(社)日本食品衛生学会第 90 回学術講演会
2005 年 10 月 20 – 21 日、大宮ソニックシティ

LC-(SPE)-GC システムを用いた残留農薬分析への応用(財) 雑賀技術研究所 ○佐々野僚一 色摩信義 中西豊【目的】ポジティブリスト制度の導入に向けて、これまで演者らは GC 大量注入法による試料の少量化と固相抽出（逆相モード）による再濃縮を組合せた作物中残留農薬の多成分一斉分析法の検討を行い良好な結果を得てきた 1),2)。しかしながら、生姜や油などの加工食品においては数成分の農薬が夾雑物と重なったりして、定性及び定量が困難になることがあった。そこで、多成分一斉分析法で検出された少数農薬の迅速確認分析を目的として、LC-(SPE)-GC システムを開発した。このシステムは HPLC で分離した目的物質を分取し自動的に GC へ導入し分析するため、汚い試料などでもその LC で効率よくクリーンアップが行え、前処理の自動化および簡易化を図ることができる。本研究ではこの
LC-(SPE)-GC システムの基礎的な評価と実試料を用いた残留農薬分析への応用を試みたので報告する。
【実験方法】 １．試料：細ねぎ、他。
２．装置および条件 ：HPLC (MIDAS;Spark, Agilent 1100)
Injection: 100 µL, Sample loop
Column: Inertsil ODS-3 3.0 mm i.d. ×100 mm
Solvents: A: Acetonitrile/Water (50/50)
B: Acetonitrile
Flow rate 0.5 mL/min
Detector: UV 210 nm
Interface SPE（LGI-S100）
SPE:
2 mm i.d.×10 mm C18
Fraction Time: 11:40-12:60 (80 sec.)
Diluting: Water 0.5 mL/min
Purge:
N2 gas, 1 min
Elution Solvent: 20%Acetone/Hexane
Elution Volume: 40 µL
Interface Injector (LVI-S200; EMINET)
Insert:Spiral Insert
Solvent Vent: 10 sec, Purge flow 150 mL/min
Splitless: 3 min
Inj. Temp.: 70ºC(3min)-120ºC/min-260ºC(10min)【動作】目的の農薬が溶出される付近（予め標準溶液で目的物質のリテンションタイムを調べておく）を分取しながらその分取液に水を加えて希釈していく。そしてそのまま固相へ通水させ、農薬を固相へ濃縮させる。
窒素ガスで水を除去した後、固相に溶出溶媒を流し、溶出液を直接 GC へ導入し分析する。
【結果と考察】LC-(SPE)-GC システム：従来の LC-GC システムの問
題点は LC からの分取量が 0.3〜1ｍL で、全量を GCへ注入することが難しいことと LC からの分取液に GCが苦手とする水や極性の溶媒が大量に含まれていることであった。この問題解決のため、LC と GC のインターフェースに固相抽出法をとり入れることで、LC からの分取液をGCへ注入可能な少量の溶媒へ転溶することが可能となった。さらに安定した GC 大量注入法を用いたことで、連続したLC-GC分析が精度よく行えるようになった。
残留農薬分析： 試験液は HPLC カラムの劣化を防ぐために、試料の抽出液を予め C18 ミニカラムに通したものを用いた。クロルピリホスを添加した細ねぎ抽出液の LC クロマトグラムとクロルピリホス標準溶液の LC クロマトグラムをFig.２に示す。このクロルピリホスのリテンションタイム付近のみを分取して GC へ導入するため、分取部分以外の夾雑物は除去され効率の良いクリーンアップが自動的に行われることがわかった。また、最終的に GC/MS で得られた SCAN クロマトグラムは夾雑物の影響もほとんどなくきれいなクロマトグラムを得た。
mAU
35

GC/MS (QP-5050A; Shimadzu)
Column:Inert Cap 5MS 0.25 mm i.d.×30 m, 0.25 µm
Oven:
70ºC(3min)-20ºC/min-280ºC(4min)
Carr. gas: He, 1 mL/minMS:
SCAN;50-550 mz

A302520分取用バルブ

バルブ
固相カートリッジポンプ

HPLC カラム

検出器
UV10ポンプ（希釈水）

ガスシリンジポンプ（溶出液）

LVI-S200

Autosampler

HPLC

15GC/MS

Fig. 1 HPL C – (SPE) – GC/MS System

50B
02

468

101214 min

Time (min)Fig. 2 HPLC chromatogram of a green onion spiked with 0.1 µg/gof chlorpyriphos (A) and a standard solution of it (B).
Marked fraction transferred to the SPE cartridge.
参考文献 1),2)佐々野，佐藤，中西；食衛学第 87，88 回講演要旨集

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LC-（SPE）-GCシステムを用いた残留農薬分析への応用（財）雑賀技術研究所
佐々野僚一 色摩信義 中西豊
SAIKA T.I.F.

緒言
ポジティブリスト制度の導入に向けて、これまで演者らはGC大量注入法による試料の少量化と固相抽出（逆相モード）による再濃縮を組合せた作物中残留農薬の多成分一斉分析法の検討し報告した。今回、その多成分一斉分析法で検出された少数農薬の迅速確認分析を目的として、LC-(SPE)-GCシステムの開発を試みた。このシステムは逆相HPLCで分離精製した目的物質を分取し自動的にGCへ導入し分析するため、汚い試料でもそのLCで効率よくクリーンアップが行え、前処理の自動化および簡易化を図ることができる。本報ではこのLC-(SPE)-GCシステムの基礎的な評価と実試料を用いた残留農薬分析への応用を試みたので報告する。
SAIKA T.I.F.

1

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ポジティブリスト制に向けて
2. 多成分一斉分析

1. 抽出
分取

GC対象前処理LC対象前処理

試料抽出定容分取3. 確認分析
LC-GCシステム

LC法
LC法Ⅰ：中〜低極性対象
LC法
LC法Ⅱ：高極性対象検出された農薬（確認が必要な農薬）
SAIKA T.I.F.

LC-GC システム
RP-HPLC
(極性)

(無極性)

溶解度, 極性, Log Pow

LCによる高選択的なクリーンアップ!

GC(LowTemp.)(HighTemp)

温度, 沸点

GCによる高い分離機能!

逆相HPLCによる大きな試料許容量と幅広い範囲の分離機能により試料の選択性の高いクリーンアップを行い、そしてGCでさらに効率的に分離します。
SAIKA T.I.F.

2

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問題点• LCからの分取量は 0.3〜1 mL であり、全量をGCへ注入することが困難• LCからの分取液にGCが苦手とする水や極性の溶媒が大量に含まれている

SAIKA解決策• LCとGCのインターフェースに固相抽出法（SPE）を取り入れることでLCからの分取液をGCへ注入可能な少量の溶媒へ転容する• 安定したGC大量注入法の開発

SAIKA T.I.F.

LC-（SPE）-GCシステム
LGI-S100
分取用バルブバルブ
固相カートリッジ

ポンプ

HPLC カラム

検出器
UVポンプ
（希釈水）

ガスシリンジ
ポンプ（溶出液）

LVI-S200

Autosampler

HPLC

GC/MS
SAIKA T.I.F.

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Step-1 分取＆濃縮
固相カートリッジ

HPLC
カラム
ニードル
ポンプ
（希釈水）

廃液口

LCから分取しながら水を加えて、希釈させながら固相カートリッジに通し、目的物質を固相に吸着させます。
SAIKA T.I.F.

Step-2 乾燥
固相カートリッジ
HPLC
カラム

検出器
UV
廃液

窒素ガスボンベ

窒素ガスで配管および固相中に残存しているLCの溶離液および水を除去します。
SAIKA T.I.F.

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Step-3 溶出＆注入

検出器
UV
廃液シリンジポンプ（溶出液）

GC大量注入口（LVI--S200）
GC大量注入口（LVIS200）

固相に溶出液を流し、そのままGCへ導入します。
SAIKA T.I.F.

Step-4 洗浄
固相カートリッジ
HPLC
カラム

ニードル

検出器
UV
廃液廃液口

シリンジポンプ（溶出液）

溶出溶媒で配管および固相を洗浄します。
SAIKA T.I.F.

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大量注入法
固相カートリッジ

従来のインサート

胃袋型
インサート

GC注入口装置

StomachInsertSplit
Mode

Splitless

Split
Mode

1st Stage

2nd Stage

3rd Stage

4th Stage

注入

濃縮導入

除去

•

インサート内の試料を低い温度でカラムへ導入できるため、熱に弱い農薬などの物質でも分析可能•

一度に100 µL以上注入可能

SAIKA T.I.F.

LC-GC/MS条件
HPLC (MIDAS;Spark, Agilent 1100)
Injection: 100 µL, Sample loop
Column: 3.0 mm i.d. ×100 mm
Inertsil ODS-3Solvents: A: Acetonitrile/Water(50/50)
B: Acetonitrile
Flow rate 0.5 mL/min
Detector: UV 210 nm
Interface SPE（LGI-S100）
SPE:
2 mm i.d.×10 mm C18
Diluting: Water 0.5 mL/min
Purge:
N2 gas, 1 min
Elution: Hexane, 40 µL

Interface Injector (LVI-S200; EMINET)
Insert:Stomach Type Insert
Solvent Vent: 10 sec, Purge flow 150 mL/min
Splitless: 3 min
Inj. Temp.: 70ºC(3min)-120ºC/min-220ºC/min(3min)-50ºC/min-260ºC(10min)
GC/MS (QP-5050A; Shimadzu)
Column: 0.25 mm i.d.×30 m, 0.25 µm
Inert Cap 5MS/Sil
Oven:
70ºC(3min)-20ºC/min-280ºC(4min)
Carr. gas:He, 1 mL/minMS:
SCAN;50-550 mz

SAIKA T.I.F.

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加水量の検討Recovery ( % )1008060402000.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

Added Water (mL/min)Fig. 1 加える水の流量と回収率の関係
SAIKA T.I.F.

溶出量の検討Recovery ( % )10080604020001020304050

Elution Volume (µL)

Fig. 2 溶出量と回収率の関係
SAIKA T.I.F.

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前処理
試料 10gCH3CN 20 mL

ﾎﾓｼﾞﾅｲｽﾞ
ほうれん草

抽出

ピーマン

にんじん

細ねぎ

CH3CN 20 mL

定容（ろ過液に水を加え 50 mL に定容）
分取 2mL （試料 0.4 g 相当）
SPE C18 30mg （精製）90% CH3CN/water 1mL
試験液はHPLCカラムの劣化を防ぐために、試料の抽出液を予めC18ミニカラムに通したものを用いた。

流出液
Water 1mL
定容 (4mL)

SAIKA T.I.F.

LC-UV Chromatogram (Spinach)mAU
3530252015105002468101214 min

Time (min)Fig. HPLC chromatogram of a spinach spiked with 0.1 µg/g ofchlorpyriphos (a) and a standard solution of it (b).
Marked fraction transferred to the SPE cartridge.
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LC-GC/MS Chromatogram (Spinach)
900e3

Chlorpyrifos

800e3

Intensity

700e3
600e3
500e3
400e3
300e3
200e3
100e30e3

89101112131415161718Time (min)Fig. GC/MS-SCAN chromatogram of the LC-(SPE)-GC/MS
analysis of a spinach spiked with 0.1 µg/g of chlorpyriphos
SAIKA T.I.F.

LC-UV Chromatogram (Green Pepper)
mAU
3530252015105002468101214 min

Time (min)Fig. HPLC chromatogram of a green pepper spiked with 0.1µg/g of chlorpyriphos (a) and a standard solution of it (b).
Marked fraction transferred to the SPE cartridge.
SAIKA T.I.F.

9

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LC-GC/MS Chromatogram (Green Pepper)
900e3

Chlorpyrifos

800e3

Intensity

700e3
600e3
500e3
400e3
300e3
200e3
100e3
0e3

89101112131415161718Time (min)Fig. GC/MS-SCAN chromatogram of the LC-(SPE)-GC/MS
analysis of a green pepper spiked with 0.1 µg/g of chlorpyriｆos
SAIKA T.I.F.

LC-UV Chromatogram (Carrot)
mAU
3530252015105002468101214 min

Time (min)Fig. HPLC chromatogram of a carrot spiked with 0.1 µg/g ofchlorpyriphos (a) and a standard solution of it (b).
Marked fraction transferred to the SPE cartridge.
SAIKA T.I.F.

10

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LC-GC/MS Chromatogram (Carrot)
900e3

Chlorpyrifos

800e3

Intensity

700e3
600e3
500e3
400e3
300e3
200e3
100e3
0e3

89101112131415161718Time (min)Fig. GC/MS-SCAN chromatogram of the LC-(SPE)-GC/MS
analysis of a carrot spiked with 0.1 µg/g of chlorpyriphos
SAIKA T.I.F.

LC-UV Chromatogram (Green Onion)
mAU
3530252015105002468101214 min

Time (min)Fig. HPLC chromatogram of a green onion spiked with 0.1µg/g of chlorpyriphos (a) and a standard solution of it (b).
Marked fraction transferred to the SPE cartridge.
SAIKA T.I.F.

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日本食品衛生学会第90回学術講演会

LC-GC/MS Chromatogram (Green Onion)
900e3

Chlorpyrifos

800e3

Intensity

700e3
600e3
500e3
400e3
300e3
200e3
100e3
0e3

89101112131415161718Time (min)Fig. GC/MS-SCAN chromatogram of the LC-(SPE)-GC/MS analysisof a green onion spiked with 0.1 µg/g of chlorpyriphos
SAIKA T.I.F.

LC-GC/MSイオンクロマトグラム（Green Onion）
314.00 (1.00)

m/z = 314

Intensity

50e3

Fig. GC/MS-SCAN
ion chromatogram andspectrum of the LC(SPE)-GC/MS analysis
of a green onion spiked
with 0.1 µg/g ofchlorpyriphos

Chlorpyrifos

40e3
30e3
20e3
10e3
0e3

9101112

13

1415

16

1718Time (min)
197

70e3
60e3

Intensity

314
50e3
40e3
258
30e3
125
210

20e3

288

109

10e3
121
0e3

100

125

169
163

142
150

244
180

175

276

224
200

225

m/z

250

275

294300

349
325

350

SAIKA T.I.F.

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まとめ• LCとGCのインターフェースに固相抽出法を取り入れることで、LCからの分取液をGCへ注入可能な少量の溶媒へ転溶することが可能となった。
• 安定したGC大量注入法を用いたことで、連続したLC-GC分析が精度よく行えるようになった。
• 逆相HPLCを前処理として使用することで効率のよいクリーンアップが自動的に行われることがわかった。
• GC/MSで得られたSCANクロマトグラムは夾雑物の影響もほとんど受けておらず、確認分析法として十分に活用できることが分かった。
• また、本装置は前処理の簡易化および省略化が図れ、機器による制度管理や保証などにおいても有効であると思われる。

SAIKA T.I.F.

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