第 8 回極限環境微生物学会シンポジウム（2007）

シンポジウムプログラム＆講演要旨

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第 8 回極限環境微生物学会シンポジウム（2007）

極限環境微生物学会 第 8 回シンポジウム～ 環境中における微生物機能 ～

日時：2007 年 7 月 3 日（火）午後 1 時～5 時 40 分 （6 時より懇親会の予定）
場所：東京工業大学 すずかけ台キャンパス すずかけホール 3F 多目的ホール
交通：東急田園都市線すずかけ台駅下車徒歩 5 分 （横浜市緑区長津田町 4259）

概要
テーマ：「環境中における微生物機能」
近年環境 DNA の解析技術が進んで、環境中における微生物叢の解析が盛んに行われている。しかし実際にこれらの微生物が生命活動を営み環境と関連を持つの かについてはまだ不明な点が多い。今回のシンポジ
ウムではさまざまなアプローチでこれらの課題に取り組んでおられる先生をお招きしてお話を伺う。
プログラム（敬称略）

13:00-13:10 開会の挨拶

13:10-13:50 北島 富美雄（九州大学大学院理学研究院 助教）「Archaea が生産するテトラエーテル脂質を用いた環境温度の推定について」
13:50-14:30 木庭 啓介（東京農工大学大学院共生科学技術研究院 特任准教授）「安定同位体を用いた窒素循環研究-微生物機能へのアプローチを目指して」
14:30-15:10 津田 雅孝（東北大学大学院生命科学研究科 教授）「生態系での細菌ゲノム情報発現 -遺伝学的手法を用いた発現遺伝子群の探索-」

コーヒーブレイク

15:30-16:10 福田 雅夫（長岡技術科学大学生物系 教授）「PCB 分解菌の芳香族分解遺伝子発現制御と環境応答」
16:10-16:50 高尾 祥丈（水産総合研究センター瀬戸内海区水産研究所日本学術振興会特別研究員）「ウイルス研究から明らかになった海産原生生物ラビリンチュラ類の分解特性の多様性」
16:50-17:30 鎌形 洋一（産業技術総合研究所ゲノムファクトリー研究部門 部門長）
「難培養性環境微生物の培養化と微生物種間ネットワークの解析」

17:30-17:40 閉会挨拶

18:00-20:00 懇親会（すずかけホールラウンジ）2

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シンポジウム要旨

Archaea が生産するテトラエーテル脂質を用いた環境温度の推定について
北島 富美雄（九州大学大学院理学研究院 助教）【はじめに】

H2C

1. 温度変化と脂質組成

バクテリアやアーキアは、環境の変化に対応して、細胞膜の物性を維持するために、膜脂質の組成を変

X

H2C

O

HC

O

O

の鎖長、二重結合の数、メチル側鎖の数などを変える。アーキアの場合、膜脂質にエーテル脂質を含む

CH

O

CH2

CH2

(1) X=H; GDGT (2) X=える。バクテリアでは、温度の変化に伴い、脂肪酸

OH

O

OH
OH
H
H

CH2OH

;GDCT

H
H
OH

図 1. GDGT、GDCT の構造

ことが知られているが、その中にはテトラエーテル型脂質のイソプレノイド鎖の部分に五員環を持つも細菌は、その後、海洋だけでなく中性・アルカリ性のがある（図 1）。Sulfolobus や Thermoplasma などの陸水中にも発見されており[5]、TEX86 を用いた温の好熱性アーキアでは、このイソプレイド鎖に含ま度計は、しだいに普及しつつある。しかし、この場れる五員環の数は、増殖時の温度が高いほど増大す

合のエーテル脂質の生産者は、五員環数の温度依存

る [1]。このような性質は、脂質組成が一種の温度性が最初に明らかになった好熱性アーキアではない。

計として利用できることを示唆するものである。また、イソプレノイド鎖のような炭化水素は、比較的

2. 熱水系でのテトラエーテル脂質温度計

年代の古い地質試料中にも残ることがあり、たとえば、白亜紀の地層中から見い出されたものも報告さ

われわれは、これまで、好熱好酸性アーキアであれている [2]。有機物を利用した過去の水温を推定

る Sulfolobales が生産するエーテル脂質に着目し、するための温度計としては、ハプト藻が生産する長温度計として用いることを検討してきた。この温度

鎖アルケノンを利用した地質温度計が知られている計の適用範囲は 65 oC から 80 oC であり、酸性の熱水が、エーテル脂質は、これと同様に利用できること

環境には Marine Group に近縁のアーキアが棲息しなが期待できる。われわれは、この性質を陸上熱水系

いところもあることから、陸上熱水系における温度における堆積時の温度を推定するための温度計とし計として、TEX86 による温度計とはまた別の有用性をて利用する試みを続けてきた [3]。

持つと期待できる。Sulfolobales は GDGT (Glycerol

一方、Marine Group の Crenarchaeota はその大部

Dialkyl Glycerol Tetraether)の他に、グリセロー分が培養できないアーキアであるが、イソプレノイ

ル残基の一方がカルジトール残基となった GDCT

ド鎖に含まれる五員環の数は、やはり表面海水温度（Glycerol Dialkyl Calditol Tetraether）を生産（SST）と相関があることが指摘され、TEX86 というする（図 1）。GDCT は Sulfolobales が特異的に生指標（Marine Group に特有の Crenarchaeol とその産するので、堆積物中から見い出された場合、生産異性体をパラメーターとして含んでいる）を用いた者を特定するのに有利である。しかし、GDCT は分子温度計が提案されている[4]。この温度計の適用範囲

量が大きく、このままの形では分析しにくいため、ooHI/LiAlH4 処理を行って、イソプレノイドに分解しなは 0 C から 30 C である。Marine Group に近縁の古3

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ければならない。これは、時間と手間がかかるうえ【結果】に、より多くのサンプル量も必要とする。GDGT は、

1.

分子構造そのものから生産者を特定することはでき

1-1. 表層堆積物から得られた GDCT から推定した古ず、生産者に関する他の情報を必要とするが、分解

水温は、全エーテル脂質から推定した古水温と 2 つを行うことなしに HPLC でより容易に分析できる点の地点（八幡地獄、湯の野地獄）では 3 oC 以内で一では有利である。われわれは、GDCT を用いた場合と致した。これは、GDCT による温度計の有効性を示す

GDGT を用いた場合、それぞれについて、熱水系におものである。

GDCT 温度計

いて活用できる温度計の開発を試みた[3, 6]。
2.
【実験】
1. GDCT 温度計

GDGT 温度計

2-1. 培養物の GDGT の環化率（C*）と温度（T）の間には、T=17.6C*+7.0 (R2=0.96)の関係が見い出され

GDGT と GDCT では、平均環化率の温度依存性が異なっている。今までは、全エーテル脂た。

質の環化率と温度の関係式しか利用できなかったが、2-2. 銀湯のコアサンプルの抽出物を HPLC-APCI-MS

われわれは、Sulfolobales を 65、70、75、80 oC でで分析したが、Marine Group に特有の Crenarchaeol

定常期まで培養し、新たに GDCT の平均環化率と温度とその異性体は検出できなかったため、ここには、の関係式を求めた。分析は、DeLong et al. [7]を一Marine Group に近縁の Crenarchaeota は棲息してい部改変した方法で、GDCT をイソプレノイドに分解し、ないと考えられる。また、Sulfolobales 以外の陸水

GC-MS を用いて行った。得られた関係式を鹿児島県

における代表的な好熱性アーキアであり、やはりイ

霧島温泉の 3 ヶ所（八幡地獄、湯の野地獄、銀湯）

ソプレノイド鎖に五員環を持つ Thermoplasma の培で採取した表層堆積物に当てはめ、古水温を推定し養をここで採取した熱水から試みたが、増殖は確認た。

できなかった。従って、この地点から得られる GDGT
は、ほぼ Sulfolobales 由来と考えられる。また、コ

2. GDGT 温度計

oSulfolobales の 65、70、75、80 C

アサンプル内の生菌からの GDGT の寄与は、計測されの培養物の全脂質抽出物をメタノリシスし、た全球菌数をすべて Sulfolobales の生菌数とみなSchouten et al. [4]の方法に従い、HPLC で分析ししても、コアから得られた全 GDGT 抽出物の 1/100

た。Sulfolobales と Marine Group では、脂質組成以下と見積もられたため、無視できると考えられる。

が異なり、Sulfolobales は Crenarchaeol を生産し2-3. 銀湯のコアでは、15cm 以深で 77oC 以上というないため、TEX86 をそのままの形で使うことはできな

高い推定温度が得られ、これは過去の地熱活動の活い。そこで、GDGT 1 分子当たりの環化率（イソプレ

発さを示すものであると考えられる。また、9 からノイド鎖 1 本当たりの環化率と区別して、C*で表す）

12cm の部位で推定温度の低下、また、15 から 18cmを定義し、これと温度の関係式を求めた。また、銀の部位で TOC の低下が見られるとともに、この下の湯で採取したコアサンプルを縦に 2 分割した後、さ部位より堆積物の粒度が粗くなっていることから、らに 2 分割した一方を 3cm ずつに分割し、それぞれ

まず堆積環境の変化が起こり、続いて温度が降下しから抽出した GDGT をメタノリシス後、HPLC で分析たことが示唆された。

して古水温を推定した。また、TOC（全有機態炭素）測定およびアクリジンオレンジ染色による全菌数計測を行った。

4

第 8 回極限環境微生物学会シンポジウム（2007）【おわりに】

い炭化水素である。また、C-2 位の立体配置がアー

1. 五員環を持つテトラエーテル脂質を生産する好キア型の sn-2,3 ではなく、バクテリア型の sn-1,2である。こちらのテトラエーテル脂質の五員環数は、

熱好酸性アーキアの分布

温度ではなく pH と相関があるらしい。また、炭化水
Sulfolobales は陸水に分布する好熱好酸性アー

素鎖の C-5、C-5’位がメチル化されるが、その割合キアである。したがって、この菌が生産する脂質のは温度と pH の両方に依存すると報告されている

分布は、Marine Group の Crenarchaeota の場合とは[10]。しかし、報告されている相関は必ずしも高く異なり、限定されたものとも予想される。しかし、はなく、環境因子の何が脂質組成を主に決定してい五員環を持つテトラエーテル脂質を生産する好熱好るのか、状況はまだ混沌としているとも言えるが、酸性アーキアの分布は、今まで考えられていたより

環境指標となる微生物由来の有機化合物が、現在、はもう少し広いらしい。たとえば、脂質そのもので次々と提案されている。

は な い が 、 ODP で 採 取 さ れ た 海 洋 コ ア か ら

Sulfolobus の rDNA が見い出されている[8]。また、【参考文献】

最近、偏性好熱好酸性のアーキア(Aciduliprofundum[1] De Rosa M. et al. (1980) Phytochemistry 19, 827-831.

boonei)が、深海底熱水噴出孔からは、はじめて単離[2] Kuypers M. M. M. et al. (2001) Science 293, 92-94.

されている[9]。このアーキアは五員環を持つテトラ[3] Kitajima F. et al. (2003) Geochim. Cosmochim. Acta

エーテル脂質を生産する。したがって、熱水系にお67, A220. [4] Schouten S. et al. (2002) Earth Planet. Sci.

けるテトラエーテル脂質温度計は、海洋を含め、もLett. 204, 265-274. [5] Pearson A. et al. (2004) Appl.

う少し広い範囲で利用できるかもしれない。

Environ. Microbiol. 70, 5229-5237. [6] Kitajima F. et al.
(2006) Abstracts The Japan Geoscience Union Meeting

2. バクテリアが生産する五員環を持つテトラエー

2006, B220-P003. [7]DeLong E. F. et al. (1998) Appl.

テル脂質

Environ. Microbiol. 64, 1133-1138. [8] Inagaki F. et al.
(2001) Extremophiles 5, 385-392. [9] Reysenbach A.-L.

一方、バクテリアもエーテル脂質を生産すること

et al. (2006) Nature 442, 444-447. [10] Weijers J. W. H.

が最近さかんに報告されるようになってきた。これ

et al. (2007) Geochim. Cosmochim. Acta 71, 703-713.

にはジエーテル型もテトラエーテル型もある。バクテリアのエーテル脂質は、アーキアのエーテル脂質のイソプレノイド鎖の部分がイソプレノイドではな

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第 8 回極限環境微生物学会シンポジウム（2007）

安定同位体を用いた窒素循環研究

シンポジウム要旨－微生物機能へのアプローチを目指して
木庭 啓介（東京農工大学大学院共生科学技術研究院 特任准教授）

ある生態系における物質循環像を描き出す際には、を駆動している主役である微生物群集構造と、そこ生息している生物群集の情報（特に機能情報）からから予想される機能群、そして発揮された機能の結駆動している物質循環を予想するアプローチと、物果としての物質濃度を詳細に比較検討して行くこと

質の濃度変動を追跡することで物質循環像全体を予で、より良い理解が進むはずである。

想するアプローチがあると考えられる。しかしこれ

しかし、重要な生元素の一つである窒素について

までの物質循環研究と言えばほとんどが後者を指しは、そのような形での研究スタイルはまだ確立されている。その理由として、ある生態系に生息していていないように思われる。微生物群集と機能の関係る生物群が持つ機能を類推することがきわめて困難を解析する際には、例えばアンモニア酸化であれ脱であることが挙げられると発表者は考えている。し窒であれ、様々な微生物が同じような機能を担ってかし物質の濃度変動情報はおおよその物質循環像をいることが困難を生んでいるように見受けられる。

描くことを可能にはするものの、特に回転の速い生

しかし、窒素固定における 15N-DNA-SIP のような、元素については、それらのフローを濃度情報のみで手法の開発が今後様々な形で進むであろう。発表者

表現することは難しい。例えばリン酸は環境中で常はもう一方の物質濃度・同位体の分野での研究を行に低濃度であり、その濃度の低さだけを議論するとっているものとして、どのようなアプローチが微生すればリンの循環が行われていないという誤った結物の機能に迫るために可能か、微生物生態研究と物論に至ってしまう。そのため安定同位体の利用（ラ質循環研究を積極的にリンクするためにどのようなベル化合物または同位体自然存在比として）が古く

アプローチが必要であるか、現在行っている研究のから行われてきた。

例をご紹介したい。

ところで近年の分子生物学的手法の発達は、ある

一つは、窒素同位体自然存在比（・15N 値）の利用

環境に生息している微生物の群集構造について詳細である。残念ながらメタンのように生態系の中で特な情報をもたらしてくれるようになった。そのため異的な同位体比を安定して持つ化合物は窒素循環の今後の物質循環研究は、ある環境中にどんな微生物

中では見あたらない。しかしアンモニウム、亜硝酸、が存在しているのかという最も基本的かつ重要な情

硝酸、一酸化二窒素、窒素ガスという窒素循環を形

報を手にした上での議論を行うことが可能になると作る物質は様々な酸化数を取っており、生成・消費期待される。例えば微生物の群集構造と生態系でのが活発に行われていることから、自然界で・15N 値は物質循環について、分子生物学的手法と物質濃度・

大きく変動する。すなわち・15N 値の解析によって、同位体比手法を駆使した研究は貧酸素水塊で盛んに窒素循環の再構築が可能であると期待できる。本発行われてきている。これらの生態系では、メタンが

表ではこれら窒素化合物の中で、硝酸と一酸化二窒

物質循環の中で重要であり、かつ非常に特徴的な炭素に注目する。この 2 つの化合物は、好気的環境で素同位体比を取ることが、微生物群集機能と物質循

独立栄養的に生じる硝化と、嫌気的で従属栄養的に環を上手くつなげることを可能にしている点である。

生じる脱窒という、2 つの相対するプロセスに関与

今後はこのような研究スタイルによって、物質循環

している。

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第 8 回極限環境微生物学会シンポジウム（2007）
東京工業大学吉田尚弘教授の研究室では、一酸化物質濃度変化と微生物群集構造とのマッチングを積二窒素の・15N 値だけでなく、・18O 値、さらには直極的に行ってゆくには、一つのプロセスだけに着目

線分子である一酸化二窒素の中央と末端の窒素原子するのではなく同時進行している可能性のあるプロの同位体比の差（Site Preference；SP）の測定（アセスについて積極的に追跡して行く必要がある。特イソトポマー測定）を行ってきた。そして近年、こに競争関係にあるプロセス（脱窒と DNRA、アナモッの SP によって硝化由来の一酸化二窒素と脱窒由来クス）の状況について濃度変動研究側から提供するの一酸化二窒素を区別することが可能であるとの報ことは、機能ポテンシャルと実際に発揮されている

告がなされている。このパラメーターがもたらす情機能との違いを解釈する際に非常に重要になってく

1518

ると考えられる。

報に、さらに硝酸についての・ N・・ O 値の情報も加えることでどのような解析が可能となっているか、

そこで現在、産業技術総合研究所の諏訪裕一博士のご協力の下、比較的安価である四重極質量分析計

森林地下水での研究を例として発表したい。
もう一つは 15N ラベル化合物測定の簡便化である。

を利用し、硝酸の・15N・・18O 測定技術を応用した窒

上に挙げた窒素化合物中の 15N 含有量を測定するこ

素酸素トレーサー測定技術を開発中である。硝酸、とは未だに煩雑であり、試料量を大量に必要とする

亜硝酸を一酸化二窒素に変換することでそれらの窒ことが多い（例えば 100 マイクログラム窒素）。その素と酸素のトレーサー含有量を、またアンモニウム

ため現在のところ、単一のプロセスにのみ着目してについては硝酸に酸化して窒素のトレーサー含有量測定を行う、例えばアナモックス活性を測定する際を比較的容易に測定することが可能である。この簡は、発生する 29/30N2 のみの測定に終始してしまうこ

便な手法によって、主要な窒素化合物についてのトとが多い。しかしラベル実験においては様々なプロ

レーサー測定が可能となり、今まで見逃していた窒セス（アナモックス活性測定であればアンモニウム

素フローを明らかにすることが可能となれば、微生

同化、DNRA や一酸化二窒素の発生）がマイクロコズ

物生態の情報とより良い議論が可能となると期待さ

ム中で同時駆動している可能性が多分にある。今後、れる。

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第 8 回極限環境微生物学会シンポジウム（2007）

シンポジウム要旨

生態系での細菌ゲノム情報発現-遺伝学的手法を用いた発現遺伝子群の探索-

津田雅孝, 西山依里, 宮越昌利, 永田裕二, 大坪嘉行 (東北大・院生命科学)

様々な自然生態系から多種多様な生物現象を示すでいる。本菌は、環境汚染物質も含めた極めて多様

微生物株が数多く分離され、実験室で純粋培養したな有機化合物を Pseudomonas 以上に炭素・エネルギ

これら微生物をいろいろな角度から検討することで、ー源にできるが、ゲノムが 3 本環状染色体から構成

先人たちは個々の生物機能の詳細な分子メカニズムされる点でも通常環境細菌とは大きく異なる特徴をを明らかにしてきた。その一方で、複雑な物理的並もつ(5)。B. multivorans ゲノムの全塩基配列を決定

びに化学的環境要因の大規模な変動に曝される複合し、本菌が根圏土壌生態系で主要炭素源となる様々

生物系の自然生態系で、研究対象としてきた環境微な芳香族化合物の好気的分解酵素遺伝子群を数多く生物が実験室で純粋培養したときと同じような様式もつことを確認した(6)。現在、芳香族化合物をはじで生物機能を発揮しているのかという、シンプルだめとする多様な炭素・エネルギー源化合物の分解・が最も重要な問題は手がつけられないでいた。一方、代謝を中心にしたゲノム微生物学的研究を実験室系

動植物病原細菌を扱う研究者は 1990 年代より、感染で行っている。これと並行して、土壌で特異的に発モデル生物を「培養装置」と見立て、この環境で菌現する本菌の遺伝子とこの環境での生存・増殖に必の生存・増殖に必要な遺伝子や特異的に発現する遺要な遺伝子の網羅的取得を、各々In Vivo Expression

伝子を探索・解析することで、病原細菌の「培養装Technology (IVET) ( 図 1)(1) と Signature-Tagged

置」での生きざまを明らかにし、病原性発揮に直接

Mutagenesis (STM) (図 2)(2)と呼ばれる遺伝学的手的並びに間接的に必要な遺伝子群の総合的理解を深法で実施し、実験室系と生態系でのゲノム情報発現

めてきた(1, 2)。このような方向性を持った研究は、の違いの検討、この違いを規定する環境要因特定化、

微生物ゲノムの全塩基配列決定が容易になるにつれ、

そして、ゲノムの各遺伝子への当該要因シグナルのさらに進展している。他方、環境細菌においては、

情報伝達機構の解明を目指している。

土壌などの自然環境を「培養装置」と見立て、本環

我々が IVET に用いているプラスミド pEN3 では、境で生存・増殖に必要な遺伝子や特異的に発現する

egf がリジンと細胞壁前駆体ジアミノピメリン酸遺伝子を探索・解析する研究がなかったが、この数(DAP)の合成に必要な酵素遺伝子 dapB で、レポータ

年の間に自然環境での微生物の特定遺伝子やゲノム

ー遺伝子が lacZ である。B. multivorans ゲノム DNA

全体の発現を解析する手法が急速に確立されてきた断片をプロモーターのない dapB-lacZ カセット上流(3)ことから、このような研究が可能になりつつある。

に 挿 入 し た pEN3 誘 導 体 ラ イ ブ ラ リ ー を B.

本講演では、土壌環境で実際に機能している遺伝子

multivorans の dapB 欠損株ゲノムに相同組換えによをどのように検索・解析するについて、我々の最近

り組み込んだ。取得した B. multivorans 誘導体ライ(4)の研究例 を紹介する。

ブラリーを花崗岩質土壌に接種し、90 日後にリジン我々の研究室では、かつては Pseudomonas 属に分と DAP、X-gal を含む最小寒天培地を用いて B.

類されていた細菌で、土壌や水圏・植物表面などのmultivorans を回収した。1%未満の回収株で認めら多様な自然環境に常在する好気性 b-プロテオバク

れた白色コロニーでは土壌特異的に転写されるゲノ

テリア Burkholderia multivorans の研究に取り組ん

ム領域に pEN3 誘導体が挿入されたと推定された。こ8

第 8 回極限環境微生物学会シンポジウム（2007）のような約 250 の土壌特異的発現遺伝子候補として、ど取得し、tag 部分が異なる 36 のトランスポゾン挿

各種物質代謝(41%)、物質透過系(20%)、細胞表層成入変異株をひとまとめにしたプールを 200 弱ほど作

分合成系(6%)に関わる遺伝子が 3/4 を占め、機能未製した。現在までに、7 割のプールを IVET で用いた知遺伝子が 1/6 ほどあった。物質代謝遺伝子にはア

時と同じ花崗岩質土壌に接種、2 週間後に回収し、ントラニル酸や p-ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢

土壌での生存・増殖に必要な遺伝子に欠損がある

酸などの芳香族化合物分解に関わる遺伝子が約 2 割

180 程の候補変異株を取得した。この中には、アミを占め、接種土壌にはこのような植物由来化合物がノ酸生合成系の突然変異株も存在し、遊離アミノ酸

多く存在すると推定された。また、細胞表層成分合がほとんど存在しない土壌ではこれら変異株は増殖

成系遺伝子の中には菌体外多糖合成酵素遺伝子があできないことを踏まえると、本 STM 系は、上記生合り、接種株の土壌粒子表面や粒子間隙での安定な定成系遺伝子以外の目的遺伝子取得にも有効と判断し着・増殖に菌体外多糖が必要であろうと推定していている。まだ目的遺伝子取得過程だが、取得変異株

る。いくつかの「土壌特異的発現遺伝子候補」につには物質取り込み輸送系やストレス応答の変異株がいて土壌での候補遺伝子発現を LacZ 活性で測定し、存在した。土壌では栄養分も少ないとともに様々な

上記の芳香族化合物分解や菌体外多糖合成に関わる

物理的並びに化学的要因によるストレスがたいへん

遺伝子の土壌特異的転写を確認した。現在、このよ

多く、取得変異株は土壌環境で生存・増殖できない

うな遺伝子破壊株を作製して実験室系と土壌での挙と推定している。今後、このような推定も考慮しな

動と、両環境での遺伝子発現制御の分子機構を検討

がら各取得株の詳細な解析を進める予定である。

している。
1) H. Rediers, et al.: Microbiol. Mol. Biol. Rev., 69, 217(2005)
2) P. Mazurkiewicz, et al.: Nat. Rev. Genet., 7, 929(2006)
3) S. Saleh-Lakha, et al.: J. Microbiol. Methods, 63, 1(2005)
4) 津田雅孝ら: 化学と生物, 印刷中(2007 年 7 月号)
5) E. Mahenthiralingam, et al: Nat. Rev. Microbiol., 3,
144 (2005)
6) Y. Ohtubo et al: in preparation

STM は基本的にはトランスポゾン挿入変異株ライブラリーから、目的とする遺伝子に変異がある株を効率よく negative screening する手法である(2)。
我々は Tn5 をベースにした STM 系を使い、土壌での生存・増殖に必要な B. multivorans 遺伝子の取得を行っている。実際には、tag 部分が異なる 36 種のト
ランスポゾンを挿入した突然変異株を合計 7,000 ほ

Tc

Tc

ori

ori
IVETプラスミド
egf rep

egf rep
Ap

Ap

Δegf

短いゲノムDNA
断片の挿入
promoter

標的ゲノム

相同組換えでゲノムに挿入

egf rep
Tc

Ap
Ap

Δegf

IVETプラスミド

野生型ゲノム断片

図1. IVETの原理. egfはあらゆる環境での生存・増殖に必須因子遺伝子で repはレポーター遺伝子。
IVETプラスミドは標的細菌株で複製不可能。本プラスミド上のegfとrepはいずれもプロモーターを欠く。

9

第 8 回極限環境微生物学会シンポジウム（2007）[Aでのプライマー対]
tag1, 2, -, -, n

[Bでのプライマー対]

tag1からtagnまでを
トランスポゾン内に挿入
薬剤耐性
遺伝子

tag1からtagnまでの各トランスポゾンを用いた挿入変異株の作製

挿入変異株プール(プール内の各変異株は異なる
tagの挿入を受けている)

B

A

Cycle number

特定環境① DNA抽出② tag領域のリアル
タイムPCR増幅

Fluorescence

コロニーの全DNAを貼り付けたメンブラン① DNA抽出② tag領域の
PCR増幅・
ラベリング③ サザン解析

Fluorescence

プール化

回収した
菌集団
Cycle number

図2. STMの原理. 我々は「B」の手法を採用。[Bでのプライマー対]で、左側のプライマーは1種類の共通プライマー、右側のプライマーは tag毎で異なる
可変プライマー。[共通プライマー]とn種の[可変プライマー]を同時に用いたPCRで、ｎ個の特異的増幅断片の取得が可能。

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第 8 回極限環境微生物学会シンポジウム（2007）

シンポジウム要旨

PCB分解菌の芳香族分解遺伝子発現制御と環境応答
福田 雅夫（長岡技術科学大学生物系

教授）

Rhodococcus sp. RHA1株は殺虫剤のリンデン（γていることをすでに明らかにしている。RNA1株には-HCH、γ-BHCとも呼ぶ）汚染土壌から分離されたPCB

BphS1T1と相同性の高いもう一つの制御遺伝子セッ（ポリ塩化ビフェニル）分解細菌でビフェニル代謝

トBphS2T2があり、ビフェニル以外のエチルベンゼン

酵素系を利用してPCBを共代謝により分解する。PCBやトルエンなどの芳香族化合物が存在する場合は分解にかかわる酵素遺伝子の解析においてビフェニ

BphS1T1とBphS2T2が協調して各遺伝子クラスターの

ル/PCB分解経路上流の各ステップで複数のアイソザ

転写を誘導する。ビフェニルに対してはBphS2T2が応イムが関与することや多くの酵素遺伝子が２つの巨答しないため、BphS1T1のみが各遺伝子クラスターの大な線状プラスミドに分かれてコードされているこ

転写を誘導する。しかしながら300を超える遺伝子のとから注目を集め、カナダ政府のプロジェクトとし転写誘導が全てBphS1T1の支配下にあるとは考えにてBritish Columbia大学に我々が協力する形でゲノ

くく、これらの遺伝子の転写制御メカニズムに興味

ム解析が進められた。一昨年にDNAシーケンスが完了が持たれる。一方、ビフェニル/PCB分解経路上流酵してアノテーションを開始し、昨年秋に解析結果を素遺伝子の転写がグルコースにより抑制されること報告することができた。その結果、RHA1株のゲノムも見いだしている。DNAアレイを用いた解析では300

は7.8 Mbの線状染色体、1.1 Mb、 0.44 Mb、および近い遺伝子の転写レベルがグルコース存在下で低下

0.33 Mbの３つの線状プラスミドで構成され、全体でしていることが示唆された。Rhodococcusは放線菌の9.7 Mbに及ぶ現時点で細菌最大のゲノムをもつこと一種でグルコース抑制のメカニズムが明確になってが明らかになった。アノテーションでは9,145のORF

いないが、ビフェニル水酸化酵素遺伝子(bphA1)プロが見いだされ、その4割近くが機能未知であった。

モーターにおいてBphS1T1による転写誘導を受ける
最小領域でグルコース抑制もかかることが示唆されビフェニル代謝系酵素については多数のアイソザている。

イム遺伝子が見いだされ、DNAアレイを用いた解析でPCB汚染の浄化を考えると汚染土壌にRNA1株を導はビフェニル/PCB分解経路下流のペンタジエン酸代入して使用することが想定され、土壌中でのRHA1株

謝経路の各ステップでも複数のアイソザイムが転写の応答に興味が持たれる。そこで、農業環境技術総誘導されることが示唆された。さらにビフェニル生合研究所の小川直人博士（現・静岡大学農学部）ら

育時には300を超える遺伝子の転写レベルが上昇しと共同で、RHA1株を滅菌土壌に接種して培養後、DNAていることが示唆された。安息香酸やフタル酸でのアレイを用いて遺伝子発現プロファイルを解析する

生育では転写レベルが上昇する遺伝子は100をはることを試みている。農業環境技術総合研究所のグル

かに下回るのに比べ、異常な数の遺伝子の転写レベープが試行錯誤の末、土壌から直接RNAを抽出する手ル上昇である。ビフェニル/PCB分解経路上流のアイ法を確立した成果である。まだ具体的な結論を得る

ソザイム遺伝子は5つの遺伝子クラスターに配置さには至っていないが、土壌から直接調製したRNAでれている。各遺伝子クラスターのビフェニルによるDNAアレイ解析が可能になった意義は大きいと考え転写誘導が二成分制御系のBphS1T1により制御され

ている。

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第 8 回極限環境微生物学会シンポジウム（2007）12

第 8 回極限環境微生物学会シンポジウム（2007）

シンポジウム要旨

ウイルス研究から明らかになった

海産原生生物ラビリンチュラ類の分解特性の多様性
高尾 祥丈（水産総合研究センター瀬戸内海区水産研究所日本学術振興会特別研究員）

1980 年代の終わりに、海洋には夥しい量 (104重要な真核生物〜 109 / ml)のウイルスおよびウイルス様粒子の分解者として(VLP: virus-like particle) が存在することが明注目されつつあらかとなって以降、様々な細菌や真核藻類に感染る。しかしながら、するウイルスが発見され、ウイルス感染が宿主の分類の混乱や検現存量変動に大きく影響していることが明らか

出・計数法の不備となった。またウイルス感染は、炭素や窒素、そ等の理由により、の他の栄養塩の循環に大きく寄与していると考

本生物群の詳細

えられており、海洋生態系においてウイルスの果な生態学的知見たす役割の重要性に関する認識が高まりつつあは得られていなる。現在、海洋ウイルスに関する研究の多くは、い。

図 1. ラビリンチュラ類の光学顕微
鏡像

細菌類や真核微細藻類を宿主とするウイルスをウイルスは、宿主の存在なしには増殖すること対象とするものであり、今日までに単離され研究が不可能であり、その宿主特異性は非常に高いこ材料として用いられている真核微細藻類感染性とが知られている。そのため、ウイルスの生態はウイルスの多くは Phycodnaviridae 科として分類

宿主のそれと密接に関係しているおり、ウイルスされる (もしくは Phycodnaviridae 科ウイルスと共の生理・生態について研究を行うことは、その宿通した性質を持つ) 大型 DNA ウイルスであるが、主生物の生理・生態についても多くの知見をもた

近年、小型 DNA ウイルスや RNA ウイルスも相次らすと考えられる。そこで、演者らは、日本各地

いで発見されている。これらのウイルスに関するの海域からラビリンチュラ類感染性ウイルスの分子生物学的な研究により、海洋ウイルスの多様分離を行い、152 株を確立した。これらのウイル性の一端も解明されつつあり、海産真核微細藻類

ス株は、その宿主域と遺伝学的・形態学的特徴にに感染するウイルスに関する生態学的ならびに

基 づ き 「 小 型 球 形 の １ 本 鎖 RNA ウ イ ル ス

分子生物学的な理解は着実に深まりつつある。し(SssRNAV：φ25 nm)」と「大型不定形ウイルス

かし無色従属栄養性原生生物を宿主とするウイ
ルスに関する知見は非常に少ないのが現状である。
一方、ラビリンチュラ類は海洋に生息する直径
5 - 20μm の無色の原生生物であり、クロミスタ界、
ストラメノパイル生物群に属する生物群である。
本生物群は極域から熱帯に至る沿岸域に広く分
図 2 ラビリンチュラ類感染性ウイルス

布し、現存量の豊富さ、ならびに高度不飽和脂肪

A: SssRNAV B: SmDNAV酸の生産能力等の特徴から、海洋生態系における13

第 8 回極限環境微生物学会シンポジウム（2007）の２本鎖 DNA ウイルス(SmDNAV：φ140 nm)」し，後者は調査期間を通して急激な現存量の変化の２タイプに群別され、それぞれのウイルスが宿を示さず、両者の動態は著しく異なることが明ら主とする株はラビリンチュラ内で系統学的に大かとなった。両ウイルスの動態はそれぞれが宿主きく異なるクレードに属していることが明らかとするラビリンチュラ類の量的推移を反映してとなった。

いると考えられることから、ラビリンチュラ類群

さらに、2004 年および 2005 年に広島県五日市

集中には、赤潮藻類の捕食ならびに死骸を積極的

港においてラビリンチュラ類感染性ウイルスのに分解するグループとその他の有機物を栄養源

現存量調査を行ったところ、上述の２タイプのウとして有するグループとが共存しており，それぞイルスが検出された。前者は赤潮原因藻の一つ

れが全く性質の異なるウイルスの影響を受けて

H.akashiwo による赤潮発生後に急増したのに対いる可能性が示唆された。

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第 8 回極限環境微生物学会シンポジウム（2007）

難培養性環境微生物の培養化とシンポジウム要旨

微生物種間ネットワークの解析
鎌形 洋一（産業技術総合研究所ゲノムファクトリー研究部門部門長）

2. 難培養性微生物とは何か？

1. 地球上に存在する微生物の種の数はどれくらいさて本演題である難培養微生物についてであるが、か？
今日性質が解明され、命名されている微生物は

上述の 0.0005%が培養可能な微生物であり、残りは5,000 種にも満たないほどである。昆虫の 65 万種に培養困難微生物であると捉えるのは大きな誤りであ

比べれば、いかにその数が少ないかがわかると同時る。近代微生物学のおよそ 100 年の歴史の中で、正に、微生物の種の数が昆虫の種の数より少ないはず

確な記述がなされてきたものは確かに 5,000 種程度はないであろうと思うのは当然のことである。それであるが、培養されてもなんら記述されていない微

では一体微生物の種はどれくらいの数だけ存在する生物も膨大であることは間違いのないところである。

のであろうか？その答えはもちろん誰も持ち合わせ

しかし、それを差し引いてもなお、多くの微生物がてはいない。ただ 1990 年、16S rRNA 遺伝子による培養困難な微生物あるいは、（感覚的に）容易に培養

多様性解析とは一線を画した研究として森林土壌をできない微生物であることは疑う余地がない。活性

対象に、複雑微生物系全体から抽出した全 DNA の解

汚泥、メタン発酵汚泥、ルーメン、バイオフィルム

離曲線の解析結果から微生物種の数を割り出した結など微生物が非常に高密度に集積している系を顕微

9果がある。それによれば土壌 1 グラムには 10 個オ

鏡で観察し、その後、適当な培地上で培養をして見ーダーの原核生物がいて、種の数はおよそ 10,000

ると、顕微鏡で見えた形態的多様性とは似ても似つのオーダーであると推定された。しかし、2005 年にかないほど、形状的に見てわずかな種類の微生物しなって 10,000 種というのはひとつひとつの種の微かコロニーを形成していないことは、誰でも“直感生物が同じような数だけ存在していると仮定した値

的に”経験しているところである。

であり、実際には優占種と希少種がいてその種の総演者はこれまで多くの難培養微生物と対峙してき数は 1 グラムの土あたり 1,000,000 種のオーダーでた経験から、難培養微生物を分類するとおおよそ以はないか、という驚くべき報告がなされた。ある特下のようになると考えている。もちろんもっとさま

定の地理的位置にある森林土壌 1 グラムあたりの微

ざまな考え方や分類の仕方があることはご了承いた

生物種が 1,000,000 とすれば地球環境全体でいっただきたい。

い何種の微生物が存在するかは、天文学的数値とは(1) 生育速度が著しく遅い微生物：大腸菌の実験室

言わないまでも、今日の我々の想像を大きく越えたでの平均世代時間は 30 分である。筆者らの常識では値であることは疑いようがない。もっとも微生物のこの世代時間はいわば“非常識な”速さである。こ種とは何か、という本質的な点については今なお議れまでに筆者らが培養に成功した微生物のうち平均論すべき問題は残している。だがその問題について

世代時間が最も長かったのは 1 週間である。これはは敢えて問わないことにして、仮に地球上の全微生（基質濃度など条件によるが）液体培養でほぼ静止

物種をさらに３桁多い 1,000,000,000 種とするだけ期に達するまで 3 ヶ月を要する長さである。実際のでも、現在正確に記述された微生物種は全体のわず環境を考えた場合、有機物濃度が常に律速になってか 0.0005%ということになる。

いるが、それでも少しずつ供給されているような場

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第 8 回極限環境微生物学会シンポジウム（2007）
であれば増殖が速くなければならない必然性はない。

(D)の生育を促進すること、さらに微生物(C)は属種(2) 寒天でコロニーを形成しない微生物：これは先の異なる微生物(G, F, I, J, K)の生産物によってもにも述べたが、そもそも寒天という物理化学的な足生育促進を受けることを明らかにした。これらのこ場の上でコロニーを作る微生物のほうが圧倒的に少とは微生物間での物質のやり取りは我々が想像するないと考えるべきである。自然界における微生物の以上に複雑多様であり、さまざまな微生物間のクロ生育の場とは鉱物粒子、植物遺体、動物消化管、水ストークが行われていることを強く示唆するもので系、さらには他の微生物のバイオフィルムなど多様ある。

であるから、寒天というのはむしろ特殊な場である(6) 種間水素伝達を行う共生微生物：嫌気性微生物と言えよう。

においては種間で主にやりとりされる分子は水素で(3) 濁度として検知できない細胞数レベルで静止期ある。多くの嫌気性微生物は物質の分解過程で水素を迎えてしまう微生物：このような微生物の代表例

を発生する（水素発生型発酵微生物）。しかし、水素はアンモニア酸化細菌、鉄還元細菌、硫黄還元菌なは一定以上の濃度まで蓄積すると、物質の嫌気的酸どであるが、その他にも同様の傾向を示すものもあ化反応そのものを阻害してしまう。水素発生型嫌気る。生成物阻害や基質や電子受容体の濃度律速で起性微生物群はこれを回避するために、発生する水素きる場合が多い。

を速やかに除去する微生物を必要とする。特に脂肪(4) 生育に一定以上の細胞濃度を必要とする微生酸や低級アルコール、芳香族化合物を分解する微生物：微生物学の基礎は細胞ひとつからの生育を前提

物にその傾向が顕著である。”水素除去者”は多くとしている。したがって液体培養においては理論的の場合、水素を用いて炭酸ガスを還元しメタンを作にひとつの生きた細胞を接種すれば生育は開始する

るメタン生成古細菌である。実際の複雑系を in situ

はずである。しかし、筆者らの経験では 103 から 105

hybridization などの手法で観察すると、水素発生

以上の初期接種量が絶対必須な微生物が確かに存在を行う微生物を取り囲むように水素資化性メタン生する。これは N-アシルホモセリンラクトンによるク成古細菌が存在している。このような水素発生型嫌オーラムセンシングと同様の効果を持つ生育因子あ気性微生物（嫌気共生細菌と呼ばれている）はほと

る い は 近 年 bacterial cytokine と 呼 ば れ る

んど例外なく分離培養が難しい。筆者らはこのようResuscitation promoting factor (Rpf)のような物な微生物の分離を試みてきたが、もっぱら分離にあ質の存在を示唆するものである。

たっては、水素を消費するメタン生成古細菌を共存(5) 他の微生物の生育因子を必要とする微生物：こさせた共培養を行っている。

れは上記(4)とも関連するが、異種微生物間のクロス(7) 昆虫などに共生する微生物：昆虫の体内にはさトークと呼べるような現象であり、精緻な解明が成

まざまな微生物が共生しているのはよく知られていされている例は少ないが、あらゆる環境が複雑微生る事実である。通常一種の昆虫に一種の微生物が共物系によって成立している以上、異種微生物間のコ生しているが、時として複数種の微生物を共生させミュニケーションや生育因子のやりとりはおそらくていることもある。最もよく研究されているものの普遍的な現象ではないかと思われる。このような微ひとつとしてはアブラムシの体細胞に共生している

生物は生育に必要な因子を供給する微生物が見つか

Buchnera と呼ばれる大腸菌と遠縁の微生物である。

らない限り培養は困難である。筆者らは最近、活性似たような細菌はカメムシを初めとする他の多くの汚泥中のある種の微生物(A)が別種の微生物(B)の生昆虫にも見いだされている。数ある難培養微生物の産する物質によって生育が著しく助長されることを中でこれらの微生物群はおそらく最も培養が難しい見いだした。さらに微生物(B)の生産物は微生物(A)

微生物であると考えられる。その最大の理由はこれのみならず、種や属を越えた他の微生物(C)や微生物

らの微生物は宿主昆虫に極度に依存した生活環を持16

第 8 回極限環境微生物学会シンポジウム（2007）
ち、宿主とともに共進化したため、単独で生きてゆ
くために必要な多くの遺伝子を欠損させている。極本講演では演者らが取り組んできた微生物の培養化

言すればミトコンドリアのような運命をたどろうとの試みを通して得られた難培養性微生物の実体につしている微生物であり、もはや細胞の一器官の様相

いて概観したい。

を呈しているといってよいからである。

極限環境微生物学会 極限シンポジウム委員会
委員長
為我井秀行（日本大学）
副委員長
野尻 秀昭（東京大学）
委員
伊藤 政博（東洋大学）
佐藤 孝子（海洋研究開発機構）
玉腰 雅忠（東京薬科大学）
八波 利恵（東京工業大学大学院）
道久 則之（東洋大学）

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