大渡・杉山・牧野・松林・田畑：メタボローム解析を用いた食品成分の評価技術の確立 (第２報)資料

メタボローム解析を用いた食品成分の評価技術の確立 (第２報)−香気成分のメタボローム解析によるブドウ品種特性の顕在化−
康夫†・杉山大渡

１. 目万里§・牧野正知＊・松林 和彦＊＊・田畑

的

２. 方

ブドウの品種はとても多く, 世界には10,000種以上ある

2.1と言われており, 世界で生産されるブドウのおよそ7割はワイン用ブドウであるが, 日本では生食用ブドウが国内全
1)

光正＊＊

法

測定試料の調製分析試料のブドウとして８品種を用意した. 品種名および略記, 系統を表1に示す.

体の８〜９割を占める . 最近では日本産の生食用ぶどう

2.2

GC/MSによるメタボローム解析の品質が海外でも高く評価され, 年々輸出量が拡大してお2.2.1 GC/MS分析

り, 2018年には1,492トンが輸出された2). また, 国内では人の咀嚼時と近い条件になるように, ブドウはミキサー

各地で独自に品種改良が取り組まれ, オリジナルブランドではなく, 皮付きのまま２〜５㎜角程度に細断した. 20としての特産化を盛んに行っており, 島根県においても新mLヘッドスペースバイアルに均一にしたサンプル５gを品種の開発を行っている.

すばやく封入し, ISQ 7000シングル四重極 GC-MSシステ

ブドウの品種には主に欧州種と米国種の２つの系統があム (Thermo Fisher Scientific) により分析に供した (各り, さらに欧州種と米国種の交雑種 (欧米雑種) に分類さ試料N＝５). 測定条件を表２に示す. 多機能オートサン

れる. その品種間差の一つの特性として香りの違いがある.

プラーTriPlus RSHを搭載し, 分析待機中にサンプルが変

欧州系ブドウ品種の特徴香にはがあり,質しないよう, サンプルトレイを冷却水循環装置と接続す

米国系ブドウ品種の特徴香は フォクシー香 と言われる.

マスカット香ることで, サンプルを４℃に保持した. 揮発性成分のサン

香りはブドウの差別化のために重視される特性の一つであプリング方法はヘッドスペース固相マイクロ抽出法 (HS-3)

り, 特徴香を活かした品種開発も行われている . 農産物SPME法) を用いた. バイアルに封入した試料を40℃・10や食品の香りは単一の成分ではなく, 多くの揮発性成分に分間加温し揮発性成分を気相に移動させた後, SPMEファ

よって複雑に構成されるため, 特性を評価するには､ よりイバー (DVB/CAR/PDMS 50/30μm, Sigma Aldrich)多くの成分を解析対象とすることが望まれる. メタボローを用いて40℃・30分間揮発性成分の抽出, 濃縮を行った.

ム解析はサンプル内の多成分を網羅的に観察することが可
表２

能で, 医療や食品などの分野で盛んに用いられている4).
今回, ガスクロマトグラフ質量分析装置 (GC/MS) を用
いて複数のブドウ品種の揮発性成分を対象に, メタボロー
ム解析により網羅的一斉分析を行い, 品種特性に寄与する香気成分を探索した.
表１

ブドウ分析試料†

食品技術科 (現：生物応用科), §農業技術センター特産開発科
生物応用科 (現：食品技術科), ＊＊食品技術科＊― 13 ―

GC/ MS測定条件

島根県産業技術センター研究報告第56号(2020)

その後, 注入口にて250℃１分間の熱脱着により濃縮したとして ｢フォクシー｣ と ｢マスカット｣ を用いて, ７段階揮発性成分をGCカラムに導入した.の両極尺度で評価した (図１). なお､ 今回はブラインド

2.2.2 データ解析

形式で評価しておらず, 評価者には香りにのみ着目するよ

GC/MS分析データ (raw形式) をABF file converter

う事前に指示された. 11名の平均値を各サンプルの香りの(https://www.reifycs.com/AbfConverter/) により, AB評価値とした. 官能評価と成分との部分最小二乗回帰

F形式に変換した. メタボローム解析用ソフトウェアMS-(PLS regression; PLS-R) はAIoutputを用い, データス

DIAL (ver. 3.96) およびMSPファイルのスペクトルライ

ケーリングはAuto Scalingで実施した9).

ブラリー ｢All records with Kovats RI (15,302 records)｣

３. 結果および考察を用いて, ベースライン補正, ピーク検出, デコンボリュー
ション, アライメント, 化合物同定を行った5), 6) . さらに

3.1

GC/MSよるブドウの揮発性成分分析

未同定のピークに対してはNIST 11 MS スペクトルライ

GC/MSにより分析した各試料のトータルイオンクロマ

ブラリーのマススペクトルとの照合により化合物を推定しトグラム (TIC) を図２に示す. 品種ごとに様々な揮発性た. 得られたデータ行列をWeb解析ツールMetaboAnalyst

成分が同時に多数検出され, MS-DIALを使用して, クロ4.0に供し多変量解析を行った7), 8). データスケーリングはマトグラムのデコンボリューション, アライメントなどをAuto Scaling (各代謝物レベルを平均０, 分散１に変換)行った. データ処理の結果, 220個の成分由来のピークがを採用し, 主成分分析 (principal component analysis;確認された. 群間の違いの評価に有用なピークを抽出する

PCA) お よ び 部 分 最 小 二 乗 判 別 分 析 (Partial Least

ために, 分散分析 (ANOVA, p ＜0.05) によるフィルタ

Squares - Discriminant Analysis; PLS-DA) を実施した.

リングを行い, ピーク数を171個に絞り込むことで以降の2.3解析に用いた. なお, 未同定のピークについては官能評価の回帰分析

ブドウの香りの官能評価を島根県農業技術センターの職Unknownとした. また, 波形処理の影響を受けにくいよ員11名により実施した. 評価には, ブドウ香気の評価用語

うに, ピーク高さをデータ行列に出力し, その後の多変量解析に供した. MetaboAnalystを用いて全ての揮発性成分間の相関分析をヒートマップにより図３に示した. 相関ヒー
トマップは複数の成分間の相関関係を俯瞰して理解するのに便利なツールである. 解析の結果, 171成分はCluster
１〜３まで３つのクラスターに大別され, その大半が

図１

７段階両極尺度による香りの評価

図２

各試料のトータルイオンクロマトグラム― 14 ―

図３ 揮発性成分間の相関分析
色の違い (赤色：正, 青色：負) で成分間の相関関係を表す.

大渡・杉山・牧野・松林・田畑：メタボローム解析を用いた食品成分の評価技術の確立 (第２報)― 15 ―

島根県産業技術センター研究報告第56号(2020)

Cluster２と３によって構成されることが分かった. Clust雑種であり, MAはマスカット香が強い欧州種のブドウでer２にはエステル類の成分が多く, 一方, Cluster３にはある. ローディングプロットを確認したところ, PC１はEテルペン類の成分が多数含まれていた. 一般に欧州種のマ

thyl propionateやEthyl Octanoateなどエステル類の寄与

スカット香にはテルペン類, 米国種のフォクシー香にはエ率が高く, PC２はβ-MyrceneやLinaloolなどテルペン類10)-15). この結の寄与率が高い結果が得られた (図４B). このことから,果から, ブドウの揮発性成分を網羅的に分析することは,PC１がフォクシー香 (エステル類が主) の強度を表し,品種間の差異を可視化するのに有用であることが示唆され

PC２はマスカット香 (テルペン類が主) の強度を表わすた.と解釈された. PCAで分離されなかった残りの５つのサステル類が主要な香気成分であると言われる

3.2

多変量解析 (PCA, PLS-DA) による品種間比較

ンプル (KK, OS, RB, SM, ST) について, サンプル間のGC/MS分析により得られた揮発性成分のメタボローム違いをより詳しく調べる目的で部分最小二乗判別分析

データを主成分分析 (PCA) により解析し, 得られたス(PLS-DA) による解析を行った. PLS-DAはPCAとは異なコアプロットを図４に示した. 横軸の第1主成分 (PC１)り, 群情報を利用して群間を判別できるようにデータの可ではFMとQNの２つのサンプルが分離され, 縦軸の第２視化を行う多変量解析法の一つである. 解析の結果, KK

主成分 (PC２) ではMAサンプルが分離された (図４A).とSTは分離されたが, 残りの３つ (OS, RB, SM) は完全FMとQNはともにフォクシー香を特徴とする米国系の交には分離されなかった (図４C). KK (欧州種) とST (米図４ 多変量解析 (PCA, PLS-DA) による品種間比較(A) PCAスコアプロット, (B) PCAローディングプロット, (C) PLS-DAスコアプロット. 楕円範囲は95％信頼区間を表す― 16 ―

大渡・杉山・牧野・松林・田畑：メタボローム解析を用いた食品成分の評価技術の確立 (第２報)
国種) はともに外国が原産の品種で遺伝的背景は異なるが,OS, RB, SMは国内で育種された品種で, その血統はいずれもMAをルーツとしてもっているため比較的近縁である.
OSとRBは香りが少ないタイプだが, SMはマスカット香を特徴として開発されたブドウである3). しかし, 今回のSMサンプルからはマスカット香の主要な寄与成分であるGeraniolやLinaloolがほとんど検出されなかった (参照：
図６上段). その原因としては, 収穫時期 (満開後日数)や栽培環境 (施肥・潅水などの肥培管理, 気温・日照等)の影響の可能性, あるいは収穫後の貯蔵温度にマスカット香が依存することが報告されていることから16), 収穫後の貯蔵条件による影響の可能性などが考えられた.
3.3

官能評価の回帰モデル作成

官能評価試験で得られた各サンプルの香りの評価値につ

図５

PLS-Rによるブドウの香りの予測モデル

いて, 表３にまとめた. ヒトが感じるフォクシー香やマスカット香に寄与する成分を探索するため, 官能評価の結果

Coefficient (回帰係数) は, 値が正の場合は予測値が正方を目的変数に, GC/MSで得られた揮発性成分のデータを向 (マスカット香側) に, 値が負の場合は予測値が負方向説明変数とし, これらの間で部分最小二乗回帰 (PLS re-(フォクシー香側) に寄与する成分を表す. 表４, ５に,gression; PLS-R) による回帰モデルの作成を行った. 回

今回のモデルにおけるVIPスコアおよびCoefficientを示し

帰式から予測された香りの評価値を横軸に, 実際の評価値た. マスカット香の関連成分として, VIPスコアが１以上を縦軸にプロットした予測モデルのグラフを図５に示す.

だった19成分のうち10成分がテルペン類であった (表４).

モデルの評価方法として, R２ (直線性：モデルの精度),

この中には, すでにマスカット香の主要成分として報告さ２(予測性能：モデルの安定性), RMSEE (予測誤差：れているGeraniolやLinaloolなども含まれていた10) -13),18) -22).

モデルのズレの程度) を用いて評価を行った. R２及びQ２

また, 高いVIPスコアを示したcis-３-Hexenol (青葉アルQ

２は１に近いほど良い予測モデルであり, 具体的にはR がコール) は, ブドウ以外にも広く植物界に存在することが0.65以上で定量的予測が可能で, Q２ は0.5以上あれば良好知られる揮発性成分の一種で, いわゆる17)２な予測モデルとされている . 今回の結果をみると, R と２

青くさみの本23)体である . 興味深いことに, ２-Ethylfuran, ２-Pentylfu

Q はそれぞれ0.9259, 0.9009となり, またRMSEEは0.5036

ran, ２-Methylfuranの３種類のフラン類が関連成分としで, 実測値に対して予測値がおよそ±0.5以内のエラーでて認められた. フラン類は, 一般的に熱処理した食品でよ収まることから良好なモデルが構築できたと考えられた.
表４

これはGC/MSによる揮発性成分のメタボローム解析が,ブドウの香り (フォクシー香あるいはマスカット香) を客観的に評価 (予測) できる可能性があることを示している.
続いて, VIP (Variable Importance in Projection：変数重要度) によりブドウの香りに寄与する重要なマーカーとなる成分の抽出を行った. VIPスコアは, 値が大きいほど予測モデルの予測性能に対する寄与度が大きいとされ,特に１以上でモデルの構築に重要な成分とされている17).
表３

ブドウの香りの官能評価値― 17 ―

VIPを指標にしたマスカット香の関連成分

島根県産業技術センター研究報告
表５第56号(2020)

次に, フォクシー香に関連する成分として, VIPスコア

VIPを指標にしたフォクシー香の関連成分が１以上だった41成分のうち上位20成分を表５に示した.
このうち13成分がエステル類であり, この結果はフォクシー香の主要成分がエステル類であるという過去の知見とも一致した14), 15), 22), 24). ただし, 主要成分の一つであるアントラ
ニル酸メチルは､ 本試験では検出されなかった14) ,15)｡ また､
VIPスコアが高い成分にはβ-Terpinene, α-Bergamotene,β-Pinene, α-Pinene, Isovaleraldehydeなどのエステル類以外の成分が上位に並び, これらのほとんどがSTにおいて多く見られる成分だった. 一方, Ethyl Acetate,Ethyl Hexanoate, Ethyl Valerate, Ethyl Butyrateなどのエステル類はFMとQNのみ存在が確認された. STは官
能的にはフォクシー香の評価だったが, 同じフォクシー香の分類でも, 成分的には他の２品種 (FM, QN) とは異なる特性を示した (図７). 今回の官能評価試験では, ブドウ香気の評価用語として ｢フォクシー｣ と ｢マスカット｣だけに絞って, ７段階の両極尺度で評価した. そのためフォクシー香やマスカット香以外に含まれる香りの存在を一部排除して評価した影響の可能性が考えられた. また, メタ
く見られ, 甘い香りや香ばしい香りと表現される揮発性成

ボロームデータと官能との相関性を解析する場合に, 分析分である. ３種類ともピーク強度が低いため, 含有濃度は型官能評価の一種である定量的記述分析法 (QDA) を活微量と考えられるが, マスカット香を構成する複数因子の用した報告例がある25) ,26). 厳密な官能評価試験には, 外観一つとして影響している可能性が考えられた. 関連する６などの先入観を与えない評価環境が求められ, 場合によっ成分のピーク強度データを図６に示す.ては香りの見本などを用いたパネラーの訓練が必要なこと

図６ マスカット香の関連成分のピーク強度(上段) 左：Geraniol, 中央：Linalool, 右：cis-３-Hexenol(下段) 左：２-Ethylfuran, 中央：２-Pentylfuran, 右：２-Methylfuran
横軸：FM, KK, MA, OS, QN, RB, SM, ST, 縦軸：ピーク強度 (高さ)― 18 ―

大渡・杉山・牧野・松林・田畑：メタボローム解析を用いた食品成分の評価技術の確立 (第２報)

図７ フォクシー香の関連成分のピーク強度(上段) 左：β-Terpinene, 中央：α-Bergamotene, 右：β-Pinene(中段) 左：α-Pinene, 中央：Isovaleraldehyde, 右：Ethyl Acetate(下段) 左：Ethyl Hexanoate, 中央：Ethyl Valerate, 右：Ethyl Butyrate
横軸：FM, KK, MA, OS, QN, RB, SM, ST, 縦軸：ピーク強度 (高さ)文もあるため, その点に関しては今後の課題である.

献

本研究では, GC/MSを用いてブドウの揮発性成分を対象にメタボローム解析を行い, 品種特性に寄与する香気成

１) 農林水産省大臣官房広報評価課広報室. 特集1 ぶどう. あふaf分を探索した. 網羅的な解析により､ 品種間の差異を可視

f, agriculture forestry fisheries. 2019, vol.50, no.5, p.8.

化し､ 官能評価の回帰モデル予測を行うことで､ 客観的に２) 農林水産省.

評価することができた. この手法は, 様々な食品にも応用(品目別)｣.

が可能で, 目的の製品の特徴 (味・香り) について評価しhttp://www.maff.go.jp/j/shokusan/export/e̲info/attach/pdf/

たり, 他の製品と比較し何がどの程度違うのか, その特徴

zisseki-179.pdf. (参照：2019年９月１日)を明らかにしたりすることができる. また, 官能評価や嗜｢平成30年農林水産物・食品の輸出実績

３) 山田昌彦ほか. ブドウ新品種

好調査と組み合わせ, 官能と成分の予測モデルを構築する

シャインマスカット. 果樹研究所研究報告. 2008, vol.7, p.21-38.

ことで, 消費者に好まれる商品群の特徴を明らかにしたり,

４) Fiehn, O. Metabolomics--the link between genotypes and

味や香りの成分と特徴の関連づけに役立てたりすることもphenotypes. Plant molecular biology. 2002, vol.48, no.1-2,可能である.

p.155-171.

― 19 ―島根県産業技術センター研究報告
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