ISSN 2186-9936

Mar. 2020

第18巻合併号

Journal of Japanese Society for Extremophiles

巻頭言・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

2

原著論文・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

4

ミニレビュー・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 12
研究奨励賞受賞研究・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

55

学会開催報告・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

68

学会誌投稿規定・執筆要領・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

71

会則・細則・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 72
運営体制・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 75

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

巻 頭Deinococcus 研究事始め
スを気にせず、耐熱性に関与するアミノ酸残基を推定することができるという論旨で論文を 1 報発表した。日本農芸化学会年会のトピックス集にも掲載され、新聞記事として取り上げられるなど、棚からぼた餅の出来事であった。
次に遺伝子解析のターゲットにしたのは、カタラーゼの遺伝子であった。カタラーゼは放射線照射で生じた活性酸素種のひとつである過酸化水素を水と酸素に分解する酵素であり、Deinococcus は通常

東洋大学生命科学 部

鳴海 一成の細菌よりも高いカタラーゼ活性を持つことが知私が放射線抵抗性細菌 Deinococcus の DNA 修復

られていた。二次元電気泳動解析の結果から、機構の研究を始めたのは、日本原子力研究所のポス

Deinococcus のカタラーゼのアミノ末端から数残基ドクの時からで、かれこれ 26 年が経つ。Deinococcusのアミノ酸配列が決定されていたので、この情報かは DNA 二本鎖切断損傷の修復能力が著しく高いと

ら推定される DNA 配列のオリゴヌクレオチドプラいう特徴があるので、最初に解析すべき遺伝子としイマーを設計し、ハイブリダイズするクローンを探て、DNA の切断点同士を連結して修復する働きを索した。この実験は、バングラデシュの Savar 原子

持つ DNA リガーゼの遺伝子をターゲットにした。

力研究所から派遣されてきた Mamun Hossain さん

他の微生物由来の DNA リガーゼ遺伝子の配列情報に協力してもらった。最終的には、Deinococcus のを基に配列の類似性が高い領域のプライマーを設

カタラーゼ遺伝子を持つクローンを見つけること計した。次に、Deinococcus の野生株ゲノムライブが出来たのだが、そのクローンはプローブとのハイラリーを作製し、大腸菌コロニーハイブリダイゼー

ブリダイズシグナルを持つクローンを選別する途

ションで、DNA リガーゼ遺伝子をクローニングし中で、Hossain さんがはずれと思い込んで廃棄袋にようとしたのである。ところが、実験で選別できた

捨てたシャーレの中から奇跡的に救出したものでクローンは DNA リガーゼ遺伝子ではなく、DNA リ

あった。このときにクローニングしたカタラーゼ遺ガーゼと同様に NAD を補酵素として用いる乳酸脱伝子のプロモーターは Deinococcus で強力な活性を水素酵素（LDH）の遺伝子であった。折角 LDH 遺持っており、現在でもマーカー遺伝子の発現に重宝

伝子をクローニングしたので、Deinococcus と進化している。

的に近縁関係にある高度好熱菌 Thermus の LDH 遺

Edinburgh 大学の Bevan Moseley 教授が分離した

伝子と配列を比較してみた。好冷菌から高度好熱菌

Deinococcus のマイトマイシン C 感受性変異株 302

まで存在する Bacillus 属あるいはその近縁種につい株と 262 株をマイトマイシン C 耐性に復帰させるこては、相同タンパク質のアミノ酸比較による耐熱性とのできるコスミドクローンを見つけたので、次に、機構の解析が盛んに行われていたが、これらの菌は

この DNA 断片から変異株の感受性形質を相補する

生育温度に依存して GC 含量が高くなる傾向があり、DNA 領域を同定することにした。この実験は、タ

それがコドン使用頻度にバイアスをもたらす。一方、

イ の Mahidol 大 学 か ら 派 遣 さ れ て き た Korbkit

Deinococcus と Thermus のゲノムの GC 含量は共にCherdchu さんに協力してもらった。その結果、302

70%程度であることから、コドン使用頻度のバイア

株ではヌクレオチド除去修復経路で働く uvrA 遺伝
2

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

子のスタートコドン付近の 144 塩基対が欠失してクロラムフェニコールの他に、カナマイシン、ストいることが判明した。また、262 株では uvrA 遺伝

レプトマイシン、ハイグロマイシン、テトラサイク

子の中央部 2,230 番目のヌクレオチドの後に 1,322

リンの計 5 種類となり、多重遺伝子破壊株を作出す

塩基対の可動性遺伝因子（IS2621 と命名）が挿入さることが出来るようになっている。

れていることが判明した。米国ユニフォームドサー

2013 年 4 月、私は群馬県板倉町にある東洋大学生

ビス大学の Kenneth Minton 教授のグループも、命科学部に移り、現在でも放射線抵抗性細菌の研究

Moseley 教授から分与された 302 株と 262 株を解析を継続している。Deinococcus radiodurans の他に、して uvrA 遺伝子を同定していた。しかし、我々のナ ポ リ の 温 泉 か ら 分 離 さ れ た Deinococcus

解析では Minton 教授のグループが解析できていな

geothermalis 、 東 京 の 水 産 試 験 場 か ら 分 離 さ れ た

かった変異部位を正確に同定していたこと、Deinococcus grandis も研究対象に加えて、DNA 修復

Deinococcus から初めて可動性遺伝因子を発見した

関連遺伝子群の機能解析を中心に研究を行っていこと、uvrA 遺伝子から作られる UvrA タンパク質でる。また、大学院時代の研究テーマであった進化工

保存されているアミノ酸配列の中から UvrA の機能学の手法を用いて、放射線抵抗性細菌の放射線耐性に重要なアミノ酸を指摘していたことなどの新規を増強する試みも行っている。私の研究室は「放射性が認められ、Minton 教授のグループの論文発表

線微生物学研究室」と言い、おそらく世界中の大学から半年遅れで論文として発表することが出来た。

を探してもこの名前の研究室はどこにもないであCherdchu さんが老眼のため、エタノールで塩析した

ろう。東洋大学生命科学部には、極限環境微生物を

微量の DNA の塊が見えないというので、塩析の際研究している教員が私を含めて 6 名おり、それぞれにブルーデキストランを加えるという工夫で切り研究室を主宰している。いわば極限環境微生物研究抜けたことを記憶している。

の世界的メッカである。東洋大学生命科学部が開設

次に、Deinococcus の放射線感受性変異株 KR4128

されたのは、1997 年 4 月であり、当時私は日本原の放射線感受性を元どおり野生株レベルの放射線子力研究所のポスドクからパーマネントの研究員

耐性に復帰させることの出来る DNA 領域の絞り込に採用されて 2 年目に入る年であった。当時の研究

み実験を行った。その結果同定されたのは相同組換室長から、東洋大学生命科学部開設記念の催しの招え修復で働く recN 遺伝子であった。変異株では待状があるから、代わりに行ってもらえないだろう

recN 遺伝子の 1498 番目のヌクレオチドの 1 塩基置かと言われ、東洋大学板倉キャンパスまで出かけて換でナンセンス変異が生じていた。この遺伝子の機行った。生命科学部の初代学部長は、極限環境微生能解析には、独自に考案した Deinococcus 遺伝子破物学会の名誉会長である堀越弘毅先生であった。堀

壊株作製方法を初めて適用してみた。遺伝子を破壊

越先生にお会いして、私が放射線抵抗性細菌から放するためには、他の微生物由来の抗生物質耐性遺伝

射線耐性に関わる新しい遺伝子を発見したことを子を発現させるのに、Deinococcus で機能するプロ

話したところ、堀越先生の学部長挨拶の際に、私のモーター配列を遺伝子の上流に配置する必要があ

話をアドリブで紹介してもらったことを今でも記った。このプロモーター配列として上述のカタラー憶している。それから 22 年後、まさか私が東洋大

ゼ遺伝子プロモーターを利用したのである。予想通学生命科学部の学部長になるとは思ってもみなかり、大腸菌由来のクロラムフェニコール不活化酵素ったことである。

遺伝子の上流に Deinococcus のカタラーゼ遺伝子プ
ロモーターを配置することで、大腸菌由来のマーカ
ー遺伝子を Deinococcus で発現させることが出来る様になった。1999 年のことである。現在では、
Deinococcus の遺伝子操作で使用できる抗生物質が3

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

ORIGINAL PAPER

Okuda K*,1), Ito K*,1), Hagiwara Y1,2),
Okeda T1), Yatsunami R1), Fukui T1) and Nakamura S1)

Characterization of novel arabinofuranosidases from Paenibacillus sp. strain H2C
1)

School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, Yokohama, Japan
Process Development Laboratory, Research Institute for Bioscience Products & Fine Chemicals, Ajinomoto Co., Inc.,
Kawasaki, Japan2)*Equal contribution
Corresponding author: Satoshi Nakamura, snakamur@bio.titech.ac.jp
Phone: +81-45-924-5765; Fax: +81-45-924-5837
Received: January 15, 2020/ Revised: February 2, 2020; February 4, 2020 / Accepted: February 4, 2020
Abstract
Genes encoding novel glycoside hydrolase (GH)efficiently when the enzymes that degrade the mainfamilies 43 and 51 arabinofuranosidases, Abf43A andsimultaneously27).

Abf51A respectively, were found on the genome of

Xylanases

Paenibacillus sp. H2C. Abf43A and Abf51A were

β-1,4-linkage of the xylan backbone. Xylanases of

expressed in Escherichia coli, purified and characterized.

glycoside hydrolase (GH) families 10 and 11 are known

Abf43A was highly active toward both polysaccharides

as the major xylanases, and both xylanases are different

and short chain substrates, whereas Abf51A was highly

in substrate specificity. GH10 xylanase, having a shallow

active toward only short chain substrates. The optimum

cleft which accommodates the side chains of substrates

conditions of Abf43A is pH 4.5-6.5 and 45-60°C,

without causing steric hindrance, can cleave β-1,4suggesting that Abf43A would be an acidophilic andlinkages close to Araf and MeGlcA substituents andthermo-active enzyme. On the other hand, Abf51A has

produce shorter oligosaccharides than those produced by

optimum for pH 6.5-7.5 and 37-50°C. Analyses ofGH11 xylanase. In contrast, GH11 xylanase has a deepcleavage specificity revealed that Abf43A belongs to thecleft and its activity is hindered by the side chains ofgroup AXH-m2,3 and Abf51A belongs to AXH-m,d2,3.

substrates2,3,11,15).

Compared to Abf51A, Abf43A was highly synergistic

Arabinofuranosidases are the enzymes which releasewith a GH11 xylanase in arabinoxylan degradation.

Araf residues from arabinoxylan, and are classified inchain and that degrade the side chain are used
are

the

enzymeswhichhydrolyze

GH families 43, 51, 54 and 622,4,18). The cleavage
Key words: arabinofuranosidase, xylanase, arabinoxylan

specificity of arabinofuranosidases can be classified into

degradation, thermo-active enzyme, acidophilic enzyme

the next three groups: arabinofuranosidases that can only
cleave Araf from singly substituted Xylp (AXH-m);

Introduction
Plant cell walls consist of cellulose, hemicellulose andarabinofuranosidases that can cleave one Araf fromdoublylignin2). The major plant hemicellulose is xylan, whichhasabackboneconsistingof

additional numbers often indicate the linkage ofarabinose to be cleaved. For example, AXH-d3 shows

substituted by 4-O-methyglucuronic acid (MeGlcA)
and

and

doubly substituted internal Xylp (AXH-m,d). The

residues with α-1,2 and/or α-1,3 bonds, and further
groups(AXH-d);and doubly substituted terminal Xylp but not act on

xylan backbone substituted by arabinofuranose (Araf)

acetylXylparabinofuranosidases that can cleave singly substituted

β-1,4-linked

D-xylopyranosyl (Xylp) residues. Arabinoxylan has theresidues,

substituted

the arabinofuranosidase that can cleave an Araf residue

others2,6-8,10,12,21,23,25).

linked by the α-1,3 bond from doubly substituted

Arabinoxylan shows resistance to enzymatic hydrolysis

Xylp4,13,17,18).

due to its complex structure, and it can be degraded4

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

Paenibacillus sp. strain H2C was isolated from an e

pET-spAbf43A and pET-Abf51A, respectively. In ordernrichment culture using corn arabinoxylan as the sole

to remove the signal peptide region, inverse PCR was

9)carbon source . The 16S rRNA sequence analysis ofperformed using pET-spAbf43A as a template tostrain H2C revealed that its most closely related type

constructstrains are Paenibacillus ginsengiterrae (99.0% identity)

pET-Abf51A contain C-terminal His-tag derived fromand P. cellulosilyticus (98.4% identity). GH5, GH10,

the vector. Sequences of the primers used are:

GH11 and GH30 xylanases (Xyn5A, Xyn10B, Xyn11A

5’-AAGGAGATATACATATGTTTAAGAAATTGAG-

and Xyn30A, respectively) are found from the culture

TTC-3’ (forward), 5’-GGTGGTGGTGCTCGAGGGTG-

supernatant of strain H2C. Genome analysis of strain

ATTCCAAATAATCGG-3’ (reverse) for construction of

H2C9) identified putative genes encoding GH43 andpET-spAbf43A; 5’-AAGGAGATATACATATGGCAA-

GH51 arabinofuranosidases, Abf43A and Abf51A,

CGAAGCCTACTGC-3’ (forward),

respectively. In this study, we characterized the two

TGCTCGAGAGCTTTCAGTGCGAGCGATG-3’ (rverse)

novel arabinofuranosidases, Abf43A and Abf51A. The

for construction of pET-Abf51A; 5’-GCTAACAGCTC-

combinational effects of Abf43A or Abf51A withTATTGCG-3’ (forward) and 5’-CATATGTATATCTC-

Xyn11A on degradation of arabinoxylans are also

CTCCTTAAAG-3’ (reverse) for constructionof pET-Abf43A.

investigated.

pET-Abf43A.

Escherichia
Materials and methods

containing

Megazyme

Arabinoxylooligosaccharides(Brey,(AXOS)

6.5)5), and disrupted by sonication. After centrifugation,
the supernatant (cell-free extract) was applied on a Ni

Ireland).

Sepharose 6 Fast Flow column (GE Healthcare, Chicago,

asIL). The column was washed with 50 mM Tris-HCl

3 2 -α-L-arabinofuranosyl-xylobiose (A 3 X), 2 3 -α-L-

buffer (pH 7.5) containing 500 mM NaCl and 25 mM

arabinofuranosyl-xylotriose (A 2 XX), 2 3 ,3 3 -di-α-L-

imidazole, and eluted using the same buffer containing

arabinofuranosyl-xylotriose (A2+3XX), 33-α-L-arabinofuranosyl-

500 mM imidazole. Eluted fractions were pooled andxylotetraose (XA3XX) and a mixture of XA3XX and
23-α-L-arabinofuranosyl-xylotetraose (XA2XX) weredialyzed against 50 mM BR buffer (pH 6.5). Protein

also

puritypurchased from Megazyme. p-Nitrophenyl-arabinofuranosidedodecylpreviously9).
DNA sequencing
DNA sequences were determined using an ABI PRISM

domains of Abf43A and Abf51A, and SignalP 4.1
algorithm (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP) was

3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Waltham,used to identify potential N-terminal signal peptides. The

MA). For sequencing reactions, a BigDye Terminator v3.1

structural genes encoding Abf43A and Abf51A were

Cycle

amplified by PCR using genomic DNA as the template,Sequencing

Ready

Reaction

Kit(Applied

Biosystems) was used. Sequence data were analyzed withand then cloned into the NdeI/XhoI site of pET-21b(+)
tosodiumRecombinant Xyn11A was prepared as described

databases were used for determination of the conserved

WI)

by

method16) using bovine serum albumin as a standard.

Preparation of recombinant enzymes
InterPro20), dbCAN28), and CAZy (http://www.cazy.org)

Madison,assessed

and protein concentration was determined by the Lowryobtained from Sigma-Aldrich Japan (Tokyo, Japan).

(Novagen,wassulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)14),(pNPA) and p-nitrophenyl-xylopyranoside (pNPX) were

vectorweresuspended in 50 mM Britton-Robinson (BR) buffer (pH(insoluble)

such

pET-Abf51A

harvested by centrifugation (7,000 x g, 4°C, 10 min),(WAX), rye arabinoxylan (RAX) and arabinan werefrom(Novagen)incubated at 18°C for 18 h with shaking. The cells wereand DNA Ligation kit were obtained from Takara Biopurchased

cells(IPTG) was added to induce gene expression, andToyobo (Osaka, Japan), and In-Fusion HD Cloning Kit
arabinoxylan

or

5’-GGTGGTGG-

0.4-0.6. Then, 0.1 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside

enzymes and KOD DNA polymerase were obtained fromWheat

pET-Abf43AM

andcontaining 50 µg/mL of ampicillin until OD660 reached

Hokkaido System Science (Sapporo, Japan). Restriction

Japan).

BL21(DE3)

pET-Abf43A

cultured at 37°C in Luria-Bertani (LB) medium24)

Materials
Oligonucleotide primers were purchased from

(Kusatsu,

coli

Both

GENETYX-MAC ver.16.0.0 (Genetyx, Tokyo, Japan).

construct
5

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

Accession numbers
The nucleotide sequences of arabinofuranosidase

Results and Discussion
Domain structures
Abf43A is predicted to be a multi-domain enzyme

genes have been deposited in DDBJ/EMBL/Genbank
with

the

following

accession

numbers:

Abf43A,

composed

LC520056; and Abf51A, LC520057.

ofcarbohydrate

a

GH43

binding

catalytic

moduledomain

(CBM)

and

a

family6

Enzyme assay
Activity measurements were performed using longcarbohydrate binding domain (Fig. 1). On the other hand,

chain polysaccharide substrates (RAX, WAX andcatalytic domain. Abf43A has an N-terminal signal

arabinan) and p-nitrophenylated short chain substrates

peptide, but Abf51A has no signal peptide, indicating the(pNPA and pNPX). The activities toward polysaccharides

difference of cellular locations and thus physiologicalwere determined by the 3, 5-dinitrosalicylic acid (DNS)

roles of Abf43A and Abf51A.

Abf51A is a single-domain enzyme composed of a GH51

assay19) using xylose as a standard. Each reaction
mixture contained 1.2% polysaccharide and enzyme
solution in 50 mM BR buffer (pH 6.5). Reaction was
carried out at 37°C for 10 min. One unit was defined as
the amount of enzyme that produces 1 µmol of reducing
sugars equivalent per min under the conditions describedabove. The activities toward pNPA and pNPX were

Fig. 1 Domain structures of Abf43A and Abf51Afrom strain H2C.
GH43, GH43 catalytic domain; GH51, GH51
catalytic domain; CBM6: CBM6 carbohydrate
binding domain.

assessed by measuring absorbance at 405 nm. Eachreaction mixture contained 0.4% pNPA or pNPX andenzyme solution in 50 mM BR buffer (pH 6.5). Reaction
was carried out at 37°C for 10 min, and then stopped byadding 667 mM Na2CO3. One unit was defined as theamount of enzyme that produces 1 µmol of pNP
equivalent per min under the conditions described above.
Cleavage specificity
Each reaction mixture contained 0.08% AXOS and
0.43 nmol/mL of an enzyme in 50 mM BR buffer (pH6.5). Reaction was carried out at pH 6.5, 37°C for 2 h.
Aliquots of reaction mixtures were applied to a thin layer
chromatography (TLC) plate (Silica gel 60 F254, Merck,
Millipore, Billerica, MA). TLC was carried out with asolvent of chloroform-acetic acid-water (3:6:1) as adeveloping solvent. Sugars were detected by heating theplate after soaking with a mixture of 6.5 mM
N-(1-naphthyl)ethylenediamine

dihydrochloride,3%

sulfuric acid and methanol.
Assessment of combinatorial effect with xylanase
For assessment of combinatorial effects with xylanase,8.33 µg/mL of Abf43A or Abf51A and/or 1.67 µg/mL of

Fig. 2 SDS-PAGE of cell-free extracts and purified
enzymes of Abf43A (A) and Abf51A (B).
Lanes M, molecular mass markers; lanes 1, cell-free
extract; lanes 2, purified enzyme.

Xyn11A were incubated with 1.0% RAX or WAX in 50
mM BR buffer (pH 6.5). Reactions were carried out at 37°C
for 24 h. After stopping the reaction by boiling, the amountof reducing sugar was measured by the DNS method19).

6

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

Cloning, expression and purification of recombinant
enzymesExpression
plasmids
encoding
C-terminallyHis-tagged

matureAbf43A

and

Abf51A

polysaccharides and short chain substrates like pNPA,
whereas Abf51A would specifically act on short chain
substrates. These facts are consistent with the previously

werereported

constructed and transformed into E. coli BL21(DE3).
Both enzymes were successfully expressed in the

of

GH43

and

GH51

arabinan, Abf51A showed much higher activity thancell-free extracts of E. coli, and were purified by affinity

Abf43A. Arabinan has the backbone consisting ofchromatography using a Ni chelate column. Each

α-1,5-linked Araf residues, and these can be branched bypurified enzyme showed a single band on SDS-PAGE

α-1,3-linked Araf residues. Therefore, Abf51A can(Fig. 2).

cleave the substrate of which backbone is constituted by
Araf. Both Abf43A and Abf51A did not react with pNPX,

Substrate specificity
The activities of Abf43A and Abf51A toward RAX,

suggesting both enzymes have no xylosidase activity.

WAX, arabinan, pNPA and pNPX were determined.

Effects of pH and temperature on activity
The effect of reaction pH on activity was determined

Abf43A showed high activity toward RAX and WAX,
while Abf51A showed little or no activity (Table 1).

at pH 2.5-10.5 in 50 mM BR buffer at 37°C. The effect

Meanwhile, Abf51A showed higher activity towardof reaction temperature on activity was determined at

pNPA than that of Abf43A. From these results, it wassuggestedcharacteristics

arabinofuranosidases2). Comparing the activity towardthat

Abf43A

would

act

on

20-80°C in 50 mM BR buffer (pH 6.5).

both

pH and temperature dependencies on activity ofAbf43A toward RAX are shown in Fig. 3. Abf43A

Table 1 Activities of Abf43A and Abf51A towardvarious substrates.

showed the highest activity (more than 80%) at pH
4.5-6.5 and 45-60°C, indicating that Abf43A would beanacidophilicandthermo-active

enzyme.

The

extremophilic characteristics of Abf43A are desirable
for industrial applications.
pH and temperature dependences on activity of
Abf51A toward pNPA are shown in Fig. 4. Abf51A
showed the highest activity at pH 6.5-7.5 and 37-50°C.
Abf51A is a cytoplasmic enzyme and the optimum pH

Trace, slightly active after overnight reaction; N.D.,
Not detected.

and temperature of this enzyme may reflect thephysiological conditions in strain H2C.

Fig. 3 Effects of pH (A) and temperature (B) on activity of Abf43A toward RAX.
Activity was measured using 1.2% RAX as a substrate. Reaction was carried out at pH 2.5-10.5 and 37°C for 10
min (A), and at pH 6.5 and 20-80°C for 10 min (B).
7

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

Mode of action
α-L-Arabinofuranosidases can be divided into three

result suggested that Abf43A could cleave only singly

groups according to the cleavage specificity18). In order

α-1,3,

substituted Araf residue of which linkage is α-1,2 orindicatingthat

Abf43A

would

belongtoto determine the group of cleavage specificity, several

AXH-m2,3. On the other hand, Abf51A cleaved bothkinds of AXOS were assayed as a substrate for Abf43A

singly and doubly substituted Araf residues, indicatingand Abf51A, and reaction products were analyzed bythat Abf51A is a member of AXH-m,d2,3. The

TLC.

differences in cleavage specificity between Abf43A andAs shown in Fig. 5, Abf43A cleaved singly substituted

Abf51A may contribute to efficient degradation of

AXOSs such as A3X, A2XX, XA2XX and XA3XX, butarabinoxylan by strain H2C.

did not cleave a doubly substituted AXOS, A2+3XX. This

Fig. 4 Effects of pH (A) and temperature (B) on activity of Abf51A toward pNPA.
Activity was measured using 0.4% pNPA as a substrate. Reaction was carried out at pH 2.5-10.5 and 37°C for
10 min (A), and at pH 6.5 and 20-80°C for 10 min (B).

Fig. 5 TLC of AXOS hydrolysates by Abf43A (A) and Abf51A (B).
M, standard markers of xylose (X1) to xylohexaose (X6); A, Arabinose; -, without enzyme; + with enzyme; 1,
A3X; 2, A2XX; 3, A2+3XX; 4, XA3XX; 5, XA3XX/XA2XX.
8

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

Table 2

Combinatorial effects of Abf43A or Abf51A with Xyn11A on hydrolysis of RAX and WAX.

*The synergy was defined as the ratio of the amount of reducing sugars generated when enzymes were usedsimultaneously to the sum of the amount of reducing sugars generated by each enzyme was used alone.
Synergistic effect with xylanasearabinoxylans. When Abf51A was simultaneously added

The combinatorial effect of Abf43A or Abf51A with

with

Xyn11A,itbecamepossible

to

act

on

Xyn11A on hydrolysis of RAX and WAX were

oligosaccharides generated by Xyn11A. Since it would

investigated by comparing the amount of reducing sugars

be assumed that Xyn11A degraded arabinoxylans to a

generated.

limited extent, the synergistic effect of Abf51A andWhen Xyn11A and Abf43A were reacted alone to

Xyn11A was restrictive. To our knowledge, there are no

RAX, the amounts of reducing sugars generated werereportsonthesynergistic

effect2.52 mg/mL and 1.03 mg/mL, respectively. The mixturearabinofuranosidases and xylanases.

of

GH51

of Xyn11A and Abf43A released higher amount of
Likewise, a synergy value of 45.1% was obtained when

Acknowledgements
The authors thank the Biomaterials Analysis Division,

Xyn11A and Abf43A were simultaneously added toTokyo Institute of Technology for DNA sequencing.

reducing sugars (4.77 mg / mL; synergy value of 34.4%).

WAX

substrate. GH11 xylanases do not prefer

References
1)
Bacic, A., and Stone, B. A. 1980. A (1→3)- andsubstituted xylans15), so it is considered that Xyn11A candegrade only a part of the main chain of arabinoxylans.

(1 → 4)-linked β-D-glucan in the endosperm

On the other hand, Abf43A has activity towardcell-walls of wheat. Carbohydr. Res. 82:

long-chain and short-chain substrates. Abf43A can

372-377.

remove the arabinose side chains from arabinoxylans

2)effectively, correspondingly increasing the ratio of

Biely, P., Singh, S., and Puchart, V. 2016.
Towards enzymatic breakdown of complex

Xyn11A-hydrolyzable glycosidic bonds in the main

plant xylan structures: State of the art.

chain of arabinoxylans. Therefore, a large synergistic

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Massou, S., Tenkanen, M., Courtin, C. M.,

mixture of Abf51A and Xyn11A released reducing

Dumon, C., O'Donohue, M. J., and Fauré, R.

sugars of 2.71 mg/mL (synergy value of 6.39%), which2014. A 1H NMR study of the specificity of

was not so much compared to the sum of reducing sugars

α-L-arabinofuranosidases

released by each enzyme alone. A similar tendency wasonnaturalandunnatural substrates. Biochim. Biophys. Acta,

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

MINI REVIEW

Fujishima K

Cysteine biosynthesis from serine using bioengineered cysteine-free enzymes
システインを含まない酵素によるシステイン生合成経路の再構成
東京工業大学地球生命研究所
藤島皓介
Earth-Life Science Institute, Tokyo Institute of Technology Ookayama, Meguro-ku Tokyo 152-8550 Japan.
Corresponding author: Kosuke Fujishima
Tel: 08021321196 Email:fuji@elsi.jp
Received: Mar. 13, 2019/ Revised: Apr. 22, 2019 Accepted: Apr. 23, 2019
Abstract

The order of amino acid addition to theはじめにgenetic code is one of the unsolved questions regarding

生命の起源，すなわち原始地球における非生物的the origin of biological system. To achieve sustainable

且つ連続的な化学反応から，どのように現在の複雑

supply of amino acids, biosynthesis pathway plays an

な生命システムが進化したのかという大きな問題は，

important role. However, enzymes are made with the

宇宙生物学分野における一大テーマである．その中

amino acids they produce. To solve this chicken-and-egg

でも，特に様々な化学反応の触媒として利用されてproblem, we focused on the cysteine biosynthesis

いるタンパク質の基本構成因子である 20 種類のア

pathway in Escherichia coli where serine is converted to

ミノ酸のうち，約半数は隕石や彗星，あるいはユー

O-acetylserine via serine acetyltransferase (CysE) and

リー・ミラーの実験に代表される地球上での無機物

O-acetylserine

O-acetylserine

からの化学進化によって合成されうることが証明さ

sulfhydrylase (CysK/CysM). We have bioengineered

れている (Danger et al., 2012; Glavin et al., 2010;

these

and

Higgs and Pudritz, 2009). 一方で，これらのアミノ酸

methionine residues (two sulfur-containing proteinogenicを安定的に供給するための生合成経路は，現在の生

amino acids) and tested their enzymatic activity both in

化学ではタンパク質そのものが担っていることから，

vivo and in vitro. We found that both the cysteine-free

非生物的に合成が難しい新規のアミノ酸を合成する

CysE and CysM are capable to rescue E.coli knockout

ために必要なタンパク質は，そのアミノ酸を配列中

strains that lack cysE gene and cysE/cysK genes.

に含まないことが予想される．つまり進化途上の生

Activities

CysM

命は，その時点で遺伝暗号表にコードされている種

recombinant proteins were also confirmed in vitro.

類の限られたアミノ酸を合成して利用していた可能

Together this research provides the first example of the性が考えられている (Lu and Freeland, 2006)．現在ア

reconstruction of complete amino acid synthesis pathway

ミノ酸の生合成経路に関わる酵素は通常 20 種類のusing enzymes that lacks the so-produced amino acids,

アミノ酸を全て含んでいるが，トリプトファン，フproviding new insight into the orders of biotic aminoェニルアラニン，チロシンといった芳香族や唯一チacids to the genetic code.

オール基を側鎖に持つシステインは生合成経路の発enzymes

of

to
and

the

cysteine
substituted

engineered

via
all

CysE

cysteineand

展とともに遺伝暗号表に後から加わったと考えられ
Keyword: システイン生合成、遺伝暗号表、アミノている．特にシステインにおいては，補酵素 A やメ酸の起源、合成生物学、遺伝子改変

チオニンなど様々な代謝物質の硫黄源として利用されている他( Ferla and Patrick, 2014)，生体内の電子伝

12

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

達や酸化還元反応に関わる普遍的な鉄硫黄クラスタ

システイン生合成経路

ータンパク質において鉄元素と直接結合するアミノ

現在，システインの生合成経路に関しては主に４酸であり(Beinert et al., 1997)，またタンパク質の高次つの経路が知られている．まず最も幅広い生物種で構造を維持するためのジスルフィド結合を提供する

保存されているのが，植物やバクテリア，一部の古

重要なアミノ酸である(Sevier and Kaiser, 2002) ．こ

細菌において確認されているセリンから中間体を介のように生命機能の様々な場面で利用される鍵分子して合成される経路である(Kitabatake et al., 2000)にも関わらず，興味深いことに過去の様々な化学進（図 1）．

化実験及び隕石等に含まれる有機物からはなぜかシ

例えば大腸菌内では CysE と呼ばれるセリンアセ

ステインは検出されていない(Parker et al., 2011b)．そチルトランスフェラーゼがセリンをアセチル化してこで本稿では，システインはそれ自身を配列に含ま

O-アセチルセリンを生じ，続いてスルフヒドリラーないタンパク質酵素によって合成されうるという仮ゼである CysM あるいは CysK が O-アセチルセリン説を検証するために我々が行った改変遺伝子群によを脱アセチル化し，硫化水素あるいはチオ硫酸を硫るシステインの生合成経路の再構築実験を紹介する

黄源として最終的にシステインを合成することが知(Fujishima et al., 2018)．具体的には大腸菌における既られている．

存のシステイン合成経路に関わる２種類のタンパク

一方で従属栄養微生物や一部の真核生物ではシス質配列を改変し，最終生成物であるシステインを一切

テインはメチオニンからトランススルフレーション

配列に含まない酵素で合成反応が進むかどうかの確経路によってホモシステインを介して最終的にシス認を行った．
これまでにもアミノ酸の種類を限定させテインを作っている(Morzycka and Paszewski, 1979)．まて作成した改変タンパク質の報告例はあるが(Reetz

たメタン生成能を持つ古細菌の場合は，興味深い事にand Wu, 2008; Walter et al., 2005)，アミノ酸生合成経路

tRNA 上に一旦ホスホセリンとしてチャージされた後に関わる酵素に対して行なわれた例はない.

に，Sep-tRNA:Cys-tRNA synthase (SepCysS)と呼ばれる別の酵素がシステインに変換している．このシステイ

図 1. 生物界における４つの主要なシステイン生合成経路
システインを生化学的に合成にする主要な経路としてホモシステインからシスタチオニンを介して合成される経路（Pathway Cys1），ホスホグリセリン酸からホスホセリンを介して合成される経路（Pathway Cys2），セリンから O-アセチルセリンを介して合成される経路（Pathway Cys3）そしてセリンから Pathway Cys2 同様，
ホスホセリンを介して合成される経路（Pathway Cys4）が挙げられる（Makino et al., 2016 の図 1 を一部改変）．

13

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

ンはそのままタンパク質の一部としてポリペプチド

ステインを配列中に含む複数の酵素による反応に依に取り込まれる事になる(Sauerwald et al., 2005)．近年，存しているという鶏と卵の問題を抱えている．

この２つの酵素を介したメカニズムはメタン古細菌

システインを持たないシステイン合成酵素の作成だけでなく，幅広い未培養古細菌と一部のバクテリア

そこで我々は直接的なやり方でこの問題の一端をにおいても発見されている．
興味深いことに 21 番目，解決する方法を試みた．それはシステイン合成酵素の22 番目のアミノ酸として知られているセレノシステ

全てシステイン残基を置換するという手法である．特インとピロリシンに関しても，それぞれ tRNA 上にアに４つの生合成経路のうち最も幅広く保存されていミノアシル化されたホスホセリンとリジンが酵素にるセリン→O-アセチルセリン→システインという経よって化学修飾を受けて合成されている(Yuan et al.,路に注目し，その各ステップに関わるそれぞれの酵素

2010)．また普遍的な 20 種類のアミノ酸の中でもグルである cysE と cysM 遺伝子配列を大腸菌から取得，シ

タミンとアスパラギンに関しては同様の tRNA 依存的ステインをコードする領域をセリンに対応するようなアミノ酸の置換あるいは修飾によって合成されるに塩基置換した cysE-C と cysM-C 遺伝子(-C はシステ

ことが報告されている(Ibba et al., 2000)．このようなインを含まないことを示す)を設計し，遺伝子の全長をtRNA 依存的なアミノ酸合成は見方によっては新しい

委託合成した．システイン残基は CysE タンパク質でtRNA 合成酵素(ARS)を介さずにタンパク質に直接新計 3 箇所，CysM タンパク質で計 2 箇所を置換した．

しいアミノ酸を導入し，ポリペプチドの機能を広げる

また同様に硫黄元素を配列中に含まないタンパク質の合成という意味で，生物が遺伝暗号表の拡張を試す良い戦にチャレンジするためにシステイン置換に加えて，さらに略なのかもしれない．いずれにせよシステインの生合

開始コドン以外のメチオニン残基を同じく疎水性アミノ酸成に関しては複数の経路が存在し，そのいずれもがシであるロイシンあるいはイソロイシンに置換した cysE-CM

図 2. システイン合成酵素 CysE 及び CysM タンパク質におけるシステイン及びメチオニン残基置換
CysE タンパク質(273 残基)と CysM タンパク質(303 残基)の配列において置換したシステイン残基（黄色），メチオニン残基（青）そして活性中心部位（赤）を示す．アミノ酸 1 文字表記は以下の通り C:システイ
ン S:セリン M:メチオニン L:ロイシン I: イソロイシン．(Fujishima et al., 2018 の図 4 と 5 を一部改変)
14

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18と cysM-CM 遺伝子も設計し遺伝子合成を委託注文した．置する．しかし大腸菌においてアセチルトランスフェ

換したアミノ酸残基の詳細なマップを図 2 に示す．

ラーゼをコードする cysE 遺伝子欠損株(ΔcysE)，及びメチオニンはシステインと異なり，硫化水素を含２種類のスルフヒドリラーゼ cysK/cysM 遺伝子の二んだミラーの実験でその存在が確認されており，原重欠損株(ΔcysKΔcysM)は，システイン合成反応が最始地球の大気中で作られる可能性があることが示唆

後まで進まないため生育することができず，システされている(Parker et al., 2011a)．一方でメチオニンをイン要求性となる．したがって導入する改変タンパ

安定に供給するための生合成経路をみるとその硫黄

ク質が CysE や CysM の機能を補完することができ源がシステインである場合が多い．したがってシス

れば，それを菌の増殖回復という表現型で確認する

テインとメチオニンの両方が配列に含まれていないことが可能となる．今回用いた ΔcysE 株は大腸菌

極端なタンパク質も同様に合成し、試験することは，

K-12 株の一遺伝子欠損株コレクションである”Keio

無機硫黄の有機物への固定反応を硫黄元素を全く含

collection” (Baba et al., 2006) から提供してもらい，

まないポリペプチドで再現できるかどうかを検証す

ΔcysKΔcysM の二重欠損株に関しては新たに作成することは重要であると考えた．

ることに成功した．これらの欠損株は M9＋グルコ

合成したタンパク質の活性を検証する前段階としースの寒天培地において 30℃で 7 日間培養後もコロて，システインとメチオニン残基の立体構造上の位ニー形成は見受けられなかったが，システイン添加

置を大腸菌の CysE タンパク質 (PDB ID: 1T3D)及びによりその生育が回復することから，システイン要

CysM タンパク質 (PDB ID: 2BHS)で確認したところ，求性であることが確かめられた．そこで早速配列中

いずれのタンパク質もシステイン残基は活性中心部にシステインを配列に含まない cysE-C とシステイ位から遠い位置に配置されており，その距離もジス

ンと開始メチオニン以外のメチオニンを含まない

ル フ ィ ド 結 合 形 成 に 必 要 な 平 均 距 離 の 2.3 ÅcysE-CM 遺伝子を ΔcysE 株にそれぞれ形質転換し，(Bhattacharyya et al., 2004) に届かないことが確認でプラスミドを維持するグルコース添加した M9 最小

きた．一方でメチオニン残基は CysM タンパク質に培地 で 30℃で液体培養した結果，生育回復の速度

おいて Met-58 および Met-95 が活性中心付近の基質に差はあるものの，cysE-C 遺伝子も cysE-CM 遺伝子

エントリーポケット近傍に２つ配置されており，おも両方とも cysE 遺伝子の欠損を補完することがでそらく基質認識に関わるであろうことが示唆された．

きることが，OD 測定による大腸菌の増殖によって以上のことから，少なくともシステインに関しては確認された(図 3)．

２つの酵素の活性には直接関係してこないことが予

システインを配列中に含む野生型の cysE 遺伝子想された．我々はさらに情報学的なアプローチを用で補完した場合は大腸菌の遅延期が 10 時間と長かいて，CysE 及び CysM タンパク質のオーソログとのったのに対し，cysE-C 遺伝子は非常に短い時間（約比較解析を通じてシステイン及びメチオニンの進化１時間）で遅延期を脱していることがわかった（図的な保存性を確認したところ，CysM タンパク質の3）これはおそらく野生型の CysE タンパク質がシス

活性中心近傍の Met-58 および Met-95 は近縁種におテイン残基を持つために，システイン欠乏下で野生いて，非常によく保存されているが，それ以外のメ型のシステイン合成酵素を作るためには，細胞内のチオニン及びシステイン残基に強い保存性は確認さタンパク質が分解されることで，遊離システインがれなかった．したがってシステインの酵素の機能そ供給されるのを待つ必要があるからだと推測される．

のものへの関与は低いことが配列解析からも明らか

逆に CysE-CM タンパク質はシステインもメチオニとなった．

ンも合成には必要ないが，タンパク質の酵素活性が2.6 µmol/min/mg と野生型 CysE タンパク質の 25.5µmol/min/mg に比べて 1/10 倍の効率しかないことがシステインなしのシステイン合成酵素は機能するか？
そこでいよいよ改変タンパク質の機能を試すこと

エルマン試薬を用いた生化学実験によって確認されになったのだが，一番わかりやすい方法として，大た．したがって，cysE-CM 遺伝子の場合，システイ

腸菌 K-12 株から cysE と cysM 遺伝子をそれぞれノンの新規合成が著しく遅いがゆえに，遅延期が長くックアウトしてシステイン要求性となった変異株をなってしまうと考えられる．

利用することにした．大腸菌は 20 種類全てのアミノ

それでは cysM 遺伝子の場合はどうだろうか？

酸合成経路を持つため野生株は M9 最小培地と呼ば

ΔcysKΔcysM 二重欠損株を cysM-C 遺伝子で形質転換れる無機塩(ミネラル、リン酸、窒素源としてのアン

すると，20 時間ほど遅延期があるものの，最終的にモニウム塩等)にグルコース（炭素源）を加えて生育

システイン要求性が解消され増殖を確認することが15

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

できた（図 3）．タンパク質自体は in vitro の実験で結論活性を維持していたことから，cysM-C 遺伝子で遅延

今回の一連の実験は「原始生命において非生物的期がみられた理由はおそらくスルフヒドリラーゼ特に得られにくいアミノ酸が遺伝暗号表に加わるため

有 の 多 様 な 硫 黄 含 有 有 機 物 の 認 識 (Zocher et al.,には，安定的なアミノ酸供給が細胞内の生化学的な2007)を考慮すると，大腸菌内での硫黄代謝バランス

反応で達成されなければいけない」という仮説に立が CysM-C タンパク質の過剰発現によって崩れ，遅脚している．そこでシンプル且つ幅広い生物種で保延期が生じたと考えられる．一方で cysM-CM 遺伝子

存されているセリンからのシステイン合成経路に関による形質転換株ではそもそも生育増殖を確認する

わる２種類の酵素からシステインを取り除くことで，ことはできなかった．大きな原因として CysM-CM

最終生成物のアミノ酸を含まないポリペプチドが，タンパク質の精製を試みた段階ですでに大部分が不新しいアミノ酸を合成できることを実験的に証明す

溶化しており，やはり 11 箇所のメチオニン置換はタることができた．遺伝暗号表の進化がアミノ酸の生

ンパク質の構造安定性を著しく下げる結果となった

合成によって次第に拡張してきたというシナリオは，と考えられる．いずれにせよ，一連の増殖回復実験

今回のような合成生物学的手法でアミノ酸の種類をによりシステイン残基を全て置換したタンパク質

限定した改変酵素を作成し，その活性を見ていく事（CysE-C と CysM-C）がシステインを合成する２つでより詳細な裏付けが可能となるだろう．今回は大の反応を担うことを証明することができた．アミノ

腸菌のタンパク質をもとに改変タンパク質を作成し酸の種類を減らした機能性タンパク質の研究報告はたが，今後は反応活性中心近傍の構造に特化した再多々あるが(Akanuma et al., 2002; Amikura et al., 2014)，

構成など，より原始的で短く機能を維持するようなアミノ酸合成経路を最終生成物のアミノ酸を使わずポリペプチドの探索が生命の起源研究の分野においに補完した例はこれが初の報告となった．

て期待されるだろう．

図 3. システイン要求性大腸菌変異株の増殖回復実験
CysE タンパク質(273 残基)と CysM タンパク質(303 残基)の配列において置換したシステイン残基（黄色），メチオニン残基（青）そして活性中心部位（赤）を示す．アミノ酸 1 文字表記は以下の通り C:システイン S:セリン M:メチオニン L:ロイシン I: イソロイシン．(Fujishima et al., 2018 の図 2 を一部改変)

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17

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

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18

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

MINI REVIEW
Matsumura S

Relationship between replicator evolution and cellularity explored by microfluidics s
マイクロ流体デバイスで迫るレプリケーターの進化と細胞との関係
富山大学 大学院理工学研究部（理学）松村 茂祥Graduate School of Science and Engineering, University of Toyama, 3190 Gofuku, Toyama, 930-8555, Japan
Corresponding author: Shigeyoshi Matsumura , smatsumu@sci.u-toyama.ac.jp
Phone: +81-76-445-6640, Fax: +81-76-445-6549
Received: Mar. 29, 2019/ Accepted: Dec. 15, 2019
Abstract

One of the most important features of life

Keyword:must be self-replication. Appearance of replicators

Replicator,

RNA

world,

Microfluidics,

Parasite, Diversit)

harboring information should be an essential process inorigins of life. The RNA world hypothesis proposes that

キーワード：レプリケーター、RNA ワールド、マthe replicators could accumulate mutations and selected,

イクロ流体デバイス、寄生体、多様性

leading evolution of novel functions, and finally the life
came out. The scenario is, however, supposed to be

はじめにunrealistic in uniform (bulk) solution since functional

生命はどのようにして生まれたのか、すなわち生RNAs would be exterminated by non-functional ones

命の起源は、科学者のみならず多くの人の関心を集(parasites).

that

める、科学においてもっとも難解な問題の一つであprotocell-like compartments encapsulating the replicators

ろう。生命の起源について探求することは、非生命

would solve this problem by suppressing the parasiteと生命の境界、すなわちある種の極限状態での生命

diffusion and providing compartment-based group

について考えることとほぼ同義であり、これは単な

selection. Several studies have verified this theory by

る過去の事柄のみならず、生命はどのような条件でexperimental evolutions, but advancement of “droplet

誕生しうるのかという現在および未来の問題までを

microfluidics”,

Theoreticalleading

aspects

edge

have

shown

handling

含む、もっとも根源的なテーマの一つである。地球

water-in-oil emulsion droplets very fast and precisely, istechnology

上で過去どのようにして生命が始まったのかという

able to make such experiments highly quantitative.

「歴史」を証明することは容易ではない。しかし、Recent study has demonstrated that molecular diversity

生命の起源においてあり得た状況の一部を抽出し、could spontaneously emerge when a few different RNA

実験での再構成および検証を行うことで、生命が成

replicators are compartmentalized in a same droplet and

立しうる一般的な条件を探索する試みが、近年、精selected as a group, potentially providing an opportunity

力的に進められている 1)。

for further functional evolution. This review overviews

生命の起源問題には、生命の原材料となる分子のsuch constructive studies approaching “origins of genetic

起源、エネルギー獲得システムの起源、遺伝情報とinformation and evolution”, and droplet microfluidic

進化の起源など、さまざまな課題が山積している。

technology.

本稿では、「遺伝情報と進化の起源」を構成的に研究

19

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

する試みについて、筆者らの最近の研究を中心に、概説したい。
レプリケーターの出現・進化と原始細胞生命がもつもっとも重要な特徴の一つは、自己複製であろう。すなわち、情報をもち自己複製の可能な高分子（レプリケーター）の成立は、生命の始まりにおいて非常に重要な過程だと考えられる。現在の生命において、この「遺伝情報の蓄積と継承」を担っている分子は、核酸である。さらに、RNA は複雑な立体構造を形成し、触媒活性などの機能も持ちうるため、生命は RNA から始まったとする「RNAワールド仮説」が提唱され、一定の支持を得ている 2)。
自らのコピーを作ることができるレプリケーター
RNA が出現すると、そこから変異によりさまざまな
RNA 分子が生じ、さらに自然淘汰が働くことで新しい機能をもつ RNA の創発と進化が起こり、最終的に生命の誕生につながる。これが RNA ワールドの
進化シナリオである 3)。
しかし、このようなシナリオが実際に起こり得る
図 1. 異なる環境における、レプリケーターRNAの予想される機能進化A) 均一溶液（バルク）系でのレプリケーターRNAの進化。複雑な RNA は、単純な RNA（寄生体）に比べて複製速度が遅いため、いずれ駆逐される。
このような条件では、レプリケーターの複雑化は起こらない。
B) 原始細胞のような区画を想定した場合のレプリケーターの進化。区画を対象とした選択圧がかかることにより、複製速度に劣る複雑な RNA が維持される。

のかを注意深く考えてみると、これはそう簡単ではないことに気づく。何らかの機能をもつ RNA は、
そうでないものに比べて複雑な構造をとると考えられる。RNA 分子がある機能を有するためには、一定以上の長さの鎖長がなければならず、かつそれが折りたたまれ安定な立体構造を形成する必要があったであろう。RNA の複製はリボヌクレオチドを 1 つず
つ重合することで行われるため、鎖長が長くなるほど複製速度は低下する。また、複製の際には折りたたまれた立体構造を一度ほどいて鋳型とする必要があるため、構造が安定な RNA ほど複製が遅くなる傾向がある。総じて、複雑な構造をもつ分子の複製

ろうか？ まず、生命起源の最初期段階、すなわちレ速度は遅くなるため、機能構造をもたない単純な分

プリケーターが出現する時点で、原始細胞（protocell）

子との競争においては不利となり、最終的には駆逐のような容器の存在を仮定する 5,6,7)。その内部にレされてしまう（図 1A）。Spiegelman らは、RNA ウイ

プリケーターが封入されて複製されるような状況がルスのゲノム複製反応を試験管内で繰り返す実験を生じれば、上記の事態を回避できることが、理論的行い、ゲノムがどのように変化するかを解析した 4)。

に提唱されている 8,9)。その理由の 1 つは、(1) 微小

すると、変異により複製速度の速い RNA 分子が現容器への区画化により寄生体 RNA の迅速な拡散がれ、ゲノムはどんどん短くなり、74 世代の複製反応抑制されることである。そしてより重要なもう 1 つ

後には、ゲノムの実に 83％が消失した。これは、複の理由は、(2) 選択の対象が、個々の RNA 分子の複製速度の点から言えば進化だが、ゲノムの機能情報

製速度から細胞の特性へと、階層が 1 段階上がるこという観点から見るとむしろ退化である。
（このようとである。その結果、レプリケーターが細胞の生存な、複製は速いがそれ以外の機能をもたない分子はに有利になる機能をもっている場合は、それが複製寄生体と呼ばれる。）つまり、このような状況ではレ速度に優先して選択されることになり、レプリケー

プリケーターからの分子機能の進化は起こり得ないターの機能消失は避けられる（図 1B）。

と考えられ、生命は誕生できない。

このような仮説を実験で検証する試みは、近年いでは、この問題はどのようにすれば解決できるだ

くつか行われている。油中水エマルジョンや脂質二20

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

重膜小胞（リポソーム）を原始細胞モデルとして用い、その内部に RNA や自己複製系を封入し、実験進化を行っている 10,11,12,13)。しかし、エマルジョンやリポソームを均一に精度良く作製するのは技術的に難しかったため、実験条件を厳密に制御し、上記のような理論を正確に検証することは、これまでほとんど不可能であった。
液滴マイクロ流体システム
ガラス等の基板上にマイクロメートルサイズの微細な流路を構築し（図 2A）、その内部で微量の液体を操作して化学反応の制御を行う技術は、マイクロ流体工学と呼ばれる。この分野では近年、流路内に微小な液滴（油中水エマルジョン）を作り出し操作する技術体系が著しい発展を見せており、液滴マイ
クロ流体システム（Droplet microfluidics）と呼ばれている 14)。
まず、ピコリットルサイズ（直径 10～100 µm）の液滴を、非常に均一に（サイズ分布誤差 5％以下）
かつ高速に（毎秒数千個）作製することができる（図2B）。作製された液滴は界面活性剤により安定化されており、通常の条件では合一することはなく、数ヶ月のオーダーで安定である。液滴の内部には水溶性の物質であれば基本的に何でも封入することができ、かつ界面活性剤は核酸やタンパク質が関わる通常の生化学反応には干渉しない。つまり、個々の液滴は微小なマイクロリアクターと見なすことができ、その内部でさまざまな反応を独立かつ平行に行うことが可能である。さらに、個々の液滴の蛍光強度を解析し、特定の液滴のみを高速で（毎秒数百個）分

図 2. 液滴マイクロ流体システムA) マイクロ流体デバイス。シリコーン樹脂（ポリジメチルシロキサン、PDMS）上にマイクロメ
ートルサイズの溝を成形し、ガラスと貼り合わせることで流路を構築する。
B) 液滴の生成。ピコリットルサイズ（直径 10～100 µm）の液滴を、非常に均一かつ高速に作製できる。水相のフローを、界面活性剤を含む油相で挟み込むことで、液滴を作り出す。
C) 液滴の分取（ソーティング）。それぞれの液滴の蛍光強度をリアルタイムで計測し、望みの液滴にのみ電場を与えることで電極（黒の線）に引きつけ、液滴を分取する。

取することもできる（図 2C）。すなわち、個々の液滴に異なった分子をそれぞれ封入しハイスループッ
ト・スクリーニングを行うことで、実験進化を行うことが可能である。
この技術を用いることで、液滴、すなわち細胞モ
デルの大きさを極めて正確に制御できる。つまり、1つの液滴に封入する RNA 分子数などの実験条件を精密に設定することができる。また、分取の際の液滴の蛍光強度の閾値を自在に変えることで、選択圧も柔軟に設定することができる。
レプリケーターRNA の液滴内進化実験
そこで我々は、この液滴マイクロ流体システムをまず、レプリケーターRNA を構築した。タンパク

用いて、RNA が細胞様の容器に封入され、そこで複質酵素 Qβレプリカーゼにより複製される製が起き、かつ細胞が淘汰を受ける条件下において、Midivariant RNA と RNA 切断活性をもつ Varkud

レプリケーターの集団がどのように変化していくか

satellite（VS）リボザイムを融合させた。これにより、を解析した 15)。

Qβレプリカーゼの存在下で自己複製し、かつ触媒

21

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

活性（RNA 切断活性）をもつレプリケーターRNAを構築できた。
次いで、このレプリケーターRNA を、Qβレプリ
カーゼ、NTP、蛍光基質 RNA などとともに、液滴マ
イクロ流体システムを用いて約 10 pL の液滴に封入した。封入されたレプリケーターRNA は液滴内で Q
βレプリカーゼにより複製され、さらに、複製された RNA は VS リボザイム部位がもつ触媒活性により
基質 RNA を切断する。その RNA 切断活性は、蛍光
基質 RNA を用いて検出が可能である。約 100 万個の液滴の蛍光強度を解析し、一定以上の蛍光をもつ
液滴を分取し、そうでない液滴を廃棄した。これは、一定以上の触媒活性を内部に有する液滴は生存し、閾値以下の活性しかもたない液滴は淘汰される、という選択圧がかかっている状態だと言い換えることができる（図 3A）。そして、分取した液滴を破壊して内部の RNA を回収・混合し、再び液滴に封入して選択する、という上記の過程を繰り返した。9 ラ
ウンドの操作の結果、レプリケーターRNA は駆逐されずに残存した。より具体的には、寄生体 RNA は出現したものの、レプリケーターRNA は絶滅せず、両者が共存する平衡状態に達した。すなわち、触媒活性をもつレプリケーターが区画化され、それが区画に対して淘汰上の利益をもたらす場合には、レプリケーターの触媒機能は維持されることが示された。
図 3. レプリケーターRNA の液滴内進化実験
A) 液滴の分布を示す二次元図とソーティング閾値。横軸を液滴内の触媒活性、縦軸を RNA 複製量とし、各液滴をプロットすると、典型的にはこのような分布になる。
約 140 の触媒活性を分取の閾値として設定することで、それ以上の触媒活性をもつ液滴は生存し、それ以下の活性しかもたない液滴は淘汰される、という選択圧をかける。B) 複雑な（複製の遅い）寄生体 RNA が優勢となる機構。レプリケーターと単純な（複製の速い）寄生体（赤色）が共存すると、寄生体が圧倒的に優勢となり、その液滴は触媒活性をほとんど失ってしまうため、生存できない。複雑な（複製の遅い）寄生体（緑色）が共存すると、
レプリケーターの量はそれほど減らないた
め、その活性も維持され、生存できる。
C) 液滴内の RNA 分子数と寄生体 RNA の多様性。寄生体は、レプリケーターの一部の配列が欠失することで生じる。次世代シーケンサーで寄生体の配列を網羅的に解析し、各寄生体について、欠失が開始する位置と終了する位置をそれぞれ縦軸と横軸にとり、プロットした。λは、一つの液滴に封入される RNA 分子の平均個数。λ= 2.1 の条件に比べ、λ= 6.9 のほうが明らかに寄生体の分子種が多く、広く分散している。

区画化による異種 RNA の共存と多様性の創発
前述のように、マイクロ流体システムを用いることで、液滴 1 つあたりに封入される RNA 分子数を精密に制御することができる。興味深いことに、封入される RNA 分子数が少ない場合（≈ 0.6 個）、平衡
状態での全 RNA に占めるレプリケーターRNA の割合は高くなり（83％、残りの 17％は寄生体 RNA）、
対して、RNA 分子数が多い場合（≈ 6.9 個）は、レ
プリケーターRNA の割合は低くなった（28％）。こ
の結果は、液滴に封入される RNA 分子数が多くなるほど、レプリケーターRNA と寄生体 RNA の共存（共生）がより顕著になることを示している。そこ
で、RNA 分子数が少ない場合と多い場合のそれぞれにおいて、どのような複製速度をもつ寄生体 RNAが出現してくるのかを、数理シミュレーションにより解析した。すると、RNA 分子数が少ない場合は複製の速い寄生体 RNA のみが現れるが、RNA 分子数が多い場合は、複製が遅い寄生体 RNA のほうが優勢となることが示唆された。実際に実験で得られたRNA について調べたところ、予想されたとおり、

22

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

RNA 分子数が多い状態で進化してきた寄生体 RNA

アプローチについて述べてきた。これは生命の起源の複製速度は比較的遅く、同じ液滴内のレプリケー

だけではなく、進化の一般的メカニズムにも関わる

ターRNA の活性を大きくは毀損しなかった。すなわ

重要な問題である。これは、「進化の原動力である多ち、レプリケーターRNA と複製の速い寄生体 RNA様性がいかに生ずるか？」という問題だと言い換えが同じ液滴に共存した場合、複製速度に勝る寄生体ることもできる。ある分子機能が進化するというこ

RNA が圧倒的に優勢となり、その液滴はレプリケーとは、特定の配列に収束してゆくことを意味し、そターRNA の活性をほとんど失ってしまうため、生存の結果、多様性は減少する。機能が進化しつつ、どできない（図 3B）。対して、複製の遅い寄生体 RNAのように多様性が維持されるのか。近年の構成的なが共存した場合は、レプリケーターRNA の量はそれ

実験研究により、その機構が徐々に明らかになってほど減らないため、その活性も維持され、生存でききている 13,17)。

る。結果として、複製の遅さがむしろ生存に有利な進化の研究はこれまで、自然界で起こってきた現形質となり、そのような寄生体 RNA が進化したと象の解析という側面が強かった。しかし、近年の技考えられる。

術革新により、進化現象を実験により再現すること

また、複製の速い寄生体 RNA は変異に対して鋭敏であが可能になりつつある。本稿で解説した液滴マイクる（小数の変異で容易に複製速度が低下する）のに対して、

ロ流体システムは、その一端である。このような技

複製の遅い寄生体 RNA は変異に対して寛容である（多少術を取り入れることで、進化を実験で再構成・検証の変異が入っても複製速度が大きくは変化しない）と予測することで理解するという研究の潮流は、ますますできる。すなわち、複製の遅い寄生体 RNA が優勢になる

大きくなっていくであろう。

ような状況では、寄生体 RNA 分子に（ほぼ）中立な変異が蓄積し、分子の大きさや配列に多様性が許容され、そこ

参考文献からより複雑な配列が生じるのではないかと考えられる。

1)

そこで、液滴内の RNA 分子数が多い状態（≈ 6.9 個）と少Pressman, A., Blanco, C., and Chen, I. A. 2015.
The RNA world as a model system to study theない状態（≈ 2.1 個）で得られた寄生体 RNA を次世代シー

origin of life. Curr. Biol., 25: R953-R963.

ケンサーでそれぞれ網羅的に解析した。すると、RNA 分
2)

子数が多い状態において、有意に寄生体 RNA の多様性がRobertson, M. P., and Joyce, G. F. 2012. The

増大していた（図 3C）。このことは、異種の RNA が同一

origins of the RNA world. Cold Spring Harb.

の区画に封入され、その区画全体に選択圧がかかることで、

Perspect. Biol., 4: a003608.

個々の分子にとって不利な形質が全体としては有利に働

3)く状況が生まれ、結果として分子の多様性が自発的に増大

Hernández, A. R., and Piccirilli, J. A. 2013.
Chemical origins of life: Prebiotic RNA unstuck.

したことを意味している。

Nat. Chem., 5: 360-362.

この結果は、進化の原動力である分子の多様性がいか4)にして生じ維持されるのか、という問いに対し、一つのMills, D. R., Peterson, R. L., and Spiegelman, S.

示唆を与える。それは、区画内に複数のレプリケーター

1967. An extracellular Darwinian experimentが存在する場合、そのいくつかが選択圧より解放され、with a self-duplicating nucleic acid molecule.

そこに変異が蓄積していくということであり、この現象

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 58: 217-224.

は遺伝子重複による進化との類似性を想起させる 16)。変5)

異が蓄積することで増大した多様性は、そこから新規な

Dobson, C. M., Ellison, G. B., Tuck, A. F., and機能が生じる次のイノベーションの原動力になり得るか

Vaida, V. 2000. Atmospheric aerosols as

もしれない。すなわち、レプリケーターが区画に封入さprebiotic chemical reactors. Proc. Natl. Acad.

れ選択を受け、そこから分子の多様性が自発的に生み出

Sci. U.S.A., 97: 11864-11868.

され、その多様性を基盤として新しい分子機能が進化す

6)

る、そういったプロセスが生命誕生には必須であったでKanavarioti, A., Monnard, P. A., and Deamer, D.
W. 2001. Eutectic phases in ice facilitate

あろうことが本研究より示唆される。

nonenzymatic

nucleicacid

synthesis.

Astrobiology, 1: 271-281.

おわりに
7)

本稿では、
「遺伝情報がどのように現れ、それがいかに進化し得たのか？」という問題に対する実験的

Szabó, P., Scheuring, I., Czárán, T., andSzathmáry, E. 2002. In silico simulations reveal

23

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

that replicators with limited dispersal evolve

8)

17)

system. Nat. Ecol. Evol., 2: 1654-1660.

Szathmáry, E., and Smith, J. M. 1995. The

Engelhart, A. E., Adamala, K. P., and Szostak, J.

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Host-parasite

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15)

Matsumura, S., Kun, Á., Ryckelynck, M.,
Coldren, F., Szilágyi, A., Jossinet, F., Rick, C.,
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16)

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13)

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12)

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11)

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10)

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9)

Mizuuchi,Ohno, S. 1970. Evolution by Gene Duplication.
Springer, New York.
24

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

MINI REVIEW
Kubota H

Basic science studies on microbiology contribute to product development in an
aspect of microbial control
微生物制御に関わる製品の開発につながるベーシックサイエンス
花王株式会社

スキンケア研究所
久保田浩美

Kao Corporation Skin Care Products Research, 2-1-3, Bunka, Sumida-ku, Tokyo 131-8501, Japan
Corresponding author: Hiromi Kubota, kubota.hiromi@kao.com
Phone: +81-3-5630-9401, Fax: +81-3-5630-9330
Received: Mar. 16, 2020 / Revised : Mar. 18, 2020/ Accepted: Mar. 18, 2020
Abstract

There are various microorganisms constantly

For the first stage of research to develop a microbial

in our environment. Many of these microorganisms

control technology, it is necessary to have a deep

provide significant benefits to human life and healthunderstanding of the objects to be controlled, that is, thewhile others can cause harm. For example, the latter cancharacteristics of the target environment and the

directly endanger the health of people through infections,microorganisms in it. We believe that basic science

allergies, and food poisoning, and in some cases, they

research will provide us with an important key tocan claim lives. In the natural environment or living

efficient technology development. In this paper, threeenvironment,

microorganisms

phenomena,

such

as

coloration,

food

spoilage,

odor

cause

unpleasantcases are introduced as examples of such basic sciencegeneration,

microbial

research: 1) unpleasant odors generated on clothing andbiodeterioration.

the major microorganisms involved, 2) pink biofilms

Unpleasant odors generated in laundry, clothes or shoes,

commonly found in bathrooms and control of theblack mold and pink stains (pink biofilm) in bathrooms,

dominant bacteria, and 3) skin characteristics andslimy sponges in the kitchen, slime in the drain port,

microbial analysis of each part of the hand, which has abacterial corrosion of piping, deterioration of leather,complicated structure.

andfood rot, and expansion of packages are familiar to us in
our everyday lives.

Keyword: basic science, microbial control, product

Daily necessities familiar to life, such as fabric care,development, laundry, malodor, bathroom, pink biofilm,

home care, oral care, hair care, and skin care products

hand skin, handwashing, 4-methyl-3-hexenoic acid,often function to reduce such unpleasant phenomena

Moraxlla osloensis, Micrococcus, Methylobacteriumcaused by microorganisms. One technique to do this isthrough “microbial control,” which is commonly termed

キ ー ワ ー ド ：ベーシックサイエンス、微生物制御、"antimicrobial

effect,"

製品開発、衣類、生乾き臭、汗臭、浴室、ピンク汚"disinfection,""eradication"bactericidalofeffect,"bacteria,"

れ、手指、手洗い、4-メチル-3-ヘキセン酸“microbiostasis," or "eradication of microbial biofilm."

25

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18の実例として 3 つのケースを紹介する。まずは、1）

はじめに
我々の身の回りには様々な微生物が存在し、我々

衣類から発生する不快なニオイの主要な成分やそれは常に微生物と接して暮らしている。これらの微生に関わる主な微生物について、次に 2）浴室などに物の存在は人の健康や生活に重要な役割を果たしてよくみられるピンク汚れに優占する微生物とその制いるのであるが、時に人に危害を与え、また不快な御についての研究を紹介する。最後に、3）適切な手思いをさせる。例えば、感染症を発症させる、アレ

洗いの啓発活動や効果的な技術の提案を目指し、複ルギーの原因となる、食中毒を起こすなど人に対し雑な手指の構造に着目して手指の部位ごとに皮膚性て直接的に危害を与え、場合によっては命を脅かす。

状と微生物の状態を解析した例について紹介する。

また、自然環境や生活環境においては、悪臭、汚れ、劣化、腐敗等の不快な現象を引き起こす原因にもな

１．衣類の不快なニオイっている。衣類や靴などから発生する不快なニオイ、

日本においては洗濯ものを室内で干す場合が多く、浴室のカビ汚れやピンク色の汚れ、台所スポンジの干している間や乾燥後の使用時にいわゆる「生乾きぬめり、排水口にみられるスライム、配管の腐食、のニオイ（生乾き臭）」を経験し、不快に感じる人が革製品のカビによる劣化、食品の腐敗や変敗、パッ多い。また、衣類の着用中、汗をかくような運動を

ケージの膨張等身近な例は枚挙にいとまがない。

した場合等に衣類から汗のようなニオイ（汗臭）を一方、生活に身近な日用品、例えば、衣料用洗剤

強く感じ不快になる人も多い（弊社調べ）。

や仕上げ剤などのファブリックケア製品、台所用洗剤や住居用洗剤などのホームケア製品、歯磨き粉な

生乾き臭のキー成分は 4-メチル-3-へキセン酸である 5）

どのオーラルケア製品、シャンプーなどのヘアケア

竹内ら 5）は、生乾き臭のニオイ強度の高い衣類を製品、化粧品類、洗顔料、ボデイソープ、ハンドソ

集め、溶剤抽出により臭気成分を回収した。ガスクープなどのスキンケア製品等では、こういった微生

ロマトグラフィー質量分析計（GC-MS）およびニオ物由来の危害を防いだり不快な現象を低減させたり

イ 嗅 ぎ ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ GC-O） に よ るする機能を有することが望まれる場合が多い。このAroma Extract Dilution Analysis(AEDA)によって悪臭ような機能を発揮させる技術の一つとして、微生物

成分を特定した。さらに悪臭成分の中でも生乾き臭を制御する（微生物制御：microbial control）技術がに特徴的なニオイである雑巾様臭を有する成分につある。なお、「微生物制御」を広義にとらえると、例

いて分画し、Preparative Fraction Collector (PFC)に接えば有用物質生産に向けた産生微生物の生育や代謝続した GC を用いながら濃縮を繰り返し、最終的になどのコントロール、活性汚泥のコントロールなど

は物質を同定することができ、その寄与度を解析した。

のような「有用微生物やその集合体のコントロール」

その結果、4-メチル-3-へキセン酸（4M3H）（図１）を含むが、本稿では一般に「除菌」、「抗菌」、「静という微量にしか存在しないが嗅覚閾値の非常に低

菌」、
「殺菌」、
「消毒」、
「バイオフィルム除去」「バ

い物質が衣類の生乾き臭のキー成分であることが明イオフィルム分散」などの言葉で代表されるようらかとなった。

な「人に有害な微生物やその集合体のコントロール」を指す。
筆者らは、製品の機能として必要な微生物制御技術を開発するためには制御する対象をしっかりと把握すること、すなわち、対象となる環境と制御すべ
図１

き微生物を正しく理解することが近道であると考え4-メチル-3-へキセン酸（4M3H）て研究を進めてきた。まずは、 “有害事象、あるい生乾きのニオイ発生に関与する主たる微生物はは不快な現象の認められる環境がどのような環境なMoraxella osloensis である 3）のか”、 “その環境のどこにどのような微生物がど

4M3H の構造からニオイの発生には微生物の関われくらいどのように存在するのか”、そして“制御のりがあると考え、生乾き臭を有する衣類から微生物対象となるべく微生物種はどのような状態で存在し、を分離した。次に分離した微生物を滅菌した中古タ

どのような特徴を有するのか”についての理解を深オル片に接種し、一定時間培養後に発生する生乾きめた。まさにベーシックサイエンス研究が技術開発臭の官能評価と４M3H の定量解析を実施した 3）。

への鍵となると考え研究を実施している。

これらの結果、衣類上において 4M3H の発生に

本稿では、このようなベーシックサイエンス研究

大きく関わる微生物として Moraxella osloensis の26

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

表１. 衣類 a からの Moraxella osloensis の検出３）
ア イテ ムサ ンプ ル数% 検 出頻 度 b

生 菌数 (c.f.u./cm2)c% >104 c.f.u./cm2 d

タ オル 類

2186

1.0×101 –1.3×107

52

5

6

T シ ャツ650

1.9×10 – 1.6×10

50

下着

6

33

1.8×102 – 2.4×104

16

3

靴下

10

50

2.1×10 –2.8×10

ズ ボン

5

0

ND e

5

ND
5

バ スマ ット

6

17

2.7×10枕 カバ ー367

1.2×103 – 2.9×104

シャツ（T シャツ以外）

2

1

50

50

17

1

1.0×10 – 4.4×10

67
0

a

, 国内 26 家庭よりニオイの有無にかかわらず 59 サンプルを集めた。
, 各アイテムにおいて M. osloensis が検出されたサンプルの割合を示す。
c, 各アイテムの生菌数の幅（最小値－最大値）を表す。
d, M. osloensis が 104 c.f.u./cm2 以上であったサンプルの割合を示す。
e, ND:検出されず。
b

存 在 が 明 ら か と な っ た 。 M. osloensis は 、動後回収した衣類の汗のようなニオイ成分の解析を

Gammaproteobacteria の Moraxellaceae に属し、SCD実施した結果、単鎖・中鎖の複数の脂肪酸がニオイ

培地等で二連短桿菌の形状をとる。本菌種についてに寄与していた。次世代シーケンサーを用いた 16S

は様々な環境や人からの分離や検出について報告さ

rRNA 配列領域に基づく菌叢解析と分離株のニオイれていたが、衣類上での検出やニオイとのかかわり

類中の汚れ成分と Micrococcus 属細菌が関与するこに関する報告はなかった。そこで国内の住環境や衣とが示唆された。

類について調査したところ、住環境の様々な箇所や衣類から本菌種が分離あるいは検出され、特にタオ

２．浴室に見られるピンク色の汚れ（ピンク汚れ）

ルなどの木綿の衣類からはニオイ発生の有無にかか

浴室の排水口、床、壁等ではピンク色の汚れ（ピンク

わらず高頻度でかつ菌数多く分離された（表１）。

汚れ）がよく認められる。その色により目立つ、こすら

また、分離源によらず試験に供したすべての M.

ないと落ちない、落としてもすぐに再発するといった課

osloensis 株が中古タオルから生乾き臭を発生させた。

題があり、生活者が浴室において気になる汚れとしてカ

さらに様々なストレス耐性の視点からも洗濯環境中

ビ汚れに次いで多く挙げられていた（弊社調べ）に生存しやすい特徴を有していた。
ピンク汚れに優占する微生物種は Methylobacterium 属
細菌である 4,6）

着用中に感じる汗臭（着用汗臭）に Micrococcus
属細菌が関わっている １）

国内の様々な家庭の浴室からピンク汚れ部分を採一般家庭より洗濯後のＴシャツ、肌着等を回収し、取し解析を行った 4,6)。走査型電子顕微鏡(SEM)でのこの衣類を成人男性が着用して運動を行った 1）。運観察、分離菌の解析、および Fluorescence in situ

表２

ピンク汚れ中の Methylobacterium 属細菌の割合の例 4）

サ ンプ ル No.

Methylobacterium 属
a

他 の属 b (%)β -1,3-, -1,4-グ ルカ ン c (%)

(%)

1

81±13

3.4±6.315±14255±3.20.1±1.745±5.53 in situ hybridization（FISH）により解析を行った。値は96±21
0.6±3.2 10 画像の平均値±標準偏差である。
2.9±1.5
Fluorescencea
MB プローブ（Methylobacterium 属特有のプローブ）によってハイブリダイゼーションした体積b
EUB338 プローブ（細菌特有のプローブ）によってハイブリダイゼーションした体積
ccalcofluor white により染色された体積
27

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

hybridization (FISH)による解析を行うことにより、ピ

この組み合わせは塩化ベンザルコニウム単独でンク汚れがバイオフィルム状態であり、この中に優はほとんど効果のない濃度でバイオフィルム状占する微生物種は Methylobacterium 属細菌であるこ態の菌に対しても効果を示した 4 ）。

とが明らかとなった（図２）。Methylobacterium 属細菌は、Alphaproteobacteria の Methlobacteriaceaeに

３．手指の皮膚性状と微生物

属し、細胞表層にカロチノイドを有することや細胞

保育園や高齢者介護施設等の福祉施設における長膜にステロールを有する特徴を持ち、植物と共生し時間の集団生活の増加、地球規模での人やモノの移て存在することなどが知られている。浴室から分離動の高速化、あるいは国際的なイベント等によるマされた本属細菌は Potato Dextrose 培地（PDB）で良スギャザリングの増加により、感染症の集団発生リ

好に増殖し、浴室で優占する要因となる様々な特性

スクの高まりや地球規模での流行が懸念されている。

を有していた。その特徴の一つとしてバイオフィル

このような集団感染や感染拡大の予防としては様々

ム状態でなくとも洗浄剤成分に対し比較的高い耐性な対策が講じられており、手洗いの実施もその一つを有することも判明したため、まずは本属に対してとして非常に重要であると考えられている。一方、効果的に働く殺菌技術の開発を目指した。

手は、爪、指、関節等を有する複雑な形状をもち、手洗いにおいては部分的な汚れの洗い残しが多いという課題

Methylobacterium 属細菌に対して効果的な薬剤のもあり、このような課題を解決するために手洗いの啓発

組み合わせがある 4,7）

活動や技術研究が広く行われている。

Methylobacterium 属細菌（浴室分離株）に対し爪と指の間の菌数は他の部位と比べて多い 2）ては、浴室の清掃時間に相当するような短時間では殺菌効果が認められなかった濃度の界面活

健常肌（手指に明確な皮疹を有しない）の成人男性剤であっても長時間接触させた場合には殺菌

女（非医療従事者）を対象に、手洗いの実態、手の性が認められた。Methylobacterium 属細菌の特殊

各部位の肌性状（手荒れ有無、角層水分量・pH・温な表層構造が薬剤の作用障壁となる可能性も考度等）、細菌状態を把握することを試みた。手の甲、えられたため、微生物表層への浸透促進に着目

指の間、手の平、指の腹及び爪と指の間を対象にスし、殺菌性のある基剤の効力を増強させることワブ法によるサンプリング後、生菌数の測定および

4,7 ）。その結果、界面活性剤（塩化ベン

次世代シーケンサーを用いた 16S rRNA 配列領域に

ザルコニウム）といくつかの溶剤の組み合わせ

基づく菌叢解析を実施した。その結果、SCD 培地をが本属の殺菌に有効であることが見いだされた。

用いた好気的条件および BHI 培地を用いた嫌気的条

を試みた

図2

手の各部位ごとの菌数
28

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

件で培養した場合のいずれも爪と指の間の菌数が他

strategies to control pink biofilms in bathrooms.

2）の部位と比べて多かった（図２） 。部位間で各科Bacterial Adherence ＆ Biofilm, 27: 55–58.

の存在比率を見ると、Propionibacterium 科等では手5)の甲で Staphylococcus 科等では爪と指の間で他の部

Takeuchi, K., Hasegawa, Y., Ishida, H., andKashiwagi, M., 2012. Identification of novel位と比べて高かった（in preparation）。また、各部位
により肌性状も異なり、手洗い行動や皮膚性状と特malodour compounds in laundry. Flavour. Fragr.

定の部位の菌数が関係することも示唆された。

J., 27: 89-94.
6)

おわりに

Yano, T., Kubota, H., Hanai, J., Hitomi, J., andTokuda,

上述のベーシックサイエンス研究で得られた知見

H.,

2013.

Methylobacterium

は、微生物制御技術を必要とする製品開発の一助とStressbiofilms

tolerance
inofbathrooms.

Microbes Environ., 28: 87-95.

なってきた。一方、微生物制御技術を開発する段階
7)

では、開発しつつある技術の能力を正しく把握する

Yano, T., Miyahara, Y., Morii, N., Okano, T.,

必要があり、そのためには適切な試験法・評価法をKubota, H. 2016.

採用することが重要である。ベーシックサイエンス

attack bacterial surface structures differently.

で得られた知見と分離した菌株そのものが適切な試

Appl. Environ. Microbiol., 82:402-408.

験法・評価系の構築においても有用であった。
日用品等の製品開発には、技術開発、処方設計、包装容器設計等において幅広い分野の研究が必要である。本稿では技術開発の中でも微生物制御に関わるベーシックサイエンスについて述べてきたが、各研究分野においてベーシックサイエンス研究がその一端を担うことにより、製品を通して人々の生活や取り巻く環境の未来に貢献できるものと考える。
引用文献
1)

半田拓弥、松村佑太、佐藤惇、今井真美、大野哲、久保田浩美、牧昌孝、柳澤友樹 2016.
衣類の汗臭とその原因菌の解析. 平成 28 年
度繊維学会年次大会予稿集, 71: 2E03.

2)

北辻早希、矢野剛久、山本奈緒子、森本拓也、
久保田浩美

2019. 一般生活者における効

果的な手指衛生を目指した手洗い実態及び肌/細菌状態の解析.

第 34 回日本環境感染学会総会・学術集会予稿集, P182.
3)

Kubota, H., Mitani, A., Niwano, Y., Takeuchi,K., Tanaka, A., Yamaguchi, N., Kawamura, Y.,
and Hitomi, J., 2012. Moraxella species areprimarily responsible for generating malodor inlaundry.

Appl.

Environ.

Microbiol.,78:

3317-3324.
4)

Pentanol and benzyl alcohol

Miyahara, Y., Yano, T., Hanai, J., Yokohata, R.,
Matsuo, S., Hiratsuka, H., Okano, T., andKubota, H. 2013. Development of novel
29

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

MINI REVIEWMetabolic

Kameya M a,b, Arai H a,b, and Ishii M a,b

features of hydrogen-oxidizing bacteria and their applicationto achieve a low-carbon society
水素細菌の代謝特性と低炭素社会実現に向けての展開a

東京大学大学院農学生命科学研究科応用生命工学専攻b
東京大学微生物科学イノベーション連携研究機構
亀谷将史 a,b、新井博之 a,b、石井正治 a,ba

Department of Biotechnology, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyob

Collaborative Research Institute for Innovative Microbiology, The University of Tokyo

Corresponding author: Masafumi Kameya, akameya@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp
Phone: +81-3-5841-5143
Received: March 16, 2020/ Accepted: March 19, 2020
Abstract

Hydrogenbacteria,

often

calledことができる一群の細菌”として生化学辞典で定義されている 43)。

hydrogen-oxidizing bacteria or knallgas bacteria, are abacterial group that autotrophically grows utilizing「水素細菌」という言葉を聞いたとき、この定義

hydrogen and carbon dioxide as the electron donor andとは逆に、「水素を生産する細菌」というイメージを

the carbon source, respectively. This article presents an

持つ人もいるだろう。しかしそのような菌は、「水素

overview

central細菌」ではなく、「水素生成菌」と呼ばれている。例

metabolism, including hydrogen oxidation and carbon

えば、活性汚泥で有機物を酸化し、共生するメタン

fixation, of hydrogen bacteria in order to explain what

生成菌に水素を供給する菌 44)や、水素生成能を有す

metabolic mechanisms endow the distinct features with

る嫌気性アーキア 16)などがよく知られている。これ

these bacteria. We also discuss the potential application

らの菌は、嫌気的環境で有機物を酸化し、生じた還of hydrogen bacteria and their advantages to achieve a

元力の最終的な捨て場としてプロトンを H2 に還元

low-carbon society based on the metabolic features.

して放出する。またこれ以外に水素を生成する菌とof

physiologicalfeatures

and

しては、窒素固定酵素 nitrogenase の副反応により水素を生じる窒素固定菌も挙げられる 22)。

Keyword: 水素細菌、独立栄養性、ヒドロゲナーゼ、二酸化炭素固定、カルビン回路、還元的 TCA 回路、「水素細菌」はこれらの菌と異なり、「水素酸化細低炭素社会、水素社会、ガス発酵生産菌」とも呼ばれ、主に好気的環境で水素を水に酸化(hydrogen-oxidizing bacteria, autotrophy, hydrogenase,

することでエネルギーを獲得し生育する菌を指す。

carbon fixation, Calvin cycle, rTCA cycle, low-carbon

従属栄養生物は有機物を摂取しエネルギー源としな

society, hydrogen society, gas fermentation)

ければ生育できないのに対し、水素細菌は有機物なしで生育することができる。すなわち水素細菌は、

1.

はじめに

水素を唯一のエネルギー源とする能力だけではなく、「水素細菌」は、“水素の酸化エネルギーを利用

二酸化炭素を唯一炭素源として固定して独立栄養的してエネルギー生産を行い、独立栄養的に生育するに生育する能力も有している。

30

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

本稿では水素細菌について、「そもそもどういう菌可能にしているのだろうか。これに関して、水素酸なのか」といった基本的なことから、菌の特性、ま化代謝と炭酸固定代謝を中心に紹介したい。

たその特性がどのような代謝機構によるものなのかを、できる限り平易に紹介したい。またこうした代

3-1. 水素酸化代謝

謝特性を踏まえた上で、低炭素社会の実現など昨今

水素酸化と hydrogenase

社会的に求められている課題に水素細菌をどのよう「水素をエネルギー源とする」という、水素細菌で最も重要な特性を支えている酵素が hydrogenaseに活用できるか、その可能性を論じたい。

である。Hydrogenase は、2.

H2 ⇄ 2H+ + 2e-

水素細菌の特性や分類、環境中分布
筆者の所属する研究室では、水素を唯一のエネルという反応を可逆的に触媒することで、分子状水素

ギー源、二酸化炭素を唯一の炭素源とした条件で水をプロトンに変換し電子を引き抜くことができる。

素細菌のスクリーニングが行われてきた。温泉土壌

水素細菌はこの反応で得た電子を呼吸鎖などに渡す

か ら は 、 70 ℃ を 至 適 温 度 と す る Hydrogenobacter

ことで、ATP 合成や各種代謝への還元力供給を行っ

thermophilus や 、 50 ℃ を 至 適 温 度 と す るている。

Hydrogenophilus thermoluteolus といった好熱性水素細菌が単離されている 10, 17)。単離源は陸上淡水環境

Hydrogenase の分類と生理学的機能に限られず、海洋からは Hydrogenovibrio marinus と26)

Hydrogenase が水素酸化に必須であることは述べ。これらたが、それでは水素細菌は hydrogenase を 1 つ持っをはじめ、その特異な代謝ていれば十分なのだろうか。それとも何らかの理由

機構の解明を目指した研究が進められている。またで複数の hydrogenase を使い分けていたりするのだ

一般的に知られる水素細菌としては、中温の土壌か

ろうか。

いった中温性の水素細菌も得られているの菌株は、ゲノム解読

2-4)

ら単離された Ralstonia eutropha (Cupriavidus necator)
H16 が代表的な菌株として広く研究されている

29)

細胞内での局在性と生理学的役割によって、。

hydrogenase は大きく 3 つに分類される。第一のグル

このように様々な環境に遍在する水素細菌であるープは、細胞膜上にある membrane-bound hydrogenase

が、どのような特性を有しているのだろうか。水素(MBH)である（図 1）。本グループの酵素は膜上でキ細菌を他の独立栄養性生物と比較したとき、その特ノンと電子授受することから、呼吸鎖やプロトン膜性の一つとして増殖能の高さが挙げられる

43)

。中で

勾配形成と共役することができる。多くの水素細菌

も H. thermoluteolus は、倍加時間約 1 時間という、において、ATP 合成に寄与しているのは MBH とさ

独立栄養性生物としては異例の速さで増殖する 10)。

れる。第二のグループは soluble hydrogenase (SH)とまた系統分類上でも広い範囲に分布することも、呼ばれ、細胞質で NAD(P)H などの酸化還元を行う。

水素細菌の特徴として挙げられる。上述の菌のうち様々な生体反応で NAD(P)H などの電子供与体が必H. marinus は γ-Proteobacteria 、 R. eutropha は要とされるが、水素細菌の多くは SH によってこれ

β-Proteobacteria、H. thermoluteolus は Hydrogenophilia

ら電子供与体を供給している。第三のグループはと、Proteobacteria 門の各綱に属する。一方グラム陽

regulatory hydrogenase (RH)と呼ばれる。RH は水素を

19)

センシングし、histidine protein kinase を介して MBH性菌でも、Firmicutes 門に属する Kyrpidia tusciae

や Actionobacteria 門 に 属 す る Mycobacterium

や SH など水素応答性タンパク質の発現を制御する。

llatzerense 9)などが水素細菌として報告されている。

多くの水素細菌はこれら 3 種の hydrogenase のうち

さらに、H. thermophilus は Bacteria 界でもっとも古くに他から分岐した Aquificae 門に属する。このようペリプラズムに広範な系統に分布することからも、後述する

H2

2H +

MBH

hydrogenase の研究から支持されるように、水素酸化

O2

e-

呼吸鎖

H2

ADP ATP
2H +細胞質という代謝様式の生命進化における古さが窺われる。
3. 水素細菌の代謝機構

H2

2H +

SH

水素を唯一のエネルギー源、二酸化炭素を唯一のN AD +

N ADH

H 2O

RH

His protein
kinase遺伝子
発現制御

炭素源として生育するという水素細菌の特性はすで
図 1. 水素細菌の hydrogenase の局在と機能。

に述べたが、ではどのような生物学的機構でこれを31

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

MBH は呼吸鎖の complex I (NADH dehydrogenase)と複数を有し、役割に応じて使い分けている。
上記の分類とは別に、活性中心に配位する金属に類似しており、complex I の進化的起源と推測されてよっても hydrogenase は分類される。大きくは 3 グ

いる 40)。こうしたことから、hydrogenase は現存生命

ループに分けられ、[NiFe]型や[FeFe]型、[Fe]型と呼の共通祖先以前から存在する古い酵素であり、そればれる 30)。このうち[Fe]型はメタン生成アーキアにが多くの現存生物種で保持されている一因と考えら特異的とされ、水素細菌は主に[NiFe]型と[FeFe]型をれる。水素細菌における hydrogenase の研究は、水有する。一次配列によってさらに細かいサブグルー

素細菌にとどまらず生物普遍的なエネルギー代謝のプへと分類され、サブグループ間で異なる機能や役進化を理解する上でも大きな鍵を握っているのかも割を有することが知られている 33)。

しれない。

各種 hydrogenase は水素細菌から精製され、その酵素学的性質や立体構造が明らかにされている 30)。

3-2. 炭酸固定代謝

水素細菌は好気環境で旺盛に生育するが、一般にカルビン回路hydrogenase は酸素に弱い酵素であることが知られ

シアノバクテリアや植物では、カルビン回路で炭ている。水素細菌由来 hydrogenase の構造の解明に酸固定が行われていることがよく知られている。水より、これら酵素がどのようなメカニズムで比較的素 細 菌 で も H. thermoluteolus や H. marinus 、 R.

高い酸素耐性を有しているかについても理解が進み

eutropha といった菌では、炭酸固定経路としてカルつつある 31, 32, 45)。

ビン回路が機能している 6, 13, 26)。これらの菌においては、光合成生物とも共通の代謝経路で二酸化炭素

Hydrogenase は普遍的酵素？

が固定されていると言える。

水素細菌には欠かせない hydrogenase だが、水素カ ル ビ ン 回 路 の 鍵 酵 素 ribulose 1,5-bisphosphate

細菌にしか存在しないわけではない。Hydrogenasecarboxylase/oxygenase (RubisCO)は CO2 を基質とするは水素生成方向の反応も可逆的に触媒するため、水が、細胞内に十分な濃度の溶存 CO2 を常に供給する素生成菌でも用いられている。

のは困難である。そこでシアノバクテリアなどの光水素細菌や水素生成菌以外の身近な菌でも、合成細菌は、細胞内に carboxysome と呼ばれる構造

hydrogenase の存在は知られている。例えば大腸菌の体を形成する 36, 41)。RubisCO を carboxysome 内に局

ゲノム中にも 4 種類の hydrogenase がコードされて在させると共に、内部に CO2 を濃縮する機構を働かおり、嫌気条件下でフマル酸を電子受容体とした際せることで、局所的な CO2 濃度を上げ炭酸固定効率

21)やギ酸を電子供与体とした際の水素生を高めている（図 2）。また、通常 RubisCO は酸素

成 5)などに関与している。水素細菌に比べればごく存在下で oxygenase 反応を触媒し生育に悪影響を与限られた能力ではあるものの、一般的に思われていえる（光呼吸）が、carboxysome 内に RubisCO を隔るより多くの生物が実は水素酸化能（・生成能）を離することでこうした反応も抑制できる。

の水素酸化有していると言える。
「水素酸化能を有していたとしても、普通の生育
環境には水素ガスなどないのだから使いどころがな
いのではないか」と思う人もいるだろう。大気中に

CO 2

HCO 3-HCO 3-

水素分子は、0.5 ppm という微少な濃度でしか存在し

CA

CO 2

2×3PG

RubisCOない。しかし近年、このような低濃度の水素を酸化

RuBPする Streptomyces 属細菌が発見され 7)、同様の代謝

Carboxysome

機構を有する生物が環境中に広く分布することも示

RuBP

されている 11)。こうした一連の研究は、菅野氏の日本語総説 42)に詳しくまとめられている。
このように多くの生物種が hydrogenase を保持していることには、進化的な背景があると考えられる。
生命起源については様々な説が提唱されているが、「原始生命はエネルギー源として水素を用いており、そのため生命初期から hydrogenase が用いられていた」とする説も多い 20)。タンパク質の構造を見ても、

32

図 2. カルボキシソームによる CO2 濃縮機構。
Carbonic anhydrase (CA)は HCO3-と CO2 とを可逆的に変換する。HCO3-はカルボキシソームの殻を通過できるのに対し、CO2 は通過できずカルボキシソ
ー ム 内 に 濃 縮 さ れ る 。 RuBP, D-ribulose
1,5-bisphosphate。3PG, 3-phosphoglycerate。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

(A)

(B)

CO 2 Acetyl- CoA
Citryl- CoAPyruvate
CO 2
CitrateOxaloacetate

CO 2
Oxaloacetate

Isocitrate

MalateOxalosuccinate

Fumarate

MalateFumarate

CO 2

(C)

CO 2 Acetyl- CoAPyruvate

CO 2 Acetyl- CoAPyruvate

CO 2
Oxaloacetate

CitrateIsocitrate

Isocitrate

MalateFumarate

CO 2
2- Oxog lutarate
Succinate
Succinyl- CoA CO 2

2- Oxog lutarate
Succinate
Succinyl- CoA CO 2

CitrateCO 2
2- Oxog lutarate
Succinate
Succinyl- CoA CO 2

図 3. 水素細菌で知られる rTCA 回路。赤矢印は ATP を消費する酵素反応を示す。青矢印は電子供与体としてフェレドキシンを必要とする酵素反応を示す。 (A) H. thermophilus をはじめとする Aquificae 門
Aquificaceae 科 の 水 素 細 菌 が 有 す る rTCA 回 路 。 (B) Aquificae 門 Hydrogenothermaceae 科 とDesulfurobacteriaceae 科の rTCA 回路 8)。2-Oxoglutarate から isocitrate の生成、citrate から acetyl-CoA +oxaloacetate への開裂がそれぞれ一段階の酵素反応で進み、前者は ATP を消費せずに進行する。(C)Thermosulfidibacter takaii（Aquificae 門）と Desulfurella acetivorans（δ-proteobacteria）の rTCA 回路 23, 27)。
Citrate 開裂反応が ATP 消費なしに進行する。
では水素細菌もこのような CO2 濃縮機構を有してい路の祖先型代謝という説も唱えられている 37)。また、るだろうか。カルビン回路を有する水素細菌のうち、rTCA 回路は起源も古く、無機炭素から有機物を合H. thermoluteolus や R. eutropha などは carboxysome

成し原始生命に供給していた反応経路とも推定されを形成しない。一方、H. marinus は carboxysome 遺ている 18)。このような代謝が、水素細菌の中でも古い伝子を有し、実際に低 CO2 条件特異的に carboxysome

進化的起源を有する H. thermophilus（Aquificae 門）でを形成することが確かめられている 39)。さらに本菌機能しているのは、生命進化の観点からも興味深い。

では、局在の異なる複数の RubisCO を有し二酸化炭
3-3. 水素細菌の中央代謝全体像

素濃度に応じて使い分けるという、シアノバクテリ
アにもない機構が見つかっている

34, 35)。

上記の水素酸化代謝と炭酸固定代謝を踏まえると、水素細菌の中央代謝を図 4A のように俯瞰的に見る

非カルビン回路による炭酸固定

ことができる。このような見方をしたとき、エネル
ギー合成と還元力供給、炭素代謝の 3 つが、互いに上述の水素細菌とは異なり、カルビン回路を持たない水素細菌も存在する。

独立した関係にあると言える。

H. thermophilus は 、 カ ル ビ ン 回 路 の 代 わ り に(A)reductive tricarboxylic acid (rTCA; 還元的 TCA)回路

H2

2H +

O2

e-

MBH

と呼ばれる経路で炭酸固定を行う 1, 14, 24, 38)（図 3A）。
られ、有機物を二酸化炭素に分解する TCA 回路とは(B)

逆に、二酸化炭素を取り込んで有機物を合成する。
rTCA 回路は、NADH よりも酸化還元電位が低く

炭酸固定

NADH

る 14, 38)が、少ない ATP 消費で効率的に炭酸固定を行

還元力供給

NAD +

H 2O

CO 2

炭素代謝

エネルギー合成

呼吸鎖

ADP

強力な電子供与体としてフェレドキシンを必要とす

有機物

NADH
O2

e-

水素細菌

ATP

NAD +

SH

還元力供給 2H +エネルギー合成

呼吸鎖

ADP

H2

rTCA 回路は TCA 回路を逆回転させた経路として知

H 2O

大腸菌

ATP

解糖・TCAバイオマス・発酵産物

有機物

炭素代謝

うことができる。例えば 2 分子の CO2 から 1 分子の(C)

acetyl-CoA を合成するのに、カルビン回路では ATP
が 7 分子消費されるのに対し、H. thermophilus のエネルギー合成

rTCA 回路では 3 分子しか消費されない 23)。さらに、

e-

SH

還元力供給
H2

炭酸固定
(WL経路)2H +ADP

rTCA 回路を構成する酵素反応ステップは水素細菌
によって異なり 8)、上記の反応に ATP を 1 分子しか

有機物
CO 2

Acetog en
炭素代謝

ATP

図 4. 各種細菌のエネルギー合成と還元力供給、炭素代謝。水素細菌(A)と大腸菌(B)、acetogen (C)の 中 央 代 謝 系 を 示 す 。 Acetogen は
Wood-Ljungdahl 経路（WL 経路；別名 acetyl-CoA経路）で炭酸固定およびエネルギー獲得を行う。

使わない高エネルギー効率な rTCA 回路も近年発見されている 23, 27)（図 3B, C）。
なお、TCA 回路の変わり種のように思われがちな
rTCA 回路であるが、実は rTCA 回路こそが TCA 回

33

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

こうした関係性は当たり前のことに聞こえるかも

自然界で実際に行っているのが、水素細菌をはじめしれないが、実はそうではない。例えば大腸菌で同とする独立栄養性生物である。

様の見方をすると、解糖系や TCA 回路のところでこ

もう一つのキーワードは、「水素社会」である。2017

れら 3 つの系が入り交じって重複している（図 4B）。

年に政府が水素基本戦略を決定するなど、化石燃料

このように、エネルギー合成・還元力供給・炭素代から水素へのシフトが国を挙げて推進されている。

謝が混線せずに独立しているというのは水素細菌の2014 年に策定されたロードマップでは水素社会実

代謝の特徴の一つであり、後述するような応用上の現までの期間を 3 つのフェーズに分けているが、興利点・可能性をもたらすと我々は考えている。

味深いことにフェーズ 1 として掲げられたのは「水素の大量製造・供給」などではなく、「水素利用の飛3-4. 水素細菌の代謝の柔軟性

躍的拡大」である。これは、「とりあえず水素をたく

水素細菌が一般的な微生物とは異なる環境で生育

さん作ってから使い道を考える」のではなく、「水素できることを述べてきたが、必ずしもそうした環境

を使うことでこういうことが可能になる、という新でしか生きられないというわけではない。

たな価値をまず創出し、それを原動力に水素社会化

例えば多くの水素細菌は、チオ硫酸などの無機化を進める」という戦略に根ざしたものであろう。
これら 2 つのキーワードで表されるニーズに対し、合物も還元力源として利用でき、こうした条件では水素なしで生育できる28)。また、有機物を資化できバイオでどう応えるかは生物工学に携わる研究者にる菌も多く、水素や二酸化炭素なしでも有機物存在課せられた使命と言えよう。上記の水素基本戦略で下では従属栄養的に生育する

25)。さらに、水素細菌

は、「水素と二酸化炭素を利用した革新的化学品合成が生育できるのは好気環境だけに限られない。嫌気方法」が必要な技術開発の一つとして挙げられてい条件では酸素の代わりに硝酸を最終電子受容体としる。もし水素細菌を宿主とし、水素と二酸化炭素をた脱窒などを行い生育できる菌も多い 15)。

原料として物質生産ができれば、求められている技

このような水素細菌は、電子供与体（水素など）術としてぴたりと当てはまるだろう。

と最終電子受容体（酸素など）を環境に応じて使い
4-2. ガス発酵生産の潮流

分け、柔軟に電子伝達系を切り替えることでエネルギーを獲得していると言える。上述の大腸菌のよう

このように水素細菌の利用が期待される一方で、に水素酸化能を持つ菌が非水素細菌にもいるように、「水素や二酸化炭素などガスを原料とした発酵生産

水素細菌らしからぬ環境で生育できる水素細菌も多なんて現実的にあり得るのか」という疑念を持つ人いのだ。

もいるだろう。そこで、実はこうした取り組みは gas
fermentation と呼ばれ、すでに世界中の企業で行われ4. 水素細菌の産業利用ていることを示す事例を簡単に紹介したい。

上で述べたような興味深い代謝特性から、水素細

ガス状の水素や無機炭素（CO2 と CO）を原料とし菌についての研究は学術的見地から長年行われてきた物質生産を行っている企業としては、アメリカのた。しかし近年はそれに加え、社会情勢の変化から、

LanzaTech 社や、ドイツの Evonik 社と Siemens 社 12)

水素細菌の産業利用についても検討されるようにななどが知られている。これらの企業では、Clostridium

った。

属の嫌気性酢酸生成菌（acetogen）を用い、エタノールやブタノールなどの有機溶媒を生産している。

4-1. 社会的背景

こうした物質生産で使用されるのは acetogen だけ

水素細菌を産業利用に結びつける一つ目のキーワにとどまらず、水素細菌も用いられている。国内のードは、「低炭素社会」である。2016 年のパリ協定

企業では、CO2 資源化研究所が水素・二酸化炭素か発効をはじめとした世界的な取り組みとして、二酸

らのイソブタノール生産などに成功している 46)。ま化炭素などの温室効果ガス排出の大幅な削減が求めた東京大学においても、水素細菌に外来遺伝子を導られていることは説明の必要がないだろう。古くは入することで乳酸生産を行えること、また電気化学「脱石油」として可食部バイオマスや非可食部バイ

的に還元力を与えることで生産量が飛躍的に増加す

オマスの利用が推進されてきたが、さらなる持続可ることなどを示している（木村ら, unpublished）。

能性向上のため、二酸化炭素など無機炭素の資源化

ガスを原料とした発酵生産は、化合物生産に限られない。アメリカの CALYSTA 社やデンマークのが今日では不可欠とされている。こうした資源化を

34

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

Unibio 社は、メタンを原料として好気性メタン酸

起こさないという、物質生産ホストとして高いポテ化菌を培養し、得られた菌体を家畜飼料化している。

ンシャルを有している。

こうした事業は、微生物菌体が飼料として高い価値（高タンパク質含量と良好な必須アミノ酸バランス）

5. 終わりにを備えている点に着目したものである。国内でも、本総説では、水素細菌の特性や代謝のあらましを2019 年に水産庁の養殖業成長産業化推進事業で「水概説し、産業利用上どのような可能性を有している素細菌を原料とする純国産養魚飼料開発」が採択さかを紹介した。
「水素細菌」という言葉自体、認知度れるなど、水素細菌の飼料としての活用を目指したはあまり高くなく、ニッチな研究対象の重箱の隅を産学官連携プロジェクトを進めている。

つついているようなイメージを持たれるかもしれな
い。しかしその代謝を詳細に調べていくと、他の独4-3. 物質生産における水素細菌の特長

立栄養性生物や生物全般に共通する生体機構、また物質生産に水素細菌を利用するメリットとしては、生命の進化についてヒントとなるものまでが見えてCO2 と CO、CH4 といった無機炭素を原料とし、カーくる。水素細菌に限った話ではないが、こうした菌

ボンニュートラル・クリーンな物質生産ができるこの代謝研究の魅力ではないかと思っている。

とがまず挙げられる。このメリットはガス発酵生産

水素細菌の産業利用について、本稿では「低酸素社で用いられる他の菌とも共通するが、そうした独立会」など昨今のキーワードに沿って紹介した。しかし

栄養性生物と比較して高い増殖能を示すことは水素

その土台になっているのは、こうした言葉が生まれる

細菌ならではの特長と言える。

前から地道に水素細菌の性状を明らかにしてきた先水素細菌の培養には必ずしも高濃度のガスを必要

人の研究結果である。今後も、「水素細菌って面白いとせず、爆発限界（約 4％）以下の水素濃度、1%以かも」と思う研究者が続き、水素細菌の新たな可能性

下の二酸化炭素濃度でも大きな生育遅延なしに培養を見出す研究が盛り上がっていくことが望まれる。本できることを我々は確認している（宮野ら,総説がそのきっかけになれば幸いである。

unpublished）。化学触媒法など高濃度・高純度のガスを必要とする手法と異なり、安価な低純度ガスや排引用文献

ガスが利用できることも期待される。

1)

エネルギー合成・還元力供給・炭素代謝が独立しAoshima M. 2007. Novel enzyme reactions
relatedているという性質も、水素細菌で物質生産を行う上

to

the

tricarboxylic

phylogenetic/functional

で有利な点だと我々は考えている（図 4）。大腸菌で

acid

cycle:

implications

and

発酵生産を行う場合を考えると、炭素代謝を改変しbiotechnological applications. Appl Microbiol

たときに、酸化還元やエネルギー合成のバランスがBiotechnol 75:249-255.

崩れてしまうことが往々にして起きる。例えば、物2)

質生産や菌の生存に必要な ATP を合成するために

Arai H, Ishii M. 2019. Complete genome
sequence

エネルギー合成系が動くと、重複している炭素代謝

ofachemolithoautotrophicも動いてしまい、必然的に収率の低下や副生成物のmesophilic

obligatelyhydrogen-oxidizing

蓄積が起きてしまう。同様に、還元力が足りないと

bacterium, Hydrogenovibrio marinus MH-110.

きや余剰となるときもそのバランスを取るため炭素

Microbiol Resour Announc 8:e01132-19.

代謝が動き、収率低下や副生成物蓄積につながる。

3)

水素細菌と同様にガス発酵生産に用いられる

Arai H, Kanbe H, Ishii M, Igarashi Y. 2010.
Complete genome sequence of the thermophilic,acetogen においても、こうした代謝系の重複が見ら

obligately chemolithoautotrophic hydrogen-oxidizing

れ、同じ問題が起こりうる。一方、水素細菌ではこれらが独立しており、エネルギーが足りない分はbacterium Hydrogenobacter thermophilus TK-6. J

MBH が、還元力が足りない分は SH が自由に動き、

Bacteriol 192:2651-2652.

水以外の副生成物を生じない。すなわち、目的生成4)物が酸化的な化合物であろうが還元的な化合物であArai H, Shomura Y, Higuchi Y, Ishii M. 2018.
Complete genome sequence of a moderately

ろうが、また合成過程でエネルギーコストがどれだ

thermophilic facultative chemolithoautotrophic

けかかる化合物であろうが、副生成物の蓄積などをhydrogen-oxidizing bacterium, Hydrogenophilus

35

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

thermoluteolus

TH-1.

Microbiol

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carboxylase/oxygenase

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38

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

MINI REVIEW
Umetsu M

Machine-learning-guided molecular evolution of functional protein
機械学習の試行設計によるタンパク質のスマート進化
12

東北大学大学院工学研究科
理化学研究所革新知能統合研究センター
梅津 光央

1Graduate School of Engineering, Tohoku University, 6-6-11 Aoba, Aramaki, Aoba-ku, Sendai 980-8579, Japan
2Center for Advanced Intelligence Project, RIKEN, 1-4-1 Nihombashi, Chuo-ku, Tokyo 103-0027, Japan
Corresponding Author: Mitsuo Umetsu, mitsuo@tohoku.ac.jp
Phone: +81-22-795-7274, Fax: +81-22-795-7276
Received: March 16, 2020; /Revised: March 23, 2020 / Accepted: March y 24, 2020
Abstract

Molecular evolution based on mutagenesis isagain. We show the potential of our approach as awidely used in protein engineering, where critical amino

powerful platform for accelerating the discovery ofacid residues of a target protein are identified based onfunctional

available structural information and mutated for function

fluorescence protein and enzyme.

alteration

andmaturation.

In

iterative

proteins

fluorescent

in

the

case

of

saturation

mutagenesis (ISM), one of the principal molecular

Keyword: 人工知能, 機械学習, 進化分子工学, 変異,

evolution methods, mutagenesis proceeds in a step-wise

タンパク質 (artificial intelligence, machine-learning,manner: however, ISM does not always lead to themolecular evolution, mutagenesis, protein)

optimal sequence, because the effects of mutations onfunction are often synergistic or antagonistic. Here, we

はじめに

propose a novel approach that combines molecularタンパク質の設計とは、「20 種類のアミノ酸をど

evolution with machine learning. In this approach, we

う並べるか」という非常に簡単なものである。このiteratedmachine-learning

アミノ酸配列に従って、アミノ酸が脱水縮合して形

guidance: a Gaussian process is trained with a last small

mutagenesis,

成したポリペプチドは立体構造を形成し、その立体

library to propose the next-round mutagenesis library.

構造に起因した機能が創出される。しかし、「20 種This enables to prepare a small library suited for

類のアミノ酸をどう並べるか」という設計は、未だ

screening

experiments

followingof「言うは易く行うは難し」である。その理由は、アfunctional proteins. A first library of variants was

with

high

enrichment

ミノ酸配列がうみだす「場合の数(配列空間)」は膨

generated, and the sequence and functional data acquired

大であり、さらにポリペプチドのアンフォールド・

from the variants in the library were used for training a

フォールド構造間のエネルギー差は水素結合数個分

machine-learning model to create the second-roundの差しかないことが多く、その小さい差を設計しな

library. The library containing the positive candidate

がら膨大な配列空間を探索しなければならないため

variants predicted by machine-learning are analyzed, andである。

the data are used for training a machine-learning model

39

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

図 1.アミノ酸の配列がつくる配列空間とライブラリー設計

図 2. 配列空間の限定化と進化分子工学
タンパク質工学 15)が提唱されて 30 年以上経た現までと言ってもせいぜい 8 残基をランダムに変異さ在、タンパク質へ変異導入し作製した変異体群のラせれば飽和してしまう規模である。また、タンパク

イブラリーから選択圧をかけて目的機能をもつタン質の機能を評価するスクリーニング技術は、作製でパク質を取得する進化分子工学は、現在のタンパクきるライブラリーに見合った規模を簡便・迅速に行質研究には欠かせない技術である。タンパク質の構うことは難しく、規模の増加とともにそれなりの設造と機能の情報化は、合理的な変異導入によるタン

備と資金を必要することが多い 6)。そのため、目的

パク質の機能改変へ大きな一歩を与え、変異を導入機能をもつタンパク質の取得確率は、誰もが気軽にする残基をある程度合理的に限定することを可能と行えるまでには至っていない。

しつつあり 5,8,18)、ライブラリー作製技術も 1010 程度

そのため、現在の進化分子工学の一つの流れとしまで調製できるようになってきた現在では、進化分て、「目的機能をもつアミノ酸配列を含む確率が高い

子工学の黎明期とは隔世の感がある確率でタンパク

配列空間を設計する」というものがある(図 1)。著者

質の機能創出を可能としている。しかし、1010程度

らは、そのような配列空間の設計に人工知能技術の40

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

ひとつである機械学習を利用して、機能的に陽性なートホットライブラリーとして、また機能評価と機変異体を高密度に含む小規模なタンパク質のライブ

械学習を繰り返していくことで最適解をもつ変異体

ラリー(スマートホットライブラリー)を設計し、汎へ近づいていく(図 3 の Step2)。

用性が高く効率的かつ確実に目的タンパク質へと進化できる進化分子工学の構築を行っている。

機械学習に必要な学習データの作成
あるタンパク質の機能を変えるためには、「どこの機械学習を用いた配列空間の限定残基」を「何のアミノ酸」に変えるか、という設計

一般的に行われているタンパク質の進化分子工学が必要である。このうち、私たちの機械学習を組み出しそうな立体構造をもつ足場タンパク質を選び、合わせた進化分子工学では、「どこの残基」の設計にその足場タンパク質の特定残基位置へ変異を導入しよる配列空間の限定は既存の技術・情報を利用し、たライブラリーから目的機能をもった変異体をスク

その限定された配列空間中で「何のアミノ酸」の最リーングしていく(図 2)。この操作を配列空間で考え適解を迅速・確実に探索していく。

ると、立体構造の観点と変異を導入する残基位置の機械学習などの人工知能の利用には、まず人工知

数で配列空間を限定し、その配列空間の中の変異体能が学習するデータ(学習データ)が必要である。著を探索していることになる。現在までに、タンパク者らの手法では、学習されるデータとして、変異体

質の立体構造やバイオインフォマティクスを用いたのアミノ酸配列とその変異体の機能の紐づけデータ

ライブラリー設計が行われており 4,9)、無作為な設計をウェット実験で作成しているが、学習データは数と比較して、目的変異体の取得確率と効率が向上し値化されている必要がある。今回の場合、アミノ酸つつある。しかし、まだ対象となる配列空間が広くを数値化する必要があるが、すでに特徴量として多最適解に近い変異体が存在する確率が高くない。そ数の提案がなされている 16)。この数値化は、物理化の背景の中、著者らは、さらに人工知能技術の一つ

学特性, 構造, 置換頻度などを主成分分析などで記である機械学習を取り入れることによって、陽性変述子化したものであるが、どの特徴量が良いかはタ

異体の存在確率を高めかつ小規模なライブラリー

ンパク質によって異なってくる。そのため、学習デ(スマートホットライブラリー)を設計し、大規模なータ内で最も機能の高い変異体の探索を複数の特徴

スクリーニングを必要としないタンパク質進化工学

量を使って行い最も収束速度が速い特徴量を選択すプロセスを開発している。この手法では、まず、対るなどして、用いる特徴量を選択する必要がある。

象となる配列空間の中で、できるだけまばらに存在

次に、学習データの「量」と「質」の検討が必要

する変異体群の配列と機能の相関データを取得するである。「量」は全データ数であり、「質」はデータ(図 3 中の Step1)。そして、その相関データを学習デに含まれる陽性データ数である。ここでの陽性とは、ータとして機械学習を行い、配列空間中の全変異体

若干でも明らかに目的機能をもつ変異体のことであに対する機能順位をつけ、その上位変異体群をスマる。データ数も陽性データも多いに越したことはな

図 3. 機械学習を組み入れた進化分子工学

41

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

図 4. 機械学習を用いたライブラリー設計とその検証

図 5. 迅速なライブラリー作製とデータ収集プロセス
いが、アミノ酸配列と紐づけする機能データは、ウ

著者らは、この手法を用いて、緑色蛍光タンパク

ェット実験で取得するので、データ数の多さはデー質(GFP)を一度の機械学習で黄色化させている 10)。

タ作成の労力と時間を増大させる。しかし、陽性デこの研究では、GFP と基準黄色蛍光タンパク質(YFP)

ータ数がゼロのデータでは、もちろん人工知能は学の配列を比較し、蛍光色の決定に関与の可能性があ習することはできない。そのため、学習データを収る 4 残基 1-3,11-13) に限定した配列空間で行っている。

集する時には、AI に対応した時間軸で収集可能な

し か し 、 そ れ で も 配 列 空 間 の 規 模 は 16 万「量」でありながら学習可能な「質」をもつデータ(204=1.6×105)であり、すべての変異体を作製し評価を収集することを考える必要がある。

することは難しい系である。著者らはまず、1 残基へ効率的に飽和変異を導入できる 22c-trick 法 7)を応用して、各残基位置での 1 飽和変異と 4 残基を同時機械学習による機能配列予測と検証
学習データを取得した後は、そのデータに基づいに飽和変異させた 200 程度の変異体群の作製と遺伝た機械学習の結果が示す有望な変異体を作製し検証

子配列解析・機能評価を最短 5 日で行える系を構築を行う工程を進めていくことで目的解をもつアミノ

し、153 種の GFP 変異体に対して、変異情報と共に

酸配列を同定していく(図 4)。

蛍光の黄色度と蛍光強度を収集した(図 5)。その結果、
42

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

図 6. GFP の黄色化実験における学習用ライブラリー(水色)と機械学習提案ライブラリー(橙)の比較。数値は機械学習でのランキング順位を示す。
弱いながらも黄色蛍光を発する変異体が 3 種含まれまとめる学習データを得た(図 6 中の水色)。

あるタンパク質の機能を向上・改変する場合に必

この学習データの陽性率は、基準 YFP を含めても要なことは、「どこの残基」を「何のアミノ酸」にす3%程度であったが、ベイズ最適化を用いた高速な機

るか、という設計である。本論文では、このうち、

17)

械学習ソフトウェアである COMBO を用いて「よ「何のアミノ酸」にするかに対して機械学習の有効

り黄色く・より明るい変異配列」を目標として機械性を説明した。同じアプローチは、進化分子工学で学習し空間配列中の全変異体(16 万)の順位付けを行ノーベル化学賞を受賞した Arnold のグループも報ったところ、モデル YFP が上位 1%(1313 位)に入っ告しており 17)、進化分子工学の新しい潮流が始まりた。この結果から、学習用データ中の陽性変異体のつつある。

存在率が 3％程度であっても、機械学習結果は有効

機械学習と連携させた進化分子工学の研究を通しであることが示唆された。

て感じていることは、学習させるデータの重要性でそこで次に、機械学習で提案された変異体ランキある。機械学習はデータを与えれば何かしらの結果

ング中の高機能な上位変異体群だけからなるスマー

は出してくれる。しかし、データ量が多くても、誤トホットライブラリーを調製し、機能評価を行った。

差が大きく陰性と陽性の区分があいまいなデータでその結果、学習用データに用いた変異体群と比較しは正しい答えは出してくれない。今後、より正確でて、黄色蛍光を示す変異体の存在率が 70%程度まで高効率な学習データの取得方法が求められてくると大幅に増加しており(図 6 中の橙色)、基準 YFP を超考えている。

える黄色蛍光を示す変異体も数多くあった。
機械学習で提案された変異体群の配列を見ると、謝辞

上位 78 位の変異体までは各残基で推測されたアミ

本論文の主要な内容は、東京大学の津田宏治教授

ノ酸の特徴に偏りがあった。そこで既報のデータか

および産業総合技術研究所の亀田倫史・齋藤裕主任

ら検討したところ、各残基において黄色蛍光を示す

研究員と共に行った研究成果を元にしたものです。

ことが報告されているアミノ酸が多くランキングさ

心より御礼申し上げます。

れていた。さらに、上位 2 位の変異体はこれまで報告されている YFP の中で最も強い黄色蛍光を示す

引用文献

Venus であることも分かり、機械学習から提案され

1)

Biteen J.S., Thompson M.A., Tselentis, N.K.,

たスマートホットライブラリーは最適解を含む変異

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43

Super-resolution

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44

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

MINI REVIEW
Kouzuma A

Electrical control of microbial metabolism: Towards development of electrogenetics
電気による微生物の代謝制御: 電気遺伝学の確立に向けて
東京薬科大学生命科学部
高妻 篤史
School of Life Sciences, Tokyo University of Pharmacy and Life Sciences, 1432-1 Horinouchi, Hachioji, Tokyo
192-0392, Japan
Corresponding author: Atsushi Kouzuma, akouzuma@toyaku.ac.jp
Phone/Fax: +81-42-676-6755
Received: March 16, 2020; /Revised: March 18, 2020; March 19, 2020 / Accepted: March 19, 2020
Abstract

Electrochemically active bacteria are capable

Keywords: electrochemically active bacteria, extracellularof electric interactions with electrodes via extracellularelectron transfer, bioelectrochemical system, Shewanella

electron transfer (EET) pathways and serve as essential
キ ー ワ ー ド : 電気化学活性細菌、細胞外電子伝達、

components of bioelectrochemical systems (BES),

微生物電気化学システム、Shewanella

including microbial fuel cells and electro-fermentation
systems. In these bacteria, intracellular redox reactions

1. はじめに

involved in energy metabolism are electrically connected

呼吸や発酵、光合成などのエネルギー代謝の根幹

to electrodes via EET pathways, and their metabolic

は酸化還元反応であり、生物の細胞内では常に物質

activity is affected by electrode potentials. A recent study

間の電子移動が生じている。この電子の流れ（電流）has found that a model EAB, Shewanella oneidensis

を人為的に操ることができれば、生物の代謝を制御

MR-1, senses shifts in electrode potential using an EET

し、有用物質生産などの任意のプロセスを効率よく

pathway and the Arc regulatory system, thereby

進行させることが可能になると思われる。しかし、

regulating the expression of diverse catabolic genes. The

多くの生物において細胞内の代謝系は絶縁体（細胞壁や細胞外膜）によって隔離されており、外界から

finding of this electrode potential-dependent regulatory

電気的なアプローチを加えることは難しい。一方、

system suggests that gene expression in living cells can

近年の研究により、ある種の細菌は細胞外の導電性

be directly controlled by using electrodes, and opens up anewmethodology,

明らかになってきた。このような細菌は電気化学活

article性細菌（electrochemically active bacteria; EAB）とよ

summarizes current knowledge on EET-related catabolic

ばれており 22)、細胞膜（外膜および内膜）に局在す

and regulatory systems in S. oneidensis MR-1 andる導電性シトクロム c から構成される細胞外電子伝describes

達経路（extracellular electron transfer pathway; EET 経

the

the

application

potential“electrogenetics”,

固体（電極）と電子の授受を行う能力を持つことがthat

facilitates

termed

of

of

BES.

This

electrogeneticsin路）41) を介して電極と相互作用することが知られてbiotechnology.

いる（図 1）。

45

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18を添加すれば、人為的に電極と細胞内代謝をリンクさせることが可能になる 48)。これを利用して微生物の代謝を制御しようとする試みは以前から行われており、その歴史は 1970 年代まで遡ることができる 13)。
最初期の研究では、発酵細菌（Brevibacterium flavum）に電子メディエーター（ニュートラルレッド）を介して電極から電子を与え、グルコースから L-グルタ
ミン酸への変換を促進させることなどが行われていた 13)。また、近年では電子メディエーターを介した
電気シグナルによって遺伝子組換え大腸菌の遺伝子
発現と細胞挙動（走化性など）を制御した例が報告されている 45)。しかし、電子メディエーターは一般に高い細胞毒性を示すうえに価格が高いため、実用的なプ
ロセスに利用することは難しいと思われる。
図 1 BES における電極と EAB の相互作用
OM: 外膜、IM: 内膜、OM c-Cyt: 外膜シトクロ
ム c、Q: 酸化型キノン、QH 2: 還元型キノン。

なくとも生来の EET 経路を介して電極と直接的に

微 生 物 電 気 化 学 シ ス テ ム （ bioelectrochemical

は電極電位の変化などの電気刺激に対して鋭敏な応

systems; BES）は EAB を触媒として電気エネルギー答を示す。例えば、代表的な EAB である Geobacterと化学エネルギーを相互変換するシステムであり

34)

一方、EAB であれば電子メディエーターを添加し電子の授受を行うことができるため、これらの細菌、

属細菌や Shewanella 属細菌が電極電位の変化に応じ

微生物燃料電池（EAB によって有機物等の化学エネて遺伝子発現や代謝経路を変化させることが報告さ

ルギーを電気エネルギーに変換する装置）47)や微生

れている 15,21,24,29,51)。さらに、筆者らの研究グループ

物電気合成（微生物に電気エネルギーを供給し、CO2はモデル EAB である Shewanella oneidensis MR-1 株

から有機物を合成させるプロセス） 、電気制御発の電極電位に対する生理学的応答を詳細に解析し、酵（EAB の細胞内酸化還元バランスを電極によって本株が EET 経路と Arc 制御系（内膜キノンの酸化還制御し、発酵生産を促進させるプロセス）33)などへ元比を認識する制御系）を介して電極電位を感知し、の応用が期待されている。これらのシステムでは、遺伝子発現を変化させることを明らかにした 11)。こ電極が EAB に対して電子受容体もしくは電子供与のメカニズムを応用すれば、電極による遺伝子発現体として働き、EAB の代謝（呼吸）と連動して電極制御法を開発できる可能性がある。そこで筆者らはと EAB 間に電流が発生する。つまり、BES では EAB

この手法を電気遺伝学（electrogenetics）と命名し 12)、の細胞内呼吸鎖と電極が EET 経路を介して電気的その基盤確立と微生物電気化学プロセスへの応用をにつながった状態となっており、EAB の細胞内電子目指して研究を行っている。本稿では MR-1 株におキャリア（キノンや NADH など）の酸化還元反応とける EET とエネルギー代謝の分子メカニズムにつ電極との電子授受が共役している（図 1）。そのため、いて概説したのち、電気遺伝学の基礎と応用可能性

電極の電位をポテンショスタット（電位制御装置）について述べる。

33)を用いて制御すれば、それに応じて EAB の細胞内電1. S. oneidensis MR-1 株の EET 経路

子キャリアの酸化還元比が変化し、関連する代謝反応に影響を与えることができる。キノンや NADH な

Shewanella 属細菌はガンマプロテオバクテリア綱

どの電子キャリアの酸化還元比はエネルギー代謝のの通性嫌気性細菌であり、多様な呼吸能を持つこと

進行を左右する重要な因子であり、微生物はその変が知られている 9)。本属細菌が呼吸に利用できる電化を感知して遺伝子発現と代謝経路を制御する機構

子受容体には、酸素、フマル酸、硝酸、亜硝酸、ジを備えている 7)。このような機構と電位制御を組み

メチルスルホキシド、トリメチルアミン-N-オキシド

合わせれば、EAB の遺伝子発現を電極によって制御などの可溶性物質に加えて、酸化鉄（III）や二酸化する手法を構築することも可能になると考えられる。

マンガン（IV）などの不溶性金属化合物が含まれる 6)。

EET 経路を持たない多くの生物は電極と直接相互

S. oneidensis MR-1 株は最もよく研究されている作用することができないが、電子メディエーター（電Shewanella 属細菌であり、二酸化マンガン（IV）を極との電子授受を媒介する可溶性の酸化還元物質）

還元して呼吸を行う異化的金属還元細菌として46

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

図2MR-1 株における EET 経路と EET 関連遺伝子群

1988 年に単離された 28)。以降、本株は異化的金属還を輸送する 43)。Mtr 複合体は MtrA、MtrB、MtrC、

元細菌および EAB のモデル菌株として、EET の分

および OmcA から構成されており、ペリプラズムか子メカニズムや BES における電流生成メカニズム

ら外膜を通して細胞外まで電子を放出する役割を担を解明するための研究に用いられている

19)っている 8,40)。MtrA はペリプラズム側に局在し、FccA。

これまでに多くの遺伝学的・生化学的研究が行わ

または STC から電子を受容する 5)。MtrA に受容された結果、MR-1 株では EET 経路を構成するタンパ

れた電子は外膜表面に局在する MtrC と OmcA へとク質群が同定されている（CymA、FccA、STC、MtrA、伝達され 8,40)、これらの外膜シトクロム c との直接

MtrB、MtrC、および OmcA; 図 2）41)。これらのタ的な接触 49)、もしくは電子メディエーターとして自ンパク質は主に導電性を示すシトクロム c であり、身が分泌するフラビン類（フラビンモノヌクレオチ

内膜から細胞外まで電子を伝達する役割を果たす。

ドおよびリボフラビン）を介して 23,46)、細胞外への本経路において、電子供与体（乳酸、ギ酸、または物質へと電子が伝達される。培地中にフラビン類がNADH）の酸化によって生じた電子は、内膜キノン

含まれる場合には MR-1 株の電流生成量が大幅に増。CymA

加することから 23)、本株の電流生成は主にフラビンは内膜にアンカーされたペリプラズムタンパク質で類を介して行われると考えられている。また、フラあり 26)、内膜キノンの酸化によって生じた電子をペビン類が外膜シトクロム c に結合し、電子伝達を介リプラズムに局在する可溶性シトクロムである

在する補因子として働くことも報告されている 30) 。

FccA または STC に伝達する 38,43)。これらの可溶性

MtrB は β バレル構造を持つ外膜タンパク質（ポリン）

シトクロムはペリプラズム空間を拡散し、外膜に局であり 2)、シトクロム c ではないが、MtrC や MtrA

在するシトクロム c 複合体（Mtr 複合体）まで電子と複合体を形成し、これらのタンパク質を外膜周辺を経由し、まず CymA へと受け渡される

25)

47

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18の適切な位置に配置させる役割を果たす 27)。MR-1

鎖を経由して酸素に伝達されると、プロトンの濃度

株の EET において、電子伝達に伴うエネルギー保存

勾配が生じて ATP が合成される 37)。つまり、MR-1（プロトン濃度勾配の形成）は CymA までの電子伝株は電極を電子受容体としてだけではなく、電子供

達過程で行われると考えられている

42)。そのため、与体としても利用して呼吸を行うことができる。しCymA 以降の電子伝達経路は、細胞内への電子の蓄たがって、本株は微生物燃料電池における発電菌と積を防ぐための電子排出経路として機能しているとして以外にも、微生物電気合成や電気制御発酵においえる。

いて有用物質を生産するためのホスト菌株としても

MR-1 株のゲノムにおいて、主な EET 関連遺伝子

利用できると考えられる。

（omcA、mtrC、mtrA、および mtrB）は同一方向に近接して並んでいる。この遺伝子群は omcA と mtrC

2. S. oneidensis MR-1 株の炭素異化代謝経路の上流にあるプロモーター（PomcA および PmtrC）からBES における電流生成は EAB のエネルギー代謝

転 写 さ れ 、 こ れ ら の プ ロ モ ー タ ー は cyclic AMPに基づくものであるため、その代謝メカニズムの理(cAMP) receptor protein (CRP) によって制御される

解は BES の効率化を図るうえで重要である。MR-1

17)（図 2） 。CRP は cAMP をインデューサーとする

株は炭素源・エネルギー源として乳酸やピルビン酸

転写活性化因子であり、細胞内の cAMP 濃度が上昇などの低分子有機酸を好んで利用し、これらの物質

すると CRP がプロモーター上流の標的配列に結合の酸化と共役して電極や他の電子受容体を還元する。

し、下流の遺伝子の転写を活性化する 3) 。CRP と

一方、糖の代謝能は限られており、N-アセチルグル

cAMP による制御系は大腸菌においてグルコース代

コサミン（NAG）は利用できるが、それ以外のほぼ

謝のカタボライト抑制に関連してよく研究されてお全ての糖（グルコースなど）を資化することができり、大腸菌ではグルコースの存在下で cAMP 合成酵

ない 35)。MR-1 株は有機物を豊富に含む湖底堆積物

素（アデニル酸シクラーゼ）の活性が抑制されるこから単離されており 28)、このような環境には発酵細と が 知 ら れ て い る 36) 。 し か し 、 MR-1 株 を 含 む菌によって生成された低分子有機酸や、キチンの分

Shewanella 属細菌における細胞内 cAMP 濃度の調節

解によって生じた NAG が多量に存在すると考えらメカニズムは未解明である。MR-1 株のゲノムには 3れる。そのため、本株はこれらの基質の資化能を発つのアデニル酸シクラーゼ（CyaA、CyaB、CyaC）

達させてきたと推測される。

がコードされており、これらの中で特に内膜結合型

MR-1 株では、ゲノム配列 10)および生化学的解析のクラス III アデニル酸シクラーゼである CyaC が主に基づいて、図 3 に示した炭素異化代謝経路が提唱

4)

要な cAMP 合成酵素として働く 。また、MR-1 株にされている。本株はグルコースの取り込みとリン酸

おいて cyaC を過剰発現させると、BES における電流化に必要な酵素を持たないが、NAG の代謝経路は保。したがっ持しており 50)、この経路によって NAG はフルクトて、MR-1 株における EET 関連遺伝子の発現と電流

ース-6-リン酸まで代謝されたのち、解糖系（エント

生成は CyaC の働きに依存しており、本株の電気化

ナードウドロフ経路）によってピルビン酸へと変換

学活性の調節にはその活性制御が重要であるといえされる。MR-1 株は NAG 以外にも乳酸（D-乳酸およる。CyaC は内膜に局在することから、何らかの環境

び L-乳酸）を好んで利用し、D-乳酸と L-乳酸はそれシグナルに応じてその活性が制御されている可能性

ぞれの光学異性体に特異的な乳酸脱水素酵素が考えられる。しかし、CyaC には既知のシグナル認（D-lactate dehydrogenase; Dld と L-lactate dehydrogenase;

識ドメインが存在せず、現時点でその制御メカニズ

LldEFG）によってピルビン酸まで酸化される 32)。こムを予想することは難しい。

れらの酵素は内膜キノンの還元と共役して乳酸を酸が顕著に増加することが報告されている

18)

化すると考えられている 32)。

MR-1 株は異化的金属還元細菌であり、自然環境
中では乳酸などの基質の酸化によって生じた電子を

上記の経路によって生じたピルビン酸は、ピルビン

二酸化マンガン（IV）などの電子受容体に伝達する

酸脱水素酵素（pyruvate dehydrogenase; PDH）もしくはことで呼吸を行い、増殖に必要なエネルギーを得てピルビン酸ギ酸リアーゼ（pyruvate-formate lyase; PFL）

。しかし、本株の EET 経路における電子移動

によって代謝される 31)。PDH は主に好気条件で働き、は双方向的であり、BES において電極電位を MtrC

ピルビン酸を NAD+依存的に酸化して、アセチル CoAなどのシトクロム c の酸化還元電位よりも低く設定と CO2、NADH を生じる。NADH は NADH 脱水素酵

した場合には、電極から細胞内への電子の流入が生素（NDH）によって酸化され、これにより内膜キノン

いる

じる

28)

36)

。この際、内膜キノンに流入した電子が呼吸が還元される。一方、PFL は主に嫌気条件で働き、ピ48

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

依存経路）、嫌気条件ではギ酸を経由する経路（ギ酸依存経路）を利用しているといえる（図 3）。
3. S. oneidensis MR-1 株の電極電位認識・応答機構
BES では、電極電位を制御することによって EABと電極間に生じる電流の量と方向を調節し、これにより EAB の触媒活性を変化させることができる。
一方、EAB は電極への電子伝達（EET）によって呼吸を行っているため、電極電位の変化は EAB が増殖に利用できるエネルギー量に影響を与えるはずである。しかし、電極電位に応じて EAB の遺伝子発現や代謝系の一部が変化することは報告されていたものの 15,21,24,29,51)、
EAB のエネルギー保存経路が電位によって変化するかどうかは不明であった。そこで筆者らの研究グルー
プは、電極電位が MR-1 株のエネルギー代謝に与える影響を詳細に解析した 11)。その結果、本株は低電位（0V vs. 標準水素電極）の電極存在下ではギ酸依存経路
によってピルビン酸を代謝するが、高電位（+0.5 V）の電極存在下では NADH 依存経路を活性化し、一部のピルビン酸を PDH と NADH 脱水素酵素（NDH）を用いて代謝するようになることが明らかになった（図 4）。
NADH 依存経路によってピルビン酸が代謝されると、

図 3 MR-1 株における主要炭素異化代謝経路
ED 経路: エントナードウドロフ経路、NAG-6P: Nアセチルグルコサミン-6-リン酸、GlcN-6P: グル
コサミン-6-リン酸、KDG-6P: 2-ケト-3-デオキシ-6ホスホグルコン酸、GA-3P: グリセルアルデヒド-3-リン酸、LDH: 乳酸脱水素酵素、PTA: ホスホ
トランスアセチラーゼ、AK: 酢酸キナーゼ。

NDH（Nuo）のプロトンポンプ活性が働き、ギ酸依存経路よりも多くのプロトン駆動力が生まれる（図 4）。
したがって、MR-1 株は高電位条件では低電位条件よりも多くのエネルギーを保存し、効率よく増殖できる
ようになると考えられる。
上記の結果は MR-1 株が細胞外に存在する電極の電位変化に応じて細胞内の代謝経路を変化させることルビン酸をアセチル-CoA とギ酸に分解する。
ギ酸はギを示しており、どのようなメカニズムによって電極電

酸脱水素酵素（formate dehydrogenase; FDH）によって位が感知されるのかに興味が持たれた。筆者らは内膜キノン依存的に CO2 に酸化される

16)MR-1 株の EET が内膜キノンの酸化還元を伴うことか。

アセチル CoA の代謝経路も環境条件によって異ら、本株はキノンの酸化還元状態の変化を感知するこなる。MR-1 株は好気条件では TCA サイクルを活性とで電極電位に応答しているのではないかと予想し44)。

た。大腸菌では、内膜キノンの酸化還元状態を感知す

この過程で放出された電子は主に NADH を介してる機構として、Arc 二成分制御系が知られている 1)。

呼吸鎖に流入し、酸素還元に使われる。一方、嫌気MR-1 株にもそのホモログ（ArcS、HptA、ArcA から構化し、アセチル CoA を CO2 まで完全に酸化する、アセ

成される三成分制御系）が存在するため 20)、これらのチル CoA は主に酢酸合成に使われる 44)。この過程でタンパク質が電位応答に関与している可能性が考えは、基質レベルのリン酸化によって ATP が合成されられた。そこでセンサーキナーゼである ArcS の欠る。嫌気条件（フマル酸呼吸条件）では、MR-1 株

損株（∆arcS 株）を作製し、電極電位に応じたトラはほぼこの酢酸合成によって生じる ATP に依存しンスクリプトーム変化を野生株と比較した 11)。そのて増殖し、呼吸鎖を介した酸化的リン酸化は増殖に結果、nuo 遺伝子を含む野生株で電位応答を示した

条件では TCA サイクルの活性が抑制され

39)

14)

。以上

遺伝子の多くが∆arcS では電位応答性を示さなかっの代謝経路をまとめると、MR-1 株は環境条件に応じた。また、レスポンスレギュレーターである ArcAて内膜キノンへの電子キャリアを使い分けており、
基と nuo 遺伝子の上流領域との相互作用を解析した結本的に好気条件では NADH を経由する経路（NADH

果、ArcA が nuo 遺伝子の上流に結合することが示さ

ほとんど寄与しないことが報告されている

49

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

図 4 MR-1 株におけるエネルギー保存経路の電位依存性（Hirose et al., 2018 より改変）（A）低電位時に利用されるギ酸依存経路。（B）高電位時に活性化する NADH 依存経路。MQ: 酸化型
メナキノン、MQH2: 還元型メナキノン、UQ: 酸化型ユビキノン、UQH2: 還元型ユビキノン。
れた。これらの結果から、MR-1 株において Arc 制電位によってその遺伝子の発現を制御することがで御系が主要な電極電位感知システムとして働き、nuo

きるようになる。

を含む遺伝子の発現を電位に応じて制御しているこ

この手法を電気制御発酵に適用することにより、物とが明らかになった（図 4）。以上の結果は、MR-1

質生産効率を大きく高めることができると考えられる。

株が細胞外の電位を認識する能力を持ち、これによ

電気制御発酵（electro-fermentation）とは発酵代謝におり酸化還元環境の変化に柔軟に適応していることをける酸化還元バランスを電極によって調節し、基質との示している。電位認識は EET 経路と電気的につなが電子バランスが釣り合わない発酵産物の生成を促すとっ た Arc 制 御 系 に よ っ て 行 わ れ る こ と か ら 、いうものであり、これにより通常の発酵法では難しい高Shewanella の EET 経路は単に電子排出経路としてだ

還元物質の生産を効率化することができると期待されけでなく，外部環境を認識するためのセンサーとしている 33)。この際、目的物質の生産に関与する酸化還ての役割を果たしているともいえる。

元酵素の遺伝子発現を電気遺伝学によって制御すれば、電気制御によって遺伝子発現と物質変換反応を協調的

4. 電気遺伝学の原理と応用に制御することが可能となる（図 5）。筆者らはこのよ

上述の MR-1 株の電極電位認識機構を応用すれば、電極を用いて EAB の遺伝子発現と代謝活性を制御

うなシステムの実現に向け、MR-1 株をホスト菌株とした電気制御発酵プロセスの構築を進めている。

することが可能になると考えられる。また、この制御システムは Arc 制御系と EET 経路を導入しさえす
れば、EAB 以外の生物にも適用できると思われる。
筆者らはこの電極による遺伝子発現・代謝制御法を“電気遺伝学（electrogenetics）”と命名し 12)、その基盤確立に向けた研究を行っている。電気遺伝学では、電極の電位変化が遺伝子の発現を制御するシグナルとなる。いわば、光遺伝学（optogenetics）における光シグナルのかわりに、電気シグナルを用いて遺伝子発現を制御しようとするものである。この手法では、電極電位認識機構（EET 経路と Arc 制御系）を持つ、あるいはそれを人為的に導入した細胞を電位制御装置（ポテンショスタット）に接続した電極とともに培養する。この時、制御対象の遺伝子を Arc

図 5 電気遺伝学を利用した電気制御発酵プロセスの概念図（Hirose et al., 2019 より改変）。

依存性プロモーターの下流に配置しておけば、電極

50Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

5. おわりに

across the periplasm of Shewanella oneidensis

BES は持続可能な電力生産や物質生産に応用でき

MR-1. Biochem. J. 108:101–108.

る可能性があり、新たなバイオテクノロジーとして

6)

注目を集めている。BES におけるエネルギー変換はFredrickson, J. K., Romine, M. F., Beliaev, A. S.,
Auchtung, J. M., Driscoll, M. E., Gardner, T. S.,

EAB の代謝に基づくものであるため、その効率化に

et al. 2008. Towards environmental systems

は EAB の代謝活性を適切に制御し、できるだけ高い

biology of Shewanella. Nat. Rev. Microbiol.

状態で保つことが重要となる。BES と電気遺伝学を

6:592–603.

組み合わせることで、電極を EAB に対する電子受容7)体・電子供与体としてだけでなく、遺伝子発現の制Green, J. and Paget, M. S. 2004. Bacterial redox
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御装置としても利用することができる。そのため、
8)

電気遺伝学は EAB の代謝活性を制御しながら効率

Hartshorne, R. S., Reardon, C. L., Ross, D.,

的に微生物電気化学プロセスを進行させるための有Nuester, J., Clarke, T. A., and Gates, A. J., et al.

用なツールとなるだろう。電気遺伝学に関する研究

2009. Characterization of an electron conduit

は端緒についたばかりだが、本手法には EAB の利用

betweenを大きく促進する可能性があり、今後の発展が期待

bacteria

andtheextracellularenvironment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.

される。

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9)

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

極限環境生物学会
研究奨励賞受賞研究
Hidese R.

Ancestral sulfur transfer pathway: an implication for the early evolution of life.
硫黄転移系から紐解く初期生命の進化
神戸大学大学院 科学技術イノベーション研究科
秀瀬涼太

Graduate School of Science, Innovation and Technology, Kobe University, Rokkodai 1-1, Nada, Kobe 657-8501, Japan.
Corresponding Author: Ryota Hidese, hidese@people.kobe-u.ac.jp
Phone: +81-78-803-6356
1. はじめに

ボキシレートが生成する（図 1）。これを介して tRNA

硫黄は必須元素である。L-システインや L-メチ

チオヌクレオシド（ユーカリア）、チアミン（バクテ

オニンの含硫アミノ酸、鉄硫黄クラスター、S-アデリア）、モリブドプテリン（ユーカリア、バクテリア、

ノシルメチオニン、モリブドプテリン、ビオチン、

アーキア）が生合成される 5,6)。

コエンザイム A、チアミン、リポ酸など含硫補因子、CD はバクテリアやユーカリアの含硫補因子生合

2-チオウリジンや 4-チオウリジンなど tRNA のチオ

成の硫黄転移に必須である。アーキアにも CD オル

ヌクレオシドはあらゆる生物の生命維持に必須であ

ソログは見られるが、その分布は限定的である 4,8)。

る 12)。微生物は生体分子の構成成分として以外にも、好塩性アーキア（Haloferax volcanii など）や常温性

2-酸化硫黄［硫酸イオン（SO4 ）、亜硫酸イオン（SO ）、

メタン生成アーキア（Methanosarcina acetivorans な

チオ硫酸（S2O32-）］や還元硫黄［元素硫黄（S0）、硫ど）の多くは CD オルソログをもつ一方で、好熱性

-

3-

-

化物イオン（S2 ）、多硫化物イオン（SnS ）など］を

アーキアでは CD オルソログをもたない種が多く存

エネルギー産生のために電子受容体または電子供与

在 す る （ 好 熱 性 メ タ ン 生 成 ア ー キ ア6)。多くの微生物では、硫黄同化に

Methanocaldococcus jannashii、好熱好酸性アーキア

硫酸イオンを用いる。例えば大腸菌は、硫酸イオン

Thermoplasma volcanium 、 好 熱 好 酸 性 ア ー キ アを細胞内に取り込み、これを硫化物イオンに還元す

Sulfolobus acidocaldarius など）。好熱性アーキアは、る。次に O-ホスホセリンスルフヒドリラーゼが、硫

主に熱水噴出孔や硫気孔など硫黄が豊富な環境から化物イオンと O-アセチルセリンを基質として L-シ

単離されているため、生息環境中の還元硫黄と CD

ステインを生成する反応を触媒する 7,15)。システイ

オルソログの分布との関連性が思われた。超好熱性ンデスルフラーゼ（CD）は、L-システインから硫黄

アーキア Thermococcus kodakarensis は元素硫黄（S0,の脱離反応を触媒する。CD の活性中心システイン

化学式：S8）を還元して硫化水素を発生しながら呼残基上に生成した CD-S-SH（パースルフィド型）の吸するが、S0 が存在しない環境では、デンプンやピ末端硫黄が、ビオチン、リポ酸、tRNA のチオウリ

ルビン酸を代謝し、プロトンを電子受容体として水ジン、チアミン、モリブドプテリンの硫黄源とな素発生型呼吸を行う 1)。本菌は、増殖速度が速く、る 5,12)。他方、CD-S-SH より末端硫黄がユビキチン

遺伝子組み換えが容易なため、好熱性アーキアのモ様タンパクの C 末端グリシン残基（グリシン-グリシ

デル生物として原始的な代謝系や高温適応機構の知ンモチーフ）のカルボキシ末端に転移し、チオカル

見が集積している 13)。ここでは、筆者らによる T.

体として用いる55

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

図１. システインデスルフラーゼを介した含硫化合物生合成における硫黄転移系. (A) 大腸菌の硫黄転移
系. 大腸菌由来システインデスルフラーゼ IscS が L-システインの硫黄を脱離し, 活性中心システインに
IscS-S-SH を形成する. IscS-S-SH の末端硫黄が鉄硫黄クラスター生合成に使われる. IscS-S-SH の末端硫黄がそれぞれユビキチン様タンパク質 MoaD や ThiS を介してモリブドプテリンやチアミンへ転移する. (B)
ヒトの硫黄転移系. Nfs1, ヒト由来システインデスルフラーゼ; MOCS2A と Urm1, ユビキチン様タンパク質.
kodakarensis の硫黄転移関連酵素の解析から見えて

s-1M-1）を示した 4)。遺伝子機能の解析では、遺伝子

きた、生育環境中の S0 の有無に応じた本菌の硫黄転破壊が極めて重要な手法となる。T. kodakarensis の移系の多様性について概説する。

特異的遺伝子破壊法は、Sato らにより開発されている 14) 。これはオロチジン-5’-リン酸脱炭酸酵素

キーワード： 硫黄転移系、好熱性アーキア、含硫補（pyrF）欠損株を宿主に、pyrF を選択マーカーとし因子、元素硫黄て相同組み換えを利用した遺伝子破壊系である。本法により、Tk-CD 破壊株を作出した。生育特性解析

2．システインデスルフラーゼ（CD）の生理的意義の結果、Tk-CD 破壊株は、元素硫黄含有培地（+S0

T. kodakarensis の シ ス テ イ ン デ ス ル フ ラ ー ゼ培地）では野生株と同等に生育した。一方、元素硫（TK1990, Tk-CD）を大腸菌で組み換え体として発黄非含有ピルビン酸含有培地（-S0+ピルビン酸培地）

現・精製した。Tk-CD は、枯草菌由来 CD（SufS）

では生育不能であったが、本培地への S0 添加量の増と 比 べ て L- シ ス テ イ ン に 対 し て 高 い 触 媒 効 率

加に応じて Tk-CD 破壊株は野生株と同等の生育まで

4

-1

-1

（Tk-CD: 8.1 × 10 s M ; 枯草菌 SufS: 5.2 × 10

4

回復した。
56

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

次に、Tk-CD の鉄硫黄クラスター生合成への関与

3．硫黄キャリアーとしてのユビキチン様タンパク質を調べた。-S0+ピルビン酸培地に少量の S0 を加えた

T. kodakarensis の CD 依存及び S0 依存鉄硫黄クラ培地で生育した野生株と Tk-CD 破壊株の鉄硫黄クラスター生合成能の存在は、ユビキチン様タンパク質

スター含有酵素（ピルビン酸：フェレドキシン酸化の硫黄転移への関与について興味が持たれた。つま還元酵素、アルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵

り、「環境中に S0 が存在する場合でも、ユビキチン+

素、NADP :フェレドキシン酸化還元酵素）活性を嫌様タンパク質を介してモリブドプテリンや tRNA チ

気チャンバー内（O2 < 1.0 ppm）で測定した。この結オヌクレオシドなどの含硫化合物が生合成されるの果、Tk-CD 破壊株で各酵素活性が顕著に減少していか」である。大腸菌ではユビキチン様タンパク質は、た。以上の結果は、T. kodakarensis には、環境中のチアミン、モリブドプテリンへの硫黄キャリアーとS0 依存及び CD 依存鉄硫黄クラスター生合成系が存しての役割をもつ。また、酵母やヒトでは、ユビキ

在する事を示している。CD 依存鉄硫黄クラスター

チン様タンパク質はモリブドプテリンの他、tRNA

生合成能を獲得できた結果、S0 が存在しない環境でチオヌクレオチドへの硫黄転移に関わる。ユビキチ

本菌の生育が可能となったと考えられた。

ン様タンパク質はアーキアにも高度に保存されており、この中には CD をもたないアーキアも多く含ま

表 1. アーキアにおけるシステインデスルフラーゼとユビキチン様タンパク質の分布

棒線は, 各オルソログ遺伝子が当該生物に保存されていないことを示す. 略語:CD, システインデスル
フラーゼ; ULP, ユビキチン様タンパク質.
57

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18れる（表１）。好塩性アーキア Haloferax volcanii におtRNA の硫黄化修飾への関与 tRNA の化学修飾

いて、ユビキチン様タンパク質 SAMP1 はモリブド（メチル化、アセチル化、硫黄化、アミノ酸付加、プテリン生合成に関わること、SAMP2 は tRNA チオ

糖付加など）は、ほぼすべての生物で見られる。

11)。ユビキチン

例えば、グルタミン酸、グルタミン、リジンの tRNA様タンパク質は硫黄転移の他に、タンパク質の翻訳の 34 位は 5-メチル-2-チオウリジンである 2)。この

後修飾としての役割を担う。T. kodakarensis にもユ修飾により tRNA のアンチコドンと mRNA のコド

ビキチン様タンパク質オルソログが 3 種（TK1065、

ンの対合を強め、正確なコドンの解読が可能とな

TK1093、TK2118）存在する。系統解析によると、る。また、一部の好熱菌（好熱性バクテリア Thermus

TK2118 と TK1093 は そ れ ぞ れ H. volcanii 由 来thermophilus や 超 好 熱 性 ア ー キ ア Pyrococcus

SAMP1 と SAMP2 と相同性が高いことがわかった。

furiosus など）では、tRNA の T-ループの 54 位もモリブドプテリン生合成や tRNA の硫黄化修飾にお5-メチル-2-チオウリジン誘導体に修飾される。54いて、これらユビキチン様タンパク質の機能を検証

位の硫黄修飾により、T-ループと D-ループから構した。

成 さ れ る tRNA の 肩 領 域 の 構 造 が 安 定 化 さ れ 、化修飾に関わることがわかっている

モリブドプテリン生合成への関与 T. kodakarensistRNA の 熱 安 定 性 が 向 上 す る

17)。 実 際 、 T.

の糖代謝にはモリブドプテリン含有酵素であるグリ

thermophilus でこの硫黄修飾を不能にさせると、高セロアルデヒド-3-リン酸：フェレドキシン酸化還元

温で生育致死になる 16)。

酵素（GAPOR）が関与する。本酵素遺伝子破壊株は、+S0 培地で∆TK1065 株、∆TK1093 株、∆TK2118 株

デンプンなどを炭素源とした培養条件では生育致死のそれぞれを 85°C、93°C（生育上限温度）で培養し10)。T. kodakarensis に存在する 3 種のユビキ

た。85°C では、∆TK1093 株で野生株と比べてわずか

チン様タンパク質遺伝子のそれぞれを破壊した株をな生育遅延が見られ、93°C では、∆TK1093 株は生育作出した（∆TK1065、∆TK1093、∆TK2118 株）。S0が遅延し、最高菌体濁度が減少した。さらに-S0+ピル

非含有デンプン含有培地でのそれぞれを 85°C（至適ビン酸培地では、85°C で∆TK1093 株と∆TK2118 株で生育温度）で培養したところ、∆TK1065 株や∆TK1093

生育が遅延し、93°C で両株とも生育致死になった。

株は生育した一方で、∆TK2118 株は生育しなかった。

次に、各遺伝子破壊株における tRNA の硫黄化修飾率

次に、ユビキチン様タンパク質の破壊がモリブドを調べるため、+S0 培地および-S0+ピルビン酸培地でプテリン含有酵素活性に及ぼす影響を調べるために、各遺伝子破壊株（∆TK1065 株、∆TK1093 株、∆TK2118-S0+ピルビン酸培地で生育した野生株および各遺伝株、3 重遺伝子破壊株）の tRNA ヌクレオシドを液体

子破壊株より細胞抽出液を調製し、モリブドプテリ

クロマトグラフタンデム型質量分析計で解析した。
こン含有酵素（GAPOR; アルデヒド：フェレドキシンの結果、-S0+ピルビン酸培地で生育した∆TK1093 株お

酸化還元酵素, AOR; ホルムアルデヒド：フェレドキ

よび 3 重遺伝子破壊株において tRNA ヌクレオシド

シン酸化還元酵素, FOR）活性を測定した。この結果、（tRNA の 54 位に見られる 5-メチル-2-チオウリジン∆TK1065 株、∆TK1093 株、∆TK2118 株ともに AOR

修飾など）のチオ化修飾の顕著な減少が見られた。しや FOR 活性が野生株と比べて低下した（GAPOR はかしながら、チオ化修飾は完全には消失しておらず、

検出感度以下）。

また+S0 培地においてはこの減少が見られなかった。

となるS0 含有培地で生育した野生株およびユビキチン様以上の結果から、TK1093 が tRNA チオ化修飾関連タタ ン パ ク 質 を も た な い 株 （ ∆TK1065, ∆TK1093,

ンパク質であること、tRNA のチオ化修飾には TK1093∆TK2118: 3 重遺伝子破壊株）の 3 種のモリブドプテが関与する硫黄転移経路とこれを必要としない経路

リン含有酵素活性（GAPOR, AOR, FOR）を測定したが存在することが示唆され、これらの経路は培地中のところ、いずれの酵素活性も野生株と 3 重遺伝子破S0 の存在に応じて使い分けがなされている可能性が壊株で同等であった。これは、S0 が存在しない環境考えられた（図 2）。

では、ユビキチン様タンパク質がモリブドプテリン
4. おわりに

生合成に関わるが、S0 が存在する環境では、それらが必須ではないことを示している（図 2）。以上の結好熱菌は、進化系統樹で根の近傍に位置するため、

果より、いずれのユビキチン様タンパク質でもモリ

原始生命体の形質を強く保存していると考えられる。

ブドプテリン生合成に関わることが示唆され、原始生命体は、鉄硫黄クラスター、S-アデノシルメ

TK2118 は特に GAPOR の活性化に関わると予想さチオニン、補酵素 A、モリブドプテリン、遷移金属、れた。

コリンやセレン原子を豊富にもち、主にラジカル反58

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

図２. T. kodakarensis の含硫化合物生合成の硫黄転移系. 元素硫黄（S0）非存在下では, システインデスル
フラーゼ（CD）は鉄硫黄クラスター生合成に必須である. ユビキチン様タンパク質 TK1093 は tRNA のチオ化修飾, 全てのユビキチン様タンパク質はモリブドプテリン生合成の硫黄転移を担う. S0 存在下では,CD やユビキチン様タンパク質に非依存の系が主要と思われる.
応により生命機能を維持していたものと考えられて倍程度低い。超好熱性メタン生成アーキアいる 18)。初期地球の嫌気環境では、二酸化硫黄、硫Methanocaldococcus jannaschii のチアミン生合成の化水素と共に S0 は豊富な硫黄種であった

19)

。これら

硫黄転移では、チアゾール合成酵素が硫化物イオンの存在比は、火山ガス中の水素の分圧により決定さを基質にしてチアミン前駆体（ニコチンアミドアデれる。メタン生成アーキアは、培養液中に 5 mM 程

ニンジヌクレオチドとグリシンの反応中間体）に硫度の硫化物イオンを生育に要求し、これを硫黄ドナ

黄を挿入する 3)。チアゾール合成酵素と相同なタンーとした特殊な硫黄転移系をもつ生物として知られパク質は、多くの好熱性アーキアに見出されている。

る。例えば、常温性メタン生成アーキア

このように原始生命体では、還元硫黄を基質にする

Methanococcus maripaludis の鉄硫黄クラスターの硫硫黄転移酵素が含硫化合物の生合成に寄与していた

黄源は L-システインではなく、硫化物イオンである 8)。

ことが推察される。

また tRNA の 8 位の 4-チオウリジン修飾では、硫黄

T. kodakarensis の CD やユビキチン様タンパク質9)

転移酵素 MMP1354 が硫化物イオンを利用する 。

の解析から、鉄硫黄クラスター生合成の硫黄転移の

実際、 M. maripaludis の細胞内の L-システインのプ

みならず、モリブドプテリン生合成の硫黄転移やールサイズは 20 µM 程度であり、これは一般にバクtRNA の硫黄化修飾において、S0 に依存した系をもテリアで見られる L-システインの濃度よりも 5-10

つことがわかってきた。個々のユビキチン様タンパ

59

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

ク質の機能重複や分担も興味深い。T. kodakarenisis

Bacterial cysteine desulfurases: versatile key

は CD 依存的鉄硫黄クラスター生合成の場合と同じ

players

く、ユビキチン様タンパク質の獲得（もしくは既存

sulfur-containing biofactors. Appl. Microbiol.

inbiosynthetic

pathwaysofBiotechnol. 91:47-61.

のタンパク質の機能の多様化）とそれに伴うモリブ
ドプテリン生合成系や tRNA の硫黄化修飾系の獲得

6)

Liu, Y., Beer, L.L., and Whitman, W.B. 2012.

の結果、S0 が存在しない環境で代謝の多様性を確保

Sulfur metabolism in archaea reveals novel

したと予想される。

processes. Environ. Microbiol. 14:2632-2644.
7)

5. 謝辞

Liu, Y., Beer, L.L., and Whitman, W.B. 2012.
Methanogens: a window into ancient sulfur
metabolism. Trends Microbiol. 20:251-258.

本研究を遂行するにあたり、終始ご指導、ご鞭撻8)を賜りました藤原伸介先生（関西学院大学理工学部）

Liu, Y., Sieprawska-Lupa, M., Whitman, W.B.,に衷心より御礼を申し上げます。様々なご助言・ごand White, R.H. 2010. Cysteine is not the sulfur

助力を頂いた関西学院大学理工学部 微生物工学研

source for iron-sulfur cluster and methionine

究室の皆様にも感謝申し上げます。tRNA ヌクレオ

biosynthesis in the methanogenic archaeon

シドの硫黄修飾の解析では、鴫直樹先生（産業総合

Methanococcus maripaludis. J. Biol. Chem.
285:31923-31929.

技術研究所）、鈴木勉先生（東京大学工学部）、大平
9)

高之先生（東京大学工学部）のご指導を賜りました。

Liu, Y., Zhu, X., Nakamura, A., Orlando, R.,

京都大学化学研究所での指導教員である江崎信芳先Söll, D., Whitman, W.B. 2012. Biosynthesis of

生（公立鳥取環境大学）、栗原達夫先生（京都大学化4-Thiouridine in tRNA in the Methanogenic学研究所）、三原久明先生（立命館大学生命科学部）

Archaeon Methanococcus maripaludis. J. Biol.

に深く御礼申し上げます。本研究は、JSPS 科研費

Chem. 287:36683-36692.

（JP17H05027）及び長瀬科学技術振興財団平成 30

10)Matsubara, K., Yokooji, Y., Atomi, H., andImanaka, T. 2011. Biochemical and genetic

年度助成金の支援を受けて実施されました。

characterization of the three metabolic routes in
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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

極限環境生物学会
研究奨励賞受賞研究
Kawamoto J.

Elucidation of the cold-adaptation mechanism of an Antarctic bacterium
南極由来の低温適応細菌の環境適応機構の解明
京都大学 化学研究所 分子微生物科学研究領域
川本 純
Institute for Chemical Research, Kyoto University, Gokasyo, Uji, Kyoto 611-0011, Japan
Corresponding Author: Jun Kawamoto
e-mail: jun_k@mbc.kuicr.kyoto-u.ac.jp
Phone: +81-774-38-4711, Fax: +81-774-38-3248
1. はじめに

2. Shewanella livingstonensis Ac10 の低温誘導性タン

地球は、極地や深海、氷河や高山といった低温

パク質の探索の極限環境が地表の約 80% を覆う低温の惑星と

Shewanella livingstonensis Ac10 は南極海水より採いえる。このような低温環境には、低温を好む生取されたグラム陰性細菌であり、4˚C から 25˚C で物種が存在し、特に低温菌、好冷菌と呼ばれる低良好に生育し、18˚C を至適生育温度とする低温菌で温適応性の細菌群が低温環境における物質循環にある。本菌に関しては 2002 年より全ゲノム情報が寄与している。低温菌、好冷菌が生産する酵素は利用可能であったことから、ゲノム情報に基づき、低温での触媒活性を有する優れた触媒であり、低本菌の低温環境適応を支える生体分子の探索・同定

温活性酵素と呼ばれている。これまでに、食品産が可能であった。そこで、筆者は 4˚C もしくは 18 ˚C

業や繊維産業、浄水に利用可能な様々な低温活性で培養した S. livingstonensis Ac10 から低温で生産量酵素が単離され、多様な産業分野で活用されていが増加する低温誘導性の可溶性タンパク質および疎る。これらの低温活性酵素について、低温での活

水性タンパク質の探索および同定に取り組んだ 6)。さ性発現に資する分子機構の詳細が明らかにされてらに、呼吸やシグナル伝達、エネルギー生産といっおり、例えば、多くの低温活性酵素において、構た重要な生理機能を担う細胞内膜局在性のタンパク

造安定性と低温での活性保持がトレードオフの関質群に着目し、密度勾配遠心法により分画した本菌係にあることがわかっている。つまり、低温活性の細胞内膜についてプロテオーム解析を行うことで、酵素はタンパク質の構造を不安定化することで、低温誘導性の内膜タンパク質を同定した 10)。

低温での触媒能を獲得している。このように、低これら低温誘導タンパク質群より推定される本菌

温菌・好冷菌に関する従来の研究の多くは、低温の低温適応機構の概要を Fig. 1 に示す。低温環境に活性酵素に関するものであった。一方で、低温菌・

おいて、S. livingstonensis Ac10 は遺伝子の転写、翻好冷菌が如何にして低温環境に適応しているかに訳に関わるタンパク質群が同定された。こ れ ら は 、ついての理解は限定的といえる。このような背景

低 温 に よ っ て 生 じ る mRNA や タ ン パ ク 質 の 立のもと、筆者は低温菌の低温環境適応機構を分子体 構 造 を 支 え る RNA シ ャ ペ ロ ン （ CspA ） やレベルで理解することを目指した研究に取り組ん

peptidyl-proryl cis-trans isomerase (PPIase) 活性を有できた。本稿においては、南極に生息する低温菌することが予想されるタンパク質群（Tig, SurA）がShewanella livingstonensis Ac10 を対象とし、本菌含まれていた。特に、低温菌において PPIase 活性の低温での生育を支えるタンパク質および生体膜を有するタンパク質の誘導生産は、低温適応性のア脂質について紹介する。

ーキア Methanococcoides burtonii13)、シベリア永久凍土由来の Psychrobacter cryohalolentis1)においても報62

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

Figure 1

Shewanella livingstonensis Ac10 の低温誘導性タンパク質群の機能告されている。本酵素は、タンパク質の立体構造形

らヒトなどの高等生物の生体膜を構成するリン脂質

成の律速段階を担う異性化酵素であり、低温においのアシル鎖として存在する（Fig. 2）。ヒトにおいてて PPIase を誘導生産することで、低温でのタンパは、動脈硬化や脳溢血といった血管系疾患の発症リ

ク質の構造形成を円滑にしていることが示唆された。

スクを軽減する効果や、抗炎症性脂質メディエータ

また、低温においては水の粘性が増加し、可溶性分ーの前駆体であることから、ヒトの健康維持に重要子の拡散速度が低下することが知られており、細菌な脂肪酸として、これらを含む健康食品やサプリメによる可溶性の栄養素の取り込みや老廃物の排出能

ントが注目されている。細菌においては、深海や極が低下することが予想されるが、S. livingstonensis

地の海水といった低温の海洋環境から採取された低Ac10 は細胞外膜のポーリンタンパク質（Omp74、

温菌の多くが、EPA やその類縁体であるドコサヘキ

Omp176）、低温においても積極的な物質輸送を可能

サエン酸（DHA）を生産し、これらの脂肪酸の生合にしている可能性が示された。

成遺伝子クラスターを有していることから、細菌の低温や高水圧への適応に、EPA や DHA を含むリ

3. 細菌の低温環境適応機構における生体膜脂質のン脂質の関与が示唆されている。そこで、筆者は S.

生理機能livingstonensis Ac10 の EPA 生合成遺伝子を破壊することで、本菌における EPA の生理機能の解明に

生体膜は外界と細胞内を区画化し、細胞内を保護取り組んだ 7)。

するバリア機能に加え、外界や細胞間の情報を受け取るインターフェース機能、物質輸送やエネルギー細菌において、EPA はポリケチド合成酵素の類縁生産といった生命活動を支える多様な機能を担う組タンパク質群によって生合成され、他の脂肪酸とは織である。細菌の環境適応機構の詳細や、低温菌を独立した系で生産される。EPA 生合成遺伝子を破壊活用した新たな産業の創生においても、生体膜の機能や構造を化学的に理解することが重要であることは疑う余地はない。筆者らは、本菌の低温環境適応機構において生体膜が担う生理的役割を解明するために、本菌の生体膜を構成するリン脂質に着目した。
S. livingstonensis Ac10 は低温誘導的にエイコサペ
ンタエン酸（EPA）を総脂肪酸の 5-10% まで生産する。EPA は 20 の炭素と 5 つの非共役二重結合で構成される長鎖多価不飽和脂肪酸であり、細菌かFigure 263

EPA 含有リン脂質の構造

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

した EPA 非生産株（∆EPA）は、本菌の至適生育温

響は、深海由来の Shewanella violacea DSS12 におい度である 18˚C においては野生株と同様に生育するても確認された 8)。また、∆EPA においては特定ののに対して、4˚C において顕著に生育速度が低下す

膜タンパク質が減少していること、細胞内に異常なることがわかった。遊離の EPA もしくは有機合成

膜構造が発達していること、菌体外膜小胞を介したした EPA 含有リン脂質を含む培地をもちいること

特定の外膜タンパク質の菌体外輸送が促進されていで、∆EPA の生育速度の低下は抑制され、野生株とたことから 14)、EPA は特定の膜タンパク質の構造同様に生育したことから、低温での生育においてや安定性に関与していることが示唆された。

EPA が重要な機能を担うことが示された。一般に、

さらに、∆EPA においては外膜ポーリンタンパク

低温環境において EPA や DHA は生体膜の流動質である Omp74 の構造多様性が消失していること性を向上させると考えられてきた。EPA の欠損によが示された。Omp74 の構造形成における EPA 含有

る本菌の膜流動性への影響を評価するために、疎水

リン脂質の生理的役割を解析するために、本タンパ

性蛍光分子 Pyrene の側方拡散を評価した。その結ク質の精製タンパク質と、本菌の脂質組成を模倣し果、大腸菌と比較して本菌は顕著に流動性の高い生た 合 成 リ ン 脂 質 を も ち い た リ ポ ソ ー ム に よ る in

体膜を有しているものの、EPA の欠損は本菌の流動vitro 再構成系を構築した結果、EPA 含有リン脂質性には影響しないことが示された。この結果は、本を含むリポソームにおいて、Omp74 のフォールディ

菌の生体膜リン脂質を構成する脂肪酸の約 45% をングが促進されることがわかった 3)。特に、EPA 含

占める不飽和脂肪酸パルミトレイン酸が、EPA の有有リン脂質は、Omp74 のリポソーム表面への吸着、無に関わらず低温での膜流動性を維持していると考

疎水的環境への組込と ß-シート形成を促進したこえられた。一方で、本菌において EPA は膜の流動とから、EPA 含有リン脂質は低温における膜タンパ

性維持以外の役割を担うことが示唆された。低温にク質の構造形成を促進するケミカルシャペロン様のおける ∆EPA を詳細に解析した結果、∆EPA は野生機能を有することが示された。これは、長鎖多価不株に比べて顕著に伸長した多核の細胞を形成するこ飽和脂肪酸が他の脂肪酸に比べて構造多様性に富むとが明らかとなり、EPA が本菌の細胞分裂、特にことで、膜タンパク質の疎水的環境への溶媒和を向上さ

DNA 分配後のステップに関与することが示された。

せることに起因すると考えられる 4)。
本菌において、EPA

EPA の欠損が低温適応細菌の細胞分裂に及ぼす影は分子の挙動が抑制される低温・高圧環境下においFigure 3 NBD 標識型 EPA 含有リン脂質アナログの構造 (A) と S. livingstonensis Ac10 における EPA
含有ドメイン (B)64Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18てケミカルシャペロンとして、細胞分裂タンパク質の膜内での機能発現を制御していと考えられる。
4. 化 学 的 ア プ ロ ー チ に よ る EPA 含 有 リ ン 脂 質の可視化
EPA は生体膜に存在し、他の脂肪酸とは異なる構

Figure 4 オメガエチニル型 EPA の構造造により、膜厚や透過性、弾性といった物理化学的特性を変化させることで周辺の膜タンパク質の機能低下し、伸長した細胞を形成するが、eEPA を添加に 影 響 す る と 考 え ら れ て い る 。 S. livingstonensis

した培地をもちいて ∆EPA を培養したとき、EPA

Ac10 においては、EPA 含有リン脂質は、細胞分裂の欠損による生育障害は抑制された。eEPA 存在下との関与が示唆される特定の膜タンパク質との相互で培養した S. livingstonensis Ac10 において eEPA作用が示唆されているが、これまでに生体膜におけは細胞膜リン脂質のアシル鎖として存在したことかる EPA を可視化した例はない。そこで筆者は、EPA

ら、eEPA は天然型 EPA の生理機能を代替するこをアシル鎖とするリン脂質の可視化を目的に、蛍光とが可能であることが示された 12)。本プローブは、発色団をホスファチジルエタノールアミン（PE）の本菌に限らず多様な生物における EPA の可視化や、アミノ基に付加したリン脂質アナログの合成に取り

代謝物解析、相互作用するタンパク質の探索といっ組んだ。リン脂質のアシル鎖はエステル結合を介した多様な応用が期待される汎用性の高いプローブとてグリセロール骨格の sn-2 位と結合しているが、本いえる。

実験ではエーテル結合を介して EPA と結合することで細胞膜でのホスホリパーゼ A2 活性によるエ5. 今後の展望

イコサペンタエノイル基の脱離を抑制した人工プロ

低温菌は地球上で最大の生存可能域を獲得した生ーブを合成した（AcyAlkyl-EPA, Fig. 3A）。NBD 標

物種であり、このような生物が如何にして低温環境

識型 AcyAlkyl-EPA を本菌に添加した結果、細胞分に適応しているかは生物学的に興味深いだけでなく、裂部位に特異的に蛍光シグナルが濃縮することが観

低温でのモノ作りのプラットフォームとしても応用察された（Fig. 3B）。一方で、グリセロール骨格の可 能 で あ る 。 筆 者 は こ れ ま で に S. livingstonensis

sn-2 位にオレイン酸を導入した対照実験では、細胞Ac10 を宿主とした低温異種タンパク質生産系を構全体から均一な蛍光シグナルが検出されたことから、築している 5, 9)。低温菌を宿主とすることで、熱安定

EPA 含有リン脂質は細胞分裂部位に特異的に濃縮性の低いタンパク質や宿主細胞に対して毒性を有す

した膜ドメイン構造を形成することが示された

11)。

るタンパク質、封入体を形成しやすいタンパク質のさらに、筆者は新たな EPA 可視化用プローブの

低温での効率的な生産が可能になると期待される。

NBD 標 識 型

実際に、本菌を宿主とすることで、熱安定性の低い

AcylAlkyl-EPA は極性頭部に嵩高い蛍光発色団を有低温活性酵素の生産に成功している。このように産し、細菌には存在しないエーテル結合を介して EPA

業面への応用が期待される低温物質生産系の開発、を導入することで、細胞内のホスホリパーゼ A2 に効率化を目的としたタンパク質生産システムの開発よるアシル鎖交換反応を回避する人工リン脂質プロや新たな宿主低温菌の探索を進めていきたい。

開発に取り組んだ。先述のーブであり、天然型リン脂質の構造とは大きく構造

さらに、 S. livingstonensis Ac10 の生体膜研究から、が異なる。筆者は、EPA の構造を最小限に改変する本菌が従来報告例のない EPA 含有リン脂質で構成ことで可視化に応用可能なプローブとしてオメガエ

される膜ドメインの存在が明らかとなった。次いで、チニル型 EPA （eEPA, Fig. 4）を開発した。eEPA は

他の EPA 生産菌や EPA が重要な生理機能を担う

天然型 EPA のオメガ末端に炭素-炭素三重結合を真核細胞における EPA の機能解析に取り組む。

導入していることから、レーザーラマン顕微鏡をも

eEPA をもちいたイメージング解析を多様な生物種

ちいた非破壊・非染色のイメージングやアジド基をを対象に行うことで、低温菌に存在した新規の膜ド有する多様な修飾試薬との選択的な環化付加反応

メインの普遍性について明らかにしたい。

（クリックケミストリー）による in situ 化学修飾が可能となる。筆者は、eEPA の効率的な合成法を確

6. 謝辞

立するとともに、S. livingstonensis Ac10 の ∆EPA を本研究を遂行するに当たり多大なご指導・ご鞭撻

もちいて eEPA の生理機能を評価した。先述の通り、を賜りました江崎信芳教授、栗原達夫教授、吉村徹∆EPA は野生株に比べて低温での生育速度が顕著に教授、三原久明教授に厚く御礼申し上げます。また、65

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

7)

生体膜研究や人工プローブ合成に参画いただいた共

Kawamoto J, Kurihara T, Yamamoto K, et al

同研究者の京都大学 佐藤智准教授、平竹潤教授、渡(2009) Eicosapentaenoic acid plays a beneficial

辺文太助教、海洋研究開発機構 加藤千明博士、青山role in membrane organization and cell division

学院大学 阿部文快教授に感謝申し上げます。最後に、of本研究に様々なご助言をいただいた江﨑研究室、栗acold-adaptedbacterium,

Shewanella

livingstonensis Ac10. J. Bacteriol. 191:632–640.

原研究室の卒業生および現役生の皆様に感謝申し上

doi: 10.1128/JB.00881-08

げるとともに、更なるチャレンジに引き続き御支援、

8)御協力賜りますようお願い申し上げます。

Kawamoto J, Sato T, Nakasone K, et al 2011.
Favourable effects of eicosapentaenoic acid on

7. 参考文献the late step of the cell division in a piezophilic

1)

Bakermans C, Tollaksen SL, Giometti CS, et albacterium, Shewanella violacea DSS12, at2007. Proteomic analysis of Psychrobacter

high-hydrostatic pressures. Environ. Microbiol.

cryohalolentis K5 during growth at subzero

doi: 10.1111/j.1462-2920.2011.02487.x
9)temperatures. Extremophiles 11:343–354. doi:2)

10.1007/s00792-006-0042-1

Construction of a low-temperature protein

D'Amico S, Collins T, Marx J-C, et al 2006.

expression

Psychrophilic microorganisms: challenges forbacterium, Shewanella sp. strain Ac10, as thelife.

Host. Appl. Environ. Microbiol. 73:4849–4856.

EMBO

Rep

7:385–389.

doi:

4)

5)

10)

Dai X-Z, Kawamoto J, Sato SB, et al 2012.

using

a

cold-adapted

Park J, Kawamoto J, Esaki N, Kurihara T 2012.

Eicosapentaenoic acid facilitates the folding of an

Identification

outer membrane protein of the psychrotrophic

membrane proteins of the psychrotrophic

bacterium, Shewanella livingstonensis Ac10.

bacterium, Shewanella livingstonensis Ac10,

Biochem. Biophys. Res. Commun. 425:363–367.

by proteomic analysis. Extremophiles. doi:

doi: 10.1016/j.bbrc.2012.07.097

10.1007/s00792-011-0422-z
11)Feller SE, Gawrisch K, MacKerell AD 2002.

ofcold-inducible

innerSato S, Kawamoto J, Sato SB, et al 2012.

Polyunsaturated fatty acids in lipid bilayers:

Occurrence of a bacterial membrane microdomain

intrinsic and environmental contributions toat the cell division site enriched in phospholipids

their unique physical properties. J Am Chem

with polyunsaturated hydrocarbon chains. J.

Soc 124:318–326. doi: 10.1021/ja0118340

Biol.

Kawai S, Kawamoto J, Ogawa T, Kurihara T

10.1074/jbc.M111.318311

2019.

6)

systemdoi: 10.1128/AEM.00824-07

10.1038/sj.embor.7400662
3)

Miyake R, Kawamoto J, Wei YL, et al 2007.

Development

of

a

12)

regulatableChem.

287:24113–24121.

doi:

Tokunaga T, Watanabe B, Sato S, et al 2017.

systemSynthesis and functional assessment of a novel

bacterium,

fatty acid probe, ω-ethynyl eicosapentaenoic

Shewanella livingstonensis Ac10, as the host.

acid analog, to analyze the in vivo behavior of

Biosci Biotechnol Biochem

eicosapentaenoic acid. Bioconjugate Chem.

low-temperature

proteinusing

psychrotrophic

theexpression

37:1–10. doi:

10.1080/09168451.2019.1638754

acs.bioconjchem.7b00235–41.

Kawamoto J, Kurihara T, Kitagawa M, et al

acs.bioconjchem.7b00235

2007.

Proteomic

cold-adapted

studiesofbacterium,

an

13)

Antarctic

doi:

10.1021/

Williams TJ, Burg DW, Raftery MJ, et al 2010.
Global proteomic analysis of the insoluble,

Shewanella

livingstonensis Ac10, for global identification ofsoluble,andsupernatantfractionsofthecold-inducible proteins. Extremophiles 11:819–

psychrophilicarchaeon

Methanococcoides

826. doi: 10.1007/s00792-007-0098-6

burtonii. Part I: the effect of growth temperature. J.
Proteome Res. 9:640–652. doi: 10.1021/pr900509n
66

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

14)

Yokoyama F, Kawamoto J, Imai T, Kurihara T
2017.

Characterizationofextracellular

membrane vesicles of an Antarctic bacterium,
Shewanella livingstonensis Ac10, and theirenhanced
phospholipid

production

bycomposition.

alterationofExtremophiles

21:723–731. doi: 10.1007/s00792-017-0937-z

67

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

学会開催報告Thermophiles 2019 (第 15 回 国際好熱菌会議)
石野良純（九州大学大学院

農学研究院）

好熱性バクテリア、アーキアの研究は、極限環境

い方々とは、雲仙、阿蘇、霧島などへも共に旅行しで生息する生物を対象とする本学会の中でも、特にた。今回、火の島九州で好熱菌会議を開催し、150

多くの会員が取り組まれている研究領域である。

名の外国人を含む 230 名の参加者を得たことは望外

Thermophiles (国際好熱菌会議) は、これまで２年毎の喜びであった（写真１）。

第 15 回の会議が、開催準備にあたり、 海外 38 名と国内 17 名の先生

昨夏 9 月 2 - 6 日に福岡市の九州大学キャンパスを会方にアドバイザーをお願いし、特に、跡見晴幸（Kyoto

場として開催された。筆者は大会長として、九大農

Univ ）、 布 浦 拓 郎 (JAMSTEC) 、 Isaac Cann (Univ学研究院の生物化学研究室のスタッフ、学生ととも

Illinois), Zvi Kelman （ Univ Malyland ） , Li Huangに会議の進行を務めた。Thermophiles 2019 開催にあ(Chinese Academy) の各先生方にご協力をいただいたっては、極限環境生物学会に協賛いただき、助成てプログラム編成を行った。できるだけ広い研究分金を活用させていただいた。まず本誌をお借りして野をカバーし、海外から招待したいと考えていたが、本学会幹事、評議員、会員の皆様に感謝の意を表し

全予算が直前まで決まらず、プログラムの決定が遅たい。

れ続けて、先生方にはたいへん苦労をおかけした。

に世界各国で開催されてきて、本会議は、第 15 回にして初の日本開催であった。

また、外国人の招待につきましては、鎌形洋一博士

筆者はジョーシア大学(USA)で開催された第 4 回大（AIST）、望月智弘博士（ELSI, Tokyo Inst Tech）に会に初めて出席して以来、今日までに好熱菌研究のもご協力いただいた。プログラム編成にご協力くだ領域で世界各国に多くの素晴らしい友人ができた。

さった先生方に厚く御礼申し上げるとともに、国内

定年退職の前に、お世話になった多くの方々にお返から参加くださった先生方にはいろいろとご無理をしができたらとずっと願っていたことが、今回の会申し上げたことを、この場をお借りしてお詫びした

議を福岡で開催し、無事に終了できたことで実現でい。最終的に決定したプログラムには、好熱菌に関き、ほんとうに嬉しく思っている。

する生理学、生態学、生化学、細胞生物学、分子生

九州は好熱菌研究者には人気の場所である。特に物学、分子情報学が盛り込まれて、たいへん有意義

別府には世界の多くの人々が興味をそそられ、筆者な５日間であった。

自身もそれまでに何度も外国からの研究者を連れて本会議は、２日（月）の夕刻から始まり、オープ行った経験がある。また、他にも有名な温泉、火山

ニングセレモニーとして、これまで本会議を運営しがたくさんある。複数回訪れてくれている特に親してきた現リーダーの Jennfer Littlechild 教授（Univ68Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

細な 3 次元構造を世界で初めて決定した。その結果、Sulfolobus の染色体はバクテリアよりもむしろ真核生物の染色体に近い高次構造をとること、そしてその高次構造形成に新規の SMC ファミリータンパク
質「コーレシン」が関わることを示した。また、Andy
Gardner 博 士 （ NEB, USA ） は 、 彼 ら が 開 発 し た
RADAR-seq 法 に つ い て 紹 介 し た 。 こ れ は RAre
DAmage and Repair sequencing 法のことで、ゲノムワ
イドに、一分子のレベルで DNA の損傷を検出する方法である。この方法を超好熱性アーキアにも応用
し、野生株に加えて修復関連遺伝子破壊株で比較したデータなどを示した。DNA 修復研究者にとってはExter, UK）が、本会議の歴史について紹介した。そたいへん興味深かった。筆者の共同研究者であるの後のオープニングレクチャーでは、Littlechild 教授

Hannuに加えて、本会議を牽引されてきた Mike Adams 教

Polytechnique, France)は、アーキアの主要なミスマッ

授（Univ Geogia, USA）と Patrick Forterre 教授（Inst

チ修復に関わる Endonuclease MS (EndoMS)について

Pasteur, France）の講演で幕開けとなった。特に、紹介し、アーキアとともに、EndoMS を所有する希Forterre 教授は８月に満 70 歳になられ、パスツール

少 な バ ク テ リ ア の 一 つ で あ る Corynebacterium

研究所ご定年（パリ大学のほうは 65 歳で名誉教授）

glutamicum を用いて、細胞内でのゲノム安定性維持の記念講演として参加者から祝福された。アーキアに EndoMS が実際に機能していることを示した。まと真核生物の進化関係を、それぞれに感染するウイ

た、同じく共同研究者である Didier Flament 博士

ルスを比較しながらの論理的な講演であった。

(Ifremer, France)はアーキアにおける相同組換えの分

Myllykallio

教 授(CNRS-INSERM-Ecole

３日からの招待講演、一般講演で、できるだけ多子機構について、特に二本鎖切断の後の過程で働く

くの方々に発表していただくために、苦心してプロ

Mre11-Rad50 の機能解析について紹介した。さらに、グラムを作成した。30 題のキーノート講演（外国人組換えに依存した複製に関する最新の知見を紹介し25 題）と口頭発表 36 題（外国人 21 題）に加えて、た。

ポスター発表も３日、５日の２回に分けて 95 題のアーキアの研究領域でも CRISPR の研究者が増え発表を聴くことができた。さらに、５日（木）の昼ているが、中でも世界の CRISPR 研究を牽引していの時間を利用して、全参加者がランチオンで、大島る一人である Mike Terns 教授 (Univ Geogia, USA)泰郎先生の Thermus thermophilus 発見 50 周年を記念

は、P. furiosus が有する CRISPR-Cas の獲得免疫機構

した特別講演として、好熱菌研究の歴史を拝聴するの第１段階である、CRISPR のスペーサー領域に外ことができたことは、日本開催の好熱菌会議として来 DNA 断片が組込まれる仕組みに関する綺麗な生の誇りであった（写真２）。日程の都合で一般講演で化学実験結果を紹介した。また、Qunxin She 教授

は２つの会場で同時進行をせざるを得ない部分があ（ Univ Copenhargen, Denmark & Shandong Univ,

り、すべての演題を聴くことができなかったのはた

China）は Sulfolobus islandicus を使って、タイプ III

いへん残念であったが、会議を通して、広い分野の

CRISPR-Cas の獲得免疫機構の第３段階である、エフ研究発表があり、好熱菌に関係する世界中の発表をェクターによる標的 RNA 及び DNA 切断メカニズム

集中して聴くことができ、たいへん充実した会議にを詳細に研究した成果について話した。特に cyclic

なったと思う。発表された研究内容について、すべoligoadenylates (cOA)による Csx1 RNase の活性化機てを紹介できないので、私の専門領域に近い研究発構について、解明された立体構造から議論を行った。

表を少し紹介したい。

Kira Makarova 博士（NIH, USA）は、Eugene Koonin

Steve Bell 教授（Indiana Univ）は、アーキアで初博士とともに CRISPR/Cas 系の系統解析をリードしめて染色体構造の構築に関する具体的な実験データているが、今回の講演ではアーキアの比較ゲノム解を示した。アーキアでは、染色体がどのような 3 次

析をおこない、原核単細胞間の多細胞化に関わる細元構造をとるのかほとんど解明されていなかったが、胞間の相互作用（Biological conflicts）に関する新し次世代シーケンサーを利用した染色体構造解析手法

いシステムの提唱を行った。このシステムに関わるを Sulfolobus に用いることで、アーキア染色体の詳遺伝子を比較すると、生物の生理学的、形態学的、

69

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

行動的適応に顕著な痕跡がゲノム上に残り、各生物のゲノムに明確な特徴として現れてくることに気付いた。そして、その機能を解析することが重要であると提唱した。そこから、制限酵素、修飾酵素、
CRISPR/Cas などの例のように、遺伝子工学のための優れた技術が生まれる可能性もある。
充実した会議は、日本を代表して、高井研 博士（JAMSTEC）と、２年後の次期会議を主催することが決まった Issac Cann 教授（Univ Illinois）の二つのたのは申し訳ないが、野球の試合を見たことがない

クロージングレクチャーを最後として、６日夕刻にというヨーロッパからの参加者を福岡ドームに連れ全プログラムを終了した。

ていって、ホークスのナイター試合を見た。地元ホ

会期中のポスターセッションは盛況で、ポスターのークスにはまったくいいところがなく完敗の試合で、前ではいつも活発に議論する光景が見られた。ポス恒例である勝利の花火もなく盛り上がりに欠けたが、ター賞を応募者の中から選考した。金井保先生

初めて見るプロ野球を楽しんでもらえた。

（Kyoto Univ）に審査委員長を務めていただき、ジ

９月は例年台風が多く、もし会議と台風が重なった

ャンル毎に分類し、Ecology & Virus、Metabolism &らという心配が付きまとったが、何とか会期中は免Applied Microbiology、Biotechnology & RNA、DNA

れ、終了直後に接近していた台風で、予定変更の参Repl. & Repair の４分野で、それぞれ専門とする日本

加者もおられたが、何とか皆さん帰路につかれたよ

人２人、外国人２人の先生方に審査員を依頼して、うで、会議を無事終了できて肩の荷が下りた。

厳正に審査していただいた。それぞれのジャンルよ筆者が最初に Thermophiles に参加した 38 歳の頃、り Hiroyuki Sakai (RIKEN BioResource Research

好熱菌研究を始めて数年後で、その魅力に取り付か

Center), Hae-Chang Jung (Korea Institute of Ocean

れていた。それから 24 年、その興味は変わらない。

Science and Technology)、Simone Antonio De Rose

常温生物と同じ DNA に遺伝情報が搭載されて、ど(Univ Exeter, UK)、Keisuke Oki (Kyushu Univ)が受賞のようにその生命現象は維持されているのか、どのした（写真３）。また、本会議に協賛いただいた極限

ようにそのゲノム安定性は維持されているのか、残環境生物学会では、極限環境生物学会員の中からポされた時間はもう長くはないが、環境が許す限り、スター賞の選考を行い、大島泰郎会長から酒井博之

好熱菌の研究を続けたいと思っている。各国を取り氏（理研）に本賞が贈られた。

巻く研究環境は厳しく、好熱菌の基礎研究を続ける

忙しい日程をやり繰りして、エクスカーションとことが今後どれだけ可能なのか楽観的なものではな

バンケットも行った。エクスカーションでは、半日

いが、今回の Thermophiles には、各国から多くの若会議をした後、福岡市内のアサヒビール工場へ行き、い研究者、学生も参加してくれた。彼らが今後も興アサヒビール生産現場の見学の後、ジンギスカンと味を持って好熱菌研究を続け、次の時代を担ってく

ビールで昼食、その後太宰府天満宮へ行った。せっれることを期待したいし、各国でその研究環境が与かく九州へ招待したので、見ていただきたいところ

えられることを切に願う。

はいっぱいあったが、半日では場所が限られてしまったものの、暑い中を多くの参加者が賑やかにすごした。バンケットは、九大邦楽部の演奏で始まり、ポスター賞の表彰式を行い、参加者の親睦を深める場となった。
２年後にイリノイ州アルバーナ・シャンペーンで会いましょう（実際にはコロナの影響で延期となり、2022 年開催の予定）、ということで、会議は解散となった。海外からの参加者はそれぞれにいろいろとご興味があり、会議終了後に各地を訪ねられたようである。多くの方々に楽しんでいただきたかったが、体が一つしかなく、十分にお世話が行き渡らなかっ70

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

論文執筆要領
極限環境生物学会誌論文執筆要領
１．一般的事項（１） テキストファイル形式または Microsoft Word
形式で保存できるワードプロセッサ等を用いて原稿を作成すること。
（２） タイトルページには、1)論文題名、2)著者名、
3)著者所属機関名、4)ランニングタイトル、5)連絡対
応著者名およびその連絡先住所・電話番号・FAX 番号・e-mail アドレス、6)キーワード（５語以内）を明示すること。日本語で作成した論文には、これらの英語訳を併記すること。
（３） 論文印刷には A4 版用紙の片面を使用し、１
行４０字（英語の場合には１行６０字）、１頁２５行で印刷すること。イタリック、ボールド、あるいはスモールキャピタルにする語句がある場合は、それぞれ赤字で下線、波下線、二重下線を記すこと。
（４） 略語リストがある場合には、本文第１頁に脚注として略語の項を設け表記すること。単位系と省略記号は SI 単位を基本とする。
（５） 生物の命名及び記載は International Code of
Nomenclature of Prokaryotes, International Code ofBotanical Nomenclature, International Code ofZoological Nomenclature に従う。学名が初出の場合は全部を記載すること。原則として、２回目以降は属名の頭文字を略号とするが、紛らわしい場合には省略せずに記載すること。
（６） 物質名の表記は以下の規定に従うこと。
１） 有機化合物の表記および放射性同位元素による標識化合物の表記は IUPAC 規定に従うこと。
２） 生化学関連事項の命名は IUPAB 制定の命名法に従うこと。
３） 化学式に用いられる記号、略号などは Chemical
Abstracts の用例に従うこと。
（７） 論文受理後、完成した本文および図表等の印刷に必要な全てのファイルを収めた電子媒体を編集委員長宛に郵送するか、またはそれらのファイルを
e-mail 添付書類として編集委員長宛に送付すること。
２．投稿論文の構成（１） 原著論文は 1)標題、2)アブストラクト、3)
本文、4)引用文献、5)表ならびに図、図の説明文、の順にまとめること。
（２） 標題は論文内容を具体的に表す簡潔なものとすること。標題の下に著者名、所属機関名、所在地を書く。著者が複数で、所属機関が異なる場合は、
著者名末尾に上付数字を付けて区別するとともに、連絡対応著者名を指定すること。
（３） 原著論文ならびに総説のアブストラクトは英語で記述するものとし、通常論文・総説では200words 以内、短論文では 100words 以内で作成すること。
（４） 通常論文の本文は原則として、緒言、材料お71

よび方法、結果、考察（あるいは結果と考察）、謝辞で構成する。短論文では項目分けをしない。
（５） 原著論文ならびに総説では、必要に応じて図表を用いる。それぞれの図表を挿入したい位置を、原稿右側の余白部分に指示すること。
（６） 文中での文献の引用は、引用文献の項目で整理した文献番号を用いること。図表の引用はその番号によること。
（７） 脚注が必要な場合には、該当事項の右肩に通し番号を付け、当該頁の下部に説明文を付けること。
３．引用文献（１） 引用文献は下記の例に準じ、本文中の該当人
名あるいは事項の右肩に 1), 1-3)のように番号を付し、また、本文末尾の引用文献の項に第一著者のファミリーネームのアルファベット順に 1., 2., 3., --の番号を付し一括記載する。Ibid., idem は用いないこと。私信、未発表の研究結果、学術雑誌に受理される前の論文、抄録が印刷されていない口頭発表など
は引用文献に含めないこと。雑誌の略号は、Chemical
Abstracts Service Source Index (CASSI) 1907-1984(Cumulative)およびその補遺版により、雑誌名、書名、
年、巻および頁の示し方は下記によること。
（２） 雑誌引用のとき
Chuakrut, S., Arai, H., Ishii, M., and Igarashi, Y. 2000.
Characterization of a bifunctional archaeral acylcoenzyme A carboxylase. J. Bacteriol. 185: 938~947.
（３） 書籍引用のとき
児玉徹. 1997. V 近代的な微生物利用工業１．アルコール, pp191~197.児玉徹・熊谷英彦編, 食品微生物学,
文永堂出版
４．表と図およびその説明（１） 表と図は印刷版下を作成すること。
（２） 本文を英語で書いた場合には図表も英文で作成すること。
（３） 表と図は一つに対して１頁使う。各頁の右上に著者名ならびに図の番号を入れること。
（４） 表題は表の上部分に書くこと。表の内容説明
文ならびに注は、表の下に記述する。注の表示にはa),b),c)を上付で明記し、記述には a),b),c)を上付にせず用いる。
（５） 図の標題ならびに説明文は別紙にまとめて印刷すること。図の標題の最後にはピリオドを付し、内容説明は標題の後に改行して記載すること。
（６） 写真は明瞭な陽画を必要部数添付すること。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2020) Vol.18

学会会則
極限環境生物学会会則（名称）第６条 会員として入会しようとする個人または団
体は、本会事務局が定める手続きに従って申し込みを行い、本会会長による承認を得なければならない。

第１条 本会は、極限環境生物学会（英文名：TheJapanese Society for Extremophiles ）という。

（会費）（以下本会という）第７条

会員は下記の会費を納めるものとする。

正会員

年額

（目的）
第２条 本会は、極限環境生物研究の発展に寄与し、極限環境生物の研究、教育、利用の推進に寄与することを目的とする。

5,000 円

（但し身分が学生である者および 65 歳以上となった正会員は申請により年額 2,000 円とすることができる。前者の場合は指導教員の署名、後者の場合は幹事会による事後承認を必要とする。）（事業）
第３条 本会は、研究発表会及び講演会等の開催、極限環境生物学会誌（英名：Journal of Japanese Society
for Extremophiles）の発行、国際極限環境生物学会等との連携事業、研究奨励賞・ポスター賞の授与、その他前条の目的を達成するために必要な事業を行う。

名誉会員

年額

0円

団体会員

年額

20,000 円

賛助会員

年額

一口以上（一口 30,000 円）（会員の種別等）（退会）

第４条 本会の会員は正会員、名誉会員、団体会員
および賛助会員とする。

第８条 会員は会長に届けることによって退会することができる。

2.正会員は極限環境生物に関する研究に従事する、または、これに関心を持つ個人であって、本会の目的に賛同し、定められた会費を納めた者をいう。身分が学生である者および 65 歳以上となった正会員の会費は別に定める。便宜上これらの者をそれぞれ正会員（学生）および正会員（シニア）と称する。

（役員）

3.名誉会員は、当学会の発展に功労のあった者で、幹事会による推薦・選考を経た後、評議員会による承認を経て、会長により指名される。

3. 副会長は会長を補佐し、会長に事故ある場合には会長の職務を代行する。

第９条 本会には会長 1 名、副会長 2 名、評議員若干名、幹事若干名、会計監査 2 名の役員をおく。
2. 会長は本会を代表し、会務を統括する。

4. 幹事は、幹事長、庶務、学術活動、会計、を分担し、事業計画の立案、事業の実施、庶務会計、シンポジウムの企画立案、学会誌発行、国際極限環境生物学会等との連絡などの本会の事務を行う。

4. 団体会員は極限環境生物に関心を持つ団体（法人等）であって、その団体内の本会の目的に賛同する
代表者を含めて３名以内の所属者を指名して会員登録を行い、定められた会費を納めた団体をいう。

5. 会計監査は本会の会計を監査する。

5. 賛助会員は本会の目的に賛同し、定められた賛助
会費を１口以上納めた個人または団体をいう。
第５条 会員は本会が開催する諸事業に参加し、本会の発行する印刷物、PDF 等の配布を受けることができる。

（役員の選出と任期）第１０条 会長、副会長、評議員は本会の総会において選出される。
2. 幹事、会計監査は、副会長、評議員以外の正会員の中から会長が指名し、総会の承認を受ける。

（入会）
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3.

会長、副会長の任期は２年とし重任を妨げない。
（評議員会）

4. 評議員の任期は２年とし重任を妨げないが、原則として連続 2 期を限度とする。但し、会長が指名する者はこの限りではない。

第１３条 評議員会は会長、副会長、評議員をもって構成する。会長は年１回以上評議員会を召集し、議長となり、会の重要事項を審議し総会に提案する。

5. 幹事長の任期は 2 年とし重任を妨げない。
（総会）
6. 庶務幹事の任期は 2 年とし重任を妨げないが、連続 2 期を限度とする。
年会幹事の任期は 2 年とし 1 期限りとする。

第１４条 本会は原則として年１回総会を開き、会務を協議し議決する。
総会は会長が召集する。

8. 庶務幹事、年会幹事以外の幹事の任期は 2 年とし重任を妨げない。

第１５条 総会の議決は出席会員の過半数の賛成をもって行う。

（名誉会長）（会計年度）

第１１条

第１６条 本会の事業年度は 4 月 1 日に始まり、翌年 3 月 31 日に終る。

7.

本会には名誉会長をおくことができる。

2. 名誉会長は、本会に対し大局的な見地による適切な助言を与える。

（付則）

3. 名誉会長は、会長として学会の運営及び発展に特別の功績があった者で、幹事会による推薦、評議員
会を経て、総会の承認を受ける。

第１７条
本会則の施行および本会の運営についての細則は総会の議決を経て別に定める。
第１８条

本会則の変更は総会の議決を経て行う。

第１９条
る。

本会則は、1999 年 10 月 19 日より施行す（委員会の設置と委員の任期）第１２条 本会に学会誌編集委員会、研究奨励賞選
考委員会、若手シンポジウム委員会を置く。

2001 年 11 月 29 日改定
2002 年 12 月 1 日改定
2003 年 12 月 1 日改定
2005 年 11 月 7 日改定
2007 年 12 月 1 日改定
2010 年 1 月 1 日改定
2012 年 12 月 1 日改定
2013 年 10 月 26 日改定
2017 年 10 月 16 日改定
2018 年 12 月 8 日改定
2020 年 4 月 1 日改定

2. 学会誌編集委員会（会長指名の若干名で構成し､委員長は互選する）は学会誌の編集、論文審査の任にあたる。
3. 研究奨励賞選考委員会（副会長が委員長を務め、学術担当幹事と委員長指名の委員、計 10 名程度で構成する）は本会の研究奨励賞受賞者を選考する。
4. 若手シンポジウム委員会（会長指名の若干名で構成する）は学術担当幹事と共同でシンポジウムを企画立案し、運営をサポートする。委員の任期は 2 年とし 2 期限りとする。委員長は 2 期目の委員の中から互選する。

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学会細則
極限環境生物学会細則（会員）
第１条 入会を承認された正会員、名誉会員、団体会
員、賛助会員は、所定の会費を速やかに納
入する。

（授賞）
第１４条 研究奨励賞・ポスター賞の授賞規定は別途定め全会員に配布する。
（細則の変更）第１５条 本細則の変更は総会の議決による。

（総会）
第２条 総会の議案は副会長、幹事等と共に会長が作成し、評議員会の議を経た後提出する。議案には前年度の事業内容及び収支決算、新年度の事業計画、及び収支予算を含むものとする。
第３条 総会は会員の１／１０以上の出席（但し委任状を含む）をもって成立する。

（付則）
第１６条 今期の本会事務局は、東洋大学 理工学部
応用化学科 生命工学研究室 峯岸宏明研究室（埼玉県川越市鯨井）内とする。
第１７条 本細則は、1999 年 10 月 19 日よりこれを実施する。

（役員の選出）第４条 会長、副会長、評議員は会員の選挙によって決められる。会長は選挙によらず評議員を指名することが出来るが、総会での承認を必要とする。
第５条 会長は会員の中から少なくとも３名を選んで選挙管理委員を委嘱する。選挙管理委員
は選挙事務を行う。
第６条 会長は、評議員会の承認を得て必要な委員会を作ることが出来る。

2002 年 12 月 1 日改定
2003 年 12 月 1 日改定
2006 年 6 月 30 日改定
2007 年 12 月 1 日改定
2010 年 1 月 1 日改定
2012 年 12 月 1 日改定
2017 年 7 月 21 日改定
2017 年 10 月 16 日改定
2019 年 11 月 17 日改定
2020 年 4 月 1 日改定（名誉会員）
第７条 名誉会員に推戴される者は、推戴される年の学会年度始まりにおいて、満 70 歳に達している会員とする 。
第８条 名誉会員の総数は、原則として会員総数の５％を目安とする。
第９条 名誉会員に推戴された者は、総会の席で、推戴の盾と記念品を贈呈される。
第１０条 名誉会員は当学会の催すシンポジウム・年会等に招待される。
（評議員会）
第１１条 評議員会は評議員の半数以上の出席（委任状を含む）をもって成立する。
第１２条 評議員会の決議は出席者の過半数の賛成により成立する。
（退会）
第１３条 会長は、会費を３年以上滞納した会員を退会させることが出来る。

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運営体制
極限環境生物学会運営体制（ 2020-2021 年度）
名誉会長

故 掘越 弘毅

会長

大島 泰郎
伊藤 俊洋
井上 明

副会長

石野 園子
板谷 光泰
石田 真巳
伊藤 佑子
大島 敏久
鎌形 洋一
川上 文淸
河原林 裕
倉光 成紀
小林 哲夫
芝 弘孝
高井 研
中川 和倫
中島 春紫
野尻 秀昭
長谷川 功
早川 敦
半澤 敏
藤浪 俊
藤原 伸介
藤原 健智
宮崎 健太郎
森屋 利幸
山岸 明彦
湯本 勳
若木 高善
山岸 明彦
湯本 勳
若木 高善

共和化工株式会社 環境微生物学研究所
一般財団法人北里環境科学センター
東洋大学 バイオナノエレクトロニクス研究センター

評議員（５０音順、敬称略）
九州大学大学院 農学研究院
慶応義塾大学 環境情報学部
東京海洋大学 海洋環境学科
創価大学 工学部
大阪工業大学 工学部
国立研究開発法人産業技術総合研究
B&I サポート所
次世代バイオ医薬品製造技術研究組
大阪大学大学院 理学研究科
合名古屋大学大学院 生命農学研究科
サントリーMONOZUKURI エキスパート株式会
国立研究開発法人海洋研究開発機構
社
愛媛県立今治西高等学校
明治大学 農学部
東京大学 生物生産工学研究センター
日本大学 生物資源科学部
味の素株式会社 バイオファイン研究所所
東ソー株式会社
アメリエフ株式会社
関西学院大学 理工学部
静岡大学 理学部
国立研究開発法人産業技術総合研究
共和化工株式会社所
東京薬科大学 生命科学部
国立研究開発法人産業技術総合研究
東京大学大学院 農学生命科学研究科
所
東京薬科大学 生命科学部
国立研究開発法人産業技術総合研究
東京大学大学院 農学生命科学研究科
所

幹事長
幹事会顧問

中村 顕
宇佐美 論
工藤 俊章
庶務担当
道久 則之
古園 さおり
編集委員長
石井 正治
編集副委員長
石野 良純
学会誌担当
古園 さおり相馬 亜希子
八波 利恵
M&E 誌担当
布浦 拓郎
会計担当
高品 知典
峯岸 宏明
ホームページ担当 三輪 哲也
黄川田 隆洋
年会担当
鴫 直樹
荻野 博康
学術担当
跡見 晴幸
伊藤 隆
伊藤 政博
折田 和泉
加藤 千明
國枝 武和
栗原 達夫
郷田 秀一郎
小西 正朗
仲宗根 薫
東端 啓貴
福居 俊昭
若井 暁
会計監査
中村 聡
鳴海 一成

幹事会
筑波大学大学院 生命環境科学研究科
東洋大学 理工学部
北里大学 生命科学部
東洋大学 生命科学部
東京大学 生物生産工学研究センター
東京大学大学院 農学生命科学研究科
九州大学大学院 農学研究院
東京大学 生物生産工学研究センター
千葉大学大学院 園芸学研究科
東京工業大学 生命理工学院
国立研究開発法人海洋研究開発機構
東洋大学 生命科学部
東洋大学 理工学部
国立研究開発法人海洋研究開発機構
国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機
国立研究開発法人産業総合研究所
構
大阪府立大学大学院 工学研究科
京都大学大学院 工学研究科
国立研究開発法人理化学研究所
東洋大学 生命科学部
東京工業大学 生命理工学院
国立研究開発法人海洋研究開発機構
東京大学大学院 理学系研究科
京都大学 化学研究所
長崎大学 工学部
北見工業大学 工学部
近畿大学 工学部
東洋大学 生命科学部
東京工業大学 生命理工学院
神戸大学 自然科学系先端融合研究環
東京工業大学
東洋大学 生命科学部

若手シンポジウム委員会
郷 田 秀 一 創価大学 理工学部
佐藤 喬章
京都大学大学院 工学研究科郎
川本 純
京都大学 化学研究所
Oleg Gusev 国立研究開発法人理化学研究所
秀瀬 涼太
神戸大学大学院
加藤 慎吾
国立研究開発法人理化学研究所
科学技術イノベーション研究科
亀谷 将史
東京大学大学院 農学生命科学研究科
大平 高之
東京大学大学院 工学系研究科

委員長
委員

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編集委員会
委員長 ：石井正治（東大）
副委員長：石野良純（九大）
学会誌担当：古園 さおり（東大）、相馬 亜希子（千葉大）、八波 利恵（東工大）
学会事務局〒350-0815 埼玉県川越市大字鯨井２１００
東洋大学 理工学部 応用化学科 生命工学研究室 峯岸宏明研究室内
極限環境生物学会事務局 中村 顕 (幹事会幹事長)
E-mail: kyokugenjm10@extremophiles.jp
URL: http://www.extremophiles.jp/
学会誌編集
山本まみ
発刊日

2020 年 3 月 31 日