バイオインフォマティクス人材育成講座

平成 24 年度
スタンダードコース講義集

株式会社リバネス

1

2

目次
1

はじめに

5

2

カリキュラム一覧

6※バイオインフォマティクス・スタンダードコース（ＷＥＢサイト）

8

3

11

講義集

3.1

バイオインフォマティクスの歴史、生命科学の基礎

11

3.2

生命科学実習①：ゲノム DNA 抽出、総 RNA 抽出

16

3.3

生命科学実習②：PCR、DNA シークエンス

22

3.4

生命科学実習③：トランスクリプトーム解析

29

3.5

生命科学実習④35

3.6

情報科学基礎

42

3.7

類似性発見

49

3.8

配列と機能

54

3.9

タンパク質の機能と構造

59

3

4

1

はじめに
バイオインフォマティクス人材育成講座 平成 24 年度スタンダードコース講義集は、公益財団法人沖縄科学技術振興センターが、平成 22 年度より 3 年計画で実施した「バイオインフォマティクス人材育成推進事業」において開発したスタンダードコースカリキュラム
をもとに、平成 24 年度に国立学校法人琉球大学の農学部食品機能科学特別講義Ⅰおよび同
じく工学部情報工学科特別講義Ⅴにおいて実施された講義を集めたものです。
本講義集では、バイオインフォマティクス人材育成推進事業が目的とする高等教育機関
における育成基盤構築の一助として、実際に行われた 30 講義（1 講義あたり 90 分授業）に関する情報を、講義スライドや実習プロトコルなど講義で用いられた資料も合わせて収録しました。新たなバイオインフォマティクス人材の育成に活用いただければ幸いです。
なお、本講義集に収録されている講義スライド等資料の著作権は、各講義を担当した講師に帰属します。許可なく転載するなどの教育目的以外の二次利用はご遠慮ください。

5

2

カリキュラム一覧

食品機能科学特別講義Ⅰ カリキュラム

2012 年 9 月 3 日（月）～9 月 7 日（金）6

情報工学科 特別講義Ⅴ カリキュラム

9 月 10 日（月）～9 月 13 日（木）7

※バイオインフォマティクス・スタンダードコース（ＷＥＢサイト）
農学部食品機能科学特別講義 I と工学部情報工学科特別講義 V の両方の講義を受講することで、バイオインフォマティクススに関連する基礎的な知識と技術を身につけるコースとなります。
平成 24 年度沖縄県産業振興基金事業「バイオインフォマティクス人材育成推進事業」 の一環として実施されます。
講座概要 pdf
農学部 食品機能科学特別講義 I
科目番号：資 535
単位数：2
開講日時：平成 24 年 9 月３日(月) 7 日(金)亜熱帯生物資源科学科の学生：選択科目
他学科・他学部の学生：自由科目
登録方法：農学部学務係
工学部情報工学科 特別講義 V
科目番号：情 495
単位数：2
開講日時：平成 24 年 9 月 10 日(月) 13 日(木)教室：総合情報処理センター2 階第 3 実習室
情報工学科の学生：選択科目
他学科・他学部の学生：自由科目
登録方法：岡崎威生(okazaki@ie.u-ryukyu.ac.jp)まで下記の情報をメールでSubject：【特別講義 V】受講登録、 学部学科：、学籍番号：、氏名：、農学部受講：登録/未登録
登録受付学生リスト(学内限定アクセス)

授業評価アンケート(農・工共通)
受講生は、担当教員毎に記入して下さい。
授業評価アンケート回答状況
農学部・食品機能科学特別講義 I 回答状況
工学部・特別講義 V 回答状況

バイオインフォマティクス技術者認定試験
平成 24 年度試験案内ポスター
平成 23 年度問題と解答
平成 23 年度解説
平成 22 年度問題と解答
平成 21 年度問題と解答
平成 20 年度問題と解答

8

平成 19 年度問題と解答

講義関連情報農学部・食品機能科学特別講義 I
9 月 3 日 バイオインフォマティクスの歴史、生命科学の基礎(要匡)oバイオインフォマティクス pdf

o

生命科学の基礎 pdfo

遺伝学の基礎 pdf

9 月 4,5 日 生命科学実習 1,2(池松真也)

oゲノム DNA の抽出 pdfo

ゲノム DNA の調整 pdfo

総 RNA の抽出 pdfo

課題 pdfo

課題解答例 pdfo

電気泳動 doco

PCR による DNA 増幅 pptxo遺伝子の増幅と配列分析法 docxo

乳酸菌のシークエンス doco

プライマー位置 ppt

9 月 6 日 生命科学実習 3(門田幸二)

o

門田幸二のホームページ リンクo(R で)塩基配列解析ウェブページ リンクo(R で)マイクロアレイデータ解析ウェブページ リンクo

講義資料（公開版） pdf

o

課題 pdfo

実習用データ zip

9 月 7 日 生命科学実習 4(田邊俊朗)

o講義スライド pdfo配布資料 pdf

工学部・特別講義 V
課題提出状況(9/21 現在)
9 月 10 日 1 限 イントロダクション(岡崎威生)

o講義スライド pdf

9 月 10 日 2 限-4 限 情報科学基礎(名嘉村盛和)

oアルゴリズムの基礎 pdfoコンピュータの基礎 pdf

9o

グラフ・アルゴリズム pdfo

探索 pdfo

整列 pdfo

ヒープ pdf

9 月 10 日 5 限-11 日 類似性発見(岡崎威生)

o講義スライド pdf

o演習問題 pdfo

R 実行メモ pdfoR 概説(総合情報処理センター広報) pdf

o

BLOSUM50 表 pdfoPAM250 表 pdfo

正規分布数表 pdfot 分布数表 pdfoF 分布数表 pdfo遺伝子発現データ csv

9 月 12 日 配列と機能(有田正規)

o講義スライド pdf

9 月 13 日 タンパク質の機能と構造(広川貴次)

o講義スライド pdfo

課題 pdfo

関連リンク集

10

3

講義集
3.1

バイオインフォマティクスの歴史、生命科学の基礎
3.1.1 概要
講師：要 匡／琉球大学大学院医学研究科遺伝医学講座准教授
日時：2012 年 9 月 3 日 10:20～／12:50～／14:40 ～場所：琉球大学農学部 207 講義室
内容：生化学、遺伝学、分子生物学など生命科学の発展に計算機が活用され、計算機の発展に伴ってバイオインフォマティクス分野が重要な役割を担うようになってきた歴史を学ぶとともに、細胞の構造や細胞内器官の働き、生体分子（DNA、RNA、タンパク質など）に関する生命科学の基礎的な知識と遺伝学の基本的な法則などを学ぶ。
3.1.2 準備特筆事項なし3.1.3 配布物
講義スライド・バイオインフォマティクス概要基礎・生命科学の基礎
・遺伝の基礎3.1.4 課題・レポート（記述 2 題）

11

3.1.5 キーワード
生命科学分野生物学基礎
細胞（生体膜、細胞内小器官、真核生物、原核生物）、細胞周期（体細胞分裂、減数分裂）、
遺伝学（メンデルの法則、連鎖)、発生・分化、シグナル伝達（受容体、プロテインキナーゼ、細胞接着）、ウィルス、免疫、脳・神経
分子生物学
セントラルドグマ、複製（DNA）、転写（RNA、遺伝子発現、逆転写、スプライシング）、翻訳（タンパク質、tRNA、リボゾーム、遺伝暗号、翻訳後修飾）、RNA 遺伝子、生体エネル
ギーと代謝、エピジェネティクス（クロマチン構造）
バイオテクノロジー
遺伝子組み換え、分子クローニング、PCR、塩基配列決定法（サンガー法、次世代シークエンサー）、ゲノム（ショットガン法）、トランスクリプトーム（マイクロアレイ）、プロ
テオーム（質量分析、二次元電気泳動、酵母ツーハイブリッド法）、立体構造決定（X 線
結晶構造解析、NMR、電子顕微鏡）、ChIP-seq 法
情報科学分野コンピュータシステム
二進数、論理演算（論理積、論理和、排他的論理和）、数値演算（浮動小数点数、丸め誤差、桁落ち）、プログラミング言語（C 言語、Perl 言語）、ネットワーク（OSI 参照モデル、
IP アドレス）、マークアップ言語（HTML、XML）
アルゴリズム
データ構造（スタック、キュー、リスト、木構造）、探索（二分探索、ハッシュ表、木探索）、ソーティング、文字列比較
データベース技術
３層スキーマ構造、データモデル（階層型、リレーショナル型）
確率・統計
確率分布・確率変数（母集団、標本、独立性、ベイズの定理）、データ解析（平均、分散、相関、回帰）、推定・検定（点推定、区間推定、帰無仮説、対立仮説、有意水準）
機械学習
決定木、k-最近接近傍法、ニューラルネットワーク、サポートベクトルマシン、感度、特異度、クロスバリデーション法、クラスタリング、K-平均法、自己組織化マップ（SOM）

12

バイオインフォマティクス分野
分子生物学データベース
文献 DB（PubMed）、ゲノム DB、核酸配列 DB、アミノ酸 DB、モチーフ DB（モチーフライブ
ラリー）、立体構造 DB、代謝パスウェイ DB、多型ＤＢ、発現ＤＢ、アノテーション、遺伝
子オントロジー（Gene ontology）
配列解析
アラインメント（動的計画法（dynamic programming）、スコアテーブル、ギャップペナル
ティ、ローカルアラインメント、グローバルアラインメント、Smith-Waterman 法、ペア
ワイズアラインメント、マルチプルアラインメント、累進法（ツリーベース法）、ClustalW、
HMM（隠れマルコフモデル））、相同性検索（FASTA、ハッシング、BLAST、有限オートマト
ン、PSI-BLAST、位置特異的スコア行列（PSSM)、プロファイル比較）、モチーフ解析（正規表現、重み行列）、分子系統解析（オーソログ、パラログ、距離行列法、UPGMA、近隣結
合法（N-J 法）、最節約法、最尤法、同義置換、非同義置換）、タンパク質機能予測（膜貫通部位予測、細胞内局在部位予測）、RNA 二次構造予測、遺伝子発見（ORF（open reading
frame）、スプライシング解析、プロモータ解析、偽遺伝子）、ゲノム特徴抽出（繰り返し
配列発見、転写因子、SSR（simple sequence repeat)、GC 含量、コドン使用頻度）、ゲノ
ム比較（ゲノムアラインメント、編集距離、系統プロファイル法、ロゼッタストーン法、
遺伝子並び順の保存、遺伝子の水平伝搬）タンパク質立体構造解析
化学構造（結合角、結合距離、二面角）、タンパク質高次構造(二次構造、三次構造、四次構造)、立体構造表現（コンタクトマップ、ラマチャンドランマップ、分子グラフィック
ス）、構造比較（重ね合わせ、RMSD、構造アラインメント、構造モチーフ、構造分類）、タ
ンパク質構造予測（二次構造予測、ホモロジーモデリング、フォールド認識、スレッディ
ング、３D-1D 法、分子動力学計算）、構造 DB
遺伝学・進化学
分子系統解析（オーソログ、パラログ、距離行列法、UPGMA、近隣結合法（N-J 法）、最節
約法、最尤法、同義置換、非同義置換）、ニューウィック形式、遺伝子の水平伝搬、多型マーカー（SNP、マイクロサテライト、VNTR、RFLP、HLA タイプ）
、Hardy-Weinberg の法則
トランスクリプトーム解析・プロテオーム解析
遺伝子発現クラスタリング、遺伝子ネットワーク推定（ブーリアンネットワーク、ベイジ
アンネットワーク）、タンパク質相互作用解析、DNA マイクロアレイ、質量分析、二次元
電気泳動、酵母ツーハイブリッド法
パスウェイ解析・システム生物学
ネットワーク解析（スケールフリー、ハブ、ネットワークモチーフ）、動的シミュレーシ
ョンとシステム解析（微分方程式、ロバストネス、フィードバック、フィードフォワード、
感度解析、安定性解析、代謝流束解析）
133.1.6 時間割
時間

内容

10:40～

講師自己紹介
略歴紹介
研究内容紹介遺伝子工学手法による疾患遺伝子の解析
TG マウス、KO マウスによる病態モデル研究
ヒト人工染色体ベクターによる遺伝子治療法

10:55～

バイオインフォマティクスの歴史
・ Bioinformatics＝Bio(生物)+informatics(情報学)・ 遺伝情報、核酸情報、タンパク質情報などを扱う
・ 従来の実験スタイルと新しいスタイル→ウェット＋ハイスループット解析＋情報処理
ゲノム解析の革新
・ シークエンス技術とヒトゲノムプロジェクト・ 次世代シーケンサの誕生
・ 次次世代シーケンサの誕生
・ 1,000 人ゲノムプロジェクト・ シークエンサーによるデータ量の変化
・ ゲノム解読費用
・ パーソナルゲノム時代を拓く
・ 生命科学研究とバイオインフォマティクス

11:50～

昼食

13:00～

生命科学の基礎・ 生命とは（自己保存、系統保存、進化）・ 細胞内器官・ ミトコンドリアの機能と局在タンパク・ クローン羊 ドリー
ゲノム・ DNA＝設計図
・ DNA の性質、相補性・ 分子遺伝学の基本ツールと用語解説
・ DNA と遺伝子と染色体（とタンパク質）
14

・ ゲノム構造と遺伝子・ コドン表・ 遺伝子スプライシング・ 転写と翻訳
遺伝子組換え技術・ ベクター・ プラスミド・ 制限酵素・ Ligase・ DNA ライブラリー
・ PCR の原理
・ シークエンス解析、使用機器
・ 遺伝子組換え事例
遺伝子組換え医薬品、青いバラ、遺伝子改変マウス等
・ キメラの作成
・ 染色体について
14:20～

休憩

14:40～

遺伝学の基礎・ 遺伝＝親から子へ受け継がれる形質
・ メンデルの遺伝粒子説
・ 病気と遺伝子・ 遺伝性疾患と対立遺伝子
・ 常染色体遺伝、ミトコンドリア遺伝・ Hardy-Weinberg 平衡
・ 血液型（ABO）
糖鎖について、血液型物質について、特殊な血液型とその遺伝
・ OMIA、色々な形質の遺伝
肌の色、髪の毛の色、眼の色、耳あか型など
・ SNP とその種類
・ 味覚の遺伝
PTC 味覚感受性遺伝、味覚受容体遺伝子・ その他の形質遺伝
アスパラガス遺伝、匂い受容体遺伝、トマト遺伝
・ 多様な形質の遺伝を調べる方法
家系図、パーソナルシークエンス
15

5’-AGCATGAAGTAG-3’
3’-TCGTACTTCATC-5’
12 bp

5’-AGCATGAAGTAG-3’
3’-TCGTACTTCATC-5’
12 bp

GA IIx
(Solexa)

FLX
(454)

SOLiD

SNP
in/delde novo

300GB/run/csfasta file
/QV file/csfasta file
/QV file, txt,

II

Enriched
TargetDNA

KS06

KMS001

KMS001-002

KMS001-002-003

KMS001-002-003-dbSNPs

heteroSNPs

62,23433,792

19,762625

ID#

homoSNPheteroSNP

totalSNP

KMS001

66,471

62,234

128,705

KMS002

66,682

57,270123,952

KMS00367,58958,393125,982p(A)

q(a)

p(A)

p2(AA)

pq(Aa)q(a)pq(Aa)q2(aa)

somato.

Science 319:1827- (2008)

3.2

生命科学実習①：ゲノム DNA 抽出、総 RNA 抽出
3.2.1 概要
講師：池松 真也／沖縄工業高等専門学校生物資源工学科教授
日時：2012 年 9 月 4 日 10:20～／12:50～／14:40 ～場所：沖縄工業高等専門学校 SE-271 生物化学工学実験室
内容：生命科学実習①：生命科学研究において利用される基本的な実験技術として、細胞からの DNA 抽出および制限酵素処理を加えて電気泳動で分離する処理について講義および実習を交えて学ぶ。生命科学実習②：ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）と、DNA シーケンサによる配列解析について、その原理の理解を中心に実習を交えて学ぶ。
ＴＡ：7 名実習体制：4 名/班×4 班
3.2.2 準備
機器
□卓上遠心機himac CT 13R／HITACHI□卓上遠心濃縮機

Concentrator 5301／eppendorf□小型恒温槽CTU-mini／TAITEC□ローテーター

Rotator RT50／TAITEC

実験器具・試料・試薬□マウス肝臓0.075g×4 個（肝臓 1/3 程度使用)□エッペンチューブ

12 個（3 個/人×4 人）□15mL チューブ

4 個（試薬分注用）□p20 ピペットマン

1個□p200 ピペットマン

1個□イエローチップ

1箱□解剖用ハサミ

1個□ピンセット

1個□保護ゴーグル

4個

□手袋

4個

□マスク

4個

□Lysis バッファー

2mL(0.5mL/人×4 人)□proteinaseK

240μL(60μL×4 人)□Tris/フェノール

2mL（0.5mL×4 人）□冷 100%エタノール

4mL(1mL×4 人)
16□2 プロパノール

4mL(1mL×4 人)□70%エタノール

適量 4mL(1mL×4 人)□PBS(-)

適量

3.2.3 配布物
・講義スライド・実習プロトコル
3.2.4 課題・プリント

17

3.2.5 キーワード
生命科学分野生物学基礎
細胞（生体膜、細胞内小器官、真核生物、原核生物）、細胞周期（体細胞分裂、減数分裂）、
遺伝学（メンデルの法則、連鎖)、発生・分化、シグナル伝達（受容体、プロテインキナーゼ、細胞接着）、ウィルス、免疫、脳・神経
分子生物学
セントラルドグマ、複製（DNA）、転写（RNA、遺伝子発現、逆転写、スプライシング）、翻訳（タンパク質、tRNA、リボゾーム、遺伝暗号、翻訳後修飾）、RNA 遺伝子、生体エネル
ギーと代謝、エピジェネティクス（クロマチン構造）
バイオテクノロジー
遺伝子組み換え、分子クローニング、PCR、塩基配列決定法（サンガー法、次世代シークエンサー）、ゲノム（ショットガン法）、トランスクリプトーム（マイクロアレイ）、プロ
テオーム（質量分析、二次元電気泳動、酵母ツーハイブリッド法）、立体構造決定（X 線
結晶構造解析、NMR、電子顕微鏡）、ChIP-seq 法
情報科学分野コンピュータシステム
二進数、論理演算（論理積、論理和、排他的論理和）、数値演算（浮動小数点数、丸め誤差、桁落ち）、プログラミング言語（C 言語、Perl 言語）、ネットワーク（OSI 参照モデル、
IP アドレス）、マークアップ言語（HTML、XML）
アルゴリズム
データ構造（スタック、キュー、リスト、木構造）、探索（二分探索、ハッシュ表、木探索）、ソーティング、文字列比較
データベース技術
３層スキーマ構造、データモデル（階層型、リレーショナル型）
確率・統計
確率分布・確率変数（母集団、標本、独立性、ベイズの定理）、データ解析（平均、分散、相関、回帰）、推定・検定（点推定、区間推定、帰無仮説、対立仮説、有意水準）
機械学習
決定木、k-最近接近傍法、ニューラルネットワーク、サポートベクトルマシン、感度、特異度、クロスバリデーション法、クラスタリング、K-平均法、自己組織化マップ（SOM）

18

バイオインフォマティクス分野
分子生物学データベース
文献 DB（PubMed）、ゲノム DB、核酸配列 DB、アミノ酸 DB、モチーフ DB（モチーフライブ
ラリー）、立体構造 DB、代謝パスウェイ DB、多型ＤＢ、発現ＤＢ、アノテーション、遺伝
子オントロジー（Gene ontology）
配列解析
アラインメント（動的計画法（dynamic programming）、スコアテーブル、ギャップペナル
ティ、ローカルアラインメント、グローバルアラインメント、Smith-Waterman 法、ペア
ワイズアラインメント、マルチプルアラインメント、累進法（ツリーベース法）、ClustalW、
HMM（隠れマルコフモデル））、相同性検索（FASTA、ハッシング、BLAST、有限オートマト
ン、PSI-BLAST、位置特異的スコア行列（PSSM)、プロファイル比較）、モチーフ解析（正規表現、重み行列）、分子系統解析（オーソログ、パラログ、距離行列法、UPGMA、近隣結
合法（N-J 法）、最節約法、最尤法、同義置換、非同義置換）、タンパク質機能予測（膜貫通部位予測、細胞内局在部位予測）、RNA 二次構造予測、遺伝子発見（ORF（open reading
frame）、スプライシング解析、プロモータ解析、偽遺伝子）、ゲノム特徴抽出（繰り返し
配列発見、転写因子、SSR（simple sequence repeat)、GC 含量、コドン使用頻度）、ゲノ
ム比較（ゲノムアラインメント、編集距離、系統プロファイル法、ロゼッタストーン法、
遺伝子並び順の保存、遺伝子の水平伝搬）タンパク質立体構造解析
化学構造（結合角、結合距離、二面角）、タンパク質高次構造(二次構造、三次構造、四次構造)、立体構造表現（コンタクトマップ、ラマチャンドランマップ、分子グラフィック
ス）、構造比較（重ね合わせ、RMSD、構造アラインメント、構造モチーフ、構造分類）、タ
ンパク質構造予測（二次構造予測、ホモロジーモデリング、フォールド認識、スレッディ
ング、３D-1D 法、分子動力学計算）、構造 DB
遺伝学・進化学
分子系統解析（オーソログ、パラログ、距離行列法、UPGMA、近隣結合法（N-J 法）、最節
約法、最尤法、同義置換、非同義置換）、ニューウィック形式、遺伝子の水平伝搬、多型マーカー（SNP、マイクロサテライト、VNTR、RFLP、HLA タイプ）
、Hardy-Weinberg の法則
トランスクリプトーム解析・プロテオーム解析
遺伝子発現クラスタリング、遺伝子ネットワーク推定（ブーリアンネットワーク、ベイジ
アンネットワーク）、タンパク質相互作用解析、DNA マイクロアレイ、質量分析、二次元
電気泳動、酵母ツーハイブリッド法
パスウェイ解析・システム生物学
ネットワーク解析（スケールフリー、ハブ、ネットワークモチーフ）、動的シミュレーシ
ョンとシステム解析（微分方程式、ロバストネス、フィードバック、フィードフォワード、
感度解析、安定性解析、代謝流束解析）
193.2.6 時間割
時間

内容

10:26～

イントロダクション・ 前日の復習・ セントラルドグマ
・ 生き物の体は細胞からできている・ プロトコル説明

10:46～【DNA の抽出】
マウス肝臓 0.075g↓

PBS( )で血を洗い流す。
＊今回は、 80℃で保管してあったものを使用

11:05～↓

組織を解剖用ハサミで細かく刻みチューブに移す↓

Lysis バッファー0.5mL、Proteinase K 溶液 60μL を加える↓

フタをして、均一になるまで上下転倒混和↓

55℃、8 時間～O/N でインキュベート＊ 今回は、前日からインキュベートしてあるものと交換

11:12～↓

Tris/フェノールを 0.5mL 加える↓

30rpm で 1 時間上下転倒＊ 空き時間に課題に取り組んだ。

11:50～

インキュベート中に昼食

13:10～↓

RT、3,000rpm、10 分間↓

上清を慎重に回収し、新しいチューブに移す＊ 今回は、100μL 程度を回収↓

200μL（2 倍量）の 100%エタノールまたは 2-プロパノールを慎重に重層↓竹ぐしを、水槽とエタノール層の界面に挿入し、析出した DNA を巻き取る
＊ 今回は十分に回収できなかったため、上清を回収し 100%エタノ
ールを 2 倍量加え、4℃、10,000rpm、3 分間遠心分離↓
13:30～

沈殿を DNA として回収

RNA 抽出について
・ 前半の復習・ RNA の種類（rRNA、tRNA、mRNA、）・ RNA 抽出に関する注意事項
・ プロトコル概要紹介20

13:50～【映像】
細胞からの RNA 抽出ビデオ

14:00～【細胞破砕液の調整】
マウス腎臓 1g 弱／班↓＋TRI-Zol（GIBCO）5mL↓

ホモジェナイズ

細胞破砕液とする
14:10～【Total RNA の抽出】
細胞破砕液 1mL↓

＋0.2 mL クロロホルム溶液↓

チューブの蓋を閉めて、15 秒間激しく浸透↓

15℃～30℃にて 2～3 分間インキュベート

14:25～↓

4℃、15 分間、12,000g

14:25～

遠心分離中に休憩↓

3 層のうち、一番上の層（透明）を新しいチューブに回収する。
＊使用した TRI-Zol の約 60％程度↓使用した TRI-Zol 1mL に対してイソプロピルアルコール 0.5mL を加え、よく混和する
14:50～↓

15℃～30℃にて 10 分間インキュベート↓

4℃、12,000g 、15min

15:05～＊ 遠心後、チューブの壁面から底にかけて白いペレットが確認できる

15:25～↓

上清を捨てる↓

75% EtOH で RNA ペレットを洗う＊使用した TRI-Zol 1mL に対して 1mL の 75% EtOH を使用↓

ボルテックスミキサーでサンプルを混ぜる↓

4℃、7500g、5min

15:35～↓

5～10 分間、Vacuum-Dry

15:48～↓

10～100μL の RNase free 滅菌水に溶解

15:58～↓

nanoDrop にて吸光度（260nm/280nm）を測定する

16:18～

課題作成／提出の上解散

21

2

DNA

RNA

DNA

RNA

2012

9

4

A.M.

DNA
DNA
4 September 2012
Shinya Ikematsu
Okinawa National College of Technology
Director of Cooperative Technology Center

DNA
PBS( )
0.075g

P100

20 l

P103

0.5ml Proteinase K
60 l
10mg
20 l

55

8

Tris/

0.5ml

25mg

3,000rpm 1030rpm 11ml(2) 100%

80

DNA
-80

DNA

SDS

K EDTA

/

70

DNA

DNA
DNA
DNA
P102

A.M.
DNA

1.)
2.)

P-20

3.)

P-100

P-200

4.)
5.)

1.)
2.) Proteinase K
3.) Tris/
4.)

100%

5.) 26.) 70%
7.) PBS()

PBS( )
0.075g

80
g

0.5ml

ml

10mg

Proteinase K

60l(

0.5ml (

ml)

3,000rpm 10
1ml

ml (2

25mg

20 l
55

Tris/

l)

30rpm

8

1

rpm
)

100%
DNA

70

DNA

20

l

A.M.

1M Tris-HCl (pH8.0)

5mL( 25 mL)

50mM

5M NaCl

2mL(

8 mL)

100mM

0.5M EDTA

20mL(

100 mL)

100mM

10%(w/v)SDS

10mL(

50

DW up tomL)

100mL( 500 mL)

1%

2012 9 4

P.M.

P.M.

RNA
4 September 2012
Shinya Ikematsu
Okinawa National College of Technology
Director of Cooperative Technology Center
2

DNA

DNA

mRNA

DNA

RNA

TRIZOL Reagent

2

RNA
RNA

DNA

7
RNase

3
RNA

TRI-Zol

A260 / A280 > 1.8

TRI-Zol

260nm
280nm

RNA

2
15-30

5

mL TRI-Zol 1
1mL

0.2mL

15
15-30
2-3
2-8

RNA
15

12000xg
TRI-Zol

15-30
1mL

10
12000xg

10

2-8
0.5mL

75%

RNA
1mL
1mL 75%7500xg 5

60%

2-8

5-10

vacuum-dry

RNase freeA260/A280 1.8

2.0

2012

9

4

2

DNA

DNA
DNA

mRNA

2012

9

4

2

DNA

DNA
DNA

DNA
DNA

DNA

DNA
DNA
DNA

mRNA

DNA
RNA
RNA

3.3

生命科学実習②：PCR、DNA シークエンス
3.3.1 概要
講師：池松 真也／沖縄工業高等専門学校生物資源工学科教授
磯村 尚子／沖縄工業高等専門学校生物資源工学科助教
日時：2012 年 9 月 5 日 10:20～／12:50～／14:40 ～場所：沖縄工業高等専門学校 SE-271 生物化学工学実験室
内容：生命科学実習①：生命科学研究において利用される基本的な実験技術として、細胞からの DNA 抽出および制限酵素処理を加えて電気泳動で分離する処理について講義および実習を交えて学ぶ。生命科学実習②：ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）と、DNA シーケンサによる配列解析について、その原理の理解を中心に実習を交えて学ぶ。
ＴＡ：7 名実習体制：4 名/班×4 班（※受講者 14 名）
3.3.2 準備
機器
□卓上遠心機himac CT 13R／HITACHI□卓上遠心濃縮機

Concentrator 5301／eppendorf□小型恒温槽CTU-mini／TAITEC□ローテーター

Rotator RT50／TAITEC□サーマルサイクラー□トランスイルミネーター□ボルテックスミキサー□吸光度計□Mupid-2plus
実験器具・試料・試薬□乳酸菌プレート

事前に単離したものを使用□エッペンチューブ

12 個（3 個/人×4 人）□15mL チューブ

4個

□PCR チューブ

4個□PCR チューブたて1個□p20 ピペットマン

1個□p200 ピペットマン

1個□イエローチップ

1箱□ブルーチップ

1箱□滅菌つまようじ

4本
22

□手袋

4個

□クラッシュアイス

1個□発泡スチロール箱

1個□パラフィルム

1枚

□タイマー

1個

□1.3％アガロースゲル

1枚□PrepMan Ultra Reagent

800μL（200μL×4 人）□10μM primer Forward

2.0μL（0.5μL×4 人）□10μM primer Reverse

2.0μL（0.5μL×4 人）□2×buffer

50μL（12.5μL×4 人）□2.5mM dNTP’s

8μL（2μL×4 人）□KOD polymerase

2.0μL（0.5μL×4 人）□dH2O（滅菌水）

14μL（7μL×4 人）□1×TAE 適量

350-450mL□分子量マーカー

5μL□loading バッファー

5μL□染色液（GelRed）

適量□DNA クリーナー

適量□70%エタノール

適量

3.3.3 配布物
・講義スライド・実習プロトコル
3.3.4 課題・プリント

23

3.3.5 キーワード
生命科学分野生物学基礎
細胞（生体膜、細胞内小器官、真核生物、原核生物）、細胞周期（体細胞分裂、減数分裂）、
遺伝学（メンデルの法則、連鎖)、発生・分化、シグナル伝達（受容体、プロテインキナーゼ、細胞接着）、ウィルス、免疫、脳・神経
分子生物学
セントラルドグマ、複製（DNA）、転写（RNA、遺伝子発現、逆転写、スプライシング）、翻訳（タンパク質、tRNA、リボゾーム、遺伝暗号、翻訳後修飾）、RNA 遺伝子、生体エネル
ギーと代謝、エピジェネティクス（クロマチン構造）
バイオテクノロジー
遺伝子組み換え、分子クローニング、PCR、塩基配列決定法（サンガー法、次世代シークエンサー）、ゲノム（ショットガン法）、トランスクリプトーム（マイクロアレイ）、プロ
テオーム（質量分析、二次元電気泳動、酵母ツーハイブリッド法）、立体構造決定（X 線
結晶構造解析、NMR、電子顕微鏡）、ChIP-seq 法
情報科学分野コンピュータシステム
二進数、論理演算（論理積、論理和、排他的論理和）、数値演算（浮動小数点数、丸め誤差、桁落ち）、プログラミング言語（C 言語、Perl 言語）、ネットワーク（OSI 参照モデル、
IP アドレス）、マークアップ言語（HTML、XML）
アルゴリズム
データ構造（スタック、キュー、リスト、木構造）、探索（二分探索、ハッシュ表、木探索）、ソーティング、文字列比較
データベース技術
３層スキーマ構造、データモデル（階層型、リレーショナル型）
確率・統計
確率分布・確率変数（母集団、標本、独立性、ベイズの定理）、データ解析（平均、分散、相関、回帰）、推定・検定（点推定、区間推定、帰無仮説、対立仮説、有意水準）
機械学習
決定木、k-最近接近傍法、ニューラルネットワーク、サポートベクトルマシン、感度、特異度、クロスバリデーション法、クラスタリング、K-平均法、自己組織化マップ（SOM）

24

バイオインフォマティクス分野
分子生物学データベース
文献 DB（PubMed）、ゲノム DB、核酸配列 DB、アミノ酸 DB、モチーフ DB（モチーフライブ
ラリー）、立体構造 DB、代謝パスウェイ DB、多型ＤＢ、発現ＤＢ、アノテーション、遺伝
子オントロジー（Gene ontology）
配列解析
アラインメント（動的計画法（dynamic programming）、スコアテーブル、ギャップペナル
ティ、ローカルアラインメント、グローバルアラインメント、Smith-Waterman 法、ペア
ワイズアラインメント、マルチプルアラインメント、累進法（ツリーベース法）、ClustalW、
HMM（隠れマルコフモデル））、相同性検索（FASTA、ハッシング、BLAST、有限オートマト
ン、PSI-BLAST、位置特異的スコア行列（PSSM)、プロファイル比較）、モチーフ解析（正規表現、重み行列）、分子系統解析（オーソログ、パラログ、距離行列法、UPGMA、近隣結
合法（N-J 法）、最節約法、最尤法、同義置換、非同義置換）、タンパク質機能予測（膜貫通部位予測、細胞内局在部位予測）、RNA 二次構造予測、遺伝子発見（ORF（open reading
frame）、スプライシング解析、プロモータ解析、偽遺伝子）、ゲノム特徴抽出（繰り返し
配列発見、転写因子、SSR（simple sequence repeat)、GC 含量、コドン使用頻度）、ゲノ
ム比較（ゲノムアラインメント、編集距離、系統プロファイル法、ロゼッタストーン法、
遺伝子並び順の保存、遺伝子の水平伝搬）タンパク質立体構造解析
化学構造（結合角、結合距離、二面角）、タンパク質高次構造(二次構造、三次構造、四次構造)、立体構造表現（コンタクトマップ、ラマチャンドランマップ、分子グラフィック
ス）、構造比較（重ね合わせ、RMSD、構造アラインメント、構造モチーフ、構造分類）、タ
ンパク質構造予測（二次構造予測、ホモロジーモデリング、フォールド認識、スレッディ
ング、３D-1D 法、分子動力学計算）、構造 DB
遺伝学・進化学
分子系統解析（オーソログ、パラログ、距離行列法、UPGMA、近隣結合法（N-J 法）、最節
約法、最尤法、同義置換、非同義置換）、ニューウィック形式、遺伝子の水平伝搬、多型マーカー（SNP、マイクロサテライト、VNTR、RFLP、HLA タイプ）
、Hardy-Weinberg の法則
トランスクリプトーム解析・プロテオーム解析
遺伝子発現クラスタリング、遺伝子ネットワーク推定（ブーリアンネットワーク、ベイジ
アンネットワーク）、タンパク質相互作用解析、DNA マイクロアレイ、質量分析、二次元
電気泳動、酵母ツーハイブリッド法
パスウェイ解析・システム生物学
ネットワーク解析（スケールフリー、ハブ、ネットワークモチーフ）、動的シミュレーシ
ョンとシステム解析（微分方程式、ロバストネス、フィードバック、フィードフォワード、
感度解析、安定性解析、代謝流束解析）
25

3.3.6 時間割
時間

内容

10:26～

イントロ
・ 本日の研究意義
亜熱帯での微生物スクリーニングについて
新規性、科学的根拠の必要性＊ 以降は磯村先生に引き継ぎ
・ 本日の目的DNA 抽出から配列決定の流れを学ぶ
ゆくゆくは自分一人でできることを目指す
操作に習熟し、トラブルシューティングができるまで・ プロトコル説明【乳酸菌の培養】
0.5% 炭酸カルシウム入り MRS Agar 培地を用いて、美ら海水族館熱帯ドリー
ムランド内にてサンプリングを実施
事前にプレスクリーニング、単離を行ったプレートを使用した。
＊ 事前にスクリーニングおよび単離まで実施しておいた【乳酸菌からの DNA 抽出】

10:48～

PrepMan Ultra Reagent 200μL をチューブに分注↓

MRS Agar 培地のコロニーを滅菌幼児でつつき、懸濁する。
＊ 必要に応じてボルテックスにて激しく懸濁10:55～↓

ヒートブロックにて 100℃、10 分間↓

室温で 2 分間静置↓

室温、13,000rpm、3 分間

上清を DNA 抽出液として PCR に使用【PCR による 16srRNA（約 1500bp）の増幅】
11:20～PCR チューブに以下の溶液を混合↓

DNA template（上清） 2μL↓

4μM Primer F↓

Primer

0.5μL
R

0.5μL

↓

2×buffer

12.5μL↓2mM dNTP’s

2μL↓

KOD FX Pol.

0.5μL
26

D.W.

7μL
Total

10:52～↓

スピンダウン↓

以下の条件にて PCR 反応

25μL

95℃ 3min
95℃ 30sec
62℃ 30sec

32cycle68℃ 1min
68℃ 3min
4℃∞

11:52～

インキュベート中に昼食

12:55～PCR について・ DNA と RNA の違い
・ Tm 値について
・ DNA ポリメラーゼ、プライマーの働き
各温度で起こる現象を紹介
・ 電気泳動原理紹介
Agarose は高分子、DNA の移動について
・ 機器の設置

13:18～

泳動槽用意、ゲルセット、バッファー添加【電気泳動による PCR 産物の確認】

13:38～PCR 産物 5μL をパラフィルムにとる↓

6×Loading buffer 1μL を加える
＊ 100bp マーカーも同様に用意する

14:00～↓

サンプルおよびマーカーをウェルに流しこむ↓

泳動槽のフタをしめ、100V にて電気泳動開始（20 分程度）
＊ 絵移動時間中に並行して PCR 産物の精製を行う↓

サンプルおよびマーカーをウェルに流しこむ↓

Loading buffer のフロントが 2/3 程度の位置で泳動を終了

14:35～↓

ゲルを染色液にひたす

14:52～↓UV を照射し、バンドを確認する＊電気泳動と並行して実施
14:15～【PCR 産物の精製】27残った PCR 産物を新しいチューブに移す

14:37 ～

15:20～↓DNA クリーナーを 23μL 加え、ピペッティングにより混和↓

室温で 10 分間以上静置する↓

室温、12,000rpm、10 分間↓

ピペッティングにより静かに上清を除く↓

チューブのフタを開けて室温で 20 分間静置、風乾させる↓

D.W. 15μL で溶解する【サイクルシークエンス（ダイターミネータ法）】
・ シークエンス波形とあわせて、ダイターミネータ法の原理を説明＊ 時間の都合上、サイクルシークエンス、その後のエタ沈作業をスキップ。
＊ SLS との混合からスタートする
事前にエタ沈精製した PCR 産物（プロトコルの 10）

15:30～↓

30μL SLS を加え、ペレットを溶解する。

↓

白色プレートの各ウェルにサンプルを全量（30μL）入れる↓

余ったウェルには D.W.を入れる↓

サンプルの上にミネラルオイルを 1 滴ずつのせる↓

透明プレートの対応するウェルに、セパレーションバッファーを入れる。
＊ 時間の都合上、スタッフでシークエンスを行い、後日結果を配布する。

16:00～

配列決定法について・ DNA シークエンスの仕組み
サンガー法、キャピラリーシークエンサー、次世代シークエンサーなど
・ 次世代シークエンサーとバイオインフォマティクス
・ ヒト 1 人の全ゲノムを解読するのに要する日数
サンガー法：8,000 年、キャピラリーシークエンサー：9 日
次世代シークエンサー：5 日

28

3

DNA

2012

9

5

3

0.5%

BI

120905MRS Agar

PrepMan Ultra Reagent

DNA

1.

PrepMan Ultra Reagent 200 l

2.

MRS Agar

1.5ml
1

100

3.
4.

2

5.

13,000 rpm

6.

10

3

PCR

PCR 16S rRNA

1500bp1.
templateDNA

1 l

4 M primer Forward

2 l

Reverse2 l

2 buffer

10

2mM dNTP s

2 l

KOD polymerase

0.8 l

dH2O

2.2 l

total

20.0 l2.

PCR
thermo-cycle95- 3 min95- 30 sec62- 30 sec

68- 1 min68- 3 min4-

32 cycles

l

PCR
1.

1.3% Agarose gel

2.

100bp

4 l

2 l

2 Loading buffer 2 l

100V 25
Loading buffer
3.
4.

1 Gel red
UV

20

DNA

DNA

PCR

1.

DNA

2.

10

3.

12,000rpm

18 l

10

4.
5.

70%

2
12,000rpm

6.

36

l

10

10

7.
8.

20
5

9.

15

l

10. Nano drop

DNA

1.
16S rRNA
1500bp
DNA
60 37

37ng
60ng/

l

1.6

PCR
PCR

5

1.6
l

3 l

8 l

2.
6

rRNA
template

1500bp1 lmaster mix

2 l

5 bufer

2 lprimer2 l)(A,B,C,D,E,F
dH2O

3

total

10.0 l / 1sample

1.

lstop solution
stop solution
3M NaOAc

1l

100mM EDTA

1 l

Glycogen

0.5 l

total

2.5 l / 1sample

2.

1

3.

95%

4.

13,000rpm

30
4stop solution

2.5 l

l

1.5ml

15min

5.
6.

70%

100

l

13,000rpm

4

2min

7.
8.

6-7

9.

1

15

2

Vacuum dry

10. SLS 30 l

SLS

-20

1

1.
1

30 l

2 1

dH2O

3

1

4
1

10

9

2.

1.

Chromas Lite2.

Forward primer

FASTA
Reverseprimer
SeqConv v081
3.
4.

DDBJ BLAST

Complement
CLUSTALW

Forward
BLAST

Reverse
16S rRNA Prokaryotes

2012/09/05( )

cDNA

1
1 TAE
100bp DNA ladderloading

gel loading Dye (6)

SYBR Safe DNA gel stain(10000 )1loading
5 l

1 lloading
100V

loading

25min

2 3
30

UV
SYBR GreenUV2011 8 21

PCR
DNA
5 September 2012
ShinyaIkematsu
OkinawaNational College of Technology
Director of CooperativeTechnologyCenter
2•

KaryBabksMullis

•
1983
1993

•

•

•

•

PCR

•

•

•

•

A

120905

16S rRNA

B
C

1500bpDEF

3.4

生命科学実習③：トランスクリプトーム解析
3.4.1 概要
講師：門田 幸二／東京大学大学院農学生命科学研究科特任准教授
日時：2012 年 9 月 6 日 10:20～／12:50～／14:40 ～場所：琉球大学総合情報処理センター
内容：細胞における遺伝子発現の全体像を調べるトランスクリプトーム解析について、その実験技術であるマイクロアレイや次世代型シーケンサの活用について
学び、サンプル間の発現変動遺伝子の抽出等、そのデータ解析の実例を実習する。
3.4.2 準備
Ｒインストール／Biostrings パッケージインストール
hoge フォルダの配布 ▼hoge 内のファイル

リンク集
1.「門田幸二」のホームページへのリンク
http://www.iu.a.u-tokyo.ac.jp/~kadota/
2.「(R で)塩基配列解析」ウェブページへのリンク
http://www.iu.a.u-tokyo.ac.jp/~kadota/r_seq.html
3.「(R で)マイクロアレイデータ解析」ウェブページへのリンク
http://www.iu.a.u-tokyo.ac.jp/~kadota/r.html
4.「講義資料（公開版）」へのリンク
http://www.iu.a.u-tokyo.ac.jp/~kadota/20120906_kadota.pdf
5.「課題」へのリンク
http://www.iu.a.u-tokyo.ac.jp/~kadota/20120906_kadai.pdf
3.4.3 配布物
・講義スライド
3.4.4 課題・プリント（課題 1～5）29

3.4.5 キーワード
生命科学分野生物学基礎
細胞（生体膜、細胞内小器官、真核生物、原核生物）、細胞周期（体細胞分裂、減数分裂）、
遺伝学（メンデルの法則、連鎖)、発生・分化、シグナル伝達（受容体、プロテインキナーゼ、細胞接着）、ウィルス、免疫、脳・神経
分子生物学
セントラルドグマ、複製（DNA）、転写（RNA、遺伝子発現、逆転写、スプライシング）、翻訳（タンパク質、tRNA、リボゾーム、遺伝暗号、翻訳後修飾）、RNA 遺伝子、生体エネル
ギーと代謝、エピジェネティクス（クロマチン構造）
バイオテクノロジー
遺伝子組み換え、分子クローニング、PCR、塩基配列決定法（サンガー法、次世代シークエンサー）、ゲノム（ショットガン法）、トランスクリプトーム（マイクロアレイ）、プロ
テオーム（質量分析、二次元電気泳動、酵母ツーハイブリッド法）、立体構造決定（X 線
結晶構造解析、NMR、電子顕微鏡）、ChIP-seq 法
情報科学分野コンピュータシステム
二進数、論理演算（論理積、論理和、排他的論理和）、数値演算（浮動小数点数、丸め誤差、桁落ち）、プログラミング言語（C 言語、Perl 言語）、ネットワーク（OSI 参照モデル、
IP アドレス）、マークアップ言語（HTML、XML）
アルゴリズム
データ構造（スタック、キュー、リスト、木構造）、探索（二分探索、ハッシュ表、木探索）、ソーティング、文字列比較
データベース技術
３層スキーマ構造、データモデル（階層型、リレーショナル型）
確率・統計
確率分布・確率変数（母集団、標本、独立性、ベイズの定理）、データ解析（平均、分散、相関、回帰）、推定・検定（点推定、区間推定、帰無仮説、対立仮説、有意水準）
機械学習
決定木、k-最近接近傍法、ニューラルネットワーク、サポートベクトルマシン、感度、特異度、クロスバリデーション法、クラスタリング、K-平均法、自己組織化マップ（SOM）

30

バイオインフォマティクス分野
分子生物学データベース
文献 DB（PubMed）、ゲノム DB、核酸配列 DB、アミノ酸 DB、モチーフ DB（モチーフライブ
ラリー）、立体構造 DB、代謝パスウェイ DB、多型ＤＢ、発現ＤＢ、アノテーション、遺伝
子オントロジー（Gene ontology）
配列解析
アラインメント（動的計画法（dynamic programming）、スコアテーブル、ギャップペナル
ティ、ローカルアラインメント、グローバルアラインメント、Smith-Waterman 法、ペア
ワイズアラインメント、マルチプルアラインメント、累進法（ツリーベース法）、ClustalW、
HMM（隠れマルコフモデル））、相同性検索（FASTA、ハッシング、BLAST、有限オートマト
ン、PSI-BLAST、位置特異的スコア行列（PSSM)、プロファイル比較）、モチーフ解析（正規表現、重み行列）、分子系統解析（オーソログ、パラログ、距離行列法、UPGMA、近隣結
合法（N-J 法）、最節約法、最尤法、同義置換、非同義置換）、タンパク質機能予測（膜貫通部位予測、細胞内局在部位予測）、RNA 二次構造予測、遺伝子発見（ORF（open reading
frame）、スプライシング解析、プロモータ解析、偽遺伝子）、ゲノム特徴抽出（繰り返し
配列発見、転写因子、SSR（simple sequence repeat)、GC 含量、コドン使用頻度）、ゲノ
ム比較（ゲノムアラインメント、編集距離、系統プロファイル法、ロゼッタストーン法、
遺伝子並び順の保存、遺伝子の水平伝搬）タンパク質立体構造解析
化学構造（結合角、結合距離、二面角）、タンパク質高次構造(二次構造、三次構造、四次構造)、立体構造表現（コンタクトマップ、ラマチャンドランマップ、分子グラフィック
ス）、構造比較（重ね合わせ、RMSD、構造アラインメント、構造モチーフ、構造分類）、タ
ンパク質構造予測（二次構造予測、ホモロジーモデリング、フォールド認識、スレッディ
ング、３D-1D 法、分子動力学計算）、構造 DB
遺伝学・進化学
分子系統解析（オーソログ、パラログ、距離行列法、UPGMA、近隣結合法（N-J 法）、最節
約法、最尤法、同義置換、非同義置換）、ニューウィック形式、遺伝子の水平伝搬、多型マーカー（SNP、マイクロサテライト、VNTR、RFLP、HLA タイプ）
、Hardy-Weinberg の法則
トランスクリプトーム解析・プロテオーム解析
遺伝子発現クラスタリング、遺伝子ネットワーク推定（ブーリアンネットワーク、ベイジ
アンネットワーク）、タンパク質相互作用解析、DNA マイクロアレイ、質量分析、二次元
電気泳動、酵母ツーハイブリッド法
パスウェイ解析・システム生物学
ネットワーク解析（スケールフリー、ハブ、ネットワークモチーフ）、動的シミュレーシ
ョンとシステム解析（微分方程式、ロバストネス、フィードバック、フィードフォワード、
感度解析、安定性解析、代謝流束解析）
313.4.6 時間割
時間

内容

10:20～

本日の講義概要紹介
参考ページ等の紹介
・ (R で)塩基配列解析
・ (R で)マイクロアレイデータ解析
各種ソフトの起動方法（word、excel、text などを含め）10:27～

講師自己紹介・ 略歴・ 研究紹介（遺伝子発現解析）

10:36～

本日の講義ねらい
ウェットな分野は限られたプロフェッショナルな人材しか生き残れな
くなる。その中で、ドライの分野の人材が、実験そのものをデザインする時代になっていく→バイオインフォマティクス人材が不足しており、スキルのある人材は引く手あまた→次世代シーケンサによるトランスクリプトーム解析について学ぶ。
それを通して基礎的なスキルを身につける。

10:38～

トランスクリプトームとは・ オーム研究について
・ これまでの研究の進め方 vs これからの研究の進め方
・ トランスクリプトーム取得方法
RNA-Seq→遺伝子発現行列→マッピング

11:17～【実習】
・ 目的配列に対して、NGS 由来塩基配列データ（今回は”AGG”）のマッ
ピングを行い、任意のファイル名で出力・ ありがちなミスについて確認

11:50～

昼食
R を用いた解析

12:50～

・ 「(R で)塩基配列解析」「(R で)マイクロアレイデータ解析」の基本を
解説
・ RNA-Seq の長所と短所
32

13:06～・ マイクロアレイの長所と短所
・ マイクロアレイの臨床応用例

13:18～

・ データの正規化＊ RPKM については省略【実習】

13:30～
13:37～

・ 配列長の補正を体験
クラスタリング・ クラスタリングの実例紹介
・ 距離の定義
マンハッタン距離、キャンベラ距離、最大距離など
・ 相関係数

13:46～【実習】
・ 2 種類のサンプルについて、様々な距離を求める・ 「？関数名」で詳細な使用方法を確認

13:57～

クラスターの併合
最長距離法、群平均法、重心法など

14:05～【実習】・ 実データのクラスタリング
・ 論文データを読み込み、クラスタリングを行った後に系統樹を作成する＊ 終わり次第休憩（14:20～）
休憩
二群間の比較

14:40～
14:47～

・ パターンマッチング法【実習】・ パターンマッチング法にて、読み込んだ二群間での発現遺伝子の同定を行う
・ Apply 関数についても解説

15:12～

R の詳細な使い方
33

・ R-Tips
・ cbind 関数（rbind 関数）について
15:23～【実習】・ テンプレートパターンとの比較により、発現が大きく変化している遺伝子を探す

15:28～

様々な組織（条件）での発現遺伝子解析
・ ランキングに基づく方法、外れ値検出、その他
・ エントロピー解析による検出

15:45～＊ 全体についてまとめた後、講義終了時刻まで課題に取り組んだ

34

I

4

R
R

http://www.iu.a.u-tokyo.ac.jp/~kadota/
kadota@iu.a.u-tokyo.ac.jp
1

Sep 6 20122

Sep 6 2012

1995 31997 3
1999 3
2002 3cDNA

2002/4/1~
2003/11/1~
2005/2/16~

3

Sep 6 20124

Sep 6 2012

NGS
NGS

R

90

13
11/25

R
R
Sep 6 20125

Sep 6 2012

6

Ome
DNA

ome

(Gene) + ome
DNA

DNA

RNA

RNA

(Transcription) + ome

RNA

RNA
(Protein) + ome

7

Sep 6 2012

DNA8

Sep 6 2012

RNA
1

2

3

4

NGS

GS FLX+

5500xl SOLiD

HiSeq 2000
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA1
4
9

Sep 6 201210

Sep 6 2012

T1
1

2

3

1

4

2

3

4

2

3

4

T2
1
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

RNA-Seq NGS
2
4
Sep 6 201211

Sep 6 2012

12

T1

RNA
transcripts

cDNA

1

2

3

4

Affymetrix GeneChip

EST SAGE(NGS)

Differential Display AFLP13

Sep 6 20124

Sep 6 2012

14

T2

T1

DNA or RNA
A T or U

15

Sep 6 2012

RNA-Seq

G C

16

Sep 6 2012

RNA-Seq
Illumina

DNA

RNA

T1

NGS

50-150
GS FLX+

5500xl SOLiD

Sequencing

HiSeq 2000

RNA
RNA-Seq1

Sep 6 201217

Sep 6 2012218

RNA-Seq
NGS
T1

1

2

3

4

1

2

3

(
)

50-125NGS RNA-seq

Linux
19

Sep 6 2012

NGS
20

Sep 6 2012

4
1

2

3

4

NGS

or 4

or 4
AGG

hoge2.txt
>

>1
>2

1
AAAAAAA>

2
AAAAAAA>

3
AAAAAAAR
21

Sep 6 2012

R

Sep 6 201222

R

hoge4.faorhoge2.txt

NGS

AGG

hoge2.txt

hoge
hoge4.fa
Sep 6 201223

Sep 6 201224

getwd()Sep 6 201225

Sep 6 201226

27

Sep 6 2012

28

R

Sep 6 2012

R ConsoleSep 6 201229

Sep 6 2012

30

hoge

hoge

31

Sep 6 2012

1

2

33

Sep 6 201232

Sep 6 201234

Sep 6 2012

3

4

R Consolewrite.tableSep 6 201235

Sep 6 201236

----------

Sep 6 2012hoge4.fa

NGS

37

Sep 6 201238

39

Sep 6 2012

40

CCT

or
hoge3.txt
Sep 6 2012

hoge

hoge

Sep 6 201241

Sep 6 201242

data_reads.txt
>seq1
TTT
>seq2
GGG
>seq3
ACT
>seq4
ACA

data_reads.txt
>seq1
TTT
>seq2
GGG
>seq3
ACT
>seq4
ACA

43

Sep 6 2012hoge4.txt

hoge4.txt

44

Sep 6 2012

RNA-Seq
T1

data_reads.txt
>seq1
TTT
>seq2
GGG
>seq3
ACT
>seq4
ACA

contig_1

contig_2

contig_3

X
X =exon,

,
1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

T2

contig_4

X =exon45

Sep 6 2012

X=46

Sep 6 2012

RNA-Seq
1

X

X=

2

3

4

X=

T1

1

2

3

4

1

2

3

4

T1
1

Sep 6 201247

Sep 6 2012

2

3

4

48

1

2

3

4

RNA-Seq
MammaPrint
2008 370

oncotype DX
2007 2
sequencing

21

GeneSearch2007 749

Sep 6 201250

Sep 6 2012

RNA sequencing (RNA-Seq)

Gene Ontology GO

RNA-Seq
R

RNA-Seq51

Sep 6 201252

Sep 6 2012

Sequence logo

or chip
sample1
Sep 6 201253

Sep 6 2012100
= 100 / 73.7
54Mortazavi et al., Nat. Methods, 5: 621-628, 2008

RNA-Seq
sequence

sequence
T1

mRNAs
1

2

3

4

AAAAAAAAAAAAAA

RPM

sequence

AAAAAAA

Reads Per Million mapped reads RPM
100 one million
T1= 1000000 / 67

AAAAAAA55

Sep 6 2012

56

Sep 6 2012

Mortazavi et al., Nat. Methods, 5: 621-628, 2008

Mortazavi et al., Nat. Methods, 5: 621-628, 2008

RPKM

AAAAAAARPMAAAAAAA

Reads per million mapped reads
read

1/

100

one million

raw counts all reads= RPM : 1,000,000
A1BG
744 : 5,087,097 = RPM : 1,000,000
1,000,000
1,000,000
RPM raw counts
744
146.3
all reads
5,087,097

1000 /
1000bpReads Per Kilobase of exon

RPKM

RNA-Seq

Reads per kilobase of exon per million mapped reads(sequence)1000
one kilobase
RPKM raw counts

1,000,000
1,000
all reads gene length

raw counts

1,000,000,000
gene length all reads

RPM
57

Sep 6 201258

Sep 6 2012

hoge

hoge

R
Sep 6 201259

Sep 6 2012

54

60

Bittner et al., Nature, 406, 536-540, 2000

31
Gene Ontology GO

61

Sep 6 2012

62

Sep 6 2012

or

x y

rxy

n 1i1
1

( xi

x )( yi

x) 2

1

n

n 1i1

D(x,y)

n

1

( xi

y)
( 1 rxy 1)

n

n 1i1

x

y

r 1

x

y

r

x

y

0
r

1

r 1
D( x, y) 1 r (0

D

2)

r

y) 2

( yi

D 1 1 00r

D 1 0 11D 1 ( 1)2

1
63

Sep 6 2012

64

Sep 6 2012

or

x y

D(x,y)nD( xiyi ) 2

i 1
n

D

| xi

yi |

i 1

D

max(| x1nD

Sep 6 2012

rx1x 2

0.98

Dx 1 x 2

1 0.98 0.02

rx1x 30.01

Dx1x 31 ( 0.01) 1.01

rx1x 40.78

Dx 1 x 4

1 ( 0.78) 1.78

i 1

65

Sep 6 2012

| xi
| xi

y1 |,... | xi

yi |,..., | xn

yn |)

yi |
yi |

66

x y

D
n

D

( xi

yi ) 2

i 1
n

D

| xi

yi |

i 1

D

max(| x1
n

n

D

| xi

yi |

D

max(| xi

D= 1.9+0.7+0.5+0.6+1.1+0.5+0.8+0.7+0.1+0.7 = 7.6

i 1

| xi
| xi

y1 |,... | xi

yi |,..., | xn

yn |)

yi |
yi |

i 1

n

D

| xi
i 1 | xiyi |)= max(1.9, 0.7, 0.5, 0.6, 1.1, 0.5, 0.8, 0.7, 0.1, 0.7) = 1.9

yi |
yi |

= 0.0830+0.0519+0.0303++0.0642 = 0.4972

67

Sep 6 2012

68

Sep 6 2012?
single-linkage

method= xxx
12
5
binary1-

minkowski

3

orz

1

4

69

Sep 6 2012

merge

1

2

2
5

Sep 6 2012

5

70

1

3

4

average-linkage

merge

2

3

Sep 6 2012

complete-linkage

1

2

5

3

3
4

1

2

3

4

5

71

4

Sep 6 2012

1

2

3

4

5

72

http://ua.t.u-tokyo.ac.jp/okabelab/asami/clustering.pdf
http://mjin.doshisha.ac.jp/R/28.pdf

Nakai et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 72, 139-148, 2008

CentroidMedian
McQuitty
flexible73

Sep 6 2012

4

_

4

_

4

_

4

_

4

_

4

hoge

74

data_rma_2.txt

75

data_rma_2.txt

Sep 6 2012

data_rma_2.txt
Fig1.png

Sep 6 2012_

Fig1.png76

Sep 6 2012

Fig1.png

400

14

500

Sep 6 201277

Sep 6 201278

Nakai et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 72, 139-148, 2008

1.
Gene Ontology GO
2.

3.

Fig. 1
79

Sep 6 2012

Sep 6 2012

80

1.
vs.

Golub et al., Science, 286: 531-537, 1999.

vs.

vs.

A ALL 27B AML 11

vs.
A

B

A

B

B

N genesA

81

Sep 6 2012

1.

Sep 6 2012

82

1.
y
1
r
1

( xi

n

n 1i1
y

n

n 1i1
( xi

x) 2

x )( yi1y)( 1 r 1)

n

n 1i1

( yi

y) 2

rgene1rgene2rgene318.85
0.994
36.32 0.52
18.85
0.842
42.87 0.52
6.41
0.825
14.88 0.52

r
Sep 6 201283

Sep 6 2012

84

1.

1.

data
85

Sep 6 2012

1.

1.

hoge

hoge
hoge

data.cldata.cl87

Sep 6 2012

1.

A

B

11

88

Sep 6 2012

apply

data

cor

apply

y data.clSep 6 201286

Sep 6 201289

Sep 6 201290

apply

apply

apply

2

91

Sep 6 2012

R-Tips92

Sep 6 2012

apply

Spearman93

Sep 6 2012

apply

94

Sep 6 2012

1.

cbind
data

apply

Sep 6 2012

cor

95

Sep 6 201296

cbindrownamesrbind

colnames

cbind
rbind
97

Sep 6 2012

coloumrow
98

Sep 6 2012

2.

1.

or

99

Sep 6 2012

Sep 6 2012100

Pavlidis and Noble, Genome Biol., 2, research0042, 2001

1.

2.

N genes

000100000000100000000000000000000000000000001000

Sep 6 2012

:
:

:
:

101

Sep 6 2012

102

2.

2.
Dixon test Greller and Tobin, Genome Res., 9, 282-296, 1999
Pattern matching Pavlidis and Noble, Genome Biol., 2, research0042, 2001
Entropy Schug et al., Genome Biol., 6, R33, 2005
Tissue specificity Index Yanai et al., Bioinformatics, 21, 650-659, 2005
Akaike s Information Criterion (AIC) Kadota et al., Physiol. Genomics, 12, 251259, 2003
Sprent s non-parametric method Ge et al., Genomics, 86, 127-141, 2005
Tukey-Kramer s Honest Significance Difference (HSD) test Liang et al.,Physiol. Genomics, 26, 158-162, 2006
ROKU (Kadota et al., BMC Bioinformatics, 7, 294, 2006)
QDMR (Zhang et al., Nucleic Acids Res., 39, e58, 2011)103

Sep 6 2012104

Sep 6 2012

Schneider and Stephens., Nucleic Acids Res., 18, 6097-6100, 1990

Sequence logos
i
j

=8
0 H

log2N

0

H

p log 2 ( pij ), where pij
j 1 ijxij /Nposition ix
j 1 ijICiNH

log 2 ( N ) H ( xi )
2

3

=4
0

105

Sep 6 2012

NGS
R

p1,4 =
90%

p5,3 =
50%
p5,1 =
50%

106

Sep 6 2012

1.

79

2.

79
_

11/25

H

log2N

IC

N
H

N

H ( xi )_83, 89, 99yPearson3.

gene1,
4.

2

103
Pearsongene1,

5.

103

gene2,

1

_

1

_

4

sample16.txt
gene3

sample15.txt
gene2,

gene3,

sample15_cl.txt

gene4,

gene5

tissue4

tissue4
Sep 6 2012107

Sep 6 2012

108

I

1

79

2

64, 72, 79
_
2

9/6

_

1

_

1

_

4

3
Pearson4

83, 89, 99

sample16.txt
gene1,

gene2,

gene3

103 sample15.txt
gene1,

gene3,

5

gene4,

Pearsongene2,

gene5

103

sample15_cl.txt

tissue4
tissue4

3.5

生命科学実習④
3.5.1 概要
講師：田邊 俊朗／沖縄工業高等専門学校生物資源工学科准教授
日時：2012 年 9 月 7 日 10:20～／12:50～／14:40 ～場所：沖縄工業高等専門学校 SE-271 生物化学工学実験室
内容：機能を担うタンパク質の総体を取り扱うプロテオーム解析として、目的とするタンパク質の検出を行う活性染色法や、二次元電気泳動および質量分析によるタンパク質発現のサンプル間比較を実習し、タンパク質同定の技術について学ぶ。
ＴＡ：3 名実習体制：5 名/班×3 班（受講生 14 名）
3.5.2 準備
機器
□卓上遠心機himac CT 13R／HITACHI□ローテーター

Rotator RT50／TAITEC□タンパク質泳動装置

BioRAD□パワーサプライ

BioRAD□インキュベーター□二次元電気泳動装置

GE Healthcare□Strip Holder

Ettan IPGphor3□ZipTip c18 ピペットチップ

適量□ターゲットプレート

1本□質量分析装置

島津製作所

実験器具・試料・試薬□工業用アクレモニウムセルラーゼ（明治製菓製）□エッペンチューブ

適量□15mL チューブ（試薬分注）

4個□p20 ピペットマン

1個□p200 ピペットマン

1個□イエローチップ

1箱□ピンセット

1個

□手袋

4個

□タッパー

2個

□サランラップ

適量□Immobiline DryStrip（7cm、3-11NL）
35

□Lysis バッファー□100mM

2mL(0.5mL/人×４人)

DTT 入り SDS 化処理液

□25%イソプロピルアルコール入り 0.05M リン酸緩衝液(pH6.8)□0.1%CBB R-250 染色液

適量□0.1%Congo Red

適量□1M NaCl

適量□0.1%TFA 入り 50%アセトニトリル

30μL／サンプル□0.1%TFA

60μL／サンプル□マトリックス飽和溶液

2μL／サンプル

3.5.3 配布物
・実習プロトコル
3.5.4 課題・プリント（記述 3 題）36

3.5.5 キーワード
生命科学分野生物学基礎
細胞（生体膜、細胞内小器官、真核生物、原核生物）、細胞周期（体細胞分裂、減数分裂）、
遺伝学（メンデルの法則、連鎖)、発生・分化、シグナル伝達（受容体、プロテインキナーゼ、細胞接着）、ウィルス、免疫、脳・神経
分子生物学
セントラルドグマ、複製（DNA）、転写（RNA、遺伝子発現、逆転写、スプライシング）、翻訳（タンパク質、tRNA、リボゾーム、遺伝暗号、翻訳後修飾）、RNA 遺伝子、生体エネル
ギーと代謝、エピジェネティクス（クロマチン構造）
バイオテクノロジー
遺伝子組み換え、分子クローニング、PCR、塩基配列決定法（サンガー法、次世代シークエンサー）、ゲノム（ショットガン法）、トランスクリプトーム（マイクロアレイ）、プロ
テオーム（質量分析、二次元電気泳動、酵母ツーハイブリッド法）、立体構造決定（X 線
結晶構造解析、NMR、電子顕微鏡）、ChIP-seq 法
情報科学分野コンピュータシステム
二進数、論理演算（論理積、論理和、排他的論理和）、数値演算（浮動小数点数、丸め誤差、桁落ち）、プログラミング言語（C 言語、Perl 言語）、ネットワーク（OSI 参照モデル、
IP アドレス）、マークアップ言語（HTML、XML）
アルゴリズム
データ構造（スタック、キュー、リスト、木構造）、探索（二分探索、ハッシュ表、木探索）、ソーティング、文字列比較
データベース技術
３層スキーマ構造、データモデル（階層型、リレーショナル型）
確率・統計
確率分布・確率変数（母集団、標本、独立性、ベイズの定理）、データ解析（平均、分散、相関、回帰）、推定・検定（点推定、区間推定、帰無仮説、対立仮説、有意水準）
機械学習
決定木、k-最近接近傍法、ニューラルネットワーク、サポートベクトルマシン、感度、特異度、クロスバリデーション法、クラスタリング、K-平均法、自己組織化マップ（SOM）

37

バイオインフォマティクス分野
分子生物学データベース
文献 DB（PubMed）、ゲノム DB、核酸配列 DB、アミノ酸 DB、モチーフ DB（モチーフライブ
ラリー）、立体構造 DB、代謝パスウェイ DB、多型ＤＢ、発現ＤＢ、アノテーション、遺伝
子オントロジー（Gene ontology）
配列解析
アラインメント（動的計画法（dynamic programming）、スコアテーブル、ギャップペナル
ティ、ローカルアラインメント、グローバルアラインメント、Smith-Waterman 法、ペア
ワイズアラインメント、マルチプルアラインメント、累進法（ツリーベース法）、ClustalW、
HMM（隠れマルコフモデル））、相同性検索（FASTA、ハッシング、BLAST、有限オートマト
ン、PSI-BLAST、位置特異的スコア行列（PSSM)、プロファイル比較）、モチーフ解析（正規表現、重み行列）、分子系統解析（オーソログ、パラログ、距離行列法、UPGMA、近隣結
合法（N-J 法）、最節約法、最尤法、同義置換、非同義置換）、タンパク質機能予測（膜貫通部位予測、細胞内局在部位予測）、RNA 二次構造予測、遺伝子発見（ORF（open reading
frame）、スプライシング解析、プロモータ解析、偽遺伝子）、ゲノム特徴抽出（繰り返し
配列発見、転写因子、SSR（simple sequence repeat)、GC 含量、コドン使用頻度）、ゲノ
ム比較（ゲノムアラインメント、編集距離、系統プロファイル法、ロゼッタストーン法、
遺伝子並び順の保存、遺伝子の水平伝搬）タンパク質立体構造解析
化学構造（結合角、結合距離、二面角）、タンパク質高次構造(二次構造、三次構造、四次構造)、立体構造表現（コンタクトマップ、ラマチャンドランマップ、分子グラフィック
ス）、構造比較（重ね合わせ、RMSD、構造アラインメント、構造モチーフ、構造分類）、タ
ンパク質構造予測（二次構造予測、ホモロジーモデリング、フォールド認識、スレッディ
ング、３D-1D 法、分子動力学計算）、構造 DB
遺伝学・進化学
分子系統解析（オーソログ、パラログ、距離行列法、UPGMA、近隣結合法（N-J 法）、最節
約法、最尤法、同義置換、非同義置換）、ニューウィック形式、遺伝子の水平伝搬、多型マーカー（SNP、マイクロサテライト、VNTR、RFLP、HLA タイプ）
、Hardy-Weinberg の法則
トランスクリプトーム解析・プロテオーム解析
遺伝子発現クラスタリング、遺伝子ネットワーク推定（ブーリアンネットワーク、ベイジ
アンネットワーク）、タンパク質相互作用解析、DNA マイクロアレイ、質量分析、二次元
電気泳動、酵母ツーハイブリッド法
パスウェイ解析・システム生物学
ネットワーク解析（スケールフリー、ハブ、ネットワークモチーフ）、動的シミュレーシ
ョンとシステム解析（微分方程式、ロバストネス、フィードバック、フィードフォワード、
感度解析、安定性解析、代謝流束解析）
383.5.6 時間割
時間

内容

10:24～

イントロ
・ 自己紹介、経歴紹介
・ 本日のテーマ
プロテオーム解析・ 活性染色（酵素とは何か）
分類と名称
EC1：オキシドレダクターゼ（酸化還元酵素）
EC2：トランスフェラーゼ（転移酵素）
EC3：ヒドラーゼ（加水分解酵素）
EC4：リアーゼ（脱離酵素）
EC5：イソメラーゼ（異性化酵素）
EC6：リガーゼ（合成酵素）

10:36～【SDS-PAGE】
工業用アクレモニウムセルラーゼ（50μL/μg）を 100mMDTT 入り SDS 化処理
液で 100℃で５分加熱処理＊ 時間の都合上、事前に用意↓

1 人 1 サンプルをアクリルアミドゲルにロード↓

200V で電気泳動＊ 時間の都合上、ここで終了。
＊ 以降は事前に用意してある、泳動後、脱 SDS をしたゲルに交換

11:08～SDS-PAGE について・ SDS-PAGE の原理紹介
・ その後の操作を解説
イソプロパノールによる脱 SDS
酵素活性の原理紹介【活性染色】

11:16～

11:32～

脱 SDS 済みのゲル（事前に用意）↓

基質を含むゲルときれいに重ね合わせる↓

ラップできれいに包む↓

37℃で 30～60 分間インキュベート3911:35～

その他の電気泳動法
・ native-PAGE との比較

11:47～

昼食

11:50～【ゲルの染色】
インキュベート後のゲル

13:07～↓

アクリルアミドゲルを CBB R-250 にて染色↓

アガロースゲルは 0.1% Congo Red にて染色↓振盪機を使い、20～40 分染色

等電点電気泳動について
・ アミノ酸の性質
20 種類のアミノ酸からなる（翻訳後修飾によりもっと多い）
アミノ酸の構造（不斉炭素、L 型と D 型）
極性アミノ酸、荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸など
等電点＝タンパク質の表面電荷が 0 になる pH【等電点電気泳動】

13:31～

工業用アクレモニウムセルラーゼをサンプルとする↓

膨潤液の作成（時間の都合上、事前に作成しておいた）↓

サンプルを 125μL（40～240μg 程度）乗せる↓

Immobiline DryStrip（7cm、3-11NL）を乗せる＊ ミネラルオイル等の作業は省略↓

泳動装置にセットし、泳動開始＊今回は機械にセットするところまでで終了

13:55～

プロテオーム解析の流れ
等電点電気泳動 1 日～
二次元電気泳動 1 日～
スキャン

半日～

サンプル調整、解析スタート
・ プロテオーム解析の活用例
・ 写真等を見せながら詳細な作業例を紹介
14:10～【ゲルの脱色】
CBB 染色したゲル＊ 今回は脱色を省略
40Congo Red 染色したゲル↓

廃液入れに染色液を捨てる↓

1M NaCl をタッパーに入れる↓

振盪機で脱色＊ 10 分間休憩

休憩
14:40～【ゲルの切り出し、ゲル抽出】＊写真を見せながら行程を紹介。作業は省略

14:47～

質量分析について・ MALDI-TOF-MS・ 原理と結果

14:57～【MALDI-TOF-MS 結晶形成】
ゲル抽出後のサンプル（事前に用意したものを使用）

15:17～↓

ZipTip による精製↓

マトリックスとの共結晶を作成するため、ターゲットプレートに乗せる↓

自然風乾させ、共結晶の形成をまつ【MALDI-TOF-MS 解析】＊ 部屋のスペースと時間の関係で、3 班に分け、順番に解析を実施。
＊ 残りの班は課題に取り組む

15:55～

課題に取り組んだ

413.6情報科学基礎3.6.1 概要
講師：名嘉村 盛和／琉球大学工学部情報工学科教授
岡﨑 威生／琉球大学工学部情報工学科講師
日時：2012 年 9 月 10 日 8:30～／10:20～／12:50～／14:40 ～／16:30 ～場所：琉球大学総合情報処理センター
内容：情報科学分野の基礎として、生命科学分野の研究者／技術者が修得すべき
データ構造とアルゴリズム、最適化計算の基本を解説と演習を通して学ぶ。
3.6.2 準備特筆事項なし3.6.3 配布資料
・講義スライド
3.6.4 課題・プリント（演習問題（1）～（5））

42

3.6.5 キーワード
生命科学分野生物学基礎
細胞（生体膜、細胞内小器官、真核生物、原核生物）、細胞周期（体細胞分裂、減数分裂）、
遺伝学（メンデルの法則、連鎖)、発生・分化、シグナル伝達（受容体、プロテインキナーゼ、細胞接着）、ウィルス、免疫、脳・神経
分子生物学
セントラルドグマ、複製（DNA）、転写（RNA、遺伝子発現、逆転写、スプライシング）、翻訳（タンパク質、tRNA、リボゾーム、遺伝暗号、翻訳後修飾）、RNA 遺伝子、生体エネル
ギーと代謝、エピジェネティクス（クロマチン構造）
バイオテクノロジー
遺伝子組み換え、分子クローニング、PCR、塩基配列決定法（サンガー法、次世代シークエンサー）、ゲノム（ショットガン法）、トランスクリプトーム（マイクロアレイ）、プロ
テオーム（質量分析、二次元電気泳動、酵母ツーハイブリッド法）、立体構造決定（X 線
結晶構造解析、NMR、電子顕微鏡）、ChIP-seq 法
情報科学分野コンピュータシステム
二進数、論理演算（論理積、論理和、排他的論理和）、数値演算（浮動小数点数、丸め誤差、桁落ち）、プログラミング言語（C 言語、Perl 言語）、ネットワーク（OSI 参照モデル、
IP アドレス）、マークアップ言語（HTML、XML）
アルゴリズム
データ構造（スタック、キュー、リスト、木構造）、探索（二分探索、ハッシュ表、木探索）、ソーティング、文字列比較
データベース技術
３層スキーマ構造、データモデル（階層型、リレーショナル型）
確率・統計
確率分布・確率変数（母集団、標本、独立性、ベイズの定理）、データ解析（平均、分散、相関、回帰）、推定・検定（点推定、区間推定、帰無仮説、対立仮説、有意水準）
機械学習
決定木、k-最近接近傍法、ニューラルネットワーク、サポートベクトルマシン、感度、特異度、クロスバリデーション法、クラスタリング、K-平均法、自己組織化マップ（SOM）

43

バイオインフォマティクス分野
分子生物学データベース
文献 DB（PubMed）、ゲノム DB、核酸配列 DB、アミノ酸 DB、モチーフ DB（モチーフライブ
ラリー）、立体構造 DB、代謝パスウェイ DB、多型ＤＢ、発現ＤＢ、アノテーション、遺伝
子オントロジー（Gene ontology）
配列解析
アラインメント（動的計画法（dynamic programming）、スコアテーブル、ギャップペナル
ティ、ローカルアラインメント、グローバルアラインメント、Smith-Waterman 法、ペア
ワイズアラインメント、マルチプルアラインメント、累進法（ツリーベース法）、ClustalW、
HMM（隠れマルコフモデル））、相同性検索（FASTA、ハッシング、BLAST、有限オートマト
ン、PSI-BLAST、位置特異的スコア行列（PSSM)、プロファイル比較）、モチーフ解析（正規表現、重み行列）、分子系統解析（オーソログ、パラログ、距離行列法、UPGMA、近隣結
合法（N-J 法）、最節約法、最尤法、同義置換、非同義置換）、タンパク質機能予測（膜貫通部位予測、細胞内局在部位予測）、RNA 二次構造予測、遺伝子発見（ORF（open reading
frame）、スプライシング解析、プロモータ解析、偽遺伝子）、ゲノム特徴抽出（繰り返し
配列発見、転写因子、SSR（simple sequence repeat)、GC 含量、コドン使用頻度）、ゲノ
ム比較（ゲノムアラインメント、編集距離、系統プロファイル法、ロゼッタストーン法、
遺伝子並び順の保存、遺伝子の水平伝搬）タンパク質立体構造解析
化学構造（結合角、結合距離、二面角）、タンパク質高次構造(二次構造、三次構造、四次構造)、立体構造表現（コンタクトマップ、ラマチャンドランマップ、分子グラフィック
ス）、構造比較（重ね合わせ、RMSD、構造アラインメント、構造モチーフ、構造分類）、タ
ンパク質構造予測（二次構造予測、ホモロジーモデリング、フォールド認識、スレッディ
ング、３D-1D 法、分子動力学計算）、構造 DB
遺伝学・進化学
分子系統解析（オーソログ、パラログ、距離行列法、UPGMA、近隣結合法（N-J 法）、最節
約法、最尤法、同義置換、非同義置換）、ニューウィック形式、遺伝子の水平伝搬、多型マーカー（SNP、マイクロサテライト、VNTR、RFLP、HLA タイプ）
、Hardy-Weinberg の法則
トランスクリプトーム解析・プロテオーム解析
遺伝子発現クラスタリング、遺伝子ネットワーク推定（ブーリアンネットワーク、ベイジ
アンネットワーク）、タンパク質相互作用解析、DNA マイクロアレイ、質量分析、二次元
電気泳動、酵母ツーハイブリッド法
パスウェイ解析・システム生物学
ネットワーク解析（スケールフリー、ハブ、ネットワークモチーフ）、動的シミュレーシ
ョンとシステム解析（微分方程式、ロバストネス、フィードバック、フィードフォワード、
感度解析、安定性解析、代謝流束解析）
443.6.6 時間割
時間

内容
＊岡﨑先生

8:33～

イントロダクション・ バイオインフォマティクス人材育成推進事業について
2 カ年の育成プログラム
スタンダード、アドバンスト、プロフェッショナル
・ バイオインフォマティクス技術者認定試験について
・ 琉球大学講義内での位置づけ紹介

8:46～

情報科学とは・ 計算機の発展により、急激に加速した分野
収集、発生、分類、操作、蓄積、…etc
・ 計算機の普及について
トランジスタの発達、集積回路の進化
・ 情報科学と生物学との関わり
ゲノム、トランスクリプトーム、メタボローム…etc
・ バイオインフォマティクスの果たす役割
・ バイオインフォマティクス人材の果たす役割
休憩＊名嘉村先生

10:20～

コンピューターの基礎
・ コンピューターと 2 進数
・ 2 進数と 10 進数
・ 情報を数字で表現・処理する
・ 論理回路（AND、OR、NOT）
・ 文字コード（ASCII、JIS）
・ プログラム、アセンブラ言語

10:36～

コンピューターの仕組み
・ コンピューターの構成要素
・ コンピューターの基本動作
CPU＝制御装置、メモリ＝主記憶装置＊ 時間の都合上、クロックパルス、キャッシュ、補助記憶装置については資料配布のみ
・ 計算機の進化について45

コンピューターは 18 ヶ月、ネットワークは 9 ヶ月で倍になる
10:46～

アルゴリズムの基礎
・ プログラミングとアルゴリズム
・ 擬似言語とフローチャート表現
代入文、ブロック、if 文、for 文、while 文、…etc
・ アルゴリズムと時間計算量
n 次多項式計算、初等探索法（線形探索法）、二分探索法11:10～

・ データの工夫
2 分探索木、部分和と総当り解法

11:24～

・ 解き難い問題について
部分和問題、総当り解法
・ アルゴリズムの評価基準、計算複雑度

11:40～

データ構造の基礎
・ 配列
・ リスト
基本操作、探索、合併、切り取り、・ スタックとキュー・ グラフ／有向グラフ
隣接リストによるグラフの実現

11:50～

昼食

12:50～

ヒープ（順序付きキュー）・ 基本操作
insert、findmax、deletemax、decreasekey など

13:20～

・ 基本操作の時間計算量
・ ヒープの構成方法

13:25～

探索・ 2 分探索木と対象順
・ 2 分探索木における基本操作
挿入、削除、回転

13:37～
13:51～・ ハッシュ法とその事例
整列（ソーティング）
・ バケットソートと基数ソーティング46

・ 選択法・ バブルソート・ 挿入法
・ ヒープソート・ マージソート
14:40～

・ クイックソート
休憩

14:48～

グラフ・アルゴリズム
・ グラフ
・ 有向グラフ・ グラフのコンピューター内での表現方法

14:55～

・ 最小木問題

15:25～

・ 最短経路問題
ダイクストラ法

15:40～・ オイラー閉路問題
パス、閉路、連結グラフと非連結グラフ

15:44～・ オイラーパス問題
・ 巡回セールスマン問題
・ ハミルトニアンパス問題（時間の都合で省略）

15:52～・ ゲノムアセンブリング＊残りの時間は課題作成に取り組んだ
休憩
＊岡﨑先生

16:30～

イントロダクション
・ 似ているってどういうこと？
・ 確立／統計の役割
・ スケジュール

16:37～

計算環境
・ ハードウェア
・ ソフトウェア・ データ記述・ 遺伝子発現データ
・ データの代表値
・ データのばらつき

47

16:59～【R 演習】・ 発現解析データ（CSV ファイル）を読み込む
・ データ表示

48

•
•

etc.
e.g.

1953 DNA
1970 1980
IC Integrated Circuit
IC

1990

1993

3

etc.

RNA
etc.

http://research.microsoft.com/en-us/UM/redmond/about/collaboration/
fourthparadigm/4th_PARADIGM_BOOK_complete_HR.pdf

etc.

No
Yes

11

21

No
Yes

1

1
No
Yes

No
Yes

1

1

got o

2

2

0 1
- >0

- >1
0 1

CD,

2
2
8

1

1
1

10 3
10 - 3(K) 10 6(m) 10 - 6(M) 10 9
10 - 9
60G

512K
CPU

2.0GHz

(G)
(n)

2
2

10

(1)

10
0 1
0, 10, 11, 100, 101,3
2 3 (= 8)
10
2
10

10

k

2k

(2)

10

2

0
1
2
3
4
..
9
10
..
100

0
1
10
11
100
..
1001
1010
..
1100100

1916- 2001:
1937
AND
AND OR NOT()

OR

AND, OR, NOT)
AND

NOT

OR

2
7

2

128 (= 27)
A

0100001A

B

0100001

0100010..

(ASCII, JIS)= 32
' = 39. = 46
5 = 53< = 60C = 67J = 74
Q = 81
X = 88_ = 95
f = 102m = 109
t = 116! = 33( = 40/ = 47
6 = 54= = 61
D = 68
K = 75R = 82
Y = 89` = 96g = 103n = 110
u = 117" = 34) = 41
0 = 48
7 = 55> = 62E = 69
L = 76
S = 83Z = 90a = 97h = 104o = 111v = 118# = 35* = 42
1 = 498 = 56= 63
F = 70M = 77
T = 84[ = 91b = 98i = 105
p = 112w = 119$ = 36+ = 43
2 = 509 = 57@ = 64
G = 71N = 78
U = 85\ = 92c = 99j = 106
q = 113x = 120% = 37, = 44
3 = 51: = 58A = 65
H = 72O = 79V = 86] = 93d = 100
k = 107r = 114y = 121& = 38- = 45
4 = 52; = 59B = 66
I = 73
P = 80W = 87^ = 94e = 101l = 108
s = 115z = 122

16bit2 16 (= 65536)

2

2
2

C

mai n( ) {
x=0;
y=5;
z =x+y;pr i nt ( z ) ;}LEA r 1,
STR r 1,
LEA r 1,
STR r 1,
ADD r 1,
STR r 1,
OUT r 1
HLT

0
X
5
Y
X
Z

00110000
01111001
00110101
01111010
10011001
01111011
11010000
11100000

Java, C, Fo rtran, BASIC

CPU(

CPU

1.
2.

CPU

3.
4.
5. CPU

CPU
1GHz

10

512k

200G

CPU
CPU

CPU
CPU

CPU

720KB 1.44MB
10GB 300GB

CD- ROM (CD- R, CR- RW)
640MB 800MB

DVD- ROM(DVD- RAM, DVD- R, DVD- RW)
4.7GB 9.4GB

SD, CF,
16MB 1GB(CCD)

=

=
=

=

9

10

11

Euler
Euler

Euler

inseart(S, x)

inseart(S, 16)delete(S, x)

delete(S, 12)(1)

delete(S, x)(2)

delete(S, 4)delete(S, x)

delete(S, 18)(3)

delete(S, x)

Inseart(S, 13); delete(S, 18)

(4)

y

x

15
3
3
3
3
3
3

19
15
6
6
6
6
6

29
19
15
9
9
9
9

9
29
19
15
11
11
11

16
9
29
19
15
15
15

11
16
9
29
19
16
16

6
11
16
11
29
19
19

3
6
11
16
16
29
29

n
n=

Tn = Tn
T n =c+ cn

Tn = Tn

+ cn ==Tn+ cn =

=

Tn

+ cn

= kT n= c n+ cn

k

Tn

+c n

+ cn

Tn

+c n

+ cn

+ kcn
n cn

n

+

+ +
+

+
< +

+

+

+ +

+

[ /2]
2
2 +1

+

+ +
+

+
+

< +

+

+ +

+

+
+

+

+
+

+

+
+

+

+

=

=

+

=

+

=

+

=

3.7

類似性発見
3.7.1 概要
講師：岡﨑 威生／琉球大学工学部情報工学科講師岡﨑
日時：2012 年 9 月 11 日 10:20～／12:50～／14:40 ～／16:30 ～場所：琉球大学総合情報処理センター
内容：データ解析の基礎となる確率論と統計的推論からスタートし、データ解析
言語 R を利用した実習を行う。次に基本的な配列解析であるアラインメントの原
理と方法を演習を交えて理解する。最後に類似性に基づいたクラスタリング手法
について、適用ノウハウと供に学ぶ。
3.7.2 準備特筆事項なし3.7.3 配布物
・講義スライド・R 実行メモ・gene.csv（遺伝子発現データ、R 実行メモ用データファイル）・正規分布表・t 分布表・F 分布表・BLOSUM50（スコアテーブル）・PAM250（スコアテーブル）・方眼紙（アラインメントワーク用）
・統計解析言語システム R の紹介（参考資料）
3.7.4 課題・プリント（演習問題 12 題）49

3.7.5 キーワード
生命科学分野生物学基礎
細胞（生体膜、細胞内小器官、真核生物、原核生物）、細胞周期（体細胞分裂、減数分裂）、
遺伝学（メンデルの法則、連鎖)、発生・分化、シグナル伝達（受容体、プロテインキナーゼ、細胞接着）、ウィルス、免疫、脳・神経
分子生物学
セントラルドグマ、複製（DNA）、転写（RNA、遺伝子発現、逆転写、スプライシング）、翻訳（タンパク質、tRNA、リボゾーム、遺伝暗号、翻訳後修飾）、RNA 遺伝子、生体エネル
ギーと代謝、エピジェネティクス（クロマチン構造）
バイオテクノロジー
遺伝子組み換え、分子クローニング、PCR、塩基配列決定法（サンガー法、次世代シークエンサー）、ゲノム（ショットガン法）、トランスクリプトーム（マイクロアレイ）、プロ
テオーム（質量分析、二次元電気泳動、酵母ツーハイブリッド法）、立体構造決定（X 線
結晶構造解析、NMR、電子顕微鏡）、ChIP-seq 法
情報科学分野コンピュータシステム
二進数、論理演算（論理積、論理和、排他的論理和）、数値演算（浮動小数点数、丸め誤差、桁落ち）、プログラミング言語（C 言語、Perl 言語）、ネットワーク（OSI 参照モデル、
IP アドレス）、マークアップ言語（HTML、XML）
アルゴリズム
データ構造（スタック、キュー、リスト、木構造）、探索（二分探索、ハッシュ表、木探索）、ソーティング、文字列比較
データベース技術
３層スキーマ構造、データモデル（階層型、リレーショナル型）
確率・統計
確率分布・確率変数（母集団、標本、独立性、ベイズの定理）、データ解析（平均、分散、相関、回帰）、推定・検定（点推定、区間推定、帰無仮説、対立仮説、有意水準）
機械学習
決定木、k-最近接近傍法、ニューラルネットワーク、サポートベクトルマシン、感度、特異度、クロスバリデーション法、クラスタリング、K-平均法、自己組織化マップ（SOM）

50

バイオインフォマティクス分野
分子生物学データベース
文献 DB（PubMed）、ゲノム DB、核酸配列 DB、アミノ酸 DB、モチーフ DB（モチーフライブ
ラリー）、立体構造 DB、代謝パスウェイ DB、多型ＤＢ、発現ＤＢ、アノテーション、遺伝
子オントロジー（Gene ontology）
配列解析
アラインメント（動的計画法（dynamic programming）、スコアテーブル、ギャップペナル
ティ、ローカルアラインメント、グローバルアラインメント、Smith-Waterman 法、ペア
ワイズアラインメント、マルチプルアラインメント、累進法（ツリーベース法）、ClustalW、
HMM（隠れマルコフモデル））、相同性検索（FASTA、ハッシング、BLAST、有限オートマト
ン、PSI-BLAST、位置特異的スコア行列（PSSM)、プロファイル比較）、モチーフ解析（正規表現、重み行列）、分子系統解析（オーソログ、パラログ、距離行列法、UPGMA、近隣結
合法（N-J 法）、最節約法、最尤法、同義置換、非同義置換）、タンパク質機能予測（膜貫通部位予測、細胞内局在部位予測）、RNA 二次構造予測、遺伝子発見（ORF（open reading
frame）、スプライシング解析、プロモータ解析、偽遺伝子）、ゲノム特徴抽出（繰り返し
配列発見、転写因子、SSR（simple sequence repeat)、GC 含量、コドン使用頻度）、ゲノ
ム比較（ゲノムアラインメント、編集距離、系統プロファイル法、ロゼッタストーン法、
遺伝子並び順の保存、遺伝子の水平伝搬）タンパク質立体構造解析
化学構造（結合角、結合距離、二面角）、タンパク質高次構造(二次構造、三次構造、四次構造)、立体構造表現（コンタクトマップ、ラマチャンドランマップ、分子グラフィック
ス）、構造比較（重ね合わせ、RMSD、構造アラインメント、構造モチーフ、構造分類）、タ
ンパク質構造予測（二次構造予測、ホモロジーモデリング、フォールド認識、スレッディ
ング、３D-1D 法、分子動力学計算）、構造 DB
遺伝学・進化学
分子系統解析（オーソログ、パラログ、距離行列法、UPGMA、近隣結合法（N-J 法）、最節
約法、最尤法、同義置換、非同義置換）、ニューウィック形式、遺伝子の水平伝搬、多型マーカー（SNP、マイクロサテライト、VNTR、RFLP、HLA タイプ）
、Hardy-Weinberg の法則
トランスクリプトーム解析・プロテオーム解析
遺伝子発現クラスタリング、遺伝子ネットワーク推定（ブーリアンネットワーク、ベイジ
アンネットワーク）、タンパク質相互作用解析、DNA マイクロアレイ、質量分析、二次元
電気泳動、酵母ツーハイブリッド法
パスウェイ解析・システム生物学
ネットワーク解析（スケールフリー、ハブ、ネットワークモチーフ）、動的シミュレーシ
ョンとシステム解析（微分方程式、ロバストネス、フィードバック、フィードフォワード、
感度解析、安定性解析、代謝流束解析）
51

3.7.6 時間割
時間

内容

10:20～【映像上映】・ セントラルドグマ ～ゲノム情報からタンパク質ができるまで～ / The
Central Dogma
独立行政法人理化学研究所 ゲノム科学総合研究センター
http://www.youtube.com/watch?v=EgweXtBCynE

10:38～

確率分布
・ 確立とは算術的確率／統計的確率
・ 確率の性質→R 演習を実施
・ 条件付き確率→R 演習を実施

11:00～

・ ベイズの定理
・ 確率分布・ 分散と標準偏差→R 演習を実施

11:47～

・ 標準化

12:00～

昼食

12:50～

確率分布（続き）
・ 正規分布（二項分布は省略）
・ 標本と母集団＊ 時間の都合上、統計的推定の項目は省略

13:25～

配列アラインメント・ 動的計画による候補の探索・ ギャップペナルティ
リニアギャップ／アフィンギャップ
BLOSUM50／PAM250
・ Needleman-Wunsch 法

14:50～→アラインメント演習
・ 相同性探索ツール
BLAST
・ 統計的検定52

・ 位置の違い検定
・ t 分布 数表→位置の違いの検定演習
15:27～・ ばらつきの違い検定（F 検定）
・ Wilcoxon 順位和検定

15:36～

相関／相関係数・ 相関係数の概念
・ 相関係数の計算式
・ ノンパラメトリック相関係数

15:57～→相関係数演習
休憩

16: 15～

クラスタリング【演習】・ クラスタ／グループ化／デンドログラム
・ 似ている度合いの測定方法
距離、類似度・ 階層的クラスタ構成
・ クラスタ併合のルール
重心法、最短距離法、最長距離法
群平均法、Ward 法・ クラスタリングの留意点
数値の確認、距離の選択、併合ルールの選択

16:47～→クラスタリング演習

53

2

3

4

5

6

7

8

9

n

x=

n i=

xi

10

11

n

Sx =

n i=

xi

x

12

13

14

15

16

17

18

X

19

X

20

X

21

X

22

X

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

- gd
g
d

- d- e(g- 1)dee<d(d, e)=(12, 2) , (11, 1)

35

36

GK- D
G- FD
- GKD
GFD37

F( 1, 0) =- d
F( 2, 0)=- 2d

F( 0, 0)=0F( i - 1, j - 1)
F( 0, 1)=- d

F( i , j - 1)=+

F( 0, 2)=- 2d

F( i - 1, j )F( i , j )
38

39

C
P

A
A
A

-A
PA

C- A
- PA

A
40

A P E G L Q P L
A P D L QA L

41

42

43

44

45

46

47

48

49

T=

x y
xi

x +
m+ n

yi

y

+
m n

50

T

51

52

T=

x y
xi

x

mm

+
xi

f =

xi

x

yi

f

y

nn
x

mm

+

yi
yi

mm
m

+

y

nn
y

nn
n
53

x

0. 7

- 1. 6- 0. 2- 1. 2- 0. 1

3. 4

3. 7

0. 8

0. 0

2. 0

y

1. 9

0. 8

1. 1

0. 1

- 0. 1

4. 4

5. 5

1. 6

4. 6

3. 4

54

T=

xi

x

yi

y

m
n

55

56

57

=
=

Rx
Rx

58

59

n

xi
r=

x yi

y

i=
n

n

xi
i=

x

yi

y

i=

60

(
=

=

=

(

(

)

(

)
)
)
61

62

63

64

n

=

=

=
=

=
=
65

=

=

=

=

=

=

=

=

66

n

67

68

+

=
=

=

=
69

70

71

72

" N: bi o ""gene. c s v"

" N: bi o "

R

/

/

" N: bi o "R
get wd( )

csv

Excel

csv
csv

gene. c s v

genedat acsv

r ow. name s

genedat a <- r ead. t abl e( " ge ne . c s v" , he ader =T, s e p=" , " , r o w. name s =" Name " )genedat a$
genedat a$EM8Z309

genedat a

4

genedat a1 <- genedat a$EM8Z309
genedat a2 <- genedat a$EM8Z310
genedat a3 <- genedat a$EM8Z313
genedat a4 <- genedat a$EM7ZC11- 1 -mean( gene dat a1)
medi an( ge ne dat a1)

max( ge ne dat a1)

mi n( ge ne dat a1)
1
quant i l e ( ge ne dat a1, pr ob=0. 25)
3
quant i l e ( ge ne dat a1, pr ob=0. 75)

r ange ( ge nedat a1)

var ( )var ( ge ne dat a1) *( l engt h( ge ne dat a1) - 1) / l engt h( gene dat a1)
s qr t ( var ( ge ne dat a1) *( l engt h( ge ne dat a1) - 1) / l e ngt h( gene dat a1) )I QR( ge ne dat a1)

hi s t ( gene dat a1)

pl o t ( gene dat a)

boxpl o t ( genedat a, r ange =0)X
x <- s eq( 0, 10, 1)

bar pl o t ( dbi no m( x, 10, 0. 3) )

- 2 -

X
x <- s eq( - 10, 10, 0. 1)

c ur ve ( dno r m( x, 0, 1) , f r o m=- 10, t o =10)

Excel

csv

dat a. c s v

t" gr eat er "" l ess "t . t es t ( dat as e t $x, dat as e t $y, al t er nat i ve =" t wo . s i de d" , var . e qual =T)t . t es t ( dat as e t $x, dat as e t $y, al t er nat i ve =" t wo . s i de d" , var . e qual =F)F
var . t e s t ( dat as et $x, dat as e t $y)
Wilcoxon
wi l c o x. t e s t ( dat as et $x, dat as e t $y, al t er nat i ve =" t wo . s i de d" )" pe ar s on"" s pear man"

" ke ndal l "c or ( dat as et , met hod=" pear s o n" )

/

/CRAN

Japan(Hyogo)

/

/

amap

l i br ar y( amap)

l ogdat a <- l og( genedat a, bas e =2)01

nor mal dat a <- s c al e ( l o gdat a)" euc l i de an"" c o r r e l at i o n"

" maxi mum"" pe ar s on"

di s t mat <- Di s t ( l ogdat a, met hod=" e uc l i de an" )- 3 -" manhat t an"

" c o mpl et e "" war d"" s i ngl e"" aver age "" c e nt r oi d"r es ul t <- hc l us t ( di s t mat , met ho d=" ave r age" )pl o t ( r es ul t , hang=- 1, mai n=" Cl us t e r i ng" , s ub=" l og&aver age " ,xl ab=" " , yl ab=" " )r ec t . hc l us t =( r e s ul t , k=10)

c ut r e e ( r e s ul t , k=10)
pdf
pdf ( " r es ul t . pdf " )pl o t ( r es ul t , hang=- 1, mai n=" Cl us t e r i ng" , s ub=" l og&aver age " , xl ab=" " ,yl ab=" " )dev. o f f ( )d1 <- Di s t ( l ogdat a, me t ho d=" euc l i de an" )d2 <- Di s t ( t ( l o gdat a) , me t ho d=" e uc l i de an" )c 1 <- hc l us t ( d1, me t ho d=" ave r age " )c 1 <- hc l us t ( d2, met ho d=" ave r age" )heat map( as . mat r i x( l ogdat a) , Co l v=as . de ndr o gr am( c 2) ,Rowv=as . dendr o gr am( c 1) , s c al e =" none " , c o l =c m. c ol or s ( 256) ,mai n=" l o g&ave r age " , mar gi n=c ( 8, 10) )- 4 -5

2008

R

R

SAS

JPEG

SPSS

Excel

EPS PNG

1

4

5

2008

4

R

R

The R Project for Statistical Computing (http://www.r-project.org/)
Linux

Windows

MacOSXThe Comprehensive R Archive Network(http://cran.r-project.org/)
OSR-2.6.1
MacOSX (10.5)

CRAN

R-2.6.1.dmg

1. MacOSX
R.mpkg
R
R

2.

R
R

2

5

2008

3.
R

R

> l i br ar y( hel p=" dat as et s " )4.
iris> i ri s

5. iris

3

4

5

2008

ID
R
Excel

csv
sample.csv

6. ExcelR> i nf i l e <- f i l e( " s ampl e. c s v" , open=" r " , e nc odi ng=" s hi f t - j i s " )> dat a <- r ead. t abl e( i nf i l e , he ader =T, s e p=" , " )> c l o s e ( i nf i l e)data
MacOSX

sample.csv
utf-8 Windows

encoding
CP932$> dat a$

4

4

5

2008

> o ut f i l e <- f i l e( " r es ul t . t xt " , o pe n=" w" , e nc odi ng=" s hi f t - j i s " )> wr i t e . t abl e ( dat a, o ut f i l e , he ader =T, s e p=" , " )> c l o s e ( o ut f i l e )> s ummar y( dat a)

8.

data
1

3

5

4

5

2008

9.

10.

> pdf ( f i l e=" gr aphf i l e . pdf " , wi dt h=400, he i ght =400)> bar pl ot ( t abl e ( dat a$))> dev. o f f ( )cor.test
pearsonkendallspearman

11.

12.

6

4

5

2008

MASS
iris

lda

4

3
lda

>

<- dat a[ , 1]><- dat a[ , 2]><- dat a[ , 3]><- dat a[ , 4]>

1 <- c bi nd(

,

,

,

>

2 <- c bi nd(

,

,

)

>

)

<- dat a[ , 5]

> r es ul t 1 <- l da(1,)> pr i nt ( r es ul t 1)

7

4

A.1
5

2008

4

> pr e s ul t 1 <- pr e di c t ( r es ul t 1)
> t abl e (, pr e s ul t 1$c l as s )

R
R

R

CRAN

Web

R
R

R

URL
[1] "An Introduction on R", W.N.Venables, D.M.Smith and R Development Core Team, Network
Thory Ltd. 2002[2] "The R Tips

R

",

2005
[3] The R Project for Statistical Computing http://cran.r-project.org/[4] The Comprehensive R Archive Network http://cran.r-project.org/
[5]
[6] R

http://aoki2.si.gunma-u.ac.jp/R/

8

,

10
gene.csv

EM8Z309 EM8Z310 EM8Z313 EM7ZC11
1

3

12
gene.csv

EM8Z309 EM8Z310 EM8Z313 EM7ZC11

gene.csv

EM8Z309 EM8Z310 EM8Z313 EM7ZC11

13

gene.csv
gene.csv

EM8Z309 EM8Z310 EM8Z313 EM7ZC11

14
2

2

5

1

3

16
52
B

1

A

P( B|A)
17

DNA

A T G C

40% 30% 20% 10%
7% 5% 4% 5%
A

1
0.01

1

0.05
B

A 1
P( A|B)

-1-

18
52

1

B

A

A

B

20
P( X=1) =0. 6

P( X=2) =0. 3

P( X=3) =0. 1
X

E[ X]
X

E[ X]
21
P( X= - 1) =0. 5
E[ X] =3

P( X=0) =0. 2

V[ X] =5

P( X=3) =0. 3

Y=- 2X+3

V[ X]

E[ Y]

V[ Y]

23
10
n=10

1

8

p=0. 324
N( 1, 4)X

N( 3, 4)X

N( 100, 16)

Y=( - X+2) / 3
P( 94! X! 109)

30

-2-

3.8

配列と機能
3.8.1 概要
講師：有田 正規／東京大学理学部生物情報学科准教授
日時：2012 年 9 月 12 日 10:20～／12:50～／14:40 ～場所：琉球大学総合情報処理センター
内容：DNA やタンパク質など生体分子の配列の相同性と機能について、BLAST による相同配列の検索や構造ドメイン、二次構造予想など配列の二次構造予測の実習を行う。また、酵素や代謝、タンパク質の相互作用など、KEGG や STRING の WEB ツールを活用して、それらのネットワークについて実習する。
3.8.2 準備特筆事項なし3.8.3 配布物
・講義スライド
・理系総合のための生命科学（参考資料／羊土社出版予定）
3.8.4 課題
※講義スライドに含む

54

3.8.5 キーワード
生命科学分野生物学基礎
細胞（生体膜、細胞内小器官、真核生物、原核生物）、細胞周期（体細胞分裂、減数分裂）、
遺伝学（メンデルの法則、連鎖)、発生・分化、シグナル伝達（受容体、プロテインキナーゼ、細胞接着）、ウィルス、免疫、脳・神経
分子生物学
セントラルドグマ、複製（DNA）、転写（RNA、遺伝子発現、逆転写、スプライシング）、翻訳（タンパク質、tRNA、リボゾーム、遺伝暗号、翻訳後修飾）、RNA 遺伝子、生体エネル
ギーと代謝、エピジェネティクス（クロマチン構造）
バイオテクノロジー
遺伝子組み換え、分子クローニング、PCR、塩基配列決定法（サンガー法、次世代シークエンサー）、ゲノム（ショットガン法）、トランスクリプトーム（マイクロアレイ）、プロ
テオーム（質量分析、二次元電気泳動、酵母ツーハイブリッド法）、立体構造決定（X 線
結晶構造解析、NMR、電子顕微鏡）、ChIP-seq 法
情報科学分野コンピュータシステム
二進数、論理演算（論理積、論理和、排他的論理和）、数値演算（浮動小数点数、丸め誤差、桁落ち）、プログラミング言語（C 言語、Perl 言語）、ネットワーク（OSI 参照モデル、
IP アドレス）、マークアップ言語（HTML、XML）
アルゴリズム
データ構造（スタック、キュー、リスト、木構造）、探索（二分探索、ハッシュ表、木探索）、ソーティング、文字列比較
データベース技術
３層スキーマ構造、データモデル（階層型、リレーショナル型）
確率・統計
確率分布・確率変数（母集団、標本、独立性、ベイズの定理）、データ解析（平均、分散、相関、回帰）、推定・検定（点推定、区間推定、帰無仮説、対立仮説、有意水準）
機械学習
決定木、k-最近接近傍法、ニューラルネットワーク、サポートベクトルマシン、感度、特異度、クロスバリデーション法、クラスタリング、K-平均法、自己組織化マップ（SOM）

55

バイオインフォマティクス分野
分子生物学データベース
文献 DB（PubMed）、ゲノム DB、核酸配列 DB、アミノ酸 DB、モチーフ DB（モチーフライブ
ラリー）、立体構造 DB、代謝パスウェイ DB、多型ＤＢ、発現ＤＢ、アノテーション、遺伝
子オントロジー（Gene ontology）
配列解析
アラインメント（動的計画法（dynamic programming）、スコアテーブル、ギャップペナル
ティ、ローカルアラインメント、グローバルアラインメント、Smith-Waterman 法、ペア
ワイズアラインメント、マルチプルアラインメント、累進法（ツリーベース法）、ClustalW、
HMM（隠れマルコフモデル））、相同性検索（FASTA、ハッシング、BLAST、有限オートマト
ン、PSI-BLAST、位置特異的スコア行列（PSSM)、プロファイル比較）、モチーフ解析（正規表現、重み行列）、分子系統解析（オーソログ、パラログ、距離行列法、UPGMA、近隣結
合法（N-J 法）、最節約法、最尤法、同義置換、非同義置換）、タンパク質機能予測（膜貫通部位予測、細胞内局在部位予測）、RNA 二次構造予測、遺伝子発見（ORF（open reading
frame）、スプライシング解析、プロモータ解析、偽遺伝子）、ゲノム特徴抽出（繰り返し
配列発見、転写因子、SSR（simple sequence repeat)、GC 含量、コドン使用頻度）、ゲノ
ム比較（ゲノムアラインメント、編集距離、系統プロファイル法、ロゼッタストーン法、
遺伝子並び順の保存、遺伝子の水平伝搬）タンパク質立体構造解析
化学構造（結合角、結合距離、二面角）、タンパク質高次構造(二次構造、三次構造、四次構造)、立体構造表現（コンタクトマップ、ラマチャンドランマップ、分子グラフィック
ス）、構造比較（重ね合わせ、RMSD、構造アラインメント、構造モチーフ、構造分類）、タ
ンパク質構造予測（二次構造予測、ホモロジーモデリング、フォールド認識、スレッディ
ング、３D-1D 法、分子動力学計算）、構造 DB
遺伝学・進化学
分子系統解析（オーソログ、パラログ、距離行列法、UPGMA、近隣結合法（N-J 法）、最節
約法、最尤法、同義置換、非同義置換）、ニューウィック形式、遺伝子の水平伝搬、多型マーカー（SNP、マイクロサテライト、VNTR、RFLP、HLA タイプ）
、Hardy-Weinberg の法則
トランスクリプトーム解析・プロテオーム解析
遺伝子発現クラスタリング、遺伝子ネットワーク推定（ブーリアンネットワーク、ベイジ
アンネットワーク）、タンパク質相互作用解析、DNA マイクロアレイ、質量分析、二次元
電気泳動、酵母ツーハイブリッド法
パスウェイ解析・システム生物学
ネットワーク解析（スケールフリー、ハブ、ネットワークモチーフ）、動的シミュレーシ
ョンとシステム解析（微分方程式、ロバストネス、フィードバック、フィードフォワード、
感度解析、安定性解析、代謝流束解析）
56

3.8.6 時間割
時間

内容

10:20～

イントロ・ バイオインフォマティクス概要
ゲノミクス
トランスクリプトミクス
プロテオミクス
メタボロミクス

10:27～

配列と遺伝子機能・ ゲノム解析の現状
・ ショットガンシーケンス
・ シーケンスのカバー率
・ 次世代シーケンス（NGS）
・ BLAST
・ DDBJ／EMBL／GenBank

11:41～【演習】
Tyranosaurus rex の配列を BLAST 検索する
・ E-Value と P-value
・ BLAST Family
Nucleotide BLAST、blastx、psi-blast など
・ アミノ酸置換行列【課題】
課題へ取り組む

12:05～

昼食

12:50～

課題の解説
タンパク質の配列と機能
・ タンパク質の立体構造
・ 立体構造決定法
Fold It!
・ 立体構造データベースの分類
PDB、SCOP、CATH，Uniprot

57

13:28～【演習】
タンパク質立体構造第一号である（ミオ）グロビンのスーパーファミリーを検索する

13:40～

解析方法
・ マルチプルアライメント
・ タンパク質の機能分類

14:02～【演習】
グロビンの機能解析／Gene Ontology
・ ヘモグロビンの仕組み
・ アロステリック効果【課題】
課題へ取り組む
休憩

14:42～

ネットワークという考え方
・ 生物学におけるネットワーク
代謝ネットワーク、タンパク質相互作用ネットワーク
進化や遺伝子のネットワーク
・ ネットワークの定義
・ 6 次の隔たり
・ ネットワークの特徴
スモールワールド、スケールフリー
・ べき分布と指数分布
・ 平均頂点間距離、クラスター係数

15:40～

・ ネットワークのキーワード
スケールフリーネットワーク、ネットワークモチーフ
・ ネットワークのモジュール・ フィードバック
・ フィードフォワード

15:57

・ ネットワーク研究について

58

DNA
RNA

GenomesOnLine Database (GOLD)
http://www.genomesonline.org/

B
E

, A

,
M
GC

GC

read

contig

1.
A
A
T

2.
3.
4.

(

SNP
SNP: single
nucleotide
polymorphism

(Next Generation Seq)
G
N

(coverage)

a = NL/G

L
L
1
G

N

a
1
N

N
N

ea

99.9%

1 e a
a = 6.9

0.999

99.99%
Illumina

a = 9.2
SOLiD

1
1(3 Gbp)emulsion PCR
optical sequencing

single-molecule
optical sequencing

semiconductor
nano-pore

25-400 bp
20 Gb / day1000 bp, skipping

100-200 bp
2 Gb / day

DNA polymerase:
Roche 454
Illumina HiSeq
DNA ligase:
AppliedBio Solid

DNA polymerase:
Pacific Bioscience

Seminconductor:
Ion Torrent
Nanopore:
Oxford Nanopore

G bp
DNA

BLAST
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/
nucleusgene
DNA
EF Keller The Century of the Gene

exon

exon

exon

mRNA

1.
2.
3.
4.
high-scoring pairRNA

protein

DDBJ/EMBL/GenBank: Tyrannosaurus rex

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
Tyrannosaurus rex
DDBJ ... DNA Data Bank of Japan
EMBL ... European Molecular Biology Laboratory (database)
GenBank ... NIH Genetic sequence database

LOCUS
NP_247669
253 aalinear BCT 28-JUL-2010
DEFINITION nitrogenase reductase NifH2 [Methanocaldococcus jannaschii DSM 2661].
ACCESSION NP_247669
DBSOURCE REFSEQ: accession NC_000909.1
KEYWORDS .
SOURCE
Methanocaldococcus jannaschii DSM 2661
ORGANISM Methanocaldococcus jannaschii DSM 2661
Archaea; Euryarchaeota; Methanococci; Methanococcales;
Methanocaldococcaceae; Methanocaldococcus.
REFERENCE 1 (residues 1 to 253)
AUTHORS Bult,C.J., White,O., Olsen,G.J., Zhou,L., Fleischmann,R.D.,
TITLE
Complete genome sequence of the methanogenic archaeon, Methanococcus jannaschii
JOURNAL Science 273 (5278), 1058-1073 (1996)
PUBMED
8688087
REFERENCE

1. NCBI2.
3.
4. GenBank
5.

blast

ProteinOK

Tyrannosaurus rex
FASTA

copy

6.
resources -> Data&Software -> BLAST
7. Protein blast8.

T.rex protein
Psi-blast

E-value 0.001-0.004

E-valuecollagenP-value

BLAST
E-value (expected value)

E-value

E

Kmne

m, n:

S

S:

K, :

2

2

2

2

P-value (probability value)

S(

P 1 e
E-valueE)

E

P-value1

BLAST Family
nucleotide BLAST (blastn)
protein BLAST (blastp)
blastxTblastpsi-blast
megablast

BLOSUM62: 62%(BLOck SUbstitution Matrix)
NCBI

A,M,I,L,V
C,S,T
N,Q
F,Y,W
H,R,K
D,E

blastpblastnK

E

PAM

Homo sapiens
Homosapiens

Escherichia coli
Saccharomyces cerevisiae

Mus musculus
Allium cepa

BLAST
E-value

97%
GBIF http://www.gbif.org/

BLOSUM62

1.

BLAST
E-value2.

TV http://togotv.dbcls.jp/20071016.html
BLAST psi-BLAST

wikipedia

X
NMR(folding)

Spring-8

David Baker

X

NMR

9

ab initio

Rosettaab initio
PDB

Spring-8 HP

Fold It!
PDB (Protein Data Bank)
http://www.pdb.org/
7
SCOP (Structural Classification Of Proteins)
http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/
4
all , all , +CATH (Class, Architecture, Topology, Homologous superfamily)
http://www.cathdb.info/(sepsis)Mannose-Binding Lectin
Uniprot ...
http://www.uniprot.org/

http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/

1. SCOP(Google scop database )2. Top of the hierarchy
3. All alpha proteins
Globin-like
Globin-like

HMM

Globins
MAFFT

profileDNA,RNA[]x(2)2[FY]-C-x(2)-C-[AGT]-E-[MLI]-D[]
F-C-x-x-C-A-E-M-D
Y-C-x-x-C-G-E-L-D

Gene Ontology

Gene Ontology
GO
1. Interpro2.

http://www.ebi.ac.uk/interpro/
globinGlobins are haem-containing proteins involved in binding and/ortransporting oxygen. They belong to a very large and well studied
family that is widely distributed in many organisms [1]. Globins
have evolved from a common ancestor and can be divided into
three groups: single-domain globins, and two types of chimericglobins, flavohaemoglobins and globin-coupled sensors. Bacteria
have all three types of globins, while archaea lackflavohaemoglobins, and eukaryotes lack globin-coupled sensors[2] .

Directed Acyclic Graphbiological process
cellular component
molecular function

1. http://www.geneontology.org/
2.
X associations

globin(allo+ steric

Hill (

L:

Hill

n

[

EC
EC

ATP

hemoglobin

http://www.pdbj.org/mom/index.php l=ja&p=041(truncated globin)
SCOP

(Kd:

n>1
n<1

PDB

truncated globin

)

Kd:

]

EC Class 1: Oxidoreductases
EC Class 2: Transferases
EC Class 3: Hydrolases
EC Class 4: Lyases
EC Class 5: Isomerases
EC Class 6: Ligases

)

L
L

1

[L]:

Levels(Metabolic Network)
A

v2 C
B
v3
D
v3

v1

(PPI Network)

Time (h)v1v2(Genetic Network)

6
G=

V,

vertex (node)edge (link)degreepath from x to yconnected component
cycle
tree
spanning tree

Oracle of Bacon
http://oracleofbacon.org/
120
150
1.
2.

E

x

n6 : n = 10
100
n = 206400
n = 301 9200

y
path

cycle

y =C xdy/dx
dy/y =yy=Cx
log y = log (C x
= log C
log-log

)
log x

C,

x

y =C e
y/x
dx/x

x

dy/dx
dy/y =
yx(x)(memoryless property)ydx

Albert, R, Barabasi, AL, Reviews of Modern Physics
74, 47 (2002)
ALCnn(n-1)/2
1
0

O( log n )BAPreferential attachment

Rich gets richer.

m0

p (k )k

A. L. Barabasi, R. Albert Emergence of Scaling in Random Networks , Science
286, 1999

5

FFL (feed forward loop)
x

x

x

x

autoregulation

z

y

z

y

y1

y2

y3

...

x

10%
X, Y

AND

Z

z
X, Y

Y

OR
Z

y

Z

x

Z
X Y AND Z

X ON
Z

z

y

3.9

タンパク質の機能と構造
3.9.1 概要
講師：広川 貴次／産業技術総合研究所 生命情報工学研究センター
創薬分子設計チーム チーム長
日時：2012 年 9 月 13 日 10:20～／12:50～／14:40 ～場所：琉球大学総合情報処理センター
内容：立体構造やドメインのデータベースについて学び、PDB でみる立体構造を実習する。また INTERPRO によるモチーフ予測、膜貫通領域予測、触媒部位の予測等を実習する他、AUTDOCK によりリガンドのドッキングシミュレーション実習も行う。
3.9.2 準備
AutoDock の導入と動作確認 ※参照：AutoDock 導入手順および確認
・autodock インストール
・MGLTools インストール
・python インストール
docking フォルダの配布 ▼docking 内のファイル

3.9.3 配布物
・講義スライド（※必要に応じて各自印刷）
3.9.4 課題・kadai.pdf （※各自印刷、回答して提出）

59

3.9.5 キーワード
生命科学分野生物学基礎
細胞（生体膜、細胞内小器官、真核生物、原核生物）、細胞周期（体細胞分裂、減数分裂）、
遺伝学（メンデルの法則、連鎖)、発生・分化、シグナル伝達（受容体、プロテインキナーゼ、細胞接着）、ウィルス、免疫、脳・神経
分子生物学
セントラルドグマ、複製（DNA）、転写（RNA、遺伝子発現、逆転写、スプライシング）、翻訳（タンパク質、tRNA、リボゾーム、遺伝暗号、翻訳後修飾）、RNA 遺伝子、生体エネル
ギーと代謝、エピジェネティクス（クロマチン構造）
バイオテクノロジー
遺伝子組み換え、分子クローニング、PCR、塩基配列決定法（サンガー法、次世代シークエンサー）、ゲノム（ショットガン法）、トランスクリプトーム（マイクロアレイ）、プロ
テオーム（質量分析、二次元電気泳動、酵母ツーハイブリッド法）、立体構造決定（X 線
結晶構造解析、NMR、電子顕微鏡）、ChIP-seq 法
情報科学分野コンピュータシステム
二進数、論理演算（論理積、論理和、排他的論理和）、数値演算（浮動小数点数、丸め誤差、桁落ち）、プログラミング言語（C 言語、Perl 言語）、ネットワーク（OSI 参照モデル、
IP アドレス）、マークアップ言語（HTML、XML）
アルゴリズム
データ構造（スタック、キュー、リスト、木構造）、探索（二分探索、ハッシュ表、木探索）、ソーティング、文字列比較
データベース技術
３層スキーマ構造、データモデル（階層型、リレーショナル型）
確率・統計
確率分布・確率変数（母集団、標本、独立性、ベイズの定理）、データ解析（平均、分散、相関、回帰）、推定・検定（点推定、区間推定、帰無仮説、対立仮説、有意水準）
機械学習
決定木、k-最近接近傍法、ニューラルネットワーク、サポートベクトルマシン、感度、特異度、クロスバリデーション法、クラスタリング、K-平均法、自己組織化マップ（SOM）

60

バイオインフォマティクス分野
分子生物学データベース
文献 DB（PubMed）、ゲノム DB、核酸配列 DB、アミノ酸 DB、モチーフ DB（モチーフライブ
ラリー）、立体構造 DB、代謝パスウェイ DB、多型ＤＢ、発現ＤＢ、アノテーション、遺伝
子オントロジー（Gene ontology）
配列解析
アラインメント（動的計画法（dynamic programming）、スコアテーブル、ギャップペナル
ティ、ローカルアラインメント、グローバルアラインメント、Smith-Waterman 法、ペア
ワイズアラインメント、マルチプルアラインメント、累進法（ツリーベース法）、ClustalW、
HMM（隠れマルコフモデル））、相同性検索（FASTA、ハッシング、BLAST、有限オートマト
ン、PSI-BLAST、位置特異的スコア行列（PSSM)、プロファイル比較）、モチーフ解析（正規表現、重み行列）、分子系統解析（オーソログ、パラログ、距離行列法、UPGMA、近隣結
合法（N-J 法）、最節約法、最尤法、同義置換、非同義置換）、タンパク質機能予測（膜貫通部位予測、細胞内局在部位予測）、RNA 二次構造予測、遺伝子発見（ORF（open reading
frame）、スプライシング解析、プロモータ解析、偽遺伝子）、ゲノム特徴抽出（繰り返し
配列発見、転写因子、SSR（simple sequence repeat)、GC 含量、コドン使用頻度）、ゲノ
ム比較（ゲノムアラインメント、編集距離、系統プロファイル法、ロゼッタストーン法、
遺伝子並び順の保存、遺伝子の水平伝搬）タンパク質立体構造解析
化学構造（結合角、結合距離、二面角）、タンパク質高次構造(二次構造、三次構造、四次構造)、立体構造表現（コンタクトマップ、ラマチャンドランマップ、分子グラフィック
ス）、構造比較（重ね合わせ、RMSD、構造アラインメント、構造モチーフ、構造分類）、タ
ンパク質構造予測（二次構造予測、ホモロジーモデリング、フォールド認識、スレッディ
ング、３D-1D 法、分子動力学計算）、構造 DB
遺伝学・進化学
分子系統解析（オーソログ、パラログ、距離行列法、UPGMA、近隣結合法（N-J 法）、最節
約法、最尤法、同義置換、非同義置換）、ニューウィック形式、遺伝子の水平伝搬、多型マーカー（SNP、マイクロサテライト、VNTR、RFLP、HLA タイプ）
、Hardy-Weinberg の法則
トランスクリプトーム解析・プロテオーム解析
遺伝子発現クラスタリング、遺伝子ネットワーク推定（ブーリアンネットワーク、ベイジ
アンネットワーク）、タンパク質相互作用解析、DNA マイクロアレイ、質量分析、二次元
電気泳動、酵母ツーハイブリッド法
パスウェイ解析・システム生物学
ネットワーク解析（スケールフリー、ハブ、ネットワークモチーフ）、動的シミュレーシ
ョンとシステム解析（微分方程式、ロバストネス、フィードバック、フィードフォワード、
感度解析、安定性解析、代謝流束解析）
613.9.6 時間割
時間

内容

10:20～

タンパク質の立体構造
・ DNA からタンパク質へ・ タンパク質の階層情報
・ タンパク質立体構造データ
・ タンパク質階層構造
1 次構造、2 次構造、3 次構造
・ タンパク質のグラフィックス表現
・ 立体構造の重要性
・ 活性部位を形成する立体構造の保存性
配列、ドメイン・ 生体高分子の立体構造決定方法
・ Protein Data Bank

10:42～【演習】
タミフルとタンパク質の結合情報確認

10:55～

タンパク質の立体構造予測・ 配列情報と構造情報のギャップ
・ タンパク質モデリングの考え方
相同性、類似性、ホモログ、アナログ
・ タンパク質モデリングの戦略
鋳型構造の探索、構造決定までのプロトコル・ ロータマーライブラリ・ ループモデリング・ 分子力学計算による極小化
・ 自動構築プログラム→モデル評価

11:13～【演習】
構造不明のタンパク質配列について Verify3D で解析＊解析中に講義を進め、昼食後に確認
鋳型構造の利用が困難な場合の解析
・ Fragment Assembly 法62

11:30～【演習】
SWISS-MODEL にて、任意の配列を解析
タンパク質の機能、構造解析
・ タンパク質機能・構造のオントロジー
生物学的機能、タンパク質局在、分子機能解析

11:45～

昼食

12:50～

タンパク質の立体構造予測
・ タンパク質機能予測の必要性
バイオ繊細設計例
・ 標的タンパク質同定
・ タンパク質機能同定方法
Direct assay、Expression pattern、Genomic interaction など
・ 機能予測のための方法
生物学的機能解析、タンパク質局在解析、分子機能解析
・ シグナルペプチドとタンパク質局在
・ モチーフ配列
正規表現、PROSITE、確率プロファイル、隠れマルコフモデル

13:16～【演習】
InterPro にて、任意の配列を持つタンパク質の局在を解析

13:23～

局在解析例
・ モチーフに依存しない解析例
・ 膜タンパク質トポロジー予測
・ 予測が難しい場合のアプローチ
分類学習、決定木、ニューラルネットワークなど

13:40～【演習】
・ PSORT II により、任意配列の局在解析
・ TMHMM による膜貫通トポロジー予測
・ SignalP によるシグナルペプチド予測は省略
・ CASTp による活性ポケット探索

13:45～

・ KEGG Ligand リサーチ

14:00～・ DrugBank による化合物探索
以降は、時間まで課題に取り組む63休憩
14:44～

タンパク質 リガンド結合予測
・ 創薬研究の推移
・ 化合物の多様性
・ 分子標的創薬のコンセプト
・ 分子標的創薬のコンセプト
・ ドッキング問題
・ リガンドドッキングについて
・ ドラッがぶるポケット予測・ タンパク質-リガンドドッキング・ スコアリングン形成

15:05～【演習】
AutoDock サイト（ver4）をもちいて、任意のリガンドとレセプターの結合を確認

64

AutoDock

3
autodock4.2.3_win32.exe
MGLTools-1.5.4-Setup.exe
python-2.5.2.msi
CC:¥docking

autodock4.2.3_win32.exe
C:¥Windows¥system32¥

C:¥docking¥C:¥docking¥system32¥
C:¥docking¥system32¥

C:¥docking¥3

autodock4.exe
autogrid4.exe
cygwin1.dll
python-2.5.2.msi

C:¥docking¥

MGLTools-1.5.4-Setup.exeC:¥docking¥commercial

NonContinue

3
PC
ID ¥

¥

C:¥

¥mi

AutoDock

AutoDockTools
AutoDockTools1.5.4
C:¥docking

Windows
docking

SHIFT

Formula

C29 H31 N7 O

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C24
Genome Data

•
–
–
–

-

2012 9 13

2012 9 13

10:20~11:50

12 50~14 20

14 40~16 10

FormulaC29 H31 N7 O

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C2© 2012 Takatsugu Hirokawa

1
2

1

3
4

-

Protein 3D-StructureWeb2012 9 133© 2012 Takatsugu Hirokawa

DNA

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaC29 H31 N7 O

Molecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C, RNA,rRNA
2

20

C

A

G

U

PHE
PHE
LEU
LEU

SER
SER
SERS
ER

TYR
TYR
STOP
STOP

CYS
CYS
STOP
TRP

U
C
A
G

C

LEU
LEU
LEU
LEU

PRO
PRO
PRO
PRO

HIS
HIS
GLN
GLN

ARG
ARG
ARG
ARG

U
C
A
G

A

ILE
ILE
ILE
MET

THR
THR
THR
THR

ASN
ASN
LYS
LYS

SER
SER
ARG
ARG

U
C
A
G

G

VAL
VAL
VAL
VAL

ALA
ALA
ALA
ALA

ASP
ASP
GLU
GLU

GLY
GLY
GLY
GLY

U
C
A
G

TYR

SER

1

tRNA

UCA
AGU

AUG
UAC

3

U

mRNA

2012 9 13© 2012 Takatsugu Hirokawa

52012 9 13© 2012 Takatsugu Hirokawa

6Formula

C29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
WeightC29 H31 N7 O
493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)CDNA
atgctggttctctttgtggccacatggagtgacctgggcctctgcaagaagcg
cccgaagcctggaggatggaacactgggggcagccgatacccggggcagggca
gccctggaggcaaccgctacccacctcagggcggtggtggctgggggcagcct
catggtggtggctgggggcagcctcatggtggtggctgggggcagccccatgg
tggtggctggggacagcctcatggtggtggctggggtcaaggaggtggcaccc
acagtcagtggaacaagccgagtaagccaaaaaccaacatgaagcacatggct
ggtgcagcagctggggcagtggtggggggccttggcggctacatgctgggaag
tgccatgagcaggcccatcatacatttcggcagtgactatgaggaccgttact
atcgtgaaaacatgcaccgttaccccaaccaagtgtactacaggcccatggat
gagtacagcaaccagaacaactttgtgcacgactgcgtcaatatcacaatcaa
gcagcacacggtcaccacaaccaccaagggggagaacttcaccgagaccgacg
ttaagatgatggagcgcgtggttgagcagatgtgtatcacccagtacgagagg
gaatctcaggcctattaccagagaggatcgagcatggtcctcttctcctctcc
acctgtgatcctcctgatctctttcctcatcttcctgatagtgggatga

MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGG
WGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIV
G 253

2012 9 137© 2012 Takatsugu Hirokawa

2012 913

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

KHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM
ATOM

91 N
92 CA
93 C
94 O
95 H
97 1HA
96 2HA
98 N
99 CA
100 C
101 O
102 CB
103 OG
104 H
105 HA106 1HB
107 2HB
108 HG
109 N
110 CA

GLY A 131
GLY A 131
GLY A 131
GLY A 131
GLY A 131
GLY A 131
GLY A 131
SER A 132
SER A 132
SER A 132
SER A 132
SER A 132
SER A 132
SER A 132
SER A 132
SER A 132
SER A 132
SER A 132
ALA A 133
ALA A 133

X

Y

Z

2.821
2.745
1.606
0.893
2.455
2.594
3.689
1.422
0.493
-0.965-1.3420.644-0.016
2.048
0.794
1.689
0.276
-0.050-1.822-3.251

4.466
5.753
5.767
4.770
4.395
6.541
5.945
6.899
7.011
6.730
6.647
8.417
8.579
7.679
6.286
8.605
9.157
9.548
6.688
6.451

6.486
7.168
8.191
8.360
5.548
6.435
7.678
8.878
9.998
9.606
8.431
10.596
11.8328.719
10.75110.7789.891
12.001
10.62210.5172012 9 131

9© 2012 Takatsugu Hirokawa

with

with

2012 9 13

2012 9132

C29 H31 N7 O

10 kcal/mol
100 kcal/mol

10© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
WeightC29 H31 N7 O
493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)Cwith

Mainly-alphaMainly-beta

8© 2012 Takatsugu Hirokawa

Alpha/Beta

Alpha+beta© 2012 Takatsugu Hirokawa

112012 913© 2012 Takatsugu Hirokawa

12Formula

C29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

(a)

(b)

(c)

C29 H31 N7 O

(d)

(f)

(e)

B
A

2012 9 1313© 2012 Takatsugu Hirokawa

2012 913C

14© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
WeightC29 H31 N7 O
493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

•

•

•

2012 9 1315© 2012 Takatsugu Hirokawa

DNA
P53

2012 913

16© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
WeightC29 H31 N7 O
493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)CDNA

Ser/His/Asp
catalytic triad

P53
182012 9 13© 2012 Takatsugu Hirokawa

17

2012 913© 2012 Takatsugu Hirokawa

18Formula

C29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
WeightC29 H31 N7 O
493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

•

•
1
•
3
2012 9 1319© 2012 Takatsugu Hirokawa

A)

C)

E)

B)

D)

F)

A

CPK

B
ConnollyC

TOPS

Wheelan et al., “Domain size distributions can predict domain boundaries”,
Bioinformatics, 2000.

3grs

D

20

© 2012 Takatsugu Hirokawa

C29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

http://www.spring8.or.jp/j/index.html

ConnollyE

http://www.jeol.co.jp/

21© 2012 Takatsugu Hirokawa

Protein Data Bank

13

FormulaF

2012 9 13

2012 92012 913

C29 H31 N7 O

http://www.varianinc.com/

etc

http://www.stanford.edu/gr
oup/pandegroup/folding/22© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
WeightIsomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Neuraminidase/Tamiflu

Isomeric
SMILES

C29 H31 N7 O
493.60 g/mol
Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

•
–

67656

2010

8

31

–

•

•
–

LigandExplorer2012 9 13© 2012 Takatsugu Hirokawa

23

2012 913© 2012 Takatsugu Hirokawa

24Formula

Protein Data Bank

C29 H31 N7 O

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

2

Protein Structure Prediction
Protein Modeling
Homology Modeling2012 9 1325© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
WeightC29 H31 N7 O
493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)CDNA
gtggctggggtcaaggaggtggcacccacagtcagtggaaca
agccgagtaagccaaaaaccaacatgaagcacatggctggtg
cagcagctggggcagtggtggggggccttggcggctacatgc
tgggaagtgccatgagcaggcccatcatacatttcggcagtg

ANCESTOR(aldolase)

Anfinsenurea

MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWG
QPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGG

HUMAN …SIAKRLQSIGTENTEENRRFYRQ…
FLY…TMGKRLQDIGVENTEDNRRAYRQ…
::.****.**.****:*** ***Fold state
Unfold state
Sequence to structure

LevinthalTime scale: ~msec
human

Not random diffusion

fly

Homologous sequence / Similar structure2012 9 1327© 2012 Takatsugu Hirokawa

2012 9

13

Folding pathway

28© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

6

C29 H31 N7 O

6DBAli Sali Group

5

4

5

3

2

1

4

0
0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Sequence Similarity (Identity; %)Remote Homologue
HUMAN PYQYPALTPEQKKELSDIAHRIVAPGKGILAADESTGSIAKRLQSIGTENTEENRRFYRQDROSO TTYFNYPSKELQDELREIAQKIVAPGKGILAADESGPTMGKRLQDIGVENTEDNRRAYRQ. :: * :.** :**::************** ::.****.**.****:*** ***3

HUMAN LLLTADDRVNPCIGGVILFHETLYQKADDGRPFPQVIKSKGGVVGIKVDKGVVPLAGTNGDROSO LLFSTDPKLAENISGVILFHETLYQKADDGTPFAEILKKKGIILGIKVDKGVVPLFGSED**:::* ::*.**************** **.:::*.** ::*********** *::.

Homologue
2

HUMAN ETTTQGLDGLSERCAQYKKDGADFAKWRCVLKIGEHTPSALAIMENANVLARYASICQQNDROSO EVTTQGLDDLAARCAQYKKDGCDFAKWRCVLKIGKNTPSYQSILENANVLARYASICQSQ*.******.*: *********.************::*** :*:**************.:

Analogue

HUMAN GIVPIVEPEILPDGDHDLKRCQYVTEKVLAAVYKALSDHHIYLEGTLLKPNMVTPGHACT
DROSO RIVPIVEPEVLPDGDHDLDRAQKVTETVLAAVYKALSDHHVYLEGTLLKPNMVTAGQS-A********:********.*.* ***.*************:*************.*:: :1Hydrolase

Growth Factor

HUMAN QKFSHEEIAMATVTALRRTVPPAVTGITFLSGGQSEEEASINLNAINKCPLLKPWALTFSDROSO KKNTPEEIALATVQALRRTVPAAVTGVTFLSGGQSEEEATVNLSAINNVPLIRPWALTFS:* : ****:*** *******.****:************::**.***: **::*******
HUMAN YGRALQASALKAWGGKKENLKAAQEEYVKRALANSLACQGKYTPSGQAGAAASESLFVSNDROSO YGRALQASVLRAWAGKKENIAAGQNELLKRAKANGDAAQGKYVAG--SAGAGSGSLFVAN********.*:**.*****: *.*:* :*** **. *.****... :..*.* ****:*

0
0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

16

Sequence Similarity (Identity; %)2012 9 13© 2012 Takatsugu Hirokawa

29

2012 913

HUMAN HAYDROSO HAY***

© 2012 Takatsugu Hirokawa

70%

30

Search and Optimization

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Potential Energy Surface•

CM

TargetTarget vs Template

•
•
•
•

•
•
•
•

Profile of Target vsTemplate•

Template

Profile of Target vsProfile of Template•• Fragment Assembly

•
•
•

•
•
•
•

C29 H31 N7 O

Threading200
FR

CM: comparative modeling
FR: fold recognition2012 9 1331© 2012 Takatsugu Hirokawa

2012 91332© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
WeightC29 H31 N7 O
493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

i
A
B
C
D
E
F
G

Target vs Template

i-2
A
R
N
D
C
Q
E
G
H
I
L
K
M
F
P
S
T
W
Y
V

i-1
0
0
0
85
0
0
9
0
0
0
0
0
0
0
0
2
4
0
0
0

2012 9 13

i
1
54
2
4
1
0
0
0
1
2
5
20
2
0
0
0
0
3
4
1

i+1
0
0
0
1
3
7
2
8
0
0
44
0
12
20
0
1
2
0
0
0

Profile of Target vsTemplate

i+2log-odds

BLAST FASTA

PSI-BLAST e-value< 10-10

Profile-Profile &2D 3DProfile of Target vsProfile of Template

Threading33© 2012 Takatsugu Hirokawa

2012 913

FFAS03 FORTE FUGUE 3D-PSSM
INBGU Sam-T99 HMAP

Sippl-Potential LIBRA GenTHREADER

34© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C&C29 H31 N7 O

no

&
yes

2012 9 13© 2012 Takatsugu Hirokawa

35

2012 913© 2012 Takatsugu Hirokawa

36Formula

C29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C•3•

g-, t,g+– Backbone-independent– Secondary structure-dependent– Alpha-helix, beta-sheet , coil
– Backbone-dependent–
2012 9 13

xi

xj

2

yi

yj

2

zi

2

z j , i, j

pe, poPreflexregion• PDB
preflex, postflexr

Rotamer library
Rotamer library•

Flex region

preflex, postflex
d ij

C

2
d ij
N N 1 i pe, po j pe , po , j 1

Dc2

C
C

C

•

C29 H31 N7 O

d rcc i rc j

2

, i, jpe, poPostflex
region/Lys: g+,g+37© 2012 Takatsugu Hirokawa

2012 91338© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
WeightC29 H31 N7 O
493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)Cbond stretch•

angle bend–––

benchmark analysis by SBC&

MODELLER Sali, 1993
SegMod Levitt, 1992

torsion

Nest Honig, 2003
VPEF
bonds

ki
2
li l0 ,i2angles

ki
2

2
0 ,i

i

torsions
N

12

N

4 ij
i 1 j i 1

2012 9 13SCRWL Dunbrack, 1997Vn
1 cos n
2
6

ij

ij

rij

rij

Other methods:
Swiss-MODEL, 3D-Jigsaw, Builder

qi q j
4

r

0 ij

39

© 2012 Takatsugu Hirokawa

2012 91340© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
WeightC29 H31 N7 O
493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

no

yes

Environment Based Method
Verify3D

Pair Potential Based Method
Prosa II or Prosa2003

2012 9 13© 2012 Takatsugu Hirokawa

41

2012 913© 2012 Takatsugu Hirokawa

42

Verify3D

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Search and Optimization

3

•
6
E

0

40

80

)

120

E
P2

0.80

B3

B1

0.60

B2

P1
B2

B3

B1

S aj

log

Pa: j

0.40

Fraction Polar

P2

43

Fragment Assembly2012 9

•
•
•
•

•
•
•
•

0.20

© 2012 Takatsugu Hirokawa•• Fragment Assembly

0

Pa

•
•
•

•
•
•
•

1.00

P1

2012 9 13

Potential Energy Surface•

18
Area Buried (C29 H31 N7 O

200

13

44

© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
WeightC29 H31 N7 O
493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

1. Select fragments
consistent with local
sequence preferences
2. Assemble fragments
into models withnative-like global
properties
3. Identify the bestmodel from the
population of decoys

Baker
CASP6
T0281

http://www.stanford.edu/group/pandegroup/folding/

Dr. Strauss Santa Fe,2002
2012 9 1345© 2012 Takatsugu Hirokawa

2012 91346© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

SWISS-MODEL

C29 H31 N7 O•
MAALDSLSLFTSLGLSEQKARETLKNSALSAQLREAATQAQQTLGSTIDKATGILLYGLASRLRDTRRLSFLVSYIASKKIHTEPQLSAALEYVRSHPLDPIDTVDFERECGVGVIVTPEQIEEAVEAAINRHRPQLLVERYHFNMGLLMGEARAVLKWADGKMIKNEVDMQVLHLLGPKLEADLEKKFKVAKARLEETDRRTAKDVVENGETADQTLSLMEQLRGEALKFHKPGENYKTPGYVVTPHTMNLLKQHLEITGGQVRTRFPPEPNGILHIGHAKAINFNFGYAKANNGICFL
RFDDTNPEKEEAKFFTAICDMVAWLGYTPYKVTYASDYFDQLYAWAVELIRRGLAYVCHQRGEELKGHNTLPSPWRDRPMEESLLLFEAMRKGKFSEGEATLRMKLVMEDGKMDPVAYRVKYTPHHRTGDKWCIYPTYDYTHCLCDSIEHITHSLCTKEFQARRSSYFWLCNALDVYCPVQWEYGRLNLHYAVVSKRKILQLVATGAVRDWDDPRLFTLTALRRRGFPPEAINNFCARVGVTVAQTTMEPHLLEACVRDVLNDTAPRAMAVLESLRVIITNFPAAKSLDIQVPNFPADETKGFHQVPFAPIVFIERTDFKEEPEPGFKRLAWGQPVGLRHTGYVIELQHVVKGPSGCVESLEVTCRRADAGEKPKAFIHWVSQPLMCEVRLYERLFQHKNPEDPTEVPGGFLSDLNLASLHVVDAALVDCSVALAKPFDKFQFERLGYFSVDPDSHQGKLVFNRTVTLKEDPGKV•– SWISS-MODEL•••2012 9 13or© 2012 Takatsugu Hirokawa

47

2012 913© 2012 Takatsugu Hirokawa

48

Formula

C29 H31 N7 O

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

3

Protein Function Prediction
Annotation
Sequence/Structure Motif2012 9 1349© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
WeightC29 H31 N7 O
493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C•–

Ubiquitin carboxylterminal hydrolase
isozyme L1
UCH-L1•–––(Biological process)(Cellular component)
Molecular function•–––2012 9 1351© 2012 Takatsugu Hirokawa

2012 91352© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Gene Ontology•

C29 H31 N7 O

Biological Process– Text mining, Pathway, etc.

•

Cellar Component– Localization site prediction• Amino acid composition, Motif, hydrophobicity•

Molecular Function– Sequence similarity, Fold similarity, Structure
Prediction– Function prediction using structure imformation2012 9 13© 2012 Takatsugu Hirokawa

53

2012 913© 2012 Takatsugu Hirokawa

54Formula

C29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
WeightC29 H31 N7 O
493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

•
–
–

•
–

•
–

•
–

UCH-L1
2012 9 1355© 2012 Takatsugu Hirokawa

2012 913

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Computational design of receptor andsensor proteins with novel functions,
Nature 423, 185 - 190 (2003)

Comparative
GenomeGene Ontology• Wild-type

Disease12-18
1045TNT

GenomeGenomeGenomeAnnotation
Annotation
Annotation

Biological Process
Cellular Component

Characterization

Molecular Function

• DEE
1

vs 3

20

2012 9 13

Drug Discovery

Chemical Resource

357© 2012 Takatsugu Hirokawa

2012 91358© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C• Direct assay•– Enzyme assays, in vitro reconstitution, immunofluorescence, etc.

C29 H31 N7 O

Cellular Component– Localization site prediction• Expression pattern• Amino acid composition, Motif, Hydrophobicity– Microarray data, northern, western blots, etc.

• Genetic interaction•– Suppressors, synthetic lethals, functional complementation, etc.
– Gene mutation/knockout, anti-sense experiments, RNAi
experiments, etc.

• Physical interaction•– 2-hybrid interaction, co-purification, co-immunoprecipitation

Biological Process– Text mining, Pathway, etc.

• Computational analysis© 2012 Takatsugu Hirokawa

Molecular Function– Sequence similarity, Fold similarity, Structure
Prediction– Function prediction using structure information• Mutant phenotype

2012 9 13C29 H31 N7 O

Genome Resource•

1015-1023
1068
L-Lactate Serotonin

56© 2012 Takatsugu Hirokawa

59

2012 913© 2012 Takatsugu Hirokawa

60Formula

C29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
WeightC29 H31 N7 O
493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Localization site
Cytoskeleton
Cytoplasma
Nuclear
MitochondriaER
Golgi
VacuolePlasma membrane
Peroxisomal
Extracell2012 9 13

mRNA

61

© 2012 Takatsugu Hirokawa

2012 913

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Protein Engineering 10, pp.1–6, 1997
Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides andprediction of their cleavage sites
Henrik Nielsen, Jacob Engelbrecht, Søren Brunak and Gunnar von Heijne

PROSITE

X
[AGL]
{CH}

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

C

A

C

a

a

a

c

g

A

G

A

B

C

A

C

a

t

g

g

-

A

G

T

C

C

A

A

t

c

t

a

-

A

G

A

D

G

A

C

c

g

c

t

-

A

G

A

E

C

A

C

a

c

t

-

-

A

G

A

C/G
63

© 2012 Takatsugu Hirokawa

2012 9Cys Hisx-x-xx(1,3)

x or x-x or x-x-x

<

N

.

C

CACnnnnAGA GAAnnnnAGT

C/A

A

G

A/T
64

© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

C

A

C

a

a

a

c

g

A

G

A

B

C

A

C

a

t

g

g

-

A

G

T

C

C

A

A

t

c

t

a

-

A

G

A

D

G

A

C

c

g

c

t

-

A

G

A

E

C

A

C

a

c

t

-

-

A

G

A

4

[RK]-x(2,3)-[DE]x(2,3)-Y.

>

KLRACEDEEYRE

C29 H31 N7 O

A

1

2

3

A

0

1.0

0.2

x(3)

A

13

PROSITE
Ala or Gly or Leu

C29 H31 N7 O

AnFig. 1. Sequence logos (Schneider and Stephens, 1990) of signal peptides,aligned by their cleavage sites. The total height of the stack of letters at eachposition shows the amount of information, while the relative height of eachletter shows the relative abundance of the corresponding amino acid. The
information is defined as the difference between the maximal and actual entropynj( )/Nj log2 nj( )/Nj, where(Shannon, 1948): Ij 5 Hmax 2 Hj 5 log220 1
nj( ) is the number of occurrences of the amino acidand Nj is the total
number of letters (occupied positions) at position j. Positively and negatively
charged residues are shown in blue and red respectively, while uncharged polar
residues are green and hydrophobic residues are black.

2012 9 1362© 2012 Takatsugu Hirokawa

5

6

7

8

C

0.8

0

0.8

G

0.2

0

0

T

0

0

0

-

0

0

0

0

0

0.2

0.75

0

--

0

0

0

0

0

0

0

1.0

0.25

9

10

11

1.0

0

0.8

0

0

0

0

1.0

0

0

0

0.2

0

0

0

0

0

0

n
2012 9 13© 2012 Takatsugu Hirokawa

65

2012 913© 2012 Takatsugu Hirokawa

66Formula

C29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

HMM

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

A

C

A

C

a

a

a

c

g

A

G

A

B

C

A

C

a

t

g

g

-

A

G

T

C

C

A

A

t

c

t

a

-

A

G

A

D

G

A

C

c

g

c

t

-

A

G

A

E

C

A

C

a

c

t

-

-

A

G

A

InterPro

C29 H31 N7 O

0.75

1.0
1.0 A
1.0 A 1.0 1.0 A 0.2
C
C 0.8
C 0.8
G
G
G 0.2
T
T
T

2012 9 13

A 0.25
C 0.25
G 0.25
T 0.250.25
A 1.0 1.0 A
1.0 A 0.8 1.0
C
C
C
G
G 1.0
G
T
T
T 0.2

67

© 2012 Takatsugu Hirokawa

InterPro

2012 91368© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

InterPro

C29 H31 N7 O

EGFR_HUMAN.fasta

http://www.ebi.ac.uk/interpro/

email

PF: Pfam(Sanger) PD:ProDom
PS:PROSITE
PR:PRINTS(SPRINT)
SM:SMART
SS:Superfamily
PIRSF: PIR
2012 9 13

2012 9 1369© 2012 Takatsugu Hirokawa© 2012 Takatsugu Hirokawa

2012 91370© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

71

2012 913© 2012 Takatsugu Hirokawa

C29 H31 N7 O

72

Formula

C29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
WeightC29 H31 N7 O
493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C2

Evaluation Cross validation, Jack knife
NN

or NOTor NOT
Disorder or NOT
Helix,Sheet,Coil2012 9 1373© 2012 Takatsugu Hirokawa

P LS i2012 9

13

HMM

74

© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)CP LS ia1 , a2 , a3, ...a N–K

C29 H31 N7 O

a1 , a2 , a3, ...aN

–K

–

–
3

2012 9 1375© 2012 Takatsugu Hirokawa

2012 91376© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)CNN

C29 H31 N7 O

• Back Propagation–––

Atom charge 9< -0.1-0.1

Dipole moment

Atom charge 4< 4.43

4.43

Atom charge 1

I< -0.139
A< 0.038< 8.83-0.139I© 2012 Takatsugu Hirokawa

–

8.83
A

ClogP

I

A

Principal Axis X

1.48

2012 9 13

0.038

NN

–

< 1.48xn

A

77

2012 913

x1, x2, …,© 2012 Takatsugu Hirokawa

78

SVM

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C••C29 H31 N7 O

RN

xi

z3

xi

RN

yi

1 or

y

sgn w

x

x2

b
x

1

RH

z1

z1 , z 2 , z32012 9 1379© 2012 Takatsugu HirokawakNN

2012 913

x12 , x22 , 2 x1 x2

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C81© 2012 Takatsugu Hirokawa

SignalP80© 2012 Takatsugu Hirokawa

PSORT II2012 913

C29 H31 N7 O

ESR1_HUMAN.fasta

http://psort.hgc.jp

2012 9 13

z2

x1

82

© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

http://www.cds.dtu.dk/services/SignalP/

TMHMM
http://www.ebi.ac.uk/services/TMHMM/

7B2_HUMAN.fasta

C29 H31 N7 O

5HT2A_HUMAN.fasta

HMM

2012 9 13© 2012 Takatsugu Hirokawa

83

2012 913© 2012 Takatsugu Hirokawa

84

Disorder

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)CDISOPRED

C29 H31 N7 O

Ward et al., J Mol Biol, 2004

Disorder- DNA/RNA/protein recognition- Modulation of specificity/affinityof protein binding- Molecular threading- Activation by cleavage
DisorderSVM
DISOPRED
PONDR2012 9 1385© 2012 Takatsugu Hirokawa

2012 913

86© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)CCASTp

C29 H31 N7 O

1. Computational Geometry: Voronoi Diagram,
Delaunay Triangulation, and Alpha Shape

•
X

NMR

Empty Delaunay triangulation•

2. Discrete Flow

– LIGSITE– PASS– CASTp– PocketFinder2012 9 13

staphyloccocal nuclease
Binding site
Jiang et al.,1998

CASTp

87

© 2012 Takatsugu Hirokawa

CASTp

2012 913

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Jiang et al., Protein Sci. 1998
© 2012 Takatsugu Hirokawa

88© 2012 Takatsugu Hirokawa

CASTp
http://sts.bioengr.uic.edu/castp/index.php

2012 9 13

alpha shapeCPK ,C29 H31 N7 O

1HIV

Upload89

2012 913© 2012 Takatsugu Hirokawa

90Formula

C29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
WeightC29 H31 N7 O
493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/data/scop.b.html
Threading

Class

All

All

Sandwitch
Fold
Immunoglobulin
Super
FamilyV set domain
FamilyP53/DNA
PyMOL
2012 9 13

Protein
Domain

1TUP

91© 2012 Takatsugu Hirokawa

2012 913

N-terminal domain

92© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
WeightC29 H31 N7 O
493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Kinome (Manning et al., Science, 2002)

HMM psi-blast

2012 9 1393© 2012 Takatsugu Hirokawa

2012 913

94© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

KEGG

KEGG Ligand

C29 H31 N7 O

http://www.genome.ad.jp/kegg/ligand.html

uric acid2012 9 13© 2012 Takatsugu Hirokawa

95

2012 913© 2012 Takatsugu Hirokawa

96Formula

C29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
WeightC29 H31 N7 O
493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)CCOMPOUND

Urate
Homo sapiens(human)Go
2012 9 1397© 2012 Takatsugu Hirokawa

2012 91398© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
WeightC29 H31 N7 O
493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

BLAST FASTA

2012 9 1399© 2012 Takatsugu Hirokawa

DrugBank

2012 913100© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

DrugBank

C29 H31 N7 O

http://redpoll.pharmacy.ualberta.ca/drugbank/• Wishart et al., NAR, 2006••

dopamine

4100
DrugCardID•

2012 9 13

Web© 2012 Takatsugu Hirokawa

101

2012 913© 2012 Takatsugu Hirokawa

102

DrugBank

2012 9 13

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C103© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaDrugBank

2012 913

C29 H31 N7 O

104

© 2012 Takatsugu Hirokawa

C29 H31 N7 O

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

•

4

–
Zn

-

•

Ligand Docking
Docking Simulation
Structure-Based Drug Design•2012 9 13105© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

•
•
•

1940

2 2
30
60

“the total number of possible smallorganic molecules that populate'chemical space' has been
estimated to exceed 1060 — an

1960
1970

amount so vast when compared to
the number of such molecules wehave made, or indeed could everhope to make, that it might as well
be infinite.”

1980

2000
2012 9 13C29 H31 N7 O

Nature 432, 823, 2004
© 2012 Takatsugu Hirokawa

107

2012 913

Nature 432, 823 (16 December 2004)
Nature chemical space© 2012 Takatsugu Hirokawa

108Formula

C29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
WeightC29 H31 N7 O
493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C•–
Emil Fischer, 1894

• Structure-based drug
design(SBDD)
–X
NMR
–

Nature 432, 824-828(16 December 2004)

Friesner et al.,J. Med. Chem., 2006

2012 9 13109© 2012 Takatsugu Hirokawa

2012 913110© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)CEntry

C29 H31 N7 O

•
–
–
–

5-FU

structure-based drug design•

Emil Fischer

2012 9 13

1960

1894

2012 9 13

DNA RNA111© 2012 Takatsugu Hirokawa© 2012 Takatsugu Hirokawa

2012 913112© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

113

2012 913© 2012 Takatsugu Hirokawa

C29 H31 N7 O

114

Formula

C29 H31 N7 O

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

A
B

F
C
E
D

2012 9 13115© 2012 Takatsugu Hirokawa

2012 913116© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

SBDD

C29 H31 N7 O

Protein ligand binding mechanisms
LL(a) Lock and key model

L

Targeting Structural Flexibility in HIV-1 proteaseinhibitor binding (DDT 12, 2007)

LL(b) Induced-fit model (KNF model)
Myosin-Actin, G subunit-RGS14,
Flis-FliC

L

LL(c) Pre-existing equilibrium model (MWC model)
Antibody Spe7-TrxShear3, Gplb-IX-V-Thrombin, NtrC-P
C.-S. Goh et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 14, 2004.

2012 9 13117© 2012 Takatsugu Hirokawa

2012 913118© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
WeightC29 H31 N7 O
493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

•

•

–
–

•
–
–

• native/non-native
•

rigid

–
–

•
•

vs

–

2012 9 13© 2012 Takatsugu Hirokawa

1192012 913© 2012 Takatsugu Hirokawa

120Formula

C29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
WeightC29 H31 N7 O
493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

PLB index• Propensity for Lligand
Binding index Soga etal., JCIM, 2007
• 41
X
Training Set

1.

Figure 2. Normalized composition of the 20 standard amino acids.
Blue: composition at the ligand-binding sites of the proteins in the
training data set (CA). Red: composition on the surface of the proteinsin the test data set (SA).

CASTp etc

• Test Set

2.

804
86%

DOCK

•

MOE
Alpha Site Finder

LUDI FlexX
2012 9 13121© 2012 Takatsugu Hirokawa-

2012 913

Figure 3. Preference factors for the 20 standard amino acids (RA )CA/SA).

122© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
WeightC29 H31 N7 O
493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

N

Gbind

R

G0

Ghb

f

r,

H bonds

Gionicfr,ionic int

N

N

Glipo AlipoR
2009 6 5
2012 9 13

R
123
123

© 2012 Takatsugu Hirokawa• QM/FEP/TI– Force field based– MM/PBSA

13

124© 2012 Takatsugu Hirokawa

C29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)CC29 H31 N7 O•–

Months

Accuracy• Molecular Mechanics

2012 9FormulaCPU time– Quantum Mechanics– Free Energy Perturbation– Thermal dynamics
integration

Grot N rot••• Induced Fit Docking

MD:Weeks–
MD/MC:days•• Empirical•– Empirical function– Knowledge-based

Minute–optimization

Pealman et.al., J. Med. Chem. 2001, 44, 3417-3423.
2012 9 13© 2012 Takatsugu Hirokawa

1252012 913© 2012 Takatsugu Hirokawa

126

AutoDock• AutoDock

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

AutoDock 4.0

C29 H31 N7 O

ver.4

– http://autodock.scripps.edu/•–
autodock4.2.3_win32.exe
MGLTools-1.5.4-Setup.exe
python-2.5.2.msi GUI•

GUIC:¥docking–
Biotin-Streptavidin

PDB-ID: 1MK5•

1MK5_A_rep.pdb
1MK5_A_lig.pdb–
2012 9 13127© 2012 Takatsugu Hirokawa

AutoDock 4.0

2012 913128© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
WeightC29 H31 N7 O
493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

autodock4.2.3_win32.exe–

C:¥Windows¥system32¥
C:¥docking¥C:¥docking¥system32¥

C:¥docking¥C:¥docking¥autodock4.exe autogrid4.exe cygwin1.dll

python-2.5.2.msi–

C:¥docking¥

MGLTools-1.5.4-Setup.exe– MGLTools
C:¥docking¥Non commercial
ID ¥– AutoDockTool
C:¥docking
2012 9 13129© 2012 Takatsugu Hirokawa

Streptavidin
Streptavidin

2012 913130© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
WeightC29 H31 N7 O
493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Streptomyces avidinii

1. ADT:Ligand/Input/Open…

Kd
10-15 mol/L

all files
1MK5_A_lig.pdb[OK]53,0004

1

2. ADT:Ligand/TorsionTree/D
etect Root…
3. ADT:Ligad/TorsionTree/Ch
oose Torsions…[Done]
4. Ligand/Output/Save as
PDBQT…

NeutrAvidin

DNA
DNA RNADNA

1MK5_A_lig.pdbqt

5. Dashbord Show/Hide [off]ELISA2012 9 13

Continue
C:¥USERS¥guest¥© 2012 Takatsugu Hirokawa

1312012 913© 2012 Takatsugu Hirokawa

132

Formula

C29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

1. ADT:Grid/Macromolecule/Open•–
all files– 1MK5_A_rep.pdb–[OK]–– 1MK5_A_rep.pdbqt

2. ADT:Grid/Set Map Types/Choose
Ligand…

C29 H31 N7 O

C:¥docking

C:¥docking>C:¥docking>autogrid4.exe –p 1MK5_A_rep.gpf –l1MK5_A_rep.glg [Enter]– Select a molecule: 1MK5_A_lig [SelectLigand]3. ADT:Grid/Grid Box…
– Ceter/Center on Ligand– 1MK5_A_lig Show/Hide [on]autogrid4.exe: Successful Completion– File/close saving current

4. ADT:Grid/Output/Save GPF– 1MK5_A_rep.gpf []2012 9 13133© 2012 Takatsugu Hirokawa

2012 913134© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

1. ADT:Docking/Macromolecule/Set
Rigid Filename•

C29 H31 N7 O

C:¥docking– 1MK5_A_rep.pdbqt

2. ADT:Docking/Ligand/Choose/– 1MK5_A_lig [Select Ligand],[Close]C:¥docking>C:¥docking>autodock4.exe –p 1MK5_A_lig.dpf –l1MK5_A_lig.dlg [Enter]

3. ADT:Docking/SearchParameters…/Genetic
Algorithm…
– Maximum Number of evals: short[Accept]

4. ADT:Docking/Docking
Parameters…
5. ADT:Docking/Output/Lamarckian
GA…

autodock4: Successful Completion on …

– 1MK5_A_lig.dpf
2012 9 13135© 2012 Takatsugu Hirokawa

1.

Edit

13

136

© 2012 Takatsugu Hirokawa

FormulaC29 H31 N7 O

FormulaMolecular
Weight493.60 g/mol

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)CC29 H31 N7 O

1. ADT:Analyze/Macromolecule/Open
…

ADT

–

2. ADT:Analyze/Dockings/Open…

2. ADT:Dashbord/MS– 1MK5_A_rep–– 1MK5_A_lig.dlg

3. ADT:Analyze/Conformations/
Load…

[on/off]

3. ADT:Dashbord/Rib– 1MK5_A_rep–– 10

4. Analyze/Clusterings/Show…
–

2012 9[on/off]

4. ADT:Analyze/Dockings/Show
Interactions

2.0 rms––

2012 9 13– Conformation play

conformation player© 2012 Takatsugu Hirokawa

137

2012 913© 2012 Takatsugu Hirokawa

138Formula

2012 9 13© 2012 Takatsugu Hirokawa

C29 H31 N7 O

Molecular
Weight493.60 g/mol

Isomeric
SMILES

Cc1ccc(cc1Nc2nccc(n2)c3cccnc3)
4ccc(cc4)CN5CCN(CC5)C139

bitools.html
Useful tools and database for protein bioinformatics
GenomeNet
NCBI FTP
KEGG
Sequence Analysis
o

BLAST

o

Primer3oClustalX(exetutable only) and sequences

Localization Predictiono

SignalP and query sequenceo

PSORT and query sequenceoInterPro and query sequenceo

TMHMM and query sequence

Structure PredictionoProtein Data Banko

RasMolo

SWISS-MODEL and query sequenceo

SWISS-MODEL resultsoVerify3D

Function Predictiono

SWISS-MODEL outputoCatalytic Site Atlas

o

CASTp

Target Databaseo

DrugBank

2012

9 13

LigandExplorer

Search© 2012 Takatsugu Hirokawa

PDB

DrugBank
DrugBank/Search/ChemQuery/Structure140