Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)ISSN 2186-9936

Aug. 2012
第11巻 第1号

Journal of Japanese Society for Extremophiles

巻頭言 ………………………………………………………

１

研究最前線 …………………………………………………

2

研究奨励賞受賞研究 ………………………………………

6

ORIGINAL PAPER …………………………………………… 12
書評 …………………………………………………………

37

学会記事 ……………………………………………………

38

学会誌投稿規定・執筆要領 ………………………………… 40
会則・細則 …………………………………………………… 42
運営体制 ……………………………………………………

44

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)

巻頭言

地球環境核戦争が始まった！
宇宙の誕生が 137 億年前、太陽系の誕生が 45 億年前、地球上の生命の起源が 38 億年前といわれている。およそ 650 万年前に人類が誕生し、人類が文明を手に入れたのがおよそ 1 万年前で、その後の 1
万年は『食』を獲得するための戦争の時代と考えてよい。武器による戦争を繰り返しながら、より良い生活環境を求めて人類同士が争ってきた。近年の100 年余の間に人類は究極の兵器、核兵器を開発し、さらに生活圏を宇宙にも拡大した。地球を何百回も滅亡させることができる核兵器を地球上に配備したが、今やその核兵器を廃絶することが当面の人類の最大の課題である。
そして、3.11 を境にして、新しい戦争の時代、地球環境核戦争が始まった。兵器による戦争の時代か
ら環境を守る戦争へと時代は大きく旋回した。現在の地球上には、400 基を超える原発が設営されているが、それはほんの一部の原発先進国のものである。
大半の国はエネルギー源を原発に頼らず、限られたエネルギー源のもとに慎ましい生活をしている。原
発先進国が世界中を放射能汚染の危険に曝しながら、
経済効率優先の政策を取り続けるなら、いずれ国家間のバランスが崩れ、原発を対象にした先進国と発展途上の国の間に摩擦が生じてくるであろう。福島
第一原発の 2 号機, 3 号機だけでも、広島型原子爆弾
数千発分の核燃料がメルトダウンしている。メルトダウンした核燃料の処理法は、まだ全く分かっていない。近い将来に、大きな地震や津波、台風、竜巻などの直撃を受けると、原発そのものが太平洋の藻屑と消えてしまうかも知れない。これは、ひとえに福島原発だけの問題ではなく、日本全国の原発、ひいては人類全体の存亡にも関わる問題でもある。
今まで地球上の生命が経験した生物大絶滅のシナリオでも、太陽光さえ戻れば、より進化した形で生命の鎖は繋がってきたが、地球規模での環境核汚染の下ではどのように収まるのだろうか。私たちは、文明発展の過程で、全く新しい危険な領域へ足を踏み入れてしまったのかも知れない。今の日本は、天国と地獄が共存する歴史的にも極めて過酷な環境に身を置いている。
この異常な環境を克服することが、文明のトップをひた走っている日本国民に課せられた究極のミッションではないかと考える。人類は、極限環境生物の一員として、地球上に生息するすべての生物を対象に、環境核汚染の下で生き抜く術について、研究に励み、その成果を世界に向けて発信
し、行動していく時と考える。そして、私に残された人生も未だ何かの役に立つかもしれないと思い始めている。
(2012/05/31)（財）北里環境科学センター 伊藤俊洋
2010 年、当会の名称が『極限環境生物学会』に変わったのを機に、当学会の研究者層は大幅に拡大した。
『微生物』が『生物』に変わっただけで、扱う領域は格段に大きな広がりを見せ、宇宙における生命の起源をはじめとして、ヒトを含めたすべての生物と環境との係わり、さらには環境と文明との関わり
も研究の対象になってきた。この度の東日本大震災とそれに引き続いて起こった福島第一原子力発電所の事故は、これからの文明を考える上で、重大な出来事であると考える。今後の文明の行く末にも思いを馳せて最近の心境を述べてみたい。
私は、昭和 16 年(1941 年)12 月 1 日生まれで、それは太平洋戦争開戦 1 週間前のことであった。私には戦争の記憶は全くない。戦後の混乱期に少年時代を過ごし、中学時代、高校時代もそれほど世の中は豊かでなく、国民は西欧諸国に追いつき追い越せの姿勢で、国を挙げて経済発展に邁進していたように思える。日本は、瞬く間に経済大国となり、世界のトップランナーとして様々な文明病(公害やバブル
経済など)の弊害をいち早く克服し、いわば天国のよ
うな国を創ってしまった。我々の世代は地獄から天国への階段を駆け上がる時代に遭遇した。最初から天国に生まれた子供達は人生で何を目標にして努力するべきかが分からず、途方に暮れてしまう場面も散見される。今の子供達は、ある種の極限環境（恵まれすぎた環境）で、悪戦苦闘しているようにも思われる。世の中はそんなに甘いものではないと思っていた矢先に今回の大震災が起こってしまった。震
災に遭われた方々には心からお見舞いを申し上げたい。
3.11 を境にして、地球環境に対する私の認識は根底から変わった。ここで、3.11 以前の地球環境を簡単に纏めてみよう。

1

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)研究最前線
超好熱菌の理解を目指して

東京工業大学大学院

生命理工学研究科 生物プロセス専攻

筆者は 1998 年に京都大学大学院工学研究科の今中忠行先生（現・立命館大学）の研究室に助手として着任し、超好熱菌 Thermococcus kodakarensis KOD1の研究に携わらせていただくこととなりました。当時 、 す で に 今 中 先 生 の 研 究 グ ル ー プ で は T.
kodakarensis から多数の耐熱性タンパク質について
常温微生物由来ホモログとの性質比較や耐熱化機構の解明、PCR 用耐熱性 DNA ポリメラーゼ（KOD ポ
リメラーゼ）の開発などの優れた成果を出しておられました。その少し前に微生物の全ゲノム解析が可能となった頃で、ゲノムサイズの小さい超好熱菌は

福居俊昭

格好の解析対象とされ、我が国でも T. kodakarensisと近縁の Pyrococcus horikoshii などの超好熱菌ゲノムが製品評価技術基盤機構の河原林先生（現・九州大学）らにより、早い段階で決定されました。当初はこれらのゲノム情報を参考にしつつ、種々の T.
kodakarensis 由来遺伝子を大腸菌で発現させて得た組換え型耐熱性タンパク質の解析を行っていましたが、やはり研究対象としている菌のゲノム情報がな
い、また超好熱菌そのものの遺伝子操作ができないという二点が問題となってきました。
現在ではかなり一般的となっている全ゲノム解析
2

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)ですが、当時はまだ大学の一研究室で行うには相当、敷居の高いものでした。今中先生のご決断でかなりの額の予算をつぎ込んでゲノム配列決定を外部委託
し、2002 年初めに約 2Mbp の塩基配列が決定されました。その配列の相同性解析によりヒットした既知タンパク質のリストを眺めるだけでも興味深いものはありましたが、それまではせいぜい 10kbp 程度の配列を扱った経験しかなかった身では、Mbp レベルのゲノム配列を相手にして体系的に情報をまとめる
ことも困難でした。多くの方から手助けやご教示をいただきながら遺伝子領域予測などの解析とアノテーションを地道に進め、公開できる質のゲノム情報とし、論文を出すことができた時には 2005 年になっていました。時間はかかりましたが、超好熱菌では重要な属である Thermococcus 属で初めての全ゲノム解析を報告でき、加えて非常によい経験をさせてもらいました。
遺伝子操作では、T. kodakarensis の合成固体培地
での培養法を確立した後、当時学生の佐藤喬章さん（現・京都大学・跡見研究室助教）の多大な努力の結果、相同性組換えによる遺伝子破壊や外来遺伝子の挿入が可能となりました （2003 年）。それ以前にも Sulofolobus 属超好熱菌などで潜在性プラスミドやウィルスを改変したベクターによる形質転換は報告されていましたが、超好熱菌染色体上の標的遺伝子を操作する実用的な技術としては初めてのものでした。佐藤さんが出してきたデータを見て興奮しつつ、冷静を装って間違いがないように確認を進めてもらい、再現良く相同性組換えが起こることを最終的に確信できた時はうれしかったことを良く覚えています。T. kodakarensis が上述のように合成培地での培養ができ、栄養要求性による選抜とモノコロニー単離が可能であったこと、特別な処理をしなくても外来
DNA 取り込み能を有していたことが幸運だった点ですが、実験的には佐藤さんが UV 変異によるウラシル要求性 pyrF 欠損株の単離に成功したことがキーポイントだったと思います。この変異株を宿主とした相同性組換えを足がかりとして様々な形質転換を積み重ね、使いやすい遺伝子操作系の確立につながりました。

ゲノム情報と遺伝子操作系を得て、超好熱菌の糖代謝などで未解決だった問題を遺伝子破壊によって決着させるなど、T. kodakarensis が超好熱菌研究のモデル生物として有用であることを示してきました。
しかし、しばらくは我々のグループの専売特許だった遺伝子操作も本菌の成功例を受けて他の超好熱菌でも確立され、遺伝子操作を用いた超好熱菌の機能解析や改変が新たな研究競争となってきています。
筆者は 2004 年に東京工業大学大学院生命理工学研究科に異動し、現在、折田和泉助教と若い学生さんとともに T. kodakarensis の研究に継続して取り組んでいます。改めて言うまでもないことですが、全ゲノム配列が決定されても細胞の全てを理解できる
わけではありません。進化系統的に根の近傍に近く、極限環境微生物である超好熱菌を対象とした機能未知遺伝子の機能解明は様々な意味で興味深いと考え、いくつかのアプローチで進めています。その１つとして、京大在籍時に当時大学院生の田中丈士さん（現・産総研）が明らかにした新規キチン代謝経路
において、この代謝を構成する遺伝子群の発現制御に関与する機能未知遺伝子を見出しており、その発現制御機の解明を目指しています。また、標的遺伝子の破壊や操作は表現型が予測できない機能未知遺伝子に対しては必ずしも有効とは言えません。最近、筆者の研究室では in vitro 転移反応で構築したトラ
ンスポゾンライブラリーを用い、相同性組換えによるランダム変異法を確立しました。この手法を用いて、表現型を指標としたスクリーニングによる新規
遺伝子機能の同定と解明を進めていくつもりです。
T. kodakarensis の研究を行うにあたり、恩師である今中先生はじめ、跡見晴幸先生、江崎 聡先生（現・クボタ）、金井 保先生に大変お世話になりました。
この場を借りて御礼申しあげます。85℃という素手では持てない熱いボトルの中で元気に生きている T.
kodakarensis に超好熱菌の不思議さを実感してからすでに 10 年以上が経ちました。達成できたことはい
くつかあるものの、未だによくわからないことだらけです。超好熱菌を少しでも多く理解できるよう、
これからも努力していきたいと考えています。

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)研究最前線

京都大学 化学研究所
本年 3 月 1 日付けで京都大学化学研究所環境物質
化学研究系分子微生物科学研究領域の教授に就任しました。江崎信芳教授の後任になります。農学研究科応用生命科学専攻の協力講座で、学部生はおらず、大学院生のみを受け入れています。私たちの研究室
では、先々代の左右田健次教授の時代から、微生物の酵素を主な研究対象とし、新しい酵素を探索するとともに、それらの触媒反応機構の解析や応用開発に取り組んできました。安定性が高く取り扱いが容易ということで好熱菌由来の耐熱性酵素を研究対象としたことが極限環境生物と関わりをもつようになったきっかけです。その後、好熱菌の対極にある低温菌の酵素にも研究対象を広げ、新しい酵素の探索やその特性解析を行ってきました。
生命が高温環境で誕生したとすると、0℃付近の低温環境に適応した低温菌は、温度軸で見た場合、最も進化した生物と捉えることができます。反応速度

栗原達夫が低下する低温下でも速やかに反応を進行させるために、触媒能の優れた好冷性酵素を進化の過程で作り出してきました。そのほかにも、低温で流動性を失わない膜を構築し、タンパク質や核酸の適切なフォールディングを介助する種々のシャペロンを生産するなど、低温適応のためのさまざまな仕組みを獲得してきました。
これらの仕組みを解析する過程で、私たちは、高度不飽和脂肪酸を含有するリン脂質が、海洋性低温菌 Shewanella livingstonensis Ac10 の低温での細胞分裂において重要な役割を果たすことを見いだしました。最近、このようなリン脂質を可視化するための蛍光プローブを合成して菌体に添加することにより、これらが細胞分裂部位に濃縮されることを見いだしました。細胞膜の新しいマイクロド
メインの存在を示したもので、その機能に興味がもたれます。細胞分裂部位での膜の高い曲率の生成に関与したり、細胞分裂を担うタンパク質との相互作
4

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)用を介してそれらの機能発現に関与する可能性が考えられ、今後、検討を加えていきたいと考えています。
上述のように、私たちの研究室で研究対象としているのは、本学会の会員の皆様と同様、特殊な環境に生息する極限環境生物です。このような極限環境
生物がさまざまな環境に適応するメカニズムを解明することは、生命のポテンシャルを理解することに直結しています。一方、極限環境生物の特殊に見える機能が、実は普遍的な生物機能の突出した現れであることも多く、極限環境生物を対象とした生命現象の解析は、生命の普遍的な仕組みを理解することにも寄与すると考えます。このような観点から私は、今後も極限環境生物の環境適応を担う分子基盤の解明を主要なテーマとして研究を行っていきたいと考えています。
特に、個々の分子の機能解析を超えて、生体膜のような分子集合体の構築原理と機能発現機構の解明を目指して研究を進めていくつもりです。

所属する化学研究所の特徴を活かして、化学を基盤としたアプローチにもこだわっていきたいと考えています。化学研究所は「化学に関する特殊事項の学
理及び応用の研究」を設立理念としています。極限環境微生物における特殊事項の探求から生物の普遍の仕組みを明らかにすべく研究を進めていきたいと考えています。
化学研究所は京都大学の本部キャンパスから 20
km ほど離れた京都府宇治市にあります。平等院や
黄檗山萬福寺の近くです。2010 年度の本学会年会が開催された場所ですので、お越しになった会員の方も多いかと思います。300 名を収容できるホールの建設や研究所本館の耐震改修工事などに伴い、緑が豊かな環境に新しい建物が建ち並ぶキャンパスに変貌を遂げつつあります。京都駅から 30 分ほどでア
クセスできる好立地ですので、機会があればお立ち
寄りください。また、シンポジウムやセミナーなどでもご利用いただければ幸いです。

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)

極限環境微生物学会
研究奨励賞受賞研究

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11, 6-11

Nunoura T.

Insights into the ecology, physiology and genomic traits of the “Aigarchaeota”

Subsurface Geobiology & Advanced Research (SUGAR) Project, Institute of Biogeosciences, Japan Agency for
Marine-Earth Science & Technology (JAMSTEC)
Corresponding Author: Takuro Nunoura, takuron@jamstec.go.jp
Phone: +81-46-867-9707, Fax: +81-46-867-9715

未培養系統群アーキア“Aigarchaeota”の生理生態及びゲノム特性(独)海洋研究開発機構 海洋・極限環境生物圏領域 布浦
１）アーキア研究の歴史
2005 年以降、未培養系統群アーキアのメタゲノム解析や培養により、これまでのアーキア研究の常識を覆す発見が相次いだ。中でも、従来 Crenarchaeotaに属するとされてきた土壌・海洋性アーキアと、最も報告されたアーキアの起源に近い系統とされてきた Korachaeota に関するゲノム解析は、アーキアの
進化・分子生物学研究上、非常に重要な知見をもたらした。まず、Crenarchaeota に属すとされてきた土壌・海洋性アーキアに対するメタゲノム解析、そして単離培養の成功は、好気的アンモニア酸化によってエネルギーを得るアーキアが存在することを初めて明らかにしただけでなく、この系統群のゲノムには、Euryarchaeota の特徴とされてきた遺伝子が多数存在することを示したのである。そして、一連のゲ
ノム比較及び、既知の超熱性 Crenarchaeota から独立した単系統性に基づき、これら土壌・海洋性アンモ
ニア酸化アーキア系統群に対して、新奇門
Thaumarchaeota が提唱されることとなった 1, 2）。一方、16S rRNA 遺伝子系統解析より、最も全生物共通祖先に近いアーキアとされてきた Korarchaeota についても、集積培養とそのメタゲノム解析により、その独自性が確認された。Crenarchaeota、Euryarchaeotaの性質を併せ持つゲノムを有すこと、
Thaumarchaeota ともゲノムの構成が異なること、さらに rRNA 遺伝子配列から示唆されてきた進化上の位置も、複数の他の遺伝子配列によって改めて明示されたのである 3)。
第三の生物界としてのアーキア（Archaea）研究は、
1977 年、Woese が rRNA の配列解析により第三の生

拓郎

命 Archaebacteria を提唱したことに始まる。
その後、蓄積した rRNA 配列情報や生化学・分子生物学研究の成果に基づき、1990 年、Woese は Archaebacteria
をアーキア（Archaea）に改称し、更に Crenarchaeota
及び Euryarchaeota の２つの門に分割した。rRNA 遺伝子系統解析の支持は勿論であるが、２つの門の間には、RNA polymerase や DNA polymerase の構成要
素等、ゲノムの転写・翻訳・複製・修復や細胞分裂といった生命の根幹システムに関わる相違が存在することが明らかになっていたのである 4)。また、当時、全てのアーキアは、超好熱菌、メタン菌、好塩菌のいずれかであり、アーキアは‘極限環境生物’と さ れ て い た 。 し か し 、 1992 年 以 降 、 海 洋 性Crenarchaeota（上述の通り、現在では Thaumarchaeotaとされる）が発見され、その後も未知のアーキア系
統群が極限環・非極限環境を問わず多数存在することが明らかにされている 5)。そして、Thaumarchaeota
や Korachaeota、2010 年にゲノム配列が明らかにされた Halobacteria に比較的近縁な極小サイズの未培
養 Euryarchaeota (ARMAN グループ) 6)を除く多くの系未培養統群は、発見後 10 年以上が経過した現在においても 16S rRNA 遺伝子の他は、せいぜい僅かなゲノム断片が知られているに過ぎず、そのゲノム・生理生態は依然として謎に包まれている。
２）未培養アーキア“Caldiarchaeum subterraneum”のメタゲノム解析
筆者らのメタゲノム解析の主な対象は、地下鉱山に 湧 く 70 度 の 熱 水 中 で 繁 茂 す る Hot Water
Crenarchaeotic Group I (HWCGI)に属するアーキア
6

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)Candidatus “Caldiarchaeum subterraneum”である 7, 8)。
この熱水環境には、水素酸化細菌、メタン酸化細菌
等の好熱性バクテリアと共に、２種のアーキア
HWCGI 及 び HWCGIII ( 現 在 で は 好 熱 性
Thaumarchaeota “Nitrosocaldus” sp.とされる)が優占した。我々は、これら未培養系統群アーキアの性状を明らかにすることを目的としてメタゲノム解析を開始したのである。
メタゲノム解析の概要は、以下の通りである。まず、
熱水中の微生物群集からゲノム DNA を抽出し、フォスミドをベクターとするメタゲノムライブラリ
ーを作成した。そして、16S rRNA 遺伝子を含むゲノ
ム断片のスクリーニング、ライブラリーを構成する
全ゲノム断片の末端配列解析等を行なってアーキア
由来のクローンを選択し、２段階の 454 GS20 によるシーケンス解析を行った。最初の約 50 クローンに対する解析の結果、HWCGI 由来の断片が集積されたため、第二段階では HWCGI 由来のゲノム断片に繋がるクローンを優先的に選択し、更に約 80 クロー
ンの配列を明らかにした。最終的には、454 GS20 で得られた配列のアセンブル及びギャップ領域のシー
ケンス解析により、HWCGI アーキア C. subterraneumの環状ゲノム(約 1.7Mb、GC 含量 51.6%)における再構築に成功した。なお、再構築に用いたフォスミド
間の重複領域の多くは 99％以上の相同性を有している。また、再構成したゲノム上の異なる複数領域から成る等、組み換えの形跡を示唆するゲノム断片も観察されている。

３）未培養系統群アーキア“Aigarchaeota” (HWCGI)とは
従来 Crenarchaeota に属すとされてきた主要な未培養系統群には、現在では Thaumarchaeota とされる
土壌・海洋性アンモニア酸化菌群の他、Deep Sea
ArchaealGroup(DSAG) や
Miscellaneous
Crenarchaeotic Group (MCG)が良く知られている（図1）。HWCGI は、そのいずれにも属さない系統群であり、深海底熱水活動域、温泉、地下熱水等の高温環境から検出されてきた。筆者らも、このメタゲノ
ム解析に用いた試料の他、深海底熱水活動域において、40 度以上の高温で嫌気的な堆積物中に HWCGIが優占することを見出している 9)。これまでの研究
成果をまとめると、90 度以上の熱水中から検出された例もあるものの、HWCGI は 40 度から 80 度程度の温度帯を好む高度好熱菌であり、酸化的から嫌気的までの多様な環境に棲息すると推測される。即ち、その棲息環境からは、HWCGI は、硫黄還元から好気呼吸まで多様なエネルギー獲得系を有する超好熱性 Crenarchaeota と類似した代謝を有すること、超好熱性 Crenarchaeota に比べ、やや低い高温環境に適応していると予想される。
実際に、ゲノム情報から代謝経路を推測したとこ
ろ、C. subterraneum は、水素あるいは一酸化炭素を電子供与体、酸素あるいは硝酸を電子受容体として用いることが明らかになった。一方、硫黄還元酵素
等、その他の嫌気呼吸に関わる機能は見出されなかった。また、その炭素代謝は、超好熱性 Crenarchaeota
である Desulfurococcales や Thermoproteales と同様、
dicarboxylate/4-hydroxybutyrate 経路による炭素固定を行うことが強く示唆された。

図１.16S rRNA 遺伝子系統解析によるアーキア系統樹。Crenarchaeota 近縁の各系統間の関係を示す。

7

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)４）C. subterraneum と既知アーキア系統群の比較ゲ
ノム解析
C. subterraneum ゲノムを arCOG によるオーソログ
分布により、既知のアーキア系統群 Euryarchaeota,
Crenarchaeota、Thaumarchaeota、Korarchaeota と比較検討したところ、Thaumarchaeota や Korarchaeotaと 同 様 、 C. subterraneum は Euryarchaeota とCrenarchaeota 双方の性質を併せ持つこと、そして
Thaumarchaeota より Korarchaeota と多くのオーソロ
グ遺伝子を共有することが明らかになった（図 2）。
また、アーキア分類の指標となってきた転写・翻訳・修復・細胞分裂に関する遺伝子の分布を検討すると、
C. subterraneum の転写・翻訳に関する遺伝子構成はKorarhcaeota に 、 修 復 や 細 胞 分 裂 に つ い て はThaumarchaeota に近いことが示された（表 1）。さらに 16S rRNA 遺伝子の系統解析においても HWCGIは独立性を有する（図１）ことから、筆者らは C.
subterraneum を含む HWCGI は新しい門に相当する
可 能 性 が 高 い と 判 断 し 、 Candidate division“Aigarchaeota”を提唱した。このように非常にユニークな性質を有する C. subterraneum ゲノムであるが、中でも特筆すべきは真核生物型蛋白質修飾系の存在である 8)。
５）C. subterraneum ゲノムからの真核生物型蛋白質
修飾系の発見
ユビキチン(Ub)、活性化酵素(E1)、結合酵素(E2)、リガーゼ(E3)からなる翻訳後蛋白質修飾系（ユビキ
チンシステム）は真核生物特有の仕組みであり、原核生物（アーキア及びバクテリア）には存在しないとされてきた 10)。一方、近年、Mycobacterium では

Pup、好塩性アーキア Haloferax では SAMP、と原核生物型ユビキチン様蛋白質による蛋白質修飾と被修飾蛋白質のプロテアソームによる選択的分解が相次いで発見された。特に Haloferax では、原核生物型
E1 様蛋白質が SAMP による蛋白質修飾系においても機能することが示されている。しかし、それでも
なお、原核生物で発見された蛋白質修飾系には真核生物型との明確な相違、即ち、Ub 様蛋白質が真核生物型とは明確に区別できること、E2・E3 様蛋白質との関わりが確認されないことが指摘されている(図３)11, 12)。
ところが、C. subterraneum ゲノムから、これら既知の原核生物型システムとは異なり、以下のように明瞭な真核生物型の特徴を有すユビキチンシステ
ムが見出されたのである。(1) RING 型 E3 の活性中心である RING finger domain を有する蛋白質が含まれる。(2) Ub 様蛋白質の C 末端は、Gly-Gly の後にもアミノ酸残基が続き、真核生物と同様の脱ユビキ
チン化酵素による成熟過程の存在が示唆される（Haloferax SAMP の C 末端は成熟過程の必要のな
い Gly-Gly である 12）。また、Mycobacterium Pup では
C 末端が Gly-Gly-Gln であり、Gln の脱アミド化後に被修飾蛋白質と結合する 11））。(3) E1 様蛋白質には、
真核生物型ユビキチンシステムに関わる E1(様)蛋白質にのみ観察されるシート構造が存在する。(4)真核生物のプロテアソームに付随する脱ユビキチン化酵
素 RPN11 と相同な蛋白質をコードする遺伝子がユ
ビキチンシステムオペロンに隣接してコードされる。
また、その C 末端には、RPN11 と同様、プロテアソームとの結合に必要なシート構造が存在する。

図２. C. subterraneum（緑）、Thaumarchaeota（青）、Korarchaeota（赤）ゲノム中のオーソログ(arCOG で定義)の分布。C. subterraneum、Thaumarchaeota、Korarchaeota ゲノム中における Euryarchaeota（E）、超好熱性
Crenarchaeota (HC)ゲノムコア遺伝子の分布(A、B、C)。ゲノムコア遺伝子を一方の門の全てのゲノムが有す
るが、他の門においては複数のゲノムで欠失する arCOG と定義したとき（A）、ゲノムコア遺伝子を一方の門の３分の２のゲノムにおいて保存されているが、他の門においては全てのゲノムで欠失する arCOG と定義したとき(B)、ゲノムコア遺伝子を一方の門の全ての目において少なくとも一つのゲノムに保存されているが、他の門においては全てのゲノムで欠失する arCOG と定義したとき(C)。 C. subterraneum、Thaumarchaeota、Korarchaeota の各グループ間で共通する arCOG の数を示す(D)。
8Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)表１.各アーキアグループにおける転写・翻訳・修復・細胞分裂に関する遺伝子の分布。
(＋)存在、(-)欠失、(a)“Nitrososphaera gargensis”にのみ存在。 (b) 融合型は Thermococcales と Thermoplasmatalesに存在。 (c) DNA polymerase の分類は、Cann, I.K., and Ishino, Y. 1999.による。 (d) C. symbiosum と N. maritimusに お い て は C 末 端 部 の み 存 在 。 (e) Thermofilum pendens と Caldivirga maquilingensis の み に 存 在 。
(f)Thermoproteales では欠失。

これら真核生物型の特徴を従来の教科書に当て嵌
めると、C. subterraneum から発見された真核生物型
ユビキチンシステムは真核生物からアーキアへの遺伝子水平伝播の産物であるとも解釈できる。しかし、これらの遺伝子は、オペロン様という明確な原核性物型の遺伝子構造として見出されたのである。
RPN11 様蛋白質は隣接する逆鎖にコードされているものの、Ub 様、E2 様、E1 様、E3 様蛋白質の順に、オペロン様遺伝子構造に含まれる。さらに、
Ub-E2-E1 という並びもまた、原核生物型のユビキチ
ン様蛋白質遺伝子クラスター（多くは機能未知ではあるが）において、良く保存されている構造である。
つまり、これら原核生物型の遺伝子構造は、C.
subterraneum の真核生物型ユビキチンシステムが、真核生物からアーキアへの遺伝子水平伝播に由来す
ると解釈することが難しいことを示すのである 8)。

上述した通り、これまでの比較ゲノム研究は、生命維持の根幹に関わる仕組みが、アーキアでは多様で可塑的であることを示している。また、これらゲ
ノムコア遺伝子の進化経路の検討結果は、ゲノムコ
アの多様性は、遺伝子水平伝播によってもたらされたのではなく、垂直的な伝播の可能性が高いことを示唆している。即ち、アーキアゲノムコアの多様性とは、アーキアの共通祖先の時代から垂直的に伝わる遺伝子の系統特異的な欠失によって形成された可能 性 が 高 い と 議 論 さ れ て い る の で あ る 13) 。 C.
subterraneum の真核生物型ユビキチンシステムは、
その後のアーキアゲノム研究からも見出されておらず、現生のアーキア内での拡がりは不明ではある。
しかし、その原核生物型の遺伝子構造を考慮すると、アーキアにおけるゲノムコア遺伝子と同様の進化の道筋を辿ってきたものと考えられる。
9

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)図３.真核生物型、Pup 型、SAMP 型、Caldiarchaeum 型ユビキチン・プロテアソームシステム（蛋白質修飾及び分解）の模式図。
６）更なる展開
筆者らの研究グループでは、一連のメタゲノム解析により、ここまで紹介した C. subterraneum ゲノム
再構築に引き続き、いくつかの興味深い成果を報告している。C. subterraneum 集団におけるイントロン
を含む tRNAThr 遺伝子に見出された多様性及び周辺領域の比較検討から、C. subterraneum tRNAThr 遺伝
子イントロンのうちの一つが、外来可動遺伝子にコードされる C. subterraneum tRNAThr 相同配列に含まれるイントロン配列に由来することを明らかにした
14)。また、同じメタゲノムライブラリーから未培養
系統群バクテリア OP1 ゲノムを集積し、この OP1
バ ク テ リ ア “ Acetothermus autotrophicum ” がacetogenesis による増殖が可能であることも報告している 15)。この他にも、C. subterraneum ゲノムに関わる研究が現在も進行中である。

めとする数多くの共同研究者の御協力により達成することができました。共同研究者の皆様に深く感謝
申し上げます。
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謝辞
本研究の成果は、（独）海洋研究開発機構 海洋・
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11

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)ORIGINAL PAPER

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11, 12-18

Kawamura A, Ishino Y and Ishino S

Biophysical analysis of PCNA from Pyrococcus furiosus
Department of Bioscience and Biotechnology, Graduate School of Bioresource and Bioenvironmental Sciences, andFaculty of Agriculture, Kyushu University, Fukuoka 812-8581, Japan.
Correspondence author: Sonoko Ishino, sonoko@agr.kyushu-u.ac.jp
Tel: +81-92-642-4218, Fax: +81-92-642-3051
Received: January 21, 2012 /Revised: February 5, 2012 /Accepted: February 5, 2012
Abstract The sliding clamp is a processivity factor thatretains DNA polymerase on the template DNA strand for

enzyme for the synthesis of nascent strands according to
the template DNA, and a processivity factor is also

processive DNA synthesis. All eukaryal and manyarchaeal proliferating cell nuclear antigen (PCNA)

required for the fast and reliable synthesis of long DNA
strands, to replicate large chromosomal DNA. The

molecules form a homotrimeric ring structure, which
encircles the DNA strand and anchors the DNA

processivity factor is referred to as a DNA sliding clamp(or the clamp), in general. In Eukarya and Archaea, thepolymerase on the DNA by binding the polymerase on
the surface (front side) of the ring. We investigated theclamp is named proliferating cell nuclear antigen(PCNA) 14, 16). The crystal structures of the clamp

stability of the ring structure of PCNA from thehyperthermophilic archaeon, Pyrococcus furiosus, via

molecules revealed a closed ring, which must be opened
before it is loaded onto the DNA, and a molecule called

mutational analysis using gel filtration chromatography,
and surface plasmon resonance analyses. It was foundthe clamp loader accomplishes this task by directlyinteracting with the clamp ring. The clamp loaders arethat the intermolecular ion pairs contributed to the ringstability of PCNA, and the stability of the ring structure

named Replication Factor C (RFC) for Eukarya andArchaea 2, 6).

was greatly affected by the ionic strength of the solution,
the concentration of PCNA, and the presence of DNA.

The crystal structure of P. furiosus PCNA, the firststructure of an archaeal PCNA, showed a toroidal,

The properties of PCNA could interpret the in vitro DNA
loading-unloading ability without replication factor C

ring-shaped structure, which is also observed in the
PCNA crystals from human and yeast, although the(RFC), which are specifically observed in the archaeal
PCNA.
Some mutants bearing less stable rings,

amino acid sequences are distantly related (22% and
25% similarity, respectively) 11). Detailed analyses ofactually improved the loading efficiency, and stimulated
DNA synthesis by DNA polymerase BI more efficiently

thecrystalstructuresof
PCNA andthe
PCNA-RFC-derived peptide complex revealed thethan the wild type.

important amino acid residues for the formation of thering structure 11, 12, 13). There are four hydrogen bonds

Key words: Archaea, Hyperthermophile,
replication, DNA polymerase, clampDNA

on the outer surface of the intermolecular interface
between the anti-parallel β-strands, βI1 and βD2 11). In

Introduction

addition, seven ion pairs involving five residues, Arg82,
Lys84, Arg109, Asp143, and Asp147, exist on the inner

DNA replication is fundamental for the maintenanceof living cells, and the molecular mechanisms of thisside of the PCNA ring 11). To investigate how theintermolecular ion pairs contribute to the ring stability ofprocess have been actively studied in the three biologicaldomains, Bacteria, Eukarya, and Archaea 1, 10). Within

PCNA, we created two mutant PCNAs, in which two
amino acid residues, Asp143 and Asp147, involved in thethe replisome complex, DNA polymerase is the key

intermolecular ion pair formation, were substituted by

12

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)alanine 13). The two mutant PCNAs, D143A andD143A/D147A (double mutant), are monomeric insolution, while under the same conditions, the wild type
PCNA, WT, is trimeric. However, we found that
D143A still retains the activity to stimulate the DNApolymerase I (PolBI) of P. furiosus in vitro, whereas
D143A/D147A lost the activity 13). These results drove
us onto further studies on the relationships between thering stability and function as the processivity factor for
DNA polymerases of the PCNA molecule.
In this article, we shows that the structure of the P.
furiosus PCNA protein easily changes depending on theconditions and the ring stability can be controlled in vitro
by changing the strength of ionic interactions between
the subunits.

UK Ltd.). To detect the direct interactions of each
PCNA molecule, WT was immobilized on a Sensor Chip
CM5, according to the manufacturer’s protocol (GEHealthcare UK Ltd.). To detect the direct interactions
between DNA and each PCNA molecule, the primed
DNA,
preparedwith
5′-biotinylated
49-meroligonucleotide and a 25-mer oligonucleotide, wasimmobilized on a Sensor Chip SA, according to the
manufacturer’s protocol (GE Healthcare UK Ltd.). The
purified WT, D143A, D143R, and D143A/D147A
proteins were loaded onto the chip at 25˚C, using 10 mM
HEPES-NaOH, pH 7.4, 3 mM EDTA, and 0.15 M NaCl,
at a flow rate of 30 μl/min. Various concentrations ofthese PCNAs were loaded for 120 s, and the apparent
equilibrium constants (KD) were calculated from thesensorgrams, using the BIAevaluation program (GEHealthcare UK Ltd.).

Materials and methods
Preparation of the recombinant proteins
PCNA, PolBI, and RFC proteins from P. furiosus were
produced in E. coli by using a recombinant expression
system. The D143R mutant was prepared by thesite-directed mutagenesis, using the primer set:
D143R-F (5′-dTTCTTGGAGAAGTCCTAAAACGTGC
TGTTAAAGATGCCTCTCTAGTGAGTGACAG-3′)
and D143R-R (5′-dCTGTCACTCACTAGAGAGGCATCTTTAACAGCACGTTTTAGGACTTCTCCAAGAA3′), containing the codon for Arg instead of Asp(underlined) 13). The detailed preparation procedure forthe proteins was described in our previous reports 3, 4, 8).

In vitro primer extension reaction
P. furiosus PolBI was used for in vitro primer
extension reactions in the absence or presence of the wild
type and mutant PCNAs, using M13mp18 singlestranded DNA (TAKARA BIO) annealed with a
32
P-labeled 55-mer oligonucleotide primer, as described
previously 3, 4). Briefly, the reaction mixture (20 μl),
containing 20 mM Tris HCl, pH 8.8, 2 mM MgSO4, 10
mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 0.1 % Triton X-100, 0.1
mg/ml BSA, 0.1 mM dNTP, and 8 nM oftemplate-primer DNA, with various concentrations of
NaCl, was preheated at 70 °C for 1 min, and then thereaction was started by adding PolBI to 8 nM. For thereactions with PCNAs, each PCNA was added to thereaction mixture at 160 nM (as the trimer). The
reaction products were analyzed by electrophoresis on an
alkaline agarose gel (1%), containing 50 mM NaOH and1 mM EDTA, and the gel electrophoresis images wereobtained by autoradiography.

Gel filtration analysis
The purified recombinant PCNAs, in the presence orabsence of the primed DNA, prepared with a 19-meroligonucleotide and a 32-mer oligonucleotide, wereincubated at 55˚C for 10 min and then subjected to gel
filtration on a Superdex 200 3.2/30 column (GEHealthcare UK Ltd.), with a mobile phase of solution A(50 mM Tris HCl, pH 8.0, 10% glycerol, 0.5 mM DTT,
and 0.1 mM EDTA) containing NaCl as indicated. The
chromatography was performed with a SMART system(GE Healthcare UK Ltd.).
The standard marker
proteins were analyzed in parallel.

Results
Preparation of the PCNA proteins
Our previous studies revealed that the ion pairs
between the involved amino acids contribute to theinteractions between the subunits of P. furiosus PCNA 11,
12, 13). To investigate the involvement of these residues
in the stability of the ring structure in more detail, we
prepared one more mutant PCNA, in which Asp143 was

Surface plasmon resonance analysis
The surface plasmon resonance (SPR) analysis was
performed using a BIACORE J system (GE Healthcare

13

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)substituted with Arg (D143R), a positively charged
amino acid, by site-directed mutagenesis. WT, D143A,
and D143A/D147A were also purified in parallel by thesame procedure.

gel filtration experiment, in which WT was loaded onto
the column at three different concentrations. As shownin Fig. 1B, 25 μM of WT eluted in a fraction
corresponding to the trimer. Interestingly, the WT
PCNA eluted at later, toward the fraction corresponding
to the monomer, at decreasing concentrations of theprotein (Fig. 1B). Even low concentrations of PCNA
may assemble and form a ring structure on the DNA
strand in native cells. Therefore, we investigated thegel filtration behavior of PCNA in the presence of DNA.
As shown in Fig.1C bottom, PCNA (WT) eluted at an
earlier fraction, toward that corresponding to the trimer,
in the presence of DNA, even though the concentration
was 2.5 μM, at which PCNA should exist mainly as themonomer, as shown above. This result suggested that
PCNA assembles on DNA and maintains a stable ring
structure.

Stability of the trimeric structure of PCNA in solution
We analyzed the oligomeric states of the four PCNAs,
WT, D143A, D143R, and D143A/D147A, in solution
using by gel filtration. As shown in Fig. 1A, D143R, as
well as the other two mutants, eluted in a fraction
corresponding to the monomer in the chromatography
buffer containing 0.15 M NaCl (upper panel). It was
found that the elution of the mutant PCNAs shifted
toward a fraction corresponding to the trimeric structure
at the lower salt concentration, although the tailing shapeof the peak suggested being disassembled of the trimericform. (Fig. 1A lower panel). We performed the similar

Fig. 1. Oligomeric states of the PCNA proteins.
The oligomeric states of the PCNA proteins were analyzed by gel filtration under various conditions. The
concentrations of the proteins are shown as the monomer. The elution profiles, monitored by the absorbance at 280
nm in black, and at 254 nm in gray, are shown. The peak positions of the marker proteins are indicated on the top withmolecular weight (× 103). (A) Each purified PCNA (25 μM) was applied with a mobile phase of solution A containing
0.15 M NaCl in the upper panel, and 0.05 M NaCl in the lower panel. (B) Different concentrations of WT wereapplied with a mobile phase of solution A containing 0.15 M NaCl. (C) Four micromoler of the primed DNA (upper),2.5 μM of the wild type PCNA (middle), and the mixture of the primed DNA (4.0 μM) and PCNA (2.5 μM) (lower)
were applied with a mobile phase of solution A including 0.05 M NaCl. Aliquots (12 μl) of each fraction from theeluates were subjected to 12% SDS-PAGE followed by CBB staining, as shown at the bottom.
Binding affinity between PCNA molecules
We measured the direct binding affinity between theimmobilized on the Biacore CM5 sensor chip at themonomer concentration, and increasing concentrations ofsubunits by SPR analyses.

wild type and mutant PCNAs were loaded over the

Purified

WT was14

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)sensor chip. As shown in Fig. 2A-D, all PCNAs boundto the WT, with different strengths. The sensorgrams ofthese four PCNAs at 2.0 μM are overlaid in one graph,for easier comparison (Fig. 2E). It is difficult toquantify the binding affinity by this method, because theimmobilized PCNA molecule has two interfaces forbinding. When one molecule binds to the immobilized

chip, the binding of the next molecule occurs under
different conditions, and thus the characterization of thebinding kinetics is not simple. However, the apparent
KD values from these experiments were calculated (Fig.
2F). The rank order of affinity was WT > D143A >D143R > D143A/D147A.

Fig. 2. Physical interactions between the wild type PCNA and the mutant PCNA.
The concentrations of the loaded PCNAs are shown as the monomer. The ligand was WT, and the analytes are WT(A), D143A (B), D143R (C), and D143A/D147A (D). The sensorgrams at 2.0 μM of the analytes are overlaid in (E).
The apparent KD values calculated from the sensorgrams are shown in (F).

Fig. 3. Physical interactions between primed DNA and PCNA.
The concentrations of the loaded proteins are shown as the monomer. The ligand was primed DNA, and the analytes
were WT (A), D143A (B), D143R (C), and D143A/D147A (D). The sensorgrams at 8.0 μM of PCNA are overlaid in(E). The apparent KD values calculated from the sensorgrams are shown in (F).

15

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)DNA (without a terminal end) 3, 4, 17). We predicted that
the PCNA rings from the hyperthermophilic archaea areless stable than those of the eukaryal PCNAs, which
definitely require RFC to load onto the DNA. Thus, inthis study, it is easier to compare the functions of themutant PCNAs as the processivity factor, without
considering the RFC. We compared the abilities of thewild type and mutant PCNAs to stimulate the primer
extension activity of PolBI in vitro, in the presence ofdifferent salt concentrations. As shown in Fig. 4,
various lengths of DNA strands were synthesized,
depending on the included PCNAs and the salt
concentrations of the reaction solutions. The DNA
synthesizing activity of PolBI is inhibited by increasing
concentrations of NaCl in vitro 7), the reaction time was
extended according to the increasing concentrations of
NaCl in the reaction mixture. A reaction by PolBI
without PCNA was done in parallel for each reaction
condition. In the reactions with NaCl concentrations
ranging from 0 to 0.08 M, longer products weresynthesized with D143R and D143A/D147A, as
compared to WT and D143A. On the other hand, thestimulating ability of D143R and D143A/D147A weresignificantly reduced at high salt concentrations. These
results indicated that the ring stability of PCNA actuallyaffects the function of the processivity factor.

Binding affinity between each PCNA and DNA
Using the same SPR technique, we measured the
direct interactions between PCNA and DNA.
A
synthetic primed DNA was immobilized on the Biacore
SA sensor chip, and increasing concentrations of the wild
type and mutant PCNAs were passed over the sensor
chip. (Fig. 3A-D). The sensorgrams of these four
PCNAs at 8.0 μM were overlaid in one graph, for easiercomparison (Fig. 3E). Once again, it was difficult toquantify the binding affinity by this method, because thebinding affinities are different between the monomericand trimeric forms of PCNA. Based on the shapes ofthe sensorgrams, the PCNAs that form more stable ring
structures (WT and D143A) tend to stay on the DNA,
while D143R and D143A/D147A, which have weaker
interfaces, dissociate more easily from the DNA. The
apparent KD values from these experiments were
calculated (Fig. 3F), and the order of the affinities wasconsistent with the prediction from the binding affinity
between the subunits analyzed by SPR (Fig. 2).
How do PCNAs work in the primer extension
reaction by PolBI?
We previously reported that PCNA stimulated theprimer extension reactions of PolBI and PolD from P.
furiosus in vitro without RFC, the clamp loader, eventhough the template M13 is a single-stranded, circularFig. 4. Effects of PCNAs on DNA-synthesizing reactions by PolBI.
The primer extension reactions by PolBI were performed at 70˚C with various PCNAs. lane M, DNA markers; lane 1,
without PCNA; lane 2, WT; lane 3, D143A; lane 4, D143R; lane 5, D143A/D147A. The concentrations of additional
NaCl into the standard reaction solution are shown at the bottom with the reaction time.
Discussion

differ among the PCNA molecules from various

When we discovered that P. furiosus PCNA can beloaded onto DNA without RFC in vitro, we started toorganisms, although the overall ring structures are highly
conserved. The interface between the subunits in theanalyze the interaction modes between the subunits 11, 12,
13). It is interesting that the intermolecular interactions

PCNA ring commonly involves antiparallel β-strands,
forming an extended β-sheet connected by hydrogen16

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)bonds on the outside of the ring. There are fewerhydrogen bonds in P. furiosus PCNA (4 bonds) than in
human PCNA (8 bonds). Instead, there is ion-pair
network in P. furiosus PCNA, while there are none inhuman PCNA. However, these features are not specificto the archaeal PCNAs.
The PCNA from
Archaeoglobus fulgidus, a hyperthermophilic archaeon,has 6 hydrogen bonds and no ion pairs 5), on the other
hand, Haloferax volcanii, a halophilic archaeon, has 4hydrogen bonds and no ion pairs 15, 18). If fewerhydrogen bonds and more ion pairs are the specificfeatures of the Thermococcal PCNAs, then these PCNAs
may be especially advantageous, since their ring stability
can be controlled by the ionic strength in the solution.
In terms of the protein concentration, the fact that thetrimeric form is disrupted to the monomer at lower
protein concentrations is not only true for P. furiosus
PCNA, but also for the PCNA from Methanosarcina
acetivorans 9). It is interesting to consider how PCNA

actually exists in the cell. We estimated the number of
PCNA molecules in the cell by comparing the band
intensities of total cell extracts of P. furiosus and serial
dilutions of purified PCNA from the western blot
analysis, and determined that it was about 2,000
molecules per cell (data not shown). The concentrationof the PCNA protein in P. furiosus cells is simply
calculated to be 3 μM, which is the concentration for amonomer of free PCNA, but it may form a trimer when itbinds to DNA.
In the structural analysis of PCNA, complexed with
PCNA-interacting peptide, a movement of the C-terminal
region of the PCNA was caused by the binding to the
peptide. The rearrangement of the interface causes the
PCNA ring to be more rigid, suitable for its functions 12).
Thus, various factors affect the stability of the ring
structure of P. furiosus PCNA. The results of thesestudies are summarized in Fig.5.

Fig. 5. Various factors affecting the ring stability of PCNA.

17

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)Acknowlegements
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Application of PCNA to processive PCR by reducing the stability of its ring
structure

Department of Bioscience and Biotechnology, Graduate School of Bioresource and Bioenvironmental Sciences, andFaculty of Agriculture, Kyushu University, Fukuoka 812-8581, Japan.
Correspondence author: Sonoko Ishino, sonoko@agr.kyushu-u.ac.jp
Tel: +81-92-642-4218, Fax: +81-92-642-3051
Received: January 20, 2012 /Revised: February 4, 2012 /Accepted: February 4, 2012
Abstract The sliding clamp, proliferating cell nuclear
antigen (PCNA) from Pyrococcus furiosus has a uniquefeature of structure fluctuation of its trimeric ring as
shown in the accompanying paper. We applied thestructural information of the ring stability of the PCNA
toward the development of a highly processive PCR.
Two PCNA mutants with reduced ring stability
considerably improved the PCR performance of DNApolymerase BI (Pfu DNA polymerase). DNA fragments
up to 15 kbp were strongly amplified in the presence of
these PCNA mutants from a marked short reaction time,
whereas the wild type PCNA was inefficient to support
the PolB-based PCR. This is the first presentation of apractical high-speed PCR methods assisted by PCNA.

practically used for PCR. The main difference between
the family A and family B DNA polymerases is theabsence or presence of a 3′–5′ exonuclease activity,
which contributes to the proofreading of DNA strand
synthesis. The 3 ′ – 5 ′ exonuclease activity is
generally associated with the family B enzymes, but notwith the family A enzymes. Based on these differences,family A is advantageous for the efficient amplificationof a long DNA region, and family B is generally moresuitable for the precise amplification of a shorter region
by PCR 7).
Pfu DNA polymerase from Pyrococcus furiosus is therepresentative enzyme for accurate PCR 15). Although
Pfu DNA polymerase is highly accurate for DNA
synthesis, it has low processivity. To overcome thisweak point of the enzyme, a small protein, Sso7d from
Sulfolobus solfataricus with high affinity to the DNA
strand, was fused to the C-terminus of the DNApolymerase 19).
This artificial DNA polymerase
possesses high processivity, while maintaining accurate
DNA synthesis ability.
The sliding clamp is the processivity factor that retains
the DNA polymerase on the template DNA strand forprocessive DNA synthesis in vivo 16, 18). The eukaryal
and archaeal proliferating cell nuclear antigen (PCNA)
molecules form a homotrimeric ring structure, which
encircles the DNA strand and anchors the DNApolymerase onto the DNA by binding it on one surface(front side) of the ring. We have been studying the

Key words: Archaea, Hyperthermophile, PCNA, DNA
polymerase, PCR
Introduction
In addition to the fundamental roles in maintaining
genome integrity during replication and repair, DNA
polymerases are widely used for genetic engineering
techniques.
Thermostable DNA polymerases are
particularly useful for Polymerase Chain Reaction (PCR)
and cycle-sequencing. To develop DNA polymerases
suitable for PCR, the enzyme’s velocity, fidelity, andefficiency of primer usage for in vitro DNA strand
synthesis are the critical factors to be evaluated.
Currently, only the family A and B DNA polymerases are19

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)structure and functions of the P. furiosus PCNA, andshowed that the structure of the P. furiosus PCNA protein
easily changes depending on the conditions, and the ringstability can be controlled in vitro by changing thestrength of ionic interactions between the subunits12).
In addition, mutational analysis revealed that the stabilityof the trimeric structure of the PCNA can be changed bysubstitutions of the amino acids involved in the subunitsubunit interaction at the interface. Furthermore, therelationships between the ring stability and function as
the processivity factor for DNA polymerases of the
PCNA molecule were investigated in detail.
In this study, we applied the P. furiosus PCNA to PCR,
and found the ring stability strongly affects on the PCR
performance of the P. furiosus DNA poloymerase B(PolBI, also called Pfu DNA polymerase as thecommercial product as described above). Finally, wedeveloped a PCNA-assisted processive PCR systemusing the PCNA mutants with reduced ring stability.

Each PCR reaction contained 20 mM Tris HCl, pH 8.8, 2
mM MgSO4, 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 0.1 %Triton X-100, 0.1 mg/ml BSA, 0.2 mM dNTP, 0.4 μM
each primer, and 1 unit of each DNA polymerase in a
final volume of 50 μl. For the reactions in the presenceof RFC, 0.2 mM ATP was added to the reaction. The
amounts of PCNA and RFC added to the reactions, and
the PCR reaction conditions, are described in therespective sections.
The PCR products werefractionated by 0.8% agarose gel electrophoresis andstained with ethidium bromide.
In vitro primer extension reaction
KOD DNA polymerase (Toyobo) was used for in vitro
primer extension reactions in the absence or presence ofthe WT and D143R, using M13mp18 single-stranded
DNA (TAKARA BIO) annealed with a 32P-labeledoligonucleotide primer (5'-dTCGTAATCATGGTCATAG
CTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAAT
TC-3'), as described previously 2). The reaction mixture(50 μl), containing 20 mM Tris HCl, pH 8.8, 2 mM
MgSO4, 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 0.1 % Triton
X-100, 0.1 mg/ml BSA, 0.1 mM dNTP, and 8 nM oftemplate-primer DNA, with various concentrations of
NaCl, was preheated at 70 °C for 1 min, and then thereaction was started by adding 1 unit of KOD DNA
polymerase. For the reactions with PCNAs, each
PCNA was added to the reaction mixture at 160 nM (asthe trimer). After the reaction (durations are indicatedin the figure), a 12.5 μl aliquot of the stop solution (0.3
M NaOH, 6 mM EDTA, 18 % Ficoll 400, 0.15 %bromocresol green, and 0.25 % xylene cyanol) was
added.
The reaction products were analyzed byelectrophoresis on an alkaline agarose gel (1%),
containing 50 mM NaOH and 1 mM EDTA, and the gelelectrophoresis
imageswereobtainedbyautoradiography.

Materials and Methods
Proteins and enzymes
Vent DNA polymerase and DeepVent DNA
polymerase were purchased from New England Biolabs.
KOD DNA polymerase was purchased from Toyobo. P.
furiosus PCNA (WT, D143A, D143R, and D143A/
D147A), replication factor C (RFC), and PolB were
produced in E. coli by using a recombinant expression
system. The detailed purification procedures were
described in our previous reports 2, 3, 12, 14).
Effect of PCNAs on PCR performance
PCR performances under various conditions werecompared, using λ phage DNA (TAKARA BIO) as the
template. The primers designed to generate the 4 kbp, 6
kbp, 8 kbp, and 15 kbp products are as follows:
4-F (5'-dAATTCTAAGCGGAGATCGCCTAGTG-3'),
4-R (5'-dGGTGTTATCTCGGATGGGAGTAAGC-3'),
6-F (same as 4-F),
6-R (5'-dCGACATTCGTGCATCGTCAGAACTG-3'),8-F (same as 4-F),
8-R (5'-dCGAACGACGGCAATGATTGCCAGAG-3'),
15-F (5'-dGAGTTCGTGTCCGTACAACTGGCGTAATCATGGCC-3'), and
15-R (5'-dGAATATCTGGCGGTGCAATATCGGTACT
GTTTGC-3').

Results
Preparation of the recombinant proteins
The studies in the accompanying paper revealed thatthe mutant P. furiosus PCNAs, D143A, D143R and
D143A/D147A, had the structural fluctuation, andtherefore, they had the potential of improving
processivity of DNA polymerase. The mutant PCNAs
may exceed the wild type PCNA. To investigate the20Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)possibility to apply these mutant PCNAs to PCR, therecombinant proteins, WT, D143A, D143R, D143A/
D147A, PfuPolBI and PfuRFC were prepared aspreviously described 2, 3, 14).

with an appropriate DNA polymerase. Therefore, we
performed model PCR experiments, assisted by aself-loading/unloading ability of PCNAs, using λ DNA
as a template and three sets of primers to amplify DNA
fragments with lengths of 6, 8 and 15 kbp, respectively.
Under the conditions of short time in the extension phase,the DNA band amplified by PolB without PCNA could
not be detected. However, D143R and D143A/D147A
worked efficiently in the amplification of the three target
DNA fragments (Fig. 2). These results indicated that
PolBI became more processive with the help of PCNA
under these PCR conditions.

PCNA-assisted PCR in the presence of RFC
Since the PCNA from the hyperthermophilic archaea
was identified as the processivity factor, this molecule
may be applicable for processive DNA synthesis under
PCR conditions. However, no successful report has
been published to date. The reason why PCNA does
not work in PCR is probably that the PCNA ring, bystaying on the DNA, inhibits the denaturation step of thesynthesized duplex. To address this possibility, we
performed PCNA-assisted PCR in the presence andabsence of RFC, and found that the PCR actually worked
when the RFC was present in the reaction solution, but
not in the absence of RFC (Fig. 1). RFC works as aclamp unloader as well as a loader 21), and therefore, we
expected that RFC would unload the PCNA after
finishing DNA strand synthesis in each cycle, to allow
the denaturation of the duplex DNA.

Fig. 2. PCNA-assisted PCR by PolB. The reaction
solutions are indicated in the “Materials and methods”
section. The cycle conditions are indicated at thebottom. Various PCNAs were added at 200 nM (as thetrimer). The primer sets for a 6 kbp product (A), a 8
kbp product (B), and a 15 kbp product (C) were used
respectively. lane M, DNA markers; lane 1, without
PCNA; lane 2, WT; lane 3, D143A; lane 4, D143R; lane
5, D143A/D147A.
Fig. 1. PCNA enhances the performance of PolB in PCR
in the presence of RFC. The primer set for a 6 kbp
product was used. PCNA (20 nM as the trimer) andRFC (50, 100, and 200 nM as the complex) were added
to the reaction. The cycle conditions are indicated at
the bottom.

Mutant PCNA assists DNA polymerases from other
Thermococcal DNA polymerases
It is probably common that family B DNA
polymerases interact with PCNA at the C-terminal
PCNA-interaction protein (PIP) box, and therefore, we
predicted that P. furiosus PCNA functionally interacts
with other DNA polymerases from the hyperthermophilicarchaea, as well as P. furiosus PolBI.
The
PCNA-assisted PCR amplification as described in theabove section was tried using DeepVent DNA
polymerase (from Pyrococcus species GB-D), Vent DNA
polymerase (Thermococcus litoralis), and KOD DNA

Effect of the ring stability of PCNA on the PCR
performance
We surmised that the mutant PCNA, with its lessstable ring structure, may be suitable for self-loading and-unloading, and may provide excellent PCR performance21

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)polymerase (Thermococcus kodakarensis). As shownin Fig. 3A and 3B, the mutant PCNAs, D143R and
D143A/D147A, worked with Vent and DeepVent DNA
polymerases clearly provided the amplified DNA
products, with the same efficiency as P. furiosus PolBI ina very short extension time. It is well known that KOD
DNA polymerase is a highly processive enzyme among
the family B DNA polymerases 11). When this enzyme
was evaluated by our PCNA-assisted PCR in the same
condition as those of Vent and DeepVent polymerases,
product bands were detected even without PCNA
because of a high processivity of the enzyme by itself.
However, obviously clear bands were observed from thereactions with the two mutant PCNAs (Fig. 3C). Whenthe PCRs were performed with standard extension times,

larger amounts of the amplified products were detectedin the presence of these mutant PCNAs, as comparedwith the reactions without PCNA (Fig. 4). When an invitro primer extension activity of KOD DNA polymerase
was compared in the presence or absence of P. furiosus
PCNA, the wild type PCNA provided longer products ascompared with the case of enzyme alone (Fig. 5).
Moreover, mutant PCNA, D143R, showed further
stimulation of the extension reaction. It is noteworthy
that distinct amounts of stalled products were observed ataround 1.3 kb long in the reaction at 1.5 min in thepresence of wild type PCNA, but not mutant PCNA.
These results indicate that the P. furiosus PCNAs
functionally interact with KOD DNA polymerase invitro.

Fig. 3. Application of PCNA to PCR by Vent, DeepVent, and KOD DNA polymerase.
The cycle conditions are indicated on the side. Various PCNAs were added at 200 nM (as the trimer) in the reaction
with Vent (A), DeepVent (B) and KOD (C). lane M, DNA markers; lane 1, without PCNA; lane 2, WT; lane 3,
D143A; lane 4, D143R; lane 5, D143A/D147A. The primer sets for a 6 kbp product (upper panels) and a 8 kbp
product (lower panels) were used.

22

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)Fig. 5. Effects of PCNAs on DNA-synthesizing reactions
by KOD DNA polymerase. The primer extension
reactions by KOD DNA polymerase were performed at
70˚C with the wild type and mutant PCNA, D143R.
Discussion
Improvement in PCR technology is one of the most
attractive aims of protein engineering for DNA-related
proteins and enzymes.
Mutations of the DNApolymerase itself, using site-specific or randommutagenesis, are powerful ways to create modified
enzymes showing better performances for in vitro DNA
manipulations. An artificial evolution procedure also
has attracted a great deal of attention, for the creation of
DNA polymerases with novel activities 1, 8, 9, 17). One
recent successful example of an engineered DNA
polymerase for PCR is the creation of a fusion protein
between PolB and Sso7d by genetic engineering
techniques as described in Introduction18). The prominent
fidelity of PolBI for the in vitro DNA synthesis isadvantageous to the accurate PCR. However, theenzyme has a marked low processivity. This artificial
DNA polymerase exhibits high processivity, while
maintaining accurate DNA synthesis ability and it is now
commercially available as Phusion DNA polymerase.
PCNA is the processivity factor, and therefore, it has
been expected to be used to PCR. A previous report
showed that the PCNA from T. kodakarensis improved
the sensitivity of PCR, in terms of the specificamplification of the target DNA, using the organism’s
own DNA polymerase, KOD DNA polymerase 13). The
reason for this improvement was not discussed in thereport. In our knowledge, the wild type PCNA has
never successfully been utilized in a processive PCR,

Fig. 4. Application of PCNA to PCR by PfuPolB, Vent
and DeepVent DNA polymerase.
The cycle conditions under standard conditions areindicated on the side. Various PCNAs were added at
200 nM (as the trimer) in the reaction with PfuPolB, Vent
and DeepVent. lane M, DNA markers; lane 1, without
PCNA; lane 2, D143R; lane 3, D143A/D147A. The
primer sets for a 4 kbp product (A) a 6 kbp product (B)and a 8 kbp product (C) were used.

23

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)even though PCNA is the processivity factor. We
applied the mutant PCNA to PCR for the first time andachieved a fast PCR system in this study. The conceptof the PCNA-assisted PCR is schematically shown in Fig.
6. The essential point of this technology is theregulation of the ring stability to optimize theself-loading/unloading ability of PCNA in the PCR
conditions.
It is important to confirm that this
PCNA-assisted PCR does not decrease the fidelity. We
have preliminary data that the PCNA-assisted PCR
occurs with high fidelity, comparable to that of PolBI
itself (data not shown). We believe this technique willcontribute to the development of more powerful PCR
methods.
Heterologous combinations of DNApolymerases and PCNAs are also applicable. For
example, the mutant P. furiosus PCNAs work with
DeepVent, Vent, and KOD DNA polymerases from
Thermococcals, as well as P. furiosus PolBI. The
PCNAs from a Thermococcus strains will also probably
work with PfuPolBI. The crenarchaeal PCNAs areheterotrimers of PCNA1-PCNA2-PCNA3 4, 5). Detailed
structural studies of the heterologous PCNA from
Sulfolobus solfataricus revealed that the ion-pairinteractions between the subunits are conserved 6, 20).
The heterologous PCNA has some specificity in each
subunit for binding proteins 5, 10), and these PCNAs haveinteresting potential for applications to modified PCR
procedures.

Fig. 6. Concept of PCNA-assisted PCR.
P. furiosus PCNA mutant has self-loading ability to DNA (A) to assist a processive DNA synthesis of DNA polymerase
in vitro (B). Then, PCNA has to be unloaded from DNA after the end of reaction (C) and reloaded for the next DNA
strand synthesis (D) in each cycle of PCR. The ring stability of PfuPCNA can be controlled by the strength of theion-pair interaction at the subunit-subunit interface (E). The PCNA molecules applied to PCR in this study are shownin the order of ring stability.

24

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)11) Imanaka, T. 2010. Enzymes involved in DNA
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Acknowledgements
This work was supported by grants from the Ministryof Education, Culture, Sports, Science and Technology ofJapan [grant numbers 21113005 and 23310152 to Y. I.].
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25

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)ORIGINAL PAPER

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11, 26-32

Kumazaki R1), Minegishi H2), Echigo A2), Shimane Y3),
Takahashi-Ando N1),2) and Usami R1),2)

Purification and Characterization of β-Cyclodextrin Glucanotransferase from
Bacillus sp. Strain 149-1

1)

Department of Biological Applied Chemistry, Graduate School of Engineering, Toyo University, 2100 Kujirai,
Kawagoe 350-8585, Japan
2)
Bio-Nano Electronics Research Center, Toyo University, 2100 Kujirai, Kawagoe 350-8585, Japan
3)
Extremobiosphere Research Center, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 2-15
Natsushima-cho, Yokosuka 237-0061, Japan
Corresponding author: Ryoichi Kumazaki, kumazaki0722@gmail.com
Phone: +81-49-239-1390, Fax: +81-49-234-2502
Received: February 24, 2012 /Revised: March 3, 2012 /Accepted: March 3, 2012
Abstract
β-cyclodextrin glucanotransferase waspurified from alkaliphilic Bacillus sp. strain 149-1, which
was isolated from Japanese soil. The purification was
performed by chromatography on Toyopearl DEAE650M, starch adsorption and ultracel low-binding
regenerated cellulose membrane, 30 kDa. The molecularweight of the purified CGTase was estimated to be 70
kDa by SDS-PAGE. Characterization of the CGTase
exhibited optimum pH and temperature of 6.0 and 60 °C,
respectively. The CGTase was stable at the range of pH
7.0-9.0 and retained high activity up to 50 °C.
Furthermore, in the presence of 10 mM CaCl2, thepurified CGTase was stable even at 65 °C. The CGTaseproduced mainly β-cyclodextrin with γ-cyclodextrin as aminor product.

have led to various industrial applications related to food,
pharmaceuticals, cosmetics, chemicals, agriculture,
etc1-6).
CDs are produced from starch using cyclodextrin
glucanotransferase (CGTase, EC 2.4.1.19). The
enzymatic product is usually a mixture of CDs, including
mainly α-, β-, and γ-CD consisting of six, seven, or eight
glucose units, respectively, and trace amounts oflarge-ring CDs with more than nine glucose units7).
CGTase has been reported to be produced by different
strains of the genns Bacillus8-11), Klebsiella12),
Paenibacillus13), Brevibacterium14), Thermococcus15),
Thermoanaerobacterium16)
andAnaerobranca17).
CGTases are most commonly reported from Bacillus
species among microorganisms. CGTase are classified
into three types depending on the major CD product from
α-1,4-glucans by intramolecular transglycosylation:(a) Bacillus macerans 1118) type (α-CD producer),(b) alkalophilic Bacillus sp. 8SB8) type (β-CD producer)and (c) Bacillus clarkia 738419) (γ-CD producer). In
general, optimum pH and temperature of CGTase of
Bacillus species are within 4.5-11.0 and around40-65 ℃, respectively18-24).
So far, all isolated CGTase produce these types of CD
in different ratios25). Thus CGTases forming
predominantly a certain type of CD are considered
promising for practical use. Besides product specificity,

Introduction
Cyclodextrins (CDs) are a family of cyclic
oligosaccharides that are composed of α-1,4-linked
glucopyranose subunits. The steric arrangement of
glucose units in the CD molecule results in the shape of ahollow truncated cone with a hydrophilic outside surface,which makes CDs water soluble, and have a hydrophobic
internal cavity, which enables CDs to form inclusion
complexes with various hydrophobic guest molecules.
The advantageous changes of guest molecular properties
after the formation of inclusions complexes with CDs
26

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)CGTases from different strains vary in their biochemical
properties. For these reasons, characterization andapplication of novel CGTases provide new perspectives
for CD production. This paper reports the first
purification and enzymatic properties of the CGTasefrom the related species of Bacillus lehensis.

using ultracel low-binding regenerated cellulose
membrane, 30 kDa (Millipore).
The molecular weight of the protein was estimated by
SDS-PAGE on a 15% homogeneous gel and the protein
bands were visualized by silver staining.
CGTase assay
CGTase activity was assayed with starch from potato(WaKo Pure Chemical) as a substrate by measuring thedecrease of starch in iodine staining power; 0.25 mL of
2.0% soluble starch (KANTO CHEMICAL) in 0.5 M
citrate-NaOH buffer (pH 5.0) was mixed with 50 µL of
the enzyme solution and the mixture was incubated for
20 min at 50 °C . The reaction was stopped by theaddition of 0.5 mL of 2 N HCl. The reaction mixture wasadded to 0.5 mL I2-KI solution (0.02% iodine, 0.2%
potassium iodide). Then, the absorbance at 660 nm wasmeasured. The detailed enzyme assay conditions of eachcharacterization are shown at figure legends and table.
One unit of the enzyme activity was defined as theamount of enzyme that decreased the absorbance at 660
nm by 1% per minute14).

Materials and methods
Screening of CGTase producing bacteria
The CGTase producing bacteria strain 149-1 wasisolated from soil in Japan (Kawagoe, Saitama). A 0.1 gof soil sample was dissolved in 5.0 mL of sterile distilledwater, and the diluted sample (40 µL) was spread on agar
alkaline plate which contained (in /L) : 20.0 g soluble
starch (KANTO CHEMICAL), 0.2 g yeast extract, 0.2 g
casamino acids, 3.0 g trisodium citrate, 1.0 g K2HPO4,
0.2 g MgSO4・7H2O, 1.0 g (NH4)2SO4, 0.1 g CaCl2・2H2O,
3.6 mg FeCl2・4H2O, 0.36 mg MnCl2・4H2O, 10.0 g
Na2CO3, 20.0 g agar, 50 mM glycine-NaOH buffer (pH10.0) and 5 mL 0.5% Bromocresol Green. Afterincubation at 37 °C for 5 days, colonies which produced
clear halo zones were selected.

Analysis of decomposition product HPLCThe starch decomposition products were analyzed by
HPLC with a refractive index detector (SHIMADZU).
For estimation CDs, Luna 5U NH2 100A column(Phenomenex) was used. The products were eluted at aflow rate of 0.6 mL/ min using acetonitrile / distillated
water (70:30, v/v).

Purification of CGTase from strain 149-1
The strain 149-1 was cultivated in a 500 mL shaking
flask containing 150 mL of the medium at 37 °C for 240
h on a reciprocal shaker (100 rpm). The culture wascentrifuged (4,000×g, 15 min, 4 °C). The supernatant
was put on a Toyopearl diethylaminoethyl(DEAE)-650M column equilibrated with 10 mM
Tris-HCl buffer (pH 7.2). All the solution which passed
through DEAE-column was collected and insoluble corn
starch (Wako Pure Chemical) (10%, w/v) and 30%
saturated ammonium sulfate were added to it. The
mixture was incubated for 24 h at 4 °C under acontinuous agitation to allow enzyme adsorption. The
mixture was centrifuged at 8,500×g for 15 min and theresidue was washed twice with 60 mL of cold water. In
order to separate the enzyme from starch, the residue wasincubated with 60 mL elution buffer (1 mM β-CD in 50
mM Tris-HCl buffer (pH 7.2)) for 30 min at 37 °C withshaking followed by centrifugation described as above.
The elution was repeated with the elution buffer. The
eluates were dialysed against 50 mM Tris-HCl buffer(pH 8.0) for 24 h at 4 °C. The dialyzed eluates wereseparated (8,500×g, 15 min, 4 °C) and concentrated by

Phylogenetic analysis of strains 149-1
DNA extraction was performed by the method ofMinegishi et al26). Cells were harvested by centrifugationand suspended in TEN buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0,
1 mM EDTA, 100 mM NaCl) and 0.3 g glass beads(SIGMA-ALDRICH) were added. The cells were broken
by vortex for 10 min at maximum speed. DNA wasextracted by phenol/chloroform treatment, precipitatedby ethanol, and dissolved in TE buffer (10 mM Tris-HCl,
pH 8.0, 1 mM EDTA). The complete 16S rRNA gene
was amplified by PCR using the following 50 µL
mixture: 5.0 µL 10×Ex Taq buffer, 4.0 µL dNTP, 1.0 µL
forward primer, 1.0 µL reverse primer (20 mM each),37.5 µL distilled water, 0.5 µL Ex Taq polymerase(TaKaRa Bio) and 1.0 µL template DNA (about 50 ng
DNA). A primer set for the full-length 16S rRNA gene27

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)sequence of the genns Bacillus, Baci-F (5’-CTTTGAAAACTRAACRAAAC-3’) and Baci-R (5’-GCGCCCTTT
CTAACTTAACC-3’) was designed in this study.
PCR thermal cycling was carried out in 0.2 ml
reaction tubes in a GeneAmp PCR system 9700 (Applied
Biosystems). The thermal profile for amplification beganwith an initial denaturation step (2 min, 96 °C) followed
by 25 cycles of denaturation (2 min, 96 °C), annealing(40 sec, 53 °C) and extension (2 min, 72 °C), followed
by a final extension step (2 min, 72 °C). Aliquots of 5 µlfrom the PCR reaction mixture was analyzed by agarosegel (1%) electrophoresis to confirm the products.
The remainder of the PCR mixture (45 µL) was
subjected to electrophoresis and the desired DNA
fragment was purified and treated with exonuclease I(TaKaRa Bio) and shrimp alkaline phosphatase(Promega). Purified DNA fragments were sequenced
using the BigDye Terminator cycle sequencing kit
version 3.1 (Applied Biosystems) and an ABI Prism 310
Genetic Analyzer (Applied Biosystems). The sequencing
primers designed in this study were351R (5’-CCCACTGCTGCCTCCCGTA-3’),531F (5’-CAGCCGCGGTAATACGTAGG-3’),

692R (5’-TCTACGCATTTCCACCGCTACAC-3’),
811F (5’-GTCCACGCCGTAAACGATGAG-3’)
953R (5’-CGAATTAAACCACATGCTCCA-3’) and
1182F (5’-GGAGGAAGGTGGGGATGAC-3’).
The 16S rRNA gene sequences retrieved from the
DDBJ (DNA Data Bank of Japan)27) were aligned using
the ClustalX multiple sequence alignment program28).
The phylogenetic tree was reconstructed by theneighbor-joining method29) and was evaluated bybootstrap sampling30), expressed as percentages of 1000
replicates.
Results and Discussion
Bacillus sp. strain 149-1, CGTase producing bacteria,
was isolated from Japanese soil. The process of CGTase
purification from the strain 149-1 was followed byrelative enzyme activity (Table 1). The CGTase waspurified 16.3-fold with a yield of 21.4% and the specificactivity was 31,001 units/mg of protein. The molecularweight of the CGTase estimated to be 70 kDa by
SDS-PAGE (Fig 1).

Table 1. Summary of purification procedure.
Total activity(units)
Crude enzyme
13,430
DEAE-Cellulose
8,343
Starch adsorption
3,100
30 kDa polyethersulfone membrane
2,880
Steps

Total protein
Specific
Fold purification(mg)
activity (U/mg)
7.058
1,903
1.0
3.620
2,305
1.2
0.111
27,99214.7
0.075
38,416
20.2

Yield
(%)
100.0
62.1
23.1
21.4

Fig 1. SDS-PAGE profile of CGTase purified from strain 149-1.
Lane 1; molecular weight marker, Lane 2; 30 kDa polyethersulfone membrance, Lane 3; molecular weight marker.

28

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)The optimum temperature of the CGTase was 60 °C
both in the presence and absence of CaCl2. The CGTase
was stable at temperature of 50 °C or less without CaCl2,
however, in the presence of CaCl2; it was stable even at

65 °C (Fig 2). It has been reported that the presence of
substrate, product or Ca2+ enhances the stability of some
CGTase, and it was consistent with our observation. The
calcium ions increased the heat stability of the CGTase.

(a)

100.0

(b)

100.0

80.0

Relative activity (%)

Residual activity (%)

80.0

60.0

40.0

20.0

60.0

40.0

20.0

0.0

0.0

20

30

40

50

60

70

25

35

45

55

65

75

Temperature (°C)

Temperature (°C)

Fig 2. Effect of temperature on activity (a) and stability (b) of CGTase from strain 149-1.
(a) Reaction mixtures containing 50 µL of the enzyme solution and 0.25 mL of 2.0% soluble starch in 0.5 M
citrate-NaOH buffer (pH 5.0) were incubated for 20 min at various temperatures in the absence of CaCl2 (▲) or in thepresence of 5 mM CaCl2 (●). (b) Enzyme solution was incubated in 0.1 M citrate-NaOH buffer (pH 5.0) for 1 h atvarious temperatures in the absence (▲) or presence (●) of 5 mM CaCl2, and the residual activity was measured at
50 °C for 20 min. Standard deviations are shown as bars.
The CGTase was most active at pH 6.0 in

CGTase was stable over pH range 7.0-10.0, withphosphate-NaOH buffer. The CGTase also showed some
activity in a wide pH range of 5.0-10.0. At 50 °C themaximum stability at pH 9.0. The CGTase lost its
activity below pH 4.0 and above pH 10.5 (Fig 3).

(a)

100.0

(b)

100.0

Relative activity (%)

Residual activity (%)

80.0

60.0

40.0

20.0

80.0

60.0

40.0

20.0

0.0

0.0
2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

11.0

2.0

pH

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

11.0

pH

Fig 3. Effect of pH on activity (a) and stability (b) of CGTase from strain 149-1.
(a) Reaction mixtures containing 50 µL of the enzyme solution and 0.25 mL of 2.0% soluble starch in 0.5 M
citrate-NaOH buffer (pH 3.0-6.0) (◆), 0.5 M phosphate-NaOH buffer (pH 6.0-8.0) (■), 0.5 M HEPES-NaOH buffer(pH 7.0-8.0) (●), 0.5 M glycylglycine-NaOH buffer (pH 8.0-8.5) (▲) or 0.5 M glycine-NaOH buffer (pH 8.5-10.5)(×) were incubated at 50 °C for 20 min. (b) Enzyme solution was incubated in 0.1 M citrate-NaOH buffer (pH 3.0-6.0)(◆), 0.1 M phosphate-NaOH buffer (pH 6.0-8.0) (■), 0.1 M HEPES-NaOH buffer (pH 7.0-8.0) (●), 0.1 M
glycylglycine-NaOH buffer (pH 8.0-8.5) (▲) or 0.1 M glycine-NaOH buffer (pH 8.5-10.5) (×) at 50 °C for 1 h. The
solution was diluted with 0.15 mL of 0.5 M citrate-NaOH buffer (pH 5.0) and then the residual activity was measured at
50 °C for 20 min. Standard deviations are shown as bars.

29

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)bioconversion conditions2). The CGTase predominantly
catalyses cyclization, and to a lesser extent, hydrolysis2).
The CGTase was the alkalophilic Bacillus sp. 8SB type
enzyme. Like the other characterized CGTase thisenzyme produces a mixture of CDs, mainly β-CD (β-CD> γ-CD). Some β- and γ-CD were produced up to 7.01
mg/mL in 24 h, and the ratio of β- and γ-CDs was 5.9:1.1(Fig 4).

The effect of various reagents on CGTase activity ispresented in Table 2. The CGTase activity was stable atdivalent metal and EDTA, but decreased by AgNO3 andsurfactant. The result of the strain 149-1 CGTase stability
is similar to pattern of other Bacillus CGTase31-35).
The production yield and ratio of the different CDs
formed by CGTases is dependent not only on the CGTase
but also on the nature of the substrate and theFormation of CDs (mg/mL)aaaa

8.0

Table 2. Effect of salt or surfactant on CGTase stability.
The enzyme solution was incubated for 20 min at 50 °C
in 0.5 M Citrate-NaOH buffer (pH 5.0) containing 5 mMof each reagent or surfactant, and then the residual
activity was measured.
Reagent
None
AgNO3
CaCl2
CoCl2
CuCl2
FeCl2
MgCl2
MnCl2
NiCl2
EDTA・2Na

Residual
activity
100.0
71.3
103.7
102.1
101.2
104.6
101.6
101.4
99.1
101.6

1000

857
750

Surfactant
None
CTAB
SDS
TritonX-100
Tween20
Tween80
Tween85

Residual
activity
100.0
36.2
8.6
19.7
83.4
87.6
85.7

7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
0

10

20

30

40

50

Reaction time (h)Fig 4. Course of CD formation from soluble starch by
CGTase. Soluble starch of 0.95 mL in 0.5 M citrate-NaOH
buffer (pH 5.0) was incubated with 50 µL CGTase at
50 °C. CDs produced in the reaction mixture wereanalyzed by HPLC. ●, β-CD; ◆, γ-CD; ▲, Total
CD. Standard deviations are shown as bars.

Bacillus pseudofirmus DSM 8715T
Bacillus bogoriensis ATCC BAA-922T
861
Bacillus alcalophilus DSM 485T
Bacillus trypoxylicola KCTC 13244T
911
Bacillus pseudalcaliphilus DSM 485T
904
917
Bacillus akibai 1139T
774
Bacillus wakoensis N-1T
1000
510
Bacillus krulwichiae AM31DT
920
Bacillus hemicellulosilyticus C-11T
Bacillus halodurans ATCC 27557T
Bacillus gibsonii DSM 8722T
1000
Bacillus plakortidis P203T
Bacillus murimartini LMG 21005T
805
Bacillus clausii DSM 8716T
998
Bacillus patagoniensis PAT05T
982
Bacillus oshimensis K11T
859
Strain 149-1
1000T
854 ‘Bacillus hunanensis’JSM 081003
622 Bacillus lehensis MLB-2T
Bacillus selenitireducens MLS10T
999
655
Bacillus saliphilus 6AGT
Bacillus agaradhaerens DSM 872T
Bacillus vedderi DSM 9768T
611
627
Bacillus cellulosilyticus N-4T
999
Bacillus mannanilyticus AM-00T
Bacillus horti K13T
1000
Bacillus cohnii DSM 6307T
998
Bacillus horikoshii DSM 8719T
Bacillus halmapalus DSM 8723T
968
0.01
Bacillus megaterium IAM 13418T
T
Bacillus lentus NCIMB 8773
Bacillus firmus IAM 12464T
Bacillus circulans IAM 12462T
779
Bacillus subtilis DSM 10T
Staphylococcus aureus ATCC 29740T

Fig 5. Phylogenetic tree of the isolated strain 149-1 based on the full 16S rRNA gene sequences using theneighbor-joining method. Number at branches are bootstrap values, derived only for the nods supported by greater than
500 probability (1,000 replicates).
30

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)The complete sequence (1555 bp) of the 16S rRNA
gene of strain 149-1 was determined and was comparedwith those of closely taxa retrieved from the DDBJ (Fig5). Pairwise sequence analysis revealed that the highest
sequence similarity was with Bacillus lehensis MLB2T 36)(99.5%),
followedby“Bacillus
hunanensis”
T 37)
JSM081003(99.0%) and Bacillus oshimensis K11T 38)(98.5%).
CGTases from Bacillus lehensis was reported by Yap
et al.39) and Kate et al.40). The optimal pH of CGTasefrom Bacillus lehensis MLB2T was pH9.240). In thesereports, the optimization of CGTase production by
Bacillus lehensis was discussed. This paper reports thefirst purification and detailed characterization of CGTasefrom the related species of Bacillus lehensis. The
CGTase from strain 149-1 exhibits distinct feature interms of pH activity. Therefore, it can be concluded thatthe purification and characterization of CGTase from
Bacillus sp. strain 149-1 enable the application of the
enzyme for CD production.

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32

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)ORIGINAL PAPER
NOTE

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11, 33-36

Tamegai Ha,b), Itagaki Sb) and Kato Cc)

Molecular analysis of the nitrogen cycle in deep-sea microorganisms from the
Nankai Trough: genes required for nitrogen fixationa)

Department of Chemistry, College of Humanities and Sciences, Nihon University, 3-25-40, Sakurajosui, Setagaya-ku,
Tokyo 156-8550, Japanb)
Department of Correlative Study in Physics and Chemistry, Graduate School of Integrated Basic Sciences, Nihon
University, 3-25-40, Sakurajosui, Setagaya-ku, Tokyo 156-8550, Japanc)
Institute of Biogeosciences, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology, 2-15, Natsushima-cho,
Yokosuka 237-0061, Japan
Correspondence author: Hideyuki Tamegai, htamegai@chs.nihon-u.ac.jp
TEL +81-3-5317-9413 FAX +81-3-5317-9433
Received: March 12, 2012 /Revised: April 10, 2012 /Accepted: April 20, 2012
Abstract We isolated DNA fragments which encode
putative nitrogenases, a crucial enzyme for bacterial
nitrogen fixation, from deep-sea environmental DNA
recovered from the Nankai Trough. Only one
environmental DNA sample out of six contained target
DNA, and the sequences of the obtained fragments
showed quite low diversity. Further, they resembled
known sequences from isolated organisms or otherenvironmental DNAs. However, these environmental
DNA samples were the same as the ones from which wehave already found many genes for nitrification anddenitrification. Thus, these results suggest the existenceof the entire nitrogen cycle within a limited area in the
deep sea.

using the The Japan Agency for Marine-Earth Scienceand Technology (JAMSTEC) unmanned submersible
KAIKO in 19967, 9, 10). Further, we have identified genes
for nitrification and denitrification from deep-sea
environmental DNA extracted from the mud of the
Nankai Trough8). These results suggest that the nitrogen
cycle operates even in the depths of the deep-sea.
However, we have no further information regarding
nitrogen fixation in these areas.
Relative to oceanic nitrogen fixation, it is known thatmethane seep sustains abundant biomass which likely
requires a ready supply of fixed nitrogen in the
deep-sea4).Therefore, molecular analyses of nitrogen
fixation were carried out at multiple sites in the deep sea,
especially in the methane seep sediments2, 3). In thesestudies, the gene encoding nitrogenase (nifH) can be auseful marker to study the diversity of nitrogen-fixing
organisms because it is the key enzyme in nitrogen
fixation catalyzing the reduction of dinitrogen toammonia.
In this study, we identified nifH-homologous genes indeep-sea environmental DNA from the Nankai Trough.
Many genes for nitrification and denitrification havebeen also found from the same environmental DNA
samples8). These results suggest the existence of theentire nitrogen cycle within a limited area of the deep sea.

Key words: Nankai Trough, deep-sea, nitrogen fixation,
nitrogenase, environmental DNA
Nitrogen fixation (reduction of N2 to ammonia),
nitrification (oxidation of ammonia to nitrate via nitrite),and denitrification (reduction of nitrate to N2 via nitrite,
nitric oxide and nitrous oxide) are essential functions of
the nitrogen cycle on the Earth, carried out by
microorganisms. We have isolated the denitrifier
Pseudomonas sp. strain MT-1 from the mud of theMariana Trench collected with a sterilized mud sampler

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)search was carried out with BLAST 11) on the Internet(http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html).
Anevolutionarytree
wasconstructedbytheneighbor-joining method 5) using DNASIS Pro. The
sequences determined in the present study have been
deposited in the DDBJ/EMBL/GenBank nucleotide
sequence databases with the accession numbers shown in
Fig. 1.
For the analysis of the nifH genes, 8 individual clones(325-328 bp) were obtained from one of the six deep-sea
samples 6K884-S2 (Fig. 1). No amplification of DNA
fragments of corresponding length was observed in theother five deep-sea environmental samples althoughgenes for denitrification and nitrification have beenfound 8). We used single primer set in this study. So, atleast, these five samples contained no DNA fragments
which were amplified with the primers used in this study.
Even in the case of 6K884-S2, the amplicon levels werequite low (data not shown). The diversity of the genes
was also low and the sequences resembled those of
known nitrogen-fixing bacteria like cyanobacteria(Microcoleus) and sulfur-reducing bacteria (Desulfovibrio), or environmental DNAs from different area. The
reason why the target genes were found only in
6K884-S2 is unclear. It was extracted from the mud of
chemosynthetic communities. However, 6K882-S2 and6K883-S4 were also from the mud of chemosynthetic
communities. Further, it is difficult to discuss therelationship between the depth and the existence ofnitrogen-fixing bacteria with our present data.
In the present study, we identified genes for nitrogen
fixation in the deep-sea environmental DNA extracted
from the mud of the Nankai Trough from which thegenes for nitrification and denitrification have beenfound. Although the diversity of these genes was low,
this result suggests that nitrogen-fixing organisms live inthe same areas with nitrifiers and denitrifiers in the
Nankai Trough and the nitrogen cycle is operative evenin the closed space of the deep-sea.

Molecular studies of the nitrogen cycle could provide
novel insights into the energy conservation systems inthe deep-sea.
The environmental DNA samples from deep-sea
sediments (cold-seep sediments)1) of the Nankai Troughwere used for the amplification of nifH. From thesesamples, we have identified many genes for nitrificationand denitrification8). Samples 6K881-S1 (34°04.003'N,
137°47.217'E, 652 m depth, normal bottom), 6K882-S2(34°04.509'N,
137°47.351'E,
609m
depth,
chemosynthetic communities), 6K883-S1 (33°15.809'N,
136°42.993'E, 2,071 m depth, normal bottom),
6K883-S4 (33°15.782'N, 136°43.055'E, 2,046 m depth,
chemosynthetic communities), 6K884-S1 (32°34.974'N,
134°41.718'E, 3,310 m depth, normal bottom), and6K884-S2 (32°34.930'N, 134°41.682'E, 3,306 m depth,
chemosynthetic communities) were used.
For the amplification of nifH, nifH1F and nifH2R
were used as primers (nucleotide numbers 109-125 for
nifH1F and 454-470 for nifH2R based on the sequenceof nifH of Desulfovibrio gigas, U68183) 12). PCR (onecycle at 95ºC for 10 min, followed by 40 cycles of 95ºC
for 1 min, 54 ºC for 1 min, and 72ºC for 1 min, and then72ºC for 10 min) was carried out with 2.5 mM MgCl2
using soil DNA as templates. Because of the low yield of
the corresponding bands, a second PCR was carried out
using the initial PCR products as templates. The reaction
conditions utilized were the same as that of the first PCR.
The second PCR product was subcloned into pT7-blue T
vector (Novagen, San Diego, CA, USA), and theresulting plasmid was sequenced randomly.
DNA manipulations were performed as described in
the literature6). DNA sequencing was carried out by Bio
Matrix Research (Chiba, Japan). PCR was performed
with a MyCycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) using
AmpliTaq Gold DNA polymerase (Applied Biosystems,
Foster City, CA). Oligo DNA for PCR primers weresynthesized by Sigma Genosys (Hokkaido, Japan).
Purification of plasmids was carried out with a GFX
MicroPlasmid Prep Kit (GE Healthcare Bio-Sciences,
Piscataway, NJ). Restriction and modification enzymes
were purchased from Takara Bio (Shiga, Japan). Allother reagents were of the highest grade commerciallyavailable. Genetic analysis was performed with DNASIS
Pro (Hitachi Solutions, Tokyo, Japan) and a database

Acknowledgements
The authors thank Professor Howard K. Kuramitsu forassistance in editing the manuscript.

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)Fig. 1. Phylogenetic tree of nifH.
The tree was constructed based on the sequence corresponding to the amplified region. Boxed clones were obtained inthis study. Accession numbers are in parenthesis. The bar indicates 0.1 nucleotide substitutions per site. The sequence of
Rhodobacter capsulatus chlorophyllide reductase iron protein was used as an outgroup.

35

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)References
1) Arakawa S, Sato T, Yoshida Y, Usami R, and Kato C.
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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)

書評
大島泰郎著「極限環境の生き物たち」

著者：大島泰郎先生

本年 4 月に、極限環境生物に関わる研究や教育に携わる人々にとっては、待望の書「極限環境の生き物たち」（大島泰郎著、技術評論社）が出版されました。著者の大島先生は、長年にわたりこの分野を牽引されてきた第 1 人者であり、当極限環境生物学会の副会長としても後進の指導と育成にご尽力いただ
いている先生でもあります。
本書では、熱水を好む好熱性の微生物から、塩分や有機溶剤、圧力、乾燥といった各種の極限環境に適応している個性的な生き物たちについて分かり易く紹介され、宇宙空間でも死なないと近年話題をさらっている極限環境生物「クマムシ」にいたるまで幅広く解説されています。文章には学術書につきものの堅苦しい表現など全くなく、一般の方々向けに平易にかみ砕かれて書かれております。大島先生が普段会話されているお優しいお人柄がにじみ出ている、話し言葉そのもので記述されている点が、本書の大きな特色であります。たとえば、「好奇心。極限環境生物の研究はここから始まる」の章に、「なぜ、・・・研究をするのですか?」の返答に、「生命への理解が深まる・・・バイオテクノロジーの応用に役立つ— を回答することが多いのです・・・。しかし、そう答える度に、内心ではもう一人の自分が「少し違うんだよなぁ」と叫んでいます。」とありますが、これは研究者ならば誰しも共感する一言ではないでしょうか?普段の会話の中の先生の、ユーモアの中にも薀蓄のあるお声が聞こえてくるような感じがするのです。こうした調子で、大島先生の蘊蓄やユーモアが本書いっぱいにちりばめられています。
本書のもう一つの特徴は、コラム欄「Extreme な

Column」のユニークさにあります。これはもう、大島先生しか知らないような素敵な秘話でいっぱいであります。オランダの著名な画家フェルメールと顕微鏡発明者のレーベンフックとの交流とか、ロシアの最後の皇帝ニコライ 2 世の娘、アナスターシアの消息の話など、現地に友人や弟子たちを持つ先生でしか知りえない「秘話」そのものです。コラムで明かされたひとつひとつの秘話だけでも、十分 1 冊の本がかけるようなネタと内容であることは間違いな
いと感じました。ということは、読者はこの本を 1
冊読むだけで、数冊の科学書と歴史書から得られるだけの知識が与えられるということであります。1
冊 1,580 円で数冊の価値のある、なんとお得な、費用対効果の高い本なのでしょうか！
本書は、極限環境生物に関わる人たちだけではな
く、広く一般に普及すべき本でもあります。私たちの家族、隣人・友人たちを始め、自然や地球環境、そして深海、地殻内、宇宙といった極限環境下の生命に思いを寄せる人々には、格好の良書であると確
信いたします。私自身、今後は研究所の後輩たちや、学生たちにこの本を広く啓蒙して、さらにもう 1 歩
深く極限環境生命に思いを寄せていきたいと感じました。
おわりに・・大島先生、この素晴らしい本を世の中にお贈りいただき、ありがとうございました。
独立行政法人海洋研究開発機構
海洋･極限環境生物圏領域
加藤 千明

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)

学会記事
極限環境生物学会第 13 回シンポジウム報告
第 12 回シンポジウムは、6 月 23 日に東洋大学・白山第 2 キャンバスで開催されました。
「極限環境生物の開拓と応用」をテーマとして、掘越弘毅会長による一般公開シンポジウムもまじえて、一般人も含めて多くの会員・非会員の皆様にご参集いただき、大変盛況な中で開催することができました。参加者合計は 220 名（内訳を以下の表に示す）となり、シンポジウムとしては最大規模の参加者人数となりました。本シンポジウムを主催していただきました、東端シンポ委員長をはじめとする若手シンポ委員の皆様によりすべて企画された大変充実した会となりました。ご参加いただいた皆様方に事務局一同心より感謝申し上げます。

一般
学生
総計

事前申し込み人数
61（会員 48、非会員 13）82（会員 2、非会員 80）
143（会員 50、非会員 93）

当日申し込み人数
一般公開講演申し込み
44（会員 6、非会員 38）
33（会員 0、非会員 33）
77（21）（会員 6、非会員 71）

合計105（会員 54、非会員 51）115（会員 2、非会員 113）
220
（会員 56、非会員 164）

【プログラム】
11:00-11:05
開会の挨拶
11:05-11:40
藤澤 誠（東洋大学 生命科学部）
講演タイトル ゲノム解析から見えてきたナトリウムイオン非依存性の好アルカリ性細菌の環境適応機構
11:40-12:15
講演タイトル

荒川 和晴（慶應義塾大学 先端生命科学研究所）
ヨコヅナクマムシ乾眠機構のメタボローム解析

13:25-13:30

一般公開シンポジウム開会挨拶

13:30-14:30
掘越 弘毅（極限環境生物学会 会長）
講演タイトル
好アルカリ性微生物学の事始め『諸君、38 億年の歴史を持つ生命が待っている。既存の生物学を越えてゆけ、
新しい研究分野を生み、そしてその名付け親となれ！』
14:30-14:35

一般公開シンポジウム閉会挨拶

14:35～15:00

コーヒーブレイクと展示イベント（フロアで機器展示会：12:00～17:40）

15:00-15:35
講演タイトル

阿部 文快（青山学院大学 理工学部）
高水圧下の微生物生理15:35-16:10
講演タイトル

本田 孝祐（大阪大学大学院 工学研究科）
耐熱性酵素モジュールを用いた合成代謝工学への挑戦

16:10-17:10

日本学術振興会賞・日本学士院学術奨励賞 受賞記念講演
高井 研（海洋研究開発機構 海洋・極限環境生物圏領域）
生命とは何か ー 極限環境生物学の目指すべき答え

講演タイトル38

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)

最後に、本シンポジウムを主催者側として盛り上げていただいた東洋大学の東端シンポ委員長をはじめとする関係者一同に感謝申し上げます。ありがとうございました。
極限環境生物学会事務局

第１３回

極限環境生物学会年会のお知らせ

以下の要領で年会を開催いたします。皆様のご参加をお待ちしております。
テーマ：1000 年後を見据えて
場所：日本大学文理学部キャンパス 3 号館 5 階
日時：2012 年 12 月 1 日（土） 2 日（日）詳しくは、当学会ホームページ並びに当学会 facebook 告知等によりお知らせいたします。
極限環境生物学会事務局

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)

学会誌投稿規定
極限環境生物学会誌投稿規定
１．投稿者の資格
極限環境生物学会誌（ISSN 1348-5474） (Journal ofJapanese Society for Extremophiles)（以下、本誌という）への投稿は極限環境生物学会（以下、本学会という）会員に限る。なお、連名による投稿の場合には、少なくとも著者の一人が本学会会員でなければならない。ただし、日本国以外からの投稿並びに本学会が寄稿を依頼した場合は例外とする。

け付ける。この場合、極限環境生物学会ホームペー
ジに掲載されている投稿要領に従うこと。

２．論文の種類
本誌への投稿論文は、極限環境生物関連分野の原著論文（通常論文、短論文）、総説、並びに諸報とし、いずれも未発表のものに限る。
（１）原著論文 (original papers)：極限環境生物に関する論文で以下の２つのいずれかに該当する論文。
１）通常論文 (regular papers)：極限環境生物に関する論文で、それ自体独立した、価値のある結論ある
いは事実を含む論文。
２）短論文 (short communications)：極限環境生物に関する論文で、断片的な結果ではあるが新しい事実や価値のあるデータを含む短い論文。
（２）総説 (reviews)：極限環境生物のある特定の研究分野について、簡単な歴史的背景を含め、最近の進歩を要約し、可能であれば、将来の研究方向性をも指し示した論文。
（３）ミニレビュー (mini-reviews)：総説の内、比較的短く纏めたもの。
（４）諸報：巻頭言、研究最前線、研究のルーツを探る、学会関連記事等。

５．論文の審査
投稿された論文の内、原著論文、総説、ミニレビュ
ーの審査には、極限環境生物学会誌編集委員の内１名が責任編集委員として関与する。原著論文および総説の審査は、責任編集委員が適宜指名する複数の査読者によりなされる。掲載の可否に関する最終判
定は、査読者からの査読結果報告に基づき責任編集委員が行う。その後、編集委員長が著者に審査結果を通知する。なお、内容・体裁に問題があると判断された原稿については、著者による修正を求める。
修正を求められた原稿は、２ヶ月以内に責任編集委
員に返送することとし、２ヶ月を過ぎて返送されなかった原稿は、著者が原稿を取り下げたものとして処理する。なお、投稿された論文は返却しない。

３．論文の書き方
論文の用語は日本語または英語とし、別途定める「原稿執筆要領」に従い簡潔に分かりやすく作成すること。総説は原稿３０頁以内、通常論文は原稿２０頁
以内、ミニレビューは原稿１５頁以内、短論文は原稿１０頁以内とする。なお、諸報の頁数に関しては編集委員会で適宜判断する。

７．別刷り
別刷りは、pdf ファイルとして配布する。

〒113-8657 東京都文京区弥生 1-1-1 東京大学大学
院農学生命科学研究科応用生命工学専攻（東大院農生科応生工と省略可）極限環境生物学会誌編集委員長
石 井 正 治 ( 電 話 ： 03-5841-8258, FAX ：03-5841-5272) (e-mail: amishii@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp)

６．校正
校正は初稿のみ著者に送付する。到着日より３日以内に、原稿とともに指定された送付先に返送すること。なお、原著論文ならびに総説に関しては、著者
校正時の文章・図表の追加や削除は一切認めない。

８．著作権
本誌に掲載された論文の著作権は本学会に帰属する。
９．その他
極限環境生物学会誌投稿規定ならびに極限環境生物
学会誌論文執筆要領で不明な部分に関しては、極限環境生物学会誌編集委員会において適宜対応する。
なお、必要が認められる場合には、文書化を進めるものとする。

４．論文の受付
論文原稿は諸報を除き、原稿原本の他にコピー３部を付け、送付状とともに簡易郵便書留として下記宛に送付すること。なお、オンラインによる投稿も受

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)

論文執筆要領
極限環境生物学会誌論文執筆要領
１．一般的事項（１）テキストファイル形式または Microsoft Word
形式で保存できるワードプロセッサ等を用いて原稿を作成すること。
（２）タイトルページには、1)論文題名、2)著者名、
3)著者所属機関名、4)ランニングタイトル、5)連絡対
応著者名およびその連絡先住所・電話番号・FAX 番号・e-mail アドレス、6)キーワード（５語以内）を明示すること。日本語で作成した論文には、これらの英語訳を併記すること。
（３）論文印刷には A4 版用紙の片面を使用し、１
行４０字（英語の場合には１行６０字）、１頁２５行で印刷すること。イタリック、ボールド、あるいはスモールキャピタルにする語句がある場合は、それぞれ赤字で下線、波下線、二重下線を記すこと。
（４）略語リストがある場合には、本文第１頁に脚注として略語の項を設け表記すること。単位系と省略記号は SI 単位を基本とする。
（５）生物の命名及び記載は International Code of
Nomenclature of Prokaryotes, International Code ofBotanical Nomenclature, International Code ofZoological Nomenclature に従う。学名が初出の場合は全部を記載すること。原則として、２回目以降は属名の頭文字を略号とするが、紛らわしい場合には省略せずに記載すること。
（６）物質名の表記は以下の規定に従うこと。
１）有機化合物の表記および放射性同位元素による標識化合物の表記は IUPAC 規定に従うこと。
２）生化学関連事項の命名は IUPAB 制定の命名法に従うこと。
３）化学式に用いられる記号、略号などは Chemical
Abstracts の用例に従うこと。
（７）論文受理後、完成した本文および図表等の印刷に必要な全てのファイルを収めた電子媒体を編集委員長宛に郵送するか、またはそれらのファイルを
e-mail 添付書類として編集委員長宛に送付すること。
２．投稿論文の構成（１）原著論文は 1)標題、2)アブストラクト、3)本
文、4)引用文献、5)表ならびに図、図の説明文、の順にまとめること。
（２）標題は論文内容を具体的に表す簡潔なものとすること。標題の下に著者名、所属機関名、所在地を書く。著者が複数で、所属機関が異なる場合は、
著者名末尾に上付数字を付けて区別するとともに、連絡対応著者名を指定すること。
（３）原著論文ならびに総説のアブストラクトは英語で記述するものとし、通常論文・総説では200words 以内、短論文では 100words 以内で作成す

41

ること。
（４）通常論文の本文は原則として、緒言、材料および方法、結果、考察（あるいは結果と考察）、謝辞で構成する。短論文では項目分けをしない。
（５）原著論文ならびに総説では、必要に応じて図表を用いる。それぞれの図表を挿入したい位置を、原稿右側の余白部分に指示すること。
（６）文中での文献の引用は、引用文献の項目で整理した文献番号を用いること。図表の引用はその番号によること。
（７）脚注が必要な場合には、該当事項の右肩に通し番号を付け、当該頁の下部に説明文を付けること。
３．引用文献（１）引用文献は下記の例に準じ、本文中の該当人
名あるいは事項の右肩に 1), 1-3)のように番号を付し、また、本文末尾の引用文献の項に第一著者のファミリーネームのアルファベット順に 1., 2., 3., --の番号を付し一括記載する。Ibid., idem は用いないこと。私信、未発表の研究結果、学術雑誌に受理される前の論文、抄録が印刷されていない口頭発表など
は引用文献に含めないこと。雑誌の略号は、Chemical
Abstracts Service Source Index (CASSI) 1907-1984(Cumulative)およびその補遺版により、雑誌名、書名、
年、巻および頁の示し方は下記によること。
（２）雑誌引用のとき
Chuakrut, S., Arai, H., Ishii, M., and Igarashi, Y. 2000.
Characterization of a bifunctional archaeral acylcoenzyme A carboxylase. J. Bacteriol. 185: 938-947.
（３）書籍引用のとき
児玉徹. 1997. V 近代的な微生物利用工業１．アルコール, pp191-197.児玉徹・熊谷英彦編, 食品微生物学,
文永堂出版
４．表と図およびその説明（１）表と図は印刷版下を作成すること。
（２）本文を英語で書いた場合には図表も英文で作成すること。
（３）表と図は一つに対して１頁使う。各頁の右上に著者名ならびに図の番号を入れること。
（４）表題は表の上部分に書くこと。表の内容説明
文ならびに注は、表の下に記述する。注の表示にはa),b),c)を上付で明記し、記述には a),b),c)を上付にせず用いる。
（５）図の標題ならびに説明文は別紙にまとめて印刷すること。図の標題の最後にはピリオドを付し、内容説明は標題の後に改行して記載すること。
（６）写真は明瞭な陽画を必要部数添付すること。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)

学会会則
極限環境生物学会会則（名称）第１条 本会は、極限環境生物学会（英文名：TheJapanese Society for Extremophiles ）という。
（以下本会という）（目的）
第２条 本会は、極限環境生物研究の発展に寄与し、極限環境生物の研究、教育、利用の推進に寄与することを目的とする。
（事業）
第３条 本会は、研究発表会及び講演会等の開催、
極 限 環 境 生 物 学 会 誌 （ 英 名 ： Journal ofJapanese Society for Extremophiles）の発行、
国際極限環境生物学会等との連携事業、研究奨励賞・ポスター賞の授与、その他前条の目的を達成するために必要な事業を行う。
（会員の種別等）
第４条
1. 本会の会員は正会員、団体会員および賛助会員とする。
2. 正会員は極限環境生物に関する研究に従事する、または、これに関心を持つ個人であって、本会の目的に賛同し、定められた会費を納めた者をいう。
3. 団体会員は極限環境生物に関心を持つ団
体（法人等）であって、その団体内の本会の目的に賛同する代表者を含めて３名以内の所属者を指名して会員登録を行い、定められた会費を納めた団体をいう。
4. 賛助会員は本会の目的に賛同し、定められた賛助会費を１口以上納めた個人または団体をいう。
第５条 会員は本会が開催する諸事業に参加し、本会の発行する印刷物、PDF 等の配布を受けることができる。
（入会）
第６条 会員として入会しようとする個人または団
体は、本会事務局が定める手続きに従って申し込みを行い、本会会長による承認を得なければならない。
（会費）
第７条 会員は下記の会費を納めるものとする。
正会員
年額 5,000 円（但し身分が学生である者は年額 2,000 円）

団体会員 年額 20,000 円
賛助会員 年額 一口以上（一口 30,000 円）（退会）
第８条 会員は会長に届けることによって退会する

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ことができる。
（役員）
第９条
1. 本会には会長 1 名、副会長 2 名、評議員若干名、幹事若干名、会計監査 2 名の役員をおく。
2. 会長は本会を代表し、会務を統括する。
3. 副会長は会長を補佐し、会長に事故ある場
合には会長の職務を代行する。
4. 幹事は、幹事長、庶務、学術活動、会計、を分担し、事業計画の立案、事業の実施、庶務会計、シンポジウムの企画立案、学会誌発行、国際極限環境生物学会等との連絡などの本会の事務を行う。
5. 会計監査は本会の会計を監査する。
（役員の選出）第１０条 会長、副会長、評議員は本会の総会において選出される。
1. 幹事、会計監査は、副会長、評議員以外の正会員の中から会長が指名し、総会の承認を受ける。
2. 評議員の任期は２年とし重任を妨げない
が、連続３期を限度とする。但し、会長が指名する評議員はこの限りではない。
（委員会）
第１１条 本会に学会誌編集委員会、研究奨励賞選
考委員会、シンポジウム委員会を置く。各委員会委員の任期は 2 年とするが重任をさまたげない。
1. 学会誌編集委員会（会長指名の若干名で構成し､委員長は互選する）は学会誌の編集、論文審査の任にあたる。
2. 研究奨励賞選考委員会（副会長が委員長を勤め、学術活動担当幹事と委員長指名の委員、計 10 名程度で構成する）は本会の研究奨励賞受賞者を選考する。
3. シンポジウム委員会（会長指名の若干名で構成し､委員長は互選する）は学術活動幹事と共同でシンポジウムを企画立案し、運営をサポートする。
（評議員会）
第１２条 評議員会は会長、副会長、評議員をもって構成する。会長は年１回以上評議員会を召集し、議長となり、会の重要事項を審議し総会に提案する。

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol.11 (1)（総会）
第１３条 本会は原則として年１回総会を開き、会務を協議し議決する。
総会は会長が召集する。
第１４条 総会の議決は出席会員の過半数の賛成をもって行う。
（会計年度）
第１５条 本会の事業年度は 1 月 1 日に始まり、同年 12 月 31 日に終る。
（付則）第１６条 本会則の施行および本会の運営についての細則は総会の議決を経て別に定める。

学会細則

第１７条 本会則の変更は総会の議決を経て行う。
第１８条 本会則は、1999 年 10 月 19 日より施行する。
2001 年 11 月 29 日改定
2002 年 12 月 1 日改定
2003 年 12 月 1 日改定
2005 年 11 月 7 日改定
2007 年 12 月 1 日改定
2010 年 1 月 1 日改定

極限環境生物学会細則（会員）
第１条 入会を承認された正会員、団体会員、賛助
会員は、所定の会費を速やかに納入する。
（総会）
第２条 総会の議案は副会長、幹事等と共に会長が作成し、評議員会の議を経た後提出する。
議案には前年度の事業内容及び収支決算、
新年度の事業計画、及び収支予算を含むものとする。
第３条 総会は会員の１／１０以上の出席（但し委任状を含む）をもって成立する。
（役員の選出）第４条 会長、副会長、評議員は会員の選挙によって決められる。会長は選挙によらず評議員を指名することが出来るが、総会での承認を必要とする。
第５条 会長は会員の中から少なくとも３名を選んで選挙管理委員を委嘱する。選挙管理委員
は選挙事務を行う。
第６条 会長は、評議員会の承認を得て必要な委員会を作ることが出来る。
（評議員会）
第７条 評議員会は評議員の半数以上の出席（委任状を含む）をもって成立する。

第８条 評議員会の決議は出席者の過半数の賛成により成立する。
（退会）
第９条 会長は、会費を３年以上滞納した会員を退会させることが出来る。
（授賞）
第１０条 研究奨励賞・ポスター賞の授賞規定は別途定め全会員に配布する。
（細則の変更）第１１条 本細則の変更は総会の議決による。
（付則）第１２条 今期の本会事務局は、東洋大学生命科学部井上研究室（群馬県邑楽郡板倉泉野）内とする。
第１３条 本細則は、1999 年 10 月 19 日よりこれを実施する。

2002 年 12 月 1 日改定
2003 年 12 月 1 日改定
2006 年 6 月 30 日改定
2007 年 12 月 1 日改定
2010 年 1 月 1 日改定

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Journal of Japanese Society for Extremophiles (2012) Vol. 11 (1)

運営体制
極
会長
副会長

限環境生物学会運営体制（2012~13 年度）

掘越弘毅

独立行政法人海洋研究開発機構

大島泰郎

共和化工株式会社

工藤俊章

長崎大学大学院水産・環境科学総合研究科

環境微生物学研究所

評議員（５０音順、敬称略）

幹事会

秋野利郎

合同酒精株式会社

幹事長

井上明

東洋大学 生命科学部

五十嵐泰夫

東京大学大学院 農学生命科学研究科

庶務

亀倉正博

好塩菌研究所

石野園子

九州大学大学院農学研究院

加藤千明

独立行政法人海洋研究開発機構

石井正治

東京大学院 農学生命科学研究科

石野良純

九州大学院 農学研究院

伊藤進

琉球大学 農学部

編集委員長

伊藤佑子

創価大学 工学部

学会誌担当

今中忠行

立命館大学 生命科学部

高品知典

東洋大学 生命科学部

大島敏久

九州大学大学院 農学研究院

古園さおり

独立行政法人理化学研究所

大森俊雄

芝浦工業大学大学院 工学研究科

跡見晴幸

京都大学大学院 工学研究科
独立行政法人理化学研究所

学術幹事

長田洋子

日本大学

伊藤隆

鎌形洋一

独立行政法人産業技術総合研究所

仲宗根薫

近畿大学 工学部

川上文清

東洋紡績株式会社 敦賀バイオ研究所

國枝武和

東京大学 大学院理学系研究科

河原林裕

独立行政法人産業技術総合研究所

青木俊夫

日本大学 生物資源科学部

倉光成紀

大阪大学大学院 理学研究科

為我井秀行

日本大学 文理学部

小林哲夫

名古屋大学大学院 生命農学研究科

シンポ担当

伊藤政博

東洋大学 生命科学部

小林良則

財団法人バイオインダストリー協会

HP 担当

三輪哲也

独立行政法人海洋研究開発機構

佐上博

東北大学 反応化学研究所

会計

宇佐美論

東洋大学 理工学部

道久則久

東洋大学 生命科学部

高瀬光徳

森永乳業（株）・栄養科学研究所

伊藤俊洋

財団法人 北里環境科学センター

芝弘孝

サントリービジネスエキスパート株式会社

菅原秀明

国立遺伝学研究所

鈴木健一朗

独立行政法人製品評価技術基盤機構

中川和倫

愛媛県立松山南高等学校

中村聡

東京工業大学大学院 生命理工学研究科

南部滋郎

日本赤十字九州国際看護大学 看護学部

長谷川功

日本大学 生物資源科学部

半澤敏

東ソ−株式会社 東京研究所

別府輝彦

日本大学

松井裕

石川県立大学 生物資源工学研究所

丸山正

独立行政法人海洋研究開発機構

山岸明彦

東京薬科大学 生命科学部

湯本勲

独立行政法人産業技術総合研究所

若木高善

東京大学大学院 農学生命科学研究科

渡辺公綱

独立行政法人産業技術総合研究所

会計監査

シンポジウム委員会
委員長

東端啓貴

東洋大学

生命科学部

委員

仲山英樹

長崎大学

環境科学部

相馬亜希子

千葉大学

園芸学研究科

黄川田隆洋（独）農業生物資源研究所

乾燥耐性研究グループ
峯岸宏明

東洋大学

バイオ・ナノエレクト

ロニクス研究センター

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鈴木宏和

九州大学院

小西正朗

（独）海洋研究開発機構

農学研究院

Journal of Japanese Society for Extremophiles (2011) Vol.10 (1)

編 集 後

記

今年前半のハイライトである、極限環境生物学会第 13 回シンポジウムにて、掘越当学会会長による一般公開講演が行われました。会長は、現在、これまでの研究人生ならびに極限環境下の生命の発見、そして今日までの極限環境生物学の発展を、1 冊の本にまとめ上げる予定であるとお話しされました。本年前半には、大島副会長が執筆された「極限環境の生き物たち」（本誌書評を参照）が公刊され、そして後半にこの会長の本が公刊されると、今年は、記念すべき極限環境生物イヤーになります。今後の当学会の発展に向けて、会員各位のますますのご協力をお願いするものであります。では、今年の、日大年会で皆様にお会いできることを楽しみとしております。
庶務幹事 加藤千明

編集委員会
委員長 ：石井正治（東大）
副委員長：石野良純（九大）
委員：阿部文快（青学大）、伊藤 隆（理研）、鎌形洋一（産総研）、河原林裕（産総研）、
高品知典（東洋大）、為我井秀行（日大）、中村 聡（東工大）、中村 顕（筑波大）、
三輪哲也（JAMSTEC）、湯本 勲（産総研）

学会事務局〒374-0193 群馬県邑楽郡板倉町泉野 1-1-1
東洋大学 生命科学部 生命科学科 井上研究室内
極限環境生物学会事務局 井上 明 (幹事会幹事長)
E-mail: kyokugenjm10@extremophiles.jp
学会誌編集〒237-0061 神奈川県横須賀市夏島町 2-15
独立行政法人海洋研究開発機構 海洋・極限環境生物圏領域 (加藤千明、庶務幹事)
TEL：046-867-9550 FAX：046-867-9525 E-Mail：kyokugenjm10@extremophiles.jp
発刊日 2012 年 8 月 31 日

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