Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)ISSN 2186-9936

Aug. 2013
第12巻 第1号

Journal of Japanese Society for Extremophiles

巻頭言 ………………………………………………………

１

研究最前線 …………………………………………………

3

研究奨励賞受賞研究 ………………………………………

5

ORIGINAL PAPER …………………………………………… 15
学会記事 ……………………………………………………

33

学会誌投稿規定・執筆要領 ………………………………… 35
会則・細則 …………………………………………………… 37
運営体制 ……………………………………………………

39

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)

巻頭言Archaea の膜質研究との出会い

伊藤佑子
創価大学工学部・生命情報工学科

教授

Carl Woese 博士が、2012 年 12 月 30 日に Illinoi
州 Urbana の自宅で逝去された。84 歳であった。昨
年改訂された高等学校生物の指導要領に基づいた教科書や資料集を見ると、「生物の進化のしくみ」の章には海底熱水鉱床の写真の説明にアーキアが登場し、「 生 物の 分類 と 系統 」の 章 では 小サ ブ ユニ ット
rRNA の塩基配列に基づく生物の系統樹が示されて、Woese が提唱した３ドメイン説が紹介されている。
分子進化に基づく生物の進化系統関係の研究は、Frederick Sanger によって開発された RNA のオリ
ゴヌクレオチドカタログの解析で本格化した(1965)。
日本の国菌ともいえる Aspergillus orizae（コウジカビ）のタカジアスターゼから、1957 年に佐藤仁子と江上不二夫によって発見された G 特異的 RNase
T1 の塩基特異性の高さがカタログ作成に決定的な意味をもっていた。さらに、内田庸子をはじめとす
る Woese の グ ル ー プ に よ っ て 、 Ustilago
sphaerogena（黒穂菌）の培養ろ液中から発見されたプリン特異的 RNase U2 を組み合わせたことが、RNA の塩基配列決定法をより確実なものとした(1974)。Woese の 3 ドメイン説誕生（1977）の基盤に、日本の酵素化学が多大な貢献をしていたことを思い起こしてみることも無駄ではあるまい。
慶応義塾大学医学部分子生物学教室で、ファージ
RNA レプリカーゼの抽出と反応機構解明の研究に参加して以来、生命の起源といえば RNA ワールド
を 念 頭に 置い て きた 私の 関 心が 、好 酸 性好 熱性Archaea の膜脂質になった背景には、Woese の 3 ド
メイン説の発表がある。アメリカから帰国後、私は
北里大学教養部化学研究室に研究生としてお世話になリ、それまでの核酸や酵素を相手とする仕事から、同研究室で続けられてきた細胞膜脂質の研究に立ち位置を移した。少し脂質の扱いに馴れた頃、好熱性
1Archae の膜脂質の研究が始まった。1978 年「蛋白質核酸酵素」（23 巻 2 号、p156-158）に内田庸子により「第三の生物、メタン生産菌の同定と細胞進化の概念」が紹介されてから、既に 2 年以上経っていた。
細胞性生物にとって、脂質は自己を外界から独立した存在として位置づける必須の化学物質である。
生命誕生の背景には、宇宙に於ける化学進化の過程
で脂質様物質が生じることが必要であったに違いない。分子進化という観点から、好熱性微生物が、現存する生物の共通の祖先に一番近いと看做されること、それらの中の Archaea（当時は Archaebacteriaと呼んでいた）の細胞膜脂質がユニークな構造をしていることを知り、私の研究対象がこの時に決まった。それ以来、好酸性好熱 Archaea とのお付き合いが続いており、極限環境生物学会での多くの方々との交流が続いている。
Archaea の脂質はグリセロールの sn-2 位と sn-3位にイソプレノイド鎖がエーテル結合しており、
sn-1 位と sn-2 位に脂肪酸がエステル結合している
Bacteria と Eukarya の脂質とは光学異性の関係にある。地球上の全生物のタンパク質を構成するアミノ酸が L 型アミノ酸のみであることと対比して考えると、生命誕生の時期に、光学異性体の一方のみを選択的に使用することになったタンパク質に対し、両者が使用されることになった膜脂質の構造には、
化学進化の上でどのような意味があったのだろうか。
未だに解けない謎の一つである。
高温、高塩濃度、嫌気状態などの Archaea の生育
環境はいずれも厳しく、実験環境を整えるにも困難がつきまとい、研究者数の少なさは 3 ドメイン説の定着の難しさにも影響していたのではないかと思われるが、細胞膜脂質のユニークな構造は、この生物群が Bacteria とも Eukarya とも異なることを納得させる十分な特徴であった。Archaea の脂質の研究
は、1970 年代から 1990 年代前半にかけて、Moris
Kates が 好 塩 菌 を 、 Thomas A Langworthy や
Mario De Rosa が好熱菌を対象として精力的に行われ た 。古 賀洋 介 らの メタ ン 菌の 研究 は 、日 本のArchaea 研究を代表するものの一つといえる。この頃には、代表的ないくつかの菌株について、膜脂質以外の細胞の構造と機能についても多くのことが明らかになり始めており、1993 に 理化学研究所（和光 ） で 行 わ れ た “ International Workshop for
Molecular Biology and Biotechnology ofExtremophiles and Archaebacteria”は、ゲノム時

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)的にも注目され、近年、Archaea を対象とする DNA
やタンパク質の研究者が急激に増えてきた。第１期の Archaea の脂質研究者の多くは研究現場から離れる時期を迎えているが、質量分析技術などの進歩に伴って、Archaea のエーテル型脂質の構造に関する Lipid Bank のデータも精査され、充実してきている。今こそ、新たなアプローチで、膜脂質の構造と機能の解明に向かう時ではないだろうか。若手研
究者の研究の発展に期待している。

代幕開け以前の第１期 Archaea 研究の最盛期に開かれたといえよう。
DNA の標的領域が PCR 法によって容易に増幅され、好熱菌の DNA ポリメラーゼが PCR 法の自動化
を 可 能に して 以 来、 膨大 な 量の 小サ ブ ユニ ット
rRNA 遺伝子の塩基配列データが蓄積されたことにより、現在では 3 ドメイン説も広く受け入れられるようになった。また、耐熱性酵素をはじめとする極限環境生物のタンパク質の特性が、科学的にも産業

Prof. Carl R. Woese (1928-2012)
Science 8 February 2013: vol. 339 no. 6120 661

2

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)研究最前線

バクテリアにおけるタンパク質単鎖アシル化修飾の解明を目指して

東京大学生物生産工学研究センター

微生物機能代謝工学研究室

2012 年の春、長年慣れ親しんだ理研を離れ、東京大学生物生産工学研究センター内に新設された微生物機能代謝工学研究室の特任准教授として着任をしました。当研究室は協和発酵キリン株式会社からの寄附講座として設立され、「微生物」と「代謝」をキーワードに農芸化学における新しい分野を開拓することをミッションとしており、現在はバクテリアのタンパク質アシル化修飾に関する研究を展開しています。
理研では、工藤俊章先生（前理化学研究所主任研究員、前長崎大学教授、現当学会副会長）が主催される環境分子生物学研究室で 12 年間、吉田稔先生（現理化学研究所主任研究員、グループディレクター）が主催される化学遺伝学研究室で 4 年間、合わ
せて 16 年のあいだ研究活動に従事してきました。工藤研在籍時には好アルカリ菌で初めて同定された
Na+/H+アンチポーターについて研究してきましたが、工藤先生が理研を定年退職された後、吉田研に移ってバクテリアのタンパク質アセチル化に関する研究を始めました。そこでは、吉田稔先生ご自身による
3

古園さおり

ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるトリコスタ
チン A の発見を機に、真核生物でのタンパク質アセチル化研究が活発に展開されていましたが、そこにバクテリアのことしか知らない私が飛び込んだのです。私が吉田研の扉をたたいたのは 2008 年ですが、
ほ 乳 類細 胞で 最 初の アセ チ ロー ム解 析 の論 文が2006 年に報告され、それまで主に核内のヒストンや転写因子で知られていたタンパク質アセチル化が、実は意外にもミトコンドリアで頻繁に起こっている
事実が明らかとなった頃でした。吉田先生から、「ミ
トコンドリアにアセチル化タンパク質がたくさんあるんだけど、バクテリアにもきっとあるんじゃな
い？調べてみない？」と言われたのがきっかけで現在の研究テーマを始めました。その当時バクテリアのアセチロームの論文はまだ出ておらず、バクテリ
アで知られているアセチル化タンパク質と言えばア
セチル CoA 合成酵素と走化性タンパク質 CheY くらいでした。早速扱い慣れた枯草菌を対象にアセチル化タンパク質の同定に着手し、幸いにも質量分析装
置がめざましく進歩した時期に重なったこともあり、

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)を明らかにしていきたいと考えています。
ところで、16 年ぶりの大学ですが、やはり研究所（理研）との文化の違いをさまざまな場面で感じています。当然のことながら大学では学生が主役として活躍しており、学生ならではの若々しい活気とエネルギーに溢れています（まるで自分も若返ったよ
うな錯覚を覚えます）。私が所属する専攻ではソフト
ボールが非常に盛んで、年に 2 回の研究室対抗ソフ
トボール大会の他、他大学との交流試合などソフトの機会には事欠きません。一体いつ実験しているのだろう？と思いますが、ゼミでの発表を聞くとやるべきことはちゃんとやっているので感心します。またようやく「先生」と呼ばれることにも慣れてきました。
今年の 4 月から 2 名の新メンバーを得て、5 人の体制でやっています。対象とするバクテリア種は枯草菌、コリネ菌、好熱菌とさまざまで、それぞれの種に特徴的でユニークな短鎖アシル化修飾の意義を明らかにしようとみな研究に励んでいます。もとは機械室だった部屋を改装して立ち上げた実験室には
メンバー全員のベンチがあり、議論や世間話が絶えずあちらこちらで飛び交っています。頼りない PI
で、彼らに支えてもらうことも多いのですが、私自身も彼らが気持ちよく研究に専念できるよう環境を整えてゆくことが自分の役目と心得て、日々精進しています。

試行錯誤の末 100 を越えるアセチル化タンパク質を同定することに成功しました。同定したタンパク質
アセチル化の意義を明らかにするために、現在も引き続き研究を行っています。
タンパク質アセチル化・脱アセチル化の反応にはアセチル CoA や NAD+などのメタボライトが利用されることから、代謝とリンクしたタンパク質の機能調節に関わると考えられています。また最近ではアセチル化以外にも、スクシニル化、マロニル化、プロピオニル化、ブチリル化、クロトニル化といった新しい修飾が発見されています。これらの修飾はすべて代謝に由来する CoA 体を利用していると考
えられ、またアセチル化酵素や脱アセチル化酵素と同じファミリーの酵素がこれらの修飾にも関わることが示唆されており、総称して「短鎖アシル化修飾」と呼んでいます。同じリジン残基に対して異なる短鎖アシル化修飾が検出されることがしばしばあり、
いつどのアシル化修飾が入るのか、アシル化修飾の違いによってタンパク質の機能が変わるのかなど、
アシル化修飾の複雑なネットワークが垣間見えています。真核生物ではタンパク質の機能発現における翻訳後修飾の重要性は良く知られていましたが、原核生物でも翻訳後修飾はタンパク質機能の発現と多様性を生み出すために重要な役割を果たしていると考えられ、扱いやすいバクテリアを用いた研究から
短鎖アシル化修飾ネットワークの全貌や新しい意義

4Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)

極限環境生物学会
研究奨励賞受賞研究

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12, 5-9

Inoue K.

Biodegradation and electricity generation by microbial electron transfer

Interdisciplinary Research Organization、 University of Miyazaki
Corresponding Author: Kengo Inoue、 kinoue@cc.miyazaki-u.ac.jp
Phone: +81-985-85-1843、 Fax: +81-985-85-1843

微生物の電子伝達による環境汚染物質分解と発電
宮崎大学 ＩＲ推進機構 井上謙吾
好気的に分解するものが知られている 1)。その一種である Pseudomonas resinovorans CA10 株はカルバゾール分解系遺伝子（car 遺伝子）・酵素について解析された最初の例として精力的に研究が行われきた。
筆者が本研究に着手し始めた当時は、CA10 株以外のカルバゾール分解菌の報告例は少なく、その遺伝
子・酵素の多様性についての知見はほぼ皆無であった。そこで、car 遺伝子の多様性や自然界中での分解系遺伝子の水平伝播のメカニズムを明らかにすることを目的として、環境サンプルからのカルバゾー
ル分解菌の単離、及びそれらの分解系遺伝子の解析を行った 2,3)。合計 27 株の分解菌を単離し、各株が持つ car 遺伝子を調べたところ、Janthinobacterium sp.
J3 株が持つ car 遺伝子群の様に CA10 株由来 car 遺伝子と類似の遺伝子を持つ株以外にも、
Novosphingobium sp. KA1 株が持つ car 遺伝子と類似遺伝子が広く保存されていることが明らかになった（図２）。また、Nocardioides aromaticivorans IC177
株はカルバゾール資化菌として報告された世界初のグラム陽性細菌になったが、その car 遺伝子の解析と各 car 遺伝子産物の機能解析からグラム陰性細菌と同様の分解代謝系を持つことが示唆された 4)。

はじめに生物が呼吸を行う際、そこには必ず電子供与体と電子受容体が存在する。ヒトであれば、食物から得られたグルコースなどが電子供与体、酸素が電子受容体となるが、微生物においては、電子供与体、電子受容体となる物質は共に多様である。微生物による自然界における物質循環や人類にとって有用な物
質の生産は、このような電子の流れに基づいた代謝によるものである。微生物が電子供与体として環境汚染物質を利用・分解するならば環境浄化へ、一方、
電子受容体として電極を利用するならば微生物燃料電池として応用可能である。本稿では、1. 環境汚染
物質カルバゾールの微生物分解と 2. 微生物燃料電池についてこれまで筆者が行ってきた研究を紹介する。
1．環境汚染物質分解カルバゾールの微生物分解
1-1. カルバゾール分解菌の多様性
カルバゾールは原油中に含まれる環境汚染物質の一種であり、毒性、変異原性を有するヘテロ環芳香族化合物である（図 1）。微生物の中にはカルバゾー
ルを炭素源、窒素源、エネルギー源として利用し、

図１．CARDO が触媒する反応

5Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)図２．カルバゾール分解菌の car 遺伝子群の多様性

1-2. カルバゾールジオキシゲナーゼ（CARDO）の電子伝達機構上記 CA10 株をはじめとする細菌によるカルバゾ
ー ル 分 解 の 初 発 酸 化 反 応 は carbazole 1 、
9a-dioxygenase (CARDO)により触媒される（図 1）。
CARDO は termianl oxygenase （CARDO-O）と 2 つの電子伝達コンポーネント、ferredoxin （CARDO-F）と ferredoxin reductase （CARDO-R）から構成される酵素で（表）、Rieske non heme iron oxygenase （RO）の一種である。これまで知られている RO においては、同じ基質を触媒する RO は同じクラスに属する（同じタイプの電子伝達コンポーネントを持つ）ことが通例であったが、それに反して、CA10 (J3)、KA1、IC177 株は互いに異なるタイプの電子伝達コンポー
ネント持っていた（表）。そこで、この多様性を利用した RO の電子伝達メカニズムの解明を新たな研究課題として CARDO の酵素学的研究を行った。IC177

6

株由来 CARDO の各コンポーネントを精製し、他のクラス由来 CARDO のコンポーネントとの互換性の解析を行った結果、CARDO-O と CARDO-F の間には高い特異性があり、本来の組み合わせでのみ効率的に電子が伝達されることが明らかになった。この高い特異性が何に起因するのかを明らかにするため、IC177 株の CARDO-O と CARDO-F の立体構造を決定し、既に明らかになっていたクラスⅢCARDO（表）の CARDO-O:CARDO-F 電子伝達複合体との比較解
析から、電子伝達複合体の形成には、酵素表面の形状、及び、相互作用するアミノ酸残基の立体的位置が重要であることを明らかにした 5)。これまでに、
terminal oxygenase と ferredoxin のタンパク質間相互作用を立体構造レベルで明らかにした例は他の ROにはなく、本研究成果は当該分野で唯一詳細が明らかになっている例であるといえる。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)

理的大きさを持った電気伝導性物質にも電子を伝達できるため、微生物燃料電池として利用可能である（図３）。微生物燃料電池ではアノード電極表面に微生物がバイオフィルムを形成し、そこで電極への電子伝達が行われる。本株は純粋培養系の微生物燃料電池において最も高い発電能力を有することが知られており、未知の微生物群集を植種源とした複合系の微生物燃料電池でも、多くの場合アノード電極表面に G. sulfurreducens の近縁種が優占的に増殖し、発電に中心的な役割を果たすことが知られている。
G. sulfurreducens ゲノム中には 100 を超える c 型シト
クロム遺伝子が存在し（大腸菌では 7 個）、これらが酸化鉄などの細胞外電子受容体への電子伝達に関与していることが示唆されてきた（図４）。

2．微生物燃料電池についての基礎的研究
土壌中や川底・海底など地球表層は嫌気的環境が多くを占めるが、嫌気的環境の至るところに細菌が存在し、硝酸、硫黄、硫酸、鉄など様々な物質を電子受容体とした呼吸を行っている。鉄還元細菌は有機物を電子供与体として酸化鉄（Ⅲ）やマンガンといった金属を電子受容体とした「異化的鉄還元」と呼ばれる呼吸形式を行う。鉄還元細菌の中でも代表的な Geobacter 属細菌は自然環境中に広く分布し、酢酸などの有機酸を好んで電子供与体として利用する 6)。Geobacter 属細菌の中でも最も多くの知見が蓄積している G. sulfurreducens は、2003 年に全ゲノムが発表され、遺伝子改変系も利用可能である。G.
sulfurreducens は 不 溶 性 の 酸 化 鉄 （ Ⅲ ）（ hematite:
Fe2O3）のみならず、炭素電極のようにある程度物

図３．微生物燃料電池の例

図４．Geobacter sulfurreducens の予想細胞外
電子伝達経路しかし、電流生成に関与することが実験的に証明されている遺伝子・酵素として報告されているものの数は極めて少なく（現在までのところ pilA、omcZ、
xapD の３種のみである 7-9)）、未解明な点が多く残っている。その謎を解明するべく、発電時に高発現する遺伝子を特定するためにトランスクリプトーム解析が行われた結果、発電時には pilA（線毛を構成す
るタンパク質をコードし、電気伝導性ナノワイヤーの構成単位と考えられている；図５）、及び、omcZ（outer membrane cytochrome Z）と命名された c 型シトクロムの発現量が著しく増加することが明らかになった 8)。omcZ 遺伝子破壊株は微生物燃料電池での発電能力が有意に低下していることが明らかとなったが、omcZ は本株が持つ c 型シトクロムの中で唯一発電能力に影響を与える遺伝子である。omcZ 遺伝子から予想されたアミノ酸配列を詳しく見てみると、
N 末端側にペリプラズム移行シグナルが存在し、分子の N 末端側半分に 7 つの c 型ヘム結合モチーフ（CXXCH）が集中して見出された。OmcZ を精製し、その生化学的特徴づけを行うことで、OmcZ の詳細な機能について解析を行った 10)。その結果、精製された OmcZ の分子サイズは約 30 kDa と塩基配列から予想されたもの（約 50 kDa）より小さく、その C 末
端配列を決定したところ推定アミノ酸配列全長の中間あたりに位置していた。また、1 分子中に 8 つの c型ヘムを持つことが明らかとなったが、上記 7 つの一般的な c 型ヘム結合モチーフ以外に CX14CH という特殊な c 型ヘム結合モチーフを 1 つ持つことが示唆された。それ以外にも、熱変性温度は 94.2℃と非常に高く安定なタンパク質であること、-420～-60
7

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)の電子を電極へ直接伝えることが強く示唆された。
以上の OmcZ についての解析から、OmcZ はまず、
N 末端側のペリプラズム移行シグナルによりペリプ
ラズムへ局在した後、何らかの機構によって細胞外へ分泌され、その過程あるいはその後に何かしらの開裂反応を経て、N 末端側（ヘム c が 8 個含まれる）の分子が電極表面に局在することが予想された。G.
sulfurreducens が形成するバイオフィルムは電気伝導性を有することが明らかになっていることから 12)、
細胞間の電子伝達には電気伝導性ナノワイヤーが、バイオフィルムから電極への電子伝達には OmcZ が重要な役割を果たすと考えられる。

mV（vs 標準水素電極）と広い酸化還元域を持つことなどが明らかになった。さらに OmcZ の微生物燃料電池内での役割をより明確化するため、免疫学的手法と透過型電子顕微鏡を使った方法により OmcZの局在性の解析を行った。微生物燃料電池内のアノード表面に形成された G. sulfurreducens のバイオフ
ィルムを電極ごと樹脂に包埋して作製した超薄切片について、OmcZ 特異的抗体を用いた免疫金コロイ
ド標識を行い、透過型電子顕微鏡にて観察したところ、OmcZ はバイオフィルム内の細胞外マトリクスの至るところに局在していた 11)。さらに、OmcZ は電極表面に非常に高い密度で存在することが明らかになった（図５）。本研究により、OmcZ が菌体から

図５．微生物燃料電池において、Geobacter sulfurreducens がアノード表面に形成するバイオフィルムの電子伝達モデル
謝辞
本研究は、東京大学生物生産工学研究センター環境保全工学部門、米国マサチューセッツ大学微生物学部、宮崎大学 IR 推進機構にて行われたものです。
野尻秀昭東京大学教授には、学生時代から現在にいたるまで厳しくも温かいご指導をいただき、また、研究の面白さをご教授くださいました。心から御礼申し上げます。研究の機会をお与えくださり、ご指導ご鞭撻いただきました大森俊雄東京大学名誉教授、
山根久和東京大学名誉教授（現帝京大学理工学部教授）に深く感謝いたします。微生物燃料電池の研究におきましては、多大なご指導、ご鞭撻を賜りまし
た Derek R. Lovley マサチューセッツ大学教授に厚く御礼申し上げます。ここで全ての方々のお名前を挙げることは叶いませんが、本研究に携わった共同研
究者の皆様に深く感謝いたします。

おわりに現在、我々の研究室では、引き続き微生物燃料電
池の発電メカニズムの解明に向けた研究を行っており、発電に必須な遺伝的因子の探索やより高い出力での発電に必要な因子を探っている。微生物燃料電
池は有機廃棄物や有機排水を燃料とした浄化と発電を同時に行う技術としての応用研究が急速に進められており、当研究室においても、宮崎県で多く発生する牛糞を燃料とした微生物燃料電池の開発を行っている 13)。今後、微生物燃料電池についての基礎的知見が蓄積することによってその応用・実用化が進
み、微生物燃料電池が高度に無駄のない社会の実現へ貢献することを期待したい。

8

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)参考文献
1) Nojiri, H. 2012. Structural and molecular genetic
analyses of the bacterial carbazole degradation
system. Biosci. Biotechnol. Biochem. 76:1-18.
2) Inoue, K., Widada, J., Nakai, S., Endoh, T., Urata, M.,
Ashikawa, Y., Shintani, M., Saiki, Y., Yoshida, T.,
Habe, H., Omori, T., and Nojiri, H. 2004. Divergent
structures of carbazole degradative car operons
isolated from Gram-negative bacteria. Biosci.
Biotech. Biochem. 68:1467-1480.
3) Inoue, K., Habe, H., Yamane, H., Omori, T., andNojiri, H. 2005. Diversity of carbazole-degrading
bacteria having the car gene cluster: Isolation of anovel Gram-positive carbazole-degrading bacterium.
FEMS Microbiol. Lett. 245:145-153.
4) Inoue, K., Habe, H., Yamane, H., and Nojiri, H. 2006.
Characterization of novel carbazole catabolism genes
from Gram-positive carbazole degrader Nocardioides
aromaticivorans IC177. Appl. Environ. Microbiol.
72:3321-3329.
5) Inoue, K., Ashikawa, Y., Umeda, T., Abo, M., Katsuki,J., Usami, Y., Noguchi, H., Fujimoto, Z., Terada, T.,
Yamane, H., and Nojiri, H. 2009. Specificinteractions between the ferredoxin and terminal
oxygenase components of a class IIB Rieske
nonheme iron oxygenase, carbazole 1,9a-dioxygenase.
J. Mol. Biol. 392:436-451.
6) Lovley, D. R. et al., 2011. Geobacter: The microbe
electric’s physiology, ecology, and practicalapplications. Adv. Microb. Physiol. 59:1-100.
7) Reguera, G., Nevin, K. P., Nicoll, J. S., Covalla, S. F.,
Woodard, T. L., and Lovley, D. R. 2006. Biofilm andnanowire production leads to increased current in
Geobacter sulfurreducens fuel cells. Appl. Environ.
Microbiol. 72:7345-7348.
8) Nevin, K. P., Kim, B.C., Glaven, R. H., Johnson, J.P.,

Woodard, T.L., Methé, B.A., Didonato, R.J., Covalla,
S.F., Franks, A.E., Liu, A., and Lovley, D.R. 2009.
Anode biofilm transcriptomics reveals outer surface
components essential for high density current
production in Geobacter sulfurreducens fuel cells.
PLoS One. 4:e5628.
9) Rollefson, J. B., Stephen, C. S., Tien, M., and Bond,
D. R. Identification of an extracellular polysaccharide
network essential for cytochrome anchoring andbiofilm formation in Geobacter sulfurreducens. 2011.
J. Bacteriol. 193:1023-1033.
10) Inoue, K., Qian, X., Morgado, L., Kim, B.-C., Mester,T., Izallalen, M., Salgueiro, C. A., and Lovley, D. R.
2010. Purification and characterization of OmcZ, anouter-surface, octaheme c-type cytochrome essential
for optimal current production by Geobacter
sulfurreducens.
Appl.
Environ.
Microbiol.
76:3999-4007.
11) Inoue, K., Leang, C., Franks, A. E., Woodard, T. L.,
Nevin, K. P., and Lovley, D. R. 2011. Specificlocalization of the c-type cytochrome OmcZ at theanode surface in current-producing biofilms ofGeobacter sulfurreducens. Environ. Microbiol. Rep.
3:211-217.
12)Malvankar, N. S., Vargas, M., Nevin, K. P., Franks, A.
E., Leang, C., Kim, B. -C., Inoue, K., Mester, T.,
Covalla, S. F., Johnson, J. P., Rotello, V. M., Toumine,
M. T., and Lovley, D. R. 2011. Tunable metallic-like
conductivity in biofilms comprised of microbial
nanowires, Nat. Nanotechnol., 6:573-579.
13) Inoue, K., Ito, T., Kawano, Y., Iguchi, A., Miyahara,
M., Suzuki, Y., and Watanabe, K. Electricity
generation from cattle manure slurry bycassette-electrode microbial fuel cells, J. Biosci.
Bioeng., in press.

9

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)

極限環境生物学会
研究奨励賞受賞研究

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12, 10-14

Goda S.

Elucidation of the heat activation mechanism of the glutamate dehydrogenasefrom hyperthermophilic archaea
Graduate School of Engineering, Nagasaki University Bunkyomachi 1-14, Nagasaki JAPAN.
Correspondence author: Shuichiro Goda
Tel&Fax +81-95-819-2685

超好熱菌由来グルタミン酸脱水素酵素の熱活性化機構の解明
長崎大学大学院・工学研究科

郷田 秀一郎与えるものと考えた。本稿では、著者が研究に用いた Pyrobaculum islandicum 由来 GDH(Pis-GDH)の結果
を主に、他の超好熱菌由来 GDH に関しても説明する。

1．序論
生体内で多くの反応を触媒する酵素は、物質生
産・分解等の代謝で重要な役割を果たしている。多くの酵素は、同一または複数種類のポリペプチド鎖からなる多量体構造、すなわち四次構造を形成している。多量体構造の形成は、それらの安定性の増強、触媒能の増減、アロステリック調節機能の発現など、酵素機能の発現と調節に直接かかわっている。このように多量体の形成が生理的機能に与える影響が大きいものの、どのような分子機構で多量体化し、活性を有する酵素を形成するかについての情報はさほど多くない。
グルタミン酸脱水素酵素(GDH; EC 1.4.1.2-4)は、補酵素にニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）（NAD(P)）を用い、L-グルタミン酸の 2‐オ
キソグルタル酸とアンモニアへの可逆的な酸化的脱アミノ反応を触媒する。本反応は、エネルギー代謝と窒素（アミノ酸）代謝をつなぐ鍵酵素として重要な役割を果たしており、これまで多くの生物由来のものの構造・酵素機能相関がよく研究され、その四次構造は二量体から六量体まで多くの種類が報告されている。その中で、いくつかの超好熱菌/好熱菌由来 GDH は、大腸菌を宿主に用いたリコンビナント
タンパク質として生産されると、著しく活性が低下した構造で得られ、それらは加熱によって酵素活性が上昇する事が報告されている（表 1）1-5)。それらの中には、単量体として存在するときに低い活性を示し、加熱によって多量体化し、活性の上昇が見られるものや 1-4)、同じ六量体であっても低い活性を示す状態が存在し、加熱によって六量体であることは変わらないものの、四次構造のアレンジメントが変わって活性化することが報告されている 5)。それゆえ、これら超好熱菌/好熱菌由来 GDH の活性化における四次構造、三次構造変化及び酵素活性変化を解析することは、これまで不明であった酵素の多量体化が機能に与えている影響を解明する重要な知見を

2．リコンビナントタンパク質として生産されると低い活性しか示さない超好熱菌/好熱菌由来 GDH
1995 年、DiRuggiero と Robb は、海洋性超好熱菌
Pyrococcus furiosus 由来 GDH(Pfu-GDH)を大腸菌で発現させた後、細胞抽出液を調製し、酵素を精製するために加熱処理（90℃）を行ったところ、総活性が顕著に増大することを見出した 1)。また、大腸菌の細胞抽出液を加熱処理せずにゲルろ過クロマトグ
ラフィーを行い、各分画液の SDS-PAGE を行ったと
ころ、六量体(270 kDa) と単量体（48 kDa）に相当す
る二つの溶出画分に Pfu-GDH のサブニットの分子質量（48 kDa）に相当するタンパク質バンドが検出された。そして六量体構造の分子種に相当する画分にのみ活性が検出でき、この分画を熱処理しても活性の増加はなかった。一方、サブユニットの分子質量に相当する溶出分画には活性が検出されなかったが、その分画を加熱処理すると明確な活性が検出され、その総活性は前出の六量体構造の総活性とほぼ同じであることが見出された。また、この単量体の溶出画分の活性を持たない酵素液を加熱後に再びゲルろ過クロマトグラフィーを行うと、六量体に相当する位置にのみ活性が検出され、単量体の溶出位置
からは加熱しても活性が見つからなかった。なお、培養した超好熱菌体から精製した天然型の Pfu-GDH
はゲルろ過クロマトグラフィーより、分子質量約270 kDa の同一のサブユニットからなる六量体構造の酵素のみであった。これらの結果から、彼らはPfu-GDH が大腸菌体内では不活性な単量体と活性を有する六量体の混合物（ほぼ 1:1 の量比）として生産され、in vitro での加熱によって多量体化が起こり、天然型酵素と同様な活性型に変換される特異的な現10

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)

象であることを明らかにした。これはタンパク質の多量体化がその活性発現に大きな機能を持つことを示した興味深い最初の事例である(表 1)。
つ い で 、 別 の 海 洋 性 超 好 熱 菌 Thermococcus
kodakaraensis 由来の GDH (Tko-GDH)についても、遺伝子組換え酵素の活性と四次構造の関係に関する研究が報告された 2, 3)。Tko-GDH は大腸菌を宿主に用いたリコンビナント酵素として不活性な単量体および非常に活性の低い六量体の混合物として生産される（表 1）。リコンビナント低活性型六量体 Tko-GDH
は、加熱処理によって活性の上昇が見られるものの、
天然型酵素と比較するとその比活性はかなり低い。
さらに、低活性型六量体酵素は天然型や加熱処理により活性化した組換え酵素とは大きく異なる円偏光
二色性(CD)スペクトルを示すことから、加熱処理による活性化は大きな構造変化を伴うと考えられた 2)。
また、Pfu-GDH と異なる点として、不活性な単量体
Tko-GDH は加熱処理を行っても、その大部分は単量体のままで存在し活性を示さず、ごく一部のみが六量体を形成し活性を示す。このことから不活性単量体 Tko-GDH の活性型六量体への正しい構造変換には、何か付加的な要因の存在が示唆された。
Izumikawa らは Tko-GDH の加熱による構造変化を示
差走査型熱量計(DSC)と CD スペクトルを用いて解析し、加熱による活性化は不可逆であり、非加熱酵

素が加熱によって安定な活性型に変換されたと報告している 3) 。また Wang らは、同様な超好熱菌
Pyrococcus horikoshii 由来 GDH (Pho-GDH)においても、組換え酵素は不活性な単量体と活性の低い六量体の混合物として生産され、加熱により酵素活性の上昇とともに蛍光や CD スペクトル解析による構造変化が起こることも示した（表 1）4)。
これらの結果は高温環境が正しいフォールディン
グに大きな影響を与えていることを示唆している。
しかしながら、これまでの報告では酵素活性の上昇は報告されているものの、その構造変化と酵素活性の上昇に関する知見は得られていない。また、大腸
菌体内で誤った構造で生産される原因も不明である。
これらの解明のため、超好熱アーキア Pb. islandicum
由来グルタミン酸脱水素酵素(Pis-GDH)をコードする遺伝子をクローニングし、大腸菌体内で発現させた 6)。大腸菌体内で生産された Pis-GDH は天然由来のものと比べて、ほとんど活性を示さず、加熱もし
くは 37℃、尿素溶液中で活性化が見られた。この活性化の機構をより詳細に、特に構造変化を解明する
ためアニリノナフタレン-8-スルホン酸(ANS)存在下での蛍光測定、円偏光二色性(CD)、示差走査型熱量計(DSC) 、Ｘ線小角散乱(SAXS)の測定を行った 5)。
また、大腸菌体内で好熱菌由来シャペロンと共発現することによる活性への影響を調べた。

表 1．これまでに報告された好熱菌/超好熱菌由来の大腸菌組換え GDH の活性、及び四次構造と活性化に伴
う変化
超好熱菌
四次構造
特徴
Pc. furiosus
不活性型(単量体）
加熱による活性化が多量体化を伴う+活性型（六量体）
T. kodakaraensis
不活性型(単量体)
加熱による部分的活性化が多量体化を伴う+不活性型(六量体)Pc. horikoshii
不活性型(単量体)
加熱による活性化が多量体化及び構造変化を伴う＋不活性型(六量体）
Pb.islandicum
不活性型（六量体）
不活性単量体の生産は見られず。
加熱による活性化が構造変化を伴う

3．Pyrobaculum islandicum 由来リコンビナントグル
タミン酸脱水素酵素の活性化における構造変化
3.1 実験方法
不活性型リコンビナント Pis-GDH は、宿主に大腸菌 BL21 (DE3)-codon plus-RIL を用い、すでに作成した発現ベクター(pET11a/Pis-GDH)を使用して生産させた 6)。SAXS 測定は、つくば市の高エネルギー加速器研究機構 BL-10C にて行った。すべての測定は25℃で行い、タンパク質の濃度は 2-5 mg/ml のものを用いた。解析は MS Visual Basic で作成したプログラム SAXSANA を用いて行った。大腸菌体内でのシャペロンとの共発現は、共発現用ベクターに
pACYC184 を用い、Thermococcus sp. KS-17)及び Pc.
horikoshii 由来 8)FK506 binding protein(以後、TcFKBP及び PhFKBP)をシャペロンとして用いた。

3.2 結果及び考察
大腸菌体内で生産された Pis-GDH は、ほとんど活性を示さず、加熱することによって活性が確認された。加熱による活性化は、温度依存性及び時間依存性を示し、90℃、15 分間の加熱によって最も高い活性を示し、その活性化後の比活性は天然由来のものと同等であった。ゲルろ過によって分子質量を求めたところ、不活性型及び熱活性化型ともに 280 kDa、
SDS-PAGE によって求められた単量体の分子質量が47 kDa であることから、どちらも六量体を形成して
い る と 考 え ら れ た 。 こ れ ま で 、 Pc. furiosus, T.
kodakaraensis, Pc. horikoshii 由来 GDH のリコンビナント酵素が低活性で得られるとの報告がなされているが、それらはすべて六量体と単量体の混合物として生産される。これらの報告に対して、Pis-GDH は、
六量体を形成している状態のままで、不活性型から

11

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)て約 8 Å 小さくなり、活性化によって構造がよりコンパクトになった。
同様に分子の最大長である Dmax
も 145 Å から 124 Å, 120 Å（熱活性化型、尿素活性化型）と小さくなり、分子が小さくなることを示していた。一方、J(0)/C から求められた分子質量は、3
種ともに大きな違いは見られず、すべて六量体を形成していた。つまり、四次構造には変化がなかった
ものの、そのアレンジメントの変化によって、分子がよりコンパクトになったものと考えられた。
熱活性化型の立体構造はすでにＸ線結晶構造解析
によって明らかとされている 4)。しかしながら、不活性化型の立体構造は、その結晶が得られないことから未だに不明である。それゆえ、SAXS データから ab initio 法による低分解能構造モデリングを行った。そのモデル構造は、熱活性型の構造と比べて２ヶ所異なる点があった。ひとつは分子の点群対称性の消滅である。熱活性型は P32 の点群対称性を持ち、分子を形成する 2 つの三量体が向き合って六量体を形成している（図 1(a)）。一方、不活性型では点群対称性を仮定したモデルと対称性なしのモデルで大きく異なる構造となった。このことは、不活性型が点群対称性を持たないことを示唆している。その結果、
熱活性型では見られた 3 回対称軸がねじれた構造となっており、対称性は失われていた（図 1(b)）。2 つ目の構造的な違いは、不活性型がシリンダー状の構造ではなく、特に分子の表面で広がった構造となっている点である。不活性型では表面の電子密度がより低くなっている（図 1(b)）。このことは、不活性型
では部分的に変性状態に近い状態であるように見える。これらのことは、オリゴマー化だけが酵素活性の発現に必要なのではなく、酵素活性の発現には正しい四次構造形成が必要であることを意味していた。
これまで、いくつかの超好熱菌/好熱菌由来グルタ
ミン酸脱水素酵素が、ほとんど活性を示さない状態
でリコンビナントタンパク質として生産されることが報告されている。しかしながら、他の酵素での低活性状態での生産の報告例は少なく、何が原因となって不活性型として得られるかは不明である。そこ
で、大腸菌体内で不活性型として生産される原因の解明を行った。
まず、加熱処理で活性化が起こることから本来の生育温度よりも低い温度での生産が影響していることが考えられた。しかしながら加熱による活性化は不可逆に起こることから、一度、活性化した酵素は低温に戻しても活性化したままである。そこで、活性型 Pis-GDH を変性剤で変性させた後、低温環境下
で変性剤の濃度を低下させることによる巻き戻しを行った。低温環境で異なるフォールディングが起こるのであれば不活性型として得られるはずである。
しかしながら、得られた酵素は活性型であり、低温環境下でのリフォールディングでも不活性型とはならなかった。また大腸菌体内の細胞内環境が好熱菌と異なることに着目し、大腸菌セルフリーでのリコ
ンビナントタンパク質の発現を行ったが、得られた
GDH は不活性型であった。そこで大腸菌とアーキア

活性型へ変化しており、このことは加熱による活性化のメカニズムが上記の 3 種のタンパク質と異なっていることが示唆された。酸化的脱アミノ化反応の酵素活性を測定し、酵素化学的パラメータを求めた
ところ、熱活性化型 Pis-GDH の補酵素 NAD 及び、
基質グルタミン酸に対する Km 値は、天然由来のものとほぼ同等の値を示した。このことは熱活性化によって、その構造が天然由来のものと同じ構造へと変化したものと思われた。
すでに天然由来の Pis-GDH が、尿素溶液中で高い活性を示すことが報告されている 9)。それゆえ、不活性型 Pis-GDH に対して尿素が同様の影響を与えるのではないかと考え、さまざまな濃度の尿素溶液中、37℃で処理を行ったところ、濃度依存性及び時間依存性で活性化が見られた。5 M 尿素溶液中で 5 時間処理したときに最も高い活性が観察され、それは天然由来及び熱活性化型 Pis-GDH とほぼ同等の活性を示した。尿素溶液中での活性化は、透析によって尿素を除いても活性に変化はなく、不可逆な反応であった。
活性化における構造変化を解析するために、蛍光スペクトル、DSC、SAXS 測定を行った。タンパク質の表面の疎水性の露出度はアニリノナフタレン-8-スルホン酸(ANS)存在下での蛍光スペクトル測定によって比較した。不活性型 GDH を ANS とともにインキュベートし、その蛍光スペクトルを励起波長
350 nm で測定したところ、446 nm に大きなピークを示した。対照的に、天然由来、熱活性化型、尿素
活性化型 GDH では、ほとんどピークは見られなかった。このことは、不活性型 GDH では、多くの疎水性残基が分子の表面に露出しており、熱もしくは尿素による活性化の結果、分子内に移動したものと考えられた。
熱活性化及び熱変性による熱力学的パラメータは
DSC によって求めた。不活性型の過剰熱容量曲線は温度の上昇に伴って２つのピークを示した。冷却後、再び加熱を行ってもピークが観察されなかったことから、熱活性化、熱変性ともに不可逆であることが示唆された。熱活性化型ではより高温側の 1 つのピークしか観察されなかったことからも、低温側のピークが熱活性化、高温側のピークが熱変性によるものと思われる。それぞれ温度は 70.2, 110.3℃、エンタルピー変化は、15.5, 1880 kJ/mol であった。
活性化による構造変化を調べるために X 線小角散乱測定(SAXS)を行った。試料には、これまでに得られた不活性型、熱活性化型、及び尿素活性型 Pis-GDHを用いた。測定によって得られた散乱曲線からギニ
エプロットを作成した。分子の平均回転半径(Rg,z)の 2 乗はギニエプロットの直線部分の傾きに比例することが知られている。さらに、直線領域を内挿して求められる散乱強度(J(0))をタンパク質濃度(C)で割ったものは平均分子質量(Mw,w)に比例することが知られている。その結果、不活性型、熱活性化型、尿素活性化型の Rg,z 値は、それぞれ 54.6, 46.5, 46.9 Åとなった。不活性型の平均回転半径は活性化によっ12

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)れたものの、天然由来のものに比べると低活性であった。このことから不活性状態で生産される原因は、プロリンの異性化がフォールディングの律速となった結果生じたものと示唆された。Pis-GDH には単量体あたりで 20 残基のプロリンが存在している。これまでに不活性型 GDH をプロテアーゼ処理した結果、172 番目のフェニルアラニン残基(Phe172)で容易に切断されることを見出しており、その近傍が不活性型では分子の表面に露出していることが示唆された。
Phe172 はサブユニット間の相互作用部位に近い位置にあり、これら周辺に存在するプロリンの異性化が酵素活性に大きな影響を与えているものと示唆された。

のシャペロン活性の違いが影響している可能性を考え、FK506 binding protein (FKBP)型 peptidyl-prolyl
cis-trans isomerase (PPIase) で あ る 超 好 熱 ア ー キ アThermococcus sp.KS-1 由来 TcFKBP 及び超好熱アー
キア Pc. horikoshii 由来 PhFKBP を用いて、生物によって異なるシャペロン活性の不活性型酵素に与える影響について実験を行った。これら 2 種の FKBP の
違いは、TcFKBP は比較的高い peptidyl-prolyl cis-transisomerase 活性（PPIase 活性）を有していることである。その結果、TcFKBP と共発現を行った Pis-GDHは天然由来のものと同等の活性を有する状態で生産された。一方、PcFKBP と共発現させたものは、単独で生産されたものに比べると比活性の上昇がみら

図 1. (a)熱活性化型 Pis-GDH の結晶構造(リボン図)と SAXS からのモデル構造（球）、(b)不活性型 Pis-GDH のSAXS からのモデル構造(P1 対称性なし、球)今後の展望
これまで多くの超好熱菌/好熱菌由来グルタミン
酸脱水素酵素が低活性もしくは、ほとんど活性を有しない形で得られているが、低活性 GDH の立体構
造の報告例はなく、詳細な構造変化は不明なままである。今後は X 線結晶構造解析によって、不活性
GDH の原子レベルでの構造解析に取り組んでいきたいと考えている。

謝辞
本研究の成果は、徳島大学工学部生物工学科大島敏久先生の研究室で行われたものであり、現・大阪工業大学教授・大島敏久先生、現・香川大学教授・
櫻庭春彦先生に心から感謝いたします。また、共同研究者である関西医大・柊弓絃先生、東京薬科大学・
小島正樹先生、大阪大学・倉光成紀先生に感謝いた
します。

13

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)参考文献
1) Diruggiero, J., and Robb, F. T. 1995. Expression andin vitro assembly of recombinant glutamate
dehydrogenase from the hyperthermophilic archaeon
Pyrococcus furiosus. Appl. Environ. Microbiol. 61:
159~164.
2) Abd. Rahman, R. N., Fujiwara, S., Takagi, M.,
Kanaya, S., and Imanaka, T. 1997. Effect of heat
treatment on proper oligomeric structure formation ofthermostable glutamate dehydrogenase from a
hyperthermophilic archaeon, Biochem. Biophys. Res.
Commun. 241: 646~652.
3) Izumikawa, N., Shiraki, K., Nishikori, S., Fujiwara, S.,
Imanaka, T., and Takagi, M. 2004. Biophysicalanalysis of heat-induced structural maturation of
glutamate dehydrogenase from a hyperthermophilicarchaeon, J. Biosci. Bioeng., 97: 305~309.
4) Wang, S., Feng, Y., Zhang, Z., Zheng, B., Li, N., Cao,S., Matsui, I., and Kosugi, Y. 2003. Heat effect on the
structure and activity of the recombinant glutamate
dehydrogenase from a hyperthermophilic archaeon
Pyrococcus horikoshii, Arch. Biochem. Biophys., 411:
56~62.
5) Goda S., Kojima M., Nishikawa Y., Kujo C.,
Kawakami R., Kuramitsu S., Sakuraba H., Hiragi Y.,
and Ohshima T. 2005. Intersubunit Interaction
Induced by Subunit Rearrangement Is Essential for
the Catalytic Activity of the Hyperthermophilic

Glutamate Dehydrogenase from Pyrobaculum
islandicum, Biochemistry 44: 15304~15313.
6) Bhuiya, M. W., Sakuraba, H., Ohshima, T., Imagawa,
T., Katunuma, N., and Tsuge, H. 2005. The first
crystal structure of hyperthermostable NADdependentglutamatedehydrogenasefrom
Pyrobaculum islandicum, J. Mol. Biol. 345: 325~337.
7) Ideno, A., Furutani, M., Iwabuchi, T., Iida, T., Iba, Y.,
Kurosawa, Y., Sakuraba, H., Ohshima, T.,
Kawarabayashi, Y., Maruyama, T. 2004. Expressionof foreign proteins in Escherichia coli by fusing withan archaeal FK506 binding protein, Appl. Microbiol.
Biotechnol. 64: 99~105.
8) Ideno, A., Furutani, M., Iba, Y., Kurosawa, Y.,
Maruyama, T. 2002. FK506 binding protein from thehyperthermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii
suppresses the aggregation of proteins in Escherichia
coli, Appl. Environ. Microbiol. 68: 464~469.
9) Kujo, C., and Ohshima, T. 1998. Enzymologicalcharacteristics of the hyperthermostable NADdependent glutamate dehydrogenase from thearchaeon Pyrobaculum islandicum and effects ofdenaturants and organic solvents, Appl. Environ.
Microbiol. 64: 2152~2157.

14

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)ORIGINAL PAPER

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12, 18-28

Hamana Ka, Hayashi Ha, Niitsu Mb, Takeda Ab and Itoh Tc

Cellular polyamines of alkaliphilic, halophilic and thermophilic methanogens,and acidophilic and alkaliphilic extreme halophiles, and acidophilic
thermophiles belonging to the domain Archaea-Polyamine catalogues of bacterial (eubacterial) and archaeal (archaebacterial) extremophiles Ⅶ-

aFaculty of Engineering, Maebashi Institute of Technology, Maebashi, Gunma 371-0816, Japan.
Faculty of Pharmaceutical Sciences, Josai University, Tsukuba, Ibaraki 305-0074, Japan.
cJapan Collection of Microorganisms, RIKEN, BioResource Center, Wako, Saitama 351-0198, Japan.
bCorresponding author: Koei Hamana, koeihamana@gmail.com
Phone: +81-27-234-4611, Fax: +81-27-234-4611
Received: 6 Dec 2012

/Accepted:19 Dec 2012
euryarchaeal
thermophiles,
slightly/moderately
thermophilic
acidophiles
belongingtoThermoplasmatales contained spermidine and spermine
whereasextremethermophiles
belongingtoThermococcales and Archaeglobales ubiquitously
containedN4-bis(aminopropyl)spermidine(plus
4
N -bis(aminopropyl)norspermidine).
Linearpenta-amines, caldopentamine and thermopentamine,
and a linear hexa-amine, caldohexamine, were detectedin some crenarchaeal extreme/hyper-thermophiles
belonging to Desulfurococcales and Thermoproteales but
not in the acidophilic thermophiles belonging to
Sulfolobales and Acidilobales. Branched penta-amines
found in many euryarchaeal extreme/hyper-thermophiles
have
never
been
found
in
crenarchaeal
extreme/hyper-thermophiles.

Abstract
Cellular polyamines were acid-extracted
from 36 methanogens, 35 extreme halophiles and 10
thermophiles and analyzed by HPLC and GC. Six
methanogenic archaeal orders were located within thephylum Euryarchaeota.
Spermidine and spermine
were distributed in the genera Methanobacterium andMethanothermobacter of the order Methanobacteriales.
A high spermine level was found in an alkaliphilic
Methanobacterium species and three thermophilic
Methanothermobacter species. In Methanococcales,
Methanococcus contained spermidine and agmatinewhereashyperthermophilic
Methanocaldococcus
contained spermine and a branched penta-amine,
N4-bis(aminopropyl)spermidine, in addition to the twopolyamines.
Distribution of homospermidine waslimited in Methanoculleus (Methanomicrobiales),Methanoplanus,
Methanocella(Methanocellales),Methanosaeta,
Methanosarcina,
Methanolobus,
Methanomethylovorans,
Methanosalsum(Methanosarcinales), but was heterogeneous within theorders and genera. Low spermidine and spermine
levels in halophilic Methanohalophilus halophilus(Methanosarcinales) and high spermine and agmatinelevels in alkaliphilic Methanosalsum zhilinae wereobserved. In extreme halophiles (Halobacteriales of
Euryarchaeota), agmatine was accumulated inalkaliphilic species andlow polyamine concentration
was detected in acidophilic and neutrophilic species. In

Key words: Archaea, extreme halophile, methanogen,polyamine, thermophile
Introduction
By our extensive cellular polyamine analyses ofarchaea (of the domain Archaea) and bacteria (of thedomain Bacteria), it has been suggested that cellularpolyamine
distribution
profiles,suchasachemotaxonomic marker, are related to their optimum
growth temperature, pH and/or salt concentration, as wellas their phylogenetically classified locations 9,18,24).
15

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)culture media (100-1000ml) designated by JCM or
NBRC, at the temperature and pH listed in Table 1.
Cells in the stationary phase were harvested andpolyamines were extracted completely from the cells by
0.5M perchloric acid (PCA) three times.
The
PCA-extract was subjected to a Dowex 50WX8 column(1cm I.D. x 3cm) and then the column was washed with
1M HCl10,25). Polyamines were eluted with 6M HClfrom the column. The effluent was evaporated todryness and dissolved in water (0.5-2.0 ml) andneutralized. Insoluble materials were removed bycentrifugation at cold. The concentrated polyamines
were analyzed by HPLC on a Hitachi L6000 using acolumn of cation-exchange resin, Hitachi 2619F(4mmI.D. x 50mm) at 70 ℃ and determined bypost-labeled fluorometry on a Hitachi F1050
Fluorescence Spectromphotometer after being heatedwith o-phthalaldehyde 10,25). Some of the concentrated
polyamine fractions were further purified on a column ofWhatman CM2325). After heptafluorobutyrization of
the purified polyamine samples, GC on a SHIMADZU
GC-17A and GC-MS on a JEOL JMS-700, equippedwith a capillary column of Inert Cap 1MS (0.32mm I.D.
x 30m) (GL Sciences), were performed 31). Various
column temperatures were operated to obtain goodpolyamine resolutions. Heptafluorobutyryl derivativesof polyamines were determined by a flame ionization
detector (FID). Diaminopropane (3) (abbreviation for
the number of methylene CH2 chain units between NH2,
NH, N or N+), putrescine (4), cadaverine (5),norspermidine (33), spermidine (34), norspermine (333),
spermine (343) and agmatine (Agm) purchased from
Sigma (St. Louis, USA) or Eastman Kodak (Rochester,USA), and homospermidine (44), thermospermine (334),
aminopropylhomospermidine (344), canavalmine (434),
caldopentamine (3333), homocaldopentamine (3334),
thermopentamine (3343), caldohexamine (33333),
homocaldohexamine (33334), thermohexamine (33343),
homothermohexamine(33433),
4
N -aminopropylnorspermidine(3(3)3),N4-aminopropylspermidine(3(3)4),
4
N -bis(aminopropyl)norspermidine(3(3)(3)3)
andN4-bis(aminopropyl)spermidine (3(3)(3)4) synthesized in
our laboratory 31) were used as the standard for
identification and determination of polyamine peaks on
HPLC and GC chromatograms and mass spectra in
GC-MS.
Quantification of polyamine peaks was
performed by peak high of the standards. Molar
concentrations of cellular polyamines per gram of wet
archaeal cell pellet (μmol-nmol/g wet wt. cell) estimatedIonic interaction of polycationic polyamines to nucleic
acids and other acidic components in the cells is
important for their growth environments30,35). Linear,tertiary branched and quaternary branched penta-amines
and hexa-amines, and agmatine found in various
bacterial and archaeal thermophiles grown in highthermal environments are possibly associated withstabilizing cellular nucleic acid structure as a major
function of the high basic polyamines13-17,19-21,23,26).
These polyamine levels were salt dependent in somearchaeal thermophiles20). Archaeal extreme halophiles
grown in high salt media showed low cellularconcentrations of spermidine, spermine and/or
agmatine11,12,17,19,22,27.34).
Anarchaebacterial
phylum,Euryarchaeota,
encompasses diverse lineages including six orders of
methanogens (Methanobacteriales, Methanococcales,
Methanomicrobiales,
Methanocellales,
Methanosarcinales and Methanopyrales), two orders ofthermophiles (Archaeoglobales and Thermococcales),one order of acidothermphiles (Thermoplasmatales), andone order of extreme halophiles (Halobacteriales)1,2).
Another phylum, Crenarchaeota is comprised of fivethermophilic orders (Sulfolobales, Desulfurococcales,
Acidilobales, Fervidicoccales and Thermoproteales)1,2).
Using the combination of high-performance liquid
chromatography (HPLC) and gas chromatography (GC)developed in our laboratory, additional polyamine
distribution catalogues of 36 new methanogens including
alkaliphilic, halophilic and thermophilic species, and 35
new extreme halophiles including acidophilic andalkaliphilic species, and 10 new thermophiles including
acidothermophilic species were presented here to searchfor unique polyamine profiles in the euryarchaeal andcrenarchaeal extremophiles.
Strictly halophilic
thermophile and strictly alkaliphilic thermophile havenever been isolated. Obligate symbiotic or uncultivatedarchaea located in the newly proposed phyla‘Nanoarchaeota’ (a fast evolving group within
Euryarchaeota), ‘Korarchaeota’, ‘Thaumarchaeota’ and‘Aigarchaeota’ 1,8,32,33) have not been available for ourpolyamine studies.
Materials and Methods
Archaeal strains were provided by JCM of the RIKEN
BRC through the National Bio-Resource Project of the
MEXT, Japan and NBRC of Biotechnology Center,
National Institute of Technology and Evaluation, Japanand were cultivated in the aerobic or anaerobic liquid
16

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)pathway and spermidine and spermine are synthesized byaminopropyl transferase in Methanococcus species7).

from the HPLC and GC analyses are shown in Table 1
and are compared with those of our previous data on
phylogenetically related archaea. Major polyamine data
were obtained by HPLC and minor polyamines were
calculated from GC data. Our analytical data without
statistical analysis would be validated to know major
cellular polyamine types in many difficult-to-culturearchaeal extremophiles.

Order Methanomicrobiales
A newly analyzed mesophilic Methanoregula species
contained putrescine and spermidine and a
Methanoplanus species contained putrescine andhomospermidien (Table 1). In this mesophilic order,
polyamine distribution profiles varied within five othergenera, Methanofollis (putrescine, cadaverine andhomospermidine), Methanomicrobium (spermidine),
Methanogenium(putrescine),
Methanospirillum(putrescine and spermidine) and Methanocalculus(putrescine, spermidine and homospermidine) as
analyzed in the present and previous studies16,17,19).
Two Methanolinea species and two Methanoculleus
species had conflicting results in regard to the occurrenceof spermidine, homospermidine and/or spermine (Table
1). New archaeal methanogens available in the future
should be analyzed to evaluate chemotaxonomic
significance of cellular polyamine type.

Results and Discussion
Phylum Euryarchaeota
Order Methanobacteriales
The newly available 13 species of Methanobacterium
analyzed showed the ubiquitous occurrence of
spermidine and spermine (Table 1). The previous
datum on M. bryantii should be corrected by thereanalysis in the present study (Table 1). In spite ofmesophilic methanogens, a high spermine level was
found in 7 species among the17 species analyzed.
Agmatine was sporadically detected in 8 species.
Alkaliphilic M. alcaliphilum grown under an alkaline
medium condition at pH 8.4, contained the highconcentrations of spermidine and spermine, suggestingthat cellular polyamine accumulation occurred in thealkaliphilic methanogen.
Moderately thermophilic
Methanothermobacter species grown at 60-65°C (Table
1) and Methanothermus species grown at 80-85°C as
previously reported16,21), contained spermidine andspermine. The spermine level was rather lower in themesophilic
Methanobrevibacterand15,16,19)
Methanosphaera
belonging to this order than inthemethanogenic
thermophiles
belongingtoMethanothermobacter and Methanothermus.

Order Methanocellales
Methanocella arvoryzae as well as Methanocellapaludicola
located
in
the
order
containedhomospermidine as the major polyamine (Table 1).
Order Methanosarcinales
Methanogens belonging to this order are known tocontribute to methanogenesis from acetate and methyl
compounds (methanol and methylamine etc.).
Methanosaeta is a specialist that uses acetate specifically.
Other methanogens belonging to other five orders use H2
and formate for their methanogenesis.
Five
Methanosarcina species and two Methanolobus species
ubiquitously contained homospermidine as a major
polyamine (Fig. 1 and Table 1). A high putrescine level
was found in most species belonging to the two genera.
Alkaliphilic Methanosalsum zhilinae grown at pH 9.0 in
the presence of 4%(0.7M) NaCl contained spermine andagmatine as the major polyamine whereas halophilic
Methanohalophilus halophilus grown at pH7.2 in thepresence of 7%(1.25M) NaCl lacked major polyamines(Fig. 1 and Table 1). Their polyamine profiles are
related to their alkaliphilic and halophilic growth
conditions. Halophilic Methanohalobium species was
not available in the present study. Non-halophilic,
neutrophilic methanogens of the order grown at
pH6.0-7.5 were cultivated in the presence of 0.1-0.3 %NaCl and contained either spermine or agmatine as theOrder Methanococcales
Extremely thermophilic Methanocaldococcus villosus,
as well as the five Methanocaldococcus species
previously analyzed, grown at 80-85 °C, contained
N4-bis(aminopropyl)spermidine as a major polyamine(Fig. 2 and Table 1). Since the quaternary branchedpenta-amine have been found in extremely thermophilic
Methanotorris grown at 70-80°C and has not been
detected in mesophilic Methanococcus grown at
25-37 °C (Table 1) and moderately thermophilic
Methanothermococcus grown at 60 °C belonging to thesame order15), the occurrence of the branchedpenta-amine seems to correlate to their extreme
thermophily.
It has been shown that putrescinesynthesis proceeds via L-arginine decarboxylation
17

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)haloalkaliphilic
Halostagicola
alkaliphila,
Natronoarchaeum mannanilyticum and Natronorubrum
sediminis grown at pH 8.8-9.5.
Although a highagmatine level was found in newtrophilic Halolamia
pelagica and Halostaginicola kamekurae (Table 1),
cellular accumulation of agmatine is also possible in thehaloalkaliphiles. Arginine decarboxylase activity to
produce agmatine has been detected in some
agmatine-rich species 22,27). On the other hand, a highspermidine level was sporadically found11,12,16,22),
however, correlation between the polyamine level andgrowth conditions is not clear. Polyamine catalogues in
the order should be rearranged into family level in future
for the phylogenetic usefulness of cellular polyaminecomponent as a chemotaxonomic marker.
Effects of culture temperature, pH and NaCl
concentration for polyamine profiles were determined in
Haloterrigena limicola (poor in polyamines) grown at
30-60°C and pH 6.5-8.5, Natrialba hulunbeirensis (richin spermidine) grown at 2.0-5.0M NaCl and pH 8.5-10.5
and Natrinema pellirubrum (rich in agmatine) grown at
2.0-3.5M NaCl and pH 6.5-8.0 (Table 1). It wassuggested that cellular levels of spermidine and/or
agmatine, increased under the high temperature(50-60°C), high alkaline pH (9.0-10.5) and high NaCl
concentration (5.0M), by the data without statisticalanalysis (Table 1).
Cellular polyamines of extreme halobacteria weredetected at a level of nmol/g wet weight of highsalt-containing cell pellet, while other groups of archaea
were present at a level of μmol/g wet weight.
Significant polyamine levels were not detected in somespecies of extreme halobacteria in the previous
studies11,12,17,19,34). Poor cellular polyamine levels seemto be related to less binding of polyamines to cellularacidic components under the high salt growth condition.
It is known that a part of the intracellular polyamines insome spermidine and/or agmatine-rich extreme
halobacteria released into the culture supernatant12,34).
Polyamine concentrations of the culture medium JCM
574 and the culture supernatant after the harvest ofHalorubellus salinus JCM 17115 were determined after
the treatment by a Dowex 50Wcolumn. Significant
differences were not found in the two 50 ml culture
samples (Table 1), indicating that polyamines were notreleased into the supernatant and then a polyamine-poor
halobacterium, H. salinus JCM 17115 do not synthesize
polyamines.

major polyamine. Methanomethylovorans hollandica
showed a unique polyamine pattern, as putrescine plus
agmatine (Fig. 1 and Table 1). Two Methanococcoides
species contained spermidine and spermine. Threedifferent polyamine profiles were found in the four
species of the genus Methanosaeta (Table 1).
Methanosaeta thermophila grown at 55°C contained
N4-bis(aminopropyl)spermidine19).
Affect of slightthermophily (45-50°C) for the cellular polyamine levelsin this order was not clear, however, their polyamine
profiles varied within the same genus. Distribution
profiles of spermidine and homospermidine were
heterogeneous and conflicted within the order
Methanosarcinales, however, re-cultures of themethanogens and re-analyses of polyamines of this ordershould be continued.
Order Methanopyrales
It has been reported that two hyperthermophilic
Methanopyrus kandleri strains contained a significant
amount of spermidine or agmatine19), as shown in Table
1. Although tetra-amines and penta-amines have been
detected in other extreme /hyper-thermophilic
methanogens
belongingtothegeneraMethaocaldococcus,
Methanothermococcus
andMethanotorris (Methanococcales), and Methanothermus
and Methanothermobacter (Methanobacteriales), theabsence of the long polyamines in Methanopyrus speciesgrown at 95-100 °C is unique, indicating its primitive
polyamine synthetic ability within the domain Archaea.
Order Halobacteriales
Polyamines of 140 strains of mesophilic/slightthermophilic,extremely
halophilic
euryarchaea
belonging to the order Halobacteriales have been
analyzed11,12,17,19,22,27,34 ). Thirty-six newly validated
species (type strain), including the 15 new genera
Halarchaeum,
Halobellus,
Halogranum,
Halogeometricum, Halolamia, Halomaina, Halonotius,
Halopelegius, Halorientalis, Halorubellus, Halorussus,
Halostagnicola, Natronoarchaeum, Salarchaeum, andSalinarchaeum grown at 37 °C in some JCM organic
media containing 3.5M (20.5%) NaCl, were analyzed in
the present study. A significant amount of agmatine
and a trace amount of spermidine and/or spermine were
distributed (Table 1). The type strain of Halorubrum
terrestre JCM 10247 transferred from a strain of H.
distributum (Table 1). The polyamine levels varied in
the extreme halophiles including haloacidophilic
Haloarchaeum acidiphilum grown at pH 4.5 and18

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)extremely thermophilic Thermococcus, Pyrococcus andPalaeococcus species belonging to the order
Thermococcales has been reported in previous
studies14,16,20,21,26). The level of agmatine was low in T.
atlanticus and P. yayanosii grown in the presence of
2.3% NaCl. In addition, temperature (70-85 °C) andsalt (0.15-2.5 % NaCl) dependent syntheses of the
branched penta-amine in the extreme thermophiles of theorder have been observed previously20).
Thepenta-amine level decreased under the growth conditions
at 70 °C or in 0.15 % NaCl20). Low levels of the
branched penta-amine have been found in the terrestrial
Thermococcus species such as T. waiotapuensis and T.
zilligii, grown at a low salt condition20). Thermococcus
onnurineus as well as Palaeococcus ferrophilus (notcited in Table 1) grown at 80 °C in the presence of 2.5 %NaCl contained the highest agmatine concentration
among the 23 species of Thermococcus, 5 species of
Pyrococcus and 2 species Palaeococcus, previously
analyzed14,16,20,21,26).
Putrescine and agmatine
productions and dual biosynthetic pathway for
spermidine from putrescine and agmatine were found insome Thermococcus and Pyrococcus species4-6,29).

Order Thermoplasmatales
Mesophiles, slight thermophiles and moderate
thermophiles were distributed in the acidophilic archaeal
order grown at pH 1.0-3.0. Slightly thermophilic
Acidiplasma aeolicum grown at 40°C were analyzed in
the present study, as well as slightly thermophilic A.
cupricumulans (formerly Ferroplasma cupricumulans)grown at 55°C and mesophilic Ferroplasma acidiphilumgrown at 35°C contained spermidine as the major
polyamine (Table 1). The same polyamine pattern has
been observed in slightly/moderately thermophilic
Thermoplasma and Picrophilus species grown at
55-60°C20,23,26). The occurrence of spermine as themajorpolyamineinmoderately
thermophilic
Thermogymnomonas acidicola grown at 60°C has beenreported20). Spermine and agmatine levels were variedin Thermoplasma species including a strain isolated in
Hakone, Japan36), analyzed in the present study (Table 1).
Acidophilic properties of the archaea would not beaffected to their polyamine profiles, thus longpolyamines have not been found in the order. The
lower limit of optimum growth temperature for theoccurrence of a tetre-amine, spermine, was estimated to
be around at 60°C within this acidophilic order.

Phylum Crenarchaeota
Order Sulfolobales
Newly validated Acidianus manzaensis andMetallosphaera cuprina, as well as three other species of
the two genera Acidianus and Methallosphaera,contained spermidine and norspermidine as the major
polyamines (Table 1).
Tetra-amines, norspermine,
spermine and/or thermospermine were found as a minor
polyamine in the total 7 species grown at 65-88°C (Table
1).
Although aminopropyltransferases have beencharacterized to produce linear triamines andtetra-amines in a Sulfolobus species3), penta-amines havenot been detected in the three extremely
thermophilic/hyperthermophilic genera Sulfolobus (S.
hakonensis was reclassified as M. hakonensis, as shownin Table 1), Sulfurisphaera and Stigiolobus of the order
Sulfolobales14,16,20).

Order Archaeoglobales
Four extremely thermophilic Archaeoglobus species,
including A. flugidus grown at 85 °C, A. profundus
grown at 85 °C, A. infectus grown at 70 °C14,17 ) and a
new species, A. sulfaticallidus grown at 75°C in thisstudy, ubiquitously contained N4-bis(aminopropyl)
spermidine
andN4-bis(aminopropyl)norspermidine(Table 1).
The occurrence of the two branchedpenta-amines as the major polyamines in the genus of theorder Archaeoglobales is unique among the domain
Archaea. Relatively lower polyamine levels in A.
infectus and A. sulfaticallidus might be due to their low
growth temperature at 70 -75°C.
Order Thermococcales
N4-bis(aminopropyl)spermidine and agmatine were
found as the major polyamines in a new marine
Thermococcus species, T. atlanticus grown at 75°C (Fig.
2 and Table 1) and a new marine species of Pyrococcus,
P. yayanosii grown at 98 °C (Table 1).
Twotetra-amines, thermospermine and canavalmine, weredetected as a minor polyamine in T. atlanticus. This is
the first report on the occurrence of thermospermine andcanavalmine within this order. The occurrence ofN4-bis(aminopropyl)spermidine and agmatine in other

Order Desulfurococcales
Penta-amines were not detected in a new species ofextreme/hyper-thermophilic Desulfurococcus and two
newly validated hyperthermophiles, Thermogladius
shockii and Pyrolobus fumarii, analyzed here (Table 1).
Linear hexa-amines and/or penta-amines have beenfound in Aeropyrum, Ignicoccus (cited in Table 1),Hyperthermus, Pyrodictium, Staphylothermus and19

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)Stetteria species (not cited in Table 1), but not in
Desulfurococcus,
Sulfophobococcus,
Ignisphaera,
Thermodiscus, Thermosphaera and ‘Caldococcus’
species (not cited in Table 1) in the order
Desulfurococcales13,16,19,20).

Order Felvidococcales
Fervidicoccus fontis belonging to the thermophilicorder Fervidicoccales, validated as fifth crenarchaeal
order, has not been available for our polyamine analysis
at the present time.

Order Acidilobales
Newly validated species were not available in thepresent study. Penta-amines have not been found in
extremely thermophilic Acidilobus aceticus andCaldisphaera lagunensis belonging to the order
Acidilobales19,26), as cited in Table 1.

Order Thermoproteales
Newly validated species were not available in thepresent study. Polyamine profiles of the six genera
Pyrobaculum, Caldivirga, Vulcanisaeta, Thermocladium,
Thermofilum and Thermoproteus analyzed in ourprevious reports13,16,19,21,26) were not cited in Table 1.

Fig. 1. HPLC chromatograms of the polyamines of Methanolobus chelungpuianus JCM 15159 (A), Methanohalophilus
halophilus NBRC 107635 (B), Methanomethylovorans hollandica NBRC 107637 (C), Methanomethylovorans
thermophile NBRC 107638 (D), Methnosalsum zhilinae NBRC 107636 (E), Methanococcoides alaskense NBRC
107632 (F). HPLC chromatograms of the concentrated polyamine fraction (100μl) from 50 mg wet weight of themethanogen are shown at Attenuation 4 (sensitivity x1) (B, C, E and F) or Attenuation 6 (sensitivity x1/4) (A and D).
Abbreviations for polyamines are given in Table 1.

20

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)Fig. 2. HPLC chromatograms (a) and GC chromatograms (b) of the polyamines of Methanocaldococcus villosus JCM
16315 (A) and Thermococcus atlanticus JCM 16138 (B). HPLC chromatograms of the concentrated polyamine
fraction (100μl) from 50 mg wet weight of the thermophile are shown at Attenuation 6. GC chromatograms areshown by SHIMADZU GC-17A at the column temperature 120°C-16°C/min-280°C. It has been known that 3(3)(3)3
is converted to 3(3)3, and 3(3)(3)4 is converted to 3(3)3 and 3(3)4 at a ratio of 3:1, and a part of agmatine is destroyed
during a GC analysis after heptafluorobutyrization 16,21,26). Abbreviations for polyamines are given in Table 1.
21

Table 1. Cellular concentrations of polyamines of methanogenic, thermophilic and extremely halophilic archaea
CulturePhylum Euryarchaeota
Order Methanobacteriales
Methanobacterium formicicum
Methanobacterium bryantii

Methanobacterium ivanovii
Methanobacterium aarhusense
Methanobacterium alcaliphilum
Methanobacterium congolense
Methanobacterium espanolae
Methanobacterium oryzae
Methanobacterium palustre
Methanobacterium subterraneum
Methanobacterium uliginosum
Methanobacterium petrolearium
Methanobacterium ferruginis
Methanobacterium kanagiense
Methanobacterium movens
Methanobacterium flexile
Methanobacterium sp.
Methanobacterium sp
Methanothermobacter crinale
Methanothermobacter marburgensis
Methanothermobacter thermautotriphicus
Methanothermobacter wolfeii
Order Methanococcales
Methanococcus maripaludis
Methanococcus maripaludis
Methanococcus maripaludis
Methanococcus maripaludis
Methanococcus maripaludis
Methanococcus maripaludis
Methanococcus aerolicus
Methanococcus vannielii
Methanococcus voltae
Methanocaldococcus villosus
Methanocaldococcus jannaschii
Methanocaldococcus indicus
Methanocaldococcus vulcanius
Methanocaldococcus fervens
Methanocaldococcus infernus

Polyamines (μmol/g wet wt. cell):

Ref.

℃

pH

4

5

33

34

44

343

334

3(3)4

JCM 10132T
NBRC 104951T

34
17

NBRC 104952T
NBRC 105225T
NBRC 105226T
NBRC 105227T
NBRC 105228T
NBRC 105229T
NBRC 105230T
NBRC 105231T
NBRC 105232T
NBRC 105198T
NBRC 105197T
JCM 15797T
JCM 15415T
JCM 15416T
NBRC 105039
JCM 10400
JCM 17393T
NBRC 100331T
JCM 10044T
ATCC 29096T
JCM 14652T

17

37
37
37
37
40
37
37
35
37
37
37
37
35
35
40
37
37
37
37
65
65
65
60
60

7.0
7.4
7.4
7.0
7.0
8.4
7.0
7.0
7.0
7.0
7.0
7.0
7.0
7.0
7.4
7.0
7.0
7.2
7.4
7.2
7.2
7.2
7.2
7.2

0.01
0.02
0.09
0.03
0.05
0.02
0.30
-

0.03
-

-

0.10
0.86
0.10
0.33
1.00
0.40
0.40
0.15
0.70
0.50
0.75
0.10
0.10
0.40
0.45
0.20
0.25
2.30
0.20
0.45
0.25
0.17
0.30

0.20
-

0.45
0.60
0.44
0.02
0.15
1.60
0.50
0.08
0.04
0.30
0.02
0.15
0.40
0.02
0.04
0.04
0.10
0.50
0.60
0.66
0.50
0.69
0.40

-

-

0.45
0.60
0.44
0.02
0.15
1.60
0.50
0.08
0.04
0.30
0.02
0.15
0.40
0.02
0.04
0.04
0.10
0.50
0.60
0.66
0.50
0.69
0.40

-

0.02
0.06
0.14
0.20
0.04
0.02
0.06
0.02
-

37
37
37
37
37
37
25
35
37
80
80
80
80
85
85

6.5
6.5
6.5
6.5
6.5
6.5
7.0
6.5
7.0
6.0
6.0
6.0
6.0
6.0
6.0

0.10
0.15
0.15
0.12
0.30
0.10
0.07
0.36
0.02
0.04
0.06
0.18
0.09

-

0.02
-

0.85
1.34
0.81
0.80
0.90
1.04
0.75
0.07
4.40
0.45
0.60
0.37
0.20
0.68
0.16

-

0.08
0.02
0.07
0.50
1.56
*
*
*
*

0.02
-

0.02
0.04
*
*
*
*

0.08
0.02
0.07
0.52
1.60
0.42
0.10
0.76
0.36

0.27
0.35
0.64
0.25
0.90
0.80

0.20
0.15
0.84
0.80
0.45
0.13
0.45
0.16
0.40
0.02
0.36
0.60
0.04
0.21

JCM 10722T
JCM 13030
JCM 10011
JCM 10012
JCM 10013
NBRC 105638
NBRC 105820
JCM 13029T
JCM 10010
JCM 16315T
JCM 10045T
JCM 11886T
ATCC 700851T
JCM 15782T
JCM 15783T

17
34
19
34
34
20
34
19

19
34
34
19
19
17
17

343/3(3)4 3(3)(3)4

Agm

Order Methanomicrobiales
Methanolinea mesophila
Methanolinea tarda
Methanoregula formicica
Methanospirillum hungatei
Methanospirillum lacunae
Methanoculleus chikugoensis
Methanoculleus hydrogenitrophicus
Methanoplanus limicola
Order Methanocellales

NBRC 105507T
JCM 13418T

Methanocella arvoryzae
Methanocella paludicola
Order Methanosarcinales
Methanosaeta thermophila
Methanosaeta concilii
Methanosaeta harundinacea
Mehanosaeta pelagica
Methanosarcina horonobensis
Methanosarcina acetivorans
Methanosarcina baltica
Methanosarcina barkeri
Methanosarcina mazei
Methanolobus profundi
Methanolobus chelungpuianus
Methanohalophilus halophilus
Methanomethylovorans hollandica
Methanomethylovorans thermophile
Methanosalsum zhilinae
Methanococcoides alaskense
Methanococcoides burtonii
Order Methanopyrales
Methanopyrus kandleri

Order Halobacteriales
Haloterrigena limicola

Natrialba hulunbeirensis

NBRC 105659T
JCM 12467T
NBRC 105244T
JCM 10133T
JCM 16384T
JCM 10825T
JCM 16311T
NBRC 105822

NBRC 101360T
JCM 10134T
NBRC 104789T
NBRC 105920T
JCM 15518T
JCM 12185T
JCM 11281T
JCM 10043T
JCM 9314
JCM 11833
NBRC 104158T
JCM 15159T
NBRC 107635T
NBRC 107637T
NBRC 107638T
NBRC 107636T
NBRC 107632T
NBRC 107633T

20
19
34

17
19
20
17

19
34
34
34
19
17

37
50
30
37
30
30
37
25

7.0
6.5
7.0
7.0
7.0
6.5
6.5
7.0

0.40
0.04
0.10
0.43
0.20
0.15
0.17

-

-

0.72
0.45
0.95
0.20
0.10
-

0.42
0.50
0.40

0.25
0.85
-

-

-

0.25
0.85
-

-

-

45
37

7.0
7.0

0.30
0.35

-

-

-

1.25
1.40

-

-

-

-

-

-

55
37
37
30
30
37
25
38
37
30
30
37
30
37
50
45
20
20

7.0
7.0
7.0
7.0
7.0
7.0
6.5
7.0
6.8
6.2
7.0
7.0
7.2
7.2
7.2
9.0
7.0
7.0

0.95
8.00
8.00
7.50
0.90
1.25
0.23
0.10
-

0.02
0.10
-

-

1.50
0.24
0.20
0.07
0.20
0.01
0.10
0.10
0.10

0.50
0.26
0.90
0.92
2.00
4.30
4.80
0.55
0.72
0.60
1.06
0.12
-

0.40
0.15
0.06
0.18
0.02
0.54
0.38
0.41

-

-

0.40
0.15
0.18
0.02
0.54
0.38
0.41

0.05
-

0.05
0.25
0.02
0.02
0.45
0.03
0.38
-

0.04
0.20
0.55
Polyamines (nmol/g wet wt. cell):
4
5
34
343
Agm
0.08
0.08
0.08
0.08
0.03
0.05
0.20
0.05
0.04
0.05
0.10
0.03
0.06
1.17
0.02
0.16
0.50
0.10
1.20
0.02
0.18
0.04
0.10
1.24
0.02
0.20

0.02
0.02

-

-

0.02
0.02

-

0.22
-

JCM 9639T
JCM 15049

34
17

95
100

6.5
6.5

3.5M NaCl

JCM 13583T

19

3.5M NaCl
2.0M NaCl
2.0M NaCl
5.0M NaCl

JCM 10989T

34

37
60
60
30
30
45
50
50
50

7.0
6.5
8.5
6.5
8.5
9.0
8.5
10.5
8.5

Natrinema pellirubrum

5.0M NaCl
3.5M NaCl
2.0M NaCl
3.5M NaCl
3.5M NaCl

Haladaptatus cibarius
Haladaptatus litoreus
Halarchaeum acidiphilum
Haloarcula salaria
Haloarcula tradensis
Halobellus clavatus
Halogranum rubrum
Halogranum amylolyticum
Halogranum gelatinilyticum
Halogeometricum rufum
Halolamia pelagica
Halomaina oriensis
Halomicrobium zhouii
Halonotius pteroides
Haloplanus aerogenes
Halopelagius inordinatus
Halopiger aswanensis
Haloplanus vescus
Halorientalis regularis
Halorubellus litoreus
Halorubellus salinus
Halorubrum aquaticum
Halorubrum californiense
Halorubrum cibi
Halorubrum terrestre
Halorussus rarus
Halosarcina limi
Halostagnicola alkaliphila
Halostagnicola kamekurae
Haloterrigena jeotgali
Haloterrigena salina
Natronoarchaeum mannanilyticum
Natronomonas moolapensis
Natronorubrum sediminis
Salarchaeum japonicum
Salinarchaeum laminariae
Culture medim JCM 574 for H. salinus JCM 17115
Culture supernatant of H. salinus JCM 17115

JCM 10476T

JCM 15962T
JCM 15771T
JCM 16109T
JCM 15759T
JCM 15760T
JCM 16424T
JCM 15772T
JCM 16428
JCM 16426
JCM 15770T
JCM 16809T
JCM 16495T
JCM 17095T
JCM 14355T
JCM 16430T
JCM 15773T
JCM 11628T
JCM 16055T
JCM 16425T
JCM 17117T
JCM 17115T
JCM 14031
JCM 14715T
JCM 15757T
JCM 10247T
JCM 16429T
JCM 16054T
JCM 16592T
JCM 16110T
JCM 14585T
JCM 13891T
JCM 16328T
JCM 14361T
JCM 15982T
JCM 16327T
JCM 17267T(μmol/50ml)(μmol/50ml)

34

34

50
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37
37

10.5
7.0
7.0
6.5
8.0
7.0
7.4
4.5
7.0
7.0
7.5
7.4
7.5
7.5
7.4
7.5
7.0
7.5
7.5
7.5
7.4
7.0
7.0
7.5
7.5
7.5
7.0
7.5
7.0
7.0
7.5
7.0
9.5
7.0
7.4
7.4
8.8
7.5
9.0
7.0
7.5

0.02
0.04
0.05
0.05
0.05
0.05
0.03
0.02
0.10
0.01
0.01

0.02
0.02
0.02
0.01

1.40
0.10
0.10
0.04
0.02
0.02
0.17
0.04
0.02
0.02
0.04
0.02
0.02
0.01
0.04
0.02
0.02
0.02
0.01
0.04
0.01
0.05
0.02
0.01
0.05
0.08
0.03
0.07
0.10
0.03
0.01
0.37
0.45

0.02
0.02
0.02
0.02
0.02
0.02
0.02
0.04
0.02
0.02
0.02
0.02
0.02
0.04
0.04
0.01

0.30
2.60
0.90
1.40
1.80
0.25
0.02
0.20
0.27
0.06
0.02
0.04
0.02
0.04
0.09
1.80
0.09
0.02
0.06
0.05
0.04
0.10
0.04
0.04
0.02
0.02
0.28
0.02
0.02
0.40
0.02
0.05
0.30
2.80
0.02
0.02
0.70
0.02
0.20
0.40
0.02
0.37
0.38

Order Thermoplasmatales
Acidiplasma aeolicum
Acidiplasma cupricumulans
Ferroplasma acidiphilum
Thermogymnomonas acidicola
Thermoplasma acidophilum

Thermoplasma volcanium

Picrophilus oshimae
Picrophilus torridus
Order Archaeoglobales
Archaeoglobus sulfaticallidus
Archaeoglobus infectus
Archaeoglobus fulgidus
Archaeoglobus profundus
Order Thermococcales
Thermococcus atlanticus
Thermococcus kodakarensis
Thermococcus onnurineus
Thermococcus waiotapuensis
Thermococcus zilligii
Pyrococcus yayanosii
Pyrococcus furiosus
Pyrococcus horikoshii
Pyrococcus woesei
Pyrococcus glycovorans
Phylum Crenarchaeota
Order Sulfolobales
Acidianus manzaensis
Acidianus brierleyi
Acidianus infernus

Acidianus sulfidivorans
Metallosphaera cuprina
Metallosphaera hakonensis
Metallosphaera sedula
Order Desulfurococcales

JCM 14615T
JCM 13668T
JCM 10970T
JCM 13583T
JCM 9062T
IFO 15155T
IFO 15156
JCM 17950
JCM 9571T
IFO 15438T
IFO 15439
JCM 10054T
JCM 10055T

JCM 14716T
NBRC 100649T
JCM 9528T
JCM 9629T

JCM 16138T
JCM 12380T
JCM 13517T
JCM 10985T
JCM 10554T
JCM 16557T
JCM 8422T
JCM 9974T
JCM 8421T
AL 585T

NBRC 100595T
IFO 15269T
IFO 15270T
JCM 13667T
JCM 15769T
JCM 8857T
IFO 15509T
JCM 9064

26
15
15
23
23

40
55
35
60
60
60
60
60
60
60
60
55
55

1.6
1.2
1.6
3.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
1.0
1.0

17
14
14

75
70
85
85

7.0
6.5
6.9
6.9

20
26
26
26

75
85
80
80
80
98
90
85
100
85

7.0
7.0
7.0
7.0
7.0
7.5
6.5
6.5
6.5
7.5

15
15

70
77
88

1.3
2.0
2.5

Polyamines (μmol/g wet wt. cell):
4
5
34
343
Agm
0.01
0.52
0.05
0.70
1.50
0.07
0.02
0.60
1.00
0.03
1.12
0.10
0.96
0.06
0.90
1.20
0.13
0.01
1.14
0.18
1.10
0.08
1.82
0.07
1.53
0.02
Polyamines (μmol/g wet wt. cell):
3
4
33
34
343
3(3)4 333/3(3)3 3(3)(3)4
0.25
0.02
0.47
0.35
0.03
0.15
0.02
0.35
0.45
0.56
2.28
0.20
1.44
0.60
2.10
0.57
Polyamines (μmol/g wet wt. cell):
334/
4
33
34
343
334
3(3)4 343/3(3)4
434
0.08
0.64
0.28
0.01
0.12
0.41
0.02
0.45
*
*
*
0.70
0.10
0.90
*
*
*
0.82
0.07
1.24
*
*
*
0.02
0.94
*
*
*
0.04
0.10
*
*
*
0.45
0.06
0.08
0.05
0.13
0.05
0.90
0.15
0.45
0.60
0.16
0.28
0.11
0.08
0.19
0.80
*
*
*
0.06
Polyamines (μmol/g wet wt. cell):
3
4
33
34
44
333
343
334
0.03
0.10
0.18
0.95
0.50
0.02
0.01
0.02
0.36
1.00
0.04
0.02
0.01
0.02
0.45
1.59
0.02
0.01
-

70
65
70
65
75

0.8
3.5
4.0
2.5
2.5

0.17
0.01
-

22
26
20
26
15
15

19
17
26
21

26
14
15
26

0.02
0.61
0.20
0.55

0.21
0.14
0.94
1.20
0.90

0.87
0.82
0.60
2.20
1.68

0.02
0.04

0.01
0.06
0.05
0.05
0.01

*
*
*
-

*
*
*
-

3(3)(3)3
0.05
0.09
0.24
1.47

Agm
-

3(3)(3)4
0.70
1.40
0.46
0.08
0.10
0.42
0.90
2.55
1.86
1.40

3(3)(3)3
-

Agm
0.04
0.05
0.55
0.10
0.25
0.06
0.01
0.02
0.02
0.42

343/334
0.02
0.03
0.01

3333
-

3343
-

3334
-

Agm
0.14
0.02
0.02

0.02
0.02
0.24
-

-

-

-

0.01
-

Desulfurococcus kamchatkensis
Desulfurococcus amylolyticus
Desulfurococcus fermentans
Desulfurococcus mobilis
Desulfurococcus mucosus
Thermogladius shockii
Pyrolobus fumarii
Aeropyrum camini
Aeropyrum pernix
Ignicoccus hospitalis
Order Acidilobales
Acidilobus aceticus
Caldisphaera lagunensis

JCM 16383T
JCM 9188T
JCM 13383T
JCM 9186T
JCM 9187T
JCM 16579T
JCM 17356T
JCM 12091T
JCM 9820T
JCM 14125T
JCM 11320T
JCM 11604T

19
23
20

82
90
80
85
85
85
100
85
90
90

6.2
6.2
6.2
5.5
5.5
5.5
5.7
8.0
7.0
6.0

0.16
0.14
-

0.30
0.04
0.04
0.03
-

0.15
0.03
0.14
0.10
0.04
0.08
0.03
0.50

0.34
1.45
0.60
0.88
0.96
0.60
0.08
0.15
0.51
0.15

0.06
0.20
0.10
0.10
0.10
0.04
0.02
-

0.30
0.28
0.10
0.28
0.30
0.03
0.50
1.28
1.17
0.25

*
*
*
*
*
*
*
0.30
*

*
*
*
*
*
*
*
*

0.27
0.10
0.10
0.36
0.88
0.80
0.04
0.30
0.05

0.09
0.08
0.04

0.02
0.04
0.02

-

-

26
19

80
75

3.5
4.5

-

0.10
0.02

1.43
0.60

1.51
0.35

-

0.07
-

*
*

*
*

0.02
0.01

-

-

-

0.15

13
19
13
13

3, diaminopropane; 4, putrescine; 5, cadaverine; 33, norspermidine; 34, spermidine; 44, homospermidine; 333, norspermine; 3(3)3, N4-aminopropylnorspermidine; 3(3)4, N4-aminopropylspermidine; 343, spermine; 334,
thermospermine; 434, canavalmine; 3333, caldopentamine; 3343, thermopentamine; 3334, homocaldopentamine; 3(3)(3)3, N4-bis(aminopropyl)norspermidine; 3(3)(3)4, N4-bis(aminopropyl)spermidine; Agm, agmatine; *, notcalculated; -, not detected (<0.005); T, type strain; ℃, culture temperature; JCM, Japan Collection of Microorganisms, RIKEN, Wako, Saitama, Japan; NBRC, Biological Resource Center, National Institute of Technology and
Evaluation, Kisarazu, Chiba, Japan; IFO, Institute for Fermentation Osaka, Japan; ATCC, American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA. Ref. (Reference No.) were cited from our previous data. Agmatine levelof P. horikoshi and P. woesei (not determined in the previous reports) were recalculated from the previous HPLC data. Pyrococcus glycovorans AL585 is deposited in IFREMER, Plouzane, France.

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)transferase: Biochemical and structural characterization of an enzyme involved in polyamine
biosynthesis in the hyperthermophilic archaeon
Pyrococcus furiosus. J. Bacteriol. 189: 6057-6067.
5) Fukuda, W., Morimoto, N., Imanaka, T., and Fujiwara,
S. 2008. Agmatine is essential for the growth ofThermococcus kodakaraensis. FEMS Microbiol. Lett.
287: 113-120.
6) Goda, S., Sakuraba, H., Kawarabayasi, Y., andOhshima, T. 2005. The first archaeal agmatinase fromanaerobic hyperthermophilic archaeon Pyrococcus
horikoshii: cloning, expression, and characterization.
Biochim. Biophys. Acta 1748: 110-115.
7) Graham, D.E., Xu, H., and White, R.H. 2002.
Methanococus jannaschii uses a pyruvoyl-dependentarginine decarboxylase in polyamine biosynthesis. J.
Biol. Chem. 277: 23500-23507.
8) Guy, L. and Ettema, T.J. 2011. The archaeal ‘TACK’superphylum and the origin of eukaryotes. Trends
Microbiol. 19: 580-587.
9) Hamana, K. 2002. Polyamine distribution pattern andchemotaxonomy of bacteria. Microbiol. Cult. Coll.
18: 17-43 (in Japanese).
10) Hamana, K. 2002. Extraction and HPLC analysis ofbacterial polyamines. Ann. Gunma Health Sci. 23:
149-153 (in Japanese).
11) Hamana, K., Hamana, H., and Itoh, T. 1995.
Ubiquitous occurrence of agmatine as the major
polyamine within extremely halophilic archaebacteria.
J. Gen. Appl. Microbiol. 41: 153-158.
12) Hamana, K., Hamana, H., and Itoh, T. 1998.
Polyamine analysis of extremely halophilic archaebacteria. Ann. Gunma Health Sci. 19: 1-4.
13) Hamana, K., Hamana, H., Niitsu, M., Samejima, K.,
and Itoh, T. 1996. Distribution of long linear andbranched polyamines in thermophilic eubacteria andhyperthermophilic archaebacteria. Microbios 85:
19-33.
14) Hamana, K., Hamana, H., Niitsu, M., Samejima, K.,
and Itoh, T. 1996. Polyamines of hyperthermophilicarchaebacteria,
Archaeoglobus,
Thermococcus,
Pyrobaculum and Sulfolobus. Microbios 87: 69-76.
15) Hamana, K., Hamana, H., Niitsu, M., Samejima, K.,
Sakane, T., and Yokota, A. 1994. Occurrence oftertiary and quarternary branched polyamines inthermophilic archaebacteria. Microbios 79: 109-119.
16) Hamana, K., Hamana, H., Shinozawa, T., Niitsu, M.,
Samejima, K., and Itoh, T. 1999. Polyamines of thethermophilic eubacteria belonging to the genera
Aquifex, Thermodesulfobacterium, Thermus andMeiothermus, and the thermophilic archaebacteria
belonging to the genera Sulfurisphaera, Sulfophobococcus, Stetteria, Thermocladium, Pyrococcus,
Thermococcus, Methanopyrus and Methanothermus.

Conclusion
In euryarchaea, branched penta-amines wereubiquitously distributed within the thermophilic orders
Archaeoglobales and Thermococcales and extremely
thermophilic methanogenic genera Methanocaldococcus
and Methanotorris of the order Methanococcales but notin the hyperthermophilic methanogenic genus
Methanopyrus of the order Methanopyrales, threemesophilic/slightly thermophilic methanogenic orders
Methanomicrobiales,
Methanocellales
andMethanosarcinales and the acidophilic (mesophilic/
moderately thermophilic) order Thermoplasmatales.
In crenarchaeota, branched penta-amines have notbeen detected in the two thermophilic orders
Thermoproteales and Desulfurococcales or in the twothermoacidophilic orders Sulfolobales and Acidilobales,in which linear penta-amines and hexa-amines have been
detected sporadically.
Their biosynthesis bycrenarchaeal polyamine synthases from Hyperthermus
belonging to the order Desulfurococcales andPyrobaculum belonging to the order Thermoproteales
has been reported28).
Acknowledgments
We would like to thank JCM and NBRC for theirgenerous donation of archaeal strains. Methanolobus
chelungpuianus JCM 15159, Thermogladius shockii
JCM 16579 and Thermococcus atlanticus JCM 16138 by
the permission of National Chung Hsing University,
Taichung, Taiwan, the National Park Service,
Yellowstone National Park, WY, USA and Laboratoire deMicrobiologie des Environnements Extremes, Plouzane,France, respectively.
References
1) Archaea, The NCBI Entrez Taxonomy website 2012.
National Center for Biotechnology Information.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/.
2) Archaea, Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology,
2nd ed. Vol. 1. D. R. Boone and R. W. Castenholz eds.
Springer, 2001.
3) Cacciapuoti, G., Porcelli, M., Carteni-Farina, M.,
Gambacorta, A., and Zappia, V. 1986. Purificationand characterization of polyamine transferase from
Sulfolobus solfataricus, an extreme thermophilicarchaebacterium. Eur. J. Biochem. 161: 263-271.
4) Cacciapuoti, G., Porcelli, M., Moretti, M.A.,
Sorrentino, F., Concilio, L., Zappia, V., Liu, Z.-J.,
Tempel, W., Schubot, F., Rose, J.P., Wang, B.-C.,
Brereton, P.S., Jenney, F.E., and Adams, M.W.W.
2007. The first agmatine/cadaverine aminopropyl
27

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)27) Kamekura, M., Hamana, K., and Matsuzaki, S. 1987.
Polyamine contents and amino acid decarboxylation
activities of extremely halophilic archaebacteria andsome eubacteria. FEMS Microbiol. Lett. 43: 301-305.
28) Knott, J.M. 2009. Biosynthesis of long-chain
polyamines by crenarchaeal polyamine syntheses
from Hyperthermus butylicus and Pyrobaculum
aerophilum. FEBS Lett. 583: 3519-3524.
29) Morimoto, N., Fukuda, W., Nakajima, N., Masuda, T.,
Terui, Y., Oshima, T., Imanaka, T., and Fujiwara, S.
2010. Dual biosynthesis pathway for longer-chain
polyamines in the hyperthermophilic archaeon
Thermococcus kodakarensis. J. Bacteriol. 192:
4991-5001.
30) Oshima, T., Moriya, T., and Terui, Y. 2011.
Identification, chemical synthesis, and biological
functions of unusual polyamines produced byextreme thermophiles. Methods Mol. Biol. 720:
81-111.
31) Niitsu, M., Samejima, K., Matsuzaki, S., andHamana, K. 1993. Systematic analysis of naturally
occurring linear and branched polyamines by gas
chromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr.
641: 115-123.
32) Nunoura, T. 2012. Insights into the ecology,
physiology and genomic traits of the “Aigarchaeota”.
J. Jpn. Soc. Extremophiles 11: 6-11 (in Japanese).
33) Nunoura, T., Takaki, Y., Kakuta, J., Nishi, S.,
Sugahara, J., Kazama, H., Chee, G.J., Hattori, M.,
Kanai, A., Atomi, H., Takai, K., and Takami, H. 2010.
Insights into the evolution of Archaea and eukaryotic
protein modifier systems revealed by the genome of anovel archaeal group. Nucleic Acids Res. 39:
3204-3223.
34) Tanaka, T., Hamana, K., and Itoh, T. 2002.
Polyamine analysis of extremely halophilicarchaebacteria and methanogenic archaebacteria. Ann.
Gunma Health Sci. 23: 137-143.
35) Terui, Y., Ohnuma, M., Hiraga, K., Kawashima, E.,
and Oshima, T. 2005. Stabilization of nucleic acids
by unusual polyamines produced by an extreme
thermophile, Thermus thermophilus. Biochem. J.
388: 427-433.
36) Yasuda, M., Oyaizu, H., Yamagishi, A., and Oshima,T. 1995. Morphological variation of new
Thermoplasma acidophilum isolates from Japanese
hot springs. Appl. Environ. Microbiol. 61:
3482-3485.

Microbios 97: 117-130.
17) Hamana, K., Hayashi, H., Niitsu, M., and Itoh, T.
2009. Polyamine analysis of thermophilic,acidophilic, alkaliphilic and radio-tolerant bacteria
belonging to the domain Bacteria and methanogens,thermophiles and extreme halophiles belonging to thedomain Archaea. J. Jpn. Soc. Extremophiles 8: 59-68.
18) Hamana, K. and Hosoya, R. 2006. Polyamines ofthermophiliceubacteria
andarchaebacteria.
Chemistry and Biology 44: 320-330 (in Japanese).
19) Hamana, K., Hosoya, R., and Itoh, T. 2007.
Polyamine analysis of methanogens, thermophilesand extreme halophiles belonging to the domain
Archaea. J. Jpn. Soc. Extremophiles 6: 25-31.
20) Hamana, K., Hosoya, R., Niitsu, M., Hayashi, H.,
and Itoh, T. 2008. Temperature and salt dependent
long linear and branched polyamine syntheses in thethermophiles belonging to the domain Archaea. J. Jpn.
Soc. Extremophiles 7: 21-27.
21) Hamana, K. and Itoh, T. 2001. Polyamines of thehyperthermophilic archaebacteria belonging to thegenera Thermococcus and Methanothermus and two
new genera Caldivirga and Palaeococcus. Microbios
104: 105-114.
22) Hamana, K., Kamekura, M., Onishi, H., Akazawa, T.,
and Matsuzaki, S. 1985. Polyamines in photosynthetic
eubacteria
andextreme-halophilicarchaebacteria. J. Biochem. 97: 1653-1658.
23) Hamana, K., Niitsu, M., Samejima, K., Itoh, T.,
Hamana, H., and Shinozawa, T. 1998. Polyamines of
the thermophilic eubacteria belonging to the genera
Thermotoga, Thermodesulfovibrio, Thermoleophilum,
Thermus, Rhodothermus and Meiothermus, and thethermophilic archaebacteria belonging to the genera
Aeropyrum, Picrophilus, Methanobacterium andMethanococcus. Microbios 94: 7-21.
24) Hamana, K. and Matsuzaki, S. 1992. Polyamines as achemotaxonomic marker in bacterial systematics. Crit.
Rev. Microbiol. 18: 261-283.
25) Hamana, K., Otsuka, E., Eguchi, F., and Niitsu, M.
2005. Occurrence of homospermidine andcanavalmine as a major polyamine in mushrooms.
Mushroom Sci. Biotech. 13: 95-102.
26) Hamana, K., Tanaka, T., Hosoya, R., Niitsu, M., andItoh, T. 2003. Cellular polyamines of the acidophilic,
thermophilic and thermoacidophilic archaebacteria,
Acidilobus, Ferroplasma, Pyrobaculum, Pyrococcus,
Staphylothermus, Thermococcus, Thermodiscus andVulcanisaeta. J. Gen. Appl. Microbiol. 49: 287-293.

28

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)Short Communication

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12, 29-32

Tadikara Ta,*, Matsubara Ta,*, Kubota Ya, Kosaka Ta, Ozawa Ta,
Tsukimura Wa, Yatsunami Ra, Fukui Ta, Nakasone Kb,
Takashina Tc and Nakamura Sa

Gene expression and characterization of aerotaxis transducer HemAT fromextremely halophilic archaeon Haloarcula japonica TR-1a

Department of Bioengineering, Tokyo Institute of Technology, 4259 Nagatsuta, Midori-ku, Yokohama 226-8501, Japan
Department of Biotechnology and Chemistry, Kinki University, 1 Umenobe, Takaya, Higashi-Hiroshima-shi,
Hiroshima 739-2116, Japanc
Department of Applied Biosciences, Toyo University, 1-1-1 Izumino, Itakura, Oura-gun, Gunma 374-0193, Japanb*

Equal contribution.
Corresponding author: Satoshi Nakamura, nakamura.s.af@m.titech.ac.jp
Phone: +81-45-924-5765; Fax: +81-45-924-5837
Received: May 21, 2013 /Revised: June 2, 2013 /Accepted: June 6, 2013
it to activate a histidine kinase CheA. The activated
CheA phosphorylates a response regulator CheY, andthen the phosphorylated CheY induces a switch at theflagella motor to control its rotational direction (for areview, see reference 3). In this signal transduction
system, some MCPs act as signal transducers and also as
sensors for the external signals.
Signal transducer proteins, HemAT-Bs and HemAT-Hs,
are found in Bacillus subtilis and Halobacterium
salinarum, respectively5). These are both cytoplasmic
aerotaxis transducers involved in aerophilic andaerophobic responses. HemAT-Bs and HemAT-Hs arehemoproteins containing a b-type heme as a prosthetic
group and show absorption spectra similar to those of
myoglobin. The heme in HemAT acts as an oxygen
sensor and molecular mechanisms involved in oxygen
sensing by HemAT-Bs and HemAT-Hs have been
elucidated by resonance Raman spectroscopy1) andFourier transform infrared spectroscopy10).
Haloarcula japonica TR-1 is a triangular disc-shaped
extremely halophilic archaeon4). Recently, the draft
genome sequence of Ha. japonica was determined8). The
genome of Ha. japonica is 4.3 Mb in size, and ispartitioned into five replicons: two chromosomes andthree plasmids. A gene encoding an aerotaxis transducer
HemAT homolog was identified in the genome. In thisstudy, the Ha. japonica hemAT gene was cloned andexpressed in Escherichia coli, and Ha. japonica HemAT
produced by E. coli was purified and characterized.
An open reading frame of 1,491 nucleotides, encoding
a protein of 497 amino acids, was found in the genome

Abstract An open reading frame encoding an aerotaxis
transducer HemAT homolog (named HemAT-Hj) was
found in the genome of extremely halophilic archaeon
Haloarcula japonica TR-1. HemAT-Hj would be acytoplasmic protein consisting of a sensor domain, alinker region and a methyl-accepting signaling domain.
The hemAT-Hj gene was successfully expressed in
Escherichia coli. Recombinant HemAT-Hj was purified
and characterized. Absorption spectra showed that E.
coli-produced HemAT-Hj contained a b-type heme
molecule.
Keywords:HemAT;
Hemoprotein;
Extremely
Haloarcula japonica

Aerotaxis
halophilictransducer;
archaeon;

Abbreviations: MCP, methyl-accepting chemotaxis
protein;
SDS-PAGE,
SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis; CBB, Coomassie brilliant blue

Motile microorganisms are known to swim toward oraway from specific environmental stimuli such as
nutrients, oxygen and light. These behaviors are calledchemotaxis, aerotaxis and phototaxis, respectively. To
respond to the external signals, microorganisms employ
individual intracellular signal transduction systems
consisting of methyl-accepting chemotaxis proteins(MCPs) and some Che proteins. MCPs transmit theexternal signals to intracellular signaling pathway of Che
proteins. The conformational change in the MCPs allows

29

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)sequence of Ha. japonica. A PSI-BLAST search using
the Protein Data Bank (PDB) database revealed that theencoded protein, named HemAT-Hj, showed 46%
homology to HemAT-Hs. HemAT-Hj would be acytoplasmic protein consisting of a sensor domain(Met1-Gln199), a linker region (Arg200-Thr236) and amethyl-accepting signaling domain (Asn237-Glu497), as
well as HemAT-Hs (Fig. 1). The sensor domain

contained a putative heme-binding motif and showed
limited homology to myoglobin. The signaling domain
showed marked similarities to other MCPs. DNA
sequence data of the hemAT-Hj gene were deposited in
the DNA Data Bank of Japan (DDBJ), the European
Molecular Biology Laboratory (EMBL), and the
GenBank nucleotide sequence database under accession
number AB823705.

Fig. 1. Schematic structure of HemAT-Hj.
The numbers refer to amino acid residue numbers. The sensor domain contained a putative heme-binding motif. The
signaling domain showed marked similarities to other MCPs.
5'-GGTACCAAACATATGGGATTACGGGACGGG-3',
which introduces an Nde I site. An antisense primer used
was5'-GGATCCCTATTAGTGGTGGTGGTGGTGTTCCGTGTCGGTGTCGAGC-3', which introduces a His-tag
sequence, tandem stop codons and a Bam HI site. The
PCR products were digested by Nde I and Bam HI and
inserted into the same sites of pET21b(+) vector(Novagen, WI, USA) to construct expression plasmid
phemJH2.
This plasmid encoding C-terminally His-tagged
HemAT-Hj was transformed into E. coli BL21(DE3)(Novagen). E. coli BL21(DE3) harboring phemJH2 wasgrown in LB medium containing 50 μg/ml ampicillin at
37˚C to a mid-logarithmic phase. Expression of thehemAT-Hj gene was induced by adding 1.0 mM
isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside. After a 3-h
incubation, the cells were collected by centrifugation(4,400 × g, 10 min, 4°C) and sonicated in 50 mM
phosphate buffer (pH 8.0) containing 2.0 M NaCl and
1.0 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF). Afterunbroken cells and cell debris were removed bycentrifugation (20,400 × g, 10 min, 4°C), the cell extract
was dialyzed against 50 mM phosphate buffer (pH 8.0)
containing 2.0 M NaCl, 1.0 mM PMSF and 20 mM
imidazole, and then loaded onto a Ni2+-immobilized
HiTrap Chelating HP column (GE Healthcare, Bucks,
England). Absorbed proteins were eluted using a linear
gradient from 20 to 500 mM imidazole in the same

To determine whether the hemAT-Hj gene is transcribedin Ha. japonica, RT-PCR of the hemAT-Hj mRNA was
performed. Ha. japonica was grown at 37˚C in a liquidmedium as described previously.9) Total RNA wasprepared using RNeasy Mini Kit (Qiagen, CA, USA).
The obtained total RNA was further treated with DNase I(Amersham, Uppsala, Sweden) to remove trace amountsof the contaminating genomic DNA. Reverse
transcription and subsequent PCR were performed using
rTth DNA polymerase (Toyobo, Osaka, Japan) andiCycler Thermalcycler (Bio-Rad, CA, USA). The
followingprimers
wereused:5'-AGATGCAGTCGCGGGCGCTC-3' (sense primer)and 5'-CCCTCCGTCACCTGCTCGG-3' (antisense
primer). An expected RT-PCR product of about 0.71 kp
was obtained and confirmed to be a part of the hemAT-Hj
gene by DNA sequencing (data not shown). No
RT-PCR products were obtained when the reverse
transcription step was omitted, indicating that theobserved product was not due to possible genomic DNA
contamination in the total RNA preparation. This result
indicated that the hemAT-Hj gene was transcribed in Ha.
japonica.
To prepare a large amount of HemAT-Hj, the hemAT-Hj
gene was expressed in E. coli. The hemAT-Hj structuralgene was amplified by PCR using KOD-plus- DNApolymerase (Toyobo). Ha. japonica genomic DNA wasprepared as described previously. A sense primer usedwas30

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)Plus Protein Standards (Bio-Rad). Purified HemAT-Hj
showed a single band on SDS-PAGE at about 90 kDa(Fig. 2). The molecular mass of C-terminally His-tagged
HemAT-Hj, estimated from the amino acid sequence,
was about 55 kDa, clearly lower than that obtained by
SDS-PAGE. Overestimation of molecular masses by
SDS-PAGE has also been reported for other proteinsfrom halophilic archaea7,11,12). This behavior is probably
due to the difficulty of SDS-binding to haloarchaeal
proteins that are rich in acidic amino acids.

buffer. The fractions containing HemAT-Hj werecollected, concentrated by ultrafiltration using Amicon
Ultra-4 Centrifugal Filter Units 30 NMWL (Millipore,
MA, USA), and then dissolved in 50 mM phosphatebuffer (pH 8.0) containing 2.0 M NaCl and 1.0 mM
PMSF.
Purified
HemAT-Hj
wasappliedto
SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)
using a 7.5% gel6). After electrophoresis, proteins in thegel were stained with Coomassie brilliant blue (CBB)
R-250. The molecular mass markers used were Precision

Fig. 2. SDS-PAGE of purified HemAT-Hj.
Purified HemAT-Hj was applied to SDS-PAGE using a 7.5% gel.
After electrophoresis, proteins in the gel were stained with CBB
R-250. Lane M, molecular mass markers; lane 1, purified HemAT-Hj.

are similar with those of HemAT-Bs and HemAT-Hs5),
suggesting that E. coli-produced HemAT-Hj also
contains a heme molecule. A pyridine hemochrome
assay2) shows that the absorption maxima of pyridine
hemochrome formed from purified HemAT-Hj are 420
nm (Soret), 560 nm (α-band) and 530 nm (β-band), in
good agreement with those from myoglobin (Fig. 4).
This result indicates that the heme group of HemAT-Hj isof the b-type.

Absorption spectra of purified HemAT-Hj were
measured on a UV-1650PC spectrophotometer(Shimadzu, Kyoto, Japan). The spectra of oxygenatedand deoxygenated HemAT-Hj are shown in Fig. 3.
Absorption maxima of oxygenated HemAT-Hj occur at
410 nm (Soret), 580 nm (α-band) and 540 nm (β-band).
On deoxygenation with sodium dithionite, the Soretbands shift to 430 nm, and the α- and β-bands converge
to a broad peak at 550 nm. These spectra of HemAT-Hj

Fig. 3. Absorption spectra of purified HemAT-Hj.
Absorption spectra of purified HemAT-Hj (4.7 mg/ml) were
measured in 50 mM phosphate buffer (pH 8.0) containing
2.0 M NaCl and 1.0 mM PMSF (oxygenated form).
Deoxygenated form was observed in the presence of excess
sodium dithionite

31

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)Fig. 4 Difference absorption spectrum of pyridine hemochromeformed from purified HemAT-Hj.
Purified HemAT-Hj (1.7 mg) was dissolved in 25% pyridine, 50
mM NaOH, and absorption spectrum was measured in theabsence or presence of Na2S2O4 to obtain a difference spectrum.

the ferredoxin gene from extremely halophilicarchaeon Haloarcula japonica strain TR-1. BioMetals,
14: 135-142.
8) Nakamura, S., Nakasone, K. and Takashina, T. (2011)
Genetics and genomics of triangular disc-shaped
halophilic archaeon Haloarcula japonica strain TR-1,
pp.364-381. In: Horikoshi, K., Antranikian, G., Bull, A.
T., Robb, F. T. and Stetter, K. O. (eds), Extremophiles
handbook. Springer, Heidelberg.
9) Nishiyama, Y., Nakamura, S., Aono, R. and Horikoshi,
K. (1995) Electron microscopy of halophilic archaea,
pp 29-33. In: DasSarma, S. and Fleischman, E. M.
(eds), Archaea, a laboratory manual: halophiles. Cold
Springer Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
New York.
10) Pinakoulaki, E., Yoshimura, H., Daskalakis, V.,
Yoshioka, S., Aono, S and Varotsis, C. (2006) Two
ligand-binding sites in the O2-sensing signal transducer
HemAT: implications for ligand
recognition/discrimination and signaling. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 103: 14796-14801.
11) Yatsunami, R., Sato, M., Orishimo, K., Hatori, Y.,
Zhang, Y., Takashina, T., Fukui, T. and Nakamura, S.
(2010) Gene expression and characterization of a novel
GH family 18 chitinase from extremely halophilicarchaeon Halobacterium salinarum NRC-1. J. Jpn. Soc.
Extr., 9: 19-24.
12) Wakai, H., Nakamura, S., Kawasaki, H., Takada, K.,
Mizutani, S., Aono, R. and Horikoshi, K. (1997)
Cloning and sequencing of the gene encoding the cellsurface glycoprotein of Haloarcula japonica strain
TR-1. Extremophiles, 1: 29-35.

We thank Dr. M. Misono, Dr. N. Fujita, and Dr. M.
Sekine of the National Institute of Technology and
Evaluation (NITE), Japan, for genome sequencing. We
also thank Professor S. Aono of the National Institutes of
Natural Sciences, Japan, for helpful discussions.
References
1) Aono, S., Kato, T., Matsuki, M., Nakajima, H., Ohta,
T., Uchida, T. and Kitagawa, T. (2002) ResonanceRaman and ligand binding studies of theoxygen-sensing signal transducer protein HemAT from
Bacillus subtilis. J. Biol. Chem., 277: 13528-13538.
2) Berry, E. and Trumpower, B. L. (1987) Simultaneous
determination of hemes a, b, and c from pyridine
hemochrome spectra. Anal. Biochem., 161: 1-15.
3) Bren, A. and Eisenbach, M. (2000) How signals areheard during bacterial chemotaxis: protein-protein
interactions in sensory signal propagation. J. Bacteriol.,
182: 6865-6873.
4) Horikoshi, K., Aono, R. and Nakamura, S. (1993) The
triangular halophilic archaebacterium Haloarcula
japonica strain TR-1. Experientia (Basel), 49: 497-502.
5) Hou, S., Larsen, R W., Boudko, D., Riley, C. W.,
Karatan, E., Zimmer, M., Ordal., G. W. and Alan, M.
(2000) Myoglobin-like aerotaxis transducers in
Archaea and Bacteria. Nature (London), 403: 540-544.
6) Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteinsduring the assembly of the head of bacteriophage T4.
Nature (London), 227: 680-685.
7) Matsuo, T., Ikeda, A., Seki, H., Ichimata, T., Sugimori,D. and Nakamura, S. (2001) Cloning and expression of32

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)

学会記事
極限環境生物学会第 14 回シンポジウム報告
第 14 回シンポジウムは、6 月 15 日に東洋大学・白山キャンバス・125 周年記念館で開催されました。「極限環境生物研究の最前線」をテーマとして、5 名の気鋭の若手研究者による講演をいただきました。当日は、多くの会員・非会員の皆様がご参集され、参加者合計は 162 名（内訳を以下の表に示す）となり、大変盛況な中でシンポジウムを開催することができました。本シンポジウムを主催していただきました東端シンポ委
員長をはじめとする、当学会の誇る若手シンポ委員の皆様によりすべて企画された大変中身の濃い会となりました。ご参加いただいた皆様方に事務局一同心より感謝申し上げます。

一般
学生
総計

事前申し込み人数48（会員 38、非会員 10）77（会員 6、非会員 71）
125（会員 44、非会員 81）

当日申し込み人数18（会員 8、非会員 10）19（会員 0、非会員 19）37（会員 8、非会員 29）

合計
66（会員 46、非会員 20）96（会員 2、非会員 113）
162
（会員 52、非会員 110）

【プログラム】（敬称略）
12:00 開場
展示イベント（フロアで機器展示会：12:00～17:40）
13:00-13:05 開会の挨拶
13:05-13:45 宮内 啓介（東北学院大学 工学部）
講演タイトル ヒ素耐性菌のヒ素耐性遺伝子群の機能解析
13:45-14:25 東江 栄（香川大学 農学部）
講演タイトル アイスプラントの高塩環境適応機構とその応用
14:25-15:05 休憩・展示イベント
15:05-15:45 諸野 祐樹（海洋研究開発機構 高知コア研究所）
講演タイトル 生命の生息限界、代謝速度の限界を探る—海底下における微生物とその活性—15:45-16:25 鹿児島 浩（情報・システム研究機構 新領域融合研究センター（国立遺伝学研究所））
講演タイトル 陸上微小動物において凍結・乾燥耐性を担う遺伝子の探索
16:25-17:05 山内 清司（愛媛大学 ベンチャービジネスラボラトリー）
講演タイトル 好冷性微生物の高温ストレス応答機構
17:05-17:10

閉会挨拶

17:10-17:40 休憩・展示イベント
17:40-19:30

懇親会（8 号館 1 階レストラン ）最後に、本シンポジウムを主催者側として盛り上げていただいた東洋大学の東端シンポ委員長をはじめとする関係者一同に感謝申し上げます。ありがとうございました。
極限環境生物学会事務局

33

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)

第 14 回

極限環境生物学会年会のお知らせ

以下の要領で年会を開催いたします。皆様のご参加をお待ちしております。
場所：明治大学生田キャンパス 第二校舎 A 館
日時：2013 年 10 月 27 日（土） 28 日（日）【最寄駅からのアクセス】●小田急線「生田駅」（準急・各駅停車）下車南口徒歩約 10 分
※新宿から急行で約 20 分の「向ヶ丘遊園駅」で下車し、 準急・各駅停車に乗り換えて 1 駅目（約 3 分）
※小田原方面から快速急行・急行「新百合ヶ丘駅」で下車し、準急・各駅停車に 乗り換えて 3 駅目（約 7 分）
●小田急線「向ヶ丘遊園駅」（快速急行・多摩急行を除く急行と準急・ 各駅停車のみ停車）北口下車→小田急バス「明大正門前」で終点下車（http://www.meiji.ac.jp/koho/campus_guide/ikuta/access.html）
詳しくは、当学会ホームページ並びに当学会 facebook 告知等によりお知らせいたします。
極限環境生物学会事務局

34

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)

学会誌投稿規定
極限環境生物学会誌投稿規定
１．投稿者の資格
極限環境生物学会誌（ISSN 1348-5474） (Journal ofJapanese Society for Extremophiles)（以下、本誌という）への投稿は極限環境生物学会（以下、本学会という）会員に限る。なお、連名による投稿の場合には、少なくとも著者の一人が本学会会員でなければならない。ただし、日本国以外からの投稿並びに本学会が寄稿を依頼した場合は例外とする。

け付ける。この場合、極限環境生物学会ホームペー
ジに掲載されている投稿要領に従うこと。

２．論文の種類
本誌への投稿論文は、極限環境生物関連分野の原著論文（通常論文、短論文）、総説、並びに諸報とし、いずれも未発表のものに限る。
（１）原著論文 (original papers)：極限環境生物に関する論文で以下の２つのいずれかに該当する論文。
１）通常論文 (regular papers)：極限環境生物に関する論文で、それ自体独立した、価値のある結論ある
いは事実を含む論文。
２）短論文 (short communications)：極限環境生物に関する論文で、断片的な結果ではあるが新しい事実や価値のあるデータを含む短い論文。
（２）総説 (reviews)：極限環境生物のある特定の研究分野について、簡単な歴史的背景を含め、最近の進歩を要約し、可能であれば、将来の研究方向性をも指し示した論文。
（３）ミニレビュー (mini-reviews)：総説の内、比較的短く纏めたもの。
（４）諸報：巻頭言、研究最前線、研究のルーツを探る、学会関連記事等。

５．論文の審査
投稿された論文の内、原著論文、総説、ミニレビュ
ーの審査には、極限環境生物学会誌編集委員の内１名が責任編集委員として関与する。原著論文および総説の審査は、責任編集委員が適宜指名する複数の査読者によりなされる。掲載の可否に関する最終判
定は、査読者からの査読結果報告に基づき責任編集委員が行う。その後、編集委員長が著者に審査結果を通知する。なお、内容・体裁に問題があると判断された原稿については、著者による修正を求める。
修正を求められた原稿は、２ヶ月以内に責任編集委
員に返送することとし、２ヶ月を過ぎて返送されなかった原稿は、著者が原稿を取り下げたものとして処理する。なお、投稿された論文は返却しない。

〒113-8657 東京都文京区弥生 1-1-1 東京大学大学
院農学生命科学研究科応用生命工学専攻（東大院農生科応生工と省略可）極限環境生物学会誌編集委員長
石 井 正 治 ( 電 話 ： 03-5841-8258, FAX ：03-5841-5272) (e-mail: amishii@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp)

６．校正
校正は初稿のみ著者に送付する。到着日より３日以内に、原稿とともに指定された送付先に返送すること。なお、原著論文ならびに総説に関しては、著者
校正時の文章・図表の追加や削除は一切認めない。
７．別刷り
別刷りは、pdf ファイルとして配布する。

３．論文の書き方
論文の用語は日本語または英語とし、別途定める「原稿執筆要領」に従い簡潔に分かりやすく作成すること。総説は原稿３０頁以内、通常論文は原稿２０頁
以内、ミニレビューは原稿１５頁以内、短論文は原稿１０頁以内とする。なお、諸報の頁数に関しては編集委員会で適宜判断する。

８．著作権
本誌に掲載された論文の著作権は本学会に帰属する。
９．その他
極限環境生物学会誌投稿規定ならびに極限環境生物
学会誌論文執筆要領で不明な部分に関しては、極限環境生物学会誌編集委員会において適宜対応する。
なお、必要が認められる場合には、文書化を進めるものとする。

４．論文の受付
論文原稿は諸報を除き、原稿原本の他にコピー３部を付け、送付状とともに簡易郵便書留として下記宛に送付すること。なお、オンラインによる投稿も受

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)

論文執筆要領
極限環境生物学会誌論文執筆要領
１．一般的事項（１）テキストファイル形式または Microsoft Word
形式で保存できるワードプロセッサ等を用いて原稿を作成すること。
（２）タイトルページには、1)論文題名、2)著者名、
3)著者所属機関名、4)ランニングタイトル、5)連絡対
応著者名およびその連絡先住所・電話番号・FAX 番号・e-mail アドレス、6)キーワード（５語以内）を明示すること。日本語で作成した論文には、これらの英語訳を併記すること。
（３）論文印刷には A4 版用紙の片面を使用し、１
行４０字（英語の場合には１行６０字）、１頁２５行で印刷すること。イタリック、ボールド、あるいはスモールキャピタルにする語句がある場合は、それぞれ赤字で下線、波下線、二重下線を記すこと。
（４）略語リストがある場合には、本文第１頁に脚注として略語の項を設け表記すること。単位系と省略記号は SI 単位を基本とする。
（５）生物の命名及び記載は International Code of
Nomenclature of Prokaryotes, International Code ofBotanical Nomenclature, International Code ofZoological Nomenclature に従う。学名が初出の場合は全部を記載すること。原則として、２回目以降は属名の頭文字を略号とするが、紛らわしい場合には省略せずに記載すること。
（６）物質名の表記は以下の規定に従うこと。
１）有機化合物の表記および放射性同位元素による標識化合物の表記は IUPAC 規定に従うこと。
２）生化学関連事項の命名は IUPAB 制定の命名法に従うこと。
３）化学式に用いられる記号、略号などは Chemical
Abstracts の用例に従うこと。
（７）論文受理後、完成した本文および図表等の印刷に必要な全てのファイルを収めた電子媒体を編集委員長宛に郵送するか、またはそれらのファイルを
e-mail 添付書類として編集委員長宛に送付すること。
２．投稿論文の構成（１）原著論文は 1)標題、2)アブストラクト、3)本
文、4)引用文献、5)表ならびに図、図の説明文、の順にまとめること。
（２）標題は論文内容を具体的に表す簡潔なものとすること。標題の下に著者名、所属機関名、所在地を書く。著者が複数で、所属機関が異なる場合は、
著者名末尾に上付数字を付けて区別するとともに、連絡対応著者名を指定すること。
（３）原著論文ならびに総説のアブストラクトは英語で記述するものとし、通常論文・総説では200words 以内、短論文では 100words 以内で作成す

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ること。
（４）通常論文の本文は原則として、緒言、材料および方法、結果、考察（あるいは結果と考察）、謝辞で構成する。短論文では項目分けをしない。
（５）原著論文ならびに総説では、必要に応じて図表を用いる。それぞれの図表を挿入したい位置を、原稿右側の余白部分に指示すること。
（６）文中での文献の引用は、引用文献の項目で整理した文献番号を用いること。図表の引用はその番号によること。
（７）脚注が必要な場合には、該当事項の右肩に通し番号を付け、当該頁の下部に説明文を付けること。
３．引用文献（１）引用文献は下記の例に準じ、本文中の該当人
名あるいは事項の右肩に 1), 1-3)のように番号を付し、また、本文末尾の引用文献の項に第一著者のファミリーネームのアルファベット順に 1., 2., 3., --の番号を付し一括記載する。Ibid., idem は用いないこと。私信、未発表の研究結果、学術雑誌に受理される前の論文、抄録が印刷されていない口頭発表など
は引用文献に含めないこと。雑誌の略号は、Chemical
Abstracts Service Source Index (CASSI) 1907-1984(Cumulative)およびその補遺版により、雑誌名、書名、
年、巻および頁の示し方は下記によること。
（２）雑誌引用のとき
Chuakrut, S., Arai, H., Ishii, M., and Igarashi, Y. 2000.
Characterization of a bifunctional archaeral acylcoenzyme A carboxylase. J. Bacteriol. 185: 938-947.
（３）書籍引用のとき
児玉徹. 1997. V 近代的な微生物利用工業１．アルコール, pp191-197.児玉徹・熊谷英彦編, 食品微生物学,
文永堂出版
４．表と図およびその説明（１）表と図は印刷版下を作成すること。
（２）本文を英語で書いた場合には図表も英文で作成すること。
（３）表と図は一つに対して１頁使う。各頁の右上に著者名ならびに図の番号を入れること。
（４）表題は表の上部分に書くこと。表の内容説明
文ならびに注は、表の下に記述する。注の表示にはa),b),c)を上付で明記し、記述には a),b),c)を上付にせず用いる。
（５）図の標題ならびに説明文は別紙にまとめて印刷すること。図の標題の最後にはピリオドを付し、内容説明は標題の後に改行して記載すること。
（６）写真は明瞭な陽画を必要部数添付すること。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)

学会会則
極限環境生物学会会則（名称）第１条 本会は、極限環境生物学会（英文名：TheJapanese Society for Extremophiles ）という。
（以下本会という）（目的）
第２条 本会は、極限環境生物研究の発展に寄与し、極限環境生物の研究、教育、利用の推進に寄与することを目的とする。
（事業）
第３条 本会は、研究発表会及び講演会等の開催、
極 限 環 境 生 物 学 会 誌 （ 英 名 ： Journal ofJapanese Society for Extremophiles）の発行、
国際極限環境生物学会等との連携事業、研究奨励賞・ポスター賞の授与、その他前条の目的を達成するために必要な事業を行う。
（会員の種別等）
第４条
1. 本会の会員は正会員、団体会員および賛助会員とする。
2. 正会員は極限環境生物に関する研究に従事する、または、これに関心を持つ個人であって、本会の目的に賛同し、定められた会費を納めた者をいう。
3. 団体会員は極限環境生物に関心を持つ団
体（法人等）であって、その団体内の本会の目的に賛同する代表者を含めて３名以内の所属者を指名して会員登録を行い、定められた会費を納めた団体をいう。
4. 賛助会員は本会の目的に賛同し、定められた賛助会費を１口以上納めた個人または団体をいう。
第５条 会員は本会が開催する諸事業に参加し、本会の発行する印刷物、PDF 等の配布を受けることができる。
（入会）
第６条 会員として入会しようとする個人または団
体は、本会事務局が定める手続きに従って申し込みを行い、本会会長による承認を得なければならない。
（会費）
第７条 会員は下記の会費を納めるものとする。
正会員
年額 5,000 円（但し身分が学生である者は年額 2,000 円）

団体会員 年額 20,000 円
賛助会員 年額 一口以上（一口 30,000 円）（退会）
第８条 会員は会長に届けることによって退会する

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ことができる。
（役員）
第９条
1. 本会には会長 1 名、副会長 2 名、評議員若干名、幹事若干名、会計監査 2 名の役員をおく。
2. 会長は本会を代表し、会務を統括する。
3. 副会長は会長を補佐し、会長に事故ある場
合には会長の職務を代行する。
4. 幹事は、幹事長、庶務、学術活動、会計、を分担し、事業計画の立案、事業の実施、庶務会計、シンポジウムの企画立案、学会誌発行、国際極限環境生物学会等との連絡などの本会の事務を行う。
5. 会計監査は本会の会計を監査する。
（役員の選出）第１０条 会長、副会長、評議員は本会の総会において選出される。
1. 幹事、会計監査は、副会長、評議員以外の正会員の中から会長が指名し、総会の承認を受ける。
2. 評議員の任期は２年とし重任を妨げない
が、連続３期を限度とする。但し、会長が指名する評議員はこの限りではない。
（委員会）
第１１条 本会に学会誌編集委員会、研究奨励賞選
考委員会、シンポジウム委員会を置く。各委員会委員の任期は 2 年とするが重任をさまたげない。
1. 学会誌編集委員会（会長指名の若干名で構成し､委員長は互選する）は学会誌の編集、論文審査の任にあたる。
2. 研究奨励賞選考委員会（副会長が委員長を勤め、学術活動担当幹事と委員長指名の委員、計 10 名程度で構成する）は本会の研究奨励賞受賞者を選考する。
3. シンポジウム委員会（会長指名の若干名で構成し､委員長は互選する）は学術活動幹事と共同でシンポジウムを企画立案し、運営をサポートする。
（評議員会）
第１２条 評議員会は会長、副会長、評議員をもって構成する。会長は年１回以上評議員会を召集し、議長となり、会の重要事項を審議し総会に提案する。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)第１７条 本会則の変更は総会の議決を経て行う。
第１８条 本会則は、1999 年 10 月 19 日より施行する。

（総会）
第１３条 本会は原則として年１回総会を開き、会務を協議し議決する。
総会は会長が召集する。
第１４条 総会の議決は出席会員の過半数の賛成をもって行う。
（会計年度）
第１５条 本会の事業年度は 1 月 1 日に始まり、同年 12 月 31 日に終る。
（付則）第１６条 本会則の施行および本会の運営についての細則は総会の議決を経て別に定める。

学会細則2001 年 11 月 29 日改定
2002 年 12 月 1 日改定
2003 年 12 月 1 日改定
2005 年 11 月 7 日改定
2007 年 12 月 1 日改定
2010 年 1 月 1 日改定

極限環境生物学会細則
第８条 評議員会の決議は出席者の過半数の賛成により成立する。
（退会）
第９条 会長は、会費を３年以上滞納した会員を退会させることが出来る。
（授賞）
第１０条 研究奨励賞・ポスター賞の授賞規定は別途定め全会員に配布する。
（細則の変更）第１１条 本細則の変更は総会の議決による。
（付則）第１２条 今期の本会事務局は、東洋大学生命科学部井上研究室（群馬県邑楽郡板倉泉野）内とする。
第１３条 本細則は、1999 年 10 月 19 日よりこれを
実施する。

（会員）
第１条 入会を承認された正会員、団体会員、賛助
会員は、所定の会費を速やかに納入する。
（総会）
第２条 総会の議案は副会長、幹事等と共に会長が作成し、評議員会の議を経た後提出する。
議案には前年度の事業内容及び収支決算、
新年度の事業計画、及び収支予算を含むものとする。
第３条 総会は会員の１／１０以上の出席（但し委任状を含む）をもって成立する。
（役員の選出）第４条 会長、副会長、評議員は会員の選挙によって決められる。会長は選挙によらず評議員を指名することが出来るが、総会での承認を必要とする。
第５条 会長は会員の中から少なくとも３名を選んで選挙管理委員を委嘱する。選挙管理委員
は選挙事務を行う。
第６条 会長は、評議員会の承認を得て必要な委員会を作ることが出来る。
（評議員会）
第７条 評議員会は評議員の半数以上の出席（委任状を含む）をもって成立する。

2002 年 12 月 1 日改定
2003 年 12 月 1 日改定
2006 年 6 月 30 日改定
2007 年 12 月 1 日改定
2010 年 1 月 1 日改定

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol. 12 (1)

運営体制
会長
副会長

極限環境生物学会運営体制（2012~13 年度）

掘越弘毅

独立行政法人海洋研究開発機構

大島泰郎

共和化工株式会社

工藤俊章

長崎大学大学院水産・環境科学総合研究科

環境微生物学研究所

評議員（５０音順、敬称略）

幹事会

秋野利郎

ゴーテック株式会社

幹事長

中村聡

東京工業大学大学院 生命理工学

五十嵐泰夫

東京大学大学院 農学生命科学研究科
伊藤政博

東洋大学 生命科学部

石井正治

東京大学院 農学生命科学研究科

研究科

石野園子

九州大学大学院農学研究院

庶務

伊藤進

琉球大学 農学部

編集委員長

伊藤佑子

創価大学 工学部

学会誌担当

石野良純

九州大学院 農学研究院
東洋大学 生命科学部
東京大学

今中忠行

立命館大学 生命科学部

高品知典

大島敏久

九州大学大学院 農学研究院

古園さおり

鎌形洋一

独立行政法人産業技術総合研究所

河原林裕

九州大学大学院農学研究院

倉光成紀

生物生産工学研究セ

ンター
学術幹事

跡見晴幸

京都大学大学院 工学研究科

大阪大学大学院 理学研究科

伊藤隆

独立行政法人理化学研究所

小林哲夫

名古屋大学大学院 生命農学研究科

仲宗根薫

近畿大学 工学部

小林良則

財団法人バイオインダストリー協会

國枝武和

東京大学 大学院理学系研究科

佐上博

東北大学 反応化学研究所

青木俊夫

日本大学 生物資源科学部

為我井秀行
栗原 達夫

日本大学 文理学部
京都大学 化学研究所

福居 俊昭

東京工業大学大学院 生命理工学
研究科

芝弘孝

サントリービジネスエキスパート株式会社

菅原秀明

国立遺伝学研究所

鈴木健一朗

独立行政法人製品評価技術基盤機構

中川和倫

愛媛県立今治西高等学校

井上明

東洋大学

長田洋子

日本大学

亀倉正博

好塩菌研究所南部滋郎

日本赤十字九州国際看護大学 看護学部

長谷川功

日本大学 生物資源科学部

シンポ担当

加藤千明
八波 利恵

半澤敏

東ソ−株式会社 東京研究所

独立行政法人海洋研究開発機構
東京工業大学大学院 生命理工学
研究科

別府輝彦

日本大学

HP 担当

三輪哲也

独立行政法人海洋研究開発機構

松井裕

石川県立大学 生物資源工学研究所

会計

宇佐美論

東洋大学 理工学部

道久則之

東洋大学 生命科学部

丸山正

独立行政法人海洋研究開発機構

山岸明彦

東京薬科大学 生命科学部

湯本勲

独立行政法人産業技術総合研究所

若木高善

東京大学大学院 農学生命科学研究科

渡辺公綱

東京薬科大学会計監査高瀬光徳

森永乳業（株）・栄養科学研究所

伊藤俊洋

財団法人 北里環境科学センター

シンポジウム委員会

生命科学部

委員長

東端啓貴

東洋大学

生命科学部

委員

仲山英樹

長崎大学

環境科学部

相馬亜希子

千葉大学

園芸学研究科

黄川田隆洋（独）農業生物資源研究所

峯岸宏明

東洋大学

鈴木宏和

九州大学院

小西正朗
折田 和泉

北見工業大学 工学部
東京工業大学大学院 生命理工学研究科

乾燥耐性研究グループ
バイオ・ナノエレクト

ロニクス研究センター

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農学研究院

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)

編

集 後 記

今年度より、学会幹事会体制が刷新され、中村聡幹事長（東京工業大学・教授）、伊藤
政博庶務幹事（東洋大学・教授）を中心として、新出発いたしました。さらに、新任の幹事 3 名、八波利恵シンポ担当幹事（東京工業大学・助教）、栗原達夫学術幹事（京都大学・教授）、福居俊昭学術幹事（東京工業大学・准教授）を迎え、更なる充実した体制が出来上がりました。会員の皆様におかれましては、この新幹事会体制を支え、さらに当学会の発展にご協力いただけますことを、心からお願いいたします。今後ともよろ
しくお願いいたします。
学術幹事（学会誌編集担当）

加藤千明

編集委員会
委員長 ：石井正治（東大）
副委員長：石野良純（九大）
委員：阿部文快（青学大）、伊藤 隆（理研）、鎌形洋一（産総研）、河原林裕（九大）、高品知典（東洋大）、為我井秀行（日大）、中村 聡（東工大）、中村 顕（筑波大）、
三輪哲也（JAMSTEC）、湯本 勲（産総研）

学会事務局〒226-8501 横浜市緑区長津田町 4259-J2-13
東京工業大学 大学院生命理工学研究科
生物プロセス専攻 中村聡研究室内極限環境生物学会事務局 中村 聡 (幹事会幹事長)
E-mail: kyokugenjm10@extremophiles.jp
学会誌編集〒237-0061 神奈川県横須賀市夏島町 2-15
独立行政法人海洋研究開発機構 海洋・極限環境生物圏領域 (加藤千明、学術幹事)
TEL：046-867-9550 FAX：046-867-9525 E-Mail：kato_chi@jamstec.go.jp
発刊日402013 年 8 月 31 日