人工血液第 18 巻 第 3 号 2011 年 1 月

目

次
会告
原著

総説

……………………………………………………………………

90

Measurement of electrolyte concentrations in serum
containing liposome vesicles ………………Seiji Miyake

他

91

人工赤血球を用いた脳酸素代謝測定……………………………………………………岡沢 秀彦

他

97

MWC２状態モデルはヘモグロビンのアロステリーといかに調和しうるか …………………………………柴山 修哉 102
オピニオン
ヘモグロビンを含んだ血液代替物を利用した
単純性血管腫のレーザー治療の効果についての考察…………………………………………………………力久 直昭 110

ARTIFICIAL BLOOD
Vol. 18 No. 3 January, 2011

Contents
Announcement ………………………………………………………………

90

Original Article：
Measurement of electrolyte concentrations in serum
containing liposome vesicles …………………Seiji Miyake, et al.

91

Review：Measurement of cerebral oxygen metabolism
using artificial RBC …………………Hidehiko Okazawa, et al.

97

How can the MWC two-state model be reconciled withhemoglobin allostery?………………………Naoya Shibayama 102
Opinion：A consideration about advantageous effect of thelaser treatment of port-wine stains with blood substitutes
including hemoglobin……………………………Naoaki Rikihisa 110

会

告XIII International Symposium on Blood Substitutes
and Oxygen Therapeutics(XIII ISBS 2011)期

日：

2011年 7 月27日
（水）
〜29日
（金）

会

場：

Massachusetts General Hospital, Boston, MA 02114, USA

President：

Professor Warren M. Zapol
Department of Anesthesia, Critical Care and Pain Medicine
Massachusetts General Hospital

Program
Topics：Blood storage with a focus on NO
Recent clinical studies of Hb-based oxygen carriers
New Hb-based oxygen carriers
Stem cell RBC production
その他

演題募集締切り：2011年 4 月 1 日（金）詳細はHomepageを参照, http://www.intsbs.info/
連 絡 先：

Warren M. Zapol, M.D.
President, ISBS 2011
Department of Anesthesia, Critical Care and Pain Medicine
Massachusetts General Hospital, Boston, MA 02114, USA
TEL: 617-643-5757 / FAX: 617-643-5767 / Email: ISBS2011@gmail.com

90

人工血液 Vol. 18 , No.3, 2010

original article

Measurement of electrolyte concentrations in serum
containing liposome vesicles
Seiji Miyake (1), Jiro Takemura (1), Hiromi Sakai (2), Masuhiko Takaori (3)Abstract
We reported in previous study that wet method using conventional electrode was not satisfactoryfor measurement of electrolyte（Na and Cl）ion concentration when one of artificial oxygen carrier,
HbV（liposome encapsulated hemoglobin）, was contained more than 1/8 volume ratio in serum. In
present study we attempted to clarify the above reason using liposome in which distilled water
was encapsulated and which was emulsified in distilled water. The liposome emulsion was mixed
with 1.68 ％ saline at volume ratio of 2.5 : 1.2 and then the mixture was diluted at 1/2, 1/4, 1/8,
1/16, 1/32 with 0.83 ％ saline. Human albumin* was added at 4 ％ in those mixtures adapting to aclinical specimen. Subsequently Na and Cl ion concentration in the above mixtures were measured
by the wet method（W method）using TBA-200FRNEOTM and dry chemistry method（D method）
using VITROS250TM, respectively. As results, Na and Cl ion concentration differences in the
mixtures measured by either wet or dry method and either Na ion or Cl ion concentrationdifferences between D and W method were obtained in most similar ranges. Therefore it was
concluded that measurement of Na and Cl ion concentration by D method is not interfered withcoexisted liposome vesicles at maximally 22 ％ volume ratio in serum. And it was assumed thatcoexistence of both hemoglobin and liposome vesicle could limit the capacity with W method formeasurement of the electrolyte ion concentration in serum containing the HbV. Consequently weevaluated the D method as it can be used for measurement of electrolyte ion concentration inserum containing liposome vesicles while some correction factors might be provided necessarily.
Accuracy in determination of liposomecrit, volume ratio of liposome mass in the emulsion, withultracentrifugation and diffusion of water molecule through the liposome membrane by osmosis
were also discussed in this paper.
* Human albumin powder supplied from Sigma-Aldrich contains a trace amount of Na.

Keywords
liposome encapsulation, electrolyte concentration measurement, liposome, polarographic method, phospholipid membrane
permeability, artificial oxygen carrier

Introduction
Many studies 1-7）have been reported on interference withhemoglobin based artificial oxygen carrier（HBOC）tolaboratory examinations in clinical practice. The interferencewith HBOC in those studies attributed most to lightabsorbance of hemoglobin molecule with spectrophotometry.
We expected, however, that polarographic measurement forelectrolyte（Na, K, Cl）ion concentrations in serum would
never be interfered even if the serum had contained HBOC.
Thus we tried to measure them in serum containing HBOC,
hemoglobin encapsulated liposome vesicle emulsified in thephysiological saline（HbV）. The measurement could performe
most satisfactorily by dry chemistry method but surprisingly
was limited partially by conventional wet method 8）. Namely（1）Osaka Prefecture Saiseikai Noe Hospital 2-2-33 Higashi-Imahuku, Jyotou-ku, Osaka 536-0002, Japan（2）Research Institute for Science and Engineering, Waseda University 3-4-1 Ohkubo, Shinjyuku-ku, Tokyo 169-8555, Japan（3）East Takarazuka Sato Hospital 2-1 Nagao, Takarazuka, Hyogo 665-0873, Japan
論文受付 2010 年４月 28 日 論文受理 2010 年６月７日

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 18 , No.3, 201091

clinically acceptable value could not be obtained, if volume of
the HbV in the serum exceeded over 1/8. We wondered
whether liposome per se or liposome encapsulating
hemoglobin would have limited the measurement.
In this study to elucidate mechanism for the above
limited ability with the wet method, we prepared liposome
vesicles encapsulating distilled water instead of hemoglobin
solution and attempted to demonstrate sole effect of those
liposome vesicles attributed to the limitation with the wetmethod comparing with the dry chemistry method.

MethodLiposome vesicles encapsulating distilled water wereprepared in Waseda University. 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3phosphatidyl choline, cholesterol, 1,5-O-dihexadecyl-N-succinylL-glutamate which were supplied from Nippon Fine Chemical
Co. Ltd. Osaka, Japan, and 1,2-distearoyl-sn-glycerol-3phosphatidyl ethanolamine-N-PEG5000 from NOF Corp.
Tokyo, Japan were mixed at mole composition of 5/5/1/0.033.
The mixture of 10 g was dissolved in 140 ml of distilled waterand stirred with a stirring machine model SFS710-AA（Advance Corp. Tokyo, Japan）overnight. After liposome
vesicle formation, the vesicles were extruded out through 220
nm pore sized FM filter（Millipore Corp. Billerica, Ma. U.S.A.）
under 30 kgf/cm2 and their size was adjusted approximately
240 nm which was confirmed with Zeta-Sizer Nano ZS（Malvern Instruments Ltd. Worestershire, U.K.）. Volume ofvesicles（liposomecrit）emulsified in distilled water wasdetermined to be 52 ％ after 100,000 G ultracentrifugation
with Optima LX-80（Beckman Coulter Co. Brea, Ca. U.S.A.）.
The emulsion was sealed with air and stored at 4 ℃ in arefrigerator. Human albumin powder（A1653-5G SigmaAldrich St Louis, Mo. U.S.A.）was dissolved in the emulsion,
1.68 ％ and 0.84 ％ saline at 4 ％ for each, simulating humanserum. Then 2.5 ml of the emulsion, 1.2 ml of the 1.68 ％ saline
and 2.5 ml of 0.84 ％ saline were mixed. This mixture（L1）was
diluted by the 0.84 ％ saline with 4 ％ albumin at 1:1 volumerate and prepared 1/2 mixture（L1/2 ）. Subsequently 1/4, 1/8,
1/16, and 1/32 mixture（L1/4 , L1/8 , L1/16 , L1/32 ）were prepared in
the same diluting fashion as for the 1/2 mixture. It spent 30〜 40 minutes for preparation of those mixtures. Na and Cl
ion concentration in those mixtures were measured
duplicated with the dry（D）and the wet（ W）method,respectively, and whole measurement was performed withinapproximately 80 〜 100 minutes. For measurement with D
method, VITROS250TM（Ortho Clinical Diagnostics, Rochester,N.Y. U.S.A.）was used and TBA-200FRNEO TM（Toshiba
Medical System Corp. Ohtawara, Tochigi）was used for W
method. On every study day, the 0.83 ％ saline with and92

without the albumin were prepared and used for reference
measurement of electrolyte ion concentration by D and W
method, respectively. Estimated concentrations of electrolyte
ion in the L1 and serially diluted mixtures were calculated bysimple, mathematical dilution equation. Incidentally（1 − 0.52）
was used as ratio of outer water volume of liposome vesicles
in original, undiluted liposome emulsion for the equation,
since liposomecrit was determined as 52 ％ with theultracentrifugation.
The human albumin powder supplied from SigmaAldrich company contains a few amount of Na notaccompanied with Cl ion9）. We measured Na ion concentrationin the 0.84 ％ saline with 4 ％ albumin and obtained 150.0 ± 1.5
mEq/L for it by D method and 143.9 ± 1.3 mEq/L by W
method.
These experimental procedures were performed in
Osaka Prefecture Saiseikai Noe Hospital on five separate
days. Mean and standard deviations for actually measured
value（Am ± SD）, its corresponding estimated value（Em ±SD）and difference（Dm ± SD）between the actually measured
value and the estimated value for each measurement of the
mixtures were listed in Table 1. Difference between ion
concentration measured by D method and by W method foreach mixture, was listed in Table 2. In Table 3, difference
between Na and Cl ion concentration in the same mixture
measured by D method and W method was listed,
respectively. Student t-test was used for statistical analysis
and p < 0.05 was evaluated as significant difference.

Results
Regarding to Na ion concentration, in general, actually
measured values were lower than their estimated values foreach using either D method or W method. This trend wasnoted markedly and significantly in L1 and L 2 . As shown in
Table 1., actually measured Na ion concentration was 24.8 ±0.8 mEq/L in L1 and 2.9 ± 0.6 mEq/L in L1/2 less than eachcorresponded estimated value by D method, respectively.
The similar trend that the actually measured value was
27.9 ± 1.4 less in L1 and 2.0 ± 1.0 mEq/L less in L1/2 than its
corresponded estimated value was noted with W method.
Every actually measured value of Na ion concentration in L1/8
〜 L 1/32 , however, did not differ significantly from eachestimated value not regarding to the methods used formeasurement.
Actually measured Cl ion concentration in L1 by D
method was 109.5 ± 0.7 mEq/L and differed 34.2 ± 0.7 mEq/Lfrom its estimated value. This difference was significantly
greater compared with other differences for L 1/2 〜 L 1/32
ranged within 7.2 ± 0.7 〜 4.4 ± 4.4 mEq/L. The similar trend

人工血液 Vol. 18 , No.3, 2010

Table 1. Na and Cl ion concentration actually measured by D and W
method, its estimated value and difference between actually
measured and estimated value

D

L1

L1/2

L1/4

L1/8

L1/16

L1/32

Am±SD

123.7±0.8135.9±0.8142.2±1.0145.5±1.0

147.1±1.2147.8±1.1

Em±SD
Dm±SD

148.5

138.9±0.3

143.5±0.4146.2±0.5147.8±0.5148.6±0.6−24.8±0.8−2.9±0.6−1.3±0.9−0.8±0.8−0.7±0.8−0.8±0.6

Am±SD116.0±1.4140.6±1.3142.2±1.1

143.1±1.3

143.9

130.1±1.2
132.1±0.6137.1±1.0

Em±SD137.6±0.5140.6±0.5142.3±0.6

143.1±0.5

Dm±SD−27.9±1.4−2.0±1.0−0.5±0.5

0.0±0.9

0.0±0.7

0.0±0.8

Am±SD109.5±0.7131.5±0.5132.6±0.7133.4±0.8

143.7

122.1±0.9129.3±0.3127.9±0.6

Em±SD133.7±0.4

136.1±0.3137.8±0.3

138.2±0.3

Dm±SD−34.2±0.7−7.2±0.7−5.8±0.5−4.5±0.4−5.2±0.6−4.8±0.7

Am±SD108.7±0.9134.1±0.6

136.1±0.7

136.8±1.0

148.5

123.3±0.7
128.9±0.4130.7±0.7

Em±SD
Dm±SD

134.3±0.3

137.4±0.3

139.0±0.3139.9±0.4−39.8±0.9−5.6±0.8−3.6±0.4−3.3±0.5−2.9±0.4−3.1±0.8NaWD

emulsion and the serial mixtures. This procedure increased
Na ion concentration in every mixture. Therefore Na ion
concentration was higher than Cl ion concentration in thesame mixture as shown in Table 1. Differences between Na
ion and Cl ion concentration in each mixture as shown in
Table 3 were ranged within 13.8 ± 1.2 〜 14.5 ± 0.9 mEq/Lwith D method and 6.1 ± 0.6 〜 7.4 ± 0.9 with W method. The
latter values were less than former significantly. Thosedifferences dispersed in relatively narrow range with eachmethod and no significant difference was noted between eachvalues, respectively.

ClW

Am ± SD : mean of actully measured value ± standard deviations
Em ± SD : mean of estiamted value ± standard deviations
Dm ± SD : mean of difference between acutally measured andits estimated value ± standard deviationsn ＝ 10unit : mEq/L
D : D method W : W method

Table 3. Difference between Na and Cl ion concentration for serial
mixtures measured by D and W method, respectively
L1

L1/2

L1/4

L1/8

L1/16

L1/32

D

14.2±0.8

13.8±1.2

14.3±1.0

14.0±0.8

14.5±0.9

14.4±0.9W

7.4±0.8

6.9±0.7

6.4±0.6

6.5±0.9

6.1±0.6

6.3±0.8

n ＝ 10was noted in Cl ion concentration differences measured by W
method, namely difference of 39.8 ± 0.9 mEq/L for L1 which
was significantly greater than those for L1/2 〜 L1/32 ranged
within 5.6 ± 0.4 〜 2.9 ± 0.4 mEq/L.
As shown in Table 2, every Na ion concentration
measured by D method was higher than that by W method.
Difference between the both methods ranged within 7.7 ± 1.9〜 4.7 ± 1.8 mEq/L for Na ion concentration. Difference of
7.7 ± 1.9 mEq/L in L1 , however, was much greater comparedwith differences for other mixtures. On the other hand, no
significant difference for Cl ion concentration was observed in
the L1 . The differences for Cl ion concentration in L1/2 〜 L1/32
measured by D method ranged within −1.2 ± 0.7 〜 −3.5 ± 0.8
mEq/L and were significantly less than those by W method.
We added human albumin powder in the liposome
Table 2. Comparison of ion concentrations measured by D and W method
Difference between Na ion concentrations measured by by D and W method
Difference between Cl ion concentrations measured by by D and W method

L1

L1/2

L1/4

L1/8

L/16

L1/32

NaD−NaW

7.7±1.95.8±1.9

5.1.±1.6

4.9±1.94.8±1.8

4.7±1.8

ClD−ClW

0.8±1.2−1.2±0.7 −2.8±0.7 −2.6±0.8 −3.5±0.8 −3.4±0.7

NaD : Na ion concentration measured by D method
NaW : Na ion concentration measured by W method
ClD : Cl ion concentration measured by D method
ClW : Cl ion concentration measured by W method
n ＝ 10mean ± standard deviations

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 18 , No.3, 2010

unit : mEq/Lmean ± standard deviations
D : D method
W : W method

unit : mEq/L

Discussion
Actually measured values for Na ion concentration
measured by the D method, in general, were higher thanthose by the W method. On the other hand, values measured
for Cl ion by the D method were lower than those by the W
method. And actually measured values for L 1 mixture
differed considerably greater from its corresponded
estimated value. These differences for L1 were greater thanthose for other mixtures not regarding to either ions or
methods used. The similar trend was observed in theprevious study 8）. Those differences might be explained asinterference with liposome vesicles contaminated in serum topolarographic measurement. Difference between the actually
measured value and its estimated value became smaller
corresponding to dilution of the liposome emulsion from the
1/2 to 1/32 mixture as shown in Table 1. It might beinterpreted that less mixing of the liposome vesicle interferedless to electrolyte ion measurement with the polarographic
method. Those changes in the differences, however, appearedin most similar fashion with either the D or W method. In
addition differences between Na and Cl ion concentration insame mixtures were limited in relatively narrow range witheither D or W method as shown in Table 3. Differences
between the actually measured and its estimated value either
by D or W method were most similar for every mixture.
Therefore reliability upon the both methods could be
evaluated likely most equivalent.

93

The relatively large difference between the actually
measured value and its estimated value noted in the L1 andL 1/2 mixture has never clarified in the previous and thisstudy. However it was explained hardly for interference withliposome vesicles on polarographic measurement alone. It
could not be excluded that the dilution equation to calculate
estimated value was not fully adjusted. In the equation weused（1 − 0.52）as water volume rate in outer phase of vesiclesof the liposome emulsion. We wonder, however, whether or
not the ratio of（1 − 0.52）was exact value of the water volume
in outer phase of liposome vesicles in the emulsion. The
liposomecrit of 52 ％ was determined by ultracentrifugation
with 100,000 G. Regarding to this procedure, it was notwarranted that the centrifugal force would drive out
sufficiently water in void space among the vesicles and it
would be suspected that much water volume more than
（1 − 0.52）ratio would remain in sedimented liposome mass.
We might assume that such nano sized vesicles had little
deformability against extremely strong compressive force,such as 100,000 G.
Other possibility can be postulated that the vesicle
would be very elastic and compressible. If so, centrifugating
power was sufficient to compress vesicles and formed
liposome layer on bottom of vessel showing absoluteliposomecrit during the centrifugation. However, the layer
would reexpand by membrane elasticity of vesicle during
centrifugating power was reducing and was fixed at 52 ％after the power was released. Therefore liposomecrit
measured after the centrifugation would be recognizedhigher than that during the centrifugation. HbVcrit, vesicle
mass rate of the HbV which was manufactured by the same
preparing process as that for the liposome used in this study,
has been defined approximately 30 ％ 10）. This value wasslightly lower than 36 ％ of the liposomecrit estimated fromthe actually measured value in this study. It is presumed that
liposome membrane of the HbV posses lower lamellarity.
Since hemoglobin as electrolyte shields the electric repulsion
between lipid bilayer membranes when hemoglobin solution
was encapsulated in the vesicle. Based on the HbVcrit, weestimated values of Na and Cl ion concentration in serum
containing the HbV and fit them to actually measured values
relatively better, respectively, in the previous study 8）. In
addition, data 8）that the HbV has been composed with 9.74
g/dL of hemoglobin and 6.65 g/dL of phospholipid may
support the above value of HbVcrit.
Regarding to the difference between the actually
measured value and its estimated value, which was notedparticularly greater in the L1 and L1/2 , we could assume that
distilled water encapsulated in the vesicle permeated through94

liposome membrane by osmosis after the mixing the liposome
emulsion with mixture of the 0.84 ％ saline of 2.0 ml and 1.68 ％saline of 1.2 ml. Liposome membrane was documented as asemipermeable membrane by Chang 11）. Diffusion coefficientvaries certainly depending upon its membrane composition
and upon physicochemical properties of solutions in insideand outside of the membrane. In this study, measurement of
Na and Cl ion concentration was carried out at 30 〜 40minutes after preparation of the mixtures. Such interval isconsidered sufficient to move water through thesemipermeable membrane of liposome.
In the previous study 8）we reported that a trace amountof potassium ion was noted in the HbV. In preparation of the
HbV, hemoglobin solution which obtained from hemolysed
red cells was encapsulated in liposome vesicle accompanying
with intracelluar potassium（K）of red cells. The vesicles wererinsed several times with physiological saline after theencapsulation and excess hemoglobin and K outside of thevesicle were removed. The K encapsulated inside of thevesicle would partially diffuse out during the rinsing but notall. Therefore we anticipated that K remained inside might
diffuse out through the liposome membrane during storage.
In this study, however, we did not attempted to observe theabove K ion diffusion through the liposome membrane. Either
analyzer mounted D or W method is provided formeasurement of electrolyte ion concentration in serum inpractice and can be adopted for measurement of K ion
concentration between 1.0 〜 10.0 mEq/L with the W method
and 1.0 〜 15.0 mEq/L with the D method. Therefore
accuracy with K ion concentration measurement is less than
1/10 〜 1/20 that with Na ion. For this reason we used asingle saline solution without K ion in this study. However
either Na or K ion is monovalent ion. Therefore K ion isassumed to move most likely through a semipermeable
membrane as same as Na does.
There were some limitations in this study. Analyzer,
VITROS250TM for D method and TBA-200FRNEOTM for W
method, both are essentially provided for measurement ofsamples obtained in clinical practice but not for saline or
unphysiological solution, such as liposome emulsion. While we
added human albumin powder in the mixtures simulating
human serum, it might be not fully adjusted to their properuse. Actually measured Cl ion concentrations in 0.84 ％ saline,
such as 134.5 ± 0.6 by D method or 137.5 ± 0.2 mEq/L by W
method, was considerably less than estimated value of 143,7
mEq/L respectively. Therefore apprehension that thoseanalyzers had been essentially inadequate for this study
remained.
In the second, any data for an accurate amount of Na

人工血液 Vol. 18 , No.3, 2010

contained in the human albumin powder used in this study
have not been informed from Sigma Adrich company. We
dissolved the albumin powder at 4 ％ in 0.84 ％ saline andobtained Na ion of 150.0 ± 1.5 mEq/L by D method and143.9 ± 1.3 mEq/L by the W method. Subsequently wesubtracted 143.7 mEq/L（essential Na ion concentration for
0.84 ％ saline）from the measured values and we anticipated
Na ion concentration associated with 4 ％ albumin alone as 6.3
mEq/L by D method and 0.2 mEq/L by W method.

Conclusion
It was concluded that liposome vesicles contained inserum per se does not interfere essentially to measurementof Na and Cl ion concentration by either the dry method with
VITROS250TM or the wet method with TBA-200FRNEOTM.
Therefore the limited capacity associated with the wetmethod noted in the previous study 8） was not clearly
elucidated. It was suggested, however, possibly thatcoexistence of hemoglobin and liposome vesicle could limit
the capacity with W method for measurement of electrolyte
ion concentration in the serum.
The marked differences between actually measured
value and its corresponded estimated value, notedparticularly for the L1 , might attribute to the accuracy ofdetermination of liposomecrit or to the water movement
across the liposome membrane.

Acknowledgement
This study was supported by the Grant for Japanese
Ministry of Health, Welfare and Labor Research Project "Clinical Applications of Artificial Oxygen Carrier H18-Drug
Innovation H18-General-022 ".

References
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95

リポソーム粒子を含む血清での電解質イオン濃度測定
三宅誠司 1），武村次郎 1），酒井宏水 2），高折益彦 3）1）大阪府済生会野江病院検査科
2）早稲田大学理工学研究所
3）東宝塚さとう病院
和文要約 以前発表した論文に臨床検査の対象となる血清に人工酸素運搬体の一つである liposome encapsulating hemoglobin
vesicle（HbV）が一定濃度以上含まれると従来の電極法，wet 法（W 法）を用いての血清電解質測定が不可能になることが認められると発表した．今回，その機序を解明するために蒸留水を包埋した liposome 微粒子分散液を 1.16 ％食塩液と容量比において38.5 ％に混合，そしてこの混合液，さらにその 1/2，1/4，1/8，1/16，1/32 の希釈液，すべてにその濃度が４％となるように人アルブミンを添加した．そしてこれら混合液についてその Na，Cl 濃度を W 法，ならびにドライ法（dry chemistry method）を用いて測定した．その結果ではそれぞれの測定法にて測定した各混合液での Na イオン濃度と Cl イオン濃度との差，また測定した各混合液での Na，あるいは Cl イオン濃度の測定法にともなう差はすべてそれぞれ一定の範囲内にあった．それゆえにそれぞれの測定法に適合した補正法の必要性は認められるが，それぞれの測定法での血清電解質（Na，Cl イオン）測定は可能であると認められた．
すなわち少なくとも liposome それ自身による測定法への干渉はないと認められた．そのためすでに発表した論文にて示された一定濃度以上の HbV の混入血清での W 法によって生じた測定上の誤差は liposome 単独の影響に包埋された hemoglobin の影響が加わる
ことで生じたものと推定した．また今回の実験結果をふまえて超遠心法にて測定された liposome のエマルジョン内での容量比（liposomecrit），実験中における liposome 膜を介しての水分子の拡散性についても考察した．

96

人工血液 Vol. 18 , No.3, 2010

総説

人工赤血球を用いた脳酸素代謝測定
Measurement of cerebral oxygen metabolism using artificial RBC
岡沢秀彦，清野 泰，Vijay Narayan Tiwari，森 哲也，小林正和，藤林靖久
Hidehiko Okazawa, Yasushi Kiyono, Vijay Narayan Tiwari,
Tetsuya Mori, Masato Kobayashi, Yasuhisa Fujibayashi

和文抄録
現在脳酸素代謝測定は，15O 標識酸素（15O2）ガス吸入によるポジトロン CT（PET）検査で行われているが，測定法開発当初は 15O2 標識赤血球を頸動脈内投与する侵襲的な方法で計測された．15O2 ガス吸入による検査法が確立されて以降，
頭部断層画像での非侵襲的計測が可能となったが，様々な問題により，脳酸素代謝測定を実施する施設は年々減少してい
る．PET による新たな脳酸素代謝測定法として，人工赤血球に 15O2 を標識する計測法を現在開発中であるので，その一部を紹介する．
Abstract
Injectable 15O2 labeling system was developed using hemoglobin-containing vesicles（HbV）, a type of artificial red blood cell, anda simple bubbling method. L-cysteine was added as a reductant to protect hemoglobin molecules from HbV oxidation.
Measurement of cerebral blood flow（CBF）and metabolic rate of oxygen（CMRO2 ）in five normal rats was performed using asmall animal PET scanner after the injection of H215O and 15O2-labeled HbV（15O2-HbV）to evaluate the precision of hemodynamic
parameters quantitatively. The most efficient method for labeling was bubbling of 15O2 combined with vortexing and the additionof 2.8 mM or greater L-cysteine in HbV solution. The mean radioactivity of 214.4 ± 7.8 MBq/mL 15O2-HbV was obtained using
this method. PET scans using 15O2-HbV and H215O yielded a mean CMRO2 value of 6.8 ± 1.4（mL/100g/min）in rats with normal
CBF of 51.4 ± 7.9（mL/100g/min）. The present injectable 15O2-HbV labeling system was successfully utilized to measure CMRO2
in rats, indicating that this new method could be useful for animal models to measure oxygen metabolism in the brain.
Keywords; L-cysteine.
Hemoglobin-vesicle（HbV）; Cerebral metabolic rate of oxygen; Injectable 15O2 ; Positron emission tomography（PET）

１．はじめに
放射性同位元素（RI）を利用した脳酸素代謝測定は，通常
15O 標識酸素（15O2 ）ガスを用いたポジトロン CT（PET）検査で行われている．多くの人は PET 酸素代謝測定法開発当初から 15O2 ガスの吸入法が用いられていると認識しているかもしれないが，実際には 15O 2 をヘモグロビン（赤血球）に結合させ，動脈内投与する方法で測定された．この検査法は，米国ワシントン大学（セントルイス）の Ter-Pogossian 等によって始めら
れ，1970 年に論文として報告された 1）．その後 15O2 ガスを一定の濃度で吸入させるガス定常法が開発され，比較的容易かつ非侵襲的に計測可能となった 2）．しかし，患者の呼吸状態に測定結果が影響されたり，最近特に厳しくなった PET 管理区域での非密封 RI 取り扱い規制等による，放射性ガスの厳しい使用制限など様々な理由により，脳酸素代謝測定を実施する施設は
年々減少している．臨床上 15O2 ガス PET 検査の有用性は十分に認識されており，普及のためにはより簡便かつ扱いやすいトレーサーによる検査法の開発が望まれている．
新たな脳酸素代謝測定法として，我々は人工赤血球を用いた計測法を開発中であるので，その一部を紹介する．「人工酸素運搬体」という名称を用いず，「人工赤血球」としているのは，
赤血球に標識する RI ガスが 15O2 のみでなく，一酸化炭素も 15O
標識（C15O）して検査に用いるためである．15O 標識水（H15O2）あるいは 15O 標識二酸化炭素（C15O2）による脳血流検査も合わ
せ，これら３種類のトレーサーを全て用いて定量画像化するこ〒 910-1193 福井県吉田郡永平寺町松岡下合月 23-3 福井大学高エネルギー医学研究センター
Biomedical Imaging Research Center, University of Fukui, 23-3, Matsuoka-Shimoaizuki, Eiheiji-cho, Yoshida-gun, Fukui 910-1193, Japan.
論文受付 2010 年８月４日 論文受理 2010 年８月 19 日

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 18 , No.3, 201097

とで，はじめて正確な PET 脳酸素代謝測定が可能となる．

２．脳酸素代謝測定の歴史
1940 年代後半に Kety と Schmidt により，ヒト生体内での脳循環代謝測定が開始された．内頸動脈・内頸静脈の両方にカテーテルを留置し，動静脈の酸素分圧計測および拡散型トレーサーである N2O（nitrous oxide）を用いた脳血流量測定から酸素代謝を定量化する方法であるが 3-5），この方法では脳全体での血流・酸素代謝が計測できるのみである．その約 20 年後，TerPogossian 等は内頸動脈から H215O および 15O2 標識赤血球を投与
し，頭部にシンチレーション・プローブを配置することで，患者の酸素代謝を計測することに成功した 1）．この方法により初めて脳局所の酸素代謝がヒトで計測可能となった．これは，現在も行われている PET による脳酸素代謝測定の原型ともいえる．彼らが開発した方法では，患者本人からの採血により血液を採取し，放射性 15 O 2 ガスの単純なバブリングにより 1mCi
（37MBq）/mL の標識効率が得られたと報告されている．同時に H 15O 2，C 15O を用いた測定も行われており，ほぼ現在の 15OPET による脳循環代謝検査と同様の RI を用いた検査が行われていたことになる 1，6-8）．
その後 1970 年代中頃から，酸素代謝測定は 15O2，C15O2 を一定濃度の希ガスとして順次吸入させる定常法が主流となり 9），赤
血球に 15O2 ガスを標識して血管内投与する Ter-Pogossian 等の手法は用いられなくなった．1980 年には Frackowiak 等がガス定常吸入法による脳血流酸素代謝定量法の基礎を完成させ 10），
その後さらに様々な補正法が加えられ，現在我が国で最も一般的となっている PET 脳循環代謝計測法が確立された．
しかし上述のごとく，患者の呼吸による変動や放射性ガスト
レーサーの取り扱いなど様々な問題があり，15O-PET 検査は次第に検査件数が減少している．また，動物実験においては，気道と脳が非常に近接し，同一断面内に高濃度の放射性ガスが存在するために大きな誤差の原因となるなど様々な問題がある．
これらの問題を解決するためには，Ter-Pogossian 等が行った，血管内投与可能なトレーサーでの検査が理想的である．
Magata 等は，人工心肺を用いた赤血球への 15O 2 標識という斬新な方法により，動物用 PET を用いた実験でラット脳の酸素代謝測定を可能とした 11，12）．放射性ガスの標識効率を向上させるため，通常の２倍の流路を有する人工心肺を用いた 15O2 標識法を開発するなど，安定した計測が可能となったが，流路の延長は循環させる血液量を増加させる必要があり，一匹の個体を検査するために何匹かのラットから血液のみを採取する必要がある．また，この方法はヒトへの応用という点でも問題が多い．
我々は，ヒトでの脳酸素代謝計測も視野に入れ，人工赤血球を用いた無菌状態での 15O-gas 標識法を開発し，ラットでの PET計測を可能としたので，その方法を紹介する 13）．

３．人工赤血球を用いた 15O2 ガス標識法
人工酸素運搬体としては，ヘモグロビンの重合体が既に市販さ れ て お り ， 米 国 OPK Biotech 社 が 動 物 用 医 薬 品 と し て

98

Oxyglobin®，ヒト用酸素運搬製剤として Hemopure® を製造販売している．これは以前 Biopure 社が製造販売していた製品で，現在は OPK Biotech 社が販売権を有している．いずれもウシ（bovine）の赤血球から作られた製剤であり，BSE 問題のため輸入等に関しては制限が厳しい．国内での人工酸素運搬体開発はテルモ社と早慶グループで行われているが，いずれも一般臨
床では用いられておらず，研究開発段階である．これらの製剤
は，輸血用あるいは脳梗塞時の治療薬としての利用が検討されている 14-16）．我々は後者が開発した hemoglobin vesicle（HbV）
を用い 17），15O-gas 標識による酸素代謝計測への応用を試みた．
HbV は直径約 250nm のリポソーム内にヒト・ヘモグロビンが包まれた製剤で，ヒト赤血球と比較するとかなり小さい（図１）．

図１. A, B: ヒト赤血球の形状およびサイズ．C: 人工赤血球（HbV）の形
状およびサイズ（Oxygenix 社パンフレットより），liposome 内に
hemoglobin が充満している．

我々は当初，Ter-Pogossian 等がヒト赤血球を用いて行った
ように，単純なバブリングでの 15O-gas 標識を試みたが，PET検査に利用するには不十分な標識効率であった．現在ヒトのPET 検査では，脳血流量測定に約 740MBq の H215O を投与している．15O2 の吸入の際も，これに匹敵する血中濃度が望まれる
ので，流速約 350MBq/min の一定速度での吸入か，または流速 1000 〜 1500MBq/min でのボーラス吸入による RI 投与が行われる．Ter-Pogossian 等が達成した標識効率では，計算上約20mL 以上の赤血球を急速に静脈内投与する必要があり，あまり実際的ではない．彼らの測定法は 15O2 標識赤血球を直接頸動脈内投与し，かつ断層画像でなくシンチレーション・プローブ
でのカウントのみの計測であったため，あまり高い比放射能を必要としなかったのであろう．ヒトの PET 検査に用いるためには，約５mL 程度の赤血球に 700MBq 以上の 15O2 標識が望ましいと考えると，３倍以上の標識効率が必要となる．この問題は，
HbV に還元剤である L-cysteine を加えて前処置することで解決された 13）．前日に約３ mM の L-cysteine 加えておくと，ボルテ

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ックス・ミキサーで撹拌しながら 15O 2 をバブリングすることで，平均約 200MBq/mL の 15O2 標識 HbV が得られた．O-15 の半
減期（約２分）や自動投与装置へのセットアップ時間等を考慮しても，ほぼ十分な放射濃度が得られたといえる．
H215O，15O2 を用い，小動物用 PET 装置（SHR41000）で撮像したラット脳血流量，酸素代謝画像を提示する（図２）．あまり良好な画質ではないが，脳梗塞モデル動物の梗塞部を反映した低血流・低酸素代謝部位が描出されている．病変局所の血流・酸素代謝計測には十分な画像である．脳血流量は平均51.4 ± 7.9（mL/min/100g），酸素代謝率で平均 6.8 ± 1.4（mL/min/100g）という結果が得られ，ほぼ従来のラット脳血流代謝測定結果と一致していた．この検討で酸素代謝率がやや高い定量値となったのは，C15O を用いた血液量計測を省略し，血液量補正（血管内にある放射能の補正）を行わなかったことも原因の一つと考えられる．現在は持続定常投与法による
H 215O，C 15O-HbV， 15O 2-HbV PET を同一個体で順次行う fullstudy を検討中であり，小動物での安定した脳循環代謝計測法の確立を目指している 18）．また，虚血性疾患では梗塞を含む病変部における血管径の変化が予想され，図１に示されるような生体内の赤血球と HbV とのサイズの違いが 15O2-HbV PET による酸素代謝画像に反映されるか興味深い点である．人工酸素運搬体による治療効果との関連も含め，今後の詳細な検討が期待される．
過 去 の 報 告 で ， 同 様 に 15O 2 標 識 人 工 赤 血 球 （ l i p o s o m e encapsulated Hb = LEH）を PET 撮像に用いた検討があるが，彼らの検討では酸素が LEH により脳内へ運搬されることを確認したのみで，酸素代謝の定量測定は行われていない 19）．ラット赤血球への標識と比べ半分以下の標識効率であったと報告されているが，L-cysteine 処理等は行われていなかったと思われ
る．

図２. 15O 標識 HbV で撮像した左中大脳動脈閉塞モデルラットの PET 画像（A: 冠状断，B: 横断）および脳切片の 2,3,5-triphenyltetrazolium
chloride（TTC）染色（C）．白矢印は梗塞部位を示す．

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４．脳血管障害における脳酸素代謝測定の意義
1980 年代に Powers 等により，閉塞性脳血管病変による虚血時脳循環動態の仮説モデルが提唱され，障害の病期が分類された 20）．正常で 40%前後とされる酸素摂取率（OEF）は，脳内灌流圧の低下に伴って上昇し，貧困灌流（misery perfusion）と呼ばれる血行動態の機能不全状態となる（図３）．この状態はstage II の脳虚血とされ，脳外科的バイパス術のよい適応期と考えられた．外頚動脈系と頭蓋内の内頚動脈系とのバイパス吻合術（=EC-IC bypass）の有効性は，1985 年に発表された大規模調査での報告により残念ながら有効性を一時否定された 21）．
しかしその後の検討により，この調査でバイパス術施行群と経過観察群の間に有意な予後の違いが認められなかった原因は，対象となる患者を適切に選択していなかったためであることが分かり，その意義が見直されている．山内等は片側性脳血管障害の患者を追跡調査することで，貧困灌流を呈した患者群が，貧困灌流のない患者群と比べ，有意に梗塞再発率が高いことを示した 22）．その後我が国では，脳外科医が中心となって JET（Japanese EC-IC bypass Trial）study を実施し，stage II の脳虚血と診断された患者においては，手術群が内科的治療群より梗塞再発率が有意に低いと報告した 23，24）．この研究はコホート調査によるバイパス手術の有効性を再検討した試みであり，エビデンスとしての価値は高い．2009 年に改訂された脳卒中ガイ
ドラインでも，EC-IC バイパス術は貧困灌流を伴う患者において，エビデンスの高い治療として評価されている（Grade B）．
しかし，JET study で判定法として採用されたのは SPECT での脳血流検査であり（後述），直接酸素代謝を測定して貧困灌流の状態を確認した訳ではない．これに対し，米国で行われている COSS（carotid occlusion surgery study）では，15O-PET
でバイパス術の適応を決めており，本来の目的により即したプ
ロトコールとなっている．
ヒトでの 15O-PET 検査は通常 15O2 ガスによる検査以外に C15O2または H 215O による脳血流（CBF）画像，C 15O による血液量（CBV）画像を全て撮像することで，はじめて定量性の高い酸
素代謝画像を計算することができる（図４）．15O2 ガス PET 撮
像時の動脈血放射能計測値と PET 画像データおよび CBF，
CBV 画像を用いて OEF を計算し，これに CBF と血中 O 2 濃度
（aO2c）を乗じたものが酸素消費量（CMRO2）となる（CMRO2= OEF ・ CBF ・ aO 2 c）． ヒ ト の 脳 で の 酸 素 代 謝 正 常 値 は
CMRO2 = 約３-４ mL /100g/min（〜〜 100 μmol/100g/min）とされている 25）．現在我が国で最も一般的に行われているのは
15
O-gas 定常吸入法で，通常１セットの 15O-PET 検査に約１時間要する．これをボーラス投与法にすることで，約 30-40 分に短縮可能であり，さらに採血を行わない簡略法にすると，約 20分程度の検査時間で循環動態の判定が可能となる 26，27）．JET
study で一般化して以来，比較的普及している SPECT 脳血流検
査での血行動態判定法では，安静時と血管拡張剤（ダイアモックス）負荷後の２回，脳血流を定量測定する必要があり，同日に両方の検査を続けて行う場合でも検査時間は１時間以上となる．施設によっては安静時および負荷時の計測を２日に分けて99

行うところもある．また，酸素代謝による OEF 上昇（= 貧困灌流）と，血管拡張によるダイアモックス負荷時の血管反応性低下が，必ずしも一致する病態とは言えないことも報告されている 28）．HbV 等人工赤血球を用いた血管内投与による安定した
酸素代謝計測法が確立すれば，SPECT より短時間でより精度の高い病態評価が可能となる．そうした意味でも，ヒトへの応用は臨床的有用性が高い．また，モデル動物における実験においても，脳梗塞・虚血性病変に対する薬剤の効果判定等に役立
つ有意義な計測法と言える．

図３. 脳主幹動脈の閉塞性病変に伴う脳灌流圧の低下と，それに伴う循
環・酸素代謝の変化を示した模式図．Stage I の状態では，血管が拡
張して脳血流量が維持される（autoregulation）．C15O で計測される血液量の上昇が血管の拡張を示す．血管拡張による代償が限界に達すると，血流量は次第に低下するが，次は酸素摂取率を上昇させて酸素消費量を維持する代償が働く．この状態を貧困灌流（misery
perfusion）と呼び，脳梗塞の発生率が有意に上昇する．

図４. 右中大脳動脈（MCA）閉塞症患者（57 才）の MRI（上段）および
15
O-PET 画像（下段）．MR angiography（MRA）で右 MCA の描出が不良であり，MCA 閉塞が示唆されるが，MRI の T1 強調画像
（T1WI），T2 強調画像（T2WI）では脳梗塞は認められない．15O-PET
検査上，右 MCA 領域での脳血流量（CBF）の著しい低下を認めるが，酸素代謝（CMRO2 ）は低下しておらず，酸素摂取率（OET）が高い
貧困灌流の状態であると診断できる．同部位では血液量（CBV）も増加し，血管拡張状態であることが分かる（図３参照）．R: 右，L: 左．

100

５．まとめ
15

O-gas 標識人工赤血球を用いた脳酸素代謝測定法に関し，
PET 検査の歴史を交えて概説した．無菌環境下で簡便に高比放射能での 15O2 標識が可能となれば，ヒト PET 検査に十分応用が可能であり，一般 PET 施設での普及が期待できる．人工酸
素運搬体の実用化とともに，治療薬としてのみでなく様々な臨
床応用の可能性が示唆される．

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101

総

説

MWC ２状態モデルはヘモグロビンのアロステリーといかに調和しうるか
How can the MWC two-state model be reconciled withhemoglobin allostery?
柴山 修哉
Naoya Shibayama

和文抄録
Monod-Wyman-Changeux（MWC）の２状態アロステリックモデルは，ヘモグロビンの構造と機能の関係を記述する最も単純で，かつ最も説得力のあるアロステリック理論である．しかし，いったん定量的な立場に立つと，２状態モデルの枠組みではヘモグロビンのアロステリーを統一的に理解できないこともまた知られている．最も大きな問題は，広範な結晶化条件で得られたデオキシヘモグロビンの結晶構造は全て同じ T 構造を呈するにもかかわらず，溶液の T 状態デオキシ
ヘモグロビンの O2 親和性は溶液条件に依存して大幅に変化することである．本稿の目的は，この問題を抱えた MWC ２状態モデルの修正の方向を探ることにある．ヘモグロビンのアロステリック平衡の実体を解明するためには，以下の二つの研究アプローチが重要である．一つは，ヘモグロビン単結晶の O2 平衡曲線の測定であり，もう一つは，多孔性シリカゲルのゲルマトリックス中で構造変化を凍結した状態のヘモグロビン分子の O2 平衡曲線の測定である．前者の研究から各結晶構造の O2 親和性が求まり，後者の研究から平衡で存在する個々の構造状態の O2 親和性が決定できる．これらの研究の結果を合わせると，ヘモグロビンのアロステリック平衡の描像が見えてくる．結果は，MWC モデルの一斉転移メカニズムを支持するが，異なる O2 親和性を示す３つ（最低３つ）のアロステリック状態の存在を示唆する．本稿では，３状態モデ
ルを示唆する実験的証拠と今後の課題について述べる．
Abstract
The Monod-Wyman-Changeux（MWC）two-state allosteric model continues to be the simplest and most conceptually appealing
theory that relates the structure and function of hemoglobin. However, it is also true that the quantitative understanding ofhemoglobin allostery based on the two-state model has not yet been successful. Perhaps the most serious problem is that the O2
affinity of T-state deoxyhemoglobin in solution varies widely with solution conditions even though all the crystal structures of
deoxyhemoglobin determined to date（over a wide range of crystallization conditions）adopt essentially the same T quaternary
structure. The purpose of this paper is to explore a possible way to modify the MWC two-state model. To understand the true
nature of the allosteric equilibrium of hemoglobin, the following two approaches are important. One is O2 equilibrium study on
single crystals of hemoglobin, and the other is O2 equilibrium study on sol-gel entrapped hemoglobin molecules within wet
porous silica gel matrices. The former approach enables direct comparison between each crystal structure and its function, andthe latter enables determination of the O2 affinities of equilibrium conformers. These studies place significant constraints on
possible mechanisms for hemoglobin allostery. The results support the MWC mechanism but suggest the existence of three（atleast three）distinct allosteric states with different O2 affinities. In this paper, experimental evidence supporting a three-statemechanism and future subjects to be solved will be presented.
Keywords
hemoglobin, MWC model, allostery, cooperativity, allosteric equilibrium

自治医科大学医学部 生理学講座 生物物理学部門 〒 329-0498

栃木県下野市薬師寺 3311-1 Department of Physiology, Division of Biophysics

Jichi Medical University, 3311-1 Yakushiji, Shimotsuke, Tochigi 329-0498, Japan.
論文受付 2010 年９月６日 論文受理 2010 年９月 12 日

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人工血液 Vol. 18 , No.3, 2010

はじめに
ヘモグロビンは多くの教科書に取り上げられている．一部には，基本的理解は既に達成されたかの誤解もある．タンパク質
分子の機能を調節している構造変化はヘモグロビンの事例を下敷きとして T 状態と R 状態の２状態平衡で説明されることが多い 1，2）．しかし，肝心のヘモグロビンでは Monod-WymanChangeux（MWC）の２状態モデル的理解が定量的に成功していないのが現状である．血液ガス運搬の主役は言わずと知れた
ヘモグロビンである．ヘモグロビンのアロステリーに対する考え方を今一度整理し直すことは，人工血液開発に携わる研究者
にとって必ずしも無駄ではないと思い，ヘモグロビンのアロス
テリーを記述する MWC ２状態モデルの今後の修正の方向について本稿で述べることにした．

ヘモグロビンのアロステリー
成人のヘモグロビンは，２本のα鎖と２本のβ鎖からなるα2β2型の４量体で，分子量約 64,500 の球状タンパク質である．α鎖は 141 個の，β鎖は 146 個のアミノ酸から成り，それぞれのポリペプチド鎖はヘムを１個ずつ巻き込んでいる．したがって，
ヘモグロビンは１分子あたり合計４個の O 2 と可逆的に結合できるが，その４段階の酸素結合の親和性は一様ではなく，初めの方に付く O2 が後から結合する O2 を著しく付きやすくする協同現象が見られる（Table 1）．これをヘム間相互作用と呼ぶ．
このヘム間相互作用のあるおかげで，ヘモグロビンの O 2 平衡
曲線はＳ字形となり O2 濃度の低い末梢組織でより多くの O2 を解離することが可能となる．ヘモグロビンではヘム間相互作用
以外に，pH を下げるとプロトンが結合し O2 親和性が低くなる
ボーア効果，CO2 が結合すると O2 親和性が低くなる CO2 効果，
2,3-diphosphoglyceric acid（2,3-DPG）が結合すると O2 親和性が低くなる 2,3-DPG 効果，Cl -が結合すると O 2 親和性が低くなる塩素イオン効果，などの非ヘムリガンド結合と O 2 結合との間の相互作用も分子内に張りめぐらされている（Fig. 1）．これFig. 1. Schematic representation of the reactions of hemoglobin withligands. Arrows indicate the directions of the reactions of nonheme ligands upon O2 dissociation. The numbers attached to theresidues are the sequence numbers. The α-amino groups and the
α-carboxyl groups are represented by -NH（or-NH3+）and -COO-,
2
respectively. Circled protons are those binding to the Bohrgroups33）. Salt bridges（dashed lines）, van der Waals contacts（solidlines）, and hydrogen bonds（dotted lines）are also shown. Notethat all the salt bridges are present in T-state deoxyhemoglobin
but absent in R-state oxyhemoglobin. The α1-β2（or α2-β1）
interface contains less bonds or contacts than the α1-β1（or α2β2）interface, and can undergo significant changes upon thequaternary structure change. Reproduced with modifications from34）
Imai（1978）.

Table 1. O2 equilibrium parameters of human hemoglobin under various solution conditions at 25 ℃ 10）.
Conditions

K1

K2

K3

K4

（mmHg- ）
1

P50

nmax

KT

KR

（mmHg- ）1（mmHg）

L0
［T0］
［R0］
/

pH 9.1, 2.6 mM Cl-

0.170

0.36

3.4

3.69

1.04

2.35

0.148

3.82

280

pH 9.1, 0.1M Cl-

0.0595

0.16

1.5

3.33

2.15

2.73

0.06043.34

2700

pH 7.4, 7 mM Cl-

0.0647

0.48

0.45

4.24

2.05

2.40

0.0929

3.82

3700

-

pH 7.4, 0.1M Cl

0.0218

0.062

0.30

3.45

5.32

3.02

0.0241

3.31

87000

pH 7.4, 0.1M phosphate buffer

0.0136

0.030

0.15

3.43

8.73

3.14

0.01473.26

570000pH 7.4, 0.1M Cl-, 2 mM 2,3-DPG

0.00814

0.033

0.030

3.82

14.0

3.08

0.00800

3.00

3000000

pH 7.4, 0.1M Cl-, 2 mM IHP

0.00502

0.013

0.0042

0.915

48.8

2.53

0.00601

0.909

2800000

pH 6.5, 0.1M Cl

0.0119

0.011

0.069

1.24

18.8

2.88

0.01171.60

620000pH 6.5, 0.1M Cl-, 2 mM IHP

0.00403

0.00440.00730.0339136

1.77

0.00402

0.0635

4000-

Experimental conditions are as follows: hemoglobin concentration, 0.6 mM on heme basis; in 0.05 M Tris buffer for pH 9.1,
and in Bis-Tris buffer for pH 7.4 and 6.5. K（i= 1, 2, 3, or 4）
is O2 association equilibrium constant for the i-th oxygenationistep（Adair constant）. P50 is partial pressure of O2 at half-saturation, and nmax is maximal slope of Hill plot. Best fit
10）parameters for the MWC two-state model（KT, KR, and L 0）are also shown. All data are taken from Imai（1982）.

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らの相互作用があるおかげで体内でのより効率的な O 2 運搬が実現され，適応可能な環境の範囲が大幅に広がる．
ヘモグロビンの各ヘム間の距離は 20 Å以上離れているので直接的な相互作用は考えにくい．したがって，ヘム間相互作用
はタンパク質部分の高次構造変化を介したものと考えられる．
ボーア効果などの非ヘムリガンドの関与する O 2 親和性調節も同様である．このように，低分子やイオンの結合がタンパク質
分子の構造変化を誘起し，分子上の離れた部位の活性を調節する現象のことをアロステリーと言う．また，アロステリーを示す一群の酵素，タンパク質のことを総称してアロステリックタ
ンパク質と呼ぶ．昔から，多くのアロステリックタンパク質には共通の分子メカニズムがあると考えられていた．それを最も手近なヘモグロビンの中に見いだそうとする研究が行われてきたのは当然の成り行きである．

MWC ２状態モデル
1965 年 Monod-Wyman-Changeux（MWC）によって酵素のアロステリーを説明する MWC ２状態モデルが提出された 1）．
これは，Ｘ線結晶解析で示されたヘモグロビン分子の対称性 3）を見事に取り入れた，最も単純で，かつ，最も洗練されたアロステリックモデルである．Monod らの最も革新的なアイデア
は，O2 親和性（酵素の場合は活性）の異なる２種類の４次構造の平衡（アロステリック平衡）の概念をモデルに導入した点にある（Fig. 2）．O2 親和性の低い状態を T（緊張が架かったいう
意味の Tense），高い状態を R（緊張が緩んだという意味の
Relaxed）と呼ぶ．そしてもう一つの大事な前提は，「T 状態でも R 状態でも１個目から４個目までの O 2 は同じ親和性で結合する」という各状態の非協同性の仮定である．そうすると，同じ分子内の４個のヘムの O 2 親和性は常に同じで，分子が T から R に転移するとき４個のヘムの O 2 親和性は一斉に変化することになる．「２状態モデル」が「一斉転移モデル」とも呼ばれる所以である．O 2 結合の協同性は，結合した O 2 の個数が増えるにつれアロステリック平衡が R の方に傾いてゆくことで簡単に説明できる．
２状態モデルが他のモデルに比べてすっきりしている点は，要求するパラメータの数が少ないことと各パラメータの物理的意味がはっきりしている点である．２状態モデルでは，デオキ
シヘモグロビンにおける T と R の相対的安定性を定める平衡定数（L 0）と，T と R のそれぞれの O 2 結合の平衡定数（K T, K R）の３つのパラメータのみで O 2 平衡曲線を記述することができる．通常，ヘモグロビンの４段階 O 2 平衡曲線の解析には独立な４つのパラメータ（各 O2 結合段階の平衡定数 K1 〜 K4）を必要とするが，これよりパラメータ数が１個少ないことは特筆に値する（Table 1）．また，非ヘムリガンドの関与するアロステ
リック効果も，２状態平衡を仮定するとエレガントに説明できる．つまり，プロトンなどの非ヘムリガンドは T と R に異なる親和性で結合することで T と R の相対的安定性（L 0）を変え，
O2 平衡機能を変化させたと解釈することができる．

104

２状態モデルがヘモグロビン研究者から支持される理由
先ず，結晶構造学的見地からの理由を簡単に述べる．ヘモグ
ロビンでは，O 2 の結合していないデオキシ型結晶構造と O 2 の４個結合したオキシ型結晶構造の間に大きな４次構造変化（サブユニットの再配置）があることが，1960 年代には既にＸ線結晶構造解析によって示されていた 4）．そして，40 年以上たった
今なお T と R の中間的な O 2 親和性を持つ３つ目の結晶構造は見つかっていない．このような状況下で，O2 結合に依存して相対的安定性が変化する２つの４次構造を仮定するのは合理的であると多くの研究者は考えている．
ヘモグロビン研究者の間で２状態モデル的な考え方が広く浸透していったもう一つの理由として，O2 平衡機能を大きく変えるアミノ酸変異を持つ異常ヘモグロビンや化学修飾ヘモグロビ
ンの中に，O 2 親和性の低いデオキシ型４次構造のまま O 2 が４個結合したもの（例えば異常ヘモグロビン Kansas［β102Asn→ Thr］5））や，逆に O2 親和性の高いオキシ型４次構造でありな
がら O2 の結合していないもの（例えば異常ヘモグロビン Philly［β35Tyr → Phe］6））が存在することが挙げられる．これらの分子状態は，２状態モデルはその存在を肯定するが通常のヘモグ
ロビン中では存在比率が少なすぎて観測できないオキシ T 構造
（T4）やデオキシ R 構造（R0）に対応する（Fig. 2 参照）．アミノ酸置換や化学修飾が L 0 を変え２状態平衡を T あるいは R に著しく傾けたことで，これらの分子状態が安定化したと考えられる．

Fig. 2. An equilibrium diagram of hemoglobin oxygenation as predictedby the MWC two-state model 1）. The MWC model assumes anequilibrium between the two affinity conformations of the entire
molecule, T and R; T denotes the tense or low-affinity quaternary
structure and R denotes the relaxed or high-affinity quaternary
structure（the subscripts indicate the numbers of bound O2
molecules）. KT is the association equilibrium constant for a subunitin the T conformation, K R is that for a subunit in the R
conformation, and L i is the equilibrium constant for theconformational equilibrium between Ti and Ri , where L i =［Ti ］［/ Ri ］i= L 0（KT/KR）. The basic assumption of the two-state model is thatKT and KR are dependent on the quaternary structure of theprotein, and not on the number of O2 molecules already bound.
Thus, the cooperativity arises simply from the ligation-induced
shift of the conformational equilibrium toward the R-state.

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では，各状態の非協同性の仮定（一斉転移の仮定）はどうであろうか．1991 年 Mozzarelli らは，顕微分光光度計を用いてヘモグロビン結晶の O2 平衡曲線測定に初めて成功した 7）．これは，
ヘモグロビンの結晶構造とその機能を直接関連づける先駆的な研究である．この研究から，ポリエチレングリコール（PEG）
で作製したデオキシヘモグロビン（T）結晶の O2 結合の親和性は非常に低く，協同性はほとんど無いことが示されている 7）．
測定中に結晶は壊れていないので，結晶格子力で４次構造変化が封印され T 構造のまま４個の O 2 を同じ親和性で結合したと考えられる．この結果は，各状態の非協同性の仮定を支持している．現時点ではまだオキシヘモグロビン（R）結晶に関する報告はないが，筆者が予備的に行った R 型結晶の O 2 平衡曲線
測定では，O2 結合に協同性はほとんどみられず，親和性は非常に高いことが示されている（柴山未発表データ）．
２状態モデルとよく対比されるのが，Koshland-NemethyFilmer（KNF）の KNF 逐次モデルである 8）．多くの教科書では，
KNF 逐次モデルは MWC ２状態モデルと並ぶアロステリック理論の双璧として紹介されている．逐次モデルは，O2 が結合したサブユニットだけが３次構造変化を起こしそれが（サブユニット間相互作用の変化を通して）隣接するサブユニットの O 2
親和性を高めるという考えに基づいている．しかし，この考え方では非ヘムリガンドの関与するアロステリック効果をすっきりとした形で説明することは難しい．また，上で述べたオキシ
T 構造やデオキシ R 構造が存在する理由もうまく説明できな
い．最近筆者は，リガンドがαまたはβサブユニットに２個結合した中間状態ヘモグロビンを使って，２状態モデルと逐次モ
デルの最も決定的な違いであるアロステリック平衡の有無を直接判定する実験を行った 9）．結果は，O2 親和性の大幅に異なる
少なくとも２つの状態の構造平衡の存在を示し，ヘモグロビンのアロステリーの説明には KNF 逐次モデルよりも MWC ２状態モデルの方が妥当であることが明らかになっている．

２状態モデルの問題点
先に述べたように，２状態モデルはヘモグロビンの４段階 O2結合の協同性をすっきりとした形で定性的に説明することができる．しかし，いったん定量的な立場に立つと，このモデルはヘモグロビンのアロステリー全般（ヘム間相互作用，ボーア効
果，2,3-DPG 効果，塩素イオン効果）を統一的に記述することはできない．最も大きな問題は，溶液条件に依存して T 状態デ
オキシヘモグロビンの O 2 親和性（K T）が大幅に変化する事実である（Table 1）10）．これは，「非ヘムリガンドは T と R の O2
親和性（K T, K R）には影響を与えずに T と R の相対的安定性（L 0）のみを変えて O2 平衡機能を変化させる」という２状態モデルの前提に抵触する．実際，K T の値は溶液条件に依存して40 倍以上も変化することが知られているが，これは自由エネル
ギーに直すとヘモグロビンの示す全 O 2 親和性変化の自由エネ
ルギーの約半分に相当する．一方，R 状態の O2 親和性（KR）は，
inositol hexakisphosphate（IHP）非存在下の溶液条件では pH
や Cl-濃度によらずほぼ一定である（Table 1）．

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T 状態デオキシヘモグロビンが示す O2 親和性の幅を説明する
モデルは大きく分けて二通りある．一つは，２状態モデルの大前提である状態数２は堅持したまま，T 状態中での各サブユニ
ットの O 2 結合による３次構造変化が許されるように修正した「修正版２状態モデル」である．もう一つは，T と R に加えて更にもう１つの中間的な O 2 親和性を持つ３つ目の状態を仮定
した「３状態モデル」である．

修正版２状態モデル： SK モデル
ここでは，修正版２状態モデルの原型となる Szabo とKarplus の SK モデル 11）を例に挙げてその問題点を指摘してみる．SK モデルにおける O2 結合の協同性は，結合した O2 の個数が増えるにつれ２状態平衡が T から R の方に傾いてゆくことで説明される．この点は２状態モデルと全く同じである．しかし，SK モデルには，２状態モデルの定義する３つのパラメータ（KT , KR , L 0）以外に，T 状態中各サブユニットのボーア基のプロトン化やそのサブユニットの関与する塩橋の切断に伴う自由エネルギー変化を表すパラメータが各サブユニット単位で組み込まれている．つまり，このモデルでは T から R への転移が起こらなくても，T 状態中各サブユニットの O2 結合に伴う塩橋の切断（３次構造変化）が各サブユニット単位で許されている．
プロトン化のパラメータも組み込まれているので KT の pH 依存性が現れる．
この修正は一見良さそうに思われるが以下の問題がある．
SK モデルを含む全ての修正版２状態モデルでは，「T 状態中でO 2 が結合して塩橋が切れたサブユニットは，隣のまだ O 2 が結合していない（塩橋が架かった）サブユニットの O 2 親和性に影響を与えない」という仮定が入っている．この仮定が崩れると，２状態モデルの前提である各状態の非協同性が成り立たな
くなる．しかしながら，人為的にαサブユニット C 末端の Arg（α141）を切除した T 状態ヘモグロビンに関するデータを見てみると，Arg（α141）の関与する塩橋切断の影響は T 状態αサブユニットのみならず隣のβサブユニットにも同程度波及しているので，T 状態中の各サブユニットの３次構造変化が独立なイメージは成り立っていない 12，13）．また，ヘモグロビンの CO
結合は O 2 結合と同程度の協同性を示すが，各結合段階ごとのCO 親和性の上昇は２段階目で 16.5 倍，３段階目で 4.6 倍，４段
階目で 7.7 倍と段階的に上昇するので，状態数２の一斉転移モ
デルでは記述できないことが指摘されている 14）．

３状態モデル
上述のように T 状態の O 2 親和性の変化は T 状態の摂動では説明しきれない．そこで，ヘモグロビンのアロステリー全般の最小限の記述法として２状態モデルに状態を１つ追加するのが３状態モデルの考え方である 15）．各々の状態の中で協同性が無いことと，アロステリック平衡と転移の概念は Monod らの考えをそのまま引き継いでいる．また，Monod らのオリジナルの論文 1）でも，状態数は 最低２ というゆるい表現になっているので MWC ３状態モデルとも呼ぶことができる．

105

ヘモグロビンの O2 親和性には上限と下限がある．上限値は，ヘモグロビンの４個目の O2 結合の平衡定数である K 4 で与えられる．これは，K4 が IHP 非存在下の溶液条件でほぼ一定の高い値を示し（K4 = 3-4 mmHg-1 at 25 ℃，Table 1），それが単離したαまたはβサブユニットの O2 親和性と大体一致することから妥当と考えられる 10）．一方下限の値は，天然のヘモグロビン，
O2 親和性の低い異常ヘモグロビン，及び，金属置換混成ヘモグ
ロビンの O 2 平衡曲線のデータを統合すると見えてくる．O2 親和性が低下する溶液条件下では，これらのヘモグロビンの K 1（１個目の O2 結合の平衡定数）は共通の下限値に収斂する（K1= 0.004 mmHg-1 at 25 ℃）16）．また，これと同時に O2 結合の協同性は無くなり非ヘムリガンドの効果も消失してくる 16）．O2 親和性の上限と下限があるということは，それぞれに対応する構造状態が存在すると考えるのが自然である．この考えを裏付けるように，デオキシヘモグロビン結晶の O2 親和性は pH や Cl-の7，17）濃度によらず一定で（K = 0.0037 mmHg-1 at 25 ℃），溶液ヘ
モグロビンの O 2 親和性の下限とよく一致する．同様に，オキ
シヘモグロビン結晶の O2 親和性も溶液ヘモグロビンの O2 親和性の上限と大体一致するようである（柴山未発表データ）．そこで，３状態モデルではヘモグロビンの O 2 親和性の下限の状態を T（構造は従来の T 型結晶構造），上限の状態を R（構造は従来の R 型結晶構造）とする．そして，中間的な O 2 親和性の状態をここでは仮に P（柔らかいという意味の Plastic，構造はまだわかっていない）と呼ぶことにする（Minton と Imai のオリジナルの論文 15）では，O2 親和性の低い方から S, T, R の順番で命名しているが，本稿では結晶構造の名称との混乱を防ぐ
ため T, P, R とした）
．Monod らの考え 1）に従い，ヘモグロビン
は T, P, R の３つの状態の間の平衡にあり，各状態は非ヘムリ
ガンドに対して異なる親和性で結合するとする．デオキシヘモ
グロビンは実質的に T と P の混ざりであるが，T の方がプロトンや Cl-の結合親和性が高いため，pH を下げたり Cl-の濃度を上げた溶液条件では T が支配的になり O 2 親和性は低下する．これが，従来の２状態モデル解析で求まる K T の溶液依存性の説明である．また，先に述べた４段階 CO 結合の親和性が段階的に上昇する現象 14）も，T → P → R の２段階の状態転移を考えればうまく説明できる．

３つ目のアロステリック状態： P 状態
筆者が３状態モデル的な考え方にこだわる最大の理由は，自身が行った実験の結果から，T と R の中間的な O2 親和性を持つ
アロステリック状態（P 状態）の存在を確信したからである．
筆者は，水に溶けたデオキシヘモグロビン分子を多孔性シリカ
ゲルの中に閉じこめ，その構造変化を凍結したまま O 2 平衡曲線を測定する実験を行った（Fig. 3）18，19）．ゲル中の溶媒条件は，デオキシヘモグロビンの O 2 親和性が高くなる陰イオンの存在しない低塩条件とした．ここで大事なことは，ゲル中のヘモグ
ロビン分子は，天然の構造を保ちつつ，ゲル・マトリックスからの外力（主にシラノール基からの静電相互作用）を受け，高次構造変化の速度が溶液中と比べて約 100 億倍も遅くなるとい106うことである 20，21）．このようなゲルに閉じこめられた個々のヘ
モグロビン分子は事実上構造変化を凍結されたまま非協同的にO2 結合することが期待される 20）．実際，低塩条件のデオキシヘ
モグロビンの O 2 平衡曲線のヒルプロットは逆 S 字形となる（Fig. 3）．これは，試料中に O2 親和性の高い成分と低い成分が共存し，各々が独立に O 2 結合したことを意味する．各状態のO2 親和性及び含有量は，各状態に対応する直角双曲線の和でフィットする解析で求めることができる（Fig. 3）．結果は，O2 親和性が約 100 倍異なる２つの成分の存在を示し 18，19），O2 親和性の低い方が T で，高い方を P と考えれば，これはまさしく３状態モデルの予想通りである．
上の実験結果は，T と R の中間的な O2 親和性を持つ P 状態の存在を示唆しているが，その構造に関する情報は何も与えない．
P 状態の構造上の実体は，T 構造のマイナーな摂動と考えるべ

Fig. 3. Hill plot for O2 equilibrium curve of gel entrapped hemoglobin
locked in anion-free low-salt deoxy state19）. Sol-gel entrapment andsubsequent O2 equilibrium measurement were carried out using amodified protocol as described previously 35）. pO2 is partial pressureof O2 , and Y is fractional O2 saturation. Closed circles represent
the O2 association curve measured at 20 ℃ in the absence ofanions and in the presence of 0.1 M N-［2-hydroxyethyl］
piperazineN （2-ethanesulfonicacid）（HEPES）at pH 7.0. Open circles indicate
the succeeding O 2 dissociation curve measured after the O 2
association measurement. The solid lines joining the circles are
the results of analysis assuming the presence of two independent
components with different O2 association equilibrium constants.
The calculated O2 association equilibrium constants for the lowand high-affinity components of the association curve are 0.0074
mmHg - 1（ 85 ％ ）and 0.96 mmHg - 1（ 15 ％ ）, respectively（ thefractional populations are shown in the parentheses）. Two dashedstraight lines corresponding to the O 2 affinities of these twocomponents（T and P）are shown. For comparison, the lowest andhighest O2 affinities of solution hemoglobin at 20 ℃ are shown as
two thin solid straight lines（corresponding to K = 0.0057 mmHg-1
and K = 5.3 mmHg-1）. These two end affinities agree well with theO2 affinities of T- and R-state crystals of hemoglobin at 20 ℃（K =0.0051 mmHg-1 and K = 5.2 mmHg-1）.

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きなのか，あるいは全くの別物と考えるべきなのか，現時点でまだ結論は出ていない．しかし，この問題に対するヒントを与えてくれる研究がある．Colombo と Seixas は，pH 7.2 のデオキ
シヘモグロビンに Cl-あるいは 2,3-DPG などの陰イオンが充分な量結合すると，O2 親和性の低下とともに 40-50 個の水和水が放出されることを示した 22）．これは，デオキシヘモグロビンが陰イオンの結合に依存して O2 親和性の異なる２つの構造をとり，両構造の水和の程度が異なることを意味する．水和水の数が少なく O2 親和性の低い方が T で，水和水の数が多く O2 親和性の高い状態が P に対応する．また，陰イオン結合型デオキシヘモ
グロビン（T）が O2 を結合してオキシヘモグロビン（R）に転移するとき約 72 個の水和水が放出されることが知られている
ので，P の水和の程度は T と R の中間くらいに位置する 22）．したがって，T から P への転移は，T 状態中の局所的構造変化というよりも，分子全体のグローバルな高次構造変化と考えた方が良さそうである．

る．前者は，非ヘムリガンドが R に強く結合して KR を KT 並に下げた場合に相当し，後者は，非ヘムリガンドが T に強く結合することでアロステリック平衡を著しく T の方に傾け，４段階
目の O 2 結合にも T が大きく関与した場合に相当する．実際，後者の可能性を示唆する実験結果も多い 27，28）．この問題をはっきりさせるためには，これらの強力な非ヘムリガンドの R と Tに対する結合平衡定数の比較や，非ヘムリガンドの結合した R型ヘモグロビン結晶 29，30）の O2 平衡曲線の測定が重要である．

まとめと今後の課題

１）R 構造の多様性
最近，従来の R とは異なる４次構造を持つ CO 結合型ヘモグ
ロビンの結晶構造がいくつか見つかっている．現在までに少な
くとも３種類の新しい４次構造（R2 23）, RR2 24）, R3 24））が報告されている．結晶の O 2 平衡曲線の測定結果を待たないと結論は出ないが，いずれの構造も O 2 親和性の高い R 状態の構造アン
サンブルを反映したものと考えられている．R 状態では，T 状態に比べてサブユニット間の塩橋や水素結合による構造的な制約が少ないので，４次構造に多様性が表れてもそれほど不思議
で は な い ． 実 際 ， N M R に よ る 15N - 1H 残 余 双 極 子 相 互 作 用（residual dipolar coupling）の測定では，溶液の CO 結合型ヘモグロビンの構造は R と R2 の平衡になっているという結果が得られている 25）．一方，広範な結晶化条件で得られたデオキシ
ヘモグロビンの全ての結晶構造は，従来の T 型結晶構造と基本的に同じである．

本稿で述べたように，３状態モデルは広範な溶液条件のヘモ
グロビンのアロステリーを統一的に説明するための一つの方向性を示している．しかし，このモデルはまだ主流にはなっていない．これは，２状態モデルの良さである単純性を犠牲にしてまで状態数を増やすことに抵抗感を持つ研究者が少なくないためであろう．今大事なことは，３つ目のアロステリック状態（P 状態）の必要性をアピールするだけではなく，その存在の動かぬ証拠を実験で示すことである．一番説得力があるのは，P 状態の結晶構造とその結晶の O2 平衡曲線を示すことである．
世界的に見て筆者を含め少なくとも数グループの研究者がそのような目的の研究に取り組んでいるが，現時点ではまだ誰も成功していない．
P 状態結晶化の最大の難しさは，P は常にアロステリック平
衡を通して T と R の間を行き来していることにある（Fig. 4）．
このため，仮に溶液中に P が存在しても，相対的に結晶化しやすい（溶解度の低い）T または R の結晶が優先的に析出してしまう問題がある（ヒトヘモグロビンでは T 型結晶の溶解度が特に低い）．また，結晶化沈殿剤はタンパク質分子から水和水を奪う働きがあるので，T に比べて水和水の多い P は相対的に不安定になる問題もある．実際，Colombo らのグループは，陰イ
オンの全く存在しない PEG のみの結晶化条件でデオキシヘモ
グロビンの結晶化を試みたが，結局従来の T 型結晶しか得られなかった 31）．我々はこの難題に立ち向かうべく，結晶性（溶解２）R 状態の O2 親和性
先に述べたように，ヘモグロビンの R 状態の O2 親和性（KR）
は K4 で精度良く近似でき，その値は溶液条件によらずほぼ一定というのが従来の考え方である（ただし，pH 6.5 では若干のボーア効果が見られる）．しかし，最近米谷らは，強力な非ヘムリガンドが存在する最も極端な溶液条件（例えば，IHP と
Bezafibrate が共存する溶液条件）の O2 平衡では，KR が KT とほ
ぼ同じ位まで低下することから，「ヘモグロビンの４次構造は
O2 親和性の決定因子ではない」と結論づけている 26）．
しかし，２状態モデル解析の K R と L 0 の間にはパラメータ間の補償が起こりうるので O 2 平衡曲線の解釈には注意が必要である．例えば，強力な非ヘムリガンドが存在するときの O 2 平
衡曲線は協同性が小さく，親和性の低いまま O 2 が４個結合する．このような O 2 平衡曲線は，K R=K T でも記述できるが，K Rを無理に下げなくても L 0 が充分大きければ精度良く記述でき

Fig. 4. Difficulty in crystallization of the P-state. In the case of humanhemoglobin, the T-state can be more readily and selectively
crystallized, because of its lower solubility than that of the R-stateor the P-state.

R 状態に関する留意点

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 18 , No.3, 2010107

度）を大きく変えるアミノ酸変異を分子表面に持つ異常ヘモグ
ロビン（例えばヘモグロビン C［β6Glu → Lys］など）を使った結晶化実験や，P 状態の安定化が期待できる CO を２個結合した中間状態ヘモグロビンのモデルとなる金属置換混成ヘモグロ
ビン 32）を用いた結晶化実験を現在進めている．

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109オピニオン

ヘモグロビンを含んだ血液代替物を利用した
単純性血管腫のレーザー治療の効果についての考察
A consideration about advantageous effect of the laser treatment ofport-wine stains with blood substitutes including hemoglobin
力久 直昭
Naoaki Rikihisa
和文抄録
単純性血管腫は生下時から存在する皮膚の赤色斑であり，真皮内に拡張した異常毛細血管が存在する疾患である．1970
年代から異常血管を選択的に破壊するレーザー治療が行われてきた．レーザー工学が発展し機器の高性能化が図られてきたが，現在でも赤色斑が完全に消退する症例は少ない．人工赤血球を投与しレーザー光の標的である血管内ヘモグロビンを増量することによって，単純性血管腫に対するレーザー治療成績が向上すると予想される．
Abstract
Hemangioma simplex, so called port-wine stains（PWS）, consist of dysfunctional dilated micro vessels in normal dermis. Laser
treatment was introduced to achieve the selective destruction of micro vessels in 1970. The targets of laser beam areerythrocytes in micro vessels. Light energy of laser is absorbed by erythrocytes and converted into thermal energy thatdamages the vessel walls. The development in laser engineering has contributed to technical advantages of therapeutic
instruments. And the complete removal of PWS has been challenging. It is extremely difficult to treat the lager or smaller
diameter micro vessels and deeply situated vessels in dermis by laser treatment. Administration of artificial red blood cell
before laser treatment is considered to have a possibility to improve the therapeutic outcome of PWS. Because the diameter ofartificial red blood cell is much smaller than that of erythrocyte, administration of artificial red blood cell raises the level ofhemoglobin in smaller micro vessels. The laser beam is converted to high thermal energy with abundant targets in micro
vessels. A treatment with combination of artificial red blood cells and laser might be new treatment option for refractory PWS,
especially in smaller diameter micro vessel cases.
Keywords
hemangioma simplex, port-wine stains, capillary malformation, artificial red blood cell, pulsed dye laser, treatment-resistant

単純性血管腫の病態
単純性血管腫は皮膚の毛細血管の拡張による，境界明瞭で平坦な赤色斑である．赤ワイン色を示すことから port-wine stainsとも呼ばれている（Fig. 1）．新生児の 0.3 ％にみられ，性差はない．生下時から存在し身体の成長に比例し拡大する．項部・前額部正中に出現する赤色斑はウンナ母斑（salmon patch）ともいい，２歳までに自然消退する傾向をもつ．しかしその他の部位にみられる赤色斑は生涯退縮することはなく，加齢ととも千葉大学医学部附属病院形成美容外科に色調が暗紫色になり病変部が隆起し凹凸に肥厚することもある（Fig. 2）．単純性血管腫の他に幼少時にみられる赤色を呈す
る血管性皮膚疾患には，出生後数週間で出現する乳児血管腫（イチゴ状血管腫）もある．この疾患は血管内皮の腫瘍性増殖病変であり単純性血管腫と病理学的に区別される．
胎生４〜 10 週の脈管形成期に血管芽細胞から未分化な網状の毛細血管叢が形成され，さらに成熟した動脈や静脈へと分化する．この時期の異常によって毛細血管叢が残存したものが単〒 260-0856 千葉県千葉市中央区亥鼻 1-8-1

Department of plastic and aesthetic surgery, Chiba

university hospital, 1-8-1 Inohana, Chuo-ku, Chiba city, Chiba 260-0856, Japan
論文受付 2010 年 10 月 14 日 論文受理 2010 年 12 月２日

110

人工血液 Vol. 18 , No.3, 2010

Fig. 1. Clinical appearance of port-wine stain on a 3 month old child. Portwine stains are present at birth. They are flat and sharply
demarcated and grow proportionately with the child. The color
ranges from pale pink to deep red.

Fig. 3. Histologic appearance of port-wine stains（HE × 40）. Biopsy of a
30 year old man with facial port-wine stain. Dilated capillaries
filled with erythrocytes in both upper and deep dermis. The
vessels walls are thin and lined by flat, mature appearing
endothelium.

単純性血管腫治療の変遷
凍結療法・放射線治療・切除術・植皮術などが行われてきたが，いずれもレーザー治療に比べて侵襲的で術後の瘢痕が目立
つことが多かった．拡張血管のみ消失させ傷跡なく，患部の色調を健常な皮膚に近づけることを目標としてレーザー治療が1970 年代に導入された．レーザー工学の発展とともに機器の高性能化が図られ，色素レーザーが単純性血管腫治療の現在のゴールドスタンダードとなっている．しかしこの色素レーザー療法で赤色斑が完全に消退する症例はまだ少ない．レーザー治療に反応しない難治性の単純性血管腫に対してレーザー照射方法の工夫・新たな治療方法などが考案されている 3）．
Fig. 2. Clinical appearance of port-wine stain on a 30 year old male face.
The color of port-wine stain gradually darkens to a red shadeduring young adulthood and to a deep purple during middle age.
In addition, with aging, the surface of the port-wine stain becomesraised and studded with nodular lesions.

純性血管腫だと考えられている 1）．また血管内皮細胞からのシ
グナルの異常によって，間葉系細胞の血管平滑筋あるいは外膜への分化誘導が障害され，異常な血管拡張が生じるとも考えられている 2）．肉眼的には境界明瞭で平坦な赤色斑であるが，病理組織学的には真皮層の毛細血管拡張がみられ，症例ごとに真皮内の異常毛細血管の分布（密度と深さ）・血管径・血管壁の厚さ・血管拡張の程度が異なる（Fig. 3）．

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 18 , No.3, 2010

レーザー治療の原理
レーザー光の条件を適切に設定すると，その熱エネルギーは標的とする組織に選択的に蓄積され，かつ周囲の組織には波及
しない 4）．単純性血管腫の治療では，レーザー光が血管内赤血球の oxyhemoglobin に吸収され，熱エネルギーに変換される．
この熱エネルギーが血管壁に伝わり血管内皮が破壊され，最終的に異常血管が壊死し吸収される．熱エネルギーは血管内に留まるため血管周囲の組織には熱影響の障害を及ぼすことはな
い．Oxyhemoglobin への光の吸収率と皮膚内のその他の標的となりうる水分・コラーゲン・メラニンへの吸収率の関係，また光線の皮膚への深達度といった条件から 585 〜 595nm の波長をもつ色素レーザーが単純性血管腫の治療に用いられている（Fig. 4）
．

111

A

Fig. 4. Absorption spectra of cutaneous chromophores. Somewavelengths in green and yellow spectra are strongly absorbed
by hemoglobin and therefore by blood vessels. The wavelength ofdye laser is determined according to the second peak ofhemoglobin's absorption spectrum curve. We can remove portwine stains without injuring of the surrounding tissue with dyelaser.（若松信吾他「レーザーによる母斑治療の基礎研究」日形会誌,
1983; 3: 439-445. から改変して引用）

B

レーザー治療の限界
単純性血管腫の治療の第一選択が色素レーザー治療となる根拠は，「異常血管のみに熱エネルギーを与えて，血管周囲の皮膚成分には熱障害を与えない」という治療原理である．しかし，正常皮膚の表面を損傷することなく治療を進めることを第一とするため，その治療の切れ味は鈍い．病変は肉眼的には境界明瞭で平坦な赤色斑を呈するが，組織学的に観察すると血管径も血管壁の厚さも異なる毛細血管が真皮層内にさまざまな密度と深さを持って存在している．このような異常血管の集団を均一なレーザー光で治療するため１回のレーザー照射で赤色斑が完
全に消退することはほとんどない（Fig. 5）．レーザー治療で一定の効果を得るためには数か月単位の治療期間で複数回治療を行うことが必要である 3）．
577nm のフラッシュランプ励起パルス色素レーザーによる血管壁障害の最深部はおおむね 1.5mm であり，有意に拡張血管を消失できるのは 0.6mm 程度であるとの報告がある 5，6）．また真皮上層の血管径が中程度（38 ± 18μｍ）の血管に有効であったとの報告もある 7，8）．このようにレーザー治療には物理学的な限界があるため，繰り返しレーザー照射をおこなってもわずかな色調の改善にとどまる病変も多い．ただそのわずかな色調改善が患者の希望を担う支えにもなるため，５年以上レーザー治療を続けている臨床例も少なくない．以下にレーザー治療に反応しにくい単純性血管腫の特徴を挙げる．①病変が真皮層深部に存在する病変では，レーザー光が標的となる oxyhemoglobin（赤血球）に届かないため，治療効果が小さい．②異常血管の血管径が非常に細い病変では，血管内の oxyhemoglobin（赤血球）が少なく熱エネルギーが十分発生しないので，治療効果が小さい．③異常血管内の血液の流速が速い病変では，熱エネル
ギーが血管壁に効率よく伝導しないため，治療効果が小さい 9）．

112

Fig. 5. Treatment of port-wine stain with the variable long-pulse pulsed
dye laser（LPPDL）. A, 4 months old child with port-wine stain on
right leg before treatment. B, 1 year old, 5 months after one time
LPPDL treatment.

血液代替物を利用したレーザー治療への期待
色素レーザーは毛細血管内の赤血球に吸収されるので，赤色が強い病変ほど効果が高い．このため，タッピング・加温・駆血などによって色調を回復させて照射を行うと効果的である 10）．
ヘモグロビン小胞体の直径は赤血球の 40 分の１と小さいので，単純性血管腫の患者に hemoglobin を利用した血液代替物を静脈投与した時，血管内では赤血球の間を埋めるように血液代替物が存在すると考えられる（Fig. 6）11）．毛細血管（径 20μm以下）内での血液代替物の流動特性についての基礎研究をふまえて，適切に血液代替物を投与することが可能になれば，毛細血管内の oxyhemoglobin 量を増やすことができるのではないだ
ろうか 12）．血管内の標的が増えればレーザー光は効率よく熱エネルギーに変換されるようになり，今まで色素レーザー治療が不得手としていた非常に細い異常血管に対しては特に優れた治療になると期待できる．
ヘマトポルフィリンなどの薬剤とレーザー光を組み合わせることで血管内に酸化還元反応を起こし，単純性血管腫の治療を行った photodynamic therapy の報告がある 13）．中国では 1000
人以上の患者がこの治療をすでに受けており，従来の色素レーザー治療と組み合わせることで良い結果を得ている．しかし少人工血液 Vol. 18 , No.3, 2010

Fig. 6. Illustration of erythrocytes and artificial red blood cells（ARBC）ina micro vessel. A, erythrocytes in a micro vessel. B, erythrocytes
and ARBC in a micro vessel. Because the diameter of ARBC ismuch smaller than that of erythrocyte, ARBC flow among
erythrocytes in a micro vessel. Administration of artificial red
blood cell raises the level of hemoglobin in smaller micro vessels.

量の薬剤投与と光線療法を組み合わせて血管壊死に至らせるこの治療方法は，その安全性の確保ため日光を含めた身体に浴びる光線量を術後数日間厳重に管理する必要がある．このような治療プロトコールは日本での小児例などでは使用しにくい．生
理学上血管内のみに豊富に存在する hemoglobin 代謝物を標的としたレーザー治療のほうが組織選択性・安全性・エネルギー
効率からも有利だと考えられる．
人工赤血球と色素レーザーを組み合わせた単純性血管腫の治
療では，血液代替物の熱変性による毒性も懸念されるが，一回のレーザー治療で破壊される血液代替物の量はわずかであるた
め副作用のリスクは少ないと予想される．レーザー治療と併用するための課題は，治療の前後に瀉血を用いて多血症による脳梗塞や心筋梗塞といった血栓症や頭痛や嘔吐などの合併症を最小限にすることや，血管内に投与した血液代替物を患部に集中させる工夫，血液代替物のレオロジーなどではないだろうか．

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reviewers. Submit your manuscripts to the Editor-in-Chief byeither of the following methods with a covering letter（of any
format）:
i）Submission by email of electronic files of the text and figures（indicate the software used）. Text and tables should be in DOC
or TXT formats, and figures should be in PPT, JPG, or TIFF
formats.
ii）Submission by post of four sets of hardcopies.
2）Manuscripts are reviewed by researchers in the field ofartificial blood selected by the Editor-in-Chief, and revisions may
be required depending on the opinion of the reviewers. Revisedmanuscripts should be submitted with a "Response to
Reviewers" to the covering letter that responds to each of thepoints made by the reviewers, indicating any revisions made to
the manuscript.
3）Once informed of the decision to accept for publication, theauthor should send by post files containing the text and figuresof the accepted paper saved in electronic media to the address
specified（indicate the software used）. Text and tables should bein DOC or TXT format, and figures should be in PPT, JPG, or
TIFF format.
4）Manuscripts should be typed on A4 or letter size paper. The
title page should include the title, names of authors, institutions
to which all the authors belong, and the address of thecorresponding author. Handwritten manuscript should be
written consisting of 20 lines to 1 page.

人工血液 Vol. 18 , No.3, 20105）Original articles, review articles, topical pieces, and opinion
pieces should include an abstract and about 6 keywords on thesecond or subsequent pages.
6）Research conducted with the aid of an official grant must be
acknowledged, and any conflict of interests（for example, if theauthor has an interest in a company distributing the drug
described in the manuscript: being an employee or consultant tothat company, receiving research funding, owning shares orpatents, and so on）must be described in a footnote on the firstpage or in acknowledgment section.
7）If a manuscript describes the results of research on humans
or animals, it should be indicated that such research was
performed in accordance with the guidelines of the instituteconcerned in the methods or other appropriate sections of themanuscript.
8）Abbreviations should be spelled out on their first appearance.
The names of drugs, medical drugs, laboratory equipment, andso on should be given. The type, distributor（manufacturer）andthe address should also be indicated.
Example: Rhodamine B（Sigma-Aldrich, St. Louis, USA）
Polygraph system（LEG-1000; Nihon Kohden Corporation,
Tokyo）.
9）The English fonts should be Times, Helvetica, Courier, orSymbol. Text should be typed in lower-case one byte characters.
However, sentences and proper nouns should begin with an
upper-case letter.
10）Figures should be expressed in Arabic numerals. Weights
and measurements should be expressed in units such as thefollowings: m, cm, mm, μm, L, mL, μL, mol, g, mg, μg, ng, pg,
fg, N/10.
11）Figures and tables should be numbered in order of citation,and it should be clearly indicated where they are to appear in
the main text. The title, legends and description in tables andfigures should be written in English. Figures will be printed bydirect offset printing. Tables will be inputted by the Editorials
as originals.
12）References should be cited numerically in order of appearance
in the text using superscript letters as follows: 2）, 3-5）, 1, 4-6）, etc.
References should be listed using the Vancouver style as follows:
Names of all authors. Title of paper. Title of journal. Year of
publication; volume number: inclusive page numbers.
Abbreviations of journal names should be in accordance with
Index Medicus. References to books should be given as follows:
Names of all authors. Title of paper. Name of editor（s）. Booktitle. Place of publication: Publisher, year; inclusive page
numbers.
References to electronic sources should be given as follows:

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 18 , No.3, 2010

Name of website.
Address on new line（month and year of last access）.
Examples:
１. Wong NS, Chang TM. Polyhemoglobin-fibrinogen: a novel
oxygen carrier with platelet-like properties in a hemodiluted
setting. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol 2007; 35:
481-489.
２. Natanson C, Kern SJ, Lurie P, Banks SM, Wolfe SM. Cell-freehemoglobin-based blood substitutes and risk of myocardial
infarction and death: a meta-analysis. J Am Med Assoc 2008;
299: 2304-2312.
３. Sakai H, Sou K, Takeoka S, Kobayashi K, Tsuchida E.
Hemoglobin vesicles as a Molecular Assembly. Characteristicsof Preparation Process and Performances or Artificial
Oxygen Carriers. In: Winslow RM, ed. Blood Substitutes.
London: Academic Press（Elsevier）, 2006; 514-522.
４. Oxygen Infusion Project, Waseda University, Japan.
http://www.waseda.jp/prj-artifblood/index-ja.html（ lastaccessed Sept 2008）13）In the case of citation or reproduction of previously
published figures or tables and other content, the permission of
the copyright holder（s）must first be obtained. Copyright in the
published papers shall belong to the Society.
14）Regarding secondary use and copyright in works publishedin the Journal, secondary use may be made of the Journal, in
whole or in part, via media such as CD-ROM or the Internet.
Reproduction rights, translation rights, film rights, dominion, andpublic transmission rights（including the right to make theworks transmittable）are transferred to the Society by theauthor's submission of the aforementioned Copyright Transfer
Agreement. This clause shall not restrict reuse by the author
himself/herself, but the Editor-in-Chief must be informed in theevent of reuse.
15）No publication fee is charged for publication in the Journal,
and the author（s）shall receive as a gift 30 offprints of theircontributions. Authors will be charged for copies in excess of
this number（approximately 100 yen per copy）. Authors wanting
prints of color photos or on art paper, etc. must pay the actual
cost of such prints.
16）Address for manuscripts to be sent:
Attn: Artificial Blood Editorial Office
The Society of Blood Substitutes, Japan
Division of General Thoracic Surgery, Department of Surgery,
Keio University, School of Medicine
35 Shinanomachi, Shinjuku-ku, Tokyo 160-8582, Japan
Tel: +81-3-5363-3493 Fax: +81-3-5363-3499
E-mail：amorjsbs@sc.itc.keio.ac.jp115

投稿規定（平成20年9月30日改訂）
本誌は，血液を構成するあらゆる成分について，その代替物を開発する研究に貢献する論文，関連する情報，学会会員のための会報，学会諸規定等を掲載するが，形式にはこだわらず創
意ある投稿を広く集める．本誌への投稿者は本学会会員であることが望ましいが，投稿を希望する者は誰でも投稿することが出来る．原稿掲載の採否は，査読結果に従って編集委員会が決定する．原著論文について，他誌に既発表あるいは投稿中の論文は掲載しない．
共著者がいる場合には，共著者全員の承諾を得てから投稿する．論文の版権は本学会に譲渡しなければならない．このため，
著者の代表者は，本誌に添付の著作権譲渡同意書（CopyrightTransfer Agreement）或は，本会のホームページサイト（http://www.blood-sub.jp/home/index.html）からダウンロードしたものに署名捺印の上，郵送，Fax，またはpdfファイル
としてE-mailにて編集委員会宛に提出する．
ワープロを用いて作製した原稿の投稿を原則とする．ただし，手書き原稿による投稿でも受け付ける．欧文による投稿を歓迎する．
１）原稿の種類は，「原著論文」，「総説」，「学会報告」，「トピックス」，「オピニオン」，「海外文献紹介」から選び，これを第１頁の右肩上に明記すること．これらに該当しない原稿も受け付ける．査読意見によっては種類が変更される場合がある．次のいずれかの方法により，送付状（任意のフォーマット）を添
えて編集委員長宛に投稿する．

者名，全著者所属，英文著者名，英文著者所属，続いて連絡の取れる著者（corresponding author）の住所，英文住所を記入する．手書き原稿の場合はＢ5版，1行20字，20行とする．
５）「原著論文」，「総説」，「トピックス」，「オピニオン」については，第2頁以降に和文抄録，Keywords（英文で6個程度）
を付け，最終頁または別紙に英文抄録を付けること．
６）投稿論文に記載の研究が公的助成を受けて実施された場合に は ， 謝 辞 に そ の 旨 を 記 載 す る こ と ． ま た ， Conflict ofInterests（例えば，論文に記載された薬品を販売する企業と著者との利害関係: 雇用，コンサルタント，研究助成，株式，特許など）があれば，これを第１頁の脚注，謝辞などに記載する
こと．
７）ヒトを対象とした研究結果，および動物実験の結果を掲載する場合には，各研究機関のガイドラインに従って実施したことを方法等に明記すること．
８）論文中の略語は初出の際に省略しないこと．薬品，医薬品，測定装置等は，外国語名の場合は言語のまま用い，日本語化しているものはカタカナとする．型式，販売（製造）元とその所在地も記入すること．
（例） Rhodamine B（Sigma-Aldrich, St. Louis, USA）
, ポリグラフシステム（LEG-1000; 日本光電工業, 東京）
９）句読点はコンマ（，）ピリオド（．）とする．

i）文章と図表の電子ファイルをE-メールで送付する（使用したソフトを明記すること）．文章・表のファイル形式は，doc, txtが好ましい．図は，ppt, jpg, tiffが好ましい．

10）文中の英語に使用するフォントは，Times, Helvetica,
Courier, Symbolを原則とし，英文半角小文字とする．ただし，文頭および固有名詞は大文字で書きはじめること．

ii）ハードコピー4部を郵送する．

11）数字はアラビア数字を使い，度量衡の単位はm, cm, mm, μm,
L, mL, μL, mol, g, mg, μg, ng, pg, fg, N／10などを用いる．

２）投稿論文の査読は，編集委員長が選んだ人工血液分野の研究者に依頼する．査読意見によっては，原稿の修正を求める場合がある．修正論文（Revised Manuscript）の投稿に際しては，送付状に「査読意見に対する回答」を添え，意見に対して一つ一つ回答をするとともに，修正箇所がある場合にはこれを明記する．
３）掲載決定通知の後，著者は採択論文の文章・図表のファイ
ルを電子媒体として，指定する宛先に送付すること（使用したソフトを明記すること）．文章・表のファイル形式は，doc, txtが好ましい．図は，ppt, jpg, tiffが好ましい．
４）原稿はA4版の大きさとし，第1頁には表題，英文表題，著11612）FigureとTable：引用順にそれぞれ番号を付けること．表
題，説明，図表中文字は，全て英文とすることが好ましい．本
文中に挿入箇所を明記すること．Figureは直接オフセット印刷とする．Tableは編集部にて入力し原図とする．
13）文献：本文に引用した順序に番号を付け，文中では2），3-5），1，4-6）などとする．文献の記載法はthe Vancouver styleに従う．全
著者名．論文題名．誌名 西暦発行年；巻数：頁〜頁．とし，誌名の省略は医学中央雑誌またはIndex Medicus に準拠する．
単行本の場合は全著者名．題名．編集者名．書名．発行地：発行書店，年号；頁〜頁．の順とする．電子文献の場合は，ホームページ名．改行してアドレス（引用した西暦年月）とする．

人工血液 Vol. 18 , No.3, 2010

（例）１. 高折益彦. 人工酸素運搬体:その将来への期待. 人工血液2007;15:90-98.
２. 橋本正晴. 単回投与毒性試験. 野村 護, 堀井郁夫, 吉田武美編. 非臨床試験マニュアル. 東京: エルアイシー, 2001;3748.
３. Wong NS, Chang TM. Polyhemoglobin-fibrinogen: anovel oxygen carrier with platelet-like properties in ahemodiluted setting. Artif Cells Blood Substit Immobil
Biotechnol 2007; 35: 481-489.
４. Natanson C, Kern SJ, Lurie P, Banks SM, Wolfe SM.
Cell-free hemoglobin-based blood substitutes and risk of
myocardial infarction and death: a meta-analysis. J Am
Med Assoc 2008; 299: 2304-2312.
４. Sakai H, Sou K, Takeoka S, Kobayashi K, Tsuchida E.
Hemoglobin vesicles as a Molecular Assembly.
Characteristics of Preparation Process andPerformances or Artificial Oxygen Carriers. In: Winslow
RM, ed. Blood Substitutes. London: Academic Press（Elsevier）, 2006; 514-522.
５. 早稲田大学酸素輸液プロジェクト．
http://www.waseda.jp/prj-artifblood/index-ja.html（2008年9月現在）
14）既発表の図表，その他を引用，転載する場合には，あらか
じめ版権所有者の許可を得ること．また，掲載論文の著作権は本学会に帰属する．
15）二次掲載について．本誌は，他の言語ですでに掲載された論文を和文で二次掲載することは二重投稿ではなく正当な掲載と認めるが，著者は以下の事項を遵守する．
ａ）すでに掲載された論文であること．
ｂ）著者は両方の雑誌の編集者より許可を得ていること．二ARTIFICIAL BLOOD Vol. 18 , No.3, 2010

次掲載する編集者に最初に掲載されたもののコピー，別刷，もしくは原稿のいずれかを添付すること．
ｃ）論旨を変えないこと．執筆者は同一（順不同）であること．
ｄ）二次掲載版のタイトル・ページに掲載される脚注には，その論文の全体もしくは一部分がすでに掲載されている旨を明記し，更に初出文献も示すこと．適切な脚注の例を以下に示す．「This article is based on a study firstreported in the［...雑誌タイトル（完全な典拠情報を添えたもの）...］（訳：この論文記事は，［...］に最初に報告された研究に基づくものである）」．
これらの要件を満たしている場合は，その旨を明記して，総説
または論文記事（二次掲載）として投稿する．
16）本誌掲載著作物の二次利用および著作権について．本誌の一部，もしくは全部をCD-ROM，インターネットなどのメディ
アに二次利用する場合がある．本誌に掲載する著作物の複製権・翻訳権・上映権・譲渡権・公衆送信権（送信可能化権を含む）は，著者が上述の著作権譲渡同意書を提出することにより，本学会に譲渡される．本項は，著作者自身の再利用を拘束する
ものでは無いが，再利用する場合は，編集委員長に通知をする
こと．
17）掲載料．掲載料は無料とし，論説，総説，原著，報告等については別刷り30部を贈呈する．それを越える分についての費用は著者の負担とする（およそ1部100円）．カラー写真掲載・
アート紙希望などの場合は，著者の実費負担とする.
18）原稿の送付先〒160-8582 東京都新宿区信濃町35
慶應義塾大学医学部呼吸器外科内日本血液代替物学会 会誌「人工血液」編集部 宛
電話：03−5363−3493，FAX：03−5363−3499
E-mail：amorjsbs@sc.itc.keio.ac.jp

117

人工血液
日本血液代替物学会会誌

Artificial Blood
The Official Journal of The Society of Blood Substitutes, Japan
日本血液代替物学会
会長 小林 紘一 殿
To: Dr. Koichi Kobayashi
President
The Society of Blood Substitutes, Japan

日本血液代替物学会 会誌「人工血液」に投稿した論文
表題
Manuscript Title:につきまして，倫理規定に準拠した内容であること，また，共著者の全員が内容を確認していることを誓約いたします．なお，掲載された論文の著作権は，貴学会に帰属することを認めます．
I attest that the content of the above manuscript, submitted for publication in Artificial Blood,
the journal of the Society of Blood Substitutes, Japan, conforms to ethical standards and has
been confirmed by all coauthors. We acknowledge that copyright will be held by the Society.
平成

年

月

日

Date:

代表著者（署名）
Corresponding Author（Signature）
連絡先
Contact Address:（本用紙はコピーしたものを使用されても結構です．）
This form may be photocopied for use.
日本血液代替物学会 会誌「人工血液」編集部〒160-8582 東京都新宿区信濃町35 慶應義塾大学医学部呼吸器外科内
TEL：03−5363−3493 FAX：03−5363−3499 E-mail：amorjsbs@sc.itc.keio.ac.jp
Artificial Blood Editorial Office
The Society of Blood Substitutes, Japan
Division of General Thoracic Surgery, Department of Surgery, Keio University, School of Medicine
35 Shinanomachi, Shinjuku-ku, Tokyo 160-8582, Japan
Tel: +81-3-5363-3493 Fax: +81-3-5363-3499 E-mail：amorjsbs@sc.itc.keio.ac.jp

118

人工血液 Vol. 18 , No.3, 2010

●編集後記●本号では先ず，野江病院の三宅先生ほかより，人工赤血球が混在することが血液の電解質測定にどのように影響するかを解析した結果についての報告がありました．三宅先生は10月の年
次大会の直前にお亡くなりになられました．ご冥福を心よりお祈り致します．印刷が大幅に遅れたことを大変申し訳なく思っております．福井大学の岡沢先生らは，人工赤血球に放射性15O2標識分子を結合させて投与し，脳酸素代謝測定に用いる方法の実験的実証，また力久先生からは，HBOCsを利用した単純性血管腫のレーザー治療について，オピニオンを頂きました．
斬新な利用法のアイディアのご提供を頂きありがとうございます．是非とも臨床応用に結びつけていただくことを期待します．

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 18 , No.3, 2010

また，自治医科大学の柴山先生からは，ヘモグロビンはR状態とT状態のみならずP状態の存在もありうるとのことで，ヘモグロビン分子はまだまだ未解明の点が多い不思議な蛋白質で，科学者の興味は尽きないと今更乍ら実感しました．会告に示しました通り，2011年７月に第13回国際血液代替物学会がボストンで開催されます．日本の血液代替物研究の成果を示す良い機会と思います．また続いて2011年10月には，札幌にて年次大会が開催されることが決定しております（大会長：米川元樹先生）．これについても逐次会告としてお知らせ致します．
（酒井 宏水）119

編集委員会●酒井 宏水（委員長），東 寛，大谷 渡，武岡 真司，堀之内 宏久，村田 満，渡辺 真純●日本血液代替物学会 会誌■発行

日本血液代替物学会■編集・制作「人工血液」編集委員会

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