アプリケーションノート
ゲノミクス

著者

Sameer Kalghatgi, Ph.D.,
Nahid Turan, Ph.D.,
Susan Jones, M.S.
Coriell Institute for Medical
ResearchCamden, NJ, USADr. Eva Graf
Agilent Technologies, Inc.

Coriell Institute のバイオレポジトリにおける長期 DNA 保存のモニタリング
概要

Coriell Institute for Medical Research （Coriell）は、バイオメディカル 研究 に利用可能 な細胞株、DNA およびその他の生体材料の最も多様なコレクションを所有していると考えられています。2016 年にCoriell は従来のゲル電気泳動から TapeStation System の Agilent Genomic DNA ScreenTape Assayを用いる方法に変更し、TapeStation System が算出する DNA Integrity Number （DIN）をゲノムDNA の品質を評価するための客観的 な指標として導入しました。本アプリケーションノートでは、さまざまな品質のゲノム DNA （gDNA）サンプルを用いた比較研究を行い、TapeStation System の機能を明らかにしました。さらに、Coriell が長期保存状態からどのように gDNA サンプルを取り出し、TapeStation System で品質確認を行うかについても示しています。1990 年から 2000 年に抽出されたDNA サンプルの DIN を比較することで、Coriell が 30 年以上にわたり安定した品質で確実に DNA を保存していることが確認できました。

はじめに
Coriell Institute for Medical Research（Coriell）は、生体試料 の収集、処理、凍結保存、配布 および 情報管理 を提供 するバイオバンキングサービスとして、国際的に高い評価を受けています。Coriell のバイオバンクは、バイオメディカル 研究 に 利用可能 な 細胞株、DNA、その他の生体試料のもっとも多様なコレクションを保存している研究所のひとつと考えられています。Coriell は、複数 のバイオレポジトリを発展・維持し、豊富 な表現型データが付加された特徴 が明確 な高品質の DNA

実験方法装置Agilent 4200 TapeStation System（型番G2991AA）および Agilent Genomic DNA
ScreenTape（型番 5067-5365）、Agilent
Genomic DNA 試薬キット（型番 5067-5366）を解析に使用しました。分解していない DNA の品質は、1 ～ 10 のスコアで評価し、10 が最も高い品質、1 が最も低い品質となります。スコアが 7.0 以上の DNA サンプルを高品質として分類しました。

を科学コミュニティに提供しています。Coriell

DNA サンプルの濃度および OD は、Nanodrop

試料の抽出、処理、凍結保存および確実な保Scientific, Inc.）を用いて測定しました。

での 主 な 強 みは、DNA およびその 他 の 生体存 にあります。長期保存の前 に、生体サンプ

ルに 対しさまざまな 品質管理（QC）のためのアッセイが実施されています。QC プロセス

では、蛍光光度計を用いた定量、酵素処理、同一性解析、分光光度計 を用 いた 純度評価（OD 比）、および品質評価 などが含まれています。一連のすべての QC 項目に合格したサンプルのみが配布に適すると見 なされ、保存されます。

4.の通りです。培養細胞に陰イオン界面活性剤を加え溶解し、RNase およびProteinase K により RNA およびタンパクえ不溶性の細胞片を遠心分離により除去しました。上清に 2 倍量のエタノールを加え、析出した DNA を巻き取り回収しました。DNA ペレットは TE バッファ（10 mM Tris、pH 8.0/1 mM EDTA）に溶解しました。

保存されました。

本研究では、管理された手作業の方法で50 サンプルが取り出されました。フリーフリーザー内の位置、サンプルボックスに関する電子情報が使用されました。解凍の管理ができるよう、サンプルはクライオ

5.

カートを用いて収集しました。

DNA が制限酵素で切断されることを確認するため、酵素処理を行いました。DNA溶液（1 µg）は EcoRI および HindIII 制限酵素で処理しました。Thermo Scientific

FastDigest EcoRI restriction enzyme（cat.# FD0274）は G^AATTC サイトを、

Thermo Scientific FastDigest HindIII

restriction enzyme（cat# FD0504）はA^AGCTT サイトを認識します。両酵素は universal FastDigest Buffer を用い

gDNA は Miller による塩析法を改変し抽出されました。方法の概要は以下

備えた -80 ℃ の標準的なフリーザーでザーを開けている時間を減らすため、サン手順
1. gDNA は、ヒトの組織または血液サンプルから樹立された細胞株から 1990 年から2000 年の間に抽出されました。
2.

サンプルは、温度モニタリングシステムを

プルの 取り出し過程ではフリーザーやUV-Vis spectrophotometer（Thermo Fischer質を分解しました。混合後、塩溶液を加2

3.

6.て 37 ℃ で 10 分間処理しました。

制限酵素処理した DNA および 未処理の DNA サンプルを 20 ng/µL に希釈し、TapeStation System と従来のゲル電気泳動を用いて評価しました。

結果と考察ASample 1
Ideal quality

Sample 2
Extra bands

Sample 3
Low conc.

Sample 4
Partially degraded

Sample 5
Failed QC

Coriell Institute における
TapeStation System の導入

2016 年以前は、Coriell では gDNA サンプルを従来のゲル電気泳動を行い、画像を取得し視覚的に品質の評価を行っていました。DNA が画像では、酵素処理・未処理のサンプルの比較において、従来の手法と同様のアプローチができ、同じ結論となることが分かります。さUncut

す。TapeStation Analysis Software のゲル

HindIII

System でのゲル画像を並 べて表示していまEcoRIした。図 1B では 各 サンプルの TapeStation

Uncut

gDNA サンプルを用いた比較試験が行われま

HindIII

性能を評価にするために、さまざまな品質のEcoRI

導 入 さ れ まし た。TapeStation System のUncut

を 利 用 するた め、TapeStation System がHindIII

指標として、DNA Integrity Number （DIN）

EcoRI

た gDNA の 品質 を評価するための 客観的 なUncut

2016 年に Coriell Institute では、抽出されHindIII定されていました。

B [bp] A1 (L)EcoRI

Nanodrop UV-Vis spectrophotometer で測Uncutました（図 1A）。DNA 濃 度 および OD は、HindIIIに、EcoRI または HindIII で処理した gDNAと 未 処 理 の gDNA とを 並 べて 泳 動 して い

EcoRI

制限酵素 で 切断可能 であるか 確認するため

H1A2B2F2G2H2B1C1D1C2D2E2E1F1G1DIN
6.3

DIN
6.5

DIN
9.2

DIN
6.4

DIN
6.4

DIN
9.1

DIN
6.5

DIN
6.6

DIN
9.5

DIN
5.9

DIN
5.9

DIN
6.9

DIN-

DIN-

DIN-

48,50015,000
7,000
4,000
3,000
2,500
2,000
1,500
1,200
900
600
400250100

図 1. 品質の異なる 5 種類の gDNA サンプルの評価

らに、各サンプルに対して自動的 に算出され各サンプルで、制限酵素未処理の gDNA を EcoRI または HindIII 処理したサンプルの隣に表示しています。A）従な数値 が得られます。制限酵素処理していなのサンプルの DIN を赤色で表示。黄色の警告は、サンプルの濃度が高すぎることを、赤色の警告はサンプル濃度がる DIN により、サンプル品質に対する客観的いサンプルの DIN は、従来のゲル電気泳動の結果を視覚的に評価したこれまでの結果と相来のゲル電気泳動の画像のキャプチャ B）同じサンプルでの TapeStation Analysis Software のゲル画像。未処理

DIN 推奨範囲外であることを示しています。

関していました。

3DNA の長期保存

Coriell では 生体サンプルの長期保存を行っています。DNA は 安定した分子と考えられていますが、さまざまな条件によって DNA 塩基の欠失や DNA 鎖が切断されることがあります。長期間 -80 ℃ で保存した後のDNA の安定性について判定する試験を実施し、1990 年から 2000 年の間に抽出された 50 サンプルを選択し、濃度および品質評価基準を確認しました。濃度は分光光度計（Nanodrop）を用いて測定し、当初の濃度との差が 10 % 以内、OD 260/280 比はおよそ 1.75 ～ 1.80 で品質が良いと判断されました。検証したすべてのサンプルに対して DIN は7.0 を超えていました（図 2）。

図 2. 1990 年から 2000 年の間に抽出され、Genomic DNA ScreenTape Assay で解析した 50 サンプルのゲル画像および DIN

レーン上の警告は濃度が高すぎることを示しています。

サンプルを抽出した年と DIN の関連を図 3 に示します。DNA の品質は1010 年間で安定しており、安定して信頼度の高い DNA 抽出が行われてい99ることが明らかになりました。さらに、すべてのサンプルで 高い DIN が88が持続して高い品質を示すことも確認できました。

66

77
DIN
DIN得られたことから、20 ～ 30 年にわたる長期の保存後でも DNA サンプル

55
44
33
22111990
1990

1992

1994

1996

1998

2000

Yearof DNA
DNAextraction
Extraction
Year of結論

図 3. 1990 年から 2000 年の間に抽出され Genomic DNA ScreenTape Assayで解析した 50 サンプルの DIN

Coriell Institute for Medical Research では、DNA、RNA、およびその抽出し長期保存された、50 サンプルの品質に関してレトロスペクティブ解

ニティに提供しています。Coriell では、2016 年に従来のゲル電気泳動にCoriell では数十年にわたって gDNA サンプルが高い水準で扱われ、確実核酸分析を自動化し、評価者の経験に依存しない客観的な DNA 品質の指うな新しい QC 手法の登場により、バイオバンクのサンプルの品質において他の生体試料の最も多様なコレクションを保有し、国際的な研究コミュ代わり TapeStation System を導入しました。TapeStation System は、標として、DIN を算出します。DIN を用いて、1990 年から 2000 年の間にwww.agilent.co.jp/chem/tapestation
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析を行いました。すべてのサンプルで高い DIN（> 7.0）を示したことから、に長期保存されていることが確認されました。TapeStation System のよ

科学コミュニティが求める品質基準を満すことを保証することができます。