別刷

ブレークスルー
バイオテクノロジー

編／東京大学先端科学技術研究センター 谷内江研究室

NGS，ゲノム編集，シングルセル…今の生命科学には，かつてないペースで新技術が登場しています．本連載
では，組合わせのアイデアで，さらなるシナジーをよび起こす先端バイオテクノロジーをご紹介いただきます．

本連載をはじめるにあたってテクノロジーを知り，新しい生命科学を創造する
これまでの生命科学の歴史のなかで研究者たちはさまざまな発見をし，われわれの知識を推し拡げてきた．他の自然科学と同様に，研究者の慧眼と努力によるそれを支えてきたのは技術であり，生命科学においては光学顕微鏡 ，X 線構造解析技術 ，D N A シークエンシングや質量分析といったテクノロジーである．また，ときには新しく発見された生命現象によって新しい技術が生まれ，それが次の発見をもたらしてきた．このような生命科学に独特な美しいサイクルには，例えば DNA の複製機構と DNA ポリメラーゼの発見が PCR 法の発明につながり，それが D N A シークエンシング法の発明につながり，今日私たちがゲノム情報を基礎とする研究をできるというものがあるだろう．
もちろん生命現象の新しい発見は狙ってできるものではない．しかしながら「このようなテクノロジーが生まれると，このような生命現象に挑戦できるようになる」と想像し，そのようなテクノロジーの実現を狙うことはできる．また，見渡してみると，いきなり一人の天才がこれまで誰も見たことがなかったような独創的な発明をして世界を驚かすというようなことはほとんどない．誰かの小さな発見やこれまでの技術を丁寧に理解して組合わせることによって，他の開発者達に「ああ，その手があったか」と思わせるような技術が生まれることが多い．その世界にどっぷりと浸かることはとてもおもしろく，それが私たち自身のことを含めた生命の神秘に迫るものであればなおさらである．特に近年は，D N A シークエンシング，D N A 合成，ゲノム編集，イメージングなどの技術が加速的に発展しており，従来の遺伝学の枠組みを超えて細胞や生物の機能を大胆に改変する合成生物学の技術と，それによる生命現象の観察が可能になってきた ．生物機能に介入するようなテクノロジーの開発は ，不確定要素の多い細胞あるいは分子のふるまいを制御する必要があり難しいが ，「ここはこういうふうに動いているのかもしれない」と想像し，その裏をとりながら目的の制御を実現できたときは技術の実現と，生命の神秘に触れてそれを少しずつ理解するという喜びを同時に得ることができる．

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バイオテクノロジー

世界では生物学，工学，情報科学を起点としたさまざまなバイオテクノロジーが生まれており ， 養われたセンスによってそれらがさらに複合され ， 分野の潮流をつくるようなアイディアが登場している．最近では，マイクロ流路デバイス，DNA バーコード，超並列 DNAシークエンシングを組合わせた 1 細胞トランスクリプトーム技術がこれにあたる．またゲノム編集の登場は，単なる染色体 D N A 配列の改変にとどまらず，多くの研究者たちを個体発生における細胞系譜トレーシング技術の開発に参入させた．DNA 合成技術や DNA アセンブ
リ技術の加速はマイコプラズマや出芽酵母の染色体まるごと合成の成功につながった．テクノロジーはビジョンをつくる．しかし，慧眼をもってすばらしいテクノロジーを生み出している科学者たちが世界中にいる一方で，どれだけの“賢い”科学者たちがこういったことが自分にもできると捉え，大胆なビジョンをもち，その価値を想像しながら挑戦しているだろうか？
私たちをとり巻くさまざまなバイオテクノロジーは，一見無関係なノードでも，その要素技術群までみてみると見事に連関しており，美しいウェブを形成している．生命科学の新しい学徒は，広大なウェブを端からほぐして逐一理解する行程を思い躊躇するだろう．しかしながら，まずは何も考えず，ウェブに身を放り込んでしまうのがよい．あなたも次々と新しいアイディアを生み出すようになり，ともすると永久に抜け出せなくなるような強烈におもしろい次の生命科学のビジョンをつくってしまうかもしれない．
本連載では東京大学先端科学技術研究センター谷内江研究室のメンバーがさまざまなバイオテクノロジーを解説し，一人でも多くの研究者とその卵をこのすばらしい世界に引き込むことを目的としている．私たち自身もまた，すばらしい技術の存在を再確認し，その可能性を誌面で議論することで自分たちのサイエンスを育み，楽しむ機会としたい．取り扱うトピックは，ゲノム編集などの基礎的な技術から高度な 1 細胞
トランスクリプトーム，細胞系譜追跡技術，情報プロファイリング，一分子イメージン
グ，人工細胞合成など多岐にわたるが，連載の進行につれ「前に説明したあれもこれもつながって ， こういう技術が生まれた」
あるいは「この技術とこの技術を組合わせれば，こういう新しいバイオロジーを考えバイオテクノロジーのウェブにダイブするることができるのではないか」と解説するようにする．第 1 回では，現在のバイオテクノロ
ジーの美しきウェブの中で，急速にハブとなりつつあるゲノム編集技術について触れ，その大いなる拡がりについて，続くいくつかの回で楽しめるようにする．

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第 1 回 ゲノム編集

美しきテクノロジーウェブの新たな中心

ゲノム編集（genome editing）は，任意の DNA 配NGG-3′）を認識してそれに隣接する 5′ 側の一定長の列を特異的に切断し，それによって染色体ゲノム配列DNA 配列（プロトスペーサー）を切り出し，ホストのを自在に改変できる技術として 2000 年代後半に登場

ゲノム上に挿入（免疫）する（図 2A）．新しく免疫さした．2012 年に CRISPR/Cas システムが登場するまでれる D N A 配列 （スペーサー）は ，ある共通配列に挟は ，任意の D N A 配列に結合するように自在にデザイまれる形で過去に免疫された配列群の先頭に挿入されンできるタンパク質にヌクレアーゼ（FokI）を融合しるため，ゲノム上には一定間隔を空けた周期的なリピーたジンクフィンガーヌクレアーゼ （ZNF）や TA L エト配列が生じる．このリピート配列がその詳しい機能フェクターヌクレアーゼ（TALEN）が主流であったが明らかになる前に発見されたことが CRISPR（clus-1）（図 1A）．

tered regularly interspaced short palindromic

哺乳動物細胞では染色体に切断が引き起こされると，repeats）という名称の由来である．一度免疫された外相同染色体を利用した相同組換え修復や非相同末端結

来 D N A の侵略が再び起こった場合は ，次のように外合修復が惹起される．非相同末端結合修復では，DNA来 DNA が分解される．まず，ゲノムの CRISPR 領域か切断末端がエキソヌクレアーゼやポリメラーゼによっら発現する pre-CRISPR RNA からプロセッシングされて処理されてから再連結されるために，欠失などの変る単位ユニット（crRNA）それぞれのリピート配列部異が入り ，これが遺伝子破壊に利用できる （図 1B）．

分と tracrRNA とよばれる RNA が二次構造を形成し，一方で ，切断末端の両方に相同な配列を末端にもつ

それらがさらに C as9 タンパク質と複合体を形成する

DNA 断片がドナーとして切断処理と同時に細胞に導入（図 2B）．複合体のスペーサー RNA 部分は外来 DNA

された場合は，相同組換え修復を経てこれが高効率にのプロトスペーサー配列の逆鎖と塩基対を形成し ，目的の染色体座位にノックインされる（図 1C）．このCas9 タンパク質が PAM を認識することで DNA 二重鎖ほか，ヌクレアーゼの代わりに転写因子や染色体修飾切断を引き起こし（図 2C），ターゲットされた D N A因子を融合させることで，狙った染色体の切断だけでを分解に導く ．この C as9 の D NA 切断活性のためのなく，遺伝子発現やエピゲノム状態を制御できるよう

PAM 要求性は，ホストゲノムの CRISPR 領域に免疫しな技術も開発された．

た同じスペーサーは切断せずに外来 DN A のみを切断

今日では，言うまでもなく，バクテリアのファージすることができる自己・非自己の認識機構として働く．

に対する免疫防御機構として発見された CRISPR/Cas

これらの機構が理解されてすぐ 2012 年にカリフォシステムがゲノム編集の中心である．天然の生命シス

ルニア大学バークレー校の Jennifer Doudna とウメオ

テムから発見された技術を利用するためには，それが大学（当時）の Emmanuelle Charpentier らが tra-元来のシステムにおいてどのように機能しているかをcrRNA と crRNA を融合させた人工的なガイド RNA理解することが要である．CRISPR/Cas システムにつ（gRNA）と Cas9 が 3′ 側に PAM 配列をもつ 20 塩基程

いては連載の後半にこのことがさらに重要になってく度の配列を自在に切断できることを示し（図 2D），翌

るため ，現在最も利用が進んでいる C a s 9 をコードす

年 Br o ad 研究所の F an g Z h an g とハーバード大のる Streptococcus pyogenes を例に外来 DNA に対するGeorge Church のグループが同時に哺乳動物細胞のゲ原核生物の免疫防御機構を簡単に説明する ．

ノム編集においてもこれが利用できることを示した ．

2）

このバクテリアではファージなど外来の D N A の侵

その後，ZNF や TALEN と異なり gRNA のスペーサー入があると，Cas1，Cas2 タンパク質が外来 DNA のも部分を変更するだけで汎用的に利用できるその簡便性

つ PAM（protospacer adjacent motif）という短いモから爆発的に利用が広がった ． C a s9 の場合はヌクレチーフ配列（S . p y o g e ne s 由来の C a s 9 の場合は 5′ -アーゼドメインを 2 つもち，これが DNA 二重鎖切断を

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谷内江 望

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バイオテクノロジー

DNA結合ドメイン（ジンクフィンガーまたはTALエフェクター）A

Fok15′3′

ジンクフィンガー

3′5′

Fok1

TALエフェクター

DNA二重鎖切断
ゲノムDNA 5′3′

B3′5′

C

非相同末端結合修復

5′3′3′5′
切断末端の処理と連結

5′3′欠失／挿入

相同組換え修復

ゲノムDNA 5′3′
修復 5′
テンプレート 3′3′5′5′
3′3′5′

積荷DNA
3′5′
ホリディジャンクションの形成と組換え
正確なゲノム編集
3′5′

図 1 TALEN や ZNF をもちいたゲノム編集

A）ジンクフィンガーや TAL エフェクターは DNA 結合性のタンパク質であり，DNA 認識モジュールのくり返し構造をもつ．ジンクフィンガーは 1 つの認識モジュールが特異的な 3 塩基と選択的に結合し，TAL エフェクターでは 1 つの認識モジュールが特異的な 1 塩基と選択的に結合する．このため任意の DNA 配列に結合するタンパク質をデザインすることが可能であり，これにヌクレアーゼドメイン（FokI）を融合させたものがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZNF）や TAL エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）といったゲノム編集ツールである．B）非相同末端結合修復と相同組換え修復．（文献 1 を参考に作成）可能にするが，これらを一部または両方欠損させたニッらグアニン・シトシン塩基対（G・C）に変換すること

カーゼ型 Cas9（nCas9）や不活性型 Cas9（dCas9）を可能にする 3）4）．これによって細胞にとって毒性のあも開発され，ZNF や TALEN のようにこれらにさまざる染色体切断や ，まだ決して効率の高くない D N A 断

まなエフェクタータンパク質を融合させた多様な染色片のノックインを必要とせずに染色体ゲノム配列を高体操作技術も実現した．

効率かつ正確に書き換えられるようになった．

CRISPR/Cas システムによる簡便な染色体切断はさまざまな生物種における遺伝子破壊を可能にし，ノックインは外来遺伝子の導入のみならず一塩基レベルでの染色体ゲノム配列の書き換えを可能にしたが，ゲノ

ゲノム編集技術がもつ力の一端
ジーンドライブ

ム編集はさらに新しい考え方によって染色体の遺伝コーゲノム編集が，自然がつくり上げた生命システムにドを書き換える方向に向かっている．塩基編集（base

どれだけの人工的なインパクトを与えうるかを端的に

e d i t i n g）とよばれるこの方法では dCa s9 あるいは示す例としてジーンドライブ（gene drive）がある 5）6）．

nCas9 にシチジンデアミナーゼや RNA アデノシンデ

通常，特定の変異をもつ個体は，自然選択の枠組みをアミナーゼを改変したものをエフェクタータンパク質超えて集団内で広がることはない．つまり，その変異として融合させ（図 2E），ターゲットとなる D N A 領が生育に有利な形質を生み出さない限り，野生型も同域の塩基を脱アミノ化反応を介してシトシン・グアニじように増殖するため，変異型の個体が集団を支配すン塩基対（C・G）からチミン・アデニン（T・A）にるようなことは生じえないし，遺伝的浮動（g en e t i c変換することや，アデニン・チミン塩基対（A・T）かdrift）によって集団から消えることも多い．このこと実験医学

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AC
ウイルスDNA

感染

TypeⅡ
CRISPR領域

TracrRNAPAM

3′5′
tracrRNA

5′3′

切断
Cas複合体RuvC domain

スペーサー

新しいリピート-スペーサー
ユニットの挿入Cas9 Cas1 Csn2

Cas9

D

Cas2

リピート スペーサー

PAM

5′3′

B
PAMが隣接する
DNAのターゲティング

感染

tracrRNA
crRNA
crRNA-tracrRNACas9複合体の生成

RNaseⅢTypeⅡCRISPR領域

TracrRNAsgRNA

E
AID UGI
5′3′

リピート スペーサー

PAM

3′5′sgRNA

Pre-CRISPR RNAの発現

Cas9 Cas1 Csn2
Cas23′5′Cas9

ウイルスDNA

Cas9

ウイルスDNAの切断

crRNA

HNH domain

Cas9

図 2 原核生物の外来 DNA に対する免疫防御機構

A）外来 DNA に対する免疫付与．B）外来 DNA に対する防御機構．C）crRNA-tracrRNA-Cas9（3 コンポーネント）によるターゲット DNA の切断．D）gRNA-Cas9（2 コンポーネント）によるターゲット DNA の切断．E）シチジンデアミナーゼをもちいた塩基編集 Target-AID 法．nCas9 にシチジンデアミナーゼ（AID）およびウラシルグリコシラーゼ阻害剤（UGI）が融合されている．nCas9 によって一本鎖化された DNA に AID が働きシチジンを脱アミノ化反応によってウリジンに変換する．UGIの作用によって一塩基除去修復が阻害され，DNA 複製過程においてウラシルはチミンに変換される．
（文献 1，2 を参考に作成）

は有性生殖であっても同様で，野生型の個体と変異型すべてジーンドライブカセットを（少なくともヘテロの個体が交配した場合は，その子には親の姉妹染色分には）もつことになる．最初はヘテロに入っていたカ体が均等な確率で分配されるため変異型が集団を支配セットも，じきにホモ化する．この，ジーンドライブすることはない（図 3A）．一方，ジーンドライブとよカセットをもつ個体が野生型と交配しはじめると，メばれる概念では，任意の「野生型配列を切断するゲノンデルの遺伝の法則を無視して，そのうち野生型が環ム編集ツールを発現する D NA カセット自体がその染境から消える（図 3C）．

色体の野生型配列と置き換えられた」個体が準備されこのようにジーンドライブはこれまでの生物進化がる．このとき，例えヘテロにジーンドライブカセット頼ってきた遺伝のバランスを一気に変えてしまうようをもつように改変された個体であっても，ゲノム編集な破壊的なインパクトをもった技術である．そのコンによって野生型配列の切断と相同組換え D NA 修復がセプト自体は 15 年ほどの歴史があるが，CIRPSR/Cas誘導されて，ジーンドライブカセットは他の相同染色システムなどのゲノム編集の登場によって，特定の個体にコピーされてすぐにホモ化する （図 3B）．した

体の任意の染色体座位に対してジーンドライブ効果をがって，その個体から生じる配偶子はすべてジーンド簡便に生み出すことが可能になった（あるいは「なっライブカセットをもち，野生型と交配してもその子はてしまった」）．例えば，ジーンドライブを活用する有3138

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A

変異型

B

積荷DNA

相同染色体

C

野生型

Cas9 gRNA

ターゲットの切断

Cas9 gRNA

変異型

バイオテクノロジー
野生型

相同組換え
修復

Cas9 gRNA
Cas9 gRNA

図 3 ジーンドライブ

A）通常 ，変異型をもつ個体は集団のなかで広まらない．B）ジーンドライブカセットは野生型の切断と相同組換え修復を経て相同染色体にコピーされる．C）ジーンドライブカセットをもつ個体は集団を支配する．

名なアイディアとして，マラリア原虫に対する耐性遺在に DN A 配列を書き換えることができるゲノム編集

伝子を保持する蚊の個体を，マラリア流行地域に放出

は，細胞内に導入された論理回路を遺伝子発現誘導系し ，媒介蚊を駆逐しようというものがある ．他のゲなどではなく，遺伝子コードレベルで精密に制御でき，ノム編集関連技術の例に漏れず，ジーンドライブも生生命科学研究のためにさらに精密で大規模な人工回路態系への影響などの倫理的な議論が未熟である．

をもつモデル生物を構築するという意味においてもそ

5）の意義が大きく，私たちの研究室を含めて世界中でそういった方向での技術開発が進んでいる．

合成生物学におけるゲノム編集◆

分子生物学以降の生命科学の歴史は ，遺伝子破壊 ，バイオテクノロジーは協調して（あるいは開発者た

遺伝子導入によって変化する細胞や個体の形質の観察，ちにとってはアイディアを“盗み”合いながら）発展

蛍光タンパク質遺伝子を融合させた遺伝子による目的しつつある．今回は近年急速にさまざまな技術開発にタンパク質の細胞内動態の可視化など，DNA にコード利用されはじめたゲノム編集に触れ，それによって生された生命システムのプログラムに介入してリバースまれたジーンドライブというシンプルなアイディアがエンジニアリングすることをスタンダードなアプロー

生態系を変化できるほどの大きなインパクトをもつとチとしてきた．また合成生物学では，転写因子の発現いう例を示した ．第 2 回は発生における細胞系譜追跡誘導や D N A の組換えを安定かつ精密に制御して ，細について解説する．細胞系譜追跡の歴史に触れ，体細胞内に複雑な論理ゲートをもった計算機 7）や外部刺激胞変異を利用した手法から D N A バーコードやゲノムの数を数え上げられるようなカウンター が開発され，編集が発生学の視点を変えつつある様子を紹介しながゲノム合成のアプローチとともに生命システムを積極らその限界についても議論する．

8）的にプログラミングするような技術開発が進んできた．
連載の後半でも徐々に触れていくが，近年ではこれらのアプローチが統合されて，より複雑な論理回路をコードする DNA を細胞に導入することによって ，動物個体の細胞を個別に蛍光識別する技術 9），タンパク質間相互作用ネットワーク 10）や遺伝子間相互作用ネット
ワーク 11）を網羅的に同定する技術，個体発生の細胞系譜をトレーシングする技術 12）〜 14）などが生まれた．自実験医学Vol. 36

文献1）Hsu PD, et al：Cell, 157：1262-1278, 2014
2）Mali P, et al：Nat Methods, 10：957-963, 2013
3）N i sh i da K , e t a l：S ci e n ce , 353：10.1126/sci e n ce .
aaf8729, 20164）Gaudelli NM, et al：Nature, 551：464-471, 20175）Akbari OS, et al：Science, 349：927-929, 2015
6）DiCarlo JE, et al：Nat Biotechnol, 33：1250-1255,
2015

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7）Weinberg BH, et al：Nat Biotechnol, 35：453-462,2017

8）Friedland AE, et al：Science, 324：1199-1202, 20099）Livet J, et al：Nature, 450：56-62, 200710）Yachie N, et al：Mol Syst Biol, 12：863, 201611）Díaz-Mejía JJ, et al：Mol Syst Biol, 14：e7985, 201812）McKenna A, et al：Science, 353：aaf7907, 201613）Frieda KL, et al：Nature, 541：107-111, 201714）Pei W, et al：Nature, 548：456-460, 2017

著者プロフィール
谷内江 望 （Nozomu Yachie）
東京大学先端科学技術研究センター准教授および慶應義塾大学先端生命科学研究所特任准教授．2009 年慶應義塾大学にて博士号を取得 ．’10 年よりハーバード大学およびトロント
大学博士研究員 ．’12 年カナダ政府が選出するバンティング
フェロー（自然科学技術分野）．’14 年より現職．実験生物学と情報生物学を組合わせたさまざまなバイオテクノロジーを開発．谷内江研究室ウェブサイト：http://yachie-lab.org/

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書籍名：実験医学 Vol.36 No.18
使⽤⾴：3134〜3140 ⾴
著者名：⾕内江 望
発⾏社：（株）⽺⼟社
発⾏年：2018 年© YODOSHA CO., LTD. 2019