琵琶湖における溶存態タンパク質の検出
地域戦略研究所 安井裕彦
水圏に存在する有機物は、濾過操作により濾紙上に残る有機物を懸濁態有機物( Particulate organic matter : POM )、濾紙を通過する有機物を溶存態有機物 ( Dissolved organicmatter : DOM ) として取り扱われることが多い。DOM 中には、ファージやバクテリアが含まれるが、量的には無視できる程少なく、DOM のほとんど総ては非生物態有機物と考えられている。また、海洋の DOM の存在量は、存在量は炭素量換算で 0.60×1018 gC と見積もられおり、陸域の植生 ( 0.95×1018 gC ) や土壌有機物 ( 1.6×1018 gC ) と並んで、地球表層上の三大有機物リザーバー（貯蔵庫）の 1 つとして知られている。その量は大気中の全二酸化炭素量 ( 0.66×1018 gC ) にも匹敵する。したがって、海洋溶存態有機物の動態解明は地球表層の炭素循環を理解するために必須であると考えられる。
海洋溶存態有機物の起源は、海洋生物であると考えられている。海洋生物を含む海洋懸濁態有機物では、生体構成成分であるアミノ酸、炭水化物、及び脂質で全有機物の 80%以上が説明できる。ところが溶存態有機物については、全量に対してアミノ酸が 1-3%、糖は 2-4%、脂質はさらに少量であると考えられている。したがって海洋溶存態有機物について、その起源は海洋生物でありながら、化学的には未同定の有機物が大部分を占めていることになる。
田上は、このような海洋溶存態有機物中に非常に少数のタンパク質分子が存在することを発見した。海洋溶存態タンパク質は海域及び深度に問わず検出され、その中の複数のタンパク質がバクテリア由来のタンパク質であることが分かった。海洋で生産される多数の有機物の中で、ある特定の有機物がそれ程修飾されないまま、溶存態有機物中に残存する現象は、興味深い。しかし、これまでの海洋溶存態タンパク質の研究には多くの解決すべき問題が残されている。
淡水環境においても、海洋と同様に溶存態有機物は存在する。陸水における溶存態有機物は、量的には、海洋溶存態有機物と比べてはるかに少ない。しかし、陸水中の溶存態有機物は河川や湖沼の富栄養化を通して地域の自然環境に大きな影響を与えている。また、陸水中の溶存態有機物は河川を経由して海洋沿岸に輸送され沿岸の環境にも無視できない効果をおよぼしている。淡水環境における溶存態有機物に関しては、湖沼毎の個別の研究はあるものの、溶存態有機物の化学的実体、換言すれば、海洋溶存態有機物で明らかになっているレベルでの知見は少ない。具体的には、湖沼有機物について、アミノ酸、炭水化物及び脂質に関する分子レベルの研究は少ない。
このような背景を受けて、本研究では、陸水中からの溶存態タンパク質の検出を試みた。この目的は、まず第 1 に、海洋環境下で認められる溶存態タンパク質と同様に、淡水環境下においても、特定かつ少数のタンパク質が溶存態有機物として残存されているか否かの現象を明らかにすることである。第 2 に、陸水、特に湖沼では、湖沼水の滞留時間はわかっている場合が多い、従って溶存態タンパク質が検出されれば、このような溶存態タンパク質の動態すなわち生成・分解に関するおおよその時間スケールが判断できると考えた。
以上のような目的のために、本研究では、対象とする湖沼に琵琶湖を選んだ。琵琶湖は日本で最も大きな湖である（ 図１）。従って、非常に短い時間スケールの環境変化、例
えば降雨や日照の影響を相対的に緩衝することにより、淡水環境下での普遍的現象をみることができると考えた。更に琵琶湖では生物学的酸素要求量 ( Biological oxygen demand:BOD ) は一定ないし減少傾向であるにも関わらず、化学的酸素要求量 (Chemical oxygendemand: COD) が増加していることが報告され、地域の環境を考える上で社会的な問題になっている。COD および BOD のいずれも溶存態有機物の性質を示す指標である。しかし、琵
琶湖水中の溶存態有機物の化学的性質が不明であるために、このような現象の解明は進んでいない。海洋溶存態タンパク質の研究から、このようなタンパク質は他の有機物に比べて、微生物学的には相対的に分解耐性を有していると考えられる。一方、タンパク質は、他の化学成分に比べてとりわけ化学的な分解に対して耐性を有するとは考え難い。したがって、琵琶湖水中から溶存態タンパク質が検出されれば、COD の増加の解明に関する基礎的な知見を与える可能性も考えられた。
琵琶湖には、2 種類の溶存態有機物が存在する。1 つは琵琶湖湖内の生物活動により生産される自生性の溶存態有機物である。もう 1 つは、琵琶湖湖外から流入する外来性の溶存態有機物である。外来性溶存態有機物は、家庭排水や農業用水などの人為起源のもの、植物や土壌よりもたらされる自然起源のものが存在する。したがって本研究目的を達成するためには、琵琶湖湖水のみならず集水域から流入する溶存態有機物も評価する必要がある。本研究では、琵琶湖及びその集水域試料を採取し、それらの試料中から溶存態タンパク質の検出を試みる事で、上記目的を達成することを目的とした。
本研究では、海洋溶存態タンパク質の濃縮・精製法として用いられてきたタンジェンシャルフロー限外濾過法以外を用いた。本研究で得られた結果は次の様に要約できる。
(1) 琵琶湖及び集水域試料から、タンジェンシャルフロー限外濾過法によって溶存態タンパク質が検出された（ 図 2＆図 3 ）。陸水環境に存在する溶存態有機物から、タンパク質を検出したのは本研究が初めてである。
(2) 琵琶湖で検出された溶存態タンパク質には、数ヶ月ないし、それより短い時間スケールで生成・分解されているものがあることが示唆された ( 図 4＆図 5 )。
本研究によって、海洋溶存態有機物と同様に、陸水中に存在する溶存態有機物中にも、タンパク質が存在していることが明らかとなった。更に、琵琶湖の溶存態タンパク質については、その動態にある程度の時間スケールを与えることができた。

竹生島

安曇川

北湖

琵琶湖
野州川
水田由来河川湧水

南湖

農村下水処理水01020 km

7549250150100100100757575494350372550374236 36
31282220221520.3 20.3

373737352525252622.423.32222.620152015105050362626

Marker Protein( kDa)

Marker Protein( kDa)

Marker Protein( kDa)

100

農村下水処理水

94

野州川

250
150

250
150

(2.5 m)(2.5 m)
250
150

湧水

(50 m) (2.5 m)

安曇川
水田由来河川南湖表層瀬田川
南湖表層中央
北湖表層
北湖深層

コントロールMarker Protein( kDa)

図 1 琵琶湖

20201510図 2 琵琶湖電気泳動図

図 3 琵琶湖 集水域 電気泳動図

75

100
625048459766

75

50
37

100

15062

Marker Protein( kDa)

Marker Protein( kDa)

Marker Protein( kDa)

100

6月

100

竹生島

2506月

月

250150竹生島

竹生島
12625752

3736574252303625252020201515

北湖表層
北湖深層
(50m)(2.5m)

Marker Protein( kDa)

北湖表層(50m) (2.5m)

北湖深層

Marker Protein( kDa)

図 4 琵琶湖竹生島 表層 電気泳動図

250150

250
150

100

10075

94

97

4971
5950
372542
36 36
2875

94

42423631503738
3128

36 25242015222015

図 5 琵琶湖 表層 深層 電気泳動図