[他誌掲載論文]
環境毒性学会誌（Jpn. J. Environ. Toxicol.），21（1），1 - 7，2018 より転載

水生双子葉植物カワヂシャを供試生物とした生長阻害試験法の開発
Development of a growth inhibition test using Veronica undulata,a dicot aquatic plant

Takahiro KATO and Satoru ISHIHARA
Agricultural Chemicals Inspection Station,
Food and Agricultural Materials Inspection Center.
/2-772 Suzuki, Kodaira, Tokyo 187-0011, Japan・本論文の版権は、環境毒性学会が所有していますが、版権所有者の許可を得て転載しています.

環境毒性学会誌（Jpn. J. Environ. Toxicol.），21（1），1 - 7，2018

水生双子葉植物カワヂシャを供試生物とした生長阻害試験法の開発
Development of a growth inhibition test using Veronica undulata,a dicot aquatic plant
加藤貴央，石原 悟
独立行政法人農林水産消費安全技術センター農薬検査部 / 〒 187-0011 東京都小平市鈴木町 2-772

Takahiro KATO and Satoru ISHIHARA
Agricultural Chemicals Inspection Station, Food and Agricultural Materials Inspection Center.
/2-772 Suzuki, Kodaira, Tokyo 187-0011, Japan

ABSTRACT

We aimed to develop a growth inhibition test using Veronica undulata, a dicot aquaticplant. The examination was carried out using simetryn, 2,4-D, and 3,5-DCP as thetest substances, to confirm the precision of the examination and sensitivity of Veronica
undulata to herbicides. Directly post-germination, Veronica undulata was exposed toeach test substance for seven days, and ErC50 was calculated based on the growth speedof the leaf area or the dry weight. The coefficient of variation of ErC50 for each test wasless than 20%, and stable test results were obtained. In the growth inhibition test, theErC50 (µg/L) values of 2,4-D and 3,5-DCP were 585 and 3,394, and the sensitivity wasat the same level as that by using Myriophyllum spicatum. These results suggest thepossibility of using this test as a screening method for assessing the toxicity of chemicalsubstances to dicot aquatic plants.
Key Words: Aquatic plant, Veronica undulata, Ecotoxicity test, Herbicide, Simetryn,
2,4-D, 3,5-DCP

1.

はじめに

水生植物に対する農薬の影響評価では、国際的な試験指針が定められている、藻類 1）および水生単子葉植物のウキクサ（Lemna sp.）2）の生長阻害試験の結果が主に活用されており、我が国では藻類（単細胞緑藻 Pseudokirchneriella subcapitata）を用いた生長阻害試験 3）が環境省の定める水産動植物への毒性に係る登録保留基準値の設定に活用されている。室内での生長阻害試験においては被験物質を溶解させた培養液を用いて曝露させるため、実環境での曝露経路を再現できる水生植物が供試植物として適している。近年欧州を中心に、

14水生双子葉植物のホザキノフサモ（Myriophyllumspicatum）を供試生物とした生長阻害試験法 4，5）が開発されるなど、供試可能な水生植物種の拡大が進められているものの、水生植物に関する影響試験法は充実しているとは言えない。
農薬の生態系への影響に関するリスク評価法としては、曝露量と毒性値を比較し二者択一的にリスクの有無を評価する決定論的リスク評価が一般的であるが、より効率的な農薬のリスク管理を可能とする評価手法として、リスクを定量的な指標で表すことができる確率論的リスク評価が有効であると考えられている 6）。確率論的リスク評

カワヂシャ生長阻害試験

価では、多種生物の薬剤感受性を統計学的に示した種の感受性分布（SSD：Species SensitivityDistribution）が用いられる。SSD の推定には、最低でも 5 属以上の生物種が必要とされている 7）

そこで、カワヂシャ生長阻害試験法の開発を目的として、除草活性を有する 3 種の被験物質を用いた生長阻害試験を実施し、本試験法の妥当性を検証した。カワヂシャ生長阻害試験の試験設計および妥当性の検証項目（対照区の倍加期間が 2.5日未満 2））は、OECD におけるウキクサ生長阻害ことから、既に試験指針が定まっている生物種に加え、更なる生物種を追加することは意義深い。
これまでに我々は、国内に生息する水生単子葉植物のウキクサ（Lemna sp.）、ミジンコウキクサ（Wolffia globosa）、水生シダ植物のサンショウモ（Salvinia natans）などを供試生物種とし試験のテストガイドライン（OECD-TG221）を参考にした。

2.

。水生た生長阻害試験法の開発を進めてきた双子葉植物を供試生物種とした試験には、ホザキノフサモ生長阻害試験（OECD-TG238 および239）があるが、常時供試生物の維持培養が必要であること、大型の容器を用いるため試験スペースが必要なこと、試験期間が 14 日間と比較的長期であることなどから、労力を要し難易度の高い試験である。そのため、他の水生双子葉植物を供試生物種とした簡易な試験手法を開発すること
は、SSD の推定に用いる生物種数を追加するとともに、毒性データ蓄積の効率改善に寄与できる。
カワヂシャ（Veronica undulata）は日本の在2.2 培養温度の検討
子葉が展開した状態のカワヂシャ幼体を異なる温度（18，20，22 および 24℃）条件下にて各温度区 3 連で培養し、生長阻害試験における培養温度を検討した。その他の環境条件および測定方法は後述の生長阻害試験方法に準じて行った。試験開始から 7 日間各日葉面積を測定し、試験開始時から 7 日後における生長速度を算出し、最適な培養温度を評価した。

来種であり、本州以西の河川や水路、水田などの水湿地に自生するオオバコ科の双子葉被子植物である 11，12）。カワヂシャの種子は発芽率が高く 13）、長期保存が可能であることが知られている 14）。
また、幼体を用いることで省スペースでの試験が可能であることからも、カワヂシャは水生双子葉植物の供試生物種としての適性が高いと考えられた。

(A)

(B)

(C)

Fig.1. Veronica undulate (A)Whole body, (B) Fruit,(C)Seeds.

材料および方法

2.1 供試生物
カワヂシャは 2013 年 5 月に東京都東久留米市
落合川より採取し室内で継代培養している系統を用いた（Fig. 1）。当該系統のカワヂシャは農地から離れた河川で採取した株であり、農地付近の河川に生息する系統と比べて除草剤抵抗性を獲得している可能性は低いと考えられる。既報の方法 14）により種子を生産し、乾燥・低温（4℃）・暗黒条
件下で保存した種子を適宜各試験に供試した。

8-10）

2.3 観察項目の検討
カワヂシャの葉面積とバイオマス生産量の相関性を検証するため、子葉期から 4 ～ 5 葉期までの各段階における葉面積および乾燥重量を測定した。培養時の環境条件は後述の生長阻害試験方法に準じて行った。
葉 面 積 は、 高 さ を 固 定 し た デ ジ タ ル カ メ ラ（Nikon 製，D3300）を用いて、ライトパネル上（CABIN 製，CL-5300N LED）に設置した試験容器を上方から撮影し、画像処理ソフト（Adobe,Photoshop Elements 8.0） を 用 い て 葉 面 の ピ ク
セル数を算出し、得られたピクセル数から面積（mm2）に換算した。

15加藤貴央ら

乾燥重量は、ペーパータオルで植物体の余分な 水 分 を 取 り 除 き、60 ℃ に 設 定 し た 恒 温 器 で
2 日 間 乾 燥 さ せ た 後、 電 子 天 秤（Sartorius 製，R-200D）を用いて測定した。
2.4 生長阻害試験
2.4.1 環境条件
前培養期間および曝露期間における培養は照明（NEC 製，FL8N，昼白色蛍光灯）付きインキュベーター（IKUTA 製，A4201D2L）内で、日長 16 時
間、光量子束密度 100 ± 20 µE/m2/s の条件で静り半数影響濃度（ErC50）を算出した。なお、試験開始時の乾燥重量は葉面積から推定した値を用いた。
試験の再現性を検討するため、各被験物質についてそれぞれ 3 反復で生長阻害試験を実施した。

3.

2.4.2 試験設計
被験物質として作用機構の異なる除草活性を有する 3 種の成分、シメトリン（和光純薬工業，Traceable Reference Material）、2,4- ジクロフェノキシ酢酸（2,4-D）（関東化学，農薬残留試験用）
および 3,5- ジクロロフェノール（3,5-DCP）（和光純薬工業，一級）を用いた。各被験物質を助剤（0.1% tween20 含有アセトン）を用いて SIS 培地に溶解させ、段階的に希釈し設定濃度の試験溶液を調製した。試験区を公比 2 で 5 ～ 6 濃度区設定し、助剤対照区および試験区における繰り返し数をそれぞれ 6 連とした。助剤対照区の助剤濃度は0.1 mL/L とした。
曝露開始時に葉面積、曝露終了時に葉面積および乾燥重量を 2.2 および 2.3 で検討した方法で測定した。被験物質の設定濃度および各測定項目に基づいた生長速度の阻害率から非線形回帰法によTABLE 1. Growth rate and doubling time for Veronica
undulata of incubation under different
temperatures
Incubation
temperature ( ℃)

Growth rate (/day)

Doubling time (day)

1820
22
24

0.34
0.36
0.39
0.41

2.02
1.92
1.76
1.69

The values are the mean (n =3)

3.2 観察項目
カワヂシャの子葉期から 4 ～ 5 葉期までの各段階における葉面積および乾燥重量を測定したとこ
ろ高い相関が認められた（Fig.2）。
0.45

R² = 0.9744

0.400.35

Dry weight (mg)

置培養を行った。温度条件は前培養時が 17 ± 2℃、曝露期間は 24 ± 2 ℃とした。培地は SIS 培地 2）（pH6.5、0.2 µm フィルター濾過）を用い、容器は前培養時が 96 ウェルマルチプレート（Thermo製，ポリスチレン製，培地 200 µL/ ウェル）、曝露時には 12 ウェルマルチプレート（Thermo 製，ポリスチレン製，培地 3 mL/ ウェル）を用いた。
培地の蒸発を防ぐため、容器と蓋の隙間はパラフィルムで封じた。
カワヂシャ種子を SIS 培地に播種した日を開始日として約 11 日間、前培養を行った。前培養後、子葉が展開した状態の幼体を後述の方法で調製した試験溶液に移した。曝露期間は OECD-TG221の条件と合わせ 7 日間とした。

結果

3.1 培養温度
最適培養温度条件を葉面積に基づく生長速度を指標として検討したところ、いずれの温度区でも試験の妥当性基準（倍加期間が 2.5 日未満 2））を満たす生長が見られた（TABLE 1）。検討した温度条件のうち、24℃区の生長速度が最も高かった
こと、および作業効率の観点から OECD-TG221の条件と合わせるため、カワヂシャ生長阻害試験における培養温度は 24 ± 2℃とした。

0.300.250.200.150.100.050.00

02030

Leaf area (mm2)4050

Fig.2. Correlation between dry weight and leafarea.

1610カワヂシャ生長阻害試験

OECD-TG221 と同様、カワヂシャの生長阻害試験においても、葉面積を測定項目として利用できると考えられた。
3.3 生長阻害試験
対照区の試験期間（7 日間）における生長速度（倍加期間）は葉面積および乾燥重量でそれぞれ2.5 日未満であり、OECD-TG221 の試験の妥当性基準 2）を満たしていた。助剤対照区において助剤の影響は認められなかった。
いずれの被験物質を用いた試験区においても容Solvent control

量反応的影響が認められた（Fig.3，4）。各生長阻害試験結果から算出された ErC50 を TABLE 2に示す。各除草剤の 3 反復試験における ErC50（0-7日間生長速度）の変動率は、葉面積・乾燥重量いずれの測定項目に基づいた場合でも 20% 以下であった。

4.

考察

生長阻害試験の結果より、本試験手法は ErC50（0-7 日間生長速度）を評価指標とした場合、試験結果は十分な精度を有すると考えられ、双子葉

6.3 µg/L

12.5 µg/L

25 µg/L

50 µg/L

Solvent control 100 µg/L

200 µg/L

400 µg/L

800 µg/L

1,600 µg/L

1,600 µg/L

3,200 µg/L 6,400 µg/L 12,800 µg/L

100 µg/L

2,4-DSimetryn

3.1 µg/L

3,5-DCP

Solvent control 800 µg/L

Fig.3. Influence of Simetryn, 2,4-D and 3,5-DCP on Veronica undulata after 7 days.

100120806040202,4-D

1008060402000

Concentration (µg/L)-20120Inhibition rate (%)

Simetryn
Inhibition rate (%)

Inhibition rate (%)

1203,5-DCP

100806040200

Concentration (µg/L)

Concentration (µg/L)

Fig.4. Concentration-growth inhibition rate relationship for test items.

17加藤貴央らTABLE 2. ErC50 (µg/L) values for Veronica undulata
based on leaf area and dry weight
Substance

Simetryn

2,4-D

3,5-DCP

Test NO.

試験は双子葉の水生植物への化学物質の影響をより簡易に評価できる試験法であると言える。EU等の海外で試験を実施する場合は、カワヂシャの近縁種であり、ヨーロッパからアジア原産のオオカワヂシャで代替することで本試験が実施可能と考えられる。
今回の試験に用いたカワヂシャは東京都で採取した 1 系統のみであるため、試験生物の系統確立には、今後、薬剤感受性の地域間差の調査を行う必要がある。

ErC50
Leaf area

Dry weight

12

22.5
17.3

10.8
16.3

3

17.5

14.2

Ave.
C.V.

19.1
15.4%

13.8
19.8%

1546

1135

23631
577

939
958

Ave.

585

1011

C.V.

7.3%

10.7%

12

3341
3169

3263
3215

33671

3301

Ave.
C.V.

3394
7.5%

3259
1.3%

5.の水生植物に対する農薬の影響評価が可能であることが示唆された。本研究の結果から定めたカワヂシャ生長阻害試験の試験条件を TABLE 3 に示す。本試験法は試験容器をマルチプレート、測定項目を葉面積としており、他試験法と比べて必要とする試験スペース及び培地等が少なく、植物の計測に特別な装置や技術を必要としないため、簡便な試験法と言える。カワヂシャ生長阻害試験は日長および容器を除き、OECD-TG221 に概ね準拠した培養条件で実施可能であり（TABLE 3）、汎用性の高い試験と考えられた。カワヂシャの種子は長期間保存可能で発芽率も高く 14）、前培養を行うのみで試験に供試可能であるため、本試験における試験生物の維持および準備は容易であった。
カ ワ ヂ シ ャ の シ メ ト リ ン、2,4-D お よ び 3,5DCP に対する感受性を他水生植物種と比較したところ（TABLE 4）、双子葉植物に対して特異的に活性が高い 2,4-D については、緑藻および単子葉植物であるウキクサと比べて 100 倍以上高い感受性を示した。また、同じ双子葉植物であるホザキノフサモとは 2,4-D および 3,5-DCP について同程度の感受性を示した。難易度の高いホザキノフサモ生長阻害試験と比べ、カワヂシャ生長阻害18

結論（まとめ）カワヂシャを供試植物とした生長阻害試験法を開発した。シメトリン、2,4-D および 3,5-DCP を被験物質として試験を実施し、良好な結果が得られた。本試験法は SSD の推定における生物種を拡充し、確立論的リスク評価に資することが期待される。当該試験は汎用性が高く、簡易な試験方法であることから、双子葉の水生植物に対する化学物質の影響評価において、ホザキノフサモ生長阻害試験（OECD-TG238 および 239）の代替法としての利用も可能と考えられる。

カワヂシャ生長阻害試験

TABLE 3.

Method of growth inhibition test using Veronica undulate, and comparison with OECD test
guidelines which using other organism
Growth inhibition
test using
Veronica undulata

OECD TG-221

Veronica undulata

Lemna minor ,Lemna gibba

Myriophyllum Spicatum

Pseudokirchneriellasubcapitata(Dicotyledon)(Monocotyledon)(Dicotyledon)(Alga)

M edium

Modified Swedish
standard (SIS)

Modified Swedish
standard (SIS)(Lemna minor ),20X-AAP(Lemna gibba )Modified Andrews'
medium(Containing sucrose)

Smart and Barko(With sediment)

OECD medium,
AAP medium

Vessel12 well multi plate(φ22.1 mm,3 mL/well)

Glass beakers(100 mL)

Glass tubes(φ20 mm,Length 250 mm)

Glass beakers(2 L)

Glass flasks

Pre culture (day)117 - 1014 - 21

≧21

Test duration (day)

7714

3

Dilution ratio

2≦3.2

≦3.2

≦3.2

Concentrations

5-6

≧55-7

≧55Replicates

6≧3

≧5≧43

Temperature (℃)

24±224±2

23±2

20±2

21 - 24

Light-Dark cycle (h)

16:8

24:0

Lighting intensity

100 ± 20 µE/m /s

285 - 135 µE/m /s

Endpoint

Total leaf area

Number of fronds

Shoot length

Dry weight,
Cell counts

Type of ECx

ErC

ErC, EyC

ErC, EyC

ErC, EyC

Organism

OECD TG-238

OECD TG-239

*2-4

24:0

16:8
22

100 - 150 µE/m /sOECD TG-201

2140 ± 20 µE/m /s

260 - 120 µE/m /s*Last seven days are culture with sediment.

TABLE 4.

Comparison of the sensitivity for simetryn, 2,4-D and 3,5-DCP of aquatic plants

ErC50（µg/L）

SpeciesVeronica undulata (Dicotyledon)
Myriophyllum Spicatum (Dicotyledon)
Pseudokirchneriella subcapitata (Alga)

Simetryn

2,4-D

3,5-DCP

19585

3,39415)16)

6.43818)

Lemna sp. (Monocotyledon)

191,30016)
58,000>100,00019)

15)

8,30017)2,4003,60020)

加藤貴央ら

参考文献
1）J.F. Fairchild（1996）Comparative sensitivity of
Selenastrum capricornutum and Lemna minor
to sixteen herbicides，Archives of Environmental
Contamination and Toxicology, 32（4）, 353-357．
2）OECD（1995）Guidance document for aquaticeffects assessment. Organization for Economic
Co-operation and Development, Paris．
3）OECD（2006a）Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test, OECD
guidelines for the testing of chemicals 201.
4）OECD（2006b）Lemna sp. Growth Inhibition
Test, OECD guidelines for the testing ofchemicals 221.
5）OECD（2014）Myriophyllum spicatum Toxicity Test: Results of an inter-laboratory ring
test using a sediment-free test system，OECDEnvironment, Health and Safety Publications(EHS) Series Testing and Assessment，No.205．
6）OECD（2014a）Sediment-Free Myriophyllum
Spicatum Toxicity Test, OECD guidelines for11）石原悟（2012）水生シダサンショウモ（栄養繁殖個体）を供試生物とした生長阻害試験法の検討，農林水産消費安全技術センター 平成
24 年度調査研究報告．
12）石原悟（2012）日本雑草学会第 57 回講演会
13）加藤貴央，石原悟（2015）室内培養によるカワヂシャ（Veronica undulata）の種子生産および種子発芽率について，水草研究会誌，
102 号，19-23．
14）角野康郎（2014）日本の水草，文一総合出版，283pp.
15）佐々木英代（2004）カワヂシャ、オオカワ
ヂシャの発芽特性について−家庭用電気冷蔵庫を利用した発芽試験−，水草研究会誌，
NO.80，6-10．
16）永井孝志，稲生圭哉，横山淳史，岩船敬，堀尾剛（2009）水稲用除草剤の確率論的生態リスク評価，日本リスク研究学会第 21 回年次大会講演論文集，22，397-402．
17）日本植物防疫協会（2005）農薬ハンドブック．
18）農業環境技術研究所（2014）河川付着藻類を用いた農薬の毒性試験マニュアル．
19）農林水産省（2000）農薬の登録申請に係る試
験成績について，12 農産第 8147 号農林水産省農産園芸局長通知
20）山崎敬（1981）“ゴマノハグサ科”，佐竹義輔・大井次三郎・北村四郎・亘理俊次・富成忠夫，
日本の野生植物 草本Ⅲ 合弁花類，平凡社，
97-128pp.

the testing of chemicals 238.
7）OECD（2014b）Water-Sediment Myriophyllum
Spicatum Toxicity Test, OECD guidelines forthe testing of chemicals 239.
8）石原悟，佃美和（2010）Lemna 属ウキクサを用いた生長阻害試験の試験条件の検討，雑草研究，NO.55，152．
9）石原悟，佃美和，清野義人（2010）アオウ
キクサ類を供試生物としたウキクサ生長阻害試験の試験条件，環境毒性学会誌，13（2），131-139．
（受付：2018 年 4 月 19 日；受理 2018 年 6 月 27 日）
10）石原悟（2011）ミジンコウキクサを供試生物とした生長阻害試験法の検討，農林水産消費安全技術センター 平成 23 年度調査研究報告．

20