グリホサートおよびグルホシネートの分析の自動化の検討-第２報-〇佐々野僚一、島三記絵、小西賢治、斎藤勲（株式会社アイスティサイエンス）【目的】
演者らはメタノール-水（1/1）で抽出を行ったグリホサートおよびグルホシネートの分析法の自動化を報告したが、目的農薬の水溶性が高いことから、水抽出を行っている分析例も多く報告されている。しかしながら、水抽出のみで固相に通すと、目詰まりを起こすことがある。そこで、本研究では水抽出した後にアセトニトリルを添加して除タンパクする一連の流れの抽出法を検討した。また、測定におけるマトリックスの影響についても調査した。それらの結果を基にほうれん草と大豆を用いて添加回収試験を行い、良好な結果を得られたので報告する。

図１ 前処理フロー【方法】
１．装置および条件
前処理装置：全自動固相抽出装置 ST-L400（アイスティサイエンス）
固相カートリッジ：Smart-SPE シリーズ（アイスティサイエンス）
測定装置：UHPLC(Nexera X2)及び LCMS-8045 (島津製作所)【LC 条件】分析カラム：TSKgel

SuperIC-AP（4 級アミン基）,（4.6 mmID × 75 mm）

移動相 A 液：2 mM ギ酸アンモニウム-水B 液：0.5 ％ ギ酸-水
流速：0.8 mL/min
グラジエント：B.Conc 5 ％(0.5 min)→95 ％(2-11 min)→5 ％(12-14 min)
注入量：5 µL
カラム温度：40 ℃【MS 条件】
イオン化モード：ESI positive
ネブライザーガス流量：3 L/min
ドライングガス流量：10 L/min
ヒーティングガス流量:10 L/min
インターフェース温度：400 ℃
DL 温度：150 ℃
ヒートブロック温度：350 ℃

２．実験方法
試料 10 g（穀類 2 g）を 50 mL 用の遠沈チューブに採取し、その試料の水分量と合わせて約 25 mL になるように水を添加し、振とうして水抽出（※1）を行った。続けて、全駅量が 50 mL になるようにアセトニトリルを添加して、5 分間静置後、遠心分離し、除タンパク（※2）を行った。次にその抽出上澄み液を 0.5 mL 分取し、水を 1.5mL 添加して試料液とし、前処理装置で精製（詳細は前回報告：参考資料 1））を行った。

抽出液 50 mL

図 2 前処理フロー【結果および考察】
１． タンパク質除去効果の確認実験
アセトニトリル添加によるタンパク除去効果を確認することを目的として、前処理
フローの水抽出したところで遠心分離し試料の固形物を取り除いた。そして、その上澄み液 3mL を 15mL の遠沈チューブに分取し、アセトニトリル 3mL を加え、5 分間静置後、遠心分離した。

① 水抽出液から 3mL 分取② アセトニトリル 3mL を加え
5 分間静置③ 遠心分離後

図 3 前処理フロー
アセトニトリルを加えたところで、一時すると、変性したタンパク質が析出してきた（写真図 3-②）。次に遠心分離し、変性したタンパク質が下に沈殿した（写真図 3-③）。
これらの結果から、アセトニトリル添加による除タンパクの効果の確認ができた。本法の場合、遠心分離により、試料の固形物と変性したタンパク質が一緒に下に沈殿していると考えられる。
２．連続測定におけるマトリックスの影響
スタンダードと添加試料の再現性を確認するために各々を連続的に測定したところ、添加試料において数回目から急にピーク面積値が上昇しその後安定し、さらにその直後のスタンダードも高い値で推移したが、同じように数回目から元の面積値に戻るという現象がみられた。そこで、スタンダードと添加試料を数回ずつ連続測定し、その挙動の確認を行った。その結果、ほうれん草のグルホシネートにおいて、先に述べた現象が再現された（図 4-上）。添加試料を測定し始めて、4 回目でピーク面積値が上昇し、そして、その直後のスタンダードも高いピーク面積を得るが、4 回目には元の値に戻った。これにより、添加試料に含まれている何らかのマトリックスが LC カラムからの溶出に 4 測定分かかり、その 4 測定目の溶出されるときにちょうどグルホシネートと重なり、エンハンス効果を起こして、ピーク強度が上昇しているものと考えられる。しかしながら、大豆は影響を受けておらず、ほうれん草由来のマトリックスの影響と思われる。その対策として、測定順序において試料抽出液をダミーとして 4 回以上測定し、続けて試料測定を行い、最後に検量線用のスタンダードを 3 測定内に行う。または、マリックス検量線を使用する。今後の課題として、マトリックスを取り除くための前処理条件の検討が挙げられる。
表 1 連続測定におけるマトリックスの影響■ほうれん草試料名順番
12
スタンダード
3バイアル
45ppb
56789
添加試料
10バイアル
115ppb121314151617
スタンダード18バイアル
195ppb202122

■大豆
試料名

順番
1
スタンダード2バイアル
310ppb
456
添加試料
7バイアル
810ppb91011
スタンダード 12バイアル
131410ppb
15（面積値）

GLU
44,79848,084
48,18348,86347,86049,942
46,884
46,59046,13369,041
63,70367,60968,65370,38175,18070,07865,65048,92050,27054,42750,28750,468GLY
34,30534,88037,13936,05534,96035,93336,17538,53935,96837,05337,022
39,64437,68037,86137,37436,67836,31336,131
36,25937,24836,444
36,144（面積値）■ほうれん草スタンダード

添加試料

スタンダード

測定順番
（面積値）

■大豆

（面積値）

GLU
93,87891,974
94,05092,157
93,154
94,712
94,80897,48399,02995,903
97,96997,303
97,481
95,35997,390GLY
68,66974,62371,563
72,34378,513
79,19078,56577,80678,25976,937
72,901
72,592
71,81974,19273,798

測定順番

図 4 連続測定におけるマトリックスの影響
上：ほうれん草,下：大豆３．多段階添加回収試験
ほうれん草と大豆を用いて多段階添加回収試験を行った。ほうれん草および大豆における基準値がほうれん草：GLY 0.2／GLU 0.1, 大豆：GLY 20／GLU 2 ppm であることから、ほうれん草：0.1ppm, 大豆：1ppm 添加することとした。添加位置は抽出前（通常の添加）、抽出後、前処理後の段階に分けて添加した。また、連続測定におけるマトリックスの影響を考慮して、測定順序は未知試料を 6 回連続で分析し、その最初の 4 回はダミーとして測定結果には入れず、続けて添加試料を測定していき、最後にスタンダードを測定した。そのピーク面積値を表 2 に示す。
表 2 多段階添加回収試験結果（面積値）■ほうれん草■大豆（ピーク面積値）

試料名

No.

GLU

U1-01-82（ピーク面積値）
試料名

GLY

No.
U1-01

194

未知試料GLU

GLY-176

181

U1-028147

Ave.

-168

328

前処理後添加

K1-01

88,16072,52036,972（試料中:1ppm）

K1-0287,32070,42564,57437,644（バイアル中:10ppb）

Ave.

87,74071,473C1-01

57,596

36,833

抽出後添加

C1-01

82,332

72,613（試料中：0.1ppm）

C1-02

62,797

37,173（試料中:1ppm）

C1-02

86,22371,939（バイアル中：5ppb）

Ave.

60,19737,003（バイアル中:10ppb）

Ave.

84,27872,276

A167,119

36,139A192,564

79,514

A266,622

37,112A2

94,57981,385

A369,725

37,349A393,280

81,201

A464,684

37,669A495,624

78,931

A568,952

39,422

A590,239

82,037

Ave.

67,42037,538Ave.

93,25780,614

RSD(%)

3.0

3.2

未知試料

U1-02

298

381

Ave.

216

575

前処理後添加K1-01

65,781

38,315（試料中：0.1ppm）

K1-02

63,367（バイアル中：5ppb）

Ave.

抽出後添加

添加回収試験
抽出前添加：n = 5
試料中濃度：0.1ppm（バイアル中：5ppb）

添加回収試験
抽出前添加：n = 5
試料中濃度:1ppm（バイアル中:10ppb）

RSD(%)

2.2

1.6

36,586

スタンダードS1-01

90,78474,66737,403バイアル中濃度

S1-0292,00275,02067,47536,995：10ppb

Ave.

91,39374,84433,304

18,245：5ppb

S245,102

37,658スタンダードS1-0170,192

バイアル中濃度

S1-0264,757

S1：5ppb

Ave.

S2：2.5ppb

S2

表 3 多段階添加回収試験結果（回収率）
ほうれん草, 0.1 ppm添加
添加位置

大豆, 1 ppm添加

GLU

GLY

GLU

GLY

回収率 RSD

回収率 RSD

回収率 RSD

回収率 RSD

抽出前（n = 5)

A/S

100

3.0

101

3.2

102

2.2

108

1.6

抽出後C/S

89ー

100ー

92ー

97ー

前処理後K/S

96ー

102ー

96ー

95ー

（単位, %）

S1-01. スタンダード：バイアル中濃度 5 ppb

A1. 抽出前添加試料：試料中濃度 0.1 ppm, バイアル中濃度 5 ppb

U1-01. 未知試料

1. グルホシネート

2. グリホサート

図 5 ほうれん草の添加回収試験で得られた MRM クロマトグラム

S1-01. スタンダード：バイアル中濃度 10 ppb

A1. 抽出前添加試料：試料中濃度 1 ppm, バイアル中濃度 10 ppb

U1-01. 未知試料

1. グルホシネート

2. グリホサート

図 6 大豆の添加回収試験で得られた MRM クロマトグラム

多段階添加回収試験による回収率の結果を表３に示す。ほうれん草および大豆とも良好な回収率（89～110 %）と再現性（RSD：5 %未満）の結果を得ることができた。
また、それぞれの MRM クロマトグラム（図 5, 6）もきれいなピークを得ることができた。ただし、大豆の抽出前添加試料のグルホシネートの MRM クロマトグラム
では、グルホシネートの前に夾雑物ピークが検出したが、未知試料ではそのピークが存在せず、その夾雑物の有無が不明であった。

【まとめ】
グリホサートおよびグルホシネートの分析法において、水抽出した後にアセトニトリルを添加して除タンパクする一連の流れの抽出法を検討した結果、水溶性の高いグリホサートなどを効率よく抽出し、前処理に悪影響を及ぼすタンパク質を効率よく除去することがこれまでの抽出法を大きく変えることなく容易にできた。また、連続測定におけるマトリックスの影響について調査した結果、試料によっては、数回分の測定後にそのマトリックスの影響を受けて感度が変動することが分かった。現時点では、試料抽出液をダミーとして 4 回以上測定し続けて試料測定し、その直後にスタンダードを測定するか、マトリックス検量線を使用することで対応することとした。そして、ほうれん草と大豆を用いて本法による多段階添加回収試験を行った結果、回収率、再現性ともに良好な結果を得るこができた。
本抽出法と前処理の自動化を組み合わせることで、グリホサートおよびグリホシネートが簡便かつ精度よく分析できることが分かった。

【参考資料】
1) 小西賢治ほか：グリホサートおよびグリホシネートの分析の自動化の検討, 第 36
回農薬残留分析研究会講演要旨集, P110-124

グリホサートおよびグルホシネートの分析の自動化の検討-第２報〇佐々野僚一、島三記絵、小西賢治、斎藤勲（株式会社アイスティサイエンス）【 目的 】

物性と構造式演者らはメタノール-水（1/1）で抽出を行ったグリホサートおよびグルホシネートの分析法の自動化を報告したが、目的農薬の水溶性が高いことから、水抽出を行っている分析例も多く報告されている。しかしながら、水抽出のみで固相に通すと、目詰まりを起こすことがある。そこで、本研
究では水抽出した後にアセトニトリルを添加して除タンパクする一連の流れの抽出法を検討した。
また、測定におけるマトリックスの影響についても調査した。それらの結果を基にほうれん草と大豆を用いて添加回収試験を行い、良好な結果を得られたので報告する。

【 実験方法 】

添加 アセトニトリル 約25 ｍL★ 全量が50 mLになるように調整※除タンパク

静置 5 min ★ タンパク質を変性させる。

全自動固相抽出装置
ST-L400

測定装置
Nexera X2 & LCMS-8045（株式会社アイスティサイエンス）（株式会社島津製作所）

NHOHO
HO

グルホシネート：Glufosinate（GLU）
化学式：C5H12NO4P
分子量：181.1
LogPow=＜0.1(pH7、22℃)
pKa1＜2、pKa2＜2.9、pKa3＜9.8OH
OP

NH2CH3OHO

4.6 mmID × 75 mm
移動相 A液：2 mM ギ酸アンモニウム-水

材質：PEEK樹脂

B液：0.5 ％ ギ酸-水
流速：0.8 mL/min
グラジエント：B.Conc 5 ％(0.5 min)→95 ％(2-11 min)

遠心分離 3500 rpm, 5 min

Step1 精製＆保持

Step2 溶出抽出液 50 mL（5倍希釈）

メタノール-水(1/9)

0.14% アンモニア-水

50mL用遠沈チューブ

試料液1mL

サンプルループ
シリンジポンプ

試料液 2 mL （20倍希釈）

水カラム温度：40 ℃

PSA

シリンジポンプバルブ

SCX：精製
陽イオン性夾雑物※12.5%アセトニトリル-水
全自動固相抽出装置 ST-L400, 前処理時間:

注入量：5 µL

目的物質

溶出液

11分/検体コンディショニング
アセトン
PBX-10㎎ / SCX-30㎎ + PSA-50㎎
メタノール-水

MSに導入

メス試験官

シリンジポンプ

PSA：保持GLY, GLU【MS条件】

排出液
非イオン親水性夾雑物

負荷[保持] 試料液 1 mL 分取（試料0.05 g相当）

GLY

洗浄 メタノール-水（1/9）1mL

O

PSA-50㎎ （PBXとSCXを取り外す）

OO

POH

溶出 0.14 %アンモニア水 0.9 mL

GLU-O

保持-OP

NH

NH2POH

O

NH

溶出-

P

ネブライザーガス流量：3 L/min

DL温度：150 ℃

ドライングガス流量：10 L/min

ヒートブロック温度：350 ℃

ヒーティングガス流量:10 L/min
MRM条件
■ 表１
MRM条件

NH2CH3PSA
Si-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH2グルホシネート

3.00 - 4.00

アンモニア水（pH10）により、PSAのN基

グリホサート4.00 - 6.00

O-PSA
⊕
⊕
Si-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH2
H

インターフェース温度：400 ℃

測定時間 (min)O⊖

H

イオン化モード：ESI positive

化合物名OO⊖

図１ 前処理フロー

OO-定容：1 mL 水で調整

-CH3

O

添加 5 %ギ酸-水 30 µL

OO-

グリホサー
トPBX：精製
疎水性夾雑物→5 ％(12-14 min)

グルホシネート☞ 水を添加して、アセトニトリルの比率を下げることでPBXへの疎水性夾雑物の吸着を促進させる。

添加 水 1.5 mLP

分析カラム：TSKgel SuperIC-AP（4級アミン基）★ 水分量が25 mLになるように調整

抽出上澄液 0.5 mL分取O

【LC条件】※水抽出

添加 水15 ｍL（穀類の場合：25 mL）

振とう 1 min

化学式：C3H8NO5P
分子量：169.1
LogPow=＜-3.2(pH2-5，20℃)
pKa=5.77±0.03、2.18±0.02(20±0.2℃)

測定条件

凍結粉砕した試料 10 g（ 穀類2 g）
振とう抽出

OH

グリホサート：Glyphosate（GLY）

O-

中性の水環境では、PSAおよび目的物質とも解離が非解離性となり、イオン交換相互作用が状態となり、イオン交換相互作用により吸着する。

なくなるため目的物質が固相から脱離する。

定量イオン

Dwell T.

Q1

確認イオン

(msec)(V)

182.10 > 136.10

400-21-15-24

182.10 > 119.00

400-21-21-21170.00 > 88.10600-17-9-18170.00 > 42.10

600-17-26-17CEQ3(V)

図２ 自動前処理工程【 結果と考察 】

ピーク面積値

２．連続測定におけるマトリックスの影響

ピーク面積値

１．タンパク質除去効果の確認実験

スタンダード① 水抽出液から3mL
分取

添加試料

スタンダードスタンダード

添加試料

スタンダード③ 遠心分離後② アセトニトリル3mLを加え5分静置

図３ タンパク質除去の効果

アセトニトリルを加えたところで、一時すると、変性したタンパク質が析出してきた。次に遠心分離し、変性したタンパク質が下に沈殿した。これらの結果から、アセトニトリル添加による除タンパクの効果の確認ができた。

測定順番

測定順番

■ ほうれん草■ 大豆

図４ 連続測定におけるマトリックスの影響

スタンダードと添加試料を数回ずつ連続測定し、その挙動の確認を行った。その結果、ほうれん草のグルホシネートにおいて、添加試料を測定し始めて、4回目でピーク面積値が上昇し、そして、その直後のスタンダードも高いピーク面積を得るが、4回目には元の値に戻った。これは、添加試料に含まれている何らかのマトリックスがLCカラムからの溶出に4測定分かかり、その4測定目の溶出されるときにちょうどグルホシネートと重なり、エンハンス効果を起こして、ピーク強度が上昇しているものと考えられる。一方、大豆は影響を受けておらず、ほうれん草由来のマトリックスの影響と思われる。
その対策として、測定順序において試料抽出液をダミーとして4回以上測定し、続けて試料測定を行い、最後に検量線用のスタンダードを3測定内に行った。

３．多段階添加回収試験
表2 多段階添加回収試験結果（面積値）■ ほうれん草■ 大豆（ピーク面積値）

試料名

No.

GLU

GLY

（ピーク面積値）
試料名

U1-01-82

194

U1-02298381

Ave.

216575

前処理後添加K1-01

65,781

38,315（試料中：0.1ppm）

K1-0263,367（バイアル中：5ppb）

Ave.

抽出後添加

No.

GLUGLYU1-01-176

181

U1-02

8147

Ave.

-168

328

前処理後添加

K1-01

88,16072,52036,972（試料中:1ppm）

K1-0287,32070,42564,57437,644（バイアル中:10ppb）

Ave.

87,74071,473C1-01

57,596

36,833

抽出後添加

C1-01

82,332

72,613（試料中：0.1ppm）

C1-02

62,797

37,173（試料中:1ppm）

C1-02

86,22371,939（バイアル中：5ppb）

Ave.

60,19737,003（バイアル中:10ppb）

Ave.

84,27872,276

A167,119

36,139A192,564

79,514

A266,622

37,112

A294,579

81,385

A369,725

37,349A393,280

81,201

A464,68437,669

A495,624

78,931

A568,952

39,422

A590,239

82,037

Ave.

67,42037,538Ave.

93,25780,614

RSD(%)

3.0

3.2

RSD(%)

2.2

1.6

スタンダードS1-01

70,19236,586

スタンダードS1-01

90,78474,667

バイアル中濃度S1-0264,75737,403

バイアル中濃度S1-02

92,00275,020S1：5ppb

Ave.

67,47536,995：10ppb

Ave.

91,39374,844S2：2.5ppb

S2

33,304

18,245：5ppb

S245,10237,658

未知試料

添加回収試験
抽出前添加：n = 5
試料中濃度：0.1ppm（バイアル中：5ppb）

未知試料

添加回収試験
抽出前添加：n = 5
試料中濃度:1ppm（バイアル中:10ppb）

ほうれん草と大豆を用いて多段階添加回収試験を行った。ほうれん草および大豆における基準値がほうれん草：GLY 0.2／GLU 0.1,大豆：GLY 20／GLU 2 ppmであることから、ほうれん草：0.1ppm,大豆：1ppm添加することとした。添加位置は抽出前（通常の添加）、抽出後、前処理後の段階に分けて添加した。

【 まとめ 】

表3 多段階添加回収試験結果（回収率）
ほうれん草, 0.1 ppm添加
添加位置

大豆, 1 ppm添加

GLU

GLY

GLU

GLY

回収率 RSD

回収率 RSD

回収率 RSD

回収率 RSD

抽出前（n = 5)

A/S

100

3.0

101

3.2

102

2.2

108

1.6

抽出後

C/S

89

ー

100ー

92ー

97ー

前処理後

K/S

96ー

102ー

96ー

95ー

（単位, %）

ほ う れ ん 草 お よ び 大 豆 と も 良 好 な 回 収 率 （ 89 ～110 %）と再現性（RSD：5 %未満）の結果を得ることができた。また、それぞれのMRMクロマトグラム（図5）もきれいなピークを得ることができた。

■ ほうれん草■ 大豆

図5 添加回収試験で得られたMRMクロマトグラム

グリホサートおよびグルホシネートの分析法において、水抽出した後にアセトニトリルを添加して除タンパクする
一連の流れの抽出法を検討した結果、水溶性の高いグリホサートなどを効率よく抽出し、前処理に悪影響を及ぼすタンパク質を効率よく除去することがこれまでの抽出法を大きく変えることなく容易にできた。また、連続測定におけるマトリックスの影響について調査した結果、試料によっては、数回分の測定後にそのマトリックスの影響を受けて感度が変動することが分かった。そこで、試料抽出液をダミーとして4回以上測定し続けて試料測定し、その直後にスタンダードを測定するか、マトリックス検量線を使用することで対応することとした。最後に、ほうれん草と大豆を用いて本法による多段階添加回収試験を行った結果、回収率、再現性ともに良好な結果を得るこができた。
本抽出法と前処理の自動化を組み合わせることで、グリホサートおよびグリホシネートが簡便かつ精度よく分析できることが分かった。