ISSN 2186-9936

Mar. 2018

第16巻 第2号

Journal of Japanese Society for Extremophiles

巻頭言 ………………………………………………………

24

研究最前線 …………………………………………………

25

Original Paper ……………………………………………

27

Mini Review ………………………………………………

46

学会誌投稿規定・執筆要領 ………………………………

76

会則・細則 …………………………………………………

78

運営体制 ……………………………………………………

81

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)23Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)巻頭言

東京薬科大学「どのような機構で」から「なぜ」の生物学へ？

生命科学部

山岸明彦

20 世紀の後半から現在に至るまで、極限環境生物学は大きく発展してきた。1987 年、2 年半のアメリ
カ留学から帰国して、当時東京工業大学の大島泰郎
先生の研究室に助手として採用された時から私はこの分野の研究を始めた。どのような研究をしても良いと大島先生に言われたことを良いことに、半年ほど何をしようかと考えた。そして少し前に発見されて、いろいろおもしろいことがわかりつつある古細菌の研究をやろうと Sulfolobus tokodaii（当時はまだこの名前ではなかったが）のゲノム構造の研究を始めた。大学院生がタンパク質の耐熱化の研究をしていたので、そのお手伝いも始めた。
それから 30 年、様々なことが明らかとなってきた。
当時は、一つの遺伝子を解析すると論文となる時代だった。Sulfolobus のゲノムの環状物理地図を書いて論文とした。それが今やメタゲノム解析の時代となっている。当時、80℃を越える超好熱菌が次々見つかり始めたのが、現在は 120℃を越えるまでになっている。当時、イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素というタンパク質を材料として、様々な手を尽くしてやっと耐熱性が上がった変異型タンパク質を一つ得る事に成功した。今では十個の耐熱性上昇変異酵素を作製することは 1 年で出来る実験となった。
1995 年、東京工業大学を定年退職して東京薬科大学へ移動した大島先生にくっついて、私も助教授として東京薬科大学へ移動した。その頃から、新たに

24

いくつかの研究を始めた。その一つは、系統樹を作製して 40 億年前のタンパク質を再生する実験で、できあがったタンパク質は 100℃以上の耐熱性を持っていた。全生物の共通祖先 LUCA、私はコモノート
とよんでいるが、が 80℃以上の環境に生育していた事を実験的に示す結果である。
当時は陸上の温泉の好熱菌を研究対象としていたが、やがて海底熱水地帯に掘削孔をあけてその解析を始めた。ほぼ並行して、成層圏に微生物がいないだろうかと、飛行機を用いて微生物を単離した。次に、大気球を用いて 20~35km 上空の微生物を採集した。現在は 400km 上空国際宇宙ステーションで微生物採集実験を実施中である。この後、火星で生命探査ができないかと思っている。
極限環境生物を探す研究はこれからもおそらく尽きない。何度まで生物は生きられるのか。何 km 上
空まで生物はいるのか。火星にはいないのか。もちろん、高圧、低温、アルカリ、酸性、放射線耐性、乾燥耐性等、極限を目指す研究は続く。
これらの耐性機構も引き続き大きな課題である。
どのような機構で好熱菌は耐熱性なのか。どのような機構で Deinococcus radiodurans は放射線耐性なのか。どのような機構で低温菌は低温耐性なのか。どのような機構で耐圧菌は耐圧なのか。好酸好アルカ
リ機構はどうなっているのか。
さて、私は来年 3 月で定年退職、自分で考えてこうした機構を解析するのは難しくなる。これまで、
やりたかったが後回しにしていた、「なぜ」の研究を始めようかと考え始めている。
「なぜ、120℃をはる
かに超えて生育する好熱菌が見つからないのか」、「なぜ、生命には液体の水が必要なのか」、「なぜ、生命は炭素を用いているのか」、「なぜ、細胞は膜に包まれているのか」、「なぜ、生命はアミノ酸と核酸を用いているのか」、「なぜ、ATP がエネルギーの通貨なのか」、「なぜ、生命は誕生したのか」、「なぜ生命は進化するのか」、そして「生命は将来どうなるのか」。それなりの答えを思いつきはするし、教科書にはそれらしいことが書いてあったりもする。だが、これらの理由がはっきりとわかっているとはとても思えない。どのような実験をすれば答えがでるのかも思いつかないし、最後まで答えが出ないのかも知れない。今年の４月以降、時間だけは大いに自由になるはずである。
「なぜ」の研究に取り組むのを楽し
みにしている。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)研究最前線〜極限環境生物研究〜
中村

1, 初めに～極限環境生物研究のきっかけ

顕（筑波大学

大学院 生命環境科学研究科）

緒に研究を行っていた学生さんに博士号を取らせる

私が極限環境生物の研究に手を染め始めたのは、ことができました。

2000 年に筑波大学へ異動してからのことになります。それまでは”何の変哲もない”常温性微生物の代

2, Thermus 研究へ着手表である枯草菌の研究をしていましたが、当時の祥子の取得～耐熱化抗生物質耐性遺伝

雲弘文教授から、「面白い生ごみ堆肥化装置がある。

極限環境生物研究に本格的に着手したのは、2003

きっと超好熱菌がいるから、それを分離しよう。」と年のことになります。祥雲教授が東京大学へ異動さ誘われました。この装置は、断熱密閉型の容器の中れ、学内の星野貴行教授とご一緒させていただいてに、生ごみとおがくず、そして堆肥(前回の醗酵産物)

からになります。星野教授は以前から T. thermophilusを投入して撹拌するものですが、加熱せずに 2 時間の宿主・ベクター系の開発で成果を挙げておられ、で 120℃にまで達するものです。
「温度上昇は微生物

私はそれを引き継ぐ形で Thermus 研究を始めました。

の代謝熱によるもので、120℃まで達するのだから超当時、Thermus のような好熱菌で選択マーカーと好熱菌がいるはず」と考えての事でしたが、結果として利用できる抗生物質耐性遺伝子は、常温菌のしては超好熱菌の分離はおろか、その存在を証明す

Staphylococcus aureus 由来のカナマイシン耐性遺伝

ることもできませんでした。ただその過程で、新属子に耐熱化変異を導入した htk しかありませんでし

新種の好熱菌などを分離することに成功し、当時一た。そのため、遺伝子破壊株にプラスミドを導入し25

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)たり、二重破壊株を作製することは非常に困難でしたタンパク質を生産することができたものの、そのた。そんな折に「大腸菌ハイグロマイシン(hygB)耐生産量は非常に低いものでした。そこで、生産され性遺伝子(hph)にアミノ酸置換変異を 2 か所導入する

た異種タンパク質の分解の可能性を考えて、大腸菌と、Sulfolobus で利用可能なまでに耐熱化される」とで異種遺伝子産物の分解に関わることが知られていいう報告があり、試してみましたが、Thermus では

る lon プロテアーゼのオルソログ 3 種について機能

野生型 hph と同じ 50℃で hygB 耐性を与えるものの、解析をするとともに、その破壊株を宿主とした異種

それ以上の温度では全く hygB 耐性を示さないこと発現を試みました。その結果、確かに生産量は 2 倍が明らかになりました。

程度に向上したものの、まだまだ改良の余地がある

そこで in vivo 分子進化工学の手法を取り入れて、ことが明らかになりました。

「野生型 hph を保持した Thermus を徐々に高温で培

我々の研究室では、Thermus での異種遺伝子発現

養し、hygB 耐性を示す細胞を選抜する」という実験に強力な恒常発現型プロモーターを使用していますを行った結果、耐熱化に関与するアミノ酸置換変異が、今後は大腸菌で用いられるような誘導発現型プを計 5 か所見出すことに成功し、これらの変異を全ロモーターを利用したいと考えています。ところがて導入した遺伝子(hph5)は、Thermus 内で 67℃まで

Thermus で報告のある誘導型プロモーターには、Pnar

選択マーカーとして機能しました。また、Hph5 が実や PdnaK のように培養条件を大きく変更しなくては際にタンパク質レベルで約 19℃耐熱性が向上してならないものしかありません。そこで現在、誘導物

いること、並びに X 線結晶構造解析(東京農大・矢質 の 添 加 と い った 、 簡 単な 操 作 で 誘 導 が可 能 な

嶋俊介教授との共同研究)の結果、耐熱性の向上が主

Thermus プロモーターを見出し、遺伝子発現調節機にタンパク質内部の疎水性コアの強化によるもので構の詳細を解析するとともに、それを利用したプロあることを明らかにしました。

モーターの開発を行っています。また、大腸菌の転同時に、Hph と 30%程度の低い相同性しか示さな

写調節因子を in vivo 分子進化工学の手法で耐熱化し、い放線菌 Streptomyces hygroscopicus 由来の HygB 耐

それを用いた誘導発現系の構築にも取り組んでいま性遺伝子(hyg)についても、同様の手法で耐熱化酵素

す。

を取得することに成功しました。こちらの場合は、74, 終わりに

アミノ酸置換変異と 3 アミノ酸の重複変異を持つ
Hyg10 が、タンパク質レベルで 13℃耐熱性が向上し、以上のように、我々は”T. thermophilus の宿主・ベ

Thermus 内では 74℃まで機能することが明らかにな

クター系の改良”をキーワードに研究を進めておりりました。また Hyg10 のモデル構造を作成し、耐熱

ますが、我々が開発している hph5, hyg10 や誘導型プ化の要因が主にタンパク質表面の親水性の増強によロモーターは、Thermus のみならず他の好熱菌でもるものであると推定しました。このことから同じ利用可能であろうと考えています。我々の開発したHygB 耐性酵素であっても耐熱化メカニズムは異なツールが極限環境生物、特に好熱菌研究に役立ててることが示唆されました。

いただければ、幸いです。
最後になりましたが、私に極限環境生物研究に目

3, Thermus 宿主・ベクター系の更なる改良に向けてを向けさせていただいた東京大学名誉教授

Thermus の宿主・ベクター系は、他の好熱菌・超祥雲弘文先生、Thermus の研究をはじめさせていただいた

好熱菌由来遺伝子の発現に用いることができます。

筑波大学教授我 々 の 研 究 室 で も 超 好 熱 性 古 細 菌 Pyrococcus

Thermus の研究に日夜取り組んでくれている学生の

horikoshii のいくつかの遺伝子の発現を試みました

皆さんに感謝いたします。

が、中には大腸菌では活性型として生産できなかっ26

星 野 貴 行先 生 、 そ し て 研究 室 でJournal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16, 27-36

ORIGINAL PAPER

Nguyen HTa,d, Hirano Sb, Arai Ha,
Nishihara Hc and Ishii Ma

Transcriptome profiles of central carbon metabolism
under autotrophic, heterotrophic, and mixotrophic conditions in
Hydrogenophilus thermoluteolus TH-1
Department of Biotechnology, Graduate school of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo, Bunkyo,
Tokyo 113-8657, Japan,bCentral Research Institute of Electric Power Industry (CRIEPI), Abiko, Chiba 270-1194, Japanc
Department of Bioresource Science, School of Agriculture, Ibaraki University, Ami, Ibaraki 300-0393, Japand
Department of Biology, Faculty of Science, HCMC University of Agriculture and Forestry, 760-000, VietnamaCorresponding author: Masaharu Ishii, amishii@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp
Phone: +81-3-5841-5142, Fax: +81-3-5841-5272
Received: Aug. 14, 2017 / Revised: Nov. 14, 2017 / Accepted: Nov. 13, 2017
AbstractThe

facultative

Introduction

chemolithoautotroph,

Hydrogenophilus thermoluteolus TH-1 has an ability toHydrogenophilus

TH-1

thermoluteolusagrow autotrophically or heterotrophically. In this study,

thermophilic,the growth under the mixotrophic condition washydrogen-oxidizing bacterium. Previous studies reported

demonstrated for the first time with carbon dioxide anddetails about the growth profiles of strain TH-1 underbutyrate as carbon sources. The transcriptome profiles ofautotrophic and heterotrophic conditions 9, 12). Under thethe cells grown under the autotrophic, heterotrophic, andoptimum condition, the autotrophically growing cells

mixotrophic

We

showed the maximum specific growth rate of 0.68 h-1,

re-confirmed the function of Calvin-Benson-Bassham

which is the highest among autotrophs 7, 9). When it(CBB) cycle as a carbon dioxide fixation pathway undergrows

the autotrophic condition. The transcriptome profiles also

Calvin-Benson-Bassham (CBB) cycle is operative forindicated that the CBB cycle is active under theCO2 fixation 8, 28). Under heterotrophic condition, strain

mixotrophic condition. Quite interestingly, we found theTH-1 can utilize acetate, propionate, butyrate, pyruvate,concomitant function of phosphoglycolate phosphatase,succinate,glycolate oxidase, and malate synthase under the

α-ketoglutarate as a carbon source. However, xylose,

autotrophic or mixotrophic condition. These reactions

DL-arabinose,

were thought to be active for the detoxification of

sucrose, lactose, D-mannose, L-sorbose, L-rhamnose,

glycolate, which originated from the oxygenase reaction

cellobiose, lactose, trehalose, xylan, raffinose, solubleof

RubisCO.

conditions

wereFurthermore,investigated.

superoxide

facultativelyisautotrophicallyfumarate,chemolithoautotrophic,

with

H2

DL-malate,

D-galactose,

and

CO2,

DL-lactate,

D-glucose,orD-fructose,

dismutase/starch, glycogen, dextrin, inulin, dextran, salicin, sorbitol,

peroxidase system was considered to be the primarymannitol, inositol, benzoate, oxalate, malonate, maleate,system to detoxify reactive oxygen species in strain

glutarate, DL-tartrate, citrate, formate, methanol, ethanol,

TH-1.

arginine, betaine, p-hydroxybenzoate, and testosterone
are not utilizedKeywords:

Transcriptome,

carbonmetabolism,8). Although the autotrophic andheterotrophic growth characteristics are reported,

8)

details of the carbon metabolism have been unclear.

Hydrogenophilus thermoluteolus

Because the knowledge about the growth and themetabolism
27

of

this

bacteriumisessentialforJournal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)understanding the molecular basis for autotrophy andstandard 14).

heterotrophy, and for the biotechnological application of
Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase assay

the strain, we conducted biochemical research on strain
TH-1 grown under autotrophic, heterotrophic, andCarboxylase activity of ribulose-1,5-bisphosphatemixotrophic conditions. Here, we report the metabolic

carboxylase/ oxygenase (RubisCO) was determined byand transcriptome profiles of strain TH-1 mainly throughmeasuring the rate of NADH oxidation at wavelength ofthe draft genome and microarray analyses.

340 nm, by following the method of Sharkey et al 21).

Materials and Methods

Microarray analysis
Microarray experiments were performed by using the

Bacterial strain and growth conditions

total RNA with two biological replicates for each growth

Hydrogenophilus thermoluteolus TH-1 (DSM 6765), a

condition. Microarray experiment was conducted bygram-negative,

non-spore-forming,

thermophilic

following the protocol prepared by the manufacture. The

hydrogen-oxidizing bacterium, was utilized throughout

protocol version 6.6, September 2012 for One-Color

this study. The strain was isolated from a hot spring in

Microarray-Based Gene Expression Analysis (Quick

Izu district, Japan. The mineral salt medium used for theAmp Labelling-Microarrays manufactured with Agilent-1

growth of strain TH-1 consisted of (NH4)2SO4 2.0 gL ,Sure Print Technology) from Agilent Technologies was-1

KH2PO4 1.0 gL , K2HPO4 2.0 gL , NaCl 0.5 gL ,employed. The samples were loaded on Agilent SureHyb

FeSO4·7H2O 1.1 mgL , CaCl2 30.0 mgL , MgSO4·7H2O

chamber and hybridized in a hybridization oven at 65 oC

0.5 gL-1 and trace element solution, pH 7.0 7).

for 17 hours. After the microarray slides were washed,

-1

-1

-1

-1

Autotrophic cultivation was performed by using thethe microarray slides were scaned by a high resolution

mineral salt medium with gas phase consisting offluorescence scanner Agilent SureScan Microarray

H2:O2:CO2 (75:10:15). Heterotrophic cultivation was

Scanner.

performed under air atmosphere using the mineral salt

For microarray analysis, all the available open reading

medium with the addition of butyrate (10 mM) as a soleframes (ORFs) were used for probe design after deletingcarbon source. Mixotrophic cultivation was performed

ORFs which are shorter than 200 bp. From each ORF,

with the mineral salt medium and gas phase as thoseseven specific probes were prepared. The probes were

under autotrophic condition, with the addition of butyrate

designed by submitting ORF sequence to the e-Array(10 mM). Strain TH-1 was cultivated by using a

tool

reciprocating shaker at 50 C with culture volume of 10(https://earray.chem.agilent.com/earray/).

mL in 100 mL vials. The pre-culture for all experiments

contained 60 oligonucleotides for the specific target

was done autotrophically. The growth was monitored bygene.

measuring the optical density at 540 nm (OD540).

(1) RNA extraction

o

in

the

websiteofAgilent
Each

probe

H. thermoluteolus TH-1 was grown autotrophically,
Preparation of cell-free extract

heterotrophically, or mixotrophically until OD540 reached

Cells were harvested at log phase by centrifugation

approximately 0.4-0.6. Then, the culture (10 mL) was(10,000 x g and 4 C for 10 min), and washed twice by

mixed with the same volume of RNA protect (QIAgen)cell suspension buffer (20 mM Tris-HCl [pH7.5]) withto stabilize total RNA. The cells were collected bycentrifugation at 15,000 x g and 4 C for 2 min. Cells

centrifugation at 3,000 x g for 10 min. RNA waswere finally suspended in cell suspension buffer at 1 g

extracted from the cell pellet by a hot-phenol method 20).

wet cells per 4 ml of the buffer. Cell-free extract was(2) Data extraction and analysisooprepared by disruption of the cells through sonication on

The data from scanned microarray slide were extracted

ice twice (each for 10 min) followed by centrifugation at

by using Agilent Feature Extraction Software 10.7

15,000 x g and 4 C for 30 min. After the disruption and(www.agilent.com/chem/feprotocols). The raw data were

centrifugation, the supernatant was designated as cell-fee

processed by using software Microsoft Excel 2010 and

extract

GeneSpringo18). Protein concentration was measured by

Bradford method using bovine serum albumin as a

GXversion13.0(http://www.genomics.agilent.com/). The raw data from28

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)Results and Discussion

the Feature Extraction software were obtained in text
format and were normalized by using GeneSpring GX

The genome analyses of H. thermoluteolus TH-1

version 13.0 (Agilent Technologies). All data werenormalized by Percentile Shift 75%. A baseline
correction was applied to the median of all samples.

Draft genome analyses were performed by Shomura et(3) Statistical analysis

al. and the details will be presented elsewhere (paper in

Data were processed with statistical analysis. For dye

preparation). The size of draft genome was about 2.3Mb.

Cy3, one-way ANOVA analysis was performed onto the

The numbers of annotated genes, which are distributed in

six microarrays to identify genes that were differentially

38 contigs, were 2,152. Annotation was performed byexpressed between the three growth modes. The

using NCBI blast tool

significance level was set at P ≦ 0.05. All data were(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), Brenda protein

expressed as the mean ± standard deviation (SD). The

database (http://www.brenda-enzymes.org/), and KEGG

mean signal value of duplicates for each probe set was

pathway database

analyzed by(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html).

Fig. 1. Proposed central carbon metabolic pathway in H. thermoluteolus TH-1 under the autotrophic growth (A), theheterotrophic growth (B), and the mixotrophic growth (C).
Abbreviations: GOX: glyoxylate; CIT: citrate; ICIT: isocitrate; KG: α-ketoglutarate; SucCoA: succinyl-CoA; SUC:
succinate; FUM: fumarate; MAL: malate; OAA: oxaloacetate; AcCoA: acetyl-CoA; AcetoAcCoA: Acetoacetyl-CoA;PYR:

pyruvate;

PEP:

1,3-bisphosphoglycerate;

phosphoenolpyruvate;
G3P:

3PG:

3-phosphoglycerate;

glyceraldehyde-3-phosphate;

F1,6P:

2PG:

2-phosphoglycerate;

BPG:

fructose-1,6-biphosphate;

F6P:

fructose-6-phosphate; X5P: xylulose-5-phosphate; Ru5P: ribulose-5-phosphate; Ru1,5P: ribulose-1,5-bisphosphate; gck:
glucokinase; pgi: glucose-6-phosphate isomerase; fbp: fructose-1,6-bisphosphatase; pfk: phosphofructokinase; fba:
fructose-bisphosphate aldolase; gapA: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; pgk: phosphoglycerate kinase; rbc:
ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase; prkB: phosphoribulokinase; rpe: ribulose-5-phosphate 3-epimerase;
tktA: transketolase; pgam: phosphoglycerate mutase; eno: enolase; pps: phosphoenolpyruvate synthase; pyk: pyruvatekinase; pdh: pyruvate dehydrogenase; pc: pyruvate carboxylase; me: malic enzyme; cs: citrate synthase; acn: aconitase;icdh: isocitrate dehydrogenase; icl: isocitrate lyase; ms: malate synthase; sucA: 2-oxoglutarate dehydrogenase E1
component; scs: succinyl-CoA synthetase; sdh: succinate dehydrogenase; fumA: fumarate hydratase; mdh: malate
dehydrogenase; thl: thiolase; hbd: hydroxybutyric dehydrogenase; crt: short-chain-enoyl-CoA hydratase.
29

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)Genome annotation analysis revealed the central carbon

pathway is not presumed to be active in strain TH-1

metabolism of strain TH-1 (Fig. 1).

because the gene coding for the key enzyme of thePrevious studies reported that strain TH-1 fixes carbon

ethylmalonyl-CoA pathway, crotonyl-CoA carboxylase/

dioxide via the CBB cycle 10, 24, 28). CBB cycle comprises

reductase, was not detected within the genome 3). The

11 different enzymes

catalyzing 13 enzymatic reactions,genome analysis showed that strain TH-1 possesses. In strain TH-1, the genes for theputative gene for pyruvate:ferredoxin oxidoreductase

CBB cycle enzymes were annotated (fructose-1,6-(por). Although the transcriptome data shows that por isbisphosphatase [fbp], fructose-bisphosphate aldolase

highly expressed, the in vitro enzymatic activities were[fba],

dehydrogenase

very low (Data not shown). Therefore, at this moment,[gapA], phosphoglycerate kinase [pgk], ribulose-1,5-

pyruvate:ferredoxin oxidoreductase is not presumed tobisphosphate

be operative in TH-1.

includingRubisCO19)

glyceraldehyde-3-phosphatecarboxylase/oxygenase

phosphoribulokinase[prkB],[rbc],

ribulose-5-phosphate
Growth3-epimerase [rpe], and transketolase (tktA) (Table 1).

characteristics

andcentralcarbonmetabolism

In bacterial glucose metabolism, three different
glycolytic pathways, Embden–Meyerhoff–Parnas (EMP)

Transcriptome analyses were performed under threepathway, Entner–Doudoroff pathway, and the pentose

different conditions: autotrophic, heterotrophic, andphosphate pathway, have been reported 4, 13, 22). The

mixotrophic conditions to know the outline of the carbon

absence of the gene coding for the key enzyme of

metabolism. The expression levels of genes under each

Entner–Doudoroff

condition are shown in Table 1. The transcriptome result

pathway,

6-phosphogluconate

dehydratase, and the absence of the gene coding for thefrom heterotrophic growth mode was used as a control.

key enzyme of the oxidative pentose phosphate pathway,
Heterotrophic growth:

glucose-6-phosphate dehydrogenase, within the genome
implied that these glycolytic pathways are not operative

Because butyrate was used as a sole carbon source,

in strain TH-1. Contrary to this, all genes coding for theglyoxylate pathway was presumed to be operative as an

EMP pathway enzymes were identified and annotated inanaplerotic reaction, which was the case (Table 1). As

the genome, suggesting that EMP pathway is operative in

expected, activity of RubisCO was not detected (Table

strain TH-1 (Table 1).

2).

Gluconeogenic pathway

is usedforsupplying
Autotrophic growth:

glucose-derivatives for biosynthetic process. Within the
genome of strain TH-1, the genes required for

All genes for CBB cycle were highly transcribedgluconeogenesis (glucose-6-phosphate isomerase [pgi],

under the condition. As shown in Table 1, the expression

fructose-1,6-bisphosphatase [fbp], fructose- bisphosphatelevels of three genes that are unique to the CBB cycle,

aldolase

glyceraldehyde-3-phosphaterbcL (RubisCO large subunit), rbcS (RubisCO small

dehydrogenase [gap], phosphoglycerate kinase [pgk],

subunit), and prkB (phosphoribulokinase), under thephosphoglycerate[fba];[eno],

autotrophic condition were 99.2-fold, 83.4-fold, andphosphoenolpyruvate synthase [pps]) were annotatedmutase[pgam],

enolase29.7-fold higher than those under heterotrophic condition,(Table 1).

respectively. Carboxylase activity of RubisCO under the

In terms of butyrate metabolism, the following

autotrophic condition was relatively high (0.188±0.005

pathways or reaction are known: the glyoxylate cycle,

unit/mg protein) (Table 2). This result confirms that theethylmalonyl-CoA pathway, and pyruvate: ferredoxin

CBB cycle is operative in strain TH-1 under theoxidoreductase (por) 27). Two genes for glyoxylate cycle

autotrophic condition.

enzymes, isocitrate lyase (icl) and malate synthase (ms),were identified (Table 1). The ethylmalonyl-CoA

30

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)Table 1: The microarray expression level of genes coding for the enzymes that are involved in the central carbon
metabolism in strain TH-1
Mean signal value (n=14)

Gene

Product

Pathwaygck

glucokinase

Glycolysis

rbcL
rbcS
prkB
pgk
gapA
fbp1

ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase
large
chain
[EC:4.1.1.39]
ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase
small
chain
[EC:4.1.1.39]
phosphoribulokinase[EC:2.7.1.19]
phosphoglycerate
kinase[EC:2.7.2.3]
glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase [EC:1.2.1.12]

Autotrophy
97.07
±17.1

Mixotrophy
147.5
±36.4

Heterotrophy
158.1
±22.8

CBB
cycle/
Photorespiration

72,396.1±7,648.8

42,630.3±7,857.6

806.5±311.4CBB
cycle/
Photorespiration

65,956.2±14,158.2

47,977.4±8,067.6

790.3±137.4

26,666.3±10,990
23,138±8,660.7

42,651.1±17,659.4
56,132.6±8,563.8

908.3±407.74,370.9±603.743,450.8±533

57,495.7±1,928.5

7,152.3±3,210.5

19,096.8±6,636.7
2,175.2±1,071.8
5,632.1±3042
24,269.1±3,514.4
442.3
±40.5
1,645
±244.3
41,979.6±4,913.4
442.1
±12.1
1,501.3±126.5
3,778.9±222
2,946.3±479.12,031.4±956.23,240.8±664.2

25,408.4±10,030.5
3,713.5±1,400.9
8,202.6±4,277.8
42,592.3±5,252.5
1,113±120.83,527.3±369.856,272.6±6,759.7
1,003.8±41.1
2,657.4±233.4
7,852.1±499.36,639.4±1,395.9
5,056.6±2,366.3
4,925±1,076.2

1,371.7±127
1,854.9±614.4
1,581±991.4
1,632.4±413.3521.8±52.9
1,293.3±146.15,105±767.5940.8±48.5
1,387.4±114.9257.2±12.7
3,148.4±656
2,408.5±1,260.8
2,911.8±736.9Glycolysis/
Gluconeogenesis

3,885.3±750.01,158.3±169.91,256.3±219.5acetyl-CoA
biosynthesis
TCA
cycle/Glyoxylate
cycle

3612
±349.1

504.4
±49.8

693.1
±65.9

2,003.6±410

5,771.6±769.6

6,388.1±1,251.5

1,472.6±478.7998.9±260.7

2,154.6±776.2
1,837.1±202.7

1,194.4±383
1,305.2±291.3

CBB cycle
CBB
cycle/
Gluconeogenesis
CBB
cycle/
Glycolysis/
Gluconeogenesis

fructose-1,6-bisphosphatase I[EC:3.1.3.11]

CBB
cycle/
Gluconeogenesis

rpe

ribulose-5-phosphate
3-epimerase [EC:5.1.3.1]

CBB cycle

tktA

transketolase

CBB cycle

glucose-6-phosphate
isomerase [EC:5.3.1.9]6-phosphofructokinase1[EC:2.7.1.11]
fructose-bisphosphate
aldolase, class I [EC:4.1.2.13]
phosphoglyceratemutase[EC 5.4.2.1T]

Glycolysis/
Gluconeogenesis

fbp2

pgi
pfk
fba
pgam
eno

enolase [EC:4.2.1.11]

pyk

pyruvate kinase [EC:2.7.1.40]

pps
me1
me2
por
pdh
cs
acnA1
acnA2

phosphoenolpyruvate synthase[EC:2.7.9.2]
malatedehydrogenase(oxaloacetate-decarboxylating,NADP+
dependent)[EC:1.1.1.38]
pyruvate
ferredoxin/flavodoxin
oxidoreductase [EC: 1.2.7.1]
pyruvate dehydrogenase [EC:1.2.1.51]
citrate synthase [EC:2.3.3.1]
aconitate[EC:4.2.1.3]

hydratase

Glycolysis
Glycolysis/
Gluconeogenesis
Glycolysis/
Gluconeogenesis
Glycolysis/
Gluconeogenesis
Glycolysis
Gluconeogenesis
Gluconeogenesis

TCA
cycle/Glyoxylate
cycle

31

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)

icdh
sucA
scs
scsD

isocitrate
dehydrogenase(NADP+
dependent)[EC:1.1.1.42]2-oxoglutarate dehydrogenase
E1 component [EC:1.2.4.2]
succinyl-CoA synthetase beta
subunit [EC:6.2.1.5]
succinyl-CoA synthetase alphasubunit [EC:6.2.1.5]

sdhD

succinate[EC:1.3.5.1]

dehydrogenase

mdh
Icl
ms
pgp
glcDH
sod
ccpR

TCA cycle
TCA cycle

TCA cycle
TCA cycle
TCA cycle

sdhC
fumA

TCA cycle

TCA cycle

sdhB
sdhA

TCA cycle

fumarate hydratase, class I[EC:4.2.1.2]
malatedehydrogenase[EC:1.1.1.37]

TCA cycle
TCA
cycle/
Glyoxylate cycle

isocitrate lyase [EC:4.1.3.1]

Glyoxylate cycle

malate synthase [EC:2.3.3.9]

Glyoxylate cycle/
Detoxification

phosphoglycolate phosphatase[EC:3.1.3.18]
glycolate dehydrogenase [EC
1.1.99.14]
superoxide
dismutase[EC:1.15.1.1]
cytochrome-c
peroxidase[EC:1.11.1.5]

Detoxification
Detoxification
Detoxification
Detoxificationcat

catalase [EC:1.11.1.21]

Detoxification

bcp

bacterioferritin [EC:1.16.3.1]

Detoxification

alkyl hydroperoxide reductase[EC:1.11.1.15]

Detoxification

ahpC1
ahpC2

3,712.8±671.3

6,872±1,076.8

11,901.1±2,094.5

1,328±451.5297.1±37.2
6,922.8±1,718.7
3,966.3±1,123.9
3,252.1±728.3
2,523.5±261.72,232.9±261.2
1,505.7±198.4
7,968.1±3,702
1,781.6±548.2
2,317.8±441.3
3,148.5±265.3
2,316.6±475.3
8,121.7±482.6
364.1
±67.8
706.4
±261.5
1,440.1±136.4
5,579.5±1,121.4
18,261±5,055.9

4,314±1,356.9
607.4
±97.2
11,150.3±2,624.2
11,001.4±3,229.4
7,745.4±1,481.6
5,731±510.6
6,649.7±805.32,749.9±273
9,206.3±3,893.4
7,931.3±2,917
3,955.4±704.2
11,372.1±1,238.3
3,884.3±932
9,613.3±701.6
2,732.7±528.2
1,076±437.3
1,514.5±127.85,774.2±1,280.2
22,638.2±6,567.2

3,811.5±1,474.8
814±137.4
11,418.6±2,8585,043.8±921.94,254.1±909.2
3,968±390.3
4,192.3±544
1,404.8±202.1
7,290.7±3,2538,072.2±3,303.5
4,570.3±829.2
1,079.3±103.72,161±410.3
5,205.5±424.8
1,647.4±320.7778±293.62,075.6±182.96,428.8±1,209.9
17,042±3,862.7

Table 2. RubisCO activity in cell-free extract of cells grown under autotrophic, heterotrophic, or mixotrophic condition.
Condition

Activity (Unit/mg protein) (n=3)

Autotrophy

0.188±0.005

Mixotrophy

0.049±0.003

Heterotrophy

ND
ND: not detected

Glycolysis is highly regulated at two of its catalytic

3-phosphate) should be influenced by the operation ofsteps, phosphofructokinase (pfk) and pyruvate kinase

the CBB cycle. Therefore, under the autotrophic(pyk). Since TH-1 operates the CBB cycle under thecondition, the glycolytic metabolism was estimated fromautotrophic condition, the upper part of the EMP

the expression of pyk. The expression level of pyk underpathway (from fructose-6-phosphate to glyceraldehyde-

the autotrophic condition was 14.7-fold higher than that

17)

32

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)under the heterotrophic condition (Table 1). In addition,
pyruvate

dehydrogenasethat

RubisCO activity was detected under mixotrophic

contributes to link the glycolysis to the tricarboxylic acidcondition at log phase (Table 2), when butyrate was(TCA) cycle, showed 5.2-fold higher expression undervigorously consumed (Fig. 2). Taken together, these facts

the autotrophic condition (3612±349.1) in comparison tosuggestthe heterotrophic condition (693.1±65.9). These results

concomitantly under mixotrophic condition. The final

suggest that the metabolism is dominantly toward

cell density under mixotrophic condition approximately

glycolysis under the autotrophic condition.

equals to the sum of cell density under autotrophic

Gluconeogenic pathway(pdh),

theis usedenzymegrowth. (Fig. 2).

for

that

CO2

and

butyrate

wereconsumed

supplyingcondition and heterotrophic condition (Fig. 2). This fact

glucose-derivatives for biosynthetic process. Since

clearly shows that the cell-carbon was derived from bothfructose-1,6-bisphosphatase (fbp) is the enzyme that

CO2 and butyrate under the mixotrophic condition.

belongs to gluconeogenesis and CBB cycle, expression

Most genes related to the CBB cycle were up

level of phosphoenolpyruvate synthase (pps) was utilized

regulated under the mixotrophic condition (Table 1). The

to estimate the function of the gluconeogenic pathway.

expression levels of rbcL, rbcS, and prkB were 52.9-fold,

Contrary to our expectation, similar expression level of

60.7-fold, and 47.0-fold higher than those under thepps under the autotrophic condition (2,946.3±479.1) was

heterotrophic condition, respectively. These results

observed as that under the heterotrophic condition

suggest that the CBB cycle is operative under the(3,148.4±656), which implies that the gluconeogenetic

mixotrophic condition.

pathway is active even under the autotrophic condition.

The high expression level of the genes coding for

The expression levels of all genes encoding the TCA

pyruvate kinase (pyk) (7,852.1±499.3) implies that thecycle enzymes were highly expressed under theglycolytic pathways is active under the mixotrophic

autotrophic condition (Table 1). The expression levels ofcondition.

genes coding for two key enzymes of the glyoxylate(6,639.4±1,395.9) implies that the gluconeogenetic

cycle showed a strange pattern; the expression level ofpathway is also active under mixotrophic condition.

isocitrate lyase (icl) was about 5-fold lower while that of

Almost all genes for the TCA cycle enzymes are highly

malate synthase (ms) was only about 2-fold lower thanexpressed. Thus, the TCA cycle is operative under thethat under heterotrophic condition.

mixotrophic condition. The high expression levels of the

The

high

expression

level

of

pps

genes coding for two key enzymes of the glyoxylate
Mixotrophic growth:

cycle, isocitrate lyase (7,931.3±2,917) and malate

The mixotrophic growth showed a long lag phase. In

synthase (3,955.4±704.2), suggest that the glyoxylate

fact, a lag phase continued for 27 hours before vigorous

cycle is active under the mixotrophic condition.

Figure 2. Growth profiles of strain TH-1 under the autotrophic, heterotrophic, and mixotrophic conditions.
White circles, white triangles, and white squares represent autotrophic, heterotrophic, and mixotrophic conditions,
respectively. Black triangles and black squares represent remaining butyrate concentration under the heterotrophic andmixotrophic conditions, respectively.
33

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)Although strain TH-1 has all the genes for EMP, it is

The growth of H. islandicus under the mixotrophic

unable to grow on hexoses such as glucose and fructose

condition with addition of butyrate (20 mM) and the gas. This might be explained by the lack the transport

phase consisting of H2/CO2/N2/O2 (40 : 10 : 40 : 10, by

system. No galactose permease system or proton-linkedvol.) is slower when compared with the autotrophic ortransport system for glucose was detected within theheterotrophic condition. In addition, a long lag phase,

genome. Similar phenomena were observed in the cases

which was observed in strain TH-1, was also observedof facultative chemolithoautotroph Hydrogenophilus

under mixotrophic growth of H. islandicus 11). However,hirschii and obligate chemolithoautotroph Thiobacillus

there has been no explanation for this observation.

25)

thiooparus and Thiobacillus neapolitanus

16, 23, 25).

Our experimental results can explain the phenomena.

Based on the genome sequence and gene expression

Under the autotrophic condition, the operation of

profiles of strain TH-1, we revealed the central metabolic

RubisCO induces an oxygenation reaction (Fig.3). In thispathway of strain TH-1 as shown in Fig. 1. We

case, RubisCO incorporates O2 into ribulose-1,5-

re-confirmed the operation of the CBB cycle under thebiphosphate to produce 2-phosphoglycolate (2PG) andautotrophic condition and suggested the concomitant

3-phosphoglycerate (3PG). 2PG will be converted into

operation of the CBB cycle and butyrate metabolic

glycolate by phosphoglycolate phosphatase (pgp) 15, 17).

system under the mixotrophic condition. Under the

In fact, the expression level of pgp under the autotrophic

heterotrophic condition with butyrate, the glyoxylate

condition was 2.9 fold higher than that under thepathway and the TCA cycle are presumed to beheterotrophic condition (Table 1). The product, glycolate,

opearative.

inhibits RubisCO, which results in reduced incorporation

Our data show that in strain TH-1 both autotrophic andof CO2 into the intermediates of the CBB cycle 5, 6).

heterotrophic metabolisms are operative under the

Therefore, accumulation of glycolate must be avoided.

mixotrophic condition with carbon dioxide and butyrate

Strain TH-1 has a metabolic system of glycolate, that is,

as carbon sources.

glycolate dehydrogenase (glcDH) and malate synthase

Mixotrophic growth with a number of organic(ms). Through the system, glycolate can be metabolized

substrates in an atmosphere containing hydrogen, oxygen,

via glyoxylate to malate. This may be the reason for theand carbon dioxide was reported for Alcaligenes

difference in the expression levels of isocitrate lyase (icl)eutrophus,

Paracoccus

and malate synthase (ms) as shown in the results section.

denitrificans strain "Vogt", Mycobacterium gordonae,

Autotrophically growing cells need malate synthase

Arthrobacter 11/x, and Hydrogenophilus islandicus

while the need is less for isocitrate lyase.

Pseudomonas

facilis,2, 25).

Figure 3. Presumed scavenging system for 2-phosphoglycolate, a product of oxygenase reaction of RuBisCO.
Oxygenase reaction of RuBisCO produces 2PG. Through transcriptome analyses, we presume the metabolic pathway of
2PG into malate as shown in the figure.

Also, from the figure, the metabolic importance for H 2O2 removal can berecognized. rbc: ribulose-bisphosphate carboxylase/ oxygenase, pgp: phosphoglycolate phosphatase, glcDH: glycolate
dehydrogenase, and ms: malate synthase.

34

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)Under the mixotrophic condition with butyrate andCO2, glyoxylate would come from two main sources: one
from glyoxylate cycle and the other from the 2PG

carboxylase/reductase:The

ethylmalonyl-CoA

pathway.

Acad.

Sci.

Proc.

Natl.

USA 104:

10631-10636.

metabolism. The transient accumulation of glyoxylate4) Flamholz A, Noor E, Bar-Even A, Liebermeister W,

might block the metabolism. The cells need to adjust the

Milo R. 2013. Glycolytic strategy as a tradeoff

metabolism so that 2PG and/or glycolate is metabolized

between energy yield and protein cost. Proc. Natl.

smoothly. Once such system works, the cells start to

Acad. Sci. USA 110: 10039-10044.

grow actively. This can be the reason for the presence of5) Glacoleva TA., Zalensky OV., Mokronosov AT. 1978.

the long lag phase.

OxygenThus, the concomitant function of phosphoglycolate

effectsonphotosynthesis

and

C

14

metabolism in desert plants. Plant Physiol. 62:

phosphatase, glycolate dehydrogenase, and malate

204-209.

synthase as a detoxification system for this bacterium,6) Gonzalez-Moro MB., Loureiro-Beldarrain I., Estavillo

might be physiologically significant. Still, details should

JM.,

Dunabeitia

MK.,

Munoz-Rueda

A.,

be clarified in future studies.

Gonzalez-Murua C. 2003. Effect of photorespiratory

The cells must rapidly detoxify reactive oxygenC2 acids on CO2 assimilation, PSII photochemistry

species (ROS) through various cellular enzymatic and/or

and the xanthophyll cycle in maize. Photosynth. Res.

non-enzymatic mechanisms (Fig. 3) . As can be seen in

78: 161-173.

1)

Fig. 3, metabolism of 2PG inevitably produces H2O2, a
typical ROS

26)7) Goto E., Kodama T., Minoda Y. 1977. Isolation and.

culture conditions of thermophilic hydrogen bacteria.

In the genome of TH-1, genes coding for superoxide

Agric. Biol. Chem. 41: 685-690.

dismutase (sod), catalase (cat), and peroxidases (ccpR,8) Goto E., Kodama T., Minoda Y. 1978. Growth and

ahpC, and bcp) were detected. The expression level oftaxonomy of thermophilic hydrogen bacteria. Agric.

the genes encoding superoxide dismutase (sod) andBiol. Chem. 42: 1305-1308.

peroxidases (ccpR, ahpC, and bcp) were strongly

9) Hayashi NR., Ishida T., Yokota A., Kodama T.,

enhanced under the autotrophic and mixotrophic

Igarashi Y. 1999. Hydrogenophilus thermoluteolus

conditions, suggesting that superoxide dismutase and/or

gen, nov., sp. nov., a thermophilic, facultatively

peroxidase is a primal detoxification system for ROS

chemolithoautotrophic,(Table 1). The fact that the mean expression signal ofbacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 49: 783-786.

ahpC was significantly high under all conditions implies

hydrogen-oxidizing10) Hayashi NR., Terazono K., Kodama T., Igarashi Y.

that alkyl hydroperoxide reductase is a key detoxifier for

2000.

Structureof

H2O2. Clarification of the ROS detoxification system iscarboxylase/oxygenase

also now under way in our laboratory.

thermophilic

ribulose
gene

1,5-bisphosphateclusterhydrogen-oxidizing

from

a

bacterium,

Hydrogenophilus thermoluteolus, and phylogeny of
Acknowledgments

the fructose 1,6-bisphosphate aldolase encoded byThis work was partly supported by The Iwatani Naoji

cbbA in the cluster. Biosci. Biotech. Biochem. 64:

Foundation’s Research Grant.

61-71.
11)

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36

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16, 37-45

ORIGINAL PAPER

Toyama K, Misu D, Kajitani R, Endo K, Fukazawa T,
Yatsunami R, Ito T, Fukui T and Nakamura S

Characterization of a novel multi-domain chitinase fromalkaliphilic Nocardiopsis sp. strain F96
School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, Yokohama, Japan.
Corresponding author: Satoshi Nakamura, nakamura.s.af@m.titech.ac.jp
Phone: +81-45-924-5765; Fax: +81-45-924-5837
Received: Dec. 5, 2017 / Revised: Dec. 23, 2017 / Accepted: Dec. 26, 2017
Abstract

Alkaliphilic actinomycete Nocardiopsis sp.

Introduction

strain F96 has been found to produce a single domain

Chitin is the second most abundant biomass on Earthglycoside hydrolase (GH) family 18 chitinase (ChiF1).

next to cellulose. It is a -1,4-linked polysaccharide

Recently, genome sequencing of strain F96 wascomposed of N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) units incompleted and three other homologs of GH18 chitinases

a linear form. Chitin chain can assemble in a crystalline

were found. One of the chitinase homologs, ChiF3, has astructure by many intramolecular hydrogen bonds14).

multi-domain architecture. The number of domains in

Therefore, chitin does not solve under neutral or alkaline

ChiF3 is the most various among the four GH18

conditions, although it shows trace solubility in acidic

chitinase homologs. It contained a signal peptide, asolutions14).

carbohydrate-binding module family 2 chitin-binding

Chitinases (EC 3.2.1.14) hydrolyze -1,4 glycosidic

domain (ChBD), a Fibronectin type Ⅲ-like domain, andbonds of chitin. Catalytic domains (CatDs) of chitinases

a GH18 catalytic domain including a chitinase insertionare classified into two glycoside hydrolase (GH) families

domain. C-terminally His-tagged ChiF3 was expressed in

18 and 193, 6). The GH18 chitinases are found in bacteria,infungi, plants and animals; the GH19 chitinases, on thecomparison with ChiF1. Both ChiF1 and ChiF3 showed

other hand, have been identified mostly in plants. ChiC

bimodal pH profiles. Especially, ChiF3 maintained highfrom Streptomyces griseus is the first GH19 chitinase

activity at pH 7.5-9.4 and showed the highest activity at

isolated from an organism other than plants16). Bacterial

pH 8.5, which is the highest of all the known chitinases

GH19 chitinases are then identified in other bacteria

from actinomycetes. ChiF3 having ChBD showed higher

including actinomycetes20, 23). Actinomycetes are now

binding ability toward insoluble chitin compared toknown as potent producers of chitinases of both families.

ChiF1, which does not have ChBD. Furthermore, theBecause of the insoluble nature of chitin, some chitinases

ratio of specific activity of ChiF3 toward insoluble andcontain one or more chitin-binding domains (ChBDs),soluble substrates [Insoluble/Soluble] is 15.2 times

which are known to help CatDs in hydrolyzing insoluble

higher than that of ChiF1. This difference of substrate

substrates. ChBDs may contribute to (i) anchoring ofpreference of both enzymes might be related to the

CatDs on to insoluble crystalline substrates, (ii)presence or absence of ChBD.

processive mode of action, and (iii) perhaps even local

Escherichia

coli,

purifiedandcharacterized

disruption of the substrate structures9).
Key words: GH18 chitinase, chitin-binding domain,alkaliphilic Nocardiopsis sp.

As chitin hardly dissolves in alkaline solutions, achitinase that could act on chitin at alkaline conditions
should have high ability for degrading insoluble
crystalline

37

chitin.

However,few

chitinases

fromJournal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)alkaliphilic microbes have been known to date21).

Recombinant plasmid pETchiF1 encoding precursor

Alkaliphilic actinomycete Nocardiopsis sp. strain F96,

ChiF15) and vector plasmid pET-21b(+) (Novagen) was

isolated from a soil sample at Fuji city in Shizuoka

used in this study.

prefecture, Japan, has been found to produce a chitinase

StrainF96

wascultivated

at

37°C

in

an

(named ChiF1) . The nucleotide sequence of cloned

chitin-containing alkaline medium [1% polypeptone,

chiF1 gene revealed that ChiF1 had a single domain

0.5% yeast extract, 0.1% K2HPO4, 0.02% MgSO4･7H2O,

structure composed of a GH18 CatD. The cloned chiF1

1% Na2CO3, pH 10.2]. E. coli strains carrying

gene was expressed in Escherichia coli and recombinant

recombinantChiF1 was characterized.

Luria-Bertani (LB) broth5)

Recently, genome sequencing of strain F96 was

plasmids

were
17)

grown

at

37°C

in

containing 50 g/ml of

ampicillin.

completed, and three other GH18 chitinase gene
homologs (named chiF2, chiF3 and chiF4) were found(unpublished data). These chitinases including ChiF1
have

different

domainarchitectures

each

Construction of expression plasmids
pETchiF1 was used as a template for construction ofother.

the expression plasmid encoding mature ChiF1. Inverse

Especially, mature ChiF3 is composed of three domains

PCR was performed using primers mChiF1-inverse-s andthat are most various among the four GH18 chitinases

mChiF1-inverse-a, and then self-ligated to constructfrom strain F96. In this study, chiF3 gene was

pET-n/ChiF1. Next, pET-n/ChiF1 was used as a template

PCR-amplified and expressed in E. coli. Recombinant

for construction of the expression plasmid encoding

ChiF3 was purified and characterized in comparison with

C-terminally His-tagged mature ChiF1. Inverse PCR was

ChiF1.

performed using primers mChiF1His-inverse-s andmChiF1His-inverse-a, and then self-ligated to construct

Materials and methods

pET-F1His.

Strains, plasmids and media

from the genomic DNA of strain F96 using primers

A DNA region encoding mature ChiF3 was amplified
Alkaliphilic Nocardiopsis sp. strain F965) was used as
the DNA donor.

mChiF3-s(containing

NdeI

site)

and

mChiF3-a

Escherichia coli JM109 (Takara Bio,(containing His-tag sequence, stop codon and BamHI

Kusatsu, Japan) was used as a host strain for plasmidsite). The PCR product was ligated into the NdeI/BamHI

construction; E. coli BL21(DE3) (Novagen, Madison,site of pET-21b(+) to obtain pET-F3His.

WI) was used as a host strain for chitinase gene
expression.

Sequences of the primers used in this study are shownin Table 1.

38

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)DNA sequencing(70%

deacetylated

chitin;kindlyprovidedby

DNA sequences were determined using an ABI

Dainichiseika Color & Chemicals, Tokyo, Japan)

PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems,

dissolved in 40 mM acetic acid. After electrophoresis,

Waltham, MA). For sequencing reactions, a BigDyethe gel was washed four times for 30 min in 20 mM

Terminator v3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit

Tris-HCl buffer (pH 7.5) [the first two washes contained(Applied Biosystems) was used. If necessary, 10%

25% (vol/vol) isopropyl alcohol] to remove SDS and(vol/vol) of dimethyl sulfoxide was added to the reaction

renature proteins in the gel, and further incubated at

mixtures.

with

37°C in the buffer over night. Active bands were thenTokyo,

visualized as clear zones (halos) by staining the residual

Sequence

GENETYX-MAC

data

ver.16.0.0

were

analyzed(GENETYX,

Japan).

substrate with CBB.

Nucleotide sequence accession number

Protein measurement

The nucleotide sequence data reported here would

The protein concentration was determined by theappear in DDBJ/EMBL/GenBank databases under the

Lowry method12) using a Bio-Rad DC Protein Assay Kit

accession number LC331094.

(Bio-Rad, Hercules, CA) with bovine serum albumin as astandard.

Expression and purification of recombinant ChiF1
and ChiF3

Enzyme assay

E. coli BL21(DE3) cells harboring pET-F1His and

The standard assay for chitinase activity was carried

pET-F3His were cultured at 37°C in LB broth containingout by measuring the amount of reducing sugars

50 µg/ml of ampicillin. When the optical density of theliberated from a soluble substrate, Daichitosan M, or anculture at 660 nm reached 0.4-0.6, isopropyl--D-insoluble substrate, chitin (Funakoshi, Tokyo, Japan), by

thiogalactopyranoside was added to the culture (final

the modified Schales’ method8) with GlcNAc as aconcentration of 0.5 mM) to induce gene expression, andstandard. Hydrolytic activity toward soluble chitin was

incubation was continued for further 3 hours. The cells

determined by mixing 40 l of purified enzyme, 40 l ofwere harvested by centrifugation (7,000 x g, 4°C, 10

0.5 % Daichitosan M solution in 40 mM acetic acid andmin) and suspended in 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5).

190 l of 80 mM Britton-Robinson buffer (pH 8.0)1) at

Then the suspention was sonicated and centrifugated

37°C for 15 min. The enzyme was inactivated by adding(20,400 x g, 4°C, 10 min) to prepare cell-free extracts.

360 µl of potassium ferricyanide reagent (0.050%

C-terminally His-tagged recombinant ChiF1 and ChiF3

K3[Fe(CN)6] and 0.50 M Na2CO3) and boiled for 15 min.

were purified from the cell-free extracts by affinity

The mixture was centrifugated (20,400 x g, 4°C, 10 min)chromatography using Ni Sepharose 6 Fast Flow (GEto remove insolubles, and absorbance of the supernatant

Healthcare, Chicago, IL). Enzyme-containing fractions

was measured at 420 nm. One unit was defined as thewere dialyzed in 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) at 4°C,

amount of enzyme that produces reducing sugars

and then concentrated using an Amicon Ultra 10K device

equivalent to 1 µmol of GlcNAc per min under the(Merck Millipore, Billerica, MA) for ChiF1 and 30K

conditions described above. Hydrolytic activity toward

device (Merck Millipore) for ChiF3. Enzyme purity was

insoluble chitin was assessed by vigorously mixing 120

verifiedµl of purified enzyme, 5.0 mg of insoluble chitin and 280

bysodiumdodecylsulfate(SDS)-

polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).

µl of 80 mM Britton-Robbinson buffer (pH 8.0) at 37°C
for 20 min. The mixture was centrifugated (20,400 x g,

SDS-PAGE and zymogram analysis

4°C, 10 min), and the amounts of generated reducing

SDS-PAGE was performed using a 12.5% gelaccording to the method of Laemmli

10)in the presence of

5% 2-mercaptoethanol. Proteins were stained with
Coomassie brilliant blue R-250 (CBB) (Nacalai Tesque,
Kyoto, Japan). For zymogram analysis, a 12.5%
polyacrylamide gel containing 0.01% Daichitosan M

39sugars in 300 µl of the supernatant were measured by themodified Schales’ method. One unit was also defined as
described above.

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)Insoluble chitin-binding assaypellet was separated by centrifugation to obtain wash 1

Six milligrams of insoluble chitin (Nacalai Tesque)and 2 fractions, respectively. Protein concentrations of

was suspended in 300 µl of chitinase solution (final

enzymeconcentration 1.7 µM) in 40 mM Britton-Robinson

pass-through, wash 1 and 2 fractions obtained after

solution

beforebindingreaction,andbuffer (pH 8.0), and continuously mixed at 4°C for 1

binding reaction were determined by the Lowry method.

hour. Then, the mixture was centrifugated (20,800 x g,

Insoluble chitin-binding rate (%) was calculated from the

4°C, 1 min) and the supernatant was collected as adecrease in protein amount of enzyme solution afterpass-through fraction. After washing two times by 80

binding reaction.

mM Britton-Robinson buffer (pH 8.0), insoluble chitin

Fig. 1

Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of chiF3 gene.

The deduced amino acid sequence of ChiF3 is shown in one letter code below the nucleotide sequence. A putative
signal sequence, a CBM2 ChBD, an FnⅢD and a GH18 CatD correspond to the regions Met1-Ala31, Tyr37-Cys136,
Pro148-Tyr234 and Val250-Asp636, respectively. A CID, corresponding to Tyr541-Tyr607, is inserted in the GH18
CatD.

40

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)Results

has a multi-domain architecture, andcontains a

N-terminal carbohydrate-binding module (CBM) family
DNA sequence and protein structure

23, 6) ChBD, a Fibronectin type Ⅲ-like domain (FnⅢD),

Four GH18 chitinase gene homologs, chiF1, chiF2,

and a GH18 CatD inclucing a chitinase insertion domain

chiF3 and chiF4, were found on the genome of strain(CID) (Fig. 2). FnⅢDs exist in many chitinases and are

F96. The nucleotide and deduced amino acid sequences

thought to play a role of the linker between ChBD andof chiF3 gene are shown in Fig. 1. The amino acid

CatD. GH18 CatDs take ()8-barrel (TIM barrel) folds.

sequence of ChiF1 has been examined5) and it consists of

CID is composed of five or six anti-parallel -strands

only a GH18 CatD. The open reading frame (ORF) of

and one -helix, and it inserts between the seventh

chiF3 gene was searched on BLAST, and using

-helix and seventh -strand of the TIM barrel11, 18).

GENETYX-MAC software, the cleaving site by signal

Although CID forms a deep substrate-binding cleft, thepeptidase was estimated. The results of BLAST searchfunctional role of CID is unclear. The number ofand computational analysis revealed that it encodes adomains in ChiF3 is the most various among the four

polypeptide comprising a signal peptide (31 amino acids)

GH18 chitinases produced by strain F96.

and a mature enzyme (620 amino acids). Mature ChiF3

Fig. 2

Schematic structure of mature ChiF1 and ChiF3 from strain F96.

CatD: GH18 catalytic domain, ChBD: CBM2 chitin-binding domain, FnIIID: Fibronectin type Ⅲ-like domain, CID:
Chitinase insertion domain.
Expression and purification of chitinases
Expression

plasmids

encoding

C-terminallyHis-tagged mature ChiF1 and ChiF3 were prepared andtransformed into E. coli. Zymogram analysis of thecell-free extracts from E. coli cells harboring expression
plasmids was performed, and single active bands wereconfirmed in both ChiF1 and ChiF3 (data not shown). It
indicates that active ChiF1 and ChiF3 were successfully
expressed in E. coli. Then, E. coli-produced ChiF1 andChiF3 were purified by affinity chromatography. The
purified enzymes exhibited single protein bands on
SDS-PAGE (Fig. 3).

Fig. 3

SDS-PAGE of purified ChiF1 and ChiF3.

Purified chitinases were electrophoresed using a 12.5%
gel and stained with CBB. Lane M: molecular mass
markers, lane 1: purified ChiF1 (1.01 µg), lane 2:
purified ChiF3 (0.740 µg).

41

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)pH and temperature profiles of hydrolytic activity

activity at pH 7.5-9.4 and showed the highest activity at

toward soluble chitin

pH 8.5. ChiF3 also showed the small maximal value at

The effects of pH and temperature on soluble chitin

pH 3.1, while the activities at pH 3.9-5.9 were quitedegradation of ChiF1 and ChiF3 were investigated. Bothlower. The optimal pH of ChiF3, pH 8.5, is the highest of

enzymes showed bimodal pH profiles (Fig. 4).

ChiF1

all the known chitinases from actinomycetes including

showed the highest activity at pH 3.9 and the second

ChiF12, 5, 20). As shown in Fig. 5, the optimal temperature

highest at pH 7.5, while the activity at pH 5.9 was theof ChiF1 and ChiF3 were 55°C and 50°C, respectively.

lowest. On the other hand, ChiF3 maintained highFig. 4

Effect of reaction pH on the activity of ChiF1 and ChiF3.

Chitinase activity was measured using 0.2% Daichitosan M as a soluble substrate. Reaction was performed at 37°C for
10 min. Britton-Robinson buffers (80 mM, pH 2.0-12.0) were used to adjust the reaction pH. Open circles: ChiF1,
closed circles: ChiF3.

Fig. 5

Effect of reaction temperature on the activity of ChiF1 and ChiF3.

Chitinase activity was measured using 0.2% Daichitosan M as a soluble substrate. Reaction was performed at pH 8.0 for
10 min. Open circles: ChiF1, closed circles: ChiF3.
42

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)Binding abilities toward insoluble chitin

Most of ChiF1 molecules, which does not have a ChBD,

Binding abilities of ChiF1 and ChiF3 toward insoluble

localized in the pass-through and wash fractions, andchitin were evaluated. The binding reactions were carriedbinding rate was only 33.8%. On the other hand, ChiF3

out at pH 8.0, 4°C for 1.0 hour. Table 2 shows themolecules, which has a ChBD, barely exsisted in therelative protein concentration of each fraction andpass-through and wash fractions, and 83.7% of ChiF3

insoluble chitin-binding rate estimated from the data.

bound toward insoluble chitin.

Hydrolytic activities toward insoluble chitin

toward soluble chitin was far higher than that of ChiF3.

Chitin-hydrolytic activities of ChiF1 and ChiF3

The substrate preferences of both enzymes can be

toward insoluble and soluble substrates were measured at

estimated by dividing the specific activity toward

pH 8.0, 37°C for 20 min and 15 min, respectively. As

insoluble chitin by that toward soluble chitin. The ratio

shown in Table 3, ChiF1 and ChiF3 showed almost theof specific activity of ChiF3 toward insoluble andsame level of hydrolytic activities toward insoluble chitinsoluble substrates [Insoluble/Soluble] is 15.2 times

each other. However, the hydrolytic activity of ChiF1

higher than that of ChiF1.

Discussion

-strands and one -helix, and it inserts between theseventh -helix and seventh -strand of the TIM barrel11,

Four GH18 chitinase gene homologs were found on the
genome of strain F96. The deduced amino acid sequence18). Although CID forms a deep substrate-binding cleft,

the functional role of CID is unclear.

of chiF3 gene revealed that ChiF3 contained a signal

ChiF3 was expressed in E. coli, purified andpeptide, a CBM2 ChBD, an FnⅢD, and a GH18 CatD

characterized in comparison with ChiF1. The effects ofincluding a CID. GH18 CatDs take ()8-barrel (TIM

reaction pH and temperature on chitin-hydrolytic activity

barrel) folds. CID is composed of five or six anti-parallelof ChiF1 and ChiF3 were investigated using Daichitosan

43

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)M (70% deacetylated chitin) as a soluble substrate. Bothhydrolases, such as cellulases, xylanases and chitinases,

ChiF1 and ChiF3 showed bimodal pH profiles. The

have been known to enhance hydrolytic activity towardsurface charges and structures of both enzymes andinsoluble substrates by anchoring enzymes to theirsubstrate

thesubstrates15, 19, 21). A GH18 chitinase (ChiJ) fromenvironmental pH, and the enzymes might fit to thealkaliphilic Bacillus sp. strain J813 contains a CBM5

substrate at two different pHs. Especially, ChiF3 showed

ChBD, and also prefer the insoluble chitin as a

maximal activity at pH 8.5, which is the highest of all thesubstrate21). CBM5 ChBD of ChiJ was also shown to be

known chitinases from actinomycetes. As Daichitosan M,

important for binding and hydrolytic activities toward

as well as chitin, hardly dissolves in alkaline solutions,insoluble chitin. CBM5s are known to interact with

ChiF3 would potentially be effective for hydrolysis ofpolysaccharides via aromatic residues exposed on theinsoluble chitin substrates. On the other hand, ChiF1

protein surfaces21). CBM5 ChBD of ChiJ contains two

showed the highest hydrolytic activity at pH 3.9. Since

surface-exposed aromatic residues, Trp541 and Trp542,

Daichitosan M relatively dissolves in acidic solutions,and these residues have been shown to contribute to

ChiF1 would prefer soluble chitin substrates compared toinsoluble

insoluble ones. The optimal temperatures of ChiF1 andHowever, the insoluble chitin-binding mechanism of

ChiF3 were 55°C and 50°C, respectively. Concerning

CBM2 ChBD of ChiF3 is still unknown. Although someenzymes from mesophilic microbes, alkaline enzymes

CBMs, including CBM2, have been reported to disrupt

generally show higher optimal temperatures compared tothe substrate structures4, 13, 22), functions of CBM2 ChBD

neutral enzymes7). Alkaline enzymes would take robustof ChiF3 besides insoluble chitin-binding are not

structures in alkaline conditions and might maintain theirelucidated yet. Further works are now underway tostructures also under high temperatures.

clarify the insoluble chitin-binding mechanisms andwouldchangecorresponding

toThe binding abilities of ChiF1 and ChiF3 towardchitin-bindingbymutational

analysis21).

other functions of CBM2 ChBD of ChiF3.

insoluble chitin were evaluated. Insoluble chitin-binding
rate of ChiF3 was greatly higher than that of ChiF1.

Acknowledgements

CBM2 ChBD of ChiF3 might contribute to the higher

The authors thank the Biomaterials Analysis Division,

binding ability of ChiF3. On the other hand, about 34%

Tokyo Institute of Technology for DNA sequencing. Thisof ChiF1 also bound to insoluble chitin. Since ChiF1 iswork was partially supported by JSPS KAKENHI Grant

composed of only a CatD and does not have ChBD, theNumber JP16K05839.

CatD of ChiF1 might have partial binding ability toward
insoluble chitin. Amino acid sequence identity between

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hydrolytic

activity

againstinsoluble

chitinsubstrates. To clarify this, hydrolytic activities of ChiF1

production

by

the

soil

actinomycete

104-110.

and ChiF3 toward the insoluble chitin were estimated.

3) Cantarel, B. L., Coutinho, P. M., Rancurel, C., Bernard,

The ratio of specific activities of ChiF3 toward insoluble

T., Lombard, V., and Henrissat, B. 2009. The

and soluble substrates [Insoluble/Soluble] was 15.2 times

Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): anhigher than that of ChiF1. Therefore, ChiF3 would

expert resource for Glycogenomics. Nucleic Acids Res.

hydrolyze insoluble chitin effectively, while ChiF1

37: Database issue D233-D238.

would prefer the soluble chitin. This difference in4) Din, N., Gilkes, N. R., Tekant, B., Miller, R. C. J.,

substrate preference of both enzymes might depend on

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)MINI REVIEWJournal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16, 46-53

Furuki T. and Sakurai M.

Molecular Feature and Functions of LEA model peptides
as desiccation protectants
乾燥ストレス応答 LEA タンパク質を模倣した合成ペプチドの分子科学的特徴と機能
東京工業大学

バイオ研究基盤支援綜合センター
古木隆生

櫻井

実

Center for biological resources and informatics, Tokyo Institute of Technology, 4529 Nagatuda, Midori-ku, Yokohama
226-8503, Japan
Corresponding Author: Minoru Sakurai, sakurai.m.ab@m.titech.ac.jp
Phone: +81-45-924-5795, Fax: +81-45-924-5795
Received: Nov. 21, 2017 / Revised: Feb. 27, 2018 / Accepted: Feb. 27, 2018
Abstract

Group-3 late embryogenesis abundant

polar head groups of phospholipid molecules. In addition,(G3LEA) proteins play important roles in the acquisition

the LEA model peptides are capable not only ofofsuppressing the desiccation-induced aggregation ofdesiccation

tolerance

in

some

anhydrobioticorganisms such as African sleeping chironomide. From

proteins such as lysozyme and-casein, but also of

their primary amino acid sequences, the potential

preserving the catalytic activities of electrostaticallyfunctional sites are inferred to be located at segments thatdifferent enzymes such as lactate dehydrogenase andinclude several times repeats of 11-mer motifs, such as-D-galactosidase, whose pI values are 4.6 and 8.2,

AKDGTKEKAGE, characteristic of G3LEA proteins. So

respectively. On the basis of these results, the LEA

far, we have investigated the structural and functionalmodel peptides developed by our group are expected toproperties of chemically synthesized 22-mer or 44-mer

be applicable to dry preservation of a variety of

peptides that include one of the consensus 11-mer motifs

biological molecules.

identified by bioinformatics analysis for various G3LEA
proteins. Our findings to be noted are as follows. Such

キーワード: LEA タンパク質、乾燥保存、リポソー

LEA model peptides can reproduce the structural features

ム、タンパク質凝集、酵素活性of the parent G3LEA proteins: they are disordered inwater, whereas they adopt

1. LEA タンパク質-helical coiled coil structurein the dry state. The dried peptides are in the glassy state

生物の体の６０～７０％は水からなり、これによup to 100 C, and have the ability of reinforcing theって生命活動に不可欠なタンパク質、核酸、及び細glassy matrix of co-existing sugar such as trehalose.

胞の構造と機能が維持されている。それ故、生物がMore importantly, the LEA model peptides have

極度の乾燥ストレスに曝されると多くの場合は死にprotective activities on various biological molecules

至る。しかし、生物の中には、アフリカの半乾燥地

against the desiccation stress. For example, they exhibit

帯に生息するネムリユスリカのように、カラカラに

anti-fusion effect on liposomes in the dry state by

乾燥しても生体組織は蘇生可能な状態を保ち、給水

covering the membrane surface through the interactions

すれば再び生命活動を開始することができるものも

between the side chains of their Lys residues and the

いる 25)。このような乾燥耐性能力を獲得する上で重º46Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)要な役割を果たす環境ストレス応答タンパク質の１をもつ両親媒性の立体構造を形成する 4)。一方、酵つとして、LEA(late embryogenesis abundant)タンパク

素やリポソームを用いた in vitro 実験等によって。LEA タンパク質のLEA タンパク質に関する機能検証が積み重ねられ名前は、元々の発見が胚発生後期の植物種子である

た結果、細胞骨格説 24)「LEA タンパク質は、水の替質が古くから知られている

11,23)

3)ことに由来する 。現在では、ネムリユスリカの他、わりに細胞内の空隙を埋めると同時に鉄筋のような乾燥に強い線虫やアルテミアなど動物からも見つか働きをして細胞の機械的強度を保つ。
」、及び分子遮っている

11,23)

蔽(シールディング)効果説 2)「LEA タンパク質は、。

LEA タンパク質は、アミノ酸配列のモチーフや遺細胞膜やタンパク質の表面を覆うことによって、生伝子発現パターンの違いからいくつかのグループに体分子同士の衝突及びそれに伴う凝集や変性を未然分類されている11,23)。今までのところ、動物から発に防ぐ。
」が、それぞれ提唱されている。

見された LEA タンパク質の多くはグループ３に属する 11,23)。LEA タンパク質のアミノ酸配列は、緩や２．LEA ペプチドの分子科学的特徴

かに保存された 11 アミノ酸配列(以下、11-mer モチ

LEA タンパク質の機能ドメインは、11-mer モチーーフ)の繰り返し部分とそれ以外の部分から成る

フのリピート部分と推定される。われわれは、この

11,23)。LEA タンパク質の分子量は一定ではなく、且作業仮説のもと、11-mer モチーフの繰返しからなるつ 11-mer モチーフが各々LEA タンパク質の全アミ

低分子ペプチド(以下、LEA ペプチド)を４種類化学ノ酸配列に占める割合も一定ではない。一方で、合成した(表 1)20)。比較のため、表 1 に示す PvLEA-22

11-mer モチーフの 1、2、5、9 番目は疎水性アミノとアミノ酸組成は同じだが、配列が異なるペプチド酸が、3、7、11 番目は負電荷をもつアミノ酸が、そ(以下、Scramble)も化学合成した。これら５つのペプ

して、6 及び 8 番目は正電荷をもつアミノ酸が占め

チドの二次構造をフーリエ変換赤外吸収(FT-IR)ス

4)

ペクトル測定によって決定した 5,20)。その結果、水ることが多い 。
LEA タンパク質の大きな特徴の１つはその立体中（重水）では５つともランダムコイル構造であっ構造である。このタンパク質は所謂天然変性タンパ

た。しかし、含水率５%程度以下まで乾燥した状態

ク質に属し、水溶液ではランダムコイル状態である。

では、４つの LEA ペプチドはすべて α-ヘリカルコ

しかし、純粋な LEA タンパク質を乾燥すると、主にイルドコイル構造であり、いずれも天然の LEA タン

α-へリックス構造へと変化し、且つ水和及び乾燥のパク質に見られる構造の特徴を再現した 5,20)。しか

両状態間で可逆的な立体構造転移を示す 11,23)。コン

し一方、Scramble は十分乾燥してもランダムコイル

ピュータモデリングによれば、11-mer モチーフの繰構造のままであったことから、乾燥に伴う構造転移

り返し部分がα-へリックス化すると、前述したアミはアミノ酸配列特異的であることが分かった 5,20)。

ノ酸配列の特徴から、疎水性の側面と親水性の側面

47

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)重量濃度 1%程度の LEA ペプチド水溶液をテフロンプレート上に滴下(～50

３．リポソームの融合防止

L)し、十分に乾燥すると、― 実験による検証 ―無色透明の極薄のフィルムとなる。これを示差走査
熱量計(DSC)で測定すると、
LEA ペプチドは約 100℃
までガラス状態であることが分かった

5,20)

3-1. LEA ペプチドによるリポソームの融合防止効果
リポソームはリン脂質が二重層になって球状のカ。このガ

プセル状に会合した小胞体であり、細胞膜のモデル

ラス転移温度は、Scramble のそれと比べると 20℃ほとしてよく用いられる。我々は、リン脂質として。ガラス状態では分子の配置に規則性

POPC(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylch

はなく熱力学的に準安定状態である。このため、エoline)を用い、extrusion 法 16)により 100 nm サイズのンタルピー緩和と呼ばれる経年劣化が徐々に起こる。

リポソーム水溶液(20mg/ml)を調製し、そこへ所定のDSC 測定で熱物性を詳しく調べると、LEA ペプチド

濃度で LEA ペプチドを添加した。それ故、以下に述は Scramble と比べてエンタルピー緩和の活性化エネ

べる実験結果では、ペプチドはリポソームの外側のルギーが大きく、ガラス状態の安定性が相対的に高みに存在する。乾燥前及び３日間乾燥後に再水和し

ど高かった

20)

いことが判明した20)。

て得たリポソーム水溶液の粒径分布を動的光散乱法

ネムリユスリカなど乾燥耐性のある生物には、乾により測定した。図１の一番下の点線に示すように、

燥保護物質としてトレハロースという二糖類が大量

乾燥前は直径 100 nm 近傍に粒径分布のピークがあに含まれ、しかも体内に均一に分布する 19)。
そこで、る。この結果は、ペプチドの有無に関係なく同じで

LEA ペプチドとトレハロースの混合乾燥試料をあった 7)。しかし、無添加の状態で乾燥し再水和しFT-IR スペクトルの温度依存性に基づいて解析した

た後の粒径分布(実線)は乾燥前とは著しく異なり、結果、両成分の相乗効果によって、各成分単体の場

ピークは 900 nm 付近にシフトしリポソームは原型

合よりも安定なガラス状態を形成することが分かっを留めていなかった(図１)。次に、LEA ペプチドの。このことから、ネムリユスリカなど蘇生可能

１つ PvLEA-22 を、全リン脂質に対してモル比率 0.1

な乾燥細胞では、「LEA タンパク質の 11-mer モチー

以上で添加して試験した結果、当該モル比率が 0.7

フのリピート部分が α-へリックス構造を形成し、そまで増加すると乾燥前後でよく一致した粒径分布がの骨格間の空隙を埋めるトレハロースと協調して堅得られた (図１)。この結果は、Scramble でも同様の固なガラスが形成される。
」と推定される。

結果であった (図 1)。一方、11-mer モチーフを構成た20)

する主要アミノ酸であるグルタミン酸やリジンの各々ホモペプチドを添加した場合では、乾燥後の粒径分布は乾燥前と異なっていた(図 1)。

図1

リポソーム水溶液の粒径分布

実線はすべて乾燥・再水和後の結果を示す。

48

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)次に、前述した高モル比率(～0.7)条件での粒径分た。その後、リン脂質膜表面から遊離することなく、布測定の結果が、リポソームの融合を抑制したこと

100 ns 後には膜の表面上で伸展したコンフォメーシに起因するのかどうかを確かめるため、蛍光分子(カョンに変わって結合した。図 2 には、LEA ペプチドルセイン)を封入したリポソームを作製して漏出試を 8 個含む系で行ったシミュレーションの 100 ns 後験を行ったところ、ペプチドを添加していない試料のスナップショットを示した。LEA ペプチドは、ではすべてのカルセインが漏出してしまったが、各々異なったコンフォメーションをとっているが、LEA ペプチドの１つである PvLEA-22 を添加した場

いずれもリン脂質膜表面との接触面積が大きくなる

合には 60%近いカルセインの保持率が得られ、リポように結合している。最も重要な点は、LEA ペプチ

7)

ソームの融合が防止されたことを確認できた 。

ド同士が会合や凝集することなく、リン脂質膜表面

上記のリポソームは直径 100 nm サイズで、市販のへ優先的に結合していることである。このような。しかLEA ペプチドの特性は、リン脂質二重膜に対してし、細胞の大きさと比べると約 100 分の１である。

LEA ペプチドが分子シールディング効果を発揮す

そこで、超音波振動子(積層圧電アクチュエータ)をるために不可欠である。

キットを用いても作製可能で一般性は高い

16)

を用いて細

LEA ペプチドとリン脂質二重膜の結合部位を拡

胞サイズのリポソームを作製し、乾燥前後の粒径分大表示したものを図 3 に示す。これを見ると、Lys

布測定によって LEA ペプチドの効果を検証した 9)。

残基の側鎖が膜の内側に向かって配向し、正電荷をその結果、直径 100 nm サイズのリポソームと同様、持つ Lys 側鎖のアミノ基が負電荷をもつリン脂質の

LEA ペプチドによる乾燥保護効果が認められた 。

リン酸部やエステルの酸素原子に近接しており、こ用いたエレクトロフォーメンション法

21)

9)

れらの分子間で静電的相互作用や水素結合が形成さ3-2. LEA ペプチドによるリポソームの融合防止メカ
ニズムれている。一方、負電荷をもつ酸性残基(Glu、Asp)―計算機シミュレーション―

は、正電荷をもつリン脂質のコリン基近傍に位置しLEA ペプチドと POPC リン脂質膜の相互作用の詳ていた(データ省略)。LEA ペプチドは、塩基性残基細を解明するため、分子動力学シミュレーションを(Lys)と酸性残基を同数もつが、それぞれがリン脂質行った 9)。計算方法の詳細は原著論文 9)に譲るが、二重膜の表面近傍に存在する正及び負の化学基と引以下に述べるのは水溶液中を想定したシミュレーシ

力相互作用をするので、リン脂質二重膜との間に全ョンの結果である。まず、LEA ペプチド１個をリン体として安定的な結合を形成すると考えられる。そ

脂質二重膜表面から約 5 nm 離した状態からシミュの結果、乾燥時には細胞膜同士の直接の接触を妨害

レーションを行ったところ、開始 5 ns 後に LEA ペ

し、細胞の融合・凝集を防ぐと推定される。

プチドはリン脂質二重膜の表面付近に移動し接触し

図２

LEA ペプチドが 8 つの場合の計算機シミュレーション

49

100 ns 時のスナップショット

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)図３ 計算機シミュレーション 100 ns 時のスナップショットを拡大

リジンの側鎖が膜の表面から深く浸潤した様子
４．タンパク質の凝集抑制

ゼインの乾燥誘導凝集を抑制した。一方で、LEA ペ変性などによってタンパク質の凝集が誘起される

プチドを加えた場合、モル比 PvLEA-22/α-カゼインと水溶液は白濁する。この現象を利用して、乾燥にが 25 及び 50 のときには、乾燥に伴う凝集は抑制さ

伴 う リ ゾ チ ー ム の 凝 集 に 対 す る LEA ペ プ チ ドれた。しかし、このペプチドをモル比 10 の濃度で α-

PvLEA-22 の効果を調べた 6)。その結果、無添加の場

カゼイン水溶液に加えたときには、直ちに激しい凝合、乾燥後に再水和して得たリゾチーム水溶液の濁集が生じた。光学顕微鏡の写真で大きな塊の存在が度は、乾燥前に比べて顕著に増加した。即ち、リゾ見て取れた。このような一見複雑な現象もまた等電チームの凝集が起こった。しかし、リゾチームに対点 pI の効果で説明できる。α-カゼインの pI は 4.2 でしてモル比２以上の PvLEA-22 を予め加えておくと、

ある 6)。それゆえ、少なくとも溶液の pH が 7 以上に乾燥前後でリゾチーム水溶液の濁度はほぼ同じであ保たれている限り α-カゼイン水溶液に凝集は起こら

り、リゾチームの凝集が抑制された。一方、比較のない。しかし、グルタミン酸(pH=3)やクエン酸ナト

ため、線虫由来の LEA タンパク質 AavLEA1 についリウム(pH=4)を α カゼイン水溶液にモル比 50 の濃度てリゾチームに対する効果を調べたところ、で加えると凝集が起こった 6)。おそらくこれは、同AavLEA1 の濃度の増加と共に、むしろ凝集は促進さ

水溶液の pH が酸性側にシフトした結果、α-カゼイ

れた。この結果は、次のように説明できる。リゾチ

ンの正味電荷がほぼゼロになり溶解度が著しく低下

ーム、PvLEA-22 及び AavLEA1 の等電点 pI は、それした為と思われる。α-カゼイン水溶液に PvLEA-22

ぞれ 9.1、7.2 及び 5.7 と見積もられる 6)。従って、をモル比率 10 の濃度で加えると pH が約４までシフ

生理的及びこれと類似する条件下では、リゾチーム

トしたことから、グルタミン酸やクエン酸を加えたと AavLEA1 は互いに反対の符号をもつ電荷を帯びときと同様に凝集が起こったと推定される。

ているはずである。水溶液中では水による静電的遮一方、前述したモル比率 PvLEA-22/α-カゼインが蔽効果が十分働いて凝集は起こらない。しかし、乾25 以上における α-カゼインの凝集低下は、Scramble

燥状態では、強い静電的相互作用によりリゾチーム

ペプチドでもみられた。したがって、これら LEA ペと AavLEA1 の強固な複合体が形成され、再水和しプチドのもつタンパク質凝集抑制機能は、アミノ酸ても解離しないと推定される。

配列ではなくアミノ酸組成に由来すると考えられる

保護対象のタンパク質が α-カゼインの場合、リゾ

6)。PvLEA-22 と Scramble は共に 22-mer のアミノ酸

チームの場合と比べて全く異なる複雑な結果が得らの中に 3 つの塩基性残基(Lys)と 3 つの酸性残基れた。無添加の場合、乾燥後は乾燥前に比べて濁度(Asp,Glu)をもち、水溶性のタンパク質の周囲にプラが増加した(図４)。図中の光学顕微鏡の写真が示す

ス及びマイナスの両電荷から成るイオン雰囲気を形ように、乾燥後には粒子状凝集体が生成しているこ成できる。α-カゼインに比べて過剰な LEA ペプチドとが確認できた。図４の右端の棒グラフに示すようが存在すると、ペプチド－α-カゼイン間の会合頻度に、α-カゼインに対する AavLEA1 のモル比率(以下、が α-カゼイン同士のそれを上回り、結果として水溶AavLEA1/α-カゼイン)が 5 のとき、AavLEA1 は α-カ

液中で α-カゼインの周囲を取り囲み、等電点近傍の

50

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)pH でも α カゼイン同士の直接の接触が阻止される防ぐと考えられる。

だろう。その結果、乾燥に伴う α-カゼインの凝集を

図４

LEA ペプチド PvLEA-22 による α カゼインの凝集抑制

グラフ内に例示した写真は、各水溶液の光学顕微鏡写真。
※ モル比が 1 と 10 の場合、各々乾燥前の時点で凝集が起こった為、乾燥実験を行わなかった。
５．酵素の失活防止

チーフの量の観点からほぼ同等のレベルとみなすこ

LEA タンパク質による酵素の乾燥保護効果を調とができる。このような条件で LEA ペプチドが天然べるために、ウサギ筋肉由来の LDH(乳酸デヒドロの LEA と比べて遜色ない乾燥保護効果を示したこ

ゲナーゼ)がしばしば用いられてきた

1,10,12-14,17,18)。

とは、後者の機能を前者が十分に代替可能であるこLDH は４つのサブユニットから成る比較的不安定とを意味する。

な酵素である。保護剤なしで LDH を乾燥すると、線虫やネムリユスリカなど乾燥に耐える生物には、殆ど活性は失われる 8,10,13,17,18)。しかし、LEA ペプチ

しばしば多くのトレハロースが含まれる。そこで、

ド PvLEA-22 を添加して乾燥した場合、PvLEA-22

LDH にトレハロースのみを加えて乾燥試験を行っ濃度の増加と共に LDH の残存活性は増加し、約 70%たところ、トレハロースに保護効果は見られなかっ8)まで達した(図５) 。PvLEA-44 を添加して乾燥したた 8)。次に、LEA ペプチドとトレハロースを同時に場合には、特にその低濃度領域で PvLEA-22 と比べ

LDH に加えて乾燥試験を行った。その結果、LEA ペて大きな残存活性を示し、LDH に対するモル比率(以プチドの濃度が低い場合にトレハロースとの相乗効

下、
PvLEA-44/LDH のように表記)が 500 の濃度でも、果が見られた 8)。

約 80%の残存活性を示した(図５)。天然の LEA タン

ウサギ筋肉由来の LDH の等電点はアルカリ側

パク質の場合、モル比 AavLEA1(線虫)/LDH が 360、

(pI=8.2)にある 15)。そこで、比較のため、LDH と同

PvLEA4(ネムリユスリカ)/LDH が 500 の場合に、そ様に４つのサブユニットから成るが、等電点は酸性

れぞれ LDH の残存活性が 80% 、100% と報告さ側にあるβ-D-ガラクトシダーゼ(BDG, pI=4.6)22) にれている。AavLEA1 及び PvLEA4 は共に 143 残基のついても LEA ペプチドの効果を調べた。その結果、アミノ酸から成るが、各々含まれる 11-mer モチー

BDG に対してモル比率 1200 の濃度で PvLEA-22 或

フの数は 4 個 10)、7 個 13)である。従って、例えばモいは PvLEA-44 を予め添加しておくと、乾燥・再水

ル比 AavLEA1/LDH が 360 であれば、11-mer モチー

和後もこの酵素の活性は 70～80%程度保持されるこ

フ 4 つから成る LEA ペプチドの PvLEA-44 に換算しとが分かった。この結果から、LEA ペプチドは等電てモル比 360 に相当する。すなわち、我々の実験で点 pI の異なる様々な酵素に対して適用可能である

用いた LEA ペプチドの濃度と、文献 10 や 13 で用いと推察される。

10)

13)られた天然の LEA タンパク質の濃度は、11-mer モ

51

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)図５

モデルペプチドによる酵素 LDH の乾燥保護効果

濃度 10μg(7.4×10-11

LDH 水溶液は、50 mM リン酸緩衝液(pH=7.5)に LDHmol)/mL に調製した。

ns:有意差なし、＊5％有意差、＊＊1％有意差、＊＊＊0.1％有意差、＊＊＊＊0.01％有意差
６．結2) Chakrabortee, S., Tripathi, R., Watson, M., Schierle,

語

本稿で紹介した結果から、グループ 3LEA タンパ

G. S. K., Kurniwa, D. P., Kaminski, F. C., Wise, M.

ク質を模倣したペプチドは、酵素やリポソームの新J., and Tunnacliffe, A. 2012. Intrinsically disordered

規乾燥保存剤として有望である。現在、全長 LEA タ

proteins as molecular shields. Mol. Biosyst., 8,

ンパク質の一般的な合成法は遺伝子組み換え技術で210-219.
3) Dure III, L., Greenway, S. C., and Galau, G. A. 1981.

あるが、大量に得るにはコスト面から見て実用へのハードルが高い。これに対し、LEA モデルペプチド

Developmental

biochemistry

は化学合成可能であり、遺伝子組み換えタンパク質

embryogenesis

and

of

cottonに比べて安価且つ大量に入手し易い。今回紹介した

messenger ribonucleic acid populations as shown by

筆者らの研究範囲では、LEA モデルペプチドは酵素

in vitro and in vivo protein synthesis. Biochemistry

germination:

seedchanging

20: 4162-4168.

の活性(乾燥前)にほとんど影響を与なかったが、も4) Dure III., L., 1993. A repeating 11-mer amino acid

し必要であれば、LEA モデルペプチドと保護するタ

motif and plant desiccation.

ーゲットタンパク質は分子量の違いを利用して再分

Plant J. 3, 363-369.

離することも原理的に可能である。以上、今回、in

5) Furuki, T., Shimizu, T., Kikawada, T., Okuda, T.,vitro における LEA ペプチドによる生体分子の乾燥

and Sakurai, M. 2011. Salt effects on the structural

保護作用について述べたが、細胞を用いた検証は今and thermodynamic properties of a group 3 LEA

後の課題である。

protein model peptide. Biochemistry, 50, 7093-7103.
6) Furuki, T., Shimizu, T., Chakrabortee, S., Yamakawa,

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Aono R.

Pentose Bisphosphate Pathway: Nucleoside Degradation in Archaea.
アーキアにおいてヌクレオシド分解を担うペントースビスリン酸経路
早稲田大学先進理工学部応用化学科
青野陸

Department of Applied Chemistry, Faculty of Science and Engineering, Waseda University, Tokyo, Japan.
Corresponding author: Riku Aono, raono@aoni.waseda.jp
Phone: +81-3-5286-3211
Received: Dec. 5, 2017 / Accepted: Dec. 6, 2017
Abstract
In bacteria and eukaryotes, the pentose
moiety of nucleosides are degraded through the pentose
phosphate pathway. In contrast, since the pentose
phosphate pathway is absent in many archaea, it had notbeen known how nucleosides are degraded in thesearchaea. On the other hand, the NMP degradation
pathway,
consistingofAMP
phosphorylase,ribose-1,5-bisphosphate isomerase and type III
ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, hadpreviously been identified in archaea. In the archaeon
Thermococcus
kodakarensis,
three
nucleosidephosphorylases and an ADP-dependent ribose-1phosphate kinase turned out to convert adenosine,
guanosine and uridine to ribose 1,5-bisphosphate,
whereas a cytidine kinase was suggested tophosphorylate cytidine to CMP. Since these enzymes link
nucleosides to the previously identified NMP
degradation pathway, this metabolic network turned out
to link nucleosides to central carbon metabolism. In thismetabolic network, nucleosides are converted to ribose
1,5-bisphosphate and ribulose 1,5-bisphosphate asintermediates, which is thus designated the pentose
bisphosphate pathway.

Key words:
Archaea, Thermococcus kodakarensis, nucleoside,
ADP-dependent ribose-1-phosphate kinase, pentose
bisphosphate pathway
1. 細菌・真核生物におけるヌクレオシド分解経路
ヌクレオシドは C5 糖であるリボースと核酸塩基とからなる化合物であり、細菌および真核生物において、そのリボース部位はペントースリン酸経路を介して分解されることが知られている (図 1)10)。細
菌 お よ び 真 核 生物 に お いて ヌ ク レ オ シ ドは ま ず
nucleoside phosphorylase による加リン酸分解により核酸塩基を遊離し、ribose 1-phosphate (R1P) を生成する。続いて R1P は phosphoribomutase (PRM) によるリン酸基転移により ribose 5-phosphate (R5P) へと変換される。その後、ペントースリン酸経路を構成する ribose-5-phosphate isomerase、ribulose-5-phosphate
epimerase、transketolase、transaldolase によって中央糖代謝の代謝中間体である fructose 6-phosphate (F6P)
および glyceraldehyde 3-phosphate (GAP) へと変換され、解糖系および糖新生経路によって代謝されると考えられる。

54

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)図 1. 細菌・真核生物におけるヌクレオシド分解.
E4P, erythrose 4-phosphate; Ru5P, ribulose 5-phosphate; S7P, sedoheptulose 7-phosphate; Xu5P, xylulose 5-phosphate.
2. アーキア特有の nucleoside 5’-monophosphate 分解経路
細菌および真核生物は上記の経路によりヌクレオ
シドを分解していると考えられている。しかし第三の生物界を構成するアーキアの多くにはペントース
リン酸経路を構成するタンパク質をコードする遺伝子が存在せず 9)、ヌクレオシドをどのように分解しているのか長い間不明であった。一方超好熱性アー
キアの一種である Thermococcus kodakarensis3, 6) を始めとする多くのアーキアには、ヌクレオシドにリ
ン 酸 基 が 結 合 し た nucleoside 5’-monophosphate(NMP) を分解経路が存在する (図 2)1, 8)。本 NMP 分
解経路は細菌や真核生物には存在しないアーキア特有の代謝経路であり、AMP phosphorylase (AMPpase)、
ribose 1,5-bisphosphate (R15P) isomerase 、 Type III
ribulose1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase(Rubisco)5) により構成されている。本経路ではまずAMPpase による AMP, CMP, UMP の加リン酸分解により R15P を生成し、R15P isomerase による異性化により ribulose- 1,5-bisphosphate (RuBP) を生成、そして Rubisco による炭酸固定反応により中央糖代謝の代謝中間体である 3-phosphoglycerate (3-PGA) まで分解される。また R15P isomerase は AMP により活性化されることが明らかになっており、本酵素がNMP 分解経路の調節を担っていることが示唆されている 1)。また興味深いことに、培地にヌクレオシドを添加したところ、AMPpase には変化は見られなかったものの R15P isomerase と Rubisco の細胞内タ
ンパク質量が増加することが明らかとなっている 1)。
このことからアーキア特有の NMP 分解経路がヌク
レオシドの分解にも関与している可能性が考えられた。

図 2. アーキア特有の nucleoside 5’-monophosphate 分解経路.
55

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)3. ヌクレオシドを NMP 分解経路へと導く酵素
アーキア特有の NMP 分解経路がヌクレオシドの分解にも関与するならば、ヌクレオシドをリン酸化
して NMP を生成する nucleoside kinase が存在する可能性を考えた。すなわちアーキアにおいてヌクレオ
シドは NMP へと変換された後、NMP 分解経路により分解されると予想した。一方 T. kodakarensis において nucleoside kinase と同定されている遺伝子は存在しないため、その探索を行った。これまでに 3 種のアーキア Methanocaldococcus jannaschii (MJ0406),
Aeropyrum
pernix(APE0012),
Thermoplasma
acidophilum (Ta0880) において nucleoside kinase が同定されている 4, 7)。T. kodakarensis についてこれらのnucleoside kinase と相同性を示す遺伝子を探索した
ところ、TK1843 および TK2029 が最も高い相同性を示した (Identity: 18-28%)。そこでこれらの遺伝子がnucleoside kinase 活性を示す可能性を考え、基質特異性の検討を行った。Kinase 活性測定は ATP から生成
す る ADP を 定 量 す る こ と で 行 っ た 。 そ の 結 果
TK1843 については cytidine 存在下で ADP の生成が観察され、cytidine kinase であることが示された。一方、TK2029 についてはヌクレオシドや糖リン酸、単糖など、様々な化合物について検討を行ったが、有意な ADP の生成は観察されなかった。一方、ヌク
レオシドの加リン酸分解産物である R1P を添加した
条件においては ADP が生成するのではなく、減少す
ることが見出された。そこで TK2029 が ATP ではな
く ADP をリン酸基供与体とする可能性を考え、検討を行った。その結果、TK2029 は R1P 存在下で ADPから AMP を生成することが明らかとなり、本酵素
が ADP-dependent R1P kinase という新しい反応を触媒することが示された。以上の結果から、TK2029
からは nucleoside kinase 活性が観察されなかったものの、TK1843 および TK2029 はともにアーキア特有の NMP 分解経路の代謝中間産物 (CMP および
R15P) を生成することが示された。

条件において R15P の生成が観察された。一方 ADPを添加しない条件においては R15P が生成せず、これらの化合物からの R15P 生成に ADP-dependent R1P
kinase が関与することが示唆された。またリン酸を添加せず、ADP のみを添加した条件において、R1P
からの R15P 生成量に変化がなかったのに対し、
adenosine, guanosine, uridine からの R15P 生成量が著
し く 減 少 し た 。 こ の こ と か ら 、 nucleosidephosphorylase が adenosine, guanosine, uridine からのR15P 生成に関与していることが示唆された。続いてcytidine についても同様の検討を行った。しかしリン酸とともに ATP または ADP を添加した条件においても R15P の生成は観察されなかった。一方リン酸
添加条件において、cytidine kinase の反応産物である
CMP からの R15P 生成が観察された。この原因としてこれまでの培養条件では cytidine kinase が発現していなかった可能性を考え、培地に cytidine を添加した条件で T. kodakarensis を培養し、cytidine 添加による各遺伝子の転写量への影響を検討した。その結
果 cytidine 添加・非添加条件において、TK1843 の転写量に大きな変化は見られなかった。一方 cytidine
添加条件において、CMP を R15P へと変換する
AMPpase の転写量が上昇していた。以上の結果より、
少なくとも AMPpase は cytidine の代謝に関与していることが示唆された。
さらに T. kodakarensis について AMPpase, TK1843,
TK2029 および各種 nucleoside phosphorylase 遺伝子を破壊した株を作製し、その細胞抽出液においてヌク
レオシドから R15P が生成するかを検討した。まずadenosine, guanosine, uridine について検討を行った。
その結果、TK2029 破壊株では R15P が生成せず、
TK2029 がこれらの代謝に関与することが示された。
また TK1895 破壊株では adenosine からの R15P 生成が著しく減少し、TK1482 破壊株では guanosine、
TK1479 破壊株では uridine から R15P が生成せず、これらの遺伝子がそれぞれ adenosine, guanosine および uridine の代謝に関与することが示唆された。
Cytidine については宿主株と同様に、いずれの細胞抽出液においても R15P の生成が観察されなかった。
一方 cytidine kinase の反応産物である CMP について
は、宿主株において R15P が生成したのに対し、AMPpase 破壊株では生成しなかった。このことより
AMPpase が CMP の代謝に関与することが示唆された。これまでの結果より、adenosine, guanosine, uridine
はそれぞれ TK1895, TK1482, TK1479 によって R1Pへと変換され、TK2029 により R15P へと変換されると示唆された。現在のところ TK1843 がどのような条件で機能するかは不明であるが、cytidine は CMPへ変換され、AMPpase により R15P へと変換される可能性が示唆された。またこれまでに宿主株の細胞抽出液において R15P が R15P isomerase および

4. 細胞抽出液におけるヌクレオシドからの R15P の生成
細菌・真核生物におけるヌクレオシドの分解では、ヌクレオシドはまず nucleoside phosphorylase による
加 リ ン 酸 分 解 に よ り R1P へ と 変 換 さ れ る 。 T.
kodakarensis に は 2 つ の purine nucleosidephosphorylase (TK1482, TK1895) と 1 つの uridine
phosphorylase (TK1479) 推定遺伝子が存在することから、これらの遺伝子がヌクレオシドを R1P に変換している可能性を考えた。そこで T. kodakarensis の細胞抽出液において各種ヌクレオシドおよび R1P から R15P を 生 成 す る か を 検 討 し た 。 Adenosine,
guanosine, uridine および R1P について検討を行った
ところ、細胞抽出液にリン酸および ADP を添加した
56

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)Rubisco により 3-PGA へと変換されることが明らかになっている 1)。以上より、ヌクレオシドから生成した R15P は R15P isomerase および Rubisco によって3-PGA へと変換され、中央糖代謝へと導かれると考えられる。
総括
以上の研究結果より、アーキアは細菌・真核生物とは異なる機構でヌクレオシドを代謝していることが明らかになった。これらの分解経路を比較すると（図 1, 3）、最初にヌクレオシドを R1P へ変換するという点では共通しているが、既知の経路では R1P のリン酸基転移反応により R5P を生成し、非酸化的ペントースリン酸経路により中央糖代謝へと導かれる。
それに対しアーキアの経路では、ADP-dependent R1P
kinase (TK2029) により R1P から R15P を生成する。

そして R15P isomerase、Rubisco により中央糖代謝の中間生成物である 3-PGA を生成する。また 3 分子のR1P を出発物質とし 3-PGA を最終生成物とした場合、既知の経路では 5 分子の 3-PGA を生成する。一方アーキアの経路では、Rubisco による炭酸固定反応が存在することから 3 分子の R1P から 6 分子の 3-PGAを生成する。すなわちアーキアの経路は炭素収率の観点において、既知の経路よりも有利であると考えられる (図 4)。
またペントースリン酸経路では、リン酸基が 1 つ結合したモノリン酸化合物を介して代謝が進むのに対し、今回発見した経路では R15P および RuBP といったリン酸基が 2 つ結合したビスリン酸化合物を介して代謝が進行する。このことから今回発見した
アーキアの代謝経路をペントースビスリン酸経路(pentose bisphosphate pathway) と名付けた 2)。

図 3. ペントースビスリン酸経路.

図 4. 細菌・真核生物とアーキアにおけるヌクレオシド分解の比較.
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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)3) Atomi, H., Fukui, T., Kanai, T., Morikawa, M., andImanaka, T. 2004. Description of Thermococcus
kodakaraensis
sp.
nov.,
a
well
studiedhyperthermophilic archaeon previously reported as
Pyrococcus sp. KOD1. Archaea 1: 263~267.
4) Elkin, S. R., Kumar, A., Price, C. W., and Columbes,
L. 2013. A broad specificity nucleoside kinase from
Thermoplasma acidophilum. Proteins, 81: 568~582.
5) Ezaki, S., Maeda, N., Kishimoto, T., Atomi, H., andImanaka, T. 1999. Presence of a structurally novel typeribulose-bisphosphate carboxylase/oxygenase in thehyperthermophilicarchaeon,
Pyrococcus
kodakaraensis KOD1. J. Biol. Chem. 274: 5078~5082.
6) Fukui, T., Atomi, H., Kanai, T., Matsumi, R.,
Fujiwara, S., and Imanaka, T. 2005. Complete genome
sequence of the hyperthermophilic archaeon
Thermococcus kodakaraensis KOD1 and comparison
with Pyrococcus genomes. Genome Res. 15: 352~363.
7) Hansen, T., Arnfors, L., Ladenstein, R., andSchönheit, P. 2007. The phosphofructokinase-B(MJ0406) from Methanocaldococcus jannaschii
represents a nucleoside kinase with a broad substratespecificity. Extremophiles 11: 105~114.
8) Sato, T., Atomi, H., and Imanaka, T. 2007. Archaeal
type III RuBisCOs function in a pathway for AMP
metabolism. Science, 315: 1003~1006.
9) Soderberg,
T.
2005.
Biosynthesisofribose-5-phosphate and erythrose-4-phosphate inarchaea: a phylogenetic analysis of archaeal genomes.
Archaea 1: 347~352.
10) Tozzi, M. G., Camici, M., Mascia, L., Sgarrella, F.,
and Ipata, P. L. 2006. Pentose phosphates in nucleosideinterconversion and catabolism. FEBS J. 273:
1089~1101.

今後の展望
本研究によりアーキアにおいてヌクレオシドがペントースビスリン酸経路により分解されることを明らかにした。本経路を構成する Rubisco は植物においては光合成の暗反応 (Calvin 回路) で機能する。
このことより Rubisco が誕生した当初は Calvin 回路
ではなくヌクレオシド・核酸由来のペントース代謝に関与していた可能性も考えられ、その関連性に興味が持たれる。一方ペントースビスリン酸経路を構成する TK1843 および TK2029 は、その一次構造か
らそれぞれ Thermococcus および Thermococcales に存在すると考えられるが、他のアーキアにおいても一次構造は異なるが同様の活性を示す酵素が存在する可能性などを検討し、ペントースビスリン酸経路の普遍性を明らかにしていきたい。またどのような条件でペントースビスリン酸経路が機能するのか、その生理的役割も明らかにしていきたい。
謝辞
本研究は著者が京都大学大学院工学研究科合成・生物化学専攻の跡見晴幸教授の研究室に所属していた時に実施されたものです。また本研究は科学技術振興機構・戦略的創造研究推進事業および日本学術振興会・特別研究員奨励費による助成を受けて実施されました。ここに心より感謝申し上げます。
参考文献
1) Aono, R., Sato, T., Yano, A., Yoshida, S., Nishitani, Y.,
Miki, K., Imanaka, T., and Atomi, H. 2012. Enzymaticcharacterization of AMP phosphorylase andribose-1,5-bisphosphate isomerase functioning in an
archaeal AMP metabolic pathway. J. Bacteriol. 194:6847~6855.
2) Aono, R., Sato, T., Imanaka, T., and Atomi, H., 2015.
A pentose bisphosphate pathway for nucleosidedegradation in Archaea. Nat. Chem. Biol. 11: 355~360.

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)MINI REVIEWJournal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16, 59-66

Nishimasu H.

Structure and Function of CRISPR-Cas Effector Nucleases
CRISPR-Cas 酵素の構造と機能
東京大学大学院理学系研究科生物科学専攻
西増 弘志
Univ. Tokyo, 7-3-1 Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo 113-0033, Japan
Corresponding Author: Hiroshi Nishimasu, nisimasu@bs.s.u-tokyo.ac.jp
Phone: +81-3-5841-4391
Received: Jan. 8, 2018 / Revised: Feb. 17, 2018 / Accepted: Feb. 17, 2018
Abstract
The RNA-guided endonuclease Cas9, whichis involved in the prokaryotic CRISPR-Cas adoptive
immune system, binds to a guide RNA and cleaves
double-stranded DNA complementary to the RNA guide.
In recent years, Cas9 has been used as a versatile
genome-editing tool in a wide range of fields, fromfundamental research to clinical applications. However,
the molecular mechanism of DNA recognition andcleavage by Cas9 was unknown, and many issues
remained to be addressed for its applications to genome
editing. We elucidated the crystal structure of S.
pyogenes Cas9, which is most widely used for genome
editing, in complex with the guide RNA and its target
DNA, thus providing the first insights into theCas9-mediated DNA cleavage mechanism. Furthermore,
we solved the crystal structures of Cas9 nucleases fromthree different bacteria and those of Cas12a (Cpf1)
nucleases, which are also harnessed for genome editing.
Collectively, these structural studies illuminated themechanistic convergence and divergence in the
CRISPR-Cas nucleases, and paved the way for theengineering of new genome-editing tools with improved
functionalities.
キーワード：CRISPR-Cas、Cas9、Cpf1/Cas12a、RNA、
結晶構造
1．CRISPR-Cas 獲得免疫機構
細菌や古細菌の多くは自身のゲノムに CRISPR（ clustered regularly interspaced short palindromic
repeat）とよばれる繰り返し配列をもつ 5)（図 1）。
CRISPR 領域は CRISPR アレイと Cas（CRISPRassociated）オペロンから構成される。CRISPR アレ
イはスペーサーおよびリピートとよばれる配列の繰り返しからなる。スペーサーとリピートの長さはCRISPR アレイによって異なるが、同一の CRISPR
アレイを構成するスペーサーとリピートはそれぞれ一定の長さ（30 塩基程度）をもつ。リピートはパリ
ンドロームを含む一定の配列からなるのに対し、スペーサーは外来核酸に由来する多様な配列をもつ。
Cas オペロンは CRISPR アレイの近傍に存在し Cas
タンパク質をコードしている。

59

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)

図 1：CRISPR-Cas 獲得免疫機構
細菌に感染した外来核酸は Cas1-Cas2 インテグラーゼ複合体により断片化され、新たなスペーサーとして CRISPR アレイに組み込まれる。CRISPR アレ
イは crRNA（CRISPR RNA）前駆体として転写され、Cas タンパク質または内在性のヌクレアーゼによって成熟型の crRNA へとプロセッシングされる。
crRNA は特定の Cas タンパク質と Cas-crRNA 複合体を形成し、Cas-crRNA 複合体は crRNA のもつガイド
配列（スペーサー）と相補的な外来核酸を特異的に分解する。crRNA のガイド配列（スペーサー）は感
染経験のある外来核酸に由来するため、CRISPR-Cas
系は外来核酸に対する獲得免疫機構としてはたらく。
CRISPR-Cas 系は 2 つのクラス（クラス 1 とクラス 2）に大別され、さらに 6 つのタイプ（I-VI 型）に分類
される 28)。このうちクラス 2 に属する CRISPR-Cas
ヌクレアーゼである Cas9（II 型）や Cas12a（V 型）
は RNA 依存的に 2 本鎖 DNA を切断するはたらきをもつため、後述するようにゲノム編集ツールとして注目されている。
2．Cas92007 年、CRISPR アレイがファージに対する防御機構に関与することが示された 4)。また、cas9 遺伝
子がこの防御機構に必要であることも明らかにされた。2010 年、細菌内において Cas9 は crRNA のガイ
ド配列と相補的なプラスミド DNA（2 本鎖 DNA）
を切断することが明らかになった 14)。2011 年、Cas9
による標 的 DNA の 認識には、 crRNA に 加え 、
tracrRNA（trans-activating crRNA）が必要であることが報告された 10)。tracrRNA は crRNA のリピート配列と部分的に相補的なアンチリピート配列をもち、
crRNA 前駆体と対合し Cas9 に結合する。Cas9 に結合した crRNA 前駆体:tracrRNA は RNase III によって切断され、成熟型の crRNA:tracrRNA が産生される。

60

そして、2012 年、Cas9 は RNA 依存性 DNA ヌクレ
アーゼであることが生化学的に示された 15,20)（図 2）。
精製した Cas9 タンパク質と crRNA:tracrRNA を用い
た in vitro 切断実験により、Cas9 は crRNA 中の 20
塩基のガイド配列と相補的な 2 本鎖 DNA を特異的に切断することが明らかになった。また、crRNA とtracrRNA を人工的に連結した sgRNA（single-guideRNA）も同様に機能することも明らかにされた 20)。
標的 2 本鎖 DNA のうち、crRNA と相補的な DNA 鎖
は HNH ドメインによって切断され、もう一方のDNA 鎖は RuvC ドメインによって切断される。
crRNA と標的 DNA の間の相補性に加え、Cas9 が 2
本鎖 DNA を認識するには標的配列の近傍に PAM（protospacer adjacent motif）とよばれる特定の塩基配列が必要である。異なる生物種に由来する Cas9は異なる配列を PAM として認識する。たとえば、
ゲノム編集に広く用いられている化膿レンサ球菌
Streptococcus pyogenes に由来する Cas9（SpCas9）はNGG（N は A/T/G/C）という配列を PAM として認識する。CRISPR アレイのリピート配列には PAM が存在しないため、Cas9 が自身の CRISPR アレイのスペーサー配列を切断することはない。したがって、PAM は自己・非自己の識別に関与する。
2013 年、Cas9-sgRNA を哺乳類細胞において発現させることにより、ゲノム DNA を特定の位置で切断し、その周辺の塩基配列を改変できることが報告された 8)。この技術は「ゲノム編集」とよばれ、基礎研究から臨床応用までの幅広い分野において利用されている。さらに、ヌクレアーゼドメインに変異（D10A/H840A）をもつ Cas9（dCas9 とよばれる）は DNA 切断活性をもたず、2 本鎖 DNA の特定の位置に結合できるため、転写制御やエピゲノム編集、
生細胞イメージングなど多くの新規技術に応用されている 11,29,33)。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)図 2：Cas9 と Cas12a による DNA 切断機構
3．Cas9 の立体構造と作動機構
Cas9 は 2 つのヌクレアーゼドメインを除き、既知
タンパク質と配列相同性をもたないため、その DNA
切断機構は不明であった。しかし、筆者らや海外の他のグループによる構造研究の結果、Cas9 によるRNA 依存的な DNA 切断機構が明らかになってきた。
とくに SpCas9 に関する構造研究が進んでおり、これまでに Cas9 単体 21)、Cas9-sgRNA 複合体 18) 、
Cas9-sgRNA-標的 DNA 複合体 3,19,26)の結晶構造が報告されている。
2014 年、筆者らは Cas9-sgRNA-相補鎖 DNA 複合体の結晶構造を世界にさきがけて報告した 26)。結晶構造から、Cas9 は 2 つのローブからなる構造をもつ
ことが明らかになった（図 3）。一方のローブはsgRNA や DNA の認識に関与していたため、REC（recognition）ローブと命名した。もう一方のローブは 2 つのヌクレアーゼドメイン（RuvC と HNH）を含むため、NUC（nuclease）ローブと命名した。
RuvC ドメインと HNH ドメインはそれぞれ既知のRuvC ヌクレアーゼや HNH ヌクレアーゼと類似した構造をもっていた。さらに、Cas9 の C 末端には新規構造のドメインが存在していた。このドメインは
PAM の近傍に位置しており、変異体解析の結果から、PAM の認識に関与していることが明らかになった。
そこで、PI（PAM-interacting）ドメインと命名した。

61

のちに報告された SpCas9-sgRNA-DNA 複合体の結晶構造から、PAM（NGG）の 2 文字目と 3 文字目のグアニン塩基は PI ドメインの Arg1333 と Arg1335
によって特異的に認識されていることが明らかにされた 3)。REC ローブと NUC ローブは Arg に富んだ長い特徴的な α ヘリックス（ブリッジヘリックス）
によって連結されていた。予想されたように、crRNAのガイド配列は標的 DNA と 20 塩基対の RNA-DNA
ヘテロ 2 本鎖を形成していた。RNA-DNA ヘテロ 2
本鎖は 2 つのローブの間に結合し、リン酸基骨格を介して認識されていた。この構造的な特徴から、Cas9による RNA 依存的な DNA 認識機構が説明された。
crRNA のリピート領域は tracrRNA のアンチリピー
ト領域と対合し、REC ローブによって認識されていた。tracrRNA の他の領域は 3 つのステムループを形
成し Cas9 と相互作用していた。結晶構造において
HNH ドメインは標的 DNA の切断部位と離れており、
標的 DNA の切断の際に HNH ドメインは構造変化を起こすことが示唆された。最近、筆者らは高速原子間力顕微鏡を用いた 1 分子解析によって、DNA 切断の際の HNH ドメインの構造変化を明らかにした 31)（図 4）。さらに、SpCas9-sgRNA-2 本鎖 DNA 複合体の結晶構造から、DNA の巻き戻しに伴い HNH ドメ
インが標的 DNA の近傍に移動することが明らかにされている 19)。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)図 3：Cas9 の結晶構造（A）SpCas9 のドメイン構造（B）SpCas9-sgRNA-標的 DNA 複合体の結晶構造（PDB：4UN3）（C）Cas9 による DNA 切断機構

図 4：Cas9-sgRNA 複合体による標的 DNA 切断の HS-AFM 動画
CRISPR-Cas9 の特徴の１つとしてその多様性があげられる。異なる生物種に由来する Cas9 のアミノ酸配列は多様であり、認識するガイド RNA や PAM の
塩基配列も大きく異なる。SpCas9（1,368 残基）よりも分子量の小さい Staphylococcus aureus 由来 Cas9
（SaCas9）（1,053 残基）や Campylobacter jejuni 由来
Cas9（CjCas9）（984 残基）はウイルスベクターへの導入効率が高いため、有用なゲノム編集ツールとして注目されている 22,30)。また、Francisella novicida
由来 Cas9（FnCas9）（1,629 残基）は最大の Cas9 オ

ルソログとして注目されている 12)。CRISPR-Cas9 の多 様 性 の 解 明 を 目 指 し 、 筆 者 ら は SaCas9sgRNA-DNA 複合体 27)、FnCas9-sgRNA-DNA 複合体
17)、CjCas9-sgRNA-DNA 複合体 34)の結晶構造を決定した（図 5）。これら 4 種類の Cas9-sgRNA-DNA 複合体の構造比較から、Cas9 による DNA 切断機構は保存されている一方、ガイド RNA の構造はオルソログによって大きく異なり、それぞれの Cas9 によって特異的に認識されることが明らかになった。

62

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)

図 5：Cas9 オルソログの結晶構造（A）SaCas9-sgRNA-標的 DNA 複合体の結晶構造（PDB：5CZZ）（B）FnCas9-sgRNA-標的 DNA 複合体の結晶構造（PDB：5B2O）
4．Cas12a の立体構造と作動機構
2015 年、V 型 CRISPR-Cas 系に関与する RNA 依
存性ヌクレアーゼとして Cas12a（発見された当初は
Cpf1 とよばれていた）が報告された 37)。Cas9 と同様に Cas12a は RNA 依存的に 2 本鎖 DNA を切断す
るはたらきをもつが、Cas9 とは異なる興味深い特徴をもつ。まず、Cas12a は tracrRNA を必要としない。
次に、Cas9 は NGG などの G リッチな配列を PAMとして認識するのに対し、Cas12a は TTTV（V はA/G/C）などの T リッチな配列を PAM として認識する。また、Cas9 は 2 本鎖 DNA を PAM の近傍において切断し平滑末端を作るのに対し、Cas12a は PAMから離れた位置を切断し突出末端を作る。さらに、
Cas9 は 2 つのヌクレアーゼドメイン（RuvC と HNH）をもつが、Cas12a は RuvC ドメインをもつが HNH
ドメインをもたない。RuvC ドメインを除き、Cas12aは既知タンパク質と配列相同性をもたないため、その RNA 依存的な DNA 切断機構は不明であった。
Cas12a による DNA 切断機構の解明を目指し、筆者らは細菌 Acidaminococcus sp.に由来する Cas12a（AsCas12a）に関して、AsCas12a-crRNA-DNA 複合体の結晶構造を世界にさきがけ報告した 35)（図 6）。
結晶構造から、Cas12a は 2 つのローブ（REC と NUCと命名した）からなる構造をもつことが明らかになった。REC ローブは REC1 ドメインと REC2 ドメインからなり、NUC ローブは RuvC ドメイン、WED
ドメイン、PI ドメイン、Nuc ドメインから構成されていた。RuvC ドメインを除く 5 つのドメインは

Cas12a に特徴的な新規の構造をもっていた。crRNAは 5’末端領域（リピート）とガイド配列（スペーサー）から構成されていた。5’末端領域はシュードノ
ット構造をとり、Cas12a によって認識されていた一方、ガイド配列は標的 DNA と RNA-DNA ヘテロ 2本鎖を形成し、REC ローブと NUC ローブの間に収容されていた。PAM（TTTA）を含む 2 本鎖 DNA 領
域は AT リッチ配列に特有の歪んだ 2 重らせん構造
をとり、WED ドメイン、REC1 ドメイン、PI ドメイ
ンによって認識されていた。さらに、PI ドメインのLys607 は副溝から PAM を塩基特異的に認識していた。変異体解析の結果から、標的となる 2 本鎖 DNAのどちらの DNA 鎖も RuvC ドメインによって切断されることが示唆された。標的 DNA が 1 つの活性部位において切断され、突出末端ができる分子機構の詳細は不明である。さらに、筆者らは Lachnospiraceae
bacterium 由来 Cas12a（LbCas12a）の結晶構造を決定した 36)。AsCas12a と LbCas12a の構造比較から、
Cas12a は保存された立体構造をもつことが明らかになった。
興味深いことに、Cas9 と Cas12a の構造比較から、
RuvC ドメインを除き、Cas9 と Cas12a は配列相同性をもたないにもかかわらず、両者の 2 つのローブからなる全体構造をもち、RNA-DNA ヘテロ 2 本鎖を認識していることが明らかになった。一方、PAM 認
識機構や DNA 切断機構は顕著に異なっていた。これらの構造比較から、Cas9 と Cas12a の間の機能収斂が明らかになった。

63

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)

図 6：Cas12a の結晶構造（A）AsCas12a のドメイン構造（B）AsCas12a-crRNA-標的 DNA 複合体の結晶構造（PDB 5B43）（C）Cas12a による DNA 切断機構
5．おわりに2014 年から 2017 年にかけての精力的な構造研究により、CRISPR-Cas 酵素の作動機構の理解は飛躍的に進み、構造情報を利用した様々な性質をもつ改変体も開発されてきた 7,13,24,23,25,32)。CRISPR-Cas 系は驚くべき多様性をもち、異なる特性をもつ CRISPR-Cas
酵素の発見が続いている。たとえば、最近発見された VI 型 CRISPR-Cas 系に関与する Cas13 は Cas9 やCas12a と異なり、RNA 依存的 RNA 切断活性をもつため、新規ツールとして注目されている 2,1,9,16)。また、メタゲノムからも新規の CRISPR-Cas 酵素が発見されており 6)、今後も新規の CRISPR-Cas 酵素の発見が期待される。

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66

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)MINI REVIEWJournal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16, 67-75

Deng Xa. and Okamoto Ab.

Energy Acquisition via Electron Uptake by
the Sulfate-Reducing Bacterium Desulfovibrio ferrophilus IS5
鉄酸化硫酸還元菌の細胞外電子摂取によるエネルギー獲得a

Department of Applied Chemistry, School of Engineering, The University of Tokyo, 7-3-1 Hongo, Tokyo 113-8656,

Japan.
NanoGREEN, National Institute for Materials Science, 1-1 Namiki, Tsukuba, Ibaraki 305-0044, Japan.

bCorresponding author: Akihiro Okamoto, OKAMOTO.Akihiro@nims.go.jp
Phone: +81-29-860-4430

FAX: +81-29-860-4706

Received: Jan. 8, 2018 / Revised: Feb. 17, 2018 / Accepted: Feb. 17, 2018
Abstract
Marine sediments harbor more than half ofthe total global biomass of the microbes, yet receive lessthan 1% of total fixed organic carbon in the ocean51).
Therefore, energy sources for bacterial sulfate reduction,
one of the most ubiquitous and predominant microbial
processes, remain ambiguous, especially in marine
sediments with scarce organics and hydrogen. We
recently showed the capability of a sulfate-reducing
bacteria (SRB) strain isolated from marine sediments,
Desulfovibrio ferrophilus IS5, to respire using
extracellular solids by direct electron uptake via outermembrane cytochromes, which are widely conserved invarious sediment sulfur-species-respiring bacteria. The
electron uptake capability of SRB provides a novel
explanation for energy acquisition by sediment microbes
under energy-limited conditions. Here, we will review
the extracellular electron uptake mechanism in sediment
SRB and discuss the ubiquity of this mechanism inmarine environments, based on the distribution of genes
encoding outer membrane cytochromes important forelectron uptake in microbes. The results suggest thatmicrobial energy production associated with extracellularelectron uptake may be ubiquitous and important in thesubsurface environments.

Introduction
Sulfate-reducing bacteria (SRB) use sulfate as theterminal electron acceptor and produce sulfide as the end
metabolite. Given that sulfate is the most abundant
electron acceptor in seawater, SRB are widely present inalmost all kinds of marine sediments, from
centimeter-deep shallows to kilometers-deep crust8),
from permanently cold Arctic sediments24) togeothermally heated ones54), and from acidic CO2-seep at
pH 358) to ikaite sediments with pH > 1019). As such,
SRB play critical roles in the global biogeochemical
cycling of sulfur, carbon, nitrogen, and metals22).
So far, SRB in sediments have been considered toutilize soluble organic matter and hydrogen (H2) aselectron donors. Organics such as acetate, lactate,
propionate, butyrate, valerate, and amino acids have beenshown to be involved in bacterial sulfate reduction innear-coastal sediments6,18), which receive organic andnutrient input from terrestrial areas9,45). Sulfate reduction
has been estimated to account for more than half of themineralization of the buried organic carbon in
sulfate-rich near-coastal marine sediments23,7). In contrast,
the open-ocean sediments, such as the South PacificGyre, have very slow organic burial rates (nMannually)10), and the crucial electron donor for microbes
in these sediments has been considered as H217,27,38),
which is produced abiotically in water-rockinteractions32) and water radiolytic reactions5,50). An
ecosystem found 2.8 kilometers deep within the earth’s
crust that is constituted of a single SRB species,

Key words: Marine sediments, Sulfate-reducing bacteria,
Energyacquisition,
Energy-limited
conditions,
Extracellular electron uptake

67

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)Candidatus Desulforudis audaxviator, has been
hypothesized to feed on radiolytic H28). However, since
the nM–µM concentrations of H2 are greatly exceeded by
the mM concentrations of sulfate in most marine
sediments10,28,33,39), and its turnover has not beensuccessfully measured so far, whether H2 could
sufficiently
supportmicrobial
ecosystems
inorganic-limited sediments remains ambiguous.
Recently, some microbes for example, theiron-reducing bacterium, Shewanella oneidensis43), andtheiron-oxidizing
bacterium,
Acidithiobacillus
21)
ferrooxidans , have been reported to be able to directly
extract electrons from extracellular solids. Electron
extraction from iron by SRB has also been proposed in
the field of microbially induced corrosion, following theisolation of highly corrosive strains from marine
sediments, including Desulfovibrio ferrophilus strain IS5,
with iron granules as the sole electron donor 13,15). If theelectron uptake processes can be identified in sediment

SRB, it would be possible to determine whether solidmaterials, such as reduced minerals, could serve as thealternative energy source in organic-limited sediments(Fig. 1). However, it has not been elucidated whether the
corrosive SRB could directly conduct electron uptake
from iron, because the other potential electron donor, H 2,
is generated on the surface of iron. In addition,
biomarkers for the electron uptake process have not been
identified in SRB, leaving the importance and ubiquity ofthis process unclear.
In this review, we summarize the recent progress inthe elucidation of the electron uptake mechanism bysediment SRB, with D. ferrophilus IS5 serving as themodel microbe. Electrochemical and biochemical
analyses of D. ferrophilus identified potential outermembrane cytochromes (OMCs) for direct electron
uptake from an electrode. The ubiquity of the identified
OMCs will be discussed, based on the distribution of
microbes possessing highly identical OMC proteins.

Low surface planktons and nutrition

Sulfate > 20 mM
Seawater
Sediments

SRB

mM sulfate

Scarce organics

SulfidenM–µM H2

eSolid electron donors,
such as reduced minerals,
hydrothermal vents.

Water radiolysis andwater-rock interactions

Fig. 1. Schematic illustration of the utilization of solid electron donors by sediment sulfate-reducing bacteria (SRB) via
direct electron uptake under conditions with limited soluble electron donors. e -, electrons.
Electron uptake from extracellular electrodes by D.
ferrophilus IS5
The extracellular electron uptake capability of D.
ferrophilus IS5 was revealed by whole-cellelectrochemical analyses21,31,41-43), with the utilization ofa highly stable indium tin-doped oxide (ITO) electrodeinstead of a reactive iron electrode as a working
electrode in three-electrode system. Direct electron
extraction from the iron substrates by corrosive SRB
strains, including D. ferrophilus IS5, has been proposed
to explain the corrosion reaction being significantly

faster than those caused by SRB that deplete
accumulated H2 on the iron16). However, while previous
study tried to examine the electron uptake capability of
SRB by electrochemical analysis with cells on an ironelectrode56), the versatile redox reactions of corrosion
products, such as iron sulfides, and the spontaneous
generation of H2 on iron complicated the electrochemical
processes and made it difficult to observe the directelectron uptake process. Therefore, we conducted
electrochemical measurements on an inert ITO electrodeto examine the capability of D. ferrophilus to extract

68

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)electrons from extracellular solids. As the ITO electrodehas a large overpotential window for H2 evolution4) andis not corroded by hydrogen sulfide produced by SRB,
electrochemical processes do not occur, except theelectron uptake by cells, at the electrode potential of –0.4
V (vs. standard hydrogen electrode, SHE). In this system,
we observed that the introduction of D. ferrophilus cells
onto the electrode surface caused an increase in thecathodic current, specifically in the presence of sulfate,demonstrating that D. ferrophilus cells extracted
electrons from the ITO electrode for sulfate reduction
without the involvement of H211). Direct cell attachment
on the ITO electrode surface suggested that cell surface
enzymes are important for the electron uptake in D.
ferrophilus IS5.

molecules)30,42), and conductive nano-filaments (pili47) or
nanowires14,46)). As these mechanisms also function inelectron uptake reactions in iron-reducing bacteria21,43),
D. ferrophilus IS5 may utilize them for electron uptake.
However, due to the lack of genomic information andbiochemical characterization, any of the electron uptake
mechanisms has not been identified in SRB. Therefore,
we first sequenced the complete genome of D.
ferrophilus and identified two gene clusters which
potentially encode OMCs (Table 1)12). These geneclusters contained adjacent genes encoding multi-heme
cytochromes,
withpredicted
periplasmic
andextracellular localizations and are likely the crucialcomponents in the electron uptake process. In addition,
genes encoding β-propeller proteins were also identified
in the gene clusters, which can function as theprotein-protein interaction sites. As β-barrel proteins,
such as MtrB of S. oneidensis MR-1, have been reported
to function as the linker for the formation of thecytochrome complex in the outer membrane20), theβ-propeller proteins of D. ferrophilus may function
similarly, and enable the formation of transmembrane
cytochrome complexes (Fig. 2).

Genes important for the electron uptake process in D.
ferrophilus IS5
Exchange of electrons between microbes and solids,
the so-called extracellular electron transfer, has been
intensely investigated in the iron-reducing Shewanella
and Geobacter species29,36,52). Three representative
mechanisms have been proposed, which involve the useof OMCs48,53), cell-secreted redox mediators (flavin

Table 1. Gene clusters in the genome of Desulfovibrio ferrophilus IS5 that potentially encode outer membrane (OM)
cytochrome complexes, including multi-heme cytochromes and β-propeller proteins. Cytochromes encoded by thegenes DFE_449 and DFE_461 were detected in the extracted OM fractions from cells.
Gene
Gene ID
clusterProtein

3

4

5

29.3

12

0

0

0

Periplasm

32.4

12

0

0

0

Periplasm (Detected in OM)

DFE_450

35.0

5

0

0

1

Extracellular

DFE_451 β-propeller protein

37.8

-

-

-

-

Unknown (Non-cytoplasmic)

DFE_461

35.5

14

0

0

0

Periplasm (Detected in OM)

45.1

16

0

0

0

Periplasm

DFE_463 β-propeller protein

32.7

-

-

-

-

Unknown (Non-cytoplasmic)

DFE_464

39.5

6

0

1

0

Unknown (Extracellular )

41.6

6

1

0

0

Periplasm

DFE_449

DFE_4622

Subcellular localization
prediction2

DFE_448
1

Heme-binding motifs
ProteinMW (kDa) CX CH CX CH CX CH CX CH

DFE_465

Cytochrome

Cytochrome

Cytochrome69

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)

SO42-

IM

S2-

IS5

e-

OM

e-

OMCs

Aligned OM
vesiclese-e-Solid electron donors,
e.g. electrodes, reduced minerals, hydrothermal vents, etc.

Fig. 2. Proposed mechanism for extracellular electron uptake by the sediment sulfate-reducing bacterium, Desulfovibrio
ferrophilus IS5. Outer membrane cytochromes (OMCs) and nanowires, which are likely the alignments of outermembrane vesicles, mediate direct electron uptake from solid electron donors. OM, outer membrane; IM, inner
membrane; Cyt, cytochromes; e-, electrons.
In contrast, only one gene (DFE_1992) encoded
extracellular pili in D. ferrophilus genome, withsignificant amino acid sequence difference to that of the
conductive pili of G. sulfurreducens (encoded by thepilA gene GSU_149647)). Although nano-filaments were
produced by D. ferrophilus when cells were starved ofsoluble electron donors, those were much thicker thanthe pili of G. sulfurreducens47), and were stained by amembrane-specific fluorescent dye (FM 4-64FX), andtherefore were more likely to be the aligned outermembrane vesicles with cytochrome coverage12), similar
to the Shewanella nanowires46). Moreover, although aflavin biosynthesis pathway is encoded in the D.
ferrophilus genome, transcriptome analysis revealed
almost no expression of gene DFE_282, which encodes aflavin exporter protein homologous to those of S.
oneidensis and G. sulfurreducens25,44), under the electron
uptake condition (unpublished data). These results
suggest that OMCs are likely the dominant mechanism
for extracellular electron uptake by D. ferrophilus.

under the starvation condition for the soluble electron
donor, lactate12). Furthermore, the higher amount of
OMCs in D. ferrophilus caused faster electron uptake
rates from an ITO electrode, in agreement with theinfrared spectroelectrochemical detection of cytochromeat the electrode interface with another corrosive SRB
strain, Desulfobacterium corrodens IS43). Therefore,
OMCs are the most-likely electron uptake conduits
mediating the electron uptake by these SRB strains fromsolids under soluble electron donor-limited conditions.
Nonetheless, further experimental analysis with the
OMC-deficient mutants will provide more direct
evidence for the electron uptake mechanisms.
Wide distribution of OMCs in sediment microbes
suggests the ubiquity of electron uptake process
Proteins highly identical to the OMCs of D.
ferrophilus, as identified in the NCBI protein database,were widely conserved in sediment bacteria from threephyla, which reduce various oxidized-sulfur species,
such as sulfate, elemental sulfur, and polysulfide (Table
2). Given the genes are conserved specifically in
sediment microbes, the capability of electron uptake may
be essential for their survival. Also, these cytochrome
homologs showed distinct amino acid sequences fromthe OMCs of iron-reducing and -oxidizing bacteria,
indicating that a new cytochrome clade may be present
specificallyinsediment
sulfur-species-respiring
microbes (Fig. 3).

Evidence for the presence of OMCs as the mainelectron uptake pathway
Various observations have indicated that OMCs are themain electron uptake components in SRB. Transcriptome
and biochemical analyses on the outer membraneproteins, together with transmission electron microscopy
observation of cellular cross-sections revealed that
OMCs were highly expressed in D. ferrophilus cells

70Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)Table 2. Summary of the microbes which have extracellular cytochromes homologous to those possessed by
Desulfovibrio ferrophilus IS5 for extracellular electron uptake.
PhylumBacteria with OMC homologs

Thermodesulfobacteria

Thermodesulfatator

Aquificae

Thermosulfidibacter
Desulfovibrio
Ca. Desulfofervidus

auxilli

Desulfobacterales

bacterium

Desulfobulbaceae

bacterium

Desulfurivibrio

alkaliphilus

Soda lake

Hydrogen/Polysulfide

sp. TF

Deep subsurface brine-/Electrodeacetoxidans

Anoxic mud from a sulfur spring

Acetate/Elemental sulfur

subterraneus

Petroleum reservoir

Acetate/Fe(III), also reduces elemental sulfur

Proteobacteria

Isolation (Enrichment) environment

e- donor/acceptor for isolation (enrichment)

Hydrothermal vents

Hydrogen/Sulfate

takaiiHydrothermal vents

Hydrogen/Elemental sulfur

ferrophilus

Marine sediments

Iron granules/Sulfate

autotrophicus
indicusatlanticus

Desulfuromonas
Geoalkalibacter

Hydrogen/Sulfate
Methane-oxidizing sediments-

Fig. 3. A protein phylogenetic tree derived from amino acid sequences of extracellular cytochromes of Desulfovibrio
ferrophilus and their homologs, the OMCs of Geobacter sulfurreducens (OmcB, OmcE, OmcS, and OmcZ), Shewanella
oneidensis (OmcA and MtrC), and Acidithiobacillus ferrooxidans (Cyc2). b., bacterium. Scale bar represents estimatedamino acid changes. This figure was adapted from X. Deng et al., Science advances, 2018, and some modifications
were made.

71

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)Acknowledgements
This work was financially supported by JSPS
KAKENHI (17H04969 to A.O., 16J07690 to X.D.), theJapan Agency for Medical Research and Development(AMED) (18gm6010002), and the US Office of Naval
Research Global (N62909-17-1-2038).

The sediment environments that harbor thispoorly-characterized microbial clade were highly diverse,
including deep-sea hydrothermal vents, soda lake
sediments, and methane seeps (Table 2). The walls andsediments of hydrothermal vents, from which the
Thermosulfidibacter and Thermodesulfatator strains
were isolated1,26,35,40), have been recently shown to beelectricallyconductive
andmayprovidechemo(electro)lithotrophs with energy by conducting
electricity from the internal reducing fluids to theexternal chimney wall37). It is also noteworthy that SRB
includingCa.
Desulfofervidus
auxilliandDesulfobacterales strains, which formed dual-species
consortia with methanotrophic archaea performing the
syntrophic methane oxidation coupled with sulfate
reduction,possessed
homologous
extracellular
cytochromes, in accordance with recently proposedinterspecies electron transfer model that these SRB candirectly receive electrons from the archaeal
partner34,55,57).
Although some bacteria listed in Table 2 were isolated
from near-coastal marine sediments, the organic
concentrations in these sediments were not directly
measured, and may become scarce during seasonal
fluctuations49). Therefore, the possession of OMCs ispotentially advantageous for these microbes. In addition,
the OMCs may mediate not only electron uptake bymicrobes from solids, but also the reduction of solid
electron acceptors, depending on the environmental
changes. Such an idea is supported by the presence of
OMCs homologous to those of D. ferrophilus in
Desulfuromonas sp. TF, which was isolated from a deep
subsurface brine using an electrode as the electron
acceptor2).

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Conclusions and perspective
In conclusion, our recent studies revealed that D.
ferrophilus IS5 possess OMCs and OMC-covered
nanowires for direct electron uptake from extracellularsolid electron donors coupled with sulfate reduction; theOMC homologs are widely conserved in various
sediment sulfur-species-respiring microbes across threephyla, suggesting that direct electron uptake may be used
for energy acquisition by these microbes underenergy-limited conditions, such as organic-deficient
sediments. Further exploration of genes critical to theelectron uptake, and new electron uptake mechanisms
would deepen our understanding of the impacts of
microbial electron uptake process in sedimentmicrobiology and ecology.

72

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)

学会誌投稿規定
極限環境生物学会誌投稿規定
１．投稿者の資格
極限環境生物学会誌（ISSN 1348-5474） (Journal ofJapanese Society for Extremophiles)（以下、本誌という）への投稿は極限環境生物学会（以下、本学会という）会員に限る。なお、連名による投稿の場合には、少なくとも著者の一人が本学会会員でなければならない。ただし、日本国以外からの投稿並びに本学会が寄稿を依頼した場合は例外とする。

け付ける。この場合、極限環境生物学会ホームペー
ジに掲載されている投稿要領に従うこと。

２．論文の種類
本誌への投稿論文は、極限環境生物関連分野の原著論文（通常論文、短論文）、総説、並びに諸報とし、いずれも未発表のものに限る。
（１）原著論文 (original papers)：極限環境生物に関する論文で以下の２つのいずれかに該当する論文。
１）通常論文 (regular papers)：極限環境生物に関する論文で、それ自体独立した、価値のある結論ある
いは事実を含む論文。
２）短論文 (short communications)：極限環境生物に関する論文で、断片的な結果ではあるが新しい事実や価値のあるデータを含む短い論文。
（２）総説 (reviews)：極限環境生物のある特定の研究分野について、簡単な歴史的背景を含め、最近の進歩を要約し、可能であれば、将来の研究方向性をも指し示した論文。
（３）ミニレビュー (mini-reviews)：総説の内、比較的短く纏めたもの。
（４）諸報：巻頭言、研究最前線、研究のルーツを探る、学会関連記事等。

５．論文の審査
投稿された論文の内、原著論文、総説、ミニレビュ
ーの審査には、極限環境生物学会誌編集委員の内１名が責任編集委員として関与する。原著論文および総説の審査は、責任編集委員が適宜指名する複数の査読者によりなされる。掲載の可否に関する最終判
定は、査読者からの査読結果報告に基づき責任編集委員が行う。その後、編集委員長が著者に審査結果を通知する。なお、内容・体裁に問題があると判断された原稿については、著者による修正を求める。
修正を求められた原稿は、２ヶ月以内に責任編集委
員に返送することとし、２ヶ月を過ぎて返送されなかった原稿は、著者が原稿を取り下げたものとして処理する。なお、投稿された論文は返却しない。

３．論文の書き方
論文の用語は日本語または英語とし、別途定める「原稿執筆要領」に従い簡潔に分かりやすく作成すること。総説は原稿３０頁以内、通常論文は原稿２０頁
以内、ミニレビューは原稿１５頁以内、短論文は原稿１０頁以内とする。なお、諸報の頁数に関しては編集委員会で適宜判断する。

７．別刷り
別刷りは、pdf ファイルとして配布する。

〒113-8657 東京都文京区弥生 1-1-1 東京大学大学
院農学生命科学研究科応用生命工学専攻（東大院農生科応生工と省略可）極限環境生物学会誌編集委員長
石 井 正 治 ( 電 話 ： 03-5841-8258, FAX ：03-5841-5272) (e-mail: amishii@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp)

６．校正
校正は初稿のみ著者に送付する。到着日より３日以内に、原稿とともに指定された送付先に返送すること。なお、原著論文ならびに総説に関しては、著者
校正時の文章・図表の追加や削除は一切認めない。

８．著作権
本誌に掲載された論文の著作権は本学会に帰属する。
９．その他
極限環境生物学会誌投稿規定ならびに極限環境生物
学会誌論文執筆要領で不明な部分に関しては、極限環境生物学会誌編集委員会において適宜対応する。
なお、必要が認められる場合には、文書化を進めるものとする。

４．論文の受付
論文原稿は諸報を除き、原稿原本の他にコピー３部を付け、送付状とともに簡易郵便書留として下記宛に送付すること。なお、オンラインによる投稿も受

76

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)

論文執筆要領
極限環境生物学会誌論文執筆要領
１．一般的事項（１）テキストファイル形式または Microsoft Word
形式で保存できるワードプロセッサ等を用いて原稿を作成すること。
（２）タイトルページには、1)論文題名、2)著者名、
3)著者所属機関名、4)ランニングタイトル、5)連絡対
応著者名およびその連絡先住所・電話番号・FAX 番号・e-mail アドレス、6)キーワード（５語以内）を明示すること。日本語で作成した論文には、これらの英語訳を併記すること。
（３）論文印刷には A4 版用紙の片面を使用し、１
行４０字（英語の場合には１行６０字）、１頁２５行で印刷すること。イタリック、ボールド、あるいはスモールキャピタルにする語句がある場合は、それぞれ赤字で下線、波下線、二重下線を記すこと。
（４）略語リストがある場合には、本文第１頁に脚注として略語の項を設け表記すること。単位系と省略記号は SI 単位を基本とする。
（５）生物の命名及び記載は International Code of
Nomenclature of Prokaryotes, International Code ofBotanical Nomenclature, International Code ofZoological Nomenclature に従う。学名が初出の場合は全部を記載すること。原則として、２回目以降は属名の頭文字を略号とするが、紛らわしい場合には省略せずに記載すること。
（６）物質名の表記は以下の規定に従うこと。
１）有機化合物の表記および放射性同位元素による標識化合物の表記は IUPAC 規定に従うこと。
２）生化学関連事項の命名は IUPAB 制定の命名法に従うこと。
３）化学式に用いられる記号、略号などは Chemical
Abstracts の用例に従うこと。
（７）論文受理後、完成した本文および図表等の印刷に必要な全てのファイルを収めた電子媒体を編集委員長宛に郵送するか、またはそれらのファイルを
e-mail 添付書類として編集委員長宛に送付すること。
２．投稿論文の構成（１）原著論文は 1)標題、2)アブストラクト、3)本
文、4)引用文献、5)表ならびに図、図の説明文、の順にまとめること。
（２）標題は論文内容を具体的に表す簡潔なものとすること。標題の下に著者名、所属機関名、所在地を書く。著者が複数で、所属機関が異なる場合は、
著者名末尾に上付数字を付けて区別するとともに、連絡対応著者名を指定すること。
（３）原著論文ならびに総説のアブストラクトは英語で記述するものとし、通常論文・総説では200words 以内、短論文では 100words 以内で作成す

77

ること。
（４）通常論文の本文は原則として、緒言、材料および方法、結果、考察（あるいは結果と考察）、謝辞で構成する。短論文では項目分けをしない。
（５）原著論文ならびに総説では、必要に応じて図表を用いる。それぞれの図表を挿入したい位置を、原稿右側の余白部分に指示すること。
（６）文中での文献の引用は、引用文献の項目で整理した文献番号を用いること。図表の引用はその番号によること。
（７）脚注が必要な場合には、該当事項の右肩に通し番号を付け、当該頁の下部に説明文を付けること。
３．引用文献（１）引用文献は下記の例に準じ、本文中の該当人
名あるいは事項の右肩に 1), 1-3)のように番号を付し、また、本文末尾の引用文献の項に第一著者のファミリーネームのアルファベット順に 1., 2., 3., --の番号を付し一括記載する。Ibid., idem は用いないこと。私信、未発表の研究結果、学術雑誌に受理される前の論文、抄録が印刷されていない口頭発表など
は引用文献に含めないこと。雑誌の略号は、Chemical
Abstracts Service Source Index (CASSI) 1907-1984(Cumulative)およびその補遺版により、雑誌名、書名、
年、巻および頁の示し方は下記によること。
（２）雑誌引用のとき
Chuakrut, S., Arai, H., Ishii, M., and Igarashi, Y. 2000.
Characterization of a bifunctional archaeral acylcoenzyme A carboxylase. J. Bacteriol. 185: 938-947.
（３）書籍引用のとき
児玉徹. 1997. V 近代的な微生物利用工業１．アルコール, pp191-197.児玉徹・熊谷英彦編, 食品微生物学,
文永堂出版
４．表と図およびその説明（１）表と図は印刷版下を作成すること。
（２）本文を英語で書いた場合には図表も英文で作成すること。
（３）表と図は一つに対して１頁使う。各頁の右上に著者名ならびに図の番号を入れること。
（４）表題は表の上部分に書くこと。表の内容説明
文ならびに注は、表の下に記述する。注の表示にはa),b),c)を上付で明記し、記述には a),b),c)を上付にせず用いる。
（５）図の標題ならびに説明文は別紙にまとめて印刷すること。図の標題の最後にはピリオドを付し、内容説明は標題の後に改行して記載すること。
（６）写真は明瞭な陽画を必要部数添付すること。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)

学会会則
極限環境生物学会会則（名称）第１条 本会は、極限環境生物学会（英文名：TheJapanese Society for Extremophiles ）という。
（以下本会という）（目的）
第２条 本会は、極限環境生物研究の発展に寄与し、極限環境生物の研究、教育、利用の推進に寄与することを目的とする。
（事業）
第３条 本会は、研究発表会及び講演会等の開催、
極 限 環 境 生 物 学 会 誌 （ 英 名 ： Journal ofJapanese Society for Extremophiles）の発行、
国際極限環境生物学会等との連携事業、研究奨励賞・ポスター賞の授与、その他前条の目的を達成するために必要な事業を行う。
（会員の種別等）
第４条 本会の会員は正会員、名誉会員、団体会員
および賛助会員とする。
2.正会員は極限環境生物に関する研究に従事する、または、これに関心を持つ個人であって、本会の目的に賛同し、定められた会費を納めた者をいう。身分が学生である者および 65 歳以上となった正会員の会費は別に定める。便宜上これらの者をそれぞれ正会員（学生）および正会員（シニア）と称する。
3.名誉会員は、当学会の発展に功労のあった者で、幹事会による推薦、評議員会による承認を経て、会長の指名により決定され、当学会の催すシンポジウム・年会等に招待される。
4. 団体会員は極限環境生物に関心を持つ団
体（法人等）であって、その団体内の本会の目的に賛同する代表者を含めて３名以内の所属者を指名して会員登録を行い、定められた会費を納めた団体をいう。
5. 賛助会員は本会の目的に賛同し、定められた賛助会費を１口以上納めた個人または団体をいう。
第５条 会員は本会が開催する諸事業に参加し、本会の発行する印刷物、PDF 等の配布を受けることができる。
（入会）
第６条 会員として入会しようとする個人または団
体は、本会事務局が定める手続きに従って申し込みを行い、本会会長による承認を得なければならない。

78（会費）
第７条 会員は下記の会費を納めるものとする。
正会員
年額
5,000 円
（但し身分が学生である者および 65 歳以上となった正会員は申請により年額 2,000 円とすることができる。前者の場合は指導教員の署名、後者の場合は幹事会による事後承認を必要とする。）
名誉会員 年額 0 円
団体会員 年額 20,000 円
賛助会員 年額 一口以上（一口 30,000 円）（退会）
第８条 会員は会長に届けることによって退会することができる。
（役員）
第９条 本会には会長 1 名、副会長 2 名、評議員若干名、幹事若干名、会計監査 2 名の役員をおく。
2. 会長は本会を代表し、会務を統括する。
3. 副会長は会長を補佐し、会長に事故ある
場合には会長の職務を代行する。
4. 幹事は、幹事長、庶務、学術活動、会計、を分担し、事業計画の立案、事業の実施、庶務会計、シンポジウムの企画立案、学会誌発行、国際極限環境生物学会等との連絡などの本会の事務を行う。
5. 会計監査は本会の会計を監査する。
（役員の選出）第１０条 会長、副会長、評議員は本会の総会において選出される。
2. 幹事、会計監査は、副会長、評議員以外の正会員の中から会長が指名し、総会の承認を受ける。
3. 評議員の任期は２年とし重任を妨げない
が、連続３期を限度とする。但し、会長が指名する評議員はこの限りではない。
（名誉会長）
第１１条 本会には名誉会長をおくことができる。
2. 名誉会長は、本会に対し大局的な見地による適切な助言を与える。
3. 名誉会長は、会長として学会の運営及び発展に特別の功績があった者で、幹事会による推薦、評議員会を経て、総会の承認を受ける。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)（委員会）
第１２条 本会に学会誌編集委員会、研究奨励賞選
考委員会、シンポジウム委員会を置く。各委員会委員の任期は 2 年とするが重任をさまたげない。
2. 学会誌編集委員会（会長指名の若干名で構成し､委員長は互選する）は学会誌の編集、論文審査の任にあたる。
3. 研究奨励賞選考委員会（副会長が委員長を勤め、学術活動担当幹事と委員長指名の委員、計 10 名程度で構成する）は本会の研究奨励賞受賞者を選考する。
4. シンポジウム委員会（会長指名の若干名で構成し､委員長は互選する）は学術活動幹事と共同でシンポジウムを企画立案し、運営をサポートする。
（評議員会）
第１３条 評議員会は会長、副会長、評議員をもって構成する。会長は年１回以上評議員会を召集し、議長となり、会の重要事項を審議し総会に提案する。
（総会）
第１４条 本会は原則として年１回総会を開き、会務を協議し議決する。
総会は会長が召集する。
第１５条 総会の議決は出席会員の過半数の賛成をもって行う。

79（会計年度）
第１６条 本会の事業年度は 1 月 1 日に始まり、同年 12 月 31 日に終る。
（付則）第１７条 本会則の施行および本会の運営についての細則は総会の議決を経て別に定める。
第１８条 本会則の変更は総会の議決を経て行う。
第１９条 本会則は、1999 年 10 月 19 日より施行する。

2001 年 11 月 29 日改定
2002 年 12 月 1 日改定
2003 年 12 月 1 日改定
2005 年 11 月 7 日改定
2007 年 12 月 1 日改定
2010 年 1 月 1 日改定
2012 年 12 月 1 日改定
2013 年 10 月 26 日改定

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)

学会細則

極限環境生物学会細則（会員）
第１条 入会を承認された正会員、名誉会員、団体
会員、賛助会員は、所定の会費を速やかに
納入する。
（総会）
第２条 総会の議案は副会長、幹事等と共に会長が作成し、評議員会の議を経た後提出する。
議案には前年度の事業内容及び収支決算、
新年度の事業計画、及び収支予算を含むものとする。
第３条 総会は会員の１／１０以上の出席（但し委任状を含む）をもって成立する。
（役員の選出）第４条 会長、副会長、評議員は会員の選挙によって決められる。会長は選挙によらず評議員を指名することが出来るが、総会での承認を必要とする。
第５条 会長は会員の中から少なくとも３名を選んで選挙管理委員を委嘱する。選挙管理委員
は選挙事務を行う。
第６条 会長は、評議員会の承認を得て必要な委員会を作ることが出来る。
（評議員会）
第７条 評議員会は評議員の半数以上の出席（委任状を含む）をもって成立する。
第８条 評議員会の決議は出席者の過半数の賛成により成立する。

（退会）
第９条 会長は、会費を３年以上滞納した会員を退会させることが出来る。
（授賞）
第１０条 研究奨励賞・ポスター賞の授賞規定は別途定め全会員に配布する。
（細則の変更）第１１条 本細則の変更は総会の議決による。
（付則）第１２条 今期の本会事務局は、東京工業大学大学院
生命理工学研究科 中村聡研究室（横浜市
緑区長津田町）内とする。
第１３条 本細則は、1999 年 10 月 19 日よりこれを実施する。

2002 年 12 月 1 日改定
2003 年 12 月 1 日改定
2006 年 6 月 30 日改定
2007 年 12 月 1 日改定
2010 年 1 月 1 日改定
2012 年 12 月 1 日改訂

80

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)運営体制

極限環境生物学会運営体制（2016~17 年度）

名誉会長

故

会長

大島 泰郎

共和化工株式会社 環境微生物学研究所

井上東洋大学 バイオナノエレクトロニクス研究センター

副会長

掘越 弘毅

明

伊藤 俊洋

一般財団法人北里環境科学センター

評議員（５０音順、敬称略）

幹事会

秋野 利郎

オエノンホールディングス株式会社

幹事長

中村 聡

東京工業大学 生命理工学院

石野 園子

九州大学大学院 農学研究院

幹事会顧問

工藤 俊章

北里大学 生命科学部

板谷 光泰

慶応義塾大学 環境情報学部

庶務担当

伊藤 政博

東洋大学 生命科学部

伊藤 進

琉球大学 農学部

編集委員長

石井 正治

東京大学大学院 農学生命科学研究科

伊藤 佑子

創価大学

編集副委員長石野 良純

九州大学大学院 農学研究院

稲垣 賢二

岡山大学大学院 環境生命科学研究科

古園 さおり東京大学 生物生産工学研究センター

今中 忠行

立命館大学 生命科学部

高品 知典

東洋大学 生命科学部

大島 敏久

大阪工業大学 工学部

宇佐美 論

東洋大学 理工学部

大島 朗伸

島根大学 生物資源科学部

道久 則之

東洋大学 生命科学部

鎌形 洋一

国立研究開発法人産業技術総合研究所

国立研究開発法人海洋研究開発機構

川上 文淸

一般財団法人北陸産業活性化センター

ホームページ担当

三輪 哲也
黄川田 隆洋国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研
究機構

河原林 裕

国立研究開発法人産業技術総合研究所

シンポ担当

八波 利恵

東京工業大学 生命理工学院

倉光 成紀

大阪大学大学院 理学研究科

青木 俊夫

日本大学 生物資源科学部

小林 哲夫

名古屋大学大学院 生命農学研究科

跡見 晴幸

京都大学大学院 工学研究科

芝 弘孝

サントリービジネスエキスパート株式会社

伊藤 隆

国立研究開発法人理化学研究所

鈴木 健一朗東京農業大学 応用生物科学部

荻野 博康

大阪府立大学大学院 工学研究科

高田 泰弘

北海道大学大学院理学研究院

加藤 千明

国立研究開発法人海洋研究開発機構

中川 和倫

愛媛県立今治西高等学校

亀倉 正博

好塩菌研究所

野尻 秀昭

東京大学 生物生産工学研究センター

國枝 武和

東京大学大学院 理学系研究科

長谷川 功

日本大学 生物資源科学部

栗原 達夫

京都大学 化学研究所

半澤 敏

東ソー株式会社 東京研究所

小西 正朗

北見工業大学 工学部

別府 輝彦

日本大学 生物資源科学部

相馬 亜希子

千葉大学大学院 園芸学研究科

宮崎 健太郎

国立研究開発法人産業技術総合研究所

仲宗根 薫

近畿大学 工学部

山岸 明彦

東京薬科大学 生命科学部

中村 顕

筑波大学大学院 生命環境科学研究科

湯本 勲

国立研究開発法人産業技術総合研究所

東端 啓貴

東洋大学 生命科学部

若木 高善

明治大学 農学部（非常勤）福居 俊昭

東京工業大学 生命理工学院

高瀬 光徳

森永乳業株式会社 研究情報センター

鳴海 一成

東洋大学 生命科学部

学会誌担当
会計担当

学術担当

会計監査

若手シンポジウム委員会
委員長

委員

81

布浦 拓郎

国立研究開発法人海洋研究開発機構

井上 謙吾

宮崎大学 農学部

谷川 実

日本大学 理工学部

中川 聡

京都大学大学院 農学研究科

平田 章

愛媛大学大学院 理工学研究科

水口 千穂

東京大学 生物生産工学研究センター

若井 暁

神戸大学 自然科学系先端融合研究環

コルネット
リシャー

国立研究開発法人農業生物資源研究所

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2017) Vol.16 (2)

編集委員会
委員長 ：石井正治（東大）
副委員長：石野良純（九大）
委員：阿部文快（青学大）、伊藤 隆（理研）、鎌形洋一（産総研）、河原林裕（産総研）、
高品知典（東洋大）、中村 聡（東工大）、中村 顕（筑波大）、三輪哲也（JAMSTEC）、
湯本 勲（産総研）

学会事務局〒226-8501 横浜市緑区長津田町 4259-J2-13
東京工業大学 生命理工学院 中村聡研究室内極限環境生物学会事務局 中村 聡 (幹事会幹事長)
FAX: 045-924-5837
E-mail: kyokugenjm10@extremophiles.jp
URL: http://www.extremophiles.jp/
学会誌編集〒237-0066 神奈川県横須賀市湘南鷹取 5−45
NPO 法人チームくじら号 (加藤千明、学術幹事)
TEL & FAX：046-866-7765
E-mail：katochi@kujirago.org
発刊日2018 年 3 月 31 日