Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)ISSN 1348-5474

July 2010
第9巻 第1号

Journal of Japanese Society for Extremophiles

巻頭言 ………………………………………………………

１

研究最前線 …………………………………………………

2

研究奨励賞受賞研究 ………………………………………

4

原著論文 ……………………………………………………

15

第 11 回シンポジウムプログラム …………………………… 31
第 11 回シンポジウム講演要旨 ……………………………

33

学会記事 ……………………………………………………

45

学会誌投稿規定・執筆要領 ………………………………… 48
会則・細則 …………………………………………………… 50
運営体制 ……………………………………………………

52

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)巻頭言

微生物を創る時代に生きる

京都大学農学研究科応用生物科学専攻 教授
左子 芳彦
つい先日 Science に米国の Venter らが、化学合成
したゲノムを移植して人工細菌を創り自己増殖できたとの論文を発表した。ご承知のように彼らは、生物の全ゲノム解析を開始し、世界の海のメタゲノム解析を試み、数年前から人工細菌の作製に取り組んでいた。生物学もいよいよくる所まで来た感がある。
分子生物学の発展により生物学は飛躍的な進歩を成し遂げたが、それとともに生物学の主流は原核生物
から真核生物に移ってきた。ポストゲノムはタンパ
ク質と考えた日本人研究者の予想は外れ、米国における次世代シーケンサーの開発とともに始まった新ゲノム時代は驚異的な進展を遂げつつある。そして微生物における最新のゲノム解析技術により、迅速に大規模なメタゲノムやトランスクリプトームの解
析も可能になってきた。生物学分野の多くの研究者にとって、将来戦略を根底から問われる時期にきていると思われる。とりわけ、ゲノムデータは急速に膨張する一方であるが、それを解析可能な研究者が日本には圧倒的に不足しているのが現状である。
このような時代に、極限環境生物を研究している
我々に有効な羅針盤はあるのか。厳しい競争と斬新なアイデアを後押しする豊富な研究費を有する米国、
数と資金や統制力の中国を相手にするのはあらゆる分野がそうであるように、将来の日本にとって極めて厳しいであろう。しかし私はまだまだ可能性があると信じている。それは日本人には、潜在的に極めて独創的で特異な文化や考え方が存在し、これをいかに発見し育てるかにかかっていると思われる。それは損得を考慮しない趣味的でセンスの良いマニア
ックな文化や気質である。好きをとことん追求し、孤高のマニアとして他の追随を許さない探究心と実行力である。例えば茶の湯、日本庭園、盆栽、漆器、
日本食やコミック等、京都や江戸をはじめ伝統的な文化や芸術品に多く認められる。また私の趣味の分野である、蝶や昆虫のコレクターやカメラのマニア
1を長年観察すると、世界には見られない独創的で驚くべき能力と持続力・集中力で自己世界を邁進されているアスリートがゴロゴロ見受けられる。アマチ
ュアでありながら、専門誌に投稿し専門書を刊行するなどそのレベルと活力は驚異である。カメラも大変良い例で、いまだに機械式ライカへの造詣が極めて深くそれを理解と尊敬を持って正当に評価して愛用し、また同時に超先端のデジタルカメラを世界に先駆けて開発しているのも日本人である。
私の研究室では 1996 年に海洋熱水孔から好気性
超好熱古細菌 Aeropyrum pernix を発見後、多様な研究テーマをやりながら即有用研究に直結しない新種探索を続けている。メタゲノム解析に代表される
ハイスループットな手法の重要性は十分認識しつつも、地球が数十億年かけて創造した地球起源の極限
環境生命を発見しその謎に挑戦したいと考えている。
最近多くの要望に応えて Aeropyrum の分離責任を果たすべく全ゲノム解析に加えて、簡便な 90℃でのコロニー形成や遺伝子操作法の確立に邁進し始めた。
また本種に感染するウイルスも、パスツール研究所との共同研究で発見に至った。これまで発見されていない全く新奇な微生物の探索には大変ロマンを感じ、相変わらずハイリスクのおたく研究を続けながら、独創的な研究を創造可能な逞しい学生の発見育成に努めている。人と異なる考えを持ち、変わった人材を求めるといつも研究室に分属前の３回生に宣言しているが、京大でも近年このような絶滅危惧種のような人材が激減し憂慮されている。幸いなことに我がラボの出身者は大変変わり者（失礼）が多く、研究成果より極限環境人を輩出できていると密かに自負しているが、学生さんの育成は大変困難な仕事
で情熱だけでは不可能である。とりわけ直近の成果を求められる昨今の研究費や環境では、日本の行く末を担う大物を育むことは極めて困難である。すぐにできることや既に他人が報告していることを始めても、日本の屋台骨を背負う人材は育たない。やはり生みの苦しみを乗り越えて、厳しい競争を繰り返し、他の追随を許さない他人が考えないあるいは思
いついてもやる気が出ないほど大変な研究を地道にしかし楽しく目標を持って一歩一歩直実にこなしていける勇気と根性を養うことは、あらゆる面で苦境が続く日本にとって必須のことと思われる。
極限環境生物を愛する人こそ、日本の再起を支える柱になっていただけると期待し、是非ともご一緒に新種と新人材の発見と育成にご協力願いたい。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)

研究最前線
ゲノム情報を基盤とした機能未知遺伝子の機能解明

京都大学大学院工学研究科合成・生物化学専攻生物化学工学分野

跡見 晴幸

管理・DNA 複製・ストレス応答など幅広い生命現象について研究している。特にゲノム解析が完了している上に遺伝子操作技術が確立されている超好熱菌
Thermococcus kodakarensis を中心に研究を進めている。ゲノム上には 2,306 の遺伝子が存在し、一次構造から機能予測できる遺伝子数はその約半数の1,165 個であり残り半数は機能未知の遺伝子であった。我々の当面の目標はこれら機能未知遺伝子の機能解明にある。
基本的な研究戦略は主に以下の２つであるがいずれも非常に単純なものである。
１）ゲノム情報と形質の違いに着目した新規代謝酵
素・代謝経路の同定
我々はゲノム情報から推定される酵素・代謝経路の有無と T. kodakarensis KOD1 株の実際の形質・代謝

ゲノム解析はこの 10 年余り盛んに行われ、その結果膨大な量の一次構造情報が提供されてきた。
Genomes OnLine Database（GOLD）によると既に1,300 の生物種（うち 9 割が微生物）に対して全ゲノ
ム塩基配列が公表されており、また現在 6,000 種の生物に対してゲノムプロジェクトが進行中である。
データベースには“hypothetical protein”と分類されるタンパク質だけでも 14,000,000 個も登録されており、大まかにしか機能推定できない遺伝子も含めると機能が不明な遺伝子（機能未知遺伝子）の数は膨大であることが容易に想像できる。増加する一方の一次構造情報をいかに解読し、有効活用へと繋げる
かがポストゲノム研究の最重要課題である。
当研究室は「極限環境微生物」と「ゲノム」をキーワードとし、代謝・転写制御・タンパク質の品質
2

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)することにより、糖代謝や熱ショック応答に関わる多数の遺伝子を同定してきた。この手法は注目している環境変化や刺激が予め明確に設定されている場
合は非常に有効であるが、ゲノム上に存在する膨大な数の機能未知遺伝子の機能解明の手掛かりにするには、あまりにも研究者の発想に依存する。そこで、
超好熱始原菌における転写制御の大部分が activator
依存型ではなく repression/derepression によって制御されていることに注目し、我々は準網羅的に転写制御因子の破壊を進めている。Repression/derepression型の制御では、その制御系がどのような刺激に応答するかを知らなくても多くの場合に転写制御因子のloss-of-function は transcriptome 変化に結びつくと考えられる。もちろん実験室で確立した最適培養条件
が細胞にとって“居心地のいい（＝刺激の少ない）”条件であることを前提にしているが、この前提が正
しいかを含め、今後の実験結果を楽しみにしている。
このような戦略で、同一 regulon 内に機能が分かっている遺伝子と不明な遺伝子が混在する場合には後者の機能を推測する大きなヒントが得られる。また
regulon を構成する遺伝子の機能から破壊した転写制御因子がどのような刺激の応答に関与するかの手掛かりも得られると期待している。

特性との違いに着目して、機能未知遺伝子の機能解明、新規代謝経路の同定を目指している。ここでの研究の進め方を簡単に紹介したい。まず機能推定可能な遺伝子の情報に基づいて T. kodakarensis の物質
取り込み・代謝マップを作成する。続いて注目する
代謝経路について、それを構成する酵素の相同遺伝子がゲノム上に存在するか否かを検証する。全て揃っている場合は問題ないが、一部の遺伝子が見当たらない場合も多々あり、その場合は新しい研究テー
マにつながる。まずは培養実験などを通じてその代謝経路の有無を実験的に調べ、増殖特性などの形質からその代謝経路の存在が示唆される場合は、欠けている遺伝子の機能を示す別の遺伝子（群）が存在するはずなので、その同定を目指すことになる（missing gene の探索）。この際には我々はオーソド
ックスな生化学・遺伝学的手法に加え、比較ゲノム的手法や transcriptome 解析を利用している。また同一代謝反応に関与し得る遺伝子がゲノム上に複数存在する場合も多々ある。この場合にはそれぞれの遺伝子産物を生化学的に解析する、あるいはそれぞれの遺伝子破壊株を作製して、形質評価を行っている。
いままでの経験では、一次構造の相同性が比較的高い遺伝子同士であっても、異なる基質特異性を示すことが多々あるので、遺伝子の機能を解析する際にはアノテーションにしばられすぎないことが重要であると実感している。このような戦略で炭素中央代
謝・アミノ酸生合成・補酵素生合成を中心に T.
kodakarensis の代謝機構の解明を目指している。
２）Regulon 確定に基づく遺伝子の機能解明
Regulon とは共通の転写因子により制御を受ける一群の遺伝子集団の総称である。我々は T. kodakarensis
を異なる条件下で培養し、DNA microarray を利用して transcriptome の変化を解析している。これまでに炭素源の変化や温度変化に対する本菌の応答を解析

研究室は昨年３月に発足し、現在は教員３名（跡見・金井・佐藤）、教務職員１名、事務補佐員１名、大学院生（博士課程１名、修士課程７名）、学部学生４名から構成されている。京大の工学研究科化学系
は２００３年８月に吉田の本部キャンパスから桂キ
ャンパスに移転しました。桂キャンパスは京都市西部に位置する緑豊かな丘の上に建設された新しいキャンパスで、研究室からは京都市内が一望でき、夜景も大変きれいです。もし機会がございましたら、一度お立ち寄り下さい。

3

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)

極限環境微生物学会
研究奨励賞受賞研究

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9,

4-10

Nojiri H.

Molecular basis of xenobiotic-degrading capacity of environmental bacteria

Biotechnology Research Center, The University of Tokyo, 1-1-1 Yayoi, Bunkyo-ku, Tokyo 113-8657, Japan
Corresponding author: Hideaki Nojiri, anojiri@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp
Phone: +81-3-5841-3964, Fax: +81-3-5841-8030
Received: June 28, 2010 / Accepted: June 28, 2010

環境細菌の難分解性環境汚染物質分解能発現機構の解明
東京大学・生物生産工学研究センター 野尻秀昭

Abstract
Xenobiotic degraders play an important role indecomposition of various contaminants in naturalenvironment. We isolated various degraders of carbazole,which is nitrogen-containing heteroaromatic compoundcontained in coal-tar, creosote, and crude oil, andisolated carbazole degradative car gene clusters fromseveral carbazole-degraders. Among the carbazole
degradation pathway reactions, initial dioxygenation
catalyzed by carbazole 1,9a-dioxygeanse (CARDO) isvery interesting because of its novel regio-selectivity indioxygenation of carbazole and dioxins. X-ray
crystallographic study of the components of CARDO
followed by biochemical investigation revealed themechanisms of substrate recognition by terminal
oxygenase component of CARDO and electron transferfrom NADH to terminal oxygenase via ferredoxin
reductase and ferredoxin. On the other hand, car genecluster is located on the IncP-7 group conjugativeplasmid pCAR1. To understand the behavior of pCAR1
and its molecular mechanism, we carried out themonitoring of pCAR1 itself and pCAR1-having hostPseudomonas strains, and transcriptome analyses ofseveral hosts with or without pCAR1. As the results, we
succeeded in detecting novel host responses to having
pCAR1. Further analyses suggested the new mechanisms
determining the plasmid effects on host cell phenotype.

１．芳香環水酸化酵素の基質特異性決定メカニズム
芳香族化合物の好気的分解経路では、芳香環に対する cis 型二水酸化反応が初発酸化反応である場合が多く、この反応は Rieske non-heme iron oxygenase（RO）と呼ばれる酵素が触媒する。RO は、実際に基質の酸化反応を担う末端酸化酵素と、NADH 由来の電子を末端酸化酵素に伝達する電子伝達コンポー
ネント（フェレドキシンとフェレドキシン還元酵素の両方、あるいは還元酵素のみ）から構成される。
RO の名前は、末端酸化酵素が活性中心に非ヘム型の 鉄 を 持 つ こ と と 電 子 伝 達 の た め の Rieske 型[2Fe-2S]クラスターを有することに由来する。
我々は、原油中の含窒素芳香族化合物カルバゾー
ルの分解菌を主な研究対象として、研究を行ってきた。カルバゾールは、窒素原子の隣とその隣の芳香環炭素原子が二水酸化されるという特殊な初発酸化反応（核間二水酸化）を経て好気的に分解される（図１A）。ナフタレン等の分解経路では、図１B に示す
分子末端の空間的に空いた場所が水酸化される反応（末端二水酸化）が初発酸化反応であるのに対し、
なぜカルバゾールの場合に空間的に混み合った位置
への二水酸化が起こるのかに興味を持ち、その分子レベルでの解明を試みた。

4

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)質結合ポケット内の壁は疎水性アミノ酸の側鎖で主に構成されており、基質の芳香環が結合しやすい環
境が作り出されている。カルバゾールの結合状態は、
ポケット内の疎水性の壁との相互作用により芳香環が保持されることと、G178 の主鎖カルボニル基がカルバゾールのイミノ基との間で水素結合を形成する
ことで図２に示す形で固定されている。この結合の結果として、活性中心に結合した酸素分子の二つの酸素原子から核間炭素原子である C9a 炭素原子とその隣の C1 炭素原子が最も近い位置に配置されることになり、芳香環に対して活性中心側から二つの酸素原子が C9a 位、C1 位をアタックして cis 型の二つの水酸基が導入されることになる。基質結合ポケッ
トの形状（疎水性ポケットの壁のでき方）が基質の結合形態（binding orientation）を決定し、その結果として活性化された酸素原子に近い位置が水酸化されるというセオリーは、構造が決定されている全ての末端酸化酵素で共通であり、全ての RO における基質特異性を決定する共通メカニズムであると考えられる。

カ ル バ ゾ ー ル 資 化 菌 Pseudomonas resinovorans
CA10 株 か ら 世 界 に 先 駆 け て 核 間 二 水 酸 化 酵 素carbazole 1,9a-dioxygenase（CARDO）をコードする遺伝子群のクローン化に成功した 11) のを契機に、
CARDO がなぜその反応を触媒できるのかを解明するため、基質特異性の解明と酵素学的解析 7,9)を行う
と共に、X 線結晶構造解析を行った。我々は、CA10
株由来 CARDO と非常に相同性が高い（数残基のアミノ酸置換しか存在せず各コンポーネントとも同一の機能を有する）Janthinobacterium sp. J3 株由来のCARDO のコンポーネントを用いて、CARDO の末端酸化酵素の構造を世界ではじめて明らかにすることができた（図２左上） 8)。このブレークスルーとその後のカルバゾール結合状態の構造解明（図２右下）
1)などにより、本酵素の基質認識機構が明らかになり、特殊な核間への二水酸化機構を明らかにすることができた。すなわち、基質ポケットの最奥部には活性中心となる二価鉄イオン（図２中の緑色の球）が二つのヒスチジンと一つのアスパラギン酸をリガンドとして結合しており、サイドオン型で酸素分子が結合する（図２中の赤色の球）。活性中心近傍の基

図１ カルバゾールへの核間二水酸化（angular dioxygenation, A）とナフタレンへの末端二水酸化（lateraldioxygenation, B）
核間二水酸化では、ヘテロ原子と結合して空間的に混み合った位置の核間炭素原子（angular carbon）とその隣の芳香環上の炭素原子が cis 型の二水酸化を受けるのに対し、末端二水酸化では分子末端の空間的に空いている部位の隣接した二つの炭素原子が cis 型の二水酸化を受ける。

5

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)

図２ Carbazole 1,9a-dioxygenase の末端酸化酵素の構造 8)と核間二水酸化を触媒するカルバゾール認識機構
ドーナッツ型の末端酸化酵素の構造（左上）から、３つのサブユニット（CarAa タンパク質）が head-to-tail型に結合したホモ三量体構造を有していることが解る。各サブユニットには右下に示した基質結合ポケットが存在している。右上、左下の図は、右下の図をそれぞれ上と左側（基質ポケット奥側）から見た構造を示している。赤の点線はカルバゾールのイミノ基の窒素と G178 の主鎖カルボニル基の酸素との間に形成される水素結合を示し、赤矢印は酸素原子のアタックを示している。

２．芳香環水酸化酵素におけるコンポーネント間電子伝達のメカニズムCARDO は、上で話題に挙げた末端酸化酵素（Oxy）とフェレドキシン（Fd）とフェレドキシン還元酵素（Red）からなり、反応の進行には３つのコンポー
ネント間の円滑な電子伝達が必須である。我々はCA10 株／J3 株由来 CARDO を用いて Oxy－Fd の結合状態での X 線結晶構造解析に成功し（図３A）、両コンポーネントの結合位置と電子伝達経路を明らかにした 1)。二つのコンポーネントの結合は多くの疎水性相互作用や塩橋・水素結合により安定化されており、それらには図３B に示したアミノ酸が関与していた。これらが、二つのコンポーネント間の特異的な相互作用の成立に重要な役割を果たしているものと思われる。
一方、上の解析と平行して、カルバゾール資化菌
を自然界から多数単離し、分解菌・分解酵素の多様性の解析も行ったが、この過程で電子伝達系（Fd やRed）が CA10 株／J3 株のものとは異なる CARDO
を２種発見した 3,18)。それら Novosphingobium sp. KA1
株、Nocardioides aromaticivorans IC177 株から得られた２種の CARDO に加え CA10 株／J3 株由来のものも加えた 3 種を用いて、コンポーネントの互換性を
分光学的・酵素学的解析により詳細に解析した 2)（一部は未発表）。その結果、KA1 株由来の Fd－Red は
例外的に選択性が高いものの、他の CARDO では Fd
6

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)とが重要となってくる。現在、嫌気環境下での結晶
化 ・ 構 造 解 析 の 実 験 系 と isothermal titration
calorimetry による嫌気環境下での結合定数の測定系を立ち上げ、酸化還元状態特異的な構造変化と結合親和性変化の検出を試みているところである。

－Red 間の認識は緩く他の由来のコンポーネントとの間で電子の授受が可能であった。一方、３種全ての CARDO における Fd－Oxy 間には厳密な相互認識が存在しており、本来の組み合わせ以外の相手とは電子の授受が不可能であった。図３B に示したアミノ酸残基の中には、IC177 株や KA1 株由来の Oxy、Fd には保存されていないものもあり、それらの中にはコンポーネント間の結合形成に共通な役割を果た
すアミノ酸残基と、各 CARDO における特異的相互作用に関わるアミノ酸残基が存在することが示唆されている。実際、IC177 株、KA1 株由来の Oxy、Fdの構造解析にも成功しており 2)（一部は未発表）、結晶構造を用いたドッキングシミュレーションから、それらが各 CARDO の Oxy－Fd 間の厳密な分子認識に関わるアミノ酸残基である可能性も示唆されている。
ところで、実際の反応サイクルでの効率的な電子伝達のためには、還元型の電子供与体（Fd）は酸化型の電子受容体（Oxy）に結合しやすく、電子を授受して酸化還元状態が逆になると結合力が減少して乖離しやすくなることが重要となる。すなわち、酸
化還元依存的に構造が変化し結合力が変化する可能性が高い。先に述べた図３の Oxy－Fd の結合構造情
報は、結合位置等の情報を与えてはくれるが、酸化還元に依存した構造変化については情報を与えてくれない。すなわち、反応サイクル中での正しい酸化還元状態を保った形で構造解析や機能解析を行うこ

３．分解プラスミドの機能発現機構の解析
P. resinovorans CA10 株のカルバゾール分解系酵素
遺伝子の解析の過程で、カルバゾール分解系 car 遺伝子群が約 200 kb のプラスミド pCAR1 上に存在することを明らかにした 10)。その後、pCAR1 の全塩基配列を決定するとともに（図４）、複製・保持・接合伝達機能について解析を進め、当該プラスミドが不和合成群 IncP-7 群に属する接合伝達性プラスミドであることを示した 4,15,17)。
ところで、pCAR1 のような接合伝達性の分解プラ
スミドは環境中で様々に宿主を変えて存在しているはずである。我々は、①pCAR1 の環境中での真の宿主は何か、②分解菌・プラスミドが環境中でどう振る舞うのか、③分解プラスミドが異なる宿主細胞内でどのように機能を発揮するのか、について興味を持ち研究を開始した。①の詳細は割愛するが、環境中での真の宿主域は提唱されているものより広い可能性が示唆されている。これについては、さらに解析を進めて今後報告していきたい。②については、
モデル環境を用いたモニタリングを様々に行い、分解の進行、接合伝達の成否、生残性などが、宿主の図３ 末端酸化酵素とフェレドキシンの結合状態の構造 1)
A は末端酸化酵素のサブユニット結合領域近くに３分子のフェレドキシンが結合している構造を示している。この結果、二つのコンポーネントの結合面が明らかになり、B に示すコンポーネント間の水素結合、塩橋、疎水結合の形成に関与するアミノ酸残基の組み合わせ（酸性アミノ酸と塩基性アミノ酸、疎水性アミノ酸どうし）が明らかになった。
7

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)込み系遺伝子の転写を活性化し、pCAR1 を保持した宿主が鉄制限培地で生育が遅れることが示されている（図５）13)。KT2440 株では Fe3+取り込みに関与するシデロフォア pyoverdine の生合成遺伝子の転写が活性化すると共に、実際に培地中の pyoverdine 量も増加することが確かめられている（データ示さず）
13)。
上で述べたような pCAR1 による宿主トランスク
リプトームや形質への影響の少なくとも一部は、
pCAR1 上にコードされる核様体タンパク質の作用であることが示されている 19)。このようなプラスミ
ド由来の核様体タンパク質は染色体由来の相同因子と相互作用することができ、両方のゲノムに由来する関連因子がトータルとしてプラスミド・染色体双方の多数の遺伝子発現に影響を与えることが予想される。接合伝達性プラスミド（あるいはその上にコードされる核様体タンパク質）にとって、接合に伴う宿主の違いは染色体上の核様体タンパク質の質
的・量的違いを表し、この違いがプラスミド・染色体両ゲノム上の多数の遺伝子の転写変動を介して、種々宿主ごとの形質の違いを生んでいる可能性がある。
今後は、核様体タンパク質の作用メカニズムをタ
ンパク質レベルでの機能を含めて詳細に解析することが必要であろう。さらに、多種の宿主（多種の染色体・多種の核様体タンパク質）と pCAR1 がどのように相互作用するのか、相互作用に基づく宿主機能の変化の幅はどの程度なのかも重要な検討対象となるだろう。

違いと環境要因の違いによって大きく変化することを見いだした 12,14)。同一の（分解）プラスミドが宿主に与える形質が宿主ごとに異なるという点 14)は、従来あまり指摘されてこなかった事実である。これは、プラスミド研究が、そのプラスミドを元々持っていた宿主のみを用いた解析を通じて主に行われて来たことに起因する。プラスミドの環境微生物学における重要性は、染色体とは異なる遺伝因子であるという点に加えて、接合伝達によって宿主を替える（共存する染色体を替える）点にある。このような観点から、我々が pCAR1 で発見した知見は非常に重要な示唆を与えるものである。また、接合伝達の成立に Ca2+, Mg2+が必須で、両イオンの効果は相乗的なことも発見した 12)。実環境中ではフミン酸などの陽イオンをキレートする物質も多く、この結果は環境中でのプラスミドの挙動を考える上でも重要な成果と言える。③については、新しいプラスミド－
染色体間相互作用の検出を目指して、種々の宿主に
pCAR1 を保持させた場合の宿主形質を精査すると共に、発現解析用アレイとタイリングアレイを利用した転写ネットワークの解明を行った 5,6,13,16)。これ
により、pCAR1 の存在が宿主特異的に多くの染色体上の遺伝子の転写を変化させること、宿主の違いが
pCAR1 上の特定の領域の転写量に大きく影響すること、pCAR1 が宿主に与える形質は宿主ごとに大きく異なることが明らかになった。顕著な例としては、
pCAR1 は Pseudomonas putida KT2440 株 、
Pseudomonas aeruginosa PAO1 株 、 Pseudomonas
fluorescens Pf0-1 株の３種の宿主内で同様に鉄取り

図４ Pseudomonas resinovorans CA10 株から単離されたカルバゾール分解プラス
ミド pCAR1 の物理地図 4)
円の外側は時計回りでコードされる遺伝子を、内側は反時計回りでコードされる遺伝子を示す。遺伝子の（推定）機能は以下の様に配色で示す。オレンジ，プ
ラスミドの保持や DNA の代謝；暗緑色，
接合伝達；青，転移あるいは integration；
赤，物質代謝；淡緑色，輸送；黒，制御；
マゼンタ，その他の機能；灰色，機能未知（hypothetical protein に相同性有り）；黄色，機能未知（相同性無し）。内部は各遺伝子の G+C 含量を示し、波線は pCAR1の平均 G+C 含量（56%）を示す。
8

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)図５ pCAR1 による鉄取り込み関連遺伝子群の転写誘導と鉄制限培地での生育への影響 13)
Pseudomonas putida KT2440 株、Pseudomonas aeruginosa PAO1 株、
Pseudomonas fluorescens Pf0-1 株における、
pCAR1 を保持する場合（赤）と保持しない場合（青）の鉄取り込み関連遺伝子群の RNA マップ（KT2440 株、PAO1 株、Pf0-1 株での結果はそれぞれ A, C, E で示す）と鉄制限培地での生育（それぞれ B, D, F で示す）。鉄制限培地は 1 μM の FeCl3 を含む。
ター、BIRD-JST、科学研究費補助金（20248010）から多大なサポートを受けました。この場を借りて御礼申し上げます。

４．最後に一般的な環境ではあっても存在する微生物の大半は培養できないこともあって、環境微生物研究は未だにフロンティアとしての側面を多く含んでいる。
この意味で一般環境も新たな発見を提供し微生物世界の裾野を広げてくれる「極限環境」の側面がある。
今後は、分子生態学的手法・ゲノム科学的手法等を積極的に取り入れ、種々の環境の中での微生物の生きざまをより詳細に明らかにしていきたい。これにより、新しい視点の「環境と微生物」のサイエンスを発展させたいと考えている。
謝辞
本研究は、東京大学生物生産工学研究センター環境保全工学部門（旧生物制御工学部門）にて行われたものです。大森俊雄東京大学名誉教授（現芝浦工業大学）、山根久和東京大学教授には研究のデザイン、遂行、考察に至るまで大変お世話になりました。また、研究室の過去・現在のポスドク・学生さん、多くの共同研究先の先生・学生さんの探究心・努力・
協力がなければこの成果は達成できなかったと思います。関与してくださった全ての方に感謝いたします。最後に、本研究を遂行するにあたり、生研セン
9

引用文献
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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9, 11-14

極限環境微生物学会
研究奨励賞受賞研究

Kikawada T.

Molecular background underlying an extreme desiccation tolerance in an
anhydrobiotic insect, Polypedilum vanderpkanki.

Anhydrobiosis Research Unit, National institute of Agrobiological Science, Ohwashi 1-2, Tsukuba, Ibaraki 305-8634,
Japan
Corresponding author: Takahiro Kikawada, kikawada＠affrc.go.jp.
Phone: +81-29-838-6170, Fax: +81-29-838-6157
Received: June 21, 2010 / Accepted: June 21, 2010

ネムリユスリカの極限乾燥耐性を支える分子基盤の解明（独）農業生物資源研究所 乾燥耐性研究ユニット 黄川田隆洋

イオン除去活性を持つ高親水性タンパク質である
LEA タンパク質(PvLEA1, PvLEA2, PvLEA3)が乾燥
誘導的に蓄積することで、乾燥時に細胞を保護している可能性を明らかにした 2)。また、ネムリユスリ
カの脱水過程に、水チャネルであるアクアポリン(PvAQP1)が関与しており、細胞膜の水透過性を上げることで、昆虫体内の自由水が完全に蒸発することを促していることも明らかにした 4)。トレハロース
は緩慢に乾燥すると生体保護効果の全くない二水和物の結晶となるが、急速に乾燥させると生体保護能を持つ無水物のガラス状態に変化する。トレハロー
スの合成・拡散とアクアポリンによる急速な脱水によるガラス化が、アンヒドロビオシス維持に重要であると考えられる 4)。また、LEA タンパク質は、乾燥に伴い二次構造を変化させ、フィラメント様構造に変化することで、ガラス化したトレハロースを物
理的に強化して、生体保護機能を発揮すると考えられている（図 2）3)。これら一連の研究から、複数の遺伝子や糖及び環境要因が複合的に関与することで、
ネムリユスリカは、アンヒドロビオシスを誘導・維持していることが示唆された（図 3）。
現在、ネムリユスリカを極限乾燥耐性研究のモデ
ル生物とすべく、ゲノム・トランスクリプトーム・
メタボローム解析、培養細胞系の樹立、遺伝子組換え体作出法の開発といった基盤研究を進めている。

最も厳しい環境に適応した究極的形質として、体の水分が完全に失われても吸水すれば蘇生することのできる乾燥休眠（アンヒドロビオシス）が知られている。この特殊な能力を有する最も大きな動物として、アフリカの半乾燥地帯に生息するネムリユス
リカが知られる。アンヒドロビオシスに入ったユスリカ幼虫は極端な温度耐性（-270～100℃）を有し、また１７年間常温保存の後に蘇生した記録もある。
しかしながらこのユスリカの室内累代飼育が不可能であったため、このユニークな現象の生理学・分子学的研究はほとんど行われてこなかった。
2000 年に共同研究者の奥田が飼育法を確立した
ことを皮切りに、ネムリユスリカのアンヒドロビオ
シス誘導には最短で 2 日間の乾燥が必要であることを明らかにした 1)。また、生体成分の保護剤として機能する糖であるトレハロースが乾重の 20％程度まで乾燥に伴って蓄積し（図 1）8)、その合成には昆
虫体内のイオン濃度上昇が引き金となり中枢神経は全く介在していないことを示した 7, 9)。トレハロース
は、脂肪体で特異的に合成され、トレハローストラ
ンスポーター（TRET1）を介して血リンパへ放出され、体内へ広がっていく 5)。そして、体内に均一に分布し、細胞内でトレハロースがガラス化すること
で、全ての細胞が保護されていることが明らかとなった 6)。同時に、昆虫で初めて、シャペロン活性や

11

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)図 1 アンヒドロビオシス誘導によるトレハロースの蓄積 （Watanabe et al. 2002 を改変）。
ネムリユスリカ幼虫は、体内の水分が減少すると共に、トレハロースを爆発的に合成し、体内に蓄積して、アンヒドロビオシス状態になる。

図 2 LEA タンパク質の乾燥耐性付与機構。
LEA タンパク質は、乾燥に伴ってランダム構造からαヘリックスコイルドコイル構造へ変化する。コイル構造に変化した LEA タンパク質は、イオン除去活性や分子シールド活性、フィラメント化などの生化学活性を介して、タンパク質や細胞膜などの生体成分及び細胞そのものを乾燥から保護すると考えられている。また、LEA タンパク質はトレハロースと共存することで、お互いの生体成分保護活性を相乗的に高めることも知られている。ネムリユスリカにはこれまで 3 種類の LEA タンパク質が同定されており、これらが、相補的
且つ協調的に機能することで、極限乾燥耐性を付与していると想像される。
12

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)図 3 ネムリユスリカのアンヒドロビオシス誘導機構の分子モデル
ネムリユスリカ幼虫に乾燥刺激が加わると体内のイオン濃度が上昇し、それがトリガーとなって乾燥特異的な情報伝達経路が活性化される。その結果、トレハロース合成酵素遺伝子（PvTps, PvTpp）及び Tret1 といった遺伝子の発現が誘導され、タンパク質として細胞質や細胞膜に局在する。トレハロースは脂肪体で PvTPS
や PvTPP により爆発的に合成され、TRET1 を通じて血リンパへ放出され、TRET1 とは別の経路でその他の組織の細胞内へ取り込まれていく。PvAQP1 によってネムリユスリカ幼虫体内からの急激な脱水が進行することでトレハロースはガラス化する。LEA タンパク質は、乾燥に伴って両親媒性のαヘリックスに変化し、トレハロースと協力しながら細胞内の様々な生体分子（タンパク質、脂質、核酸など）を乾燥による変性から保護する。

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)ORIGINAL PAPER
NOTE

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9, 15-18

Tsukimura W, Watanabe K, Morokuma C,
Yatsunami R, Fukui T and Nakamura S

Improvement of alkaliphily of thermostable GH family 10 xylanase from
Thermotoga maritima by directed evolution

Department of Bioengineering, Tokyo Institute of Technology, 4259 Nagatsuta, Midori-ku, Yokohama 226-8501, Japan
Corresponding author: Satoshi Nakamura, nakamura.s.af@m.titech.ac.jp.
Phone: +81-45-924-5765, Fax: +81-45-924-5837
Received: December 17, 2009 / Revised: December 24, 2009 /Accepted: December 26, 2009
Abstract Xylanase B (XynTB) from hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima MSB8 is athermostable xylanase classified into glycoside hydrolase
family 10. XynTB is most active at pH 6.0, and shows
lower activity at alkaline pHs. Improvement ofalkaliphily of XynTB was attempted by directed
evolution. One mutant enzyme that showed slightly
higher activity under high temperature and alkaline pH
conditions was acquired from a newly constructed
random mutant library. Protein engineering study of thismutant revealed that the amino acid substitution N92D
(Asn92 was substituted by Asp) could contribute to theimprovement of alkaliphily.

genomic sequence of T. maritima MSB8 has beenreported.11) This bacteria produces two kinds ofxylanases, xylanase A (XynTA) and xylanase B(XynTB).16) XynTA is a multi-domain enzyme consistingof two thermostabilizing domains (TSDs), one catalytic
domain (CatD), two cellulose-binding domains (CBDs)
in this order. On the other hand, XynTB is a single
domain enzyme consisting of only a CatD. In general,xylanases are classified into two glycoside hydrolase(GH) families 10 and 11 on the basis of amino acidsequence similarities in their CatDs.4) Both CatDs of
XynTA and XynTB belong to GH family 10. Previously,
the genes encoding the CatD regions of XynTA(XynTAc) and XynTB were cloned and expressed in
Escherichia coli BLR(DE3).6) The E. coli-produced
XynTAc and XynTB were both thermostable andoptimally active at 60-70°C and 100-110°C, respectively.
The pH optima of these enzymes were 6.0, and bothshowed lower activity under alkaline pH conditions.
The aim of this study is to create the xylanase that is
active under high temperature and alkaline pH conditions.
We focused on XynTB that exhibited higher optimum
temperature than XynTAc, and attempted to improve thealkaliphily of XynTB by directed evolution.
Expression plasmid pET-TB, encoding the mature
sequence of XynTB, was used in this study.6) Random
mutations were introduced into the CatD region ofpET-TB by error-prone PCR.3) The PCR primers used for
amplification were 5′-GAGCGGATAACAATTCCCCTCTAG-3′ and 5′-GCCGGATCTCAGTGGTGGTG-3′. A
random mutant library was constructed by NON-PCR
temperature cycling method.12) Xylanase activity of

Key words: xylanase; glycoside hydrolase (GH) family
10; alkaliphily; thermostability; Thermotoga maritima
Xylan, a major component of plant hemicelluloses, isheterogeneous polysaccharide that has a backbone of
β-1,4-linked
xylopyranosyl
residues.
Xylanase(1,4-β-D-xylan xylanohydrolase; EC 3.2.1.8) catalyzeshydrolysis of β-1,4 bonds of xylan to generate
xylooligosaccharides and xylose. Various applications ofxylanases have been suggested in the paper, food andanimal feed industries.1) The application of xylanases inpulp prebleaching enables minimization of the use ofharsh organochlorine.15) As the pulp is processed underhigh temperature and alkaline pH conditions, xylanases
that are active at elevated temperatures and high pHs aredesirable as industrial catalysts for pulp applications.
Anaerobic hyperthermophilic bacterium Thermotoga
maritima grows at temperatures up to 90°C.5) The entire
15

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)were identified by DNA sequencing. The sequence data
revealed that Mutant 1 possessed three amino acidsubstitutions, N15Y (Asn15 was substituted by Tyr),
Y35F (Tyr35 was substituted by Phe) and N92D (Asn92
was substituted by Asp). Recently, we have solved the
crystal structure of XynTB (PDB ID: 1VBU).7) XynTB
folds into the (β/α)8-barrel structure, which is common
among GH family 10 xylanases. It was suggested thatinteractions between the catalytic residues and the aminoacid residues existing near the active site would
influence the alkaliphily of GH family 10 xylanases.13)
The positions of the substituted amino acid residues,
Asn15, Tyr35 and Asn92, are shown on thethree-dimensional structure of XynTB (Fig. 1). Asn92
existed near the catalytic residues (Glu135 and Glu241)
in the cleft, whereas Asn15 and Tyr35 were located far
from the cleft, indicating that the amino acid substitution
at Asn92 might contribute to the acquired alkaliphily of
Mutant 1.

evolved mutants was screened for improved activity
under high temperature and alkaline pH conditions by
the filter assay.8) Briefly, E. coli BLR(DE3)transformants constituting the library were cultured on anitrocellulose filter laid on a Luria-Bertani (LB) agar
plate containing 50 µg/ml of ampicillin at 37°C for
overnight. The nitrocellulose filter was transferred onto axylan-containing alkaline plate composed of 0.4% (w/v)
oat spelt xylan (Sigma, St. Louis, MO), 1% (w/v) Gelrite(Wako, Osaka, Japan) and 0.2 M Na2CO3-NaHCO3
buffer (pH 10.2), and then hydrolysis reaction was
performed at 90°C for 3 min. By staining xylan in the
Gelrite plate with Congo Red, xylanase activity was
identified as halo-forming ability.
About 27,000 colonies generated by randommutagenesis were screened for alkaline-active mutantsby the filter assay. As a result, one mutant (named
Mutant 1) exhibited a slightly larger halo, compared towild-type XynTB, under high temperature and alkaline
pH conditions. Amino acid substitutions in Mutant 1

Fig. 1. Three-dimensional structure of XynTB.
Top (A) and side (B) views are shown. Glu135 and Glu241 are catalytic residues. The positions ofamino acid substitutions found in Mutant 1 are Asn15, Tyr35 and Asn92.

Site-directed mutations were introduced into pET-TB
using QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene, La Jolla, CA) to construct the expression
plasmid encoding mutant N92D. The PCR primers usedwere as follows: 5′-CTCTTGTCTGGCACgACCAGCTcCCgGGATGGATCACTGG-3′ (small letters andunderlining represent substituted bases and a restriction
site for confirmation of mutagenesis, respectively) andits complementary sequence. The expression plasmids
encoding wild-type XynTB and mutants weretransformed into E. coli BLR(DE3). The transformants
were cultured at 37°C in LB broth containing 50 µg/ml
of ampicillin. When the optical density at 660 nm of theculture reached about 0.5, 0.5 mM isopropyl-β-D-thiogalacto-pyranoside was added to induce gene

expression. The transformants were further cultured at
37°C for 3 h, and harvested by centrifugation at 6,000 ×
g and 4°C for 10 min. The cells were suspended in 25
mM NaH2PO4-NaOH buffer (pH 6.0), sonicated andcentrifuged at 20,400 × g and 4°C for 10 min to preparecell extracts. Since wild-type XynTB and mutants were
thermostable, the cell extracts were heated at 75°C for 30
min, and then the supernatants after centrifugation wereused as purified enzymes. The purified enzyme
preparations were applied to SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis9) followed by staining with Coomassie
Brilliant Blue R-250. Xylanase activity was determinedby measuring the amount of reducing sugars liberated
16

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)suggested that the amino acid substitution N92D should
function to improve the activity under high temperature
and alkaline pH conditions. The Asp residue introducedat position 92 might heighten pKa of the catalytic residue(acid/base catalyst) and thus activity at alkaline pH
values was improved. On the other hand, the amino acidsubstitutions N15Y and/or Y35F might lower the activity
at pH 5.0 and 8.0. Effect of reaction temperature on
activity of XynTB and mutants were measured at pH 6.0.
Wild-type XynTB and mutant N92D were optimally
active at 110°C, while the optimum temperature of
Mutant 1 was 100°C. Furthermore, thermostability of
Mutant 1 was somewhat lower compared to wild-type
XynTB and mutant N92D (data not shown). These
results suggested that the amino acid substitutions N15Y
and/or Y35F in Mutant 1 might lower the thermostability
of XynTB.

from 1.5% (w/v) birchwood xylan (Sigma, St. Louis,
MO). The hydrolysis reaction was carried out at 90°C for
10 min in 80 mM Britton-Robinson buffers.2) The pH
value of each buffer was measured at room temperature.
The reducing sugars formed were measured by theconventional 3,5-dinitrosalicylic acid method.14) One unit
was defined as the amount of enzyme which produced
reducing sugars equivalent to 1 µmol of xylose per min.
The protein concentrations were determined by the
Lowry method10) using the Bio-Rad DC Protein Assay
Kit (Bio-Rad, Hercules, CA) with bovine serum albumin
as a standard.
The purity of each enzyme was confirmed to be morethan 95% by SDS-PAGE (data not shown). Effect ofreaction pH on activity of wild-type XynTB and mutants
were measured at 90°C and various pHs (pH 4.0-11.0).
All the enzymes were optimally active at pH 6.0 (Fig. 2).
Mutant 1 showed higher specific activity at pH 6.0-8.0
compared to wild-type XynTB. Mutant N92D also
showed higher specific activity at pH 5.0-8.0 thanwild-type XynTB. As shown in Fig. 2B, the relative
activity at pH 8.0 of mutant N92D was higher than thatof wild-type XynTB (t test, P < 0.01). These results

Acknowledgments
This work was partially supported by the Global COE(Centers of Excellence) Program from the Ministry of
Education, Culture, Sports, Science and Technology ofJapan (MEXT).

Fig. 2. Effect of reaction pH on activity of wild-type XynTB and mutants.
The enzyme was incubated at 90°C for 10 min with 1.5% (w/v) birchwood xylan as a substrate. The pH of buffers
was measured at room temperature. The level of activity at pH 6.0 (the highest activity) was defined as 100% inpanel B. Circles, wild-type XynTB; triangles, Mutant 1; squares, mutant N92D.

17

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)9)

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9, 19-24

ORIGINAL PAPER
NOTE

Yatsunami Ra, Sato Ma, Orishimo Ka, Hatori Ya,
Zhang Ya, Takashina Tb, Fukui Ta and Nakamura Sa

Gene expression and characterization of a novel GH family 18 chitinase fromextremely halophilic archaeon Halobacterium salinarum NRC-1
a

Department of Bioengineering, Tokyo Institute of Technology，4259 Nagatsuta, Midori-ku, Yokohama 226-8501, Japan
Department of Applied Biosciences, Toyo University, 1-1-1 Izumino, Itakura, Oura-gun, Gunma 374-0193, Japanb

Corresponding author: Satoshi Nakamura, nakamura.s.af@m.titech.ac.jp
Phone: +81-45-924-5765, Fax: +81-45-924-5837
Received: December 24, 2009 / Revised: December 28, 2009 /Accepted: December 30, 2009
family established by Henrissat and Bairoch10) based on
the amino acid sequence similarity for their catalytic
domain regions. GH family 18 contains chitinases frombacteria, fungi, viruses, animals and some plants. On theother hand, GH family 19 contains plant chitinases andfew bacterial chitinases such as Streptomyses griseus
chitinase C. 22) Halobacterium species are extremely
halophilic archaea that thrive in environments nearlysaturated with salt (4.0-5.0 M NaCl). Chitinases from
halophilic archaea have not been reported to date.
Recently, the complete genome sequence ofHalobacterium salinarum NRC-1 was reported19), and achitinase-homolog (named ChiN1) was found in the
genome. Haloarcula japonica TR-1 is also an extremely
halophilic archaeon and has a glycoprotein (CSG) on its
cell surface12,17,21). Because a large amount of CSG is
produced by Ha. japonica, the promoter of csg gene is
expected to be powerful. Thus, it may be possible toconstruct efficient expression systems for foreign genes
in Ha. japonica by employing the csg promoter. In thisstudy, we report expression of Hb. salinarum chiN1 geneincluding its signal sequence in Ha. japonica using the
csg promoter. The biochemical characterization of therecombinant enzyme is also described.
An open reading frame (ORF) of 1,638 nucleotides,
encoding a 546-amino acid precursor enzyme, was foundin the genome sequence of Hb. salinarum. According to
SignalP
V2.0
World
Wide
Web
Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0), a predictedsignal peptide sequence was found in the N-terminal
28-amino acid portion. The predicted signal peptide
contained the sequence D-R-R-S-Y-L-R (in single-letter

Abstract An open reading frame encoding a chitinasehomolog (ChiN1) was found in the genome of extremely
halophilic archaeon Halobacterium salinarum NRC-1.
ChiN1 is a multidomain enzyme consisting of achitin-binding domain, a polycystic kidney diseasedomain and a catalytic domain belonging to glycosidehydrolase family 18. chiN1 gene was successfully
expressed in extremely halophilic archaeon Haloarcula
japonica TR-1 by employing the promoter sequence ofits cell surface glycoprotein gene. A large amount ofrecombinant ChiN1 was secreted into the culture
supernatant. The Ha. japonica-produced ChiN1 was
purified and characterized. The optimal pH andtemperature of ChiN1 are pH 4.5 and 55˚C, respectively.
ChiN1 was most active at 1.0 M NaCl and stable over awide range of NaCl concentration from 1.0 to 4.5 M.
This is the first report on a chitinase from extremely
halophilic archaeon.
Key words: Chitinase; Glycoside hydrolase (GH) family
18; Extremely halophilic archaeon; Halobacterium
salinarum; Haloarcula japonica
Chitin is a polysaccharide made up of N-acetylglucosamine by β-1,4-linkages. It exists widely in nature,such as components of fungal cell walls, shells of crabs
and shrimps, and exoskeletons of insects. For utilizationof chitin, degradation of a polymer is an important
process. Chitinase (EC 3.2.1.14) is an enzyme that candegrade chitin into small molecules. Chitinases, so far
sequenced or identified, are classified into two different
families 18 and 19 within the glycoside hydrolase (GH)19

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)To determine whether chiN1 gene is transcribed in Hb.
salinarum, RT-PCR of chiN1 mRNA was performed.
Hb. salinarum was grown at 37˚C in a liquid medium as
described previously.20) Total RNA was prepared using
RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). The
obtained total RNA was further treated with DNase I(Amersham, Uppsala, Sweeden) to remove trace
amounts of the contaminating genomic DNA. Reverse
transcription was performed using an iCycler
Thermalcycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). The
primer used was 5'-CGTGCCGTCGAAGGGCTGGTAGAGG-3' (MQC-3). The generated cDNA wasthen amplified by PCR by using the following primers:
5'-CATCGAGCTCACTGTCACCACCGGC-3'(senseprimer) and MQC-3 (antisense primer). An expected
RT-PCR product of about 900 bp was obtained andconfirmed to be a part of chiN1 gene by DNA
sequencing (DSQ-2000L DNA Sequencer, Shimadzu,
Kyoto, Japan; ABI PRIZM 310 Genetic analyzer,
Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). No
RT-PCR products were obtained when the reverse
transcription step was omitted, indicating that theobserved product was not due to possible genomic DNA
contamination in the total RNA preparation. This result
indicated that chiN1 gene was transcribed in Hb.
salinarum. The amount of ChiN1 produced by Hb.
salinarum, however, seemed to be small, since chitinase
activity could not be detected in the culture supernatantof Hb. salinarum.
To prepare a large amount of ChiN1, chiN1 gene wasexpressed in Escherichia coli using the pET-system(Novagen, Madison, WI, USA). The overexpressed
protein, however, was produced as an inactive inclusion
body. Then, overexpression of chiN1 gene in Ha.
japonica was performed by employing the Ha. japonica
csg promoter. The gene encoding Ha. japonica CSG had
been previously cloned.29,30) The Kpn I-Eco RI fragment
containing the promoter region of csg gene was
subcloned into pBluescript II SK(+) (Stratagene, La Jolla,
CA, USA). The entire ORF of chiN1 gene was amplified
by PCR, and ligated downstream of the csg promoter.
The Xba I fragment, which contained the csg promoter
and chiN1 gene, was then ligated into the unique Xba I
site of shuttle vector pWL102. The resulting expression
plasmid was designated pChiN9. Prior to transformationof Ha. japonica, pChiN9 was passaged through E. coli
JM110 (dam-, dcm-) to avoid an influence of thehaloarchaeal restriction system.11) Transformation of Ha.
japonica performed using the conventional polyethylene
glycol method6,8) with some modifications. Transformants were selected on agar plates containing 8 μg/ml

codes). This is nearly identical to the consensus sequence[ST]-R-R-X-F-L-K (X denotes a certain amino acidresidue) of prokaryotic proteins that are secreted by thetwin-arginine translocation (Tat) system24). The majorityof proteins in prokaryotes are translocated via theubiquitous Sec system16). In halophilic archaea, however,most proteins are predicted to translocate via the Tat
system2, 25). The Tat system is unique in its ability totranslocate folded proteins across membranes. Halophilicarchaea accumulate high levels of salt intracellularly, andnewly synthesized haloarchaeal secretory proteins haveto fold very rapidly to prevent aggregation before
reaching the membrane. There was a twin-arginine motif
in the signal peptide of ChiN1, and it is therefore likelythat ChiN1 might be a Tat-dependent substrate.
The deduced amino acid sequence revealed thatmature ChiN1 was composed of three domains: achitin-binding
domain(ChBD)
belongingtocarbohydrate-binding
module(CBM)5(http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/), a polycystic kidneydisease domain (PKD) and a catalytic domain (CatD)(Fig. 1). The family 5 CBMs are also found in somechitosanases, xylanases and cellulases, as well as
chitinases. PKD was first identified in humanpolycystin-1, the primary protein responsible forpolycystic kidney disease5). Some other chitinases also
possess PKDs7,14,26). The function of PKDs in chitinases,
however, is unknown at this time. The amino acidsequence of the CatD of ChiN1 showed moderate
similarity to those of Thermococcus kodakaraensis
chitinase A27) and Bacillus circulans WL-12 chitinase
A11,31) belonging to GH family 18, suggesting that
ChiN1 would also belong to GH family 18. The
sequence F-D-G-L-D-I-D-W-E found in ChiN1 matched
the consensus sequence pattern [LIVMFY]-[DN]-G[LIVMF]-[DN]-[LIVMF]-[DN]-X-E of GH family 18
chitinases.28) The last residue E (glutamic acid) is thepotential catalytic residue that is conserved in all of GH
family 18 chitinases.28) The mature sequence of ChiN1
proved to be rich in acidic amino acids with a 17%
aspartic-acid/glutamic-acid content, corresponding to thenature of proteins from halophilic archaea.32)

Fig. 1. Molecular architecture of ChiN1 from Hb.
salinarum NRC-1.
20

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)containing 3.0 M NaCl, and stored at 4˚C. The purified
ChiN1 showed a single band on SDS-PAGE, and theyield was about 56 mg per litre of culture. Chitinase
activity was assayed by measuring the amount of
reducing sugar generated from a chitinous substrate by amodified version of the Schales’ method.13) One unit ofchitinase activity was defined as the amount of enzymethat produced 1 μmol of reducing sugar per min. For the
standard assay, chitianse activity was routinely assessedby mixing 7 μl of enzyme solution, 90 μl of 0.2% (w/v)
Daichitosan M in 40 mM acetic acid, and 263 μl of 80
mM Britton-Robinson buffer (pH 6.0)4) containing 1.0 M
NaCl. The reaction was carried out at 37˚C for 12 min.
Specific activity of the purified ChiN1 was about 8.9
x10-3 U/mg.

plavastatin (a gift from Daiichi Sankyo Co., Ltd., Tokyo,
Japan) instead of mevinolin. The unmethylated pChiN9
preparation was introduced into Ha. japonica. Ha.
japonica transformants obtained were grown to a late
exponential phase. Culture supernatant and whole cells
were prepared by centrifugation at 10,000 x g and 4˚Cfor 30 min, and then was applied to SDS-polyacrylamide
gel electrophoresis (SDS-PAGE) using a 7.5% gel.15)
After electrophoresis, proteins in the gel were stainedwith Coomassie brilliant blue (CBB) R-250. The
molecular mass markers used were Precision Plus
Protein Standards (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
SDS-PAGE analysis revealed the presence of a major
protein band at about 70 kDa in the culture supernatantof Ha. japonica carrying pChiN9 (Fig. 2). Zymogram
analysis of the Ha. japonica culture supernatant was also
performed as described previously.18) Samples were
electrophoresed on an SDS-7.5% polyacrylamide gel
containing 0.01% of Daichitosan M (Dainichiseika Color& Chemicals Mfg. Co., Ltd., Tokyo, Japan). Then, thegel was washed four times for 30 min in 100 mM
NaH2PO4-NaOH buffer (pH 6.5) [the first two washes
contained 25% (v/v) isopropyl alcohol] to remove SDS
and renature proteins in the gel, and further incubated in
the buffer at 37˚C for 12 h. The gel was soaked in 0.1%(w/v) Congo red solution for 15 min at room temperature
and washed with 1.0 M NaCl until excess dye wasremoved from the gel. To make the active bands clear,
the gel was soaked in 0.5% (v/v) acetic acid. Zymogram
also gave an active band at about 70 kDa (data notshown). These results indicated that chiN1 gene had beensuccessfully expressed in Ha. japonica under the controlof csg promoter, and the Ha. japonica-produced
recombinant ChiN1 could be secreted into the culture
medium.
Recombinant ChiN1 was purified from the culture
supernatant of Ha. japonica carrying pChiN9. Proteins in
the culture supernatant were concentrated byultra-filtration (Disc Membrane PM30, Millipore,
Billerica, MA, USA). The concentrated fluid was
filtrated by Millex PVDF filter (0.45 μm, Millipore) anddialyzed against 10 mM K2HPO4-KH2PO4 buffer (pH7.0) containing 3.0 M NaCl. The dialyzed solution wasapplied to a hydroxylapatite column (Macro-Prep
Ceramic Hydroxylapatite TYPE I 40 μM, Millipore)equilibrated with the same buffer. The absorbed proteins
were eluted using a linear gradient from 10 mM to 400
mM K2HPO4-KH2PO4 buffer (pH 7.0) containing 3.0 M
NaCl. ChiN1-containing fractions were collected anddialyzed against 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0)

Fig. 2. Extracellular production of recombinant ChiN1 in
Ha. japonica.
Lane M, molecular mass markers; lane 1, culture
supernatant of Ha. japonica carrying pChiN9; Lane 2,
whole cells of Ha. japonica carrying pChiN9; lane 3,
culture supernatant of Ha. japonica carrying pWL102;
lane 4, whole cells of Ha. japonica carrying pWL102.

21

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)The purified ChiN1 was applied to SDS-PAGE,
subsequently transferred onto a polyvinylidene difluoride(PVDF) membrane (Sequi-Blot PVDF Membrane,
Bio-Rad), and then stained with CBB G-250. The
70-kDa protein band was cut off and subjected to an
automated Edman-type protein sequencer Procise 494HT(Applied Biosystems). The N-terminal amino acidsequence of ChiN1 was determined to be:
H2N-A-D-T-P-P-E-W-D-P-D-T-V.
This
sequence
corresponded to alanine-29 to valine-40 of the structuralprotein encoded by chiN1 gene, indicating that the signal
peptide would be the first 28 residues of the precursor
protein. This agreed with the predicted signal sequence.
The molecular mass of mature ChiN1 estimated from theamino acid sequence was 57 kDa, which was obviously
lower than that obtained by SDS-PAGE (70 kDa).
Overestimation of molecular masses by SDS-PAGE wasalso observed in other haloarchaeal proteins. It is
probably due to the difficulty of SDS-binding tohaloarchaeal proteins that are rich in acidic aminoacids30).
Activity of ChiN1 was measured at various pHs using
the Britton-Robinson buffers (pH 2.0-12.0) containing
1.0 M NaCl. ChiN1 was most active at pH 4.5 in thepresence of 1.0 M NaCl and retained 50% of the highest
activity even at pH 9.0. Activity was also measured atvarious temperatures using 80 mM Britton-Robinson
buffer (pH 6.0) containing 1.0 M NaCl. The optimal
temperature was 55˚C at pH 6.0 in the presence of 1.0 M
NaCl. The high optimal temperature is also a common
feature among halophilic proteins.3,9,23) It may be an
adaptive response of haloarchaeal proteins to hightemperatures that they may endure in the naturalenvironments. Activity of ChiN1 was measured atvarious concentrations of NaCl and 37˚C using 80 mM
Britton-Robinson buffer (pH 6.0). As shown in Fig. 3,
ChiN1 showed the maximal activity at 1.0 M NaCl andretained 50% of the maximal activity even at 3.8 M NaCl.
In contrast to most other haloarchaeal proteins, ChiN1
also retain its activity at low salt conditions; for example,
the enzyme still had more than 30% of the maximal
activity at 0.08 M NaCl. ChiN1 was very stable over awide range of NaCl concentration from 1.0 to 4.5 M,
when incubated at 4˚C for 24 h. ChiN1 was also active
and stable in the presence of high concentration of KCl(data not shown), indicating that the type of monovalentcation is not critical for the activity and stability of
ChiN1. This is the first report on a chitinase found in
extremely halophilic archaeon.

Fig. 3. Effect of salt concentration on activity of ChiN1.
Chitinase activity was measured at 37˚C and pH 6.0 in
the presence of 0.08-3.8 M NaCl.

Acknowledgments
This work was partially supported by the Global COE(Centers of Excellence) Program from the Ministry of
Education, Culture, Sports, and Technology of Japan(MEXT).

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9, 25-30

ORIGINAL PAPER

Sekiguchi Ta,b, Sato Ta, Enoki Mb,
Kanehiro Hb and Kato Ca

Procedure for isolation of the plastic degrading piezophilic bacteria fromdeep-sea environmentsaJapan Agency for Marine-Earth Science and Technology, Yokosuka, Kanagawa 237-0061, Japan
Department of Marine Science, Tokyo University of Marine Science and Technology, Minato-ku, Tokyo 108-8477,
Japan

b

Corresponding author: Chiaki Kato, kato_chi@jamstec.go.jp
Tel: +81-46-867-9550, Fax: +81-46-867-9525.
Received: January 18, 2010 /Revised: February 20, 2010 /Accepted: February 26, 2010
Abstract A procedure for the isolation of aliphatic
polyester-degrading bacteria from deep-sea environments
was developed using three step high-pressure cultivation.
First, the sediments collected from the deep-sea floor, theKurile and Japan Trenches at a depth of 5000-7000 m,
were cultivated with poly ε-caprolactone (PCL) films
under low-temperature (4°C) and high-pressure (50MPa)
conditions.
Secondly,high-pressure
continuous
cultivation using the deep-sea baro-piezophile andthermophile isolation and cultivation (DEEPBATH)
system was performed three times to accumulatepiezophilic bacteria. Finally, piezophilic PCL degrading
bacteria were isolated using the pressure bag method
involving media with PCL granules. Using thisprocedure, we succeeded in isolating several piezophilicaliphatic polyester-degrading bacteria from the sediment
samples of deep-trenches.

replacement of non- degradable plastics withbiodegradable polymers is considered to reduce thenegative environmental impact caused by plastic
materials since the later can be degraded by
microorganisms24). During the past thirty years, several
biodegradable plastics, such as poly β-hydroxybutyrate(PHB), poly ε-caprolactone (PCL), poly ethylene
succinate (PES), poly butyrene succinate (PBS) and polylactic acid (PLA), have been developed25).
The diversity of aliphatic polyester-degrading
microorganisms in natural environments is one of theessential factors in evaluating biodegradation. By using
the plate count and clear-zone techniques, thedistribution and proportions of polyester-degrading
microorganisms in different environments could be
evaluated 11, 12, 20). However, these studies have primarily
focused on general microbial populations in environment
ssuch as the soil, compost material and rivers on land.
Thus, there is little information regarding such bacteria
isolated from deep-sea environments under low
temperature and high-hydrostatic pressure conditions.
From the deep-sea depths of many of the world oceans,numerous cold and high-hydrostatic pressure adapted
microorganisms, called piezophiles, have been isolated
and characterized6-8, 13-18, 26, 27). Therefore, it can beassumed that the plastic degrading bacteria in the
deep-sea environments are also piezophiles. In this study,
we describe a new procedure of isolation of PCL (one of
the aliphatic polyesters)-degrading bacteria from deep
sea trench sediment samples.

Key words: aliphatic polyester, biodegradation, deep-sea,piezophilic bacteria, plastic degrading bacteria
Introduction
Plastic wastes have caused major marine pollutions
harming numerous marine animals9) and inducing “ghost
fishing”4) because of their semi-permanence stability inthese environments. Researchers have indicated thatghost fishing produces major deep effects on marine
resources4, 10, 19). Even at the deep-sea floor, abundant
plastic wastes have often been found, implying that theplastic wastes accumulate without degradation at sea
bottoms and cause harm to the deep-sea ecology3). Partial25

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)High-pressure continuous cultivation using the
DEEPBATH system
The sediment maintained with PCL films at 50MPa inpressure vessels was diluted to 1000 ml by addition ofmarine broth 2216 (MB; Difco co., USA) liquid media.
Next, the diluted sediment was cultivated at 4°C and
50MPa using the deep-sea baro-piezophile thermophileisolation and cultivation (DEEPBATH) system (Fig. 2)5)
with sterilized PCL films (1.0 cm square x 10 sheets).
Cultivation was repeated three times continuously
without decompression for accumulation of piezophilic
PCL-degrading bacteria.

Materials and Methods
Collection of deep-sea sediment samples
Deep-sea sediment samples were collected by thesubmersibles SHINKAI 6500 (Station 1, 41°15.29'N,
144°38.56'E, dive No. 6K#1029, at a depth of 4819 m,
September 2007, during the cruise YK07-14, PI: T.
Miwa) and KAIKO 7000II (Station 2, 39°06.33'N,
143°53.54'E, dive No. 7K#399, depth of 5356 m, andStation 3, 40°01.61'N, 144°12.88'E, dive No. 7K#400,
depth of 6957 m, November 2007, during the cruise
KR07-14, PI: C. Kato), in the Kurile and Japan Trenches
using sediment samplers (Fig. 1). Samples roughly
1.0 cm below the sediment surface were used forscreening of aliphatic polyester-degrading bacteria. The
sediments were added into each 2ml-sterilized tube with
1 cm square PCL films (Sigma Aldrich co., Japan)
sterilized with 70 % ethanol and then sealed withparafilm immediately after being taken from the deep-sea.
Each plastic tube was statically placed in a pressure
vessel controlled at constant temperature (4°C) andpressure (50MPa). These operations were carried out on
ice. The sediments were kept under these conditions until
microbial growth was confirmed by observation with amicroscope.

DNA manipulation and terminal-restriction fragment
length polymorphism (t-RFLP) analysis
Total DNA was extracted from about 1.0 g deep-sea
sediments using a Power soil DNA extraction kit (MoBio Laboratories, USA). Extraction of chromosomal
DNA from the cultured cells using the DEEPBATH
system was conducted according to the method of Saito
and Miura21). The fragments of bacterial 16S ribosomal
RNA genes for t-RFLP analysis were amplified by thepolymerase chain reaction (PCR) using a primer set of
Bac27F and FAM-labeled Bac927R2) with the DNA
templates. Amplified products were purified using a Gel
Spin DNA purification kit (MO Bio Laboratories, USA).
DNA was then precipitated with ethanol, centrifuged,
and the pellets were re-suspended in distilled water. The
purified 16S rRNA gene fragments were then digested
with HhaI at 37 °C for 12h. The electrophoresis patternsof terminal restriction fragments (t-RFs) were analyzed
using a model 3130x sequencer (Perkin-Elmer/Appliedbiosystems, USA) equipped with GENE MAPPER
software according to the manufacturer’s protocol. The
precise lengths of the t-RFs were determined bycomparison
withaninternal
size
standard(GENESCAN-2500 ROX) added to each digested
sample.
Isolation of piezophilic PCL-degrading bacteria
Screening for PCL degrading bacteria from thedeep-sea environments was accomplished by using a
PCL-granule agar medium with a slight modification22).
The medium of 1.0 L contained: 1.87 % MB, 1.5 % NaCl,
0.35 % KCl, 5.4 % MgCl2.6H2O, 2.7 % MgSO4.7H2O,
0.5 % CaCl2.2H2O and 1.2 % low-melting point agar
(gelling temperature 30~31°C, Nacalai Tesque co.,Japan). The medium was sterilized by autoclaving at
121°C for 15 min and then 50 ml PCL-granule solution
was added. The PCL granule solution was prepared byreprecipitation of 2 % (w/v) PCL-acetone solution with

Fig. 1. Locations of sampling points of deep-sea
sediments used for screening of plastic degrading
bacteria. Station 1 (St.1): Kurile Trench at a depth ofabout 5000 m (dive No. 6K#1029). Stations 2 and 3(St.2, St.3): Japan Trench at a depth of 5000 and
7000 m (dives No. 7K#399 and 7K#400),
respectively.

26

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)then inoculated into fresh PCL agar medium plates.

1.0 L of 30 % acetone/ distilled water. The emulsion was
evaporated until the volume of the solution was reduced
to 50 ml. The PCL-granule media prepared by thismethod was placed in a water bath and kept at 37°C. The
medium cultivated twice in the DEEPBATH system were
inoculated and added into each high-pressure bag volume( 20 ml), and the bags were sealed with a heat sealer. The
bags were next cooled immediately with ice-cold water.
The bags were finally incubated at 4°C and 50MPa for 1
week. Bacterial degrading ability was determined by theformation of clear zones around the colonies on the
PCL-containing agar plates. Single colonies forming
clear zones were isolated using a disposable syringe andExtraction of DNA from isolates and the sequence
analysis
Extraction of chromosomal DNA from isolates was
conducted according to the method of Saito and Miura21).
16S rRNA genes were amplified using the PCR methodwith primers Eubac27F and Eubac1492R2). The
amplified DNA was partially sequenced forapproximately 500 bp by a direct sequencing procedureusing Eubac520R primers to determine species
relatedness.

Fig. 2. The DEEPBATH system. The system is composed of four devices: 1) pressure-retaining sampling
device (A), 2) dilution device under pressure conditions (B), 3) isolation device (C), and 4) cultivation
device (D). The system is controlled by Monitoring and Control Console (E).
Optimal growth conditions
Optimal temperatures for the growth of isolates were
investigated in the range of 4-20 °C on the basis of
optical density in a liquid media containing 1.87 % MB,
1.5 % NaCl, 0.35 % KCl, 5.4 % MgCl2.6H2O, 2.7 %,MgSO4.7H2O, and 0.5 % CaCl2.2H2O. High-pressure
cultivation for determination of optimal pressure for
growth was carried out using the modified method of
Kato et al.8). About 2.0 ml of the liquid media inoculatedwith the isolates and 500 μl per-fluorinated liquids(Sumitomo-3M co., Japan) saturated with O2 were added
into each sterilized plastic tube and sealed with parafilm.
All procedures were carried out on ice. Each plastic tube
was placed in a titanium pressure vessel filled with waterat 4°C. The pressures in the vessels were controlled atconstant pressures of 0.1, 10, 30, 50 and 70 MPa. To
evaluate the growth of the isolates under these pressures,the medium was taken out from each vessel every 12hours and the OD value of the medium at 660 nm wasmeasured using a spectrophotometer (Ultraspec 500 pro,Amersham GE Healthcare Japan).
Results and Discussion
t-RFLP analysis of high-pressure cultivated cultures
To monitor the change of microbial community
structures following cultivation with the DEEPBATH
system, t-RFLP analysis was preformed. As an example,
Fig. 3 shows t-RFLP profiles of initial sediment andcultivated cells, cultivated in the DEEPBATH systemthree times from the Kurile Trench sediment. The
number of apparent peaks progressively decreased from
10 in the initial sediment to 3 in the cultivated cells.
From the results of t-RF analysis reported by Arakawa etal.1), it was assumed that the peaks remaining after
high-pressure cultivation were derived from the genera
Moritella and Shewanella. These generea were often
27

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)(Table 1). These related species have not been previously
reported as aliphatic-polyesters degrading bacteria,
therefore, this could be a first report that PCL degrading
bacteria can be isolated from deeper sea bottoms.
The effects of temperature and hydrostatic pressure on
the growth of isolates were then investigated. Table 1
shows the optimal temperature and pressure conditions
for the growth of the isolates. The optimal temperaturesof the isolates ranged from 4-12°C and the isolates were
not able to growth over 20°C. Furthermore, optimalpressures for the isolates, strains CT01, CT03, CT08,
CT12 and JT01 ranged from 30-50 MPa. In previous
study, the optimal growth temperatures for
PCL-degrading bacteria isolated from seawaters wereabout 30-40°C23). These results revealed thathigh-pressure cultivation enabled the isolation ofpiezophilic and psychrophilic bacteria from the deep-sea.

isolated from deep-sea environments as piezophilic
bacteria7). From these results, it was considered that
piezophilic bacteria accumulated under high-pressure
cultivation. The mixed cultures were then subjected toadditional analysis. .
Isolation of piezophilic PCL-degrading bacteria
Fig. 4 shows colony development and clear-zone
formation under high-pressure conditions using thepressure bag method. As indicated, isolates were detectedwhich showed clear zones around the colonies underhigh pressure. A total of eleven different bacterial strains
were identified from the partial 16S rRNA genesequences as PCL -degrading bacteria from the Kurileand Japan Trenches. Eight strains of these isolates, CT05,
CT06, CT08, CT12, CT13, JT01, JT02 and JT04, areclosely related to Moritella sp. and three strains, CT01,
CT03 and CT07, are closely related to Shewanella sp.

Fig. 3. Comparison of t-RFLP profiles between the microbial community before and after high-pressure
cultivation (three times). The length of fragments (x-acis) and relative fluorescence intensity of peaks(y-axis) are indicated. A: bacterial community of initial sediment collected from Kurile Trench. B: bacterial
community of the cells cultivated continuously three times without decompression in the DEEPBATH
system.

Fig. 4. Colony and clear-zone (halo) formation underhigh-pressure conditions using the bag system.

28

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)Table 1. Species relationships and optimal growth temperatures and pressures for the isolates.
Sampling
locations

KurileTrenchJapan
TrenchShewanella sp.

Optimaltemperaturefor growth (°C)
8

Optimalpressure for
growth (MPa)
30

CT03

Shewanella sp.

8

30

CT05

Moritella sp.

N.T.

N.T.

CT06

Moritella sp.

N.T.

N.T.

CT07

Shewanella sp.

N.T.

N.T.

CT08

Moritella sp.

8

30

CT12

Moritella sp.

5

30-50

CT13

Moritella sp.

N.T.

N.T.

JT01

Moritella sp.

6

30

JT02

Moritella sp.

12

0.1

JT04

Moritella sp.

12

0.1

Strains

Related species

CT01

N.T. : not tested. CT05, CT06/CT13, and CT07 were very similar to JT01, CT08, and CT01
in the partial 16S rRNA gene sequences.

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Conclutions
The sediments collected from the deep-sea floor were
cultivated with PCL films under low-temperature (4°C)
and high-pressure (50MPa) conditions as an initial screen,
which revealed potential PCL- degrading bacteria. Then,following additional screening, high-pressure cultivation
using the DEEPBATH system and the pressure bag
method, piezophilic PCL-degrading bacteria wereisolated. A total of eleven piezophilic aliphaticpolyester-degrading bacteria were isolated from deep-sea
environments by combining these methods. From thisstudy, it was revealed that procedures for high-pressure
cultivation were adequate for isolating novel plastic
degrading microorganisms from deep-sea environments.
Acknowledgements
We are very grateful to the science groups of the
YK07-14 (PI, T. Miwa) and KR07-14 (PI, C. Kato)
cruises, the SHINKAI 6500 and KAIKO 7000II operation
teams, and the crews of the MS YOKOSUKA and MS
KAIREI for helping us to collect the deep-sea sediment
samples. We also thank Dr. H. K. Kuramitsu forassistance in editing the manuscript. This study waspartially supported by a Grant-in-Aid for Exploratory
Research, No. 21580106, provided by the Ministry of
Education, Culture, Sports, Science and Technology ofJapan (CK).

29

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)

8)

9)

10)

11)

12)

13)

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30

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)シンポジウムプログラム

31

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)

極限環境生物学会 第 11 回シンポジウム～極限環境適応の分子・ゲノム・システム基盤～
日時：2010 年 6 月 4 日（金）13 時 00 分～17 時 00 分
（17 時 30 分より懇親会の予定）
場所：産業技術総合研究所（つくば） つくば中央第 1 事業所 共用講堂 2 階 大会議室
交通：つくばエクスプレスつくば駅よりバス、または東京駅八重洲南口発 常磐高速バスつくば号 並木 2 丁目下車徒歩 5 分
概要： テーマ：「極限環境適応の分子・ゲノム・システム基盤」
学会も発足 10 年を経過し、極限環境生物学会と衣替えしました。
「微」生物にとどまらず、より多様な生物の環境適応戦術を理解・利用することを目指します。今回のシンポジウムでは、極限環境への生物の適応機
構を、分子・ゲノム・システムなど様々な角度からアプローチする研究者をお招きし、最新の知見をご紹介していただきます。
13:00-13:05 開会の挨拶
13:05-13:40
大河内 美奈（名古屋大学大学院 工学研究科）「超好熱性古細菌由来プレフォルディンの機能解析とその利用」
13:40-14:15
白木 賢太郎（筑波大学大学院 数理物質科学研究科）「溶液添加剤を用いる難溶性分子の分散法」
14:15-14:50
コルネット・リシャー（農業生物資源機構 乾燥耐性研究ユニット）「驚異の昆虫・ネムリユスリカ：その乾燥耐性の分子基盤」
コーヒーブレーク
15:10-15:45
片山 俊明（東京大学 医科学研究所）「ヨコヅナクマムシのゲノム解読とトランスクリプトーム解析」
15:45-16:20
小山 純弘（海洋研究開発機構 海洋・極限環境生物圏領域）「深海生物の分子細胞生物学 -深海生物捕獲飼育装置の開発から細胞株樹立にいたるまでの研究-」
16:20-16:55
阪口 利文（県立広島大学 生命環境学部）「海洋微生物によるセレン・テルル回収の可能性」
16:55-17:00

閉会挨拶

17:30-19:30

懇親会（共用講堂 1 階ホワイエ）

問い合わせ先 宮崎健太郎（産業総合研究所・シンポジウム委員長）

32

miyazaki-kentaro (at) aist.go.jp

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)シンポジウム講演要旨

超好熱性古細菌由来プレフォルディンの機能解析とその利用○大河内美奈名古屋大学 大学院工学研究科
極限環境で生育する古細菌のタンパク質は熱安定性が高いばかりでなく有機溶媒に対する耐性が高い
ことが示唆されている。プレフォルディンは、酵母の細胞質において細胞骨格の形成に必要な遺伝子
GIM (Genes Involved in Microtuble Biogenesis)
として同定され、変性中間状態にある細胞骨格たんぱく質に結合し、それを細胞質シャペロニンへ受け渡す機能を有することからプレフォルディンと命名されている。我々は、プレフォルディンとシャペロ
ニンの協調作用を解析するため、古細菌の中でも特に単純な分子シャペロンシステムを有する超好熱性
古細菌に着目し、 Pyrococcus horikoshii OT3 由来
プレフォルディンの機能解析を行った。さらに、プレフォルディンを大腸菌内で発現させて、その有機溶媒耐性について検討し、微生物を利用した有機溶媒混合系における有用物質生産への産業利用を目指した。
超好熱性古細菌 P. horikoshii OT3 のゲノム配列からプレフォルディンの α、β サブユニットをコードする遺伝子を用いた発現系を構築し、大腸菌で生産した。プレフォルディン (PhPfd)は、豚心臓由来クエン酸合成酵素の熱凝集を阻害する他、変性
GFPのリフォールディングを阻害し、変性中間状態のたんぱく質と結合することが示された(1)。さらに、
PhPfdとシャペロニンが直接結合することを免疫沈降及び表面プラズモン共鳴(Biacore)により解析した。そこで、Phpfdαおよび Phpfdβの各末端欠損体を作成し、これらを再構成し、基質およびシャペロ
ニンとの結合能や分子シャペロン活性を測定した。
その結果、PhPfdβのC末6-8残基が変性たんぱく質
認識に重要な部位であり、PhPfdα C末 8残基欠損および β C末 5残基に、シャペロニンとの結合に重要な部位が存在することが示唆された (2,3)。以上のことから、古細菌のプレフォルディンにおいても、
そのコイルドコイルの先端部分で変性たんぱく質と結合し、協調的にシャペロン活性を示すことが明かとなった。
好熱菌由来の蛋白質は熱や有機溶媒等に対する安定性が高いことから、新しいデバイスの材料(4)など、様々な産業利用が可能であると考えられている。特に、化学プロセスの一部をバイオプロセスで代替することで、省エネルギーで低コストな、トータルプ
ロセスを実現するグリーンバイオテクノロジーという視点が注目されている。実際の化学プロセスを考えた場合には、様々な物質を溶解できるという利点
33から極性が高くて疎水性が低い溶媒、すなわち微生物に対して毒性の高いトルエン、p-キシレン、シク
ロヘキサンといった有機溶媒存在下でも活性を示す
酵素の探索や微生物の育種が進められている。高濃度のトルエン中で生育可能な微生物の存在が報告されて以来、微生物の有機溶媒耐性機構に関する研究が進められてきた。これまでに、微生物の有機溶媒耐性機構の一部概要が明らかとなり、有機溶媒排出ポンプの存在、急速な細胞膜修復機構、細胞膜透過性の低下、細胞膜の硬化、細胞表面の疎水度の低下などの関与が明らかとなっている。我々は、微生物の有機溶媒に対する耐性機構を解析するため、DNA
マイクロアレイにより大腸菌の有機溶媒添加後の時
系列データの情報解析に基づいた溶媒耐性遺伝子の探索を行ってきた（5,6）。有機溶媒耐性を獲得した大腸菌の変異株によるDNAマイクロアレイデータ
は、有機溶媒耐性を誘発する細胞のプログラムの変化をとらえており、耐性を獲得する上で必要な遺伝
子や代謝経路について知見が得られるものと考えられる。有機溶媒添加により、高発現した遺伝子群に多くのストレス応答たんぱく質がみられたことから、
分子シャペロンを利用した耐性化を検討した。
Phpfd導入株は、オクタン、ヘキサン混合溶媒(1:1,v/v)で増殖でき（図）、細胞内の溶媒取込量は、コントロール株に比べ低く抑えられた。PhPfdは、変性中間状態にあるたんぱく質と結合し有機溶媒との接触による変性を抑えることで、細胞内の溶媒取込量を低く保ち、大腸菌の有機溶媒耐性を向上する
ことが示唆された(7)。これより、超好熱性古細菌由来プレフォルディンは、幅広いたんぱく質に結合しJournal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)て変性中間状態を保持することができ、溶媒存在下での微生物を利用した有用物質生産への展開も期待される。極限環境で生育する微生物群のたんぱく質
は、産業利用の分子基盤であることから、今後ます
ます活用されることが期待される。

9,127-134.
(4) Ishii D, Kinbara K, Ishida Y, Ishii N, Okochi M,
Yohda M, Aida T. (2003) Chaperonin-mediatedstabilization and ATP-triggered release of
semiconductor nanoparticles. Nature, 423, 628-632.

【文献】(1) Okochi M, Yoshida T, Maruyama T, Kawarabayasi
Y, Kikuchi H, Yohda M. (2002) Pyrococcus
prefoldin stabilizes protein-folding intermediates
and transfers them to chaperonins for correct folding.
Biochem. Biophys. Res. Commun., 291, 769-774.

(5) Okochi M, Kurimoto M, Shimizu K, Honda H(2008) Involvement of global transcriptional
regulators related to carbohydrate metabolism onorganic solvent tolerance in Escherichia coli J.
Biosci. Bioeng. 105, 389-394.
(6) Okochi M, Kurimoto M, Shimizu K, Honda H(2007) Increase of Organic Solvent Tolerance byOverexpression of manXYZ in Escherichia coli
Appl. Microbiol. Biotechnol.3:1394-1399.

(2) Okochi M, Nomura T, Zako T, Arakawa T, Iizuka R,
Ueda H, Funatsu T, Leroux M, Yohda M. (2004)
Kinetics and binding sites for interaction of
prefoldin with group II chaperonin: contiguous
nonnative substrate and chaperonin binding sites inarchaeal prefoldin, J. Biol. Chem. 279,
31788-31795.

(7) Okochi M, Kanie K, Kurimoto M, Yohda M, Honda
H (2008) Overexpression of prefoldin from thehyperthermophilic archaeum Pyrococcus horikoshii
OT3 endowed Escherichia coli with organic solvent
tolerance. Appl. Microbiol. Biotechnol., 79,
443-449.

(3) Okochi M, Matsuzaki H, Nomura T, Ishii N, Yohda
M. (2005) Molecular characterization of the group
II chaperonin from the hyperthermophilic archaeum,
Pyrococcus horikoshii OT3. Extremophiles

34

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)シンポジウム溶液添加剤を用いる難溶性分子の分散法○白木賢太郎筑波大学大学院 数理物質科学研究科【はじめに】
物質が水に溶ける。つまり物質が溶液中に分散す
る、このありふれた現象を説明するのは今でも難しい問題として残されている。たとえば卵白リゾチー
ムは、塩化ナトリウム水溶液とヨウ化ナトリウム水
溶液にどちらによく分散するか。ホフマイスター論を知っている人は後者の方が分散すると答えるだろうが、そう単純ではない。最近、塩濃度が薄いときには前者によく分散することが報告されている（PNAS 106, 15249–15253, 2009）。本講演では、溶液の組成に少しだけ意を払うことで、タンパク質や化合物を水溶液中に分散させることができることを、応用例を中心に紹介したい。
【タンパク質の凝集抑制剤】
タンパク質は特定の立体構造へと自発的にフォー
ルディングして機能するものが多い。しかしタンパ
ク質は、凝集しやすい性質もあわせもっている。タ
ンパク質を凝集させずに溶液中に分散させるために、塩酸グアニジンや界面活性剤を溶液に添加する方法が用いられてきたが、これらはタンパク質を変性させてしまう性質もある。近年、溶液添加剤としてアルギニンが注目されている。アルギニンはありふれたアミノ酸だが、溶液に添加しておくとタンパク質を変性させることなく、凝集をふせぐことが知られている。ほかにアルギニン誘導体やアミノ酸誘導体にも似たような性質がある（Biotechnol. Prog. 24,
436-443, 2008. Biotechnol. Prog. 25, 1515-1524, 2009.
Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 400-407, 2009）。
アルギニンのこの性質をつかったタンパク質への応用例が開発されてきている。試験管内でのタンパ
ク質リフォールディングが代表例である。塩酸グアニジンで変性させたタンパク質をリフォールディン
グさせるとき、希釈や透析で塩酸グアニジン濃度を低下させる。このときアルギニンを加えておくと、タンパク質の凝集をふせいでリフォールディング収率を増加させる。単量体タンパク質の多くはこの方法でリフォールディングできることが報告されてきているが、多量体タンパク質のリフォールディングにも、塩を併用することでアルギニンの性質をうまく活かして応用できることがわかってきた（Protein
J. in press, 2010）。このほか、
アルギニンやアミノ酸、
アミノ酸誘導体類はタンパク質の結晶化にも応用できることがわかってきたので紹介したい。
【難溶性化合物の溶液分散法】
アルギニンの有益な性質を理解するために、水溶35

液中で溶質とどのような相互作用をするのかを調べてきた。その結果、アルギニンは芳香環をもつ化合物の溶解度を増加させることがわかった（Arch.
Biochem. Biophys. in press, 2010. J. Phys. Chem. inpress, 2010. Int. J. Biol. Macromol. 46, 217-222, 2010. J.
Biochem. 144, 363-369, 2008）。この結果は、アルギニ
ンがタンパク質の表面にある芳香族アミノ酸残基に結合しやすいという報告とも一致する。アルギニン
は、芳香環を持つ化合物だけでなく、核酸塩基のよ
うなヘテロ芳香環を持つ化合物の溶解度も増加させることがわかってきた。アルギニンは安価で無毒なので、たとえば難溶性の薬剤を水溶液中に分散させる方法として応用できると考えている。
【ポリマーを用いる酵素機能スイッチ】
タンパク質を水溶液中に分散させておくために、ポリマーとの複合体を形成させる方法がある。私たちと共同研究者は、荷電基をもつグラフト型ポリマーを用いたタンパク質の溶液分散方法を提案している（Macromol. Biosci. in press. J. Am. Chem. Soc. 131,6549-6553, 2009）。タンパク質がポリマーと複合体を形成すると活性が一時的に失われる。ここに荷電相補性のあるポリマーを加えると、ポリマー同士が複合体を形成してタンパク質がフリーになり、活性がふたたびあらわれる（図１）。この方法は、あらかじめタンパク質をポリマーと結合させて基材上や沈殿体としてトラップしておき、必要なタイミングでタンパク質を放出する酵素機能スイッチとして応用できると考えている。
【タンパク質を用いる
カーボンナノチューブの溶液分散法】
カーボンナノチューブは炭化水素なので、そのままでは水にほとんど分散しない。水溶液にカーボン
ナノチューブを分散させるために、これまでにＳＤ
Ｓのような界面活性剤を使うことが多かった。近年
では、タンパク質や DNA を用いるカーボンナノチ
ューブの分散方法が開発され注目されているが、この方法は分散させる能力が低いという欠点が残されていた。私たちはタンパク質とハロゲン系アルコー
ルなどを併用し、溶解度を増加させる方法を開発してきた（Jap. J. Appl. Phys. in press, 2010. Chem. Eur. J.
15, 9905-9910, 2009）（図２）。塩酸グアニジンを用いると、タンパク質でカーボンナノチューブを分散させたあと、タンパク質をはがしてカーボンナノチューブを単離する方法にも応用できる。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)

図１：リボヌクレアーゼをモデルにした酵素機能スイッチ。A：結晶構造。B：酵素活性はポリアクリ
ル酸（●）を添加すると低下するが、ポリアリル
アミン（○）を添加しても変化しない。C:ポリアクリ
ル酸を加えて酵素機能をオフにしたあと、ポリア
リルアミン（●）を添加すると酵素活性が回復する。

図２：カーボンナノチューブの溶液分散法。
タンパク質を添加するとカーボンナノチュー
ブ は 水 溶 液 に 分 散 す る よ う に な る （ noaddition）が、そこにハロゲン系アルコール（HFIP, TFE）やタンパク質変性剤（GdnHCl,urea）を添加すると分散量が増える。

36

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)シンポジウム
驚異の昆虫・ネムリユスリカ：その乾燥耐性の分子基盤○CORNETTE Richard
農業生物資源研究所 乾燥耐性研究ユニット
ネムリユスリカ（Polypedilum vanderplanki）はアフリカの半乾燥地帯にある岩盤の上の小さな水たまりに生息している。乾季になると水たまりが干上
がり、ネムリユスリカの幼虫もカラカラに干からびるが、再び雨が降ると蘇生して発育を再開する。この驚くべき乾燥耐性はアンヒドロビオシス（anhydrobiosis）と呼ばれ、無代謝状態である。アンヒドロビオシス状態で、蘇生能力を保ちながら数年間も乾燥に耐えることができる。
その驚くべき極限乾燥耐性の分子メカニズムを解明するため、ネムリユスリカの幼虫から乾燥耐性関連 EST データベースを作成し、アンヒドロビオシスに関わる新規遺伝子を探索した。
具体的には、ネムリユスリカ幼虫の乾燥開始後 0
時間、12 時間、36 時間で cDNA を作成し、配列をデータベースにまとめた。データベースは 15,056
個の EST を含んでおり、4,807 のクラスターに集約された。アノテーションを進めた結果、全クローンのおよそ半分は既存のデータベースと相同性を示さなかったことから、新規な遺伝子を多く含む可能性が高いことが明らかとなった。EST の数に基づいて、各遺伝子の想定発現パターンを調べることで、乾燥誘導性遺伝子を選抜した。このうちで、アノテーシ
ョンによる機能推定によりネムリユスリカの乾燥耐性に重要に関与している可能性の高い遺伝子に関して、実際の発現パターンを定量 PCR により確認した。
乾燥耐性関連因子とよく知られている LEA タン
パク質は、乾燥過程で一番強く誘導されていた。
LEA タンパク質にアノテーションされた EST クローンは、全クローンの 12%ほどを占めていた。高親
水性である LEA タンパク質は、乾燥に伴う変性からタンパク質や細胞膜を保護し、トレハロースのガラス化を安定化させることで、細胞に乾燥耐性を与えると考えられている（図１）。
抗酸化因子も乾燥によって発現が強く誘導されていた。このことは、乾燥過程で酸化ストレスが生じていることを示している。実際、本研究とは別の生理学的研究により、酸化ストレスが乾燥応答遺伝子
発現の引き金であることが最近分かった（図１）。
多くの熱ショックタンパク質（Hsp70, DnaJ,
Crystallin など）も乾燥によって誘導されていた。
Crystallin に代表される低分子量熱ショックタンパ
ク質は乾燥時に他のタンパク質の凝集を抑制し、
37

hsp70 などの熱ショックタンパク質が乾燥過程で変性したタンパク質を正しい立体構造に戻す役割を果たしている可能性が考えられる。
生体成分保護機能をもつ糖として知られるトレハ
ロースは、乾燥に伴って脂肪体で大量に合成され、体中に行き渡ってガラス化することにより細胞と生体分子を保護している（図１）。裏付けるように、トレハロース代謝に関連する遺伝子群、すなわちトレ
ハロース合成酵素（TPS, TPP）やトレハロース輸送
タンパク質（Tret1）が、乾燥に伴って発現が上昇していた。

図１：ネムリユスリカ幼虫における乾燥応答の分子メカニズムの流れ（予想図）

乾燥過程でチャンネルやトランスポーターなどの輸送タンパク質の発現が有意に誘導されていた。それは乾燥に伴う水、イオン、代謝産物などの移動が頻繁に行われていることを反映しているのであろう。
ヘモグロビンは、ネムリユスリカの呼吸の中心的な役割を持つタンパク質であるため、大量に（全EST の 7.5%）発現するグループであるが、乾燥過程でほとんどのヘモグロビン遺伝子の発現が抑制されていた。一方、乾燥により強く誘導されるヘモグ
ロビンは数個だけ存在していた。ヘモグロビンは親電子官能基を有する物質であるので、坑酸化因子として機能する可能性が考えられる。
このように、乾燥過程のネムリユスリカでは、トレハロースや LEA タンパク質によって細胞やその中に含まれる多くの生体成分が保護されていることが明らかとなったが、全ての生体成分がもれなく保護されているわけではない。実際、ネムリユスリカ

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)幼虫の DNA は、乾燥過程で発生する活性酸素により二本鎖切断や塩基修飾などの損傷を高頻度に受けている。損傷を受けた DNA は、蘇生過程で完全に修復される。したがって、ネムリユスリカには、高度の DNA 修復系が備わっている可能性が考えられる。DNA 修復機構には、cis（DNA 配列自身の要因）と trans（DNA 結合性因子）の双方の因子が重要に関与していることが知られている。そこで、DNA修復の cis 因子の同定を目的として、ネムリユスリ
カのゲノム構造を調べることにした。手始めに、ネ
ムリユスリカのゲノムサイズをフローサイトメトリーにより測定した。その結果、ネムリユスリカのゲ
ノムサイズはショウジョウバエよりも小さいことが判明した。その他のユスリカ 13 種のゲノムサイズを測定したところ、いずれも小さく、ネムリユスリ
カのゲノムサイズはユスリカ科の範囲以内であることが判った。一方、ヤマユスリカは昆虫界で最も小さいゲノムサイズ（81 Mb）を持っていることが判明した。ユスリカの中で極限環境（乾燥地帯、南極、
塩濃度の高い水たまり）に適応した種が多く、酸化ストレスによる DNA 損傷を受けている可能性がある。DNA 修復を行うためにコンパクトなゲノムサ

イズが有利であると考えられ、ユスリカ科の小さい
ゲノムサイズは極限環境進出のために前適応的な形質であると示唆された。
EST データベースを用いることで、乾燥耐性関連
遺伝子の単離は効率化されたが、生体内での本当の機能を知ることはできない。すなわち、単離した遺伝子の in vivo 機能解析を行うためには、ネムリユ
スリカでの逆遺伝学的手法を開発する必要がある。
以前、ネムリユスリカに適した微量注入法を用いた
RNAi 法の開発を試みたが、目標遺伝子の発現抑制が低く、非特異的効果も見られたため、バイオアッ
セイには利用できないという結論に至った。そこで、
transgenic RNAi を行うために、ネムリユスリカにおける遺伝子導入系統の開発に着手した。現在、ハマダラカの遺伝子導入法を参考にしながら、ネムリ
ユスリカの遺伝子導入系統の開発を続けている。最終的に、ネムリユスリカのゲノム情報と遺伝子導入技術という強力な機能解析ツールが利用可能になったら、ネムリユスリカを極限乾燥耐性研究の重要なモデル生物にしたい。

38

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)シンポジウムヨコヅナクマムシのゲノム解読とトランスクリプトーム解析○片山 俊明 1, 荒川 和晴 2, 長谷部 百合子 2, 木戸 信博 2, 國枝 武和 3, 豊田 敦 4, 新井 理 4, 堀川 大樹 5,
桑原 宏和 3, 大石 加寿子 4, 松崎(許山) 肖子 4, 会津 智幸 4, 金久 實 1, 小原 雄治 4, 藤山 秋佐夫 61
東大・医科研・HGC, 2 慶応大・先端生命, 3 東大・院理・生物科学 , 4 遺伝研,
5NASA Ames Res. Center, 6 情報研

シのゲノム解読を行うことによって、極限環境耐性における分子メカニズムを解明したいと考えている。
クマムシだけからなる緩歩動物門は、進化的に線形動物門と節足動物門の間に位置するとされるが、これまでにゲノム解読された種はなかったため、無脊椎動物の進化を探る上でも重要な基礎データを提供できると考えられる。

クマムシ類は、身の回りの苔や地衣類のほか、土壌・河川・深海・南極・高山など、陸上・淡水・海水を問わず、地球上のほぼあらゆる場所で見つかっている。このうち、陸生のクマムシは乾燥耐性を持つものが多く、乾燥時には代謝などの生命活動を停止し、高温・低温・高圧・低圧・放射線など様々な極限環境に対して非常に強い抵抗性を持つことが知られている。我々は、このような特性を持つクマム

図 1: ヨコヅナクマムシの乾燥による状態変化と極限環境耐性

ける発現 RNA を、Solexa シーケンサを用いて各 2000
万リードペア(3Gb x 4)配列解読した。これをゲノム配列にマッピングした結果、約 7000 遺伝子の発現が観測され、クマムシ特異的なものを含むより正確な遺伝子構造が推定された。さらに、約 4 万クローンの完全長 cDNA 配列ライブラリを作成し、両末端配列を解読した。この結果、約 6,500 遺伝子の転写ユニットについて転写開始点と終結点が同定できた。
解読したゲノム配列のカバレッジは高いものの、6本と推定されている染色体はまだ完全には繋がっていない。ショートリードによる補完や異なるアセン
ブル法の利用により、ゲノム配列の完成度を高める
ことを目指している。また、
完全長 cDNA と RNA-Seqから転写ユニットの遺伝子構造をもとに、全遺伝子

我々は乾燥耐性を持つクマムシのモデルとして札幌で独自に採集したヨコヅナクマムシの飼育系を確立し、ゲノム配列の解読を行った。ヨコヅナクマム
シのゲノムサイズは約 60Mb と推定されており、クマムシ類の中でも特に小さい。これまでに、ホール
ゲノムショットガン法によってゲノム配列の 16x をカバーする約 80 万リードの解読を完了し、ドラフト
ゲノム配列のアセンブルを行った。これを元に、近縁生物種の既知遺伝子との類似性を網羅的に調べ、また遺伝子モデルの ab initio 予測により、約 15,000個の遺伝子を推定した。
また、乾燥前後での遺伝子発現変動を調べるために、RNA-Seq 法によるトランスクリプトーム解析を行った。通常・乾眠・復帰中・復帰後の 4 状態にお39

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)と相同性のある約 3000 遺伝子の機能アノテーショ
ンとパスウェイデータベースを利用した代謝系の解析を行った結果、トレハロース合成酵素パスウェイを構成する遺伝子群や、乾燥耐性に関わる可能性があるとされる LEA 遺伝子などが見つかってきている。しかし、クマムシにおける乾燥耐性メカニズムの全容解明はまだこれからの課題であり、日本で確立された数少ないモデル動物のゲノム解析に、今後より多くの実験生物学者が興味を持って参入して頂ければ幸いである。

のより正確な推定を行っている。得られた予測遺伝
子については網羅的な機能解析を行い、遺伝子アノテーションをはじめ、種間で保存された遺伝子群の進化解析や、クマムシ特異的な遺伝子の発見に取り組んでいる。
解析の結果得られた情報をクマムシ研究者のコミュニティで共有し、効率的なゲノムアノテーションと分子生物学的な解析を行うために、ゲノムブラウ
ザや相同性検索サーバを含むゲノムデータベースを構築している(http://kumamushi.org/)。既知の遺伝子40

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)シンポジウム
深海生物の分子細胞生物学―深海生物捕獲飼育装置の開発から細胞株樹立にいたるまでの研究―○小山純弘
海洋研究開発機構 海洋・極限環境生物圏領域
潜水調査艇の誕生によって深海に棲息する生命の研究が可能となり、近年、深海微生物の分子生物学的な研究が極めて活発に進められるようになった 1)。
その一方で、深海微生物と同様に関心が寄せられている深海多細胞生物は、捕獲時や減圧にともなう外皮の損傷、温度変化のストレスに耐え切れず、ほとんどは捕獲して数時間以内に死滅してしまう。そのため、深海生物を使った地上での研究の大半が、死んだサンプルを用いた成分分析や分類学的な解析に留まっている。そして、細胞を使った分子生物学的な研究はおろか、地上での深海生物の飼育でさえも、極めて困難な状況にある。
深海生物由来の細胞を用い地上の研究施設で研究するためには、大きく 3 つの難関が存在する。
1) 深海多細胞生物を生きたまま捕獲し、地上の研究施設に持ち帰るための保温保圧型捕獲飼育装置の開発。
2) 捕獲した深海生物を地上の研究施設で段階的に大気圧まで減圧し、一定期間大気圧で飼育する技術の開発。
3) 深海生物組織から人工的に抽出した細胞を大気圧下で増殖および凍結保存する方法の開発。
これら 3 つの問題点は、深海多細胞生物を捕獲・飼育する装置の開発 2,3)、そして、水深 1,000 m 以深に生息する深海生物の大気圧下での飼育、初代培養、および細胞の凍結保存の成功 3,4)によって、ようやく解決に向かいつつある。本講演では、深海生物捕獲
飼育装置の開発から深海魚由来の細胞株樹立にいた
るまでのこれまでの研究を報告する。
【深海生物捕獲飼育装置の開発】
筆者は深海の水温と水圧を保持した状態で、深海生物を捕獲した後、地上で加圧飼育するための装置（ディープアクアリウムシステム）を開発した 2,3)
（図 1）
。この装置は、仕掛けたトラップにかかった深海生物や近くにいる深海生物を、掃除機のように吸引捕獲することができる（図 1）。深海生物が耐圧容器内に入ったことを確認した後、潜水調査艇のマニピュレーターで図中のピンをディープアクアリ
ウムシステムから引き抜く事によって、ばねの力で内蓋が閉じる構造となっている。この装置は、計算
上水深 3,000 m までの耐圧能を有するが、安全を考慮し水深 2,000 m までの使用としている。水深 2,000m よりも深い所で深海生物を捕獲する場合は、保圧水槽に取り付けた圧力制御弁の働きにより、容器内
海水を排出する事で、海表面浮上時に容器内圧力を
41

水深 2,000 m の水圧に保持するように設計した。
ディープアクアリウムシステムを用いて筆者らは、深海魚や深海エビ、深海巻貝などを保温保圧した状
態で捕獲回収し、研究室で 4 ヶ月以上、各種深海生物を加圧飼育することに成功している。
【深海魚由来細胞株の樹立】
筆者らは、ディープアクアリウムシステムで各種深海魚を捕獲後、徐々に大気圧まで減圧した後、大気圧条件で組織培養が可能な種を探索した。その結果、
水深 1,000 ~ 2,500 m 付近に棲息する深海魚コンゴウ
アナゴの胸ヒレ組織から、細胞株を樹立することに世界で初めて成功した 4)。このコンゴウアナゴ細胞
は、分裂して倍になるまでの倍加時間は 170 時間(約一週間)もかかる。約 20 時間で倍になる地上生物由来細胞と比べ、分裂準備期間である間期が非常に長いことが確認された。培地中に含まれるウシ胎児血清（FBS）量を 2 倍の 20％(v/v)にすると増殖速度は加速し，細胞の倍加時間は 170 時間から 77 時間以下にまで短縮されることが確認された 4)。今回使用した血清はウシ胎児血清であり，深海魚の体液は含まれていない。
そのため，FBS に含まれる増殖因子は，
深海魚コンゴウアナゴ細胞が受け取る事のできる増殖因子の形状とは多少異なるものの，よく似た形状を持つものと考えられる。耐圧特性について調査した結果、樹立した深海魚コンゴウアナゴ由来の細胞株は、各種地表生物由来の細胞株と比べて、極めて高い耐圧能力を有することが明らかとなった。本研究の詳細は当日、会場で報告する。
【参考文献】(1) K. Horikoshi, K. Tsujii eds.: Extremophiles in
Deep-Sea Environments (Springer, Tokyo, 1999).
(2) S. Koyama, T. Miwa, M. Horii, Y. Ishikawa, K.
Horikoshi, M. Aizawa, Pressure-stat aquarium
system designed for capturing and maintaining
deep-sea organisms., Deep-Sea Res. I,
49,2095-2102 (2002).
(3) S. Koyama, Cell biology of deep-sea
multicellular organisms., Cytotechnology, 55,
125-133 (2007).
(4) S. Koyama, M. Horii, T. Miwa, M. Aizawa,
Tissue culture of the deep-sea eel Simenchelys
parasiticus collected at 1,162 m., Extremophiles,
7, 245-248 (2003).

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)

図１ ディープアクアリウムシステムの写真と模式図

42

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)シンポジウム海洋微生物によるセレン・テルル回収の可能性○阪口利文
県立広島大学 生命環境学部【背景】
セレンにはレアエレメントとして戦略物質の希少性があり、元素としての循環利用技術が必要とされている。また、ガラスや家電製品の製造にも多く用いられ、特異的な色彩や電気・光学的挙動を生み出す材料元素として幅広く利用されている 1)。さらに、石油や石炭などの化石燃料にも含まれており、燃焼に伴って環境中に排出されている 2)。このような工業的利用の副産物として排出されたセレン化合物、
たとえばそのアニオン性酸化物質であるセレンオキ
サニオンは高い毒性を有し、生体に対し多くの弊害をもたらす可能性がある。そのため、新規の処理技
術素材として環境に流出したセレンオキサニオンのバイオレメディエーションや資源回収に微生物の利用をする動きが盛んである。ある種の微生物は嫌気条件下で、毒性の高いセレン酸(SeO42-)や亜セレン酸(SeO32-)などを最終電子受容体として、生体活動のエ
ネルギーを獲得するということが知られている。これらは(亜)セレン酸還元菌と呼ばれ、セレン化合物
をより毒性の低い単体セレン(Se(0))や亜セレン酸な
どの酸化度の低いイオン種にまで還元することがで
きる 3)。現在では様々な環境中の微生物がセレン酸還元能を持つことが知られているが、詳細な研究が実施された微生物種は限られたものであり、(亜)セレン酸還元菌に関しては代謝機構や種系統などの詳しい特性において不明な点が多く、バイオレメディ
エーションや材料合成への利用を目的とした菌体内外へのセレン粒子の合成過程やその分子メカニズムに関する知見を得るためにも、培養特性などの把握が望まれるところである。
【目的】
本研究では、高塩濃度の存在下においても、セレンオキサニオンを還元し沈澱できうる微生物種の獲得について研究を行い、セレン酸イオンなどのセレ
ンオキサニオンイオンをセレンナノ結晶として回収、変換できる可能性について検討した。また、セレンと同族元素で同種のレアエレメントであるテルルの回収についても、その酸化物であるテルル酸、亜テ
ルル酸の微生物変換の可能性に検討し、実試料に適応できるような塩耐性セレン（テルル）オキサニオ
ン還元性微生物を用いたセレン・テルル除去、さらにセレン・テルルナノ結晶材料の合成による再資源化技術の開発を目的とした。
【実験方法】
セレン酸、テルル酸などの金属様オキサニオンを
43

最終電子受容体として、乳酸もしくは酢酸を電子供与体物質として含み、その他燐酸などの無機塩などから構成される培地に 3％以上（3％、5％、10％、15％、20％）の塩化ナトリウム濃度を含む集積培地を作製した。次に、日本各地の海洋環境などから海洋生物を中心に接種試料を採取した。また、海洋深海底、塩田、炭坑・鉱山跡地、原油湧出地などからも泥質、水質を収集し、接種試料とした。接種後、集積培養体の形成を観察しながら、培地色の変化や沈殿物の形成がみられた試料を選出した。選出した集積培養体からプレート法を用いて単菌株の分離を行った。分離株については基礎的な分類、形態観察を子なった。また、各分離株の培養に伴い、菌体内外に生成したナノ結晶粒子を超音波破砕機もしくは、リゾチーム、プロテアーゼ酵素処理によって抽出した。その後、蒸留水で洗浄、メンブランフィルターなどを用いて粒径分画された生成微粒子について透過型電子顕微鏡観察の他、X 線元素分析、結晶回折など解析を行った。
【結果および考察】
日本各地の様々な海洋泥質や海洋生物などから海
洋環境の塩濃度である3％NaClや高塩環境の塩濃度である5％、10％において生育可能なセレンオキサ
ニオン・テルルオキサニオン還元性微生物株の分離が可能であった。まず、一般的な海洋環境の塩濃度である3％のNaClを含む培地からは、セレン酸ナト
リウムを単体セレンまで還元できるNZ3-1株、亜セレン酸ナトリウムを還元し、単体セレンを生成できるNZ3-2, NZ3-3株が長崎県福島の海洋泥質から分離 さ れ た 。 こ の 他 に も 、 ホ タ テ (Patinopecten
yessoensis)のウロ（中腸線）からHU-1, HU-2株な
どの好塩性菌株が分離された(Figure 1 A)、さらにシロ ギ ス （ Sillago japonica ） の 体 表 面 か ら SK3-1,
SK4-1株など4株のセレン酸還元菌が分離された。これらはいずれも大きさが2～3μmのグラム陰性短桿菌であった。この他にも有明海、日本海、瀬戸内海、太平洋沿岸から採取された泥質から同様に多くの（合計20数株）グラム陰性短桿菌のセレンオキサニ
オン還元性微生物の分離株を獲得できた。全体的な傾向として、これらの分離株の多くが、セレン酸よりも亜セレン酸に対して強い還元能を有しており、海洋泥質においては亜セレン酸を単体セレンまで還元できる微生物が多く分布していると考えられた。
さらに、これらの菌体をネガティブ染色法によって染色し、透過型電子顕微鏡で観察を行った。その結Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)果、菌体には電子線を通さない約100nm～300nmセ
レンのみで構成される球状微粒子が形成されており(Figure 1 B)、（亜）セレン酸の嫌気代謝によって、ナノサイズのセレン単体結晶粒子の形成が行われていることが明らかになった。さらにこれらの微粒子から回折像が得られたことから、結晶体の微粒子であると示唆された 。また、セレンオキサニオンの減少モル量に相当する単体セレンの形成が確認され、これらの培養液中からの単体セレンの回収は可能であり、遠心分離などによって容易にセレンを除去できることが確認された。
加えて、セレンに他にもテルル酸を還元しながら単体テルルを生成できる微生物株を深海底などから獲
得できた。

【結論】
本研究では、バイオレメディエーションへの利用を踏まえ、酸素族のセレンの微生物回収を目的として、様々な海洋環境、海洋生物から NaCl 耐性を有し、セレン・テルルオキサニオンを還元できる微生物株の獲得、ならびにその還元機構を利用したセレ
ンナノ微粒子の形成の可能性について研究を遂行した。今後はさらにスクリーニングを継続させること
で多様な性質を有する目的株の獲得を目指したい。
また、得られた純化株に対する系統分析が現在ところの不十分であり、新規の微生物であることが予想されることから早急に 16SrDNA にもとづく解析を進展中である。さらに、純化微生物株や集積培養コ
ンソーシアによるバイオレメディエーション、元素
資源回収を目的としたバイオリアクターシステムによるセレン・テルル回収を実行する必要があると考
えている。

A

B

Figure 1 ホタテ(Patinopecten yessoensis).の中腸線から分離された亜セレン酸還元菌 (strain HU-2)の透過型電子顕微鏡写真 (A: HU-2 株の細胞 B: HU-2 株によって形成された Se ナノ微粒子。
Bars indicate A: 200 nm and B: 200 nm respectively.
影響 4 セレン “4. 循環”
pp.44、
桜井 治彦,土屋 健三郎 訳、東京化学
参考文献
同人、東京.
1) 加藤 勇、(1995) 五訂 公害防止の技術と法規
3) J. F. Stolz and R. S. Oremland (1999) Bacterial“3 水質関係有害物質処理技術” pp.281～282、
respiration of arsenic and selenium 。 FEMS
公害防止の技術と法規編集委員会 編、丸善株
Microbial Rev. 23, 615-627.
式会社、東京.
2) H. J. Schroeder (1978) 環境汚染物質の生体への44

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)

学会記事
極限環境微生物学会創立 10 周年記念第 10 回年会報告
10 月 28、29 日の両日にわたって開催された、当学会年会には、多くの会員・非会員の皆様にご参集いただ
き、大変盛況な中で開催することができました。参加者合計は 294 名（内訳を以下の表に示す）となり、過去 10 回開催してきた年会で最高の参加者人数となりました。また総会にて平成 22 年度からの役員体制が承認され、学会名称も来年度から微の字が抜けて「極限環境生物学会」とすることが了承されました。会員各位のご協力に事務局一同感謝申し上げます。

一般
学生
総計

事前申し込み人数
94（会員 75、非会員 19）95（会員 9、非会員 86）
189（会員 84、非会員 105）

当日申し込み人数20（会員 13、非会員 7）85（会員 0、非会員 85）105（会員 13、非会員 92）

合計114（会員 88、非会員 26）180（会員 9、非会員 171）294
（会員 97、非会員 197）

スペシャルセッション
明治大学スペシャルセッションとして、「環境生物学の新たな展開」と題し、別府輝彦先生（日本大学）、浅沼成人先生（明治大学）、糸山享先生（明治大学）にご講演をいただいた。別府先生からは、「炭酸ガスと光：微生物の環境を見直す」と題し、微生物共生の研究から環境と微生物の相互作用に関するご自身のご研究を１時間にわたりご紹介いただいた（右写真）。
学会奨励賞受賞者（敬称略）
・野尻秀昭、東京大学・生物生産工学研究センター¾ 環境細菌の難分解性環境汚染物質分解能発現機構の解明
・黄川田隆洋、農業生物資源研究所・乾燥耐性研究ユニット¾ ネムリユスリカの極限乾燥耐性を支える分子基盤の解明

大島選考委員長を囲んで。左、黄川田博士。右、野尻博士。おめでとうございます。今後の更なるご活躍を期待しております。

45

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)ポスター賞受賞者

賞品の刻印入りワイン（左）と受賞者。左から（敬称略）、
P-34 守野正人（東洋大）好アルカリ性細菌 Bacillus pseudofirmus OF4 株がもつマルチサブユニット型 Na+/H+ ア
ンチポーターMrp の網羅的な機能アミノ酸残基の同定
P-33 高橋優嘉（東洋大）枯草菌が持つ 2 種類のべん毛モーター固定子 MotAB、MotPS の回転機構に重要なアミノ酸残基の同定と解析
P-6 向井彩子（九州大）耐熱性 ATP 再生系の DNA 組換え反応への応用
P-25 花岡賀子（北海道大・産総研）過酸化水素耐性細菌 ExiguobacteriumoxidotoreransT-2-2T 株の細胞外カタ
ラーゼ産生に関する研究
P-20 佐藤勝也（原子力機構）放射線抵抗性細菌における新規遺伝子操作系の開発
P-45 川本純（京都大）低温誘導性ポーリンのフォールディングにおけるエイコサペンタエン酸含有リン脂質の生理的役割スペシャルイベント
10 周年記念年会を記念して懇親会にてスペシャルな企画がありました。
掘越会長のお誕生祝い。

懇親会の日、10 月 28 日は掘越会長の？？回目のお誕生日でもありました。そこでサプライズ
企画として、幹事会の紅１点、古園幹事より掘越会長に花束と記念品が贈呈されました。

JSE 事務局を 10 年間支え続けてくれた兼次さんへの感謝。

もう一つのサプライズ企画として、事務局の兼次さんに、掘越会長から感謝の花束が贈呈されました。裏方あっての 10 年間でした。兼次さん、ありがとうございます。次の 10 年もよろしくお願いいたします。

46

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)リバティタワーから望む東京の夜景（上）と参加者の皆さん（下）。
最後に、本年会を会場側として盛り上げていただいた明治大学の浜本先生をはじめとする関係者一同に感謝申し上げます。ありがとうございました。
極限環境微生物学会事務局

47

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)

学会誌投稿規定
極限環境生物学会誌投稿規定
１．投稿者の資格
極限環境生物学会誌（ISSN 1348-5474） (Journal ofJapanese Society for Extremophiles)（以下、本誌という）への投稿は極限環境生物学会（以下、本学会という）会員に限る。なお、連名による投稿の場合には、少なくとも著者の一人が本学会会員でなければならない。ただし、日本国以外からの投稿並びに本学会が寄稿を依頼した場合は例外とする。

け付ける。この場合、極限環境生物学会ホームペー
ジに掲載されている投稿要領に従うこと。
〒113-8657 東京都文京区弥生 1-1-1 東京大学大学
院農学生命科学研究科応用生命工学専攻（東大院農生科応生工と省略可）極限環境生物学会誌編集委員長
石 井 正 治 ( 電 話 ： 03-5841-8258, FAX ：03-5841-5272) (e-mail: amishii@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp)

２．論文の種類
本誌への投稿論文は、極限環境生物関連分野の原著論文（通常論文、短論文）、総説、並びに諸報とし、いずれも未発表のものに限る。
（１）原著論文 (original papers)：極限環境生物に関する論文で以下の２つのいずれかに該当する論文。
１）通常論文 (regular papers)：極限環境生物に関する論文で、それ自体独立した、価値のある結論ある
いは事実を含む論文。
２）短論文 (short communications)：極限環境生物に関する論文で、断片的な結果ではあるが新しい事実や価値のあるデータを含む短い論文。
（２）総説 (reviews)：極限環境生物のある特定の研究分野について、簡単な歴史的背景を含め、最近の進歩を要約し、可能であれば、将来の研究方向性をも指し示した論文。
（３）ミニレビュー (mini-reviews)：総説の内、比較的短く纏めたもの。
（４）諸報：巻頭言、研究最前線、研究のルーツを探る、学会関連記事等。

５．論文の審査
投稿された論文の内、原著論文、総説、ミニレビュ
ーの審査には、極限環境生物学会誌編集委員の内１名が責任編集委員として関与する。原著論文および総説の審査は、責任編集委員が適宜指名する複数の査読者によりなされる。掲載の可否に関する最終判
定は、査読者からの査読結果報告に基づき責任編集委員が行う。その後、編集委員長が著者に審査結果を通知する。なお、内容・体裁に問題があると判断された原稿については、著者による修正を求める。
修正を求められた原稿は、２ヶ月以内に責任編集委
員に返送することとし、２ヶ月を過ぎて返送されなかった原稿は、著者が原稿を取り下げたものとして処理する。なお、投稿された論文は返却しない。

３．論文の書き方
論文の用語は日本語または英語とし、別途定める「原稿執筆要領」に従い簡潔に分かりやすく作成すること。総説は原稿３０頁以内、通常論文は原稿２０頁
以内、ミニレビューは原稿１５頁以内、短論文は原稿１０頁以内とする。なお、諸報の頁数に関しては編集委員会で適宜判断する。

７．別刷り
別刷りは、pdf ファイルとして配布する。

６．校正
校正は初稿のみ著者に送付する。到着日より３日以内に、原稿とともに指定された送付先に返送すること。なお、原著論文ならびに総説に関しては、著者
校正時の文章・図表の追加や削除は一切認めない。

８．著作権
本誌に掲載された論文の著作権は本学会に帰属する。
９．その他
極限環境生物学会誌投稿規定ならびに極限環境生物
学会誌論文執筆要領で不明な部分に関しては、極限環境生物学会誌編集委員会において適宜対応する。
なお、必要が認められる場合には、文書化を進めるものとする。

４．論文の受付
論文原稿は諸報を除き、原稿原本の他にコピー３部を付け、送付状とともに簡易郵便書留として下記宛に送付すること。なお、オンラインによる投稿も受

48

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)

論文執筆要領
極限環境生物学会誌論文執筆要領
１．一般的事項（１）テキストファイル形式または Microsoft Word
形式で保存できるワードプロセッサ等を用いて原稿を作成すること。
（２）タイトルページには、1)論文題名、2)著者名、
3)著者所属機関名、4)ランニングタイトル、5)連絡対
応著者名およびその連絡先住所・電話番号・FAX 番号・e-mail アドレス、6)キーワード（５語以内）を明示すること。日本語で作成した論文には、これらの英語訳を併記すること。
（３）論文印刷には A4 版用紙の片面を使用し、１
行４０字（英語の場合には１行６０字）、１頁２５行で印刷すること。イタリック、ボールド、あるいはスモールキャピタルにする語句がある場合は、それぞれ赤字で下線、波下線、二重下線を記すこと。
（４）略語リストがある場合には、本文第１頁に脚注として略語の項を設け表記すること。単位系と省略記号は SI 単位を基本とする。
（５）生物の命名及び記載は International Code of
Nomenclature of Prokaryotes, International Code ofBotanical Nomenclature, International Code ofZoological Nomenclature に従う。学名が初出の場合は全部を記載すること。原則として、２回目以降は属名の頭文字を略号とするが、紛らわしい場合には省略せずに記載すること。
（６）物質名の表記は以下の規定に従うこと。
１）有機化合物の表記および放射性同位元素による標識化合物の表記は IUPAC 規定に従うこと。
２）生化学関連事項の命名は IUPAB 制定の命名法に従うこと。
３）化学式に用いられる記号、略号などは Chemical
Abstracts の用例に従うこと。
（７）論文受理後、完成した本文および図表等の印刷に必要な全てのファイルを収めた電子媒体を編集委員長宛に郵送するか、またはそれらのファイルを
e-mail 添付書類として編集委員長宛に送付すること。
２．投稿論文の構成（１）原著論文は 1)標題、2)アブストラクト、3)本
文、4)引用文献、5)表ならびに図、図の説明文、の順にまとめること。
（２）標題は論文内容を具体的に表す簡潔なものとすること。標題の下に著者名、所属機関名、所在地を書く。著者が複数で、所属機関が異なる場合は、
著者名末尾に上付数字を付けて区別するとともに、連絡対応著者名を指定すること。
（３）原著論文ならびに総説のアブストラクトは英語で記述するものとし、通常論文・総説では200words 以内、短論文では 100words 以内で作成す

49

ること。
（４）通常論文の本文は原則として、緒言、材料および方法、結果、考察（あるいは結果と考察）、謝辞で構成する。短論文では項目分けをしない。
（５）原著論文ならびに総説では、必要に応じて図表を用いる。それぞれの図表を挿入したい位置を、原稿右側の余白部分に指示すること。
（６）文中での文献の引用は、引用文献の項目で整理した文献番号を用いること。図表の引用はその番号によること。
（７）脚注が必要な場合には、該当事項の右肩に通し番号を付け、当該頁の下部に説明文を付けること。
３．引用文献（１）引用文献は下記の例に準じ、本文中の該当人
名あるいは事項の右肩に 1), 1-3)のように番号を付し、また、本文末尾の引用文献の項に第一著者のファミリーネームのアルファベット順に 1., 2., 3., --の番号を付し一括記載する。Ibid., idem は用いないこと。私信、未発表の研究結果、学術雑誌に受理される前の論文、抄録が印刷されていない口頭発表など
は引用文献に含めないこと。雑誌の略号は、Chemical
Abstracts Service Source Index (CASSI) 1907-1984(Cumulative)およびその補遺版により、雑誌名、書名、
年、巻および頁の示し方は下記によること。
（２）雑誌引用のとき
Chuakrut, S., Arai, H., Ishii, M., and Igarashi, Y. 2000.
Characterization of a bifunctional archaeral acylcoenzyme A carboxylase. J. Bacteriol. 185: 938~947.
（３）書籍引用のとき
児玉徹. 1997. V 近代的な微生物利用工業１．アルコール, pp191~197.児玉徹・熊谷英彦編, 食品微生物学,
文永堂出版
４．表と図およびその説明（１）表と図は印刷版下を作成すること。
（２）本文を英語で書いた場合には図表も英文で作成すること。
（３）表と図は一つに対して１頁使う。各頁の右上に著者名ならびに図の番号を入れること。
（４）表題は表の上部分に書くこと。表の内容説明
文ならびに注は、表の下に記述する。注の表示にはa),b),c)を上付で明記し、記述には a),b),c)を上付にせず用いる。
（５）図の標題ならびに説明文は別紙にまとめて印刷すること。図の標題の最後にはピリオドを付し、内容説明は標題の後に改行して記載すること。
（６）写真は明瞭な陽画を必要部数添付すること。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)

学会会則
極限環境生物学会会則（名称）第１条 本会は、極限環境生物学会（英文名：TheJapanese Society for Extremophiles ）という。
（以下本会という）（目的）
第２条 本会は、極限環境生物研究の発展に寄与し、極限環境生物の研究、教育、利用の推進に寄与することを目的とする。
（事業）
第３条 本会は、研究発表会及び講演会等の開催、
極 限 環 境 生 物 学 会 誌 （ 英 名 ： Journal ofJapanese Society for Extremophiles）の発行、
国際極限環境生物学会等との連携事業、研究奨励賞・ポスター賞の授与、その他前条の目的を達成するために必要な事業を行う。
（会員の種別等）
第４条
1. 本会の会員は正会員、団体会員および賛助会員とする。
2. 正会員は極限環境生物に関する研究に従事する、または、これに関心を持つ個人であって、本会の目的に賛同し、定められた会費を納めた者をいう。
3. 団体会員は極限環境生物に関心を持つ団
体（法人等）であって、その団体内の本会の目的に賛同する代表者を含めて３名以内の所属者を指名して会員登録を行い、定められた会費を納めた団体をいう。
4. 賛助会員は本会の目的に賛同し、定められた賛助会費を１口以上納めた個人または団体をいう。
第５条 会員は本会が開催する諸事業に参加し、本会の発行する印刷物、PDF 等の配布を受けることができる。
（入会）
第６条 会員として入会しようとする個人または団
体は、本会事務局が定める手続きに従って申し込みを行い、本会会長による承認を得なければならない。
（会費）
第７条 会員は下記の会費を納めるものとする。
正会員
年額 5,000 円（但し身分が学生である者は年額 2,000 円）

団体会員 年額 20,000 円
賛助会員 年額 一口以上（一口 30,000 円）（退会）
第８条 会員は会長に届けることによって退会する

50

ことができる。
（役員）
第９条
1. 本会には会長 1 名、副会長 2 名、評議員若干名、幹事若干名、会計監査 2 名の役員をおく。
2. 会長は本会を代表し、会務を統括する。
3. 副会長は会長を補佐し、会長に事故ある場
合には会長の職務を代行する。
4. 幹事は、幹事長、庶務、学術活動、会計、を分担し、事業計画の立案、事業の実施、庶務会計、シンポジウムの企画立案、学会誌発行、国際極限環境生物学会等との連絡などの本会の事務を行う。
5. 会計監査は本会の会計を監査する。
（役員の選出）第１０条 会長、副会長、評議員は本会の総会において選出される。
1. 幹事、会計監査は、副会長、評議員以外の正会員の中から会長が指名し、総会の承認を受ける。
2. 評議員の任期は２年とし重任を妨げない
が、連続３期を限度とする。但し、会長が指名する評議員はこの限りではない。
（委員会）
第１１条 本会に学会誌編集委員会、研究奨励賞選
考委員会、シンポジウム委員会を置く。各委員会委員の任期は 2 年とするが重任をさまたげない。
1. 学会誌編集委員会（会長指名の若干名で構成し､委員長は互選する）は学会誌の編集、論文審査の任にあたる。
2. 研究奨励賞選考委員会（副会長が委員長を勤め、学術活動担当幹事と委員長指名の委員、計 10 名程度で構成する）は本会の研究奨励賞受賞者を選考する。
3. シンポジウム委員会（会長指名の若干名で構成し､委員長は互選する）は学術活動幹事と共同でシンポジウムを企画立案し、運営をサポートする。
（評議員会）
第１２条 評議員会は会長、副会長、評議員をもって構成する。会長は年１回以上評議員会を召集し、議長となり、会の重要事項を審議し総会に提案する。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)第１７条 本会則の変更は総会の議決を経て行う。
第１８条 本会則は、1999 年 10 月 19 日より施行する。

（総会）
第１３条 本会は原則として年１回総会を開き、会務を協議し議決する。
総会は会長が召集する。
第１４条 総会の議決は出席会員の過半数の賛成をもって行う。
（会計年度）
第１５条 本会の事業年度は 1 月 1 日に始まり、同年 12 月 31 日に終る。
（付則）第１６条 本会則の施行および本会の運営についての細則は総会の議決を経て別に定める。

学会細則2001 年 11 月 29 日改定
2002 年 12 月 1 日改定
2003 年 12 月 1 日改定
2005 年 11 月 7 日改定
2007 年 12 月 1 日改定
2010 年 1 月 1 日改定

極限環境生物学会細則
第８条 評議員会の決議は出席者の過半数の賛成により成立する。
（退会）
第９条 会長は、会費を３年以上滞納した会員を退会させることが出来る。
（授賞）
第１０条 研究奨励賞・ポスター賞の授賞規定は別途定め全会員に配布する。
（細則の変更）第１１条 本細則の変更は総会の議決による。
（付則）第１２条 今期の本会事務局は、東洋大学生命科学部井上研究室（群馬県邑楽郡板倉泉野）内とする。
第１３条 本細則は、1999 年 10 月 19 日よりこれを
実施する。

（会員）
第１条 入会を承認された正会員、団体会員、賛助
会員は、所定の会費を速やかに納入する。
（総会）
第２条 総会の議案は副会長、幹事等と共に会長が作成し、評議員会の議を経た後提出する。
議案には前年度の事業内容及び収支決算、
新年度の事業計画、及び収支予算を含むものとする。
第３条 総会は会員の１／１０以上の出席（但し委任状を含む）をもって成立する。
（役員の選出）第４条 会長、副会長、評議員は会員の選挙によって決められる。会長は選挙によらず評議員を指名することが出来るが、総会での承認を必要とする。
第５条 会長は会員の中から少なくとも３名を選んで選挙管理委員を委嘱する。選挙管理委員
は選挙事務を行う。
第６条 会長は、評議員会の承認を得て必要な委員会を作ることが出来る。
（評議員会）
第７条 評議員会は評議員の半数以上の出席（委任状を含む）をもって成立する。

2002 年 12 月 1 日改定
2003 年 12 月 1 日改定
2006 年 6 月 30 日改定
2007 年 12 月 1 日改定
2010 年 1 月 1 日改定

51

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol. 9 (1)

運営体制
会長
副会長

極限環境生物学会運営体制（2010~11 年度）

掘越 弘毅

独立行政法人海洋研究開発機構

大島 泰郎

共和化工株式会社

工藤 俊章

長崎大学

環境微生物学研究所

水産学部

評議員（５０音順、敬称略）

幹事会

秋野利郎

合同酒精株式会社

幹事長

井上明

東洋大学生命科学部

五十嵐泰夫

東京大学大学院農学生命科学研究科

庶務

亀倉正博

好塩菌研究所伊藤進

琉球大学農学部

加藤千明

独立行政法人海洋研究開発機構

伊藤雅道

駿河台大学経済学部

伊藤佑子

創価大学工学部

今中忠行

立命館大学生命科学部

大島敏久

九州大学大学院農学研究院

大森俊雄

芝浦工業大学大学院工学研究科

高品知典

東洋大学生命科学部

鎌形洋一

独立行政法人産業技術総合研究所

古園さおり

独立行政法人理化学研究所

川上文清

東洋紡績株式会社敦賀バイオ研究所

学術活動
編集委員長

石井正治

学会誌担当

石野良純

学術幹事

東京大学大学院農学生命科学研
究科
九州大学大学院農学研究院

跡見晴幸

京都大学大学院工学研究科
独立行政法人理化学研究所

河原林裕

独立行政法人産業技術総合研究所

伊藤隆

倉光成紀

大阪大学大学院理学研究科

仲宗根薫

近畿大学工学部

小林哲夫

名古屋大学大学院生命農学研究科

國枝武和

東京大学大学院理学系研究科

青木俊夫

日本大学生物資源科学部

為我井秀行

日本大学文理学部

シンポ担当

伊藤政博

東洋大学生命科学部

HP 担当

三輪哲也

独立行政法人海洋研究開発機構

会計

宇佐美論

東洋大学理工学部

会計監査

高瀬光徳

小林良則

財団法人バイオインダストリー協会

小松泰彦

独立行政法人産業技術総合研究所

坂口健二
佐上博

東北大学反応化学研究所

芝弘孝

サントリービジネスエキスパート株式会社

菅原秀明

国立遺伝学研究所

鈴木健一朗

独立行政法人製品評価技術基盤機構

冨田房男

放送大学北海道学習センター

中川和倫

愛媛県立松山南高等学校

中村聡

東京工業大学大学院生命理工学研究科

南部滋郎

日本赤十字九州国際看護大学看護学部

長谷川功

日本大学生物資源科学部

半澤敏

東ソ−株式会社東京研究所

古川謙介

別府大学食物栄養科学部

別府輝彦

日本大学

松井裕

石川県立大学生物資源工学研究所

丸山正

独立行政法人海洋研究開発機構

山岸明彦

東京薬科大学生命科学部

仲山英樹

山本幹男

日本食品化工株式会社研究所

相馬亜希子

立教大学理学部

湯本勲

独立行政法人産業技術総合研究所

東端啓貴

東洋大学生命科学部

若木高善

東京大学大学院農学生命科学研究科

渡辺公綱

独立行政法人産業技術総合研究所

伊藤俊洋

森永乳業株式会社栄養科学研究所
財団法人北里環境科学センター

シンポジウム委員会
宮崎健太郎

委員

平山仙子

独立行政法人海洋研究開発機構

梅野太輔

千葉大学大学院工学研究科

前田理久
黄川田隆洋

52

独立行政法人産業技術総合研究

委員長

所

明治大学

農学部

独立行政法人農業生物資源研究所
神戸大学自然科学系先端融合研
究環Journal of Japanese Society for Extremophiles (2010) Vol.9 (1)

編

集 後 記

学会創立 10 周年の本年は、当学会にとって記録ずくめの年でありました。春の第 10 回
シンポジウム（6 月 9 日、東京大学弥生講堂）では、一般公開シンポジウムを併設させて開催し、総勢 223 名の方にご参加いただき、過去最高のシンポジウムの参加者数を記
録いたしました。また、秋の第 10 回年会（10 月 28-29 日、明治大学アカデミーコモン）
では本誌でもご報告させていただいたとおり、総勢 294 名の参加者を記録し、300 名に迫る勢いでした。この参加者数も過去の年会と比較して最高人数を記録させていただいた訳でございます。思い起こせば、第１回シンポジウム（2000 年 5 月 22 日、東京大学
山上会館）、第１回年会（2000 年 9 月 22 日、東京大学山上会館）の参加者がそれぞれ、
149 名、104 名でしたから、会議の規模としては、2〜3 倍近くに成長してきた訳であります。その間、会員各位の皆様のご尽力のおかげでございます。
さて、当学会も来年度から「微」の字が取れて「極限環境生物学会」として、極限環
境下の生命全般を対象とする学会へと発展して参ります。次の 10 年目指し更に運営に努力を傾注して参りますので、引き続き皆様のご協力をお願い申し上げます。ありがとうございました。
庶務幹事 加藤千明

編集委員会
委員長 ：石井正治（東大）
副委員長：石野良純（九大）
委員：阿部文快（青学大）、伊藤 隆（理研）、鎌形洋一（産総研）、河原林裕（産総研）、
高品知典（東洋大）、為我井秀行（日大）、中村 聡（東工大）、中村 顕（筑波大）、
三輪哲也（JAMSTEC）、湯本 勲（産総研）

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発刊日53

2010 年 7 月 30 日