上池・三代・出口：チョウザメ由来ムコ多糖類の抽出方法の検討

資料

チョウザメ由来ムコ多糖類の抽出方法の検討
上池
１．目

貴晃*・三代恭広*・出口
2.2

的

2.2.1

智博*

試料の酵素分解
凍結乾燥試料の酵素分解

過疎化する中山間地の産業振興は島根県の課題の一つでチョウザメ廃棄部位を液状化するため，次に示す方法であり，その中で邑南町ではユニークな取組が行われている．

酵素分解条件の検討を行った．まず試料を凍結乾燥し，ブ同町の株式会社セレビアはチョウザメを養殖し，高級食材レンダーにて破砕した．この乾燥破砕試料に対して重量比であるキャビアの生産を進め，2016年には自家種苗生産に10倍の水を添加し，次の３通りの条件で処理を行った．①

成功し，現在は完全養殖に至っている．そのセレビアはチョ処理温度と処理時間はそれぞれ40℃と30分に固定し，酵ウザメ養殖技術に興味を示す事業者へ養殖技術の移転を模

素添加量は0.1，0.3，0.5，0.7，1.0%とした．②処理温度は索しており，中山間地域の産業の一つとして今後の発展が40℃から60℃まで５℃間隔で変化させ，処理時間と添加量期待される．

はそれぞれ30分と0.3%とした．③処理温度は50℃，処理時

チョウザメ養殖では，雌雄の判別が可能となるふ化後３～４年までは，全数の飼育を行い，雌雄の判別後には雌魚間は240分までの間で所定の時間とし，酵素添加量を0.3%とした．

はさらに４から７年程度飼育した後に，キャビアの採取が分解酵素にはプロチンSD-NY10（天野エンザイム社製）行われる．キャビアが採取された魚体は，雄魚と判別されを用いた．処理後の酵素分解液をろ紙（５A）でろ過し，た魚体と同様に，フィレ加工品としてその一部が販売されろ紙上に残った分解残渣の乾燥重量を分解前試料の乾燥重ている．しかしながら，それらの大部分は廃棄されており，量から差し引いて分解率を算出した．

キャビア採取後の魚体と雄魚の活用が大きな課題となって2.2.2いる．

乾燥前試料の酵素分解

乾燥前試料の酵素分解については，試料に対して重量比

チョウザメはチョウザメ目チョウザメ科に分類され，古２倍の水を添加し，酵素添加量0.5％（w/v），50℃，24時代魚とされる分類群の１つである．硬骨魚類に属するが，間の処理を行った．

硬骨魚類の中でも軟骨の割合が大きいことが知られている

2.3１）

ムコ多糖類の抽出・精製．この軟骨部分にはプロテオグリカンを含む有用な糖タ

2.2.1項により調製した分解液は固形残渣を除去後，遠心ンパク質やコンドロイチン硫酸を主とするムコ多糖類が含分離機（クボタ商事製6200）を用いて8000rpm，20分間遠まれている２-３）．プロテオグリカンやコンドロイチン硫酸心分離し，沈殿物および油脂を取り除いた．次に限外ろ過は，機能性成分として多くの健康食品や化粧品に配合され膜（旭化成社製UFペンシル型モジュールAHP-0013D）をており，プロテオグリカンの原料としてサケ鼻軟骨が，コ用いて透析液は超純水，通液速度100mL/分にて精製した．

ンドロイチン硫酸の原料としてブタやサメ軟骨が主に利用得られた精製液は凍結乾燥し，乾燥粉末とした．
また身や血合い等を除去した背骨破砕物の熱水抽出液されている．本稿ではチョウザメ廃棄部位の酵素分解により液状化および酵素分解液からのムコ多糖類の抽出精製を（80℃，６時間処理）についても同様に精製した．

おこなった．酵素分解法では分解率90％以上の処理条件を

2.4

ムコ多糖類の精製度の評価はムコ多糖類の定量およびタ見出した．また分解液から限外ろ過膜でムコ多糖類の抽出

ンパク質の定量により行った．

および粗精製をおこなったので報告する．

２．方
2.1

ムコ多糖類の標準品にはコンドロイチン硫酸Cナトリウ法ム（富士フィルム和光純薬社製）を用いた．ムコ多糖類

供試試料の定量には簡易型・酸性ムコ多糖定量キット（コスモバ株式会社セレビアより提供されたチョウザメ廃棄部位（頭部，背骨）を試料とした．

ムコ多糖類の精製度の評価

イオ社製）およびカルバゾール硫酸法４） を用い，定法に従い試験を行った後，定量値をコンドロイチン硫酸C相当量として算出した．タンパク質の定量にはTakara BCA

＊

環境技術科

Protein Assay Kitを用い，定法に従い試験を行った後，― 19 ―

島根県産業技術センター研究報告第59号 （2023）

定量値をBSA相当量として算出した．
2.5

ムコ多糖類の推定分子量の分析2.3項で精製したムコ多糖類抽出液およびプルラン標準品（SHODEX STANDARD p-82）について，ゲルろ過クロマトグラフィー分析を行った．分析条件を表１に示した．標準品のクロマトグラフより分子量校正曲線を作成し，ムコ多糖類の推定分子量を算出した．

表１

ゲルろ過クロマトグラフィー分析条件

HPLC装置PU-2089 Plus（日本分光社製）

検出器

RI-2031 Plus（日本分光社製）

カラム

SHODEX LB-806M

カラム温度40℃

溶離液0.1mol/l NaNO3

流速0.8ml/min

３．結果および考察
3.1.1

100

チョウザメ廃棄部位の酵素分解
凍結乾燥試料

酵素処理による分解率は，酵素の添加量，処理温度，処理時間に依存する．そこで凍結乾燥試料について2.2.1の処理①，②，③をそれぞれ行った．図１に処理①を行った場
合の酵素添加量と分解率の関係を示した．添加量0.3％において分解率は75.1%となり，それ以上酵素を添加した場

80
分解率（％）

3.1

604020合でも分解率の顕著な向上は見られなかった．
図２に2.2.1の処理②を行った場合の処理温度と分解率の00.1関係を示した．処理温度50℃で分解率は80.1％となり，それ以上の処理温度であっても分解率の顕著な向上は見られ0.30.50.71.0

酵素量（%）

なかった．処理温度60℃における分解率は86％であり，そ

図１

酵素添加量

4550

れ以下の温度による処理と比較すると分解率は高いが，高温下における長時間の処理は酵素の活性低下や失活を招く

100

可能性が考えられ，以降の実験では50℃を処理温度とした．

80

図３に2.2.1の処理③を行った場合の処理時間と分解率のり，以降は緩やかに分解率が上昇し，処理時間120分においてほぼ上限となる分解率97％となった．
以上の結果から，チョウザメ残渣の酵素分解処理は酵素

60

分解率（％）

関係を示した．処理時間20分において分解率は85.2%とな

40
20

添加量0.3％以上，処理温度50-55℃，処理時間30分以上で行えばよいことが分かった．
3.1.20乾燥前試料

403.1.1項で得られた処理条件をもとに，乾燥前試料の分解

5560

温度（℃）

処理をおこなった．なお，養殖現場では頭部や背骨を細か

図２

く破砕する手段がないため未破砕のまま処理する．未破砕

処理温度の生試料では分解効率が低下することから酵素添加量を0.5%とし，2.2.2項に記載した方法で処理を行った．その結100主体とする固形残渣は初期重量の３％程度であった．同様の方法で頭部の処理を行った場合は，硬骨が頭部には多く含まれていることにより，初期重量の10％程度の固形残渣があった．硬骨を主体とする固形残渣以外は液状化しており，この分解液をムコ多糖類の抽出用試料とした．
3.2

チョウザメ廃棄部位からのムコ多糖類の抽出・精製

3.1.2項の分解液を用いてムコ多糖類の抽出精製操作を行った．図４に各工程における分解液の外観を示した．分
解液の精製が進むにつれて液の透明度が増し，かつ着色が薄くなっている．図５に分解液，限外ろ過膜精製後の液，― 20 ―分解率（％）

果，分解率94％程度まで分解可能であり，処理後の硬骨を8060402000306090120

150時間（min）

図３

処理時間

180210240

上池・三代・出口：チョウザメ由来ムコ多糖類の抽出方法の検討
限外ろ過膜処理における廃液のそれぞれに含まれる酸性ムコ多糖とタンパク質の定量結果を示した．酸性ムコ多糖量の濃度は，分解液と限界ろ過膜精製後の液ではほぼ等しいが，タンパク質含有量は限界ろ過膜精製後では大きく減少し，廃液中に多く含まれていることが分かった．このことは，限外ろ過膜精製によって不純物であるタンパク質が除去され，ムコ多糖類の純度が上がったことを示唆している．
カルバゾール硫酸法によるムコ多糖定量でも同様の傾向が見られた（データは示していない）．
2.3項に記載した熱水抽出液についても同様に精製処理を行った．酵素分解液は茶褐色であり，限外ろ過膜精製を経て白色透明の液になったが，熱水抽出液は限外ろ過膜精図４

ムコ多糖類精製工程における分解液の外観（左：酵素分解液，中：遠心分離後，右：UF膜精製後）製を経ていないにも関わらず白色透明の液であったため，
800

出液は酵素分解処理液と比較してムコ多糖類，タンパク質700

ともに含有量が少なく，限外ろ過膜による精製後もタンパ

600

含有量（mg/100ml）

抽出液の時点で不純物が少ないことが予想された．熱水抽

ク質量の減少は見られなかったため，ここに含まれるタンパク質は糖タンパク質である可能性がある．チョウザメの頭部にはプロテオグリカンが含まれていることが分かっており，背骨から熱水抽出された糖タンパク質もプロテオグリカンが含まれていることが予想される５-６）．これら精製溶液を凍結乾燥し，推定分子量測定に用いた．
3.3

酸性ムコ多糖量
タンパク量

500
400
300
200
100

ムコ多糖類の推定分子量の分析

03.2項で得られた凍結乾燥試料を用いて試料に含まれるムコ多糖類の推定分子量分析を行った．図６に酵素処理液

2000

図５排液

各工程の酸性ムコ多糖量およびタンパク量

酵素処理液UF膜精製

1500
Intensity

UF膜精製後分解液

酵素処理液UF膜精製-酵素分解

1000
500
0-500

0246810121416182014161820時間（min）

図６

酵素処理液のGPC-クロマトグラム

2000
熱水抽出UF膜精製

Intensity1500

熱水抽出UF膜精製-酵素分解

1000
5000-500024681012時間（min）

図７

熱水抽出液のGPC-クロマトグラム― 21 ―

島根県産業技術センター研究報告第59号 （2023）

精製溶液のプロテアーゼ処理前後のゲルろ過クロマトグラ

水抽出されたムコ多糖類は糖タンパク質と推察された．今ムを，図７に熱水抽出・限外ろ過膜精製液のプロテアーゼ後，ムコ多糖類およびプロテオグリカンの有用な原料とし処理前後のクロマトグラムを示した．熱水抽出液から精製て，チョウザメ廃棄部位の利用が期待される．

したムコ多糖類のゲルろ過クロマトグラフィーをおこなっ謝たところ，プロテアーゼ処理前の推定分子量は36万，プロテアーゼ処理後の推定分子量は５万であった．コンドロイ
チン硫酸の平均分子量は２万～５万とされていることから本研究を行うのにあたり，チョウザメを提供して頂いた
株式会社セレビアに深謝いたします．

７），チョウザメ廃棄部位より抽出された多糖類はムコ多糖

文の一種であるコンドロイチン硫酸であると予想される．
3.4

まとめ

酵素分解法を用いることで，チョウザメ廃棄部位を破砕せずに分解率94％程度まで分解することができた．また分解液より簡易な手法でムコ多糖類の抽出が可能であることを示した．部位別では，背骨分解液からのムコ多糖類の抽出及び限外ろ過膜法による精製は容易であったが，頭部分解液は骨以外の組織も多く不純物が取り除けないため，精製工程を増やす必要があると考えられた．
酵素分解液から抽出したムコ多糖類の推定分子量は５万であり，コンドロイチン硫酸であると予想された．また熱辞献１）浅野 安信，中倉 敬．JSCE．2016, vol. 42, no. 159，p.87-89.
２）Shionoya，K.; Suzuki, T.; Takada, M.; Sato, K.; Onishi, S.;
Dohmae, N.; Nishino, K.; Wada, T.; Robert JL.; Toida, T.;
Higashi, K. Comprehensive analysis of chondroitin sulfate andaggrecan in the head cartilage of bony fishes: Identification ofproteoglycans in the head cartilage of sturgeon．International
Journal of Biological Macromolecules．2022, vol. 208, p.333-342.
３）Francesca, M.; Fabrizio, F.; Nicola, V.Structural characterizationof chondroitin sulfate from sturgeon bone．Carbohydrate
Research . 2010, vol. 345, p.1575-1580.
４）福井作蔵．還元糖の定量法Ⅲ．化学と生物．vol. 3, no.10，p.45-51.
５）後藤昌史，末川裕，花田友香子，山本和司，柿崎育子．応用糖質科学 . 2017, 7巻, 第1号, p.23-28.
６）三浦 絢子, 伊藤 聖子, 加藤 陽治．日本食品科学工学会誌. 2013,vol. 60, no. 5, p.237-241.
７）阿武 喜美子．高分子. 1968, 17巻, 4号, p.285-295.

― 22 ―