豚病会報
資No.
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17料
PEDウイルスの物理化学的性状に関する研究鈴木亨、大橋誠一（国立研究開発法人

農業・食品産業技術総合研究機構

動物衛生研究部門）

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hi,S.(2018)
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キーワード：豚流行性下痢ウイルス、物理化学的性状、消毒薬、不活化

２．
１．
１．温度変化による消毒薬効果への影響について
２．
１．
２．有機物混入による消毒薬効果への影響に

はじめに家畜の伝染性疾病の侵入防止及び発生予防のためについて２．
２． 消毒薬の有効最小濃度については、日頃からの農場における飼養に係る衛生管理の徹

なお、PEDウイルスに対する不活化条件および消毒底が重要であるとの観点から、平成１６年に家畜の所有薬の有効性を検証するにあたって、PEDウイルスは者の遵守すべき衛生管理の基準（以下、飼養衛生管理

NK９４P６Tr()株（力価１０5TCID50/１００ml）、培養細胞は基準）が定められた。その後、平成２２年の宮崎県におVeroKY5細胞を用いた。

ける口蹄疫の発生後にとりまとめられた「口蹄疫対策検証委員会報告書」を踏まえ、平成２３年に同基準の見直しが行われた。しかしながら、わが国では平成２５年１０月に豚流行性下痢（以下、PED）が発生し、全国に１．PEDウイルスに対する不活化条件
１．
１．有機物の有無条件下における温度変化によるウイルスの不活化について感染拡大し、甚大な被害をもたらした。この要因を考PEDウイルスを１００mlずつマイクロチューブに分えた場合、PED発生農場においては、同基準が十分に注し、さらに FBS非添加、２％FBS添加の両条件で効果を発揮していなかったのではないかと推察された。

７０℃、６０℃、５０℃に温めたヒートブロックで１、３、これを受けて、平成２６年度飼養衛生管理基準の実効性

７、１０、２０、３０、４０、５０分間処理し、PEDウイルス確保に関する調査事業が立ち上がり、農場における飼の不活化を検証した。また同様に、FBS非添加、養衛生管理に関する実態等を調査し、飼養衛生管理基２％ FBS添加の両条件で３７℃、２５℃（室温）、４℃、準の実効性や衛生管理の徹底が生産性に与える影響等－２０℃で１、３、５、７、１４、２１、２８、３５日間処理を検証することが行われた。本研究はその調査事業のし、PEDウイルスの不活化を検証した。

一環として、飼養衛生管理基準の見直しに資する PED
ウイルスに関する科学的知見を収集するため、実験室

１．
２．pH変化によるウイルスの不活化について内において、細胞培養感染系を用いて、PEDウイルス限外ろ過スピンカラム１００K（株式会社アプロサイ

に対する不活化条件および消毒薬の有効性について検エンス）を用いて PEDウイルスを精製し、以下の証した。

手順に従って、直接ウイルスと pH緩衝液（pH２、４、６、７、７．
６、８、９、１０、１２）を 感 作 さ せ、主な試験内容

PEDウイルスの不活化を検証した。

１．PEDウイルスに対する不活化条件【手順１】滅菌水５００mlをスピンカラムに添加し、

１．
１．有機物の有無条件下における温度変化によるウイルスの不活化について
１．
２．水素イオン濃度（pH）変化によるウイルスの不活化について
２．PEDウイルスに対する消毒薬の有効性
２．
１．消毒薬の有効性について

１
４，０００g、２分、４℃ で遠心し、ろ液は除去した。この予備洗浄作業を２回実施した。
【手順２】PEDウイルス液２００mlをスピンカラムに添加し、１４，０００g、１０分、４℃で遠心し、カラム上に PEDウイルスを回収した。
【手順３】pH緩衝液２５０mlをスピンカラムに添加し、

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５分間一定温度下で PEDウイルスと感作させた後、ウイルスを回収した。

１４，０００g、１０分、２５℃（室温）で遠心し、ろ液を除去
ウイルス不活化の検証方法

した。
【手順４】滅菌水３００mlをスピンカラムに添加し、１４，０００g、５分、４℃で遠心し、ろ液は除去した。こウイルスの不活化は１．
２．で述べた方法と同様の方法で検証した。の洗浄作業を３回実施した。
【手順５】２％ FBS添加細胞培養液２００mlをスピンカラムに添加し、１０回ピペッテイングした後に PED

２．
１．消毒薬の有効性について市販されている５種類の消毒薬（逆性石鹸剤、塩素系製剤、アルデヒド剤、ヨード系製剤、グルコンウイルスを回収した。

酸塩）を用意し、それぞれを常用濃度に希釈し（範囲で示されている場合は、濃い濃度を選択）、上述のウイルス不活化の検証方法
感作後の PEDウイルスを用いてタイトレーショ手順に従って、PEDウイルスと感作させ、PEDウインを実施し、培養細胞への感染価によってそれぞれルスに対する消毒薬の有効性を検証した。その一方の効果を検証した。ウイルス接種前日に１０％ FBSで、消毒薬のスピンカラムへの残留による細胞毒性

5添加細胞培養液を用いて５×１０cell/mlに調整したの有無を確認するため、上述した【手順２】におい細胞を９６wellプレートに１００mlずつ分注し、３７℃、て、ウイルス液の代わりに細胞培養液を用いて同様５％CO2ガス存在下で培養した。ウイルス接種時にに操作し、検証した。

は２％ FBS添加細胞培養液でプレートを洗浄した

２．
１．
１．温度変化による消毒薬効果への影響について後、同細胞培養液で調整した感作後のウイルスを１０倍階段希釈し、各 well
１００mlずつ接種し、３７℃、５％【手順３】において、あらかじめ４℃に冷却しておCO2ガス存在下で１週間培養して、CPE（細胞傷害いた消毒薬と PEDウイルスを氷上で感作させ、そ0.
5性）の有無を判定した。１０ TCI
D50/
１００ml以下の場の後の遠心操作もすべて４℃で実施し、PEDウイ合を不活化されたと定めた。

ルスに対する温度変化による消毒薬効果への影響を検証した。

２．PEDウイルスに対する消毒薬の有効性

２．
１．
２．有機物混入による消毒薬効果への影響について

PEDウイルスに対する消毒薬の感作方法
限外ろ過スピンカラム１００K（株式会社アプロサイ【手順３】において、有効性が確認された消毒薬のエンス）を用いて PEDウイルスを精製し、以下の中から４種類（逆性石鹸剤、塩素系製剤、アルデ手順に従って、直接ウイルスと消毒薬を感作させ、ヒド剤、ヨード系製剤）を選択し、それら消毒薬それらの効果について検証した。に２％ FBSを添加した後、PEDウイルスと感作【手順１】滅菌水５００mlをスピンカラムに添加し、させ、PEDウイルスに対する有機物混入による消１４，０００g、２分、４℃ で遠心し、ろ液は除去した。こ毒薬効果への影響を検証した。の予備洗浄作業を２回実施した。
【手順２】PEDウイルス液２００mlをスピンカラムに添加し、１４，０００g、１０分、４℃で遠心し、カラム上

２．
２．消毒薬の有効最小濃度について有効性が確認された消毒薬の中から３種類（逆性に PEDウイルスを回収した。

石鹸剤、塩素系製剤、アルデヒド剤）を選択し、そ【手順３】消毒薬２５０mlをスピンカラムに添加し、５れぞれ常用濃度の１０倍、１００倍、１０００倍に希釈し、上分間室温下（２５℃）で PEDウイルスと接触させた後、述の手順に従って、PEDウイルスと感作させ、PED

１４，０００g、１０分、２５℃で遠心し、ろ液を除去した。

ウイルスに対する消毒薬の効果を検証した。

【手順４】滅菌水３００mlをスピンカラムに添加し、１４，０００g、５分、４℃で遠心し、ろ液は除去した。こ

成績の洗浄作業を３回実施した。

１．PEDウイルスに対する不活化条件【手順５】２％ FBS添加細胞培養液２００mlをスピンカラムに添加し、１０回ピペッテイングした後に PED

１．
１．有機物の有無条件下における温度変化によるウイルスの不活化について

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７０℃では FBS非添加、２％FBS添加の両条件共に19となった。

３分で不活化され、６０℃では前者は３分、後者は７分で不活化され、５０℃では両条件共に５０分で不活化された（表１）。また、３７℃では１日以内に両条件共２．PEDウイルスに対する消毒薬の有効性
２．
１．消毒薬の有効性についてに不活化され、２５℃（室温）では前者は３日、後者は５種類の消毒薬について、室温（２５℃）
下、常用濃５日で不活化されたが、４℃および－２０℃では４週度で用いた際には、全ての消毒薬が PEDウイルスの間経過しても感染性が保たれていることが明らかと不活化に有効であることが明らかとなった（表２）。

なった。

なお、消毒薬のスピンカラムへの残留による細胞毒性は確認されなかった。

１．
２．pH変化によるウイルスの不活化について
pH１２以上ではウイルスの感染性は完全に消失し２．
１．
１．温度変化による消毒薬効果への影響についてたが、pH２以下では感染性は大きく減弱したもの

５種類の消毒薬について、４℃ 下、常用濃度での、完全に消失しなかった（図１）。また、本ウイル

用いた際には、逆性石鹸剤およびグルコン酸塩は

スは pH６－１０では、比較的安定であることが明らか

PEDウイルスの不活化に有効であることが明ら

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71 2018かとなった。しかしながら、塩素系製剤、アルデであると考えられた。各種消毒薬において定められたヒド剤およびヨード系製剤は、PEDウイルスを不常用濃度に従って用いた際には、いずれの消毒薬も本活化できなかった。すなわち、それらの有効性がウイルスの不活化に有効であることが明らかとなった。

温度により低下することが明らかとなった。

しかしながら、低温条件下（４℃）や有機物混入時

２．
１．
２．有機物混入における消毒薬効果への影響に（この場合、FBS添加）においてはいくつかの消毒薬についておいて、それらの有効性が低下することが明らかと用いた４種類の消毒薬のうち、２％FBS存在下なった。消毒の基本は、洗浄、消毒、乾燥という工程において、逆性石鹸剤、塩素系製剤、アルデヒドを遵守することが病原性微生物の感染性を不活化する剤は PEDウイルスの不活化に有効であったが、ために有効である。改めて、消毒の際には有機物を出ヨード系製剤はその有効性が低下することが明ら来るだけ除去してから消毒を行い、そして十分に乾燥かとなった。

させてから、畜舎等を使用することの重要性が確認された。また、本研究を通じて得られたデータを今後の２．
２．消毒薬の有効最小濃度について有効性が確認された消毒薬のうち、３種類の消毒PED防疫対策の見直し、さらには飼養衛生管理基準の見直しに積極的に活用していただきたい。

薬について、常用濃度の１０倍、１００倍、１０００倍希釈液を用いて、ウイルスの不活化を検証した結果、１０倍希釈液ではそれらの有効性は認められたが、１００倍、１０００倍希釈液では有効性は認められなかった。

謝辞
本内容は平成２６年度飼養衛生管理基準の実効性確保に関する調査事業の助成を受けて実施されたものである。また、これらの試験は五嶋祐介先生（岩手県中央おわりにPEDウイルスは有機物の有無にほとんど関係なく、高温下（３７℃以上）では比較的容易に不活化することが示された。一方、低温下（４℃以下）では、ウイル
スは長い期間感染性を保持していることが示された。
従って、排泄されたウイルスを含む糞便由来の堆肥等の処理については、深部までしっかりと熱をかけることが重要であることが示唆された。本ウイルスは水素イオン濃度（pH）に対しては幅広く安定的であったた
め、酸、あるいはアルカリ処理には十分に注意が必要

家畜保健衛生所）の協力のもと実施いたしました。心
より深謝いたします。