人工血液第 17 巻 第 1 号 2009 年 6 月

目

次
追悼

Dr. Robert M. Winslow（1941-2009） …………………………

2

会告……………………………………………………………………

4

原著

ヘモグロビン小胞体を含有する血液検体の臨床検査-デキストラン添加による干渉作用の回避- ……宗 慶太郎 他

6

膠質浸透圧特性に基づいた周術期のハイドロキシエチルスターチ製剤の選択:
体液動態シミュレーションによる分析 …………多田羅 恒雄

16

ヒトES細胞からの血液産生 …………………………辻 浩一郎

29

総説

トピックス
E-Cell Systemによるヒト赤血球
代謝シミュレーションの展開 …………………西野 泰子

他

37

Eulogy：Dr. Robert M. Winslow（1941-2009）……………………………

2

Announcement from the Society …………………………………………

4

Original Article：
Clinical Laboratory Test of Blood Specimens Containing
Hemoglobin-vesicles - Interference Avoidance by Addition of
Dextran- ………………………………………Keitaro Sou, et al.

6

Review：Perioperative Choice of Hydroxyethyl Starch Solutions
Based on Colloid Osmotic Properties: Analysis Using Fluid
Dynamics Simulation ……………………………Tsuneo Tatara

16

Generation of blood cells from human ES cells……………………………………………………Kohichiro Tsuji

29

Topics：Development and Applications of Human Erythrocyte
Simulation using E-Cell System …………Taiko Nishino, et al.

37

ARTIFICIAL BLOOD
Vol. 17 No. 1 June, 2009

Contents

追悼カリフォルニア大学サンディエゴ校（UCSD）教授でSangart, Inc.社の創設者であられたDr. Robert M. Winslowが脳腫瘍のため，2009年２月２日にご自宅にて永眠されました．享年67歳でした．Dr. Winslowは血液代替物および高地生理学の先駆者でした．2007年10月に北京で開催された第11回国際
血液代替物学会では，いつも通りの元気なお姿をお見せになりましたが，2008年春に発病，余りにも早いご逝去でした．

Dr. Robert M. Winslow（1941-2009）

Dr. Winslowは，1941年９月30日にミネソタ州ニューアルムで生まれました．1962年にミネソタ大学を首席で卒業．1966年ジョンズ・ホプキンス大学
メディカルスクールを卒業し，1970年まで国立衛生研究所（NIH）研究員．
その後臨床研修のためジョンズ・ホプキンス大学に戻り，NIHの主任研究員となり1974年までフェローおよび講師として在籍．1979年に疾病対策センター（CDC）に移籍し，血液学部の異常ヘモグロビン症部門の主任，医学部長補佐となりました．1985年サンフランシスコ・プレシディオのレターマン
陸軍研究所の陸軍血液研究部門主任，後に副司令官．1991年に公職を退き学会活動に戻り，UCSDでNIH支援のプロジェクトを開始し，修飾ヘモグロビ
ンを用いる酸素運搬体に関する研究を開始．その成果を基にSangart, Inc.社を設立し，人工酸素運搬体の製品開発を継続．2008年６月までSangart, Inc.
社の代表取締役，CEOおよびChief Medical Officerを，そして2008年12月まで会長を務められましたが，病状の進行のため後任にその責を委譲していました．

Dr. Winslowの研究には，ペルー，チリ，ネパールにおけるのべ５回の高所野外研究が含まれ，低酸素環境下の住民の血液についての研究を行いました．また，極端な高度におけるヒトの急性順応を研究するため，1981年にはAmerican Medical Research
Expedition to Mount Everest 探検のメンバーでした．これらの功績に対し，公衆衛生局および陸軍から勲功章など数多くの賞を受けました．長年にわたり，食品医薬品局，世界保健機構，連邦航空局，汎米保健機構など多くの政府機関の顧問を務めました．
また200以上の学術論文を執筆し，酸素運搬の生理学や人工酸素運搬体に関する出版の著者および編者となられております．他方，
日本血液代替物学会の活動にも貢献してくださり，本学会設立記念シンポジウム（1993），第４回年次大会／第７回血液代替物学会国際会議（1997），第８回年次大会（2001），第10回年次大会／第９回血液代替物学会国際会議（2003），第12回年次大会（2005），などにてご講演を頂いております．
Dr. Winslowには，人工酸素運搬体の開発やその臨床応用に関してまだまだ教えて頂かなければならないことが沢山ありました．
私達は先生のご意志を継いで，人工酸素運搬体の臨床応用を目指して更に邁進して行く決意を新たにしております．どうぞ私達の活動を見守って下さい．
ここに謹んで哀悼の意を捧げ，ご生前の数多くのご業績に衷心より敬意を表し，お別れの言葉と致します．
小林 紘一
慶應義塾大学 名誉教授
日本血液代替物学会 会長

追記
Dr. Winslowは2009年２月20日，サンディエゴ郡のValley Center Cemestery で密葬されました．また，UCSDのFaculty Club
にて偲ぶ会が執り行われ，120名余の参列がありました．Dr. Winslowの妻Mrs. Nancy Lessman Winslowをはじめ，ご遺族は献花の代わりに出身大学であるUniversity of Minnesota Foundationへ寄付するよう希望されておりましたので，その意に沿うように日本
血液代替物学会ならびに慶應義塾大学と早稲田大学の有志４名より，condolence contributionとしてMrs. Winslowにお渡ししました．日本からは代表として早稲田大学理工学術院 酒井宏水 准教授がご参列されました．その後，Mrs. Winslowより丁寧なお礼のお手紙を頂いております．

2

人工血液 Vol. 17 , No.1, 2009

Bob Winslow and the special blood substitutes trans Pacific connection between
Japan and the U.S.
Marcos Intaglietta
Distinguished Professor of Bioengineering, University of California, San Diego
La Jolla, California
It is said that we will know a person when we
consume a kilogram of salt together. Having joined
for lunch at least once a month at our UCSD faculty
club for almost twenty years must have taken us
close to this threshold. To the end, he did not ceaseto surprise me with innovation, style and therelevance of his ideas, perceptions and scientificquestions.
At the time that we first met, at UCSD, mylaboratory was engaged in the analysis of
microvascular function in health and disease. Bob
was on a mission: the development of blood
substitutes, an era that begun at the Army
Letterman Institute, where he spawned thedevelopment of many of the molecules that that are
still under study today. It is clear that he convinced
me to join that mission, rather than the other way
around.
Under Bob's leadership we established an NIH
program project at UCSD to promote thedevelopment of blood substitutes. This attracted
national and international attention, leading Bob and
I to start the series of symposia Current Issues inBlood Substitutes Research and Development, in
1994, in the attempt to provide an academic forum
primarily directed at reporting and discussing thescience underlying blood substitutes.
The attendance to these meeting was
extraordinary because of diversity and wide ranging
scope of interests represented. The Japanese
representation was particularly remarkable becauseof the evident national commitment to blood
substitute development. The scientific leaders of thegroup were Professor Eishun Tsuchida, an old friendof Bob, and clearly one of the world leaders ofpolymer chemistry, being holder of fractions of the
Kodak Color patents, and Professor Koichi
Kobayashi, a distinguished specialist in lung surgery
at Keio University who was and remains theprincipal clinical force that since then drives theJapanese development of artificial blood.
With these premises as a stage it is insightful
to dwell deeper in the ambient in which Bob
Winslow worked and operated since I knew him.
Even though he was a professor of hematology at
UCSD his aura was that of a scientist, entrepreneur
and an elegant and difficult person. However, Bob
was and will always be in my memory the ultimate
professor. Professors exist in the context of
research, teaching and intellectual exploration. Bob
did all of these superlatively, being an eloquent
lecturer and the mentor of many students. He felt
very strongly about transcending barriers, between

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.1, 2009

disciplines, professions, and those due to geography,
leading him to promote the work of many young
investigators. This is how Dr. Hiromi Sakai wasjointly sponsored to bridge the Japanesedevelopments in polymer chemistry applied to blood
substitutes with the physiological studies of Bob's
Program Project.
It is worth to reflect that both Bob and Eishun
Tsuchida recognized early on that PEG（polyethylene
glycol）is a necessary component for introducing
hemoglobin based oxygen carriers into thecirculation and lower or eliminate side effects.
However this approach appears to reach a limit as
the resulting encapsulation efficiency, i.e., quantity of
pay load（i.e., oxygen carrier）vs. non carrier material
is seldom greater than 70% regardless whether wedeal with a molecular solution（PEG-Hb）, an emulsion（Perfluorocarbons）, or Hb vesicles（HbV）.
Bob was dispassionately aware of limitationsand virtues of virtually all proposals on how todeliver oxygen to the tissue, and held in very highregard the Japanese developments on how toaccomplish this. In fact, in the Spring of 2008 we had
a conversation where he proposed that Hb vesicles
might represent the next step in the evolution ofblood substitutes, and asked me to discuss with
Eishun Tsuchida the possibility of using Bob's know
how to test and help to bring his hemoglobin vesicles
to the market.
We should remain cognizant of Bob's proposal,
because he had a fundamental knowledge of oxygen
transport. And his proposals for oxygen carriers
were derivatives of this knowledge of how oxygen is
managed and used in our organisms. He would often
state that oxygen being the source of energy formetabolism was the most protected and guardedorganic process, and that our intervening in thisprocess with oxygen carriers should be done withextremes care, and profound understanding.
Finally it is also said that we should not mournthe death of a traveler, but the death of a road. For
me and the trans Pacific readers of this note I
proposed a moment of reflection for a Professor who
principally contributed to our times and knowledge.
For the remaining and possible futures I entrustthem to the younger generation, like Hiromi Sakai,
Hirohisa Horinouchi, Andre F. Palmer, Pedro
Cabrales and Amy G. Tsai. I welcome colleagues in
the field to enlarge this cadre, an initiative that I am
certain that Bob Winslow would haveenthusiastically endorsed and that will ensure thatthe road of blood substitutes reaches destination.

3

会 告第16回日本血液代替物学会年次大会
テーマ：世界をリードする血液代替物会期：平成21年10月16日（金），17日（土） 午前 9 時−午後17時

会

場：慶應義塾大学医学部 信濃町キャンパス内医学情報センター 北里講堂

参 加 費：¥ 8,000（懇親会費を含む）
総会：平成21年10月16日 正午

シ ン ポ ジ ウ ム：細胞型人工酸素運搬体をつくる 平成21年10月16日
早稲田大学理工学部

酒井宏水先生

Hb溶液から包埋粒子まで

ニプロ株式会社研究部

横江淳一先生創薬領域でのペグ化と将来への展望

ベネシス株式会社研究部

柚木幹弘先生生物製剤の安全性確保とHbVの無菌化

テルモ株式会社開発部

金田伸一先生HbV工業生産への道−その障害を乗り越えて

特別発言：東京大学生産技術研究所

酒井康行先生

特 別 講 演：人工血小板の過去，現在，未来 平成21年10月17日
慶應義塾大学医学部

半田

誠 先生

：微小循環系でのナノ粒子の不思議な流れ 平成21年10月17日
岡山大学理学部

百武

徹 先生

特別発言：慶應義塾大学神経内科

冨田

裕 先生

：獣医医療における血液代替物の意義
酪農大学獣医学部

萩原克郎先生

特別発言：麻布大学獣医学

一 般 演 題：発表

並河和彦先生

各発表時間12分（質疑応答を含み15分）

発表予定
平成21年10月16日（午前，午後）15題程度

平成21年10月17日（午前，午後）15題程度

応募演題数により設定時間に多少の変更もあります．

評 議 員 会：平成21年10月16日 正午頃
総4

会：平成21年10月17日 ランチョンセミナー終了後

人工血液 Vol. 17 , No.1, 2009

ランチョンセミナー：平成21年10月17日 正午
代用血漿剤HES

埼玉医科大学医療センター

宮尾秀樹 先生（主催：フレゼニウス・カービ・ジャパン株式会社）懇

親会：平成21年10月16日 17：30−20：00
慶應義塾大学病院新館11階 パレスホテル・オアシス
会費は参加費に含まれております．

会員の方々，いまだ入会されておられない方，本学会の研究テーマにご興味をおもちの方，ならびに関係分野でご研究の方々のご発表，ご参加を心からお待ちいたしております．
演 題 申 込：演題名，演者名（ローマ字付き），共同発表者名，ご所蔵，電話番号，Fax番号，E-mail
番号と800字以内の抄録をE-mailにて 1）kita@kenkousya.jp2）r-kobayashi@mail.hts-hsp.comの2箇所にお送り願います．
演題申込締切り：平成21年7月21日
なお今後この日本血液代替物学会ホームページ
http://www.blood-sub.jp/art-bl/に学会関係の連絡事項を逐次掲載いたしますので検索をお願いいたします．
平成21年 6 月吉日
第16回日本血液代替物学会年次大会
会長〒665‐0873

高折益彦

兵庫県宝塚市長尾町2番地1号

Tel：0797‐88‐2200

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.1, 2009

東宝塚さとう病院

Fax：0797‐88‐5782

5原著

ヘモグロビン小胞体を含有する血液検体の臨床検査-デキストラン添加による干渉作用の回避Clinical Laboratory Test of Blood Specimens Containing
Hemoglobin-vesicles- Interference Avoidance by Addition of Dextran宗 慶太郎（1），小峰 梨沙（2），酒井 宏水（1），小林 紘一（3），土田 英俊（1），村田 満（2）Keitaro Sou (1), Risa Komine (2), Hiromi Sakai (1), Koichi Kobayashi (3), Eishun Tsuchida (1), Mitsuru Murata (2)

和文抄録
ヘモグロビン（Hb）小胞体（250 nm）は赤血球（８μm）に比べ 1/30 程度の大きさの人工酸素運搬体である．Hb 小胞体を含有する血液検体を遠心分離操作すると Hb 小胞体は血清に浮遊し，Hb 小胞体による干渉作用が血液生化学検査を阻害することが解っているが，その他にも免疫学検査，凝固線溶検査，血糖検査などにおける Hb 小胞体の干渉作用を検討する必要がある．本研究では，これらの検査における Hb 小胞体の干渉作用を明らかにすると共に，その回避法を明らかにすることを目的とした．遠心分離により血球と同時に Hb 小胞体を沈降分離させるため，各種分子量のデキストラン（Dex）を添加して血液中の Hb 小胞体を凝集させる条件を設定した．さらにヒト血液に Hb 小胞体を 15vol ％混合した試料についてこの分離条件を適用し，各検査項目について干渉の有無を検討した．Dex の分子量（487 kDa）および濃度（終濃度： 2.6 g/dL）の設定により，通常の遠心分離（3000-5000 rpm, 10 min）で Hb 小胞体を沈降分離できることを確認した．
Hb 小胞体は生化学および凝固線溶検査の多くの項目で干渉作用を示したものの，Dex を添加して遠心除去することにより大部分の項目で干渉を回避できた．ただし，Dex 添加により生化学検査でリポプロテインの低下，および凝固線溶検査
で von Willebrand factor（vWF）活性の低下，トータル plasminogen activator inhibitor type-1（PAI-1）の上昇を認め，
これらについては Dex 添加による干渉を受ける項目として注意を要する．血糖検査項目として検討したグルコースとグリ
コヘモグロビンは，Hb 小胞体と Dex の干渉なく測定できた．従って，Hb 小胞体投与後の血液検体に本法を利用すれば，従来通り遠心分離で血清や血漿が得られ，生化学・免疫学検査，凝固線溶検査，血糖検査の多くの項目で干渉なく検査ができる．
Abstract
Hemoglobin-vesicle（HbV）is an artificial oxygen carrier of which the size（250 nm）is 30 times smaller than red blood cells（８μm）. HbVs remain in serum after centrifugation because of its small size and as a result, HbV interferes with the clinicallaboratory test. Here we examine the interference of HbV in other clinical laboratory tests such as immunological test,
coagulation fibrinolysis examination, and blood sugar test. To precipitate the HbV by conventional centrifugal separation ofblood, we determined an appropriate condition to aggregate HbV by an addition of Dextran（Dex）. The obtained plasma or
serum was evaluated by common clinical laboratory test. HbV could be precipitated by addition of Dex（Mw. 489 kDa, final
concentration: 2.6 g/dL in blood）with conventional centrifugation（3000-5000 rpm, 10 min）
. Though the presence of HbVinterfered with the measurement of many analytes, the interference could be removed by the addition of Dex. However, it
should be cautioned that this method underestimates lipoprotein concentration and von Willebrand factor（vWF）activity, andoverestimates total plasminogen activator inhibitor type-1（PAI-1）. Blood sugar tests for glucose and glycated hemoglobin（HbA1C）（1）早稲田大学 理工学術院 理工学研究所 Research Institute for Science and Engineering, Waseda University（2）慶應義塾大学 医学部 臨床検査医学 〒 160-8582 東京都新宿区信濃町 35 Department of Laboratory Medicine, School of Medicine, Keio
University, 35 Shinano-cho Shinjuku-ku Tokyo 160-8582, Japan（3）慶應義塾大学 医学部 呼吸器外科 Department of Thoracic Surgery, School of Medicine, Keio University
論文受付 2009 年１月 13 日 論文受理 2009 年１月 30 日

6

人工血液 Vol. 17 , No.1, 2009

could be performed without interference effect of HbV and Dex. Taken together, the present method will be useful to separate
serum and plasma from the blood specimens containing HbV for accurate clinical laboratory tests.
Keywords
Hemoglobin-vesicles, oxygen carrier, blood specimen, clinical laboratory test, interference, dextran

１．はじめに輸血代替物として人工酸素運搬体の使用が想定される救命救
急や大手術では，各種の臨床検査やモニタリングにより患者の容態の管理が行われる．大量に投与される人工酸素運搬体の臨床応用を円滑に進めるには，人工酸素運搬体の投与が周辺の医療技術や機器にどのような影響を及ぼすか把握しておく必要がある．これまでに，血液検体検査のほか，Co-oximetry，pulse
oximeter，あるいは magnetic resonance（MR）oximetry による酸素飽和度のモニタリングなどにおいて人工酸素運搬体の影響が調べられてきている 1-19）．Hb ベース，パーフルオロカーボン（PFC）ベースを含め，人工酸素運搬体は血球成分に比較して小粒径のため，遠心分離を経てなお血漿層に浮遊する．このため，人工酸素運搬体の特性吸収や濁度が血液生化学検査の多くの項目で測定値に影響を与える．血漿タンパク質と同程度の大きさの修飾 Hb は実験的にも血漿から分離するのが極めて困難であり，干渉作用の少ない機器の選定や修飾 Hb 濃度の関数として干渉分の補正係数を算出することで対処せざるを得ない 5，10，12，13）．
ただし，干渉は濃度だけでなく，経時的に変化する MetHb 含量などの影響を受けるため 11），実際にはこれらの因子を複合的に考慮した補正が必要となる．特定の測定機種について独自の補正を含めた解析手法は臨床試験データの詳細解析には有効と思われるが，補正係数が測定機種に依存するため一般に普及する方法としては適していない．
一方，リン脂質二分子膜で Hb 溶液を被覆した Hb 小胞体（250 nm）は，赤血球（８μm）に比較すれば 1/30 程度の大きさであるが，血漿タンパク質や修飾 Hb（数 nm）に比較すれば数十倍の大きさがある．この大きさになると，超遠心分離機を使用すれば比較的短時間で沈殿させることができ，また，デキ
ストランなど高分子凝集剤の添加により Hb 小胞体を凝集させれば，遠心分離操作で血清から Hb 小胞体を分離できる．このような分離法の工夫により血液生化学検査における干渉を回避できることがわかっている 8，9）．本研究では，デキストラン添加による Hb 小胞体の凝集現象を利用し，血液から一段階の遠心分離操作により血漿や血清を分離する条件を検討した．更にこの条件で得られる血清や血漿について生化学・免疫検査，凝固線溶検査，血糖検査を実施し，Hb 小胞体による干渉作用を回避できる項目，およびデキストラン添加による干渉作用のある項目を明らかすることを目的とした．

２．実験方法
２.１. デキストラン（Dex）添加による Hb 小胞体の凝集
市販の分子量の異なる Dex 粉末（分子量； 11, 19,6, 40.2, 72.2,
124, および 487 kDa, SIGMA）を生理食塩水に溶解させて高分

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子凝集剤として使用した．Hb 小胞体分散液（Hb; 0.05 g/dL,
３ mL）と Dex 溶液（20 g/dL, 0.3 mL）を混合し（Dex 終濃
度： 1.8 g/dL），25 ℃に静置して溶液濁度の変化（λ＝ 700 nm）
から凝集を検出し，その経時変化を観測した．この結果から
Hb 小胞体の凝集生起に要する Dex 分子量および時間に関する知見を得た．
２.２. 血清分離条件の検討
Hb 小胞体が浮遊する血液から血清を分離する実験では，出血蘇生試験のため Hb 小胞体を投与したビーグル犬から採取した血液を使用した 20）．循環血液量の 50 ％を脱血した後に，同量の Hb 小胞体分散液（［Hb］=8.6 g/dL, ５％ リコンビナントア
ルブミンに浮遊）を投与し，４時間経過した時点での採血液を利用した．採血液（5 mL）と Dex 溶液（20 g/dL, 0.5 〜 0.88mL）を混合し，25 ℃で 10 分間静置した．この混合液を遠心分離（5000 rpm, 10 分）して上澄み液からの Hb 小胞体の除去を観測した．これらの結果から，Dex の分子量と濃度について
Hb 小胞体を完全に除去できる条件を決定した．
２.３. ヒト血液検体検査
健康成人から採血した新鮮血 8.5 容に対し Hb 小胞体を 1.5 容の割合で混合し各種採血管（ベノジェクトⅡ，テルモ）に分注した．さらに予め Dex（分子量 400 〜 500 kDa, SIGMA）を 20
g/dL になるよう生理食塩水に溶解した溶液を終濃度 2.6 g/dL
で添加混合した．10 分間室温放置後 3000 rpm，10 分遠心分離
し血清または血漿を得た．得られた血清の生化学検査［総タンパク，アルブミン，総ビリルビン，アスパラギン酸アミノトラ
ンスフェラーゼ（AST），アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT），γグルタミルトランスペプチダーゼ（γ-GTP），乳酸
脱水素酵素（LDH），ロイシンアミノペプチダーゼ（LAP），
クレアチニンキナーゼ（CK），コリンエステラーゼ（ChE），
尿素窒素，尿酸，総コレステロール，エステル型コレステロー
ル，遊離型コレステロール，リポプロテイン（A），トリグリ
セライド，リン脂質，遊離脂肪酸，高密度リポタンパク質-コ
レステロール（HDL-C）定量，カリウム，カルシウム，無機リン，クレアチニン，C 反応性蛋白（CRP）定量，フェリチン，ハプトグロビン］，免疫学検査［免疫グロブリン G（IgG），免疫グロブリン M（IgM），B 型肝炎ウィルス表面（HBs）抗原，
B 型肝炎ウィルス表面（HBs）抗体，B 型肝炎ウィルス（HCV）抗体）］，血漿の凝固線溶検査［活性化部分トロンボプラスチン
時間（APTT），プロトロンビン時間（PT），アンチトロンビ
ン III（ATIII），トータルプラスミノゲンアクチベーターイン
ヒビター-1（PAI-1），フィブリノゲン，フォン・ヴィレブラン

7

ド因子（vWF）抗原，vWF 活性，D-ダイマー，フィブリン分
解産物（FDP）］，糖尿病関連検査［血中グルコース，グリコヘモグロビン（HbA1C）は血液検体で測定］をそれぞれ実施した．
これら全ての検査を株式会社エスアールエル（東京）に依頼した．比較は Hb 小胞体添加血液に生理食塩水を添加し得られた血清または血漿と，生理食塩水添加血液に Dex または生理食塩水を添加し得られた血清または血漿とした．また血清採取用真空採血管は凝固促進剤，血清分離剤が収容されているものなど
幾つか種類があるので（Fig. 3 の採血管収容物を参照），採血管の違いによる影響も調べた．干渉作用の有無の判定では，米国 FDA の Clinical Laboratory Improvement Amendments（CLIA）の規定する臨床試験に関する測定誤差の許容範囲（CLIA limit）を判断基準とし 5，8），基準値との較差（誤差）が許容範囲を正に超える項目を（↑），負に超える項目を（↓）と表記した．また，基準値との較差が許容範囲内である場合には干渉作用無（none）と判断した．CLIA limit が規定されていない項目に関しては，較差の許容範囲を 20 ％として判定した．
今回はコントロールとの比較による干渉の有無の判定を目的としたため，血液に Hb 小胞体，Dex 溶液ないし生理食塩水を添加して希釈率を統一（1.35 倍希釈）して比較した．希釈率の補
正は行っていない．

は共存する高分子との相互作用が比較的詳しく調べられている21-24）．高分子による小胞体凝集の主要な作用として，小胞体
表面の電荷（ゼータ電位）の中和あるいは遮蔽による粒子の不安定化，小胞体間の架橋，高分子による粒子の排除（枯乾効果）などが知られ，一般に同一の繰り返し単位を有する高分子であれば高分子量体ほど凝集能が高く，凝集生起の臨界分子量の存在が認められる 23）．今回の結果より，分子量 487 kDa 程度のDex が Hb 小胞体の凝集に適していると考えられる．Hb 小胞体の凝集は数分間で進行するため，Dex を添加して Hb 小胞体を凝集させる条件を室温（25 ℃）で 10 分間静置に設定した．

３．結果および考察

ここで，d（cm）：粒子の直径，σ（g/cm 3）：粒子の密度，
ρ（g/cm3）：溶液の密度，η
（g ・ cm-1 ・ s-1）：溶液の粘度．
沈降速度は粒子直径の２乗に比例するため，凝集により見かけ上の粒子の直径を大きくすることで沈降速度が増大する．Fig.
1 の結果との対応から，Dex 487 kDa の添加による Hb 小胞体の著しい凝集により遠心で沈降できる大凝集体が生起するものと考えられる．この結果より，Dex の分子量を 487 kDa に設定
した．
次に，Dex 487 kDa の濃度条件を検討した．７ mL 採血管（プレーン）に高分子凝集剤として Dex 487kDa の 0.3 〜 0.75
mL を添加した採血管を作成し，採血液（５ mL）を各採血管に採取して，25 ℃で 10 分間静置した．この混合液を遠心分離（5000 rpm，10 分）して血漿層からの Hb 小胞体の除去の有無を観測した．結果として，透明な血漿層が得られるのは Dex
487kDa を終濃度で 1.8 g/dL 以上添加した場合であり，更に血漿層を超遠心分離して分析すると，2.6 g/dL 以上でほぼ完全に
Hb 小胞体が除去されることを確認した（Fig. 2b）．血漿層にHb 由来の吸収はなく Dex 487kDa 添加による赤血球や Hb 小胞体の溶血もない．沈殿物は下層の血球層と上層の Hb 小胞体で明らかな界面を認め，容易に各々の沈降占有容積率（クリット値）を計測できる．また Hb 小胞体の沈殿と血漿の界面も明確であるため，血漿採取は比較的容易である．以上より，Hb 小
胞体投与後には，Dex 487kDa が終濃度 2.6 g/dL となるように封入された採血管を使用すれば，従来通りの遠心分離にて濁度や Hb 吸収の干渉作用のない血漿ないし血清を採取できることが示された．

３.１. Dex 添加による Hb 小胞体の凝集
まず，Hb 小胞体に各種分子量の Dex を添加し，溶液濁度変化（Δ O.D.）を経時的にモニターした結果を Fig. 1 に示す．分子量 72.1 kDa 以下の Dex を Hb 小胞体に添加してもほとんど溶
液濁の変化を認めないが，分子量 124 kDa の Dex では溶液濁度の上昇が観測され，さらに分子量 487 kDa の Dex 添加により著
しい溶液濁度の増大が観測された．粒子による光散乱強度は粒子径の６乗に比例するため，凝集による粒子径の増大は溶液濁度の増大（光散乱強度の増大）として検出される．高分子添加により懸濁粒子が凝集する現象はよく知られ，リン脂質小胞体

Fig. 1. Kinetics of aggregation of HbV in the presence of 1.8 ％ dextran at
25 ℃. Dex solution was added to the HbV dispersion. Increase of
the ΔO.D. indicates the formation of larger aggregate of HbV by
the addition of Dex.

8

３.２. 血清分離条件の検討
Hb 小胞体の浮遊する採血液に対し分子量の異なる Dex 溶液を添加し，10 分間静置した後に遠心分離した採血管を Fig. 2aに示す（Dex 終濃度： 1.8 g/dL）．Dex 分子量の効果は明確で，
487 kDa の Dex を添加した系のみ透明な血漿が得られた．124
kDa では Hb 小胞体の沈殿を認めるものの不十分であり，それ以下の分子量では沈殿を認めなかった．遠心加速度（rω2）による粒子の沈降速度（v）は次の式（１）で表すことができる．
2（σ−ρ） rω2
v= d ×
×
1.8
η

（１）

人工血液 Vol. 17 , No.1, 2009

Fig. 2. Precipitation of the aggregated HbV by centrifugation.（a）Effectof the molecular weight of the Dex.（b）Effect of the concentrationof the Dextran. HbV could be precipitated in centrifugation ofblood sample in presence of 2.6 g/dL Dex（Mw. 487 kDa）.
Aggregated HbV forms pellet on a red blood cell pellet after
centrifugation.

３.３. ヒト血液検体検査
高分子量 Dex 添加により Hb 小胞体を除去する方法について，血液検体検査への適合性をヒト血清，血漿の外観と検査結果で評価した．Hb 小胞体添加血液に生理食塩水を加えて遠心分離した血清，血漿は Hb 小胞体が浮遊しているため赤色であった．しかし Dex 添加により Hb 小胞体を除去した血清と血漿（Fig. 3）は一部の血清採取用採血管（Fig. 3c, d）で少し赤みが帯びていたもののほぼ黄色であった．赤みが帯びていた血清はDex と血液の混和が不十分であったため Hb 小胞体を除去しきれなかったことが考えられる．Hb 小胞体の除去効果は血清，
血漿の外観から肉眼で確認可能であった．各検査において Hb
小胞体浮遊血清，血漿は以下のような干渉作用を示した．生化学検査（Table 1 〜 3）においては総タンパク，アルブミン，
LDH，CK，クレアチニン，CRP，ハプトグロビンの上昇が見られた．また，総コレステロール，エステル型コレステロール，
遊離型コレステロール，リン脂質では Hb 小胞体の脂質膜が影響し上昇した．尿素窒素と IgM は低下し，ChE は低下傾向を示した．総ビリルビン，AST，ALT，γ GTP においては検査不能と判断された．免疫学検査項目である HBs 抗原・抗体，
HCV 抗体いずれも Hb 小胞体による影響は認められなかった．
これらの結果は４種すべての血清採取用採血管で同様であった．生化学・免疫学検査の全 32 項目中，Hb 小胞体の干渉作用により適切な測定値が得られない項目は 17 ないし 18 項目に上った（Table 1 〜 3）．一方，Dex の添加により Hb 小胞体を除去することで，３ないし４項目（遊離脂肪酸，リポプロテイン，
遊離コレステロール，フェリチン，ALT，AST）を除き適切

Fig. 3. Blood collecting tubes and analytes of clinical laboratory tests.（a）（g）
Blood samples after centrifugation.
The blood collecting tube contain blood+saline+saline（control）, blood+saline+Dex（interference effect ofDex）, blood+HbV+saline（interference effect of HbV）
, or blood+HbV+Dex（this method）.

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.1, 20099

Table 1. Clinical chemistry and immunological tests（Blood collection tube without contents）
Blood+Saline
Analytes

Units

CLIA limits+SalineBlood+HbV

+Dex

IF＊

+Saline

IF＊

+Dex

IF＊

（Control）
Total protein

g/dL

± 10%

5.1

4.8

none

14

↑

4.8

none

Albumin

g/dL

± 10%

3.3

3.2

none

4.3

↑

3.2

none

mg/dL

±0.4mg/dL or ± 20%

0.2

0.1

none

impossible

×

0.1

none

AST

IU/L

± 20%

11

10

none

impossible

×

10

none

ALT

IU/L

± 20%

7

7

none

impossible

×

7

none

γ-GTP

IU/L

± 20%

8

8

none

impossible

×

7

none

LDH

IU/L

± 20%

134

118

none

270

↑

127

none

LAP

IU/L

ND, ± 20%

63

62

none

58

none

64

none

CK

IU/L

± 30%

46

46

none

89

↑

47

none

ChE

IU/L

ND, ± 20%

243

242

none

215

none

247

none

Total bilirubin

Urea nitrogen

mg/dL± 2 mg/dL or ± 9%

6.1

6.0

none

1.2

↓

6.3

none

Creatinine

mg/dL±0.3 mg/dL or ± 15%

0.39

0.43

none

2.03

↑

0.47

none

Uric acid

mg/dL

± 17%

2.6

2.5

none

2.5

none

2.7

none

Total cholesterol

mg/dL

± 10%

129

119

none

334

↑

113

none

Cholesterol ester

mg/dL

ND, ± 20%

99

92

none

238

↑

92

none

Free cholesterol

mg/dL

ND, ± 20%

30

27

none

96

↑

21

↓

Triglyceride

mg/dL

± 25%

90

73

none

86

none

69

none

phospholipid

mg/dL

ND, ± 20%

163

156

none

235

↑

153

none

Free fatty acid

mEQ/L

ND, ± 20%

0.08

0.08

none

0.09

none

0.14

↑

HDL-C

mg/dL

ND, ± 20%

43

43

none

39

none

45

none

Lipoproteins

mg/dL

± 30%

12

5

↓

15

none

6

↓

mEQ/L

±0.5 mmol/L

2.4

2.5

none

2.5

none

2.6

none

+

K

2+

Ca

mg/dL

±0.25 mmol/L

6.2

6.2

none

5.9

none

6.2

none

Inorganic phosphate

mg/dL

ND, ± 20%

2.1

2.0

none

2.2

none

2.2

none

CRP

mg/dL

ND, ± 20%

≤ 0.02≤ 0.02

none

0.1

↑

≤ 0.02none

Ferritinng/mL

ND, ± 20%

3.5

3.0

none

3.4

none

2.8

↓

Haptoglobin

mg/dL

ND, ± 20%

80

74

none

117

↑

80

none

IgG

mg/dL

± 25%

747

734

none

655

none

744

none

IgM

mg/dL

ND, ± 20%

93

86

none

60

↓

88

none

HBs antigen

IU/mL

positive or negative< 0.05< 0.05

none

<0.05

none

< 0.05none

HBs antibody

mIU/mL

positive or negative< 10.0< 10.0none< 10.0none< 10.0none

positive or negative

0.0

0.0

none

0.0

none

0.0

none

HCV antibody

AST: aspartate aminotransferase, ALT: alanine aminotransferase, γ-GTP: γ−glutamyltranspeptitase, LDH: lactate dehydrogenase, LAP:
leucine aminopeptidase, CK: creatine kinase, ChE: cholinesterase, HDL-C: high density lipoprotein cholesterol, CRP: C-reactive protein,
HBs: hepatitis B surface, HCV: hepatitis C virus. ＊ IF means interference. (↑) overestimation, (↓) underestimation, (none) no interference.

10

人工血液 Vol. 17 , No.1, 2009

Table 2. Clinical chemistry and immunological tests（Blood collection tube containing clot activator）
Blood+Saline
Analytes

Units

CLIA limits+SalineBlood+HbV

+Dex

IF＊

+Saline

IF＊

+Dex

IF＊

（Control）
Total protein

g/dL

± 10%

5.2

4.8

none

14.3

↑

4.9

none

Albumin

g/dL

± 10%

3.3

3.2

none

4.2

↑

3.2

none

mg/dL

±0.4mg/dL or ± 20%

0.1

0.1

none

Impossible

×

0.1

none

AST

IU/L

± 20%

11

11

none

Impossible

×

12

none

ALT

IU/L

± 20%

5

8

↑

Impossible

×

8

↑

γ-GTP

IU/L

± 20%

7

7

none

Impossible

×

7

none

LDH

IU/L

± 20%

131

114

none

265

↑

115

none

LAP

IU/L

ND, ± 20%

61

62

none

58

none

62

none

CK

IU/L

± 30%

48

47

none

73

↑

48

none

ChE

IU/L

ND, ± 20%

239

236

none

220

none

241

none

Total bilirubin

Urea nitrogen

mg/dL± 2 mg/dL or ± 9%

6.1

6.3

none

Impossible

×

5.9

none

Creatinine

mg/dL±0.3 mg/dL or ± 15%

0.45

0.41

none

1.80

↑

0.42

none

Uric acid

mg/dL

± 17%

2.5

2.5

none

2.3

none

2.7

none

Total cholesterol

mg/dL

± 10%

126

126

none

333

↑

119

none

Cholesterol ester

mg/dL

ND, ± 20%

95

96

none

239

↑

91

none

Free cholesterol

mg/dL

ND, ± 20%

31

30

none

94

↑

28

none

Triglyceride

mg/dL

± 25%

88

80

none

82

none

69

none

phospholipid

mg/dL

ND, ± 20%

162

157

none

229

↑

157

none

Free fatty acid

mEQ/L

ND, ± 20%

0.08

0.08

none

0.09

none

0.15

↑

HDL-C

mg/dL

ND, ± 20%

41

42

none

39

none

43

none

Lipoproteins

mg/dL

± 30%

14

11

none

14

none

4

↓

mEQ/L

±0.5 mmol/L

2.4

2.4

none

2.5

none

2.6

none

+

K

2+

Ca

mg/dL

±0.25 mmol/L

6.0

6.1

none

5.7

none

6.0

none

Inorganic phosphate

mg/dL

ND, ± 20%

2.1

2.0

none

2.8

none

2.1

none

CRP

mg/dL

ND, ± 20%

≤ 0.02≤ 0.02

none

0.08

↑

≤ 0.02none

Ferritinng/mL

ND, ± 20%

2.8

2.5

none

2.8

none

2.6

none

Haptoglobin

mg/dL

ND, ± 20%

78

78

none

118

↑

82

none

IgG

mg/dL

± 25%

736

721

none

640

none

742

none

IgM

mg/dL

ND, ± 20%

90

84

none

55

↓

85

none

HBs antigen

IU/mL

positive or negative< 0.05< 0.05none< 0.05none< 0.05none

HBs antibody

mIU/mL

positive or negative< 10.0< 10.0none< 10.0none< 10.0none

positive or negative

0.0

0.0

none

0.0

none

0.0

none

HCV antibody

AST: aspartate aminotransferase, ALT: alanine aminotransferase, γ-GTP: γ−glutamyltranspeptitase, LDH: lactate dehydrogenase, LAP:
leucine aminopeptidase, CK: creatine kinase, ChE: cholinesterase, HDL-C: high density lipoprotein cholesterol, CRP: C-reactive protein,
HBs: hepatitis B surface, HCV: hepatitis C virus. ＊ IF means interference. (↑) overestimation, (↓) underestimation, (none) no interference.

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.1, 200911

Table 3. Clinical chemistry and immunological tests（Blood collection tube containing clot activator, inert barrier material, and thrombin）
Blood+Saline
Analytes

Units

CLIA limits+SalineBlood+HbV

+Dex

IF＊

+Saline

IF＊

+Dex

IF＊

（Control）
Total protein

g/dL

± 10%

5.0

4.8

none

14.0

↑

5.0

none

Albumin

g/dL

± 10%

3.3

3.2

none

4.3

↑

3.2

none

mg/dL

±0.4mg/dL or ± 20%

0.1

0.1

none

Impossible

×

0.1

none

AST

IU/L

± 20%

9

11

↑

Impossible

×

11

↑

ALT

IU/L

± 20%

6

8

↑

Impossible

×

7

none

γ-GTP

IU/L

± 20%

8

7

none

Impossible

×

7

none

LDH

IU/L

± 20%

113

110

none

260

↑

117

none

LAP

IU/L

ND, ± 20%

61

62

none

59

none

63

none

CK

IU/L

± 30%

48

47

none

55

none

49

none

ChE

IU/L

ND, ± 20%

239

240

none

225

none

244

none

Total bilirubin

Urea nitrogen

mg/dL± 2 mg/dL or ± 9%

5.9

6.1

none

0.2

↓

5.8

none

Creatinine

mg/dL±0.3 mg/dL or ± 15%

0.39

0.40

none

1.90

↑

0.5

none

Uric acid

mg/dL

± 17%

2.6

2.6

none

2.6

none

2.7

none

Total cholesterol

mg/dL

± 10%

127

123

none

337

↑

121

none

Cholesterol ester

mg/dL

ND, ± 20%

95

93

none

245

↑

92

none

Free cholesterol

mg/dL

ND, ± 20%

32

30

none

92

↑

29

none

Triglyceride

mg/dL

± 25%

89

79

none

84

none

70

none

phospholipid

mg/dL

ND, ± 20%

161

160

none

232

↑

157

none

Free fatty acid

mEQ/L

ND, ± 20%

0.07

0.08

none

0.09

↑

0.14

↑

HDL-C

mg/dL

ND, ± 20%

40

41

none

40

none

43

none

Lipoproteins

mg/dL

± 30%

14

9

↓

13

none

4

↓

mEQ/L

±0.5 mmol/L

2.4

2.4

none

2.5

none

2.7

none

+

K

2+

Ca

mg/dL

±0.25 mmol/L

6.1

6.1

none

6.0

none

6.1

none

Inorganic phosphate

mg/dL

ND, ± 20%

1.9

1.9

none

2.3

↑

2.2

none

CRP

mg/dL

ND, ± 20%

≤ 0.02≤ 0.02

none

0.08

↑

≤ 0.02none

Ferritinng/mL

ND, ± 20%

3.1

2.6

none

2.7

none

2.6

none

Haptoglobin

mg/dL

ND, ± 20%

77

82

none

121

↑

83

none

IgG

mg/dL

± 25%

736

729

none

670

none

748

none

IgM

mg/dL

ND, ± 20%

89

85

none

60

↓

87

none

HBs antigen

IU/mL

positive or negative< 0.05< 0.05none< 0.05none< 0.05none

HBs antibody

mIU/mL

positive or negative< 10.0< 10.0none< 10.0none< 10.0none

positive or negative

0.0

0.0

none

0.0

none

0.0

none

HCV antibody

AST: aspartate aminotransferase, ALT: alanine aminotransferase, γ-GTP: γ−glutamyltranspeptitase, LDH: lactate dehydrogenase, LAP:
leucine aminopeptidase, CK: creatine kinase, ChE: cholinesterase, HDL-C: high density lipoprotein cholesterol, CRP: C-reactive protein,
HBs: hepatitis B surface, HCV: hepatitis C virus. ＊ IF means interference. (↑) overestimation, (↓) underestimation, (none) no interference.

12

人工血液 Vol. 17 , No.1, 2009

Table 4. Coagulation fibrinolysis examination
Blood+Saline
Analytes

Units

CLIA limits+Saline+Dex

Blood+HbV
IF＊+Saline

IF＊

+Dex

IF＊

（Control）
APTT

second

±15%

38.5

41.2

none

Impossible

×

40.8

none

PT

second

± 15%

12.2

12.2

none

Impossible

×

11.9

none

fibrinogen

mg/dL

± 20%

157

149

none

Impossible

×

161

none

ATIII

%

ND, ± 20%

69

67

none

82

↑

70

none

vWF antigen%

ND, ± 20%

48

34

↓

Impossible

×

43

none

vWF activity%

ND, ± 20%

52

24

↓

Impossible

×

21

↓

Total PAI-1

ng/mL

ND, ± 20%

6

15

↑

3

↓

12

↑

FDP

μg/mL

ND, ± 20%

≤2

≤2

none

≤2

none

≤2

none

D-dimerμg/mL

ND, ± 20%

0.22

0.2

none

≤ 0.10

↓

0.18

none

APTT: Activated partial thromboplastin time, PT: Prothrombin time, ATIII: AntithrombinⅢ, PAI-1: plasminogen activator inhibitor-1 ,FDP: fibrinogen degradation products. ＊ IF means interference. (↑) overestimation, (↓) underestimation, (none) no interference.

Table 5. Blood sugar tests
Blood+Saline
Analytes

Units+SalineBlood+HbV

+Dex

IF＊

+Saline

IF＊

+Dex

IF＊

66

none

57

none

69

none

（Control）
Glucosemg/dL

Analytes

Units

HbAIC

%

65

Blood+Saline

Blood+HbV

IF

4.8

4.8

none

HbA1C : glycated hemoglobin. ＊ IF means interference. (↑) overestimation, (↓) underestimation, (none) no interference.

な測定値が得られた．遊離コレステロール，フェリチン，ALT，AST の干渉作用は試験管によるため，検体数を増やして確認する必要がある．採血管の種類に依らず共通して干渉作用のある項目は，遊離脂肪酸とリポプロテインの２項目であった．血液に Dex を添加した検体でもリポプロテインの低下を認めるため，脂質粒子として血漿中に存在するリポプロテインが，Dex 添加により凝集して一部が沈降することで低値となったものと考えられる．遊離脂肪酸は血液に Hb 小胞体と Dex を共存させた検体でのみ増大し，血液に Hb 小胞体あるいは血液にDex を添加した検体では干渉を認めなかった．このことから，
Hb 小胞体に Dex を添加することにより遊離脂肪酸として検出される成分が増大したと考えられ，遊離脂肪酸については Dexを添加しない方が正確な測定値が得られている．
凝固線溶検査では Hb 小胞体の存在により ATIII で上昇，トータル PAI-1 で低下を示し，その他 FDP，D-ダイマーを除くすべての検査で測定不能と判断された（Table 4）．一方，Hb 小胞体浮遊血液に Dex を添加し遠心分離で除去した血漿では，vWF 活性の低下とトータル PAI-1 の上昇を除き干渉作用を回避できた．この２項目では，Hb 小胞体の有無に依らず血液にARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.1, 2009

Dex を添加した場合にも同程度の vWF 活性の低下とトータル
PAI-1 の上昇を認めることから，Dex の添加が干渉作用の原因と考えられる．これらの項目については他の方法を模索する必要がある．糖尿病関連検査に関してはグルコース，HbA1C ともに Hb 小胞体の影響を受けずに測定可能であった（Table 5）．
本研究では，一回の測定であるが多くの項目で Hb 小胞体の干渉作用を回避できる効果が示された．生化学・免疫学検査や凝固線溶検査は人工酸素運搬体の安全性を評価する上でも重要な検査項目であり 25，26），今後はこの方法で測定検体を増やし，統計的に信頼性を解析すると共に，Hb 小胞体の投与が想定される各種病態における血液検体における評価も必要に応じて実施する必要がある．

４．結論
Hb 小胞体が混在する血液検体では，通常の遠心により血液検査に適した血漿を得ることができず，多くの項目で測定が干渉される．一方，Dex（分子量 400 〜 500 kDa）の添加（終濃度;2.6g/dL）により，従来通りの遠心で血清または血漿が得られる．
生化学・免疫学検査，凝固線溶検査，糖尿病関連検査の大部分

13

の検査項目について干渉作用なく測定できることが確認され，Hb 小胞体投与後の血液検体検査が容易になると考える．ただし，Dex 添加の影響により生化学検査ではリポプロテイン（A）の低下，凝固検査では vWF 活性の低下，トータル PAI-1 の上昇が見られているので，これらの項目については注意を要す．

謝辞
本研究は，厚生労働科学研究費補助金（医薬品・医療機器等レギュラトリーサイエンス総合研究事業）によって行われた．
記して謝意を表す．

参考文献
１. Ma Z, Monk TG, Goodnough LT, McClellan A, Gawryl M,
Clark T, Moreira P, Keipert PE, Scott MG. Effect ofhemoglobin- and Perflubron-based oxygen carriers oncommon clinical laboratory tests. Clin Chem 1997;43:17321737.
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Kahn S, Bermes EW Jr. In vitro effects of a novel
hemoglobin-based oxygen carrier on routine chemistry,therapeutic drug, coagulation, hematology, and blood bankassays. Clin Chem 1997;43:1744-1748.
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Duh SH, Trump B, Christenson RH. In vitro interferenceof the red cell substitute pyridoxalated hemoglobinpolyoxyethylene with blood compatibility, coagulation, andclinical chemistry testing. J Cardiothorac Vasc Anesth
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Chem Lab Med 1999;37:453-64.
６. Wolthuis A, Peek D, Scholten R, Moreira P, Gawryl M,
Clark T, Westerhuis L. Effect of the hemoglobin-based
oxygen carrier HBOC-201 on laboratory instrumentation:cobas integra, chiron blood gas analyzer 840, Sysmex SE9000 and BCT. Clin Chem Lab Med 1999;37:71-6.
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15

総

説

膠質浸透圧特性に基づいた周術期のハイドロキシエチルスターチ製剤の選択:
体液動態シミュレーションによる分析
Perioperative Choice of Hydroxyethyl Starch Solutions
Based on Colloid Osmotic Properties:
Analysis Using Fluid Dynamics Simulation
多田羅 恒雄Tsuneo Tatara

和文抄録
代用血漿剤の血漿増量効果は，代用血漿剤の膠質浸透圧（COP）と各種病態における毛細血管の血管内皮細胞間隙の大きさに依存する．ハイドロキシエチルスターチ（HES）製剤に含まれる膠質の分子量は分布幅を持っているため，HES の
COP は時間に依存したパラメータである．つまり，血管内皮細胞間隙より大きな HES 分子は有効な COP を維持するのに対し，血管内皮細胞間隙より小さな HES 分子は一過性に COP を発揮する．重量平均分子量 70,000（HES 70），130,000（HES 130），200,000（HES 200），670,000（HES 670）の６％ HES の COP を in vitro で測定すると，分画分子量 1,000 の半透膜を使用した時は，HES 70 が最も高い COP（80 mmHg）を発揮したのに対し，分画分子量 50,000 の半透膜を使用した
時のこれら HES の COP はほぼ同一（16 〜 20 mmHg）であった．Microvascular exchange model に基づいた体液動態シ
ミュレーションでは，毛細血管の透過性が正常な状態では，HES 70，HES 130，HES 200 の血漿増量効果はほぼ同様であった．しかし，血管透過性が亢進した開腹手術時の急性出血に対して，HES 200 は，HES 70 と HES 130 にくらべて緩徐ではあるが持続の長い血液量回復効果を発揮した．
Abstract
Volume expanding effects of plasma substitutes depend not only on their colloid osmotic pressure（COP）but also on capillarypermeabilities in various clinical conditions. Given that hydroxyethyl starch（HES）solutions are all polydisperse regarding theirmolecular weights, COP of HES is a time-dependent parameter. HES molecule the radius of which is larger than that of capillarypore maintains effective COP, while small HES molecule exerts COP only transiently. The in vitro COP measurement for 6 ％HES of weight average molecular weight 70,000（HES 70）, 130,000（HES 130）
, 200,000（HES 200）
, and 670,000（HES 670）showedthat COP of these HES were comparable with semipermeable membrane of molecular weight cut-off 50,000（16-20 mmHg）, whileHES 70 exerted highest COP（80 mmHg）with semipermeable membrane of molecular weight cut-off 1,000. The fluid volume
simulation based on microvascular exchange model showed that volume expanding effects of HES 70, HES 130, and HES 200
were similar in the normal capillary integrity. However, after acute hemorrhage during abdominal surgery with capillaryleakage, HES 200 showed a slow but long-lasting restoration of blood volume compared to HES 70 and HES 130.
Keywords
Plasma substitute, Fluid volume, Plasma, Interstitium, Hemorrhage, Injury

兵庫医科大学 麻酔科学講座〒 663-8501

西宮市武庫川町 1-1

Department of Anesthesiology, Hyogo College of Medicine, 1-1 Mukogawa-cho, Nishinomiya, Hyogo 663-8501, Japan
論文受付 2008 年 12 月２日 論文受理 2009 年１月 16 日

16人工血液 Vol. 17 , No.1, 2009

はじめに
代用血漿剤は，周術期における血漿量維持のために広く使用されている．特に，ハイドロキシエチルスターチ（hydroxyethyl
starch, HES）は，デキストラン（dextran, DEX）にくらべてアレルギー反応が少ないため，臨床において最も使用されている．しかし，現在日本で臨床使用可能な HES は，重量平均分
子量が 70,000 のものに限られており，中・高分子量（重量平均
分子量： 130,000 〜 670,000）の HES を使用する欧米にくらべ，その選択性はきわめて限られている．しかし，今後数年以内に日本でも重量平均分子量 130,000 および 670,000 の HES が市販される見込みである．これに伴い，臨床における HES 選択の余地は大きくひろがることになるが，逆に「どのような場合にどの HES を選択するのか」という問題に直面することになる．
本稿では，「出血」と「血管透過性亢進」という周術期の典型的な病態において，体液動態シミュレーションモデルを使ってこの問題にアプローチする．特に，HES の分子量の違いに基づ
く膠質浸透圧特性が周術期の体液動態におよぼす影響に焦点をあてる．

（polydispersity）を有している 1）．この分子量の分布パターン
は，代用血漿剤によって大きく異なり（Fig. 1），代用血漿剤に含まれるすべての膠質分子が有効な COP を発揮するわけではない．また，膠質分子にとって半透膜となる血管内皮細胞間隙の大きさも臓器や部位によって異なり，また同一部位においても炎症などの病態により大きく変化する．このように，代用血漿剤に含まれる膠質分子，血管内皮細胞間隙のいずれの大きさにも「不均一性」が存在することが，様々な病態において代用血漿剤を適切に選択する際のキーポイントとなる．
① 膠質分子量の分布
代用血漿剤に含まれる膠質の分子量は，通常，重量平均分子
量により記述される．代用血漿剤に含まれるすべての膠質分子
をその分子量にしたがって分類し，分子量が M i である分子の重量分率（分子量が Mi であるすべての分子の総重量/代用血漿剤に含まれるすべての膠質分子の総重量の比）を wi とすると，重量平均分子量（Mw），数平均分子量（Mn）は，それぞれ

Mw =Σ(wi ･ Mi )i

１．代用血漿剤の膠質浸透圧特性
代用血漿剤に含まれる膠質分子は，イオンや糖などの低分子にくらべて毛細血管の血管内皮細胞間隙を透過しにくいため，
血漿と細胞間質間に膠質浸透圧（colloid osmotic pressure,
COP）が発生する．この結果，代用血漿剤は晶質液にくらべて血管内により多くの水をとどめることにより血漿増量効果を発揮する．しかし，ここで重要なことは，「血管内皮細胞間隙を透過しない膠質分子のみが有効な COP を発揮する」ということである．つまり，代用血漿剤に含まれる膠質は人工合成されているため，その分子量は均一ではなく，ある程度の分布幅

Fig. 1. Molecular weight distribution of plasma substitutes. HES 70:
hydroxyethyl starch of weight average molecular weight 70,000;
DEX 40: dextran of weight average molecular weight 40,000; HES
200: hydroxyethyl starch of weight average molecular weight
200,000; HES 670: hydroxyethyl starch of weight averagemolecular weight 670,000; DEX 70: dextran of weight averagemolecular weight 70,000. Molecular weight distribution for HES 70
was theoretically derived based on a statistical model describing aprobability distribution for molecular weight. Cited in part from
"Arfors K-E, Buckley PB. Pharmacological characteristics ofartificial colloids. Baillie｀re's Clinical Anesthesiology 1997;11:15-47."

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.1, 2009Mn =1
Σ(wi /Mi )iと表される．重量平均分子量は，重量分率による平均であるため高分子量成分の影響を受けるのに対し，数平均分子量は，溶液中の膠質の総重量を分子の個数で割ったものであるため，低分子量成分の影響を敏感に受ける．
代用血漿剤に含まれる膠質分子の分子量分布は，重量平均分
子量/数平均分子量の比により表され，この数値が大きいほど分子量分布が広い．たとえば，重量平均分子量がともに 70,000である DEX（DEX 70）と HES（サリンヘス ®，フレゼニウ
ス・カービ・ジャパン，HES 70）の数平均分子量は，それぞれ 41,000 と 19,000 であり，重量平均分子量/数平均分子量の比はそれぞれ 1.7，3.7 となる（Table 1）．つまり，Fig. 1 からもわかるように HES 70 は DEX 70 にくらべて低分子量の膠質を多く含んでいる．この分子量分布のため，代用血漿剤に含まれる膠質分子のうち，血管内皮細胞間隙よりも大きい分子は血管
内皮細胞間隙を透過せず有効な COP を発揮するのに対し，血管内皮細胞間隙よりも小さい分子は血管内皮細胞間隙を透過するため有効な COP を有さない．近年，欧州において開発された重量平均分子量が 130,000 の HES（Voluven ® ，Fresenius
Kabi，HES 130）は，アレルギー反応の原因となる非常に大きな分子量の膠質分子と血管内皮細胞間隙を容易に透過するため有効な浸透圧を発揮しない非常に小さな分子量の膠質分子を排除することにより，分子量分布の幅を狭めている 2）．
② 膠質分子の大きさ
代用血漿剤に含まれる膠質分子は異なった分子量分布を有し，またその形状が代用血漿剤により異なるため，膠質分子の大きさを単純にその平均分子量により比較できない．このため，

17

Table 1. Comparison of plasma substitutes in terms of molecular weight
ColloidMw (daltons)

Mn (daltons)

Mw/Mn ratio

DEX 4040,00025,0001.6

DEX 7070,00041,000

1.7

HES 7070,00019,000

3.7

HES 130

130,000

not available

not available

HES 200

200,000

not available

not available

HES 670670,000

69,0009.7

Mw: weight average molecular weight; Mn: number average molecularweight.
DEX 40: dextran of weight average molecular weight 40,000（lowmolecular weight dextran 40®, Otsuka Pharmaceutical）; DEX 70: dextranof weight average molecular weight 70,000; HES 70: hydroxyethyl starchof weight average molecular weight 70,000（Salinhes®, Fresenius Kabi
Japan）; HES 130: hydroxyethyl starch of weight average molecularweight 130,000（Voluven ®, Fresenius Kabi）; HES 200: hydroxyethyl
starch of weight average molecular weight 200,000（HAES-steril ®,Fresenius Kabi）; HES 670: hydroxyethyl starch of weight averagemolecular weight 670,000（Hetastarch®, Hospira, previously described as
HES 450）.
Cited in part from "Traylor RJ, Pearl RG. Crystalloid versus colloid
versus colloid: all colloids are not created equal. Anesth. Analg
1996;83:209-12."

通常，膠質分子の大きさの比較には，水中における膠質分子の拡散速度から計算した流体力学的分子半径（Stokes-Einstein
radius，SE 半径）が用いられる．DEX の SE 半径については，
下記の近似式がある 3）．

R = 0.033 ･ M 0.463（１）

ここで，R は DEX の SE 半径（nm），M は DEX の（重量平均）
分子量（Da）である．式（１）を使用して求めた重量平均分子
量が 40,000 である DEX（低分子デキストラン L 注 ®，大塚製薬
工場，DEX 40）および DEX 70 の SE 半径は，それぞれ，4.5 nm，5.8 nm となる（Fig. 2）．
一方，膠質分子の SE 半径は，分子が球形であると仮定して次の関係式により膠質溶液の固有粘度からも近似的に求められ
る 4）．

R=

3[η]M
10πN

1/3

･107

（２）

ここで，R は膠質分子の SE 半径（nm）,［η］は膠質溶液の固3
有粘度（cm /g），M は膠質分子の（重量平均）分子量（Da），
N は Avogadro 定数（6.02 × 10 23, mol-1）である．HES の SE 半
径については文献的資料が得られないため，著者が毛細管粘度計を用いて測定した HES の固有粘度を式（２）に代入して求めた SE 半径を Fig. 2 に示す．比較のため，DEX の SE 半径を粘度法により求めたところ，DEX 40 については 4.6 nm と式（１）により求めた値とほぼ一致したが，DEX 70 については 6.5 nmとなり式（１）により求めた値をやや上回った．

18

Fig. 2. Stokes-Einstein radius of plasma substitutes. DEX 40: dextran ofweight average molecular weight 40,000; DEX 70: dextran ofweight average molecular weight 70,000; HES 70: hydroxyethyl
starch of weight average molecular weight 70,000; HES 130:hydroxyethyl starch of weight average molecular weight 130,000;
HES 200: hydroxyethyl starch of weight average molecularweight 200,000; HES 670: hydroxyethyl starch of weight averagemolecular weight 670,000. Stokes-Einstein radius of plasma
substitute（denoted by the number in nm）was obtained fromequations in the text for dextran, and from intrinsic viscosity ofplasma substitute for hydroxyethyl starch. Stokes-Einstein radiusof albumin was cited from "Venturoli D, Rippe B. Ficoll anddextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular
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capillary pore（denoted by the number in nm）was cited from"Michel CC, Curry FE. Microvascular permeability. Physiol Rev
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予想されるように，代用血漿剤の中では，DEX 40 の分子半径が最も小さく，重量平均分子量が 670,000 である HES（Hetastarch®, Hospira, HES 670）の分子半径が 11.9 nm と最大になる．また，DEX 70 と HES 130 を比較した場合，HES 130の重量平均分子量は DEX 70 のほぼ２倍であるにもかかわらず，分子半径はわずか 0.2 nm しか異ならない．代用血漿剤の分子半径を Fig. 2 に付記した血管内皮細胞間隙の大きさ 5）と比
較すると，DEX 40 は small pore を比較的自由に透過すると予想される．HES 70 の分子半径は small pore のサイズとほぼ同じであるため，ある程度の膠質分子が small pore を透過する．
これに対し，DEX 70，HES 130，重量平均分子量が 200,000 である HES（HAES-steril ®, Fresenius Kabi, HES 200），HES 670
は small pore を透過しにくいと予想される．一方，いずれの代用血漿剤も large pore を自由に透過する．これらの結果は，ハムスターの骨格筋において，DEX 40 が血管内皮細胞表面層（endothelial surface layer, ESL）を容易に透過したのに対し，
DEX 70 は ESL を透過しなかったという知見 6）と一致する．
注意すべきことは，アルブミンの分子半径が DEX 40 よりも

人工血液 Vol. 17 , No.1, 2009

小さいことである．生体内では，アルブミンが有する負電荷がESL の負電荷と反発するため，アルブミンは血管内皮細胞間隙を透過しにくい 6）．つまり，電荷を持たない代用血漿剤については，膠質分子の大きさが血管内皮細胞間隙の透過性を決定す
るが，電荷（アルブミンなど）や極性（ゼラチンなど）を持った膠質分子の場合は，分子の大きさだけでなく，膠質分子とESL の負電荷との相互作用が血管内皮細胞間隙の透過性を決定する重要な因子となる 7）．
③ 膠質浸透圧の動的特性
半透膜を介した代用血漿剤の COP は，代用血漿剤が，ａ）どのくらい多くの膠質分子を含むか？
ｂ）どのくらい多くの大きな膠質分子（non-permeating colloid）
が，半透膜を透過せずに溶液内に残存するか？
ｃ）どのくらい多くの小さな膠質分子（permeating colloid）
が，どのくらい速く半透膜を透過するか？
により決まる 7）．つまり，代用血漿剤の COP は，静的なパラメータではなく，経時変化を伴った動的パラメータである．著者
が作成した膠質浸透圧計（Fig. 3）8）を用いて，代用血漿剤のCOP を経時的に測定すると，COP は時間により大きく変化する 7）．たとえば，分画分子量（この値以上の分子量の分子を透過させない）50,000 の半透膜（日本ミリポア社 限外ろ過ディス
ク PBQK，孔の推定半径： 4.8 nm）9）を用いて６％ DEX 40 の
COP を測定すると，COP は最初の約 10 分間に 25 mmHg 程度
まで急上昇した後に徐々に低下し，約８ mmHg で一定となった（Fig. 4）．この一過性の浸透圧上昇には，分画分子量より小さい膠質分子（permeating colloid）が関与している．つまり，低分子量の膠質分子は一時的に COP を発揮するが，これらの膠質分子が半透膜を透過するのにしたがい，これらの膠質分子に起因する COP が徐々に消失する．一方，最終的な平衡状態における COP は半透膜を透過しない大きな膠質分子（nonpermeating colloid）により引き起こされる．
HES の COP を半透膜の分画分子量を変えて測定すると，
COP の経時変化パターンは分画分子量によって異なる．分画
分子量 1,000 の半透膜（日本ミリポア社 限外ろ過ディスク
PLAC，孔の推定半径： 1.3 nm）9）を使用した場合，HES に含まれる膠質分子のほとんどが半透膜を透過しないため，COP
は徐々に上昇した後平衡に達し，その後もこの値を維持した（Fig. 5，上図）．一方，血管内皮細胞間隙に近い大きさの孔を有する半透膜（分画分子量 50,000，孔の推定半径： 4.8 nm）を使用すると，HES の COP は，いったん上昇した後，徐々に低下した（Fig. 5，下図）．COP の最初の立ち上がりが急峻なの

Fig. 3. Schematic representation of osmotic flow cell for measurement of
colloid osmotic pressure. Water flows from the reference chamberto the sample chamber due to the osmotic force exerted by thecolloid molecules（thick arrow）. Permeating（i.e., small）colloid
molecules diffuse from the sample chamber to the referencechamber（dotted arrow）. Cited from "Tatara T, Tashiro C.
Analysis using a linear viscoelastic model of the in vitro osmotic
kinetics of polydisperse synthetic colloids. Biomacromolecules
2005;6:1732-8."

Fig. 4. Typical time-course of colloid osmotic pressure for polydisperse
colloid.The data shows colloid osmotic pressure for 6 ％ dextran ofweight average molecular weight 40,000 using the osmotic flow
cell with semipermeable membranes of molecular weight cut-off
50,000. COP: colloid osmotic pressure.

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.1, 2009

Fig. 5. Representative recordings of colloid osmotic pressure for 6 ％hydroxyethyl starch solutions using the osmotic flow cell withsemipermeable membranes of molecular weight cut-off 1,000（upper panel）and 50,000（lower panel）. COP: colloid osmoticpressure; MWCO: molecular weight cut-off; HES 70: hydroxyethyl
starch of weight average molecular weight 70,000; HES 130:hydroxyethyl starch of weight average molecular weight 130,000;
HES 200: hydroxyethyl starch of weight average molecularweight 200,000; HES 670: hydroxyethyl starch of weight averagemolecular weight 670,000.

19

子量に依存することは，生体内における代用血漿剤の血漿増量効果を考える上で非常に重要である．つまり，炎症により毛細血管の血管内皮細胞間隙が拡大すると，より多くの膠質分子が有効な COP を発揮しなくなることになり，正常時の代用血漿剤の浸透圧特性を炎症時の体液動態にそのまま適用することはできない．

は HES 70 である．これは，HES 70 に多く含まれる小さな膠質分子が，一過性ではあるが急激に浸透圧活性を発揮するためである．一方，HES 200 と HES 670 は，分画分子量より小さな膠質分子をわずかしか含まないため，COP が最高値を示した後の COP の低下が小さい．しかし，HES 200 と HES 670 は，
HES 70 と HES 130 にくらべて COP の最初の立ち上がりが遅い．つまり，HES 200 と HES 670 は，HES 70 と HES 130 にくらべて緩徐に浸透圧活性を発揮する．これは，浸透圧が引き起
こす水移動が半透膜表面における膠質-水交換過程に基づいており，膠質分子が大きいほどこの膠質-水交換速度が低下するためである 7）．
６％ HES の COP の最高値を分画分子量が異なる半透膜間で比較した（Fig. 6）．溶質が半透膜をほとんど透過しない場合，溶液の浸透圧は基本的に溶液に含まれる溶質の数により決まる
ため，COP は代用血漿剤に含まれる膠質分子の総数を反映する．つまり，分画分子量 1,000 の半透膜（孔の推定半径： 1.3nm）を使用して測定した COP は，小さな膠質を多く含む HES
70 で最大となり（80 mmHg），HES 130，HES 200，HES 670の順に小さくなった．しかし，正常時の血管内皮細胞間隙に近い大きさの孔を有する半透膜（分画分子量 50,000，孔の推定半径： 4.8 nm）を使用すると，HES 70 は 16 mmHg，HES 130 とHES 200 は 20 mmHg，HES 670 は 18 mmHg の COP となり，
COP の大きさの順序が逆転した．さらに大きいサイズの孔を有する半透膜（分画分子量 100,000，日本ミリポア社 限外ろ過
ディスク PBHK，孔の推定半径： 6.2 nm）9） を使用すると，
HES 70 と HES 130 はほとんど COP を生じなかったが，HES
200 と HES 670 は 2 〜 3 mmHg の COP を発揮した．
このように代用血漿剤の COP の経時変化が半透膜の分画分① モデルの作成
体液動態シミュレーションに使用するモデルは，Bert ら 11），Gyenge ら 12）により提唱された生理学的モデル（microvascularexchange model）である．このモデルでは，各体液分画間の水・溶質（イオン，タンパク質）の移動を数式化し，時間につFig. 6. Comparison of peak colloid osmotic pressure for 6 ％ hydroxyethyl
starch solutions using the osmotic flow cell with semipermeable
membranes of molecular weight cut-off 1,000, 50,000 and 100,000.
COP: colloid osmotic pressure; MWCO: molecular weight cut-off;
HES 70: hydroxyethyl starch of weight average molecular weight
70,000; HES 130: hydroxyethyl starch of weight average molecularweight 130,000; HES 200: hydroxyethyl starch of weight averagemolecular weight 200,000; HES 670: hydroxyethyl starch of weightaverage molecular weight 670,000. The numbers in theparenthesis denote estimated pore radius of semipermeable
membranes. The measurements were carried out at room
temperature in duplicate.

Fig. 7. Schematic diagram showing the compartmental model of the bodyand the relevant mass flows of fluid, protein and synthetic colloid
in the normal state. JHEM: hemorrhage rate; JINF: fluid infusion rate;
JISL: insensible water losses; JIT: rate of fluid transfer from plasma
to interstitium; J L: rate of fluid transfer from interstitium tolymphatics; JPER: perspiration rate; JU: rate of urine production;
・Q HEM: rate of protein or synthetic colloid transfer by hemorrhage;
・
Q INF: rate of protein or synthetic colloid transfer by fluid infusion;
・
Q IT: rate of protein or synthetic colloid transfer from plasma tointerstitium; ・Q L: rate of protein or synthetic colloid transfer frominterstitium to lymphatics.

20２．体液動態シミュレーション
では，これら代用血漿剤の浸透圧特性は，臨床における体液動態にどのように反映されるのだろうか．臨床研究では，研究条件，たとえば，手術の規模・時間，輸液量・投与速度，輸液剤の種類などが異なるため，周術期における代用血漿剤の適切な使用方法について統一した見解を得ることは困難である．これに対し，コンピュータを用いたシミュレーションでは，研究条件を自由に変更することにより各体液分画の体液量変化をリ
アルタイムに分析することができる．モデルに使用するパラメ
ータ値の多くが動物での値であることやパラメータ値が対象者により異なることから体液量の絶対値の信頼性は高くないが，その相対値，つまり経時変化や異なる研究条件間の比較にシミュレーションは威力を発揮する 10）．ここでは，生理学的な体液動態モデルを用いたシミュレーションにより，様々な条件下における代用血漿剤投与時の体液動態を分析する．

人工血液 Vol. 17 , No.1, 2009

いての微分方程式を解くことにより，体液量の変化量を経時的に算出することができる．周術期の体液変化は主として細胞外液の変化であることから，今回は，彼らのモデルを簡略化し，血漿，細胞間質液の変化のみを考慮した（Fig. 7）．さらにリンパ流，尿排泄，不感蒸発を考慮し，各体液分画間の水，タンパ
ク質，代用血漿剤に含まれる膠質の移動に関する数式を作成した．数式の詳細については，文献 13，14）を参照していただきたい．
正常状態におけるモデルパラメータの値を Table 2 に示す．なお，今回のシミュレーションはすべて体重 70 kg の男性を対象として行った．
Table 2. Normal steady-state values for fluid and protein in thecompartments and parameters related to capillary exchange,
lymphatics and kidney in a 70 kg male 11-14）
Variables

ValuesPlasma volume (mL)

3200

Hematocrit (%)

40

Interstitial volume (mL)

8400

Plasma hydrostatic pressure (mmHg)

11

Plasma protein concentration (g/mL)

0.07

Interstitial protein concentration (g/mL)

0.0298Reflection coefficient for protein

0.875
-1

-1

Fluid filtration coefficient (mL･mmHg ･h )321.4

Permeability-surface area product for protein (mL/h)

200.7

Lymph flow sensitivity (mL･mmHg-1･h-1)

43.1

Lymph flow rate (mL/h)

75.7

Rate of urine production (mL/h)

60.0② モデルにおける仮定
体液動態シミュレーションを施行するには，次のような仮定（モデルの簡略化）が必要となる．
ａ）毛細血管内の静水圧は，血漿量の増減に比例して増減する．
実際には，毛細血管内の静水圧は，心拍出量や血圧の変動により変化し，さらに毛細血管の動脈側の括約筋が収縮するとその遠位側の血管内静水圧が低下する 2）．
ｂ）血漿タンパク質は，すべてアルブミンと同じ特性（分子量など）を持つ．
血漿の膠質浸透圧は，血漿総タンパク質濃度の関数として計算した 13）．
ｃ）正常時における毛細血管壁の水および高分子（タンパク質，
代用血漿剤に含まれる膠質分子）に対する透過性は，生体内で均一である．
血管内皮細胞間隙の多くは continuous capillary に存在する
small pore であるが，残りは venule に存在する large pore であ15）る（Fig. 8）．Small pore と large pore の数の比率は，4,000 ：１（骨格筋）から 1,000 ：１とされている 5）．血管内皮細胞間隙はARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.1, 2009

Fig. 8. Schematic representation of permeation of polydisperse colloids
through pores of different size in vascular beds. The fluid
distribution simulation assumed that polydisperse colloids wereglobular molecules of averaged size, and pores in vascular beds
had averaged radii. Cited and modified from "Jacob M, Bruegger
D, Rehm M, Stoeckelhuber M, Welsch U, Conzen P, Becker BF.
The endothelial glycocalyx affords compatibility of Starling's
principle and high cardiac interstitial albumin levels. Cardiovasc
Res 2007;73:575-86."

フリーなスペースではなく，血管内皮細胞表面の糖鎖ゲルからなる ESL が血管内皮細胞間隙を介した水および膠質移動を決定している（Fig. 8）．Continuous capillary における ESL の厚み
は，0.5 μm 程度であるのに対し，venule における large pore
は ESL を欠いている．したがって，ほとんどの膠質は large
pore を自由に透過し細胞間質に分布する 15）．体液動態シミュレーションにおいては，全身における平均的な血管内皮細胞間隙の半径（7.6 nm）を仮定し，この半径と膠質分子の SE 半径の関係から毛細血管壁における膠質の反発係数を算出した．
ｄ）尿生成速度は，血漿量の増減に比例して増減する．
実際には，尿生成速度は腎血流量に依存し，出血や手術侵襲時に増加するストレスホルモンは，尿生成を抑制する．
ｅ）代用血漿剤に含まれる膠質分子の大きさは均一である．
代用血漿剤に含まれる膠質の分子量は均一ではないため，シミュレーションにおいてはその平均的な大きさとして SE 半径を使用した．
ｆ）代用血漿剤に含まれる膠質分子の生体内における代謝および腎排泄は考慮しない．
代用血漿剤に含まれる低分子量（50,000 〜 60,000 以下）の膠質
分子は，投与直後から腎臓からすみやかに排泄される 2）．また，HES の高分子量成分は，血液中のアミラーゼによって数時間のうちに低分子量の膠質分子に分解される 2）．たとえば，ヒトにHES 70 1,000 mL を１時間かけて投与した際，投与終了１時間

21

Fig. 9. Plasma volume changes during saline infusion of 25 mL/kg over
20 min（upper panel）and fluid distribution during saline infusionof 10 mL/kg over 30 min（lower panel）in a simulated 70 kg male.
ΔVPL: plasma volume change relative to baseline; ΔV: volume
change relative to baseline. Filled circles denote experimental datain sheep and the solid line denotes the model-fitted curve（upper
panel）. Cited from "Tatara T, Tashiro C. Quantitative analysis of
fluid balance during abdominal surgery. Anesth Analg 2007; 104:347-54." The experimental data in sheep was obtained from
"Connolly CM, Kramer GC, Hahn RG, Chaisson NF, Svensén CH,
Kirschner RA, Hastings DA, Chinkes DL, Prough DS. Isoflurane
but not mechanical ventilation promotes extravascular fluid
accumulation during crystalloid volume loading. Anesthesiology
2003;98:670-81."

後において投与した HES 70 の 77 ％，投与終了３時間後においては 67 ％が血管内にとどまっていた 16）．このアミラーゼによる
HES の分解は，HES のグルコース環の水酸基をハイドロキシ
エチル基によって置換する度合い（置換度）に依存する．置換度が高いほどアミラーゼによる分解を受けにくくなるため，
HES の血中半減期が長くなる 2）．したがって，置換度が 0.7 である HES 670 にくらべて，置換度が 0.5 である HES 70 は，アミラーゼによる分解を受けやすいため，血漿増量効果の持続時間は短くなる．
ｇ）代用血漿剤は，毛細血管壁における水およびタンパク質の透過性に影響を与えない．
実際には，HES 130 が，炎症時における毛細血管内から細胞間質への水およびタンパク質漏出を減少させることが報告されている 17）．
③ 輸液時の血漿量の経時変化＜晶質液＞
正常時のヒツジにおける晶質液投与時の血漿量の経時変化 18）を体液動態シミュレーションモデルと比較することにより，モ

22

Fig. 10. Colloid osmotic pressure of hydroxyethyl starch（HES）solutions
as a function of HES concentrations using the osmotic flow cellwith semipermeable membranes of molecular weight cut-off
1,000. The hydroxyethyl starch（HES）solutions were diluted byphysiological saline（control, upper panel）or 8 ％ albumin
solution（lower panel）. COP: colloid osmotic pressure; HES 70:
HES of weight average molecular weight 70,000; HES 130: HES ofweight average molecular weight 130,000; HES 200: HES ofweight average molecular weight 200,000.

デルに用いる毛細血管の透過性パラメータの最適値を求めた 13）．
この結果，シミュレーションモデルが，輸液時の血漿量の経時変化を良好に予測できることがわかった（Fig. 9，上図）．そこ
で，このシミュレーションモデルを用いて晶質液 10 mL/kg を
30 分間で投与した時の血漿量，細胞間質液量，尿量の変化を算出した（Fig. 9，下図）．晶質液投与終了時，血漿量は投与輸液
量の約 40 ％だけ増加した後，急激に減少した．細胞間質液量は，晶質液投与により徐々に増加し，投与開始３時間後，投与輸液量の約 50 ％が細胞間質に分布した．最終的に投与輸液量の約 40 ％が尿として失われた．つまり，投与された晶質液は，投与終了後約 30 分間で血管内から細胞間質へすみやかに移動し，投与終了２時間後では血管内にほとんどとどまらない．
＜代用血漿剤＞
代用血漿剤投与時の体液動態シミュレーションには，各代用
血漿剤の COP 値が必要となる．特に，血漿，細胞間質にはアルブミンが存在するため，アルブミン濃度が代用血漿剤のCOP におよぼす影響を調べる必要がある．そこで，臨床的な膠質の血漿濃度（0.5 ％〜２％）において，アルブミン非添加（コントロール）および８％ アルブミン添加での HES の COP
を分画分子量 1,000 の半透膜を用いて測定した（Fig. 10）．この結果，８％ アルブミン存在下では，コントロールにくらべて，２％ HES の COP は，いずれの製剤でも５〜 10 mmHg 上昇した．これには，アルブミンの排除体積効果（アルブミンと HESが同一の空間を占めることができないため，HES の実効濃度が上昇する）が関与している．
これらの COP 値を使用して，６％ HES 70 1,000 mL を１時間かけて投与した時の血漿量の経時変化（総輸液量に対する血漿変化量のパーセント）をシミュレーションにより算出した

人工血液 Vol. 17 , No.1, 2009

（Fig. 11）．この結果は，小手術予定患者の術前または術後にHES 70 を同条件下で投与した時の血漿量変化 16）とおおよそ一致した．HES 70 投与終了 10 分後の血漿量増加が，臨床では90 ％とシミュレーションでの値（82 ％）をやや上回っているのは，実際には，HES 70 に含まれる小さな膠質分子が一過性に高い浸透圧活性を発揮するためと考えられる．
次に晶質液，５％ アルブミン，６％ HES（HES 70, HES
130, HES 200）をそれぞれ 15 mL/kg，30 分間かけて投与した時の血漿および細胞間質液量の経時変化をシミュレーションにより求めた（Fig. 12）．この結果，血漿増量効果は晶質液で最も小さく，投与終了時の血漿増加量は投与量の約 40 ％であった．一方，HES については，投与終了時の血漿増量効果は，
HES 70 において最大であり，投与終了時の血漿増加量は投与量の約 90 ％となった．HES 70 は小さな膠質分子を多く含むため，実際には投与終了時の血漿増加量はシミュレーション値よりやや高く，逆に投与終了後は，小さな膠質分子の血管外への漏出のためシミュレーションの結果よりすみやかに血漿増量効
果は消失すると考えられる．つまり，HES 70 の血漿増量効果
は，Fig. 5 に示した HES 70 の COP の経時変化に類似した経過をとる．この結果は，帝王切開を施行された患者において，晶質液および６％ HES 70 を 30 分間でそれぞれ約 25 mL/kg および約 16 mL/kg 投与した際，投与終了時の血漿増加量が，それぞれ投与量の 28 ％および 100 ％であった結果 19）とおおよそ一致する．HES 130 と HES 200 については，血漿増量効果の経時パ
ターンはほぼ同様であり，投与終了時の血漿増加量は投与量の約 75 ％で，投与終了後 2.5 時間でも投与量の約 50 ％が血管内にとどまっていた．この結果は，婦人科手術患者において，手術開始時から手術終了６時間後までに血圧，心拍数を安定化させるのに必要であった６％ HES 130 と６％ HES 200 の総量に有意な差がなかったとする報告と一致する 20）．また，ボランティ
アにおいて，HES による等容量性血液希釈を行った際のヘマト
クリット値の経時変化を HES70, HES 130, HES 200 間で比較した研究では，異なった HES 間でヘマトクリット値に有意な違いは認められなかった（Fig. 13）21）．この結果は，これら３種類の HES がほぼ同等の血漿増量効果を有していることを示している．HES 投与終了後，ヘマトクリット値が徐々に上昇しているのは，血漿の一部が尿として排泄されるためである（血液濃縮）．

Fig. 12. Time course of changes to plasma and interstitial volume during
crystalloid or plasma substitute infusion of 15 mL/kg over 30
min in a simulated 70 kg male in a normal state. Crys: isotonic
crystalloid solution; HES 70: 6 ％ hydroxyethyl starch of weightaverage molecular weight 70,000; HES 130: 6 ％ hydroxyethyl
starch of weight average molecular weight 130,000; HES 200: 6 ％hydroxyethyl starch of weight average molecular weight 200,000;
Albumin: 5 ％ albumin solution.

Fig. 13. Relative hematocrit changes during acute normovolemic
hemodilution by hydroxyethyl starch solutions in volunteers. Hct:
Hematocrit. Within 30 min, volunteer donated 18 ％ of his or her
own blood. In parallel, the respective 6 ％ hydroxyethyl starch（HES）solution was infused in a ratio of 1.2:1 to the donatedblood volume. There were no statistical differences of hematocrit
between different HES groups. The data was cited from "Standl
T, Burmeister M-A, Schroeder F, Currlin E, Schulte am Esch J,
Freitag M, Schulte am Esch J. Hydroxyethyl starch（HES）
130/0.4 provides larger and faster increases in tissue oxygen
tension in comparison with prehemodilution values than HES
70/0.5 or HES 200/0.5 in volunteers undergoing acutenormovolemic hemodilution. Anesth Analg 2003;96:936-43.".

Fig. 11. Plasma volume changes during 1000 mL infusion of 6 ％hydroxyethyl starch of weight average molecular weight 70,000
over an hour in a simulated 70 kg male in a normal state. ΔVPL:
plasma volume change relative to baseline; VINF: totally infused
fluid volume. The dashed line denotes percent of fluid infusion
volume relative to totally infused fluid volume. Clinical data inpatients hospitalized for minor surgical conditions was cited from
"Metcalf W, Papadopoulos A, Tufaro R, Barth A. A clinicalphysiological study of hydroxyethyl starch. Surg Gynec Obstet
1970;131:255-67."

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.1, 200923

Fig. 14. Comparison of plasma dilution between experimental data andthat predicted by our simulation model during 25 mL/kg
crystalloid infusion over 30 min in a 76 kg male when he wasnormovolemic（upper panel）and when 900 mL of blood waswithdrawn over 15 min（lower panel）. The experimental data innormovolemic state cited from "Drobin D, Hahn RG. Volume
kinetics of Ringer's solution in hypovolemic volunteers.
Anesthesiology 1999;90:81-91." was used to obtain estimatedvalues of the fluid filtration coefficient and the permeabilitysurface area product for protein by a fitting procedure using ourmodel（upper panel）. The time-course plasma dilution during
crystalloid infusion after 900 mL of blood withdrawal was
calculated by our model using these parameter values（lower
panel）. Cited from "Tatara T, Tsunetoh T, Tashiro C. Crystalloid
infusion rate during fluid resuscitation from acute haemorrhage.
Br J Anaesth 2007;99:212-7."

一方，５％ アルブミンは，血漿増量効果が膠質液の中では最も小さく，投与終了時の血漿増加量は投与量の約 60 ％であった．投与終了後，血漿量は徐々に減少した．Rehm ら 22）は，
婦人科手術患者 20 名を対象として，手術開始前に 15 分かけて５％ アルブミンまたは６％ HES 200 を 20 mL/kg 投与し，投与終了 30 分後に血漿量を測定した．その結果，それぞれ投与
した５％ アルブミンおよび６％ HES 200 の 38（± 21）％，43（± 26）％が血管内にとどまっていた．同時点での血漿量増加
は，シミュレーションではそれぞれ 43 ％，66 ％であった．
細胞間質液量は，晶質液および５％ アルブミンでは増加したのに対し，HES では正常値以下まで徐々に減少し，その効果
は HES 70 において最大であった（Fig. 12，下図）．この結果は，HES が細胞間質から血管内へ水を動員することにより血漿増量効果を発揮することを示している．
④ 出血時の体液動態
血液量の 20 ％以内の出血（〜 15 mL/kg）に対しては，晶質液の投与により対応できることが多い．教科書によると血液量の回復には｢出血量の約３〜４倍の晶質液が必要｣であり，これは｢投与した晶質液の約 20 ％が血管内にとどまるため｣と説明されている．しかし，Fig. 9 に示したように晶質液投与時の血24

Fig. 15. Time course of changes to blood and interstitial volume during
fluid resuscitation by crystalloid solution from acute hemorrhageof 15 mL/kg over 30 min in a simulated 70 kg male in a normal
state. Isotonic crystalloid solution of 2, 3 or 4 times thehemorrhage volume was intravenously administered over 60min.

漿量増加は時間経過により大きく変化する．そこで，シミュレ
ーションモデルを用いて出血時の晶質液による蘇生の分析を行った 14）．
まず，正常時における晶質液投与時（25 mL/kg を 30 分間で投与）の血漿希釈（血漿増加量/晶質液投与前の血漿量の比）の経時変化の臨床データ 23）をもとにモデルにおける毛細血管の透過性パラメータの最適値を求めた（Fig. 14，上図）．このパラメータ値を用いて，体重 76 kg の男性において 15 分間に 900
mL の出血終了直後に 25 mL/kg の晶質液を 30 分間で投与した時の血漿希釈をモデルにより求めた結果，臨床データとおおよそ一致した（Fig. 14，下図）．
では，急性出血による血液量減少を補うには，出血量の何倍の輸液量が必要だろうか．急性出血（30 分間に 15 mL/kg）後に 60 分間にわたって出血量の２，３，４倍量の晶質液を投与した時の血液量と細胞間質液量の経時変化を示す（Fig. 15）．
出血終了時の血液量の減少が 12.4 mL/kg と出血量よりやや少なくなっているのは，出血による血漿量の減少を補うために水が細胞間質から血管内に動員されたためである．血液量を回復するには，出血量の２，３倍の輸液では不十分で，出血量の４倍の輸液が必要であった（Fig. 15，上図）．しかし，出血量の４倍の輸液でもボーラス投与のみでは血液量は 40 分間程度しか回復しなかった．つまり，投与された輸液は徐々に血管内から細胞間質に移動するため，出血量の４倍の輸液では細胞間質
液量は約 45 mL/kg 増加した（Fig. 15，下図）．
今度は，急性出血（30 分間に 15 mL/kg）後に出血量と同量の５％ アルブミンまたは６％ HES（HES 70, HES 130, HES
200）を 30 分間にわたって投与した時の血液量と細胞間質液量

人工血液 Vol. 17 , No.1, 2009

Fig. 16. Time course of changes to blood and interstitial volume during
fluid resuscitation by plasma substitute from acute hemorrhageof 15 mL/kg over 30 min in a simulated 70 kg male in a normal
state. Plasma substitute of equal to the hemorrhage volume wasintravenously administered over 30 min. HES 70: 6 ％hydroxyethyl starch of weight average molecular weight 70,000;
HES 130: 6 ％ hydroxyethyl starch of weight average molecularweight 130,000; HES 200: 6 ％ hydroxyethyl starch of weightaverage molecular weight 200,000; Albumin: 5 ％ albumin
solution.

の経時変化を示す（Fig. 16）．６％ HES では，いずれの製剤でも投与終了時に血液量はほぼ出血前値まで回復したが，５％アルブミンでは血液量は出血前値まで回復しなかった．HES
70 は小さい膠質分子を多く含むため，投与終了後の血液量回復
効果はよりすみやかに消失すると考えられるが，HES 130 および HES 200 については，投与終了２時間後でも出血前の血液量を維持していた．HES が細胞間質から血管内へ水を動員する結果，細胞間質液量は出血前値にくらべて減少するが，この作用は HES 70 において著明であった．
⑤ 手術時の体液動態
手術時には手術侵襲により手術部位の組織に炎症が生じる．
この結果，毛細血管壁の水およびタンパク質に対する透過性が亢進するため，水が血管内から細胞間質に漏出し，細胞間質の浮腫が生じる．この結果，輸液を行っているにもかかわらず，
低血圧や尿量減少などの血漿量不足（hypovolemia）の臨床兆候を呈する．これに関し，「代用血漿剤は血漿量を維持し，細胞間質の浮腫を軽減させることができる」との考えがある一方，「細胞間質に漏出した膠質分子がかえって細胞間質の浮腫を増強させる」との可能性が指摘されてきた 24）．集中治療室入室患者を対象とした研究では，４％ アルブミン投与群と生理食塩水投与群の間で，集中治療室入室日数や人工呼吸を必要とした日数などに有意な違いは認められなかった 25）．一方，敗血症患者を対象とした研究では，HES 200 投与は，乳酸リンゲル液投
与にくらべて急性腎不全の発生率を増加させた 26）．しかし，こARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.1, 2009

Fig. 17. Schematic diagram showing the compartmental model of the
body and the relevant mass flows of fluid, protein and synthetic
colloid during abdominal surgery. JHEM: hemorrhage rate; JINF:
fluid infusion rate; JISL: insensible water losses from whole bodyor injured tissue; J IT: rate of fluid transfer from plasma tointerstitium; J L: rate of fluid transfer from interstitium tolymphatics; JPER: perspiration rate; JU: rate of urine production;
・Q HEM: rate of protein or synthetic colloid transfer by hemorrhage;
・
Q INF: rate of protein or synthetic colloid transfer by fluid infusion;
・
Q IT: rate of protein or synthetic colloid transfer from plasma tointerstitium; ・Q L: rate of protein or synthetic colloid transfer frominterstitium to lymphatics. Cited and modified from "Tatara T,
Tashiro C. Quantitative analysis of fluid balance during
abdominal surgery. Anesth Analg 2007;104:347-54."の研究では，投与された HES 200 の濃度が 10 ％と高濃度であることから，HES 200 の組織への蓄積による有害事象が発現した可能性がある．このように，大規模な臨床研究では，対象患者の違い（手術患者，重症患者），代用血漿剤の濃度の違いなどのため，代用血漿剤の適正な使用に関する見解が異なる．
そこで，手術患者を対象として，手術中の輸液を晶質液のみで施行する場合と代用血漿剤を併用する場合の体液動態をシミュレーションにより比較した．
＜モデルの作成＞
上または下腹部の開腹消化管手術を仮想し，手術操作がおよぶ上または下腹部を手術部位，四肢・胸部など手術操作がおよばない身体部位を非手術部位とした．体液動態シミュレーショ
ンモデル（Fig. 7）において全身を手術部位と非手術部位にわけ，全身の体液の 20 ％が手術部位に分布するとした（Fig. 17）．
これにより，手術部位・非手術部位の細胞間質の体積をそれぞれ算出することができる．さらに，ネコ骨格筋での炎症時のデータをもとに，手術部位では，手術侵襲に伴う炎症の進行に伴い毛細血管壁の水ろ過係数が正常時の 31 ％だけ増加し，毛細血管壁のタンパク質反発係数が正常時の 30 ％だけ減少するとした 13）．なお，炎症時には，細胞間質のゲル構造が変化することにより，細胞間質の静水圧が正常時にくらべて陰圧となる 27）．
この静水圧勾配にしたがって血管内から細胞間質に水が移動す
るが，体液動態シミュレーションモデルは，この特性を考慮し
ていない．

25

＜手術時の体液動態シミュレーション＞
８時間の開腹消化管手術において，基本となる晶質液投与速度を６ mL/kg/h とした．そして，１時間の尿量が１ mL/kg を下回った時は，晶質液投与を一時中断し，15 分間かけて晶質液，５％ アルブミンまたは６％ HES（HES 70, HES 130, HES 200）
をそれぞれ 250 mL ボーラス投与した．輸液の体液動態への影
響を明確にするため，手術中の出血はなしと仮定した．手術中の血漿量，手術部位・非手術部位における細胞間質液量および尿量の経時変化を求め，異なる輸液製剤間で比較した（Fig. 18）．
手術が進行するにしたがい，晶質液を投与しているにもかかわらず，手術開始２時間後には血漿量不足の状態になった．これに起因する尿量減少に対し，晶質液をボーラス投与しても血漿量の増加はわずかであり，血漿量不足がさらに進行した．これに対し，５％ アルブミンまたは６％ HES のボーラス投与は血漿量を正常値まで回復させることができたが，その効果は５％ アルブミンが最も小さく，HES 70，HES 130，HES 200
はほぼ同等であった（Fig. 18，上段）．しかし，血漿量を維持する時間は，HES 200 が最も長かった．これは，分子量が大き
い HES 200 は，血管透過性が亢進している状態においても血漿量を維持する効果を有していることを示している．

細胞間質については，５％ アルブミンまたは６％ HES の投
与は，晶質液のみの投与にくらべて非手術部位における体液貯留を著明に抑制した．その効果は，アルブミンよりも HES が大きく，HES の投与は晶質液のみの投与にくらべて非手術部位
における体液貯留を半減させた（Fig. 18，中段）．これに対し，手術部位の体液貯留は，晶質液のみの投与と HES 130 の投与ではほぼ同程度，逆にアルブミンの投与では晶質液のみの投与の場合をわずかながら上回った（Fig. 18，下段）．これに対し，
HES 70 および HES 200 の投与は，晶質液のみの投与にくらべてそれぞれ約 15 ％，約 30 ％だけ手術部位の体液貯留を軽減させた．これは，HES 200 に含まれる大きな膠質分子が，手術部位においてもある程度の有効な COP を発揮することにより，細胞間質の浮腫を軽減する可能性を示している．
結果として，HES の併用は，晶質液のみの投与にくらべて手術中に必要となる総輸液量を約 10 ％減少させたが，アルブミ
ンは総輸液量を減少させなかった（Fig. 19）．また，アルブミ
ンおよび HES 投与は，晶質液投与にくらべて，それぞれ約15 ％，40 〜 60 ％だけ尿量を増加させた．この結果は，手術中の血漿量不足に対する HES 投与が循環動態を安定化させ，肺などの非手術部位の水分貯留を抑制することにより開腹消化管
手術後の回復を早める可能性を示している．

Fig. 19. Comparison of totally infused volume and urine volume during 8
h-abdominal surgery in a simulated 70 kg male for crystalloid,
albumin or hydroxyethyl starch solution. Crys: isotonic
crystalloid solution; Albumin: 5 ％ albumin solution; HES 70: 6 ％hydroxyethyl starch of weight average molecular weight 70,000;
HES 130: 6 ％ hydroxyethyl starch of weight average molecularweight 130,000; HES 200: 6 ％ hydroxyethyl starch of weightaverage molecular weight 200,000.
Fig. 18. Time course of changes to plasma and interstitial volume during
8 h-abdominal surgery in a simulated 70 kg male. Isotonic
crystalloid solution was intravenously administered at a rate of
6 mL/kg/h. When urine volume for an hour was below
1 mL/kg, 250 mL bolus of crystalloid, 5 ％ albumin or 6 ％hydroxyethyl starch（ HES）solution was intravenously
administered over 15 min（shown by incremental increases ofplasma volume）instead of crystalloid infusion of 6 mL/kg/h.
Crys: isotonic crystalloid solution; HES 70: HES of weightaverage molecular weight 70,000; HES 130: HES of weightaverage molecular weight 130,000; HES 200: HES of weightaverage molecular weight 200,000.

26⑥ 手術時の出血
手術侵襲により毛細血管の透過性が亢進した状態での急性出血は，周術期体液管理の大きな課題である．つまり，先述のような正常時における出血の場合と異なり，血管透過性が亢進した状態では，投与した輸液製剤の多くが血管外へ漏出するため，血液量の回復が困難となる可能性がある．そこで，先述の開腹消化管手術において，基本となる晶質液投与速度を８ mL/kg/hとし，手術開始３時間後に急性出血（30 分間に 15 mL/kg）が生じたとした．そして，出血終了後に５％ アルブミンまたは

人工血液 Vol. 17 , No.1, 2009

６％ HES（HES 70, HES 130, HES 200）を 30 分間にわたって
出血量と同量投与した時の血液量の経時変化を示す（Fig. 20）．
この結果，アルブミンは血液量を回復させる効果が最も乏しかった．一方，一時的に血液量を回復させる効果は，HES 70 が最も大きく，次いで HES 130 と HES 200 がほぼ同程度であった．注目すべきことは，代用血漿剤の投与終了後，HES 130 では徐々に血液量が減少したのに対し，HES 200 では逆に血液量が徐々に増加した．これは，HES 200 が，手術時でも血管内の有効な COP を維持することにより，細胞間質から血管内へ水を緩徐に動員することを示している．

３．シミュレーションのまとめと臨床的意義
正常時および急性出血時には，HES 70，HES 130，HES 200の血漿増量効果はほぼ同程度であった（Fig. 12，Fig. 16）．しかし，手術侵襲により毛細血管の透過性が亢進した状態では，血漿増量効果の持続時間は HES 200 において最も長かった（Fig. 18）．このため，手術時の急性出血に対して，HES 200 は血液量回復効果を長く維持することができた（Fig. 20）．HES
70 も，一時的ではあるが大きな血液量回復効果を示した．これ
ら代用血漿剤投与時の体液動態シミュレーションは，周術期における HES の選択に関するヒントを与える．
HES 70 は，分子量の小さな膠質分子を多く含むため，一時的ではあるが大きな血漿増量効果を速効性に発揮する．しかし，これら分子量の小さな膠質分子はすみやかに血管外へ漏出するため，血漿増量効果の持続時間は短い．したがって，HES 70
は，麻酔薬による血管拡張に起因する一時的な血圧低下を防い
だり，毛細血管の透過性が正常な状態における急性出血に対する血液量の回復に適している．あるいは，開腹消化管手術などの侵襲の大きな予定手術において，手術中の晶質液投与を制限
し，血漿量不足を HES 70 により補えば，肺などの非手術部位
組織の浮腫を軽減することができる．しかし，敗血症のように高度に毛細血管の透過性が亢進した状態では，HES 70 は有効
な COP を発揮しないため，HES 70 の血漿増量効果はほとんど期待できない．
一方，HES 130 と HES 200 は，正常時においては HES 70 とほぼ同等の血漿増量効果を示した．しかし，高分子量膠質を含む HES 200 は，毛細血管の透過性が亢進した状態でも大きな膠質分子が血管内にある程度とどまるため，持続の長い血漿増量効果を発揮する可能性がある．したがって，HES 200 は，手術後患者や敗血症など毛細血管の透過性が高度に亢進している症例における血漿量維持に適している．さらに，HES 130 は，抗炎症作用や血管透過性亢進を抑制する作用が報告されており 28），
今回のシミュレーションでは把握できない新たな効果を手術侵襲時の体液動態におよぼす可能性がある．

おわりに代用血漿剤の血漿増量効果は，代用血漿剤の膠質浸透圧特性と各種病態における血管内皮細胞間隙の大きさの両者に依存する．最近発表された周術期輸液に関する総説では，従来の晶質
液中心の輸液を見直す必要性が提唱されている 29）．つまり，晶質液投与を必要最小限にとどめ，急性出血などによる血漿量不足に対して代用血漿剤を積極的に使用することが，患者の予後を改善する．今回の体液動態シミュレーションは，多くの仮定に基づいているため，あくまで体液量変化の目安として理解すべきである．しかし，これまで臨床にそくした体液動態を記述
するモデルはほとんどなく，臨床現場では手探りの体液管理を余儀なくされてきた．これに対し，体液動態シミュレーション
は輸液時の体液動態を予測するのに有用であり，教育面での効果，さらには臨床研究を行うための予備的実験としての役割が期待される．今後，臨床データへのフィードバックによりモデルの妥当性を評価し，モデルに改良を加えていくことが必要である．これにより，体液動態シミュレーションが，科学的な根拠に基づいた代用血漿剤の適切な使用に少しでも貢献できることを期待する．

引用文献

Fig. 20. Time course of changes to blood volume during fluid
resuscitation by albumin or hydroxyethyl starch solution fromacute hemorrhage of 15 mL/kg over 30 min during 8 habdominal surgery in a simulated 70 kg male. The 5 ％ albuminor 6 ％ hydroxyethyl starch（HES）solution of equal to thehemorrhage volume was intravenously administered over 30 min
after acute hemorrhage. Albumin: 5 ％ albumin solution; HES 70:
6 ％ HES of weight average molecular weight 70,000; HES 130:
6 ％ HES of weight average molecular weight 130,000; HES 200:
6 ％ HES of weight average molecular weight 200,000.

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人工血液 Vol. 17 , No.1, 2009

総説

ヒト ES 細胞からの血液産生
Generation of blood cells from human ES cells
辻 浩一郎
Kohichiro Tsuji

和文抄録
輸血療法は，現在の先端医療においてもなお重要な治療法といえるが，ドナー人口の減少，感染症のリスクなど，輸血医療には多くの問題があり，安全な輸血用血液の安定的確保が強く求められている．そこで，半永久的に増殖でき，血液細胞を含む全ての組織細胞に分化可能なヒト胚性幹細胞（ES 細胞）が，輸血用血液の新たな供給源として注目されている．しかし，ヒト ES 細胞由来の血液が実際の輸血医療に臨床応用されるためには，技術的にも，倫理的にも数多くの解決されるべき問題が残されており，我々はそれらを着実に克服していく必要がある．
Abstract
Blood transfusion is an important therapy even at the developed present medicine. The main problems impeding progress inblood transfusion are the inconsistency of supply and the risk for infection of various microorganisms. Therefore, increased
interest in the use of human embryonic stem（ES）cells has emerged to procure a large quantity of safe blood for therapeutictransfusion, because they can proliferate in culture without apparent limits and also differentiate all cell types includinng blood
cells. Although there remain a number of technological and ethical issues for the clinical use of human ES cell-derived blood
cells, we have to solve them step by step to achieve it.
Keywords
Embryonic stem cells, Induced pluripotent stem cells, Blood cells, Blood transfusion, Hematopoietic stem cells, Erythropoiesis

はじめに患者の体内循環中に血液を輸注する輸血療法は，様々な疾患に対する治療の補助療法として極めて重要な治療技術といえる．特に近年の移植医療などの医療技術の高度化に伴い，輸血療法の重要性はこれまで以上に高まってきている．現在輸血療法として用いられている血液細胞としては，赤血球，血小板，
好中球などがあり，これらは成分輸血として効率的に利用されるようになってきた．
赤血球輸血は歴史的には最も古くから行なわれてきたが，現在の先端医療においても不可欠な治療法であることにかわりはない．しかし輸血用赤血球の供給は今なお多くのドナーの善意に依存しているため，ドナーの対象となる青壮年齢層の人口減
少とともに輸血用赤血球の供給量の絶対的不足が社会問題となりつつある．さらに，輸血用赤血球は不特定多数のドナーから採取されるため，種々の感染症の危険性など，その安全性も大きな問題となっている．そのため充分量の安全な輸血用赤血球
東京大学医科学研究所 先端医療研究センター 細胞療法分野〒 108-8639の安定確保が強く求められている．
一方近年需要が増加している血小板輸血についても，恒常的なドナー不足に悩まされている．さらに好中球輸血については，
重症感染症に対する有効性（特に抗がん剤治療などにより好中球減少をきたしている患者において）が証明されているにもかかわらず，ドナー不足のために実施できない場合が多い．
こうした社会状況を背景に，半永久的に増殖可能なヒト胚性幹細胞（ES 細胞； embryonic stem cell）から輸血用血液を産生しようという研究が進んでいる．本稿では，我々のヒト ES細胞からの赤血球産生の試みを例にとりながら，そうしたヒト
ES 細胞からの血液産生の研究の現状と課題を概説する．

造血における幹細胞システム
我々の体の組織には各組織特異的に，幹細胞と呼ばれるごく少数の細胞集団を頂点とする幹細胞システムが存在し，我々の生体を一生にわたり維持していると考えられている．こうした
東京都港区白金台 4-6-1

Division of Cellular Therapy, Advanced

Clinical Research Center, Institute of Medical Science, University of Tokyo, 4-6-1 Shirokanedai, Minato-ku, Tokyo, 108-8639 Japan
論文受付 2009 年１月７日 論文受理 2009 年１月 24 日

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.1, 200929

我々成人の各組織に存在する幹細胞は，体性幹細胞あるいは成体幹細胞，組織幹細胞と呼ばれ，自分と同じ能力を有する幹細胞を複製する能力（自己複製能）と複数の機能細胞に分化する能力（多分化能）という二つの能力を併せ持つことによって，恒常的に死滅していく各組織の細胞を過不足無く補充している．造血組織にも造血幹細胞を頂点とする体性幹細胞システムが存在し，造血幹細胞は，各々固有の寿命で崩壊している形態と機能を異にする種々の血液細胞を一生の間供給し続けている．
Fig. 1 は造血幹細胞から血液細胞が産生される過程を示している．恒常状態では多くの造血幹細胞は静止期にあり，必要に応じて細胞周期に入り細胞分裂する．造血幹細胞が細胞分裂すると，その娘細胞は自己複製して再び造血幹細胞となるか，あるいは分化して多能性造血前駆細胞（multipotential hematopoietic
progenitor）となる．多能性造血前駆細胞はすでに分化することが運命づけられた細胞で，多分化能は有しているが自己複製能は持たないことより造血幹細胞とは区別される．

造血幹細胞から赤血球への分化
Fig. 2 は，赤血球造血という観点から成人造血幹細胞から成熟赤血球への分化を示している．前述の通り，造血幹細胞から分化した多能性造血前駆細胞は，細胞分裂を繰り返しながら次第に多分化能を喪失し，赤血球への分化を運命付けられた赤血球系前駆細胞（erythroid progenitor）となる．この分化段階までの細胞は小リンパ球様で，形態学的に区別することは困難とされている．赤血球系前駆細胞は，分化段階によって BFUE（erythroid burst-forming unit）と CFU-E（erythroid
colony-forming unit）に分けられる．この名称は，造血前駆細胞 の in vitro 検 出 法 で あ る 血 液 細 胞 コ ロ ニ ー 形 成 法（hematopoietic colony-forming assay）に由来する．

Fig. 2. Differentiation of hematopoietic stem cells into erythrocytes inhuman adult.

Fig. 1. Proliferation and differentiation of hematopoietic stem cells.

造血幹細胞由来の多能性造血前駆細胞は細胞分裂を繰り返しながら次第にその多分化能を失い，数種類の血球系細胞への分化能のみを有する寡能性造血前駆細胞（oligopotent
hematopoietic progenitor）を経て，単一の血液細胞への分化を運命付けられた単能性造血前駆細胞（monopotent
hematopoietic progenitor）となり，最終的にはリンパ球を含む全ての血液細胞を産生する．この造血幹細胞から血液細胞が産生される過程は，主に血液細胞を取り囲んでいるストローマ
細胞と細胞外マトリックスから成る「造血微小環境」（ニッチ（Niche）とも呼ばれる）と，種々の細胞から産生される液性因子であるサイトカインにより制御されている．特に単能性造血
前駆細胞から血液細胞への分化には，各血液細胞に特異的なサイトカインが重要な役割を担っている．赤血球造血の場合はエリスロポエチン（EPO: erythropoietin），巨核球造血ではトロ
ンボポエチン（TPO: thrombopoietin），好中球造血では G-CSF（granulocyte colony-stimulating factor）がこれにあたる．

血液細胞コロニー形成法とは，造血前駆細胞を EPO などの種々の造血に必要なサイトカインを含むメチルセルロースのよ
うな半固形培地を用いて，炭酸ガス培養器中で培養する方法である（Fig. 3）．半固形培地の中で増殖するため，１個の造血前駆細胞から産生された血液細胞は拡散することなく細胞塊として観察され，これを血液細胞コロニーと呼ぶ．この血液細胞コ
ロニーに含まれる血液細胞を解析することにより，その血液細胞コロニーの起源となった前駆細胞を推定することができる．
例えば，顆粒球，マクロファージなどの骨髄系細胞からなる顆
粒球・マクロファージコロニーならば骨髄球系前駆細胞，顆粒
球，マクロファージ，赤血球が混在するコロニー（混合コロニーと呼ぶ）ならばいずれの血液細胞にも分化可能な多能性造血Fig. 3. Hematopoietic colony-forming assay.

30

人工血液 Vol. 17 , No.1, 2009

前駆細胞を起源とすると判断される．
赤血球系前駆細胞を血液細胞コロニー培養法で１週間培養す
ると，約 50 〜 100 個の赤血球系細胞からなる赤い球状の細胞集団が出現する（Fig. 4A）．このコロニーは赤血球コロニーと呼ばれ，このコロニーの起源となった前駆細胞が CFU-E と呼ばれる．一方２週間培養すると，赤血球コロニー（これをサブコ
ロニーと呼ぶ）が数個から数十個集まったような細胞集団が出現する（Fig. 4B）．この細胞集団は倒立顕微鏡下ではバースト（爆発）のように見えることから赤血球バーストと呼ばれ，その前駆細胞は BFU-E と呼ばれる．

ある一方，in vivo では半永久的に自己複製し続ける造血幹細胞も in vitro での増幅率は，現在までの報告では数倍から十数倍に留まっている 1）．そこで，大量の赤血球産生の供給源として，半永久的に増殖可能なヒト ES 細胞が注目されるようになってきた．

ES 細胞研究の歴史
受精卵は卵割を繰り返して，胎生初期に胚盤胞（blastocyst）となる（Fig. 5）．ES 細胞は，この胚盤胞内の未分化な幹細胞集団である内部細胞塊（inner cell mass）から分離した細胞を，マウス胎仔線維芽細胞（MEF; mouse embryonic fibroblast）などのフィーダー細胞と共培養することにより樹立される．
1981 年にマウスにおいて初めて ES 細胞が樹立された 2，3）．マウス ES 細胞は，MEF 以外にも STO 細胞などのフィーダー細胞あるいは LIF（leukemia inhibitory factor）存在下の培養により未分化な状態のまま増殖継代される 4）．

Fig. 4. Erythroid colony（A）and erythroid burst（B）.

成体の CFU-E と BFU-E ではサイトカインに対する感受性が異なっている．成体の赤血球コロニーは EPO 刺激のみで形成されるが，赤血球バーストは形成されない．赤血球バーストが形成されるためには EPO の他に SCF（stem cell factor），
interleukin（IL）-3 などのサイトカイン刺激が必要であり，これらのサイトカインの活性はバースト促進活性（BPA ： burstpromoting activity）と表現される．このことは，EPO に対する感受性を獲得する─言い換えれば細胞表面に EPO 受容体を発現してくるのは CFU-E からで，BFU-E は EPO 受容体を発現していないことを示している．一方 BFU-E は SCF の受容体
（c-Kit）や IL-3 の受容体を発現しており，これらのサイトカイ
ンは BFU-E から CFU-E への分化を促進していると考えられる．
EPO 刺激により CFU-E が前赤芽球（proerythroblast）へと分化すると形態学的にもそれと判断することが可能となる．前
赤芽球ではすでにヘモグロビン（Hb: hemoglobin）合成が始まっており，その後好塩基性赤芽球（basophilic erythroblast），
多染性赤芽球（polychromatic erythroblast），正染性赤芽球（orthochromatic erythroblast）と形態を変えつつ分化する．
成人正染性赤芽球は最終的には脱核を果たして赤血球となる．
単に赤血球を産生するだけならば，必ずしも ES 細胞から赤血球を作る必要はなく，造血幹細胞，多能性造血前駆細胞，あるいは赤血球系前駆細胞からも赤血球産生は可能である．しかし多能性造血前駆細胞や赤血球系前駆細胞の増殖能には限界が

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Fig. 5. Establishment of ES cells.

マウス ES 細胞を同系マウスや免疫不全マウスの皮下や精巣内に移植すると，外胚葉，中胚葉，内胚葉の３胚葉に属する細胞が混在するテラトーマが形成される．また，マウス ES 細胞を注入された胚盤胞を成体雌マウスの子宮に移植すると，ES細胞由来細胞を有するキメラマウスが作られ，このキメラマウ
スの交配により ES 細胞由来の完全なマウス個体ができる．こうした ES 細胞由来の個体の作製は遺伝子改変された ES 細胞でも可能であり，これを利用して多くの遺伝子改変マウスが作製され，数々の遺伝子の機能解析に大きく貢献してきた．同時にこのことは，ES 細胞が生殖細胞を含めた全ての組織細胞に分化可能であり，最終的には個体全体を形成することができることを示している．その意味において ES 細胞は，体性幹細胞の多能性に対して全能性を有する幹細胞といわれる．
その後マウス以外の動物でも ES 細胞が樹立されたが，ついに 1998 年にヒト ES 細胞が樹立された 5）．当然のことながらヒ
ト ES 細胞からキメラ個体が作製できるか確認することはでき
ないが，ヒト ES 細胞を免疫不全マウスに移植すると，マウス
ES 細胞と同様に３胚葉由来の組織を含むテラトーマが形成されることより（Fig. 6），ヒト ES 細胞もマウス ES 細胞と同様に全能性を有していると考えられている．しかしヒト ES 細胞は，

31

マウス ES 細胞と比較して栄養芽細胞に分化しやすい，マウス
ES 細胞の維持に有用な LIF が有効でない，発現する分化マー
カーに差違があるなど，マウス ES 細胞と異なる性質を有することも指摘されており，実際マウス ES 細胞の研究成果がヒト
ES 細胞に適応できないことはしばしば経験される．そこにヒト ES 細胞を研究する意義があり，困難さもあるといえる．

ていない．我々は，ヒト ES 細胞から血液細胞への分化誘導が従来の培養法では非効率的であった理由として，胎生期を起源とする ES 細胞から血液細胞への分化誘導には，胎生期の特定な時期に特定な部位で特異的に機能する分子の刺激が重要であると推測し，ヒト ES 細胞から血液細胞へ効率的に分化誘導するためには胎生期の造血環境を再現することが有効ではないかと考えた．
そこで，研究計画「ヒト胚性幹細胞（ES 細胞）から造血細胞への分化誘導法の開発」を，東京大学倫理審査委員会の承認を得た後，平成 14 年７月８日に文部科学省特定胚及びヒト ES
細胞研究専門委員会に申請した．同年 12 月 20 日に同委員会により本研究は承認され，文部科学大臣の確認を得て開始された．
しかしヒトの胎生期造血については，倫理的問題からヒト胎児の詳細な解析が困難であるため，充分に解明されているわけではない．また同様に倫理的な理由から，ヒトの胎児組織を実験に使用することもできない．ただ幸いなことに，ヒトと同じ哺乳類であるマウス由来のストローマ細胞の多くがヒト造血支持能を有することが報告されていたので，マウス胎仔の造血環境を in vitro で構築することを計画した．

マウス胎生期造血Fig. 6. Generation of teratoma from human ES cells in an immunodefficientmouse.

ES 細胞の分化
マウス ES 細胞から in vitro で分化誘導可能な細胞としては血液細胞 6-8），血管内皮細胞 9），神経細胞 10）などが報告されている．
こうした誘導法の多くは，ES 細胞をフィーダー細胞非存在下で浮遊培養により形成される胚様体を利用したもので，胚様体を種々の条件で培養し胚様体内部の細胞分化を誘導する方法 9，10），
初期胚様体から形成される芽細胞コロニーから分化誘導する方
法 7）などがある．また胚様体を用いない方法としては，ES 細胞を種々のストローマ細胞上で培養する方法 6），ある程度分化させた ES 細胞の中から特定の分化能を有する細胞を細胞表面マーカーなどにより選別して分化させる方法 8）などがある．さらに最近では，種々の細胞分化に関わる転写因子の遺伝子を導入することにより，ES 細胞を特定の機能細胞へ分化誘導しようという試みも行われている．例えば，myoD により筋細胞へ，
Hox11 により血液細胞へ，PDX-1 により膵β細胞への分化誘導などが試みられている．
一方ヒト ES 細胞では，神経細胞 11），心筋細胞 12），膵臓β細胞 13），内皮細胞 14）などへの分化誘導が報告されている．ヒト
ES 細胞から血液細胞への分化誘導については，胚様体を用いた培養法 15）とストローマ細胞を用いた培養法 16）が報告されている．しかし，そのいずれの方法でも血液細胞への分化誘導効率は必ずしも高くなく，また分化誘導された血液細胞が実際に臨床応用可能な機能を有しているかについても十分に検討され

32

哺乳類では胎仔が母体の子宮内で発育するため，これまでマウスにおいても胎生期造血の解析は必ずしも容易ではなかった
が，近年の解析技術の進歩によりその全体像が次第に明らかとなりつつある．マウスに限らず哺乳類の胎生期造血の最大の特徴は，造血臓器が胎仔の発育に伴い移動することである（Fig. 7）．ただし最近まで，造血細胞自身が実際に造血臓器間を移動するのか，あるいは各々の造血臓器で新たな造血が発生するのかについては，厳密に検証されていなかったが，解析技術の進歩により胎生期造血においては実際に造血細胞が造血臓器間を移動することが明らかになってきた 17）．
Fig. 7 に示すように，マウス胎生期造血においては，初期の造血は胎生７〜８日に胚体外組織である卵黄嚢（yolk sac）の血島で発生し，これを一次造血（primitive hematopoiesis）という．一方中期以降の造血を担うことになる二次造血（definitive hematopoiesis）は胎生 10 日頃の胚体内の AGM 領域（AGM region ：大動脈（aorta），性腺（gonad），中腎Fig. 7. Mouse embryonic hematopoiesis.

人工血液 Vol. 17 , No.1, 2009

（mesonephros）を含む領域）と呼ばれる部位に出現し 18，19），その後造血の場を胎仔肝（fetal liver）に移す 20）．そこで造血細胞は劇的に増幅した後，最終的には骨髄，脾臓へと移動し，その後一生にわたって血液細胞を供給し続けることになる．
このように，胎生期の造血細胞が胎児の発育とともに，あた
かも最適な造血環境を求めるかのごとく造血臓器を移動していくことは，胎生期の造血細胞にとって，その発達段階に応じたニッチが極めて重要な役割を果たしていることを意味している．実際，マウスの AGM 領域から樹立されたストローマ細胞
はマウスの胎仔組織からの造血幹細胞の発生を支持することができるし 21），胎子肝から樹立されたストローマ細胞は造血細胞の分化・増殖を支持することができる 22）．

Fig. 8 に示すように，ζグロビン，εグロビンは一次造血においてのみ，βグロビン，δグロビンは二次造血においてのみ産生される．一方αグロビンは一次造血から一生にわたり産生され続ける．γグロビンも一次造血から産生されるが，出生直前から急激に産生が低下し生後６ヶ月以降はほとんど産生されなくなる．その結果，一次造血では Hb Portland（ζ 2 γ 2），
Hb Gower I（ζ 2 ε 2）
，Hb Gower II（α 2 ε 2）の３種類の Hb
が，二次造血では Hb F（α 2 γ 2），Hb A（α 2 β 2），Hb A 2（α 2 δ 2）の３種類の Hb が産生される．

一次造血と二次造血
一次造血と二次造血では，造血幹細胞やリンパ球造血は一次造血には存在せず二次造血において初めて出現する，また一次
造血と二次造血では関連する遺伝子が違うなど，明らかな違いがあるが，両者の赤血球造血にも大きな違いが認められる．
１）形態学的違い
哺乳類の一次造血で作られる赤血球（胚型赤血球）は成熟しても脱核することはなく有核のままだが，二次造血の成熟赤血球（成体型赤血球）は最終的には脱核し，小型の赤血球となる．
また一次造血の胚性赤血球は，二次造血の成体型赤血球と比較して寿命が短期であることも知られている．
２）EPO に対する依存性の違い
既述のように，二次造血である成体の赤血球造血においては，
Fig. 2 の分化過程の CFU-E 以降の分化は EPO に依存している．
ところが血液細胞コロニー形成法を用いて，一次造血に由来する胎生８日のマウス胎仔の卵黄嚢と二次造血に由来する胎生 15日の胎仔肝の CFU-E を培養してみると，後者では赤血球コロニー形成には EPO が不可欠であるが，前者においては EPO は必須ではなく，SCF だけでも赤血球コロニーは形成される．また EPO あるいは EPO 受容体遺伝子欠損マウスでは，一次造血の赤血球造血は減少するものの保持されるが，二次造血の赤血
球造血の CFU-E 以降の分化は完全に障害される 23，24）．これらのことは，二次造血の赤血球造血には EPO は不可欠であるが，一次造血においては EPO が必ずしも必須でないことを示している．
３）Hb の違い
Hb は４分子のヘムと２対のグロビン−ペプチド鎖から構成され，グロビン−ペプチドは１対のα様グロビンと１対のβ様グロビンから成る四量体である．ヒトの Hb としては，２種類のα様グロビン（α，ζ）と４種類のβ様グロビン（β，γ，δ，ε）の組み合わせにより，少なくとも６種類の Hb が一次
造血と二次造血で出現するが，両者の赤血球では合成される
Hb が異なっている．

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.1, 2009

Fig. 8. Globins in human fetus and infant.

ただ Fig. 8 からも予想されるように，二次造血初期の赤血球で合成される Hb の多くは Hb F で，臍帯血中の赤血球では Hb
F が 80%，Hb A が 20%を占める．しかし，出生直前から Hb Fの合成量は急激に低下し，生後６ヶ月の乳児の赤血球では Hb
A が 97%，Hb A2 が 2.5%を占め，Hb F は 0.5%以下となりその後はこの比率は大きくは変わらない．Hb A と Hb F では酸素結合能が異なっている．従って，臍帯血と成人末梢血の酸素解
離曲線を比較すると，同じ酸素分圧では臍帯血の方が酸素結合能が高い．胎盤では，この結合能の差により臍帯血と母体血の間で酸素の受け渡しが行なわれると考えられる．

ヒト ES 細胞から血液細胞への分化
前述の様に，マウス胎生期造血においては，一生を担うことになる二次造血は胎生中期の胎仔肝で爆発的に増幅して大量の血液細胞が産生されることから，我々は胎生 14 〜 16 日のマウ
ス胎仔肝からストローマ細胞を樹立し，ヒト ES 細胞との共培養を試みた．
ヒト ES 細胞をマウス胎仔肝より樹立されたストローマ細胞と共培養すると，培養３日目頃まではヒト ES 細胞は未分化な状態を維持して増殖し続けるが，４日目頃より分化を開始し，小型の円形細胞が出現し始める（Fig. 9）．これらの小型円形細胞は次第に増加し，培養 10 〜 12 日目頃には，その一部は未分化な造血細胞の増殖を示す，いわゆる cobble stone area（CSA）（未分化な造血細胞がストローマ細胞下を這うようにして増殖

33

する様子が，敷石を敷きつめたように観察されることから，この名称で呼ばれる）を形成し，その数は次第に増加する．CSAの数が最大となる培養 14 〜 16 日目頃にこれらの培養細胞を採取し，EPO，TPO，IL-3，SCF，G-CSF，GM-CSF（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor）存在下で血液細胞コロニー培養すると，赤血球系前駆細胞に由来する赤血球コロニーおよびバースト，骨髄球系前駆細胞に由来する顆
粒球・マクロファージコロニー，多能性造血前駆細胞に由来する混合コロニーなど，様々な血液細胞コロニーが形成される 25）．
これらの血液細胞コロニーには赤血球，好中球，マクロファー
ジ，巨核球などの血液細胞が含まれており，特にヒト ES 細胞
由来の赤血球は，HbA を合成する二次造血由来の赤血球であり，その酸素運搬能も確認することができた 26）．

Fig. 9. Coculture of human ES cells with murine fetal liver-derived
stromal cells.

以上の結果は，我々の開発したマウス胎仔肝由来ストローマ
細胞を用いた培養法により，ヒト ES 細胞から多能性造血前駆細胞を含む種々の造血前駆細胞が分化誘導され，さらにそれらの前駆細胞から多くの血液細胞への分化誘導が可能となったことを示している．

ヒト ES 細胞からの血液産生における技術的問題
前述のようにヒト ES 細胞から血液細胞の分化誘導が可能となり，その臨床応用が現実のものとなりつつある．しかしそれが実際に実現されるためには，解決されねばならない幾つかの技術的問題がある．
１）ヒト ES 細胞の樹立および維持培養に関わる問題
ヒト ES 細胞の樹立や維持に，現時点では MEF やウシ胎仔血清が必要とされているという問題がある．異種間感染ということを考えれば，こうした異種の細胞や血清に依存しないヒト
ES 細胞の樹立，維持培養法が開発されねばならない．

34２）ヒト ES 細胞から血液細胞への分化誘導に関わる問題
ヒト ES 細胞から血液細胞への分化誘導においても，我々の方法と同様にその多くの分化誘導法が動物細胞や動物血清に依存していることが問題となる．またヒト ES 細胞が半永久的に増殖可能であるとしても，現在の小規模な分化誘導法では大量の血液細胞の産生は難しい．実際に臨床応用に充分な量の血液細胞をヒト ES 細胞から産生するためには，分化誘導培養法のスケールアップが必須である．
さらに，ヒト ES 細胞から種々の血液細胞が分化誘導されたといっても，ヒト ES 細胞の一部が分化誘導されたというだけであって，全てのヒト ES 細胞を血液細胞に分化誘導できる方法は確立されていない．ただ，目的とする血液細胞だけを選別して用いることは可能かもしれない．例えば我々の方法でヒト
ES 細胞から分化誘導された赤血球系コロニーでは，RT-PCR
レベルでも未分化な ES 細胞などの血液細胞以外の細胞は検出できないので 25），これらのコロニーを多数採取すれば赤血球系
細胞のみを集められる．さらに集められた赤血球系細胞に放射線照射可能なことから，増殖可能な細胞を含まない赤血球系細胞集団を作製することができる．
またこれまでのところ，ヒト ES 細胞から安定的に造血幹細胞を分化誘導する方法は確立されていない．もしヒト ES 細胞から造血幹細胞への分化誘導が可能となれば，造血幹細胞移植
医療におけるドナー不足を解決できるかもしれない．さらには，
ヒト ES 細胞由来造血幹細胞を使用することによって，これまで一過性にしか効果を発揮することができなかった種々の先天性造血不全や免疫不全の遺伝子治療の効果を恒久的に維持することが可能となるかもしれない．ただしヒト ES 細胞由来の成熟血液細胞の輸血と違って，ヒト ES 細胞由来の造血幹細胞を移植するためには HLA（human leukocyte antigen）という免
疫学的バリアーを克服しなければならない（ヒト ES 細胞由来
赤血球を輸血する場合には，血液型を一致させるだけでよい）．

移植免疫の克服
前述のように，ヒト ES 細胞から目的とする造血幹細胞が invitro で分化誘導できたとしても，実際の移植医療に利用する
ためには移植に伴う免疫反応を克服しなければならない．ただし，臍帯血移植に用いられる造血幹細胞が必ずしも全てのHLA を一致させる必要がないことを考えれば，ヒト ES 細胞から分化誘導された造血幹細胞を用いた移植においても患者のHLA と完全に一致させなくてもよい可能性はあるし，あるいはその方が GVL（graft versus leukemia）効果という点では有利かもしれない．しかし現時点では，安全性という点を考慮す
れば HLA が完全に一致するヒト ES 細胞を用意するのが妥当と考えられる．もちろん外傷などにより損傷した組織の治療というような場合には，患者と全く同じ遺伝子をもったヒト ES 細胞を用意することが理想といえる．そうしたヒト ES 細胞由来の移植片を用いた移植における免疫学的問題を解決する方法としては，現在以下のようなことが考えられている．

人工血液 Vol. 17 , No.1, 2009

１）ヒト ES 細胞バンク
現行の臍帯血移植医療における臍帯血バンクの成功を考えれば，様々な HLA を有するヒト ES 細胞を作製しこれをバンキングしておき，移植時にドナーと一致する HLA を持った ES 細胞から必要な造血幹細胞を作製するという方法が考えられる．しかし，仮に用意する ES 細胞が臍帯血と同程度の HLA の一致度でよいとしても，実際には多数のヒト ES 細胞の樹立と維持ということには，技術的にも倫理的にも多くの困難がともなうと予想される．
２）ヒト ES 細胞の遺伝子改変
マウス ES 細胞で培われてきた遺伝子改変技術を駆使して，HLA の問題を解決しようという考えがある．方法としては，相同遺伝子組替えを利用してドナーの HLA 遺伝子をヒト ES 細胞に導入する方法，さらには内在する HLA 遺伝子を破壊した
ヒト ES 細胞を作製し，これに必要とされる HLA 遺伝子を導入する方法などが考案されている．
３）体細胞核移植の応用
あまりにも有名な羊のドリーの成功 27）以来，体細胞核の未受精卵への移植によるクローン動物の作製技術は畜産分野において著しい進歩を遂げた．この核移植技術を用いて組織適合性の問題を解決しようという試みが提案されている．核移植のレシ
ピエント細胞としてはヒト ES 細胞自身とヒト未受精卵が考えられている．前者においては，患者の体細胞核を移植された
ES 細胞を分化誘導して患者と同じゲノムを持った移植片を得ることになるが，現在のところ技術的にまだ困難な点が多い．
一方後者においては，患者の体細胞核をヒト脱核未受精卵を移植されたクローン胚から得られた胚盤胞を用いて，患者本人のゲノムを持つ ES 細胞を樹立し，この ES 細胞から移植片を作製する．この方法は，少なくとも現時点では前者よりも実現性は高いが，その過程で作製されるクローン胚から得られた胚盤胞を成人女性の子宮に移植すれば，理論的にはいわゆるクローン
人間の作製が可能であり，このことが後述する倫理的問題をはらんでいる．

会の承認を得た研究についてはヒト ES 細胞の作製と使用が認められることとされている．我々の研究についても本指針を遵守して実施されている．
ヒトクローン胚研究については，2001 年に成立した「ヒトに関するクローン技術等の規制に関する法律」（クローン技術規制法）によりクローン人間の誕生は法的に禁止されている．しかしクローン胚を用いた研究については，2004 年７月に総合科
学技術会議の生命倫理専門委員会により，科学的妥当性が検証されたヒトクローン胚研究については基本的に認めるという最終報告書がまとめられた．ただこの報告書に対しては批判も多く，現在のところはクローン胚研究の科学的検証のための枠組
みの構築がほとんど進んでおらず，実質的にはモラトリアム状
態にある．
そうした状況下で，京都大学の山中伸弥教授が，ヒト体細胞である皮膚繊維芽細胞に４つの遺伝子（Oct4, Sox2, c-Myc,
Klf4）を導入することにより，ヒト ES 細胞に類似した性質を有する iPS 細胞（induced pluripotent stem cell）の樹立に成功した 28）．もしヒト iPS 細胞がヒト ES 細胞の代替細胞として医療に応用可能であるならば，ヒト胚を破壊することなくの ES 細胞類似の iPS 細胞を作製できることなる．同時に患者固有の
iPS 細胞の樹立が可能となれば，免疫学的問題を克服するためにクローン胚を作製する必要もなくなり，ヒト ES 細胞を用いた再生医療における倫理的問題の多くが解決されたことになる．もちろんヒト ES 細胞と iPS 細胞が全く同様の性質を有す
るか否かについては，今後の厳密な検討を待たねばならない．

まとめ
ヒト ES 細胞や iPS 細胞から安全な輸血用血液や造血幹細胞が大量に産生できるようになれば，現在の輸血医療や造血幹細胞移植医療は大きく様変わりするであろうし，先天性造血障害や免疫不全が遺伝子治療により治癒することも夢物語ではなくなる．しかしその実現のためには数多くの克服されるべき課題があり，我々は拙速に陥ることなくひとつひとつの問題を確実に解決していかなければならない．

参考文献
ヒト ES 細胞をめぐる倫理的問題
ヒト ES 細胞を用いた再生医療に関わる倫理的問題は大きく
は，ヒト ES 細胞の作製に必要とされるヒト胚に関わる問題と，免疫学的問題を克服するために作製されるヒトクローン胚に関わる問題に分けられる．ただこうした倫理的問題の背景には，
個人あるいは社会が抱える宗教，思想，生命観の違いがあり，全ての人々が納得する回答はないともいえる．実際，これらの倫理的問題に対する取り組みには世界各国でかなりの違いがある．
我が国においては，ヒト ES 細胞の作製と使用について 2001
年に文部科学省より「ヒト ES 細胞の樹立及び使用に関する指針」が示された．この指針では，ヒト胚を「生命の萌芽」と位置付け慎重に扱われねばならないとした上で，同省の審査委員

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人工血液 Vol. 17 , No.1, 2009

トピックス

E-Cell Systemによるヒト赤血球代謝シミュレーションの展開
Development and Applications of Human Erythrocyte Simulation
using E-Cell System
西野 泰子（1，2），谷内江 綾子（1，3），冨田 勝（1，2，4）
Taiko Nishino (1,2), Ayako Yachie-Kinoshita (1,3), Masaru Tomita (1,2,4)

和文抄録
分子生物学の進歩により精緻で信頼性の高い細胞モデルの構築が可能になりつつある現在，生体細胞を対象としたコン
ピュータシミュレーションは生物学や医学の分野においても注目を集めている．慶應義塾大学にて発足したE-Cellプロジ
ェクトでは，ヒト赤血球代謝モデルを構築し，シミュレーションの結果を生物学的な視点に基づいて考察することで赤血球生理機能の解明に取り組んできた．本稿では，G6PD異常症の解析，赤血球低酸素応答の解明，そして輸血用保存赤血球の代謝予測といったこれまでに行われてきた赤血球代謝シミュレーションについて概説し，細胞シミュレーション研究の意義や臨床応用へ向けた展望についての所感を述べる．
Abstract
E-Cell project has been founded in Keio University in order to facilitate cell simulation for experimental biologists and medical
scientists, who are unfamiliar with computer science. We developed computer model of human erythrocyte metabolism anddiscussed simulation results from the biological viewpoint. Here we explain simulated results of E-Cell erythrocyte model:
analysis of G6PD deficiency, prediction of hypoxia-induced metabolic alterations, and computational approach for prolonging cold
preservation of erythrocytes. We also suggest the significance and the perspective of living cell simulation research.
Keywords
Erythrocyte metabolism, Computer simulation, G6PD deficiency, Hypoxia-induced metabolic alteration, Blood preservation

はじめに

Table 1. 赤血球代謝モデルの特徴

ヒトをはじめとした哺乳類の赤血球は，核や小胞体，ミトコ
ンドリアなどの細胞小器官を成熟段階で失い，内部にヘモグロビンを大量に有する非常に単純な袋状細胞である．赤血球はこのようにきわめて簡単な構造を持つことやサンプル採取のしやすさから，古くから様々な分野で研究材料として用いられてきた．細胞シミュレーションの研究分野でもヒト赤血球はモデルケースとして重用されており，数々の数理モデル1-12）が発表されている（Table 1.）．細胞シミュレーションとは，生化学や分子生物学で得られた知見を元に細胞内で起きている生命プロセ（1）慶應義塾大学 先端生命科学研究所〒252-8520

Rapoport et al.
Joshi and Palsson
Mulquiney and Kuchel
Nakayama et al.
Kinoshita et al.
Kinoshita et al.

特徴
出典
解糖系モデル［1−2］
赤血球細胞の包括的モデル［3−6］
2,3−BPG代謝系, pHによる酸素親和性の変化 ［7−9］GSH生合成系, GSSG排出系［10］
メトヘモグロビン還元系［11］
ヘモグロビンと酸素の関係［12］

スを再構築してその動的挙動を理解しようとする試みである．
Fig. 1.に細胞シミュレーション研究の概要を示した．生命シス
テムの作用原理の解明に向けたシミュレーションが主流である
が，測定機器の限界や倫理的な問題から生物学実験では観察が神奈川県藤沢市遠藤5322

Institute for Advanced Biosciences, Keio University, Endo

5322, Fujisawa, Kanagawa 252-8520, Japan（2）慶應義塾大学大学院 政策・メディア研究科 Systems Biology Program Graduate School of Media & Governance, Keio University（3）慶應義塾大学 医学部 医化学教室 School of Medicine, Keio University, Biochemistry and Integrated Medical Biology, Keio Univ.
（4）慶應義塾大学 環境情報学部 Environment & Information Studies, Keio University
論文受付 2008年11月12日 論文受理 2008年12月３日

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.1, 200937

Fig. 2. E-Cell ヒト赤血球代謝モデルに含まれる代謝経路
代謝物質の略称はTable2を参照．
［12］
から転載．

Table 2. E-Cell赤血球代謝モデルに含まれる反応・代謝物質・略語一覧
代謝系
解糖系

Fig. 1. 細胞シミュレーション研究の概要

不可能な生命現象も予測できるという利点があり，薬効の作用機序の予測や人工臓器の開発への展開も期待されている．1997
年に慶應義塾大学環境情報学部で発足したE-Cellプロジェクト
では，全細胞シミュレーションの実現に向けたシミュレーショ
ンプラットフォーム（E-Cell System / E-Cell Simulation
Environment）の技術開発とそれを用いた細胞モデル構築に取り組んでいる13）．このプロジェクトの一環として，ヒト赤血球の主要な代謝制御機構とそれに関連した物質の輸送機構を再現するシミュレーションモデルをE-Cell System上に構築してきた10-12）．赤血球の代謝ネットワークを対象としたシミュレーシ
ョンは1980年代頃から盛んに行われてきた（Table 1.）．その理由として，細胞システムの抽象化が容易であること，モデル構
築の際に必要となる生化学的な情報がすでに揃っていることなどが挙げられる．E-Cellヒト赤血球代謝モデルでは，これまで
は部分的に表現されていた数種類の代謝系，膜輸送系，イオンポンプ機構を統合し，すべての酵素反応をその特性にあわせた
反応速度式で表現することに成功している．E-Cellヒト赤血球
代謝モデルで再現されている代謝経路をFig. 2.とTable 2.に示す．
本稿では，E-Cell Systemを用いたシミュレーションとメタ
ボローム解析を主軸に展開されている赤血球生理機能の解明に向けた取り組みについて解説し紹介する．

38

代謝物質

略記

GlucoseGlucose 6−phosphate
Fructose 6−phosphate
Fructose 1,6−bisphosphate
Dihydroxyacetone phosphate
Glyceraldehyde 3−phosphate
1,3−Bisphosphoglycerate
3−Phosphoglycerate
2−Phosphoglycerate
Phosphoenolpyruvate
Pyruvate
Lactate

GLC
G6P
F6P
F−1,6BPDHAP
GA3P
1.3−BPG
3PG
2PG
PEP
PYR
LAC

Gluconolactone 6−phosphate

Ribulose 5−phosphate
Sedoheptulose 7−phosphate
Xylulose 5−phosphate
Erythrose 4−phosphate
Glutathione（reduced）
Glutathione（oxidized）
Ribose 5−phosphate

GL6P
GO6P
RU5P
S7P
X5P
E4P
GSH
GSSG
R5P

ペントース
リン酸回路

Ribose 1−phosphate
5−Phosphoribosyl 1−phosphate
Inosine monophosphate
InosineAdenineAdenosine
Hypoxanthin

R1P
PRPP
IMP
INO
ADE
ADO
HX

核酸代謝

Nicotinamide adenine dinucleotide
Nicotinamide adenine dinucleotide
Nicotinamide adenine phosphate
Nicotinamide adenine phosphate
Potassium ion
Sodium ion
Inorganic phosphate
Total adenosine diphosphate
Total adenosine monophosphate
Total adenosine triphosphate
Total 2,3─bisphosphoglycerate

NAD
NADH
NADP
NADPH
Ki
Nai
Pi
t A DPt A MPt ATP
t 2,3−BPG

膜輸送系

ペントース
Gluconate 6−phosphate
リン酸回路

核酸代謝

代謝系
解糖系

酵素反応プロセス

略記

Hexokinase
Phosphoglucoisomerase
Phosphofructokinase
Aldolase
Triose Phosphate isomerase
Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase
Diphosphoglycerate mutase
Diphosphoglycerate phosphatase
Phosphoglycerate kinase
Phosphoglyceromutase
EnolasePyruvate kinase
Lactate dehydrogenase
Glucose 6−phosphate dehydrogenase
6−Phosphogluconolactonase
6−Phosphogluconate dehydrogenase
Transaldolase
Transketolase Ⅰ
Transketolase Ⅱ
Ribose−5−phosphate isomerase
Xylulose−5−phosphate isomerase
Glutathione turnover
Glutathione reductase
Adenosine deaminase
Adenine phosphoribosyl transferase
Adenosine kinase
Adenosine monophosphate deaminase
AMP phosphohydrolase
Adenylate kinase
Hypoxanthine−guanine phosphoryl transferase
Inosine monophosphatase
Purine nucleotide phosphorylase
Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase
Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase
Adenine transport process
Adenosine transport process
Hypoxanthine transport process
Inosine transport process
Lactate transport process
Pyruvate transport process
Inorganic phosphate transport process
GSSG transport process
Leak of potassium
Leak of sodium
Sodium／potassium pump

HK
PGI
PFK
ALD
TPI
GAPDH
DPGM
DPGase
PGK
PGM
ENO
PYR
LDH
G6PDH
6PGLase
6PGODH
TA
TK1
TK2
R5PI
X5PI
OX
GSSGR
ADA
ADPRT
AK
AMPDA
AMPaseAPK
HGPRTIMPasePNPasePRM
PRPPsyn
ADEtr
ADOtr
HXtr
INOtr
LACtr
PYRtr
Pitr
GSSGtrK̲LeakNa̲Leak
Nak̲Pump

ヒト赤血球代謝モデルによるG6PD酵素異常症の病態解析
G6PD異常症は変異酵素の産生によって起こる遺伝性疾患で，赤血球の先天性酵素異常症でも最も患者数が多い．G6PDはペントースリン酸回路の入り口部分の反応に関与する律速酵素であり，細胞内の抗酸化物質であるNADPHや還元型グルタチオン（GSH）の生成に重要な役割をもつことが知られている（Fig. 3-A）．変異によってG6PDの酵素活性が低下すると，抗酸化物質であるNADPHやGSHが不足して酸素ストレスによる赤血球タンパク質の変性を引き起こし，急性溶血性貧血の症状をもたらす．変異酵素の性質によって臨床症状は異なり，重度の患者では酵素活性の著しい低下による慢性溶血性貧血の症状を呈する場合もある．このG6PD異常症に特有な代謝異常をシ

人工血液 Vol. 17 , No.1, 2009

A

B

Fig. 3. G6PD異常症のシミュレーション解析
A:G6PD周辺の代謝プロセス
B:G6PD異常症シミュレーションの結果 GSH関連代謝系を組み込
む前（破線）と組み込み後（実線）の赤血球モデルで200,000秒のシ
ミュレーションを実行したときの濃度変化．ATP（A）, GO6P（B）,
GSH（C）, GSSG（D）, NADP（E）NADPH
（F）
［10］
から転載

ミュレーションによって再現し，周辺代謝系とG6PD異常症の関連性についての詳細な解析を試みた．
まず，G6PD異常症患者の赤血球から取得された酵素反応速度に関するデータを文献から入手し，構築した赤血球代謝モデ
ルに適用してシミュレーションを行った結果，NADPHやGSHが枯渇し，溶血性貧血をもたらす病態が再現できていた（Fig.
3-B 破線）．しかし同時に，解糖系活性やATP濃度も著しく低下していた．G6PD異常症の赤血球細胞では解糖系酵素の活性やATP濃度は正常細胞と差異がないことが実証されていることから14），構築したモデルではG6PD異常赤血球の代謝動態を正しく再現できていないと考えられた．この結果から，モデルには考慮されていない系がG6PD異常症の病態再現に必要である可能性が示唆され，これまでモデルに組み込まれていなかった代謝経路にも注目した．
赤血球細胞では膜を介して輸送された３種類のアミノ酸（グルタミン酸，システイン，グリシン）と２分子のATPからGSHが生合成される15，16）．また，GSSGはATPの駆動力を利用して能動的に細胞外へ輸送されている17，18）．これらの機構を数理モ
デル化し従来モデルに組み込んでG6PD異常症のシミュレーシ
ョンを行ったところ，解糖系活性とATP濃度を維持しつつ，ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.1, 2009

同時に，NADPHやGSHの減少というG6PD異常赤血球に特徴的な代謝の挙動が再現されていた（Fig. 3-B 実線）．
モデル拡張前後のG6PD異常症のシミュレーション解析を通して，G6PD異常症の病態を再現するには，主要な代謝経路だ
けでなくGSH生合成系やGSSG排出系の存在が不可欠であることが示された．換言すれば，モデル拡張の対象としたこれらの代謝系はG6PD異常赤血球の解糖系活性やATP濃度の維持に重要な機能を果たしている，ということが指摘された．次に，効率的な酸素運搬を可能にしている赤血球の代謝酸素センサーメ
カニズムの理解を可能にしたシミュレーション研究を解説する．

赤血球低酸素応答のシミュレーション予測とメタボローム
解析による実証
生体内における赤血球の生理的意義を考えるとき，その主たる機能である酸素運搬を無視することはできない．この機能はヘモグロビンが担っており，赤血球内はヘモグロビン分子が大量にひしめき合っている状態である．ヘモグロビンによる酸素運搬機能は二酸化炭素などのガス分子やATP, 2,3-BPGなどの代謝物質によって複雑に制御されている．先述したように，赤血球細胞のシミュレーション研究については歴史が深く，代謝
ネットワーク解析のみならず，ヘモグロビンの分子機構やヘモグロビンとガスの関係性をモデル化した研究も多い 19-21）．しかし，ヘモグロビンによる酸素運搬と代謝という異なる事象を関連付けたシミュレーション研究はこれまで前例がなかった．そこで，ヘモグロビンによる酸素運搬機能を付加した赤血球代謝モデルの構築に取り組んだ．ヘモグロビンが酸素を感知して代謝に影響を及ぼし，代謝の状態遷移が酸素運搬機能に反映される仕組みをFig. 4.に示す．まず，酸素飽和曲線を実装し，酸素分圧とヘモグロビン飽和度の決定因子（2,3-BPG, pH, 温度, 二酸化炭素濃度）によりヘモグロビンの２つの構造（R型/T型）の存在比を算出可能にした．また，ヘモグロビンはATPや2,3BPGといった代謝物質と結合し，これらの結合度合いはR型/T型の状態によって大きく異なっていることに注目した．この現象を再現するため，２つのヘモグロビン型と代謝物質との結合定数を文献から調査し，ヘモグロビンと代謝物質の結合を実装した．さらに，赤血球膜に最も多く含まれる陰イオン輸送タン
パク質であるBand3の細胞質ドメインにヘモグロビンと解糖系酵素（PFK, GAPDH, ALD）が競合的に結合することがわかっており，これらの解糖系酵素は結合により可逆的に活性を失う
ことが報告されている．このタンパク質間相互作用についても同様にモデルへの実装を行った．
このシミュレーションモデルを用いて，酸素分圧を100mmHgから30mmHgへ下げることで低酸素状態を再現した結果をFig. 5-A, 5-Bに示した．Band3と酵素・ヘモグロビンの結合を考慮したモデル（Band3（+）モデル：図中では実線）では，結合を考慮しないモデル（Band3（−）モデル：図中では破線）に比べて解糖系の活性化が顕著に起こることがわかった．
このとき，Band3（−）モデルでは代謝物質濃度にほとんど変化

39

Fig. 4. ヘモグロビンの状態変化・Band3を介した赤血球代謝制御の概要が見られなかったが，Band3（+）モデルからは解糖系前半に位置するG6PとF6P濃度は低下，解糖系後半の物質濃度は上昇（フルクトース1,6ビスリン酸濃度は一瞬低下した後上昇），ピ
ルビン酸は減少し乳酸量は変化しないという予測結果が得られた．
これらの予測結果を検証するため，酸素分圧が低下した時の赤血球のメタボローム測定を行った．その結果，30mmHgの低酸素状態に曝されてから３分間の解糖系代謝物質量の変動は，
Band3（+）モデルによるシミュレーション結果と一致することがわかった（Fig. 5-B, 5-C）．この実験結果から，ヘモグロビ
ン・膜タンパク質・代謝酵素の相互作用と酸素分圧の影響を加味した赤血球代謝シミュレーションモデルの妥当性が示された．
シミュレーションモデルによる予測とメタボローム解析による検証から，ヘモグロビン，Band3，解糖系酵素を中心とした代謝制御機構が低酸素に曝された赤血球の代謝応答に重要であることが実証できた．次項では，この酸素感知機構を盛り込んだモデルの応用研究として現在進行中である輸血用低温保存赤血球のシミュレーションによる代謝予測の取り組みを紹介したい．

低温保存赤血球の代謝予測
少子高齢化による輸血用血液の不足が深刻化する中で，保存40Fig. 5. 赤血球低酸素応答のシミュレーションによる予測とメタボローム解
析による実測結果の比較
A: 酵素活性の予測結果 B: 代謝物質濃度の予測結果 実線は
Band3
（+）
モデル，破線はBand3（−）
モデルの結果．C: 代謝物質濃度
の実測結果
［12］
から転載

血液の有効期限の延長は血液資源を有効に活用するためにも重要な研究課題である．日本で最も広く用いられている輸血用血液製剤である濃厚赤血球液（RCC-LR）は，献血などで採取された血液から赤血球画分のみを分離して保存のための添加液（MAP）を混和し４℃で静置保存される．このRCC-LRは，赤
血球の酸素運搬機能を左右する2,3-BPGが保存後約２週間で枯渇し，エネルギー物質であるATPも保存６週目までに半減してしまうため，42日間（実際に使用するのは21日間）という有効期限が設定されている．ATP, 2,3-BPGは保存赤血球の品質を評価する指標として用いられてきたが 22），保存期間中にこれ
らの代謝物質が減少するメカニズムは明らかになっていない．
赤血球製剤保存法の改善による有効期限延長を目指すには，保存期間中の代謝動態を詳細に把握することが不可欠である．そこで，ATPや2,3-BPGをはじめとした代謝物質濃度の予測が可能なヒト赤血球シミュレータと計算機科学の分野で蓄積されてきた手法を利用して，保存赤血球の代謝不全メカニズムの解明を目指している．

人工血液 Vol. 17 , No.1, 2009

まず，体内環境を想定していたこれまでの赤血球モデルを用
いて保存状態を再現するために，保存液の組成や低温等の保存条件から代謝に影響を与えると考えられる要素を抽出した．これらの要素には，（1）低温条件による代謝酵素とNa＋/K＋ポンプ活性の低下（2）低温条件によるヘモグロビンのR型遷移（3）赤血球内pH低下（4）pH低下による核酸代謝系酵素の活性化，が含まれる．上記の要素を変数として既存のモデルに実装し，
RCC-LRモデルを作成した．文献調査をもとに見積った値をそれぞれの変数に組み込んだモデルでシミュレーションを実施したところ，ATP, 2,3-BPG濃度の挙動は実際に同じ条件で測定された先行研究 23）の結果と非常によく一致しており，作成したモデルの妥当性が示唆された（Fig. 6.）．このモデルを用いたパラメータ解析によって，実装した各変数は保存赤血球の代謝変動を決定付ける要因として重要であることが示されている．
酵素活性の低下やpH変化による影響を詳細に解析することでATPや2,3-BPGが保存中に著しく減少する代謝変化の原理が明らかになる．同時に，シミュレーションによってATP, 2,3BPGが最も維持される条件を探索し，実際にメタボローム解析と比較することで血液保存手法の提案が可能になるであろう（Fig. 7.）．実時間よりもはるかに短い時間で長期の代謝予測が可能であること，さまざまな条件設定が容易であることなどの，コンピュータシミュレーションの利点を最大限に生かした応用例だといえる．

おわりに

Fig. 6. RCC-LR長期保存実験とシミュレーション予測結果の比較
A：先行研究における長期保存試験の結果（［23］のデータを元に図を作成）
B：RCC-LRモデルによるシミュレーション予測結果
ATP（実線）, 2,3-BPG（破線）

Fig. 7. シミュレーションとメタボローム解析による血液保存法の提案

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G6PD異常症の解析では従来の知見とシミュレーションの相違点を検証し，その原因を考察することで異常症細胞における代謝不全の鍵を握る経路を見つけた．また，赤血球低酸素応答
シミュレーションでは，異なる分野で議論されてきた幾つかの体系的な知見を統合した結果，血管内の酸素圧を感知するセンサー機構と代謝システムの巧妙な連携によって効率的な酸素運搬を実現していることを明らかにした．細胞シミュレーションの狭義の目的は，既に理解されている情報を元に生命現象を再構築し，その動的挙動の詳細を理解することである．しかしな
がら，G6PD異常症の解析や低酸素応答シミュレーションでは，単なる再現や模倣によるシステムの理解に留まらず新たな生物学的知見の発見に寄与しており，細胞シミュレーション研究の新機軸を打ち出したといえる．赤血球の低温保存シミュレーシ
ョンでは，最適な保存条件の網羅的探索など計算機科学の利点を生かして，臨床に役立つ技術開発への展開を目指している．
一方で，臨床応用までを視野にいれた細胞シミュレーション
は，一般的な手法として受け入れられていると現状では言い難
い．その理由として，生物学や基礎医学といったいわゆる「ウェット」な実験にたずさわっている研究者と，シミュレーショ
ンを行う計算機科学研究者との間で充分な理解が得られていな
いことが指摘できる．これまで協調して研究を行うことがなかった異分野間のコラボレーションによって細胞シミュレーショ
ンをさらなる段階へと発展させるためには，計算機科学と実験
生物学の相互理解が重要な意味を持つ．現在，実験科学者が直感的な操作によって数理モデルを構築し，シミュレーションが実行できる環境作りが進められており，CellDesigner 24）やECell IDE 25）といったソフトウェアが提供されている．加えて，計算機科学者が構築した数理モデルを第三者が簡単に再利用できるようにするために，細胞シミュレーションモデルの標準記
述言語であるSBML（Systems Biology Markup Language）26）
や，生体内ネットワーク図の統一的な表記法であるSBGN（Systems Biology Graphical Notation）27）の整備が進められている．また，臨床レベルで利用できる数理モデルを計算機科学
研究者が構築するには，生命現象に関する詳細で高精細度のデ41

ータを効率的に計測する手法が実験生物学研究に求められる．
近年のオミックス解析の発展を通じてこうしたデータが蓄積され始め，臨床的な数理モデルを構築する環境が整ってきている．
本稿でヒト赤血球代謝モデルの実証実験に用いたメタボローム
解析に関しても，細胞内の代謝物質を短時間で一斉に分析する技術が確立されており28），さらに高精度で高速な測定に向けた技術開発が行われている．
こういった研究基盤技術の充実だけでなく，実験研究者と計算機学者が議論を重ねて実験・シミュレーション研究の現状を理解しあい，互いの研究を自らの分野で活かす可能性を考えていくことが，相互理解に必要なことであろうと考えている．互
いが歩み寄りを深めて分野間の垣根を低くしていくことで，今後ますます細胞シミュレーションの研究が発展し，新たな生命科学の発見や医療分野への応用に貢献することが期待される．

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Call for Papers
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oxygen carrier with platelet-like properties in a hemodiluted
setting. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol
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http://www.waseda.jp/prj-artifblood/index-ja.html（ lastaccessed Sept 2008）13）In the case of citation or reproduction of previously
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としてE-mailにて編集委員会宛に提出する．
ワープロを用いて作製した原稿の投稿を原則とする．ただし，手書き原稿による投稿でも受け付ける．欧文による投稿を歓迎する．
１）原稿の種類は，「原著論文」，「総説」，「学会報告」，「トピックス」，「オピニオン」，「海外文献紹介」から選び，これを第１頁の右肩上に明記すること．これらに該当しない原稿も受け付ける．査読意見によっては種類が変更される場合がある．次のいずれかの方法により，送付状（任意のフォーマット）を添
えて編集委員長宛に投稿する．

５）「原著論文」，「総説」，「トピックス」，「オピニオン」については，第2頁以降に和文抄録，Keywords（英文で6個程度）
を付け，最終頁または別紙に英文抄録を付けること．
６）投稿論文に記載の研究が公的助成を受けて実施された場合に は ， 謝 辞 に そ の 旨 を 記 載 す る こ と ． ま た ， Conflict ofInterests（例えば，論文に記載された薬品を販売する企業と著者との利害関係: 雇用，コンサルタント，研究助成，株式，特許など）があれば，これを第１頁の脚注，謝辞などに記載する
こと．
７）ヒトを対象とした研究結果，および動物実験の結果を掲載する場合には，各研究機関のガイドラインに従って実施したことを方法等に明記すること．
８）論文中の略語は初出の際に省略しないこと．薬品，医薬品，測定装置等は，外国語名の場合は言語のまま用い，日本語化しているものはカタカナとする．型式，販売（製造）元とその所在地も記入すること．
（例） Rhodamine B（Sigma-Aldrich, St. Louis, USA）
, ポリグラフシステム（LEG-1000; 日本光電工業, 東京）
９）句読点はコンマ（，）ピリオド（．）とする．

i）文章と図表の電子ファイルをE-メールで送付する（使用したソフトを明記すること）．文章・表のファイル形式は，doc, txtが好ましい．図は，ppt, jpg, tiffが好ましい．

10）文中の英語に使用するフォントは，Times, Helvetica,
Courier, Symbolを原則とし，英文半角小文字とする．ただし，文頭および固有名詞は大文字で書きはじめること．

ii）ハードコピー4部を郵送する．

11）数字はアラビア数字を使い，度量衡の単位はm, cm, mm, μm,
L, mL, μL, mol, g, mg, μg, ng, pg, fg, N／10などを用いる．

２）投稿論文の査読は，編集委員長が選んだ人工血液分野の研究者に依頼する．査読意見によっては，原稿の修正を求める場合がある．修正論文（Revised Manuscript）の投稿に際しては，送付状に「査読意見に対する回答」を添え，意見に対して一つ一つ回答をするとともに，修正箇所がある場合にはこれを明記する．
３）掲載決定通知の後，著者は採択論文の文章・図表のファイ
ルを電子媒体として，指定する宛先に送付すること（使用したソフトを明記すること）．文章・表のファイル形式は，doc, txtが好ましい．図は，ppt, jpg, tiffが好ましい．
４）原稿はA4版の大きさとし，第1頁には表題，英文表題，著

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者名，全著者所属，英文著者名，英文著者所属，続いて連絡の取れる著者（corresponding author）の住所，英文住所を記入する．手書き原稿の場合はＢ5版，1行20字，20行とする．

12）FigureとTable：引用順にそれぞれ番号を付けること．表
題，説明，図表中文字は，全て英文とすることが好ましい．本
文中に挿入箇所を明記すること．Figureは直接オフセット印刷とする．Tableは編集部にて入力し原図とする．
13）文献：本文に引用した順序に番号を付け，文中では2），3-5），1，4-6）などとする．文献の記載法はthe Vancouver styleに従う．全
著者名．論文題名．誌名 西暦発行年；巻数：頁〜頁．とし，誌名の省略は医学中央雑誌またはIndex Medicus に準拠する．
単行本の場合は全著者名．題名．編集者名．書名．発行地：発行書店，年号；頁〜頁．の順とする．電子文献の場合は，ホームページ名．改行してアドレス（引用した西暦年月）とする．

人工血液 Vol. 17 , No.1, 2009

（例）１. 高折益彦. 人工酸素運搬体:その将来への期待. 人工血液2007;15:90-98.
２. 橋本正晴. 単回投与毒性試験. 野村 護, 堀井郁夫, 吉田武美編. 非臨床試験マニュアル. 東京: エルアイシー, 2001;3748.
３. Wong NS, Chang TM. Polyhemoglobin-fibrinogen: anovel oxygen carrier with platelet-like properties in ahemodiluted setting. Artif Cells Blood Substit Immobil
Biotechnol 2007;35:481-489.
４. Natanson C, Kern SJ, Lurie P, Banks SM, Wolfe SM.
Cell-free hemoglobin-based blood substitutes and risk of
myocardial infarction and death: a meta-analysis. J Am
Med Assoc 2008;299:2304-2312.
４. Sakai H, Sou K, Takeoka S, Kobayashi K, Tsuchida E.
Hemoglobin vesicles as a Molecular Assembly.
Characteristics of Preparation Process andPerformances or Artificial Oxygen Carriers. In: Winslow
RM, ed. Blood Substitutes. London: Academic Press（Elsevier）, 2006;514-522.
５. 早稲田大学酸素輸液プロジェクト．
http://www.waseda.jp/prj-artifblood/index-ja.html（2008年9月現在）
14）既発表の図表，その他を引用，転載する場合には，あらか
じめ版権所有者の許可を得ること．また，掲載論文の著作権は本学会に帰属する．
15）二次掲載について．本誌は，他の言語ですでに掲載された論文を和文で二次掲載することは二重投稿ではなく正当な掲載と認めるが，著者は以下の事項を遵守する．
ａ）すでに掲載された論文であること．
ｂ）著者は両方の雑誌の編集者より許可を得ていること．二ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.1, 2009

次掲載する編集者に最初に掲載されたもののコピー，別刷，もしくは原稿のいずれかを添付すること．
ｃ）論旨を変えないこと．執筆者は同一（順不同）であること．
ｄ）二次掲載版のタイトル・ページに掲載される脚注には，その論文の全体もしくは一部分がすでに掲載されている旨を明記し，更に初出文献も示すこと．適切な脚注の例を以下に示す．
「This article is based on a study
first reported in the［...雑誌タイトル（完全な典拠情報を添えたもの）...］（訳：この論文記事は，［...］に最初に報告された研究に基づくものである）」．
これらの要件を満たしている場合は，その旨を明記して，総説
または論文記事（二次掲載）として投稿する．
16）本誌掲載著作物の二次利用および著作権について．本誌の一部，もしくは全部をCD-ROM，インターネットなどのメディ
アに二次利用する場合がある．本誌に掲載する著作物の複製権・翻訳権・上映権・譲渡権・公衆送信権（送信可能化権を含む）は，著者が上述の著作権譲渡同意書を提出することにより，本学会に譲渡される．本項は，著作者自身の再利用を拘束する
ものでは無いが，再利用する場合は，編集委員長に通知をする
こと．
17）掲載料．掲載料は無料とし，論説，総説，原著，報告等については別刷り30部を贈呈する．それを越える分についての費用は著者の負担とする（およそ1部100円）．カラー写真掲載・
アート紙希望などの場合は，著者の実費負担とする.
18）原稿の送付先〒102-0073 東京都千代田区九段北1-1-7
カーサ九段２階（株）
研恒社「人工血液」編集係 宛
電話: 03-5286-3122, FAX: 03-3205-4740
E-mail: kita@kenkousya.jp

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●編集後記●グルタルアルデヒド架橋ヒトHb溶液（PolyHeme）の臨床試
験を進めていたNorthfield社が，この５月に開発を中止することを発表した．臨床第三相試験の結果に対し，FDAから安全性についての追加試験が要求されていたが，これを継続するための資金集めが困難になった為とのことである．有望とされていた開発グループがまた一つ消える事になり，非常に残念な話であるが，非細胞型Hbの宿命かもしれない．細胞型Hbを進めている日本の出番はこれからである．
本号の宗先生ほか執筆の細胞型ヘモグロビン小胞体の臨床検査法に対する影響の解析は，臨床試験を円滑に進めるために重要な知見である．多田羅先生の代用血漿剤の膠質浸透圧に関する総説は，従来に無いシミュレーションを使った体液動態の推移がまとめられている．国産の遺伝子組換えアルブミンのほか，
海外から分子量の異なるヒドロキシエチルスターチが登場しようとしており，臨床現場において適切な代用血漿剤を選択・使用するために重要な知見となろう．辻先生のヒトES細胞からの血液産生は，輸血細胞治療の技術開発の最前線の話題である．
実現までに立ちはだかる課題についても率直に記述頂いているが，今後のご発展を期待したい．西野先生ほかのE-cellは，コンピュータ内（in silico）に構築された人工赤血球といえようか．多成分系の反応を網羅でき，輸血代替としての人工赤血球の機能デザインにも利用できると考えられるし，また病態の解明にも利用できる，学際研究の極みといえる．今後も最先端の研究を本誌で紹介出来ればと思います．会員の皆様の話題提供を期待します．
さて，私事であるが13年前，恩師の土田英俊先生の勧めもあり，カリフォルニア大学サンディエゴ校（UCSD）に1996年から約二年間，留学する機会を得た．公的な書類の上では，プロ
ジェクト主任のProf. Winslowが私のSupervisorであったが，空港に私を迎えに来たのは共同研究者のProf. Intagliettaで，以来直接的にProf. Intagliettaから御指導を頂いた．未だにその理由は良くわからないが，多分，新しい物質系を追い求めるDr.
Winslowと土田先生は，ライバルだったからではないかと思っている．二年間の留学の間に培ったUCSDほかの研究者との繋がりは，有難いことに今なお継続している．良き友，共同研究者であり，また時に良きライバルでもある．Dr. Winslowから
この大切なコネクションをつくる機会を頂いたこと，お会いするたびに激励の言葉を頂いたことに心より感謝申し上げます．
謹んでご冥福をお祈り致します．
（酒井 宏水）編集委員会●酒井 宏水（委員長），東 寛，大谷 渡，武岡 真司，寺嶋 克幸，堀之内 宏久，村田 満，渡辺 真純●日本血液代替物学会 会誌■発行

日本血液代替物学会■編集・制作「人工血液」編集委員会

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vol.17（1） 2009年 6 月 5 日発行〒160−8582 東京都新宿区信濃町35
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