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豚のウイルス予防に関する研究桑原博

義（譛日本生物科学研究所：〒１９８−００２４ 東京都青梅市新町９−２２２１−１）
   

はじめにへの応用、試験用細胞としての実用化にも取り組んで受賞対象業績は、「豚のウイルス病の予防に関するきた。これらの業績が今回の受賞対象となったもので研究」という大変幅の広い内容であった。私は１９６５年あり、本来ならばそれぞれについて説明せねばならなに日本獣医畜産大学獣医学科を卒業後、直ちに日本生いが、最近実用化が達成された について説明す

物科学研究所及び日生研株式会社（以下日生研と略）る。に入社以来３５年間、主に豚のウイルス性疾病の予防に関する研究に従事してきた。その内容を簡単に述べる

１ PED 発生の概況と、入所社当時野外で使用されていた豚コレラクリス

日生研は従来より野外材料の抗体検査、病性鑑定をタルバイオレット不活化ワクチンの製造に従事すると受け入れてきた。私が日生研に入所社した当時の豚の供に、すでに開発されていた豚コレラ生ワクチン試作

主要なウイルス性疾病は豚コレラ、日本脳炎であり、品の野外応用試験、豚伝染性胃腸炎ウイルスの分離と従って抗体検査もこの２種類に限定されていた。

弱毒化およびそれを用いた高濃度生および活性化ワク

その後、日本では豚の新たなウイルス性疾病が海外

チンによる強力なＬ−Ｋ免疫法の開発と実用化、豚ロタから次々と侵入して発生し、その原因ウイルスが家畜ウイルスの分離と分離株の血清型の決定、豚オーエス衛生試験場（現動物衛生研究所）により明らかにされ、

キー病ウイルスの分離と分離ウイルスから作出した弱ウイルス、豚ロタウイルス、オーエスキー病ウイ毒ｇ
Ｉ欠損株の免疫効果の確認、新たな豚コロナウイル

ルスが分離された。我々も野外の抗体検査や抗原証明スである豚流行性下痢（）ウイルスの分離と弱毒の要望に答えるべく、独自にこれらのウイルス分離・化、および筋肉内注射法による予防法の開発と生ワク同定し、それぞれの特異的免疫血清を作製し、中和抗チンの実用化、・混合生ワクチンの実用化、豚体価の測定や蛍光抗体法による抗原証明が可能となり、繁殖・呼吸障害症候群（）ウイルスの分離とその野外材料についての検査を行ってきた。

性状解析などについて試験を行ってきた。また、当初

一方、ヨーロッパでは 及び豚ロタウイルスが実験動物研究所で固定、生産されたミニチュアピッグ

否定された豚の水様下痢が次々に発生し、新たな豚のの各種病原体に対する感受性試験、各種動物の臓器か下痢症候群として と呼ばれていた。その初発はら細胞株の作出とその感受性の確認及びワクチン製造

１９７１年のイギリスと言われているが、１９７７年に再度イ

表１ PED 発生の経緯
発生年代

発生国発生状況

１９７１イ ギ リ ス 急性下痢の集団発生、４〜５週齡以下の豚では発病せず。
流行性ウイルス性下痢（   ：）として区別

１９７６

イ ギ リ ス 日齡に関係なく急性下痢の集団発生。 ウイルスは否定
ベ ル ギ ー 新たな豚の下痢症候群として   又は 
 ：と呼び、区別された。

１９７７

イ ギ リ ス 急性下痢の集団発生。下痢便からコロナウイルス様（  ：）ベ ル ギ ー 粒子を検出、とは異なるコロナウイルスによる疾病と断定

１９７９

チェコスロバキア 急性下痢の集団発生、下痢便から とは異なるコロナウイルス粒子を検出
西 ド イ ツハンガリー

１９８０カ１９８１

フ ラ ン ス とは異なる豚の急性下痢の集団発生、下痢便から とは異なるコロナウイルス粒子を検
出

１９８２日

ナダ

本

とは異なる豚の急性下痢の集団発生、下痢便から とは異なるコロナウイルス粒子を検出

とは異なる豚の急性下痢の集団発生、下痢便から とは異なるコロナウイルス粒子を検出

2Proc
JpnPigVetSocNo.38
2001

ギリスとベルギーで本症が発生した際に採取された下２

下痢便の病性鑑定成績

痢便や小腸内から電顕でコロナウイルス様（）粒

日本では の発生は確認されておらず、ウイ子が検出された。さらに 

らはベルギーで採取

ルスはまだ侵入していないと考えられていたが、１９８２した材料の２０％小腸乳剤を１日齡の仔豚に経口投与し、年末から１９８３年初めを発生の頂点として、日本の各地下痢発症後に採取した小腸の２０％乳剤を濾過減菌し、で食欲不振と水様性の下痢を特徴とする豚の急性下痢

３〜１５日齡の豚に経口投与したところ、下痢が再現さが集団発生した。この下痢は全ての日齡の豚に見られれた。その下痢便や小腸内容から 粒子が検出され、たが死亡率は７日齡以下の豚で０〜４０％であり、１０日

の原因は ウイルスとは異なるコロナウイル

齡以上の豚では水様性の下痢が３〜４日間続いた後にスであることが確認されていた（表１）。

耐過生存する場合が多く見られた。これらの下痢の原因追及のために当所に病性鑑定材料が多く送付されて

表２
検材

査料

下 痢 便発 症 豚計

検査数

野外下痢材料の検査成績（１９８
２年１月〜１９８３年１１月）
ＴＧＥ
陽 性Ｒｏ
ｔａ
陽 性大腸菌症

ＴＧＥ，Ｒｏｔａ
陰 性

１９件

３（）８（）ＮＴ

８（）１０３例

１０（）２７（）ＮＴ

６６（）１１件

１（）１（）３（）６（）３１例

４（）２（）６（）１９（）３０件

４（）９（）３（）１４（）１３４例

１４（）２９（）６（）８５（）ＴＧＥ，Ｒｏｔａ：ＦＡ抗原の検出，大腸菌症：実質臓器からの菌分離（）内数字：％

図５ MPS CF 抗体陽性率の推移No.382001
きた。
１９８２年１月から１９８
３年１１月までに受領した材料の検査成績を表２に示す。
検体の内容は下痢便が１９件１０３例、発症豚が１１件３１例、合計３０件１３４例であった。

3４ PED ウイルスの細胞継代
この様にして培養細胞を用いたウイルス分離のための適切な材料が得られたことから、各種細胞を用いてウイルス分離を行った（表３）。
豚腎由来細胞としては Ⅲ 、、を用方法は ウイルス及び豚ロタウイルスは間接蛍い、培養液には結晶トリプシンを１ 
当たり１０裹に光抗体法を用い、１０％の下痢便または小腸乳剤を作成

含む ・イーグル 及び血清を加えた ・イー

し、各ウイルス感受性細胞に接種して培養後、常法にグル  を用いた。その他の細胞としてはハムスより標本を作製し、蛍光顕微鏡で観察した。大腸菌のター由来 及び 、ウズラ由来 、猫腎由来検出は、実質臓器からの菌分離を行い、病原性である、ヒト羊膜由来 、マウス由来 、さらに豚か否かを確認した。

胎児由来初代の小腸、甲状腺、心臓、肺及び腎臓培養

その結果、ウイルス抗原陽性は合計で４件の

％、１４例の％、ロタウイルス抗原陽性は合計で細胞を用い、培養液には血清を加えた ・イーグル を用いた。

９件の３０％、２９例の
％、病原性大腸菌は合計で３これらの細胞に分離材料を接種して７日間培養し、件の１０％、６例の４．５％であったが ウイルス、ロその培養液を採取して新たな細胞に接種する方法で３タウイルス及び大腸菌陰性は合計で１４件の
％、８５代まで継代したが、いずれの細胞にも は出現しな

例の％の高い率を示した。

かった。

これらのことから、今回の下痢の原因として ウイルスが関与していることが疑われた。
また、高橋らは１９８
２年２月に岩手県内の某養豚場で一方、ヨーロッパでは 
らが豚継代 ウイルスを用い、培養細胞は豚由来初代または２代目の
表３豚の水様下痢が発生し、２０日齡以内の子豚が死亡した

使用細胞症例を調査し、死亡率は約２０％であったこと、蛍光抗体法により ウイルスの抗原は検出されなかったが、粒子が電顕で検出されたことを１
９８
３年に報告

培養細胞での豚継代ＰＥＤウイルスの分離

接種

唆した。
豚胎仔由来
初代細胞

今回の病性鑑定に用いた 、豚ロタウイルス抗原
陰性材料のうち、鹿児島県下のＪ農場及び香川県下のＹ農場での水様性下痢発症仔豚の小腸を採取し、新た豚腎由来で、Ｙ材料では４代目まで継代を行った（図１）。これらの豚の小腸材料を電顕で観察したところ下痢発症後、時間が経過した豚での 粒子が検出された。
このことは、ウイルス検査材料の採取時期が重称

初代

２代

３代

小腸・−

・−

・−

甲状腺・−・−

・−

心臓・−・−・−

肺・−・−・−

腎臓・−

・−

−−・−

Ⅲａ −−

ＣＰＫ−−−−

−

−

ＥＳＫ−

−−−

−

−

ＢＨＫ

・−・−

・−

ＨｍＬｕ

・−・−・−

ウズラ由来

ＱＥ

・−・−・−

猫腎由来

ＣＲＦＫ

・−・−・−

ヒト羊膜由来

ＦＬ・−

・−

・−

な豚に経口投与して継代したところ、いずれの材料を投与した豚全てが下痢を発症し、Ｊ材料では２代目ま名トリプシン トリプシン トリプシン
有 無
有 無
有 無

し、本流行に ウイルスが関与していたことを示

３ PED ウイルスの豚継代

観察成績
種類後の継代数：

ハムスター
由来

マウス由来

要であることと、ウイルス分離材料としては野外材料

ＭＥＦ

・−

・−・−

Ｖｅｒｏ−−＋−＋−ＭＡ１０
４−−−−−−

を新たに７日齡前後の仔豚に経口投与し、下痢発症直猿腎由来

後に採取する必要性が感じられた。

継代方法：豚継代 ウイルス（感染豚小腸の２０％乳剤）の１ ずつを接種後３７℃ で６０分間静置吸着させて除去し、各細胞に対応するウイルス増殖用媒溶液を加え、３７℃ で静置培養後、が認められない場合は７日ごとに、が認められた場合はその極期に培養上清を採取し、新たな細胞に接種して継代する。

さらに、発症耐過した豚の血清中には ウイル
スに対する中和抗体は検出されず、本コロナウイルスは ウイルスであると固定された。
この成績は、１９８８年に誌上報告された。

4

Proc
JpnPigVetSocNo.38
2001
表４

分離ウイルスの理化学性状
ウイルス感染価（）処理方法


（代）

ＴＧＥＶ

牛アデノ７型

ＡＤＶ

牛エンテロ６型


添加培養


同上無添加対照 °３ 



同上無処理対照 
エーテル加°
時間
同上無処理対照表５




分離ウイルスと豚コロナウイルスとの交差中和試験

ウイルスしたところ、分離ウイルスは２種類の豚コロナウイル

免疫血清
抗ＰＥＤＶ

抗ＴＧＥＶ

集性脳脊髄炎ウイルスとを用いて交差中和試験を実施

抗ＨＥＶ

分離ウイルス
（８３Ｐ−５）

６４＜４＜４ＴＧＥＶ（ｈ−５）＜４≧１０２４

ＨＥＶ＜４ＮＤ

１０２４スを交差しないことが確認され、分離ウイルスは ウイルスであると同定された（表５）。
これらの成績は１９９２年に誌上発表された。

５ 日本における抗 PEDウイルス中和抗体保有状況
中和試験が可能となったことから各種抗体検査を依小腸、肺、腎臓、肝臓、脾臓、大脳及び皮膚培養細胞頼され、保存しておいた過去の血清の ウイルスを、継代細胞としてはアフリカミドリザル腎由来 に対する中和抗体価を測定した（表６）。血清は１９７７年細胞、豚甲状腺由来 細胞、


細胞及びヒト直腸から１９９２年までの１６年間に採取された


例を用い

腫瘍由来 
細胞を用い、培養液は血清加イーグルた。その結果、１９７７年の血清７例中１例


％が中和

 を用いて培養したところ、トリプシン添加イー抗体陽性を示した。１９７８年から１９８０年の血清は検査しグル  で培養した 
細胞でのみ を示してていないが、１９８１年では６５例中４例


％が陽性であっ継代が可能であったこと、培養液の電顕検索で 粒たが、１９８２年には２１例中１８例の
％に上昇し、１９８３子が観察され、さらに感染細胞を 

より分与された豚コロナウイルス 
株免疫血清を用いた蛍光抗体法を実施したところ陽性であり、ウイルスが培養細胞で初めて分離されたことを１９８８年に誌上報告した。
我々はこの成績を参考としてサル腎由来 細胞を １０４細胞を用いて再度ウイルスの分離を試みた
ところ、表３下欄に示した様に、

らの報告と同様に結晶トリプシン添加 イーグル を用いて培養した 細胞で が出現し、継代が可能であった。さらに継代を続け、その過程で培養中に添加するトリプシン量を徐々に減少させ、トリプシン非依存性株を作出した。その結果、中和試験の実施が可能となった。
分離ウイルスの理化学性状を調べたところ、表４に

表６ 日本における豚血清のＰＥＤ中和抗体陽性地区（部分）
採血年
計

陽性数／検査数（％）

・・・
・

陽性県数／検査県数
・・・・

示したように、コロナウイルスである ウイルスの性状と一致していた。

年以降も高い陽性率を示していた。これは、この間にさらに分離ウイルスに対する特異的免疫血清を作製全国的な発生があったことを裏付けている。その後はし、豚コロナウイルスである ウイルスと血球凝徐々に減少傾向となっており、発生が散発になったこNo.382001とを示している。

5
会誌に掲載されている。

この様に、１９７
７年には１例ではあったが陽性の豚が存在したことは、イギリスでの初発から少なくとも６

参考文献

年後には日本も ウイルスの侵襲を受けた可能性）  

が示唆されたが、その前後の年に採血された血清の成   

績がないのではっきりとは言い切れない。

 ） 

６

生ワクチンの緊急開発

この様にして作出されたトリプシン非依存株の性状を調べたところ、３日齡の豚に経口投与しないことが確認され、弱毒ウイルスワクチン候補株として有望であることが確認された。しかしながら、は１９８３年の全国的な大発生後、その発生は散発的となり、ワク         ） 桑原博義（１９８８）豚流行性下痢症の病原であるコロナウイルスの豚継代） 





チンを要望する声は聞かれなくなった。しかし、１９９４




年には九州の薩摩半島で、１９９６年には同じく大隅半島





   で ウイルスによる豚の集団発生があり、大きな日獣会誌   ）    

被害を受けた事から急速にワクチンが必要であるとの 


声が高まり、大至急実用化にむけた試験を実施し、 

１
９９６年９月に製造承認申請書を提出したところ、緊急）  

 

性を有するワクチンとして優先的に審議され、同年１１   

月に承認された。直ちに製造を開始し、同時検定で国    

家検定申請を行った結果、翌年１月に最初の２ロットが合格し、直ちに九州地方で実際応用されたことにより、の発生は急速に減少し、緊急防疫効果が確認された。

おわりに以上のように、野外の下痢に関する病性鑑定材料から新たなウイルスが分離され、その結果、新たな生ワクチンが開発され、養豚の安定的な経営の一助として貢献することができた。
また、異常産関係の病性鑑定材料のうち、原因が特定されなかった事例で、その材料を保存しておき、後日改めて新たな資料と知識及び技術を用いてウイルスの分離や保存血清の中和抗体価を測定することでウイルスが分離され、中和抗体陽性血清の存在が明らかになり、その発生時期はアメリカでの初発とほぼ同時であることが確認された。
このように、病性鑑定を実施することは、大変な手間を要することで敬遠されがちであるが、非常に重要な材料が得られる可能性がある。従って、当所では積極的に病性鑑定を受ける体制を今後も取り続ける所存である。
なお、及び についての詳細は、すでに本