研究用試薬 製品データシート Code No. 27797

2023 年 11 月 第 4 版作成(2) 標識抗体濃縮液の希釈方法

Glucagon ELISA Kit – IBL

標識抗体濃縮液を別に用意した採取用容器にて、標識抗体用溶解液で 30倍希釈してください。これを標識抗体とします。
希釈例)
１スリット（8 ウェル）使用する場合＝800μL 必要(最低量)(標識抗体濃縮液を 30 μL とり、標識抗体用溶解液 870 μL を加え良く和し、100 μL ずつ使用します。)
この操作は、標識抗体添加の直前におこなってください。
標識抗体濃縮液の残りは、蓋をしっかり閉め冷蔵にて保存してください。有効期限内に再度使用できます。

96 Well
ご使用の際はこの添付文書をよく読んでから使用してください。
全般的な注意本キットは、研究用試薬です。診断等に用いることはできません。

形状・構造等（キットの構成）(3) 標準物質の希釈方法

1 抗体プレート

標準物質バイアル瓶に精製水を 0.5 mL 加えて完全に溶解します。
この時標準物質濃度は 40 pmol/L となります。溶解後の標準物質は凍結保存することができます。凍結融解の繰り返しはできません。
希釈用テストチューブを 7 本用意し希釈用緩衝液を 230 μL ずつ量り取ります。
20 pmol/L の希釈用テストチューブに 40 pmol/L の標準物質溶液を230 μL 加え混和しその溶液 230 μL を 10 pmol/L の希釈用テストチューブに加え混和します。順次 2 倍連続希釈をおこない 20 pmol/L～0.31 pmol/L までの 7 点を希釈標準品とします。

(Anti-Glucagon(23-29)* 142A1A Mouse IgG MoAb. 固 相 )96Well x 1
2 標識抗体濃縮液 (30 倍濃度)
(HRP 標識 Anti-Glucagon N6mer 201A2A Rat IgG Fab’) 0.4mL x 1
3 標準物質 (Glucagon)
0.5mL x 2
4 希釈用緩衝液
30mL x 1
5 標識抗体用溶解液
12mL x 1
6 TMB 基質液15mL x 17 停止液
12mL x 1
8 濃縮洗浄液
50mL x 1

Tube-1Tube-2Tube-3Tube-4Tube-5Tube-6Tube-7

測定対象
ヒト EDTA 血漿※検体採取の際は、Glucagon 専用の採取容器のご使用を推奨します。
(例：BDTM P800 GLP-1, GIP, Glucagon, Ghrelin 保存用真空採血管,日本ベクトン・デイッキンソン(株))本製品は、サンドイッチ法による ELISA (Enzyme-linked ImmunosorbentAssay)キットです。1 次抗体はプレートに固相されていますので、検体および標準物質を加え 1 次反応をおこないます。その後、HRP 標識された 2 次抗体を加え 2 次
反 応 をおこ ない 、 反応 後過剰 の 2 次 抗体 を 洗浄 除去し た後 、 Tetra MethylBenzidine (TMB) により発色させます。

3 測定操作方法 (測定操作一覧 参照)(1) 検体ブランクの添加
検体ブランクのウェルを設定し、希釈用緩衝液を 100 μL 入れます。
(2) 検体、希釈標準品の添加
検体 100 μL および希釈標準品各 100 μL をそれぞれのウェルに入れます。
(3) プレートカバーをして第１反応(4) 洗浄（操作上の注意 8.9 参照）
ウェルの反応液を除去します。洗浄液を加え除去します。
(5) 標識抗体の添加
標識抗体を 100 μL 添加します。
(6) プレートカバーをして第２反応(7) 洗浄（操作上の注意 8.9 参照）
ウェルの反応液を除去します。洗浄液を加え除去します。
(8) TMB 基質液の添加
TMB 基質液を 100 μL 添加します。
(9) 遮光して発色反応(10) 停止液の添加
停止液を 100 μL 添加します。
(11) 吸光度測定
プレート底面のよごれや水滴を拭き取り液面に気泡がないことを確認した
後、検体ブランクを対照とした検体および標準の吸光度を測定してください。
測定波長：450 nm、2 波長の場合は主波長：450 nm、副波長：600～650 nm

操作上の注意1 検体は、採取後速やかに測定してください。保存する場合は、凍結（-80℃）保存とし、検体の凍結融解を繰り返さないでください。また、融解は低温でおこない測定前に十分混和してください。
2 検体は希釈用緩衝液で希釈してください。
3 検体や標準物質は、二重測定することをおすすめします。
4 測定に当たってはその都度検量線を作成してください。
5 検体は、中性域のものを使用してください。また、有機溶媒等の混入も反応に障害がありますので注意してください。
6 試薬は使用前に常温に戻し、数回静かに転倒混和し変化のないことを確かめてください。
7 抗体プレ－トの洗浄は必ず付属の洗浄液を使用してください。不十分な洗浄は、測定誤差の原因となりますので正確におこなってください。
8 洗浄は機械洗浄（wait time 0 秒）を推奨いたします。洗浄瓶を用いて洗浄する場合は、洗浄液をウェルに満たした後、直ちにプレートを逆さまにして振り払い洗浄液を除去します。この洗浄操作を規定回数おこなってください。操作は洗浄むらのないよう十分注意しておこなってください。
9 洗浄操作を規定回数おこなった後に、プレートをペーパータオルの上でたたいて、完全に水分を除去してください。この時ペーパータオルがウェルの中に入らないよう注意してください。
10 TMB 基質液は、光に対して敏感です。遮光保存してください。金属との接触も避けてください。使用に際しては必要量を採取用容器にとり分けてください。
11 TMB 基質液添加後、反応液は徐々に青色に変ります。この時の反応は、遮光してください。また、採取用容器に残った TMB 基質液は、コンタミの原因になりますので元に戻さないでください。
12 吸光度測定は、停止液添加後 30 分間以内におこなってください。

測定操作一覧

試用法および用量 (操作方法)

2マイクロピペットおよびチップ
メスシリンダーおよびビーカー
ペーパータオル
採取用容器 (清潔な試験管など)

浄検 体

標 準検体ブランク

検体
100 μL

希釈標準品
100 μL

希釈用緩衝液100 μL

プレートカバーをして 2 ~ 8°C overnight 反応
2 回 (洗浄液 350 μL 以上)（操作上の注意 8.9 参照）

標識抗体

100 μL

第２反応

プレートカバーをして 2 ~ 8°C 60 分間反応

洗

浄TMB 基質液(1) 濃縮洗浄液の希釈方法

停 止 液

濃縮洗浄液を精製水で 40 倍希釈してください。これを洗浄液とします。必要量を調製してください。

免疫生物研究所

吸光度測定

群馬県藤岡市中 1091-1
1

100 μL100 μL

3 回 (洗浄液 350 μL 以上)（操作上の注意 8.9 参照）
100 μL

発色反応

準備製造販売元 株式会社

料第１反応
洗必要な器具・器材
プレートリーダー
希釈用テストチューブ
精製水
プレートウォッシャー又は洗浄瓶
冷蔵庫

pmol/Lpmol/Lpmol/L
pmol/Lpmol/Lpmol/Lpmol/L(4) 検体の希釈方法
検体は添付の希釈用緩衝液で、下記の希釈倍率にて希釈してください。
ヒト EDTA 血漿の場合は、 2 倍

測定原理

120105
2.5
1.25
0.63
0.31

100 μL100 μL

遮光常温 30 分間反応
100 μL100 μL100 μL450 nm / 600～650 nm

研究用試薬 製品データシート Code No. 27797

2023 年 11 月 第 4 版作成

測定結果の算出方法
18

特異性

グラフの X 軸に標準物質濃度を、Y 軸にその吸光度をプロットします。各プロットに適当な回帰曲線を当てはめ(例：両対数変換の二次回帰等)、検量線を作成します。
検体の吸光度を検量線に当てはめ、濃度を読みとります。
その値に検体の希釈倍率を乗じ、検体の濃度を算出します。

23

測定値と検量線作成例
10.00

吸光度(450nm)
2.763

10.

1.402

5.

0.698

2.50.350

1.25

0.176

0.630.090

0.310.046

1.00

OD 450

標準品濃度( pmol/L)
20.

Oxyntomodulin

Cross reactivity
(%)
0.06

Glicentin (1-61)

0.05

Glicentin (1-69)<0.01

Glucagon (3-29)<0.01

Mini-glucagon<0.01

GLP-1(7-36) amide

0.01

Substance

0.10

9GLP-1(9-36) amide

0.01

GLP-2

<0.01

GIP (1-42)<0.01

GIP (3-42)<0.01

較正用基準物質WHOInternational Standard Glucagon ,Porcine
code;69/194

NIBSC

0.010110100Glucagon(pmol/L)
使用上または取り扱い上の注意
1 取り扱い上(危険防止)の注意(1) 構成試薬には動物血液成分を含む物があります。取り扱いに注意し使用後は手洗いなどをおこなってください。
(2) 停止液は強酸性 (1N 硫酸) です。衣服・皮膚等への接触および廃棄には十分注意してください。

性能1

感度0.05 pmol/L (標準品を用いて NCCLS 法にて算出)

2

測定範囲0.31 ～ 20 pmol/L

3

2 使用上の注意(1) 標準物質は、凍結乾燥品です。開封は、十分注意しゆっくりとおこなってください。
(2) 保存は、2～8°C としてください。
(3) 希釈用緩衝液、標識抗体濃縮液および濃縮洗浄液は、まれに析出を認める場合がありますが、性能に問題はありません。
(4) ロットが異なる製品の構成試薬や他のキットの構成試薬を混ぜたり、交換したりして使用しないでください。
(5) 期限切れの試薬は、使用しないでください。

希釈直線性
10Dilution linearityof Human Plasma

8pmol/L

63 廃棄上の注意
使用後の抗体プレートや試薬は多量の水で洗い流してから廃棄してください。

42

参考文献

000.250.50.75

11. Kobayashi M, Maruyama N, Yamamoto Y, Togawa T, Ida T,Yoshida M, Miyazato M, Kitada M, Hayashi Y, Kashiwagi A,Kitamura T.A newly developed glucagon sandwich ELISA is
useful for more accurate glucagon evaluation than thecurrently used sandwich ELISA in subjects with elevatedplasma proglucagon-derived peptide levels.
J Diabetes Investig. 2023 May;14(5);648-658.

1/Dilution(1; 2-fold diluted Human Plasma)4

添加回収試験
検体

HumanEDTAPlasma(x2)5

添加量(pmol/L)

理論値(pmol/L)

測定値(pmol/L)

%

10.00

11.95

12.52

104.8

2.50

4.45

4.41

99.1

0.63

2.58

2.40

93.0

貯蔵方法・有効期間
2～8°C 保存
使用期限は外箱に記載

同時再現性

測定値(pmol/L)

SD (pmol/L)

CV (%)

n

11.00

0.43

3.9

24

2.73

0.10

3.7

24

0.73

0.05

6.8

24

包装単位および製品番号
96 Well
製品番号 27797

問合せ先
6

測定値(pmol/L)

SD (pmol/L)

11.17
2.840.757株式会社 免疫生物研究所〒375-0005 群馬県藤岡市中 1091-1
電話：0274-50-8666
FAX：0274-23-6055
URL: https://www.ibl-japan.co.jp
E-mail: do-ibl@ibl-japan.co.jp

測定間再現性妨害物質の影響
溶血ヘモグロビン
遊離ビリルビン抱合型ビリルビン
乳ビ

製造販売元 株式会社

CV (%)

n0.23

2.1

80.09

3.2

80.04

5.3

854 mg/dL
20 mg/dL
20 mg/dL
1410（ホルマジン濁度） まで測定値に影響ありません。

免疫生物研究所

群馬県藤岡市中 1091-12