RESEARCH COMMUNICATIONS

No.

35

2 0 2 1I N S T I T U T E F O R F E R M E N TAT I O N , O S A K A ( I F O )Published by
INSTITUTE FOR FERMENTATION, OSAKA
17 — 85, JUSO — HONMACHI 2 — CHOMEYODOGAWA — KU, OSAKA 532 — 8686, JAPAN公益財団法人発酵研究所

理 事 長

中濱

一雄

常務理事

樽井

直樹

理

事

左子 芳彦
鈴木健一朗
原山 重明
松下 一信

清水
原島
古川
横田

昌
俊
謙介
篤

監

事

下元

高文

藤井

智幸

大島 敏久
笹川 千尋
関 達治
谷 吉樹
藤田 正憲

北本
下田
武田
土屋
吉田

勝ひこ
親
直久
英子
敏臣

評 議 員

目

次
和夫

1

遺伝子ドーピングによる希少系統群微生物の革新的分離培養法の構築……… 加藤創一郎

3

細菌における細胞外膜小胞への選択的タンパク質輸送機構の解明と細胞外タンパク質生産場構築への応用…………………………………………… 栗原達夫

11

未だ活用できていない酢酸菌の新規な酸化的物質変換系の探索……………… 藥師寿治

27

化学物質の還元反応に寄与する異種微生物間の固体腐植を介した細胞外電子伝達機構の解明………………………………………………………… 片山

新太

45

智

61

光合成複合微生物系の形成・維持機構…………………………………… Vera THIEL

67

新規酸素非発生型光合成細菌 Chloracidobacterium の発見とその特性…………………………………………………………………… Marcus TANK

75

好熱性シアノバクテリアの多様性…………………………………………… 花田

智87

好気性光合成細菌の分布と多様性…………………………………………… 花田

智97

巻頭言………………………………………………………………………………… 永井■ 2019年度大型研究助成■ 2015年度寄付講座助成
光合成原核生物の新規菌株の分離分類とバイオリソース化およびそれらを含む複合微生物系の環境・エネルギー産業活用を目指した
研究シーズの開発
光合成複合微生物系の環境・エネルギー活用シーズ開発………………… 花田

■ 2019年度 一般研究助成
DNA バーコードと標本を活用したビョウタケ目ヘソタケ科の探索・分類・系統学的研究………………………………………………………… 細矢

剛

109

有用生物資源としての日本産クロボ菌類由来の担子菌酵母の菌株確立……… 田中

栄爾

110

さやか

111

昆虫病原糸状菌の選択的分離法と培養菌株の確立、および分類学的研究…… 伴
ハラタケ綱( Agaricomycetes )における外生菌根菌の進化と多様化の解明………………………………………………………………………… 佐藤

博俊

112

アフリカ(旧世界)で初めて分離された新世界型回帰熱ボレリア，
Candidatus Borrelia fainii, の全ゲノム比較解析ならびに表現型解析による分類・進化・系統学的検討…………………………………… 邱

永晋

113

渦鞭毛藻－自由生活性バクテリアの“緩やかな共生関係”の解明とその情報を利用した無菌化技術の開発…………………………………………… 鈴木

重勝

114

鉱物による直接的な代謝促進を利用した難培養性微生物の新規単離技術の確立………………………………………………………………… 五十嵐健輔

115

嫌気的芳香族系廃水処理に特化した DPANN 上門アーキアの培養とその生態学的意義の解明…………………………………………………………… 黒田

恭平

116

地衣に共生する担子菌酵母の分布と多様性を紐解く…………………………… 清水

公徳

117

海生変形菌は存在するのか – 変形体および子実体形成能の検証から
分類学的定義を議論する…………………………………………………………… 矢島

由佳

118

節足動物消化管の内外双方で異なる生活ステージを持つ
腸内外両生接合菌類の探索………………………………………………………… 出川

洋介

119

キノコ類(子嚢菌および担子菌)を起源とする新規抗生物質探索のための分子育種法の構築…………………………………………………………………… 渡辺

賢二

120

黒酢醸造に関わる酢酸菌の優占化機構に関する研究…………………………… 石井

正治

121

細菌性ウイルス様粒子 GTA による環境適応機構の分子基盤 ………………… 清水

隆之

122

次世代型プレバイオティクスを用いた腸内細菌叢制御………………………… 中井

博之

123

Frankia 属放線菌の窒素固定と樹木との共生に関わる遺伝子の同定 ………… 九町

健一

124

二次代謝産物の生物学的意義解明による放線菌潜在能の開拓………………… 木谷茂

125

次世代バクテリアセラピーを可能にするための微生物の体内制御技術……… 黒田

章夫

126

海藻多糖フコイダンの微生物分解酵素系の解明とアミロイド線維抑制効果… 大城隆

127細菌の菌体内外に生じるセレンナノ粒子の生成機構の解明とバイオアベイラビリティーに関する研究………………………………………… 三原

久明

128

微生物がつくりだすガラクトオリゴ糖合成酵素の機能改変－次世代型プレバイオティクスの生産基盤の構築－…………………………… 田中

俊一

129

Bacillus 属細菌由来のべん毛モーター蛋白質を利用したナトリウムイオンセンサープローブの開発……………………………………… 南野徹

130

微生物のもつシームレスクローニング活性を利用した
新規シームレス DNA クローニングシステムの開発 …………………………… 本橋健

131

メタノール濃度に応答するシグナル伝達と転写制御機構の解明……………… 由里本博也

132

プロバイオティクス有用菌の消化管内定着性向上を目指した
基盤技術の創製……………………………………………………………………… 小川

哲弘

133

大腸菌の呼吸鎖変異株が示す異常代謝の解析と産業利用……………………… 横田篤134

ω3 系高度不飽和脂肪酸の微生物変換の解析とその応用に関する研究 ……… 小川

拓哉

135

電気的膜電位制御に基づく細菌間相互作用の制御法の開発とそのデバイス化の検討……………………………………………………………… 長峯

邦明

136

分裂酵母胞子表層タンパク質の特性を生かした新奇の異種タンパク質発現・分泌生産・胞子細胞表面提示システムの構築………… 今田

一姫

137

耐熱性シアノバクテリアと微小電極を使って単光子を捉える………………… 山野井慶徳

138

シアノバクテリアを用いた非枯渇性資源生産基盤株の開発…………………… 景山

伯春

139

自己生成させたポルフィリン色素を光増感剤として利用する
光駆動型の微生物触媒反応によるバイオ水素生産……………………………… 本田

裕樹

140

高耐熱性バイオポリエステル微生物生産のための遺伝子資源探索…………… 柘植

丈治

141

地下圏の難分解性有機物を電気微生物分解してメタンを生成する
微生物群集中の電子授受機構の解明……………………………………………… 石井

俊一

142

亜硝酸・硝酸イオントランスポーターが脱窒細菌の亜酸化窒素の親和性へ及ぼす影響評価…………………………………………………………… 寺田

昭彦

143

雅晴

145

■ 2018年度若手研究者助成
南北両極アイスコアに眠る古代菌類から見た過去 70 万年の菌類の進化とその環境適応………………………………………………………… 辻

巻

巻

頭

言

頭

言
永

井

和

夫＊

現在および未来の私たち人類の生活を脅かしている，あるいは近い将来に脅かす可能性があるのは，どのようなコトあるいはモノだろうか？ 気候変動がもたらす自然破壊，環境変化
による温暖化，地球温暖化による生態系の変化，地球の各地に広く生活する人類，人類が先頭に立って進めてきた，自分たちの生活快適さ追求に伴う植生の改変，自然状態ではあり得ない単一植物の大量集積栽培を含む自然界の改変 etc. 何れを取り挙げてみても，我らヒトの生活が地球環境の変化，現状形成に深く関わってきたと思われる．これからの地球の，全てとは言わず，多くの生物が一定のバランスを保ちながら平和に共存し，できれば互いに繁栄することが可能となる方策を提案したいものである．
このように考えると，エゴと言われるかも知れないが，ヒトの生活と他の生物の生存との間にどのように軽重をつけるか，という議論になるかも知れない．例えば，（ヒトにとっての）病原菌や有害生物は，無害化或いは積極的に排除し，有用生物は動・植物から細菌に至るまで大切に扱う，という感覚である．ただし，有用であるか，無用であるか，更には有害かを，結論することは容易ではなく，明確な判定点が得られるまでは，中間的な評価をせざるを得ないものも少なくないであろう．また，現段階では有用，有害あるいはその中間と評される
もの，更には有害物の効果を凌駕するほどのメリットを含むものも科学の進展によって明らかになるまでは，保存・保持が必要であるかも知れない．
それにしても，恣意的な考えにより現状を無視して快適さを追及するのは，ヒトのエゴで，少なくとも解決が可能であることが科学的に証明されるまでは，残念ながら，現状維持に甘んじざるを得ない，と思われる．すなわち凍結等による休眠処理が理解された時点で，その延長である未来像を考えてみたい．
既に多くの研究者が指摘或いは想定しているように，現在の状況がそのまま進展すると，地球の自浄機能だけでは早晩限界を迎えるであろうと思われる．特に，石炭，石油等に代表される化石燃料に依存したエネルギー消費は，二次産物，三次産物等のように環境悪化につながる影響で，すでに許容されない段階にある．しかし，専門家の意見によると，「太陽光，
化学的に生成する水素ガスなど，地球温暖化の原因とならないエネルギー獲得システムの利用が，すでに実用段階あるいはその入り口に迫りつつあるのが現状」とのことなので，その早期実現化と特に人口密集地近郊における普及を大いに期待したいものである．
これからの地球の多くの生物が一定のバランスを保ちながら平和に共存し，できれば互い＊

永井和夫
東京工業大学・中部大学名誉教授，元公益財団発酵研究所理事

－1－

永

井

和

夫

に繁栄することが可能となる方策を提案したいものである．
さて話題は変わるが，ここで最近の難題の一つであるコロナウイルス（以下コロナと略称）についての現状に触れてみたい．わが国では，一時，患者数が病院の収容力を超える状況となったが，最近では入院する患者の数が日に日に減少する傾向が認められるようである．これは，各製薬企業によって開発されたワクチンの投与による効果が顕著に表れているから，と理解されている．このまま世の中からコロナが消滅すれば，“めでたし ! ”であるが，敵も去るもので，新たな変異株ができて，現状のワクチンの効果が減殺される可能性も考えておかねばならない．もうひとつのコロナに敵対する手段として，化学療法剤の併用が考えられよう．それぞれ互いに異なる作用機構をもつワクチンと化学療法剤を，同時に投与あるいは併用することにより，耐性コロナの出現はほぼなくなる，のではなかろうか ? ただし，ヒトとコロナの遺伝情報発現機構は重複している可能性が高い，とも考えられるので，これは素人の見やすい夢物語，に過ぎないことであるかも知れないが．
これからの地球では，全てとは言わず，より多くの生物が一定のバランスを保ちながら平和に共存し，できれば互いに繁栄することが可能となる方策を提案したいものである．
地球の温暖化現象にしても，コロナの跋扈にしても，原因のかなりの部分に人類の活動や繁栄があるように感じる．前者はヒトと言う名の動物が，文明と言う能力を快適さ増大のために過度（ヒト以外にはできないほど ! ? ）に応用したことを，後者は地球上の生物は互いに共通の要素をかけて生存しているのだ，ということを理解しつつ互いに共存が可能となるありかたを模索すべきことを．
地球上には，現在未知の微生物群をはじめとして，人類がいまだ触れることができていな
い生物の存在が予想されている．本財団によるご支援でこの世界探訪が実り多いものであることを祈念する．

－2－

2019 年度大型研究助成の研究報告
助成期間:2019 年 4 月～ 2021 年 3 月

IFO Res.Commun. 35
3-10, 2021

遺伝子ドーピングによる希少系統群微生物の革新的分離培養法の構築
加

藤

創一郎

国立研究開発法人産業技術総合研究所〒062-8517

札幌市豊平区月寒東二条17-2-1

Isolation of rare-phyla microorganisms by a gene-doping strategy
Souichiro Kato
National Institute of Advanced Industrial Science & Technology (AIST)
2-17-2-1, Tsukisamu-Higashi, Toyohira, Sapporo, Hokkaido, 062-8517
Many attempts have been made to develop efficient methods of isolating uncultured microorganisms. The main
strategy was to modify the culture conditions to be closer to the natural environment, but it is impossible toexperimentally reproduce the environmental conditions. In this study, we aimed to construct a new culture method("gene doping method") that enables the culture of difficult-to-culture microorganisms by conferring specificfunctions by gene engineering. (1) The gene engineering method for rare-taxa microorganisms (a phylum
Verrucomicrobia) was investigated. By using transposome, an antibiotic resistance gene was successfullytransferred Verrucomicrobia isolates. (2) We attempted to isolate microorganisms under conditions in which theconcentration of H2O2 was artificially changed. Seven strains that are sensitive to low-concentration H2O2 weresuccessfully isolated. (3) The catalase genes derived from Escherichia coli was introduced into the H2O2-sensitive
isolates. Resistance to H2O2 was successfully conferred by heterologous expression of catalases in the H2O2sensitive isolates, which implies the effectiveness of the gene-doping method.
Key words: Bacteria, rare-phyla, isolation, genetic modification, oxidative stress緒

言されていることを考えると，半数以上の門が未知のまま取り残されている現状はかなり異常と言えよう．加えて，微生物は驚くほど多様な代謝系・物質生産能を有し，

これまでに分離培養され同定されたバクテリアの 90 ％

機能化合物生産・食品製造・廃棄物処理等の幅広い分野

以上はわずか 4 つの門( Proteobacteria 門，Firmicutes 門，

で利用されている．しかし人類が分離培養に成功した微生物は，環境中の全微生物種のうちわずか 1 ％にも過ぎBacteroidetes 門，Actinobacteria 門)に分類されている．
すなわち，分離の報告例がある 27 門のうち実に 23 門は，ないと言われている．栄養豊富な寒天培地で培養可能な

ごくわずかな分離培養例しかない，いわゆる「希少系統

微生物の数は，蛍光顕微鏡観察などにより計測される環群」なのである．例えば，一般的な土壌から直接 DNA

境微生物数と比べ，2 ～ 3 桁低いことがよく知られておを抽出し，16S rRNA 遺伝子を対象とした菌叢解析をおり，この現象は“great plate count anomaly”と呼ばれてこなうと Verrucomicrobia 門や Acidobacteria 門に代表さいる(Staley & Konopka, 1985 ; Amann et al., 1995 )．またれる希少系統群微生物が 20 - 30 ％程度の存在比で検出

環境ゲノムデータを加味した進化系統解析により，バクされるが，一般的な培養法ではこれらの微生物はほとん

テリアは全 58 門からなると推計されているが，そのうど分離培養されてこない( Tanaka et al., 2014 )．以上の

ち半数以上の 31 門は分離の報告例がない「推定上の」系

ように，人類は微生物が持つ膨大な有用機能・遺伝子資統群とされている( Hug et al., 2016 )．ヒトがホヤやナ

源のほとんどを，利用どころか発見すらできていないの

メクジウオなどとともに 1 つの門(脊索動物門)に分類

である．
近年の環境ゲノム・シングルセルゲノム解析の技術革E-mail: s.katou@aist.go.jp
共同研究者:北川 航(国立研究開発法人産業技術総合研究所)．

新は，微生物を分離培養することなくそのゲノム情報への ア ク セ ス を 可 能 と し た( Wang & Jia, 2016 ; Dance,

－3－

加

藤

2020 )．しかし膨大な遺伝子配列データを得たとしても，創一郎利用できるのは既知微生物の既知遺伝子とある程度の相Rubritalea squalenifaciens NBRC 103619T は独立行政法人
製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター

同性を持つ遺伝子のみであり，ほとんどは「 hypothetical( NBRC )より，Verrucomicrobium spinosum JCM18804T

protein 」として機能未知のまま放置されているのが実は理化学研究所バイオリソース研究センター( JCM )よ情である．既知のものから類推・想像すらできない真にりそれぞれ分譲を受けた．すべての菌株は 25 ℃好気条

新奇な微生物機能の発見には，該当の微生物の分離培養

件，C. akajimensis と R. squalenifaciens は Marine Brothが不可欠である．近年発見された，石炭成分を直接メタ培地，それ以外の株は R2A 培地を使用して培養した．

ンに変換可能な微生物( Mayumi et al., 2016 )やポリエ

遺伝子導入に用いるベクターとして，広範なグラム陰

チレンテレフタラート( PET )分解細菌( Yoshida et al.,性菌で保持される pBHR1( pBBR1 レプリコン)，およ2016 )，耐性菌の出現頻度が極めて少ない新奇抗生物質

びグラム陰性・陽性菌で保持される pHRP308( RSF1010

生産菌( Ling et al., 2015 )などは，分離培養によって初レプリコン)をそれぞれフナコシ，国立遺伝学研究所よめて新奇の微生物機能が明らかにされた好例である．

り入手し，薬剤耐性遺伝子の変更など一部を改変して使これまでに数多くの微生物学者が培養困難な環境微生

用 し た． プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー の 接 合 伝 達 は 供 与 菌物の分離培養に向け様々な挑戦を続けてきた(Vartoukian( Donor )となる大腸菌株，受容菌( Recipient )となる

et al., 2010; Pham & Kim, 2012; Lewis et al., 2021 )．例を挙げると，寒天以外のゲル化剤の使用( Tamaki et al.,

稀少系統微生物株，また接合伝達を仲介するプラスミド

2009 )， 細 胞 内 シ グ ナ ル 物 質 の 添 加( Bruns et al.,

三親接合で行った．個別に液体培養した三株を同等の細2002 )，培地中の活性酸素種の除去( Martin et al., 1976;

胞数で混合したのち遠心分離で大半の上清を除去して三pRK2013 を持つヘルパー株( Helper )の三者を用いる

Tanaka et al., 2014 )，競合者や阻害物質の影響を物理化

者の濃縮液を作製し，これを受容菌の培養に適した寒天

学 的 に 排 除 し た 培 養 法( Connon & Giovannoni, 2002;

培地上にスポット植菌・培養して接合伝達を促した．接Zengler et al., 2002 )，拡散透過膜や中空糸膜を用いた in

合伝達体の選択にはベクター導入により耐性となる選択

situ 培養法( Kaeberlein et al., 2002; Fujitani et al., 2014 )薬剤(カナマイシン)に加え，カウンターセレクションなど様々な培養法が試験され，新規微生物の獲得を可能として大腸菌と受容菌の耐性が本質的に異なるテトラサにしてきた．環境中の微生物を分離培養できない究極的な要因は，微生物が住む自然環境と実験室内での培養環

イクリンなどの抗生物質を添加した培地を用いた．エレクトロポレーションに用いる細胞は液体培養で OD600 =

境との乖離にあると言える．環境中の難培養微生物の分0.1 – 0.3 としたものを 10 ％ glycerol 液で 2 回洗浄し，元離培養を目的としたこれまでの研究では，実験室内でのの培養液の 1/20 容量の 10 ％ glycerol 液で再懸濁したも培養条件を自然環境に近づけることでその解決が図られのをコンピテントセルとした．遺伝子導入は Bio-Rad 社てきた．しかし究極的には実験的に自然環境を完全に再の GenePulser Xcell を用い，1 mm ギャップのキュベッ

現するのは不可能であり，未知微生物の培養化効率の飛トに 0.1 – 1 µg のプラスミドベクターを混合したコンピ

躍的な向上には大きなブレークスルーが必要である．筆テ ン ト セ ル( 40 – 80 µL ) を 入 れ，1.0 – 1.8 kV，200Ω，者らはそのブレークスルーとして，培養条件を改変する

25 µF のパルス条件で行った．パルス後は選択圧なしでのではなく，分離対象とする未知微生物に遺伝子を導入

数時間から半日間回復培養し，その後選択薬剤を含む寒し特定機能を人為的に付与することで実験室内の培養環

天培地に植菌して培養した．トランスポゾンによる遺伝

境に適応させることができないか，という逆転の発想を子導入はゲノム DNA 上にランダムに導入される EZ-Tn5

提案する．本研究でははこの新たな培養技術，「遺伝子transposase( Lucigen 社)を使用した．トランスポサー

ドーピング法」について，特に希少系統群の難培養微生

ゼ酵素が認識する反復配列を 5' 末端に持つプライマー

物の分離培養を目的とした基盤技術の開発ならびに原理

でカナマイシン耐性遺伝子とカタラーゼ遺伝子をタンデ実証を実施した．

ムにつないだ DNA 配列を PCR 増幅し，上記酵素と PCR
産物を 37 ℃で反応させ“酵素 – DNA 複合体”
(トランス

実験方法

ポゾーム)を形成させ，これをエレクトロポレーションに用いた．形質転換体の確認は選択薬剤マーカーである

希少系統群微生物への遺伝子導入

カナマイシン耐性遺伝子の内部を特異的に増幅するプラ

Verrucomicrobia 門の既知菌株 Lacunisphaera limnophila
DSM 26815T，Chthoniobacter flavus DSM 22515T はDeutsche

イマーセット(Det-kmr-F : ACA AGATGGAT TGCACGC,

Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)

Det-kmr-R : T TCCACCATGATAT TCGGC，590 bp 増幅)
およびカナマイシン耐性遺伝子 – カタラーゼ遺伝子をスより，Coraliomargarita akajimensis NBRC 103620 T ，

パンする領域を特異的に増幅するプライマーセット－4－

遺伝子ドーピングによる希少系統群微生物の革新的分離培養法の構築( kmr-GE-check-F : GT TGGC TACCCGTGATAT TG ，
kmr- GE - check-R : T TGGATCGAGA AGATCGA AG ，katE(それぞれ Catalase-peroxidase HPI，Catalase HPII )を PCR 増幅し，In-Fusion クローニングにてタンデムに

3,780 bp 増幅)を用いて PCR 検出を行った．

ベクターにクローニングした．また宿主での遺伝子発過酸化水素感受性菌の分離培養

遺伝子であるカナマイシン耐性遺伝子の上流には人工現の可能性を広げるため，katGE の上流および薬剤耐性
微生物培養に用いる PYG 培地は既報の方法( Tanaka

合成したバクテリアのコンセンサスプロモーター配列

et al., 2014 )に従い過酸化水素の発生が最も少ない PW
手法(リン酸無添加培地)を用いて調製した．過酸化水(それぞれ T TGACAgctggggcgccctctggTATA AT および素添加培地は 30 ％の過酸化水素を希釈し，最終濃度がなベクター pRSFkatGE を作製した．

T TGACAtccaaacgagagtctaaTATA AT )を導入し，最終的

40 µM となるようにシャーレに成型する直前に培地に添

過酸化水素感受性菌として単離された OS-4 株の形質加した．個化後の寒天培地の過酸化水素濃度は無添加のPW 培地が 1 - 2 µM，過酸化水素添加培地は 15 - 20 µM

転換にはエレクトロポレーション法を使用した．OD600= 0.3 - 0.4 程度に液体培養した菌体を 10 ％ glycerol 液でとなった．またこれらの中間的な濃度も初期添加量を調2 回洗浄し，元の培養液の 1/20 容の 10 ％ glycerol 液で節することで作製した．

再懸濁したものをコンピテントセルとした．遺伝子導入

北海道札幌市に位置する北海道大学の構内の大野池のは Bio-Rad 社 の GenePulser Xcell を 用 い，1 mm ギ ャ ッ

底泥をかき混ぜ，巻き上がった底泥を含む水サンプルをプのキュベットに 0.1 – 1 µg のプラスミドベクターを混採取し微生物の分離源とした．水サンプルの入ったボト

合したコンピテントセル( 40 – 80 µL )を入れ，1.6 kV，ルを転倒攪拌した後，2 時間静置することで大きい粒子

400Ω，25 µF のパルス条件で行った．パルス後は選択圧を沈殿させ上清を得た．これをを蒸留水にて 10 にまでなしで半日程度回復培養し，その後選択薬剤を含む寒天

段階希釈した後，50 μl を PW 培地に接種し 20 ℃の暗所培地に植菌して培養した．形質転換にはカタラーゼ遺伝にて培養を行なった．寒天培地上に生育したコロニーを子を搭載した上記ベクター( pRSFkatGE )および同ベ-4PW 培地および過酸化水素添加培地に植え継ぎ，PW のクターでカタラーゼを搭載しないものをコントロール

みに再度コロニー形成が見られるものを過酸化水素感受(空ベクター，pRSFbr)として用いた．
カタラーゼ搭載ベクターまたは空ベクターが導入され性株とした．得られた分離株は 16S rRNA 遺伝子解析

た OS-4 株を R2A 培地で液体培養し，10 倍希釈で数段( Tanaka et al., 2014 )により微生物種を同定した．
寒天培地は -80 ℃にて一晩冷凍した後，室温にて三時階の希釈をして各段階 50 µl ずつをコロニーカウント用

間暗所に放置することで融解した．解凍後の離液(上清)の菌液とした．これを過酸化水素濃度の異なる三種類のを回収し，既報の方法( Tanaka et al., 2014 )に従って

寒天培地プレート(固化後の最終濃度 1.1 µM，6.7 µM，過酸化水素濃度の測定に用いた．測定の標準となる高濃15.9 µM )に五反復で接種し，20 ℃の暗所で一週間培養度( mM オーダー)の過酸化水素は 240 nm の波長におした．過酸化水素濃度 1.1 µM のプレート(過酸化水素

ける透過係数 43.6 M cm を用いてその濃度を決定し無添加培地)上で 100 前後のコロニーが形成された希釈た．上記で測定した高濃度過酸化水素を 1000 倍希釈し段階を選択し，この希釈段階において各濃度のプレートて発色試薬と反応し，得られる 560 nm の吸収を測定しに形成されたコロニー数を計測し，五反復の平均値で各た値を低濃度( µM オーダー)の過酸化水素の標準とし濃度間のコロニー形成数の比較を行った．

-1-1

た．サンプルは同様に発色試薬と反応させて 560 nm の結果および考察

吸収を測定し，標準との相対的な値から過酸化水素濃度 を 求 め た． サ ン プ ル と 発 色 試 薬( 試 薬 A : 200 mM
sorbitol，200 µM xylenol orange と試薬 B : 500 µM ferrous

希少系統群微生物への遺伝子導入法の検討

ammonium sulfate，50 mM H2 SO4 を 24:1 の割合で混合

本研究では，モデルとなる希少系統群として，土壌・したもの)は等量混合して室温で 45 分反応した後に測淡水・海水等に幅広く存在しながら分離培養例が限られ定した．

ている Verrucomicrobia 門( Freitas et al., 2012 )を選択した．Verrucomicrobia 門に属する微生物種はこれまで

過酸化水素感受性菌への抗酸化酵素遺伝子導入

28 属 65 種 が 記 載 さ れ て い る が， こ れ は 例 え ば

過酸化水素感受性株への遺伝子導入は広宿主域プラス

Proteobacteria 門(約 500 属，2000 種)と比較すると極ミドベクターである pHRP308( RSF1010 レプリコン)

めて少ないといえる．Verrucomicrobia 門の微生物種を対を一部改変したものを用いた．このプラスミドに大腸菌象とした遺伝子操作に関する報告は，Verrucomicrobium

K-12 株由来の二種類の異なるカタラーゼ遺伝子 katG，spinosum におけるトランスポゾンによるランダム変異

－5－

加

藤

創一郎

挿入に関する 1 例( Domman et al., 2011 )のみであり，

こ の 結 果 は，Verrucomicrobia 門 微 生 物 の 細 胞 へ の使用可能な遺伝子ベクターや外来遺伝子の導入・発現に

plasmid の導入や抗生物質耐性遺伝子の発現自体には問関する報告例はなかった．また Verrucomicrobia 門の既題はないが，プラスミドの複製や保持の点で問題が生じ

知分離株のうちゲノム情報が報告されているものについていることを示唆している．この結果を受け，plasmidて plasmid の保持を調べたが，plasmid を有しているも等の遺伝子ベクターを使用しないトランスポゾーム法をのはなかった( Kant et al., 2011; Wertz et al., 2012; Song適用した( Fig. 1 )．PCR 増幅したカナマイシン耐性遺et al., 2019 )．以上を踏まえ，Verrucomicrobia 門の既知
微生物種のうち，一般的な培地で好気培養が可能なもの

伝子に transposase を結合したトランスポゾームをエレ
クトロポレーションにより Verrucomicrobia 門微生物にをできるだけ多くの系統群から選抜し，Table 1 に示す

導入した結果，C. akajimensis および R. squalenifaciens

計 5 株を使用し遺伝子導入法を検討した．

の 2 菌株で遺伝子導入された株の取得に成功した

グラム陰性，グラム陽性の幅広い微生物で機能するこ( Fig. 2 )．遺伝子，タンパクの発現確認には至っていなと が 知 ら れ て い る 広 宿 主 域 ベ ク タ ー pBHR1 お よ び

いが，これは Verrucomicrobia 門微生物における遺伝子

pHRP308 を使用し，エレクトロポレーションもしくは導入の初めての事例となる．一方で試験した 5 株のうち接合伝達法により遺伝子導入を試みた．その結果，どち3 株では遺伝子導入株の取得に至っておらず，この手法

らのベクターでも複数の菌株で抗生物質耐性を指標としが Verrucomicrobia 門において一般的に適用可能である

た 1 次スクリーニングでは形質転換された候補株が得らかは定かではない．

れるものの，その後安定した継代培養ができなかった．

Table 1. Phylogenetic information of phylumVerrucomicrobia strains used in this study.
Class

Order

FamilyGenus/Species/Strain

Opitutae

Opitutales

Opitutaceae

Lacunisphaera limnophila DSM 26815T

Puniceicoccales

Puniceicoccaceae

Coraliomargarita akajimensis NBRC 103620T

Spartobacteria

Chthoniobacterales

Chthoniobacteraceae

Chthoniobacter flavus DSM 22515T

Verrucomicrobiae

Verrucomicrobiales

Rubritaleaceae

Rubritalea squalenifaciens NBRC 103619T

Verrucomicrobiaceae

Verrucomicrobium spinosum JCM 18804T

Fig. 1. Summar y of the transposome method. DNA fragments to be inserted into the genome (recognition
sequence of transposase was added) were mxed with transposes to obtain "transposome" (the complex of
DNA end transposase). The transposome was transformed by electroporation into the target bacterial cells.
The transformed strains were obtained by selection plate (e.g., containing antibiotics), and the presence ofinserted DNA fragment was confirmed by specific PCR.

－6－

遺伝子ドーピングによる希少系統群微生物の革新的分離培養法の構築子を導入し発現させることで，通常の培養法では分離培
養困難な微生物の取得が可能になると考えた．
その原理実証に向け，一般的な培地作製法で発生する
10 μM オーダーの過酸化水素によりコロニー形成が阻害される微生物の分離培養を試みた．リン酸と寒天を別々にオートクレーブ滅菌し培地を調整することで，過酸化水素濃度を極めて低濃度( 1 - 2 μM )しか含まない寒天培地を作製し北海道大学敷地内の大野池の底泥を分離源とし微生物を分離培養した．既報( Tanaka et al., 2014 )と同様に，低濃度過酸化水素培地では，通常の調整法で作製した培地と比較して得られるコロニー数が多い傾向にあった．低濃度過酸化水素培地で得られた約 300 のコ
ロニーを対象としコロニー PCR 法による 16S rRNA 遺伝 子 断 片 を 増 幅 し シ ー ク エ ン ス 解 析 に 供 し た．RDP
Classifier による系統分類解析により配列が類似するものを同一の系統群としてまとめた結果，120 の系統群に分類された．このうち存在頻度が高かった系統群について，低濃度過酸化水素培地では生育可能かつ過酸化水素添加培地(終濃度約 15 μM )では生育できない株を選別
Fig. 2. PCR detection of gene transformation to a Verrucomicrobia
strain (Rubritalea squalenifaciens). Rsq-23: the genomeof transformed R. squalenifaciens strain (DNA fragment
was successfully introduced into the genome) was usedas the PCR template, Negative control; the genome of
R. squalenifaciens strain without transformation was usedas the PCR template, 16S: using universal primers for 16S
rRNA gene (a positive control, expected product size:
500 bp), det; using a primer set for kanamycin resistancegene (a transformed gene, expected product size:
590 bp), and kmr: using a primer set for the spanning
region of kanamycin resistance gene and catalase gene(transformed genes, expected product size: 3780 bp). The
white arrows indicate PCR products with expected sizes.

し た． そ の 結 果，OS-1，OS-2 ，OS-3 ，OS-4 の 4 株 が選別され，これらが過酸化水素感受性菌であることが確認された．
過酸化水素感受性菌への抗酸化酵素遺伝子導入
前項にて得られた 4 株に加えて，筆者らの過去の研究で得られていた 3 株の過酸化水素感受性菌も以降の実験に使用した．以上計 7 株の過酸化水素感受性菌の分類学的情報を Table 2 に示す．大腸菌由来の 2 種のカタラー
ゼ，katG と katE を広宿主域ベクター pHRP308 に搭載し，Table 2 に示した過酸化水素感受性株に対し，エレクト
ロポレーション法より形質転換を試みた．その結果，OS-4 株 に つ い て plasmid 保 有 株 の 取 得 に 成 功 し た．
OS-4 株について katGE を持たない空ベクター株を同様に作製し，異なる過酸化水素濃度下でのコロニー形成を

過酸化水素感受性菌の分離培養比較した( Fig. 3 )．その結果，空ベクター株では元株

環境微生物への遺伝子導入により付与する機能としと同様，低過酸化水素培地(1.1 μM )では良好なコロニーて，本研究では酸化ストレス耐性という機能に着目した．

形成がみられたものの，コロニー数は過酸化水素 6.8 µM

寒天平板培地でのコロニー形成は，大気下という多くの条件で約 1/10，過酸化水素 15.9 µM 条件では 1/1000 以

環境微生物にとっては特殊な環境での増殖を伴うプロセ

下にまで低下し，極めて感受性が高いことが示された．

スである．特に 20 ％の酸素に直接さらされるというの一方でカタラーゼ発現株では，過酸化水素 6.8 µM 条件

は多くの微生物にとって大きな酸化ストレスがかかるとでは有意なコロニー数低下がみられず，また過酸化水素

考えられる．加えて，筆者らのグループでは，一般的な15.9 µM 条件においてもコロニー数低下は 1/2 程度に抑寒天培地の作製時に，培地に含まれるリン酸と寒天を同えられていた．この結果は，一般的な培地では分離培養時にオートクレーブ処理することで過酸化水素が発生すできない過酸化水素感受性株を，外来遺伝子の導入によること，またそれにより環境微生物の少なくとも一部がり分離可能な状態に改変することが可能であることを示

生育阻害を受けることを報告している( Tanaka et al.,している．

2014 )．以上のことから，環境微生物に抗酸化酵素遺伝
－7－

加

藤

創一郎

Table 2. Phylogenetic information of H2O2 -sensitive isolates used in this study.
StrainClass

Closest relative (identity, ％)OS-1

Betaproteobacteria

Rhodoferax ferrireducens T118 (99.2)

OS-2

Betaproteobacteria

Rhodoferax sp. strain GR-4 (99.4)

OS-3

Betaproteobacteria

Pelomonas sp. 7A-202 (100)OS-4Betaproteobacteria

Curvibacter sp. AEP1-3 (99.6)

SO-S41

Alphaproteobacteria

Pleomorphomonas oryzae (89.0)

SE-S32Alphaproteobacteria

Prosthecomicrobium hirschii (95.1)

SE-S63Alphaproteobacteria

Methylocella silvestris (92.3)

Fig. 3. Comparison of colony forming units (CFUs) on agar solidified media
with different concentrations of H2O2. (A) strain OS-4 with pRSFbr (anempty vector) and (B) strain OS-4 with pRSFkatGE containing catalase
genes. Data are represented as averages from five replicate agar plates.
Error bars represent standard deviations.

考察と展望

本研究で使用した Verrucomicrobia 門微生物のように，

本研究では希少系統群微生物である Verrucomicrobia

ある特定の環境に相当数存在していながら分離培養が困門微生物を対象とした遺伝子導入法の開発，ならびに一難な特定の系統群を対象とする．この場合，その対象の般的な培地では培養ができない過酸化水素感受性菌への系統群で効率的な遺伝子導入法，その系統群で(できれ遺伝子導入による可培養化を通し，難培養性微生物へのば特異的に)機能するベクターなどの構築が必要となる．

遺伝子導入(遺伝子ドーピング)による可培養化の実現

また例えば門レベルで分離培養例が存在しないような系可能性を示すことができた．しかし今後，環境中の微生統群を対象とすることも理論的には可能である．この場

物への直接遺伝子導入による可培養化，ひいては新奇微合，メタゲノムデータからその系統群が保持しているプ

生物の分離培養の実現に向けては，検討が必要な課題おラスミドの配列を特定し，塩基配列合成によりプラスミ

よびそれを解決するための更なる研究開発が必要である．

ドを再構築するなどの手段により，未培養系統群で機能

本技術の適用に際しまず検討すべき項目は，どの微生するベクターを得るような工夫が必要であろう．また標物を対象として遺伝子導入を試みるべきか，である．こ的型遺伝子導入においては，単純に抗生物質耐性遺伝子

れはその対象の範囲から「標的型遺伝子導入」と「非標などを導入するだけでも，他の系統群微生物との競合を的型遺伝子導入」の 2 つに大別できる．「標的型」では排除でき分離培養の可能性をあげられるであろう．加え－8－

遺伝子ドーピングによる希少系統群微生物の革新的分離培養法の構築て，メタゲノムデータから対象とする微生物のゲノムをにできないか，という発想に基づき研究を行った．
(1)分離

再構築できていれば，そのゲノムデータから自律的な生例が非常に少ない希少系統群微生物(Verrucomicrobia 門)

育を困難にしている遺伝子欠損を割り出し，遺伝子ドーを対象とし，遺伝子導入法を検討した．トランスポソー
ムを用いた手法により，Verrucomicrobia 門の微生物でピングにより補填することが可能となるであろう．
もう一方の「非標的型」では，土壌や水圏などの多様初めて遺伝子導入に成功した．
(2)寒天培地中の過酸化な微生物が生息する環境を対象とし，特定の微生物種で水素濃度を変えた条件で微生物の分離培養を試み，通常はなく存在するすべての微生物に対し遺伝子導入・機能の培地調整時に発生するレベルの過酸化水素に感受性を付与を試み，分離培養効率の全体的な向上，および系統持つ環境微生物の分離に成功した．
(3)分離した過酸化的に新規性の高い微生物の分離確率向上を目的とする．

水素感受性株に大腸菌由来のカタラーゼ遺伝子を導入しこの場合，できるだけ多岐にわたる微生物系統群で機能発現させた．感受性株への遺伝子導入により，培地調整する遺伝子導入法，および超広宿主域ベクターの開発が時に発生する過酸化水素に対する抵抗性を付与可能であ必要となる．遺伝子導入法としては，本研究で使用したることを実証し，本手法の有用性が示された．今後環境エレクトロポレーション法は有用な候補であるが，加え微生物への直接遺伝子導入の実験を行うことで，本手法てリポソーム等の膜小胞を利用した細胞融合法(真核生が新規微生物の分離培養に有効であることが示されると物では一般的な手段であるが原核生物での適用例は乏し期待される．

い)など，新たな技術開発を行う余地もあるであろう．

本助成で得られた研究成果の報告

非標的型においては，本研究でも使用した過酸化水素分
解酵素のような，実験室培養で生じるストレスを軽減するような遺伝子の導入が有効であろう
我々のグループでのこれまでの研究( Tanaka et al.,2014; Kato et al., 2018; 2020 )で，多くの環境微生物が寒天培地調整時に発生する微量の過酸化水素により生育阻害を受けることが明らかとされている．しかし好気条件で生育する微生物にとっては，酸素呼吸の過程の電子伝達系にて活性酸素種が発生することは不可避であり，何らかの活性酸素除去機構は備えられているはずである．

口頭発表1) 加藤創一郎．2021．培養困難な微生物たちとそれらを培養したい研究者たち．第67回日本放線菌学会学術講演会(3月9日，オンライン開催)
原著論文
1) Watanabe, M., Igarashi, K., Kato, S., Kamagata, Y., & Kitagawa,W. Complete genome sequence of Alphaproteobacteria
bacterium strain SO-S41. Microbiol. Resour. Announc. 10:
e0053621.

実際，本研究で使用した SO-S41 株のゲノム解析の結果，過 酸 化 水 素 感 受 性 で あ り な が ら カ タ ラ ー ゼ や alkyl

謝hydroperoxide reductase といった過酸化水素分解酵素を保持していることが明らかとされた(原著論文 1 )．本

辞研究で分離培養した過酸化水素感受性菌が，細胞内で発本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公

生する過酸化水素の除去機構を持ちながら，なぜ培地中益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．また，の微量の過酸化水素により生育が阻害されるのか，その本研究の遂行にご協力いただいた国立研究開発法人産業

理由は不明である．その理由を明らかにすることで，外技術総合研究所の三浦愛技術補佐員，北海道大学大学院

来遺伝子の導入ではなく，内在しながら機能を果たせて農学院基礎環境微生物学分野の学生諸氏に感謝の意を表いない遺伝子の活性化による可培養化のような技術につします．

ながるかもしれない．

要

文

約

環境中に存在する難培養性微生物の分離培養に向け，
これまで多くの試みがなされてきた．これまでの研究では，
培養条件を改変し自然環境に近づけることでその解決が図られてきたが，究極的には実験的に自然環境を完全に再現するのは不可能である．本研究では，遺伝子導入による特定機能の付与，すなわち遺伝子ドーピングにより，難培養微生物を人為的に改変し実験室内での培養を可能

献

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－ 10 －

IFO Res.Commun. 35
11-25, 2021

細菌における細胞外膜小胞への選択的タンパク質輸送機構の解明と細胞外タンパク質生産場構築への応用
栗

原

達

夫

京都大学化学研究所〒611-0011

京都府宇治市五ケ庄

Elucidation of the mechanism of selective protein transport tobacterial extracellular membrane vesicles and its application to
the construction of extracellular protein production platform
Tatsuo Kurihara
Institute for Chemical Research, Kyoto University
Gokasho, Uji, Kyoto 611-0011
A Gram-negative cold-adapted bacterium, Shewanella vesiculosa HM13, isolated from the intestinal contents ofhorse mackerel (Trachurus japonicus), abundantly produces extracellular membrane vesicles containing a proteinwith a molecular mass of about 49 kDa, named P49, as their major cargo protein. Whole genome sequence analysisof this bacterium revealed a gene cluster upstream of the P49 gene that encodes proteins similar to the componentsof the type II secretion system (T2SS), which is involved in protein translocation across the outer membrane inGram-negative bacteria. Disruption of the genes in this gene cluster abolished P49 transport to the membrane
vesicles and caused its accumulation in the cells, suggesting that the T2SS-like machinery is responsible for P49
secretion. Genes coding for proteins that are probably involved in the synthesis of cell-surface polysaccharides
were also found around the P49 gene. The mutant strains obtained by disrupting these genes secreted P49, but
P49 in the extracellular space was not associated with the membrane vesicles. These results suggest that P49 istranslocated to the extracellular space by the T2SS-like machinery and loaded onto the membrane vesicles byinteraction with their surface polysaccharides. When GFP was fused to the C-terminus of P49 and expressed in
S. vesiculosa HM13, the fusion protein was found in the membrane vesicles besides the cells. Thus, P49 may be
useful as a carrier for the production of foreign proteins as cargoes of the membrane vesicles. It was also foundthat the membrane vesicle productivity of S. vesiculosa HM13 was enhanced by increasing L-lysine concentrationin the culture medium, and the sensor protein homolog involved in this response was identified.
Key words: membrane vesicle, cargo protein, protein secretion, protein transport, cell-surface polysaccharide緒

言

ドラッグデリバリーのキャリア，生体触媒等としての応用も期待されている( Toyofuku et al., 2015; Gerritzen et

細菌が生産する細胞外膜小胞(extracellular membrane
vesicle)は，細胞間コミュニケーション，環境中の栄養

al., 2017; Turner et al., 2019; Li & Liu, 2020 )．本研究は，
膜小胞高生産性細菌を用いて，膜小胞形成の分子機構，

素の利用など，生理的に重要な多くの機能を担ってい

特に特定のタンパク質が膜小胞に輸送される仕組みを明る( Schwechheimer & Kuehn, 2015; Watanabe, 2016;

らかにし，膜小胞をプラットフォームとしたタンパク質

Toyofuku, 2019; Caruana & Walper, 2020 )．ワクチンやの細胞外生産系開発の基盤を構築することを目指して実施したものである．

E-mail: kurihara@scl.kyoto-u.ac.jp
共同研究者:川本 純(京都大学化学研究所)．
小川拓哉(京都大学化学研究所)．

本研究で用いた膜小胞高生産性細菌は，外来タンパク質の分泌生産系構築に適した低温適応細菌を探索する過程で発見された．低温適応細菌は，極地，深海，高山な－ 11 －

栗

原

達

夫

どの低温環境に広く棲息している( Yumoto, 2013 )．こを添加した．S. vesiculosa HM13 と S. livingstonensis Ac10

れらの細菌は低温での使用に有用な低温活性酵素の生産は 4 ℃または 18 ℃，Shewanella oneidensis MR-1 は 30 ℃，

者として酵素工学的な観点から注目されているほか，熱Escherichia coli MG1655 と Pseudomonas putida KT2440
は 37 ℃で培養した．

安定性が低い外来タンパク質などを生産する宿主としても有用と期待される(Margesin, 2017 )．筆者らは，以前，
南極海水由来の低温適応細菌 Shewanella livingstonensis

膜小胞の調製

Ac10 を宿主とした外来タンパク質低温生産系を構築し，培養液を 6,000 ～ 6,800 x g で 10 分間の遠心分離に供

熱安定性の低いタンパク質の生産に有用であることを示

して細胞を回収した．上清は 13,000 ～ 15,000 x g で 10した( Miyake et al., 2007 )．このシステムを更に有用な～ 15 分間の遠心分離に供した．得られた上清を 0.45 µm

ものとすべく，外来タンパク質の分泌生産に適した低温のポアサイズのフィルター濾過に供することで細胞を完適応細菌を探索することにした．分泌タンパク質は遠心全に除去した．濾液を 100,000 x g で 2 時間の超遠心分離

分離や濾過操作によって簡便に細胞と分離できるため，に 供 し， 膜 小 胞 を 沈 殿 さ せ た． 得 ら れ た 膜 小 胞 は分泌生産することで純度の高い外来タンパク質を容易に

Dulbeco リ ン 酸 緩 衝 液( 135.9 mM NaCl，2.7 mM KCl，取得できるようになるものと考えられる．S. livingstonensis

8.9 mM Na2HPO4・7H2O，1.5 mM KH2PO4 )に 0.2 M NaCl

Ac10 はタンパク質分泌生産能に優れた株ではないため，を追加した緩衝液( DPBSS )に懸濁した( Chutkan et

宿主として有望な低温適応細菌を新たに探索することにした．高純度のタンパク質を培養上清中に著量生産する

al., 2013 )． 超 遠 心 分 離 で 得 ら れ た 上 清 は post-vesicle
fraction( PVF )として回収した．遠心分離はすべて 4 ℃

株を探索した結果，アジの腸管内容物から Shewanella

で行った．

vesiculosa HM13 と命名した低温適応細菌が得られ，本菌が特定タンパク質を積荷とした膜小胞を分泌高生産す

ショ糖密度勾配超遠心法による膜小胞画分の分析ることが見いだされた．そこで，本菌を宿主として，外上記操作で得られた膜小胞画分をショ糖密度勾配

来タンパク質を膜小胞の積荷として分泌生産するシステ( 20，32.5，45，57.5，70 ％ w/v;各 6.25 mL )に重層しムを開発することを目指して研究を進めることにした．

103,745 x g，4 ℃で 15 時間の超遠心分離に供した．そのそのような応用開発を進める上では，本菌の膜小胞生産

後，底から 1 mL ずつ分取し，各画分のタンパク質を機構や膜小胞へのタンパク質の積み込み機構を理解する

TCA で沈殿させたのち，SDS-PAGE で分析した．

ことが重要と考えられ，それらの解明を本研究の主な目的とした．細胞外膜小胞の生産は細菌に普遍的に備わっ

膜小胞の定量た機能であるが，その分子機構には依然として不明な点

供試菌を定常期( OD600 = 3.0 )まで培養したのち，上が多い．膜小胞高生産性細菌を用いた研究を進めること

述 の 方 法 で 膜 小 胞 を 調 製 し た． 膜 小 胞 の 定 量 で は，によって，膜小胞生産に関する普遍的に重要な仕組みがDPBSS 中で親油性蛍光色素 FM4-64 を終濃度 5 µg/mL

明らかにされてくることも期待される．

になるように添加し，20 分間，室温でインキュベート
した( McBroom et al., 2006 )．その後，膜中の FM4-64

実験方法の蛍光強度を励起波長 515 nm，蛍光波長 635 nm で測定した．

低温菌の分離と分泌タンパク質の分析
魚類腸管内容物を LB 培地［1 ％(w/v)Tryptone, 0.5 ％リン脂質と脂肪酸の分析(w/v)Yeast extract, 1 ％(w/v)NaCl（pH 7.0）］に懸濁し，細胞と膜小胞からメタノール／クロロホルム( 2:1,

懸濁液上清を LB 寒天培地に塗布した．4 ℃で数日間保vol/vol )を用い，Bligh-Dyer 法によってリン脂質を抽温し，出現したコロニーを 5 mL の LB 培地に植菌し，4 ℃出した( Bligh & Dyer, 1959 )．得られたリン脂質抽出物

で約 48 時間培養した．培養液を遠心分離に供し，得らをエレクトロスプレーイオン化トリプル四重極型質量分れた上清中のタンパク質をトリクロロ酢酸( TCA )を

析計 Sciex API 3000 LC/MS/MS(Applied Bio-Systems )用いて沈殿させたのち，SDS-PAGE によって分析した．

で分析した( Cho et al., 2012 )．一方，リン脂質のアシル鎖をメチルエステル化し，Clarus 680 ガスクロマト

各種細菌株の培養条件

グ ラ フ と Clarus SQ 8C 質 量 分 析 計 か ら な る GC-MS

培養は，特に断らない限り，5 mL の LB 培地を用いて好気的に行った．必要に応じて，リファンピシン 50 µg/mL，( Perkin-Elmer )で分析した(使用カラム:Agilent J&W
GC column DB-1 )( Tokunaga et al., 2017 )．

カナマイシン 50 µg/mL，クロラムフェニコール 30 µg/mL－ 12 －

細菌における細胞外膜小胞への選択的タンパク質輸送機構の解明と細胞外タンパク質生産場構築への応用

透過型電子顕微鏡（ TEM ）観察

伝達によって S. vesiculosa HM13-Rif r に導入した．シン

既報( Yokoyama et al., 2017 )と同様の方法で膜小胞

グルクロスオーバーの相同組み換えでゲノム上の P49 遺の TEM 観察を行った．親水化処理を施した炭素被覆銅

伝子下流に GFP 遺伝子が挿入された株を，カナマイシン

グリッドに 2 µL の膜小胞サンプルを吸着させ，2 ％酢酸とリファンピシンを含む LB 寒天培地を用いて選抜した．

ウラニルで二回処理することでネガティブ染色した．

対照実験用に P49 に融合されていない GFP を発現す

TEM 観察には，JEM-1400 透過型電子顕微鏡(日本電子)

る S. vesiculosa HM13 も作製した．具体的には，P49 遺を 120 kV の 加 速 電 圧 で 用 い た． 観 察 像 の 取 得 に は伝子のプロモーターを含むと考えられる 5́ 非翻訳領域

JEM-1400 に内蔵の CCD カメラを使用した．

500 bp の 下 流 に GFP 遺 伝 子 を 接 続 し た DNA 断 片 を

緩衝液中でのインタクトな膜小胞の構造は，クライオ

pJRD215-Cmr に挿入し，E. coli S17-1/λpir を介して接合

電子顕微鏡法によって -175 ℃で観察した．ここでは，伝達によって S. vesiculosa HM13 の P49 欠損株に導入しサイドエントリー型クライオホルダー( Model 626.DH

た．目的の株はカナマイシン，リファンピシン，クロラ

holder，Gatan Inc. )を使用した．サンプルはマイクロ

ムフェニコールを含む LB 寒天培地を用いて選抜した．

グ リ ッ ド( lacey carbon film，Ted Pella Inc. ) に 載 せ，
膜小胞局在性タンパク質の網羅的同定

既報( Yokoyama et al., 2017 )と同様に処理した．

LB 培地で好気的に培養した gspD2 破壊株 Δhm3349
電界放出型走査電子顕微鏡（ FE-SEM ）観察( ΔgspD2 )由来の膜小胞画分に回収されたタンパク質

膜小胞を分泌する細胞の表層構造を観察するため，野( 600 µg )を，既報( Park et al., 2012 )と同様の方法で生型の S. vesiculosa HM13 を 1 mL の LB 培地中，18 ℃で
OD600 = 1.0 に到達するまで静置培養し，得られた細胞を

二次元電気泳動に供し，ペプチドマスフィンガープリン

終 濃 度 1 ％ の グ ル タ ル ア ル デ ヒ ド 溶 液 で 固 定 し た．

は BLAST( Altschul et al., 1997 )と HHpred( Söding et

FE-SEM 解析は既報( Koyama et al., 2015 )の方法に基al., 2005 )で相同性解析を行ったほか，PSORTb version
3.0.2( Yu et al., 2010 )を用いて局在性解析を行った．

づいて行った．サンプルはオスミウムプラズマコーター

ティング法で同定した．同定されたタンパク質について( POC-3，盟和商事)を用いてオスミウムでコーティン

結グし，FE-SEM( JSM-6700F，日本電子)を用いて加速
電圧 5 kV で観察した．

果

S. vesiculosa HM13 の分離と同定
低温での外来タンパク質分泌生産用宿主として適した

遺伝子破壊
相同組み換えによる遺伝子破壊には S. vesiculosa HM13低温適応微生物を魚類腸管内容物から探索した．その結での自律複製能をもたないプラスミド pKNOCK-Km を果，Pseudomonas 属，Shewanella 属，Flavobacterium 属

用 い た( Alexeyev, 1999 )． 標 的 遺 伝 子 の 内 部 配 列 をの数種の細菌株が得られた．特に，アジの腸管内容物かr

PCR で 増 幅 し，pKNOCK-Km に 挿 入 後，Escherichia

ら得られた株において，培養上清に単一の著量の分泌タ

coli S17-1/λpir を介して接合伝達によって S. vesiculosa
HM13 に導入した( Cho et al., 2012 )．この際の受容菌

ンパク質が見いだされたため，本菌を対象として研究をとしては，あらかじめ取得しておいたリファンピシン耐

配列(アクセッション番号:LC460999，LC461000 )の性を獲得した突然変異株( S. vesiculosa HM13-Rif r )を系統解析，および ANI( Average Nucleotide Identity )解用いた．シングルクロスオーバーの相同組み換えでゲノ

析によって，本菌は Shewanella vesiculosa と同定された．

ム上の標的遺伝子にプラスミドが挿入された遺伝子破壊

アジ( Horse Mackerel )から分離された No. 13 と呼称し株を，カナマイシンとリファンピシンを含む LB 寒天培ていた株であったことから，本菌を Shewanella vesiculosa

地を用いて選抜した．

HM13 と命名した(寄託機関:RIKEN BRC-JCM，ID:r

進めた．本菌の全ゲノム解析を行い，16S rRNA 遺伝子

JCM 33296 )．本菌は 4 ～ 25 ℃で生育し，18 ℃で最も良P49 融合型 GFP を発現する S. vesiculosa HM13 の作製

好に生育した．倍加時間は 4 ℃で 4.1 h，18 ℃で 1.8 h で

GFP 遺伝子をゲノム上の P49 遺伝子のコーディング

あった( Fig. 1A )．

領域 3́ 末端に挿入することで P49 融合型 GFP を発現す
る S. vesiculosa HM13 を作製した．具体的には，P49 のS. vesiculosa HM13 によるタンパク質の分泌生産

C 末端領域をコードする約 500 bp の DNA 断片(終止コ
ドンは含まない)と GFP 遺伝子の融合物を挿入した

S. vesiculosa HM13 が約 49 kDa のタンパク質を単一の主要分泌タンパク質として生産していることを見いだし

pKNOCK-Kmr を作製し，E. coli S17-1/λpir を介して接合た( Fig. 1B )．この分子質量に基づいて，本タンパク質－ 13 －

栗

原

達

夫

Figure 1. Characterization of S. vesiculosa HM13. (A) Growth of S. vesiculosa HM13. The cells were grown at 4 ℃(open circles) and 18 ℃ (closed circles) in LB medium. Bars represent the SD values calculated from three
independent experiments. (B) Secretory protein production by S. vesiculosa HM13. The cells were grown
at 4 and 18 ℃ to the indicated OD600, and 1 mL aliquots of the culture supernatants were subjected to TCA
precipitation and SDS-PAGE. The gel was stained with Coomassie Brilliant Blue G-250. The major protein
bands of about 49 kDa are indicated by arrowheads. (C) Negative-stained TEM image of extracellular
membrane vesicles produced by S. vesiculosa HM13. (D) FE-SEM image of the S. vesiculosa HM13 cellgrown at 18 ℃. (Reproduced from Chen, C. et al. (2020) Front. Microbiol. 10: 3001 with modifications withpermission from Frontiers Media SA.)を P49 と命名した．培養上清中の P49 は培養時間の経過とともに増加し，定常期後期( OD600 = 3.0 )では 4 ℃でた．BLAST 解析の結果，Shewanella sediminis HAW-EB3

3.6 mg/L，18 ℃で 5.3 mg/L の生産量が見られた．培養

ABV37623 )と 28 ％の相同性が認められたが，機能が明上清中に高純度で存在することから，本菌を宿主とし，

らかなタンパク質との有意な配列相同性は見いだされP49 をキャリアとして用いることで，高純度の外来タンず，一次構造からの機能推定は困難であった．

の機能未知タンパク質 Ssed_3019(アクセッション番号:

パク質を分泌生産するシステムの構築が可能になること
P49 の N 末端アミノ酸配列を決定し，全ゲノム配列

S. vesiculosa HM13 による P49 を積荷とした細胞外膜小胞の生産( 4,279 ORF )と照合した結果，hm3347 が P49 をコード

P49 の局在性を SOSUIGramN(https://harrier.nagahama-が期待された．

す る こ と が 見 い だ さ れ た( ア ク セ ッ シ ョ ン 番 号:

i-bio.ac.jp/sosui/sosuigramn/sosuigramn_submit.html )LC431027 )．本遺伝子にコードされる 473 アミノ酸残基( Imai et al., 2008 )で解析したところ，外膜への局在性のうち，シグナル配列と考えられる N 末端 22 残基が切が推測された．培養上清に見いだされた P49 について外除されて 451 残基の成熟型の P49 が生成すると考えられ膜への局在性が推測されたことから，P49 が培養上清中－ 14 －

細菌における細胞外膜小胞への選択的タンパク質輸送機構の解明と細胞外タンパク質生産場構築への応用の外膜に由来する膜と相互作用していることが示唆された．そこで，S. vesiculosa HM13 が外膜に由来する細胞
外膜小胞を生産し，その積荷として P49 が存在する可能性を検討することにした．
P49 の局在性解析のため，本菌の培養上清をショ糖密度勾配超遠心分離に供した．各画分を SDS-PAGE で解析した結果，P49 が 30 – 40 ％のショ糖を含む画分に存在することが見いだされた．また，P49 を含む画分を TEMで解析した結果，多数の膜小胞が存在することが見いだされた( Fig. 1C )．これらの結果は，P49 が膜小胞の積荷として存在することを示唆するものと考えられた．観察された膜小胞は 30 - 100 nm 程度の直径を有していた．
大多数の膜小胞は一重膜で囲まれていたが，複数の膜で囲まれているように見える膜小胞も観察された．
膜小胞と P49 はショ糖密度勾配を用いない超遠心分離により沈殿として回収することもできた．P49 が膜小胞に積み込まれていることを確かめるため，この沈殿画分をプロテアーゼ消化実験に供した．界面活性剤非存在下でトリプシンによって処理した場合，P49 は分解されなかったが，1 ％ Triton X-100 存在下で処理した場合，P49
はほぼ完全に分解された．この結果は，P49 が膜によってトリプシンの作用から保護されていることを示しておFigure 2. Production of membrane vesicles by S. vesiculosa
HM13 and other Gram-negative bacteria. The cells
were grown in LB medium at the temperaturesindicated. The membrane vesicles were collected
when the OD600 of the culture reached 3.0. n = 3.
(Reproduced from Chen, C. et al. (2020) Front.
Microbiol. 10: 3001 with permission from FrontiersMedia SA.)り，P49 が膜小胞の積荷タンパク質であることが結論された．
次に，S. vesiculosa HM13 の膜小胞生産性を他のグラまれた膜小胞も観察された．一方，FE-SEM を用いて

ム陰性細菌と比較した( Fig. 2 )．膜小胞の定量には，
膜染色性蛍光試薬 FM4-64 を用いた．S. vesiculosa HM13

S. vesiculosa HM13 の細胞を観察したところ，細胞表層に多数の出芽構造が見いだされた( Fig. 1D )．これらのと近縁の低温菌 S. livingstonensis Ac10 は 4 ℃と 18 ℃で出芽の大きさは膜小胞の大きさと同等であったことか生育させ，他の細菌については，それぞれの至適温度でら，本菌は溶菌を伴わない細胞表層からの出芽によって生育させた．その結果，S. vesiculosa HM13 による膜小膜小胞を生産するものと考えられた．

胞の生産量は，18 ℃において，4 ℃の 3 倍程度であり，次に，S. vesiculosa HM13 の膜小胞と細胞のリン脂質

いずれの温度においても，S. livingstonensis Ac10 よりも組成の解析を行った( Fig. 3A )．主要なリン脂質は細胞はるかに著量の膜小胞を生産することがわかった．また，と膜小胞のいずれについても，ホスファチジルエタノー
ルアミン( PE )では 16:0/16:1 PE，13:0/15:0 PE，ホ

18 ℃ に お け る S. vesiculosa HM13 の 膜 小 胞 生 産 性 は，S. oneidensis MR-1 ，P. putida KT2440 ，E. coli MG1655
よりも高いことが示された．

スファチジルグリセロール( PG )では 16:1/16:1 PGであった．sn-1 位と sn-2 位の両方に不飽和脂肪酸鎖をもつリン脂質( 16:1/16:1 PE，16:1/18:1 PE，16:1/20:5

S. vesiculosa HM13 が生産する細胞外膜小胞の特徴
上述のように S. vesiculosa HM13 の培養上清から回収( EPA )PE ，16:1 / 18:1 PG ，16:1 / 20:5( EPA )PG )した膜小胞の大部分は直径 30 - 100 nm 程度の球形であ

一方，細胞と膜小胞のリン脂質画分から調製した脂肪ることが TEM 観察によって見いだされている．動的光

酸メチルエステルを GC-MS で分析した( Fig. 3B )．そ

散乱法による解析では，膜小胞の平均直径が 80 - 100 nmの結果，細胞については，パルミトレオイル基( C16:1 )，であると見積もられた．これらの特徴については，4 ℃

パルミトイル基( C16:0 )，イソペンタデカノイル基は膜小胞において，細胞より著しく少なかった．

で培養した場合と 18 ℃で培養した場合とで，顕著な差( iC15:0 )が主要なリン脂質アシル鎖であり，それぞれがなかった．クライオ電子顕微鏡法では，脂質二重層と42.3 ％，18.7 ％，11.3 ％を占めることがわかった．膜小考えられる電子密度の高い領域に囲まれた膜小胞が観察

胞については，パルミトイル基( C16:0 )，イソペンタ

された．一重膜で囲まれた膜小胞に加えて，二重膜で囲

デカノイル基( iC15:0 )，パルミトレオイル基( C16:1 )，－ 15 －

栗

原

達

夫

Figure 3. Phospholipid and fatty acyl chain compositions of membrane vesicles and the cells of S. vesiculosa HM13.
(A) The cells were grown in LB medium at 4 ℃ to the stationary phase. Phospholipids were extracted
from the cells (white) and membrane vesicles (black) and subjected to electrospray ionization-mass
spectrometry analysis. n = 3. *p < 0.001 (Student's t-test). (B) Methyl-esterified fatty acids were preparedfrom the phospholipid extracts and analyzed by GC-MS. n = 3. *p < 0.001 (Student's t-test). (Reproduced
from Chen, C. et al. (2020) Front. Microbiol. 10: 3001 with permission from Frontiers Media SA.)

ステアロイル基( C18:0 )が主要なリン脂質アシル鎖で分泌装置( T2SS )サブユニットのホモログをコードあり，それぞれ 30.1 ％，23.0 ％，15.7 ％，11.2 ％を占めする遺伝子群( hm3349，hm3354，hm3358，hm3359，

ることがわかった．細胞と比較すると，膜小胞では飽和のアシル鎖，特にパルミトイル基( C16:0 )，イソペン

hm3360 ) が 存 在 す る こ と が 見 い だ さ れ た( Fig. 4，
Table 1 )．T2SS はグラム陰性細菌のタンパク質分泌装

タデカノイル基( iC15:0 )，ステアロイル基( C18:0 )置の一種で，ペリプラズム画分から細胞外へのタンパクの含量が高いことが見いだされた．

質の移行に関与する( Naskar et al., 2021 )．本菌のゲノム上には，P49 遺伝子上流の遺伝子群とは別に，典型的P49 遺伝子を含む遺伝子クラスターの特徴な T2SS をコードする遺伝子群( hm0375–hm0386 )がP49 の膜小胞への積み込み機構についての手がかりが存在することも見いだされた．このことから，P49 遺伝

得られることを期待して，P49 遺伝子周辺の遺伝子群を

子上流遺伝子群がコードする T2SS 様分泌装置が P49 の解析した．S. vesiculosa HM13 の全ゲノム解析の結果，細胞外への輸送を担う専用の装置である可能性が考えら

P49 遺伝子( hm3347 )の上流には，Ⅱ型タンパク質れた．

－ 16 －

細菌における細胞外膜小胞への選択的タンパク質輸送機構の解明と細胞外タンパク質生産場構築への応用

Figure 4. Organization of the gene cluster containing the P49 gene. Characteristics of the genes constituting the cluster are
summarized in Table 1. (Reproduced from Chen, C. et al. (2020) Front. Microbiol. 10: 3001 with modifications withpermission from Frontiers Media SA.)

Table 1. Predicted functions and localization of proteins encoded by the gene cluster containing the P49 gene.
Gene

Function of the protein predicted by its sequence

Localization*

Accession

hm3363

Wza, EpsE, polysaccharide export protein

OM

LC431043

hm3362

WecA, enzyme of enterobacterial common antigen biosynthesis, undecaprenyl-phosphatealpha-N-acetylglucosaminyl 1-phosphatetransferase

IM

LC431042

hm3361

WecA, enzyme of enterobacterial common antigen biosynthesis, undecaprenyl-phosphatealpha-N-acetylglucosaminyl 1-phosphatetransferase

IM

LC431041

hm3360

GspG2, Type II secretion system, major pseudopilinIM

LC431040

hm3359GspE2, Type II secretion system, secretion ATPaseCP

LC431039

hm3358

GspF2, Type II secretion system, inner membrane platform protein

IM

LC431038

hm3357

Prepilin-type cleavage/methylation domain-containing protein

ND

LC431037

hm3356

Prepilin-type cleavage/methylation domain-containing protein

ND

LC431036

hm3355

Prepilin-type cleavage/methylation domain-containing protein

ND

LC431035

hm3354

GspK2, Type II secretion system, minor pseudopilinIM

LC431034

hm3353

Hypothetical protein, no putative conserved domains

ND

LC431033

hm3352

Hypothetical protein, no putative conserved domains

IM

LC431032

hm3351

Hypothetical protein, no putative conserved domains

ND

LC431031

hm3350

Hypothetical protein, no significant similarity found

ND

LC431030

hm3349GspD2, Type II secretion outer membrane pore forming protein, secretin

OM

LC431029

hm3348

Hypothetical protein, no significant similarity found

ND

LC431028

hm3347

P49, no putative conserved domains, a cargo protein of EMVs

ND

LC431027

hm3346

Hypothetical protein, no putative conserved domains

ND

LC431026

hm3345

GdpD, uncharacterized hypothetical proteins similar to the catalytic domains of phosphoinositide-specific phospholipase and glycerophosphodiester phosphodiesterases

IM

LC431025

hm3344

LptA, phosphoethanolamine transferase for periplasmic glucans, alkaline phosphatasesuperfamily

IM

LC431024

hm3343Wzx, a subfamily of the multidrug and toxic compound extrusion (MATE)-like proteins,
flippase assisting in the membrane translocation of lipopolysaccharides including thosecontaining O-antigens

IM

LC431023

hm3342

NfnB, nitroreductase family protein

CP

LC431022

hm3341

Ugd, UDP-glucose 6-dehydrogenase

CP

LC431021*Protein localization was predicted with PSORTb version 3.0.2 (http://www.psort.org/psortb/). Abbreviations are as follows: OM,
outer membrane; IM, inner membrane; CP, cytoplasm; ND, not determined.
(Reproduced from Chen, C. et al. (2020) Front. Microbiol. 10: 3001 with modifications with permission from Frontiers Media SA.)－ 17 －

栗

原

達

夫

一方，P49 遺伝子の下流および T2SS 様分泌装置遺伝が見られた．このことから，いずれの遺伝子も膜小胞生

子群の上流には，細胞表層成分の生合成への関与が推定

産には必須でないことが示された．また，TEM 観察の結される遺伝子群が見いだされた( Fig. 4，Table 1 )．こ果，各遺伝子破壊株と親株が生産する膜小胞の形状にはれらのうち，hm3363 は多糖の細胞外への移行を担う

顕著な差異がないことがわかった．各株の膜小胞の平均Wza のホモログ，hm3362 と hm3361 は細胞表層多糖生

直径は 31.5±4.7 nm(親株)，46.4±9.2 nm( Δhm3359 )，合成の初発反応を触媒する WecA の N 末端領域と C 末

33.7±9.0 nm( Δhm3358 )，38.1±6.2 nm( Δhm3354 )，端領域のホモログ，hm3343 は細胞表層多糖生合成前駆38.4±9.4 nm( Δhm3349 )，37.1±5.6 nm( Δhm3347 )，体の細胞質画分からペリプラズム画分への移行を担う

42.8±7.8 nm( Δhm3345 )，39.4±5.5 nm( Δhm3344 )，Wzx のホモログをそれぞれコードすることが見いだされ36.7±8.9 nm( Δhm3343 )，37.7±5.4 nm( Δhm3342 )た( Woodward & Naismith, 2016; Caffalette et al., 2020 )．

(各 n = 50 )であった．

これらの遺伝子群がコードする表層成分との相互作用を

次に，各遺伝子破壊株と親株における P49 の局在性を介して P49 が膜小胞に積み込まれる可能性が考えられた．

調べた．各株を 18 ℃で培養したのち，細胞画分，膜小胞画分，培養上清から膜小胞を除いた画分( post-vesicle

P49 遺伝子近傍遺伝子群の破壊が P49 の局在性に及ぼす

fraction(PVF))に分画し，各画分中の P49 を Western影響

blot 法で分析した( Fig. 5 )．親株については細胞と膜小P49 遺伝子の近傍に存在する遺伝子群が P49 の膜小胞胞の両方にバンドが観察された．P49 欠損株(Δhm3347 )

への積み込みに関与する可能性を検討するため，それらではこのバンドが消失したことから，P49 を特異的にの遺伝子群を破壊し，P49 の局在性に及ぼす影響を調べ検出できていることが確かめられた．遺伝子破壊株のうた．相同組み換えによって標的遺伝子にプラスミドを挿ち，T2SS サブユニットのホモログをコードする遺伝子

入 す る 手 法 で hm3359，hm3358，hm3354，hm3349，の 破 壊 株( Δhm3359( ΔgspE2 )，Δhm3358( ΔgspF2 )，hm3347，hm3345，hm3344，hm3343，hm3342 の破壊株を得た．これらの遺伝子破壊株と親株を 18 ℃で培養し，Δhm3354( ΔgspK2 )，Δhm3349( ΔgspD2 ))については，
細胞画分の P49 は残存したのに対し，膜小胞画分の P49

培養上清中の膜小胞を FM4-64 を用いて定量した結果，は消失した．また，これらの遺伝子破壊株では少量の各遺伝子破壊株において親株の 33 - 90 ％の膜小胞生産性

P49 が PVF に検出された．これらの結果は，P49 遺伝子

Figure 5. Effects of gene disruption on localization of P49. Localization of P49 in the parent strain (S. vesiculosa
HM13-Rif r ) and the gene-disrupted mutants grown at 18 ℃ were analyzed by western blotting with anti-P49
antibody. The cellular fraction, PVF, and the extracellular membrane vesicle fraction (EMV) corresponding
to 50 µL culture were subjected to the analysis. The positions of P49 are indicated with arrowheads.

－ 18 －

細菌における細胞外膜小胞への選択的タンパク質輸送機構の解明と細胞外タンパク質生産場構築への応用

上流にコードされる T2SS 様分泌装置が P49 の細胞外膜小胞への移行において必須の役割を担っていること，また，この T2SS 様分泌装置が存在しない場合，少量のP49 が膜小胞には積み込まれない状態で細胞外に分泌されることを示している．一方，P49 遺伝子の下流の遺伝 子 群 を 破 壊 し た 株( Δhm3345( ΔgdpD )，Δhm3344( ΔlptA )，Δhm3343( Δwzx )，Δhm3342( ΔnfnB ))では，大部分の P49 は PVF に存在し，細胞画分や膜小胞画分には微量の P49 しか存在しなかった．これらの結果は，T2SS 様分泌装置によって細胞表層あるいは細胞外に移行した P49 が膜小胞に積み込まれるためには，P49 遺伝
子の下流の遺伝子群がコードするタンパク質によって生合成される表層成分が必要であることを示唆するものと考えられる．
P49 をキャリアとした外来タンパク質の膜小胞への積み込み
外来タンパク質を膜小胞の積荷として分泌生産することが可能か検討するため，P49 の C 末端に GFP を融合したタンパク質( P49-GFP )を S. vesiculosa HM13 を宿主として生産した．対照実験用に，P49 に融合されていない GFP を生産する株( ΔP49/pGFP )も作製した．これらの株における GFP の局在性を抗 GFP 抗体を用いたWestern blotting で解析した結果，P49-GFP の一部が膜小胞に存在することが認められたのに対し，P49 と融合していない GFP は膜小胞画分には検出されなかった( Fig. 6 )．以上の結果から，P49 をキャリアとして外来
タンパク質を膜小胞に積み込むことが可能であるものとFigure 6. Localization of GFP fused to the C-terminus of P49.
The fusion protein was produced in S. vesiculosa
HM13 (P49-GFP). As a control, GFP without being
fused to P49 was produced (ΔP49/pGFP). The cells
were grown in LB medium at 18 ℃ to the stationary
phase. Distribution of the proteins in the insoluble
fraction of the cells (Insol.), the soluble fraction of
the cells (Sol.), PVF, and extracellular membrane
vesicles (EMVs) was analyzed by western blottingwith anti-GFP antibody. The samples prepared from100 µL culture were subjected to the analysis.
Asterisk and arrowhead indicate the position of GFP
and GFP fused to P49, respectively. (Reproduced
from Chen, C. et al. (2020) Front. Microbiol. 10: 3001
with permission from Frontiers Media SA.)考えられた．一方，P49-GFP を生産する株においては，
P49 から切り離されたと考えられる GFP のバンドも観察され，P49 と GFP の間を切断するプロテアーゼの存在が示唆された．

チドマスフィンガープリンティング法によってタンパク質を同定した( Table 2 )．同定されたタンパク質の多く

S. vesiculosa HM13 が生産する細胞外膜小胞のプロテ
オーム解析

は細胞質や内膜への局在が推測されるタンパク質であっ

S. vesiculosa HM13 の膜小胞の特性と生産機構に関する手がかりを得ることを目的として，膜小胞のプロテ報告されている外膜と内膜の両方で囲まれた膜小胞が，オーム解析を行った．膜小胞中に微量しか存在しないタ考えられる( Pérez-Cruz et al., 2015 )．

た．この結果は，種々のグラム陰性細菌において存在が本菌によっても生産されている可能性を示唆するものとンパク質を検出し同定する上では，大量に存在する P49を除去した膜小胞を用いることが望ましいと考えられセンサータンパク質ホモログ HM1275 による膜小胞生

た． そ こ で P49 の 膜 小 胞 へ の 輸 送 に 必 須 の hm3349

産制御( gspD2 )を破壊した株を用いて実験を進めることとし

膜小胞画分に見いだされた HM1275 について，データ

た．本遺伝子破壊株については，上述のように膜小胞のベース中のタンパク質との相同性を BLAST と HHpred

P49 は消失するが，膜小胞の生産自体は損なわれない．

によって解析した結果，本タンパク質がメチル基受容走本株を 18 ℃で LB 培地にて培養し，超遠心分離によって化性タンパク質( MCP )と相同性を有し，シグナル受得られた膜小胞画分を二次元電気泳動に供し，SYPRO

容に関与する PAS ドメイン( Henry & Crosson, 2011 )Ruby で染色した．検出されたスポットについて，ペプと MCP シグナリングドメイン( Falke et al., 1997; Ud-Din－ 19 －

栗

原

達

夫

Table 2. Proteins found in the membrane vesicles produced by ΔgspD2.
GeneFunction of the protein predicted by its sequence

E-valuea

Localizationb

Accession-2

IM

LC533412

hm67

Siderophore biosynthesis protein PvsD

4.8×10hm433

50S ribosomal protein L

4.2×10-2

C

LC533413-2

LC533414

hm594

HDOD domain-containing protein

3.6×10C

hm679

DNA-directed RNA polymerase omega subunit

7.6×10-3

C

LC533415

hm841

Mechanosensitive ion channel family protein

1.3×10-2

IM

LC533416

hm858

Lysine-sensitive aspartokinase 3

4.0×10-2

C

LC533417

hm1275

Methyl-accepting chemotaxis protein

3.3×10-2

IM

LC533418

hm1305

Zinc chelation protein SecC

3.1×10-2

Not predictable

LC533419

hm1390Error-prone, lesion bypass DNA polymerase V (UmuC)

5.1×10-2

C

LC533420

hm1529

Hypothetical protein

3.2×10-4

Not predictable

LC533421

hm2195tRNA (carboxy-S-adenosyl-L-methionine) synthase CmoA

3.6×10-2

C

LC533422

hm2235

Glucose-1-phosphate adenylyltransferase

4.5×10-2

Not predictable

LC533423

hm3132

Pyruvate oxidase

4.8×10-2

IM

LC533424

hm3337

Hypothetical protein

4.5×10-2

IM

LC533425

hm3779RNA polymerase-binding protein DksA
(C4-type zinc finger protein)-2

C

LC533426

5.4×10a

The E-value is the number of hits expected with a similar score by chance when searching the database with the amino acid sequenceof each protein.
b
The subcellular localization of each protein was predicted using a subcellular localization prediction tool, PSORTb version 3.0.2. IM,
inner membrane; C, cytoplasm.
(Reproduced from Yokoyama, F. et al. (2021) Front. Microbiol. 12: 629023 with modifications with permission from Frontiers Media SA.)& Roujeinikova, 2017 )を有することが見いだされた．
この結果から，本タンパク質が環境中の何らかの分子に応答するセンサータンパク質として機能する可能性が考えられた．
HM1275 が環境に応答して膜小胞の生産を制御する可能性を探るべく，まず，S. vesiculosa HM13 の膜小胞生産性が培地成分によってどのように変動するかを調べた．貧栄養培地である M79 培地［ 1 g/L KH2PO4, 1 g/L
NH 4NO 3, 10 g/L NaCl, 0.2 g/L MgSO 4・7H 2O, 10 mg/L
FeSO4, 10 mg/L CaCl2・2H2O, 0.5 ％(w/v)casamino acid ］
を基本培地として，ここに種々の化合物を添加し，膜小胞生産量を調べた結果，本菌の膜小胞生産量が培地中のL -リシン濃度の増加に伴って増加することが見いだされた( Fig. 7 )．この L -リシン濃度に依存した膜小胞生産
性向上に HM1275 が関与するか検討するため，hm1275
破壊株( Δhm1275 )を用いて同様の実験を行った．その結果，Δhm1275 においては，L -リシン誘導的な膜小胞生産量増加が著しく抑制されていることが見いだされた( Fig. 7 )．Δhm1275 に HM1275 を発現するプラスミドを導入した場合，HM1275 をコードしないプラスミドを導入した場合と比べて高濃度 L -リシン存在下での膜小胞生
産量が増加したことから，L -リシン濃度依存的な膜小胞生産量増加に HM1275 が関与するものと考えられた．

Figure 7. Vesicle production by Δhm1275 and the parent strain(S. vesiculosa HM13-Rif r ) cultured at different L ys
concentrations. The vesicle production was quantified
by lipid staining with FM4-64. Each value of vesicle
production was divided by that of cells grown in M79
containing 0.26 g/L Lys to compare relative vesicle
production in each condition. The data are the means ±relative standard errors of the values from three
independent batches. Statistical analysis was performed
using two-tailed unpaired Student's t-test. n.s. and ***indicate p ≧ 0.1 and p < 0.01, respectively. (Reproduced
from Yokoyama, F. et al. (2021) Front. Microbiol. 12:629023 with permission from Frontiers Media SA.)－ 20 －

細菌における細胞外膜小胞への選択的タンパク質輸送機構の解明と細胞外タンパク質生産場構築への応用

考察

ム陰性細菌の分泌タンパク質の外膜透過を担うことが知ら れ て い る の で，P49 遺 伝 子 上 流 に コ ー ド さ れ る

本研究で新たに分離された低温適応グラム陰性細菌

T2SS-2 が P49 の 外 膜 透 過 を 担 う も の と 考 え ら れ た

S. vesiculosa HM13 は，主要積荷タンパク質として分子
質量約 49 kDa の P49 を含む細胞外膜小胞を生産するこ( Fig. 4，Table 1 )．T2SS-2 成分の遺伝子破壊株で P49の膜小胞移行が見られなくなったことは，この考えを支とが見いだされた( Fig. 1 )．P49 は膜小胞の全タンパク持するものと言える( Fig. 5 )．一方，これらの T2SS-2

質の 90 ％以上を占めるが，このように高純度の特定タ欠損株では，少量の P49 が PVF に見られた．この結果は，ンパク質を積み込んだ膜小胞を生産することは，本菌のT2SS-2 に依存しない P49 分泌機構の存在を示唆してい注目すべき特徴と言える．また，近縁の Shewanella 属

る．本菌は，T2SS-2 とは別に，典型的な T2SS をコー

低温菌や他のグラム陰性細菌と比較して本菌が高い膜小ドする遺伝子群を有することから，これらがコードする

胞生産性を有することも特筆される( Fig. 2 )．本菌をT2SS( T2SS-1 )が T2SS-2 非存在下での P49 の細胞外宿主とし，P49 をキャリアとすることで，高純度の外来移行を担っている可能性が考えられる．T2SS-1 で分泌タンパク質を細胞外膜小胞の積荷として高生産できるこされる P49 のコンフォメーションと T2SS-2 で輸送されとが期待される．また，外来タンパク質を積み込むことる P49 のコンフォメーションが異なっていると考えれによって，様々な機能を膜小胞に付与できると考えられ，

ば，T2SS-2 存在下でのみ P49 が膜小胞に積み込まれる

例えば，ワクチンや生体触媒の開発にも繋がるものと期ことを説明できるが，この仮説の妥当性については，さ待 さ れ る( Toyofuku et al., 2015; Gerritzen et al., 2017;

らなる検討が必要である．

Turner et al., 2019; Li & Liu, 2020 )．本菌は低温適応細菌

P49 遺伝子周辺遺伝子群の破壊株のうち，表層成分生であり，0 ℃付近での培養も可能であるため，熱安定性合成への関与が示唆された hm3342，hm3343，hm3344，の低いタンパク質の生産にも有用と考えられる(Miyake

hm3345 の破壊株では，膜小胞と細胞の P49 は激減し，主として PVF に存在することが見いだされた( Fig. 5 )．

et al., 2007 )．このような応用展開を図る上でも，本菌の膜小胞生産機構やタンパク質の膜小胞積み込み機構を

この結果は，これらの遺伝子群の関与で生合成される表

理解することは重要であり，本研究でそれらの解明に取層成分が，P49 と膜小胞および細胞との相互作用に必須

り組んだ．

であることを示すものと考えられる．これらの遺伝子群

グラム陰性細菌の細胞外膜小胞の生産機構としては，のうち，hm3343 は Wzx フリッパーゼのホモログをコー

二種類の異なる機構が知られている．一つは外膜からのドする．Wzx はリポ多糖の O 抗原多糖と莢膜多糖の生出芽によるもので，もう一つは explosive cell lysis と呼合 成 に 関 与 す る こ と が 知 ら れ て い る( Woodward &ばれる細胞溶菌を伴うものである( Schwechheimer &Naismith, 2016; Caf falette et al., 2020 )．S. vesiculosa

Kuehn, 2015; Toyofuku et al., 2019 )．後者では，細胞溶

HM13 の細胞と膜小胞の糖脂質の解析では，いずれの場菌で生成する膜断片が会合することで膜小胞が生成す合も O 抗原多糖を持たないリポオリゴ糖のみが検出さる．S. vesiculosa HM13 の膜小胞生産機構に関する知見れたことから，hm3343 が O 抗原多糖の生合成に関与すを得るため，本菌の膜小胞と細胞のリン脂質組成を解析ることは考えにくい．一方，本菌は多糖を生合成しておしたところ，特定のリン脂質が膜小胞画分で濃縮されてり，hm3343 破壊株ではその生産がほぼ見られなくなる

いることが見いだされた( Fig. 3 )．また，P49 と外膜タことが明らかとなった．以上の結果から，hm3343 は表

ンパク質 Omp74 について，細胞画分と膜小胞画分にお層多糖の生合成に関与するものと考えられ，その表層多ける存在比を比較したところ，P49 に比べて，Omp74

糖が P49 と膜小胞および細胞との相互作用に関与するもは膜小胞に移行しにくいことが見いだされた．さらに，のと考えられた．

細胞表層を FE-SEM で解析した結果，膜小胞と同程度以上の結果から考えられる P49 の膜小胞への積み込みの大きさの出芽構造が多数観察された．以上の結果から，機構モデルを Fig. 8 に示した．Sec トランスロコンの働

本菌は，特定成分が濃縮された膜小胞を，外膜からの出きでペリプラズム画分に移行した P49 は，T2SS 様分泌芽によって生産するものと考えられた．

装置の働きで細胞外に移行し，表層多糖との相互作用に

P49 の膜小胞への積み込み機構を解析するために行っ

よって膜小胞に積み込まれるものと考えられる．

た P49 遺伝子周辺遺伝子群の破壊実験では，T2SS 様分

P49 をキャリアとした外来タンパク質の膜小胞への積泌装置( T2SS-2)の関与を示す結果が得られた．新生

み込みについては，P49 の C 末端に融合させた GFP が

P49 は N 末端にシグナル配列をもつことが推定されてい膜小胞に移行することが見いだされた(Fig. 6 )．しかし，るので，Sec トランスロコンの働きで内膜を透過してペその移行量は少なく，今後，P49 の膜小胞移行に必要なリプラズム画分に移行すると考えられる．T2SS はグラ領域の絞り込みや，融合方法の検討によって，積み込み－ 21 －

栗

原

達

夫

Figure 8. Proposed model of P49 loading onto extracellular membrane vesicles of S. vesiculosa HM13. In this model,
P49 is translocated across the outer membrane (OM) to the extracellular space via the T2SS-like translocon
and then loaded onto the membrane vesicles through the interaction with their surface component that is
synthesized by NfnB, Wzx, LptA, and GdpD encoded by hm3342, hm3343, hm3344, and hm3345, respectively.

量を向上させることが必要と思われる．P49 に融合させの膜構造を持つように見える膜小胞が電子顕微鏡で観察た GFP を発現させた株では，融合タンパク質とともに，されている．この結果は，HM1275 が外膜 - 内膜小胞にP49 から切り離されたと考えられる GFP も膜小胞画分

存在することを支持するものと捉えることができる．一に見られた．この結果は，融合部位を切断するプロテアー

方，HM1275 が膜小胞画分に存在することの生理的意義

ゼの存在を示唆している．融合タンパク質の生産量向上

については今のところ不明である．本タンパク質がセンのためには，このプロテアーゼ活性を抑制することも重サーとして機能するためには細胞中の内膜に存在するこ要と思われる．

とが必要と考えられる．従って，膜小胞中の HM1275

本研究では，S. vesiculosa HM13 の膜小胞生産制御には積極的な生理的役割は有しておらず，タンパク質の品

関わるセンサータンパク質ホモログの同定にも成功し

質管理の一環として，細胞から排除されたものなのかもた．本菌の膜小胞の生産量は，培地中の L -リシン濃度がしれない( McBroom & Kuehn, 2006 )．別の可能性とし増加するに従って増加するが，この L -リシン濃度への応て，HM1275 を膜小胞に積み込み，他の細胞に本タンパ

答にメチル基受容走化性タンパク質ホモログ HM1275

ク質を輸送することで細菌細胞の集団挙動を制御していが関与することが示された( Fig. 7 )．本菌はアジの腸るということもあるかもしれない．しかし，内膜タンパ

管内容物から分離されたが，魚の腸管内の環境は魚の摂ク質が膜小胞を介して他細胞の内膜に輸送されて機能す

食状況によって大きく変動する．環境変化に適切に応答る仕組みが存在するのかは不明で，膜小胞中の HM1275

する上で，魚の主要な食物由来成分である L -リシンに応の生理的意義については，今後，さらなる検討が必要で答するシステムを本菌が有していることは理にかなったある．本タンパク質が膜小胞に存在することの生理的意ものと考えられる．

義は不明であるものの，環境中の成分に応答した膜小胞

HM1275 は内膜に局在することが PSORTb を用いた解析によって推測されているが，本研究では膜小胞画分生産制御に関与するタンパク質を同定したことは，本研究の重要な成果の一つとして位置づけられる．

中に同定された( Table 2 )．この結果は，本タンパク質

本研究によって，膜小胞高生産性細菌 S. vesiculosa

が外膜 - 内膜小胞( outer-inner membrane vesicles )に

HM13 における積荷タンパク質の膜小胞輸送機構の概略存在する可能性を示している．種々のグラム陰性細菌が，や膜小胞生産制御機構の一端を明らかにすることができ

このような二重の膜構造を持つ膜小胞を細胞外膜小胞のた．また，効率は低いものの，積荷タンパク質と融合さマイナーな成分として生産することが報告されておりせることで外来タンパク質を膜小胞に移行させることが( Pérez-Cruz et al., 2015 )，S. vesiculosa HM13 でも二重可能であることも見いだした．今後は，外来タンパク質－ 22 －

細菌における細胞外膜小胞への選択的タンパク質輸送機構の解明と細胞外タンパク質生産場構築への応用
制御．第20回極限環境生物学会年会(11月16–17日，京都)6) Yokoyama, F., Imai, T., Kawamoto, J., Ogawa, T. & Kurihara,
T. 2020. Regulation of vesiculation and biofilm dispersion of
Shewanella vesiculosa HM13 in response to extracellularenvironment. 3rd Bacterial Cell Biology Conference(February 26–29，Nassau, Bahamas)
7) 釜阪紘平，陳晨，川本純，小川拓哉，栗原達夫．2020．
菌体外膜小胞へのタンパク質輸送における細胞表層構造
制御タンパク質の機能．日本農芸化学会2020年度大会(3月27日，福岡(誌上))
8) 横山文秋，今井友也，川本純，小川拓哉，栗原達夫．
2020．細菌のセンサータンパク質によるベシクル生産とバイオフィルム分散の誘導．日本農芸化学会2020年度大会(3月27日，福岡(誌上))
9) 栗原達夫．2020．膜小胞高生産性細菌におけるタンパク
質の膜小胞への輸送機構．日本農芸化学会2020年度大会(3月27日，福岡(誌上))
10) 釜阪紘平，川本純，小川拓哉，栗原達夫．2020．細胞外膜小胞へのタンパク質輸送における Wzx フリッパーゼホ
モログの機能．第93回日本生化学会大会(9月16日，横浜(Web))
11) 中野咲梨，小川拓哉，川本純，栗原達夫．2020．低温菌
Shewanella vesiculosa HM13における膜小胞生産への膜リ
ン脂質の関与．第21回極限環境生物学会年会(10月31日，Web)
12) 都築大空，釡阪紘平，Liu Yuying，今井友也，川本純，小川拓哉，栗原達夫．2020．Shewanella vesiculosa HM13 の表層糖鎖合成酵素による細胞外膜小胞構造と積荷タンパ
ク質輸送の制御．第21回極限環境生物学会年会(10月31日，Web)
13) 栗原達夫．2020．細菌の細胞外膜小胞へのタンパク質輸送機構．令和2年度日本農芸化学会東北支部シンポジウム(11月7日，Web)
14) Kurihara, T. 2020. Mechanistic analysis of protein transport
to extracellular membrane vesicles of a hypervesiculating
bacterial strain, Shewanella vesiculosa HM13. ASEMV2020(Annual meeting of the American Society for Exosomes andMicrovesicles)(November 18，Web)
15) 栗原達夫．2021．膜小胞高生産性細菌Shewanella vesiculosa
HM13における細胞外膜小胞生産の分子基盤．日本農芸化学会2021年度大会(3月20日，仙台(Web))
16) 都築大空，釜阪紘平，Liu Yuying，今井友也，川本純，小川拓哉，栗原達夫．2021．細胞外膜小胞高生産菌の積荷タンパク質輸送における表層糖鎖合成酵素の機能．第67回日本生化学会近畿支部例会(5月29日，Web)
17) 釜阪紘平，都築大空，川本純，今井友也，小川拓哉，栗原達夫．2021．Shewanella vesiculosa HM13由来細胞外膜小胞への新奇タンパク質輸送機構に関する研究．日本農芸化学会関西支部第515回講演会(6月5日，Web)を膜小胞に効率的に積み込むシステムの開発を進めるとともに，外膜の出芽や膜小胞の形成に関与する因子の同定や機能の解明にも取り組みたいと考えている．

要

約

アジの腸管内容物から分離されたグラム陰性低温適応
細菌 S. vesiculosa HM13 は，分子質量約 49 kDa のタンパ
ク質 P49 を主要な積荷とする細胞外膜小胞を高生産す
る．本菌の全ゲノム解析の結果，P49 遺伝子上流に，分泌タンパク質の外膜透過に関与する T2SS のホモログをコードする遺伝子群が見いだされた．これらの破壊によって P49 の膜小胞移行が見られなくなったことから，
T2SS 様 分 泌 装 置 が P49 の 分 泌 を 担 う と 考 え ら れ た．
P49 遺伝子の周辺には，細胞表層糖鎖生合成への関与が示唆される遺伝子群も見いだされた．これらの破壊株では，P49 は細胞外に分泌されたものの，膜小胞へは積み込まれなかった．これらの結果から，P49 は T2SS 様分
泌装置によって細胞外に輸送され，表層糖鎖との相互作用によって膜小胞に積み込まれると考えられた．P49 のC 末端に GFP を融合させたタンパク質を S. vesiculosa
HM13 を宿主として発現させると，一部が膜小胞に移行することが見いだされたことから，P49 は，膜小胞をプ
ラットフォームとした外来タンパク質生産におけるキャリ ア と し て 有 用 と 考 え ら れ た． 一 方，S. vesiculosa
HM13 の膜小胞生産性が，培地中の L -リシン濃度の増加に伴って向上することを見いだすとともに，この応答に関与するセンサータンパク質ホモログを同定した．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表1) 横山文秋，川本純，小川拓哉，今井友也，栗原達夫．
2019．バイオフィルム分散関連タンパク質BdlAホモログの細菌ベシクル中からの同定．第33回日本バイオフィル
ム学会学術集会(7月5–6日，久留米)
2) 栗原達夫．2019．細菌生体膜機能発現の分子基盤: 膜リン脂質・膜小胞研究の新展開．第33回ケミカルバイオロ
ジー研究所セミナー/第105回生物科学フロンティアセミ
ナー(8月7日，堺)
3) 釜阪紘平，Chen Chen，小川拓哉，川本純，栗原達夫．
2019．細菌の菌体外膜小胞を介した選択的タンパク質分泌における細胞表層構造の役割．第92回日本生化学会大会(9月20日，横浜)
4) 釜阪紘平，陳晨，川本純，小川拓哉，栗原達夫．2019．
細菌の細胞外膜小胞へのタンパク質積み込みにおける膜表層構造の機能．第20回極限環境生物学会年会(11月
16–17日，京都)
5) 横山文秋，今井友也，川本純，小川拓哉，栗原達夫．
2019．低温菌 Shewanella vesiculosa HM13 のセンサータン
パク質によるベシクル生産およびバイオフィルム分散の原著論文
1) Chen, C., Kawamoto, J., Kawai, S., Tame, A., Kato, C., Imai, T.
& Kurihara, T. 2020. Isolation of a novel bacterial strain
capable of producing abundant extracellular membrane
vesicles carrying a single major cargo protein and analysis
of its transport mechanism. Front. Microbiol. 10: 3001.
2) Kamasaka, K., Kawamoto, J., Chen, C., Yokoyama, F., Imai,－ 23 －

栗原

T., Ogawa, T. & Kurihara, T. 2020. Genetic characterizationand functional implications of the gene cluster for selective
protein transport to extracellular membrane vesicles of
Shewanella vesiculosa HM13. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 526: 525–531.
3) Di Guida, R., Casillo, A., Yokoyama, F., Kawamoto, J.,
Kurihara, T. & Corsaro, M.M. 2020. Detailed structuralcharacterization of the lipooligosaccharide from the extracellular membrane vesicles of Shewanella vesiculosa HM13.
Mar. Drugs. 18: 231.
4) Kawano, K., Yokoyama, F., Kawamoto, J., Ogawa, T.,
Kurihara, T. & Futaki, S. 2020. Development of a simple andrapid method for in situ vesicle detection in cultured media.
J. Mol. Biol. 432: 5876–5888.
5) Yokoyama, F., Imai, T., Aoki, W., Ueda, M., Kawamoto, J. &Kurihara, T. 2021. Identification of a putative sensor protein
involved in regulation of vesicle production by a hypervesiculating bacterium, Shewanella vesiculosa HM13. Front.
Microbiol. 12: 629023.
その他(総説・書籍)
1) 栗原達夫. 2021. 新奇細菌に見いだされた細胞外膜小胞へのタンパク質積み込み機構. 生化学 93: 252–256.
2) Kawamoto, J. & Kurihara, T. 2021. Membrane vesicles
produced by Shewanella vesiculosa HM13 as a prospective
platform for secretory production of heterologous proteinsat low temperatures. Methods Mol. Biol. in press.

保存機関に寄託した菌株
Shewanella vesiculosa HM13(寄 託 機 関:RIKEN
BRC-JCM，ID:JCM 33296 )謝

辞本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．また，本研究の遂行にご協力いただいた京都大学生存圏研究所の今井友也教授，京都大学化学研究所の二木史朗教授，
河野健一助教(現・薬学研究科)，京都大学大学院農学研究科の植田充美教授(現・名誉教授)，青木航助教，海洋研究開発機構の加藤千明博士，多米晃裕博士，Universityof Naples "Federico II" の Maria Michela Corsaro 博士ならびに京都大学化学研究所分子微生物科学研究領域の学
生諸氏に感謝の意を表します．

文

献Alexeyev, M.F. 1999. The pKNOCK series of broad-host-range
mobilizable suicide vectors for gene knockout and targeted
DNA inser tion into the chromosome of Gram-negative
bacteria. Biotechniques 26: 824–826.

達夫
Altschul, S.F., Madden, T.L., Schäffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z.,
Miller, W. & Lipman, D.J. 1997. Gapped BLAST and
PSI-BLAST: a new generation of protein database search
programs. Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402.
Bligh, E.G. & Dyer, W.J. 1959. A rapid method of total lipid
extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37:
911–917.
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Biosynthesis and export of bacterial glycolipids. Annu. Rev.
Biochem. 89: 741–768.
Caruana, J.C. & Walper, S.A. 2020. Bacterial membrane vesicles
as mediators of microbe-microbe and microbe-host community
interactions. Front. Microbiol. 11:432.
Cho, H.-N., Kasai,W., Kawamoto, J., Esaki, N. & Kurihara,
T. 2012. Characterization of 1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate
acyltransferase from a polyunsaturated fatty acid-producing
bacterium, Shewanella livingstonensis Ac10. Trace Nutr. Res.
29: 92–99.
Chutkan, H., MacDonald, I., Manning, A. & Kuehn, M.J. 2013.
Quantitative and qualitative preparations of bacterial outermembrane vesicles. Methods Mol. Biol. 966: 259–272.
Falke, J.J., Bass, R.B., Butler, S.L., Chervitz, S.A. & Danielson,
M.A. 1997. The two-component signaling pathway of bacterial
chemotaxis: a molecular view of signal transduction by receptors,
kinases, and adaptation enzymes. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 13:
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Gerritzen, M.J.H., Martens, D.E., Wijffels, R.H., van der Pol, L. &Stork, M. 2017. Bioengineering bacterial outer membrane
vesicles as vaccine platform. Biotechnol. Adv. 35: 565–574.
Henry, J.T. & Crosson, S. 2011. Ligand-binding PAS domains in agenomic, cellular, and structural context. Annu. Rev. Microbiol.
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Imai, K., Asakawa, N., Tsuji, T., Akazawa, F., Ino, A., Sonoyama,
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prediction for sub-cellular localization of proteins in Gramnegative bacteria. Bioinformation 2: 417–421.
Koyama, S., Tsubouchi, T., Usui, K. et al. 2015. Involvement offlocculin in negative potential-applied ITO electrode adhesionof yeast cells. FEMS Yeast Res. 15: fov064.
Li, R. & Liu, Q. 2020. Engineered bacterial outer membrane
vesicles as multifunctional deliver y platforms. Front. Mater
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Biotechnology, Second Edition. Springer Inter national
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McBroom, A.J., Johnson, A.P., Vemulapalli, S. & Kuehn, M.J.
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is independent of membrane instability. J. Bacteriol. 188: 5385–
5392.
McBroom, A.J. & Kuehn, M.J. 2006. Release of outer membrane
vesicles by Gram-negative bacteria is a novel envelope stressresponse: outer membrane vesicles relieve envelope stress.
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IFO Res.Commun. 35
27-43, 2021

未だ活用できていない酢酸菌の新規な酸化的物質変換系の探索− PQQ 依存性脱水素酵素 9 と PQQ 依存性グルコース脱水素酵素の機能解析と応用−
藥
山口大学

師

寿

治

中高温微生物研究センター〒753-8515

山口市吉田1677-1

Exploring uncharacterized substrate-oxidation systems in acetic acid bacteria－ Characterization and application of PQQ-dependent dehydrogenase 9
and PQQ-dependent glucose dehydrogenase －Toshiharu Yakushi
Research Center for Thermotolerant Microbial Resources, Yamauchi University
1677-1, Yoshida, Yamaguchi 753-8515
Acetic acid bacteria are widely used for industrial purposes because they can incompletely oxidize sugars, alcohols,
polyols, carbohydrates, and their related compounds. Genetic information of uncharacterized membrane-bounddehydrogenases is increasing due to development of the genome sequencing technology. Here, we characterized thepyrroloquinoline quinone (PQQ)-dependent dehydrogenase 9 (PQQ-DH9), a homolog of PQQ-dependent glycerol
dehydrogenase (GLDH), and PQQ-dependent glucose dehydrogenase (GdhM) of Gluconobacter sp. strain CHM43.
For characterization of PQQ-DH, we used a plasmid to express PQQ-DH9. The expression host was a derivative
strain of CHM43, which lacked the genes for GLDH and the membrane-bound alcohol dehydrogenase andconsequently had minimal ability to oxidize primary and secondary alcohols. The membranes of the transformant
exhibited considerable D-arabitol dehydrogenase activity, whereas the reference strain did not, even if it had PQQDH9-encoding genes in the chromosome. This suggests that PQQ-DH9 is not expressed from the chromosome. The
activities of the membranes containing PQQ-DH9 and GLDH suggested that PQQ-DH9 similar to GLDH oxidizeda wide variety of secondar y alcohols but had higher Michaelis constants than GLDH with regard to linear
substrates such as glycerol. Cyclic substrates such as cis-1,2-cyclohexanediol were readily oxidized by PQQ-DH9.
Lactobionic acid is used in foods and humectants and produced by oxidation of lactose by GdhM of acetic acidbacteria. However, the rate of lactose oxidation by GdhM is much lower than that of glucose oxidation. We constructed
GdhM-over-expression strains to examine the properties of GdhM and to produce lactobionic acid efficiently. We
constructed the plasmids with different promoters for expression of GdhM of Gluconobacter sp. CHM43. The
gdhM-knock out strain harboring the plasmids carr ying the gdhM gene under control of a ribosomal protein
promoter showed the productivity of lactobionic acid of 1.1 mM/h. The KM values of the membranes that containhigh levels of GdhM for maltose, isomaltose, cellobiose, and lactose were much higher than that for glucose.
Key words: Pyrroloquinoline quinone; lactobionic acid; acetic acid bacteria; orphan enzyme緒言ム側)に存在する脱水素酵素(以下，表層脱水素酵素と呼ぶ)は，基質の酸化に伴い，還元力を細胞膜中のユビ酢酸菌は他の微生物にはあまり見られない酸化的物質

キノンに伝達する．還元型のユビキノンはユビキノール

変換能を持つ．その細胞膜の外側(すなわちペリプラズ

酸化酵素によって再酸化され，酸素が水へと還元される

E-mail: juji@yamaguchi-u.ac.jp
共同研究者:赤壁 善彦(山口大学大学院創成科学研究科)
片岡尚也(山口大学中高温微生物研究センター)
後藤 勝(東邦大学理学部)
阿野嘉孝(愛媛大学大学院農学研究科)

反応で終結する．Gluconobacter 属酢酸菌は，膜結合グリ
セロール脱水素酵素( GLDH; ポリオール脱水素酵素 またはソルビトール脱水素酵素とも呼ばれる)によって
D -ソルビトールを L -ソルボースに酸化する．L -ソルボース

は，ほぼ化学量論的なレベルで培養液に蓄積され，工業－ 27 －

藥

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寿

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用ビタミン C 生産の前駆体に使用される(Pappenbergerで進む反応速度に近づく．私たちは，表層脱水素酵素を& Hohmann, 2014)．本研究で研究材料にしている

過剰発現させた組み換え酢酸菌を用いて，野生株では遅Gluconobacter sp. CHM43 のゲノムに含まれる表層脱水
素 酵 素 を 全 て 書 き 込 ん だ 模 式 図 を Fig. 1 に 示 すい酸化反応を高効率で行わせることに成功している(Kataoka et al., 2015)．ゲノム解析の結果として蓄積し(Matsumoto et al., 2018)．例えばグルコース脱水素酵素

た膨大な遺伝子情報と組み換え酢酸菌技術の成熟という( GdhM )はグルコースを酸化してグルコン酸(正確に二つの要因が今回の研究を進める駆動力である．

はグルコノラクトン)を生じる．アルコール脱水素酵素( ADH )はエタノールを酸化してアセトアルデヒドを生

Gluconobacter sp. CHM43 株のドラフトゲノムには，基質が明らかではないオーファン PQQ 依存性脱水素酵

じる．いずれの酵素もユビキノンを還元するので，酸化素 9( PQQ-DH9 ) の 遺 伝 子 が 存 在 す る(Matsumoto et反応の多様性は表層脱水素酵素の多様性で説明ができる．本研究の目的は，新しい脱水素酵素の探索であり，

al., 2018)．PQQ-DH9 は膜結合型 GLDH のホモログであるが，機能は不明なままとなっている(Yakushi et al.,①新しい表層脱水素酵素による新しい物質酸化系の探索2018)．PQQ-DH9 は，2 つの遺伝子産物( GLF_2583 とと，②既知の表層脱水素酵素による新しい物質酸化系の

GLF_2584 )で構成されており，それぞれ GLDH の膜貫通サブユニット SldB と触媒サブユニット SldA に類似し探索を進めた．
ゲノム情報の解析に伴い，多くの「オーファン表層脱て い る．GLF_2583 お よ び GLF_2584 タ ン パ ク 質 は，水素酵素」が見いだされたが，機能未知のままとなって

CHM43 株 の 対 応 す る SldB( GLF_2777 ) お よ び SldA

いる．酢酸菌で初めて完全ゲノム配列が発表された( GLF_2776 )に対してそれぞれ 97 ％および 82 ％のアミ

Gluconobacter oxydans ATCC621H 株では，4 種のピロロ
キノリンキノン( PQQ )依存型のオーファン表層脱水

ノ酸配列の同一性を持つ．

素酵素が見いだされたが，二つは未だ基質が不明のまま

番目の炭素で D -エリスロ配置の「第 2 級アルコール」

である．一方，既知の酵素であっても広い基質特性を持を酸化する(Hann et al., 1938; Kulhánek, 1989)．グリセつ酵素では，新しい反応が発見される．「本来の」基質

ロールと D -ソルビトールは GLDH によって酸化され，の 10 分の 1 程度の活性しか示すことができない基質で化学日焼け剤として使用されるジヒドロキシアセトン

あっても，酵素が 10 倍高濃度になれば，「本来の」基質と，ビタミン C の前駆体として使用される L -ソルボー

GLDH は幅広い基質特異性を持つ．分子の末端から 2Fig. 1. Membrane-bound dehydrogenases in Gluconobacter sp. CHM43.
Black, white, and gray indicate PQQ-, FAD-, and molybdopterin-dependent enzymes, respectively. IDH,
inositol dehydrogenase; PQQ7, PQQ-dependent dehydrogenase 7; ADH, alcohol dehydrogenase; ALDH,
aldehyde dehydrogenase; GLDH, glycerol dehydrogenase; PQQ9, PQQ-dependent dehydrogenase 9; PQQ4,
PQQ-dependent dehydrogenase 4; SDH, sorbose dehydrogenase; FDH, fructose dehydrogenase; GADH,
gluconate dehydrogenase; GdhM, glucose dehydrogenase; DHA, dihydroxyacetone; GA, gluconic acid.

－ 28 －

未だ活用できていない酢酸菌の新規な酸化的物質変換系の探索

スをそれぞれ生成する(Gupta et al., 2001)．GLDH によ

微生物の培養る 1-（2- ヒドロキシエチル)アミノ- 1 -デオキシ- D -ソルビ

本 研 究 で 用 い た 酢 酸 菌 は Table 1 に 示 す． 酢 酸 菌

トールの酸化は，抗糖尿病薬ミグリトールの前駆体であGluconobacter sp. CHM43 株( NBRC 101659; http://
www.nite.go.jp/en/nbrc/index.html )(Moonmangmee

る 6(2- -ヒ ド ロ キ シ エ チ ル)ア ミ ノ- 6 -デ オ キ シ- L -ソ ル
D -フルクトー
ボースを生成する(Yang et al., 2008)．
最近，

スや L -リボースなどの単糖が GLDH の基質リストに追et al., 2000)，その ΔadhAB 誘導体である SEI46 株，および ΔadhAB ΔsldBA 誘 導 体 で あ る TORI4 株 を 用 い た

加された(Ano et al., 2017; Yakushi et al., 2018)．本研究(Yakushi et al., 2018)．また，G. oxydans NBRC 3293 株

では，遺伝子欠失とプラスミドを用いた過剰生産の組みとその ∆ gdhM 誘導体 HK3 株も用いた(Sriherfyna et al.,

合わせを使用して組換え Gluconobacter 株を作製した．

2021)．グルコノバクター属菌株は，ソルビトール培地(1作製した菌株の膜画分の脱水素酵素活性測定を様々な基

リットルあたり D -ソルビトール 50 g，酵母エキス 3 g，質を用いて行った．それぞれの基質で見られた反応速度

およびハイポリペプトン 3 g )あるいはグルセロール培を比較することで，PQQ-DH9 の基質特異性の解析を試地( 1 リットルあたりグリセロール 10 g，酵母エキス

みた．

5 g，およびハイポリペプトン 5 g )で培養した．代謝物

ラクトビオン酸はラクトースの還元末端を酸化するこ分析のために，10,000×g で 5 分間，4 ℃で遠心分離してとで得られる．ラクトビオン酸は，カルシウム塩として細胞を除去した．上清を 0.4 µm ポアのフィルターに通食品やサプリメントに含まれ，腸管でのカルシウムの吸し高速液体クロマトグラフィー( HPLC )による分析を収を促進する作用を持つ有用な物質である(Kiryu et al.,

行 っ た． プ ラ ス ミ ド 構 築 に 大 腸 菌 株 DH5α(Hanahan,2009)．ラクトビオン酸の食品への添加とその安全性を

1983)を用い，LB 培地で培養した．テトラサイクリン，

考慮して酢酸菌の使用が検討されてきたが，効率の良い

カナマイシン，ならびにアンピシリンは，終濃度それぞ生産を行うためには酢酸菌の改良育種が考えられる．

れ 10 µg mL-1 ，50 µg mL-1 ，ならびに 100 µg mL-1 で使用

GdhM はグルコースの他にラクトースも酸化するが，酢した．

酸菌野生株の場合，ラクトースはグルコースよりもはる
かに遅い速度でしか酸化されない．本研究では，ラクトー

プラスミド構築

スをより高い速度で酸化し，短い反応時間で大量のラクPCR を用いて遺伝子のクローニングを行った．Marmur

トビオン酸を生成させることを目的に GdhM 過剰発現の方法(Marmur, 1961)で調製された CHM43 株のゲノム株を構築した．しかし，組換え株の生育と GdhM 活性DNA，ex-GLF_2583-Xba（+）（5'-tctagaacctcaccttctacag-3';は不安定だったので，G. oxydans 由来のリボソームタン

XbaI 認 識 部 位 に 下 線 ) と ex- GLF_ 2584 -Kpn（-）

パク質 GOX0452 をコードする遺伝子のプロモーター領（5'-ggtacctgcccgcatcaagaaatg-3'; KpnI 認 識 部 位 に 下 線 )域を使用した GdhM 発現プラスミドを構築した(Kallnikのオリゴヌクレオチドペア，Herculase DNA Polymerase

et al., 2010)．GdhM の基質特異性を明らかにするために，
グルコースを含むさまざまな二糖類に対する酵素活性を(Stratagene)による PCR を行った．PQQ-DH9 をコードする遺伝子( pqq9 )を含む約 2.7 kb の PCR 産物を XbaI測定した．本研究により明らかになった GdhM のラク

および KpnI で消化してから，pCM62 のマルチクローニ

トースに対する親和性と反応性の低さを克服し，ラクト

ング部位に挿入することで p62SGLDH2-11 と名付けた

ビオン酸生産能の向上を試みた．

プラスミドを構築した(Marx & Lidstrom, 2001)．
pJJ264 ，pJJ384 ， お よ び pJJ452 は，pBBR1 p264 ，

実験方法

pBBR1 p384， お よ び pBBR1 p452 の SacI-SalI 断 片(～
450 b )を pBBR1MCS-4 の SacI-SalI 部位に挿入すること

試薬

によって構築した．

酵母エキスとハイポリペプトンは，それぞれオリエン
タル酵母工業株式会社製と日本製薬株式会社製を用い

Gluconobacter oxydans 621H 株のゲノム DNA を親鎖，
プライマーとして 621H-gdhM(+)（5'-ggtaccatgagcacaa-

た．遺伝子工学系の試薬は東洋紡株式会社製を用いた．

catcccg-3'，KpnI 認 識 部 位 に 下 線 ) と 621H-gdhM(-)

2,3 -ブタンジオールは和光純薬工業株式会社製を用い（5'-aagcttccgagggtcctgtcaga-3', HindIII 認識部位に下線)

た．ラクトビオン酸は東京化成工業株式会社製を用いた．

を用い，Herculase II fusion DNA polymerase によって他の試薬は高純度の市販品を用いた．2 - ヘキサノール，

PCR を行った．この 2.6 kb の PCR 産物を KpnI と HindIII

シクロヘキサノール，1 -シクロヘキシルエタノールはエで消化し，gdhM 遺伝子を持つ 2.6 kb の断片を得た．こ

タノールに溶解し，酵素活性測定に用いた．

の DNA 断片を pBBR1MCS-4 の KpnI-HindIII 部位に挿入
し，pGdhM を構築した．
－ 29 －

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Table 1. Bacterial strains and plasmids used in this study
Strain or plasmid

Description

Source or reference

CHM43

Wild type(Moonmangmee et al., 2000)

SEI46

CHM43 ∆adhAB(Yakushi et al., 2018)

TORI4

CHM43 ∆adhAB ∆sldBA(Yakushi et al., 2018)

UCD1

CHM43 ∆ gdhM

This study

ATCC 621H

Wild type

ATCC

NBRC 3293

Wild type

NBRC

HK3

NBRC3293 ∆ gdhM

(Sriherfyna et al., 2021)

KmR, mob, PlacZ(Kovach et al., 1995)

Gluconobacter sp.

Gluconobacter oxydans

Plasmids
pBBR1MCS-2

R

pBBR1MCS-4

Ap , mob, PlacZ(Kovach et al., 1995)

pCM62

TcR, mob, PlacZ(Marx & Lidstrom, 2001)

pKOS6b

KmR, mob codBA(Kostner et al., 2013)

pBBR1p264

pBBR1MCS-2, PGOX0264(Kallnik et al., 2010)

pBBR1p384

pBBR1MCS-2, PGOX0384(Kallnik et al., 2010)

pBBR1p452

pBBR1MCS-2, PGOX0452(Kallnik et al., 2010)

p62SGLDH2-11

pCM62, a 2.7-kb pqq9 fragment from CHM43(Nguyen et al., 2021)

pGdhM

pBBR1MCS-4, a 2.6-kb gdhM fragment from 621H

This study

pJ793

pKOS6b, a 1.4-kb ∆gdhM fragment from CHM43

This study

pJJ264pBBR1MCS-4, PGOX0264

This study

pJJ384pBBR1MCS-4, PGOX0384

This study

pJJ452

pBBR1MCS-4, PGOX0452

This study

pER264pBBR1p264, a 2.6-kb gdhM fragment from CHM43

This study

pER384pBBR1p384, a 2.6-kb gdhM fragment from CHM43

This study

pER452

pBBR1p452, a 2.6-kb gdhM fragment from CHM43

This study

CHM43 株のゲノム DNA を親鎖，プライマーとして

CHM-∆gdhM-5-Sal(+)（5'-gtcgacgcttcttgttgcgacgg-3';

CHM-Ex-gdhM-5-Sal(+)（5'-gtcgacgtgagcaagatgaacc-3',

SalI 認 識 部 位 に 下 線 ) と CHM-∆gdhM-5-Nco(-)（5'-

SalI 認 識 部 位 に 下 線 ) と CHM-Ex-gdhM-3-HinKpn(-)

ccatggccgggaggatgtgctc-3'; NcoI 認識部位に下線)を用( 5'-ggtaccaagctttatgttacagatgaatcctg-3', KpnI, HindII 認識

い，Herculase II fusion DNA polymerase に よ っ て PCR

部位に下線)を用い，Herculase II fusion DNA polymerase

を 行 い， 生 じ た 産 物 を SalI と NcoI で 消 化 し 0.7 kb

によって PCR を行った．この 2.6 kb の PCR 産物を KpnIの DNA 断 片 を 得 た． 同 様 に CHM-∆gdhM-3-Nco(+)と SalI で消化し，gdhM 遺伝子を持つ 2.6 kb の断片を得（5'-ccatggcaggaccgtctgcc-3'; NcoI 認 識 部 位 に 下 線 ) とた．この DNA 断片を pJJ264，pJJ384，ならびに pJJ452

CHM-∆gdhM-3-Kpn(-)（5'-ggtacctctcctgacatgcgcag-3';の KpnI-SalI 部位に挿入し，それぞれ pER264，pER384，

KpnI 認識部位に下線)を用い，生じた産物を NcoI と

pER452 を構築した．構築したプラスミドを用いたエレ

KpnI で消化し 0.7 kb の DNA 断片を得た．これら 2 つのクトロポレーションで酢酸菌を形質転換した(Yakushi

DNA 断片を，あらかじめ SalI と KpnI で消化しておいた

et al., 2018)．
CHM43 株のゲノム DNA を親鎖，プライマーとしてを得た．

pKOS6b(Kostner et al., 2013)に連結し pJ793(∆gdhM )－ 30 －

未だ活用できていない酢酸菌の新規な酸化的物質変換系の探索

菌株の構築

ニット( U )として定義した．DCPIP のミリモル吸光エ レ ク ト ロ ポ レ ー シ ョ ン 法 に よ り，CHM43 株 を

係数は 8.6( mM-1 )を用いた(Armstrong, 1964)．

pJ793(∆gdhM )で形質転換し，50 µg mL ，カナマイシ-1

ンを含むソルビトール培地でスクリーニングした．この

速度論解析

形質転換株を 60 µg mL-1 のフルオロシトシンを含むソル

酵素活性の KM 値は，Kaleida Graph を使用して，実ビトール培地でスクリーニングすることにより UCD1

験データをミカエリス - メンテン式にフィッティングす(∆gdhM )株を得た．

ることによって求めた．触媒効率を評価するために，休止菌体の調製

Kcat /KM の代わりに Vmax /KM を求めた．Lineweaver-Burk
プロットを作成し，その傾きの逆数を Vmax /KM とした．

UCD1(∆gdhM )/ pER452 を 2 mL のソルビトール培地
を用いて 30 ℃で 24 時間培養し，これを前培養とした．

EDTA 処理とホロ酵素形成

1 mL の前培養液を 100 mL のソルビトール培地に接種し，EDTA ストック溶液の pH を NaOH で 6.0 に調整した．

30 ℃で 24 時間培養した．培養液を 8,000×g で 10 分間，

10 mM MES-KOH( pH 6.0 ) に 10 mg タ ン パ ク 質 mL-1

4 ℃で遠心分離して細胞を回収し，50 mL の 100 mM 酢を含む膜懸濁液を，2，5，10，および 20 mM EDTA 存

酸ナトリウム( pH 6.0 )で 2 回洗浄した．この懸濁液を在下に 4 ℃で一晩インキュベートした．

4 ℃，8,000×g で 10 分 間 遠 心 し，2 mL の 100 mM 酢 酸

EDTA 処理した膜懸濁液を超遠心分離( 100,000×g，

ナ ト リ ウ ム( pH 6.0 ) に 懸 濁 し た． 細 胞 の 濁 度 は

1 時 間，4 ℃) で 沈 殿 さ せ，2 mM CaCl2 を 含 む 10 mM

600 nm で測定した．

MES-KOH( pH 6.0 )に再懸濁した．このステップをもう 1 回繰り返し，得られた膜懸濁液を 5 µM PQQ および

膜画分の調製

2 mM CaCl2 存在下 25 ℃で 30 分間インキュベートするこ

pCM62 プラスミドを保有する TORI4（∆adhAB ∆sldBA）とによりホロ酵素を形成した．

および SEI46（∆adhAB）株および p62SGLDH2-11( pqq9+)プラスミドを保有する TORI4 株を，テトラサイクリン

休止菌体反応10 µg mL を含む 100 mL のソルビトール培地で培養し休止菌体懸濁液( OD600 = 10 )と 100 mM 酢酸ナトリ

た．指数関数増殖期の後期に達するまで 30 ℃で振とう

ウム( pH 6.0 )，100 mM ラクトースからなる 5 mL の反培養した．4 ℃で 10,000×g で 10 分間遠心分離すること

応混合物を，8 つの穴(穴径 2 mm )のあるキャップ付に よ り， 細 胞 を 回 収 し 2 mM CaCl2 を 含 む 10 mM

き の 50 mL 容 プ ラ ス チ ッ ク チ ュ ー ブ 内 で，200 rpm，

MES-KOH(pH 6.0)で 2 回洗浄した．細胞を 4 倍量の同30 ℃で 24 時間振とうした．反応混合物の一部( 500 µL )-1

バ ッ フ ァ ー に 再 懸 濁 し た( 細 胞 の 湿 重 量 1 g あ た りを定期的に採取し，12,000 rpm，4 ℃で 5 分間遠心分離

4 mL )．Phenylmethylsulfonylflouride を 0.5 mM となるよ

することで細胞を除去し，上清を孔径 0.4 µm のフィルうに加えた細胞懸濁液をフレンチプレス( 1,100 kg cm-2 )ターに通し定量分析に用いた．

に 2 回通した．10,000×g，4 ℃で 10 分間遠心分離して未破砕細胞を除去した後，上清を 100,000×g，4 ℃でさ膜画分を用いたバイオトランスフォーメーション
膜画分( 1.0 mg mL-1 のタンパク質)，50 mM 酢酸ナト

らに 1 時間遠心分離した．沈殿物を同じ緩衝液に再懸濁し，膜画分として使用した．

リウム( pH 5.0 )と 100 mM 基質からなる 5 mL の反応
液を，8 つの穴(穴径 2 mm )のあるキャップを備えた

酵素活性測定50 mL プラスチックチューブ内で，150 rpm，30 ℃で 24

酵 素 活 性 は，25 ℃ で フ ェ ナ ジ ン メ ト サ ル フ ェ ー ト

時間振とうした．反応混合物 500 µL を定期的に採取し，( PMS )還元活性を 2,6 -ジクロロフェノールインドフェ

100,000×g および 4 ℃で 1 時間超遠心分離した後，沈殿ノール( DCPIP)とのカップリングによって 522 nm でを廃棄し上清を得た．これを孔径 0.4 µm のフィルター

分光的に測定した．反応液は，酵素，50 mM 酢酸ナトに通し定量分析に用いた．

リ ウ ム( pH 5.0 )，0.2 mM PMS，0.11 mM DCPIP， お
よび 100 mM 基質から成り，基質に依存した DCPIP のラクトース酸化産物の加水分解

吸光度変化を追跡した．なお，2 -ヘキサノール，シクロ

反応後の休止細胞からの 500 µL の反応液を 500 µL の

ヘキサノールおよび 1 -シクロヘキシルエタノールはエ

2.0 M HCl と混合し，95 ℃で 45 分間保温した．その後，タノールに溶解し，終濃度 25 mM で使用した．1 分あた

約 200 µl の 5.0 M NaOH で中和し，生成物を HPLC で分りに変換される基質の分子数( µmol )を酵素活性のユ析した．加水分解および中和による容積増加分を HPLC

－ 31 －

藥

師

クロマトグラフでの濃度算出の際に補正した．

寿治

アルコール脱水素酵素( GLDH )の両方の遺伝子を欠いている(Matsushita et al., 2003; Yakushi & Matsushita,

分析方法2010)．したがって，PQQ-DH9 の遺伝子( pqq9 )を含ろ過されたサンプルは，屈折計( RI )検出器とフォ

む pCM62 である p62sGLDH2-11 を持つ ΔadhAB ΔsldBA

トダイオードアレイ(PDA )を備えた HPLC システム(島pqq9 + 株と呼ぶ)およびコントロールベクター
株(以下，津製作所)を使用して分析した．SUGAR SP0810, 8.0 mm

pCM62 を保有する株(以下，対照株と呼ぶ)を構築した．

ID×300 mm L(昭和電工株式会社)を使用し，移動相比較のために，コントロールベクター pCM62 を持つと し て 蒸 留 脱 イ オ ン 水 を 用 い て，80 ℃， 流 速
0.5 mL min-1 で分析を行った．あるいは，RSpak KC-811,

ΔadhAB 株(以下，sldBA+ 株と呼ぶ)を構築した．この菌株は GLDH をコードする sldBA 遺伝子を染色体に持8.0 mm ID×300 mm L(昭和電工株式会社)を使用し，

つ．

移 動 相 と し て 0.1 ％ リ ン 酸 を 用 い て，60 ℃， 流 速

グルコノバクター菌株を D -ソルビトールで培養する

0.5 mL min-1 で分析を行った．定量はピークの面積ある

ことにより，in vivo で PQQ-DH9 の機能を調べた．つまいは高さを使用した．タンパク質濃度は，ウシ血清アルり，L -ソルボースの生成とそれに伴う D -ソルビトールのブミンを標準として，改変ローリー法により決定した消費を評価した( Fig. 2 )．比較のために，pCM62 を保(Dulley & Grieve, 1975)．

有する野生型 CHM43 を含めた．GLDH 欠損株( ΔsldBA
ΔadhAB )の増殖は野生型株と同様であったが，L -ソル
ボースの産生は見られなかった( Fig. 2 )．pqq9+ 株は，結果と考察

野生型よりも低い速度で L -ソルボースを生産した．ソル

PQQ-DH9 は，GLDH 欠損株における L -ソルボース産生

ボース産生速度は，野生株，sldBA+ ，pqq9+ ，および対を補完する照株で，それぞれ 7.0，6.7，2.7，および 0.056 mM h-1

PQQ-DH9 の特性を明らかにするために，CHM43 のであった．L -ソルボースが蓄積しない対照株による D -ソ

ΔadhAB ΔsldBA 株 で 広 宿 主 域 プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー
pCM62 を使用して GLF_2583 および GLF_2584 遺伝子によるものと思われる(Soemphol et al., 2012)．以上のの発現を試みた．この菌株は，野生株に大量に生産され結果は，PQQ-DH9 がグルコノバクターのソルビトールる第一級アルコール脱水素酵素( ADH )および第二級

酸化システムにおける初発脱水素酵素として機能できる

ルビトールの消費は，おそらく D -ソルビトールの同化

Fig. 2. PQQ-DH9 complements deficiency in L-sorbose production by the ΔadhAB ΔsldBA strain.
Gluconobacter strains were cultivated on sorbitol medium. The wild-type strain harboring pCM62 (WT, white
triangles), the ΔadhAB ΔsldBA strain harboring pCM62 (Ref, gray triangles), the ΔadhAB strain harboring
pCM62 (sldBA+, white circles), the ΔadhAB ΔsldBA strain harboring pCM62 (Ref for the reference strain),and the ΔadhAB ΔsldBA strain harboring p62sGLDH2-11 (pqq9 +, black circles). D-Sorbitol and L -sorbose
levels in the medium were determined by high-performance liquid chromatography (HPLC).

－ 32 －

未だ活用できていない酢酸菌の新規な酸化的物質変換系の探索

た．対照株は，膜結合型グルコース脱水素酵素により，ことを示している．

多種多様な基質，特に糖に対してかなり高い活性を示し
PQQ-DH9 の発現た( Table 2 )．そこで，pqq9 + 株または sldBA+ 株の比活

上記のように，PQQ-DH9 をコードする遺伝子をゲノ

性 か ら 対 照 株 の 比 活 性 を 差 し 引 く こ と に よ り，ムに有する対照株( pCM62 を持つ ΔadhAB ΔsldBA )は，

PQQ-DH9 および GLDH の酵素活性を評価することとし

ごくわずかな量の L -ソルボースしか産生しなかった．こた．いずれの場合もその結果を Δ 活性と呼ぶ( Table 2 )．

の結果は，本実験で使用した培養条件下では，この遺伝子がゲノムからほとんど発現されないことを示唆していsldBA+ 株の膜と同様に，pqq9 + 株の膜は多種多様な基質を酸化した．pqq9 + 株は sldBA+ 株よりも，シス- 1,2 -シクる．膜画分の D -アラビトール脱水素酵素活性を測定しロヘキサンジオールを基質に高い Δ 活性を示した．さらたところ，pqq9+ 株の膜は 0.20 µmol min-1 mg-1 の活性をに，L -リボースは両方の膜によってよく酸化された．た

示したが，対照株の膜画分は検出限界未満の活性であっ

だし，グリセロール，リビトール，D -マンニトール，D -た(Fig. 3 )．これらの結果は，PQQ-DH9 がクリプティッ

ソルビトール，イソプロパノール，および 1,2 -ブタンジク酵素であることを示唆する．PQQ-DH9 の発現を誘導

オールは，pqq9 + 膜によって低い速度でしか酸化されなする培養条件の探索は重要な問題と捉えており，現在調か っ た． つ ま り，pqq9+ 膜 は こ れ ら の 基 質 に 関 し て，査中である．対照的に sldBA 株の膜は，GLDH を持つの で よ り 高 い 活 性( 0.41 µmol min-1 mg-1 ) を 示 し た

sldBA+ 膜よりもはるかに低い酸化活性であった．
PQQ-DH9 は，トランス異性体よりもシス型の 1,2 -シ( Fig. 3 )．PQQ-DH9 の 至 適 pH は 5.0 ～ 6.0 で，GLDH

クロヘキサンジオールを高い速度で酸化した(Table 2 )．

の至適 pH と同様であった．以上の結果は，構築されたプラスミドによって，PQQ-DH9 がグルコノバクター株

pqq9 + 膜の Δ 活性値は，シス型とトランス型でそれぞれ
520 nmol min-1 mg-1 と 10 nmol min-1 mg-1 であった．たで機能的に発現できたことを示している．

だ し，sldBA+ 株 は 240 nmol min-1 mg-1 お よ び 230 nmol+

min-1 mg-1 でそれぞれシス型およびトランス型を酸化しPQQ-DH9 の基質特異性

た．これの結果は，Moonmangmee らによる以前の観PQQ-DH9 の基質特異性を評価するために，膜画分を察と一致していた(Moonmangmee et al., 2001)．

用いて様々な基質の脱水素酵素活性を pH 5.0 で測定しFig. 3. D-Arabitol dehydrogenase assay indicates the functional expression of PQQ-DH9.
D-Arabitol dehydrogenase activity in the membranes of the ΔadhAB strain harboring
pCM62 (sldBA+, white circles), the ΔadhAB ΔsldBA strain harboring pCM62 (Ref for thereference strain, gray triangles), and the ΔadhAB ΔsldBA strain harboring p62sGLDH2-11(pqq9 +, black circles) grown on sorbitol medium were determined by PMS/DCPIP assay
with 100 mM D-arabitol in 50 mM Na+-acetate (pH 4.0, 5.0, and 6.0) at 25 ℃. The membranesof the reference strain (Ref) had activities below the detection limit (0.001 µmol min-1 mg-1).

－ 33 －

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寿

治

Table 2. Substrate specificities of pyrroloquinoline quinone-dependent dehydrogenase 9 and glycerol dehydrogenase
pqq9 +

Reference

sldBA+

Specific activity(nmol min-1 mg-1)aSpecific activity(nmol min-1 mg-1)a∆ activity(nmol min-1 mg-1)b∆ activity(nmol min-1 mg-1)cGlycerol

4.0±5

18±10

14

490

meso-Erythritol

0 (n = 2)

190 (n = 2)

190

330

D,L -Threitol

0 (n = 2)

3.1 (n = 2)

3.1

25

Xylitol

0 (n = 2)0 (n = 2)

0

3.3

Ribitol

0 (n = 2)

28 (n = 2)

28

260

0

170±20170

400

D-Arabitol
L -Arabitol

0

0

0

4.6

Galactitol

0 (n = 2)0 (n = 2)0

8.5

D-Mannitol

0

27±10

27

210

D-Sorbitol

2.8±3

55±10

52

410

0±0

<0

<0

Inositol

31±19

Isopropanol

8.0±8

35±10

27

240

2-Butanol

26 (n = 2)

140 (n = 2)

114

380

2-Hexanol

7.0 (n = 2)

30 (n = 2)23

78

1,2-Butanediol

2.1 (n = 2)

80 (n = 2)

78

460

1,3-Butanediol

11 (n = 2)

65 (n = 2)

54

140

2,3-Butanediol

26±8400±50

370

770

25±7

85±4

60

240

1,2-Cyclopentandiol

2,4-Pentanediol

119 (n = 2)

350 (n = 2)

230

630

cis1,2-Cyclohexanediol

35±13

550±90520

240trans1,2-Cyclohexanediol

0±010±0.410230

1-Cyclohexylethanol

6.3 (n = 2)

22 (n = 2)

16

43

Cyclohexanol

5.1 (n = 2)

84 (n = 2)

79

270

Glyceraldehyde

63 (n = 1)

140 (n = 1)

77

120

D-Xylose

220±90120±50<023

D-Ribose

14±3

90±30

76

120

L -Ribose

25±2

200±7

180

210

D-Arabinose

9.8 (n = 2)

5.2 (n = 2)

<018

L -Arabinose

157 (n = 2)

120 (n = 2)<0

16

D-Lyxose5.5±3

100±1095

89

D-Galactose

240±100

130±10<045

D-Gluconate

140±40130±10<082

Specific activity was calculated from three independent enzyme assays, shown in mean value ± standard deviation.
Otherwise, results of the numbers (n) of enzyme assays indicated in parentheses were used for the calculation of meanvalue.
b∆ activity in the pqq9+ membrane was calculated by subtracting the mean specific activity of the reference strain fromthe corresponding mean specific activity of the pqq9+ strain.
c∆ activity in the sldBA+ membrane was calculated by subtracting the specific activity of the reference strain (n = 1) fromthe corresponding specific activity of the sldBA+ strain (n = 1).
a－ 34 －

未だ活用できていない酢酸菌の新規な酸化的物質変換系の探索

基質に対するミハエリス定数

EDTA で処理した( Fig. 4 )．20 mM EDTA では，sldBA+

グリセロール，L -リボース，D -アラビトール，2,3 -ブ

膜は EDTA の非存在下で対照膜の活性の 60 ％を保持しタンジオール，および 1,2 -シクロヘキサンジオールのシたが，pqq9+ 膜はそれらの活性の 80 ％を失った．これらスおよびトランス異性体に関して，pqq9 + および sldBA+の 結 果 は，EDTA 処 理 を 行 う と PQQ-DH9 が GLDH よ

株の膜画分の脱水素酵素の KM 値を算出した( Table 3 )．

りも安定性が低いことを示唆する．EDTAを除去した後，グリセロール，D -アラビトール，および 2,3 -ブタンジオー

5 µM PQQ と 2 mM Ca2+ を添加することにより，活性はルに関する pqq9 膜の KM 値は，sldBA 膜の KM 値より回復した．したがって，酵素からの PQQ および Ca2+ のも高かった．ただし，L -リボースとシス- 1,2 -シクロヘキ

離脱は，EDTA 処理に起因する活性の低下を説明し，サンジオールに関する 2 つの膜の KM 値は同等であった．

PQQ-DH9 が PQQ 依存的に機能することを示す．これは，私たちが示唆したように，GLDH がピラノース型の L -リ

PQQ-DH9 が GLDH よりも容易に PQQ と Ca2+ を遊離す

ボースを酸化して L -リボノラクトンを生成すると考える

ることを示唆する．

++と(Yakushi et al., 2018)，環状基質に対する PQQ-DH9の親和性は GLDH の環状基質に対する親和性に匹敵すD -アラビトール，2,3 -ブタンジオール，シス- 1,2 -シクロると示唆される．しかし，鎖状基質に対する PQQ-DH9ヘキサンジオール，および L -リボースの酸化生成物の親和性は，GLDH のそれよりも低いと示唆される．

「 材 料 と 方 法 」 で 説 明 し た 方 法 に よ り，sldBA+ と

1,2 -シクロヘキサンジオールに対する pqq9+ 膜の KM
値は，シス異性体よりもトランス異性体の方が高かった

pqq9+ の膜画分を使用して得られた D -アラビトール，2,3 ブタンジオール，シス- 1,2 -シクロヘキサンジオール，おが，1,2 -シクロヘキサンジオールに関する sldBA+ 膜のよび L -リボースの酸化生成物を調べた．2 つの膜からのKM 値は，シス異性体よりもトランス異性体の方が低かった．2 つの酵素がシス異性体とトランス異性体を区別す

ビトール，2,3 -ブタンジオール，シス- 1,2 -シクロヘキサ

るメカニズムは興味深いものであり，構造解析を含むさ

ンジオール，L -リボースの酸化生成物については，それ反応生成物は互いに近い保持時間で溶出された．D -アラ

らなる生化学的分析が必要である．
酵素活性に対する EDTA の影響
EDTA に対する脱水素酵素の感受性を調べた．PQQ
は Ca2+ を介して酵素に結合しているため(Ghosh et al.,1995)，EDTA は Ca2+ をキレート化することによって
PQQ 依存性酵素を可逆的に不活性化する．pqq9+ およびsldBA+ 膜 の 両 方 で， 最 大 20 mM の さ ま ざ ま な 濃 度 のTable 3. KM values (mM) of membrane-associated dehydrogenases with regard to various substratesa

a

pqq9+

sldBA+

Glycerol450±408.4±0.7

L -Ribose

41±2

61±3

D-Arabitol

88±4

5.5±0.3

2,3-Butanediol

9.4±0.4

1.8±0.2

cis-1,2-Cyclohexanediol

2.8±0.3

4.6±0.6trans-1,2-Cyclohexanediol

19±3

0.49±0.07

The KM values were determined by a phenazine methosulfate/
2,6-dichlorophenol indophenol assay using membranes fromthe pqq9 + and sldBA+ strains grown on sorbitol medium withvarious concentrations of the substrate in 50 mM Na+-acetate(pH 5.0) at 25 ℃, followed by data analysis using KaleidaGraph(ver. 4.5, Synergy Software).

Fig. 4. Effects of EDTA treatment on dehydrogenase activity.
The membranes of the ΔadhAB strain harboring pCM62(sldBA+, white circles) and the ΔadhAB ΔsldBA strain
harboring p62sGLDH2-11 (pqq9 +, black circles) weretreated with 2, 5, 10, and 20 mM EDTA on ice overnight.
Then, D-arabitol dehydrogenase activity in the EDTAtreated membrane was determined by PMS/DCPIP
assay in 50 mM Na+ -acetate (pH 5.0) at 25 ℃. The
remaining activity relative to that of the control
membrane was expressed as a percentage.

－ 35 －

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師

寿

治

ぞれ 20.5，30.3，43.2，および 20.6 分( Fig. 5 および非つのアイソフォームの混合物であり，基質 B はこれら

表示データ)であった．この結果から，PQQ-DH9 によっのアイソフォームの一つであると考えられる．基質 Bて生じる生成物は GLDH によって生じる生成物と同じは基質 A よりも遅い速度で消費され( Fig. 6 )，sldBA+であると結論付けた．

膜 よ り も pqq9+ 膜 に よ っ て ゆ っ く り と 酸 化 さ れ た

反応時間 0 の場合，保持時間 31.9 分と 32.9 分で 2,3 -(Fig. 6)．sldBA+ 膜によって生成された酸化生成物のピー

ブタンジオールの HPLC クロマトグラムに 2 つのピーク

ク強度( 30.3 分の保持時間)は pqq9 + 膜によって生成さが見られた( Fig. 5 )．どちらも 2 つの膜との酸化反応のれたものよりも高かったため( Fig. 6 )，ピーク強度の結果として消費された．31.9 分と 32.9 分に溶出された違いは基質 B の消費量の違いに対応すると解釈できた

アイソフォームをそれぞれ基質 A と B と呼ぶ．市販の( Fig. 6 )．したがって，PQQ-DH9 と GLDH が 2,3 -ブタ

2,3 - ブタンジオールは，2S,3S-, 2R,3R-, およびメソ型の 3ンジオールを立体異性体特異的に酸化することが示唆さFig. 5. High-performance liquid chromatography (HPLC) chromatograms of the reaction products resulting fromthe action of the membranes on several substrates.
The reaction products were run on an organic acid column and were detected with a refractive index (RI)
detector. The reaction products resulting from the oxidation of 2,3-butanediol by the sldBA+ (A and B) and
pqq9 + (C) membranes for 0 h (A) and 24 h (B and C). The inverted triangle and black circle indicate thepeaks attributable to the substrates A and B, respectively. The black arrows indicate the peaks attributable
to the remaining substrate B after the 24-h reactions. The dashed lines indicate the trough attributable towater, the peak attributable to the reaction product, and the peak attributable to acetate, which was used asa buffer in the oxidation reactions.

－ 36 －

未だ活用できていない酢酸菌の新規な酸化的物質変換系の探索

Fig. 6. Time course of 2,3-butanediol oxidation by the membranes.
2,3-Butanediol was treated with the sldBA+ (white) and pqq9 + (black) membranes for 0, 6, 12, and 24 h.
The reaction products were run on an organic acid column and detected with a refractive index (RI)
detector. The peak intensities of substrate A (31.9 min retention time), substrate B (32.9 min retentiontime), and the product (30.3 min retention time) are shown in panels A, B, and C, respectively.

れる．2,3 -ブタンジオールの酸化生成物はアセトインで(Yakushi et al., 2018)．私たちの実験では染色体発現レあり，これは乳製品，化粧品，製薬業界，および化学合

ベルの活性が検出されなかったため，PQQ-DH9 はクリ成で使用される物質である．G. oxydans DSM2003 株は，プティック酵素であることが示唆された．PQQ-DH9 の(2S,3S)- および(2R,3R)- 2,3 -ブタンジオールからそれぞ発現のための培養条件は，この酵素の生理学的役割を理れ(3S)-アセトインおよび(3R)-アセトインを生成し，メ解するための重要な問題として今後検討する．

ソ- 2,3 -ブタンジオールを（3S）-アセトインへ立体選択的に変換する(Wang et al., 2013)．
(3S)-アセトインと(3R)-

酢酸菌グルコース脱水素酵素の単糖類に対する基質特異性

アセトインは本研究の HPLC では単一のピークとして現酢酸菌のグルコース脱水素酵素の基質特異性に関してれるため，酸化生成物( 30.3 分の保持時間)にはアセ

は，過去に精製酵素を用いた報告があるが，研究グルー

トインの 3S- および 3R- 異性体が含まれている可能性がプによって幾つかの相違点があった．私たちの研究室である．

は G. oxydans NBRC 12528( 発 表 当 時 は Gluconobacter

メタゲノムや G. oxydans のオーファン PQQ 依存性脱水素酵素を特徴づけるためにいくつかの試みがなされてsuboxydans IFO 12528 ) の 本 酵 素 の 基 質 特 異 性 は 非 常に 高 い と 報 告 し た(Ameyama et al., 1981)． 一 方 で，きた(Peters et al., 2013; Peters et al., 2017; Mientus et al.,

Buchert は G. oxydans ATCC 621 株からキシロース脱水

2017)． 本 研 究 で は GLF_2583-2584 タ ン パ ク 質 を素酵素として本酵素を精製し調査したところ，D -グル

PQQ-DH9 として特徴付けた．これは，GLDH に類似しコース，D -ガラクトース，D -マンノース，L -アラビノーているが，基質特異性が異なっていた．鎖状基質(グリスが D -キシロースの 50 ％以上の速度で反応することをセロール，リビトール，D -マンニトールなど)について報告している(Buchert, 1991)．比較的最近発表されたは，PQQ-DH9 は GLDH よりも低い速度で酸化し低い親研究にも相違点が認められる．Meyer らは G. oxydans

和性を示した．一方，シス- 1,2 -シクロヘキサンジオール

ATCC 621H 株の GdhM を過剰発現，精製し，基質特異やピラノース型の L -リボースなどの環状基質を，GLDH性を評価した(Meyer et al., 2013)．一方，Peters らは人と同等の親和性と速度で酸化した．pqq9+ 膜の反応生成

工電子受容体を用いた酵素アッセイ系に ATCC 621H 株

物は，HPLC で sldBA+ 膜の反応生成物と同様の保持時の gdhM 遺伝子を持つ変異株と gdhM 欠損株の菌体懸濁間を示したため，2 -ケト - シクロヘキサノールがシス-液を用いて，様々な糖類に対する反応性を調査した

1,2 -シクロヘキサンジオールから生成され，L -リボース(Peters et al., 2013)．Meyer らは，D -マンノースと D -ア

は GLDH 触媒作用との類似性に基づいて L -リボノ- 1,5 -ルトロースに対する活性は無いと報告している一方で，ラクトン，続いて L -リボン酸に変換されると考えられる

Peters らは有ると報告しており，両者の主張が異なって－ 37 －

藥

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寿

治

ロースの順で反応した．最も速度が低い D -アルトロー

いる．
ここでは，G. oxydans NBRC 3293 株の gdhM 遺伝子欠スでも対グルコースの 10 ％程度の活性を示した．一方損株とその株に ATCC 621H 株の gdhM 遺伝子を過剰発で，L -グルコース，リボース( D -，L - 共に)，D -アラビノー

現させた株との比較から，本酵素の基質特異性を再検討

スには反応性を示さなかったことから，広くアルドース

することとした( Fig. 7 )．なお，NBRC 12528 の GdhMを酸化するもののそのエナンチオーマーには反応しないと ATCC 621H 株の GdhM のアミノ酸配列は同一である．

といった特異性が認められた．以下に解析するマルトー

私たちの実験系では，D -グルコースに対して最も高い反スについても過去の研究には相違点が認められるが，こ応速度を示し，次いで D -アロース，D -キシロース，D -マれについては用いた試薬の純度によって，混入する D -ンノース，L -アラビノース，D -ガラクトース，D -アルト

グルコースの影響が大きいと考えられる．

Fig. 7. PMS-DCIP reductase activities in the membranes on various substrates.
For the membrane preparation, the cells were cultured in glycerol medium at 30 ℃. G. oxydans
HK3 (Δ gdhM )/pBBR1MCS- 4 (vector) and G. oxydans HK3 (Δ gdhM )/pGdhM ( gdhM +) areindicated with black bar and white bar, respectively. A. Substrates that show high activity.
Results of D-galactose, L-arabinose, D-xylose and D-mannose were from single assays. B.
Substrates that show low activity. The membranes of G. oxydans HK3 (Δ gdhM )/pGdhM ( gdhM +) showed activity of 23 µmol min-1 mg-1 in this enzyme assay. Mean values andstandard deviations of other substrates were calculated from triplicate assays. All enzyme activities were examined with 100 mM substrate in 50 mM K+-phosphate (pH 6.0).

－ 38 －

未だ活用できていない酢酸菌の新規な酸化的物質変換系の探索

gdhM 遺伝子の発現に用いるプロモーターの検討
前節で構築し使用した組換え Gluconobacter 株はそののゲノム DNA から PCR にて増幅した gdhM 遺伝子を含膜画分に高い GdhM 活性を持つが，生育が不安定で，む DNA 断片を pJJ264，pJJ384，ならびに pJJ452 にクロー

1995)の誘導体である(Kallnik et al., 2010)．CHM43 株

最終的には生育することができなくなってしまった．今

ニングし，pER264，pER384，および pER452 と名付けた．

後の安定的な酵素の解析や組換え株を用いた生産試験を

UCD1(ΔgdhM )/pER264 お よび UCD1(ΔgdhM )/pER384

見据え，安定に GdhM を高発現する組換え株を構築すは 比 較 的 生 育 が 遅 く， 安 定 性 も 悪 か っ た が，UCD1

る試みを行った．Gluconobacter sp. CHM43 株はタイで(ΔgdhM )/pER452 は 安 定 し て 速 く 生 育 し た( Fig. 8 )．

分離された耐熱性酢酸菌であり(Moonmangmee et al.,

一方，GdhM 活性については三者でほとんど変わらな

2000)，熱だけでなく様々なストレスに対する耐性を持かった．本実験により，GdhM の高発現は生育に悪影響

つ と 期 待 さ れ た の で， 以 後 は CHM43 株 を 宿 主 と し，を与えると示唆された．よって，UCD1(ΔgdhM )/pER452

CHM43 株の gdhM 遺伝子を発現する試みを行った．は( gdhM +)は，その安定した増殖と GdhM 活性により，以じ め に，CHM43 株 の gdhM 遺 伝 子 を 破 壊 し，UCD1

後の解析に用いる株として最も優れていると判断した．

(ΔgdhM )株を作製した．
pJJ264，pJJ384，ならびに pJJ452 は，ATCC 621H 株のGdhM の二糖類に対する脱水素酵素活性と速度論

リボソームタンパク質をコードする GOX0264，GOX0384，

ラクトース，マルトース，イソマルトース，セロビオー

GOX0452 遺伝子のプロモーター領域(PGOX0264 ，PGOX0384 ，
PGOX0452 )約 450 b をそれぞれ含み，その下流にマルチクする．Kiryu らによって，酢酸菌の GdhM がこれらの二ローニングサイトを持つ pBBR1MCS-4(Kovach et al.,

糖 類 を 酸 化 す る こ と が 報 告 さ れ て い る(Kiryu et al.,スには共通して，D -グルコースに由来する還元末端を有2019; Kiryu et al., 2020)．ここでは，本研究で構築した菌株を用いて，GdhM によるこれら二糖類の酸化能を評価した( Fig. 9 )．最も活性が高かったのは D -グルコー
スであり，次にセロビオース，イソマルトース，マルトース，およびラクトースの順であった．セロビオースに対Fig. 8. The growth of GdhM-overexpression strains.
The cells were cultivated on sorbitol medium containing
500 µg mL-1 ampicillin (A). After the culture, cells were
harvested and the membrane fractions was prepared. The
specific glucose dehydrogenase activity in the membranes
were measured (B). UCD1 (ΔgdhM )/pER264 ( gdhM +),right gray; UCD1 (Δ gdhM )/pER384 ( gdhM + ), gray;
UCD1 (ΔgdhM )/pER452 ( gdhM +), black.

Fig. 9. The specific disaccharide dehydrogenase activity in themembranes of the UCD1(ΔgdhM)/pER452( gdhM +) strain.
The cells were cultivated on sorbitol medium containing
500 µg mL -1 ampicillin. After the culture, cells were
har vested and the membrane fractions was prepared.
The specific glucose and disaccharide dehydrogenase
activities in the membranes were measured. The eachnumber above bar indicates the relative activity on each
substrate to that on glucose.

－ 39 －

藥

師

寿

治

する活性はイソマルトースと同様であり，マルトースとスのそれの 10 倍程度高いものであった．ラクトースとマ

ラクトースの酸化活性は非常に低く，D -グルコース酸化

ルトースの基質濃度活性曲線も互いに類似していたが，活性の 1 ％を下回った．

ほぼ直線となり，ミハエリス・メンテンの式でのフィッ

これらの二糖類に対するミハエリス定数の算出を試み

ティングはできなかった．したがって，Lineweaver-Burk

た( Fig. 10 )．セロビオースとイソマルトースの基質濃プロットの傾きの逆数をとることで，Vmax /KM 値を求め，度活性曲線は互いに類似していた．KM 値は D -グルコー

触媒効率の指標として用いることにした( Table 4 )．マ

Fig. 10. The activity curves of GdhM on the several disaccharides.
The UCD1 (ΔgdhM )/pER452 ( gdhM +) strain was cultivated on sorbitol medium containing 500 µg mL-1 ampicillin.
After the culture, cells were harvested and the membranes were prepared. The specific dehydrogenase activity on
the several disaccharides in the membranes were measured with different concentrations of substrates. The data
were fitted to the Michaelis-Menten equation with KaleidaGraph ver. 4.5 (Synergy Software, Reading, PA, USA).

－ 40 －

未だ活用できていない酢酸菌の新規な酸化的物質変換系の探索
Table 4. KM, Vmax, and Vmax/KM values of the membranes of UCD1 (ΔgdhM )/pER452 ( gdhM +) strain with regard to various substrates
KM (mM)aVmax(µmol min-1 mg-1)aVmax/KM(µmol min-1 mg-1 mM-1)b

Glucose6.8±0.8

28±1

3.2

Cellobiose

53±312±0.40.25

Isomaltose

94±9

8.8±0.5

0.12

Maltose––1.2 × 10-3Lactose––7.3 × 10-4

a

The KM and Vmax values were determined by a phenazine methosulfate/2,6-dichlorophenol indophenol assay
using the membranes of UCD1 (ΔgdhM )/pER452 ( gdhM +) strain with various concentrations of the substrate,
followed by fitting the data to the Michaelis-Menten equation using KaleidaGraph (ver. 4.5, Synergy Software).
b
A slope of the Lineweaver–Burk plot is KM /Vmax, and the reciprocal of the slope is Vmax/KM. Thus, the Vmax /KM(µmol min-1 mg-1 mM-1) value was calculated with Lineweaver–Burk plot.

ルトースとラクトースの Vmax /KM 値は，グルコースのそれの 1,000 分の 1 から 10,000 分の 1 となった．GdhM は
これら二糖類の還元性を持つグルコース部分を酸化すると考えられる．反応速度や親和性の違いは，立体障害によるものと思われるが，単糖間の結合様式による説明は
現在のところ難しそうである．
ラクトビオン酸の生産
前節の速度論解析から，酢酸菌の GdhM によるラクトース酸化は，グルコースと比較してかなり不利である
ことが示唆された．しかしながら，本研究で構築した
GdhM 過剰発現株は野生株の 10 倍程度高い活性を示す
ため，ここではラクトビオン酸(LacA )の生産試験を行った．菌の生育に依存しない休止細胞反応でのラクトビオ
ン酸生産を試みた．UCD1(ΔgdhM )/pER452(gdhM +)は
24 時間で 25.3 mM のラクトビオン酸を生成し，生成速度は 1.1 mM h-1 であった( Fig. 11 )．CHM43/pJJ452 と比較すると，約 8 倍速かった．酵素の特性からは物質生産に不向きのように見える場合でも，酵素の高生産によって生産性が向上する例と言える．
反応生成物
休止菌体反応後，生成物を塩酸で加水分解し，HPLCで分析した(非表示データ)．反応前加水分解生成物中にグルコースおよびガラクトースが検出された．反応後の加水分解生成物は，ガラクトースおよびグルコン酸のピークを示した．したがって，反応前のラクトースがラ
クトビオン酸に変換されたことが確認された．

要

約

酢酸菌は細胞表層の酸化系を用いて様々な化合物を不完全に酸化する特徴を持つ．近年のシーケンシング技術の発展により，多くの膜結合型酵素が機能未知のまま残Fig. 11. Lactobionic acid production with the resting cells.
The wild-type CHM43/pJJ452 (vector) indicated as WT,
UCD1 (Δ gdhM )/pJJ452 (vector) indicated as ∆ gdhM,
UCD1 (Δ gdhM )/pER452 ( gdhM +) indicated as gdhM +,strains were cultivated on Sorbitol medium containing
500 µg mL -1 ampicillin. After the culture, cells were
harvested and the cell suspensions were prepared. This
strain produced 25.3 mM of LacA in 24 h, and LacA production rate was 1.1 mM h-1. The error bars represent thestandard deviation of three experiments. A, pH; B, Lactose
consumption; C, Lactobionic acid (LacA) production.

－ 41 －

藥

師

寿治
酸化の改善．日本農芸化学会2021年度大会(2021年3月
18–21日，仙台，オンライン)

されている．本研究では，グルコノバクター属 CHM43
株のピロロキノリンキノン( PQQ )依存性脱水素酵素
9( PQQ-DH9 )を特徴づけた．本遺伝子産物は PQQ 依
存性グリセロール脱水素酵素( GLDH )のホモログである．CHM43 の派生株である発現宿主は，GLDH および膜結合型アルコール脱水素酵素の遺伝子を欠いており，第一級および第二級アルコールを酸化する能力がほ
とんどない．形質転換体の膜画分は D -アラビトール脱水素酵素活性を示したが，ベクターのみを持つ対照株は，染色体に PQQ-DH9 をコードする遺伝子が残されている

原著論文
1) Nguyen, T.M., Naoki, K., Kataoka, N., Matsutani, M., Ano, Y.,A d a c h i , O . , M a t s u s h i t a , K . & Ya k u s h i , T. 2 0 2 1 .
Characterization of a cr yptic, pyrroloquinoline quinonedependent dehydrogenase of Gluconobacter sp. strain
CHM43. Biosci. Biotechnol. Biochem. 85: 998-1004.
その他(総説・書籍・特許など)
なし

が，活性をほとんど示さなかった．これは，PQQ-DH9 が謝

ゲノムで発現されていないことを示唆する．PQQ-DH9と GLDH を含む膜の活性は，GLDH と同様に，PQQ-DH9

辞は多種多様な第二級アルコールを酸化したが，グリセ本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公ロールなどの鎖状基質に関しては GLDH よりも反応速益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．本研

度が遅くミカエリス定数も高かった．シス- 1,2 -シクロヘ

究は，山口大学農学部応用微生物学研究室で実施された

キサンジオールなどの環状基質は，PQQ-DH9 によってものであり，Nguen Mihn Thuy 博士，内田侑里君，古容易に酸化された．

谷晃一君，小池尚史君，松本奈実博士，松下一信先生，

ラクトビオン酸は，食品や保湿剤などに使用される有ならびに足立収生先生に感謝申し上げます．また，本研用な物質である．酢酸菌は，ラクトースを酸化すること究の遂行にご協力いただいた地方独立行政法人大阪産業

でラクトビオン酸を生成できるグルコース脱水素酵素

技術研究所の桐生高明博士に感謝の意を表します．

( GdhM )を持っている．ただし，GdhM によるラクトー

文

スの酸化はグルコースの酸化よりもはるかに遅いため，ラクトビオン酸を効率的に生成するには GdhM の過剰発現が有効と考えた．プロモーターを検討し，リボソー
ムタンパク質プロモーターと gdhM 遺伝子を持つプラスミドを構築した．このプラスミドを用いて gdhM ノック
アウト株を形質転換し，過剰発現株を構築した．この形
質転換株は安定して増殖し，親株よりも 10 倍程度高い活性を示した．さらに，ラクトースに加えて，マルトース，イソマルトース，セロビオースに対する KM 値を決定した．ラクトースおよびマルトースに対する KM 値は計算できないほど高かった．ラクトースに対する GdhMの親和性と反応速度が低いにもかかわらず，GdhM 過剰発現株を使用すると，ラクトビオン酸がより短時間で
1.1 mM h-1 の速度で生成された．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表
1) Thuy Minh Nguyen, Naoya Kataoka, Osao Adachi, Kazunobu
Matsushita, Toshihar u Yakushi. Characterization of acryptic, membrane-bound PQQ-dependent dehydrogenase
of Gluconobacter sp. CHM43．日本農芸化学会2020年度中
四国支部大会(第57回講演会)(2020年9月17–18日，徳島，オンライン)2) 内田侑里，ケオケン トラポン，片岡尚也，松下一信，薬師 寿治．2021．グルコノバクター属酢酸菌の膜結合型グ
ルコース脱水素酵素によるラクトビオン酸生産と二糖類

献

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－ 43 －

IFO Res.Commun. 35
45-59, 2021

化学物質の還元反応に寄与する異種微生物間の固体腐植を介した細胞外電子伝達機構の解明
片

山

新

太

東海国立大学機構名古屋大学未来材料・システム研究所〒464-8603 名古屋市千種区不老町

Mechanism of extracellular electron transfer mediated by solid-phase humic substance
between different microorganisms contributing to the reducing reactions of chemicals
Arata Katayama
Institute of Materials and Systems for Sustainability, Nagoya University,
Tokai National Higher Education and Research System
Furo-Cho, Chikusa, Nagoya 464-8603
Mechanism of extracellular electron transfer (EET) mediated by humin, a humic substance insoluble at any pH,
was studied using anaerobic pentachlorophenol-dechlorinating consortium, carbon dioxide (CO2)-reducing
acetogenic consortium, anaerobic nitrogen fixing consortium and nitrate reducing Pseudomonas stutzeri. Although
EET by humin has been observed in the anaerobic dehalogenation, nitrate reduction and iron reduction, which0have positive E ' (standard redox potential, versus standard hydrogen electrode, at pH = 7), the EET from humin0
was newly found to support or promote the anaerobic microbial reactions with E ' < -250 mV: CO2 -reducing
acetogenesis and anaerobic nitrogen fixation. It was demonstrated that the energy network in the anaerobic
microbial world based on EET via humin contained the microbial reactions with wider redox potentials. In theCO2 -reducing acetogenesis by the enriched consortium and nitrate reduction by P. stutzeri, humin donated0extracellular electrons even to the microbial reactions with more reduced E ' than the average redox potential of
humin. This indicated that humin contained the redox-active moieties heterogeneously, with wide redox potentials
from the reduced to the oxidized. Further study should be carried out to elucidate the heterogeneity in the redox
potential in humin. The similar microbial community structures of nitrogen fixing consortia enriched with andwithout humin and the promotion in the nitrogen-fixing activity of both consortia using the EET from humin
demonstrated that anaerobic nitrogen-fixing bacteria obtained in the absence of humin can also utilize theextracellular electrons of solid-phase humin, indicating the strategy to isolate the humin-utilizing microorganisms
from the environments. In addition to P. stutzeri, isolation of new microorganisms utilizing EET of humin would
accelerate the study on the EET of humin among different microorganisms contributing the reducing reactions ofchemicals. It is also expected that the EET of humin is applied to the technologies for environmental microbial
remediation and microbial electrosynthesis.
Key words: humin, extracellular electron mediator, CO2 -reducing acetogenic consortium, anaerobic nitrogenfixing consortium, Pseudomonas stutzeri緒言ミン質)として環境中に残留する．腐植物質は，酸・ア
ルカリへの溶解度によって，酸・アルカリ両方に可溶の地圏環境では，動物の排泄物や生物の死骸は分解されフルボ酸，アルカリに可溶で酸に不溶の腐植酸，酸・アるとともに縮重合反応を起こし，いわゆる腐植物質(フルカリ両方に不溶のヒューミン(ここでは，固体である
ことを明瞭にするために固体腐植ヒューミンとして示E-mail: katayama.arata@nagoya-u.jp
共同研究者:笠井拓哉・出町豊子(東海国立大学機構名古屋大学未来材料・システム研究所)

す)に分類されている( Fig. 1 )．フルボ酸と腐植酸は，ほぼ有機物からなるが，固体腐植ヒューミンは無機物(アルミノケイ酸塩)が 50 ％以上を占める有機無機複合体－ 45 －

片

山

新

太

Fig. 1 Formation and Classification of humic substances

である．鉄還元菌の研究から，腐植酸を電子受容体としいるが，地圏に広く分布する上に，多様な微生物の細胞て利用する Geobacter 属細菌が発見( Lovley et al., 1996 )外電子伝達を可能とする固体腐植ヒューミンを介した異されて以来，腐植物質の細胞外電子伝達機能に関する多種微生物共生系の方が，より重要である可能性が示唆さくの研究が進められ，腐植酸が電子受容体であるばかりれる．これまで，微生物還元された固体腐植ヒューミン

で無く，電子供与体としても働くことが示されたが，研からの電子が当該微生物に直接供給されるという細胞外究の殆どは水溶性腐植酸かそのモデル化合物アントラキ

電子伝達が起こっていることが明らかにされてきた．フ

ノン- 2,6 -ジスルホン酸( AQDS )を細胞外電子伝達物質

ラビン，AQDS，水溶性腐植酸などの水溶性電子伝達物と し て 用 い た 研 究 で あ っ た( Lovley et al., 1999 )．

質による細胞外電子伝達の場合は，その物質自身が細胞

AQDS を電子供与体として用いた硝酸イオンの脱窒反応内(または細胞膜内)へ取り込まれて電子輸送が起こるの促進( Van Trump et al., 2011 )や，AQDS を電子受容と考えられる( Liu et al., 2018 )が，固体の細胞外電子体として用いたクレゾールの微生物分解の促進伝達物質ではこのメカニズムを想定することは難しい．

( Cervantes et al., 2008 )等が報告されている．一方，地一方，細胞外固体電極と直接電子授受を行う能力を持つ

圏環境では腐植物質の殆どが水に溶けていない形で存在

電気微生物( Geobacter 属や Shewanella 属細菌)では，することから，固体の腐植物質の細胞外電子伝達能が調

導電性繊毛や c 型チトクロームタンパクを介する細胞外べられ，腐植酸は固体でも Geobacter 属細菌の電子受容

電 子 伝 達 メ カ ニ ズ ム が 明 ら か に さ れ て き た( Lovley

体として働き鉄還元反応を促進することが明らかにされ2017 )．しかし，固体腐植ヒューミンの細胞外電子伝達

たが，酸にもアルカリにも不溶の固体腐植ヒューミンにでは，それ自身が固体電極と直接電子伝達の能力を持たは，細胞外電子伝達能が無いと報告された( Roden et

ないと考えられる微生物(Pseudomonas stutzeri 等)でも，

al., 2010 )．この様な状況の中で，我々はペンタクロロ
フェノールの嫌気性脱塩素微生物に関する研究の中で，細胞外電子伝達による還元反応促進が観察( Xiao et al.,2016 )され，固体腐植ヒューミン特有の電子伝達メカ

固体腐植ヒューミンが嫌気性脱塩素菌(おそらくはニズムが想定される．固体腐植ヒューミンの化学構造にDehalobacter 属細菌)に細胞外電子供与体として機能することを見いだした( Zhang & Katayama, 2012 )．更に，関する研究から，その有機画分に含まれるキノン構造お固体腐植ヒューミンの細胞外電子伝達機能によって，難連 性 が 示 唆 さ れ て い る( Pham & Katayama, 2018 )燃性有機ハロゲン化合物の嫌気性脱臭素反応( Zhang et( Fig. 2A)．そこで本研究では，固体腐植ヒューミンを

al., 2013 )，鉄還元反応，アンモニア生成型硝酸還元反応( Zhang et al., 2015b )，および脱窒反応( Xiao et al.,

介した細胞外電子伝達メカニズムの解明へ向け，微生物

2016 )などの幅広い微生物呼吸が促進されることを明

微生物間の細胞外電子共生系を解析するとともに，酸化らかにしてきた．

還元反応の標準電位が還元的な二酸化炭素還元反応や窒よびペプチドグリカン構造の細胞外電子伝達機能への関

群集構造解析によって固体腐植ヒューミンを介した異種

水田や底質の嫌気環境での電子授受に関する共生系と素固定反応に対する固体腐植ヒューミンからの電子供与

して，水素を介した微生物共生系があることが知られての有無を調べ，固体腐植ヒューミン自体の酸化還元電位－ 46 －

化学物質の還元反応に寄与する異種微生物間の固体腐植を介した細胞外電子伝達機構の解明

Fig. 2 Scheme of extracellular electron transfer via humin for different microorganisms with the redox
reaction centers in humin (A) and the redox potentials of humin reported (B) (Pham et al., 2021)

酢酸を電子供与体とする固体腐植ヒューミン依存性嫌気と細胞外電子伝達反応の関係を考察した．

性ペンタクロロフェノール脱塩素微生物群の集積

実験方法

嫌気性条件に保ち乳酸を継続添加してペンタクロロ
フェノール( PCP )脱塩素活性を長期間維持している鎌固体腐植ヒューミンの調製

島土壌を微生物源として用いた( Yoshida et al., 2007 )．

鎌島水田土壌，名古屋大学農場連用圃畑土壌，茨城黒無 機 塩 培 地 A( NH4Cl 1.00 g/L，CaCl2·2H2O 0.05 g/L，

ボク畑土壌，弥富グライ水田土壌，荒子川底質から固体

MgCl2·6H2O 0.10 g/L，K2HPO4 0.4 g/L，NaHCO3 4.00 g/L，

腐植ヒューミンを常法により抽出した( Zhang et al.,

1 mL/L SL-10 微量要素液，1 mL/L セレンータングステ

2015a )．即ち，土壌または底質試料を風乾し 1 mm のふン溶液(Widdel et al., 1983))20 mL を，あらかじめ鎌島

るいでふるった後，100 g の土壌を 150 mL の 2 ％フッ化

土壌由来の固体腐植ヒューミン 1 g を加えておいた 50 mL

水素酸，0.1 M NaOH 水溶液で洗浄した．洗浄は，24 時

嫌 気 培 養 瓶 に 分 注 し た． 窒 素 と 炭 酸 ガ ス の 混 合 気

間振とうし 8,000×g で 15 分遠心分離後，デカンテーショ(N2:CO2=4:1 )を培地中に 45 分間通気し，培地 pH を 7.0

ンすることによって行った．計 10 回の洗浄を行った後，±0.2 に調製した．嫌気培養瓶は，ブチルゴム栓とアル超純水で中性になるまで洗浄し，最終的に pH を 7.0 - 7.5

ミシールで密閉し，121 ℃ 20 分オートクレーブした．

に調製し，凍結乾燥した．

冷却後，ビタミン溶液( Hollinger et al., 1988 )，酢酸ナ
トリウム溶液(最終濃度 10 mM )，PCP 溶液(最終濃度

酸化型・還元型の固体腐植ヒューミンの調製

20 μM )を各 1 mL 加えた．微生物源を 2 mL 接種すると鎌島土壌由来の固体腐植ヒューミンを 0.5 M NaCl 溶

ともに，還元剤として 0.2 mM のトリニトリル酢酸チタ

液 中 に 懸 濁 し， 嫌 気 チ ャ ン バ ー( Coy-7450000, COY,

ン溶液を 100 μL 加えた．暗条件 30 ℃で 2 週間培養してGrass Lake, MI, USA)内に設置した電気化学システム

PCP 脱塩素活性を確認した後，同じ培地に 10 ％の割合

で，酸化および還元を行った．電気化学システムは，ポで植継を行った．これを繰り返して安定な PCP 脱塩素

テンシオスタット(オートマチックポーラリゼーション

微生物群集を得た．

システム HSV-110，北斗電工，大阪)にらせん状にした

PCP およびその脱塩素代謝産物は，トルエン－アセ

白金電極(直径 0.8 mm，長さ 1 m )を作用電極とカウン

ト ニ ト リ ル で 抽 出 し た 後，DB-5ms カ ラ ム( J&W

ター電極として取り付け，また参照電極として Ag/AgCl

Scientific, Folsom, CA, USA )を取り付けたカラムガス

電極(+0.199 V 標準水素電極(SHE)基準)を取り付けたクロマトグラフィー・マススペクトロメトリー(島津ものである．設定した酸化還元電位を 24 時間保って，

QP2010，島津，京都)で定量分析した．

固体腐植ヒューミンが酸化還元平衡に達した後，濾過して減圧乾燥した．
－ 47 －

片

山

新

太

固体腐植ヒューミンを電子供与体とする独立栄養型の二を 置 換 後，2 mL の 微 生 物 群 を 接 種 し， ア セ チ レ ン

酸化炭素還元酢酸生成微生物群の集積

200 μL を加えて暗条件 30 ℃で 1 週間培養した．培養後，上記の酢酸を電子供与体とする嫌気性 PCP 脱塩素微

ヘッドスペース中の残留アセチレンと生成エチレンを水生物群を接種源として，培地中の酢酸ナトリウム濃度を素炎検出器付き島津 GC-14B ガスクロマトグラフ(京都)10 mM から 1 mM に減らして培養し，安定な PCP 脱塩

で定量分析した．培養物中の全窒素量の増加は，培養物

素活性とともに，酢酸ナトリウム濃度が 2 週間の培養中を 105 ℃で乾燥後に CHN アナライザーで元素分析する

1 mM 以下には減少しなくなった．そこで，更に酢酸ナ

ことによって評価した．

トリウムの添加をやめて植継を繰り返し，最終的に固体

固体腐植ヒューミン無添加培地で集積した微生物群を腐植ヒューミンを電子供与体とする二酸化炭素還元嫌気用いて各種因子の影響を調べた．酸化型・還元型の固体

性酢酸生成微生物群を得た．この嫌気性酢酸生成微生物

腐 植 ヒ ュ ー ミ ン の 影 響 は，MNDA 培 地 の 緩 衝 液 を

群を，固体腐植ヒューミンの有無，炭酸イオンの有無，

CaCO3 から 30 mM HEPES に変えたマンニトールを含ま接種源の有無，で組み合わせた条件で培養し，0 日，5 日，ない培地で集積微生物群を洗浄後，30 ℃で 2 週間飢餓培

10 日，15 日後に酢酸の生成状況を調べ，固体腐植ヒュー

養し，マンニトールを含まない MNDA HEPES 培地中でミンが電子供与体，二酸化炭素が炭素源となっているこ

窒素固定活性を調べ，酸化型・還元型の固体腐植ヒューとを確認した．

ミンの効果を評価した．窒素固定活性は，アセチレン還

有機酸の定量は，逆相カラム( Puresil C18，Waters,

元活性と窒素量の増加の二つの方法で評価した．また，Milford, MA, USA )を取り付けた高速液体クロマトグラ

窒素固定活性に対する異なる固体腐植ヒューミンの影フ(島津 LC-10AT，京都)で行った．溶離液には 0.1 ％響，微量要素( SL-10，Widdel et al., 1983 )およびビタリン酸溶液を用いた．培地試料は，孔径 0.2 μm のメン

ミ ン( Hollinger 1988 ) の 影 響， 還 元 剤 の 種 類 の 影 響

ブ レ ン フ ィ ル タ ー( OmniporeTM, Merck, Darmstadt,( 15 mM Na2S, 1.7 mM L -システイン塩酸塩，0.025 mM ト

Germany )を通したものを用いた．ヘッドスペース中

リニトリル酢酸チタン)を，アセチレン還元活性に対すの H2 ，CO2 ，CH4 はモレキュラーシーブ 5A カラムを付る影響により評価した．

けた熱伝導度検出器およびポラパック Q をつけた水素
炎検出器からなる島津 14B ガスクロマトグラフ(京都)で定量分析した．

Pseudomonas stutzeri を用いた脱窒試験
無処理，または酸化型( +615 mV，SHE 基準)，還元型(－400 mV，SHE 基準)に調製した鎌島土壌由来の固嫌気性窒素固定微生物群の集積と窒素固定活性試験

体腐植ヒューミンを 0.15 g ずつ 50 ml 容の嫌気培養瓶に鎌島土壌を接種源とし，窒素欠乏 Ashby 培地( Ashby,

入 れ， 静 菌 培 地(Na2HPO4 4.58 g/L, NaH2PO4 2.13 g/L，

1907 ) を 改 変 し た MNDA 培 地 を 用 い て 集 積 し た．

KCl 0.13 g/L, SL-10 溶液 1 ml/L, セレン－タングステン

MNDA 培 地 の 組 成 は， マ ン ニ ト ー ル 20 g/L，K2HPO4溶液 1 ml/L(Widdel et al., 1983)，ビタミン溶液 1 ml/L

0.2 g/L ，MgSO4・7H2O 0.2 g/L ，NaCl 0.2 g/L ，K 2SO4

(Hollinger et al., 1988 )，レサズリン溶液 1 ml/L)を 10 ml

0.1 g/L，CaCO3 5 g/L である．50 mL 容の嫌気培養瓶にずつ分注し，ブチルゴム栓とアルミシールで密閉した後，20 mL の培地を分注し，窒素ガスをバブリングしてブチ

N2 を培地中に吹き込んで嫌気状態にした．LB 培地で培

ルゴム栓とアルミシールで密閉し，オートクレーブ後，養した Pseudomonas stutzeri JCM 20778 株を 20,000 g で 15

ヘッドスペースを窒素ガスで再度置換し嫌気性条件とし分遠心分離し，静菌培地で 3 回洗浄した後，JCM 20778

た．固体腐植ヒューミン添加培地では，あらかじめ 0.3 g

株の懸濁液を注射器で 0.5 ml ずつ嫌気培養瓶中の静菌培の固体腐植ヒューミンを添加しておいた．固体腐植地に接種し，最終菌体密度を菌体数 1.6×1011 個/60 ml

ヒューミン添加培地と無添加培地の 2 種類を用い，暗条とした．更に嫌気培養瓶のヘッドスペースの 5 ml を，件下 30 ℃で培養した．当初 4 週間のインターバルで植

ガスタイトシリンジを用いてアセチレンと置換した(ア

継いだが，11 世代目からは 2 週間のインターバルとした．

セチレンは亜酸化窒素の窒素への変換を防ぐ阻害剤とし窒素固定活性は，アセチレン還元活性試験とケルダーて加えた)．0.1N NaNO3 を 0.4 ml ずつ(0.4 mmol/容器)

ル窒素定量の 2 種類の方法で評価した．アセチレン還元

入れて 30 ℃ 80 rpm で 7 日間，振盪培養した．培養後，活性試験は，窒素固定酵素が構造類似のアセチレン還元

イオンクロマトグラフィー(メトロームジャパン，東京)

反応を起こしてエチレンを生成することを利用した簡便で硝酸イオンと亜硝酸イオンを定量氏，電子捕獲型検出

な活性試験である( Hardy et al., 1973 )．あらかじめヘ

器付きガスクロマトグラフィー( GC-2014，島津，京都)

リ ウ ム で バ ブ リ ン グ し た MNDA 培 地 2 mL を 加 え た

で亜酸化窒素ガスを定量した．また，無処理の固体腐植

10 mL 容の嫌気性培養瓶に，ヘリウムでヘッドスペース

ヒューミンの実験時の酸化還元電位を上述した電気化学－ 48 －

化学物質の還元反応に寄与する異種微生物間の固体腐植を介した細胞外電子伝達機構の解明システムで測定した．なお，Pseudomonas stutzeri JCM
20778 株は，文部科学省ナショナルバイオリソースプロ

Shewanella 属 細 菌 ) は 検 出 さ れ な か っ た( Zhang &Katayama, 2012 )ので，Geobacter 属細菌の生育しやす

ジェクトを介して，国立研究開発法人理化学研究所バイ

い酢酸を電子供与体として用いて集積培養を行い，次世代シークエンサーによる 16S rRNA 遺伝子を解析した

オリソース研究センターから提供された．

( Fig. 3 )．集積した微生物群は，主にプロテオバクテ
微生物群集構造解析

リ ア 門( 36 ％)， フ ァ ー ミ キ ュ ー テ ス 門( 38 ％)， バ

微生物群集構造は，16S rRNA 遺伝子の V3 -V4 領域をクテロイデテス門( 21 ％)で構成されていた．プロテPCR 増幅してシークエンスを調べることによって解析

オバクテリア門の殆どは Azospira 属であった．ファー

した．プライマーとして，Pro341F(5’- CCT ACG GGN

ミ キ ュ ー テ ス 門 は 主 に Lachnospiraceae 科( 7.3 ％)，BGC ASC AG-3')と Pro805R(5'- GAC TAC NVG GGTATC TAA TCC-3')を 用 い た(Takahashi et al., 2014)．

Ruminococcaceae 科( 5.4 ％)，またバクテロイデテス門の殆どは，Bacteroides 属であった．固体腐植ヒューミン

PCR 反応には，5 µL テンプレート DNA(5 ng/µL)，2.5 µL

酸化細菌で且つ嫌気性脱塩素細菌と考えられる

Pro341F と Pro805R プライマー(各 2 µM)，および 12.5 µL

Dehalobacter 属が微生物群集の 3 ％を占めたのに対し，KAPA HiFi HotStar t Ready mix(KAPA Biosystems,
Wilmington, MA, USA)を用いた．PCR 増幅反応は，以Geobacter 属は 0.3 ％に過ぎなかった．電子の流れ(エネルギーの流れ)の上流に位置する固体腐植ヒューミン還下の様に行った．初期活性化を 94 ℃ 30 秒，次に 94 ℃

元菌の方が，下流となる固体腐植ヒューミン酸化菌より10 秒，60 ℃ 30 秒，72 ℃ 30 秒を 10 サイクル，更に 94 ℃も優占すると考えられるので，Geobacter 属細菌は主要

10 秒，59 ℃ 30 秒，72 ℃ 30 秒を 10 サイクル，また更にな固体腐植ヒューミン還元菌では無いものと推定された．

94 ℃ 10 秒，58 ℃ 30 秒，72 ℃ 30 秒 を 10 サ イ ク ル， そまた，嫌気性条件下では水素を介した共生系が，しばしして最終の延長反応を 72 ℃ 4 分行った．PCR 増幅 DNA

ばみられるが，この PCP 脱塩素微生物群に水素を電子

は，AMPure XP kit(Beckman Coulter Genomics Inc.,供与体として加えても固体腐植ヒューミン無しでは脱塩

Brea, CA, USA)を用いてメーカーの指示に従って純化し素反応が起こらなかった．更に還元型ヒューミンを加えた．PCR 増幅は，1 ％アガロースゲル電気泳動で確認しると，水素添加無しの条件で脱塩素反応が進んだ(Zhang

た． 純 化 DNA の 濃 度 を，QuantiFluor dsDNA System& Katayama, 2012 )ことから，脱塩素反応の電子供与体(Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA)で 測 定 し，Miseq reagent kit v3(600 cycle, Illumina Inc., San Diego,
CA, USA)を用いた Miseq プラットホームでシークエン
ス し た． 各 リ ー ド の 基 本 シ ー ク エ ン ス に 対 し て，
USEARCH v6.1( Edgar, 2010 )を用いてキメラチェック
を 行 っ た．QIIME 2( Bolyen et al., 2019 ) を 用 い て，
97 ％以上の類似度の DNA 配列を持つものをオペレー
ショナル分類単位(OTU )としてクラスター解析を行い，Green-gene データベース(ver. 13_8)を参照して，分類学的位置を決定した( McDonald et al., 2012 )．

結果および考察
酢酸を電子供与体とする脱塩素微生物群の解析
固体腐植ヒューミンによって PCP の嫌気性脱塩素反応が促進される系では，電子供与体としてギ酸を用いて固体腐植ヒューミンを最終電子受容体として還元する微生物と固体腐植ヒューミンを電子供与体として用い PCP
を最終電子受容体とする嫌気性脱塩素菌( Dehalobacterと推定される)の異種微生物間の細胞外電子伝達が起こる( Fig. 2A )．これまで，クローニングによる解析ではペンタクロロフェノール脱塩素微生物群中に，固相の電
極 に 電 子 授 受 で き る 電 気 活 性 微 生 物( Geobacter 属，Fig. 3 Microbial community structure of humin-dependent
pentachlorophenol-dechlorinating anaerobic consortium,
based on 16S rRNA gene sequence. "Others" include
phyla with relative abundance less than 0.5 ％, namely
Spirochaetes, Crenarchaeota, Cyanobacteria, Actinobacteria, OD1, SAR406, and Thermotogae. (Modified from
Laskar et al., 2019)－ 49 －

片山は固体腐植ヒューミンであると結論づけられる．以上の

新太-300 mV ～ +40 mV( SHE 基準)にあり，例外的なものことから，この PCP 脱塩素集積微生物群では，以下のよを含めると -400 mV ～ +275 mV( SHE 基準)の範囲に

うな異種微生物間で固体腐植ヒューミンを介した細胞外あることが報告されている( Fig. 2B )．従って，ギ酸ま

電子授受が行われていたものと考えられる．まず，このたは酢酸の酸化を行う嫌気性菌から，固体腐植ヒューミ

微生物群集の中で主要なプロテオバクテリア門

ンに電子供与が起こり，次いで，固体腐植ヒューミンか( Azospira 属)，ファーミキューテス門( Lachnospiraceae

ら脱塩素微生物へ電子供与が起こって PCP が脱塩素さ

科 や Ruminococcaceae 科 )， バ ク テ ロ イ デ テ ス 門れるという細胞外電子の流れは，物理化学的に妥当であ( Bacteroides 属)の全部または一部が酢酸をエネルギーると考えられる．なお，ギ酸を用いた PCP 脱塩素微生源として固体腐植ヒューミンを最終電子受容体として還物群の活性に比べ，酢酸を用いたものは，活性が弱かっ

元し，次に還元型固体腐植ヒューミンに蓄積された細胞た．これは，ギ酸酸化の標準電位が，－425 mV( SHE 基

外電子を Dehalobacter 属が利用して固体腐植ヒューミン

準)であるのに対し，酢酸の場合は－290 mV( SHE 基準)

を酸化するとともに，PCP を脱塩素したものと推定さで，還元力が低いことも要因として考えられる．

れる．これらのいずれの菌も，これまで電気活性は報告
されていないことから，固体腐植ヒューミンは非電気活

固体腐植ヒューミンを電子供与体とする二酸化炭素還元性微生物の電気共生系を可能とするものと考えられた．

−酢酸生成微生物群の集積と解析

更なる固体腐植ヒューミン還元菌の特定とその解明に

固体腐植ヒューミン以外に電子供与体の無い条件下，は，固体腐植ヒューミン還元菌を特異的に集積する系を二酸化炭素( CO2 )を還元して酢酸を生成する嫌気微生

構築して解析することが必要と考えられた．

物群を集積した．酢酸以外の有機酸(ギ酸，プロピオン

細胞外電子の流れを反応電位に基づいて考察した．

酸，乳酸など)は検出されなかった．培地中に共存する

PCP の脱塩素反応の標準電位は，+333 mV よりも高い

PCP の 脱 塩 素 反 応， お よ び メ タ ン 生 成 が 見 ら れ た．

( Table 1 )こと，および鎌島土壌由来の常法で調製した

Fig. 4 に，培養期間中の酢酸生成を示す．固体腐植ヒュー

固 体 腐 植 ヒ ュ ー ミ ン の 酸 化 還 元 電 位 は，-100 mV ～ミン，CO2/HCO3- ，集積微生物群の接種がそろった条+100 mV 程度の範囲にある( Zhang & Katayama, 2012 )．

件では，20 mL 培養液あたり(培養瓶あたり)12 μmol

またこれまでサイクリックボルタンメトリ測定で推定さの酢酸が 15 日間で生成した．CO2 /HCO3- を添加しなかっれた固体腐植ヒューミンの酸化還元電位は，多くがた条件では 10 日まで酢酸生成が見られなかった．このTable 1 Redox potentials of reactions－ 50 －

化学物質の還元反応に寄与する異種微生物間の固体腐植を介した細胞外電子伝達機構の解明

Fig. 4 Autotrophic reductive acetogenesis in the consortiumwith humin as electron donor under the conditions withhumin, CO 2/HCO 3- and acetogenic consor tium (□),
under the conditions without addition of CO2/HCO3- (■),
under the condition without humin (◇), and under thecondition only with medium (△). (Modified from Laskar
et al., 2020)

ことは，酢酸生成が CO2 /HCO3- を還元して生成したものであること示している．CO2 /HCO3- を添加しなかった条件でも 15 日後に酢酸生成が見られたのは，植継にFig. 5 Microbial community structure of autotrophic acetateproducing consor tium with humin as electron donor,
based on 16S rRNA gene sequence. The data shows theaverage of four replicates. "Others" denotes the populations
less than 0.5 ％ abundance. "Unassinged" represents thegenes that were not assigned to any taxonomic positionby blast sequencing. (Modified from Laskar et al., 2020)

よる CO2/HCO3- 持ち込みのためと考えられる．固体腐植ヒューミンの無い場合は，殆ど酢酸生成が見られな
かった．また微生物接種無しの条件では，酢酸生成は見テス門が優占することは，WL 経路の多くがファーミられなかった．以上のことから，固体腐植ヒューミンがキューテス門に検出される( Ragsdale & Pierce, 2008 )電子供与体として酢酸生成に必須であることが示された．

こととよく一致している．Clostridiales 目に含まれる主二酸化炭素を還元して酢酸生成を行う生化学反応は，

要 な 微 生 物 は，Lachnospiraceae 科( 21.6±1.3 ％) と

Wood-Ljundahl 経路( WL 経路)として知られている．
その経路で働く formyltetrahydrofolate synthase をコー

Ruminococcaceae 科( 16.4±0.7 ％)であった．
今回用いた固体腐植ヒューミンは，抽出したものをそドする遺伝子がこの微生物群に含まれることを，特異的のまま用いたものである．これまで報告された固体腐植

プライマー( Henderson et al., 2010 )を用いた PCR 増幅

ヒューミンの酸化還元電位は，-300 mV ～ +40 mV の範により確認した．また，この集積した酢酸生成微生物群

囲のものが殆どで( Fig. 2B )，それよりも還元的な固体に一酸化炭素( CO )を添加すると，酢酸生成が固体腐

腐植ヒューミンは，河川底質などの還元的環境から得ら

植ヒューミン存在下でのみ観察された．CO は，WL 経

れたものに限られている( Pham et al., 2021 )．鎌島土路で必須の Carbon monoxide dehydrogenase/acetyl-CoA

壌から常法により抽出した固体腐植ヒューミンの酸化還synthase 複合体の基質である．この点からも，酢酸生成

元電位は，-100 mV ～ +100 mV 程度の範囲にある(Zhang

における固体腐植ヒューミンへの依存性が示された．一方で，CO 添加時のメタン生成量は固体腐植ヒューミン& Katayama, 2012 )．PCP の脱塩素反応の場合は，その標準電位が > +300 mV である( Table 1 )ことから，固の有無によって影響を受けなかった．CO/CO2 の標準電体腐植ヒューミンが脱塩素反応の電子供与体となること

位 は -520 mV( SHE 基 準 ) と 低 い( Schuchmann &は，物理化学的に妥当であることは上述した通りである．

Müller, 2014 )ためと考えられる．

一方，CO2 を還元して酢酸を生成する反応の標準電位はFig. 5 に，この酢酸生成微生物群の群集構造を示した．

-290 mV( Table 1 )であり，固体腐植ヒューミンの持つClostridiales 目(ファーミキューテス門)が全体の 71.8
±2.5 ％に達した．次いで，Bacteroidales 目(バクテロ電位よりも，より還元的な電位である．また，副生成物

イ デ テ ス 門，11.8±2.2 ％)，Rhodocyclales 目( β プ ロ テ-240 mV( Table 1 )であって，固体腐植ヒューミンの電オバクテリア門 9.2±1.5 ％)であった．WL 経路による位よりも還元的な電位である．WL 経路を有する酢酸生

酢酸生成を行うこの酢酸生成微生物群にファーミキュー

成菌は，CO2 還元に必要とされる高度な還元条件を細胞としてメタン生成も観察されたが，その標準電位も－ 51 －

片

山

新

太

内の酸化還元分岐反応によって生成できることが知られを添加したヒューミン添加集積群集と，無添加の無添加ているが，それでも CO2 還元からの酢酸生成における集積群集の 2 種類の窒素固定微生物群を集積した．アセ

電 位 は，Acetobacterium woodii で 報 告 さ れ た -340 mV

チレン還元活性および窒素含量変化を用いて，窒素固定( SHE 基 準 ) が 限 界 と 考 え ら れ て い る( Bar-Even,

活性に対する鎌島土壌由来の固体腐植ヒューミンの効果

2013 )．そのため，一見，物理化学的にあり得ない反応を調べたところ，Fig. 6A に示すように，ヒューミン添にみえるが，固体腐植ヒューミンの酸化還元官能基の電加集積群集および無添加集積群集ともに，固体腐植

位は不均一であることも指摘されており( Pham et al.,ヒューミン添加によってアセチレン還元活性が高まっ

2021 )，高度に還元された固体腐植ヒューミンの酸化還た．特に，ヒューミン添加集積群集は，窒素含量を大き

元官能基が一部に存在し，酢酸生成菌の電子供与体とく増加させた(対照条件の 342 ％，Fig. 6B )．無添加集

なったものと想像される．

積群集では，この増加は対照条件の 127 ％であった．
ヒューミン添加集積群集における促進効果が固体腐植

固体腐植ヒューミンによる嫌気性窒素固定微生物群の窒ヒューミンによる化学反応で無いことは，接種無しの条素固定促進

件では窒素含量の増加が見られないことから明らかであ窒素を殆ど含まずマンニトールを炭素源とする嫌気性

る．次に，アセチレン還元活性を指標に，異なる由来の

MNDA 液体培地を用い，培地中に固体腐植ヒューミン

固体腐植ヒューミン(名古屋大学付属農場畑土壌，茨城

Fig. 6 Promotion of nitrogen fixation of consortium in a nitrogen-deficient medium: (A) Acetylene
reduction activity of no-humin consortium (enriched without humin) and humin consortium(enriched with humin). Activity test was carried out under the conditions with (+) and without (-)
humin for both consortia. (B) Changes in the relative total nitrogen content in the cultures underfour conditions during 14 days of incubation: humin consortium, no-humin consortium, humin
only and control (medium only as 100 ％). (Reproduced from Dey et al., 2021)－ 52 －

化学物質の還元反応に寄与する異種微生物間の固体腐植を介した細胞外電子伝達機構の解明

黒ボク畑土壌，弥富グライ水田土壌，荒子川底質)を用群集ともアセチレン還元活性が高まったが，そこに固体いて無添加集積群集に対する効果を試験したところ，い腐植ヒューミンを添加すると更にアセチレン還元活性がずれの固体腐植ヒューミンも窒素固定促進効果を示し高まった．このことは，微量要素およびビタミン類によた．また，固体腐植ヒューミン自体が培養液を還元的雰る窒素固定促進効果と固体腐植ヒューミンによる窒素固囲気にしているだけの可能性も考えられたため，還元試

定効果が異なることを示している．

薬として Na2S，システイン塩酸塩，トリニトリロ酢酸

固体腐植ヒューミンの窒素固定促進効果が，細胞外電チタン( III )を，無添加集積群集に添加して効果を調子伝達によるものであることを調べるために，電気化学

べたところ，還元試薬を添加すると，むしろアセチレン

的に酸化還元した固体腐植ヒューミンを調製して，炭素還元活性が低下した．従って，固体腐植ヒューミンが還源無しの条件下，無添加集積群集(洗浄後に飢餓培養し元剤として機能している可能性は否定された．また，固たもの)に添加して影響を調べた．Fig. 7A に示すよう

体腐植ヒューミンが微量要素の供給源となっている可能にアセチレン還元活性は，抽出したままの固体腐植性を調べるために，MNDA 液体培地に微量要素 SL-10

ヒューミン(以下，無処理ヒューミン)や酸化型の固体

溶液とビタミン溶液を添加し，その効果をヒューミン添

腐植ヒューミン( +400 mV，SHE 基準，以下，酸化型

加集積群集，無添加集積群集の両方で調べた．微量要素

ヒューミン)を添加した系では活性が全く見られなかっおよびビタミン溶液が添加されることによって，両集積

たが，還元型の固体腐植ヒューミン( -400 mV，SHE 基

Fig. 7 Effect of humin with different redox potentials. (A) Acetylene reducing activity of the no-humin consortium(enriched without humin) tested with reduced, oxidized, and intact humin and without humin. Humin (Kamajima
humin) concentration was set at two levels shown by "1 x" and "2 x", indicating 15 g/L and 30 g/L, respectively.
ND denotes not detected. (B) Effect of humin preparation on the nitrogen fixation activity of the no-humin consortium, tested using reduced, oxidized, and intact humin, as shown by the change in the relative nitrogen content
during 14 days of incubation. Gray bars denote the nitrogen content at 0 day (100 ％) and black bars denote thoseafter 14 days of incubation. (Reproduced from Dey et al., 2021)－ 53 －

片山

準，以下，還元型ヒューミン)を添加した系ではアセチ

新太

群集構造を示す．ヒューミン添加集積群集では，ファーレン還元活性がみられ，その活性は添加量に比例して増ミキューテス門が 73 - 77 ％を占めた．Clostridiales 目に属加した．また，窒素含量の変化をみると，還元型ヒュー

する Clostridium 属，Ruminococcus 属，Oxobacter 属が主

ミンを加えた条件でのみ窒素含量の増加が見られたであった．他の Clostridiales 目として，Desulfocporosinus( Fig. 7B )．このことから，固体腐植ヒューミンによる

属，Ethanoligenens 属，Coprococcus 属，Oscillospira 属，

窒素固定促進効果は，固体腐植ヒューミンが炭素源とCaloramator 属が検出された．Clostridiales 目以外には，なっているのでは無く，細胞外電子伝達による効果であ

Sporolactobacillus 属( Bacillales 目 )，Phylobacterium 属(Rizobiales 目)，Sphingomonas 属(Sphingomonadales 目)，

ることが明らかとなった．窒素固定の標準酸化還元電位
は，－278 mV とされている( Table 1 )．また，各種の水
溶性細胞外電子伝達物質を用いてニトロゲナーゼ酵素のRalstonia 属( Burkholderiales 目)が数パーセントを占めた．アーキア(殆どは Methanobacterium )が 22 - 26 ％活性化を行った実験では，－360 mV( SHE 基準)よりもを占め，ヒューミン添加集積群集の特徴となっていた．

還元的な酸化還元官能基を持つ水溶性細胞外電子伝達物

無 添 加 集 積 群 集 は 殆 ど バ ク テ リ ア か ら な っ て お り，

質のみが窒素固定を促進したことが報告されている

ファーミキューテス門，特に Clostridiales 目に属する( Badalyan et al., 2019 )．ここでは，還元型ヒューミン
は－400 mV( SHE 基準)で調製したことから，固体腐植

Clostridium 属，Pelosinus 属，Ruminococcus 属が 96 ％を占 め た． 他 に 小 数 で は あ る が，Sporolactobacillus 属

ヒューミンから窒素固定菌への電子供与反応は，物理化( Bacillales 目)，Methylobacterium 属，Mesorhizobium 属，学的に妥当であったと考えられる．

Phyllobacterium 属(以上，Rhizobiales 目)，Sphingomonas
属( Sphingomonadales 目)，Pelomonas 属，Ralstonia 属，Fig. 8 にヒューミン添加集積群集と無添加集積群集のFig. 8 Microbial community structures of the no-humin and humin consortia based on 16S rRNA genesequencing. The data shows the community structures of two replicates (G1 and G2) of the consortia,
individually. "Others" denotes the taxonomic groups with less than 0.02 ％ abundance. (Modified from
Dey et al., 2021)－ 54 －

化学物質の還元反応に寄与する異種微生物間の固体腐植を介した細胞外電子伝達機構の解明

Burkholderia 属，Curvibacter 属，Salinispora 属( 以 上，は，全く硝酸還元反応が進まず，固体腐植ヒューミンと

Burkholderiales 目)が見られた．アーキアは，0.02 ％しか検出されなかった．Clostridium 属および Ruminococcus

P. stutzeri の両方があるときのみ硝酸還元反応が進んだ．
還元型ヒューミンと無処理ヒューミンを加えた条件では，属は両方の集積群集で主要微生物として検出された．両亜硝酸イオン( NO2- )，亜酸化窒素ガス( N2O )が検出

集 積 群 集 に 共 通 し て 見 ら れ た，Methanobacterium 属，されたが，酸化型ヒューミンを加えた条件では，NO2-

Clostridium 属，Desulfosporosinus 属，Ethanoligenens 属，だけが少量検出された．硝酸還元量を比較すると，還元

Pelosinus 属，Sporolactobacillus 属，Methylobacterium 属，型ヒューミン＞無処理ヒューミン＞酸化型ヒューミンのMesorhizobium 属，Phyllobacterium 属，Sphingomonas 属，順となった．Table 1 の式に従って，固体腐植ヒューミン

Pelomonas 属，Ralstonia 属は，窒素固定遺伝子の系統樹
でクラスター I，II，III にまたがる窒素固定菌である．

から P. stutzeri に供給された細胞外電子量を推定すると，これらの一部または多くの窒素固定菌が，固体腐植

ミンは 355 μEq/g，無処理ヒューミンは 258 μEq/g，酸化ヒューミンから細胞外電子を受け取ることによって窒素型ヒューミンは 7 μEq/g となった．硝酸還元反応の標準固定を促進したものと考えられる．また，一方，主要微

電 位 は，NO3-/NO2- が +433 mV( SHE 基 準 )，NO2-/NO

固体腐植ヒューミン 1 g 当たり，それぞれ還元型ヒュー生物群の中にはマンニトールを利用して固体腐植ヒューが +350 mV( SHE 基 準 )，NO/N2O が +1175 mV( SHE

ミンを還元する微生物も存在したはずである．10 ％以基準)である(Table 1 )．これに対して，固体腐植ヒュー上を占める主要微生物として検出された Ruminococcus

ミンは還元型ヒューミン -400 mV( SHE 基準)，酸化型

属細菌は，窒素源としてオリゴペプチド，アンモニア，

ヒューミン( +615 mV( SHE 基準)で調製したものと，尿素を利用する事が報告されている( Kim et al., 2014 )無 処 理 ヒ ュ ー ミ ン の 酸 化 還 元 電 位 測 定 値 は +367 mVが，窒素固定能があることは報告が無い( Vos et al.,( SHE 基準)であった．従って，還元型ヒューミンは，

2009 )．これらのことは，Ruminococcus 属がマンニトー

NO3- から N2O までの 3 反応のいずれの標準電位よりもルをエネルギー源とする固体腐植ヒューミン還元微生物

還元的な状態にあるので，N2O 生成は物理化学的に妥当の一つであることを示唆している．他の窒素固定菌の生と考えられた．一方，無処理ヒューミンは，2 段階目の成するアンモニアを窒素源として利用して増殖したもの

NO2-/NO 反応よりも酸化的状態にあるので，硝酸還元反と考えられる．これまで，Geobacter 属細菌を除き，窒応は NO2- で止まることが予想されたが，N2O 生成が見ら

素固定菌の多くは電気活性微生物として報告されていなれた．更に，酸化型ヒューミンは，はじめの NO3-/NO2-

い．PCP 脱塩素微生物群と同様に，嫌気性窒素固定微の反応の標準電位より酸化的状態にあるので，全く反応生物群でも，固体腐植ヒューミンは非電気活性微生物間が進まないものと予想されたが，少量ではあるが NO2-の細胞外電子伝達を可能としているものと推定される．

を生成した．24 時間の電気化学処理では，まだ十分にヒューミン添加集積群集と無添加集積群集の間で，共酸化しきれない反応部位が残っており，P. stutzeri に電通する微生物種が多く見られたこと，無添加集積群集で子供与したものと考えられる．このことはまた，固体腐も固体腐植ヒューミン添加によって窒素固定促進が見ら

植ヒューミンには細胞外電子伝達物質として酸化還元電れたことは，固体腐植ヒューミンによって窒素固定促進位の異なる部位が存在しており，多様な微生物反応に対する窒素固定菌は，固体腐植ヒューミンを用いて集積しして電子供与していることを示唆している．この多様ななくても得られることを示唆している．固体腐植ヒュー

酸化還元部位を示唆する結果は，二酸化炭素還元－酢酸

ミンと電子授受を行う微生物の分離は，固体腐植ヒュー

生成微生物群でも観察された固体腐植ヒューミンが平均

ミンの無い条件で増殖させることによって分離すること

的酸化還元電位では，反応が説明できなかったこととよが困難なことが理由で難しいと考えられてきたが，このく一致している．細胞外電子伝達機構を調べる上で，固結果は，細胞外電子を利用できる窒素固定菌の分離をす

体腐植ヒューミンの不均一性の取り扱いが課題であるこる際には，固体腐植ヒューミンの無い条件で増殖させてとが示された．

も固体腐植ヒューミンの細胞外電子を利用できる菌の取要得が可能であることを示唆しており，今後，分離株を用いた研究が期待される．

約

固体腐植ヒューミンと微生物の間での細胞外電子伝達
Pseudomonas stutzeri を用いた硝酸還元試験
静菌培地で固体腐植ヒューミンを電子供与体とする条件で，P. stutzeri JCM 20778 株を 7 日間培養した．固体腐植ヒューミン無し，または P. stutzeri 接種無しの条件でメカニズムを，嫌気性 PCP 脱塩素微生物群，CO2 還元－
酢酸生成微生物群，嫌気性窒素固定微生物群，硝酸還元
Pseudomonas stutzeri を用いて検討した．微生物群集の
16S rRNA 遺伝子に基づく群集構造解析から，以下の様な－ 55 －

片

山

新

太

Fig. 9 Energy network in anaerobic microbial world based on extracellular electron transfer via humin,a solid-phase humic substance

固体腐植ヒューミンを介した異種微生物間の細胞外電子伝研究では E 0 ' が －250 mV よりも還元的な反応である CO2

達系が推定された( Fig. 9)．嫌気性 PCP 脱塩素微生物群

還元－酢酸生成反応，嫌気性窒素固定反応に対しても，

で は，Azospira 属，Lachnospiraceae 科，Ruminococcaceae

固体腐植ヒューミンから電子供与して微生物反応を支科，Bacteroides 属に属する全部または一部の細菌が，酢持・促進できることが新たに明らかとなった．固体腐植

Dehalobacter 属酸を利用して固体腐植ヒューミンを還元し，ヒューミンの細胞外電子伝達に基づく嫌気微生物生態系

細菌が，還元型ヒューミンの細胞外電子を利用(ヒューでのエネルギーネットワークに，より還元的な反応も含ミン酸化)し，且つ PCP 脱塩素反応を起こしたものとまれることが明らかとなった( Fig. 9 )．一方，CO2 還推定された．CO2 還元－酢酸生成微生物群では，固体腐

元－酢酸生成反応および硝酸還元反応に関する研究で，植ヒューミンを唯一のエネルギー源とする条件で，優占

固体腐植ヒューミンの平均酸化還元電位よりも還元的なする Lachnospiraceae 科，Ruminococcaceae 科に属する細E0 ' を持つ反応に対しても，固体腐植ヒューミンから当菌が酢酸生成を行ったと推定された．窒素固定微生物群

該微生物に対して電子供与が起こることが見いだされでは，Ruminococcus 属細菌がマンニトールを利用してた．このことから，固体腐植ヒューミンは，酸化型から

固体腐植ヒューミンを還元し，Clostridium 属細菌を主還元型にわたる広い酸化還元電位を有する多様な部位をとする嫌気性窒素固定微生物群が還元型固体腐植ヒュー持つことが示唆された．固体腐植ヒューミンの酸化還元

ミンの細胞外電子を利用して窒素固定活性を高めていた電位の不均一性を明らかにする研究を実施することが必ものと推察された．Pseudomonas stutzeri は，固体腐植要である．また，固体腐植ヒューミン添加条件と無添加

ヒューミンを細胞外電子源として利用して脱窒反応を行条件で集積した窒素固定微生物群の群集構造がよく似てう事が明らかとなった．以上の様に多様な異種微生物間

いたこと，および固体腐植ヒューミンの添加によって両での固体腐植ヒューミンを介した細胞外電子授受が推定

微生物群とも窒素固定反応を促進した事から，固体腐植

されたが，これらの微生物の殆どは，これまで細胞外電

ヒューミンの無い条件で得られた嫌気性窒素固定菌も固子伝達能の知られていない非電気活性微生物である．固体腐植ヒューミンの細胞外電子を利用できる事が示さ

体腐植ヒューミンが，非電気活性微生物間の細胞外電子れ，固体腐植ヒューミン利用細菌の分離の可能性が明ら伝達物質として機能している可能性が高く，今後の研究かとなった．P. stutzeri に加えて，新たな分離株の取得

によって新規な細胞外電子伝達機構の解明が期待される．

によって，固体腐植ヒューミンの細胞外電子伝達機構のこれまで固体腐植ヒューミンの細胞外電子伝達では，研究の進展が期待される．
また一方で，固体腐植ヒューミンを電気化学的に還元

E0(' 標準反応電位，pH = 7，標準水素電極( SHE )基準)がプラス側にある嫌気的脱ハロゲン反応，硝酸還元反応，して微生物へ細胞外電子を連続的に供給するシステム

鉄還元反応に対する電子供与反応が知られていたが，本(生物電気化学システム)を開発することによって，多－ 56 －

化学物質の還元反応に寄与する異種微生物間の固体腐植を介した細胞外電子伝達機構の解明

様な環境浄化・物質生産技術への応用が期待される．本2019. Acceleration of biological nitrogen fixation using
humin as exter nal electron mediator, Inter national
Conference on Materials and Systems for Sustainability
2019 (November 1-3, Nagoya, Japan)
8) Laskar, M., Awata, T., Kasai, T. & Katayama, A. 2019.
Carbon-dioxide fixation by humin-dependent mixed consortium exercises humin's alternate functionality in electrontransfer, International Conference on Materials and Systems
for Sustainability 2019 (November 1-3, Nagoya, Japan)9) 笠井拓哉，ラスカーマハスウェタ，粟田貴宣，片山新太．2020．固体腐植ヒューミンによる生物学的CO2固定・資源化反応の促進，日本農芸化学会2020年度大会 (3月25-28日，福岡 + Online)
10) Dey, S., Kasai, T. & Katayama, A. 2020. Promotion of biologicalnitrogen fixation using extracellular electron mediator –Humin, The Water and Environment Technology Conference,
WET2020-online (November 7-8, Online)
11) Katayama, A. 2021 Humin, an insoluble fraction of humic
substances, as a key extracellular electron mediator inanaerobic microbial world, Vebleo webinar 2021 on
Materials Science, Engineering and Technology online(March 20, Online)
12) 笠井 拓哉，ラスカー マハスウェタ，片山 新太．2021．固
体腐植物質による生物学的二酸化炭素資源化反応の促
進，日本農芸化学会2021年度大会(3月18-21日，仙台＋
Online)13) Pham D.M., Kasai, T. & Katayama, A. 2021. How do solidphase humic substances （humin） ser ve as extracellularelectron mediator in multiple anaerobic microbial reactions?
日本農芸化学会2021年度大会(3月18-21日，仙台＋Online）
14) Dey S., Kasai T. & Katayama A. 2021. Promotion of nitrogenfixation activity of diverse heterotrophic diazotrophs by
supplying extracellular electrons from humin, a solid-phase
humic substance. 日本農芸化学会2021年度大会(3月18-21
日，仙台＋Online)

研究で用いた微生物(群)を例とすれば，地下水を汚染する有機塩素化合物を脱塩素反応により無害化する微生物の生物電気化学的活性化技術や，同じく地下水を汚染する硝酸イオンの脱窒除去反応の生物電気化学的促進技術などの環境浄化技術への発展が期待される．地下水系の微生物の活性化技術では，養分注入による 2 次的汚染の防止が課題となっているが，生物電気化学システムの利用によって養分注入が不要にできると思われる．また，
生物電気化学システムを酢酸生成微生物に応用すれば，二酸化炭素を原料とする酢酸生成技術として，二酸化炭
素削減とともに有用物質を生産する技術への発展が期待される．また窒素固定反応を促進する生物電気化学シス
テムは，現在，世界エネルギー消費量の 1 ％強を占める
ハーバーボッシュ法による窒素固定技術の省エネルギー型代替技術としての発展が期待される．以上の様に，固体腐植ヒューミンの細胞外電子伝達に関する研究は，環境微生物学における基礎研究だけでなく応用技術開発の面でも大きな発展が期待される．

本研究で得られた研究成果の報告
口頭発表
1) Laskar, M., Awata, T., Kasai, T. & Katayama, A. 2019.
Homoacetogenesis induced autotrophic dechlorination in ahumin dependent pentachlorophenol-dechlorinating consortium, Water and Environmental Technology Conference
2019 (July 13-14, Osaka, Japan)
2) Katayama, A. 2019. Characterization of humin, insoluble
humic substance, as versatile extracellular electron mediator for bioelectrochemical systems, The 10th National
Conference on Environmental Chemistr y (August 15-19,
Tianjing, China)
3) Katayama, A. 2019. Management of nitrogen fertilizer forenergy-saving agricultural systems, The 10th National
Conference on Environmental Chemistr y (August 15-19,
Tianjing, China)4) Laskar, M., Awata, T., Kasai, T. & Katayama, A. 2019. Humin
functions as the electron donor in reductive acetogensis,
International Society for Microbial Electrochemistr y andTechnolgy, ISMET7, Global Conference (October 7-11,
Okinawa, Japan)
5) Kasai, T., Dey, S., Mitsushita, J., Awata, T. & Katayama, A.
2019. Promotion of biological nitrogen fixation with solidphase humin, Inter national Society for Micr obial
Electrochemistr y and Technology, ISMET7, Global
Conference (October 7-11, Okinawa, Japan)
6) Katayama, A., Pham. D.M. & Kasai, T. 2019. Humin, insoluble humic substances, as the external electron donor for
multiple microbial reducing reactions, International Society
for Microbial Electrochemistry and Technology, ISMET7,
Global Conference (October 7-11, Okinawa, Japan)
7) Dey, S., Kasai, T., Mitsushita, J., Awata, T. & Katayama, A.

原著論文
1) Laskar, M., Awata, T., Kasai, T. & Katayama, A. 2019.
Anaerobic dechlorination by a humin-dependent pentachlorophenol-dechlorinating consor tium under autotrophic
conditions induced by homoacetogenesis, Int. J. Environ.
Res. Public Health 16: 2873.
2) Lakser, M., Kasai, T., Awata, T. and Katayama, A. 2020.
Humin assists reductive acetogenesis in absence of otherexternal electron donor, Int. J. Environ. Res. Public Health
17: 4211.
3) Dey, S., Awata, T., Mitsushita, J., Zhang, D.D., Kasai, T.,
Matsuura, N. & Katayama, A. 2021. Promotion of biologicalnitrogen fixation activity of an anaerobic consortium using
humin as an extracellular electron mediator, Sci. Rep.11:
6567.
総説
1) Pham, D.M., Kasai, T., Yamaura, M. & Katayama, A. 2021.
Humin: No longer inactive natural organic matter,
Chemosphere 269: 128697.

－ 57 －

片

謝

山

辞

本研究の実施に当たり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に心から御礼申し上げます．また，
本研究の一部は，科学研究費補助金を利用して行われました．本研究実施に尽力していただいた東海国立大学機構 名 古 屋 大 学 工 学 研 究 科 の 学 生 の 皆 様( Mahasweta
Lasker，Sujan, Dey, 三下純平，能登健仁，小田垣隆伍，
氏林亮太)に深く御礼申し上げます．固体腐植ヒューミ
ンの電気化学特性評価にご協力頂いた東海国立大学機構
名 古 屋 大 学 未 来 材 料・ シ ス テ ム 研 究 所 Duyen Minh
Pham 博士，次世代シークエンサーを用いた微生物群集
構造解析でご助力頂いた粟田貴宣博士(現，大阪工業大
学工学部)，各種機器分析をサポートして頂いた東海国立大学機構名古屋大学未来材料・システム研究所の太田象三博士，および同生命農学研究科の厚味智子氏に深く感謝申し上げます．

文

献

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－ 59 －

2015 年度寄付講座助成の研究報告
助成期間:2015 年 10 月～ 2021 年 3 月

IFO Res.Commun. 35
61-65, 2021

光合成複合微生物系の環境・エネルギー活用シーズ開発
花

智＊

田

東京都立大学大学院理学研究科
光合成複合微生物系の環境・エネルギー活用シーズ開発寄付講座〒192-0397

八王子市南大沢1-1

Photosynthetic microbial communities– application to environmental and energy issues –Satoshi HANADA＊
Graduate School of Science, Tokyo Metropolitan University
Minami-Osawa 1-1, Hachioji, Tokyo 192-0397, Japan
Photosynthetic microbial communities are widely distributed in terrestrial environments including geothermal
springs and riverbed. Microbial communities mainly composed of photosynthetic prokar yotes have attracted
considerable attention as potential solutions for environmental and energy issues. In our studies, we applied
culture-independent and culture-dependent methods to clarify the microbial diversity of photosynthetic microbialcommunities with a special focus on thermophiles and epilithic river biofilms. We found unexpected diversity ofphotosynthetic bacteria and successfully isolated novel bacteria in several phylogenetic lineages. We also
determined spatial and temporal distribution of bacterial members and their metabolisms within photosynthetic
microbial communities in geothermal springs. These studies found the efficient cooperation of cyanobacteria andanoxygenic photosynthetic bacteria for development and maintenance of the community. We believe that ourachievements help to establish photosynthetic microbial communities which are useful for industrial andenvironmental applications.

第一章

はじめに

において，高いポテンシャルを持っている( Thiel et al.,2018 )．しかし，光合成複合微生物系の主要構成者であ光合成は，光エネルギーを化学エネルギーに変換する
過程で，地球上のすべての生物を支える最も重要な生物

る光合成原核生物の活用研究だけでなく，それらの基礎的な研究も十分に進んでいない．

反応である．光合成生物は大型の高等植物へと進化を遂

現在までに光合成原核生物は，細菌界の七つの門に見げてきたが，その起源は約 30 億年前の細菌にさかのぼ

つかっているが，その系統的，生理的多様性の理解も不り，現地球でも光合成をする細菌は生態系における主要充分である．光合成細菌の多様性およびその反応機構に一次生産者のひとつである．シアノバクテリアを含む光

ついて，これまで，海洋などの水圏や土壌圏において広合成原核生物を主体とする微生物生態系は，地球上の太く研究され，なかでも中温性の光合成細菌については，陽光の当たるさまざまな環境に発達している．これら光

遺伝子・酵素レベルで詳しく調べられてきた．最近，高合成複合微生物系は，資源・環境問題の解決や宇宙開発

温環境に生息する光合成細菌が実に多様であり，未知系
統群が多数分布していることが示されるようになってきE-mail: photomic2015@gmail.com＊
花田 智 現 産業技術総合研究所

たが，分離培養法によって取得された種はわずかで，そsatohana@tmu.ac.jp

教員:Vera Thiel (東京都立大学大学院理学研究科，
現，Leibniz Institute DSMZ )．
Marcus Tank(東京都立大学大学院理学研究科，
現，Leibniz Institute DSMZ )．

の全容解明には至っていない( Tank et al., 2017 )．
細菌による光合成は，生命が誕生したころの古地球の高温環境でも進行していたと予想される．それらの好熱性光合成細菌系統群が起源となり，真核生物の植物に至る光合成生物の多様化が進み，地球上の生態系が発達し－ 61 －花

田智てきた( Hanada, 2019 )．地下から熱水が噴出する陸上温泉は，古地球環境を模した環境として，地球科学的研究だけでなく，生命・生態系の進化研究に広く利用されている．
本寄付講座では，エネルギー・環境問題の解決に資す
る光合成複合微生物系の維持・制御のための基礎的な技術開発や活用シーズの発見を目指し，新規光合成原核生物の発見・特性解明とともに，高温環境に発達する好熱性光合成複合微生物系の機能解明を目的とした．

第二章

研究成果の概要

1. 光合成複合微生物系の形成・維持機構
米国イエローストーン国立公園の温泉で発達した光合成複合微生物系を対象に各種オミックス解析を実施して，その構成種および代謝能を明らかにし，そこには多Fig.1 Microbial mats developed at geothermal springs(Nakabusa hot springs, Nagano).

様な光合成細菌が分布していることを見出した( Thielet al., 2016; Thiel et al., 2017 )．さらに詳細な機能解析のために，シアノバクテリアが優占化し，約 3 mm 厚まで生長する長野県中房温泉の微生物マット( Fig. 1 )を研究対象として，その層構造を明らかにした( Martinez
et al., 2019 )．すなわち，その表層部にはシアノバクテ
リアが優占するが，酸素濃度の減少していく中央部には

2. 新規酸素非発生型光合成細菌 Chloracidobacterium の発見とその特性

多様な光合成細菌が共存しており，さらに最深部からはChloracidobacterium 属細菌は，Tank らによって 2015
年に Acidobacteria 門に初めて見つかった新規系統の好未 培 養 の Chlorobi 細 菌 が 検 出 さ れ た( Thiel et al.,

熱性光合成細菌である( Tank & Bryant, 2015 )．温泉微2019 )．微小センサーを活用した透過光波長分布解析か

生物マットを構成する光合成細菌の一つとして光合成複ら，微生物マットの深度ごとの光合成細菌の分布も明ら

合微生物系の理解に重要であるばかりでなく，本菌は始かにした．さらに，現地培養装置を開発し，現地温泉水

原的な光合成特性と植物型の代謝的特徴も併せ持つこと

中で微生物マットに異なる波長の光を照射し，群集構造から光合成の進化の面からも興味がもたれている(Tankの変化を観察することで，各光合成細菌の他菌に与えるet al., 2018 )．本研究では本菌の有するⅠ型の光合成反
応中心の分光学的・生化学的特徴を明らかにした( Zill

影 響 を 明 ら か に す る こ と が で き た( Nishida et al.,2018 )．
温泉微生物マットを形成する主要種のひとつである糸et al., 2018; He et al., 2019 )．さらに，イエローストーン国立公園(米国)から新たに Chloracidobacterium 属細状性酸素非発生型光合成細菌 Chloroflexus aggregans に菌を分離することに成功し，それらのゲノムおよび生理関しては，1995 年の発見以来，その光独立栄養生育能

学的性質の比較から多様性を明らかにした( Saini et al.

は実証されていなかった( Hanada et al., 1995 )．本研究2021 )．また，ゲノムには炭酸固定関連遺伝子が見つかでは分離株を用いて，硫化水素に依存した光嫌気独立栄らないが，その生育には CO2 の添加が促進的に働くこ養生育能を初めて確認することに成功した( Kanno etとが示された．安定同位体標識した CO2 を用いたトレー

al., 2019; Kawai et al., 2019a )．加えて，水素依存的光嫌気独立栄養生育能および水素依存的好気呼吸独立栄養生

んでいることを明らかにし，ホスホエノールピルビン酸

ス解析から，本菌が CO2 を炭素源として菌体に取り込育能を有することも明らかになってきた( Kawai et al.,からオキサロ酢酸に至るアナプレロティック反応を介し

2019b )
．さらに，微生物マットの遺伝子転写解析から，てアスパラギン酸やメチオニンに取り込まれていること

本菌が日照量に応じて，電子源(硫化水素，水素，有機を示した( Saini et al., in preparation )．

物等)を使い分けていることを明らかにした( Kawai etal., 2021 )．以上から，Chloroflexus が多様なエネルギー代謝を有し，シアノバクテリアと協調して，効果的に光

3. 好熱性シアノバクテリアの多様性

合成複合微生物系を形成していることが分かった．

リアの系統的多様性，遺伝的多様性，生理的多様性に関陸上温泉などの高温環境における好熱性シアノバクテ－ 62 －

光合成複合微生物系の環境・エネルギー活用シーズ開発

する研究はまだ少なく，その系統分類も進んでいない．

初めて好気性光合成細菌を見出し新種提案した( Hirose

本研究では陸上温泉を対象にした環境 DNA 解析からそet al., 2020 )．また河川環境から高頻度に検出されるの分布と多様性を調査し( Martinez et al., 2019; Thiel etTabrizicola 属細菌にも光合成能が広く認められることを
発 見 し た( Tarhriz et al., 2019 )． さ ら に Roseobacter 属

al., 2016; Thiel et al., 2017 )，これまでに考えられていた以上に系統的に多様なシアノバクテリアが高温域まで分布していることを明らかにした．なかには新規未培養系( Muramatsu et al., 2020 )，Litoreibacter 属( Kanamuro

統群と考えられるものも見つかった．さらに，いくつか

et al., 2021 )に光合成能を有する新種細菌を分離培養し，光合成能が広くプロテオバクテリアに分布していることの好熱性シアノバクテリア株の培養に成功し，ゲノム情を明らかにした．

報，分子系統および窒素固定能，赤色光利用性や生育可

第三章

能温度域，生育可能 pH などの生理学的特性を明らかにした．また，温泉微生物マットにおける他菌との共生関おわりに係も推定された．これらの成果は光合成微生物複合系の本寄付講座では，環境 DNA 解析を主体とする非培養形成・維持・生産性を理解・制御する上で重要な知見で法および新規開発した培地・培養法を活用することで，ある．

陸水環境から新規細菌を発見し，その系統および生理学的特性を明らかにした．本寄付講座から報告した新規細4. 好気性光合成細菌の分布と多様性

菌を Table 1 にまとめた．これまで考えられていたより

好気性光合成細菌は，主に酸素呼吸で生きるとともにも多様な細菌の系統群に光合成能が見出されたことは特光エネルギーも利用するため，光合成能の進化および活筆に値する．系統的にも生理的にも多様な新規光合成原用を考える上で重要な細菌群である．本研究では非培養核生物を分離培養できたことは，本寄付講座の大きな成法および培養法によって河川環境における好気性光合成果であり，これらの研究成果は生物進化，地球環境の形

細菌の分布と多様性を明らかにした( Hirose et al., 2016;

成・保全，の観点からも意義深いものであると確信して

Sato-Takabe et al., 2020 )．特に河床礫バイオフィルムのいる．また，陸上温泉に発達する光合成複合微生物系で光合成複合微生物系において，その主要構成メンバーである微生物マットの解析では，構成種およびそれらの代あることが示され，さらにそのなかには未培養系統群の謝活性の時空間的分布を明らかにすることができた．そ存在が示唆された．光合成細菌が有する光合成色素バクの成果により，太陽から降りそそぐ幅広い波長の光を効

テリオクロロフィルの近赤外蛍光を検出できる装置( Fig. 2 )率的に化学エネルギーに変換できる複合微生物系の形を組み立て，光合成細菌の効率的な検出・分離法を確立

成・制御法の確立に大きく近づいた．

した．その結果，新規好気性光合成細菌の分離培養に成

多くの新規細菌が分離培養できた一方で，非培養法で功し，ベータプロテオバクテリアの Aquabacterium 属に検出・推定されながら，純粋培養に成功していない系統
群も多数ある．メタゲノム解析により未培養ながらそれらのゲノム情報を取得できており，培養法の確立ならびに共培養系・複合微生物系での活用方策の提案に着実につながっている．それら細菌には，C1 化合物利用能，
窒素固定能，異化的硫黄代謝能などの新しい代謝特性もみつかってきており，微生物機能の利用性拡大に貢献できる成果である．
シアノバクテリアおよび酸素非発生型光合成細菌が混在する光合成複合微生物系は，炭酸固定による温室効果
ガスの削減，光エネルギーを使った物質生産だけでなく，宇宙開発でも期待が高まる生物機能を有する．複合微生物系を思いのままに制御するにはまだまだ包括的かつ完全な全体像の解明が求められるが，本寄付講座は国際的Fig. 2 Bacteriochlorophyll-containing colony detection system.
Infrared signals from bacteriochlorophyll a are detectedby a digital camera through the long-pass filter under
LED (590 nm) illumination.

にも当該研究分野を先導し，先駆的な知見を提供することができたと考えている．本寄付講座から発表した研究
成果，提供した細菌培養株，収集した環境ゲノム情報が今後の研究の大きな礎となり，本研究分野がさらに発展することを切に願っている．

－ 63 －

花
Table 1
Species田智

List of new species found in our study

Culture collection

PhylumFeatures

References
Saini et al., 2021

Chloracidobacterium sp.

n.y.

Acidobacteria

Thermophilic,
AAPB

Ca. Chlorohelix
allophototrophan.y.

Chloroflexota

Photosynthesis,
Type I reaction center

Tsuji et al., 2020a

Chlorogloeopsis sp.

NBRC 108921

Cyanobacteria

Thermophilic,
N2 fixation

In preparation

Leptolyngbya sp.

n.y.

Cyanobacteria

Thermophilic,far-red utilization

In preparation

Ca. Chlorobium
canadensen.y.

Chlorobi

Purple sulfur bacteria

Tsuji et al., 2020b

Ca. Thermonerobacter
thiotrophicusn.y.

Chlorobi(Ca. Kapabacteria)

Thermophilic,sulfate reduction

Thiel et al., 2019

Roseobacter cerasinus

DSM 110091
NBRC 114115(Alpha-)Proteobacteria

AAPB

Muramatsu et al.,2020

Litoreibacter roseus

DSM 110109
NBRC 114114(Alpha-)Proteobacteria

AAPB

Kanamuro et al.,2021

Aquabacterium pictum

DSM 106757
NBRC 111963(Beta-)
Proteobacteria

AAPB

Hirose et al., 2020

Caldichromatium
japonicum

DSM 110881
JCM 39101(Gamma-)Proteobacteria

Thermophilic,purple sulfur bacteria

Saini et al., 2020

Hydrogenobacter sp.

n.y.

Aquificae

H2-oxidation,
N2-fixation

Nishihara et al.,2018

n.y., not yet.
AAPB, aerobic anoxygenic photosynthetic bacteria

謝

辞

本研究は公益財団法人発酵研究所の平成 27 年度寄付講座助成で行われたもので，ここに感謝の意を表します．
そして研究は，寄付講座特任助教(永島咲子)，寄付講
座特任研究員(広瀬節子，佐藤剛，菅野菜々子)，特別研究員(高部由季)の協力のもとに実施しました．また，
松浦克美東京都立大学名誉教授をはじめとして，東京都
立大学大学院理学研究科生命科学専攻環境微生物学研究室の春田伸教授および国内外の多数の共同研究者の皆様のご支援とご協力，光合成複合微生物研究室( Photomic
Lab. )に在籍した大学院生・卒研生の皆さんの協力の賜物です．あわせて感謝します．

文

献Hanada, S., Hiraishi, A., Shimada, K. & Matsuura, K. 1995.
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－ 65 －

IFO Res.Commun. 35
67-74, 2021

光合成複合微生物系の形成・維持機構
Vera THIEL＊
東京都立大学大学院理学研究科
光合成複合微生物系の環境・エネルギー活用シーズ開発寄付講座〒192-0397

東京都八王子市南大沢1-1

Development and maintenance of photosynthetic microbial communities
Vera THIEL＊
Graduate School of Science, Tokyo Metropolitan University
Minami-Osawa 1-1, Hachioji, Tokyo 192-0397
In this study, we analyzed cyanobacteria-dominated microbial mats in Nakabusa hot springs (Nagano, Japan). To
elucidate development of the mats, we identified microbial community members and their vertical distribution.
The upper layer was dominated by cyanobacteria and middle to deeper layers contained various anoxygenic
photosynthetic bacteria. Illumination of different wavelength detected effects of each phototroph on other bacterial
members. Furthermore, we found that Chloroflexus aggregans, a major anoxygenic photosynthetic bacteria in themats possessed multiple modes for the autotrophic growths. Meta-transcriptomic analysis of the mats indicatedthat C. aggregans changed its metabolisms depending on the amount of solar irradiation during a day. These
results showed the cooperation of cyanobacteria and anoxygenic photosynthetic bacteria to efficiently develop andmaintain the photosynthetic microbial community.
Key words: microbial mat, hot spring, cyanobacteria, anoxygenic photosynthesis

緒

言系を理解するためのモデルとしても研究されている．これまでも国内外の温泉を対象に幅広い研究が行われ，特光合成複合微生物系は二酸化炭素を吸収し，無機物かに Thomas D. Brock 博士( 1926 - 2021 )( https://www.

らの有機物を生産する場として，生産業，温室効果ガス

youtube.com/watch?v=YdkTW30Gv64 )による Thermus

対策や宇宙開発でも注目されている．そのひとつである

aquaticus の発見をはじめとして，米国イエローストー
ン国立公園の温泉に発達する微生物マットを対象にした

温泉微生物マットは微生物種構成が単純で，複合微生物

研究報告が多数ある( Tank et al., 2017 )．微生物マット
E-mail: photomic2015@gmail.com＊
Vera THIEL 現 Leibniz Institute, DSMZ
共同研究者:花田は，シアノバクテリアや酸素非発生型光合成細菌をはじ

vet20@dsmz.de

めとして多様な微生物が群集を形成していることが知ら

智(東京都立大学大学院理学研究科，
現 産業技術総合研究所)．
永島咲子(東京都立大学大学院理学研究科，
現 神奈川大学)．
佐藤 剛(東京都立大学大学院理学研究科，
現 神奈川大学)．
菅野菜々子(東京都立大学大学院理学研究科，
現 関西学院大学)．
福島俊一(東京都立大学大学院理学研究科，
現 大阪大学)．
Martinez, J. N.(東京都立大学大学院理学研究科，
現 University of St. La Salle，広島大学)
春田 伸(東京都立大学大学院理学研究科)．

れるが( Thiel et al., 2016; Thiel et al., 2017 )，まだ培養されていない微生物も含まれ，その群集形成・維持機構について未解明な部分が多い．
本研究では弱アルカリ性硫黄泉である長野県中房温泉に発達する微生物マットを主な対象として，その層構造，
光吸収分布，各光合成細菌の役割を現地培養法およびオ
ミックス解析を用いて解析した．中房温泉には一年を通して野外に 90 ℃以上の温泉水が安定に流れ出している環境がある．流れに伴い温度勾配が形成され，各温度域の温泉流水中には微生物マットが安定して発達しており( Everroad et al., 2012 )，また微生物学的な基礎的知見－ 67 －

Vera THIEL

も 集 積 し て き て い る こ と か ら( Nakagawa & Fukui,bacteria kit(イルミナ社)を用いてリボソーム RNA を

2002; 春田, 2012 )，本研究を遂行するのに好適な環境で除去した．ランダムプライマーを用いて cDNA を合成し，ある．

NextSeq 500(イルミナ社)で塩基配列情報を取得した．
得られたデータは情報に従い処理したのち( Kawai et

実験方法al., 2021 )，各遺伝子の転写量は，各試料の全リード数あたりの相対値として評価・比較した．

試料採取と微小センサーを用いた解析結果および考察長野県中房温泉の 56 ℃から 64 ℃の温泉流水中に発達する緑色の微生物マットを採取した．深度ごとの分光放射照度は，ハロゲン光源のもと，80 μm 径の微小セン

シアノバクテリア優占微生物マットの層構造と微生物種

サー・光ファイバー分光計( USB2000+; Ocean Optics,の分布

Florida, USA )を用いて測定した．マットの層構造解析

アルカリ硫黄泉のひとつ，長野県中房温泉に発達するのためには，層構造を崩さないように自作のコルクボー

シアノバクテリア優占微生物マット(約 5 mm 厚)を採ラーを用いてマットをくり抜き，メスを用いて約 1 mm

取し，
その層構造
(垂直分布)
について解析した(Martinez

厚ごとの層に切り分けた．微生物マットからの DNA や
RNA 抽出については既報論文に詳細に示した( Nishida

et al., 2019 )．まずハロゲン光源照射下で，微小センサーを用いて上部 1 mm について深度ごとの分光放射照度をet al., 2018; Martinez et al., 2019; Kawai et al., 2021 )．

測定した( Fig. 1 )．この結果から，マット表層部からクロロフィル a およびフィコシアニンによる吸収が強い

PCR アンプリコン解析

ことが分かる．バクテリオクロロフィル a や c の吸収は細菌の 16S rRNA 遺伝子断片を対象とするユニバーサ

深部になるほど顕著で，また表層から 1 mm 下までこれ

ルプライマーを用いて PCR 増幅し，増幅産物の塩基配

らバクテリオクロロフィルが吸収する光が届いているこ

列はイルミナ社 MiSeq プラットホームを用いて取得しとを示している．

た．得られた配列データは常法に従い処理し，rRNA 遺次いで，5 mm 厚の微生物マットを約 1 mm ずつ五つの伝子塩基配列データベースとの相同性検索を行った層に分け，DNA を抽出し，16S rRNA 遺伝子を対象に PCR( Nishida et al., 2018; Martinez et al., 2019 )．

アンプリコン解析した( Martinez et al., 2019 )．主要構
成種である光合成細菌についての結果を Fig. 2 に示す．

微生物マットの現地培養

表層部にはクロロフィル a( Chl a )およびフィコシア採取した微生物マットをホモジナイズし，ミクロ培養

ニンを有するシアノバクテリア( Thermosynechococcus )コンテナ( 2×1.6×0.5 cm3 )に分注した．コンテナ上部が優占するが，中央部から底部にかけてバクテリオクロは 透 明 な ア ク リ ル 板 で 覆 い， 上 部 か ら LED( 5 mA )ロフィル a( BChl a )をもつ糸状性酸素非発生型光合成( OSR5CA5B61P, 625 nm; SX534IR-730, 730 nm; TSHF5410,

細菌 Roseiflexus が多く分布していた．またバクテリオク

890 nm; 秋月電子通商)を用いて光を照射した．コンテ

ロロフィル c( BChl c )を有する糸状性酸素非発生型光

ナは温泉水中( 50 ℃～ 56 ℃，pH 7.3 )に設置し，培養

合成細菌 Chloroflexus は特に上部に多いことが分かった．

した．

さらに存在量は 1％以下と少ないものの，新規光合成細菌 Chloracidobacterium や未培養 Chlorobi 細菌も検出さChloroflexus の独立栄養条件での培養
無機培地を下記のように調製し，光照射条件，55 ℃でれた．また，深度ごとに酸素要求性の異なる化学合成細培養した．培地組成( 1 リットルあたり);0.1 g (NH 4)2 SO4,

これらのうちいくつかは新たに分離培養に成功している菌が分布していることが示された( data not shown )．

0.15 g KH 2PO4, 0.16 g K 2HPO4 （pH 7.0）． こ こ に 既 報( Saini et al., 2020; Iino et al., 2020; Nishihara et al., 2018;( Hanada et al., 1995 )に従いビタミン混合液，微量ミネ

Chen et al., 2021 )．以上の結果から，微生物マットの層

ラ ル 溶 液 を 添 加 し た． 培 養 容 器 の 気 相 は，N2:CO2構造について Fig. 3 のようにまとめることができる．

( 80％:20％ [v/v] )で満たして嫌気条件とし，オートク

さらに，光の波長( 625 nm, 730 nm, 890 nm )およびレーブ滅菌後，NaHCO3 および Na2S をそれぞれ終濃度

それらを利用する光合成細菌と他細菌の関係を探った

50 mM，1.5 mM となるよう無菌的に添加した．

( Nishida et al., 2018 )．微生物マットを採取し，2×1.6
×0.5 cm3 サイズの培養槽に入れ，現地で自然の温泉水

RNA-Seq 解析

を供給しながら培養した．各培養槽には LED 光源を用

微 生 物 マ ッ ト か ら 抽 出 し た 全 RNA か ら Ribo-Zero

い て 異 な る 波 長 の 光 を 照 射 し た．20 日 間 の 培 養 後，

－ 68 －

光合成複合微生物系の形成・維持機構

Fig. 1

Spectral irradiance measured in different depths in the hot spring microbial mat.

Fig. 2

Vertical distribution of photosynthetic members in the hot spring microbial mat.
L1 to L5 indicate mat layers (L1, surface; L5, bottom).

－ 69 －

Vera THIEL

Fig. 3

Schematic representation of the hot spring microbial mats.

DNA を抽出し，16S rRNA 遺伝子を対象にした PCR ア
ンプリコン解析を行った．予想した通り，625 nm 光照
射条件では Thermosynechococcus シアノバクテリアが優占 化 し，730 nm と 890 nm の 光 照 射 で は そ れ ぞ れ
Chloroflexus と Roseiflexus が優占化することが確認できた．Thermosynechococcus の増加に伴い，好気従属栄養細菌である Thermus をはじめとする多様な細菌が増加
す る こ と が 明 ら か に な っ た． 一 方，Chloroflexus とRoseiflexus 等の酸素非発生型光合成細菌の増加は，硫黄不均化菌などの硫黄代謝を活性化することが示された．
以上から，微生物マットにおける光合成に伴う炭素，硫
黄循環の直接的な知見を得ることができた．

Fig. 4

シアノバクテリア優占微生物マットにおける酸素非発生

Phase contrast photomicrograph of the cultureof C. aggregans with sulfide.

型光合成細菌 Chloroflexus の役割
糸状性酸素非発生型光合成細菌 Chloroflexus aggregans状を解析し，基準株と比較した( Kanno et al. 2019 )．

は長野県中房温泉に発達するシアノバクテリア優占微生

新規分離株 ACA-12 の 16S rRNA 遺伝子塩基配列は，基物マットにおける主要な光合成細菌のひとつであり，国準株 MD66 と 98.9％の相同性を示した．ACA-12 株は，内外で多数の分離株の報告があるが，まだその生理機能

硫化水素を唯一の電子源，CO2 を唯一の炭素源とした培に不明な点がある．基準株のゲノム解析からは炭酸固定

地で，嫌気光照射の下，増殖することが確認できた．そ経路( 3-hydroxypropionate bi-cycle )の遺伝子セットがの増殖に伴い，硫化水素濃度の減少および元素硫黄の蓄見つかっているが( Klatt et al. 2007 )，独立栄養的炭酸積が観察された( Fig. 4 )．基準株についても同様の条固定生育は確認されていない．そこで中房温泉の微生物件で試験したところ，わずかながら増殖することが確認

マットから新規に C. aggregans 株を分離し，その生理性できた．

－ 70 －

光合成複合微生物系の形成・維持機構

上述したように微生物マットに 730 nm の光を照射しによる酸素濃度が 400 μmol/L を超える日中には，シアて現地で培養した実験では Chloroflexus と硫黄不均化細ノバクテリアによって供給される有機物を酸化して，菌の強い関係が示唆されている．これらの知見も基に，もっぱら好気呼吸で従属栄養的に生育していると考えら

Kawai らは C. aggregans と硫黄不均化細菌 Caldimicrobium

れた．夕方には酸素濃度が減少し，硫黄や水素酸化酵素

thiodismutans(中房温泉分離株)( Kojima et al., 2016 )の共培養系を確立し解析した( Kawai et al., 2019a )．そ遺伝子の転写量の上昇が検出されたことから( data notの結果，硫黄不均化細菌による元素硫黄の除去が C.

発化していると考えられた．また夜間には発酵代謝に切

aggregans の硫化水素依存的な光独立栄養を促進するとともに，C. aggregans による硫化水素の消費が硫黄不均り替わることが示唆された．

化細菌の生育を支えることが分かった( Kawai et al.,

その運動は他細菌や環境(光や酸素，温度)によって影

2019a )．また中房温泉から分離した C. aggregans 株に水響を受けることから，微生物マット内での動的な分布変素ガス依存的な光合成独立栄養生育能および酸素呼吸独化もあることが予想される( Hanada et al., 2002; Morohoshi

立栄養生育能があることも明らかになってきた( Kawai

et al., 2015 )．

shown, Fig. 7 in Kawai et al., 2021 )，嫌気的な光合成が活

さらに，C. aggregans には滑走運動能が知られており，

et al., 2019b )．
微生物マットにおける C. aggregans の多様な代謝能の結使い分け，役割を明らかにするため，微生物マットの転写解析を実施した(Kawai et al., 2021)．
現地においてマッ語

ト試料を経時的に採取して，RNA を抽出し，RNA-Seq

シアノバクテリアが優占化する微生物マットの層構造解析に供した．Chloroflexus の炭酸固定経路の鍵酵素遺を，特に光合成微生物およびその代謝活性に注目して明伝子に着目すると，夜明け前および夕方に転写量が高くらかにしてきた．層ごとに異なる波長の光を使い分け，なっており( Fig. 5 )，一次生産者として働いているとまた日周サイクルに応じた代謝変化を示すことができ考えられた．夜明け前にはヒドロゲナーゼ遺伝子の転写

た． 現 地 培 養 装 置 の 開 発 も 進 め た が( Cantrell et al.

も活発で( data not shown, Fig. 7 in Kawai et al., 2021 )，2017 )，メタゲノム解析からは新規系統の光合成細菌や水素酸化による化学独立栄養生育していると考えられ

異化的硫黄代謝能を有する未培養細菌も発見され(Thiel

た．日照量が大きくシアノバクテリアの光合成の活性化

et al. 2019 )，未解明な部分も残されている．本研究では，

Fig. 5

Relative transcription level of genes encoding key enzymes of the 3-hydroxypropionate (3-OHP) bi-cycle and the photon irradiance (400 - 700 nm). The meanvalues of the relative transcription levels of key 3-OHP enzymes, malonyl-CoA
reductase and propionyl-CoA synthase are shown.

－ 71 －

Vera THIEL菌の役割．第59回日本植物生理学会年会，第3回光合成細菌ワークショップ(3月27日，札幌)
9) Thiel, V. 2018. 50 years studying Yellowstone's Mushroom
Spring microbial mats. Current Topics in Bio and Food
Technology Seminar, Flensburg University of Applied
Sciences (June 29, Flensburg, Germany)10) Thiel, V., Tank, M., Mar tinez, J.N., Trampe, E.C.L.,
Lichtenberg, M., Kühl, M., Hanada, S. 2018. Microbial
diversity and activity in a hot spring associated oxygenic
phototrophic microbial mat disclosed by a comprehensive
multi-method study. 16 th Inter national Symposium on
Phototrophic Prokaryotes (ISPP) (August 5-9, Vancouver,
Canada)11) Tank, M., Thiel, V., Br yant, D.A., Hanada, S. 2018. Hot
springs microbial mats are treasure chests for the isolationof novel chlorophotrophic bacteria. 16th International
Symposium on Phototrophic Prokaryotes (ISPP) (August
5-9, Vancouver, Canada)
12) 菅野菜々子. 2018. 温泉微生物マットの大黒柱:光合成細菌の一次生産者としての役割とその能力．自由集会「ジグソーパズルのピースを埋める― 単一微生物種にフォーカスする若手研究者たち―」．日本微生物生態学会第32回大会(7月11-13日，沖縄)
13) 花田智．2018．酸素非発生型光合成の複雑なタペスト
リー．日本微生物資源学会第25会大会(6月13-15日，つくば)14) Nishihara, A., McGlynn, S.E., Thiel, V., Tank, M., Nobu, M.
K., Tamaki, H. & Haruta, S. 2019. Evidence of active nitrogenfixation in hyperthermophilic bacteria from terrestrial hot
springs. 日本微生物生態学会第33回大会 (9月10-13日，山梨)15) Martinez, J.N. 2020. Vertical distribution of phototrophic
bacteria exhibits niche differentiation within hot springassociated microbial mat. Friday Seminar, Department of
Biology, The State University of New York-Oneonta,(February 21, Oneonta, NY, USA)

微生物マットの炭素代謝，硫黄代謝が明らかになってきたが，近年，陸上温泉から多様な窒素固定細菌も見出されるようになり( Nishihara et al. 2018; Chen et al. 2021 )，窒素循環，エネルギー分配を含む，全容解明に大きく近づいている．

要約

シアノバクテリアが優占化し，5 mm 厚まで生長した
長野県中房温泉の微生物マットについて，その形成機構を解析した．まず層構造について，表層部にはシアノバ
クテリアが優占するが，中央部から深部にかけて多様な
酸素非発生型光合成細菌が分布していることがわかった．微生物マットに異なる波長の光を照射し，群集構造の変化を観察することで，各光合成細菌の他菌に与える影響を明らかにした．また主要な酸素非発生型光合成細菌である Chloroflexus aggregans が，多様な独立栄養生育能を有することを発見した．さらに，微生物マットの転写解析から，本菌が日照量に応じて，電子源(硫化水素，
水素，有機物等)を使い分けていることを明らかにした．
以上から，シアノバクテリアと他の酸素非発生型光合成
細菌が協調し，光合成微生物複合系を効果的に形成している様子を示すことができた．

本助成で得られた研究成果の報告
1) Thiel, V., Wood, J.M., Olsen, M.T., Ward, D.M. & Bryant,
D.A. 2016. The dark side of the Mushroom Spring microbial
mat: life in the shadow of chlorophototrophs. Annual
Conference of the Association for General and Applied
Microbiology (VAAM) (March 13-16, Jena, Germany)2) 花 田 智 ． 2 0 1 6 ． 原 始 的 な 光 合 成 — 酸 素 非 発 生 型 光 合成—．第89回日本細菌学会総会(3月23-25，大阪)
3) Thiel, V. 2017. From Kiel to Pennsylvania and Tokyo.
Following the call of photosynthetic bacteria. Retirment
Symposium for Prof. Dr. Johannes F. Imhoff. (March, Kiel,
Germany)4) Nishihara, A., McGlynn, S.E., Thiel, V., Matsuura, K. &Haruta, S. 2017. Biological nitrogen fixation coupled tochemolithotrophic sulfur metabolisms in thermophilic
microbial community developed at geothermal springs.
JpGU-AGU Joint Meeting 2017 (May 20-25, Chiba)5) 花田智．2017．分離培養の進展を阻害しているのは「分離できない」って思い込み以外の何ものでもない．環境
微生物系学会合同学会2017(8月29-31日，仙台)
6) 花田智．2017．温泉バイオマット－温泉に存在する特殊な微生物生態系－．生命科学系学会合同年次大会ConBio2017(12月6-9日，神戸)
7) 花田智．2017．極限の世界から．第7回日本微生物学連盟
フォーラム「微生物－変わり者たちの素顔」(12月16日，東京)8) 花田智．2018．古地球生態系での酸素非発生型光合成細原著論文
1) Fukushima, S., Morohoshi, S., Hanada, S., Matsuura, K. &Har uta, S. 2016. Gliding motility driven by individual
cell-surface movements in a multicellular filamentous bacterium Chloroflexus aggregans. FEMS Microbiol. Lett. 363:
fnw056.
2) Thiel, V., Wood, J.M., Olsen, M.T., Tank, M., Klatt, C.G.,
Ward, D.M. & Br yant, D.A. 2016. The dark side of themushroom spring microbial mat: Life in the shadow of chlorophototrophs. I. Microbial diversity based on 16S rRNA
gene amplicons and metagenomic sequencing. Front.
Microbiol. 7: 919.
3) Bernstein H.C., McClure R.S., Thiel V., Sadler N.C., Kim
Y.-M., Chrisler W.B., Hill E.A., Bryant D.A., Romine M.F.,
Jansson J.K., Fredrickson J.K. & Beliaev A.S. 2017. Indirectinterspecies regulation: Transcriptional and physiologicalresponses of a cyanobacterium to heterotrophic partnership.
mSystems. 2: e00181-16.
4) Thiel, V., Tank, M., Tomsho, L.P., Burhans, R., Gaya, S.E.,
Hamilton, T.L., Schuster, S.C. & Br yant, D.A. 2017. Draft
genome sequence of Anoxybacillus ayderensis strain MT-Cab－ 72 －

光合成複合微生物系の形成・維持機構(Firmicutes). Genome Announc. 5: e00547-17.
5) Thiel, V., Drautz-Moses, D.I., Purbojati, R.W., Schuster, S.C.,
Lindemann, S. & Bryant, D.A. 2017. Genome sequence of
Prosthecochloris sp. strain HL-130-GSB from the phylum
Chlorobi. Genome Announc. 5: e00538-17.
6) Thiel V., Hügler M., Ward D.M. & Bryant D.A. 2017. The
dark side of the Mushroom Spring microbial mat: Life in the
shadow of chlorophototrophs. II. metabolic functions ofabundant community members predicted from metagenomic analyses. Front. Microbiol. 8:943.
7) Tank, M., Liu, Z., Frigaard, N.U., Tomsho, L.P., Schuster,
S.C. & Bryant, D.A. 2017. Complete genome sequence ofthe photoautotrophic and bacteriochlorophyll e-synthesizing
green sulfur bacterium Chlorobaculum limnaeum DSM
1677T. Genome Announc. 5: e00529-17.
8) Nishida, A., Thiel, V., Nakagawa, M., Ayukawa, S. &Yamamura, M. 2018. Ef fect of light wavelength on hot
spring microbial mat biodiversity. PLoS One. 13: e0191650.
9) Nishihara A., Haruta S., McGlynn S.E., Thiel V. & Matsuura
K. 2018. Nitrogen fixation in thermophilic chemosynthetic
microbial communities depending on hydrogen, sulfate, andcarbon dioxide. Microbes Environ. 33: 10–18.
10) 福島俊一，春田伸．2018．糸状性細菌の滑走運動．生物工学会誌96: 240-265．
11) Thiel, V., Costas, A.M.G., Fortney, N.W., Martinez, J.N., Tank,
M., Roden, E.E., Boyd, E.S., Ward, D.M., Hanada, S. & Bryant,
D.A. 2019. "Candidatus Thermonerobacter thiotrophicus," anon-phototrophic member of the Bacteroidetes/Chlorobi with
dissimilatory sulfur metabolism in hot spring mat communities. Front. Microbiol. 10: 3159.
12) Nishihara, A., Thiel, V., Matsuura, K., McGlynn, S.E. &Haruta, S. 2018. Phylogenetic diversity of nitrogenase
reductase genes and possible nitrogen-fixing bacteria inthermophilic chemosynthetic microbial communities in
Nakabusa Hot Springs. Microbes Environ. 33: 357–365.
13) Nishihara, A., Matsuura, K., Tank, M., McGlynn, S.E., Thiel,V. & Haruta, S. 2018. Nitrogenase activity in thermophilic
chemolithoautotrophic bacteria in the phylum Aquificae;
isolated under nitrogen-fixing conditions from Nakabusa
Hot Springs. Microbes Environ. 33: 394–401.
14) Martinez, J.N., Nishihara, A., Lichtenberg, M., Trampe, E.,
Kawai, S., Tank, M., Kühl, M., Hanada, S. & Thiel, V. 2019.
Vertical distribution and diversity of phototrophic bacteria
within a hot spring microbial mat (Nakabusa Hot Springs,
Japan). Microbes Environ. 34: 374–387.
15) Kanno, N., Haruta, S. & Hanada, S. 2019. Sulfide-dependent
Photoautotrophy in the Filamentous Anoxygenic Phototrophic
Bacterium, Chloroflexus aggregans. Microbes Environ. 34:
304–309.
16) Kawai, S., Martinez, J.N., Lichtenberg, M., Trampe, E., Kühl,
M., Tank, M., Haruta, S., Nishihara, A., Hanada, S. & Thiel,
V. 2021. In-Situ Metatranscriptomic analyses reveal themetabolic flexibility of the thermophilic anoxygenic photosynthetic bacterium Chloroflexus aggregans in a hot spring
cyanobacteria-dominated microbial mat. Microorganisms 9:652.
17) Martinez, J.N., Kawai, S., Saini, M.K., Tank, M., Hanada, S.
& Thiel, V. 2020. Draft genome sequence of a filamentous

anoxygenic phototrophic bacterium, "Candidatus Roseilinea
sp. strain NK_OTU-006," recovered from metagenomic dataof a hot spring microbial mat. Microbiol. Resour. Announc.
9: e01104-20.
18) Saini, M.K., Chihche, W., Soulier, N., Sebastian, A., Albert, I.,
Thiel, V., Br yant, D.A., Hanada, S. & Tank, M. 2020.
Caldichromatium japonicum gen. nov., sp. nov., a novel thermophilic phototrophic purple sulphur bacterium of the
Chromatiaceae isolated from Nakabusa hot springs, japan.
Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 70: 5701–5710.
その他(総説・書籍・特許など)
1) Hanada, S. 2016. (Research Highlight) Anoxygenic photosynthesis :A photochemical reaction that does not contributeto oxygen reproduction. Microbes Environ. 31: 1-3.
2) Thiel, V., Tank, M. & Br yant, D.A. 2018. Diversity of
Chlorophototrophic Bacteria Revealed in the Omics Era.
Annu. Rev. Plant Biol. 69: 21–49.
3) Tank, M., Thiel, V., Ward, D.M. & Br yant, D.A. 2017. A
panoply of phototrophs: An Overview of the thermophilic
chlorophototrophs of the microbial mats of alkaline siliceous
hot springs in Yellowstone National Park, WY, USA, In
Hallenbeck, P.C. (ed.), Modern Topics in the Phototrophic
Prokar yotes: Environmental and Applied Aspects, pp.
87-137, Springer International Publishing, Switzerland.
4) Hanada, S. 2019. Evolution of Photosynthetic System, In
Yamagishi A, Kakegawa T, Usui T (eds.), Astrobiology:
From the Origins of Life to the Search for Extraterrestrial
Intelligence, pp. 137-152, Springer, Singapore.
5) 花田智(訳)，2016．微生物－目には見えない支配者たち－，Money, N.P.(著)，サイエンスパレット031，全
205ページ，丸善出版，東京．

謝

辞

本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．また，本研究の遂行にご協力いただいた Kühl 博士( Universityof Copenhagen, Denmark )，Lichtenberg 博士(Universityof Copenhagen, Denmark )，Trampe 博士( University of
Copenhagen, Denmark )，Hügler 博 士( DVGWTechnologiezentrum Wasser, Germany )，Br yant 博 士( Pennsylvania State University, USA )，Wood 博 士( Montana State University, USA )，Olsen 博士( Montana
State University, USA )，Klatt 博 士( Montana State
University, USA )，Ward 博士( Montana State University,
USA )，山村雅幸博士(東京工業大学)，西田暁史博士(東京工業大学，現 早稲田大学)，Cantrell 博 士( Georgia
Institute of Technology, USA )，Sutton 博 士( Georgia
Institute of Technology, USA )，Tan 博 士( Georgia
Institute of Technology, USA )，Duca 博 士( Georgia
Institute of Technology, USA )，Balayan 博 士( Georgia
Institute of Technology, USA )，Rennie 博 士( Georgia－ 73 －

Vera THIEL

Institute of Technology, USA )，Stockton 博 士( Georgia
Institute of Technology, USA )，Rajesh 博 士( Wheeler
High School, USA )，河合繁博士(海洋研究開発機構)，
西原亜理沙博士(産業技術総合研究所)，中房温泉社長・百瀬孝仁氏，嶋田敬三東京都立大学名誉教授ならびに光合成複合微生物寄付講座( Photomic Lab. )の学生諸氏に感謝の意を表します．

文

献Cantrell, T., Sutton, S.A., Tan, G. et al. 2017. In situ culturing withisolation-chip technology in hydrogeothermal springs. American
Geophysical Union, Fall Meeting #V51C-0369.
Chen, Y., Nishihara, A. & Haruta, S. 2021. Nitrogen-fixing ability
and nitrogen fixation related genes of thermophilic fermentative
bacteria in the genus Caldicellulosiruptor. Microbes Environ.
36:ME21018
Everroad, C. R., Otaki, H., Matsuura, K. & Haruta, S. 2012.
Diversification of bacterial community composition along atemperature gradient at a thermal spring. Microbes Environ.
27:374-381.
Hanada, S., Hiraishi, A., Shimada, K. & Matsuura, K. 1995.
Chloroflexus aggregans sp. nov., a filamentous phototrophic
bacterium which forms dense cell aggregates by active gliding
movement. Int. J. Syst. Bacteriol. 45:676–681.
Hanada, S., Shimada, K. & Matsuura, K. 2002. Active and energydependent rapid formation of cell aggregates in the thermophilic
photosynthetic bacterium Chloroflexus aggregans. FEMS
Microbiol. Lett. 208:275–279.
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－ 74 －

IFO Res.Commun. 35
75-85, 2021

新規酸素非発生型光合成細菌 Chloracidobacterium の発見とその特性
Marcus TANK＊
東京都立大学大学院理学研究科
光合成複合微生物系の環境・エネルギー活用シーズ開発寄付講座〒192-0397

東京都八王子市南大沢1-1

Characterization of novel anoxygenic photosynthetic bacteria Chloracidobacterium
Marcus TANK＊
Graduate School of Science, Tokyo Metropolitan University
Minami-Osawa 1-1, Hachioji, Tokyo 192-0397
Chloracidobacterium is reported to be the first phototrophic bacterium in the phylum Acidobacteria in 2015. For
this novel thermophilic phototroph, we clarified the biochemical properties of the photosynthetic reaction centerand determined phylogenetic diversity of the genus Chloracidobacterium through isolation of several strains fromhot springs and their comparative genomics. Chloracidobacterium does not possess gene sets for autotrophic
carbon fixing pathways but addition of CO2 to the culture stimulated the growth. Stable isotope tracer analysis
revealed CO2 utilizing metabolic pathways in Chloracidobacterium.
Key words: Acidobacterium, type I reaction center, anaplerotic reaction, hot spring緒

言2015a )．本菌は始原的な光合成生物である偏性嫌気性の緑色硫黄酸素非発生型光合成細菌に見られる特徴(Ⅰ細菌による光合成は，生命が誕生したころの古地球の型光合成反応中心，クロロソーム)を示す一方で，植物

高温環境でも進行していたと予想される．それらの好熱型の光合成生物の代謝的特徴(ケトカロテノイド合成や性光合成細菌系統群が起源となり，真核生物の植物に至酸素依存的なクロロフィル合成)も併せ持つ細菌である．

る光合成生物の多様化が進み，地球上の生態系が発達ししかし分離株は一例のみであり，研究が進んでいなかってきた．これまでにも多様な光合成細菌が世界各地で見た．そこで本研究では，本菌の生理生化学的特性を明らつかっているが，まだ人類が知らない未培養の光合成細かにするとともに，この新規系統の好熱性光合成細菌を菌の存在も示唆されている．酸素非発生型光合成細菌は，さらに陸上温泉から分離培養し，それらを分子系統学的，細菌の五つの門から見つかっていたが，著者は 2015 年

代謝学的，生理・生化学的，遺伝学的に特徴づけることに 新 た に Acidobacteria 門 に 属 す る 好 熱 性 光 合 成 細 菌を目的とした．

Chloracidobacterium 属 を 発 見 し た( Tank & Bryant,E-mail: photomic2015@gmail.com＊
Marcus TANK 現 Leibniz Institute, DSMZ
共同研究者:花田

mat19@dsmz.de智(東京都立大学大学院理学研究科，
現 産業技術総合研究所)．
Vera Thiel(東京都立大学大学院理学研究科，
現 Leibniz Institute DSMZ )永島咲子(東京都立大学大学院理学研究科，
現 神奈川大学)．
春田 伸(東京都立大学大学院理学研究科)．

実験方法
Chloracidobacterium 属細菌の培養
Chloracidobacterium 属細菌は，Tank & Bryant( 2015a,b ) に 従 っ て CTM 培 地( C. thermophilum Midnight
Medium ) で タ ン グ ス テ ン ラ ン プ に よ る 20 - 50 µmol
photons m−2s−1 の光照射下でおよそ 51 ℃にて培養した．
固体 NMR 測定用の 15N 標識培地ではバクトペプトンとアミノ酸混合の代わりに単一窒素源として 100 mg の 15N
標 識 藻 類 ア ミ ノ 酸 混 合 試 薬 NLM-2161( Cambridge－ 75 －

Marcus TANKLaboratories, Tewksbury, MA, USA )を用いた．

1993; Rassolov et al., 2001 )を使い，計算上の溶媒は THF
として，量子化学計算プログラム Gaussian 09( revision

反応中心タンパク質（ RC ）の調製

D. 01. Gaussian Inc., Wallingford, UK )にて計算した．

Chloracidobacterium (Cab.) thermophilum の 細 胞 を
150 mM のリン酸緩衝液(pH 7.2 )中でリゾチーム(3 mg/

高速液体クロマトグラフィーmL )とともに室温，暗所に 25 分静置した後，フレンチ・

精製した RC の色素組成は Frigaard et al.( 1997 )のプレス( 138 MPa )でライセート(細胞溶解液)を回収方法に従い，C18 カラムを備えた Agilent 1100 HPLC シ

した．ライセートはさらに超遠心( 220,000×g, 2 時間)

ス テ ム( Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA ) のにて膜画分を回収した．膜画分を 5 - 25％(w/v)のショ糖

RP-HPLC により行った．

密度勾配にかけ 18 時間の超遠心で深緑色のクロロソー
ム画分の下の茶褐色の RC を含む画分を得た．回収した

EPR 測定反応中心膜画分をリン酸緩衝液へ懸濁，超遠心で洗浄し連続波 (CW)-EPR 実験は E-500 ELEXSYS EPR 分光計

た．限外濾過フィルター( Centricon Plus-20 centrifugal(Bruker BioSpin Corp., Billerica, MA, USA )にて行った．

filter devices; Amicon®, Millipore Corporation, Bedford,

低温の X バンド過渡 EPR( trEPR )実験は共振器と液体

USA )で濃縮して測定試料とした．実験によってはさヘリウムクライオスタットを備えた E300 EPR 分光器

らに 0.6 M の炭酸ナトリウムを含むリン酸バッファーに( Bruker BioSpin Corp., Billerica, MA, USA )を使用して懸濁し，4 ℃で一晩静置した．RC 精製のための可溶化実施した．

は n-dodecyl-β-maltoside( β-DDM; 終濃度 1％ w/v )で行った．超遠心(200,000×g )後の上清を 10 - 50％（w/v）

時間分解吸光度変化の測定のショ糖密度勾配遠心にて RC 画分を得た．限外濾過

840 nm での時間分解電荷再結合速度測定は室温でポ( 50-kDa molecular mass cut-off; Millipore, Billerica, MA,

ンププローブ分光計( Biologic LLC, Decatur, AL, USA )USA )で濃縮した．クロロソームによって集められたを 使 用 し て 室 温 で 測 定 し た．840 nm で の 減 衰 速 度 は光エネルギーを RC へ伝達する FMO タンパク質を含む

Igor Pro( Wavemetrics, Lake Oswego, OR, USA ) の ア

画 分 は 更 に DEAE-Sepharose カ ラ ム で 精 製 し て FMO

ルゴリズムを使用してフィッテングした．

タ ン パ ク 質 を 除 去 し た． 精 製 し た RC は Genesys 10
spectrophotometer( ThermoFisher Scientific, Waltham,

酸化還元滴定MA, USA )による吸光度測定，Varian Cary 50 UV-Vis 分
光光度計を組み込んだ装置による明暗差スペクトル測定

Cab. thermophilum の ク ロ ロ ソ ー ム 除 去 膜 を 用 い てFerlez et al.(2016 )の方法に従って実施した．溶液電位に使用した．また，SDS-PAGE 法による分析を行い，ポは Ag/AgCl 参 照 電 極( Microelectrodes Inc., Bedford,

リアクリルアミドゲルから回収したタンパク質はトリプ

NH, USA )に接続された高インピーダンスデジタル電シン処理の後，ペンシルバニア州立大学の Huck 生命科

圧計にて測定し，同時にサンプリングされた各電位学研究所のプロテオミクスおよび質量分析施設にて( -300 ～ -600 mV )の試料の trEPR スペクトルを測定しLC-MS-MS による分析に供した．

た．

固体 NMR 測定

分子系統解析

固 体 NMR 測 定 は Avance-III 400-MHz NMR spectro-

16S rRNA 遺伝塩基配列を決定し，MUSCLE を用いて

meter( Bruker BioSpin GmbH, Rheinstetten, Germany )アライメントした．Maximum likelihood 法による系統

を 使 用 し た Photo-CIDNP(TPPM)MAS-NMR 法 に て

樹作成には RAxML を用いた．系統解析には Type Strain

行った( Fischer et al., 1992; Bennett et al., 1995 )．観測

Genome Ser ver( TYGS )( Meier-Kolthof f & Göker,核種として 15N で標識されたアミノ酸を使用し，ヒスチ

2019 )プラットホームのソフトウェアを使用した．

ジンのアミノ基を標準とした．対照とした亜鉛型バクテ
リオクロロフィル a( Zn-BChl a )は 15N 標識硫安を窒

ゲノム解析
細菌株からゲノム DNA を抽出し，RS-II プラットホー

素源として培養した Rhodobacter sphaeroides からメタ
ノール抽出した Mg-BChl a を酢酸亜鉛を含むバッファーム ま た は PacBio Sequel プ ラ ッ ト ホ ー ム( Pacificに高温( 90 ℃)で保温し精製して調製した( Tsukatani

Biosciences of California, Inc., CA, USA )を用いて，塩

et al., 2012 )．得られた 15N 間距離情報から分子構造を構築するための理論・基底関数は B3LYP/6-31G(d)(Becke,

基配列情報を取得した．既報に従いアッセンブルおよび
品質確認を行い，RAST アノテーションシステム( Aziz

－ 76 －

新規酸素非発生型光合成細菌 Chloracidobacterium の発見とその特性

Fig. 1 Culture appearance of different Chloracidobacterium strains in liquid CTM medium grown at 50 ℃ on day 10.

et al., 2008 )によりアノテーションを行った．
NaH CO3 標識実験13

安 定 同 位 体 13C で 標 識 し た NaH13CO3( Cambridge
Isotope Laboratory, Inc., Andover, MA,USA )を培地に添加し，培養した．培養過程から経時的に細胞を回収し，細 胞 破 砕 後，IRMS( Thermo Scientific, MA, USA ) で
δ 13C を 測 定 し た．13C 標 識 さ れ た 細 胞 内 ア ミ ノ 酸 は
Snijders et al.( 2016 ) に 従 い，GCMS を 用 い て 検 出・
定量した．

結果および考察新規 Chloracidobacterium 属細菌の分離培養と比較解析
イエローストーン国立公園( Mushroom Spring およFig. 2び Octopus Spring )の pH 8.2，50 - 60 ℃のアルカリ温泉微生物マット由来のシアノバクテリアの集積培養( Bryant

16S rRNA gene sequence-based phylogenetic
tree showing the phylogenetic position of
Chloracidobacterium spp.

et al., 2007 )から Acidobacteria 門の Chloracidobacterium
属細菌を分離した( Fig. 1 )．BT 株は Cab. thermophilumの基準株である( Tank & Bryant, 2015a )．Fig. 1 に示す
ようにいくつかの株では細胞集塊を形成するなどその増GC 含 量 な ど は 類 似 し て い た．Average Nucleotide

殖形態に違いが見られた．基準株を含む 8 株について

Identity(ANI ％)，digital DNA:DNA hybridization(dDDH)

16S rRNA 遺伝子に基づく分子系統樹を作成した(Fig. 2 )．

を解析したところ，上述の分子系統樹( Fig. 2 )と一致

Mushroom Spring から得られた D 株は，Octopus Spring

して，D 株は基準株 BT 株と高い相同性があり，98％ ANI，基準株と同系統であったが(相同性 99.9％)，他の 6 株

84％ dDDH で，同種と考えられた．相互に類似性が高は別系統の別種と考えられた．また至適生育温度，酸素

かった A 株，S 株，2 株，N 株，E 株の五つの株は，基要求性 / 感受性にも違いが見られた( data not shown )．

準株 BT 株や他の株( MS40/45 株)と，93％～ 95％ ANI，

Chloracidobacterium 属細菌分離株について，そのゲノ
ム情報を比較した( Table 1 )．ゲノムサイズ，染色体数，53％～ 58％ dDDH で，別種と考えられた．また，MS40/45
株は他と 92％ ANI，45％ dDDH の低い値を示し，種レ－ 77 －

Marcus TANK

Table 1
Characteristics

Genomic features of Chloracidobacterium spp.
Strains

T

B

D

2

A

S

N

E

MS40/45

Source*

OS

MS

MS

MS

MS

MS

MS

MS

Temp. (℃)

51-61

52

52

52

52

60

52

40-45

Size (M bp)

3.8

3.6

3.8

3.8

3.8

3.7

3.8

3.7

Number ofchromosomes

2

2

2

2

2

2

2

2

GC mol％

61.3

61.5

62.2

62.1

62.1

62.2

62.2

62.7

CDS

3424

3161

3339

3411

3407

3217

3325

3097

tRNA

48

46

47

47

48

47

49

46

rRNA operon

1

1

1

1

1

1

1

1

*MS, Mushroom Spring; OS, Octopus Spring

ベルで異なると考えられた．以上から，これら 8 株は三型好気性光合成細菌である Acidiphilium rubrum の他につの種に分けられ，既知基準種 Cab. thermophilum に続は報告例がなかった( Wakao et al., 1996 )．
本 研 究 で は 15N 標 識 し た Cab. thermophilum BT 株 のく，Chloracidobacterium 属細菌の二つの新種の発見といえる．

RC の光化学的電荷分離反応を白色光連続照射した超高速 Magic Angle Spinning 法を使った固体 NMR で計測し，Chloracidobacterium thermophilum 光 合 成 反 応 中 心 のPhoto-CIDNP -NMR 分析

3 種類の光励起蛍光シグナル(シグナル強度の高い順に，Chloracidobacterium はシアノバクテリアが優占する温泉微生物マットの下層から見つかる．マット下層の光合( Fig. 3 a のスペクトル B, D )．実験的および量子化学的化 学 シ フ ト 値 216 ppm, 250.1 ppm, 191.4 ppm ) を 得 た
な 15N NMR データに基づいて観測された信号をそれぞ

成生物は光吸収に関して様々な適応進化を遂げている

れ Chl a の N-II, N-IV, N-III( Fig. 3 b )によるものと同定( Revsbech et al., 2016; Thiel et al., 2016, 2017, 2018 )．

し，一次電子受容体であることが実証された( Zill et al.,Cab. thermophilum BT 株 は 至 適 温 度 51.6 ℃， 至 適
pH 5.0 - 7.0 の好熱性微好気細菌であり，系 I 型のホモ二2018 )．Chl a および 81-OH Chl a は，それぞれ緑色硫黄量体反応中心(RC)を有し，その周りにバクテリオクロ

ことが示されているため，Chl a 分子はすべての既知の細菌およびヘリオバクテリアの主要な電子受容体である

ロフィル(BChl)c を主要成分とする集光器官クロロソー

ホモ二量体系 I 型光合成反応中心でこの役割を果たす．

ム( chlorosome )および BChl a を含む FMO タンパク質 が 結 合 し て い る こ と が わ か っ て い る( Wen et al.,Cab. thermophilum の RC にはフィトールでエステル化されたバクテリオクロロフィル(BChl）aP，Δ2,6 -フィタ

2011 )．系 I 型 RC を持つ光合成細菌として，Firmicutes

ジエノールでエステル化されたクロロフィル(Chl )aPD ，門のヘリオバクテリアや Chlorobi 門細菌が知られている

フィトールでエステル化された亜鉛(Zn）-BChl aP' が約が，これらと異なり，Cab. thermophilum は生育に酸素

32:24:4 の モ ル 比 で 存 在 す る．RC の Photo-CIDNPを要求する．その上，RC には 3 種類のクロロフィル，-NMR 分析により，RC に含まれる 3 種類の(バクテリオ)

BChl a, Chl a, Zn-BChl a' が含まれるという特徴がある

クロロフィルの内 Chl a が RC の一次電子受容体であるが( Tsukatani et al., 2010, 2012; Tank & Bryant, 2015a )，ことが明らかになったため，RC でのモル存在比から一しかし，これらそれぞれのクロロフィルの役割はよくわ

次供与体が Zn-BChl a' であると考えられた．これはさかっていない．Zn-BChl は亜鉛結合型のバクテリオクロ

ら に，14N と 67Zn に よ る hyperfine sublevel correlation

ロフィルで，これまで Alphaproteobacteria の酸素非発生( 67Zn-HYSCORE )スペクトルの測定によって確かめる－ 78 －

新規酸素非発生型光合成細菌 Chloracidobacterium の発見とその特性

Fig. 3(a) 15N-photo-CIDNP effect observed on Cab. thermophilum BT : A, dark, cycle delay = 12 s, 16,300
scans; B, light, cycle delay = 12 s, 16,300 scans; C, dark, cycle delay = 4 s, 45,000 scans; D, light, cycle
delay = 4 s, 45,000 scans; E, dark, cycle delay = 0.5 s, 345,000 scans; F, light, cycle delay = 0.5 s, 345,000
scans, *spectrometer signal. (b) 15N photo-CIDNP MAS NMR intensity pattern of Cab. thermophilum.

と 25 kDa のペプチドが検出され，それらは，質量分析のことができた( Charles et al., 2019, 2020 )．

結果，PscA と同じオペロン上にコードされているチト
Chloracidobacterium thermophilum 光合成反応中心の分
光学的諸性質の解析
Cab. thermophilum BT の RC 標品を高度に精製し，詳
細な構造情報を得，他の系 I 型 RC との類似点や相違点を明らかにすることを目的とした．Cab. thermophilumの RC に結合するクロロソームの BChl c を除去するた

クロム c とカロテノイド結合タンパク質( CBP )複合体
( Tsukatani et al., 2012 )と同定された( Figs. 4a,b )．
以 前 の 結 果 及 び 逆 相 HPLC，LC-MS に よ り，Cab.
thermophilum の RC に含まれるクロロフィル，BChl ap ，Chl aPD ，Zn-BChl aP' の 比 率 は 7.1:5.4:1 で あ っ た．

め，リン酸バッファーで膜画分を洗浄し，ショ糖密度勾

Heliobacterium modesticaldum の RC と の 比 較 か ら，RC
あたり 32 の BChl aP ，24 の Chl aPD ，4 の Zn-BChl aP' が

配で RC 画分と分離した．さらに BChl a を含む FMO タ

含まれると推定された．RC の高解像度の明暗差スペク

ンパク質を除去するため，陰イオン交換クロマトグラ

トルからは一次電子供与体 P840 に相当する 839 nm にフィーで RC を精製した( Fig. 4 a )．Cab. thermophilum

Zn-BChl aP' の ス ペ シ ャ ル ペ ア の 特 徴( Charles et al.,のゲノムには，緑色硫黄細菌の RC に見られる PscC，2019 )が観測された．およそ 815 nm 付近には一次電子

PscD をコードする遺伝子が見つかっていない( Garcia

供与体の電荷分離によって生成された局所電場に起因す

Costas et al., 2012 )．PscC は，PscA に 強 固 に 結 合 し，る，近隣の BChl a のものと推定される電気化学的バン

RC の電荷分離反応によって酸化した一次電子供与体

ドシフトが生じた．

( P840＋)に電子を供与する二組の膜に結合した c 型チト

クロロソームを除去した膜サンプルを用いて P840＋とクロムである．また PscD は，PscB の FA/FB クラスター

PscB に 結 合 し た [FA/FB]- の 電 荷 再 結 合 速 度 を 840 nm

からフェレドキシンへの電子伝達を促進させる役割を持で 測 定 し た．PSI の 60 ms( Vassiliev et al., 1997 )，H.

つ．Cab. thermophilum から精製した RC には粗精製の段階では認められた PscB が精製過程で除去された．精製

modesticaldum( Heinnickel & Golbeck, 2007 ) の 70 msと比べると比較的遅い 156 ms で 47％の再結合反応が観RC の SDS-PAGE 解析では，16 kDa の c 型のチトクロム

測 さ れ た．P840＋ と PscA 内 の FX- で は 同 様 に PSI で－ 79 －

Marcus TANK

Fig. 4 Preparation of highly purified RCs from Cab. thermophilum BT. (a) Twice linear 5 to 25％ sucrose gradientsused to prepare a crude RC fraction devoid of the carotenoid-binding protein CbpA. The crude RCs were
further purified by chromatography on DEAE- cellulose and were analyzed on SDS-PAGE gels stainedwith silver. Markers and their sizes are shown to the left, and selected proteins are identified by the locus
tag numbers for the corresponding genes. (b) The organization of the reaction center operon that
includes pscA, pscB, and fmoA as well as a gene encoding an ArsA- like ATPase and two predicted c-type
cytochrome lipoproteins. (c) Schematic illustration of the RC complex in Cab. thermophilum based on the
RC complex model proposed by Cba tepidum (Frigaard et al., 2003). Subunits that were absent in genome
analysis (Garcia Costas et al., 2012) are shown by the dotted line. The arrangement model of electrontransport chain cofactors in RC of Cab. thermophilum is based on the position of the cofactors in the
structure of the H. modesticaldum homodimeric type-1 RC (PDB entry 5VHK; Gisriel et al., 2017). The
electron trans- port chain comprises a P840 special pair of Zn-BChl aP' molecules (Charles et al., 2019);
the accessory Chls A –1, which are most likely Mg-BChl aP (or possibly Zn-BChl aP'); and the primary
acceptor Chls, A0, which are Chl aPD( Zill et al., 2018). Zn2＋ ions are shown as gray spheres, and Mg2＋
ions are shown as green spheres. The intrasubunit [4Fe–4S] cluster FX is ligated by two cysteine residues
from each PscA subunit of the RC homodimer. The esterifying alcohol tail groups have been omitted forclarity (Redrawn from He et al., 2019).

－ 80 －

新規酸素非発生型光合成細菌 Chloracidobacterium の発見とその特性

1.5 ms，H. modesticaldum で 15 ms であるところ，20 ms

子が伝達されることがわかった．分離膜画分の洗浄実験

で 53％の再結合であった．EPR により測定された電荷

では PscB サブユニットはヘリオバクテリアの PshB よ

再結合速度は 90 K の低温では 80 ms の P840＋と FX- とのり強く RC に結合していた．Cab. thermophilum の RC は再結合が観測され，低温では効率が低いことが示された．

他のホモ二量体の RC に似た特性と，系 I 型により似て

過渡 EPR( trEPR )による Fx の中点電位測定の結果，H.

いる特性もある．これらの違いはおそらく電子伝達系をmodesticaldum( -504±10 mV )( Ferlez et al., 2016 ) より 77 mV 低い -581±7 mV であった．

酸素から保護し，この微好気細菌の酸素耐性にも寄与す

リン酸緩衝液で洗浄した膜を trEPR で測定したとこ

thermophilum RC の電子伝達系モデルを Fig. 4 c に示した．

ろ，スピン偏極した P Fx ラジカルペアのシグナルが＋-ると考えられる．これらのことから推測された Cab.

観測された．項間交差の結果として，BChl アンテナ分
子からの三重交差に特徴的な弱い偏波パターンが見られChloracidobacterium thermophilum の二酸化炭素代謝

た．これはアンテナの励起状態の殆どが P840 に効果的に移動していることを示す．Fx が還元状態のときにはChloracidobacterium 属細菌の基準種 Cab. thermophilum
BT のゲノム解析から，本菌はこれまでに見つかっている

一次ラジカルペアにおける一重項―三重項混合の結果といずれの独立栄養性炭酸固定経路も有していないと考えしての P＋ A 0- ラジカルペア再結合のシグナルが観測さられた( Garcia Costas et al., 2012; Tank & Bryant, 2015a,

れた．このことから，一次電子受容体が Chl a で一次電

2015b; Tank et al., 2018 )．しかし，培養系に CO2 を添加

子供与体が( Zn- )BChl a であると推測された．

すると本菌の増殖が促進されることが観察された

クロロフィル蛍光測定では 839 nm に光励起酸化還元( Fig. 5 )． そ こ で，13C で 標 識 し た NaHCO3 を 用 い て，差スペクトルのピークを持ち，P840＋付近のカロテノイ細胞への 13C の取り込みを確認するとともにその取り込ドによるバンドシフトも明らかにした．FX [4Fe–4S] ク

み代謝経路を解析した．NaH13CO3 を添加した培地で培

ラスターの酸化還元中点電位はおよそ -581 mV で P＋ FX−

養した菌体を回収し，質量分析によって 13C の取り込みのスピン偏極ラジカル対の分光学的特徴はヘリオバクテ量を測定したところ，菌体全炭素量 3％ ～ 4％の割合で

リアや緑色硫黄細菌とよく似ていた．さらに，他の RCs

13

C が検出された．

のホモ二量体系 I の RC と同様に，A 0 から FX へ直接電−Fig. 5Growth curve showing the effect of bicarbonate on growth of Cab. thermophilum BT.
Open circle, without NaHCO3; Closed circle, with NaHCO3.

－ 81 －

Marcus TANK

CO2 の取り込みとその代謝経路を探るため，GCMS

らの前駆体であるピルビン酸や α ケトグルタル酸を経由による 13C 標識化合物の同定を試みた．得られた結果とする取り込みも考えられた．ただし，既報のよく知られゲノムからみつかる代謝酵素の情報をもとに炭素代謝フた酵素，ピルビン酸デヒドロゲナーゼや α ケトグルタル

ローを Fig. 6 のように推定できた．アスパラギン酸およ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子はなく，代わり

びメチオニンへの 13C 標識が見られたことから，CO2 はに 2 オキソ酸:フェレドキシン酸化還元酵素がこれらの

これらアミノ酸の前駆体であるホスホエノールピルビン

反応を触媒していると推定される．さらに興味深いこと

酸からオキサロ酢酸に至るアナプレロティック反応ににゲノム情報からリジンの生合成経路を欠いていると予よって取り込まれると考えられた．また，アラニンおよ

想されていたが，13C 標識されたリジンも検出され，未びグルタミン酸への顕著な 13C の取り込みもあり，これ

知代謝酵素を有している可能性が示唆された．

Fig. 6 Metabolic route for Cab. thermophilum BT based on the genomic data and 13C proteogenic isotope tracing
via GCMS.
1, phosphoenolpyruvate carboxykinase; 2, phosphoenolpyruvate carboxylase; 3, NAD-dependent malic
enzyme; 4, 2-oxoacid:ferredoxin oxidoreductase－ 82 －

新規酸素非発生型光合成細菌 Chloracidobacterium の発見とその特性

結bacteriochlorophylls. Langmuir. 33: 6427–6438.
3) Tank, M., Liu, Z., Frigaard, N.U., Tomsho, L.P., Schuster,
S.C. & Bryant, D.A. 2017. Complete genome sequence ofthe photoautotrophic and bacteriochlorophyll e-synthesizing
green sulfur bacterium Chlorobaculum limnaeum DSM
1677T. Genome Announc. 5: e00529-17.
4) Zill, J.C., He, Z., Tank, M., Ferlez, B.H., Cannif fe, D.P.,
Lahav, Y., Bellstedt, P., Alia ,A., Schapiro, I., Golbeck, J.H.,
Br yant, D.A. & Matysik, J. 2018. 15N photo-CIDNP MAS
NMR analysis of reaction centers of Chloracidobacterium
thermophilum. Photosynth. Res. 137: 295–305.
5) Günther, L.M., Löhner, A., Reiher, C., Kunsel, T., Jansen,
T.L.C., Tank, M., Br yant, D.A., Knoester, J. & Köhler, J.
2018. Structural variations in chlorosomes from wild-type
and a bchQR mutant of Chlorobaculum tepidum revealed bysingle-molecule spectroscopy. J. Phys. Chem. B. 122: 6712–
6723.
6) He, Z., Ferlez, B., Kurashov, V., Tank, M., Golbeck, J.H. &Br yant, D.A. 2019. Reaction centers of the thermophilic
microaerophile, Chloracidobacterium ther mophilum(Acidobacteria) I: biochemical and biophysical characterization. Photosynth. Res. 142: 87–103.
7) Tsuji, J.M., Shaw, N.A., Nagashima, S., Venkiteswaran, J.J.,
Schiff, S.L., Hanada, S., Tank, M. & Neufeld, J.D. 2020.
Anoxygenic phototrophic Chloroflexota member uses a
Type I reaction center. bioRxiv. 2020.07.07.190934. (posted
2020-08-28)
8) Tsuji, J.M., Tran, N., Schiff, S.L., Venkiteswaran, J.J., Molot,
L.A., Tank, M., Hanada, S. & Neufeld, J.D. 2020. Anoxygenic
photosynthesis and iron–sulfur metabolic potential of
Chlorobia populations from seasonally anoxic Boreal Shieldlakes. ISME J. 14: 2732–2747.
9) Saini, M. K., Sebastian, A., Shirotori, Y., Soulier, N.T., Garcia
Costas, A.M., Drautz-Moses, D.I., Schuster, S.C., Albert, I.,
Haruta, S., Hanada, S., Thiel, V., Tank, M., and Bryant, D.A.
2021. Genomic and phenotypic characterization of
Chloracidobacterium isolates provides evidence for multiple
species. Front. Microbiol. (in press)

語

本研究では，Acidobacteria 門に見つかった好熱性光合成細菌 Chloracidobacterium 属細菌について，その系
統的多様性，ゲノム情報および生理生化学的特性を明らかにできた．我々は，系 I 型光合成反応中心複合体を持つ光合成細菌について，他にもそのタンパク質構
造解析( Günther et al., 2018 )や新規系統の分離培養( Tsuji et al., 2020a; Tsuji et al., 2020b )を報告しており，
Chloracidobacterium 属細菌を含むこれら始原的な光合成細菌に関する知見は，光合成生物の進化だけでなく，地球環境の形成の観点からも意義深い．

要約

Chloracidobacterium 属細菌は，2015 年に Acidobacteria
門に初めて見つかった新規系統の好熱性光合成細菌である．本研究では光合成反応中心の生化学的特徴を解明するとともに，新たに複数の Chloracidobacterium 属細菌株を分離することに成功し，それらのゲノム比較から種の多様性を明らかにした．また，ゲノムには炭酸固定関連遺伝子が見つからないが，その生育には CO2 の添加が促進的に働くことが示され，安定同位体標識した CO2を用いたトレース解析から，本菌の CO2 利用代謝経路を明らかにした．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表
1) Thiel, V., Tank, M., Mar tinez, J.N., Trampe, E.C.L.,
Lichtenberg, M., Kühl, M., Hanada, S. 2018. Microbial
diversity and activity in a hot spring associated oxygenic
phototrophic microbial mat disclosed by a comprehensive
multi-method study. 16th International Symposium on
Phototrophic Prokaryotes (ISPP) (August 5-9, Vancouver,
Canada)2) Tank, M., Thiel, V., Br yant, D.A., Hanada, S. 2018. Hot
springs microbial mats are treasure chests for the isolationof novel chlorophototrophic bacteria. 16th International
Symposium on Phototrophic Prokaryotes (ISPP) (August
5-9, Vancouver, Canada)
原著論文
1) Thiel, V., Tank, M., Tomsho, L.P., Burhans, R., Gaya, S.E.,
Hamilton, T.L., Schuster, S.C. & Br yant, D.A. 2017. Draft
genome sequence of Anoxybacillus ayderensis strain MT-Cab(Firmicutes). Genome Announc. 5: e00547-17
2) Orf, G.S., Collins, A.M., Niedzwiedzki, D.M., Tank, M.,
Thiel, V., Kell, A., Br yant, D.A., Montano, G.A. &Blankenship, R.E. 2017. Polymer-chlorosome nanocomposites consisting of non-native combinations of self-assembling

その他(総説・書籍・特許など)
1) Thiel, V., Tank, M. & Bryant, D.A. 2018. Diversity of chlorophototrophic bacteria revealed in the Omics Era. Annu. Rev.
Plant Biol. 69: 21–49.

謝辞

本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．また，
本 研 究 の 遂 行 に ご 協 力 い た だ い た Bryant 博 士( Pennsylvania State University, USA )，Tomsho 博 士( Pennsylvania State University, USA )，Burhans 博 士( Pennsylvania State University, USA )，Gay 博 士( Pennsylvania State University, USA )，Hamilton 博士( Pennsylvania State University, USA )，Schuster 博士－ 83 －

Marcus TANK文

( Pennsylvania State University, USA )，Blankenship 博士( Washington University, USA )，Orf 博 士( Washington
University, USA )，Collins 博 士( Los Alamos National
Laboratory, USA )，Montaño 博士( Los Alamos National
Laborator y, USA )，Niedzwiedzki 博 士( Washington
University, USA )，Kell 博 士( Kansas State University,
USA )，Liu( Pennsylvania State University, USA )，Frigaard 博 士( University of Copenhagen, Denmark )，Zill 博 士( University of Leipzig, Germany )，He 博 士( P e n n s y l v a n i a S t a t e U n i v e r s i t y, U S A )， F e r l e z( Pennsylvania State University, USA )，Cannif fe( Pennsylvania State University, USA )，Lahav 博士( The
Hebrew University of Jerusalem, Israel )，Bellstedt 博 士( Friedrich-Schiller-Universität Jena, Germany )，Alia 博士( University of Leiden, Netherlands )，Schapiro 博 士( The Hebrew University of Jerusalem, Israel )，Golbeck
博 士( Pennsylvania State University, USA )，Matysik 博士( University of Leipzig, Germany )，Günther, 博 士( University of Bayreuth, Germany )，Löhner 博 士( University of Bayreuth, Germany )，Reiher 博 士( University of Bayreuth, Germany )，Kunsel 博 士( University of Groningen, Netherlands )，Jansen 博 士( University of Groningen, Netherlands )，Knoester, 博士( University of Groningen, Netherlands )，Köhler 博 士( University of Bayreuth, Ger many )，Ferlez 博 士( Pennsylvania State University, USA )，Kurashov 博 士( Pennsylvania State University, USA )，Golbeck, 博 士( Pennsylvania State University, USA )，Tsuji 博 士( University of Waterloo, Canada )，Shaw 博士( Universityof Waterloo, Canada )，Tran 博士( University of Waterloo,
Canada )，Schiff, 博士( University of Waterloo, Canada )，Venkiteswaran 博 士( University of Waterloo, Canada )，Molot, 博士( York University )，Neufeld 博士( Universityof Waterloo, Canada )，Sebastian 博 士( Pennsylvania
State University, USA )，Soulier 博士( Pennsylvania State
University, USA )，Garcia Costas 博 士( Pennsylvania
State University, USA )，Drautz-Moses 博 士( Nanyang
Technological University, Singapore )，Schuster 博 士( Nanyang Technological University, Singapore )，Albert
博 士( Pennsylvania State University, USA )，Ward 博 士( Montana State University, USA )，Moran 博 士( PacificNorthwest National Laboratory, USA )，Kim 博士( PacificNorthwest National Laboratory, USA )，嶋田敬三東京都立大学名誉教授ならびに光合成複合微生物寄付講座( Photomic Lab. )の学生諸氏に感謝の意を表します．

献

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－ 85 －

IFO Res.Commun. 35
87-96, 2021

好熱性シアノバクテリアの多様性
花

智＊

田

東京都立大学大学院理学研究科

光合成複合微生物系の環境・エネルギー活用シーズ開発寄付講座〒192-0397

東京都八王子市南大沢1-1

Diversity of thermophilic cyanobacteria
Satoshi HANADA＊
Graduate School of Science, Tokyo Metropolitan University
Minami-Osawa 1-1, Hachioji, Tokyo 192-0397
This study applied environmental DNA analyses to terrestrial hot springs and determined distribution anddiversity of thermophilic cyanobacteria in the thermal environments. We detected more diverse cyanobacteria than
expected and found cyanobacteria in novel lineages. We successfully cultivated thermophilic cyanobacteria andclarified their genomic information, molecular phylogeny, and physiology such as N 2 -fixing ability, far-red lightutilizing ability, growth temperature and growth pH.
Key words: Cyanobacteria, hot springs, microbial mats緒

言アノバクテリアの存在が指摘される．また，シアノバク
テリアは生育に伴い二酸化炭素を吸収すると，その環境

シアノバクテリアは酸素発生型光合成能を有する唯一はアルカリ化する．そのため，シアノバクテリアは一般の細菌群で，系統的にはひとつの門に限定的に分布して的にアルカリ性条件に抵抗性を示す( Stal, 2012 )．しかいる．シアノバクテリアは地球生態系の 1 次生産に大きし，pH 9.5 以上の高アルカリ環境で生育するシアノバク

く貢献しているだけでなく，農業，産業，医療への利用

テリアは報告例が少なく，特に好熱性の種はほとんど見技術の開発も進んでいる．古くから研究される微生物のつかっていない．本研究では，陸上温泉における好熱性一つであるが，形態的特徴による分類体系が中心であっシアノバクテリアの分布と多様性を明らかにするとともた( Castenholz, 2001 )．海洋，湖沼や土壌圏に生息するに，耐アルカリ/ 好アルカリ性好熱性シアノバクテリア

シアノバクテリアに関する生態機能や多様性についてのを探索することを目的とした．

研究に比べて，陸上温泉などの高温環境におけるシアノ

実験方法

バクテリアの系統的多様性，遺伝的多様性，生理的多様性に関する研究はまだ少なく，未知，未培養の好熱性シ

PCR アンプリコン解析
E-mail: photomic2015@gmail.com＊
花田 智 現 産業技術総合研究所

微 生 物 マ ッ ト か ら の DNA 抽 出 に は MO BIO Power
Biofilm DNA extraction kit( Qiagen, Hilden, Germany )satohana@tmu.ac.jpを用いた．抽出した DNA 試料を鋳型として，プライマー

共同研究者:永島咲子(東京都立大学大学院理学研究科，
現 神奈川大学)．
佐藤 剛(東京都立大学大学院理学研究科，
現 神奈川大学)．
Martinez, J. N.(東京都立大学大学院理学研究科，
現 University of St. La Salle，広島大学)
春田 伸(東京都立大学大学院理学研究科)．

515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')およびプライ
マー 806R(5'-GGACTACHVHHHTWTCTAAT-3')を用いて，16S rRNA 遺伝子の V4 領域を PCR 増幅した．酵素は Takara Taq HS polymerase( Takara Bio, Japan )を
使 用 し た． 精 製 PCR 産 物 は dsDNA BR assay( Life
Technologies )と Qubit 3.0 fluorometer( Invitrogen )を－ 87 －

花田智

使 用 し て 定 量 後，2-step tailed PCR 法 に よ り ラ イ ブ ラ

106F(5'-CGGACGGGTGAGTAACGCGTGT-3')(Nübel et

リーを作製した．ライブラリーの定量には Synergy H1( Bio Tek )および QuantiFluor dsDNA System を用いた．

al., 1997)および PLG2.3R(5'-CTTCAYGYAGGCGAGTTG
CAGC-3')(Urbach et al., 1992)，PCR 酵 素 Ex Taq Hot

Illumina Miseq システムと MiSeq Reagent Kit v3（Illumina）

Start Version(タカラバイオ)を用いた．PCR 産物はを用いて，2 x 300 bp の条件でペアエンドシーケンス解

NucleoSpin Gel and PCR Clean-up kit(Macherey-Nager,

析を行った．得られた配列データから，Fastx toolkit(ver.

Landsmeer, The Netherlands)にて精製し，分光分析とア

0. 0. 14 )を用いてプライマー配列に一致したリードを

ガロースゲル電気泳動による検出・定量の後，シークエ

抽出し，Qiime2( ver. 2020. 8 )によりプライマー配列

ンス反応の鋳型とした．シークエンス反応には，BigDye™

と 3' 末端の 50 bp，キメラ配列，ノイズ配列を除去する

Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit を使用し，PCR とことで代表配列および OTU 表を出力した．取得した代同じプライマーにて実施した．シークエンス反応後の精表配列を公的データベース Greengene( ver. 13_8 )の製 に は BigDye XTerminator™ Purification Kit(Applied

OTU(97％相同性)と比較することで系統推定を行った．

Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いた．塩基配列
決 定 に は DNA シ ー ケ ン サ ー ABI3130xl(Applied

シアノバクテリアの培養

Biosystems)を使用した．

シアノバクテリアの培養には BG11 培地あるいは窒素源を除いた BG110 培地を用いた( Rippka et al., 1979 )．

分子系統解析

採 取 し た 試 料 を BG11 培 地 に 接 種 し， 白 色 LED 照 射

得 ら れ た 16S rRNA 遺 伝 子 塩 基 配 列 は SeqMan Pro( 3 μmol m-2 s-1 ，12 時間周期の明暗サイクル)条件で培養(DNAStar, Inc., Madison, WI, USA)にてコンティグ化しした．好アルカリ性のシアノバクテリアの培養には，培た 後，NCBI の BLAST( https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/

地の pH を 20 mM の N-Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic

Blast.cgi )を用いた相同性検索により得られた近縁種のacid(CHES)を用いて採集地の pH に調整した．分離培

塩基配列とともに系統解析に供した．アライメント処理

養には 1 mL の滅菌水中で白金耳あるいはホモジナイを実行するプログラムには Clustal W( Thompson et al.,ザーペッスルを用いて菌塊片を破砕し，懸濁液を 1.3％

1994 ) を 用 い た． 系 統 解 析 は MEGA7( Kumar et al.,(w/v)寒天( BactoTM Agar; BD, NJ, USA )あるいは 0.8％

2016 )にて行い，最尤法にて系統樹を作成した．

(w/v)ジェランガム( gellan gum; 和光純薬工業，大阪)
培地に塗布した．これを 3 回以上繰り返した細菌塊を形

ゲノム解析

態観察及びシークエンス解析試料とした．形態観察は位分離株から抽出・精製した DNA からライブラリーを相差蛍光顕微鏡( ECLIPSE E600; Nikon, 東京)にて行っ

調製し，GridION X5( Oxford Nanopore )および HiSeq

た．715 nm 以上を透過する蛍光フィルターでシアノバ

2000( Illumina ) を 使 用 し 塩 基 配 列 情 報 を 取 得 し た．

クテリアのクロロフィル a の自家蛍光を特異的に検出

GridION X5 で得られた配列から，Porechop( v. 0. 2. 3 )し，イメージングソフトウェア(NIS-Elements D, Nikon,

によりアダプター配列のトリミングを行い，Filtlong( v.

東京)で撮影した．

0. 2. 0 )および Canu( v. 1. 8 )によりエラー配列を取りアルカリ耐性や最適 pH を調べるために pH 7.0 ～ 11.0

除いた．HiSeq 2000 で得られた配列から，Cutadapt( v. 1.

の各 pH にて培養試験を行った．培養は培養プレートに0 )によりアダプター配列のトリミングを行い，SeqKit( v.

800 μl の BG11 培 地，100 μl の 200 μM の Good's buffer

0. 11. 0 )および Sickle( v. 1. 33 )によりエラー配列を(HEPES, tricine, CHES, CAPS; 同仁化学研究所，熊本)，取り除いた．GridION X5 および HiSeq 2000 から得られ

100 μl の懸濁培養液を混合して 30 ℃あるいは 40 ℃連続た塩基配列のハイブリッド・アッセンブルは Unicycler(v.

照射好気条件下で行った．増殖量は 11 日後のクロロフィ

0. 4. 7 )を用いて行った．アッセンブル配列のアノテー

ル a 量を Grimme & Boardman(1972)に従って推定した．

シ ョ ン 解 析 に は Rapid Annotations using Subsystems
Technology(RAST, v 1.073)を使用した．

16S rRNA 遺伝子塩基配列結果および考察

細菌菌体からの DNA 抽出は DNeasy PowerBiofilm Kit(Qiagen, Hilden, Germany)を使用したビーズ破砕法にて行った．抽出した DNA は分光光度計 BioSpec-nano(島陸上温泉におけるシアノバクテリアの分布と多様性

津製作所，京都)で定量した．抽出した DNA を鋳型とし長野県中房温泉において 45 ℃ ～ 65 ℃の温泉流水中にて，PCR 法により 16S rRNA 遺伝子を増幅した．PCR に発達する微生物マットを採取し，DNA を抽出して，16S

はシアノバクテリアの 16S rRNA 遺伝子特異的プライマー

rRNA 遺伝子を対象にしたアンプリコン解析に供した．

－ 88 －

好熱性シアノバクテリアの多様性

得られた塩基配列を系統解析した結果を Table 1 に示す．
60 ℃を超える試料からは優占的に Thermosynechococcus

Leptolyngbya は系統的に多様で，淡水から海水環境まで広く見つかっている．上述したように，長野県中房温泉

属の配列が得られた．本シアノバクテリアは，生理・生の弱アルカリ性硫化水素泉に発達する微生物マットに

化学的にもよく研究されてきた単細胞性好熱性シアノバ

は，45 ℃～ 60 ℃の温度域に七つの系統( Groups A ～ G,

クテリアの一つで，これまでに中房温泉だけでなく，日Table 1 )の Leptolyngbya が混在していることが示唆され本各地の温泉から報告があり，類縁種は世界中の陸上温た．中には，これまで他の環境でほとんど見つかってい泉からも見つかっている( Katoh et al., 2001; 春田, 2012;ない系統や未記載の系統もあった．これら試料から好熱

Papke et al., 2003; Thiel et al., 2016 )．また高温域からは性 Leptolyngbya シアノバクテリアの分離培養を試みた．

Chlorogloeopsis に分類される配列も見つかった．本系統
群は，中温性のヘテロシスト形成性糸状性シアノバクテ

中房温泉から採取した微生物マット試料を BG11 液体培

リアとして知られている．過去には好熱性株も報告されバクテリア培養系を選別していった．さらに，マイクロ地に接種し，継代培養を繰り返したのち，糸状性シアノているが，その遺伝学的，生理・生化学的研究は進んでシリンジ( 0.5×25 mm; TERUMO, 東京)を用いて倒立

い な い( 春 田, 2012; Castenholz, 2001; Estrella et al.,

顕微鏡( IX73; OLYNPUS, 東京)下で糸状体を分取した．

2017 )．一方，北米等の同じような温度域の陸上温泉か得られた培養系から 16S rRNA 遺伝子塩基配列を決定しら高頻度に報告されている Mastigocladus 属は中房温泉

系統解析した結果，アンプリコン解析で検出されていたからは検出されなかった．

七つのグループの Leptolyngbya のうち，四つの系統の

60 ℃以下の温度域からは，Leptolyngbya 系統群の実に多様な配列が検出された．Leptolyngbya 系統群も上述のLeptolyngbya シアノバクテリア( Group B, C, D, E )が培養できたことがわかった．Group C については，配列

Chlorogloeopsis と同様に中温性のシアノバクテリアとして知られていたが，最近，高温環境からの検出例が増え( Fig. 1 )．

の違いから二つのサブグループ C1 と C2 に分けられたてきている( Strunecky et al., 2019 )．しかし，培養され，得られた Leptolyngbya シアノバクテリアについて，形

生理生化学性状が調べられた例はまだ少ない．中房温泉

態を比較した( Fig. 2 )．既報の Leptolyngbya シアノバクから検出された Leptolyngbya 系統群には，熊本の温泉かテリアに観察されていたように，細胞凝集を形成するこらの分離株( Leptolyngbya sp. O-77，Table 1 )や中国四と，ヘテロシスト等の分化細胞を作らないこと，薄い莢

川省の温泉から最近，報告された配列と相同性がみられ膜に覆われた多細胞糸状性であること，糸状体に分岐がるものもあったが( Group B や Group E, Table 1 )，新見られないこと，という形態学的特徴を示した．しかし，

規配列も見つかった．

Group E に分類される Leptolyngbya シアノバクテリアには，他と異なり，偽分岐(短い分岐)がみられることを

Leptolyngbya シアノバクテリアの分布と系統学的・生理
学的多様性

発見した．

Leptolyngbya はヘテロシスト非形成性・非分岐型の糸状性シアノバクテリアの一群である( Komarek, 2014 )．

シアノバクテリアも 60 ℃では生育が見られず，Group

Table 1

続いて，増殖温度域を比較した．いずれの Leptolyngbya
D および E の増殖最高温度は 57 ℃であった．興味深い

A list of cyanobacteria detected from Nakabusa Hot Springs

Phylogenetic group

Cultured relatives

Thermosynechococcus

Thermosynechococcus sp. NK55

Temp. (℃)
45 - 60

Chlorogloeopsis

Chlorogloeopsis sp. ON57a

57- 69

Leptolyngbya Group A

n.r.

45

Leptolyngbya Group B

Leptolyngbya sp. PKUAC-SCTA121

45 -50

Leptolyngbya Group C

Leptolyngbya sp. O-77

45 - 60

Leptolyngbya Group D

Leptolyngbya sp. Nb3F1

45 - 60

Leptolyngbya Group E

Leptolyngbya sp. PKUAC-GDTS1-24

60

Leptolyngbya Group F

n.r.

45

Leptolyngbya Group Gn.r.

45 -50n.r., not reported (not cultivated yet)

－ 89 －

花

田智Fig. 1 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequences for Leptolyngbya obtained from Nakabusa Hot Springs andthe relatives.
Phylogenetic tree was inferred by using the Maximum Likelihood method. The robustness of the tree wastested with 100 bootstrap replicates and the bootstrap values are shown at the nodes.

－ 90 －

好熱性シアノバクテリアの多様性

Fig. 2

Photo images of the Leptolyngbya cultures (left) and their microscopic images (right)－ 91 －

花

田智か．生理学的多様性の一つとして近赤外光の利用能が挙ことに Group C では，サブグループ C1 とサブグループ
C2 で増殖温度が異なり，C1 が 55 ℃で増殖能を示したげられる( Ohkubo & Miyashita, 2017 )．1 cm 程度までのに対し，C2 は 55 ℃では生育しなかった．16S rRNA

厚く発達する微生物マットにおいて，深度ごとに届く光

遺伝子塩基配列に基づく分子系統と増殖温度特性には関の 波 長 が 異 な る こ と が 示 さ れ て い る( Nishida et al.,連性があると思われた．また今回調べたすべてのグルー2018; Martinez et al., 2019)．シアノバクテリアの系統的・

プの Leptolyngbya シアノバクテリアが窒素化合物無添加

生理的多様性を生み出す環境因子に興味がもたれ，本研

BG11 培地での生育を示し，窒素固定能が確認された．

究の知見および得られた培養株は，今後の研究に大きく貢献できると期待される．

Group D に分類される Leptolyngbya シアノバクテリア
として，2017 年に中房温泉から大久保 & 宮下によって

好熱性 Chlorogloeopsis シアノバクテリアの比較ゲノム解析

Leptolyngbya sp. Nb3F1 が分離され，近赤外光を吸収す
る特殊なクロロフィル，クロロフィル f を有することが示された( Ohkubo & Miyashita, 2017 )．本研究で得らChlorogloeopsis は形態に基づく分類法で subsection Vに分類されている糸状性ヘテロシスト形成性シアノバク

れた Leptolyngbya シアノバクテリアについても近赤外光テリアである(Castenholz, 2001 )．なかには，クロロフィ

利用性を調べたところ，Leptolyngbya sp. Nb3F1 同様に

ル d やクロロフィル f を合成する種がいる等，生理的にGroup D の Leptolyngbya シ ア ノ バ ク テ リ ア の ほ か，

多様な種がみつかっている( Airs et al., 2014; Antonaru

Group E シアノバクテリアも近赤外光照射条件(ハロゲンランプ照射，< 700 nm カットフィルター)で増殖能をet al., 2020 )．その多くは，中温性であるが，好熱性株の存在も知られていた．しかし，好熱性株の生態学的，遺示した．Group E シアノバクテリアの近赤外光利用能に伝学的知見はほとんどない．本研究および近年の研究でついては，本研究が初めての報告である．

温泉地に Chlorogloeopsis が分布していることが知られるようになってきた(春田, 2012 )．上述した長野県中房温以上から，中房温泉という限られた地域において多様泉だけでなく，宮城県鬼首温泉からも見つかり，分離株

な好熱性シアノバクテリアが分布していることが明らかが報告されている(春田, 2012 )．本研究では，鬼首温泉になった．培養株も多系統から得られ，分子系統と生理より分離された，Chlorogloeopsis 属の ON57a 株(=NBRC

学的知見に基づいた好熱性シアノバクテリアの系統分類

108921 )について，全ゲノム解読を行った．その結果，学的研究の礎を築くことができた．60 ℃以上の高温領

ON57a 株 は 4.9 Mbp の 環 状 ゲ ノ ム を 持 ち，GC 比 率 は域には Thermosynechococcus，Chlorogloeopsis が主に検出

42.4％であった．アノテーション解析により，4890 個のされ，これらはよく研究されている北米の温泉シアノバ

タンパク質遺伝子，4 セットの rRNA 遺伝子，49 個のクテリアとは異なる系統であることが示唆される(春田tRNA を持つことが分かった．Chlorogloeopsis 属ではこれ

2012; Papke et al. 2003 )．60 ℃以下の温度域に観察されま で，Chlorogloeopsis fritschii PCC 6912，Chlorogloeopsis

た Leptolyngbya は，日本国外の温泉シアノバクテリアと相同性がみられるものもあったが，一か所の温泉地から

fritschii PCC 9212，Chlorogloeopsis sp. PCC 7702 の 3 株
で ゲ ノ ム 配 列 が 報 告 さ れ て い る．Average Nucleotide

これほどまでに多系統の Leptolyngbya シアノバクテリア

identity( ANI )法による解析では，Chlorogloeopsis sp.

が検出された例は他にない．中房温泉は年間を通して温PCC 7702 と 99 ％ 相 同 を 示 し た 一 方，Chlorogloeopsis

泉水が安定に流出しており環境変動は小さいと考えられ
る．微生物マット内に異なるミクロニッチが形成されて

fritschii PCC 6912 ，Chlorogloeopsis fritschii PCC 9212 とは 80％程度であった( Table 2 )．Chlorogloeopsis 属内でいることが考えられるとともに，Leptolyngbya の生理学の分類を整理する上で有効な知見である．
ON57a 株のゲノムから窒素固定関連遺伝子セットが的多様性が多種共存を可能にしているのではないだろう

Table 2

Pairwise Average Nucleotide Identity (ANI) analyses for genome sequenced Chlorogloeopsis strains.

ON57a

ON57a

PCC 7702

PCC 6912

PCC 9212100％

99.46％

80.00％

79.93％

PCC 7702-

100％

79.79％

79.82％PCC 6912

-

-

100％

99.93％

PCC 9212

-

-

-

100％

－ 92 －

好熱性シアノバクテリアの多様性

Fig. 3Maps of the two nitrogenase gene clusters in Chlorogloeopsis sp. ON57a.

二 つ 見 つ か っ た( Fig. 3 )． 遺 伝 子 セ ッ ト の 一 つ は，nif B, nif S, nif U, nif H, nif D, nif K, nif E, nif N, nif X, nif W
オペロンと nif V, nif Z, nif T オペロンからなり，これらは酵素活性部位にモリブデンを配位する Mo 型ニトロゲ
ナーゼの発現・成熟に必要な遺伝子として知られる．オペロン構造を他の近縁 Chlorogloeopsis 属シアノバクテリ
アと比較すると，Chlorogloeopsis fritschii PCC 6912 およびChlorogloeopsis fritschii PCC 9212 では，nif D と nif K の間に約 8.2 kbp の別の遺伝子群が入っており，nif D と nif Kは分断されているが，ON57a および Chlorogloeopsis sp.
PCC 7702 ではこのような分断配列が見られなかった．もう一つの遺伝子セットはバナジウム( V )型ニトロゲナー
ゼ で，vnfDG, vnfK, vnfE, vnfN を 含 む．Chlorogloeopsis
sp. PCC 7702 も同様の遺伝子群を保有しているが，活性部 位 を コ ー ド す る vnf DG の 大 部 分 を 欠 損 し て い る．
ON57a はバナジウム(主にバナジン酸)を細胞内に取り入れるための膜貫通型の輸送タンパクをコードする
vupA, vupB, vupC を有していた．ON57a はモリブデン
枯渇等で Mo 型ニトロゲナーゼが活用できない環境でも，V 型ニトロゲナーゼを使って窒素固定生育できると考えられた．
好アルカリ性好熱性シアノバクテリアの培養とその生理学的性質
山梨県の桃の木温泉( pH 9.6, 42.6 ℃)，奈良県の入之波温泉五色湯( pH 9.1, 26.8 ℃)，和歌山県の佐部温泉( pH 9.7, 29 ℃)からシアノバクテリアが優占する微生物
マットを温泉水とともに採集した( Fig. 4 A, D, G )．こ
れらの試料を BG11 培地に対して 1/2 あるいは 1/10 量Fig. 4の現地温泉水とともに移植し，12 時間ごとの明暗サイク
ル条件下，桃の木温泉試料は 42.0 ℃，pH 9.5，入之波温泉試料は 25 ℃，pH 9.0，佐部温泉試料は 25 ℃，pH 9.5 で培養した．桃の木温泉から分離した MO17-1 株は上述のLeptolyngbya シアノバクテリアに類似した形態学的特徴を示した( Fig. 4 C )．固化剤としてジェランガムを用い－ 93 －

Photo images of the cyanobacteria from alkaline hotsprings; A-C, Cyanobacteria from Momonoki hot spring;
D-F, Cyanobacteria from Goshikiyu hot spring; G-I,
Cyanobacteria from Sabe hot spring; A, D, G Samplingsights with showing the mats sampled (white arrow); B, E,
H Cyanobacteria cultures; C, F, I Phase contrast and fluorescence microscopy analysis. of samples obtained fromalkaline hot springs. Observation of the same microscopy
field by phase contrast (C, F, I), autofluorescence (c, f, i).

花

田

智

結

て平板培養すると，Fig. 4 B に示すようにジェランガムを分解している様子が観察された．五色湯から採取した試語料から培養できたシアノバクテリアも Leptolyngbya シア

陸上温泉における好熱性シアノバクテリアについてはノバクテリアと同様の形態学的特徴を示した(Fig. 4 F )．

国内外で古くから研究があり，近年でも遺伝子解析法を

佐部温泉は前述二つの採集地より構成種が多様で，シア

中 心 と し た 研 究 結 果 が 報 告 さ れ て い た( 春 田, 2012;

ノバクテリア，硫黄酸化細菌，非光合成細菌などがマッ

Papke et al., 2003; Thiel et al., 2016; Estrella et al., 2017;

トを構成していた．顕微鏡観察から Leptolyngbya シアノ

Strunecky et al., 2019 )．しかし本研究のように一つの温バクテリア，Anabaenopsis，Synecchococcus，Chroococcales，

泉地を対象に培養法と次世代シーケンサーによる遺伝子

Nostoc 様の形態が観察されたが，集積培養系で増殖したのは主に Fig. 4 I に示す繊維状の Leptolyngbya シアノバク

解析を組み合わせて解析した例はほとんどない．本研究テリアだった．

アノバクテリアがみつかり，これまでにも多様なシアノで解析した長野県中房温泉郷からは実に多様な系統のシ

桃の木温泉からの分離株 MO17-1 および佐部温泉からバクテリアが限られた高温温度域に共存していることはの集積培養系統 SB21-1 を対象にして，アルカリ耐性や初めての発見である．形態学的および生理学的特性の違

最適 pH を調べた．Good's buffer を用いて pH 7.0 ～ 11.0

いが共存を可能にしていると考えられ，系統分類だけでの 各 pH に て 培 養 試 験 を 行 っ た( Fig. 5 )． そ の 結 果，なく，生態および応用利用の点からも興味深い．

MO17-1 の増殖最適 pH は 8.5 ～ 9.0 で，pH 11.0 において

シアノバクテリアは他の細菌群に比べ生理的多様性がも生育が確認された．SB21-1 は，最適 pH は 8.0 ～ 8.5 で，低いこともあり，細菌の系統分類指標( International

pH 11.0 においても生育が確認された．どちらも最適 pH

Code of Nomenclature of Prokaryotes )に則った系統分

は中性付近であったが，高 pH 画分では光合成の影響で類は困難を伴う．ゲノム情報の解読・活用が期待される

pH が上昇した可能性が考えられた．これら分離株は好が，分離株のゲノム情報はまだまだ限定的である．本研

アルカリ性ではなかったが，増殖可能な pH の範囲が広究では系統的にも生理的にも興味がもたれている好熱性

い こ と が 示 さ れ た． な お，pH 8.5 に お い て Tricine とTAPS で の 生 育 を 比 較 す る と TAPS で の 生 育 が 悪 く，

Chlorogloeopsis シアノバクテリアのゲノム情報を解析した．Chlorogloeopsis シアノバクテリアについて生理・形

TAPS はシアノバクテリアの生育に阻害的に働くことが態学的特徴，16S rRNA 遺伝子塩基配列，16S-23S ITS 塩

示された．

基配列での比較解析も進められているが，本研究のゲノFig. 5 Growth of cyanobacteria collected from alkaline spring sources. The cells were cultured in BG11 liquid medium.
The pH of the medium was adjusted using various 20 mM Good's buffers (HEPES, tricine, TAPS, CHES, CAPS).
a, cyanobacteria from Momonoki hot spring (Yamanashi); b, cyanobacteria from Sabe hot spring (Wakayama).
After culturing on a culture plate under continuous irradiation aerobic conditions for 11 days, the amount ofgrowth was estimated by the amount of chlorophyll a. Data are means ± SE, n = 3.

－ 94 －

好熱性シアノバクテリアの多様性菌の役割．第59回日本植物生理学会年会，第3回光合成細菌ワークショップ(3月27日，札幌)
7) Thiel, V., Tank, M., Mar tinez, J.N., Trampe, E.C.L.,
Lichtenberg, M., Kühl, M., Hanada, S. 2018. Microbial
diversity and activity in a hot spring associated oxygenic
phototrophic microbial mat disclosed by a comprehensive
multi-method study. 16th International Symposium on
Phototrophic Prokaryotes (ISPP) (August 5-9, Vancouver,
Canada)8) 菅野菜々子. 2018. 温泉微生物マットの大黒柱:光合成細菌の一次生産者としての役割とその能力．自由集会「ジグソーパズルのピースを埋める― 単一微生物種にフォーカスする若手研究者たち―」．日本微生物生態学会第32回大会(7月11-13日，沖縄)
9) Martinez, J.N. 2020. Vertical distribution of phototrophic
bacteria exhibits niche differentiation within hot spring-associated microbial mat. Friday Seminar, Depar tment of
Biology, The State University of New York-Oneonta,(February 21, Oneonta, NY, USA)

ム解析により，より明確な系統分類学的知見を得ることができた．
顕著に好アルカリ性を示すシアノバクテリアの取得には至らなかったが，その探索過程でシアノバクテリアに
嫌気性紅色硫黄光合成細菌が共存している様子が観察された( data not shown )．シアノバクテリアの硫黄代謝
および硫黄細菌との共生関係に興味がもたれる．緑色硫黄細菌が優占する微生物マット(リトルソルトスプリン
グ，フロリダ)から単離された Leptolyngbya sp. hensonii
株に酸素非発生型光合成能が報告されている(Hamilton
et al., 2018)．またイタリアの鉱泉から単離されたシア
ノバクテリア Pseudanabaena FS39 は，酸素発生型光合成と硫黄酸化を伴う酸素非発生型光合成を切り替えられることが示されている(Klatt et al., 2015)．このようなシ
アノバクテリアの報告例はまだ少ないが，高温硫黄泉でのシアノバクテリアの生理・生態研究は，硫黄泉での光合成複合微生物系での役割だけでなく，光合成の進化や
古地球生態系の形成過程の究明にも貢献できると期待さ
れる．

要

約

本研究では，陸上温泉を対象に環境 DNA 解析から好熱性シアノバクテリアの分布と多様性を明らかにした．
予想されていた以上に多様なシアノバクテリアが見つかり，新規未培養系統群も見つかった．またいくつかの好熱性株の培養に成功し，ゲノム情報，分子系統および窒
素固定能，赤色光利用性や生育可能温度域，生育可能pH などの生理学的特性を明らかにした．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表
1) 花田智．2017．酸素非発生型光合成－光合成の起源と進化－．ラン藻ゲノム交流会(6月24日，東京)
2) 花田智．2017．分離培養の進展を阻害しているのは「分離できない」って思い込み以外の何ものでもない．環境
微生物系学会合同学会2017(8月29-31日，仙台)
3) 花田智．2017．温泉バイオマット－温泉に存在する特殊な微生物生態系－．生命科学系学会合同年次大会
ConBio2017(12月6-9日，神戸)
4) 花田智．2017．どうなるシアノバクテリアの新種提案？
－シアノバクテリアの国際命名規約に絡む厄介な問題－，
研究集会「シアノバクテリアの生態学的多様性と系統分類」京都大学生態学研究センター，日本微生物資源学会(11月23日，京都)
5) 花田智．2017．極限の世界から．第7回日本微生物学連盟
フォーラム「微生物－変わり者たちの素顔」(12月16日，東京)6) 花田智．2018．古地球生態系での酸素非発生型光合成細

原著論文
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Ward, D.M. & Br yant, D.A. 2016. The dark side of theMushroom Spring microbial mat: life in the shadow of
Chlorophototrophs. I. Microbial diversity based on 16SrRNA gene amplicons and metagenomic sequencing. Front.
Microbiol. 7:919.
2) Thiel V., Hügler M., Ward D.M. & Bryant D.A. 2017. The
dark side of the Mushroom Spring microbial mat: Life in the
shadow of chlorophototrophs. II. metabolic functions ofabundant community members predicted from metagenomic analyses. Front. Microbiol. 8:943.
3) Bernstein H.C., McClure R.S., Thiel V., Sadler N.C., Kim
Y.-M., Chrisler W.B., Hill E.A., Bryant D.A., Romine M.F.,
Jansson J.K., Fredrickson J.K. & Beliaev A.S. 2017. Indirectinterspecies regulation: transcriptional and physiologicalresponses of a cyanobacterium to heterotrophic partnership. mSystems. 2: e00181-16.
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Kawai, S., Tank, M., Kühl, M., Hanada, S. & Thiel, V. 2019.
Vertical distribution and diversity of phototrophic bacteria
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その他(総説・書籍・特許など)
1) Hanada, S. 2016. (Research Highlight) Anoxygenic photosynthesis: A photochemical reaction that does not contributeto oxygen reproduction. Microbes Environ. 31: 1-3.

－ 95 －

花田2) Thiel, V., Tank, M. & Bryant, D.A. 2018. Diversity of chlorophototrophic bacteria revealed in the Omics Era. Annu. Rev.
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From the Origins of Life to the Search for Extraterrestrial
Intelligence, pp. 137-152, Springer, Singapore.

謝

辞

本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．また，本研究の遂行にご協力いただいた Yoon 博士(九州大学)，
中房温泉社長・百瀬孝仁氏，光合成複合微生物寄付講座( Photomic Lab. )の学生諸氏に感謝の意を表します．

文

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IFO Res.Commun. 35
97-107, 2021

好気性光合成細菌の分布と多様性
花

智＊

田

東京都立大学大学院理学研究科
光合成複合微生物系の環境・エネルギー活用シーズ開発寄付講座〒192-0397

東京都八王子市南大沢1-1

Distribution and diversity of aerobic anoxygenic photosynthetic bacteria
Satoshi HANADA＊
Graduate School of Science, Tokyo Metropolitan University
Minami-Osawa 1-1, Hachioji, Tokyo 192-0397
We analyzed distribution and diversity of aerobic anoxygenic photosynthetic bacteria in river and seacoast using
culture-dependent and culture-independent methods. This study discovered aerobic anoxygenic photosynthetic
bacterial species in eight lineages in Proteobacteria. Phylogenetic studies on these novel aerobic anoxygenic
photosynthetic bacteria provided important insights into evolutionary history and diversification of photosynthetic
bacteria. Ecological studies on aerobic anoxygenic photosynthetic bacteria in Tama River, Japan indicated thataerobic anoxygenic photosynthetic bacteria ubiquitously exist in river water and epilithic biofilms from upper to
middle reaches throughout the year. The population of photosynthetic bacteria in river environments were higher
than expected. These results strongly suggest that aerobic anoxygenic photosynthetic bacteria play importantroles in material cycles in river.
Key words: aerobic anoxygenic photosynthetic bacteria, bacteriochlorophyll, river epilithic biofilm, Proteobacteria緒言

細菌などは嫌気条件でのみ光合成を行い，好気条件では光合成色素や光合成器官を作らず，生育できないか，まシアノバクテリア以外の光合成細菌は，光合成で酸素

たは呼吸により生育する．1978 年に日本人の研究者らを発生しないことから非酸素発生型光合成細菌と呼ばれにより好気条件で光合成色素バクテリオクロロフィル aている．古くから知られている典型的な非酸素発生型光を作る細菌が発見された( Sato, 1978; Harashima et al.,

合成細菌である紅色細菌，緑色硫黄細菌，糸状性光合成1978 )．本菌は，嫌気光合成条件では生育できず，好気性光合成細菌，aerobic anoxygenic photosynthetic bacteria

E-mail: photomic2015@gmail.com＊花田 智 現 産業技術総合研究所( AAPB)と呼ばれる．発見当初は例外的な光合成細菌と思われていたが，その後，海洋表層に広く分布し，物質

satohana@tmu.ac.jp

循環に大きく寄与していることが報告されるようになっ

共同研究者:広瀬節子(東京都立大学大学院理学研究科)．
高部由季(東京都立大学大学院理学研究科，
現 東京大学大気海洋研究所)．
永島咲子(東京都立大学大学院理学研究科，
現 神奈川大学)．
福島俊一(東京都立大学大学院理学研究科，
現 大阪大学)．
Vera Thiel(東京都立大学大学院理学研究科，
現 Leibniz Institute DSMZ )．
Marcus Tank(東京都立大学大学院理学研究科，
現 Leibniz Institute DSMZ )．
春田 伸(東京都立大学大学院理学研究科)．

た( Kolber et al., 2000, 2001; Koblížek, 2015 )．これまでに報告されている好気性光合成細菌の多くはアルファプ
ロテオバクテリアに属しているが，最近では，ベータプ
ロテオバクテリアやガンマプロテオバクテリアに属するも の も 見 つ か っ て き た( Yutin et al., 2007; Yurkov &Costonyi, 2009; Koblížek, 2015 )．しかしまだ分離株の数は少なく，環境 DNA 解析からはまだまだ多様な好気性
光合成細菌が分布している可能性が指摘されている．
好気性光合成細菌は光合成による ATP 生産が可能なため，栄養塩飢餓環境においても高い生残性を示すと考え－ 97 －

花

田られており，さまざまな環境に分布しその物質循環に寄智発するコロニーを選択し(Hirose et al., 2016 )，純化した．

与していることが予想されている．好気性光合成細菌の研究は主として外洋に注目されてきており，湖沼での研分離株の系統分類解析

究( Mašín et al., 2008, 2012; Fauteux et al., 2015; Yurkov

16S rRNA 遺伝子の塩基配列情報を取得し，分子系統& Hughes, 2017 )は報告されるようになってきたが，他解析した( Tamura et al., 2013 )．既報の確立されたプロの 環 境 で の 研 究 は 遅 れ て い る( Waidner & Kirshman,

トコールに従い，脂肪酸およびキノン分析，生化学試験

2005; Jiang et al., 2010 )．

を実施した( Hanada et al. 2002; Mori et al., 2018 )．ゲ

本研究では，光合成色素バクテリオクロロフィル蛍光

ノム解析には，単離株から抽出した全 DNA を次世代シー検出法を導入し，分子生態学的手法および分離培養法をケンサー Illumina Miseq を用いてゲノムデータを取得し用いて，河川や沿岸部における好気性光合成細菌の多様た．アセンブリには SPAdes version 3.7.1 を用い，アノ性と分布を明らかにすることを目的とした．

テーションは Prokka version 1.11 を用いて行った．

実験方法

結果および考察

蛍光顕微鏡による光合成細菌の細胞計数

河川環境における好気性光合成細菌の分布と多様性

バクテリオクロロフィル a の自家蛍光を蛍光顕微鏡

河川水中や川底に付着している微生物は一次生産者とNikon ECLIPSE E600 と CCD カメラ Hamamatsu DIGITAL

して，また分解者として河川生態系に重要であるが

CAMERA C11440 ORCA-Flash 4.0 で検出し，環境試料中( Allan, 1995 )，これまで好気性光合成細菌の研究はほとの光合成細菌の細胞数を計数した( Sato-Takabe et al,.

んどなかった( Hirose et al. 2012 )．東京都南西部を流2016 )．キセノンランプを光源とし，励起光 350 - 550 nm

れる多摩川を対象として，上流から中流にかけて，釜ので，830 nm 以上の蛍光を検出した．ただし，クロロフィ

淵(青梅市)，小作(羽村市)，永田橋(福生市)，小宮ルに由来する蛍光も観察されてしまうため，クロロフィ(八王子市)の 4 地点から 2017 年 5 月および 6 月に試料

ル 蛍 光 を 有 す る 細 胞 を 励 起 光 440 - 490 nm， 検 出 光を採取した．蛍光顕微鏡を用いて，河川水中の浮遊性細715 nm 以 上 で 別 に 計 数 し， 除 外 し た． ま た 全 菌 数 は菌数を計数した結果を Fig. 1 に示す．調査した 4 地点の

DAPI 染 色 し 計 数 し た( 励 起 光 355 - 375 nm， 検 出 光

全菌数とバクテリオクロロフィル含有細胞( Aerobic

400 nm 以上)．

anoxygenic photosynthetic bacteria, AAPB )数を比較す
ると，それぞれ 1.6×10 5 ～ 4.3×105 細胞 mL-1 ，1.5×104

微生物群集の 16S rRNA，18S rRNA 遺伝子アンプリコン～ 4.4×104 細胞 mL-1 ，で調査地点間の大きな違いはな

解析かった．光合成細菌の全細菌数に占める割合は調査した試料から DNA を抽出し，16S rRNA 遺伝子 V4 領域お4 地点で 6.1 ～ 19.6％であった．またクロロフィル含有

よび 18S rRNA 遺伝子 V1-V2 領域を PCR 増幅した．増幅細胞(シアノバクテリア)数は小宮では検出限界以下

産物の塩基配列は次世代シーケンサー Illumina Miseq を(< 3.4×10 3 細胞 mL-1 )であったが，他地点では計数でき，用いて解析した．

その数は 2.1×103 ～ 3.2×104 細胞 mL-1 であった．シア
ノバクテリアの多いサンプルにバクテリオクロロフィル

バイオフィルム試料の光合成関連色素解析

含有細胞数が多い傾向がみとめられ，両者の共存が示唆

バイオフィルム試料をガラス繊維フィルターで吸引ろされた．一方，釜の淵と永田橋の試料において河川水中過し，ジメチルホルムアミドと超音波抽出器を用いて色の粒子付着性分画についても細菌数を調べたところ，全素抽出を行った後，超高速液体クロマトグラフィー

菌 数 に 占 め る 光 合 成 細 菌 の 割 合 は 52.2 ％ と 高 か っ た

Shimadzu UHPLC Nexera X2 SR( Agilent ZORBAX( data not shown )．光合成細菌は，多摩川上流域および

Eclipse Plus C8 RRHT カラムを装着)を用い，Suzuki et

中流域の河川水に広く存在しており，沿岸海洋において

al.( 2015 )に従い光合成色素の分析を行った．

観 察 さ れ て い た よ う に( Waidner & Kirchman 2007,
Lami et al..2009 )，河川水中においても粒子付着性の割

好気性光合成細菌の分離培養合が高いと考えられた．

環 境 か ら 採 取 し た 試 料 を 有 機 物 含 有 の PE 培 地

多摩川の 5 地点，釜の淵(青梅市)，小作(羽村市)，( Hanada et al., 1995 )を 1/10 に希釈した寒天培地に塗永田橋(福生市)，小宮(八王子市)，日野(日野市)に布し，30 ℃好気暗条件で培養を行った．生育したコロ

おいて，2016 年 6 月および 8 月に川底のバイオフィルム

ニーのうち，バクテリオクロロフィルの赤外自家蛍光をを採取し，分散後，寒天平板培地で培養した．すべての－ 98 －

好気性光合成細菌の分布と多様性

Fig. 1 Bacterial cell abundance in the free-living fraction in the Tama River. Cell abundances of the total bacteria (a), aerobic
anoxygenic photosynthetic bacteria (AAPB) as bacteriochlorophyll-containing bacteria (b), cyanobacteria as chlorophyllcontaining bacteria (c), and the relative ratios of AAPB (％) (d) and cyanobacteria (％) (e) in total bacteria. The cellnumbers were counted using the infra-red epifluorescence microscopy (n = 8). OM0, OM: Ome, OZ: Ozaku, FS: Fussa,
KM: Komiya. The sample of OM0 was collected in May 2017. Other four samples (OM, OZ, FS and KM) were collected inJune 2017. Asterisks indicate 'under detection limit'. Error bars show standard error of eight sets of the counting data.

試料からバクテリオクロロフィル含有コロニーが検出さアルファ 4 グループ( Sphingomonadales 目)の割合がれ， そ の コ ロ ニ ー 数 を 計 数 し た と こ ろ，2.93×10 ～高く，それらは主に Porphyrobacter 属と考えられた．

5

29.67×10 5 CFU cm-2 of biofilm であった．河川水中だけ続いて，多摩川の釜の淵(青梅市)において一年を通でなく川底バイオフィルム中においても光合成細菌が普して季節ごとに川底バイオフィルムを採取し，PCR ア

遍的に存在することがわかった．バクテイオクロロフィ

ンプリコン解析および色素分析を実施した．18S rRNA

ル含有コロニー数は，6 月に比べて 8 月のバイオフィル

遺伝子を対象にしたアンプリコン解析の結果，珪藻，緑ムに多い傾向があった．これらバイオフィルム試料のう藻のほかに後生動物，卵菌類が検出された．藻類の割合

ちクロロフィル含量が多くバイオマス生産量が高い試料

は，春，夏よりも秋から冬にかけて多くなる傾向が見らと，クロロフィル含量が少なくバイオマス生産量が低い

れた．藻類の中では年間を通じて緑藻よりも珪藻が優占

試料を選択して，単離株を得，16S rRNA 遺伝子塩基配していた．色素分析の結果，珪藻の色素であるフコシア列を解析した．100 株の単離株は 25 系統に分かれ，そニンが多く検出されアンプリコン解析の結果を支持しれらはアルファプロテオバクテリアまたはベータプロテ

た．また，16S rRNA 遺伝子を対象にしたアンプリコン

オバクテリアに属していた(Fig. 2 )．いずれの試料でも，解析では，プロテオバクテリア，バクテロイデテス，シ－ 99 －

花

Fig. 2

田智

The ratio of AAPB isolates belonging to each phylogenetic group isolated
from two different biofilms in the Tama River. A: In the biofilm with thehighest value of Chl a/protein. n = 50. B: In the biofilm with the lowest valueof Chl a/protein. n = 46. α1, α3, α4, and β indicate alpha-1 (Rhodospirillales),alpha-3 (Rhodobacterales), and alpha-4 (Sphingomonadales) subclasses of
Alphaproteobacteria and Betaproteobacteria.

アノバクテリアが優占種として検出された．春にはプロ以上の結果から，多摩川の上流および中流域では河川

テオバクテリアが多く 7 ～ 9 割を占めていたが，冬はプ

水，川底バイオフィルムのどちらにも好気性光合成細菌

ロテオバクテリアの割合が 3 ～ 5 割に減った一方，シアが普遍的に存在することがわかった．存在量は試料によ

ノバクテリアが増え 2 ～ 5 割となっていた．これまでのり異なったが河川水浮遊性画分では全細菌の 19.6％，川研究で多摩川川底バイオフィルムからロドバクター科，底バイオフィルムでの場合は全細菌の 15％を占める場

スフィンゴモナス科，エリスロバクター科などのプロテ合があることが示された．バイオフィルムにおける好気

オバクテリアに属する好気性光合成細菌を分離培養して性光合成細菌の細胞数および全細菌数あたりの割合についた( Hirose et al., 2016 )．アンプリコン解析では，これいて，上流から中流にかけての各地点間では顕著な違い

ら好気性光合成細菌のなかでもロドバクター属細菌が多は認められなかった．これは河川水中についても同様で

く，67％(春)，59％(夏)，52％(秋)，89％(冬)を占めた．

あった．上流域と中流域では河川水の栄養塩濃度が異な

河川水の流速に注目して結果を比較すると，流速が遅いることが知られているが，栄養塩濃度の違いが好気性光

地点( 0.1 m/s ～ 0.2 m/s )で，流速が速い地点( 1.5 m/s

合成細菌の分布に与える影響は小さいと考えられた．ま～ 1.6 m/s )に比べて，単位面積当たりのクロロフィル

た，バイオフィルム中の好気性光合成細菌の割合は，ど量が大きく(遅い地点 23.45 mg/m2 ～ 141.12 mg/m2 ，速の季節でも，流速が遅く，クロロフィル量が多いバイオ

い地点 0.48 mg/m ～ 1.37 mg/m )，バイオマス生産量がフィルムにおいて，高くなる傾向がみられた．流速が遅多かった．全細菌に占める好気性光合成細菌の割合は全い場所ではクロロフィル量の多い厚いバイオフィルムが2

試料平均 1.75％であったが，クロロフィル量 74.34 mg/m

発達し，間隙に溶存物質が保持される( Battin et al.,以上の試料で 9.66％，クロロフィル量 23.45 mg/m2 以上

2003 )．海洋においてもクロロフィル量と好気性光合成の試料で 5.70％，と多く，クロロフィル量 21.21 mg/m2

細菌数に同様の相関があるとの報告がある( Jiao et al.,22以下の試料で 0.84％と低くなる傾向が見られた．クロロ

2007 )．河川環境における好気性光合成細菌の分布につフィル量が多くよく発達したバイオフィルムには，好気

いても，好気性光合成細菌の有機物の利用性の高さが強性光合成細菌の存在比が高くなると考えられた．

く関係していると考えられた．

－ 100 －

好気性光合成細菌の分布と多様性

川底バイオフィルムから分離した新規好気性光合成細菌

YIM730274T ，A. parvum B6T お よ び A. olei NHI-1T と のAquabacterium pictum の新種提案

ゲノム類似性( ANI )を調べたところ，78 - 79％であっ

多摩川の川底バイオフィルムから分離培養したバクテ

た．基質の利用性，酵素活性，リン脂質，脂肪酸やキリオクロロフィル含有細菌について，系統解析した．まノンの種類と割合などを解析した多相分類比較の結果，ず，分離株の中から好気性光合成細菌の特徴(嫌気条件

W35T 株が Aquabacterium 属の他のメンバーと明確に区では光照射下でも生育しない)を示すものを選抜した．

別 で き る こ と を 示 し た た め， 基 準 株 を W35T( DSM

16S rRNA 遺伝子塩基配列を解析し，既知種との相同性

106757T = NBRC11963T )とする Aquabacterium 属の新種が低いものとして W35 株を得た．W35 株は絶対好気

Aquabacterium pictum sp, nov を提案した．

性・非運動性の細菌で，有機物を含む寒天培地上にピンクベージュ色のコロニーを形成した．16S rRNA 遺伝子

Aquabacterium pictum W35T は Aquabacterium 属 細 菌の中でバクテリオクロロフィル a の生産が確認された初塩基配列に基づく系統解析の結果，ベータプロテオバク

めての光合成細菌である．また，ベータプロテオバクテ

テ リ ア に 属 す る と 考 え ら れ た( Fig. 3 )． 最 近 縁 種 はリアに属する好気性光合成細菌として記載された 3 例目

Aquabacterium commune B8T で 97.9 ％ の 類 似 性 を 示 した．Aquabacterium 属 の 近 縁 基 準 株，A. tepidiphilumの細菌である．

T

Fig. 3T

Maximum-likelihood tree based on 16S rRNA gene sequences showing the phylogenetic position of
W35T and related Burkholderiales members within the Betaproteobacteria. The tree was reconstructedusing the MEGA 6.0 software program. Bootstrap values over 50％ are shown at the nodes. Bar, 0.02
nucleotide substitutions per site. Rhodoferax saidenbachensis ED16T (FJ755906) and Rhodoferax
fermentans FR2T (D16211) were used as outgroups.

－ 101 －

花田

魚類養殖場海水から分離した新規好気性光合成細菌 1:
Roseobacter cerasinus sp. nov.

智

16S rRNA 遺伝子塩基配列を解析したところ，本株は海洋の好気性光合成細菌の生態について主に外洋に注Roseobacter ponti MM-7 T 株に近縁( 97.8％)であったが( Fig. 4 )，ゲノム情報に基づくデジタル DNA-DNA ハイ

目されていたが，比較的有機物含量の高い沿岸部についブリダイゼーションによる相対類似度は 18.70％と低ては調べられていなかった．しかし，先行研究での分子かった．さらに，その他の生理性状試験の結果ももとに，

生態学的解析から，魚類養殖場に通年で多様な光合成細本株を Roseobacter 属の新種と結論づけた．Roseobacter

菌が多く分布していることが指摘された( Sato-Takabe

cerasinus と 命 名 し，A I77 T( = DSM 110091T = NBRC
114115 T )を基準株とした．AI77 T は既報の近縁種と異な

et al., 2016 )．本研究では愛媛県愛南町の養魚場のいけす内から海水試料を採取し，培養法を用いて，新規バクテリオクロロフィル含有細菌を探索した．探索の結果，り，種々の薬剤に対する耐性能があり，ゲノム解析結果
からも薬剤耐性に関連する遺伝子群が多数確認された .

好気性光合成細菌の特性を示す AI77 株を分離した．
T

Fig. 4 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences showing the position of strain AI77T andclosely related species. Bootstrap values were expressed as a percentage of 1000 replicates and only those higher
than 50％ are shown. Filled circles indicated on the nodes were also recovered in the maximum-likelihood tree
(Muramatsu et al., 2020, Fig. S4). Stappia stellulata IAM 12621T (GenBank accession no. D88525) was used as an
outgroup (not shown). Bar, 0.01 substitution per nucleotide position.

－ 102 －

好気性光合成細菌の分布と多様性

魚類養殖場海水から分離した新規好気性光合成細菌 2:Litoreibacter roseus sp. nov.

ロ ロ フ ィ ル a の 生 産 が 知 ら れ て お ら ず， 本 K6T 株 は
Litoreibacter 属で初めての光合成細菌の発見である．

上記同様に愛媛県愛南町の養魚場から分離培養した結果，好気性光合成細菌の特性を示す K6T 株が得られた．

Tabrizicola 属細菌における光合成能の発見

本株は，Litoreibacter ponti GJSW-31T 株に近縁( 98.56％)

Tabrizicola 属は，アルファプロテオバクテリアに属す
るグラム陰性，好気・化学栄養性の桿菌で，2013 年にであったが( Fig. 5 )，デジタル DNA-DNA ハイブリダ
イゼーションによる相対類似度は 19.40％と低く，その他の生理性状試験の結果から Litoreibacter 属の新種と結論 づ け た . Litoreibacter roseus と 命 名 し，K6 T( = DSM

Tabrizicola aquatica RCRI19T を基準株として新属提案されて以来，非光合成細菌と認識されていた( Tarhriz et

110109T = NBRC 114114T)を基準株として新種記載した .

al., 2013 )．しかし，広範囲な系統解析の結果，近縁の系統群には光合成能を有する細菌が知られるようになっ

これまで Litoreibacter 属細菌に光合成色素バクテリオクてきた．本研究では，Tabrizicola aquatica RCRI19T につFig. 5 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences showing the position of strain K6 T andsome closely related taxa. Bootstrap values were expressed as a percentage of 1000 replicates and only thosehigher than 50％ are shown.

－ 103 －

花

Fig. 6

田智

The autofluorescence of Tabrizicola aquatica strain RCRI19T grown under aerobic, heterotrophic low
light conditions. For the detection of bacteriochrolophyll a autofluorescence, LED's with maximum
emission at 375 nm, 500 nm and 590 nm, respectively, were used for excitation and a long-pass filter
allowed the detection of fluorescent light longer than 850 nm. Left: A photograph of an agar plate withcolonies grown. Right: Fluorescence image of the same plate.

いて改めて生理・生化学，遺伝学的特性を調べた．その介したプロテオバクテリア門の光合成細菌と同様に系

結果，RCRI19T 株のゲノムに光合成色素と光合成器官合II 型の反応中心をもつ．本稿では詳細を割愛したが，成に必要な全ての遺伝子が存在すること，好気従属栄養，

我々の研究でカナダの淡水湖から，系 I 型反応中心をも低照度条件下で光合成色素バクテリオクロロフィル a をつ Chloroflexota 門 光 合 成 細 菌 'Candidatus Chlorohelix

合成することが明らかになった( Fig. 6 )．ただし，嫌allophototropha' を発見した( Tsuji et al., 2020 )．今後，

気光条件では生育せず，好気性光合成細菌の特性を示し

これら分離株を用いた比較系統解析により，酸素非発生

た．そのため，Tabrizicola aquatica を好気性酸素非発生型光合成の進化の変遷への重要な手がかりを与えてくれ型光合成細菌として記載を修正した．本研究の成果にることが強く期待される．

よって，環境中での好気性光合成細菌の分布・生態について理解を深めることができた．

好気性光合成細菌は，これまで外洋の表層水に優占的に存在する細菌群として知られていたが，我々の研究に

これまでに Tabrizicola 属に属する細菌は 7 種記載されより，養魚場のような沿岸部や河川にも普遍的に分布している．本研究で調べた基準種 T. aquatica RCRI19T のていることが明らかになった．時には全細菌の約半数をほ か に Tabrizicola sediminis，Tabrizicola alkalilacus，

好気性光合成細菌が占めることもあり，自然環境の物質

Tabrizicola piscis，Tabrizicola algicola の 4 種( Liu et al.,2019; Phurbu et al., 2019; Han et al., 2020; Park et al., 2020 )循環に大きく寄与していることが示唆される．

要がバクテリオクロロフィル a を合成するが，残りの 2 種，
Tabrizicola fusiformis( Ko et al., 2018 )，Tabrizicola

約

河川および沿岸部を対象に，分子生態学的手法およびoligotrophica( Sheu et al., 2020 )は色素合成が認められず，ゲノム中にも光合成遺伝子の存在が認められないこ

分離培養法を用いて，好気性光合成細菌の分布と多様性とが明らかになった．本研究が同じ属に属する近縁種のを解析した．本研究で，新たにプロテオバクテリアの 8間に光合成能を持つ菌と持たない菌がいることを明らかつの系統に光合成色素合成能をもった細菌種がいることにする発端となり，光合成細菌の進化研究のための新たが明らかになった．これら好気性光合成細菌の系統解析な知見を提供することができた．

は，細菌界における光合成能の獲得進化および多様化に結ついて重要な知見を提供できる．また，多摩川を対象に語した時空間的分布調査から，好気性光合成細菌は一年を通して上流中流の河川水および川底バイオフィルムに普本研究で新種に分類される好気性光合成細菌を河川環遍的に存在することが示された．光合成細菌の全細菌に境から 1 種，沿岸地域から 2 種分離培養することができ，占める割合が 10 ～ 20％になる環境もあり，これまで考既報細菌群も含め，プロテオバクテリアの多様な系統群

えられていたよりも，河川環境の物質循環に重要な役割に光合成能が広がっていることを示すことができた．

を果たしていると考えられた．

Chloroflexota 門に属する既知の光合成細菌は，本稿で紹－ 104 －

好気性光合成細菌の分布と多様性

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表
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第89回日本細菌学会総会(3月23-25，大阪)
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第57回日本植物生理学会年会(3月18-20日，盛岡)
3) 花田智．2017．分離培養の進展を阻害しているのは「分離できない」って思い込み以外の何ものでもない．環境
微生物系学会合同学会2017(8月29-31日，仙台)
4) 広瀬 節子, 松浦 克美, 春田 伸, 花田 智．2017．河床礫バイオ
フィルムから単離した β プロテオバクテリアBurkholderiales目に属する新規好気性光合成細菌．環境微生物系学会合同
学会2017(8月29-31日，仙台)5) 高部 由季, 鈴木 聡, 花田 智．2017．日本沿岸域における酸素を発生しない光合成を行う細菌の炭素循環への高い寄与．環境微生物系学会合同学会2017(8月29-31日，仙台)6) 花田智．2017．極限の世界から．第7回日本微生物学連盟
フォーラム「微生物－変わり者たちの素顔」(12月16日，東京)7) 花田智．2018．古地球生態系での酸素非発生型光合成細菌の役割．第59回日本植物生理学会年会，第3回光合成細菌ワークショップ(3月27日，札幌)
8) 永島賢治，永島咲子，佐藤剛，井上和仁．2019．光合成
細菌Rubrivivax gelatinosusの光合成における代替え的な電子伝達循環経路の発見．第60回日本植物生理学会年会(3月13-15日，名古屋)
9) 中小路菫，成廣隆，延優，嶋田敬三，春田伸，花田智．
2019．アンモニア酸化をする酸素非発生型光合成細菌の探索．日本農芸化学会2019年度大会(3月24-27日，東京)
10) 花田智．2018．酸素非発生型光合成の複雑なタペスト
リー．日本微生物資源学会第25会大会(6月13-15日，つくば)11) 金室晶貴，高部由季，鈴木聡，花田智．2018，養殖場環境における培養可能な酸素非発生型好気性光合成細菌の多様性．日本資源微生物学会第25会大会(6月13-15日，
つくば)12) 高部由季，嶋田敬三，花田智，高市真一．2018．好気性
光合成細菌のカロテノイド～スフェロイデノンの特殊性」光合成セミナー(7月21-22日，神戸)
13) 高部由季，中井亮佑．2018．光合成関連遺伝子pufMを有する細菌の多様性．日本海洋学会秋季大会(9月25-29
日，東京)14) 高部由季，原田二郎，嶋田敬三，花田智，高市真一．
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丸善出版，東京．

謝

辞本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．また，本研究の遂行にご協力いただいた北海道大学の鈴木光次
教授，愛媛大学沿岸環境科学研究センターの鈴木聡教授，
同大林由美子講師，とらや水産株式会社の山下勇造氏，
嶋田敬三東京都立大学名誉教授ならびに光合成複合微生物寄付講座( Photomic Lab. )の学生諸氏に感謝の意を
表します．

文

献

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－ 107 －

2019 年度一般研究助成の研究報告
助成期間:2019 年 4 月～ 2021 年 3 月

IFO Res.Commun. 35
2021

DNA バーコードと標本を活用したビョウタケ目ヘソタケ科の探索・分類・系統学的研究
細矢剛【目的】ビョウタケ目は，子嚢菌類の中で最も多様な菌配列の類似性によるクラスター化の妥当性が示唆され，群である．本菌群の一部は植物の根にも多数共存してい複数の種を既知種と同定することができた．一部は検討ることが示されており，腐生的であるばかりでなく，生中だが，これらの中には，Mollisia 9 種，Phialocephala

植物とも相互作用する「多能な」菌群であることが示唆

8 種，Neomollisia 1 種，Pyrenopeziza 1 種 が 含 ま れ，13

されるようになった．この主要なグループがヘソタケ科種の日本新産種を明らかにすることができた．また 48

である．ヘソタケ科は褐色で球形の細胞からなる托外被のクラスターは現時点では，該当する既知種の配列がな層を有するのが特徴的だが，属あるいは種レベルでの識

く，配列未取得の種であり，未記載種である可能性もあ別をするための顕著な形態的特徴に乏しいため，形態分る(図 1 )．

類が難しい．しかし，本菌群は日本には広範囲に分布し，培養も比較的容易であるため，国立科学博物館には多数の標本と菌株が保存されている．一方，ITS-5.8S シー
クエンスを種の同定・識別領域とするバーコード的手法
は，菌類において広く利用されつつあり，既知種のバー
コード配列があれば，未同定の試料を同定できる可能性が高い．そこで，本研究では，これらの資源をもとに，バー
コード的手法を利用して，ヘソタケ科の主要な属である
Mollisia・Pyrenopeziza 類縁菌において種のまとまりを見出し，日本産ヘソタケ科の多様性を把握するとともに，同定結果を再検討した．
【方法】コロナ禍であったため，国内での新規の採集は

図1限られたが，茨城県のほか，北海道・青森・秋田・長野・

配列相同性に基づいた各クラスターの同定結果

佐賀など国内各地で採集を行い，100 点以上の採集品と，その大部分から培養株を得た．これらに加え，国立科学博物館に保存されていた株のバーコード配列データを取得し，186 の標本から得られた配列を解析対象とした．
これらのデータから，CD-HIT にて 98.5 ％以上の相同性をもつ配列どうしをまとめた．
【結果・考察】全部で 65 のクラスターが得られた．クラスターの約半数がシングルトンであったが，残りからは
2 ～ 19 点の標本を内包する約 30 のクラスターが検出された(図 1 )．そこで，各クラスターに含まれる最長の配列を代表配列として NCBI データベースからタイプ種
由来か，カルチャーコレクションに保存されている菌株に由来し，98.5 ％以上の相同性をもつ配列を BLAST 検索して抽出し，これらとともに NJ 法で系統解析を行ったところ，これらのクレードの多くは既知種と近い遺伝的距離を有し，高いブートストラップ値(≧ 90 )で支持されたため(図 2 )，バーコード領域をもとにして複図2数の既知種が存在することが示唆された．次に，文献情ITS-5.8S の NJ 法による解析結果報などをもとに，これらのクレードを構成する標本と，以上の結果より，日本に存在するヘソタケ科は従来の認既知種の形態を比較した結果，その形態はよく一致し，識よりもずっと多様であることが確認された．

所属

国立科学博物館植物研究部

E-mail: hosoya@kahaku.go.jp－ 109 －

IFO Res.Commun. 35
2021

有用生物資源としての日本産クロボ菌類由来の担子菌酵母の菌株確立
田

中

栄

爾

【目的】担子菌酵母は，主に野外の様々な分離源からス

鏡と走査電子顕微鏡を用いて形態学的観察をおこなっ

クリーニングによって分離され，物質生産や酵素生産な

た．また，DNA を抽出し，ITS 領域と 18S rDNA 領域のどの有用な生物資源として農芸化学分野で研究が進めら

塩基配列を解読した．これらの情報から種の同定を試みれてきた．一方で，分子系統学的研究により，多くの担た．さらに，黒穂胞子を蒸留水に懸濁したものを水寒天

子菌酵母は植物病原菌として知られるクロボ(黒穂)菌培地上に散布し，黒穂胞子の発芽を観察した．18 ℃も類の無性世代であることが明らかにされてきた．このこ

しくは 4 ℃の条件下に置き，4 ℃条件のものは 3 ヶ月，6 ヶとから，クロボ菌類の無性世代の菌株は，これまでの方

月後に 18 ℃に移した後に，発芽する様子を観察した．発法では得ることができなかった担子菌酵母の分離源と考芽した場合，単一の黒穂胞子由来の菌株を分離培養した．

えられ，潜在的な有用生物資源といえる．本研究では，野外で採集した日本産のイネ科植物やタデ科植物に寄生するクロボ菌類を確実に同定し，そのクロボ胞子を発芽させて無性世代である担子菌酵母の菌株を確立することを目的とした．また，これらの菌株を菌株保存機関に寄託して広く利用可能な状態にすることも目的とした．

図2

黒穂胞子からの発芽の例【結果・考察】これまで分類学的に未確定の種を含めイ
ネ科，カヤツリグサ科，タデ科の植物から 25 種以上のクロボ菌類の分離培養に成功した．そのうち，ヒデリコを宿主とする Pilocintractia fimbristylidicola，ハイヌメリを宿主とする Sporisorium manilense，トダシバを宿主とする Tilletia arundinellae，チヂミザサを宿主とするTilletia vittata，ヨシを宿主とする Ustilago phragmitis の5 種を日本新産種のクロボ菌として記載した．また，ヨシを宿主とする Neovossia moliniae について日本で 2 例目の記録として記載した．それ以外に，分類学的に確実な菌株として，キンエノコロを宿主とする Macalpinomyces
図1

neglectus，ギョウギシバを宿主とする Ustilago cynodontis，
イヌビエを宿主とする Moesziomyces antarcticus，カゼク

イネ科植物を宿主とするクロボ菌の例

サを宿主とする Macalpinomyces spermophorus を菌株保【方法】黒穂病の病徴があるイネ科植物やタデ科植物な存機関に寄託した．分類学的に未確定な種については新どを日本各地で採集した．それらの黒穂胞子を光学顕微種である可能性も含めて検討中である．

所属

石川県立大学生物資源環境学部

E-mail: tanakae@ishikawa-pu.ac.jp－ 110 －

IFO Res.Commun. 35
2021

昆虫病原糸状菌の選択的分離法と培養菌株の確立および分類学的研究
伴【目的】昆虫(節足動物含む)病原性真菌のうち，いわさやか

生育菌体に出芽型細胞( budding cell，酵母状細胞)のゆる冬虫夏草類(ボタンタケ目;フンタマカビ綱;チャ形成が認められた．一方，O. sobolifera の薬剤感受性試

ワンタケ亜門;子嚢菌門)には 500 種近くが知られてい験では全ての薬剤に対して感性であった．過去の調査で，る．うち 300 種程度が日本に生息すると言われている．

近縁の Purpureocillium lilacinum や Cordycipitaceae 科の1900 年代に日本で小林義雄博士・清水大典氏によって記載された約 150 種のタイプ標本のほとんどは，国立科

Lecanicillium 属種，Beauveria bassiana はアゾール系薬剤への耐性があることがわかっていた．しかし，今回の学博物館( TNS)に収蔵されている．しかしそのタイ

結果からは抗真菌剤を添加するだけの選択培地の開発は

プ標本の多くは，ホルマリン浸漬などの理由から DNA

難しく，選択分離培養については異なるアプローチをす情報が得られないため，これら希少種の分子生物学的なる必要があると考えられた．

系統位置を把握することは分類学上重要な課題となって最終的に確立した 28 種 53 株(Beauveria 属，Cordyceps

いる．本研究では，それらの種のタイプ標本の採取地(タ属，Metarhizium 属，Ophiocordyceps 属，Perennicordyceps

イプ・ロカリティー)近くからの再採取を行い，分離培属，Polycephalomyces 属，Pleurocordyceps 属，Pochonia 属，養株と標本が揃っているコレクションの確立を目指す．
また，本菌群の一部は絶対寄生性ともいえる宿主との密Tolypocladium 属，Clavicipitaceae 科未同定種)を千葉大
学真菌医学研究センター( IFM )に寄託し，遺伝子や接な関係性により，通常の培地や培養方法では培養が難宿主・採取地等の情報を付与して公開する．

しく，生態的にも明らかになっていない．そこで特に生育の遅い Ophiocordycepitaceae 科の菌種を宿主昆虫や環境中から直接検出したり，分離株を得られることを目指
し，培養条件の改善と抗真菌剤への耐性の有無を検討した．
【方法】採集調査は国内で 2 番目に多数の種のタイプ・
ロカリティーである東京大学秩父演習林(埼玉県秩父市大滝)の広葉樹混生林を中心に行った．得られた標本か
ら，子嚢胞子または分生子を顕微鏡観察下で単～複数個の胞子を釣菌して培養株を得た．同定は標本と培養株の形態観察と rRNA ITS 領域の塩基配列により行った．分
離後の標本は乾燥させ，栃木県立博物館へ寄託した．

図1

Ophiocordyceps purpureostromata (Kobayasi) G.H.
Sung et al.

図2Pleurocordyceps sinensis (Q.T. Chen, S.R. Xiao & Z.Y.
Sh) Y.J. Yao et al.

生育試験では昆虫細胞培養用の 2 種類の液体培地〔グレース改変培地:Grace's Insect TC Medium(BioConcept，
関東化学)，グルコース 26.68 g/L，酵母エキス 3.3 g/L 〕，
及び SF-4 Baculo Express ICM( BioConcept，関東化学)
Ophiocordycepsを試した．一方，選択培地の開発を目的に，
sobolifera NBRC 114805 をモデルとして 9 種類の抗真菌剤への薬剤感受性試験を行った．
【結果・考察】秩父東大演習林の大血川渓畔林と栃本地
区(入川沿い)にある広葉樹混生林の区域を中心として，
2019 年 は 19 種 23 標 本 28 菌 株，2020 年 は 7 種 26 標 本
25 株を得た．その他の関東地域で採取されたものも含めて 95 標本を収集した．グレース改変培地で Ophiocordyceps
属(特に旧 subgenus Neocordyceps )の生育が改善され，所属

千葉大学真菌医学研究センター微生物資源分野

E-mail: bansay-red@chiba-u.jp－ 111 －

IFO Res.Commun. 35
2021

ハラタケ綱（ Agaricomycetes ）における外生菌根菌の進化と多様化の解明
佐

藤

博

俊

【目的】温帯・熱帯林の優占樹種の相利共生菌である外後，研究の数が増えるにしたがってどの程度，操作分類

生菌根菌は，様々な日外生菌根菌(たとえば，腐生菌や群の数が増えるかの累積曲線を作成し，累積曲線が頭打

寄生菌)の系統から平行進化したとされる．外生菌根菌ちになる点を推定することによって外生菌根菌の系統群

は菌根菌の中でも特に多様な菌群として知られているそれぞれの種数推定を行った．

が，その適応放散がどのようなタイミングでどのような【結果・考察】分子系統推定の結果，350 種のハラタケ系統で生じたかは十分に理解が進んでいない．本研究で綱菌から，ワカフサタケ属菌( Hebeloma )，アセタケ属

は，外生菌根菌の種群の大半を含む系統群であるハラタ菌( Inocybe )，フウセンタケ属菌( Cortinarius )，キツケ綱( Agaricomycetes )を対象として分子系統推定をネタケ属菌( Laccaria )，テングタケ属菌( Amanita )，行うことによって，外生菌根菌の進化と多様化のパター

キシメジ属菌( Tricholoma )，シメジ属菌( Lyophyllum )，ンを探ることを目的とした研究を行った．

イ ッ ポ ン シ メ ジ 属 菌( Entoloma )， ヌ メ リ ガ サ 属 菌【方法】分子系統推定を行うために，DNA 試料として日( Hygrophorus )，ピロデルマ属菌( Piloderma )，ヌメリ

本国内の野外調査で採集した，あるいは海外の標本庫か

イ グ チ 亜 目 菌( Suillineae )， ニ セ シ ョ ウ ロ 亜 目 菌ら入手したハラタケ綱菌類の標本を 185 種選別した．以( Sclerodermatineae )，ヒダハタケ亜目菌( Paxillineae )，前の研究において開発した PCR プライマーを用いて，

イ グ チ 亜 目 菌( Boletineae )， イ ボ タ ケ 科 菌104 個の核シングルコピー遺伝子の塩基配列の PCR 増幅( Thelephoraceae)， ニ ン ギ ョ ウ タ ケ モ ド キ 属を行い，その後にハイスループットシーケンサーである( Albatrellus )，ベニタケ科( Russulaceae )，オツネンタ

イルミナ社の MiSeq を用いて同時並列的に塩基配列のケ属( Coltricia )，ウスタケ科( Gomphaceae )，ロウタ

解読を行った．104 個の各シングルコピー遺伝子のうち，ケ属( Sebacina )，セレンディピタ属( Serendipita )お89 遺伝子について十分な配列数を解読することができ

よびアンズタケ目( Cantharellales )の合計 22 の系統でたので，以後の解析ではこれらの遺伝子配列を使用して外生菌根性が平行的に進化したことが示された．これら解析を進めた．これらの新規に配列解読した種に加えて，の中で，アンズタケ目，ウスタケ科，ヌメリイグチ亜目

私がこれまでの研究で同遺伝子配列の配列解読をしたイ

菌およびニセショウロ亜目菌が相対的に起源の古い外生グチ目菌 37 種についても解析に加えた．さらに，ゲノ菌根菌の系統であり，逆にピロデルマ属菌，ヒダハタケ

ム解読の進んでいるハラタケ綱菌類 128 種についても，亜目菌，ニンギョウタケモドキ属，ロウタケ属およびセゲノムデータベース上で相同な遺伝子配列を検索するこレンディピタ属は相対的に起源の新しい外生菌根菌の系とによって，これらの菌群の同遺伝子配列情報を解析に統で，それ以外は中間的な時期に外生菌根性が起源した

加えた．合計 350 の菌種の 89 遺伝子の配列に対して多ことが示唆された．また，種数推定の結果で 1,000 種を

重整列( multiple alignment )を行った後，エキソン部

超える種数を誇る種数の豊富な系統群として推定された位とイントロン部位の識別を行い，インデルの多いインのは，フウセンタケ属( 3,892 種)，アセタケ属( 3,144 種)

トロン部位は解析から除外した．最終的に，89 遺伝子

ベニタケ科(2,593 種)，イグチ亜目(1,160 種)およびイッのエキソン部位 20,652 塩基の連結配列に基づいて，最ポンシメジ属菌( 1,150 種)であり，いずれも中間的な尤法による分子系統推定を行った．

時期に外生菌根性が起源した系統群であった．このようまた，ハラタケ綱菌に見られる外生菌根菌の系統群のな結果は，外生菌根菌において同調的に種多様化が起

種多様性を DNA 塩基配列に基づいて評価する試みをこった可能性を示している．同調的な種多様化が起こっ行った．この解析を行うため，国際塩基配列データベーた原因としては，被子植物との共種分化および共進化がスからハラタケ綱菌類のバーコード領域(核 ITS 領域)

関係しているのではないかと私は考えている．この仮説の塩基配列をダウンロードした後，97 ％以上類似するについて検証するため，今後は分岐年代推定なども行っ

配列を操作分類群(近似的な種)としてまとめた．そのていく予定である．

所属

京都大学大学院人間・環境学研究科

E-mail: sato.hirotoshi.5a@kyoto-u.ac.jp－ 112 －

IFO Res.Commun. 35
2021

アフリカ（旧世界）で初めて分離された新世界型回帰熱ボレリア，Candidatus Borrelia
fainii，の全ゲノム解析ならびに表現型解析による分類・進化・系統学的検討邱

永晋(QIU Yongjin)【目的】回帰熱はボレリア属細菌による感染症の一種で，ネカ)を用いて DNA を抽出した．Borrelia 属細菌のフ適切な治療が行われなかった場合，高い致死率を示すこ

ラジェリン蛋白遺伝子を標的とした nested PCR で Ca.

とが知られている．本疾患は節足動物によって伝播されBorrelia fainii の検出を試みた．

る人獣共通感染症で，中央アジア，サブサハラ周辺アフ

透過型電子顕微鏡による Ca. Borrelia fainii の形態学的リカ，南欧，北アメリカで罹患例が報告されている．回

観察をネガティブ染色法にて実施した．

帰熱ボレリア属細菌は，地理的・遺伝子学的にアフリカ【 結 果・ 考 察 】 ハ イブ リッド アッ セン ブ ル の 結 果，

大陸に分布する旧世界型と北米大陸に分布する新世界型

951,503 bp のゲノム( GC 含量 28.4％，CDS 数 863)を持に大別される．これまで，新世界型回帰熱ボレリアのア

つことが分かった．旧世界型回帰熱ボレリアの Borrelia

フリカ内での検出が散発的に報告されていたが，申請者らはザンビア共和国において発熱患者ならびに洞窟性コ

duttonii は，931,674 bp の ゲノム( GC 含 量 27.6 ％，CDS
数 857 )，新世界型回帰熱ボレリアの Borrelia turicatae はウモリから新世界型回帰熱ボレリアを世界で初めて分離

917,330 bp のゲノム
(GC 含量 29.1％，CDS 数 856)を持つ．

し， そ の 新 規 ボ レ リ ア 属 細 菌 の 菌 種 名 を Candidatus
Borrelia fainii と提唱した(図 1 )．本研究では，アフリカ(旧世界)で分離された，新世界型回帰熱ボレリアである Candidatus Borrelia fainii のゲノム情報，形態情報，
病原性情報を取得することを目的とした．

図 2 Ca. Borrelia fainii Qtaro 株の電子顕微鏡像（上）と接種実験時のマウス（C3H）体重の増減（下)図1

Ca. Borrelia fainii Qtaro 株 の マ ウス( C3H な ら び に

回帰熱ボレリア属細菌の系統樹

BALB/c)への接種実験では，両系統のマウスにおいて非【方法】発熱患者から分離した Ca. Borrelia fainii Qtaro

接種群と比較し体重の変化に有意な差は認められなかった

株 を BSK-M 培 地 を 用 い て 増 菌 さ せ た．Qiagen 社 の(図 2 下)．また，どの血液サンプルからも Ca. Borrelia

DNeasy Blood & Tissue Kit を用いて DNA の抽出を行っfainii の遺伝子は検出されなかった．Ca. Borrelia fainii は，た．次世代シーケンサーの MiSeq(イルミナ)でショー

両系統のマウスにおいて感染性を示さないと考えられた．

トリードシーケンスを，MinION(オックスフォードナ
ノポアテクノロジーズ)でロングリードシーケンスを実電子顕微鏡観察では，長さ 20 μm で太さ 300 nm の螺
旋状の形態が認められた(図 2 上)．

施した．二つの次世代シーケンサーで得られた配列をハ

近年，中国のコウモリからも Ca. Borrelia fainii の遺伝

ブリッドアセンブルし，ドラフトゲノムを決定した．

子が検出されたという報告がなされており( Han et al.,増菌させた Ca. Borrelia fainii Qtaro 株を 106 個 /200 μl

EID. 2020; Li et al., PLoS Negl Trop Dis. 2021 )，かなりに調整し，8 週令のマウス( C3H ならびに BALB/c )に広範囲に本ボレリア菌種が分布していると予想される．

106 個と 103 個の細菌を腹腔内接種した．26 日間にわた

また，現在の旧世界型と新世界型に大別されている回帰熱

り体重の計測と尾からの血液採取を 2 日おきに実施しボレリアの分類が分布実態に即していないと考えられ，世た．採取した血液から簡易 DNA 抽出キット version2(カ界的な回帰熱ボレリアの分布と多様性の解明が必要である．

所属

北海道大学人獣共通感染症リサーチセンター，現 人獣共通感染症国際共同研究所－ 113 －

E-mail: yongjin_qiu@czc.hokudai.ac.jp

IFO Res.Commun. 35
2021

渦鞭毛藻−自由生活性バクテリアの“緩やかな共生関係”の解明とその情報を利用した無菌化技術の開発
鈴

木

重

勝

【目的】自由生活性バクテリアは一部の藻類と相互作用

れ 5.3 Mbp と 6.5 Mbp であり，4,831 遺伝子と 5,501 遺伝

しており，藻類の成長や増殖に対して影響を及ぼすこと

子がコードされていた．これらの遺伝子をもとに代謝経が知られている．そのため，藻類とバクテリアの相互作

路のマッピングを行い，代謝産物を予測したところ，

用の理解は，藻類培養株の維持管理や，藻類細胞の無菌D9 株がリボフラビン，ビタミン B6，葉酸，トレハロー

化 プ ロ セ ス の 最 適 化 に 重 要 で あ る． 渦 鞭 毛 藻ス，インドール酢酸を合成できることが示唆された．そProrocentrum shikokuense は赤潮形成種であり，無菌状
態では増殖しないことから，藻類と自由生活性バクテリし た． こ の 培 地 を 用 い て 産 地 や 採 集 年 が 異 な る P.

アとの相互作用の解析に適している．本研究では，P.
shikokuense の複数の培養株を(図 1 )用いて，その共在バクテリアとの相互作用を明らかにすることを目的としこで，これらの代謝産物を添加した mIMK 培地を開発
shikokuense 4 培養株の無菌化を試みたところ，無菌化に成功した．NIES-900 株以外の 3 株でもメタゲノム解析を行い，共存バクテリアの種組成は大きく異なるが，同て，研究を行った．さらに，バクテリアの代謝産物をも様の代謝産物を産生可能であることが予測された．つまとに新規培地を開発し，その有効性を検証した．

り，P. shikokuense はバクテリアよりこれらの代謝産物の供給を受けていることが示唆される．C3 株のゲノムにはそれらの代謝経路の遺伝子は見られなかったが，細胞外分泌が予測されるホスホリパーゼ遺伝子とセルラーゼ遺伝子がコードされていた．細胞外セルロースの分解活性を調べるために，カルボキシメチルセルロース含有培地でバクテリアを培養し，コンゴーレッドで染色した．
その結果，C3 株のみが細胞外セルロースの分解活性を示した．渦鞭毛藻の細胞はセルロース性の鎧板で囲まれ

図 1 Prorocentrum shikokuense の培養株
A: NIES-682, B: NIES-900, C: NIES-2010, D: NIES-3444ており，バクテリアが死細胞の鎧板へ付着する様子が観察されることから，C3 株は渦鞭毛藻の鎧板を分解し炭素【方法】Prorocentrum shikokuense NIES-900 株には，大源として利用できると考えられる．したがって，D9 株 がきく 2 種類の共存バクテリアが含まれていた，それらの代謝産物を P. shikokuense に供給し，その増殖を促進し，バクテリアを単離培養し，illumina と Nanopore シーケ

C3 株が P. shikokuese の鎧板を分 解することで炭素源をンサーを用いてシーケンスを行い，ゲノム配列を決定しD9 株に供給するという相互作用モデルを提案する(図 2)．

た．DFAST を用いて遺伝子モデルを予測し，産生可能な代謝産物を KEGG により予測した．IMK 培地をベースに予測されたバクテリアの 5 つの代謝産物を加えた新規培地( mIMK )を開発し，マイクロピペット法により P. shikokuense の 複 数 の 培 養 株( NIES-682，NIES900，NIES-2010，NIES-3666 )の無菌化を試みた．さらに，共存バクテリアのセルロース資化性を検証するために，0.5 ％カルボキシルメチルセルロース含有培地で培養し，コンゴーレッドによる染色を行った．
【 結 果・ 考 察 】 メ タ ゲ ノ ム 解 析 の 結 果，Prorocentrum
shikokuense NIES-900 株 の 共 存 バ ク テ リ ア は， 主 にAlteromonadales bacterial strain D9 と Cytophagales
bacterial strain C3 の 2 種で構成されていた．それらの単離培養株を確立し，ゲノム解析を行ったところ，それぞ所属

国立環境研究所 生物・生態系環境研究センター

図2

Prorocentrum shikokuense と共存バクテリアの相互作用モデル

E-mail: suzuki.shigekatsu@nies.go.jp－ 114 －

IFO Res.Commun. 352021

鉱物による直接的な代謝促進を利用した難培養性微生物の新規単離技術の確立
五十嵐

健

輔

【目的】環境中の多くの微生物が難培養性であることの結果，独立栄養条件のいずれの培養でも，グライガイト

理由の一つとして，他の微生物や鉱物によって与えられ添加時には増殖の速い酢酸生成菌が徐々に優占化している補因子や生理活性物質が実験室内では供給されないこく傾向が見られた．グライガイトを直接混合した平板培とが挙げられる．磁硫化鉄(グライガイト，Fe3 S 4)は様々

地を用い，種々の環境微生物源からの分離培養を試みたな嫌気環境に存在しており，その結晶構造は生物がもつ結果，特に水田土壌でのコロニー形成数の増加が確認さ鉄イオウクラスターに類似していることが知られていれた(図 1，B)．またこのコロニー形成の促進は，グラる．この鉱物は，特に嫌気性で独立栄養性の細菌とアーイガイトの抽出液を添加した際にも観察された．ニッケ

キアの増殖を促進する活性をもつことが純粋培養系の実

ルをドーピングしたグライガイトでは，コロニー形成率

験で示されている．更に近年では，細菌の代謝において上昇に更に効果的であった．硫化ナトリウムによる培地

細胞外の鉄イオウクラスターを取り込む機構が報告されの還元は，グライガイトの促進効果の発現に必要であるている．以上から，細胞外の鉄イオウクラスターを要求ことが示された．分離培養の結果，16S rRNA 遺伝子ベーする微生物は，グライガイトの存在下で生育可能になる

スで既知の株との比較的低い相同性を示す複数の株，即という仮説を考案した．本研究では，このグライガイト

ち 代 表 例 と し て Tepidibacter formicigenes(95 ％)や，のもつ増殖促進作用を利用して，環境微生物の増殖促進手法を確立し，更には難培養性の微生物を培養・単離す

Aquipluma nitroreducens(96 ％)に最近縁株をもつ株などを取得することに成功した．これらの株は，グライガ

ることを目的とした．

イト非存在下でも増殖するものの，グライガイト存在下【方法】グライガイトの合成は，既報による無機合成法

で増殖促進を示した．また，既知の株と高い相同性を示に従って行った．また，グライガイトにニッケルをドーす 単 離 株( 例 え ば，Clostridium magnum strain FM5，

ピングした改変グライガイトの合成も行った．グライガ

99 ％)であっても，グライガイト存在下で著しい増殖促

イト結晶をリン酸緩衝液中で嫌気的に加熱することで，進を示した．増殖促進を示した単離株の共通性質として，増殖促進性の成分を含む抽出液を調製した．種々の嫌気鉄イオウタンパク質がキー酵素として機能する炭素固定環境(水田土壌，森林土壌，河川底泥など)由来の微生経路や電子伝達系をもつことが示され，グライガイト由

物源を，グライガイト(添加濃度 20 g/L)，または，そ来の鉄イオウクラスター供給と代謝促進との関係性が示の抽出物を添加した液体培地を用い，独立栄養条件(H2唆された．本研究により，グライガイトを用いた微生物+CO2 ，または CO)，および従属栄養条件(酢酸またはエ

群集の活性化と，それを利用した単離法についての基礎

タノール)で集積培養(静置，20 ～ 35 ℃)した．グライ技術が確立したと考えられる．今後の研究では，グライ

ガイトによる促進効果の評価は，菌密度の直接計数法とガイトによる促進機構の解明，および真に難培養である

各種クロマトグラフィーによる代謝産物(メタン，有機

微生物の単離を試みる予定である．

酸など)の定量により行った．集積培養物の菌叢解析は，
16S rRNA 遺伝子 V3-V4 領域を対象とした次世代シーケンシング(MiSeq または iSeq 100)により行った．分離培養実験では，グライガイト粒子，および，その抽出物を添加した寒天またはゲランガム平板培地を用いた．なお，グライガイトは空気酸化しやすいため，グライガイ
トを扱う全ての実験操作は，嫌気雰囲気下で行った．
【結果・考察】本実験で試したいずれの微生物源を用いた培養でも，特に独立栄養条件では，グライガイト添加
特に増殖の促進効果が見られ，それは特に水田土壌で顕著であった(図 1，A)
．このことから，環境中の複雑な微生物群集に対してもグライガイトによる増殖促進効果が有効であることが示された．集積培養物の菌叢解析の所属

産業技術総合研究所生物プロセス研究部門

図1

グライガイトによる増殖促進効果．(A)水田土壌を植菌源として独立栄養条件(H2+CO2)で培養した際の酢酸生成量の推移．
(B)グライガイト添加が水田
土壌懸濁物からのコロニー形成効率へ与える影響．

E-mail: igarashi.kensuke@aist.go.jp－ 115 －

IFO Res.Commun. 35
2021

嫌気的芳香族系廃水処理に特化した DPANN 上門アーキアの培養とその生態学的意義の解明
黒【目的】アーキアは土壌や淡水，海水，深海，地下水，温泉

田

恭

平

は 2 本ずつ作製し，培養 78，109 日目にそれぞれフェノーのような様々な環境に幅広く存在しており，地球上の窒ルに合わせて酢酸(PNHAc, PNaAc)とメタノール＋水素

素循環や炭素循環，嫌気廃水処理技術等において重要な(PNHMH, PNaMH)を 5 mM ずつ添加した．基質濃度は役割を果たしている．このようにアーキアは自然環境とすべて 5 mM に設定した．発生メタンガス量は TCD 型

人工環境の双方にとって必須の微生物である．一方，培

ガスクロマトグラフィーで測定した．16S rRNA 遺伝子

養の難しさのためにその生理機能は未知であるものが多解析は各培養系から DNA を抽出後，Univ515F-909R プ

い．しかし近年の急速なゲノム解析の進歩により，他のアー

ライマーセットを用いて PCR 増幅を行い，MiSeq によ

キアと共生するなどの新しい代謝機能をもつ DPANN 上門

り遺伝子配列を得た．16S rRNA 遺伝子配列は QIIME2(提唱された当時の Diapherotrites 門，Parvarchaeota 門，により解析した．DPANN アーキアとメタン生成アーキ

Aenigmarchaeota 門，Nanoarchaeota 門，Nanohaloarchaea

アの相関を Spearman の順位相関に基づいて解析した．

門の頭文字から命名)に属するアーキアが明らかになり【結果・考察】本研究において 4 種類の廃水処理汚泥の始め，研究者たちの間でもしばしば研究されている．

メ タ ゲ ノ ム 解 析 を 行 っ た 結 果，Woesearchaeota，

DPANN アーキアは細胞とゲノムサイズが小さく，一部の系

Pacearcheaeota，Iainarchaeota，Micarchaeota に属する統群が他のアーキアに共生する可能性が示唆されている．

5 種の DPANN アーキアの高品質ゲノムを得た(ゲノム

また我々の既往の研究により，この系統群は嫌気性廃水処

サイズ 0.62 – 0.93 Mb)．最も DPANN アーキアのゲノム

理汚泥中に多く存在することが明らかになっている．本研を回収した UASB 反応槽保持汚泥を植種源とし，培養実究では，嫌気的芳香族系廃水処理システムを中心とした廃験及びその 16S rRNA 遺伝子解析を行った結果，F，CH

水処理汚泥から DPANN アーキアのゲノムを回収し，そのを除くすべての系において DPANN グループに属する

生理機能の予測を行った．加えて，嫌気環境下で DPANN

WCHD3-30 が検出された(原核生物全体での存在割合

アーキアの培養を行い，その培養系の群集構造変化から0.027 – 5.5 ％)． そ の 他 の DPANN ア ー キ ア と し て

DPANN アーキアの生態学的意義の推測を行った．

Y L A 114 が MH ，P1 ，P2 ，PAc ，PMH ，PNaAc ，【方法】ポリエチレンテレフタレート製造模擬廃水を処

PNaMH の系に存在していた(0.018 – 2.0 ％)．これら嫌理する upflow anaerobic sludge blankt(UASB)反応槽保

気性 DPANN アーキアは，阻害剤に塩化アンモニウム

持汚泥，活性汚泥，下水消化汚泥から抽出した DNA は，を用いると検出されなかったことから，高濃度のアン

NovaSeq6000(150 bp×2)によるショットガンシーケン

モニアが嫌気性 DPANN アーキアの生育を阻害する可ス解析に供した．DNA 配列データはクオリティトリミ

能 性 が 考 え ら れ た． 相 関 解 析 の 結 果，WCHD3-30 はング等を行い，megahit や SPAdes によるアセンブリを

Methanoregula，Methanosaeta 及 び Methanosarcina と の間 に 正 の 相 関 が み ら れ た(p < 0.05)．YLA114 は行 っ た．Binning 後， 得 ら れ た Bin は CheckM に よ りcompleteness，contamination の 推 定 を 行 っ た． 各 Binの 系 統 学 的 位 置 の 推 定 に は GTDB-Tk を 使 用 し た．

Methanoregula，Methanosaeta との間に正の相関がみられ た(p < 0.05)． 特 に，WCHD3-30 と YLA114 は 共 に

DPANN アーキアの培養では，Widdel 培地を基本培地

Methanoregula(WCHD3-30:rs = 0.62;YLA114:rs = 0.48)，

として，37 ℃の嫌気環境下で静置培養を行った．植種
源には UASB 反応槽保持汚泥を用いた．培養系は基質にMethanosaeta(WCHD3-30: rs = 0.49; YLA114: rs = 0.48)と強い相関があった．さらに WCHD3-30 と YLA114 とそれぞれギ酸(F)，酢酸(Ac)，メタノール＋水素(MH)，の間にも正の相関がみられた(rs = 0.47)．以上の結果か

二酸化炭素＋水素(CH)，植種汚泥の採取時期が異なる

ら，目レベルで異なる WCHD3-30 と YLA114 の生育にフェノール添加系(P1, P2)，フェノールに酢酸，メタノー

は同じ系統のメタン生成アーキアが関与している可能性

ル＋水素(5 mM)を添加した系(PAc, PMH)
，フェノーが考えられ，これまで報告されている DPANN アーキア

ルに阻害剤として塩化アンモニウム(5 g-N/L)を加えたの生理学的機能(アーキアに寄生，アミノ酸等を獲得)

系(PNH)，フェノールに塩化ナトリウム(5 g-Na/L)をから，これら嫌気性 DPANN アーキアはメタン生成アー

加えた系(PNa)を全量 20 mL で作成した．PNH と PNa

キアを宿主として生育していることが示唆された．

所属

都城工業高等専門学校物質工学科，現 産業技術総合研究所生命工学領域－ 116 －

E-mail: k.kuroda@aist.go.jp

IFO Res.Commun. 35
2021

地衣に共生する担子菌酵母の分布と多様性を紐解く
清

水

公

徳

【目的】地衣体は，菌類の仲間である地衣類と藻類の共の比較では，半年で数 mm の菌糸生育にとどまる地衣類

生体である．地衣体には地衣類，藻類の他にも多くの微に比べて分離された担子菌酵母の生育ははるかに早く，生物が共生あるいは寄生しているが，種の構成について

平板培地上では一週間ほどで同程度のサイズの集落を形は明らかになっていない．近年，地衣体には担子菌酵母成した．また，単一の地衣体から複数の異なる担子菌酵が普遍的に共生していることが示唆された．本研究では，

母が分離される例が認められたことから，地衣体内にはツエハナゴケ( Cladonia rei )を用いて地衣体に共生す複数種類の担子菌酵母が共生することが明らかになった．

る担子菌酵母の特徴を調査するため，微生物学的および地衣体から抽出された全ゲノム DNA を鋳型として，真分子生物学的検討を行った．

核生物全般の ITS 領域を対象とする PCR プライマーに【方法】千葉および神奈川の 8 地点で採取した C. rei により ITS 領域を増幅し，増幅産物についてメタゲノム解ついて担子菌酵母の分離を試みた．担子菌酵母の分離は，析を行ったところ，地衣体に含まれる担子菌酵母の割合

地衣体を細かく磨り潰し，その微小片を培養することでは地衣類( 60～75 ％)や藻類( 25～40 ％)と比較して担子菌酵母を出現させた．また，分離された担子菌酵母

圧倒的に低い( 0.1 ％未満)ことが明らかになった．そ菌株について，生育速度や形態などの諸性状を解析した．

こで，同じ DNA を鋳型として担子菌酵母特異的プライ

続いて，地衣体には複数種類の担子菌酵母が共生するこマーにより増幅された ITS 領域を用いてメタゲノム解析と が 明 ら か に な っ た た め， 真 核 生 物 の リ ボ ソ ー ムを行ったところ，いずれの地衣体にも 10 種類以上の異DNA-ITS 領域(以下，ITS 領域)を用いてメタゲノム

なる担子菌酵母が存在することが示唆された．これらは，解析を行い，地衣体内の担子菌酵母の種類や割合についHalobasidium 属，Septobasidium 属，Microsporomycesて解析を試みた．さらに，本研究で用いた C. rei は形態属に所属することが推定されるが，これらの菌群が地衣的にヒメレンゲゴケ( Cladonia ramulosa )と考えられとの共生関係を示唆する報告はいまだかつて存在しなていたが，種の異同に疑義が生じたため千葉県内にて採い．また，メタゲノムにより検出された 10 種以上の担取された地衣体標本の ITS 領域の塩基配列を調べた．

子菌酵母のうち，分離培養されたものは 1 種だけであっ【結果・考察】千葉および神奈川県内 8 地点で採取した C.

たことから，地衣体に共生する担子菌として分離に至っ

rei から 41 株の担子菌酵母が分離された．これらは，ITS領域の塩基配列から 25 種類に分けられた．また，塩基配ていない種が相当数残されているものと考えられた．逆に，分離された担子菌の中にもメタゲノムのデータとし

列データベースとの比較の結果，今回分離した 25 種類て現れないものもあることから，地衣体ごとに共生するの担子菌はいずれも Microsporomycetaceae 科に分類さ担子菌は大きく異なっていることが示唆された．本研究れることが示唆された．また，系統解析の結果，これらで供試したツエハナゴケは形態的にヒメレンゲゴケと同の担子菌は，Lichenozyma 属または Microsporomyces 属

定されたものだが，C. rei と C. ramulosa の種の異同にに所属する少なくとも 6 系統に分類されることが示唆さ

ついて ITS 領域の塩基配列をもとに分類学的再検討をれ た． な お，Microsporomycetaceae 科 Lichenozyma 属

行った．その結果，供試した地衣体の塩基配列はヨーロッに所属する L. pisutiana は，地衣体から分離報告された

パ産の C. ramulosa のものとは異なり，C. rei と一致した．

ものである．平板培地上に形成される集落はオレンジ色

このことから，本研究で用いたサンプルは C. rei であるから淡褐色で，表面は滑らかな様子を呈した．生育速度と結論付けられた．

所属

東京理科大学先進工学部

E-mail: shimizuk@rs.tus.ac.jp－ 117 －

IFO Res.Commun. 35
2021

海生変形菌は存在するのか – 変形体および子実体形成能の検証から分類学的定義を議論する
矢

島

由

佳

【目的】変形菌は子実体と多核単細胞の変形体を形成すによる湿室培養と，海砂の寒天培地への塗布による培養

るステージを生活環に持つアメーバ様の陸生生物としを行なったが，これらからも変形菌に近縁なアメーバ様て，他の生物から分けられてきた．しかし所謂「例外」

生物は見られなかった．海水および汽水は寒天培地へのも知られ，特に近年では子実体も変形体も報告のない水直接塗布と，それぞれを濾過したメンブレンの寒天培養

生アメーバが，分子系統解析の結果から変形菌に属するを行い，汽水を濾過したメンブレンの素寒天・非冠水培可能性が複数報告されている．陸生変形菌は，一部の種

地の 10 ℃培養物から変形菌の Trichiales に近縁と推定さ類が陸水中でも変形体や子実体形成することが知られてれるアメーバ様生物が得られた(図 1 )．

おり，変形菌としての特徴を示せる状態で水中にも適応できることが示唆される．ところが 2007 年に海生ウニから単離された単核アメーバは，分子系統解析の結果変形菌に属する可能性が示唆されたものの，変形体も子実体も確認されず，その後の追加報告もない．そこで本研究では，一般に陸生生物と考えられている変形菌を海で探索し，さらに含塩環境での変形体および子実体形成能の検証か
ら，変形菌の分類学的定義を議論することを目的とした．
【方法】海生変形菌の探索は，太平洋および噴火湾沿岸の 4 地点を定期観察地とし 2019 年および 2020 年に実施

図1した．海水および汽水，海砂，海藻，ウニを対象とし，得られたアメーバ様生物

湿室培養および寒天培養によりアメーバ様生物の単離培

このアメーバ様生物は非含塩培地条件から単離された

養 を 行 っ た． 寒 天 培 養 に は 素 寒 天，MY75S，MY75S

ため，耐塩性検証のため含塩培地に接種したところ，

30 ％，および Erdschreiber 培地を用い含塩/非含塩ならMY75S 30 ％寒天培地で増殖が確認された．アメーバ形

びに冠水/非冠水条件を調製し，また湿室培養には人工以外に，変形菌の遊走細胞で見られるコンマ形で鞭毛を海水にて湿室環境を調製し，10 ℃および室温で培養を持ち螺旋状の運動をする姿も観察された．ミトコンドリ行なった．アメーバ様生物が見られた培養物から単離をアのクリステは管状であったが，ミトコンドリア核と鞭行い，変形体および子実体形成が見られるか培養を続け，

毛装置は現在まで観察されていない．また継続中の培養

またアメーバまたはシストを用いて DNA 抽出を行なった．

で変形体形成は見られず，近縁と推定される陸生変形菌

変形菌の明色胞子群，暗色胞子群用プライマーおよび真との Mating test では変形体形成は見られていない．以

核生物用プライマーを用いて 18S rRNA 部分配列を増幅さ上の結果から，得られたアメーバ様生物は変形菌の特徴

せ，相同性検索および系統解析を行なった．超微細形態が一部確認されるものの，その特定にはさらなる検討がは透過型電子顕微鏡観察にて検討を行なった．さらに陸必要であり，またアメーバ期の変形菌の分類形質自体も生変形菌および陸水性変形菌の調査も同時に行い，得らさらなる研究が必要であると考えられる．

れた変形菌の耐塩性を検討した．含塩環境から得られた

陸生変形菌を用いた耐塩性試験では，Didymium 属種

変形菌に近縁と推定されるアメーバは，陸生変形菌の近縁で含塩条件でのアメーバの増殖が見られた．先行研究の種と Mating test を実施し，変形体形成の有無を検証した．

ウニで得られたアメーバも Didymium 属に近縁とされる【結果・考察】海藻は 19 種が得られ，海藻片を基物としことから，本属にはアメーバ状態で含塩環境にも適応でた人工海水による湿室培養，海藻片を寒天培地上に接種きる種が存在すると考えられる．また非含塩条件で変形または海藻表面粘液を寒天培地に塗布した培養を実施し体形成した種が，含塩条件ではアメーバ増殖するもののたが，得られたアメーバ様生物に変形菌に近縁なものは変形体形成が見られないという結果が得られた．した見られなかった．ウニは 2 種が得られ，先行研究に従いがって，含塩条件でその形成が見られないとしても変形体腔液を寒天培地に塗布し培養を行ない，海砂は海中と体形成能を持たないことを意味せず，現行の分類学的定

砂浜で採取し，海砂上に滅菌した稲藁を載せた人工海水

義が直ちに否定されるわけではないことが示唆された．

所属

室蘭工業大学大学院工学研究科

E-mail: y.yajima@mmm.muroran-it.ac.jp－ 118 －

IFO Res.Commun. 35
2021

節足動物消化管の内外双方で異なる生活ステージを持つ腸内外両生接合菌類の探索
出

川

洋

介

【目的】接合菌類キクセラ亜門には節足動物の腸内菌と糞・土壌などに生育する糸状の腸外菌が知られるが , 双方の特徴を併せ持つ腸内外両生菌と称すべき生態群を新たに発見した．本研究では，カマドウマ科昆虫から得た腸 内 外 両 生 菌 類 の 未 記 載 種 Kickxellales( 未 記 載 属 )sp. 1 の分子系統解析を行い，近縁の既知種が腸内外両生菌である可能性を検証した．また，コオロギ科昆虫か
ら得た近縁種 sp. 2 と宿主交換実験，胞子の付着様式の観察による比較をして，宿主特異性について考察した．

図1【方法】長野県産カマドウマ科昆虫およびコオロギ科昆虫の糞より Kickxellales sp. 1，sp. 2 を検出し嫌気条件下

胞子を摂食させたフタホシコオロギの前胃の剛毛表面への付着胞子数( 2 種について 3 株ずつを適用)

で胞子を発芽させ分離菌株を確立した．18S および 28S

この結果より 2 種には宿主特異性が存在すると考えら

rDNA 領域の塩基配列を決定し最尤法系統樹を構築してれ，「宿主の前胃の剛毛の形態と胞子の修飾構造(歯列)系統関係を推定した．自然界ではこの 2 種は各科の宿主の形態との対応関係により宿主特異性が成立する」とい昆虫からしか検出されない．未感染のフタホシコオロギ

う作業仮説を考えた．そこでマダラカマドウマとフタホ(コオロギ科)を飼育し 2 種の胞子を摂食させ，糞から

シコオロギの前胃の剛毛の形態を詳しく観察したが，との菌の出現率，解剖による腸管内(前胃表面の剛毛密生

もに羽状の枝毛であり著しい差はなかった．次に 2 種の部)への胞子付着数の計測を行い，宿主特異性を検証し胞子の各宿主の前胃の剛毛への付着様式を詳しく観察した．また，走査型電子顕微鏡により胞子の腸内(前胃表た．その結果，sp. 1 では胞子片端で 6 面×縦 9 列の歯列面の剛毛)への付着様式を観察した .

において 6 個並ぶ歯と歯の間隙に剛毛が数カ所で挟まり付【結果・考察】系統解析の結果，sp. 1 は，既知のキクセ

着していた(図 2: 1-2，3 )．他方，sp. 2 の胞子には 6 面

ラ目菌の Myconymphaea yatsukahoi と系統的に類縁だと×縦 5 列の歯列があるが(図 2: 4 )，腸内では歯列以外の新たに判明した．同種は 2001 年に菅平高原の昆虫死骸部分が全て溶解し(図 2: 5 )，歯列のみが縦に並んだ 6 本より記載発表されて以後，再発見例が無かった．野外調の腕が開裂して折れ曲がり随所で絡まっていた(図 2:6 )．

査の結果，同種が小型の尿酸排泄動物の糞に発生することが判明し倍脚綱動物が宿主候補と考えられた．そこで，タイプ標本産地で 2019 年 7 - 10 月，イシムカデ目 58 個体，
オオムカデ目 27 個体を採集し糞を培養した結果，イシ
ムカデ目からのみ 19 個体の糞から本種が検出された．
また，他の 6 カ所で同様な検討をした結果，3 カ所の糞から本属菌が得られ，群馬県産株は胞子長径が顕著に短い未記載種であった．腸内ステージは未確定だが本種は

図 2 各種の胞子とその前胃表面の剛毛への付着の様子．
1-3: Kickxellales sp. 1(カマドウマ科昆虫腸内外両生菌)，
4-6:Kickxellales sp. 2(コオロギ科昆虫腸内外両生菌)

腸内に滞留して増殖すると判断され，昆虫に加え倍脚綱にも腸内外両生菌類が存在する可能性が判明した．今後，昆虫に限らず節足動物全般の探索が必要と考えられる．
次に Kickxellales sp. 1(カマドウマ科より分離)と sp. 2

いずれも歯列の歯と歯の間隙に剛毛を挟むという原理(コオロギ科より分離)の胞子をフタホシコオロギに摂を用いる点は共通で，各宿主の剛毛の形態に明瞭な差は食させたところ，糞からは 2 種とも出現したが sp. 2 にないため上述の作業仮説は棄却される．しかし，歯列の比べ sp. 1 の出現率は顕著に低かった．また胞子摂食後 2

数や配置，二次変化(溶解)の有無等，2 種の戦略は際立っ

日目に解剖をして腸内(前胃表面)への付着胞子数を計て異なり，宿主特異性に関連する可能性が高いが，これ測した結果，sp. 1 が sp. 2 に比べ著しく少なかった(図 1 )．

が宿主の何に対応するのか現段階ではわからない .

所属

筑波大学生命環境系

E-mail: degawa@sugadaira.tsukuba.ac.jp.

－ 119 －

IFO Res.Commun. 352021

キノコ類（子囊菌および担子菌）を起源とする新規抗生物質探索のための分子育種法の構築
渡

辺

賢

二

【目的】キノコ(担子菌類)は他の生物種とは異なるユ
ニークな二次代謝産物を生産することが知られている．
一方，キノコのゲノム情報が解読されるにつれ，既にキノコより単離されている二次代謝産物よりも多くの二次代謝産物生合成遺伝子がゲノム中に存在すると示唆されたため，多くの生合成遺伝子は休眠型であると考えられた．これら休眠型生合成遺伝子を強制的に発現させることで，化学構造として新規な二次代謝産物の獲得が期待

図1

される．しかしながら，キノコは遺伝子操作が一般的に化合物 1(coprinoferrin)の構造決定困難であるため，これまでにそのような研究例は報告さフォアだと決定し，coprinoferrin（ CPF ）と命名した．

れていない．そこで，本研究ではキノコのレギュレーター

活性を確認するためΔCclaeA/ Δcpf1( CPF 生合成遺伝子

遺伝子改変に基づく生合成経路の活性化ならびに新規化欠損株)に対して外部より CPF を投与する化学的相補試合物の獲得を目的に研究に着手した．

験を行った．その結果，培養 8 日目では陰性対照(DMSO)【方法】レギュレーター遺伝子 laeA 破壊による二次代謝変動と比較して固体培地上の CPF 投与域において菌糸成長が本研究では，キノコのモデル生物で我々が遺伝子操作系促進されていることが確認された．培養 16 日目では CPFを確立したウシグソヒトヨタケ Coprinopsis cinerea を用側においてのみ子実体形成が確認された(図 2)．以上のこいた．C. cinerea のゲノム情報をもとに，レギュレーター

とから，CPF は C. cinerea の菌糸成長促進作用・子実体

遺伝子を探索したところ，Aspergillus fumigatus のレギュ形成作用を有する生理活性分子であることが判明した．

レーター遺伝子 laeA と 49 ％の相同性を示す CC1G_00498
遺伝子(CclaeA )を見出した．そこでプロトプラスト-PEG 法 に て CclaeA を 破 壊 し， 得 ら れ た 破 壊 株(ΔCclaeA )の化合物生産を調べた．その結果，ΔCclaeAに お い て， 保 持 時 間 4.7 分 に 化 合 物 1(m/z 744.4871[M+H]+)の分子イオンピークが観測された．マススペ
クトルから化合物 1 の分子式は C35H66O10N7 であると推図2

定され，データベース検索から化合物 1 は新規化合物であることが示唆された．

ΔCclaeA/ Δcpf1 に対する化学的相補試験(a:CPF，b:DMSO)

化合物 1 の単離・構造決定と鉄（Ⅲ）結合能評価【結果・考察】C. cinerea は，CPF を産生・分泌するこΔCclaeA を MYG 培地(6.75 L )にて培養し，培養物の酢とで外部の鉄を効率的に体内に取り込んでいると考えら

酸エチル抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー

れる．そして取り込まれた鉄が菌糸成長の促進・子実体で分離し，さらに HPLC を用いて化合物 1 を 3.3 mg 単形成に重要な働きを有すると本研究から示唆された．

離することに成功した．NMR による構造解析を行った

CPF の生合成遺伝子クラスターはブナシメジなどの 200

ところ，化合物 1 は 3 回繰り返し型のアシル化ヒドロキ

種類を超える担子菌種で高度に保存されており，実際にシオルニチン構造を含む新規化合物であることが判明しCPF 類似生合成遺伝子クラスターを有する担子菌種にた．3 つの N-ヒドロキシオルニチンの絶対配置は改良

おいて CPF の生産が確認された．また，一般に子嚢菌

マーフィー法で 3 種とも L 体と決定した(図 1)．また，

由来 laeA は二次代謝産物生産を正に制御するのに対し，化合物 1 はその構造から鉄に配位し鉄取り込みを促進

予想外にも担子菌由来 CclaeA は CPF の生産を負に制御しする化合物(シデロフォア)と予想された．単離した化ていた．本研究は LaeA タンパク質の二次代謝制御におけ

合物 1 に対して鉄投与試験を行ったところ，鉄投与後る新たな機能を世に提示するものであり，本機能の解明ににピークの保持時間が変化し，鉄結合体に該当するマスより生合成遺伝子の休眠・覚醒化の理解，ひいては効率スペクトルが観測された．以上から化合物 1 はシデロ的な新規天然物獲得法の樹立へとつながると期待される．

所属

静岡県立大学薬学部

E-mail: kenji55@u-shizuoka-ken.ac.jp－ 120 －

IFO Res.Commun. 35
2021

黒酢醸造に関わる酢酸菌の優占化機構に関する研究
石【目的】壺造り純米黒酢は，鹿児島県霧島市福山町にお

井

正

治

てその差が顕著であった(図 1)．エタノールと乳酸は，

いて 200 年以上前から伝統的手法により醸造されてい黒酢醸造中にそれぞれ 7 ％と 0.8 ％程度まで上昇するが，る．黒酢の発酵には麹菌，酵母，酢酸菌，乳酸菌が関与

この濃度で A. pasteurianus の各菌株と A. aceti の共培養しているが，麹以外の培養菌を加えることなしに，素焼を行ったところ，A. pasteurianus の標準菌株，黒酢由来

きの壺の中で，糖化，アルコール発酵，酢酸発酵が自然株ともに有意に優占化したことから，エタノールと乳酸に進行するという特徴がある．酢酸菌については，壺内に対する耐性の違いが黒酢中での A. pasteurianus の優占壁に定着する多種の細菌の中から酢酸発酵中に化の主要因であることが示唆された．

Acetobacter pasteurianus が 自 然 に 優 占 化 す る こ と が 分かっている．Acetobacter 属酢酸菌は一般的にエタノールの不完全酸化により酢酸を一時的に蓄積する性質を持
ち，食酢醸造に利用されているが，先行研究において，A.
pasteurianus の類縁菌である Acetobacter aceti の培養液を壺に添加しても，酢酸生産経過に大きな影響はなく，A.
aceti は経時的に淘汰され，最終的には A. pasteurianus
が優占化することが示されており，壺内の何らかの物理

図1

化学的要因や A. pasteurianus に特有の代謝特性が，壺内酢酸菌株の 7 ％エタノール含有培地での生育での優占化に関わっていると予想される．本研究では，

黒酢発酵中に優占化する A. pasteurianus は，種菌また黒酢醸造において A. pasteurianus が優占化するメカニズ

は種酢としては添加していないため，壺内壁に定着してムを解明することを目的とした．

いる菌株が発酵中に増殖すると考えられている．黒酢醸【方法】黒酢醸造中に A. pasteurianus が優占化し始める造においては，酢酸発酵終了後の発酵液を複数の壺から時期は，発酵液中のエタノールと乳酸の濃度が上昇し始一つの壺に合わせる「壺寄せ」と呼ばれる操作の後に，める時期と一致している．そこで，A. pasteurianus の標

数ヶ月以上の熟成を行うため，壺内壁への菌株の定着は，

準株 NBRC 3283，
黒酢由来 A. pasteurianus の 3 菌株(BV1,

壺 寄 せ 後 の 熟 成 期 間 中 に 起 こ る と 予 想 さ れ る．16S

BV2, BV3)，および，A. aceti NBRC 14818 を用いて，エrDNA 配列のアンプリコン解析により，黒酢熟成過程にタノール，乳酸，酢酸に対する耐性を比較した．培養における経時的な細菌叢変化を解析したところ，壺寄せ直はグルコースとグリセロールを炭素源とし，5 ～ 7 ％の後には Lactobacillus 属の乳酸菌が細菌の 90 ％近くを占エタノール，0.5 ～ 1 ％の乳酸，または，1 ～ 6 ％の酢酸

めていたが，169 日目あたりから Komagataeibacter 属やを添加した寒天培地を用い，この上に段階希釈した酢酸

Gluconacetobacter 属の酢酸菌が優占種となり，熟成後期の 253 日目から酢酸菌の優占種が A. pasteurianus に交代菌培養液をスポットし，コロニー生育を観察した．共培
養試験は，液体培地に A. pasteurianus 各菌株と A. aceti

した(図 2 )．この結果により，長期間の熟成が壺内部にを等量植菌し，一定培養時間後に培養液から DNA を回おける A. pasteurianus の相対的残存量の増加をもたらし，収し，菌株特異的プライマーを用いた定量 PCR により同菌株の壺内壁への定着に有利に働くことが示された．

各菌株の存在割合を算出した．
黒酢熟成中の菌叢解析は，壺寄せ直後から約 2 週間おきに，液面下 20 cm の深さの発酵液をホールピペットでサンプリングし，DNA 回収後，16S rDNA V4 領域を PCR増幅した．PCR 産物を精製後，Illumina Miseq を用いた
シークエンス解析後，BLASTN による菌種同定を行った．
【結果・考察】耐性試験の結果，A. pasteurianus は標準
菌株，黒酢由来株ともに，A. aceti に比べてエタノールと乳酸に対して高い耐性を示し，特にエタノールにおい所属

東京大学大学院農学生命科学研究科

図2

E-mail: 141masaharu@g.ecc.u-tokyo.ac.jp－ 121 －

黒酢熟成期間中の細菌叢の変遷

IFO Res.Commun. 35
2021

細菌性ウイルス様粒子 GTA による環境適応機構の分子基盤
清

水

隆

之

【目的】近年，細菌における新たな遺伝子水平伝搬機構

パースルフィドの代謝制御に関わり，パースルフィドは活性と し て， 細 菌 性 ウ イ ル ス 様 粒 子 Gene Transfer Agent

酸素種( ROS)の消去に関わることから，SqrR がパース

( GTA )による形質導入機構が明らかになってきた．

ルフィドと ROS のバランスを適切に制御することでレドック

GTA は，細胞密度や栄養飢餓などのストレス状態に応スに応答した GTA 制御に関与していると考える．

じて細胞内で産生され，自身のゲノム DNA を内部に封入し細胞外に排出し，他個体に DNA を受け渡す機能を持つ．しかし，この応答の制御機構や制御を受ける意義の理解は不充分であった．申請者のこれまでの研究から，硫化水素由来のパースルフィド応答性転写因子 SqrR が
GTA 関連遺伝子の制御に関わることを見出していた．本
研究では，SqrR を介した新規 GTA 制御機構の解明に加えて，GTA が制御を受ける意義を考察するために，ストレス条件下での GTA の生育への有効性の解明を目的とした．
【方法】GTA 制御機構に対する SqrR の寄与を検証するために，野生株( WT )と sqrR 遺伝子欠損株(ΔsqrR )を用いて解析を行った．GTA 産生・放出量は GTA 抗体を用いたウェスタンによって検出した．細胞外に放出された GTA による他個体への DNA 導入活性は，リファ
ンピシン( Rif )耐性株から放出された GTA を Rif 感受性株に感染させることで得られた Rif 耐性株の数から算出した．また，GTA の生育への影響を解析するために，
GTA 関連遺伝子の欠損株(ΔGTA )を作成した．WT とΔGTA を炭素飢餓培地で 7 日，14 日，21 日培養した時の生残性を，コロニー形成率と ATP 量で定量した．
【結果・考察】GTA 制御機構への SqrR の寄与を検証す

図1

るために，GTA 産生量・放出量を log 期および定常期

GTA 関連遺伝子の転写量変化で検出したところ，WTよりもΔsqrR で GTA 量が多いこGTA が細胞内外のストレス状態に応じて産生・放出とがわかった．培養液中に放出された GTA の細菌へのされることの生物学的な意義を考察するために，ストレDNA 導入活性についても，WTよりもΔsqrR の方が高い

ス条件下での細胞の生残性を検証した．GTA は炭素飢活性を示し，ΔsqrR で機能的な GTA が多く産生・放出

餓で特に誘導されるため，WT とΔGTA を炭素飢餓条件

されることがわかった．この原因を調べるために，GTAにさらした際の生残性を調べた．飢餓 7 日目の生残性は関連遺伝子の転写量を比較したところ，GTA を構成す

ΔGTA の方が高かったが，その後は WT とΔGTA で差はる因子とその制御因子の転写量がΔsqrR で高いことがわなかった．飢餓 21 日後の細胞を富栄養な培地で復帰培かった(図 1A )．一方で，硫化水素処理はこれら遺伝子養した後，再度飢餓におくと，7 日目で観察されていたの転写量に影響を与えなかった．硫化水素処理は，細胞生残性の差がなくなった．1 度目の飢餓での差は GTA

内レドックス状態に影響を及ぼすことが考えられたた放出に伴う溶菌が原因でΔGTA の生残性が高くなったとめ，WT における GTA 関連遺伝子の転写量に対する過考える．一方，2 度目の飢餓で差がなくなったのは，

酸化水素の影響を検証したところ，WT では同様の転写

GTA による遺伝子構造の変化に基づく飢餓応答能の向量変化が観察されたが，ΔsqrR では変化は見られなかっ上が考えられる．以上より，GTA は細胞が各種ストレた．以上のことから，レドックスに応答した GTA 制御

スに恒常的に適応するのに重要な役割を持つ可能性が示機構に SqrR が関与することが明らかになった．SqrR は

唆された．

所属

東京大学大学院総合文化研究科

E-mail: ctshimizu@g.ecc.u-tokyo.ac.jp－ 122 －

IFO Res.Commun. 35
2021

次世代型プレバイオティクスを用いた腸内細菌叢制御
中

井

博

之

【目的】腸内常在菌叢バランスの崩壊により様々な疾患『汎用的オリゴ糖合成技術』(図 1 )を用いて，下記の評が発生することや様々な疾患に特徴的な腸内常在菌叢が価系に用いる g 単位でのオリゴ糖調製を可能とした．

これまでに報告されてきており，ヒトの健康保持増進や健康寿命の伸長の観点から腸内細菌叢制御の重要性への認識が高まってきている．そこで本研究では，ヒト腸管内でビフィズス菌や乳酸菌に代表される有用腸内細菌のみを「狙い撃ち」で増殖させ，効率的な腸内細菌叢改善を通した疾患予防・治療を可能とする『次世代型プレバ
イオティクス』を開発する．
【方法】腸内細菌叢を構成する細菌は善玉菌・悪玉菌・日和見菌の 3 つに大別され，その組成を制御する目的として難消化性のオリゴ糖がプレバイオティクスとの名で上市され流通しているが，これまで主にヒトによる消化
耐性と善玉菌の増殖促進の観点から開発されてきており，腸内に常在する日和見菌の資化によって起こる損失

図1

多種多様なオリゴ糖合成に適応可能な汎用的製造技術等は考慮されてこなかった．その要因として，ヒト腸内常在菌叢の全貌が明らかとなってこなかったことが挙げ

次に，ヒト腸内常在菌叢最優勢種，善玉細菌，悪玉菌等られる．しかし近年ヒト腸内細菌叢最優勢種が明らかとを配置した使い捨てのグリセロールストックから植菌スなり，その殆どが日和見菌であることが判明した．さらタンプを用いて，調製したオリゴ糖を含む培地が分注さに日和見菌の一部の細菌の増殖がヒトに慢性的なダメー

れた 96 穴プレートに植菌し，OD600 を指標に嫌気チャジを与えていることも明らかになってきている．そこでンバー内で培養した各細菌の生育度を測定した(図 2 )．

本研究では，オリゴ糖合成に有用な糖質関連酵素(主にその結果，ビフィズス菌や乳酸菌，その他の有用腸内細糖質加リン酸分解酵素:ホスホリラーゼ)を活用して独菌，各々を選択的に増殖可能なオリゴ糖を複数見出すこ

自で調製した新規オリゴ糖を含むオリゴ糖ライブラリーとが出来た．

を対象とし，上記ヒト腸内常在菌叢最優勢種等を用いたハイスループット資化性試験を実施することで，有用腸内細菌のみを増殖させ，効率的な腸内細菌叢改善を可能とする次世代型プレバイオティクスを探索した．
【結果・考察】水溶液中で行われるグリコシド結合の消長の際に脱水縮合反応を進行させること，単糖を重合させる反応は本質的に困難である．また糖転移酵素等による合成反応では基本的に元のグリコシド結合と同じ結合しか生成しないため，多種多様なオリゴ糖の大量調製は困難を極める．そこで今回，申請者が独自に見出してきたホスホリラーゼを活用することで，新規なオリゴ糖を含む多種多様なオリゴ糖を大量調製した．ホスホリラー
ゼは，無機リン酸存在下でオリゴ糖を含む糖質を分解して糖 1 リン酸を生成する反応を触媒すると同時に，糖 1リン酸と糖受容体を出発物質とした際はオリゴ糖合成反応を効率良く触媒する．そこで分解反応による糖 1 リン酸生産と目的とするオリゴ糖合成反応を組み合わせた所属

新潟大学農学部

E-mail: nakai@agr.niigata-u.ac.jp－ 123 －

図2

ヒト腸内常在菌叢最優勢種等を用いたハイスルー
プット資化性試験

IFO Res.Commun. 35
2021

Frankia 属放線菌の窒素固定と樹木との共生に関わる遺伝子の同定
九

町

健

一

【目的】Frankia 属は窒素固定能を持つ放線菌である．

窒素固定能も回復していた．従って，G23D3 変異株の窒素固定は単独または植物との共生状態で行われる．共原因遺伝子は共生・非共生の窒素固定に必須である．ゲ

生の宿主はハンノキやグミ・モクマオウ等の 200 種以上

ノム解析によりアミノ酸変化を伴いかつ表現型の異なるの樹木であり，共生の場は根に形成される根粒内である．

変異株が持たない変異を探索した結果，9 個の原因変異Frankia は，窒素固定酵素を酸素による失活から守るため，厚い脂質多重膜で覆われたユニークな球状構造体(ベ候補を見出した．

シクル)を菌糸の先端に分化させる(図 1 )．本課題で感受性蛍光色素による染色により，ベシクル内の酸素濃は窒素固定やベシクル分化が異常な変異株の詳細な表現度を調べた．変異株のベシクルは野生株のものに比べて型解析と，それらの変異原因遺伝子の同定に取り組んだ．

蛍光強度が弱く(図 2 )，ベシクル内の酸素濃度が上昇

ベシクル多重膜の発達が異常な N9D9 変異株 ― 酸素

していることが示唆された．変異株と復帰変異細胞のゲノム解析を行い，変異株では変異しているが復帰変異細胞では野生型に復帰している塩基を探索した．その結果，そのような塩基がヘリックス・ターン・ヘリックス型の転写因子をコードする遺伝子中に見いだされ，これがN9D9 変異株の変異原因遺伝子だと予想された．

図1

Frankia の窒素固定専用構造体ベシクル(矢印)．

【方法】ベシクルのサイズと膜厚の評価は暗視野顕微鏡により行った．変異株の細胞をアンモニアを含まない( N-）液体培地で培養することにより，復帰変異細胞またはサプレッサー変異細胞を濃縮した．これらの細胞をN-固体培地で培養し，単一コロニー由来の復帰変異株ま図2

酸素感受性蛍光色素によるベシクルの染色像．

たはサプレッサー変異株を得た．ゲノム解析は民間業者
または米国の共同研究者に委託した．根粒着生試験の宿ベシクルの見た目は正常だが共生・非共生ともに窒素主植物としてモクマオウ( Casuarina glauca )を用いた．

固定が行えない N3H4 変異株 ― 変異株とサプレッサー【結果・考察】変異株のゲノム解析の結果から，NAD+ 合成酵素が変異

ベシクルをほとんど形成しない G23D3 変異株 ― わず原因遺伝子であることが予想された．N-条件由来の細かに形成されるベシクルを顕微鏡で観察した結果，サイ

胞粗抽出タンパク質の NAD+ 合成活性は，変異株では野ズは小さく脂質多重膜の発達も乏しかったことから，こ生株より著しく低かった．一方，サプレッサー変異株はの変異株はベシクル分化に多面的な異常を示すことが分野生株と同等の活性を示した．大腸菌で合成した組換え

かった．N-条件において菌糸細胞で誘導される窒素代

タンパク質を用いて活性測定を行った結果，変異型の組謝遺伝子(グルタミン合成酵素)の発現調節は正常だっ

換えタンパク質は NAD+ 合成活性をほとんど示さなかった．また，微好気状態では窒素固定活性を示した．以上た．加えて，N-条件で培養した変異株の細胞内 NAD(H)の結果から，この変異株では一般的な窒素応答に関わる濃度は，野生株とサプレッサー株に比べて著しく低かっ

制御系( ntr 制御系)は正常であり，ベシクル分化に特た．以上の結果から，N3H4 変異株の変異原因遺伝子は化したマスター制御遺伝子が変異していると考えられNAD+ 合成酵素遺伝子であり，窒素固定に大量に必要とた．この変異株は根粒着生も全く行えなかった．単離さされる NAD(H)を十分量合成できないことにより，共れた復帰変異株は，非共生での窒素固定能に加えて共生

生・非共生双方での窒素固定に異常を示すと考えられた．

所属

鹿児島大学大学院理工学研究科

E-mail: k9928078@kadai.jp－ 124 －

IFO Res.Commun. 352021

二次代謝産物の生物学的意義解明による放線菌潜在能の開拓
木谷茂【目的】放線菌は，構造多様な生理活性物質を二次代謝菌株)の放線菌が S. albus との共培養に応答して，その産物とする微生物である．しかし，この二次代謝産物の代謝物生産が増加することが分かった．また，4 菌株で放線菌における「真の生物学的意義」は不明である．一は，化合物生産が共培養時にのみ検出されたのに対し，方，1 つの放線菌が多くの二次代謝クラスターを有する

残りの 5 菌株では，既存物質の生産性が共培養により向が，その大半は発現しておらず，この潜在する物質生産上していることが明らかとなった．化合物生産が共培養能を覚醒できれば，生理活性物質の有効な探索技術とな時にのみ検出された 4 菌株について精査したところ，1

りうると考えられる．

つの化合物の生産は，S. albus が産生する二次代謝シグ

本研究では，放線菌代謝物の他種放線菌に対する二次ナルに依存したが，他の化合物は二次代謝シグナルに応

代謝誘導能を解析し，「微生物二次代謝産物の生物学的答しない共培養依存的な物質であることが分かった．し役割」の一端を示すこと，また二次代謝誘導能を活用し，たがって，S. albus は二次代謝を誘導する新たなシグナ

休眠天然物を生産覚醒させる有用物質探索技術を確立すルを有する可能性が示唆された．また，1 つの放線菌種る，ことを目指した．

が，S. albus の代謝物プロファイルを変化させたことか【 方 法 】 二 次 代 謝 シ グ ナ ル 生 産 菌 Streptomyces albus

ら，放線菌間の代謝物による相互作用が示唆された．

J1074 株を各種放線菌 50 種との固体培地 3 種を用いた共一 方， 研 究 代 表 者 が 単 離 し た 海 綿 共 生 放 線 菌培養に供した．また，放線菌 Streptomyces lividans TK23株の色素系抗生物質の休眠生産を覚醒する海綿共生放線

Blastococcus sp. ST9 株は，S. lividans の休眠する色素系
抗生物質生産を覚醒する．そこで，Blastococcus sp. ST9菌 Blastococcus sp. ST9 株をゲノム DNA 情報がある放線株をゲノム DNA 情報がある放線菌種と液体培地にて共菌 5 種と液体培地 3 種を用いた共培養に供した．次に，培養させ，その代謝物プロファイルの変化を観察したと固体培地はメタノールにて，また液体培地は n -ブタノー

ころ，新たな化合物の生産を共培養時に検出した．これ

ルにて抽出し，その濃縮乾固物を DMSO に再溶解させ，までに，この共培養依存的物質を精製する工程を確立で共培養による代謝物プロファイルの変化を逆相 HPLC にきたことから，今後は，NMR などにより構造を解析し，より解析した．
【結果・考察】S. albus J1074 株は，その二次代謝シグナ

Blastococcus sp. ST9 株と S. avermitilis 間の共培養メカ
ニズムを解析する予定である．

ルを介して，放線菌 Streptomyces avermitilis のエバーメ

以上より，放線菌間に代謝物を介したシグナルトーク

クチン生産を誘導する．そこで，S. albus が他種放線菌が存在すること，またそのシグナルトークが放線菌の潜の二次代謝を誘導する可能性があると考え，共培養時の在的な物質生産能を開拓することに活用できることが示

代謝物を解析した．この代謝物解析では，2 菌株を非接唆された．今後は，覚醒物質や誘導物質の構造同定のさ触状態にて培養し，拡散性シグナル物質による代謝物変らなる解析により，微生物二次代謝産物の真の生物学的動を期待した．NBRC 供託放線菌株と研究室所有の放線意義が明らかとなることが期待される．

菌株の計 50 菌株の代謝物を解析したところ，18 ％( 9所属

大阪大学生物工学国際交流センター

E-mail: kitani@icb.osaka-u.ac.jp－ 125 －

IFO Res.Commun. 35
2021

次世代バクテリアセラピーを可能にするための微生物の体内制御技術
黒【目的】遺伝子改変微生物を使った治療(バクテリアセ

田

章

夫

Kit( QIAGEN )を用いて RNA を抽出して解析した．細ラピー)の研究が世界で進んでいる．例えば，尿素サイ

胞外多糖(EPS )量は Total Carbohydrate Assay Kit( Cell

クル異常症の患者は窒素をうまく代謝できず，血中の高Biolabs ) を 用 い た 硫 酸 -フ ェ ノ ー ル 法 で 測 定 し た．

濃度アンモニアによって脳障害を引き起こす．アルギニ

RN1008 株 の phoR 破 壊 は KEIO ク ロ ー ン JW0390 株

ンを生産する遺伝子改変大腸菌はアンモニアを効率的に(phoR::Km r )を用いて調整した P1 lysate を用いて行った．

除去できるので，アメリカ食品医薬品局(FDA)はこの【結果・考察】亜リン酸依存性株(RN1008)の増殖，生遺伝子改変大腸菌を経口で投与して，尿素サイクル異常存率等を解析した結果，次の二点について顕著な表現型症の治療に使う研究に許可を出した．しかしながらバクの変化が見出された．( i )生存特性:RN1008 株は亜リ

テリアセラピーを一般化するには，遺伝子改変細菌はン酸が存在しなければ増殖できないものの，亜リン酸が①治療が終わると死滅すること，②環境中で生存できな存在すれば野生株よりも(野生株のリン酸培地の生存よりいことなど，生育を厳密に制御できることが求められる．

も)長く生存できることがわかった．
(ii)EPS 分泌の亢進:

生物の利用するリンは，+5 価のリン酸( H2PO4 )も寒天培地上における EPS 産生量が RN1008 株では野生株

しくはリン酸化合物である．一方，本研究で利用する亜に比べて 6 倍以上に亢進していることが明らかとなった．

リン酸( H2PO3- )は +3 価のリンであり，天然にはほとRNAseq 解析による原因特定を試みた結果，リン酸レんど存在しない．我々は，大腸菌に亜リン酸の取り込み

ギュロン支配下のストレス応答(sodA)，生存性(ytfK)，と代謝に必要な遺伝子を導入し，同時に大腸菌本来のリ

EPS 生産(waaH, cpsB, ugd)等の遺伝子の発現量が大幅

ン酸輸送タンパク質の遺伝子を欠失させることで，通常に上昇しており，これらの関与が示唆された．RN1008のリン酸培地では生育できず，亜リン酸に依存して生育

株ではリン酸輸送体 pstSCAB 遺伝子が破壊されており，する改変大腸菌(亜リン酸依存性株)を作り出した．亜

その下流に存在するレギュレーター因子 phoU 遺伝子がリン酸依存性株は，亜リン酸のない一般環境や体内では共に破壊されていることが原因と考えられた．

-

増殖できないことから，人為的に亜リン酸を投与するこリン酸レギュロンは PhoU が欠損すると転写因子であとによってその増殖を制御することが可能であると考え

る PhoB が 恒 常 的 に 活 性 化 す る．RNAseq 解 析 で は，られた(図 1 )．本研究では，亜リン酸依存性株の増殖・

RN1008 において予想どおり PhoB 支配下遺伝子群の発生存特性の解明，また将来バクテリアセラピーに利用す現が上昇した．そこでセンサーキナーゼ phoR 遺伝子をるための改変を目的とした．

破壊することによって PhoB の活性化を抑制した．phoR
破壊株の生存率および EPS 産生を調べた結果，ともに野生株と同等に戻ることが明らかとなった．つまり，RN1008
株における生存率向上および EPS 産生亢進のいずれもリン酸レギュロンの活性化によってもたらされる表現型であることが明らかとなった．また今回生存特性が異なる亜リ
ン酸依存性株を得たことから，バイオセラピーに利用できる宿主のバラエティーを増やすことができたと言える．

図1

亜リン酸依存性株を使った体内制御【方法】大腸菌野生株(MG1655)および亜リン酸依存性株( RN1008: ∆pitA::frt, ∆pitB::frt, ∆phnC::frt, phoA::frt∆glpT::frt, ∆ugpB::frt, ∆uhpT::frt, ∆(pstSCAB - phoU)
560::Kmr, Ptac4071-ptxD/pTWV229, htxABCDE/pSTV28)
を，MOPS -グルコース培地(リン酸あるいは亜リン酸
濃度 1.0 mM )を用いて 37 ℃で培養し，対数増殖期の培
養 液 か ら RNAprotect Bacteria Reagent と RNeasy Mini
所属

広島大学大学院統合生命科学研究科

E-mail: akuroda@hiroshima-u.ac.jp－ 126 －

図2

亜リン酸依存性株の生存特性

IFO Res.Commun. 352021

海藻多糖フコイダンの微生物分解酵素系の解明とアミロイド線維抑制効果
大【目的】フコイダンは，L -フコースを主構成糖とする，

城隆

Fsut107

側鎖に硫酸基やウロン酸残基が結合した分子量 100,000

QDB06555
pdb|2X98

NP_001170991～ 1,000,000 の褐藻類特有の硫酸化多糖類であるが，そsp|P05186
AYI45556
NP_000469の分解代謝の詳細は明らかになっていない．フコイダン

Alkaline
phosphatase(PhoD )

XP_016856392
NP_001356734
NP_001348904には，抗ウイルス作用，抗ガン作用，抗凝血作用などのNP_001339832
NP_989703
XP_024306426

生理活性が報告されており，健康食品，医薬品としての

Arylsulfatase

NP_937793
AFR33673

期待がもたれているが，構造と活性の関連性は不明な点

sp|P51691
XP_005271961
WP_068828765

が多い．そこで我々の研究室では，規則的な分解産物をWP_068825883.1

生成できる酵素を利用したフコイダン分解について検討

フコイダン脱硫酸化酵素

図 1 Fsut107 とスルファターゼ，ホスファターゼのアミノ酸配列の系統樹解析を行ってきた．今までに，オキナワモズクフコイダン資化性微生物 Luteolibacter algae H18 が有するフコイダン
分解に関与する酵素群のうち，フコイダンデアセチラー(図 1 )．そこで，ホスファターゼ，スルファターゼの活ゼとフコイダン低分子化酵素を見出し，詳細な解明を実性測定に一般的に用いられる人工基質に対する活性を見施した．さらに H18 株がフコイダンを分解する際に脱たところ，p-ニトロフェニルホスフェート( pNPP )に硫酸化反応が起こることを明らかにしている．そこで本

対する活性が検出された一方，p-ニトロフェニルサル

研究では，フコイダン脱硫酸化酵素を研究の対象にした．

フェートに対する活性は認められなかった．本酵素のオまた，予備的な検討ではあるが，フコイダンがアルツハ

キナワモズクフコイダンと pNPP に対する反応性を比較

イマー病の原因とされているアミロイド線維の形成を阻すると，最大活性はフコイダンを基質にした方が高く，害することを明らかにしている．本研究では，フコイダン

親和性は pNPP を基質にした方が高かった．

のアミロイド線維形成阻害についての詳細な評価も行った．

オキナワモズク，コンブ，アカモク由来フコイダンの【方法】H18 株をオキナワモズクフコイダンを単一炭素

アミロイド線維形成阻害について検討した．その結果，源とする合成培地で培養し，得られた菌体からフコイダ

フコイダンを加えない場合，インキュベート 5 時間過ぎ

ン脱硫酸化酵素を精製した．N 末端アミノ酸配列とゲノから蛍光の上昇すなわち，アミロイド線維形成が見られ

ム情報より見出された目的遺伝子を，pCold I ベクター

たのに対し，フコイダンを添加すると，すべての場合でにより大腸菌で発現させ，粗酵素を Hi Trap で精製した

蛍光上昇の遅延，線維形成の阻害効果が見られ，なかで後，酵素化学的性質検討に用いた．酵素活性は，フコイ

もアカモクフコイダンに非常に強い阻害効果が認められダンから遊離する硫酸基をバリウム沈殿法により定量すた(図 2 )．これらフコイダンをオートクレーブ処理し，ることにより測定した．アミロイド線維形成阻害は，インシュリンをモデルタンパク質として用い，アミロイド＋コンブフコイダン 2.4 %線維と特異的に結合する色素，チオフラビン T がもたら

－フコイダン

す蛍光強度を測定することにより評価した．

＋モズクフコイダン 2.5 %【結果・考察】H18 株から精製した酵素の N 末端アミノ酸配列を基に，約 50 kDa のタンパク質をコードする脱硫酸化酵素遺伝子 fsut107 を見出した．組換え大腸菌か＋アカモクフコイダン 2.3 %ら精製した Fsut107 を用いて酵素化学的諸性質を検討したところ，本酵素はオキナワモズク以外にオオウキモフ
コイダンにも作用することがわかった．Fsut107 のアミ

図2ノ酸配列について BLAST 解析を行った結果，本酵素はフコイダンによるアミロイド線維形成阻害

既に報告されているフコイダン脱硫酸化酵素やアリルス

分子量を約 10 ～ 20 万から数千程度へと低分子化してもルファターゼよりも，PhoD ファミリーに属するアルカ効果を有していた．さらに，添加量についても検討した

リホスファターゼに類似していることが明らかになった

ところ，0.5 ％の添加でも効果が認められた．

所属

鳥取大学工学部

E-mail: ohshiro@tottori-u.ac.jp－ 127 －

IFO Res.Commun. 35
2021

細菌の菌体内外に生じるセレンナノ粒子の生成機構の解明とバイオアベイラビリティーに関する研究
三

原

久

明

【目的】セレンは主に，セレンタンパク質として種々の生理機能を発揮する．一方，ある種の細菌は，異化作用や無毒化作用により，セレン酸や亜セレン酸を，毒性の低い元素状セレンナノ粒子(SeNPs)に還元して細胞内外に蓄積・排出するが，SeNPs の形成機構は不明である．
本研究では，SeNPs の生成に関わる遺伝子，タンパク質を同定し，SeNPs 生成機構を解明することを目的とした．また，細菌が生成する SeNPs が，ラットの微量栄養素としてのセレン源になり得るかも検討した．

図1【 方 法 】 偏 性 嫌 気 性 異 化 的 金 属 還 元 細 菌 Geobacter

MHSEP が触媒する亜セレン酸還元反応

sulfurreducens のゲノム上に存在する extHIJK L MNOPQSに注目し，extKL を同菌内でリコンビナント発現させ，ると，40 - 100 nm の SeNPs を細胞外に生成する．SeNPs

その産物である Cyt c 様セレンタンパク質(MHSEP)をク質である OmpC，OmpA を含む複数のタンパク質が生化学的に解析した．extI 欠損株を作製し，その表現型

確 認 さ れ た． 外 膜 構 造 に 関 わ る ompC，ompA，nlpI，を調べ，ExtI と ExtH の細胞内局在を解析した．また，

tolA 遺伝子の各遺伝子破壊株を亜セレン酸含有培地で培養し，SeNPs 生成の様子を位相差顕微鏡で観察した結果，

SeNPs の形成と外膜小胞(OMV)の関連について調べる
た め，Escherichia coli BW25113(WT)お よ び ompC，
ompA，nlpI，tolA 遺伝子の各遺伝子破壊株について，
SeNPs の比較を行った．さらに，セレン欠乏状態ラットに E. coli 由来 SeNPs，亜セレン酸または人工 SeNPsに付着しているタンパク質を解析した結果，外膜タンパ

ΔtolA および ΔompC において，SeNPs が細胞表面もし
くは内部に蓄積・凝集している状態が観察された(図 2)．
ΔtolA および ΔompC では，SeNPs の細胞外への放出が出来ないことが示唆された．ΔtolA，ΔompC は WT に比を経口投与後，血清，尿，糞便及び各臓器を採取し，

べ約 2 倍量の OMV を生産する．ΔtolA では外膜の不完

LC-ICP-MS で血清中セレンタンパク質を定量すること

全さから細胞分裂位や極に大きな OMV が過剰に形成さでセレン欠乏状態からの回復を評価した．

れることが報告されており，細胞外への SeNPs 放出に【結果・考察】MHSEP は，サブユニット当たり 5 つのは，外膜構造の完全性が必要であることが示唆された．

ヘムと 1 つのセレノシステイン残基(Sec)をもち，還元型メチルビオロゲンを電子供与体とした亜セレン酸還元
反応を触媒することを見出した(図 1)．部位特異的変異
解析により，MHSEP の活性には Sec が必須であることが示された．extI 遺伝子がコードする ExtI は外膜タンパ
ク質と予想され，extH 遺伝子の産物 ExtH はロダネーゼ
様リポタンパク質であると推定された．in silico 解析お
よび，ウエスタンブロット解析により，ExtI は外膜タンパク質であることが示され，extI 遺伝子欠損株の解析よ

図2

り，ExtI は亜セレン酸の取り込みおよび SeNPs の形成

SeNPs を生成した E. coli ΔtolA 株の光学顕微鏡像に関与する可能性が示唆された．一方，ロダネーゼ様

E. coli 由来 SeNPs のラット投与時には他の化学形態

ExtH は内膜と外膜に局在することが示された．extI 遺で観察されたセレン欠乏状態からの回復が観察されな伝子の欠損は ExtH の外膜への局在に影響を与えた．外かった．また，セレンの臓器への分布もほとんど観察さ膜画分のゲルろ過解析を行ったところ，ExtI は ExtH とれなかった．経口摂取された E. coli 由来 SeNPs は吸収複合体を形成する可能性が示唆された．

がされにくいことが示され，動物にとっては，セレン栄

E. coli BW25113(WT)を亜セレン酸含有培地で培養す所属

立命館大学生命科学部

養源としての生理的活性を有しないことが示唆された．

E-mail: mihara@fc.ritsumei.ac.jp－ 128 －

IFO Res.Commun. 35
2021

微生物がつくりだすガラクトオリゴ糖合成酵素の機能改変－次世代型プレバイオティクスの生産基盤の構築－
田

中

俊

一

【目的】ミルクオリゴ糖には様々な結合様式と重合度のものがあり，その種類は 200 を超える．この構造的多様性こそが，数多のプレバイオティクスとしての生理機能を発揮する基盤となっている．一方，ミルクオリゴ糖を模倣する食品素材としてガラクトオリゴ糖( GOS )が利用されているが，その製造に使われる微生物由来 β-ガ
ラクトシダーゼは主に直鎖型 GOS を作るため，構造的多様性に乏しいのが現状である．そこで本研究では，
GOS の機能をよりミルクオリゴ糖に近づけることを志向し，分枝型 GOS を効率的に産生するような改変型酵素の作出を目指した．
【方法】我々の先行研究から，抗体様ペプチド(以降，
spMB と呼ぶ)を Bacillus circulans 由来 β -ガラクトシダー
ゼ(以降，BgaDD と呼ぶ)の基質結合部位周辺に結合させることで産生 GOS を直鎖型 β-1,4 から分枝型 β-1,3に改変できうることが分かっている．この知見を基に，本研究ではまず，spMB が BgaDD の特異性を改変する
メカニズムを解明するために，spMB と BgaDD の複合体の結晶化ならびに X 線結晶構造解析を行った．X 線回

図 1 spMB による BgaDD の基質特異性改変メカニズム
3 糖 GOS(黄色スティック)周辺の構造を示す．
(A)野生型 BgaDD による GOS 産生(B)spMB が結合した状態での BgaDD による GOS 産生

折データの取得は大型放射光施設 SPring-8 にて実施し続いて，得られた構造情報を基に，分枝型糖への特異た．その後，得られた構造情報に基づく変異体設計によっ性をさらに高めるような改良型 spMB の創出を検証して，分岐型 GOS の産生能が向上した改変型酵素の創出

た．spMB を構成するアミノ酸のうち，GOS の 3 糖目なに 取 り 組 ん だ． な お， 酵 素 反 応 に よ っ て 産 生 された

らびに 4 糖目部分に立体障害を与えているアミノ酸

GOS の 解 析 に は，ULTRON AF-HILIC-CD カ ラ ム( 信( Y31，S83 )を選択し，それぞれより嵩高いアミノ酸和化工)を設置した LC-20AD HPLC システム(島津製へと変異を導入した．その結果，表 1 に示すように，作所)を用いた．

spMB/S83Y( spMB/SY )，spMB/S83W( spMB/SW )【結果・考察】本研究対象である BgaDD と spMB の複はその側鎖の大きさに応じて分枝型糖( β-1,3 結合)の合体の X 線結晶構造解析に成功した．その構造から，比率を向上させた．つまり，より大きな立体的障害を設

spMB は BgaDD の活性中心近傍に結合し，GOS の 3 糖計することで，分枝型糖への特異性を大きく向上させる

目および 4 糖目部分の結合に対して立体的な障害を与えことに成功した．

ていることが確認された．図 1A に示すように，野生型

表1

BgaDD においては，GOS は触媒中心から糖結合ポケッ

産生 GOS の直鎖型と分枝型の比率
BgaDD

トの外側へ直線的に結合しており，産生される GOS は
直線的なもの(つまり直鎖型 GOS )に強く限定されると考えられる．一方で，spMB の活性中心近傍への結合
は，GOS の 3 糖目および 4 糖目部分の結合に対して立3 糖 GOS
4 糖 GOS

体的な障害を与えており，そのために GOS は直線的で

直鎖型
分枝型
直鎖型
分枝型

92 ％
8％
95 ％
5％

BgaDD
+spMB
60 ％
40 ％
40 ％
60 ％

BgaDD
+spMB/SY
37 ％
63 ％
38 ％
62 ％

BgaDD
+spMB/SW
28 ％
72 ％
26 ％
74 ％

はなく曲がった状態で結合していた．つまり，直鎖型糖

今後は，直鎖型を好む野生型酵素と分枝型を好む改変

よりも分枝型糖の産生に適した反応場が，spMB の結合型酵素の組合せ反応等を試験し，構造的多様性の広いによって作り出されていることが明らかとなった．

GOS の産生を検討する予定である．

所属

京都府立大学大学院生命環境科学研究科

E-mail: stanaka1@kpu.ac.jp－ 129 －

IFO Res.Commun. 35
2021

Bacillus 属細菌由来のべん毛モーター蛋白質を利用したナトリウムイオンセンサープローブの開発
南野徹【目的】運動性細菌は，べん毛と呼ばれるらせん繊維状

いて一分子観察したところ，この PGB ドメインは Na+の運動器官をスクリューのように回転させて水中を泳を取り除いても機能状態の構造が維持されていた．

ぐ . 回転運動を駆動しているのは，べん毛繊維の根元に300 mM NaCl および 300 mM KCl という条件下で成長ある直径約 45 ナノメートルの回転分子モーターである．

させた MotS(68-242) 結晶からそれぞれ 1.9 Å および 2.2 Å 程

べん毛モーターは回転子と，その周りに配置される約度の分解能の X 線回折強度データを収集することに成功

10 個の固定子複合体から構成される．イオンチャネル

した．両者の原子モデルを構築し精密化したところ，として働く固定子複合体が細胞の外側から内側に向かっNa+ の有無による構造の違いが確認できなかった(図 1)．

て流れる一価のカチオン流を回転力に変換する．固定子
は環境変化を感知するバイオセンサーとしても働く．固
定子のペプチドグリカン結合ドメイン(以降，PGB ド
メインと呼ぶ)が環境変化を感知すると，べん毛モーターの周りに配置される固定子の数が制御される．これまでに，我々は Bacillus subtilis(枯草菌)のべん毛モーターの固定子として働く MotPS 複合体がナトリウムイオン( Na+ )を直接感知するセンサーとして働くこと，Na+を取り除くと機能状態から機能しない状態へと可逆的に構造変化することを見出した．本研究では，MotPS 複

図1

合体が Na+ を感知する仕組みを利用し，生体内各部でNa+ の濃度変化をリアルタイムで計測できる蛍光タンパ
ク質プローブを開発することを目的とした．

Na+ の有無による MotS(68-242) の構造比較．
青，300 mM NaCl，シアン，300 mM KCl．

MotS(68-242) の β1 鎖に存在する 113 番目のアラニンは α1【方法】軟寒天培地を用いて 5 mM NaCl 存在下でも運動

ヘリックスに存在する 98 番目のバリンと疎水結合を形能を示す motPS 変異株を単離し，DNA シーケンス解析成していた．113 番目のアラニン残基がスレオニンスににより変異点を同定した．MotPS 複合体の PGB ドメイ

置換すると，スレオニン側鎖のメチル基が 98 番目のバ

ンは MotS の 68 番目のグルタミン残基から 242 番目のセリン残基と疎水結合するとともに，スレオニン側鎖の水

リ ン 残 基 で 構 成 さ れ る( 以 降，MotS(68–242) と 呼 ぶ)．

酸基が 99 番目のアスパラギン残基との間で水素結合をMotS(68–242) の X 線結晶構造解析を行うため，Escherichia形成できる．このことから，Na+ がない状態でも A113T

coli BL(DE3)Star 株内で MotS(68–242) を大量発現できるプ ラ ス ミ ド を 構 築 し た．MotS(68-242) を 発 現・ 精 製 し，の相互作用が安定になるものと推察された．さらに，結変異によって MotS(68-242) の α1 ヘリックスと β1 鎖との間

300 mM NaCl および 300 mM KCl という条件下で結晶化

晶中では MotS の 68 番目のグルタミン残基から 82 番目

した．大型放射光施設 SPring-8 のビームライン B41XUのセリン残基までの領域が安定な 2 次構造をとっていな

おび B45XU により得られた結晶の X 線回折強度データ

いことから，この領域の構造が Na+ によって安定化されを収集した．Na に依存した MotS(68-242) の構造変化をとるのではないかと考えた．そこで，MotS(68-242) の遠紫外らえるため，精製した MotS(68-242) の遠紫外円偏光二色性

円偏光二色性スペクトル測定を行った結果，MotS(68-242)+

スペクトルの測定を行った．

の α ヘ リ ッ ク ス 含 量 が 300 mM NaCl 存 在 下 に 比 べ て【結果・考察】MotS(68-242) に存在する Na+ センサー領域

25 mM NaCl 存在下では有意に減少していた．さらに，を同定するため，Na 濃度が 5 mM でも部分的に機能で68 番目のグルタミン残基から 77 番目のリジン残基を欠きる motPS 変異体を単離した．DNA シークエンス解析失させた MotS(78-242) では，Na+ に依存した α ヘリックス

から，MotS(68-242) の 113 番目のアラニンがスレオニンに含量の変化が見られなかった．以上の結果から，MotS

置 換 し て い る こ と が 判 明 し た． こ の A113T を 有 す るの 68 番目のグルタミン残基から 77 番目のリジン残基のMotPS 複合体を単離精製して高速原子間力顕微鏡を用領域が Na+ センサーとして機能することが示唆された．

+

所属

大阪大学大学院生命機能研究科

E-mail: tohru@fbs.osaka-u.ac.jp－ 130 －

IFO Res.Commun. 352021

微生物のもつシームレスクローニング活性を利用した新規シームレス
DNA クローニングシステムの開発
本橋健【目的】近年，急速に普及しているシームレスクローニ【結果・考察】シームレスクローニングでは，市販品がング法は，古典的な制限酵素とリガーゼを使用するク多数発売されているため，それと同様のクローニング効ローニング法と比較し，効率が高い．バイオ試薬各社は率を持つことが大切である．クローニング効率を市販の複数 DNA 断片を同時にベクターへクローニングできる

シームレスクローニングキットと比較を行った．図 1 にキットを競って発売している．これに対し，これまでの示すように反応温度が異なるもののほぼ同様のプロト

シームレスクローニング法とはまったく異なるアプロー

コールでその効率を比較したところ，コロニーの形成率，

チで，より効率の高いシームレスクローニング法であるクローニング効率でほぼ市販キットと同様の結果を示し

Seamless Ligation Cloning Extract(SLiCE)法 を 開 発 した(図 2 )．この結果から，SLiCE 法および In-Fusion 法

た．この方法は，通常研究室で使用する一般的な大腸菌などのシームレスクローニング法では，インサート:ベ株( JM109, DH5α など)から ｢ある一定条件下｣ で調

クターのモル比は，1:1 ～ 3:1 程度で効率良く反応が進製した粗抽出液を用いると，DNA 断片を効率良くベク

み，過剰のインサート DNA 断片(10:1 以上)は反応を阻

ターへシームレスに挿入できる．この方法を使用すると，害することが分かった．

一般的な大腸菌株の粗抽出液でシームレスクローニングできるため，特別な試薬を必要とせず，超低コストにク
ローニングできる．しかし，SLiCE 法では大腸菌粗抽出液を用いるため，ヌクレアーゼなどの混入もある．そのため反応条件等を工夫し，より安定に，かつ高い効率
で SLiCE クローニングを行う方法を検討した．
【方法】一般のシームレスクローニング法と同様に，
SLiCE 法はベクターの両末端と 15 bp 程度の相同配列をもつ DNA 断片を PCR などにより調製し，それをベク
タ ー に 挿 入 で き る． 反 応 に 用 い る Seamless Ligation
Cloning Extract(SLiCE)は，市販のタンパク質抽出液やTriton X-100 を含む緩衝液を用いて簡単に調製できる．
しかし，SLiCE はバクテリアの粗抽出液であるため，ヌ

図 2 SLiCE 法と In-Fusion のクローニング効率

クレアーゼをはじめ様々な夾雑物を含むことが予想される．そこで，その反応条件について，市販のシームレス

これ以外に，反応時間は 30 分程度で十分であり，通クローニング法との比較も含めて詳細に検討した(図 1 )．

常 15 分で十分なクローニング効率を得ることができた．

また，効率良くシームレスクローニングできる特徴を

クローニング時の DNA 断片精製は，通常のアガロース
ゲル電気泳動からの精製，およびシリカカラムを用いた活かして，いくつかの応用法も検討した．

精製サンプルでクローニング効率が高いだけでなく，未精製 DNA 断片や ExoSAP-IT 処理した DNA 断片でもクローニングできた．
また，SLiCE の高いクローニング活性を利用して，多断片 DNA の同時クローニングや SLiCE を用いた部位特異的突然変異法である SLiP 法のプロトコールも確立した．SLiCE 法は，特別な菌株を必要とせず，研究室で通常使用する大腸菌から調製できるため，0.4 円／反応
図1

所属という超低コストでシームレスクローニングできる方法

SLiCE 法と In-Fusion 法の概要

京都産業大学生命科学部

である．

E-mail: motohas@cc.kyoto-su.ac.jp－ 131 －

IFO Res.Commun. 35
2021

メタノール濃度に応答するシグナル伝達と転写制御機構の解明
由里本

博

也

【目的】強力なメタノール誘導性プロモーターを利用した異【結果・考察】Mxr1-FLAG を発現する K. phaffii 細胞を種タンパク質生産宿主として広く利用されているメタ

グルコース培地から様々な濃度のメタノール培地にシフノール資化性酵母 Komagataella phaffii(Pichia pastoris)

ト し，30 分 後 に タ ン パ ク 質 を 抽 出 し て Phos-tag

では，メタノール濃度に応答してメタノール誘導性遺伝

SDS-PAGE に供した．抗 FLAG 抗体を用いたイムノブ

子の発現レベルが制御される．メタノール資化性酵母はロット解析を行った結果，Mxr1 のリン酸化レベルがメ

メタノール濃度が約 0.05 ～ 0.2 ％の範囲内で日周変動す

タノール濃度が高くなるにつれて顕著に減少することをる植物葉面にも棲息しており，この濃度範囲においてメ見出した．さらに，抗 FLAG 抗体を用いた免疫沈降にタノール誘導性遺伝子の発現レベルが高く，通常の異種より精製した Mxr1-FLAG タンパク質について，抗ホスタンパク質生産時のメタノール濃度 0.5 ％以上ではそのホセリン抗体および抗ホスホスレオニン抗体を用いたイ発現レベルが低下する(図 1 )．本研究では，本酵母がムノブロット解析を行ったところ，Mxr1 のセリン残基持つポテンシャルを最大限に引き出し，低濃度から高濃がメタノール濃度非依存的に脱リン酸化され，スレオニ

度までのメタノール濃度に応じた効率的な生育と異種タ

ン残基がメタノール濃度依存的にリン酸化されることがンパク質生産の両立を可能にするため，メタノール濃度わかった．また，他のメタノール資化性酵母の Mxr1 ホに応答した転写制御機構とそのシグナル伝達機構の解明

モログタンパク質間で高度に保存されたアミノ酸領域にを目的とした．

含まれるスレオニン残基に着目し，その変異体を用いてメタノール誘導性遺伝子の発現レベルを解析した結果，スレオニン残基の 1 つが 0.1 ％以上のメタノール濃度での遺伝子発現制御に寄与している可能性が示唆された．
次に，メタノール濃度依存的な遺伝子発現制御に重要な Mxr1 における機能領域を同定するため，mxr1Δ 株において Mxr1 のドメイン欠失体発現株を作成し，メタ
ノール誘導性遺伝子(AOX1)の発現レベルを解析した．
全 長 1155 ア ミ ノ 酸 か ら 成 る Mxr1 の N 末 端 付 近 に はDNA 結合ドメインがあるため，C 末端側から段階的に

図1欠失させた変異体を設計した．各変異体を mxr1Δ 株でメタノール濃度に応答したメタノール誘導性遺伝子( AOX1 )の発現レベルと Wsc タンパク質の関与

発現し，各種メタノール濃度誘導時の AOX1 mRNA 量
を Mxr1 全長を持つ株と比較した結果，Mxr1 の中程の【方法】我々はこれまでに，細胞表層においてメタノー

ドメインに 0.1 ％以上の高濃度でのメタノール濃度依存

ル濃度の感知に寄与する Wsc タンパク質( Wsc1, Wsc3 )的な遺伝子発現制御に重要な領域があること，さらに Nを同定し，これらがメタノール濃度に依存した転写活性

末端側のドメインに 0.01 ％以下の低濃度での遺伝子発化レベルの制御に関与することを明らかにした(図 1 )．

現制御に重要な領域があることがわかった(図 2 )．今

また，Wsc タンパク質はメタノールと細胞表層ストレス後は，各ドメイン内でのリン酸化部位を同定し，上流のの両者に応答し，cell wall integrity(CWI)経路を経て下シグナル伝達因子との関連を明らかにしたい．

流の遺伝子発現を制御するが，これまでの解析により，メタノール誘導性遺伝子の発現は CWI 経路から分岐す
る未知の経路を経て，メタノール誘導性遺伝子発現に必須な転写因子 Mxr1 に伝達されると考えられた．そこで
本研究では，メタノール濃度に応答する遺伝子発現制御における Mxr1 の役割を明らかにするため，Mxr1 のリ
ン酸化動態を解析し，Mxr1 の機能領域を同定定するために，ドメイン欠失体を用いた解析を行った．
所属

京都大学大学院農学研究科

図2

E-mail: yurimoto.hiroya.5m@kyoto-u.ac.jp－ 132 －

Mxr1 ドメイン欠失体を用いた機能領域の解析

IFO Res.Commun. 35
2021

プロバイオティクス有用菌の消化管内定着性向上を目指した基盤技術の創製
小

川

哲

弘

【目的】近年の健康志向の高まりから，プロバイオティ【結果・考察】2′, 3′- 環状ヌクレオチドは，大腸菌が持クスの開発が盛んに進められている．その中にあって，

つ RNase I による宿主 RNA の分解産物として生成する．

これら有用菌の定着性の低さがボトルネックとなり，機バイオフィルムが形成されるためには，環境変化に応答能の発揮が制限されていた．今後，プロバイオティクス

して RNase I が阻害される必要があるが，そのメカニズ開発を発展させる上で，この点は克服すべき大きな課題

ムは不明であった．RNase I はリボソームと相互作用すである．当研究室では，これまで大腸菌をモデルとして，ることが知られている．また，バイオフィルム形成条件

バイオフィルム形成の分子機構について研究を行ってき下では，リボソームは構造変化を介して不活性型へと変た．細菌はバイオフィルムを介して腸管内に定着するこ換されるが，この現象は「リボソームの休眠」と呼ばれとから，バイオフィルム形成能を高めることで，有用細る．以上を踏まえ，我々は，この不活性型リボソームが菌の腸管での定着性を強化出来ると考えた．また，普遍特異的に RNase I を阻害するとの仮説を立てた．そこで，性の高いバイオフィルム形成機構を示すことで，幅広い細胞内に不活性型リボソームを蓄積する変異株のバイオ細菌に利用可能な技術へと発展することが期待された．

フィルム形成能を調べた．その結果，これら変異株では，こうした中，大腸菌において，新規シグナル因子 2′, 3′-

野生株と比較して有意に高いバイオフィルム形成能を示

環状ヌクレオチドがバイオフィルム形成を抑制するこした．一方，これら株において RNase I をプラスミドかとが報告された．しかし，このメカニズムには不明な点

ら過剰発現させると，バイオフィルム形成能は低下した．

があった．そこで，本研究では，2′, 3′- 環状ヌクレオチ

更に，不活性型リボソームが RNase I と結合し，RNAドを介した大腸菌の新規バイオフィルム形成機構の解明

分解が抑制されることを，in vitro で示した．以上より，を行った．この成果に基づいて，高いバイオフィルム形

2′, 3′- 環状ヌクレオチドの合成が，RNase I および不活成能を示す大腸菌変異株を選択した．そして，これらの性型リボソームにより制御されることが分かった．

株が，マウス腸管内で高い定着性を示すことの実証を試

次に，RNase I 欠損株( Δrna 株)および上述の不活性みた．これにより，遺伝子組換えプロバイオティクスの，型リボソーム蓄積株の，マウス腸内での定着性を調べた．

将来的な臨床利用に向けた基盤技術の創製を目指した．

これら株の培養液をマウスに経口接種した後，腸管内での定着性を解析した．その結果，実験に用いた全ての週【方法】不活性型リボソームを蓄積する変異株を，大腸

齢マウスで，これらの株がコントロール株に比べて高い

菌非必須遺伝子破壊株コレクション( Keio collection )腸内定着能を示すことが分かった(図 1 )．また，これらから取得した．これらの株をアミノ酸飢餓条件下で培養の株が盲腸から大腸にかけて定着する様子が観察された．

することで，バイオフィルム形成を誘導した．形成され今回明らかにした 2′, 3′- 環状ヌクレオチド，およびリたバイオフィルムを，クリスタルバイオレット法によりボソームの休眠は細菌に共通することから，本バイオ定量した．定着性評価には，5, 7, 9, 11 週齢のマウスをフィルム形成機構を応用することで，細菌に普遍的な腸用いた．また，大腸菌の可視化を目的とし，自家発光可管内定着性技術の確立が期待される．

能なバクテリア由来ルシフェラーゼ遺伝子を，アンピシ
リン耐性遺伝子をコードするプラスミドにて導入した．
マウスにカルベニシリンを投与し，あらかじめ常在菌を駆除した後，このプラスミドにて形質転換した大腸菌株の培養液を，マウスに経口投与した．その後，糞便を経時的に採取した．ルシフェラーゼ発光量を指標に，グラ
ム当たりの糞便中に含まれる大腸菌細胞数を算出し，これに基づいて定着性を評価した．また，In vivo イメー
ジング( IVIS )により，接種した大腸菌のマウス腸管での定着の様子を観察した．

所属

東京大学大学院農学生命科学研究科

図1

E-mail: atetsu@g.ecc.u-tokyo.ac.jp－ 133 －

RNase I 欠損株のマウス腸内定着性

IFO Res.Commun. 35
2021

大腸菌の呼吸鎖変異株が示す異常代謝の解析と産業利用横田篤【目的】大腸菌の呼吸鎖は NADH 脱水素酵素( NDH )【結果・考察】ΔΔ株において NDH-II の過剰発現を誘導しと末端酸化酵素(Cyt )から成り，プロトン駆動力(PMF )た NAD+ 株は，100 μM の IPTG 添加誘導時( NDH+100 )形成能の異なる成分を含む(図 1 )．我々は大腸菌のエに非誘導時( NAD+0 )と比較して最大生育量が増加し，

ネルギー代謝と糖代謝の関係を解析中に，PMF 形成能

W 株と同程度となった．一方，ndh 誘導時の比増殖速度の高い二つの呼吸鎖酵素である，I 型 NADH 脱水素酵素や糖消費速度はΔΔ株と同程度の値を示したことから，ΔΔ( NDH-I )と，bo 型末端酸化酵素( Cytbo )を同時に欠株における最大生育量の低下は主に酸化還元バランスの失させた変異株(ΔΔ株)が，生育の低下，中枢代謝の偏りによって引き起こされている一方，比増殖速度の低活性化及び，グルタミン酸と酢酸の異常蓄積を示すこと

下や糖消費速度の上昇はエネルギーレベルの低下によっを見出した．本研究では，このようなΔΔ株における野て引き起こされていることが示唆された．また，NDH

生株では観察されない異常な代謝を引き起こす原因を明活性及び，呼吸活性を測定したところ，NDH+ 株は ndh

らかにすることを目的とした．

誘導時にΔΔ株と比較して約 2 倍の NDH 活性を示し，呼吸活性も約 1.3 倍に上昇していた．さらに，NDH+ 株は
ndh 誘導時に野生株と同程度の NAD+/NADH 比を示した．
このことから，NDH-II の過剰発現により，ΔΔ株における酸化還元バランスが野生株並みに改善されたことが確認された．有機酸生産量を調べたところ，ΔΔ株では最大約 9 g/L の酢酸を生成した一方，NDH+ 株では ndh 誘
導時に野生株同様に培地中に酢酸はほとんど検出されなかった(図 2 )．これに対して，グルタミン酸の異常蓄
積は NDH-II を過剰発現しても解消されなかった(図 2 )．

図1

大腸菌の呼吸鎖成分とその PMF 形成能．

【方法】ΔΔ株におけるグルタミン酸と酢酸の蓄積が，エネルギーレベルの低下，または酸化還元バランスの偏りのどちらのエネルギー代謝の撹乱によって引き起こされて い る の か を 明 ら か に す る た め に， Δ Δ 株 に お い て
NADH 再酸化系の強化を試みた．そこで，大腸菌が有する ndh にコードされる PMF 形成能が無い II 型 NADH
脱水素酵素( NDH-II )をΔΔ株において過剰発現させる系を構築し，エネルギーレベルに影響を与えずに酸化還図2

元バランス( NAD+/NADH 比)の是正を試みた．ΔΔ株とその親株である野生株 Escherichia coli W1485 株( W

ΔΔ株及び NDH-II 過剰発現株による酢酸及びグルタミン酸生成量の変化．

株)，さらにΔΔ株に低コピープラスミド pMW119 に ndh

以上の結果から，NDH-II の過剰発現は NADH の再酸化をクローニングした IPTG 誘導型 ndh 過剰発現プラスミ

能を強化し，NADH によって阻害される TCA サイクルド( pMW119/ndh ) を 導 入 し た NDH+ 株 に つ い て，が活性化されたことで，酢酸へと向かっていたカーボン

50 g/L の グ ル コ ー ス を 含 む 無 機 塩 発 酵 培 地 を 用 い た

フローが TCA サイクル方向へ流れたと考えられた．こジャーファーメンターによるバッチ培養を行った．これ

れにより菌体を形成する前駆体物質の供給が増加したこ

らの株について，生育，糖消費，NDH 活性，呼吸活性，とで，最大生育量が増加したと思われた．一方，ΔΔ株

NAD /NADH 比，及び有機酸やグルタミン酸濃度を測におけるグルタミン酸の異常蓄積に関して，酸化還元バ

定した．

ランスの影響は限定的であると考えられた．

+

所属

北海道大学大学院農学研究院

E-mail: yokota@chem.agr.hokudai.ac.jp－ 134 －

IFO Res.Commun. 35
2021

ω3 系高度不飽和脂肪酸の微生物変換の解析とその応用に関する研究
小

川

拓

哉

【目的】エイコサペンタエン酸( EPA )やドコサヘキサ

し た と こ ろ，DHA の 2,4 -ジ エ ノ イ ル- CoA 体 に 対 し てエン酸(DHA )は ω-3 系高度不飽和脂肪酸の一種であり，DECR 活性を示した．これらのことから，DHA から EPA

人の健康維持・増進に有益な脂肪酸である(図 1 )．こへの変換にSl_1351 の寄与が重要であることがわかった．

れまでに EPA/DHA 生産性の真正細菌や真核微生物が次に，本菌が持つ 2 つの FadE ホモログ(Sl_1016, FadE1;

発見され，これらの微生物を利用した EPA/DHA 生産

Sl_1037, FadE2 )についても遺伝子変異解析を行ったと系の開発を目指して研究が進められてきた．既往の研究

ころ，fadE1 破壊株において DHA-EPA 変換が低下した．

によって EPA/DHA の生合成に関する理解は深まった

また，特異抗体を用いて発現レベルを調べた結果，培養が，一方で，EPA/DHA の分解や変換といった他の代謝

液への DHA の添加によって FadE1 の発現が上昇した一経路や代謝制御の研究報告は乏しく，EPA/DHA 代謝の方で，FadE2 の発現レベルは低いままだった．さらに，

包括的な理解には至っていない．EPA 生産菌 Shewanellain vitro アッセイの結果，組換え FadE1 は DHA-CoA に対して ACDH 活性を示した．以上のことから，FadE1

livingstonensis Ac10 は EPA の de novo 合成能を持つとともに，細胞外 DHA から EPA をつくるユニークな代謝変が DHA-EPA 変換に必要な ACDH であることがわかった．

換能を有する．微生物による EPA/DHA 代謝の知見を広Sl_1351( FadH )や Sl_1016( FadE1 )は 大 腸 菌げ，それらの応用可能性を検証するため，本 DHA-EPA

Escherichia coli の既知の β 酸化酵素に高い相同性を示す
ことから，DHA は典型的な β 酸化酵素群によって EPA変換を担う代謝酵素の同定と機能解析に取り組んだ．

へと変換されることが強く示唆された(図 2 )．しかし，組換え酵素を用いて in vitro で DHA-EPA 変換の再現を試みたところ，十分量の補酵素の存在下では EPA の β 酸化が進むことが示唆された．したがって，β 酸化を介して
図1

EPA を選択的に生じるには，β 酸化酵素群のほかに別のEPA（左）と DHA（右）の化学構造因子が必要であることが考えられた．S. livingstonensis【 方 法 】DHA か ら EPA へ 変 換 さ れ る 過 程 で 2 炭 素 とAc10 において，EPA は主に細胞膜リン脂質のアシル鎖

C=C 二重結合が 1 つ失われることから，β 酸化，あるいとして存在し，アシル基転移酵素 PlsC1 の働きによりは類似の代謝反応によって本変換が進むことを想定し，

EPA はリン脂質へ導入される．そこで，plsC1 破壊株を4 位の C=C 二重結合の還元に必要な 2,4 -ジエノイル- CoA

作製し DHA-EPA 変換能を分析したところ，本変異株に還元酵素( DECR, FadH )，および，β 酸化反応の初発

おいては EPA の蓄積は認められなかった．このことかステップを担うアシル- CoA 脱水素酵素( ACDH, FadE )ら，EPA の蓄積に PlsC1 が関わることが示唆された．変に注目した．S. livingstonensis Ac10 が持つ複数の FadH

換によって DHA から生じた EPA は PlsC1 によって素早および FadE ホモログについて，遺伝子破壊株の脂質組

く細胞膜へ取り込まれることで，さらなる β 酸化を免れ成の分析と，組換え酵素を用いた in vitro アッセイを行る可能性が考えられ，現在，その詳細な分子機序の解明

い，本代謝変換への関与を検討した．また，β 酸化を介に向けて研究を進めている．

して DHA から EPA を生じるには，β 酸化を 1 サイクルで終結する必要がある．この代謝制御機構を調べるため，
in vitro での DHA-EPA 変換の再構成，および，EPA を細胞膜リン脂質へ導入するアシル基転移酵素 PlsC1 の遺伝子破壊株の作製とその脂質分析を行った．
【結果・考察】本菌が持つ 6 つの FadH ホモログについて
遺伝子破壊株を作製したところ，sl_1351 破壊株における DHA-EPA 変換は親株と比べて 7.4 倍低下した．また，
Sl_1351 の組換え酵素を調製し in vitro で酵素活性を検討

所属

京都大学化学研究所

E-mail: ogawa.tky@mbc.kuicr.kyoto-u.ac.jp－ 135 －

図2

想定される DHA-EPA 変換反応

IFO Res.Commun. 35
2021

電気的膜電位制御に基づく細菌間相互作用の制御法の開発とそのデバイス化の検討
長

峯

邦

明

【目的】細菌は化学物質を介した相互作用により互いの機能(代謝活性，遊走，毒性発現等)を制御している．
特に枯草菌では K+イオンをシグナル伝達物質とした膜
電位依存的な代謝活性制御，及びシグナル伝達物質としての K+イオン分泌の膜電位依存的制御が明らかにされ，細菌の電気生理研究が加速しつつある．ここで膜電位とは，細菌の細胞内膜に蓄積された電位差である．
本研究の最終目標は，細菌と電極を一体化し，（1）デバイス化細菌への電気刺激印加によるシグナル伝達物質

図 2 (a)実験セットアップ，(b)グルコースに対する枯草菌の電流応答．

分泌制御と，（2）デバイス化細菌が周辺細菌からのシグ
ナル伝達物質を受容した時の代謝活性変化の計測，という 2 つの機能を実現する送受信型細菌/電極ハイブリッ
ドデバイスの確立である．これにより細菌間相互作用の天ゲルを電極対表面に貼付し，矩形パルス電流印加(電把握と攪乱を実現したい．本助成期間ではその基礎研究

流 10 mA，パルス幅 9.9 ms，周波数 100 Hz，印加時間 2.5 s )として①電気刺激による膜電位制御法の確立と②細菌代

を 3 回繰り返した時の蛍光輝度変化を 30 秒間隔で撮影

謝活性の電気化学計測法の確立を目的とした．

した．

【方法】膜電位制御実験

細菌の電気化学的代謝活性計測

本実験で用いた Bacillus subtilis（枯草菌）は -140 mV ～ここでいう代謝は酸素を利用した好気的代謝である．

-75 mV の静止膜電位を有する．この静止膜電位より負酸素を代替する酸化還元体(メディエータ)を用い，呼に帯電することを過分極，より正に帯電することを脱分吸電子伝達鎖の酵素により還元されたメディエータを細極と呼ぶ．膜電位はカチオン性蛍光膜電位プローブ

胞外電極で酸化することで間接的にその活性を計測しThioflavin T で可視化した．過分極では Thioflavin T が細た．測定溶液である各種メディエータを含むリン酸緩衝

菌内に蓄積し細菌から発せられる蛍光輝度が増加，脱分液へ作用極，対極，および Ag/AgCl 参照極を設置し(図極では細菌外に放出され蛍光輝度が減少する．図 1(a)に2(a))，そこへの枯草菌，及び栄養源である 20 mM グル

実験系の概略図を示す．電気刺激用電極には，通電時のコースの添加に伴う電流変化を計測した．

水の電気分解による溶液 pH 変化を抑えるために高電気二【結果・考察】図 1(b)に，繰り返し電気刺激印加時の蛍重層容量の導電性高分 子 poly(ethylene dioxythiophene

光輝度変化を示す．刺激印加により膜電位の過分極を反(PEDOT)を被覆した炭素電極対(電極間距離 1 mm )映した一過的かつ可逆的な蛍光輝度の増加が得られた．

を用いた．Thioflavin T 処理した枯草菌を付着させた寒この過分極応答は生細菌でのみ得られ，細菌非存在下，及びオートクレーブ処理細菌や脱共役剤カルボニルシア
ニド m -クロロフェニルヒドラゾン( CCCP )処理細菌
ではほとんど変化が無かった．現在，刺激前後の周辺
K+ イオン濃度変化を定量しており分泌制御の可能性を
引き続き調べている．
図 2(b)は 1-methoxy-5-ethylphenazinium をメディエータとした枯草菌のグルコース代謝活性計測の結果である．枯草菌添加後の電流増加は内因性の代謝活性に起因する．その後，グルコース添加に伴い電流が増加したことから本手法の妥当性が示された．現在，高分子を用い

図 1 (a)実験セットアップ，(b)枯草菌への電気刺激時の蛍光輝度変化．
所属

山形大学大学院有機材料システム研究科

た本メディエータと枯草菌の電極への固定化を引き続き検討している．

E-mail: nagamine@yz.yamagata-u.ac.jp－ 136 －

IFO Res.Commun. 35
2021

分裂酵母胞子表層タンパク質の特性を生かした
新奇の異種タンパク質発現・分泌生産・胞子細胞表面提示システムの構築
今

田

一

姫

【目的】分裂酵母の胞子は直径約 3 μm の球形で，凹凸のある強固な胞子壁に覆われている．胞子壁は主に多糖類からなるが，胞子壁の最外層は Isp3 タンパク質よって構成されている．Isp3 は減数分裂時に大量に発現し，将来の胞子の細胞質となる部分に蓄積する．前胞子が完成すると，細胞質部分に蓄積していた Isp3 は，胞子の細胞外である子のう側に分泌され，その後胞子壁の多糖類層の外側に Isp3 が定着し，Isp3 層を形成する(図 1 )．
図 2 GFP 融合 Isp3 の局在(左)胞子細胞外に分泌されない(中)胞子細胞外に分泌されるが定着しない(右)胞子細胞外に分泌され，胞子表層に定着する

後 の 遊 離 胞 子 に お い て も 蛍 光 観 察 を 行 い，GFP 融 合
図1

Isp3 の胞子表層定着安定性を確認した．

Isp3 の胞子形成過程における挙動【結果・考察】Isp3 の胞子細胞外への分泌と胞子表層へ
本研究は，胞子形成時に大量に発現する分裂酵母の胞の定着に必要あるいは十分な領域は明確には見つから

子表層タンパク質 Isp3 の発現系とその挙動を利用して，ず，領域の組合せによっては分泌率や定着率が低下する

異種タンパク質発現生産系を構築することを目的とすといった結果となった．このことから，Isp3 の挙動にはる．胞子の細胞外である子のう側に分泌されるのに必要構造も重要である可能性が考えられる．胞子細胞外へのな領域を用いることでタンパク質の分泌生産システム

分泌は，GFP に Isp3 の N 末端側 20 aa または C 末端側を，胞子壁の最外層として定着するのに必要な領域を用

52 aa の領域を付与することで見られた．特に N 末端側いることで胞子表層に任意のタンパク質を提示する新しが分泌に重要であり，さらに N 末端側 52 aa の領域で胞いタンパク質発現システムを構築できると考えられる．

子壁の多糖類層に結合していることが示唆された．Isp3【方法】Isp3 は 182 アミノ酸( aa )からなるタンパク質の胞子表層への安定的な定着には，Isp3 の中央領域が必である．Isp3 はプロリンが 5 つ連続する配列や，塩基性要であり，この領域は元の Isp3 と結合することで定着

アミノ酸が連続する配列など，特徴的な配列を有していに寄与していることが示唆された．胞子が遊離した後もる．Isp3 の挙動に関わる配列を特定するため，この配列安定して定着し続けるためには，この領域により元のを特徴的な配列を元に分割し，GFP を融合させること

Isp3 層への組込みが重要で，Isp3 の N 末端側による多で可視化した．本研究では，Isp3 の一部分の C 末端側糖類層への結合だけでは不十分であった．

に GFP を融合させた Isp3-GFPと，Isp3 の一部分の N 末

このような Isp3 の各領域による挙動の違いを利用す

端側に GFP を融合した GFP-Isp3 を発現させるためのプ

ることにより，分泌率は高いが胞子表層へは定着しない

ラスミドを作製した．各種 GFP 融合 Isp3 の発現には，
isp3 プロモーターと nmt1 ターミネーターを組合せて用

isp3Δ 株における Isp3(1-20 aa)を用いた分泌生産システ
ム，遊離直後は胞子表層へ定着するが時間経過とともにいた．これらのプラスミドを分裂酵母の野生型株または定着率が低下する isp3Δ 株における Isp3(1-79 aa)を用い

isp3Δ 株に導入し，GFP の蛍光観察を行うことで Isp3 の局在を確かめ，Isp3 が ①分泌されない，②分泌される

た一時的な細胞表面への提示システム，遊離後も安定しが定着しない，③分泌され定着する細胞の割合を求めたを用いた胞子細胞表面への持続的な提示システムなど，(図 2 )．さらに，胞子が子嚢から遊離した後の胞子表層用途に応じたタンパク質発現系を構築することができるへの定着を確認するため，胞子形成誘導後 3 日後と 7 日と考えられる．

所属

E-mail: imada@chem.suzuka-ct.ac.jp

国立高等専門学校機構鈴鹿工業高等専門学校生物応用化学科て胞子表層へ定着する野生型株における Isp3(1-47 aa)－ 137 －

IFO Res.Commun. 352021

耐熱性シアノバクテリアと微小電極を使って単光子を捉える
山野井

慶

徳

【目的】自然界で行われている光合成では光電変換効率が約 100 ％を示し，デバイスに応用することができれば，高性能な光電変換素子を作製できる．そのため，光合成の反応中心である光化学系 (I PSI)や光化学系 II(PSII)
を部品として光応答素子に組み込む試みが行われている．本研究では，PSI に着目し，生体－人工ハイブリッ
ド電極の作製を行った．
【方法】光化学系を用いた光電極を作製した時に問題となるのは，これらの電極接着時の配向性である．ルーメ
ン側，ストロマ側以外の部分で PSI が電極と接触すると，タンパク質でおおわれているので絶縁性が高く，光電変図2

換効率が落ちるという問題がある．本研究では，PSI のHOPG 上に(a)N-PSI と Cyt c，(b)G-PSI と Cyt c を固定化した電極の模式図

配向性を高めるために，シアノバクテリア Synechocystis
sp. PCC6803 の Psa E サブユニットに 6 つのシステインを向いていることが予想された．Cyt c とタンパク質コネクを導入し，図 1 に示すような白金ナノ粒子(PtNP)ナノター BS 3 の混合溶液を，PSI 層の上に滴下した(図 2)．

シートとの積層構造電極とした．加えて，電子伝達材料

光電気化学測定及び可視吸収分光測定を行い，デバイ

である Cyt c を積層させて電極と電解液中の犠牲試薬(電スの性能を調査した．PSI/PtNPs の光電流を測定した．

子供給源)との電子伝達効率を高める試みを行った．

その結果，N-PSI の平均光電流密度は 13.8 nA/cm2 であり，G-PSI の平均光電流密度 7.7 nA/cm2 の約 2 倍であった．また，波長依存性光電流測定では，PSI の Q バンド
吸収と同様のスペクトル形状を示し，PSI に由来する光電流であることが証明された．
次に，光導波路を用いて，PSI の可視吸収スペクトルを測定した．得られたスペクトルから，内部量子効率( IQE)を算出した．その結果，G-PSI/PtNPs の IQE は
N-PSI/PtNPs の IQE の 約 2 倍 と な り，G-PSI の 方 向 性

図1が制御された結果であると考えられる．さらに，PSI 上

Cyt c－PSI－PtNP で構成された光電極の模式図に Cyt c をドロップキャストした後，N-PSI と G-PSI の【結果・考察】デバイスを作製するために，まず PtNP

光電流密度を測定したところ，それぞれ 42.3 nA/cm2 とを合成し，透過型電子顕微鏡(TEM)観察により PtNP

14.4 nA/cm2 に飛躍的に向上した．これは電子メディエーの平均直径が 5.0±1.0 nm であることを確認した．そのターとしての Cyt c が PSI 中の P700+ の還元を促進する

後，Langmuir-Blodgett(LB)法により PtNPs ナノシート

こ と に 成 功 し た こ と を 示 唆 し て い る．Cyt c/N-PSI/を形成し，HOPG 基板上に貼り付けた．原子間力顕微鏡

PtNPs の効率は，Cyt c/G-PSI/PtNPs の効率をはるか( AFM )で観察したところ，ナノシートの厚さは 6 nmに上回っていた．

程度であり，単分子膜の厚さとほぼ一致していた．そのこの現象を明らかにするために，Cyt c/N-PSI/PtNPs

後，N-PSI( 未処理の PSI )と Pt-S 結合と水素結合を介の AFM 測定を行った．その結果，Cyt c の一部は N-PSI

して PtNP を接続する分子ワイヤを固定化した．一方，の上だけでなく，N-PSI の周囲にも固定化されていた．

陽極電流を発生させる設計では，ストロマ側に位置するタ

N-PSI の配向が不適切なため，最初は一部の PSI が利用

ンパク質に 6 個のシステインを挿入して G-PSI(遺伝子組みされないと考えていたが，末端に結合した Cyt c によっ

換え PSI )を形成した．G-PSI は Pt-S 結合を介して PtNPて PSI が活性化され，最終的には N-PSI の効率が大幅にと直接接続することができ，そのストロマ側が基質の方向

向上した．

所属

東京大学大学院理学系研究科

E-mail: yamanoi@chem.s.u-tokyo.ac.jp－ 138 －

IFO Res.Commun. 35
2021

シアノバクテリアを用いた非枯渇性資源生産基盤株の開発
景

山

伯

春

【目的】シアノバクテリアは光合成能を有し，増殖力が強いため，バイオ燃料等の有用物質生産プラットフォー
ムとしての応用が期待できる．農作地等の土地利用との競合の観点から海洋を利用した培養が望ましいが，海洋性のシアノバクテリアは一般に遺伝子操作が困難である．その一方で，淡水性シアノバクテリアには容易に遺伝子操作できる株が知られている．これらの淡水性シアノバクテリアが海水レベルの塩濃度で増殖力を保ったま
ま培養可能となれば，有用物質の生産基盤株として利用できる．淡水性シアノバクテリアを耐塩性化する為には，
まずシアノバクテリアの耐塩性機構を理解する必要がある．そこで，本研究では耐塩性シアノバクテリアを用いて塩ストレス耐性機構の分子基盤解析を行った．
【方法】耐塩性シアノバクテリア Halothece sp. PCC7418の細胞抽出液に含まれる蛋白質を 2 段階クロマトグラ
フィーの手法を用いて分離し，塩ストレス環境下において蓄積量が顕著に増加する蛋白質を N 末端アミノ酸配列解析によって同定した．同定した蛋白質をコードする遺伝子を Halothece sp. PCC7418 からクローニングした後に，大腸菌細胞内に導入して発現させた組み換え蛋白質を得た．この組み換え蛋白質は，酵素活性の生化学的解析に用いると共に，抗体作製用の抗原として使用した．

図1

調製したウサギポリクローナル抗体を用いることで，対解糖系と糖新生象蛋白質の細胞内動態を調査した．また，クローニング

続いて塩ストレス条件下における遺伝子発現パターン，した遺伝子を発現ベクターに組み込み，これを淡水性シ

蛋白質蓄積パターン，細胞内局在および複合体形成能にアノバクテリア Synechococcus elongatus PCC7942 に導入

ついて調査した．その結果，H2846 蛋白質が細胞質とペした．

リプラズム空間に局在し，ホモ六量体と推定される複合【結果・考察】Halothece sp. PCC7418 において強く塩誘体を形成していることを明らかにした．さらに，H2846

導される蛋白質として，基本代謝酵素の一つである I 型

遺伝子を淡水性シアノバクテリア Synechococcus elongatusのフルクトース- 1,6 -ビスリン酸アルドラーゼ( FBA )PCC7942 株に導入することで，耐塩性強化株を作出す( H2846 と命名)を同定した．FBA は解糖系や糖新生にる こ と が で き た． そ の 後，H2846 と Halothece sp.

必須の酵素である(図 1 )．系統解析により，II 型 FBA

PCC7418 に存在する II 型 FBA( H2847 と命名)との酵がシアノバクテリアにおいて普遍的に存在するのに対し

素活性比較解析をさらに詳細に行い，H2846 の活性のみて，H2846 と相同性の高い I 型 FBA は耐塩性シアノバ

が塩ストレス環境下で上昇することを見出した．さらに，クテリアのみにおいて存在していることが明らかになっH2846 の酵素活性は，Halothece sp. PCC7418 が塩ストレた．また，H2846 蛋白質の生化学的な機能解析を行い，ス環境下で合成・蓄積するグリシンベタインによって安フルクトース 1,6 -ビスリン酸を基質とする開裂反応の基定化することが明らかになった．これらの結果は，耐塩本パラメータを求めた．Km 値は 21 µM となり，これは性シアノバクテリアにおいて，塩誘導された I 型 FBA

既知のシアノバクテリアや高等植物由来の I 型 FBA とが基本代謝活性を保つことで耐塩性を増強していること

比較して概ね同レベルだった．

を示唆している．

所属

名城大学理工学部

E-mail: kageyama@meijo-u.ac.jp－ 139 －

IFO Res.Commun. 352021

自己生成させたポルフィリン色素を光増感剤として利用する
光駆動型の微生物触媒反応によるバイオ水素生産
本

田

裕

樹

【目的】水素は次世代のエネルギーキャリアとして注目

第 2 に，精製した Zn-UroIII を用いて MV の光触媒的され，今後の需要拡大が見込まれる．一方，工業的な水還元を試みた．緩衝液中で MV と TEOA を添加し光を照

素生産は化石燃料の使用に依存しており，水素社会の実射した際，光照射依存的に還元型 MV が生成した．MV

現に向けて，太陽光エネルギーを利用する水素生産系のは各種の金属酵素(例えばヒドロゲナーゼやニトロゲ構築に期待が寄せられる．本研究では，生体触媒の機能ナーゼ)への電子伝達体としての使用例が知られる．大を巧みに活用した水素生産，具体的には，光-化学エネ

腸菌で合成した色素による MV 光還元反応は，酵素反応

ルギー変換能と水素生産能を同時に付与した組換え大腸との共役による光駆動型生体触媒反応の構築につながる．

菌を触媒とする新たな光水素生産系の構築を目指した．

第 3 に，精製した Zn-UroIII，TEOA，MV，水素生成【方法】①ポルフィリン色素の生合成経路の強化と，②高能を付与した大腸菌を含む懸濁液へ光を照射したとこ

活性な水素生成能を示す [FeFe]-ヒドロゲナーゼ遺伝子

ろ，光照射依存的に水素が生成した(図 1 )．水素生成

群の発現，を同時に大腸菌に施し，生合成された色素に量は微量であるが，生合成された色素を光増感剤としたよる光エネルギー変換と，得られた還元力を用いる酵素で光水素生産系が構築可能なことを示した．一方，当初予の水素生産の共役により光水素生産の達成を目指した．

定した，色素合成能と物質生産能の両方を同時に組み込

大 腸 菌 BL21(DE3)で の 色 素 合 成 能 の 強 化 に 向 け，んだ大腸菌を用いる生体光触媒系の構築は，両者の条件

Rhodobacter capsulatus 由来アミノレブリン酸合成酵素
HemA，大腸菌由来 HemBCD を高生産させた．2YT 培が大きく異なるために未達成である．

地で培養後，陰イオン交換樹脂( DEAE sephadex A-25 )

色素分子と大腸菌細胞による光水素生産が可能なのか検に色素を吸着させ，洗浄，溶出を経て上清から色素を精討した．懸濁液に 530 nm の単色光を照射すると水素が製した．吸光度，ESI-MS，HPLC 分析から色素を同定生成した．EY と酵素間の電子伝達には MV の添加は不した．

要で，シンプルかつ高効率(見かけの量子収率 14 ％)

第 4 に，EY と TEOA，大腸菌細胞の懸濁液を用いて，精製した色素による光エネルギー変換能の確認には，な光水素生産が達成された．本結果は，本研究で掲げた色素，酵素への電子伝達を担うメチルビオローゲン(以色素による光増感反応によって酵素を光駆動するという

下，MV )，電子供与体トリエタノールアミン( TEOA )考えをヒントとしており，新規な光水素生産系の提案にを含む溶液に対して光照射( 405 nm )し，光照射時間

つながる成果を得た．

依存的な還元型 MV の生成を吸光度測定で追跡した．
大腸菌への水素生成能の付与に向け，[FeFe] -ヒドロゲナーゼおよび修飾酵素( Clostridium acetobutylicum 由来)を生産させた．組換え大腸菌の懸濁液に，色素，
MV，TEOA を加え，光照射時の水素生産を検討した．
また，光水素生産への色素分子の適用可能性を明らかにするため，大腸菌懸濁液に色素エオシン Y( EY )と
TEOA を添加し，光照射依存的な水素生産を検討した．
【結果・考察】以下の 4 つの実験から，色素分子の光増感反応と酵素反応を共役させる光水素生産系を構築した．
第 1 に大腸菌の色素合成能の強化により，培養液は赤
く呈色し色素の合成が確認された．培養上清から色素を精製し，各種分析を経て，生成された色素の主要成分は亜鉛が配位したウロポルフィリン III(Zn-UroIII)と同定
された．

所属

奈良女子大学研究院自然科学系化学領域

図1

E-mail: honda@cc.nara-wu.ac.jp－ 140 －

精製した色素を用いた光水素生産

IFO Res.Commun. 35
2021

高耐熱性バイオポリエステル微生物生産のための遺伝子資源探索
柘

植

丈

治

【目的】微生物が炭素貯蔵物質として細胞内に蓄積するポリヒドロキシアルカン酸( PHA )は，海洋環境でも生分解が可能なバイオプラスチックとして，その利用に注目が集まっている．PHA の中でも α 位にメチル基が付いた 3 -ヒドロキシ- 2 -メチルブタン酸( 3H2MB )をモ
ノマーユニットとする P(3H2MB)は，既存の PHA と比較して高耐熱性のポリマーである．現在，遺伝子組換え
大腸菌を用いた P(3H2MB)の生産量(蓄積量)は乾燥
菌体重量の 10 wt％程度であり，PHA の生産量としては低い値である．P(3H2MB)の生合成経路において律速

図2段階と考えられるのが，モノマー供給に関わる R 特異的

種々の phaJ 遺伝子を用いた P(3H2MB)合成結果

水和反応であり，その反応を触媒する R 特異的エノイル【結果・考察】この研究で調査した phaJ 遺伝子は，A.

CoA ヒドラターゼ( R -ヒドラターゼ，PhaJ )が，基質であるチグリル CoA に対して活性が低いことが原因と

caviae FA440 由 来 phaJ Ac, Pseudomonas aeruginosa
DSM1707 株由来 phaJ1 Pa, phaJ2 Pa, phaJ4 Pa の 3 種類，考えられる．そこで本研究では，P(3H2MB)生合成に

Pseudomonas putida KT2440 株 由 来 の phaJ1Pp, Bacillus

おけるモノマー供給酵素遺伝子を他細菌由来の phaJ 遺cereus YB-4 株由来の phaJBc の合計 6 種類である．このう
ち，P. aeruginosa DSM1707 由来の phaJ2Pa および phaJ4Pa

伝子に置き換えることで，P(3H2MB)生産量の増強が可能かを調べることを目的とした．

は，炭素鎖数 6 ～ 12 の基質に対して高い活性を示す中鎖特異的ヒドラターゼをコードしている．それ以外の

アセチル
CoA

チグリン酸

phaJ 遺伝子は，炭素鎖数 4 ～ 6 の基質に対して高い活性を示す短鎖特異的ヒドラターゼをコードしている．

酢酸

培養実験の結果，P(3H2MB)の合成が確認できたもプロピオニルトランスフェラーゼ
（）

特異的エノイル
ヒドラターゼのは全て短鎖異的ヒドラターゼを発現させたものであり，中鎖特異的ヒドラターゼ( phaJ2Pa と phaJ4Pa )では

H2O

P(3H2MB)の合成は確認できなかった．これまで用いていた phaJAc 遺伝子よりも P(3H2MB)の合成量が増加したのは，P. aeruginosa 由来の phaJ1Pa 遺伝子を発現さCoAせた場合のみで , 収量は 1.3 倍に増加した．
次 に， 大 腸 菌 の 粗 酵 素 液 を用 いて，PhaJAc および重合酵素改変体

図1

PhaJ1Pa のエノイル CoA に対する活性を測定した．PhaJAc
は，クロトニル CoA に対して 7500 U/mg の活 性値( A )P(3H2MB)の人工生合成経路を示したが，3H2MB の前駆体であるチグリル CoA には
0.18 U/mg( B)であり， その活 性 比( B/A )は 2.4×10 -5【方法】Aeromonas caviae 由来の PHA 生合成オペロンをと低い値であった．一方で PhaJ1Pa では，クロトニル CoA

組み込んだ大腸菌( β 酸化欠損株)に，種々の細菌由来に対して4200 U/mg の活性値であるのに対して，チグリルの phaJ 遺伝子を発現させ，チグリン酸を炭素源としてCoA には 0.16 U/mg であり，その活性比は 3.7×10 -5 であっ

30 ℃で 76 時間振とう培養した．チグリン酸は生育阻作た．これより，PhaJ1Pa は PhaJAc よりもチグリル CoA に対用を示すため，4 g/L を 2 回に分けて培地に添加した．

して相対的に若干高い活性を有することが分かった．

PHA 含有量は細胞から回収した PHA の重量を用いて算以上のことから，チグリル CoA に対する R 特異的ヒ

出し，モノマー組成はガスクロマトグラフ質量分析計

ド ラ タ ー ゼ 活 性 を 上 昇 さ せ る こ と が で き れ ば，

( GC-MS )を用いて調べた．

P(3H2MB)収量を増加できる可能性が示唆された．

所属

東京工業大学物質理工学院

E-mail: tsuge.t.aa@m.titech.ac.jp－ 141 －

IFO Res.Commun. 35
2021

地下圏の難分解性有機物を電気微生物分解してメタンを生成する
微生物群集中の電子授受機構の解明
石

井

俊

一

【目的】海底下 2 km の石炭層を含む下北沖掘削コア中か使用して褐炭分解のメタン生成を行う新たな機能性微生

ら，メタン生成を行う地下圏微生物群が，低品位炭(褐物群集が形成された事が示唆された．
続いて，両電極および浮遊菌群における全遺伝子発現炭)を基質とした DHS バイオリアクター中にて集積された． そ の 後， 当 該 微 生 物 群 集 を 生 物 電 気 化 学 セル

解析を行った．その結果，陽極で増殖した Geoalkalibacter( Bioelectrochemical system，BES )に播種し，褐炭か属細菌は，エタノールを栄養基質とし，多ヘム型シトク

らの電気メタン生成運転を行った．本研究では，BES

ローム C によって電極への電子輸送を行う発電菌であ中の電極上に形成されるバイオフィルム中の微生物群集る事が示唆された(図 1 )．興味深いことに，浮遊状態

が，どのように褐炭を生分解し，電気エネルギーを介しにおいては，鞭毛遺伝子と別の多ヘム型シトクローム Cてメタンを生成するのかを明らかにするため，メタオミ( 46 ヘムや 23 ヘムなど非常に多くのヘム鉄を有する)

クス解析を行った．

を高発現しており，明らかに電極上と浮遊菌状態で異な【 方 法 】 炭 素 織 布 電 極 間 に 600 mV の 電 圧 印 加 を 行 うる遺伝子発現挙動を示した(図 1 )．これは，この微生

BES 培養の 2 年および 4.5 年時に，陽極，陰極，および物が電気に依存して生きている事を強く示唆する結果であ浮遊菌を回収し，DNA と RNA を共抽出した．その後，る．陰極で高い遺伝子発現を示した微生物は，陰極に優回収された核酸を用いて，メタゲノムおよびメタトラン

占的に集積されている微生物群ではなく，水素資化性のメ

スクリプトームシーケンスを行った．DNA のリードは，タン生成を行うMethanobacterium 属アーキア，エタノール

CLC Genomics Workbench を用いて De novo アセンブリー

資化性の硫酸還元反応を行うDesulfomicrobium 属細菌，

し，Contig を 作 成 後，Metagenome assembled genome

ペプチドや多糖を栄養基質とする Anaerolineae 網細菌で( MAG ) を 作 成 し た．Open reading frame( ORF ) をあった．この中で Methanobacterium 属アーキアは，電流MetaGeneMark により作成後，RNA リードをマッピンに伴い電子と水素イオンから生成される水素を使用するこグ し， 各 遺 伝 子 の 相 対 発 現 量 を RPKM で 算 出 し た．

とから，間接的電気合成微生物である事が示唆された．

ORF は K A AS を用いて機能アノテーションし，CXXCH

以上の結果より，BES を用いて低品位炭(褐炭)のドメインの検出により電極との電子授受を担うシトク

微生物電気分解反応を行うと，各電極上に特異的な微生

ローム C を同定した．

物群集が集積し，陽極では直接電子授受が起こり，陰極【結果・考察】単一コピーの保存遺伝子である RpsC を

では水素を介してメタンが生成される事が示された．ま使用した群集構造解析の結果，2 年間の集積培養を行った，エタノールが低品位炭分解における重要な中間代謝

た BES 中においても，播種源の DHS バイオリアクター

産物である事が分かった．

中に存在する褐炭分解を担うと推測される各種バクテリ
アと，メタン生成を担う Methanobacterium 属アーキア
陽極バイオフィルム中での遺伝子発現（mRNA-RPKM)が保持されている事が分かった．しかし，陽極と陰極での微生物構造の差異は少なく，唯一，Desulfomicrobiumに属する硫酸還元菌が，陰極において多く見られた．これは，陰極において直接あるいは間接的に電極酸化・硫酸還元反応が行われている事を示唆している．4.5 年が経過した BES において，電子を収奪する陽極には発電性のGeoalkalibacter 属細菌が集積しており，電子が供給される陰極には Coriobacteriia 網，Thioalbus 属，Anaerolineaceae
科に属する細菌が見られ，播種源である DHS リアクターの群集には見られない微生物群の増殖が確認された．また，メタン生成を担う Methanobacterium 属アーキアも，国立研究開発法人海洋研究開発機構 超先鋭研究開発機構

cytC6

fliC

aor
mcp

cytC2

fliD
flgM
cytC3
cytC46
cytC13flgF
flgG

cytC24

電解溶液中での遺伝子発現（mRNA-RPKM)

図1

播種源とは別の微生物が見られ，BES 内で『電気』を
所属

cytC3
nuoA
gltA
cytC4
pilA
sdhC
nuoE
yiaY

BES 中における Geoalkalibacter の遺伝子発現挙動

E-mail: sishii@jamstec.go.jp－ 142 －

IFO Res.Commun. 35
2021

亜硝酸・硝酸イオントランスポーターが脱窒細菌の亜酸化窒素の親和性へ及ぼす影響評価
寺

田

昭

彦

【目的】二酸化炭素の約 265 倍の温室効果を有する亜酸と非ラベルの N2O(44N2O)を電子受容体として添加し，化窒素(N2O)は，農耕地や排水処理施設などで発生し嫌気条件で培養を行った．これにより，電子受容体であており，削減が強く求められている．N2O の生成はアン

る NO3- と N2O のどちらが優先的に使われるかを体系的

モニア酸化微生物や従属栄養性の脱窒細菌による複数のに評価した．

反応経路が存在する一方，N2O の消費は脱窒反応の最終

I13 株の N2O 消費性能の回復能力を調査するため，好段階である N2O 還元酵素を保有する細菌(N2O 還元細気環境への暴露により失活した N2O 消費活性の回復ダ菌)や菌類による呼吸反応に依存している．これまで申イナミクスに関する評価を行った．評価には 10 mL の請者は，N2O 還元速度が高く，かつ N2O 親和性の高い

チャンバー内で溶存 N2O および溶存酸素を精緻に追跡

細菌群の集積化・単離を目指し，Azospira sp. strain I13

可能なマイクロレスピレーションシステム(Unisense,

をはじめとする細菌種の動力学的特性を評価してきた．

Aarhus, Denmark)を用いた．チャンバー内に I13 株の優れた N2O 還元活性を示す Azospira sp. strain I13 のゲノ

懸濁液を植種し，N2O と酢酸塩を供給した．チャンバー

ムを確認すると，脱窒反応を担う遺伝子を全て保有してに挿入された微小電極にて溶存 N2O と溶存酸素濃度をい る こ と を 明 ら か に し た． さ ら に， こ の 菌 株 は他の追跡し，N2O 消費活性の回復を定量的かつ時系列的に評

Azospira 属の細菌と異なり，亜硝酸・硝酸イオントラン
スポーター遺伝子(nrt)を保有しておらず，亜硝酸・硝価した．さらに，Michaelis-Menten 式およびアレニウス

酸イオンを効率的に細胞膜に取り込めない可能性が高い

度の温度依存性をそれぞれ評価した．

ことを示した．この特徴は，N2O と亜硝酸・硝酸イオン【結果・考察】15NO3- 還元速度を評価したところ，I13 株が共存する環境下において，優先的に N2O を電子受容が最も低い値を示し，還元速度は同等の N2O 消費性能

体として利用できる可能性を示唆している．言い換えれを持ち nrt を保有する Az. suillum PS よりも 37 ％低い値式を用い，I13 株の N2O に対する親和性および比増殖速ば，従来の脱窒細菌のように N2O 生成細菌として機能となった．試験に用いた 5 種類の N2O 還元細菌のうち，してしまう懸案が無く，N2O 消費を促進できる可能性がnrt を欠損しているのは I13 株のみであり，15NO3- トラ
ンスポーターの有無との関連性が示された．最も高い

高い．そこで本研究は，脱窒細菌の亜硝酸・硝酸トラン
スポーターの有無や脱窒の遺伝子型が，N2O 還元能力に15及ぼす影響を評価した．さらに，N2O 排出削減の有用細の濃度上昇に伴い線形的に減少し，60 mg/L で完全に脱菌として，Azospira sp. strain I13 の利用可能性を検証す

窒反応が阻害された．一方，I13 株の脱窒速度は適用しるべく，酸素暴露後の N2O 還元性能や温度依存性など

た塩素酸塩の濃度範囲において影響を受けなかった．この生理学特性評価を行った．

れより，15NO3- トランスポーターが NO3- 還元活性に関【方法】本研究では，脱窒の遺伝子型や N2O 消費に関す与していることを示唆した．

NO3- 還元速度を示した I51 株の脱窒速度は，塩素酸塩

る生理学的特性が類似している一方，Azospira sp. strain

次に，15N でラベルした NO3- と N2O の共存下での脱I13(I13 株)と異なり nrt を有する Azospira suillum PS，窒速度を評価したところ，I13 株は NO3- 還元よりも優研究室で単離された脱窒細菌 Alicycliphilus denitrificans

先的に N2O 還元が進行する傾向を示し，NO3- 還元が優

strain I51(I51 株)を含む 5 菌種を選定した．バイアル内

先 し て 進 行 し た I51 株 と 逆 の 傾 向 と な っ た．I13 株 はを嫌気状態とした後，各細菌懸濁液に供給し，NO3- を

N2O を効率的に消費するシンクとして機能することを示

電子受容体，酢酸塩を電子供与体として，嫌気条件下でした．

の NO3 還元速度の算出を行った．

さらに，酸素暴露後の I13 株の N2O 消費活性は，他の-次に，NO3- 還元速度が 5 種類の中で最も高かった I51

細菌よりも早く回復した．一方，I13 株の N2O に関する

株，最も低かった I13 株を対象に，NO3- トランスポーター

活性化エネルギーは既往研究で報告されている脱窒細菌の阻害剤存在下での脱窒性能の評価を行った．阻害剤とよりも高かった(114.0±22.6 kJ mol-1)．低温環境下ではして塩素酸ナトリウムを異なる濃度で添加し，酢酸塩のN2O 消費活性が低下するため，排水処理施設への適用に存在下，安定同位体 N でラベルされた NO3( NO3 )は検討の余地を残した．

15

東京農工大学 大学院工学研究院 応用化学部門

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15

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E-mail: akte@cc.tuat.ac.jp－ 143 －

2018 年度若手研究者助成の研究報告
助成期間:2018 年 4 月～ 2021 年 3 月

IFO Res.Commun. 35
2021

南北両極アイスコアに眠る古代菌類から見た過去 70 万年の菌類の進化とその環境適応
辻雅晴【目的】地球環境は過去 70 万年の間，氷期と間氷期を繰

年前からは計 2 株を分離．1 株は近縁種が昭和基地からり返しながら大きく変動しており，このような過去の環分離されている菌と ITS 領域の遺伝子配列で 97 ％の相境変動や生物起源物質は，南北両極の氷床に低温状態で同性があった．もう 1 株は現生の菌類とは ITS 領域の配連続して保存されている．南極や北極に生息している菌列で 86 ％の相同性だったことから新属の可能性がある類は－40 ℃を下回る極限環境でも生存可能であることかことが分かった．さらに，約 9000 年前からは 2 種の菌

ら，有機物の最終分解者として，極地での物質循環や生類を分離した．両種とも ITS 領域の配列で既知の菌類

態系の維持に重要な役割を果たしている．しかし，菌類とは約 56 - 64 ％の相同性だった．

が過去の環境変動に対し，どのように適応し，進化して次にドームふじ( 77°19' S，39°70' E )のアイスコアか

きたのかは未だに不明であり，このことが極地におけるら約 3000 年前，4000 年前，5000 年前までの 3 つコアを生態系がどのように変遷し，維持されてきたのかを理解

利用し，菌類の培養を試みた．その結果，約 3000 年前

する上で障害となっている．そこで，本研究は，有機物のコアからは，5 株の菌類を培養する事ができ，そのうの最終分解者である菌類が，氷期や間氷期のような過去

ち 4 株について ITS 領域のシーケンスに成功した．これの環境変動に対してどのように適応し進化してきたのか

らの菌株は，既知の種の配列と 95 ％の相同性があり，を，南北両極のアイスコアに眠る菌類を分離し，そのゲノムや生理生態学的な特徴を現世の菌類と比較すること

Alternaria sp. と Aspergillus versicolor とそれぞれ同定した．約 4000 年前のコアから分離した 7 株のうち 3 株ににより解明することを目的としている．

ついては DNA の増幅が得ら，シーケンスに成功した．

【方法】アイスコアから菌類を分離する方法として，ア

この 3 株は既知の種の配列と 90 ～ 95 ％の相同性があり

イスコアを溶解させ，その溶けた水をフィルターろ過にそ れ ぞ れ Cladosporium iridis, Arthrinium sp., Vestigium

変えることで，集菌する方法を採用した . また，アイス

sp. と同定した．また 5000 年前のコアから分離した 13コアの表面は，ヒビ割れ，コアを採掘した人や外気など

株のうち 7 株については DNA の増幅に成功した．7 株により汚染されている可能性があるため，どのような菌の う ち 4 株 は Cystobasidium sp.，2 株 は Vestigium sp.，

類が実験環境による菌類の可能性があるのかという情報

残 り 1 株 は Botryotinia sp. だ っ た．Cystobasidium sp. はを得て，その情報を分離した菌類の情報から差し引く必

昭和基地周辺から報告された C. ongulense と ITS 領域で要があると考えた．そこで，実験環境由来の菌類を確認

93 ％の相同性が，Arthrinium sp. は最近縁種であったするため，未使用の培地と，クリーンベンチでの作業中に未使用の培地の蓋をしない状態で置いたものを併せてArthrinium marii と 94 ％の相同性が，さらに Botryotinia
sp. は Botryotinia ranunculi と 75 ％の相同性しかなかっインキュベータで培養した．また，コアの外側 25 ％かたことから属レベルまでの同定に留めた．

ら分離した菌も実験環境由来の菌類であると考え，コア

みずほ基地，ドームふじのコアから分離した菌類は共の中心 75 ％から分離した菌類のみをアイスコア由来のに，分離に使用したコアの年代が古くなるに連れ既知の菌類と定義する事とした．

菌類との遺伝子の相同性が低くなる傾向があった．この【 結 果・ 考 察 】 南 極・ み ず ほ 基 地( 70°41' S，44°19' E )ことから，今回分離した菌類は，古代菌類であったと考の約 1000 年前，6000 年前および約 9000 年前のコアからえた．本研究によりアイスコアから古代菌類の分離方法

菌類の分離を試みた．その結果，約 1000 年前のコアかが確立した事から，今後生きた古代菌類の情報を得られらは担子菌類の 5 株，計 2 種を分離した．これらの菌株る事になり，ゲノム解析による菌類の進化の解明や機能は全て菌類の分類に広く使用されている ITS 領域の配性遺伝子の産業利用など様々な分野への応用が期待でき列で既知の種の配列と 99 ％の相同性があった．約 6000

る．

所属

情報・システム研究機構 国立極地研究所，現 旭川工業高等専門学校 物質化学工学科－ 145 －

E-mail: spindletuber@gmail.com

発酵研究所助成研究報告集

第 35 号【非売品】

令和 3 年 12 月 10 日 印刷
令和 3 年 12 月 20 日 発行
編集委員長
編集委員
発行人
発行所

印刷所

横田 明
大島敏久，加藤暢夫，高橋洋子
藤田正憲
樽井直樹
公益財団法人発酵研究所
大阪市淀川区十三本町 2 丁目 17 番 85 号
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