除去してアッセンブルできる（< 10 bp）。インサー
ト DNA に付加する相同配列を設計するときに、余分な配列をスキップしておく。

部位特異的 アッセンブル： インサート DNA を PCR 増幅 する 際、 プライ

マーの 特異的配列部分 に 変異 を 入 れておけば、 それを 反映 した 組換 え
* ベクター末端に不要な配列がある場合、これを除去したアッセンブルが可能（< 10 bp）** ベクター＋ 11 インサート

36

DNA が作出できる。

DNA アッセンブル

NEBuilder HiFi DNA Assembly プロトコール

1. プライマーの設計と PCR
ベクターとの相同配列（15 ～ 30 bp）を付加したプライマーを設計する。この際、オンラインツール：NEBuilder Assembly Tool（NEBuilder.neb.com） を 使 う。 この時、設計されたプライマー配列に加えて、Tm 値および PCR アニーリング温度も表示される。17 ページのプロトコールに従って、Q5 DNA Polymerase で PCR を行う。PCR 産物中に非特異的増幅がみられない場合、クリーンアップの必要なく
アッセンブルができるが、効率向上のためにクリーンアップを推奨する。もし非特異的増幅があれば、アガロースゲル電気泳動のゲル抽出で目的 DNA を精製する（15 ページ）。
2. ベクターの切断（直鎖状化）
ベクターを制限酵素で切断する。NEBuilder では原理的にセルフアニーリングは起こらないため、ダブルダイジェストをする必要はない。切断産物はアガロー
スゲル電気泳動のゲル抽出で精製しておく。または、制限酵素で切断せず、インバース PCR でベクター骨格の必要部分を増幅してもよい。

3. アッセンブル
以下に注意して反応をセットアップ、50℃で 15 分間インキュベーションする。
インサートサイズが長 い 場合 や 複数断片 の 場合 には 60 分間 にする。 アッセン
ブル後は –20℃で保存ができる。製品付属のコントロール DNA を使用してポジ
ティブコントロール反応も行う。
反応に使用する DNA 比と量

2–3 Fragment
Assembly

4–6 Fragment
Assembly

DNA モル比

vector:insert =1:2

vector:insert =1:1

DNA 量（トータル）

0.03-0.2 pmol
X µl0.2-0.5 pmol
X µl

10 µl

NEBuilder HiFi DNA
Assembly Master Mix

ヌクレアーゼフリー水
全反応容量

NEBuilder Positive
Control

10 µl

10 µl

10 µl

10–X µl

10–X µl

0

20 µl

20 µl

20 µl

NEBuilder アッセンブリのヒント
アッセンブル反応• マニュアルに 記載 のインサート DNA： ベクターのモル比および反応系中の DNA の総モル数に従う。
• インサート DNA の両末端にベクターとの相同配列（15～ 30 bp）を付加しておく。

• PCR 産物 は 非特異的増幅 がみられなければクリーン
アップの必要がないが、持ち込み量は 20％以下とする。ただしクリーンアップをした方が効率は高い。
• キット付属のコントロール DNA を用いる。
プライマー設計• オンラインツール：NEBuilder Assembly Tool（NEBuilder.
neb.com）を使うとよい。設計したプライマー内にオーバーラップが含まれること、最終産物が目的に合致していることを確認する。

• オーバーラップの長さが適切であることを確認する。
アッセンブルする断片数が多いほど、オーバーラッ
プの長さを長くするとよい。

形質転換• できる限り形質転換効率が高いコンピテントセルを使用する。NEB 5-alpha High Efficiency Competent E. coli（NEB#C2987）または NEB 10-beta High Efficiency CompetentE. coli （NEB #C3019）を推奨。
• 他社もしくは自作のセルを使用する場合にはアッセンブル反応溶液を希釈したものを用いる。

• NEBuilder.neb.com でプライマーをデザイン• 反応中の DNA 量とモル比が重要• 日本語マニュアル完備

4. 形質転換
アッセンブル反応後、2 µl の溶液をそのままコンピテントセル（NEB #C2987 または NEB #C3019）に形質転換する。自作もしくは他社のコンピテントセルを使用する場合、5 µl のアッセンブル溶液に 15 µl の純水を加えて 4 倍希釈をしたもの
を 2 µl 使用する。
DNA

標準プロトコール *2 µl

コンピテントセル

50 µl

ヒートショック

42℃、30 秒間

インキュベーション
インキュベーション（Outgrowth）

氷上、30 分間
（1）氷上、5 分間（2）室温に戻しておいた SOC 培地を 950 µl 加える（3）37℃、60 分間* 使用するコンピテントセルの推奨プロトコールに従う

5. 確認
コロニー PCR などで確認をする。32 ～ 33 ページを参照する。複雑なアッセン
ブルの場合、シーケンスも確認しておくとよい。
NEBuilder Assembly の原理

37

DNA アッセンブル

Golden Gate AssemblyGolden Gate Assembly は Type IIS 制限酵素と T4 DNA Ligase を利用したアッセンブル方法
である（1、2）。ベクターにインサート DNA を入れるシンプルなクローニングはもちろん、複数の DNA のクローニングができる。特にインサート DNA を保有する
プラスミドストックから好きなものを選択して色々な組み合わせのクローンを作成することに向いている。反応は一定温度（制限酵素による）か、一定温度と 16℃の繰り返しサイクルで行う（3、4）。

リガーゼの正確性

PCR 酵素の正確性はよく知られているが、リガーゼの正確性についてはあまり知られていない。NEB はリガーゼ毎に正確性の違いがあること、それに連結部分の突出末端配列も正確性に影響を及ぼすことを発見した（5）。このデータに基づいて連結部分の配列を設計することにより、正確なアッセンブルが可能となり、また同時にアッセンブルできる断片数も 50 以上となった。

Golden Gate に使用できる Type IIS 制限酵素

NEB は様々な Type IIS 制限酵素（認識配列の外側を切断）を提供しているが、多くはGolden Gate Assembly に使用できる。特にお薦めなものを右に記載する。

Golden Gate Assembly のワークフロー
BsaI-HFv25´
3´

N
N N NN
N

N
NN N

5´

GGTCTCNNNNN

NNNNNGAGACC 3´

3´

CCAGAGNNNNN

NNNNNCTCTGG 5´Insertfragment A

P2

+

P3
5´

GGTCTCNNNNN

NNNNNGAGACC 3´

3´

CCAGAGNNNNN

NNNNNCTCTGG 5´Insertfragment B

P4
PCR amplification of fragments

Single-tube
reaction• BsaI-HFv2
or BsmBI-v2• DNA ligase

BsaI-HFv2digested vector

+

A

+

B

PCR-amplified fragments,
BsaI-HFv2-digested(or BsmBI-v2-digested)

Assembled
DNA productCan be used in complex(35+) fragment assemblies

最も単純な Golden Gate アッセンブリーの場合、dsDNA 断片の両端に Type IIS 制限酵素の認識部位（この例では BsaI（GGTCTC））を付加しておく必要がある。制限酵素での切断後、これらの部位は残り、各断片にはアッセンブリーを方向付ける 4 塩基の突出末端が生じる。

References:
1. Engler, C. et al. (2008) PLoS ONE, 3: e3647.
2. Engler, C. et al. (2009) PLoS ONE, 4: e5553.
3. Lee, J.H. et al. (1996) Genetic Analysis: Biomolecular Engineering, 13; 139-145.
4. Padgett, K.A. and Sorge, J.A. (1996) Gene, 168, 31-35.
5. Potapov, V. et. al. (2018) ACS Synth. Biol. DOI: 10.1021/acssynbio.8b00333.

Golden Gate Assembly の原理

38（NNEB #E1602）
NEB Golden Gate Assembly Kit（BsmBI-v2）• 余分な配列を付加しないシームレスなクローニング• ベクター（Destination Plasmid）付属• 複数断片を一度にアッセンブル（2 - 35+）

• GC リッチ配列やリピート配列のアッセンブル• 様々なサイズの DNA をアッセンブル（> 15 kb、< 100 bp）• オンラインツール（Goldengate.neb.com） で 簡単 に
プライマーをデザイン• Ligation Fidelity Tools でアッセンブルデザインをアシスト
NEBridge Ligase Master Mix（NEB #M1100）• 任意の Type IIS 制限酵素と組み合わせた Golden Gate

Golden Gate Assembly 用制限酵素- BbsI（NEB #R0539）- BbsI-HF（NEB #R3539）- BsaI-HFv2（NEB #R3733）- BsmBI-v2（NEB #R0739）- BspQI（NEB #R0712）- BtgZI（NEB #R0703）- Esp3I（NEB #R0734）- PaqCI（NEB #R0745）- SapI（NEB #R0569）

www.neb.com/GoldenGate

P1

GGT
ACC
CCA C T C
A G GGGA N
N G TCTGN N
N N NNC
NN
Destination
vector（NEB #E1601）
NEB Golden Gate Assembly Kit（BsaI-HF v2）

技術情報＆ツール(or BsmBI-v2)

GGTCTCNNNNN 3´
CCAGAGNNNNN 5´

推奨製品と特長• Golden Gate Assembly 法とリガーゼの正確性に関する
文献とプロトコール• 各断片数のアッセンブルデータ• オンラインツール：NEB Golden Gate Assembly Toolを公開
• オンラインツール：Ligase Fidelity Tools を公開、突出末端の正確性をシミュレーション可能• 概要やリガーゼ正確性、Type IIS 制限酵素などの動画• MoClo のガイドライン

DNA アッセンブル

Golden Gate Assembly プロトコール

ここではインサート DNA を PCR で調製する方法を記す。詳細はウェブサイトもしくは製品プロトコールを参照する。

1. Type IIS 制限酵素の選択
目的 DNA（インサート DNA）およびベクター骨格中に制限部位がない Type IIS 制限酵素を選択する。オンラインツール：NEBcutter が便利である。仮に制限部位があったとしても、1 部位であれば、かつシンプルなクローニング（シングルインサート DNA とベクターのアッセンブル）であれば、問題になることはほとんどないので、そのまま選択・使用してもよい。ただし複数断片のアッセンブルの場合は控えること。もし内部に制限部位があった場合、チュートリアル動画を参考にして解決方法を選ぶ。
2. プライマーの設計と PCR
Type IIS 制限酵素の認識配列が目的 DNA の内側を向くように設計する。アッセンブル面は正確性を考慮するとよい。オンラインツール：NEB
Golden Gate Assembly Tool（goldengate.neb.com）を使えば、これらの点が考慮されたプライマーが設計できる。設計されたプライマー配列に加えて、Tm 値および PCR アニーリング温度も表示される。17 ページのプロトコールに従って、Q5 DNA Polymerase で PCR を行う。PCR 産物
中に非特異的増幅もしくはプライマーダイマーがみられない場合、クリーンアップの必要なくアッセンブルができるが、効率向上のためにクリーンアップを推奨する。もし非特異的増幅があれば、アガロースゲル電気泳動のゲル抽出で目的 DNA を精製する（15 ページ）。特にプライマーダイマーは持ち込まないようにする。

3. ベクターの選択
ベクターには 2 か所の Type IIS 制限酵素部位が必要である。キット：NEB #1601 などにはすぐに使用できる pGGAselect Destination Plasmid が付属しているため、これを使用するとよい。BsaI、BsmBI、BbsI を使用したアッセンブルに対応している。ミニプレップしたベクター／プラスミドを使用する場合、RNA 除去をしておく。
4. アッセンブルのセットアップ
以下に注意して反応をセットアップする。

アッセンブル反応

pGGAselect Destination Plasmid*、
75 ng/µl
インサート DNA：

– プラスミド（precloned）**– PCR 産物 ***T4 DNA Ligase Buffer（10X）

For 1 Insert

For 2-4 Inserts
For 5-10 Inserts
For 11 - 20+ inserts

1 µl–

2:1 molar ratio

NEB Golden Gate Assembly Mix

インサートの数

1 µl
75 ng each plasmid(insert : vector; pGGAselect = 2155 bp;
75 ng = 0.05 pmol)

ヌクレアーゼフリー水

5. アッセンブル反応

ネガティブコントロール

2 µl

2 µl

1 - 2 µl

1 - 2 µl****to 20 µl

to 20 µl

各注釈の詳細はマニュアルを参照

アッセンブル反応

37° C, 5 min (cloning) or 37° , 1 hr (library preparation) → 60° C, 5 min

37° C, 1 hr → 60° C, 5 min(37° C, 1 min → 16° C, 1 min) x 30 → 60° C, 5 min(37° C, 5 min → 16° C, 5 min) x 30 → 60° C, 5 min

6. 形質転換
アッセンブル反応後、2 µl の溶液をそのままコンピテントセル（NEB #C3019 を推奨）に形質転換する。10 倍希釈した内の 50 µl をクロラム
フェニコール選択プレートに植菌する。
DNA

コンピテントセル

インキュベーション
ヒートショック

インキュベーション（Outgrowth）

標準プロトコール

2 µl

50 µl

氷上、30 分間• goldengate.neb.com でプライマーと反応をデザイン

42℃、30 秒間（1）氷上、5 分間（2）室温に戻しておいた SOC 培地を 950 µl 加える（3）37℃、60 分間

7. 確認
コロニー PCR などで確認をする。32 ～ 33 ページを参照する。複雑なアッセンブルの場合、シーケンスも確認しておくとよい。

39

トラブルシューティング

トラブルシューティングガイド（Traditional Cloning）

クローニング時にトラブルがあった場合を想定して、以下のコントロール反応を行うことを推奨する。このコントロール反応により、どのステップに問題があったかを特定でき、それに基づいた改善ができる。

1 100 pg ～ 1 ng の未切断ベクターを形質転換し、コンピテントセルの状態やベクター状の薬剤耐性能を確認する。

2 切断した直鎖状ベクターを形質転換し、その中の未切断ベクターに由来するバックグラウンドの割合を確認する。この反応では未切断ベクターの形質転換時のコロニー数に比べて（コントロール 1）、1％以下となることが好ましい。

3 ベクターだけをライゲーションしたもの（インサートなし）を形質転換する。切断面の異なる 2 種類の制限酵素で切断している場合、あるいは脱リン酸化を行っている場合には原理的にセルフライゲーションされないはずである。この場合、コントロール 2 と同様、1％以下のコロニー出現頻度となる。
4 ベクターを 1 種類の制限酵素で切断、ライゲーションしたものを形質転換する。未切断ベクターを形質転換したコントロール 1 と同様のコロニー数が得られることを確認する。

クローニングにおいては、DNA を正しく定量することも重要であるため、できる限り各工程で DNA 定量を行うことを推奨する（43 ページ参照）。
問題

原因

大腸菌が死滅抗生物質の種類または濃度が不適切インサート DNA による

細胞毒性

ヒートショック時の温度が高いエレクトロポレーション時に PEG が混入

エレクトロポレーション時のアーキングもしくは電圧不足

プラスミドサイズが大きい
プラスミドが大腸菌内で組換えられた形質転換体がほとんど得られな
い、
または
全く得られない

哺乳類もしくは植物ゲノム
由来の DNA を直接クローニ

ングした形質転換でライゲーション
産物を多く使いすぎた

ライゲーションが不十分

リン酸化が不十分

平滑化が不十分40

改善方法• pUC19 などの未切断ベクターを形質転換し、効率を確認する。もし形質転換効率が 104 以下の場合、コンピ
テントセルを再調製もしくは購入しなおす• 実験に合った抗生物質の種類と濃度を確認する• 抗生物質を調製しなおす• やや低温で培養する（25 ～ 30℃）
• 発現制御できる（ベーサル発現を抑制できる）コンピテントセルを使用する（NEB 5-alpha F´ I q CompetentE. coli , NEB #C2992 など）• 使用するコンピテントセルのマニュアルを 確認する。ヒートショック時の温度が推奨よりも高い場合、細胞の死滅を引き起こす• 形質転換前に DNA を精製する• 精製不要な ElectroLigase（NEB #M0369）を使用する• ライゲーション前に DNA を精製する• キュベットに泡が入らないようにする• 使用機器のマニュアルに従う• 10 kb 以上のプラスミドを形質転換する場合、NEB 10-beta Competent E. coli （NEB #C3019）を使用する• エレクトロポレーションで形質転換を行う• NEB 5-alpha（NEB #C2987）や NEB 10-beta（NEB #C3019）などの RecA – 株を使用する• 哺乳類もしくは植物ゲノム DNA はメチル化シトシンが含まれており、多くの大腸菌内で切断される• NEB 10-beta（NEB #C3019）のようなメチル化欠損株（McrA、McrBC、Mrr 欠損）を使用する• 形質転換には 5 µl 以下のライゲーション産物を使用する• ライゲーションに使用した DNA の 5´ 末端がリン酸化されていることを確認する• ベクター：インサートのモル比を 1：1 から 1：10 の間で最適化する• DNA を精製してライゲーション反応を行う（NaCl や EDTA などの夾雑物が効率を低下させる）• バッファー中の ATP が凍結融解による分解されることがあるため、新しいバッファーを用いる• ライゲーション前に脱リン酸化を行っている場合、熱による不活性化か精製を行う• 1 塩基突出末端のライゲーションには、Blunt/TA Ligase Master Mix（NEB #M0367）か、Quick Ligation Kit（NEB#M2200）、高濃度 Ligase（NEB #M0202T）を使用する• Lambda-HindIII digested DNA（NEB #N3012）を使用してリガーゼ活性を確認する• リン酸化の前に DNA を精製する• DNA が平滑末端あるいは 5´ 陥没末端の場合、DNA とバッファーを混ぜたものを 70℃で 10 分間インキュベー
トする。その後速やかに氷上に移し、ATP と酵素を加えてリン酸化反応を行う• ATP が含まれていない T4 Polynucleotide Kinase（NEB #M0201）を使用する場合など、ATP を添加する• 1X T4 PNK バッファーの代わりに T4 DNA Ligase バッファーを使用する。本バッファーには ATP が予め含まれている• 平滑化の前に制限酵素を不活性化あるいは除去する• 平滑化の前に PCR 産物を精製する• ゲノム DNA を超音波で断片化した場合、多くは突出末端となるため、最低 30 分間の平滑化を行う• 使用する酵素は最大 1 unit/µg DNA とする• 15 分間以上インキュベートしない• T4 DNA Polymerase（NEB #M0203）の場合は 12℃以下、Klenow（NEB #M0210）の場合は 24℃以下でインキュベー
トする• 十分な dNTP が含まれていることを確認する。Klenow（NEB #M0210）の場合は 33 µM、T4 DNA Polymerase（NEB#M0203）の場合は 100 µM を推奨する• Mung Bean Nuclease（NEB #M0250）を使用する場合、室温で 30 分間以下の反応を行う。1 unit/µg DNA 以上の酵素を使用しないトラブルシューティング

問題
形質転換体がほとんど得られな
い、

または
全く得られない原因

3′ A 付加が不十分
制限酵素による切断が不十分

抗生物質の濃度が低い
形質転換体に空ベクターしか含まれていない
サテライトコロニーを（インサートがピックアップした
挿入されていない）

形質転換体に目的以外のプラスミドが含まれている

制限酵素消化産物が電気泳動上でスメアになる• 大きく、早くに出現したコロニーを選択する• クローニングに使用した制限部位が内部に存在するかを確認する

目的 DNA がホストに毒性を示した

キナーゼが残存

未切断ベクターが多い（制限酵素の切断が不十分）

ライゲーションが不十分

リガーゼが DNA に結合制限酵素が DNA に結合

ヌクレアーゼの混入
メチル化による切断のブロック

塩による阻害

制限酵素切断が不十分• 抗生物質の濃度を高くする（推奨濃度を用いる）• 抗生物質を新たに調製する

制限部位が内部に存在非特異的な PCR 産物が夾雑抗生物質の濃度が低い

ライゲーション
産物が電気泳動上でスメアになる• 制限酵素のメチル化感受性およびベクター配列を確認する• 酵素付属の最適バッファーを用いる• 制限反応前に DNA を十分に精製する• 少なくとも 6 個のヌクレオチドを制限酵素部位の上流に付加したプライマーを再設計する• NEB 5-alpha（NEB #C2987）や NEB10-beta（NEB #C3019）などの RecA – 株を使用する

脱リン酸化が不十分

ライゲーション
産物を電気泳動してもバンドが観察されない• A 付加を行う前に PCR 産物を精製する。高正確性 DNA ポリメラーゼは 3´ → 5´ エキソヌクレアーゼ活性を有するため、十分精製を行う

大腸菌内でプラスミドが組換えられた変異導入

バックグラウンドが多い

改善方法

PCR 溶液成分による阻害
不適切なバッファー

酵素量が少ない
反応時間が短い

スーパーコイル DNA を切断
サイトプレファランス

2 箇所の認識部位が必要

サンプル DNA 中に阻害剤が混入• PCR 条件を最適化する• PCR 産物をゲル精製する（モナーク・ゲル抽出キット、NEB #T1020）• やや低温で培養する（25 ～ 30℃）
• 発現制御できるコンピテントセルを使用する（NEB 5-alpha F´ I q Competent E. coli , NEB #C2992）• 高正確性 DNA ポリメラーゼを使用する Q5 DNA Polymerase（NEB #M0491）の使用を推奨する• シーケンスで配列を再確認する• 脱リン酸化前に制限酵素を失活または除去する• キナーゼの失活が不十分な場合、脱リン酸化ベクターが再リン酸化される• 制限酵素のメチル化感受性およびベクター配列を確認する• 酵素付属の最適バッファーを用いる• 制限反応前に DNA を十分に精製する• 抗生物質の濃度を高くする（推奨濃度を用いる）• ライゲーションに使用した DNA の 5´ 末端がリン酸化されていることを確認する• ベクター：インサートのモル比を 1：1 から 1：10 の間で最適化する• DNA を精製してライゲーション反応を行う（NEB #T1030）• 新しいバッファーを用いる（ATP の劣化に注意する）• ライゲーション前に脱リン酸化を行っている場合、熱による不活性化か精製を行う• 1 塩基突出末端のライゲーションには、Blunt/TA Ligase Master Mix（NEB #M0367）か、Quick Ligation Kit（NEB#M2200）、高濃度 Ligase（NEB #M0202T）を使用する• 電気泳動前に Proteinase K（NEB #P8107）で処理する• 酵素量を減らす• 制限産物に終濃度 0.1 ～ 0.5％の SDS を加えてから電気泳動に供する• 新しい泳動バッファーを使用する• 新しいゲルを使用する• DNA を精製する（NEB #T1030）• 大腸菌で調製したプラスミドが Dam/Dcm メチル化されている• 哺乳類ゲノム由来の DNA が CpG メチル化されている• 使用する制限酵素のメチル化感受性とベクター配列を確認する• 制限酵素が Dam/Dcm メチル化でブロックされる場合、dam–/dcm– 株（NEB #C2925）を使用してプラスミドを調製する• NEBuffer r3.1 で低い活性を示す制限酵素は特に塩で阻害されやすいため、DNA を十分に精製する• スピンカラムで DNA 精製を行った場合、塩が残留しやすいため、全反応溶液量の 25％未満の DNA を使用する• 制限反応前に PCR 産物を精製する（NEB #T1030）• 製品付属の最適バッファーを使用する• 酵素量を増やす（1 µg DNA あたり 5 ～ 10 units）• 反応時間を長くする• 酵素量を増やす（1 µg DNA あたり 10 ～ 20 units）• 酵素によっては特定の配列に対する切断効率が低いため、反応時間を長くする。

• 一部の制限酵素は DNA 中に 2 箇所の制限部位を必要とする。酵素情報を再確認する• コントロール DNA とサンプル DNA を混ぜて切断する。もし阻害剤が混入していればコントロール DNA が切断されない。ミニプレップ DNA には阻害剤が混入しやすい• スピンカラムなどで DNA を精製する• 全反応容量を増やして阻害剤を低濃度にする

41トラブルシューティング

トラブルシューティングガイド（Traditional Cloning）（続き）
問題

原因

高分子バンドが観察される
場合、酵素と DNA が結合

スター活性
ゲル上で
非特異的バンドが観察される

制限反応が不十分

プライマーが不適切

アニーリング温度が不適切

PCR 産物が検出されない伸長反応が不適切ポリメラーゼの量が少ない

プライマー濃度が不適切

Mg2+ 濃度が不適切

PCR 産物がゲル上でスメアになるPCR 産物中に非特異的バンドがある

テンプレートが複雑

高分子側にスメアなバンドが観察された場合、酵素とDNA が結合アニーリング温度が低い

Mg 濃度が不適切
2+

プライミングサイトが他に存在

プライマーダイマー

ポリメラーゼが不適切

改善方法• 酵素量を減らす• 制限産物に終濃度 0.1 ～ 0.5％の SDS を加えてから電気泳動に供する• Gel Loading Dye, Purple（NEB #B7024）を使用して泳動する• 酵素付属の最適バッファーを使用する• 酵素量を減らす• 反応に使用する制限酵素は全容量の 10％以下とし、スター活性を防ぐためにグリセロール濃度が 5％以下となるようにする• 反応時間を短くする• HF 制限酵素を使用する• NEBuffer r3.1 で低い活性を示す制限酵素は特に塩で阻害されやすいため、DNA を十分に精製する• スピンカラムで DNA 精製を行った場合、塩が残留しやすいそのため、全反応溶液量の 25％未満の DNA を使用する• 制限反応前に PCR 産物を精製する• 製品付属の最適バッファーを使用する• 1 µg DNA あたり 3 ～ 5 units の酵素を使用する• 1 ～ 2 時間反応する• プライマー配列を再確認する• Tm Calculator（TmCalculator.neb.com）を使用して正しいアニーリング温度を設定する• ポリメラーゼによって伸長温度と速度が異なるため、説明書に従う• 反応系に適切な酵素量を用いる• ポリメラーゼによって最適プライマー濃度が異なるため、マニュアルを確認する• Mg2+ 濃度を最適化する• 異なるポリメラーゼやバッファーを用いる。Q5 DNA Polymerase（NEB #M0491）をお薦めする• 制限産物に終濃度 0.1 ～ 0.5％の SDS を加えてから電気泳動に供する• Gel Loading Dye, Purple（NEB #B7024）を使用して泳動する• Tm Calculator（TmCalculator.neb.com）を使用して正しいアニーリング温度を設定する• Mg2+ 濃度を最適化する• プライマーおよびテンプレート配列を確認する• プライマー配列を再設計する• 異なるポリメラーゼやバッファーを用いる

DNA Assembly（NEBuilder & Golden Gate）のトラブルシューティングガイドは
ウェブサイトを参照：www.nebj.jp/re/Assembly42微量分光光度計による核酸濃度・純度分析
はじめに

微量分光光度計（MSV）は核酸サンプルの分
析 に 一般的 に 使用 されている。 この 種 の 分
光光度計は、必要なサンプル量が少なく（0.5～ 2.0 µl）
、経済的で使用しやすく、広く市販されている。通常、1 ng/µl の低濃度の核酸を測定 でき、 あらゆる 種類 の 核酸 とタンパク質を測定することができる。微量分光光度計
で 測定 される 濃度 および 純度 の 値 は 多 くの場合に信頼性が高いが、より深く理解することにより、 サンプルの 品質 および 下流実験への 適合性 について 有意義 な 知見 を 得 ることができる。

本項では、微量分光光度計の測定値をどのように解釈し、使用するかについて詳細な説明とガイダンスを示す。シリカスピンカラムを 用 いて 精製 した 核酸 サンプルに 焦点 を 当てた 上 で、以下 のトピックスについて 説明をする。

1. 濃度および純度の測定に最適な核酸濃度範囲
2. タンパク質の夾雑A260/A280 比

A260/A280 比は存在する核酸の種類（dsDNA または RNA）に関する情報となるほか、純度の目安 となる。一般 に、 タンパク 質混入 はこの比の低下で検出できる。RNA 混入はこの比の増大で検出できる。緩衝した溶液中では、純粋な dsDNA の A260/A280 比は 1.85 ～ 1.88 であり、純粋な RNA の A260/A280 比は約 2.1 である。

A260/A230 比

A260/A230 比 は、230 nm で 吸収 される 混入物質の 感度 の 高 い 指標 である。 このような 混入
物質 は 280 nm で 吸収 される 混入物質 よりもはるかに多く、グアニジンチオシアン酸塩（GTC）やグアニジン塩酸塩（GuHCl）などのカオトロピック 塩、EDTA、Triton ™ X-100 や
Tween 20 などの非イオン性界面活性剤、タン
パク質、およびフェノールが含まれる。ポリサッカライドなどの物質やシリカ繊維などの浮遊性固形粒子がこの波長で吸収されるが、影響は比較的弱い。

6. 水または緩衝液中における核酸の測定緩衝 した 溶液中 では、純粋 な dsDNA の A260/
A230 比 は RNA よりもわずかに 高 く、一般 に報告されている値は dsDNA で 2.3 ～ 2.4、RNAで 2.1 ～ 2.3 である。A260/A230 比 の 標準偏差 はA260/A280 比 よりも 一般 に 大 きいため、慎重 に解釈する必要がある。

背景

1

3. バッファーの夾雑
4. その他の夾雑

5. DNA サンプルの RNA の夾雑

特記 しない 限 り、微量分光光度計 は Nanodropを使用した。本機のOne（Thermo Fisher Scientific）
仕様は、検出下限が 2 ng/µl、再現性は 2 ～ 100
ng/µl の濃度範囲において 2 ng/µl、または > 100
ng/µl の濃度で 2% である。

濃度・純度測定の標準実施法は、分光光度計
による紫外線吸光度測定である。核酸濃度は
紫外線吸光度 を 測定 して 求 める。 ランベル
ト・ ベールの 法則 に 従 うと、260 nm において吸収される光の量が溶液中の核酸の濃度に比例する。dsDNA、RNA、ssDNA の吸光係数が
経路長 10 mm を使用して算出されており、標準曲線がない場合、吸光係数から変換係数を求 めることができる。 このような 変換係数は次の通りである。

• dsDNA については 50 µg/ml• RNA については 40 µg/ml• ssDNA については 33 µg/ml

たとえば、A260 = 1 の dsDNA サンプルの濃度は50 µg/ml である。

また、 サンプル 純度 の 指標 として、260 nmにおける吸光度と 280 nm における吸光度の比（A260/A280） および 260 nm における 吸光度と 230 nm における 吸光度 の 比（A260/A230） を求めることができる。

通常 の 試験室業務 では、A260/A280 比 および A260/
A230 比が 1.8 を超える DNA サンプルおよび RNA
サンプルは「クリーン」とみなされ、大半のダウンストリームアプリケーションへの使用に適している。

濃度および純度比の測定に最適な核酸濃度範囲MVS 装置のサプライヤーは検出限界を 0.5 ～2 ng/µl に 規定 しているが、20 ng/µl 未満 では
純度比 の 信頼性 が 損 なわれると 警告 している。低濃度 の 場合 には、蛍光 ベースの 方法（「Qubit」 など ） がより 適 した 代替法 になるかという 点 が 議論 されることが 多 い。 このような 問題 に 取 り 組 むために、TE 緩衝液 で調製 した 150 ng/µl から 1 ng/µl までの 希釈系
列について分析を行った（表 1 A ～ C）
。測定を 3 回繰り返して実施し、濃度および純度比のデータを 収集 した。比較 のために、同 じDNA 希釈系列 を Qubit で 3 回測定 し、 その 平
均値をデータに含めた。

DNA 定量

濃度測定値

表 1 A に示した濃度データは、5 ng/µl 以下の濃度（黄） ではデータに 大 きな 広 がりがあることを 示 しており、 これは 相対標準偏差に 現 れている。 しかし、繰 り 返 し 測定 を 行うことで、比較的正確 な 結果 を 得 ることができる。5 ng/µl 以下では、Qubit の測定値は偏差 は 大 きくないものの、精度 は 全体 としてわずかに劣る。MVS に比べ蛍光測定法は時間とコストがかかることから、純度 が 十分 に高い（核酸種を十分分離できる高品質シリカ
キットで 精製 したものなど ）1 ng/µl 以上 のサンプルの濃度を評価する場合には MVS が推奨ツールとなる。

純度比の測定3 回の測定値のばらつきからわかるように、
20 ng/µl 未満の濃度（青）では A260/A280 比は不安定である（表 1B）。特記すべきは、20 ～ 50
範囲（黄）でもばらつきが 比較的大
ng/µl の、平均値きいことでありが 高 くなりすぎる傾向がある。これよりも高い濃度（緑）の測定を行う場合にのみ、一貫した信頼性ある値を得られる。

A260/A230 比 についても同様 の 傾向 が 見 られる（表 1C）。20 ng/µl 未満の濃度（青）ではこの
比 は 不安定 であり、20 ～ 50 ng/µl（黄） における 値 は 慎重 に 使用 する 必要 がある。 この
濃度範囲では A260/A230 比が高くなりすぎ、ばらつきが 大 きい。50 ng/µl を 超 えると 値 の信頼性 が 高 くなる（緑）。全体 として、A260/
A230 比の標準偏差は A260/A280 比よりも大きい。
RNA についても同様の傾向が認められる（表
5B）。
要約：

純度 が 極 めて 高 い 核酸溶液 を 扱 う 場合 には、以下のことが言える。

• MVS は 1 ng/µl を下限とする濃度範囲において有効に使用できる。

• 5 ng/µl 以下の濃度範囲で正確に定量するには、測定を数回繰り返すことが必要である。
• 全体 として、蛍光法 による 測定値 は 精度 お
よび再現性の面で優れているとは言えないが、低濃度のサンプルについては再現性が比較的高い結果が得られる。
• A260/A230 比 は A260/A280 比 よりもばらつきが 大
きい。

• 20 ng/µl 未満の濃度ではこの 2 つの純度比はともに不安定であり、50 ng/µl まではばらつ
きが比較的大きい（高くなりすぎる傾向がある）。数回繰り返し測定することが推奨される。

43

DNA 定量2

タンパク質混入

核酸 サンプルにタンパク 質 が 多 く 混入 している 場合、 タンパク 質／ DNA 混合物 と 同等の 紫外線吸収 スペクトルを 示 す。一般 に、
A260/A230 比 に 対 する 影響 が 強 く、A260/A280 比 に対する影響は小さい。タンパク質の紫外線吸
収 は 核酸 に 比 べて 低 いことから、A260/A280 比がタンパク 質混入 の 兆候 を 示 しているのであれば、比較的多量 のタンパク 質 が 存在 す
ることになる。また、核酸濃度が低い場合、タンパク 質混入 は 純度比 に 大 きく 影響 するが、核酸濃度が高い場合にはタンパク質混入は検出されにくいことがある。

表 1：MVS による DNA の濃度と純度の評価（A）
TE 緩衝液で調製した NIH3T3 gDNA 原液を TE 緩衝液で希釈して表に示す DNA 希釈液を得た。濃度値（OD260）
および純度比 A260/A280（B）、A260/A230（C）は、Nanodrop One で 3 回測定した。MVS 濃度値を、同じ希釈液について
Qubit BR DNA キットを用いて蛍光法で 3 回測定した値と比較した。

サンプル濃度（ng/µl）

図 1 に、純粋 DNA（赤） または 純粋 タンパ

ク 質（青） を 含 むサンプル、 または 規定 の濃度の混合物（紫）から得た紫外線 - 可視光
線 スペクトルを 示 す。 タンパク 質 の 典型的な 紫外線吸収 スペクトルは 220 ～ 230 nm の範囲 で 強 いピークを 示 し、280 nm 付近 に 高さおよそ 1/10 のショルダーが見られる（図1）。純度比に対するタンパク質混入の影響は
200 ng/µl の DNA サンプルに比べ 25 ng/µl のサンプルで 大幅 に 大 きい。 したがって、純度
比は混入の相対的指標とみなすべきであり、常に測定する核酸濃度範囲に照らして考える必要がある。

B

表 2 に、TE 緩衝液 で 調製 した 様々 な 濃度 の

BSA タンパク質を添加したとき、4 レベルのDNA 希釈液の純度比に対してどのような影響が 生 じるかを 示 す。DNA 濃度 100 ng/µl および 50 ng/µl ではタンパク 質混入 は A260/A280 比にほとんど影響しないが（緑）、DNA 濃度 25ng/µl では 同 じタンパク 質濃度 で 純度比 に 対する強い影響が見られ、大幅な混入が示唆される（黄）。 また、DNA 濃度 が 低 い 場合 にはタンパク 質 の 存在 が DNA 濃度測定値 に 影響するが（青）、DNA 濃度 が 高 いと 相対的影響ははるかに小さくなる。Nanodrop One など一部のシステムには、A260 値に対するタンパク
質 の 影響 を 補正 できるソフトウェアツール
がある。
血液由来 の 核酸 サンプルには 410 nm 付近 で吸光 するヘモグロビンが微量含 まれていることがある。また、上記の影響が純度比に現れる。 バックグラウンド 吸光値 の 上昇 も 認
められることがある。
要約：• タンパク 質混入 は A260/A280 よりも A260/A230 に強く影響することから、タンパク質混入の評価には A260/A230 の方が適している。

• 純度比に対するタンパク質混入の影響は核酸濃度に依存する：– 低濃度 の 核酸溶液 のタンパク 質混入 は、濃度および純度の測定に強く影響する。
– より高濃度の DNA サンプルでは、タンパ
ク 質混入 の 影響 は 過小評価 される 傾向 がある。

44

微量分光光度計（MVS）

A

C

濃度測定値（ng/µl）

1

2

1

0.3

1.2

3
1.6

2.5

1.9

2.9

2.8

平均濃度
（ng/µl）

1.0

蛍光法（Qubit）

相対標準
偏差（%）

66.9

Qubit 相対標準偏差
Qubit で 測定した平均濃度（ng/µl） （%）
0.7

3.8

2.6

21.3

2.0

4.2

5

4.9

5.2

5.2

5.1

3.5

4.6

4.1

10

9.1

9.9

9.9

9.6

4.5

9.1

1.7

15

13.8

15.2

14.2

14.4

5.0

13.7

1.9

20

19.7

19.5

19.6

19.6

0.5

19.0

2.1

25

25.0

24.9

25.0

25.0

0.3

23.8

0.3

30

29.0

29.5

29.2

29.2

0.9

28.4

1.9

40

38.4

39.8

39.8

39.3

2.1

37.3

1.2

50

48.1

48.4

49.3

48.6

1.3

47.5

1.0

75

71.8

72.3

74.5

72.9

2.0

72.7

3.2

100

93.0

98.4

97.8

96.4

3.1

99.4

1.5

150

147.4

149.2

147.9

148.2

0.6

151.2

0.7

サンプル濃度

1

2

3

1

5.91

1.11

2.83

2.5

3.80

1.89

5

1.93

10
15

（ng/µl）

A260/280

平均値

相対標準偏差（%）

1.60

2.43

49.1

1.85

1.70

1.82

6.5

1.95

1.85

1.78

1.86

4.7

1.80

1.86

2.04

1.90

6.6
4.4

3.28

74.2

20

1.86

1.77

1.93

1.85

25

1.86

1.86

1.92

1.88

1.7

30

1.85

1.87

1.92

1.88

1.9
1.5

40

1.91

1.85

1.88

1.88

50

1.86

1.84

1.90

1.87

1.6

75

1.86

1.84

1.86

1.86

0.8

100

1.86

1.86

1.86

1.86

0.3

150

1.87

1.86

1.86

1.86

0.2

サンプル濃度

1

2

3

1

-0.52

137883.58

2.1312628.4

平均値

相対標準偏差（%）

2.5

-2.60

6.03

8.84

4.09

145.8

5

12.97

3.28

4.40

6.88

77.0

10

5.94

3.28

2.99

4.07

39.9

（ng/µl）

A260/230

173.2

15

3.62

2.90

3.08

3.20

11.6

20

3.17

3.02

3.09

3.09

2.5

25

3.10

2.91

3.09

3.04

3.5

30

2.94

2.37

2.89

2.73

11.5

40

3.02

2.85

2.94

2.94

3.0

50

3.02

2.79

2.75

2.85

5.0

75

2.95

2.77

2.81

2.84

3.3

100

2.80

2.74

2.80

2.78

1.3

150

2.83

2.77

2.76

2.79

1.4

DNA 定量
核酸調製物中の緩衝液混入物質

前述 の 混入物質 のそれぞれについて 検出限界を求め、スペクトルを比較できるように、

OD230 = 1 に達するために必要な濃度も求めた（表 3）。後者の値を求めることで、混入物質
スペクトルの 相互比較 を 行 える（図 2）。10～ 50 µM という少量の GTC および EDTA を検出できる。GuHCl などの他の物質の場合、50mM を超える量が存在しなければ精製した核酸 の 純度比 に 影響 を 及 ぼさない。 シリカカ
ラムからの 溶出液中 に 50 mM から 1 M の 濃
度 で GuHCl が 存在 することは 考 えにくいことから、GuHCl による混入は紫外線 - 可視光線分光法では通常は検出されない。調査した

図 1：純度比に対するタンパク質混入の影響は DNA 濃度に依存する

TE 緩衝液で調製した NIH3T3 gDNA 原液をウシ血清アルブミン（BSA）タンパク質溶液（NEB #B9000）と混合して表に示す濃度とした。このとき、EDTA 濃度は 1 mM に維持した。濃度値（A260）および純度比 A260/A280、A260/A230
を Nanodrop One で 3 回測定した。各サンプルから得た個々のスペクトルおよび純度比を示す。DNA 濃度が低い
方が、タンパク質混入を純度比で検出しやすい。
A. 100 ng/µl gDNA

B. 25 ng/µl gDNA

2.5

A260/A280 = 1.83
A260/A230 = 2.48

2A260/A280 = 1.78
A260/A230 = 1.57

1.5
1
0.5
0
220

240

260

280

300

320

1.4

10 mm Absorbance

核酸精製 キットの 緩衝液 に 使用 されている物質も、調製中に完全に除去されなければ、
精製 サンプルの 紫外線吸収 スペクトルに 影
響することがある。グアニジンチオシアン酸塩（GTC）、 グアニジン 塩酸塩（GuHCl） な
どのカオトロピック 塩 が 結合緩衝液 に 使用
されることが多い。溶解緩衝液中には Triton
X-100、Tween 20 などの非イオン性界面活性剤が含まれることが多い。DNA 溶出緩衝液に多く使用される EDTA も吸収スペクトルに影響する。また、RNA 精製キットにはフェノール、
TRIzol や同等の試薬が頻繁に使用され、紫外線 - 可視光線吸収の測定値に影響する可能性がある。なお、TRIzol にはフェノールと GTCの両者が含まれている。洗浄緩衝液に一般に使用 されているエタノールも 吸光度値 にある 程度影響 することから、 この 分析 に 含 めている。

10 mm Absorbance

3

340

Wavelength (nm)gDNA (100 ng/µl)

BSA (100 ng/µl)

gDNA (100 ng/µl) + BSA (100 ng/µl)

濃度範囲 では 大半 の 混入物質 は A260/A230 にのみ影響を及ぼすが、Triton X-100 は両方の純度比に影響する。

図 2 に、各物質のスペクトルとともに、その物 質 を 含 む 100 ng/µl の gDNA 溶 液 の ス ペ ク
トルを 示 す。混合物 のスペクトルは 全 て、
gDNA と混入物質の両者が寄与することを示している。唯一の例外はエタノールで、そのスペクトルはシグナルが均一に増加することを示している。

表 2：純度比に対するタンパク質混入の影響は DNA 濃度に依存する

TE 緩衝液で調製した NIH3T3 gDNA 原液を BSA タンパク質溶液（NEB #B9000）と混合して表に示す濃度とした。
このとき、EDTA 濃度 は 1 mM に 維持 した。濃度値（OD260） および 純度比 A260/A280、A260/A230 を Nanodrop One で3 回測定した。
検出された核酸濃度
インプットした
gDNA 濃度（ng/µl） BSA 濃度（mg/ml） （ng/µl）

100

50

25

12.5

A260/280

A260/230

0

103.7

1.83

2.48

200

105.3

1.73

1.13

100

103.3

1.78

1.57

50

100.7

1.82

2.04

25

100.8

1.85

2.33

0

53.2

1.84

2.44

200

55.3

1.60

0.76

100

51.1

1.71

1.19

50

50.8

1.78

1.66

25

49.8

1.79

2.07

0

25.5

1.81

2.66

200

29.4

1.45

0.48

100

26.5

1.59

0.83
1.21

50

25.0

1.67

25

24.8

1.72

1.69

0

12.7

1.80

2.86
0.29

200

16.3

1.21

100

13.5

1.42

0.49

50

12.2

1.55

0.77

25

11.9

1.67

1.34

A260/A280 = 1.90
A260/A230 = 2.83

1.2
1A260/A280 = 1.62
A260/A230 = 0.80

0.8
0.6
0.4
0.2
0
220

240

260

280

300

320

340

Wavelength (nm)gDNA (25 ng/µl)

BSA (100 ng/µl)

gDNA (25 ng/µl) + BSA (100 ng/µl)

グアジニン塩／界面活性剤

以前 に 報告 されたデータ（1） とは 異 なり、
GTC の吸光度極大値は 240 ～ 260 nm ではなく220 ～ 230 nm の範囲で見られる。GTC の吸光度極大値 が 240 ～ 260 nm の 範囲 に 割 り 付 けられたのは、220 ～ 230 nm の 範囲 のシグナ
ルを一部 カットオフする Nanodrop システム
ソフトウェアのアーチファクトであると考える（2）。

GTC や非イオン性界面活性剤のような物質は
紫外線吸収スペクトルに大きく影響すると思われるが、ダウンストリームのアプリケー
ションに対するその影響は無視できることが多い。Von Alflen および Schlumpberger は、相当量のカオトロピック塩が qPCR アッセイに
キャリーオーバーされるが、これは qPCR 反
応効率に影響しないことを明らかにした
（2）
。

フェノール

RNA 精 製 プ ロ ト コ ー ル に 多 く 使 用 さ れ る
フェノールは、紫外線 — 可視光線範囲 で
光 を 強 く 吸収 する。水相 のフェノールを 約
10,000 倍希釈 しても、 そのスペクトルを 視認 できる。TRIzol 試薬 のスペクトルはフェノールのシグナルと極めて近似しているが、220 ～ 230 nm でも 吸光 が 認 められる。 これは GTC の 典型的 な 吸光 である。図 3 に、既知量 のフェノールまたは TRIzol と 混合 したRNA サンプルを、混入 された RNA の 典型例
として 示 す。 フェノールが 高濃度 で 存在 する場合には、スペクトルの 260 nm のピーク
が 270 nm に向かって明確にシフトすることを観察でき、両方の純度比がわずかに低下する。TRIzol は 260 nm のピークに対して同等の影響を及ぼすが、GTC が存在するため 220 ～230 nm で 強 い 吸光 が 生 じ、 その 結果 として
A260/A230 が大きく低下する。

45

DNA 定量• GTC、EDTA、フェノールおよび Triton X-100
は紫外線吸収スペクトルに影響するとともに、特に A260/A230 に大きく影響する。

• 他の混入物質、たとえば GuHCl や Tween 20 は、高濃度 で 存在 する 場合 にのみ 検出 でき、 シ
リカカラムで精製した核酸調製物から検出されることは考えにくい。
• タンパク質混入とは異なり、シリカカラムに使用した緩衝液の成分による混入がダウ
ンストリームのアプリケーションに及ぼす影響は過大評価されることが多い。
• 低濃度の DNA 溶出液中とブランク中の遊離
EDTA 濃度のわずかな違いが、A260/A230 に強く影響 する。TE 緩衝液 ではこの 比 が 3.0 を 超えることも珍しくない。

• エタノールは核酸吸光度スペクトルで明確に識別することはできないが、MVS を用いて単独または水に希釈して測定すると検出可能である。

水に残留する緩衝液成分の検出可能な濃度には大きな幅がある。検出されるために必要な量が、シリカカラムからの溶出液について通常予測される量を上回ることもある（GuHCl などの場合）。
混入物質

植物サンプル

純度 が 十分 に 高 くない 植物 サンプル 由来 の核酸抽出物 は、 ポリフェノールが 残留 するため強いフェノール様のシグナルを示すか、ポリサッカライドによる弱いシグナルを示

OD230 = 1

50 mM

2.5 M

GTC

10 µM

0.6 mM

EDTA

20 µM

1.25 mM

0.02％

1.50％

0.0002％

Triton X-100
Tween 20

エタノール0.012％

2％

NA（20％使用）

図 2：一般的な混入物質の単独での紫外線吸収スペクトルおよびDNA と混合したときの紫外線吸収スペクトル

混入物質は A230 = 1 となるように TE 緩衝液で希釈し、その後単独で、また NIH3T3 細胞から得た gDNA 100 ng/µlと混合して測定を行った。全ての混合物のスペクトル（エタノール混合物を除く）は、DNA と混入物質の両者の吸光を反映している。混入物質は主として A260/A230 に影響し、A260/A280 はほぼ不変のままであった。
A. GuHCl

B. GTC

2.5

A260/A280 = 1.85
A260/A230 = 1.32

2
1.5
1
0.5
0
220

240

260

280

300

320

3

2
1.5
1
0.5
0
220

340

A260/A280 = 1.85
A260/A230 = 1.18

2.5

240

Wavelength (nm)C. EDTA
A260/A280 = 1.90
A260/A230 = 1.28

2
1.5
1
0.5

240

260

280

300

320

2.5

320

340

1.5
1
0.5
0
220

340

240

A260/A280 = 1.83
A260/A230 = 1.28

2.5
2
1.5
1
0.5
240

260

280

300

320

340

Wavelength (nm)F. Ethanol

3

10 mm Absorbance

300

A260/A280 = 1.70
A260/A230 = 1.30

2Wavelength (nm)

0
220

280

D. Triton™ X-100

2.5

0
220

260

Wavelength (nm)E. Tween 20

260

280

300

320

340

2.5

A260/A280 = 1.89
A260/A230 = 1.63

2
1.5
1
0.5
0
220

240

Wavelength (nm)gDNA
A260/A280 = 1.87
A260/A230 = 3.34*

46

検出限界

GuHCI

10 mm Absorbance要約：

表 3：一般的な混入物質の検出限界

10 mm Absorbance

水 で 希釈 したエタノールは、230 ～ 240 nm
で紫外線吸収のピークを示す。しかし、DNA溶液中 に 存在 すると 紫外線吸収 スペクトルに 対 する 影響 が 低減 し、A260/A230 が 低下 する
ほかは 見 た 目 で 識別 することはできない。
イソプロパノールについても同様の影響が認められる（データは示さない）。

す。このような不純物は主として A260/A230 に影響 し、 バックグラウンド 散乱 を 引 き 起 こ
す。抽出中 に 特定 の 溶解 ケミストリーを 用いることで、 ポリフェノールおよびポリ
サッカライドを除去できる（図 4）。

10 mm Absorbance

エタノール

その他の混入物質

ポリサッカライド（植物物質、 アガロースなど ） およびリポサッカライド（細菌、酵母 など ） が 核酸調製物中 に 存在 することがあり、 バックグラウンド 吸 収 を 引 き 起 こす。 一 部 の MVS 機 器（Trinean® Dropsense 16、Unchained Labs Lunatic など ） は、 このバックグラウンドシグナルをフィルターを通して除去し、別個に表示できる（図 4）。しかし、全ての MVS システムでこのデコンボリュー
ションを行えるわけではない。したがって、
ポリサッカライドで混入されたサンプルでは A260/A230 比が低下し、A260/A280 比がわずかに上昇 することがあり、測定値 のばらつきが大きくなる。

10 mm Absorbance

DNA を 分析 する 際 には、 ヌクレアーゼ 活性を低下させるために EDTA が一般に使用される。EDTA は Mg2+、Ca2+ などの 二価陽 イオン
をキレート化する。しかし、EDTA が Mg2+ や
Ca2+ と複合体を形成すると、この EDTA- 陽イ
オン複合体の紫外線吸収は遊離 EDTA よりも低 くなる。 したがって、DNA 溶液 に Mg2+ お
よび Ca2+ イオンが 含 まれている 場合 には、このイオンが 関心核酸 の 対 イオンとして 作
用 することから、230 nm の 吸光度 はブラン
クよりも低くなる。このため、クリーンな
DNA の A260/A230 は EDTA が存在しなければ一般に 2.4 を 超 えないが、EDTA およびキレート化 した Mg2+ などの 二価陽 イオンを 含 む 溶液
中では 3.0 を超えることがある。日常的な分析では、TE 緩衝液中の純粋な gDNA の A260/A230
比 が 2.6 ～ 3.0 となることが 多 いが、10 mM
Tris（pH 8.5）中 で 測定 すると、 この 比 が 2.3～ 2.4 となる。DNA 濃度が高いと、A260/A230 に対する EDTA の影響が小さくなる。

4

10 mm Absorbance

EDTA

260

280

300

Wavelength (nm)Contaminant

gDNA + contaminant* A260/A230 ratio for gDNA alone exceeds 3.0 due to the presence of EDTA.

320

340

DNA 定量
図 3：RNA と混合したフェノールおよび TRIzol の紫外線吸収スペクトル

フェノールを水と混合し、上相の水を取り、これを希釈に用いた。TRIzol およびフェノールの水相を A270 が
およそ 1 になるまで希釈した。希釈率が 5 倍高い液も調製、両方の希釈液をラット肝由来の RNA 100 ng/µl と混合した。フェノールは両方の純度比に対し中程度の影響を及ぼした。TRIzol は GTC を含むため、A260/A230 に対してより強く影響した。
A. Phenol

B. TRIzol Reagent

6

A260/A280 = 2.06
A260/A230 = 2.04

4
3
2
1

240

260

280

300

320

340

10 mm Absorbance

10 mm Absorbance

5

0
220

6

A260/A280 = 1.94
A260/A230 = 1.99

A260/A280 = 1.95
A260/A230 = 1.44

5A260/A280 = 2.04
A260/A230 = 1.71

4

2
1
0
220

240

RNA
A260/A280 = 2.11
A260/A230 = 2.12

260

280

300

RNA
A260/A280 = 2.11
A260/A230 = 2.12

RNA + Phenol 1,100X

RNA + TRIzol 5,000X
RNA + TRIzol 25,500X
dilutedPhenol 1,100X

TRIzol 5,000X

Phenol 5,500X diluted

TRIzol 25,500X diluted

核酸 サンプルにシリカ繊維 が 含 まれている
場合、同様 のバックグラウンドシグナルが検出される。このような繊維は、溶出ステッ
プでシリカメンブレンから遊離されることがあり、多量に存在すると溶出液中に白い濁りとして見られる。

シリカ 繊維 は 遠心分離 で 溶液 から 除去 できる。紫外線吸収 スペクトルに 対 するシリカ
繊維 の 影響 は、 ポリサッカライドの 影響 と同 等 である。 図 5B に、 シリカ 繊 維 を 含 む
QIAGEN® DNeasy® Blood & Tissue Kit を 用 いて 分離 した gDNA 溶出液 を 示 す。Monarch ゲノム
DNA 精製 キット（NEB #T3010） カラムには、
このような 繊維 を 除去 する 固有 のメンブレン層が使用されているため、よりクリーン
な gDNA 溶出液が得られる（図 5A）。

吸光しない物質

核 酸 精 製 用 の 多 くのシリカキットに 使 用されている 最終洗浄緩衝液 には 一般 にエタ
ノールが 含 まれており、 しばしば Tris も 含
まれている。このような緩衝液に NaCl も含まれていることもある。最終洗浄ステップ
後 にシリカメンブレンを 遠心脱水 しても、溶出液中に洗浄緩衝液の各成分が微量に存在することがある。 これを 説明 する 事実 として、シリカカラムから溶出した RNA は水に溶出 されるものの、A260/A280 比 は 依然 として緩衝した溶液に典型的な 2.1 前後の値である（表 5 B）。

Tris および NaCl のほか、様々 な 緩衝液 および緩衝液成分、食塩、種々の界面活性剤（SDSなど）、抗酸化剤（β- メルカプトエタノールなど ） といった 物質 が 様々 なステップで 核酸調製物に使用される。このような物質の有無は分光光度計では検出できない。

340

Wavelength (nm)RNA + Phenol 5,500X
diluted

シリカ繊維

320

サンプルのRNA混入

gDNA 溶液の純度比に対する RNA 混入の影響

gDNA 溶液に添加する RNA の量を増大させると 定量値 および 純度比 に 対 してどのような影響が生じるかを観察するために、gDNA と
RNA の 混合物 を 調製 した。RNA の 範囲 は 総
核酸含量の 0 ～ 50％とし、gDNA については
100 ng/µl の一定濃度を使用した。EDTA 濃度は
1 mM とした（表 4）。

表 4 の結果は、総核酸濃度の測定値は予測よ3

Wavelength (nm)

5 DNA

要約：

• ポリサッカライドを含むサンプルは A 260/A 230に影響するバックグラウンド吸収を示し、そのためシグナルのばらつきが大きくなる。

• ポリサッカライドおよびリポポリサッカラ
イドは OD 値 にほとんど 影響 しないため、通常は検出されない。
• 他の可溶性または不溶性の物質、たとえばシリカ繊維が同じように吸光度測定値に影響することがある。

りも 高 いことを 示 している。 これは、MVS
ソフトウェアでは dsDNA については 変換係
数 50 が使用されているのに対し、添加したRNA には変換係数 40 が使用されているためである。A260/A280 は 通常 はどの 核酸 が 存在 す
るかを 分析 するために 使用 されるが、最初は gDNA のみが 存在 するためその 値 は 1.86である。少量 の RNA を 添加 するとこの 比 はわずかに 増大 するが、A260/A280 比 が 1.90 を 超えるのは RNA が総核酸量の 20％に達してからである（黄）。したがって、混入物質としての RNA が 少量 の 場合 には、MVS はその 検出には適していない。RNA 混入のために A260/
A280 が 1.90 にまで上昇した場合、総核酸量の少なくとも 15 ～ 20％が RNA であるという意
味になる。

RNA 量の増加に伴って A260/A280 は上昇するが、TE 緩 衝 液 中 で は A260/A230 は 3.0 か ら 2.4 に 低下する。これは、緩衝溶液中では純粋な RNAの A260/A230 は 純粋 な gDNA よりも 低 いという所見と一致する（表 5 B）。
要約：

表 4：DNA 溶液に添加する RNA
量の増大により生じる A260/A280
比の上昇はわずかである

表 に 示 す よ う に、TE 緩 衝 液 で 調 製 し た 100 ng/µlの NIH3T3 gDNA と 混 合 す る RNA の 量 を 増 加 さ せて い っ た。RNA の 量 は 総 核 酸 量 に 対 す る ％ 値 で示 す。DNA 濃度（A260）および 純度比 の 測定 を 3 回行 った。 その 平均値 を 示 す。A260/A280 が 1.90 を 超 えようになるには、総核酸量の 15％を超える RNA 含量が必要である。
総核酸量に対 するRNAの
%値

0

平均濃度
（ng/µl）

平均• 15％未満の RNA 混入では A260/A280 は 1.90 を超
えて 上昇 せず、日常的 な 核酸分析 で 特定 することは困難である。
• RNA の A260/A230 比は DNA よりも低い gDNA 溶
液中の RNA 量が増加すると、A260/A230 比が低
下する。

平均

A 260/A 280

A 260/A 230

101.1

1.86

3.03

1%

99.7

1.87

3.02

2.5%

101.9

1.87

3.02

5%

104.7

1.87

3.00

7.5%

108.1

1.88

2.98

10%

110.9

1.88

2.90

15%

117.5

1.89

2.83

20%

126.4

1.91

2.78

25%

135.3

1.92

2.69

30%

147.7

1.93

2.62

40%

175.6

1.95

2.48

50%

215.6

1.99

2.40

47

DNA 定量
図 4：部分的に精製したトマト葉由来 gDNA サンプルの Trinean Dropsense16
による紫外線 - 可視光線吸収スペクトル

グレーの線はポリサッカライドによるバックグラウンドシグナルを示す。このシグナルの一部は 230 ～280 nm の範囲にわたる吸光値の増大によるものであり、吸光曲線の異常な形状につながっている。
A. Plant gDNA sample 16水中または緩衝液中の核酸の測定

純度比 は pH に影響される（3）。水中 または
酸性溶液中の核酸について分光光度測定を行うと、緩衝 した 弱 アルカリ 性溶液中 の 核酸を測定した場合に比べ A260/A280 比が一般に約0.3 ～ 0.4 単位低くなる（4）。RNA を扱う場合、
RNA のアルカリ加水分解を避けるという名目
で、水への溶出が一般に行われる。水によるRNA の希釈が濃度値および純度比に及ぼす影響を記録するため、Monarch Total RNA Miniprep
Kit（NEB #T2010）を使用してラット肝から分離 した 総 RNA サンプルを 水 で 希釈 し、RNA
系列希釈液を調製した。その後測定したサン
プル濃度（表 5 A）から、水中の RNA の測定
値は 精度 が 低 くばらつきが大 きいことがわかる（黄）。実際、20 ng/µl 未満の濃度値は一般 に 過小評価 されるが、20 ng/µl 以上 では 過

B. Plant gDNA sample 2

大評価される傾向にある。しかし、同じ希釈系列を 10 mM Tris（pH 8.0）で調製すると、濃度値の精度および再現性が大幅に向上し、代替法として蛍光測定を行う必要がなくなる。

A260/A280 比 は 1.75 ～ 1.80、A260/A230 比 は 1.95 ～2.0 であり、両者ともにばらつきが大きかった（黄）。Tris 緩衝液を使用した場合、濃度が十分高いサンプルでは純度比は両者とも 2.1前後である（緑）（表 5 B）。
水 で 希釈 した RNA サンプルのうち 最 も 濃度が高いものでは、A260/A280 比の方が高かった。
希釈系列に用いた RNA サンプルの A260/A280 比
は 2.1 であった。 この 所見 は、洗浄緩衝液の 残留成分 によって 緩衝 された 水 に 溶出 した RNA と一致する。溶出液を水で 10 倍に希釈すると、残留緩衝成分はその影響を失う。
同様の影響が DNA についても認められる。

図 5：ある種のシリカキットで精製した gDNA サンプルにはシリカ繊維が含まれることがある

Monarch キットで精製したゲノム DNA（A）および QIAGEN DNeasy キットで精製したゲノム DNA（B）。DNeasy
キットで精製した DNA には、グレーの線で示されるようにシリカ繊維が含まれている。シリカ繊維により
A230 がわずかに上昇している（黒の線と青の線を比較）。15,000 x g で 1 分間遠心分離すると、DNeasy 精製サン
プル中に微小な白いペレットが認められた。データは Trinean Dropsense 16 を使用して収集した。
A. Monarch-purified gDNA

48

B. DNeasy-purified gDNA

要約：

• 水に溶解した RNA サンプルの A260/A280 比は、緩衝した弱アルカリ性のサンプルに比べ 0.3～ 0.4 単位低い。
• 水 で 希釈 した RNA および DNA の 測定値 は精度が低くばらつきが大きい。
• 分光光度分析用 Tris 緩衝液は水の適切な代替物 であり、蛍光法 による 測定 の 必要性 がなくなる。

• シリカカラムから 溶出 した 水 は、以前 の洗浄ステップから残留する緩衝成分によりわずかに緩衝されている。

DNA 定量
表 5：RNA を水に溶解した場合、A260/A280 比が低く、濃度値は精度が低くばらつきが大きい

Monarch Total RNA Miniprep キットを用いてラット肝臓から分離した総 RNA を水中に溶出し、水または 10 mM Tris-Cl（pH 8.0）で以下に示す RNA 濃度にまで希釈した。濃度（A）
および純度比（B）を Nanodrop One MVS で 3 回測定した。各表に平均値を示す。この濃度値を、Qubit BR RNA キットで 3 回測定した濃度値と比較した。

A

B

Nanodrop（溶出：水）RNA インプット
濃度（ng/µl）濃度（ng/µl）

Nanodrop（溶出：Tris）

偏差（%）

相対標準
偏差（%）

濃度（ng/µl）

偏差（%）

相対標準
偏差（%）

Qubit
濃度（ng/µl）

偏差（%）

相対標準
偏差（%）

11.1

1

0.54

2.5

1.53

-39.00

25.3

2.27

-9.31

1.5

2.17

-13.045

3.71-25.77

15.3

4.37-12.60

3.8

4.60

-8.04

6.1

7.5

6.11

-18.55

11.6

6.72-10.42

2.1

7.14

-4.78

4.7

10

8.53

-14.72

6.0

9.16

-8.42

2.9

9.72

-2.82

5.0

15

14.35

-4.34

9.0

13.65

-8.99

2.9

15.07

0.46

4.5

-46.12

63.5

1.08

8.32

11.6

0.88

-11.53

7.1

20

20.32

1.60

6.8

19.34

-3.28

1.1

20.14

0.71

3.3

25

25.22

0.86

3.0

23.71

-5.17

1.2

24.26

-2.96

4.0

30

30.78

2.61

2.3

28.64

-4.52

0.8

29.49

-1.71

3.7

40

45.27

13.17

1.2

39.32

-1.70

0.4

42.48

6.20

1.1

50

53.92

7.83

0.4

51.26

2.51

1.2

49.97

-0.05

0.4

100

10 8.968.96

1.4

105.085.08

0.3

105.45

5.45

2.6

200

215.397.69

0.1

203.291.65

0.1

198.07-0.96

1.1

RNA 濃度（ng/µl）

Nanodrop（溶出：水）

Nanodrop（溶出：Tris）

A260/280

A260/280

相対標準
偏差（%）

相対標準
偏差（%）

Nanodrop（溶出：水）

Nanodrop（溶出：Tris）

濃度（ng/µl）

A260/280

A260/280

相対標準
偏差（%）

相対標準
偏差（%）

1

1.40

91.9

4.70

1

-0.98

-210.6

6.51

2.5

1.75

25.2

2.45

16.0

2.5

2.83

201.6

2.18

69.9

5

1.86

8.7

2.18

7.2

5

1.85

58.6

2.50

45.0

7.5

1.87

3.9

2.27

5.7

7.5

2.27

38.7

2.23

10.4

10

1.75

10.1

2.09

8.4

10

2.05

19.5

2.14

4.0

15

1.77

10.5

2.16

6.7

15

1.86

24.9

2.17

5.6

20

1.76

13.4

2.12

2.9

20

1.93

22.1

2.07

3.3

25

1.71

8.8

2.12

3.2

25

1.97

17.6

2.00

0.5

30

1.73

3.0

2.11

2.2

30

1.95

12.4

2.05

3.1

40

1.75

3.4

2.09

2.5

40

2.03

9.8

2.04

1.5

83.4

85.3

50

1.80

4.2

2.09

1.5

50

2.02

7.1

1.94

6.1

100

1.89

1.2

2.09

0.4

100

1.99

3.5

2.06

0.8

200

1.96

0.8

2.10

0.2

200

2.04

1.4

2.08

0.5

結論

微量分光光度計は核酸サンプルを定量しその純度を分析する手段として優れており、簡便である。しかし、上記のように、定量についても純度分析についても考慮すべき限界がある。

• 微量分光光度計は 1 ng/µl までの濃度のサンプルに使用できるが、精度を求めるためには低濃度のサンプル
は繰り返し測定する必要がある。

• 20 ng/µl よりも低濃度のサンプルの純度比には信頼性がなく、20 ～ 50 ng/µl のサンプルでも大きなばらつきが見られる。

• 純度比に対するタンパク質混入の影響は、DNA または RNA の濃度によって異なる。低濃度の核酸サンプル
は混入度が高く見え、高濃度の核酸サンプルではほぼクリーンに見えることがある。
• タンパク質混入の評価において A260/A280 が果たす役割について、一般的認識とは異なり、A260/A230 の方がタン
パク質混入の指標として感度が高い。

参考文献：（1）N.N., Interpretation of Nucleic Acid

260/280 Ratios (2012) Thermo Fisher
T123– Technical Bulletin, NanodropLite.
（2）von Ahlfen, S. and Schlumpberger,M., (2010) Qiagen Gene Expression
Newsletter , 15, 7–8.
（3）Wilfinger, et al. (1997) BioTechniques .
22, 474–481.
（4）Sauer, P., et al, (1998) Quantitation of
DNA. Qiagen News , 2, 23–26.

• GTC、Triton X-100、EDTA、フェノールなどの緩衝成分の存在を評価するために紫外線吸収スペクトルを使用できるが、検出された成分はダウンストリームのアプリケーションに悪影響を及ぼさないことが多い。
• タンパク質およびポリサッカライドが相当量存在する可能性があるが、純度比に対するその影響はおそらく限られている。

• DNA サンプル中の遊離 EDTA 度のわずかなばらつきが、A260/A230 比を異常に高くすることがある（3.0 以上）。
• A260/A280 を DNA 溶液中の RNA 濃度の指標として使用できる。しかし、この比の大幅な変化は RNA 濃度が15％を超える場合にのみ認められる。
• 核酸を水でシリカメンブレンから溶出させた場合にも、以前の洗浄ステップから残留する成分により核酸がわずかに緩衝されることがある。

• 水中の核酸を測定すると、測定値の精度が低くばらつきが大きくなり、A260/A280 比が大幅に低下する。Tris
緩衝液を測定に用いれば、この問題は解決する。

49

オーダーインフォメーション

PCR 増幅
製品名

推奨

高正確性 PCR 酵素（インサート増幅）
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase

Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix
Q5 High-Fidelity PCR Kit

M0493S/L
M0492S/L
M0494S/L/X
E0555S/L

製品名

製品番号

容量

100/500 units

LunaScript RT Master Mix Kit (Primer-free)

E3025S/L

25/100 reactions

100/500 units

M-MuLV Reverse Transcriptase

M0253S/L

10,000/50,000 units

100/500 reactions

AMV Reverse Transcriptase

M0277S/L

200/1,000 units

ProtoScript II First Strand cDNA Synthesis Kit

E6560S/L

30/150 reactions

50/200 reactions

ProtoScript First Strand cDNA Synthesis Kit

E6300S/L

30/150 reactions

M0466S/L

20/100 reactions

100/500/500 reactions

LunaScript RT SuperMix Kit

推奨E3010S/L

25/100 reactions

Q5U Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase

M0515S/L

100/500 units

Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with
HF Buffer

M0531S/L

100/500 reactions

ProtoScript II Reverse Transcriptase

M0368S/L/X

4,000/10,000/40,000
units

Phusion High-Fidelity PCR Master Mix withGC Buffer

M0532S/L

100/500 reactions

WarmStart RTx Reverse Transcriptase

M0380S/L

50/250 reactions

Phusion Hot Start Flex 2X Master Mix

M0536S/L

100/500 reactions

Phusion High-Fidelity PCR Kit

E0553S/L

50/200 reactions

Phusion High-Fidelity DNA Polymerase

M0530S/L

100/500 units

Phusion Hot Start Flex High-Fidelity DNA
Polymerase

M0535S/L

100/500 units

OneTaq DNA Polymerase

M0480S/L/X

200/1,000/5,000 units

OneTaq Quick-Load DNA Polymerase

M0509S/L/X

100/500/2,500 units

OneTaq Hot Start DNA Polymerase

M0481S/L/X

200/1,000/5,000 units

OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer

M0482S/L

100/500 reactions

OneTaq Quick-Load 2X Master Mix withStandard Buffer

M0486S/L

100/500 reactions

制限酵素（HF 酵素、全リストはウェブサイト参照）
製品名

製品番号

容量

AgeI-HF

R3552S/L

300/1,500 units

ApoI-HF

R3566S/L

1,000/5,000 units

BamHI-HF

R3136S/L/T/M

10,000/50,000 units

BbsI-HF

R3539S/L

300/1,500 units

BclI-HF

R3160S/L

3,000/15,000 units

BmtI-HF

R3658S/L

300/1,500 units

BsaI-HFv2

R3733S/L

1,000/5,000 units

BsiWI-HF

R3553S/L

300/1,500 units

ハイフィデリティー制限酵素

OneTaq Hot Start 2X Master Mix withStandard Buffer

M0484S/L

100/500 reactions

OneTaq Hot Start 2X Master Mix with GC Buffer

M0485S/L

100/500 reactions

BsrGI-HF

R3575S/L

1,000/5,000 units

OneTaq Hot Start Quick-Load 2X Master Mix withStandard Buffer

M0488S/L

100/500 reactions

BstEII-HF

R3162S/L/M

2,000/10,000 units

OneTaq Hot Start Quick-Load 2X Master Mix withGC Buffer

BstZ171-HF

R3594S/L

1,000/5,000 units

M0489S/L

100/500 reactions

DraIII-HF

R3510S/L

1,000/5,000 units

Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer

M0267S/L/X/E

400/2,000/4,000/20,000
units

EagI-HF

R3505S/L/M

500/2,500 units

EcoRI-HF

R3101S/L/T/M

10,000/50,000 units

Taq DNA Polymerase with Standard Taq Buffer

M0273S/L/X

400/2,000/4,000 units

EcoRV-HF

R3195S/L/T/M

4,000/20,000 units

Taq DNA Polymerase with Standard Taq (Mg-free)
Buffer

M0320S/L

400/2,000 units

HindIII-HF

R3104S/L/T/M

10,000/50,000 units

Taq PCR Kit

E5000S

200 reactions

KpnI-HF

R3142S/L/M

4,000/20,000 units

Quick-Load Taq 2X Master Mix

M0271L

500 reactions

MfeI-HF

R3589S/L

500/2,500 units

Taq 2X Master Mix

M0270L

500 reactions

MluI-HF

R3198S/L

1,000/5,000 units

Taq 5X Master Mix

M0285L

500 reactions

NcoI-HF

R3193S/L/M

1,000/5,000 units

Multiplex PCR 5X Master Mix

M0284S

100 reactions

NheI-HF

R3131S/L/M

1,000/5,000 units

Hot Start Taq DNA Polymerase

M0495S/L

200/1,000 units

NotI-HF

R3189S/L/M

500/2,500 units

Hot Start Taq 2X Master Mix

M0496S/L

100/500 reactions

NruI-HF

R3192S/L

1,000/5,000 units

Vent DNA Polymerase

M0254S/L

200/1,000 units

NsiI-HF

R3127S/L

1,000/5,000 units

Vent (exo ) DNA Polymerase

M0257S/L

200/1,000 units

PstI-HF

R3140S/L/T/M

10,000/50,000 units

Deep Vent DNA Polymerase

M0258S/L

200/1,000 units

PvuI-HF

R3150S/L

500/2,500 units

Deep Vent (exo ) DNA Polymerase

M0259S/L

200/1,000 units

PvuII-HF

R3151S/L/M

5,000/25,000 units

LongAmp Taq DNA Polymerase

M0323S/L

500/2,500 units

SacI-HF

R3156S/L/M

2,000/10,000 units

LongAmp Hot Start Taq DNA Polymerase

M0534S/L

500/2,500 units

SalI-HF

R3138S/L/T/M

2,000/10,000 units

LongAmp Taq 2X Master Mix

M0287S/L

100/500 reactions

SbfI-HF

R3642S/L

500/2,500 units

LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix

M0533S/L

100/500 reactions

ScaI-HF

R3122S/L/M

1,000/5,000 units

LongAmp Taq PCR Kit

E5200S

100 reactions

SpeI-HF

R3133S/L/M

500/2,500 units

SphI-HF

R3182S/L/M

500/2,500 units

SspI-HF

R3132S/L/M

1,000/5,000 units

StyI-HF

R3500S/L

3,000/15,000 units

Gel Loading Dye, Purple (6X)

B7024S

4 ml

Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS

B7025S

4 ml––

PCR クローニング＆変異導入

50

M0491S/L

容量

Template Switching RT Enzyme Mix

PCR 酵素（汎用＆確認用）

推奨

製品番号

cDNA 合成

NEB PCR Cloning Kit

E1202S

20 reactions

NEB PCR Cloning Kit (Without Competent Cells)

E1203S

20 reactions

Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit

E0554S

10 reactions

Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit(Without Competent Cells)

E0552S

10 reactions

KLD Enzyme Mix

M0554S

25 reactions

Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set

N0446S

25 μmol of each

Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix

N0447S/L

8/40 μmol of each推奨ゲルローディングダイ

オーダーインフォメーション
末端修飾
推奨

推奨
推奨

製品名

製品番号

容量

Shrimp Alkaline Phosphatase (Recombinant)M0371S/L

Antarctic Phosphatase

DNA マーカー／ラダー
製品名

製品番号

容量

500/2,500 units

TriDye 1 kb DNA LadderN3272S

125 gel lanes

M0289S/L

1,000/5,000 units

Quick-Load 1 kb DNA LadderN0468S/L

125/375 gel lanes

T4 DNA Polymerase

M0203S/L

150/750 units

100 bp DNA LadderN3231S/L

100/500 gel lanes

DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment

M0210S/L/M

200/1,000/1,000 units

TriDye 100 bp DNA LadderN3271S

125 gel lanes

Quick Blunting Kit

E1201S/L

20/100 reactions

Quick-Load 100 bp DNA Ladder

N0467S/L

125/375 gel lanes

Mung Bean Nuclease

M0250S/L

1,000/5,000 units

1 kb Plus DNA Ladder

N3200S/L

200/1,000 gel lanes

T4 Polynucleotide Kinase

M0201S/L

500/2,500 units

1 kb Plus DNA Ladder for Safe Stains

N0559S

50 µg/ml

Klenow Fragment (3´ → 5´ exo–)

M0212S/L/M

200/1,000/1,000 units

TriDye 1 kb Plus DNA Ladder

N3270S

250 gel lanes

β-Agarase I

M0392S/L

100/500 units

Quick-Load 1 kb Plus DNA LadderN0469S

250 gel lanes

Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA LadderN0550S/L

250/750 gel lanes

TriDye Ultra Low Range DNA LadderN0558S

100 µg/ml

50 bp DNA LadderN3236S/L

200/1,000 gel lanes

Quick-Load Purple 50 bp DNA LadderN0556S

250 gel lanes

Quick-Load 1 kb Extend DNA LadderN3239S

125 gel lanes

Quick-Load Purple 1 kb DNA LadderN0552S/L

125/375 gel lanes

Quick-Load Purple 100 bp DNA LadderN0551S/L

125/375 gel lanes

Low Molecular Weight DNA LadderN3233S/L

100/500 gel lanes

N0557S

125 gel lanes

Quick CIP

M0525S/L

1,000/5,000 units

1 kb DNA Ladder

推奨

ライゲーション
推奨
推奨
推奨
推奨

推奨

製品名

Blunt/TA Ligase Master Mix

50/250 reactions

ElectroLigase

M0369S

50 reactions

T4 DNA Ligase

M0202S/L/T/M

20,000/100,000 units

Salt-T4 DNA Ligase

M0467S/L

20,000/100,000 units

Quick-Load Purple Low Molecular Weight
DNA Ladder

Hi-T4 DNA Ligase

M2622S/L

20,000/100,000 units

Fast DNA LadderN3238S

200 gel lanes

Quick Ligation Kit

M2200S/L

30/150 reactions

PCR Marker

N3234S/L

100/500 gel lanes

T3 DNA Ligase

M0317S/L

100,000/750,000 units

T7 DNA Ligase

M0318S/L

100,000/750,000 units

Taq DNA Ligase

M0208S/L

2,000/10,000 units

製品名

製品番号

容量

NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix

E2621S/L

10/50 reactions

NEBuilder HiFi DNA Assembly Bundle
for Large Fragments

E2623S

20 reactions

Gibson Assembly Cloning Kit

E5510S

10 reactions

Gibson Assembly Master Mix

E2611S/L

10/50 reactions

NEB Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HFv2)

E1601S/L

20/100 reactions

NEB Golden Gate Assembly Kit (BsmBI-v2)

E1602S/L

20/100 reactions

BioBrick® Assembly Kit

E0546S

50 reactions

BbsI

R0539S/L

300/1,500 units

BbsI-HF

R3539S/L

300/1,500 units

BsaI-HFv2

R3733S/L

1,000/5,000 units

BsmBI-v2

R0739S/L

200/1,000 units

製品名

製品番号

dam-/dcm- Competent E. coli

C2925H/I

20 x 0.05 ml/tube/
6 x 0.2 ml ml/tube

C2987H/I/P/R/U

20 x 0.05 ml/tube/
6 x 0.2 ml/tube/
1 x 96 well plate/
1 x 384 well plate/
12 x 8 tube strips

NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency)

推奨

推奨
推奨

E5520S

10 reactions

6 x 0.4 ml/tube

NEB 5-alpha F´ I Competent E. coli
(High Efficiency)

C2992H/I

20 x 0.05/6 x 0.2 ml

NEB 10-beta Competent E. coli (High Efficiency)

C3019H/I

20 x 0.05 ml/tube/
6 x 0.2 ml ml/tube

NEB 10-beta Electrocompetent E. coli

C3020K

6 x 0.1 ml/tube

Esp3I

R0734S/L

300/1,500 units

NEB Turbo Competent E. coli (High Efficiency)

C2984H/I

20 x 0.05 ml/tube/
6 x 0.2 ml/tube

PaqCI

R0745S/L

200/1,000 units

SapI

R0569S/L

250/1,250 units

NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency)

C3040H/I

20 x 0.05 ml/tube/
6 x 0.2 ml/tube

BtgZI

R0703S/L

100/500 units

BspQI

R0712S/L

500/2,500 units

T4 DNA Polymerase

M0203S/L

150/750 units

Taq DNA Ligase

M0208S/L

2,000/10,000 units

T4 DNA Ligase

M0202S/L/T/M

20,000/100,000 units

T5 Exonuclease

M0363S/L

1,000/5,000 units

Exonuclease V (RecBCD)

M0345S/L

1,000/5,000 units

DNA 精製推奨

容量

NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit

C2988JNEB Cloning Competent E. coli Sampler

推奨

DNA Assembly
推奨

q

推奨

50/250 reactions

M0370S/LNEB 5-alpha Competent E. coli
(Subcloning Efficiency)

推奨M0367S/L

容量200/1,000 gel lanes

Instant Sticky-End Ligase Master Mix

形質転換

推奨

製品番号

N3232S/L

製品名

C1010S

製品番号

8 tubes

容量

Monarch Plasmid Miniprep Kit

T1010S/L

50/250 preps

USER Enzyme

M5505S/L

50/250 units

Monarch DNA Gel Extraction Kit

T1020S/L

50/250 preps

Thermolabile USER Enzyme II

M5508S/L

50/250 units

Monarch PCR & DNA Cleanup Kit (5 μg)

T1030S/L

50/250 preps

Monarch Genomic DNA Purification Kit

T3010S/L

50/150 preps

Monarch Total RNA Miniprep Kit

T2010S

50 preps

Monarch RNA Cleanup Kit (10 µg)

T2030S/L

10/100 preps

Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg)

T2040S/L

10/100 preps

Monarch RNA Cleanup Kit (500 µg)

T2050S/L

10/100 preps

相同組換えクローニング
製品名

Cre Recombinase

製品番号M0298S/L/M

容量50/250 units

カラムとバッファーは単品販売品もあり

51

Featured Tools
NEBcloner：
NEBcloner.neb.com

クローニング試薬の選択やプロトコールを簡単に検索

NEBuilder DNA Assembly Tool：
NEBuilder.neb.com
DNA アッセンブリのプライマーを簡単にデザイン
NEB AR App
NEB

AR

製品資料中のアイコンをスキャンして動画や実験プロトコール、ヒントなどを視聴（iPhone、iPad、
Android 対応）

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