牧野・太田・中川：反復UVA1曝露に応答するヒト真皮線維芽細胞とヒト表皮角化細胞のプロテオーム解析

報文

反復UVA1曝露に応答するヒト真皮線維芽細胞とヒト表皮角化細胞のプロテオーム解析&RPSDUDWLYHSURWHRPHDQDO\VHVRIQRUPDOKXPDQGHUPDO¿EUREODVWVDQGLPPRUWDOL]HG
human epidermal HaCaT keratinocytes in response to repetitive UVA1 exposures

牧野正知*，太田ゆかり*，中川れい子＊＊

皮膚は紫外線によって老化し，その結果生じた表現系変化を光老化という．我々は光老化度を推定するためのバイオマーカー候補蛋白質の同定を見据え，紫外線曝露により発現変動するヒト培養皮膚細胞のプロテ
オーム解析を試みた．本研究では紫外線の種類および曝露量について検討し，皮膚への透過率の高い長波長
紫外線（UVA1）を用いることにした．正常ヒト真皮線維芽細胞（NHDF 細胞）と不死化ヒト表皮角化細胞（HaCaT 細胞）にそれぞれ 1 日あたり 5.0 J/㎠で一定期間反復曝露させ，これらを測定試料とした．蛋白質の同定ならびに相対定量解析には，安定同位体標識を用いた定量的ショットガンプロテオミクスを採用した．
強陽イオン交換カラムによる分画を経て nano-LC/MS/MS 分析したところ，NHDF 細胞試料を分析したデー
タセットと HaCaT 細胞試料を分析した．それから，それぞれ 1,472 蛋白質と 1,582 蛋白質を同定し，そのう
ち比較定量解析から発現変動蛋白質としてそれぞれ 62 蛋白質と 16 蛋白質を見出した．このうちコラーゲンやヘムオキシゲナーゼ 1 などは他の研究で報告されている変動方向と一致していた．今回新規に見出した蛋
白質は今後で光老化した皮膚を検証する上での手がかりになると考えられる．

ギーは皮膚内部の核酸や蛋白質，脂質など様々な生体高分

1．はじめに子に吸収されラジカルや ROS を惹起する．これらは，二皮膚は体の表面全体を覆うことで境界を形成するととも次的に多くの生体高分子を傷つけた結果，DNA 損傷に基に，外部刺激に対しての感知・応答，熱の交換，物質の透づく変異ダメージの発生，持続的なメラニン合成刺激，細過排泄といった多機能性を有する人体最大の臓器組織であ

胞膜機能障害，酸化障害，糖化の促進，脂質過酸化による

1）

る ．他の臓器と同様に経時的に老廃物の蓄積，遺伝子のリポフスチンの蓄積，真皮エラスチン・コラーゲンの変性

損傷・変異，機能性蛋白質の劣化，細胞内シグナル伝達のなどに至る．また UV は MAPK 経路を刺激し，マトリッ

破綻などから皮膚の生理機能は低下し，やがて組織障害をクスメタロプロテアーゼ類（以下 MMPs と略す）の発現

惹起し形態異常を伴った退行性変化に至る．その原因の一を亢進するとともに，コラーゲン生合成量を下方制御するつは酸化的代謝の過程で発生する活性酸素種（以下 ROS

5‒7）

2）

．これら複数の要因から出現する局所的な色素沈着，小と略す）による内因性ダメージの蓄積と考えられている ．

色素斑やシワ，弾性線維症といった表現系変化は光老化と一方，皮膚は外界に露出している特徴上，外的ストレスに呼ばれる 8）．

直接的に曝されるため，環境要因に依存した老化現象が上

UV は長波長側から UVA1
（340‒400 nm），
UVA2（320‒340

乗せされる運命にある．代表的な環境因子は，タバコの煙，

nm），
UVB（280‒320 nm），
UVC（100‒280 nm）に分類され，環境ホルモンやホルムアルデヒドなど化学因子と，乾燥やこの中で最もエネルギーが高い UVC は，大気中のオゾン

気温の変化，
電離放射線，
赤外線や紫外線（以下 UV と略す）

層や酸素分子によって吸収されるため地表には届かず光老3）への曝露といった自然因子である ．

化には寄与しない．一方，UVB は UVA よりエネルギーが皮膚への UV 曝露はビタミン D 生合成における 7- デヒ

1,000 倍程度高く，核 DNA を直接的に酸化損傷する 9）．まドロコレステロールからプレビタミン D への変換に必須でた表皮角化細胞や真皮線維芽細胞において誘導型一酸化窒4）あることから生体にとって有益である反面 ，そのエネル

素合成酵素（iNOS），オルニチン脱炭酸酵素，シクロオキ
シゲナーゼ 2（COX- 2 ）などの蛋白質や腫瘍壊死因子（TNF-* 高齢化社会対応の機能性素材開発プロジェクトチーム（現：生物機能応用技術開発プロジェクトチーム），** 理化学研究所ライフサ
イエンス技術基盤研究センター（現：理化学研究所 生命機能科学
研究センター）α），インターロイキン，プロスタグランジンといった炎症性サイトカインの発現を誘導する．それらは皮膚炎症や免疫抑制，ひいては皮膚癌を引き起こすことから 10），UVB―1―

島根県産業技術センター研究報告
は皮膚老化の主要因だと考えられてきた．一方，UVA の第57号 （2021）

5.0 J/㎠の単回曝露による NHDF 細胞あるいは HaCaT 細エネルギーは UVB のそれと比較して低いため，UVB ほど胞内で発生する ROS 量は，ジヒドロエチジウム（以下直接的かつ急性的な反応を惹起することはない．しかし真DHE と略す，Life technologies）を用いたハイコンテンツ

皮組織において ROS を発生させ，間接的に真皮蛋白質のイメージングで評価した．すなわち 96 穴プレートにてそ変性，脂質過酸化反応や DNA 損傷などを誘発するほか，

れぞれの細胞をコンフルエントまで培養したのち，培地にROS 感受性シグナル伝達経路を刺激して蛋白質分解酵素群

よる UVA1 吸収効果を除くため細胞を 200 µL のリン酸緩の発現を誘導するため，幾分か光老化に寄与していると見衝生理食塩水（以下 PBS と略す，Takara ）で一度洗い，なされていた11）．しかし近年になって UVA の特徴である
12）

再び 100 µL の PBS で保護したのち細胞の上方から UVA1

，緯度，天候，オゾン層の厚みなどにを 5.0 J/㎠曝露させた．曝露後は速やかに 30 µM の DHE

対する輝度の影響の受けにくさ 13），太陽光中の UVA の豊を含む PBS に置換し，遮光して 30 分間 CO2 インキュベー

富さなどを考慮して皮膚への影響が見直された結果，UVA

タ内で静置した．なお UVA1 を曝露させず 10 mM の過による光老化は無視できないと考えられるようになってき酸化水素（Wako）を含む PBS に 30 分間置換したものと，

皮膚透過力の高さ

14）

同じく UVA1 を曝露させずに PBS に置換しただけのも

島根県産業技術センターでは 2013 年度から 5 年間取りのを用意し，それぞれを陽性，陰性対照とした．その後，組んだ高齢化社会対応の機能性素材開発プロジェクトと，細胞個々の蛍光強度を Cytell で測定し，ソフトウェア IN

それを発展させ 2018 年度からスタートした生物機能応用

Cell Investigator（いずれも GE healthcare）で解析した．

技術開発プロジェクトにおいて，スキンヘルスケアに関連

2.4 UVA1 反復曝露と細胞生存率の関係た．

する素材開発を進めている 15）．その中で我々は皮膚内部

NHDF 細胞および HaCaT 細胞の UVA1 反復曝露に対すで潜在的に進行している光老化の新規推定法の開発を念頭る影響はヨウ化プロピジウム（以下 PI と略す，Dojindo）に，ショットガンプロテオーム解析によって反復 UVA1 曝染色法による細胞生存率により評価した．96 穴プレートに露の影響を受ける培養皮膚細胞中の蛋白質を明らかにした

コンフルエントまでそれぞれの細胞を培養し，上記と同様ので報告する .

に PBS で処理してから UVA1 を 5.0 J/㎠曝露させた．引き続き速やかに培地に置換して 4 時間 CO2 インキュベータ

2．試料および方法で保持した後，細胞生存率を評価する細胞においては既報

2.1 細胞および培養方法

21）

本研究ではヒトの真皮線維芽細胞と表皮角化細胞としと同様にヘキスト 33342（Dojindo）と PI を含む培地に交換したのちハイコンテンツイメージングにより細胞生存て，それぞれ正常ヒト真皮線維芽細胞（以下 NHDF 細胞率を求めた．なお，一度細胞生存率を評価した細胞においと略す，ロンザ）とヒト不死化表皮角化 HaCaT16）細胞（以ては以後用いないこととし，この操作を 9 日間繰り返した．

下 HaCaT 細 胞 と 略 す，German Cancer Research Center

陰性対照は培養プレートをアルミ板で覆うことで UVA1

（DKFZ））とを選択した．それぞれの細胞は，10％（v/v）

を遮光し，上記と同様の操作を 9 日間繰り返したものと牛胎児血清（GIBCO）を含有した MEM 培地（Sigma-Aldrich）

した（sham と略す）
．0 mJ/㎠の試験区における細胞生存と D-MEM 培地（4.5 g/L glucose 含有，Cell Lines Service）

率と UVA1 曝露区（Sham を含む）のそれらとの比較は，とを用い，CO2 インキュベータ（ 5 ％（v/v）CO2，37 度）

Dunnett の多重比較法により検定することとし， <0.05 の内で培養した．

場合を有意とした．

2.2

2.5

UVA1 ランプと分光分布測定

UVA1 を反復曝露させた細胞試料の調製

本研究では UVA1 の光源としてブラックライト（USHIO，

は じ め に NHDF 細 胞 と HaCaT 細 胞 を 150 ㎜ デ ィ ッ

F15T8BLB） を 選 択 し た． そ の ス ペ クト ル 分 布 は 小 型

シュ（住友ベークライト）上でコンフルエントまで培養しファイバ 光 学 分 光 器（USB2000，Ocean Optics）で 測 定

た．このとき細胞数は単層で 5 × 106 cells 以上であった．

し，365 nm における輝度は，細胞へ照射する直前に毎回次に細胞を 10 mL の PBS で一度洗浄したのち再び 20 mL

Radiometer Sensor UVX-36（UVP）を用いて測定した．

の PBS で保護してから，速やかに上方から一日あたり

2.3 UVA1 単回曝露による活性酸素量の推定

UVA1 を 5.0 J/㎠となるよう細胞に曝露させた（n = 4 ）．

皮膚における UVA 曝露の影響は，これまで培養細胞や陰性対照はアルミ板を用いて UVA1 の曝露を避けた細胞

三次元再構成皮膚モデル試料を対象に，蛍光ディファレン

とした（n = 4 ）．UVA1 曝露後は直ちに細胞を保護していシャル二次元電気泳動法や DNA マイクロアレイ法などでた PBS を培地に置換し CO2 インキュベータで再び培養し17）た．この操作を NHDF 細胞と HaCaT 細胞で毎日繰り返で実施された実験条件である培養新生児包皮由来線維芽細したところ，それぞれ 9 日目と 7 日目にわずかな細胞肥大胞に対する 1 日あたりの UVA1（320‒400 nm）曝露量 9.9 J/が目視で認められたため，細胞への反復曝露は同日までと㎠を参考とし，安全をみて 1 日あたり 5.0 J/㎠と設定した．

した．このとき累積曝露量はそれぞれ 45 J/㎠と 35 J/㎠と評価されてきた17‒20）．本研究では，Wondrak らの研究

―2―

牧野・太田・中川：反復UVA1曝露に応答するヒト真皮線維芽細胞とヒト表皮角化細胞のプロテオーム解析

図 1

実験スキームNHDF 細胞と HaCaT 細胞とも UVA1 曝露（No. 1 ~No. 4 ）と UVA1 非曝露（No. 5 ~No. 8 ）の 4 連 2 グループの試料調製とした．
培養プレートごとに蛋白質を抽出・還元アルキル化したのちトリプシン消化しペプチド試料とした．図中 126~130C は TMT 試薬における同位体ラベルを表している．コントロール（同位体ラベル 126）は No. 1 ~No. 8 のペプチド試料を等量混ぜ合わせたものとした．ペプチド試料ごとに TMT ラベル化したのち混合し，StageTip によるプレ分画を経て nano-LS/MS/MS 測定を行った．

なった．最終日は UVA1 を曝露してから 4 時間後に CO2エチル（Wako），脱水アセトニトリル（Sigma Aldrich），ト

インキュベータから培養ディッシュを取り出し，速やかにリエチル重炭酸アンモニウム（以下 TEAB と略す，Sigma

氷上で 5 mL の氷冷 PBS で 3 回洗浄してから 0.05％（w/v）

Aldrich）， ヒ ド ロ キ シ ア ミ ン（Wako）， 尿 素（Wako），

トリプシン（Wako）を用いて細胞を剥離させたのち遠心

TMT10plex isobaric label reagent kit（Thermo Fisher

管に回収し，125 × g，3 分間遠心して細胞ペレットを得た．

Scientiﬁc），トリフルオロ酢酸（以下 TFA と略す，Wako）

さらに 10 mL の氷冷 PBS で細胞ペレットを懸濁してから

2.7 蛋白質の同定方法および比較定量方法

遠心する洗浄操作を 3 回繰り返し，得られた細胞ペレット

本研究では UVA1 曝露・UVA1 非曝露の 4 連 2 グルーを細胞試料として ‒80 度で保管した．

プの比較とした（図 1）．冷凍保存しておいた細胞試料は2.6 蛋白質の同定に用いた試薬

相間移動可溶化法（PTS 法 22））により可溶化した．すな

使用した試薬は以下のとおりである．PTS 緩衝液（12わち NHDF 細胞ペレットと HaCaT 細胞ペレットにそれ

mM デオキシコール酸ナトリウム（Wako），12 mM ラウロイ

ぞれ 300 µL の PTS 緩衝液を加えて懸濁・攪拌したのち，ルサルコシン酸ナトリウム（Nacalai），50 mM 重炭酸アンモ

95 度で 5 分間処理と超音波処理（VP-15S，TAITEC）しニウム（以下 ABC と略す，Sigma Aldrich）， 1 × proteaseてから遠心分離し上清を回収した．BCA Protein Assay

inhibitor cocktail Complete EDTA-free（Roche）），ジ チオ

にて蛋白質定量を行い，各試料あたり 25 µL の PTS 緩

トレイトール（以下 DTT と略す，Wako），ヨードアセトアミ

衝液に 50 µg の蛋白質が含まれるよう濃度調製してから，ド（以下 IAA と略す，Wako），BCA Protein Assay（Pierce），

1 µL の 250 mM DTT を加えて 30 分間常温で還元したのTrypsin/Lys-C Mix，Mass Spec Grade（Promega），酢酸

ち，3.3 µL の 325 mM IAA を 添 加 し て 20 分 間 常 温 遮 光―3―島根県産業技術センター研究報告
表1第57号 （2021）

蛋白質同定パラメータ一覧

㡯┠

タᐃ್

Database

UniProtKB/Swiss-Prot(2016_03)

MS tolerance
MS/MS tolerances

10 ppm
0.8 Da (CID)
20 mmu (HCD)

Fixed modifications

TMT 6-plex (K)Carbamidomethyl (C)Dynamic modifications

Oxidation (M)Acetyl (Protein N-term)
TMT 6-plex (N-term)

EnzymeMax. missed cleavage sites

図2

Trypsin/P

UVA1ランプの分光分布

UVB（280‒320 nm）, UVA2（320‒340 nm）, UVA1（340‒400nm）,可視光（400 nm‒）の範囲を図中に示した .

2

下でシステインのチオール基をアルキル化した．次に 100

トルは FTMS スキャンにより検出される 2 価，3 価およµL の 50 mM ABC を 加 え て か ら Trypsin/Lys-C Mix をび 4 価のシグナルのうち強度の強い順に 3 つシグナルをプ

1 µg 加えて 37 度で一晩消化した .

レカーサーイオンとして選択，引き続く衝突誘起解離及びト リ プ シ ン 消 化 後， 試 料 液 に 125 µL の 1 ％（v/v）

高エネルギー衝突解離によって取得した．なお FTMS とTFA 含有酢酸エチルを加えて攪拌・遠心し液液分離させ，

HCD-MS2 の分解能は両者とも 60,000 で，スキャンレンジ

界面活性剤を含む上層を除去した．消化ペプチドを含むはそれぞれ 400‒2,000 m/z と 100‒2,000 m/z とした．

下層は減圧下で乾固させ， 1 ％の TFA を含有する 2.0 M

2.9 蛋白質の同定と相対定量

尿素を 200 µL 加えて再溶解した．このとき各試料から等蛋白質の同定と相対定量は，それぞれ MASCOT（version

量ずつ採取し混合して相対比較のための基準試料（コント

2.4.1，Matrix Science） と Proteome Discoverer（version

ロール）を得た．引き続き消化ペプチドを含む試料液を固1.4.0，Thermo Fisher Scientiﬁc）を用いた．蛋白質同定に相抽出（OASIS HLB，Waters）により脱塩し，再び減圧適応したパラメータは表 1 に示した．同定された各ペプ

下で溶媒を留去してから，100 µL の 100 mM TEAB で溶

チドのうち，false discovery rate（以下 FDR と略す）が解した．ここに脱水アセトニトリルに溶解した TMT 試薬

1％を超えるものまたは TMT レポーターイオンが一つでを 10 µL 加え， 1 時間常温で反応させラベル化を行った．

も欠損しているものについては以後の解析から除外した．

8 µL の 5 ％（v/v）ヒドロキシアミンを含有する 100 mM
ずつ全てのラベル化試料を混合した．足立らの方法 23）に

相対定量値は MS/MS スペクトルに記録された TMT レ⤖  ᯝ
ポーターイオン強度に基づき，コントロール試料（ラベル⤖  ᯝ
126）のそれと各試料のそれらとの相対比とした．発現変

従い強陽イオン交換カラムを保持した StageTip（GL-Tip

動比（fold change，以後 FC と略す）は，平均強度比［平SDB-SCX，GL Science）に供し，TFA グラジエント法に均強度（UVA1 曝露群）/ 平均強度（UVA1 非曝露群）］

よって 7 分画した．減圧下で溶媒を留去してから再び 0.1とした．有意差検定は Welch -test を採用し，Benjamini-％（v/v）TFA に 溶 解 さ せ， そ れ ぞ れ nano-LC/MS/MS

Hochberg24）の調整を行った．

分析試料とした．

2.10 統計解析

TEAB の添加によりラベル化反応を停止したのち，等量2.8 nano-LC/MS/MS 分析

統計処理ならびにグラフの作成には統計解析言語

測 定 機 器 は Advance UHPLC/HTSxt-PAL（AMR） をＲ（version 3.6.2）25）を用いた．

接続した Orbitrap Velos Pro（Thermo Fisher Scientiﬁc）

3.

を用いた．カラムは L-column 2 ODS（プレカラム 0.3 ×
5 ㎜，分析カラム 0.1 × 150㎜ C18，CELI）で，分析条件

結果

3.1 UVA1 の輝度特性

は，オーブン 45 度，0‒135 分にかけてＡ液：0.1％（v/v）

本研究で使用した UVA1 ランプの相対強度 > 5 ％にTFA 含有水，Ｂ液：0.1％（v/v）TFA 含有アセトニトリ

お け る 波 長 範 囲 は 352‒392 nm で あ り， 輝 度 ピ ー ク はルによるグラジエント溶出（Ｂ液 0‒35％）とした．質量364.8 nm で半値全幅は 16.4 nm であった（図 2 ）．また輝

分析は Data Dependent Acquisition とし，MS/MS スペク

度は 2.78 ± 0.11 mW/㎠（平均値±標準偏差）であった．

―4―

牧野・太田・中川：反復UVA1曝露に応答するヒト真皮線維芽細胞とヒト表皮角化細胞のプロテオーム解析

図3

DHE 蛍光強度ヒストグラム

UVA1 非曝露条件における相対累積度数 95％を下限としたゲートとゲート中の細胞数の割合を図中に示した．
（NHDF 細胞（A），HaCaT 細胞
（B））
.

図4

UVA1 曝露量と細胞生存率

曝露量と細胞生存率の関係を示した．sham は UVA1 非曝露であることを除いて 45 J/㎠の試験条件と同様の操作を行った．細胞生存率はハイコンテンツイメージングによって求めた全細胞数に対する PI 透過細胞の割合（％）を示した．* <0.05, 0 mJ/㎠の試
験区との比較（NHDF 細胞（A），HaCaT 細胞（B））.

3.2 UVA1 曝露による ROS の影響あるものの，有意差は認められなかった（ <0.05，n = 3，

5.0 J/ ㎠ の UVA1 曝 露 に よ る NHDF 細 胞 と HaCaT 細胞との影響を明らかにするため，ハイコンテンツイメー

Student's -test）．
3.3 UVA1 反復曝露と細胞生存率の関係

ジングの手法により細胞内で発生した ROS を評価した．

UVA1 の反復曝露による UVA1 累積曝露量と細胞生存陽性対照は過酸化水素（10 mM，PBS で希釈）を 30 分率の関係を図 4 に示した．初日の曝露によって NHDF 細間作用させた条件とした．図 3 A，図 3 B に示すように

胞の細胞生存率と HaCaT 細胞のそれは，それぞれ 88.8％

NHDF 細胞および HaCaT 細胞における蛍光強度の分布と 91.7％に低下したが，その後 45 J/㎠にかけて曝露量依

は，UVA1 非曝露と比較して 10 mM 過酸化水素水の作用存的に低下する傾向は観察されなかった．陰性対照（図で増大方向にシフトすることを確認した．次に NHDF 細

4 では sham と表記）の細胞生存率はそれぞれ 97.9％と胞と HaCaT 細胞のそれぞれ影響を評価するため，UVA1

96.1％であった．なお 35 J/㎠の時点で HaCaT 細胞におい非曝露における蛍光強度のヒストグラムから蛍光強度の下ては若干の細胞肥大が観察されたものの，NHDF ではこ

限値を相対累積度数 95％，上限値をそれぞれ 8,000 と 9,000のような形態変化は観察されなかった．

としたゲートを設定した．解析の結果，UVA1 5.0 J/㎠の3.4 蛋白質同定の結果

単回曝露による閾値超過細胞の割合はわずかに増加傾向に―5―

図 1 の実験ワークフローに従い，UVA1 を反復曝露させ島根県産業技術センター研究報告第57号 （2021）

た NHDF 細胞と HaCaT 細胞からそれぞれ蛋白質を抽出し ,4. 考

相対定量解析に必要な TMT レポーターイオンラベルを付

察

与してから，質量分析計に供した．Proteome Discoverer

本研究では皮膚浸透性の高い UVA1 による光老化現象

により測定データを統合してから蛋白質同定ソフトウェアに焦点を絞り，蛋白質レベルにおける表現系の理解を目指

MASCOT にてデータベースサーチしたところ，NHDF 細

して TMT 同位体ラベルを用いたショットガンプロテオー

胞から取得したデータセット（以下 NHDF データセット

ム解析を実施した．測定対象はと略す）及び HaCaT 細胞から取得したデータセット（以皮細胞と表皮細胞のモデルとしてそれぞれ NHDF 細胞と

下 HaCaT データセットと略す）から，それぞれ 1,472 蛋

HaCaT 細胞を選択した．なお UVA1 の曝露により分泌型

白質と 1,582 蛋白質を同定した．そのうち TMT レポーター

蛋白質における発現変動も当然予想されるものの，本研究

イオンの完全性と FDR の基準でフィルターをかけ，それでは細胞のみを回収して試料としたため，それらについて

ぞれ 1,397 蛋白質と 1,479 蛋白質を定量解析することとしは検出できていない可能性が高い．

た．観測した MS/MS スペクトルやペプチド数などは表 2モデルとし，真光源として用いた UVA1 ランプの分光分布は 352‒392にまとめた .

nm（輝度 > 5 ％）であった．このことから UVA2（320‒340

3.5 相対定量解析結果nm）や UVB（280‒320 nm）領域の光をほとんど含んでい

NHDF データセットと HaCaT データセットで同定さ⪃  ᐹ
れた蛋白質のうち，相対定量値が得られた各蛋白質とないと判断される．一方，可視光領域の光（>400 nm）が一部含まれていたが，そのエネルギーは UVA1 ランプが値（以下 -value と略す））の分布

照射する全エネルギーの 1.86％（図 2 の分光分布強度をヤをそれぞれボルケーノプロットで示した．このときカット

コビヤン変換して計算 26））であったため，細胞に対する

オフ・クライテリアを -value < 0.05 かつ FC ≧ 1.3 または影響は極めて小さいものと考えられる．なお本光源の分光

log2FC と log10（補正≦ 0.77 と設定した（図 5 ）．カットオフ・クライテリアに分布と太陽光のそれとの違いについて述べると，クエート

従い反復 UVA1 曝露により影響を受けた蛋白質を抽出しにおける冬季 8 ヶ月にわたる測定結果から UVA（320‒400

たところ，NHDF 細胞において 62 蛋白質（上方制御 29,nm）に対する UVB（280‒320 nm）の照射量比は 5％程度で，下方制御 33），HaCaT 細胞において 16 蛋白質（上方制御

290 nm から 330 nm にかけて輝度が 5 桁増大し，330 nm

11, 下方制御 5 ）が見出された．図 6 にこれら蛋白質一覧

から 400 nm にかけてはほぼ一定の輝度であることが示さを FC の順に示した．

れている 27）．
UVA1 ランプを用いて 5.0 J/㎠を単回曝露させた NHDF
細胞と HaCaT 細胞のそれぞれの ROS レベルは，非曝露
表2

DatasetSearch inputs

peptide spectrum
matches

同定結果一覧
protein groups
peptidesmerged proteins
identiﬁed

quantiﬁed

NHDF

110,375

88,632

23,378

11,914

1,472

1,397

HaCaT

111,844

93,25723,991

12,018

1,582

1,479

図5

ボルケーノプロット（A）NHDF データセット，（B）HaCaT データセット
点線はカットオフ・クライテリアである FC=1.3 と 0.77, -value = 0.05 を示した．

―6―

牧野・太田・中川：反復UVA1曝露に応答するヒト真皮線維芽細胞とヒト表皮角化細胞のプロテオーム解析のそれらと有意差がなかった．これらのことから両細胞に

NHDF 細胞と HaCaT 細胞の細胞生存率は，0 J/㎠（非曝露，対する 5.0 J/㎠の UVA1 単回曝露は，シクロピリミジンダ

0 日目）のそれらと比較して有意差は認められなかったこ

イマー 28）や 6‒4 光産物 29）といった直接的な酸化的損傷をとから，本研究で採用した PBS への置換など実験操作に惹起しないか，惹起してもその程度は小さいと推定されよる細胞への影響は極めて小さく，それゆえ細胞生存率のる．しかし一方で 5.0 J/㎠の UVA1 単回曝露は NHDF 細低下は主に UVA1 の曝露に起因すると判断される．ただ胞と HaCaT 細胞の生存率をそれぞれ 1 割程度低下させた．

し累積曝露量依存的に生存率は悪化しなかったことから，

PBS への置換を 9 日間繰り返した陰性対照（sham）の

UVA1 の致死的影響は限定的であるといえる．また曝露初

図 6

変動蛋白質一覧（A）NHDF 細胞，（B）HaCaT 細胞

カットオフ・クライテリアに従って蛋白質を抽出した．図中ラベルは順に FC，log10（ ‒value），蛋白質名，遺伝子名である．

―7―

島根県産業技術センター研究報告第57号 （2021）

日から 2 日目にかけて NHDF 細胞の細胞生存率と HaCaT

本研究で採用したカットオフ・クライテリアによって除外細胞のそれともそれぞれ上昇する傾向が見られたが，これされている可能性もあり，それらの検出には別の検出手法

らは細胞内でストレス応答が誘導され，UVA1 曝露に対や UVA1 曝露量を上げるなどの工夫が必要であろう．興する耐性の高まりが反映されていると推定される．

味深いことに今回の研究で見出された発現変動蛋白質のう

NHDF 細胞に 45 J/㎠の UVA1 を蓄積させ，非曝露の陰

ち GPNMB，SARS，VDAC2，VDAC3 は両細胞試料に共性対照と比較して注目すべき蛋白質を抽出したところ，カ

通して見出された．このことがどのような意味を持つのか

テプシン K，ヘムオキシゲナーゼ（HMOX1）の発現上昇

不明であるものの，共通のシグナル伝達系で発現制御されやコラーゲン（COL1A1，COL1A2，COL3A1，COL5A1）ていることも想定される．光老化度の推定には，本研究での発現減少が確認された（図 6 Ａ）
．これらの蛋白質の発見出した各々の蛋白質の生理機能の解明やそれらの発現制

現変動は，UVA を曝露させた培養線維芽細胞を用いた免

御メカニズム，また表皮組織と真皮組織間でのクロストー

疫組織化学染色研究や三次元再構成皮膚モデルを用いた

クに対する理解など今後の研究が必要で，それらはまた

20,30,31）

UVA1 曝露に起因する光老化現象の根底にある分子メカ

DNA マイクロアレイ解析などでも報告されており発現の方向（上方 / 下方制御）は一致した．このことは本

ニズムに対して新たな洞察を与えるであろう．

研究で採用した実験系が適切に機能したことを支持するも5. まのである．膜貫通型糖蛋白質 NMB（GPNMB）もまた発とめ現上昇した蛋白質として同定された．この蛋白質は特にメ

本研究は培養皮膚細胞を用いて，UVA1 による光老化

ラノソーム細胞の表面において発現していることが報告さに関係すると予想される蛋白質の探索まで行った．今回のれており，UVA 曝露量依存的に発現増強される 32）．また研究より新規に発現変動蛋白質として同定されたものにつGPNMB は老化あるいは老化関連疾患に関与する蛋白質のいては，真に UVA1 の反復曝露に起因した生理状況を反候補として提唱されており

33），その細胞外ドメインとイ映しているのか，別の研究手法や試料などを用いンテグリンとの相互作用によって免疫抑制や血管新生が誘て検証されなければならない．今後の研究の進展によって，導されることや，チロシンキナーゼレセプターやインテグ

UVA1 との関係について裏付けされた蛋白質は真皮組織

リンシグナリングへの関与から，下流にあるキナーゼシグ

や表皮組織における光老化度の判定指標の候補となり，実ナリングを刺激することによって MMPs やサイトカイン

用的な応用研究への展開が期待される．

の発現を促進する 34）．今回の解析では MMPs のうち膜貫6. 謝入型マトリックスメタロプロテアーゼ 14（MMP-14）の辞発現上昇が認められており，上記発現制御系と関連してい本研究は，JSPS 科研費（若手研究Ｂ，課題番号 26860909）

るのかもしれない．一方でこれまで MMPs の発現は，皮の助成を受けて実施した．細胞培養や実験デザインについ膚への UV 曝露に刺激された転写因子 AP-1 や NF- κB にては島根県産業技術センター前第二技術部長・故勝部拓矢

よって誘導されることが知られているが10），この制御系

博士にご指導・ご助言いただいた．また測定試料調製方法と MMP-14 との関係性においてはこれまで知見がないたについては日本プロテーム学会平成 27 年度第 2 回トレー

め，UVA1 によって誘導される新たな現象の一面を捉えニングコースを参考にしたほか，国立研究開発法人医薬基た可能性もある．

盤・健康・栄養研究所プロテオームリサーチプロジェクト

HaCaT 細胞由来試料から見出された発現変動蛋白質の足立淳博士にご助言いただいた．ここに謝意を示します．

数は NHDF 細胞由来試料のそれと比較すると少なく（図5 Ｂ，図 6 Ｂ）
，ボルケーノプロットでは原点のわずか上方に集中する結果となった．表皮は皮膚の最外層に位置する組織であるため，エネルギーの高い UVB に曝される運命にあり，そのためカタラーゼやスーパーオキシドジス
ムターゼ（SOD- 1 ，SOD- 2 ）といった抗酸化酵素群の発現レベルや脂溶性・水溶性抗酸化物質の存在量が真皮組織のそれらと比較して高いことが知られている 35，36）．それゆえ表皮組織では UV の直接的あるいは間接的な酸化ストレスに応答する蛋白質間ネットワークや修復システム
が真皮組織より優れており，それらが今回の実験結果である HaCaT 細胞の UVA1 に対する感受性の低さの一つの原因であるかもしれない（図 4 Ｂ）．なお変動が小さくとも UVA1 の影響を受けた蛋白質は存在すると思われるが，

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7. 文

献

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