豚病会報

No.39

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組換え表層防御抗原 SpaA を用いた豚丹毒の ELISA
今田由美子（独立行政法人動物衛生研究所：〒３０５−０８５６ 茨城県つくば市観音台３−１−５）
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はじめに定、あるいはワクチン接種の際の移行抗体の消失時期

豚丹毒は、豚に伝染性の急性敗血症死を起こす病気やワクチンに対する免疫応答を、従来の手法では的確として古くから知られ、典型的な死亡例では、全身のに判定できていないことも一因と考えられる。そこで、皮 膚 に 紅 い チ ア ノ ー ゼ が み ら れ る こ と か ら Swine

感染防御に関与すると考えられていた２種類の抗原、

Erysipelas（Red Skin の意）の名前が付けられている。

６４〜６６ｋＤａ蛋白とノイラミニダーゼについて遺伝子をこのほかに亜急性に経過するじんま型や、慢性に経過クローニングすることから検討を始めた。

する慢性型関節炎・心内膜炎も起こす。原因菌は   という、グラム陽性の小桿菌で、主として経口ルートで母豚あるいは同居豚から感染する。

３ 表層防御抗原 SpaA
我々は、６４〜６６ｋＤａ蛋白とノイラミニダーゼいずれのクローニングにも成功したが、ノイラミニダーゼにはマウス感染防御活性が全く認められなかった。一方、

１

豚丹毒の現状豚丹毒はわが国では、昭和４１〜４２年にかけて合計４６４〜６６ｋＤａ蛋白すなわち表層防御抗原 SpaA はマウスだけでなく豚も感染防御することが証明できた。

万頭以上の大発生をして以後、ワクチン接種の普及に精製組換え SpaA で免疫した豚各群２頭は血清型１伴って一旦は減少したが、昭和６０年から再び増加に転ａと２ｂ型のどちらの強毒株の攻撃に対しても、無症状じ、最近の１５年間は年間４〜５千頭の発生がある。昭で耐過した。一方、非免疫対照豚は１ａ型の攻撃では和６０年以降の発生の特徴は約半数を食肉検査所での慢敗血症死し、２ｂ型の攻撃では重篤な敗血症を示した。

性型豚丹毒による全廃棄が占めるという点である。

この結果は、SpaA という１種類の抗原で豚を主要ななお、豚の敗血症型から分離される豚丹毒菌の血清豚丹毒菌から完全に防御できることを示している。

型はすべてが血清型１と２に属し、その他の病的材料

表層防御抗原 SpaA は、分泌に必要なシグナル配列

由来株も殆どが血清型１と２に属し、血清型１と２のをもった前駆体として合成され、合成途中でシグナル

豚丹毒菌はすべて   である。このこと配列が切り離されて、残りが分子量６９ｋＤａ（１ａ型強毒から豚の豚丹毒対策は、  の血清型１株である藤沢株の場合）の成熟型 SpaA として菌体外と２の菌を対象とすべきことが分かる。一方、健康なに分泌される。感染防御には SpaA の前半７０％が関与

豚の扁桃から分離される豚丹毒菌の４０％はその他の血し、後半３０％は分泌された SpaA が菌体表層に結合す清型で、この中には豚に病原性がない 
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るのに関与している。我々が豚やマウスでの感染防御も一部含まれている。

試験に使用した SpaA は先を少し欠いた防御領域である。

２

豚丹毒の問題点

成熟型 SpaA は菌体外に分泌されたのち、結合領域

豚丹毒の予防法としては、豚群の清浄化、生菌ワクを使って菌体の表層に結合するが、豚丹毒菌の培養上チンあるいは不活化ワクチンの接種、ならびに発病誘清中にみられる約４８ｋＤａの低分子防御抗原は、結合領因の排除がある。また、発生群に対しては発病予防と域から切れて菌体に結合できなくなった SpaA の前半しての投薬も行なわれる。野外では生菌ワクチンを接部分と考えられる。

種しているにも関わらず発生する例も散見されているが、こういった予防上の問題点は、豚群の清浄度の判

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４ SpaA の ELISA 抗原性のである。

組換え SpaA 断片のうちマウス感染防御活性を示し生菌ワクチン接種豚と対照豚各２頭の抗体応答を平た５種類について、間接法 ELISA における抗原性を均値でみると（図３上）、免疫豚ではワクチン接種２〜比 較 し た。そ の 結 果、SpaA 全 長 と 防 御 領 域 全 長

３週後から抗体が検出され、攻撃後さらに増加してい（SpaA416）に高い反応性が認められ、これまで有用性る。これに対し、対照豚では免疫時から攻撃１週後まを報告してきたサンドイッチ法 ELISA と同様、各種で抗体陰性で、抗体応答は免疫豚より１週間遅い攻撃ワクチンに対する抗体応答を感度よく検出することが２週後から検出された。なおこれらの対照豚は発病後できた（図１、２）。このうち収量がよい SpaA416を以治療した。

後 SpaA-ELISA 抗原として使用した。
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図１ マウス感染防御活性を示す組換え SpaA 断片᡹᠄䋱ㅳᓟ㪈㪅㪌

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図３఺∉㪊ㅳᓟ᡹᠄㪈ㅳᓟ

生菌ワクチン実験豚の抗体応答例および阻害例

図３下は、同じく生菌ワクチン接種豚と対照豚各６㪍

頭の抗体応答を平均値でみたものである。この例では、

㪋

ワクチン接種時に S/P 比0.2程度の移行抗体が残って㪉おり、このために免疫群の抗体応答が完全に阻害され、㪇㒐ᓮ㗔ၞో㐳㪈㪄㪋㪈㪍SpaAో㐳㪈㪄㪌㪐㪋⽋㒐ᓮ㗔ၞ㪍㪈㪄㪋㪇㪏

抗体価は逆に攻撃時にかけて低下していることが明瞭にわかる。しかし免疫群は対照豚と異なり攻撃後わず㪍᛫ේ2.5㱘g/mL

か１週間で強い抗体応答を示したことから、感作はさ㪉れていたことが分かる。これらの免疫豚の防御成績は、

㪜㪣㪠㪪㪘㪄㪦㪛

㪋

完全な耐過から敗血症死まで様々で、完全な感染防御㪇㪈㪄㪏㪐㒐ᓮ㗔ၞ䌎ᧃ

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図２ マウス感染防御活性 SpaA 断片の間接法
ELISA 抗原性には ELISA 抗体価の上昇が必要と考えられた。
豚丹毒の生菌ワクチン免疫に及ぼす PRRS ウイルスの影響をみた全農家畜衛生研究所の実験豚の抗体応答

なおダブル抗体サンドイッチ法には、豚丹毒菌からをみたところ、各群５頭の免疫時の抗体価は全群陰性

アルカリ抽出した抗原をウサギ抗 SpaA 抗体で ELISA

で、PRRS ウイルス感染を先行させた群および生菌ワプレートにトラップする際、SpaA と結合しているそ

クチン単独免疫群は攻撃時に S/P 比0.4の抗体価の上の他の抗原もトラップする欠点がある。これに対し、昇を示し、攻撃から完全に防御された。

精製組換え SpaA416を用いる間接法では、SpaA 抗体だけを特異的に検出できる。

一方、生菌ワクチン免疫１週後に PRRS ウイルスを感染させた群では、抗体応答が上記２群に比べて半分以下に阻害されていた。この群は抗体価が幾分上昇し５生菌ワクチン実験豚血清の反応

SpaA-ELISA の感度と特異性を、まず各種ワクチンたものの攻撃がウイルスの増殖時期と重なったため、対照群と同等の発病をした。

で免疫し感染防御試験を行った実験豚の血清を用いて生菌ワクチン単独免疫群、対照群について実施した調べた。特に断らない限り免疫豚はすべて無症状で耐ラテックス凝集反応では、両群はともに免疫時から攻過し、対照豚は敗血症死ないし全身性の発病をしたも撃１週後まで終始高い抗体価を示し、免疫に伴う抗体

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価の変動も殆どなく、抗体価と感染防御との関連性が生菌ワクチンおよび日生研の不活化ワクチン接種豚に認められなかった。

比べ非常に強いため、ELISA は抗原濃度を1/5に下げて実施してある。

６

各種ワクチンで免疫した実験豚の反応

実験豚のうち、生菌ワクチン接種豚１８頭、日生研の７

野外豚血清への応用

不活化ワクチン接種豚４頭、対照豚１５頭の抗体応答を以 上 の 実 験 豚 血 清 を 用 い た 試 験 の 結 果、SpaA-ELISA でみたところ、免疫時の抗体価は全群が陰性で、ELISA では、全頭が発病した対照豚では攻撃時の抗体免疫群では攻撃時までに上昇し攻撃によりさらに増加価がすべて陰性、全頭が防御された各種ワクチン免疫した。一方、対照群では抗体価は攻撃時も陰性で、攻豚では攻撃時の抗体価がすべて陽性と、理論どおりの撃１週後の上昇もわずかであった。なおこれらの生菌反応を示した。そこでさらに野外豚の血清を用いてワクチン接種豚には、上記移行抗体による抗体応答阻ELISA の応用性を検討した。

害例６頭と PRRS ウイルスによる抗体応答阻害例５頭は含んでいない（図４）。

まず、岩手県の野外肉用豚群から日齢別に採取された血清の ELISA 抗体価を例に説明する。母豚が年１䌅䌌䌉䌓䌁᛫૕ଔ䋨᛫ේ㪉㪅㪌㱘㪾㪆㫄㪣㪀㪪㪆㪧Ყ

回の生菌ワクチン補強接種を受けているＡ、Ｂ、Ｃの３㪈㪅㪇㪈㪌㩷ኻᾖ㪇㪅㪏㪈㪏㩷↢⩶䍺䍖䍟䍻㪇㪅㪍㪋㩷䍨䍼䍖䍡䍶䍻

農場のうちＡ農場では、子豚はワクチン未接種で、理論どおり移行抗体だけが検出された。Ｂ農場では、子㪇㪅㪋豚は７０日齢でワクチン接種を受けており、理論どおり

㪇㪅㪉

接種３週後の９０日齢で抗体上昇が認められた。Ｃ農場

㪇㪅㪇఺∉ᤨ᡹᠄ᤨ᡹᠄䋱ㅳᓟ

では、移行抗体価がＢ農場に比べてかなり高かったた㪍

めか、子豚は６０〜７０日齢でワクチン接種を受けている㪌䋲䈱ኻᢙ䊤䊁䉾䉪䉴ಝ㓸ଔ

㪋にも拘わらず、免疫後の抗体応答は微弱であった。Ｄ㪊㪉

農場では、母豚はワクチン未接種であるため、殆どの

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図４᡹᠄ᤨ

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生菌ワクチンおよび日生研不活化ワクチン
実験豚血清の抗体応答

子豚は移行抗体を持たなかった。子豚は７０〜９０日齢でワクチン接種を受けているが、ワクチン接種前にも抗体価が S/P 比約1.5と非常に高い個体がみられ、この群に保菌豚が混在していることが推察された。

実験豚のうち、インターベット不活化ワクチン接種
豚３頭、組換え SpaA 免疫豚７頭、対照豚１５頭の抗体

８

母豚と出荷時肉豚の抗体価の関係

応答を ELISA でみたところ、免疫時は全群が抗体陰

野外血清への ELISA 応用試験の結果、野外の農場性で、免疫群では攻撃時までに急上昇した。一方、対は ELISA 抗体価をもとに、殆どの個体の抗体価が低照群では攻撃時も攻撃１週後も陰性であった（図５）。

い清浄群、高抗体価と低抗体価の個体が混在する中等

なお、これらのワクチンについては、血清の反応性が度汚染群、殆どの個体の抗体価がＳ／Ｐ比１以上を示す高度汚染群の３種類に大別された。
これについて、富山県の母豚と出荷時肉豚の ELISA䌅䌌䌉䌓䌁᛫૕ଔ䋨᛫ේ㪇㪅㪌㱘㪾㪆㫄㪣㪀㪪㪆㪧Ყ㪈㪅㪌㪈㪈㪌㩷ኻᾖ㪊㩷䍐䍻䍞䍎䍫䍼䍍䍢䍺䍖䍟䍻㪎㩷㪪㫇㪸㪘㪂㪝㪚㪘㪇㪅㪌

平均抗体価を例に説明する。これらの母豚は子豚期に１回生菌ワクチン接種を受けた以降はワクチン未接種で、肥育豚は３０〜６０日齢で生菌ワクチン接種を受けて㪇఺∉ᤨ᡹᠄ᤨ᡹᠄䋱ㅳᓟ䊤䊁䉾䉪䉴ಝ㓸ଔ䋲䈱ኻᢙいる。ELISA 抗体価は農場間で大きく異なり、６戸は㪍㪌㪋㪊㪉㪈㪇

清浄群、１戸は中等度汚染群、３戸は高度汚染群と考えられた。母豚と出荷時肉豚の ELISA 平均抗体価は農場毎によく相関していたが、このことは豚丹菌は主఺∉ᤨ᡹᠄ᤨ᡹᠄㪈ㅳᓟ

図５ インターベット不活化ワクチンおよび SpaA
実験豚の抗体応答として保菌母豚や保菌同居豚から子豚に感染するという、豚丹毒の感染様式を正確に反映していると考えられた（図６）。

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みたところ、１頭を除き全頭が低い抗体価を示し清浄度と一致した（図７）。しかし、ラテックス凝集反応ならびに豚丹毒菌の超音波抽出抗原を用いた間接法

㪇 㪅㪍
㪇 㪅㪋

ELISA では、全頭が清浄度と全く相反する非常に高い㪇 㪅㪉㪇 㪅㪇㪘㪙㪚㪛㪝㪟㪢㪣㪤㪦

抗体価を示し、これらは非特異と考えられる。

㪏䊤䊁䉾䉪䉴ಝ㓸ଔ䋲䈱ኻᢙ㪎㪍㪌

１１．敗血症集団発生農場の豚の反応㪋㪊

豚丹毒の被害がないことから長年ワクチンを使用し㪉㪈ていなかった秋田県の農家で、昨年敗血症型豚丹毒が㪇㪘㪙㪚㪛㪝㪟㪢㪣㪤㪦

発生し、１週間で飼養２００頭中１４頭が死亡した。この農図６ 農場別母豚と肉豚出荷時の ELISA 平均抗体価（富山県）

家の平成１０〜１２年の出荷豚各１０頭の ELISA 抗体価は殆どの豚で陰性であったが、平成１１年と１２年に各１頭

これらの豚の抗体価をラテックス凝集価でみると、の S/P 比が1.5前後と非常に高く保菌が疑われる個体

ラテックス凝集価は ELISA 抗体価とは相関せず、農がみられた（図８）。敗血症型豚丹毒が発生するには、場間の抗体価の差は小さかった。従来、生菌発育凝集

この農場のように抗体陰性の多数の感受性豚の中に少価は生菌ワクチン接種２週後がピークで接種７週後に数の保菌豚が存在する状況が必要であるが、SpaA-は殆どが４倍以下に低下するとされたが、ラテックスELISA 結果はこれを正確に反映していると考えられ凝集反応では殆どの農場で出荷時の豚の抗体価が３２〜た。
ラテックス凝集反応では、ワクチンを長年使用して６４倍と高い値を示した。

いないにも関わらず、殆どの豚が高い抗体価を示し、９

野生のイノシシの反応

これが感染防御抗体とすれば沢山の豚が敗血症死した

埼玉県下で狩猟により捕獲された野生のイノシシか状況と矛盾する結果であった。

ら採取した血清の ELISA 抗体価をみたところ、殆どが非常に高い ELISA 抗体価を示した。この結果から、

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態にあり、敗血症型豚丹毒による大量死は起きていな㪪㪆㪧Ყ

野生イノシシは殆どが保菌しているが、高度な免疫状㪇㪅㪌いことが推察された。
㪇㪅㪇䊤䊁䉾䉪䉴ಝ㓸ଔ

１０ SPF 豚の反応
動衛研に導入後隔離飼育された、豚丹毒ワクチン未接種の２２頭のセカンダリー SPF 豚の ELISA 抗体価を㪉䈱ኻᢙ㪏㪍㪋㪉㪇㪟㪈㪇㪄㪈㪉㪊㪋㪌㪍㪎㪏㪐㪈㪇 㪟㪈㪈㪄㪈㪉㪊㪋㪌㪍㪎㪏㪐㪈㪇 㪟㪈㪉㪄㪈

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１２ まとめ及び考察㪉䈱ኻᢙ㪏䊤䊁䉾䉪䉴ಝ㓸ଔ

以上の実験豚ならびに野外豚への ELISA の応用成㪍㪋績を総合すると、SpaA416を用いた SpaA-ELISA は、

㪉①従来の抗体測定法に比べ特異性が非常に高い。②感㪇㪜㪣㪠㪪㪘㪄㪦㪛㪉㪅㪇⿥㖸ᵄ᛽಴᛫ේ
㪄䌅䌌䌉䌓䌁᛫૕ଔ

図８ 敗血症型豚丹毒発生農場豚の ELISA 抗体価（秋田県）

染防御抗原である SpaA の精製組換え蛋白を抗原とし㪈㪅㪌㪈㪅㪇ているため、SpaA に対する抗体応答を特異的かつ高㪇㪅㪌㪇㪅㪇㪢㪉㪢㪌㪢㪈 㪈㪢㪈 㪊㪢㪈 㪌㪢㪈 㪎㪢㪈 㪐㪢㪉 㪈

図７ ワクチン未接種セカンダリー SPF 豚のELISA 抗体価感度に検出できる。③組換え蛋白であるため、豚丹毒菌から調製するのに比べて一定の品質の抗原調製が容易である。という大きな利点を持った、有用な抗体検豚病会報

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査法であると考えられた。

１３ 謝辞
SpaA-ELISA の検討にあたり、沢山の貴重な血清ならびに農家情報やラテックス凝集反応成績などを提供して頂いた下記の方々に深謝いたします。
全農家畜衛生研究所阪野哲也、秋田県中央家畜保健衛生所工藤一磨、石川県南部家畜保健衛生所早川裕二、
高井光、岩手県水沢家畜保健衛生所長山玲子、埼玉

県大宮家畜保健衛生所吉田徹、富山県西部家畜保健衛生所保田仁美、台蔵正司、長野県飯田家畜保健衛生所遠藤純子、ＪＡ愛知経済連江口森康行、木嶋真人。

修、動物衛生研究所