島根県産業技術センター研究報告

総

第50号

(2014)

説

水産加工食品に含まれるトビウオ類の鑑定
Studies on the Authentication of flying fish in processed fishery products

永瀬

光俊＊

トビウオ類 (以下トビウオ) はダツ目に属し, 世界中の亜熱帯から熱帯の海に生息しており, 世界では９属50数種, 日本近海に６属27種１)が確認されている. 代表的な食用種としては, トビウオ Cypselurus agoo, ホ
ソ ト ビ ウ オ Cypselurus hiraii , ツ ク シ ト ビ ウ オ Cypselurus heterurus , ハ マ ト ビ ウ オ Cypseluruspinnatibarbatus, アヤトビウオ Cypselurus poecilopterus, ホソアオトビウオ Hirundichthys oxycephalusが挙げられ, 全国で年間約8000トン２)が漁獲されて, 鮮魚以外に各種かまぼこ, 干物, だしの素, くさや, 魚
卵加工品などに用いられている.
日本海沿岸では, ５月から７月にかけて産卵期を迎え, 日本海を北上するトビウオが大量に漁獲されるが,鮮魚として処理できない余剰分は, 加工用に廻される. そのため, 日本海沿岸に位置する島根県東部地域では,主原料にトビウオを用いることで, 水産練製品製造業が発達した. 特にあご野焼は, 他の地域に見られない特産品として有名であり, 島根県の主要な食品産業の一つとなっている.
島根県では2000年より, あご野焼の価値を守ることを目的とし, 高品質なあご野焼の品質保証制度を採用している. この制度では, トビウオを一定量以上用いる必要があるが, かまぼこの一種であるあご野焼は, 原料
魚の形態学的な特徴を残さないことから, トビウオ使用の有無や使用量は外見から判断不能で, 書類上あるいは現地調査で確認するしかなかった. そのため, 分子生物学的手法を応用することにより, あご野焼に使われるトビウオを定性的, 定量的に分析する技術開発を行った. 本総説では, ホソトビウオのミトコンドリア
DNA全塩基配列の決定から始まり, ダイレクトPCRを用いたトビウオ類の定量法の確立に至った一連の研究について解説する.
表１

１. はじめに
1.1

水産加工食品と鑑定

我が国で食用とする魚類の種類数は, 外国産の輸入品を含めて約1,000種類もある. また, 代表的な食品の成分を収載する五訂増補日本食品標準成分表３)でも, 食品群中で魚介類の生物学的種が174種類で, 野菜類他より最も多く,日本人は世界で最も多種類の水産物を食べるという国民性の一端がうかがえる (表１).
一般に, 脊椎動物である魚類の判別は, 形態学的特徴により行われ, 外見・鰭の配列や形状・鱗の形状・側線上の鱗の数等により分類される. しかしながら, 市場に流通する魚種は極めて多く, その中には, 一見では区別できないほど, 似通った形態を持つ魚種が多数存在する. そして,魚種が変われば, 品質や価格に大きな違いが出てくる場合が多数あることが知られている. 例えば, マダイは, お祝
いの席でも使われる高級魚といえるが, ○○ダイというタイ類として包括することのできる名称の魚種は20種類以上あり, 品質や価格が大きく異なる. そのため, 価格が安い
種を高い種と偽って販売する危険性が常に存在しており,＊

生物応用科― 10 ―

食品群と使用される生物種数3)

永瀬：水産加工食品に含まれるトビウオ類の鑑定
実際に種を偽装する不正が毎年のように起こっている. 一たり, 偽りがあったとしても, 確認できない. よって, 消方, 水産加工食品においては, 加工すなわち, 切り身化,

費者に正確な情報を伝え, 公正で公平な流通を確保するた

すり身化することにより, 本来の魚種の持つ形態学的な特めには, 上記①, ②について, 科学的根拠に基づく客観的徴が著しく損なわれ, 原材料の魚種が形態からでは, 判断な鑑定データおよび鑑定技術開発が強く求められている.

できなくなる. このため, 水産加工食品における魚種鑑定

1.3は, 鮮魚に比べてはるかに困難となる.
1.2

水産加工食品の種判別

水産加工食品の種判別は, 水産物の種類が極めて多いこ

水産練製品の原料魚を判別する意義ともあり, 基本的には種による価格差が出やすい産業的重

水産加工食品の一種であるかまぼこ等の水産練製品は,要種について研究が進んでいる. 解析には, ミトコンドリ

図１のように, 魚のすり身を塩ずりして塩溶性タンパク質

アDNA (以下文中ではmtDNAと表記) が用いられることを溶出し, 加熱によりゲル化させたゲル状食品であるため,が多い. mtDNAは, ひとつの細胞あたりのコピー数が多魚本来の持つ形態学的な特徴は, 完全に壊されている. 水く, 核遺伝子に比べて丈夫で変異蓄積量が大きいことで種産練製品は, 古来より地元の海で漁獲された魚を使い, 地判別に使いやすい利点がある. 魚種としては, マグロ

方ごとに独特の風味ある高価値の製品が作られていたが,類５,６), タラ類７), コチ類８), イワシ類９),10), ヒラメ・カレ

1960年頃から冷凍すり身が使われるようになったことで,イ類11),12), サケ類13), スズキ類14), アジ類15), サバ類16), ウ

原料魚種の特性に由来する地方色が薄まり, 地域の特産品

ナギ類17,18), タイ類19), フグ類20)で種判別に関する報告が見としての価値が失われつつあるのが現状である.

られる.

1980年以降, かまぼこ消費量は毎年漸減しており, 製品

また, 加工品の種類としては, 切り身５),15) , 干物９),15) ,

価格は二極分化する傾向にある. 低価格なものは種名をほ蒲焼17),18), 塩蔵品21), レトルト６), 魚卵７)に種判別の報告がとんど問わないが, 高価格なものは, 昔から地元で獲れて見られ, すり身22),23)でも一部見られる.

きた魚種を使うことで, 商品価値を高めている. 2003年に1.4Eマークについて行われた高知県の調査によれば, 高知市内の量販店で購入

Eマーク制度は, 1990年度から農林水産省総合食料局食

したすまき７サンプルを調査したところ, 単位グラムあた

品産業企画課が実施した ｢ふるさと認証食品品質表示推進

りの価格で, 最も高いものは最安値の2.3倍であり, その事業｣ において始められ, 地域特産品の生産振興と利用拡

主要な原料魚として, ゲル強度を出すために特に高知県で大を目的として, 全国各地の優良な食品に ｢認証マーク｣

４)

好んで使うエソが表示されていた . これは, 原料魚の種を付けるというものである. 図２にその図柄を示す. 認証類やその含量が品質の良し悪しに影響を与え, ひいては,は都道府県単位で行われ, ｢認証基準｣ については, 原料,価格に反映される一例といえる.

製造とも地元の産品を使うことや, 地元の伝統的な製法を

水産練製品の場合, 味覚だけでなく, 食感や見た目も重使うことが基本となっている. 具体的な手続きとしては,要になるために単独の魚種で製造されることはまれで, 数

各県は食品事業者からの申請に基づき, 品目別の認証基準

種類を混合することが多いが, ①原料魚の判別はおろか,を作成し, その基準に適合するかどうか衛生, 品質, 表示②魚種の混合割合などは外見から判断することは不可能で等の確認を行う. そして, 学識経験者, 食品事業者代表,

ある. また, 水産練製品の原料魚について科学的に鑑定す

消費者代表, 試験研究機関, 関係行政機関等からなる委員

る方法は見あたらないことから, 表示の内容に誤りがあっ会が設置され, その基準が審議される. 認証されれば, 各製品にＥマークを貼付して出荷・販売が可能となる. Eマー
ク制度が始まった当初は, 12県のみの参加であったが, 現
在では全国20都府県で456品目の食品が, Eマーク食品と

図１

かまぼこの製造工程

図２― 11 ―

Eマーク (３個のEのシンボル部分は赤色)

島根県産業技術センター研究報告
して認証されている (2011年３月現在).

第50号(2014)

L7255-CO1(5 -GATGCCTACACMCTGTGAAA-3 )

島根県では, 現在９品目の認証が行われており, このう

H15149ad(5 -GCNCCTCARAATGAYATTTGTCCTCA-3 )ちあご野焼は, 最初に認証された品目であり, 2000年から

次に, ３つのPCR産物を鋳型として, ダイレクトシー

行われている. その目的は, 特産品としてあご野焼の価値

ク エ ン ス を 行 っ た . DNA シ ー ク エ ン ス は , ABIを守ることであり, 申請のあった基準を満たすあご野焼のPRISMTM3100 Genetic analyzer (アプライドバイオシ

品質を保証することにある. この制度では, トビウオを70

ステムズ) を用い, メーカーの指示に従い, 図３中に％以上用いる必要があるが, かまぼこは魚の形態学的な特番 号 で 示 す 相 対 位 置 に 作 用 す る 60種 類 の プ ラ イ マ ー 25)

徴を残さないことや, 加熱等の食品製造工程を経ているこを 使 用 し て , BigDye terminatorTMサ イ ク ル シ ー ク エとから, あご野焼に用いられる魚肉種を特定する技術開発

ン ス キ ッ ト (Ver3.1, ア プ ラ イ ド バ イ オ シ ス テ ム ズ )が望まれていた.

による伸長終了法を用いた.

２. ホソトビウオ Cypselurus hiraii ミトコンドリア
ゲノム全塩基配列の決定
2.1

緒言

2.2.2 DNA塩基配列の解析
13のタンパク質をコードしている遺伝子の位置は,イダテントビウオ, マイワシ, ウナギ, そしてカタク
チイワシのミトコンドリアゲノムの塩基配列かアミノ生物が持つDNAは, 生物体の設計図である遺伝情報が酸 配 列 と 比 較 す る こ と に よ り 決 定 し た 24),26),27),28) . tRNA

全て記録されている核DNAと細胞内器官であるミトコン

をコードすると推定される領域は, イダテントビウオ

ドリアが持つmtDNAの２つに大別される. 核DNAのコピーの 全 ミ ト コ ン ド リ ア 配 列 (DDBJ/EMBL/GenBank受 付

数は１つの細胞あたり２であるが, mtDNAは1000コピー

番号AP002933) とのシークエンスホモロジーによって以上ある.

同定した. 解析したホソトビウオのシークエンスデー

また, mtDNAは, 分子量が小さな閉環状分子であるたタは, データベースに登録した. (DDBJ/EMBL/GenB

め壊れにくく, 核DNAに比べて５〜10倍速い進化速度を

ank受付番号AB182653)

持ち, 母性遺伝をするなどの特徴を持っている. つまり,

2.3

核遺伝子に比べて丈夫で変異蓄積量が大きいということで2.3.1 ミトコンドリアゲノムの構造結果および考察あり, あご野焼のような加工食品をサンプルとして扱う場

ホソトビウオのミトコンドリアゲノムの全長は,合は, 検出感度の点からmtDNAが適している. そこで,

16,528bp25) で あ っ た . 図 ３ お よ び 表 ２ に 詳 細 を 示 し た .

mtDNAをターゲットとして鑑定技術の開発を目指すこと

ミトコンドリアゲノムの構造は, ２個のrRNA, 22個のtRNとした.

A , 13 個 の タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る 遺 伝 子 と control

一方, 日本近海のトビウオ類は, 20数種類いるとされる

regionを含み, 他の脊椎動物と同様であった. 一般的にミが, 日本海を北上してくるトビウオ類は, ホソトビウオとトコンドリアゲノムに並んでいる37遺伝子の配置は, 魚類

ツクシトビウオの２種類である. 漁獲の９割方はホソトビ

をはじめとして, 哺乳類, 爬虫類, 両生類を含む脊椎動物ウオであることから, かまぼこ原料に用いられるトビウオ

では, いくつかの例外を除き, まったく同じ順で並び, 非類は, 島根県の場合, ほとんどがホソトビウオと考えるこ

常によく保存されているが, ホソトビウオの結果は, これとができる. ところが, ホソトビウオのmtDNAに関するに沿うものであった.

報告はこれまで全くなかった. そこで, トビウオ類を鑑定

なお, 今回ホソトビウオは, ５個体の筋肉片を混合し,する際の基礎情報として, 島根県で最も漁獲のあるホソト

全mtDNAを増幅するためのDNA抽出に供した. このようビウオのmtDNAとその遺伝子構成をPCRの手法を用いてにして, ５個体中で次の８つの塩基置換が検出された.

決定した.

3109 (C/T), 3880 (A/G), 4951 (C/T), 6680 (C/T),

2.2

7808 (C/T), 8732 (A/G), 11,036 (A/G) および12,051

実験方法

2.2.1 mtDNAの増幅と塩基配列決定(A/C). 但し, 検出できていない塩基置換の存在, キメラ

ホソトビウオの筋肉片から, 全DNAを抽出し, まず下記の３つのプライマーセットによるPCRを行い, mtDNA

配列が含まれる可能性は否定できない.
2.3.2 タンパク質コード遺伝子
13個のタンパク質コード遺伝子のうち, 同じ側で３個の全領域を網羅する３つの断片を増幅させた. なお, プライ
24)

マーは既報を参考にし, 以下のウナギ に使われたものをリーディングフレームの重なりがあった. ATPase８と６用いた. 図３にその概要を示した.

は７塩基を, ND4LとND４は７塩基を, ATPase６とCO

L13562-ND5(5 -CTWAACGCCTGAGCCC-3 )Ⅲは１塩基をそれぞれ共有していた. 他の硬骨魚類と同様,

H3058-16S(5 -TCCGGTCTGAACTCAGATCACGTA-3 )全てのミトコンドリアのタンパク質コード遺伝子はGTG

L1854-16S(5 -AAACCTCGTACCTTTTGCAT-3 )でスタートするCOⅠを除き, ATG開始コドンで始まってH8168-CO2(5 -CCGCAGATTTCWGAGCATTG-3 )

いた (表２) . ホソトビウオのオープンリーディングフレー― 12 ―

永瀬：水産加工食品に含まれるトビウオ類の鑑定
ムはTAA (ND4L, ND5), TAG (ND1, COⅠ, ATPase

トランド複製開始点は５つのtRNA遺伝子クラスタで見ら

8, ND6), AGA (COⅡ) で終了し, 残りは不完全なストッ

れ (ウァンシー領域29) ), 長さは38塩基であった. この領

プコドン, TA− (ATPase6, COⅢ) もしくはT−(ND2,

域は, ステムにおいて13bpとループにおいて12ntの着実

ND3, ND4, cytb), を有していた (表２). なお, ２個のなステムループ二次構造に折り重ねる可能性を有している.

遺伝子 (COⅡと cytb) は, tRNAをコードする領域で重保存されたモチーフ (5 -GCCGG-3 ) はtRNACys 遺伝子中なっていた.

のステムの塩基に見られた.

2.3.3 リボゾームRNA (rRNA) 遺伝子およびホソトビウオmtDNAに見られる主要な非コード領域は,トランスファーRNA (tRNA) 遺伝子

tRNAProとtRNAPhe遺伝子の間に位置している. この非コー

ホソトビウオの２つのrRNA遺伝子は, イダテントビウ

ド配列 (868bp) は, control regionに相当して出現してオ28)の塩基配列とのシークエンスホモロジーによって同定いる. なぜなら, それはこの領域の特徴である保存シーク

した. 12Sと16SのrRNA遺伝子はそれぞれ943と1687塩基

エンスブロック (CSB) とターミネーションアソシエイツの長さであった. それらは, 他の脊椎動物と同様, tRNと推定される配列30),31)を持っているからである.

APhe とtRNALeu(UUR) 遺伝子の間に位置し, tRNAVal 遺伝子と３. PCR−RFLPを用いた各種加工食品中のは重なりがなく完全に分離していた. ホソトビウオのミト

トビウオ類の定性的検出

コンドリアゲノムは22個のtRNA遺伝子があり, rRNAとタンパク質コード遺伝子の間に点在している. (図３, 表

3.1

緒言

２)そのうち21個は, イダテントビウオが持つミトコンド

水産分野では, PCRを用いた多型分析法が多数開発され

リアtRNA遺伝子28)の塩基配列とのシークエンスホモロジーている. PCRによるDNA多型分析法は, ゲノムDNA全体

によって同定した. しかしながら, tRNASer(AGY)遺伝子は,にわたる広範囲から多型を分析する場合と, 限られた狭いコンピュータプログラムでは検出できず, 目視で確認して,範囲から多型を分析する場合の２つに大別される.

His

tRNA 遺伝子とtRNA

Leu(CUN)遺伝子の間に同定された. tR

PCR-RFLP (ポリメラーゼ連鎖反応―制限酵素断片長多NAのサイズの範囲は66から74塩基 (表２) であった.

型) 法は後者に属し, スケトウダラ32) , マグロ６) , 巻貝33)

2.3.4 非コード配列のような魚類鑑定に広く用いられている. この方法は, 狭ほとんどの脊椎動物と同様に, ホソトビウオのライトス

図３

い範囲を分析することから, あご野焼のような加熱工程に

ホソトビウオのミトコンドリアDNAのゲノム構造とシークエンス戦略

・ND６以外のすべてのタンパク質遺伝子はH鎖にコードされており, ND６遺伝子はL鎖にコードされている.
・tRNA遺伝子はアミノ酸コードの略号で示した. 遺伝子地図の上にH鎖にコードされているもの, 下にL鎖にコードされているものを示した.
・ミトコンドリアゲノムを全てカバーするDNA断片を増幅するPCRプライマーセット(L13562-ND5+H3058-16S, L1854-16S+H8168-CO2,
L7255-CO1+H15149ad)の位置関係を地図にそれぞれ示した.
・その他の60種のプライマーの相対位置は, 数字と矢印で示した.
・12Sと16S, リボソームRNA遺伝子；ND１〜６と４L, NADH 脱水素酵素複合体のサブユニット；COI〜III, チトクロムc 酸化酵素のサブユニット；ATPase 6 と8, ATP 合成酵素のサブユニット；cytb, チトクロムb；CR,― 13 ―

control region (Dループ領域)

島根県産業技術センター研究報告第50号(2014)

よるDNAの変性があるサンプルにも有効であるが, トビ

16S-F (5 -GTATCTTGACCGTGCGAAGGTAG-3 )ウオ類あるいはトビウオ類を含む加工食品で検討した報告

16S-R (5 -GTCTGAACTCAGATCACGTAGGAC-3 )はなかった. そこで, 前項で得られたホソトビウオ

次に, このプライマーセットを用いて, 表３と表４に示

mtDNAの部分配列と, 他のトビウオ類やあご野焼に使わした様々な魚および加工食品から抽出した全DNAを鋳型れる他のいくつかの魚種と比較し, PCR-RFLPによりあごにしてPCRを行い, 増幅産物を得た. 増幅産物は, 制限酵

野焼および各種トビウオ加工品からトビウオ類を定性的に

素 AfaⅠと MfeⅠ ( MunⅠ) で消化後, アガロースゲル電検出することを試みた.

気泳動, 染色後, UVライトで可視化して写真撮影した.

3.2

また2.2.1と同様にして, 増幅産物のシークエンスを行い,

実験方法
25)

ホソトビウオ ( C. hiraii, DDBJ/EMBL/GenBank受付

塩基配列を決定した. なお, MfeⅠと MunⅠは同一の制限

番号AB182653), マアジ34)( T. japonicus, 同AP003091),

酵素であるが, 製造メーカーにより商品名が異なるので以イダテントビウオ28)( Exocoetusvolitans, 同AP002933),

下括弧書きを併記する.

35)

3.3

およびスケトウダラ( T. chalcogramma, 同AB182300)のDNA配列を比較することにより, ミトコンドリア16SrR

3.3.1 あご野焼に使う魚種の塩基配列

NA遺伝子領域の３ 末端側を増幅する下記のプライマーセッ
トを設計した.

結果および考察

準備したユニバーサルプライマーセット16S-Fと16S-Rにより, 日本で漁獲される7種類のトビウオや, また同様に

表２

ホソトビウオのミトコンドリアゲノムの位置関係― 14 ―

永瀬：水産加工食品に含まれるトビウオ類の鑑定
あご野焼製造に用いられるマアジ, スケトウダラ, ミナミ
ダラ, クラカケトラギスの計11種類の魚肉から, それぞれ約530bpのPCR産物を増幅することができた. PCR産物
は, 塩基配列を決定し, ホソトビウオ以外のトビウオ６種
およびミナミダラ, クラカケトラギスについては, 塩基配列を登録した. (DDBJ/EMBL/GenBank受付番号AB4448
58-AB444865) 次に, 11種類の塩基配列を比較して, PCRRFLP解析でトビウオ類の同定が期待される制限酵素サイトを検索したところ, 制限酵素 AfaⅠと MfeⅠ ( MunⅠ)のサイト36) を認めた. AfaⅠは４塩基認識, MfeⅠ ( Mun
Ⅰ) は６塩基認識の酵素である. それぞれ, トビウオ類のPCR産物を203bpと326bpおよび217bpと312bpに切断するサイトであった. ２つの制限酵素サイトは, トビウオ類以外の魚種にはなかった. ホソトビウオとツクシトビウオについて, それぞれの種ごとに５個体のミトコンドリア16Sr
DNAの配列多型を確認したところ, 制限酵素サイトの変異はなかった. その他のトビウオ類は島根県沿岸では漁獲されないので, １個体のみ調べたが, 全てのトビウオ類に２つの制限酵素サイトが保存されていた.
3.3.2 RFLP解析による種特異的検出
図４および表３にトビウオ類とその他魚種のPCR-RFLPについて示した. トビウオ類７種におけるミトコンドリア

図４

制限酵素処理した各種DNA断片の電気泳動図

16SrDNA３ 末端側のRFLPパターンは, 期待されたPCR

A, AfaI；B, MfeI

産物プロファイルと一致し, それぞれ AfaⅠによる消化でlane M, 100-bp ladder marker；１, C. hiraii;

203bpと326bp,と MfeⅠ ( MunⅠ) による消化で217bpと２, C. heterurus；３, C. agoo;

312bpのDNA断片が生成し, 529bpのDNA断片はともに認４, C. pinnatibarbatus；５, C. poecilopterus;

められなかった. 一方, トビウオ類ではない４種のPCR産

６, C. cyanopterus；７, C. antoncichi;

物は, 両制限酵素で消化されなかった. クラカケトラギス,

８, T. chalcogramma；９, M. australis;

スケトウダラ, ミナミダラでは530bp付近, マアジでは550

10, T. japonicus；11, P. sexfasciata.

bpの１つのDNA断片が認められた. その結果, この方法
は, トビウオ類の特異的検出に有効であることが明らかに４に示した. Eマーク認定されたあご野焼の15サンプル,なった.

トビウオ魚肉を含まない野焼の２サンプルおよび他のトビ

次に, この方法を水産加工品に応用した. その結果を表

表３

ウオ加工品７種をPCR-RFLP解析に用いた. 全DNAを抽供試魚とそのPCR-RFLP― 15 ―

島根県産業技術センター研究報告第50号(2014)

出してから, ミトコンドリア16SrDNAの３ 末端側を増幅てトビウオ魚肉を含む加工品か否か定性的に検出することさせた. 530bp付近のDNA断片は, 製品の焼きと蒸しといっができた.

た調理方法にかかわらず, 全てのあご野焼および野焼で増６)

あご野焼, 野焼, アゴはんぺんについて, 530bp付近の幅された. 以前に水産缶詰の鑑定が報告 されているが,DNA断片はマアジを除くトビウオ以外の他魚種の未消化120bpもしくはそれ以下のPCR産物によるものであった.

DNA断片に一致すると考えられる. なお, マアジの未消

一般的に水産物は, 缶詰に加工される場合, Clostridium

化DNA断片は確認できなかった. このことは, 製造の際

botulinumや Bacillus cereusのような胞子形成菌を殺菌すにトビウオとトビウオ以外の魚肉を混合していることを示るために120℃近くで加熱される. すなわち, 加工品鑑定

唆している. PCR-RFLPによるこの方法は, 最小限の実験に応用できる十分な大きさのPCR産物を得ることは, 調理手法のみで簡単, 迅速に信頼のあるデータを得ることがで方法, すなわち調理温度や殺菌法に依存している. 増幅産

きる. 食品検査は, 日常調査に多数のサンプルを使うこと

物を, AfaⅠと MfeⅠ ( MunⅠ) で消化させたところ, あから, 時間とコストを抑える必要があるが, この点につい

ご野焼, 野焼, トビウオ加工品, のそれぞれ全てについて,ても十分に対応できる.

３つのDNA断片, AfaⅠでは203bp, 326bp, 529bpのうち４. あご野焼中のトビウオ類の定量的検出

３本もしくは一部のDNA断片, MfeⅠ ( MunⅠ) では217
bp, 312bp, 529bpのうち３本もしくは一部のDNA断片が

4.1

緒言

３項において, 各種加工食品からトビウオを定性的に検確認できた.
具体的には, 15種のあご野焼サンプル全てにおいて,出できるPCR-RFLPの技術が確立され, サンプル中にある

AfaⅠ, MfeⅠ (MunⅠ) による消化ともに３本のDNA断

トビウオの有無の確認が可能になった. しかしながら, 島

片全てが確認された. これに対して, トビウオ魚肉を含ま根県が認定するEマーク制度では, あご野焼中に含まれるない野焼の２サンプルについては, AfaⅠ, MfeⅠ ( Mun

トビウオの有無だけでなく, その含量を検出する必要があⅠ) による消化ともに529bpの１本のDNA断片が確認され,る. 検査対象となるサンプルは加工履歴が不明の加工食品

他の２本のDNA断片は確認されなかった. またトビウオ

であり, DNAがどのくらい変性しているか全くわからな

加工品７種については, 両酵素による消化ともに529bp以

い. よって, 定量的検出の信頼性を上げるためには, 複数

外の２本のDNA断片が確認されたが, 他の魚肉も含んでの方法で検査することが望ましいと考えた. そこで, PCR-いると想定されるアゴはんぺんのみでは, 529bpを含む３

RFLPに加えて, 新たに画像解析技術を組み合わせた方法,

本のDNA断片が確認された. 以上のことから, AfaⅠ,

およびリアルタイムPCRを用いる方法で, あご野焼中のト

MfeⅠ (MunⅠ) の両酵素の消化により確認される, 203bp

ビウオすり身の定量を試みた.

と326bpおよび217bpと312bpの２つのDNA断片はトビウ

4.2

画像解析を用いた加工食品中のトビウオ類のオ魚肉由来であり, 529bpのDNA断片は他魚種の魚肉由来定量的検出であると結論できる. これにより, 全てのサンプルについ4.2.1 実験方法

表４

トビウオ各種加工品のPCR-RFLP― 16 ―

永瀬：水産加工食品に含まれるトビウオ類の鑑定
4.2.1.1 スタンダードあご野焼の調製と市販製品

オすり身の相対量が増加するに従って, 500bp断片の蛍光

２種類の冷凍すり身を用いて, トビウオ含量を明らかに強度は減少し, 一方で200bpと300bpの断片は蛍光強度がしたスタンダードあご野焼を作成した. 用いたのは, ホソ増加した. この傾向は, AfaⅠおよび MunⅠ ( MfeⅠ) でトビウオ C. hiraii の自家製冷凍すり身およびスケトウダラ

消化した両方のサンプルで認められた. 結果の再現性につT. chalcogramma (Alaska pollack) の冷凍すり身 (二級,

いては, それぞれのスタンダードサンプルについてDNA

日水製) である. トビウオとスケトウダラすり身の水分含抽出およびPCRを繰り返し確認した (n＝4). その結果,

量は, 最終的に77％であった. 2種類の冷凍すり身は, ３切断したDNA断片の蛍光強度およびトビウオすり身量と% (w/w) NaClを加えて塩ずりし, さらに適量の水道水の関係を用いることにより, 市販製品について定量分析をを加えて適当なねばりが出るまで塩ずりした. 水道水の総することができた.

量は, トビウオで5% (w/w), スケトウダラで30% (w/w)37)

つまり, スタンダードサンプルに含まれる実際のトビウであった. その後, それぞれの塩ずり身を様々な割合 で

オすり身含有量との関係を決めるのに, まず画像解析を用混合した. なお, 相対的なトビウオすり身含量は, 水道水

いて, 500bp断片の蛍光強度をそれぞれのスタンダードサを加水する前の最初の冷凍すり身重量に基づいた. 混合しンプルについて測定した. この際, 画像解析については,た塩ずり身は40℃で30分坐らせ, ドライオーブンで200℃,

データのバックグランド補正を行い, ゲル染色の影響を考

30分間焼いた後, 急冷した. また, 定量性判定のサンプル慮した. 図6に500bp断片の相対蛍光強度と実際のトビウとした市販製品は, マーケットで購入した. スタンダード

オすり身含有量の間の関係を示す. 相対蛍光強度は次のと

あご野焼と市販製品は半分に切り, かまぼこゲルの中心部おり計算した.

(加熱された表面の反対側) からサンプルを採取して実験に供した.
4.2.1.2 RFLP分析と画像解析による定量
3.2に示した方法で, RFLP分析を行い, デジタル化された画像をソフトウェアを使い解析した. 制限酵素 AfaⅠとMunⅠ ( MfeⅠ) 処理を用いたRFLP法の結果に基づき,
トビウオすり身含量を決定するのに, 500bpまでのバンドの蛍光強度を調べた. 500bpのバンドについて, 制限酵素
処理前の蛍光強度から処理後の蛍光強度を引き, さらに処理前の蛍光強度で割ることにより相対強度を求めた.
4.2.2 結果および考察
4.2.2.1 トビウオすり身含量と相対蛍光強度との関係
トビウオすり身のみのPCR産物を制限酵素 AfaⅠと Mun
Ⅰ ( MfeⅠ) で消化すると, どちらの酵素処理についても,トビウオすり身に特有な約200bpおよび約300bpの２本のDNA断片が認められ, 約500bpの１本のDNA断片だけは消失した. また, トビウオすり身とスケトウダラすり身の混合物では, ３本全てのDNA断片が認められたことから,
制限酵素処理で残存する500bpのDNA断片の量は, サンプ
ル中の非トビウオすり身の総量を示していることが示唆された. よって, 消化前の500bp断片の蛍光強度から消化後の蛍光強度を引いた値は, トビウオすり身の相対量を反映していると考えられる.
図５に, AfaⅠと MunⅠ ( MfeⅠ) でPCR産物を消化させた時の代表的な結果について示した. これによると, ト
ビウオすり身だけ含むT100サンプルでは, ２本のDNA断片 (200bpと300bp) が認められた. また, トビウオすり
身とスケトウダラすり身の両方を含むT20〜T80サンプル

図５

では, ３本のDNA断片 (200b, 300bp, 500bp) が認めら

制限酵素処理した各種スタンダード
あご野焼DNA増幅断片の電気泳動図

れた. そして, スケトウダラすり身だけ含むT0サンプル

A, AfaI；B, MunI, (−), undigested；(＋), digested

では, 500bpのDNA断片のみが認められた. また, トビウ

lane M, 100-bp ladder marker― 17 ―

島根県産業技術センター研究報告第50号(2014)

図６のデータ(n＝4)の回帰式から, それぞれの制限酵

製品の表示は適正とする. そして第三に, AfaⅠと MunⅠ

素による切断につき, 以下の検量線を得ることができた.

( MfeⅠ) の結果が異なった場合であるが, その製品の表

2

AfaI digestion: y = 0.0084x + 0.0757, R = 0.977 (2)示は条件付きで適正であるとする. それは, 酵素反応がう2

MunI digestion: y = 0.0091x + 0.0153, R = 0.974 (3)まくいかなかった可能性があるからである.

それぞれの決定係数は0.977と0.974であり, 相対蛍光強4.2.2.2 市販あご野焼におけるトビウオすり身相対量の決定度と実際のトビウオすり身含有量との間に高い相関を示していた. よって, それらの検量線を使えば, あご野焼中のスタンダードサンプルの結果を用いて, 島根県によりE

トビウオすり身の相対量を評価できるはずである.(2)式おマーク認証がされている５個の市販あご野焼製品およびト

よび(3)式によれば, トビウオすり身含有量がEマーク制

ビウオすり身を含まずEマーク認証はされていない２個の度の70％にあたる相対蛍光強度は, それぞれ AfaⅠで0.66,

野焼製品についてトビウオ含有量を評価した. 結果を表５

MunⅠ ( MfeⅠ) で0.65に対応している.

に示す. 野焼製品 (N１, N２) は, 相対蛍光強度が0.15

よって, 期待される相対蛍光強度は, それぞれ0.66と程度となり, トビウオすり身を含まないか, もしくは含ん

0.65以上である. そこで, あご野焼のトビウオ含量についでいても微量であると評価された. 対照的に, ４つのあごて次のように考えることができる. まず, Eマークの付い

野焼製品 (E１, E２, E３, E４) の相対蛍光強度は0.67

た市販あご野焼を評価する場合, 結果は３つのケースに分から0.82の間であり, それらの製品は70％以上のトビウオけることができる. 第一に, Eマークの付いた市販あご野

すり身を含み, 全ての製品について表示が適切であること

焼製品について切断されたDNA断片の相対蛍光強度が,を示していた. また, すり身中の原料魚由来DNA含有量

それぞれの数値, すなわち Afa Ⅰについて0.66, Mun Ⅰに基づき, トビウオすり身含有量を計算することができた.

( MfeⅠ) について0.65の両方を下回る場合, その製品の表

これらの結果より, Eマーク認証がされているあご野焼示は誤りとする. 第二に, 切断されたDNA断片の相対蛍のうち, １個 (E15) を除いた他の４個のEマーク付サン

光強度が, それぞれの数値, すなわちAfaⅠについて0.66,

プル全てこのPCR-RFLP鑑定テストにパスしており, Eマー

MunⅠ ( MfeⅠ) について0.65の両方を上回る場合, そのクを証明する最初のスクリーニングとしてこの方法が適していることを示している. E15については, 表５に示すよ
うに, 相対蛍光強度は同一サンプルについてAfaⅠでは0.66
以上, MunⅠ ( MfeⅠ) では0.65以下であり, 一方のみ基準を満たした. この結果は, サンプル誤差あるいはロット
誤差のどちらによるものか明確ではない. このような場合,
その製品はPCR-RFLP鑑定テストに追試験の条件付きでパスしていると判定した. このサンプルは, 違うロットを分析することにより, 基準を満たすことが確認された.
つまり, Eマーク認証製品を検証するのに, PCR-RFLPを用いた画像解析法により, あご野焼製品からトビウオすり
身含量を定量することができた. 分析時間については, 約
１日である. この方法は, 正確性は改良する必要があるが簡単にできる. 但し, この方法をあご野焼以外の加工食品に応用する場合は, その都度, 新しい検量線を作る必要がある.
4.3

リアルタイムPCRを用いた加工食品中のトビウオ類の定量的検出

4.3.1 実験方法
4.3.1.1 トビウオ類の種特異的プライマーおよびユニバーサルプライマーの設計3.2で設計したプライマーセット
16S-F (5 -GTATCTTGACCGTGCGAAGGTAG-3 )16S-R (5 -GTCTGAACTCAGATCACGTAGGAC-3 )で増幅される, 16SrRNA遺伝子領域の３ 末端側の塩基配
図６

スタンダードあご野焼のトビウオ含量と相対蛍光強度の関係

列のアライメント38)を行った. そして, トビウオ類に特徴的な塩基配列の保存領域に基づいて, 下記のトビウオ類の― 18 ―

永瀬：水産加工食品に含まれるトビウオ類の鑑定
種特異的プライマーセットを設計した.

ドリア16SrDNAについてトビウオを特異的に増幅するもTobi16SF3 (5 -CAGACCATGCTAATTAGACCT-3 )のと全ての魚を増幅するものを設計した. そして, 増幅産

Tobi16SR (5 -TCTGGGAGAAAAGTTCTCCTGCTC-3 )物がトビウオ特異的であることを確認するために, ７種の25)( C. hiraii ,トビウオおよび４種のトビウオ以外の魚種を鋳型として,

DDBJ/EMBL/GenBank受付番号AB182653), ツクシトビ

プライマーセット (Tobi16SF3/ Tobi16SRとUniv16SF2/

ウ オ36) ( C. heterurus , 同 AB444858) , ト ビ ウ オ36) ( C.

Univ16SR2) を用いてPCR増幅を行った. まず, それぞれここで用いたものは, ホソトビウオ

36)(C. pinnatibarbatus,の種に対して普遍的な反応性があることを確認するのに,( C. poecilopterus, 同AB

ユニバーサルプライマーセット (Univ16SF2とUniv16SR2)

agoo, 同AB444859), ハマトビウオ
同AB444860), アヤトビウオ
36)

36)

( C. cyanopterus, 同AB4448を用いたところ, 図７Aのとおり, 全ての魚種で明確なバ

62), オオメナツトビ36) ( C. antoncichi, 同AB444863) でンドが認められた. 次に, トビウオプライマーセット (Tある. 次に, あご野焼製造に用いる全ての魚について, ト

obi16SF3とTobi16SR) を用いた時は, 図７Bのとおり,

ビウオ類と上記のトビウオ以外の魚にある塩基配列の保存

トビウオ種のみで明確なバンドが認められた. すなわち,領域に基づいて, 下記のユニバーサルプライマーセットを設計したトビウオプライマーは, トビウオに種特異的であ設計した.

ることと, ユニバーサルプライマーは, あご野焼製造に使Univ16SF2 (5 -CTAGGGATAACAGCGCAATCC-3 )う全ての魚種を増幅することを確認した.

Univ16SR2 (5 -AATCGTTGAACAAACGAACCCT-3 ).

4.3.2.2 トビウオすり身含量と, スタンダードあご野焼

ここで用いたものは, 上記の７種類のトビウオ類およびからリアルタイムPCRを用いて算出したトビウ

444861), カラストビウオ

スケトウダラ35) ( T. chalcogramma, DDBJ/EMBL/GenB
AB444864), マアジ
36)

オすり身実測値の関係の推論( M. australis, 同

トビウオすり身を100％ (T100) から0％ (T0) まで含( T. japonicus, 同AP003091), ク

んでいるいくつかのスタンダードあご野焼について, リア

ank受付番号AB182300),ミナミダラ
34)

36)

( P. sexfasciata, 同AB444865) である.

ルタイムPCRで測定した相対DNA量と実際のトビウオす

また, 定量PCRの標準曲線を作るのに, プライマーセット

り身重量の間の関係を求めた. トビウオすり身含量とリア

16S-Fと16S-Rで鋳型DNAを増幅した. これらのプライマー

ルタイムPCRで決定された魚の相対DNA量との相関関係

セットは, トビウオ類の特異的検出およびよびトビウオのを図８に示す. なお, 相対DNA量は以下のとおり計算し

定 量 (Tobi16SF3 と Tobi16SR) お よ び 全 て の 魚 の 定 量

た.

ラカケトラギス(Univ16SF2 とUniv16SR2) に用いた.
4.3.1.2 試料調製とリアルタイムPCR
スタンダードあご野焼は, 4.2.1.1と同様に作成した. 市
販製品は, マーケットで購入した. DNA抽出の際には,サンプルを凍結乾燥し, サンプルミルで粉末化した. 粉末化したサンプルは,

図８のデータに基づき, 以下の近似曲線を得た.
y ＝1.08x −3.20, R2＝0.977

TE bufferに懸濁した後, 沸騰水中で加熱してその上清を, リアルタイムPCRのDNA鋳型とトビウオの相対DNA量と実際のトビウオすり身含量の間して用いた.

で, 決定係数(R2 ＝0.977)は高い相関関係を示した. よっ

リアルタイムPCRは, SYBR Greenとトビウオ特異的プ
ライマーセット (Tobi16SF3とTobi16SR) を用いて行った. また, 全ての魚肉を検出する
ポジティブコントロールとして,て, この近似式をあご野焼製品におけるトビウオすり身の相対重量を評価するのに用いた.
表５

ユニバーサルプライマーセット(Univ16SF2とUniv16SR2) を用いた. 標準曲線は, ホソトビウオC.
hiraiiからプライマーセット (16SFと16S-R) で増幅させたDNA断片を段階希釈することで求めた.
4.3.2 結果および考察
4.3.2.1 プライマー設計と特異性
２つのプライマーセットは, あ
ご野焼に含まれるトビウオの相対含量を評価するために, ミトコン
― 19 ―

トビウオすり身含量の定量

島根県産業技術センター研究報告

第50号

図８

(2014)

リアルタイムPCRによる実際のすり身
含量と相対DNA量との関係

オすり身を含むことを検証できる方法の開発を試みた. 図
８のスタンダードサンプルから得た結果から, ８つの市販
あご野焼製品におけるトビウオ含有量を評価した. これらの製品は, 異なるメーカー製であり, いくつかは島根県からEマーク認証を受けていた. また, トビウオ使用の表示がない野焼と蒸し板かまぼこについても分析した. その結
図７
A,

DNA

果を表６に示した. リアルタイムPCR分析によれば, 相対

あご野焼に用いるトビウオ類およびその他の魚種の16SrDNAのPCR増幅結果
fragments

amplifiedwithuniversal

DNA量が０％であったことから, あご野焼以外の製品はprimers

トビウオすり身を含まないことを確認し, 一方でEマーク

Univ16SF2 andUniv16SR2.；B, DNA fragments amplified withの付いていない７つのあご野焼製品の相対DNA量は, 32

flying fish specific primers Tobi16SF3 and Tobi16SF3.

％から65％の間であった. 対照的に, ２つのEマーク付き

lane M, 100-bp ladder marker； １, C. hiraii；のあご野焼製品は, 74％と76％で, すなわち70％以上のト

２, C. heterurus； ３, C. agoo；
４, C. pinnatibarbatus； ５, C. poecilopterus；

ビウオすり身を含んでおり, これらの製品はEマークに適６, C. cyanopterus； ７, C. antoncichi；

合していた.

８, T. chalcogramma；
10, T. japonicus；

リアルタイムPCRに用いる4.3.1.1の３組のプライマーセッ

９, M. australis;11, P. sexfasciata.

トは, 短いDNA断片でも増幅できるように設計した. つまり, DNAがレトルト食品のような高温や高圧で加工したサンプルから増幅される時, 短いDNA断片を増幅する

表６

プライマーが有利だからである. あご野焼の製造には, 図市販されている各種あご野焼に含まれる
トビウオの定量９のとおり, いくつかの加工工程がある. 加工をする際に,単位重量あたりのDNA含量は, 加水量やその他の添加物量により各ステップで変動している. しかしながら, この方法では, 単にすり身中に存在する総DNA量に基づいた
トビウオすり身のDNA量の相対値から, トビウオすり身の含量を計算する. そのため, 製造方法が違っても正確な検出が可能である.

５. ま

と

め

我が国では, 2000年代に, 産地偽装, 賞味期限改ざん,
事故米不正転売など, 食品関連業者が消費者を欺く事件が次々と起こったことから, 水産物､ 農産物､ 畜産物およびその加工品など食品全般に関して, 消費者の安全・安心の4.3.2.3 Eマーク認証を検証するためのあご野焼製品

関心が高まった. このことにより, 2009年９月からは, 国におけるトビウオすり身の相対含有量の決定

により消費者庁が設置されている. 一方, 関係研究機関にEマーク認証されたあご野焼製品が, 70％以上のトビウ

おいては, 様々な食品の科学的な鑑定を目的とした, 研究,― 20 ―

永瀬：水産加工食品に含まれるトビウオ類の鑑定

図９

あご野焼製造フローチャート

文

技術開発が盛んに行われるようになった.

献

本研究は, このような時代背景のもと行われ, 島根県の特産品であるあご野焼に使用されるトビウオの定量が最終

１) 阿部宗明. 原色魚類大圖鑑. 北隆館. 1987, 1029p.

目的であった. 研究の手順としては, 主要なトビウオであ２) Ministry

るホソトビウオのミトコンドリア全塩基配列の決定を行い,も, また加熱等の加工がされていても, 定性的, 定量的鑑定が可能になった. すなわち, あご野焼Eマーク基準の分

Forestry

andFisheries.

(in Japanese).
３) 文部科学省科学技術学術審議会資源調査分科会. 五訂増補日

リアルタイムPCR法という二種類の方法で定量的検出を試みた. そして, トビウオ類に関して形態的な特徴がなくてAgriculture,

Agriculture, Forestry and Fisheries). Tokyo, Japan. 2006,

それを元に, まずはPCR−RFLP法を用いたトビウオ類の定性的検出を試みた. 次のステップとして, 画像解析法とofProduction of fishery and aquaculture. MAFF (Ministry of

本食品標準成分表. 2008, 508p.
４) 高知県立消費生活センター. 商品テスト報告No. 40. 2003,
12p.
５) Chow S.; Nohara K.; Tanabe T.; Itoh T.; Tsuji S.; Nshikawa
Y.; Uyeyanagi S.; Uchikawa K. Genetic and morphological析法を確立することができた. また, 同時にトビウオ類を

identification of larval and small juvenile tunas (Pisces:

用いた製品全般に関しても鑑定が可能となった. 今後は,

Scombridae) caught by a mid-water trawl in the western

地域食品ブランドや食の安全・安心に関する分析技術とし

Pacific. Bulletin ofて活用が期待される. なお, この技術は島根県が出願人となり, 特許39)を取得している.

謝

8, p. 1-14.
６) Ram J.L.; Ram M.L.; Baidoun F.F. Authentication of canned
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本研究を遂行するにあたりご指導とご鞭撻を賜りました
県立広島大学教授

Fisheries Research Agency. 2003, vol.

森永力博士をはじめ関係各位に深甚な

７) Namikoshi A.; Takashima Y.; Iguchi J.; Yanagimoto T.;

る謝意を表します.

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― 21 ―

島根県産業技術センター研究報告

第50号

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