豚病会報

No.
70 2017

19トピックDNAマーカーを用いた豚の育種改良研究について
藤村達也、両角岳哉、高萩陽一（日本ハム㈱中央研究所）
Fujimura,T.
,Morozumi,T.
andTakahagi,Y.(
2017).DNAmar
ke
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g.
Proc.Jpn.Pi
gVet.So
c.70,1924.

キーワード：抗病性育種、PRRSウイルス、ゲノム編
集

感染などによる疾病の増加、または、日和見感染症や複合感染といった新たな問題が発生してきている。特に大きな問題となっているのが、様々な感染症の発生

１．はじめにによる事故率の増加である。

ニッポンハムグループは、食肉、食肉加工品、デリ感染症は、ウイルス、細菌、原虫あるいは真菌など

食品、水産品、乳製品などの１３の領域で事業を行っての病原微生物が豚に感染し、体内で増殖して発症するいる食品企業である。グループ全体の売上額は、約１疾病であり、これらの発生を最小限に抑制することが、兆２４００億円（平成２８年３月）であるが、その社名にも感染症に対する抵抗性が未熟な哺乳豚や離乳後の子豚なっているハム・ソーセージなどの食肉加工品の売上の事故率低減のために重要である。

比率は１０数％に過ぎず、売上げの５０％以上を食肉の販

養豚現場の疾病対策は大きく分けて、３種類に分類売が占めている。企業方針として掲げているバーティされる。１つ目は、ワクチンや抗生剤などの薬剤投与

カルインテグレーションシステムは、家畜の生産からによる予防・治療である。２つ目としては、豚舎の構処理加工、販売までのバリューチェーンを自社で行う造などを改善したり、清掃や消毒を徹底して行ったり一貫生産であり、その川上にある生産事業は、当社のといった環境面からの対策である。しかしながら、こ基幹事業の１つである。牛の生産拠点は海外が中心でれらの対策には、新たな設備投資が必要になったり、あるが、豚と肉用鶏の生産拠点は大部分が国内に存在労力やコストがかかったりするため、必ずしも万全なしている。その中で養豚農場は北海道、東北、南九州対策が講じられないことも多い。の３か所を拠点とし、年間約６０万頭の肉用豚を出荷し３つ目の対策として、遺伝子情報を活用した育種改ている。弊社の農場は大規模化・集約化が進んでおり、良があげられる。病原菌やウイルスの侵入に対する免最も飼養頭数（年間出荷頭数）が多い農場においては、疫応答力は、遺伝的要素も強く影響する。しかしなが年間約７万頭に達している。

ら、遺伝子情報を活用した育種は産仔数や飼料効率の国内養豚業全体においても大規模化・集約化が進ん向上などを指標とした改良には積極的に活用されていで い る。畜 産 統 計 に よ る と、平 成２８年 度 は 全 国 でるが、病気への抵抗性に関してはこれまで積極的には

９，３１
３，０００頭の豚が飼育されているが、ここ３０年で飼養用いられていなかった。その理由として、産仔数や増頭数にそれほど大きな変化はない。一方、飼養戸数は体重などの明確な指標と異なり、抗病性を評価する手７４，２００戸から４，８３０戸まで大幅に減少しているため、１法が固まっていない点があげられる。そこで今回我々戸当たりの飼養頭数が１４９．
１頭から１９２８．
２頭と１３倍近は、３つの抗病性指標を用いて育種選抜に活用した7)。

くにまで増加している。このような大規模化・集約化

これらの結果と合わせて、近年の技術革新を活用したは、低コスト生産や生産効率の向上を目的としたもの

将来展望についても紹介したい。

であるが、一方で、家畜へのストレス増加、微生物やウイルスの農場への蓄積、さらには豚繁殖・呼吸障害

２．抗病性育種による個体選抜と遺伝子マーカー症 候 群（porcinereproductiveand respirator
ysyn-の探索

drome,
PRRS）や豚流行性下痢（porci
neepidemicdi-

まず我々は、大ヨークシャー種において抗病性育種

arrhea,PED）などの過去には存在しなかったウイルスを試みた。理由として、大ヨークシャー種は、国内で

20

Pr
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圧倒的なシェアを持つ交雑肉用種の母豚集団を形成すまることが分かったので、次に免疫能の違いが実際のる主要な品種であるため、大ヨークシャー種の抗病性農場でどのぐらいの効果を発揮するかを調べるために、を高めることは、肉用種の子豚の事故率低下に大きな第３世代、第４世代それぞれの後代を用いて検討した。

影響を与えると考えられるからである。

各世代で免疫総合育種価が高い群（高免疫能群）と低い群（低免疫能群）それぞれをマイコプラズマ（Myco-

クシャー種の雄２２頭、雌５３頭の小規模閉鎖集団を基礎

plasmahyopneumoniae）陽性農場に導入し、効果を比較集団として３種類の免疫形質を指標とした育種選抜をした。第３世代、第４世代それぞれの後代について、行った。免疫形質には、白血球貪食能、補体代替経路

高免疫能群・低免疫能群の種豚を掛け合わせて後代を活性、豚丹毒ワクチンに対する抗体産生能の３つを使生産し、それぞれを別々の農場（第３世代後代は A農用した。白血球貪食能は、体内にある異物排除能力の場、第４世代後代は B農場）で出荷まで飼養し、生産指標として、ザイモザン貪食時の活性酸素類による発性に関与する形質（事故率、１日増体重、MPS病変、光をルミノールで増幅した化学発光を測定した。補体肉質等級）を比較した（表１）。事故率は出荷までの死代替経路活性は、自然免疫能力の指標として、ウサギ亡個体数と総個体数の比で算出し、１日増体重は日齢

赤血球感作後の赤血球破壊率を測定した。豚丹毒ワクあたりの枝肉重量で算出した。また、MPS病変は屠チンに対する抗体産生能は、獲得免疫能力の指標とし畜場における目視によるスコアで評価した。肉質等級て、豚丹毒ワクチン接種後の特異的抗体（IgG）産生は屠畜場による格付け値を使用した。

⫱✀౯実験では、当社グループの種豚農場において、大ヨー事故率は両農場とも改善傾向が見られた。統計的に量を測定した。各能力値の合計を免疫総合育種価とした。育種選抜は、免疫総合育種価の高い集団（高免疫能群）から約１５頭の雄と約５０頭の雌を、近親交配が高まり過ぎないように調整したうえで選抜し、交配させ産仔を獲得し、第１世代とした。すべての産仔で３種類の免疫形質の測定と免疫総合育種価の算出を行い、同様に高免疫能群を選抜し第２世代とした。育種選抜
は、第６世代まで実施し、各世代の産子の免疫形質の測定と育種価による選抜効果の評価を行った。いずれの免疫形質の育種価についても第６世代までほぼ直線的な上昇がみられた（図１）。選抜指標に用いた免疫形質の遺伝率はそれぞれ０．
２以上であるのに対し、各形質の遺伝相関は弱いことから、各形質ともに選抜による

表１：第３世代（A農場）と第４世代（B農場）の高免疫群および低免疫群の育種価7)改良が同時に可能であることが示唆された。
育種選抜の結果、３つの指標それぞれの育種価が高65㣗⣽⬊άᛶ⿵య௦᭰⤒㊰άᛶ⫱✀౯/sd4䝽䜽䝏䞁ᢠయ⏘⏕⬟3ච␿⥲ྜ⫱✀౯

2
10

G1G2G3G4G5G6Ͳ1

図１：後代ごとの免疫指標の育種価と免疫総合育種価の推移7)

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図２：A，B農場それぞれにおける高免疫群（High）と低免疫群（Low）後代の事
7)
故率と１日増体量の比較。
は第３世代を用いた農場でのみ有意差が見られた。１

３０、HRSP
１２、MATN２、LAPTM４B、MTDH の１３遺

日増体重に関しては、両農場とも有意な差は見られな伝子と第１４染色体の９９．
６－１１０．
０Mb領域の TMEM７２、かったが、増加傾向は見られた（図２）。MPS病変率

CXCL
１２、ZNF
２３９、ZNF
３２、RPL
３７A、PCDH１５、DKK

や肉質等級はほぼ変化は見られなかった。

１、PRKG
１、CSTF
２T、A１CF、ASAH２、SGMS
１、第３～４世代の上位下位合計５６８頭について、豚ゲMI
NPP
１、PAPSS
２、ATAD１、PTEN、LI
PK、LI
PN、

ノム上に配置された６万個の SNPの遺伝子型を同時

LI
PM、ANKRD２
２、STAMBPL
１の２１遺伝子が存在し、判定できる Porcine
SNP
６０ BeadChip（６０Kチップ）でこれらが候補遺伝子と考えられた。さらに、高免疫能ジェノタイピングを行い、各免疫能の育種価との相関群と無選抜群の血液由来マクロファージにおけるを解析した。食細胞活性は第２染色体、補体代替経路

lipidA及び polyI：C刺激に対する遺伝子発現の違いを活性は第２および第４染色体、豚丹毒ワクチン特異的マイクロアレイで解析し、豚群間で発現変化に差が検

抗体産生能は第４および第１４染色体に有意な相関が検出された免疫系遺伝子を抽出した。これらの免疫系遺出された。

伝子のプロモーター領域について次世代シークエン

豚ゲノム情報を用いて有意となった領域中の遺伝子

サ ー を 用 い た 多 型 検 索 を 行 い、TRI
M２
１、STAT３、検索を行い、食細胞活性については第２染色体１３８．
１－

TMEM１５０C、RNASEL、SAMHD１に豚群間で有意に

１３９．
１Mb領域の HI
NT１、LYRM７、CDC
４２SE２、RAP-

分布パターンの異なる SNPを検出した。これらの候GEF６の４遺伝子が、補体代替経路活性については第補遺伝子プロモーター領域では、高免疫能群には親か

２ 染 色 体１
９．
５－２２．
０Mb領 域 の EXT２、ACCS、ら子に染色体が受け継がれた特徴的な保存領域の存在

ALKBH３、TTC
１７、API５の５遺伝子と第４染色体のが予想される。組換えが起こらずに同じような遺伝様

２２．
６－２３．
９Mb領 域 の SLC
３０A８、RAD２１、UTP２３、式を示す染色体上のひとまとまりの SNPの組み合わ

EI
F
３Hの４遺伝子が、豚丹毒ワクチン応答についてはせ（ハプロタイプ）を推定し、高免疫能群に特徴的な第４染色体の３９．
９－４２．
５Mb領域の RGS
２２、VPS１３B、ハプロタイプを抽出した。

OSR２、STK３、STK４、KCNS２、NIPAL２、POP１、RPL

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３．PRRSウイルス感染を防御する遺伝子マーれ国内に存在する１５の品種の豚１９２頭と、主要商用４品カーの探索種各６頭ずつ計２４頭の DNAを用いて多型を解析した

養豚現場で最も経済損失の大きい疾病は PRRSであところ、両遺伝子ともに複数の領域に遺伝子多型が存ると言われている。その年間経済損失は、米国で６億在することが明らかとなった（図３、両角ら、論文未６，４００万 ド ル、日 本 で２８０億 円10)と 報 告 さ れ て い る。

発表データ）。もしこれらの多型のうち、PRRSV感染PRRSは１９８７年に初めて米国で見つかり、その後急激に重要な領域が欠損するなどの変化をおこして感染回に世界に拡大した豚の新興感染症である。子豚では慢避に寄与する遺伝子型が存在するのであれば、非常に性間質性肺炎、発育不全などを起こし、妊娠豚の早産、有益だと考えられる。しかしながら、PRRSは複合感死産や虚弱子分娩などの繁殖障害、成豚で呼吸困難な染をもたらし、症状が複雑化しているため、個体別のど肺炎の症状を起こすが、病原体である PRRSウイル

所見と遺伝子変異を単純に比較するのは困難である。

ス（PRRSV）の伝播力が強くマクロファージで増殖するので、個体全体の免疫力が低下し、他の疾病との複４．ゲノム編集技術の活用合感染を起こしやすいことが特徴である。PRRSVは

ゲノム編集技術は、遺伝子の狙った領域に切り込みアルテリウイルスに属するゲノムサイズ約１５kbのプを入れ、そこに外来遺伝子を導入したり、数～数１０塩

ラス鎖の１本鎖 RNAウイルスで、１１個の ORFが確認基の欠失を誘起したりすることのできる技術である。

1)

されている 。PRRSVは遺伝子変異の頻度が非常に高これまでも遺伝子を組み換えたりする方法は存在したいウイルスで、特に ORF
５遺伝子は遺伝的多様性が最が、ゲノム編集技術はその確実性と効率性が格段に向も高く、感染防御上重要と考えられているため、この上したため、農業や医療などの分野で飛躍的に発展し遺伝子の塩基配列を基に野外分離株の分子系統樹解析てきている。畜産業界においても、この技術を活用しが行われている。て家畜の生産性や病気への耐性向上に役立てる研究がPRRSVのマクロファージへの感染には、マクロ進められている。

ファージの膜上に存在する CD１５１、CD１６３、CD１６９、豚に対するゲノム編集技術の利用も進んでおり、養CD２０９、ヘパラン硫酸、ビメンチンなどが関わってい豚産業的にも重要な研究成果が報告されている。１つることが分かっている。ヘパラン硫酸は細胞表面でウ目の研究成果として、PRRSV感染の最も重要な因子イルスが結合する際の受容体となり、CD１６９はウイルの 解 明 が 行 わ れ た。ま ず PRRSV の 受 容 体 で あ る

スが細胞内に取り込まれる際の受容体と考えられていCD１６９遺伝子のノックアウト豚が作出された3)。しかる。CD１６３は、細胞内侵入とカプシドを脱ぎ捨てる際しながら、CD１６９ノックアウト豚は、PRRSV感染を回11)に必要な因子である 。
このうち、CD１６３と CD１６９遺伝子について、それぞ避できなかった。次に CD１６３遺伝子をノックアウトした豚が作出された9)。CD１６３遺伝子ノックアウト子

図３：豚の CD１６３と CD１６９のドメイン構造模式図。同義置換を白抜きの丸、非同義置換を黒塗りの四角で示した。ドメイン構造は SMART（http://smar
t.
embl
hei
delberg.
de/）を用いて推定した。SP:oline,serinet
hr
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ner
i
chr
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si
gnalpeptide,SRCR:scav
engerr
ecept
orcy
stei
ner
i
ch,PST:prTM:tr
ans
membr
ane,IG:immunoglobul
in.

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豚３頭を７頭の正常な子豚と同じ豚舎内で約１０万感染ることも可能である。これまでに、TALEN法を用い単位の PRRSVを接種したところ、５日目に正常豚はてヒト大腸がん細胞で１塩基置換を成功させた例2)や、発熱し発病したが、CD１６３遺伝子をノックアウトした

CRI
SPR/
Cas９を用いて、マウスで１塩基置換を成功さ豚は３５日の観察期間中、発病は見られなかった。またせた例6)などが存在するが、豚ではまだ成功事例が存

ウイルス抗体は産生されなかった。これらの結果より、在しない。

PRRSVへの感染には、CD１６３が必須の因子であることが明らかとなってきた。

おわりに２つ目の研究成果として、ミオスタチン遺伝子のここ１０年ぐらいのうちに、欧米の種豚メーカーは、ノックアウトによるダブルマッスル豚の作出が試みら

ゲノム育種の手法を積極的に取り入れて品種改良を加れた。ミオスタチンは TGFbスーパーファミリーに速させており、特に、１日増体重や離乳時産仔数など属するタンパク質で、発生の段階で筋芽細胞の増殖とは飛躍的に向上している。一方、抗病性や肉質を指標筋管細胞への分化を制御すると考えられており、そのとした育種改良はまだ積極的に進められていない。今

遺伝子欠損型は、極端な筋肥大をもたらすことが分回我々は、白血球貪食能、補体活性、抗体産生能の３かっている。牛では、ミオスタチン遺伝子に複数の突つの指標を用いることで、抗病性育種選抜が可能であ然変異で現れた多型があり、これらが筋肥大をもたらることを示し、遺伝子マーカーの候補を選抜することしていることが分かっているが、豚では発見されていに成功した。今後はこれらの遺伝子マーカー候補が、なかった。その後いくつかのグループにおいて、ゲノ

抗病性育種選抜の指標として機能するかどうか検証すム編集技術を用いて、ミオスタチン遺伝子のノックアる必要がある。しかしながら、マーカー候補の数が増

4,5,8)

ウト豚作出に成功した。牛ほど劇的な変化ではなかったが、牛と同様の筋肥大が見られた（図４）。
ゲノム編集技術は、対象領域に１塩基置換を誘発すえれば増えるほど、検証には多数の母集団が必要となり、時間もコストもかかることになる。
ゲノム編集技術は、目的の変異を効率的に導入する

図４：ミオスタチン遺伝子を欠損した豚（Bialleli
cmutant）と野生型（WT）との比較。最下段は筋線維の断面の比較。Bi
allelicmutantでは筋繊維の過形成が観察される。

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70 2017ことが可能であり、マーカー候補の効果の検証を迅速６３，４１３－４１６．

かつ効率的に行うツールとなる可能性があり、未だ活

１１）ZhangQ,etal.(2015)PRRSvirusrecept
orsand用されていない遺伝資源の活用に繋がることも期待さthei
rroleforpa
thoge
nesis.VetMi
crobiol,177:れる。まだまだ技術的なハードルは高いが、今後ます

229241

ます注目されていく技術であるのは間違いないだろう。
全ての著者は開示すべき利益相反はない。

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