講演番号（記入不要）

ネオマクロフォリン類の単離・構造決定及び生理活性（1 弘前大農生、2 岩手大連合農学、3 広島大総合科学）○橋本勝 、広瀬あかね 1、本村優奈 1、日下部一晃 1、上杉祥太 2、殿内暁夫 1、前多隼人 1、根平達夫 3、木村賢一 21

白神山地は 1993 年に登録された UNESCO 世界自然遺産として知られている。報告者らはこの地域の微生物を遺伝子資源ととらえ、有用二次代謝物の探索研究を展開、これまで複数の新規天然物を単離してきた。今回、弘前大学白神自然観察園で採取した Daedaleopsis tricolor（チャカイガラタケ）に寄生する Trichoderma sp. 1212-03 の培養液から新規ドリマン型ジテルペンであるネオマクロフォリン I-VI (1-6)、及びその生合成前駆体と考えられるプレマクロフォリン (7)を単離した 1。

【単離と構造決定】
Trichoderma sp. 1212-03 培養液の酢酸エチル抽出物をシリカゲルクロマトグラフィ
ーなどを用いてこれら化合物を精製した。まず、ネオマクロフォリン I (1) の構造を解析した。ESIMS スペクトルはプロトン化した分子イオンを m/z 477.2493 に与えたことから分子式 C26H36O8 を推定、さらに NMR 解析により 3-位にアクシアル水酸基を有するドリマン誘導体であると決定した。H-9 は H-5’との間に明確な NOE を与えたが、分子モデリングの結果、(9S*,5’R*)-異性体
では、安定配座（図 1）においてH-9/H-5’間距離は近く観測した NOEを説明できるが、その異性体の安定配座ではこれを説明出来ないことから、ドリマン環部とエポキシキノン環部との相対立体配置を決定した。
図 1. 1 の安定配座と NOE側鎖の C-4”メチル基は 19.51 ppm

に観測された。複数の 2,3-ジヒドロキシブタン酸エステルの文献値を調査したところ、threo-体の場合 4-位メチル基は 19.5 ppm 付近に、erythro-体のそれは17.5 ppm 付近に普遍的に現れることを見出し、threo-体と決定した。また、プロトン非デカップリング 13C スペクト
ル等より 3JCH, 3JHH 値（3JC-1”/H-3” = ca 1
Hz, 3JH-2”/H-3” = 2.3 H, 3JH-3”/C-4” = 2.0 Hz）
を帰属したところ、図２のような関係を帰属し、先の相対配置に矛盾しないことを確認した。

図 2. 1”-4”部側鎖の結合定数及び立体化学

2 では 13C NMR カルボニルシグナルが 1 個減少した。NMR の解析により、2 は 1の 4’-位アルコール体であると結論した。JH-4’/H’-5 は 0.9 Hz であり二面角 H-C4’-C5’-H
 90°が示唆された。分子モデリング等によりトランス配置と推定したが、シス異性体でも対応する二面角は約 60°であり、観測したスピン結合を完全に否定できるものではなかった。最終的には後述する ECD による絶対配置の議論の中で確定した。
3, 4 はそれぞれ 2, 1 の 2”-位についてのデオキシ体であることが判明した。側鎖 3”位水酸基の立体化学はメタノリシスにより 3-ヒドロキシブタン酸メチルとした後、キラル GC により標品と比較することにより絶対配置として(3”S)-配置を決定した。
5, 6 は 1”-4”側鎖を持たない C7’アルコール体であることが判明した。さらに培養液を検索したところ、ドリマン部が環化していない 7 を単離し、これをプレマクロフ
ォリンと命名した。このものでは、7’-位も酸化されておらずメチル基のままである。
ドリマン骨格では両鏡像体の天然物が知られていることから、他のマクロフォリン類の報告などから一意的に決定することは危険である。我々は ECD 解析によりこれを議論することとした。1 の ECD スペクトル[386 nm ( -0.64), 261 nm (+2.89),
238 nm ( -2.16), 228 nm ( -0.16), 214 nm ( -5.04), 図３]は、既知物質マクロフォ
リン D の文献値 2 とほぼ対称であった。これらのコットン効果
は、その波長から UV 吸収のほとんど無いドリマン部の不斉が影響したとは考えにくい。したがって、これらは UV 吸収を示すエポキシキノン構造に起因するとして、マクロフォリン
D のエポキシキノン部とは鏡像 関 係 の (5’S,6’S)-配 置 と 予想した。2 の ECD スペクトルは 1のそれとは大きく異なり、338nm (R-帯, n→*遷移)および 243nm (K-帯, →*遷移)に特徴的な二つの負のコットン効果を
図 3．天然物 1-3 の ECD スペクトル観測した。Sekiguchi らはエポキシドンはじめ多くの類縁体 ECD スペク
トルを解析しており、R-帯のコットン効果は、エポキシドの配置を逆オクタント則で説明でき、K-帯のコットン効果はエポキシセミキノールの水酸基絶対配置とそれぞれが独立して反映されると結論している 3。これを参考にエポキシセミキノール部の絶 対 配 置 を (5’R,6’S)-配 置 と推 定 した。更に、2 の 1”-4”側鎖を省略したモデル化合物を用いて時間依存密度汎関数（TD-DFT）分子起動計算［①配座解析（MMFF）、②構造最適化（EDF2/6-31G*）、③ECD 計算（def2B3LYP 等）］よりスペクトルを再現してこれを確認した。推定した 1, 2 の5’/6’-エポキシド部について、IUPAC法では RS 表記が異なるが同じキラ
図 4．1 及びそのベンゾイルエステル誘導体リティーである。また、これを手がの ECD スペクトル
かりにドリマン部の絶対配置も同時に導くことができたが、全て同一のキラリティーとなり、生合成的にも矛盾はない。3, 5, 7 及び 4, 6 の ECD スペクトルはそれぞれ 2 及び 1 のそれらとほぼ同一であり、ほぼ同様な議論及び生合成を考慮することにより決定した。
最後に 1 の 2,3-ジヒドロキシブタン酸エステル側鎖について、ベンゾイル化後にECD スペクトルを測定して決定した。2”,3”-O-ジベンゾアート誘導体の ECD スペク
トルは、負の分裂型コットン効果を示した。ベンゾイル化反応時に同時に生成した
3”-O-モノベンゾアート体では、このようなコットン効果は観測されない。したがって、導入したベンゾイル基同士の相互作用、即ち励起子キラリティー法が適用可能である 4。2”,3”-O-ジベンゾアート体の 3JH-2”/H-3”は 3.4 Hz であり、両プロトンがゴーシュの関係である conformation A 及び B が考慮すべき配座で、conformation C は無視することができる（図 3）。また、conformation B の場合、ベンゾイル基同士がアンチ、即ち発色団間にキラルなねじれが消失するので ECD への寄与は小さいと考えるべきである。したがって、conformation A のみを考慮すればよく、(2”R,3”S)-配置と帰属することができた。3”位のキラリティーは全て共通であり、生合成的にも矛盾しない。
【生物活性】COLO 201 細胞を用いた実験では 1 に弱い細胞毒性を観察した（IC50: 97 M）。一方、ヒト急性前骨髄性白血病 HL60 細胞に対しては、比較的強い細胞毒性を示し、1,3, 4, 5 の IC50 はそれぞれ 2.1、11.3、0.9、23.0 μM であった。また、これらはいずれも HL60 に対して DNA 断片化と caspase-3 切断を起こしたことから、アポトーシスを誘導することが示された。そこで、ネオマクロフォリン類の標的分子について解析した。類似骨格を有するエポキシフォマリン類がタンパク質分解酵素複合体プロテアソームを阻害することを参考にし、ネオマクロフォリン類のプロテアソームに対する作用を検討した 5。
ヒト赤血球由来 20S プロテアソームと、プロテアソームの 3 種のプロテアーゼ活性（chymotrypsin 様活性、trypsin 様活性、caspase 様活性）に対する各蛍光基質を用いて活性を測定した。その結果、1, 3, 4 はプロテアソームの chymotrypsin 様活性と caspase 様活性を酵素レベルで濃度依存的に阻害するが、5 は 100 μM でも全く阻害しないことが判明した（表 1）。ユビキチン・プロテアソーム系は、主要な細胞内タンパク質分解システムであり、その阻害剤はユビキチン化タンパク質の細胞内蓄積を引き起こす。そこで、ネオマクロフォリン類で処理した HL60 細胞の全タンパク質について、抗ユビキチン抗体を用いた
western blotting によりユビキチン化タンパク質を検出した。その結果、細胞毒性並びにプロテアソーム阻害活性がともに強かった 1 と 4 は、ユビキチン化タンパク質を顕著に蓄積させ、3 もわずかに蓄積させたため、細胞レベルでもプロテアソームを阻害していることが示された。これらの結果から、ネオマクロフォリン類の標的分子の１つがプロテアソームであることを明らかにし、さらに構造活性相関として、5 のみが 100 μM でも阻害活性を示さないためその活性には 1”-4”位側鎖が重要であり、さらに 3 と比較して 1 と 4 の活性が著しく強いことからキノン型であることが阻害活性に大きく寄与することが示唆された。
前述したようにこれら化合物の生産菌は、Daedaleopsis tricolor（チャカイガラタケ）に菌寄生する。現在、菌寄生の関連を現在検討している。

文献
1. Hirose, A.; Maeda, H.; Tonouchi, A.; Nehira, T.; Hashimoto, M. Tetrahedron 2014, 70,1458.
2. Fujimoto, H.; Nakamura, E.; Kim, Y.-P.; Okuyama, E.; Ishibashi, M.; Sassa, T., J. Nat.
Prod. 2001, 64, 1234.
3. Sekiguchi, J.; Gaucher, G. M. Biochemistry 1978, 17, 1785.
4. Harada, N.; Nakanishi, K., Acc. Chem. Res. 1972, 5, 257-263, Harada, N. Enantiomer,1996, 1, 196.
5. Mohamed, I. E.; Kehraus, S.; Krick, A.; König, G. M.; Kelter, G.; Maier, A.; Fiebig, H.H.; Kalesse, M.; Malek, N. P.; Gross, H. J. Nat. Prod. 2010, 73, 2053-2056.

Isolation, Structural Determination, and Biological Activity of
Neomacrophorins○Masaru Hashimoto1, Akane Hirose1, Yuna Honmura1, Kazuaki Kusakabe1,Shota Uesugi2, Akio Tonouchi1, Hayato Maeda1, Tatsuo Nehira3, Ken-ichi Kimura2(1Faculty of Agriculture and Life Science, Hirosaki University, 2The United Graduate
School of Agricultural Sciences, Iwate University, 3Graduate School of Integrated
Arts and Sciences, Hiroshima University)
Neomacrophorins I-VI (1-6) and premacrophorin (7) were isolated from theculture broth of Trichoderma sp. 1212-03 which was collected at Shirakami
Mountainous area in Japan. Structural analyses disclosed that these resemble known
macrophorins but possess axial-hydroxy group at C3 as well as different side chainsat C7’. These are diastereomeric forms of macrophorins for 5’,6’-epoxide functionality.
The NMR analyses suggested their relative configurational relationship between theC1-C15 drimane and C1’-C7’ epoxyquinone moieties. ECD spectral discussions
verified them particularly for C5’,C6’-epoxyquinone (1, 4, and 6), C5’,C6’epoxysemiquinone (2, 3, and 5), and 2”,3”-dihydroxybutanoate moiety in 1 and 2. The
relative and absolute configuration of 2” and C3”-stereocenters of 1 was establishedwith a combination of 13C chemical shift for C4” and the exciton ECD coupling of thedibenzoate. C3”-Stereocenter of 3 was determined by chiral GCMS after converting
into methyl (S)-3”-hydroxybutanoate by basic methanolysis. Premacrophorin (7) isassumed to be a biosynthetic precursor of 1-6.
This presentation also discusses the biological properties of these metabolites.
1, 3, 4 and 5 showed cytotoxicities against human acute promyelocytic leukemia
HL60 cells with IC50 values of 2.1, 11.3, 0.9 and 23.0 M, respectively. Since
neomacrophorins induced DNA fragmentation and cleavage of caspase-3, theycaused apoptosis. Furthermore, we found that 1, 3 and 4 inhibit chymotrypsin-likeand trypsin-like activities of proteasome in vitro, and they also induced accumulation
ofubiquitinatedproteins

inHL60cells.

These

findings

indicatedthat

neomacrophorins are novel proteasome inhibitors and C1”-C4” moiety is important
for the inhibition of proteasome and C5’,C6’-epoxyquinone enhances this activity.