第115回日本食品衛生学会学術講演会
技術セミナー 2019年10月04日

グリホサートおよびグルホシネート分析法について

株式会社アイスティサイエンス

物性と構造式
グリホサート：Glyphosate（GLY）
化学式：C3H8NO5P

OHO

分子量：169.1

POH

NH

LogPow=＜-3.2(pH2-5，20℃)

O

pKa=5.77±0.03、2.18±0.02(20±0.2℃)

HO

グルホシネート：Glufosinate（GLU）
化学式：C5H12NO4P
分子量：181.1
LogPow：アンモニウム塩LogPow：＜0.1(pH7、22℃)
pKa1＜2、pKa2＜2.9、pKa3＜9.8

OH
O

P

NH2

CH3
O
HO
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装置

全自動固相抽出装置

測定装置

ST-L400

Nexera X2 & LCMS-8045（株式会社アイスティサイエンス）（株式会社島津製作所）

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予冷式ドライアイス凍結粉砕★ メリット■パウダー状に粉砕することで、試料全体が均一化できる。

■すじや繊維質が多く切断し難い試料でも粉砕可能。
■パウダー状になり試料を採取し易い。
■ドライアイスでかさ増しさせることで、少量試料の粉砕が可能。

■水分と固形物が均一化された状態で冷凍保存できるため、再検査の際もサンプリング誤差が生じにくい。
ポイント■予め「容器」「試料」「使用器具」などを十分に冷却しておく。
■試料の種類によって予冷の方法やドライアイスの量にコツがある。
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～凍結粉砕をお手軽に～
予冷式ドライアイス凍結粉砕キットのご紹介

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前処理 抽出フロー
水抽出＆除タンパク
試料10 g（ 穀類2 g ）添加 水15 ｍL（穀類の場合：25 mL）
振とう抽出

※水抽出

★ 水分量が25 mLになるように調整

添加 アセトニトリル 約25 ｍL
振とう 1 min
静置 5 min★ 全量が50 mLになるように調整★ タンパク質を変性させる。

遠心分離 3500 rpm, 5 min※除タンパク50mL用遠沈チューブ

抽出液 50 mL（5倍希釈）
6個別試験法（通知試験法）の抽出方法■ グリホサート
試料20gを量り採り、水100mL及びクロロホルム50mLを加え、振とう・遠心分離後、水層を分取する。残渣の沈殿に水50mLを加え、振とう・遠心分離後、水層を分取し合わせる。これをろ過後、水を加えて正確に200mLとする。
引用資料：https://www.mhlw.go.jp/topics/bukyoku/iyaku/syoku-anzen/zanryu3/2-048.html■ グルホシネート
A.穀類・豆類の場合
試料10gを量り採り、水70mLを加え、細砕後、水を加えて正確に150mLとする。
⇒ 10gを150mLで定容
B.果実及び野菜の場合
試料20gを量り採り、ジクロロメタン50mL及び水150mLを加え、振とう・遠心分離後、水層を分取する。残渣の沈殿に水50mlを加え、振とう・遠心分離後、水層を分取し合わせる。これをろ過後、水を加えて500mLとする。
引用資料：https://www.mhlw.go.jp/topics/bukyoku/iyaku/syoku-anzen/zanryu3/2-049.html

7応用例
通知法と同じ試料採取量にしたい場合
試料20 g（ 穀類20 g ）添加 水190~200 ｍL
振とう抽出★ 全量が200mLになるように調整※水抽出

遠心分離 3500 rpm, 5 min
分取：上澄液 5 mL

200mL用遠沈チューブ※イメージ（写真加工しています）

添加 アセトニトリル 約 5 ｍL
振とう 1 min

★ 全量が10 mLになるように調整

静置 5 min ★ タンパク質を変性させる。

※除タンパク

遠心分離 3500 rpm, 5 min
抽出液 10 mL（20倍希釈）

15mL用遠沈チューブ※ 本法と希釈率が変わりますので注意。

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除タンパクについて■ 除タンパクの効果を確認するための実験
固相抽出において、タンパク質は目詰まりの原因となったり、操作において支障をきたす。

そのタンパク質を抽出工程の段階で除去することで、固相抽出での影響を未然に防ぐことができる。
① 抽出液3mLにアセトニトリル3mLを加え5分放置
タンパク質が変性して析出した。

② 遠心分離後※水-アセトニトリル（1/1）
変性したタンパク質が下に沈殿した。

前処理 精製フロー
抽出上澄液 0.5 mL分取
添加 水 1.5 mL☞ 水を添加して、アセトニトリルの比率を下げることでPBXへの疎水性夾雑物の吸着を促進させる。

試料液 2 mL （20倍希釈） ※12.5%アセトニトリル-水
全自動固相抽出装置 ST-L400, 前処理時間:11分/検体
コンディショニング
アセトン
メタノール-水（1/9）
PBX-10㎎ / SCX-30㎎ + PSA-50㎎
負荷[保持]
洗浄

試料液 1 mL 分取（試料0.05 g相当）

メタノール-水（1/9）1mL

PSA-50㎎ （PBXとSCXを取り外す）
溶出0.14 %アンモニア水 0.9 mL

添加 5 %ギ酸-水 30 µL
定容：1 mL 水で調整（20倍希釈）
10自動前処理工程：Step-1 精製＆保持
メタノール-水(1/9)

試料液1mL

サンプルループ
シリンジポンプ

水PBX_精製：疎水性夾雑物
SCX_精製：陽イオン性夾雑物

PBX
ポリスチレンジビニルベンゼン系
HLB：疎水性相互作用
SCX
スルホン酸基（-SO3⊖）を持つ
強陽イオン交換樹脂

シリンジポンプ

PSA_保持：目的物質

PSA-CH2-NH-CH2-CH2-NH2を持つ：陰イオン性物質を保持

排出液：非イオン親水性夾雑物
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自動前処理工程：Step-2 溶出
0.14% アンモニア-水PSA

OPOH

PNH
2CH
3NHO

⊖

OO⊖

目的物質

メス試験官

OH

O-OPOHOなるため目的物質が脱離する。

-溶出PNHNH2CH3OO

アンモニア水により、PSAのN基が非解離性となり、イオン交換相互作用がなくO

PSA⊕⊕
Si-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH2
H

溶出液

保持OOO

シリンジポンプ

グルホシネート-

グリホサート-

O-

O-

PSA
Si-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH2
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前処理操作写真（自動前処理の場合）

遠心分離

振とう抽出

①試料採取

③水抽出後 ④アセニト添加②水添加⑤遠心分離後

自動前処理⑥抽出上澄液１ｍL分取⑦水1.5mL添加⑧試料液⑨試料液とメス試験官を装置にセット⑩メス試験官 ⑪1mLにを取り出す
定容
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お試しキットの紹介 （手作業）

商品名：グリホサート分析用お試しキット
入数：10検体分
型番：SS-5030-003

お試し価格：19,000円（税抜）14前処理 精製フロー（手作業の場合）
抽出上澄液 0.5 mL分取
添加 水 1.5 mL☞ 水を添加して、アセトニトリルの比率を下げることでPBXへの疎水性夾雑物の吸着を促進させる。

試料液 2 mL （20倍希釈） ※12.5%アセトニトリル-水

PBX-10㎎
SCX-30㎎
PSA-50㎎

コンディショニング
アセトン 2mL
メタノール-水（1/9）2mL

負荷[保持]
洗浄

試料液 1 mL 分取（試料0.05 g相当）

メタノール-水（1/9）1mL

PSA-50㎎ （PBXとSCXを取り外す）
溶出

0.14 %アンモニア水 0.9 mL

添加 5 %ギ酸-水 30 µL
定容：1 mL 水で調整（20倍希釈）
15前処理操作写真（手作業）①~⑤遠心分離後⑥コンディショニング ⑦試料液調製⑨PBXとSCXを脱着器で取り外す。

⑦試料液1mL負荷⑩PSAにアンモニア水を添加してメス試験官に溶出

⑧洗浄

⑪1mLに
定容
16測定条件【LC条件】
分析カラム：TSKgel SuperIC-AP（4級アミン基）,（4.6 mmID × 75 mm）
移動相 A液：2 mM ギ酸アンモニウム-水

B液：0.5 ％ ギ酸-水

材質：PEEK樹脂

流速：0.8 mL/min

グラジエント：B.Conc 5 ％(0.5 min)→95 ％(2-11 min)→5 ％(12-14 min)
注入量：5 µL
カラム温度：40 ℃

グリホサートグルホシネート

バルブ

MSに導入

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測定条件
【MS条件】
イオン化モード：ESI positive
ネブライザーガス流量：3 L/min
ドライングガス流量：10 L/min

ヒーティングガス流量:10 L/min
インターフェース温度：400 ℃
DL温度：150 ℃
ヒートブロック温度：350 ℃■ MRM条件
化合物名

測定時間 (min)

グルホシネート

3.00 - 4.00

グリホサート4.00 - 6.00

定量イオン

Pause Time Dwell Time

Q1CEQ3

確認イオン(msec)(msec)(V)(V)

182.10 > 136.10

1400-21-15-24

182.10 > 119.00

1400-21-21-21

170.00 > 88.10

1600-17-9-18

170.00 > 42.10

1600-17-26-1718

添加回収試験■ 添加回収率と再現性（n=5）の結果
ほうれん草, 0.1 ppm 添加

大豆, 1 ppm 添加

G LU

G LY

G LU

G LY

回収率 R S D .

回収率 R S D .

回収率 R S D .

回収率 R S D .

100

101

102

108

3.0

3.2

2.2

1.6
単位：％

GLU

GLY
GLU：グルホシネート
GLY：グリホサート
試料中濃度 0.1 ppm
バイアル中濃度 5 ppb相当■ ほうれん草の添加回収試験で得られたMRMクロマトグラム
19全自動固相抽出装置ST-L400による固相抽出20

ST-L400の主な構成
タッチパネルによる直感的な操作が可能

ロボットアームがノズルや固相カートリッジを掴み移動

サンプルトレー
（20検体）

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ST-L400に必要な操作①あらかじめ溶媒を準備③サンプルバイアルと試験管セット②固相カートリッジSmart-SPEをセット④タッチパネルで簡単入力運転

あとは全自動固相抽出装置にお任せ！
22自動化のメリット❑ ルーチン分析：時間の有効活用❑ 前処理技術の管理：教育、訓練、引き継ぎの効率化❑ バリデーション：再現性の向上、反復数増加による負担軽減❑ メソッド開発：確実な再現、メソッドの記録、保存❑ 分析法の共有：複数のラボで同じ分析結果❑ 人材の有効活用 ：新技術開発に人材投入、適材適所

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