人工血液第 14 巻 第 4 号 2007 年 5 月

目

次
会告
総説

…………………………………………………………………… 106
Notchリガンドを用いたヒト造血幹細胞増幅法の開発…………………………………………………………千葉

滋 108

CD4陽性T細胞の分化とRac1 ………………………白井睦訓 113
組織接着剤開発の現状 ………………………………田口哲志 118
小動物臨床における輸血の現状と人工赤血球の使用例…………………………………………………………並河和彦 124
二次投稿論文ハムスター皮下の細動脈血流を一過性に遮断するモデルを用いた
P50値が異なるHb小胞体の酸素放出挙動 ……………酒井宏水 130
事務局たより ……………………………………………………………… 138

ARTIFICIAL BLOOD
Vol. 14 No. 4 May, 2007

Contents
Announcement ……………………………………………………………… 106
Review：Development of a Highly Efficient Ex Vivo Expansion
System of Human Hematopoietic Stem Cells Using
Delta1-Fc Chimeric Protein. ……………………Shigeru Chiba 108
Role of Rac1 in Differentiation of CD4 T Cells…………………………………………………Mutsunori Shirai 113
Development of Tissue Adhesives …………Tetsushi Taguchi 118
Circumstances Regarding Blood Transfusion andCases Using Artificial Erythrocyte in
Small Animal Clinics ……………………Kazuhiko Namikawa 124
Secondary Publication：
Oxygen Release from Low and Normal
P50 Hb-Vesicles in Transiently Occluded Arteriolesof the Hamster Window Model. …………………Hiromi Sakai 130

会 告
第14回日本血液代替物学会年次大会
大 会 長：慶應義塾大学 輸血・細胞療法部 半田誠
開催日程：平成19年 6 月14日（木）、15日（金）
開催場所：慶應義塾大学三田キャンパス北館
テ ー マ：人工血液の未来を語ろう
登録受付：当日（事前受付なし）、参加登録費：10,000円
会員懇親会：無料、 6 月14日（木）6 時特別プログラム：○特別講演：人工血液に期待する
座長：池田康夫（慶大）- 稲田英一 順天堂大麻酔科（医療者の立場から）- 有賀友則 エホバの証人の医療機関情報デスク（患者の立場から）- 清水勝 （血液事業全体から俯瞰して）○大会長シンポジウム：人工血液の将来展望
座長：堀之内宏久（慶大）、武岡真司（早稲田大）- 基調講演：小林紘一（慶大）- 人工酸素運搬体：高折益彦（東宝塚さとう病院）- 人工（代用）血漿：宮尾秀樹（埼玉医大麻酔）- 人工免疫グロブリン・人工抗体：鈴木和男（千葉大免疫）- 人工血小板：半田誠（慶大）○教育講演1）赤血球が語る膜機能（女子医大生化学 高桑雄一）
2）リコンビナント活性型第Ⅶ因子製剤：人工止血剤としての可能性（ノボノルディスクファーマ 止血開発企画部 新井盛大）○シンポジウム
1）人工血液研究の最前線（ 4 題）2）人工酸素運搬体の適応（ 6 題）
3）人工酸素運搬体の諸問題（ 8 題）：
モデレータ：酒井宏水（早稲田大）、川口章（東海大）-「ナノカプセル型人工酸素運搬体TRM-645の開発状況と今後の展開」、金田伸一（テルモ）-「体外循環における人工酸素運搬体の効果について」、水野敏秀、妙中義之（国立循環器病センター研究部 人工臓器部）-「人工酸素運搬体の常温並びに低体温脳虚血に対する効果に関する研究―胸部大動脈瘤手術への応用を目指して―」、織田貞二（島根大 心臓血管外科）-「人工赤血球OXY-0301の開発状況と今後の展開」、松浦昭宏（オキシジェニクス）-「人工赤血球の血液適合性と免疫系に対する影響」、東寛（北海道赤十字血液センター 研究部）-「臨床検査における人工赤血球の影響とその解決策」、村田満（慶大 中央検査部）-「Higher O 2 Affinity Potentiates Protective Effect of Artificial O 2 Carrier in Brain
Ischemia/Reperfusion in a Rat Model」、川口 章（東海大）-「ヘモグロビン小胞体と各種代用血漿剤の併用に関する検討」、酒井宏水（早大 理工学術院）

106

人工血液 Vol. 14 , No.4, 2006

第14回日本血液代替物学会年次大会プログラム案
6/14（木）

6/15（金）

09:00

09:00

09:30

09:30

一般演題（ 6 題）
開会
10:00

10:00
シンポ 1 ：人工血液研究の最前線

10:30

10:30
（ 4 題）

11:00

特別講演：人工血液に期待する
11:00
座長：池田康夫（慶大）

11:30

11:30
理事会

12:00

12:00
昼休み

12:30

12:30
評議員会

13:00

13:00
教育講演 1 ：赤血球が語る膜機能

13:30

総会
13:30
教育講演 2 ：リコンビナント活性型第Ⅶ因子製剤

高桑雄一（女子医大）
14:00

14:00
新井盛大（ノボ）

会長シンポジウム：人工血液の将来展望
14:30

14:30
シンポ 3 ：人工酸素運搬体の諸問題

座長：堀之内宏久（慶大）、武岡真司（早大）
15:00

15:00
座長：酒井宏水（早大）、川口章（東海大）

15:30

15:30

16:00

16:00

（ 8 題）
シンポ 2 ：人工酸素運搬体の適応
16:30

16:30
（ 6 題）

17:00

17:00
閉会

17:30

17:30

18:00

18:00
懇親会

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 14 , No.4, 2006

107

総

説

Notchリガンドを用いたヒト造血幹細胞増幅法の開発
Development of a Highly Efficient Ex Vivo Expansion System of Human
Hematopoietic Stem Cells Using Delta1-Fc Chimeric Protein.
鈴木隆浩，千葉滋

Takahiro Suzuki, Shigeru Chiba
和文抄録
血液製剤は現在そのほとんどを献血に依存しているが，献血に頼った輸血医療は供給が必ずしも安定せず，感染の危険性を完全には除外できないなど，課題が残されている．課題克服のための取り組みとして代替血液の可能性が模索されており，輸血製剤の体外生産技術を確立することは，代替血液を手にするための選択肢の一つである．造血幹細胞の増幅と分化血球誘導技術とを組み合わせることで，効率的な輸血製剤の体外生産を可能にすることが期待される．我々は，幹細胞維持因子であるNotchシグナルの活性化が造血幹細胞の体外増幅に有効であることを見出し，Notchリガンドである
Delta1を適切なサイトカインと共に加えることで，ヒト臍帯血造血幹細胞（SCID repopulating cell）を約６倍に増幅できることを確認した．本技術は将来の輸血医療・移植医療にとって重要な役割を担うことが期待される．
Abstract
Supply of blood products mainly depends on voluntary donation, but this system bears a potential risk of insecure supply andpathogenic contamination. Therefore, establishment of the technology that enables efficient ex vivo production of blood products
is expected. Expansion of hematopoietic stem cells（HSCs）ex vivo can be a powerful tool for such a demand when combinedwith a technology to induce differentiation of HSCs into specific blood lineages. We found that activation of the Notch signaling
pathway by Delta1, one of the physiological Notch ligands, is effective for HSC expansion, and culture of human cord blood
HSCs with Delta1 and other conventional cytokines expanded HSCs（SCID repopulating cells, SRCs）by about 6-fold. Our
technique is expected to play an important role for the future blood transfusion medicine as well as the stem cell transplantation
medicine.
Keywords
Notch, Delta1, Hematopoietic stem cell, Stem cell expansion, CD133, CD34

はじめに
現在血液製剤はそのほとんどを献血事業に依存しているが，献血に頼った輸血医療は，量的質的な供給の不安定性，感染の危険性などの問題を孕んでおり，改善すべき点も多い．これを解決する手段として，人工材料を用いた代用血球製剤の開発や幹細胞からの血球産生システムの開発等が考えられ，現在盛んに研究が進められている．その中でも幹細胞からの血球産生は，幹細胞に備わった自己複製能と分化増殖能を最大限利用することにより，理論上相当数の分化血球を得ることが可能であり，また代用血球の目処の立っていない血球の産生も可能である．
以上のことから，我々は主に臍帯血や骨髄中に存在する体性造東京大学医学部附属病院

無菌治療部〒113-8655

血幹細胞に注目し，体外で幹細胞を増幅させ，さらに赤血球・白血球・血小板等の各種血球細胞を誘導する技術の開発を試みてきた．そして，幹細胞維持因子であるNotchシグナルの活性化が，幹細胞由来血球製剤化にあたり最も基本的な技術となる
造血幹細胞の体外増幅に有効であることを見出した1）．

NotchシグナルとはNotchシグナルは細胞膜表面に存在する受容体（Notchファ
ミリー分子）がリガンド（Delta，Jaggedファミリー分子）からの刺激によって活性化されることで伝えられる情報伝達系である．本シグナルはショウジョウバエから哺乳類に至るまで高東京都文京区本郷7-3-1

Department of Cell Therapy/Transplantation Medicine,

University of Tokyo Hospital, Hongo 7-3-1, Bunkyo-ku, Tokyo 113-8655, JAPAN
論文受付 2006年12月１日 論文受理 2007年３月22日

108

人工血液 Vol. 14 , No.4, 2006

度に保存されており，種々の組織における幹細胞の発生・維持，分化制御に重要な役割を果たすことが明らかになっている2，3）．
特に造血系について述べると，Notch1ノックアウトマウス
では発生過程で造血幹細胞が出現しないことから，Notchシグ
ナルは胎生期の造血幹細胞の発生に必須であることが分かっている 4）．また，Notchは成体造血幹細胞の維持にも重要である
ことが近年数々の研究によって明らかになってきた．Notchおよびその関連分子をマウス骨髄造血幹細胞で活性化させると，幹細胞の表現型が維持されることから，Notchが造血幹細胞の維持，分化抑制に重要であることが示唆される5）．さらに，造血幹細胞は骨髄において特殊な解剖学的位置（ニッチと呼ばれる）において自己複製すると考えられてきたが，近年海綿骨の表面にある骨芽細胞がニッチの一つであることが明らかとなった6，7）．そして，骨芽細胞が増生するトランスジェニックマウス
では造血幹細胞の増加も認められるが，このマウスの骨芽細胞
ではNotchリガンドの一つであるJagged1が高発現されており，
コントロールマウスに較べて造血幹細胞においてNotchシグナ
ルが亢進していることが報告された6）．以上より，成体内骨髄ニッチでは骨芽細胞上のNotchリガンドにより造血幹細胞のNotchシグナルが活性化することによって，造血幹細胞の分化が抑制され，自己複製に重要な役割を果たしているというモデルが想定されている（Fig. 1.）．

Osteoblast

Trabecular bone

Osteoblast

Notch ligand(Jagged1)
Notch ligand(Jagged1)

Inhibition of differentiation
Self renewal

Notch■Delta1の添加は未分化造血細胞を増幅するのに効果的である
まず，造血幹細胞増幅のための最適培養条件を探るため，臍
帯血CD133陽性細胞を様々なサイトカインおよびDelta1-Fc存在下に培養し，未分化造血コロニー（CFU-Mix）の増幅率を比較した．サイトカインは従来から幹細胞増幅効果が確認されている，Stem cell factor（SCF），thrombopoietin（TPO），
flt-3 ligand（FL）をベースとし（STF），これにIL-6，IL-6/可溶性IL-6受容体キメラ蛋白（FP6），IL-3，Delta1-Fcを様々な組
み合わせで添加し，培養を行った．Delta1-Fcはヒトフィブロ
ネクチンと共に培養底にコーティングし，その上で細胞を培養した（Fig. 2.）．

Fig. 2. The outline of our culture system

その結果，CFU-MixはSTF + FP6 + IL-3 + Delta1-Fc（STFF3+D）で３週間培養することにより最も効率よく増幅できることが判明した（Fig. 3.）．

Notch

CFU-Mix

300

Fig. 1. Hematopoietic stem cell niche and Notch.
Osteoblasts express Jagged1, one of the Notch ligands, while
hematopoietic stem cells（HSCs）express Notch receptors. The
Notch signaling pathway in HSCs is activated by Jagged1
presented on osteoblasts, and this signal is thought to suppress
differentiation and help self-renewal of HSCs.

Rate of expansion (fold)

Hematopoietic stem cell
200

100

Notchリガンドを用いた造血幹細胞の体外増幅
最近本シグナルを活性化可能な可溶型精製リガンドが開発され，その再生医療への応用が期待されている．そこで我々は本可溶型リガンド（Delta1-Fc：Delta1とヒトIgG Fc部分を繋いだ人工キメラ蛋白）を用いてヒト臍帯血造血幹細胞濃縮分画（CD133陽性細胞）を培養，これをNOD/SCIDマウスに移植し造血幹細胞の増幅効果を定量的に検討した．その際，将来の製剤化を容易にするため，培養にはフィーダー細胞を用いず，培養液も血清を含まない化学的組成の明らかなものを用いることとした．

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 14 , No.4, 2006

0

1 2

1 2

Fc

D1

3GFs + IL-6

1 2 3 1 2 3Fc

D1

3GFs + IL-6
+ IL-3

1 2 3 1 2 3Fc

D1

3GFs + FP6

1 2 3 1 2 3 wk
Fc

D1

3GFs + FP6+ IL-3Fig. 3. The expansion rates of CFU-Mix.
CB CD133-sorted cells were cultured in the presence of indicatedcytokines and Delta1-Fc for one, two and three weeks.
After indicated periods of culture, cells were replated in asemisolid medium and the number of CFU-Mix was evaluated.
The expansion rate of the number of CFU-Mix is shown. Fc, IgGFc; D1, Delta1-Fc. 3GFs, three growth factors（SCF, TPO, and FL）.

109

■Delta1を含むSTFF3+D条件は造血幹細胞を 6 倍に増幅し，これは従来の報告より効率的である
ヒト造血幹細胞は，現在のところ表面抗原などを用いた
prospectiveな同定は困難であり，免疫不全マウス（NOD/SCIDマウス）へ移植を行った後ヒト細胞による長期造血再建を確認することによってretrospectiveに検出することしかできない．
そこで我々はマウスに細胞を移植し，限界希釈法の原理を用いることで含まれる造血幹細胞数（SCID Repopulating Cell:
SRC）を定量化した（Fig. 4.）．
STFF3+D条件にて最も効率よく未分化造血細胞が増幅されることが示されたため，臍帯血CD133陽性細胞をSTFF3+Dで３週間培養し，含まれているSRC数を培養前（分離直後）のものと比較した．
その結果，分離直後のCD133陽性細胞中のSRCは1,020個中に１個であったのに対し，STFF3+Dで3週間培養を行った細胞集団中には，175個中に１個（培養開始時細胞数に換算）のSRCが存在していることが判明した．これは培養によってSRC（造血幹細胞）が5.8倍に増幅されたことを示しており，本増幅効率
は無血清・無フィーダー条件下での報告では最高効率に属する．
次に本培養条件と従来有効と報告されている培養条件を比較した．これまでに，STF + FP6（STFF）8）およびSTF + IL-6
+ IL-3 + Delta1（STF63+D）9）についても造血幹細胞増幅に関して有効という報告がなされている．しかし，これらの報告は有血清条件での結果，あるいは定量化を行っていないなどの問題があった．そこで，我々はSTFF3+Dとこれらの培養条件
を，無血清・無フィーダー条件下で定量比較した．その結果，培養細胞中に含まれるSRCはSTFFでは640個中に１個（増幅効率1.6倍，p=0.001（STFF3+Dと比較）），STF63+Dでは266個中に１個（増幅効率3.8倍，p>0.05（STFF3+Dと比較））とな
り，我々が検討したSTFF3+D条件はSTF63+Dとは有意差は認A

D

Fresh CD133-separated cells
100

10

1

266

0

1000

1500

2000

2500

3000

Number of transplanted cells / mouse

B

37

10

1

0

1000

1500

2000

60

125

250

500

750

1000 1500

0

2000

1500

60

100

37

0.1

361

0

1000

500

1500

2000

60

Fraction of negative mice (%)

Chimerism of human cells (%)

Fraction of negative mice (%)

250

500

750

10

1

37

STFF3+D

1/175

STF63+D

1/266

STFF+D

1/361

STFF

1/640

Fresh CD133-sorted cells

1/1020

0.1

640
10

0

500

125

Number of transplanted cells (equivalent to the initial cells) / mouse100

n = 430n = 34

F

100

37

750

500

1

10
0

Cells cultured with STFF

100

250

10

Number of transplanted cells (equivalent to the initial cells) / mouseC

125

Number of transplanted cells (equivalent to the initial cells) / mouse

Cells cultured with STFF+D

3000 5000

Number of transplanted cells (equivalent to the initial cells) / mouse

Number of transplanted cells (equivalent to the initial cells) / mouse

0.1

1000

500

100

n = 60

0.1

175
10
500

1

Number of transplanted cells (equivalent to the initial cells) / mouse

Fraction of negative mice (%)

Chimerism of human cells (%)

Fraction of negative mice (%)

100

0

E

Cells cultured with STFF3+D
100

0

10

10

2500
5000
10000
1250
Number of transplanted cells / mouse

625

3500

Chimerism of human cells (%)

500

37

0.1

1020
10
0

100

n = 32Fraction of negative mice (%)

Chimerism of human cells (%)

Fraction of negative mice (%)

37

Cells cultured with STF63+D
100

n = 26

Chimerism of human cells (%)

100

1000

1500

2000

Number of transplanted cells (equivalent to the initial cells) / mouse

10
125

250

500

750

1000

1500

3000

Number of transplanted cells (equivalent to the initial cells) / mouse

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

Number of transplanted cells (equivalent to the initial cells) / mouse

Fig. 4. The repopulating ability of fresh CB CD133-sorted cells and their progenies after the culture with various combinations of cytokines for three
weeks.
（A-E）The frequencies of SRCs in fresh CD133-sorted cells（A）, cells cultured with SCF + TPO + FL（STF）+ FP6 + IL-3 + Delta1-Fc（STFF3+D）（B）, STF + FP6（STFF）（C）, STF + IL-6 + IL-3 + Delta1-Fc（STF63+D）（D）and STF + FP6 + Delta1-Fc（STFF+D）（E）. They were
estimated as 1/1020（A）, 1/175（B）, 1/640（C）, 1/266（D）and 1/361（E）, respectively, by limiting dilution analyses. The right panels show
chimeric proportion of human CD45+ cells in the bone marrow of recipient mice, and the number of transplanted mice is shown in the upperleft margin of the panels.（F）Integrated representation of（A）to（E）. Correspondence of the symbols and lines are noted in the right.

110

人工血液 Vol. 14 , No.4, 2006

められなかったものの，これらの培養条件と同等かそれ以上の増幅効率を示すことが示された．
STFF3+D条件はIL-3を添加サイトカインとして含むが，IL3は分化を促進するとの報告もあり，その造血幹細胞増幅への影響については評価が定まっていない．そこで，我々はSTF +FP6 + Delta1 （STFF+D）条件の培養も試み，幹細胞数の比較を行った．その結果，STFF+Dで培養された分画中に含まれるSRCは361個中に１個（2.8倍）と算定され，STFF3+Dより有意に（p=0.02）増幅効率が低いことが判明した．これはIL-3が少なくともDelta1存在下では造血幹細胞増幅に効果的に作用することを示している．
■増幅された造血幹細胞は正常機能を保持している
増幅された造血幹細胞が正常機能を有することを確認するた
め，我々はヒト細胞が生着したマウスにおいて血液細胞を回収し，その分化状態を検討した．前述したようにヒト血液細胞の移植にはNOD/SCIDマウスが頻繁に用いられるが，本マウスへの移植系ではヒトT細胞が再構築されないことが知られており，問題点として認識されていた．最近NOD/SCIDマウスを
IL-2受容体共通γ鎖（IL-2Rγc）ノックアウトマウスと交配することにより，移植細胞のあらゆる血球系への分化が可能なマウスが樹立された（NOD/SCID/γcnullマウス（NOGマウス））10）．
そこで，我々はSTFF3+D条件で増幅した細胞をNOGマウスに移植し長期間経過後（24週後），ヒト血球分化状態を解析した．
移植レシピエントより骨髄，末梢血，脾臓，胸腺を回収し，その中に含まれるヒト血球細胞（ヒトCD45陽性細胞）の各分化抗原を解析したところ，CD13/33陽性骨髄系細胞，CD19陽性B
細胞，CD3陽性T細胞，CD56陽性NK細胞が認められ，T細胞においてはCD4あるいはCD8 single positive細胞も確認できて
おり，移植されたヒト造血幹細胞が正常に骨髄球系細胞，リンパ球系細胞に分化していることが明らかとなった．骨髄においては，CD133+CD34+未分化造血細胞が認められており移植後も造血幹細胞が骨髄内に存在していることが示唆された（Fig. 5.A）．
そこで，骨髄に存在する未分化細胞中に造血幹細胞が存在していることを確認するため，本マウスより骨髄細胞を回収し，別のNOGマウスへ２次移植を行った．１匹の１次レシピエント骨髄より細胞を回収し，これを３等分して３匹のNOGマウスに移植を行ったところ，２匹にヒト血液細胞の生着を認め，骨髄系・B細胞系への分化が確認された（Fig. 5.B, 5.C）．
以上の結果より，STFF3+D条件で３週間培養した場合でも正常な造血幹細胞活性が保たれていることが明らかとなった．

Fig. 5. In vivo repopulating and differentiation capacity of the cells cultured with SCF + TPO + FL + FP6 + IL-3 + Delta1-Fc（STFF3+D）.
CB CD133-sorted cells were cultured with STFF3+D for three weeks and were transplanted into NOG mice.
（A）The bone marrow（BM）, peripheral blood（PB）, spleen（SP）and thymus（TH）of recipient mice were collected 24 weeks after
transplantation, and contribution of human cells to various hematopoietic lineages were examined by flow-cytometric analyses. A high level ofengraftment（panel a; 39%）
, reconstitution of CD133+CD34+ immature cells（d; 2.1%）and contribution to myeloid（b）, B cell（c, e, f, h）, T cell（b, f,g, h, i）and NK cell（c, e）lineages were confirmed in the BM, spleen, thymus and peripheral blood. Panels b to i represent data gated by humanCD45+ cells.
（B, C）Ten thousand CB CD133-sorted cells were cultured and were transplanted into a primary NOG mouse. Twenty four weeks after
transplantation, bone marrow cells were harvested and serially transplanted into three secondary NOG recipients.（B）Ten weeks after
secondary transplantation, bone marrow cells of recipient mice were harvested and chimerism of human cells was analyzed. Two of the threesecondary recipients showed substantial human engraftment.（C）Representative flow-cytometric data of bone marrow cells in a secondary
recipient（mouse S1）. Human myeloid（CD13+ or CD33+）and lymphoid（CD19+）cells can be identified. Data with isotype controls are shown as
insets in the upper-left margin of the figures.

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 14 , No.4, 2006

111

まとめと考察

参考文献

今回我々は，SCF，TPO，FL，FP6，IL-3，Delta1-Fcを用いて無血清・無フィーダー条件下で３週間培養することにより，造血幹細胞（SRC）を約６倍に増幅できることを示した．
培養は将来の臨床応用を容易にするため，無血清・無フィーダ
ー条件で行ったが，６倍の増幅効率は現在までの報告中最高効率に属するものである．今後は，培養液量，培養環境（酸素濃度など）や培養期間の更なる最適化を行い，より効率的な培養系を確立したい．
造血幹細胞の体外増幅技術は，幹細胞からの各種血球誘導技
術と組み合わせることにより，最も効率的な体外培養血液製剤
産生を可能にする．現在筆者のグループでは，造血幹細胞から成熟好中球を効果的に誘導する技術開発研究を行っており，今回紹介した幹細胞増幅技術と組み合わせ，将来は臨床に応用できるレベルにまで発展させていきたいと考えている．
造血幹細胞の体外増幅のメリットは人工血液製剤への応用に限らない．本技術を利用すれば，少量の造血幹細胞から移植に利用できる十分量の造血幹細胞を得ることが可能である．これは骨髄，末梢血に次ぐ第３の移植用造血幹細胞ソースとして期待されているものの，含まれる幹細胞数の絶対量が少ないため適応が狭められている臍帯血移植にとって有用である．また，必要採取量が減少するため，骨髄移植ドナーにとってもメリッ
トは大きい．さらに，造血幹細胞の増幅は遺伝子治療分野でも重要であり，効率の良い遺伝子導入を可能にすることが期待される．さらに，将来ヒトES細胞からの造血幹細胞誘導が可能になれば，誘導された造血幹細胞をさらに増やすことも可能である（Fig. 6.）．
今回我々の確立した幹細胞増幅システムは，将来の輸血医
療・移植医療にとって重要な技術になることが期待される．

１. Suzuki T, Yokoyama Y, Kumano K, et al. Highly efficient
ex vivo expansion of human hematopoietic stem cells
using delta1-fc chimeric protein. Stem Cells. 2006;24:24562465.
２. Chiba S. Notch signaling in stem cell systems. Stem Cells.
2006;24:2437-2447.
３. Suzuki T, Chiba S. Notch signaling in hematopoietic stem
cells. Int J Hematol. 2005;82:285-294.
４. Kumano K, Chiba S, Kunisato A, et al. Notch1 but not
Notch2 is essential for generating hematopoietic stem cells
from endothelial cells. Immunity. 2003;18:699-711.
５. Kunisato A, Chiba S, Nakagami-Yamaguchi E, et al. HES-1
preserves purified hematopoietic stem cells ex vivo andaccumulates side population cells in vivo. Blood.
2003;101:1777-1783.
６. Calvi LM, Adams GB, Weibrecht KW, et al. Osteoblastic
cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature.
2003;425:841-846.
７. Zhang J, Niu C, Ye L, et al. Identification of thehaematopoietic stem cell niche and control of the nichesize. Nature. 2003;425:836-841.
８. Ueda T, Tsuji K, Yoshino H, et al. Expansion of human
NOD/SCID-repopulating cells by stem cell factor,
Flk2/Flt3 ligand, thrombopoietin, IL-6, and soluble IL-6
receptor. J Clin Invest. 2000;105:1013-1021.
９. Ohishi K, Varnum-Finney B, Bernstein ID. Delta-1
enhances marrow and thymus repopulating ability ofhuman CD34（+）CD38（-）cord blood cells. J Clin Invest.
2002;110:1165-1174.
10. Ito M, Hiramatsu H, Kobayashi K, et al. NOD/SCID/
gamma（c）（ null）mouse: an excellent recipient mousemodel for engraftment of human cells. Blood.
2002;100:3175-3182.

Fig. 6. Applications of ex vivo expansion of HSCs.

112

人工血液 Vol. 14 , No.4, 2006

総説CD4陽性T細胞の分化とRac1
Role of Rac1 in Differentiation of CD4 T Cells
小田浩代（1，2），鈴木春巳（2），白井睦訓（1）Hiroyo Oda (1, 2), Harumi Suzuki (2), Mutsunori Shirai (1)

和文抄録
血球の分化制御機構の解明は，免疫療法の確立において非常に重要である．血球の重要な成分であるT細胞は胸腺で分化，成熟し，CD4陽性T細胞はヘルパーT細胞として，CD8陽性T細胞はキラーT細胞として末梢組織で機能する．Rac1はアクチン再構成に重要な役割を果たすことで知られるRhoファミリーGTPaseに属するタンパク質であり，T細胞受容体（TCR）シグナル下流で活性化することが知られているが，胸腺内でのCD4陽性T細胞の分化における機能はまだ十分に明らかにされていない．そこでドミナントネガティブ型Rac1（dnRac1）分子を未熟胸腺細胞株および造血幹細胞様培養
株に強制発現し，その分化における機能を解析した．その結果，Rac1は未熟胸腺細胞においてTCR依存性のアクチン再構成に必須なだけでなく，bcl-2を介した生存シグナルを伝達することによりCD4陽性T細胞への分化を促進することが明らかになった．
Abstract
T cells are generated in the thymus and CD4 positive T cells act as helper T cells and CD8 positive cells act as killer T cells in
the periphery. Rac1, one of the Rho family small GTPases has been shown to work as a "molecular switch" in various signaltransduction pathways and also activated downstream of T cell recepter（TCR）. In order to assess the function of Rac1 in the
differentiation process of CD4 single positive（CD4-SP）T cells from CD4CD8 double positive（DP）cells, we utilized a DP cell line
DPK, which can differentiate into CD4-SP cells upon TCR stimulation in vitro and hematopoietic stem cell like cell line. DPK
expressing dnRac1 underwent massive apoptosis upon TCR stimulation and resulted in defective differentiation of CD4-SP cells.
We found that TCR-dependent induction of Bcl-2 was greatly suppressed in dnRac1-expressing DPK and this suppression was
independent of actin rearrangement. Furthermore, introduction of exogenous Bcl-2 inhibited TCR-dependent induction of
apoptosis and restored CD4-SP generation in dnRac1-expressing DPK without restoring TCR-induced actin polymerization.
Collectively, these data indicate that Rac1 is critical in differentiation of CD4-SP from the DP cells by preventing TCR-induced
apoptosis via Bcl-2 upregulation.
Keywords
T lymphocytes, TCR, CD4, apoptosis, thymus

はじめにリンパ球は免疫機能の中でも極めて重要な役割を果たしている．リンパ球をはじめ血球は造血幹細胞から分化しており（Fig. 1.），その分化制御メカニズムの解明は，人工的に制御可能な血球の開発（言わば人工血液）において必要不可欠であり，新たな再生医療技術の創出に繋がることが期待されている．免
疫機能不全に起因する難治性の疾病は極めて多様であり，発癌（1）山口大学大学院医学系研究科ゲノム・機能分子解析学分野の制圧にも免疫機能は深く関与している．リンパ球の増殖や分化などの機能を遺伝子制御により自由に制御できる技術は，これら疾病の多くを治療可能とするもので，我々は造血幹細胞の安定した培養供給技術や，遺伝子制御を施した幹細胞のinvitroでの免疫細胞への分化誘導とvivoへの移植後の生体内組織
再構築による免疫機能不全の治療法の開発を検討してきた．免
疫機能制御は極めて巧妙にできていて，また個々人でその制御〒755-8505

山口県宇部市南小串1-1-1

Department of Microbiology,

Yamaguchi University School of Medicine, Minamikogushi 1-1-1, Ube, Yamaguchi 755-8505, Japan（2）国立国際医療センター研究所 臨床病理研究部 Department of Pathology, International Medical Center of Japan
論文受付 2006年12月９日 論文受理 2007年３月13日

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 14 , No.4, 2006

113

は複雑に異なっており，現在の技術では化学的に合成した物質
で免疫細胞機能を代替することは不可能で，これまで患者個人の造血幹細胞を採取してex vivoで大量に増やすことが試みられてきたが成功していない．ここでは，リンパ球のなかでも，特にT細胞の分化と制御について概説したい．

た研究がなされており，造血幹細胞の増殖と生着，Th1細胞の分化に関与することが明らかにされたが 13-16），胸腺内でのT細胞分化における役割は不明な点が多い．
以下に，我々が最近解明した成果の一端として，未熟胸腺細胞株にドミナントネガティブ型Rac1（dnRac1）分子を強制発現したときのCD4陽性T細胞の分化における機能の解析結果17）を紹介するとともに，造血幹細胞様細胞株を用いたT細胞分化機構解析への応用とT細胞増強療法への応用について考察した．

Rac1のCD4陽性T細胞分化における機能

Fig. 1. Differentiation of hematopoietic cells.

T細胞は造血幹細胞から生じるT前駆細胞が胸腺に到達した
のち複雑な過程を経て分化する.成熟T細胞はCD8分子を発現して細胞傷害性を有するキラーT細胞と，CD4分子を発現して他の免疫担当細胞の活性を制御するヘルパーT細胞とに大別されるが，いずれのT細胞も病原性微生物の排除や体内に生じたがん細胞の排除などの種々の反応において獲得免疫の要として機能する（Fig. 1.）．
近年T細胞の機能障害をはじめとする重篤な免疫不全を伴う
Wiskott-Aldrich syndromeの原因遺伝子がアクチン結合タンパ
ク質WASPをコードすることが解明され，T細胞におけるアクチン再構成がその機能に重要な役割を果たすことが明らかになった1，2）．T細胞において，アクチンはT細胞受容体刺激依存性に重合し，抗原提示細胞との相互作用や炎症局所への遊走などのさまざまな動きを制御する3-5）．このアクチン再構成を制御する分子群にはRhoファミリー低分子量Gタンパク質があるが，そのうちでもRacは上流および下流にさまざまな因子が存在し，多岐にわたるシグナル伝達における分子スイッチとして注目されている6-9）．
RacにはRac1，2，3という相同性の高いアイソフォームが存在し，Rac1は普遍的に発現するのに対してRac2およびRac3はそれぞれ造血系および神経系に限局して発現する．近年Rac2欠損マウスが作成され，このマウスにおける胸腺分化は正常であるが末梢T細胞の活性化およびTh1型ヘルパーT細胞の分化とこれに伴うIFNγ産生が阻害されていることが示された10-12）．
また，Rac1欠損マウスは胎生致死となるためコンディショナ
ルノックアウトマウスやドミナントネガティブ型変異体を用い

114

CD4陽性T細胞はその機能からヘルパーT細胞と呼ばれ，細胞性免疫を制御するTh1細胞と液性免疫を制御するTh2細胞とに大別される．最近ではTh1/Th2バランスがアレルギー発症
や腫瘍排除などのさまざまな病態に関与することが注目を浴びており18-20），CD4陽性T細胞の分化機構の解明は免疫療法をはじめとする医療への応用に大きく貢献するものと考えられる．
CD4陽性T細胞は, 胸腺内でCD4CD8ダブルポジティブ（DP）
T細胞のT細胞受容体（TCR）がMHCクラスII分子と自己ペプ
チドに弱く結合することにより分化する（正の選択）が，同時に胸腺内では自己ペプチドに強く反応してそれ以上分化することなくアポトーシスに陥るDP細胞も存在する（負の選択）21，22）．
TCRというひとつの受容体から正と負の２種類のシグナル，すなわち生存シグナルとアポトーシスシグナルを伝達する分子機構は複雑で，今日までに多くの知見が蓄積しているが未だ明確な伝達経路は明らかになっていない．Rac1はTCR下流で活性化することが知られているGタンパク質であり，B細胞をはじめとする様々な細胞において生存シグナルの伝達に関与することが知られている23-25）．
われわれはCD4陽性T細胞の分化におけるRac1の機能を解析する目的で，ダブルポジティブ胸腺細胞株DPKにレトロウイル
スベクターを用いてdnRac1遺伝子を導入してその機能を検討した．DPKはANDトランスジェニックマウスに自然発生した
胸腺細胞腫由来の細胞株で，in vitroでの抗原刺激によって
CD4陽性T細胞へと分化するためCD4陽性T細胞の分化機構の解析に有用なモデルシステムとして活用できる26）．dnRac1導入
DPK（dnRac1-DPK）およびコントロールベクター導入DPK（Cont-DPK）を抗原刺激して３日間培養したところ，ContDPKはその約８割がCD4陽性T細胞へと分化したのに対してdnRac1-DPKのCD4陽性T細胞への分化は著しく阻害されることが明らかになった（Fig. 2.a）．さらにこの時，dnRac1-DPK
では抗原刺激依存性にアポトーシスが亢進していることが明らかになった（Fig. 2.b）．そこでdnRac1-DPKにおいて，抗原刺激に伴い伝達されるアポトーシスシグナル分子及び生存シグナ
ル分子の発現の変化を検索した結果，抗アポトーシス分子bcl-2の誘導が著しく減弱していることが明らかになった（Fig. 3.）．
以上の結果からTCRシグナル伝達において，Rac1がbcl-2分子の上流に存在することが推測される．これを検証する目的で，
dnRac1導入DPKにさらにbcl-2遺伝子を強制発現させたところ

人工血液 Vol. 14 , No.4, 2006

Fig. 2. TCR induced generation of CD4 single positive cells is inhibitedby dnRac1.
a）Vector only（cont-DPK）and pMXs-PREP-dnRac1 transduced
DPK cells were co-cultured with DC-I（antigen presenting cell）
and 100ng/ml SEA（Staphylococcus aureus enterotoxin A）. Afterthe indicated culture periods, cells were harvested and expression
levels of CD4 and CD8 were analyzed by flow cytometry.
b）Vector control or dnRac1 transduced DPK cells at indicatedculture periods were stained with Annexin V and the proportionof Annexin V stained cells in each group was plotted.

Fig. 4. Overexpression of bcl-2 rescues CD4 single positive cells
generation.
Vector only（cont-DPK）and dnRac1, Bcl2 or both dnRac1+ Bcl2transduced DPK cells were co-cultured with DC-I and 100ng/ml
SEA. After the indicated culture periods, cells were harvested
and expression levels of CD4 and CD8 were analyzed by flow
cytometry.

Fig. 3. Effect of dnRac1 on the expression of anti-apoptotic gene.
Changes in expression of Bcl-2 was determined by quantitative
real-time RT-PCR in DPK cells activated with plate-bound antiCD3 and CD28 antibodies for 16 hrs．Results are presented as aratio of expression of Bcl-2 and the control housekeeping gene
GAPDH.

Fig. 5. Rac1 is critical in TCR-induced actin polymerization.
Vector control or dnRac1-transduced DPK cells were cultured onanti-CD3 and CD28 mAb coated coverslips for 30 min and thenfixed, permeabilized, and stained with Alexa594 conjugatedphalloidin（red）to detect polymerized actin fibers and DAPI（blue）
to visualize nucleus.

（dnRac1-DPK Bcl-2），in vitroでの抗原刺激に伴うCD4陽性T細胞への分化はコントロールと同程度までに回復した（Fig.
4.）．これより，Rac1はDP細胞のCD4陽性T細胞への分化において，抗原刺激依存性にbcl-2の発現を誘導することによって生存シグナルを伝達することが明らかになった．また，dnRac1DPKにおいてTCR刺激依存性のアクチン再構成の阻害が認められたが，これはbcl-2の強制発現によっては回復しなかった（Fig. 5.）ことから，Rac1下流では細胞骨格へのシグナルと生存シグナルが独立して伝達されると推定される．

造血幹細胞様細胞株の利用とT細胞増強療法への応用

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 14 , No.4, 2006

Pax5ノックアウトプロB細胞（Pax5PB）は1999年にオーストリアのBusslingerらによって，プロB細胞でありながらB細胞
以外の種々の血球系細胞へと分化することのできる造血幹細胞様の性質を持つ培養細胞として報告された27）．この細胞はRAG2
ノックアウトマウスに移入後３週間で胸腺を再構築することが可能であり（Fig. 6.），in vitroでレトロウイルスベクターによる遺伝子導入を行えば遺伝子改変マウスを作成するよりも早く
簡便に多数の遺伝子の機能を検索することが出来る．われわれ

115

はDPK細胞を用いたin vitroの分化系において明らかになった
CD4陽性T細胞の分化におけるRac1の機能をin vivoで確認する
目的で，Pax5PBにレトロウイルスベクターを用いてdnRac1遺伝子を導入して再構築実験を行った．その結果，in vitroで得られた結果と同様に，胸腺においてDP細胞からCD4陽性T細胞への分化が著しく阻害されていることが明らかとなり，in vivoにおいてもRac1が生存シグナルの伝達に寄与していることが示唆された（未報告成績）．

ている．モデルシステムを用いた網羅的スクリーニングによって，患者自身の造血系細胞を用いたオーダーメイド医療への展開が期待される．

謝辞
本研究は，厚労省科学研究費補助金（H16-医薬-031）の支援により行われた．記して謝意を表する.

文献

Fig. 6. Thymus was successfully reconstituted from Pax5-/- proB cells.
Pax5 PB cells that express CD45.2 were injected into sublethally
irradiated RAG2 - /- -CD45.1 mice. After 3 weeks, reconstituted
thymocytes were analyzed with flow cytometory for the
expression of CD45.1 and CD45.2（left）, or CD8 and CD4（right）.

われわれは現在，独自に作成した免疫担当細胞由来cDNAラ
イブラリー中の遺伝子などをDPK細胞に導入し，T細胞の分化を促進する遺伝子の探索を行っている．また，この一次スクリーニングで得られたT細胞分化に関与する遺伝子群をPax5PBへ導入し，in vivoでの作用を解析している．いっぽうPax5PBが造血幹細胞様の性質をもつことを利用して，造血，再生に関与する多数の遺伝子の中からT前駆細胞の増幅に関与する遺伝子の検索を行うと同時に，Pax5PBの培養液中に種々の液性因子を添加することによりT前駆細胞をin vitroで維持する能力をもつ因子やT前駆細胞をin vitroで増幅することのできる因子の検索を行っており，このうちいくつかの因子についてはマウス
造血幹細胞への応用も開始している．さらにこの実験によって得られた種々の遺伝子あるいは因子を用い，免疫不全状態や担がん状態のヒトから採取した造血幹細胞を処置することによってin vitroでのT前駆細胞の増幅が可能になれば，GVHD（移植
片対宿主病）を誘発することなくT細胞を増強することができると考えられる．

今後の課題
現在，免疫不全症の改善，癌の免疫学的排除をはじめとする
様々な局面で安全かつ有効なT細胞増強法の確立が待ち望まれ

116

１. Derry JM, Ochs HD, Francke U. Isolation of a novel genemutated in Wiskott-Aldrich syndrome. Cell. 1994; 78: 63544.
２. Zhang, J., Shi, F., Badour, K., Deng, Y., McGavin, M. K.,
Siminovitch, K. A. WASp verprolin homology, cofilin
homology, and acidic region domain-mediated actin
polymerization is required for T cell development. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 2002; 99: 2240 -45.
３. Sasahara Y, Rachid R, Byrne MJ, de la Fuente MA,
Abraham RT, Ramesh N, Geha RS. Mechanism ofrecruitment of WASP to the immunological synapse andof its activation following TCR ligation. Mol Cell. 2002; 10:1269-81.
４. Barda-Saad M, Braiman A, Titerence R, Bunnell SC, Barr
VA, Samelson LE.Dynamic molecular interactions linking
the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton.Nat
Immunol. 2005; 6: 80-9.
５. Vicente-Manzanares M, Rey M, Perez-Martinez M, YanezMo M, Sancho D, Cabrero JR, Barreiro O, de la Fuente H,
Itoh K, Sanchez-Madrid F. The RhoA effector mDia is
induced during T cell activation and regulates actin
polymerization and cell migration in T lymphocytes. J
Immunol. 2003; 171: 1023-34.
６. Tapon, N., Hall, A. Rho, Rac and Cdc42 GTPases regulate
the organization of the actin cytoskeleton. Curr. Opin. Cell
Biol. 1997; 9: 86 -92.
７. Burridge K, Wennerberg K. Rho and Rac take center
stage. Cell. 2004; 116: 167-79. Review.
８. Arrieumerlou C, Randriamampita C, Bismuth G,
Trautmann A. Rac is involved in early TCR signaling. J
Immunol. 2000; 165: 3182-9.
９. Cantrell DA. GTPases and T cell activation. Immunol Rev.
2003; 192: 122-30. Review.
10. Li, B., Yu, H., Zheng, W., Voll, R., Na, S., Roberts, A. W.,
Williams, D. A., Davis, R. J., Ghosh, S., Flavell, R. A. Role of
the guanosine triphosphatase Rac2 in T helper 1 celldifferentiation. Science 2000; 288: 2219 -22.
11. Croker, B. A., Handman, E., Hayball, J. D., Baldwin, T. M.,
Voigt, V., Cluse, L. A., Yang, F. C., Williams, D. A., Roberts,
A. W. Rac2-deficient mice display perturbed T-cell

人工血液 Vol. 14 , No.4, 2006

distribution and chemotaxis, but only minor abnormalities
in T（H）1 responses. Immunol. Cell Biol. 2002; 80: 231-40.
12. Yu, H., Leitenberg, D., Li, B., Flavell, R. ADeficiency ofsmall GTPase Rac2 affects T cell activation. J. Exp. Med.
2001; 194: 915-26.
13. Gomez, M., Tybulewicz, V., Cantrell, D. A. Control of pre-T
cell proliferation and differentiation by the GTPase Rac-I.
Nat. Immunol. 2000; 1: 348 -52.
14. Gomez, M., Kioussis, D., Cantrell, D. A. The GTPase Rac-1
controls cell fate in the thymus by diverting thymocytes
from positive to negative selection. Immunity 2001; 15:703-13.
15. Glogauer, M., Marchal, C. C., Zhu, F., Worku, A., Clausen,
B. E., Foerster, I., Marks, P., Downey, G. P., Dinauer, M.,
Kwiatkowski, D. J. Rac1 deletion in mouse neutrophils has
selective effects on neutrophil func- tions. J. Immunol.
2003; 170: 5652-57.
16. Gu, Y., Filippi, M. D., Cancelas, J. A., Siefring, J. E.,
Williams, E. P., Jasti, A. C., Harris, C. E., Lee, A. W.,
Prabhakar, R., Atkinson, S. J., Kwiatkowski, D. J., Williams,
D. A. Hematopoietic cell regulation by Rac1 and Rac2
guanosine triphosphatases. Science 2003; 302: 445- 9.
17. Oda H, Suzuki H, Sakai K, Kitahara S, Patrick MS, Azuma
Y, Sugi K, Kitamura T, Kaye J, Shirai M. Rac1-mediatedBcl-2 induction is critical in antigen-induced CD4 singlepositive differentiation of a CD4+CD8+ immature
thymocyte line. J Leukoc Biol. in press
18. Prioult G, Nagler-Anderson C. Mucosal immunity andallergic responses: lack of regulation and/or lack of
microbial stimulation? Immunol Rev. 2005; 206: 204-18.

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 14 , No.4, 2006

Review.
19. Neurath MF, Finotto S, Glimcher LH.The role of Th1/Th2
polarization in mucosal immunity. Nat Med. 2002; 8: 567-73.
Review.
20. Knutson KL, Disis ML. Tumor antigen-specific T helper
cells in cancer immunity and immunotherapy. Cancer
Immunol Immunother. 2005; 54: 721-8. Review.
21. Aliahmad P, Kaye J.Commitment issues: linking positive
selection signals and lineage diversification in the thymus.
Immunol Rev. 2006; 209: 253-73. Review.
22. Palmer E. Negative selection clearing out the bad apples
from the T-cell repertoire. Nat Rev Immunol. 2003; 3: 38391. Review.
23. Zhang B, Zhang Y, Shacter E. Rac1 inhibits apoptosis in
human lymphoma cells by stimulating Bad
phosphorylation on Ser-75. Mol Cell Biol. 2004; 24: 6205-14.
24. Jiang K, Zhong B, Ritchey C, Gilvary DL, Hong-Geller E,
Wei S, Djeu JY. Regulation of Akt-dependent cell survival
by Syk and Rac. Blood. 2003; 101: 236-44.
25. Walmsley MJ, Ooi SK, Reynolds LF, Smith SH, Ruf S,
Mathiot A, Vanes L, Williams DA, Cancro MP, Tybulewicz
VL. Critical roles for Rac1 and Rac2 GTPases in B cell
development and signaling. Science. 2003; 302: 459-62.
26. Kaye J, Ellenberger DL. Differentiation of an immature T
cell line: a model of thymic positive selection. Cell. 1992; 71:
423-35.
27. Nutt SL, Heavey B, Rolink AG, Busslinger M.
Commitment to the B-lymphoid lineage depends on thetranscription factor Pax5. Nature. 1999; 401: 556-62.

117

総

説

組織接着剤開発の現状
Development of Tissue Adhesives
田口哲志，内田義之，立石哲也
Tetsushi Taguchi, Yoshiyuki Uchida, Tetsuya Tateishi

和文抄録
組織接着剤は，手術時間を短縮し，患者への負担を軽減する目的のために合成高分子系，生体高分子系，合成／生体高分子複合系の３種類が開発され，臨床で使用されている．しかしながら，現在使用されている組織接着剤は，生体親和性，接着強度等を十分に満たすものではない．そのため，様々な組織接着剤に関する研究が行なわれている．本稿では，現在臨床応用あるいは研究中の組織接着剤と問題点に触れ，我々の行っている組織接着剤についても紹介する．
Abstract
In order to bond tissue-tissue interface, synthetic, semi-synthetic and naturally-derived tissue adhesives have been developed
and applied in clinical field. However, these adhesives have several disadvantages on biocompatibility and bonding strength.
Possibility of some virus infections of naturally-derived tissue adhesives has been also pointed out for use in this kind of tissueadhesive. Therefore, some researchers have tried to develop tissue adhesives by using various crosslinking reagents in order tobond tissues with both high bonding strength and biocompatibility. In this review, researches on tissue adhesives including ourwork are introduced.
Keywords
Keywords: tissue adhesive, glue, cyanoacrylate, fibrin, gelatin, citric acid, organic acid

１．はじめに外科手術では，一般に創傷部を接合するために縫合糸が用いられているが，患部をより簡便・迅速に閉鎖するために接着剤を使用することが考案され，数種類が臨床現場において使用されている．組織接着剤は，外科手術における縫合時の補助的な利用のみならず，シーラント，止血剤，塞栓剤など，その用途は極めて広範囲に及ぶ．これらの用途により要求される特性は若干異なるが，組織接着剤は通常生体内で使用されるため，組織に対する接着性に加え，生体適合性が高く，操作が容易であることなどが必要となる．特に軟部組織用接着剤においては，
体液や血液の存在下で用いられるなど，他の用途と比較して厳しい条件下で使用される．そのため，生体組織をより強固に接合し治癒の遅延を惹起しないために，生体組織と馴染み易い流動性のある液体であり，硬化後は適度な弾性を有しており，損傷部位の治癒に伴って速やかに分解・吸収されることも要求される．表１に組織接着剤に要求される特性をまとめた．既に臨床応用されている組織接着剤には，合成材料を素材としている（独）物質・材料研究機構 生体材料センター〒305-0044

ものにシアノアクリレート系接着剤，天然由来材料を素材としているものにはフィブリン系接着剤，天然由来材料と合成素材を使用したものに生体高分子-アルデヒド系接着剤が挙げられる．しかしながら，これらの組織接着剤には先述した要求される特性を十分に満たしているとは言えず，新規な組織接着剤の開発が望まれている．本稿では，組織接着剤開発の現状と筆者らが現在行っている研究について紹介する．
表１. 組織接着剤に求められる性質
生体吸収性

生体に吸収され，分解生成物が無害であること

滅菌

消毒・滅菌が可能であること

十分な接着強度

血液の存在下でも生体組織と十分に接着すること

温和な反応性体温前後で接着し，組織を損傷するような反応熱を出さないこと

迅速な接着速度

数秒-数分以内に接着すること

ハンドリング

簡便な操作で使用できること

細胞進入性細胞が進入するための足場となること

茨城県つくば市並木1-1

Biomaterials Center, National Institute for Materials

Science, 1-1 Namiki, Tsukuba, Ibaraki 305-0044, Japan
論文受付 2006年12月６日 論文受理 2007年３月13日

118

人工血液 Vol. 14 , No.4, 2006

２．臨床で使用されている組織接着剤
２．１ シアノアクリレート系接着剤
シアノアクリレート系接着剤は，水のような弱塩基存在におけるアニオン重合により瞬時に硬化する特性を有する（Fig. 1.）．
そのため，外科手術における縫合の代替として応用しようとする試みが積極的に行われている．シアノアクリレート系接着剤に関する研究の起源は1950年代にまでさかのぼり，これまで数多くのシアノアクリレート誘導体が合成されてきたが，現在は，
n−ブチル−２−シアノアクリレートおよび２−オクチル−シ
アノアクリレートが臨床応用されている 1）．本接着剤は，接着速度が速く，接着強度が強い特長を有するが，硬化物が極めて硬いため軟部組織には馴染みにくく，ポリマーの加水分解物として生成するホルムアルデヒドの毒性により炎症反応が惹起される．そのため，シアノアクリレート系接着剤は，皮膚用などの用途に限定されている．

まざまな製品がヨーロッパ，日本，カナダ，アメリカ合衆国などで使用されている．フィブリン系接着剤には，HIV ウイル
ス等の混入の危険性があるが，より安全性を高める為，患者自身の血液を使用したり，安全性が確認されたドナーのみからの血液を採取したりするなどの方法が取られている．フィブリン
系接着剤は，接着強度が弱いため，接着剤としてではなく主にシーラントとして使用されている．
２．３ 生体高分子―アルデヒド系接着剤
代表的な例としてゼラチン−レゾルシン−グルタルアルデヒド（GRF）グルーがある．この接着剤はメチルシアノアクリレート系接着剤よりも毒性が低いものとして，1960年代に開発された．この接着剤は，ゼラチンとレゾルシンの混合溶液にホルムアルデヒドを添加することによって硬化・接着する．GRF
グルーは，高い接着強度を示すが，ホルムアルデヒドによる毒性が指摘され，適用範囲が狭まっている．そのため，ホルムア
ルデヒドに代わり，グルタルアルデヒド（Fig. 3.）やグリオキ
サールなどの他の架橋剤が検討されている3，4）．

Fig. 3. Crosslinking of biopolymers with aldehyde-based crosslinkers.
Fig. 1. Polymerization of cyanoacrylate-based monomers.

３．研究中の組織接着剤
２．２ フィブリン系接着剤
フィブリン系接着剤による接着剤の基本コンセプトは，1972
年になって条件が確立されている 2）．フィブリン系接着剤は，
Fig. 2.のようなフィブリノーゲンのトロンビンによる重合反応を利用した接着剤であり，現在日本で用いられている接着剤，
シーラントの８割を占める．現在，２液性やシート状など，さFig. 2. Coagulation process of thrombin and fibrinogen.

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 14 , No.4, 2006

現在研究中の組織接着剤／シーラントは，接着剤用架橋剤に関する研究と自然界の架橋反応・接着機構を用いた接着剤の研究に分けることができる．
３．１ 接着剤用架橋剤に関する研究
Fig. 4.には，接着剤（あるいはシーラント）に用いられている架橋剤あるいは縮合剤の構造を示した．まず，新規架橋剤を用いた接着剤には，以下のような研究が挙げられる．接着剤に用いる架橋剤として側鎖のカルボン酸をN-ヒドロキシスクシン
イミドで活性エステル化したポリ-L-グルタミン酸誘導体が合成されている5）．この架橋剤は，ゼラチンとの２成分系接着剤として使用されている．活性エステルは，ゼラチン中のアミノ基と生理的環境下で反応し，アミド結合を形成する．この反応を組織間で行うことによりポリ-L-グルタミン酸誘導体中の活性エステルは，接着剤中のゼラチンと反応するだけでなく生体内の細胞外マトリックス成分とも反応するという仕組みである．調製された接着剤は，「フィブリン系」接着剤と比較して接着性が優位に高いことが示されている．その他，活性エステル体の出発物質として研究されているものには，生体内に存在する
ジ／トリカルボン酸や末端にカルボキシル基を持つポリエチレ
ングリコール 6，7）などが用いられ，これらの架橋剤とアルブミン（球状タンパク質）やコラーゲン（棒状タンパク質）などの生体高分子から構成される接着剤（あるいはシーラント）も119

「フィブリン系」と比較して高い性能を示すことが明らかにされている．これらの活性エステル体とアミノ基との反応は，水との競争反応となるため，加水分解された架橋剤が接着剤中に残存することが考えられる．そのため，接着剤中に残存しても生体に対して毒性を示さない出発物質を選択する必要がある．
また，水溶性カルボジイミド（縮合剤），コラーゲンおよびポ
リグルタミン酸の３成分を用いた接着剤についても報告されている8）．また，最近，デキストランを過ヨウ素酸ナトリウムで処理することによりアルデヒド基を導入し，この誘導体とポ
リ−L−リジンの２成分から構成される自己分解性接着剤についても報告されている9）．
一方，高分子ミセルを一成分とする接着剤が検討されている10）．
この接着剤は，ポリエチレングリコールとポリ乳酸からなるAB型のブロックコポリマーの末端にアルデヒド基を持つミセ
ルを第１成分とし，ポリアリルアミンあるいはポリリジンを第２成分とするものである．この接着剤は，１秒程度でゲル化し「フィブリン系」と同程度の接着力を示すことが示されている．
分子量，分子構造等の最適化を進めることにより更なる性能向上が期待される．

３．２ 自然界の架橋反応・接着機構を利用した接着剤の研究（バイオ接着剤）
一方，植物由来の分子を架橋剤として用いる研究も近年報告されている11）．ゲニピンは，アカネ科のクチナシに含まれるイ
リドイド配糖体で，タンパク質中のリジン残基と反応して架橋形成することが知られている（Fig. 5.）．このゲニピンは，細胞毒性がグルタルアルデヒドの１／10000で「生体高分子−アルデヒド系」接着剤の約50％の接着強度を持つことが示されている．
近年，架橋剤を使用しない接着剤の研究が報告されている12）．
ムール貝から抽出した接着性タンパク質は，３価の鉄イオンが作用することにより，接着性を示す 13）．接着強度は，「フィブ
リン系」接着剤と同等であるが，新しいタイプの接着剤として期待される．

Fig. 5. Crosslinking reaction between genipin and biopolymers.

４．有機酸誘導体−生体高分子から構成される組織接着剤

Fig. 4. Structures of crosslinkers used for tissue adhesives:a）formaldehyde, b）glutaraldehyde, c）poly（L-glutamic acid）, d）
poly（ethylene glycol）disuccinimidyl disuccinate, e）pentaerythritol
poly（ethylene glycol）ether tetrasuccinimidyl glutarate, f）genipin,g）1-ethyl-3-（3-dimethyl aminopropyl）carbodiimide hydrochloride.

120

４．１ 有機酸を出発物質とする架橋剤
前項で述べたように「生体高分子−アルデヒド系」接着剤は，接着剤強度は強いものの接着剤中に残存するアルデヒド系架橋剤（ホルムアルデヒド・グルタルアルデヒド）が高い毒性を示
し，治癒を阻害する．すなわち，アルデヒド系架橋剤に代わる毒性の低い架橋剤を用いることができれば，生体親和性の高い接着剤を合成することが可能になると考えられる．そこで，筆者らは生体内の代謝系回路であるクエン酸回路に着目した．クエン酸回路には，架橋剤の出発物質となりうるジ／トリカルボン酸が複数存在する．これらの分子を架橋剤の出発物質として捉え，カルボン酸をN-ヒドロキシスクシンイミドで修飾することにより活性エステルを導入した架橋剤を合成した．有機酸に導入した活性エステルは，アミノ基と反応することによりアミド結合を形成する．例えば，クエン酸を用いた場合，３個の活性エステルが導入されるため，最大３点で架橋すると考えられる．（Fig. 6.）ここでは，クエン酸から合成した架橋剤（CAD）
を用いて得られた結果を紹介する．

人工血液 Vol. 14 , No.4, 2006

Fig. 6. Crosslinking reaction between citric acid derivative andbiopolymers.

４．２ クエン酸誘導体により得られるゲルの性質 14）
Fig. 7.には，CAD によって調製したゼラチンゲルの膨潤度をCAD 濃度に対してプロットした結果を示す．ゼラチンゲルの膨潤度は，CAD 濃度が100mM まで架橋剤濃度依存的に減少し，その後増加した．このことは，ゼラチンゲルの架橋密度
は，CAD 濃度が100mM までは高くなり，それ以降では低くなることを示している．ゼラチンゲル中に含まれるアミノ基の残存量は，CAD 濃度依存的に減少していることから，Fig. 8.
のような架橋が形成されていると考えられる．すなわち，
CAD が100mM までは，グルタルアルデヒドなどの一般的な架橋剤と同様に架橋剤濃度依存的に減少するが，それ以上の濃度になると余剰のカルボン酸がゼラチン分子内に形成され，この電荷反発により架橋密度が低くなると考えられる．この傾向は，ゼラチンの代わりにコラーゲンを用いることによって得られるゲルも同様な挙動を示すことが確認されている．15）

４．３ クエン酸誘導体を用いた組織接着剤の接着強度 16）
CAD によりゲルが得られることが明らかになったことから，
CAD を接着剤の硬化成分とし，コラーゲン（Col）を接着成分とする接着剤について検討した．Fig. 9.には，ブタ軟部組織（筋肉）に接着剤を塗布した後，接着強度を測定した結果を示
す．接着強度は，CAD 濃度の増加に伴い増加し，Col濃度を増加させるとさらに増加した．Col 濃度50％，CAD 濃度が100mM では，元の組織の引き裂き強度にほぼ匹敵する高い接着強度を持つことが明らかとなった．この接着剤による高い接着強度の実現は，Fig. 10.のメカニズムよるものと考えられる．
すなわち，接着剤を塗布すると，CAD は接着剤中のコラーゲンと反応するだけではなく，接着剤がブタ軟部組織中に浸透し，接着剤中のコラーゲンと軟部組織の細胞外マトリックス成分（コラーゲン，フィブロネクチン等）がCAD によって橋かけ状態になるため，強固に接着すると考えられる．CAD 及びCol
濃度の増加に伴う接着強度の増加は，接着剤中の架橋密度の増加に起因するものと考えられる．この接着剤は，肝臓，軟骨，
小腸など様々な臓器に接着することを確認しており，現在用途に応じた条件の最適化を行っている．

Fig. 9. Dependency of bonding strength on CAD and collagenconcentration. Error bars represents standard deviations; n=5.

Fig. 7. Crosslinking reaction between citric acid derivative and biopolymers.

Fig. 10. Proposed bonding mechanism of tissue adhesive to soft tissues.

Fig. 8. Swelling and deswelling mechanism of gelatin gels crossllinked
with citric acid.

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 14 , No.4, 2006

４．４ クエン酸誘導体を用いた組織接着剤の生体親和性評価
クエン酸誘導体の細胞に対する毒性を調べるため，マウスの121

繊維芽細胞（L929）を用いた細胞培養試験を行った．100ppmという高濃度の硬化成分を添加した場合，アルデヒド系接着剤の硬化成分（ホルムアルデヒド，グルタルアルデヒド）では，細胞が死滅した．一方，CADでは75％の高い生存率を示し，細胞に対する毒性が非常に低いことが明らかとなった．Fig.
11.には，マウス背部皮下に接着剤をインジェクションした後の様子を示している．比較としてフィブリン系，アルデヒド系
も同様の実験を行った．フィブリン系は炎症反応もほとんどな
く接着剤は分解・吸収している様子が観察された．アルデヒド
系をインジェクションすると炎症が徐々に拡大し，組織切片の観察から強い炎症反応が起こっていることが明らかとなった．
一方，本接着剤の場合には，強い炎症反応は観察されず，徐々に分解・吸収されている様子が観察された．以上のことから，
クエン酸誘導体を用いた組織接着剤は，高い生体親和性を持つ
ことが明らかとなった．

した背部に接着剤を塗布し有効性評価の検証を行った．Fig.
12.には，接着剤を塗布して７日後の組織閉鎖の様子を示している．コントロール（接着剤なし）およびフィブリン系は，十分に組織が閉鎖されていない様子が観察された．アルデヒド系
では，塗布直後には創部の十分な閉鎖が認められたが，時間がたつにつれ炎症が強くなり，７日目には切開部の判別ができな
いほどであった．一方，本接着剤（CAD-アルブミンの組み合わせ）を塗布した場合においては，良好な創部の修復が認められた．この結果から，in vivo においても本接着剤が有効に接着性および生体親和性を示すことが明らかとなった．

Fig. 12. Macroscopic observation after application of glues 7 days post
application.（a）aldehyde-based; b）fibrin-based; c）developed
adhesive（collagen and CAD concentration was 50％ and 100
mM, respectively）; d）control

５．まとめと今後の課題
接着剤は，外科領域と歯科領域で用いられている．外科用と歯科用では，その開発状況が大きく異なるため，本稿では，外科領域についてのみ記載した．現在進められている接着剤の研究は，合成高分子系，生体高分子系，複合系の３種に大きく分けることができるが，生体高分子系では，ウイルス感染や不純物の混入などの問題点は未だ解決されていないのが現状である．また，合成高分子系，複合系の接着剤は，研究開発の過程
で接着剤の硬化・分解に関与する低分子の代謝・排泄の過程を追跡することも必要である．さらに，外科医が実際に臨床で使用する場合を想定し，２成分を均一に混合するためのデバイス開発も同時に進めていく必要があると考えられる．

６．謝辞
Fig. 11. 11 Implantation of adhesives at the back of mice after 7 days.
（a）, d）aldehyde-based; b）, e）fibrin-based; c）, f）developed
adhesive（collagen and CAD concentration was 50％ and 100
mM, respectively.）

４．５ クエン酸誘導体を用いた組織接着剤のin vivo における有効性評価 17）マウス皮膚に対する接着剤としての効果を調べるため，切開122

本研究の一部は，NEDO 平成16年度産業技術研究助成事業により行われた．

７．文献
１. Quinn JV Tissue Adhesives in Clinical Medicine Second
Edition , BC Decker Inc., p.27（2005）.
２. Smith DC Biomaterials Science , B. D. Ratner, A. S.
Hoffman, F. J. Schoen, J. E. Lemons, eds., Elsevier
Academic Press, California, p.577（2004）.

人工血液 Vol. 14 , No.4, 2006

３. Ennker J, Ennker IC, Schoon D et al. The impact ofgelatin-resorcinol glue on aortic tissue-A histomorphologyic
evaluation. J Vasc Surg 1994;20:34-43.
４. Ennker J, Ennker IC, Schoon D et al. Formaldehyde-freecollagen glue in experimental lung gluing. Ann Thorac
Surg 1994;57:1622-7.
５. Iwata H, Matsuda S, Mitsuhashi K et al. A novel surgicalglue composed of gelatin and N-hydroxysuccinimide
activated poly（L-glutamic acid）: Part 1. Synthesis ofactivated poly（L-glutamic acid）and its gelation withgelatin. Biomaterials 1998;19:1869-76.
６. Kobayashi H, Sekine T, Nakamura T et al. In vivo
evaluation of a new sealant material on a rat lung air leakmodel. J Biomed Mater Res（Appl Biomater）2001;58:658-65.
７. Wallace DG, Cruise GM, Rhee WM et al. A tissue sealantbased on reactive multifunctional polyethylene glycol. J
Biomed Mater Res（Appl Biomater）2001;58:245-55.
８. Sekine T, Nakamura T, Shimizu Y et al. A new type of
surgical adhesive made from porcine collagen andpolyglutamic acid. J Biomed Mater Res 2001;54:305-10.
９. Nakajima N, Sugai H, Tsutsumi S et al. Self-degradable
Adhesive, Polym Prepr Jpn. 2006;55:1998-1998.
10. 横山昌幸，岡野光夫，西田博他，高分子ミセルを一成分とする外科用接着剤，第25 回日本バイオマテリアル学会大会
予稿集2003;25:212-212.

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 14 , No.4, 2006

11. Sung HW, Huang DM, Chang WH et al. Evaluation ofgelatin hydrogel crosslinked with various crosslinking
agents as bioadhesives: In vitro study. J Biomed Mater
Res 1999;46:520-30.
12. 山本浩之，大川浩作，バイオ接着剤，接着とはく離のための高分子―開発と応用―，シーエムシー出版，監修松本章
一，2006;122-136.
13. Monahan J and Wilker JJ. Specificity of metal ion crosslinking in marine mussel adhesives. Chem Commun
2003;14:1672-3.
14. Saito H, Taguchi T, Kobayashi H et al. Physicochemical
properties of gelatin gels prepared using citric acidderivative. Mater Sci Eng C 2004;24:781-5.
15. Saito H, Taguchi T, Aoki H et al. pH-responsive swelling
behavior of collagen gels prepared by novel crosslinkers
based on naturally-derived di- or tri-carboxylic acids. Acta
Biomater, in press.
16. Taguchi T, Saito H, Uchida Y et al. Bonding of soft tissues
using a novel tissue adhesive consisting of a citric acidderivative and collagen. Mater Sci Eng C 2004;24:775-80.
17. Taguchi T, Saito H, Iwasashi M et al. Development of anovel tissue adhesive consisting of naturally-derived
biomolecules: Citric acid and human serum albumin, J
Nanosci Nanotech 2007;7:742-7.

123

総

説

小動物臨床における輸血の現状と人工赤血球の使用例
Circumstances Regarding Blood Transfusion and Cases Using
Artificial Erythrocyte in Small Animal Clinics
並河和彦（1，2），仲井邦彦（3），横田泉（2），市川陽一郎（4），須永藤子（1），土屋亮（5），岸川正剛（6），小方宗次（2）Kazuhiko Namikawa (1, 2), Kunihiko Nakai (3), Izumi Yokota (2), Yoichiro Ichikawa (4), Fujiko Sunaga (1),
Ryo Tuchiya (5), Seigo Kishikawa (6), Munetugu Ogata (2)

和文抄録
小動物臨床で遭遇する疾患の中で，緊急輸血を必要とする犬の貧血性疾患は多い．しかし現在，小動物領域における血液供給システムは整っていないため，獣医師は院内でドナー犬を飼育したり予めボランティアとして募った一般家庭で飼育している犬から血液を採取して用いており，安全で十分量の輸血用血液を集めるためにはかなりの労力と経費を必要とする．
そこで，人工赤血球が緊急時の輸血用血液の代替物と成り得るかを検討するために，米国で市販されている
hemoglobin-based oxygen-carrying solution（HBOC）と，筆者らが人工赤血球として作成しているpolyethyleneglycolconjugated bovine hemoglobin derivative（PEG-HbBv）を，造血障害と溶血性貧血を示す犬の症例に適応し，院内ドナー
犬から採血した血液を用いて治療した症例の経過と比較した．その結果，基礎疾患が重篤で化学療法が無効であった1症例を除き，HBOCはきわめて有用で輸血と同等の効果を示した．さらに自己凝集を起して輸血の実施が不可能になった犬の貧血症例に，PEG-HbBvを化学療法剤が効果を示すまでの間の酸素運搬体として投与した結果，貧血は回復し症例は順調に快方に向かった．
これらのことから，小動物臨床において人工赤血球は極めて有用な酸素運搬体であることが証明されたので，今後さらに需要は増すものと思われ更なる開発が望まれる．
Abstract
In Japan, veterinarians in small animal clinics encounter a number of anemic diseases that require blood transfusions. The lackof a system in Japan for supplying blood for transfusions in sufficient amounts means that veterinarians are obliged to keepsome donor dogs in their hospitals or ask for voluntary blood donations from dogs kept by member of the general public. The
current situation forces Japanese veterinarians to spend a lot of time and money storing blood with adequate safety measuresand in sufficient amounts.
Hemoglobin-based oxygen-carrying solution（HBOC）manufactured in the USA and polyethyleneglycol-conjugated bovine
hemoglobin derivative（PEG-HbBv）produced on-site as an artificial erythrocyte for dogs with dyserythropoiesis or hemolytic
anemia were administered to 7 dogs to compare HBOC and PEG-HbBv with whole blood in terms of convenience and efficacy.
Consequently, excluding one case which had from the start presented symptoms of severe disease that did not respond tochemical treatment, HBOC demonstrated its usefulness and was shown to have the same effect as whole blood.
In addition, canine anemic cases that were impossible to treat with a blood transfusion owing to the risk of auto-agglutination,（1）麻布大学獣医学部伝染病学研究室，〒229-8501 神奈川県相模原市淵野辺1-17-71

Laboratory of Infectious Diseases, School of Veterinary

School, Azabu University, 1-17-71, Fuchinobe, Sagamihara-shi, Kanagawa 229-8501（2）麻布大学獣医学部附属動物病院，〒229-8501 神奈川県相模原市淵野辺1-17-71（3）東北大学医学系研究科環境保健医学，〒980-8575 宮城県仙台市青葉区星陵町2-1（4）いちかわ動物病院，〒270-0011 千葉県松戸市根木内168-1（5）麻布大学獣医学部内科学第二研究室，〒229-8501 神奈川県相模原市淵野辺1-17-71（6）麻布大学環境保健学部病理学研究室，〒229-8501 神奈川県相模原市淵野辺1-17-71
論文受付 2006年12月１日 論文受理 2007年３月15日

124

人工血液 Vol. 14 , No.4, 2006

were injected with PEG-HbBv as an oxygen-carrying solution until the chemical treatment could take effect and facilitate asuccessful recovery.
The results indicate that further development of the artificial erythrocyte is desirable and increasing demand for this productmay be expected, owing to its usefulness as an oxygen-carrying solution for small animal clinics.
Keywords
PEG-HbBv, HBOC, dog, anemia, treatment, blood transfusion

はじめに
近年，小動物臨床における診療技術の向上と，犬猫の病気に対するオーナーの認識が高まってきたことにより，輸血を必要とする貧血症例に遭遇する機会が多くなってきている1）．
犬猫の貧血性疾患はその原因により，赤芽球癆（pure redcell aplasia ; PRCA），骨髄異形成症候群（myelodysplastic
syndrome ; MDS）
，リンパ腫の骨髄転移や鉄欠乏性貧血などの造血障害によるもの，免疫介在性溶血性貧血（immune mediatedhemolytic anemia ; IMHA）やBabesia gibsoniによる犬のバベシア症（Fig. 1.）およびMycoplasma haemofelisによる猫のヘモプ
ラズマ感染症（Fig. 2.）などの血管内および血管外溶血によるもの，および鉤虫感染症，犬パルボウイルス感染症や播種性血管内凝固症候群（disseminated intravascular coagulation
syndrome ; DIC）などの失血によるものがある．これらの疾患
時には生命維持のための輸血や，診断過程での骨髄穿刺や生検時の麻酔のリスクを減らすための輸血，あるいは治療薬が効果を示すまでの緊急処置としての輸血が必要となる2，3）．
しかし現在，小動物領域における血液供給システムは整っていない．そのため，獣医師は輸血用血液を確保するために院内でドナー動物を飼育したり，ボランティアを募って一般家庭で飼育されている動物から必要時に血液を提供していただき治療に用いている．ドナー動物を飼育する場合には大型種であること，健康であることと感染症フリーであることを確認しなくてはならず，さらに引退後には里親探しまでしなくてはならない
ため，人手と経費の面からも個人病院で実施するのは困難な場合が多い 4）．
さらに輸血実施時における問題点として血液型の適合性の問題がある．犬ではDEA（dog erythrocyte antigen）による分類が一般的で，最も抗原性が強いサブタイプであるDEA1.1の抗原の有無を調べるキット（ラピッドベッド®-H，共立製薬株
式会社）が市販されている．しかし，他のサブタイプのDEA1.2やDEA1.3あるいは他の血液型については調べる事はできないので，輸血を実施する時には，ドナーの赤血球とレシピ
エントの血清の適合性を調べる主試験と，ドナーの血清とレシ
ピエントの赤血球の適合性を調べる副試験からなる交差適合試
験を行う必要がある5）．
猫についてはABシステムとして知られており，同様にキットでA型，B型とAB型に対する抗原の有無を調べることができるが，他の血液型については知る事ができないので，輸血実施
時には交差適合試験を行う必要がある．
以上のように小動物臨床において輸血を実施するためには手間と経費がかかり，さらに実施時には煩雑な操作を必要とする．
そこで今回は，小動物臨床領域において輸血を実施する機会が最も多いと思われる犬の貧血性疾患の中で全血輸血を行った
症例，人工赤血球として米国で獣医師向けに市販されている
hemoglobin-based oxygen-carrying solution（HBOC）（ O x y g l o b i n ®） を 投 与 し た 症 例 と ， 筆 者 ら が 作 成 し た
polyethyleneglycol-conjugated bovine hemoglobin derivative（PEG-HbBv）を治療に用いた臨症例の使用経験を紹介し，小動物臨床における人工赤血球の今後の展望について考察する．

Fig. 1. Peripheral blood from a dog infected with Babesia gibsoni. Twoparasites are seen in this field.

Fig. 2. Peripheral blood from a cat infected with Mycoplasma haemofelis.
Three organisms are seen in this field（arrows）.

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 14 , No.4, 2006125

１．輸血適用症例（Table 1.）
Table 1. Hematological findings of the cases administered with whole
blood
Case 1Case 3
Malignant lymphoma

0

63

0

6

0

Treatment Initiation
RBC（×104/μl）

96

608

237

511

111

Hb
（g/dl）

2.3

15.6

5.8

12.6

3.3

Ht（％）

6.8

47.5

17.4

39.8

9.7

MCV
（fl）
MCH
（pg）

70.8
24.0

78.1
25.7

73.4
24.5

77.9
24.6

87.1
30.0

MCHC
（g/dl）

33.8

32.8

33.3

31.5

34.0

Ret（％）

0

−

9.6

10.4

Blood transfusion

200ml
Recovery

Outcome

PRCA

Case 2
IMHA

Diagnosis
Days Following

200ml
Recovery

7

−
160ml
Death

供血用のドナー犬を飼育するためには，十分な居住空間を確保し，常時新鮮な水と蛋白質や鉄分に富んだ高品質の食事を与えなくてはならず，健康診断と犬ジステンパーやパルボウイル
ス感染症などに対するワクチン接種およびバベシア症の検査などを定期的に行わなくてはならないため，かなりの経費と労力を必要とする．筆者が所属している麻布大学獣医学部附属動物
病院ではこれらの条件を遵守しドナー犬を管理している．ここではこれらのドナー犬から採取した輸血用血液を用いて治療した３症例について紹介する．
症例１は７歳９ヵ月，体重10kg，雌のウェルシュコーギーで，２週間前から元気消失，食欲減退がみられ，血液検査で貧血を指摘され本病院に来院した．初診時の血液検査で赤血球数96×104/μl，Hb量2.3g/dl，Ht値6.8％と重度の貧血を示していたが，網状赤血球がまったく見られなかったので赤血球の低形成を疑い全身麻酔下で骨髄穿刺を行った．その結果，骨髄球および巨核球系には異常は見られなかったが赤血球の低形成が顕著であったことからPRCAと診断され，発症時がすでに成犬に達し急激に見られたことから後天性で特発性と考えられた．そこでプ
レドニゾロン２mg/kg/dayを投薬するとともに，ドナー犬と交差適合試験によって得た血液200mlを輸血した．その後赤血球数の増加とともに経過は良好に推移し，63日目には赤血球数608×104/μl，Hb量15.6g/dl，Ht値47.5％まで回復し維持している．
症例２は13歳，体重12kg，雄のビーグルで，２週間前から元
気食欲が落ち，血液検査によって貧血が確認された．本病院での血液検査所見は赤血球数237×10 4/μl，Hb量5.8g/dl，Ht値
17.4％であり，血液塗抹所見では幼若赤血球の出現は微弱であったが，球状赤血球（Fig. 3.A；矢印）が多数見られ，クーム
ス試験が陽性を示したのでIMHAと診断された．そこで抗体産生の抑制，補体の活性化阻止とマクロファージによる赤血球の貪食阻止を目的としてプレドニゾロンとシクロフォスファミドを処方し，輸血を行った．その結果，6日後には網状赤血球数の増加がみられ（Fig. 3.B；矢印），赤血球数は511×10 4/μl，Hb量12.6g/dl，Ht値39.8％まで回復していた．
症例３は６歳，体重８kg，避妊済み雌，キャバリアで，約１年前に下顎，浅頸，鼠徑，膝下リンパ節など体表リンパ節の腫脹がみられ，リンパ節の針穿刺塗抹標本の所見から多中心型の悪性リンパ腫，ステージ５と診断された症例である．治療は導入薬としてL-アスパラギナーゼとプレドニゾロンを用い，その後シクロフォスファミド，プレドニゾロンとビンクリスチンの多剤併用療法によって，約１年間の緩解期間が得られていた．
しかし，１年経過した時点で容態が急変したので血液検査を実施した結果，赤血球数111×104/μl，Hb量3.3g/dl，Ht値9.7％と重度の貧血を示したことから，腫瘍細胞の骨髄転移が考えられた．そこで化学療法に160mlの輸血を追加して治療したが，明らかな貧血の回復がみられないまま７日後に死亡した．
以上のことから，症例１と症例２では輸血で貧血が改善している間に化学療法に対する反応がみられたので回復に向かわせることができたが，症例３では基礎疾患が末期状態の悪性リンパ腫であったので，全血輸血による治療効果がみられず回復させることはできなかった．

Fig. 3. A blood smear from case 2 with immune-mediated haemolytic anaemia.
A ; Note the marked anisocytosis due to a mixed population of small spherocytes（arrows）and large, immature,and normal RBCs.（Wright-Giemsa stain, original magnification 1,000X）
B ; Three reticulocytes（arrows）are seen in this field.（NMB stain, original magnification 1,000X）

126

人工血液 Vol. 14 , No.4, 2006

２．わが国におけるHBOCの臨床使用例（Table 2.）
Table 2. Hematological findings of the cases administered with HBOC
Case 4

Case 5

Case 6

IMHA

IMHA
0
2

Renal failure04120 （27）

205

207

298

4.3

5.3

8.9

6.4

10.7 4.3
89.2 （159）

17.6
85.9

19.4
93.7

20.5
68.8

MCH
（pg）

35.8 （233）

25.8

43.0

21.5

MCHC
（g/dl）

40.2 （147）

30.1

45.9

31.2

HBOC

125ml
Recovery

125ml
RecoveryDiagnosis
Days Following

0

Treatment Initiation
RBC（×104/μl）
Hb（g/dl）
Ht（％）
MCV
（fl）

Outcome

2

6.3

125ml
Death

行った．その後一旦貧血は回復したが４ヵ月後再び貧血が顕著になり赤血球数298×104/μl，Hb量6.4g/dl，Ht値20.5％と低値を示していたので輸血を行おうとしたがドナーが見つからなかったためHBOCを投与した．しかしBUNは76.8mg/dlとさらに上昇し，一般状態の改善も見られないまま4日後に斃死した．
以上のことから，HBOCは症例６の様に基礎疾患が改善しない場合には無効になるが，化学療法に対する反応がみられる症例に対しては輸血と同様に用いることができる極めて有用な治療薬であると思われた．

３．PEG-HbBvの臨床使用例（Table 3.）
Table 3. Hematological findings of the case administered with PEG-HbBv
Case 7

貧血を示している症例の中で，輸血用血液が入手できなかったり，ドナーとの交差適合反応が合わない犬に遭遇した場合，
あるいはオーナーが輸血を拒否した場合には輸血ができなくな
る．そのような場合に緊急避難的にHBOCを用いる事ができる．
米国ではHBOCとして，牛の赤血球を溶血させて得られた
Hb分子間をglutaraldehydeで重合しポリマーとした
Oxyglobin ®が獣医師向けに市販されている．本剤は１パック
Hb濃度13g/dlで125ml入っているので16.25gのHbを供給することができるが，日本では一般に販売されていないため容易に入手することはできない．今回は個人輸入によって購入した本剤をオーナーの了解を得て適応した症例について紹介する．
症例４．ポメラニアン，雌，４歳，2.1kg，前日よりふらつき，元気消失，食欲低下，下痢がみられ，陰部に血色素尿の付着が見られた．血液検査所見では赤血球数120×104/μl，Hb量
4.3g/dl，Ht値10.7％と重度の貧血が見られ，血液検査所見で多染性赤血球が見られたが，球状赤血球が散見されたのでIMHAと仮診断した．治療方針としてプレドニゾロンとシクロスポリンを併用するとともに貧血を緩和するための輸血が必要であったが，自己凝集が顕著に起きていたことと，オーナーが輸血の危険性を危惧したことからHBOCを使用した．２日後症例は一時的に赤血球数とHt値が相対的な減少を示していたがHb量は増加し，10日目には赤血球数の増加も見られ21日目には退院できるまでに回復した．HBOCの投与による副作用と思われる所
見は見られなかった．
症例５．シーズー，雌，12歳，6.1kg，振戦と赤色尿を主訴とし，血液検査にて重度の貧血が確認された．血液塗抹で大小不同症と球状赤血球を多数認めたのでIMHAと診断し，プレド
ニゾロンとシクロスポリンの治療を開始し，同時にHBOCを投与した．その後５ヵ月の継続治療により良好に回復し，治療を終了することができた．
症例６．雑種，避妊済み雌，17歳，10kg，元気消失，食欲廃絶にて来院し，精査したところBUNの上昇（61.7mg/dl），
ALTの上昇（126IU/L），心雑音聴取，乳腺に多数の腫瘤を認めた．本症例は高齢であること，BUNの上昇と貧血および血液塗抹所見から多染性赤血球などの幼若赤血球が見られなかったことから慢性腎不全による非再生性貧血と診断し全血輸血をARTIFICIAL BLOOD Vol. 14 , No.4, 2006

Diagnosis
Day Following
Treatment Initiation
RBC（×104/μl）
Hb（g/dl）
Ht（％）
MCV
（fl）
MCH
（pg）
MCHC
（g/dl）
Ret（％）
Blood transfusion
PEG-HbBv
Outcome

PRCA
0
104
2.7
8.0
76.9
26.0
33.8
0.8
160ml

3

10

14

28

88

299
7.3
21.5
71.9
24.4
34.0
−

155
5.4
13.6
87.7
28.1
39.7
14.4

245
7.6
24.2
98.8
31.0
31.4
39

498
13.7
41.5
83.3
27.5
33.0
24

679
16.1
47.3
69.7
23.7
34.0
4.4

170ml
Recovery

症例７：ウェルッシュコーギー，雄，３歳８ヵ月，体重8.15kg，
屋内飼育，来院２ヵ月前から後肢がふらつき，血液検査で貧血を指摘され当院受診となった．平成18年７月25日の初診時の血液検査では赤血球数104×104/μl，Hb量2.7g/dl，Ht値8.0％と重度の貧血を示していたが，血液塗抹Wright-Giemsa染色標本では幼若赤血球がみられず成熟赤血球がまばらに塗抹され（Fig.
4.A），網状赤血球の増加がほとんど見られなかった．そこで状態を改善させるために全血輸血160mlを行った後，全身麻酔下で骨髄穿刺を行った結果，骨髄球および巨核球系には異常は見られなかったが赤血球の低形成が顕著であったことからPRCAと診断され，プレドニゾロン3.75mg/kg/dayとシクロスポリン
6.2mg/kg/dayを投薬した．その結果３日後には赤血球数299×
10 4/μlと一旦貧血が改善されたが，10日後には再び赤血球数155×104/μlまで減少し，さらに自己凝集が発現して他の犬からの輸血が不可能となった．そこで，オーナーへのインフォー
ムドコンセントを得た後，筆者らが作成したPEG-HbBv（Hb
量7.0g/dl）170mlを，５ml/kg/hrの速さで点滴静注した．投与
中症例の様子に異常所見は見られなかった（Fig. 5.）．その後，化学療法の効果が発現し貧血は順調な回復を示して多染性赤血球の増加が見られ（Fig. 4.B）
，28日目には赤血球数498×104/μlまで回復し，88日目には赤血球数679×104/μl，Hb量16.1g/dl，
Ht値47.3％と正常値を示すまでに至った．
以上のことから，PEG-HbBvは化学療法に対する反応がみられるまでの間，輸血の代替物として緊急避難的に用いることができる極めて有用な治療薬であると思われた．

127

Fig. 4. A blood smear from case 7 with pure red cell aplasia.
A ; Immature RBCs are not seen in this field.
B ; Blood smear of case 7 taken on the 6th day following treatment initiation. Almost all RBCs are enlarged anda few polychromatophils are seen in this field.
（Wright-Giemsa stain, original magnification 1,000X）

Fig. 5. Dog（case 7）administered with PEG-HbBv

４．まとめ
日常の小動物臨床において，造血障害や溶血による犬の貧血性疾患に遭遇することは多い．これらの疾患では化学療法による治療が行われるが，重度の貧血を示していたり，診断のために全身麻酔をかけるときには輸血が必要になる．しかし小動物
臨床における輸血用血液の供給システムは整っていないため，
必要時に十分量の輸血用血液を入手することは困難なことが多く，さらに自己凝集が起きて輸血不可能になる場合もある．
HBOCはこのような輸血用血液の入手ができない場合に用いることができる人工酸素運搬体であり，米国ではOxyglobin®として獣医師向けに市販されている6，7）．HBOCを用いた最初の報告 8）は消化管内寄生虫である鉤虫と外部寄生虫であるノミによって重度の貧血を示した犬４頭に駆虫薬とともに用いたもので，
HBOCを用いることにより症例は全て治癒したと述べている．
その後本剤の有用性が認識されるようになり治療報告も多くみられるようになったが，いずれも基礎疾患に対する治療の効果128が奏効するまで貧血を一時的に改善させる目的で，全血輸血の代替物として使用している．しかしながらHBOCは赤血球膜を除去しているので交差適合試験をする必要がなく，輸血による感染の危険もない．さらに長期保存ができるので必要時に必要量を用いることができることから有用であると同時に，輸血の危険性を危惧するオーナーに対しても受け入れられる治療薬であると思われる．
このように米国で市販されているOxyglobin®は有用なHBOC
であるが，ヘモグロビン分子をglutaraldehydeで重合しポリマ
ーとしているので反応系の制御が困難で重合に伴う新たな抗原性の生成の可能性があり，再発の可能性がある貧血性疾患の治療に繰り返し使用するには危険があるのかもしれない 9）．そこ
で筆者らは，免疫を抑制する作用を有するpolyethyleneglycol 10）で牛ヘモグロビンをコンジュゲイトしたPEG-HbBvを作成し11）
臨床例に用いたところ良好な結果が得られた．このことから，治療が長期にわたったり，再発の危険性がある症例に対しては人工血液 Vol. 14 , No.4, 2006

PEG-HbBvが有用であると考えている．
以上の事例から，小動物臨床における人工赤血球の需要は今後さらに高まるものと思われるが，わが国では使用経験のある獣医師が少ないため人工赤血球に対する認識が低く，また高価であることも事実であるので，今後基礎実験と臨床治験例でのデータを集積して人工赤血球の利便性と有効性を実証すると同時に，単価を下げる手立てを考えることも人工赤血球の需要に応じるためには必要なことと考える．

謝辞
PEG-HbBvの作成に際し，polyethyleneglycolを提供していただきました日本油脂㈱DDS事業開発部の杉中徳恭氏に深謝致します．

文献
１. Callan MB, Oakley DA, Shofer FS, Giger U. Canine red
blood cell transfusion practice. J Am Anim Hosp Assoc
1996;32:303-311.
２. Callan MB, Rentko VT. Clinical application of ahemoglobin-based oxygen-carrying solution. Vet Clin Small
Anim 2003;33:1277-1293.
３. Haldane S, Roberts J, Marks SL, Raffe MR. Transfusion
medicine. Compend Contin Educ Pract Vet 2004;26:502-

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 14 , No.4, 2006

518.
４. 佐々木伸雄． 小 動 物 の 外 科 手 術 と 輸 血 療 法 ． 人 工 血 液
1994;2:74-76．
５. 江島博康．小動物血液型システムと輸血の現状．人工血液
1994;2:47-51．
６. Gibson GR, Callan MB, Hoffman V, Giger U. Use of ahemoglobin-based oxygen-carrying solution in cats:72
cases（1998-2000）. J Am Vet Med Assoc 2002;221:96-102.
７. Day MJ. Antigen specificity in canine autoimmune
haemolytic anaemia. Vet Immunol Immunopathol. 1999;69:
215-224.
８. Giger U, Griot M, Rosenzweig M, Macintire D. Purified
hemoglobin as a blood substitute in the treatment ofparasite-induced anemia in dogs [abstract]. J Vet Intern
Med 1991;5:140.
９. 関口定美，仲井邦彦．人工血液の開発と臨床応用．日本輸血学会雑誌 1995;41:131-138.
10. Levy Y, Hershfield MS, Fernandez-Mejia C, Polmar SH,
Scudiery D, Berger M, Sorensen RU. J Pediatrics 1988;113:
312-317.
11. 仲井邦彦，小林由稀，高橋恒夫，関口定美．Polyethyleneglycol
修飾ウシヘモグロビン誘導体の開発．人工臓器 1996;25:490493．

129

二次投稿論文

ハムスター皮下の細動脈血流を一過性に遮断するモデルを用いた
P50値が異なるHb小胞体の酸素放出挙動†
Oxygen Release from Low and Normal P50 Hb-Vesicles in Transiently Occluded Arteriolesof the Hamster Window Model.
酒井宏水（1）*，ペドロ カブラレス（2，3），エミ G. ツァイ（2，3），土田英俊（1），マルコス インタリエッタ（2，3）
Hiromi Sakai（1）, Pedro Cabrales（2，3）, Amy G. Tsai（2，3）, Eishun Tsuchida（1）*, and Marcos Intaglietta（2，3）

要旨Hb溶液を内包したリン脂質小胞体（Hb小胞体，HbV）が輸血代替として開発されている．HbVの特徴の一つに，Hbの酸素親和度（P 50値）をアロステリック因子であるピリドキサル
5 -リン酸の内包量によって容易に調節できることがある．本研
究では，P50値が異なる二つのHbVを調製し（８，29 mmHg，それぞれHbV8，HbV29），ハムスター皮下微小循環観測モデル（Hamster window chamber model）を用い，細動脈の血流を遮断した直後の酸素放出挙動について観察した．無麻酔条件下，
ハムスターにHbV8或はHbV29を７mL/kg投与した．顕微鏡観察
下に，マニピュレータに固定した硝子製ピペットを用い，細動脈（内径53.0 ± 6.6 μm）の血流を経皮的に遮断し，100μm下流の細動脈内酸素分圧（pO2）の低下する様子を，予め投与したPd-ポルフィリンの燐光解消から追跡した．ベースラインの細動脈pO（50- 52 mmHg）は５mmHgまで低下した．HbV8投2
与後の血流遮断では，HbV 29に比較して僅か乍らpO 2の低下に遅れがあった．pO2値と酸素結合解離曲線をもとに細動脈内酸
素含量を解析したところ，HbV29に比較してHbV8が有意に遅い
酸素放出を示し，投与量が少ないにも拘らず，pO2が低下した場合（例えば 10 mmHg以下）では赤血球を上回る酸素供給源（全体の55％以上）になることが明らかになった．この結果は，Hbを用いる人工酸素運搬体のP50値を小さく設定することにより，虚血性疾患の治療に利用できる可能性を示している．
キーワード：血液代替物／人工赤血球／血流遮断／微小循環動態／リポソーム

緒

言

高濃度のヒトヘモグロビン溶液（Hb）を内包したHb小胞体（HbV），或はリポソーム内包Hb（LEH）は，その酸素運搬機能が赤血球と同等に調節でき，輸血代替として利用できうる1，5，8，16，24，30）．
HbV（粒子径約250 nm）の細胞構造は，赤血球（RBCs）の構
造と同様の特徴を有している．Hb溶液が血液成分や血管内皮と直接的に接触することを防止し，Hb分子に起因する様々な
酸化的細胞障害を抑制する 4，38）．また，内因性血管弛緩因子であるNOやCOをHbが捕捉することによって生起する血圧亢進
は，小胞体にHbを内包することによって防止できる 12，18，26）．
HbVの安全性については，主にげっ歯類を用いた実験により検討され，例えば細網内皮系における速やかな代謝が組織病理学
的，血液生化学的解析から明らかにされつつある28，29）．
細胞型HbVの特徴の一つに，酸素親和度（P50値，Hbが酸素で50％飽和するときの酸素分圧）が，HbVに内包するアロステ
リック因子の量によって調節できることがある．架橋型Hbや重合型Hb など化学修飾したHb溶液では，そのP50値は修飾状態で決定されるのに対し，HbVでは酸素運搬機能の調節が自在にできる利点を有する34）．我々はアロステリック因子としてピリドキサル 5 -リン酸（PLP）を使用している33，45）．PLPをHbに対し2.5倍モル添加すると，P50値は約29 mmHgになる．PLPを添加しないと，P 50値は約８mmHgになる．歴史的にみても人工酸素運搬体のP50値は赤血球の値 25 - 30 mmHgと同等の値に調節され，論理的には微小循環系を流動する際に十分な酸素を放出すると考えられてきた．酸素親和度を下げる（P50値を上げる）と，末梢組織での酸素放出が増大する．例えば，高P50値の赤血（1）早稲田大学理工学研究所、（2）カリフォルニア大学サンディエゴ校 生体工学部、（3）ラ ホヤ生体工学研究所（1）Advanced Research Institute for Science and Engineering, Waseda University;（2）Department of Bioengineering, University ofCalifornia, San Diego; and（3）La Jolla Bioengineering Institute.
†本論文は，American Physiological Societyの許可のもと，American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology第288巻 H2897

頁-H2903頁，2005年に最初に掲載された論文に基づき和文として作製したものである．
C 2005 the American Physiological Society, Am J Physiol Heart Circ Physiol 288（6）0363-6135/05 $8.00 Copyright ○* 連絡先 酒井 宏水: 〒169-8555 東京都新宿区大久保3-4-1 早稲田大学 理工学研究所 酸素輸液プロジェクト
論文受付 2006年12月１日 論文受理 2007年３月15日

130

人工血液 Vol. 14 , No.4, 2006

球を有するミュータントマウスは，酸素放出が促進され，運動機能が高くなることが報告された36）．
HbVも含め，Hb利用酸素運搬体（Hemoglobin-based O 2
carrier : HBOC）の粒子径は，虚血性組織の酸素化に有効であると期待されている 6，43）．粒子径が小さいと，赤血球が通過できないような血管の狭窄部位，或は部分的に遮断された血管も通過できると考えられているからである19）．このような状況の血管や，側副血管などは通常，血流が遅く，血液の通過時間も長くなり7，11），結果的に組織酸素分圧（pO2）は低く，また赤血
球は毛細血管に到達する前に殆どの酸素を放出してしまう．例
えば，pO2が５mmHg以下の低酸素組織では，赤血球の酸素飽
和度は約５％程度となり，低酸素領域に到達する前に95％の酸素を放出してしまう．従って，赤血球と同等の通常のP50値を有するHBOCでは，虚血領域に酸素を効率よく運搬するには効果的では無いと考えられる．
本研究で我々は，P50の高いHbVと低いHbVについて，細動脈を一時的に遮断したときの酸素放出速度について検討を行った．細動脈は内径約50μmのものを選んだ．それは，この程度の細動脈が組織酸素化に大きく関与しているからである13）．本
研究では，低酸素領域でのHbVの酸素放出，或は酸素保持の効果を明らかにし，虚血組織の酸素化の可能性について検討することを目的とした．

方法

HbVの調製
P 50値の異なる二種類のHbVは無菌的条件下，既報に従って調製した32，34，37）．Hb溶液は，日本赤十字社（東京）から提供を受けた期限切れ非使用赤血球から精製した．HbV 29（P 50 = 29mmHg）は，アロステリック因子として14.7 mMのピリドキサ
ル 5 -リン酸（PLP，シグマ，St. Louis）を 38 g/dLのHb溶液にモル比でPLP/Hb = 2.5になるように添加して調製した．
HbV（P8
50 =８mmHg）は，Hb溶液にアロステリック因子を添加せずに調製した．HbVの脂質成分は，Presome PPG-I［ amixture of 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine,
cholesterol，および 1,5-di-O-octadecyl-N-succinyl-L-glutamate
がモル比で５/５/１の割合で混合されたもの（日本精化，大阪）］から構成される．HbVの粒径はエクストルージョン法によって調節した．粒子表面は，0.3 mol％の1,2-distearoyl-sn-glycero-3phosphatidylethanolamine-N-poly（ethylene glycol）（Sunbright
DSPE-50H, H-form, NOF Co., Tokyo, Japan）により，ポリエ
チレングリコールで修飾した．HbVは生理食塩水に分散，フィ
ルター滅菌し（Dismic，東洋濾紙: 0.45μm），窒素通気により酸素を除去して保存した．残存エンドトトキシンは，LAL変法
により0.2 EU/mL以下であることを確認した27）．HbV29およびHbV8の酸素結合解離曲線は，ヘモックスアナライザー（TCSMedical Products, Philadelphia）により測定した（Fig. 1.）．物
理化学的特徴はTable 1.にまとめた．

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 14 , No.4, 2006

Fig. 1. Oxygen equilibrium curves（OECs）of HbV8 and HbV29 measured
with a Hemox Analyzer（TCS Medical Products）at 37 ℃ incomparison with hamster blood.（Cited from: Sakai et al., Am J
Physiol Heart Circ Physiol 2005;288:H2897-H2903）

Table 1. Physicochemical properties of HbV8 and HbV29 in comparison
with hamster blood（Cited from: Sakai et al., Am J Physiol Heart
Circ Physiol 2005;288:H2897-H2903）
parameters

HbV8

HbV29

hamsterblood

Hb concentration（g/dL）

10

10

particle diameter（nm）

250 ± 64247 ± 44

5000 - 7000＊

P50（mmHg）

8

29

28

Molar ratio of PLP to Hb

0

2.5

-

MetHb（％）

<3

<1

-

HbCO（％）<2<2-

14.8 ± 0.5＊

size of hamster RBC（Ref. 39）.

動物実験方法12匹の雄性シリアンゴールデンハムスター（体重59 ± 12 g,
Charles Rivers, Worcester, Mass.）を使用した．ペントバルビ
ツールナトリウムを腹腔内投与（ca. 50 mg/kg b.w., Abbott
Lab., North Chicago, IL）して麻酔状態とした．背中の皮膚の毛を剃り，摘まみ上げて片側の皮膚と筋肉層を約15mm径の円形に切り抜き，12 mm径のカバーグラスの窓枠の付いたチタン製フレームを装着させた．このカバーグラスを通して，皮下微小循環系の顕微鏡観察を行った20，22，25）．
ポ リ エ チ レ ン 製 チ ュ ー ブ （ PE-10, Becton Dickinson,
Parsippany, NJ，約１cm）とPE-50（約25 cm）をシリコンチ
ューブ（約４cm，Technical Products, Inc., Decatur, GA）で結合し，頸動脈，頸静脈にカテーテルとして挿入した．これらを内頸から背部皮膚を経由して体外に引出し，チタン製フレー
ムに固定した．カテーテルはヘパリン添加生理食塩水（40IU/mL）で満たした．外科的侵襲の影響を低減するため窓131

枠取付けの操作から５日後に微小循環観測を行った．ハムスタ
ーを多孔性プラスチックチューブに入れ，チタン製の窓枠はチ
ューブの外に出るよう固定し，無麻酔ハムスターの呼吸を維持しつつ，体位変化の影響を極力小さくする工夫をした．本動物
実験は，カリフォルニア大学サンディエゴ校の動物実験委員会の承認を得た．また，実験動物の管理と使用に関するガイドラ
イン Institute of Laboratory Animal Resources Commission
on Life Sciences, National Research Council-National
Academy of Sciences（Washington: National Academy Press,
1996） に従った．
HbV8およびHbV29の投与と，細動脈血流の遮断
無麻酔ハムスターを多孔性プラスチックチューブに入れ，顕微鏡のステージに設置し安定するまで待った．システミックパ
ラメータが基準範囲内のハムスターのみ実験に用いた（心拍数> 340 bpm，平均動脈圧 > 80 mmHg，ヘマトクリット > 45％，
動脈血酸素分圧 > 50 mmHg，顕微鏡視野で微小循環系に浮腫や出血が無いこと）．ベースラインの微小循環系の各パラメー
タおよびpO2（後述）の測定は，HbV8或はHbV29を静脈内投与（７mL/kg）する前に行った．循環血液量は70 mL/kgと仮定した．
我々の以前の論文では，出血性ショック蘇生や血液希釈の際にHbVはアルブミン溶液に分散させて膠質浸透圧を調節した30，33）．
しかし本実験では，負荷投与になるので，循環血液量の増大を回避するためアルブミンを併用しなかった．また同様の理由により，投与量は循環血液量の10％に留めた（７mL/kg）．
ハムスターの状態が安定しシステミックパラメータを測定した後，細動脈径と血流速度を測定した．細動脈としては，
Large feeding arterioles 或は small arcading arterioles（53.0± 6.6μm径 ） を 選 択 し た ． ガ ラ ス 製 マ イ ク ロ ピ ペ ッ ト を
pipette pullerで細くし，炎で熱して湾曲させた細管を準備し（Fig. 2.），この細管の湾曲した部位で皮膚内の細動脈の血流を遮断させる操作を，反対側から顕微鏡で微小循環系を観察し，位置を確認し乍ら行った．遮断時間は30秒とした．
微小循環動態の計測
微小血管系は，透過型倒立顕微鏡（IMT-2，オリンパス）により観察した．画像の観察，録画には，Cohu 4815-2000（SanDiego），TV-VCR（Sony Trinitron PVM-1271Q monitor,
Tokyo），Panasonic AG-7355 recorder（Tokyo）を使用した．
既報に従い細動脈を選定し33），血流遮断前の血管径と赤血球流速は，on-line観察した14，15）．血管径は，画像剪断法を（DigitalVideo Image Shearing Monitor 908, I.P.M. Inc., San Diego,
CA），また赤血球流速はフォトダイオード相関法を用いた（Velocity Tracker Mod-102 B, I.P.M. Inc.）．血流速度Qは，式（Ⅰ）により求めた．
Q =（赤血球流速/Rv）×（血管径/2）2（Ⅰ）

132

Fig. 2.（a）Microscopic image of an occluded arteriole in the hamster
window chamber. The glass fiber lies across the arteriole. Scalebar, 100μm.（ b）Schematic representation of occlusion of（ a）
showing the different tissue layers of the skin（Not to scale）.
（Cited from: Sakai et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol
2005;288:H2897-H2903）

ここで，既報20）に従い，中心流速と平均流速の比Rvに1.6を用いた．
パラジウムポルフィリンが結合した牛アルブミン溶液（7.6
wt％, 0.1 ml）を，HbV投与20分前に投与した．細動脈内pO2は，パルス光照射でパラジウムポルフィリンから生起する燐光寿命から測定する非侵襲的手法を採用した．この燐光寿命は，局所的な酸素濃度の関数となる 17，40，44）．燐光寿命とpO 2 の関係は，
Stern-Volmer式（Ⅱ）として表される．
τo /τ = 1+ kq × τo × pO2（Ⅱ）

ここでτo とτはそれぞれ，無酸素状態（pO2 = 0 mmHg），測定pO2値のときの燐光寿命を示す．kqはpHと温度に依存する定数である．励起光は20 × 5μmの窓枠を介して血管上に照射した．１秒おきのフラッシュ照射ごとにpO2を測定した．
血流遮断により観測される酸素分圧の減衰曲線は，先ずHbV
投与前に測定し，その20分後HbVを投与して測定した．各pO2値におけるHbVの酸素飽和度は，酸素結合解離曲線から求め（Fig. 1.），血液１dL当たりの総酸素含量（mL O2）は（Ⅲ）式
によって見積もることができる．

人工血液 Vol. 14 , No.4, 2006

［SaO（RBC）+ 0.0667×SaO（HbV）
］
pO2
2
2
酸素含量= 23.6×+ 2.42×
（Ⅲ）
100
713

この式で，平均的な動脈血Hb濃度として15 g/dL とした（14.8± 0.5 g/dL，ヘム濃度 9.3 mM，B-Hemoglobin Photometerにより測定，Hemocue, Sweden）．酸素飽和度（SaO2）が100％のとき，100 mLの血液には23.6 mLのO2がHbに結合（37 ℃の理想気体）していることがBoyle-Charle's の法則: PV = nRTから計算できる．ここで，P（atm）は大気圧，V（L）はガス容
量，nはモル数，Rはガス定数（0.082 atm・L/K/mol），T は絶対温度である［23.6（mL）= 9.3 × 10-4（mol）× 0.082 ×（273 + 37）
× 1000］．物理的溶解した酸素含量は，１atm O（713mmHg，
2
水蒸気圧47 mmHgを差引いた値），37 ℃のとき2.42 mLとなる．
SaO（RBC）およびSaO（HbV）は，それぞれ細動脈内の酸素22分圧に対応したRBCとHbVの酸素飽和度である．

Table 2. Profiles of arterioles for occlusion before and after infusion of
HbVs. Arteriolar pO2, SaO2, and O2 contents were obtained
during 6 sec prior to occlusion. Mean ± SD. #p < 0.05 vs. RBC
and HbV29 ; ＊p < 0.05 vs. before infusion.（Cited from: Sakai et al.,Am J Physiol Heart Circ Physiol 2005;288:H2897-H2903）
parameters

beforeAfter HbV infusion

infusion

HbV8

HbV29

53.0 ± 6.6

56.2 ± 6.8

55.8 ± 6.9

Centerline flow velocity（mm/sec） 3.1 ± 0.5

3.4 ± 0.7

3.5 ± 0.5

Blood flow rate（nL/sec）

6.8 ± 1.6

8.7 ± 3.1

8.5 ± 2.1

Arteriolar pO2（mmHg）

50.7 ± 4.7

51.4 ± 4.8

52.1 ± 5.3（％）
SaO2（RBC）

78.1 ± 5.1

76.0 ± 7.7

77.9 ± 6.5（％）
SaO2（HbV）−

95.9 ± 0.6#

79.6 ± 4.7

O2 content in whole blood

18.61 ± 1.23

20.30 ± 1.18＊

20.17 ± 1.54＊−

1.51 ± 0.01

1.25 ± 0.07

Arteriolar diameter（μm）（mL O2 / dL blood）
O2 content in HbV（mL O2 / dL blood）

HbVは生理食塩水に分散してあり（［Hb］= 10 g/dL），負荷
投与後に血液の膠質浸透圧が低下し，水分が血管外に漏出することになる．これを考慮し，HbV投与後20分待って計測を行った．この時間によって，過剰の水分が血管内から組織に移行し，循環血液量が一定になり，血中のHb濃度が6.7％上昇するものと仮定した．

数値解析
数値は，平均±標準偏差として示した．統計解析は，群間比
較では分散分析（ANOVA）と Fisher's protected leastsignificant difference（PLSD）を用いた．Student's t-testは各群のベースラインとの比較に用いた．全ての計算はGraphPad
Prism 4.01（Graph Pad Software, Inc., San Diego, CA）を用いた．p < 0.05のとき有意差とみなした．

結果細動脈の血行動態
選択した細動脈の血管径，中心の赤血球流速，血流速度，および血管内pO2について，HbV投与前後についての値をTable 2.
にまとめた．群間に有意差は無かった．各pO2値におけるハム
スター赤血球に結合した酸素と物理的溶解した酸素の総量は，
式（Ⅲ）より18.61 ± 1.23 mL O2 / dLと計算できる．HbV8或はHbV29の投与後，酸素含量は，それぞれ，20.30 ± 1.18および20.17 ± 1.54 mL O2 /dLに増大する．HbV8およびHbV29の寄与は，それぞれ1.51 ± 0.01および1.25 ± 0.07 mL O2/dLである．
SaO（HbV28）は95.9 ± 0.6％であり，SaO（HbV229）の79.6 ±
4.7％に比較して高いため，HbV8投与群は HbV29投与群に比較して高い酸素含量を示した．
HbV投与後に血流遮断したときの細動脈内pO2の変化
血流を遮断する前の細動脈内pO2は，平均的に50 - 52 mmHgであったが，Fig. 3.に示すように，血流遮断とともに急激に低下した．全群において，遮断開始10秒，30秒で，pO2はそれぞ

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 14 , No.4, 2006

Fig. 3. Time course of the pO 2 in the blood of an occluded arteriole（diameter, 53.0 ± 6.6μm）before and after infusion of 7 mL/kg
HbV8 or HbV29 into hamsters. Measurements were made in blood
at a distance of 50μm from the point of occlusion. Most vessels
equilibrate to intravascular partial pressure in the range of 4-6
mmHg about 15-20 seconds after occlusion.
（Cited from: Sakai etal., Am J Physiol Heart Circ Physiol 2005;288:H2897-H2903）

133

れ10，５mmHgにまで低下した．pO2値の変化をベースライン
値（血流遮断前）に対する比として表すと，HbV29の投与或は何も投与せずに血流遮断したときに比較して，HbV8を投与して血流遮断した方がpO2値の低下が遅くなる傾向が認められた（Fig. 4.）
．HbV8投与群と無投与群では，７秒後のみに有意差が認められた（ p = 0.035）．

Fig. 4. Changes in pO2 relative to before occlusion. The data in Figure 3
were averaged. Baseline values before occlusion was obtained as
the average of six values before occlusion, and fixed as 1.0. There
was a significant difference between the HbV8 infusion and before
infusion groups only at 7 sec（p = 0.035）（Cited.
from: Sakai et al.,Am J Physiol Heart Circ Physiol 2005;288:H2897-H2903）

各pO2値におけるSaO（RBC）およびSaO（HbV）の変化は，
22細動脈内の温度やpHが通常の条件（37 ℃，pH = 7.4）から大きく逸脱しないことを仮定し酸素結合解離曲線（Fig. 1.）から算出した．Fig. 5.aに血流を遮断した際の酸素含量の変化を示す．遮断開始直後から酸素含量は急激に低下する．HbV8投与
群は，HbV29投与群および無投与群に比較して低下が遅くなる
傾向が得られた．HbVの寄与を明らかにするため，Fig. 5.bにHbV由来の酸素含量のみを示した．HbV8は非常に緩やかな酸素放出を示した．血流遮断30秒でpO2値は5.2 ± 0.7 mmHgにまで低下したが，SaO（HbV
28）は26.1 ± 7.3％であり，まだ一定値にはならず，酸素を放出し続けた．HbV29は血流遮断15秒後にはほぼ一定となり，SaO（HbV
229）は30秒後には7.4 ± 1.0％となった．Fig. 5.cはFig. 5.bを微分したもので，HbVが酸素を損失する速度を示す．HbV29の場合は，血流遮断開始２秒後に最大値0.18 mL O2 /dL/secを示すが，17秒後以降では酸素を放出しない．他方HbV8は緩慢に酸素を放出し，10秒後に最大値
0.08 mL O2 /dL/secを示し，30秒後も酸素を放出し続けた．
Fig. 6.に，血液全体の酸素含量に対するHbV由来の酸素含量の比率を示す．血流遮断前は，HbV8およびHbV29の寄与は非常に小さいが，これは赤血球の量に比較してHbVの投与量が極めて少ない為である．しかし，血流遮断後HbV8由来の酸素含量
分率は10秒後に0.55に達した．これは，pO2値が極度に低下した場合には，赤血球ではなくHbV8が主要な酸素供給源になっていることを示している．

134

Fig. 5.（a）Time course of the arteriolar O2 content in the whole blood of
an occluded arteriole before and after infusion of 7 mL/kg HbV8 or
HbV29 into hamsters. The O2 contents are calculated using theequation（Ⅱ）
and the data of OECs
（Fig.1.）and pO2 changes（Fig. 3.）.
（b）Time course of the O2 content derived from HbV in the blood.
The contributions of HbV are derived from the data in Fig. 5.
（a）and magnified in scale.（c）Rate of O2 loss from HbV. The graphs in
Fig. 5.（b）were differentiated and plotted.（Cited from: Sakai et al.,Am J Physiol Heart Circ Physiol 2005;288:H2897-H2903）

Fig. 6. Time course of the fraction of O2 content from HbV in the whole
blood. The extended time of occlusion induced hypoxic condition
and the fraction of O2 content from HbV8 increased significantly incomparison with HbV29（Cited.
from: Sakai et al., Am J Physiol
Heart Circ Physiol 2005;288:H2897-H2903）

人工血液 Vol. 14 , No.4, 2006

考察

本研究では，酸素親和度を高く（P 50値を小さく）設定したHbV（P8
50 =８mmHg）が，HbV29よりも酸素放出が遅いことがハムスター細動脈遮断モデルで具体的に示すことが出来た．また低酸素状態ではHbV29ではなくHbV8 が主要な酸素供給源になることも明示できた．
細動脈血流を急激に遮断すると，酸素含量は低下する．同様の現象はRichmondらがラット僧帽筋組織で観測している 23）．
細動脈管壁で多くの酸素が消失する結果が最近報告されており，通常の組織に比較して血管壁で酸素が多く消費されると考えられ9，35，42），本実験における急激なpO2値の低下も，一部は同様の理由と考えられる．本実験では，正常な皮下組織において
細動脈１本のみ血流を遮断し，pO2が５mmHgまで低下したが，これはラット僧帽筋の臨界pO2値2.9 ± 0.5 mmHgよりも高い値である23）．血流遮断によって酸素供給は顕著に低下するが，周辺の細動脈，細静脈および毛細血管からの酸素の拡散がある．
そのため，組織全体への血流を遮断しているRichmondらの実験に比較して高いpO2値で平衡に達したものと考えられる．酸
素結合解離曲線（Fig. 1.）より，５mmHgのときSaO（HbV
2
8）
は26％と見積もられる．これはHbV 29（６％）および赤血球（２％）に比較して高い値であり，HbV8は血流を遮断した後，長時間に亘って酸素供給源となり，Fig. 6.に示すようにその分率は0.5を超え，赤血球をも上回った．
本実験モデルの問題点として，SaO2の算出において，細動脈内の環境が酸素結合解離曲線を測定する時の条件と同じと仮定していることである．しかし，Hbの酸素親和度は，温度，pH，
電解質，CO2濃度によって変化する．血流遮断によって生起する局所的な虚血は，pHの低下，CO2濃度の増大などをもたらし，
酸素親和度の僅かな低下（P50値の上昇）が予想される．しかし，
僅か30秒の短い血流遮断が大きな変化をもたらすとは考えられない．
我々は以前に，人工のプラスチック製の細管（内径: 28μm）
内にHb溶液を一定流速で流動させ（１mm/s），細管を亜ニチオン酸溶液に浸して管壁を透過した酸素を消費させることにより，Hbの酸素放出速度を測定した．すると，Hb溶液は赤血球に比べ酸素放出が速くなることが解った．対照的にHbVではそのような効果は見られず，赤血球と同等の酸素放出を示した31）．
この違いは，酸素が結合した小さいHb分子が拡散する事による促進輸送効果に起因する21，31）．対照的にHbV（粒径250 nm）
は大きいため十分な拡散効果が得られず，促進輸送が見られなかったと考えられる．この条件では，酸素親和度（P50）が酸素放出速度と血管壁への酸素供給における決定的因子となる．今回の実験結果は，HbVの存在はpO2値および酸素含量の低下を促進するのではなく，むしろ低下を遅延させる効果を有することを示している．

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 14 , No.4, 2006

本実験は，血流を遮断した微小血管からの酸素放出の特性を明らかにすることを目的としており，臨床的な虚血性疾患とは直接的な関係は無い．なぜならば，僅か30秒間の一本の細動脈の血流遮断は，周辺の組織を虚血状態に陥れることは無いからである．しかし，今回の結果は，HbV 8が虚血性状態のように
組織pO2が極度に低下した条件で主要な酸素供給源になりうることを示している．少量のHbV8投与のため（10 mL/kg），血流遮断後の酸素含量（５mL O2 /dL，５秒後）は，ベースライン（20 mL O2 /dL，0秒）に比較して極めて少ない．HbVの寄与を高めるには，投与量を多くすることと，血流の維持が必要になろう．Contaldoらは最近，HbV（P50 = 15 mmHg）をデキ
ストランに分散させた溶液を用いハムスターの50％血液希釈を行い，有茎皮弁の虚血領域の酸素分圧が改善する効果を得ている7）．このことは，低P50値のHbVが上流の血管で酸素を放出せずに保持し，血流速度が遅いと予想される側副血管を経由して虚血領域にまで酸素を運搬してから放出した為と考えられる．
小粒径のHBOCは赤血球が通過できない収縮血管，狭窄血管を通過できるので，虚血領域の酸素化が期待されている．しかし，
Contaldoらの結果も本実験の結果もこれを支持するものではな
い．それは，細動脈を完全に結紮或は遮断しているからである．
重要なのは，HbVも含め粒径の小さいHBOCが血漿層に均一に分散していることである．これによって赤血球に比較して末梢組織により均一に酸素を運搬することができる．疾患のある場
合に特に末梢血管内のHct値にばらつきがあるからである．このような条件で，酸素親和度の高いHbVがより遅い酸素放出を示し，虚血領域の酸素化に有効であると考えられる．
HbVはその酸素親和度（P50）をPLPの添加で調節できる特徴を有する33，45）．最近，低P50値（高い酸素親和度）のHBOCが虚血領域への標的酸素輸送に効果的であることが報告された2，3，41，43）．
本実験モデルは人工酸素運搬体の設計と最適化を行うために有用な結果を提供することができる．また本研究により，虚血性疾患の治療法としてHbVを使用することの可能性を提示することができた．

謝辞ハムスター実験モデルの作製を行ったA. Barra氏，C. Walser
女史（カリフォルニア大学サンディエゴ校），試料調製の協力を頂いた武岡真司教授，宗慶太郎博士（早稲田大学），また虚血領域の酸素化について議論をして頂いたD. Erni博士（ベルン大学附属Inselspital病院）に感謝申し上げます．本研究の一部は，厚生労働科学研究費補助金（医薬品・臨床機器等レギュ
ラトリーサイエンス総合研究事業），USPHS NIH Bioengineering
Partnership grant R24-HL 64395, grants R01 HL 40696, R01
HL 62354により推進された．記して謝意を表する．

参照文献
１. Awasthi VD, Garcia D, Klipper R, Goins BA, and Phillips
WT. Neutral and anionic liposome-encapsulated135

hemoglobin: effect of postinserted poly（ethylene glycol）
distearoylphosphatidylethanolamine on distribution andcirculation kinetics. J Pharmacol Exp Ther 2004;309:241248.
２. Baines AD, Adamson G, Wojciechowski P, Pliura D, Ho P,
and Kluger R. Effect of modifying O2 diffusivity anddelivery on glomerular and tubular function in hypoxic
perfused kidney. Am J Physiol Renal Physiol 1998;274:744-752.
３. Baines AD, and Ho P. O 2 affinity of cross-linked
hemoglobins modifies O2 metabolism in proximal tubules. J
Appl Physiol 2003;95:563-570.
４. Buehler PW, and Alayash AI. Toxicities of hemoglobin
solutions: in search of in-vitro and in-vivo model systems.
Transfusion 2004;44:1516-1530.
５. Chang TMS. Blood substitutes: principles, methods, products,
and clinical trials. Karger, Basel, 1997.
６. Cabrales P, Sakai H, Tsai AG, Tsuchida E, and Intaglietta
M. Oxygen transport by low and normal P50 hemoglobin
vesicles in extreme hemodilution. Am J Physiol Heart Circ
Physiol 2005;288: （- in press）.
７. Contaldo C, Schramm S, Wettstein R, Sakai H, Takeoka S,
Tsuchida E, Leunig M, Banic A, and Erni D. Improved
oxygenation in ischemic hamster flap tissue is correlatedwith increasing hemodilution with Hb vesicles and theirO2 affinity. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2003;285:H1140H1147.
８. Djordjevich L, Mayoral J, Miller IF, and Ivankovich AD.
Cardiorespiratory effects of exchange transfusions withsynthetic erythrocytes in rats. Crit Care Med 1987;15:318323.
９. Duling BR, and Berne RM. Longitudinal gradients inperiarteriolar oxygen tension. A possible mechanism forthe participation of oxygen in the local regulation of blood
flow. Circ Res 1970;27:669-678.
10. Endrich B, K. Asaishi, A. Gotz, and K. Messmer. Technicalreport: a new chamber technique for microvascularstudies inunanesthetized hamsters. Res Exp Med (Berl)
1980;177: 125-134.
11. Erni D, Wettstein R, Schramm S, Sakai H, Takeoka S,
Tsuchida E, Leunig M, and Banic A. Normovolemic
hemodilution with hemoglobin-vesicle solution attenuates
hypoxia in ischemic hamster flap tissue. Am J Physiol Heart
Circ Physiol 2003;284:H1702-H1709.
12. Goda N, Suzuki K, Naito S, Takeoka S, Tsuchida E,
Ishimura Y, Tamatani T, and Suematsu M. Distribution ofheme oxygenase isoform in rat liver: topographic basis forcarbon monoxide-mediated micorvascular relaxation. J Clin
Invest 1998;101:604-612.
13. Intaglietta M, Johnson PC, and Winslow RM. Microvascular

136

and tissue oxygen distribution. Cardiovasc Res 1996;32:632643.
14. Intaglietta M, Silverman NR, and Tompkins WR. Capillary
flow velocity measurements in vivo and in situ by
television methods. Microvasc Res 1975;10:165-179.
15. Intaglietta M, and Tompkins WR. Microvascularmeasurements by video image shearing and splitting.
Microvasc Res 1973;5:309-312.
16. Izumi Y, Sakai H, Hamada K, Takeoka S, Yamahata Y,
Kato R, Nishide H, Tsuchida E, and Kobayashi K.
Physiologic responses to exchange transfusion withhemoglobin vesicles as an artificial oxygen carrier inanesthetized rats: changes in mean arterial pressure andrenal cortical tissue oxygen tension. Crit Care Med 1996;24:
1869-1873.
17. Kerger H, Torres Filho IP, Rivas M, Winslow RM, andIntaglietta M. Systemic and subcutaneous microvascularoxygen tension in conscious Syrian golden hamsters. Am J
Physiol Heart Circ Physiol 1995;267:H802-H810.
18. Kyokane T. Norimuzu S, Taniai H, Yamaguchi T, Takeoka
S, Tsuchida E, Naito M, Nimura,Y, Ishimura Y, andSuematsu M. Carbon monoxide from heme catabolism
protects against hepatobiliary dysfunction in endotoxintreated rat liver. Gastroenterology 2001;120:1227-1240.
19. Linberg R, Conover CD, Shum KL, and Shorr RGL.
Increased tissue oxygenation and enhanced radiation
sensitivity of solid tumors in rodents following
polyethylene glycol conjugated bovine hemoglobin
administration. In Vivo 1998;12:167-174.
20. Lipowsky HH, and Zweifach B. Application of the 'two slit'
photometric technique to the measurement of
microvascular volumetric flow rates. Microvasc Res 1978;15:
93-101.
21. McCarthy MR, Vandegeriff KD, and Winslow RM. The
role of facilitated diffusion in oxygen transport by cell-freehemoglobins: implications for the design of hemoglobinbased oxygen carriers. Biophys Chem 2001;92:103-117.
22. Papenfuss HD, Gross JF, Intaglietta M, and Treese FA. A
transparent access chamber for the rat dorsal skin fold.
Microvasc Res 1979;18:311-318.
23. Richmond KN, Shonat RD, Lynch RM, and Johnson PC.
Critical Po2 of skeletal muscle in vivo. Am J Physiol Heart
Circ Physiol 1999;277:H1831-1840.
24. Rudolph AS, Klipper RW, Goins B, and Phillips WT. In
vivo biodistribution of a radiolabelled blood substitute:
99m
Tc-labeled liposome-encapsulated hemoglobin in ananesthetized rabbit. Proc Natl Acad Sci USA 1991;88:1097610980.
25. Sakai H, Hara H, Tsai AG, Tsuchida E, Johnson PC, and人工血液 Vol. 14 , No.4, 2006

Intaglietta M. Changes in resistance vessels during
hemorrhagic shock and resuscitation in conscious hamster
model. Am J Physiol Heart Circ Physiol 1999;276:563-571.
26. Sakai H, Hara H, Yuasa M, Tsai AG, Takeoka S, TsuchidaE, and Intaglietta M. Molecular dimensions of Hb-based O2
carriers determine constriction of resistance arteries andhypertension in conscious hamster model. Am J Physiol
Heart Circ Physiol 2000;279:908-915.
27. Sakai H, Hisamoto S, Fukutomi I, Sou K, Takeoka S, andTsuchida E. Detection of Lipopolysaccharide inhemoglobin-vesicles by Limulus amebocyte lysate test withkinetic-turbidimetric gell clotting analysis andpretreatment with a surfactant. J Pharm Sci 2004;93:310321.
28. Sakai H, Horinouchi H, Tomiyama K, Ikeda E, Takeoka S,
Kobayashi K, and Tsuchida E. Hemoglobin-vesicles as
oxygen carriers: influence on phagocytic activity andhistopathological changes in reticuloendothelial systems.
Am J Pathol 2001;159:1079-1088.
29. Sakai H, Masada Y, Horinouchi H, Ikeda E, Sou K,
Takeoka S, Suematsu M, Kobayashi K, and Tsuchida E.
Physiologic capacity of reticuloendothelial system for
degradation of hemoglobin-vesicles（artificial oxygen
carriers）after massive intravenous doses by daily
repeated infusion for 14 days. J Pharmacol Exp Therap
2004;311:874-884.
30. Sakai H, Masada Y, Horinouchi H, Yamamoto M, Ikeda E,
Takeoka S, Kobayashi K, and Tsuchida E. Hemoglobinvesicles suspended in recombinant human serum albuminfor resuscitation from hemorrhagic shock in anesthetized
rats. Crit Care Med 2004;32:539-545.
31. Sakai H, Suzuki Y, Kinoshita M, Takeoka S, Maeda N, andTsuchida E. O2-release from Hb-vesicles evaluated using
an artificial narrow O2-permeable tube: comparison with
RBC and acellular Hb. Am J Physiol Heart Circ Physiol
2003;285:H2543-H2551.
32. Sakai H, Takeoka S, Yokohama H, Seino Y, Nishide H, andTsuchida E. Purufication of concentrated Hb using organic
solvent and heat treatment. Protein Expression Purif 1993;4:
563-569.
33. Sakai H, Tsai AG, Rohlfs RJ, Hara H, Takeoka S, TsuchidaE, and Intaglietta M. Microvascular responses tohemodilution with Hb-vesicles as red cell substitutes:
Influences of O2 affinity. Am J Physiol Heart Circ Physiol
1999;276:553-562.
34. Sakai H, Yuasa M, Onuma H, Takeoka S, and Tsuchida E.
Synthesis and physicochemical characterization of a series

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 14 , No.4, 2006of hemoglobin-based oxygen carriers: objective
comparison between cellular and acellular types.
Bioconjugate Chem 2000;11:56-64.
35. Shibata M, Ichioka S, Ando J, and Kamiya A.
Microvascular and interstitial pO2 measurements in rat
skeletal muscle by phosphorescence quenching. J Appl
Physiol 2001;91:321-327.
36. Shirasawa T, Izumizaki M, Suzuki YI, Ishihara A, Shimizu
T, Tamaki M, Huang F, Koizumi KI, Iwase M, Sakai H,
Tsuchida E, Ueshima U, Inoue H, Koseki H, Senda H,
Kuriyama T, and Homma I. Oxygen affinity of hemoglobin
regulates O 2 consumption, metabolism, and physicalactivity. J Biol Chem 2003;278:5035-5043.
37. Sou K, Naito Y, Endo T, Takeoka S, and Tsuchida E.
Effective encapsulation of proteins into size-controlled
phospholipid vesicles using freeze-thawing and extrusion.
Biotechnol Progr 2003;19:1547-1552.
38. Takeoka S, Teramura Y, Atoji T, and Tsuchida E. Effectof Hb-encapsulation with vesicles on H2O2 reaction andlipid peroxidation. Bioconjugate Chem 2002;13:1302-1308.
39. Tomson FN and Wardrop KJ. Clinical chemistry andhematology. In: Laboratory Hamsters, edited by van
Hoosier GL Jr and McPherson CW. Orlando, FL:
Academic, 1987; Chapt. 3
40. Torres Filho IP, and Intaglietta M. Microvascular Po2
measurements by phosphorescence decay method. Am J
Physiol Heart Circ Physiol 1993;265:1434-1438.
41. Tsai AG, Kerger H, and Intaglietta M. Microcirculatory
consequences of blood substitutution with αα-hemoglobin.
In "Blood Substitutes: Physiological Basis of Efficacy" Eds.
by Winslow RM, Vandegriff K, Intaglietta M. Birkhauser,
Boston, 1995;155-174.
42. Tsai AG, Friesenecker B, Mazzoni MC, Kerger H, Buerk
DG, Johnson PC, and Intaglietta M. Microvascular andtissue oxygen gradients in the rat mesentery. Proc Natl
Acad Sci USA 1998;95:6590-6595.
43. Tsai AG, Vandegriff KD, Intaglietta M, and Winslow RM.
Targeted O2 delivery by low-P50 hemoglobin: a new basis
for O2 therapeutics. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2003;285:
H1411-H1419.
44. Vanderkooi JM, Maniara G, Green TJ, and Wilson DF. An
optical method for measurement of dioxygen
concentration based on quenching of phosphorescence. J
Biol Chem 1987;262:5476-5482.
45. Wang L, Morizawa K, Tokuyama S, Satoh T, andTsuchida E. Modulation of oxygen-carrying capacity ofartificial red cells（ARC）. Polymer Adv Technol 1992;4:8-11.

137

●事務局たより

日本血液代替物学会
１． 日 時 ：平成18年８月24日（木）総会

３． 議 題 ：報告事項

２． 場 所 ：慶應義塾大学医学部北里記念図書館 ２階 北里講堂
〒160-8582 東京都新宿区信濃町 35

以下審議内容を略記します。

① 第13回年次大会の報告② 会員動向
③ 委員会報告④ 平成17年度事業報告⑤ 平成17年度収支決算⑥ 平成18年度事業（実績報告）

平成17年度 会計

収支決算表（学会事務局）（自 平成17年４月１日

報告事項①年次大会の開催状況として下記事項が報告された。
1） 第13回日本血液代替物学会年次大会
2） 平成18年８月24日（木）〜25日（金）3） 東京都新宿区信濃町 35 慶應義塾大学医学部北里講堂
4） 日本血液代替物学会会員、臨床医学・理工学研究者、国内の大学および医療機関臨床医、
血液センター関係者の参加があった。
②会員状況は以下のとおり。
1）維持会員：５社2）賛助会員：５社
3）正会員：144名
4）購読会員：19箇所
5）学生会員：１名③会誌編集委員会からの報告は以下のとおり。
会誌「人工血液」の発行。
・平成17年度：第13巻２号、３号発行。
・平成18年度：第13巻４号、第14巻１号、２号、３号発行。
④平成17年度事業報告（平成17年４月１日〜平成18年３月31日）
が行われ各々承認された。
1）定期総会の開催
平成17年６月７日（火） 早稲田大学国際会議場にて開催。
2）第12回年次大会 （大会長 武岡 真司）
平成17年６月６日（月）、７日（火）早稲田大学国際会議場で行われた。

収摘要
前 期 繰 越 金
正 会 員 会 費
入会
金
賛助会員会費
維持会員会費
購読会員会費
雑
収
入
利
息

入
金
額
12,811,533
620,000
25,0001,600,000
6,000,000
54,00070,7102,275

計21,183,518

至 平成18年３月31日）

支
出
金
額
摘
要
1,627,070
会 誌 出 版 費661,236
集会・委員会費
1,500,000
年 会 補 助 金
ホームページ維持費
1,500,000
事 務 人 件 費2,159,760
事
務
費
414,514
人工血液をつくる（6）開催費助成522,462
基金に繰り入れ2,000,000
次 期 繰 越 金 10,798,476
計
21,183,518⑥平成18年度事業（実績報告）
1）定期総会の開催
平成18年８月24日（木）慶應義塾大学医学部北里講堂にて開催。
2）第13回年次大会の開催（大会長 末松 誠）
平成18年8月24日（木）、25日（金） 於 慶應義塾大学医学部北里講堂
3）「人工血液」の発行
4）「人工血液をつくる（7）」後援

理事会報告
平成18年３月23日に理事会が開催された。
1）平成18年度事業／会計経過報告
2）平成19年度事業計画／予算案
3）第14回年次大会準備経過報告
4）委員会報告
5）役員の確認
6）次期会長、大会長について⑤平成17年度収支決算報告が行われ承認された。
以上が報告、審議された。
現行役員は下記の通り。

138

人工血液 Vol. 14 , No.4, 2006

●事務局たより
日本血液代替物学会 役員名簿
顧

問

尾形利郎
高久史麿
堀 原一
遠山 博

東海大学医学部 名誉教授
自治医科大学 学長
筑波大学 名誉教授
埼玉医科大学総合医療センター 名誉所長

会

長

小林紘一

慶應義塾大学医学部 教授

副会長

池田康夫

慶應義塾大学医学部 教授

監

理

池田久實
川村明夫
末松 誠
高折益彦
武岡真司
土田英俊

北海道赤十字血液センター 所長
札幌北楡病院 理事長
慶應義塾大学医学部 教授
東宝塚さとう病院 名誉院長
早稲田大学理工学部 教授
早稲田大学理工学部 名誉教授

（事務局） 堀之内宏久 慶應義塾大学医学部 准教授（会誌担当）武岡真司
早稲田大学理工学部 教授（HP担当） 藤島清太郎 慶應義塾大学医学部 講師

事

西 勝英
肥後医育振興会 理事
半田 誠
慶應義塾大学医学部 准教授
平澤博之
千葉大学 名誉教授
堀之内宏久 慶應義塾大学医学部 准教授
四津良平
慶應義塾大学医学部 教授
事

清水 勝
阿岸鉄三

杏林大学医学部 前客員教授
板橋中央総合病院 血液浄化療法センター
ブラッドアクセス治療センター 所長

日本血液代替物学会 評議員名簿
青木
明石
阿岸

克憲
勝也
鉄三

浅野 茂隆
東
寛
阿部喜代司
池田 久實
池田 康夫
池淵 研二
石原 弘規
伊藤 俊之
稲田 英一
大島 宣雄
大塚 節子
大柳 治正
尾形 利郎
片岡 一則
川村 明夫
黒澤 良和
小林 紘一
小室 勝利
斎藤 英彦
酒井 清孝
酒井 宏水
佐久間一郎
桜井 靖久
佐藤
誠
鮫島 達也
清水
勝
清水 慶彦
十字 猛夫
末松
平
高折

誠
明
益彦

浜松医科大学 教授
聖マリアンナ医科大学 教授
板橋中央総合病院 血液浄化療法センター
ブラッドアクセス治療センター 所長
早稲田大学理工学部 教授
北海道赤十字血液センター
筑波大学 名誉教授
北海道赤十字血液センター 所長
慶應義塾大学医学部 教授
埼玉医科大学 教授
弘前大学医学部 准教授
京都府立医科大学 准教授
順天堂大学医学部 教授
筑波大学基礎医学系 名誉教授
岐阜大学医学部 講師
近畿大学医学部 教授
東海大学医学部 名誉教授
東京大学大学院工学系研究科 教授
札幌北楡病院 理事長
藤田保健衛生大学総合医科学研究所 教授
慶應義塾大学医学部 教授
名古屋セントラル病院 院長
早稲田大学理工学部 教授
早稲田大学理工学部 准教授
カレスサッポロ北光記念クリニック 所長
東京女子医科大学 名誉教授
ニプロ（株）医薬品研究所 所長
青山学院大学理工学部 名誉教授
杏林大学医学部 前客員教授
京都大学再生医科学研究所 教授
日本赤十字血液事業本部
中央血液研究所 前所長
慶應義塾大学医学部 教授
鹿児島大学医学部 名誉教授
東宝塚さとう病院 名誉院長

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 14 , No.4, 2006

高木 智史
高久 史麿
高橋
晃
高橋 英嗣
高橋 恒夫
武岡 真司
田所 憲治
土田 英俊
遠山
博
友田
夫
豊田 忠之
仲井 邦彦
中井 一士
長澤 俊郎
中島 常隆
西
勝英
西出 宏之
西谷 孝子
半田
誠
平澤 博之
福島 昭二
藤井 寿一
藤島清太郎
船津 昭信
外 須美夫
堀
進悟
堀
原一
堀之内宏久
宮尾 秀樹
宮崎 保
村田 満
湯浅 晋治
四津 良平
米川 元樹

（株）オキシジェニクス 会長
自治医科大学 学長
テルモ（株）代表取締役社長
山形大学医学部 准教授
東京大学医科学研究所 教授
早稲田大学理工学部 教授
日本赤十字社血液事業本部
早稲田大学理工学部 名誉教授
埼玉医科大学総合医療センター 名誉所長
東京医科大学 教授
東部地域病院 元院長
東北大学医学部 准教授
血液製剤調査機構 元理事
筑波大学臨床医学系 教授
三菱ウェルファーマ（株）生物製剤本部長
肥後医育振興会 理事
早稲田大学理工学部 教授
ナノキャリア株式会社
慶應義塾大学医学部 准教授
千葉大学 名誉教授
神戸学院大学薬学部製剤学 准教授
東京女子医科大学 教授
慶應義塾大学医学部 講師（財）化学及血清療法研究所 常務理事
北里大学医学部 教授
慶應義塾大学医学部 准教授
筑波大学 名誉教授
慶應義塾大学医学部 准教授
埼玉医科大学総合医療センター 教授
札幌逓信病院 名誉院長
慶應義塾大学医学部 教授
順天堂大学 名誉教授
慶應義塾大学医学部 教授
札幌北楡病院 院長（ア順敬称略）139

140

人工血液 Vol. 14 , No.4, 2006

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 14 , No.4, 2006

141

142

人工血液 Vol. 14 , No.4, 2006

●編集後記●会誌 人工血液 が創刊されて既にVol.14まで来ております．
多くの専門の先生方から寄稿して頂きました．本号の総説にもあるように，研究では 造血幹細胞による人工的な血球細胞の誘導と増幅 の段階まで進められているものの，酸素運搬体の開発動向を見る限り具体的な製品が上市されるまでの道のりは大変険しい状況で，そのギャップは益々広がる様に思えます．

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 14 , No.4, 2006

それは，先端生命科学と生産工学のギャップなのか，産と学のギャップなのか，色々な見方があると思うが，そのギャップを埋める努力をどこかが行い，そして行い続けなければならないのだろうと考えるこの頃です．
（武岡 真司）143

投稿規定
本誌は，血液代替物開発研究に貢献する
論文，関連する情報，学会会員のための会
報，学会諸規定等を掲載するが，形式にはこだわらず創意ある投稿を広く集める．本誌への投稿者は本学会会員であることが望
ましいが，投稿を希望する者は誰でも投稿することが出来る．原稿掲載の採否は編集委員会が決定する．原著論文について，他誌に既発表あるいは投稿中の論文は掲載し
ない．

執筆規定
ワープロを用いフロッピーによる投稿を原則とする．ただし，手書き原稿による投稿でも受け付ける．欧文による投稿を歓迎する．
１）原稿はワープロを用いて作成し，使用したソフト名を記載してフロッピーにより提出すること．その際，ハードコ
ピー4部を添え右肩上に「論説」，「総説」，「原著」等を明記すること．オリジナルのソフトおよびテキストファイル形式
でも保存し提出すること．
２）原稿はA4版の大きさとし，第1頁には
表題，英文表題，著者名，全著者所属，
英文著者名，英文所属，ついで筆頭著者の住所，英文住所を記入する．手書き原稿の場合はＢ5版，1行20字，20行とする．
３）総説，原著，および報告については，第2頁以降に和文抄録，Keywords（英文で6個程度）を付け，最終頁または別紙に英文抄録を付けること．英文抄録
は英文ワープロを用いて，別の「ABSTRACT」ファイルとしてハードコピーとともに提出しても構わない．
４）句読点はコンマ
（， ）
ピリオド
（． ）
とする．
５）文 中 の 英 語 は ， Times, Helvetica,
Courier, Symbol フォントを原則とし，
英文半角小文字とする．ただし，文頭および固有名詞は大文字で書きはじめ
ること．
６）数字はアラビア数字を使い，度量衡の単位はm, cm, mm, μm, L, mL, μL,

mol, g, mg, μg, ng, pg, fg, N／10などを用いる．
７）FigureとTable：引用順にそれぞれ番号を付けること．表題，説明，図表中文字は全て英文とすること．本文ハードコピー上に挿入箇所を明記すること．
Figureは直接オフセット印刷とする．
Tableは編集部にて入力し原図とする．
８）文献：本文に引用した順序に番号を付け，文中では2），3-5），1 4-6）などとする．
文献の記載法はthe Vancouver styleに従う．全著者名．論文題名．誌名 西
暦発行年；巻数：頁〜頁．とし，誌名の省略は医学中央雑誌またはIndex
Medicus に準拠する．単行本の場合は全著者名．題名．編集者名．書名．発
行地：発行書店，年号；頁〜頁．の順とする．
１. 太田和夫. 移植医療と社会. 医学のあゆみ 1993;164:442-6.
２. 砂本順三, 岩本 清. リポソームの調製. 野島庄七, 砂本順三, 井上圭三 編.
リポソーム. 東京: 南江堂,1988;21-40.
３. Fowler SA, Andracki M, Hurst G,
Honkan VA, Walder J, Casteel DA.
Prolongation of the intravascularretention of hemoglobin modified
with a long-chain fatty acidderivative. Artif Cells Blood Substit
Immobil Biotechnol 1994;22:27-42.
４. Reichert CM, Kelly VL, Macher
AM. Pathologic features of AIDS.
In: DeVita VT Jr, Hellman
S,Rosenberg SA, eds. AIDS.
Philadelphia: Lippincott, 1985;111-60.
９）論文中の略語は初出の際に省略しない
こと．
10）既発表の図表，その他を引用，転載する場合には，あらかじめ版権所有者の許可を得ること．また，掲載論文の著
作権は本学会に帰属する．
[本誌掲載著作物の二次利用および著作権について]
以下の点につきまして，あらかじめご了承ください．
本誌の一部，もしくは全部をCD−ROM，
インターネットなどのニューメディアに二次利用させていただく場合があります．本誌に掲載する著作物の複製権・翻訳権・上映権・譲渡権・公衆送信権（送信可能化権を含む）は本学会に譲渡されたものとします．したがって，上記の諸権利の承諾は本学会で行います（本項については，著作者ご自身の再利用を拘束するものではありませんが，再利用される場合はご一報ください）．
掲載料は無料とし，論説，総説，原著，
報告等については別刷り30部を贈呈する．
それを越える分についての費用は著者の負担とする（およそ1部100円）．カラー写真掲
載・アート紙希望などの場合は，著者の実費負担とする．

二次掲載について人工血液では，他の言語ですでに掲載された論文を和文で二次掲載することは二重投稿ではなく正当な掲載と認めますが，以下の事項を遵守してください．
１）すでに掲載された論文であること．
２）著者は両方の雑誌の編集者より許可を得ていること.二次掲載する編集者に最初に掲載されたもののコピー，別刷，
もしくは原稿のいずれかを添付すること．
３）論 旨 を 変 え な い こ と ． 執 筆 者 は 同 一（順不同）であること．
４）二次掲載版のタイトル・ページに掲載される脚注には，その論文の全体もし
くは一部分がすでに掲載されている旨を明記し，更に初出文献も示すこと．
適切な脚注の例を以下に示す．「Thisarticle is based on a study firstreported in the［...雑誌タイトル（完全な典拠情報を添えたもの）...］（訳：この論文記事は，［...］に最初に報告された研究に基づくものである）」．
これらの要件を満たしている場合は，その旨を明記して，総説または論文記事（二次掲載）として投稿してください．

編集委員会●武岡真司（委員長），東 寛，池淵研二，小林 薫，酒井宏水，寺嶋克幸，堀之内宏久，村田 満，渡辺真純●日本血液代替物学会 会誌■発行

日本血液代替物学会■編集・制作「人工血液」編集委員会

■印刷

株式会社

研恒社

人工血液

vol.14（4） 2007年 5 月25日発行〒160−8582 東京都新宿区信濃町35
慶應義塾大学医学部呼吸器外科内TEL（03）5363−3493 FAX（03）5363−3499〒169-8555 東京都新宿区大久保3−4−1
早稲田大学理工学部65-208室
TEL（03）5286−3217 FAX（03）3205−4740〒102−0073 東京都千代田区九段北1−1−7
TEL（03）3265−8961 FAX（03）3264−1995
再生紙を使用