人工血液第 18 巻 第 4 号 2011 年 3 月

目

次
会告

…………………………………………………………………… 126

In Memoriam:
Memorial for Professor Eishun Tsuchida ……………………… 127
原著

Effects of crystalloid and colloid osmotic pressure on HbV（liposome encapsulated hemoglobin）membrane…………………………………………………Seiji Miyake 他 128

総説

リポソーム技術を基盤とする骨髄指向性薬物送達キャリアー…………………………………………………………宗 慶太郎 134
バイオ医薬品におけるプリオンの問題−ヒト赤血球を原料とする人工酸素運搬体をめぐる問題−……………………………………………………柚木 幹弘 他 142

トピックス
血小板の活性化機能：ADPの果たす役割…………………………………………………………冨山 佳昭 151
事務局たより ……………………………………………………………… 154

ARTIFICIAL BLOOD
Vol. 18 No. 4 March, 2011

Contents
Announcement ……………………………………………………………… 126
In Memoriam:
Memorial for Professor Eishun Tsuchida ………………………… 127
Original Article：
Effects of crystalloid and colloid osmotic pressure on HbV（liposome encapsulated hemoglobin）membrane…………………………………………………Seiji Miyake, et al. 128
Review：Bone Marrow-Targeted Drug Delivery Carriers Based on
Liposome Technology ……………………………Keitaro Sou 134
Current Situation of Prion Risks on Biological Products- Points on the Consideration for Prion Risk in Artifical Blood
Products Derived from Human Red Cells ……………………………………………Mikihiro Yunoki, et al. 142
Topics：Molecular mechanism for platelet activation: a role for ADP………………………………………………Yoshiaki Tomiyama 151

会

告第18回日本血液代替物学会年次大会期日：

2011年10月27日（木）〜会場：北海道大学医学部学友会館フラテ（札幌市北区北15条 7 丁目）

大会長：

28日（金）

米川 元樹（特定医療法人北楡会 札幌北楡病院 理事長）

テーマ： 「血液代替物実用化を促進させよう」【特別講演】・ iPS細胞から血小板を作る（仮題）・ 酸素はわれわれに善玉か悪玉か（仮題）・ 血液代替物の歴史と現状（仮題）【教育講演】
・ 臨床治験について（仮題）・ リポソームの組成とその組織親和性（仮題）【シンポジウム】
・ 人工酸素運搬体の実用化を促進するためには・ 虚血灌流障害と酸素運搬体【一般演題】【ランチョン】
演題募集締切：2011年 7 月末日※ 演題募集はホームページにて行います。その他詳細につきましても
ホームページ上でお知らせする予定です。

http://sbsj2011.jp
大会事務局（連絡先）：〒003-0006

札幌市白石区東札幌 6 条 6 丁目 5 − 1

特定医療法人北楡会 札幌北楡病院
TEL: 011-865-0111

FAX: 011-863-5553

E-mail: sbsj2011@hokuyu-aoth.org
担当：津島

126

人工血液 Vol. 18 , No.4, 2010

In Memoriam :Memorial for Professor Eishun Tsuchida

Eishun Tsuchida（Professor Emeritus, Waseda University）passed away on April 25, 2010 at the age of 79 years. I first met,
him in the 1980 s when he presented his research in an international congress and I have been impressed ever since with his
research, development and contribution to the area of blood substitutes. We have developed a very close research and collegial
friendship and it is with great sadness that it has to come to an end.
Professor Tsuchida obtained his PhD from Waseda University in 1963, and rose rapidly from assistant, lecturer, assistantprofessor to his professorship appointment in 1973. His pioneering research led to the establishment of a new field of"macromolecular complexes as functional material systems". He held important positions in the Chemistry Society of Japan and
The Society of Polymer Science, Japan. Examples of his many awards and prizes included the Purple Ribbon Medal in 1998, and,
the Grand Cordon of the Sacred Treasure in 2004. His most important life s work is in the area of blood substitutes. He
reported in 1983 his research in this area on "Electronic process control of macromolecular complex" and "Molecular assembly
science". His novel reversible aqueous oxygen complex（lipid-heme）that can carry oxygen similar to that of red blood cell isanother first in the world. This research was recognized by awards from the Chemical Society of Japan（1986）, Ohkuma
Memorial Academic Award（1987）, Fat and Oil Excellent Technology Prize（1989）, Macromolecular Science Achievement Prize（1991）, and the Avogadro-Minakata prize（1995）. In collaboration with the late S. Sekiguchi（Hokkaido Red Cross Blood Center）
and Professor K. Kobayashi（Keio University）, Dr. Sakai（Waseda University）and many others, he develops a human hemoglobin
liposome blood substitute towards clinical application. Together they organized the Society of Blood Substitutes of Japan in
1993 and he acted as its first chairman. He interacted closely with me and other researchers around the world and contributed
tremendously to the international efforts in this area and the International Society for Artificial Cells, Blood Substitutes andBiotechnology. In addition to acting as one of the associate editors of our journal he also organized and chaired in Japan the1997 7th International Symposium on Blood Substitutes（7-ISBS）and the 2003 9th International Symposium on Blood Substitutes（9-ISBS）. In 1997 he received major research support for 6 years on blood substitutes from The Ministry of Health and Welfare（current Ministry of Health, Labour and Welfare）. In 2001, he became an Emeritus Professor and launched the "Oxygen Infusion
Project" of the Advanced Research Institute for Science and Engineering, Waseda University. With this he actively interactedwith academics and industries to develop this work towards clinical use. This was close to its aim but Professor Tsuchida did
not see its final completion and use. His colleagues Professor Kabayashi, Dr. Sakai and others are continuing with this effort
towards the clinical use of this important project.
All researchers and developers in the area of blood substitutes have lost an important researcher, pioneer and friend. My
personal research and collegial friendship with him for the last 30 years has also regretfully come to a close. However, his
enormous contribution and his friendship will always stay with us all, both in Japan and all over the world.
Professor Thomas Ming Swi Chang, OC., MD, CM, PhD, FRCPC, FRSC
Director, Artificial Cells & Organs Research Centre
Departments of Physiology, Medicine and Biomedical Engineering
McGill University, Montreal, Quebec, Canada
Honorary President and Editor in Chief
International Society for Artificial Cells, Blood Substitutes and Biotechnology
11 Jan 2011, Montreal, Quebec, Canada

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 18 , No.4, 2010127

Original article

Effects of crystalloid and colloid osmotic pressure on HbV（liposome encapsulated hemoglobin）membrane
Seiji Miyake (1)＃, Hiromi Sakai (2), Masuhiko Takaori (3)Abstract
To clarify the unexpected decrease in electrolyte concentrations of saline mixed with liposome vesicle emulsion observed inprevious studies, the same liposome vesicles were emulsified into 0.625 g ％ saline containing 0.4 g ％ albumin. Then Na and Cl
ion concentrations were measured serially at 0, 15, 120 min, 24 and 168 hr, respectively, in Exp. 1. The measured values were
within 107.5 ± 0.7 〜 108.4 ± 1.0 mEq/L for Na ion and 106.0 ± 0.7 〜 106.5 ± 0.8 mEq/L for Cl ion. These values were mostcomparable with the predict-1 value, which was calculated on the assumption that water permeates the liposome membrane
freely. Results show that water permeation had been completed within at least 3.07 ± 0.03 min after the vesicles contacted withthe saline. In Exp. 2, the liposome vesicles emulsified in 0.8 g ％ saline were mixed with 4 g ％ albumin solution. Then Na and Cl
ion concentrations in the mixture were measured serially at 0（detected time of 2.61 ± 0.03 min）
, 5, 15, 180 min after mixing,
respectively. The Na and Cl ion concentrations were within 149.1 ± 1.2 〜 149.4 ± 1.2 mEq/L and 138.9 ± 1.2 〜 139.9 ± 1.0 mEq/L,
respectively. No significant change was observed in either Na or Cl ion concentrations within 3 hr after mixing. Those results
showed that colloid osmotic pressure associated with albumin in the saline did not contribute to the water permeation observedin Exp. 1. Therefore, results show that the unexpected decrease in electrolyte concentration of saline mixed with liposome
emulsion observed in the previous study resulted from efflux of inside water of liposome vesicles induced by crystalloid osmoticpressure.

Keywords
liposome, phospholipid membrane, permeability, osmotic pressure, crystalloid, colloid, water efflux, artificial oxygen carrier,hemoglobin based

1. Introduction
We reported interference with a hemoglobin-based
oxygen carrier（ HbV, prepared by encapsulation ofhemoglobin solution with liposome membrane）on electrolyte
ion measurements using polarography in our previous study 1）.
In that study, the electrolyte concentrations were determinedusing a wet method（TBA-200FRNEOTM; Toshiba Medical
Systems Corp., Ohtawara, Tochigi, Japan）, which showed
limited performance when the HbV was mixed at lower
volume rates. To explain the limitation, we preparedemulsions of liposome vesicles in which distilled water was
encapsulated. Then we observed the interference withliposome vesicles per se on measurements of electrolyte（Naand Cl）ion concentrations by comparing results obtainedusing wet and dry methods 2）. Results show that liposome
vesicles alone never interfere with polarographic
measurements of electrolyte ion concentrations when using
the W method. In the study, however, we observed lower
electrolyte ion concentrations in the mixture of the liposome
emulsion than those predicted, particularly when the mixing
rate of the emulsion in saline was at 1:1 but not less. Somepossibilities were proposed. Among them, it was strongly
presumed that water inside of liposome vesicles diffused out
through the liposome membrane by osmosis because theliposome membrane had been documented as asemipermeable membrane by Chang 3）. Therefore it was（1）Osaka Prefecture Saiseikai Noe Hospital, 2-2-33 Higashi-Imahuku, Jyotou-ku, Osaka 536-0002, Japan（2）Waseda Bioscience Research Institute in Singapore; 11 Biopolis Way #05-01/02 Helios, Singapore, 138667 Republic of Singapore（3）East Takarazuka Sato Hospital, 2-1 Nagao, Takarazuka, Hyogo 665-0873, Japan＃ Seiji Miyake, B.M.T. passed away after the submission of this manuscript.
論文受付 2010 年 10 月 20 日 論文受理 2011 年１月 17 日

128

人工血液 Vol. 18 , No.4, 2010

thought that the saline mixed with the liposome emulsion
would be diluted more excessively than when diluted withwater outside of the vesicles. Therefore, assuming that water
does not permeate the membrane, a lower electrolyte
concentration might be observed than the calculated
concentration.
To resolve the speculation presented above, we attempted
first to measure Na and Cl ion concentrations serially until
168 hr after the liposome emulsion was mixed with saline.
Second, we observed additional effects of colloid osmoticpressure on the liposome vesicles for 3 hr because, in theprevious studies, human albumin had been added at 4 g ％ to
all examined materials for adjustment to the clinical sample 1-2）.

2. Materials and Methods
Liposome vesicles encapsulating distilled water wereprepared at Waseda Bioscience Research Institute inSingapore. Preparation of the liposome vesicle encapsulating
distilled water was described elsewhere 2）. Briefly, a mixtureof cholesterol, phospholipid, and other lipids was dissolved in
distilled water and stirred overnight. The liposome vesicle
diameter was adjusted approximately 220 nm by extrusion
through filters under 30 kgf/cm2 pressure. Liposomecrit, thevolume ratio of liposome vesicles emulsified in distilled water,
was determined as 46.6 ％ after 100,000 × g ultracentrifugation（Optima LX-80; Beckman Coulter Inc., Brea, Ca. U.S.A.）. The
emulsion was sealed with air and stored in a refrigerator at
4 °C.
In the first experiment（Exp. 1）, human albumin powder（A1653-5G; Sigma-Aldrich Corp., St Louis, Mo. U.S.A.）was
dissolved in distilled water to 2.5 g ％. This albumin solutionof 0.1 ml was added to the liposome emulsion of 0.5 ml. Then
this mixture was transferred to a sample analysis vessel for
VITROS250TM（Ortho Clinical Diagnostics Inc., Rochester,N.Y. U.S.A.）. To the mixture described above, 2.5 g ％ salineof 0.2 ml was added and mixed well within 3-4 s. The vessel
was set into the analyzer quickly. Analyses of Na and Cl ion
concentrations were started promptly. Subsequently, Na andCl ion concentrations in the same mixture of the liposome
emulsion, saline, and albumin as prepared above were
measured concomitantly at 15 and 120 min, and at 24 and 168
hr using the same analyzer. These measurements were
performed in triplicate for each sample. The proceduredescribed above and measurements were repeated on four
separate days.
In the second experiment（ Exp. 2）, the liposome
emulsion of 0.4 ml was mixed with 2.0 g ％ saline of 0.4 ml in
the sample vessel for VITROS250TM. Subsequently, 25 g ％albumin solution of 0.2 ml was added to the mixture.

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 18 , No.4, 2010

Immediately after mixing, measurements of Na and Cl ion
concentrations in the above mixture were conducted. Thenthe liposome emulsion, the saline, and albumin solution weremixed at the same mixing rate described above. The Na andCl ion concentrations in the latter mixture were measured
concomitantly using the same analyzer at 5, 15, and 180 min
after mixing. Each measurement was conducted in triplicate.
The experimental procedures and measurements wererepeated on four separate days. Before and after
measurements of the mixtures, Na and Cl ion concentrations
in 0.96 g ％ saline of 1.0 ml mixed with 0.4 g ％ the albumin of
0.2 ml in Exp. 1 and with 4.0 g ％ the albumin in Exp. 2 were
measured, respectively, as reference in triplicate.
The predicted concentrations of Na and Cl ions for the
mixture were calculated mathematically. The predict-1 values
in Exp. 1 and Exp. 2 were calculated on the assumption thatwater molecules permeate the liposome membrane freely as
follows. For example, the concentration（g ％）of Cl in the
mixture was obtained dividing the Cl amount in the mixture
by the water volume of the mixture as 0.2 × 2.5 / 0.1 + 0.2 +0.5. Then the concentration of Cl（0.625 g ％）was converted to106.9 mEq/L through multiplication by 154/0.9.
However, the predict-2 value in Exp. 1 was calculated on
the assumption that water molecules do not permeate theliposome membrane. In the latter calculation, liposomecrit of
46.6 vol ％ was used for subtraction of the water volume inthe liposome emulsion. Consequently, the water volume of the
mixture（0.1 + 0.2 + 0.5）used for the equation for calculating
the predict-1 value was modified to 0.1 + 0.2 + 0.5（1 - 0.466）.
The increment in Na concentration associated withaddition of albumin which fundamentally contains Na
molecule 4）was calculated by averaging differences between
Na and Cl ion concentrations found in Exp. 1 and Exp. 2,
respectively. Consequently, 0.7 mEq/L was determined as theincrement in Na ion concentration in Exp. 1 in which thealbumin was added at 0.4 g ％, and as 6.6 mEq/L in Exp. 2
added at 4.0 g ％.
These experimental procedures including preparation of
mixtures and measurement of Na and Cl concentrations wereconducted at Osaka Prefecture Saiseikai Noe Hospital. Alldata were recorded and reported as means and standard
deviations in Table 1 and Table 2. Comparison of means was,done using Student s t test and p < 0.05 was inferred asstatistically significant.

3. Results
3.1. Experiment 1
The interval between mixing 2.5 g ％ saline into theliposome emulsion containing albumin and display of Na and129

Cl concentrations on the analyzer was 3.07 ± 0.03 min. As
shown in Table 1, the actually measured values for Na ion
concentrations were within 107.5 ± 0.7 〜 108.4 ± 1.0 mEq/Lduring 0 min and 168 hr after mixing the liposome emulsion
with 2.5 g ％ saline. These Na concentrations did not differ
significantly from each other. The predict-2 value, which was
calculated on the assumption that water molecules do notpermeate through the liposome membrane, was 152.8 mEq/L.
This value was markedly higher than the actually measured
values. On the other hand, the predict-1 value, which was
calculated on the assumption that water permeates freely
through the liposome membrane, was 108.8 mEq/L. It
differed by 1.3 mEq/L at the most from the actually
measured values.

Actually measured Cl ion concentrations ranged at
106.0 ± 0.7 〜 106.5 ± 0.8 mEq/L during 0 min and 168 hr after
mixing the liposome emulsion with 2.5 ％ saline. The predict-2
value of 150.9 mEq/L for the Cl ion concentration wasmarkedly higher than the actually measured value of 106.0 ±0.7. On the other hand, the predict-1 value of 106.9 mEq/L
was very close to the actually measured values with the
maximum difference of 0.9 ± 0.8 mEq/L.
The Na ion concentration for the reference solution was
137.0 ± 0.8 mEq/L for the actually measured value and 136.2
mEq/L for the predicted value. The Cl ion concentration of
the reference solution was 136.3 ± 0.7 mEq/L for the actually
measured value and 135.5 mEq/L was for the predictedvalue. Differences of the actually measured value and theTable 1.（Predict-1）: Calculated Na and Cl ion concentrations（mEq/L）in the mixture on the assumption that water molecules
permeated the liposome membrane freely.（Predict-2）: Calculated Na and Cl ion concentrations in the mixture on theassumption that water molecules could not permeate the liposome membrane. The Na ion concentrations in predict-1, -2, andthe reference solution were adjusted, respectively, by adding Na ion contained in albumin powder（see text）.
0 min.
n=15

15 min.
n=15

120 min.
n=15

24 h.
n=15

168 h.
n=15

Reference Solution
n=30

actually measured

107.5±0.7108.2±0.6108.2±0.8108.3±0.7

108.4±1.0

137.0±0.8predict−1

108.8

predict−2

152.8

Time after mixing

Na ion concentration

136.2（predicted）

Ci ion concentration
actually measured

106.0±0.7predict−1

106.9

predict−2

150.9

106.0±0.8

106.1±0.7

106.5±0.8

106.3±0.7

136.3±0.7
135.5（predicted）

Table 2.（Predict-1）: Calculated Na and Cl ion concentrations（mEq/L）in the mixture on the assumption that water molecules
permeated the liposome membrane freely. The Na ion concentrations for predict-1 and reference solution were adjusted,
respectively, by adding concentration of Na ion contained in albumin powder（see text）.
Time after mixing

0 min.
n=15

5 min.
n=15

15 min.
n=15

180 min.
n=15

Reference Solution
n=30

actually measured

149.3±1.3

149.4±1.2

149.3±1.1

149.1±1.2

142.2±0.8predict−1

146.7

Na ion concentration

142.1（predicted）

Cl ion concentration

130

actually measured

139.9±1.0predict−1

136.9

139.5±1.5139.3±1.2138.9±1.2135.6±0.7
135.5（predicted）

人工血液 Vol. 18 , No.4, 2010

predicted value were 0.8 mEq/L for each of Na ion and Cl ion
concentrations.
3.2. Experiment 2
The interval between the mixing 25 g ％ albumin
solution with liposome vesicles emulsified in the saline anddisplay of Na and Cl concentrations on the analyzer was
2.61 ± 0.03 min. Actually measured Na ion concentrations
were 149.4 ± 1.2 〜 149.1 ± 1.2 mEq/L during 0 min and 180
min after the mixing of the liposome emulsion and thealbumin solution, as shown in Table 2. These values did not
differ significantly from each other. A maximal difference of
2.7 mEq/L was observed between those actually measured
values and the predict-1 value of 146.7 mEq/L, which was
calculated using the equation on the assumption that water
permeates the liposome membrane freely.
Actually measured Cl ion concentrations were 139.9 ± 1.0
mEq/L at 0 min 〜 138.9 ± 1.2 at 180 min after mixing withthe albumin solution. The Cl ion concentrations tended todecrease gradually over time, but no significant difference
was found between the final measured value at 180 min andthe initial value. Those values differed 3.0 ± 1.5 mEq/L at
most from the predict-1 value of 136.9 mEq/L.
The Na ion concentration of the reference solution was
142.2 ± 0.8 mEq/L for the actually measured values and 142.1
mEq/L for the predicted value. The Cl ion concentration of
the reference solution was 135.6 ± 0.7 mEq/L for the actually
measured value and 135.5 mEq/L for the predicted value.
Differences between the actually measured and predictedvalues were 0.1 mEq/L for each of Na ion and Cl ion.

4. Discussion
As observed in Exp. 1, the serially measured means of
Na and Cl ion concentrations respectively showed a narrow
range of less than 1.0 mEq/L. Furthermore, these values
were closest to the predict-1 values calculated on theassumption that water would permeate the liposome
membrane freely. On the other hand, they were so different
from the predict-2 values calculated on the assumption thatwater would not permeate the liposome membrane. Results
show that the added saline to the liposome emulsion should
be diluted by water outside of the liposome vesicles alone.
Paula et al.5）reported that the water permeability coefficientfor bilayer liposome membrane is 2.4 ･ 10 -2 - 5.0 ･ 10 -3 cm/s
which was determined using a light scattering method.
Carruthers et al.6）and Jansen et al.7）reported a similar but
slightly smaller permeability coefficient. The Na or Cl ion
concentrations were displayed on the analyzer within 3.07 ±0.03 min after mixing the liposome emulsion with the saline in

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 18 , No.4, 2010

Exp. 1. Therefore it was presumed that the water efflux fromthe liposome vesicles was completed within the display
period described above, which explains that the predict-1
value should become closer to the actually measured value
for each electrolyte ion concentration. Hauser et al.8）reported
that the Na ion permeability coefficient through an egg
lecithin membrane was 0.53-2.2 ･ 10 -14 cm/s and less 1/1,000
times than that for Cl ion. Furthermore, Paula et al.5）reported
that the K ion permeability coefficient of 1.5 ･ 10 -10 - 1.7 ･ 10 -12
cm/s was markedly lower than the coefficient of water.
However, those authors emphasize that those permeability
coefficients varied depending on physicochemical property ofphospholipid, thickness, and surface continuity of liposome
membrane and the smooth sphericity of vesicles.
In the previous studies 1，2）we added albumin to theexamined samples for simulating clinical samples and for
accuracy in determination by analyzers. In Exp. 2, therefore,
we examined the effect of colloid osmotic pressure
influencing to the water efflux. We observed changes in Na
and Cl ion concentrations of the liposome emulsified in thesaline serially until 3 hr after mixing albumin. Results showthat the Na and Cl ion concentrations did not change
significantly within 3 hr. All experimental procedures werecompleted in the previous studies within 3 hr. Therefore, it
was verified that colloid osmotic pressure associated with theadded albumin did not affect the water efflux from thevesicles within 3 hr. However, a slight decreasing trend wasobserved in the Cl ion concentration from the initial to thefinal measurement time, although no statistical significancewas found. We presumed that, if we would extend theobservation period longer, we might find a statisticallysignificant decrease in those changes, but such aninvestigation would be beyond the scope of this study. The
above results demonstrated the possibility that the insidewater of the liposome vesicles diffused out through theliposome membrane by osmosis and diluted the saline morethan predicted. We can exclude the other possibility
concerning with the measurement of liposomecrit 2）.
One limitation of this study is that we were unable tomeasure the electrolyte concentrations immediately when theliposome vesicles contacted the saline in Exp. 1. We
attempted to measure Na and Cl ion concentrations as soon
as possible after the liposome emulsion was mixed with thesaline. However, 3.07 ± 0.03 min was needed to display the ion
concentrations on the analyzer. Therefore, we did notobserve precise changes in concentrations of Na and Cl ion at
the moment of mixing, namely, at 0 min after mixing.
Detection and display by the analyzer were delayed
extremely compared with water movement through the131liposome membrane, as reported previously by the authors 5-7）.
Another limitation was that we used very lowconcentration（0.4 g ％）albumin for minimizing the contributionof colloid osmotic pressure in Exp. 1. Such a low concentrationof albumin is never experienced in clinical practice. Therefore,
it has not been warranted whether the analyzer can determine
electrolyte concentrations accurately or not. Fortunately, themeasured values of Na and Cl ion concentrations in thereference solution containing the low concentration albumin
remained in the acceptable range.

5. Conclusion
It was concluded based on crystalloid osmotic pressurethat the efflux of inside water of the liposome vesicles
occurred promptly after mixing with the saline. Colloid
osmotic pressure associated with 4 g ％ albumin did not
influence the water efflux at least 3 hr. Therefore, thedifference between actually measured and predicted values
for Na and Cl ion concentrations − which was observed in
the previous study 3）particularly when liposome emulsion was
mixed to saline at 1:1 volume ratio − was explained as
produced by the efflux of water from liposome vesicles.

Acknowledgment
This study was supported by a Grant from the Japanese
Ministry of Health, Welfare and Labor Research Project
Clinical Applications of Artificial Oxygen Carrier H18-Drug
Innovation H18-General-022 .

132

References
１. Miyake S, Takemura J, Takaori M. Determination ofelectrolyte concentrations in serum containing cellular
artificial oxygen carrier（HbV）Artif Blood 2010; 18: 3-8.
２. Miyake S, Takemura J, Sakai H, Takaori M. Measurementof electrolyte concentrations in serum containing liposome
vesicles Artif Blood 2010; 18: 91-96.
３. Chang TMS. Semipermeable aqueous microcapsules（artificial cells）with emphasis on experiments in an
extracorporeal shunt system. Trans Am Soc Artif Int
Organs 1996; 12: 13-19.
４. Report from Sigma-Aldrich. Jan. 2010.
５. Paula S, Volkov AG, Van Hoek AN, Haines TH, Deamer
DW. Permeation of protons, potassium ions, and small
polar molecules through phospholipid bilayers as afunction of membrane thickness. Biophys J 1996; 70: 339348.
６. Carruthers A, Melchior DL. Studies of the relationshipbetween bilayer water permeability, and bilayer physicalstate. Biochemistry 1983; 22: 5797-5807.
７. Jansen M, Blume A. A comparative study of diffusive andosmotic water permeation across bilayer composed ofphospholipids with different head group and fatty acyl
chains. Biophys J 1995; 68: 997-1008.
８. Hauser H, Oldani D, Phillips MC. Mechanism of ion escapefrom phosphatidylcholine and phosphatidylserine single
bilayer vesicles. Biochemistry 1973; 12: 4507-4517.

人工血液 Vol. 18 , No.4, 2010

HbV（liposome encapsulated hemoglobin）膜への晶質，膠質浸透圧作用
三宅誠司 1），酒井宏水 2），高折益彦 3）1）大阪府済生会野江病院検査科
2）Waseda Bioscience Research Institute in Singapore
3）東宝塚さとう病院
和文要約 前回の研究で 蒸留水内包 liposome emulsion を一定濃度の食塩液と混合した時，とくに１：１容量混合でみられた食塩
液中の Na イオン，Cl イオンの予想以上の低下原因を明らかにするため以下の研究を行なった．研究１では前回使用したものと同質，同サイズの liposome 粒子を 0.4 g ％アルブミンを含む 0.625 g ％の食塩液に浮遊させ，０，15，120 分，24，168 時間後にその食塩液中の Na，Cl イオン濃度を測定した．その結果，実測した Na，Cl イオン濃度はそれぞれ 107.5 ± 0.7 〜 108.4 ± 1.0 mEq/L，
106,0 ± 0.7 〜 106.5 ± 0.08 mEq/L にあり，時間経過による変化は認められなかった．そして liposome 粒子内部の水分によって Na，Cl イオン濃度が希釈されると推定した予測値にほぼ一致した．したがって前回の研究で認められた liposome emulsion を一定濃度の食塩液と混合した時にみられた予想以上の Na イオン，Cl イオンの希釈は上記 liposome 粒子内部の水分の浮遊液への移動によると結論された．またその水分移動は liposome 粒子と食塩液との混合後測定器が表示するまでの 3.07 ± 0.03 分以内に生じていたことが推定された．研究２では 0.625 g ％ 食塩液に上記 liposome 粒子を浮遊させた後にアルブミンを 4.0 ％ になるように添加し，０，
５，15，180 分に浮遊液中の Na，Cl 濃度を測定した．その結果，Na，Cl イオン濃度はそれぞれ 149.4 ± 1.2 〜 149.1 ± 1.2 mEq/L，
139.9 ± 1.0 〜 138.9 ± 1.2 mEq/L であって，多少，時間経過とともに低下傾向，すなわちコロイド浸透圧によると思われる liposome
粒子の内部の水分の移動傾向がみとめられたが統計学的には有意性を立証するに至らなかった．すなわち初期測定時から３時間測
定時までで変化は認められなかった．そのため前回の研究での観察時間，３時間以内では少なくとも測定系に共存した４ g ％アルブミンの膠質浸透圧はこの liposome 粒子内部の水分の粒子外移動に関与していなかったことが確認された．

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 18 , No.4, 2010

133

総

説

リポソーム技術を基盤とする骨髄指向性薬物送達キャリアー
Bone Marrow-Targeted Drug Delivery Carriers Based on
Liposome Technology
宗 慶太郎
Keitaro Sou

和文抄録
リポソームは細胞型人工酸素運搬体としての応用のほか，各種薬物や遺伝子の運搬体としての応用が期待されている．
人工酸素運搬体に利用されるリポソームは大量投与を想定して開発され，薬物キャリアーとして少量投与で使用される血中滞留性リポソームとは粒子径や脂質組成などで異なる特徴を有している．このリポソームにヘモグロビンを内包させた
人工酸素運搬体（Hb 小胞体）を大量投与（680 mg lipid/kg body weight）すると，主に肝臓，脾臓，骨髄に捕捉され，2〜 3 日程度の半減期で血中から消失する．一方，薬物送達の対象となる少投与量（15 mg lipid/kg body weight）では，興味深いことに骨髄に集中した体内分布が観測される．この体内動態特性により，骨髄に薬剤を効率的に運搬できる薬物送達システムとしての新しい応用が期待できる．
Abstract
Liposomes are expected as carriers of drugs and genes as well as application for artificial oxygen carriers. Liposomes for
artificial oxygen carriers have been engineered in consideration of large infusion doses, therefore their specifications are uniquein size and lipid composition in comparison with conventional long-circulating liposomes for drug carriers at small infusion dose.
Artificial oxygen carriers, liposomes encapsulating hemoglobin（Hb-vesicles）, are distributed in liver, spleen, and bone marrow
mainly, and disappear from blood in half life of two or three days at large doses（680 mg lipid/kg body weight）. On the other
hand, interestingly, the liposomes are distributed in bone marrow locally at small infusion dose such as 15 mg lipid/kg bodyweight. This finding may offer a new application of the liposomes for drug delivery system which can carry therapeutics tobone marrow effectively.
Keywords
biodistribution, bone marrow, drug delivery, liposomes, macrophages,

１．はじめにリポソームは閉鎖小胞構造の分子集合体で，リン脂質を水相で懸濁すると自発的に形成される 1，2）．リポソームの内水相には水溶性薬物，タンパク質，遺伝子，生理活性物質などを内包できることから，薬物送達キャリアーとしての様々な応用が検討されてきた．特に薬物を目標とする部位まで安定かつ効率的に届けるための薬物送達システムに期待がよせられている．
従来，リポソームに限らず微粒子の経静脈投与では，投与した微粒子の大部分が肝臓と脾臓に捕捉されることが知られている．このため，肝脾での捕捉を回避し血中滞留性を向上させ，目標とする部位への到達率を向上させる方法論が検討されてき早稲田大学 先端生命医科学センター

た．血中滞留性の向上にはポリエチレングリコール（PEG）によるリポソーム表面修飾が有効で，この PEG 修飾リポソームに抗悪性腫瘍剤ドキソルビシンを内包した医薬品（Doxil®）が臨床で実用化されている 3，4）．腫瘍組織では血管透過性が著しく亢進しているため，リポソームのような微粒子でも血管外に流出し，血中滞留性を向上させれば腫瘍組織で流出するリポソー
ムの割合が増大する（受動的ターゲティング）5，6）．更に，生体内で特異的集合現象に関与する分子（例えば抗体，アプタマー，
リガンド）をリポソーム表面に取り付けることで，特定の部位に積極的に治療薬を送り届ける能動的ターゲティングを可能にする薬物送達システムの構築が検討されている．

〒 162-8480 東京都新宿区若松町 2-2

Center for Advanced Biomedical Sciences, Waseda University（TWIns）, 2-2 Wakamatsu-cho, Shinjuku, Tokyo 162-8480, Japan.
論文受付 2011 年１月８日 論文受理 2011 年１月 17 日

134

人工血液 Vol. 18 , No.4, 2010

人工酸素運搬体の研究開発分野では 1970 年代にリポソームが登場し，これまでにリポソームの内水相にヘモグロビンを内包したタイプとリポソームの二分子膜に合成ヘムを包埋したタ
イプの人工酸素運搬体が開発されている 7-11）．人工酸素運搬体
を輸血代替として投与する場合，薬物送達キャリアーとしての応用に比較してリポソームの投与量が数十倍に及ぶため，脂質成分や製法の最適化によりできるだけ少ない脂質でヘモグロビ
ンを効率良く内包でき，かつ大量投与に耐えうる高い安全性を有するリポソームが検討されてきた 12-14）．このように大量投与でも安全性の高いリポソームは，人工酸素運搬体としての応用のみならず，薬物送達キャリアーとして様々な応用が期待される．本稿では，細胞型人工酸素運搬体の研究開発の中で見出された骨髄に指向性を示すリポソームの特異な体内動態について
概説し，骨髄を標的とする新しい薬物送達キャリアーとしての応用について展望する．

その両親媒構造により血液脳関門を通過することを特徴とす
る．この 99m Tc-HMPAO 複合体の両親媒構造によりリポソーム
膜を透過できるようになり，内水相まで浸入してグルタチオンと 99mTc が複合体を形成する．99mTc-グルタチオン複合体はリポソーム膜を透過できないので 99m Tc を封じ込めたリポソームが得られ，未導入の 99mTc はゲル濾過や超遠心分離で除去できる．
99m
Tc とグルタチオンは１対２の安定な複合体を形成し 16），通常 80 ％以上の高効率で標識できる．血漿中（37 ℃）でインキュベーションし経時的にリポソームから 99m Tc の漏出を定量したところ，98 ％以上の 99m Tc が 48 時間後までリポソーム内に留

２．リポソームの体内動態評価
リポソームをキャリアーとする薬物送達システムにおいて，
薬物動態はキャリアーであるリポソームの体内動態に依るため，リポソームの体内動態の定量評価が重要になる．イメージング技術を利用することにより，投与したリポソームの体内動態を非侵襲で定量的に可視化でき，安全性や有効性に関連する
多くの情報が得られる．In vivo イメージングとしては，Ｘ線，
CT，PET（positron emission tomography）/SPECT（single
photon emission tomography），光イメージング，核磁気共鳴
イメージング（MRI）などが，動物を対象とする基礎研究から人体を対象とする臨床診断まで，生きた生体を対象に広く用いられている．SPECT では体内に投与した放射性化合物から放出されるガンマ線量を体外で検出して定量的に画像化する．リ
ポソームを放射性同位元素で標識して投与し，経時的に取得した画像を解析することで経時変化を含めた体内動態の詳細な情報が得られ，99m Tc，123 I，67Ga，111 In などが SPECT 核種としてイメージングに用いられる．
リポソームの標識部位として，表面，二分子膜内，内水相があるが，予め調製したリポソームの内水相に［technetium99m］pertechnetate（99m TcO−4 ）を後導入する方法で簡便に標識できる 15）． 99m Tc は放射壊変によりγ線を放出する放射性同位元素であり，比較的安価に入手でき，γカメラ計測に適したエネルギー（140 keV）を放出し，物理学的半減期は６ hr で蓄積性もないので臨床でも多用される核種である． 99m TcO−4 はチオール化合物と安定な複合体を形成し，この性質を利用して小胞体内水相を標識できる．図１ A に示すスキームのように，チオール化合物としてグルタチオン（30 〜 200 mM）を内包したリポソームを調製し，粒子径制御や諸物性計測を完了させた後，体内動態実験を行う直前に 99m Tc で標識することができる．
99m
Tc はリポソーム膜を透過できないため，両親媒性のhexamethylpropylene amine oxime（HMPAO）と複合体を形成させてからリポソームと混合する．99m Tc-HMPAO は局所脳血流シンチグラフィ剤として用いられる放射性医薬品であり，ARTIFICIAL BLOOD Vol. 18 , No.4, 2010

Fig. 1. Biodistribution study of radioisotope-labeled liposomes.（A）Remote loading of technetium-99m（ 99m Tc）into preformed
liposomes encapsulating glutathione（GSH）. 1,2-Dipalmitoyl-snglycero-3-phosphocholine（DPPC）and cholesterol which are
typically used as component of liposomes.（B）Static gamma
camera images of rabbits acquired at 10 min and 6 h after
intravenous injection of conventional 99m Tc-labeled liposome
composed by DPPC and cholesterol at 15 mg lipids/kg body.

135

り，少なくとも２日程度の実験においては安定標識体として取り扱えるものと考えられる 17）．
こうして 99mTc 標識した一般的なリポソーム（1,2-dipalmitoylsn-glycero-3-phosphocholine, DPPC/Cholesterol, 1/1 molar
ratio）を経静脈投与したウサギをガンマカメラ下でスキャンす
ると通常図１ B に示すような画像が得られる．リポソームを投与して 10 分後の画像では，リポソームが血流中に存在するため心臓の血液プールに強い放射線量が観測される．投与してから 24 時間後には肝臓と脾臓に強い放射線量が観測され，リポソームの大部分が肝脾に分布していることがわかる．リポソー
ムは肝脾で単核食細胞系に捕捉されることが明らかになっている 18，19）．

３．リポソームの表面修飾による骨髄選択性の発現と増強
リポソームはリン脂質を主成分とする両親媒性分子の集合体であるため，両親媒構造を有する特定の分子をリン脂質と混合
して分子集合させることで，リポソーム表面を特定の分子で修飾できる．特定分子で表面修飾することにより特定細胞や特定組織との相互作用を選択的に増幅することで，標的部位に選択的に薬剤を送達できるキャリアーとしての付加機能が創出される．
人工酸素運搬体に用いられるリポソームの表面物性に関与する特徴的な成分として負電荷脂質が挙げられ，この負電荷脂質
はリポソームによるヘモグロビンの内包効率を最大化するために必要な成分である．リン脂質とコレステロールで形成される
一般的な脂質膜は表面が電荷的に中性であり，多重層膜を形成する傾向がある．このような多重層リポソームでは，被覆層数が大きいほど単位脂質量当たりの内包量が減少する．大雑把に見積もって，二枚膜リポソームでは一枚膜リポソームに比較して単位脂質量当たりのヘモグロビン内包量がほぼ半分に減少する．このため，ヘモグロビンをリポソームに効率高く内包するには，均一粒子径の一枚膜リポソームを調製する技術が必要であり，負電荷脂質はこの内包技術において重要な役割を担っている．すなわち，負電荷脂質の導入による被覆層間の静電反発を利用して被覆層数の減少を促すことで，高い効率でヘモグロ
ビンを一枚膜リポソームに内包することができる 20-22）．
図２ A に示すように市販のパルミチン酸（PA）やジパルミ
トイルホスファチジルグリセロール（DPPG）に加え，合成脂質; 1,5-O-dihexadecyl-N-succinyl-L-glutamate（DHSG）が負電
荷脂質として使用できる．これらの負電荷脂質は，分子構造特異的にリポソームの生体適合性に関与することが明らかになっている 23-25）．最近の研究から，負電荷脂質の導入によりリポソームの体内動態にも著しい変化が認められることがわかってきた 17）．図２ B は，各種負電荷脂質（総脂質に対して９ mol ％）を含有するリポソームをウサギに投与（投与量 15 mg lipid/kg）
して 24 時間後の骨髄への分布率を比較した結果である．負電荷脂質を含有していないリポソームは図１ B にも示すように骨髄には殆ど分布せず，分布率は投与量の 2.3 ± 0.4 ％にすぎない．
負電荷脂質として PA や DPPG を導入したリポソームでも骨髄

136

Fig. 2. Structural specific effect of surface modification with anionic lipids
on uptake of liposomes by rabbit bone marrow.（A）Structure ofanionic lipids for preparing negatively charged liposomes. DHSG;
1,5-O-dihexadecyl-N-succinyl-L-glutamate, PA; palmitic acid, DPPG;
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylglycerol.（B）Comparisonof the liposome uptake by bone marrow at 24 h after injection.
Liposomes were injected at 15 mg lipids/kg body weight into
rabbits intravenously.

への分布率に大きな変化はなく，負電荷脂質を含有していない
リポソームと同レベルの低値である．一方，DHSG を導入した
リポソームでは，骨髄への分布率が 23.1 ± 3.1 ％にまで大幅に増大する．この結果より，DHSG の分子構造に特異的な相互作用が関与して骨髄への分布が増大していると考えられる．
図３には，DHSG を含有させたリポソームに更に1,2-distearoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-［monomethoxy poly
（ethylene glycol）（5000）］（PEG-DSPE）を導入し，ウサギに投与（投与量 15 mg lipid/kg）して 24 時間後の臓器分布を示している 17）．PEG-DSPE の導入量は 0.3 〜 2.6 mol ％として，PEGDSPE 含量による臓器分布の変化を調べた．DHSG を含有させたリポソームでは，PEG-DSPE の導入量に関わらず骨髄への高い分布率を示し，特に 0.6 mol ％の導入で最も高値を示した．
一方，PEG 修飾量の増大により肝臓への分布率が有意に減少することから，PEG 修飾は主に肝臓への取込みを抑制していることがわかる．PEG-DSPE 0.6 mol ％の導入で骨髄への分布率が最も高い値を示したのは，PEG 修飾により肝臓への取込みが抑制され，受動的に骨髄への分布率が高まった結果と考えられる．
0.6 mol ％以上に PEG-DSPE を増やしていくと，肝臓および骨髄の両者とも取込みが抑制される傾向を認めた．これは，人工血液 Vol. 18 , No.4, 2010

PEG-DSPE の増大によりリポソーム表面の DHSG 親水基がPEG 鎖で遮蔽されるためと考えられる．

Fig. 3. Effect of surface modification with poly
（ethylene glycol）（PEG）onorgan distribution of liposomes containing DHSG.（A）Structureof PEG-DSPE.（B）Biodistribution of liposomes in bone marrow,
liver, and spleen at 24h after injection. Liposomes were injected at
15 mg lipids/kg body weight into rabbits intravenously.

４．骨髄指向性リポソームの臓器分布過程 17）
骨髄への最も高い分布率が認められた，DHSG と 0.6 mol ％の
PEG-DSPE で修飾した骨髄指向性リポソーム（図４ A）について，ウサギに投与後（投与量 15 mg lipid/kg）からの臓器分布の時間推移を詳しく調べた．図４ B に示すように，投与 10 分
後のガンマカメラ像は心臓と肝臓の血液プール像を示し，投与
リポソームは血中にて循環していることがわかるが，時間経過と共に骨髄への分布が明確となる．図１ B に示す DHSG を含有していないリポソーム投与後の画像と比較すると，その相違は明確である．この画像から，骨髄，肝臓，脾臓への取込み量の経時変化を解析したのが図４ C である．投与後から骨髄への取込みが進行し，６時間後には投与量の 68.5 ± 3.3 ％に達した．
リポソームを捕捉したウサギ骨髄切片の透過型電子顕微鏡観
察から，リポソームは形態学的に骨髄マクロファージと同定される単核食細胞に捕捉されることが明らかになっている．骨髄マクロファージのファゴソーム内に多数のリポソームが取込まれていることから，ファゴサイトーシスにより捕捉されているものと考えられる．従って，骨髄指向性リポソームは骨髄マク
ロファージのファゴサイトーシス機構を特異的に標的化している．

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 18 , No.4, 2010

Fig. 4. Bone marrow-targeted liposomal carriers.（ A）Schematic
representation of bone marrow-targeted liposomal carriers which
consisted of four kinds of lipids.（B）Static gamma camera imagesof rabbits acquired at 10 min and 6 h after intravenous injectionof bone marrow-targeted liposomal carriers at 15 mg lipids/kg
body weight.（C）Initial distribution profiles of bone marrowtargeted liposomal carriers as a percentage of the injected doseanalyzed from the gamma camera images.

５．投与量と動物種による体内動態の相違
薬物送達キャリアーとして応用では，脂質の投与量にして15 mg/kg 程度での体内動態が対象となるが，細胞型人工酸素運搬体として応用する場合には，その数十倍の脂質に加えヘモグロビンが投与される．これまでに DHSG を含有するリポソー

137

ムにヘモグロビンを内包したヘモグロビン小胞体の体内動態がマウス，ラット，ウサギで調べられており，主に肝臓，脾臓，
骨髄に捕捉されることがわかっている 26-28）．体内動態に特に顕著な種差は認められず，複数種動物試験データを基にした血中半減期の見積もりでは，血液量の 25 ％程度のヘモグロビン小胞体をヒトに投与した場合の血中半減期は３〜４日程度と見積もられている 26-28）．ただし，ヘモグロビン小胞体の血中半減期や体内動態は投与量に依存するため，投与量が少なくなるにつれ血中半減期が短くなる．このため，健常人に僅かな量を投与する第１相試験などでは，多量投与から予想される体内動態と異なる特性を示す可能性がある．本稿で注目している骨髄指向性は少量投与で顕著に認められるが，大量投与では特に骨髄に偏った体内分布は観測されていない 26）．少量投与では各臓器でFig. 5. Biodistribution of bone marrow-targeted liposomal carriers invarious species.（A）Static gamma camera images of rhesus
monkeys（at 3 h）
, rats（at 6 h）
, and mice（at 6 h）after intravenous
injection of bone marrow-targeted liposomal carriers at 15 mg
lipids/kg body weight.（B）Biodistribution of bone marrowtargeted liposomal carriers in rhesus monkeys（at 3 h）
, rabbits（at6 h）, rats（at 6 h）
, and mice（at 6 h）after injection. H: heart, L:
liver, S: spleen

138の初期取込み速度が顕著に反映され，肝臓や脾臓に比べ骨髄での取込み速度が著しく速いため骨髄に偏った体内分布となるが，骨髄での単核食細胞系による取込み飽和量以上のリポソームを投与すると，骨髄での取込みが飽和するため，肝臓や脾臓での取込み率が増大してくるものと考えられる．また，図５に示すように少量投与であっても動物種により異なる臓器分布を示し，これまでに検討したアカゲザルとウサギでは骨髄への高い分布率を示すが（〜 70 ％），ラットでは特に脾臓への分布率が高く，マウスでは肝臓への分布率が高いことがわかっている 29，30）．

６．分子機構に関する考察
リポソームに骨髄指向性を発現させる要因は DHSG の導入であり，骨髄マクロファージによる捕捉を促す情報分子となっていることが予想されるが，その分子機構の詳細はまだ明らかでない．ここでは，DHSG の分子構造や既知の生体システムから推測される分子機構の関与について考察してみる．分子構造に選択的な生体反応では受容体（レセプター）の関与が示唆され，実際にマクロファージ表面には様々な受容体が発現しており，
これら受容体が特別な分子構造（リガンド）と特異的かつ選択的に相互作用することがわかっている．マクロファージは細菌やウィルスなど外来異物に対する生体防御の役割において注目されることが多いが，恒常的に脂肪や細胞の代謝に関与しており，血中から酸化リポタンパク質や老化細胞などの微粒子を選択的に除去している．このように血中から微粒子を選択的に除去するのに受容体が関与しており，具体的にはスカベンジャー
受容体やホスファチジルセリン（PS）受容体が酸化リポタンパ
ク質中の酸化リン脂質や老化細胞表面のホスファチジルセリン
をリガンドとして認識している 31-35）．これらのリガンドとなる脂質が末端カルボキシル基を有している点は注目に値し（図６），

Fig. 6. Structure of known lipid ligands against scavenger receptors.
Oxidation of unsaturated fatty acid in phospholipids produces
terminal carboxyl group. PS has a carboxyl group at its
hydrophilic head group.

人工血液 Vol. 18 , No.4, 2010

DHSG の末端カルボキシル基がマクロファージ表面のスカベン
ジャー受容体に認識されている可能性が示唆される．最近の研究では，酸化リン脂質のカルボキシル基が脂質膜に露出した
Whisker model がスカベンジャー受容体との結合に重要であることが明らかにされている 33）．図２に示すように PA も末端にカルボキシル基を有しているが，DHSG と異なり骨髄マク
ロファージによる取込みに関与しない．これは PA のような脂肪酸の分子長はリン脂質に比較して短いため，末端カルボキシル基がリン脂質の親水部に埋もれて脂質膜に露出していないことが原因かもしれない 36）．
ところで，スカベンジャー受容体はマクロファージや内皮細胞表面に広く発現しているため，この点において DHSG がスカ
ベンジャー受容体に結合する場合，なぜ骨髄マクロファージに選択的に捕捉されるのかが説明できない．しかし，リポタンパ
ク質や細胞など生体粒子の血中からのクリアランスにおいて，骨髄がその役割を担うことを示す観測例が報告されている．リ
ポタンパク質の一種であるカイロミクロンの代謝では，ウサギや霊長類のマーモセットにおいて骨髄が主要な臓器であることが報告されている 37）．また，カイロミクロンの代謝臓器には種差を認め，ラット，モルモット，犬では骨髄での取込みは低く，ラットとモルモットでは脾臓での取込みが高い．この動物種による臓器分布の相違は，図５に示す骨髄指向性リポソームで観測された傾向とよく似ている．従来，肝臓と脾臓が主に注目されていた好中球の血中からのクリアランスにおいても，最近の研究や臨床診断から，かなりの部分を骨髄が担っていることが報告されている 30，38，39）．成人骨髄から一日に血中に放出される血球細胞は 4.9 × 10 11 個におよび 40，41），これを重量に換算すると年間 88kg の血球細胞が骨髄から放出されていることになる．
物質収支の観点から血中に放出した分は補充が必要であり，骨髄が造血に必要な物質として脂肪や老化細胞を血中から積極的に取込むシステムは合理的である．げっ歯類では，脾臓などでの髄外造血が微粒子の体内動態に影響している可能性がある．

７．おわりに赤血球，白血球，血小板産生臓器として機能している骨髄を標的とする薬物送達システムには，様々な応用が期待できる．
リポソームはモジュール方式で構成されているため，内包する薬剤を診断薬，治療薬，造血刺激因子などと取り替えることは容易であり，造血機能に関連する疾患に様々な治療戦略を提供できる．骨髄マクロファージに寄生するリーシュマニア症の治
療には，骨髄マクロファージへの効率的な薬物送達システムが検討されており 42），骨髄指向性リポソームが有効なキャリアーとなるであろう．PEG 修飾リポソームにドキソルビシンを内包
した Doxil® が骨髄腫治療の併用薬剤として検討されているが 43），
このような骨髄腫治療薬のデリバリーに骨髄指向性リポソームが役に立つ可能性が高い．骨髄マクロファージにファゴサイト
ーシスで取込まれていることから，pH 応答性などの内包薬物を効率的に放出させる仕組みをリポソームに付加することにより，より効果的な薬物送達システムが構築できるものと考えら

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 18 , No.4, 2010

れる．また，これらの薬物キャリアーの体内動態特性を活用するための医薬品化合物の開発，イメージング診断と治療を同時に行う theranostic 医薬品の開発など，リポソーム技術を基盤とする新しい創薬の方法論の展開も期待される 44，45）．

謝辞
本稿で紹介した研究は，早稲田大学 土田英俊名誉教授，武岡真司教授，酒井宏水准教授の御指導御助言の下に行われた．
また，実験の遂行にあたり人工酸素運搬体の研究開発に携わる
先生方，学生諸氏の多くの協力を得た．In vivo イメージングは，Professor William T. Phillips, Professor Beth Goins（Universityof Texas, Health Science Center at San Antonio）の御指導御協力の下に行われた．ここに深く感謝いたします．本研究は，日本学術振興会科学研究費補助金，日本学術振興会二国間共同研究事業（日米）の支援を受けた．記して謝意を表する．

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141

総

説

バイオ医薬品におけるプリオンの問題−ヒト赤血球を原料とする人工酸素運搬体をめぐる問題−
Current Situation of Prion Risks on Biological Products- Points on the Consideration for Prion Risk in Artifical Blood
Products Derived from Human Red Cells 柚木 幹弘（1，2，3），萩原 克郎（2），生田 和良（3）Mikihiro Yunoki (1, 2, 3), Katsuro Hagiwara (2), Kazuyoshi Ikuta (3)

和文抄録
生体成分を原料とするバイオ医薬品やヒト血液成分を原料とする血漿分画製剤には感染性病原体の理論的混入リスクが存在する．そのため，製造工程における安全対策の導入と製造工程中の感染性病原体の不活化・除去能力の評価が求められている．本稿では，ヒト血液由来の赤血球を原料とする人工酸素運搬体を中心に，注目すべき感染性病原体のひとつであるプリオンの問題に関して，１）疫学などの背景，２）輸血領域で現在とられている施策，３）バイオ医薬品のプリオンに対する安全対策研究の現状，などについて概説する．
Abstract
Biological products derived from animal materials and human blood theoretically carry the possible risks of contamination with
infectious pathogens. Therefore, to employ the safety measures against the risks during manufacturing process, evaluation forpathogen inactivation and/or removal ability during the manufacturing process steps in individual products are required. Prionissue is an important risk factor of the biological / blood products. In this manuscript, points to consider the above possibility
such as 1）epidemiology and background of prion issue, 2）safety measures against prion risks in blood transfusion and blood
products fields, and 3）current situation through several researches against prion risks in the field, are summarized.
Keywords
Prion, Biological product, Blood, Safety, vCJD

１．はじめに抗体医薬を始めとするバイオ医薬品の基本的な製造手法は確立されており，原料や細胞由来の病原体混入リスクや製造工程における病原体等の不活化・除去能力の評価に関する多くの知見が集積されている．血液製剤や血漿分画製剤についても，多くの研究や対策の実施，教訓によって得られた数多くの知見の集積がある．一方，新しい領域の血液代替物は開発途上であるが故に，これらのリスク評価は研究成果の集積途上にあると言える．このような製剤には，その製剤特性を理解した上でバイオ医薬品や血液・血漿分画製剤で得られた知見からそのリスク（1）㈱ベネシス安全管理部 品質安全対策グループ〒 541-8505の全容を俯瞰し，製造工程をデザインした上で，その製剤のリスクを評価する必要がある．本稿では研究開発途上の血液代替物の一つであり，日本の献血血液由来の赤血球を原料とする人
工酸素運搬体を中心にバイオ医薬品におけるプリオン問題の現状について概説する．

２．BSE 及び vCJD の発生
1986 年，英国においてこれまでに確認されていない神経症状を呈するウシの疾患が流行していることが報告された．この疾患は狂牛病（Mad Cow Disease）と一般的に報道されたが，学大阪市中央区北浜 2-6-18

Pathogenic Risk Management, Benesis Corp.

Pathogenic Risk Management, Benesis Corporation, 2-6-18, Kitahama, Chuo-ku, Osaka, 541-8505 Japan.
（2）酪農学園大学大学院獣医学研究科 病原体リスク管理学講座 School of Veterinary Medicine, Rakuno Gakuen University（3）大阪大学微生物病研究所 ウイルス免疫分野 Department of Virology, Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University
論文受付 2010 年１月 23 日 論文受理 2011 年１月 24 日

142

人工血液 Vol. 18 , No.4, 2010

術 的 に は 伝 染 性 海 綿 脳 症 （ Transmissible Spongiform
Encephalopathy, TSE）のひとつであり，ウシ海綿状脳症（Bovine Spongiform Encephalopathy, BSE）と名付けられた．
この BSE 発生の原因が，ヒツジの TSE であるスクレイピーに感染した個体を含む肉骨粉の摂取によることが指摘され，BSE
は羊の TSE の原因物質による感染によって生じることが疑われた．英国の公衆衛生当局は，英国内の家畜飼料からこの肉骨粉を排除する決定と，ウシ全頭モニタリング制度を導入することにより，更なる流行の拡大を抑止した．BSE は全世界的に流行する事が懸念されたが，そのほとんどが英国での発生にとどまり 1992 年をピーク（年間発生頭数約 37,000 頭）にその発生は減少した（Fig. 1）1，2）．
日本においては 2001 年に BSE の発生が初めて確認され，その後，英国と同様の全頭モニタリング制度の導入と全頭検査が導入された．日本では 2010 年 12 月現在で総計 36 例の発生が確認されている 3）．
ところが，1996 年に英国においてこれまでに確認されていない病態を呈するクロイツフェルトヤコブ病（Creutzfeldt-Jakob
Disease, CJD）が報告された．この新しいヒトの疾患はこれま
での CJD とは違い若年性であることが特徴であるとされ，変異型 CJD（Valiant CJD, vCJD）と命名された．この vCJD は
BSE 同様にほとんどが英国で発見され，その流行パターンがBSE のパターンと相関関係にあることから，vCJD の原因がBSE 発症ウシ由来の原料の摂取によるものと疑われた．このvCJD は BSE 同様に全世界的に流行・拡大することが懸念されたが大流行には至らず，全世界の現時点での総発生数は 221 名となっている．一番多く発生した英国では 2000 年に 28 例の発生をピークとした現時点の総計 174 名（内，生存４例），続いてフランスの 2005-2006 年の６例をピークとする総計 25 名であった（図１）2，4）．日本においては 2004 年に vCJD 患者が１名（英国渡航歴有）発生している 5）．

Fig. 1. BSE と vCJD の流行経過（引用 1）2）より改変）．

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 18 , No.4, 2010

３．伝達性海綿状脳症の原因物質であるプリオン蛋白
CJD/vCJD, BSE, Scrapie などの TSE の原因物質については長い間論争があったが，1982 年に Prusiner がプリオン説を提唱したことで一定の収束を得た 6）．プリオン（Prion）とは蛋白性の感染性粒子という意味である Proteinaceous Infectious
Particle の短縮形造語であり，この感染性病原体はウイルス等と異なり遺伝情報を持たない蛋白質そのものである．ヒトの正常型プリオン蛋白（Celler Prion protein, PrPc）は CD230 と同じで，第 20 番染色体に PRNP 遺伝子としてコードされている 7）．
病原体としての感染性プリオン蛋白質はウイルス等の外来性物
質ではなく，宿主の蛋白分解酵素感受性でαへリックスリッチな構造をしている PrP c がβシートリッチな構造をとる，蛋白分解酵素抵抗性（Proteinase resistance prion protein, PrPres）の構造に変換したものである．これを異常型プリオン蛋白と呼ぶが，PrPres の種類により蛋白質分解酵素への抵抗性は同じではない．この構造変換は PrPres を種として，体内の PrPc が次々に PrPres に変化・結合・集積するものと考えられている．また，感染性プリオン蛋白は単量体でなく重合体として存在していると考えられ，粒子径 10nm 以下の重合体は感染性がなく，20 〜
25nm の粒子径のものが最も感染性が高いとの報告がある 8）．通常病原体はその存続のために宿主に感染・増殖し，遺伝情報の伝達により子孫を増やすというのが一般的な理解である．しかしながら，このプリオンは存続させるべき遺伝情報を持たない
ことから，これまでの概念に一石を投じることになった．これらのプリオン蛋白は，高次構造の違いを除いて宿主蛋白そのものであることから，新しい感染性病原体の概念がここに確立することになった．

４．社会の反応
BSE と vCJD の関連性が指摘された事は，畜産を中心とした
食品安全上の BSE 問題を再び惹起する事となった．さらに，
感染性プリオン蛋白は蛋白分解酵素に抵抗性であるだけでな
く，121 ℃のオートクレーブ滅菌にも耐えるなど不活化が困難であることから，医薬品領域においても大きな問題を惹起した．
医薬品にはゼラチンカプセルなどウシ由来の原材料が数多く使用されていることから，日欧米の規制当局はプリオンに関するガイダンスの制定や行政指導をおこなった．厚生労働省も，
1996 年にメーカーに対してウシ由来原材料の使用実態と原産国の把握を求めた 9），そしてプリオンに対するリスク評価を 2000
年に求めた 10）．メーカーはこの BSE 問題に対応するとともに，可能なものについてはウシ由来以外の原料への切り替えを行った．
ヒトや動物組織を原料とする蛋白医薬製剤は，その製剤化工程で強力な蛋白変性操作は導入されていない．そこで，ヨーロッパの規制当局は 1998，2003，2004，2009，2010 年にプリオンのリスク評価に関する見解を発出した 11，12，13）．日本においても 2003 年に厚生労働省よりプリオン対策強化が通知された 14）．
これを受け，ウシ組織抽出物由来の医薬品や血液製剤のメーカ
ーは各蛋白医薬製剤に導入されている工程のプリオン除去能力

143

の評価を行い，必要に応じてプリオンに対するリスク低減のために，ウシ原産国の変更や新たな工程の導入を実施した．

５．CJD の疫学
ヒトのプリオン病である CJD には孤発性 CJD（Sporadic
CJD, sCJD），家族（遺伝）性 CJD（Familial CJD, fCJD），医
原性 CJD（iatrogenic CJD, iCJD）そして vCJD がある．sCJD
は 55 歳以上のヒトに約 100 万人に１人の割合で発症する CJD であるが，輸血などを通じてのヒト−ヒト感染例の報告は現時点ではない．医薬品への感染性プリオン蛋白の混入リスクが高い
もののひとつに，輸血を始めとする血液製剤がある．献血後にvCJD に感染していることが判明したドナー由来の血液製剤を輸血された事例が英国で確認され，現時点で受血者４名がvCJD に感染したと考えられている 15）．2010 年の WHO 見解ではヒト血液は低感染性組織のカテゴリーに分類され，vCJD の感染性あり，CJD は感染性なしと判断されている 16）．更に，英国では血友病患者もモニタリングされている．本年，死亡した
血友病患者の病理解剖を行ったところ，脾臓に異常型プリオン蛋白が発見された 17）．この患者は生前に神経症状を発症していなかったにも関わらず vCJD に感染していた．英国健康保健局（Health Protection Agency, HPA）及び米国食品医薬品局（Food and Drug Administration, FDA）は見解を出したが，そのリスクレベルの変更は行わなかった 18，19）．この事例は輸血製剤だけではなく血漿分画製剤でもリスクが残存することを示
すことになった．2010 年，欧米の規制当局はそれぞれ，メーカーが実施する製剤のリスクアセスメントに関するガイダンス（改定案）を発表した 11，13，20）．また，他の医原性感染として硬膜移植，ヒト脳下垂体由来製剤（成長ホルモンなど），角膜移植や手術器具を介しての感染も認められている 21，22）．
日本では CJD のサーベイランスが実施されており，1999 年
から 2009 年までの間に確認された 1324 例の CJD は，sCJD が1019 例（77 ％），fCJD が 220 例（16.6 ％），iCJD（全例硬膜移植）が 80 例（6.0 ％，期間外を加えると総計 138 名）），vCJD が
１例（0.1 ％），分類できない CJD が４例（0.3 ％）であった 22）．
この中で実際に輸血によるリスクがあると考えられるドナーとなりうるのは iCJD と vCJD 患者由来であるが，手術歴などの確認により iCJD 患者がドナーになる可能性を排除しており，現
実には vCJD のリスクを検討する必要がある．日本の vCJD は
現時点で１例であるが，英国渡航に由来して vCJD に感染する
リスクと，その感染者が献血し，輸血を通して国内で感染が拡大するリスクを検討したところ，2007 年までに 0.06 人が発症し，ポアソン分布を適用すると少なくとも１人の発生は否定できな
いが，２人以上の発生は極めて低いという結果が得られた．次に輸血による感染予測が行われた．モデル予測は，１）1990 年に 20 代前半の感染者が１名存在し，２）輸血感染による潜伏期間は食餌による感染時と同じ，３）汚染血の輸血で必ず感染，
４）輸血歴のある人や海外渡航歴のある人の献血制限は実施しない，５）輸血経験者の死亡率は増加しないという条件で実施した．その結果，感染者数は 2003 年ごろにピークを迎え，累144

積発症者数の増加は 2010 年代の前半でほぼ終わり，0.563 人という結果となった．これらの結果から，現在の BSE/vCJD の疫学状況等の知見が大きく変化しない限り，2010 年以降の日本における輸血による vCJD 感染が現実に発生する可能性は非常に低いと考えられる 23）．

６．血液及び血液成分のリスクとその低減策
プリオンリスクの実効的対策は，検査によるリスク排除である．現在，日本ではウシに対して世界でも例を見ない全数検査を行っており，世界的にも最高レベルの対策を取っている．これに加えて，餌の管理，臨床症状のモニタリング，イヤータグ
による全数管理，屠場での解体方法や交差汚染の管理など，多くの対策を組み合わせることによってその安全性を確保している．ヒトの vCJD についてもウシの場合と同様に多数の検体を迅速に安価に検査する方法を開発する必要がある．vCJD 検査の産業応用できる手法として，蛋白分解酵素を用いない
ELISA 法が提案されている 24）．しかしながら産業応用可能で
CJD/vCJD に有効な検査手法は現時点で開発されていない 25）．
血液は主に赤血球，血小板，白血球，血漿の画分に分けることができる．プリオン蛋白は細胞膜上に存在すると考えられていることから，血液細胞が輸血領域における主なプリオン伝播
リスクであると考えられる．輸血による vCJD 感染リスクの低減策を講じる必要があるが，献血基準の中に CJD/vCJD リスクを低減させる問診項目として英国などの滞在歴を設定し，ドナーの適格性を確保している．また，白血球除去フィルターがプリオン除去に効果があるとされ，その効果が確認されているものもある 25，26）．血漿分画製剤の原料となる血漿については，更に６ヵ月の貯留保管を行った後に日本赤十字社からメーカーに出荷されることにより，採血（原料）段階でのリスク低減を行っている．更に，血漿分画製剤の製造工程においてプリオンを除去する工程を導入することによりその安全性の確保に努めている 27）．

７．人工酸素運搬体
現在開発研究が進められている人工酸素運搬体の種類はいく
つかあるが，その多くはヒト赤血球よりヘモグロビンを抽出・精製した高純度・高濃度のヒトヘモグロビン（Hb）溶液を原料とし，脂質二重膜で包埋したリポソーム型又は非カプセル型
架橋修飾・ PEG 修飾の形状をとる 28）．ヒト赤血球の大きさは約８μm，精製した Hb は約４ nm の大きさであり，これを小胞体に包埋した時の小胞体径は約 200 〜 250nm である 28，29）．これらの運搬体は Hb をヒト赤血球から得ていることから，ドナー由来の病原体の混入が理論的なリスク因子として存在する．この
人工酸素運搬体に使用される Hb は赤血球を出発原料として精製されるが，Hb の大きさが約４ nm に対して，異常型プリオン
蛋白単分子の分子量は約 30,000，感染性プリオン蛋白の粒子は10nm 以上の重合体 8）と考えられる．Hb の精製工程におけるプリオン除去は血漿分画製剤の製造工程に導入されているプリオン除去手法を応用可能であると考えられ，人工酸素運搬体の製

人工血液 Vol. 18 , No.4, 2010

Fig. 2. 界面活性剤処理による 263K 株感染ハムスター脳由来マイクロソーマル画分の粒子径変化（文献 30 より引用）．

造工程にプリオン除去工程を導入するには赤血球からヘモグロビンを精製する過程に導入するのが適している．

８．工程評価を行う上でのプリオン材料調製法の問題
プリオン除去に関する工程評価を行う場合，感染動物の脳を出発材料として調製することが一般的である．プリオン研究初期には脳ホモジネート（Brain Homogenate, BH）を用いていたが，その後は精製操作を加えて膜画分（Microsomal
Fraction, MF）が主に使われるようになった．本来，工程評価に用いるプリオン材料は感染動物の血液や血漿を用いることが望ましい．しかしながら，血液から工程評価に用いることができる量の感染性プリオン蛋白を得ることは困難であり，このMF を使用せざるを得ない．しかしながら MF は工程評価に用いる材料として最適化されたものではなかった．
そこで私たちは，ヒツジのスクレイピー株（Hamster
adopted scraipie ハムスター 263K）を用いてこの MF の粒子径に着目した工程評価材料としての適格性を検討した．MF の平均粒子径は約 800nm 程度あったのに対して，Sarcosyl や
Lysolecithin や超音波処理によって短時間で，約 200nm 以下の平均粒子径にすることができた．ウイルス不活化に用いられる
SD 処理は用いられる Tri（ n-butyl）phosphate（TNBP） と
Polyoxyethylensorbitan monooleate（Tween80）を組み合わせて長時間処理しないと平均粒子径を 200nm 以下に出来なか

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 18 , No.4, 2010

Fig. 3. 超音波処理による 263K 株感染ハムスター脳由来マイクロソーマル
画分の粒子径変化（文献 30 より引用）．

った．これに対して，Polyoxyethylene-p-isooctylphenol（Triton X-100）は平均粒子径に影響を与えなかった（Fig. 2，3）30）．また，MF を PBS に添加し 220nm，100nm，75nm，35nm，19nm，15nm のろ過膜でろ過したところ，100nm と75nm のろ過膜の結果において超音波処理の有無で除去効果（除去指数, Log Reduction Factor, LRF）に差が生じた（Table 1）30）．このことより，工程評価に用いるプリオン材料
は Sarcosil や Lysolecithin などの界面活性剤処理や超音波処理を行う事が望ましいことが明らかになった．なお，超音波処理

145

Table 1. PBS 中の 263K 株異常型プリオン除去（文献 30 より引用）．
Planovaフィルター

PVDFフィルター

220nm

公称膜孔径

72nm

100nm

35nm

15nm

超音波処理

あり

なし

あり

なし

あり

なし

あり

なし

あり

なし

ろ過前

4.2 / 3.5

3.5 / 4.2

4.2 / 3.5

3.5 / 4.2

4.2 / 4.2

3.5 / 4.2

4.2 / 4.2

3.5 / 4.2

4.2 / 4.2

3.5 / 4.2

ろ過後

3.8 / 3.8

3.1 / 3.8

3.8 / 3.1

2.4 / 3.1

2.4 / 2.4

<1.0 / <1.0

<1.0 / <1.0

<1.0 / <1.0

<1.0 / <1.0

<1.0 / <1.0

除去指数

0.4 / -0.3

0.4 / 0.4

0.4 / 0.4

1.1 / 1.1

1.8 / 1.8

≥2.5 / ≥3.2

≥3.2 / ≥3.2

≥2.5 / ≥3.2

≥3.2 / ≥3.2

≥2.5 / ≥3.2

ウエスタンブロッティング（WB 法）による評価．
数値は Non-detectable endpoint 法によって求めた総 Log10 値で示した．

した MF は組成の変化がなく，工程サンプルに与える影響は最小限に止めることができるが，界面活性剤処理した MF は界面活性剤が残存することから工程サンプル及び評価に与える影響を考慮する必要がある．
次に，このプリオン材料が工程評価を行う上で，血液中の感染性プリオン蛋白をどこまで反映・再現させているかという問題がある．輸血で vCJD が伝播することが報告されており，血液細胞画分には膜結合蛋白であるプリオン蛋白が含まれることは予測できる．しかしながら血漿には感染性プリオン蛋白が細胞断片として含まれるのか，それとも可溶化画分として存在す
るのかについては不明な点が多い．私たちは血漿分画製剤の製造工程に導入されているウイルス除去膜（平均膜孔径 15nm）を用いて，実際の製造条件を模倣してプリオン蛋白の除去性能を評価した．この 15nm のろ過膜はバイオ医薬品分野に産業応用できる世界で最も公称膜孔径の小さなウイルス除去膜である．この膜処理により，ウエスタンブロッティング（WB）法による評価でろ液中の異常型プリオン蛋白は検出限界以下にまで除去され 3.5Log 以上の除去指数を示した．これに対して，動物への接種実験ではろ液中の感染性プリオン蛋白は 4.0Log 以上の除去指数を示したものの，一部のサンプルで感染性を認めた．
更にこの 15nm ろ液を 150,000g，１時間の超遠心操作を行い，得られた上清画分と沈殿画分について感染実験を行った．この超遠心条件はプリオン蛋白を濃縮する時に採用されている条件
であるが，驚くべきことに両方の画分に感染性が認められた（Table 2）30，31）．感染動物の脳ホモジネートの超遠心上清に感染性が認められることは Berardi らが報告している 32）が，この上清画分に残存する感染性プリオン蛋白が 15nm の膜を通過することが可能であることは新しい知見である．一方，Silveira ら
は約 20 〜 25nm の重合体が最も感染性が高く，10nm 以下の画分には感染性は認められなかったと報告している 8）．15nm のウイルス除去膜はその孔径に近い粒子径を有するパルボウイル
スなどを高負荷した時に一部のウイルスがろ液に認められることを経験している 33）が，15nm 以下の大きさの感染性プリオン
蛋白が膜を通過した可能性がある．一方，vCJD 感染マウスの，赤血球，Buffy coat，血小板含有血漿，血漿等を正常マウスに

146

Table 2. 15nm ろ過による異常型プリオン蛋白の除去（文献 30，31 より引用）．
Lysolecthin及び超音波処理263K

超音波処理263K

WB（定量）

BA（定量）

ろ過前

6.1 / 6.1

7.97 / 8.30

3.6

発症

ろ過後

<2.6 / <2.6

<3.25 / 4.30

<0.8

発症

除去係数

≥3.5 / 3.5≥4.72 / 4.00

≥2.8

NA

超遠心沈殿

NA

NA

<1.0

発症

超遠心上清

NA

NA

<1.0

発症

WB（定量） BA（定性）WB ：ウエスタンブロッティングによる評価．
数値は Non-detectable endpoint 法によって求めた総 Log10 値で示した．
BA ：動物接種試験による定量又は定性評価．
定量評価は階段希釈サンプルを用い一群６匹の結果から Karbar 法により，総 ID50（Log10）値で示した．

脳内又は静注にて接種したところ，赤血球画分には感染性が認められなかったものの，それ以外のサンプルすべてに感染性が認められた 34）．これらの結果はあくまで実験的に得られた現象
であり，ヒト血漿中の存在様式を証明したものではないが，感染性プリオン蛋白はこれまでに知られている膜結合型としての存在様式に加えて，血漿中に可溶化又は非常に微細な画分（私たちは，Soluble like form とした）としても存在し得ることを示唆することとなった．
赤血球を原料とする Hb を考える場合，混入してくるプリオン蛋白の形態として，膜由来（結合）と Soluble like form のプ
リオン蛋白の２つの存在様式が考えられる．血漿も同様に細胞断片及び Soluble like form の存在様式が理論的に考えられる．
現在評価試験に用いているプリオン材料はその両方を含んでいることが実験結果から示されているので，評価結果は両方の存在様式を反映したものと思われる．しかしながら，Soluble
like form の感染性プリオン蛋白の実態や血漿中の感染性プリオン蛋白の存在様式に関する知見はほとんどないので，Soluble like form の意味についての更なる研究が求められる．

人工血液 Vol. 18 , No.4, 2010

９．工程評価を行う上でのプリオン株の問題
現在工程評価には vCJD のモデルとして，263K 株などが主に使用されている．これは 263K 株が長期にわたりプリオン研究に用いられてきており，評価手法が確立していたことや，BSE
や vCJD の動物馴化株がなかったことによる．しかしながら，
263K 株を評価に用いる場合は，BSE 株，vCJD 株の持つ蛋白分解酵素（PK）への抵抗性等の性状が異な可能性があることを考慮する必要がある．また，再利用するデバイスや設備などのプリオン清浄化（不活化）に関しても，プリオン蛋白の持つ性状から慎重にその条件を設定する必要がある 35）．これらのことから，vCJD や BSE のモデルとして 263K 株を用いることによる影響を工程条件設定時や評価時には必ず意識しておくべきである．
米国赤十字の Akimov らは，vCJD のマウス馴化株及び細胞培養法を樹立した 36）．私たちはこの株と関連技術を導入し，
vCJD を直接用いた評価試験技術確立と vCJD のモデルとしての 263K 株の妥当性に関する検討を進めている．vCJD 感染マウ
ス脳由来の超音波処理プリオン材料を用いて 15nm ろ過膜による異常型プリオン蛋白の除去特性を WB 法で評価したところ，
2.8Log の除去指数を示したものの，ろ液中に異常型プリオン蛋白を認めた（Table 3）37）．この結果から，同じ方法で調製したプリオン材料を用いたろ過実験では，263K 株も，vCJD 株も同様のろ過（除去）特性を示すことが明らかになった．しかしな
がら 263K 株はこれまで WB レベルで 15nm ろ過後液には検出された事がなかったのに対して，vCJD 株は検出された．この結果は検出感度によるものなのか，263K 株と vCJD 株由来の異常型プリオンの物性の違いによるものなのか，現時点で判断することはできない．感染性を含めた詳細を更に検討する必要がある．

Table 3. 15nm ろ過膜によるvCJD 及び263K 由来・超音波処理マイクロソー
マル画分中の異常型プリオン蛋白の除去．
vCJD

263K

ろ過前

3.1

4.2

ろ過後

0.3

<1.0

除去指数

2.8

≥3.2

ウエスタンブロッティング（WB法）による検出．
数値はNon-detectable endpoint法によって求めた総Log10 値で示した．

10．リスク評価を行う上での留意点
工程評価を行う上でのプリオン材料の留意点は上述の通りであるが，製剤のリスク評価を行うにあたっては他にも留意すべき点がある．まず，製剤のリスク評価はいくつかの施策の組合せによって完成するという点が挙げられる．人工酸素運搬体のリスク評価を行う場合，原料に対する評価と工程に対する評価が基本となる．そしてその製剤を投与される患者に対するリス
ク・ベネフィットに基づき有用性の判断を行うことになる．
原料に対する評価は，１ロットの製剤を製造するための原料

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 18 , No.4, 2010

（赤血球）に異常型プリオン蛋白が混入する量を疫学的に推定することによって行う．現在，日本では輸血による vCJD の発生確率は１人と考えられている 23）．現在，ヒト血液中の vCJDの感染価を定量的に推測することができないが，英国ではvCJD に汚染していると思われる輸血例 66 例中４例が感染している 38）．vCJD 感染マウスの Buffy coat，赤血球及び血漿を静注ルートによりマウスに感染させたところ，Buffy coat と血漿は感染性を示し，赤血球画分は感染性を示さなかった 34）．これ
らの知見に基づけば，日本の献血由来の vCJD 陽性原料を製造に用いる可能性はほとんどないと解釈されるが，原料画分には感染性が認められることから，任意のロットに混入する推定最大量は１単位（ドナー）となる．よって，工程の評価はこれを基準として考えることになる．
具体的な対策として，次の対策が考えられる．先ず，採血時に白血球除去膜処理を導入し，原料段階でのリスク低減策を講じる．白血球除去膜は白血球除去によるリスク低減に加え，プ
リオン蛋白そのものの除去が期待できる．しかしながら白血球
除去膜によるプリオン蛋白除去については一部の製品を除き評価は定まっていない 11，12，25）．次に製造工程におけるリスク低減を行う．工程にはプリオン除去の堅牢性を確保するために，除去能力を示す複数の工程を導入する．この能力についてはガイドラインに従って評価する必要がある．ウイルスを対象とした評価においては数値目標が設定されているが，プリオンを対象とした評価では現時点で数値目標は設定されていない 39，40，41）．
このことからも，プリオンを対象とした評価において，目標とする数値の妥当性や必要とする安全係数についての更なる議論が必要であり，得られた数値（RLF）だけで安全性を判断するのは時期尚早である．むしろ，製造工程中にプリオン除去の機
作が異なる工程を複数導入することによってセーフティーネッ
トを構成する方が効果的であり，工程の堅牢性も高くなると考えられる．
血漿分画製剤や Hb 精製工程に導入可能と思われるデバイス
は，採血時の白血球除去フィルターの他に，ウイルス除去フィルター，デプスフィルター，荷電された除菌・清澄ろ過フィル
ター等があり，蛋白質の精製工程としては，エタノール分画，
硫安分画，ポリエチレングリコール分画，クロマトグラフィー
等が考えられ，複数の工程対応は可能と考えられる．なお，目標とする除去係数やその妥当性を評価するために血液中の感染性プリオンの性状や感染価についての更なる研究が望まれる．
工程での除去能力はプリオンに対する安全性確保の根幹となるので慎重な試験デザインと解釈が求められる．基本的な手法
はガイドライン 11，39，40，42）に記述されているが，ガイドラインは策定時の Minimum requirement であって，指針のひとつにすぎない．よって，実際にはその製剤と製造工程の特性を良く理解した上でデザインしなければならない．工程のプリオン除去評価を行うにあたって，WB レベルで検出限界以下になったプ
リオン除去に関する重要工程については，動物への接種実験で感染性の有無を確認することが望ましい 11）．また，プリオン蛋
白の実態が良く分かっていない以上，不十分な知識や誤解に基

147

づくデザインによる評価試験の結果解釈は誤った判断を導く可能性を秘めていることを明確に理解しておかなければならな
い．製剤の有効性と安全性は承認審査の時に評価されるが，有用性は科学技術の進歩により得られたプリオンに関する新しい知見に基づき，その時々に評価・確保されなければならないことも理解しておくべきである．

謝辞
本研究の一部は大阪大学微生物病研究所，酪農学園大学獣医学部，米国赤十字，ベネシスの共同研究として実施された．また，本研究の一部は厚生労働科学研究（H22 −医薬−一般−006）として実施された．本稿を執筆するにあたって，㈱ベネシス岡島文子氏，池田美朗氏の貢献に深謝します．これらの共同研究の成果が血液製剤領域のみならずバイオ医薬品領域の安全性向上に役立つことを願います．

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150

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人工血液 Vol. 18 , No.4, 2010

トピックス

血小板の活性化機能： ADP の果たす役割
Molecular mechanism for platelet activation: a role for ADP
冨山 佳昭
Yoshiaki Tomiyama

和文抄録
血小板がその止血機能を発揮する際，血小板内から放出されるアデノシン二リン酸（ADP）が重要な役割を果たしていることが明らかとなってきた．血小板 ADP 受容体としては G 蛋白共役型受容体である P2Y1 および P2Y12 が存在するが，特に P2Y12 は Gαi 蛋白を共役しており，ADP 刺激による細胞内 cAMP の低下を惹起し血小板機能発現に極めて重要な役割を担っている．この P2Y12 の重要性は，P2Y12 欠損患者における出血傾向，P2Y12 欠損血小板を用いた ex vivo 実験での血栓形成能の障害からも明らかである．P2Y12 を介したシグナルはフィブリノゲン受容体であるインテグリンαIIbβ（GPIIb-IIIa）
3の活性化を持続させるために必須であり，最終的に止血血栓の安定化に寄与している．さらに，最近ではチエノピリジン
系 P2Y12 阻害剤の優れた抗血栓作用が明らかにされ，P2Y12 が抗血小板薬の分子標的としても注目されている．
Abstract,
Recent advance in platelet biology has revealed that adenosine-5 -diphosphate（ADP）play a crucial role in platelet function.
Platelets possess at least two major G protein-coupled ADP receptors: P2Y1 and P2Y12 . P2Y12 is a G i -coupled receptor
responsible for mediating the inhibition of adenylyl cyclase and sustained platelet aggregation. The importance of P2Y12 isunderscored by the clinical features of patients with P2Y12 deficiency and ex vivo experiments using P2Y12 -deficient platelets.
ADP interaction with P2Y12 plays a critical role in the maintenance of αIIbβ3 activation. Moreover, P2Y12 is now the target of
efficacious antithrombotic thienopyridine agents such as clopidgrel and prasugrel.
Keywords
ADP, P2Y12 ，integrin αIIbβ3 , bleeding tendency

１．はじめに人工血小板の作製において，血小板による止血機構の詳細な解析は血小板機能発現の中核を成す分子を同定する上においても必要不可欠である．血管が傷害され血管内皮が脱落すると，流血中の血小板は血管内皮を裏打ちしている血管内皮下組織，
主としてコラーゲン線維，に曝露され直ちに活性化し血管傷害部位を閉塞し止血する．この過程は，① 血小板粘着 → ②
血小板活性化と放出反応 → ③ 血小板凝集，の段階により構成されており，その主要な分子機構を図１に示す 1-3）．血小板膜に存在する接着分子受容体である GPIb-IX やインテグリン
αIIbβ3（GPIIb-IIIa とも呼ばれている）はそれぞれ血小板の初期の粘着と，血小板凝集に必須の糖蛋白であるが，これらの糖大阪大学医学部附属病院

輸血部〒 565-0871

蛋白に加え血小板内から放出されるアデノシン二リン酸（ADP）とその受容体である P2Y12 の重要性が明らかとなってきている．

２．P2Y12 の血小板における機能
血小板活性化物質である ADP は赤血球内にも存在するが，血小板内においては濃染顆粒内に貯蔵されている．血小板 1011
個あたり約 2.5μmol 存在し，血小板の活性化に伴い細胞外に放出され血栓形成局所においては数μM の濃度になると考えられ
る．放出された ADP はさらなる血小板の活性化を促す．ADP
は in vitro の血小板凝集惹起作用に関してその活性は決して強力ではないものの，生体内での血栓形成において極めて重要な

大阪府吹田市山田丘 2-15

Department of Blood Transfusion, Osaka University Hospital,

2-15 Yamada-oka, Suita, Osaka565-0871, JAPAN
論文受付 2010 年 12 月 14 日 論文受理 2011 年１月 24 日

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 18 , No.4, 2010151

３．P2Y12 欠損患者の臨床症状

図１．止血栓形成の分子機構（文献３より引用）．止血栓および病的血栓の形成過程は１）血小板粘着 → ２）血小板活性化と放出反応→ ３）血小板凝集の段階により構成されている．血小板粘着には
GPIb-IX が，血小板凝集にはインテグリン αIIbβ3（GPIIb-IIIa）が必須であるが，血小板から放出される ADP は血小板活性化反応およびαIIbβ3 の活性化を維持する上で極めて重要である．

役割を担っている．血小板は２種類の ADP 受容体を有しており，1996 年に P2Y1 が，2001 年に P2Y12 が同定された 4）．どちらも７回膜貫通型の受容体であり G 蛋白が共役している（図２）．
ヒトではこれらの遺伝子は３番染色体の長腕に存在し，P2Y 1
は 373 個の，P2Y 12 は 342 個のアミノ酸から構成されている．
ADP 刺激により同時にこれら２つの受容体が作働するが，P2Y 1 受容体は G 蛋白質の Gαq を共役しており，ホスホリパー
ゼ C（PLC）を活性化し，細胞内 Ca イオンの上昇，血小板の形態変化（shape change）や一過性の血小板凝集を惹起する．
一方，P2Y12 受容体は Gαi を共役しており，ADP 刺激による細胞内 cAMP の低下を惹起すると共に，放出反応の増強や血小板
5，6）．
凝集の安定化に必要である（図２）図２．血小板における ADP 受容体（文献５を一部改変し引用）．血小板は２種類の ADP 受容体（P2Y1 および P2Y12）を有しており，P2Y1 受
容体は Gαq を介して，ホスホリパーゼ C（PLC）を活性化し，細胞内 Ca イオンの上昇，血小板の形態変化（shape change）や一過性の血小板凝集を惹起し，P2Y12 受容体は Gαi を介して，アデニル酸
シクラーゼ（AC）を抑制し，細胞内 cAMP の低下を惹起すると共に，血小板の持続的な凝集に必要である．

152

筆者らは本邦初の P2Y12 欠損患者を同定しているが，この患者では P2Y12 の翻訳開始コドン ATG が AGG に変異するホモ接合体異常を有しており，その結果 P2Y12 が完全に欠損していた．
臨床症状としては出血時間の延長と軽度の出血傾向が認められた．過去に出産２回，中絶１回を経験しているが，出血量は多かったものの輸血するほどの多量出血ではなかった．この患者の血小板凝集能検査を図３に示す 7）．ADP 惹起血小板凝集が極端に障害されているのが解る．さらに興味深いこととして
ADP 以外にも，低濃度のコラーゲンや U46619（トロンボキサ
ン A 2 のアナログ）に対しても血小板凝集が障害されていた．
このように，ADP 以外の血小板活性化物質の刺激により血小板が凝集する場合においても活性化血小板から放出された ADP
は血小板凝集に重要な機能を担っていることが理解できる．

図３．ADP 受容体 P2Y12 欠損患者における血小板凝集異常（文献７より引用）．
ADP 受容体 P2Y 12 が欠損すると，ADP 以外にも，コラーゲンやTXA 2 アナログである U46619 に対しても血小板凝集が障害され，血小板凝集塊は極めて脆弱となる．

血小板凝集には血小板膜上の接着分子受容体であるインテグ
リンαIIbβ3（GPIIb-IIIa）の活性化が必要不可欠である．αIIbβ3
はフィブリノゲンおよびフォンビルブランド因子の受容体であり，活性化型となって初めてその機能を発揮する．このαIIbβ3
活性化は活性化型のαIIbβ3 のみを認識するユニークな PAC1 抗体の結合で解析可能である．図４に示すように，強力な血小板活性化物質であるトロンビンで血小板を活性化させるとαIIbβ3が活性化すると共に，α顆粒放出の指標である P セレクチンが発現してくる．筆者らは，P2Y12 阻害剤を添加しない状態で血小板をトロンビンで活性化させ，活性化が完了した時点において P2Y12 阻害剤を加えると，P セレクチンの発現は変化しない
が PAC1 抗体の結合が低下しαIIbβ3 が非活性化状態に戻ることを明らかにした 8）．この成績は，トロンビン刺激によるαIIbβ3活性化の持続には血小板から放出された ADP と P2Y12 の反応が必須であり，この反応が阻害されるとαIIbβ3 が非活性化型に戻

人工血液 Vol. 18 , No.4, 2010

ることを示している（図４）．生体に近い条件にすべく，血流下での ex vivo での血栓形成実験を行なうと，P2Y12 欠損血小板では血栓形成能が悪く正常血小板による血栓に較べ約半分の高さの血栓しか形成できず，また形成された血栓も極めて脆弱であることが明らかとなった 7）．このように P2Y 12 が欠損するとαIIbβ3 の安定した活性化が阻害される結果，血小板凝集反応が障害され血栓形成が脆弱となり，また血栓サイズも減少することが示された．

５．おわりに血小板からの放出 ADP とその受容体である P2Y12 は，血小板の止血機能に極めて重要な役割を担っている．これらの成績よ
り，ADP を内包した人工血小板の作製は，血管傷害部位において局所 ADP 濃度を上昇させることにより流血中の血小板を必要な部位に効率よくリクルートし安定な止血血栓を形成することに寄与すると推察される．

謝辞
本研究の一部は，独立行政法人日本学術振興会科学研究費補助金および厚生労働科学研究費補助金の助成を受けた．

文献

図４．P2Y12 のインテグリンαIIbβ3 活性化維持機構．トロンビンで血小板を活性化させるとαIIbβ3 が活性化（＝ PAC1 の結合）すると共に，α顆粒放出の指標である P セレクチンが発現するが，P2Y12 阻害剤を加えると，P セレクチンの発現は変化しないが PAC1 抗体の結合が低下しαIIbβ3 が非活性化状態に戻る．このように P2Y 12 を阻害するとαIIbβ3 の安定した活性化が障害される．

４．P2Y12 阻害薬の臨床成績
P2Y12 阻害剤としてはチエノピリジン系抗血小板薬であるチク
ロピジン，クロピドグレルやプラスグレルが知られており，これらの薬剤は優れた抗血栓作用を有することが示されている 5，6）．
クロピドグレル 75mg/日は，アスピリン 325mg/日との二重盲検比較試験においてハイリスク患者における血管性イベント（脳梗塞，心筋梗塞，末梢動脈疾患）を約 8.7 ％減少させた（CAPRIE 試験）9）．さらに，クロピドグレルと較べより効果発
現が早くより強力な作用を有する P2Y12 阻害剤，プラスグレルとクロピドグレルとの二重盲検比較試験が行われた（TRITONTIMI38 試験）10）．プラスグレル群の血管性イベントはクロピド
グレル群よりも約 18 ％減少したものの（プラスグレル群 9.9 ％，クロピドグレル群 12.1 ％），出血合併症は約 33 ％増加した（プラスグレル群 2.4 ％，クロピドグレル群 1.8 ％）11）．これらの成績
は，より強力な P2Y12 阻害は血管イベントの抑制効果は増強す
るが，一方では血小板機能を障害し出血の合併症も増加させる
ことを示している．

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 18 , No.4, 2010

１. Savage B, Almus-Jacobs F, Ruggeri ZM. Specific synergyof multiple substrate-receptor interactions in platelet
thrombus formation under flow. Cell 1998; 94: 657-666.
２. Kulkarni S, Dopheide SM, Yap CL, et al. A revised modelof platelet aggregation. J Clin Invest 2000; 105: 783-791.
３. 冨山佳昭. 血栓形成のメカニズム up-to-date. Angiology
Frontier 2007; 6: 11-17.
４. Hollopeter G, Jantzen HM, Vincent D, et al. Identificationof the platelet ADP receptor targeted by antithrombotic
drugs. Nature 2001; 409: 202-207.
５. Gachet C. ADP receptors of platelets and their inhibition.
Thromb Haemost 2001; 86: 222-232.
６. Dorsam RT, Kunapuli SP. Central role of the P2Y 12
receptor in platelet activation. J Clin Invest 2004; 113: 340345.
７. Shiraga M, Miyata S, Kato H, et al. Impaired platelet
function in a patient with P2Y12 deficiency caused by amutation in the translation initiation codon. J Thromb
Haemost 2005; 3: 2315-2323.
８. Kamae T, Shiraga M, Kashiwagi H, et al. Critical role of
ADP interaction with P2Y12 receptor in the maintenanceof αIIbβ3 activation: association with Rap1B activation. J
Thromb Haemost 2006; 4: 1379-1387.
９. CAPRIE Steering Committee. A randomised, blinded, trialof clopidogrel versus aspirin in patients at risk ofischaemic events（CAPRIE）. Lancet 1996; 348: 1329-1339.
10. Wiviott SD, Braunwald E, McCabe CH, et al. Prasugrel
versus clopidogrel in patients with acute coronary
syndromes. N Engl J Med 2007; 357: 2001-2015.
11. Wiviott SD, Braunwald E, Angiolillo DJ, et al. Greater
clinical benefit of more intensive oral antiplatelet therapy
with prasugrel in patients with diabetes mellitus in thetrial to assess improvement in therapeutic outcomes by
optimizing platelet inhibition with prasugrel-thrombolysis
in myocardial infarction 38. Circulation 2008; 118: 1626-1636.

153

●事務局たより

日本血液代替物学会
１． 日 時 ：平成22年10月18日（月）３． 議
18：00〜

２． 場 所 ：熊本市国際交流会館大ホール〒860-0806 熊本県熊本市花畑町4-8

以下審議内容を略記します。
①年次大会の開催状況として下記事項が報告された。
1）第17回日本血液代替物学会年次大会
2）平成22年10月18日（月）・19日（火）3）熊本県熊本市花畑町4-8 熊本市国際交流会館
4）日本血液代替物学会会員、臨床医学・理工学研究者、国内の大学および医療機関臨床医、
血液センター関係者の参加があった。
②会員状況は以下のとおり。
1）維持会員：４社2）賛助会員：１社
3）学生会員：１名
4）正会員：121名
5）購読会員：15箇所③平成21年度事業報告（平成21年 4 月 1 日〜平成22年 3 月31日）
が行われ各々承認された。
1）定期総会の開催
平成21年10月17日（土） 慶應義塾大学信濃町キャンパ
ス北里講堂にて開催。
2）第16回年次大会 （大会長 高折益彦）
平成21年10月16日（金）・17日（土）慶應義塾大学信濃町キャンパス北里講堂にて行われた。
3）会誌「人工血液」の発行：第17巻１号〜４号

154

総会
題 ： ① 第17回年次大会の報告② 会員動向③ 平成21年度事業報告④ 平成21年度会計報告⑤ 平成22年度事業計画④平成21年度収支決算報告が行われ承認された。
平成21年度 会計（自 平成21年４月１日

収摘
要
前 期 繰 越 金
正 会 員 会 費
入会
金
維持会員会費
賛助会員会費
購読会員会費
雑
収
入
利
息
計

入
金
額
7,983,390
410,000
10,0008,000,000
200,000
48,00045,67023,46016,720,520

収支決算表

至 平成22年３月31日）

支
出
摘
要
金
額
会 誌 出 版 費
3,057,905
集会・委員会費
585,240
年 会 補 助 金
1,245,278
610,680
ホームページ維持費
3,000,525
事 務 人 件 費314,424
事
務
費7,906,468
次 期 繰 越 金
計

16,720,520⑥平成22年度事業（実績報告）
1）定期総会の開催
平成22年10月18日（月） 於 熊本市国際交流会館大ホール
2）第17回年次大会の開催 （大会長 小田切優樹）
平成22年10月18日（月）・19日（火）於 熊本市国際交流会館
3）会誌「人工血液」の発行：第18巻１号〜４号（予定）4）市民公開講座を後援
現行役員は下記の通り。

人工血液 Vol. 18 , No.4, 2010

●事務局たより
日本血液代替物学会 役員名簿
顧

問

尾形利郎
高久史麿
堀 原一

東海大学医学部 名誉教授
自治医科大学 学長
筑波大学 名誉教授

会

長

小林紘一

慶應義塾大学 名誉教授

副会長

池田康夫

早稲田大学理工学術院 教授理東寛
北海道赤十字血液センター 研究部長
小田切優樹 崇城大学薬学部 教授
酒井宏水
早稲田大学総合研究機構 准教授
末松 誠
慶應義塾大学医学部 医学部長
高折益彦
東宝塚さとう病院 名誉院長
武岡真司
早稲田大学理工学術院 教授事

西 勝英
肥後医育振興会 理事
半田 誠
慶應義塾大学医学部 教授
平澤博之
千葉大学 名誉教授
堀之内宏久 慶應義塾大学医学部 准教授
米川元樹
特定医療法人北楡会 理事長
監

事

清水 勝
阿岸鉄三

西城病院 理事
ふれあい町田ホスピタル
血液浄化センター センター長（事務局） 堀之内宏久 慶應義塾大学医学部 准教授（会誌担当）酒井宏水
早稲田大学総合研究機構 准教授（HP担当） 藤島清太郎 慶應義塾大学医学部 講師

日本血液代替物学会 評議員名簿
青木
阿岸

克憲
鉄三

東
寛
阿部喜代司
池田 久實
池田 康夫
池淵 研二
石原 弘規
伊藤 俊之
稲田 英一
大柳 治正
尾形 利郎
小田切優樹
片岡 一則
川村 明夫
木下
学
黒澤 良和
小林 紘一
小松 晃之
斎藤 英彦
酒井 清孝
酒井 宏水
佐久間一郎
佐藤
誠
清水
勝
十字 猛夫

浜松医科大学 教授
ふれあい町田ホスピタル
血液浄化センター センター長
北海道赤十字血液センター 研究部長
筑波大学 名誉教授
北海道赤十字血液センター 所長
早稲田大学理工学術院 教授
埼玉医科大学 教授
弘前大学医学部 准教授
京都赤十字血液センター
順天堂大学医学部 教授
近畿大学医学部 教授
東海大学医学部 名誉教授
崇城大学薬学部 教授
東京大学大学院 教授
特定医療法人北楡会 会長
防衛医科大学校 准教授
藤田保健衛生大学総合医科学研究所 教授
慶應義塾大学 名誉教授
中央大学理工学部 教授
名古屋セントラル病院 院長
早稲田大学理工学術院 教授
早稲田大学総合研究機構 准教授
カレスサッポロ北光記念クリニック 所長
ニプロファーマ（株）社長
西城病院 理事
日本赤十字血液事業本部
中央血液研究所 前所長

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 18 , No.4, 2010

末松
誠
高折 益彦
高久 史麿
高橋
晃
高橋 英嗣
武岡 真司
田所 憲治
友田
夫
仲井 邦彦
長澤 俊郎
中島 常隆
西
勝英
西出 宏之
西谷 孝子
半田
誠
平澤 博之
福島 昭二
藤井 寿一
藤島清太郎
船津 昭信
外 須美夫
堀
進悟
堀
原一
堀之内宏久
宮尾 秀樹
村田
満
湯浅 晋治
米川 元樹

慶應義塾大学医学部 医学部長
東宝塚さとう病院 名誉院長
自治医科大学 学長
テルモ（株）取締役特別顧問
佐賀大学大学院 教授
早稲田大学理工学術院 教授
日本赤十字社血液事業本部 中央血液研究所 所長
東京医科大学 教授
東北大学大学院医学研究科 准教授
筑波大学臨床医学系 元教授（株）ベネシス 経営戦略部 担当部長
熊本大学 名誉教授
早稲田大学理工学術院 教授
ナノキャリア株式会社
慶應義塾大学医学部 教授
千葉大学 名誉教授
神戸学院大学薬学部 教授
東京女子医科大学 教授
慶應義塾大学医学部 准教授（財）化学及血清療法研究所 理事長
九州大学大学院医学研究院 教授
慶應義塾大学医学部 教授
筑波大学 名誉教授
慶應義塾大学医学部 准教授
埼玉医科大学総合医療センター 教授
慶應義塾大学医学部 教授
順天堂大学 名誉教授
特定医療法人北楡会 理事長（ア順敬称略）155

156

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ARTIFICIAL BLOOD Vol. 18 , No.4, 2010

157

158

人工血液 Vol. 18 , No.4, 2010

M E M O

Call for Papers
Artificial Blood, the official bilingual journal of The Societyof Blood Substitutes, Japan, welcomes papers and otherarticles contributing to the research and development ofblood substitutes.
If you wish to submit an article for publication, please email
it to the following address after first confirming the
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The Journal's purpose is to publish research and related articles
contributing to the development of blood substitutes, information
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results of peer review. Original articles will not be accepted ifthey have been previously published or are being considered for
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required before submission. As copyright to articles must betransferred to the Society, the representative of the author（s）
must sign and seal a copy of the Copyright Transfer Agreementfound in the Journal or downloadable from the Society's website（http://www.blood-sub.jp/home/index.html）, and submit it to
the Editorial Board by post, fax, or by email as a PDF fileattachment.
Manuscripts should, as a rule, be prepared by word-processor.
However, handwritten manuscripts may be accepted.
1）Articles should be categorized into one of the followings:
original articles, review articles, conference reports, topicalpieces, and opinion pieces. The category into which amanuscript falls should be clearly indicated at the top right-handcorner of the first page. Manuscripts that do not fall into any ofthese categories may also be accepted, and manuscripts may
also be re-categorized depending on the opinion of the160

reviewers. Submit your manuscripts to the Editor-in-Chief byeither of the following methods with a covering letter（of any
format）:
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or TXT formats, and figures should be in PPT, JPG, or TIFF
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be required depending on the opinion of the reviewers. Revisedmanuscripts should be submitted with a "Response to
Reviewers" to the covering letter that responds to each of thepoints made by the reviewers, indicating any revisions made to
the manuscript.
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specified（indicate the software used）. Text and tables should bein DOC or TXT format, and figures should be in PPT, JPG, or
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4）Manuscripts should be typed on A4 or letter size paper. The
title page should include the title, names of authors, institutions
to which all the authors belong, and the address of thecorresponding author. Handwritten manuscript should be
written consisting of 20 lines to 1 page.

人工血液 Vol. 18 , No.4, 20105）Original articles, review articles, topical pieces, and opinion
pieces should include an abstract and about 6 keywords on thesecond or subsequent pages.
6）Research conducted with the aid of an official grant must be
acknowledged, and any conflict of interests（for example, if theauthor has an interest in a company distributing the drug
described in the manuscript: being an employee or consultant tothat company, receiving research funding, owning shares orpatents, and so on）must be described in a footnote on the firstpage or in acknowledgment section.
7）If a manuscript describes the results of research on humans
or animals, it should be indicated that such research was
performed in accordance with the guidelines of the instituteconcerned in the methods or other appropriate sections of themanuscript.
8）Abbreviations should be spelled out on their first appearance.
The names of drugs, medical drugs, laboratory equipment, andso on should be given. The type, distributor（manufacturer）andthe address should also be indicated.
Example: Rhodamine B（Sigma-Aldrich, St. Louis, USA）
Polygraph system（LEG-1000; Nihon Kohden Corporation,
Tokyo）.
9）The English fonts should be Times, Helvetica, Courier, orSymbol. Text should be typed in lower-case one byte characters.
However, sentences and proper nouns should begin with an
upper-case letter.
10）Figures should be expressed in Arabic numerals. Weights
and measurements should be expressed in units such as thefollowings: m, cm, mm, μm, L, mL, μL, mol, g, mg, μg, ng, pg,
fg, N/10.
11）Figures and tables should be numbered in order of citation,and it should be clearly indicated where they are to appear in
the main text. The title, legends and description in tables andfigures should be written in English. Figures will be printed bydirect offset printing. Tables will be inputted by the Editorials
as originals.
12）References should be cited numerically in order of appearance
in the text using superscript letters as follows: 2）, 3-5）, 1, 4-6）, etc.
References should be listed using the Vancouver style as follows:
Names of all authors. Title of paper. Title of journal. Year of
publication; volume number: inclusive page numbers.
Abbreviations of journal names should be in accordance with
Index Medicus. References to books should be given as follows:
Names of all authors. Title of paper. Name of editor（s）. Booktitle. Place of publication: Publisher, year; inclusive page
numbers.
References to electronic sources should be given as follows:

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 18 , No.4, 2010

Name of website.
Address on new line（month and year of last access）.
Examples:
１. Wong NS, Chang TM. Polyhemoglobin-fibrinogen: a novel
oxygen carrier with platelet-like properties in a hemodiluted
setting. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol 2007; 35:
481-489.
２. Natanson C, Kern SJ, Lurie P, Banks SM, Wolfe SM. Cell-freehemoglobin-based blood substitutes and risk of myocardial
infarction and death: a meta-analysis. J Am Med Assoc 2008;
299: 2304-2312.
３. Sakai H, Sou K, Takeoka S, Kobayashi K, Tsuchida E.
Hemoglobin vesicles as a Molecular Assembly. Characteristicsof Preparation Process and Performances or Artificial
Oxygen Carriers. In: Winslow RM, ed. Blood Substitutes.
London: Academic Press（Elsevier）, 2006; 514-522.
４. Oxygen Infusion Project, Waseda University, Japan.
http://www.waseda.jp/prj-artifblood/index-ja.html（ lastaccessed Sept 2008）13）In the case of citation or reproduction of previously
published figures or tables and other content, the permission of
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14）Regarding secondary use and copyright in works publishedin the Journal, secondary use may be made of the Journal, in
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15）No publication fee is charged for publication in the Journal,
and the author（s）shall receive as a gift 30 offprints of theircontributions. Authors will be charged for copies in excess of
this number（approximately 100 yen per copy）. Authors wanting
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16）Address for manuscripts to be sent:
Attn: Artificial Blood Editorial Office
The Society of Blood Substitutes, Japan
Division of General Thoracic Surgery, Department of Surgery,
Keio University, School of Medicine
35 Shinanomachi, Shinjuku-ku, Tokyo 160-8582, Japan
Tel: +81-3-5363-3493 Fax: +81-3-5363-3499
E-mail：amorjsbs@sc.itc.keio.ac.jp161

投稿規定（平成20年9月30日改訂）
本誌は，血液を構成するあらゆる成分について，その代替物を開発する研究に貢献する論文，関連する情報，学会会員のための会報，学会諸規定等を掲載するが，形式にはこだわらず創
意ある投稿を広く集める．本誌への投稿者は本学会会員であることが望ましいが，投稿を希望する者は誰でも投稿することが出来る．原稿掲載の採否は，査読結果に従って編集委員会が決定する．原著論文について，他誌に既発表あるいは投稿中の論文は掲載しない．
共著者がいる場合には，共著者全員の承諾を得てから投稿する．論文の版権は本学会に譲渡しなければならない．このため，
著者の代表者は，本誌に添付の著作権譲渡同意書（CopyrightTransfer Agreement）或は，本会のホームページサイト（http://www.blood-sub.jp/home/index.html）からダウンロードしたものに署名捺印の上，郵送，Fax，またはpdfファイル
としてE-mailにて編集委員会宛に提出する．
ワープロを用いて作製した原稿の投稿を原則とする．ただし，手書き原稿による投稿でも受け付ける．欧文による投稿を歓迎する．
１）原稿の種類は，「原著論文」，「総説」，「学会報告」，「トピックス」，「オピニオン」，「海外文献紹介」から選び，これを第１頁の右肩上に明記すること．これらに該当しない原稿も受け付ける．査読意見によっては種類が変更される場合がある．次のいずれかの方法により，送付状（任意のフォーマット）を添
えて編集委員長宛に投稿する．

者名，全著者所属，英文著者名，英文著者所属，続いて連絡の取れる著者（corresponding author）の住所，英文住所を記入する．手書き原稿の場合はＢ5版，1行20字，20行とする．
５）「原著論文」，「総説」，「トピックス」，「オピニオン」については，第2頁以降に和文抄録，Keywords（英文で6個程度）
を付け，最終頁または別紙に英文抄録を付けること．
６）投稿論文に記載の研究が公的助成を受けて実施された場合に は ， 謝 辞 に そ の 旨 を 記 載 す る こ と ． ま た ， Conflict ofInterests（例えば，論文に記載された薬品を販売する企業と著者との利害関係: 雇用，コンサルタント，研究助成，株式，特許など）があれば，これを第１頁の脚注，謝辞などに記載する
こと．
７）ヒトを対象とした研究結果，および動物実験の結果を掲載する場合には，各研究機関のガイドラインに従って実施したことを方法等に明記すること．
８）論文中の略語は初出の際に省略しないこと．薬品，医薬品，測定装置等は，外国語名の場合は言語のまま用い，日本語化しているものはカタカナとする．型式，販売（製造）元とその所在地も記入すること．
（例） Rhodamine B（Sigma-Aldrich, St. Louis, USA）
, ポリグラフシステム（LEG-1000; 日本光電工業, 東京）
９）句読点はコンマ（，）ピリオド（．）とする．

i）文章と図表の電子ファイルをE-メールで送付する（使用したソフトを明記すること）．文章・表のファイル形式は，doc, txtが好ましい．図は，ppt, jpg, tiffが好ましい．

10）文中の英語に使用するフォントは，Times, Helvetica,
Courier, Symbolを原則とし，英文半角小文字とする．ただし，文頭および固有名詞は大文字で書きはじめること．

ii）ハードコピー4部を郵送する．

11）数字はアラビア数字を使い，度量衡の単位はm, cm, mm, μm,
L, mL, μL, mol, g, mg, μg, ng, pg, fg, N／10などを用いる．

２）投稿論文の査読は，編集委員長が選んだ人工血液分野の研究者に依頼する．査読意見によっては，原稿の修正を求める場合がある．修正論文（Revised Manuscript）の投稿に際しては，送付状に「査読意見に対する回答」を添え，意見に対して一つ一つ回答をするとともに，修正箇所がある場合にはこれを明記する．
３）掲載決定通知の後，著者は採択論文の文章・図表のファイ
ルを電子媒体として，指定する宛先に送付すること（使用したソフトを明記すること）．文章・表のファイル形式は，doc, txtが好ましい．図は，ppt, jpg, tiffが好ましい．
４）原稿はA4版の大きさとし，第1頁には表題，英文表題，著

16212）FigureとTable：引用順にそれぞれ番号を付けること．表
題，説明，図表中文字は，全て英文とすることが好ましい．本
文中に挿入箇所を明記すること．Figureは直接オフセット印刷とする．Tableは編集部にて入力し原図とする．
13）文献：本文に引用した順序に番号を付け，文中では2），3-5），1，4-6）などとする．文献の記載法はthe Vancouver styleに従う．全
著者名．論文題名．誌名 西暦発行年；巻数：頁〜頁．とし，誌名の省略は医学中央雑誌またはIndex Medicus に準拠する．
単行本の場合は全著者名．題名．編集者名．書名．発行地：発行書店，年号；頁〜頁．の順とする．電子文献の場合は，ホームページ名．改行してアドレス（引用した西暦年月）とする．

人工血液 Vol. 18 , No.4, 2010

（例）１. 高折益彦. 人工酸素運搬体:その将来への期待. 人工血液2007;15:90-98.
２. 橋本正晴. 単回投与毒性試験. 野村 護, 堀井郁夫, 吉田武美編. 非臨床試験マニュアル. 東京: エルアイシー, 2001;3748.
３. Wong NS, Chang TM. Polyhemoglobin-fibrinogen: anovel oxygen carrier with platelet-like properties in ahemodiluted setting. Artif Cells Blood Substit Immobil
Biotechnol 2007; 35: 481-489.
４. Natanson C, Kern SJ, Lurie P, Banks SM, Wolfe SM.
Cell-free hemoglobin-based blood substitutes and risk of
myocardial infarction and death: a meta-analysis. J Am
Med Assoc 2008; 299: 2304-2312.
４. Sakai H, Sou K, Takeoka S, Kobayashi K, Tsuchida E.
Hemoglobin vesicles as a Molecular Assembly.
Characteristics of Preparation Process andPerformances or Artificial Oxygen Carriers. In: Winslow
RM, ed. Blood Substitutes. London: Academic Press（Elsevier）, 2006; 514-522.
５. 早稲田大学酸素輸液プロジェクト．
http://www.waseda.jp/prj-artifblood/index-ja.html（2008年9月現在）
14）既発表の図表，その他を引用，転載する場合には，あらか
じめ版権所有者の許可を得ること．また，掲載論文の著作権は本学会に帰属する．
15）二次掲載について．本誌は，他の言語ですでに掲載された論文を和文で二次掲載することは二重投稿ではなく正当な掲載と認めるが，著者は以下の事項を遵守する．
ａ）すでに掲載された論文であること．
ｂ）著者は両方の雑誌の編集者より許可を得ていること．二ARTIFICIAL BLOOD Vol. 18 , No.4, 2010

次掲載する編集者に最初に掲載されたもののコピー，別刷，もしくは原稿のいずれかを添付すること．
ｃ）論旨を変えないこと．執筆者は同一（順不同）であること．
ｄ）二次掲載版のタイトル・ページに掲載される脚注には，その論文の全体もしくは一部分がすでに掲載されている旨を明記し，更に初出文献も示すこと．適切な脚注の例を以下に示す．「This article is based on a study firstreported in the［...雑誌タイトル（完全な典拠情報を添えたもの）...］（訳：この論文記事は，［...］に最初に報告された研究に基づくものである）」．
これらの要件を満たしている場合は，その旨を明記して，総説
または論文記事（二次掲載）として投稿する．
16）本誌掲載著作物の二次利用および著作権について．本誌の一部，もしくは全部をCD-ROM，インターネットなどのメディ
アに二次利用する場合がある．本誌に掲載する著作物の複製権・翻訳権・上映権・譲渡権・公衆送信権（送信可能化権を含む）は，著者が上述の著作権譲渡同意書を提出することにより，本学会に譲渡される．本項は，著作者自身の再利用を拘束する
ものでは無いが，再利用する場合は，編集委員長に通知をする
こと．
17）掲載料．掲載料は無料とし，論説，総説，原著，報告等については別刷り30部を贈呈する．それを越える分についての費用は著者の負担とする（およそ1部100円）．カラー写真掲載・
アート紙希望などの場合は，著者の実費負担とする.
18）原稿の送付先〒160-8582 東京都新宿区信濃町35
慶應義塾大学医学部呼吸器外科内日本血液代替物学会 会誌「人工血液」編集部 宛
電話：03−5363−3493，FAX：03−5363−3499
E-mail：amorjsbs@sc.itc.keio.ac.jp

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人工血液
日本血液代替物学会会誌

Artificial Blood
The Official Journal of The Society of Blood Substitutes, Japan
日本血液代替物学会
会長 小林 紘一 殿
To: Dr. Koichi Kobayashi
President
The Society of Blood Substitutes, Japan

日本血液代替物学会

会誌「人工血液」に投稿した論文

表題
Manuscript Title:につきまして，倫理規定に準拠した内容であること，また，共著者の全員が内容を確認していることを誓約いたします．なお，掲載された論文の著作権は，貴学会に帰属することを認めます．
I attest that the content of the above manuscript, submitted for publication in Artificial Blood,
the journal of the Society of Blood Substitutes, Japan, conforms to ethical standards and has
been confirmed by all coauthors. We acknowledge that copyright will be held by the Society.
平成

年

月

日

Date:

代表著者（署名）
Corresponding Author（Signature）
連絡先
Contact Address:（本用紙はコピーしたものを使用されても結構です．
）
This form may be photocopied for use.
日本血液代替物学会 会誌「人工血液」編集部〒160-8582 東京都新宿区信濃町35 慶應義塾大学医学部呼吸器外科内
TEL：03−5363−3493 FAX：03−5363−3499 E-mail：amorjsbs@sc.itc.keio.ac.jp
Artificial Blood Editorial Office
The Society of Blood Substitutes, Japan
Division of General Thoracic Surgery, Department of Surgery, Keio University, School of Medicine
35 Shinanomachi, Shinjuku-ku, Tokyo 160-8582, Japan
Tel: +81-3-5363-3493 Fax: +81-3-5363-3499 E-mail：amorjsbs@sc.itc.keio.ac.jp

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人工血液 Vol. 18 , No.4, 2010

●編集後記●
三宅先生・高折先生からは，続報として本号でもliposome分
散系の電解質濃度について英字原著論文の投稿を頂いた．本誌
活性化のために御協力頂き，誠に有難うございます．宗先生からはリポソームの表面状態と臓器特異性，特に骨髄移行性について話題提供頂いた．薬物キャリアの機能とイメージングの機能を同時に持つ theranostic agent という新しい領域の可能性はとても興味深い．今後の実用化に向けた展開を期待したい．
柚木先生からは，生成物製剤開発におけるプリオン対策について，最先端の話題を提供頂いた．人工血液の開発者にとっては頭の痛い問題であるが，安全性向上のためには，一つ一つ解決
して行かなければならない．今後も御指導を頂きたい．現在最も有望視されている人工血小板は，ADPを内包し，これが傷口で放出されると血小板が集まって止血を促進する仕組みであARTIFICIAL BLOOD Vol. 18 , No.4, 2010

る．冨山先生からは血小板のADP受容体とADPの反応性について最新の話題提供を頂いた．人工血小板のより最適な
formulationの決定に重要な内容と思われた．他方，赤血球からはATPが放出され血管弛緩作用を示すという．エネルギー
代謝に関わるものと教わってきたATPとADPが血管系の恒常性に寄与していることはとても興味深い．
今回の総説，トピックス，計３件は，一昨年，昨年の代替物
学会年次大会の講演者にお願いして御寄稿頂いたものです．本
誌は慢性的に投稿数が不足しております．会員の皆様には，是非とも御寄稿・話題提供に御協力を頂きたく，よろしくお願い申し上げます．

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人工血液 Vol. 18 , No.4, 2010

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 18 , No.4, 2010167

編集委員会●酒井 宏水（委員長），東 寛，大谷 渡，武岡 真司，堀之内 宏久，村田 満，渡辺 真純●日本血液代替物学会 会誌■発行 日本血液代替物学会■編集・制作「人工血液」編集委員会■印刷 株式会社

研恒社

人工血液

vol.18（4） 2011年 3 月30日発行〒160−8582 東京都新宿区信濃町35
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