技術紹介

FISH 法によるカビ検出
山村

隼志 *1

Yamamura Junji

大村綾子 *2

Oomura Ayako（1）（2）

カビの迅速検出・同定に蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（FISH）法が適用できることを報告した。

FISH 法は、菌体内に蛍光色素標識した短い DNA 鎖（DNA プローブと称す）を取り込ませ、蛍光顕微鏡で検出するものである。また、検出したい菌の遺伝子と特異的に結合できるように DNA プローブの塩基配列を設計することで属レベルの菌種同定も可能である。これまで FISH 法をカビ検出に適用した例は少なく、特定のカビの分布状況を調べる研究等に限られていたが、汚染、品質劣化等、さまざまな問題を引き起こすカビの検出に FISH 法を利用することで迅速な検査が可能となる。
きょう

本稿では、実環境中で採取した試料で FISH を行う際に問題となる、夾雑物由来の蛍光について検討を行ったので報告する。
キーワード：蛍光 in situ ハイブリダイゼーション、FISH、カビ検査、迅速検出ように DNA プローブの塩基配列を設計すること1. はじめにで、菌種の同定も可能である。図 1 に FISH 法のカビが引き起こす問題は、食品や住環境等の汚概要を示す。各工程は以下の通りである。

染による品質劣化だけでなく、アレルゲンとして① 固定：採取したカビの形態を保持するため、健康への影響も懸念されている。

パラホルムアルデヒドによる固定処理を行う。

現在、カビ検査は培養・形態観察によるものが② ろ過：メンブレンフィルタに捕集、濃縮する。

主流であるが、培養に時間がかかるため検査に数③ プローブ添加：DNA プローブの溶液にフィ日から一週間程度を要し、迅速性という点においルタを浸し、菌体内のリボソーム RNA と結て課題がある。また、形態観察による同定には豊合させる（ハイブリダイゼーション）。

富な知識と経験が求められる。

④ 洗浄：塩基配列が一致しない菌に取り込まれ培養工程を経ずに微生物を検出する方法の一つ

た DNA プローブを除去する。に、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション法（以下、⑤ プレパラート作製：洗浄後、フィルタを乾燥

FISH 法）があり、細菌の検出方法として研究分させ蛍光観察用のプレパラートを作製する。

野で多く用いられてきた。FISH 法は、菌体内に⑥ 観察：蛍光顕微鏡で観察を行う。青色の励起蛍光色素で標識した DNA プローブ（※ 1）を取光によって蛍光色素が緑色蛍光を発するたり込ませ、蛍光顕微鏡で検出するものである。まめ、プローブが結合した菌体は光って見える。

た、検出したい菌の遺伝子と特異的に結合できる*1：計測事業部*2：計測事業部

化学環境部
化学環境部

課長

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31—

IIC REVIEW/2015/10. No.54

FISH 法がカビの検出に適用できることを報告

2. 実験方法（1）（2）

したが、環境中から採取した試料に含まれる
2.1 試料夾雑物も蛍光を発する場合があるなど、正確な検査を行う上で課題も残っていた。本稿では、FISH

寒天培養で調製した Aspergillus niger （黒コウジで染色されたカビの蛍光と夾雑物が発する蛍光をカビ）の胞子液に、屋内の棚等に積もった埃を混識別可能とするため、蛍光観察において励起光お合したものを試料として用いた。埃の採取は、目よび観察光の選択を担うミラーユニット（※ 2）

視でカビが繁茂していない箇所を選択して行った。

ほこりについて検討を行ったので報告する。
2.2 FISH※ 1： DNA プローブ：カビの遺伝子と相補的な配列を持つ短い合成 DNA。細胞内のカビと夾雑物の混合試料に対しパラホルムアル核酸（リボソーム RNA）と相補的な部デヒド溶液で固定処理を行った。細胞内へのプ分で結合する（ハイブリダイゼーショ

ローブの浸透性を良くするため、試料をガラスン）。蛍光で検出するため、末端に蛍光ビ ー ズ と 混 合・ 攪 拌 し た。 真 菌 検 出 用 と し て色素を結合させる。

EUK516 プローブを用いて FISH を行い、蛍光顕かくはん

（3）

（2）

微鏡で観察を行った 。

※ 2： ミラーユニット：蛍光色素に最適な波長の光（励起光）だけを透過するフィルタ、2.3 ミラーユニット

試料からの蛍光を選択的に透過する今回用いたミラーユニットを表 1 に示す。

フィルタなどから構成されるユニット。

図1

FISH 法によるカビ検出の概要—

32—

表1ミラーユニット一覧

3. 結果
カビと夾雑物の混合試料で FISH を行い、同一試料を三つのミラーユニット（U-FBNA、U-FBNおよび U-FBW）を用いて観察した。U-FBNA では緑色以外の波長が吸収されるため、蛍光を発する粒子は夾雑物を含め全て緑色となった（図 2）。
一方、U-FBW や U-FBN では夾雑物は黄色となり、緑色に染色されたカビと識別しやすくなった（図3、図 4）。

図3

U-FBN（観察波長域 510nm ～）図 2 と同一視野

図4

U-FBW（観察波長域 510nm ～）図 2 と同一視野
U-FBW は U-FBN より励起光の波長領域が広く、全体が明るくなる。

U-FBNA は FISH 法でも使用している緑色蛍光色素（FITC）に最適とされるミラーユニットであり、緑色より長波長の光を吸収するため緑色蛍光以外は観察されない。そのため、夾雑物から蛍光が発せられている場合、染色したカビと同様、緑色蛍光のみが観察される。その結果、特に形状が似ている夾雑物との判別が難しくなっている（図 5、左側）。

一方、U-FBN または U-FBW のように緑色より長波長の光も透過・観察できるミラーユニットを用いた場合、夾雑物に相当する粒子は黄色に見えるため識別が容易になる。カビからは FITC の発図2する強い緑色光が観察されるが、染色されていな

U-FBNA（観察波長域 510 ～ 550nm）
矢印は夾雑物の一例—

い夾雑物からは緑色より長波長の蛍光も発せられ33—

IIC REVIEW/2015/10. No.54

図5

ミラーユニット（吸収フィルタ）の違いによる蛍光観察像の変化（イメージ図）（左）U-FBNA：吸収フィルタで緑色光以外は吸収される。
（右）U-FBW または U-FBN：緑色光より長波長の光も透過する。ており、黄色に近い色になると考えられる（図 5、5. 参考文献

右側）。

（1） 山村隼志、古泉綾子、石井浩介：蛍光 in situ

4. おわりにハイブリダイゼーション（FISH）法による観察できる蛍光の波長域が異なるミラーユニッ

カビの迅速検出、防菌防黴、39、No.9、2011

トの使用により、色素由来の蛍光と夾雑物由来の（2） 山村隼志、古泉綾子、石井浩介：FISH 法のカ蛍光の識別が容易になることが確認できた。よりビ検出への適用、IIC REVIEW、No.45、2011/04

正確な検査を可能とするためには、試料に混入す（3） Rudolf I. Amann, Brian J. Binder, Robert J. Olson,

る可能性のあるさまざまな物質だけでなく、より多Sallie W. Chisholm, Richard Devereux, David A.

くのカビについても蛍光の有無・色などの特性を把Stahl, Combination of 16S rRNA-Targeted

握し、適切なミラーユニットを選択する必要がある。

Oligonucleotide Probes with Flow Cytometry for
Analyzing Mixed Microbial Populations. Appl.
Environ. Microbiol. 56, 1990, pp.1919-1925

計測事業部
化学環境部課長

計測事業部
化学環境部

大村 綾子

山村 隼志

TEL. 045-791-3516
FAX. 045-791-3541

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