2020-6-5（公財) 発酵研究所
2018年度大型研究助成 O-2

糸状菌の細胞接着制御による有用物質高生産を目指した新規高密度培養技術の開発
東北大学大学院農学研究科
生物産業創成科学専攻 応用微生物学分野

阿部 敬悦(E-mail: keietsu.abe.b5@tohoku.ac.jp)

発表内容
背景
糸状菌の産業利用の現状
糸状菌の細胞表層構造
Part-1「モデル糸状菌Aspergillus nidulansにおける細胞壁α-1,3-グ
ルカンの分子量及び細胞壁中の局在と菌糸凝集の関係性の解析」
Part-2「産業用糸状菌Aspergillus oryzaeにおける第二の菌糸凝集
因子の探索及び菌糸凝集メカニズムの解析」
まとめ背景： 糸状菌の液体培養時の形態【糸状菌の工業培養】
酸素や基質の拡散が容易な液体培養で行われることが一般的。

【課題】
糸状菌は一般的に、液体培養時に菌糸が絡まりペレットを形成する。

東洋紡 バイオケミカル事業部HPより
https://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/enzyme/m_service_j.html

ペレット内部が嫌気的になるため、物質生産効率の制限要因

図. 麹菌のフラスコ培養

世界中の発酵生産メーカーから、生産効率改善に繋がる新技術の開発が強く望まれている。

背景： 菌糸塊形成に関する知見とその対処法〈菌糸塊形成メカニズム〉
 分生子接種時～膨潤時 分生子発芽以降
具体的な
凝集因子は
未解明。

疎水性相互作用, 静電的作用

静電的作用, 細胞壁成分特異的な相互作用
Zhang & Zhang, Crit. Rev. Biotechnol. 2016

〈対処法〉
 古典的手法

pH, 接種胞子数, 培養温度の調整 (Kelly et al. (2004); Nielsen et al. (1995)他)
攪拌回転や通気による物理的ストレス誘導(Bizukojc & Ledakowicz (2010); Lopez et al. (2005)他)

 近年開発された手法
培養液への微粒子（Talc, チタン等）の添加(Driouch et al. B&B (2010); Gonciarz & Bizukojc Eng. Life Sci. (2014))

培養液浸透圧の調整 (Wucherpfennig et al. Microb. Cell Fact. (2011))

完全な形態制御を可能にする技術は現在のところ開発されていない。

背景: 糸状菌の細胞壁
 細胞壁の主成分は多糖
 菌の生育に必須の役割
 細胞壁の構成成分
多糖成分

アルカリ可溶性(含有量%) 不溶
可溶
β-1,3-Glucan
30
ND
Chitin13NDα-1,3-Glucan
ND
42
Galactomannan
5
1.4
Galactosaminogalactan
42.3

抗真菌剤の標的となり得る。

Yoshimi et al., BBB 2016

図. 糸状菌細胞壁構造の模式図
Yoshimi et al. (2016) BBB 80(9):1700-1711

α-1,3-グルカン• 出芽酵母には含まれない細胞壁成分である。
• 糸状菌におけるAGの機能には不明な点が多い。
⇒CWIS経路の解析の結果を受けて、AGの機能解析が行われた。

Fujioka et al Eukaryotic Cell (2007)

α-1,3-グルカンの生物学的機能
ヒト感染真菌: Histoplasma capsulatum
Rappleye et al. (2007) PNAS 104, 1366-1370.

植物病原糸状菌:
Fujikawa et al. (2009) Mol. Microbiol. 73, 553-570.

は、宿主の免疫応答反応からの回避機能（ステルス機能）に関与している。
非病原性真菌がα-1,3-グルカンを持つ意味は？
その他の生物学的機能は？

Yoshimi et al.
J. Fungi 2017

背景: イネいもち病菌CWI シグナル伝達阻害と感染阻害及びα-1,3-glucan
Sugahara et al., AEM, 2019

Cell wall stresses
Appressorium (AP)Germ tube

ConidiumM. grisea

Hyperosmotic Pkc1
stress signaling
etc.
Mps1

Z-705 Germ tube
Conidium

Melanization
No
Turgormelanizationpressure UP

Pig1

Invasion

Infection

AP

AP

Blocking
host
recognition

Host
recognition

MAPK

Rlm1

Germ tube
Germ tube
Conidium
Conidium

SCD1, 3HNR,
4HNR

AGS1

Melaninbiosynthesis

α-1,3-Glucan
biosynthesis

Invasive hyphae

No
Infection

Germ tube
Conidium

Pathogenic

AP

AP

Invasive hyphae

α-1,3-Glucan
Infection,
Increase

No
Infection

PKC is directly or indirectly involved in pathogenicity of M. grisea.

背景: A. nidulans AGS遺伝子破壊株の表現型
 液体振盪培養時の生育

Wild-type

ΔagsA

ΔagsB

ΔagsAΔagsB

ΔagsB株: 菌糸が培地中に完全分散

Wild-type

ΔagsB

ΔagsB株: 菌糸同士が凝集せず、絡まらない
Yoshimi et al., PLoS One (2013) 8:e54893

α-1,3-グルカンは菌糸の接着因子として機能することが示唆された。

背景: 麹菌のAG欠損株の表現型
産業用糸状菌（麹菌） Aspergillus oryzae
AG合成酵素遺伝子３重破壊株（ΔagsAΔagsBΔagsC）• 細胞壁からAGが欠損• 野生株よりも小さな菌糸の塊を形成→ 菌糸の露出面積が大きく、物質生産に好適な宿主株であることが示唆された。

平均直径 3.2 mm

培養性状

菌糸塊

野生株

2.2 mm

培養性状

菌糸塊

AG欠損株
Miyazawa et al., BBB, (2016) 80,1853―1863背景: 麹菌のAG欠損株の酵素生産性
 モデルタンパク質の高発現系の構築• モデルタンパク質： クチナーゼ CutL1（菌糸非吸着性）

野生株
AG欠損株

形質転換

• cutL1 高発現ベクターを各株に１コピー導入 ［同一 locus （niaD）］。

CutL1高発現株の取得

 AG 欠損株の酵素生産性AG欠損株の酵素生産量は野生株に比べて顕著に高い。

乾燥菌体量

M WT AGΔ Ctrl.

amylaseCutL1

Weight of dry mycelium(mg/50 mL culture broth)(mg/50 mL培養液)
250

**

200
150
100
50
0

1

**P < 0.01

Concentration of secreted
CutL1 (µg/mL)

A. oryzae

CutL1
CutL1
CutL1

CutL1分泌量（µg/mL）
10

**

8
6
4
2
0

1

Miyazawa et al., BBB, (2016) 80(9):1853—1863

細胞表層改変による表現型の制御は物質生産に有効な手段である。

背景: AGS遺伝子破壊株の細胞壁多糖の分析☆ 細胞壁多糖の分析(%)
Weight ratio of carbohydrate(/ fraction)

細胞壁多糖の熱水・アルカリ抽出

アルカリ可溶（AS）画分
グルコース
ガラクトースマンノース
グルコサミン 菌糸分散株（ΔagsB, ΔagsAΔagsB）では細胞壁α-1,3-グルカンが欠損。
⇒α-1,3-グルカンは菌糸接着因子。
 ΔagsAでは細胞壁成分に変化なし。

⇒agsAの機能は？

Part 1の目的
【研究目的】
α-1,3-グルカン生合成におけるAgsA, AgsBの機能の解明【研究方針】① agsA, agsB高発現（agsAOE, agsBOE）株の作製とその表現型の観察② agsAOE, agsBOE株のASグルカンの化学構造解析③ agsAOE, agsBOE株の細胞壁成分の蛍光ラベリングと顕微鏡観察

agsAOE, agsBOE株の作製
 agsAOE株の作製

図. agsAOE株作製確認のサザン解析

プロモータ領域を構成的高発現プロモータに置換

 agsBOE株の作製

図. agsBOE株作製確認のサザン解析

一方のAGS遺伝子破壊株を親株として、もう一方のAGS遺伝子を構成的高発現化。
agsAOE, agsBOE株を取得した。

agsAOE, agsBOE株の培養性状

Bar = 1 mm

WT

ΔagsB

agsAOE

ΔagsA

agsBOE(Host of agsAOE)(ΔagsB)(Host of agsBOE)(ΔagsA)

Miyazawa et al., Front. Microbiol. (2018) 9:2623（培養条件）
CD 最少培地 50 mL / 200 mL 三角フラスコ
培養温度37oC, 回転数160 rpm
培養時間24 h, 接種胞子数5.0 x 105/mL

agsAOE 株 ： ΔagsB株の菌糸
分散性を失い菌糸塊を形成

agsAOE 株 ： 菌糸密度の低い菌糸の塊
agsBOE 株 ： 緊密な菌糸の塊（野生株と類似）⇒構成多糖の成分が異なる可能性が示唆された。

agsAOE, agsBOE株の細胞壁多糖の化学構造解析
Weight of saccharides(% of total cell wall fractions) 細胞壁多糖の分画

c

20

c

15
10
5
0

a
b

α-1,3-Glucan**P < 0.01, *P < 0.05

図. AS画分の構成単糖量 (%)
図. 細胞壁成分の分画法

agsAOE, agsBOE株ではAS画分の量比が増加。
（ASグルカン量は両株間でほぼ同じ）各株のAS画分
13C NMR

メチル化分析

多糖主成分・アノマー性 結合の種類と量比

ゲルろ過クロマト

Smith分解

糖鎖の平均分子量

糖鎖の限定分解

agsAOE, agsBOE株間の接着性差をもたらす多糖構造差に迫る。

13C NMRWT AS

agsAOE AS

agsBOE AS

Mutan （α-1,3-glucan）

(ppm)

100

90

80

70

60

Miyazawa et al., Front. Microbiol. (2018) 9:2623

agsAOE 株，agsBOE 株とも，AS 画分に含まれる多糖の主鎖は α-1,3-グルカンである

ASグルカンのメチル化分析
 メチル化分析 ― 多糖の結合の様式および量比を解析する方法
Methylation
Hydrolysis

Reduction

Acetylation（Open）

Alditol acetates
2,3,4,6-Tetra-O-Me-Glc
2,4,6-Tri-O-Me-Glc
2,3,6-Tri-O-Me-Glc
3,4,6-Tri-O-Me-Glc
2,4-Di-O-Me-Glc

RT
Linkage (min)G115.1
16.4-3G116.5-4G117.4-2G1-6 G
17.9- 3 1-

GC-MS

Molar amounts (%)
WT
agsAOE
agsBOE
0.69
0.46
0.73
89.31
94.09
87.98
5.41
1.74
7.01
2.08
1.45
1.68
2.51
2.26
2.42

(-2G1-, マンナン由来と予想; --63G1-, β-1,3/1,6-グルカンと予想) Miyazawa et al., Front. Microbiol. (2018) 9:2623

いずれの株でも、AS画分の構成糖の約90%は1,3-結合から成る。
G1-（非還元末端）の量比 WT = agsBOE > agsAOE⇒AgsAとAgsBの合成多糖の化学構造は、糖鎖重合度に差異？

ASグルカンの分子量分析
 AS2画分の分子量分析
Relative signal intensity

0.05(kDa) 2,160

1.00000E+07

500
110
1,400

0.04

1.00000E+06

1.00000E+05

70

0.03

1.00000E+04

1.00000E+03

0.02

Samples
WT
agsAOE
agsBOEMp (kDa)147 ± 52
1,480 ± 80
372 ± 47DPn
908 ± 319
9,160 ± 520
2,297 ± 287

1.00000E+02

1.00000E+01

0.01

1.00000E+00

1.00000E-01

01.00000E-02-0.01

1.00000E-03

7

8

9

10 11 12 13 14

Elution volume (mL)

〈分析条件〉• カラム
SUGAR KS-G（ガードカラム）
SUGAR KS-805• 流速 1 mL/min for 25 min• カラム温度 35oC
• 溶離液 1 M NaOH
• 示差屈折検出器(FLC-10)

Miyazawa et al., Front. Microbiol. (2018) 9:2623

agsAOE株のAS多糖の分子量はagsBOE株の約４倍大きい。

agsAOE株とagsBOE株の菌糸塊形状差⇒agsAOE株とagsBOE株のASグルカンの分子量差に起因することが示唆された。

ASグルカンのSmith分解〈Smith分解〉1,2-, 1,4-, 1,6-結合の糖を選択的に分解する方法（1,3-グルカンは分解しない）。
〈想定される結果〉①AS糖鎖中に1,4-グルカンが一つの場合②AS糖鎖中に複数の1,4-グルカンがある場合

Smith degradation
分子量は半減程度

分子量は大きく減少する

Relative signal intensity

【結果】
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
-0.01

Smith degradation

1.E+06(kDa) 110

40
70 10
20

1.E+05

1.E+04

1.E+03

1.E+02

1.E+01

Samples
WT (non-degraded)
WT, Smith-degradedagsAOE (non-degraded)
agsAOE, Smith-degradedagsBOE (non-degraded)agsBOE, Smith-degradedMp (kDa) DPn
147 ± 52 908 ± 319
31.6 ± 3.7 195 ± 23
1,480 ± 80 9,160 ± 520
41.6 ± 5.8 257 ± 36
372 ± 47 2,297 ± 287
38.3 ± 3.0 237 ± 19

1.E+00

1.E-01

ASグルカンの分子量は各株とも大きく減少。

1.E-02

1.E-03

7

8

9

10

11

12

Elution volume (mL)Miyazawa et al., Front. Microbiol. (2018) 9:2623

13

14

α-1,3-グルカン鎖には、複数の短いスペーサーの糖が含まれることを示唆。
（約200残基のα-1,3-グルカン単位を隔てる）

菌糸中の細胞壁多糖の蛍光ラベリング
菌糸塊の凝集性はα-1,3-グルカンの量だけでなく、その分子量によっても制御される。
細胞壁中のα-1,3-グルカンの空間分布も凝集性に影響する可能性があるのではないか？
菌糸細胞
Outer layer
Inner layer
α-1,3-Glucanaseα-1,3-glucan
binding domain

α-1,3-Glucan
β-1,3-Glucan & chitin
Alexa
594

GFP
Hyphal cell
Alexa
350

Anti-β-1,3-glucan
antibody
Chitin specific lectin(Wheat germ agglutinin)

菌糸細胞
β-1,3-Glucan & chitin
α-1,3-Glucan layer

細胞壁成分を蛍光ラベル
α-1,3-Glucan ― GFP
β-1,3-Glucan ― Alexa Fluor 594
Chitin ― Alexa Fluor 350

共焦点レーザー顕微鏡で観察した。

細胞壁多糖の空間分布（蛍光顕微鏡観察）
DIC

GFP
Alexa Fluor 350 Alexa Fluor 594 Merge(β-1,3-Glucan)(α-1,3-Glucan) (Chitin)

WT

ΔagsAΔagsB

agsAOE

agsBOE
Miyazawa et al., Front. Microbiol. (2018) 9:2623

WT—細胞壁外層にα-1,3-グルカンが局在,
β-1,3-グルカンやキチンを被覆
agsAOE—β-1,3-グルカンやキチンが露出（外層のα-1,3-グルカンは僅か）
ΔagsAΔagsB（α-1,3-グルカン欠損株）—β-1,3-グルカンやキチンが露出
agsBOE—細胞壁外層にα-1,3-グルカンが局在

菌糸細胞のα-1,3-/β-1,3-glucanase処理と顕微鏡観察〈蛍光顕微鏡観察〉
agsAOE株とagsBOE株間で細胞壁中のα-1,3-グルカンの空間分布が異なることが示唆された。
細胞壁多糖分解酵素で処理した細胞を蛍光ラベリングすることにより、細胞壁内の多糖の空間分布についてさらに検証する。
【方法】

α-1,3-Glucanase

agsAOEβ-1,3-Glucanase
agsBOE

蛍光ラベリング

α-1,3-Glucan ― GFP
β-1,3-Glucan ― Alexa Fluor 594
Chitin ― Alexa Fluor 350

共焦点レーザー
顕微鏡観察

α-1,3-/β-1,3-glucanase処理細胞の蛍光顕微鏡観察
DIC

GFP
Alexa Fluor 350 Alexa Fluor 594 Merge(α-1,3-Glucan) (Chitin)(β-1,3-Glucan)

agsAOE+α-1,3-glucanase

agsAOE+β-1,3-glucanase

agsBOE+α-1,3-glucanase

agsBOE+β-1,3-glucanase
Miyazawa et al., Front. Microbiol. (2018) 9:2623

agsAOE ― β-1,3-glucanase処理によってα-1,3-グルカンが露出⇒α-1,3-グルカンは主にagsAOE株で内層に、agsBOE株で外層に局在

α-1,3-グルカン鎖の推定化学構造と菌糸塊凝集性株

菌糸塊凝集性

推定糖鎖構造推定細胞表層構造

agsAOE
Loose

agsBOE
Tight
Miyazawa et al., Front. Microbiol. 2018

菌糸塊
凝集性

①α-1,3-グルカンの量だけでなく②分子量、③細胞壁中の空間分布が関与する。

発表内容
背景
糸状菌の産業利用の現状
糸状菌の細胞表層構造
Part 1「モデル糸状菌Aspergillus nidulansにおける細胞壁α-1,3-グ
ルカンの分子量及び細胞壁中の局在と菌糸凝集の関係性の解析」
Part 2「産業用糸状菌Aspergillus oryzaeにおける第二の菌糸凝集
因子の探索及び菌糸凝集メカニズムの解析」
まとめPart 2の目的
【課題】
麹菌のAG欠損株は菌糸完全分散に至らなかった。
→未知の菌糸塊形成因子が存在することを示唆している。
【目的】• 麹菌における第二の菌糸凝集因子の探索?
• 第二の接着因子を介した菌糸凝集メカニズムの解析?

A. oryzae における追加の菌糸接着因子の探索• Galactosaminogalactan (GAG)

Lee et al., J. Microbiol. (2016) 54, 232—242

・2011年, A. fumigatus の病原因子として同定
A. fumigatus における GAG 欠損株の ・Gal, GalNAc, GalN からなるヘテロ多糖
・細胞外に分泌され、細胞壁に接着
菌糸表面は野生株と異なる(Bamford et al, J. Biol. Chem., (2015), 290, 27438—450) ・バイオフィルム形成と宿主への感染に関与⇒ GAG が A. oryzae における未知の菌糸接着因子か？
• A. fumigatus における GAG 生合成遺伝子クラスター

Sheppard & Howell, J. Biol. Chem., (2015) 291,12529-12537

 ５遺伝子がクラスターを形成。
A. oryzae における生合成クラスターの ３遺伝子はその機能が報告されている。 存在は不明。
 クラスターは複数の真菌種に保存。
⇒BLAST検索によりクラスターを探索。

GAG生合成遺伝子クラスターの同定と遺伝子破壊• A. oryzae の推定 GAG 生合成遺伝子クラスター

Miyazawa et al. Front. Microbiol. (2019) 10:2090⇒A. oryzae にも同様の遺伝子クラスターが保存されている。
Sheppard & Howell, J. Biol. Chem., (2015) 291,12529-12537
 遺伝子破壊株の取得

WT
sphZ, ugeZ
遺伝子破壊

GAGΔ

(sphZΔugeZΔ)〈遺伝子破壊コンストラクト〉

AGΔ
麹菌ゲノム

AG-GAGΔ(agsAΔagsBΔagsCΔsphZΔugeZΔ)

５遺伝子のうち、隣接する sphZ, ugeZ の２遺伝子を同時に破壊。
GAG 欠損株および AG-GAG 欠損株を取得。

図. 遺伝子破壊確認のサザン解析

GAG欠損株の表現型解析（液体振盪培養）【培養条件】YPD培地 50 mL, 30℃, 120 rpm, 24 h, 分生子 1.0 x 105/mL

Miyazawa et al. Front. Microbiol. (2019) 10:2090

GAG 欠損株：野生株に比べて大きな菌糸塊を形成
AG-GAG 欠損株：菌糸が液体培地中に完全分散
A. oryzae における菌糸完全分散を達成した。
A. oryzae においては、AG に加え GAG も菌糸接着因子として機能。

GAG欠損株の表現型解析（SEM観察）

Miyazawa et al. Front. Microbiol. (2019) 10:2090

WT, AGΔ 株では、菌糸表面に凹凸が見られた。
GAG 生合成遺伝子破壊株では、凹凸が消失。
⇒ GAG が実際に細胞表層から消失したことが示唆される。

細胞壁中のGAGの定量
【方法】
菌体回収

リン酸buffer

凍結乾燥
菌体破砕

菌体を懸濁

加水分解 HPAEC-PAD
透析
熱水抽出 上清
単糖分析
121℃
凍結乾燥
熱水可溶画分中の60 min x 2（残渣）
GalN量を定量【結果】

GalN content (mg/g biomass)

24 h培養
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
WT

AGΔ

AG-GAGΔ

GAGΔ

Miyazawa et al. Front. Microbiol. (2019) 10:2090

AG-GAG 欠損株および GAG 欠損株 → 熱水可溶画分中の GalN が消失⇒ GAG 生合成遺伝子破壊により、実際に GAG が失われたことを確認した。

小スケールの分生子凝集評価系の構築
【方法】

30oC

(1) Conidia, 106/mL(2) 500 µL MM+0.05% Tween 20

Agitation (1,200 rpm)

048-well plate

【結果】

AGΔ

6

9 (h)

実体顕微鏡観察

AG-GAGΔ

GAGΔ

9h

6h

3h

0h

WT

3

Miyazawa et al. Front. Microbiol. (2019) 10:2090

AG-GAGΔ株以外で菌糸が凝集; フラスコ培養の結果が再現された。

α-1,3-グルカンとGAGの蛍光標識と顕微鏡観察【方法】

Confocal laser
scanning
microscope
Cultured for
0, 3, 6, 9 h

48-well plate

【結果】

SBA
(GAG)

DIC

GFP
(α-1,3-Glucan)

SBA
(GAG)

6h

0h

DIC

GFP
(α-1,3-Glucan)

9h

3h

20 µm

α-1,3-Glucan: labeled from 0 h ↔ GAG: labeled from 6 h

α-1,3-グルカンは接種後すぐから、GAGは分生子発芽後から、菌糸塊形成に寄与することが示唆された。

AG欠損株に対してGAG生合成遺伝子を破壊することにより、菌糸の塊形成が全く見られなくなった。
（遺伝学的な解析）

多糖としてのGAGが直接的に菌糸の塊形成に寄与しているか否かは
不明。

実体顕微鏡
フラスコ写真（目盛 = 1 mm）

GAGは直接的に菌糸塊形成に寄与するのか？

GAGを精製し、GAGと菌糸を混合することにより、菌糸の塊形成が再現されるか否かを評価した。
（生化学的な解析）

WT

AG-GAG
二重欠損株?
?

培養上清からのGAGの精製【方法】

EtOH分別沈殿(AGΔ or AG-GAGΔ)

透析

30oC
72 h
Modified Brian
medium (1 L x 3)

+EtOH

+NaOH
(Final conc., 0.5 M)

0

培養上清

0.5

1 1.5 2 2.5(vol. EtOH Fr.)

Weight of carbohydrate(% of total fraction weight)

【結果】
25

GalN

20

GlcN

15

Gal

10

Glc

5

Man

0
AGΔ
EtOH Fr.
Miyazawa et al. Front. Microbiol. (2019) 10:2090

1.5 vol. EtOH画分にGalNとGalが最も多かった。

In vitro 凝集評価系の構築【方法】(1) AG-GAGΔ hyphae (9 h)(2) 50 µL 1 M Na Pi buffer (pH 7.0)
(3) 50 µL EtOH fraction (2 mg/mL)(total 500 µL)

Agitation (1,200 rpm)

048-well plate1 (h)実体顕微鏡観察

1h

0h

【結果】

30oC

0 vol.

0.5 vol.

1 vol.

1.5 vol.

2 vol.

2.5 vol.

DIC

SBA (GAG)

AGΔ
DIC

SBA (GAG)

AG-GAGΔ
1.5 vol.

20 µm

Miyazawa et al. Front. Microbiol. (2019) 10:2090

1.5 vol. EtOH画分を加えたときのみ菌糸凝集が見られた。

GAGが直接的に凝集に寄与することが強く示唆された。

AG-GAG欠損株の酵素生産性
 モデルタンパク質の高発現系の構築

フラスコ培養定量
生育菌体量A. oryzae

形質転換

CutL1
CutL1
CutL1

CutL1高発現株の取得

WT
AGΔ
AG-GAGΔ

生育菌体量

Mycelial dry weight(mg/5 mL culture broth)

120
100
80

ns

60
40
20
0

1

CutL1 分泌生産量
**

ns

12
Concentration of secreted
CutL1 (µg/mL)*

140（YPM培地50 mL）

10*

培養上清中のCutL1量（SDS-PAGE）【培養条件】
YPM培地 50 mL
30oC, 100 rpm, 24 h
胞子数 1.0 x 104/mL

8
6

ns

* p < 0.05** p < 0.01
ns not significant

4
2
0

1

AG-GAGΔ株は、野生株やAGΔ株に比べて酵素生産性が高い。

ジャー培養のCFD解析~AG-GAGΔ株の優れた攪拌性
AG-GAGΔ

野生株

フローパターン

上部まで流れが出来ている
38

攪拌翼底面
剪断力

強い攪拌力がかかっている

粘性のため液全体が回る(スリップ)まとめ
1. モデル糸状菌A. nidulansにおいては、α-1,3-グルカンの量に加えてその分子量と細胞壁中の局在も菌糸の塊形成に寄与することを明らかにした。(Part-1)
2. 産業用糸状菌A. oryzaeにおいては、α-1,3-グルカンに加えて細胞外分泌多糖ガラクトサミノガラクタン（GAG）も菌糸の塊形成に寄与することを明らかにした。(Part-2)
3. GAGを介した菌糸凝集メカニズムを解析し、GAG分子中のGalN残基のアミノ基を介した水素結合がGAG依存的菌糸塊形
成の本質であることを示した。(Part-2)
4. 菌糸分散性のAG-GAGΔ株は、野生株に比較して培養液の粘度が低く、攪拌性の向上により野生株よりも優れた酵素生産性を示した。(Part-2)

謝辞
 AG欠損株、AG-GAG欠損株、シグナル伝達の解析、菌糸接着解析
東北大学未来科学技術共同研究センター (現 京都大学)
吉見 啓 准教授
東北大学大学院農学研究科 応用微生物学分野 （現 国立感染研) D3 宮澤 拳
同M2 古明地 敬介
同M1 市川 暉金沢工業大学
佐野元昭 教授
山形大学工学部
矢野成和 博士（現）琉球大学
水谷 治 准教授（現）クミアイ化学
藤岡 智則 博士
 A. oryzae α-1,3-glucan 合成酵素遺伝子３重破壊株の作製
東北大学大学院農学研究科
五味勝也 教授
 AG, GAG の定量に関する助言
宮城大学食産業学部
笠原紳 教授 培養のCFDシミュレーション
佐竹化学機械工業（株）
加藤好一 研究所長

グラント：(公財) 発酵研究所 大型研究助成
ご支援に御礼申し上げます。

阿部研究室-糸状菌チーム