ISSN 1348-5474

Dec. 2011
第10巻 第2号

Journal of Japanese Society for Extremophiles

巻頭言 ………………………………………………………

42

特別寄稿 ……………………………………………………

43

MINI REVIEW ……………………………………………

54

ORIGINAL PAPER ………………………………………… 83
学会記事 ……………………………………………………

98

学会誌投稿規定・執筆要領 ………………………………… 100
会則・細則 …………………………………………………… 102
運営体制 ……………………………………………………

99

104

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)

巻頭言

激動の平成 23 年を振り返り

東京工業大学 大学院生命理工学研究科
生物プロセス専攻 教授
中村 聡
2011 年（平成 23 年）はまさに激動の１年であった。中東諸国で反政府デモ激化，ＧＤＰで中国が日本
を抜き世界第２位，ニュージーランド直下型地震，京大
入試問題のネット投稿，東日本大震災，福島第一原発
事故，ウサマ・ビンラディン死亡，国産スパコンが世界第１位を奪回，なでしこジャパン女子サッカーＷ杯初優勝，
円高で 1 ドル 75 円台を記録，菅内閣に代わり野田新内
閣発足，タイ大洪水，ギリシヤ危機，トルコ大地震，スティーブ・ジョブス死亡，カダフィ大佐死亡，金正日死亡など，新聞やウェブサイトではさまざまな見地から平成 23 年の出来事が報じられているが，筆者自身の平成 23 年を振り返ってみたい。
正月休みも明けない平成 23 年年頭に，掘越弘毅先生の編集による「Extremophiles Handbook」が Springer
社より出版された。筆者も近畿大・仲宗根薫先生および東洋大・高品知典先生との共著で，一つの章を執筆する機会をいただいた。掘越先生が見つけた三角菌 Haloarcula japonica に関する内容で，研究の端緒となった菌の分類同定から，多くの分子生物学的研究，さらにはつい最近の全ゲノム解析に至るまで，
筆者らのこれまでの研究の集大成と言える。ポスト
ゲノム時代に突入する今後の三角菌研究のあり方を見直すこともでき，たいへん清々しい新年のスタートとなった。
さて，博士・修士・学士の論文発表を終え，大学
教員は少しホッとしている 3 月 11 日に，あの東日本大震災が起こった。筆者は東工大主催のシンポジウ

42

ムに出席しており，会場である品川のホテルの 34階で被災した。免震構造のビルに特徴的な大きな振幅の揺れが止まらず，船酔い状態のまま階段で避難した後は，隣り駅にある東工大附属高校まで徒歩で移動し，そのまま一晩を過ごした。幸い東京・神奈
川の地震による実害はそう大きなものではなかった
が，直後に起こった福島第一原発事故の影響で，計画停電に備えた研究活動の制限，夏の節電に備えた
前学期授業の前倒し実施など，東工大では教職員が一丸となって対応に追われた。そして，研究もままならなかった期間ではあったが，改めて人と人との絆や日本人の良さを認識することができた。また，
過去をきちんと振り返り，日本人としてこれから何をなすべきかについて，立ち止まってじっくり考える時間が与えられたように思う。
震災の影響で長引いていた学生の就職活動も終焉を迎え，また大学院入試や秋の学会が終わり，ようやく大学が落ち着きを取り戻し始めた 10 月のある日，家内が足を骨折する事態に見舞われた。家の中でも松葉杖を突いていた関係で，皿洗い・風呂洗い・
洗濯物干しなど，筆者もこれまでに無い生活を余儀なくされた。この間，家内のありがたさを痛感した
ことは言うまでもないが，一方で，皿洗いは実験科学者の方が厳密であることも実感した。そんな家内もようやく松葉杖とお別れし，筆者も「のど元過ぎれば・・・」の生活に戻りつつある。
平成 23 年を振り返るつもりが，もっと長い期間を振り返ることとなった。筆者が大学院を修了してから 30 年近くが過ぎたが，多少の問題点は感じつつも，忙しさにかまけ，過去を振り返ることなく走り続けてきた観がある。定年まで残り 10 年を切った現在，きっかけはともあれ，過去を振り返る機会が与えられたということは，将来を見直せという意味であろう。平成 23 年 12 月 31 日，除夜の鐘代わりの横浜港の貨物船の汽笛を聞きながら，筆者自身の将来について思いを馳せることにしよう。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)

特別寄稿

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10, 43-53

鉄酸化細菌 Acidithiobacillus ferrooxidans の基礎と応用―水銀耐性鉄酸化細菌の分離と水銀耐性機構―
杉尾化学合成独立栄養細菌研究所 杉尾 剛
岡山大学環境管理センター
竹内文章
鉄酸化細菌 Acidithiobacillus ferrooxidans はグラム陰性の桿菌で、２価鉄(Fe2+)と還元型無機硫黄化合物の両方をエネルギー源にし、炭酸ガスを固定することによって細胞炭素を賄っている化学合成独立栄養細菌である。細菌を利用して鉱石から銅やニッケルなど有用金属を溶出する技術をバクテリアリーチン
グ ( バ イ オ リ ー チ ン グ ) と 呼 ん で い る 3,5) 。 A.
ferrooxidans は、バイオリーチングの現場に常在し、この菌の働きで銅鉱石からの銅の溶出が顕著に活性化される。また、高濃度の Fe3+や Fe2+とともに種々の重金属イオンの溶解する酸性鉱山排水の処理にも利用され、河川水の褐色化、酸性化、溶存酸素量の低下などを防いでいる。筆者は本邦の河川や土壌から多数の A. ferrooxidans 菌株を分離しているが、鉱山に限らなくても 2 価鉄や還元型硫黄化合物が存在する酸性環境には A. ferrooxidans が存在できると考えている。
A. ferrooxidans は銅、クロム、カドミュウムなど多種類の重金属に対して比較的耐性な細菌と言える。
例外は、水銀(Hg2+)、銀（Ag+ ）、タングステン酸（WO42- ）、モリブデン酸(MoO42-)で、これらは A.
ferrooxidans の 生 育 を 強 く 阻 害 す る 。 従 っ て A.
ferrooxidans をバイオリーチングや重金属を含む排水の処理に利用するためには、重金属に対する耐性株や重金属耐性のメカニズムを明らかにしておくことは重要である。本稿では水銀耐性鉄酸化細菌の分離と新規な水銀気化機構について紹介したい。中性
pH で増殖する従属栄養細菌の水銀耐性に関与する
酵素と関連遺伝子については多くの優れた研究がなされている。特に、無機水銀の還元、気化に直接かかわっている酵素 mercuric reductase (MerA)、並びに有機水銀の炭素-水銀結合を切断する酵素 mercuric
lyase (MerB)に関しては詳細な研究がなされている 1,
4, 7, 8, 15)。
本稿では、水銀耐性 A. ferrooxidans には MerA とは異なる新規な水銀還元・気化システムが存在すること、新たに見出した水銀還元・気化システムの本体は水銀耐性の aa3 型 cytochrome c oxidase(cyt.
c oxidase)であることについて紹介したい。

2. 2 価鉄依存性の水銀気化活性の存在
微生物の仲間には、生物毒性の非常強い水銀化合物に対して耐性を示すものが存在する。これら水銀耐性菌は、水に溶解した水銀化合物（Hg2+）をまず
細 胞 内 に 取 り 込 ん だ 後 、 水 銀 還 元 酵 素 mercuric
reductase (MerA)を用いて金属水銀（Hg0）に還元する。還元されガス状となった金属水銀（Hg0）は、培養液から大気中へと放出される。このように、水
銀化合物が生育環境から除去されると菌は増殖することが可能となる。
自然界より単離した約 100 株の A. ferrooxidans に対して、無機水銀（Hg2+）に対する耐性株の存在をスクリーニングした。第 1 段階目のスクリーニング
を 0.7 μM の Hg2+を含む 2 価鉄水銀培地(pH 2.5)で、第 2 段階目のスクリーニングを 6 μM の Hg2+を含む 2 価鉄水銀培地(pH 2.5)で行った２, 18)。青森県の酸ケ湯温泉付近の小川から分離した A. ferrooxidans
SUG 2-2 株が最も水銀耐性で、6 μM の Hg2+存在下でも増殖でき培養 5 日目に最大増殖量(6.0 ☓ 107
cells/ml)を与えた。一方、岡山県の柵原鉱山から分離した AP19-3 株は最も水銀感受性で 0.7μM の Hg2+を含む 2 価鉄水銀培地に 28 日間培養しても増殖は観察されなかった。SUG 2-2 株及び AP19-3 株を 0.7μ
M の Hg2+を含む 2 価鉄水銀培地（水銀として 14 nmolを含む）で培養すると、培養 4 日後に水銀トラプ剤
中にトラップされた水銀量は、SUG 2-2 株が全水銀量の 86%、AP19-3 株が 1.4%であった。このように
SUG 2-2 株は AP19-3 株に比べ水銀還元・気化力が非常に優れた菌株であった。これらの結果をふまえ、SUG 2-2 株は、従来報告のある水銀還元酵素(MerA)
活性が AP19-3 株よりはるかに高い株であることが予想された。しかし予想に反して両株から調製した
細胞質画分の NADPH 依存性の水銀還元酵素活性はほぼ同レベルであった 2, 18)。
SUG 2-2 株には従来報告されている水銀還元酵素とは別の水銀還元システムの存在が予想された。そこで洗浄細胞を 14 nmol の Hg2+を含む酸性水（pH 2.5）
で、30℃、3 時間振とうし、反応液外に気化してくる Hg0 をトラップ後 cold-vapor atomic absorption
spectroscopy で定量を行った。全水銀量(14 nmol)の43

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)20%が 3 時間振とう処理することによって気化した。
この反応液中に 25 mM になるように硫酸第一鉄を添加して振とうすると、驚いたことに約 3 倍量の62%の水銀が気化した。この水銀気化量の増加は、反応液中の 2 価鉄濃度、及び菌体濃度に比例していたので”2 価鉄依存性の水銀気化活性”と仮に命名した 2)。
SUG 2-2 株で観察された“2 価鉄依存性の水銀気化活性”が他の A. ferrooxidans 株においても観察されるかを 10 種類の代表的菌株で検討した。A. ferrooxidans
SUG 2-2 株、Funis 2-1、NG-4 株、ATCC 14119 株、NAS-6 株、ATCC 33020 株、SNA-3 株、KO-1 株、ATCC
13661 株、AP19-3 株の順番に水銀耐性のレベルが低下することを明らかにしている。即ち、SUG 2-2 株
は、0.7μM の Hg2+を含む 2 価鉄培地(pH 2.5)で最大増殖量に到達するに要する時間は 4 日である。一方、
Funis 2-1 株は 7 日、NG-4 株は 10 日、ATCC 14119
は 12 日、NAS-6 は 13 日、ATCC 33020 は 14 日であった。SNA-3 株、ATCC 13661 株、AP19-3 株は 28
日間培養しても増殖しなかったので水銀感受性株とした。そこで 10 種類の菌株について、最終濃度が25 mM になるように硫酸第 1 鉄を添加した場合と無添加の場合について、1 時間当たりに気化される水
銀量（nmol）で水銀気化活性を比較した（図１）。2
価鉄添加時の Hg0 気化量から、2 価鉄無添加時の Hg0
気化量を差し引いた値が”2 価鉄依存性の水銀気化
活性“に相当する。図１は”2 価鉄依存性の水銀気化活性”のレベルが、各菌株の水銀耐性レベルとほぼ一致することを示している 2)。図１の右端に示された

水銀感受性の 3 菌株は”2 価鉄依存性の水銀気化活性”
をほとんど示さなかった。
“2 価鉄依存性の水銀気化活性”の本体を理解するための実験を以下行った。SUG 2-2 株と Funis 2-1 株
は、他の菌株に比較して高い“2 価鉄依存性の水銀気化活性”を示した（図１参照）。両菌株の洗浄細胞を
5 mM のシアン化ソーダ（NaCN）で前処理し、その後洗浄してから 25 mM の硫酸第 1 鉄を添加して水銀気化活性を測定した。
NaCN で前処理した洗浄細胞は“2 価鉄依存性の水銀気化活性”を全く示さなかった。この結果は、鉄酸化酵素の成分である aa3 型 cyt. c oxidase が 2 価鉄依存性水銀気化反応に関与していることを示唆している。
Cyt. c oxidase が水銀気化に関与することが示唆されたので SUG 2-2 株から細胞膜を調製し、調製した細胞膜と 2 価鉄の存在下で 2 価鉄依存性の水銀気化活性を測定した。50 μg の細胞膜、1 mM の Fe2+、7nmol の Hg2+の存在下で、5 日間、30℃で反応させた
ところ、添加した全水銀の 48%が気化した 2)。一方、
Fe2+を添加しないと水銀気化量は 12%にとどまった。
以上の結果より、A. ferrooxidans SUG 2-2 株に観察された”2 価鉄依存性の水銀気化活性”の本質は、“2 価鉄の電子が鉄酸化酵素系に入り cyt. c oxidase を経てHg2+に伝達され、その結果 Hg0 が生成・気化される反応”と理解することができる。この微生物反応は従来の水銀還元酵素 (MerA)による水銀気化反応とは全く異なる機構の反応ということができる(図 5及び 11 参照)。

6

Hg0 volatilized (nmol/h)

5

4

3

2

1

0

図１．2価鉄依存性の水銀気化活性A.ferrooxidansの洗浄細胞を用いて水銀気化活性を25 mMの2価鉄の存在下（+Fe）あるいは非存在下（-Fe）で測定した25mMの2価鉄を含む場合の反応溶液組成は、20 mlの9K-基本塩（pH 2.5）中に、洗浄細胞（1 mg protein）、Hg2+(14 nmol)、
Fe2+ （25 mM ）を添加したものである。気化してくるHg0はトラップ剤にトラップした後cold-vapor atomic absorption
spectroscopyで測定した。

44

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)合は 5%であった。また、反応液から Fe2+を除くと気化される Hg0 量は 1%に減少した。煮沸処理した cyt.
c oxidase の場合には Hg0 気化量は 0.7%であった。以上の結果より、水銀耐性 SUG 2-2 株由来の cyt. coxidase は、水銀還元・気化活性を持っていると結論した 11)(図 5 及び 11 参照)。
Cyt. c oxidase による水銀気化機構を更に明らかにするために、還元型の cyt. c oxidase が Hg2+によって酸化されるかを検討した。Fe2+を存在させると cyt. coxidase の α-band に由来する 595 nm のピークは増加した。この結果は、Fe2+によって cyt. c oxidase が還元されることを示している 11)。この還元された cyt. coxidase に 5 nmol の Hg2+を加えると、Hg2+無添加の場合と比較して、α-band に由来するピークがより速く小さくなった（図３）。この結果は、還元型の cyt.
c oxidase が Hg2+によって酸化されることを示している 11)。
以上、”2 価鉄依存性の水銀気化活性”は“Fe2+を電子供与体にする cyt. c oxidase による Hg2+の還元・気化”とまとめることができる。

3. 水 銀 耐 性 A. ferrooxidans SUG 2-2 株 由 来 の
cytochrome c oxidase は水銀還元能を持つ
先に述べた“2 価鉄依存性の水銀気化活性”の本体をさらに明らかにするために、2 価鉄で増殖した
SUG 2-2 株の細胞膜を 1-o-octyl-D-glucopyranoside(OGL) で 可 溶 化 し 、 CM-Toyopearl 650M 並 び にTSK-gel 3000SW カラムクロマトグラフィー等を行うことによって cyt. c oxidase を 32.1 倍に精製した（比活性は 67.5 mU/mg）。SUG 2-2 株の cyt. c oxidaseは 3 種類の subunits [α-subunit (56 kDa)、β-subunit (24kDa)、γ-subunit (19 kDa)]から構成されていた。水銀
感受性 AP19-3 株からも cyt. c oxidase を電気泳動的に均一に精製した（比活性は 24 mU/mg）。AP19-3
株の cyt. c oxidase も 3 種類の subunits [α (53 kDa)-、β(24 kDa)-、γ (19 kDa)-subunits ]から構成されていた。
精製した cyt. c oxidase(10 μg)を Hg2+(7 nmol)及び
Fe2+(10 μmol)を含む 10 ml の酸性無機塩溶液中（pH3.8）で 7 日間、30℃で反応させ、気化してくる Hg0
をトラップ剤にトラップさせ定量した(図２)。SUG
2-2 株の精製 cyt. c oxidase は、添加した全水銀の 39%を気化させた 11)。一方、AP19-3 株 cyt. c oxidase の場

3

Hg0 volatilized (nmol)

2.5
2
1.5
1
0.5
0
0

2

Time (days)

46

図２. 水銀耐性A. ferrooxidans SUG 2-2株、及び水銀感受性A. ferrooxidans AP19-3株から精製した
cytochrome c oxidaseによる水銀の気化
Symbols: ◆, 10 μg SUG 2-2 cyt. c oxidase, 7 nmol Hg2+, 10 μ mol Fe2+; ■, 10 μg AP19-3 cyt. c oxidase, 7 nmol Hg2+, 10 μ mol Fe2+; ▲, 10 μg
SUG 2-2 cyt. c oxidase, 7 nmol Hg2+; ☓, 10 μg SUG 2-2 cyt. c oxidase (煮沸処理10 min後）, 7 nmol Hg2+, 10 μ mol Fe2+ .

45

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)Absorbance

0.8(A) Hg2+の非存在下

Fe2+ 添 加後の時間
0 min

0.4

2 min
20 min

0
500

600

700

25 h

Wavelength (nm)Absorbance

0.8(B) 5 nmol Hg2+の存在下
Fe2+、次いでHg2+ 添加後
の時間
0 min

0.4

2 min
20 min

0

25 h

500

600

700

Wavelength (nm)図3. 還元型cytochrome c oxidaseのHg2+による酸化精製したSUG 2-2株 cytochrome c oxidase (8 μg)を含む100 μlの反応液(pH 3.8)に1 μmolの2価鉄を加えてcytochrome c oxidaseを還元させた。その後、直ちに反応液を好気的条件下でincubateした（A）。同様に、2価鉄を加えた後、ただちに5 nmolのHg2+を加えてi好気的条件下でincubateした（B）。

を含む 2 価鉄水銀培地にわずかではあるが増殖できたが 80 μM の Hg2+を含む培地には増殖できなかった。

4. 高度水銀耐性 A. ferrooxidans MON-1 株の分離
A. ferrooxidans SUG 2-2 株を、6 μM から 20 μM
まで順次 Hg2+濃度を増加させた 2 価鉄水銀培地で継代培養を続けた後、2 価鉄を含むジェランガム平板培地(pH 2.5)に塗布、コロニーを形成・採取する方法
で高度水銀耐性 A. ferrooxidans MON-1 株を分離する
ことができた。
水銀耐性 SUG 2-2 株は 6 μM の Hg2+を含む 2 価鉄水銀培地に 22 日間の lag time の後に増殖することが可能である。一方、10 μM の Hg2+を含む 2 価鉄培地に増殖することはできない。SUG 2-2 株を 6 μ
M の Hg2+を含む 2 価鉄水銀培地で 8 回継代培養を続けると、順次 lag time の短縮が起こり、最初 22 日間だった lag time が 4 日間に短縮された。この最終培養液から、2 価鉄を含むジェランガム平板培地を用
いて SUP-1 株を単離した。SUP-1 株は、10 日間の lagtime を必要としたものの 20 μM の Hg2+を含む 2 価鉄水銀培地に増殖することができた。SUP-1 株を 20
μM の Hg2+を含む 2 価鉄水銀培地でさらに 5 回継代培養すると lag time は 4 日間に短縮された。この最終培養液から MON-1 株を単一コロニーとして分離した 10)。MON-1 株の 16S rRNA の塩基配列分析は
A. ferrooxidans のものと一致した。驚いたことにMON-1 株は 2 日間の lag time の後に 20 μM の Hg2+を含む 2 価鉄水銀培地に増殖できた。この株は著者の知る範囲で、現在知られている最も強い水銀耐性
A. ferrooxidans 株である。MON-1 株は 40 μM の Hg2+

5. 水銀感受性株と水銀耐性株の相違
水銀感受性の AP19-3 株、並びに水銀耐性の SUG
2-2 株、MON-1 株の NADPH 依存性の水銀還元酵素（MerA）活性ははほ同レベルであった 10,18)。それでは水銀感受性 AP19-3 株、中等度水銀耐性 SUG 2-2株、高度水銀耐性 MON-1 株の違いはどこにあるのであろう？
水銀耐性の異なる 3 菌株の鉄酸化酵素活性と cyt.
c oxidase 活性を測定した。興味深いことに MON-1
株の鉄酸化活性は、AP19-3 株及び SUG 2-2 株の活性よりそれぞれ 2.6 倍及び 1.6 倍高かった 10)(図４)。Cyt.
c oxidase 活 性 を 2, 3, 5, 6-tetramethyl-p-phenylen
diamine (TMPD)の酸化速度、及び還元型 mammalian
cytochrome c の酸化速度で測定した。水銀耐性が増加するほど比活性は増大し、MON-1 株は SUG 2-2株に比較して 2.8 倍高い cyt. c oxidase 活性を持っていた 10)。Cyt. c oxidase は鉄酸化酵素の成分なので cyt.
c oxidase 活性の高い菌株が高い鉄酸化活性を持つことは理解できる。以上まとめると、MON-1 株は、
AP19-3 株や SUG 2-2 株と比較して cyt. c oxidase（末端酸化酵素活性と水銀気化活性を併せ持っている）
がより強化された株と言える(図５)。

46

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)TMPD 酸化活性

鉄酸化酵素活性

10

30

40
30
20
10

8
Activity (mU/mg)

O2 uptake (μ l/mg protein/min)

50
O2 uptake (μ l/mg protein/min)Cyt. c oxidase activity

20

10

4
2

0

0

6

0

図４．A. ferrooxidans AP19-3, SUG 2-2, MON-1株の鉄酸化酵素活性及びcytochrome c oxidase活性
鉄酸化酵素活性及びTMPD (2,3,5, 6-tetramethyl-p-phenylenediamine) 酸化活性は洗浄細胞を用いて、またcytochrome c oxidase活性は細胞膜を用いて測定した。

CO2 固定に利用

Transhydrogenase

NADPH
NADH
Hg2+
NADP＋

Hg 0

NAD+

fp

CoQ

Cyt. bc1

電子の逆流による
NADHの生成

Cyt. coxidaseCyt. ce-

1/2O2 + 2H+

e-

Fe2+

NADPH-依存性水銀
還元酵素(MerA)

H 2O

Hg 2+

Hg 0

Fe2+-依存性水銀還元システム

図５．A. ferrooxidans MON-1株はcytochrome c oxidaseが強化された株である

そして MON-1
M の Hg2+によって完全に阻害された。
株由来 cyt. c oxidase は 10 μM の Hg2+が存在していても 30%の活性が残存していた。これらの結果は、MON-1 株は少なくとも 10 μM の水銀存在下においても cyt. c oxidase が 100%でないまでもある程度機能できることを示唆している。

非常に興味深い点は、MON-1 株由来の cyt. coxidase が、水銀感受性 AP19-3 株由来 cyt.c oxidaseに比較して顕著に水銀耐性である点である（図６）。
AP19-3 株から精製した cyt. c oxidase 活性は 1 μMの Hg2+によって完全に阻害された。一方、中等度に水銀耐性の ATCC 23270 株由来 cyt. c oxidase は 5 μ
47

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)140120Relative activity (%)

100
80
60
MON-1株40
20
0AP19-3株01

2

ATCC23270株

5Concentration of HgCl2 (μM)

10

図６．A. ferrooxidans AP19-3、 ATCC 23270、 MON-1株のcytochrome c oxidase活性に及ぼすHg2+濃度の影響
A. ferrooxidans AP19-3, ATCC 23270, MON-1株より単一に精製したcytochrome c oxidaseを酵素標品として用いた。

6. 有機水銀耐性 A. ferrooxidans の存在と新規な有機
水銀分解メカニズム
A. ferrooxidans の標準菌株である ATCC 23270 株は、染色体 DNA の塩基配列がほぼ完全に決定されている。ところがこの塩基配列中に、有機水銀の炭素水銀結合を切断する酵素 mercuric lyase (MerB)に対応する遺伝子配列は存在していない 6)。多分このような理由から有機水銀耐性の鉄酸化細菌に関する研究は十分なされてこなかった。
著者は、先に述べた無機水銀耐性 A. ferrooxidansに 関 す る 研 究 で 代 表 的 な 株 と 考 え ら れ た 11 株
（ATCC 23270 株を含める）について、0.1 μM の
p—chloromercuribenzoic acid (PCMB)を添加した 2 価

鉄 PCMB 培地(pH 2.5)で生育の有無を検討した。その結果、Hg2+に最も耐性であった MON-1 株が PCMBに対しても最も高い耐性を示した 1９)。また、最もHg2+感受性であった AP19-3 株が PCMB に対しても最も感受性であった。即ち、水銀感受性の AP19-3
株は 16 日間の培養後にも増殖は観察されなかったが、MON-1 株、SUG 2-2 株、Funis 2-1 株、ATCC 23270
株は、それぞれ 2 日、5 日、10 日、12 日間の lag timeの後に増殖した。また、これらの菌株の洗浄細胞を用いて PCMB からの Hg0 の気化活性を測定すると、
MON-1 株が最も高く、2 価鉄-PCMB 培地における増殖が速い菌株ほど PCMB からの Hg0 の気化活性が高かった 19)(図７)。

Hg0 volatilized (nmol/mg/h)

0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0

図７．A. ferrooxidans菌株によるPCMBからの金属水銀の気化
A.ferrooxidans 洗浄細胞（1.0 mg）と PCMB (1.0 μM)を含む5 mlの酸性水 (pH 2.5)から気化してくる
金属水銀をトラップ剤にトラップさせた後cold-vapor atomic absorption spectroscopyで測定した。

48

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)13, 14, 16, 17)

MON-1 株 の 洗 浄 細 胞 は PCMB ば か り で な く
phenylmercury acetate (PMA)や methylmercury acetate(MMC)からも金属水銀を気化する能力を持っていた。A. ferrooxidans MON-1 株は 2 価鉄ばかりでなく元素硫黄（S0）をエネルギー源にしても増殖できる（図 11 参照）。2 価鉄及び元素硫黄で増殖した MON-1 株の洗浄細胞は、用いたエネルギー源の違いに関わらず、ほぼ同じ速度で MMC を分解できる こ と を Electron-Capture-Detector (ECD) gas
chromatography で確かめた 12)(図８)。

反応溶液に残存するMMC量 (%)

1 20
1 00
80
60
40
20
0

0

3

6

9

12

15

18

21

24

Time (h)図８． 2価鉄及び元素硫黄で増殖したA. ferrooxidans MON-1株洗浄細胞による
methylmercury chloride (MMC)の分解
2価鉄（●）及び元素硫黄（■）で増殖したA. ferrooxidans MON-1株によるMMCの分解を0.1 μMのMMCと1.0 mgの洗浄細胞を含む10 mlの酸性水(pH 2.5）中で行った。反応液中に残存するMMC量はElectronCapture-Detector (ECD) gas chromatographyで定量した。コントロール実験として10分間煮沸処理した洗浄細胞（2価鉄生育菌,○; 元素硫黄生育菌, □）に対してもMMCの分解活性の有無を検討した。

以 上 の 結 果 は 、 merB 遺 伝 子 を 持 た な い A.
ferrooxidans においても有機水銀耐性株が存在する
ことを示している。それでは merB 遺伝子を持たない MON-1 株がどのような機構で有機水銀の炭素-水銀結合を切断し、Hg0 を気化するのか・・非常に興味ある問題である。
MON-1 株の洗浄細胞は MMC 及び PMA 分解活性を持っている（ECD gas chromatography で確認）。また、MMC 及び PMA から Hg0 を気化する活性を持っている（cold-vapor atomic absorption spectroscopy で確認）。両活性は 1 mM の NaCN でほぼ完全に阻害された。また予想に反して、MON-1 株の無細胞抽出液で観察された MMC 分解活性、並びに Hg0 気化活性のほぼ 100%が、MerB の存在する細胞質画分にではな
く、細胞膜画分に回収された。これらの結果は、有機水銀の分解にも aa3 型 cyt. c oxidase が関与していることを示唆している。
そ こ で 、 MON-1 株 洗 浄 細 胞 を 2% の
1-o-octyl-D-glucopyranoside (OGL)と 1.0 M の硫酸ア
ンモニュウムを含む 0.1 M β–alanine-SO42- buffer (pH3.0)中で可溶化し、次いで各種カラム分画を行う事
によって cyt. c oxidase を精製した。精製した cyt. coxidase の比活性は 92.2 mU/mg、還元型スペクトルは 439.5 nm と 594.5 nm に γ-、及び α-バンドに由来するピークを示した 12)(図９)。スペクトル的判定では cytochrome c を夾雑していなかった。
精製した酵素は 3 種類の subunits から構成され（α-subunit, 52 kDa; β-subunit, 26 kDa; γ-subunit, 22
kDa ）、 γ-subunit の N- 末 端 ア ミ ノ 酸 配 列(AAKKGMTTVI)は、A. ferrooxidans ATCC 23270 株,
OK1-50 株, SUG 2-2 株, Funis 2-1 株, NASF-1 株のγ-subunit の N-末端アミノ酸配列と一致した。
精製した MON-1 株の cyt. c oxidase が Hg2+及びMMC から金属水銀を気化できるかを検討した。電子供与体には還元型の mammalian cytochrome c とMON-1 株から部分精製した c 型 cytochrome を用い
た 9, 12)。たいへん驚いたことに、完全反応系[精製 cyt.
c oxidase、ascorbate（還元剤）、mammalian cytochromec (あるいは、MON-1 株から部分精製した c 型
cytochrome)]が存在する時にのみ、Hg2+からばかりでなく MMC からも Hg0 の気化が観察された 12)(図 10)。
コントロール実験として用いた、酵素のみ、酵素とascorbate、酵素と mammalian cytochrome c、cytochromec と ascorbate などの場合には完全反応系に比較してHg0 の気化量は明らかに少なかった。完全反応系に0.5 mM 及び 1.0 mM の NaCN を添加すると Hg0 の気
49

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)化は強く阻害された。MON-1 株から部分精製した c型 cytochrome (Cyc1 及び Cyc2)の電子供与体としての利用性は mammalian cytochrome c とほぼ同レベル
か、少し劣る結果を示した 9, 12)。 Cyt. c oxidase がHg2+のみならず MMC からも Hg0 を気化することをさらに確かめるために、MON-1 株の cyt. c oxidaseに対して調製した抗体を上記完全反応系に添加した。
その結果、Hg2+及び MMC からの Hg0 気化反応はともに cyt. c oxidase 抗体によって完全に阻害された 12)。

0.30

Absorbance

0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
400

450

500

550

600

650

Wavelength (nm)図９． A. ferrooxidans MON-1株から精製したcytochrome c oxidaseのスペクトル
Symbols:, sodium hydrosulfiteで還元した enzyme (0.48 mg/ml);, KMnO4で酸化した enzyme (0.48 mg/ml).

MMCからのHg0の気化

3

Hg0 volatilized (μmol/mg protein/h)

Hg0 volatilized (μmol/mg protein/h)

HgCl2からのHg0 の気化

2 .5
2
1 .5
1
0 .5
0

A

B

C

D

E

F

G

H

0 .5
0 .4
0 .3
0 .2
0 .1
0

A

B

C

D

E

F

G

H

図10．A. ferrooxidans MON-1株から精製したcytochrome c oxidaseによる塩化水銀あるいはmethylmercury chloride (MMC)からの水銀の気化
電子供与体としてsodium ascorbateで還元したmammalian cytochrome cまたはA. ferrooxidans MON-1株から部分精製したc型 cytochrome (Cyc1, Cyc2)を用いた。Symbols:A, MON-1 cyt.c oxidase;B,MON-1
cyt.c oxidase, ascorbate; C, MON-1 cyt.c oxidase, mammalian cyt.c; D, ascorbate, mammalian cyt.c; E,
MON-1 cyt.c oxidase, mammalian cyt.c, ascorbate; F, MON-1 cyt. c oxidase, MON-1 c型 cytochrome,ascorbate; G, MON-1 Cyt.c oxidase, mammalian cyt.c, ascorbate, 0.5 mM NaCN; H, MON-1 Cyt.c oxidase,
mammalian cyt.c, ascorbate, 1.0 mM NaCN.

50

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)7. まとめ自然界より単離した約 100 株の A. ferrooxidans 株
に対して水銀耐性株の存在をスクリーニングし、水銀耐性 SUG 2-2 株と水銀感受性 AP19-3 株を選抜した 2, 18)。また、SUG 2-2 株より、さらに高い水銀耐性能を持つ高度水銀耐性 MON-1 株を誘導した 10)。
水銀還元酵素（MerA）活性の強さに関して上記 3 菌
株間に大きな相違が認められなかったことから、未知の水銀還元システムの存在が予想された。SUG
2-2 株及び MON-1 株の洗浄細胞を用いた水銀気化実験から、2 価鉄の存在下で水銀気化量が顕著に増大することが明らかになった 2)。この 2 価鉄依存性の水銀気化活性は、本菌の水銀耐性レベルと深く関係しており、耐性が高くなるに従って活性は高く、水銀感受性 AP19-3 株にはこの活性が存在しなかった。
この 2 価鉄依存性の水銀気化活性は細胞膜に存在し、NaCN で強く阻害されることから鉄酸化酵素の構成成分である cyt. c oxidase の関与が示唆された２)。
AP19-3 株、SUG 2-2 株、並びに MON-1 株から cyt. coxidase を精製した 11,12)。精製 cyt. c oxidase は、還元型の mammalian cytochrome c や MON-1 株から精製した cytochrome c、あるいは 2 価鉄を電子供与体にして Hg2+を Hg0 に還元した 9, 11, 12)。また、この水銀
還元・気化反応が NaCN や MON-1 cyt. c oxidase 抗体
によって完全に阻害されることも水銀還元への cyt.
c oxidase の関与を支持している 12)。Cyt. c oxidase が2 価鉄によって還元されること、還元された cyt. coxidase が Hg2+によって再酸化されることがスペク
トル的に確かめられ、2 価鉄依存性の水銀還元シス
テムの本体は”cyt. c oxidase による Hg2+還元反応である”と結論した。
A. ferrooxidans においては、水銀耐性になるほどその株の cyt. c oxidase の活性は高くなり、それに伴って鉄酸化酵素活性も増大した。即ち、高度水銀耐性
MON-1 株は cyt. c oxidase が強化された株と言うことができる 10)。水銀耐性鉄酸化細菌の cyt. c oxidase において、さらに重要な性質は cyt. c oxidase そのもの
が水銀耐性になっている点である 9)。一方、水銀感
受性 AP19-3 株の cyt. c oxidase は水銀感受性で Hg2+
を Hg0 に還元できない。
有機水銀の炭素-水銀結合を開裂させる mercuric
lyase 遺伝子(merB)を持たない A. ferrooxidans も有機
水銀から金属水銀を気化する能力を持っていることを示した。無機水銀に最も耐性であった MON-1 株
が有機水銀に対しても最も耐性を示した 19)。有機水
銀から Hg0 を生成する活性は細胞膜に局在し、NaCNによって完全に阻害された。検討した結果、MON-1

51株から精製した aa3 型 cyt.c oxidase が、無機水銀のみ
ならずメチル水銀（MMC）からも金属水銀を気化することを明らかにした 12)。この反応は MON-1 株 cyt.coxidase に対して調製した抗体によって完全に阻害された 12)。
MON-1 株の cyt. c oxidase が、なぜ有機水銀中の炭素-水銀結合を切断できるのか・・その機構に関しては現在未解決で、今後の研究課題となっている。また、微生物生理学的に非常に興味深い点は、MON-1
株由来の cyt. c oxidase が、水銀感受性 AP19-3 株由来の cyt.c oxidase と比較して、顕著に水銀耐性である点である（図６）。水銀耐性菌と感受性菌の cyt. coxidase はアミノ酸配列や酵素タンパク質の構造が異なっていることが強く示唆される。これらの問題を理解するために MON-1 株 cyt. c oxidase より 3 種類の subunits（α-, β-, 及び γ-subunit）を単離し、単離した subunit を用いて無機及び有機水銀からの金属
水銀の気化を検討している。
これまでに得られた知見を基礎にして高度水銀耐性鉄酸化細菌 A. ferrooxidans MON-1 株で見出された新規な金属水銀還元・気化システムの細胞内局在場所を推定した（図 11）。MON-1 株は A. ferrooxidans
ATCC 23270 株と同様に元素硫黄を基質にして Fe3+
を Fe2+に還元する鉄還元酵素を持っている 13, 14, 16, 17)。
このため、2 価鉄及び還元型硫黄化合物を電子供与体にして Hg2+あるいは MMC などの無機及び有機水
銀化合物から金属水銀を菌体外へ気化排出できる 12)。
最大の特徴は細胞内膜に局在する cyt.c oxidase (現在
進 行 中 の 研 究 で は cyt. c oxidase 中 の α-, 及 び
β-subunits) が Hg2+の還元、及び有機水銀中の炭素水銀結合の切断に直接関わっている点にある。この機能が行えるのは、MON-1 株 cyt. c oxidase が高度に水銀耐性であるからで 9)、水銀感受性 AP19-3 株
cyt. c oxidase は水銀感受性でこの活性を持たない 11)。
MON-1 株は従来知られている NADPH 依存性の水銀
還元酵素 MerA を持っているが、これは 0.7 μM 以下の低濃度の Hg2+存在下でのみ機能できるものと考えている。6 μM 以上の高濃度の Hg2+存在下で素早く増殖できる MON-1 株は、水銀耐性の cyt.coxidase が増強されているからである 10)。今回 MON１株に新たに見出された cyt. c oxidase 依存性の水銀
還元・気化システムは MerA に比較すると大きな利点がある。それは、MerA あるいは MerB による水銀気化システムとは異なり、気化すべき水銀を細胞内へいったん取り入れる必要がないからである。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)Hg2+ + CH4

CH3Hg (MMC)

Hg2+

Fe2+

Hg0

Fe3+
rus

Cyc1

α β γ

硫黄化合物
の酸化

Cyc2
Fe2+

Fe3+

Cyt.c oxidase

S0, S4O62Fe3+ reductase

鉄酸化酵素系

SO42-

Hg2+

Hg2+

NADPH

Hg0

Hg0

NADP＋

NADPH-依存性の水銀還元酵素（MerA）
ペリプラズマ空間
細胞内膜

細胞外膜

図11. 高度水銀耐性鉄酸化細菌 A. ferrooxidans MON-1株由来 cytochrome coxidaseによる無機及び有機水銀からの金属水銀の気化

8. 謝辞
化学合成独立栄養細菌研究へのきっかけを作っていただき、研究の基礎をご丁寧にご指導いただきました岡山大学名誉教授今井和民先生に深く感謝致します。また、研究の過程で貴重なアドバイスをいた
だくとともに常に暖かく見守っていただきました岡
山大学名誉教授田野達男先生に心より感謝致します。
今井和民先生のご縁でお知り合いになることができ、化学合成独立栄養細菌研究の指針を常にお示しいた
だきました東京大学名誉教授蓑田泰治先生、東京大学名誉教授児玉徹先生、東京大学教授五十嵐泰夫先生、東京大学准教授石井正治先生に心より御礼を申し上げます。
9. 参考文献
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52

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mercury-resistant Acidithiobacillus ferrooxidans
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11) Sugio, T., Iwahori, K., Takeuchi, F., Negishi, A.,
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Acidithiobacillus ferrooxidans volatilizes mercury. J.
Biosci. Bioeng. 92: 44-49.
12) Sugio, T., Komoda, T., Okazaki, Y., Takeda, Y.,
Nakamura, S., and Takeuchi, F. 2010. Volatilizationof metal mercury from organomercurials by highly
mercury-resistant Acidithiobacillus ferrooxidans
MON-1. Biosci. Biotechnol. Biochem.74: 1007-1012.
13) Sugio, T., Taha, T. M., Kanao, T., and Takeuchi, F.
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Biosci. Biotech. Biochem. 71: 2663-2669.
14) Sugio, T., Taha, T.M., and Takeuchi, F. 2009. Ferrous
iron production mediated by tetrathionate hydrolaseintetrathionate-,sulfur-,andiron-grown
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Biotech. Biochem. 71: 2663-2669.

15) Summer, A.O. 1986. Organization, expression, andevolution of genes for mercury resistance. Ann. Rev.
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16) Taha, T.M., Kanao, T., Takeuchi, F., and Sugio, T.
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sulfur-grown Acidithiobacillus ferrooxidans. Appl.
Environ. Microbiol. 74: 6808-6810.
17) Taha, T.M., Takeuchi, F., and Sugio, T. 2009.
Reduction of cytochrome c by tetrathionate in thepresence of tetrathionate hydrolase purified from
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23270 cells. Adv. Materials Research.1-73: 243-246.
18) Takeuchi, F., Iwahori, K., Kamimura, K., and Sugio,
T. 1999. Isolation and some properties of
Thiobacillus ferrooxidans strains with differing levelsof mercury resistance from natural environments. J.
Biosci. Bioeng. 88: 387-392.
19)Takeuchi, F., Negishi, A., Nakamura, S., Kanao, T.,
Kamimura, K., and Sugio, T. 2005. Existence of aniron-oxidizing
bacterium
Acidithiobacillus
ferrooxidans resistant to organomercurial compounds.
J. Biosci. Bioeng. 99: 586-591.
連絡先：杉尾 剛
杉尾化学合成独立栄養細菌研究所〒703-8255
岡山市中区東川原 250-30
TEL & FAX 086-273-1425
E-mail:tcmry-sugio@nifty.com

53

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)MINI REVIEWJournal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10, 54-62

Ohtani N

Polyploidy of an extremely thermophilic bacterium Thermus thermophilus
Institute for Advanced Biosciences, Keio University, Tsuruoka, Yamagata 997-0017, Japan
Corresponding author: Naoto Ohtani, ohtani@ttck.keio.ac.jp
Tel: +81 235 29 0526, Fax: +81 235 29 0529
Received: October 4, 2011 / Accepted: November 4, 2011
thermophilus might allow for genomic DNA protection,
maintenance, and repair at elevated growth temperatures, it
often complicates the recognition of an essential gene in
genetic analyses. We also demonstrated a third plasmid
pVV8 in the HB8, and determined its sequence. Limited
information and an unfortunate dropout in the substrain,
whose genomic sequence was determined, would have
prevented the plasmid from coming to public attention. The
intrinsic circular plasmid, which was estimated to be six toten copies in a cell, is 81,151 bp and its G+C content is 68%.
The pVV8 was suggested to be nonessential for cell growth.

Abstract
An extreme thermophile Thermus thermophilus is a modelorganism for structural biology and systems biology, and theso-called “Structural and Functional Whole-Cell Project forT. thermophilus HB8” is in progress. Its genomic sequence
composed of a chromosome, a megaplasmid pTT27, and aplasmid pTT8 is available. We revealed that this modelorganism was a polyploid bacterium harboring four to fivecopies of the chromosome in a cell. The finding is not
surprising, as Deinococcus radiodurans, an extremely
radioresistant bacterium closely related to Thermus, is wellknown to be polyploid. Although the polyploidy of T.

Key words: extreme thermophile, Thermus thermophilus, polyploid, genome, plasmid
キーワード： 高度好熱菌、Thermus thermophilus、倍数体、ゲノム、プラスミド

高度好熱菌 Thermus thermophilus ゲノムの倍数性
慶應義塾大学 先端生命科学研究所 ゲノムデザイングループ
大谷直人
はそれほど単純ではない。細胞内に環状の染色体が１つあるだけ…周知の事実のように扱われていたとしても、実際は立証されていないことが多い。特に倍数性に関しては、現状ではゲノム配列を決めたところで明らかになるわけではない。細胞内に環状の染色体が１つあるだけ…先入観からあえて調べられることもなく、一倍体扱いされてしまっている場合が多いように思う。
高度好熱菌 Thermus thermophilus HB8 もそのようなバクテリアの１つであった。T. thermophilus HB8 と言えば、『高度好熱菌丸ごと一匹プロジェクト』として、安定で結晶化しやすいタンパク質の立体構造解析（構造ゲノム解析）10)、確立された遺伝子操作系を利用した機能ゲノム解析など、理化学研究所を中心としたシステ
ム生物学の研究対象として注目を集めるモデル生物で【はじめに】
バクテリアといえば細胞内に環状のゲノム（染色体）が１つあるだけ…。そのように認識されている研究者の方々も少なくはない。システム生物学のモデル生物とされる大腸菌や枯草菌の話である。環状のゲノムが１つだけと単純であるが故にモデル生物となりえたのかもしれない。実際のところ、コレラ菌などは大小２つの環状の染色体を持つし、放線菌の染色体は線状、シアノバクテリアの多くは細胞内に環状染色体を複数コピー持った倍数体である。放射線耐性菌として有名
な Deinococcus radiodurans も環状染色体を複数コピー持つ倍数体のバクテリアで、倍数体であることは放射線耐性を示す要因の１つとも言われている 14,17)。アー
キアでも倍数体は報告されており、原核生物のゲノム
54

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)ある 16)。これほど注目されたバクテリアでさえ、ゲノムに関する基本的なことが調べられていなかったのである。本稿では、T. thermophilus HB8 が倍数体であることを示した経緯とともに、公開された HB8 ゲノムには含まれていない第３のプラスミドについてもご紹介したい。

２． バクテリアの倍数性
前述のように T. thermophilus HB8 の遺伝子破壊を行っていたところ、いくつかの遺伝子について不思議な結果が得られた。薬剤耐性を獲得し遺伝子が破壊されていると思われるコロニーを PCR で確認したところ、野生株で検出されるバンドと遺伝子破壊株で検出されるはずのバンドの両方が確認されたのである（図３A、レーン３、４のようなイメージ）。当然のことながら、野生株の混在が考えられたので何度もシングルコロニ
ーにして確認したが、結果は同じであった。バクテリ
アといえば細胞内に環状の染色体が１つあるだけ…そう思い込んでいたため、しばらく頭を悩まされた。一ヶ月ほどして、シアノバクテリアが細胞内に染色体を複数コピー持つ倍数体であることを思い出した。調べていくと、アブラムシやゴキブリの共生細菌、ライム病を引き起こすボレリア菌、淋病菌（淋菌）、窒素固定
細菌 Azotobacter vinelandii、Pseudomonas putida など、
そしてなにより Thermus 属の類縁である Deinococcus
属も倍数体であるという。系統的に近い Deinococcus
やシアノバクテリアが倍数体であるなら、Thermus も
また倍数体である可能性が考えられる。倍数体であれば、複数コピーある染色体のうちの、いくつかでのみ遺伝子が破壊された場合（図１B）には、PCR で確認
すると２本のバンドが観察されるはずである。調べた
限り、Thermus が倍数体であると述べた論文はなかった。しかしながら、一倍体ということを証明した論文も見当たらない。そこで、T. thermophilus HB8 が一倍体であるのか倍数体（多倍体）であるのかを調べてみることにした。リアルタイム PCR やフローサイトメトリーなどを用いて倍数性を調べている論文もあるが、設備に恵まれていないこともあり、簡単に次のような手法を取った。
３． T. thermophilus は倍数体である
PCR で２本バンドが検出されたのは、対象とした遺伝子が生育に必須の遺伝子だったからと考えられる。
図１B のように、一倍体の場合、必須遺伝子ならば薬剤耐性遺伝子で置換することはできない。一方、倍数体の場合は、何コピーかのうち１つでも野生型の遺伝子が保存されていれば、残りは薬剤耐性遺伝子で置換できると想像される。逆に言えば、染色体上のある遺伝子座において異なる２つの遺伝子が共存しうることを示すことができれば、染色体が複数コピーあると考えても良さそうである。そこで、２種類の薬剤耐性遺伝子を使うことにした。薬剤存在下では、その薬剤に対する耐性遺伝子は必須遺伝子となる。これをもう１
つ別の薬剤耐性遺伝子で置換しようとしたとき、それら２つの薬剤耐性遺伝子が共存しうるのかどうかを検討した。遺伝子座としてはジャンクションリボヌクレ
アーゼ遺伝子（jrn 遺伝子、RNase HII のホモログ）を選択した。図２A のように、jrn 遺伝子をカナマイシン
あるいはブレオマイシンで置換する組換え用 DNA を【T. thermophilus の倍数性】11)
１． T. thermophilus での遺伝子操作
T. thermophilus は、培養温度が高いことを除けば、扱いやすいバクテリアである。LB 培地に植菌し、70℃で一晩振とう培養すれば十分に増殖し、コンタミネーシ
ョンの心配をする必要もない。遺伝子操作も簡単で、
常にコンピテントな状態にあるため、培養液にプラス
ミドあるいは組換え用の DNA を加えるだけでよい。
抗生物質での選択も可能で、高温でも安定なカナマイ
シン、ハイグロマイシン、ブレオマイシンなどが使用でき、これらに対して高温下で機能する薬剤耐性遺伝
子が開発されている 1,2,5,9)。遺伝子破壊には、図１A に示すように、目的遺伝子の上流と下流の配列それぞれ
500 bp を薬剤耐性遺伝子の両端に付加した組換え用のDNA を用いれば、大抵の遺伝子は破壊できている 4)。
遺伝子の欠失あるいは置換は、目的遺伝子の上流と下流（遺伝子の外側）に相補的なプライマーを用いて PCRすることで簡単に確認し、その後サザン解析などで念を押せば良い。

図 1 T. thermophilus の遺伝子操作
A. 遺伝子破壊。B. 一倍体と倍数体での必須遺伝子破
壊の概念図

55

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)作製し、T. thermophilus HB8 を形質転換した。
本遺伝子は簡単に遺伝子破壊することができ、生育に必須ではない。PCR（図３A）やサザン解析（図３B）から、もとの遺伝子が確実に破壊されていることが確認できる（レーン２、５）。次に、得られたブレオマイ
シン耐性の遺伝子破壊株に対して、カナマイシン耐性遺伝子の組換え用 DNA で形質転換を行い、カナマイ
シンとブレオマイシンの両方の抗生物質を含むプレー
トでインキュベートしてみた。一倍体であるなら、同じ遺伝子座において両耐性遺伝子が共存することは有り得ないため、コロニーは得られないはずである。しかし実際には、両抗生物質を含むプレート上にコロニーは形成された。カナマイシン耐性株をブレオマイシ
ン耐性遺伝子の DNA で形質転換しても同様の結果である。なお、薬剤は違うものの、同様の実験を一倍体の枯草菌で行ったが、コロニーは１つも得られなかった。
両方の薬剤耐性を示すというだけでは、何らかの理由により片方の耐性遺伝子が染色体上の別の遺伝子座に組込まれた可能性を否定できない。そこで、得られた形質転換体について薬剤耐性遺伝子が同じ遺伝子座にあるのかどうかを詳細に検討した。まず図３A に示すように jrn 遺伝子の上流と下流のプライマーで PCRを行ったところ、両薬剤耐性を示す形質転換体では２本のバンドが増幅した（レーン３、４）。サイズから、
カナマイシンあるいはブレオマイシン耐性だけの親株でのバンド（レーン２、５）とそれぞれ同じものと考えられた。これはシーケンシングによっても確認され、形質転換体においては、カナマイシンおよびブレオマ
イシン耐性遺伝子のどちらの遺伝子も jrn 遺伝子を置換していることが示された。図２A のように、カナマイシンあるいはブレオマイシン耐性遺伝子にはハイグ
ロマイシン耐性遺伝子を付随させてある（サザン解析用に共通の配列として導入しており、特にハイグロマ
イシン耐性遺伝子である必要はない）。この共通配列に対するプローブを用いたサザン解析（図３C）でも、両薬剤耐性を示す形質転換体（レーン３、４）では、片方だけに耐性の親株（レーン２、５）それぞれと同じ位置にシグナルが確認でき、jrn 遺伝子の位置にそれぞれの薬剤耐性遺伝子が組込まれていることを示している。さらに、形質転換体のゲノムをパルスフィールド電気泳動で解析した。T. thermophilus HB8 ゲノムにはEcoRI サイトは十数箇所しかないため、必然的に EcoRI
消化断片は大きくなる。導入したカナマイシンあるいはブレオマイシン耐性遺伝子のプロモーター領域には
EcoRI サイトが１箇所ある（図２A）。したがって、これらの薬剤耐性遺伝子がゲノム中に組込まれると、それを含む EcoRI 断片は分断されることになる。図３Dのように、野生株（レーン２）と比較して、カナマイ
シンあるいはブレオマイシン耐性だけの株（レーン３、４）では同じ断片が分断されており、同じ遺伝子座にそれぞれの薬剤耐性遺伝子が組込まれていることがわかる。一方、両薬剤耐性を示す株の EcoRI 消化断片（レーン５）も、これら親株と同様のパターンであり、異なる遺伝子座に耐性遺伝子が組込まれているとは考えにくい。以上のことから、カナマイシンおよびブレオ
マイシンの耐性遺伝子は染色体上の同じ jrn の遺伝子座に位置していると考えられ、それぞれの薬剤耐性遺伝子でラベルされた染色体が細胞内で共存していることが示唆される。すなわち、T. thermophilus HB8 は細胞内に染色体を複数コピー持った倍数体の生物と言えよう。図３C、レーン３、４におけるカナマイシンおよびブレオマイシン断片のシグナル強度の違いから、染色体は３コピー以上と考えられる。以上の結果は、染色体上で jrn とは真逆に位置する DNA ポリメラーゼ X
遺伝子（polX）についても同様に確認された。
HB8 のみならず、T. thermophilus の別の株である
HB27 でも同様の結果が得られている。類縁の D.
radiodurans やシアノバクテリアが倍数体であることを考慮すると、Thermus 属全体が倍数体である可能性は高い。

図２ 実験に用いたコンストラクト
T. thermophilus HB8のjrn遺伝子破壊株。
Hmr, ハイグロマイシン耐性遺伝子； Bmr, ブレオマイシン耐性遺伝子； Kmr,
カナマイシン耐性遺伝子。B. 枯草菌の Hmr ラベル株。
56

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)

図３ T. thermophilus HB8 の jrn 遺伝子破壊株の確認
A. jrn 遺伝子の上流、下流のプライマーを用いたコロニーPCR。B. ゲノムを SfiI で消化し、jrn 遺伝子に対するプローブで行ったサザン解析。C. Hmr に対するプローブで行ったサザン解析。以上 A〜C は、レーン１, λ/HindIII マーカ
ー； レーン２, カナマイシン耐性遺伝子による破壊株； レーン３、４, カナマイシンおよびブレオマイシンの両薬
剤耐性を示す形質転換体； レーン５, ブレオマイシン耐性遺伝子による破壊株； レーン６, 野生株。黒および白色の指示はそれぞれカナマイシンおよびブレオマイシン耐性遺伝子を含む断片を示す。D. EcoRI で消化したゲノムのパルスフィールド電気泳動による解析。レーン１, λ/HindIII マーカー； レーン２, 野生株； レーン３, カナマイシ
ン耐性遺伝子による破壊株; レーン４, ブレオマイシン耐性遺伝子による破壊株； レーン５, カナマイシンおよび
ブレオマイシンの両薬剤耐性を示す形質転換体； レーン６, λ ラダー。レーン２の＊のバンドが、レーン３以降の２
本の＊のバンドに分断されている。

図４ 染色体のコピー数の算出
図２の T. thermophilus HB8（Bmr ラベル）と枯草菌を各細胞数比で混合し、そこから抽出したゲノムを KpnI で消化後、Hmrに対するプローブでサザン解析を行った。白および黒色の指示はそれぞれ HB8 および枯草菌由来のシグナルを示す。
１:４〜１:５あたりで両シグナルが同程度となる。
57

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)れた。
D. radiodurans には染色体が複数あり、その第２染色体はコンカテマー（マルチマー）化しているらしい 7)。
T. thermophilus HB8 の染色体も同様にコンカテマー化
している可能性が考えられる。そこで、T. thermophilus
HB8 のゲノムをアガロースゲルブロックで調製し、制限酵素で処理することなく、そのままパルスフィールド電気泳動で解析してみた。エチジウムブロマイド染色で検出した限りでは、染色体 DNA は 1.9 Mbp 付近のモノマーのサイズに位置していた。この結果からは、染色体の大部分はモノマーの状態で存在していると考えられる。しかしながら、T. thermophilus HB8 のプラス
ミドは非常にコンカテマー化しており（後述の図５A）、
染色体がコンカテマー化している可能性が全くないとは言い切れない。さらに詳細な解析をしたい。
５． 染色体分配
倍数体のバクテリアの染色体がどのように複製され次の細胞に分配されていくのかは、一部のシアノバク
テリアでランダムに分配されることが示唆されてはいるものの 6,13)、よくわかってはいない。あるいは、細胞内に複数コピーある染色体のそれぞれが、複製されるとともに娘細胞に分配され、全く等価な染色体セットを持つ細胞が生じるのかもしれない。また、もし仮に染色体がコンカテマー化しているのなら、別の複製、分配のメカニズムもあり得るだろう。前述の異なる薬
剤耐性遺伝子でラベルされた染色体が共存する T.
thermophilus HB8 を、薬剤という選択圧のない条件で培養し、その薬剤耐性の変化を調べてみた。培養１時間後には、両薬剤耐性を示す菌体は 60％に減少し、残りは片方の薬剤耐性しか示さなかった。さらに 24 時間
後では、両薬剤耐性を示す菌体は全体の２％となった。
一見すると、染色体がランダムに分配されているように思える。しかしながら、T. thermophilus HB8 の細胞内では頻繁に相同組換えが起こっていると推測され、そうなるとランダムな染色体分配とは素直には考えられない。というのも、jrn や polX などの必須でない遺伝子の破壊株は難なく取得できるからである。つまり、染色体４〜５コピーのすべてにおける遺伝子の置換は容易く達成されるのである。おそらく染色体間の相同組換えにより促進されるものと推測する。染色体間の相同組換えが頻繁に起こっていると考えると、薬剤耐性といった表現型のみで染色体の分配を分析することは困難である。染色体分配をリアルタイムで観察する必要があろう。
６． 倍数体の生理的意義
放射線は DNA の二本鎖を切断し、ゲノムを断片化する。放射線耐性菌 D. radiodurans は、このような断片化した DNA から完全な染色体（ゲノム）を再構成
でき、倍数体であることがこれに貢献している。すな
わち、断片化した染色体間で相同組換えを行うことで、それらの断片を連結し、染色体の再構成を助長するの

４． 染色体のコピー数
３つ以上と推定されるものの、実際の染色体のコピー数を算出するためには、その基準となるものが必要である。プラスミドのコピー数は、大抵の場合、染色体を基準として（細胞内に環状の染色体が１つあるだ
け…を前提として）算出されている。したがって、通常絶対値とされる染色体のコピー数を算出するために、同じ細胞内の何かを基準とすることは難しそうである。
そこで、一倍体と立証されている枯草菌を基準として用いることにした。方法は以下のとおりである。１） T.
thermophilus と枯草菌の両方に共通の配列を導入する。
２ ） そ れ ぞ れ 細 胞 数 の わ か っ た 枯 草 菌 と T.
thermophilus を混合し、その混合物からゲノムを抽出する。３） 抽出したゲノム DNA に対し共通配列のプローブでサザン解析を行う。４） 各ゲノムに由来するシグナルの強度を比較する。 一般的に、増殖速度が速い場合には、複製開始領域で次々と新たな複製が開始されるため、その近傍はマルチコピーになる。これを少しでも避け、できるだけ正しい値を算出するため、増殖が遅くなるような条件（最少培地、低温など）で培養し、菌体を調製した。また、共通配列の導入位置
は、枯草菌では複製終止領域に近い proB 遺伝子、T.
thermophilus の場合は複製開始点が立証されていない
ので染色体上で真逆に位置する jrn と polX の２つの遺伝子座で調べることにした。通常は薬剤等で複製を停止させて実験を行うのだが、T. thermophilus に有効な薬剤の見当がつかなかったので、以上のような手法を取った。
枯草菌の proB の位置にハイグロマイシン耐性遺伝子を導入し（図２B）、最少培地、20℃で定常期まで培養し、細胞数を計測した。一方、T. thermophilus HB8
は図２A に示すブレオマイシン耐性の株を用いた。前
述のように、ブレオマイシン耐性遺伝子にはハイグロ
マイシン耐性遺伝子を付随させてある。これを合成培
地、55℃で対数増殖期および定常期まで培養し、細胞数を計測した。次に、一定の細胞数の T. thermophilus
HB8 に対して同数、２倍、４倍、…の細胞数の枯草菌を混合し、その混合物からゲノム DNA を調製した。
図２のように、枯草菌のハイグロマイシン耐性遺伝子の両端および T. thermophilus HB8 のブレオマイシン-ハ
イグロマイシン耐性遺伝子の両端には KpnI が導入してある。KpnI でゲノムを消化し、ハイグロマイシン耐性遺伝子に対するプローブでサザン解析を行えば、定量しやすい手頃なサイズでシグナルを検出できる。結果を図４に示すが、対数増殖期および定常期ともに、枯草菌の細胞数が T. thermophilus HB8 の４〜５倍のときに、両ゲノムに由来するシグナル強度が同程度となっている。すなわち、T. thermophilus HB8 の染色体は枯草菌の４〜５倍と見積もられる。枯草菌は一倍体なので、T. thermophilus HB8 は四〜五倍体となろう。染色体上で jrn とは真逆の polX の位置でも同様の値が算出さ58

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)である 14,17)。一方、T. thermophilus は放射線に耐性のあるバクテリアではない。しかし、T. thermophilus が生育する高温環境下においては、活性酸素が生じやすくなるためゲノム DNA 中に一本鎖切断が生じやすくなると考えられる。ゲノム中の一本鎖切断の頻度が高くな
ると、高温環境では二本鎖が解離しやすくなると想像され、放射線による二本鎖切断のような状態となり得る。そのような場合には、倍数体であることがゲノムを維持する上で重要な意味を持ってくるのかもしれな
い。実際、T. thermophilus HB27 における recA 遺伝子（相同組換えを担う）の不活性化は、高温での生存率を低下させると報告されており 3)、高温環境がゲノム DNAにダメージを与えうることを示唆している。現時点では倍数体と高温で生育できることとの因果関係は不明
だが、倍数体であることが DNA 修復に有利に働くことは容易に想像できよう。また、倍数体であることは、
いわば大規模な遺伝子重複のようにも思える。ある染
色体上でもとの遺伝子が保存されていれば、他の染色体上ではいろいろとチャレンジできる可能性がある。
強い放射線や高温といった過酷な条件下における環境変化に適応せねばならない場面では、このようなチャレンジが生存に有利に働くかもしれない。
しかし、研究対象としては、倍数体は厄介と言えよう。前述のように、必須遺伝子を破壊しようとした場
合には、一部のみが破壊されて、一部はもとの遺伝子が保存された状況になる。これをさらに選択圧のかかった状態で培養し続けると、他の領域にサプレッサー変異が生じ、いずれもとの遺伝子さえも破壊されてしまう可能性もある。その場合、必須遺伝子であるはずのものが、見かけ上は必須遺伝子ではなくなってしまう。今後、倍数体のバクテリアの遺伝学においては、
このようなサプレッサー変異の確認（解析）も不可欠になってくるのかもしれない。次世代シーケンサーが普及しつつある今では、それほど不可能な話でもない。
必須遺伝子とそのサプレッサー変異を大規模に解析し因果関係を探ることで、細胞内の新たなシステムが見いだされるかもしれない。倍数体ならではのアプロー
チと言えよう。T. thermophilus HB8 は、奇しくもシステ
ム生物学のモデル生物として選ばれた倍数体のバクテリアであり、その使命を担うべき存在である。以上、倍数体についての妄想を書き連ねていくと、ゲノムに可塑性が有りすぎるように思えてくる。おそらく、細胞内ではゲノム（染色体）を安定に維持する何らかのメカニズムが働いているに違いない。そのようなメカ
ニズムを追求するためにも、一倍体の T. thermophilus
変異体を取得できないものか、倍数性をコントロール
できる系を作れないものかと考えている。

【T. thermophilus HB8 の第３のプラスミド pVV8】12)
１． T. thermophilus HB8 の第３のプラスミド pVV8
T. thermophilus ゲノムは、HB27、HB8、SG0.5JP17-16の３株について公開されている。HB27 お よ び
SG0.5JP17-16 のゲノムは染色体とメガプラスミド（HB27は0.23 MbpのpTT27、
SG0.5JP17-16は0.44 Mbpの pTHTHE1601）からなり、HB8 のゲノムは染色体と0.26 Mbp のメガプラスミド pTT27 にくわえ 9.3 kbp のプラスミド pTT8 で構成されている。HB8 においては
過去に pVV8 と名付けられた 47 MDa（70〜80 kbp 程度に相当）のプラスミドも報告されているが、２報ほどと情報が少なく、しかも当時は pTT27 の存在も明らかでなかったため、その違いも明確にされてはいない 8,15)。
そもそも HB8 ゲノムのデータベースには含まれていないため、実体もなく、ほとんど知られることのない存在である。
筆 者 ら は 、 別 の 目 的 で HB8 の pTT8 欠 損 株（BEST24004）を取得した際に、HB8 に pTT8 や pTT27とは異なる第三のプラスミドが存在することに気がついた。
BEST24004 から一般的なアルカリ SDS 法によりプラスミドを抽出し電気泳動したものが、図５A のレーン２である。レーン３の、親株とした野生株から抽出したものと比べると、pTT8 のバンドが無くなってい
るのがわかる。しかし、これとは別に１本明確なバンドがあり、これは野生株でも観察される。pTT27 とも考えられたが、レーン５の HB27 からの抽出物ではこのバンドは見られない。一般的なアルカリ SDS 法では、
pTT27 を無傷の状態で調製することが難しいことを意味している。また、制限酵素で処理した結果からも、このバンドが pTT27 ではないことが示唆された。そこ
で、これがかつて報告された幻の pVV8 プラスミドではないかと考えた。pVV8 に関しては論文が少なく情報に乏しいため、pVV8 と同定しうる根拠がほとんどない。後述するが、図５A のレーン２のプラスミドの配列を決定したところ、全長 81,151 bp であり、pVV8で報告された47 MDaと一致している。
これに基づき、
本稿では以下このプラスミドを pVV8 として論ずることとする。
しかしながら、図５A のようにかなり明確なバンドが見られるのに、なぜこれまで日の目を見ることがな
かったのだろうか？ これはおそらく、プラスミドを調製するのに若干のコツを要するのと、pVV8 のバンドが＊で示す pTT8 のコンカテマーのバンドと重なって見えるためだろうと推測される。そしてもう１つ、なぜ HB8 ゲノムのデータベースには pVV8 が含まれていないのだろうか？

59

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)

図５ T. thermophilus から抽出したプラスミド
A. アルカリ SDS 法で抽出したプラスミドを、制限酵素で処理することなく電気泳動した。レーン１, λ ラダー; レーン２, BEST24004; レーン３, ラボ保有のHB8; レーン４, 理研のHB8; レーン５, HB27; レーン６, λ/HindIIIマーカー。pTT8、pVV8 ともに実際のサイズよりも大きく見積もられ、コンカテマー化している（＊は pTT8 のコンカテマー）。通常の小スケールのアルカリ SDS 法では、pTT27 は調製できていない。B. ゲノムを NdeI で消化し、pVV8 の配列の一部を用いてプローブを作製し、サザン解析を行った。レーン１, λ ラダー; レーン２, 調製した pVV8; レー
ン３, BEST24004; レーン４, ラボ保有のHB8; レーン５, 理研のHB8; レーン６, HB27; レーン７, λ/HindIIIマーカー。
２． ゲノム解読された（とされる）HB8 株
ゲノム解読したとされる T. thermophilus HB8 は、理化学研究所バイオリソースセンターより入手できる。
これを取得し、プラスミドを調製してみた。図５A のレーン４に示すが、pVV8 は見られない。次に、BEST24004 から抽出した pVV8 を BglII で切断し、その断片の１つに対するプローブでサザン解析を行った。
図５B に示すとおり、BEST24004 およびラボ保有のHB8 ではシグナルが検出されたが、理研からの株および HB27 ではシグナルは検出されなかった。以上の結果から、理研の HB8 では pVV8 が欠落しているものと考えられる。したがって、実際にこの株のゲノム配列を決定したのなら、pVV8 の配列が含まれないのは当然である。
HB8 がもともと pVV8 を持っていたのか、あるいは持っていなかったのか、という話になろう。ラボ保有の HB8 は、かつて pVV8 を報告したラボから譲り受けたものではない。したがって、複数のラボの HB8 株でそれぞれ見つかっているので、pVV8 を持った株がオリジナルと考えるのが自然のように思う。理研の株は、たまたま pVV8 を失った株が偶然にも選択され、標準株とされてしまったものと推測する。おそらく pVV8については情報が少なかったために、チェックできなかったのだろう。こう述べると、pVV8 を不安定なプラスミドのように思われるかもしれない。しかしながら、pVV8 を持った HB8 を８日間毎日継代し、培養し続けても、pVV8 を失った菌体はまったく見当たらなかった。実際のところは、細胞から頻繁に欠落するよ

うな不安定なものではないようである。
３． pVV8 の性質
理研の HB8 は pVV8 を失っている。さらに、理研のHB8 とラボ保有の株を比べても、生育に顕著な差は見られない。したがって、pVV8 は HB8 の生育には必須ではない（サプレッサー変異が入っていないことが前提ではあるが）。かつて報告された論文では、pVV8 の性質として細胞凝集との関連性が示唆されている 8)。
HB8 では HB27 と比べ、図６のように培養中に細胞凝集あるいはバイオフィルム形成といった現象が見られる。これが pVV8 によって引き起こされるというのである。しかしながら、pVV8 を欠く理研の株でも細胞凝集は見られるし、また、pVV8 を HB27 に導入しても細胞凝集あるいはバイオフィルム形成などの現象は見られなかった。pVV8 で唯一報告されている表現型が確認できないため、実際のところ、サイズ以外に
pVV8 と同定できる情報はないのである。
T. thermophilus HB8 は pTT8、pVV8、pTT27 の３つのプラスミドを持つ。染色体４〜５コピーに対し、pTT8は８倍、pTT27 は同数あると見積もられており、pVV8のコピー数も算出してみた。方法は、図２A のブレオ
マイシン耐性の株において、pVV8 にハイグロマイシ
ン耐性遺伝子を挿入し、そのゲノムをハイグロマイシ
ン耐性遺伝子のプローブでサザン解析するというものである。その結果、染色体由来のシグナルに対し、pVV8由来のシグナル強度は 1.5〜２倍であった。したがって、
染色体４〜５コピーに対し、pVV8 は６〜10 コピーと見積もられる。
60

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)ム委員会の先生方に深く感謝いたします。本研究は慶應義塾大学先端生命科学研究所において行ったもので、
板谷光泰教授、冨田勝所長には多大なるご支援を賜りました。また、大阪大学大学院/理化学研究所の倉光成
紀先生、増井良治先生、中川紀子先生、産業技術総合研究所の小山芳典先生には、貴重なご意見ならびに試料をご提供いただきました。ここに改めてお礼申し上げます。
【引用文献】．
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marker in the host-vector system of Thermus

図６ T. thermophilus HB8 の細胞凝集/バイオフィルム形成
４． pVV8 の配列
BEST24004 から調製した pVV8 の塩基配列を次世代
シ ーケ ンサー で決 定した （ DDBJ/EMBL/GenBank:
accession number AB677526）。81,151 bp、GC 含量 68.0％のプラスミド上には 91 個の ORF が見いだされ、その内のキシロースイソメラーゼのみがすでに論文発表されている。亜リン酸代謝関連遺伝子群や複数の転写因子、制限修飾系遺伝子などとともに、染色体やメガプ
ラスミドと同じ遺伝子もいくつかコードされているが、半数近くは機能のわからない遺伝子である。複製開始
領域も明確ではなかったのだが、これに関しては実験的に決定した。
【おわりに】
T. thermophilus HB8 と言えばシステム生物学のモデ
ル生物として有名なバクテリアである。そのような多方面から注目される解析対象に対し、スペシャリスト
でもない筆者が俄には信じ難いことを論じるのには若干の不安があった。しかしながら、他の先生方から「Thermus で過去に思い当たる節が…」とか「うちで扱っているバクテリアでも…」とお話を伺うことも多くなり、安心すると同時に、改めて原核生物のゲノムが思ったほど単純ではないことを実感させられている。
あえて調べられていなかっただけで、実際には倍数体のバクテリアは多いのかもしれない。バクテリアとい
えば細胞内に環状のゲノム（染色体）が１つあるだけ…この先入観が少しでも払拭されるきっかけになれば幸いである。周知の事実のように扱われていたとしても 、 実 際 は 立 証 さ れ て い な い こ と は 多 い 。 T.
thermophilus に関する、また別の俄には信じ難い実験結果について、深く調べようとしているところである。
【謝辞】
極限環境生物学会シンポジウムでの講演ならびに本稿の執筆の機会を与えて下さいました学会シンポジウ
61Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)14) Slade, D., Lindner, A. B., Paul, G. and Radman, M.
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62

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)MINI REVIEWJournal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10, 63-68

Hatanaka R

The function of LEA proteins in an extreme desiccation tolerance, anhydrobiosis,
in the sleeping chironomid and the application of LEA-mimetic peptides.
Anhydrobiosis Research Group, National Institute of Agrobiological Sciences
1-2 Ohwashi, Tsukuba, Ibaraki, 305-8634, Japan
Correspondence author: Rie Hatanaka, hatanakarie@affrc.go.jp
Tel: +81-29-838-6170 Fax: +81-29-838-6157
Received: October 24, 2011 / Accepted: November 18, 2011
understand roles of the 11-mer motif, we investigatedwhether typical features of G3LEA were able to be
substituted by a synthesized 22-mer peptide (PvLEA-22)
consisting of 2 tandem repeats of the consensus motif of
the G3LEAs. Second structure of PvLEA-22 reversiblytransformed from random coils in the aqueous solutions
into α-helices in the dry state. Such structural transitionis similar to that in G3LEA. In addition, PvLEA-22
reinforced glassy matrix of disaccharides, as well as
G3LEA. These results indicate that the 11-mer motif
structurally governs pivotal roles of G3LEA. PvLEA-22
is expected to become a useful tool for dry preservationof biomaterials and cells at room temperature.

Abstract
The larvae of the sleeping chironomid Polypedilum
vanderplanki show an extreme desiccation tolerance,
anhydrobiosis, which enable them to survive in analmost completely desiccated state. Upon desiccation,
they accumulate a large amount of trehalose andstress-related proteins, such as LEA proteins. LEA
proteins would have various roles in cellular protection
during drying. Thus, LEA proteins probably contribute to
the extreme desiccation tolerance in the larvae. To date,
three cDNAs encoding group 3 LEA protein (G3LEA)
were cloned from P. vanderplanki. One of the structuralcharacteristics of G3LEA is 11-mer motif repeats. To

Key words:Sleeping chironomid, LEA protein, LEA peptide, desiccation tolerance, anhydrobiosis
キーワード：ネムリユスリカ、LEA タンパク質、LEA ペプチド、乾燥耐性、アンヒドロビオシス

ネムリユスリカの極限乾燥耐性におけるLEA タンパク質の役割とペプチドによる機能摸倣
独立行政法人 農業生物資源研究所 乾燥耐性研究グループ
畑中理恵
ような、乾燥により誘導される蘇生可能な無代謝状態をアンヒドロビオシスと呼んでいる。この現象はネムリユスリカでは幼虫の時期に限定される。
野外で観察されるネムリユスリカ幼虫が持つ極限乾燥耐性は、実験室でも再現可能である 19)。ネムリ
ユスリカ幼虫を急速に乾燥すると、再水和後の生存率は低い。それに対して、二日かけてゆっくり乾燥させた幼虫は、再水和後ほぼ全てが覚醒して活動し始める。ゆっくり乾燥させたネムリユスリカ幼虫で極限環境生物ネムリユスリカ
ネムリユスリカ (Polypedilum vanderplanki) は極
限的な乾燥耐性を示す唯一の昆虫である (図 1) 10)。
アフリカの半乾燥地帯の岩盤にできた水たまりに生息するが、8 ヶ月に及ぶ長い乾季には水たまりは干上がり、ネムリユスリカ幼虫はカラカラに乾いて無代謝状態に陥って、生命活動を完全に停止する。しかし、雨季が訪れて岩盤のくぼみに再び水が張ると、幼虫は吸水して 1 時間以内に活動を再開する。この63

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)は、乾燥重量の 20％相当のトレハロースが蓄積することが明らかになった 19)。トレハロースは昆虫の血糖であるが、乾燥耐性の高い動物においては、細胞保護物質としても機能することが知られている 3, 4)。
一般に、厳しい乾燥にさらされた生物の生体内では脱水が進み、生体高分子の構造を維持する水が失われるため、タンパク質の凝集や失活、膜の融合や相転移が起こる。トレハロースは、脱水時に水と置き換わって生体高分子と結合することで、細胞に蓄積するダメージを抑えるとされている (水置換説)4)。
また、細胞内に多量に蓄積したトレハロースは、脱水に伴い濃縮され、細胞質をガラス化する。ガラス化した細胞内は、非常に高い粘性のために拡散が起きにくく、生体高分子の物理的な変化が抑制されると考えられている(ガラス化説)3)。事実として、乾燥の過程でネムリユスリカ幼虫体内に蓄積したトレハ
ロースは、水と置換しながら全身のすみずみに行渡って、最終的にガラス化していることが明らかになった 15)。このことから、トレハロースはネムリユス
リカ幼虫の極限乾燥耐性を担う主な因子の一つといえる。

LEA タンパク質の発見
乾燥耐性の高い生物に共通してみられる別の保護因子として、ストレスタンパク質の一種である LEA(late embryogenesis abundant) タンパク質がよく知られている。LEA タンパク質は、1980 年代に植物種子の胚発生後期に多量に蓄積するタンパク質として初めて報告された 7)。現在では、さまざまな植物組織で、乾燥や低温、高塩濃度などの脱水ストレスに応答して Lea 遺伝子が発現することが報告されている
11)。2002 年に LEA タンパク質をコードする遺伝子
が乾燥耐性を示す線虫 (ニセネグサレセンチュウ)
で発見されたのを皮切りに、多くの極限乾燥耐性生物（例えば、ヒルガタワムシや甲殻類のアルテミアなど）にも Lea 遺伝子が存在することが明らかになってきた 2, 13, 14)。そこで、極限乾燥耐性を示す昆虫
であるネムリユスリカにも Lea 遺伝子が存在すると推測し、アンヒドロビオシス関連 EST データベース
を検索した。その結果、LEA タンパク質と相同な配列を持つ EST クローンが複数存在することが明らかとなり、そこから LEA タンパク質をコードする 3
つの cDNA (PvLea1, PvLea2, PvLea3) を単離した 12)。
PvLea1, PvLea2, PvLea3 は、ネムリユスリカ幼虫で乾燥あるいは塩処理により発現が誘導された(表 1)ことから、脱水ストレス応答性の遺伝子であることが明らかとなった 12)。
LEA タンパク質の特徴
LEA タンパク質は、アミノ酸配列の違いから 6 つのグループに分類されており、各グループに特徴的な配列モチーフが知られている 1, 18)。例えば、グループ 3 の LEA タンパク質 (G3LEA) は、共通して 11
アミノ酸配列の繰り返し構造 (11-mer リピート) を持つ。この共通構造は、タンパク質ドメインのデー
タベース Pfam で “LEA_4” モチーフ (PF02987) と定義されている 6)。ネムリユスリカの LEA タンパク質 PvLEA1 では 6 個、PvLEA2 では 2 個、PvLEA3
では 3 個の LEA_4 モチーフを持つことから、グルー
プ 3 に分類された 12)。

図 1 ネムリユスリカ幼虫のアンヒドロビオシス．
ネムリユスリカ幼虫(左)は、実験室では 2 日かけて乾燥すると含水率が 5%以下まで減少して無代謝状態になる(右)。吸水させれば、直ちに活動を再開する(左)。乾燥した幼虫は、体内に水分が無いにも関わらず蘇生可能な状態を維持しており、この現象はアンヒドロビオシスと呼ばれる。乾燥と吸水によるアンヒドロビオ
シスの誘導と覚醒は可逆的である。

64

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)G3LEA の最も顕著な物理化学的な特徴は、水分活性依存的に起こるタンパク質二次構造の可逆的な転移である (図２)。フーリエ変換赤外吸収分光法(FT-IR) によるタンパク質二次構造の解析から、
G3LEA は、溶液中では構造を持たない（ランダム構
造である）が、乾燥により両親媒性 α-ヘリックスへと構造変化することが示された 8)。このヘリックスの表面はプラスとマイナスに分極してイオンと結合できるため、G3LEA はイオンスカベンジャーとして機能することが推測されている 5)。この機能により、脱水に伴い細胞内の塩濃度が上昇した場合、細胞内で G3LEA がイオンを吸着して隔離することで、タンパク質の塩析や細胞膜電位の攪乱などを抑える効
果が期待される。また、乾燥により両親媒性ヘリックスとなった G3LEA は、生体膜やタンパク質などの生体高分子と結合して分子同士の接触を防ぐこと
で、乾燥に伴う不可逆的な凝集を防ぐことが報告されている 9, 17)。G3LEA の抗凝集効果がトレハロースの存在下では相乗的に増大することや、G3LEA がシ
ョ糖（トレハロースと同じ非還元性の二糖類）のガ
ラスの安定性を高めたという報告もある 9, 20)。つまり、LEA タンパク質は、ネムリユスリカ幼虫の高い乾燥耐性を担う重要な因子のひとつであることが推測される。加えて、ネムリユスリカの LEA タンパク質は、乾燥幼虫に多量に蓄積するトレハロースと協調して、細胞の保護にあたることが期待される。

除き、1、2、5、9 番目は、疎水性アミノ酸 (Φ) 、3、7、11 番目は無電荷あるいは負電荷をもつ極性アミノ酸 (Ω) 、6、8 番目は正電荷を持つ極性アミノ酸のリジン(K)であることが多く、共通配列としては“ΦΦΩXΦKΩKΦXΩ”が提唱されている (図 3)5)。
11-mer リピート自体が G3LEA に特徴的な構造転移や機能を示すかどうかを検証するため、当研究グル
ープでは、ネムリユスリカ LEA タンパク質の 11-mer
リピートのアミノ酸配列をもとに、ペプチドを化学合成した 16)。PvLEA1、PvLEA2、PvLEA3 それぞれの 11-mer リピートから 11 アミノ酸残基の共通配列を統計的に決定し、その共通配列を 2 回繰り返したものが、ネムリユスリカ LEA タンパク質のモデルペ
プチド PvLEA-22 である (図 3)。ネムリユスリカ LEA
タンパク質由来の 11-mer リピートの 2 番目のアミノ酸は、提唱されている共通配列とは異なり、リジンの出現頻度が高かった。
PvLEA-22 の二次構造を FT-IR で解析したところ、
このペプチドは、溶液中では無構造（ランダム）であるが、乾燥状態では α-ヘリックスへと構造変化することが明らかになった 16)。さらに、この構造転移は可逆的であった。つまり、11-mer リピート自体がG3LEA と同じ特徴 (水分活性依存的な構造変化) を示すことが明らかになった(図 2)。FT-IR では、ガラスの安定性を評価することもできる。トレハロース
単一試料および PvLEA-22 混合試料のガラス転移温度 (Tg)はそれぞれ、112℃および 103℃であった (図4)。単一試料と比較して、混合試料のガラスは OH
伸縮振動最大値が 70 cm-1 低周波側に見られ、かつ、プロットの傾きが小さかった (図 4)。この結果は、混合試料の方がガラスの水素結合力が強いことを示している。トレハロース単一のガラスと比較して、
PvLEA-22 とトレハロース混合のガラスの方が、より 熱力 学的に 安定 なガラ スで あった こと から、
PvLEA-22 はトレハロースのガラス安定化剤として機能することが示された 16)。以上のように、ネムリ
ユスリカの LEA タンパク質の 11-mer リピート部分を模倣したペプチド PvLEA-22 が G3LEA と同様の構造転移や機能を示したことから、G3LEA の特徴は
11-mer リピートに起因することが証明された。つまり、LEA タンパク質の機能を、化学的に合成したペプチドでも代替できることを示唆している。

図 2 G3LEA の二次構造変化．
G3LEA は、水分活性に依存してその二次構造を変化させる。
G3LEA は溶液中では構造を持たないが（ランダム構造）、乾燥時にはα-ヘリックス構造になる。この構造転移は可逆的である。
ネムリユスリカ LEA ペプチド PvLEA-22 も G3LEA と同様の構造変化を示す。

ネムリユスリカの LEA タンパク質を模倣したペプ
チド
それぞれの G3LEA がもつ 11-mer リピートは、各
ポジションにおいて共通する性質を持つアミノ酸で構成されるが、バリエーションに富む。11-mer リピートの内、ランダムである 4、10 番目のアミノ酸を

65

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)図 3 11-mer リピートを模倣したネムリユスリカ LEA ペプチドと各 LEA タンパク質の共通配列．
ネムリユスリカ LEA ペプチド PvLEA-22 のアミノ酸配列と PvLEA1、PvLEA2、PvLEA3、植物 LEA タンパク質の 11-mer リピートの共通配列をアミノ酸の性質ごとに色分けして示した。青：疎水性、赤：正電荷、黄：負電荷、白：その他。PvLEA1、PvLEA2、PvLEA3の共通配列は、11-mer リピートの各ポジションにおける個々のアミノ酸出現頻度から導き出した (Shimizu et al. 2010)。アミノ酸出現頻度が 50%以上のアミノ酸については、太字・太枠で示した。

図 4 PvLEA-22 はトレハロースのガラスマトリックスを強化する．
トレハロースの単一試料および PvLEA-22 混合試料のガラスの安定性を FT-IR で評価した。試料の温度上昇に伴い変化する OH 伸縮振動最大値をプロットし、傾きが変化した温度をガラス転移温度 (Tg)とした。(Shimizu et al. 2010 より改変)

66

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)by reciprocal heterologous complementary
deoxyribonucleic acid--messenger ribonucleic acidhybridization. Biochemistry, 20: 4169-4178.
8) Goyal, K., Tisi, L., Basran, A., Browne, J., Burnell,A., Zurdo, J., and Tunnacliffe, A. (2003) Transition
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9) Goyal, K., Walton, L.J., and Tunnacliffe, A. (2005)
LEA proteins prevent protein aggregation due towater stress. Biochem. J., 388: 151-157.
10) Hinton, H.E. (1951) A new Chironomid from Africa,
the larva of which can be dehydrated without injury.
Proc. Zool. Soc. London, 121: 371-380.
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12) Kikawada, T., Nakahara, Y., Kanamori, Y., Iwata,
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13) Menze, M.A., Boswell, L., Toner, M., and Hand,
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Late Embryogenesis Abundant (LEA) gene inanimals increases organelle resistance to water
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14) Pouchkina-Stantcheva, N.N., McGee, B.M.,
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16) Shimizu, T., Kanamori, Y., Furuki, T., Kikawada, T.,
Okuda, T., Takahashi, T., Mihara, H., and Sakurai,
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17) Tolleter, D., Jaquinod, M., Mangavel, C., Passirani,C., Saulnier, P., Manon, S., Teyssier, E., Payet, N.,
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Structure and function of a mitochondrial lateembryogenesis abundant protein are revealed bydesiccation. Plant Cell, 19: 1580-1589.

LEA ペプチドに期待される乾燥保存技術
今回紹介した LEA ペプチド PvLEA-22 は、G3LEAの代替物質として乾燥保存技術に応用できる可能性を秘めている。例えば、LEA ペプチドを乾燥保存したいタンパク質試料に添加すれば、乾燥による試料の不可逆的な凝集や変性を抑えることができる保護剤として機能することが期待される。LEA ペプチドで保護した乾燥試料は、ネムリユスリカの乾燥幼虫のように常温で保存できるようになるはずである。
現在、多くのタンパク質試料が冷蔵・冷凍条件で保存あるいは輸送されているが、常温保存可能な乾燥
試料は、冷蔵庫や超低温フリーザーが不要になるため、圧倒的なコストの削減に貢献できる。この低分
子のペプチドは、遺伝子組換えタンパク質の合成・精製に比べて安価で大量に化学合成できるため、上述した工業面での利用に適していると考えられる。
ネムリユスリカを含む極限乾燥耐性生物を用いた多面的な研究から、LEA タンパク質が、乾燥から生体を保護する重要な因子の一つであることが明らかになってきている。当研究グループでは、今後ネム
リユスリカ LEA タンパク質の生体における機能を解明すると同時に、G3LEA の機能を模倣した LEAペプチドが産業面で役立つことを期待している。
引用文献
1) Battaglia, M., Olvera-Carrillo, Y., Garciarrubio, A.,
Campos, F., and Covarrubias, A.A. (2008) The
enigmatic LEA proteins and other hydrophilins.
Plant Physiol., 148: 6-24.
2) Browne, J., Tunnacliffe, A., and Burnell, A. (2002)
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3) Crowe, J.H., Carpenter, J.F., and Crowe, L.M.
(1998) The role of vitrification in anhydrobiosis.
Annu. Rev. Physiol., 60: 73-103.
4) Crowe, J.H., Hoekstra, F.A., and Crowe, L.M.
(1992) Anhydrobiosis. Annu. Rev. Physiol., 54:
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5) Dure, L., 3rd. (1993) A repeating 11-mer aminoacid motif and plant desiccation. Plant J., 3:
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6) Finn, R.D., Mistry, J., Tate, J., Coggill, P., Heger, A.,
Pollington, J.E., Gavin, O.L., Gunasekaran, P.,
Ceric, G., Forslund, K., Holm, L., Sonnhammer,
E.L., Eddy, S.R., and Bateman, A. (2010) The Pfam
protein families database. Nucleic Acids Res., 38:
D211-222.
7) Galau, G.A., and Dure, L., 3rd. (1981)
Developmental biochemistry of cottonseedembryogenesis
andgermination:changing
messenger ribonucleic acid populations as shown67

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)18) Tunnacliffe, A., and Wise, M.J. (2007) The
continuing conundrum of the LEA proteins.
Naturwissenschaften, 94: 791-812.
19) Watanabe, M., Kikawada, T., and Okuda, T. (2003)
Increase of internal ion concentration triggers
trehalose synthesis associated with cryptobiosis inlarvae of Polypedilum vanderplanki. J. Exp. Biol.,

206: 2281-2286.
20) Wolkers, W.F., McCready, S., Brandt, W.F., Lindsey,
G.G., and Hoekstra, F.A. (2001) Isolation andcharacterization of a D-7 LEA protein from pollenthat stabilizes glasses in vitro. Biochim. Biophys.
Acta, 1544: 196-206.

68

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)MINI REVIEWJournal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10, 69-76

Suzuki H

Genetic engineering of thermophiles for bioprocess applications
Faculty of Agriculture, Graduate School, Kyushu University, 6-10-1 Hakozaki, Higashi-ku, Fukuoka 812-8581, Japan.
Corresponding author: Hirokazu Suzuki, hirokazusuzuki@agr.kyushu-u.ac.jp
Tel: +81-92-642-7609; Fax: +81-92-642-3053;
Received: October 27, 2011 / Accepted: December 14, 2011
thermophile is able to grow between 42ºC and 74ºC (optimum,
60ºC) and has some advantages particularly in industrial
applications. This review deals with genetic modifications now
available in G. kaustophilus HTA426, along with a perspectiveon thermophiles which are able to be genetically modified and arational strategy to facilitate the establishment of genetic
modification system for desired microbes.

ABSTRACT
Bioprocesses under elevated temperatures have several
advantages such as reducing risk from contamination, lowenergy expenditure in agitation and cooling, and facilitating
recovery and removal of volatile products. We have focused ona thermophilic bacillus, Geobacillus kaustophilus HTA426, as apotential host for various bioprocesses elevated temperaturesand established its genetic modification system. This

Keywords: thermophiles, Geobacillus sp., genetic engineering, bioprocess, elevated temperature
キーワード：好熱菌、ジオバチラス属細菌、遺伝子工学、バイオプロセス、高温

高温バイオプロセスを志向した好熱菌の遺伝子工学
九州大学大学院農学研究院
鈴木 宏和
法を研究してきた 25)。本稿で紹介する好熱菌 Geobacillus
kaustophilus HTA426 の遺伝子組換え技術は、その研究の一環として確立されたものである。その原点は“好熱性
微生物は耐熱性酵素の供給源として広く研究されているが、これまでに見出された様々な耐熱性酵素を同一の好熱性微生物中で産生させることで、高温バイオプロセスに有用な好熱性微生物を新たに創出できないだろうか？”という動機にあった。そこで本稿では、まず高温バイオプロセスの潜在的有用性について概説する。つづいて G.
kaustophilus HTA426 の諸特性、これまでに確立した遺伝子工学技術、ならびに、その過程において重要な役割を果たした DNA 制限修飾系の戦略的回避法について紹介する。Geobacillus 属細菌を研究に利用したい方や、研究対象としている微生物の遺伝子組換えができずに困っている方々に、本稿が少しでもご参考になれば幸いである。

1.

はじめに
微生物の遺伝子組換え技術は、分子微生物学や応用微生物学の発展に大きく貢献している。遺伝子組換えの容易なモデル微生物を研究対象とすることで発展してきた、と言いかえることもできるだろう。事実、大腸菌 K-12
株 16)や枯草菌 38)による外来 DNA 取り込み能はいずれも早期に発見された。その一方で、任意微生物の遺伝子組換え技術の確立は容易な作業ではない。自然界から見出されている幾多の有用微生物のうち遺伝子組換えが可能
なものは僅かにすぎず、その他多くの微生物については
プラスミド導入や遺伝子破壊などといった基本的な遺伝
子組換えすら行えないのが現状である。全ゲノム配列が解読されたにも関わらず、遺伝子組換えができないがた
めに、その学術的および産業的な発展性を大きく制限された有用微生物も少なくない。有用微生物の探索技術やゲノム解析技術の進展にともない、任意微生物の遺伝子組換え技術を効率よく確立する戦略的手法が急速に要求されている。
これまでに我々は、遺伝子組換えを妨害する要因として微生物の DNA 制限修飾系に注目し、その戦略的回避

2.

高温バイオプロセス
バイオプロセスとは生物もしくは生物材料を利用したプロセス（物質の生産、分解、濃縮、変換、および純化など）の総称であり、それには精製酵素を利用した酵素
69

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)は決して新しいものではない。Wiegel & Ljungdahl (1984)の総説 34)で指摘されている好熱性微生物プロセスの利点を以下にまとめる。
i) 好熱性微生物の中には代謝活性が高いものが見出される。高い代謝活性は目的産物の生成速度を向上させる。
ii) 病原菌汚染を抑制できる。ほぼ全ての病原性細菌およびウィルスは 65ºC 以上の高温環境下で増殖できない。iii)
冷却に要するエネルギーを削減できる。常温バイオプロ
セスでは、発酵熱によるプロセス温度上昇に対して、冷却が必要になりうるが、高温バイオプロセスでは発酵熱を有効に活用できる。
iv) プロセスの反応停止において過剰な冷却（20ºC 以下）が必要ない。v) 化合物の水溶性、拡散率、およびイオン化率が上昇する。vi) 培地粘度が低下することにより、攪拌に要するエネルギーを削減できる。vii) エタノールなどの揮発性生成物を効率よく回収できる。結果として培地中の生成物濃度が減少し、生成物による細胞毒性やフィードバック阻害が抑制される。

プロセスや微生物細胞を利用した微生物プロセスなどが含まれる。酵素プロセスは比較的単純な反応に利用しやすい。例としては、ニトリルヒドラーゼを用いたアクリ
ロニトリルの水和によるアクリルアミド生産などが挙げられる。一方、微生物プロセスは多段階反応や細胞膜を介した分離濃縮などの複雑なプロセスに利用でき、発酵
食品や繊維染色などにおける伝統産業から、アミノ酸生
産や発酵医薬品生産などの近代産業、そしてバイオエタ
ノール生産などの新興産業に至るまで、今もなお幅広い産業分野で利用されている。
レアメタル濃縮、
環境浄化、
およびバイオマス分解などに関する環境調和型技術への応用も活発に研究されている。これらバイオプロセスは
概して常温微生物に依存するため、バイオプロセスは常温条件下（45ºC 未満）で行われる。これら常温バイオプ
ロセスに対し、高温条件下（45ºC 以上）で行われるバイ
オプロセスを、本稿では高温バイオプロセスとよぶ。
“好熱性微生物を利用した高温バイオプロセス”という概念

表 1 遺伝子組換え技術が報告されている好熱性微生物。
好熱性微生物分類
生育至適温度
Clostridium thermocellum
嫌気性グラム陽性細菌
70ºC

ゲノム公開株
DSM 2360，
JW20

遺伝子組換
え技術 a)
P

32

Geobacillus
stearothermophilus
Geobacillus
thermoglucosidasius
Thermoanaerobacter sp.
X514
Thermoanaerobacterium
saccharolyticum
Thermotoga maritima
Thermotoga neapolitana

好気性グラム陽性細菌

55ºC

通性嫌気性グラム陽性細菌

55ºC

C56-YS93

P，H

5，30

嫌気性グラム陽性細菌

60ºC

X514

P

13

嫌気性グラム陽性細菌

60ºC

P，H

24

嫌気性グラム陰性細菌
嫌気性グラム陰性細菌

80ºC
77ºC

P
P

39
39

Thermus thermophilus

好気性グラム陰性細菌

65ºC

P

文献

MSB8
RKU-10，
DSM 4359
HB8，HB27

11，20，35

P，H，pyr，
3
R
Pyrococcus abyssi
嫌気性アーキア
96ºC
GE5
P，pyr
14
Pyrococcus furiosus
嫌気性アーキア
100ºC
DSM 3638
P
33
Sulfolobus acidocaldarius
好気性アーキア
75ºC
DSM 639P，H
2
Sulfolobus solfataricus
好気性アーキア
75ºC
P2
P，H，R
2
Thermococcus
嫌気性アーキア
85ºC
KOD1
P，H，pyr，23
kodakarensis
Ra) 各記号は以下の遺伝子組換え技術を指す：P，プラスミド形質転換；H，相同組換え；pyr，pyrE および pyrF 遺伝子を利用したカウンター選択システム；R，レポーターシステム。
3.

重要な役割を果たす。近年報告された Thermoanaerobacterium saccharolyticum お よ び Geobacillus thermoglucosidasius の遺伝子組換え体による高温エタノール発
酵 5, 24, 29)は、好熱性微生物の遺伝子工学技術が高温バイオプロセスの応用性を飛躍的に拡大することを示した良い

好熱性微生物の遺伝子工学技術
微生物プロセスは難解複雑な生物というものを使用するため、その制御や改良は容易なことではないが、遺伝
子工学技術は有用微生物の分子育種を可能とし、微生物プロセスの生産量向上や副産物抑制などにおいて極めて
70

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)（Bacillus subtilis）と近縁である。枯草菌に関して蓄積された生物学的知見は HTA426 株における遺伝子機能の予測に極めて有用で、この点も HTA426 株の長所といえる。

例であろう。しかしながら、好熱性微生物の遺伝子工学
は、一部の細菌（Thermus thermophilus3)）やアーキア（Thermococcus kodakarensis23)および Sulfolobus solfataricus2)）において一定の進展が見られるが、およそ発展途
上の初期段階にある。とりわけ好気性のグラム陽性菌については、Geobacillus 属細菌のプラスミド形質転換が早期から取り組まれてきたにも関わらず 11, 20, 35)、十分な遺伝子工学技術は未だ確立されていない（表 1）。そこで我々は、高温バイオプロセスに利用できる汎用的微生物として G. kaustophilus HTA426 に注目し、その遺伝子工学
技術の開発に取り組んだ。本好熱菌はバイオプロセス利用における様々な利点を兼ね備えており、その遺伝子工学技術は高温バイオプロセスの活用を拡大するうえで極めて有用と期待できる。次節に HTA426 株の諸特性とバイオプロセス利用における利点をまとめる。

5.

任意微生物の遺伝子工学技術を確立する
G. kaustophilus HTA426 の遺伝子工学技術を紹介する前に、微生物の遺伝子組換えを妨害する DNA 制限修飾系とその戦略的回避法について概説する。本手法はHTA426 株の遺伝子組換えを確立する際に利用したものである。
微生物の遺伝子組換えを達成するためには、以下 4 つの課題を解決しなくてはならない：i) 外来 DNA を如何にして細胞内に導入するか；プロトプラスト法、化学処
理法、電気穿孔法、接合伝達、超音波法など様々な手法が知られているが 1, 13)、しばしば試行錯誤が要求される。
ii) DNA 制限修飾系の障壁を如何にして突破するか；対象
微生物が DNA 制限修飾系を有する場合、外来 DNA が細胞内で切断される可能性がある。詳細については後述する。
iii) 細胞内で如何にして安定維持させるか；外来 DNA
が対象微生物の増殖過程において維持されなければならない。対象微生物中で機能するプラスミド複製起点を利用してプラスミド状態で維持させるか、相同組換えなどにより染色体に挿入するのが一般的である。
iv) 遺伝子組換え体を如何にして選別するか；薬剤耐性遺伝子などの選択マーカーを外来 DNA に含めておくのが一般的である。
上記 4 課題のうち、DNA 制限修飾系の障壁については
戦略的に突破できる。制限修飾系は、ファージなどの外来 DNA による侵略から自己遺伝情報を維持するために微生物が獲得した防衛システムで、最もよく知られる II
型制限修飾系は、DNA 分解酵素（制限酵素）と DNA 修
飾酵素（メチル化酵素）から構成される。制限酵素は外来 DNA を配列特異的に切断する役割を担い、メチル化
酵素は宿主 DNA を同認識配列中においてメチル化することで、制限酵素による切断から宿主 DNA を保護する役割を担う。マシナリーが異なるが、I 型および III 型制限修飾系についても機能は同様である。IV 型制限系は制限酵素のみから構成される。詳細なメカニズムは明らかではないが、一定の特異性をもって異種メチル化 DNAを切断する 7, 12, 15, 40)。つまり、いずれの制限修飾系も宿主
DNA と外来 DNA の区別を宿主特有の DNA メチル化に依存する。したがって対象微生物の DNA メチル化を人為的に模倣した外来 DNA は宿主 DNA と区別できない。
この原理を利用した高効率形質転換法が多くの微生物について報告されている（表 2）。我々は対象微生物の DNA
メチル化を模倣した DNA を host-mimicking DNA と呼んでいる 25)。Host-mimicking DNA の調製には、大腸菌内在性の遺伝子、対象微生物ゲノム配列中のメチル化酵素遺伝子、対象微生物中のメチル化を模倣できる異種遺伝子、市販のメチル化酵素、対象微生物の粗酵素抽出液、およ
びこれらの組み合わせが利用される（表 2）。対象微生物

4.

好熱性グラム陽性桿菌 G. kaustophilus HTA426
G. kaustophilus HTA426 はマリアナ海溝深海から単離された好熱性のグラム陽性桿菌で 28)、適度な高温条件下で好気的に生育する。生育可能温度は 42ºC から 74ºC、生育至適温度は60ºC、生育可能pHは4.5から8.0である26)。
生育速度が速く、例えば LB (Miller) 培地中での好気培養（60ºC）では、20 min 以下の倍化時間をもって増殖する（unpublished data）。3 w/v% NaCl 存在下で生育でき 26)、
我々の分析では 4 w/v% NaCl を含有する LB 培地中でも増殖した。その際の倍化時間は 40 min であった。海水の塩分濃度は 3.5 w/v%程度であるから、本好熱菌は海水を用いたバイオプロセスにも適用可能と考えられる。なお
5 w/v% NaCl を含有する LB 培地中では増殖しなかった。
HTA426 株は深海底から単離されたが、耐圧性は示さな
い 28)。興味深いことに、Geobacillus 属細菌は寒冷地を含む地球上の様々な場所から見出されている 17)。胞子形成能が低く、有害性も認められていない。栄養要求性は低
く、塩化アンモニウム、D-グルコース、および無機塩類から構成される最少培地中で増殖する。その一方で様々な有機物を炭素源にでき、ペントースも効率よく資化できる。1 w/v% 炭素源を含む最少培地中、60ºC で培養した場合の倍化時間（min ）は以下のとおりである（unpublished data）：D-グルコース，
120；D-ガラクトース，
120；myo-イノシトール，140；D-マンノース，90；L-ア
ラビノース，120；D-キシロース，60；セロビオース，120；
マルトース，180；スクロース，170；グリセロール，160；
エタノール，420；可溶性デンプン，80；カザミノ酸，20。
ゲノム配列 27)が公開されている点も大きな長所である。
染色体は約 3.5 Mbp で、プラスミド pHTA426（約 48 kbp）
も保有している。GC 含量は中庸（52.1 mol%）で、幅広い異種遺伝子の発現が期待できる。グラム陽性桿菌であることから、遺伝子工学技術を駆使することで異種タン
パク質を高度に分泌生産させられる可能性が高い。
Geobacillus 属は 2001 年に Bacillus 属から再分類された属で 21)、系統学的、生物学的、および遺伝学的に枯草菌
71

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)中の制限修飾系予測には、染色体 DNA 分解物の高速液
体クロマトグラフィー分析 8, 25)が簡便である。
高比率のメ
チル化塩基は強力な I-III 型制限修飾系の存在を示唆する。
この場合は、当該メチル化を施した host-mimicking DNA

を使用すべきである。メチル化塩基が低比率の場合はI-III 型制限修飾系は無視できるかもしれない。ただし IV
型制限系の存在は本手法で予測できないので、いずれの場合においても不必要なメチル化は避けるべきである。

表 2 Host-mimicking DNA を利用した微生物の遺伝子組換え。
In vivo メチル化
対象微生物
大腸菌内在性メチラーゼ 異種メチラーゼ
Bacillus cereus ATCC 14579
dam+，dcm+，hsd+
Bacillus weihenstephanensis DSM
dam+，dcm+，hsd+
11821
Bifidobacterium adolescentis ATCC
dam+，dcm+，hsdBAD_1233，BAD_1283
15703
Bifidobacterium longum MG1
dam+，dcm+，hsd+
Borrelia burgdorferi B31 A3
dam+，dcm+，hsdphage Ԅ3T I
Clostridium acetobutylicum ATCC 824 dam+，dcm+，hsd+
methyltransferase
Clostridium difficile
dam+，dcm+，hsdSau96I
Clostridium thermocellum
dam+，dcm+，hsd+
Helicobacter pylori
dam+，dcm+，hsd+
Streptomyces avermililis NRRL 8165
dam-，dcm-，hsdStreptomyces bambergiensis S712
dam-，dcm-，hsd+
Streptomyces griseus IFO 13350
dam-，dcm-，hsdSGR_4675，M. NaeI++
Streptomyces griseus NRRL B-2682
dam ，dcm ，hsd
Streptomyces natalensis ATCC 27448
dam-，dcm-，hsdThermoanaerobacter sp. X514
dam+，dcm+，hsd+
6.

G. kaustophilus HTA426 の遺伝子工学技術
HTA426 株のゲノム配列中 27)には数多くの制限修飾系
遺伝子が見出される（I 型：GK0343，GK0344，GK0346，
GK1380，GK1381，GK1382，GK2905；II 型：GKP08，
GKP09；III型：GK1416；IV型：GK1378，
GK1379，GK1390）。
HTA426 株の染色体 DNA 分解物を分析したところ、メチ
ル化デオキシアデノシンが見出された。その比率はデオ
キシアデノシンに対して 2.0 mol%以上であった。染色体
DNA の GC 含量が 52 mol%であることを考慮すると、本
結果はHTA426 株において1 kbp 当り10 ヶ所以上の高頻度で DNA がメチル化されていることを示す。これら全てのメチル化が HTA426 株において制限修飾に関わっているかは明らかでないが、HTA426 株の遺伝子組換えには host-mimicking DNA（第 5 節参照）を使用している。
当該 host-mimicking DNA は HTA426 株の I 型メチル化酵素遺伝子を発現する大腸菌 BR408（GK0343-GK0344，
GK1380-GK1381，dam+，dcm-，hsd-）を用いて生産する。
プラスミド pUCG18T の導入では、host-mimicking DNAの方が非メチル化DNAより105倍高い形質転換効率が得られた（以下参照）。
Geobacillus 属細菌への DNA 導入法としてはプロトプ
ラスト法および電気穿孔法が報告されているが 5, 11, 20, 30, 35)、
HTA426 株への DNA 導入には大腸菌 BR408 からの接合

In vitro メチル化

文献

粗酵素抽出液粗酵素抽出液9936

M.SssI，M.CviPI
M.SssI

粗酵素抽出液M. AluI，M. HpaII

37
4
18
22
32
6
15
40
25
12
7
13

伝達を利用している。電気穿孔法による DNA 導入も検討したが、今までのところ成功していない。接合伝達では、DNA 供与体と受容体が物理的に接触した上で、DNA供与体が有する oriT 含有 DNA が、DNA 受容体へ伝達される。上述した大腸菌 BR408 は接合伝達プラスミド
pUB307 を有しており、接合伝達に必須な接合伝達因子を発現する。操作過程の概略を以下にまとめる：i) まず
oriT 含有プラスミドを大腸菌 BR408 に導入する。ii) 得られた大腸菌を培養し、HTA426 株培養液と混合する。iii)
フィルターろ過もしくは遠心分離により細胞同士を密着させ、37ºC で数時間静置する。iv) 処理した細胞を回収し、適切な選択培地に塗布する。v) 高温培養により、
HTA426 株の形質転換体を得る。このように実際の操作過程は極めて単純で，再現性も高い．また接合伝達によるDNA 導入ではDNA 供与体とDNA 受容体の区別がしばしば困難となるが、HTA426 株への接合伝達では高温培養するだけで DNA 供与体（大腸菌）を除去できる。
スケールアップが容易な点も接合伝達の長所と言えよう。
本研究結果は、接合伝達が好熱性微生物への実用的なDNA 導入法の 1 つであることを示している。
自 律 複 製 プ ラ ス ミ ド と し て は 、 既 報 の E.
coli-Geobacillus シャトルプラスミド pUCG1830)および
pSTE3320)に接合伝達起点oriTを各々導入したプラスミド
72

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)pUCG18T および pSTE33T が利用できる（図 1a，b）。

伝子が消失した株を正選択によって効率よく選別できる（カウンター選択；図 2b）。

図 1 G. kaustophilus HTA426 の遺伝子組換えに利用できる
プラスミド pUCG18T (a)、pSTE33T (b)、および pGAM46(c)。
pUCG18T および pSTE33T は、各々pUCG1830)および
pSTE3320)に oriT を導入することで作製した。各略号の意
味は以下のとおりである：AmpR，アンピシリン耐性遺伝
子；KmR，耐熱性 kanamycin nucleotidyltransferase をコー
ドするカナマイシン耐性遺伝子 TK101；pyrF，HTA426
株由来 pyrF 遺伝子；pUC ori.，pUC 由来複製起点；pSTK1
ori.，pSTK1 由来複製起点；pBST1 ori.，pBST1 由来複製
起点；oriT，接合伝達起点；MCS，マルチクローニング
サイト；GK0707'，GK0707 上流領域；’GK0707，GK0707
下流領域。

図 2 ΔpyrF/pyrF 宿主マーカーシステムを利用したカウンター選択の一般模式図。
（a）PyrE および PyrF はオロチン酸からウリジン-モノリ
ン酸（UMP）への変換を触媒する酵素群で、ピリミジン
系化合物の生合成に必須であることが、様々な微生物において知られている。一般に PyrE および PyrF は、FOAを細胞毒性化合物フルオロウリジン- モノリン酸（Fluoro-UMP）に変換する反応も触媒する。（b）
ΔpyrF/pyrF 宿主マーカーシステムにおける陽性クローンの選別方法。pyrF 遺伝子破壊株（ΔpyrF）は UMP 生合成
能を欠失しているため、ウラシル非含有最少培地で生育できないが、pyrF マーカーが導入されたクローン（ΔpyrF[pyrF]）はウラシル非含有最少培地で生育できる。本クローンは FOA を細胞毒性化合物に代謝するためウラシル/FOA 含有最少培地で生育できないが、pyrF マーカーが消失したクローンはウラシル/FOA 含有最少培地で生育できる。

pUCG18T はコピー数が低いものの形質転換効率が高い（10-3 recipient-1）。DNA 供与体および DNA 受容体の培養液を各々5 mL ずつ混合してpUCG18T を接合伝達させた
場合、104‐105 程度の形質転換体が得られる。スケール
アップにより 107 程度の形質転換体が容易に得られると考えられ、
pUCG18T はライブラリー構築などに有用と期待できる。一方、pSTE33T は形質転換効率が低いという欠点をもつが（10-7 recipient-1）、コピー数が高く、異種遺伝子の高発現に利用できると考えられる。
様々な微生物においてオロチン酸からウリジン-モノ
リン酸への生合成は PyrE および PyrF によって触媒される 31)（図 2a）。本経路はウラシルなどのピリミジン系化
合物生合成に必須で、pyrF 遺伝子破壊株はウラシル要求性を示すことから、pyrF 遺伝子は pyrF 遺伝子破壊株において選択マーカーとして利用できる。重要なことに、
PyrEF は 5-フルオロオロチン酸（FOA）を細胞毒性化合物フルオロウリジン-モノリン酸に変換する（図 2a）。これを利用すると、pyrF 遺伝子を有する株中から pyrF 遺このような選択マーカーをカウンター選択マーカーとよぶ。pyrF 遺伝子と pyrF 遺伝子破壊株を利用したカウンター選択システムは T. thermophilus や T. kodakarensis においても利用されている 3, 23)。相同組換えを利用してHTA426 株の pyrF 遺伝子（GK1155）を破壊したところ、73

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)得られた遺伝子破壊株 MK54 はウラシル要求性で、その相補株はウラシル非要求性であった（図 3）。

図 4 G. kaustophilus HTA426 における異種遺伝子の発現。
（a）pGAM46 を利用した GK0707 locus への遺伝子挿入
模式図。（b）G. kaustophilus ATCC 8005 由来耐熱性（+ bgaB）
β-galactosidaseの遺伝子bgaB10)を挿入した変異株
ならびに G. stearothermophilus ATCC 12980 由来耐熱性
α-amylase の遺伝子 amyE19)を挿入した変異株（+ amyE）の表現型を解析した。親株と各変異株は 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド（X-gal）もしくは可溶性デンプンを含有する LB 培地上で培養した。デ
ンプンの分解はヨウ素-ヨウ化カリウム溶液を用いて検出した。

図 3 G. kaustophilus HTA426（野生株）、ΔpyrF 株
（MK54）、
MK54 の pyrF 相補株（MK54 [pyrF]）、ΔpyrF/ΔpyrR 株（MK72）、および MK72 の pyrF 相補株（MK72 [pyrF]）のウラシル要求性ならびに FOA 感受性。野生株およびMK54 [pyrF]はウラシル存在下で FOA 耐性を示すが、MK72 [pyrF]株はウラシル存在下においても FOA 感受性を示し、カウンター選択が可能である。なお、いずれの株もウラシル非存在下では FOA 感受性を示す。
本結果は、pyrF 遺伝子が MK54 株中で選択マーカーとして利用できることを示す。しかしながら本相補株はウラシル存在下で FOA に耐性を示し、
pyrF 遺伝子はMK54
株中でカウンター選択マーカーとしては利用できなかった（図 3）。そこで枯草菌において pyr 遺伝子群の発現を負に制御している PyrR31)のホモログ遺伝子（GK1147）を破壊したところ、得られた MK72 株はウラシル要求性な
らびに FOA 耐性を、その pyrF 相補株はウラシル非要求性ならびに FOA 感受性を示した（図 3）。MK72 株において pyrF 遺伝子はカウンター選択マーカーとして使用でき、多重遺伝子破壊や複数遺伝子の染色体挿入などに活用している。
異種遺伝子の機能的発現も可能である。pyrF 遺伝子をカウンター選択マーカーとするGK0707 locus インテグレ
ーションベクターpGAM46（図 1c）を構築し、これを利用して耐熱性 β-galactosidase 遺伝子 10)や耐熱性 α-amylase
遺伝子 19)をMK72株のGK0707 locusに挿入した（図4a）。
いずれの遺伝子もシグマプロモーターの制御下において効率よく発現し、
amyE 遺伝子の発現産物は細胞外に分泌生産された（図 4b）。

以上の結果は、HTA426 株において様々な異種タンパ
ク質を細胞内もしくは細胞外に高生産できる可能性を示唆している。高発現プロモーターとしては、推定マルトース代謝遺伝子群上流の内在性 gk704 プロモーターが利用できる。本プロモーターは、bgaB レポーター遺伝子を用いたスクリーニングによって見出されたもので、マルトース存在下でとりわけ高発現し、キシロース存在下では発現が抑制される。両条件における bgaB 発現レベルには 100 倍程度の差がある。pGAM46 や gk704 プロモー
ターは異種耐熱性酵素遺伝子の発現に広く利用できると期待している。
7.

今後の展望
G. kaustophilus HTA426 は、好熱性微生物に関する研究の 1 素材として、十分な魅力をもっている。例えば、本好熱菌のタンパク質分泌能は高温バイオマス分解などに活用できるはずである。高い導入効率を示すプラスミド
pUCG18T と高発現プロモーターを利用すれば、環境
DNA などに由来する有用耐熱性酵素遺伝子を効率よくスクリーニングできるだろう。さらには好熱性微生物に特有な代謝物の解析もしくは産生に利用できるかもしれない。我々の知る限り、G. kaustophilus HTA426 は、i) グ
ラム陽性細菌で、ii) 好気性で、iii) ゲノム配列が公開されており、iv) 十分な遺伝子工学技術が確立している、唯一の好熱性微生物である（表 2 参照）。これら要素とHTA426 株の特性を活かしながら、応用研究に固執することなく、今後は幅広い研究を展開していきたい。
74

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謝辞
本研究の推進にあたり厚い支援を頂きました神戸大学
大学院農学研究科の吉田健一 教授に感謝申し上げます。
またプラスミド pSTE33 を分与して頂きました日本原子力研究開発機構の鳴海一成 博士ならびに pUCG18 を分
与して頂きました Imperial College London の David J. Leak
教授に厚く御礼申し上げます。なお本研究成果は、科学技術振興調整費（先端融合領域イノベーション創出拠点の形成プログラム）および科学研究費補助金（#22310130）の助成を受けて得られたものである。
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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)MINI REVIEWJournal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10, 77-82

Suzuki Y.

Challenges to Explore the Terrestrial Subsurface Biosphere in Japan
我が国の陸域地下微生物生態系の解明に向けた取り組み
東京大学理学系研究科地球惑星科学専攻
鈴木庸平
Department of Earth and Planetary Science, Graduate School of Science, The University of Tokyo, 7-3-1 Hongo,
Bunkyo-ku, Tokyo 113-0013, Japan.
Corresponding author: Yohey Suzuki,
FAX:
Received: Nobember 6, 2011 / Accepted: December 16, 2011
Keywords: subsurface microbiology, molecular phylogeny, aseptic drilling, underground research laboratory, deep
biosphere
キーワード：地下微生物学、分子系統学、無菌掘削、地下研究施設、地下生命圏
1. はじめに大陸縁辺のプレート収束帯に位置する日本列島は、火山フロントに代表されるダイナミックな地質特性を有し、その骨格は火成岩、変成岩、堆積岩の幅広い岩石から構成される。地下深部に賦存する流体も、
海水または天水を主な起源として、様々な温度・圧力条件下での岩石−水反応により変質する。安定大陸とは異なる我が国の多様な陸域地下環境を対象に調査が行われたが、先行研究の多くが燃料や鉱物資源関連施設を用いたものであった。燃料資源として
新潟県中条ガス田と千葉県茂原ガス田 11-13)、静岡県
相良油田 17)と秋田県八橋油田 9)、北海道夕張炭坑 19)および岩手県久慈市の地下石油備蓄基地 22)において研究が行われてきた（図 1）。鉱物資源として、鹿児
島県菱刈金鉱山 2, 4)、岐阜県東濃ウラン鉱山 10, 14, 15)、岩手県釜石鉱山 5)および新潟県豊羽鉱山 16)で調査が行われた。上記に加えて、深層温泉水を用いた静岡県島田市での研究事例も知られる 7)。
上記の物質濃集や熱源および過去 100 万年以降の火山・断層活動を伴わない深部地質環境を対象とした調査が、放射性廃棄物の地層処分を想定して行われてきた。現在、国内二カ所で地下研究施設が建設中で、北海道幌延深地層研究所は日本海側平野部で一般的な第三紀堆積岩を対象としており 6, 8, 18)、岐阜県瑞浪超深地層研究所は日本列島に広く分布する花崗岩を対象としている 1)。地下深部で生命活動を制約する代謝物質の濃度や岩盤中の割れ目・空隙構
77

造および地下水流動等の物理化学因子の詳細な計測結果から、地下微生物の生態が解き明かされつつある。本ミニレビューでは、国内における陸域地下微生物生態系の先行研究を紹介すると共に、地表からの掘削で地下微生物生態系の人為的擾乱を最小限にするため、フィルター滅菌と脱酸素処理した掘削流体を用いた新しい掘削手法について紹介する 20, 21)。
また、高レベル放射性廃棄物の地層処分を想定した
国内の地下研究施設における微生物調査について紹介する。

図 1. 地表に露出する地層毎に色分けされた地図（地質図）と地下微生物研究が行われた地点。地質図は独立行政法人産業技術総合研究所地質調査センター
作成のシームレス地質図（商標登録番号：第 5435691）
を基に作成した。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)2. 国内での研究事例
国内で陸域の地下微生物を対象に調査が実施された地点を図 1 に示す。日本列島には小規模ながら油ガス田が点在して、深度 1,000 メートル級の生産井から採取した油層水や地下水中に棲息する微生物の研究が行われている。油徴やガスの濃集は、海底で堆積した泥が固結した際にトラップされた海水が、陸化後も降水起源の淡水でフラッシュされない閉鎖的な若い地層中で多く見られる。微生物研究が行われた新潟県の中条町と千葉県茂原市のガス田にも化
石海水にメタンガスが多量に溶けており、中条ガス
田は深度 700−800 メートルで地下水温度は 53°C と高温で、全菌数も 2.5×105 cells/ml と高いのに対し、茂原の地下水は深度 600−1,100 メートルであるが、地下水温度は 27°C と低く、全菌数も 102 cells/ml と低い 12, 13)。16S rRNA 遺伝子を用いた微生物相の解
析では、中条の地下水は Deferribacter 属の細菌が、古細菌は Methanothermobacter 属の細菌が優占していた 13)。茂原の地下水では、細菌の群集組成は明らかではないが、古細菌は Methanobacterium 属の優占と共に、多様なメタン生成古細菌（Methanocalculus
属 、 Methanococcus 属 、 Methanosaeta 属 、Methanosarcina 属、Methanolobus 属）が検出されている 12)。八橋の油層水は、地上採取時の温度は 30°Cであるが、40〜82°C と推定される 1,300〜1,430 メー
トルの地下深部を反映して、Methanocalculus 属とMethanothermobacter 属の古細菌が優占し、中条と茂原の特徴を兼ね備えている 9)。一方、細菌は Fimicutes
門 の 栄 養 共 生 Syntrophomonas 属 、 酢 酸 生 成
Thermacetogenium 属、硫酸還元 Desulfonispora 属が主要であった 9)。夕張炭坑の深度 890 メートルの石炭層から採取した化石海水中は、28°C で 3×105
cells/ml の 微 生 物 細 胞 を 含 み 、 古 細 菌 はMethanocalculus 属 、 Methanobacterium 属 、Methanolobus 属が、細菌は δ-Proteobacteria 綱の栄養共生 Syntrophus 属と硫酸還元細菌および Fimicutes
門の酢酸生成 Acetobacterium 属の優占が見られた 19)。
また、直接生産井から採取した訳ではないが、北海道幌延町と静岡県島田市は、それぞれ豊富ガス田と静岡ガス田に近接し、深部地下水中には上述のガス田と類似した微生物が棲息すると考えられる。幌
延深地層研究所周辺の深度 625 メートルの 35°C の化石海水には 3.2×105 cells/ml の細胞が含まれ、Methanocalculus 属の古細菌と δ-Proteobacteria 綱の硫酸 還 元 細 菌 、 お よ び Firmicutes 門 の 未 知 の 細 菌(Accession No.: AB237726)が優占していた 18)。このFirmicutes 門の未知の細菌は、硫酸還元、酢酸生成
または栄養共生のいずれかの役割を果たすと推測される。深度 1,200-1,500 メートルからくみ上げる
40−44°C の島田の温泉水は、化石海水成分は薄いが(海水の 1/10 から 1/100 程度の塩分)、化石海水レベ
78

ルの微生物細胞（8.0×104 cells/ml）を含み、古細菌
は Methanobacterium 属と Methanothermobacter 属、
細 菌 は Nitrospira 門 の 好 熱 性 硫 酸 還 元
Thermodesulfovibrio 属と Fimicutes 門の硫酸還元細菌
Desulfotomaculum 属の細菌に比較的相同な細菌が優占した 7)。また、岩手県久慈市の地下石油備蓄基地
は石油を帯水層に注入した地下空洞中で、
δ-Proteobacteria 綱の硫酸還元細菌と Fimicutes 門の酢
酸生成 Acetobacterium 属が主要になっており 22)、石油や天然ガスに代表される炭化水素が濃集する地下深部には、メタン生成古細菌、Fimicutes 門またはδ-Proteobacteria 綱の栄養共生、硫酸還元または酢酸生成細菌が重要な地下微生物であると特徴付けられる。
燃料資源施設は堆積岩が母岩であったが、国内の金属鉱山を用いた地下微生物研究は結晶質岩（高温で生成した火成岩や変成岩等）の事例も多い。2000
年に地下微生物群集について報告がなされた岩手県
釜石鉱山は、閃緑岩または花崗閃緑岩を母岩とする
金・銀・銅・鉛・亜鉛の鉱山で、深度 300-800 メー
トルで 11-15°C の地下水を対象に調査が行われた 5)。
全菌数は 0.2−1.5×105 cells/ml、Firmicutes 門の硫酸還元 Desulfotomaculum 属の細菌が優占する。インジウ
ムの品位が世界位一であった北海道豊羽鉱山（2006年閉山）の深度 500−550 メートルの坑道から採取された 48−71°C の地下水中には、Aquificales 門の水素
酸化 Sulfurihydrogenobium 属、Firmicutes 門の硫酸還元 Desulfotomaculum 属と栄養共生 Syntrophothermus
属が優占する 16)。世界一の品位を誇る鹿児島県菱刈
金山の深度 320 メートル、温度 71°C の地下水には
Aquificales 門の Sulfurihydrogenobium 属が主要であり、火山砕屑物から成る凝灰岩を母岩とする豊羽鉱山と、低温高圧変成した泥岩を母岩とする菱刈鉱山の間でも共通点が見られたのは興味深い 2, 4)。
3. 新たな地下微生物調査手法の開発
上述の研究事例は全て地下水または油層水といった液体中の微生物に関する調査であったが、地下環境を構成するのは岩石であり、岩石中の微生物を調べる際には掘削コアを用いる。地下深部の岩石の大部分は固結して、微生物の棲息は割目や空隙に限られる。掘削コアを取得するには、ドリルビットを回転させ岩を削る必要があるが、その際にカッティン
グス(削りカス)の除去と摩擦熱による温度上昇を防ぐために、掘削流体を注入しながら掘進する。仮に掘削流体中で繁殖する微生物が、岩石中で土着な微生物が棲息する割目や空隙に侵入したら、存在量の少ない地下微生物のシグナルは消えてしまう。従来の掘削コアを用いた微生物研究は、最も重要な地下
微生物の棲息場を汚染するリスクを伴う。
この技術的な問題を解決するためには、掘削流体

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)自体を滅菌し、加えて酸素を取り除くことにより地下環境の擾乱を防ぎ、微生物汚染も低減する必要がある。北関東那須烏山市の固結した堆積岩を対象に、浅層地下水をクロスフロー方式の限外濾過膜でフィルター滅菌し、その後真空引きと窒素ガスパージを繰り返し、溶存酸素濃度を 0.2 mg/L 以下に低減させた掘削流体を用いてコアを取得した 20, 21)。対象とした栃木県那須烏山市の堆積岩には粗粒の凝灰岩質砂岩が厚さ 10 メートルの層として含まれる（図 2 左の柱状図の灰色部）。この凝灰岩質砂岩に掘削流体は容易に侵入したが、微生物による汚染は定量 PCR や顕微鏡による菌数カウントで検出されず、従来法では汚染なしで採取が不可能であった空隙の多い岩相のコアを微生物調査用に回収できた（図 2 真中）。また、
シルト岩とシルト質砂岩を掘進中に、掘削流体中で微生物の繁殖が見られた。繁殖した微生物はPseudomonas 属と Flavobacterium 属が主要で、これらの微生物が岩石中に元々存在する可能性はあるが、明らかに有機物と硝酸を含む浅層地下水由来の掘削
流体中で増殖したと考えられる 20)。
掘削コア中の微生物群集を明らかにするために、コアからの DNA 抽出を試みたが、市販 DNA 抽出キット（例えば MoBio 社 Soil DNA キットや日本ジー

ン社 ISOIL キット）では失敗に終わった。日本の堆積岩はシリカの殻を持つ珪藻を多く含み、シリカ鉱
物が DNA を吸着・結合して抽出を困難にしていると考えられた。そこで、シリカ鉱物を溶かして DNAを抽出するアルカリ加熱法を新規に開発してコアからの DNA 抽出に成功した 8)。そこで明らかになった
微生物群集組成として、Pseudomonas 属に加えて
β-Proteobacteria 綱 の 金 属 耐 生 Cupriavidus
metallidurans に近縁な種が優占することが判明し 8)、
Pseudomonas 属は掘削流体中で比較的増殖速度が速いと裏付けられた。
従来の掘削法で取得したコアを用いた微生物研究として相良油田（深度 200 メートル）の事例が報告されている 17)。特に油層のコア試料からは、培養と培養に依存しない群集構造解析の結果、
Pseudomonas 属の優占が報告されている。また、幌延深地層研究所周辺の化石海水と淡水の地下水が混
じ り 合 う 深 度 281−312 メ ー ト ル の 地 下 水 中 で
Pseudomonas 属 の 優 占 が 報 告 さ れ て い る 6) 。
Pseudomonas 属が本当に優占する地下微生物なのか、掘削の影響で増殖したのか、後者の可能性も踏まえて、今後の掘削調査では注意深く試料およびデータを取得する必要性がある。

図 2. 北関東堆積岩を対象とした無菌掘削の掘削流体評価 20)。定量 PCR と全菌数測定により掘削流体で汚染された凝灰岩質砂岩（ピンクで囲まれた）は微生物汚染が検出されなかった。一方掘削流体中で繁殖したのは Pseudomonas 属と Flavobacterium 属であった。
4. 地下研究施設における微生物研究
日本原子力研究開発機構が岐阜県瑞浪市に建設中の地下研究施設は、中生代白亜紀の基盤花崗岩に主立坑と換気立坑および両立坑間を 100 メートル間隔で連結する水平坑道等の坑道群から成る（図 3）。微79

生物調査における一連の工程は、坑道から水平ボーリング孔の掘削によりコアを採取した後、孔径・孔曲検層、ボアホールテレビューアー(BTV)計測（ボーリング孔壁のテレビカメラ観察による割れ目頻度
測定）、湧水地点を明らかにするための電磁フロー検

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)層、透水性や間隙水圧および湧水量を測定するための水理試験を実施する。その後、各湧水地点を仕切るパッカーを多段で挿入し、各パッカー区間からチュービングを介して、地下水採取と間隙水圧・温度・
pH・Eh・電気伝導度のモニタリングを行う。通常１週間程度地下水を排水して孔内のパッカー区間の洗浄を行い、微生物のサンプリングを開始する。深度200 メートルの水平ボーリング孔は 2007 年、深度 300
メートルは 2009 年および深度 400 メートルは 2010
年から観測を開始した。半年から１年の頻度で全菌数と 16S rRNA 遺伝子配列による群集構造解析および fluorescence in-situ hybridization(FISH)用試料のサンプリングを行い、掘削直後からの経時変化を追跡している。生物地球化学分析として溶存ガスの定量と安定同位体組成分析、有機酸や腐植物質濃度を基
本水質と合わせて測定している。
これまでの調査により、透水性は k: 10-5 〜10-8 m/s（深度 200 メートル）、k: 10-5〜10-7 m/s（深度 300 メートル南側）、k: 10-9〜10-11 m/s（深度 300 メートル北側）と、ボーリング孔の掘削箇所により明確な違いとして観測された。生物地球化学特性も高透水性の地下水中では、従属栄養硫酸還元微生物の活動により、硫化水素と無機炭素（主に二酸化炭素と炭酸水素イオン）の濃度増加が顕著なのに対し、低透水性の地下水中では硫酸塩イオンの枯渇、酢酸イオンと水素分子の蓄積と無機炭素濃度の減少、および炭素安定同位体組成の正側へのシフトを伴う微生物の
二酸化炭素還元による酢酸生成と調和的なプロファ

イルが得られている。また表層の光合成由来と考えられる腐植物質も、深度 300 メートルの低透水性領域では高感度な分光学的手法による検出限界付近であり、鉱物溶解や地下深部からのガスの拡散等のフラックスの小さなエネルギー源に依存する生態系が形成されている可能性が高い。25°C 付近の地下水の全菌数は 103 cells/ml 後半から 105 cells/ml 前半の範囲内であり、 掘削後に増加した後、減少して安定する傾向が見られる。高透水性の地下水中では、ボーリ
ング孔掘削直後に好気性のアンモニア酸化
Nitrosomonas 属やメタン酸化 Methlomonas 属が増殖するのに対し、低透水性の地下水中では水素酸化
Hydrogenophaga 属から鉄酸化細菌 Siderooxydans 属への優占種のシフトが見られる。観測を開始して 4年目の深度 200 メートルのボーリング孔では、2009年以降で Nitrospira 門、Chlorobi 門、candidate division
OP11 等の環境クローンや培養株と相同性の高い細菌が優占することが DNA による群集構造解析から示されており、掘削の影響から回復して土着な微生物群集に回復している可能性がある。
また、瑞浪超深地層研究所に近接する東濃ウラン鉱山を用いた研究では、深度 100−180 メートルの堆積岩と花崗岩から採取した地下水（17.2−20.1°C）は、全菌数が 0.8 から 8.4×106 cells/ml と高く 14, 15)、優占するのはβ-Proteobacteria 綱の Rhodocyclaceae 科の細菌であった 10)。掘削後 2 年後のサンプリングであるため、掘削の影響が残っている可能性が考えられる。

図 3. 日本原子力研究開発機構瑞浪超深地層研究所。主立坑と換気立坑を覆う櫓（左）、深さ 500 メートルまで延びる主立坑（真中）、主立坑乗降するリフト（右）。
5. 今後の展望
これまでの研究により、陸域地下環境にも海底下生命圏と同様に、分子系統学的研究により多様な未知微生物が棲息することが明らかになった 3)。16S
rRNA 遺伝子の配列の相同性が著しく低いため、近縁な環境クローンや培養株からの生理学的特性の推定は不可能な現状である。培養法により生育条件を明らかにする取り組みも必要であるが、地下微生物の多くは難培養性であることが予測される。従って、メタゲノミクス、プロテオミクスやメタボローム解析等を通じて、生理学的特性や地下環境への適応機
80

構を解明する必要がある。また、燃料資源の生成・分解、鉱物資源の沈殿・溶解反応、放射性核種の物
質移行への地下微生物の影響について、陸上では坑道等を通じて地下に直接アクセスできる利点を活かして、現場実験により地下の温度・圧力や代謝物質のフラックス等の条件を反映した測定を実施できる。
プレートの沈み込みを伴う我が国の多様な地下環境は地球科学のみならず、生命科学においても広大な
フロンティアであることは間違いのない事実である。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)[謝辞]
本研究は独立行政法人日本原子力研究開発機構瑞浪
超深地層研究所との共同研究および原子力安全保安院または独立行政法人原子力安全基盤機構からの委託事業として産業技術総合研究所深部地質環境コアにて実施された。
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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)ORIGINAL PAPER
NOTE

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10, 83-89

Hamana Ka, Hayashi Ha, Niitsu Mb,
Sugata Db, Higuchi Kb and Itoh Tc

Cellular distribution of unusual long linear and branched polyamines within the
newly validated thermophiles belonging to the bacterial orders
Thermoanaerobacterales and Clostridiales-Polyamine catalogues of bacterial (eubacterial) and archaeal (archaebacterial)
extremophiles ⅥaFaculty of Engineering, Maebashi Institute of Technology, Maebashi, Gunma 371-0816, Japan.
Faculty of Pharmaceutical Sciences, Josai University, Sakado, Saitama 350-0290, Japan.
cJapan Collection of Microorganisms, RIKEN, BioResource Center,Wako, Saitama 351-0198, Japan.
bCorresponding author: Koei Hamana, koeihamana@gmail.com
Phone: +81-27-234-4611, Fax: +81-27-234-4611
Received: November 8, 2011 / Accepted: December 6, 2011
Abstract
Acid-extracted cellular polyamines from some newly
validated bacterial thermophiles were analyzed by HPLC,GC and GC-MS. A quaternary branched penta-amine,
N4-bis(aminopropyl)spermidine, was found in six
Thermoanaerobacter species, grown at 60-65℃. A novel
tertiary branched penta-amine, N4- aminopropylspermine
and a linear penta-amine, thermopentamine, weredetected in T. italicus. In four Caldicellulosiruptor
species, grown at 70℃, N4-bis(aminopropyl)spermidine,N4-bis(aminopropyl)norspermidine and thermopentamine
were ubiquitously distributed and caldopentamine,homocaldopentamine and N4-aminopropylspermine were
sporadically found.
N4-bis(aminopropyl)spermidine
spread in Fervidicola, Thermovorax and Ammonifex
species grown at 70℃ but not in Tepidanaerobacter
species grown at 37-50℃, belonging to the order
Thermoanaerobacterales. Terrestrial Thermaerobactercompost grown at 70℃ contained caldopentamie andcaldohexamine, whereas marine Thermaerobacter
species, T. litoralis, T. marianensis and T. nagasakiensis,
grown
at
70℃,
contained
thermopentamine,homocaldopentamine, thermohexamine and homocaldohexamine, suggesting that their long polyamine
profiles depend on a salt environment as well as growthtemperature. Penta-amines and hexa-amines were notfound in Thermotalea, Tepidimicrobium, Fervidicella,
83

Caldinitratiruptor and Caloramator species belonging tothe order Clostridiales, grown at 50-70℃.
Key words: Clostridiales, hexa-amine, penta-amine,polyamine, Thermoanaerobacterales, thermophile
Using the combination of high-performance liquid
chromatography (HPLC) and gas chromatography (GC)developed in our laboratory, the chemotaxonomic andphylogenetic significance of the cellular distribution
profile of long linear and branched polyamines within
extremophiles belonging to the domains Bacteria andArchaea, has been proposed 2, 4-11, 13, 16). The occurrenceof the high basic long and branched polyamines in thethermophiles is possibly associated with their
thermophily and salt-tolerance to stabilize cellular
nucleic acids and other acidic cellular components underhigh thermal environments but not relevant to their
acidic and alkaline growth conditions 7-10).
In the thermophilic, anaerobic genus Thermoanaerobacter, grown at 60-65 ℃ , of the order Thermoanaerobacteriales of the bacterial phylum Firmicutes, aquaternary branched penta-amine, N4-bis(aminopropyl)
spermidine (3(3)(3)4) (abbreviation for the number ofmethylene CH2 chain units between HH2, NH, N or N+)
2,8,11), has been found by HPLC, GC and GC-mass
spectrometry (GC-MS) 4, 5, 16). Another quaternary

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)branched
penta-amine,
N4-bis(aminopropyl)
norspermidine (3(3)(3)3) in addition to 3(3)(3)4 wasfound in Caldicellulosiruptor species, grown at 70℃, of
the order 4, 13). The occurrence of 3(3)(3)4 was alsosuggested in the thermophilic, aerobic genus
Thermaerobacter, grown at 70 ℃ , of the order
Clostridiales of the phylum Firmicutes by HPLC
analysis without GC and GC-MS analyses 10, 13, 16).
During the additional research on long and branchedpolyamines possibly related to their growth hot
environments, polyamines of three new Thermoanaerobacter species, a new Caldicellulosiruptor species
and five newly validated thermophilic anaerobes
belonging to the order Thermoanaerobacteriales, and a
newly validated terrestrial species in addition to threemarine species of Thermaerobacter, and five newly
validated thermophiles belonging to the order
Clostridiales, were analyzed by HPLC, GC, and GC-MS
in detail.
Bacterial strains were provided by JCM of the RIKEN
BRC through the National Bio-Resource Project of the
MEXT, Japan and NBRC of Biotechnology Center,
National Institute of Technology and Evaluation, Japanand were cultivated in the aerobic or anaerobic culture
media designated by JCM or NBRC, at the temperatureand pH, listed in Table 1. Cells in the stationary phasewere harvested and homogenized in equal volumes ofcold 1.0M perchloric acid (PCA). The PCA-extract
was subjected to a Dowex 50W column to concentratepolyamines 3, 14). The concentrated polyamines wereanalyzed by HPLC on a Hitachi L6000 using a columnof cation-exchange resin, Hitachi 2619F (4mmI.D. x50mm) at 70 ℃ and determined by post-labeledfluorometry after heating with o-phthalaldehyde 3, 14).
The concentrated polyamine fraction was further purified
on a column of Whatman CM23 14). GC on a
SHIMADZU GC-14A equipped with a packed column of
3% SE-30 Chromosorb WHP (3mmI.D. x 2.1m)(GL
Sciences) and/or SHIMADZU GC-17A equipped with acapillary column of Inert Cap1MS (0.35mmI.D. x 30m)
(GL Sciences), and GC-MS on a JEOL JMS-700
equipped with a capillary column of Inert Cap1MS(0.35mmI.D. x 30m) were performed after
heptafluorobutyrization of the purified polyamine
samples 12, 20). Heptafluorobutyryl derivatives of thepolyamines were determined by a flame ionization
detector. Diaminopropane (3), putrescine (4), cadaverine(5), norspermidine (33), spermidine (34), norspermine(333), spermine (343) and agmatine (Agm) purchasedfrom Sigma (St. Louis, USA) or Eastman Kodak(Rochester, USA), and homospermidine (44),84thermospermine (334), aminopropylhomospermidine(344), canavalmine (434), caldopentamine (3333),
homocaldopentamine (3334), thermopentamine (3343),
caldohexamine (33333), homocaldohexamine (33334),
thermohexamine(33343),
homothermohexamine
4(33433),N -aminopropylnorspermidine(3(3)3),N4-aminopropylspermidine (3(3)4), 3(3)(3)3 and3(3)(3)4 synthesized in our laboratory 20), were used as
the standard for identification and determination ofpolyamine peaks on HPLC and GC chromatograms andmass spectra in GC-MS. It has been known that
3(3)(3)3 is converted to 3(3)3, and 3(3)(3)4 is converted
to 3(3)3 and 3(3)4 at a ratio of 3:1, and agmatine isdestroyed during a GC analysis after heptafluorobutyrization12).
Authentic
N4-aminopropylspermine(3(3)43) was not available and a peak corresponding to
the penta-amine found on the GC chromatogram was
identified by its mass spectrum by GC-MS. Molar
concentration of cellular polyamines per gram of wet cellpellet, estimated from the HPLC and GC analyses, areshown in Table 1 and compared with our previous data ofrelated thermophiles.
The order Thermoanaerobacterales
Sixteen species of moderately thermophilic Thermoanaerobacter, isolated from terrestrial thermal
environments such as hot spring, oil well and compost,
are listed in the NCBI Taxonomy browser (NCBI website,2011). The four Thermoanaerobacter species, available
in the present study, were cultivated in the media JCM
No. 825, JCM No. 826 or JCM No. 112, pH 7.0,
consisting of similar medium components in the absenceof NaCl. Thermoanaerobacter sp. JCM 7503 is closely
related to T. mathranii subsp. mathranii with a 99.6%
16S rRNA gene sequence similarity (JCM Strain
Catalogue, 2011). In addition to the significant amountof 3(3)(3)4, a novel tertiary branched penta-amine,
3(3)43 and a linear penta-amine, 3343 were found in T.
italicus grown at 65℃ in the present study (Figs. 1 and
2). The coexistence of the three types of penta-amines
found in T. italicus is a unique cellular polyamine profile.
Quaternary branched penta-amine levels were low in thestrains grown at 60℃ of its optimum, within the total 11
strains (9 species) previously and newly analyzed, as
shown in Table 1.
In T. acetoethylicus and T.
thermohydrosulfuricus, grown at 60 ℃ , the samepolyamine profiles have been obtained previously in thetwo cultures cultivated in the different media ATCC
No.1118 and ATCC No.1135 (b-1 and b-2 in Table 1) 5).
The previous and present polyamine profiles ofThermoanaerobacter species were not affected bydifferent media compositions. These findings indicate

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)that the occurrence of penta-amines relate to theirhigh-thermal growth conditions. Temperature- dependent
distribution of 3(3)(3)4 has been observed inFig. 1. HPLC chromatogram of the concentrated
polyamine fraction from Thermoanaerobacter
italicus JCM 16815 grown at 65℃ (A) and
Thermaerobacter compost JCM 15650 grown at
70℃ (B). Arrows indicate the elution positionof authentic 3333, 3334 and 3343. Position of
3(3)43 was estimated.
Abbreviations forpolyamines are given in Table 1.

Caldanaerobacter subterraneus, grown at 55-75℃16), as
cited in Table 1.

Fig. 2. GC chromatogram of the purified polyamine
fraction from Thermoanaerobacter italicus JCM 16815
grown at 65℃ by SHIMADZU GC-14A (A-1), by GC-MS(A-2), Thermaerobacter composti JCM 15650 grown at 70℃
by GC-MS (B) and Thermaerobacter nagasakiensis JCM
11223 grown at 70℃ by SHIMADZU GC-17A (C). GC
column temperature was raised from 200℃ to 280℃ (8℃/min) (A-1), 120℃ to 280℃ (15℃/min) (A-2), 100℃ to
280℃ (15℃/min) (B) or 120℃ to 280℃ (15℃/min) (C).
Retention times (min) of the heptafluorobutyryl derivativesof polyamines are printed on each peak (A-1) or axis (A-2, B,
C). Abbreviations for polyamines are given in Table 1.

Ten species of anaerobic, extremely thermophilic
cellulolytic Caldicellulosiruptor have been validated(NCIMB website, 2011)1).
‘Thermoanaerbacter
cellulolyticus’ IFO 14436 (=NBRC 14436) isolated inJapan should be transferred into the genus
Caldicellulosiruptor 18, 23) but has not been validated.
The occurrence of 3(3)(3)3 and 3(3)(3)4 has been
demonstrated in three Caldicellulosiruptor species and a
species of Thermanaeromonas, T. toyohensis of the orderby HPLC and GC analyses 4, 13, 16). This uniquepolyamine profile was also observed in a newly validated
species of Caldicellulosiruptor, C. obsidiansis, grown at
70℃ , isolated in the Obsidian Pool of Yellowstone85

National Park, USA 15). The cellular levels of 343, 333
and 3333 decreased and the levels of 3343, 3(3)(3)4 and3(3)(3)3 increased at 75℃ in ‘T. cellulolyticus’ as shownin the present study (Table 1). The relative ratio of
3(3)(3)3 and 3(3)(3)4 were varied within the polyamine
data of Caldicellulosiruptor and Thermanaeromonas
species, grown at same temperature, 70℃ (Table 1).
The relative abundance between the two branchedpenta-amines depending on salt, pH and otherenvironmental growth conditions seems to be impossible.

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)Table 1. Cellular concentrations of polyamines of the themophiles belonging to the ordersThermoanaerobacterales andClostridiales of the phylum Firmicutes

4, putrescine; 5, cadaverine; 33, norspermidine; 34, spermidine; 44, homospermidine; 333, norspermine; 3(3)3,N4-aminopropylnorspermidine; 3(3)4, N4-aminopropylspermidine; 343, spermine; 334, thermospermine; 434, canavalmine; 344,
aminopropylhomospermidine; 3333, caldopentamine; 3343, thermopentamine; 3334, homocaldopentamine; 3(3)43,
N4-aminopropylspermine: 3(3)34, N4-aminopropylthermospermine: 3(3)(3)4, N4-bis(aminopropyl)spermidine; 3(3)(3)3,N4-bis(aminopropyl)norspermidine; 33333, caldohexamine; 33334, homocaldohexamine: 33343, thermohexamine: 33433,
homothermohexamine; Agm, agmatine; *, not calculated; -, not detected (<0.005); T, type strain; ATCC, American Type Culture
Collection, Manassas, Virginia, USA; IAM, IAM Culture Collection, Institute of Molecular and Cellular Biosciences, The
University of Tokyo, Tokyo, Japan; IFO, Institute for Fermentation, Osaka, Japan: JCM, Japan Collection of Microorganisms,
RIKEN, Wako, Saitama, Japan; NBRC, Biological Resource Center, National Institute of Technology and Evaluation, Kisarazu,
Chiba, Japan. (a), (b)(b-1,b-2 in different media), (c), (d), (e) and (f) were cited from Hamana et al., 1996 (5), Hamana et al., 1996(4), Hamana et al., 2001 (13), Hosoya et al., 2004 (16), Hamana et al,, 2009 (7) and Hamana et al., 2008 (10), respectively.

Other three extremely thermophiles, grown at 70℃,
belonging to the genera Fervidicola, Thermovorax andAmmonifex, newly analyzed in the present study,
contained 3(3)(3)4 as a major polyamine and lacked
3(3)(3)3 (Table 1). It has been suggested that the
distribution of 33, 333, 3(3)3, 3333, and/or 3(3)(3)3 is
genus-specificfor
Caldicellulosiruptor
andThermanaeromonas within the order. Penta-amines
86

were not detected in the slight-thermophilic/mesophilic
Tepidianaerobacter species grown at 35-50℃ (Table 1).
N4-aminopropylspermine (3(3)43) was detected as aminor penta-amine in T. italicus as well as three
Caldicellulosiruptor and a Thermanaeromonas species,
as found on the GC chromatogram (Fig. 2) and identified
on GC-MS (Fig. 3). The novel penta-amine has been
foundinthermophilic
Bacillus,
Geobacillus,

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)Saccharococcus and Calditerricola species belonging tothe order Bacillales of the phylum Firmictes 16,19).
Since the tertiary branched penta-amine should be
produced from a quaternary branched hexa-amine,
N4-bis(aminopropyl)spermine (3(3)(3)43) during GC

analysis, the occurrence of 3(3)(3)43 is not excluded in
the thermophiles.
The hexa-amine has not been
detectable as a significant polyamine peak in the HPLC
chromatograms of their cellular polyamines.

Fig.3. Mass spectrum of a peak corresponding to heptafluorobutyryl N4-aminopropylspermine (3(3)43) in the GC-MS
chromatogram of Thermoanaerobacter italicus JCM 16815 (Fig. 2A-2). Molecular weights of heptafluorobutyryl
3(3)43 (M), M-F, M-C3F7 and other five fragments corresponding to major MS peaks are shown.
The order Clostridiales
Thermaerobacter composti, T. litoralis, T. marianensis,
T. nagasakiensis and T. subterraneus have been
published as Thermaerobacter species of the
Clostridiales (NCBI website, 2011)1). A terrestrial
Thermaerobacter species, T. compost, was isolated froma food sludge compost in Japan and could not grow inmore than 1% NaCl 22) but was grown in a JCM 734
medium containing 0.1% NaCl, 0.1% MgSO2 and 0.2%
CaCl2 as the salts, at a pH of 8.0. The three marine
species, T. litoralis, T. marianensis and T. nagasakiensis,
were available and reanalyzed by HPLC and GC in thepresent study, were isolated by Japanese laboratories
from marine geothermal areas (NCBI website, 2011)1)
and grown in Marin Broth 2216 (Difco, USA), at a pH of
7.2 containing 1.95% NaCl, 0.60% MgCl2, 0.30%
MgSO4 and 0.18-0.01% of many other salts. Linear
penta-amines, 3333, 3334 and 3343 distributed in theterrestrial and marine species grown at 70 ℃ , were87

identified by GC and GC-MS (Fig. 2 and Table 1).
Branched penta-amine 3(3)(3)4 was not detected,
however, our previous tentative assignment for a
penta-amine peak of marine Thermaerobacter species by
HPLC alone 10, 14, 15) should be correct. Hexa-amines
33333, 33334 and 33343 were detected and identified asa minor polyamine by GC and GC-MS analyses. Total
cellular polyamine levels decreased in the culture, grownin same media at 65℃, as found in T. marianensis (Table1). Relative ratios of 333 to 343 plus 334, 3333 to 3334
plus 3343, and 33333 to 33334 plus 33343 wereremarkably higher in terrestrial T. compost grown under
low salt conditions rather than the ratios found in theother three marine species, at same culture temperature,
70 ℃ (Table 1). The relation of their polyamine
profiles to their growth salt concentration in hot
environments is possible. In thermal denaturation
experiments in vitro, the stabilization of nucleic acids isincreasedbythebindingofaminobutyl

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)moiety-containing linear tetra-, penta- and hexa-amines(343, 334, 3343, 3334, 33334, 33343 and 33433) rather
than the linear polyamines consisting of aminopropyl
moieties alone (333, 3333 and 33333) 21). The elution
order of the polyamines in our HPLC method using a
NaCl gradient elution from a cation-exchange resin
column at 70℃, support the above findings 3, 8).
Penta-amines were not found in modarately/slightly
thermophilic
Thermobrachium,
Thermosyntropha,
Thermotalea, Tepidimicrobium and Caldinitratiruptor
species, grown at 50-60℃ (Table 1). An extremely
thermophile, Caloramator fervidus was absent inpenta-amines and hexa-amines, as reported previously 4,7).
Within the three Caloramator species, C. mitchellensis
grown at 50℃, C. australicus grown at 60℃ and C.
fervidus grown at 70℃, for their optimum growth, thecellular level of a common tetra-amine, spermine,increased at higher growth temperature (Table 1).
Fervidicella methallireducens grown at 50 ℃ had aunique polyamine profile in which tertiary branchedtetra-amines, 3(3)3 and 3(3)4 in addition to 333, 343 and334 were detected by GC analysis. Although it has
been known that quaternary branched penta-amine,
3(3)(3)4 has been converted into tertiary branchedtetra-amines, 3(3)3 and 3(3)4 during GC analysis after
the heptafluorobutyrization 12), 3(3)(3)4 was not detectedin HPLC analysis of its polyamines. High tetra-aminelevels are essential for thermophily (thermotorerancy) of
the thermophiles in the absence of penta-amines andhexa-amines, as observed in the present study as well as
our previous reports on many moderately thermophilic
bacteria 6, 17).
Acknowledgment
We would like to thank JCM and NBRC for supplying
the bacterial strains. Caldicellulosiruptor obsidiansis
JCM 16842 was supplied with the permission of the U.S.
National Park Service, Yellowstone National Park, WY,
USA.

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In vitro Refolding of an OmpA Homolog, a Major Cold-Inducible Outer
Membrane Protein, from a Psychrotrophic Bacterium,
Shewanella livingstonensis Ac10
Institute for Chemical Research, Kyoto University, Uji, Kyoto 611-0011, Japan
Corresponding author: Tatsuo Kurihara, kurihara@scl.kyoto-u.ac.jp
Tel: +81-774-38-4710, Fax: +81-774-38-3248
Received: December 2, 2011 / Accepted: December 14, 2011
Introduction
Permanently cold environments such as the Polar
Regions, deep seas, and high mountains constitute oneof the largest ecosystems on the earth 18). A great
diversity of cold-adapted microorganisms thrive inthese extreme environments 1). Many researchers
have been studying the cold-adaption mechanisms ofthese microorganisms and revealed a part of theirstrategies to adapt to low temperatures. The strategies
include the production of enzymes with high activity at
low temperatures, the modulation of the lipid
composition to maintain membrane fluidity, and the
production of RNA chaperones to suppress theformation of undesired secondary structures of RNA
3,5,7,8). Anti-oxidant activities are also important forcold adaptation because the solubility of oxygen isincreased and radicals are stabilized at low
temperatures resulting in a high concentration ofreactive oxygen species 14). Recent proteomic studiesof an Antarctic bacterium, Pseudoalteromonas
haloplanktis TAC125, suggested that protein folding isa rate-limiting step for bacterial growth at low
temperatures and that the trigger factor, a molecularchaperone interacting with nascent polypeptides, isproduced as the major cold-acclimation protein 15,16).
Besides these machineries, proteins involved inmembrane transport are supposed to play a critical rolein cold-adaptation of microorganisms because these
proteins must counteract the low diffusion rate ofsolutes at low temperatures.
Shewanella livingstonensis Ac10, a psychrotrophic
bacterium isolated from Antarctic seawater, grows wellat a temperature range of 4-25˚C 13). We previously

Abstract
Shewanella livingstonensis Ac10, a psychrotrophic
bacterium isolated from Antarctic seawater, grows wellat a temperature range of 4-25˚C. Its major outermembrane protein, named Omp74, is inducibly
produced at low temperatures and supposed to play arole in cold adaptation of this bacterium. Omp74 is ahomolog of Escherichia coli OmpA, which plays astructural role and forms a channel for hydrophilicsolutes in the outer membrane. OmpA has been
extensively used as a model to study the folding
process of membrane proteins.
To characterize
Omp74 and analyze its folding process in vitro, it isrequired to establish in vitro refolding conditions of
this protein. In this study, we established the method
for purification and refolding of Omp74.
Recombinant Omp74 without the signal peptide was
overproduced in E. coli, purified, and dissolved with abuffer containing 1% SDS. Then the solution was
diluted 50-fold with a buffer containing a detergent.
SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, tryptophan
fluorescence, circular dichroism, and limited
proteolysis analyses revealed that refolding wasachieved by using a buffer containing various
detergents such as 1% octyl β-D-glucopyranoside. We
refined the conditions and succeeded in complete
refolding of recombinant Omp74 in vitro.
Key Words: β-barrel protein, folding, outer membraneprotein, psychrotroph, Shewanella livingstonensis

90Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)AAGAATTAACACCTTG-3’ and reverse primer
5’-GCGGGATCCTTAACGTAATACTACGCGCTTTT
CAG-3’ by PCR with KOD-plus DNA Polymerase(Toyobo, Osaka, Japan). The amplified product wasdigested with NheI and BamHI, and ligated to plasmid
pET-21a(+) digested with the same restriction enzymes
to get expression plasmid pET-21a-74. pET-21a-74
was introduced into E. coli BL21(DE3), and thetransformant was cultivated at 37˚C in 500 ml LB until
OD600 of the culture reached about 1.0. Then thecultivation temperature was turned down to 20˚C.
After the cells were cultivated for 1 h to let them adapt
to
the
lower
temperature,isopropyl
1-thio-β-D-galactoside was added to 0.4 mM, and theexpression of Omp74 was induced at 20˚C overnight.
Cells were harvested by centrifugation at 4˚C (8,000 x
g, 30 min) and washed twice with 0.9% (w/v) NaClsolution. The cell pellet was suspended in 35 ml of
TED buffer (20 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 2 mM
DTT, pH 8.0) and disrupted by passing through a
French Press at 1,000 psi for 3 times. The lysate wassonicated to reduce its viscosity and centrifuged at
8,000 x g for 30 min to collect inclusion body. The
inclusion body was washed once with 1% (v/v) Triton
X-100 (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) to remove
contaminating proteins and twice with TED buffer toremove remaining detergent. Purified inclusion bodywas resuspended in 5 ml TED buffer and stored at-80˚C. N-Terminal amino acid sequence of theprotein in the inclusion body was analyzed to makesure that this is the mature form of Omp74.

found that a major outer membrane protein (OMP)
named Omp74 is inducibly produced at low
temperatures, suggesting that the protein is involved incold adaptation of this bacterium 10).
Omp74
(GenBank accession number: BAF64763) is a homologof OmpA from Escherichia coli (GenBank accession
number: AF234269) and shows 25% amino acidsequence identity to OmpA. OmpA plays a structuralrole and forms a channel for hydrophilic solutes in theouter membrane of E. coli 19,22). Omp74 is supposed
to play similar roles in S. livingstonensis Ac10.
However, the function of this protein has not beenstudied so far because a method to prepare functional
Omp74 in vitro has not been established. To clarify
the structure and function of Omp74, we searched for
conditions to obtain properly-folded Omp74 in vitro.
We found that Omp74 with a native-like structure canbe obtained by denaturing Omp74 overproduced asinclusion bodies in E. coli and refolding it in detergent
micelles. This is the first report of in vitro refoldingof OMP from cold-adapted bacteria and paves the way
to analyze their membrane transport machinery
operating at low temperatures.
Materials and Methods
Preparation of native Omp74-enriched fraction
from S. livingstonensis Ac10
S. livingstonensis Ac10 was cultivated in LB liquid
media containing 50 µg.ml-1 of rifampicin at 4˚C to an
OD600 of about 3.0. The cells were harvested anddisrupted by passing through a French Press at 1,000
psi twice. The cell lysate was centrifuged at 6,000 x g
for 15 min to remove intact cells, and then centrifuged
at 27,000 x g for 60 min to collect membrane fraction.
The pelleted membrane fraction was resuspended in 20
mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) and centrifuged
at 13,000 x g for 30 min. Omp74 was found in the
supernatant, which was centrifuged at 27,000 x g for 60
min to get Omp74-enriched pellet. The pellet wasdissolved in 1.5% (v/v) of n-octyl polyoxyethylene(Octyl-POE, Bachem, Bubendorf, Switzerland) andsubjected to SDS-PAGE with or without boiling at
100˚C for 5 min.

In vitro refolding of Omp74 into detergent micelles
Purified inclusion body of recombinant Omp74 wasdissolved in TED buffer containing 1% SDS (w/v) andcentrifuged at 20,000 x g for 30 min to remove
insoluble contaminants. The protein concentration was
adjusted to 0.5 mM, and refolding was carried out by
diluting the SDS-dissolved Omp74 solution 50-foldwith TED buffer containing micelles of detergents (1%(v/v for Octyl-POE and Triton X-100 and w/v for other
detergents)). Incubation of the mixture was done under
the conditions described in Results and Discussion.
The detergents used were as follows: Brij 35 (Sigma, St.
Louis, MO), n-octyl β-D-glucopyranoside (OG, Sigma),
TritonX-100,
Octyl-POE,
3-(N,N-dimethylmyristylammonio) propanesulfonate (SB3-14,Sigma),and N-lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl, Sigma).
When the effects of pH on the refolding were examined,
the following buffers were substituted for Tris-HCl in
the TED buffer: citrate buffer (pH 4.3 and 5.8),

Expression and purification of Omp74
To obtain recombinant Omp74 as inclusion body, thegene coding for mature Omp74 without its signal
peptide, which was confirmed by N-terminal aminoacid sequence analysis of native Omp74, was amplified
with forward primer 5’-CTAGCTAGCATGGCAC
91

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)1A). The results suggest that Omp74 was refolded
under these conditions because the fast-moving bandcorresponded to the unboiled native Omp74 extracted
from S. livingstonensis Ac10 (Fig. 1B). The band of
the refolded protein was not observed in the absence ofthe detergent (Fig. 1A). The intensity of the band of
the refolded protein was very weak when an anionicdetergent (Sarkosyl) was used (Fig. 1A). Thus thefolding of Omp74 is facilitated by nonionic andzwitterionic detergents.

Tris-HCl (pH 7.0 and 8.0), and sodium
carbonate-bicarbonate buffer (pH 9.0 and 10).
Fluorescence spectroscopy
Tryptophan fluorescence measurements were carriedout with RF-5300 PC (Shimadzu, Kyoto, Japan). The
slit width was 3 nm for excitation and 5 nm foremission. The excitation wavelength was 295 nm,
and the emission spectrum was measured from 310 nm
to 380 nm. The fluorescence spectrum of the buffer
containing detergents was measured and subtracted as
background.
Circular dichroism (CD) spectroscopy
CD spectra were measured using a JASCO J-820-L
Circular Dichroism Spectropolarimeter (Jasco Inc.,Tokyo, Japan). The far-UV spectrum was recorded in
the spectral range of 200-250 nm and averaged overfour scans at 18˚C, using a 1 mm-path length cell.
TED buffer (pH 8.0) containing detergents were
scanned to obtain the baseline, which was subtracted
automatically during scanning.
Limited proteolysis
Proteinase K (Sigma) was added to a 10 µl reaction
system containing Omp74 folded into detergent
micelles to a final concentration of 5 µg ･ ml-1.
Omp74 was digested for 5 min or 15 min at 18˚C.
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) was added toa final concentration of 10 mM to stop the reaction.
Digested samples were analyzed by SDS-PAGE.

Fig. 1. Refolding of Omp74 in detergent micelles.
(A) Effects of various detergents on the refolding
efficiency. Omp74 denatured with 1% SDS was
diluted 50-fold with a buffer containing 1% detergent
indicated in the figure. Boiled and unboiled samples
were subjected to SDS-PAGE.
(B) Comparison
between native Omp74 extracted from S.
livingstonensis Ac10 and recombinant Omp74 refoldedwith 1% OG.

Results and Discussion
Refolding of Omp74 with detergents
Omp74 is predicted to form a 12-stranded β-barrel
domain and a soluble periplasmic domain(PRED-TMBB(Posterior
Decoding
Method):http://biophysics.biol.uoa.gr/PRED-TMBB/). Several
OMPs have been shown to fold spontaneously in thepresence of an amphipathic environment such asdetergent micelles2,4,12).
Here we searched for
conditions to fold Omp74 in detergents. Recombinant
Omp74 (0.5 mM) dissolved in 1% SDS was 50-folddiluted with 1% detergents and incubated at 18˚C for 3
h before analyzed by SDS-PAGE as described inMaterials and Methods. When nonionic detergents(Brij 35, OG, Triton X-100, and Octyl-POE) and azwitterionic detergent (SB3-14) were used and thesamples were not boiled, a band with faster mobility
than that of the unfolded protein was observed (Fig.

Spectroscopic analysis of Omp74 refolded withdetergents
To further confirm the refolding of Omp74, we
measured the tryptophan fluorescence spectra and CD
spectra of the refolded protein. Omp74 contains six
tryptophan residues (Trp7, Trp38, Trp64, Trp93,
Trp155, and Trp165), four of which are predicted toreside at the water/membrane interface (Trp7, Trp38,
Trp93, and Trp165). Tryptophan fluorescence is very
sensitive to the hydrophobicity and acidity of its local
environment. The fluorescence is blue-shifted when
the tryptophan residues move into the hydrophobic
environment. The fluorescence intensity decreases as
the pH decreases. Thus, the changes of tryptophan
fluorescence can be used to monitor structural changes
92Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)of a protein 11,21).
The tryptophan fluorescence
spectrum of Omp74 refolded with 1% OG had anemission maximum at about 330 nm (Fig. 2).

Limited proteolysis of Omp74 refolded withdetergents
Membrane proteins integrated into the hydrophobic
core of the lipid bilayer or micelles are resistant tohydrophilic protease. Therefore limited proteolysis isoften used to verify folding of OMPs 4,17,20). To
examine whether the two-domain structure of Omp74
was produced after refolding in the detergents, we
performed limited proteolysis as described in Materials
and Methods. Omp74 refolded with Brij35, OG,
SB3-14, Triton X-100, and Octyl-POE was degraded
into a 28-kDa fragment and a 24-kDa fragment after
5-min digestion with proteinase K, and only the
24-kDa fragment remained after 15-min digestion (Fig.
4).

Fig. 2. Tryptophan fluorescence spectra of recombinant
Omp74 refolded in 1% OG (solid line) and unfolded
Omp74 obtained by boiling (dashed line).
When the protein solution was boiled, the emission
maximum shifted to 345 nm and the fluorescenceintensity decreased, indicating that the tryptophan
residues in the hydrophobic environment in the
refolded protein became exposed to hydrophilic
environments by unfolding of the protein. We also
evaluated the secondary structure of the folded protein
by CD spectroscopy. The protein refolded with 1%
OG showed a typical β-sheet CD spectrum with asingle minimum at about 215 nm, and the boiled
sample displayed a random coil spectrum 9) (Fig. 3).
Omp74 refolded with other detergents gave virtually
the same fluorescence spectra and CD spectra as theprotein refolded with OG (data not shown). These
results are consistent with the results shown in Fig. 1
and indicate that Omp74 was refolded properly byusing the detergents.

Fig. 4. Limited proteolysis of Omp74 refolded indifferent detergents. The samples shown in Fig. 1A
were digested with 5 µg･ml-1 of proteinase K at 18˚C
for 5 min (left panel) and 15 min (right panel),followed by SDS-PAGE analysis.
This result suggests that the 24-kDa fragment is
protected in the detergent micelles and that theremaining portion is susceptible to the protease.
Proteinase K treatment of the native Omp74-enrichedfraction from S. livingstonensis Ac10 under the same
condition also produced a 24-kDa fragment, which was
detected by Western blot analysis with anti-Omp74
antibody (data not shown). These results support theview that Omp74 forms a two-domain structure like
OmpA from E. coli. When Omp74 incubated with
Sarkosyl was subjected to the experiment, noprotease-resistant band was observed after 15-mindigestion, demonstrating that the protein was notfolded into the hydrophobic core of the Sarkosyl
micelles. The results indicate that Sarkosyl does notsupport the folding of Omp74.

Fig. 3. Circular dichroism spectra of recombinant
Omp74 refolded in 1% OG (solid line) and unfolded
Omp74 obtained by boiling (dashed line).

93

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)Effects of pH, temperature, and denaturant
concentration on the refolding of Omp74
We examined the effects of pH on refolding of
Omp74 in 1% OG. The samples were incubated at
18˚C for 3 h at various pH before SDS-PAGE analysis.
Omp74 was refolded efficiently under basic pH
conditions (Fig. 5).

Fig. 6. Effect of temperature on the refolding of
Omp74 in 1% OG. (A) SDS-PAGE analysis of therefolded Omp74. Unboiled samples were subjected tothe analysis. (B) Refolding efficiency at different
temperatures. The refolding efficiency was calculatedby dividing the intensity of the folded protein with thetotal intensity of the unfolded and folded protein andplotted as a function of the temperature.

Fig. 5. Effect of pH on the refolding of Omp74 in 1%
OG. (A) SDS-PAGE analysis of the refolded Omp74.
Unboiled samples were subjected to the analysis. (B)Refolding efficiency at different pHs. The refolding
efficiency was calculated by dividing the intensity of
the folded protein with the total intensity of theunfolded and folded protein and plotted as a function of
the pH value.
The optimum pH was 9-10. We found that Omp74
precipitated at pH 4.3, which almost corresponds to thepI value of the N-terminal β-barrel domain (pI = 4.4).
We next examined the effects of temperature on thefolding efficiency of Omp74. Omp74 dissolved with
SDS was diluted into 1% OG solution and incubated atvarious temperatures for 3 h before SDS-PAGE
analysis. The refolding efficiency increased as thetemperature increased to 37˚C (Fig. 6). Above 37˚C,
the refolding efficiency decreased as the temperature
increased.

94

During in vitro refolding of OMPs, denaturants play a
critical role in avoiding self-association of the OMP
molecules.
The concentration of the denaturant
greatly affects the refolding efficiency of OMPs: a highconcentration of the denaturant unfolds the protein,
whereas the protein precipitates when the denaturant
concentration is too low 4,6). Here we examined theeffects of the concentration of the denaturant SDS on
the refolding efficiency of Omp74. Omp74 dissolved
with 1% SDS was diluted 50-fold with 1% OG or 1%
Octyl-POE solutions containing various concentrationsof SDS: the final concentration of SDS in the refolding
mixture was 0.02%, 0.2%, 0.4%, and 0.8%. The
mixture was incubated at 18˚C for 3 h prior to
SDS-PAGE analysis. As shown in Fig. 7A, therefolding efficiency depended on the SDS
concentration. When 1% OG was used, the best
refolding efficiency was achieved in the presence of
0.2% SDS, whereas refolding did not occur in thepresence of 0.4% and 0.8% SDS.
When 1%Octyl-POE was used, refolding efficiency increased as
the SDS concentration increased up to 0.4%, whereas
no refolding was observed in the presence of 0.8%
SDS. When the incubation time was increased, theJournal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (2)demonstrate varied folding behavior in vitro. J.
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7B).

Fig. 7. Effect of SDS concentration on the refolding of
Omp74 in 1% OG and 1% Octyl-POE. Refolding
was carried out at pH8.8 by using 20 mM Tris-HCl.
Unboiled samples were subjected to SDS-PAGE. (A)SDS-PAGE analysis of Omp74 incubated with 1% OG
and 1% Octyl-POE in the presence of various
concentrations of SDS for 3 h at 18˚C.
(B)
SDS-PAGE analysis of Omp74 incubated overnight at
18˚C with 1% OG in the presence of various
concentrations of SDS.
In conclusion, we succeeded in in vitro refolding of anouter membrane protein Omp74 from a psychrotropic
bacterium, S. livingstonensis Ac10, which paved theway to investigate the structure of this protein and its
function in cold adaptation of this bacterium. The
protein would also serve as a model protein to analyze
the folding process of membrane proteins at low
temperatures.
Acknowledgements
This work was supported in part by the Grants-in-Aid
for Scientific Research (B) from JSPS (20360372 and
22404021 to T.K. and 21405038 to J.K.), Grant-in-Aid
for Challenging Exploratory Research 22658028 (toT.K.), a Grant from the Institute for Fermentation,
Osaka (to T.K.), a Grant from Japan Foundation forApplied Enzymology (to T.K.), the grant for Research
for Promoting Technological Seeds 10-041 from JST(to J.K.), and a Global COE program Integrated
Materials Science (to J.K.).
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96

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (1)97Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (1)

学会記事
極限環境生物学会第 12 回シンポジウム報告
第 12 回シンポジウムは、6 月 13 日につくば・産業技術総合研究所、つくば中央第 1 共用講堂にて開催されました。今回の開催にあたっては、3 月 11 日に発生した東日本大震災の余震に十分注意した上で、以下の注
意事項をホームページ上にて呼びかけました。
注意）東日本大震災による余震の影響、ならびに福島第一原子力発電所事故に関連する電力不足問題により、開催を已む無く中止する場合があります。その場合、このホームページでの掲示、ならびにシンポジウム申込登録者に電子メールで連絡いたします。
幸いなことに当日余震等の発生はなく、多くの会員・非会員の皆様にご参集いただき、シンポジストの先生
方による熱のこもった講演もあり、盛況な中で無事故で開催することができました。参加者合計は 140 名（内訳を以下の表に示す）となり、昨年のシンポジウムを上回る参加者人数となりました。シンポジウムを主催していただきました、産総研・宮崎先生（シンポ委員長）には、研究室が震災による深刻な被害を受けたにも関わらず、シンポ開催に向け精力的に奔走していただきました。ここで、宮崎委員長に感謝申し上げるとともに、当日ご参加いただいた皆様方に事務局一同心より感謝申し上げます。

一般
学生
総計

事前申し込み人数
51（会員 37、非会員 14）49（会員 5、非会員 44）100（会員 42、非会員 58）

当日申し込み人数20（会員 14、非会員 6）
20（会員 0、非会員 20）40（会員 14、非会員 26）

合計71（会員 51、非会員 20）
69（会員 5、非会員 64）140（会員 56、非会員 84）

シンポジウムプログラム
鈴木庸平 先生（東京大学大学院 理学系研究科 地球惑星科学専攻）
講演タイトル 我が国の陸域地下微生物生態系の解明に向けた取り組み
鈴木宏和 先生（九州大学大学院 農学研究院 極限環境微生物ゲノム機能開発学）
講演タイトル 好熱菌 Geobacillus kaustophilus を利用した高温バイオプロセス基盤の創出
大谷直人 先生（慶應義塾大学 先端生命科学研究所 ゲノムデザイングループ）
講演タイトル 高度好熱菌 Thermus thermophilus ゲノムの倍数性
津田 栄 先生（産総研 生物プロセス研究部門 機能性蛋白質研究グループ）
講演タイトル 不凍タンパク質の分子機能解明に基づく新技術の創成
畑中理恵 先生（農業生物資源研究所 乾燥耐性研究ユニット）
講演タイトル ネムリユスリカの極限乾燥耐性：LEA タンパク質の役割
今回のシンポジストも若手の気鋭の先生方にご講演をいただき、当学会の将来を見つめた内容となった。多くのシンポジストの先生方には、本号にて Mini Review をご投稿いただき,掲載させていただきました。

98

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (1)

極限環境生物学会次期役員体制
11 月 27 日に長崎大学・良順会館で開催された、第 12 回極限環境生物学会総会において 2012～2013 年度の学会役員体制が承認されました。掘越会長、大島副会長、工藤副会長のもと、新規の評議員として石野園子
先生、長田洋子先生が選出されました。以下に次期役員体制（敬称略）を示します。

会長
副会長

評議員 31 名(50 音順)極限環境生物学会 2012−2013 年体制
掘越弘毅
独立行政法人海洋研究開発機構
大島泰郎
共和化工株式会社 環境微生物学研究所
工藤俊章
長崎大学大学院水産・環境科学総合研究科
秋野利郎
五十嵐泰夫
石野園子
伊藤進
伊藤佑子
今中忠行
大島敏久
大森俊雄
長田洋子
鎌形洋一
川上文清
河原林裕
倉光成紀
小林哲夫
小林良則
佐上博
芝弘孝
菅原秀明
鈴木健一朗
中川和倫
中村聡
南部滋郎
長谷川功
半澤敏
別府輝彦
松井裕
丸山正
山岸明彦
湯本勲
若木高善
渡辺公綱

合同酒精株式会社
東京大学大学院 農学生命科学研究科
九州大学大学院農学研究院
琉球大学 農学部
創価大学 工学部
立命館大学 生命科学部
九州大学大学院 農学研究院
芝浦工業大学大学院 工学研究科
元日本大学
独立行政法人産業技術総合研究所
東洋紡績株式会社 敦賀バイオ研究所
独立行政法人産業技術総合研究所
大阪大学大学院 理学研究科
名古屋大学大学院 生命農学研究科
財団法人バイオインダストリー協会
東北大学 反応化学研究所
サントリービジネスエキスパート株式会社
国立遺伝学研究所
独立行政法人製品評価技術基盤機構
愛媛県立松山南高等学校
東京工業大学大学院 生命理工学研究科
日本赤十字九州国際看護大学 看護学部
日本大学 生物資源科学部
東ソ−株式会社 東京研究所
日本大学
石川県立大学 生物資源工学研究所
独立行政法人海洋研究開発機構
東京薬科大学 生命科学部
独立行政法人産業技術総合研究所
東京大学大学院 農学生命科学研究科
独立行政法人産業技術総合研究所

極限環境生物学会事務局

99

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (1)

極限環境生物学会誌投稿規定
１．投稿者の資格
極限環境生物学会誌（ISSN 1348-5474） (Journal ofJapanese Society for Extremophiles)（以下、本誌という）への投稿は極限環境生物学会（以下、本学会という）会員に限る。なお、連名による投稿の場合には、少なくとも著者の一人が本学会会員でなければならない。ただし、日本国以外からの投稿並びに本学会が寄稿を依頼した場合は例外とする。

け付ける。この場合、極限環境生物学会ホームペー
ジに掲載されている投稿要領に従うこと。

２．論文の種類
本誌への投稿論文は、極限環境生物関連分野の原著論文（通常論文、短論文）、総説、並びに諸報とし、いずれも未発表のものに限る。
（１）原著論文 (original papers)：極限環境生物に関する論文で以下の２つのいずれかに該当する論文。
１）通常論文 (regular papers)：極限環境生物に関する論文で、それ自体独立した、価値のある結論ある
いは事実を含む論文。
２）短論文 (short communications)：極限環境生物に関する論文で、断片的な結果ではあるが新しい事実や価値のあるデータを含む短い論文。
（２）総説 (reviews)：極限環境生物のある特定の研究分野について、簡単な歴史的背景を含め、最近の進歩を要約し、可能であれば、将来の研究方向性をも指し示した論文。
（３）ミニレビュー (mini-reviews)：総説の内、比較的短く纏めたもの。
（４）諸報：巻頭言、研究最前線、研究のルーツを探る、学会関連記事等。

５．論文の審査
投稿された論文の内、原著論文、総説、ミニレビュ
ーの審査には、極限環境生物学会誌編集委員の内１名が責任編集委員として関与する。原著論文および総説の審査は、責任編集委員が適宜指名する複数の査読者によりなされる。掲載の可否に関する最終判
定は、査読者からの査読結果報告に基づき責任編集委員が行う。その後、編集委員長が著者に審査結果を通知する。なお、内容・体裁に問題があると判断された原稿については、著者による修正を求める。
修正を求められた原稿は、２ヶ月以内に責任編集委
員に返送することとし、２ヶ月を過ぎて返送されなかった原稿は、著者が原稿を取り下げたものとして処理する。なお、投稿された論文は返却しない。

〒113-8657 東京都文京区弥生 1-1-1 東京大学大学
院農学生命科学研究科応用生命工学専攻（東大院農生科応生工と省略可）極限環境生物学会誌編集委員長
石 井 正 治 ( 電 話 ： 03-5841-8258, FAX ：03-5841-5272) (e-mail: amishii@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp)

６．校正
校正は初稿のみ著者に送付する。到着日より３日以内に、原稿とともに指定された送付先に返送すること。なお、原著論文ならびに総説に関しては、著者
校正時の文章・図表の追加や削除は一切認めない。
７．別刷り
別刷りは、pdf ファイルとして配布する。

３．論文の書き方
論文の用語は日本語または英語とし、別途定める「原稿執筆要領」に従い簡潔に分かりやすく作成すること。総説は原稿３０頁以内、通常論文は原稿２０頁
以内、ミニレビューは原稿１５頁以内、短論文は原稿１０頁以内とする。なお、諸報の頁数に関しては編集委員会で適宜判断する。

８．著作権
本誌に掲載された論文の著作権は本学会に帰属する。
９．その他
極限環境生物学会誌投稿規定ならびに極限環境生物
学会誌論文執筆要領で不明な部分に関しては、極限環境生物学会誌編集委員会において適宜対応する。
なお、必要が認められる場合には、文書化を進めるものとする。

４．論文の受付
論文原稿は諸報を除き、原稿原本の他にコピー３部を付け、送付状とともに簡易郵便書留として下記宛に送付すること。なお、オンラインによる投稿も受100論文執筆要領
極限環境生物学会誌論文執筆要領
１．一般的事項（１）テキストファイル形式または Microsoft Word
形式で保存できるワードプロセッサ等を用いて原稿を作成すること。
（２）タイトルページには、1)論文題名、2)著者名、
3)著者所属機関名、4)ランニングタイトル、5)連絡対
応著者名およびその連絡先住所・電話番号・FAX 番号・e-mail アドレス、6)キーワード（５語以内）を明示すること。日本語で作成した論文には、これらの英語訳を併記すること。
（３）論文印刷には A4 版用紙の片面を使用し、１
行４０字（英語の場合には１行６０字）、１頁２５行で印刷すること。イタリック、ボールド、あるいはスモールキャピタルにする語句がある場合は、それぞれ赤字で下線、波下線、二重下線を記すこと。
（４）略語リストがある場合には、本文第１頁に脚注として略語の項を設け表記すること。単位系と省略記号は SI 単位を基本とする。
（５）生物の命名及び記載は International Code of
Nomenclature of Prokaryotes, International Code ofBotanical Nomenclature, International Code ofZoological Nomenclature に従う。学名が初出の場合は全部を記載すること。原則として、２回目以降は属名の頭文字を略号とするが、紛らわしい場合には省略せずに記載すること。
（６）物質名の表記は以下の規定に従うこと。
１）有機化合物の表記および放射性同位元素による標識化合物の表記は IUPAC 規定に従うこと。
２）生化学関連事項の命名は IUPAB 制定の命名法に従うこと。
３）化学式に用いられる記号、略号などは Chemical
Abstracts の用例に従うこと。
（７）論文受理後、完成した本文および図表等の印刷に必要な全てのファイルを収めた電子媒体を編集委員長宛に郵送するか、またはそれらのファイルを
e-mail 添付書類として編集委員長宛に送付すること。
２．投稿論文の構成（１）原著論文は 1)標題、2)アブストラクト、3)本
文、4)引用文献、5)表ならびに図、図の説明文、の順にまとめること。
（２）標題は論文内容を具体的に表す簡潔なものとすること。標題の下に著者名、所属機関名、所在地を書く。著者が複数で、所属機関が異なる場合は、
著者名末尾に上付数字を付けて区別するとともに、連絡対応著者名を指定すること。
（３）原著論文ならびに総説のアブストラクトは英語で記述するものとし、通常論文・総説では200words 以内、短論文では 100words 以内で作成す

101

ること。
（４）通常論文の本文は原則として、緒言、材料および方法、結果、考察（あるいは結果と考察）、謝辞で構成する。短論文では項目分けをしない。
（５）原著論文ならびに総説では、必要に応じて図表を用いる。それぞれの図表を挿入したい位置を、原稿右側の余白部分に指示すること。
（６）文中での文献の引用は、引用文献の項目で整理した文献番号を用いること。図表の引用はその番号によること。
（７）脚注が必要な場合には、該当事項の右肩に通し番号を付け、当該頁の下部に説明文を付けること。
３．引用文献（１）引用文献は下記の例に準じ、本文中の該当人
名あるいは事項の右肩に 1), 1-3)のように番号を付し、また、本文末尾の引用文献の項に第一著者のファミリーネームのアルファベット順に 1., 2., 3., --の番号を付し一括記載する。Ibid., idem は用いないこと。私信、未発表の研究結果、学術雑誌に受理される前の論文、抄録が印刷されていない口頭発表など
は引用文献に含めないこと。雑誌の略号は、Chemical
Abstracts Service Source Index (CASSI) 1907-1984(Cumulative)およびその補遺版により、雑誌名、書名、
年、巻および頁の示し方は下記によること。
（２）雑誌引用のとき
Chuakrut, S., Arai, H., Ishii, M., and Igarashi, Y. 2000.
Characterization of a bifunctional archaeral acylcoenzyme A carboxylase. J. Bacteriol. 185: 938~947.
（３）書籍引用のとき
児玉徹. 1997. V 近代的な微生物利用工業１．アルコール, pp191~197.児玉徹・熊谷英彦編, 食品微生物学,
文永堂出版
４．表と図およびその説明（１）表と図は印刷版下を作成すること。
（２）本文を英語で書いた場合には図表も英文で作成すること。
（３）表と図は一つに対して１頁使う。各頁の右上に著者名ならびに図の番号を入れること。
（４）表題は表の上部分に書くこと。表の内容説明
文ならびに注は、表の下に記述する。注の表示にはa),b),c)を上付で明記し、記述には a),b),c)を上付にせず用いる。
（５）図の標題ならびに説明文は別紙にまとめて印刷すること。図の標題の最後にはピリオドを付し、内容説明は標題の後に改行して記載すること。
（６）写真は明瞭な陽画を必要部数添付すること。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (1)

学会会則
極限環境生物学会会則（名称）第１条 本会は、極限環境生物学会（英文名：TheJapanese Society for Extremophiles ）という。
（以下本会という）（目的）
第２条 本会は、極限環境生物研究の発展に寄与し、極限環境生物の研究、教育、利用の推進に寄与することを目的とする。
（事業）
第３条 本会は、研究発表会及び講演会等の開催、
極 限 環 境 生 物 学 会 誌 （ 英 名 ： Journal ofJapanese Society for Extremophiles）の発行、
国際極限環境生物学会等との連携事業、研究奨励賞・ポスター賞の授与、その他前条の目的を達成するために必要な事業を行う。
（会員の種別等）
第４条
1. 本会の会員は正会員、団体会員および賛助会員とする。
2. 正会員は極限環境生物に関する研究に従事する、または、これに関心を持つ個人であって、本会の目的に賛同し、定められた会費を納めた者をいう。
3. 団体会員は極限環境生物に関心を持つ団
体（法人等）であって、その団体内の本会の目的に賛同する代表者を含めて３名以内の所属者を指名して会員登録を行い、定められた会費を納めた団体をいう。
4. 賛助会員は本会の目的に賛同し、定められた賛助会費を１口以上納めた個人または団体をいう。
第５条 会員は本会が開催する諸事業に参加し、本会の発行する印刷物、PDF 等の配布を受けることができる。
（入会）
第６条 会員として入会しようとする個人または団
体は、本会事務局が定める手続きに従って申し込みを行い、本会会長による承認を得なければならない。
（会費）
第７条 会員は下記の会費を納めるものとする。
正会員
年額 5,000 円（但し身分が学生である者は年額 2,000 円）

団体会員 年額 20,000 円
賛助会員 年額 一口以上（一口 30,000 円）（退会）
第８条 会員は会長に届けることによって退会する

102ことができる。
（役員）
第９条
1. 本会には会長 1 名、副会長 2 名、評議員若干名、幹事若干名、会計監査 2 名の役員をおく。
2. 会長は本会を代表し、会務を統括する。
3. 副会長は会長を補佐し、会長に事故ある場
合には会長の職務を代行する。
4. 幹事は、幹事長、庶務、学術活動、会計、を分担し、事業計画の立案、事業の実施、庶務会計、シンポジウムの企画立案、学会誌発行、国際極限環境生物学会等との連絡などの本会の事務を行う。
5. 会計監査は本会の会計を監査する。
（役員の選出）第１０条 会長、副会長、評議員は本会の総会において選出される。
1. 幹事、会計監査は、副会長、評議員以外の正会員の中から会長が指名し、総会の承認を受ける。
2. 評議員の任期は２年とし重任を妨げない
が、連続３期を限度とする。但し、会長が指名する評議員はこの限りではない。
（委員会）
第１１条 本会に学会誌編集委員会、研究奨励賞選
考委員会、シンポジウム委員会を置く。各委員会委員の任期は 2 年とするが重任をさまたげない。
1. 学会誌編集委員会（会長指名の若干名で構成し､委員長は互選する）は学会誌の編集、論文審査の任にあたる。
2. 研究奨励賞選考委員会（副会長が委員長を勤め、学術活動担当幹事と委員長指名の委員、計 10 名程度で構成する）は本会の研究奨励賞受賞者を選考する。
3. シンポジウム委員会（会長指名の若干名で構成し､委員長は互選する）は学術活動幹事と共同でシンポジウムを企画立案し、運営をサポートする。
（評議員会）
第１２条 評議員会は会長、副会長、評議員をもって構成する。会長は年１回以上評議員会を召集し、議長となり、会の重要事項を審議し総会に提案する。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (1)第１７条 本会則の変更は総会の議決を経て行う。
第１８条 本会則は、1999 年 10 月 19 日より施行する。

（総会）
第１３条 本会は原則として年１回総会を開き、会務を協議し議決する。
総会は会長が召集する。
第１４条 総会の議決は出席会員の過半数の賛成をもって行う。
（会計年度）
第１５条 本会の事業年度は 1 月 1 日に始まり、同年 12 月 31 日に終る。
（付則）第１６条 本会則の施行および本会の運営についての細則は総会の議決を経て別に定める。

学会細則2001 年 11 月 29 日改定
2002 年 12 月 1 日改定
2003 年 12 月 1 日改定
2005 年 11 月 7 日改定
2007 年 12 月 1 日改定
2010 年 1 月 1 日改定

極限環境生物学会細則
第８条 評議員会の決議は出席者の過半数の賛成により成立する。
（退会）
第９条 会長は、会費を３年以上滞納した会員を退会させることが出来る。
（授賞）
第１０条 研究奨励賞・ポスター賞の授賞規定は別途定め全会員に配布する。
（細則の変更）第１１条 本細則の変更は総会の議決による。
（付則）第１２条 今期の本会事務局は、東洋大学生命科学部井上研究室（群馬県邑楽郡板倉泉野）内とする。
第１３条 本細則は、1999 年 10 月 19 日よりこれを
実施する。

（会員）
第１条 入会を承認された正会員、団体会員、賛助
会員は、所定の会費を速やかに納入する。
（総会）
第２条 総会の議案は副会長、幹事等と共に会長が作成し、評議員会の議を経た後提出する。
議案には前年度の事業内容及び収支決算、
新年度の事業計画、及び収支予算を含むものとする。
第３条 総会は会員の１／１０以上の出席（但し委任状を含む）をもって成立する。
（役員の選出）第４条 会長、副会長、評議員は会員の選挙によって決められる。会長は選挙によらず評議員を指名することが出来るが、総会での承認を必要とする。
第５条 会長は会員の中から少なくとも３名を選んで選挙管理委員を委嘱する。選挙管理委員
は選挙事務を行う。
第６条 会長は、評議員会の承認を得て必要な委員会を作ることが出来る。
（評議員会）
第７条 評議員会は評議員の半数以上の出席（委任状を含む）をもって成立する。

2002 年 12 月 1 日改定
2003 年 12 月 1 日改定
2006 年 6 月 30 日改定
2007 年 12 月 1 日改定
2010 年 1 月 1 日改定

103

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol. 10 (1)

運営体制
会長
副会長

極限環境生物学会運営体制（2010~11 年度）

掘越弘毅

独立行政法人海洋研究開発機構

大島泰郎

共和化工株式会社

工藤

俊章

長崎大学

環境微生物学研究所

水産学部

評議員（５０音順、敬称略）

幹事会

秋野利郎

合同酒精株式会社

幹事長

井上明

東洋大学生命科学部

五十嵐泰夫

東京大学大学院農学生命科学研究科

庶務

亀倉正博

好塩菌研究所伊藤進

琉球大学農学部

加藤千明

独立行政法人海洋研究開発機構

伊藤雅道

駿河台大学経済学部

伊藤佑子

創価大学工学部

今中忠行

立命館大学生命科学部

大島敏久

九州大学大学院農学研究院

大森俊雄

学術活動
東京大学大学院農学生命科学研

編集委員長

石井正治

学会誌担当

石野良純

九州大学大学院農学研究院

芝浦工業大学大学院工学研究科

高品知典

東洋大学生命科学部

鎌形洋一

独立行政法人産業技術総合研究所

古園さおり

独立行政法人理化学研究所

川上文清

東洋紡績株式会社敦賀バイオ研究所

学術幹事

究科

跡見晴幸

京都大学大学院工学研究科
独立行政法人理化学研究所

河原林裕

独立行政法人産業技術総合研究所

伊藤隆

倉光成紀

大阪大学大学院理学研究科

仲宗根薫

近畿大学工学部

小林哲夫

名古屋大学大学院生命農学研究科

國枝武和

東京大学大学院理学系研究科

青木俊夫

日本大学生物資源科学部

為我井秀行

日本大学文理学部

小林良則

財団法人バイオインダストリー協会

小松泰彦

独立行政法人産業技術総合研究所

坂口健二

シンポ担当

伊藤政博

東洋大学生命科学部

HP 担当

三輪哲也

独立行政法人海洋研究開発機構

会計

宇佐美論

東洋大学理工学部

会計監査

高瀬光徳

佐上博

東北大学反応化学研究所

芝弘孝

サントリービジネスエキスパート株式会社

菅原秀明

国立遺伝学研究所

鈴木健一朗

独立行政法人製品評価技術基盤機構

冨田房男

放送大学北海道学習センター

中川和倫

愛媛県立松山南高等学校

中村聡

東京工業大学大学院生命理工学研究科

南部滋郎

日本赤十字九州国際看護大学看護学部

長谷川功

日本大学生物資源科学部

半澤敏

東ソ−株式会社東京研究所

古川謙介

別府大学食物栄養科学部

別府輝彦

日本大学

松井裕

石川県立大学生物資源工学研究所

丸山正

独立行政法人海洋研究開発機構

山岸明彦

東京薬科大学生命科学部

仲山英樹

山本幹男

日本食品化工株式会社研究所

相馬亜希子

立教大学理学部

湯本勲

独立行政法人産業技術総合研究所

東端啓貴

東洋大学生命科学部

若木高善

東京大学大学院農学生命科学研究科

渡辺公綱

独立行政法人産業技術総合研究所

伊藤俊洋

森永乳業株式会社栄養科学研究所
財団法人北里環境科学センター

シンポジウム委員会
宮崎健太郎

委員

平山仙子

独立行政法人海洋研究開発機構

梅野太輔

千葉大学大学院工学研究科

前田理久

明治大学

黄川田隆洋

104

独立行政法人産業技術総合研究

委員長

所

農学部

独立行政法人農業生物資源研究所
神戸大学自然科学系先端融合研
究環Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol. 10 (1)

編

集 後 記

今年度の年会は長崎の地で開催されました。長崎という地は、幕末に改革の志士・坂本龍馬が跋扈し、また江戸時代に唯一世界に開かれていた街として、恋する女性・蝶々夫
人の舞台であったりと、文化の香り豊かな歴史の街であります。また忘れてはならないのは、第 2 次大戦末期に広島に続いて原爆が落とされた街でもあるということであります。年会会場ともなった、長崎大学良順会館のすぐそばには、原爆記念館が建っており、200 名を超える年会参加者の皆様からも多くの方がここを訪れたことと思います。今後
ともこうした関東以外での年会の開催を企画していきたいと考えておりますので、我が地に皆さんをお呼びしたいと思う方は遠慮なく申し出ていただきたいと思っております。今後とも会員各位との生命線でもあります、本学会誌を守っていく所存ですので、よろしくお願いいたします。

庶務幹事 加藤千明

編集委員会
委員長 ：石井正治（東大）
副委員長：石野良純（九大）
委員：阿部文快（青学大）、伊藤 隆（理研）、鎌形洋一（産総研）、河原林裕（産総研）、
高品知典（東洋大）、為我井秀行（日大）、中村 聡（東工大）、中村 顕（筑波大）、
三輪哲也（JAMSTEC）、湯本 勲（産総研）

学会事務局〒374-0193 群馬県邑楽郡板倉町泉野 1-1-1
東洋大学 生命科学部 生命科学科 井上研究室内
極限環境生物学会事務局 井上 明 (幹事会幹事長)
D-FAX: 020-4662-1960 E-mail: kyokugenjm10@extremophiles.jp
学会誌編集〒237-0061 神奈川県横須賀市夏島町 2-15
独立行政法人海洋研究開発機構 海洋・極限環境生物圏領域 (加藤千明、庶務幹事)
TEL：046-867-9550 FAX：046-867-9525 E-Mail：kyokugenjm10@extremophiles.jp
発刊日

105

2011 年 12 月 31 日