アプリケーションノート
ゲノミクス

Heidelberg CardioBiobank のDNA サンプルの品質に関するレトロスペクティブ分析

著者

Tanja Heimberger1,
Steffi Sandke1, Tanja Weis1,
2

and Eva Graf
1

Heidelberg CardioBiobank,
Department of Internal
Medicine III,
University Hospital,
Heidelberg Germany

2

Agilent Technologies, Inc.

概要

本アプリケーションノートでは、Agilent 4150 TapeStation System を品質管理（QC）ツールとして使用し、Heidelberg CardioBiobank（HCB）に保存されている DNA サンプルを分析した事例をご紹介します。血液検体から DNA を抽出した直後に、確実に高品質の DNA サンプルのみを保存する重要なステップとして品質管理が実施されています。その後の研究に使用される前に、過去に凍結された DNAサンプルの品質管理も繰り返し行われます。本アプリケーションノートでは保存されている DNA サンプ

ルの品質と定量に関してのレトロスペクティブな分析に着目しています。一部のサンプルでは、サンプルの代表として一度も凍結融解されず –80 ℃で 9 年間保存したものを使用し、分析しました。

HCB ではこの期間中、異なる DNA 抽出方式が採用されており、結果としてサンプルの品質レベルにはばらつきが生じました。QC 後の分析により、過去に使用されたサンプル抽出や処理方法の効率性の検証を行うことができました。

はじめに必須である高品質 なサンプルの保存が可能となりました（図 2）。バイオバンクにおいてこ（QM）ツールで解析しました。さらに、4150

とつで、心血管疾患 に 重点 をおいています。

ため、2010 年から 2018 年の連続 9 年間のるゲノム DNA の 定量 と品質評価 を行う QCと収量 をほかの確立された品質マネジメント

れらの手順 がどのように影響するかを調 べる

HCB はドイツで最大規模のバイオバンクのひTapeStation System を全自動電気泳動によ

サンプルから無作為 に 選択し、DNA の 品質

HCB は 病院統合型 のバイオバンクとして運営されるだけでなく、 いくつかの 国内 およびツールとして評価し、結果を比較しました。

国際的 な臨床治験や研究プロジェクトの中枢となるバイオバンクでもあります（図 1）。このバイオバンクでは 発足当初、各研究それぞHCB
Heidelberg CardioBiobank

れの 方法 で 保存 された 生体 サンプル （主 に液体 サンプル）を通常 の -80 ℃ フリーザーで 保存し、生体 サンプルの 収集 は 各研究 のガイドラインに 応 じて 実施 されていました。

Core Biobank:
National/International Studies

Core Biobank:
University Hospital Heidelberg

Standardized
shipping/storage

Human and animal
sampling/storage

2014 年 に HCB は 組織改 編 を 行 い、 最 大で 120 万 サンプルを収容可能 なフルオートメーションの -80 ℃保存 システム（LiconicAG （Liechtenstein）による特注システム）を導入し、生体サンプルが確実に目的に適したものであることを保証するため、 サンプル 収集、処理、輸送および保存方法において全体のワークフローを評価し、最適化 を行 いました。さらに、プレアナリシスの 全工程 に 具体

SOP conform sample processing procedures (automated and manual)

的 な 標準作業手順書（SOP）を開発・実装

図 1. Heidelberg CardioBiobank（HCB）の体系し、最先端のトランスレーショナルリサーチに

SOP

SOP

ResearchStudy

Research
interest

Whole blood
sampleSOP

Automatedstorage

Automated
DNA extraction

Quality andquantity control

SOP

Documentation
LIMS

Automatedaliquoting

図 2. DNA 抽出を含めた全血サンプル処理のワークフロー

すべてのプレアナリシス過程において、SOP を作成し標準時間が設定されました。SOP は生体サンプルとその輸送、さらに該当する場合は自動化された DNA 抽出（Tecan/Promega Freedom EVO HSM workstation）の 手順 に 関して示されています。液体 サンプルは 自動で分注（TecanFreedom EVO system）され、自動化 -80℃フリーザーシステム（Liconic 社による特注 STC store）で保存されます。各ステップの正確な記録はサンプルデータだけではなく各過程のタイムスタンプを記録する LIMS software CetraXX（Kairos）で実施されます。

2

実験方法
DNA 抽出長期保存された DNA の 解析 のため、2010年 から 2018 年 までの 1 年 あたり 20 サン

プル を 無 作 為 に 選 択 しました。2015 年 以

前 は、血液 サンプルの 収集 は 若干異 なる条

件 で 行 われていました。例 えば、 ある 研 究

では DNA 抽出前 の 4 ℃ での 保存 についての 時間 を定 めていませんでした。DNA 抽出は EDTA 採血した 全血（9 mL）から、 シリカメンブレンカラムを 使用 する NucleoSpin

Blood XL カラムキット（Macherey-Nagel、Düren、Germany）を 用 い 手 作 業 で 行 いました。2015 年以降、DNA 抽出 はビーズ 法による ReliaPrep Large Volume HT gDNA

Isolation system を使用し自動化された抽出システム（Tecan/Promega Freedom EVO

HSM workstation、 Tecan、 Männedorf、Switzerland）により行いました。EDTA 採血した 全血（9 mL）はサンプル 処理 まで 4 ℃で保存し、全自動での DNA 自動抽出までの保 存 期 間 は 7 日 以 内 としました。2014 年

から自動化 システムへの 変更 に 伴 い、消耗品（生体 サンプルの 保存チューブ）を変更する必要 がありました。保存 チューブがサンプルの品質に影響する可能性を除外するために2014 年のサンプルに関しては 2 グループの解析を行いました。2014 年のサンプルグルー

プ 1 は Mironic 社のチューブ、グループ 2 はFluidX 社のチューブで保存したものです。自動化システムの実装と並行して、生体サンプルの取り扱い、処理、輸送に関連した SOP の改善を行いました。

DNA 分析

選択した DNA サンプルは 同一 の 融解条件（4 ℃ で 18 時間）で処理し、分注して次 のり扱 い説明書 に従 い、すべてのキットの 構成品は室温に 30 分間置き、室温に戻しました。
選択した DNA サンプルを希釈した後、10 µLステップに 進 めました。まず、 サンプル 濃度の Genomic DNA Sample Buffer と 1 µL のFisher Scientific、Waltham、USA）で 測 定で 1 分間混合後、スピンダウンして Genomic

測定結果 と比較 しました。さらに 蛍光色素

く の 場 合、4150 TapeStation Controller

を NanoDrop spectrophotometer（Thermoし、2010 年 から 2018 年 までの 凍 結 前 のによる 測定法 である Quantus Fluorometer（Promega、Madison、USA）でも測定しました。Quantus の測定結果を用いて DNA 濃度 を Agilent 4150 TapeStation System のGenomic DNA ScreenTape Assay の 定 量範囲（10 ～ 100 ng/µL）に調整しました。取

ゲノム DNA を注意深く分注し、 ボルテックス

DNA ScreenTape に ロ ードし まし た1。多Software で利用可能 なすべてのサンプルポジションを選択しました。図 3 に示したワークフローの通り、測定は 3 回繰り返しで実施しました。TapeStation Analysis Software を用いて、DNA サンプルの濃度と DNA IntegrityNumber（DIN）を評価しました。

サンプル• Heidelberg CardioBiobank からのゲノム DNA サンプル
• -80℃での保存（2010 – 2018）• 手作業または 自動化 DNA 抽出方法（2015～）• 凍結前に NanoDrop による濃度測定
手順• 4 ℃、一晩でサンプルを融解• 20 µL を分注• Nanodrop および Quantus による濃度測定• 10～100 ng/µL に調整
分析• Agilent 4150 TapeStation System• Agilent Genomic DNA Screen Tape Assay• 20 サンプル/年（2010 – 2018）を解析• 3 レプリケート/サンプル
図 3. DNA 定量と品質評価解析のワークフロー

3

結果と考察のそれぞれ 代表するサンプルのゲル表示とエ

品質

プルは 2 セット（2014/1 と 2014/2）を解析

レクトロフェログラムの 重 ね 書きを示します。

しました。チューブの製造元を Micronic 社から

テムの 導入 に伴 い、保存チューブのタイプが品質に影響はありませんでした。

2014 年に自動化された保存および処理シス

DIN アルゴリズムは、TapeStation Analysis

FluidX 社に変更しましたが、DNA サンプルの変更されました。そのため、 2014 年 のサンSoftware に搭載されており、1 ～ 10 までの数値スコアを割り当て DNA サンプルの 品質評価を行います。DIN が高い場合、分解をうけていない高品質 のゲノム DNA であること

10DNA Qualityを、DIN が低い場合、分解された ゲノム DNAであることを 示 します2。DNA 分析 の 結果、

9

自動化プロセスと改善版 SOP が導入された2015 年から現在にいたるまで、解析した DNA

サンプルは一貫して品質が高い（DIN > 9）こ8DINとがわかりました。対照的に、2014 年以前のサンプルは 品質に大きなばらつきがありました（図 4）。図 5 に 2010 年 から 2018 年 まで

7652010

2011

2012

2013 2014/1 2014/2 2015
Years201620172018

図 4. 9 年間のサンプル品質の比較

各年につき 20 の DNA サンプルを Genomic DNA ScreenTape Assay で分析しました。2014 年はチューブを変更したため 2 グループを分析しました。

(L)

A

2010

2011

2012

2013 2014/1 2014/2 2015

2016

2017

2018

B

2010
2011
2012
2013
2014/1
2014/22015
2016
2017
2018

Sample intensity (normalized FU)

1,400

Size(bp)
48,50015,000
7,000
4,000
3,000
2,500
2,000
1,500
1,200
900
600
400

1,200
1,000
800
600
400

DIN
8.9

DIN
9.4

DIN
9.7

DIN
9.6

DIN
9.5

図 5. 2010 年から 2018 年までの代表サンプルの比較

7,000
15,00048,500

DIN
8.8

4,000

DIN
9.0

900
1,200
1,500
2,000
2,500
3,000

DIN
8.2

600

DIN
8.6

4000
DIN
8.1

250

100

100

200

250

Size (bp)DNA サンプル 2014/1 は Micronic 社のチューブを、2014/2 は FluidX 社のチューブを使用しました。サンプルの品質は 2015 年以降に向上し、高い DIN 値に反映されていこれらの表示はサンプルの品質を視覚的に比較可能です。
ます。
A）TapeStation ゲル表示 B）10 サンプルのエレクトロフェログラムの重ね書き。

4

DNA 定量

500DNA 濃度 は HCB での DNA 抽出 の 直後 にConcentration before freeze

DNA Quantity

Concentration after freeze

NanoDrop spectrophotometer で 規 定 通りに 測定しました。2010 年 から 2014 年 の400

DNA サンプルは 手作業で抽出され （実験方法を参照）、DNA 濃度は平均で約120 ng/µL

DNA 抽出法を導入した結果、DNA 収量の平均 は 約 300 ng/µL となりました。本研究 で300ng/µLでした。2015 年 に SOP を改善し、自動化

200

は、サンプルを解凍した後、再度 NanoDropで DNA を定量しました。-80 ℃ での保存 は保存期間 に 関 わらず、 サンプル 濃度 に 変化100

は あ りま せ んでした（図 6）。TapeStation

System は DNA 濃度の決定が蛍光色素ベースであるため、蛍光色素で DNA を評価するの DNA 濃度を示しました（図 7）。

2010201120122013

2014
Years2015

2016

2017

2018

図 6. NanoDrop 分光光度計で測定した DNA 濃度

2014 年から 2015 年の間に DNA 抽出方法をマニュアルから自動化に変更したことで、DNA 濃度が増加しました。すべての DNA 濃度は-80℃での保存で数年にわたり安定していました。

300

DNA Quantity
Concentration TapeStation
Concentration Quantus

200
ng/µL

Quantus でもサンプルを測定しました。評価

したサンプルはすべて、双方のシステムで同等

01000

2010

201120122013

2014
Years20152016

20172018

図 7. Quantus fluorometer と TapeStation System による DNA 定量

2014 年と 2015 年の間での DNA 濃度の増加は、DNA 抽出方法をマニュアルから自動化に切り替えたことによります。

5

結論自動化することにより、収量、品質および品質の安定性を大幅に向上させることができま2010 年 から 2014 年 まで、HCB での 生体した。Genomic DNA ScreenTape Assay に比較するといくつかの研究では 厳密性 が低いとができるようになりました。サンプルの処理、サンプルの収集 は、2015 年から 2018 年にSOP で実施されていました（例えば、血液サより、DNA の品質を DIN を用いて評価するこし、DIN の値が有意に高いレベルで安定した

結果として、2010 年から 2014 年では分析さ療の必要性 は 非常に明白であり、 ベストプラ

れた DNA サンプルの品質 にばらつきが認 められました。

2015 年 にプロセスの 大幅 な 改善 のために、サンプル収集、輸送、サンプル調製手順 などのワークフローの評価を行いました。インキュベーション時間、保存方法 など前処理のパラメータが DNA の品質に与える影響を調査し、その結果、先進的な SOP の開発と実装につながりました。手順の標準化に加え、DNA 抽出のために自動化装置を導入したことで、結果 が 改善 されました。DNA 抽出プロセスを値となりました。現在、個別化医療や精密医

Quick Guide for 4200 TapeStation
System, Agilent Technologies,
publication number G2991-90040,
2015.
2.

Gassman, M.; McHoull, B. DNA
Integrity Number（DIN）with

the Agilent 2200 TapeStation

ノートでは、標準化され、 ほぼ完全に自動化

DNA ScreenTape Assay, Agilent

チが必要とされています。本アプリケーション

されたサンプル処理システムの導入により、生体 サンプルの 品質 を非常 に 高く保てることを示 しました。4150 TapeStation System とGenomic DNA ScreenTape Assay は 下 流のアプリケーションで重要となる DNA サンプ

ルの品質を確認するための信頼のおける QC

ツールとして、我々のワークフローにスムーズに統合することができました。

本社 / 〒192-8510 東京都八王子市高倉町9-1●カスタマコンタクトセンタ
0120-477-111
mail：email_japan@agilent.com※仕様は予告なく変更する場合があります。
※本資料掲載の製品はすべて研究用です。
その他の用途にご利用いただくことはできません。

http://www.agilent.com/chem/genomics:jp

本書の一部または全部を書面による事前の許可なしに複製、改変、翻訳することは、著作権法で認められている場合を除き、法律で禁止されています。

Printed in Japan, April 9, 20195994-0811JAJPGenomic DNA ScreenTape System

クティスに従ったトランスレーショナルリサー[お問い合わせ窓口]
アジレント・テクノロジー株式会社© Agilent Technologies, Inc. 20201.

抽出プロセスの改善は DNA の 品質にも反映

ンプルを処理するまでの保存時間が 2 時間から数日、研究 によりばらつきがありました）。

参考文献

System and the Agilent Genomic

Technologies Technical Overview,
publication number 5991-5258EN,
2015.