2P-056

P-12
糸状菌テルペノイドのコンビナトリアル生合成
Cellulolytic
Microorganism’s
Cellulosome-mimetic Enzyme Complex
Immobilized on Cellulose Matrix一 瀬 博 文

九州大学大学院農学研究院（九大院生資環）○野北 昂志、（九大院農） 一瀬 博文、北岡 卓也

Introduction

研究の目的
・ 担子菌 STS と P450 を自由自在に組みあわせて様々な化合物を創る

セスキテルペノイド (C15 化合物)

ユニークかつ多様な構造

・ 生理活性セスキテルペノイド（担子菌由来）の生合成経路を解明する

多彩な生物活性我々の研究背景：糸状菌P450の遺伝子を獲得して異種発現を可能にしたセスキテルペノイドの生合成機構
合成酵素 (STS) による環化反応
ファルネシル
ピロリン酸 （FPP）

白色腐朽菌 Phanerochaete chrysosporium (120 種)
褐色腐朽菌 Postia placenta (184 種)
麹菌Aspergillus oryzae (121 種)
合計 425 種の糸状菌 P450

P450 による酸化修飾

Experiments

1,11位

1011

P. chrysosporium
11 種の候補遺伝子

候補遺伝子の探索とクローニング
1

既存の担子菌 STS の配列情報

ゲノムデータベース

1,10位

BLAST 検索7P. placenta
25 種の候補遺伝子

P. chrysosporium

6110Omphalotus olearius

Coprinus cinereus

11 種

5種

1,10位

ネロリジル
ピロリン酸

P. placenta

STS および P450 の機能解析

ヒドリドシフトワグナー・メアワイン転位

セスキテルペノイドの機能理解・高度利用へ向けた

RT-PCRSTS(cDNA)

STS と P450 の獲得・機能化が期待される

揮発性化合物 / GM-MS

STS の機能同定

網羅的な機能探索
pAUR101

P450遺伝子

形質転換共発現・GAPDH promoter
・染色体組み込み型

・GM-MSによるスクリーニング
・NMRによる構造決定

P450 の機能同定

・GAPDH promoter
・自立複製型

Saccharomyces cerevisiae

425 種類の共発現株

Results & Discussion
担子菌 STS の cDNA 遺伝子獲得

プロトイルデン合成酵素と P450 の共発現

Targetgene

Fungi

Isolated
cDNA

Heterologous
Expression

Identified
Metabolites

HO(x10 6 )(x10 6 )CYP5344B1 (pH 6.5)

10M18HCYP5348E1 (pH 6.5)

108

CYP5344B1M4M1
H

P. chrysosporium

1011101366442

200

Δ6-Protoilludene-8-ol

161322

Intensity

25

P. placenta(x10 6 )10M2

S. cerevisiae を宿主とする STS の異種発現 (GC-MS分析)
特異的な生成物を与える STS: 13種

複数の生成物を与える STS: 10種(x10 6 )7.0

6.0

105914.055

69644δ-cadinene

β-elemene

7920455 67

3.0

γ-muurolene

1.0

1.000

α-copaene

2.0282930313233
34
Retention Time (min)353637383940262728293031323334
Retention Time (min)353637383940例) P. placenta 由来の多機能性 STS

担子菌 STS が産出するセスキテルペン骨格化合物
P. chrysosporium

HHH

α-cubebene

cyclosativene

sesquisabinene

bicycloelemene

cadina-1(6),4-dienesativene

bicyclogermacrene

α-copaeneΔ6-Protoilludene

M4

CYP5348E1
CYP5348J3

404244HHO

Δ6-Protoilludene-5-ol

30

46

32

3481 91

M450

109 121 135

163173

149

205

3638

40424446

H

Retention Time (min)

100

81

107

161

176

M5H

95

69

OH

CYP5348J3

121

187

135
145

Hydroxyprotoilludene

205

220

(unidentified)220

124 135

M2

100

192

5055 67 77

91109149 163

177

50055

205 220

135

4060

80

91

151 163120140m/z

160

177
180

205 220
200

220

60

105

131

79

145

67

187
159

100

120140m/z

160

生理活性化合物の生合成中間体

220
205

80

180200220

プロトイルデン水酸化酵素が初めて同定された240

プロトイルデン誘導体のGC-MS分析

192

109

10040

水酸化体

11991

500124M3173M5240

P. chrysosporium 由来のP450
CYP5144C8HCYP5146A4水酸化体-1β-copaene

β-cubebene

CYP5158A1

水酸化体-2HH

HH

α-gurjunene

HH

M5(cis-syn-cis)

ビサボレン合成酵素と P450 の共発現共通P. placentaHallo-aromadendr-9-en

3819155 67 77例) P. placenta 由来のプロトイルデン合成酵素

H

36025

Δ7-Protoilludene-6-ol

0100

100273450

4.0

2.02632

M1100M/Z

25M455189147 161

HΔ7-Protoilludene-6-ol0133

3.0HHM3HO(cis-anti-cis)

Retention Time (min)

5.0

HHO

230

Relative Intensity

HIntensity

5.0Intensity

175

H

6.060

α-muurolene

H82(x10 6 )7.0
119

Δ6-protoilludene

CYP5348J3 (pH 6.5)

10M3M2

PpSTP-08(x10 6 )CYP5344B1 (pH 2.6)

8Non-enzymatic reaction(acidic media)

OPP

FPP

水酸化体-4水酸化体-3β-barbatene

H

H

H

pentalenene

H
H

H
H

caryophyleneHHδ-cadinene

α-alaskene

P. placenta 由来のP450
CYP5158B2

H

H

H

bicyclosesquiphellandrene

γ-cadineneH

α-cadinene

Hγ-muuroleneH

epi-cubebol

A. oryzae 由来のP450
CYP52G3水酸化体-6OHH9-epi-(E)-caryophylene

HOHcubebol

β-elemeneHα-muurolene

水酸化体-7P. chrysosporium が産生する
ビサボレンから 7 種の水酸化体が得られた

水酸化体-5α-neocallitropsene

P. placenta や A. oryzae のP450が優れた変換活性を示した

HHΔ6-protoilludene

STS と P450 の「種の壁を越えた」組みあわせ生理活性化合物の前駆体として期待される
bisabolene

多種多様な担子菌セスキテルペン合成酵素の機能同定に成功

担子菌によるプロトイルデン誘導体の生合成機構解明に貢献

セスキテルペン変換活性を示す P450 の同定に成功 (上例他も実施済)

生物種の壁を越えたコンビナトリアル生合成の可能性を実証