別刷

ブレークスルー
バイオテクノロジー

編／東京大学先端科学技術研究センター 谷内江研究室

NGS，ゲノム編集，シングルセル…今の生命科学には，かつてないペースで新技術が登場しています．本連載
では，組合わせのアイデアで，さらなるシナジーをよび起こす先端バイオテクノロジーをご紹介いただきます．

第4回

DNA イベントレコーダーによって細胞の過去の状態を知る
森 秀人

自然科学には常に「科学者は目の前に現存する試料しか解析できない」という問題が付きまとう．蛍光タンパク質やプローブをもちいた生細胞イメージングでは，細胞や分子を生きたまま観測できるが，限られた種類や数の対象しか扱うことができない．凄まじいスピードで開発されている超並列 D N A シークエンシングや質量分析では，分子プロファイルを網羅的に解析できるが，これらの技術では細胞を破壊してしまうので，同一細胞や個体における分子の動態を調べられないし，細胞がどういった経緯で観察時点における状態に至ったのかを知ることはできない．これまでの連載では D N A 配列が経時的にランダムに書き換わるメ
モリーシステムによって細胞系譜トレーシングができる例をみた．このようなアプローチに加えて，細胞の内部状態や外部環境の情報を細胞自身がもつ D N A メモリーに時間経過とともに書き込むような技術も生まれつつある．細胞にこのようなイベントレコーディングシス
テムをもたせられるようになると，ある時刻でシステムを破壊して高解像度の分子プロファ
イルを得ると同時に，それが過去に何を経験してきたのかが分かるだろう．

Cas1-Cas2 が担う
CRISPR–Cas システムの免疫獲得機構

断・分解するというものである．CRISPR–Cas システ
ムは進化的に多様であり，この切断・分解を担う Cas
タンパク質複合体の種類によって大きく 3 つのタイプ

第 1 回でも触れたように，天然の CRISPR–Cas シス

および，少なくとも 10 以上のサブタイプに分類される

テムの役割は，侵入してきた外来 DNA 配列を CRISPR

が ，外来 D N A の免疫機構はそのタイプにかかわらず配列へ免疫し ，同じ外来 D N A の侵入が再び生じたと共通で，Cas1，Cas2 という 2 種類のタンパク質が重きに免疫した配列からcrRNA（CRISPR RNA）を発現

要な役割を担う 1）．

させて外来 DNA に Cas タンパク質複合体を誘導し，切
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実験医学

Vol. 37

Cas1，Cas2 タンパク質は複合体を形成し，Cas2 タ
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ブレークスルーA

バイオテクノロジー

プロトスペーサーDNA
情報記録
PAM
情報記録
デジタルテープへのデータ記録

Cas2二量体

CRISPRアレイへのデータ記録

図 2 デジタルテープへのデータ記録と Cas1–Cas2
による CRISPR アレイへのデータ記録

Cas1二量体

外部環境あるいは細胞内部の状態に従って細胞内に特定のB

DNA を生じさせることができれば，時系列情報を伴ってCRISPR アレイにその状態情報を書き込むことができる．
（文献 4 を参考に作成）

先頭リピート配列の認識

リーダー配列

3′
5′

PA
M

IHF

ンパク質二量体の両脇に C as1 タンパク質二量体が一つずつ結合する構造を形成する（図 1A）．プラスミド

先頭リピート配列

やウイルスといった外来 D N A が侵入してくると ，こ求核置換反応の Cas1-Cas2 複合体がその配列をスキャンし，PAM配列を認識したカ所について約 30 b p 程度のプロト

PAM（前駆）スペーサーを切り出す．CRISPR 配列は過去に免疫されたプロトスペーサーがスペーサーとしてリピー
ト配列に挟まれたものがくり返されたアレイ構造をも求核置換反応つ．この CRISPR アレイへの新しいプロトスペーサーの取り込みは，その上流のリーダー配列に最も近いリ
ピート配列に対するプロトスペーサーの末端への求核PAM置換反応を起点として生じ，リーダー配列の 3′ 側に新しくリピート配列に挟まれたスペーサーを獲得する（図180°1B）．したがって，CRISPR アレイにおけるスペーサー
は，リーダー配列に近いものほどより最近に獲得されたものであり，「宿主が過去に経験した免疫の時系列情DNA修復報」が記録されているということになる．
CRISPR–Cas システムは，Cas9 に代表されるゲノム編集としての応用が急速に発展した ．しかしながら ，

スペーサーの獲得

図 1 タイプⅠ CRISPR における Cas1–Cas2–プロト
スペーサー DNA 複合体の構造（A）とCRISPR
アレイにおけるスペーサー獲得機構（B）（A の立体構造は PDB ID：5DQZ，B は文献 1 より引用）

近年 「C as 1- C as 2 によって外来 D N A の配列が順序
だって CRISPR アレイに保存されていく」という性質を利用して，これを人工データや細胞内外のイベント
レコーディングに利用しようという試みが誕生してきた（図 2）．

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細胞への人工データの保存アが採用された ．ここでは ，各プロトスペーサーは ，2016 年にハーバード大学の George Church のグ

pixet 配列および対応する各ピクセルの濃淡情報がコー

ループの Seth Shipman が中心となって，Cas1-Cas2

ドされた 3 bp が 9 つ並ぶように設計された．このようによる人工的な DNA 配列の CRISPR アレイへの記録がに，近傍のピクセル情報が同じプロトスペーサーに集可能であることが示された 2）．この研究では AAG とい中してコードされないようにし，画像の濃淡パターン

う PA M 配列を 5′ 側にもつプロトスペーサーを免疫すによってプロトスペーサー配列が極端に特定の塩基にる Type I-E CRISPR システムがもちいられた．まず，偏らないように工夫された．さらに同グループは 1878

あらかじめ Cas1 と Cas2 遺伝子を欠損させた大腸菌に

年にエドワード・マイブリッジが連続写真によって作

対して，外部からエレクトロポレーションで導入する成した疾走する馬の動画を 5 フレーム 36 × 26 ピクセ

短 い二 本 鎖 のプロトスペー サー DN A がゲノム上 のルにしたものを大腸菌細胞集団の CRISPR アレイに保CRISPR アレイに Cas1 と Cas2 タンパク質の発現誘導存した．ここでは各フレームについて，手のひらの画依存的に導入できることが示された．次に，異なるプ像データと同様に pixet をもちいてエンコードした 104

ロトスペーサーを一定間隔おきに導入した場合に ，のプロトスペーサーが準備され，一定の時間間隔を空CRISPR アレイの配列から導入したプロトスペーサー

けながら 5 ラウンドに渡って各フレームのプロトスペーの順序が再構成できるか検討された ．具体的には 5 種

サー混合プールがエレクトロポレーションによって大類のプロトスペーサーが別々に 3 セット準備され ，各腸菌に導入された ．これは同グループが先の 3 セット

セットのプロトスペーサーが混合されたものが 5 ラウ

混合 5 ラウンドのプロトスペーサー連続導入実験を行っ

画像上の任意の 9 つのピクセル座標を指し示す 4 bp のンドに渡って順々に大腸菌集団に導入された（図 3A）．

たものを 104 セット混合に拡張したことと等価であり5 ラウンドの導入実験後，CRISPR アレイ領域は PCR（フレーム情報はプロトスペーサーにコードされていなで増幅され超並列 D N A シークエンシングによって解い！），それでも大腸菌集団のCRISPR アレイから90 ％析された．当然，大腸菌 1 細胞あたりでは外来 DNA の以上の精度で動画情報が復元できることが示された ．

免疫が起こるものもあれば ，起こらないものもある ．

Shipman と Church らのデモンストレーションは人工したがって，集団から得られた各 CRISPR アレイ領域

的な時系列情報の記録であったとはいえ，細胞集団がのシークエンシングリードにおいて同じセット由来の

これだけの高密度情報を「そのイベントが発生した順

プロトスペーサー配列が複数確認された場合にそれら序通りに」DNA に記録できることを示していた．

の 2 つの組合せそれぞれが想定された順序で並んでいるかが評価された（図 3B）．その結果，大腸菌集団全体における CRISPR アレイの集合からすべての 3 セットについてプロトスペーサーの導入順序を正しく再構
成できることが示された．

細胞の外部環境を記録する
Shipman と Church らが大腸菌集団に動画データを保存してからわずか 4 カ月後に ， コロンビア大学の翌年，同グループは Cas1-Cas2 によって人工 DNA

Harris Wang らは Cas1-Cas2 をもちいて大腸菌の外部配列群を細胞内のゲノムに取り込ませられるというこ

環境変化を時間変化とともに細胞集団の CRISPR アレとを利用して画像データや動画データを大腸菌細胞集イに記録する TRACE（temporal recording in arrays

3）

団に書き込むというデモンストレーションを行った ．

by CRISPR expansion）法を発表した 4）．Shipman と

例えば，30 × 30 ピクセルから成る手のひらのグレー

Church らが人工データの保存技術として Cas1-Cas2

スケール画像データ（494 バイト）が 100 種類のプロを利用していた一方で，Wang らは冒頭で述べた細胞

トスペーサーにコードされ，この混合プールを大腸菌の 「状態ヒストリー」を細胞自身の D N A に記録する

集団に導入，その後 CRISPR アレイ領域の超並列シーということの重要性に注目して，技術コンセプトの確

クエンシングによって画像データが完全に復元された．

立をめざしていたということになる．

このとき画像のエンコードには pixet というアイディ
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実験医学

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TRACE では，細胞内に特定の化学物質などの外部環
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ブレークスルー

A

Rd1

Rd2

16h 2h 2hRd3

16h 2h 2h

16h 2h 2hB

Rd5

16h 2h 2htrh
Leader

Rd5

g

l
f

Rd4

e

c

b
Rd2

k
q

G/P

Rd1

a

G/P

i
o

G/P

s

ordering rules
（15）
：
e＞f

G/P

d
Rd3

m

c＞d

j

g＞h

i＞j

k＞1

m＞n

o＞p

q＞r

セット1
セット2
セット3

16h 2h 2h

G/P

p

n

a＞b

Rd4

u
w
y
aa
cc

s＞t

Rd1
Rd2
Rd3
Rd4
Rd5

バイオテクノロジー

16h

v
x
z
bb
dd

u＞v

G/P
G/P
G/P
G/P
G/P
w＞x

＊

y＝ z aa＞bb cc＜dd

図 3 大腸菌集団のもつ CRISPR アレイへの人工データの記録

A）5 ラウンドに分けて異なるプロトスペーサー（Rd1 〜 Rd5）が導入された．5 ラウンドのデータ記録を行うプロトスペーサー
は 3 セット準備され，各ラウンドにおいて 3 セットそれぞれのプロトスペーサーは混合して導入された．B）取りうる 2 つの獲得スペーサーすべての並び順．矢印の始端は新しく取り込まれたスペーサー，終端は先に取り込まれたスペーサー．細胞内にあるゲノムやプラスミド（G/P）も一定頻度で CRISPR アレイに取り込まれるため，それらと獲得されたスペーサーの順序も考えられる．プロトスペーサーを Rd1，Rd2，Rd3，Rd4，Rd5 という順番で導入し，集団の CRISPR アレイをシークエンシングした場合，2 つのスペーサーの組の順序それぞれを反映するシークエンシングリードの数は ordering rules（15）に示すような関係が得られると想定される．

境によってコピー数の変化するプラスミド（T ri g g e r

ターンから得られた CRISPR アレイが細胞の過去の環D NA）が用 いられ ， これが C a s 1- C a s 2 によっ て境状態を正しく反映できることを示した．また銅，ト

CRISPR アレイへと取り込まれるしくみが利用された．

レハロース ，フコースによってコピー数の変化する

Cas1-Cas2 が高発現状態にあるとき，細胞内には常にTrigger DNA を同時に用いることで，集団が複数の化

一定頻度で CRISPR アレイに取り込まれる自身のゲノ

学物質についてどのような組合せと順序で暴露されて

ム DNA や Trigger DNA とは別に TRACE を作動させいたかをトレースできることが示された．

る目的で導入されたプラスミド（Reference DNA）が存在する．したがって，Trigger DNA のコピー数が少ない状態では Reference DNA が優先的に CRISPR ア

塩基編集による環境変化のレコーディング

レイの先頭に取り込まれる一方で，外部環境に変化がCas1-Cas2 による環境変化メモリーに続いて，2018

あって Trigger DNA のコピー数が増加した場合は，こ

年 2 月 には Br o ad 研 究 所 の D av i d L i u のチー ムがちらが優先的にCRISPR アレイに取り込まれる（図 4）．

CAMERA（CRISPR-mediated analog multi event

実際にWang らはIPTG（遺伝子発現誘導物質）によっ

recording apparatus）法という Cas9 をベースにしたてコピー数が制御される Trigger DNA によって，4 日

環 境 変 化 メ モ リ ー を 発 表 し た 5）． そ の な か で も間にわたって 1 日ごとに I P T G に暴露するかしないか

CAMERA2 ではニッカーゼ型 Cas9（nCas9）にシチジの 16 パターンで大腸菌集団を処理し ，それぞれのパンの脱アミノ化反応を引き起こすシチジンデアミナー

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染色体DNA

外部シグナルの無い状態
外部シグナルTrigger DNA
外部シグナルに応じて取り込み頻度が変わる

プラスミド
Reference DNA

常に一定頻度で取り込まれるCas1‒Cas2
タンパク質複合体
CRISPRアレイへの
一方向性の書き込み

CRISPRアレイ

図 4 TRACE 法の概念

外部シグナルに応じてコピー数の変化するプラスミド（Trigger DNA）が準備された．Cas1–Cas2 によって染色体 DNA やプ
ラスミドは一定頻度で CRISPR アレイに取り込まれる一方で，Trigger DNA は外部シグナルに応じて取り込み頻度が変化する．
CRISPR アレイのシークエンシングにより，Trigger DNA の増幅が生じた（外部シグナル入力があった）タイミングを読み出すことができる．（文献 4 をもとに作成）

ゼが融合された塩基編集ツール 「B a s e E di t o r（図gRNA は 20 塩基程度のスペーサー配列をもち，3′ 側に5A）」によってガイド RNA（gRNA）のターゲット配

PAM（NGG）をもつそれと相同な配列をターゲットに列の特定の位置にC → T 変異を引き起こす手法 6）7）が採するが，ターゲット配列の 5′ 側に近い領域は gRNA と用され ，複数の外部環境の変化を DN A にメモリーである程度のミスマッチが許され，完全にgRNA のスペー

きるシステムがつくられた．

サー配列とターゲット配列が一致している必要はない．

gRNA を特定の外部環境依存的に誘導プロモーター

逆に PA M に近い 3′ 側の領域は 「シード配列」とよばによって発現するようにしておくと，その環境におかれ完全に一致している必要がある ．これを利用して ，れた細胞においては gRNA ターゲット配列に C → T 変

g R N A 1 によってターゲット 1 を狙うとこれの 5′ 側と異がメモリーされる．Liu らはまず IPTG，アラビノー

オーバラップするターゲット 2 のシード配列が gRNA2

ス，ラムノースといった複数の化学物質それぞれによっ

によってはじめてターゲット可能になるという仕掛けて発現誘導される gRNA を Base Editor とともに大腸がつくられた（図 5B）．これによって，例えばアラビ

菌細胞に導入することによって，細胞集団がどのよう

ノース→ラムノースという順番で化学物質に暴露されな化学物質の組合せに暴露されたかを検知できるようたときのみターゲットサイトに情報が記録されることにした．しかしながら，この方法では前述のCas1-Cas2などが実現された．またこの研究では，ヒトの Wnt シ

による CRISPR アレイへのスペーサー獲得のように時グナルに応答して発現する（LEF-TCF）7 プロモーター

系列に依存した D N A メモリーができない ．したがっを Base Editor の発現誘導に用いることによって，Wntて，Liu らは Base Editor をもちいた手法でも順序依存シグナルの活性化状態を D N A メモリーに記録できる性を実現できるように，特定の化学物質誘導によってこともデモンストレーションされた．

発現する gRNA1 が別の gRNA2 のターゲット配列を書

Liu らの CAMERA についての論文が Science 誌に掲

き換えるまで gRNA2 は作用できない，というしくみ載された同日，連載第 2 回でも stgRNA の開発 8）でとを構築した．つまり，こういうことである．C a s 9 のり上げたマサチューセッツ工科大学の Timothy Lu ら

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ブレークスルーAB
AID UGI

5′
3′

3′
5′
sgRNA

nCas9

C
最小プロモーター
＊

gRNA1

5′
GGGACCGGGTGGGAGCCCTGGTGGGACTGGATGGGG 3′
Base EditorによるC→T変異の誘導
gRNA2
..
...
GGGACCGGGTGGGAGTTTTGGTGGGACTGGATGGGG 3′
5′
Base EditorによるC→T変異の誘導..
GGGATTGGGTGGGAGTTTTGGTGGGACTGGATGGGG 3′
5′

PAM

C

...

バイオテクノロジー

Base EditorにVP64が融合されたもの
転写誘導

GFP

＊＊

GFP

＊ ＊ ＊

GFP

＊ ＊ ＊ ＊ ＊＊GFP

互いにオーバーラップ
したリピート配列

図 5 CAMERA 法および DOMINO 法

A）Base Editor の構造．シチジンデアミナーゼ（AID）がスペーサー配列の PAM から遠い位置にあるシチジンを脱アミノ化によってウリジンに変換する．ウラシルグリコシラーゼ阻害ドメイン（UGI）の作用によって一塩基除去修復が阻害され，ウリジ
ンは DNA 複製を経てチミンに変換される．B）CAMERA および DOMINO における回路設計．gRNA1 が gRNA2 のターゲッ
トサイトのシード配列を編集すると gRNA2 がはじめてそのターゲットサイトに作用できるようになる．C）DOMINO 法による時間発展に伴った遺伝子発現増幅．Base Editor に転写因子 VP64 が融合された BE–VP64 が用いられた．時間発展とともにドミノ倒しのように塩基編集が進み，より多くの BE-VP64 が GFP の発現誘導に作用する．最小プロモーターは発現誘導のために必要な転写エレメントで単独では遺伝子発現を引き起こさない．
（A は Hsu PD，et al：Cell, 157：1262-1278, 2014 より引用．C は文献 9 より引用）のチームがまさにこの CAMERA を拡張したかのよう

ト数も徐々に増えていく．同論文のなかではこれを利な DOMINO（DNA-based Ordered Memory and

用して，DOMINO によって編集されるリピート配列

Iteration Network Operator）法をプレプリントサー

が 5 回くり返されたものの下流にプロモーターをもたバーの bi oR x i v で公開した ．準備していた原稿をない GFP をコードした DNA と Base Editor に転写因CAMERA の発表を受けて即日公開したようなタイミ

子 VP64 を融合させたものをヒト培養細胞に導入するングであった．

と，時間変化とともに GFP の発現量が増加することも

9）

DOMINO も CAMERA とほぼ同じアイディアであっ示された（図 5C）．

たが，例えば IPTG 依存的に発現する gRNA1 がター
ゲット 1a を狙うことで，ターゲット 1b のシード配列を書き換え，また同じ gRNA1 がターゲット 1b を狙えるようになることで，ターゲット 1c のシード配列を書

ゲノム編集を用いたトリックは生物学に有用なイベントレコーダーになれるか？

き換えるという gRNA1 による多段階反応が正しくド

ここまでに見てきた技術はいずれもゲノム編集をもミノ倒しのように 3 回くり返された時点で，アラビノー

ちいて人工的な外部環境の情報をレコーディングする

ス依存的に発現する gRNA2 がターゲット 2 にはじめてものであった．しかしながら，例えば，人工的に準備作用できるような回路がつくられ，IPTG の濃度あるいされた DNA を CRISPR アレイに順序よく保存できる技

は作用日数依存的にアラビノースによるターゲット 2

術に果たしてどれほどの意味があるのだろうか？ ほか

への情報記録が実現された．このような回路では同じの技術も，細胞の外部環境をレコーディングできるとgRNA がリピートする配列を 3′ 側から 5′ 側に向かってはいっても，それぞれのモデルシステムにおいて特定次々と編集し，そのたびにgRNA に編集されるターゲッの化学物質によって誘導できる発現プロモーターは限実験医学

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転写履歴レコーダープラスミド

染色体DNA

リーダー配列PT7lac
RT-Cas1Cas2
発現

リピート配列RNA転写産物RT‒Cas1‒Cas2
タンパク質複合体

RNAとの
複合体形成

RT‒Cas1‒Cas2‒RNA
スペーサー配列の獲得
CRISPRアレイ

新しく獲得したスペーサー
転写履歴情報の記録

細胞図 6 RT-Cas1–Cas2 による内在性 RNA の逆転写と CRISPR アレイへの取り込み（文献 11 より引用）られており，そのような特定の化学物質（大腸菌にお指摘されており，外来 RNA を逆転写して CRISPR アレ

ける IPTG とかアラビノースとか）を検知できるに留イに保存する機構があることが示唆されていた．そのまるのではないだろうか？ 結局，オタクな合成生物学ようななか，2016 年にスタンフォード大学の Andrew

者達がおもしろいトリックを作って満足しているだけ

Fire らの研究グループによって，バクテリア Marino︲

ではないのだろうか？

monas mediterranea のタイプⅢの CRISPR–Cas シス

もちろんトリック作り自体がおもしろいという側面

テムにおいて逆転写活性をもつタンパク質（RT-Cas1）

はこういった技術の開発者であれば誰もがもっているが報告され，RT-Cas1–Cas2 によって細胞内の RNA が一方で，この手のデモンストレーションが増えるにつ逆転写されて CRISPR アレイに取り込まれるメカニズ

れ，少なくない研究者達がある共通の可能性を想像す（図 6）．また，このシステムをムが明らかになった 10）

るようになった．
「細胞内外で発生するさまざまなイベ

もつバクテリアでは内在性の高発現な遺伝子の配列ほントを D N A メモリーに書き込むようなことができれ

ど CRISPR アレイにスペーサーとして保存されている

ば，今詳細にオミクス解析をしているサンプルが過去ことが観察され，自身の細胞において発現した RNA もにどのような分子プロファイルをもっていたか，どの

逆転写されて CRISPR アレイに取り込まれていること

ような外部環境にあったか知ることができる」―例えが明らかになった．一方，この RT-Cas1–Cas2 複合体

ば，大脳皮質の神経細胞が発生過程においてどういっはそのままでは大腸菌などの外部システムにおいてはた遺伝子発現状態の変遷を辿ってそこに至ったのかわ

機能しないことも確認されていたが，研究者達はこれかるようになるかもしれない．肺で悪性腫瘍を形成しが細胞内トランスクリプトーム動態の記録装置と成りた細胞クローンが過去にどのような物質にさらされてうることを見逃さなかった．

いたか情報が得られるかもしれない．

2018 年 10 月，スイス連邦工科大学チューリッヒ校のRandall Platt らの研究グループが世界に先駆けて大腸

遺伝子発現状態のレコーディング菌における遺伝子発現状態の変化をCRISPR アレイへと以前から一部の生物種の CRISPR アレイに RNA ウイ

めにさまざまな生物種がもつRT-Cas1–Cas2 のスクリー

ルスゲノム由来のスペーサーが保存されていることがニングを行い，Fusicatenibacter saccharivorans の

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実験医学

記録するシステムを発表した 10）．研究グループははじVol. 37

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ブレークスルー

バイオテクノロジー

RT-Cas1–Cas2 が大腸菌で作動することを発見，これしたがって，この研究では過去の複数の時刻におけるが大腸菌において発現誘導をかけた遺伝子の配列や ，

トランスクリプトーム動態を捉えることは行われなかっ感染させた RNA ウイルスゲノムの配列を CRISPR アレ

たが ，時系列情報に従って発生したイベント情報をイに取り込むことを示した．さらに，CRISPR アレイ

CRISPR アレイに書き込んで読み出す手法はすでにみに取り込まれた配列群を超並列 D NA シークエンシン

たように Shipman と Church らによって達成されておグによって同定するための手法 Record-seq を開発，り，RT-Cas1–Cas2 を用いる手法についても観察時点

RT-Cas1–Cas2 を作動させた大腸菌集団を対数増殖期から遡って過去のトランスクリプトーム動態を再構成

から停滞期まで培養し，RNA-seq によって得られたトできるようになるにはそう長い時間はかからないであ

ランスクリプトーム情報と Record-seq の結果を比較

ろう．

したところ，高い相関が観察された．特に停滞期の細◆胞集団から得られる Record-seq の結果は，停滞期特細胞の外部イベントあるいは内部状態を時間発展と異的な遺伝子群よりも対数増殖期特異的な遺伝子群のともに細胞搭載型の D N A イベントレコーダーに記録

発現状態と高い相関を示し，CRISPR アレイに過去のし，観察する時点で一気に取り出すというようなこと

トランスクリプトーム情報が保持されていることが示が可能になった場合，それによって新しく挑戦できるされた．さらに，大腸菌集団を酸または酸化ストレス

生物学の課題には枚挙にいとまがない．こういったこの有無で分けて培養した後 ， R e c o r d- s e q によってとを考えていく場合，次のようなことがさらなる技術

CRISPR アレイに取り込まれた配列によって細胞集団

開発の指針になるはずである．例えば，特定の化学物がストレスを受けたか否かを判別することができた．

質に応答する発現誘導プロモーターを用いたシステム

さらに大腸菌集団を一過的に薬剤に暴露した場合 ，は限られた細胞環境についてのみ情報を記録できるに

薬剤暴露時のトランスクリプトーム状態が CRISPR ア

とどまる．したがって，RT-Cas1–Cas2 のように比較レイに反映されるかが試験された．RT-Cas1–Cas2 を的広範に細胞内の分子状態を網羅的に記録して，そこもつ大腸菌集団を除草剤であるパラコートへの「暴露から環境状態を推定するようなアプローチの方がよりなし」「一過的な暴露（その後，暴露なし）」「継続的な筋が良さそうである．一方で，RT-Cas1–Cas2 はおろ

暴露」の 3 条件のいずれかで処理し ，いくつものレプ

か，Cas1–Cas2 についても哺乳動物の細胞内で動作しリケートサンプルについて RNA-seq によるトランス

た例はない．今後哺乳動物細胞で動作する Cas1–Cas2

クリプトームと Record-seq による CRISPR アレイにおよび RT-Cas1–Cas2 の開発がますます重要になって保持された配列情報を得た．その結果，主成分分析にくるであろう．あるいは，CAMERA や DOMINO のよ

よるトランスクリプトームの差は観察した時点におけうなアプローチは現在のところ発現誘導プロモーター

るパラコートへの暴露の有無を見分けることができたを利用して特定の環境や状態の応答記録に限られていが，「暴露なし」の群と「一過的な暴露」の群を見分けるが，哺乳動物で利用できる Base Editor をもちいてることができなかった．一方で，Record-seq の配列いるため，これらを拡張することも考えられる．例え

情報の主成分分析は「暴露なし」の群と「一過的な暴ば，自在にOct4 やNanog，その他の多くの重要なマー露」の群を判別することできた．

カー遺伝子の発現状態を時系列で Base Editor によっ

このように RT-Cas1–Cas2 と Record-seq は細胞の内部情報を （比較的網羅的に）その細胞自身の DN Aて D N A メモリーに記録していくようなことはできるだろうか？

メモリーに書き込んで，取り出した世界ではじめての単一細胞あたりに保存できるデータ量も重要である．

例となった．一方で，Record-seq における DNA シー

今回見た技術群はいずれも細胞集団に情報を記録する

クエンシングライブラリー調製手法は，CRISPR アレものであり，単一細胞にすべての情報を記録できるもイに取り込まれたそれぞれのスペーサー配列を独立にのではなかった．これはひとえに，Cas1–Cas2 や Base

決定するためのもので，同一 CRISPR アレイ内におけEditor をはじめとした回路構築にもちいられた部品のるスペーサーの順序を同定することができなかった ．

多くが確率論的に作動するために，少数分子のDNA メ

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モリーシステムをもった単一細胞のみですべての情報

DNA バーコードとゲノム編集による細胞系譜技術は直記録ができないこと，そもそも単一細胞あたりに書き

ちにシングルセルトランスクリプトーム技術と結びつ込んで読み出せる情報量が限られているということにき，どのような細胞種がどのような細胞系譜を辿った

尽きるであろう．集団が補完し合う情報を利用せざるのか大規模に調べられるようになりつつある．DNA イ

を得なかったのだと考えられる．より大きな情報を取

ベントレコーダー技術もシングルセル技術と結びつけり扱うために長い CRISPR アレイからの情報の読み出ることができるのか，そうなった場合どういった生物

しを考えると，ナノポアなどによるロングリードシー

学にチャレンジできるようになるのか，想像しながらクエンシングがこの分野の一助を担うことが期待され

触れると大きく知的好奇心が掻き立てられるはずである．一方で，特に現代生物学は対象の集団平均にはある．

まり興味がなく，このような DNA イベントレコーダー

文献

技術も個体や複雑なシステムのなかにある不均質な細1）Jackson SA, et al：Science, 356：eaa15056, 20172）Shipman SL, et al：Science, 353：aaf1175, 20163）Shipman SL, et al：Nature, 547：345-349, 2017
4）Sheth RU, et al：Science, 358：1457-1461, 20175）Tang W, Liu DR：Science, 360：eaap8992, 20186）Komer AC, et al：Nature, 533：420-424, 20167）Nishida K, et al：Science,353：aaf8729, 20168）Perli SD, et al：Science, 353：aag0511, 20169）Farzadfard F, et al：bioRxiv, 263657, 201810）Silas S, et al：Science, 351：aad4234, 201611）Schmidt F, et al：Nature, 562：380-385, 2018

胞動態を知ろうとするからこそ価値が見出される．し
たがって ，今後 D N A イベントレコーダーという考え
方がどのように対象とするシステムにおける異なる細胞の状態記録に応用可能か考えていく必要がある．
次回はこの点にも鑑みて ，近年発展の目覚ましい 1
細胞解析技術に焦点を当てる．特にシングルセルトラ
ンスクリプトーム技術は分化過程にある細胞，組織や腫瘍における大量の 1 細胞のトランスクリプトームを同定することを可能にし，これらのシステムが実に多様な細胞種から構成されることを明らかにした．また

著者プロフィール森

秀人 （Hideto Mori）

東京大学先端科学技術研究センター谷内江研究室交流研究生．
慶應義塾大学大学院政策・メディア研究科後期博士課程 1 年．
周期的リピート配列捕捉のアルゴリズム ，ソフトウェア開発
等 ，理論的アプローチによって生命システムを理解するための研究を進めている．
谷内江研究室ウェブサイト：http://yachie-lab.org/

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実験医学

Vol. 37

No. 3（2 月号）2019

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書籍名：実験医学 Vol.37 No.3
使⽤⾴：440〜448 ⾴
著者名：森 秀⼈
発⾏社：（株）⽺⼟社
発⾏年：2018 年© YODOSHA CO., LTD. 2019