アプリケーションノート

Agilent OpenLab CDS

Agilent OpenLab CDS と質量分析計によるハイスループット純度測定の自動化
パート I: LC/MS を用いたサンプル純度の測定

著者

Hua Dong
Agilent Technologies, USA
Leo Wang
Agilent Technologies, USA
Doug McIntyre
Wiefling Consulting, USA概要

このアプリケーションノートでは、Agilent OpenLab CDS ソフトウェアを用いた化合物確認およびサンプル純度測定ワークフローの簡素化と自動化について説明します。このアプリケーションノートで用いたデータは、ハイスループットの Agilent InfinityLab 液体クロマトグラフィー /質量選択検出器 XT (LC/MSD XT) と、Agilent OpenLab CDS ソフトウェアで作成しました。このシミュレートしたサンプル純度実

験では、分解されやすいようにさまざまな医薬品を 4 か月間冷蔵保管した後、LC/MS で分析しました。

分解サンプルのサンプル純度を求めるために、得られたデータの処理、データレビュー、レポート作成を完全に自動化しました。色分けされたバッチサマリー表示とレポートにより、純度測定結果を視覚化でき、バッチ内の分解サンプルを素早く見つけることができます。

はじめに純度測定 は 多くのラボにとって重要 な作業です。有機化学の研究者は、同定した化合物の確認や合成プロセスにおける収率の推定に純度分析 を用 います。医薬品 の 研究者 は 通常、生物学的研究 に 進 む前 に 合成した 医薬品 の純度を測定します。製剤の研究者は製剤の最適化や保管に関する注意を規定する際に、純度測定 の 結果 を利用します。医薬品 QA/QC

意思決定を迅速にするために、研究者はセントラルラボやコントラクトラボの分析サポートサービスに依頼するより、自分自身で純度測定 を実施する方 を好 みます。しかし、主 に次の 3 つの点が、研究者自身がサンプルを分析する障壁となっています。1) LC/MS 機器への自由なアクセスが必要、2) LC/MS システムのワークフローによって、この 3 つの課題を解決

すべての 標 準 試 薬 の 各 原 液 の 濃 度 はデータを解釈せずに、純度結果を迅速に得る製しました。原液 は 4 か 月間冷蔵保管した度や幅広い化合物に対するレスポンスが良好ことができます。占有スペースが 大幅 に 削減

合物 を区別する選択性 があるためです。よって、LC/MS を用いて純度 を測定することで、測定結果の信頼性が大幅に向上します。

は、Sigma-Aldrich (セントルイス、ミズーリ州)

で化合物のサイズに関する LC/MS の幅広いします。OpenLab CDS により、研究者はMS化合物特有 の 物理化学的特性 に 基 づいて化塩、パクリタキセル、フォシノプリルナトリウムスペースが必要。ここで紹介するソリューショ

日常的に実施します。

で、そしてなにより、質量電荷比 (m/z) という標準試薬の塩酸ブスピロン、塩酸アミトリプチ

リン、塩酸ネファゾドン、クロピドグレル硫酸操作や MS データの解釈方法の習得にトレーニングが必要、3) 質量分析計の設置にラボのンは、OpenLab CDS に組み込まれた自動化

LC/MS が純度測定に用いられる理由 は、感標準試薬および化学物質から購入しました。これらの 化合物 の 分子量ラボでは、医薬品の中間体や最終製品が品質管理規定値内かを確認するために純度分析を実験方法されるため、小さなラボスペースに合 わせて質量選択検出器と LC モジュールを積み重 ねることが可能です。

この アプリケ ー ションノートで は、Agilent

OpenLab CDS ソ フ ト ウ ェ ア を Agilent

InfinityLab 液体 クロマトグラフィー /質量選択検出器 XT (LC/MSD XT) とともに使用し、いくつかの医薬品をシミュレートした保管分解実験で化合物の確認およびサンプル純度分析を自動化する方法 について示します。この 構成により、研究者 はサンプルの純度を迅速に決定することができます。

は 277 から 853 であり、これらを用いること適用性の実証ができます。

1000 µg/mL で、アセトニトリル (ACN) で調後、20 % ACN 溶液で 20 ng/µL の作業溶液を調製しました。次にこれらの作業溶液を分析して、4 か月保管後のサンプル純度を求めました。

LC/MS 機器および分析

Agilent シングル四重極 InfinityLab LC/MSD

XT システムを用いて LC/MS 分析を実施しました。このシステムには、Agilent Jet Stream(AJS) 技術 によるエレクトロスプレーイオン(ESI) ソース付のシングル四重極質量分析計、Agilent 1260 Infinity II バイナリポンプ、サンプラ、ダイオードアレイ検出器が含まれます。

4 分間の一般的なハイスループット LC 分離を2.1 x 50 mm Poroshell 120 EC-C18 カラム

において、移動相に水と 0.1 % ギ酸アセトニトリル 溶液 を用 いて実施しました。LC/MSD シ

ステムはポジティブ ESI モードで、1 秒あたり2 スキャン、100 ～ 900 m/z のフルスキャンスペクトルで測定しました。

ソフトウェアAgilent OpenLab CDS バージョン 2.2 を用

いて、データ取り込み、データ処理、およびレポート作成をしました。

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結果と考察化合物確認

LC/MS は化合物の確認に最適なツールです。

これは、通常の条件下で、少量のフラグメントイオンとともに、分子量 を示すイオンを生成するためです。LC/MS 分析 をポジティブイオンモードで実施したとき、分子量 M の化合物は通常、プロトンが付加した [M+H]+ イオンを生成します。例えば、分子量 853.9 のパクリタキセルは通常、m/z 854.3 (プロトン化したモノアイソトピック質量) のイオンを生成します。LC/MS 分析 に 用 いる移動相 によっては、[M+NH4] または [M+Na] が生成される場合++もあり、イオンの m/z はそれぞれ 871.3 または 876.3 になります。ネガティブイオンモード

では、水酸化物 の 引き抜きによりプロトンを失って [M-H] イオンを生成し、場合によって–は [M+Cl]– または、[M+CH3COO]– イオンを生成します。

サンプル純度の推定で示されます。このため、MSD とサンプル純は TIC のシングルピークの面積と TIC の他のはシグナルのディレイタイムを適用する必要がサンプル 純度 は EIC のピーク面積 の 合計またすべてのピーク面積 の 合計 を比較することにより推定します。例えば、EIC のピーク面積 が950,000 カウントで、TIC の他のピークの面積度の計算 に用いる検出器のクロマトグラムにあります。

シグナルのディレイタイムを 考慮して MSD

EIC での 化合物 のリテンションタイムを使用の合計が 50,000 カウントの場合、サンプルのし、他の検出器における化合物のピークを見イオン化効率 (ひいては MS レスポンスファクル純度の測定値となります。図 1 に保管中にの研究者は「汎用性の高いレスポンス」が得ら示します。UV シグナルレスポンスに基づくと、純度は 95 % と推定できます。

ター ) は、化合物間で大きく異 なるため、多くれる検出器 (UV や DAD などの分光検出器) を用いてサンプル純度を推定することを選びます。
一般的には UVD を用いますが、蒸発光散乱検つけます。ピークの面積パーセントは、サンプ分解したパクリタキセルの純度の算出方法をパクリタキセルは 97 % の純度を維持しています。

出器 (ELSD) を用 いる場合 もあります。検出器を直列に配置した場合、カラムから溶出される同じ化合物が、UVD や ELSD と MSD ク

ロマトグラムでは 異 なったリテンションタイム

分子量が既知の場合、抽出イオンクロマトグラ

ム (EIC) を用いて、予想される化合物が存在するかどうかを確認することができます。EICの大きなシングルピークが、トータルイオンクロマトグラム (TIC) の大きなピークと時間的に重なる場合、予想される化合物が確実に存在したと考えられます。

図 1. MSD 分析でのわずかなディレイタイムを調整したリテンションタイムでのパクリタキセルの [M+H]+ のEIC と UV クロマトグラム

3データ解析およびレポート作成の自動化

OpenLab CDS により、研究者 はデータシス

テムのトレーニングや MS データの解釈の経験 がほとんどなくても、推定純度で化合物同定 を確認するレポートを迅速 に作成することができます。サンプルまたはサンプルセットを提示する際に、研究者はこのソフトウェアで自動的にデータを解析し、レポートを作成するために使用するターゲット化合物の分子量 (モノアイソトピック質量) または分子式を指定します (図 2)。

図 2. シーケンステーブルの例。
「Target1」カラムには予想される化合物の化学式か分子量のいずれかを研究者自身が入力します。

解析メソッドウィンドウで OpenLab CDS のパラメータを指定し、 シグナルのディレイタイ

ム、積分パラメータ、可能性のある付加体、純度のカットオフ値、純度計算に使用するシグナ

ルの選択 などから、 サンプル純度 を計算します (図 3)。大半のサンプルの純度分析 には 1

つの 解析メソッドを使用しますが、OpenLabCDS ではサンプル純度を分析する別のメソッドを指定することもできます。研究者は変更した分子量または 化学式 を入力することによりデータを後で再解析することもできます。これは 最初のデータ入力時に誤りがあった場合に非常に有用です。

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図 3. 測定するサンプル純度の解析メソッドの設定。この設定では、サンプル純度はカットオフ値が 80 % で+H と +Na 付加を考慮し、TIC で計算します。

サンプル 分析およびデータ解析後 のサンプル

バッチの結果は要約表 (図 4) 、あるいは EIC、TIC、および UV シグナルでそれぞれのサンプルごとに確認できます (図 5)。色分けされているため、問題のあるサンプルを迅速に判断できます。図 4 に示したように、ブスピロン、アミトリプチリン、ネファゾドンおよびクロピドグ

レルは純度のカットオフ値 80 % に適合しまし
たが、パクリタキセルおよびフォシノプリルは適合しませんでした。図 5 に示したように、特定のサンプルを確認することにより、正確に計算した純度と TIC で積分したすべてのピークの質量スペクトルを得ることができます。質量スペクトルにより、不純物の性質について有用な情報が提供されます。

図 4. サンプル純度結果の要約表。色分けによりパクリタキセルおよびフォシノプリルナトリウムが指定した純度のカットオフ値 80 % に適合しないことを示しています。

図 5. アミトリプチリンの特定のサンプルデータレビューで、EIC、TIC、UV シグナルおよび TIC で積分したピークの質量スペクトルを示しています。

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標準搭載されたレポートテンプレートを用 い
れば、化合物が検出されたかどうかを示すサ

ンプル 純度 のレポートとサンプルの 推定純度が、サンプル分析後に自動的に作成されます(図 6)。レポートが 色分 けされていることで、化合物が検出されたか、また必要な純度かどうかを簡単に判断することができます。

図 6. 典型的なサンプルの純度レポート。この場合、TIC シグナルに基づいて純度のカットオフ値 80 % を指定しています。パクリタキセルが検出 (緑表示) されましたが、サンプルでのパクリタキセルの純度は 61 % であり、カットオフ値を下回っています (赤表示)。

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ワークフローの自動化

OpenLab CDS を用 いれ ばサンプル 純度測定のワークフローを自動化できます。図 2 に示したように、サンプル情報、ターゲット質量、結論OpenLab CDS はサンプル 純度測定 における簡単に自動化できるソリューションです。シ

解析メソッドをシーケンステーブルで簡単 にステムのトレーニングや MS データの解釈 のOpenLab CDS レポートモジュールを用いてサービスに依頼 せずに、サンプル純度の結果わせることが 可能です。図 7 に示すように、が向上します。

管理することができます。レポート設定では、カスタマイズすることで、さまざまな目的に合経験がほとんどない研究者でも、外部の分析を迅速に得ることができ、ラボのスループット標準搭載の計算機能と結果を色で分類する機能があり、サンプルの純度結果 (化合物の検出の可否および推定純度) を簡単に視覚化できます。サンプル純度のレポートはサンプル分析後に自動的に作成できます。

研究者は、例えば誤った化学式を入力した場合でも入力したサンプルの情報を簡単に変更できます。つまり、 サンプルを再注入する必要がなく、迅速に再解析することができます。

選択したレポートテンプレートを解析メソッド

大量のサンプルでも、サンプル純度結果の色サンプル 純度 ワークフロー 全体 を OpenLabことができます。

ルを簡単 に 見 つけることができます。サンプ

ボの生産性が大幅に向上します。に統合し、レポート作成と印刷を自動化する

分 けされた概要表により、純度の低いサンプ

ルごとの確認では、不純物の情報をさらに得CDS で自動化できるため、ハイスループットラるために、EIC、TIC や UV シグナル、正確に計算した 純度 および TIC で 積分したすべてのピークの質量スペクトルを研究者 が精査することができます。パワフルで 柔軟性 のある

OpenLab CDS のレポートテンプレートには、

図 7. ワークフロー自動化のレポート設定

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ホームページ

www.agilent.com/chem/jp

カストマコンタクトセンタ

0120-477-111

email_japan@agilent.com
本製品は一般的な実験用途での使用を想定しており、医薬品医療機器等法に基づく登録を行っておりません。

本文書に記載の情報、説明、製品仕様等は予告なしに変更されることがあります。

アジレント・テクノロジー株式会社© Agilent Technologies, Inc. 2018
Printed in Japan, May 17, 20185991-9085JAJP