Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)ISSN 1348-5474

Dec. 2010
第9巻 第2号

Journal of Japanese Society for Extremophiles

巻頭言 ……………………………………………………

54

研究最前線 ………………………………………………

55

特別寄稿 …………………………………………………

57

ORIGINAL PAPER ………………………………………

61

MINI REVIEW ……………………………………………

78

学会参加報告……………………………………………

129………………………………………………………

137

書評

学会記事

…………………………………………………

138

学会誌投稿規定・執筆要領 ………………………………

139

会則・細則 …………………………………………………

141

運営体制

143

…………………………………………………

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)超好熱菌の酵素を研究しながら巻頭言東京大学大学院

ナーゼも同様（ADP-PFK）であることを発見した。
これらの酵素のアミノ酸配列は互いに類似していたが、他のどのような酵素とも類似性を示さなかった。
これらの新規な ADP キナーゼは ATP ではなく ADP
しかリン酸供与体として使うことができない（これは従来既知の多数の「キナーゼ」の仲間には類例のない、予想も出来なかったことである）。その原子レベルでのしくみは、われわれのグループが X 線結晶構造解析によって運良く最初に解明したとおり、アデノシン結合部位の独自性によって説明できる。この菌の仲間の特異な解糖系については、大島敏久先生や今中・跡見両先生のグループの先駆的な研究があるが、ADP-GK について補足すると、この酵素はThermococcales 目の超好熱性古細菌（とメタン生産菌の一部）だけに分布する、と考えられていたが、近年のゲノム解析の進展に伴って、ヒトをはじめとする哺乳類にもオルソログが発見された。それらがどの程度発現しているのか、ヒトのエネルギー代謝の図式を考え直す必要があるのか、興味深い。
ADP-GK の場合のように、非常に特殊だと考えていた酵素が、進化系統的にはかけ離れた哺乳類にも存在して細胞内で働いている可能性がある、という研究の展開は、私のような基礎分野の研究者にとっては、嬉しい限りである。へーそー珍しいね、で片付けられていた特殊事例が、ヒトと関連づけられたとたんに普遍的な価値を帯びてくるような気がする。
医療・食糧・環境・資源の分野の問題解決に貢献す
ることは我々のような生命科学分野の研究者の願いではある。しかし、生命現象の奥深い謎と、その解き明かしは、そうした社会貢献からは独立したとこ
ろに隠されていることが多いようにも思う。オワン
クラゲの発光現象の謎にこだわって、その原因タン
パク質を突き止める過程で下村博士が発見した緑色
蛍光タンパク質は、その典型ではないだろうか？
ADP-GK の研究は、立体構造解析を終わったとこ
ろで私の手から離れて、外国の研究者にバトンタッチした。彼らがヒトにも ADP-GK があることに気づいた時には、少し惜しい気もしたが、そのかわり、私が主たる研究対象にしている好酸好熱性古細菌のグルコキナーゼを初めとする解糖・糖新生経路の酵素への取り組みを進めた。どの酵素も「くせ者」で、次々に謎を投げかけてくる。これが現在まで展開してきて、面白くてたまらない。研究成果は出来るだ
け早くとりまとめなければならないのだけれど、そうした思惑をよそに、超好熱菌は今も過酷な環境で原始地球以来のんびりとしっかりと生きのびているのだろうと思うと、また一段といとおしさが湧いてくるのである。

農学生命科学研究科

応用生命工学専攻 酵素学
若木 高善
2010 年の International Congress on Extremophiles(Ponta Delgada, Azoles, Portugal) に参加したとき、往復合計で 8 回も飛行機に乗った。どの飛行機でも離陸前に CA が救命胴衣の使い方を説明するが、美しい CA の表情豊かで舞うような仕草を見ていると、説明のアナウンスはさておいて見とれてしまうこともある。一挙手一投足の動作には意味があって、舞踏とは本来そのように発生したのだろう。
（と思っていたら帰国して間もなく、CA が音楽に合わせて救命胴衣を着脱する振り付けを披露する、一種のショータイムをする航空会社が現れたという TV 報道を見た。
）
すべての形や動きには意味があるとすると、それらの関連を探ろうとすることは科学の仕事に近づいてくるかもしれない。私の関心に引き寄せれば、タンパク質の形や働きにはどのような意味があるのだ
ろうかという問題である。
近年の構造生物学の進展に伴って、生化学の教科書にもタンパク質の立体構造が示されることが多くなり、酵素の反応機構も、われわれが Maxwell の悪魔になって、まるで見てきたかのように記述されるようになった。ハード・ソフト両面での進歩は目を見張るばかりである。
従来思いもつかなかった化学反応を触媒する新しい酵素を見つける面白さは、その酵素の存在意義（生理的役割）や応用の可能性とも相まって我々の関心をかきたてる。超好熱菌はそのような新規酵素の宝庫である。
十数年前のことであるが、オランダの研究者が超好熱性古細菌 Pyrococcus furiosus の解糖系を研究中に、注意深い観察（菌体粗抽出液を用いて ATP とグ
ルコースからグルコース−6−リン酸の生成を調べた
ときに起こる初期突発のような経時変化を見逃さなか っ た ） か ら 、 グ ル コ キ ナ ー ゼ は ADP 依 存 性（ADP-GK）であること、さらにホスホフルクトキ
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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)研究最前線
極限環境微生物研究と私

日本大学文理学部化学科
これまで私は主に 2 つの流れで研究を行ってきました。1 つは微生物の呼吸鎖電子伝達系に関する研究で、もう 1 つは抗生物質の生合成に関する研究です。
東京工大理学部化学科で山中健生先生（現東京工大名誉教授）、福森義宏先生（現金沢大院教授）の研究室に配属になり、細菌の呼吸系に関する研究の手ほどきを受けました。多くの生物は呼吸により生育に必要なエネルギーを得ます。多くの場合、有機化
合物を酸素で酸化する（つまり好気呼吸）ことによって大きなエネルギーを得ますが、細菌の場合、電子供与体も電子受容体も様々です。このように多くの呼吸基質を利用することによって細菌はさまざまな環境に適応して生育することができるようになります。また微生物はいつどんな環境にさらされるかも分からないため、様々な呼吸系を同時に持ち、環境の変化に対応できるように備えています。つまり微生物の呼吸系はその生育環境と大きな関連性を持
ち、呼吸系の性質はその生育環境を反映するものと言えます。ここで学んだ「環境と微生物」というのが、現在でも私の研究の基本的な流れになっています。
学位取得後、海洋科学技術センター（現独立行政

為我井

秀行

法人海洋研究開発機構）で、掘越弘毅先生（現東京工大名誉教授、海洋研究開発機構特任上席研究員）、
加藤千明先生（現海洋研究開発機構上席研究員）のもとで研究員としてお世話になり、研究を行わせていただきました。ここでは深海という、なかなか触れることのできない世界を教えていただきました。
このとき深海環境と呼吸系に関して関心を持つようになったのは、これまでの経緯から自然な流れでした。ここで現在の研究のメインテーマである、呼吸系の機能と深海環境適応機構に関しての研究をスタートさせていただくことができました。
その後東京工大で故柿沼勝己先生、江口正先生（現
東京工大院教授）のもとで助手としてお世話になり、大学教員としてのキャリアをスタートさせていただ
きました。ここではこれまであまり縁のなかった、
抗生物質生合成に関する研究を行っていました。私はそれまでは環境と微生物をテーマに研究をしてきましたが、抗生物質というキーワードを加え、新たな方向へ研究を展開することができました。
（柿沼先生は 2005 年、日本農芸化学会賞を受賞された直後に、病のため急逝されました。謹んでご冥福をお祈り申し上げます。
）
2003 年より日本大学文理学部化学科に異動し、初め
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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)て自分の研究室を持つことになりました。当初はまったく何の設備もなく、狭い部屋と机とクリーンベ
ンチと冷蔵庫のみからのスタートでした。大変ではありましたが、自分で自分の城を作り上げていくのだと思えばやりがいはありました。
なんとかサーマルサイクラーを手に入れ、まず始めたのが、環境中に存在する抗生物質生合成遺伝子の探索でした。抗生物質生産菌は土壌などの環境サンプルから単離されますが、どの程度存在するのか、またどの程度分布に偏りがあるのかなどに関心を持ったからです。当時ちょうど環境 DNA の単離と解析の技術開発が進み、微生物の多様性解析に関して多くの研究がなされている頃でした。この技術を利用して様々な環境から抗生物質生合成遺伝子の断片を取得しました。その結果、深海サンプルからも遺伝子が確認でき、地球上にはかなり幅広く、深海のようないわゆる極限環境にも抗生物質生産菌が存在することが明らかになりました。
このテーマの今後の展開については、極限環境生物とはあまり関係のない方向になってしまいますが、「環境と微生物」という私自身のキーワードには沿ったものです。いま気になっているのは、「これらの菌は環境中でも本当に抗生物質を作っているのだろうか」ということです。環境中では菌密度はそれほど高くならないでしょうから、他の菌を排除するほ
どの濃度の抗生物質が蓄積できるとは思えません。
だとすると他を排除して自分が生き残るために抗生物質を作るわけではないということになります。そうなると当然上記のような疑問、さらには「抗生物質ってなに？生産菌にとってこれを作ることはなんのメリットがあるの？」ということになります。な
かなか大きなテーマになってしまいますが、とりあえずは生産菌を実験室内の土壌に蒔き、これを疑似環境として生合成遺伝子の転写・翻訳を解析するなどの実験が考えられます。現在のところ、その方向で準備を進めているところです。
だんだんと研究室の設備も整い、遺伝子解析以外の実験もできるようになり、海洋機構時代からのテ56ーマである深海微生物の呼吸系に関する研究を再開しました。深海には高圧を好んで生育する好圧性細菌が存在します。これらの中には、培養圧力の違い
により呼吸系構成成分が変化するものがあります。
写真のような装置を使って高圧下での細菌の培養や酵素活性の測定を行い、好圧性細菌の 1 つである
Shewanella violacea では高圧培養時にはより耐圧性の強い呼吸鎖末端酸化酵素が発現することを明らかにしました。
高圧条件下での可溶性タンパク質の振る舞いに関してはすでに研究例があり、酵素の反応遷移状態における体積変化が正のものは活性の耐圧性が弱いことが知られています。では膜貫通型タンパク質ではどうなのでしょうか。細胞膜は生体内でも特に圧力の影響を強く受ける部分の一つと考えられます。通常の条件下では膜は液晶状態ですが、高圧下ではその流動性は大きく低下します。膜貫通型酵素の活性と圧力との関係は酵素自身の性質に依存するのか、
それとも膜の流動性と相関があるのか、よくわかっていません。また高圧下では、溶媒である水の状態が変わります。このことと活性と、どのような関わりがあるのかについても不明です。いまのところ私の頭の中で、いくつかのキーワードが雲の中に漂っているような状態ですが、この中から 1 本の糸を紡ぎ出し、すべてのキーワードをつなぎ合わせるべく研究を進めていくつもりです。
以上、私のこれまでの研究についてご紹介させていただきましたが、これらはすべてお名前を上げさせていただいた先生方のご指導によるものです。また共同研究者の先生方、東工大や海洋センター、日大で出会った学生諸君にも大変お世話になりました。
特に日大に移った直後、研究室の立ち上げ時に配属となった学生諸君には随分と力を貸していただきました。この場をお借りして、皆様に改めて感謝の意を表したいと思います。最後に本稿執筆の機会を与えてくださいました石井正治先生（東大院）に御礼申し上げます。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)特別寄稿「好鹽菌」、「嗜盐菌」から「好嗜塩菌」へ
好塩菌研究所亀倉

正博て、初期には facultative halophiles（通性好塩菌）と obligate
halophiles（偏性好塩菌）に大別されていた。1962 年になって Larsen４）が、生育に最適な塩濃度を基準に、微生物を nonhalophiles と halophiles に二分し、後者を slightly
halophilic（最適濃度 2-5 % salt）、moderately halophilic（5-20 % salt）、extremely halophilic（20-30 % salt）と分けた。この提唱を日本語に直したのは 1967 年、好井５）で、
halophiles の内 slightly, moderately, extremely を夫々、微、中等度、高度とした。この頃の日本では好塩菌の代表選
手は腸炎ビブリオ Vibrio parahaemolyticus で（文献 4 の其の４）、Halobacterium に代表される高度好塩菌を研究対象としている人は殆んどいなかった。
その後、更に様々な halophiles が分離され情報が蓄積されると、1978 年に Kushner６）が Larsen 提案を微修正し、
slight-halophile（最適濃度 0.2-0.5 M salt）、moderate-halophile（0.5-2.5 M salt）、
extreme halophile（2.5-5.2 M salt）とした。
これには、低度好塩菌、中度好塩菌、高度好塩菌という訳が与えられ７）、現在も広く使われており、筆者も文献 4の其の 1 に書いた。
英和辞典には以下のような訳語が並ぶ。
slightly：1 わずかに，少し 2 細く，きゃしゃに, もろ
く, 繊細にmoderately：適度に，ほどよく, 節度を守って, 控えめに, 穏やかに
extremely：1 極端に，極度に, きわめて, 非常に, 大いに 2 《口語》 とても，すこぶる (very)

Halophiles「好塩菌って何？」と専門外の人に訊かれた時、「halophile の訳語で、塩を好む微生物」と大雑把に説明すると、フーン、という返事が返ってくる。少し知っている人から「好塩菌って、細胞壁の無い赤い菌だろう」と物知り顔に言われたこともあった。
ランダムハウス ウェブスター英英辞典の”halophile”には、塩が濃い環境を必要とする微生物で、salt（食塩）を意味する halo-と、lover 愛する人を意味する-phile or -philから成る、との趣旨の説明がある。
「好塩菌」研究者仲間
では、“halophile” あるいは“halophil”という単語が学術用語として最初に使われたのは 1880 年であるということになっている。塩漬けにした鱈や、なめす前の塩漬け牛皮に真っ赤な斑点をつくる悪役として微生物学者の前に登場したのである。
好鹽細菌
日本には古くから味噌、醤油という高濃度の塩の存在下で微生物を利用する醗酵産業があったが、「塩を好む微生物」という概念は明治期の日本には無く、日本人学者が西欧から微生物学を学び吸収する中で日本にもたらしたものであった。“halophile”, “halophil”に接した彼等は、
salt は鹽（戦後は塩）でいいが、lover をどう訳すか、悩んだであろう。愛好、熱心、熱中から「愛鹽菌」も考えたか？
最初に halophile の日本語訳が現れたのはいつであろうか。遅くとも 1932 年の『細菌學概論』１）には「好鹽性細菌 (Halophile Bakterien)」の記述がある。これ以前の細菌学の教科書にも「好氣性」、「好熱菌」の記載があるので、「好鹽菌」
はごく自然な訳語であったのであろう。
1941
２）
年の文献 には柔魚鹽辛から「好鹽細菌」を分離し’Bacteroides halophilus’と命名したとある。増殖に食鹽
5 %以上を必要とするれっきとした halophile であった。
この 80 年間、多くの人が「好塩菌」、「好塩性」という言
葉を使って来て、すっかり定着している。筆者も自身の定年後の居場所を何の躊躇もなく、「好塩菌研究所」と名付け、本誌にも「塩と好塩菌」という記事３）を掲載して頂いた。

「好塩菌」だけでいいのか？
1971 年に好塩菌の仕事を始めた筆者は、H. Larsen とD. J. Kushner が好塩菌の physiology の分野の泰斗であることを学び、日本語訳も含めこの提案を、ハイ解りました、とありがたく受け入れてきた。
しかしこの分け方には問題がある。当然のことだが、生き物には夫々、生きて行くのに最適な条件があると同時にその下限と上限がある。好塩菌についてあまり馴染の無い方に、一つの例を出してみよう。Natronobacterium
gregoryi という好塩菌は17.5 % NaCl 添加培地で最もよく増殖する。
Bacillus 属の一種、Bacillus saliphilus の最適NaCl
濃度は 16 %である。両者とも Kushner の定義に従えば高度好塩菌である。しかし増殖可能な NaCl 濃度範囲を見ると、N. gregoryi は 12 %から 30 %までで、最低 12 %も様々な種類の「好塩菌」
さて、halophile にも様々な菌がいることが知られてい57

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)の塩を要求するのに対し、B. saliphilus は 1 %から 25 %までで、下限は 1 %である。塩の要求性から見ると 1 %と12 %は極めて大きな差である。
Kushner の分け方の最大の問題は、best growth を支える
塩の濃度にのみ注目し、増殖を支える最低の塩濃度には触れていない点である。短い用語（とその漢字訳語）に両方の意味を持たせること自体無理というものであるが、0.2 M に至適塩濃度がある菌も、5.2 M に至適塩濃度がある菌も、同じく halophile の訳語「好塩菌」で括ってニコ
ニコしていてよいのかなと、この数年、内心悩んできた。
嗜盐菌
さて、漢字の本家、中国ではどのようにしているのか。
実は halophile 全体に「嗜盐菌」という訳語を与えているのである。
中国では 1964 年の「簡化字總表」に基づき「鹽」は「盐」と書く。筆者の知る中国語での halophile についての最初期 1984 年の論文８）の別刷りを、著者の周培瑾氏から戴いた時、「极端嗜盐菌？extreme halophile をこう訳すのか！」と思ったが、恥かしながらそれ以降今日まで「嗜」という字について深刻に考えた事はなかった。
勿論、日本語で書かれた文章のなかに「嗜塩菌」を見ることもなかった。
今回筆者がこの論考をしたためようと思いたったのは、2010 年 6 月末に北京で開催された Halophile の会議(Halophiles 2010) に出席した時、筆者と同年輩の中国人研究者が、小泉純一郎から鳩山由紀夫まで最近の首相五人の名前を綺麗な漢字で書き、日本語で何と読むのか訊
かれ、全く違う言語なのに日本と中国が同じ漢字を使って居る事に不思議な感銘を覚えたことに起因する。中国から戻ってすぐに、好塩菌関連の中国語論文のファイルを取り出してみたところ、矢張り中国の論文では全て「嗜盐」。正確を期すためネットで探した論文も含め 55 本全て「嗜盐」であった。中華民国の文献には「嗜鹽」と「好鹽」の両方が見受けられるが、論文数が少ないのでどちらが優勢かは判断できない。
2002 年の张永光らの論文９）では Kushner の提唱を以下のように中国語に置き換えている。
嗜盐菌最适生长盐浓度(NaCl)
非嗜盐菌
小干 0.2 mol/L (相当干 1.17 %)弱嗜盐菌
0.2-0.5 mol/L (1.17 %-2.93 %)中等嗜盐菌 0.5-2.5 mol/L (2.93 %-14.63 %)极端嗜盐菌 2.5-5.2 mol/L (14.63 %-30.4 %)slightly と moderately を Lexiconer online English-Chinese
dictionary（以下 Lexiconer と略す。简体中文表記）で調べると以下のようになっている。
slightly はadv. 些微地,稍微,有点,苗条地[I know her 〜. She shivered ~.]moderately はadv. 适当地,适度地,中庸地 [a ~ hot day]58

日本語と中国語で、低度↔弱、中度↔中等、と異なるのは許容範囲であろう。
では高度↔极端、と異なるのはどうであろうか。
Lexiconer で extremely は、
adv. 极端地,非常地,很 [It pains me ~ to have to leave you.
It was an ~ fine day in May. He was ~ angry.]と説明している。
日本語でも extremely は「極端に」と訳すのが通常であろう。Lexiconer で「高度」を引くと、highness, height, high,highly, tallness, altitude とある。日本語の「高度」は、高度機械化、高度成長、高度文明、など、程度の高いさま、を意味する（『大辞林』）。
「好塩」と「嗜塩」
最大の問題は、halophilic が日本式の「好塩」でいいのか、中国式の「嗜塩」とするのが相応しいのか、である。
日本語でも中国語でも、「好」には、①みめよい、よい、などの意味（好感、好事など）と、②このむ、すく、などの意味（好色、好学など）がある。
「好塩」の好は②の意味で使っている。再度 Lexiconer に当たると、love Æ n. 爱,恋爱,爱情,性爱 vt. 爱,爱好,爱慕 vi. 爱[~ and hate, ~ of one's own country, the ~ for one's
children, Give my ~ to]loving Æ adj. 亲爱的,钟情的,忠诚的[a ~ look, a peace-loving people]
halophilic Æ 嗜盐的
halophile Æ n. 好盐菌
好 Æ so as to, can, fine, good, kind, may, nice, so that, Ok,
嗜 Æ indulge in（indulge の名詞形 indulgence は耽溺（亀倉））爱Æ fondle, love, affection
耐 Æ dree（英和辞典で引くと((スコット・北イング))とあり、endure の意（亀倉））嫌 Æ mislike, mind, suspicion, disrelishなどとある。以上から、中国語では「嗜」は「好」よりも love の度合いが強い意味を持つのは明らかである。
「嗜」か「好」か「嗜」は「好」に比べ使用頻度が低い漢字であろう。
『類聚名義抄』観智院本（佛中 二八）にあるように、
日本語では「嗜」を「タシナむ」、あるいは｢タシむ｣と読む。
「たしなむ、たしむ」の語源については、立息嘗、喰知見、など諸説あるようだ（小学館『日本語大辞典』）。
三省堂『大辞林』の「たしなむ」の項には「芸事などを習い覚えて親しんでいる（踊りを嗜む）、何かを好んで親しむ（酒を嗜む）、
自分のおこないに気をつける」とあり、
上品、つつしみ、節制という意味で使うことが多い。用例として、「その大納言はさやうに。みちをたしなみて。
やんことなくなんおはしける」（『今鏡』六）、「和歌の道をたしなみて其名きこゆる人也」（『今物語』十一）、「年
来嗜(ﾀｼﾅﾐ)弄(ﾓﾃｱｿﾋﾞ)給し事とて、最後の時も不忘、」（『太Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)

食塩に依存する菌の分離と分類の研究が中国で始まった直後であったいう事を総合すると、「嗜盐菌」は素直に頷
けるし、けだし名訳である。であるが、上述の Bacillus
saliphilus のように嗜塩性ではなく好塩性の halophile もいるのであるから、halophile 全体を嗜塩菌で置き換えること妥当ではない。
Kushner の分別法が提案された 30 年前と違い、微生物の系統関係が仔細に明らかにされつつある現在、「好塩性」
が中度か高度かの議論の必要性が薄くなった事は確かだ
が、これから halophile の研究を始める人に、現在の認識
到達点を簡潔に伝えることは大切であると考える。
[Extreme halophiles 即ち高度好塩菌]がすっかり定着している処に敢えて切り込み、Kushner の分別法を大本にするがとらわれず、微生物の至適塩濃度と増殖最低塩濃度両方を考慮に入れ、中国、日本初め漢字圏の 15 億を超す人々に理解して貰えるよう、
「嫌塩菌」
、
「好塩菌」
、
「嗜塩
菌」という三つの範疇を設ける分別法を提唱したい。
「非
好塩」は「塩を好きに非ず」と回りくどく、素直に「嫌塩」とした。国によって「鹽」、「塩」、「盐」を使い分けるのは当然である。
これまで広い意味で使ってきた「好塩菌」は、今後「好嗜塩菌コウシエンキン」と呼びたいと思う。表語文字（表意文字）である漢字の有難さを感ずる。
---------------------------------------------------------------------嫌塩菌：培地に塩を添加すると増殖が抑制される。
耐塩菌：塩による抑制が弱く、10-20 %の塩にも耐える。
好塩菌：塩を好む、塩の在る方が好きな菌。生理的食
塩水程度の微量の塩で増殖するが、塩の添加により増殖が促進される。
高度好塩菌：高濃度の塩を好む菌。微量の塩でも増殖するが、10 %程度以上の塩存在下で最適に増殖する。
嗜塩菌：塩に依存する菌。微量の塩では増殖せず、少なくとも海水塩濃度（3-3.5 %）以上の塩を要求する。
極度嗜塩菌：塩中毒、塩耽溺菌。嗜塩菌の内でも特に塩依存度が強く、増殖に 10 %程度以上の高濃度の塩の添加を要求する。それ以下の濃度では瞬時に死滅するものが多い。
--------------------------------------------------------------------例を挙げれば、Escherichia coli は嫌塩菌、Vibrio
parahaemolyticus は好塩菌、Bacillus saliphilus は高度好塩菌、Halomonadaceae 科の Kushneria indalinina は嗜塩菌、Halobacteriaceae科のNatronobacterium gregoryiは極度嗜塩菌、ということになる。

平記』十 信忍自害事）など。しかし、これらはもともとの「嗜」という漢字にはない意味で、日本語にだけある使い方のようだ。
平凡社の白川静『字統』の「嗜」には、【耆は六十の老境をいう。耆はおそらく老と旨との会意字で、老いて旨しとするもの、それに口をそえて嗜という。
】とある。日本
語にも「嗜」を音で shì「シ」と読む言葉もある。
「嗜好品」は（味わうことを目的にとる飲食物。酒・茶・コー
ヒー・タバコ）、「嗜癖」は（あることを特に好きこのんでするくせ）、「嗜欲」は（思うさま飲んだり、見たり、聞いたりしたいという心）、「嗜食」は（好んで食べること。また、習慣として食べること。獣肉を嗜食する）（以上、大辞林）。貝原益軒の『養生訓』や、夏目漱石の『それから』、『三四郎』などにも「嗜欲」という言葉が出ている。
『角川大字源』には「嗜」の解説として、「特に好む、つねに好む、意符の口と、音符の耆シ（うまい意＝旨）とからなる。うまいと喜び味わう意」とあり、嗜愛、
嗜痂、嗜玩なども並ぶ。大修館の諸橋『大漢和辞典』修訂版にも「甚だ好む」とある。つまり日本でも、「シ」と読む「嗜」は「好」より好みの度合いが強い文字としても使われていると言っていいだろう。
大東文化大学中国語大辞典編纂室・編『中国語大辞典』（角川書店 1994 年）の[嗜]の項には、好む、愛好する、という簡単な説明しかないが、嗜痂、嗜酒、嗜色、嗜血などのおぞましい単語が並ぶ。
「嗜好」には「もとは多く
アヘン吸飲を指した」との説明がある。専門語彙、新語も収集するとの本辞典編者の方針の成果であろうか、他に、嗜热細菌、嗜湿植物、嗜酸菌、嗜盐細菌などが並ぶ。
一方[好]の項には、愛する、好む、の説明の後に、好酒、好色、好学、好气などがあるが、好热、好酸、好盐は無い。
言語は進化するものでもある。しかし、漢字は中国で生まれたものであり、中国語の本来の意味こそが正しい事は誰しも認めるであろう。日本に渡ってきた漢字は、千数百年の間に日本の風土と日本人の感覚に合うように色々と変化を遂げ、元々の意味から大きく変ったものも多いが、幸いにして「好」、「シ」の「嗜」夫々に、中国語、日本語両方とも同じ意味を保持していると言えるであろう。嗜好品の代表、酒で考えると、「好酒」は飲まな
いでも平気だが、飲めば気分が良くなり活発になる、の意。
「嗜酒」は酒を特に甚だ好み、飲まないではいられな
い、アルコール依存、中毒状態の意。
ここまで考察して来ると、増殖に 15 %以上の高濃度食塩を必要とし、12 %以下の塩濃度環境に置かれると菌自身が溶けてドロドロになって死滅する、塩依存、塩中毒状態の菌には嗜塩菌が相応しいことはもう論を待たないと思う。

謝辞
オタワ大学の故 Donn J. Kushner 先生には一方ならぬお世話になりました。Kushner 研で 1983-1985 年の 2 年間一緒に研究した中国科学院・微生物学研究所の周培瑾氏には、简体中文表記では亀倉を龟仓と書く事も含め色々なことを教えて戴きました。両氏にはここにあらためて篤く御礼を申し上げます。

結論
以上の考察と、中国の研究者が halophiles に「嗜盐菌」という訳語を与えたのは、Halobacterium 属という高濃度
59

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)文献
１） 小川政修 (1932) 細菌學概論 修正再版, 三省堂,
p.64
２） 半澤 洵, 佐々木酉二, 中根正行 (1941) 水産醗酵製品の蛋白質分解菌に関する研究（第 1 報）
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３） 亀倉正博 (2007-2009) 塩と好塩菌 其の 1, 2, 3, 4,
極限環境微生物学会誌 6: 4-10, 7(1): 3-9, 7(2): 4-10,
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４） Larsen, Helge (1962) Halophilism. pp. 297-342. In The
Bacteria, Vol.4, Academic Press
５） 好井久雄 (1967) 食塩と微生物 (1), 日本醸造協会
雑誌 62: 43-49.
６） Kushner, Donn J. (1978) Life in high salt and soluteconcentrations: Halophilic bacteria. pp. 317-368. In
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Academic Press

７） 増井正幹, 大西 博, 畝本 力 編 (1979) 『好塩微生物』, 医歯薬出版
８） 王大珍, 周培瑾, 田新玉, 马贵宏 (1984) 极端嗜盐
菌新种的鉴定, 微生物学报 24: 304-309.
９） 张永光，李文均，姜成林，张忠泽 (2002) 嗜盐放线菌的研究进展, 微生物学杂志 22(4): 45-48.

連絡先：亀倉正博
好塩菌研究所〒278-0043
千葉県野田市清水 677-1
TEL & FAX 04-7125-8007
masahirokamekura@krc.biglobe.ne.jp

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)ORIGINAL PAPER

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol. 9 (2), 61-66

Yoshida Na, Ohmura Nb, Matsumoto Nb, Sasaki Kb,
Saiki Hc, Arai Ha, Ishii Ma and Igarashi Ya

Dissimilatory Fe (III) reduction by cytochrome c-552 in a thermophilic,
obligately chemolithoautotrophic bacterium, Hydrogenobacter thermophilus TK-6
a

Department of Biotechnology, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo, 1-1-1
Yayoi, Bunkyo-ku, Tokyo 113-8657, Japanb
Central research Institute of Electric Power Industry, 1646 Abiko, Abiko City, Chiba 270-1194, Japanc
School of Bionics, Tokyo University of Technology, 1404-1 Kataoka, Hachiouji, Tokyo 192-0982
Corresponding author: Masaharu Ishii, amishii@mail.ecc.u-tokuo.ac.jp
Tel: +81-3-5142-5143, Fax: +81-3-5841-5272
Received: August 20, 2010 / Revised: September 8, 2010 / Accepted: September 8, 2010
Abstract A thermophilic, obligately chemolithoautotrophic H2-oxidizing bacterium, Hydrogenobacter
thermophilus TK-6 can utilize O2 or NO3- as an electron
acceptor. Here we show that this bacterium can growautotrophically by the reduction of Fe(III)-EDTA or
Fe(III)-DTPA (diethylene-triamine-pentaacetic acid) as
an electron acceptor, through oxidation of H2 as anelectron donor. A 7.6 kDa c-type cytochrome waspurified from soluble fraction as the iron reducing
protein and the protein was identified as cytochrome
c-552. A rate constant for the reduction of Fe(III)-EDTAby the cytochrome was kinetically determined to be 1.73
× 107 s-1 by stopped-flow spectrophotometry, which ismore than 20-fold higher than the constants of other iron
reductases. The redox potential was measured as E =+0.27 V (vs NHE [Normal Hydrogen Electrode]), which
is high enough to reduce Fe(III)-EDTA. These results
suggest that cytochrome c-552 works as a terminal
electron donor for Fe(III) in the periplasmic space.

dissimilatory iron reduction. Examples are Thermotoga
maritima, which has been known as an obligate
fermentating bacterium, and Pyrobaculum islandicum,
which has been known to grow with thiosulfate as aterminal electron acceptor 25).
Hydrogenobacter thermophilus TK-6 is known as an
obligate chemolithoautotroph growing on the oxidationof H2 by the reduction of O2 or NO3- 12). TK-6 has somedistinctive characteristics; CO2 fixation via the reductive
TCA cycle 26), a novel aminophospholipid 27), and asulfur-containing methionaquinone 7). Furthermore, on
the basis of 16S rRNA gene analysis, TK-6 is positioned
at the deepest branching point in the phylogenic tree 21).
Thus, we suspected that there is high possibility that
TK-6 has a dissmilatory iron reduction ability. In thispaper, we report that cytochrome c-552 works as aterminal electron donor for Fe(III) in TK-6.
Materials and Methods
Microorganism, medium and culture.
H. thermophilus TK-6 (IAM 12695, DSM 6534) wasused throughout this study. Culturing of TK-6 underaerobic or anaerobic conditions was carried out aspreviously described with minor modification 12).
Culturing medium contained (per liter of distilled water):
1.5 g: NH4(SO4)2, 0.25 g: NaCl, 0.5 g: KH2PO4, 0.6 g:
K2HPO4, 0.2 g: MgSO4·7H2O, 0.01 g: CaCl2·2H2O, 0.01
g: FeSO4·7H2O, and 2 ml of trace element solution 12).
For anaerobic growth experiments, Fe(III)-EDTA,
Fe(III)-DTPA (diethylene-triamine-pentaacetic acid),Fe(III)-NTA (Nitrilo Triacetic Acid), or Fe(III)-citrate
was added to the culturing medium to a final
concentration of 4 mM, or Fe2O3 or Fe(OH)3 to 1.69 g/L
or 0.89 g/L, respectively, and pH was adjusted to 7.2
using 5 M NaOH. Growth experiments were carried out
using a 100 ml anaerobic culture bottle. Thirty millilitersof the medium were added to the bottle after filter
sterilization. After inoculation of preculture, the bottle
was sealed with a sterilized butyl stopper and analuminum cap. The gas in the headspace of the bottle

Key Words: Hydrogenobacter thermophilus, iron
reduction,
cytochrome,
respiration,
electrolytic
regeneration
Introduction
Microbial iron reduction plays an important role in theoxidation of organic matter to CO2 and in the formationof minerals such as magnetite and siderite 15,18). Suchiron reduction results from anaerobic respiration using
ferric iron as an electron acceptor, and has been
identified in a wide variety of microorganisms during thepast three decades 13,14,18). They are widely distributed inboth Bacteria and Archaea, and the representatives are,Geobacter sulfurreducens 1,16) and Shewanella
frigidimarina 3). Based on phylogenetic diversity of iron
reducing microorganisms, dissimilatory iron reduction isthought to be arised in an early evolutionary ancestor ofextant microorganisms 2,25). Recently, some thermophilesthat had not been recognized as iron reducing
microorganisms were identified to have the ability for61

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)was then removed by suction for 15 min using a syringe
needle inserted in the butyl stopper and replaced with amixture of H2 and CO2 (4:1 v/v at 100 kPa) for anaerobic
cultures. These degassing and pressurization cycles wererepeated at least three times. Cultivation was carried out
at 70°C in an incubator with shaking. Cell numbers were
determined directly by counting cells under a phase
contrast microscope at 400 × magnification.
Concentration of Fe(II)-EDTA was measured as afunction of the absorbance at 562 nm using ferrozine 20).

Fe(II)-EDTA production. After determining the protein
concentrations using the Bradford method (Protein Assay
Kit, BioRad), samples (500 μl) were firstly reduced byadding 2-mercaptoethanol (to 0.01% (v/v)) at 20°C for
10 min before the addition of 10 mM Fe(III)-EDTA.
Then the mixture was incubated at 70°C for 10 min
while shaking at 100 rpm. Iron reducing activity was
assayed by measuring Fe(II)-EDTA production byferrozine method 20).
Kinetic analysis for electron transfer.
Rapid-scan measurements were carried out using a
stopped-flow spectrophotometer that consisted of anabsorbance mixing chamber equipped with an
OLIS-RSM data acquisition and analysis system (ONLine Instrument Systems, Inc., Georgia, USA). Sample
preparations were performed in anaerobic chamber filledwith N2. Purified iron reducing protein (0.12 mg/ml) wascompletely
reducedusing
anexcessof
2-mercaptoethanol (final concentration: 1.0%) on ice for1.0 h. The 2-mercaptoethanol was then removed by using
a desalting column (Φ1.0×10 cm, Sephadex G-50,
Amersham Biosciences co., New Jersey, USA) with 10
mM phosphate buffer (pH 7.0). Fe(III)-EDTA solutions(0, 1.0, 5.0, 10.0 and 20.0 mM) prepared in thephosphate buffer (pH 7.0) and protein solutions wereseparately added to driving syringes, which wereconnected into the mixing chamber of the stopped-flow
instrument. The temperature of the syringes and chamber
was maintained at 25 ± 1 °C by circulating water. The
reaction was then initiated by rapidly mixing 0.15 ml ofeach solution, and the spectra between 400 to 600 nm
were recorded every 10 ms. Electron transfer from thereduced protein to Fe(III)-EDTA was then traced as atime dependent change in the absorbance at 552 nm.
Under all experimental conditions, the concentrationof Fe(III)-EDTA was at least 125-fold greater than theprotein concentration in the reaction mixture. This
ensured pseudo-first order conditions and allowed theconcentration of Fe(III)-EDTA complex to beapproximate constant during the experiments. The
second order equation for the formation of the oxidized
cytochrome thus can be expressed as (1).
(1) d[Cyt(ox)]/dt = k1[Cyt(red)] [Fe(III)][Fe(III)] is the concentration of Fe(III)-EDTA,[Cyt(red)] and [Cyt(ox)] are the concentrations of the
reduced and oxidized cytochrome, respectively, and k1 is
the forward rate constant. Under the pseudo-first orderconditions of this study equation (1) simplifies to:(2) d[Cyt(ox)]/dt = kobs[Cyt(red)]kobs is equal to the second order rate constant k1 times
the constant Fe(III)-EDTA concentration.
Asabsorbance at 552 nm is directly proportional to[Cyt(red)], the solution to the differential equation (2)can be written:(3) ∆At = ∆A∞ e –k obs t.
∆At is the absorbance at time t minus one at the end of
the reaction (At - A∞), ∆A∞ is the total absorbance change
observed (A0 - A∞), and kobs is the observed pseudo-firstorder rate constant for the absorbance change.

Culturing with electrolysis.
To confirm growth through iron reduction, TK-6 wasanaerobically cultivated with elecrolysis underpotentiostatic-controlling as described previously 19). The
anode bath was filled with 100 ml of culturing medium
with 4 mM Fe(III)-EDTA, while the cathode bath was
filled with medium without Fe(III)-EDTA. The entire
apparatus was placed in an airtight box (width, 30 cm;
depth, 30 cm; height, 25 cm) and incubated at 70°C withan atmosphere containing anaerobic mixed gas (H2:CO2= 4:1, v/v, 100 kPa). After TK-6 was inoculated to theanode bath, the potential for the electrolysis wasmaintained at E = +400 mV (vs Ag/AgCl).
Purification of iron reducing protein.
Cell-free extract or membrane fraction was firstly
prepared as follows. Cells grown anaerobically throughthe reduction of Fe(III)-EDTA were suspended in 10 mM
phosphate buffer (pH 7.0), sonicated and thencentrifuged (22,500 × g, 30 min, 4°C). The supernatant
was taken as the cell-free extract, while the precipitate(membrane fraction) was resuspended in the same buffer,
after which both were stored in anaerobic bottles under a
N2 atmosphere.
Iron reducing protein was purified from cell-free
extract. The cell-free extract (50 ml) was firstly loaded
onto a SP-Toyopearl 650M column (Φ1.0 cm×15 cm,
TOSOH, co., Tokyo, Japan) that had been
pre-equilibrated with 10 mM phosphate buffer (pH 7.0)
at room temperature. After washing the column with 100
ml of the buffer, the column was separately washed with
50 ml each of phosphate buffer containing 0.1, 0.2, 0.5 or
1.0 M NaCl in that order. Each fraction was assayed forFe(III)-EDTA reducing activity, and activity was
detected in the elution at 0.1 M NaCl. The active fraction
was then concentrated to 0.3 ml using a Centricon
YM-10 (Millipore co., Massachusetts, USA) and loaded
onto a gel-filtration column (Superose R12, Φ1.5 cm ×30 cm, Amersham Biosciences co., New Jersey, USA,)
that had been pre-equilibrated with 10 mM phosphatebuffer (pH 7.0) containing 0.15 M NaCl. The purified
iron reducing protein was stored anaerobically in a
culture bottle at 4°C in the presence of N2.
Electrophoretic homogeneity of the purified protein was
examined by SDS-PAGE. After running the protein on a
12.5% gel, it was stained with either Coomassie brilliant
blue or heme staining 23). The purified iron reducing
protein (20 μg) was carboxymethylated, then applied tothe amino acid sequencing (HITACHI, co., Ltd. , Japan).
Fe(III) reduction assay. During the purification steps,
iron reducing activity was assayed by measuring the62Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)reduced to Fe(II)-EDTA (Fig. 2). In contrast, withpotential-controlled electrolysis, a log phase was 19). In
the absence of electrolysis, TK-6 grew up to 9.8 ×
prolonged to 110 h, resulting in the cell numbers of 8.3
×108 cells/ml, when Fe(II)-EDTA was re-oxidized toFe(III)-EDTA by the electrode (anode). Thus, theRedox potential measurement of the iron reducing
protein.
Redox potential of purified iron reducing protein wasmeasured using cyclic voltammetry. Solution of iron
reducing protein (1.5 mg/ml) was prepared in a 10 mM
phosphate buffer containing 0.1 M NaCl. A gold
electrode (Φ 4 mm) which was used as a working
electrode was modified by 4,4’-bipyridyl as described by
Eddowes 4). Three electrodes, working electrode,reference electrode (Ag/AgCl, RE-1B, BAS co., Japan)
and counter electrode (Pt line), were put into the 100 μl
iron reducing protein solution. The solution wasdegassed by bubbling of N2 gas for 15 min. Cyclic
voltammetry (BAS 100B, Electrochemical Analyzer,
Cell Stand CS-2, BAS co., Japan) was operated in a
potential range of E = +0.6 to –0.4 V (vs Ag/AgCl) withsweep rate of 50 mV/min at 20˚C.
Results and Discussion
Anaerobic growth by the reduction of Fe(III).
When TK-6 was grown under Fe(III)-EDTA, H2 andCO2, cell number increased up to 1.0×108 cells/ml during
80 h (Fig. 1A). The growth was correlated with reductionof Fe(III)-EDTA and generation of Fe(II)-EDTA (Fig.
1B). By contrast, no increase in cell number wasobserved in the absence of either Fe(III)-EDTA, H2 or
CO2. When cells were not inoculated, Fe(III)-EDTA was
not reduced, suggesting that Fe(III)-EDTA was notchemically reduced by H2. Clearly, it was shown that
TK-6 has an ability to grow autotrophically by the
reduction of Fe(III)-EDTA though the oxidation of H2.
The optimum concentration of Fe(III)-EDTA for thegrowth was found to be 4 mM (data not shown). In
addition, Fe(III)-DTPA could be utilized like
Fe(III)-EDTA, while Fe(III)-NTA, Fe(III)-citrate,
Fe(OH)3 and crystalline Fe2O3 were not utilized. There isa remarkable difference between H. thermophilus and theother thermophilic iron reducing microorganisms, that is,a preference of iron form. All known thermophilic iron
reducing microorganisms utilize insoluble iron, forexample, P. islandicum utilizes Fe(III)-citrate or ironoxide, and Geothermobacter ferrireducens utilizes only
iron oxide 9,10). In contrast, TK-6 utilizes only soluble
iron, Fe(III)-EDTA or Fe(III)-DTPA, but TK-6 does not
utilize insoluble iron, as demonstrated by the growthexperiments. Furthermore, no genes encoding
homologues of reported ion reductases, such as omcA-B
of S. putrefaciens or G. sulfurreducens, were found in the
genome of TK-6 (data not shown). The ability to utilize
only soluble ion is also reported in an iron reducing
microorganism, Desulfitobacterium metallireducens 5).

Fig. 1. Chemolithoautotrophic growth through anaerobiciron respiration in H. thermophilus. A, Time-dependentchanges in cell numbers. (●): Complete (gas phase: H2 +CO2, and presence of Fe(III)-EDTA), (▲): Complete
minus Fe(III)-EDTA, (■): Complete minus H2, (♦):
Complete minus CO2. B, Time-dependent concentration
changes under complete condition. (●): Fe(II)-EDTA,
and (▲): Fe(III)-EDTA.

Fig. 2. Culturing with potential-controlled electrolysis. A,
Time-dependent changes in cell numbers (gas phase: H2+ CO2, and presence of Fe(III)-EDTA) withpotential-controlled electrolysis (●), or without
electrolysis (▲), respectively. B, Time-dependentchanges in the concentrations of Fe(III)-EDTA withpotential-controlled electrolysis (●), or without
electrolysis (▲) , and current with potential-controlled
electrolysis (○).

Culturing with electrolysis.
Cultivation with potential-controlled electrolysis was
performed to confirm the dissimilatory iron reduction in
TK-6, as the growth of Acidithiobacillus ferrooxidans
was successfully accelerated by this culturing technique
not cause other chemical reactions based on cyclic
voltammetric analysis (data not shown). Therefore,
acceleration of the growth by electrolytic regeneration of
Fe(III)-EDTA clearly demonstrates the ability of 107
cells/ml in 40 h, when all of the Fe(III)-EDTA had been63

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)potential for iron reduction was E = +0.77 V (vs NHE),
the purified protein was suitable to reduce Fe(III)-EDTA.
A purified protein also reduced Fe(III)-DTPA, but did
not reduce Fe(III)-NTA, Fe(III)-citrate, Fe(OH)3 or
crystalline Fe2O3. The result was in line with the growthexperiment.

electrochemical re-oxidation to Fe(III)-EDTA resulted inabout 10-fold increase of cell growth compared with theyield observed in its absence. The potential for theoxidation of Fe(II)-EDTA at the anode was kept constantat E = +400 mV by Ag/AgCl reference electrode. It did
dissimilatory iron reduction in TK-6. Furthermore,
0.1-2.0 mA of current was observed in the culturing
period. Integrated current in this period was calculated as435.4 A·s, therefore, 4.5 mmol of Fe(III)-EDTA can beapproximately generated on the electrode based on the
Faraday constant. Presuming that cell growth is
proportional to the amount of Fe(III)-EDTA in themedium, the cells grown with electrolysis utilized 3.4mmol of Fe(III)-EDTA, which is 76 % of Fe(III)-EDTA
generated on the electrode, suggesting thatelectrochemical reaction on the electrode is mainly
oxidization of Fe(II)-EDTA. Thus, it was again
confirmed that TK-6 can utilize Fe(III)-EDTA as anelectron acceptor. Also, it is suggested that the culturing
technique with potential-controlled electrolysis could beavailableforotherpossibleiron
reducing
microorganisms.

Rate constant for the reduction.
By a stopped-flow spectrophotometric analysis, thereduction of Fe(III)-EDTA was correlated withabsorption decrease at 520 and 552 nm and the shift ofthe peak from 415 nm to 412 nm in the iron reducing
cytochrome (Fig. 4A). The time course of the change inabsorbance at 552 nm in the presence of various
concentrations of Fe(III)-EDTA is illustrated by thetraces in Fig. 4B, suggesting that the cytochrome wascompletely oxidized by 20 mM Fe(III)-EDTA in 2000 ms.
Equation 3 (see Materials and Methods) was then fitted
to each experimental trace independently, and the fitted
values of kobs were plotted as a function of the
Fe(III)-EDTA concentration in Fig. 4C, which yielded astraight line. The first order rate constant for theoxidation of the cytochrome by Fe(III)-EDTA was givenby the slope of this line, so that the measured rate
constant for electron transfer from the cytochrome toFe(III)-EDTA was 1.73 × 107 s-1. The rate constants foriron reduction by iron reductase purified from several
iron reducing microorganisms have been reported asfollows. In G. sulfurreducens, the rate constants for theouter membrane NADH-dependent iron reducing
cytochrome, OmcB (previously mentioned as FerA), andsoluble NADPH-dependent iron reductase, Fro1, that can
reduce Fe(III)-NTA, are 0.70 × 101 s-1 and 3.48 × 102 s-1,
respectively 11,17). In S. frigidimarina, the rate constantfor Fe(III)-EDTA reduction by flavocytochrome c3 wascalculated to be 0.80 × 106 s-1 3,6), and in Archaeoglobus
fulgidus, the rate constant for Fe(III)-EDTA reduction
was calculated to be 1.04 × 103 s-1 24). Thus, the rate
constant for Fe(III)-EDTA reduction by the cytochrome
was more than 20-fold higher than those of the others.

Purification and characterization of the iron reducing
protein.
Iron reducing activity was observed only in cell-free
extract, but not in membrane fraction, therefore, theion-reducing protein was purified from cell-free extract.
The protein was purified to electrophoretic homogeneity
by cation-exchange and gel-filtration chromatography(Fig. 3A, lane 2). The purified protein ran as a 7.6 kDa
monomer on SDS-PAGE and gel-filtration analysis. The
purified protein exhibited a broad absorbance peak at
410 nm in oxidized state (dotted line in Fig. 3B), or
peaks at 415, 520 and 552 nm, in reduced state (solid line
in Fig. 3B). These spectral absorptions are typical toc-type cytochromes. The purified protein also gave avisible band by heme staining on SDS-PAGE (Fig. 3A,
lane 3). Therefore, the iron reducing protein was
identified as a cytochrome c. The redox potential of thepurified protein was E = +0.27 V (vs NHE). Since theFig. 3. Purification of iron reducing cytochrome from anaerobically grown cells. A, SDS-PAGE: lane 1, cell-free
extract; lanes 2 and 3, purified protein. Lanes 1 and 2 were stained by CBB, while lane 3 was stained by heme
staining. B, Absorption spectra of the oxidized (dashed line) and reduced (solid line) forms of the purified
cytochrome. The inset shows the difference spectrum.

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)Identification of the iron reductase as cytochrome
c-552.
The N- terminal amino acid sequence of the purified
iron reducing cytochrome was determined as
NEQLAKQKGCMACHDLKAKKVGPAYADVAKKYAGRKDAVDYLAGKIKK-GGS, which was completely
identical to that of cytochrome c-552 22). The sequence
was unique in the genome of TK-6, indicating thatcytochrome c-552 catalyze the iron reduction.
Cytochrome c-552 is expressed constitutively at highlevel even under aerobic condition, and its physiological
function has been suggested to be a component withinelectron transfer chain 8). The protein purified fromaerobically grown cells also had an ability to reduce
Fe(III)-EDTA, and had the same preference to reduce
Fe(III) chelator species as the protein purified fromanaerobically grown cells. Moreover, the redox potential
and rate constant for Fe(III)-EDTA reduction by thecytochrome purified from aerobically grown cells were
E=+0.27V (vs NHE) and 1.55 × 107 s-1, respectively, andthese two values were essentially the same with thecorresponding values for the cytochrome fromanaerobically grown cells.
Conclusions.
As a result of the investigations, we have elucidated
the following facts; (i) H. thermophilus TK-6 can growautotrophically by the reduction of Fe(III)-EDTA throughthe oxidation of H2. (ii) Fe(III)-NTA, Fe(III)-citrate,
Fe(OH)3 or crystalline Fe2O3 is not utilized. (iii)
Cytochrome c-552 was purified as the iron reductase
from soluble fraction, and was shown to reduce
Fe(III)-EDTA or Fe(III)-DTPA. (iv) Genomic datasuggest that TK-6 does not have any genes homologous
to reductases for insoluble iron reported in Shewanella
and Geobacter. (v) Rate constant for Fe(III)-EDTA
reduction by the purified cytochrome is more than
20-fold higher than those of any other reductases.
Fig. 4. Electron transfer between the cytochrome andFe(III)-EDTA. A, Absorbance spectra of the reduced
form of the purified cytochrome after mixing with anexcess of Fe(III)-EDTA (final concentration, 10 mM).
The spectra were measured at every 500 ms and illustrate
the time-dependent shift from the reduced form of thecytochrome to the oxidized form. B, The time course
for the absorbance changes of the purified cytochrome at
552 nm depends on the concentration of Fe(III)-EDTA.
The reduced form of the cytochrome was mixed withFe(III)-EDTA at concentrations of 0 (●), 1.0 (▲), 5.0 (■),
10.0 (♦) and 20 (▼) mM. C, Pseudo-first order rate
constants determined by fitting Eq. 3 to the data of panel
B are plotted vs. the Fe(III)-EDTA concentrations; thesecond order rate constant is given by the slope of thebest fit line (determined by the Least Squares method).

Acknowledgments
We thank Robert C. Blake in College of Pharmacy at
Xavier University of Louisiana for technical assistanceand performing Stopped-flow spectrophotometricanalysis.
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66

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)ORIGINAL PAPER

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol. 9 (2), 67-71

Shiotsuka K, Tanaka A, and Sakai K

Occurrence of Extreme Thermophiles, Thermaerobacter spp., in Sewage Sludge
Department of Bioscience and Biotechnology, Graduate School of Bioresource and Bioenvironmental Sciences, Kyushu
University, 6-10-1 Hakozaki, Higashi-ku, Fukuoka 812-8581, Japan
Corresponding author: Kenji Sakai, kensak@agr.kyushu-u.ac.jp
Tel/Fax: +81-92-642-2861
Received: September 1, 2010 / Revised: October 13, 2010 / Accepted: Nobember 4, 2010
Abstract We isolated an extreme thermophilic
bacterium strain SS, which grew between 55 and 82°C
(optimum 70°C), from sewage sludge in Kagoshima City,
Japan. Morphological and physiological properties, aswell as 16S rRNA gene sequence indicated that strain SS
belongs to the genus Thermaerobacter. To confirm the
distribution of Thermaerobacter spp. in sewage sludge,
genus-specific detection by nested PCR of 16S rRNA
gene was performed. As a result, the existence ofThermaerobacter spp. in six sewage sludge samples
including composted sludge was demonstrated bysequencing of the nested PCR products. However,enrichment cultures with sewage sludge were needed todetect the target products, indicating that population of
Thermaerobacter spp. may be significantly low. As far as
we know, this is the first report on occurrence of extreme
thermophilic bacteria in a municipal wastewater
treatment process under mesophilic condition.

Here, we report isolation and characterization of an
extremely thermophilic bacterium, strain SS, fromsewage sludge. Also, distribution of Thermaerobacter
spp., to which the isolate probably belongs, in sewage
sludge and its compost was investigated by a nested PCRtechnique 7) using genus-specific primers.
Materials and Methods
Samples
Sewage sludge samples were kindly provided by
Nanbu municipal wastewater treatment plant (31°31.147’
N, 130°32.077’ E, located in Kagoshima City, Japan). In
the plant, municipal wastewater has been treated bystandard activated sludge process. Excess sludge fromsedimentation tanks was thickened and flocculated bypressure-filtration with a mixture of lime and ferricchloride (sludge L), or with a cation polymer (sludge P).
Part of sludge P was subsequently digested underanaerobic mesophilic condition (sludge D). Thesesludges were finally mixed with seed compost andtreated aerobically to make compost (sludge C). During
the composting process, a relatively high temperature(more than 80°C) has been maintained over a long period.
Two sewage sludge samples, designated sludge C04 andsludge L04, were obtained in February 2004. Sludge C04
was the original source of strain TH 9), and sludge L04
was used for screening extreme thermophiles. Four
samples (sludge L08, P08, D08 and C08) were obtainedin April 2008. All sewage sludge samples were passed
through a 2 mm-sieve and stored in sterilized plastic
bottles at room temperature until use.

Key words: extreme thermophile, sewage sludge, genus
Thermaerobacter, nested PCR
Introduction
The activated sludge process is very widely used forbiological wastewater treatment, but this process
generates a considerable amount of excess sludge 6). In
Kagoshima City, mixture of dewatered excess sludge anddigested sludge (sewage sludge) has been composted
through the hyperthermal composting method, which
proceeds at temperatures of 80°C over a long period 3).
As hyperthermal composting process has initiallyrecognized in Kagoshima City and was considered thatthe process would be caused by its unique microbial
structure 5).
We isolated an extreme thermophile, designated strain
TH, from sewage sludge compost produced through thehyperthermal composting method 9). The strain TH isclosely related to “Caldaterra satsumae” YMO81
isolated from high-temperature compost, sewage sludge
compost made through the same composting process, by
Oshima and Moriya 5). On the other hand, we
incidentally found extreme thermophiles in the material
sewage sludge, not in the compost. As far as we know,
isolation of extreme thermophiles from sewage sludge
has not ever been reported.

Culture media
CYS medium 9) solidified with 1%(w/v) GELRITE®
gellan gum (Sigma, Tokyo, Japan) and 20 mM CaCl2
was used in process of isolation of extreme thermophilic
bacteria. Cultural properties of an isolated bacterium
were examined using CYS medium. Medium A, sewage
sludge extract containing additional nutrients andminerals, was also used in the isolation process andcultivation for DNA preparation. The medium was
prepared as follows. Twenty grams of autoclaved (121°C,
30 min) and air-dried sewage sludge were suspended to
980 ml of deionized water and autoclaved at 121°C for
15 min. The autoclaved suspension was passed through a67

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)filter paper (No. 6, Advantec Toyo, Tokyo, Japan) withaspiration. After adjustment of the pH to 7.5–7.7 with 1
M HCl, the filtered extract was autoclaved again (121°C,
15 min) and then mixed with sterilized CYS medium at
the ratio of 9:1 (v/v).

(Takara Bio) gels in 1×TAE stained with 0.5 μg/ml
ethidium bromide. The direct sequencings were
performed by FASMAC Co., Ltd. (Atsugi, Kanagawa,Japan), after target DNA fragments were purified using
QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Tokyo, Japan).

Isolation
andcharacterizationofextremethermophilic bacteria from sewage sludge
Air-dried sludge L04 (1 g) was suspended into 49 mlof sterilized water, adjusted the pH to 7.5–8.0 and thenincubated at 75°C for 7 days statically. After the
incubation, the suspension was pour-plated onto CYS
gellan gum plate. The solidified CYS plate was thenincubated at 75°C for 2 days. Single, small but
well-separated distinct colonies were picked andinoculated into 5 ml medium A to incubate at 75°C for 2days. The turbid liquid culture was spread onto CYS
gellan gum plates, and the plates were incubated at 75°C
for 2 days. This single colony isolation procedure wasrepeated three times. One of the pure cultures obtained,
designated strain SS, was stored in a medium A/DMSO
mixture (10:1) at -20°C.
Characterization of strain SS was performed aspreviously described 9), using CYS medium and medium
A.
Strain SS has been deposited with Japan Collection of
Microorganism (JCM 15564) and American Type
Culture Collection (ATCC BAA-1783), and the 16S
rRNA gene sequence has been submitted to DDBJ
(accession no. AB444428).

Enrichment culture of sewage sludge for PCR
detection
Enrichment culture of sludge L04, L08, P08, and D08
was carried out by reproducing the process for isolationof strain SS, except for incubation period of 2 weeks.
After the incubation, DNA was extracted from theprecipitate of their centrifugation (7,000 × g for 10 min)and nested PCR was then performed as described above.
Results
Isolation of extreme thermophiles from sewage sludge
Growth of extreme thermophiles was observed in asuspension of air-dried sludge L04 after incubation at
75°C for 7 days statically. Uniform, very small (< 1 mm),translucent, and circular colonies were formed on thesolidified CYS plate after incubation at 75°C for 2 days.
One of the pure cultures, strain SS, was characterized
further.
Characteristics of strain SS
Strain SS cells were non-motile rods (1–5 × 0.2–0.4μm), occurring singly or in pairs, and stainedGram-negative under the following conditions tested:
two growth phases (exponential and stationary phase),
two kinds of liquid culture (medium A and CYS
medium) and colonies on CYS gellan gum plate. No
spore formation was observed in the cells under any
growth conditions tested: high temperature (overnight at85°C), low temperature (24 hr at 30°C), long-term
incubation (7 days at 75°C), and poor-nutrient (overnightat 75°C in M9 medium 8). Strain SS cells did not possess
flagella.
Strain SS was an aerobe and grew better with agitation
than as a stationary culture. The optimal temperature andpH for growth of strain SS in liquid CYS medium were
70°C (temperature range of 55–82°C, Fig. 1a) and pH
7.0 (pH range of 6.0–9.5, Fig. 1b). The strain grew theconcentration range of about 0–4% NaCl, with optimum
growth at around 0.3% NaCl (Fig. 1c). For strain SS
growing on CYS gellan gum plate, catalase activity was
positive, and oxidase activity was weakly-positive. Strain
SS could utilize glucose, trehalose, cellobiose, isoleucine,
threonine, asparagine, tyrosine, acetate, glutarate, caseinacid hydrolysate, yeast extract, Casamino acids,
polypeptone, tryptone, malt extract, meat extract andaesculin (each 0.2% w/v) in 0.1× CY medium 9).
The dominant menaquinone type of strain SS was
MK-6. The G+C content of strain SS was 74.2 mol%, as
determined by HPLC analysis. Partial 16S rRNA genesequence of strain SS (1292 bp) was similar to those of
Thermaerobacter species (97.5–99.7% similarity) andthe nearest neighbor of the strain was a recent isolate
Thermaerobacter composti 17) (accession no. AB454087;
Fig. 2).

DNA extraction and nested PCR
DNAs from six sewage sludge samples were extractedusing a PowerSoilTM DNA Isolation Kit (MO BIO
Laboratories, Inc., Carlsbad, CA, USA). Extraction of
DNA from five Thermaerobacter strains (T. marianensis
JCM 10246T, T. nagasakiensis JCM 11223T, T.
subterraneus DSMZ 13965T, T. litoralis JCM 13210T
and strain SS) and Escherichia coli JM109 was also
carried out.
To detect the target bacteria, a nested PCR technique
was applied. At the first stage of the nested PCR,
universal primers 8F and 1492R were used to obtainnearly full-length 16S rRNA genes. The PCR mixture
and cycling conditions for the amplification were based
on to the method of Burr et al. 1), except that Quick
TaqTM HS Dye Mix (Toyobo Co., Ltd., Osaka, Japan)
and a Dice model thermal cycler (Takara Bio Inc., Otsu,
Japan) were used.
At the second stage of the nested PCR, genus-specificprimers of THRM424F (5’-GGGTGTAAACCCCTGTCGTCC-3’) and THRM998R (5’-CTTTCGGCCAGGTTCGCGGTG-3’) were used. The PCR mixture consistedof 12.5 μl of Quick TaqTM HS Dye Mix, 0.4 μM eachprimer, and 1 μl of a 10-fold dilution of the first-stage
PCR product in a final volume of 25 μl. Cycling
conditions for the amplification were as follows: initialdenaturation at 94°C for 2 min, 40 cycles of denaturation
at 94°C for 1 min, annealing at 58.9°C for 1 min andextension at 68°C for 1 min, and a final extension at
68°C for 15 min. Second-stage PCR products wereanalyzed by electrophoresis on 1.5% LO3 agarose
68

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)sludge L04 was the isolation source of strain SS. Then,enrichment culture of four sewage sludge samples was
performed to increase target bacterial cells.
Establishment of a genus-specific nested PCR
In order to design genus-specific primers for detecting
Thermaerobacter spp., five 16S rRNA gene sequencesfrom Thermaerobacter strains including strain SS werealigned with those of three Moorella strains (genus
Moorella is closely related to genus Thermaerobacter)and three other generic bacteria (Escherichia,
Geobacillus and Thermus). A primer set of THRM424F
and THRM998R, which was predicted to amplify anapproximately 600-bp fragment, was selected byexamining the validity of several candidates (data notshown). PCR conditions such as annealing temperatureand each primer concentration were optimized. Clear
bands were obtained at target position from five
Thermaerobacter strains including strain SS (lane 1̶5 in
Fig. 3a). The detection limit was ca. 8.0 × 102 cells per
ml of liquid culture. On the other hand, no DNA
fragment at target position was obtained from a negative
control of the reaction (lane 6 in Fig. 3a). By using
DNAs from enrichment cultures of sludge L04, L08, P08
and D08, the target fragment could be detected (lane 1–4
in Fig. 3b). Sequences of these DNA fragments weresignificantly similar to strain SS (AB444428) T.
composti (AB454087), or T. marianensis (AB011495).
Also, sequences of nested PCR products from sludge
C08 and C04 were similar to T. marianensis (AB011495),
indicating that members of the genus Thermaerobacter
existed in all of sewage sludge samples. Considering thedetection limit of the specific nested PCR, populations ofThermaerobacter in these samples before enrichment
cultivation were estimated less than 103 cells g-1 dryweight.
Discussion
In this paper, we studied on extreme thermophiles insewage sludge from Kagoshima City, Japan. These
results are very interesting: most bacteria in sewage
sludge are mesophilic, as activated sludge treatment ofwastewater is generally performed under ordinary
temperatures. Although some thermophiles have been
isolated from sewage sludge 2,10,11), these were moderate
thermophiles, showing maximum growth temperatures
below 70°C. Thus, the growth temperature of strain SS is
obviously different from both the temperature for thewastewater treatment process and from the growthtemperatures of these moderately thermophilic isolates.
In contrast, extreme thermophiles, which show optimum
temperatures for growth around 70-80°C 13), do not
generally grow under ordinary temperatures. Most
members of the genus Thermaerobacter have been
isolated from hot marine environments 4,14,16), deep bore
sediments 12). The DNA–DNA hybridization between
strain SS and these marine isolates gave relatively highDNA homologies (data not shown). Recently, Yabe et al.
17)
reported to isolate a novel extremely thermophilic
bacterium from food sludge compost, and identified theisolate as T. composti. From 16S rRNA gene sequencing

Fig. 1. Effects of temperature (a), pH (b) and NaCl
concentration (c) on growth of strain SS.
(a) Growth was determined in CYS medium at pH
7.5. (b) Growth was determined in CYS medium at 75°C.
The pH of the medium at room temperature was adjustedwith HCl or NaOH. (c) Growth was determined in CYS
medium at 75°C.

Distribution of Thermaerobacter spp. in sewage sludge
We investigated distribution of Thermaerobacter spp.
in sewage sludge samples by PCR action using theprimer set as described above. However, no band at thetarget position was obtained from all samples by single
PCR (data not shown). This indicates that the populationof target extreme thermophiles in these samples would
be too low to detect by the single PCR. So a nested PCRtechnique was applied to increase sensitivity of thedetection. As a result, the target DNA fragment was
detected from sewage sludge compost (sludge C08 andC04, corresponding to lane 10 and 12 in Fig. 3a,respectively). It was unexpected that the target band was
not seen in sludge L04, but was seen in sludge C04, since69

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)Fig. 2. Neighbor-joining tree showing the phylogenetic position of strain SS and related taxa based on 16S rRNA genesequences, using 1264 bp sequences for the analysis. Gaps and unknown bases were eliminated from the sequences, andthe phylogenetic tree was constructed using the software package MEGA, version 4.0 15). The sequence of Geobacillus
stearothermophilus DSM 22T was used to root the tree. Bootstrap confidence values obtained with 1,000 bootstrap trials
are given at branching points. Scale bar = a nucleotide substitution per 100 nucleotides.

Fig. 3. Representative photographs of agarose gel electrophoresis results for nested PCR products.
(a)Detection of bacteria belonging to the genus Thermaerobacter in sewage sludge samples. Lane M, 100-bp DNA
Ladder Marker (Takara Bio); lane 1, T. marianensis JCM 10246T; lane 2, T. nagasakiensis JCM 11223T; lane 3, T.
subterraneus DSM 13965T; lane 4, T. litoralis JCM 13210T; lane 5, Thermaerobacter sp. strain SS; lane 6, Escherichia
coli JM109; lane 7, sludge L08; lane 8, sludge P08; lane 9, sludge D08; lane 10, sludge C08; lane 11, sludge L04; lane
12, sludge C04; lane 13, no DNA template.
(b)Effect of enrichment culture of sewage sludge samples on the detection of the target bacteria by the nested PCR.
Lane M, 100-bp DNA Ladder Marker; lane 1, sludge L04 with enrichment culture; lane 2, sludge L08 with enrichment
culture; lane 3, sludge P08 with enrichment culture; lane 4, sludge D08 with enrichment culture; lane 5, no DNA
template.

not always high-temperature environments. Thus it isdifficult to consider that sewage sludge is an “original”
habitat for extreme thermophiles. As a few percent of hot
spring water was contained in the sewage sludge in
Kagoshima city (personal communication), the “original”
habitat of these extreme thermophiles may be the hotspring water. Further investigation of the distribution andpopulation of Thermaerobacter in natural environment
will be of great interest.

analysis, strain SS was closely related to T. compostiwith 99.7% similarity. Also, some properties of strain SS
such as ability of colony-formation and some carbon
source utilizations including yeast extract requirement
were similar to those of T. composti. On the other hand,some characteristics of strain SS such as Gram-staining,
motility and spore-forming were different from those ofT. composti. Further investigation including their
DNA-DNA hybridization experiment and morphologicalinvestigation such as spore formation test should be
performed to identify strain SS. At least, our report
indicates that Thermaerobacter may exist widely
throughout nature. It was suggested that members of thegenus Thermaerobacter in sewage sludge compost would
come from sewage sludge, the source material of thecompost. However, both sewage sludge and compost are

Acknowledgement
We gratefully appreciate Professor Yoshihiko Sako and
Mr. Satoshi Kawaichi, Kyoto University, for their kinddiscussion on classification of strain SS.

70

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)ORIGINAL PAPER
NOTE

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol. 9 (2), 72-74

Zhang Y*, An R*, Yatsunami R, Sato M, Orishimo K,
Hatori Y, Fukui T and Nakamura S

Characterization of a Haloarchaeal GH Family 18 Chitinasewith Additional Acidic Amino Acids on Its Protein Surface
Department of Bioengineering, Tokyo Institute of Technology, 4259 Nagatsuta, Midori-ku, Yokohama 226-8501, Japan
Corresponding author: Satoshi Nakamura, nakamura.s.af@m.titech.ac.jp
Tel: +81-45-924-5765, Fax: +81-45-924-5837* Equal contribution
Received: December 6, 2010 / Revised: December 10, 2010 / Accepted: December 10, 2010
Abstract A chitinase (ChiN1) from Halobacterium
salinarum NRC-1 belongs to the glycoside hydrolase
family 18. According to the three-dimensional structure
model of ChiN1, Asn239 and Gln242 on a small helix
between Phe237 and Arg247 were targeted formutagenesis. Mutants N239D (Asn239 was replaced by
Asp) and Q242E (Gln242 was replaced by Glu) wereexpressed in Haloarcula japonica and then characterized.
Characterization of the mutants revealed that
halotolerancy could be improved by introducing an
acidic amino acid on the surface of ChiN1.

there were the promoter sequence from the geneencoding the cell surface protein of Ha. japonica10) andthe chiN1 structural gene including both signal peptide
and mature protein.
Generally, halotolerant proteins contain more acidic
amino acids on the protein surface than non-halotolerant
ones5). Hence, they could catch many water molecules toform a water shell around the proteins. Because of thewater shell, proteins might be protected from salting out
under high salt conditions. In this study, some ChiN1
mutants with more acidic amino acids were designed,
prepared and characterized in comparison with wild-type
ChiN1.
Three-dimensional (3D) structure model of ChiN1 wasconstructed by using the Discovery Studio program(Accelrys Software, San Diego, CA, USA) based on the
3D structure of other GH family 18 chitinases(http://www.pdbj.org/index_j.html). It is considered that
ChiN1 had a typical TIM barrel structure as otherchitinases belonging to the GH family 18 (Fig. 1A).
Although there were more acidic amino acids on thesurface of ChiN1 compare to other non-halotolerant
chitinases, a small helix between Phe237 and Arg247 had
no acidic amino acid (Fig. 1B). The positions Asn239
and Gln242 on this helix were targeted for mutagenesis
and were replaced by Asp and Glu, respectively.
Site-directed mutagenesis of chiN1 gene was carried out
with QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene, La Jolla, CA, USA) according to the
manufacturer's instruction. The oligonucleotide primers
used were as follows: 5´-CGTATTTCTCagACGCCGCCCAGTCGC-3´ (small letters and underlining represent
substituted bases and a restriction site created for
confirmation of mutagenesis, respectively) and its
complementary sequence for mutant N239D (Asn239
was replaced by Asp), and 5´-CTCGAACGCCGCCgAGTCGCAGGCCAG-3´ and its complementary
sequence for Q242E (Gln242 was replaced by Glu). The
expression plasmids pChiN9-N239D and pChiN9Q242E, encoding the mutants N239D and Q242E

Key words: Chitinase; Glycoside hydrolase (GH) family
18; Halotolerancy; Extremely halophilic archaeon;
Halobacterium salinarum
Chitin, one of the most abundant polysaccharides, ismade up of N-acetylglucosamine (GlcNAc) by β-1,4linkages. It exists widely in nature, such as componentsof fungal cell walls, shells of crabs and shrimps, andexoskeletons of insects. For utilization of chitin,degradation of a polymer is an important process.
Chitinase is an enzyme that can degrade chitin into small
molecules. Although many chitinases are identified frombacteria, fungi, plants and some kind of archaea, there is
no report about haloarchaeal chitinases. Recently,
genome sequencing of extremely halophilic archaeon
Halobacterium salinarum NRC-1 was completed6), and achitinase-homolog (named ChiN1) was found. The
deduced amino acid sequence revealed that ChiN1 had asignal sequence and therefore should be secreted
extracellularly. Hb. salinarum NRC-1 might degrade andutilize environmental chitinous compounds, although thestrain produced only small amount of ChiN1. Mature
ChiN1 would be composed of three domains: a probablechitin-binding
domain,afunctionally-unknown
polycystic kidney disease domain and a glycosidehydrolase (GH) family2) 18 catalytic domain. The geneencoding ChiN1 (chiN1 gene) was successfully
expressed in extremely halophilic archaeon Haloarcula
japonica5,9). In the expression plasmid pChiN9 for ChiN1,
72

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)Fig. 1. 3D structure of ChiN1 (A) and its enlargement (B).
Asn239 and Gln242 on a small helix between Phe237 and Arg247 were targeted for mutagenesis.

Fig. 2. Effect of NaCl concentration on activity of wild-type ChiN1 and mutants N239D and Q242E.
Chitinase activity was measured at 37˚C and pH 6.0 in the presence of 0.08-3.8 M NaCl. Circles, wild-type
ChiN1; triangles, mutant N239D; squares, mutant Q242E.

ChiN1 and mutants N239D and Q242E was measured atvarious pHs, temperatures and concentrations of NaCl.
The pH and temperature profiles of the mutants were
almost similar with those of wild-type ChiN1 (data notshown). On the other hand, both of the mutants showed
higher activity than wild-type ChiN1 in the presence of≥1.5 M NaCl, although the optimal NaCl concentrationsof these enzymes were the same (Fig. 2). From theseresults, it was indicated that halotolerancy was improvedby introducing only an acidic amino acid on the surfaceof ChiN1. Other mutants with more acidic amino acids
are now under construction. Hyper-halotolerant
chitinases might be useful for efficient degradation of
crab and shrimp shells preserved in salt.

respectively, were constructed, and then transformed into
Ha. japonica. Transformation of Ha. japonica was
performed using the modified polyethylene glycol
method1,8). Transformants were selected on agar plates
containing 8.0 μg/ml of plavastatin (a gift from Daiichi
Sankyo, Tokyo, Japan) instead of mevinolin. Ha.
japonica transformants obtained were grown on the
nutrient medium7) supplemented with pravastatin to alate exponential phase. Extracellular and whole cell
fractions were prepared by centrifugation at 10,000 x g
and 4˚C for 30 min, and then applied to
SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)4)
using a 7.5% gel. SDS-PAGE analysis revealed thepresence of a major protein band at about 70 kDa in theextracellular fractions of Ha. japonica carrying
pChiN9-N239D and pChiN9-Q242E, as well as thatcarrying pChiN9 (data not shown).
Chitinase activity was assayed by measuring the amountof reducing sugars librated from 0.2% Dai-chitosan M (agift from Dainichiseika Color & Chemicals, Tokyo,
Japan). The reducing sugars formed were measured by
the modified Schales method3). The activity of wild-type

Acknowledgment
This work was partially supported by the Salt Science
Research Foundation, No. 1020.

73

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)ORIGINAL PAPER
NOTE

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol. 9 (2), 75-77

Hamana Ka, Hayashi Ha and Niitsu Mb

A tertiary-branched tetra-amine, N4-aminopropylspermidine is a major cellular polyamine inan anaerobic thermophile, Caldisericum exile belonging to a new bacterial phylum, CaldisericaabFaculty of Engineering, Maebashi Institute of Technology, Maebashi, Gunma 371-0816, Japan.
Faculty of Pharmaceutical Sciences, Josai University, Sakado, Saitama 350-0290, Japan.

Corresponding author: Koei Hamana, koeihamana@gmail.com
Phone: +81-27-234-4611, Fax: +81-27-234-4611
Received: November 17, 2010 / Revised: December 8, 2010 /Accepted: December 8, 2010
Abstract Acid-extractable cellular polyamines ofthermophilic Caldisericum exile belonging to a newbacterial phylum, Caldiserica were analyzed by HPLC
and GC. The coexistence of an unusual tertiarybrancehed tetra-amine, N4-aminopropylspermidine with
spermine, a linear tetra-amine, as the major polyaminesin addition to putrescine and spermidine, is first reported
in the moderate thermophile isolated from a terrestrial
hot spring in Japan. Linear and branched penta-amines
were not detected. The novel cellular polyamine profile
found in the moderate thermophile has never been
observed within various bacteria and archaea previously
analyzed.

Anaerobic, moderately thermophilic, filamentous,
thiosulfate-reducing Caldisericum exile was isolated
from a terrestrial hot spring in Japan for the first
cultivated representative of the candidate phylum OP5and located in the newly validated bacterial phylum
Caldiserica(orderCaldisericales)19,20).
The
temperature range for growth is 55-70°C, with the
optimum growth at 65°C 20). The optimum growthoccurs at pH 6.5 and with the absence of NaCl 20).
Caldisericum exile NBRC 104410T was provided by
NBRC (Biological Resource Center, National Institutefor Technology and Evaluation, Kisarazu, Chiba, Japan)
and cultivated anaerobically under a N2/CO2 (80/20) at
65°C in a NBRC No.1039 medium, pH 6.520). Cells inthe stationary phase were harvested and homogenized inequal volumes of cold 1.0M perchloric acid (PCA).
Cell residues after the PCA extraction were hydrolyzed
with 6M HCl, at 110°C, for 20h. The PCA-extract and
HCl-hydrolysate were subjected to a Dowex 50W
column to concentrate polyamines1,15). The concentrated polyamines were analyzed by high-performanceliquid chromatography (HPLC) on a Hitachi L6000
high-speed liquid chromatograph using a column ofcation-exchange resin1,15). The concentrated polyamine
fraction was further purified on a column of Whatman
CM2315). Gas chromatography (GC) was performed ona Shimadzu GC-9A gas chromatograph after
heptafluorobutyrization of the purified polyamine
samples12,22).
Polyamines were identified by gas
chromatography-mass spectrometry (GC-Mass) using a
JEOL JMS-700 mass spectrometer12,22).
HPLC chromatogram of the concentrated acidextractable polyamine fraction from C. exile showed theoccurrence of putrescine (4; abbreviation for the numberof methylene CH2 between N), spermidine (34) and atetra-amine peak (Fig. 1A).
Spermine (343) andN4-aminopropylspermidine (3(3)4) were eluted in thetetra-amine peak by HPLC.
When the purified
polyamine fraction was analyzed in GC, the twotetra-amines were detected (Fig. 1B) and identified by
GC-Mass. Roughly estimated cellular concentrations( μ mol/g wet weight of cells) of putrescine (4),Key words: Caldisericum, polyamine, tertiary branchedtetra-amine, thermophile
The chemotaxonomic and phylogenetic significance ofthe cellular distribution of quaternary branchedpenta-amines, N4-bis(aminopropyl)norspermidine andN4-bis(aminopropyl)spermidine within thermophilic
bacteria belonging to the domain Bacteria andthermophilic archaea belonging to the domain Archaea
has been proposed6-10).
The occurrence of thehigh-basic quaternary branched penta-amines is possibly
associated with their thermophily to stabilize cellular
nucleic acids and other acidic cellular components underhigh thermal environments7,23). On the other hand,tertiary branched tetra-amines, N4-aminopropylnorspermidine and/or N4-aminopropylspermidine have been
detected as a minor polyamine component selectively inthe bacterial and archaeal thermophiles containing thequaternary branched penta-amines as a major polyamine.
In our course of the studies on cellular polyamine
analyses of newly validated bacterial and archaeal
thermophiles, a novel polyamine profile was found in a
new member of thermophilic bacteria, Caldisericum
exile, in which an unusual tertiary branched tetra-amine,
N4-aminopropylspermidine was detected as a major
polyamine in the absence of quaternary branchedpenta-amines.

75

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)spermidine (34), spermine (343) and N4-aminopropylspermidine (3(3)4) were 0.33, 0.52. 0.30 and 0.60,
respectively. Norspermidine (33), norspermine (333),
N4 -aminopropylnorspermidine (3(3)3) and thermospermine (334) were not found. Branched pentaamines, N4-bis(aminopropyl)norspermidine (3(3)(3)3),N4-bis(aminopropyl)spermidine(3(3)(3)4)
andN4-aminopropylspermine(3(3)43),
andlinearpenta-amines were not detected. Polyamines were notdetected in the HCl-hydrolysate of the cell residues,
indicating that the cellular polyamines of C. exile wereextracted completely by PCA extraction.
Many extreme-/hyper-thermophiles belonging to thebacterial orders Aquificales (of the phylum Aquificae),
Thermales (of the phylum Deinococcus-Thermus),Thermodesulfobacteriales (of the phylum Thermodesulfobacteria),
Thermoanaerobacteriales
andClostridiales(ofthephylumFirmicutes),
Sphingobacteriales (of the phylum Bacteroidetes) andRubrobacterales (of the phylum Actinobacteria)
2,3,5,6,10,11,13,17), and archaeal orders Methanococcales,
Archaeoglobales and Thermococcales (of the phylum
Euryarchaeota)4,6,8,9,16), grown at 70-100°C, contained
quaternary branched penta-amines as a major polyamine
and tertiary branched tetra-amines as minor polyaminecomponents.
Some extreme-/hyper-thermophiles
belonging to the bacterial orders Thermotogales (of thephylum Thermotogae) and Nitrospirales (of the phylum
Nitrospirae)6,10,17) and archaeal orders Sulfolobales andDesulfurococcales (of the phylum Crenarchaeota)8,9)
contained linear tetra-amines and penta-amines andlacked branched tetra-amines and penta-amines.
Although many moderate thermophiles grown at
55-65℃ were widespread within various bacterial andarchaeal phyla, they contained a linear tetra-amine,
spermine (343) alone, as the major common tetra-amine
and lacked penta-amines2,5,6,10,13,17,18).
The coexistence of N4-aminopropylspermidine (3(3)4)
with spermine (343) as the major polyamines in theabsence of N4-bis(aminopropyl)spermidine (3(3)(3)4),
was first found in the moderate thermophile, C. exile
grown at 55-70°C with optimum growth at 65°C, as
shown in the present study. The occurrence of the twotetra-amines is possibly associated with its moderate
thermophily. However, this novel and simple cellularpolyamine profile has never been known in archaea aswell as other bacteria except C. exile. A tertiarybranchd penta-amine, N4-aminopropylspermine (3(3)43)
has been found in extremely/moderately thermophilic
Bacillus, Geobacillus, Saccharococcus, Caldicellulosiruptor and Thermoanaeromonas species grown at
14,17)
55-70°Candextremely
thermophilic“ Calditerricola ” species grown at 75-80°C 21)
belonging to the bacterial phylum Firmicutes but notdetected in C. exile, as shown in the present study. In
contrast, significant amount of N4-aminopropylspermidine (3(3)4) was not found in the former six
thermophiles. However the degree of thermophily inbacterial and archaeal thermophiles is estimated roughly
and cannot be defined exactly. Although analyses of
the cellular polyamine levels of C. exile under different

growth conditions are being planned, its uniquepolyamine profile suggests the phylogenetic uniquenessof the polyamine synthetic ability of C. exile located in
the new phylum, Caldiserica.

Fig. 1. HPLC chromatogram (A) and GC chromatogram(B) of the acid-extracted polyamines from Caldisericum
exile NBRC 104410T grown at 65 ℃ . The arrows
indicate the elution position or retention position of 334,
3(3)3, 3(3)(3)4 and 3(3)(3)3, respectively. Long linear
and branched polyamines were concentrated in the
purified polyamine sample for the GC. Abbreviations
for polyamines: 4, putrescine; 34, spermidine; 343,
spermine; 334, thermospermine; 3(3)3, N4 -aminopropyl
norspermidine; 3(3)4, N4 -aminopropylspermidine;
3(3)(3)3, N4-bis(aminopropyl)norspermidine; 3(3)(3)4,N4-bis(aminopropyl)spermidine.

Acknowledgment
We would like to thank NBRC (Dr. K. Mori) for
supplying Caldisericum exile.

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Mini Review
Okochi M

Functional analysis of prefoldin from hyperthermophilic archaea and its application
Department of Biotechnology, School of Engneering, Nagoya University, Furo-cho, Chikusa, Nagoya 464-8603, Japan
Received: October 18, 2010 / Accepted: November 22, 2010
Keywords: prefoldin, chaperone, organic solvent tolerance

超好熱性古細菌由来プレフォルディンの機能解析とその利用
名古屋大学

大学院工学研究科
大河内

極限環境で生育する古細菌のタンパク質は熱安定性が高いばかりでなく有機溶媒に対する耐性が高い
ことが示唆されている。プレフォルディンは、酵母の細胞質において細胞骨格の形成に必要な遺伝子
GIM (Genes Involved in Microtuble Biogenesis) として同定され、変性中間状態にある細胞骨格タンパク質に結合し、それを細胞質シャペロニンへ受け渡す機能を有することからプレフォルディンと命名されている 1, 2, 4, 13, 15)。我々は、プレフォルディンとシャペ
ロニンの協調作用を解析するため、古細菌の中でも特に単純な分子シャペロンシステムを有する超好熱性古細菌に着目し、Pyrococcus horikoshii OT3 由来プ
レフォルディンの機能解析を行った。さらに、プレフォルディンを大腸菌内で発現させて、その有機溶媒耐性について検討し、微生物を利用した有機溶媒
混合系における有用物質生産への産業利用を目指した。
超好熱性古細菌 P. horikoshii OT3 のゲノム配列からプレフォルディンの α、β サブユニットをコードする遺伝子を用いた発現系を構築し、大腸菌で生産した。プレフォルディン(PhPfd)は、豚心臓由来クエ
ン酸合成酵素の熱凝集を阻害する他、変性 GFP のリ
フォールディングを阻害し、変性中間状態のタンパ
ク質と結合することが示された 11)。さらに、PhPfdとシャペロニンが直接結合することを免疫沈降及び表面プラズモン共鳴により解析した。そこで、Phpfdα
および Phpfdβ の各末端欠損体を作成し、これらを再構成し、基質およびシャペロニンとの結合能や分子シャペロン活性を測定した。その結果、PhPfdβ の C
末 6-8 残基が変性タンパク質認識に重要な部位であり、PhPfdα C 末 8 残基欠損および β C 末 5 残基に、

美奈

シャペロニンとの結合に重要な部位が存在することが示唆された 9,10)。以上のことから、古細菌のプレフォルディンにおいても、そのコイルドコイルの先端部分で変性タンパク質と結合し、協調的にシャペロン活性を示すことが明らかとなった。
好熱菌由来の蛋白質は熱や有機溶媒等に対する安定性が高いことから、新しいデバイス材料 3)など、様々な産業利用が可能であると考えられている。特に、化学プロセスの一部をバイオプロセスで代替することで、省エネルギー、低コストなグリーンバイ
オテクノロジーという視点が注目されている。実際の化学プロセスを考えた場合には、様々な物質を溶解できるという利点から極性が高くて疎水性が低い
溶媒、すなわち微生物に対して毒性の高いトルエン、
p-キシレン、シクロヘキサンといった有機溶媒存在下でも活性を示す酵素の探索や微生物の育種が進められている。高濃度のトルエン中で生育可能な微生物の存在が報告されて以来、微生物の有機溶媒耐性機構に関する研究が進められてきた。これまでに、微生物の有機溶媒耐性機構の一部概要が明らかとなり、有機溶媒排出ポンプの存在、急速な細胞膜修復機構、細胞膜透過性の低下、細胞膜の硬化、細胞表面の疎水度の低下などの関与が明らかとなっている
5,12,14)。我々は、微生物の有機溶媒に対する耐性機構を解析するため、DNA マイクロアレイにより大腸菌の有機溶媒添加後の時系列データの情報解析に基づいた溶媒耐性遺伝子の探索を行ってきた 7,8）。有機溶
媒耐性を獲得した大腸菌の変異株による DNA マイ
クロアレイデータは、有機溶媒耐性を誘発する細胞のプログラムの変化をとらえており、耐性を獲得する上で必要な遺伝子や代謝経路について知見が得ら78

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)れるものと考えられる。有機溶媒添加により、高発現した遺伝子群に多くのストレス応答タンパク質がみられたことから、分子シャペロンを利用した耐性化を検討した。Phpfd 導入株は、オクタン、ヘキサン混合溶媒(1:1,v/v)で増殖でき（図）、細胞内の溶媒取込量は、コントロール株に比べ低く抑えられた。
PhPfd は、変性中間状態にあるタンパク質と結合し有機溶媒との接触による変性を抑えることで、細胞内の溶媒取込量を低く保ち、大腸菌の有機溶媒耐性を向上することが示唆された 6)。これより、超好熱性古細菌由来プレフォルディンは、幅広いタンパク質に結合して変性中間状態を保持することができ、溶媒存在下での微生物を利用した有用物質生産への展開も期待される。極限環境で生育する微生物群のタンパク質は、産業利用の分子基盤であることから、
今後ますます活用されることが期待される。

Prefoldin: Cofactor of group II chaperonin
Overexpression of prefoldin from
Pyrococcus horikoshii OT3 in E. coli BL21
Octane:hexane=1:1
Control(pET23b)

PhPFD(wtα wtβ)

Observation of E. coli cells
overexpressing PhPFD in
two-phase culture withoverlaid octane and hexane(1:1 mixture).

Control (pET23b)

PhPFD (wtα wtβ)

PhPFD (tc8α tc8β)

Prefoldin mutants withlow chaperone activity

PhPFD (tn17α tn10β)
107

106

105

104

103

102
[cells/spot]

図 超好熱性古細菌由来プレフォルディ
ンによる有機溶媒耐性の向上

引用文献
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79

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80

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol. 9 (2), 81-89

Mini Review
Tomita S and Shiraki K

Solution additives to suppress protein deterioration:
Non-covalent aggregation and covalent modification
Institute of Applied Physics, University of Tsukuba, 1-1-1 Tennodai, Tsukuba, Ibaraki 305-8573, Japan
Received: October 24, 2010 / Accepted: December 4, 2010

タンパク質の劣化を抑制する溶液添加剤：
非共有結合的な凝集と共有結合的な修飾
筑波大学物理工学系

冨田

峻介、白木

賢太郎

タンパク質のネイティブ構造を安定化するといわれている。実験的には、1 M 程度の安定化剤を加えると、タンパク質の変性温度を 5~10°C 増加させることができる 6)。安定化剤によるタンパク質の安定化機構は、水中から安定化剤溶液中にアミノ酸を移したときの自由エネルギー差（移相エネルギ
ー変化: ΔGtr）によって説明できる。タンパク質を構成する多くのアミノ酸は、安定化剤溶液に対して正の ΔGtr を示す。つまり、タンパク質を構成す
るアミノ酸は、水溶液中と比べて安定化剤溶液中では不安定なので、溶媒への露出表面積が少ない構造の方が好ましい。その結果、安定化剤溶液中
では、タンパク質は変性構造よりもネイティブ構
造が相対的に安定化される。
水溶液中でタンパク質はしばしば非晶質な凝集体を形成する。通常、タンパク質は疎水性部位を立体構造内部に溶液から隔離するようにフォールドする（図 1（A）
）が、凝集も同じ機構で説明ができる（図 1（B））16)。すなわち、タンパク質の凝集は、変性によって溶媒に露出した疎水性領域
間の非特異的な相互作用が駆動力になって進む。
そこで、疎水性アミノ酸の水中への溶解度を増加させて凝集をふせぐために、グアニジンや尿素といった変性剤を凝集抑制剤として用いることがある。変性剤はタンパク質の凝集抑制剤として機能するが、同時にタンパク質の立体構造を不安定化するため、凝集抑制と変性作用がトレードオフの関係にあるという問題を抱えている。
凝集抑制剤は疎水性部分の溶解度を増加させる【はじめに】
一般にタンパク質は水溶液中で不安定であり、熱や pH 変化などのストレスによって容易に劣化して、失活してしまう。タンパク質の劣化は大きくわけて物理的過程と化学的過程がある。物理的過程は主に、タンパク質の立体構造の変性にともなう非共有結合的な凝集がかかわる。化学的過程
は主に、タンパク質を構成するアミノ酸の化学修
飾や、共有結合的な架橋形成がかかわる。本総説
では、水溶液中でのタンパク質の劣化に関する二つの過程と、劣化を抑制する溶液添加剤を紹介する。
【物理的過程によるタンパク質の劣化とその抑制】
タンパク質の立体構造は、水素結合や塩橋、疎水効果、ファンデアワールス力などの非共有結合
的な相互作用によって安定化されている。しかし立体構造の形成によってエントロピーが減少する
ために、ネイティブ構造は変性構造に比べて、自由エネルギーとしてみるとわずかな安定性を持つにすぎない。このネイティブ構造と変性構造との間のぎりぎりの安定性（marginal stability）のために、溶液条件が変わると容易に変性して失活する。
変性を抑制するために、安定化剤をタンパク質溶液に添加することがある。安定化剤は、硫酸アン
モニウムに代表されるコスモトロープと、ポリオールや糖、アミノ酸といったオズモライトに分類される 4,56)。前者は主に溶液の表面張力を増加させることによって、後者は排除体積効果によって、
81

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)ている。最近では、どのようなタンパク質もアミ
ロイドを形成しうるコア配列を持つことが指摘されている 19)。アミロイド形成の駆動力は、コア配列に含まれるアミノ酸の主鎖の間のクロス β 構造
だけでなく、アミノ酸の側鎖の間の複雑な相互作用が関係する 44)。そのため、アミロイド形成を抑制する溶液添加剤をデザインすることは難しい。
成功している例としては、コア配列中の芳香族アミノ酸の相互作用が主な駆動力のアミロイド形成に、ポリフェノールを添加する方法がある 45)。これと似た例として、アミロイドのコア配列の鋳型として働くペプチドを添加する方法がある 50)。これらの溶液添加剤は、ネイティブ構造の安定化剤
や凝集抑制剤とは異なり、低濃度でも高い効果を発揮する。つまり、コア配列に直接結合する特異的なリガンドであると見なせるだろう。興味深いことに、アルギニンはアミロイド形成を抑制せず
34)、タンパク質変性剤はむしろアミロイド形成を促進する 22,40,53)。非晶質のタンパク質凝集を抑制する添加剤とは異なり、アミロイド形成を抑制する
汎用性の高い添加剤は、多点的かつ特異的な相互作用能から綿密にデザインする必要があるのだろう。

ので、タンパク質を変性させる作用があると考えられてきた。しかし、アミノ酸の一種であるアル
ギニンは、タンパク質の凝集を抑制するが変性させない優れた性質を持つ 6,35,38,46,52)。アルギニンによる凝集抑制機構は詳細が明らかになっていないが、アルギニン側鎖のグアニジウム基とタンパク質表面の芳香族アミノ酸側鎖の間の特異的な相互作用による水中での疎水性部分の安定化が関与していると考えられている 5,26,27,29,52)。興味深いことに、アルギニンの主鎖カルボキシル基をアミド化したアルギニンアミドはより効果的に凝集を抑制する 23)。ポリエチレングリコール（PEG）も、タ
ンパク質の変性作用がほとんどない優れた凝集抑制剤として古くから利用されている 11)。PEG は両親媒性の高分子なので、変性状態のタンパク質と複合体を形成する 3,10)ため、分子間会合を抑制できるのだろう。アルギニンやアミノ酸誘導体、PEG
は、タンパク質の結晶化 28)やリフォールディング
11,14,23,38,52)といった凝集体形成が競合する過程を相対的に促進することを目的に用いられている。
タンパク質は適当な溶媒条件で、アミロイドと呼ばれる線維状の凝集体を形成する（図 2）7,15)。
アミロイドはさまざまな疾患と関連しているため、凝集の形成や抑制に関する研究が精力的に行われ

図 1 疎水性コアの相互作用による凝集機構。
（A）タンパク質フォールディング。変性状態のタンパク質は部分的に折り畳まれて（四角部分）、最終的にネイティブ状態に至る。その際、疎水性コア（赤）が親水性部位（青）の内部に取り込まれる。（B）疎水性
領域間の相互作用による非晶質凝集体の形成。変性により露出した疎水性領域が分子間で会合して凝集体が形成する。

図 2 アミロイド線維の形成モデルと構造。
（A）アミロイドの形成機構。タンパク質が部分的に変性し、露出したコア配列が分子間で会合してアミロイド化する。
（B）ニワトリ卵白由来リゾチームのアミロイド線維の電子顕微鏡画像。スケールバーは 500 nm。
82

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)よびジスルフィド結合の数が変化しないため、連鎖的に反応が起こる。分子間でもジスルフィド交換反応が起こるのでしばしば凝集体形成の原因となる 57)。システインが全てジスルフィド結合を形成しているタンパク質でも、β 脱離によってチオール基が生産されるため、ジスルフィド交換反応が起こりうる 55)。
iv) メチオニンおよびシステインの酸化
アミノ酸の主鎖や側鎖はいずれも酸化剤によって酸化されうるが、なかでもメチオニンとシステ
インの側鎖は酸化されやすい 13)。これらのアミノ酸の酸化反応は活性酸素（ROS）だけでなく溶存
酸素によっても起こるので、試験管中でのタンパ
ク質の取り扱いの際にも注意が必要である 17)。事実、メチオニン側鎖の酸化反応はタンパク質の精
製や貯蔵中にも頻繁に起こり、タンパク質の熱力学的安定性や酵素活性を低下させることが知られている 9,13)。また、システインのチオール基は様々な金属原子と配位しうるが、熱処理によってシステイン側鎖が酸化すると配位能を失うこともある
39)。基本的にメチオニン側鎖が酸化するとメチオ
ニンスルホオキシドが生じるが、ごく一部はさらに酸化反応が進行してメチオニンスルホンが生じる（図 3（D））。一方、システインの酸化過程は主にジスルフィド結合の形成であるが、同時にスルフェン酸を生じる別の過程も競合する。システイ
ンもメチオニンと同様に酸化がさらに進行して、僅かにシステイン酸が生成する。
v) アスパラギン酸の加水分解
弱酸性ではアスパラギン酸の C 末端側のペプチ
ド結合は加水分解されやすい。加水分解によってタンパク質は断片化するため、電気泳動や質量分析によるタンパク質の解析時に問題になることがある 20)。この反応は、アスパラギン酸側鎖のカルボキシル基が主鎖のカルボニル基に求核攻撃することで起こる（図 3（E））30)。求核攻撃によってア
スパラギン酸の C 末端側で環状中間体が生成する。
その後、加水分解が起こって、ペプチドが断片化する。

【化学的過程によるタンパク質の劣化とその抑制】
高温でも立体構造を維持できる好熱性タンパク質でも不可逆な化学反応が原因で劣化しうる 36)。
頻繁に見られる化学修飾として、i) アスパラギン
およびグルタミンの脱アミド化、ii) ジスルフィド
結合の β 脱離、iii) ジスルフィド交換反応、iv)メ
チオニンおよびシステインの酸化、v) アスパラギン酸の加水分解が挙げられる。まず、これらの化
学修飾機構について述べる。
i) アスパラギンおよびグルタミンの脱アミド化
アスパラギンの脱アミド化は最もよく見られる
化学修飾の一つである 59)。医薬品としての組換え抗体を製剤化する過程でも頻繁に生じてしまい、
最終生産物の不均一化の主な原因になっている 8)。
脱アミド化は質量分析用のタンパク質を調製する
過程でも生じてしまうので、問題になっている 31)。
脱アミド化は酸性から塩基性にかけて広い pH 領域で起こりうるが、加水分解の機構が pH によって変わる 43)。すなわち、アスパラギンは、酸性では加水分解して直接アスパラギン酸になるが、中性から塩基性では分子内環化反応を経由してアスパラギン酸とイソアスパラギン酸の混合物を生じる（図 3（A））。後者の反応では、まず C 末端側のペプチド結合の窒素原子が側鎖のカルボニル基に求核攻撃してスクシンイミド中間体を形成する。ス
クシンイミド中間体は不安定なので速やかに加水分解する。グルタミンも同様の機構で脱アミド化
するが、アスパラギンと比べて反応が 10 倍ほど遅い。
ii) ジスルフィド結合の β 脱離
ジスルフィド結合はシステイン間の架橋によってタンパク質のネイティブ構造を安定化する。しかしジスルフィド結合は、中性から塩基性では β脱離して切断されやすい 55)。ジスルフィド結合のβ脱離は、脱アミド化と同様に、抗体の貯蔵過程
12)や質量分析用のタンパク質の調製過程 58)でも起
こり、タンパク質の劣化の主な原因になっている。
β 脱離は塩基触媒によるシステインの Cα-H 結合の脱プロトン化が引き金となって起こり、分解生成物としてチオシステインとデヒドロアラニンを生じる（図 3（B））2)。チオシステインは、さらに分解・反応して様々な硫黄含有化合物に変化する。
一方、求核性の高いデヒドロアラニンは、リジンの ε-アミノ基と反応して架橋を形成する。
iii) ジスルフィド交換反応
システイン側鎖のチオール基は求核性が高く、中性から塩基性で脱プロトン化したチオレートイ
オンがジスルフィド結合の硫黄原子に求核攻撃してジスルフィド交換反応を起こす（図 3（C））。ジ
スルフィド交換反応は、反応前後でチオール基お

化学的過程によるタンパク質の劣化は、以上の５種類の化学修飾が主に関係する。Klibanov らは、弱酸性から弱塩基性条件下でのニワトリ卵白リゾ
チームとウシ膵臓リボヌクレアーゼの熱失活機構
は上述の化学的過程の組み合わせであることを報告している（表 1）1,60)。特に中性では、どちらのタンパク質の熱失活もアスパラギンの脱アミド化とジスルフィド結合の β 脱離、ジスルフィド交換
反応の３種類の化学反応が原因になる。つまり、リゾチームとリボヌクレアーゼ A の熱失活は、共83

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)きの酵素活性の半減期（τ1）を比較したところ、線形の相関が見られた（図 6（A））
。この結果は、リゾチームの熱失活を抑制した溶液添加剤はリボ
ヌクレアーゼ A の熱失活も同様に抑制したことを示しており、溶液添加剤によるタンパク質の熱失活の抑制機構が普遍的に説明できることを示唆する。そこで、これらのタンパク質の熱失活の原因となる上述の脱アミド化と β 脱離への溶液添加剤の影響を調べた。その結果、タンパク質の熱失活抑制効果が高いスペルミジンはリゾチームとリ
ボヌクレアーゼ A の脱アミド化と β 脱離を著しく抑制することがわかった（図 6（B））。そこで、様々な溶液添加剤存在下における脱アミド化および β脱離の時間変化から、タンパク質あたり脱アミド化が平均 1 回起きる時間（τ2）
、β 脱離が平均 0.2
回起こる時間（τ3）を見積もり、それぞれを酵素
活性の半減期と比較したところ、いずれも線形の相関があった（図 6（C））
。つまり、タンパク質の
熱失活の抑制は、化学修飾の抑制と良く一致するわけである。以上の結果から、溶液添加剤は熱による化学修飾を抑制するために、タンパク質の熱失活を抑制することが示唆される。しかしながら、ここで新たな疑問が生じる。なぜこれらの溶液添加剤が化学修飾を抑制するのかという疑問である。
今後、溶液添加剤の応用研究に加えて、化学修飾の抑制の分子機構の解明を進めていきたいと考えている。

有結合的な反応が律速になっていることを意味する。実際に、熱失活したタンパク質を塩酸グアニ
ジンで溶解したのちリフォールディングさせても酵素活性は回復しない。つまり、非共有結合的な相互作用による凝集形成は熱失活の原因ではないという説を支持する。
これまでに著者らのグループは、中性におけるリゾチームの熱失活は、アミノ酸やアミン化合物
を溶液に添加すると抑制できることを報告してきた（図 4）。例えば、アミノ酸によるリゾチームの
熱失活の抑制能を網羅的に調べたところ、アルギ
ニンやリジンといった陽イオン性側鎖を有するアミノ酸が効果的に失活を抑制することを見出した
47)。アミノ酸以外にも、アンモニウム塩 24)やポリ
アミン 18,25,32,41)といった陽イオン性化合物は顕著に熱失活を抑制する。ほかにもアミノ酸の主鎖カルボキシル基をエステル化やアミド化したアミノ酸誘導体もリゾチームの熱失活抑制に効果が高い
37,38,48,49)。一例として、1.0 mg/ml のリゾチームに
200 mM のスペルミジンを加え、98°C で任意時間
加熱した後の残存活性の経時変化を測定したところ、スペルミジンによって酵素活性の半減期が約 9倍も増加した（図 5）。タンパク質の熱失活を抑制
する上述の溶液添加剤の作用機序が、著者らの最近の研究で明らかになりつつある（Tomita et al.,Biotechnol. Prog., accepted）。1.0 mg/ml のリゾチー
ムおよびリボヌクレアーゼ A の溶液に 200 mMのさまざまな添加剤を加えて、98°C で加熱したと

図 3 タンパク質に生じる化学修飾。
（A）アスパラギンの脱アミド化反応、（B）ジスルフィド結合の β 脱離反応、（C）ジスルフィド交換反応、（D）メチオニンおよびシステインの酸化反応、（E）アスパラギン酸の加水分解反応。
84

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)表 1 リゾチームとリボヌクレアーゼ A の熱失活速度定数と各機構の寄与。
Hen egg white lysozyme, 100°C 1)

Bovine pancreatic ribonuclease A, 90°C 60)

Rate Constant (h-1)

Rate Constant (h-1)

Irreversible Thermoinactivation
Directly measured

pH 4

pH 6

pH 8

pH 4

pH 6

pH 8

0.49

4.1

50

0.13

0.56

23.4

0.45

4.1

18

0.02

0.15

0.8

6

0.05

2.8

32

0.31

19.4

overall process
Due to individual

Deamidation of Asnmechanisms

residues
Hydrolysis of Asp-X

0.1

peptide bonds
Destruction ofdisulfide bonds
Formation ofincorrect structures

図 4 タンパク質の熱失活を抑制する添加剤。

図 5 スペルミジンによるリゾチームの熱失活の抑制。
200 mM スペルミジン, 1.0 mg/ml リゾチーム, 50 mM リン酸緩衝液 (pH 7.0)を 98°C で任意時間
加熱処理した後に残存活性を測定した。
85

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)図 6 添加剤によるタンパク質の熱失活の抑制機構。
200 mM 各種溶液添加剤、1.0 mg/ml タンパク質、50 mM リン酸緩衝液 (pH 7.0)を 98°C で熱処理したときの残存酵素活性の半減期（τ1）、タンパク質あたり脱アミド化が平均 1 回起きる時間（τ2）、β脱離が平均0.2 回起こる時間（τ3）を見積もった。溶液添加剤にはアルギニンおよびグリシン、リジン、グアニジン、
グリシンアミド、塩化ナトリウム、塩化アンモニウム、スペルミジンを用いた。
（A）種々の溶液添加剤存在下におけるリボヌクレアーゼ A およびリゾチームの τ1 の比較。
（B）スペルミジン存在下における熱による脱アミド化および β 脱離反応。98°C で 20 分間加熱後、脱アミド化および β 脱離を定量化した。
（C）種々の添加剤存在下におけるリボヌクレアーゼ A およびリゾチームの τ1 と τ2 および τ3 の比較。

ると良い。生体内でのタンパク質の劣化にも、溶媒環境が関係していると考えている。溶液添加剤の研究は、タンパク質の構造や機能を理解する新しい切り口になるだろう。

【おわりに】
好熱菌由来のタンパク質は高い熱力学的安定性を備えており、高温でも変性せずに機能を維持できる。しかし高温では化学修飾を受けやすくなる
54)。好熱菌由来タンパク質を構成するアミノ酸の組成を常温菌由来タンパク質のものと比較すると、熱に不安定なアスパラギンやグルタミン、システ
イン、メチオニンは確かに少ない 21,33,51,61)。しかし一定の比率でこれらのアミノ酸が好熱性タンパク質にも存在するという事実は無視できない。タン
パク質の熱による劣化を防ぐために、細胞内に存在する低分子化合物が役割を担っている可能性があるだろう。たとえばポリアミンは好熱菌体内に高濃度存在しており、主に核酸の構造の物理的な安定化に役立っているという報告がある 42)。しかし上述どおり、ポリアミンはアミノ酸の化学修飾にともなうタンパク質の劣化を防ぐ役割も担っているのだろう。
本総説で述べてきたように、タンパク質の劣化
は、溶媒環境によって影響を受ける。したがって、試験管内でタンパク質を取り扱う際には、タンパ
ク質の劣化を抑制できる添加剤を意識的に使用す【引用文献】
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Mini Review
Cornette R

Identification of anhydrobiosis-related genes in the Sleeping Chironomid(Polypedilum vanderplanki)
Anhydrobiosis Research Unit, National Institute of Agrobiological Sciences, 1-2 Ohwashi, Tsukuba, Ibaraki, 305-8634
Japan
Received: November 11, 2010 / Accepted: December 4, 2010
Keywords: Polypedilum vanderplanki, anhydrobiosis, oxidative stress, LEA proteins, trehalose

ネムリユスリカ（Polypedilum vanderplanki）の極限乾燥耐性（アンヒドロビオシス）に関連した遺伝子の探索（独）農業生物資源研究所・乾燥耐性研究ユニット

Abstract Some organisms are able to survive toalmost complete desiccation, entering a latent state
known as anhydrobiosis. The sleeping chironomid(Polypedilum vanderplanki) lives in the semi-arid
regions of Africa and its larvae can survive desiccationin an anhydrobiotic form during the dry season. In
order to unveil the molecular mechanisms of thisdesiccation tolerance, an anhydrobiosis-relatedExpressed Sequence Tag (EST) database was obtained
from the sequences of three cDNA libraries constructedfrom P. vanderplanki larvae after 0h, 12h and 36h ofdesiccation. ESTs were classified according to gene
ontology categories, and putative expression patterns
were deduced for all clusters on the basis of thenumber of clones in each library; expression patterns
were confirmed by real-time PCR for selected genes.
Results suggest that the oxidative stress response playsa central role in successful anhydrobiosis. Similarly,
protein denaturation and aggregation may be prevented
by marked up-regulation of heat shock proteins (Hsps)
and of the late embryogenesis abundant (LEA) proteins,which are anhydrobiosis specific. A third major featureis the increase in trehalose synthesis and the expressionof various transporter proteins allowing the distributionof trehalose and other solutes to all tissues.

コルネット・リシャー

極限的な乾燥耐性、アンヒドロビオシスとは？
生物にとって、水は必要不可欠な物質であり、生命活動維持のために体内の水分を保たなければならない。生物種によって体内の水分含量は異なるが、一般的に体重の約 60〜80％を占める。当然ながら、脱水は細胞に大きな障害を与える。人間の場合、体内の水分を 14%ほど失うと深刻な状態になり、死に至ることもある。したがって、陸生生物にとって、乾燥の危険性は乗り越えなければならない普遍的な問題である。特に乾燥地帯では脱水を避けるために大きく分けて二つの生命戦略が進化した。多くの生物は、移動して乾燥地帯から離れたり、休眠することによって低代謝状態に変化することで不必要な水分消費を抑えたり、表皮を厚くして物理的に脱水を防いだりすることで、極度な乾燥を回避している（乾燥回避の戦略）。一方、一部の生物は敢えてその場で乾燥してしまい、
究極の休眠状態で環境条件の改善を待つ戦略を選択した（乾燥許容の戦略）。その究極な休眠状態はアンヒドロビオシスとよばれる。体内の水分含量が 3%以下まで落ちる脱水状態と測定限界以下の無代謝状態はアンヒドロビオシスの特徴である 7)。
アンヒドロビオシスを発揮できる生物は様々な分類群に見られる。例えば、細菌、酵母、カビの胞子、植物の種子や花粉、復活草などが挙げられる。
しかし、アンヒドロビオシス能をもつ動物は、甲90

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)能力を獲得できずに死んでしまう 15,9)ことから、トレハロース蓄積がアンヒドロビオシスに必要な条件の一つであることが示唆された。
アンヒドロビオシス状態のネムリユスリカ幼虫
は、乾燥以外のストレスに対しても耐性（交叉耐性）を示す。アンヒドロビオシス状態のネムリユ
スリカ幼虫を-270°C から 90°C までの温度に曝しても、蘇生能力が保たれていた。また、真空と 1.2
GPa の高圧を経験しても蘇生できる。更に化学物
質に対する耐性も確認されている。例えば、アセトンやエタノールに浸けても乾燥幼虫の蘇生能力は維持される。また、ネムリユスリカの放射線耐性も非常に高く、5 kGy のγ線を浴びても乾燥幼虫は蘇生した。しかし、次世代を残せる暴露線量の限界は 200 Gy と比較的に低かった 14)。ちなみに人間はわずか 4 Gy で死に至る。以上のネムリユスリ
カの様々な交叉耐性の秘密は、アンヒドロビオシ
スのメカニズムを解明することで説明できるであろう。

殻類の休眠卵、ワムシ、クマムシ、線虫などの微小生物に限定的に多く見つけることができる 21)。
その中、昆虫の一種であるネムリユスリカ（Polypedilum vanderplanki）の幼虫は、その極限的な乾燥耐性を示す最大かつ最高等な動物として知られている。一般的に、アンヒドロビオシス状態の生物は蘇生能力を保ちながら、数十年間も乾燥に耐え続けることができる。一番有名な例として、
およそ 1200 年前の蓮の種子が発芽した報告がある
18)。ちなみに、アンヒドロビオシス状態の生物は乾燥耐性だけではなく、様々な環境ストレスにも交叉耐性を示すことが知られている。アンヒドロ
ビオシス状態になった様々な無脊椎動物は-272°Cから 151°C までの温度に曝されても蘇生可能である。圧力に対しても同様で、真空という超低圧から 1.2 GPa の超高圧にも耐えられる。更に、アンヒ
ドロビオシスでは驚くべき放射線耐性も見られる。
乾燥クマムシは 7 kGy のγ線を浴びても蘇生できた。しかし、1 kGy 以上の照射では不妊になる 16)。
ネムリユスリカの乾燥耐性
アンヒドロビオシス能をもつ昆虫であるネムリ
ユスリカは、アフリカの半乾燥地帯に分布している 15,6)。ネムリユスリカの幼虫は花崗岩の岩盤の上にある小さな水たまりの中に生息しており、その水たまりが干上がってしまうと、その幼虫もカラカラに乾いて、アンヒドロビオシス状態に変化する。乾燥した幼虫は 8 ヶ月間にも及ぶ乾季に耐え、雨季の降雨とともに再び蘇生し、水たまりの中で発育を再開する。ちなみに、ネムリユスリカでは幼虫以外のステージ（蛹、成虫と卵）では、たとえ乾燥状態であってもアンヒドロビオシスは誘導されない。むしろ成虫は、乾季がきた時には飛翔分散することで乾燥を回避する。
2000 年に世界で初めて当研究室でネムリユスリ
カの継代飼育の開発し、同時に幼虫でのアンヒド
ロビオシス誘導条件を確立することに成功した。
48 時間をかけて幼虫をゆっくり乾燥させると、蘇生可能なアンヒドロビオシス状態の幼虫を得ることができる。その乾燥幼虫を再水和させると、１時間以内という短い期間で蘇生し、また元気に泳ぎはじめる(図１)。これまでの研究結果から、ネム
リユスリカのアンヒドロビオシスは中枢神経とホルモン制御の影響を受けず、細胞・組織が自立的に誘導されることが分かった 20,9)。この乾燥過程で幼虫の体内に、生体成分保護活性を有する非還元糖であるトレハロースが大量に（乾燥重量の 20%ほど）蓄積することが明らかとなった。一方、２日間をかけずに早く乾燥させると、幼虫の体内のトレハロース蓄積量が不十分なため、幼虫が蘇生

図１：ネムリユスリカの乾燥耐性
ネムリユスリカの幼虫をゆっくり乾燥させると、
48 時間でアンヒドロビオシス状態に入る（体内含水量は 3%程度、半永久的に保存可能）。アンヒド
ロビオシス状態の乾燥幼虫を水に戻すと、１時間以内に蘇生してまた泳ぎはじめる。
ネムリユスリカの乾燥耐性に関わる遺伝子の同定
ネムリユスリカ幼虫の乾燥耐性を支える分子基盤を解明するためにアンヒドロビオシス関連の遺伝子転写産物の情報を含む Expressed Sequence Tag（EST）のデータベースを構築した。コントロールの生幼虫（乾燥 0 時間）と乾燥処理して 12 時間と36 時間が経った時点で採集した幼虫から RNA を抽出したあと、３つの cDNA ライブラリーを作成した（乾燥 0 時間、12 時間と 36 時間）。無作為に単離したクローンから得られた塩基配列情報を
EST データベースにまとめた。この乾燥耐性関連
EST データベースは、アンヒドロビオシス誘導に
91

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)(PvTPP)の発現は乾燥過程で誘導されていた（図４、PvTps ）。 グ リ コ ー ゲ ン を 分 解 す る glycogenphosphorylase の発現量は乾燥過程で一定であった
ため、トレハロース合成の律速ステップは PvTPSと PvTPP であることが強調された。これらネムリ
ユスリカの PvTPS と PvTPP のトレハロース合成活性は、酵母の相補性テストやリコンビナントタン
パク質を用いた in vitro の実験で証明されている 13)。
脂肪体で合成されたトレハロースは、他の組織に輸送しなければ適合溶質として機能できない。データベースからトレハロース輸送体 PvTret1 の配列が同定され、その発現が乾燥過程で誘導されていることが確認された。アフリカツメガエル卵母細胞を用いた実験から、PvTRET1 タンパク質が選択的にトレハロースを細胞膜に透過させる機能を有していることが証明された 10)。幼虫の全身に渡ったトレハロースは乾燥の最終過程でガラス化し、そのガラスマトリックスが細胞と生体分子を保護する 17)。興味深いことに、トレハロースの分解酵素であるトレハラーゼの発現も乾燥過程で誘導されている。しかし、グリコーゲンの貯蔵を作り直すためのトレハロース分解は蘇生過程に行われる。
したがって、蘇生過程で素早くトレハロースを分解するために、アンヒドロビオシス中に不活性化されたトレハラーゼが事前に合成されると考えられる 13)。

関わる遺伝子発現変動を反映している。EST デー
タベースは全部で 15,056 個の EST クローンを含んでおり、4,807 個のクラスターに統合された 2)。
データベース解析の際、EST の半数が公共データ
ベースに含まれる既知遺伝子と相同性を示さなかった（図２、ホモロジー無し）。したがって、ネム
リユスリカ独特な新規遺伝子が多く存在すると示唆された。一方、遺伝子の機能を現すオントロジーグループによって EST を分類すると、タンパク質合成系、ヘモグロビン複合体と電子伝達系が一番大きい割合を占めていることが明らかになった。
ネムリユスリカのみならずユスリカの幼虫は、沼の底などの低酸素環境に生息しているため、酸素キャリアーであるヘモグロビンのパラログを多く有していると考えられる。幼虫の乾燥が進むに連れ、特定の遺伝子オントロジーグループに属する
EST の存在割合が変化した。特に酸化ストレス関
連の EST は著しく増え、その割合が全体の 0.4%
（乾
燥 0 時間）から 2.6%（乾燥 36 時間）まで増加した（図２）。
遺伝子クラスターの中に含まれる EST の数はその遺伝子の発現量を反映していると見なすことができる。そこで、３つのライブラリー（乾燥 0 時
間、12 時間、36 時間）に含まれる EST のクラスタ
ー解析に基づいて、各遺伝子の推定発現パターンを予測した。多くの遺伝子の発現は主に乾燥 12 時
間に抑制されたが、乾燥 36 時間まで顕著な遺伝子発現誘導が見られた。キーワード検索によってヒット数が多い遺伝子グループをデータベースから抽出し、それぞれの推定発現パターンを解析した。
乾燥過程で明らかに発現が誘導されたグループは
主に４つに分類することができた（抗酸化因子、LEA タンパク質、熱ショックタンパク質と輸送タ
ンパク質（図３）。これらの機能グループ以外に、発現パターンが乾燥と相関を示した個々の遺伝子も多かった（シグナル伝達系の因子、プロテアソームのサブユニット、DNA 修復酵素など）。これらの機能グループに加え、既知のネムリユスリカ
乾燥耐性関連因子を含めた遺伝子群について、以降、詳しく述べる。

酸化ストレス関連遺伝子群
EST データベース解析の際、酸化ストレス関連遺伝子が乾燥ストレスに対する一番顕著な応答を示した（図２、図３）。実際に、酸化ストレスはアンヒドロビオシスの中心的な問題である。細胞が乾燥ストレスを受けると、不調な酵素反応や化学反応によって、たくさんの活性酸素が発生することは知られている。活性酸素は有害であり、タン
パク質のカルボニル化、脂質の過酸化や DNA 損傷
を引き起こす 3)。活性酸素の除去に関わる経路の一
つ は superoxide dismutase (SOD) ／ カ タ ラ ー ゼ（catalase）という２つの重要な酵素を含む。SOD
は主な活性酸素種の一つであるスーパーオキシド
アニオンラジカルを過酸化水素に変える反応を媒介する。続いて、カタラーゼが過酸化水素を無害な水と酸素に変化させる。EST データベースの中にカタラーゼと複数の SOD 遺伝子が見つかり、乾燥によってそれらの発現が誘導されることが確認された。一方、もう一つの重要な活性酸素除去シ
ステムはグルタチオン経路である。データベース

トレハロース代謝
ネムリユスリカ幼虫の乾燥過程で体内にトレハロースが大量蓄積しなければ、蘇生できなくなる
15,9)。EST データベースから、トレハロース合成酵素など、複数のトレハロース代謝に関連する遺伝
子クラスターが見つかった。トレハロースは幼虫の脂肪体にあるグリコーゲンから合成される。トレハロース合成酵素である trehalose-6-phosphatesynthase (PvTPS)と trehalose-6-phosphate phosphatase92

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)

図２：遺伝子オントロジーによってグループ分けした EST
左側のパイチャートは EST 全体の各遺伝子オントロジーグループの割合を示している。右側の表に各ライ
ブラリー（乾燥処理後 0 時間、12 時間、36 時間）における EST の詳しい割合（%）が遺伝子オントロジーグ
ループごとに記されている。

図３：乾燥によって発現が誘導される遺伝子ファミリー
キーワード検索で遺伝子機能ファミリーをデータベースから抽出した。各クラスターが含む EST クローンの数はその遺伝子の推定発現パターンを現している。乾燥過程（12 時間と 36 時間）側にに発現量の高いクラスターは誘導される遺伝子を示している。
93

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)能が推定された。例えば、イオン除去、分子シー
ルド（タンパク質の凝集抑制）、細胞骨格の補強（LEA 多量体のフィラメント化）といった機能によって、生体分子を保護すると考えられている 12)。
最近、LEA タンパク質がトレハロースのガラス化を安定させる効果も証明された。ネムリユスリカ
が持つ多くの LEA タンパク質のうち、３つが特定された。それらの LEA タンパク質の遺伝子発現が乾燥によって誘導され（図４、PvLea3）、乾燥誘導はタンパク質レベルでも確認された。高親水性の
LEA タンパク質は煮沸しても凝集しない性質を持っている。ネムリユスリカの LEA タンパク質も invitro で 15 分煮沸しても凝集しなかった 8)。ネムリ
ユスリカにおいて、LEA の特徴を持つタンパク質が多く存在しているので、その機能は多少異なっている可能性がある。また、組織特異的に発現させることによって、ネムリユスリカはそれぞれのLEA タンパク質を使い分けていると考えられる。
一方、親水性の新規タンパク質も LEA タンパク質と似たような機能を持つ可能性がある。ネムリユ
スリカでは親水性の新規タンパク質 Pv-Dip1 が乾燥によって強く誘導され（図４、Pv-Dip1）、細胞外に分子シールドの役割を果たしているのではな
いかと示唆された 2)。

には、グルタチオンペルオキシダーゼに相同なクラスターは複数存在しており、抗酸化因子の中で一番多くの EST を含んでいたため、特別に重要な酵素であると考えられる。実際にネムリユスリカのグルタチオンペルオキシダーゼは乾燥によって強く誘導されている（図４、Pv-GPX）。グルタチ
オンペルオキシダーゼは細胞膜の過酸化脂質を還元する機能や、カタラーゼと同様に過酸化水素を分解する機能などを持つ酵素である。また、デー
タベース上で一番 EST の増加を示した抗酸化因子
はミトコンドリアのチオレドキシンであり、その実際の発現量は乾燥によって 100 倍以上誘導された（図４、Pv-Thioredoxin2）。ミトコンドリアは重要な活性酸素発生源であり、アンヒドロビオシスの時も酸化による重傷を負うと予想され、ネムリ
ユスリカのミトコンドリアの最初の防衛線はチオ
レドキシンであると示唆された。クマムシやワム
シ、線虫など、乾燥耐性を持つ他生物においてもSOD やカタラーゼ、ペルオキシダーゼなどの抗酸化因子の重要さが確認されている 5)。しかしアンヒ
ドロビオシスにおけるチオレドキシンの中心的な役割はネムリユスリカで初めて示唆された。以上の抗酸化因子は ROS の発生を抑制しながら、酸化した生体分子の還元にも関わっている。しかし、このような強力な抗酸化システムが存在するにも関わらず、生体分子は完全には防御されずに損傷が生じる。プロテアソーム（カルボニル化タンパ
ク質の分解）と DNA 修復に関わる複数の遺伝子が乾燥過程で誘導される事実は、酸化に伴う傷害の修復機構が作動していることを示唆している。

熱ショックタンパク質（Hsp）
乾燥ストレスによるタンパク質の変性と凝集を防ぐためにネムリユスリカの幼虫は LEA タンパク質以外にたくさんの Hsp を発現させていた。EST
データベース解析の結果、Hsp に相同な遺伝子クラスターは全体的に乾燥によって誘導されることが明らかとなった（図３）。Hsp は典型的なシャペ
ロンタンパク質であり、熱ショック以外に様々な環境ストレスで誘導されていることでよく知られている。ネムリユスリカの乾燥過程で一番多くの遺伝子クラスターを含んでいたのは Hsp70 ファミ
リーだった。Hsp70 ファミリーのシャペロンはタンパク質合成の際、新しいタンパク質の正しいフォールディングを補助している。一方、同じように乾燥に誘導される Hsp40/DnaJ は Hsp70 と一緒に働いて、変性したタンパク質の立体構造を直す役
割を果たしている。実際にそれぞれの Hsp の発現パターンを確認したところ、ほとんどが乾燥過程で徐々に誘導されていた 4)。おもしろいことに、乾燥過程の最後に small-Hsp (sHSP)の一つである
Pv-p23 だけが急激な発現上昇を示した（図４、
Pv-p23）。α-クリスタリンのモチーフを持つ sHsp
はオリゴマー複合体を形成して、タンパク質を凝集から保護する役割を果たしている。sHsp は乾燥耐性を持つ様々な生物から発見され、アルテミア

LEA タンパク質も と も と 植 物 の 種 子 で 発 見 さ れ た Late
Embryogenesis Abundant (LEA)タンパク質は特異的に乾燥耐性と関連しており、現在はアンヒドロビ
オシスを示すさまざまな生物で発見されている。
ネムリユスリカでは、LEA タンパク質の種類が多く、44 遺伝子クラスターも既知の LEA タンパク質と相同性を示した。そのほとんどが乾燥過程で強く誘導されていた（図３）。乾燥 12 時間の時点でLEA タンパク質が全 EST の 11.9%まで占めるようになり、非常に多く発現していた。普段はリボソームタンパク質とヘモグロビンが一番多い発現量を示すが、乾燥 12 時間には LEA タンパク質がそれらの発現量を上まわるようになった。EST デー
タは乾燥耐性における LEA タンパク質の重要性を裏付けているであろう。LEA タンパク質は高親水性タンパク質であり、通常ランダム構造を示すが、乾燥過程でコイル構造（α-へリックス）に変化す
る。その二次構造から LEA タンパク質の様々な機
94

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)図４：実際の遺伝子発現パターン
乾燥過程 0 時間（D0h）から 48 時間（D48h）までリアルタイム定量的 PCR によって各遺伝子の発現パターンを測定した。想定発現量はリボソームタンパク質の PvRpL32 と翻訳伸長因子 PvEF1a の発現で補正され、乾燥 0 時間の発現量を 1 とした。各値は反復３つの平均を現している。
Pv-Globin2:グロビン２；PvTrx2:ミトコンドリアのチオレドキシン；Pv-GPX:グルタチオンペルオキシダーゼ；
Pv-HbCTT6:ヘモグロビン CTT6；PvLea3: LEA タンパク質３；Pv-Dip1:新規の親水性タンパク質；Pv-p23:小型
熱ショックタンパク質；PvTPS:トレハロース合成酵素；PvAqp1:アクアポリン１。

の休眠卵において sHsp p26 はトレハロースと相乗効果を示し、タンパク質の凝集を抑制していることが証明された 19)。ネムリユスリカのアンヒドロビオシスでも Pv-p23 は LEA タンパク質とトレハ
ロースと共に乾燥ストレスによるタンパク質の凝集を抑制し、Hsp70 と DnaJ の働きによってタンパ
ク質の立体構造が修復されると考えられる。一方、乾燥過程の前半における Hsp の誘導は乾燥応答によるタンパク質合成の活性化に関連する可能性もある。

見られた（図３）。アンヒドロビオシス誘導の際、ホメオスタシスの急激な変化に伴う水、イオンや代謝産物の大量移動が予想される。乾燥過程で発現が誘導と予想される輸送タンパク質のほぼ 75%は細胞膜の通過を行う膜タンパク質だった。上記のトレハローストランスポーターTret1 はその一つであり、特に重要な役割を果たしている。PvTRET1の他に複数の糖トランスポーターも乾燥ストレスに応答していた。例えばグルコーストランスポー
ター様遺伝子の発現上昇はアンヒドロビオシス準備のために必要なエネルギー源として、グルコー
ス要求を現していると考えられる。一方、乾燥 36
時間における Na+-K+-2Cl-共輸送体の誘導は、乾燥過程の後半に起こる急激な脱水に起因する塩スト

輸送タンパク質
EST データベース上、乾燥過程で輸送タンパク質に相同な遺伝子クラスターの有意な発現誘導が95

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)Pv-HbCTT6 は EST データベース上で乾燥によって一番強く誘導された遺伝子であり、実際の発現パターンも乾燥２４時間にピークに達することが確認された（図４、Pv-HbCTT6）。アンヒドロビオシ
スのために重要な役割を果たす遺伝子であることに違いないが、その機能に関しては二つの仮説を立てられる。他のヘモグロビンと違って、
Pv-HbCTT6 は乾燥しても酸素結合能力を失わずにアンヒドロビオシス中に機能し続けられるという特徴があるかもしれない。また、ヘモグロビンのヘム結合サイトを利用して、Pv-HbCTT6 は乾燥過程で発生する活性酸素を捕捉して無毒化する機能も考えられる。実際に活性酸素種を捕捉するヘモ
グロビンの例はいくつか知られている。アンヒド
ロビオシスの際、細胞内だけではなく、体液中にも活性酸素を除去しなければならないと考えられるので、Pv-HbCTT6 はその役割を果たす補足分子であるのかもしれない。

レスの緩和を現しているのかもしれない。この急激な脱水が生じる原因として、細胞膜が水を高速に通過させるメカニズムを考慮する必要がある。
EST データベースからアクアポリンと呼ばれる膜貫通の水チャンネルが二つ同定された 11)。その一つである PvAqp1 の発現が乾燥 24 時間から誘導されていた（図４、PvAqp1）ことから、PvAqp1 は積極的な脱水促進に関与していると考えられる。また、この急激な脱水は乾燥耐性機能の発揮に重要であるかもしれない。トレハロースは、緩慢な脱水では生体成分保護機能が全くない二水和物結晶を生じるのに対し、急激な脱水ではガラス化無水物を生じる。したがって、PvAqp1 の発現はトレハ
ロースの適切な物性変化を促すことで、ネムリユ
スリカのアンヒドロビオシス誘導に重要に関与していると考えられる。体液中の輸送タンパク質に関しては、アポリポプロテイン D やコレステロー
ルトランスポーターなども乾燥に誘導され、アンヒドロビオシスにおける脂質代謝の重要性を裏付けている。アンヒドロビオシスを示す南極の線虫においても、同様に脂質トランスポーターの発現が乾燥に誘導されている報告がある 1)。最後に、ネ
ムリユスリカではα-トコフェロール輸送タンパ
ク質の発現量も乾燥過程で上昇していることがEST 解析から浮かび上がった。α-トコフェロール（ビタミン E）は重要な抗酸化分子であるため、アンヒドロビオシスにおける活性酸素の被害を防ぐ防御システムに関連していると考えられる。

ネムリユスリカ研究の展望
ネムリユスリカ幼虫のアンヒドロビオシスを支える分子基盤の解明のために、乾燥過程の EST データベースの構築は大きい成果をもたらした。乾燥耐性の準備の際に起こる遺伝子発現の大筋の変化を現しながら、LEA タンパク質、アクアポリンやトレハロース輸送体などの重要な遺伝子の特定に繋がった。また、酸化ストレスの重要性と生体分子の損傷も浮かび上がった。現在、研究室ではアンヒドロビオシス後の蘇生過程に関連する EST
データベースの解析が進んでおり、特に DNA 修復
メカニズムが重要であることが明らかとなってきている。この事実を踏まえると、アンヒドロビオ
シスに入る度に DNA の損傷と修復が繰り返されるため、乾燥耐性がゲノムレベルで大きい影響を与えているに違いない。そのゲノムに刻まれたア
ンヒドロビオシスの痕跡を求めて、ネムリユスリ
カのゲノム解読を計画している。ネムリユスリカのゲノムサイズは 100 Mb 以下という小さいもの
であり、大きい負担をかけずにゲノム解析から有意義な情報が得られると考えている。
EST とゲノムの解析から膨大なデータが蓄積し、アンヒドロビオシスに対する新たな仮説もどんどん出てくる。それぞれを支持する生理実験の必要性も高まり、遺伝子機能解析ツールの開発も必要不可欠になる。幼虫の大きい体サイズは既に様々な生理実験を可能にしている。現在、ネムリユス
リカの in vivo 機能解析を行うため、RNAi 技術と遺伝子組み換え体の作出方法の開発を進めている。
将来的に、ネムリユスリカを乾燥耐性研究の重要なモデル生物へ発展させる目的を目指している。

ヘモグロビン遺伝子群
昆虫類ではヘモグロビンを持たない種が多い。
例外的にユスリカ科では多くのヘモグロビンが存在し、キミドリユスリカ（Chironomus biwaprimus）
では 40 以上のヘモグロビン遺伝子が見つかっている。ユスリカのヘモグロビンは血リンパ（体液）に存在し、一般的な酸素輸送に関わっているが、低酸素の環境に適応するために酸素の貯蔵機能も進化したとも言われている。ネムリユスリカの
EST データベースでは、ヘモグロビンに相同な遺伝子クラスターが 118 個も同定された 2)。EST の割合として、ヘモグロビン複合体は一番大きいグループの一つだった（図２）。乾燥過程でほとんどの
ヘモグロビン遺伝子の発現が抑制される（図４、Pv-Globin2）。それはアンヒドロビオシス中に酸素の輸送が不要であり、ヘモグロビン合成に必要な大量のアミノ酸源を乾燥耐性関連のタンパク質合
成に使い回すためであると考えられる。しかし、全てのヘモグロビン遺伝子の発現が抑制されるわ
けではない。事実、乾燥過程で誘導されるヘモグ
ロビン遺伝子は数個存在している。そのうち、
96

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol. 9 (2), 98-105

Mini Review
Katayama Ta) and Kunieda Tb)

Genome sequencing and assembly of anhydrobiotic extremotolerant tardigradea)Human Genome Center, Institute of Medical Science, University of Tokyo, 4-6-1 Shirokanedai, Minato-ku, Tokyo
108-0071, Japan. b) Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, University of Tokyo, 7-3-1 Hongo,
Bunkyo-ku, Tokyo 113-0033, Japan
Received: December 4, 2010 / Accepted: December 8, 2010
Keywords: Tardigrada, genome sequencing, gene finding, extremotolerance, anhydrobiosis

ヨコヅナクマムシのゲノム解読
東京大学医科学研究所ヒトゲノム解析センター 片山 俊明
東京大学大学院理学系研究科生物科学専攻

國枝 武和

年からクマムシのゲノム解読プロジェクトを行ってきた。その進捗を 2009 年の第 11 回国際クマム
シシンポジウムで発表し注目と期待を集めたが、本稿ではゲノム解読に到るまでの過程とその後のゲノム解読の状況について報告する。

1. はじめにクマムシ類は、身の回りの苔や地衣類のほか、土壌・河川・深海・南極・高山など、陸上・淡水・海水を問わず、地球上のほぼあらゆる場所で見つかっている。このうち、陸生のクマムシは乾燥耐性を持つものが多く、乾燥時には代謝などの生命活動を停止した乾眠とよばれる状態に移行し、超高温・超低温・超高圧・真空・放射線など様々な極限環境に対して非常に強い耐性を示すことが知られている。我々は、このような特性を持つクマ
ムシのゲノム解読を行うことによって、極限環境耐性における分子メカニズムを解明したいと考えている。クマムシだけからなる緩歩動物門は、進化的に線形動物門と節足動物門の間に位置するとされるが 4)、これまでにゲノム解読された種はなかった。このため、クマムシのゲノム解読は無脊椎動物の進化を探る上でも重要な基礎データを提供することができると考えられる。
極限環境耐性はクマムシに注目を集める大きな要因となっているが、長年にわたりクマムシの研究は形態分類や発生など主に動物学的な観察に基づくものが主流となっていた。1974 年から 3 年に一度開催されている国際クマムシシンポジウムでも、分子生物学的な研究報告がなされるようになったのは最近のことである。我々の研究グループ
は、札幌で単離されたヨコヅナクマムシの飼育系を確立し、文部科学省の特定領域研究「ゲノム」
において比較ゲノム領域の公募研究として、2008

2. クマムシの極限環境耐性と系統関係
クマムシが文献に最初に記載されたのは意外と
古く、1767 年の Eichhorn もしくは 1773 年の Goezeによるものとされている 11)。1774 年には Corti が乾燥からの復帰能力について記しており、その後
1790 年にリンネによって Systema Naturae にも掲載されている 11)。極限環境耐性に関する研究が始まったのは 1900 年代に入ってからであり、1921 年にRahm による 151℃の高温耐性 18)、1950 年に
Becquerel による-273℃の低温耐性 1)などの実験がなされた。その後、1962 年に Ramazzotti によって節足動物とは独立した動物門「緩歩動物門」が提唱されている 19)。化石記録としては 1964 年にCooper により白亜紀の琥珀からクマムシの化石が見つかっている 3)。放射線耐性については、1964
年に May により 5,000Gy の X 線耐性が報告され 15)、
最近になって 2005 年に Jönsson による 6,000Gy の
γ 線耐性 9)、2006 年に Horikawa による 7,000Gyの He イオンビーム耐性 6)が報告されている。圧力については、2007 年に欧州の FOTON-M3 プロジェ
クトによる乾燥したクマムシの宇宙空間への暴露実験が行われており、10 日間の地球周回後、生還
98

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)とができた 7)。ヨコヅナクマムシは数十〜数百匹ごとにシャーレに分けられ、餌となるクロレラを与えて 25℃のインキュベータで飼育された。生活史の調査から、平均寿命は 35 日であり、孵化後 9 日
目から産卵が見られること、産卵後は平均約 6 日で孵化すること、生涯で平均約 8 個の卵を産むことが分かった。個体数のコントロールとカビなどの発生を防ぐため、週に 1〜2 度はすべての個体と卵を新しいシャーレにピペットで移す、という地
道なプロトコルを数ヶ月継続することによって、ようやくヨコヅナクマムシを 2 万匹まで増やすことに成功した。

したことが 2008 年に Jönsson らによって報告されている 10)。また同年、Ono らが 7.5GPa の耐高圧性について報告している 17)。
クマムシは陸生のものも全て、体表が水で覆われているときだけ活動する水生動物である。乾燥耐性を持つクマムシは、周囲の水がなくなると自発的に体内の水分を放出し、乾眠状態（その形状から酒樽を意味するタン状態とも呼ばれる）に移行する。乾眠状態では図１に挙げられるような温度や圧力などさまざまな極限環境に耐性を示す。
興味深いことに、放射線耐性は活動状態でも高いことが報告されている 6)。これには、DNA の損傷
修復機構が優れている、細胞内の組織を守る未知の仕組みがある、といった可能性が考えられるが、分子的なメカニズムはまだ解明されていない。乾
眠状態にあるクマムシを水に戻すと体内に水分を吸収し活動状態に戻る。乾燥と蘇生に要する時間はそれぞれ数十分であり、他の乾燥耐性を持つ動物と比較してもかなり速い。乾眠の能力は、クマムシの他にも、ワムシ・線虫・ネムリユスリカの幼虫などで見出されている。これらの動物の中ではトレハロースを蓄積し水と置換することで細胞内構造を保護していると考えられている種も多い
が、クマムシの場合、乾眠状態におけるトレハロ
ースの蓄積量は顕著ではない（図２）。このため、クマムシの乾燥耐性能力は、苔など日常的に乾燥を繰り返す環境に適応するために、独自のメカニズムを獲得したのではないかと考えられる。

4. ゲノム配列の解読
純系統のヨコヅナクマムシ（YOKOZUNA-1 系統）を大量飼育できるようになったことを受けて、我々のグループは 2008 年に文部科学省特定領域研
究「ゲノム」の公募研究に採択され、クマムシのゲノム解読を行うことになった。試料の調製では、餌であるクロレラが混入するのを避けるため 2 日間の絶食を行ったのち洗浄し、同時に抗生物質を投与して細菌の繁殖を抑制した。DNA 抽出法についてもいろいろ検討を重ね、最終的に品質の高い
ヨコヅナクマムシの長鎖ゲノム DNA を得ることができた。
この試料を、共同研究者でゲノム特定の支援班でもあった遺伝学研究所の藤山・豊田グループに送り、１リードが約 1kb となるサンガー法によるホールゲノムショットガン解析を数回に分けて行った。これまでにインサート長 5kb 未満のペアエ
ンド約 77 万リード 951Mb と、インサート長 30〜
50kb の Fosmid ライブラリのペアエンド約 4 万リー
ド 55Mb を解読している。細胞あたりの DNA 量をデンシトメトリー法により解析した結果、ヨコヅ
ナクマムシのゲノムサイズはクマムシ類の中でも特に小さい約 60Mb 程度と推定された。サンガー法による解読は総計 1Gb であり、ゲノムサイズの約 16x のカバレッジに到達したことが分かった。
並行して、乾眠前後の遺伝子発現の変化を調べるため RNA-Seq によるトランスクリプトーム解析を行うことになったが、その際 mRNA に加え
Illumina GAII の３レーンを用いたゲノム配列のショートリード解析も行われた。こちらは一度の解析で、インサート長が約 220bp、塩基長 75bp の 6000
万ペアエンド配列が解読され、計 1 億 2000 万リー
ドの総量は約 9Gb となった。約 1Gb のサンガー法
による配列とあわせると、クマムシゲノムの 160xのカバレッジをもつゲノム配列が現在までに得られていることになる（表１）。

3. ヨコヅナクマムシの飼育系の確立
ゲノムプロジェクトのためにはクマムシを数万匹の単位で培養する必要があった。これまでのところ飼育系が確立されているクマムシはまだ非常に少なく、乾燥耐性を持つものでは鈴木によるオ
ニクマムシの培養方法 21)が知られている。しかし、オニクマムシは高頻度な世話（ほぼ毎日）が必要
なこと、餌として与えるワムシを大量に準備する必要があることなど、飼育にかかる労力が非常に大きく、大量飼育には相当な手間がかかることが予想された。
乾燥耐性を持つクマムシのモデル生物種を探索していた堀川は、札幌にある瑞穂大橋の歩道から採集した苔より Ramazzotius 属のクマムシを見出した（図３）。このクマムシは、乾燥耐性を含む高い極限環境耐性をもつことが確認されたため、ヨコヅナクマムシと名付けられた。堀川らは、クロレラを餌としたヨコヅナクマムシの継代飼育法を確立し、1 つの卵から単為生殖により培養した純系
統のヨコヅナクマムシ（YOKOZUNA-1）を得るこ

99

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)図 1: クマムシの乾燥による状態変化と極限環境耐性

図 2: クマムシの系統関係と乾眠状態におけるトレハロース蓄積量の比較

100

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)

(a)

(b)

図 3: ヨコヅナクマムシ (a) 活動状態 (b) 乾眠状態 （写真は堀川大樹・行弘文子の両氏による）表 1: ヨコヅナクマムシの配列解読
ABI 3730xl リード長約 1,000bp のサンガー法
WGS ペアエンド
Fosmid ペアエンド
完全長 cDNA (38,400 クローン)

772,854 reads
42,592 reads
76,800 reads

951Mb
55Mb
88Mb

Illumina GAII リード長 75bp のショートリード
WGS 6,000 万ペアリード
RNA-Seq 2000 万ペア×4 state

120,000,000 reads
160,000,000 reads

9,000Mb
12,000Mb

101

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)セットには、当初はハエ（D. melanogaster）の遺伝子モデルを用いたが、進化的に離れているため予測精度はあまり高くなかった。このため、既知の他の生物種の遺伝子群に対して、クマムシの推定
遺伝子のホモロジーが低く見積もられ、クマムシには固有の遺伝子が多いという推定に繋がっていた。
後に、完全長 cDNA と RNA-Seq のデータが得られたため、これらを利用してクマムシの発現遺伝
子の転写ユニットを決定し、これを学習セットとして、全遺伝子のより正確な推定を行った。この結果、15,346 個のクマムシ遺伝子が同定され、このうち半数を越える 7,845 個の遺伝子が BLAST のe-value 1e-10 以下という閾値で他の生物種の遺伝子と相同性を示した。予測遺伝子の９割以上はア
ミノ酸配列長が 1,000 残基以下の短いものであったが、中には糖タンパク質 titin など 5,000 残基以上の長い遺伝子もいくつか含まれている。平均エクソン数は 5.3 個で、シングルエクソンの遺伝子が1,774 個、２エクソンのものが最も多く 2,956 個、
エクソン数が 30 を超えるものも 41 個予測された。
これら全ての予測遺伝子について網羅的な機能解析を行い、遺伝子アノテーションをはじめ、種間で保存された遺伝子群の進化解析や、クマムシ特異的な遺伝子の発見に取り組んでいる（図４）。タ
ンパク質をコードする遺伝子の他に、tRNA 遺伝子、rRNA 遺伝子の解析も行った。tRNA 遺伝子はtRNAscan-SE14)を利用して予測した結果、91 個が同定された。これは他の生物種と比較すると少ない数であるが、Genomic tRNA データベース 2)によると、そもそも tRNA 遺伝子数は生物種によって数のばらつきが非常に大きいことから、ヨコヅナク
マムシもしくはクマムシ類では tRNA の数が少な
く、ほぼ全ての tRNA を同定できていると考えて矛盾はない。今回同定した tRNA 群は、他の一般的な生物種と同様に、アンチコドン全 61 種を網羅するものでは無いが、塩基対のゆらぎ(wobble base)を考慮すると全 20 アミノ酸をカバーしており、機能的には充分な数と考えられる。なお、これらのtRNA は全てアセンブルの長いスーパーコンティ
グ 0〜20 番に由来していた。一方で、rRNA 遺伝子
は RNAmmer13)と Rfam5) / Infernal16)を使って予測された。リボソームの 60S サブユニットを構成する
5S, 5.8S, 28S rRNA のうち、5S rRNA はアセンブルの長いスーパーコンティグ 2〜11 より合計 22 個見
つかっている。残りの 5.8S, 28S rRNA と 40S サブ
ユニットを構成する 18S rRNA の３種は通常一つの転写単位に由来するとされるが、5.8S, 18S, 28SrRNA はそれぞれ 125 個、27〜65 個（予測法に依る）、7 個が検出されており数に大きな差がある。

5. ゲノム配列のアセンブル
ドラフトゲノムのアセンブルはサンガー法によるリードを元に、PCAP 法 8)を用いて行われた。コ
ンティグ数は 4,191 本で 58.3Mb をカバーしており、これらを Fosmid のペアエンドなどを利用してまとめたスーパーコンティグ数は 3,002 本、総ドラフト
ゲノム長は 58.8Mb になっている（表２）。平均のGC 含量は 47.3%で、これは節足動物であるショウ
ジョウバエ（Drosophila melanogaster）の 41%、線形動物である線虫（Caenorhabditis elegans）の 35%に対し比較的高い値となっている。3,002 本のスー
パーコンティグは、予想される染色体数 6 本と比べるとドラフトの域を出ていないように思われる数字であるが、純系統のクマムシが利用できたことから実はこれらの配列のアセンブル精度は大変高く、ドラフトゲノム長の 94%はトップ 22 本のスーパーコンティグにアセンブルされている。実際、最長のスーパーコンティグは 7Mb を超えており、
アセンブルの精度を示す指標としてよく使われるN50 は 7 本目の 3.5Mb、つまりそれより長いトッ
プ 7 本のスーパーコンティグで全長の半分を達成している。
一方、30 番目以降 3,002 本目までの配列は 10Kb
以下といずれも短いものであるが、このうちスーパーコンティグ 43〜2546 に含まれる 100 本はミトコンドリアに該当することがわかり、共同研究者
によってミトコンドリアゲノムの全長配列 14kb が完成している。残りの短いものの中には、ヘテロ
クロマチン領域などリピートの多い配列や rRNA
配列などアセンブルが困難な配列と、ごくわずか
バクテリア由来の DNA がコンタミしたものがあり、現在クリーニングとショートリードの配列を用いたアセンブルの見なおしが進められている段階である。
なお、ショートリードの配列だけを用いたゲノ
ムの de novo アセンブルは、Velvet22)や Abyss20)など
複数のツールを比較検討したが、どれも最長 70kb
程度の配列しか得ることができなかった。このことから、クマムシのように、比較対象となる近縁生物種のゲノム配列が利用できない場合は、リード長の長いサンガー法の配列は必須であり、ショートリードの解析はドラフトゲノムのアセンブル
における未解読な領域を補完するデータとして活用するのがよいと考えられる。
6. ゲノムアノテーション
アセンブルされたクマムシのドラフトゲノム配列を元に、SNAP 法 12)を用いた機械学習による遺伝子構造の ab initio 予測を行った結果、約 15,000個の推定遺伝子が同定された。遺伝子構造の学習
102

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)表 2:ドラフトゲノムにおけるスーパーコンティグの長さ分布
順位

スーパーコンティグ ID

アセンブル長(bp)累積%1Supercontig0

7,140,667

12%

2Supercontig1

4,750,386

20%

3Supercontig2

4,702,191

28%

4Supercontig3

4,331,810

35%

5Supercontig4

4,143,22542%

6Supercontig5

3,653,697

48%

7

Supercontig7

3,563,305

54%

8Supercontig6

3,481,702

60%

9Supercontig8

2,482,774

65%

10Supercontig92,455,833

69%

11

Supercontig10

2,439,883

73%

12Supercontig11

2,062,25276%

13Supercontig12

1,890,942

80%

14Supercontig13

1,534,697

82%

15Supercontig14

1,327,87485%

16Supercontig15

1,219,862

87%

17Supercontig16

1,167,732

89%

18

Supercontig17

844,48290%

19Supercontig18

707,009

91%

20

Supercontig19

652,126

92%

21

Supercontig20

385,490

93%

22Supercontig21

315,695

94%

23

Supercontig22

63,054

94%

24

Supercontig23

62,853

94%

25

Supercontig24

38,688

94%

26

Supercontig26

24,79994%

27

Supercontig25

16,85094%

28

Supercontig27

15,927

94%

29

Supercontig28

12,31594%

30

Supercontig34

7,996

94%

3000

Supercontig1888

312

99%

3001

Supercontig2998

311

99%

3002

Supercontig2979

311

100%

----- N50 -----:

103

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)は生命活動のない物体から生命活動が再開する過程でもある。このメカニズムを解明することは、
医療や産業などへの応用だけでなく、システムとしての生命の理解や、さらには人工生命の創出といった発展的な研究も展開できるのではないかと期待している。

これらは全て断片化した短いスーパーコンティグ
から見つかっており、rRNA 配列がゲノム中に複数コピー存在することがアセンブルのミスに繋がっていると考えられるため、正確な数はまだ確定していない。
7. 今後の展開
解析の結果得られた情報をクマムシ研究者のコミュニティで共有し、効率的なゲノムアノテーシ
ョンと分子生物学的な解析を行うために、ゲノム
ブラウザや相同性検索サーバを含むゲノムデータ
ベースを構築している（http://kumamushi.org/）。既
知の遺伝子と相同性のある遺伝子の機能アノテー
ションと、パスウェイデータベースを利用した代謝系の解析を行った結果、トレハロース合成酵素
パスウェイを構成する遺伝子群や、乾燥耐性に関わる可能性があるとされる LEA 遺伝子などが見つかってきている。しかし、クマムシにおける乾燥耐性メカニズムの全容解明はまだこれからの課題である。日本で確立されたゲノム情報の利用できるモデル動物として、今後より多くの実験生物学者に興味を持って参入して頂ければ幸いである。
クマムシの乾眠は、生命活動という動的なシステ
ムが、乾眠という静的状態と何度も可逆的にスイッチするという現象であり、特に乾眠からの復帰

謝辞
本稿の執筆の機会を与えてくださいました極限
環境生物学会の皆様に感謝いたします。本研究は、文部科学省特定領域研究「ゲノム」の支援によって行われました。ヨコヅナクマムシを単離し培養法を構築された堀川大樹氏、クマムシの電子顕微
鏡写真を撮影して頂いた行弘文子氏、培養系を維持して頂いた桑原宏和氏、ゲノム配列の解読を行って頂いた国立遺伝学研究所の豊田敦准教授、新井理氏、大石加寿子氏、松崎（許山）肖子氏、会津智幸氏、ゲノム配列の解析にご助力頂いた慶応
義塾大学の荒川和晴講師、長谷部百合子氏、木戸
信博氏、文部科学省特定領域研究「ゲノム」において様々なご支援を頂いた国立情報学研究所の藤山秋佐夫教授、国立遺伝学研究所の小原雄治教授、
京都大学化学研究所の金久實教授に深く感謝いたします。

図 4:クマムシゲノム解読のプロトコル

104

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol. 9 (2), 106-115

Mini Review
Koyama S

Molecular and Cellular Biological Studies for Deep-sea Multicellular Organisms
under Atmospheric Pressure Condition

Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology, Institute of Biogeosciences, 2-15 Natsushima-cho, Yokosuka
237-0061, Japan
Received: October 6, 2010 / Accepted: November 29, 2010
Keywords: Deep-sea, Deep Aquarium System, Cell culture, Hydrostatic pressure, Deep-sea multicellular organism

深海多細胞生物の分子細胞生物学
独立行政法人海洋研究開発機構

海洋・極限環境生物圏領域

小山純弘

究の大半が、死んだサンプルを用いた成分分析や分【はじめに】
類学的解析の研究で占められている。そして、細胞深海には暗黒、高水圧、低温、熱水噴出による高を使った分子生物学的な研究はおろか、地上での深温、そして未知なる深海生命体、このように大きく海生物の飼育でさえも、極めて困難な状況にある。
5 つの特徴がある。
深海多細胞生物の分子細胞生物学的な研究を進める
海洋生物分野において、深海は一般に水深 200 m
1-3)
ためには、大きく 3 つの難関が存在する。
以深を定義し、海洋の約 95％の容積を占める 。
1） 深海多細胞生物を長期間加圧飼育する技術お太陽光は、非常に澄んだ海でも水深 200 m で、海表よび装置の開発。
面の約 1/100 未満の明るさとなり、水深 200 m より
2） 捕獲した深海生物の大気圧環境への適応。
深い場所では植物の光合成が行われなくなる 1)。
3） 深海生物組織から人工的に抽出した細胞の長
深海の特徴の一つである水圧は、
水深が 10 m 深く
期培養および凍結保存。
なるごとに 1 気圧、1 cm2 当たり約 1 kg 重ずつ水圧
これら 3 つの問題点は、深海多細胞生物を捕獲・がかかっていく。そして、水深 10,924 m の世界一深飼育する装置の開発 5)、そして、水深 1,000 m 以深いマリアナ海峡チャレンジャー海淵まで潜った時の2
水圧は、1 cm 当たりの重さにして約 1 トン、約 110に生息する深海生物の大気圧飼育、初代培養、および細胞の凍結保存の成功 6)によって、ようやっと解
MPa もの圧力を受けることになる。続いて、もう一つの深海の特徴である水温について簡単に説明する。 決に向かいつつある。
深海の水温は季節変動がほとんど無く、緯度や水深
本稿では、筆者らが深海生物を捕獲・飼育する装の違いによって 0〜4℃に保たれている。その一方、置を開発するプロセスから、深海生物由来細胞株樹
地下からマグマが供給される海域には、海底にしみ立に至るまでの研究を、他の文献を交えながら解説込んだ海水がマグマに熱せられ、200℃以上の熱水がする。
噴出する場所が存在する。このような熱水噴出口付【深海二枚貝シロウリガイの細胞培養と形質転換技
近には数多くの深海生物が確認されている。
術】
潜水調査艇の誕生によって、深海に棲息する生命の地表生物由来の培養細胞に高水圧を加えると、30研究が可能となり、近年、深海微生物の分子生物学
MPa（水深にして約 3000 m）の加圧条件までは細胞的な研究が、極めて活発に進められるようになったに形態変化が現れず、1 時間程度加圧しても大気圧（例えば[4]の総説）。その一方で、深海微生物と同条件に戻すと細胞は増殖を再開することが確認され様に関心が寄せられている深海多細胞生物は、捕獲ている 7, 8) 。ヒト皮膚細胞を使用した実験では、70時にともなう圧力減少や温度変化に深海生物が耐え
MPa（水深にして約 7000 m）の圧力下でも１時間以られず、そのほとんどが捕獲後数時間以内に死滅し内であれば細胞は死なず、遺伝子発現やタンパク質てしまう。そのため、深海生物を使った地上での研106

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)産生などの細胞機能が維持される事を筆者は明らかとしている 8)。そのため、水深 3000 m よりも浅い場
所に生息する深海生物ならば、大気圧条件下でも深海生物の組織や細胞が生き残る可能性が考えられる。
深海生物の研究を進めるにあたり、まず水深 1000〜
3000 m に棲息する深海生物を捕獲回収し、深海生物
由来の細胞や組織が大気圧条件下で生存が可能か、
さらに大気圧条件下での細胞培養の可能性についても検討した。筆者は水深 1200〜1400 m に棲息し、大気圧で数日間生存できるシロウリガイを実験サンプ
ルとして用い検討した 9)。
シロウリガイ組織由来細胞の生死判別および大気圧
培養には、組織損傷時に自己修復機能を有する外套膜を用い、血液様体液を培地に加えることで検討した 9)（図 1）。図 2 は、培養処理直後の外套膜組織切片の蛍光顕微鏡写真である。体液を加えた人工海水
ベースのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で 4℃培養すると、6 日後には組織内の細胞が遊走を開始する（図 2）。この細胞遊走は、培地に体液を加えない場合は確認できなかった。Calcein による緑色蛍光で染色された細胞は、細胞内にエステラーゼ活性を有する生きた細胞であることを示している（図2）。この結果から、シロウリガイ外套膜組織から遊走したこれらの細胞が、大気圧条件でも生存していることが確認できた。また、シロウリガイ細胞のDNA 合成を検討した結果、このシロウリガイ細胞は
大気圧条件で DNA 合成が進んでいることも確認した。このシロウリガイ細胞は、大気圧条件で最長 14日間培養する事に成功している 9)。
シロウリガイ細胞を大気圧で短期間培養することに成功したので、次にシロウリガイのエラ細胞を用い、動物細胞に利用する形質転換技術がシロウリガイ細胞にも利用可能か検討した。貝のエラ組織はヒダ状になっており、エラ組織のヒダの奥深くに培養の妨げとなる雑菌が存在する。エラ組織片を次亜塩素酸
ナトリウム溶液や 70%エタノールで処理しても、この雑菌は除去できなかった。そこで抗生物質含有培
地中で、エラ組織を細かく切り刻んだ後、数回抗生物質含有培地ですすぐことにより雑菌を取り除いた（図 3）。この手法でシロウリガイのエラ細胞は、７日間大気圧でも生存できることを確認した。この生存期間に、リポソームによる遺伝子導入技術を利用
し 10)、貝のエラ細胞に蛍光タンパク質を持つプラス
ミドの導入発現を試みた。 図 4 にシロウリガイのエラ細胞にプラスミドを導入して４８時間経過した時の蛍光顕微鏡観察の結果を示す。図 4 から、シロ
ウリガイエラ細胞内で蛍光タンパク質を標識したア
クチンタンパク質が発現していることが明らかとなった。シロウリガイエラ細胞への遺伝子導入効率を測定した結果、ほぼ 100%（125/125 cells）の極めて高い効率で細胞内に導入した遺伝子の発現が確認された。以上の結果から、深海生物を大気圧条件下で分子細胞生物学的に研究できることが明らかとなった。

107

図 1 シロウリガイ(Calyptogena soyoae)の解剖図と解剖写真
赤い液体は、シロウリガイの体液。

【深海生物の捕獲および、地上での加圧飼育】
次に地上の研究施設で長期間生きた深海生物を確保するため、深海生物を圧力保持した状態で捕獲回収
後、地上で長期間加圧飼育するための技術開発に取り組んだ。
深海に棲息する多細胞生物の研究は、大きく 3 つのサンプリング手法によって進められて来た。第一に、底引き網や地質試料のサンプリングで利用されるコ
ア採取機、そして深海底泥ごと回収するつかみ機などによる採取法である。これらの手法は捕獲された深海生物を傷つけるだけでなく、減圧、そして表層の高温海水に曝されるダメージも加わり、捕獲された深海生物のほとんどが死滅してしまう。
第二に、潜水調査艇のマニピュレーターなどで深海生物を捕獲する方法 9) がある。しかし、潜水調査艇の浮上時にともなう減圧と高温表層海水による長時間曝露の双方のダメージによって、やはり捕獲できた深海生物のほとんどが死滅してしまう。
第三に、圧力保持型トラップで深海生物を捕獲する手法（たとえば[11]の総説）があげられる。しかし、これまでに開発されている保圧型トラップは、容器
内海水を循環・交換しながら、水圧および水温の双方を厳密に制御する装置が存在せず、しかも容器内に餌を入れることも出来なかった。そのため、捕獲した深海生物を長期間加圧飼育しながら、徐々に減圧することが出来なかった。
上記 3 つの理由から、深海多細胞生物に関する研究の大半が死んでしまったサンプルを利用した研究で

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)図 2 シロウリガイ外套膜組織からの細胞遊走
A: Calcein-AM と EthD-1 の二重染色写真。B:位相差顕微鏡像。C:A と B を重ね合わせた画像。

図 3 シロウリガイのエラ細胞の初代培養法

108

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)図 4 蛍光タンパク質を遺伝子導入発現させたシロウリガイエラ細胞
Enhanced yellow fluorescent protein (EYFP)とヒトアクチンタンパク質をつなげたプラスミドをシロ
ウリガイのエラ細胞にリポフェクション法で導入発現させた。
プラスミドをリポフェクションしてから４８時間後の蛍光画像。125 個中、125 個の細胞で導入した遺伝子の発現が確認された。

図 5 Deep aquarium system の写真
A:吸引捕獲装置。B:加圧飼育装置。
深海生物を吸引捕獲した後、深海生物の入った圧力容器を白の矢印のように加圧飼育装置へ接続する。

109

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)あり、深海生物サンプルを飼育しながら、地上で研究を進める事は、極めて難しい状況にあった。
そこで筆者は深海の水温と水圧を保持した状態で、深海生物を捕獲した後、地上で加圧飼育するための装置（Deep Aquarium System）を開発した 5)（図 5）。
Deep Aquarium System は、仕掛けたトラップにかかった深海生物や近くにいる深海生物を、掃除機のよ
うに吸引捕獲することができる（図 6A）。深海生物が耐圧容器内に入ったことを確認した後、潜水調査
艇のマニピュレーターで図中のピンを Deep
Aquarium System から引き抜く事によって、ばねの力で内蓋が閉じる構造となっている。Deep Aquarium
System（図 6A）は、計算上水深 3000 m までの耐圧能を有するが、安全を考慮し水深 2000 m までの使用とした。
水深 2000 m よりも深い所で深海生物を捕獲した場合は、水槽に取り付けてある圧力制御弁（図6A）の働きにより、容器内海水を排出する事で、浮上時に容器内圧力を水深 2000 m の水圧に保持するように設計した。捕獲した深海生物を長期間飼育するため、加圧飼育装置（図 6B）に接続した耐圧水槽の容器内は、高水圧低温環境に保持した状態での給餌および海水交換を可能としている。加圧飼育装置
は設定値±0.1 MPa（水深約 10 m）の精度で、最大20 MPa(水深約 2000 m)までの圧力制御ができる。水槽内海水は真夏の 30℃を超える室温でも、水温を5℃以下まで冷却できるように設計した。
Deep Aquarium System を用いて、深海魚や深海エビ、
深海巻貝などを保温保圧した状態で捕獲回収することで、研究室で 2 ヶ月以上、各種深海生物を加圧飼育することに成功している 12)。
【深海魚組織の大気圧培養】
シロウリガイの細胞培養実験で、水深 1,000m を超える深海に生息する生物から取り出した細胞も、大気圧条件で DNA 合成や細胞分裂、外部遺伝子の導入発現ができることを前述した。この結果は、培地に細胞の増殖因子が存在すれば、深海生物は、大気圧条件下でも細胞株樹立の可能性がある事を示唆している。しかし、海洋性無脊椎動物は細胞培養が極めて難しく、海洋性貝類は有史以来一株も細胞株が樹立されていない 13,14)。筆者はこれまで数多くの深海性無脊椎動物の細胞培養を試み続けてきたが、大気圧条件下では最長でも２週間までしか細胞を生存させることができていない。その一方で、魚類の株化
細胞は百数十種以上が樹立されており 15)、海洋性魚類の細胞培養は 1960 年代から報告されている 13, 16)。
そこで、Deep Aquarium System で各種深海魚を捕獲後、徐々に大気圧まで減圧した後、大気圧条件で細胞培養が可能な種を探索した。
その結果，水深 1000〜2500 m 付近に棲息する深海魚
コンゴウアナゴの細胞培養に成功した 6, 17) 。大気圧条件で増殖させたコンゴウアナゴ細胞を凍結保存する事にも成功したので、まず初めにこの細胞の増殖速度について調査した 17)。

110

細胞は細胞周期を一周する事で一回分裂する。G1 期で細胞は DNA の合成を準備し、S 期で細胞分裂のために遺伝情報である DNA を合成する。G2 期に入ると、細胞分裂の準備に入り、M 期で細胞は分裂する。
M 期を分裂期、M 期以外の細胞周期（G1, S, G2 期）をまとめて間期と呼ぶ事もある。コンゴウアナゴ細胞の有糸分裂に要する時間（M 期）は約 1 時間程度と地上生物由来の細胞とほとんど差が無かった（図7）。しかし、細胞が分裂して倍になるまでの倍加時
間（細胞周期を一周する時間）は 170 時間(約一週間)もかかる。この結果から、約 20 時間で細胞の数が倍になる地上生物由来細胞と比べ、分裂準備期間である間期（G1, S, G2 期）が非常に長いことが確認された。培地中に含まれるウシ胎児血清（FBS）量を 2
倍の 20％(v/v)にすると増殖速度は加速し、細胞の倍加時間は 170 時間から 77 時間以下にまで短縮されることが確認された 6)。この FBS には、細胞増殖を引き起こすタンパク質である増殖因子が含まれている。
動物細胞は細胞表面上にある受容体と呼ばれるアン
テナで、この増殖因子の信号を受け取る事により、細胞内に分裂増殖の命令を伝える。動物細胞も、培地中にこの FBS が多いほど細胞増殖が盛んになるが、10％(v/v)もあれば細胞増殖に支障は無くなる。今回使用した増殖因子はウシ胎児血清のものであり、深海魚の増殖因子は含まれていない。そのため、FBSに含まれる増殖因子は、深海魚コンゴウアナゴ細胞が受け取る事のできる増殖因子の形状とは多少異なるものの、よく似た形状を持つものと考えられる。
そして、この増殖因子の形状が多少異なることから、深海魚由来の細胞は 20％(v/v)という高濃度の FBSを培地に加える事で、増殖速度が速まったものと考えられる。
続いて、地表生物と深海魚の細胞株がどの程度の圧力に耐えられるのか、細胞の生死判別テストで調査した。生死判別テストには様々な手法があるが、膜損傷を受けた細胞に蛍光色素が入ることで、死細胞のみから蛍光が放たれる検出法を利用した。この手法を用いて調査した結果、地表生物由来の細胞株は100〜130 MPa で 20 分間加圧処理すると、ほぼすべての細胞が死滅した 17)（図 8）。一方、深海魚コンゴ
ウアナゴ細胞は、150 MPa(約 1500 気圧)の水圧で 20分間のパルス加圧を加えても、死細胞は全く検出されず、200 MPa（約 2000 気圧）で全滅が確認された
17)。この生死判別テストの結果から、深海魚コンゴ
ウアナゴ細胞は、地表生物由来の細胞と比べて高い耐圧能力を持つ事が確認できた。
さらに細胞骨格が高水圧に曝されたときの影響についての比較調査を試みた。建物には鉄骨があり、ヒトには骨があるように、細胞にも細胞の形状を維持する細胞骨格がある。細胞骨格タンパク質として有名なものには、アクチンやチューブリンと呼ばれる球状のタンパク質が存在する。この球状の細胞骨格タンパク質は、単量体として細胞質内に存在するが、可逆的かつ自発的に繊維状の重合体を形成する。マウスやマアナゴを含めた、ほぼすべての地表生物由Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)来の細胞株は 40 MPa で 20 分間加圧処理すると、細胞骨格は重合体から単量体に脱重合し、細胞の形状は球形化することが知られている（図 9）。これは、加圧によって水分子が細胞骨格タンパク質間の結合部分に入り込むことで、細胞骨格タンパク質間の水素結合やイオン結合を阻害し、フィラメント状の重合体は単量体に脱重合する事に起因している。コン
ゴウアナゴ細胞を 20 分間加圧する事で細胞骨格の変化を調査した結果、40 MPa の圧力条件では細胞に変化が現れず、100 MPa 以上の加圧条件から細胞骨格の一部が脱重合し始めることが確認された 17)（図10）。このようにコンゴウアナゴ細胞は細胞骨格構造においても極めて高い耐圧能力を有する事が見出されている。今後、このコンゴウアナゴ細胞は圧力変化を受けて、どのような適応機構を発現するのか遺伝子レベルで調べていきたい。

図 6 Deep aquarium system の模式図
A:吸引捕獲装置。B:加圧飼育装置。

111

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)図 7 深海魚コンゴウアナゴ細胞の細胞分裂
A:コンゴウアナゴ細胞の細胞分裂の継時変化。
B:コンゴウアナゴ細胞の各細胞周期における写真。
青色蛍光は DAPI による DNA の局在部位、緑色蛍光は免疫染色によるチューブリンの局在部位をそれぞれ示している。

図 8 20 分間加圧処理後における各種細胞株の生存率

112

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)図 9 加圧処理前後におけるマウスおよびマアナゴ由来細胞株の細胞骨格の局在変化
マウス細胞は 37℃、マアナゴ細胞は 25℃で、20 分間、40MPa 加圧処理した。

113

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)図 10 加圧処理前後におけるコンゴウアナゴ由来細胞株の細胞骨格の局在変化
15℃で 20 分間、各種圧力条件にて細胞を処理した。

114

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)【おわりに】
深海生物を保温保圧した状態で捕獲回収後、段階的に大気圧まで減圧する事で、地上の研究施設や水族館などで深海生物を飼育観察できる環境が整いつつある。また、深海生物組織の大気圧培養に成功した事で、深海生物を分子細胞生物学的に研究する事も可能となった。
今後はこれらの研究をふまえて、もっとも難しく、誰も詳細な研究に着手できなかった硫化水素を栄養源とする深海生物の謎に迫りたい。

8)

9)

10)

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol. 9 (2), 116-128

Mini Review
Sakaguchi T

Biological recovery and conversion of selenium by marine microorganisms

Department of Environmental Sciences, Prefectural University of Hiroshima, 562, Nanatsuka Shobara, Hiroshima
727-0023, Japan
Received: October 21, 2010 / Accepted: November 22, 2010
Keywords: Selenium, Selenium-oxyanion, Selenium oxyanion-reducing bacteria, Elemental recovery, Metalbiotechnology

海洋微生物によるセレン回収の可能性
県立広島大学 環境科学科

1. はじめにセレンは人を含む多くの生物において重要な栄養元素であり、セレノシステインやグルタチオンペ
ルオキシターゼなどの生体物質にも含まれる元素である 36)。また、天然に多様に分布し多くの水圏での存在が確認されている 5, 16)。また、セレンには
レアエレメントとして戦略物質の希少性があり、元素としての循環利用技術が必要とされている。
今日、ガラスや家電製品の製造にも多く用いられ、特異的な色彩や電気・光学的挙動を生み出す材料
元素として幅広く利用されている 12)。さらに、石油や石炭などの化石燃料にも含まれており、燃焼に伴って環境中に排出されている 34)。この他にも工業的利用の廃棄物や鉱山開発などに伴って排出されたセレン化合物、たとえばそのアニオン性酸化物質であるセレンオキサニオンは高い毒性を有するため広範囲な水圏の汚染は生体に対し多くの弊害をもたらす可能性がある 16)。米国の Stewart
Lake30)や San Joaquin Valley (Kesterson Retservoir)
22)をはじめとして、多くの地域（水圏・土壌）でセレンによる汚染が報告されており、その対策が望まれている 16)。また、これらの水圏における微生物によるセレンの変換・循環の可能性が確認されている 7, 21, 27, 28)。そのため、新規の処理技術素材
として環境に流出したセレンオキサニオンのバイ
オレメディエーションや資源回収に微生物などの阪口 利文

生物素材をはじめ、化学吸着や電気的還元法など
様々な手法を利用する動きが盛んである。
ある種の微生物は嫌気条件下で、毒性の高いセレン酸(SeO42-)や亜セレン酸(SeO32-)などを最終電子受容体として、生体活動のエネルギーを獲得するということが知られている 18, 38)。これらは(亜)セレン酸還元菌と呼ばれ、セレン化合物をより毒性の低い単体セレン(Se(0))や亜セレン酸などの酸化度の低いイオン種にまで還元することができる 38)。
現在では様々な環境中の微生物がセレン酸還元能を持つことが知られているが、詳細な研究が実施された微生物種は Escherichia coli 2)、Enterobactercloacae 29)、Thauera selenatis 14)など限られたものである。コスモポリタン的にあらゆる環境、様々な属種におおいて見出されているにもかかわらず 38)、(亜)セレン酸還元菌に関しては代謝機構や種系統などの詳しい特性において不明な点が多い。そのため、バイオレメディエーションや材料合成への利用を目的とした菌体内外へのセレン粒子の合成過程やその分子メカニズムに関する知見を得るた
めにも、培養特性などの把握が望まれるところである。
本稿では、セレンオキサニオン還元性微生物の多様性に着目し（図 1）、高塩濃度の存在下におけるセレン除去、回収に利用できうるセレンオキサニ
オン還元性微生物の獲得についての研究を紹介したい。また、セレン酸イオンなどのセレンオキサ
116

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)られている（図 2）。平成 21 年度まで暫定基準値(0.3ppm)が設定されるほど水質からの除去が困難な物質である。加えて日本国内においても総セレン量として、年間約 30 トンが環境中に排出されていると見積もられており 11)、汚染対策が望まれている。
セレンは専用鉱がなく、銅精錬やスクラップ・電解スライム精錬に伴って生産されている。日本での生産量は世界における生産量の 25%に相当し、国内生産量は 830t に及び、その 7〜8 割は海外に輸出されている 35)。そのため日本はセレンの最大の生産国となっている 11, 35)。半導体、電子、着色材
料や顔料、化学薬品などとして活用範囲も多いことから今後も国内での生産量、需要量は増加すると予想されており（図 2）、環境への排出量は増加傾向である。また、国内外ともに専用鉱がないことや粗銅鉱や精錬対象となっている鉱物の入手が完全に海外輸入に依存している現状があり、セレンは厳密にはレアアース元素ではないが、生産業にとっては欠くことのできない有用元素である 35)。
そのため、はからずも尖閣諸島問題を契機に顕在化した国内における希少元素の確保といった観点からもセレン元素の資源回収、リサイクルが重要課題になっている。

ニオンをセレンナノ結晶として回収、変換できる
可能性について検討した。実試料に適応できるよ
うな塩耐性セレンオキサニオン還元性微生物を用いたセレン除去・回収、さらにセレンナノ結晶材
料の合成による再資源化技術の開発に関する研究
内容について述べたい。
2. セレンを取り巻く状況とセレン回収の意義
製塩、ガラス工場などの産業活動や砂漠、乾燥気
候地帯における農業では塩濃縮に伴う有害イオン
種の濃縮の問題が指摘されている 25, 26)。高塩濃度
環境では塩化ナトリウムの濃縮と同時に重金属や毒性オニオン種も濃縮されるため農業では塩と濃縮有害元素との二重汚染に悩まされることになる。
また、塩業では有害イオン種の混入、製造業では高塩濃度における有害オン種の選択的除去の困難さが問題となっている 25)。これらのことは有害アニオン種であるセレンオキサニオンの場合においても該当することであり、塩濃度に左右されない
セレンオキサニオンの除去、回収が望まれている。
セレンオキサニオンはセレン酸化物のアニオンのことであり、セレン酸（SeO42-）や亜セレン酸（SeO32-）
が主なイオン種であるがいずれも生体毒性が強く、水域における総セレン量として環境基準値が設け

図 1 セレンオキサニオン還元菌の多様性

図 2 日本におけるセレンをとりまく諸事情とその用途.

117

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)次いでおり、各種のグラム陰性菌や Bacillus 属をはじめとするグラム陽性菌 41)など、現在、ほぼすべての微生物種にセレンオキサニオン還元機構が存在していると考えられる状況である。このような状況において、海洋環境や高塩環境における微生物によるセレンオキサニオンの還元についてみてみると、前記した一部の光合成物生物については海洋由来であり 40)、多くの海洋性光合成細菌でのセレンオキサニオン還元の存在が予想できうる状況である。また、イスラエルの死海の泥質からDSSe-1 と名付けられた好塩性セレン酸還元菌が分離されており 4),極限環境から好塩性セレン酸還元菌が見出されている。この他にも、米国カリフォ
ルニア州の塩湖である Mono Lake からはセレン酸呼吸によって元素体セレンを生成できる好アルカ
リ性好塩性 Bacillus 1, 3)や San Joaquin Valley に存在する乾燥によって生じた高塩濃度池から
Halomonas をはじめ多くの Proteobacteria のサブクラスに属するセレンオキサニオン還元が可能な多様な好塩性微生物の存在が明らかになっている 6)。
これらの結果は、種々の高塩（極限）環境をはじめ、海洋、海洋底など幅広い領域から塩耐性を備えたセレンオキサニオン還元性微生物の存在や高塩環境に適したセレン回収用の生物素材として利用可能な微生物が期待できる状況であることを示している。

3. 高塩環境に適した微生物によるセレン回収と除去
セレンオキサニオンの微生物還元・変換はかなり
古くから明らかになっており、亜セレンは菌体増殖抑制因子を利用して菌種識別を目的として培地などに添加された物質でもあった 15)。また、1960から 1970 年代にかけて相次いで Salmonella
heidelberg 23), Neurospora crassa 43), Candida albicans
8), Micrococcus lactilyticus (Veillonella alcalescens) 42)など多くの腸内細菌類や酵母・菌類において亜セレン酸の還元と元素体セレンの結晶の生物合成が観察されている。また、古くは 1920 年代から微生物によるセレン化合物の変換と耐性についての報
告がみられる 17)。この当時の概念として、亜セレン酸などのセレンオキサニオンは生育のための基質として利用されるわけではなく、微生物がこれ
ら毒性物質に対する耐性の一環として生物還元をおこない、原子価の少ない形態をとることで毒性の低減や無毒化を行うものであると考えられていた。無論この考えは現在でも完全な誤りではなく、多くの微生物種にはセレンオキサニオンに対する還元能があることが判明している 7, 38)。しかしながら、嫌気呼吸の基質としてセレンオキサニオンを生育必須要素に利用する微生物の存在が明らかになったのは J. M. Macy らによって 1989 年米国カリフォルニア州の San Joaquin Valley のセレンで汚染された農業用用水路から分離されたグラム陰性菌
AX 株 19)（後に Thauera selenatis と命名 20））の分離報告が最初である。Thauera selenatis は嫌気呼吸の基質としてセレン酸、硝酸を用いて嫌気的に生育できる桿菌であり、セレン酸を亜セレンに還元できる通性嫌気性細菌であることが明らかになっている 20)。また、系統分類的には Iodobater に近縁であることが判明している。この菌体に相次いで、セレンオキサニオンの還元の結果、元素体セレンを合成できる偏性嫌気性細菌として SES-3 株が分離された 37)。この分離株はセレン酸の他にも硝酸、亜硝酸、元素体硫黄、ヒ酸を還元しながら嫌気的生育できる。また、既存のセレン酸還元性菌である Wolinella succinogenes 39)が存在する
ε-Proteobacteria に分類されることが明らかになっており、Sulfurosprillum barnesii と命名されている
37)。
一方、光合成微生物が光合成によって生じた電子をセレンオキサニオンなどの酸化物アニオンの還元に利用できることが報告され 13, 24, 40)、光エネル
ギーによるセレンオキサニオンの還元回収の可能性が明らかになっている。これらの発見以来、現在まで多くのセレンオキサニオン還元性微生物、
セレンオキサニオン呼吸を行う微生物の発見が相4. 海洋生物からのセレンオキサニオン還元菌の探索
これまで、我々の研究室においても淡水、海洋泥質などから幾つかのセレンオキサニオン還元性微生物の探索を行ってきた。セレン酸などのセレン
オキサニオンを最終電子受容体として、乳酸もし
くは酢酸を電子供与体物質として含み、その他、
燐酸などの無機塩などから構成される集積培地を作製した。この集積（分離）培地に日本各地の河川、湖沼、塩田、炭坑・鉱山跡地、原油湧出地などから泥質、水質を収集して接種試料として接種した。接種後、静置培養しながら集積培養体での培地色の変化や沈殿物の形成を観察した。その後、継代しても安定に変化がみられた試料を選出し、集積培養体からプレート法を用いてセレン酸還元菌の純化を実施した。これまで得られた増殖の速い菌株については、北陸先端科学技術大学院大学
敷地内の用水路、神奈川県鶴見川の泥質、有明海の底泥から淡水及び海洋泥由来のセレン酸還元菌
分離株の獲得が可能であった（図 3）。これらの16SrDNA 系統分類解析の結果、すべて Citrobacter属に属する微生物であった 32)。これらの分離株は嫌気状態でセレン酸、硝酸を還元しながら生育で118

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)及び一部菌株に対する部分的な系統分類解析の結果から、これらの分離株も Vibrio 属の微生物ではないかと考えられている。これらの分離株の他にも有明海、日本海、瀬戸内海、太平洋沿岸から採取された泥質から同様に多くの（合計 20 数株）グ
ラム陰性短桿菌のセレンオキサニオン還元性微生物の分離株を獲得できた。全体的な傾向として、これらの分離株の多くが、セレン酸よりも亜セレン酸に対して強い還元能を有しており、海洋泥質においては亜セレン酸を単体セレンまで還元できる微生物が多く分布していると考えられた。さらに、これらの菌体をネガティブ染色法によって染色し、透過型電子顕微鏡で観察を行った。その結果、菌体には電子線を通さない約 100 nm〜300 nm
セレンのみで構成される球状微粒子が形成されており（図 6、7）、（亜）セレン酸の嫌気代謝によって、ナノサイズのセレン単体結晶粒子の形成が行われていることが明らかになった。さらに抽出された微粒子から回折像が得られたことから、結晶体の微粒子であると示唆された 。また、不溶性である単体セレンの形成が確認されていることから、
少なくとも海水や 10%程度の高塩濃度条件からのセレンの回収は可能であり、遠心分離などによって容易にセレンを除去できることが確認された。
そこで、さらに、循環型バイオリアクターを作製(図 8)、得られた海洋性セレンオキサニオン還元菌（亜セレン酸還元菌 HU-1 株）をアルギンサンゲル
で固定し、連続型バイオリアクターを用いた高濃度 NaCl (10%)からの亜セレン酸回収を行った。その結果、10%NaCl 存在下から亜セレン酸を微生物
還元によって選択的に回収能であることが確認できた（図 9）。現在のところ、ゲルビーズからの菌体の漏出や完全回収にむけた回収効率の向上などの問題があるが、原理的にはバイオリアクターによる生物回収が達成されたことから今後運転条件の最適化によってこれらの問題は解決可能であると考えている。

き、好気呼吸をも有している通性嫌気性菌であることが判明した。分離株は菌体内外やその近傍に粒径 50〜200nm 程度のほぼセレンで構成されるナ
ノ微粒子を合成でき、極端に塩類を含まないような淡水の通常条件でのセレン除去・回収への利用が期待できる微生物素材であると考えられた。これらの内、Citrobacter sp. strain JSA 株についてはト
ランスポゾンによる挿入変異によるセレン酸還元
欠損変異株が創製されている。この変異株解析か
らそのセレン酸還元が硝酸還元などの嫌気呼吸鎖とは独立していることが明らかになっており、セレン酸還元機構の分子レベルからの解明を進展中である 31)。Citrobacter 属におけるセレン酸還元微生物の存在はいくつか明らかになっているが、その還元機構に関する分子情報は不明であることから、今後 JSA 株はその解明に向けた研究材料としての利用が期待されている。
次に、分離培養例が少ない海洋に生息するセレン
オキサニオン還元菌を分離することを目的に日本各地の様々な海洋泥質や海洋生物などから海洋環
境の塩濃度である 3% NaCl や高塩環境の塩濃度である 5%、10%において生育可能なセレンオキサニ
オン還元性微生物株の分離について検討した。その結果、一般的な海洋環境の塩濃度である 3%のNaCl を含む培地に長崎県福島の泥質を接種した試料からセレン酸、亜セレン酸を単体セレンまで還元できる NZ3-1 株（図 4）、亜セレン酸を還元し、単体セレンを生成できる NZ3-2, NZ3-3 株が分離された。これらの株は 16SrDNA 系統分類解析の結果、
すべて Vibrio 属に属する微生物であり、既存の基準株との間に高い相同性で合致する（最高値で約99.2%の相同性）ものがなく、Vibrio 属の新種微生物であると考えられた。また、これまで Vibrio 属においてセレンオキサニオン還元を有する菌種の報告がなく、本研究の結果から Vibrio 属におけるセレンオキサニオン還元活性の存在が初めて明らかになった。
この他にも、ホタテ(Patinopecten yessoensis)のウロ（中腸線）から高塩濃度条件で生育可能なセレン
オキサニオン還元性菌の分離について検討したところ（図 5）、HU-1, HU-2 株などの好塩性菌株が分離された(図 6)、さらにシロギス（Sillago japonica）の体表面や貝類のタマキビ(Littorina (Littorina)
brevicula (Philippi,1844))から少なくとも SK3-1,
SK4-1 株など 5 株の（亜）セレン酸還元菌が分離された（図 7）
。これらはいずれも大きさが 2〜3 μmのグラム陰性のやや湾曲を伴った短桿菌であり、塩要求性を有していた。5 mM のセレンオキサニオ
ン存在下、10%程度の塩濃度までセレンオキサニ
オン還元を伴った生育が観察された。この結果、

5. 深海底からのセレンオキサニオン還元菌の探索
海水中にはセレンやテルルをはじめ、金、バナジ
ウム、タングステンなどの多くの有用元素の存在が確認されている。また深海底にはメタンハイド
レートをはじめ、マントルや火山由来と考えられるマンガン団塊、海底熱水鉱床が存在し、多くのメタル・元素資源の含有が予想されている。故に、その特異的な環境や金属元素の含有から、金属（様）
イオンを呼吸物質として利用できる微生物種の存在も考えられる。そこで、本研究では日本海溝三陸沖の水深 6500〜7000 m 級の深海底より採取され119

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)た泥質、海水試料（図 10）から、セレンオキサニ
オンの回収、及び単体セレン元素への変換が可能
な新規亜セレン酸還元性微生物の分離・培養し、得られた菌株によって合成されたセレン微粒子の観察おこなった。結果的には多くの分離株が得られ、セレンオキサニオンの還元回収を容易化できる可能性が示唆されている。
平成 19 年度において実施された深海調査研究かい
こう 7000II 調査潜航に参加し、無人探査機かいこう 7000II によって三陸沖の日本海溝水深6500~7000 m 級の深海底より泥質、海水試料を採取した（図 10）。採取した試料をセレン酸、亜セレン酸を含む嫌気的な培地に植菌（図 11））して菌体の増殖の有無などについて観察した。その結果、少なくとも 20 以上の集積培養体に変色、沈殿物の生成などの変化が観察された。そこで、これらの集積培養体から寒天プレート法を用いて微生物を純化したところ、水深 6983m から採取された泥質、及び水深 6957m から採取した海水の混合試料などから乳酸や酢酸を炭素源に亜セレン酸の還元が可能な菌株を少なくとも 5 株分離できた。これらの菌株はシリコ栓を用いた通気・振とう（120 rpm）
条件で 1mM の亜セレン酸を還元して生育し、培地に元素体セレンによるものと考えられる赤色沈殿物の形成が多数観察された（図 12）。次に、NA-1、
NA-5、SA-3 株などにおいて合成されたナノ微粒子
ついて透過型電子顕微鏡、及びエネルギー分散型
X 線分析による観察、元素解析を行ったところ、両株ともに菌体の内部や外部周辺に、粒径が 100〜300 nm 程度のナノ微粒子の存在が明らかになった（図 13）。形成されたセレンナノ微粒子は、概ね球形でほぼセレンのみで構成されていた。この結果から深海底から分離された亜セレン酸還元菌は乳酸、酢酸を用いながら、振とう（25˚C, 120 rpm）
を伴う好気条件下で亜セレン酸を還元し、嫌気処理などを施すことなく容易に元素体セレンの球形
ナノ微粒子に変換できることがあきらかになった。
今後、これら分離株の系統分類や既存種による好気的なセレンオキサニオン回収 9, 10)との比較などを行い、セレンオキサニオン回収生物素材としての可能性を明らかにする予定である。

獲得、ならびにその還元機構を利用したセレンナ
ノ微粒子の形成の可能性に関する研究について紹介した。海洋由来のセレンオキサニオン還元の報
告はこれまでも少なく、今後もさらにスクリーニ
ングを継続させることで多様な性質を有する目的
株の獲得を目指したい。また、得られた純化株に対する系統分析が現在ところの不十分であり、新規の微生物であることが予想されることから早急に 16SrDNA にもとづく解析を進展中である。さらに、純化微生物株や集積培養コンソーシアによるバイオレメディエーション、元素資源回収を目的としたバイオリアクターシステムによるセレン回収を実行する必要があると考えている。くわえて、シンポジウムでは若干述べさせていただいたテル
ル回収についても、セレンと同様に研究の進展が期待されるところであり、深海底からも単体セレンを合成できる数種のテルル酸還元菌の獲得に成功しており、同様の性質を有する既存菌種や光合成細菌にみられるテルル還元能などと比較を行っている。さらには、セレン・テルル回収のみならず、これら分離株によるセレン・テルルを含む化合物半導体の合成の可能性 33)についても探っていきたいと考えている。
【謝辞】本研究における電子顕微鏡観察並びに、元素分析は，文部科学省先端研究施設供用イノベーション創出事業【ナノテクノロジー・ネットワーク】の支援を受けて，京都・先端ナノテク総合
支援ネットワークにおいて実施された。ここに謝辞を表したい。また、前記創出事業のもと本研究において TEM 観察、EDX 解析等を担当された北陸先端科学技術大学院大学ナノテクノロジーセン
ター 東嶺孝一先生、片山まどか技官、池田愛技官に厚く御礼申し上げたい。また、本研究成果の一部については、財団法人ソルトサインエス財団（平成 18 年度助成研究、助成番号：0625）、平成
14 年度笹川科学研究助成海洋・船舶科学研究（課
題番号：14-381M）、平成 21 年度 独立行政法人 科
学技術振興機構（JST）地域イノベーション創出総合支援事業「シーズ発掘試験」A（発掘型）（課題番号：12-086）より研究資金の援助を賜り、遂行されました。 ここに厚く感謝、御礼申し上げたく思います。最後に、深海底からの泥質採取や分離微生物に関する有益な御助言を賜った海洋研究開発機構・極限環境生物圏研究センター加藤千明先生、近畿大学工学部教授仲宗根薫先生に心より感謝申し上げます。

6. おわりに
本稿では、バイオレメディエーションへの利用を踏まえ、酸素族のセレンの微生物回収を目的として、様々な海洋環境、海洋生物から NaCl 耐性を有し、セレンオキサニオンを還元できる微生物株の120

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)図 3 淡水・海洋泥質から分離された Citrobacter spp.セレン酸還元菌.

図 4 長崎県福島の海洋泥質から分離されたセレン酸還元菌
Vibrio sp. NZ3-1 株の透過型顕微鏡（TEM）写真.

121

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)図 5 接種試料作製に用いたホタテ(Patinopecten yessoensis)中腸線の前処理行程.

図 6 ホタテ(Patinopecten yessoensis)の中腸線から分離された亜セレン酸還元菌 (strain HU-2)の透過型電子顕微鏡写真.
A: HU-2 株の細胞 B: HU-2 株によって形成された Se ナノ微粒子。 Bars indicate A: 200 nm and B: 200
nm respectively.

122

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)図 7 シロギス(Sillago japonica)の体表面から分離されたセレン酸還元菌 (strain SK4-2)の透過型電子顕微鏡写真.
A: SK4-2 株の細胞 B: SK4-2 株によって形成された Se ナノ微粒子。 Bars indicate A: 200 nm and B:
200 nm respectively.

図 8 セレンオキサニオン回収用循環型バイオリアクター（実体図と模式図）.

123

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)図 9 菌体固定化、循環型バイオリアクターによるセレン回収.

図 10 深海底試料の採取場所.

124

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)図 11 深海底から得られた採取試料の接種.

図 12 深海底から分離されたセレンオキサニオン還元性純化株の観察例.
(NA-1 株：亜セレン還元性菌）
125

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)図 13 純化株(NA-1 株：亜セレン還元性菌)によって合成されたセレンナノ微粒子の透過型電子顕微鏡写真.

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)

学会参加報告Halophiles 2010, Life in saline environments,
9 International Conference on Halophilic Microorganismsth嶋根 康弘 1,2,3、越後 輝敦 3,4、峯岸 宏明 31

東洋大学学際融合科学研究科 バイオ･ナノサイエンス融合専攻
独立行政法人海洋研究開発機構
3
東洋大学バイオナノエレクトロニクス研究センター
4
東洋大学理工学部
2

左から嶋根、越後、亀倉氏、峯岸、Mădălin 氏(ルーマニア)、井上氏

リオロドプシンにより塩田が赤く染まる現象が記録
2010 年 6 月 29 日から 7 月 3 日に Halophiles 2010, Lifein saline environments, 9th International Conference on
されている。
Halophilic Microorganisms が中華人民共和国・北京市
我々3 名は亀倉正博博士（好塩菌研究所）と同行しで開催された。第 1 回会議から順に、Israel、Germany、て 6 月 28 日に北京入りした。北京首都国際空港へ着
Spain、USA、Israel、Spain、Slovenia、UK で開催さ
くと中国科学技術大学の学生達が暖かく迎えてくれれており、アジア圏では初めての Halophiles である。
た。彼らは皆英語が堪能であり、つたない英語を話
中国は塩の生産高が 6600 万トン／年で世界一の国
す我々は日頃の勉強不足を実感させられると共に、である。海塩のほか、四川省や内モンゴル自治区に
会期中は事ある毎に実に親切に対応して頂いた。こ代表される岩塩鉱床、青海湖（グレートソルトレイの場を借りてお礼を申し上げたい。日本からは他にクに次ぐ世界二位の塩湖）に代表される塩湖など塩井上健太郎氏（東京大）が参加した。隣国でありな資源に大変恵まれており、好塩微生物の調査・研究
がら日本からの参加者は僅か 5 名にすぎず、改めて対象として重要な地域である。また、中国は高度好日本の好塩菌研究者層の薄さを感じた。
塩菌に関する人類最古の記録を記した国でもある。
カンファレンスは翌 29 日の夕刻に開会し、主催者
1596 年に李時珍が著した医学・本草学書「本草綱目」
Yanhe Ma 氏（中国科学院微生物研究所）の挨拶に続
中には「塩田が赤色を呈すると食塩の結晶が現われ
いて、中国科学院の高官から「中国は好塩微生物のる」との記載があり、バクテリオルベリン、バクテ
研究に国家を挙げて取り組んでおり、今会議の開催
129

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)にあたり、相当額の資金援助を行っている」との説明があった。
30 日のセッションでは、Evolution and Ecology で 4
題、Ecology and Diversity で 8 題のオーラルプレゼン
テーションが行われた。井上氏の発表”Isolation of anovel halophilic archaeon from marine environments”
では、世界で初めて海水中から分離・同定された
Haloarchaea である Halomarina oriensis に関する報告がなされ、大きなインパクトを与えた。井上氏はこの他に、海域別、深度別になんと 68 株を取得しているという。高度好塩菌は一般に増殖最適 NaCl 濃度
が 1.5 M 以上と定義されている微生物であり、海洋を通じた生息域間の交流の有無は大変興味深いテー
マの一つである。Haloarchaea は海水中で active なのか？はたまた浸透圧、捕食圧に対するなんらかの防御機構を有して休眠しているのか？
続く Taxonomy のセッションでは Halomonadaceae（Antonio Ventosa 氏）、Haloarchaea （Emma White氏）における MLSA（MultiLocus Sequence Analysis）の利用に関する報告があったほか、峯岸が”Towarda refined taxonomy of the family Halobacteriaceae”というタイトルで、16S rRNA 遺伝子、rpoBʼ両遺伝子の全長を決定するための新規プライマー配列を報告した。
セッション後には International Committee ofSystematics of Procaryots (ICSP)の Halobacteriaceae お
よび Halomonadasea の Subcommitee が行われた。前回の会議後に提唱された分類群の確認の他、新規分類群提唱時における MLSA 利用の推奨（Thane Papke氏）、16S rRNA 遺伝子配列全長の登録の推奨（Minegishi, Echigo）、正確な DNA-DNA ハイブリダ
イゼーションの実施の要望（Minegishi, Echigo）などの提案がなされた。
7 月 1 日、午前中のセッションでは、Biochemistry
and Physiology で 4 題、Physiology で 3 題のオーラル
プレゼンテーションが行われた。
午後は故宮の見学ツアーに参加した。当日はあいにくの小雨であったが、これは現地のガイドに言わせると、この季節、炎天下の北京市は 35℃を超えることもあるということで、逆にラッキーだという話であり、20 名ほどの参加者と行動を共にした。会場からはバスで市内を観ながら約 30 分で天安門広場に到着した。多くの歴史上の大事件の舞台となり、最大で 50 万人を収容できるという世界最大の広場である。その天安門を抜けると、いよいよ故宮、ユネ
スコの世界遺産にも認定されている世界最大級の宮殿の遺構である。幾重もの門を抜けると、映画「ラストエンペラー」で見た宮殿に辿り着く。そこでは明清朝時代の中国の歴史を肌で感じることができる。
かなり速足の見学であったはずだが出口まではたっぷりと 3 時間ほどを要し、頂上から入口付近の建物が霞んで見えるほど巨大な宮殿であった。建造物の絢爛な装飾、収集・展示されている美術品などからも、当時の皇帝の絶大な権力が覗えた。

130

天安門と毛沢東主席の肖像
2 日のセッションでは、Physiology で 4 題、Biotechnological Application で 11 題のオーラルプレ
ゼンテーションが行われた。その後のポスタープレ
ゼンテーションでは越後が”Halophiles isolated from
non-saline soil”、嶋根が”Novel haloarchaea andenzymes from commercial salt”というタイトルで発表し、各国の著名な研究者と活発な討論を行った。
セッション後の Gala ディナーは、正院大宅門というお店で行われ、豪華な食事と共に、煌びやかな中国
衣装をまとった美女の踊りや歌、アクロバテックな演技などを堪能した。

Gala ディナーでの歌劇
3 日の最終セッションでは DasSarma 氏による特別講
演が行われ、ゲノム解析における 10 年間の歴史と好塩菌の 10 種ゲノムの解析に関する発表が行われた。
DasSarma 氏の 13 歳（！）の子息が新開発したプロ
グラムを用いて、相同配列間の相互比較やタンパク
質翻訳領域の予測を行い、高塩濃度環境中への適応機構に関する考察がなされた。全タンパク質の予測
pI 値の平均が 4.6-5.4 であることが明確に示され、酸性アミノ酸による負電荷が重要な意味を持つことがゲノム解析の結果から改めて示された。
閉会式ではポスター賞の発表が行われ、112 件のポスター発表の中から 3 件が表彰された。幸運にも嶋根が受賞の栄誉に浴した。これを励みに、今後もより一層の努力をして研究を進めたい。
閉会後には中国科学院微生物研究所の見学ツアーも開催された。筆者らは参加することができなかったが、井上氏によると高層建の研究所内には最先端のJournal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)分析装置がずらりと並んでいたそうである。今会議への出資の件といい、中国は今まさに国家を挙げて科学技術振興に取り組んでいる事が伺える。
北京市は人口約 2000 万人が住む巨大な都市で、高速道路や 6-8 車線道路が碁盤目状に都市を貫いている。
バスから市内を見渡すと、大気汚染や水質汚染、生活レベルの格差などの問題が見受けられたが、人々は皆活気に満ちあふれていた。
我が国が「科学技術大国ニッポン」と呼ばれたのはすでに昔の話、現在の我が国は「理科離れ」が叫

ばれて久しいが、ここで今一度方向を転換し、国家を挙げて好塩菌研究をはじめとした科学技術の振興に取り組むべきではないかと我々は考えている。
次回、2013 年にはアメリカ合衆国 Connecticut 州で10th Halophiles が予定されている。我々はそれまでに必ずや英語をマスターして参加し、次々回の 2016
年には 11th Halophiles を日本で開催しようと固く心に誓ったのであった。

会場のホテルから見た夕暮れの国家体育場(鳥巣)2010 年 7 月 4 日 11 時、北京首都国際空港にて

連絡先:
嶋根 康弘
東洋大学理工学部応用化学科 生命工学研究室〒350-8585 埼玉県川越市鯨井 2100
049-239-1390
yshimane@jamstec.go.jp

131

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)

学会参加報告Extremophiles 2010: The 8th International Congress on Extremophiles
東洋大学

生命科学部

道久

則之

2010 年 9 月 12 日から 16 日まで、ポルトガル領アゾ
レス諸島サンミゲル島で開催された Extremophiles
2010: The 8th International Congress on Extremophilesに参加しました。アゾレス諸島は、本土からおよそ1400 km から 1800 km 離れた範囲の大西洋上に浮かぶ島々です。サンミゲル島はアゾレス諸島で一番大きい島であり、気候は 1 年を通じて温暖であるそうです。火山があり、カルデラ湖も存在します。中心都市はポンタ・デルガーダであり、学会はここで行われました。街周辺には、美しい南欧風の家やのど
かな田園、美しい海岸・港がありました。

会場近くの海岸

今回の会議は、ポルトガルの New University of
Lisbon の Helena Santos 教授が Congress Chair を務められ、同大学のメンバーが中心となって開催されました。開催場所は、Teatro Micaelense という会場（劇場）でした。口頭発表は主に 2 つのホールで行われました。ポスターは会場主に 2 階の廊下スペースなどで行われました。ポスターを掲示するスペースがやや狭く、かなりの数が会場の廊下の壁に直貼りす
るようになっていました。参加者は約 400 名であり、ヨーロッパを中心に、アメリカやアジアの国々（合計 30 数カ国）から参加していたようです。Keynote
Lecture が 26 題、口頭発表が 32 題、ポスター発表が246 題ありました。セッションは 12 あり、「Polar
Microbial Ecology」「Adaptation to Extreme Conditions I」「Physiology and Metabolism」「Biotechnology」「Microbial Ecology I」「Genetics and Gene Expression」「Omics Approaches」「Proteins and Enzymes I」「HighPressure」「Microbial Ecology II」「Proteins and Enzymes
II」「Adaptation to Extreme Conditions II」といった多岐にわたる内容で各発表が行われました。
Opening Lecture では、Karl O. Stetter 先生 (Universityof Regensburg) が、「Microorganisms in Extreme
Environments」というタイトルで、先生のこれまでの超好熱菌研究の話をまとめて発表されました。特に、古細菌 Ignicoccus hospitalis の表面に共生して生育するナノサイズの Nanoarchaeum equitans について
は、以前から興味をもっておりましたが、あらため

ポンタ・デルガーダの街

会場となった Teatro Micaelense132

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)深海探査船“ちきゅう”に乗船されたことや酵素に
合成アミノ酸を導入して新しい酵素を創製する
synthetic biotechnology（Thermoanaerobacter
theramohydrosulfuricus の lipase を例として）についての興味深い内容もありました。
Excurion では、Frunas 地区の温泉や火山湖（Lagoa
do Fogo）に行きました。温泉地帯では、鉄分のため土色に濁ったプールに多くの観光客が泳いでいたり、熱水が噴出している間欠泉のような場所や様々な植物が生い茂った庭園があり、非常に見応えがありました。事前登録をしておくと、温泉からサンプリングができたようです。
学会 3 日目の Congress Dinner において、若手研究者に対する Best Poster Award の発表がありました。
女性研究者ばかり 5 人が受賞しました。受賞者はヨーロッパの研究者が多く、アジアではホンコン大学の研究者が受賞しました。学会の名誉賞の発表もあり、掘越弘毅先生と Mosè Rossi 先生（Institute ofProtein Biochemistry, Italy）が受賞されました。また、
Helena Santos 教授（New University of Lisbon）が次期の International Society for Extremophiles の会長に就任され、跡見晴幸教授（京大）が副会長に就任されるとの報告がありました。今後の極限環境（微）生物研究の益々の発展を期待したいと思います。

て話をうかがっても大変興味深いものでした。この菌は、既知の古細菌 3 界いずれにも属していない未知の系統であり、非常に小さなゲノムしかもっていないとのことで今後の研究展開も興味深いと思います。Stetter 先生は既に大学をリタイアされているよ
うで、最近は、趣味で蘭（確か蘭だったと思う）の栽培にも注力されており、賞もとられているというのが、印象的でした。
「Biotechnology」のセクションでは、出口先生（JAMSTEC）によるセルロースを用いた極限環境微生物用固体培地についての講演がありました。この培地を用いると、幅広い pH や温度範囲での使用が可能となるとのことで、海外の研究者からも大変興味をもたれているようでした。極東製薬株式会社の方から販売されているようで、同社のブースが会場にあり、盛んにアピールされているようでした。また、このセクションでは、Dr. Stefan Janecek (Instituteof Molecular Biology, Slovakia)によるタンパク質のバ
イオインフォマティックな観点からの Archaea のαアミラーゼの講演や Jennifer Littlechild 教授（University of Exeter, UK）による好熱菌の酵素の応用に関する講演など、個人的には興味深い演題が多くありました。また、Dr. Muhammad Islam (Institutefor Health, Environment & Safety, Belgium) による重金属耐性菌の Cupriavidus metallidurans CH34 株の研究も興味深い内容でした。様々な重金属を添加してマイクロアレイにより、CH34 株のトランスクリプ
トーム解析を行った結果、抗酸化に関わる新規なタ
ンパク質を発見したというもので、将来的には、バイオレメディエーション等への応用につながると思われる興味深い成果でした。本内容はポスターでも発表されており、発表者の Dr. Muhammad Islam に詳
しく研究内容を聞くことができました。彼は、もと
もとバングラディッシュ出身ですが、大阪大学で博士号を取得されたそうで、日本語も上手でした。また、「Proteins and Enzymes II」というセクションにおいて Beate Averhoff 教授(Johann Wolfgang Goethe
University, Germany)の「Shuffling genes around in hot
environments」という講演がありました。内容はThermus thermophilus の DNA 取り込み機構に関するものでした。私自身は Thermus thermophilus が DNAを取り込む機構があるということくらいしか知らなかったこともあり、PilQ などの secretin-like proteinが関与している詳細な機構は、大変勉強になりました。
Closing Lecture では、Garabed Antranikian 教授(Hamburg University of Technology, Germany)が、「Perspectives for a bio-based economy: from deep
subseafloor biosphere to the coming age of synthetic
biotechnology」という内容で発表されました。国際的視点からのバイオテクノロジーについて、現在のエネルギー問題や経済的潜在性についての話から始
まり、極限環境微生物やその酵素の必要性や応用性についての幅広い発表内容でした。発表の中で、Antranikian 教授が、JAMSTEC との共同研究により、Frunas 地区の温泉プールで泳ぐ人々

Frunas 地区の熱水サンプルを採取する学会参加者
133

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)Lagoa do Fogo

Best Poster Award を受賞された研究者

名誉賞を受賞された掘越弘毅先生（右）と Mosè Rossi 先生（中央）（左は井上明先生）

最終日の集合写真

134

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)

学会参加報告第 6 回バイオサイエンスとバイオテクノロジーに関する国際会議に参加して青山学院大学理工学部 化学・生命科学科

2010 年 8 月 28 日〜9 月 1 日、高圧バイオサイエン
スとバイオテクノロジーに関する国際会議（6thInternational Conference on High Pressure Bioscienceand Biotechnology, HPBB2010）がドイツ南部の都市、
フライジング（Freising）で開催された。ヴァイヘン
シュテファン（Weihenstephan）で有名なビールの聖地である。主催者はミュンヘン工科大学の Rudi F.
Vogel 博 士 で 、 参 加 者 は お よ そ 100 名 、Kardinal-Döpfner-Haus という司教の学術会館内で 5日間の議論が行われた。この国際会議の第 1 回は2000 年に京都で開催され、林力丸博士（京都大学名
誉教授）が初代チアマンだった。参加者の主なアク
ティビティーは、（１）タンパク質や脂質の構造を高圧下で解析することで、それらの安定化の原理や分子内にある空隙の存在、高分子のフレキシビリティ
ーを理解すること、（２）大腸菌や酵母などのモデル
生物や深海微生物を用い、分子生物学的な手法で圧力応答機構を解明すること、および（３）食品加工や殺菌を目的とするもの、などに分類される。我が国からは海洋研究開発機構をはじめ、徳島大学、近畿大学、新潟薬科大学、食品総合研究所、産業技術総合研究所などから、国別にみると開催国であるドイツとほぼ互角で最多の参加者数を誇った。
初日の基調講演では、近畿大学の赤坂一之博士が高圧 NMR を用いたタンパク質の構造解析とその応用に関する研究を紹介した。赤坂博士らはこれまで、タンパク質分子の集団内にエネルギー状態の異なる
種々のポピュレーションが混在しているという“高エネルギー構造説”を提唱してきた。通常の条件下ではマイナーで検出することが困難なフラクション
でも、圧力をかけることでその割合が増大することを示し、アミロイド病などいわゆるタンパク質のコ
ンフォメーション病が発症するメカニズムの解明につながる可能性を報告した。
スポットライト講演として、UCLA の Wayne L.
Hubbell 博士は High-pressure EPR（高圧電子スピン共鳴）を用いた水溶性タンパク質のフレキシビリティ
ーに関する報告を行った。この手法は NMR では解析が困難な巨大タンパク質や膜タンパク質であっても、ピコ秒からミリ秒までの幅広い時間軸で振動する高次構造を捉えることができる。いくつかのタンパク質が高圧下で可逆変性する様子が捉えられた。
リヨン大学の Phil M. Oger 博士は、深海底における微生物の多様性や呼吸活性に関する報告を行った。
深海や地殻内の微生物においては、玄武岩の成分が

135

阿部 文快

電子受容体や供与体のソースになる可能性が示された。
スクリップス海洋研究所の D. H. Bartlett 博士は、プエルトリコの海底試料についてメタゲノム解析を行い、エネルギー代謝、アミノアシル tRNA 合成酵素、ジャイレースなどの遺伝子の割合が浅海より多く検出されることを報告した。
ミュンヘン工科大学の Christian A. Lenz 博士とアルバータ大学の Simmon Hofstetter 博士は食材中に混入しているボツリヌス菌の高圧殺菌に関する報告を行った。特に内生胞子の高圧殺菌は困難で、対数増殖期の菌を死滅させるよりはるかに高い 600 MPa 以上の高圧を要することが報告された。内生胞子の成分である Dipicolinic acid の放出を菌体死滅の指標とし、抗菌ペプチドであるナイシン存在下での圧力効
果が調べられた。その結果、ナイシンは 600 MPa における殺菌効果を著しく向上させることが明らかとなった。
フリードリッヒ・アレクサンダー大学の Eva-Maria
Weiss 博士はガン治療ワクチンの製造に高圧処理を用いる手法について報告した。ガン治療ワクチンは癌細胞に存在する成分のうち宿主免疫系が標的抗原として認識しうる構成成分（癌抗原）を同定し、この癌抗原を宿主に人為的に与えることで癌に対する特異的な抗腫瘍免疫を誘導するものである。ガン細胞を 100 MPa の高圧にさらしたところ、細胞はアポ
トーシス様の形態変化を伴って死滅し、かつガン細胞の抗原性は十分維持されていることが報告された。
その他、食品関連では魚介類や牛肉、牛乳、果物、野菜などあらゆる食材に対する圧力効果が研究されており、調理や殺菌のみならず低アレルゲン食品の開発など、新しいジャンルの取り組みが広範囲で進行中であることがよくわかった。
我が国は圧力研究の伝統がありながら、ここ数年
いささか元気がないように思われる。一方、韓国や中国の追い上げは激しく、高圧食品加工は
Non-thermal food processing の代表格となりつつある。
欧米諸国ではもはや普及技術である。2012 年の第 7回国際会議は、近畿大学の赤坂博士によって我が国で開催される。それに先立ち、2011 年には長岡で国内の生物関連高圧研究会シンポジウムが開催される。
これを機に生化学、分子生物学、応用科学を融合した圧力研究の新ジャンルの模索を行うべきであろう。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)＜写真の説明＞チアマンの Rudi F. Vogel 博士（一番右）と開催委員の方々、および筆者（左から 2 番目）

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)

書評
難培養微生物研究の最新技術 II（シーエムシー出版）書評
東京大学 石井正治

物を実際に対象とはしていない研究者にも示唆に富んだ内容を多く含んでいる。
本書の具体的な内容は以下の通りである。
第１編：難培養微生物の研究技術
第２編：難培養微生物のゲノム・メタゲノム解析
第３編：難培養微生物の機能と応用
第４編：微生物資源としての難培養微生物
１では最新技術の有効性や限界が細かく紹介されている。即ち、微小電極法、MAR-FISH 法、生細胞内の RNA 検出技術、SIP 法、複合系内の特定微生物
由来の核酸定量法、統計的解析、SIGEX 法などである。
２ではゲノム・メタゲノム解析の広がる将来性が述べられている。即ち、ゲノム解析とメタゲノム解析
について詳細な記述がなされた後、ヒト腸内微生物、
地下生物圏微生物、植物根圏微生物、シロウリガイ
類共生微生物、Single cell、のゲノム解析、さらには微生物群集を対象としたメタボローム解析についても記載されている。
３では各種環境における機能的難培養細菌の生化学が詳述されている。即ち、メタン生成に関わる共生
細菌、アナモックス細菌、水田脱窒細菌、嫌気的脱ハロゲン細菌、昆虫細胞内共生細菌などである。
４では難培養微生物研究の現在の位置さらには将来像が哲学と共に述べられている。
第一線で活躍されている研究者諸氏が執筆に関わっている本であるため、値段が多少張る（65,000 円＋税）のは仕方ないであろう。これは、確定申告で取り戻す（？）か、所属機関に購入を依頼するかして、兎に角のご一読を強くお薦めする。
本書の記述は明快かつ軽快であり、読み物としても充分に堪能でき、参考書としても十二分に諸氏の要求に応えてくれることは間違いない。適切に選択されている参考文献の豊富さも嬉しい限りである。
書評者としての本書の読後感は爽快と言える。暫くの間それが何故だか分からなかったが、漸く納得出来た。執筆者が微生物に誘われるようにして研究を意欲的に進め、そうした熱意に基づいて書かれているからである。

「微生物の研究を行っています。」と、話す時がある。そうした時、自分には明らかにしたい事柄があり、そのためには、今使用している微生物[群]を材料とするのがベストだからそれを使っているのか、
あるいは、現在用いている微生物[群]に導かれるよ
うにして、明日の科学を探し求めて研究しているのか、判然としなくなる場合が往々にしてある。ヒトも微生物も同じ生き物なので、何かしらの相互作用があるのだろうか。
さて本書は、限られた研究分野（難培養微生物）を対象とした専門書であるかのようなタイトルを有しているが、内容は全く異なっている。明日の微生
物学を論じる微生物学者諸氏の熱い自己アピールと澄み切った未来予想、さらには微生物研究讃歌から成っている、と言っても過言ではない。
地球上に存在している微生物の内、これまでに単離されかつ人為的な培養が可能なものは、全体の中で微々たるものである。そう考えると、培養出来るものを対象とした俗にいう微生物学と、難培養微生物を対象とした学問分野の姿と裾野は、砂山と富士山ぐらいの違いとなってくる。本書はそうした大所高所からの視点で執筆されているため、難培養微生137

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)

学会記事
極限環境生物学会

第 11 回年会報告

極限環境生物学会として改名して行われた最初の年会は、京都大学・黄檗ホールにて開催されました。参加者総数が、195 名となり、東京以外で開催された年会としては、過去最高の参加者となりました。参加者の内訳を以下に示します。
事 前
一

般

学

生

当

8 5
会 員：74
非会員：11
7 8
会 員： 6
非会員：72

日

合計

2 4
会 員：7
非会員：17
８
会 員 ： 0
非会員： 8

1 0 9

8 6

年会の開催に当たり、京都大学の跡見晴幸先生、栗原達夫先生を初めとする、スタッフ学生の皆様にお世話になりました。ここに心より感謝申し上げます。ありがとうございました。
JSE 事務局

ポスター賞の表彰。

学会奨励賞の表彰。

受賞された、友池史明(大阪大学)、仲山英樹(神戸大学)、峰岸宏明(東洋大学)、平田章(愛媛大学)、牧野友里子(東京工業大学)、梅田隆志(東京大学)各若手研究者。掘越会長を囲んで。

左から、國枝武和(東京大学)、道久則之(東洋大学)、掘越会長、大島副会長、八波利恵(東京工業大学)、金井保(京都大学)各先生方。

138

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)

学会誌投稿規定
極限環境生物学会誌投稿規定

１．投稿者の資格
極限環境生物学会誌（ISSN 1348-5474） (Journal ofJapanese Society for Extremophiles)（以下、本誌という）への投稿は極限環境生物学会（以下、本学会という）会員に限る。なお、連名による投稿の場合には、少なくとも著者の一人が本学会会員でなければならない。ただし、日本国以外からの投稿並びに本学会が寄稿を依頼した場合は例外とする。

け付ける。この場合、極限環境生物学会ホームペー
ジに掲載されている投稿要領に従うこと。

２．論文の種類
本誌への投稿論文は、極限環境生物関連分野の原著論文（通常論文、短論文）、総説、並びに諸報とし、いずれも未発表のものに限る。
（１）原著論文 (original papers)：極限環境生物に関する論文で以下の２つのいずれかに該当する論文。
１）通常論文 (regular papers)：極限環境生物に関する論文で、それ自体独立した、価値のある結論ある
いは事実を含む論文。
２）短論文 (short communications)：極限環境生物に関する論文で、断片的な結果ではあるが新しい事実や価値のあるデータを含む短い論文。
（２）総説 (reviews)：極限環境生物のある特定の研究分野について、簡単な歴史的背景を含め、最近の進歩を要約し、可能であれば、将来の研究方向性をも指し示した論文。
（３）ミニレビュー (mini-reviews)：総説の内、比較的短く纏めたもの。
（４）諸報：巻頭言、研究最前線、研究のルーツを探る、学会関連記事等。

５．論文の審査
投稿された論文の内、原著論文、総説、ミニレビュ
ーの審査には、極限環境生物学会誌編集委員の内１名が責任編集委員として関与する。原著論文および総説の審査は、責任編集委員が適宜指名する複数の査読者によりなされる。掲載の可否に関する最終判
定は、査読者からの査読結果報告に基づき責任編集委員が行う。その後、編集委員長が著者に審査結果を通知する。なお、内容・体裁に問題があると判断された原稿については、著者による修正を求める。
修正を求められた原稿は、２ヶ月以内に責任編集委
員に返送することとし、２ヶ月を過ぎて返送されなかった原稿は、著者が原稿を取り下げたものとして処理する。なお、投稿された論文は返却しない。

〒113-8657 東京都文京区弥生 1-1-1 東京大学大学
院農学生命科学研究科応用生命工学専攻（東大院農生科応生工と省略可）極限環境生物学会誌編集委員長
石 井 正 治 ( 電 話 ： 03-5841-8258, FAX ：03-5841-5272) (e-mail: amishii@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp)

６．校正
校正は初稿のみ著者に送付する。到着日より３日以内に、原稿とともに指定された送付先に返送すること。なお、原著論文ならびに総説に関しては、著者
校正時の文章・図表の追加や削除は一切認めない。
７．別刷り
別刷りは、pdf ファイルとして配布する。

３．論文の書き方
論文の用語は日本語または英語とし、別途定める「原稿執筆要領」に従い簡潔に分かりやすく作成すること。総説は原稿３０頁以内、通常論文は原稿２０頁
以内、ミニレビューは原稿１５頁以内、短論文は原稿１０頁以内とする。なお、諸報の頁数に関しては編集委員会で適宜判断する。

８．著作権
本誌に掲載された論文の著作権は本学会に帰属する。
９．その他
極限環境生物学会誌投稿規定ならびに極限環境生物
学会誌論文執筆要領で不明な部分に関しては、極限環境生物学会誌編集委員会において適宜対応する。
なお、必要が認められる場合には、文書化を進めるものとする。

４．論文の受付
論文原稿は諸報を除き、原稿原本の他にコピー３部を付け、送付状とともに簡易郵便書留として下記宛に送付すること。なお、オンラインによる投稿も受

139

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)

論文執筆要領
極限環境生物学会誌論文執筆要領
１．一般的事項（１）テキストファイル形式または Microsoft Word
形式で保存できるワードプロセッサ等を用いて原稿を作成すること。
（２）タイトルページには、1)論文題名、2)著者名、
3)著者所属機関名、4)ランニングタイトル、5)連絡対
応著者名およびその連絡先住所・電話番号・FAX 番号・e-mail アドレス、6)キーワード（５語以内）を明示すること。日本語で作成した論文には、これらの英語訳を併記すること。
（３）論文印刷には A4 版用紙の片面を使用し、１
行４０字（英語の場合には１行６０字）、１頁２５行で印刷すること。イタリック、ボールド、あるいはスモールキャピタルにする語句がある場合は、それぞれ赤字で下線、波下線、二重下線を記すこと。
（４）略語リストがある場合には、本文第１頁に脚注として略語の項を設け表記すること。単位系と省略記号は SI 単位を基本とする。
（５）生物の命名及び記載は International Code of
Nomenclature of Prokaryotes, International Code ofBotanical Nomenclature, International Code ofZoological Nomenclature に従う。学名が初出の場合は全部を記載すること。原則として、２回目以降は属名の頭文字を略号とするが、紛らわしい場合には省略せずに記載すること。
（６）物質名の表記は以下の規定に従うこと。
１）有機化合物の表記および放射性同位元素による標識化合物の表記は IUPAC 規定に従うこと。
２）生化学関連事項の命名は IUPAB 制定の命名法に従うこと。
３）化学式に用いられる記号、略号などは Chemical
Abstracts の用例に従うこと。
（７）論文受理後、完成した本文および図表等の印刷に必要な全てのファイルを収めた電子媒体を編集委員長宛に郵送するか、またはそれらのファイルを
e-mail 添付書類として編集委員長宛に送付すること。
２．投稿論文の構成（１）原著論文は 1)標題、2)アブストラクト、3)本
文、4)引用文献、5)表ならびに図、図の説明文、の順にまとめること。
（２）標題は論文内容を具体的に表す簡潔なものとすること。標題の下に著者名、所属機関名、所在地を書く。著者が複数で、所属機関が異なる場合は、
著者名末尾に上付数字を付けて区別するとともに、連絡対応著者名を指定すること。
（３）原著論文ならびに総説のアブストラクトは英語で記述するものとし、通常論文・総説では200words 以内、短論文では 100words 以内で作成す

140

ること。
（４）通常論文の本文は原則として、緒言、材料および方法、結果、考察（あるいは結果と考察）、謝辞で構成する。短論文では項目分けをしない。
（５）原著論文ならびに総説では、必要に応じて図表を用いる。それぞれの図表を挿入したい位置を、原稿右側の余白部分に指示すること。
（６）文中での文献の引用は、引用文献の項目で整理した文献番号を用いること。図表の引用はその番号によること。
（７）脚注が必要な場合には、該当事項の右肩に通し番号を付け、当該頁の下部に説明文を付けること。
３．引用文献（１）引用文献は下記の例に準じ、本文中の該当人
名あるいは事項の右肩に 1), 1-3)のように番号を付し、また、本文末尾の引用文献の項に第一著者のファミリーネームのアルファベット順に 1., 2., 3., --の番号を付し一括記載する。Ibid., idem は用いないこと。私信、未発表の研究結果、学術雑誌に受理される前の論文、抄録が印刷されていない口頭発表など
は引用文献に含めないこと。雑誌の略号は、Chemical
Abstracts Service Source Index (CASSI) 1907-1984(Cumulative)およびその補遺版により、雑誌名、書名、
年、巻および頁の示し方は下記によること。
（２）雑誌引用のとき
Chuakrut, S., Arai, H., Ishii, M., and Igarashi, Y. 2000.
Characterization of a bifunctional archaeral acylcoenzyme A carboxylase. J. Bacteriol. 185: 938~947.
（３）書籍引用のとき
児玉徹. 1997. V 近代的な微生物利用工業１．アルコール, pp191~197.児玉徹・熊谷英彦編, 食品微生物学,
文永堂出版
４．表と図およびその説明（１）表と図は印刷版下を作成すること。
（２）本文を英語で書いた場合には図表も英文で作成すること。
（３）表と図は一つに対して１頁使う。各頁の右上に著者名ならびに図の番号を入れること。
（４）表題は表の上部分に書くこと。表の内容説明
文ならびに注は、表の下に記述する。注の表示にはa),b),c)を上付で明記し、記述には a),b),c)を上付にせず用いる。
（５）図の標題ならびに説明文は別紙にまとめて印刷すること。図の標題の最後にはピリオドを付し、内容説明は標題の後に改行して記載すること。
（６）写真は明瞭な陽画を必要部数添付すること。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)学会会則
極限環境生物学会会則（名称）第１条 本会は、極限環境生物学会（英文名：TheJapanese Society for Extremophiles ）という。
（以下本会という）（目的）
第２条 本会は、極限環境生物研究の発展に寄与し、極限環境生物の研究、教育、利用の推進に寄与することを目的とする。
（事業）
第３条 本会は、研究発表会及び講演会等の開催、
極 限 環 境 生 物 学 会 誌 （ 英 名 ： Journal ofJapanese Society for Extremophiles）の発行、
国際極限環境生物学会等との連携事業、研究奨励賞・ポスター賞の授与、その他前条の目的を達成するために必要な事業を行う。
（会員の種別等）
第４条
1. 本会の会員は正会員、団体会員および賛助会員とする。
2. 正会員は極限環境生物に関する研究に従事する、または、これに関心を持つ個人であって、本会の目的に賛同し、定められた会費を納めた者をいう。
3. 団体会員は極限環境生物に関心を持つ団
体（法人等）であって、その団体内の本会の目的に賛同する代表者を含めて３名以内の所属者を指名して会員登録を行い、定められた会費を納めた団体をいう。
4. 賛助会員は本会の目的に賛同し、定められた賛助会費を１口以上納めた個人または団体をいう。
第５条 会員は本会が開催する諸事業に参加し、本会の発行する印刷物、PDF 等の配布を受けることができる。
（入会）
第６条 会員として入会しようとする個人または団
体は、本会事務局が定める手続きに従って申し込みを行い、本会会長による承認を得なければならない。
（会費）
第７条 会員は下記の会費を納めるものとする。
正会員
年額 5,000 円（但し身分が学生である者は年額 2,000 円）

団体会員 年額 20,000 円
賛助会員 年額 一口以上（一口 30,000 円）（退会）
第８条 会員は会長に届けることによって退会する141ことができる。
（役員）
第９条
1. 本会には会長 1 名、副会長 2 名、評議員若干名、幹事若干名、会計監査 2 名の役員をおく。
2. 会長は本会を代表し、会務を統括する。
3. 副会長は会長を補佐し、会長に事故ある場
合には会長の職務を代行する。
4. 幹事は、幹事長、庶務、学術活動、会計、を分担し、事業計画の立案、事業の実施、庶務会計、シンポジウムの企画立案、学会誌発行、国際極限環境生物学会等との連絡などの本会の事務を行う。
5. 会計監査は本会の会計を監査する。
（役員の選出）第１０条 会長、副会長、評議員は本会の総会において選出される。
1. 幹事、会計監査は、副会長、評議員以外の正会員の中から会長が指名し、総会の承認を受ける。
2. 評議員の任期は２年とし重任を妨げない
が、連続３期を限度とする。但し、会長が指名する評議員はこの限りではない。
（委員会）
第１１条 本会に学会誌編集委員会、研究奨励賞選
考委員会、シンポジウム委員会を置く。各委員会委員の任期は 2 年とするが重任をさまたげない。
1. 学会誌編集委員会（会長指名の若干名で構成し､委員長は互選する）は学会誌の編集、論文審査の任にあたる。
2. 研究奨励賞選考委員会（副会長が委員長を勤め、学術活動担当幹事と委員長指名の委員、計 10 名程度で構成する）は本会の研究奨励賞受賞者を選考する。
3. シンポジウム委員会（会長指名の若干名で構成し､委員長は互選する）は学術活動幹事と共同でシンポジウムを企画立案し、運営をサポートする。
（評議員会）
第１２条 評議員会は会長、副会長、評議員をもって構成する。会長は年１回以上評議員会を召集し、議長となり、会の重要事項を審議し総会に提案する。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (2)第１７条 本会則の変更は総会の議決を経て行う。
第１８条 本会則は、1999 年 10 月 19 日より施行する。

（総会）
第１３条 本会は原則として年１回総会を開き、会務を協議し議決する。
総会は会長が召集する。
第１４条 総会の議決は出席会員の過半数の賛成をもって行う。
（会計年度）
第１５条 本会の事業年度は 1 月 1 日に始まり、同年 12 月 31 日に終る。
（付則）第１６条 本会則の施行および本会の運営についての細則は総会の議決を経て別に定める。

学会細則2001 年 11 月 29 日改定
2002 年 12 月 1 日改定
2003 年 12 月 1 日改定
2005 年 11 月 7 日改定
2007 年 12 月 1 日改定
2010 年 1 月 1 日改定

極限環境生物学会細則
第８条 評議員会の決議は出席者の過半数の賛成により成立する。
（退会）
第９条 会長は、会費を３年以上滞納した会員を退会させることが出来る。
（授賞）
第１０条 研究奨励賞・ポスター賞の授賞規定は別途定め全会員に配布する。
（細則の変更）第１１条 本細則の変更は総会の議決による。
（付則）第１２条 今期の本会事務局は、東洋大学生命科学部井上研究室（群馬県邑楽郡板倉泉野）内とする。
第１３条 本細則は、1999 年 10 月 19 日よりこれを
実施する。

（会員）
第１条 入会を承認された正会員、団体会員、賛助
会員は、所定の会費を速やかに納入する。
（総会）
第２条 総会の議案は副会長、幹事等と共に会長が作成し、評議員会の議を経た後提出する。
議案には前年度の事業内容及び収支決算、
新年度の事業計画、及び収支予算を含むものとする。
第３条 総会は会員の１／１０以上の出席（但し委任状を含む）をもって成立する。
（役員の選出）第４条 会長、副会長、評議員は会員の選挙によって決められる。会長は選挙によらず評議員を指名することが出来るが、総会での承認を必要とする。
第５条 会長は会員の中から少なくとも３名を選んで選挙管理委員を委嘱する。選挙管理委員
は選挙事務を行う。
第６条 会長は、評議員会の承認を得て必要な委員会を作ることが出来る。
（評議員会）
第７条 評議員会は評議員の半数以上の出席（委任状を含む）をもって成立する。

2002 年 12 月 1 日改定
2003 年 12 月 1 日改定
2006 年 6 月 30 日改定
2007 年 12 月 1 日改定
2010 年 1 月 1 日改定

142

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol. 10 (2)運営体制
極限環境生物学会運営体制（2010~11 年度）
会長
副会長

掘越

弘毅

独立行政法人海洋研究開発機構

大島泰郎

共和化工株式会社

工藤

俊章

長崎大学

環境微生物学研究所

水産学部

評議員（５０音順、敬称略）

幹事会

秋野利郎

合同酒精株式会社

幹事長

井上明

東洋大学生命科学部

五十嵐泰夫

東京大学大学院農学生命科学研究科

庶務

亀倉正博

好塩菌研究所伊藤進

琉球大学農学部

加藤千明

独立行政法人海洋研究開発機構

伊藤雅道

駿河台大学経済学部

伊藤佑子

創価大学工学部

今中忠行

立命館大学生命科学部

学術活動
東京大学大学院農学生命科学研

編集委員長

石井正治

学会誌担当

石野良純

九州大学大学院農学研究院

究科

大島敏久

九州大学大学院農学研究院

大森俊雄

芝浦工業大学大学院工学研究科

高品知典

東洋大学生命科学部

鎌形洋一

独立行政法人産業技術総合研究所

古園さおり

独立行政法人理化学研究所

川上文清

東洋紡績株式会社敦賀バイオ研究所

跡見晴幸

京都大学大学院工学研究科

河原林裕

独立行政法人産業技術総合研究所

伊藤隆

独立行政法人理化学研究所

倉光成紀

大阪大学大学院理学研究科

仲宗根薫

近畿大学工学部

小林哲夫

名古屋大学大学院生命農学研究科

國枝武和

東京大学大学院理学系研究科

小林良則

財団法人バイオインダストリー協会

青木俊夫

日本大学生物資源科学部

為我井秀行

日本大学文理学部

小松泰彦

学術幹事

独立行政法人産業技術総合研究所

坂口健二

シンポ担当

伊藤政博

東洋大学生命科学部

HP 担当

三輪哲也

独立行政法人海洋研究開発機構

会計

宇佐美論

東洋大学理工学部

会計監査

高瀬光徳

佐上博

東北大学反応化学研究所

芝弘孝

サントリービジネスエキスパート株式会社

菅原秀明

国立遺伝学研究所

鈴木健一朗

独立行政法人製品評価技術基盤機構

冨田房男

放送大学北海道学習センター

中川和倫

愛媛県立松山南高等学校

中村聡

東京工業大学大学院生命理工学研究科

南部滋郎

日本赤十字九州国際看護大学看護学部

長谷川功

日本大学生物資源科学部

半澤敏

東ソ−株式会社東京研究所

古川謙介

別府大学食物栄養科学部

別府輝彦

日本大学

松井裕

石川県立大学生物資源工学研究所

丸山正

独立行政法人海洋研究開発機構

山岸明彦

東京薬科大学生命科学部

仲山英樹

山本幹男

日本食品化工株式会社研究所

相馬亜希子

立教大学理学部

湯本勲

独立行政法人産業技術総合研究所

東端啓貴

東洋大学生命科学部

若木高善

東京大学大学院農学生命科学研究科

渡辺公綱

独立行政法人産業技術総合研究所

伊藤俊洋

森永乳業株式会社栄養科学研究所
財団法人北里環境科学センター

シンポジウム委員会
委員長
委員

宮崎健太郎

所

平山仙子

独立行政法人海洋研究開発機構

梅野太輔

千葉大学大学院工学研究科

前田理久

明治大学

黄川田隆洋

143

独立行政法人産業技術総合研究

農学部

独立行政法人農業生物資源研究所
神戸大学自然科学系先端融合研
究環Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol. 10 (2)

編

集 後 記

今回も学会誌の発刊が遅れてしまいました。そろそろボランティア
ベースのこの作業にも限界が近づいてきたような気がいたしております。読者の皆様方の中で、いいアイデアがあったらどしどしお寄せください。
さて、2011 年度の年会は、長崎で開催することが決まりました。会
員書誌の積極的なご参加をお待ちしております。創立 12 周年目を迎える 2011 年度もよりいっそうがっばってまいりますので、今後ともよろしくお願いいたします。
庶務幹事 加藤千明

編集委員会
委員長 ：石井正治（東大）
副委員長：石野良純（九大）
委員：阿部文快（青学大）、伊藤 隆（理研）、鎌形洋一（産総研）、河原林裕（産総研）、
高品知典（東洋大）、為我井秀行（日大）、中村 聡（東工大）、中村 顕（筑波大）、
三輪哲也（JAMSTEC）、湯本 勲（産総研）

学会事務局〒374-0193 群馬県邑楽郡板倉町泉野 1-1-1
東洋大学 生命科学部 生命科学科 井上研究室内
極限環境生物学会事務局 井上 明 (幹事会幹事長)
D-FAX: 020-4662-1960 E-mail: kyokugenjm10@extremophiles.jp
学会誌編集〒237-0061 神奈川県横須賀市夏島町 2-15
独立行政法人海洋研究開発機構 海洋・極限環境生物圏領域 (加藤千明、庶務幹事)
TEL：046-867-9550 FAX：046-867-9525 E-Mail：kyokugenjm10@extremophiles.jp
発刊日

144

2010 年 12 月 28 日