人工血液第 16 巻 第 4 号 2009 年 2 月

目

次
会告
総説

原著

総説

…………………………………………………………………… 186
巨大ヘモグロビンの構造と機能……………………………………………………三木 邦夫

他 188

多波長パルス分光法を用いたHb小胞体用
パルスオキシメータに関する研究 ……………須崎 裕典

他 198

体外循環時におけるリポソーム型人工酸素運搬体（TRM645）の有用性と安全性に関する研究 …水野 敏秀

他 205

ヘモグロビン小胞体のin vitroにおけるヒト血液細胞および血漿タンパクへの適合性 ………………………藤原 満博 他 212
事務局たより ……………………………………………………………… 222

ARTIFICIAL BLOOD
Vol. 16 No. 4 February, 2009

Contents
Announcement ……………………………………………………………… 186
Review：Structure and Function of Giant Hemoglobins…………………………………………………Kunio Miki, et al. 188
Original Article：
Study on Multiwavelength Pulse Spectrophotometry
Applicable for Hemoglobin-vesicles……Hironori Suzaki, et al. 198
Review：Evaluation of a Novel Combined Therapy of a Extracorporeal
Cardiopulmonary Bypass Using Liposome-encapsulated
Hemoglobin（TRM645）………………Toshihide Mizuno, et al. 205
Biocompatibility of Hemoglobin Vesicles, a Cellular-type
Artificial Oxygen Carrier, on Human Blood Cells andPlasma Proteins in Vitro ……………Mitsuhiro Fujihara, et al. 212

会

告第16回日本血液代替物学会年次大会
期会日：平成21年10月16日（金），17日（土）
場：慶應義塾大学 信濃町キャンパス医学情報センター

北里講堂（予定）

テーマ：「世界をリードする血液代替物」
・シ ン ポ ジ ウ ム

細胞型人工酸素運搬体を作る

・特人工血小板の過去，現在，未来

別

講

演

微小血管内での微粒子の不思議な流れ
獣医学と血液代替物研究
・ランチョンセミナー

代用血漿剤 Hydroxyethyl Starch※一般演題･･･広く血液代替物研究に関係ある演題を募集
演題申込締め切り 平成21年 7 月21日（火）詳細は日本血液代替物学会ホームページ，あるいは次号参照
第16回日本血液代替物学会年次学術総会会長
東宝塚さとう病院 名誉院長
川崎医科大学 名誉教授

高折 益彦

186

人工血液 Vol. 16 , No.4, 2008

会

告平成20年度厚生労働省科学研究費補助金
政策創薬総合研究推進事業 研究成果等普及啓発事業
平成20年度 研究成果発表会

人工血液をつくる（ 9 ）平成21年2月11日（水）時 間：９：00〜17：10
慶應義塾大学信濃町キャンパス医学情報センター
定 員：250名
主後

北里講堂

催：財団法人 ヒューマンサイエンス振興財団
援：日本血液代替物学会

プログラム
総合司会

慶應義塾大学 医学部 呼吸器外科准教授

堀之内 宏久

10：10〜10：20 「御挨拶」
厚生労働省 医政局 研究開発振興課
10：20〜10：30 「御挨拶」
日本赤十字社 輸血事業本部 経営会議委員、中央血液研究所所長
座長
川崎医科大学 名誉教授、東宝塚さとう病院
10：30〜10：50 「人工血液開発の将来展望」（演者）慶應義塾大学 医学部 名誉教授
10：50〜11：20 「人工赤血球の出血性ショックへの応用」（演者）慶應義塾大学 医学部 呼吸器外科
11：20〜11：50 「重症呼吸器疾患における人工血液の役割」（演者）慶應義塾大学 医学部 呼吸器外科
11：50〜12：50

名誉院長

憲治

高折

益彦

小林

紘一

堀之内 宏久
泉

陽太郎

昼休み

座
長
慶應義塾大学 医学部 呼吸器外科 准教授
12：50〜13：20 「赤血球構造の生理的意義とヘモグロビン小胞体」（演者）早稲田大学 理工学術院 理工学研究所
13：20〜13：50 「虚血性脳血管疾患あるいは出血性ショック時の人工酸素運搬体投与の効果について」（演者）慶應義塾大学 医学部 神経内科
座長
慶應義塾大学 医学部 名誉教授
13：50〜14：20 「人工赤血球の体内動態について」（演者）熊本大学大学院 医学薬学研究部 薬物動態学
14：20〜14：50 「人工血液使用時の免疫の変調について」（演者）北海道赤十字血液センター 研究部
14：50〜15：00

田所

堀之内 宏久
酒井

宏水

冨田

裕

小林

紘一

小田切 優樹
東

寛

休憩

座
長
早稲田大学 理工学術院 理工学研究所 准教授
15：00〜15：30 「遺伝子組換え人血清アルブミン製剤の誕生から承認まで」（演者）田辺三菱製薬株式会社 研究本部 先端医療研究所 先端医療研究部 精製工学グループ

酒井

宏水

大谷

渡

15：30〜16：00 「人工血小板の開発現状」（演者）慶應義塾大学 医学部 輸血・細胞療法部

半田誠

16：00〜16：10 「閉会のご挨拶」
慶應義塾大学 医学部 血液内科

池田康夫

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 16 , No.4, 2008

教授

187

総

説

巨大ヘモグロビンの構造と機能
Structure and Function of Giant Hemoglobins
沼本 修孝（1，2），中川 太郎（2，3），福森 義宏（2），三木 邦夫（1）Nobutaka Numoto (1, 2), Taro Nakagawa (2, 3), Yoshihiro Fukumori (2), Kunio Miki (1)

和文抄録
無脊椎動物のヘモグロビン（Hb）は，よく知られている脊椎動物のHb四量体とは異なり，多様なオリゴマー状態と会合様式を示す．なかでも環形動物の巨大Hbの構造解析は難航していたが，近年になりようやく高分解能の結晶構造が得られるようになってきた．環形動物マシコヒゲムシの巨大Hbは分子量約40万の24量体構造であり，他の無脊椎動物にもみられる２量体構造が規則正しく会合している．他の環形動物の異なる巨大Hb間においても，共通の構造がみられた．
マシコヒゲムシの巨大Hbは酸素と同時に硫化水素も運搬することができると考えられ，結晶構造からその分子機構が推察された．また，巨大Hbとしては初めて，一部のサブユニットがリガンド非結合型となっている結晶構造の解析もなされた．これまでの酸素結合型と比較して構造の変化が認められ，巨大Hbの協同性機構の解明へ向けて重要な知見が得られた．巨大Hbは一般に酸素親和性が高く，また自動酸化されにくいが，その理由が結晶構造からも確認できた．
Abstract
Invertebrate hemoglobins（Hbs）show remarkably different oligomeric structure and quaternary assemblage from well-known
mammalian tetrameric Hb. Recent crystallographic studies reveal structures of some giant Hbs of annelids. The structure of
giant Hb from Oligobrachia mashikoi has been determined. Oligobrachia Hb shows 24meric hollow-spherical structure. It isconstructed from the common dimeric units, which occurs in some invertebrates. The same dodecameric subassembly isobserved in the structures of other annelids. Oligobrachia Hb has ability to bind sulfide as well as oxygen, and the structure also
provides insights into the mechanisms of sulfide-binding. In addition, the structure of partially unliganded met form is solved.
Compared to the structure of oxy form, the remarkable structural changes are observed. These findings provide insights into
the cooperative mechanisms. Structural bases for the high oxygen affinity and autoxidation resistance of giant Hbs have also
been elucidated.
Keywords
crystal structure, giant hemoglobin, polychaete, assembly, cooperative, sulfide

はじめにヒトやウシ，ウマなどの脊椎動物のヘモグロビン（Hb）は，
古くから各分野において非常によく研究されているタンパク質である．また，原子レベルでの立体構造がX線結晶構造解析の手法を用いて初めて決定されたタンパク質としても，ひろく知られている．その後，酸素結合型（oxy型），酸素非結合型（deoxy型）の結晶構造も相次いで決定され，Hbの酸素平衡曲線がシグモイド状のカーブを示す（協同性）機構がその立体構
造のちがいから説明され，構造と機能の関係が明確にされた代（1）京都大学大学院理学研究科〒606-8502

表的な例となった1）．
Hbの構造解析の成功によって，タンパク質のような巨大分子についても，その原子ひとつひとつに至るまでの立体構造を
精度よく決定する手法が実証され，タンパク質をはじめとする生体高分子が働く機構を，その立体構造から解明しようとする
構造生物学の原点ともなった．この十数年間には技術的な進展もあいまって，立体構造が解明されたタンパク質等は年々指数関数的に増加し，現在までに５万以上のタンパク質の原子座標がPDB（Protein Data Bank, http://www.pdb.org/）にデータ

京都市左京区北白川追分町

Department of Chemistry, Graduate School of Science, Kyoto

University, Kitashirakawa oiwake-cho, Sakyo-ku, Kyoto 606-8502, Japan（2）金沢大学大学院自然科学研究科 Department of Life Science, Graduate School of Natural Science and Technology, Kanazawa University（3）現所属：法政大学マイクロ・ナノテクノロジー研究センター Research Center for Micro-Nano Technology, Hosei University
論文受付 2008年８月30日 論文受理 2008年10月１日

188

人工血液 Vol. 16 , No.4, 2008

ベース化されるまでになった．今日では，タンパク質の機能を深く議論するために，その詳細な立体構造の情報は欠かせないという認識は，多くの研究者に広く受け入れられるようになった．
脊椎動物Hbの構造解析以後，無脊椎動物のHbの解析もいくつかなされてきた．無脊椎動物は，脊椎動物のものとは異なったHbを有しているが，そのなかでも，単量体や二量体，四量体の比較的小さなHb（脊椎動物Hbは四量体）で立体構造が決定されている．一方，ミミズやゴカイなどの環形動物には，数十ないし百以上のサブユニットからなる多量体構造のHbが存在し，その分子量は数十万から数百万にも及ぶ．しかしながらこのような環形動物の巨大Hbについては，その巨大な分子量ゆえに長い間解析が困難であった．本稿では，近年ようやく詳細な立体構造が解明されつつあるこれらの巨大Hbについて，
構造解析から明らかになったことを概説する．

また，近年の放射光施設の整備は，構造解析の成功の飛躍的な上昇に大きく貢献している．放射光施設で利用できるX線の強度は非常に強く，通常実験室で用いる回折実験用X線発生装置から得られるX線（タンパク質では多くの場合Cu Kα線を利用する）と較べて最大で３-４桁程度も大きい．これにより，実験室のX線発生装置を用いた解析をはるかに上回る精度，分解能での解析が可能となったほか，そもそもこれまで解析が困難であった回折能の弱い結晶や，サイズの小さな結晶からでも迅速に構造解析を行うことが可能となった．現在もX線ビームの高輝度化やタンパク質X線結晶構造解析用ビームラインの高度化などが精力的に進められており，これに伴って，これまで結晶化が困難でよりサイズの小さな微結晶しか得ることができなかったような場合でも構造解析が可能になるなど，今後もこれまで解析が困難とされたタンパク質，特に巨大なタンパク質
複合体や膜タンパク質などについても結晶構造が決定されることが期待されている．

X線結晶構造解析法
現在，タンパク質などの生体高分子の立体構造を決定する主な手法としては，前述のX線結晶構造解析の他，NMRによるもの，また電子顕微鏡による解析がひろく行われている．ところが，NMRによる解析では，溶液状態で測定ができるというメ
リットがある一方，適用できる分子量がおよそ数万までに限られ，比較的小さなタンパク質にしか適用できない．また，電子顕微鏡による解析については，ごく一部の例外を除き，個々の原子位置を決定できるほどの分解能を得ることが困難である．
X線結晶構造解析法は，良質なタンパク質の単結晶が得られれ
ば，解析可能な分子量にはほぼ限界はなく，また十分な分解能（目安として，３Å以上）があれば個々の原子座標を決定できることから，今日の構造生物学において構造決定法の主流となっており（Fig. 1），PDBに登録されている構造数の実に約85%がこのX線結晶構造解析法によるものである．

Fig. 1. Overview of X-ray crystal structure analysis.

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無脊椎動物のHb
無脊椎動物においては，酸素を結合・運搬する役割を果たすものとして，Hbやヘモシアニンがよく知られている．無脊椎動物のHbは，脊椎動物と基本的に同一の構造のグロビン鎖から構成されているが，多量体を形成する際の会合の様式が大きく異なる（Fig. 2）．さらに脊椎動物のHbがα鎖，β鎖ふたつずつからなる四量体であるのに対し，無脊椎動物のHbには，単Fig. 2. Oligomeric Hbs whose crystal structures have been determined.
Cylindrical representations of known structure of vertebrate andinvertebrate Hbs are shown. Human Mb is included. The E and F
helices accommodating the heme are highlighted.

189量体から，ときには非グロビン鎖を含む100以上のサブユニッ
トから構成される巨大なHbを持つものも存在する2）．それらの酸素親和性，協同性などの性質はそれぞれで全く異なっており，
特に協同性を発揮する機構については，脊椎動物のHb四量体とは分子の会合状態が異なることから，まったく別個のメカニズムで実現していると思われる．このような無脊椎動物のHbの立体構造が解明された例はあまり多くなく 3，4），とくに酸素（一酸化炭素）結合型と非結合型の双方の構造に基づいた詳細な協同性機構の研究例は，わずかにアカガイ（Scapharca
inaequivalvis）のHbI 5）にあるのみである．
ミミズやゴカイなどの環形動物の一部に，分子量が数十万，
あるいは数百万にも及ぶ巨大なHb（erythrocruorinとも呼ばれている）が存在していることは古くから知られており，超遠心分析法や電子顕微鏡の開発の黎明期にすでに研究対象として用いられている．しかしながら，原子レベルでの構造は決定されておらず，多数のグロビン鎖がどのように構成されて機能しているのか，詳細は不明であった．

を形成する．またさらにこの４量体が３つ会合し，12量体となる．最後に12量体が２つ会合して，24量体となっていた．
また，この巨大Hbの構造中には多くのdisulfide結合がみられた．まず４種のグロビン鎖にはすべて，分子内に１箇所のdisulfide結合が存在する．さらに４量体内のA1鎖とB2鎖間にもdisulfide結合が形成されており，また４量体同士を結びつけるようにもdisulfide結合が存在していた（Fig. 4）．これらの分子間disulfide結合は，12量体構造のいわば外縁部をつなぎ止めるような形で存在しており，12量体構造を安定に保つために寄与していると考えられる．12量体同士の会合に関しては特にdisulfide結合の形成はない．これは接触面積が十分に確保されているためであろう．

マシコヒゲムシ巨大Hbの結晶構造
われわれは環形動物の一種である有鬚動物マシコヒゲムシ（Oligobrachia mashikoi）の巨大Hb（分子量約40万）の構造を，シンクロトロン放射光を用いたX線結晶構造解析により2.85Å
分解能で解明した6）．この巨大Hbは４種類のグロビン鎖（A1，A2，B1，B2）がそれぞれ６つずつ会合し，球状の24量体を形成していた（Fig. 3a）．分子の直径は約120Å（12 nm）であり，内部には直径およそ50Å（5 nm）の空洞を有している（Fig. 3b）．
４種類のグロビン鎖から24量体が形成される様子は，規則正
しい階層的なものであった（Fig. 3c）．まず，A1鎖とB1鎖が会合して２量体を形成する．同様にA2鎖とB2鎖も全く同様な２量体を形成する．さらにこの２種類の２量体が会合し，４量体

Fig. 4. Schematic diagram of disulfide bonds in the dodecamer
subassembly of Oligobrachia Hb.
Each globin is shown as a circle, and tetramer subassembly isshown as a rounded square. Disulfide bonds are indicated as boldlines.

12量体構造の共通性

Fig. 3. Overall structure and structural hierarchy of Oligobrachia Hb.
A1, A2, B1, and B2 subunits are shown in red, green, blue, andyellow, respectively.（a）Overall structure of Oligobrachia Hb. The
views along the three-fold axis（left）and the two-fold axis（right）
perpendicular with the three-fold axis.（b）Sliced surface model of
Oligobrachia Hb reveals hollow-spherical structure.（ c）
Hierarchical subassemblies of Oligobrachia Hb.

190

私たちのマシコヒゲムシ巨大Hbの構造解析にわずかに先だって，同じ環形動物であるツリミミズ（Lumbricus terrestris）の巨大Hb（erythrocruorin）の部分構造についてのX線結晶構造解析が報告された 7）．ツリミミズの巨大Hbは分子量およそ360万にもおよぶ巨大なHbであり，グロビン鎖144個と，リンカー鎖と呼ばれる分子量25,000前後の非グロビンサブユニット
36個の，計180個のサブユニットより構成されている．それまでの電子顕微鏡や低分解能のX線結晶構造解析 8）により，グロビン鎖12量体と，リンカー鎖３量体がひとつのユニットを形成し，それが12ユニット会合していることがわかっていた．このうちグロビン鎖12量体のみの結晶構造がまず報告されたのだ
が，直後にわれわれが解析したマシコヒゲムシ巨大Hb内の12量体構造と，disulfide結合の位置も含めて全く同一の会合様式

人工血液 Vol. 16 , No.4, 2008

であった（Fig. 5）．すなわち，有鬚動物の24量体巨大Hbと，環形動物の180量体巨大Hbは，どちらも４種類のグロビン鎖からなる共通の12量体構造を構成要素としていることが明らかとなった．

Fig. 5. Structural components of giant Hbs.
Both Lumbricus Hb（3,600 kDa）and Oligobrachia Hb（400 kDa）
have common globin-dodecamer subassembly.

ツリミミズの巨大Hbに関してはその後，すべてのサブユニッ
トを含んだ全体の結晶構造が，3.5Å分解能で報告されている9）．

２量体構造の共通性
マシコヒゲムシと，ツリミミズの巨大Hbに共通してみられる12量体部分構造のうち，さらにこれを構成する２量体の会合様式について，同様のものがいくつかの無脊椎動物のHbに見られる．Fig. 2.には，これまでに解明された無脊椎動物Hbの立体構造のうち，２量体以上のものを示した．これ以外にも，単独のグロビン鎖で働いているHbも多く，それらの立体構造も多数報告されているが，ここではすべて省略してある．
マシコヒゲムシやツリミミズの巨大Hbの構成単位となっている２量体構造は，軟体動物のアカガイ5，10）や，棘皮動物のナマコ（Caudina arenicola）のHb11）における２量体構造と基本的に同一の会合様式である．すなわち，ヘムを挟み込むように配位しているEヘリックスとFヘリックスを，各々向かい合わせるようにして２量体を形成している．このような会合様式のため，これらはEFダイマーと呼ばれている．
EFダイマー構造では互いのヘムのプロピオン酸の距離は最も近いところで３-６Åほどしかなく，またヘム周辺の環境に大きく寄与しているEヘリックス，Fヘリックスの残基が互いのサブユニットの残基と接触していることからも，いかにも協同性の機構に直接影響していると考えられる．無脊椎動物Hbのなかで唯一，アカガイのHbIで協同性の機構が詳細に議論されているが 5，12-16），はたして，２量体接触面に位置するE10（Thr），F3（Lys），F4（Phe）が協同性の機構に大きく関わっていることが明らかにされている．興味深いことに，アカガイ
HbIはCO結合型とdeoxy型で，その会合状態はほとんど変わらない．上記のE10，F3，F4を含む，２量体接触面付近の残基とヘム分子のわずかな動きによって，一方のサブユニットにおけるligand分子の結合・解離の情報を伝えているものと考えられる．これは，oxy型とdeoxy型でその四量体の会合状態を大きく変えて協同性を発揮する脊椎動物のHbとはまったく異なった機構である．

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アカガイ，ナマコ，環形動物のEFダイマー構造を基準に，これまでに明らかになっているHbの構造を２量体に注目して比較したものがFig. 6である．マシコヒゲムシ，ツリミミズの巨大HbはEFダイマーとして分類した．アカガイはHbIとHbIIの２種類のHbを持っているが，HbIIはHbIと同様のEFダイマ
ー構造がさらにふたつ会合した４量体である10）．これは，巨大
Hbの４量体構造とよく似た会合状態でもあり，やはりEFダイ
マーとして分類できる．ユムシ（Urechis caupo）のHb17）は４量体であるが，これも２量体構造がさらに会合したものとみなせる．原始的な脊椎動物であるヤツメウナギ（Petromyzon
marinus）のHbは（進化上の前後は無視すると），EFダイマー
から少し変化したものであるとみなせ，依然互いのEヘリック
スとFヘリックスは比較的近い位置に配置している．ユムシHbの２量体構造ではこれがさらに離れ，ヒトなどの脊椎動物Hbの２量体（αβ）に至っては，もはや互いのEヘリックスとFヘリックスは完全に逆方向に配置されるかのような会合状態となっている．このように，脊椎動物のHbと無脊椎動物のHbが極めて異なった機構で協同性を実現していることが，そのグロビン鎖会合状態の違いからも明らかであろう．

Fig. 6. Dimeric Hbs or dimer subassemblies of the oligomeric Hbs.
The orientation of each dimer structure is aligned with that of an
upper subunit of EF-dimer, indicated in the box. Note that Urechis
Hb has no cooperativity.

ところで，マシコヒゲムシ，ツリミミズ巨大Hbの２量体構
造，およびナマコHbは，アカガイHbIと基本的に同様のEFダ
イマー構造を持つのだが，鍵となる２量体接触面の残基は特に保存されておらず，前述のE10，F3，F4の残基もおのおの異なっている．後述するように，同様のEFダイマー構造を持つにもかかわらず，その協同性の詳細な機構はそれぞれ異なっている．

有鬚動物巨大Hbの特殊な機能
われわれが研究に用いているヒゲムシ（beard worm）と呼ばれる有鬚動物は，海底に生息している動物であるが，口や消化管を退化させており18，19），栄養源の多くは体内の特殊な組織（trophosome）に共生する化学合成細菌に依存している 20-23）．
この共生細菌は，おもに硫化水素を利用する硫黄酸化細菌の一種と考えられており，実際，有鬚動物の生息する海底は硫化水素が豊富な環境となっている24，25）．われわれが対象にしている191

マシコヒゲムシ（Oligobrachia mashikoi）は，石川県能登半島の九十九湾海底およそ25 m付近に生息しており（Fig. 7a），体
長10数cm，体の直径は１mmにも満たない細長い生き物である18）．
これが棲管と呼ばれるキチン質の鞘におさまり，さらに棲管ごと体をなかば海底の泥に埋め込むようにして生活しているものと考えられている25）．この付近に体積している泥の表面近くで硫化水素（硫化物）が検出されており25），マシコヒゲムシの共生細菌はこの硫化水素を利用しているものと考えられる．マシ
コヒゲムシを含む比較的小型のヒゲムシ類のほかにも，ハオリ
ムシ（tube worm）類と呼ばれるやや大型の有鬚動物も存在す
る．体長が数mにも及ぶことがあるハオリムシ 26）は，深海底の熱水噴出口近くなどの硫化水素が高濃度で存在する環境に生息しており，やはり消化管をもたずに共生細菌に栄養源を依存している27-29）．このハオリムシ類もまた，血液中に巨大Hbをもっており，分子量約40万，および分子量約360万の巨大Hbの両方が存在している30）．これらはそれぞれ，マシコヒゲムシの巨大Hb，ツリミミズの巨大Hbと相同なものである（Fig. 7c）．

Fig. 7. Sulfide-binding Hbs of beard worms and tube worms.
（a）Collected beard worm, Oligobrachia mashikoi.（b）Giant Hbs ofbeard worms and tube worms have the ability to bind andtransport sulfide as well as oxygen. The giant Hb provides theendosymbionts with sulfide.（c）Tube worms have both 3,600 kDa
and 400 kDa Hbs. These Hbs have essentially the same structuralfeatures as that of Lumbricus Hb and Oligobrachia Hb, respectively.

192

有鬚動物の共生細菌は，trophosomeと呼ばれる特定の組織内に存在しているため，外部環境から取り込んだ硫化水素を共生細菌まで供給するシステムが必要であるが，これを担っているのは巨大Hbであると考えられている31-33）．すなわち，有鬚動
物の巨大Hbは，通常のHbと同様に酸素を結合・運搬するほか，共生細菌が利用する硫化水素も同時に結合・運搬している（Fig. 7b）．酸素の結合と，硫化水素の結合は独立していることから，硫化水素は酸素と競合してヘムに配位するのではないと考えられ31-33），ヘムとは別の硫化水素結合部位があるものと考えられている．このように有鬚動物の巨大Hbは他のHbには見られない非常に特徴的な機能を有しており，この硫化水素結合の分子機構の解明も，われわれの大きな目的である．
硫化水素結合の機構を直接証明する，硫化水素結合型の立体構造はいまだ明らかになっていないが，他の実験結果から，巨大Hb内に存在するdisulfide結合を形成していないCys残基が関わっているとの予想がされていた 34，35）．そして，これらのシス
テイン残基は硫化水素結合の機能をしめす巨大Hbにのみ共通に保存されており，一方ほとんど同様の構造を持つにもかかわらず，硫化水素結合の機能を示さないツリミミズの巨大Hbでは他のアミノ酸に置き換えられている．われわれが解析したマ
シコヒゲムシの巨大HbにおいてもこれらのCys残基は保存されており（Fig. 8a），さらに結晶構造中でその周囲はPheや，Leu，Ileなどの疎水性のアミノ酸残基に取り囲まれていた（Fig. 8b）．
硫化水素はこれらのCys残基がpersulfideを形成するかたちで結合・運搬するものと考えられている．非常に反応性の高い
persulfideを溶媒領域に不必要にさらすことなく，共生細菌に硫化水素を引き渡すまで，周囲の疎水性のアミノ酸残基により，安定的に保持していると考えられる．
われわれの構造解析とほぼ同時期に，ガラパゴスハオリムシ（Riftia pachyptila）のもつ巨大Hbの結晶構造も報告された 36）．
この巨大Hbは血液中に存在しているHbではなく，体腔内に存Fig. 8. Putative sulfide-binding sites of Oligobrachia Hb.
（a）Four subunits of Oligobrachia Hb are superimposed. The
conserved Cys residues at E8 and E18 positions occur in sulfidebinding Hbs.（b）The environments of putative sulfide-binding
Cys residues are highly hydrophobic.

人工血液 Vol. 16 , No.4, 2008

在しているHbであるが，その構造はわれわれが解析したマシ
コヒゲムシの巨大Hbと全く同様の24量体であった．このガラ
パゴスハオリムシの体腔Hbには強固に結合している亜鉛イオンが見つかり，さらにはこの亜鉛イオンをキレート剤で除去すると硫化水素結合活性が低下することが観測されたことから36，37），
Cys残基が全く関わらない，別個の硫化水素結合機構の存在も提唱されている．ただしこの亜鉛イオンの保持に関わっている残基（多くはHis）は一部の巨大Hbでしか保存されておらず，
他の巨大Hbも同様の機構を有するかは不明である．

一部リンガンド非結合型の構造
これまでに解析された巨大Hbの構造は，すべてoxy型あるいはCO結合型であり，リガンドの結合していない構造は明らかになっておらず，協同性の機構も不明なままであった．われわ
れは最近，マシコヒゲムシ巨大Hbについて，４種類のグロビ
ン鎖のうち３種類がリガンドを結合していない状態（全体の24量体のうち，18のグロビン鎖がリガンド非結合型）での構造解析に成功した 38）．構造解析の結果得られた電子密度図で，A1鎖以外のヘムポケットにはまったく電子密度が観測されず（Fig.
9），リガンドが何も配位していないことが明らかである．A1
鎖にのみ，はっきりとリガンド由来の電子密度が観測され，これは酸素分子として解釈が可能であった．

ムには水分子が配位しているが，われわれが解析したマシコヒ
ゲムシ巨大Hbでは，水分子に相当する電子密度がまったく観測されなかった．これはリガンド分子が配位するヘムポケットの上方に位置するバリン残基（E11）が大きく関わっていると思われる．先に解析したoxy型の構造と比較してみると，met（A1-oxy）型ではVal E11の側鎖がヘムポケットへ向かって大きく張りだしており，これによる立体障害によって水分子の配位が妨げられているものと考えられる．さらに遠位His（E7）が逆に遠ざかることにより，リガンド分子との水素結合が形成できにくくなっていることも原因のひとつと思われる（Fig. 10a）．
met（A1-oxy）型ではこのほかにも，oxy型と較べて構造の変化が認められた．EFダイマー構造を両者で比較してみると，互いのグロビン鎖のAヘリックスとBヘリックスをつなぐループ領域（ABループ）で構造の変化が見られ，結果としてmet（A1-oxy）型のほうが若干コンパクトな２量体構造をとっていることがわかった．２量体構造がそれぞれ構造変化を起こすことにより，それらが組み合わさって形成される12量体構造においても，met（A1-oxy）型のほうがわずかにコンパクトな構造となっていることも明らかになった．リガンド非結合型のほうがよりコンパクトな構造をとるのは，脊椎動物のHbも含めてこれまでに構造が知られているHbに共通する特徴である3）．

Fig. 9. Electron density maps around the hemes of each subunit.
2Fo-Fc and Fo-Fc maps calculated from the oxygen omitted modelare drawn in cyan and magenta, respectively.

このときに用いた結晶は茶色がかった典型的なメト型の色を呈しており，この結晶を再度溶解させて可視光スペクトルを計測すると，630 nm付近の吸収が観測された．これらのことか
らこの結晶構造は，A1鎖のみ酸素が結合したまま他のグロビン鎖ではヘム鉄が酸化されてメト型となった状態（met（ A1oxy）型）であると結論した．通常多くのHbでは，メト型のヘ

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Fig. 10. The ligand binding site of Oligobrachia Hb.
（a）Structural changes around the distal site in Oligobrachia Hb.
The B2 subunits of oxy and met（A1-oxy）form are represented
in yellow and blue, respectively.（b）The space-filling model
reveals the narrow space of distal site of the A1 subunit of
Oligobrachia Hb.

193

巨大Hbの酸素親和性，自動酸化met（A1-oxy）型において，A1鎖のみ酸素が結合したままであったことは，A1鎖におけるヘムポケット周辺の残基が結合した酸素分子を安定的に保つために最適な環境となっているためと考えられる（Fig. 10b）．特に，ヘムポケット上方に位置す
るPhe残基（B10）の芳香環によって，ヘムに配位した酸素分子が安定化されており38），A1鎖においては芳香環平面と，酸素分子との角度や距離がほぼ理想的な値 39）となっている．他のグロビン鎖においてもB10の残基は芳香性のPheまたはTrpとなっているが，芳香環平面と酸素分子との立体的な位置関係がA1鎖ほど理想的な値ではなく，A1鎖において最も酸素分子が安定的に保持されていることから，メト型化を逃れたものと考えられる．
B10のPhe残基の効果はMbでの変異解析からも確認されており，酸素親和性の上昇と，自動酸化の抑制が報告されている40）．
マシコヒゲムシ巨大Hbをはじめ，ミミズやハオリムシの巨大HbにおいてもB10はPheまたはTrpがよく保存されており，ヘ
ムポケット周辺はヒトHbと較べて空間的な余裕が非常に少な
い7，38）．これら巨大Hbでは酸素親和性が高く，自動酸化は起こ
りにくいが，これにはヘム周辺におけるこのような環境が大きく寄与しているものと考えられる．またこれらの巨大Hbは血液中に直接溶解して存在している細胞外Hbであり，自動酸化が起こりにくいことは，機能を安定的に維持するため極めて重要であると思われる．
通常では自動酸化がほとんどみられないにもかかわらず，マシコヒゲムシ巨大Hbでmet（A1-oxy）型の結晶が得られたことについては，結晶化する際に用いたポリエチレングリコール（PEG）試薬にわずかに含まれる不純物などによって，徐々に酸化を受けたものと考えられる．

巨大Hbの協同性機構
脊椎動物の四量体Hbでは，酸素結合の協同性を促進する分子として，BPG，IHP，ATP，あるいは塩化物イオンなどがひろく知られている．一方，環形動物の巨大HbではCa 2+やMg 2+などの二価金属イオンの存在下で協同性が顕著に上昇することが報告されており41，42），これら金属イオンによる巨大Hbの協同性への影響に関して，立体構造からその機構を明らかにするため，Ca2+およびMg 2+が結合した状態でマシコヒゲムシ巨大Hbの構造解析を行った 43）．その結果，いずれの構造もoxy型で，Ca2+やMg 2+は各グロビン鎖の間を結びつけるように結合していることが明らかになった（Fig. 11）．特筆すべきは，これらの金属イオンは分子間disulfide結合の存在しないグロビン鎖間に配置されていることであり，これによって巨大Hbの24量体構造をより安定に保っているものと考えられる．これらの金属結合型oxy構造は，先にCa2+やMg 2+が存在しない状態で構造解析が行われたoxy型構造と比較して，その全体的な構造はほとん
ど変化しておらず，このことからCa2+やMg 2+の存在は，oxy型（R型）構造をより安定的に保つことに寄与しているものと思われる．マシコヒゲムシ巨大Hbの酸素親和性実験の結果41）か194

ら，Ca2+やMg 2+の存在下ではR型の酸素親和性が上昇することが示されており，巨大Hbの協同性上昇はこれら金属イオンによるR型構造の安定化によって実現されていることが明らかになった．

Fig. 11. Metal binding sites of Oligobrachia Hb.
（a）The Ca2+ binding site. Only one out of four sites is shown.
（b）
The Mg 2+ binding site. This site is shared between Ca2+ andMg 2+ bound forms.（c）The positions of Ca 2+ and Mg 2+ ionslocated at interfaces of subunits are presented with a split modelof whole molecule.

また，oxy型構造と一部リガンド非結合型構造との詳細な比較により，環形動物巨大Hbにおいても，特にヘムを含めたEF
ダイマー間の接触部位での構造変化が協同性の機構に重要な役割を果たしていることが明らかになった．脊椎動物Hbと同様に巨大Hbにおいても，ヘム平面はリガンド非結合時に折れ曲がっており，酸素結合時にはよりきれいな平面状になっている．
このヘムの構造変化が，EFダイマーの隣のF3'（His/Arg），
F7'（Gln）残基を介して隣のF'ヘリックスに伝えられ（ここでは，「 ' 」は隣のサブユニットであることを示す），このヘリックスに配位しているヘムのdistal pocketの環境に影響を与えている（Fig. 12）．すなわちF'ヘリックスの動きにより，先述したヘムとVal E11'およびHis E7'との位置関係の変化を引き起こ
し，リガンド分子の結合に影響を与える機構が解明された．マ
シコヒゲムシ以外の環形動物の巨大Hbにおいては，これらの残基は大変よく保存されており，このEFダイマー間での協同性の機構は環形動物の巨大Hb間で共通しているものと考えられる．

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って，脊椎動物Hbとは大きく異なった性質を実現し，さらには硫化水素結合のような機能まで付加していることは驚きである．巨大Hbに限らず，まだ不明なものの多い無脊椎動物のHbからは今後も様々な発見が期待される．それらの知見により既存のHbの機能と構造を人工的に改変できるようなことがあれば，大変興味深い研究に発展していくのではないかと期待して
いる．

引用文献

Fig. 12. Close up views of the interface of the EF-dimer of Oligobrachia
Hb.
The A2B2 dimer of the oxygenated Ca2+-bound form and that ofmet（ A1-oxy）form are superimposed.（ a）Conformational
movement of the propionate group of the heme causes a slidingof neighboring F' helix, due to movement of the propionate
group together with neighboring residues, Arg F3' and Gln F7'.
（b）
The sliding of the F' helix includes sliding of the coordinatedheme and result in the tertiary rearrangement of the relative
positions between the heme and Val E11' to control open or
closed form for the ligand binding.

先にも述べたように，同じEFダイマー構造をもつアカガイ
HbIにおける協同性機構とは全く異なり，ダイマー構造の変化を伴いながら異なった残基によって構造変化を伝えているところが興味深い．巨大HbではこのEFダイマー同士がさらにdisulfide結合で結ばれている．4量体や12量体での協同性機構を解明することが今後の課題である．

おわりに
マシコヒゲムシの巨大Hbは酸素親和性が最大で0.19 mmHgと高いため41），中性付近の緩衝液中で精製，保存する限り安定
してoxy型を保ち，また特別な処理をすることがなくとも自動
酸化は数ヶ月にわたってほとんど観測されない．また，その24量体構造も安定的に保持しており，極端な条件でない限りサブ
ユニットの解離なども起こりにくい．脊椎動物のHbと共通のグロビン鎖構造から構成されているにもかかわらず，アミノ酸残基の違いやグロビン鎖同士の会合状態を変えることなどによ

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197

原著

多波長パルス分光法を用いた
Hb小胞体用パルスオキシメータに関する研究
Study on Multiwavelength Pulse Spectrophotometry
Applicable for Hemoglobin-vesicles
須崎 裕典（1，2），酒井 宏水（1），小林 直樹（2），池田 達彦（3），堀之内 宏久（3），小林 紘一（3），武田朴（1，2），戸川 達男（1），土田 英俊（1）Hironori Suzaki (1, 2), Hiromi Sakai (1), Naoki Kobayashi (2), Tatsuhiko Ikeda (3), Hirohisa Horinouchi (3),Koichi Kobayashi (3), Shinji Takeda (1, 2), Tatsuo Togawa (1), Eishun Tsuchida (1)

和文抄録
ヘモグロビン小胞体（HbV）は，高純度高濃度ヘモグロビン溶液をリン脂質二分子膜で被覆した形状の人工酸素運搬体である．これまでに輸血代替としての酸素運搬機能と安全性が明らかにされてきた．今後の課題の一つとして，臨床現場で緊急投与を想定した場合に，患者の呼吸管理，各種検査，HbVの機能変化の観察が継続して支障なくできることが挙げられる．パルスオキシメータ（POM）は，経皮的・非侵襲的に動脈血の酸素飽和度と心拍数を計測でき，救急医療，集中医療の現場で日常的に利用され，その有用性も充分に認知されているので，HbVを投与した場合も，支障なく使用でき
ることが望まれる．しかし，HbVは赤血球と同じ血色素Hbを有しているものの粒子径が小さく光学的特性が異なること，また，HbVは次第にHbが酸化しメトヘモグロビン（MetHb）が増大するが，POMはdeoxyHbとO2Hbの二成分系の測定を前提としているので，正確な測定が出来ない可能性がある．そこで本研究では，現行のPOMを使用した場合のHbVの干渉作用の程度を確認するとともに，HbVを投与した後も酸素飽和度およびMetHb含量を正確に測定できる新しいPOMの開発を試みた．In vitro試験として血液循環シミュレータを構築しブタ血液を循環させ，HbVで段階的に置換したところ，
現行のPOM（DDG-3300, 日本光電）が表示する酸素飽和度（SpO2）は低下する傾向にあり，血液置換60％のとき，SpO2
は約70％にまで低下し，HbVの干渉作用の存在が明らかになった．現行POMシステムの測定波長（660, 940 nm）に対し，更に２波長（620, 730 nm）を加え，計４波長の発光ダイオードを測定プローブ（TL-301P）に組み込んだ．ビーグル犬７匹を用いたHbVの投与試験（循環血液量の40％置換）に際し，FiO2を1.0, 0.2, 0.15 に設定して酸素飽和度を変化させ，採血液の酸素飽和度とMetHb含量の変化を４時間実測するとともに，測定プローブを舌に装着し減光度を計測した．各波長の減光度比から，酸素飽和度（SpO2 ），およびMetHb濃度を求める計算式を重回帰分析により構築し，DDG-3300の内部ソ
フトウェアに導入し改良型を試作した．現行型と改良型POMを比較検討したところ，HbVの投与により，現行POMのSpO2計測精度は-7.2±3.3％であったが，改良型POMのSpO2計測精度は1.1±1.9％に改善され，また，MetHb計測精度は0.7±1.3％であった．今後更に最適波長の検討と投与実験を重ねることにより，精度の向上が期待できる．
Abstract
A pulse oxymeter（POM）is indispensable in a clinical setting to monitor arterial blood O2-saturation（SpO2）of a patient noninvasively. POM is designed to analyze spectrum of Hb on the arterial pulse with two wavelengths under the assumption that
there are only two components of Hb, namely, deoxy- and oxy-Hb. Hb-vesicles（HbV, 250 nm）are artificial O2 carriers, and thesafety and efficacy as a transfusion alternative have been clarified. HbV encapsulates human Hb, however, the particle
dispersion induces a strong light scattering in comparison with RBC, and gradual MetHb formation is inevitable because of the（1）早稲田大学理工学術院 〒169-8555 東京都新宿区大久保3-4-1 Research Institute for Science and Engineering, Waseda University 3-4-1
Okubo Shinjuku-ku Tokyo 169-8555（2）日本光電工業（株）
荻野記念研究所 Ogino Memorial Laboratory, Nihon Kohden Co.
（3）慶應義塾大学 医学部呼吸器外科 Department of General Thoracic Surgery, School of Medicine, Keio University
論文受付 2008年10月７日 論文受理 2008年10月20日

198

人工血液 Vol. 16 , No.4, 2008

lack of the MetHb-reducing system in HbV. It is speculated that such peculiar characteristics of HbV would interfere with SpO2monitoring. Under such background, we aimed to clarify the interference effect of HbV on the commercially available POM, andto establish a method to avoid such effect using a multiwavelength system. Using the in vitro blood circulation system comprisedof a pulsatory pump, an artificial lung, and the POM（Nihon Koden, DDG-3300; detection wavelengths: 660, 940 nm）, we clarified
that the stepwise addition of 60 vol％ HbV to a pig blood tended to decrease the SpO2 to 70％, and interference effect of HbV
was evident. We introduced two detection wavelengths（620, 730 nm）in addition to 660 and 940 nm to a probe（TL-301）, andtested its effectiveness in the 40％-blood exchange experiments using 7 beagles. FiO2 was set 1.0, 0.2, and 0.15, and the accurate
SaO2 and MetHb content were monitored for 4 hrs. Equations to calculate SpO2 and MetHb content was established by amultiple regression analysis. Using the modified POM with 4 wavelengths, the deviation of SpO2 is minimized from -7.2±3.3％ to
1.1±1.9％, and MetHb level can be measured with in the deviation 0.7±1.3％. Optimization of wavelengths and moreexperiments will improve the accuracy of POM for HbV.
Keywords
pulse oxymeter, blood substitutes, interference effect, light scattering

はじめに
人工酸素運搬体であるHb小胞体（HbV）について，動物投与試験から優れた酸素運搬機能と安全性が実証されてきた 1）．
臨床現場で使用することを想定した場合に，人工酸素運搬体投
与前後の生体モニターの継続とモニタリング精度の保障，投与された人工酸素運搬体の機能のモニタリングを確保すること
が，Medical Engineering（ME）に関連する課題の一つとして重要である．人工酸素運搬体の光学的特性が血液とは異なるため，検査項目によっては従来法では測定が困難となる場合がある．事実，血液生化学検査においても，修飾Hb溶液，HbV，パールフオロカーボン乳剤の投与後，採血液から血球を分離した血清・血漿中にこれら人工酸素運搬体が残存するため，比色法や比濁法による測定において干渉作用を示す 2）．しかし，HbVの場合は，比重が大きいので，超遠心分離，或は高分子量
デキストランを添加して遠心分離することで透明な血清・血漿が得られ，干渉作用を回避できることが確認されている3，4）．また，自動輸血検査器による血液型検査でも，HbVによる干渉作
用の存在が確認され5），注意を要する．
青柳ら（日本光電工業）が1974年に世界に先駆けて開発した
パルスオキシメータ（POM）は，経皮的・非侵襲的に動脈血液のみの酸素飽和度（deoxy-oxy二成分系）と心拍数を計測でき，救急医療，集中医療の現場で呼吸管理に利用され，その有用性も充分に認知されており6，7），現在では各社製品が世界中で使用されている．人工酸素運搬体の臨床試験が行われている米国では既に，修飾Hb溶液を投与した場合のPOMに対する影響が検討され，POMが正確な酸素飽和度を示さない場合がある
ことが報告されており，その対処法が求められている8，9）．従ってHbVを投与した場合も，その影響を明らかにする事と，影響がある場合の対処策を考える必要がある．HbVはメトヘモグロ
ビン（MetHb）還元酵素系を有しないため，次第にHbが酸化し，比較的早い時間にMetHbが増大するが 10），POMは二成分系の測定を前提としているので，血中にMetHbが存在すると実際の酸素飽和度よりも高く表示されることになる 11）．また，

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 16 , No.4, 2008

HbVは粒子径250 nmであり，赤血球に比較して極めて小さい．
その微粒子分散系は血管内，毛細血管内において血漿層中に均一に分散することが微小循環動態の観察から明らかになっているので 12），光散乱により生体組織の吸光度測定においても干渉作用を呈する可能性がある．そこで本研究では，現行のPOMを使用した場合のHbVの干渉作用の程度を確認するとともに，HbV投与後も酸素飽和度およびMetHb含量を正確に測定できる新しいPOMの開発を目的とした．

方法

１．計測装置に用いる検出波長の決定法
POMの原理であるパルス分光法は，分光分析の基本理論であるLambert-Beerの法則を生体に応用したものである．生体組織を透過しやすい近赤外光を用い，入射光に対する透過光の低下分を，吸光度として測定する．組織には静脈血の吸収，組織による吸収，光散乱もある．しかし，動脈血は常に拍動しているので，心臓の拡張期と収縮期では動脈血の量が変化するのに対し，静脈血や組織はほぼ一定であるので，拡張期と収縮期の吸光度差は，動脈血の吸収を見ていることになる．これが動脈血酸素分圧のみを見る原理となる．
先ず，Hb諸成分の可視光-近赤外スペクトル（既知, Fig. 1）をもとに，Lambert-Beerの法則を利用し，式（１）から波長i，jにおける減光度比Φを計算し，濃度の変化に対して相関の高い減光度比Φを理論的に検討した 11，13）．
（１）
ここで，E：吸光係数（dl/g/cm），C：濃度（g/dl）（添字：
O2 H b ＝ 酸 素 化 ヘ モ グ ロ ビ ン ， R H b ＝ 還 元 ヘ モ グ ロ ビ ン ，COHb＝一酸化炭素ヘモグロビン，MetHb＝メトヘモグロビン），i， j： 測定波長（nm，610，620，660，730，805，940）を意味する．式（１）において，O 2 Hbの濃度は60〜100％，
MetHbは１〜40％，COHbは１％，RHbは１〜40％とした．総199

Fig. 1. Hb諸成分の可視-近赤外領域の吸収スペクトルと，既存POMと改良型POMの測定波長の位置．
Table 1. 改良型POMの測定波長を選択するための重回帰分析の結果．最も標準誤差が小さかった組合せは③であったが，660 nmと940 nmの2波長を含むと従来のPOMとの比較ができるので，②の４波長を選択した．
組合わせ4波長（nm）

標準誤差（％）

番号
λ1

λ2

λ3

λ4

MetHb

SpO2

①

610

940

620

730

0.225

0.132

②

660

940

620

730

0.337

0.135

③

805

940

620

730

0.109

0.147

④

660

940

620

805

0.659

0.982

ヘモグロビン濃度tHb=16 g/dlとし，各血液成分濃度をg/dlに変換してから式（１）に代入し，重回帰分析を行った（Table
1）．その結果，最も標準誤差が小さかった組合せは620，730，
805，940 nmであったが，他の組合せも充分に精度が良く，
660 nmと940 nmの２波長が含まれていれば従来のPOMとの比較ができるため，620，660，730，940 nmの４波長を選択した．
２．改良型4波長光学システム
測定プローブ（TL-301P）に４波長LED（620，660，730，
940nm，㈱光波）を組み込み，DDGアナライザ（DDG-3300, 日
本光電社, 東京）の内部ソフトウェアを改良して人工赤血球用のPOMを開発した．Fig. 2にその概要を示す．また４波長LEDの特性をTable 2に示す．
３．in vitro実験
HbVの光学特性に起因する干渉作用について検討することを目的したin vitro実験を行った．HbVの粒子径（250 nm）は赤血球（８μm）に比べて小さく，更にPOMに使用される光源の波長よりも小さい．従って波長600〜1300 nmの光の散乱特性が異なると予想され，HbV投与後にHbVの光学特性がPOMに干渉作用を与えると予想される．しかし，動物にHbVを投与する

200

Fig. 2. 開発したPOMプローブの概要．（a）４波長LED（㈱光波製）の概観，
および（b）基板図面，（c）開発したプローブ，（d）人工赤血球用
POMの概観Table 2. ４波長LED特性（W.L.: Wavelength，Po: Total Output Power，
Vf: Forward Voltage，λp: Peak Wavelength，Δλ: スペクトル
半値幅）
W.L.（nm）

940

660

620

730

Po（mW）

3.24

5.12

1.86

3.49

Vf（V）

1.2

1.8

1.9

1.6

λp

944.0

657.6

621.6

732.9

Δλ

45.8

24.4

20.2

28.8

場合，干渉作用の原因を生理的な現象なのか，光学特性である
か特定できない．そこで，血液循環シミュレータを用いてHbV
を血液に混合する実験を行い，生理的な条件を排除し，血液の光学特性のみに着目した．
使用した血液循環シミュレータ（Fig. 3）は，拍動ポンプ（Centrimag Blood Pumping System, Levitronix, Massachusetts,USA），脈動フローセル，人工肺（泉工医科工業㈱）から構築した（循環容量: 約120 ml）．血液循環シミュレータは水に浸し，多用途加熱＆保温ヒーター（SCH-901, クマガイ電工㈱），熱電対（TR-1101-100，㈱アドバンテスト），Thermal Arraycorder（WR7800，グラフテック㈱）を用い37℃に維持した11）．血液循
環シミュレータに豚血液（tHb=6.1 g/dl）を充填し，拍動流で循環させた．ポンプ出口の圧力は収縮期で100〜130 mmHg，拡張期で70〜100 mmHgとし，流量は470〜500 ml/minとした．
５％アルブミン溶液に分散させたHbVを，リン酸緩衝生理食
塩水で希釈し，200 ml（4.9 g/dl）として使用した．後述の動物実験ではビーグル犬の総Hb濃度 約10 g/dlに対し，投与HbV濃度が8.6 g/dlなので，これと混合比を同じにするため，豚血液のHb濃度 6.1 g/dlに対しHbVのHb濃度を4.9 g/dLとした．
循環している豚血液をHbVで段階的に置換し，POMの酸素飽和度表示の変化を調べた．置換量は内容量の０％，20％，
40％，60％とした．人工肺では純酸素をガス交換させ，酸素飽和度を理論上ほぼ100％に維持した．

人工血液 Vol. 16 , No.4, 2008

Fig. 3. 血液循環シミュレータの構築．（a）拍動ポンプ（Centrimag Blood
Pumping System, Levitronix, Massachusetts, USA）
，
（b）
動物実験
用の小型人工肺（泉工医科工業㈱），（c）血液循環シミュレータの外観，（d）血液循環シミュレータにより得られた圧力および流量波形の一例．

４．動物実験
慶應義塾大学呼吸器外科にて，ビーグル犬（雄，７頭，体重7.2±0.3kg）を用いてHbV投与実験を行った 14）．ビーグルは人工呼吸器（MODEL SN-480-3，㈱シナノ製作所）を用いてセボ
フルレン２〜３％麻酔下で安静状態に維持し，一回換気量は約140ml，換気回数は20回/分程度とした．ビーグル犬の循環血液量の40％を脱血し，１時間経過してから５％リコンビナントア
ルブミンに分散させたHbV溶液（8.6 g/dL）を同量投与した．
脱血前，HbV投与直後，投与２時間後，投与４時間後のそれぞれについて，吸気酸素濃度FiO2を0.2, 1.0, 0.15と調整することによりSaO2を変化させた．ビーグル犬の舌に４波長光学システムのプローブを取り付け，SaO 2およびMetHbの変化に対する各波長の減光度を連続的に測定した．
採血液を基にした酸素飽和度の測定には，血液ガス測定装置（CO-Oximeter, ABL555，Radiometer）より測定した動脈血酸
素分圧PaO2もとに，赤血球とHbVの既存の酸素解離曲線（Fig.
4, ヘモックスアナライザーにより測定）に照らし合わせ，赤血球とHbVそれぞれの酸素飽和度を得た．そして赤血球とHbVの混合比率の実測値から，動脈血の酸素飽和度を算出した．
混合比率の算出方法は，先ず，採血液を小型遠心機（チビタ
ン-R，2,000G，6,200 rpm，コスモ・バイオ㈱）を用いて遠心分離し，赤血球とHbVを含有する血漿層に分けた．全血のHb濃度と血漿層のHbV由来のHb濃度をシアノメトヘモグロビン法により得た．ヘマトクリット値をもとに，血液中の赤血球由来
Hb濃度とHbV由来のHb濃度を求め，混合率を算出した．
採血液中のHbV由来MetHb濃度は，紫外可視分光光度計を用い，脱酸素条件で測定した波長405，430 nmにおける吸光度の比から算出した 10）．

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 16 , No.4, 2008

Fig. 4. HbVとビーグル犬の赤血球の酸素結合解離曲線．ヘモックスアナラ
イザーにより測定（37 ℃）．

５．解析法
４波長光学システムで計測した各波長の減光度比から酸素飽
和度，およびMetHb濃度を求める計算式の構築には重回帰分析を用いた．重回帰式から求めた血液成分濃度を本法の測定値とした．本法の測定値と採血による測定値を比較し，本法の精度を検証した．
４波長光学システムで計測した減光度比φから酸素飽和度およびMetHbを求める計算式を構築するために，動物実験に用いたビーグル犬７頭のうち，ビーグル犬４頭のデータを用いて重回帰分析を行った．計算式構築に用いたビーグル犬４頭のデー
タ（28データ）をTraining setと呼ぶ．独立変数は最大で６個とし，偏相関係数が最も小さい独立変数を計算式から除外し，独立変数の個数を１個ずつ減少させた．独立変数の個数が１〜６個それぞれの計算式における相関係数，AIC（Akaike's
Information Criterion: 統計的モデルを観測値と理論値の差（残差）を用いて評価する統計量．値が小さいほど当てはまりが良い），自由度調整済み寄与率（大きい方が良い）を求め，最適な計算式決定の指標とした．決定した計算式の再現性を確認するために，残りのビーグル犬３頭のデータ（27データ）に構築した計算式を適応した．再現性を確認したビーグル犬３頭のデータをValidation setと呼ぶ．

結果および考察１．HbVのパルスオキシメータに対する光学的干渉作用の解明
in vitro実験におけるHbV置換比と現行型POM表示の関係を
Fig. 5に示す．血液をHbVで段階的に置換すると，POMが表示
する酸素飽和度は低下する傾向を示した．つまり，HbVの光学的な干渉作用により，現行型POMは酸素飽和度を過小評価す
る．各測定波長における減光度変化を追加したところ，HbVの混合割合の増加に伴い，各波長の減光度が増加した．特に波長620 nmの減光度の増加が顕著であり，次いで波長660 nmの増加が大きかった．物質に光が照射されると反射・透過・回折が同時に起こる（まとめて光散乱と呼ぶ）．透過光には多重屈折

201

Table 3. 酸素飽和度の各計算式における統計量
φ660/940

-0.32

-0.62

-0.72

-0.67

-0.63

-0.60

φ660/730

0.25

0.69

0.65

0.59

×

×

各独立変数の

φ620/660

0.14

0.32

×

×

×

×

偏相関係数

φ730/940

0.74

0.75

0.72

0.67

0.44

×

φ620/940

-0.16

-0.39

-0.34

×

×

×

φ620/730

-0.01

×

×

×

×

×

偏差平方和SE113.57113.60126.13142.41

219.94273.1828

サンプル数N

28

28

28

28

28

独立変数の数n

6

5

4

3

2

1

相関係数

0.73

0.73

0.704

0.665

0.483

0.358

AIC

134.67132.67133.60135.00145.17149.24

自由度調整済みの寄与率

0.657

0.673

0.652

0.624

0.442

0.334

POMは酸素飽和度を過小評価することが分かった．
酸素飽和度の各計算式における統計量をTable 3に示す．酸
素飽和度の最適な計算式として，φ660/940，φ660/730，φ
620/660，φ730/940，φ620/940の５つの独立変数が選択された．５つの独立変数による計算式を式（２）に示す．

Fig. 5. 血液循環シミュレータ（in vitro実験）におけるHbV置換量に対する
POMの酸素飽和度表示，および４波長の減光度変化．

によるものも含まれる．大粒子による散乱光は前方に集中し，小粒子の場合はランダムに散乱する．従って，HbVにより血液中には小さい粒子が増加し，前方散乱光が減少する．その結果，各波長で減光度が増加したと考えられる．つまり，現行型
POMが酸素飽和度を過小評価した要因は，HbVの混合による減光度の変化が要因と言える．Fig. 5において，波長660 nmは940 nmに比べてHbV投与による減光度の増加率が大きい．現行型POMは波長660 nmと940 nmの減光度比φから酸素飽和度を求めている．従って，波長660 nmの減光度が940 nmの減光度よりも増加すれば，減光度比φは増加する．既報のPOMにおける酸素飽和度と減光度比φとの関係より15），減光度比φが増加すれば，酸素飽和度は減少する．

（２）
Training setにおける採血による酸素飽和度SaO2と改良型４波
長POMによる酸素飽和度SpO2の関係および誤差をFig. 7（上）に示す．Training setでは0.0±2.1％の精度で酸素飽和度を計測できた．Validation setにおける採血による酸素飽和度SaO2と改良型４波長POMによる酸素飽和度SpO2の関係および誤差をFig. 7（下）に示す．Validation setでは1.1±1.9％の精度で酸素飽和度を計測できた．

２．パルスオキシメータの精度と４波長光学システムの有効性
HbV投与前後における，現行型POMによる酸素飽和度SpO2と採血による酸素飽和度SaO2の関係，および誤差をFig. 6に示す．動物実験でもin vitro実験と同様に，HbV投与後に現行型

Fig. 6. HbV投与前後における，（a）POMによる酸素飽和度SpO2と採血による酸素飽和度SaO2の関係，および（b）
誤差

202

Fig. 7. 採血液から測定・算出した酸素飽和度SaO2と，改良型４波長POM
による酸素飽和度SpO 2の関係および誤差（上）Training set，
（ 下）
Validation set．

人工血液 Vol. 16 , No.4, 2008

Fig. 8. 現行型POMおよび改良型４波長POMにおける，採血による酸素飽
和度SaO2とパルス分光法による酸素飽和度SpO2の関係および誤差．
Table 4. MetHbの各計算式における統計量
φ660/940

0.11

0.10

0.08

×

×

×

φ660/730

-0.17

-0.17

-0.19

-0.19

×

×

各独立変数の

φ620/660

-0.21

-0.21

-0.20

-0.19

-0.03

×

偏相関係数

φ730/940

-0.05

×

×

×

×

×

φ620/940

-0.10

-0.09

×

×

×

×

φ620/730

0.19

0.18

0.25

0.24

0.56

0.61

偏差平方和SE

46.70

46.83

47.232

47.51

49.21

49.25

サンプル数N

28

28

28

28

28

28

独立変数の数n

6

5

4

3

2

1

相関係数

0.41

0.41

0.403

0.4

0.378

0.378

AIC

109.78107.86106.10104.27103.25101.27

自由度調整済みの寄与率

0.242

0.274

0.300

0.325

0.329

0.354

現行型POMと改良型４波長POMの酸素飽和度計測の精度を同じデータで比較した．それぞれの採血による酸素飽和度SaO2とパルス分光法による酸素飽和度SpO2の関係および誤差をFig.
8に示す．POMによる酸素飽和度の計測精度が-7.2±3.3％であったのに対し，改良型４波長POMの酸素飽和度の計測精度は1.1±1.9％であった．４波長にすることによって，HbVの干渉作用を緩和できたと言える．
MetHbの各計算式における統計量をTable 4に示す．メトヘ
モグロビンの最適な計算式として，φ620/730の１つの独立変数が選択された．１つの独立変数による計算式を式（３）に示す．

（３）
Training setにおける採血によるMetHb̲sと改良型4波長
POMによるMetHb̲pの関係および誤差をFig. 9（上）に示す．
Training setでは0.0±1.4％の精度でMetHbを計測できた．
Validation setにおける採血によるMetHb̲sと改良型４波長
POMによるMetHb̲pの関係および誤差をFig. 9（下）に示す．
Validation setでは-0.1±1.1％の精度でメトヘモグロビンを計測できた．
現行型POMのHbV投与量に対する酸素飽和度計測の精度に対し，４波長光学システムの導入により，HbVの干渉作用に対する補正効果が得られた．HbV投与に対するPOMの精度をFig.
10（a），現行型POMと改良型４波長POMの精度比較をFig. 10（b）に示す．血液交換率40％で酸素飽和度の平均値は約６％異ARTIFICIAL BLOOD Vol. 16 , No.4, 2008

Fig. 9. 採血液から測定・算出したMetHb̲sと，改良型4波長POMによる
MetHb̲pの関係および誤差（上）Training set，（下）
Validation set．

Fig. 10.（a）HbV投与に対する現行型POMの酸素飽和度計測の精度，（b）現行型POMと改良型4波長POMの酸素飽和度計測の精度比較．

なるのに対し，分散は同程度の変化である．投与量によって平均値だけが変化するのであれば，投与量によって現行型POMの酸素飽和度表示を読み変える方法も考えられる．しかし，
MetHb計測には式（３）より波長620，730 nmが必要である．
MetHbによる現行型POMへの干渉作用もあることから，HbV
投与時の呼吸管理には４波長が必要と思われる．またHbV投与
によるPOMへの干渉作用を緩和するために，４波長パルス分
光法は有効であったと言える．

結論

HbVは，現行の日本光電社製のPOM（DDG-3300）に対し光学的な干渉作用を示し，酸素飽和度を過小評価することが解り，臨床応用に際しての新たな問題の提起となった．今後，他社製のPOMについても干渉作用の有無を確認する必要がある．し203

かし，その原因は極めて明らかであり，対応策は今から検討する必要がある．今回開発した４波長光学システムは，酸素飽和度とMetHbを計測でき，HbVによるPOMへの干渉作用の緩和，
およびMetHb濃度の計測に有効であった．但し，今回得られた計算式は経験式であり，測定部位やHbVの投与量によって変化する可能性があるので，今後更なる検討が必要である．

謝辞

動物実験の補助をしていただいた大竹 俊男 氏（慶應義塾大学医学部 動物実験センター）に感謝致します．本研究は，厚生労働科学研究費補助金（医薬品・医療機器等レギュラトリー
サンエンス総合研究事業）により推進された．

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人工血液 Vol. 16 , No.4, 2008

総説

体外循環時におけるリポソーム型人工酸素運搬体（TRM645）の有用性と安全性に関する研究
Evaluation of a Novel Combined Therapy of a Extracorporeal
Cardiopulmonary Bypass Using Liposome-encapsulated
Hemoglobin（TRM645）
水野 敏秀（1），石塚 隆伸（2），金田 伸一（2），巽

英介（1），妙中 義之（1）Toshihide Mizuno (1), Takanobu Ishizuka (2), Shinichi Kaneda (2), Eisuke Tatsumi (1), Yoshiyuki Taenaka (1)
和文抄録
本研究では，体外循環時および心肺停止蘇生時の心肺補助装置の回路充填剤として，テルモ社製人工酸素運搬体（TRM645）を使用し，その予後侵襲の軽減化などに対する有用性および安全性について検討を行った．実験動物にはヤギを使用し，希釈体外循環実験では，右房脱血，頚動脈送血で常温体外循環を行った．TRM645投与群には40％ TRM645
加回路充填液を使用した．体外循環は心停止下で 120 分間施行し，経時的に全身酸素運搬量・全身酸素消費量・混合静脈
血酸素飽和度の測定と血液生化学検査を行った．結果，ナノカプセル型人工酸素運搬体を回路充填剤に添加することによって，希釈体外循環施行時の全身組織酸素代謝が促進される傾向にあることが示された．また，新規心肺蘇生法の有用性の検討を目的とした実験では，実験的心停止後に経皮的心肺補助装置（PCPS）を用いて20分間の右房脱血，右頚動脈送血による呼吸循環補助を行った．実験では，心肺補助中の酸素運搬量が同等にもかかわらず，TRM645投与群で酸素代謝量が維持され，組織への酸素到達状態が良好であることが示された．また，血液生化学的にも，TRM645の使用により蘇生後の臓器傷害が軽減されていたと考えられた．以上より，体外循環による心肺補助とTRM645の併用は，循環補助中の
全身酸素代謝の維持や蘇生後の多臓器不全を防止する効果が期待できると考えられた．
Abstract
We have developed novel circulatory support methods combined with artificial oxygen carrier in cardiopulmonary bypass（CPB）
for cardiac surgery and cardiopulmonary resuscitation therapy using a percutaneous cardiopulmonary support（PCPS）. We used
newly developed liposome-encapsulated hemoglobin（TRM645）which has some preferable features for the clinical use, and it isexpected to improve the oxygen metabolism to work as oxygen carrier. Our two studies were purposed to evaluate the
combined therapy with TRM645 in large animal experiments focusing on systemic oxygen metabolism during diluted CPB and
low flow PCPS. These results suggested that the application of TRM645 in the priming solution was able to maintain systemic
oxygen consumption under the diluted CPB and low flow PCPS. In the method we have proposed, we determined the feasibility
to deliver oxygen to the peripheral tissues at which red blood cells could not transport oxygen.
Our new method with TRM645 showed potential to maintain the oxygen metabolism, and to prevent hypoxic organ injury
during the diluted CPB and low flow PCPS.
Keywords
liposome-encapsulated hemoglobin, cardiopulmonary bypass, percutaneous cardiopulmonary support, oxygen metabolism（1）国立循環器病センター研究所〒565-8565

大阪府吹田市藤白台5-7-1

国立循環器病センター研究所，人工臓器部

Dept. Artificial

Organs, National Cardiovascular Center Research Institute, Fujishirodai 5-7-1, Suita, Osaka（2）テルモ株式会社研究開発センター R&D center, TERUMO CORPORATION
論文受付 2008年９月８日 論文受理 2008年12月17日

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 16 , No.4, 2008

205

はじめに
Cardiopulmonary Bypass（ CPB） や Extracorporeal
membrane oxygenation（ECMO）など人工心肺装置を用いた体外循環法は，今日の心臓外科の最も基本的な技術の一つであり，この体外循環技術の開発と安全性の向上は，心臓外科の成績向上に直接関連している 1）．現在の一般的な体外循環法は，
体外循環中の非生理的な循環動態の安全性を保証するために，低体温状態での希釈体外循環法が基本の一つとして普及している．しかし，この体外循環時における低体温や血液希釈などの状態は，循環生理学的に必ずしも適切な環境とはいえない 2，3）．
一方で，常温での希釈体外循環については，低体温の副作用の回避，冷却と加温に必要な体外循環時間の短縮，出血の減少などが利点とされるが，体外循環中の酸素運搬量を高値に設定する必要があり，低体温循環と比較し，高いヘマトクリット値やポンプ流量に維持しなければならない 4）．また，特発的な低循環状態に対する安全時間が短くなることも大きな問題点としてあげられている．更に大量のプライミング液により血液を希釈した状態は，低ヘモグロビン血症を伴う危険性が常にあり，術後合併症の発生や回復に大きな影響を及ぼすことが考えられる5-7）．
特に，小児に対する本法の適用時には，かかる血液希釈による障害が術予後に大きく影響する危険性が高いとされている．現段階では，その対応として自己ないし多家輸血療法を併用しているが，輸血療法には免疫的な不適性や，感染症の発生など，輸血自体が新たな合併症を招く可能性を有する．このため，現在でも無輸血でより安全で高効率な体外循環法の開発は，心臓外科の発展に大きく貢献できる課題である．
また，経皮的挿入が可能な送脱血カテーテルと膜型人工肺および遠心ポンプを組み合わせた経皮的心肺補助（Percutaneous
cardiopulmonary support; PCPS）システムは，大学病院救急部や救命救急センターなどの三次救急施設を中心に行われている有効な心肺蘇生法であるが，平成15年度に救急搬送された病
院外心肺停止患者約95,000例において自己心拍が再開し１ヵ月後の生存を得た症例は約500例，３％程度であり，PCPSなど新しい蘇生法の適用により自己心拍の再開は可能ながらも，その後の蘇生後脳症，多臓器不全などの合併症のため社会復帰に至るまでの回復を望むことは困難な場合が多い 8）．この原因としては，PCPS手技が末梢血管からのアプローチに限られるため
全身の循環維持に必要な至適流量を得ることが困難なことが挙げられる．またショック状態にある心肺停止患者は末梢循環不全が顕著であるため，PCPS施行後においても脳，心臓の低酸素状態が遷延し，社会復帰の点で劇的な成績向上はなく，標準的治療とは言い難いのが現状である．
換言すれば，これら呼吸循環に関する機械的補助法においても，低ヘモグロビン血漿や低流量循環によって血液の酸素運搬能が低下している場合は，各臓器への十分な酸素供給をおこなうことができず，生命の維持が困難であるといえる．臨床的に，これら諸事象への対策としては，酸素運搬量を増加させる手法（おもに血中ヘモグロビンの増加，血流量の増加）を講じる場
合が多いが，上述したように臨床現場で効果的に行えることは

206

少ない．
我々は，かかる問題に対し，テルモ社と共同研究を行っているナノカプセル型人工酸素運搬体を体外循環回路の充填剤として使用し，希釈体外循環の血液希釈時や低流量循環時における血液の酸素運搬能を向上させ，術中の末梢組織における低酸素状態を改善し，より安全な体外循環が期待可能な手法の開発を行った．我々が使用したナノカプセル型人工酸素運搬体はヘモグロビンをリポソームで包埋していたナノ粒子で，生体赤血球に比較し非常に高効率に酸素を運搬することが可能であり，他の人工酸素運搬体と比較して血中半減期が長く，生体に対する影響が少ないことを特徴としている9，10）．
従来の研究より，機械的循環法への人工酸素運搬体併用法の効果については，動物実験にて検討が行われ11），高次脳機能の保存効果 12），心筋保護効果が認められているが 13，14），人工酸素運搬体を添加した場合の体内を循環する血液全体の酸素運搬能
および酸素代謝能を直接的に評価した研究は少ない．
本論文では，新エネルギー・産業技術総合開発機構による課
題設定型産業技術開発費助成事業「ナノカプセル型人工酸素運搬体製造プロジェクト（平成15年度〜平成17年度実施）」の一環として行われた「体外循環時におけるテルモ社製人工酸素運
搬体TRM645の有用性と安全性に関する研究」に関する２つの研究を紹介する．これらの研究は，機械式呼吸循環補助と人工酸素運搬体の投与を併用することにより，低ヘモグロビン血症，
低流量ながら全身の酸素供給を維持し，人工酸素運搬体を用いて末梢組織への酸素供給を確保するという，双方の短所を補完する新しい強力な呼吸循環補助法を確立するものである．

１．小児希釈体外循環時におけるナノカプセル型人工酸素
運搬体添加回路充填材使用による全身組織酸素代謝の変化に関する研究
本研究では，小児希釈体外循環に対しナノカプセル型人工酸
素運搬体添加回路充填材を使用し，その体外循環時の全身酸素
代謝の変化について，仔ヤギを用いた動物実験モデルを作成し，検討を行った 15）．
（１）方法
本実験には，実験動物としてオス仔ヤギを使用し，対照群４頭（BW 21.5±2.6 kg），テルモ社製人工酸素運搬体使用群（TRM群）４頭（BW 19.8±0.8 kg）とし，実験を行った．
i ）人工酸素運搬体
本実験で使用された人工酸素運搬体は，テルモ株式会社研究
開発センターで作成された人工酸素運搬体（TRM645）を使用した．TRM645は，精製したヒトヘモグロビンにinositol
hexaphosphate を添加して，脂質を混合したのち高速撹拌器で処理してリポソーム化したものを，ポリエチレングリコールで修飾し，生理食塩水に懸濁したコロイド状溶液である．ヘモグ
ロビンを内包したリポソームは，平均粒子径が 約230 nm，P50を45-55 mmHg，懸濁溶液中のヘモグロビン濃度が６g/dL

人工血液 Vol. 16 , No.4, 2008

Fig. 1. ナノカプセル型人工酸素運搬体と生体赤血球の比較に調整した（Fig. 1）．
ii ）体外循環実験
動物実験では，検体は常法を用い麻酔導入が行われ，イソフ
ルレン吸入による全身麻酔下で行われた．次に，血行動態として，心電図，平均大動脈圧，中心静脈圧の計測ラインを装着し，体温は直腸温を計測した．
体外循環は，開胸下に左頚動脈送血・右房後大静脈脱血方式
で行われ，回路内の充填剤には，TRM群にTRM645 400 mLを添加した回路充填材（ヒドロキシエチルデンプン520 mL，７％炭酸水素ナトリウム溶液30 mL，マンニトール50 mL，ヘ
パリン2,000 IU）を使用し，総充填量 1,000 mLとした．なお，対照群にはTRM645 の代替として，同量の酢酸リンゲル液を添加したものを使用した．体外循環回路は，ハードシェルリザ
ーバー付ホローファイバー型膜型人工肺（キャピオックス
SX10X，テルモ），遠心ポンプ（キャピオックス CX-SP4538，
テルモ），および動脈血フィルタ（キャピオックス CX-AF02，テルモ）を選択した（Fig. 3）．本実験における体外循環条件は，深部体温を 36-37 ℃とし，バイパス流量を 100-120 ml/kg/min，
V/Q = 0.5，FiO2 100 ％ とした．体外循環開始後には，検体を電気的細動器により心室細動状態とし，完全体外循環を確立した（Fig. 2）．
iii ）測定方法および測定項目
本実験において，血行動態の計測にはデータ記録解析システ
ム（MacLab/16s, AD Instruments, Castle Hill, Australia）を用いて測定を行い，体外循環回路のバイパス流量の測定には超音波流量計（T106, Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA）を用いた．体外循環開始前の酸素消費量は呼気ガスモニタ（S/5 コンパクトモニター，Detax Ohmeda, Helsinki, Finland）
を用いて計測した．血液ガス性状（酸素分圧（PO2）と血中乳
酸値，血中ヘモグロビン濃度（Hb）と酸素飽和度（SvO2,
SaO2））の測定には，血液ガスシステム（ABLTMシステム，
ラジオメーター，コペンハーゲン，デンマーク）とヘモオキシメータ（OSMTM3，ラジオメーター，コペンハーゲン，デンマーク）を用いた．なおこの実験に先立って，血液検体にARTIFICIAL BLOOD Vol. 16 , No.4, 2008

Fig. 2. 小児希釈対外循環の模式図および実験風景

Fig. 3. 体外循環回路

TRM645が含まれる場合に，各計測値に関して血液ガスシステ
ムとヘモオキシメータが適正な値を示すことを確認した．各項
目の計測について，体外循環開始前および開始後５，10，15，
30，60，90および120分後に経時的に行った．
全身酸素運搬量（DO2），全身酸素消費量（VO2），心拍出量（CO），動静脈血酸素較差（AVDO2），動脈血酸素含有量（CaO2），静脈血酸素含有量（CvO2）については，実験により測定された各値に基づき，以下の式より計算を行った．
DO2 = CaO2×CO［ml O2 /kg/min］（体外循環前）DO2 = CaO2×BF［ml O2 /kg/min］（体外循環中）CO = VO2 / AVDO2［dL/kg/min］（体外循環前）VO2 = AVDO2×BF［ml O2 /kg/min］（体外循環中）AVDO2 =（CaO2×CvO2）［mL/dL］
CaO2 = 1.34×Hb×SaO2 + 0.003×PaO2［mL/dL］
CvO2 = 1.34×Hb×SvO2 + 0.003×PvO2［mL/dL］
実験中のヘマトクリット値および，TRM645加血液におけるTRM645の血中容積比の計測については，採取された全血１mLに そ れ と 同 量 の ８ ％ デ キ ス ト ラ ン 溶 液 （ D4876, SIGMAALDRICH, Inc., MO, USA）を加え，12,000 rpm，10分間の遠心分離を行いTRM645と血球とを血漿から分離し，その容積比207を算出した．また，血液性化学検査用に採取された血液は，全血を3,000 rpm で10分間遠心分離した上清を１mL使用し，同量の35 ％デキストラン溶液を加えてから再度3,000 rpmで30分
間遠心分離を行い，TRM645 を分離後，被検血清として使用した．病理学的検索のために，120分間の体外循環の後，安楽殺処置を行い，速やかに脳，心，肺，肝，脾，腎を採取し，10％中性緩衝ホルマリン固定を行った．検体は常法を用い，ヘマ
トキシレン・エオジン染色による組織標本を作製した．
（２）結果
本実験における体外循環の平均大動脈圧は，TRM群が47-61
mmHg，対照群が41-50 mmHgの範囲であり，実験条件内で維持が可能であった．また，バイパス流量は，対照群（109-116
mL/kg/h），TRM群（103-118 mL/kg/min）とも，予定の流量で実験を行った．一方で，全身の末梢血管抵抗においては，
TRM群で顕著に高い傾向にあった（Table 1）．実験中におけるヘマトクリット値は，体外循環による血液希釈により，
TRM群では術前値の34±６％から体外循環中は15±４％に低下し，またTRM645の添加によるTRM群のTRM645の血中容積比は，体外循環中約５％で維持されていた．
Table 1. 希釈体外循環中の血行動態

体外循環中のTRM645を含む総ヘモグロビン値は 6.3±1.5
g/dLであり，同様に対照群においても体外循環中のヘマトク
リット値が16±３％に低下し，ヘモグロビン値は6.2±1.3 g/dL）
で，両群において差は認められなかった．このため，ヘモグロ

Fig. 4. 希釈体外循環中の血液性状および酸素運搬量

208

Fig. 5. 希釈体外循環中の酸素消費量

ビン値，血中酸素飽和度およびバイパス流量から算出される
DO2に関してもTRM群で11.0±2.0 mL/kg/min，対照群 で20.9±4.8 mL/kg/minから 11.0±2.3 mL/kg/minとなり，術前値の約半分量に低下していた（Fig. 4）．
一方，体外循環中のSvO2は，TRM群で低く推移する傾向が認められ（対照群 86-89 ％，TRM群 82-85 ％），結果，全身のVO2に関しては，実験中を通じTRM群が高値を示す傾向（対照群2.4-2.5 mL/kg/min，TRM群 2.5-2.7 mL/kg/min）が認められた（Fig. 5）．生化学的に，乳酸値はTRM群でやや高値を示す傾向にあったが，対照群との間に差異は認められず，体外循環開始30分後に最高値となり（対照群 23.8±11.1 mg/dL，
TRM群 25.0±2.9 mg/dL），以降徐々に低下した．
体外循環中の血液生化学的にピルビン酸値は，対照群では体外循環開始30分後に最高値（1.0±0.5mg/dL）となり，以降2時
間後（1.0±0.4mg/dL）まで一定の値で推移したが，TRM群では30分後（1.0±0.1 mg/dL）以降２時間後（1.4±0.4 mg/dL）まで上昇傾向にあった．また，末梢組織での酸素代謝の指標となる乳酸/ピルビン酸比では，両群ともに体外循環後一時的に上昇し，末梢組織での無酸素呼吸が優位になり，体外循環30分
後以降徐々に低下する傾向が認められるが，同期において，
TRM群が明らかに低値で推移し，早期に回復する傾向を示し
た．病理組織学的検索により，両群ともに主要臓器に対する著名な病理的変化は認められず，TRM群では，TRM645投与による毒性的所見や，各臓器内の細網内皮系組織内へのヘモジデ
リン沈着は認められなかった．
（３）考察
一般に体外循環時おける末梢組織での酸素消費量は，経時的に低下してゆく傾向にある．本現象は，全身に送り出される動脈血の酸素運搬量が十分であっても，体外循環下の特殊な血流状態下よって，血流分布の不均衡などが併発し，局所的に十分人工血液 Vol. 16 , No.4, 2008

な酸素が到達していない末梢循環不全部位が存在するためと考えられている．本研究においても，実験的体外循環中には血液希釈に起因する酸素運搬量および酸素消費量の低下が認められ，特に対照群においては，混合静脈血酸素飽和度が著しく高値で推移し，末梢組織で酸素消費が行われていない状態が観察された．しかしながら，人工酸素運搬体の添加により，体外循
環中のヘモグロビン濃度に変化は認められないものの，体外循
環中の末梢組織酸素消費量は，対照群に比較し，高値で推移する傾向が認められ，特に体外循環開始直後の酸素消費量の低下は緩やかで，従来の生体赤血球では酸素が到達しにくかった末
梢組織へ酸素が到達していることが想起された．さらに，乳酸・ピルビン酸比の結果からも，人工酸素運搬体の使用により比較的早期に末梢組織での好気的代謝が回復し，組織での酸素消費が良好に行われていることが示されている．また，体外循
環中の酸素運搬量に対する酸素消費量の変化は，体外循環中の酸素運搬量が通常の1/2程度と低下するに従い，同範囲の酸素運搬量の変化に対し，全身の酸素消費量が急激に変動しているが，一方でTRM群においては，酸素運搬量が少ない体外循環中においても，全身酸素消費量の変動が少ないことが認められた（Fig. 6）．かかる結果は，TRM645の投与が体外循環中の低酸素運搬時においても，全身での酸素代謝が比較的安定して行われていることを示し，常温体外循環の欠点である特発的な低流量状態の危険性を軽減できる可能性があると考えられる．従って，人工酸素運搬体の添加は，体外循環時の強度血液希釈による酸素消費量の経時的な低下を抑制するための有用な手法になり得ると考えられる．

Fig. 6. 希釈体外循環中における酸素運搬量に対する酸素消費量の変化

２．PCPSと人工酸素運搬体併用による新規心肺蘇生法の実験的検討
本研究ではPCPSを用いた病院外心肺停止に対する蘇生後の社会復帰率を向上させる目的で，心肺停止時のPCPS使用と同時に，赤血球より末梢組織への酸素運搬性に優れた人工酸素運搬体を併用し，低流量補助下における末梢組織での酸素代謝を確保することにより，脳および心臓の低酸素状態を改善する手法の検討を行った 16）．

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 16 , No.4, 2008

Fig. 7. PCPSによる心肺蘇生実験風景（１）方法
実験では，成ヤギ10頭（体重59±6.5 kg）を使用し，常法を用いてイソフルレンによる全身麻酔下に行われた．検体は，心電図，大動脈圧，中心静脈圧計測ラインが装着された後，開胸下に心臓を露出し，直流細動器を用いて，10分間の心肺停止状態にさせた．次にPCPS装置（Capiox EBS，テルモ）を用いて右房脱血，右頚動脈送血方式による呼吸循環補助（30ml/kg/min，V/Q=1.0）を20分間行った．20分間の補助循環後，体外式除細動器にて自己心拍を再開させ，その後120分間の観察を行った．動物実験には，回路内にテルモ社製人工酸素運搬体（TRM645，テルモ）を充填した回路（TRM群，５頭），および同量の生理食塩水を充填した回路（対照群，５頭）を準備し（回路充填量300 mL），回路内充填材への人工酸素運搬体添加による全身酸素代謝の変化について検討を行った（Fig. 7）．
各項目の計測については，心停止前の値を術前値とし，PCPS
駆動直後より，経時的に血行動態の計測を行い（PCPS駆動後
５，10，15，20分，心拍再開後30，60，90，120分後），また同時に酸素運搬量（DO2），全身組織酸素摂取量（VO2）を算出
し，全身末梢組織での酸素代謝の指標とした．血液生化学的検査項目としては，GOT，LDHの測定を行った．
（２）結果
実験では，全例において自己心拍の再開が可能であった．
PCPS駆動後における両実験群のヘマトクリット値およびヘモ
グロビン値には，ほぼ変化は認められず，TRM群においては，
人工酸素運搬体の血中容積比は実験中約１％であった．しかしながら，心肺停止後PCPSのみによる低流量の呼吸循環補助中には，DO2およびVO2は，術前値と比較し，著しく低下し，全身への酸素の運搬量は術前値の半分量ほどであることが示された．PCPS駆動中のDO2については，対照群とTRM群ともにほぼ一定で推移していた．しかしながら，対照群のVO2は，
PCPS駆動５，10，15分後と暫時減少し（143，103および94
mL/min），経時的に全身の酸素代謝が低下する所見が認められたが，TRM群においては，VO2の減少はPCPS駆動５，10，
15分後（154，126および131 mL/min）においてほぼ軽微であった（Fig. 8）．また，血液生化学的には，自己心拍再開120分

209

するPCPS補助や心拍再開後においても，低流量循環によって末梢組織での酸素不足が遷延し，二次的な臓器障害を併発する原因の一つであると考えられた．しかし，我々の提案する本法により，低循環PCPS補助下においても，人工酸素運搬体が，従来生体赤血球では酸素を運搬することが困難であった末梢組
織へも酸素を到達させることが可能であり，全身酸素代謝の維持に貢献していることが示され，心拍再開後における臓器への二次的な障害を軽減していると推察された．

まとめFig. 8. 循環再開後の全身酸素消費量

Fig. 9. 自己心拍再開後の血液生化学値（ASTおよびGOT）

後におけるGOT（TRM群104 vs. 対照群181 IU/L）およびLDH（TRM群342 vs. 対照群761 IU/L）がTRM群で明らかに低値を示していた（Fig. 9）．
（３）考察
本研究では，実験的心肺停止下のPCPS補助循環中に，低流量循環に起因するDO2の半減が認められ，この結果，初期的に維持可能であったVO2が，PCPS駆動下においても経時的に減少していくことが示された．かかる現象は，心肺停止状態に対210

本プロジェクトで行われた２つの研究の特徴は，人工酸素運搬体を用いることにより，低ヘモグロビン血症や低循環など全身的な酸素運搬量の低下時において，血液の いわゆる 酸素
運搬量を変化させずに，全身の酸素消費量を増加させることが可能であることを示した点にある．本実験のような中大動物を用いた新規医療部材の検討については，実験数を多く設定することが困難であり，本研究においても，n=4 の群間比較となった．このため現段階での人工酸素運搬体の効果については，実測値からの直接的に解釈を行っており，各群間の傾向を示すの
みにとどまった．しかしながら，本検討においても人工酸素運搬体を使用した群では，希釈体外循環時の酸素代謝経過に特徴的な傾向が指摘されるなど，人工酸素運搬体の投与が対象の体
内酸素代謝動態に影響を及ぼしている事は，十分に想起される．
従って，体外循環時における回路充填剤への人工酸素運搬体添
加の併用療法は，生体赤血球の到達しにくい末梢組織での酸素代謝を増加させ，安全域の広い常温希釈体外循環法や，新しい強力な呼吸循環補助法に応用可能な新規手法になりえると期待されるが，今後の研究として，我々は，実験数を増やし，統計
手技の適用による有意差検定の実施や，人工酸素運搬体の酸素
代謝動態の特徴を解析する必要性があると考えている．
また一方で，別の課題として，ナノ粒子である人工酸素運搬
体を血管内に投与することによる生体や医療計測機器への様々な影響を詳細に検討しなければいけないことが，現在の問題点として挙げられている．たとえば希釈体外循環の研究で述べた
体外循環中の酸素消費量の増加は，実験中には混合静脈血の酸
素飽和度および酸素ガス分圧の低下として記録され，さらに乳酸値も従来法に比較し高くなる傾向にある．このため，従来の体外循環の概念のまま各測定値に対し対応を行うと，対象とする患者の状態を見誤る可能性もあり，臨床現場で実際に使用する場合には，人工酸素運搬体を使用した場合の血液性状の特殊性を体外循環士などが熟知しなければならない．また，人工酸
素運搬体混合血については，その血液性状を測定する際に様々な臨床検査機器への影響が懸念され，人工酸素運搬体の血中濃度による測定値校正の分析や精度の再評価が必要である．これからの研究では，その実用化に向け，人工酸素運搬体の治療効
果を示す事と共に，本治療法を使用した場合の体内動態や血液検査値の特殊性を明らかにする必要もあると考える．

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211

総

説

ヘモグロビン小胞体の in vitro におけるヒト血液細胞および血漿タンパクへの適合性
Biocompatibility of Hemoglobin Vesicles, a Cellular-type Artificial
Oxygen Carrier, on Human Blood Cells and Plasma Proteins in Vitro
藤原 満博，東寛，池田 久實Mitsuhiro Fujihara, Hiroshi Azuma, Hisami Ikeda

和文抄録
ヘモグロビン小胞体（hemoglobin vesicles; HbV）は，脂質二重膜からなるリポソームの中にヘモグロビンを内包させたセル型の人工酸素運搬体である．HbV はいわゆる「人工赤血球」として血管内に輸注されるため，その臨床応用に向けた安全性の評価には，生体適合性，とくに血液構成成分に対する適合性をみることが重要である．そこで我々はヒト血液細胞およびヒト血漿タンパク系を用いた in vitro の評価に焦点をあてた検討をおこなってきた．止血や炎症反応に関与する血小板に対し，HbV 自体には活性化作用はみられず，またアゴニストによる活性化への影響もみられなかった．自然免疫に重要な働きをする好中球の機能（走化能，脱顆粒，活性酸素産生）の活性化に対しても，HbV は影響を与えなかった．
造血機能に対しては，HbV は in vitro での共存が３日間までの短期間であれば造血前駆細胞活性を損なうことはないことが示された．またリポソームの特性から補体の活性化が懸念されたが，現行の HbV では活性化はみられず，さらに凝固系，カリクレイン・キニン系にも影響はみられなかった．以上のことから，HbV はヒト血液細胞ならびに血漿タンパクに対し高い適合性を持つことが示唆される．
Abstract
Hemoglobin vesicles（HbV）, a cellular-type artificial oxygen carrier, are composed of human hemoglobin encapsulated within aphospholipid bilayer membrane. As HbV are injected intravenously, biocompatibility of the HbV with blood components is very
important to ensure safety of this material for clinical use. We have evaluated this biocompatibility by focusing on the influenceof HbV on human blood cells as well as plasma proteins in vitro. 1）As to the influences to platelets which are involved not onlyin the hemostasis but also in inflammation, HbV themselves did not activate platelets, and had no aberrant effect on agonistinduced platelet activation. 2）HbV did not affect on agonist-induced activation of neutrophil functions（chemotaxis,
degranulation, and production of superoxide）which play important roles on innate immunity. 3）HbV had no effect on thehematopoietic progenitor activity, if the exposure period is brief. 4）The present HbV（containing DHSG）did not activatecomplement system, although the old-type HbV（containing DPPG, no PEG modification）did markedly. 5）The coagulation as
well as kallikrein-kinin cascades were not affected by the present HbV. Thus, our in vitro studies show that HbV are highlybiocompatible with human blood cells and human plasma proteins.
Keywords
artificial oxygen carrier, biocompatibility, platelets, neutrophils, hematopoietic progenitor cells, complement, coagulation,
kallikrein-kinin

はじめに
赤血球製剤の人工代替物として人工酸素運搬体の開発が進められてきている．人工酸素運搬体の臨床応用における利点は，
北海道赤十字血液センター 研究部〒 063-0002

輸血時の血液型判定の必要がないこと，製剤の長期保存が可能となること，同種抗原感作や細菌感染およびウイルス感染の伝播を回避できること等があげられる 1）．これらの利点から，災

札幌市西区山の手 2 条 2 丁目

Hokkaido Red Cross Blood Center, Yamanote 2-2, Nishi-ku,

Sapporo 063-0002, Japan
論文受付 2008 年 11 月 12 日 論文受理 2008 年 12 月３日

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人工血液 Vol. 16 , No.4, 2008

害時の緊急事態において大量の血液製剤が必要とされる時，また血液型検査および適合した血液製剤の供給を待機する間，人工酸素運搬体を応急措置として用いることが想定される．現行の同種血輸血や自己血輸血との組み合わせにより，人工酸素運
搬体は合理的な輸血システムを構築することに寄与することが期待される．
ヘモグロビン小胞体（hemoglobin vesicles; HbV）は，粒子径約 250nm のリポソーム包埋型ヘモグロビンで 1），細胞膜を模擬し人工的に作成したリン脂質／コレステロール／陰性荷電脂質／ PEG 脂質からなる脂質二重膜のリポソームの中にヘモグ
ロビンを内包させたセル型の人工酸素運搬体である．HbV の人工赤血球としての酸素運搬能に関する有効性，組織分布，代謝等についてはこれまで詳細に検討されている 1）．一方，HbVの臨床応用を進めていく上では，その生体適合性を評価することが重要である．生体適合性を評価すべき項目は多岐にわたる 2）．
その中で我々は，HbV が輸注された際に相互作用を起しうる
血液構成成分，即ち，血液細胞および血漿タンパクに対しHbV がどのような影響をあたえるかについて焦点をあてた検討をおこなってきた．本稿においてはヒト血液細胞として血小板，好中球，造血前駆細胞を，ヒト血漿タンパクとして補体系，
血液凝固系，カリクレイン-キニン系をとりあげ，HbV の invitro におけるそれぞれへの影響について我々の検討結果を概説し，HbV の生体適合性について言及したい．

１．ヘモグロビン小胞体の血小板活性化に対する影響
げっ歯類の動物モデルにおいては，リポソーム包埋型ヘモグロビン投与による副作用が知られ，その症状の一つとして一過性の急性血小板減少が報告されている 3-5）．同様な一過性の急性
血小板減少は，陰性荷電のリポソームの投与においてもみられている 6，7）．この急性血小板減少の発生原因を解明するため，invitro においてリポソームとげっ歯類の血小板との結合に関して研究がなされた結果 8），リポソームの構成成分が負電荷の脂質である場合，ラット多血小板血漿とのインキュベーションによりリポソームは血漿中の補体成分 C3b に覆われ，C3b を介したリポソーム‐ C3b ‐血小板上 CR1 receptor の結合による凝集塊が形成されることが示された．そして in vivo においては，
この凝集塊が速やかに網内系によって処理されることが急性血小板減少の原因と考えられている 8）．これに対しヒト血小板上には CR1 receptor が存在しないため，リポソームと血小板との凝集塊は観察されない 8）．従ってヒトにおいてはリポソームの構成成分が負電荷の脂質であったとしても，動物モデルで観察されるリポソーム輸注後の急性血小板減少は発症しないと推測される．
一方，血小板はその顆粒中に種々の炎症性生理活性物質を含有していることや，膜表面の接着分子を介して白血球と結合することから，止血血栓の形成のみならず炎症反応にも関与していると考えられている 9，10）．HbV の投与により急性の血小板減少症が起こらないとしても，HbV が生体内で血小板を活性化したり，あるいはアゴニストによる反応を助長させたりするよ

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うな影響を及ぼし，血小板由来生理活性物質の放出が起こるという事態は，生体にとって好ましいことではない．
このような背景のもと，われわれはリポソームの構成成分として DPPG（1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidyl glycerol）
を含有する HbV の血小板活性化への影響について，RANTESの放出反応を指標として検討した 11）．RANTES は血小板のα顆粒に存在する炎症性ケモカインで，好塩基球，好酸球，単球およびリンパ球に対する強力な走化作用を有する 9，12）．そこでヒト多血小板血漿と最大 20 ％（vol/vol）までの濃度の HbV を予めインキュベーション後，アゴニストであるコラーゲンで刺激した反応上清中の RANTES の濃度の増加を測定した．その結果，コラーゲンの濃度に依存した RANTES の放出がみとめられたが，20 ％ HbV と予めインキュベーションさせた場合においては，RANTES の放出への影響はみられなかった（Table 1）．
またアゴニスト刺激なしの場合においても，RANTES の放出に関して血小板と HbV を予めインキュベーションした影響は
なんらみとめられないことから，HbV が血小板を活性化する作用もないと考えられた．
次に，リポソームの構成成分として DPPG をカルボン酸脂質
DHSG（1,5-O-dihexadecyl-N-succinyl-L-glutamate）に置き換えた現行の HbV の血小板への影響について，HbV 濃度最大 40 ％まで検討した 13）．血小板活性化の評価は，RANTES に加え同じくα顆粒に存在する炎症性ケモカインβ-thromboglobulin（βTG），濃染顆粒に存在するセロトニンの放出反応，ポジティブ
フィードバックによって血小板活性化を増幅する Thromboxane
A2（TXA2）の産生，さらにα顆粒由来の CD62P の膜表面への発現，および血小板膜糖タンパクαIIbβ3 の構造変化を認識す
る抗体 PAC-1 の結合を指標とした．なお，TXA2 は半減期が短いためその代謝産物の Thromboxane B2（TXB2）を測定した（Table 1）．
Table 1. Effect of HbV on human platelets .

セロトニンは血小板の濃染顆粒に存在する生理活性アミンで，血管収縮作用をはじめ繊維芽細胞増殖作用，マクロファージの活性酸素産生促進作用，NK 細胞活性化促進作用を有する 9）．
CD62P はセレクチンファミリーに属する接着分子で 9），血小板

213

活性化に伴ってα顆粒から膜表面に分布するため，血小板活性化マーカーとして汎用されている 14）．PAC-1 は血小板上のαIIbβ3（GPIIb-IIIa）が血小板活性化にともなって構造変化を起こした時に発現するエピトープを認識するモノクローナル抗体である 14，15）．低濃度の ADP 刺激によっても発現の増加がみられることから，高感度でかつ特異的な血小板活性化マーカーとして有用であるとされている．αIIbβ3 はインテグリンファミリーに属する接着分子であり，血小板においてフィブリノーゲ
ンや von Willbrand 因子のレセプターとして機能し，血小板凝集や粘着の重要な分子である 16）．
ヒト多血小板血漿に 20 ％および 40 ％の濃度の HbV を１時間
予めインキュベーション後，アゴニスト刺激の無い場合は，血小板反応上清中の RANTES，セロトニン，β-TG，TXB 2 および血小板表面 CD62P のレベルの上昇はみられないことから，
HbV に血小板活性化作用は無いと考えられた．この際，RANTES レベルはむしろ減少したが，この程度の変化での臨床的意義は少ないと推察された．アゴニスト刺激により血小板の脱顆粒を惹起させると，いずれの濃度の HbV 処理においても RANTES，セロトニン，β-TG の放出，TXB 2 の産生，および CD62P 発現が引き起こされ，そのレベルは HbV 未処理のものと有意差はみられなかった（Table 1）．一方，PAC-1 の発現は HbV 未処理では影響がないものの，HbV 処理により低濃度の ADP 刺激血小板において僅かな亢進がみられた．PAC-1 の発現の亢進は空の小胞体処理においても観察されたため，ヘモグロビンの有無にはよらず，小胞体それ自体または小胞体の構成成分に起因する可能性が考えられた．以上のことから，HbV
は低濃度のアゴニスト存在下でαIIbβ3 の構造変化を僅かに促進するものの，CD62P の膜への発現，RANTES，セロトニン，
β-TG の放出，TXB 2 の産生にはアゴニスト刺激の有無にかかわらず影響を与えないことから，ヒト血小板に対し高い生体適合性があると結論された（Table 1）．

２．ヘモグロビン小胞体の好中球活性化に対する影響
HbV がヒトに投与される状況として大量出血が想定される．
その際に，生体防御のファーストラインを担う好中球の機能に対し，HbV が抑制的に働くならば，感染症などを合併する危
険性が懸念される．循環血中の好中球は活性化を受け，炎症部
位に遊走し，生体を脅かす細菌を効率的に殺菌する必要がある．
好中球は，ザイモザンや細菌由来のペプチド（N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine（fMLP））によって活性化を受け，多岐にわたる機能を発揮することが知られているが，
PEG-distearoylphosphatydylethanolamine（PEG-DSPE）修飾を受けたある種のリポソームは，これらの刺激に対する好中球の反応を阻害することが報告されている 17）．逆に，フォスファ
チジルコリンやフォスファチジルセリンからなるリポソームが，マウスのアレルギーモデルにおいて，好中球の肺への集積を昂進させたという報告がなされている 18）．そこで，HbV 自体
が PEG-DSPE 修飾をうけていることもあり，fMLP 刺激によって好中球が発揮する機能に対し，どのような影響を及ぼすかに

214

Table 2. Effect of DPPG-HbV on fMLP-induced neutrophil functions.

ついて検討を加えた 19）．
この検討においては，リポソームの構成成分として DPPG を含有する HbV を用いた．fMLP 刺激による好中球の機能評価として，（1）好中球の走化能，（2）β2 インテグリンである CD11bの 膜 発 現 ，（ 3） 脱 顆 粒 に と も な う gelatinase B（ matrix
metalloproteinase-9）の放出，（4）活性酸素の産生をとりあげた．Table 2 にこれらの結果を示した．
走化性（ケモタキシス）は，細胞が化学物質の濃度勾配に従い，一定の方向に運動性を示すことであり，ヒト単離好中球を異なる濃度（最大 0.6 ％）の HbV と 37 ℃にて 30 分間予めイン
キュベーション（プレインキュベーション）後，ケモタキシ
ス・チャンバー法によって評価をおこなった．fMLP（１μM）
刺激によって好中球の走化能が活性化されたが，これに対する
HbV の影響はみとめられなかった．CD11b は CD18 と二量体を形成して好中球の遊走能における接着因子 Mac-1 として機能する分子であるが，HbV とプレインキュベーションさせた好中球において，fMLP 刺激による CD11b の発現亢進は，HbV を作用させなかった好中球の場合と同等であった．gelatinase B は，
好中球の組織浸潤に関与する酵素であるが，fMLP 刺激による好中球からの放出の経時変化を HbV とのプレインキュベーシ
ョンの有無で比較したが，両者には違いはみとめられなかった．
また好中球の殺菌能に関与する活性酸素産生についても，HbVとプレインキュベーションした好中球からの fMLP による産生量は，HbV を作用させなかった好中球の場合と同等であった．
以上の結果より，fMLP 刺激によって発揮される好中球の少な
くとも４つの機能において，用いた HbV の濃度ではなんら影
響はみられず，HbV の好中球への高い適合性が示唆された．
PEG-DSPE 修飾したリポソームが fMLP 刺激による好中球の走化能活性化を阻害するという報告 17）を上述したが，リン脂質濃度にして大過剰の濃度を用いたにもかかわらず，HbV では阻害がみられないことの理由は不明である．リポソームの構成成分であるリン脂質の種類，脂肪酸の飽和度の程度，脂肪酸の側鎖の数が，fMLP やザイモザンによる好中球の走化能に影響することが報告されている 20）．前述の PEG-DSPE 修飾したリポ
ソームと HbV との間では，これらのパラメーターを始め，
PEG-DSPE とリポソームのモル比が異なっており，これらの違いが異なる結果を得た理由となっている可能性が考えられる．

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以上，HbV の好中球への高い適合性が示されたが，より高濃度即ち臨床で用いられる 20 ％および 40 ％での検討をみる必要性は残されている．

３．ヘモグロビン小胞体の造血前駆細胞に対する影響
血管内投与したリポソーム製剤は，漸次，肝臓のクッパー細胞，脾臓および骨髄のマクロファージなどの細網内皮系において捕捉される 21）．HbV においても，アイソトープラベルを用いた追跡によって組織分布が詳細に検討され，肝臓，脾臓，骨髄に主として分布していることが示されている 22）．他の組織学的検討においても，HbV は細網内皮系において捕捉されることが報告されている 23）．骨髄に HbV が移行することから，骨髄を主たる場とする造血に対し少なからず影響するのではないかと考えられた．40 ％脱血し HbV を輸血したラットさらにビーグル犬の場合，脱血による赤血球造血の亢進によってヘマトク
リットは１週間以内には回復し，特に造血系への影響は認められていない 24，25）．さらに，20 ％の HbV を topload させたラットの場合においても，末梢血の血球数は投与後１週間観察しても一定に保たれていた 26）．とはいえヒトへの投与を考えた場合，その造血前駆細胞の増殖・分化への影響について，in vitro の系において検討する必要があると考えられ検討をおこなった 27）．
造血の in vitro のアッセイ系としては，コロニー形成細胞の数を評価するコロニーアッセイと造血前駆細胞の増殖の度合いを評価する液体培養系を用いた．そして臍帯血から分離した
CD34 陽性細胞を含む単核球を，造血を支持する各種サイトカ
インを添加したメチルセルロースからなる半固形培地に播種し，一定期間培養後に形成したコロニーの数をカウントした．
赤芽球バーストとよばれる BFU-E（Burst forming unit oferythrocyte），顆粒球・マクロファージ系コロニーとよばれる
CFU-GM（ Colony forming unit of granulocyte andmacrophage），両者が混在した CFU-mix，これらのコロニーの総数である Colony-forming cells（CFC）は培養２週間後に，増殖能が高くコロニーのサイズが１ mm 以上になったものを
HPP-CFC（High proliferative potential-colony forming cell）と定義し，培養４週間後にそれぞれカウントした．用いた
HbV は PEG 修飾された DHSG を構成成分とする HbV で，その濃度は最大３％と設定した 27）．
コロニーアッセイの培地に HbV を添加し，14 日間共存させると，それぞれのコロニーの数およびサイズが HbV の濃度に依存して減少する傾向がみられた．さらに 14 日間 HbV と共存
後にコロニー数を測定する HPP-CFC の数は著しく減少した（Fig. 1A）．一方，HbV に CD34 陽性細胞を含む単核球を 20 時
間だけ曝してコロニーアッセイした場合は，HPP-CFC の数に影響はなく，３日間曝した場合でも，HPP-CFC の数の減少の程度は少なかった（Fig. 1B）．次に液体培地に血清と造血支持サイトカインを添加して，赤芽球系または顆粒球系の細胞へと増殖させる系に HbV を添加させ影響を評価した．10 日間の培養期間，HbV が継続して存在する場合には赤芽球系または顆
粒球系への細胞の増殖が抑制された．これに対し，コロニーア

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Fig. 1. Effects of HbVs on the formation of high proliferative potential
colony forming cells（HPP-CFC）in the clonogenic assay of cord
blood-derived hematopoietic cells. Cord blood-derived mononuclear
cells were seeded at 300 at CD34+ cells per dish in complete
methylcellulose medium for human clonal culture assays. HPPCFC was scored after 28 days incubation.（A）HbVs（0 to 3 ％）were added to the cells until the end of culture.（B）Cord bloodderived mononuclear cells were incubated for 20 h（open column）
or for 3 days（slashed column）with different concentrations of
HbVs in IMDM containing FCS, BSA, and cytokines.
Subsequently, they were recovered, washed to remove the HbVs,
and subjected to the clonal assay. Data are expressed as themean ± SD of the percentage of control（HbV 0 ％）performed on
three separate cord blood donors in（A）and（B）.

ッセイの場合と同様に，HbV に 20 時間または３日間曝しただ
けの場合は，赤芽球系または顆粒球系への細胞の増殖は影響されなかった（Table 3）．
以上 HbV は，in vitro の閉鎖系において，長期間にわたり共存することにより造血前駆細胞の活性を阻害するという結果が，２つの評価系から明らかとなった．しかしながら，動物モデル
で HbV を投与した場合，骨髄において１-３日に HbV の蓄積が認められ，以後１週間では激減することが報告されている 24）．

Table 3. Effect of DHSG-HbV on the proliferation of erythroid andmyeloid lineage cells in liquid culture.

Various concentrations of HbVs were added to the medium containing,
the cord blood-derived CD34+ cells. After 10 days incubation, CD235a++
cells for erythroid lineage and CD15 cells for myeloid lineage,
respectively, were analyzed by flow cytometry. The number of CD235a+
cells or CD15+ cells at each concentration of DHSG-HbV is expressed asa percentage of the number in the control（ HbV 0%）. Data arerepresented as the mean ± SD from three experiments performed on
three separate cord blood donors. *p < 0.05, **p < 0.01 versus HbV（0%）.

215よって，２週間連続して HbV に造血幹・前駆細胞が曝されるという状況はヒトの臨床例では想定できないし，むしろ１-３日間曝されるというのが想定できる期間である．さらに in vivo
では，HbV はマクロファージ内に蓄積しており，in vitro のよ
うに HbV と造血幹・前駆細胞が直接相互作用をすることは極めて少ないと考えられる．従って造血幹・前駆細胞が直接１３日間 HbV に暴露される場合において，造血前駆細胞の活性に大きな影響がなかったという結果は，HbV をヒトに投与した場合，造血に大きな悪影響を及ぼす可能性が極めて少ないことを支持するものと捉えることができる．
国外では，ヘモグロビンを基盤とし化学修飾させたセルフリー型の人工酸素運搬体の開発が進められている．これらの修飾
ヘモグロビンや分子内架橋を行ったヘモグロビンは，我々と同じようにヒト臍帯血から調製した CD34 陽性細胞を用いた液体
培養系において，赤芽球前駆細胞の増殖の亢進を促すと報告されている 28）．また，AIDS の治療に用いられる薬剤 3 -azido-3 deoxythymidine（AZT）による造血抑制を，ヘモグロビンおよび化学修飾ヘモグロビンが in vitro，in vivo の両方で回復させる（但し赤血球造血に特異的）ことが示され 29，30），これらの赤血球造血作用は酸素運搬能以外の付加価値と位置付けられている．修飾ヘモグロビンのこれらの in vitro での作用は，赤芽球系前駆細胞が修飾ヘモグロビンを取り込み，赤血球造血作用のある heme に分解するためと推測されている 29）．HbV の場合
は，赤芽球系前駆細胞を含めて造血前駆細胞の増殖亢進作用はみられず，逆に長期間では抑制する結果となったが，その機序は現時点では明らかでない．少なくとも赤芽球系前駆細胞は，HbV を修飾ヘモグロビンのようには容易には取り込まないと考えられる．

４．ヘモグロビン小胞体の補体系，凝固系，カリクレイ
ン-キニン系に対する影響
リポソームは細胞膜と同様リン脂質を構成成分としているが，生体にとっては異物であり，血液細胞のみならず血漿タン
パク質と相互作用する 31）．この作用は，リポソームの大きさ，荷電，構成脂質，さらにリポソーム自体への化学修飾により異なってくる．リポソームの中で陰性荷電のものは，ラット，モルモット，そしてヒトの補体を活性化することが広く知られている 32-34）．その結果，オプソニン化したリポソームは，細網内皮系により循環血液中から速やかに排除される．また陰性荷電
リポソームは凝固系第７因子を活性化させ，内因系の凝固カス
ケードならびにカリクレイン・キニン系活性のトリガーとなる 35，36）．リポソームの構成成分のコレステロール含量も補体の活性化に影響することが知られ，この活性化は血液中の自然抗体によると考えられている 34，37，38）．これまで述べてきたリポソーム包埋型ヘモグロビンにおいても，ヒトの血液中の脂質に対する自然抗体によって，古典経路と第二経路の両方を介して補体の活性化が惹起される 39）．さらに，ブタモデル実験においては，ある種のリポソームによって偽アレルギー反応が起こり，補体活性化との関連が考えられている 40-42）．一方，リポソーム

216

を PEG 修飾することで，これらの反応を防ぐことができることが報告されている 43-45）．しかしながら，リポソーム包埋型ヘモグロビンのみならず抗ガン剤 doxorubicin を封入した PEG 修
飾リポソーム Doxil/Caelyx においても，顔面紅潮，呼吸困難，
紅斑，胸痛，背面痛，血圧低下または血圧上昇が報告されている 46-48）．またこれらの症状は doxorubicin 自体では起こらないため，リポソームによるものと考えられている 49）．したがってHbV の生体適合性を評価するうえで，ヒトの補体系，凝固系，
カリクレイン-キニン系に対する影響を検討することの意義は大きいと考えられた．
この検討においては，DHSG をそのリポソーム構成成分としPEG 修飾された現行の HbV（DHSG-HbV），DPPG を構成成分とし PEG 修飾された HbV（DPPG-HbV），DPPG を構成成分とするが PEG 未修飾の HbV（DPPG-HbV（no PEG）），強陰性荷電 PEG 未修飾リポソーム（EL-A）を用いた 50）．なお，EL-A の
脂質構成は DPPC:CHOL:DPPG（30:40:30）（mol ％）からなり，
その生理食塩水中でのゼータ電位は-47.2mV であった 50）．
HbV を健常人ヒト血清と 20 ％あるいは 40 ％で混合し，37 ℃
にて 24 時間インキュベーション後，遠心により各種 HbV を除去し，その上清の補体価（CH50）を測定した．Table 4 に示す
ように，DHSG-HbV を混合することによって血清が希釈されるため CH50 は低下した．強陰性荷電 PEG 未修飾リポソーム（EL-A）を添加した群では著しい CH50 の低下がみられるのに対し，DHSG-HbV を 20 ％あるいは 40 ％で添加した群では，それぞれ生食を添加した場合の CH50 より減少することはなかった．さらに３種の HbV で比較してみると（Table 5），DHSGHbV と DPPG-HbV は，補体消費を起こさなかったのに対し，
DPPG-HbV（no PEG）は 40 ％の添加によってほぼ完全に補体が消費された．以上の結果から，現行の DHSG-HbV およびPEG 修飾された DPPG-HbV は，ヒト血清補体系を活性化しな
いと考えられた．
Table 4. Consumption of complement by HbV and Liposome.

The complement titer（CH50）was measured using a 50% hemolysis
assay with a commercial kit. DHSG-HbV, saline or Coatsome EL-A（anegative-charged liposome）were mixed with serum as indicated ratio（v/v）at 37 ℃ for 24 hr. The lipid composition（mol%）of Coatsome EL-A
was DPPC:CHOL:DPPG=30:40:30. Data are represented as the mean ±SD using serum from five individuals. The CH50 of 100% serum was 38± 3.2 U/mL. *p < 0.05 vs. saline.

人工血液 Vol. 16 , No.4, 2008

Table 5. Consumption of complement by various types of HbV.

The complement titer（CH50）was measured using a 50% hemolysis
assay with a commercial kit. DHSG-HbV, DPPG-HbV, DPPG-HbV（noPEGylation）or saline were mixed with serum as indicated ratio（V/V）
at 37 ℃ for 24 hr. The CH50 of 100% serum was 45.1 U/mL.

次に凝固系に及ぼす影響をこれら３種のリポソーム構成成分の異なる HbV を用い，プロトロンビン時間（PT）および活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）について比較した．
PT は健常人ヒト血漿との混合比率が上昇するにつれて凝固時間が遅延した．血漿に対し生食の比が 20 ％および 60 ％においては，これら３種の HbV はいずれも生食添加の場合の PT 時間を有意に短縮させたが，その差は１秒以内であった．APTT 時
間に対し，DPPG-HbV と DPPG-HbV（no PEG）は，生食添加の場合の APPT 時間を２秒以内ではあるが有意に短縮させたのに対し，DHSG-HbV はどの血漿比率の場合においても生食の場合と差はみられなかった．
カリクレイン-キニン系に対する影響は，血漿にそれぞれこれら３種の HbV または生食を添加し，37 ℃にて 24 時間インキュベーション後，血漿中高分子キニノーゲンの分解による低分子化された高分子キニノーゲンの出現をイムノブロッティング
法にて検出した．血漿に対し 40 ％あるいは 60 ％にて DPPGHbV または DPPG-HbV（no PEG）を添加させた場合，intact
な高分子キニノーゲンが減少し，低分子化された高分子キニノーゲンの増加が顕著に観察される．これに対して，DHSG-HbV
ではいずれの血漿比率の場合においても生食の場合と差はみられず，DHSG-HbV は血漿中高分子キニノーゲンの分解を引き起こさないことが示された（Fig. 2）．
以上の検討から，陰性荷電の DPPG を構成成分とする HbV
では PEG 修飾がなければ補体の活性化が惹起されるのに対し，PEG 修飾することで補体の活性化が抑えられることが明らかとなった．生理食塩水中でゼータ電位を測定すると DPPG-HbV（no PEG）が-14.5 mV，DPPG-HbV が-3.4 mV であり 50），表面荷電の影響を裏付けていた．しかしながら，ここに示したごと
く DPPG-HbV では，わずかではあるが，凝固時間，特にAPTT 時間の短縮およびカリクレイン-キニン系の活性化を引き起こした．これに対し，DHSG-HbV は，補体系，APPT 時
間，カリクレイン-キニン系のいずれに対しても影響が無いことが示された．DHSG-HbV のゼータ電位は-2.6 mV で DPPG-ARTIFICIAL BLOOD Vol. 16 , No.4, 2008

Fig. 2. Activation of kallikrein-kinin cascade by HbVs. HbVs or saline
were mixed with plasma at 40 ％ or 60 ％ at 37 ℃ for 24 h.
Appearance of digested S-HMWK was detected using western
blot analysis as a result of kallikrein activation. Arrowhead（ ）indicates digested S-HMWK.

HbV のそれとほとんど変わらないことから，単に表面荷電だ
けでなく，構成脂質の親水性頭部（hydrophilic head group）
が作用の有無に影響を及ぼすものと考えられる．
いずれにしても，今後の臨床試験に用いられる現行の HbV
は，血漿中の補体系に影響を及ぼさないということから， 補体活性化関連偽アレルギー反応 と呼ばれるリポソーム投与直後の心血管系の急性副作用 51）に対する懸念はほとんど無いと推測される．加えて，凝固系やカリクレイン-キニン系への影響も無いことは，ヒト血漿タンパクへの高い適合性を示している．
第１章の血小板に対する HbV の影響に関して，げっ歯類においては血小板上に補体成分 C3b が結合する CR1 レセプターを有しているが，ヒトを含む霊長類では有さないことを上述した．
これに対し，ヒトを含む霊長類では赤血球が CR1 レセプターを有しているため，補体活性化に伴って免疫複合体の赤血球への結合が報告されている 52）．そのため，補体活性化を惹起しうる化合物および医薬品のヒト血液を対象とした in vitro における適合試験や臨床試験においては，赤血球も相互作用する可能性のある血液構成成分の一つとして重要であり，そのため，赤血球をモニターする意義や結果の解釈にも影響する可能性を考慮しておく必要がある．しかしながら，少なくとも今後の臨床試験に用いられる現行の HbV は，in vitro の評価試験において血漿中の補体系に影響を及ぼさないため，補体成分を介してHbV が赤血球と結合する可能性は少ないと推測される．

おわりにHbV が臨床応用に向けて，前臨床試験でその有効性，安全性について検討しなければならない事項の中に，免疫系および血液構成成分に対する影響があげられている．ヒト血液細胞およびヒト血漿タンパク系を用いた評価により，止血また炎症反217

応にも関与する血小板に対し，HbV 自体による活性化作用はみられないこと，またアゴニストによる活性化を亢進するような作用はないことが示された．自然免疫に重要な働きをする好中球の機能（走化能，脱顆粒，活性酸素産生）にも影響を与えなかった．造血機能への影響としては，短期間であれば造血前駆細胞活性を損なうことはないことが示された．またリポソー
ムの特性から補体の活性化が懸念されたが，現行の HbV では
活性化はみられず，また，凝固系，カリクレイン・キニン系にも影響はみられなかった．しかしながら in vitro では評価できない抗体産生，投与後の補体価の変動，リンパ球の抗原刺激による増殖反応等については現在ラットを用いて検討をおこなっている．本稿にては詳細は割愛したが，それらの影響は，投与直後に一過性の抑制がみられるものの１週間では回復することをみいだしている 26，53）．以上のことから，免疫系，および血液構成成分に対して HbV が高い適合性を持つことを示すことができた．
最近，Natanson ら 54）は，ヘモグロビンを基盤とする非セル型の人工酸素運搬体を対象とした無作為化された前臨床試験および臨床試験の中から，一定の基準を満たした 16 トライアル
において，死亡のリスクが 30 ％増，心筋梗塞のリスクが 2.7 倍増加しているというメタ解析の結果を報告した．この報告に伴って，へモグロビンを基盤とする非セル型の人工酸素運搬体の安全性を見直し，リスクの増加の原因を明らかにすべきとの指摘がなされている 55）．このような状況下にあって，我が国だけが開発を進めているセル型の人工酸素運搬体の一つである
HbV に，大きな期待がよせられる．

謝辞
本研究は，厚生科学研究費補助金（高度先端医療研究事業）「酸素運搬能を有する人工赤血球の創製とその評価に関する研究（平成９年〜 11 年）」「臨床応用可能な人工赤血球の創製に関する研究（平成 12 年〜 14 年）」，厚生科学研究費補助金（高度先端医療研究事業）「人工赤血球の安全性向上に関する研究（平成 15 年〜 17 年）」，「人工酸素運搬体の臨床応用に関する研究（平成 18 年〜 20 年）」によって行われた．記して謝意を表す
る．

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人工血液 Vol. 16 , No.4, 2008

●事務局たより

日本血液代替物学会
１． 日 時 ：平成20年10月23日（木）16：30〜17：00

総会

３． 議 題 ：報告事項

２． 場 所 ：慶應義塾大学信濃町キャンパス 北里講堂
〒108-8582 東京都新宿区信濃町35

以下審議内容を略記します。
報告事項①年次大会の開催状況として下記事項が報告された。
1）第15回日本血液代替物学会年次大会
2）平成20年10月23日（木）3）東京都新宿区信濃町35慶應義塾大学信濃町キャンパス
北里講堂
4）日本血液代替物学会会員、臨床医学・理工学研究者、国内の大学および医療機関臨床医、
血液センター関係者の参加があった。
②会員状況は以下のとおり。
1）維持会員：４社2）賛助会員：４社
3）正会員：141名
4）購読会員：20箇所
5）学生会員：１名① 第15回年次大会の報告② 会員動向
③ 委員会報告④ 平成19年度事業報告⑤ 平成19年度収支決算⑥ 平成20年度事業（実績報告）

2）第14回年次大会 （大会長 半田 誠）
平成19年６月14日（木）、15日（金）慶應義塾大学三田キャンパス北館で行われた。
3）「人工血液をつくる（8）」後援⑤平成19年度収支決算報告が行われ承認された。
平成19年度 会計（自 平成19年４月１日

収摘
要
前 期 繰 越 金
正 会 員 会 費
入会
金
賛助会員会費
維持会員会費
購読会員会費
雑
収
入
利
息

入
金
額
18,302,866
530,000
20,000800,000
8,000,000
36,000105,240
47,191

計27,841,297

収支決算表

至 平成20年３月31日）

支
出
金
額
摘
要
1,642,085
会 誌 出 版 費603,945
集会・委員会費
2,000,420
年 会 補 助 金
ホームページ維持費
2,000,460
事 務 人 件 費5,830,460
事
務
費
363,085
人工血液をつくる（8）開催費助成
252,410
基金に繰り入れ2,500,000
次 期 繰 越 金 12,648,432
計27,841,297⑥平成20年度事業（実績報告）③各種委員会からの報告は以下のとおり。
＊編集委員会
会誌「人工血液」の発行。
・平成19年度：第14巻4号、第15巻1号、2号発行。
・平成20年度：第15巻3-4号、第16巻1号、2号発行。第16巻3号、4号発行予定。
＊ホームページ委員会
学会ホームページURL： http：//www.blood-sub.jp/
会員向け論文データベースの稼働開始。

1）定期総会の開催
平成20年10月23日（木）慶應義塾大学信濃町キャンパス
北里講堂。
2）第15回年次大会の開催（大会長 堀之内 宏久）
平成20年10月23日（木）於 慶應義塾大学信濃町キャンパス 北里講堂
3）「人工血液」の発行
4）「人工血液をつくる（9）」後援予定
現行役員は次頁の通り。

④平成19年度事業報告（平成19年 4 月 1 日〜平成20年 3 月31日）
が行われ各々承認された。
1）定期総会の開催
平成19年６月15日（金）北館にて開催。

222

慶應義塾大学三田キャンパス

人工血液 Vol. 16 , No.4, 2008

●事務局たより
日本血液代替物学会 役員名簿
顧

問

尾形利郎
高久史麿
堀 原一
遠山 博

東海大学医学部 名誉教授
自治医科大学 学長
筑波大学 名誉教授
埼玉医科大学総合医療センター 名誉所長

会

長

小林紘一

慶應義塾大学 名誉教授

副会長

池田康夫

慶應義塾大学医学部 教授

理

池田久實
川村明夫
酒井宏水
末松 誠
高折益彦
武岡真司

北海道赤十字血液センター 所長
札幌北楡病院 会長
早稲田大学理工学術院 准教授
慶應義塾大学医学部 教授
東宝塚さとう病院 名誉院長
早稲田大学理工学術院 教授

事土田英俊
早稲田大学理工学術院 名誉教授
西 勝英
肥後医育振興会 理事
半田 誠
慶應義塾大学医学部 教授
平澤博之
千葉大学 名誉教授
堀之内宏久 慶應義塾大学医学部 准教授
四津良平
慶應義塾大学医学部 教授
監

事

清水 勝
阿岸鉄三

西城病院 理事
板橋中央総合病院 血液浄化療法センター
ブラッドアクセス治療センター 所長（事務局） 堀之内宏久 慶應義塾大学医学部 准教授（会誌担当）酒井宏水
早稲田大学理工学術院 准教授（HP担当） 藤島清太郎 慶應義塾大学医学部 講師

日本血液代替物学会 評議員名簿
青木
阿岸

克憲
鉄三

浅野 茂隆
東
寛
阿部喜代司
池田 久實
池田 康夫
池淵 研二
石原 弘規
伊藤 俊之
稲田 英一
大島 宣雄
大塚 節子
大柳 治正
尾形 利郎
片岡 一則
川村 明夫
黒澤 良和
小林 紘一
小室 勝利
斎藤 英彦
酒井 清孝
酒井 宏水
佐久間一郎
佐藤
誠
鮫島 達也
清水
勝
清水 慶彦
十字 猛夫
末松
平
高折

誠
明
益彦

浜松医科大学 教授
ふれあい町田ホスピタル
血液浄化センター センター長
早稲田大学理工学部 教授
北海道赤十字血液センター
筑波大学 名誉教授
北海道赤十字血液センター 所長
慶應義塾大学医学部 教授
埼玉医科大学 教授
弘前大学医学部 准教授
京都赤十字血液センター
順天堂大学医学部 教授
筑波大学基礎医学系 名誉教授
岐阜大学医学部 講師
近畿大学医学部 教授
東海大学医学部 名誉教授
東京大学大学院工学系研究科 教授
北楡会札幌北楡病院 会長
藤田保健衛生大学総合医科学研究所 教授
慶應義塾大学 名誉教授
名古屋セントラル病院 院長
早稲田大学理工学術院 教授
早稲田大学理工学術院 准教授
カレスサッポロ北光記念クリニック 所長
ニプロ（株）医薬品研究所 所長
青山学院大学理工学部 名誉教授
西城病院 理事
日本赤十字血液事業本部
中央血液研究所 前所長
慶應義塾大学医学部 教授
鹿児島大学医学部 名誉教授
東宝塚さとう病院 名誉院長

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 16 , No.4, 2008

高久 史麿
高橋
晃
高橋 英嗣
高橋 恒夫
武岡 真司
田所 憲治
土田 英俊
遠山
博
友田
夫
豊田 忠之
仲井 邦彦
中井 一士
長澤 俊郎
中島 常隆
西
勝英
西出 宏之
西谷 孝子
半田
誠
平澤 博之
福島 昭二
藤井 寿一
藤島清太郎
船津 昭信
外 須美夫
堀
進悟
堀
原一
堀之内宏久
宮尾 秀樹
宮崎
保
村田
満
湯浅 晋治
四津 良平
米川 元樹

自治医科大学 学長
テルモ（株）代表取締役社長
山形大学医学部 准教授
東京大学医科学研究所 客員教授
早稲田大学理工学術院 教授
日本赤十字社血液事業本部
早稲田大学理工学術院 名誉教授
埼玉医科大学総合医療センター 名誉所長
東京医科大学 教授
東部地域病院 元院長
東北大学医学部 准教授
血液製剤調査機構 元理事
筑波大学臨床医学系 教授（株）ベネシス 経営戦略部 担当部長
肥後医育振興会 理事
早稲田大学理工学術院 教授
ナノキャリア株式会社
慶應義塾大学医学部 教授
千葉大学 名誉教授
神戸学院大学薬学部製剤学 准教授
東京女子医科大学 教授
慶應義塾大学医学部 講師（財）化学及血清療法研究所 理事長
北里大学医学部 教授
慶應義塾大学医学部 准教授
筑波大学 名誉教授
慶應義塾大学医学部 准教授
埼玉医科大学総合医療センター 教授
札幌逓信病院 名誉院長
慶應義塾大学医学部 教授
順天堂大学 名誉教授
慶應義塾大学医学部 教授
北楡会札幌北楡病院 理事長（ア順敬称略）223

224

人工血液 Vol. 16 , No.4, 2008

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 16 , No.4, 2008

225

226

人工血液 Vol. 16 , No.4, 2008

●編集後記●欧米で臨床試験が進んでいる修飾ヘモグロビンについては，
様々な副作用が明らかになり，難しい局面を迎えていることは，
第16巻１号でも紹介した．粒子径あるいは細胞型構造が重要であることを示唆していると考えられる．ところで，ミミズなどの無脊椎動物は赤血球を持っていないが，代わりにヘモグロビ
ン自体が非常に大きく，メガダルトン級の分子量をもつ．サイズを大きくすることで血管外漏出を防いでいるのかもしれない．実は欧米には，ミミズやゴカイなど環形動物に分類される生物から抽出・精製した巨大ヘモグロビンをそのまま人工酸素運搬体として利用することを本気で考え，臨床試験を目指しているグループがある．米国のミミズは日本のミミズよりも大きいので，血液が沢山取れるらしい．一体どのように抽出しているのか疑問だが，知らない方が良いのかもしれない．さて，本号では三木先生ほかのマシコヒゲムシの巨大ヘモグロビンのX
線結晶構造解析について話題提供を頂いた．三木先生はこれを
人工酸素運搬体とするようなお考えは無いようである．しかし，人工酸素運搬体の研究者から見ると，とても興味深い物質である．巨大ヘモグロビンをそのまま用いないにしても，ヘム近傍の環境がヒトヘモグロビンと微妙に異なるので，新規な機能を有する変異ヘモグロビン設計のヒントになるかもしれない．

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 16 , No.4, 2008

本号ではいわゆる細胞型の，ヘモグロビン小胞体，カプセル型ヘモグロビンに関する話題を三つ掲載することができた．須崎先生ほかのパルスオキシメータに関する原著論文では，ヘモグロビン小胞体の臨床応用における問題提起をしている．微粒子の投与によって，汎用臨床検査機器による計測が正確に行う事ができなくなる．因果関係がはっきりとしているので，技術的に克服はできると考えられる．あらゆる測定装置について，
ヘモグロビン小胞体の干渉作用の有無を事前に知る必要がある
ことを示唆している．水野先生ほかの体外循環時における充填液としての利用は，大動物モデル（ヤギ）を用い有用性が再確認出来た内容といえる．体外循環を要する胸部外科手術の間だ
け酸素運搬機能があればよいので，血中滞留時間が短くても人
工酸素運搬体の利点を最大限活かせる利用法と考えられる．藤原先生ほかの血液適合性に関する報告で重要なメッセージは，カプセル型としてヘモグロビンの副作用を低減させたとしても，カプセル基材の副作用の有無を十分に検討しなければならないことである．同じリポソームでも表面の状態によって生体反応が異なり，重要な知見である．日本発の物質系の臨床試験の開始が待たれる．
（酒井 宏水）227

Call for Papers
Artificial Blood, the official bilingual journal of The Societyof Blood Substitutes, Japan, welcomes papers and otherarticles contributing to the research and development ofblood substitutes.
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The Journal's purpose is to publish research and related articles
contributing to research on the development of blood
substitutes, information on Society proceedings, regulations, andother matters of interest to the Society members, and it
welcomes original articles from a range of contributors
regardless of format. Although contributors should ideally bemembers of the Society, this is not a requirement. Decisions on
acceptance of manuscripts are made by the Editorial Board
based on the results of peer review. Original articles will not be
accepted if they have been previously published or are being
considered for publication in another journal.
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must sign and seal a copy of the Copyright Transfer Agreementfound in the Journal or downloadable from the Society's website（http://www.blood-sub.jp/home/index.html）, and submit it to
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However, handwritten manuscripts may be accepted.
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also be re-categorized depending on the opinion of the228

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Reviewers" to the covering letter that responds to each of thepoints made by the reviewers, indicating any revisions made to
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to which all the authors belong, and the address of thecorresponding author. Handwritten manuscript should be
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人工血液 Vol. 16 , No.4, 20085）Original articles, review articles, topical pieces, and opinion
pieces should include an abstract and about 6 keywords on thesecond or subsequent pages.
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acknowledged, and any conflict of interests（for example, if theauthor has an interest in a company distributing the drug
described in the manuscript: being an employee or consultant tothat company, receiving research funding, owning shares orpatents, and so on）must be described in a footnote on the firstpage or in acknowledgment section.
7）If a manuscript describes the results of research on humans
or animals, it should be indicated that such research was
performed in accordance with the guidelines of the instituteconcerned in the methods or other appropriate sections of themanuscript.
8）Abbreviations should be spelled out on their first appearance.
The names of drugs, medical drugs, laboratory equipment, andso on should be given. The type, distributor（manufacturer）andthe address should also be indicated.
Example: Rhodamine B（Sigma-Aldrich, St. Louis, USA）
Polygraph system（LEG-1000; Nihon Kohden Corporation,
Tokyo）.

Address on new line（month and year of last access）.
Examples:
１. Wong NS, Chang TM. Polyhemoglobin-fibrinogen: a novel
oxygen carrier with platelet-like properties in a hemodiluted
setting. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol
2007;35:481-489.
２. Natanson C, Kern SJ, Lurie P, Banks SM, Wolfe SM. Cell-freehemoglobin-based blood substitutes and risk of myocardial
infarction and death: a meta-analysis. J Am Med Assoc
2008;299:2304-2312.
３. Sakai H, Sou K, Takeoka S, Kobayashi K, Tsuchida E.
Hemoglobin vesicles as a Molecular Assembly. Characteristicsof Preparation Process and Performances or Artificial
Oxygen Carriers. In: Winslow RM, ed. Blood Substitutes.
London: Academic Press（Elsevier）, 2006;514-522.
４. Oxygen Infusion Project, Waseda University, Japan.
http://www.waseda.jp/prj-artifblood/index-ja.html（ lastaccessed Sept 2008）13）In the case of citation or reproduction of previously
published figures or tables and other content, the permission of
the copyright holder（s）must first be obtained. Copyright in the
published papers shall belong to the Society.

10）Figures should be expressed in Arabic numerals. Weights
and measurements should be expressed in units such as thefollowings: m, cm, mm, μm, L, mL, μL, mol, g, mg, μg, ng, pg,
fg, N/10.

14）Regarding secondary use and copyright in works publishedin the Journal, secondary use may be made of the Journal, in
whole or in part, via media such as CD-ROM or the Internet.
Reproduction rights, translation rights, film rights, dominion, andpublic transmission rights（including the right to make theworks transmittable）are transferred to the Society by theauthor's submission of the aforementioned Copyright Transfer
Agreement. This clause shall not restrict reuse by the author
himself/herself, but the Editor-in-Chief must be informed in theevent of reuse.

11）Figures and tables should be numbered in order of citation,and it should be clearly indicated where they are to appear in
the main text. The title, legends and description in tables andfigures should be written in English. Figures will be printed bydirect offset printing. Tables will be inputted by the Editorials
as originals.

15）No publication fee is charged for publication in the Journal,
and the author（s）shall receive as a gift 30 offprints of theircontributions. Authors will be charged for copies in excess of
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cost of such prints.

12）References should be cited numerically in order of appearance
in the text using superscript letters as follows: 2）, 3-5）, 1, 4-6）, etc.
References should be listed using the Vancouver style as follows:
Names of all authors. Title of paper. Title of journal. Year of
publication; volume number: inclusive page numbers.
Abbreviations of journal names should be in accordance with
Index Medicus. References to books should be given as follows:
Names of all authors. Title of paper. Name of editor（s）. Booktitle. Place of publication: Publisher, year; inclusive page
numbers.
References to electronic sources should be given as follows:
Name of website.

16）Address for manuscripts to be sent:
Attn: Hiromi Sakai（Editor-in-Chief）
Artificial Blood Editorial Office
The Society of Blood Substitutes, Japan
Oxygen Infusion Project
Bldg. ＃55S, Rm. 703
Research Institute for Science and Engineering
Waseda University
3-4-1 Okubo, Shinjuku-ku, Tokyo 169-8555, Japan

9）The English fonts should be Times, Helvetica, Courier, orSymbol. Text should be typed in lower-case one byte characters.
However, sentences and proper nouns should begin with an
upper-case letter.

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 16 , No.4, 2008

Tel: +81-3-5286-3122 Fax: +81-3-3205-4740
E-mail: kita@kenkousya.jp229

投稿規定（平成20年9月30日改訂）
本誌は，血液を構成するあらゆる成分について，その代替物を開発する研究に貢献する論文，関連する情報，学会会員のための会報，学会諸規定等を掲載するが，形式にはこだわらず創
意ある投稿を広く集める．本誌への投稿者は本学会会員であることが望ましいが，投稿を希望する者は誰でも投稿することが出来る．原稿掲載の採否は，査読結果に従って編集委員会が決定する．原著論文について，他誌に既発表あるいは投稿中の論文は掲載しない．
共著者がいる場合には，共著者全員の承諾を得てから投稿する．論文の版権は本学会に譲渡しなければならない．このため，
著者の代表者は，本誌に添付の著作権譲渡同意書（CopyrightTransfer Agreement）或は，本会のホームページサイト（http://www.blood-sub.jp/home/index.html）からダウンロードしたものに署名捺印の上，郵送，Fax，またはpdfファイル
としてE-mailにて編集委員会宛に提出する．
ワープロを用いて作製した原稿の投稿を原則とする．ただし，手書き原稿による投稿でも受け付ける．欧文による投稿を歓迎する．
１）原稿の種類は，「原著論文」，「総説」，「学会報告」，「トピックス」，「オピニオン」，「海外文献紹介」から選び，これを第１頁の右肩上に明記すること．これらに該当しない原稿も受け付ける．査読意見によっては種類が変更される場合がある．次のいずれかの方法により，送付状（任意のフォーマット）を添
えて編集委員長宛に投稿する．

者名，全著者所属，英文著者名，英文著者所属，続いて連絡の取れる著者（corresponding author）の住所，英文住所を記入する．手書き原稿の場合はＢ5版，1行20字，20行とする．
５）「原著論文」，「総説」，「トピックス」，「オピニオン」については，第2頁以降に和文抄録，Keywords（英文で6個程度）
を付け，最終頁または別紙に英文抄録を付けること．
６）投稿論文に記載の研究が公的助成を受けて実施された場合に は ， 謝 辞 に そ の 旨 を 記 載 す る こ と ． ま た ， Conflict ofInterests（例えば，論文に記載された薬品を販売する企業と著者との利害関係: 雇用，コンサルタント，研究助成，株式，特許など）があれば，これを第１頁の脚注，謝辞などに記載する
こと．
７）ヒトを対象とした研究結果，および動物実験の結果を掲載する場合には，各研究機関のガイドラインに従って実施したことを方法等に明記すること．
８）論文中の略語は初出の際に省略しないこと．薬品，医薬品，測定装置等は，外国語名の場合は言語のまま用い，日本語化しているものはカタカナとする．型式，販売（製造）元とその所在地も記入すること．
（例） Rhodamine B（Sigma-Aldrich, St. Louis, USA）
, ポリグラフシステム（LEG-1000; 日本光電工業, 東京）
９）句読点はコンマ（，）ピリオド（．）とする．

i）文章と図表の電子ファイルをE-メールで送付する（使用したソフトを明記すること）．文章・表のファイル形式は，doc, txtが好ましい．図は，ppt, jpg, tiffが好ましい．

10）文中の英語に使用するフォントは，Times, Helvetica,
Courier, Symbolを原則とし，英文半角小文字とする．ただし，文頭および固有名詞は大文字で書きはじめること．

ii）ハードコピー4部を郵送する．

11）数字はアラビア数字を使い，度量衡の単位はm, cm, mm, μm,
L, mL, μL, mol, g, mg, μg, ng, pg, fg, N／10などを用いる．

２）投稿論文の査読は，編集委員長が選んだ人工血液分野の研究者に依頼する．査読意見によっては，原稿の修正を求める場合がある．修正論文（Revised Manuscript）の投稿に際しては，送付状に「査読意見に対する回答」を添え，意見に対して一つ一つ回答をするとともに，修正箇所がある場合にはこれを明記する．
３）掲載決定通知の後，著者は採択論文の文章・図表のファイ
ルを電子媒体として，指定する宛先に送付すること（使用したソフトを明記すること）．文章・表のファイル形式は，doc, txtが好ましい．図は，ppt, jpg, tiffが好ましい．
４）原稿はA4版の大きさとし，第1頁には表題，英文表題，著

23012）FigureとTable：引用順にそれぞれ番号を付けること．表
題，説明，図表中文字は，全て英文とすることが好ましい．本
文中に挿入箇所を明記すること．Figureは直接オフセット印刷とする．Tableは編集部にて入力し原図とする．
13）文献：本文に引用した順序に番号を付け，文中では2），3-5），1，4-6）などとする．文献の記載法はthe Vancouver styleに従う．全
著者名．論文題名．誌名 西暦発行年；巻数：頁〜頁．とし，誌名の省略は医学中央雑誌またはIndex Medicus に準拠する．
単行本の場合は全著者名．題名．編集者名．書名．発行地：発行書店，年号；頁〜頁．の順とする．電子文献の場合は，ホームページ名．改行してアドレス（引用した西暦年月）とする．

人工血液 Vol. 16 , No.4, 2008

（例）１. 高折益彦. 人工酸素運搬体:その将来への期待. 人工血液2007;15:90-98.
２. 橋本正晴. 単回投与毒性試験. 野村 護, 堀井郁夫, 吉田武美編. 非臨床試験マニュアル. 東京: エルアイシー, 2001;3748.
３. Wong NS, Chang TM. Polyhemoglobin-fibrinogen: anovel oxygen carrier with platelet-like properties in ahemodiluted setting. Artif Cells Blood Substit Immobil
Biotechnol 2007;35:481-489.
４. Natanson C, Kern SJ, Lurie P, Banks SM, Wolfe SM.
Cell-free hemoglobin-based blood substitutes and risk of
myocardial infarction and death: a meta-analysis. J Am
Med Assoc 2008;299:2304-2312.
４. Sakai H, Sou K, Takeoka S, Kobayashi K, Tsuchida E.
Hemoglobin vesicles as a Molecular Assembly.
Characteristics of Preparation Process andPerformances or Artificial Oxygen Carriers. In: Winslow
RM, ed. Blood Substitutes. London: Academic Press（Elsevier）, 2006;514-522.
５. 早稲田大学酸素輸液プロジェクト．
http://www.waseda.jp/prj-artifblood/index-ja.html（2008年9月現在）
14）既発表の図表，その他を引用，転載する場合には，あらか
じめ版権所有者の許可を得ること．また，掲載論文の著作権は本学会に帰属する．
15）二次掲載について．本誌は，他の言語ですでに掲載された論文を和文で二次掲載することは二重投稿ではなく正当な掲載と認めるが，著者は以下の事項を遵守する．
ａ）すでに掲載された論文であること．
ｂ）著者は両方の雑誌の編集者より許可を得ていること．二次掲載する編集者に最初に掲載されたもののコピー，別刷，もしくは原稿のいずれかを添付すること．

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 16 , No.4, 2008ｃ）論旨を変えないこと．執筆者は同一（順不同）であること．
ｄ）二次掲載版のタイトル・ページに掲載される脚注には，その論文の全体もしくは一部分がすでに掲載されている旨を明記し，更に初出文献も示すこと．適切な脚注の例を以下に示す．「This article is based on a study
first reported in the［...雑誌タイトル（完全な典拠情報を添えたもの）...］（訳：この論文記事は，［...］に最初に報告された研究に基づくものである）」．
これらの要件を満たしている場合は，その旨を明記して，総説
または論文記事（二次掲載）として投稿する．
16）本誌掲載著作物の二次利用および著作権について．本誌の一部，もしくは全部をCD-ROM，インターネットなどのメディ
アに二次利用する場合がある．本誌に掲載する著作物の複製権・翻訳権・上映権・譲渡権・公衆送信権（送信可能化権を含む）は，著者が上述の著作権譲渡同意書を提出することにより，本学会に譲渡される．本項は，著作者自身の再利用を拘束する
ものでは無いが，再利用する場合は，編集委員長に通知をする
こと．
17）掲載料．掲載料は無料とし，論説，総説，原著，報告等については別刷り30部を贈呈する．それを越える分についての費用は著者の負担とする（およそ1部100円）．カラー写真掲載・
アート紙希望などの場合は，著者の実費負担とする.
18）原稿の送付先〒169-8555 東京都新宿区大久保3-4-1
早稲田大学理工学研究所 55号館S棟703室
酸素輸液プロジェクト内
日本血液代替物学会 会誌「人工血液」
編集部
酒井 宏水 宛
電話: 03-5286-3122, FAX: 03-3205-4740
E-mail: kita@kenkousya.jp

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232

人工血液 Vol. 16 , No.4, 2008

編集委員会●酒井 宏水（委員長），東 寛，大谷 渡，武岡 真司，寺嶋 克幸，堀之内 宏久，村田 満，渡辺 真純●日本血液代替物学会 会誌■発行

日本血液代替物学会■編集・制作「人工血液」編集委員会

■印刷

株式会社

研恒社

人工血液

vol.16（4） 2009年 2 月 5 日発行〒160−8582 東京都新宿区信濃町35
慶應義塾大学医学部呼吸器外科内TEL（03）5363−3493 FAX（03）5363−3499〒169-8555 東京都新宿区大久保3−4−1 55号館S棟703号室
早稲田大学 理工学研究所 酸素輸液プロジェクト
TEL（03）5286−3122 FAX（03）3205−4740〒102−0073 東京都千代田区九段北1−1−7
TEL（03）3265-8961 FAX（03）3264−1995
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