Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)ISSN 2186-9936

Dec. 2013
第12巻 第2号

Journal of Japanese Society for Extremophiles

巻頭言 ………………………………………………………

41

研究最前線 …………………………………………………

42

ORIGINAL PAPER …………………………………………

45

MINI REVIEW ………………………………………………

50

学会記事 ……………………………………………………

86

学会誌投稿規定・執筆要領 ………………………………

89

会則・細則 …………………………………………………

91

運営体制 ……………………………………………………

94

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)巻頭言

極限環境生物研究の歴史に思う

加藤

トが次々と立ち上がり、大きな研究のうねりとなりました。下左図に、極限環境生物学の流れと、その中で中心的に活躍された科学者の写真を示しました。
こうした、研究のうねりと広がりを受けて、1996
年から International Congress on Extremophiles と銘打った国際会議が 2 年ごとに開催されるようになり、
2014 年には第 10 回の会議が、ロシアのサンクトペ
テルベルグで開催される運びとなっております（下右図）。
私ども「極限環境生物学会」も 1999 年に掘越先生の主導のもと産声を上げて、早 15 年の歳月を経ました。この間、極限環境微生物だけではなく、より広く極限環境生物全体を対象とする学会へと変貌し、基礎から応用まで幅広く、多くの若手研究者を糾合しながら発展してきました。そして、2014 年度には、当学会の会長が、会発足以来長年に渡りご尽力いた
だいた掘越弘毅先生から、当会の重鎮の大島泰郎先生に交代いたします。また、学会事務局運営体制も2013 度から若返りし、中村聡先生中心に、ますますの発展を続けてきております。今後は、これまでの研究の歴史を振り返りつつ、会員お一人お一人のより独創性のあるアイデアで世界を驚嘆させるような成果を出していくことが、より一層問われる時代になってくると思います。更に各々の研究力に磨きをかけ新たなる未来を切り拓いてまいりましょう！
最後に、更なる当学会の発展と会員各位のご健闘を願い、巻頭言を締めさせていただきます。

千明

独立行政法人海洋研究開発機構
極限環境生物学研究の歴史をひもとくと、それは、前世紀の後半 1970 年前後に相次いで報告された、2人の微生物学者の新発見にその発祥を求めることができます。ひとつは、アメリカの Thomas Block 教授の好熱菌の発見、そしてもう一つは我が国の掘越弘
毅教授の好アルカリ菌の発見であります。この 2 つの大発見が機縁となって、私たち人間が快適に住める環境から大きくはずれた「極限環境」にも多くの生き物が生息していて、私たちの全く知らなかった世界を構築していることが知られるようになりました。その後、極限環境を好んで生息できる生命の探
査研究が本格的に開始されたのであります。1977 年には、前世紀最大の生物学上の発見のひとつといわれている、深海底の熱水鉱床周辺に生息する化学合成生態系の発見があり、極限環境生物の研究は地上世界から、深海の果てにまで及んできたのであります。その後、我が国をはじめアメリカ・ヨーロッパ
で、極限環境下の生命探査を目的としたプロジェク

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)研究最前線『東京大学大学院農学生命科学研究科

応用生命工学専攻

応用微生物学研究室』

教授

石井

１．応用微生物学研究室の歴史
表題にある私の研究室は昭和 19 年に創設され、今年（2014 年）70 周年を迎える。創設時の研究室名が発酵燃料生産学研究室であることから、緊迫した国情が想像できよう。私は研究室 6 代目の教授であり、
朝井勇宣先生は 1944 年から 58 年まで、山田浩一先生は 1958 年から 1972 年まで、蓑田泰治先生は昭和1972 年から 1985 年まで、児玉徹先生は昭和 1986 年
から 1996 年まで、五十嵐泰夫先生は平成 1996 年から 2013 年まで、研究室を担当されてきた。
この間、研究室名も少しずつ変わってきている。
即ち、上述の発酵燃料生産学研究室（戦後すぐぐら
いまで）、発酵生産学研究室（1954 年まで）
、微生物
利用学研究室（1994 年まで）、応用微生物学研究室（1994 年から）と変遷している。

正治
２．応用微生物学研究室の歴史に絡めた、自分の歴史
山田浩一先生の時代、微生物利用学研究室は『石油タンパク』において、文字通り世界をリードする研究室であった。製品への発癌性物質残存可能性を巡り、強い反対運動が起こったため、『石油タンパク』
は日本においては産業化されることはなかった。反対運動の強さが一因と思われるが、『石油タンパク』
は新聞紙上で取り上げられることもしばしばで、当時小学校５年生であった私もその言葉を自然に覚えていた。ただし、石油からプラスチックができるよ
うに、タンパク質も化学的に合成できるようになった、と全くの誤解をしていたが。
その後私は、区立中学校、都立高校、東大理科Ⅱ類、農芸化学科へと進み、学部４年時に微生物利用
学研究室へ入室した。こう書くと、『石油タンパク』

42

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)で研究室と私とが、とても強く繋がっているように見えるが、実際には偶然の部分もかなりある。
微生物利用学研究室に配属され与えられたテーマ
は、「絶対独立栄養性水素細菌のキノンの構造を決めよ」であった。同菌は、多くの生理生化学的特質を有していることが予想されたものの、有機物資化性を示さないため、それまでの分類学的指標が役に立たなかった。そのため、化学分類学的手法を適用することで同菌の分類学的位置づけを明らかにしようという考えの一環としてのテーマであった。
マススペクトル解析により、同菌のキノンが既知のキノンとは異なる親イオンピークを示すことを見出した。その後、1H-NMR や Hi-MS 解析などでキノンの骨格構造を決めた。
キノンのオゾン分解物を GC
さらには GC-MS にて解析し、イソプレン側鎖の飽和位置も決めることで、全化学構造を決定した。さらに同骨格を有するキノンをメチオナキノンと命名した（下図）。

え、PX の大量分取、酸分解、分解産物（極性頭部）の構 造解析と進 めた。結果、 13C-NMR や ２ 次元
1
H-NMR などで極性頭部の推定構造は提唱できたものの、肝心なリン酸との結合が推測の域を出なかったため、研究はこの段階では日の目を見ることはな
かった。後年になり、弱アルカリ分解で脂肪酸を除いた物質で同じことを行
えば構造も決まるだろうと考え、強引な力仕事ではあったものの、化学構造を決めることができた（右図）。此処で学んだことは、要素還元的に物事を観る時には、全体に繋がるような見方をしていかないと危険である、というものであった。
さて、同菌の生き様を深く知るためには、水素酸化系を中心としたエネルギー産生系を知る必要がある。そこで膜に関わるエネルギー産生の基礎的知見を収集した。
同菌の細胞質膜画分を用いたメチオナキノン除去
並びに添加実験により、同キノンが電子伝達系に直接関わっていることを示した。別途細胞質膜画分からヒドロゲナーゼを精製し、メチオナキノンとの反応性を調べたところ、生理的に意味のある速度での反応性が観察されたため、メチオナキノンが膜結合型ヒドロゲナーゼの直接の電子受容体であることが判明した。
この研究を進めている時、生命の営みの縮図を覗き込んでいる不思議な感覚に襲われた。生命活動の根幹を支えているエネルギー代謝の主要な部分を観ていると確信できたからなのであろう。さらに、エネルギー代謝こそが、他の全ての代謝を支えていることを得心できた時でもあった。
同菌の生き様を深く知るためには、二酸化炭素ガ
ス固定系について生化学的に調べる必要もあった。
当時は、粗酵素液の酵素活性測定結果などにより、還元的 TCA サイクルの機能性が間接的に示唆されているに過ぎなかった。そこで、可能な限り酵素レ
ベルで還元的 TCA サイクルの機能性を実証することを目指して、研究を推進した。Pyruvate:ferredoxin
oxidoreductase、2-Oxoglutarate:ferredoxin oxidoreductase、Fumarate reductase など、還元的 TCA サイクル
中の殆どの反応について酵素レベルで実証し、さらには生化学的特質をも明らかにすることができた。
その後、同菌のゲノム解析も行い、還元的 TCA サイ
クル（次図）以外の二酸化炭素ガス固定系が同菌には存在しないこととも併せ、同菌における還元的
TCA サイクルの機能性を証明できた。

菌の分類を行うために純粋な化学的手法を採用することに当初は驚きと戸惑いも覚えてはいた。しかし、研究を進める中で、一つの学問体系（分類であれば分類学）に固執し過ぎてはいけないことを学ぶことができた。
キノンが極めて新規な物質であることなどから、同菌は新属新種として Hydrogenobacter thermophilusと 命 名 さ れ 、 Bergey’s Manual of Systematic
Bacteriology にも記載されている。
此処で、研究の分岐路に立った。同菌の化学分類をさらに深化させるような分類学の方向に進むか、同菌の生理生化学に進むか、というものである。私は化学を基盤として物質に根差した研究を行いたいと考えていた。加えて、この頃には、同菌の生き様（分子状水素をエネルギー源として二酸化炭素を唯一炭素源として生きる）に完全に魅せられていた。
そのため、分類学と生理・生化学の二股掛けが可能な研究を行うと同時に、生理生化学を深化させる（＝同菌の生き様を深く知る）研究も開始しようと考えた。
二股掛けの研究としては、同菌の主要アミノリン
脂質 (PX と略) の構造解析を行った。PX はホスホリパーゼ A2 により分解されることからアシル型リン脂質であることは明白ではあったが、ホスホリパ
ーゼ C や D により分解されず、極性頭部に新規性があるものと推測された。そこで、極性頭部の構造を決めれば全体の構造も難しくなく決まるだろうと考43

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)二酸化炭素ガス固定系に関して答えが出揃った頃、同化的代謝としてのアミノ酸代謝にも興味が広がってきた。この部分はまだまだ齧りかけではあるが、グルタミン酸生合成に関わる新規酵素系が見つかり、
アミノトランスフェラーゼ系、グリシン生合成、セリン生合成について続々と新知見を発表し続けている。
同菌は代謝特性上、還元的環境が必要と思われるのにも関わらず、高い酸素濃度環境でも生育が可能である。こうしたことから同菌の活性酸素除去系に着目し、新たな活性酸素除去系の同定にも成功している。
同菌の一連の研究で掴んだことは、生物は何時でも生成するエネルギーを適切に割り振っている、という事柄である。生物的エネルギーは自由電子の統制された動きにより生成されている。言い換えれば、生物は電子の流れを巧みに制御することで生きている状態を保っている訳である。これを逆から見ることで、電子の流れを意識して生命現象を観ることが、基礎的な代謝研究においても応用的な物質生産研究においても重要であることが自ずと分かってきた。
多くの研究者諸氏がそうであるように、私もいつの日からか、実験や研究の面白さに目覚め、できる
ことなら出身研究室で教員になりたい、と強く思うようになった。結果として、助手に採用され、助教授にもして戴き、さらには２０１３年９月１日に教授に任命された。
３．応用微生物学研究室と私の、現在と未来
大学の研究室では、科学創造と人材育成とを常に関連させて進めて行く必要がある。どちらか一方だけに偏るべきではない。
まず、科学創造の部分について述べると、応用微生物学研究室においては、資源・環境・エネルギー・

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食糧問題をバイオで解決することを目的として、基盤的さらには応用的研究を進展させてきている。
具体的には、常に柔軟に周囲の学問領域を見つめ、化学を基盤として現象に根差した微生物研究を推進し、その際、電子の流れ（＝エネルギーの流れ）を意識して微生物が司る諸々の現象を観ることを旨としている。こうした観察によって得られる微生物の代謝能力に関わる知識や知見を、資源、環境、エネ
ルギー、食糧問題解決に繋がるような、基礎的な代謝研究さらには応用的な物質生産研究へと展開して行きたい、と考えている。このような理念に基づき、『e-バイオ』なる言葉と、緩やかな連合体である『eバイオ研究会』も作り、活動を続けている。
人材育成については、以下のように考えている。
科学に対する深い敬意を心に宿し、自ら進んで新たな科学を創造し、さらにそのことに喜びを感じると共に、科学創造の全体の過程を良きものとして次の世代に積極的に、かつ共感性を保ちながら伝え得る、リーダー的人材を育成することを、私は指導方
針の根幹としている。
なお、現在は、
１．独立栄養生物の網羅的代謝解析を基盤とした物
質生産指向型研究
２．微生物の独立栄養性に関する分子基盤的研究
３．微生物共存系における物質生産の代謝生化学的解析
４．微生物のエネルギー代謝制御と環境適応・病原性に関する研究５．微生物における呼吸酵素の多様性と機能解析などを主要な研究テーマとして掲げ、科学創造と人材育成との二股掛けをしている。
研究室にも私にも、これからどのような未来が待ち受けているかは分からない。一方では、いろいろな物事が絶え間なく生じる現実は、目の前にある。
それ故、未来をしっかりと捉えた上で、今を生き切ることを大事にしていきたい。万が一、未来を捉え切れない場合には、行おうとしていることが、少な
くとも、今、行う価値のあることと信じられるか否かを慎重に考え、価値があると判断できた場合には、
真摯に丁寧に、その事にあたる。こんな風に大学人としてベストを尽くしていきたい。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)ORIGINAL PAPER

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12, 45-49

Watanabe K, Kusumi K, Yun DL and Yasui M

Amino acid replacements of thermophilic Mn-superoxide dismutase enhanced
detergent tolerance
好熱性 Mn 型スーパーオキシドディスムターゼのアミノ酸置換による変性剤耐性の向上
室蘭工業大学工学研究科応用理化学系専攻
渡辺健太，楠美恵太，Ding Ling Yun，安居光國
Division of Applied Science, Department of Technology, Muroran Institute of Technology, 27-1 Mizumoto, Muroran,
Hokkaido 050-8585, JAPAN
Corresponding author: Mitsukuni Yasui, yasui@mmm.muroran-it.ac.jp
Phone: +81-143-46-5748, FAX: +143-46-5701
Received: 16 Oct., 2013 / Revised: 24 Oct., 2013 / Accepted: 25 Oct., 2013
疎水性の増大が安定性を引き起こしたものと考えられた。これを確かめるために、単一アミノ酸を置換した酵素を作製し、２つのアミノ酸置換がそれぞれ耐性に関与していることを明らかにした。このことは、酵素の耐性向上において指標を示し、今後の酵素の利用を広げるものである。

Abstract Mn superoxide dismutase from thermophilic
bacteria is useful antioxidant enzyme for industry.
Activity of MnSOD from thermophilic bacteria wasmeasured after treatment of SDS(sodium lauryl sulfate).
MnSOD of Bacillus stearothermophilus strain C36 wasstable than that of Bacillus stearothermophilus strain
IFO12550. There were only two differences of aminoacid residues between strain C36 and strain IFO12550.
Substitution position with Glu102Asp and Ile187Val
were neither essential nor conserved. These inneramino acid residue changes suggested an approach toobtain a stable MnSOD.

スーパーオキシドディスムターゼ(SOD)は活性酸素(O2−) を H2O2 や O2 に不均化する酵素であり、生体中の有毒な活性酸素種を無毒化し酸素ストレスに対する重要な酵素でもある 9,10,16)。また SOD は保持する金属種により、Cu/Zn 型，Fe 型そして Mn 型の3 種があり、Mn 型が原核生物および真核生物に共通する基本的なストレス応答酵素として着目され、医療においても多くの有効利用が考えられている 17,20)。
こうした応用面で利用するためには酵素のより高い安定性が求められ、好熱菌から熱安定性の高い SODが分離されている 1,8,14)。本研究では中度好熱菌の 2つの菌株から得られた MnSOD の活性を比較し、変性剤に対する耐性の違いが非保存性領域のアミノ酸置換によるものであることを示した。このことは，
SOD のさらなる医療や臨床検査等の利用を広げる
ものと考える。
Bacillus stearothermophilus IFO12550 株 (ATCC12980)は IFO(Institute of Fermentation, OSAKA)から譲渡を受けた。Bacillus stearothermophilus C36 株は土壌 よ り 単 離 し 、 Leibniz Institute DSMZ-German

Key words: superoxide dismutase, protein stability,
sodium dodecyl sulfate, thermophilic bacteria【要約】好熱菌から得られる Mn 型スーパーオキシ
ドディスムターゼ（MnSOD）は工学的有用利用が期
待 で き る 抗 酸 化酵 素 で ある 。 ２ つ の 中 度好 熱菌
Bacillus stearothermophilus IFO12550 株 お よ び
Bacillus stearothermophilus C36 株の SOD についてラ
ウリル硫酸ナトリウム（SDS, sodium lauryl sulfate）
に対する耐性を比較したところ、後者の耐性が高かった。これは C36 株の持つ SOD の 102 番目のアミノ酸がグルタミン酸であるのに対し IFO12550 株ではアスパラギン酸、187 番目ではそれぞれのアミノ酸はイソロイシン、バリンであり、いずれの置換も側鎖の炭素数を増加させ、後者ではタンパク内部の45

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)で得られた front メガプライマー、5’-GGCTC GAGCATATGC CATTT GAATT GCCAG CATTG CCGTA
TCCGT ATGAT GCGCT TGAGC CGCAC ATCGACAAAG AAACG ATGAA CATTC ACCAC ACGAAGCACC ATAAC ACATA CGTTA CAAAT TTGAATGCGG CGCTT GAAGG GCATC CGGAT TTGCA
AAACA AATCG CTCGA AGAAT TGCTC AGCAA
TTTGG AAGCC CTTCC GGAAA GCATT CGCAC
GGCGG TGCGC AACAA CGGCG GCGGT CATGC
AAACC ACTCG CTTTT CTGGA CGATT TTGTCGCCAA ATGGC GGCGG TGAGC CGACG GGTGAGCTGG CTGAG GCGAT CAACA AAAAA TTCGG
CAGCT TCACC GCGTT TAAAG ACGAG TTTTCGAAAG CAGCG GCCGG CCGTT TCGGT TCTGG
CTGGG CATGG CTTGT CGTGA ACAAC GGCGAGCTGG AAATT ACGAG CACGC CGAAC CAAGACTCGC CGATC ATGGA AGGCA AAACG CCGATTCTCG GCTTG GACGT TTGGG AGCAT GCGTA
CTACT TGAAA TACCA AAACC GCCGT CCGGAATACA TTGCC GCATT CTGGA ACATT GTCAA
CTGG-3’と、5’-TTCTG GAACG TTGTC AACTG G-3’ および5’-CCGGA ATTCT TACTT CGCTT TCGCT TC-3’のプ
ライマーセットによる PCR 反応（アニーリング温度
49.3 ℃ ） で 得 ら れ た reverse メ ガ プ ラ イ マ ー 、
5’-CCGGA ATTCT TACTT CGCTT TCGCT TCGCTGTACC GTTTC GCCAC TTCGT CCCAG TTGAC
AATGT TCCAG AA-3’ を組み合わせた二次 PCR 反応（アニーリング温度 51.5℃）をおこなった 22)。なお、メガプライマー以外のプライマーは北海道シス
テ ム サ イ エ ン ス社 に 合 成を 委 託 し た 。 得ら れ た
MnSOD の PCR 産物は精製後， DNA ligation kit
ver2.1(TAKARA)を用いて pColdI にライゲーション
し、E. coli BL21 で発現させた。E. coli BL21 は 50
g/mL Ampicillin、20 g/mL Chloramphenicol および 5
ng/mL Tetracycline 加えた LB 培地で 37℃で 600nm に
お け る 吸 光 度 が 0.5 に な る ま で 培 養 し 、 1mM
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside を加え 15℃、24時間で発現させた 11)。 組替え DNA の塩基配列はBigDye Terminator Cycle Sequencing v3.1 キットを用い ABI310 DNA sequencer で確認した。
菌体培養後、超音波処理により得た粗抽出液を菌
体内タンパクとした。酵素活性は非変性アクリルア
ミド電気泳動後の NBT（nitro blue tetrazolium）を用いた Beauchamp4)の活性染色および Radical catch II
kit（Hitachi-ALOKA）による ORAC 法でトロロック
ス当量として求めた。タンパク質濃度は Lowry 法を用い BSA 換算した。
Lauryl dodecyl sulfate (SDS)はタンパク変性剤としてよく知られ、タンパクの高次構造に作用し多量体を解離し酵素活性を失わせる。そこで、２種の好熱

Collection of Microorganisms and Cell Cultures により同定された。２つの好熱菌は LB 培地により 60℃で好気的に培養した 13)。
MnSOD 遺伝子は B. stearothermophilus C36 株ある
いは IFO12550 株のゲノムを鋳型にし、5'-GGCTCGAGCA TATGC CATTT GAATT GCC-3'と 5'-CCGGAATTCT TACTT CGCTT TCGCT TC-3'のプライマーセットにより増幅した。増幅プログラムは 94℃30 秒、アニーリング温度 46.8℃30 秒、72℃1 分（30 サイクル）とし、Top DNA Polymerase (Bioneer inc.)を用いておこなった。アミノ酸置換はメガプライマー法を用い、B. stearothermophilus C36 株の MnSOD ORF
から 309 番目の G を T に置換し、アミノ酸が Glu から Asp になるように設計した。すなわち、5’-GGCTCGAGCA TATGC CATTT GAATT GCC-3’ お よ び
5’-GATCG CATCA GCCAG CTCAC C-3’のプライマ
ーセットによる PCR 反応（アニーリング温度 57.4℃）で得られた front メガプライマー、5’-GGCTC GAGCATATGC CATTT GAATT GCCAG CATTG CCGTA
TCCGT ATGAT GCGCT TGAGC CGCAC ATCGACAAAG AAACG ATGAA CATTC ACCAC ACGAAGCACC ATAAC ACATA CGTTA CAAAT TTGAATGCGG CGCTT GAAGG GCATC CGGAT TTGCA
AAACA AATCG CTCGA AGAAT TGCTC AGCAA
TTTGG AAGCC CTTCC GGAAA GCATT CGCAC
GGCGG TGCGC AACAA CGGCG GCGGT CATGC
AAACC ACTCG CTTTT CTGGA CGATT TTGTCGCCAA ATGGC GGCGG TGAGC CGACG GGTGAGCTGG CTGAG GCGAT C-3’と、5’-GAGCT GGCTG
ATGCG ATCAA C-3’ お よ び 5’-CCGGA ATTCTTACTT CGCTT TCGCT TC-3’のプライマーセットによる PCR 反応（アニーリング温度 55.4℃）で得られた reverse メガプライマー、5’-CCGGA ATTCT TACTT
CGCTT TCGCT TCGCT GTACC GTTTC GCCACTTCGT CCCAG TTGAC AATGT TCCAG AATGC
GGCAA TGTAT TCCGG ACGGC GGTTT TGGTATTTCA AGTAG TACGC ATGCT CCCAA ACGTCCAAGC CGAGA ATCGG CGTTT TGCCT TCCATGATCG GCGAG TCTTG GTTCG GCGTG CTCGT
AATTT CCAGC TCGCC GTTGT TCACG ACAAG
CCATG CCCAG CCAGA ACCGA AACGG CCGGC
CGCTG CTTTC GAAAA CTCGT CTTTA AACGC
GGTGA AGCTG CCGAA TTTTT TGTTG ATCGC
CTCAG CCAGC TC-3’ を組み合わせた二次 PCR 反応（アニーリング温度 53.1℃）をおこなった。また
B. stearothermophilus C36 株の MnSOD ORF から
562 番目の A を G に置換し、アミノ酸が Ile から Valに な る よ う に 設 計 し た 。 す な わ ち 、 5’-GGCTCGAGCA TATGC CATTT GAATT GCC-3’ お よ び
5’-CCAGT TGACA ACGTT CCAGA A-3’のプライマ
ーセットによる PCR 反応（アニーリング温度 56.5℃）
46

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)菌から得た MnSOD 粗酵素を 0、0.1、0.2 あるいは
0.3% SDS と 10 分間混合し、非変性アクリルアミド
電 気 泳 動 に よ り 残 存 活 性 を 比 較 し た ( 図 1) 。 B.
stearothermophilus IFO12550 株由来の SOD は 0.2 %で活性が減少し、0.3% SDS では活性がほとんど消失した。しかし、B. stearothermophilus C36 株由来の SOD
は SDS のいずれの濃度においても活性が保持され、C36 株由来の SOD はより高い変性剤耐性を持つことが示唆された。
この SOD の変性剤耐性とアミノ酸配列の関連性を明らかにするために、両株の SOD をコードする
DNA 領域の塩基配列を求め、アミノ酸配列を比較した(図 2)。それぞれのアミノ酸配列は，MnSOD 特有の保存性領域を有し、Mn 原子の保持に関わる His26、His81、 Asp163、 His167 および DXWEHXXY 領域が認められた 5,6,15,18,24)。違いは Glu102Asp、 Ile187Valだけであり、この２つのアミノ酸残基はいずれも保
存されておらず、102,187 の位置の残基は他のホモロ
グ間でも保存されておらず、活性部位から離れていた 5,18)。

図 1 MnSOD 活性に対する SDS の阻害効果。12%未変性系ポリアクリ
ルアミドゲルによる活性染色

図 2 MnSOD のアミノ酸配列比較。＊、C36 株と IFO12550 の相違；○、MnSOD の不変領域；●、Mn 保持に関わるアミノ酸。

C36 株由来の SDS 耐性は 2 か所のアミノ酸の違いによるものと考えられたが、粗酵素に共存するタン
パクの影響を除外するため、B. stearothermophilus
IFO12550 株および B. stearothermophilus C36 株のMnSOD をクローニングし、それぞれを大腸菌系で発現させた。図 3 は大腸菌の lysate を用い SOD 活性
を ORAC 法 で 測 定 し 比 較 し た も の で あ る 。 B.
stearothermophilus IFO12550 株由来の SOD は 1%SDS
でほとんど活性を失ったが、 B. stearothermophilus
C36 株由来の SOD は 1%SDS 存在下でも 50%以上の活性を保持していた。つまり、共存好熱性タンパクがない状態でも、C36 株由来の SOD がより高い耐性を示し、それは 2 か所のアミノ酸配列の違いによるものであることが示された。
Glu102Asp, Ile187Val の 2 か所の置換のうち、いずれが活性を保持するために機能しているかを知るた
めに、C36 株由来 MnSOD のアミノ酸配列のうち一方のアミノ酸だけを置換した。図 4 に示したように、
102Glu→Asp の単一置換では 0.5%SDS での活性低下が見られたが、1%SDS では約 50%が残存した。同様に 187Ile→Val の単一置換でも 1%SDS では約 50%が残存した。これは，２か所のアミノ酸置換がともに
SDS 耐性に寄与しているが、協同的に機能していることを示唆していた。
B. stearothermophilus C36 株の MnSOD のアミノ酸配列の特徴は、MnSOD に特有の共通配列、Mn 原子の保持に関わるアミノ酸である 3 つのヒスチジンとアスパラギン酸(His26、His81、His167、Asp163)そして MnSOD に特徴的なモチーフ（Glu166 、His167）
を保存しつつ IFO12550 株との違い（102Asp→Glu、
187Val→Ile）を持つことである。また、いくつかの
MnSOD の３次構造が X 線解析によって明らかになっており、２つの SOD の相違点である 102 残基、187残基はいずれも保存性領域でも活性部位でもなく、内部に位置することが推定できる 3,19,23）。102 Asp お
よび 102Glu は二次構造の alpha4 領域内にあり、グルタミン酸もアスパラギン酸も酸性アミノ酸であり、電荷に変化は生じていない。また、187Val および187Ile は alpha6 領域と alpha7 領域の間にあり、イソ
ロイシン，バリンのいずれもが疎水アミノ酸である
18)。すなわち、2 か所の置換はアミノ酸の電荷を変えることなくアミノ酸側鎖の炭素数だけが変化したものであった。Argos らによるとタンパク質の安定性は内部の疎水性を高め、外周部の疎水性を下げる
ことの小さな変化の積算によるものであると傾向が示され 1, 21)、タンパク内部のアスパラギン酸からグ

47

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)ルタミン酸への置換は熱力学的に安定化を生み出す
ことがチオレドキシンで示され 7）、バリンからイソロイシンへの置換が疎水的な結合を高めることがリゾチームでも示された 12)。よって、本研究で示されたアミノ酸変異はいずれもがタンパク質の構造安定化に働いたものであり、酵素の高次利用に適するよ
うに改変する方法論を示したものと言える。

図 3 recombinatMnSOD の活性に対する SDS の阻害効果。MnSOD の活性は ORAC 法で求め、SDS
未処理を 100%として比活性で示した。

図 4 1 残基置換 recombinatMnSOD の活性に対す
る SDS の阻害効果。左は Glu102Asp、右はIle187Val の 1 残基置換を示し、MnSOD の活性はORAC 法で求め、SDS 未処理を 100%として比活性で示した。

謝辞
佐藤学氏、安部芳朗氏、草薙潤栄氏には多くの示
唆、議論をいただいたことを感謝する。また、金木則明教授には研究のサポートをいただいたことを感謝する。

276–2875) Brock C.J and Walker J.E. 1980. Superoxide
dismutasefrom Bacillus
stearothermophilus:
Complete amino acid sequence of a manganese
enzyme. Biochemistry; 19: 2873–2882
6) Cheng W, Tung Y.H, Chiou T.T. and Chen J.C. 2006.
Cloning and characterization of mitochondrial
manganese superoxide dismutase (mtMnSOD) fromthe giant freshwater prawn Macrobrachiumrosenbergii. Fish Shellfish Immunol. 21: 453–466
7) Duck Y.L, Kyeong-Ae K, Yeon G.Y. and Key-Sun K.
2004. Substitution of aspartic acid with glutamic acidincreases the unfolding transition temperature of aprotein. Biochem. Biophys. Res. Commun.; 320:
900-906
8) Emregul E. 2005. Development of a new biosensor
for superoxide radicals. Anal. Bioanal. Chem.; 383:
947–954
9) Fridovich I. 1978. Superoxide dismutases: Defense
against endogenous superoxide radical. Ciba Found.
Symp.; 65: 77–93
10) Fridovich I. 1995. Superoxide radical and superoxide
dismutases. Annu. Rev. Biochem.; 64: 97–112
11) Inoue H, Nojima H. and Okayama H. 1990. High

引用文献
1) Amo T, Atomi H. and Imanaka T. 2003. Biochemical
properties and regulated gene expression of thesuperoxide dismutase from the facultatively aerobic
hyperthermophile Pyrobaculum calidifontis. J.
Bacteriol.; 185: 6340–6347
2) Argos P, Rossman MG, Grau UM, Zuber H, Frank G.
and Tratschin JD. 1979. Thermal stability and protein
structure. Biochemistry.; 18(25): 5698–5703
3) Atzenhofer W, Regelsberger G, Jacob1 U, Peschek G.
A, Furtmüller P. G, Huber1 R. and Obinger C. 2002.
The 2.0 Å Resolution Structure of the Catalytic
Portion of a Cyanobacterial Membrane-bound
Manganese Superoxide Dismutase. J. Mol. Biol.;
321: 479–489
4) Beauchamp C and Fridovich I. 1971. Superoxide
dismutase: improved assays and as assay applicableto acrylamide gels. Analytical Biochemistry.; 44:

48

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)efficiency transformation of Escherichia coli withplasmids. Gene.; 96(1): 23–28
12) Kawamura S, Chijiima T. Torikata T. and Araki T.
2013. The mutational effect of Ile58 at subsite C inhen egg-white lysozyme on substrate binding,
enzymatic activity, and protein stability. Biosci
Biotechnol Biochem.;77(3): 560-565
13) Kikuchi S, Shibayama J, Yasui M, Takeuchi T,
Yamamoto I. and Sato M. 1993. Purification of
α-amylase by an immobilized theromophilic Bacillus
strain under nitrate respiration, Bioscience,
Biotechnology & Biochemistry; 57(5): 845-846
14) Li D.C, Gao J, Li Y.L. and Lu J. 2005. A
thermostablemanganese-containing
superoxide
dismutasefromthethermophilic
fungusThermomyces lanuginosus. Extremophiles; 9: 1–6
15) Ludwig M.L, Metzger A.L. and Pattridge K.A ,Stallings. 1991. C. Manganese superoxide dismutase
from Thermus thermophilus: A Structural modelrefined at 1.8A resolution. J. Mol. Bio.; 219: 335–358
16) McCord J.M and Fridovich I. 1969. Superoxide
dismutase: An enzymic function for erythrocuprein(hemocuprein). J. Biol. Chem.; 244: 6049–6055
17) Ng ES, Jourd'heuil D, McCord JM, Hernandez D,
Yasui M, Knight D. and Kubes P. 2004. Enhanced
S-nitroso-albumin formation from inhaled NO during
ischemia/reperfusion. Circ Res.; 94(4): 559–565
18) Parker M.W and Blake C.C. 1988. Iron- andmanganese-containing superoxide dismutases can be

distinguished by analysis of their primary structures.
FEBS Lett.; 229: 377–382
19) Parker M.W, and Blake C.C. 1988. Crystal structureof manganese superoxide dismutase from Bacillus
stearothermophilus at 2.4 A resolution. J. Mol. Biol.;
199:646-661
20) Petkau A, Chelack W.S, Pleskach S.D, Meeker B.E.
and Brady C.M. 1975. Radioprotection of mice bysuperoxide dismutase. Biochem. Biophys. Res.
Commun.; 65: 886–893
21) Scandurra R, Consalvi V, Chiaraluce R, Politi L andEngel P.C. 1998. Protein thermostability inextremophiles. Biochimie; 80: 933–941
22) Song-Hua Ke+ and Edwin L. Madison. 1997. Rapidand efficient site-directed mutagenesis by single-tube‘megaprimer’ PCR method. Nucleic Acids Research.
25(16): 3371–3372
23) Umasuthan N, Bathige S.D, Revathy K.S, Lee Y,
Whang I, Choi C.Y, Park H.C. and Lee J. 2012. A
manganese superoxide dismutase (MnSOD) from
Ruditapes philippinarum: comparative structural- andexpressional-analysis with copper/zinc superoxide
dismutase (Cu/ZnSOD) and biochemical analysis ofits
antioxidant
activities.
Fish
Shellfish
Immunol.;33(4):753-65
24) Whittaker M.M and Whittaker J.W. 1998. A
glutamate bridge is essential for dimer stability andmetal selectivity in manganese superoxide dismutase.
J. Biol. Chem.; 273: 22188–22193

49

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12, 50-55

MINI REVIEW

Miyauchi K

ヒ素耐性菌のヒ素耐性遺伝子群の機能解析とヒ素高蓄積植物を用いたヒ素汚染土壌の浄化
東北学院大学工学部環境建設工学科
宮内啓介

Department of Civil and Environmental Engineering, Tohoku Gakuin University, Tagajo, Miyagi, 985-8537, JAPAN
Corresponding author: Keisuke Miyauchi, kmiya@tjcc.tohoku-gakuin.ac.jp
Phone: +81-22-368-7445
Received: Dec. 3, 2013 /Revised: Dec. 21, 2013 /Accepted: Dec. 22, 2013
Abstract

Key words: arsenic, arsenic resistantRhodococcus, Pteris vittata, phytoremediation

Arsenic is one of metalloids and widelydistributed throughout the world.

Bacteria have various

mechanisms to resist to arsenic, especially to trivalent

1. ヒ素について
ヒ素（As）は地球上に広く存在する元素であり、農薬や染料、半導体などに使用されている一方、高い毒性を示すことも知られている。これまでに世界規模で多くのヒ素汚染問題が起こっているが、それらは人為起源のものと自然由来のものに大別される。
前者の例としては、東日本大震災直後に問題となった鉱山での採掘時に発生した鉱滓由来の汚染（地震で鉱滓が堆積場から流出し、津波によって広がった。
沢の水や井戸水から最大で 240 ppb のヒ素が検出された）、後者の例としては、井戸水として使用した地下水が汚染されていた、バングラディシュの飲料水
由来のヒ素中毒問題等が挙げられる。我が国の土壌汚染対策法では、乾燥土壌：水＝1:10 で 6 時間振とうして溶出したときの水中のヒ素濃度が 10 ppb 未満（溶出量基準）となっている 8)。また、農用地の土
壌汚染防止法では、乾燥土壌：1N 塩酸＝1:5 で 30
分振とうして溶出する土壌中のヒ素濃度が 15 mg/kg
未満（農用地含有量基準）と定められている 9)。ヒ
素は有機ヒ素、無機ヒ素両方の形態で存在しており、As (V)、As (III)、As(0)、As(-III)の 4 種類の価数を取りうる。水溶液中では主に 5 価のヒ酸（arsenate）と3 価の亜ヒ酸（arsenite）として存在しており、亜ヒ酸のほうが毒性が高い。

arsenite and pentavalent arsenate, which are stablearsenical

species.

Tworhodococcal

strains,

Rhodococcus jostii RHA1 and R. erythropolis IAM1399,
show resistance to arsenate and arsenite, and the arsenic
resistance of the latter is much higher than that of theformer.

To elucidate the genetic factors conferring thearsenate resistance to these strains, cloning of thearsenate resistance genes from each genome wasattempted.

It was shown that RHA1 and IAM1399

have one and two arsenic resistance gene clusters,
respectively, which are composed of arsRBC in RHA1
and arsR1B1C1 (ars1 cluster) and arsR2B2C2C3C4orf11-arsD1A1 (ars2 cluster) in IAM1399.

It wasrevealed that the arsRBC gene cluster is the only ars
gene cluster which is responsible for the arsenic
resistance in RHA1, and that both ars1 and ars2 clusters
are capable of conferring the arsenic resistance to an
arsenic sensitive strain.

Some plants also show highresistance to arsenic, and it has been known that the
Chinese brake fern (Pteris vittata) is an arsenichyperaccumulator.

It highly accumulates arsenic in its

fronds, so this fern is one of the candidates for the use inphytoremediation of the environments contaminated byarsenic.

The

phytoremediation

field
of

experiments

arsenic-contaminated

for

the

sites

in

genes,

2. 細菌のヒ素耐性機構
ヒ素は様々な環境中に存在するため、生物の多くはヒ素耐性機構を備えている。細菌においては ars
遺伝子群が耐性に関与していることが知られており、ほぼ全ての細菌がこの耐性遺伝子群を保持している。

Miyagi prefecture are also reported.

50

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)ars 遺伝子群は arsRBC の 3 つの遺伝子群からなる場
合と、arsRBCDA の 5 つの遺伝子群からなる場合に大別される（図 1）。細菌細胞はヒ酸を細胞内に取り込むが、これはリン酸の取り込み機構によって行われる。リンとヒ素は同族元素であり、リン酸とヒ酸の構造が類似しているためであると考えられる。取り込まれたヒ酸は細胞内でヒ酸還元酵素（ArsC）に
よって亜ヒ酸に還元され、ArsB トランスポーターによって細胞外に排出される。ArsR はヒ素非存在下において ars 遺伝子群の転写を抑制する転写制御因子
であり、亜ヒ酸に応答してその転写抑制を解除する。

arsRBCDA 遺伝子群を保持する細菌においては、
ATPase である ArsA が ArsB と結合しており、ArsC
によって還元された亜ヒ酸は亜ヒ酸シャペロンである ArsD によって ArsA に運ばれ、ArsA を経由してArsB から細胞外に排出される。毒性の低いヒ酸から毒性の高い亜ヒ酸に変換して排出する理由は不明であるが、リン酸と類似の構造を持つヒ酸を排出する機構を持たず、亜ヒ酸に還元してから亜ヒ酸特異的なトランスポーターを用いて排出する、という方法がとられていると考えられる。

図 1 細菌の一般的なヒ素耐性機構 ArsC; ヒ酸還元酵素、ArsB; 亜ヒ酸トランスポーター、ArsD; 亜ヒ酸シ
ャペロン、ArsA; ArsB と複合体を作る ATPase、ArsR; 転写抑制因子. arsA、arsD 遺伝子は保持している菌と保持していない菌がある。ヒ酸呼吸をおこなう菌は ArrAB というヒ酸還元酵素を保持している。亜ヒ酸酸化酵素である AoxAB を保持している菌も存在するが、その生理的意義は不明な点が多い。

その他にもヒ素耐性を示す細菌として、ヒ酸を電子受容体とするヒ酸呼吸を行う細菌や、亜ヒ酸をヒ酸に酸化することでエネルギーを得る独立栄養細菌も存在する 5)。前者は ArrA と ArrB からなるヒ酸還元酵素をもつが、この酵素は前述の arsC がコードするヒ酸還元酵素とは相同性を示さず、ArsC が細胞質に局在するのに対して、ArrAB は細胞膜に局在する。
後者の細菌は、AroAB、あるいは AsoAB、AoxBAと命名されている亜ヒ酸酸化酵素を用いて、エネル
ギーを得ている。亜ヒ酸酸化酵素遺伝子をもつ従属栄養細菌も多く、これらの菌における本遺伝子の役
割としては、亜ヒ酸をより毒性の少ないヒ酸に変換する解毒の作用が考えられるが、その真の生理的意
義は不明である。
3. Rhodococcus 属細菌のヒ素耐性機構 4)
我々の研究室では、環境汚染物質であるポリ塩化
ビフェニル（PCB）を分解する細菌 Rhodococcus jostii
RHA1 の PCB 分解機構について研究をおこなっており、本菌の PCB 分解遺伝子を発現させる宿主として

51

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)R. erythropolis IAM1399 という株を用いている。この2 種類の Rhodococcus 属細菌のヒ素耐性を測定した
ところ、RHA1 に比べて IAM1399 の方が非常に高い耐性を示した。図 2 に示す通り、RHA1 は亜ヒ酸では 3 mM まで、およびヒ酸では 10 mM まで耐性を示
す一方、IAM1399 は亜ヒ酸では 20 mM まで、ヒ酸は 50 mM まで耐性を示す。そこでこの耐性の違いの原因を調べるため、両細菌のヒ素耐性遺伝子群の解

図2

析をおこなった。
RHA1 株はそのゲノム配列が明らかになっており
2)、染色体上に既知の arsRBC と高い相同性をもつ遺伝子群が存在する（図 3）。本遺伝子群の破壊株を作製したところヒ素耐性能が大幅に低下したことから、
RHA1 株においてはこの遺伝子群（arsRBC）がヒ素耐性に関与する唯一の遺伝子群であることが示された。

(A) Rhodococcus jostii RHA1 と(B) Rhodococcus erythropolis IAM1399 のヒ素耐性能

図3：RHA1 株が保持するヒ素耐性遺伝子群

IAM1399 株からは 2 種類の ars 遺伝子群に相同性を示す領域を単離し、それぞれ ars1、ars2 領域と命名した。ars1 領域に存在する遺伝子を arsR1B1C1、
ars2 領域に存在する遺伝子を arsR2B2C2C3C4D1A1と命名した。ars2 領域の arsC3 と arsD1 の間には、oxidoreductase と相同性を示す機能未知の ORF である ORF11 が存在していた。ars1 領域と ars2 領域のヒ素耐性への関与を調べるため、それぞれの遺伝子群
を、ヒ素耐性を示さない RHA1ΔarsRBC 株（RHA1
株の arsRBC 破壊株）に導入してヒ素耐性を調べた
結果、どちらを導入した場合も高いヒ素耐性を示した（図 4）。このことから、ars1 と ars2 の両領域は共にヒ素耐性遺伝子群として機能することが示された。
ars2 遺伝子群中に存在する機能未知の ORF である
ORF11 を ars2 から欠失させたプラスミドを導入した際も耐性に変化が見られなかったことから、ORF11
は IAM1399 のヒ素耐性には関与していないことが強く示唆された。ars1 と ars2 どちらを導入した場合も高い耐性を示したのは、両遺伝子群が共にIAM1399 の高いヒ素耐性に関与している可能性と、用いたベクターのコピー数が高いため本来より高い耐性を示した可能性の両方が考えられる。現在両領域の破壊株の作製を試みている。

52

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)

(A)

(C)

(B)

(D)

ORF11

図 4 (A) R. jostii RHA1arsRBC 株（arsRBC 破壊株）、(B) IAM1399 株の ars1 領域を導入したarsRBC 株、(C)IAM1399 株の ars2 領域を導入したarsRBC 株、(D) IAM1399 株の ars2 領域から ORF11 を削除した領域を導入したarsRBC 株、のヒ素耐性。

4. モエジマシダを用いたヒ素汚染の浄化 3)
一方、植物の中にもヒ素に強い耐性を示すものがある。これらは一般にヒ素高蓄積植物と呼ばれており、シダ植物の一種であるモエジマシダ（ Pteris
vittata）がよく知られている。モエジマシダは乾燥
重量の 2%までヒ素を蓄積することが可能であることが 2001 年に明らかとなっている 1)。モエジマシダ
はヒ素をヒ酸の形でリン酸輸送システムを用いて根から吸収した後、根の細胞内でヒ酸を亜ヒ酸に変換すると考えられている。変換された亜ヒ酸は導管を通じて地上部の羽片に蓄積される。植物を用いて環境浄化をおこなう方法をファイトレメディエーショ
ンと呼ぶが、モエジマシダは低濃度、広範囲に汚染されたヒ素汚染土壌のファイトレメディエーションに適した植物であるといえる。東日本大震災の際には、宮城県内の鉱山付近を流れる川の河口域およびそれに続く海底に堆積していたと考えられるヒ素が、津波によって津波堆積物として堆積したことが明らかとなった 6)。そこで我々は、津波被災地域、およびその周辺地域において、5 カ所の圃場を用いてモ
エジマシダを用いたヒ素汚染土壌の浄化実験をおこなった。
5 カ所のうち 4 カ所は津波被災地域であり，
1 カ所は津波被災地域ではないが，元来のヒ素濃度が高い土壌である．5 カ所の土壌のヒ素濃度は、先53に述べた水溶出量で 3 – 20 ppb であった。実験期間であるが，モエジマシダは日本では和歌山県以南にのみ自生するため，宮城県内では冬場の低温で枯死してしまうことが予想された．そのため，気温が上昇し始める５月に苗を植え，気温が下がる前の 11
月に刈り取ることとして実験をスタートした．その間，一ヶ月ごとに土壌とシダをサンプリングし，それぞれのヒ素濃度を測定した．モエジマシダの植え
付けは，基本的に一畝を 1 m×10 m とし，一畝に 100株のシダを植え付けた．1 圃場当たり 10 畝を基本としたので，１圃場に約 1000 株のシダを植えたことになる．シダのサンプルは，羽片の数と長さを測定した後に細かく裁断し乾燥させ，乾燥重量を量った後に酸分解して植物地上部内に含まれるヒ素含有量を測定した．本稿では 5 つの圃場のうち一つの圃場を例として 1 年目の結果を報告する．
図 5 にモエジマシダ羽片のバイオマス量（図 5A）と羽片のヒ素濃度（図 5B）の経時変化結果を示す．
モエジマシダの羽片バイオマスは 5〜7 月にかけてはほとんど変化がないが，その後急速に生育が見られ（図 6），11 月には一株当たりの乾燥重量が約 80グラムとなった（図 5A）．1 ㎡当たり 10 株植えているので，バイオマス量は 800 g DW / ㎡となる．羽片のヒ素濃度（乾燥重量 1 g 当たり）の変化について

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)は，苗を植えてから一ヶ月で約 20 μg / gDW に上昇
し，その後 8 月から 10 月にかけては 50-60μg / gDW
でほぼ一定であった．しかし，11 月になるとその値は大きく落ち，30μg / gDW となった．羽片のヒ素濃度と乾燥重量を乗じて羽片のヒ素含有量を求めたグラフが図 7 である．7 月から 10 月にかけてヒ素含有量が増加しており，11 月に大きく減少することが見て取れる．シダの刈取りは 11 月におこなったので，
この圃場（100 ㎡）
からは 800 g DW / ㎡×100 ㎡×30μg/ gDW = 約 2.4g のヒ素を除去できたことになる．今回の実験では 11 月に羽片のヒ素濃度が減少した。気温の低下や降水量等の原因が考えられるが、これについては現在ポット栽培や実験室での水耕栽培で解析をおこなっているところである。

図 5 ：モエジマシダ羽片のバイオマス量（A）とヒ素濃度（B）の経時変化．一株当たりの乾燥重量と乾燥
重量当たりのヒ素濃度を一ヶ月ごとに測定した．

図6

モエジマシダの生長の様子．(A)5 月，(B)9 月，(C)11 月の圃場の様子．

図7

モエジマシダ一株当たりの羽片に含まれるヒ素含量の経時変化．
54
54

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)

今後の展望
Ars タンパク質を用いた細菌のヒ素耐性機構は普遍的に存在しているが、各菌のヒ素耐性の違いと ars
遺伝子群の配列の対応については不明な点が多い。
また、ars 遺伝子群だけでなく、arr タイプのヒ酸還元酵素遺伝子をもつ細菌や aro タイプの亜ヒ酸酸化
酵素遺伝子をもつ細菌など、土壌中の細菌類が土壌中のヒ素の変換に大きく関与していると考えられる
7)。これらの菌の動態を明らかにし、ヒ素超蓄積植物であるモエジマシダと組み合わせることで、効率的で省エネルギーなヒ素汚染除去技術の開発が可能になると考えられる。

catabolic powerhouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
103: 15582-7.
3) Miyauchi, K., Chien, M., Huang,Y., Ohtomo, S.,
Waizumi, T., Inoue, C., Kitajima, N., and Endo, G.
2013. 津波による土壌のヒ素汚染とその修復への取り組み. J. Environ. Biotech. 13: 27-30.
4) Miyauchi, K. 未発表データ.
5) Silver, S. and Phung, L. T. 2005. Genes and enzymes
involved in bacterial oxidation and reduction of
inorganic arsenic. Appl. Env. Microbiol. 71: 599–608.
6) 簡 梅芳、宮内啓介、井上千弘、北島信行、遠藤銀朗. 2013. 宮城県主要河川沖積平野部の土壌ヒ素濃度と東北地方太平洋沖地震津波の影響. 土木学会論文集(G 分冊) 69: 19-24.
7) 簡梅芳，小畑和貴，黄毅，宮内啓介，遠藤銀朗. 2013.
ヒ素高蓄積植物による土壌ヒ素の吸収・除去と土壌微生物の亜ヒ酸酸化に関する研究. 土木学会論文集 G（環境）. 69: III9-III15
8) 環境省. 2002. 土壌汚染対策法施行規則. 平成 14年環境省 令第 29 号.
9) 環境省. 1970. 農用地の土壌の汚染防止等に関する法律. 昭和 45 年法律第 139 号

謝辞：本発表の研究の一部は三井物産環境基金、文部科学省私立大学戦略的研究基盤形成支援事業の助成を受けておこなわれたものであることをここに記し感謝の意を表します。
参考文献
1) Ma L. Q. et al. 2001. A fern that hyperaccumulatesarsenic. Nature 409: 579
2) McLeod M. P. et al. 2006. The complete genome of
Rhodococcus sp. RHA1 provides insights into a55

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)MINI REVIEWJournal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12, 56-64

Agarie S

アイスプラントの高塩環境適応機構とその応用
香川大学農学部
東江 栄
香川大学農学部、香川県木田郡三木町池戸２３９３
Corresponding author: Sakae Agarie, agarie@ag.kagawa-u.ac.jp
Phone: +81-87-891-3062, Fax: +81-87-891-3021
Received: Dec. 11, 2013 /Revised: Dec. 16, 2013 /Accepted: Dec. 16, 2013
Abstract

The common ice plant Mesembryanthemum

The ice plants could grow in the tsunami-affected soils

crystallinum L. is an annual halophyte native to South

collected from coastal regions in the Miyagi and Iwate

Africa. This species can grow under severe salt stressprefectures, which contained high amounts of sodium

condition equivalent to the seawater salinity. Following

and heavy metals. The ice plant accumulated arsenic,

exposure to salinity, the ice plant shifts its photosynthetic

cadmium, copper and zinc at higher levels in shoots.

mode from C3 to Crassulacean acid metabolism (CAM).

These results indicated that the ice plant is attractive

It also develops a specialized trichome, called epidermal

sources for phytoremediation, functional food and usefulbladder cells (EBCs) on all aerial parts, which contribute

adaptive determinants for engineering improved salt

to sequestration of salt from photosynthetically active

stress tolerance in crops.

tissues. We have isolated CAM-deficient mutants and a
EBC-less mutant from the first large-scale mutant

Keywords: アイスプラント、塩生植物、機能性野菜、

collections of the ice plant. The CAM-deficient mutants

耐塩性、ファイトレメディエーション

failed to express an enzyme catalyzing reaction critical to
１．はじめにgluconeogenesis and starch formation. Moreover, we
obtained genes responsible for bladder cell formation

塩害は植物の生育を阻害する最も重要な要因の一

using cDNA-based suppression subtractive hybridizationつである。世界の陸地面積の約６％（８億ヘクター

PCR, and orthologs of Arabidopsis trichome-related

ル以上）、全耕地面積の約２０％が塩の影響を受けて

genes and cotton fiber-related genes with the comparison

いる 31)。また近年、灌漑事業の大規模化に伴い、不of transcriptional abundance between mutant and wild

適切な後処置によって引き起こされた人為的な塩害

type plants. In response to osmotic stresses caused byが増加しており、その総面積は灌漑地の約４０％にsalinity, the ice plant accumulated myo-inositol, pinitol

もなる 31)。将来予想される食糧問題に対応して劣悪

and proline as compatible solutes to maintain osmotic

土壌における農業生産が求められるが、塩類集積土pressure

These

壌の利用は限られている。対策として、現有作物のcompounds are known to have beneficial effects for

耐塩性を向上させるか、耐塩性の高い植物を作物と

human health, suggesting that the ice plant has a high

して活用する方法が考えられる。前者は、耐塩性作

potential as a functional food. We have firstly sold the

物及び品種のスクリーニング、耐塩性メカニズムの

ice plant as a new vegetable in Japan. We also suggested

解明、関連遺伝子（座）の同定等が求められる。後that the ice plant can be used for phytoremediation of

者は、作物として利用可能な植物の選定、利用法のsalinized and heavy metal contaminated soils. The ice

確立ならびに塩蓄積能の高い植物を用いた除塩技術

plant could withstand under severe salt stress conditionの検討等が挙げられる。塩生植物の耐塩性機構の解and exhibited a high tolerance to cadmium and copper.

明はいずれにとっても重要である。

incytoplasmic

compartments.

56

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)植物の耐塩性は種によって大きく異なる。一般的

２．耐塩性機構な作物の耐塩性は低く、海水の１０分の 1 程度 NaCl

１）ブラッダー細胞（約 50mM）で生育は著しく阻害され、種によって塩生植物の中で特に耐塩性の高い種は、塩嚢細胞，は短期間のうちに枯死する。塩生植物は同じ条件で

塩囊毛，あるいはブラッダーヘアー等とよばれる塩正常に生活環を完結させる。アイスプラント

集積細胞をもち、体内で過剰になった塩をこの細胞（Mesembryanthemum crystallinum L.）は，ハマミズに取り込むことで塩濃度を調整している 12,16,28)。ア

ナ科メセンブリアンテマム属に属する南アフリカ原イスプラントも同様に、ブラッダー細胞とよばれる産の 1 年生草本で、100〜200 mM NaCl で生育が促進

塩集積細胞をもつ（図１） 1)。この細胞はストレス

し、800mM NaCl 存在下においても枯死しない。まのない条件下においてもみられるが、塩ストレスにた、塩ストレスにともない光合成型を C3 型から伴い肥大する。著者らは、アイスプラントの種子に7)CAM 型に変換する 。本種はこれまで、環境要因の中性子線を照射して誘導した突然変異体約３万個体

変動にともなう光合成変換機構ならびにストレス耐からブラッダー細胞を持たない突然変異体を単離し性機構を解明するモデル植物として多くの研究がなた 4)。野生株の葉身及び茎には、ブラッダー細胞がされてきた 7)。最近では重金属を吸収する能力を利観察され、処理 NaCl 濃度の増加にともない肥大し用したファイトレメディエーションも検討されていたが、変異株にはほとんどみられなかった（図２）。

る 13,34)。また興味深いことに、この植物は食用とな

NaCl を 400mM 与えて栽培した場合、変異株の地上る。1727 年にヨーロッパに導入され、1881 年には米部生重は野生株の約半分にまで低下した。また、変国でホウレンソウのような野菜として紹介された

30)。

異株の葉身の Na+と Cl-の含量は、いずれも野生株の

著者らは我が国で初めてアイスプラントを野菜とし

葉身とブラッダー細胞のそれぞれの含量を合わせたて流通させた。さらに最近、外見や食味を改良した

値と同程度であった。変異株の葉身では、Na+と Cl-

新しい品種を育成した。本ミニレビューでは、著者の増加にともない K+と NO3-の含量が低下した。一らが明らかにしたアイスプラントの耐塩性機構の一方、野生株では、このように、ブラッダー細胞の K+端と、その特異な特性を利用した農作物あるいは環と NO3 の含量は変異株の葉身と同様に低下したが、境浄化植物としての可能性を紹介したい。

葉身のこれらの含量は高く維持された。ブラッダー細胞はアイスプラントの耐塩性及びイオン恒常性に強く関与することが示唆された。

図１．茎と蕾表面のブラッダー細胞．
ブラッダー細胞はアイスプラントの体表面全体を覆う．

図２．野生株とブラッダー細胞欠損変異株の葉表面の走査型顕微鏡写真．左：野生株，右：変異株．bar: 500 µm．

塩毛はトライコームの一種と考えられている 7)。

初期段階に発現する遺伝子８個（GhACY、GhFDH、アイスプラントのブラッダー細胞形成の分子機構を

GhSCP 、 GhTUA 、 GhAUB1 、 GhCesA-5 、 GhACT 、調べるために、すでに詳細が明らかにされているシGhSuSy）、繊維伸長に関与する遺伝子９個（GhSUT1、ロイヌナズナのトライコームとワタの繊維の形成に

GhEXP1 、 GhABP 、 GhMAPK 、 GhRac1 、 GhACT1 、関与する遺伝子と相同性の高いアイスプラントの遺

GhPFN1、GhCER6、GhEF1A4）について調査した（図伝子の発現を調べた 5)。ワタ繊維形成遺伝子につい３）。その結果、わずかに MYB2 及び TUB1 の発現量

ては既報

20)

を参考にし、繊維形成の初期段階に発現が変異体で低かった。MYB2 は MYB 転写因子をコーする遺伝子２個（GaMYB2、GaRDL1）、繊維伸長のドし、繊維形成の初期段階に発現する。シロイヌナ
57

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)ズナでは、葉身のトライコームの形成に関与することが示唆されている

38)

格の構成要素である微小管の形成に関与し、発達中。TUB1 は、チューブリン構の繊維における急激な細胞伸長と皮層微小管の劇的な変化に対応して発現すると考えられている 22)。

成因子（β チューブリン）をコードする遺伝子であり、ワタの綿毛で強く発現する

22)。TUB1 は細胞骨

図３．アイスプラントブラッダー細胞変異体における繊維形成関連遺伝子の発現．
MYB2 及び TUB1 の発現量が変異株で低い．
シロイヌナズナの表皮細胞では、TRANSPARENT

子 ANGUSTIFOLIA(AN) 及 び TUBULIN-FOLDINGTESTA GLABRA１（TTG1）、GLABRA3（GL3）(あCOFACTOR A（TFCA）、トライコームの伸長に関わるいは ENHANCER OF GL3（EGL3）)、GLABRA1る遺伝子 WURM(WRM)及び CROOKED(CRK)、それ（GL1）(あるいは MYB2)といった三種類のタンパクぞれと相同性の高い遺伝子の発現を調べた 5)。変異質が転写因子複合体を形成し、同時に TRIPTYCHON

株では、GL2、AN、WRM、及び CRK の発現量が低(TRY)、CAPRICE (CPC)といった制御因子の発現がく、逆に TRY と CPC の発現量が高かった（図４）。

誘導される

14)

。転写因子の複合体は GLABRA2（GL2）以上のことから、ブラッダー細胞の形成は、少なくの発現を誘導し、トライコームの形成が誘導される。

ともその一部はシロイヌナズナのトライコーム形成

TRY や CPC タンパク質は隣接する表皮細胞に移動と類似したメカニズムによって制御されていると考し、タンパク質複合体の形成を阻害する。TTG1、えられた。

GL2、TRY、CPC、トライコームの分枝に関わる遺伝

図４．アイスプラントブラッダー細胞変異体におけるトライコーム形成関連遺伝子の発現．
変異株では、GL2、AN、WRM、及び CRK の発現量が低く、逆に TRY と CPC の発現量が高い．

58

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)サプレッションサブトラクティブハイブリダイゼ

MW11 は、システインプロテアーゼ遺伝子と相同性ーション法を用いて、野生種と変異株とで発現量のが高く、MW21 はプロテインキナーゼ遺伝子と相同

5)異なる遺伝子の単離を試みた 。その結果、1３個の性が高かった。一方、野生株で強く発現していた機能未知遺伝子の DNA 断片が得られ、そのうちのWM10 はジャスモン酸誘導タンパク質をコードする５個が変異体で強く発現し、２個が野生株で強く発遺伝子と相同性が高かった。それ以外は報告のない現していた（図５）。変異株で強く発現していた新規遺伝子であった 5)。

図５．サプレッションサブトラクティブハイブリダイゼーション法により単離した機能未知遺伝子の発現．
13 個の機能未知遺伝子の DNA 断片が得られた．変異株では、MW3、MW11、MW21、MW29 及び MW31 が強く発現し、野生株では、WM10 及び WM28 が強く発現している．
２）光合成変換発現を調査した。変異株では、塩処理によって 17

CAM は夜間に CO２を固定するため、水利用効率が高い

個の遺伝子の発現が 2 倍以上増加した。その中には、

9)。アイスプラントは、塩ストレスによってタウマチン様タンパク質や抗病原体タンパク質等の光合成型を C3 型から CAM 型へ変換させる。CAM

防御機構関連遺伝子等が含まれていた。逆に、発現化はアイスプラントの耐塩性の向上に寄与しているが半分程度に抑制された遺伝子は 65 個で、ホスホエ

7)。光合成変換及び CAM の日変化を制御する分子機

ノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（PEPC）、構を明らかにするために、CAM にならない変異体を各種プロテアーゼ、及びピニトール合成関連遺伝子

作成した

10)

。塩処理後、野生株では夜間の CO2 固定

等、塩によって誘導される遺伝子であった。このよ

速度が増加し、同時にリンゴ酸及びデンプン含量のうに、CAM 化には複数の代謝系が関与していること

日変化が認められた（図６）。一方、変異株では、夜が示唆された。

間の CO2 固定がなく、リンゴ酸及びデンプンが一日を通じて低く推移した。塩ストレスによって誘導さ

３．応用れる遺伝子の発現を調べたところ、変異体では糖新１）機能性野菜としての利用

生及びデンプン合成の鍵酵素であるホスホグルコム

著者らの研究グループは 2001 年頃からアイスプ

ターゼの活性がなく、それをコードする遺伝子の発ラントを野菜として流通させる取り組みを開始した。

現がみられなかった（図７）。このため変異株ではデアイスプラントは塩ストレス下で適合溶質としてミンプン合成及びその分解により生じる有機酸の合成

オイノシトール、ピニトール、プロリン等を 3)、まが正常に行われず、CO2 固定に必要な基質が生成さた抗酸化物質としてベタシアニンやフラボノール

れなかったと考えられた 10)。変異株の遺伝子の発現（メセンブリアンチン）等を生成する 37)。また、塩パターンを網羅的に調べるために、重複のないようストレスにともなって二次的に誘発される酸化ストに調整した約 1600 個のアイスプラントの EST クロ

レスに対して、活性酸素消去系関連酵素の活性が増ーンをのせたアレイを作成し、塩処理に伴う遺伝子加する 3,33)。 さらに、CAM 化した葉身にはリンゴ

59

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)図６．CAM 欠損変異体における葉身の滴定酸度

図７．CAM 欠損変異体における CAM 酵素遺伝子

及びデンプン含量．

の発現量．

300mM NaCl を 2 週間与えた野生株（●）
、変異系

300mM NaCl を 10 日間与えた．変異株２系統では

統 351（○）及び変異系統 371（□）の葉身．変異

ホスホグルコムターゼ（Pgm2）の発現がみられな

株では、リンゴ酸の蓄積をしめす滴定酸度及びデい．Ppck，ホスホエノールピルビン酸カルボキシ

ンプン含量の日変化がみられない．

ラーゼキナーゼ；Ppc1，ホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼ；Gpt2，グルコース-6-リン酸／リン酸輸送体；Ubp1，ユビキチン；WT，野生株；351，変異系統 351；371，変異系統 371．

酸 23)及びクエン酸 15)が蓄積する。これらの物質は機

よく，歯ごたえは従来品種とかわらないが，えぐみ能性を有していることが報告されている。例えば、がすくない．食味の総合評価は従来品種よりも高かイノシトールは抗脂肪肝ビタミンとよばれ、脂肪肝った．著者らはこれを KA-I243 と名付け，品種登録

や動脈硬化の予防に関与し糖値の低下に作用する

18,25)

26,27)、ピニトールは、血の出願を行った。新しい地域特産野菜として活用す。また、リンゴ酸とクエるための取り組みをすすめている。

ン酸は、腎臓結石の生成を抑え 21,29)、キレーターとしてアルミニウムの集積を抑制する作用があるとさ

２）ファイトレメディエーションへの応用れる。さらに、プロリンは脂肪燃焼アミノ酸とよば塩生植物を利用した塩害土壌からの除塩 11,19）や重れ、
コラーゲンの生成・修復 39)や傷の治癒に作用し、金属汚染土壌のファイトレメディエーションが試み

筋肉や軟骨、及び関節の保持に機能するヒドロキシられている 24）。塩害土壌の除塩に用いられている植プロリンの前駆体となる 6)。著書らは，先端技術を物、たとえば、Mesembryanthemun barklyi 11 ） 及び活用した農林水産研究高度化事業（農水省）、及び際

Suaeda salsa19）は地上部に NaCl をそれぞれ 3.7 g、及立つ佐賀・ベンチャー創出支援事業（佐賀県）等のび 10 g 蓄積する。アイスプラントを 100 mM NaCl

支援をうけ，アイスプラントを新規機能性野菜とし条件下で水耕栽培したところ、地上部に約 14 g の塩て栽培・販売する事業をすすめた．現在では、アイ分を蓄積した 2）。また、アイスプラントは、銅やカスプラントは野菜として広く認知され、全国各地でドミウム等の重金属に対する耐性が高かった

様々な商標で販売されている。しかし，流通してい

13,17,32,35）

るものはすべて野生種であり，品種登録されたもの

CuSO4）でも生存し、バイオマス量はイネの約７倍ではない。著者らは、著者らが保有する変異体コレであった。この処理区に 100mM NaCl を共存させる

クションの中から，葉身のクロロフィル含量及びカとバイオマス量が約 1.3 倍増加した。一般的な植物

ロテノイド含量が低く，葉色が黄緑色を呈する系統の銅含量は、乾燥重量 1 g あたり 0.002～0.05 mg でを選抜した．この系統は，彩りが鮮やかで見た目があり 8）、乾燥重量 1 g あたりに 1 mg の銅を含む植物。銅に対しては、イネが枯死する濃度（0.1mM

60

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)は高集積植物（ハイパーアキュムレーター）とよばれる

ムに対する耐性が高く、いずれも高濃度に集積する

36）。アイスプラントの葉身中の銅含量は、0.3

ことが明らかとなった。東日本大震災における津波

mM CuSO4 で栽培した場合、乾燥重量 1 g あたり 0.53

被害をうけた土壌でアイスプラントを栽培し，生育

mg であり、単純に計算してハイパーアキュムレータ

量及び無機成分含量を調べた 34）．その結果，アイスーの約半分程度、通常の植物の約 10～265 倍であっプラントは津波被災土壌でも良好に生育し（図８），た。また、カドミウムに対しては、イネが１週間程

NaCl を個体あたり最大で約 11 g 蓄積した．耕地面

度で枯死する濃度（1.0 mM CdCl2）でも生存した。

積１ヘクタールあたりに換算すると、約 4 t である．

一般的な植物のカドミウム含量は乾燥重量 1 g あた

採取地点によっては、土壌中にアルミニウム、亜鉛、り 0.03-0.5 µg であり、ハイパーアキュムレーターでコバルト、ニッケル、鉛、ヒ素等を含む場合もあっは 100 µg /g 以上とされる

36）。アイスプラントのカ

たが、生育阻害はみられず良好に生育した。アイス

ドミウム含量は、1 mM CdCl2 で栽培した場合、葉、プラントはカドミウム及び銅を蓄積することはすで茎でそれぞれ 1500 µg /g 及び 1900 µg /g となり、ハにわかっていたが、今回新たに亜鉛及びヒ素を蓄積

イパーアキュムレーターの基準値を大きく上回った。

することが明らかとなった（図９）。重金属を集積す以上のことから、アイスプラントは銅及びカドミウ

るメカニズムについては今後の研究を待ちたい。

図８．東日本大震災津波被災土壌におけるアイスプラントの生育．
①岩手県陸前高田市（水田、除塩なし）、②宮城県気仙沼市（水田、除塩・ヘドロ除去なし、③宮城県気仙沼
市（除塩・ヘドロ除去なし）、④宮城県本吉郡（水田、除塩・ヘドロ除去なし）、⑤宮城県本吉郡（水田、表面土壌除去）、⑥宮城県石巻市（水田、除塩・ヘドロ除去なし）、⑦宮城県石巻市（水田、除塩・ヘドロ除去なし）、⑧宮城県石巻市（畑地、瓦礫・ヘドロ除去）、⑨宮城県石巻市（水田、ヘドロ混和後代掻き）、⑩宮城
県石巻市（水田水路内のヘドロ）、⑪宮城県石巻市（水田、ヘドロ除去なし）、⑫宮城県東松島市（公園前、民家前のヘドロ）、⑬宮城県東松島市（水田、除塩・ヘドロ除去なし）、⑭宮城県東松島市（地盤沈下による海水流入）、⑮宮城県仙台市（重機による表面土壌除去）、⑯宮城県仙台市（重機による表面土壌除去）．

61

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)図９.アイスプラント地上部あたりの重金属含量．図中の番号は採取地．図８参照．アルミニウム、亜鉛、ニッケル、銅、ヒ素、及びカドミウム等の含量が高い．
４．今後の展望

ストレスに対し代謝を変動させて対応する。生成さCAM にならない変異体は塩ストレス下で葉身のれる代謝産物は医療や健康補助に役立つ有用成分で退色や枯死が目立った。特に夏期、野外で栽培したある場合も多い。アイスプラント以外にも食用可能個体で顕著になる傾向にあった。これは CAM 化がな塩生植物は多数存在する。塩生植物は、乾燥、高耐塩性の向上に寄与することを示唆する。CAM が耐

低温、病害虫等のストレスに対する耐性が現有作物

塩性を高めるメカニズムはよくわかっていないが、より高いことから、栽培にかかる労力を省力化でき少なくとも活性酸素の発生は抑えられるようである

る。また、本研究で示したように、有害物質を吸収

33)。CAM 植物は昼間気孔を閉じ、夜間に蓄積したリする能力を利用したファイトレディエーションへのンゴ酸から CO2 を脱炭酸する。その際、葉内の CO2

応用も期待される。アイスプラントに代表される野

濃度が増加し、活性酸素の発生が抑えられると考え生植物は、植物の諸特性を調べる基礎的研究の研究られる。CAM が塩ストレス（あるいは浸透圧ストレ材料として以外に、有用成分の原料として、あるいス）に対し何らかの直接的な作用をもつのか、あるはそれを高濃度に含有する機能性食材として高い可

いは、塩によって二次的に誘発される酸化ストレス

能性を秘めている。

を軽減することで塩ストレス耐性を高めているのかを明らかにすることは、CAM の生理的意義を知る上謝辞で重要である。そのために、単離した遺伝子の機能

本研究の一部は、科学研究費補助金

基盤研究 C解析を行う必要があるが、変異体の相補性試験に必（ No.24580025 、 21580016 ） 及 び 基 盤 研 究 B No.

須な形質転換法はアイスプラントでは確立されてい18380015）の支援をうけて実施した。

ない。培養細胞から個体への再分化が困難なためである。著者らは再分化法も含めて様々な形質転換法

引用文献

を試しており、期待される成果も得られている。

1) Adams, P., Nelson, D.E., Yamada, S., Chmara W.,

アイスプラントの CAM 化のように、植物は各種

Jensen, R.G., Bohnert, H.J., Griffiths, H. 1998.

62

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)Growth and development of Mesembryanthemum

Cadmium effects on growth and mineral nutrition of

crystallinum (Aizoaceae). New Phytol. 138: 171-90.

two halophytes: Sesuvium portulacastrum and2) 東江栄．2004. アイスプラントを用いた土壌脱Mesembryanthemum crystallinum. J. Plant Physiol.

塩技術の可能性．熱帯農業 48： 294-8.

162: 1133-1140.

3) Agarie, S., Kawaguchi, A., Kodera, A., Sunagawa,14) Grebe, M. 2012. The patterning of epidermal hairs in

H., Kojima, H., Nose A. and Nakahara, T. 2009.

Arabidopsis-updated.

Plant Prod. Sci. 12: 37-46. Potential of the common
food

as

evaluated

Opin.

Plant

Biol.

15:31-7.

ice plant, Mesembryanthemum crystallinum as a new
high-functionalCurr.

15) Herppich, M., von Willert, D.J. and Herppoch, W.B.

by polyol

1995. Diurnal rhythm in citric acid content preceded

accumulation.

the onset of nighttime malic acid accumulation

4) Agarie, S., Shimoda, T., Shimizu, Y., Baumann, K.,

during metabolic changes from C3 to CAM in

Sunagawa, H., Kondo, A., Ueno, O., Nakahara, T.,

salt-stressed

plantsofMesembryanthemum

Nose A. and Cushman, J.C. 2007. J. Exp. Bot.

crystallinum. J. Plant Physiol. 147:38-42.

58:1957-67. Salt tolerance, salt accumulation, and16) Jeschke, W.D. and Stelter, W. 1983. Ionic relations

ionic homeostasis in an epidermal bladder-cell-lessof garden orache, Atriplex hortensis L.: growth andmutantion distribution at moderate salinity and the function

of

the

commonice

plant

Mesembryanthemum crystallinum.

of bladder hairs. J. Exp. Bot. 34, 795-810.

5) 東江栄・副島健太郎・Cushman, J.C. 2012. アイ

17) 金子康昭・早川啓亮・多田将宏・東江栄．アイ

スプラントブラッダー細胞関連遺伝子の単離とスプラントの銅及びカドミウム耐性．日本作物発現解析. 日本作物学会紀事 81 別１：112-3.

学会紀事 80 別１：390-91．

6) Balch, P.A. and Balch, J.F. 2000. Prescription for18) Kang, M.-J., Kim, J.-I., Yoon, S-Y., Kim, J. C. andnutritional healing. Penguin Putnam Inc., New York.

Cha, I.-J. 2006. Pinitol from soybeans reduces

42-53.

postprandial blood glucose in patients with type 2

7) Bohnert, H.J. and Cushman, J.C. 2000. The ice plantdiabetes mellitus. J. Medicinal Food 9 : 182-6.

cometh: Lessons in abiotic stress tolerance. J. Plant

19) Ke-Fu, Z. 1991. Desalinization of saline soils by

Growth Regul. 19:334-346.

Suaeda salsa. Plant Soil. 135:303-5

8) Burkhead, J.L., Gogolin Reynolds, K.A., Abdel‐

20) Lee, J.J., Woodward, A.W. and Chen, Z.J. 2007.

Ghany, S.E., Cohu, C.M., Pilon, M. 2009. Copper

Gene expression changes and early events in cotton

homeostasis．New Phytologist. 182: 799–816.

fibre development. Annal. Bot. 100: 1391-401.

9) Cushman, J.C. 2001. Crassulacean Acid Metabolism.
Aplastic

photosynthetic

adaptationto21) Levine,

arid

B.S.,

Rodman,J.S.,

Wienerman,

S.,

Bockman, R.S., Lane, J.M. and Chapman, D.S. 1994.

environments. Plant Physiol. 127:1439-48.

Effects of calcium citrate supplementation on

10) Cushman, J.C., Agarie, S., Albion, R.L., Elliot, S.M.,

urinary calcium oxalate saturation in female stone

Taybi, T., Borland, A.M. 2008. Isolation andformers: Implications for prevention of osteoporosis.

characterization of mutants of common ice plant

Am. J. Clin. Nutr. 60 : 592-6.

deficient in crassulacean acid metabolism. Plant

22) Li, C.-H., Zhu, Y.-Q., Meng, Y.-L., Wang, J.-W., Xu,

Physiol. 147:228-38.

K.-X., Zhang, T.-Z., Chen, X.-Y. 2002. Isolation of11) de Villiers, A.J., van Rooyen, M.W., Theron G.K.

genes preferentially expressed in cotton fibers by

and Claassens, A.S. 1995. Removal of sodium andcDNA filter arrays and RT-PCR. Plant Science.

chloride from a saline soil by Mesembryanthemum

163:1113-20.

barklyi . J. Arid Environ. 29:325-30.

23) Libik, M., Pater, B., Elliot, S., Slesak, I. and

12) Freitas, H. and Breckle, S.W. 1992. Importance of

Miszalskia, Z. 2004. Malate accumulation inbladders for salt tolerance of field-grown Atriplex

different

species from a Portuguese salt marsh. Flora.

crystallinum L. following age-dependent or salinity-

187:283-97.

triggered13) Ghnaya, T., Nouairi, I., Slama, I., Messedi, D.,organsCAM

ofMesembryanthemum

metabolism.

Z.

Naturforsch.

59:223-8.

Grignon, C., Abdelly, C. and Ghorbel, M.H. 2005.

24) Manousaki,

63

E.

and

Kalogerakis,

N.

2011.

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)Halophytes - an emerging trend in phytoremediation.

50: 678-685.

Int. J. Phytoremediation. 13: 959-69.

33) Sunagawa, H., Cushman, J.C. and Agarie, S. 2010.

25) Narayanan, C.R., Joshi, D.D., Mujumdar A.M. andCrassulacean

acid

metabolism

mayalleviate

Dhekne, V.V. 1987. Pinitol - a new anti-diabetic

production of reactive oxygen species in acompound from the leaves of Bougainvillea

facultative CAM Plant, the common ice plant

spectabilis. Curr. Sci. 56: 139-41.

Mesembryanthemum crystallinum L. Plant Prod. Sci.

26) 大呑尚子・片山徹之. 1997. ショ糖およびオロト

13: 256-60.

酸摂取によるラット肝脂質蓄積に対する食餌ミ34) 多田将宏，木村雅子, 鈴木均, 東江栄，2012，東

オイノシトールおよびフィチン酸の影響. 日本

北地方太平洋沿岸地域の津波被災土壌における栄養・食糧学会誌 50(4), 267-272, 1997．

アイスプラントの生育，日本作物学会紀事 81 別

27) Maeba, R., Hara, H., Ishikawa, H., Hayashi, S.,

2, 8-9．

Yoshimura, N., Kusano, J., Takeoka, Y., Yasuda, D.,35) Thomas, J.C., Malick, F.K., Endreszl, C., Davies, E.

Okazaki, T., Kinoshita, M., and Teramoto, T. (2008).

C. and Murray, K.S. 1998. Distinct responses to

Myo-inositol

copper stress in the halophyte Mesembryanthemum

treatment

increases

serum

plasmalogens and decreases small dense LDL,
particularlyinhyperlipidemic

subjects

crystallinum. Physiol. Plant. 102: 360-368.

with36) van der Ent, A., Baker, A.J. M., Reeves, R. D. andmetabolic syndrome. J. Nutr. Sci. Vitaminol., 54,

Pollard,196-202

Hyperaccumulators of metal and metalloid trace

28) Osmond, C.B., Luttge, U., West, K.R., Pallaghy,

flavonol

supplementation. J. Urol. 137: 1212-3.

inbladdercellsof38) Wang, S., Wang, J.-W., Yu, N., Li, C.-H., Luo, B.,

31) Rozena, J. and Flowers, T. 2008. Crops for a

Gou, J.-Y., Wang, L.-J. and Chen, W.-Y. 2004.

salinized world. Science 322: 1478.

Control of plant trichome development by a cotton32) Shevyakova, N. I., Netronina, I. A., Aronova, E. E.

fiber MYB gene. Plant Cell. 16: 2323-34.

and Kuznetsov, Vl. V. 2003. Compartmentation ofinaccumulation

52:583-92.

history of plants. – London/New York, Routledge.

during2012.

Mesembryanthemum crystallinum. Phytochemistry.

30) Prance, G., Sir and M. Nesbitt. 2005. The cultural

iron

H.

and Strack, D. 1999. Light-induced betacyanin and29) Pak, C.Y. 1987. Nephrolithiasis from calcium

plantsSchat,37) Vogt, T., Ibdah, M., Schmidt, J., Wray, V., Nimtz, M.

bladders. Aust. J. Biol. Sci. 22:797-814.

and

and

10.1007/s11104-012-1287-3

Atriplex leaf tissue. II. Secretion of ions to epidermal

crystallinumJ.

elements: Facts and fiction. Plant Soil. DOI

C.K., Shacher-Hill, B. 1969. Ion absorption in

cadmiumA.

39) Watanabe, M., Sugimura, K. and Yamanoha, B. 1999.

Mesembryanthemum

Effect of acute deﬁciency of dietary proline ontheproline balance in the rat small intestine and liver. J.

adaptationtocadmium stress. Russian Journal of Plant Physiology.

Anim. Physiol. Anim. Nutr. 82:294-304.

64

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12, 65-70

MINI REVIEW

Morono Y

海底下における微生物とその代謝・活性
未知の海底下生命圏を紐解くテクニックとその応用
1)
2)

独立行政法人海洋研究開発機構 高知コア研究所

独立行政法人海洋研究開発機構 海底資源研究プロジェクト
諸野 祐樹 1)2)

独立行政法人海洋研究開発機構 高知コア研究所、〒783-8502 高知県南国市物部乙 200
Corresponding author: Yuki Morono, morono@jamstec.go.jp
Phone: +81-88-878-2198, Fax: +81-88-878-2192
Received: Dec. 9, 2013 /Revised: Dec. 14, 2013 /Accepted: Dec. 14, 2013
Abstract 地球表面積の 7 割を占める海、さらにその下の海底下には数百メートル以上にわたる海底下生命圏が存在している。20 世紀後半から行われた国際海洋掘削計画（ODP；Ocean Drilling Program）およびそれに続く統合国際海洋掘削計画（IODP；
Integrated Ocean Drilling Program）によって、世界各
地の海洋底から堆積物（海底に降り積もった生物由来、陸上無機物由来、火山活動由来などの粒子で構成される海底土砂）試料が採取され、最新の報告も合わせると海底下から 1600 m までの堆積物中には1cm3 あたり少なくとも 104 個を超える微生物細胞が存在することが分かってきた 16,19)。地球の約 70%を占めている海洋と海洋底の空間の広がりを考慮し算出された Whitman や Kallmeyer らの試算によれば、海底下に存在する原核細胞のバイオマスは 0.3～
3.6×1030 細胞とされており、水圏（1.2×1029）や陸域（2.5×1029～2.5×1030）にも匹敵する巨大な生命圏が海底下に横たわっていると考えられている 10,23)。一方で、リボソーム RNA 遺伝子配列による分子系統学的解析によると、海底下には現在の技術では分離・培養に至っていない多くの未知系統微生物群が優占種として存在することが明らかとなっている 7)。
海底下に広がる生命圏は、全地球規模での元素循環や海底下資源の生成、分解など、環境、エネルギーを含む諸分野から注目を集めているものの、実際にどのような微生物がどんな活動を海底下で行っているかについて、明確になっていない部分が大きい。
試料としての海底下堆積物は、その特徴として、多くの無機粒子が存在し、微生物を計数することはおろか、様々な解析を行うのに多大な困難が伴う。本稿では、これまで筆者らが実施してきた海底下生命圏探索のための技術開発とそれによって見えてきた
海底下生命の実態をご紹介したい。

65

微生物を数える—イメージ解析による生物特異的検出—微生物バイオマスを測定する際には、試料を定量的に扱うためフィルター上に試料をトラップして観察する。一般的には孔径 0.2μm のポリカーボネート
メンブレン（Millipore、ADVANTEC など）やアルミ
ナ素材のメンブレン（Anodisc、Whatmann）などがメンブレン表面の平坦性、孔径が一定であるなどの理由で用いられている。河川水、海水などの液体サ
ンプルの場合はそのまま、土や堆積物の場合はバッファーなどにサンプルを懸濁したのち、フィルター
上に捕集する。25 年以上前から一般的な方法として用いられてきたこの方法は、フィルター上に保持した微生物を DAPI
（4’,6-diamidino-2-phenylindole）18) やアクリジンオレンジ（AO）3) など、DNA 塩基対間に入り込み蛍光を発する蛍光インターカレーターを用いて染色し、DNA を有する微生物細胞を計数するという手順で行われてきた。しかし、近年になって応用範囲が拡大するにつれ、DAPI で用いられる励
起波長である UV 域の光では鉱物粒子由来の自家蛍光が問題となることや、アクリジンオレンジで観察される高いバックグラウンドなどが障害と認識され、最近ではバックグラウンドが低く、特異性が高いといわれる SYBR Green I（以降 SYBR I）の利用に関心が高まっている 12,14)。ところが筆者らが 450℃で 3
時間以上加熱した堆積物を用意し、ネガティブコン
トロールとして染色、観察を試みたところ、非染色では自家蛍光がほとんど観察されなかったにも関わらず多数の粒子が SYBR I 染色によって蛍光を発した。SYBR-SPAM (SYBR-Stainable Particulated Matter)と名付けたこれらの粒子は、非特異的に吸着した
SYBR I 分子に由来する蛍光が観察されるものと推察される。また、微生物と似通った形態を持つもの

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)検知する方法が 1981 年に Krambeck により報告 11)
されて以来、様々な研究者によって検討が進められてきた 8,20,24)。最も一般的なものは画像の輝度に一定のしきい値（Threshold）を設定し、それを上回るものを細胞として認識するものである 20)。また、画像における Signal-to-noise ratio を設定し、その比を超えたものを細胞と認識する手法や、DNA に吸着したDNA 染色剤と非吸着の染色剤における蛍光スペク
トルの違いを利用した微生物検出法もある 17,21)が、SYBR-SPAM などの False-Positive シグナルが存在す
る場合正確なカウントを得ることは極めて困難である。

もあり、人間の目によって形態で計数し分けることも困難であると思われた。
これまで、特に海底下堆積物において微生物の直接計数は人間の目による直接目視で行われてきた。
しかし、どれくらいの蛍光を発している粒子を「微生物細胞」として計数するか、どのような形、色が「微生物らしい」のか、その基準が明確でなければ、計数をする人の間で異なる計数結果が導き出されてしまう。特に SYBR-SPAM が存在する海底下堆積物
では、一様の結果を出すことは容易ではなく、時に二桁以上の偏差が出ることもある。このような偏差の無い計数法として、画像解析により微生物細胞を

図１：SYBR-DiCE（Discriminative Cell Enumeration）法
a: 長波長側の蛍光も通す Long-pass Filter を通して観察した SYBR I 染色後の微生物細胞と SYBR-SPAM、
b: DNA-SYBR 複合体と SYBR-SPAM の蛍光波長の差、c: SYBR-DiCE 法、緑色域の蛍光画像と赤橙色域の蛍
光画像について、画像中の各ドット（ピクセル）における輝度について割り算を行い「緑らしさ」を示す画像を得る。この画像に対して一定の閾値（1.1）を適用することによって False-Positive である SYBR-SPAM を除き、微生物からのシグナルのみを残すことができる。
蛍光の観察を行う場合、ターゲットとなる蛍光物
質の最大蛍光波長の周辺数十 nm の光が通過するフィルター（band-pass filter）を用いるのが一般的である。ところが、ある一定の波長より長い光をすべて通過させるフィルター（long-pass filter）を通して試料を観察した時、SYBR I で染色した堆積物試料中の微生物細胞と SYBR-SPAM で蛍光色が異なることに気づいた（図１a）。詳細に調べるためにマルチスペ
クトル顕微鏡を用いて SYBR I で染色した微生物細胞、SYBR-SPAM それぞれの蛍光スペクトルを測定してみたところ、SYBR-SPAM の蛍光ピークの方がより赤色波長側にシフトしており、DNA と結合した
SYBR I のそれとは明確に異なった（図１b）。そこで、この現象を応用し SYBR-SPAM のシグナルを除外することができないか検討したところ、画像の割り算を行うことでほぼ完全に SYBR-SPAM シグナルを除去することに成功し SYBR-DiCE（Discriminative Cell

Enumeration）法と名付けた（図１c）。SYBR-DiCE
法では、SYBR-DNA 複合体の蛍光波長ピークがある
緑色域と SYBR-SPAM の蛍光波長ピークに近い赤橙色域の画像を別々に取得する。この二枚の画像のそれぞれのピクセル（ドット）において輝度の演算（割り算、緑画像÷赤橙画像）を行い、演算結果を結果画像で対応する位置のピクセル輝度とする。このよ
うな処理を行って得られた画像はそれぞれの位置における緑と赤橙色との割合を示すものとなり、より緑が強ければ値が大きく、赤橙が強ければ値が小さ
く、すなわち蛍光の色の傾向を「緑らしさ」で表現するものとなる。この画像について多数の堆積物試料や大腸菌などの培養株の観察によって見出した「緑らしさ」の閾値を適用し、SYBR-DNA 複合体が含まれる微生物細胞を浮かび上がらせる。同条件で観察、画像を撮影している限り試料の変化による閾値の変化は見られない。閾値以下のシグナルを消去

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)することは画像内で DNA を含む細胞以外のノイズを除去することを意味し、観察者による偏差の原因を根本から除去した、客観的な生物計数結果が得られることになる。
代謝活性を探る－NanoSIMS を用いた同位体取り込
みからのアプローチ－
上記の技術で海底下の微生物細胞を特異的に認識、計数できるようになった。しかし、彼らは海底下環境で生存、代謝活動を行っているのか、それとも細胞の遺骸が分解されずに残っているだけなのだろう
か？Parkes らはペルー沖における海底下掘削試料に放射線同位体を注入し、微生物による代謝活性を直接測定した。その結果、海底下 100m 前後までの堆積物における硫酸や硝酸の還元活性やメタン生成活性プロファイルを取得した 15)。一方、掘削試料を化学的に分析することで得られる海底下における深度
方向の化学物質プロファイルはこのような微生物の活性を間接的に推測することに役立てられてきた
2,4)。一般的な沿岸域の堆積物を例にとれば、海底面付近の数 cm までしか酸素は存在せず、硝酸や硫酸などの嫌気呼吸を支える電子受容体物質も数 m～
10m 程度までしか存在しない。また、海底下で生成されるメタンやその嫌気的分解が起こる領域もメタ
ン濃度などを測定することで特定されてきた。このような化学物質プロファイルを用いると、特定の深度でどれくらいの微生物代謝活性が起こるのかが推測できる。さらに、細胞数の分布を用いて、細胞ごとの代謝活性や細胞分裂に要する時間などが計算され、微生物は極めて低い代謝活性を持ち、分裂は数
年から千年に一度くらいしか起こらないと推測された 9)。
以上のようなバルク試料分析からは微生物群集全体の代謝活性や分裂頻度の平均値などを導き出すことが出来るが、群集の中でどれくらいの割合の細胞が生存しているのか、実際の代謝を担っている微生物の割合などについては知ることが出来ない。そこ
で、NanoSIMS（ナノシムス）という装置を利用した分析が、最近環境微生物学で徐々に応用が広がっている。正確には Nanometer-scale Secondary-Ion Mass
Spectrometry (超高解像度二次イオン質量分析計)という、走査型の質量分析装置である。NanoSIMS では、最小 30nm に絞ったセシウムイオンビーム（一次イオンビーム）を対象物に当て、局所的（層厚1-20nm）な破壊とそれに伴うイオン化された原子群（二次イオン）の生成を誘起する。生成した二次イオンは質量分析器で分画、検出され、安定同位体の存在比などの定量的データを与える（図２）。この際、一次イオンビームを数十マイクロメーターレベルの微小領域で走査し、そこから得られる二次イオン量を画像上の各ピクセル値（輝度値）として記録することで、顕微鏡画像のようなイオン存在量画像を得ることが出来る。この際の分析解像度（空間分解能）
は、イオンビームの直径に依存し、最小 30nm の空間分解能、すなわち 0.5~1µm 程度のサイズである微生物一細胞を可視化するのに十二分な二次元元素分
析画像が結果として得られることになる。

図２：NanoSIMS の動作原理

この装置の特徴は、その空間分解能だけではなく、高い質量分解能と検出感度の高さにもある。例えば、二次イオンとして生体物質から生成されるイオンとして、12C15N-と 13C14N-というイオンがある。これらは共に質量数 27 のイオンであるが、小数点以下の質量に違いがあることから NanoSIMS で分画することが可能である。また、検出感度も高く、安定同位体
基質の取り込み実験では微生物を構成する 10-15g レベルの炭素でも十分に安定した測定を実施することが可能である。
筆者らは下北半島沖海底下、南太平洋還流域などの試料を用いて安定同位体基質を栄養源とした培養実験を行い、NanoSIMS 分析によって生理活性を有する微生物細胞の検出、基質毎の取り込みの割合や速度についての解析を行ってきた 13)。下北半島沖の海底下 219m、約 46 万年前に堆積したと考えられる

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)海底下掘削試料を用い、安定同位体基質（グルコース、酢酸、ピルビン酸、重炭酸、アミノ酸、メタン、
アンモニア）を栄養源とした培養実験では、当初の予想としては、ほとんどの微生物が活性を持っていないか、休眠状態にあっても実験室内環境ではなか
なか再活性化されないと考えていた。しかし、
NanoSIMS 分析によって生理活性を有する微生物細胞の検出、基質毎の取り込みの割合や速度についての解析を行ったところ、予想に反してメタン以外のすべての基質について微生物体内への取り込みが65 日間の培養ののちに多数観察され、グルコースを与えた系では全体の 76%以上の微生物が基質を取り込む活性を有していたことが分かった。また、それぞれの基質取り込みの速度は大腸菌と比較すると10 万分の 1 程度であることも判明した。さらに、取り込まれた炭素と窒素の割合も併せて計測したとこ
ろ、細胞内の全炭素、全窒素に対する取り込まれた炭素源（グルコース）、窒素源（アンモニア）の割合
は窒素の方が高い、すなわち細胞の C/N 比が低くなるような取り込みを行っていたことが分かった。試料を採取した海底下環境、すなわち解析した微生物が元々存在していた生育環境には十数 mM のアンモニアが存在していた。それにも関わらず、なぜ窒素源が不足していたかのような挙動を示したのか？これについては推論の域を出ないが、エネルギー源に乏しい海底下では、ATP を必要とするようなアンモニアの取り込みは制限され、必要最低限の生命機能を維持する代謝しか行われていないのではないかと推測している(9)。
上記のように、NanoSIMS の同位体イメージング法を用いることで、これまでは間接的な実験データから推測していた微生物間物質移動や環境微生物の活性を個々の細胞レベルで直接観測、可視化して定量的な解析を行うことも可能となった。また、ハロゲン原子をプローブとした Fluorescent In Situ
Hybridization（FISH）や Catalyzed Reporter Deposition（CARD）－FISH との組み合わせ例も報告されている 8, 10)。これらの技術を統合的に用いることで、混合微生物群の動的挙動を理解する上でカギとなる情報をもたらしうる「誰が」「何をしているのか」、す
なわち、個々の微生物の系統と機能を合致させることも NanoSIMS によって可能となってきている。

ながら、未培養系統群を多く含む海底下環境では、解読された遺伝子配列の 8 割においてデータベースとマッチしない、すなわち未知の遺伝子であるという結果が出ている 1)など、データベースを基礎とした解析手法の適用が困難であるケースが見られていた。
そこで筆者らは、基質誘導を遺伝子機能検出のカギとした SIGEX 法 22)を海底下生命圏試料に適用した解析を行っている。SIGEX 法は内山らによって開発された方法で、ゲノムライブラリーを作成するプラ
スミドに gfp 遺伝子を配置してある（図３）。

図３：SIGEX のフロー
ゲノムライブラリーとして挿入された遺伝子断片中に基質誘導に関わる因子があり、それが宿主の大腸菌内で機能する場合、ライブラリーの大腸菌群を培養する際に基質を含む培養液で培養を行えば遺伝子発現が起こり、下流の gfp 遺伝子も一緒に発現し、宿主大腸菌が蛍光を発する。この蛍光を利用することにより、基質による誘導を受けた遺伝子断片を有するクローンのみを選択的に得ることが可能となる。
この gfp 遺伝子はゲノムライブラリー作成時の断片
未挿入クローンの識別にも役立ち、ライブラリー作
成時には逆に緑色の蛍光を示さないクローンを選択的に取得することによって断片が挿入されたクロー
ンのみをライブラリー構成大腸菌として取得するこ

基質応答ポテンシャルを探るーSubstrate Induced
Gene Expression（SIGEX）
海底下環境には未だ分離、培養に至っていない微生物系統群が多数存在することが知られているが、これまでに紹介した NanoSIMS などによる解析から、これらの微生物は化石ではなく生きた生命体である
ことが明らかになってきた。では、彼らは現場でどのような代謝を行っている、あるいは行うポテンシ
ャルを持っているのだろうか？このような問いに答えることを目的として、環境試料から抽出した DNA
断片を網羅的に解読し、遺伝的ポテンシャルを探る試みとしてメタゲノム解析が行われてきた。しかし68

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)とが出来る。SIGEX 法の特徴はフローサイトメトリー/セルソーターを用いたハイスループットな識別方法にある。セルソーターを利用することによって膨大なライブラリーを構築することや、その中から少数の基質誘導遺伝子を取得することが可能となる。
ホスト―ベクター系の制約はあるものの、この方法を用いると、データベースに依存せず、基質による誘導に応答してくる転写因子などを含む遺伝子断片のスクリーニングを効率的に実施することが出来る。
この方法を南海トラフ海底下から採取し、その後の培養によってハロゲン化フェノールの脱ハロゲン反応が見られた集積培養系に適用した。人為的起源と考えられることの多い有機ハロゲン化合物であるが、自然環境下においても生物地球化学的反応に起因する有機ハロゲン化合物の生産が知られている。
また、脱ハロゲン反応の機能遺伝子である rdhA が、
下北半島沖、及び南海トラフの堆積物から検出されており、酸化的物質が消費され尽した海底下深部における呼吸反応として脱ハロゲン呼吸が注目されている 5)。SIGEX 法によるスクリーニングの結果、23のクローンが基質による応答を示すものとして得られた。これらの塩基配列解析を実施したところ、
Gammaproteobacteria, Deltaproteobacteria,
Dehalococcoidetes, Deferribacteres, Methanomicrobiaに由来すると思われる遺伝子断片が得られた。由来
微生物と推測されたものの中には既知の脱ハロゲン呼吸をする微生物系統群が含まれていたが、一方でアーキアであるに Methanomicrobia に由来すると思われる遺伝子断片も多数得られた。同綱の微生物にはコメタボリズム的に脱ハロゲンを行う種が知られていることから、有機ハロゲン化合物に対して誘導を受けたのではないかと推測している。また、得られた遺伝子断片の機能をデータベース検索で解析したところ、二つが転写因子との相同性が高いことが判明したが、rdhA などの脱ハロゲン系遺伝子との相同性を示すものは見つからず、データベース上では機能の予測が出来ないものも存在した 6)。また、サンガー法による塩基配列解析ではどうしても塩基配列が同定できない挿入断片も存在した。転写をつかさどる遺伝子部分は二次構造を取る場合もあることから、このような問題が起こったのかもしれない。
いくつかの問題は将来への課題として残っているが、単純な既知遺伝子をベースとした PCR では得ることのできない機能遺伝子候補を多数得ることが出来たという点で SIGEX はユニークな特徴を有していると考えている。現在はこの手法を嫌気仕様にアップグレード、さらに多様な遺伝子群を解析対象とするため、ライブラリー自体のサイズを拡大する手法改良を行い、より広範な海底下生命圏探索ツールの一つとして適用を進めている。
おわりに
本稿では海底下生命圏を紐解くツールとして、筆者がこれまでに行った手法構築、改良や解析の実例を紹介した。海底下生命圏に限らず、極限環境に生

69

育する生命を解析対象とする場合、既存の手法をそのまま適用したのでは見えない部分が出たり、逆にノイズを含み見えすぎたりするといった事象が起こる。近年は分子生物学などの技術が飛躍的に進歩した一方、人為的な実験誤差を排除するため、または迅速に結果を得るためにキット化された試薬が多数利用可能となり、その技術の理論的背景を知らないまま適用、結果を得ることが出来てしまうが、問題を抱えた時にそれを解決することが非常に困難になり得る。一般的でない環境に生きる生命を研究対象とする場合には、これら実験手法の背景にある理論を把握したうえで、獲得したい情報を如何に見えるようにするかが鍵となると考えている。
謝辞
本稿の研究は独立行政法人海洋研究開発機構 高知
コア研究所の稲垣史生上席研究員、伊藤元雄技術研究副主幹、九州大学大学院農学研究院の二神泰基助教、株式会社マリン・ワーク・ジャパンの寺田武志氏と共同で実施したものです。本研究は科学研究費補助金 若手研究 A（24687004）、および挑戦的萌芽研究（24651018）の支援を受けて実施しました。こ
こに心より感謝申し上げます。
参考文献
1) Biddle JF, Fitz-Gibbon S, Schuster SC, Brenchley JE,
House CH. Metagenomic signatures of the Peru
Margin subseafloor biosphere show a geneticallydistinct environment. Proc Natl Acad Sci USA
2008;105:10583-8.
2) D'Hondt S, Jorgensen BB, Miller DJ, et al.
Distributions of microbial activities in deep
subseafloor sediments. Science 2004;306:2216-21.
3) Daley RJ, Hobbie JE. Direct counts of aquatic bacteria
by a modified epifluorescence technique. Limnol
Oceanogr 1975;20:875-82.
4) DeLong EF. MICROBIOLOGY: Microbial Life
Breathes Deep. Science 2004;306:2198-200.
5) Futagami T, Morono Y, Terada T, Kaksonen AH,
Inagaki F. Dehalogenation Activities and Distributionof Reductive Dehalogenase Homologous Genes inMarine Subsurface Sediments. Appl Environ
Microbiol 2009;75:6905-9.
6) Futagami T, Morono Y, Terada T, Kaksonen AH,
Inagaki F. Distribution of dehalogenation activity insubseafloor sediments of the Nankai Troughsubduction zone. Philosophical Transactions of theRoyal Society B: Biological Sciences 2013;368.
7) Inagaki F, Nunoura T, Nakagawa S, et al.
Biogeographical distribution and diversity of
microbes in methane hydrate-bearing deep marine
sediments on the Pacific Ocean Margin. Proc Natl
Acad Sci USA 2006;103:2815-20.
8) J. Bloem MV, J. Shepherd. Fully Automatic
Determination of Soil Bacterium Numbers, Cell
Volumes, and Frequencies of Dividing Cells by
Confocal Laser Scanning Microscopy and Image
Analysis. Appl Environ Microbiol 1995;61:926-36.

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)9) Jørgensen BB, Boetius A. Feast and famine-microbial
life in the deep-sea bed. Nat Rev Microbiol
2007;5:770-81.
10) Kallmeyer J, Pockalny R, Adhikari R, Smith D,
D'Hondt S. Global distribution of microbialabundance and biomass in subseafloor sediment. Proc
Natl Acad Sci USA 2012;109:16213-6.
11) Krambeck C, Krambeck H-J, Overbeck J.
Microcomputer-Assisted Biomass Determination of
Plankton Bacteria on Scanning Electron Micrographs.
Appl Environ Microbiol 1981;42:142-9.
12) Lunau M, Lemke A, Walther K, Martens-Habbena W,
Simon M. An improved method for counting bacteria
from sediments and turbid environments by
epifluorescence microscopy. Environ Microbiol
2005;7:961-8.
13) Morono Y, Terada T, Nishizawa M, et al. Carbon andnitrogen assimilation in deep subseafloor microbial
cells. Proc Natl Acad Sci USA 2011;108:18295-300.
14) Noble RT, Fuhrman JA. Use of SYBR Green I for
rapid epifluorescence counts of marine viruses andbacteria. Aqua Microbial Ecol 1998;14:113-8.
15) Parkes RJ, Cragg BA, Bale SJ, et al. Deep bacterial
biosphere in Pacific Ocean sediments. Nature
1994;371:410-3.
16) Parkes RJ, Webster G, Cragg BA, et al. Deepsub-seafloor prokaryotes stimulated at interfaces overgeological time. Nature 2005;436:390-4.
17) Pernthaler J, Pernthaler A, Amann R. Automated
Enumeration of Groups of Marine Picoplankton after

Fluorescence In Situ Hybridization. Appl Environ
Microbiol 2003;69:2631-7.
18) Porter KG, Feig YS. The use of DAPI for identifying
and counting aquatic microflora. Limnol Oceanogr
1980;25:943-8.
19) Roussel EG, Bonavita M-AC, Querellou J, et al.
Extending the Sub-Sea-Floor Biosphere. Science
2008;320:1046.
20) Shopov A, Williams SC, Verity PG. Improvements inimage analysis and fluorescence microscopy todiscriminate and enumerate bacteria and viruses inaquatic samples. Aquatic Microbial Ecology
2000;22:103-10.
21) Sunamura M, Maruyama A, Tsuji T, Kurane R.
Spectral imaging detection and counting of microbial
cells in marine sediment. Journal of Microbiological
Methods 2003;53:57-65.
22) Uchiyama T, Abe T, Ikemura T, Watanabe K.
Substrate-induced gene-expression screening ofenvironmental metagenome libraries for isolation of
catabolic genes. Nat Biotech 2005;23:88-93.
23) Whitman WB, Coleman DC, Wiebe WJ.
Prokaryotes: The unseen majority. Proc Natl Acad Sci
USA 1998;95:6578-83.
24) Zhou Z, Pons MN, Raskin L, Zilles JL. AutomatedImage Analysis for Quantitative Fluorescence In Situ
Hybridization with Environmental Samples. Appl
Environ Microbiol 2007;73:2956-62.

70

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12, 71-78

MINI REVIEW

Kagoshima H

Studies on anti-desiccation and anti-freezing mechanisms
in Antarctic organisms.
南極生物における凍結・乾燥耐性研究の現状
情報・システム研究機構

新領域融合研究センター, 国立遺伝学研究所
鹿児島浩

Research Organization of Information and Systems (ROIS), Transdisciplinary Research Integration Center (TRIC), andNational Institute of Genetics (NIG), Yata 1111, Mishima, Shizuoka 411-8540, JAPAN.
Corresponding author: Hiroshi Kagoshima, hkagoshi@nig.ac.jp
Phone: +81-55-981-6860, Fax: +81-55-981-6855
Received: Dec. 9, 2013 /Revised: Dec. 11, 2013 /Accepted: Dec. 11, 2013
Abstract

Antarctica is an extreme environment for life.

proposed to function in preventing protein-aggregation

The cold is an obviously challenging problem for life in

by interacting with desiccation-sensitive proteins in a

Antarctica, however, another is that Antarctica is very

dehydrated condition.

dry. The availability of liquid water is recognized as themost important determinant of the biological activity for

Keywords: Antarctica, desiccation tolerance, freeze

Antarctic

tolerance, nematoda, LEA genes

organisms.

Desiccation

toleranceisasimportant as cold tolerance for the survival of terrestrialorganisms in the Antarctic environments. This review

キーワード: 南極、乾燥耐性、凍結耐性、線形動物、

describes 1. Introduction to Antarctic animals, 2.

LEA 遺伝子Antarctic environment for life and their tolerances, 3. A
tolerance gene, LEA, in animals.
極限環境: 南極大陸

1. We established a cultivation method for Antarctic
tardigrade and nematode, Acutuncus antarcticus and

南極大陸は、生命にとって必要不可欠の要素であPlectus murrayi, which have freezing and desiccation

る水と温度が極度に制限された極限環境である 16,17)。

tolerances. P. murrayi were recovered from 25.5 years of

南極の低温についてはここで改めて説明するまでもstorage at -20°C. They might tolerate freezing during

ないが、この大陸はまた低温に起因する低湿度と特periodic

有の大気の循環のため非常に乾燥している。南極大short-term(severaldecades)glacialadvance-retreat cycles.

陸の大部分は雪と氷に覆われているため、水の欠乏

2. Animals survive low temperature in Antarctica byは意外に思われるが、個体状態の水(氷)はどれだけ

freeze avoidance and/or freeze tolerance, with small

大量にあっても生物はこれを生命活動に使う事はで

molecules such as sugar and sugar alcohols, and with

きない。このため南極大陸は「氷の砂漠」とも表現

anti-freezing proteins. Under desiccation stress, animals

される。このような極限環境で生物はどのようにしalso produce small molecules like trehalose, andて生き抜いてきたのだろうか？

protective proteins like LEA.

南極に生息する動物、2. 南極環境が生物に与える影

3. LEA proteins are rich in hydrophilic amino acids and響とこれらに対する生物の耐性、3. 環境耐性遺伝子

intrinsically

LEA について、これまでに得られた知見を紹介する。

disordered,however,they

becomeamphiphilic α-helix when dried. LEA proteins are71

この概説では、1.

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)1. 南極に生息する多細胞動物

は耐性はない（ただし、例外的に放射能耐性は活動

南極の動物と言えば、多くの人はペンギンやアザ中でも高い）。しかし、乾眠状態のクマムシは-273

ラシを想像するが、これらは餌を海中で摂り、体熱度から 151 度の温度、真空、6000 気圧の圧力、アルを産生することで自律的に体温を制御する海洋の動

コールやアセトニトリルなどの有機溶媒、宇宙空間物である。一方、”真"の意味での南極の動物とは、への暴露、などの苛烈な環境に対して耐性を持つ 2)。

生活や体の全体が低温で乾燥した南極環境そのもの

我々は昭和基地周辺の露岩域ラングホブデ、スカに曝されるクマムシ、ワムシ、線虫などの微小な動

ルスブスネスで採取された、ギンゴケのサンプルか物である。これらは寒冷化が進んだ低温で乾燥した

ら南極のクマムシを単離し、その飼育に成功した(図南極環境に適応し、3000 万年を生き抜いて来た。こ1)。このクマムシの形態的解析、および遺伝子配列

れらの代表として、ここで筆者らが研究を進めていの解析から、これを南極固有種である Acutuncus

る 南 極 ク マ ム シ Acutuncus antarcticus 、 南 極 線 虫

antarcticus と同定した 9)。この生物は、常に凍結、乾Plectus murrayi と Panagrolaimus davidi について紹介

燥環境に曝される南極地表のコケに生息しており、する

9,10,16,17)。

凍結・乾燥に対して強い耐性を持つことを確認した。
最近、同じ A. antarcticus が冬期でも凍結しない、乾クマムシは燥も起こらない南極湖沼の水中に生えるコケから発緩歩動物門に属する、体長 1 ミリ以下の微小な生物見された。これら湖沼の A. antarcticus は、地上の A.

である。深海から高山までの地球上の至る所に生息

antarcticus が風で飛ばされて侵入した可能性も考えしている。この生物(の一部である陸棲クマムシ)がられるが、もしも長期にわたってこの環境で生活し強力な環境耐性を持つことから、近年、クマムシにているとすれば、湖沼と地上の種間で耐性に違いがは「地球最強」「不死身」などのキャッチフレーズと生じている可能性、すなわち遺伝的な違い生じていともに語られることが多いが、これは環境から水がる可能性も考えられる。現在、我々はこれらの種間失われ乾眠(anhydrobiosis)状態に入った場合のこと

で耐性に違いがあるか、遺伝的な差異があるか、な

で、水がある状態で生活しているクマムシには、実どについてゲノム解析、発現解析を進めている。

[南極クマムシ Acutuncus antarcticus]

図 1. 南極クマムシ Acutuncus antarcticus の走査型電子顕微鏡像。
頭部を左側にした南極クマムシ A. antarcticusの腹側表面を撮影。4 対の足のうち、頭部から 3 対目の足の間にあるものは偶然このサンプルに接着していた同クマムシの卵。スケールバーは 50 µm。

72

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)[ 南 極 線 虫 Plectus murrayi]

線形動物(線虫:

線虫は南極にも生息している。我々は、1983 年にNematoda)は、名前(Nema=thread: 糸)が示す通り、糸国立極地研究所の神田啓史博士により収集され、25状のシンプルな体制を持ち、その大半が数ミリほど

年 6 ヶ月の間、凍結保存された昭和基地周辺のコケしかない小さな生物である。緩歩動物と同様に熱帯、のサンプルから線虫を単離した。この線虫は形態解

砂漠から極地まで、地中、海底を問わず地球上のあ析、分子系統解析の結果から Plectus murrayi と同定

らゆる環境に進出している。線虫は個体数、およりされた。P. murrayi は-20 °C、-80°C での凍結、相対種数において、全ての動物門を凌駕しており、個体

湿度 75%での急速乾燥に対しても耐性を持っていた数は動物全体のバイオマスの 15%を占め、種数は節(図 2)。この線虫が凍結に耐性を持つことは知られて足動物の 100 万種と同じか、それ以上の巨大な生物

いたが、この状態で何年間生存できるかは明らかに群を構成するのではないかと推定されている

19)

。線

なっていなかった。しかし、我々の研究から少なく

虫はまた、様々な環境に耐性を示すのみならず、そとも数十年の凍結に耐え得ることが明らかになったの環境に適応し、むしろこれら厳しい環境を生活の10)場とさえしている。例えば、Turbatrix aceti は pH 3.5

伸長・縮退のサイクルが起こっており、これまで氷から 9 という広い pH で増殖でき、1.6 から 11 の範河より高い位置にある山脈の露岩域(ヌナターク)が囲の pH に耐性を持つ。植物寄生性の線虫 Anguina

動物の唯一の「避難場所」だと考えられて来た。しtritici は、強力な乾燥耐性を持ち、乾燥状態で 40 年

かし、本線虫の凍結状態での長期生存により、氷床間の保存から蘇生した記録がある。また、下での生存が十分に可能であることが判明した。こAphelenchoides parietinus は、51 °C の温泉中に生息しれは南極の生態系の全貌の理解に向けた重要な知見ていた

16,17)。

。南極大陸では、数年から数十年の周期で氷河のだと考えられる。

図 2. 南極線虫 Plectus murrayi の乾燥と加水回復。A. 相対湿度 98 ％で 24 時間乾燥させた P. murrayi、B. 乾
燥後に水を加え 24 時間回復させた P. murrayi の微分干渉顕微鏡写真。Plectus murrayi は全ての発生ステージ
で乾燥耐性を持ち、加水回復後は発生を再開、正常に増殖を行う。
体長約 1 mm ほど

25°C であり、6.8°C 以下では全く成長しない。25 °Cの小さな線虫 Panagrolaimus davidi (図 3)は、南極ロで飼育すれば世代時間(親になり次の世代(卵)を産み

ス島の雪解け水が流れる砂利に生えた藻類の中から始めるまでの時間)は 7 日間であるが、南極環境では単離された 16,17)。この場所は年間を通じて、気温が生育限界温度に達する時間はわずかであり、一世代

0 度を越えることはほとんどなく、P. davidi は秋からを 1 年で終えることはまずないと推測されている。

春まで、少なくとも 8 ヶ月間は凍って乾燥した休眠

このような環境に生息している P. davidi は細胞内凍

状態で過ごす。しかもこの場所は、夏期においてす結に耐える唯一の動物であることが知られている。

ら、毎日、凍結再融解を繰り返される苛烈な環境で凍結耐性生物は節足動物、環形動物やカエル、カメある。興味深いことに、この線虫の発育至適温度はなどの多くで知られているが、回復可能な場合の凍[南極線虫 Panagrolaimus davidi]

73

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)結は体液に留まり、細胞内の凍結が起きた場合はこにこの線虫 P. davidi を研究材料に使い、乾燥・凍結

れらの生物も生存することはできない。このことか耐性を担う遺伝子の同定とこれらの耐性遺伝子の担ら P. davidi は他の生物にない特殊で強力な耐性機構

う分子メカニズムの解明を目標に研究を進めている。

を持つことが考えられている 14,18)。我々は現在、主

図 3. 南極線虫 P. davidi の微分干渉顕微鏡像。P. davidi は単為生殖のため、発生の開始には受精は必要なく、単独の雌から正常な雌の子孫が生まれる。しかし、大半の遺伝子には微妙に配列が異なる複数コピーが見つかっており、この生物は遺伝子のヘテロ接合性を維持する何らかの特殊なメカニズムを持っていると考えられる。
2. 南極環境が生物に与える影響と耐性

これらに対して生物は、凍結回避、凍結耐性の二［凍結耐性］南極の生物が乗り越えなくてはならな

つの戦略によって低温の致死的な効果から逃れ生命い第一の問題は凍結である。生物に対して凍結は次を維持する 16,17)。
「凍結回避」とは、過冷却状態のまのような致命的な影響を与える

16,17,20)。

ま凍結しないことによって、凍結による致命的な効1) 物理的損傷：氷の結晶の成長は細胞膜や細胞内小果を逃れることである。凍結回避を行う生物は、冬器官を物理的に破壊する。

が近づくと断食によって消化管内の氷核因子を除き、

2) 塩濃度の上昇：凍結が起こる場合、水分子が先に体表を乾燥させ周囲の環境からの氷核の接触を避け結晶を作り、残った液体に塩類が濃縮される。このる。また体液中や細胞内の氷核因子を包み込んで不結果、細胞内外の浸透圧差が細胞の脱水や破壊を引活化することで結晶の形成を抑え、水の過冷却状態き起こす。また、塩濃度の著しい上昇は生体膜や蛋を保つことで凍結を回避する。凍結回避生物はさら

白質の機能を喪失させる。

に不凍物質として働く低分子物質(ショ糖、グリセロ

3) 自由水の喪失：水が結晶化することで、細胞からールなど)を高濃度に蓄積する。これらの濃度が高い

生命活動のための化学反応の場となる自由水が奪わほど凝固点は下がるが、生体内での濃度には限界がれ、代謝が停止する。また、水分子によって取り囲ある。そこで凍結回避生物は、不凍蛋白質/氷構造化

まれていることで保たれている蛋白質や膜の構造が蛋白質 AFPs/ISPs (anti-freezing proteins/ice structuring

脱水によって破壊される。

proteins)を合成する 20)。魚類の AFPs/ISPs は 0.2-0.3

4) 膜の流動性の低下：低温は膜の流動性を低下させ、度、昆虫の AFPs/ISPs で 5 度ほど水の凝固点を低下

その結果、膜構造や機能が失われる。

させる。これらによる凝固点の低下は大きなもので

5) 部分凍結・溶解：凍結や溶解は一様に起こらず、はないが、この蛋白質はむしろ微小な氷の結晶の成

部分的な凍結や溶解が細胞内の膜構造を壊す。

長を阻害することで凍結の進行を阻害する。

74

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)AFPs/ISPs は水の結晶(氷)に特異的に作用するため、が示されている 13)。またトレハロースは濃度が高く

低濃度(数 µM)で効果を発揮し、凍結阻害効果は低分

なるとガラス化し、蛋白質や細胞膜を取り囲んで物

子物質の 300-500 倍にも相当する

20)。これらの複合質の運動性を制限することで乾燥による変性から保効果により、生物は体液を過冷却状態で保ち凍結回護する作用を持つと考えられている。トレハロース

避を行う。

が、乾燥耐性に対して重要な役割を果たすことは明しかし過冷却状態は非常に不安定であり、ちょっらかであるが、昆虫の多くはトレハロースを血糖ととした衝撃や氷核との接触があれば、一瞬で体全体して持つにも関わらず、そのうち大半は乾燥耐性をが凍結してしまう。これは生物にとって非常に危険

持たず、逆にクマムシの中には細胞内トレハロースである。そこで生物は第二の戦略「凍結耐性」を発を全く持たないにも関わらず強い乾燥耐性を持つも達させた。凍結耐性は、体内に氷の結晶が生じても、のが存在している。このためこの物質だけで乾燥耐

それが生命に致命的な影響を与えないように対応す性を全て説明することは出来ない 8,16,17)。一方、乾燥ることである。この場合、凍結回避とは逆に生物は耐性に関与すると考えられている蛋白質成分として

氷核因子となる蛋白質を合成する。矛盾するようだは、熱や乾燥などにより構造が壊れた蛋白質の巻きが、これは過冷却が進めば進むほど凍結は急速にな戻しに働く熱ショック蛋白質やシャペロン蛋白質、るため、積極的に氷核を作り比較的高い温度でゆっ

酸化ストレスからの細胞の保護に重要な活性酸素除

くりと凍結するための適応であると思われる。また

去酵素やグルタチオン転移酵素などが知られている

凍結耐性生物でも凍結回避生物と同様にグリセロー

が、これらは広く一般の生物からも見出される。こル、トレハロースなどの低分子物質が誘導される。

れらに対して乾燥耐性を持つ生物に特徴的に見出さ

しかし、この場合は凍結を阻害する目的ではなく、れる蛋白質として LEA (late embryogenesis abundant)

凍結の進行を遅らせ、より制御されたものにするたがある 15)。

めに合成されると考えられている。また蛋白質因子である AFPs/ISPs の合成も起こるが、凍結耐性生物

3. 環境耐性遺伝子 LEAの AFPs/ISPs は凍結回避生物とは異なり、結晶の形

LEA は、1981 年に綿の種子(後期胚)で高発現する成や成長を直接阻害する訳ではない。融点以下の温蛋白質として発見され、1988 年に遺伝子配列が決定度に保持していても、氷の結晶は周囲の小さな結晶された。LEA は配列的特徴と発現パターンによって、を取り込んで、より少数で大きな氷の結晶に成長す

大きく 1-3 型の 3 つのグループに分類される(このグ

る(長時間冷凍庫で保存したアイスクリームがザク

ループの他に 4 型、5 型、6 型などのグループも提案

ザクした食感になるのと類似の現象)。長期冷凍保存されたが、おそらくこれらは 1-3 型に含まれるか、した細胞や生物が徐々に死んで行く原因が、この凍LEA 以外に分類されるべきだと考えられている) 15)。

結状態にある氷の再結晶にある。凍結耐性生物の1 型 LEA は、20 アミノ酸からなるグリシンに富むリ

AFPs/ISPs はすでに存在する氷の結晶同士の隙き間

ピート配列(GGQTRREQLGEEGYSQMGRK)を持ち、に入り、結晶間の水分子の交換を阻害することで、主に植物で見つかっている。2 型 LEA(デヒドリン)

再結晶による結晶の巨大化を阻止するものと考えら

は植物のみで見つかっており、3 つのモチーフ(Yれている。凍結耐性生物の AFPs/ISPs については、

motif:

残念ながら凍結回避生物の AFPs/ISPs ほどには解析

EKKGIMDKIKEKLPG)を持つ。2 型 LEA には Y モチが進んでいない 16,17)。

ーフを持つ a 型とこれを持たない b 型の二種類があDEYGNP,S

motif:

poly-S,K

motif:

り、後者は低温耐性との関係が示唆されている。3［乾燥耐性］南極大陸に生息する生物は低温だけで型 LEA は 11 ア ミ ノ 酸 か ら な る リ ピ ー ト 構 造

なく、乾燥に対しても強い耐性を持つ。乾燥に対し(ΦΦΩXΦΨΩΨΦXΩ: Φ は疎水性アミノ酸(A, I, L, M,ても、凍結の場合と同様に生物は低分子、および蛋

T)、Ω は酸性アミノ酸とそのアミド(D, E, N, Q)、Ψ

白質からなる保護因子を誘導して、乾燥と加水回復

は塩基性アミノ酸(K, R)、X は任意のアミノ酸)を持によるストレスに対応する

1,2,11)。乾燥耐性の要素とつ。1 型、2 型、3 型 LEA の間に相同な配列は認めして最も有名な低分子化合物はトレハロースである。

られないが、次のような共通の性質を持っている：

線虫、ワムシ、ネムリユスリカなど多くの乾燥耐性

1) 蛋白質全体に親水性が高く、疎水性コアになる配生物は乾燥状態になる前にトレハロースを大量に蓄列を持たないために水溶液中で構造を取らず、天然

積する。脱水時にトレハロースは水分子と置換され、変性蛋白質である。

蛋白質を保護し、膜の固化や融合を防いでいること

2) このため熱によって内部の疎水性コアが露出す

75

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)ることがなく、熱しても凝集・沈殿が起こらない。

1) LEA ヘリックスの疎水面が、生体膜や蛋白質の疎3) 乾燥・低温ストレスで誘導されることが多い。

水性の高い領域に結合し「分子シャペロン」として当初、LEA 遺伝子は植物にしか存在しないと思わ機能することで、これらの乾燥による不可逆的な凝れていたが、植物寄生性線虫であるニセネグサレセ

集や変性からの保護を行う。

ンチュウ Aphelenchus avenae で 3 型 LEA 遺伝子が発2) LEA 蛋白質は、乾燥によって部分的に変性した蛋4)、多くの動物、細菌など

白質や融合しようとする膜の間で、これらの間の相に 3 型 LEA 遺伝子が存在することが確認された。し互作用を隔離する「分子シールド」として機能する。

かし、動物界では脱水生命状態になることが出来る

3) LEA ヘリックスの疎水面同士が結合してフィラ

生物、ネムリユスリカ、トビムシ、アルテミア、線

メント状になり、細胞骨格のような構造に変化し、虫、ワムシ、クマムシなどでしか見つかっておらず、乾燥による細胞の変形を防ぐ。

これらの動物の乾燥耐性と 3 型 LEA 遺伝子との強い

4) LEA 蛋白質はトレハロースなどの糖のガラス状関連が示唆されている 3,7,11,12)。3 型 LEA 蛋白質(以下、態を安定化させる。

見されたことを皮切りに断らない限り、単に「LEA 蛋白質」とする)は、水溶

しかし、これらの仮説は、ほとんどが試験管内の液中では無構造であるが、乾燥が起こると α ヘリッ

実験や、コンピュータによるシミュレーションの結クス構造を取るように変化する

5,6)。この際、α ヘリ

果から導き出されたものであり、生体内で実際に同ックスの一方の面が疎水性、反対側が親水性アミノ様のメカニズムで蛋白質や膜が保護されているのか酸の側鎖が並ぶ両親媒性の構造となる(図 4)。これまどうかは、今後の研究で明らかにされなければならでの研究から、LEA は次の 4 つの機構により乾燥かない。

らの生体の保護を担うと考えられている

15)。

図 4. LEA による α ヘリックス構造。3 型 LEA 蛋白質が乾燥時に取る両親媒性 α ヘリックス構造(予測)。疎水性(オレンジ)、塩基性(緑)、酸性・アミド(紫)のアミノ酸側鎖が 4 本の縞状に α ヘリックス上に一列に並ぶ。

76

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)4. 今後の展望

M.

Holmstrup

andV.

Loeschcke(2009).

これまでの研究から、LEA 蛋白質が乾燥耐性におBioinformatics and protein expression analyses

いて重要な因子であることは間違いないと考えられ

implicate LEA proteins in the drought response of

るが、これだけで耐性の全てが説明出来る訳ではなCollembola. Journal of insect physiology 55(3):い。本文ではあまり触れることが出来なかったが、210-217.

トレハロースなどの糖類、細胞内小器官や細胞膜を4) Browne, J., A. Tunnacliffe and A. Burnell (2002).

構成する脂質の組成、さらに熱ショック蛋白質、酸Anhydrobiosis: plant desiccation gene found in a

化ストレス耐性蛋白質、DNA 修復蛋白質など、様々

nematode. Nature 416(6876): 38.

な蛋白質機能が統合的に関与して初めて細胞単位の5) Goyal, K., C. Pinelli, S. L. Maslen, R. K. Rastogi, E.

乾燥耐性が成立する。今後の研究では、これら全体

Stephens and A. Tunnacliffe (2005). Dehydration-に対して生化学的、分子遺伝学的解析を進めて行く

regulated processing of late embryogenesis abundant

必要がある。

protein in a desiccation-tolerant nematode. FEBS

現在、我々は線虫 P. davidi、および南極クマムシ

letters 579(19): 4093-4098.

A. antarcticus のゲノム解析、発現解析などから、乾6) Goyal, K., L. Tisi, A. Basran, J. Browne, A. Burnell, J.

燥・凍結耐性を担う遺伝子の同定とこれら遺伝子産

Zurdo and A. Tunnacliffe (2003). Transition from

物の作用メカニズムの解明を目指して研究を進めて

natively unfolded to folded state induced byいる。本研究の成果は、食品、医療品の乾燥・凍結

desiccation in an anhydrobiotic nematode protein.

による長期保存に応用できると考えられる。さらにThe Journal of biological chemistry 278(15):

進んで臓器や個体を低温、乾燥した状態に置くこと

12977-12984.

によって長期保存が可能になれば、医療や産業、さ7) Hatanaka, R., Y. Hagiwara-Komoda, T. Furuki, Y.

らには宇宙技術にも大きな貢献を行うと考えている。

Kanamori, M. Fujita, R. Cornette, M. Sakurai, T.

凍結・乾燥耐性の全貌を理解するまでの道のりは遠Okuda and T. Kikawada (2013). An abundant LEA

いが、今後、厳しい環境に直面しても、線虫、クマ

protein in the anhydrobiotic midge, PvLEA4, acts as

ムシのごとく耐え、少しずつでも前に進んで行きたa molecular shield by limiting growth of aggregating

いと考えている。

protein particles. Insect biochemistry and molecularbiology 43(11): 1055-1067.

謝辞8) Hengherr, S., A. G. Heyer, H. R. Kohler and R. O.

本研究の遂行にあたり、新領域融合研究センター、

Schill (2008). Trehalose and anhydrobiosis in

および国立遺伝学研究所の小原雄治教授、仁木宏典

tardigrades-evidence for divergence in responses to

教授から丁寧かつ熱心なご助言、ご指導を賜りましdehydration. . FEBS J. 275: 281-288.

た。ここに感謝の意を表します。本研究は、情報・

9) Kagoshima, H., S. Imura and A. C. Suzuki (2013).

システム研究機構、新領域融合プロジェクト「地球Molecular and morphological analysis of Antarctic

環境変動の解析と地球生命システム学の構築」の成tardigrade, Acutuncus antarcticus. . Journal of

果で、JSPS 科研費 23510239, 23247012 の助成を一部

Limnology 72(s1): 15–23.

受けたものです。

10) Kagoshima, H., K. Kito, T. Aizu, T. Shin-i, H.
Kanda, S. Kobayashi, A. Toyoda, A. Fujiyama, Y.

References

Kohara, P. Convey and H. Niki (2012). Multi-decadal

1) Adhikari, B. N., D. H. Wall and B. J. Adams (2010).

survival of an Antarctic nematode, Plectus murrayi,

Effect of slow desiccation and freezing on genein a -20 degrees C stored moss sample. Cryo Letterstranscription and stress survival of an Antarctic

33(4): 280-288.

nematode. The Journal of experimental biology11) Kikawada, T., Y. Nakahara, Y. Kanamori, K. Iwata,213(11): 1803-1812.

M. Watanabe, B. McGee, A. Tunnacliffe and T.

2) Arakawa, K. (2012). Comparative metabolomics ofanhydrobiosis

intardigradeOkuda (2006). Dehydration- induced expression ofRamazzottius

LEA proteins in an anhydrobiotic chironomid.

varieornatus. Journal of Japanese Society for

Biochem. Biophys. Res. Com., 348(1): 56-61.

Extremophiles 11(2): 75-82.

12) Pouchkina-Stantcheva, N. N., B. M. McGee, C.

3) Bahrndorff, S., A. Tunnacliffe, M. J. Wise, B. McGee,

Boschetti, D. Tolleter, S. Chakrabortee, A. V. Popova,

77

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)F. Meersman, D. Macherel, D. K. Hincha and A.

Organisms in extreme environments. Cambridge,

Tunnacliffe (2007). Functional divergence of former

Cambridge University Press.
17) Wharton, D. A. (2004). 極限環境の生命

alleles in an ancient asexual invertebrate. Science

アラーク東京株式会社.

13) Ring, R. A. and H. V. Danks (1998). The role fo
trehaloseincold-hardiness

anddesiccation.

18) Wharton,

Cryoletters 19: 275-282.

A.

and

S.

Barclay(1993).

Panagrolaimus davidi. Fund Appl Nematol 7:

Cold tolerance of an Antarctic nematode that survives
freezing:

D.

Anhydrobiosis in the free-living Antarctic nematode14) Smith, T., D. A. Wharton and C. J. Marshall (2008).
intracellular

生物のすみかのひろがり. 東京, シュプリンガー・フェ

318(5848): 268-271.

comparisonswith578-584.
19) 小原雄治 (1997). 線虫［１０００細胞のシンフ

otherォニー］. 東京, 共立出版.

nematode species. J Comp Physiol B 178(1): 93-100.
15) Tunnacliffe, A. and M. J. Wise (2007). The

20) 灘浩樹 (2008). 不凍タンパク質による氷の成

continuing conundrum of the LEA proteins. Die

長抑制機構. 日本結晶成長学会誌 35(3): 166-170.

Naturwissenschaften 94(10): 791-812.
16) Wharton, D. A. (2002). Life at the Limits:78

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12, 79-85

MINI REVIEW

Yamauchi S and Hayashi H

Heat shock response in psychrophilic bacteria
好冷性細菌の高温ストレス応答
愛媛大学プロテオサイエンスセンター
山内 清司、林 秀則
Proteo-Science Center, Ehime University, 3 Bunkyo-cho, Matsuyama 790-8577, JAPAN
Corresponding author: Hidenori Hayashi, hayashi.hidenori.mj@ehime-u.ac.jp
Phone/Fax: +81-89-927-9611
Received: Nov. 28, 2013 / Accepted: Nov. 28, 2013付近）、常温性細菌（至適生育温度 37℃付近）、低温性細菌（至適生育温度は常温性細菌と同じであるが、低温でも生育可能）、好冷性細菌（至適生育温度 15℃以下）の 5 種類に分類され、極域の氷河のような低温から熱水の噴出口のような高温に至るまで、過酷な温度環境下でも生育することができる。しかし、環境の温度が生育温度からずれてしまった場合、どのような生物でも高温や低温などの温度ストレスを受けることになる。このような温度ストレスに対抗するために、生物は高温および低温ストレス応答とよばれる、遺伝子発現の変化による防御機構を備えている。
高温ストレスによる大きな傷害の一つは、細胞中のタンパク質が変性し、機能しなくなることである。
このようなタンパク質の傷害を防ぐために、高温ス
トレス応答では、熱ショックタンパク質（Hsp）とよばれる一群のタンパク質の発現量が細胞中で増加する。主要な Hsp はタンパク質の凝集抑制や変性タ
ンパク質の修復の機能を持つ分子シャペロンで、
Hsp104（原核生物では ClpB）、 Hsp90（HtpG）、Hsp70（DnaK）、Hsp60（GroEL）、低分子量 Hsp（IbpA, IbpB）の 5 種類に分類される 19)。また、原核生物において
Lon, HslVU, ClpAP, ClpXP, FtsH とよばれる Hsp は、
変性タンパク質を分解するプロテアーゼとして機能
する 6)。高温ストレス時における Hsp の発現量の増加は、原核生物から真核生物、アーキアまで共通に見られる現象であることから、高温ストレス応答は全ての生物に普遍的に存在する防御機構であると考えられる 16)。
好冷性細菌は至適生育温度を 15℃以下に持ち、20℃以上では生育できない細菌である 13)。好冷性細菌は低温で生育するために、低温で高い活性を有す
る低温適応型のタンパク質を持っている。低温適応型のタンパク質は常温性細菌のものと比べて柔軟な

Abstract Psychrophilic bacteria grow optimally attemperature below 15oC. In these bacteria, heat stressoccurs at relatively low temperatures in comparison withthat in mesophilic bacteria. We have investigated the heatshock response of a psychrophilic bacterium, Colwelliamaris ABE-1. Northern blot analysis revealed that thelevel of mRNAs of groESL and dnaK was increased at
20oC, suggesting that this temperature induces the heatshock response in this bacterium. The groESL and dnaKof C. maris are regulated by the 32 system like those of
E. coli, although the temperature for their induction isover 20oC lower than the case of E. coli. In C. maris, it
seems that the base pairing of the downstream box in themRNA secondary structure of rpoH encoding 32 shouldbe less stable than that of E. coli. This feature plays a keyrole for the translation of 32 followed by the expression
Hsp at relatively low temperature in C. maris. The
protein folding mechanism of the GroEL system of a
psychrophilic bacterium, Colwellia psychrerythraea 34H(CpGroEL) was also investigated. We found that ATP is
not the optimum energy source of the CpGroEL system.
Thus, we consider that the CpGroEL system possesses anenergy-saving mechanism for avoiding excess
consumption of ATP to ensure growth in a
low-temperature environment.
Keyword: psychrophilic bacteria, heat shock response,heat shock protein, mRNA secondary structure, protein
folding,
キーワード: 好冷性細菌、高温ストレス応答、熱ショックタンパク質、mRNA 二次構造、タンパク質フォールディング
はじめに
生物は地球上のあらゆる温度域に分布している。
特に細菌は生育温度に応じて、超好熱性細菌（至適生育温度 80℃以上）、好熱性細菌（至適生育温度 60℃

79

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)構造をしており、低温での構造変化や基質との相互作用を効率良く行うことができる。しかし、このような構造の柔軟性はタンパク質の熱不安定さの原因と なっ てしま う。例 えば、 好冷 性細菌 Colwellia
psychrerythraea NRC 1004 のイソクエン酸リアーゼ
は 25℃で最大活性を示すが、30℃, 2 分の処理で完全に 失 活 し て し ま う 20) 。 こ の ほ か 、 好 冷 性 細 菌
Arthrobacter DS2-3R の ク エ ン 酸 合 成 酵 素 や
Flavobacterium frigidimaris KUC-1 のリンゴ酸脱水素酵素も同様の熱不安定さを示すことが報告されている 4,15)。このような低温適応型タンパク質の熱不安
定性さを考慮すると、好冷性細菌は常温性細菌と比べてより低い温度で高温ストレスを起こす、即ち、
高温ストレスに対して最も鋭敏に応答する生物であると考えられる。
近年、いくつかの好冷性細菌において全ゲノム配列が決定され、好冷性細菌も他の生物と同じく様々な Hsp をコードする遺伝子を持っていることが明らかとなってきた。このことから、Hsp は好冷性細菌の低温環境下での生育に重要な働きをしていることが推測される。本レビューでは、好冷性細菌の高温
ストレス応答について、
１．好冷性細菌の Hsp 発現機構
２．好冷性細菌の Hsp によるタンパク質修復の特徴の 2 点についてまとめる。

我々は好冷性細菌 Colwellia maris ABE-1 を用いて、比較的低温で起こる高温ストレス応答の研究を進めてきた。C. maris は北海道のオホーツク海で単離されたグラム陰性菌の一種で、至適生育温度は 10〜
15℃、致死温度は 25℃である 26)。
大腸菌をはじめとする細菌は、獲得性熱耐性とよばれる機構を持っている。これは、細胞を一度穏やかな高温にさらすと、その後の致死温度に対する耐性が野生株と比べて増加するというものである。穏やかな高温にさらされている間、細胞中では高温ス
トレス応答が起こり Hsp の発現量が増加する。このような高温に対する防御機構が、その後の致死温度に対する傷害から細胞を保護したと考えられている。
つまり獲得性熱耐性を調べることで、その生物の高温ストレス応答が起こる温度を予測することができる。そこで我々は、C. maris の獲得性熱耐性を解析
して、C. maris が高温ストレスを感じる温度を調べてみた。その結果、10℃で培養した C. maris の細胞を 20℃で 1 時間処理をすると、その後の致死温度
30℃に対する耐性が増加していることがわかった。
このことから、C. maris の高温ストレス応答は 20℃付近で起こっていることが示唆された。
我々は C. maris から Hsp60 と Hsp70 のホモログである groEL および dnaK 遺伝子をクローニングし、
高温ストレス時における転写パターンをノーザンブ
ロット法により解析した 22,23)。10℃で培養した C.
maris の細胞を 20℃で 1 時間処理をすると、groEL,
dnaK ともに mRNA 量が増加することがわかった（図1A,B）。このことは、他の生物と同じく C. maris も高温ストレス応答として、Hsp の発現量を増加させる機構を持っていることを意味する。検出された
mRNA の長さから、C. maris の groEL は上流に存在する groES とオペロンを形成していた（図 1C）。一方 C. maris の dnaK は下流の dnaJ とオペロンを形成しておらず、単独で転写されており、大腸菌のものとは異なる転写パターンを示した（図 1D）。

１．好冷性細菌の Hsp 発現機構
至適生育温度が 15℃以下の好冷性細菌は、20℃という比較的低温で高温ストレス応答を起こすことが考えられる。しかし大腸菌などの常温性細菌では、20℃は低温ストレス応答が起こる温度である。このため、好冷性細菌は比較的低温での Hsp 発現を可能にするために、常温性細菌のものとは異なる Hsp 発
現機構を持っていることが推測される。

好冷性細菌 Colwellia maris ABE-1 の Hsp 遺伝子の転写パターン

図 1. C. maris の groESL および dnaK の転写パターン
10℃で培養した C. maris の細胞を様々な温度で 1 時間処理した後、groESL (A), dnaK (B) の mRNA 量をノー
ザンブロット法により解析した。(C), (D)は groESL と dnaK の遺伝子配置を示している。ノーザンブロットに用いたプローブ領域を黒四角で、検出された mRNA を長さと共に矢印で示している。P32 は32 プロモーター
を、ステムループは推定ターミネーター領域を示している。

80

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)大腸菌の Hsp 遺伝子の転写は、RNA ポリメラーゼ
サブユニットの一つである32 による正の調節を受けている。このため Hsp 遺伝子の上流には熱ショッ
クプロモーターとよばれる32 が特異的に結合する配列が見られる 5)。C. maris の groESL および dnaK遺伝子の上流の塩基配列を調べると、大腸菌の熱シ表1ョックプロモーターとよく似た配列が存在していた（表 1）。このため、C. maris の Hsp は大腸菌のものと比較して 20℃以上も低温で発現が増加するにもかかわらず、大腸菌と同じ32 による制御を受けていることが明らかとなった。

C. maris と大腸菌の groESL, dnaK のプロモーター配列

プロモーター-35 領域

spacing-10 領域(ヌクレオチド)

C. maris

groESL
dnaK

TAGCACTTCTGAA --- 12 --- CCCCACTTCTTTATCTATTGAA --- 14 --- CCCCATTTC

大腸菌

groESL
dnaK

TTTCCCCCTTGAA --- 13 --- CCCCATTTCTCTCCCCCTTGAT --- 14 --- CCCCATTTC

32 コンセンサス配列

TNNCNCCCTTGAA -- 13-15 –- CCCCATNTA

20℃での発現を可能にする C. maris の Hsp 発現機構
C. maris の Hsp の発現は大腸菌と同じく32 による制御を受ける。しかし C. maris では、大腸菌と比べて 20℃以上も低温で Hsp の発現量が増加する。どのようにして C. maris の32 は比較的低温での Hsp の発現誘導を可能にしているのだろうか？ここでは32をコードする rpoH 遺伝子に着目して、１．rpoH
mRNA 量の調節、２．rpoH mRNA 二次構造による
32 の翻訳調節、の 2 点から C. maris の Hsp 発現機構について考察する。
まず rpoH mRNA 量の調節である。一般的に常温性細菌の rpoH は、複数のプロモーターによって制御されている場合が多い。例えば大腸菌の rpoH の場合、通常の転写を担う70 と高温で活性化されるEの 2 種類のプロモーターで制御されており（図 2A）、大腸菌の rpoH の転写量は、E プロモーターにより高温ストレス時に増加する 1)。
我々の解析の結果、C. maris の rpoH のプロモータ
ーは70 タイプの１種類のみであり（図 2A）、C. marisの rpoH の転写量は、温度に関係なく一定であることが予想された。しかし C. maris の rpoH mRNA 量を調べると、高温である 20℃の処理で、mRNA 量が約 3 倍に増加していることがわかった 24)。70 プロ
モーターで制御される C. maris の rpoH mRNA 量が、高温で増加した理由を明らかにするため、転写阻害剤であるリファンピシンを用いて解析を行った結果、
C. maris の rpoH mRNA は 10℃と 20℃で分解速度に違いがあり、20℃の方が安定に存在することがわかった 24)。以上の結果から、C. maris において 20℃でrpoH mRNA 量が増加する主な要因は、温度変化における mRNA の安定性の違いであると結論づけた。
次に rpoH mRNA 二次構造による32 の翻訳調節である。大腸菌では、37℃から 42℃の温度上昇によって細胞中の32 の量が増加する。この増加は主に翻訳

81段階で制御されており、rpoH 5’側の mRNA 二次構造が関与している。大腸菌の rpoH は、開始コドンのすぐ下流に downstream box とよばれる 16S rRNAと相補的な配列を持っている 14)（図 2B）。通常生育
温度 の 37℃では、 SD 配列、開始コドンおよ び
downstream box が二次構造で塞がれてしまい、リボ
ソームが mRNA に結合することができず、32 の翻訳が抑制される。しかし、高温の 42℃では二次構造がほどけて、32 の翻訳が進行する。このように rpoH
mRNA の二次構造は温度センサーとして機能し、温度変化による32 の翻訳量を制御している 12,17)。
C. maris の rpoH mRNA 二次構造による温度センサ
ーは、大腸菌の場合と比べて、32 の翻訳を 20℃以
上低温側にシフトさせる必要がある。C. maris が比較的低温で Hsp を発現する機構を明らかにするために、我々は C. maris と大腸菌の rpoH mRNA 二次構造の比較を行った。C. maris の rpoH の塩基配列を調べると、downstream box が 2 カ所存在しており、大腸菌の場合と比較して 16S rRNA と相補的な領域が長くなっていた 24)（図 2B）。このような downstream
box の特徴は、C. maris における比較的低温での32の翻訳に重要な働きをしていることが推測される。
図 3A は C. maris の rpoH mRNA 二次構造のコンピュータでの予測結果を示している。大腸菌のものと比べると downstream box の二次構造に違いが見られ、大腸菌では downstream box 全ての塩基が対を形成しているのに対し、C. maris では部分的に対を形成していない塩基が存在しており、大腸菌のものに比べてほどけやすくなっていることが示唆された 24)（図3B,C）。このような rpoH mRNA 二次構造の違いが、大腸菌と C. maris における32 の翻訳促進の温度やこの後に起こる Hsp 発現誘導温度の違いに関与していると推測される。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)図 2. (A) 大腸菌と C. maris の rpoH のプロモーター。転写開始点を矢印で、プロモーターの種類を括弧内に示している。(B) 大腸菌と C. maris の rpoH のダウンストリームボックス。rpoH mRNA の配列を上段に、16S
rRNA の配列を下段に示している。

図 3. 大腸菌と C. maris の rpoH mRNA 二次構造の比較(A) Vienna RNA secondary structure prediction program (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi/) を用いて予測した C. maris の rpoH mRNA 5’領域（-20 から+144）の二次構造を示している。(B), (C) は大腸菌と C. marisの rpoH mRNA 二次構造において、downstream box 周辺を拡大して示している。

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)２．好冷性細菌の Hsp によるタンパク質修復の特徴
Hsp は高温ストレス時における変性タンパク質の修復だけでなく、通常の生育温度においても重要な働きをしている。具体的には、新規合成タンパク質の正しい構造形成の補助や高温ストレス応答の負の調節因子としての機能などがあげられる 8,9)。好冷性
細菌の Hsp も通常の生育温度でこのような働きを担っているとすれば、これらの Hsp は低温環境で機能するための特徴を持っていることが考えられる。本項では Hsp60 のホモログである GroEL に焦点を当てて、好冷性細菌の Hsp によるタンパク質修復の特徴について述べる。
GroEL システムによるタンパク質修復
GroEL システムは GroEL と補助因子 GroES から構成される。これまでの大腸菌 GroEL システムの研究から、構造ならびにタンパク質修復の大まかな流れが明らかにされている。GroEL は約 57 kDa のタンパ
ク質で、頂点、中間、赤道の 3 つのドメインから構成される。頂点ドメインでは構造の崩れたタンパク
質や GroES が結合し、赤道ドメインでは ATP の加水分解が起こる。中間ドメインは頂点と赤道の 2 つのドメインを繋ぎ、ATP 結合後の GroEL の構造変化に関与している。GroEL は、各サブユニットが上下に
7 つリング状に結合した合計 14 量体を形成しており、片側のリングには、補助因子である GroES が 7 量体で結合し、合計 840 kDa の巨大な複合体となっている 21)。
GroEL は補助因子 GroES と共同で、ATP 加水分解によるエネルギーを利用してタンパク質を修復する
7)。具体的な流れは以下の通りである（図 4）。
①. 構造の崩れたタンパク質が GroEL の上部に結合する。
②. GroEL に ATP が結合すると GroES が結合して、構造の崩れたタンパク質が GroEL 中心の空洞に閉じ込められる。
③. ATP 加水分解の間、空洞内でタンパク質が修復される。
④. GroEL から GroES が解離して、修復されたタ
ンパク質が外に放出される。
GroEL システムは、新規合成タンパク質の正しい構造形成の補助にも重要な働きをしている。大腸菌
において、GroEL システムは少なくとも 13 の必須代
謝酵素の構造形成に関与しており、GroEL, GroES 共に大腸菌の生育に必須のタンパク質であることが知られている 10)。また、低温が GroEL システムに与える影響について、Mendoza らは 15℃以下で大腸菌のGroEL システムは有意なタンパク質修復活性を示さないことを明らかにした 11)。このことは、常温性細菌の GroEL システムは好冷性細菌の至適生育温度付
近では機能できないことを意味する。

図 4. GroEL システムによるタンパク質修復の流れ
GroEL の片側のリングに着目して、タンパク質修復の流れを示している。図中①〜④の番号は、本文中の番号と一致している。詳細は本文を参照のこと。
好冷性細菌の GroEL システムによるタンパク質修
復の特徴
我 々 は 至 適 生育 温 度が 8 ℃ で あ る 好冷 性 細菌
Colwellia psychrerythraea 34H の GroEL システムに着目して、低温で機能する Hsp の特徴の解析を進めている。これまでに我々の C. psychrerythraea のほか、
Oleispira antarctica RB8 および Pseudoalteromonas
haloplanktis TAC125 の計 3 種類の好冷性細菌のGroEL システムの特徴が報告されている。これら 3
種類の GroEL は 75%以上の高いアミノ酸配列の相同性を示すにも関わらず、各々異なる特徴を持っていることがわかった。

O. antarctica の GroEL システム（OaGroEL）は、
低温適応型の特徴を持っていることで注目を集めた。
精製タンパク質を用いた解析により、OaGroEL シス
テムは 4〜18℃の低温域で高いタンパク質修復活性を示すこと、OaGroEL システムを発現させた大腸菌は 4℃で生育が増加することが明らかにされた 2,3)。
一方、P. haloplanktis の GroEL システム（PhGroEL）
は、温度低下と共にタンパク質修復活性も低くなり、常温性細菌の GroEL システムとよく似た性質を持っていることが明らかにされた 18)。このように、同じ
好冷性細菌でも O. antarctica と P. haloplanktis のGroEL システムは全く逆の特徴を持っていた。

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)我 々 は C. psychrerythraea の GroEL シ ス テ ム（CpGroEL と CpGroES）について、ヌクレオチドの選択性が異なるという好冷性細菌の GroEL システムの新たな特徴を見出した 25)。一般的に、細胞中ではATP が他のヌクレオチドと比べて多量に存在するため、GroEL などの分子シャペロンは主に ATP を用いて機能していることが推測される。しかし CpGroEL
システムは ATP よりも CTP 存在下で高いタンパク
質修復活性を示し、CpGroEL にとって ATP は最適なエネルギー源ではないことが示唆された。更なる解析の結果、このヌクレオチド選択性の違いに
CpGroEL と CpGroES の相互作用の強さの違いが関与していることが明らかとなった。CTP 存在下でのCpGroEL と CpGroES の相互作用の強さは、ATP 存
在下の場合と比較して弱く、CTP の場合 CpGroESが CpGroEL から解離可能なため、ATP よりも効率良くタンパク質を修復できることが示唆された（図 5）。
異なるヌクレオチド選択性を持つという CpGroEL
システムの特徴は、ATP の過剰消費を抑制し、代謝速度が遅い低温環境で、好冷性細菌が生育するための戦略の一つではないかと推測している。現在我々は、大腸菌の GroEL と CpGroEL のキメラを作製し、このような特徴に関わる GroEL の領域の特定を進めている。

図 5. CpGroEL システムの特徴
ATP 存在下では CpGroES と CpGroEL の相互作用が強いため、空洞内のタンパク質が放出されず、タンパク質修復が進まない。一方 CTP 存在下では、CpGroES は CpGroEL から解離可能であり、タンパク質修復が進
行する。
今後の展望
好冷性細菌 C. maris は、常温性細菌より 20℃以上
も低温で高温ストレスを感じ、Hsp の発現量を増加させていた。このような Hsp の発現温度の違いに、
32 をコードする rpoH の mRNA 二次構造の違いが関与していることが示唆された。今後レポーター遺伝子を用いた解析を行うことで、 C. maris の rpoH
mRNA 二次構造の特徴がより明確になるはずである。
また、このような mRNA 二次構造の温度センサーに関する知見は、様々な温度で翻訳可能な翻訳スイッチとしての利用が可能となる。
好冷性細菌の Hsp は GroEL システムだけを見ても、低温で高い活性を示すもの（OaGroEL）、常温性細菌と 同じ 温度依 存性 を示すも の（ PhGroEL お よび
CpGroEL）、異なるヌクレオチド選択性を示すもの（CpGroEL）など、様々な特徴を持っていることがわかってきた。このような GroEL システムの多様性

84

は、好冷性細菌の生育とどのような関係があるのだ
ろうか？好冷性細菌 O. antarctica では、高温ストレス時に Hsp の発現誘導が起こらないことが報告されている 3)。このため、低温で高い活性を示す OaGroEL
システムは、新規合成タンパク質の構造形成の補助に特化していることが推測される。一方、常温性細菌 の も の と 同 じ 温 度 依 存 性 を 示 す PhGroEL と
CpGroEL は、高温ストレス時にのみ機能し、新規合成タンパク質の構造形成の補助には関与していないことが推測される。大腸菌の生育に GroEL システムは 必須で あるが 、今後 P. haloplanktis および C.
psychrerythraea の生育における GroEL システムの必要性について、遺伝子破壊株を用いた解析を行う必要がある。
このような Hsp の多様性に関する知見は、
Hsp 機能の新たなメカニズムの発見だけでなく、好冷性細菌の進化の点においても重要な情報を得られるものと考えている。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)

引用文献
1) Erickson J. W., Vaughn V., Walter W. A., Neidhardt
F. C., and Gross C. A. 1987. Regulation of thepromoters and transcripts of rpoH, the Escherichia coliheat shock regulatory gene. Genes Dev. 1: 419-432.
2) Ferrer M., Chemikova T. N., Yakimov M. M.,
Golyshin P. N., and Timmis K. N. 2003. Chaperonins
govern growth of Escherichia coli at low temperatures.
Nat. Biotechnol. 21: 1266-1267.
3) Ferrer M., Lünsdorf H., Chernikova T. N., Yakimov
M., Timmis K. N., and Golyshin P. N. 2004. Functional
consequences of single:double ring transitions inchaperonins: life in the cold. Mol. Microbiol. 53:
167-182.
4) Gerike U., Danson M.J., Russell N.J., and Hough
D.W. 1997. Sequencing and expression of the geneencoding a cold-active citrate synthase from an
Antarctic bacterium, strain DS2-3R. Eur. J. Biochem.
248: 49-57.
5)Hawley D. K., and McClure W.R. 1993.
Compilation and analysis of E. coli promoter DNA
sequences. Nucleic. Acids. Res. 11: 2237-2255.
6) Hengge R., and Bukau B. 2003. Proteolysis inprokaryotes: protein quality control and regulatory
principles. Mol. Microbiol. 49: 1451-1462.
7) Horwich A. L., Farr G.W., and Fenton W. A. 2006.
GroEL-GroES-mediated protein folding. Chem. Rev.
106: 1917-1930.
8) Houry W. A. 2001. Chaperone-assisted protein
folding in the cell cytoplasm. Curr. Protein Pept. Sci. 2:
227-244.
9) Kanemori M., Nishihara K., Yanagi H., and Yura T.
1997. Synergistic roles of HslVU and other
ATP-dependent proteases in controlling in vivo
turnover of 32 and abnormal proteins in Escherichia
coli. J. Bacteriol. 179: 7219-7225.
10) Kerner M. J., Naylor D. J., Ishihama Y., Maier T.,
Chang H. C., Stines A.P., Georgopoulos C., Frishman
D., Hayer-Hartl M., Mann M., and Hartl F.U. 2005.
Proteome-wide analysis of chaperonin-dependent
protein folding Escherichia coli. Cell 122: 209-220.
11) Mendoza J. A., Dulin P., and Warren T. 2000. The
lower hydrolysis of ATP by the stress protein GroEL isa major factor responsible for the diminishedchaperonin activity at low temperature. Cryobiology
41: 319-323.
12) Morita M., Kanemori M., Yanagi H., and Yura T.
1999. Heat-induced synthesis of 32 in Escherichia
coli: structural and functional dissection of rpoH
mRNA secondary structure. J. Bacteriol. 181: 401-410.
13)
Morita R. Y. 1975. Psychrophilic bacteria.
Bacteriol. Rev. 39: 144-167.
14) Nagai H., Yuzawa H., and Yura T. 1991. Interplayof two cis-acting mRNA regions in translational controlof 32 synthesis during the heat shock response ofEscherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:
10515-10519.

15) Oikawa T., Yamamoto N., Shimoke K., Uesato S.,
Ikeuchi T., and Fujioka T. 2005. Purification,
characterization, and overexpression of psychrophilic
and thermolabile malate dehydrogenase of a novel
Antarctic psychrotolerant, Flavobacterium frigidimaris
KUC-1. Biosci. Biotechnol. Biochem. 69: 2146-2154.
16) Richter K., Haslbeck M., and Buchner J. 2010. The
heat shock response: life on the verge of death. Mol.
Cell. 40: 253-266.
17) Terao-Morita M., Tanaka Y., Kodama T. S.,
Kyogoku Y., Yanagi H., and Yura T. 1999. Translational
induction of heat shock transcription factor 32:
evidence for a built-in RNA thermosensor. Genes Dev.
13: 655-665.
18) Tosco A., Birolo L., Madonna S., Lolli G., Sannia
G., and Marino G. 2003. GroEL from the psychrophilic
bacterium Pseudoalteromonas haloplanktis TAC 125:
molecular characterization and gene cloning.
Extremophiles 7: 17-28.
19)
Walter S., and Buchner J. 2002. Molecularchaperones-cellular machines for protein folding.
Angew. Chem. Int. Ed. 41: 1098-1113.
20) Watanabe S., Yamaoka N., Fukunaga N., andTakada Y. 2002. Purification and characterization of acold-adapted isocitrate lyase and expression analysis of
the cold-inducible isocitrate lyase gene from thepsychrophilic bacterium Colwellia psychrerythraea.
Extremophiles 6: 397-405.
21) Xu Z., Horwich A. L., and Sigler P. B. 1997. The
crystalstructureoftheasymmetric
GroEL-GroES-(ADP)7 chaperonin complex. Nature
388: 741-750.
22) Yamauchi S., Okuyama H., Morita E. H., andHayashi H. 2003. Gene structure and transcriptional
regulation specific to the groESL operon from thepsychrophilic bacterium Colwellia maris. Arch.
Microbiol. 180: 272-278.
23) Yamauchi S., Okuyama H., Nishiyama Y., andHayashi H. 2004. Gene structure and transcriptional
regulation of dnaK and dnaJ genes from a
psychrophilic
bacterium,
Colwellia
maris.
Extremophiles 8: 283-290.
24) Yamauchi S., Okuyama H., Nishiyama Y., andHayashi H. 2006. The rpoH gene encoding heat shock
sigma factor 32 of psychrophilic bacterium Colwelliamaris. Extremophiles 10: 149-158.
25) Yamauchi S., Ueda Y., Matsumoto M., Inoue U.,
and Hayashi H. 2012. Distinct features of protein
folding by the GroEL system from a psychrophilic
bacterium,
Colwellia
psychrerythraea
34H.
Extremophiles 16: 871-882.
26) Yumoto I., Kawasaki K., Iwata H., Matsuyama H.,
and Okuyama H. 1998. Assignment of Vibrio sp. strain
ABE-1 to Colwellia maris sp. nov., a new
psychrophilic bacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 48:
1357-1362.

85

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)

学会記事
極限環境生物学会第 14 回年会報告
第 14 回年会は、10 月 26-27 日（土・日）に明治大学生田キャンパス（川崎市多摩区東三田）、第二校舎 A 館
にて開催されました。当日は、多くの会員・非会員の皆様にご参集いただき、口頭発表 20 件、ポスター発表
65 件の一般発表の他、年会実行委員長の中島春紫先生（明治大）の企画による特別セッション（明治大セッション）を行い、更に、東京大学の野尻秀昭先生による第 9 回日本学士院学術奨励賞・第 9 回日本学術振興会賞受賞記念講演、東京薬科大学の山岸明彦先生がオーガナイザーとして企画された火星シンポジウム、学会奨励賞受賞講演 2 件と大変盛りだくさんな会となりました。参加者合計は 238 名（内訳を以下の表に示す）となりました。年会のお世話をいただきました明治大学・中島先生には、年会開催に向け精力的に奔走していただきました。ここで、中島先生に感謝申し上げるとともに、当日ご参加いただいた皆様方に事務局一同
心より感謝申し上げます。

一般
学生
総計








事前申し込み人数
96（会員 85、非会員 11）67（会員 25、非会員 42）163（会員 107↑、非会員 53↓）

当日申し込み人数
29（会員 6、非会員 23）
46（会員 0、非会員 46）（会員 6、非会員 69）

合計125（会員 91、非会員 34）
113（会員 25、非会員 88）
238（会員 116↑、非会員 122↓）

今回も、企業技術コーナーには以下の 6 社にご参加いただきました。
筑波家田化学株式会社+家田貿易株式会社
ライカ マイクロシステムズ株式会社
興研株式会社
株式会社ワールドフュージョン
バイオツールズ株式会社
株式会社トミー精工学会事務局より、年会へのご協力に関して心より感謝申し上げます。
【特別講演】
東京大学の野尻秀昭先生に「難分解性環境汚染物質の分解細菌が有する分解能の分子基盤の解明」と題して、ご講演をいただきました。今回の受賞に至るまでのご自身の研究をご紹介いただきました。
【明治大セッション】
中島春紫先生の企画により、以下の 3 名の気鋭の先生方によるご講演をいただきました。いずれの講演も話題提供が豊富で講演自体もその後の質疑も大変に盛り上がりました。
・前田理久先生（明治大学農学部農芸化学科）「多芸多才なバクテリア Alcaligenes denitrificans A41 株」
・佐々木泰子先生（明治大学農学部農芸化学科）「ヨーグルトにおける乳酸菌の共生発酵」
・中島春紫先生（明治大学農学部農芸化学科）「ハイドロフォービン：麹菌の気中構造を支えるタンパク質」【特別セッション】「火星生命探査計画」
東京薬科大学の山岸明彦先生の企画により、以下の 3 名の先生方によるご講演をいただきました。いずれの講演も「火星」探査という夢のある話題であったこともあり会場内は立ち見が出るほどの盛況でした。
・山岸明彦先生（東京薬科大学生命科学部）「火星生命探査計画：極限環境生物学会員へのお願い」
・佐藤毅彦先生（宇宙科学研究所）「火星着陸生命探査 MELOS1 計画の概要」
・宮本英昭先生（東京大学総合研究博物館）「火星環境進化と MELOS1 着陸候補地点」

86Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)

年会・発表会場風景

ポスター会場の風景

懇親会会場の風景【奨励賞受賞講演】2013 年度の学会奨励賞は次の 2 名に決定し、受賞講演をいただきました。
・諸野祐樹 先生（独立行政法人海洋研究開発機構 高知コア研
究所）「海底下環境における微生物生命圏とその生態に関する研究」
・中川聡 先生（北海道大学・大学院水産科学研究院）「深海底
熱水活動域に棲息する化学合成独立栄養微生物の多様性とその進化」
今回のご受賞大変におめでとうございました。

【名誉会員証授与式】今年度から新設されました名誉会員の第 1 回会
員証授与式が行われました。今年度は長年に渡り当学会の発展に功績があった 5 名の方が名誉会員に選出されました。授与式には、魚住武司先生が出席してくださいました。
以下の 5 名の方々が名誉会員に選出されました。
（敬称略、五十音順）
魚住武司
大森俊雄
古賀洋介
冨田房男
山本幹男
郷田秀一郎先生
名誉会員になられた魚住武司先生と大島副会長

87

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)【優秀ポスター賞】
優秀ポスター賞は、審査員による厳正な審査の結果、以下の 4 名の方々が受賞されました。若手の皆様の今後のご活躍を祈念しております。
・ P-13 折田和泉（東京工業大学大学院生命理工学研究科）二重交差相同性組換えによる Thermococcus
kodakarensis ランダム変異法の確立
・ P-19 松原惇高（東京工業大学大学院生命理工学研究科）「高度好塩性古細菌 Haloarcula japonica 由来走気性トランスデューサーの機能解明：キメラトランスデューサーの構築と生理学的機能解析」
・ P-39 加藤真悟（理化学研究所バイオリソースセンター）「海底下の熱水性硫化物中の微生物の分布、群集組成および代謝機能」
・ P-45 丸山沙織（京都大学化学研究所 分子微生物科学研究領域）「低温菌 Shewanella livingstonensis Ac10による 金属還元機構の解析」

優秀ポスター賞受賞者と大島副会長、為我井・古園両幹事

極限環境生物学会事務局

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)

学会誌投稿規定
極限環境生物学会誌投稿規定
１．投稿者の資格
極限環境生物学会誌（ISSN 1348-5474） (Journal ofJapanese Society for Extremophiles)（以下、本誌という）への投稿は極限環境生物学会（以下、本学会という）会員に限る。なお、連名による投稿の場合には、少なくとも著者の一人が本学会会員でなければならない。ただし、日本国以外からの投稿並びに本学会が寄稿を依頼した場合は例外とする。

け付ける。この場合、極限環境生物学会ホームペー
ジに掲載されている投稿要領に従うこと。

２．論文の種類
本誌への投稿論文は、極限環境生物関連分野の原著論文（通常論文、短論文）、総説、並びに諸報とし、いずれも未発表のものに限る。
（１）原著論文 (original papers)：極限環境生物に関する論文で以下の２つのいずれかに該当する論文。
１）通常論文 (regular papers)：極限環境生物に関する論文で、それ自体独立した、価値のある結論ある
いは事実を含む論文。
２）短論文 (short communications)：極限環境生物に関する論文で、断片的な結果ではあるが新しい事実や価値のあるデータを含む短い論文。
（２）総説 (reviews)：極限環境生物のある特定の研究分野について、簡単な歴史的背景を含め、最近の進歩を要約し、可能であれば、将来の研究方向性をも指し示した論文。
（３）ミニレビュー (mini-reviews)：総説の内、比較的短く纏めたもの。
（４）諸報：巻頭言、研究最前線、研究のルーツを探る、学会関連記事等。

５．論文の審査
投稿された論文の内、原著論文、総説、ミニレビュ
ーの審査には、極限環境生物学会誌編集委員の内１名が責任編集委員として関与する。原著論文および総説の審査は、責任編集委員が適宜指名する複数の査読者によりなされる。掲載の可否に関する最終判
定は、査読者からの査読結果報告に基づき責任編集委員が行う。その後、編集委員長が著者に審査結果を通知する。なお、内容・体裁に問題があると判断された原稿については、著者による修正を求める。
修正を求められた原稿は、２ヶ月以内に責任編集委
員に返送することとし、２ヶ月を過ぎて返送されなかった原稿は、著者が原稿を取り下げたものとして処理する。なお、投稿された論文は返却しない。

３．論文の書き方
論文の用語は日本語または英語とし、別途定める「原稿執筆要領」に従い簡潔に分かりやすく作成すること。総説は原稿３０頁以内、通常論文は原稿２０頁
以内、ミニレビューは原稿１５頁以内、短論文は原稿１０頁以内とする。なお、諸報の頁数に関しては編集委員会で適宜判断する。

７．別刷り
別刷りは、pdf ファイルとして配布する。

〒113-8657 東京都文京区弥生 1-1-1 東京大学大学
院農学生命科学研究科応用生命工学専攻（東大院農生科応生工と省略可）極限環境生物学会誌編集委員長
石 井 正 治 ( 電 話 ： 03-5841-8258, FAX ：03-5841-5272) (e-mail: amishii@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp)

６．校正
校正は初稿のみ著者に送付する。到着日より３日以内に、原稿とともに指定された送付先に返送すること。なお、原著論文ならびに総説に関しては、著者
校正時の文章・図表の追加や削除は一切認めない。

８．著作権
本誌に掲載された論文の著作権は本学会に帰属する。
９．その他
極限環境生物学会誌投稿規定ならびに極限環境生物
学会誌論文執筆要領で不明な部分に関しては、極限環境生物学会誌編集委員会において適宜対応する。
なお、必要が認められる場合には、文書化を進めるものとする。

４．論文の受付
論文原稿は諸報を除き、原稿原本の他にコピー３部を付け、送付状とともに簡易郵便書留として下記宛に送付すること。なお、オンラインによる投稿も受

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)

論文執筆要領
極限環境生物学会誌論文執筆要領
１．一般的事項（１）テキストファイル形式または Microsoft Word
形式で保存できるワードプロセッサ等を用いて原稿を作成すること。
（２）タイトルページには、1)論文題名、2)著者名、
3)著者所属機関名、4)ランニングタイトル、5)連絡対
応著者名およびその連絡先住所・電話番号・FAX 番号・e-mail アドレス、6)キーワード（５語以内）を明示すること。日本語で作成した論文には、これらの英語訳を併記すること。
（３）論文印刷には A4 版用紙の片面を使用し、１
行４０字（英語の場合には１行６０字）、１頁２５行で印刷すること。イタリック、ボールド、あるいはスモールキャピタルにする語句がある場合は、それぞれ赤字で下線、波下線、二重下線を記すこと。
（４）略語リストがある場合には、本文第１頁に脚注として略語の項を設け表記すること。単位系と省略記号は SI 単位を基本とする。
（５）生物の命名及び記載は International Code of
Nomenclature of Prokaryotes, International Code ofBotanical Nomenclature, International Code ofZoological Nomenclature に従う。学名が初出の場合は全部を記載すること。原則として、２回目以降は属名の頭文字を略号とするが、紛らわしい場合には省略せずに記載すること。
（６）物質名の表記は以下の規定に従うこと。
１）有機化合物の表記および放射性同位元素による標識化合物の表記は IUPAC 規定に従うこと。
２）生化学関連事項の命名は IUPAB 制定の命名法に従うこと。
３）化学式に用いられる記号、略号などは Chemical
Abstracts の用例に従うこと。
（７）論文受理後、完成した本文および図表等の印刷に必要な全てのファイルを収めた電子媒体を編集委員長宛に郵送するか、またはそれらのファイルを
e-mail 添付書類として編集委員長宛に送付すること。
２．投稿論文の構成（１）原著論文は 1)標題、2)アブストラクト、3)本
文、4)引用文献、5)表ならびに図、図の説明文、の順にまとめること。
（２）標題は論文内容を具体的に表す簡潔なものとすること。標題の下に著者名、所属機関名、所在地を書く。著者が複数で、所属機関が異なる場合は、
著者名末尾に上付数字を付けて区別するとともに、連絡対応著者名を指定すること。
（３）原著論文ならびに総説のアブストラクトは英語で記述するものとし、通常論文・総説では200words 以内、短論文では 100words 以内で作成す

90

ること。
（４）通常論文の本文は原則として、緒言、材料および方法、結果、考察（あるいは結果と考察）、謝辞で構成する。短論文では項目分けをしない。
（５）原著論文ならびに総説では、必要に応じて図表を用いる。それぞれの図表を挿入したい位置を、原稿右側の余白部分に指示すること。
（６）文中での文献の引用は、引用文献の項目で整理した文献番号を用いること。図表の引用はその番号によること。
（７）脚注が必要な場合には、該当事項の右肩に通し番号を付け、当該頁の下部に説明文を付けること。
３．引用文献（１）引用文献は下記の例に準じ、本文中の該当人
名あるいは事項の右肩に 1), 1-3)のように番号を付し、また、本文末尾の引用文献の項に第一著者のファミリーネームのアルファベット順に 1., 2., 3., --の番号を付し一括記載する。Ibid., idem は用いないこと。私信、未発表の研究結果、学術雑誌に受理される前の論文、抄録が印刷されていない口頭発表など
は引用文献に含めないこと。雑誌の略号は、Chemical
Abstracts Service Source Index (CASSI) 1907-1984(Cumulative)およびその補遺版により、雑誌名、書名、
年、巻および頁の示し方は下記によること。
（２）雑誌引用のとき
Chuakrut, S., Arai, H., Ishii, M., and Igarashi, Y. 2000.
Characterization of a bifunctional archaeral acylcoenzyme A carboxylase. J. Bacteriol. 185: 938-947.
（３）書籍引用のとき
児玉徹. 1997. V 近代的な微生物利用工業１．アルコール, pp191-197.児玉徹・熊谷英彦編, 食品微生物学,
文永堂出版
４．表と図およびその説明（１）表と図は印刷版下を作成すること。
（２）本文を英語で書いた場合には図表も英文で作成すること。
（３）表と図は一つに対して１頁使う。各頁の右上に著者名ならびに図の番号を入れること。
（４）表題は表の上部分に書くこと。表の内容説明
文ならびに注は、表の下に記述する。注の表示にはa),b),c)を上付で明記し、記述には a),b),c)を上付にせず用いる。
（５）図の標題ならびに説明文は別紙にまとめて印刷すること。図の標題の最後にはピリオドを付し、内容説明は標題の後に改行して記載すること。
（６）写真は明瞭な陽画を必要部数添付すること。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)学会会則
極限環境生物学会会則（名称）第１条 本会は、極限環境生物学会（英文名：TheJapanese Society for Extremophiles ）という。
（以下本会という）（目的）
第２条 本会は、極限環境生物研究の発展に寄与し、極限環境生物の研究、教育、利用の推進に寄与することを目的とする。
（事業）
第３条 本会は、研究発表会及び講演会等の開催、
極 限 環 境 生 物 学 会 誌 （ 英 名 ： Journal ofJapanese Society for Extremophiles）の発行、
国際極限環境生物学会等との連携事業、研究奨励賞・ポスター賞の授与、その他前条の目的を達成するために必要な事業を行う。
（会員の種別等）
第４条 本会の会員は正会員、名誉会員、団体会員
および賛助会員とする。
2.正会員は極限環境生物に関する研究に従事する、または、これに関心を持つ個人であって、本会の目的に賛同し、定められた会費を納めた者をいう。身分が学生である者および 65 歳以上となった正会員の会費は別に定める。便宜上これらの者をそれぞれ正会員（学生）および正会員（シニア）と称する。
3.名誉会員は、当学会の発展に功労のあった者で、幹事会による推薦、評議員会による承認を経て、会長の指名により決定され、当学会の催すシンポジウム・年会等に招待される。
4. 団体会員は極限環境生物に関心を持つ団
体（法人等）であって、その団体内の本会の目的に賛同する代表者を含めて３名以内の所属者を指名して会員登録を行い、定められた会費を納めた団体をいう。
5. 賛助会員は本会の目的に賛同し、定められた賛助会費を１口以上納めた個人または団体をいう。
第５条 会員は本会が開催する諸事業に参加し、本会の発行する印刷物、PDF 等の配布を受けることができる。
（入会）
第６条 会員として入会しようとする個人または団
体は、本会事務局が定める手続きに従って申し込みを行い、本会会長による承認を得なければならない。

91（会費）
第７条 会員は下記の会費を納めるものとする。
正会員
年額
5,000 円
（但し身分が学生である者および 65 歳以上となった正会員は申請により年額 2,000 円とすることができる。前者の場合は指導教員の署名、後者の場合は幹事会による事後承認を必要とする。）
名誉会員 年額 0 円
団体会員 年額 20,000 円
賛助会員 年額 一口以上（一口 30,000 円）（退会）
第８条 会員は会長に届けることによって退会することができる。
（役員）
第９条 本会には会長 1 名、副会長 2 名、評議員若干名、幹事若干名、会計監査 2 名の役員をおく。
2. 会長は本会を代表し、会務を統括する。
3. 副会長は会長を補佐し、会長に事故ある
場合には会長の職務を代行する。
4. 幹事は、幹事長、庶務、学術活動、会計、を分担し、事業計画の立案、事業の実施、庶務会計、シンポジウムの企画立案、学会誌発行、国際極限環境生物学会等との連絡などの本会の事務を行う。
5. 会計監査は本会の会計を監査する。
（役員の選出）第１０条 会長、副会長、評議員は本会の総会において選出される。
2. 幹事、会計監査は、副会長、評議員以外の正会員の中から会長が指名し、総会の承認を受ける。
3. 評議員の任期は２年とし重任を妨げない
が、連続３期を限度とする。但し、会長が指名する評議員はこの限りではない。
（名誉会長）
第１１条 本会には名誉会長をおくことができる。
2. 名誉会長は、本会に対し大局的な見地による適切な助言を与える。
3. 名誉会長は、会長として学会の運営及び発展に特別の功績があった者で、幹事会による推薦、評議員会を経て、総会の承認を受ける。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)（委員会）
第１２条 本会に学会誌編集委員会、研究奨励賞選
考委員会、シンポジウム委員会を置く。各委員会委員の任期は 2 年とするが重任をさまたげない。
2. 学会誌編集委員会（会長指名の若干名で構成し､委員長は互選する）は学会誌の編集、論文審査の任にあたる。
3. 研究奨励賞選考委員会（副会長が委員長を勤め、学術活動担当幹事と委員長指名の委員、計 10 名程度で構成する）は本会の研究奨励賞受賞者を選考する。
4. シンポジウム委員会（会長指名の若干名で構成し､委員長は互選する）は学術活動幹事と共同でシンポジウムを企画立案し、運営をサポートする。
（評議員会）
第１３条 評議員会は会長、副会長、評議員をもって構成する。会長は年１回以上評議員会を召集し、議長となり、会の重要事項を審議し総会に提案する。
（総会）
第１４条 本会は原則として年１回総会を開き、会務を協議し議決する。
総会は会長が召集する。
第１５条 総会の議決は出席会員の過半数の賛成をもって行う。

92（会計年度）
第１６条 本会の事業年度は 1 月 1 日に始まり、同年 12 月 31 日に終る。
（付則）第１７条 本会則の施行および本会の運営についての細則は総会の議決を経て別に定める。
第１８条 本会則の変更は総会の議決を経て行う。
第１９条 本会則は、1999 年 10 月 19 日より施行する。

2001 年 11 月 29 日改定
2002 年 12 月 1 日改定
2003 年 12 月 1 日改定
2005 年 11 月 7 日改定
2007 年 12 月 1 日改定
2010 年 1 月 1 日改定
2012 年 12 月 1 日改定
2013 年 10 月 26 日改定

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)学会細則

極限環境生物学会細則（会員）
第１条 入会を承認された正会員、名誉会員、団体
会員、賛助会員は、所定の会費を速やかに
納入する。
（総会）
第２条 総会の議案は副会長、幹事等と共に会長が作成し、評議員会の議を経た後提出する。
議案には前年度の事業内容及び収支決算、
新年度の事業計画、及び収支予算を含むものとする。
第３条 総会は会員の１／１０以上の出席（但し委任状を含む）をもって成立する。
（役員の選出）第４条 会長、副会長、評議員は会員の選挙によって決められる。会長は選挙によらず評議員を指名することが出来るが、総会での承認を必要とする。
第５条 会長は会員の中から少なくとも３名を選んで選挙管理委員を委嘱する。選挙管理委員
は選挙事務を行う。
第６条 会長は、評議員会の承認を得て必要な委員会を作ることが出来る。
（評議員会）
第７条 評議員会は評議員の半数以上の出席（委任状を含む）をもって成立する。
第８条 評議員会の決議は出席者の過半数の賛成により成立する。

（退会）
第９条 会長は、会費を３年以上滞納した会員を退会させることが出来る。
（授賞）
第１０条 研究奨励賞・ポスター賞の授賞規定は別途定め全会員に配布する。
（細則の変更）第１１条 本細則の変更は総会の議決による。
（付則）第１２条 今期の本会事務局は、東京工業大学大学院
生命理工学研究科 中村聡研究室（横浜市
緑区長津田町）内とする。
第１３条 本細則は、1999 年 10 月 19 日よりこれを実施する。

2002 年 12 月 1 日改定
2003 年 12 月 1 日改定
2006 年 6 月 30 日改定
2007 年 12 月 1 日改定
2010 年 1 月 1 日改定
2012 年 12 月 1 日改訂

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (2)運営体制

極限環境生物学会運営体制（2014~15 年度）

名誉会長

掘越 弘毅

独立行政法人海洋研究開発機構

会長

大島 泰郎

共和化工株式会社 環境微生物学研究所

工藤 俊章

独立行政法人理化学研究所

井上東洋大学 バイオナノエレクトロニクス研究センター副会長

明

評議員（５０音順、敬称略）
秋野 利郎

合同酒精株式会社

石野 園子

九州大学大学院 農学研究院

幹事長

中村 聡

東京工業大学大学院 生命理工学研究科

板谷 光泰

慶応義塾大学 環境情報学部

庶務担当

伊藤 政博

東洋大学 生命科学部

伊藤 進

琉球大学 農学部

学会誌担当

伊藤 佑子

創価大学 工学部

編集委員長

石井 正治

東京大学大学院 農学生命科学研究科

今中 忠行

立命館大学 生命科学部

石野 良純

九州大学大学院 農学研究院

大島 敏久

大阪工業大学 工学部

古園 さおり東京大学 生物生産工学研究センター

大島 朗伸

島根大学 生物資源科学部

高品 知典

東洋大学 生命科学部

鎌形 洋一

独立行政法人産業技術総合研究所

宇佐美 論

東洋大学 理工学部

川上 文淸

一般財団法人北陸産業活性化センター

道久 則之

東洋大学 生命科学部

河原林 裕

九州大学大学院 農学研究院

ホームペー

三輪 哲也

独立行政法人海洋研究開発機構

倉光 成紀

大阪大学大学院 理学研究科

ジ担当

為我井 秀行日本大学 文理学部

小林 哲夫

名古屋大学大学院 生命農学研究科

シンポジウ

小林 良則

財団法人バイオインダストリー協会

ム担当

八波 利恵

東京工業大学大学院 生命理工学研究科

佐上 博

東北大学 多元物質科学研究所

青木 俊夫

日本大学 生物資源科学部

芝 弘孝

サントリービジネスエキスパート株式会社

跡見 晴幸

京都大学大学院 工学研究科

鈴木 健一朗

独立行政法人製品評価技術基盤機構

伊藤 隆

独立行政法人理化学研究所

高田 泰弘

北海道大学大学院理学研究院

加藤 千明

独立行政法人海洋研究開発機構

中川 和倫

愛媛県立今治西高等学校

亀倉 正博

好塩菌研究所長谷川 功

日本大学 生物資源科学部

國枝 武和

東京大学大学院 理学系研究科

半澤 敏

東ソー株式会社 東京研究所

栗原 達夫

京都大学 化学研究所

別府 輝彦

日本大学 生物資源科学部

仲宗根 薫

近畿大学 工学部

丸山 正

独立行政法人海洋研究開発機構

中村 顕

筑波大学大学院 生命環境科学研究科

山岸 明彦

東京薬科大学 生命科学部

鳴海一成

東洋大学 生命科学部

湯本 勲

独立行政法人産業技術総合研究所

東端 啓貴

東洋大学 生命科学部

若木 高善

東京大学大学院 農学生命科学研究科

福居 俊昭

東京工業大学大学院 生命理工学研究科

渡辺 公綱

東京薬科大学 生命科学部

伊藤 俊洋

財団法人北里環境科学センター

高瀬 光徳

森永乳業株式会社 研究情報センター

幹事会

学会誌担当

会計担当

学術担当

会計監査

若手シンポジウム委員会
委員長

折田 和泉

東京工業大学大学院 生命理工学研究科

副委員長

鈴木 宏和

九州大学大学院 農学研究院

小西 正朗

北見工業大学 工学部

峯岸 宏明

東洋大学 バイオナノエレクトロニクス
研究センター

井上 謙吾

宮崎大学 IR 推進機構

谷川 実

日本大学 理工学部

布浦 拓郎

独立行政法人海洋研究開発機構

委員

94

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2013) Vol.12 (1)

編

集

後

記

第 14 回年会において、学会運営体制が大きく刷新されました。2014 年度から、大島泰郎先生を第 2 代の当会会長としてお迎えし、大島会長、工藤俊章副会長、井上明副会長
を中心として、更なる極限生物分野における研究の発展を支えることになりました。掘
越弘毅初代会長には、学会創設以来，14 年間にわたってお世話いただいてきたわけでありますが、今後も名誉会長としてご指導いただける運びとなっております。新しい学会の第 2 期の船出にあたり、幹事会といたしましても、会員各位と心を合わせて邁進していく所存でございますので、今後ともよろしくお願い申し上げます。
学術幹事（学会誌編集担当）

加藤千明

編集委員会
委員長 ：石井正治（東大）
副委員長：石野良純（九大）
委員：阿部文快（青学大）、伊藤 隆（理研）、鎌形洋一（産総研）、河原林裕（九大）、高品知典（東洋大）、為我井秀行（日大）、中村 聡（東工大）、中村 顕（筑波大）、
三輪哲也（JAMSTEC）、湯本 勲（産総研）

学会事務局〒226-8501 横浜市緑区長津田町 4259-J2-13
東京工業大学大学院 生命理工学研究科
生物プロセス専攻 中村聡研究室内極限環境生物学会事務局 中村 聡 (幹事会幹事長)
FAX: 045-924-5837
E-mail: kyokugenjm10@extremophiles.jp
学会誌編集〒237-0061 神奈川県横須賀市夏島町 2-15
独立行政法人海洋研究開発機構 海洋・極限環境生物圏領域 (加藤千明、学術幹事)
TEL：046-867-9550 FAX：046-867-9525 E-mail：kato_chi@jamstec.go.jp
発刊日2013 年 12 月 31 日