心身科学 第 6 巻第 1 号（ 1 ┉ 8 ）（2014）

マウスにおけるビタミン A 欠乏とミッドカインの発現変化についての研究坂本

祥子＊ 1 ）市原啓

子＊ 2 ）望月

美佳＊ 2 ）村松

壽子＊ 2 ）

ミッドカインは，胚性腫瘍細胞（EC 細胞）をレチノイン酸（ビタミン A 酸）で分化誘導した際に発現される遺伝子の産物として見出された．マウスおよびヒトのミッドカイン遺伝子の上流域には
レチノイン酸受容体の機能的結合部位が存在することが解明されている．ミッドカインとプレイオト
ロフィンはファミリーを形成する．このミッドカインとプレイオトロフィンをともに欠損させたダブ
ルノックアウト（DKO）マウスは，産まれ難い，成長不良，雌の生殖能力の著しい低下，高度な難聴などの異常が認められた．ビタミン A の欠乏症では，成長不良，生殖，視覚，聴覚に異常が現れることが知られている．このようにビタミン A 欠乏と DKO マウスの症状には多くの類似点が認められる．これらのことから，ビタミン A がミッドカインの発現に強く関わっていることが示唆された．
そこで今回，ビタミン A 欠乏マウスの脳と腎臓におけるミッドカインの発現量を調べた．
雌の ICR マウスを用いてコントロール食群とビタミン A 欠乏食群に分けて飼育した．ビタミン
A の量は，肝臓のビタミン A を抽出し，HPLC で測定した．ミッドカインの発現量は脳と腎臓からRNA を抽出し，リアルタイム PCR 法で解析した．その結果，ビタミン A 欠乏食で飼育したマウスは，飼育開始 8 ヶ月において肝臓のビタミン A 量は検出限界以下にまで減少していた．これらのマウスは，眼の網膜の組織染色等により，ビタミン A 欠乏状態に陥っていたことが判明した．しかし，ミッド
カインの発現量は，コントロール食群に比べて，腎臓では約 1 / 2 に低下したものの，脳では差は認められなかった．このことから，腎臓でのミッドカインの発現には，一部ビタミン A が関与しているが，脳におけるミッドカインの発現にはビタミン A は関与していないことが判明した．
キーワード：ミッドカイン，プレイオトロフィン，ビタミン A，レチノイン酸

現はレチノイン酸とその受容体により，大きく増強さⅠ．緒れることが明らかになった 3 ）．そして，マウスおよび言

ヒトのミッドカイン遺伝子の上流域には，レチノインの酸受容体の機能的結合部位が存在することが解明されレチノイン酸による分化誘導の初期段階に発現が誘た3.4）．他の細胞系でも，レチノイン酸はミッドカイン

導される遺伝子の産物として発見された 2 ）．レチノイ
ン酸は生体内で，ビタミン A（レチノール）からレチの発現を上昇させることが判明している 5 ）．さらに，ナールを経て産生される．HM- 1 細胞を 10┉ 6 ～ 10┉ 8 M
レチノイン酸で 2 日間処理すると，分化を開始し 5

ッドカイン抗体により阻害され 6 ），ミッドカインはレ
チノイン酸の作用を具現化する分子の 1 つと考えるに～ 14 日間の間に分化が終了する．そして，筋原細胞，

至った．

ミッドカインは胚性腫瘍（EC 細胞）株 HM- 1

1）

レチノールによる血管内皮細胞の線溶系活性化は抗ミ神経細胞，線維芽細胞，胚体外内胚葉細胞など多彩な

ミッドカインが最も強く発現しているのは中期胚で細胞が生じる．この系では，ミッドカイン遺伝子はレ
チノイン酸 10┉ 6 M 処理後，1 日目に発現が誘導されたあり，上皮組織，分化中の神経組織が主な発現部位のである．その後の研究により，ミッドカインの発の中では腎臓が強く，脳での発現は弱い 2 , 7 ）．しかし，である 2 ）．それに比べると成体での発現は弱いが，そ＊ 1 ）愛知学院大学大学院心身科学研究科健康科学専攻＊ 2 ）愛知学院大学心身科学部健康栄養学科（連絡先）〒 470┉0195 愛知県日進市岩崎町阿良池 12 E-mail: hmurama@dpc.agu.ac.jp

─ 1 ─

坂本

祥子，市原

啓子，望月

壽子

本研究は，愛知学院大学心身科学部動物実験委員会

成体でも組織が損傷をうけると，ミッドカインの発現は増大，あるいは新たに誘導され，細胞の生存，移動

美佳，村松

指針に従って実施した．

を促進する．
ミッドカインはプレイオトロフィン 8 , 9 ）とファミリーを形成する．プレイオトロフィンはミッドカインと50％に近いアミノ酸配列同一性を示す．プレイオトロ

２．マウス肝臓からのレチノールの抽出
飼育開始から 2 ，3 ，4 ，5 ，7 ，10 ヶ月後の時点で，フィンは後期胚に強く発現し，成体ではミッドカイン

コントロール食群，ビタミン A 欠乏食群より各群マ
ウス 1 匹ずつの肝臓を採取し，レチノールを抽出し，と同様に発現は弱いが，脳と腎臓に発現している．しHPLC の測定サンプルとした．追加実験についても，

かし，プレイオトロフィンはミッドカインと異なり，

飼育 8 ヶ月時に同様に行った．

その発現は脳に強く腎臓には弱い．また，生理機能についても，ミッドカインと同様な in vitro 活性を示す．
ミッドカインあるいはプレイオトロフィンのどちらか一方の遺伝子を欠損させた遺伝子欠損マウスでは，著
しい異常は示さない10,11）．しかし，ミッドカインとプ

１）肝臓からのレチノール抽出13）

肝臓試料 1 g を共栓付褐色試験管にはかりとり，1 ％NaCl 溶液 0.5ml，3 ％ピロガロール／エチルアルコー
ル溶液 10ml，60％ KOH 溶液 1 ml を加え，70℃の恒温水槽において，ガラス棒で時々攪拌しながら 30 分間

レイオトロフィンともに欠損させたダブルノックアウ

加熱してけん化した．冷水中で冷却後，けん化液に 1

トマウスでは，産まれ難い，成長不良，雌の生殖能力の著しい低下，高度の難聴などの異常が認められ％ NaCl 溶液 22.5ml を加え，酢酸エチル／n- ヘキサン
15ml を加えた．振とう器で 5 分間振り，混液 1 / 9（V/V）

る12）．

遠心分離（3000rpm，5 分間）後，パスツールピペッ

一方，ビタミン A 欠乏では，成長不良，生殖および視覚，聴覚などに異常が現れることがすでに知られている．このビタミン A 欠乏症は，ミッドカイン，
プレイオトロフィンダブルノックアウトマウスの症状とかなりの類似点が認められる．しかしながら，ビタ
ミン A 欠乏と成体内ミッドカインの発現量についての研究は全く行われていない．そこで今回，ビタミンA 欠乏マウスを用いて，ミッドカインの脳と腎臓におトで溶媒層（上層）を褐色ナス型フラスコに移した．
水層に酢酸エチル／n- ヘキサン混液 15ml を加え，抽出した（ 2 回）．溶媒層をあわせて，溶媒をロータリ
ーエバポレーターにより減圧乾固した．エチルアルコ
ール約 3 ml を加えて試料を溶解し，全量を 15ml スピ
ッツ管に移し，遠心エバポレーターで減圧乾固し，4℃で保存した．
２）レチノール標準試料の作成
パルミチン酸レチノール 333㎎を共栓付褐色試験管

ける発現量を調べた．

に量りとり，肝臓試料と同様にけん化し，不けん化物

Ⅱ．方を抽出し，溶媒を乾固後，レチノールを得た．レチノ
ールを 2 - プロピルアルコールで希釈し，325nm の吸法

１．動物及び飼育方法
3 週齢の ICR マウスの雌 13 匹を 2 群に分け，コン

光度を測定して，次式よりレチノール濃度を求めた．

トロール食群（n= 6 ）とビタミン A 欠乏食群（n= 7 ）に分けて飼育した．ビタミン A 欠乏食群には，コンレチノール濃度（μg/ml）= E×549/100
E：325nm における吸光度（対照： 2 - プロピル

トロール食よりビタミン A のみを除いたビタミン A

アルコール）

欠乏食（いずれもオリエンタル酵母株式会社にて調整）を，水は両群とも水道水を与え，自由に摂取させた．
室温 23 ～ 25℃，湿度 45 ～ 65％，12 時間明暗サイクル

３．HPLC（High Performance Liquid Chromatography）法
JASCO 社の HPLC 機器を使用した．

（点灯；AM 8：00，消灯 PM 8：00）の飼育室で最長 10ヵ月（44 週齢）まで飼育した．週に 1 回ケージ，
飼料，

レチノール標準試料，肝臓からのレチノール抽出

水の交換を行い，体重測定は週に 1 回，個体ごとに記試料を用いて，HPLC でレチノールの解析を行った．

録した．

カラムは ODS 系カラム（4.6i.d.×150㎜）を使用し，流速 1.0ml/min，各試料は 20μl インジェクションし，追加実験では，3 週齢の ICR マウスの雌 6 匹をコントロール食群（n= 3 ），ビタミン A 欠乏食群（n= 3 ）に分け，同様の条件で 8 ヶ月間（37 週齢）飼育した．

325nm による紫外吸収検出器で検出した．移動相は，
水／メチルアルコール 8 /92（V/V）を用いた．

─ 2 ─

ビタミン A 欠乏とミッドカインの発現

肝臓レチノール量の算出に関しては，レチノール標
準試料を 325nm の吸光度から算出したレチノール濃Ⅲ．結度と HPLC でのピーク面積をもとに計算した．肝臓

果のレチノール抽出試料は，
メタノールで濃度を調整し，HPLC 試料とした．ビタミン A 欠乏により，HPLC で

１．体重変化
週 1 回の体重測定の結果を図 1 に示した．コントロのピークの検出が困難な場合，希釈倍率を下げて，限ール食群では，体重は増加し続けるのに対し，ビタミ
ン A 欠乏食群では飼育 4 ヶ月ごろから増加がみられ界まで解析を行った．さらに，正確に測定するために追加実験の 8 ヶ月マウスの肝臓のレチノール量に関しては，レチノール標準試料の検量線を用いて測定した．

ず，減少傾向が見られた．8 ヶ月での体重はコントロール食群に比べ，ビタミン A 欠乏食群では平均で約45％減少していた．

４．リアルタイム PCR 法
組 織 か ら の RNA 抽 出 に は，MACHEREY-NAGEL

90

社 Total RNA Isolation NucleoSpin RNA Ⅱ を 使 用 して行った．さらにリアルタイム PCR に関しては，タカ ラ バ イ オ 株 式 会 社 Thermal Cycler Dice Real Time
System Ⅱを用いて解析した．結果は，脳と腎臓につ

70
体重
（g）

た．また，逆転写反応には，タカラバイオ株式会社
PrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time） を 用 い

80

60
50
40
30

いて各組織のβ-actin の発現量を 1 としてミッドカイ

ビタミン A 欠乏食

20ン（MK）とプレイオトロフィン（PTN）の発現量をコントロール食10測定した．使用したプライマーは以下の通りである．

0

MK Forward：ATGCAGCACCGAGGCTTCTT

35

7 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36
週齢

図1

MK Reverse：CTTTGACTTGGTCTTGGAGG

体重変化

PTN Forward：ACTGGCGCCGAGTGCAAACAGPTN Reverse：GAGCTTGCCACAGGGCTTGGA
β-actin Forward：GTGGGCCGCTCTAGGCACCA
β-actin Reverse：CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGG

２．HPLC によるビタミン A の定量
HPLC の結果の一例として，図 2 にスタンダードとして用いたレチノール標準試料（A）と飼育 2 ヶ月後

GGのコントロール食のマウスの肝臓のレチノール（B）
およびビタミン A 欠乏食マウスの肝臓のレチノール

30 秒）1 cycle，
60℃，30 秒）
反応は，
（95℃，
（95℃，5 秒，
40cycle，（95℃，15 秒，60℃，30 秒，95℃，15 秒）1 cycle（C）を示した．

の条件で行った．
2 ，3 ，4 ，5 ，6 ，7 ，10 ヶ月飼育マウスについては，

レチノールのピークは約 5.8min で認められた．飼
育 2 ヶ月において，コントロール食と比較し，ビタ⊿⊿ Ct 法を用いて解析し，追加実験の 8 ヶ月飼育マウ

ミン A 欠乏食では，著しい減少が認められた．このHPLC での結果から，それぞれのマウスの肝臓のレチスについては，検量線を用いて解析を行った．

ノール量を算出し，図 3 と表 1 に示した．コントロー
５．マウスの組織免疫染色法
飼育開始 7 ヶ月後，10 ヶ月後の各群のマウスについルはすべての飼育期間のマウスの平均値を示しており，肝臓 1 g あたり 108μg であった．ビタミン A 欠乏て，子宮，卵巣，皮膚，眼球（10 ヶ月のみ）の組織

マウスでは，飼育 2 ヶ月で肝臓 1 g あたり 18.9μg となっており，コントロールと比較して，約 6 分の 1 でを採取し，固定，パラフィン包埋後，5μm の厚さで組織切片を作成した．追加実験の飼育 8 ヶ月では，子宮，卵巣，皮膚，眼球に加えて，肝臓についても同様あった．その後，経時的に減少を示し，飼育 7 ヶ月では，0.03μg と肝臓のビタミン A 量は，ほとんど認められに組織切片を作成した．その後，ヘマトキシリン，エ

ない程度にまで減少した．飼育 10 ヶ月では，今回のオジンで染色（HE 染色）し，顕微鏡で観察した．

測定方法では，検出限界以下（ND）であった．

─ 3 ─

坂本

祥子，市原

啓子，望月

美佳，村松

壽子

飼育期間 8 ヶ月（37 週齢）におけるマウスの肝臓のレチノール量の測定結果は，図 4 と表 2 に示した．
ビタミン A 欠乏マウスでは今回の HPLC の測定方法
では ND であった．コントロール食群については，肝臓 1 g あたり平均 165μg であった．

図3

ビタミン A 欠乏食で飼育後のレチノール量の変化

数字はビタミン A 欠乏食での飼育月数である

図2

HPLC によるビタミン A の定量

A：レチノール標準試料，B：コントロール食飼育 2 ヶ月マウス，C：ビタミン A 欠乏食飼育 2 ヶ月マウス

図4

表1
飼育月数

飼育 8 ヶ月マウスの肝臓レチノール量の比較

肝臓 g あたりのレチノール量

Control（n= 5 ） 2（n= 1 ） 3（n= 1 ） 4（n= 1 ） 5（n= 1 ） 7（n= 1 ） 10（n= 1 ）レチノール量（μg）

108

表2

18.9

1.47

0.16

0.30

0.03

ND

飼育 8 ヶ月マウスの個々の体重と肝臓 g あたりのレチノール量
C1

C2

C3

A1

A2

解剖時の体重（g）

84

78

72

30

53

肝臓レチノール量（μg）

147

218

131

ND

ND

C 1 ～ 3：コントロール食マウス，A 1 ～ 2：ビタミン A 欠乏食マウス

３．リアルタイム PCR
飼育 2 ，3 ，4 ，5 ，6 ，7 ，10 ヶ月における脳，腎臓からミッドカインとプレイオトロフィンの RNA を抽出し，cDNA を作成し，リアルタイム PCR 法で測定を行った（β-actin を対照とする）．
図 5 に飼育 3 ヶ月（ 1 ）および 7 ヶ月（ 2 ）の結果

─ 4 ─

ビタミン A 欠乏とミッドカインの発現を示した．飼育 3 ヶ月，7 ヶ月ともに脳ではコントロール食とビタミン A 欠乏食との間に大きな差は認め（ 1 ）飼育 3 ヶ月

られなかった．しかし，腎臓におけるミッドカインの発現量は，コントロールのマウスに対してビタミンA 欠乏マウスは減少していた．3 ヶ月では，約 45％，7ヶ月では，約 20％の減少が認められた．今回，図には記載しなかったが，10 ヶ月においても約 45％の減少が認められた．
8 ヶ月の結果は，表 3 に示した．脳のミッドカイン（ 2 ）飼育 7 ヶ月については，ビタミン A 欠乏食群コントロール食群の間で差は認められなかった．腎臓のミッドカインについては，ビタミン A 欠乏食群がコントロール食群に比べて，約 44％の減少を示した．プレイオトロフ
ィンの発現量は，脳，腎臓ともに両群間での大きな差は認められなかった．
図5

ミッドカインとプレイオトロフィンの遺伝子発現量C：コントロール食，A：ビタミン A 欠乏食，MK：ミッド
カイン，PTN：プレイオトロフィン

表3
脳

腎臓

飼育 8 ヶ月におけるミッドカインとプレイオトロフィン遺伝子の発現量（Qty 値）
1

2

3

平均値

相対値＊

MK

コントロール群
ビタミン A 欠乏群

0.924
0.962

1.006
1.368

0.885

0.938
1.165

1.000
1.242

PTN

コントロール群
ビタミン A 欠乏群

1.003
1.349

0.975
1.355

0.956

0.978
1.352

1.000
1.383

MK

コントロール群
ビタミン A 欠乏群

1.005
0.483

0.999
0.477

0.572

0.859
0.480

1.000
0.559

PTN

コントロール群
ビタミン A 欠乏群

0.952
0.942

1.196
0.992

1.341

1.163
0.967

1.000
0.832

MK：ミッドカイン，PTN：プレイオトロフィン，＊相対値：各遺伝子におけるコントロール群平均値を 1 とした値

４．組織染色飼育 7 ヶ月後のマウスについては皮膚，子宮・卵Ⅳ．考巣，10 ヶ月および 8 ヶ月については皮膚，子宮・卵巣

察に加えて眼球の組織切片の観察を行った．すべての飼

ビタミン A は，体内では主にレチニルエステルと育期間において皮膚，子宮，卵巣についてはコントロール食群，ビタミン A 欠乏食群間で著しい違いは認して肝臓に貯蔵され，残りは脂肪組織に存在している．
今回のビタミン A 欠乏マウスの実験では，肝臓のビ

められなかった．しかし，眼球については，図 6 に示すように飼育 8 ヶ月マウスの網膜の厚さに著しい違い

タミン A の測定を行った．マウス肝臓内のビタミン
A は，ビタミン A 欠乏飼料での飼育後 2 ヶ月で 20％が認められた．ビタミン A を欠乏させたマウスでは，
飼育 10 ヶ月，8 ヶ月のすべてのマウスについてコント以下になり，8 ヶ月では検出限界以下となった．しかロール群のマウスに比べて，網膜が著しく薄くなって全にビタミン A が消失したとは断言できない．しかしながら，このビタミン A 欠乏 8 ヶ月マウスは，コいることが確認できた．

し，ビタミン A 欠乏 8 ヶ月のマウスの生体内で，完

─ 5 ─

坂本

祥子，市原

啓子，望月

美佳，村松

壽子

が，主な誘導効果は，10┉ 8 から 10┉ 7 M レチノイン酸が引き起こす14）．一方，成体マウスの脳での all-trans レA

チノイン酸濃度は海馬での測定結果からも 10┉ 8 M レベルと考えられる15）．今回解析したビタミン A 欠乏マ
ウスでは肝臓のビタミン A が検出限界以下，すなわ
ち少なくとも 10┉ 8 M 以下となっている．レチノイン酸
はビタミン A の代謝産物の一部に過ぎないので，脳においてのレチノイン酸レベルは 10┉ 9 M 以下に低下していると考えられる．したがってビタミン A 欠乏によるレチノイン酸の濃度変化は，胚性腫瘍細胞であればミッドカインの発現低下が起こるが，それは大幅なものでないレベルである．さらに，ミッドカインの発現制御のメカニズムは細胞によって異なっており，そのため成体の特定の臓器では，ビタミン A 欠乏による，B

低濃度におけるレチノイン酸の濃度変化の効果が検出しがたい可能性がある．この考えを裏書するように，
ケラチノサイトのミッドカイン発現は 10┉ 6 M レチノイン酸で弱く，10┉ 5 M レチノイン酸で強く誘導され，胚性腫瘍細胞より高濃度のレチノイン酸が発現上昇に要求されている 5 ）．
私たちは，腎臓におけるミッドカインの発現は，定常的発現に，あるレベルのレチノイン酸に依存する発図6現が加わったものであり，脳での弱い発現はほぼ定常

網膜の構造の違い的発現であると考えている．

A：コントロールマウス，B：ビタミン A 欠乏マウス

さらに，臓器によるレチノイン酸の生産量，蓄積量
ントロールマウスに比べて体重は約 55％であり，眼の差も考慮する必要がある．実際，腎臓はレチノインの網膜は著しく薄くなるという顕著な異常を呈していることから，この時点でこれらのマウスがビタミン A

酸を蓄積するが，それでもレチノール投与後に増加した濃度は 17 日後には減少が始まっている16）．

欠乏症に罹っていることは明らかである．
今回の実験により，ビタミン A 欠乏マウスにおいて，本研究の結果，マウスの腎臓ではレチノイン酸がミ
ッドカインの発現を増強することが確認された．しか腎臓のミッドカイン mRNA の発現量は，ほぼ 1 / 2 にし，脳においてはそのような効果は認められなかった．

低下し，脳のそれは，ほとんど変化しないことが判明

ミッドカインは神経幹細胞の生存と増殖を助け17），ア

した．この結果について，我々は以下のように考察しミロイドβペプチドの蓄積を抑えると考えられる18）のた．

で，その脳内発現レベルを保つのはアルツハイマー病

ミッドカインは，基本的には胎児性タンパク質であり，成体における発現は限局され，多くの場合少量で予防のために重要である可能性が高い．しかし，ビタ
ミン A 欠乏が脳内ミッドカインの発現に影響を及ぼある．マウスにおいては，腎臓が主な発現部位であさなかったので，ビタミン A 欠乏を招かない食事のり，脳においての発現は少ないものの，機能的に重要効果は薄いと考えられるであろう．

な可能性がある．一方，胚性腫瘍細胞などの胚性細胞はレチノイン酸処理しなくてもミッドカインを弱いながら発現している．このように外来性レチノイン酸なしでのミッドカインの発現を定常的発現と呼ぶことにする．
HM- 1 胚性腫瘍細胞においては，10┉ 9 M レチノイン酸により定常的発現を超える発現誘導が認められる

─ 6 ─

引用文献

1 ）Muramatsu, H., Hamada, H., Noguchi, S., Kamada, Y., andMuramatsu, T.（1985）Cell-surface changes during in vitro
differentiation of pluripotent embryonal carcinoma cells. Dev.
Biol. 110, 284┉296.
2 ）Kadomatsu, K., Tomomura, M., and Muramatsu, T.（1988）

ビタミン A 欠乏とミッドカインの発現

cDNA cloning and sequencing of a new gene intensely expressed

Cells. 3 , 811┉822.

in early differentiation stages of embryonal carcinoma cells and11）Amet, L. E., Lauri, S. E., Hienola, A., Croll, S. D., Lu, Y.,

in mid-gestation period of mouse embryogenesis. Biochem.

Levorse, J. M., Prabhakaran, B., Taira, T., Rauvala, H., and Vogt,
T. F.（2001）Enhanced hippocampal long-term potentiation in

Biophys. Res. Commun. 151, 1312┉1318.
3 ）Matsubara, S., Take, M., Pedraza, C., and Muramatsu, T.（1994）

mice lacking heparin-binding growth-associated molecule. Mol.

Mapping and characterization of a retinoic acid-responsive
enhancer of midkine, a novel heparin-binding growth /Cell. Neurosci. 17, 1014┉1024.
12）Muramatsu, H., Zou, P., Kurosawa, N., Ichihara-Tanaka, K.,differentiation factor with neurotrophic activity. J. Biochem. 115,

Maruyama, K., Inoh, K., Sakai, T., Chen, L., Sato, M., and1088┉1096.

Muramatsu, T.（2006）Female infertility in mice deficient in

4 ）Pedraza, C., Matsubara, S., and Muramatsu, T.（1995）A retinoic

midkine and pleiotrophin, which form a distinct family of growthacid-responsive element in human midkine gene. J. Biochem.

factors. Genes Cells. 11, 1405┉1417.
13）新美康隆編（2003）．
ビタミン A の定量 新・図解食品学実験，

117, 845┉849.
5 ）Inazumi, T., Tajima, S., Nishikawa, T., Kadomatsu, K.,

81┉84．

Muramatsu, H., and Muramatsu, T.（1997）Expression of the14）Huang, R.-P., Muramatsu, H., and Muramatsu, T.（1990）Effects

retinoid-inducible polypeptide, midkine, in human epidermalof different conditions of retinoic acid treatment on expression of

keratinocytes. Arch. Dermatol. Res. 289, 471┉475.

MK gene, which is transiently activated during differentiation of6 ）Kojima, S., Muramatsu, H., Amanuma, H., and Muramatsu,

embryonal carcinoma cells. Develop. Growth. Differ. 32, 189┉

T.（1995）Midkine enhances fibrinolytic activity of bovine

195.
15）Kane, M. A., Folias, A. E., Wang, C., and Napoli, J. L.（2010）

endothelial cells. J. Biol. Chem. 270, 9590┉9596.
7 ）Muramatsu, H., Shirahama, H., Yonezawa, S., Maruta, H., andEthanol elevates physiological all-trans-retinoic acid levels in

Muramatsu, T.（1993）Midkine, a retinoic acid-inducible growth/

select loci through altering retinoid metabolism in multiple locidifferentiation factor : immunochemical evidence for the function: a potential mechanism of ethanol toxicity. FASEB J. 24, 823┉

and distribution. Dev. Biol. 159, 392┉402.

832.

8 ）Li, Y.-S., Milner, P. G., Chauhan, A. K., Watson, M. A., Hoffman,16）Bhat, P. V.（1997）Tissue concentrations of retinol, retinyl esters,

R. M., Kodner, C.M., Milbrandt, J., and Deuel, T. F.（1990）

and retinoic acid in vitamin A deﬁcient rats administered a single

Cloning and expression of a developmentally regulated protein

dose of radioactive retinol. Can. J. Physiol. Pharmacol. 75, 74┉

that induces mitogenic and neurite outgrowth activity. Science.

77.
17）Zou, P., Muramatsu, H., Miyata, T., and Muramatsu, T.（2006）

250, 1690┉1694.
9 ）Merenmies, J., and Rauvala, H.（1990）Molecular cloning of the

Midkine, a heparin-binding growth factor, is expressed in neural

18-kDa growth-associated protein of developing brain. J. Biol.

precursor cells and promotes their growth. J. Neurochem. 99,

Chem. 265, 16721┉16724.

1470┉1479.

10）Nakamura, E., Kadomatsu, K., Yuasa, S., Muramatsu, H.,18）Muramatsu, H., Yokoi, K., Chen, L., Ichihara-Tanaka, K.,

Mamiya, T., Nabeshima, T., Fan, Q.-W., Ishiguro, K., Igakura,

Kimura, T., and Muramatsu , T.（2011）Midkine as a factor toT., Matsubara, S., Kaname, T., Horiba, M., Saito, H., andcounteract the deposition of amyloid β-peptide plaques: in vitro

Muramatsu, T.（1998）Disruption of the midkine gene（Mdk）

analysis and examination in knockout mice. Int. Arch. Med. 4 , 1

resulted in altered expression of a calcium binding protein in the┉9.

hippocampus of infant mice and their abnormal behaviour. Genes（最終版平成 25 年 12 月 4 日受理）─ 7 ─

Journal of the Institute for Psychological and Physical Science, Vol. 6 , No. 1 , 1 ┉ 8 , 2014

Studies on the Relationship between Vitamin A Deﬁciency and Midkine Expression in Mice
Shoko Sakamoto, Keiko Ichihara-Tanaka, Mika Mochizuki, Hisako Muramatsu
Abstract
Midkine was found as the product of a gene, the expression of which is increased upon differentiationof embryonal carcinoma (EC) cells induced by retinoic acid (vitamin A acid). There are functional bindingsites of the retinoic acid receptor in the upstream region of murine and human midkine genes. Pleiotrophin
is another member of the midkine family. Mice doubly deﬁcient in the genes of midkine and pleiotrophin are
difﬁcult to be born and exhibit female infertility and auditory deﬁcits. These phenotypes are similar to those ofvitamin A-deﬁcient mice, namely abnormalities in growth, reproduction, vision and hearing. All these ﬁndings
suggested that vitamin A might be involved in the expression of midkine through its metabolite, retinoic acid.
In the present investigation, we examined expression levels of midkine gene in the brain and kidney of vitamin
A deﬁcient mice. Female ICR mice were kept with control or vitamin A-deﬁcient food. Vitamin A levels of theanimals were determined by HPLC after extraction from the liver; they became undetectable in mice fed withvitamin A deﬁcient food for 8 months. Histological examination of these mice revealed symptoms of vitamin
A deﬁciency, particularly abnormality in the retina. Real time PCR was used to monitor the levels of expressionof midkine mRNA. We found that midkine mRNA expression was lowered to around 1 / 2 of the control, in thekidney of vitamin A-deﬁcient mice. However, the expression level was unchanged in the brain. These results
indicate that vitamin A is partly involved in the expression of midkine in the kidney, but is not involved in its
expression in the brain.
Keywords: midkine, pleiotrophin, vitamin A, retinoic acid

─ 8 ─