島根県産業技術センター研究報告第58号 （2022）

ノ ー ト

高速液体クロマトグラフ–四重極飛行時間型質量分析計を用いた清酒の品質予測
牧野

1．目

正知*・大渡

康夫**・秋吉

渚月**・田畑光正*

よって清酒オリゴ糖が 3），また LC 部に低流量液体クロマ

的トグラフを用いた LCMS によって山廃仕込み清酒のメタ

清酒には原材料ならびに発酵に関与する酵母・麹菌など

ボライトが分析された 4）．岩下らの研究グループは，逆相微生物に由来する代謝産物（以下，メタボライトと略す）

クロマトグラフィーカラムを用いた LCMS によって 198

が 280 種類以上含まれており，それらが清酒の香味を特徴

種の清酒メタボライトを同定する方法を構築し，複数の醸1）付けている ．メタボライトの種類やその濃度は，使用す造条件から得られた清酒を分析することで醸造パラメー

る米の種類やその精米歩合，醸造に用いる酵母や麹菌の株

タとメタボライトの関係を明らかにした 5）．

といった原材料の特徴のほか，米の吸水歩合，麹の破精込

このような背景から，筆者らはこれまでに取り組んできみ状態や，醸造時の温度や時間といった醸造パラメータにた GCMS による清酒の評価方法に，新たに LCMS 測定を

よって影響を受ける．そのためメタボライトの全体像と醸組み合わせることによって，より多角的に清酒の特徴を機

造パラメータの関係に対する理解とその利用は，清酒の香器分析で捉えることができると考えた．そこで本研究は平

味特性や酒質を科学的にコントロールする新しい醸造技

成 28 酒造年度島根県新酒技術研究会に出品された清酒を術として期待されている．そのような背景から島根県産業試料として LCMS 測定し，官能評価で分類された品質，香技術センターでは，ガスクロマトグラフ－質量分析計（以気成分量，吟醸酒と純米酒の特徴などが清酒 LCMS データ

下，GCMS と略す）を用いメタボライトに注目した清酒のから説明できるか検証したので報告する .

2）

客観的評価法の開発に取り組んできた ．

2．試料および方法

GCMS は，比較的高分解能で保持時間（以下，RT と略す）再現性の高い測定が可能で，気体を移動相とする仕組

2.1

みから揮発性メタボライトの測定に適している．またアミ

2.1.1

分析試料
清酒試料

ノ酸，糖や核酸塩基など不揮発な親水性メタボライトのう本研究では，平成 28 酒造年度島根県新酒技術研究会（以ちいくつかは，誘導体化することにより測定可能である．

下，研究会と略す）において島根県内の酒造メーカーより

しかしメタボライトの中には誘導体化できない物質ある「吟醸酒の部」と「純米酒の部」に出品された合計 134 点

いは誘導体化しても揮発しないもの，また熱分解するものの清酒を試料とした（以下，「吟醸酒の部」と「純米酒のもあり，GCMS によって試料に存在する全てのメタボライ部」にそれぞれ出品された清酒を吟醸酒と純米酒と略す）．

トの測定をカバーすることは難しい．そのため分析対象の酒造メーカーによっては，同一ロット（醪）に由来する清

化学的特徴に応じて別の測定系である高速液体クロマト

酒が複数出品された（例：斗瓶違い）．これらの品質差につグラフ－質量分析計（以下，LCMS と略す），キャピラリー

いては本研究では取り扱わないこととし，研究会における電気泳動－質量分析計や核磁気共鳴装置なども用いられ

官能評価の結果，同一メーカー酒のうち指摘事項が重複してきた．

後述する品質クラスの近いものについては，本研究の研究

LCMS は，保持時間の揺らぎや汎用同定 MS スペクトルライブラリが利用できないなどの課題があるものの，幅広

対象から除外することとした．
2.1.2

清酒モデル試料

い化学的特性に対して適応可能で，また誘導体化など前処

データを統合するプロセスの一つであるデータアライ

理が必要ないことから食品分野での測定に活用されてきメントでは，RT と質量分析計の質量電荷比（以下，m/z とた．特に清酒などの液体試料の場合，希釈してそのまま測略す）のそれぞれの許容範囲の設定が必要である．それら定に供することができるという簡便性のため，近年は親水を求めるため清酒に含まれる成分 1）の一部を含む以下の溶性相互作用クロマトグラフィーカラムを用いた LCMS に液（以下，清酒モデル試料と略す）を調製し，これを繰り＊

食品技術科，＊＊ 生物応用科

返し測定して評価を行った．15%（v/v）エタノール，1.4%（w/v）グルコース，110 mg/L L- アルギニン，110 mg/L
─8─

牧野・大渡・秋吉・田畑：高速液体クロマトグラフ-四重極飛行時間型質量分析計を用いた清酒の品質予測
アルデヒド,
イソバレルアルデヒド, n-プロピ
0.18 mm, 0.18酢酸エチル,µm）で，溶出条件としてオーブンの温度をル
アルコー
ル ,: 35℃，1.00–6.25
イ ソ ブ チ ル ア ルmin
コー
ル, 酢 酸 イ ソ ア ミ ル ,0.00–1.00
min:35–140℃，6.25–9.25

表
1 質量分析計の測定条件
質量分析計の測定条件
表1
GCMS

イソアミルアルコール,
フェネチルアmin :140–230℃, 9.25–11.3カプロン酸エチル,
min : 230℃ とした．定量した成ルコール.
分は以下のとおり：アセトアルデヒド , 酢酸エチル , イソ

GCMS 7000B (Agilent)装置
ヘッドスペースサンプラー

TurboMatrixHS40

2バレルアルデヒド.4 グ ル コ ー ス
濃プロピルアルコール度測定, n, イソブチルア(PerkinElmer)

抽出法

60o C, 24 min

注入口温度, イオン源温度

250 o C, 200 o C

トランスファーライン温度

230 o C

清酒に含まれるグルコース濃度は，グルコースCIIテスト
ルコール, 酢酸イソアミル , イソアミルアルコール, カプ
ワコー(富士フイルム和光純薬)で測定した．
値は重量%とし
ロン酸エチル , フェネチルアルコール .
て求めた．
2.4 グルコース濃度測定

2.清酒に含まれるグルコース濃度は，グルコース
5 LCMS分 析
CII テス

MRMトランジション
アセトアルデヒド

44 m/z > 43 m/z

酢酸エチル

70 m/z > 55 m/z

イソバレルアルデヒド

86 m/z > 58 m/z

n-プロピルアルコール60 m/z > 59 m/z

イソブチルアルコール74 m/z > 41 m/z

酢酸イソアミル70 m/z > 55 m/z

イソアミルアルコール70 m/z > 55 m/z

カプロン酸エチル

115 m/z > 87 m/z

フェネチルアルコール122 m/z > 91 m/z

試料は2.3
mg/Lカフェイン(和光純薬)含有メタノールに
トワコー（富士フイルム和光純薬）で測定した．値は重量％て10倍希釈し，遠心分離して得られた上澄み液とした．用として求めた．

いた質量分析計は四重極飛行時間型で，その分析条件を表
2.5 LCMS 分析
1に示した．分離に用いたカラムはACQUITYUPLC HSS T3
試料は 2.3 mg/L カフェイン（和光純薬）含有メタノー(1.8μm,102.1mm×150 mm， Waters)で，0.1%ギ酸含有水とルにて倍希釈し，遠心分離して得られた上澄み液とし0.1%ギ酸含有アセトニトリルによるグラジエント溶出とした．用いた質量分析計は四重極飛行時間型で，その分析た．溶出条件は0.0–5.0
min: 0%, 5.0–15 mn:0–100%とし，オ条件を表 1 に示した．分離に用いたカラムは
ACQUITY
o C，流速は0.3 mL/minとした．繰り返し測定は，ーブンは40UPLC HSS T3（1.8 µm, 2.1 mm × 150 mm，Waters）で，全ての試料を一通り測定してからそれを更に2回繰り返す
0.1% ギ酸含有水と 0.1% ギ酸含有アセトニトリルによるグ方法とした(測定セット1，2，3)．このとき清酒モデル試料
ラジエント溶出とした．
溶出条件は 0.0–5.0 min: 0%, 5.0–15

LCMS

は10回の清酒試料測定後に1回測定されることとし，
このシ
mn:0–100% とし，オーブンは 40℃，流速は 0.3 mL/minとーケンスを測定セット内のサブセットと設定した．各測定した．繰り返し測定は，全ての試料を一通り測定してからNexera (Shimadzu)
装置

micrOTOF-QII

セットにおけるサブセットの順序は，質量分析計の感度振それを更に 2 回繰り返す方法とした（測定セット 1，2，3）．
れや日間誤差の影響を最小化するためランダム化した．な
このとき清酒モデル試料は 10 回の清酒試料測定後に 1 回(Bruker Daltonics)
ドライガス流量，温度8.0 L/min, 200 o C

イオン源，極性，電圧

ESI, ポジティブ, 4500 V

ネブライザー

0.16 MPa

サンプリングレード，範囲

1.0 s , 50–1000 m/z

おいずれの測定においても質量電荷比補正用に測定開始後測定されることとし，このシーケンスを測定セット内のサ
0.0–0.5
minにわたり5 mmol/Lのギ酸ナトリウムを質量分析
ブセットと設定した．各測定セットにおけるサブセットの計に導入した．
順序は，質量分析計の感度振れや日間誤差の影響を最小化–1

110 mg/L L-アスコルビン酸，130 mg/L チアミン，7.0 mg/L
L- チロシン , 130 mg/L L- プロリン，120 mg/L L- アスパ
リボフラビン.
ラギン酸，120 mg/L L- メチオニン，100 mg/L ロイシン，

2.120
2 mg/L
官 能DL
評-価ピログルタミン酸，110 mg/L パントテン酸

官能評価は研究会にて6名の審査員が審査カード 6) に従っ
カリウム，120 mg/L バニリン，110 mg/L L- アスコルビて実施した．本研究における官能評価データはここで記録
ン酸，130 mg/L チアミン，7.0 mg/L リボフラビン .
された官能評価プロファイルとした．また本研究における2.2 官能評価
清酒の品質クラスは，研究会の審査では総合評価の悪いも官能評価は研究会にて 6 名の審査員が審査カード 6） にのを脱落させながら複数回(純米酒の部は3回，吟醸酒の部
従って実施した．本研究における官能評価データはここでは4回)審査されたことを反映させ，審査された回数とした．
記録された官能評価プロファイルとした．また本研究におすなわち1回目の審査で脱落した清酒の品質クラスは1，4回ける清酒の品質クラスは，研究会の審査では総合評価の悪
目の審査まで残ったものは4とした．
いものを脱落させながら複数回（純米酒の部は 3 回，吟醸

2.3

GCMS分 析酒の部は 4 回）審査されたことを反映させ，審査された回試料0.9 mLは内部標準溶液(アセトン-d6 ，1-ペンタノー数とした．すなわち 1 回目の審査で脱落した清酒の品質ク
ル，カプロン酸メチルの混合液)0.1 mLとガラスバイアル中
ラスは 1，4 回目の審査まで残ったものは 4 とした．
で混合し，ヘッドスペースサンプラーを接続したトリプル
2.3 GCMS 分析
四重極型GCMSにて分析した．質量分析計の条件は表1に示
試料 0.9 mL は内部標準溶液（アセトン -d6，1- ペンタ
した．使用したカラムはDB-WAX(20 m, 0.18 mm, 0.18 µm)
ノール，カプロン酸メチルの混合液）0.1 mL とガラスバ
で，溶出条件としてオーブンの温度を0.00–1.00 min : 35oC，イアル中で混合し，ヘッドスペースサンプラーを接続し1.00–6.25 min :35–140oC，6.25–9.25 min :140–230oC, 9.25–11.3
たトリプル四重極型 GCMS にて分析した．質量分析計のmin : 230oCとした．定量した成分は以下のとおり：アセト
条件は表 1 に示した．使用したカラムは DB-WAX（20 m,

2するためランダム化した．なおいずれの測定においても質.6 LCMSデ ー タ の 統 合
2量電荷比補正用に測定開始後.6.1 ア ラ イ メ ン ト パ ラ メ0.0–0.5
ー タ ーminの決定にわたり
5 mmol/は じ め に 全 て の LCMS デ ー タ の 質 量 電 荷 比 を ，L のギ酸ナトリウムを質量分析計に導入した．
DataAnalysis 4.0 (Bruker Daltonics)により同一データ内のギ
2.6 LCMS データの統合
酸ナトリウムマススペクトルを基準に補正した．次に清酒
2.6.1 アライメントパラメーターの決定
モデル試料を測定したLCMSデータをMS-DIAL7)で解析し，は じ め に 全 て の LCMS デ ー タ の 質 量 電 荷 比 を，標準成分ごとにRTとプレカーサイオンのm/zを抽出した．
DataAnalysis 4.0（Bruker Daltonics）により同一データ内
この操作を全ての清酒モデル試料(n=22)で行い，標準成分のギ酸ナトリウムマススペクトルを基準に補正した．次にごとにRTとm/zを整理してそれぞれの標準偏差を求めた．
清酒モデル試料を測定した LCMS データを MS-DIAL7）で本研究では標準成分間で標準偏差を比較してから最大値を解析し，標準成分ごとに RT とプレカーサイオンの m/z を求め，それを5倍した値をピークアライメントにおけるRT抽出した．この操作を全ての清酒モデル試料（n=22）で行とm/zのそれぞれの揺らぎの許容範囲とした．
い，標準成分ごとに RT と m/z を整理してそれぞれの標準2偏差を求めた．本研究では標準成分間で標準偏差を比較し.6.2 デ ー タ セ ッ ト の 作 成

次 に 清 酒 試 料 を 測 定 し た LCMSデ ー タ の ピ ー ク 検 出 をてから最大値を求め，それを 5 倍した値をピークアライメ
MS-DIALによって行った．先に求めた許容範囲にてデータ
ントにおける RT と m/z のそれぞれの揺らぎの許容範囲と間のアライメントを行い，RTとm/zの組み合わせたデータ
した．
ポイント(以下，マーカーと略す)を定めた．次に試料ごとに2.6.2 データセットの作成
マーカー×ピークエリア面積で整理し，3次元構造(試料名
次に清酒試料を測定した LCMS データのピーク検出を×マーカー×ピークエリア面積)を有するデータマトリッ
MS-DIAL によって行った．先に求めた許容範囲にてデー
クスがLCMSデータセットとして出力された．
タ間のアライメントを行い，RT と m/z の組み合わせたデー

2.6.3 デ ー タ リ ダ ク シ ョ ン

タポイント（以下，マーカーと略す）を定めた．次に試料測定再現性の乏しいマーカーを解析から除外するため，ごとにマーカー×ピークエリア面積で整理し，3 次元構造─9─

島根県産業技術センター研究報告第58号 （2022）

表 2清酒試料の品質クラスとグルコース濃度および香気成分の統計量
清酒試料の品質クラスとグルコース濃度および香気成分の統計量
表2
清酒の属性

吟醸酒

品質クラス

1

試料数（測定データ数）

12(36)

項目

平均値

*

純米酒

2

3

4

1

11(33)

9(27)

8(24)

11(33)

最小値

最大値

平均値

*

2

3

9(27)

6(18)

最小値

最大値

グルコース(%(w/w))

2.4±0.6

1.5

4.0

2.0±1.1

0.50

4.9

アセトアルデヒト(mg/L)

75±18

48

120

76±34

30

160

酢酸エチル(mg/L)

49±23

25

130

87±43

26

180

イソバレルアルデヒド (mg/L)

0.1±0.1

0.0

0.3

0.1±0.1

0.0

0.7

n-プロピルアルコール(mg/L)

56±13

42

92

65±15

32

110

イソブチルアルコール(mg/L)

39.0±8.0

29

72

52±16

30

86

酢酸イソアミル(mg/L)

2.0±1.0

0.90

6.1

3.5±2.2

1.1

9.0

イソアミルアルコール(mg/L)

110±1688160

140±2598180

カプロン酸エチル(mg/L)

13.0±4.6

1.2

24

6.6±6.2

1.2

25

フェネチルアルコール(mg/L)

170±45110270160±4361260* 平均値±標準偏差

試料内(n=3)のマーカーごとにピークエリア面積値の変動率相関係数の値(以下，R値と略す)を求めた．最後に品質ク（試料名×マーカー×ピークエリア面積）を有するデータ
係数(以下,
CVと略す)を計算した．次に試料間で各マーカー

データセットとした．ただし繰り返し測定（n=3）
におけるラスがPLSとサポートベクトルマシン(以下，SVMと略す)のマトリックスが LCMSmax
データセットとして出力された．
)を求めた．本研究ではCVmax>20に対応する最大CV(CV

同一試料は同じ学習あるいは検証区分になるようにした．
組み合わせで予測できるか検証した．吟醸酒と純米酒デー

2.6.3 データリダクションを示すマーカーを除外することとした．

まず学習データセットから 10 の潜在変数で予測モデルを
タセットのそれぞれのLCMSデータを上記と同様に学習と2.7測定再現性の乏しいマーカーを解析から除外するため，
統計解析

構築し，それに学習と検証データセットをそれぞれ入力し検証データセットに分け，PLSによって二乗平均平方根誤

試料内（n=3）のマーカーごとにピークエリア面積値の変統計解析のためLCMSデータセット，清酒の属性(吟醸酒て，得られた目的変数（予測値）と実測値のピアソンの積差(RootMean Square Error of Estimation，以下，RMSEEと略

動係数（以下 , CV と略す）を計算した．次に試料間で各あるいは純米酒)，官能評価データ，品質クラス，香気成分率相関係数の値（以下，R 値と略す）を求めた．最後に品質す)が最小となる潜在変数の数で次元縮約した．
次に次元縮マーカーに対応する最大 CV（CVmax）を求めた．本研究でとグルコース濃度のそれぞれをマイクロソフトExcelによ

クラスが
PLS
とサポートベクトルマシン（以下，SVM
と
約
した各試
料の
PLS ス コ ア に 対 し て SVM(kernlab, version

は CVmax>20 を示すマーカーを除外することとした．
り統合した．以降の統計解析とグラフ作成はプログラミン

略す）の組み合わせで予測できるかを検証した．吟醸酒と0.9-29)で学習・分類させ，検証データセットにおける品質

8) を用いた．はじめに吟醸酒属性と純米酒属性のそ2.7 統計解析
グ言語R

純米酒データセットのそれぞれの LCMS データを上記とクラスの実際の値と予測値の一致度を予測精度とした．

統計解析のため LCMS データセット，
清酒の属性（吟醸
れぞれのデータセット(以下，吟醸酒データセットと純米酒

同様に学習と検証データセットに分け，PLS によって二乗酒あるいは純米酒），官能評価データ，品質クラス，香気成
データセットと略す)に対し，LCMSデータを説明変数とし平均平方根誤差（Root Mean Square Error of Estimation，

分とグルコース濃度のそれぞれをマイクロソフト
Excel にた主成分分析(Principal
Component Analysis, 以下PCAと略と略す）が最小となる潜在変数の数で次元3以下，RMSEE.1 官 能 評 価，グルコース濃度と香気成分

より統合した．以降の統計解析とグラフ作成はプログラミす)とUMAP(Uniform
Manifold Approximation and Projection,

縮約した．次に次元縮約した各試料のPLS スコアに対し6人の審査員によって審査された134点の出品酒のうち，

8）

結 果 お よ び 考 察

ング言語
R を用いた．はじめに吟醸酒属性と純米酒属性のversion
0.2.7.0，教師なしモデル)で解析し，次元縮約した結て SVM（kernlab, version 0.9-29）で学習・分類させ，検官能評価の結果を参考にして分析に供する試料を選択した

それぞれのデータセット（以下，吟醸酒データセットと純果と品質クラス及び香気成分を照らし合わせ，それらの関証データセットにおける品質クラスの実際の値と予測値
結果，吟醸酒40点，純米酒26点の合計66点を研究試料とし米酒データセットと略す）に対し，LCMS データを説明変係を考察した．次にLCMSデータセットから清酒の属性をの一致度を予測精度とした．
た．このとき品質クラス，グルコース濃度及び香気成分の数とした主成分分析（Principal Component Analysis, 以下判別できるか試みた．判別分析は直交部分最小二乗判別分

平均値と標準偏差は表2のとおりであった．

PCA と略す）とUMAP（Uniform
Manifold Approximation
析(Orthogonal
PartialLeast Squares-Discriminant
Analysis，以

3.2

3．結果および考察

データ統合

and Projection, version 0.2.7.0，教師なしモデル）で解析
下，OPLS-DAと略す)を用いた．このとき目的変数と説明変

3.1
官能評価，グルコース濃度と香気成分
清酒モデル試料を繰り返し測定(n=22)して得られた標準数をそれぞれ清酒の属性とLCMSデータとし，7セグメント
し，次元縮約した結果と品質クラス及び香気成分を照ら+物質の[M+H]
イオンのm/zとRTを集計した．標準物質ごと
6 人の審査員によって審査された
134 点の出品酒のうによる交差検証とした．次にグルコース濃度と香気成分がし合わせ，それらの関係を考察した．次に LCMS データにそれぞれ標準偏差を求め比較したところ，最大のそれら
ち，官能評価の結果を参考にして分析に供する試料を選択

LCMSデータから予測できるか部分的最小二乗回帰(Partial
セットから清酒の属性を判別できるかを試みた．判別分析

はそれぞれ0.0020 40
m/z(リボフラビ
した結果，吟醸酒
点，純米酒26ン)と0.0080
点の合計 66 min(チアミ
点を研究

Least
Squares Regression, 以下，PLSと略す)で検証した．本は直交部分最小二乗判別分析（Orthogonal
Partial Leastン)であった．これらの5倍値を許容範囲として清酒試料か試料とした．このとき品質クラス，グルコース濃度及び香検討ではLCMSデータセットをランダムに二分割して学習
Squares-Discriminant Analysis，以下，OPLS-DA と略す）

ら得られたLCMSデータに対してアライメントした結果，気成分の平均値と標準偏差は表 2 のとおりであった．

と検証データセットとした．ただし繰り返し測定(n=3)におを用いた．このとき目的変数と説明変数をそれぞれ清酒の5,519マーカー(RT_m/z)
× 66(試料数) × 3 (繰り返し数)のデ
3.2 データ統合

ける同一試料は同じ学習あるいは検証区分になるようにし属性と LCMS データとし，7 セグメントによる交差検証とータセットが得られた．
CV値を基準に解析に用いるマーカ
清酒モデル試料を繰り返し測定（n=22）して得られた標た．まず学習データセットから10の潜在変数で予測モデル
した．次にグルコース濃度と香気成分が LCMS データから+ーを選択した結果，最終的なマーカー数は149となった．
準物質の［M+H］
イオンの m/z と RT を集計した．標準物を構築し，それに学習と検証データセットをそれぞれ入力予測できるか部分的最小二乗回帰（Partial Least Squares

3質ごとにそれぞれ標準偏差を求め比較したところ，最大の.3 次 元 削 減 法 を 用 い た 測 定 デ ー タ の 可 視 化して，得られた目的変数(予測値)と実測値のピアソンの積
Regression, 以下，PLS と略す）で検証した．本検討ではLCMS データセットをランダムに二分割して学習と検証

はじめに品質クラスがLCMSデータに反映されているか
それらはそれぞれ
0.0020 m/z（リボフラビン）と 0.0080 min（チアミン）であった．これらの 5 倍値を許容範囲として清─ 10 ─

牧野・大渡・秋吉・田畑：高速液体クロマトグラフ-四重極飛行時間型質量分析計を用いた清酒の品質予測

図1

主成分分析（第 1, 2 主成分，A, B, C：吟醸酒データセット，D, E, F：純米酒データセット）（A, D）スコアプロット : ポイントの色形とポイントのサイズはそれぞれ品質クラスとグルコース濃度に対応している．（B, E）ローディングプロッ
ト : 合計 149 マーカーを相対寄与率で色付けし，そのうち寄与率の大きなものについてはベクトル表示とともにマーカー名を示した．（C, F）ロー
ディングプロットでベクトル表示したマーカーにおける正規化面積値．

図2

UMAP を用いた次元縮約（A）吟醸酒データセット，（B）純米酒データセット，プロットの色は酒造メーカーを表している．

酒試料から得られた LCMS データに対してアライメント

3.3

次元削減法を用いた測定データの可視化した結果，5,519 マーカー（RT_m/z）× 66（試料数）× 3

はじめに品質クラスが LCMS データに反映されている（繰り返し数）のデータセットが得られた．CV 値を基準にかを PCA によって調べた．PCA は教師なし機械学習に解析に用いるマーカーを選択した結果，最終的なマーカー分類される古典的な線形次元縮約の解析方法である．今回

数は 149 となった．

の解析では PCA によって清酒試料の分布状況を求めると
─ 11 ─

島根県産業技術センター研究報告

図3第58号 （2022）

判別分析

OPLS-DA を用いた吟醸酒と純米酒データセットの判別分析結果．
（A）スコアプロット：各試料の第 1，第 2 成分のスコアをそれぞれ G と J ラベ
ルしてプロット．（B）VIP：上位 10 位までの VIP とそのスコアを示した．色は面積値が大きい方の属性を示している．

ともに，ばらつきの度合いやグループ間の傾向，ひいてはこれらのマーカーと面積値は，LCMS データを用いて品質データの背後に存在する本質的な構造の抽出を試みた．得クラスを判断するうえでの指標の一つと示唆される．なおられたスコアプロットとローディングプロットはそれぞ

品質クラス 2 以上については，スコアプロットの分布におれ図 1（A,D）と図 1（B,E）となった．なおスコアプロット

いてこれ以上注目すべき特徴を見出すことは難しく，第 5とローディングプロットのそれぞれの軸の方向は対応関主成分（累積寄与率 79.4%）まで確認したが同様であった．

係にあり，またローディングプロットは各マーカーの主成

次に最新の機械学習による非線形次元削減分類方法の分軸に対する重みを原点からベクトルで表している．第 1

一つで，リーマン幾何学と代数的位相幾何学に基づいた理

主成分と第 2 主成分に対する寄与率は吟醸酒と純米酒デー

論的フレームワークにより次元を圧縮する UMAP9） を採

タセットとでそれぞれ 38.8%，18.9% と，38.1%，19.8% と用して，吟醸酒と純米酒データセットがそれぞれどのようなり，共に約 6 割の情報が縮約されたといえる．また吟醸に次元縮約して分類されるかを調べることとした．UMAP

酒データセットにおける第 2 主成分は，グルコース濃度とで次元縮約された結果は図 2 となり，複数の酒造メーカー

負の相関があり（ p<0.01），その相関係数は－ 0.651 であっ試料で構成される集団をいくつか形成した．このとき品質た．清酒のグルコース濃度はアミラーゼ系酵素の供給源でクラスや醸造に使用した麹菌と酵母の種類を反映するグある麹菌の影響を受けるため，第 2 主成分軸方向には麹菌

ルコース濃度とカプロン酸エチル濃度をそれぞれ指標にに関した情報が縮約されていると考えられる．なお，図 1

対応関係を調べたが，分布上目立った特徴は見出せなかっ（A）において原点付近のほか第 1 象限に一部の試料が集た．しかし本結果は，集団内の試料において共通する未知中しているが，これらはアミラーゼ系酵素低活性タイプのの要素の存在を示唆している．

麹菌を使用した清酒である可能性が高い．品質クラスに着

3.4

判別分析

目すると，品質クラス 2 以上の試料はそれぞれのスコアプ

清酒の属性が LCMS データから判別できるかを OPLS-

ロットにおいて原点付近に集中していた．一方，品質クラDA によって検証した．得られた予測モデルにおける予測

ス 1 の試料は第 1 主成分，第 2 主成分とも原点から離れた性能の指標である Q2 値と予測残差を示す RMSEE 値はそ

位置にプロットされた．次にローディングプロットにおいれぞれ 0.601 と 0.265 になり，このとき潜在変数の数は 7て相対寄与率の高いマーカー（図 1（B，E）におけるベクであった．一般的にモデルの評価は Q2>0.5 で good，>0.9

トル表示したマーカー）について注目し，品質クラスごと

で excellent と見なされ 10），本モデルはある程度の予測性にそれらの面積値（平均値）を正規化して比較した結果を能があるものと考えられる．スコアプロットは図 3（A）の

図 1（C，F）に示した．品質クラスに対応して面積値（平ようになり，清酒の属性に応じて第 1 成分方向に対してそ

均値）は単純増加あるいは単純減少，または凹凸であった．

れぞれ離れるようにプロットされた．しかし原点付近にプ─ 12 ─

牧野・大渡・秋吉・田畑：高速液体クロマトグラフ-四重極飛行時間型質量分析計を用いた清酒の品質予測
表
ピアソンの積率相関係数一覧
表33 ピアソンの積率相関係数一覧

可能性が高い．
ロットされた試料もあり，これらは今回構築したモデルにまた清酒の属性を判別する指標として，OPLS-DAから得よる判別は難しいことを示している．研究会には純米酒でられた説明変数(マーカー)の重要度(Variable
Importance in
あっても高精白で吟醸造りしたものが「純米酒の部」としProjection,
以下，
VIPと略す)に注目した．
10位までのVIPと，て出品されたケースもあるようで，判別が難しい試料につそれが清酒の属性のどちらにおいて強く観測されたかについては，そのような造りをした清酒が該当する可能性が高いて図3(B)で示した．例えば吟醸酒属性と純米酒属性の特い．

徴的なマーカーとして，それぞれ1.44min－ 85.02m/z，1.55
また清酒の属性を判別する指標として，OPLS-DAか
minら
m/zが見出された．今回の結果はLCMSデータか－ 75.04
得 ら れ た 説 明 変 数（ マ ー カ ー） の 重 要 度（Variable
ら清酒の 属 性 inを判別す る う以下，
えで の指候 補を 示唆 し て いImportance
Projection,
VIP標と略す）に注目した．
る．
10 位までの VIP と，それが清酒の属性のどちらにおいて3.5強く観測されたかについて図
グルコース濃度・香気成分と品質クラス
3（B）
で示した．例えば吟醸の予測
酒属性と純米酒属性の特徴的なマーカーとして，それぞれLCMSデータからPLSによってグルコース濃度と香気成
1.44min_85.02m/z，1.55min_75.04m/z が見出された．今回
分量を予 測 できる か調
べ た ．学 習デ ー タ セッ トを 用 い た
の結果は
LCMS
データから清酒の属性を判別するうえで

データセットの種類

学習

検証

グルコース

0.985

*

0.764 *

酢酸エチル

0.996 *

0.870 *

アセトアルデヒド

0.948 *

0.330 *

イソバレルアルデヒド

0.989 *

0.651 *

n-プロピルアルコール

0.986 *

0.817 *

イソブチルアルコール

0.990 *

0.910 *

酢酸イソアミル

0.994 *

0.794 *

イソアミルアルコール

0.991 *

0.931 *

カプロン酸エチル

0.985*

0.904 *

フェネチルアルコール

0.969 *

0.180

* p<0.05

PLSは表3(学習)の相関を示す予測モデルを構築した．これの指標候補を示唆している．
らの予測モデルのうち検証データセットにおいて最も精度
3.5 グルコース濃度・香気成分と品質クラスの予測

良く予測できた成分はイソアミルアルコールで，そのR値
LCMS データから PLS によってグルコース濃度と香気(以下，R値(検証)と略す)は0.931(p<0.01)であった(表3，図
成分量を予測できるかを調べた．学習データセットを用い4(A,たB))．そのほかグルコースや酢酸エチル，n-プロピルア
PLS は表 3（学習）の相関を示す予測モデルを構築し
ルコール，イソブチルアルコール，酢酸イソアミル，カプた．これらの予測モデルのうち検証データセットにおいて

ロン酸エチルではR値(検証)が0.70を超えた(表3)．一方，予最も精度良く予測できた成分はイソアミルアルコールで，測の難しい成分がフェネチルアルコールで，R値(検証)はその R 値（以下，R 値（検証）と略す）は 0.931（ p<0.01）

0.180となり(表3，図4(C,D)),
検定の結果，相関はなかったであった（表 3，図 4（A,B））．そのほかグルコースや酢酸(p>0.05)．
清酒の香気成分は醸造に使用する酵母の影響を強エチル，n- プロピルアルコール，イソブチルアルコール，酢11) ，酵母に関した情報が清酒
く受けることが知られており
R 値（検証）が 0.70酸イソアミル，カプロン酸エチルではに含まれるメタボライトを介してLCMSで捉えられることを超えた（表 3）．一方，予測の難しい成分がフェネチルア
は注目に値する．
ルコールで，R 値（検証）は 0.180 となり（表 3，図 4（C,品質クラスの予測はPLS-SVM法を用いた．PLSは今回のD））, 検定の結果，相関はなかった（ p>0.05）．清酒の香気研究対象のようなサンプルサイズよりも圧倒的に説明変数
成分は醸造に使用する酵母の影響を強く受けることが知が多い場合や説明変数間の共線性が高い場合に有効とされられており 11），酵母に関した情報が清酒に含まれるメタボる手法である．それを拡張したPLS-SVM法は，PLSによっライトを介して LCMS で捉えられることは注目に値する．
て高次元データを目的変数と関連の強い低次元データ(PLS
品質クラスの予測は PLS-SVM 法を用いた．PLS は今スコア)に変換し，それらをSVMにより超平面で分類する方回の研究対象のようなサンプルサイズよりも圧倒的に説明法である．最近では本手法を用いた食肉動物種のFTIRスペ
変数が多い場合や説明変数間の共線性が高い場合に有効と12) ．なお本研究においクトルによる識別が報告されているされる手法である．それを拡張した PLS-SVM
法は，PLSてはPLS-SVM法で清酒の属性を分類させると，検証データによって高次元データを目的変数と関連の強い低次元デー
セットにおける正解率は80.0%となることを予め確認してタ（PLS スコア）に変換し，それらを SVM により超平面いる．品質クラスの分類に際し，学習データセットを用いで分類する方法である．最近では本手法を用いた食肉動物てRMSEEが最小となるPLSモデルを作成したところ，その種の FTIR スペクトルによる識別が報告されている 12）．な
潜在変数の数は10となった．次に学習データのPLSスコア
お本研究においては PLS-SVM 法で清酒の属性を分類さセットでSVM分類器を学習させたのち，検証データセット
せると，検証データセットにおける正解率は 80.0% となるのそれを同様に分類器に入力して品質クラスを分類させたことを予め確認している．品質クラスの分類に際し，学習
ところ，吟醸酒と純米酒データセットにおける分類結果のデータセットを用いて RMSEE が最小となる PLS モデル
単純な正解率は，それぞれ40%と46%であった．またそれぞを作成したところ，
その潜在変数の数は 10 となった．次にれの品質クラスにおける分類予想は図5のようになった．吟
学習データの PLS スコアセットで SVM 分類器を学習させ
醸酒データセットでは品質クラス3試料における分類一致
たのち，検証データセットのそれを同様に分類器に入力し率は66.7%で比較的高い結果となったものの，品質クラス4て品質クラスを分類させたところ，吟醸酒と純米酒データ
試料では一致率は0%となった(図5(A))．また純米酒データ
セットにおける分類結果の単純な正解率は，それぞれ 40%

図4 PLSによる香気成分量の予測

図 4 PLS による香気成分量の予測(A,B)イソアミルアルコールと(C,D)フェネチルアルコールにつ（A,B）イソアミルアルコールと（C,D）フェネチルアルコールについいて，学習と検証データセットのそれぞれの予測値と実測値をて，学習と検証データセットのそれぞれの予測値と実測値をプロット
プロットした．回帰直線を青線で，また回帰直線の95%信頼区
した．回帰直線を青線で，また回帰直線の 95% 信頼区間を灰色で示した．

間を灰色で示した．

─ 13 ─

図5 PLS-SVM法による分類

図 5 PLS-SVM 法による分類(A)吟醸酒データセット，(B)純米酒データセット．

（A）吟醸酒データセット，（B）純米酒データセット．

島根県産業技術センター研究報告第58号 （2022）と 46% であった．またそれぞれの品質クラスにおける分類

ゆかり研究助手，二瀬充幸研究助手に協力していただい予想は図 5 のようになった．吟醸酒データセットでは品質た．ここに謝意を示します．

クラス 3 試料における分類一致率は 66.7% で比較的高い結6．文果となったものの，品質クラス 4 試料では一致率は 0% となった（図 5（A））
．また純米酒データセットにおける品質クラスが 2 と 3 の試料について注目すると，1 と予測され

1 ）日本醸造協会 編 . 醸造物の成分 . 日本醸造協会 . 1999, p.1-108.
2 ）大渡康夫 , 牧野正知 , 松林和彦 , 田畑光正 . メタボローム解析を用いた食品成分の評価技術の確立（第 1 報）- メタボローム

たものはなく，
一致率はそれぞれ 58% と 55% となった（図解析による日本酒の品質評価技術について -. 島根県産業技術

5（B））．これらのことから，
本研究で用いた LCMS データ
から精度よく清酒の品質クラスを予測するには至らなかっ
たが，一方で示唆的な結果も得られていると考えられた．

献センター研究報告 . 2020, vol.56, p.7–12.
3 ）Tokuoka, M.; Honda, C.; Totsuka, A.; Shindo, H.; Hosaka,
M. Analysis of the oligosaccharides in Japanese rice wine,
sake, by hydrophilic interaction liquid chromatography–

4．ま と めtime-of-flight/mass spectrometry. Journal of Bioscience and

本研究では LCMS 分析によって清酒の香味特徴を多角的にとらえることができるか，ひいては品質が予測できる

Bioengineering. 2017, vol.124, p.171–177.
4 ）Tatsukami, Y.; Morisaka, H.; Aburaya, S.; Aoki, W.; Kohsaka,C.; Tani, M.; Hirooka, K.; Yamamoto, Y.; Kitaoka, A.;

か，それらの可能性について検証した．その結果，品質ク

Fujiwara, H.; Wakai, Y.; Ueda, M. Metabolite profiling of the

ラスや吟醸酒・純米酒の判別に関与するマーカー候補を見fermentation process of “yamahai-ginjo-shikomi” Japanese出した．また LCMS データがイソアミルアルコールなど

sake. PLOS ONE. 2018, vol.13, p.e0190040.

いくつかの香気成分の定量的な予測に適応できることを5 ）Yazawa, H.; Tokuoka, M.; Kozato, H.; Mori, Y.; Umeo, M.;

示した．PLS-SVM 法による品質クラスの分類では，そのToyoura, R.; Oda, K.; Fukuda, H.; Iwashita, K. Investigationof relationship between sake-making parameters and sake

可能性が示唆されたものの，精度よく予測するには至らな

metabolites using a newly developed sake metabolome analysis

かった．試料の情報は確かに測定できているのか，またそ

method. Journal of Bioscience and Bioengineering. 2019,

れはデータリダクションや次元圧縮・機械学習時に欠損していないかなど検討すべき課題は残ったままである．デー
タ分析の観点からはサンプル数を増やすことや別の機械

vol.128, p.183–190.
6 ）大渡康夫 , 永田善明 , 土佐典照 , 田畑光正 , 秋吉渚月 . 味覚センサーによる清酒の評価とその活用方法の検証 . 島根県産業

学習の手法を検討することも重要で，そのため LCMS デー
タによる清酒品質評価・予測に関する可能性は今後も検討

技術センター研究報告 . 2018, vol.54, p.27–32.
7 ）Tsugawa, H.; Cajka, T.; Kind, T.; Ma, Y.; Higgins, B.; Ikeda,
K.; Kanazawa, M.; VanderGheynst, J.; Fiehn, O.; Arita, M.

されなければならない．なお本研究においてマーカーとメ

MS-DIAL: data-independent MS/MS deconvolution for

タボライトの関係については踏み込まなかった．もちろんcomprehensive metabolome analysis. Nature Methods. 2015,

メタボライトの同定が進めば，それが何に由来するのか，どのようなプロセスで生産されるのかといった科学的理解に繋がり，ひいては高度な醸造技術の開発へ貢献するとvol.12, p.523–526.
8 ）R Core Team; R: A language and environment for statisticalcomputing. https://www.R-project.org/. 2019.

考えられる．一方で LCMS データをあえてそのまま使用す9 ）McInnes, L.; Healy, J.; Melville, J. UMAP: Uniform Manifold

ることで清酒の品質予測や品質管理が可能になるのであApproximation and Projection for Dimension Reduction.

れば，その利用は新しい価値創出に対する近道になり得るのかもしれない．

ArXiv e-prints 1802. 03426, 2018.
10）玉田佳大 , 樺島文恵 , 櫻井昌文 , 徳井美里 , 山下伸雄 , 窪寺隆
文 , 明石貴裕 . ノンターゲット GC/MS による清酒の「押し5．謝味」のモデル化 . 生物工学会誌 . 2018, vol.96, p.234–239.

辞

LCMS を用いた清酒分析は酒類総合研究所の岩下和裕

11）Tsutsumi, H. Mechanism of aroma production in Japanese sake.
Journal of Japan Association on Odor Environment. 2015,

成分解析研究部門長，小林拓嗣研究員にご指導いただい
た．清酒の官能評価には酒類総合研究所 品質評価部門 伊vol.46, p.346–349.
12）Tsakanikas, P.; Karnavas, A.; Panagou, E. Z.; Nychas, G.-

豆英恵主任研究員，広島国税局 鑑定官室 宮脇達也 鑑定官に，また試料調製の一部は島根県産業技術センターの太田─ 14 ─

J. A machine learning workflow for raw food spectroscopic
classification in a future industry. Scientific reports. 2020,
vol.10, p.11212.