統合データ解析トライアル終了報告会 2014 3/2 @JST東京本部

データを用いたメタゲノム解析Webアプリケーションの開発
森 宙史
Hiroshi Mori
東京工業大学
大学院生命理工学研究科
生命情報専攻 黒川・山田研 助教
1© 2014森 宙史（東京工業大学大学院）licensed under CC表示2.1日本

Metagenome

This Figure is obtained fromNational Research Council (USA)Obtained from Togo Picture2

16S rRNA gene amplicon sequencing analysis(メタ16S解析)
Pre-analysis (Remove Primer, Chimera etc.)

DNA extraction

Sequence clustering with species levelby CD-HIT-EST or UCLUST, etc.

PCR amplification

DNA Sequencing

Taxonomic assignment andComparison between samples

Who’s there?

Metagenomic sequencing analysis(メタゲノム解析)
Metagenomic reads
Assemble

SOAPdenovo2, Velvet,
IDBA-UD etc.

Contig sets

DNA extraction

Gene finding

MGA, MetaGeneMark

Gene sets

DNA Sequencing

BLASTP

Sample1
Metadata
Comparative
Sample2 metagenomics
Metadata

Who’s there?

Gene Function abundance
Pathway abundance
Pathway reconstruction
Taxonomic abundance
What are they doing?4

・ メタ16S・メタゲノム解析データ(塩基配列データ)から、容易に系統組成および遺伝子機能組成の情報を抽出したい
・ 組成情報を既存のメタ16S・メタゲノム解析サンプルと比較したい

その環境の細菌群集は他のサンプルと比較するとどのような共通性・違いがあるか？
その環境のメタデータと自分のサンプルのメタデータを比べて、何が異なるのか？

5integrates lots of data related to microbes.
Especially, we integrates the microbial data that can be linked to genomes.

http://microbedb.jp/

Gene
Ortholog: MBGD

Taxon

Environment
Taxonomy:
NCBI Taxonomy

Genome: GTPS/RefSeq
Annotation:
TogoAnnotation

Culture Collection:
NBRC/JCM

Metadata:
INSDC SRA

Metagenome:
INSDC SRA
6

Red color indicates our collaborators.

既存のメタゲノム・メタ16Sデータの整理・統合
微生物の情報とその生息環境の情報を結びつける
1. 公共DB(SRA)からメタ16S・メタゲノム配列データとメタデータを取得
2. 配列データから系統組成・遺伝子機能組成情報を計算
3. メタ16S・メタゲノム論文から微生物の生息環境についてのメタデータを抽出
4. 生息環境を記述するために同義語、語彙間の関連性を記述した
オントロジーMEOを構築
5. MEOとメタ16S・メタゲノムのメタデータの対応付け
サンプルの種類

サンプル数

メタ16S

23952

メタゲノム

1078
7

公共塩基配列DB(INSDC SRA)
メタゲノム配列データを取得

DDBJスーパーコンピューター

大規模計算実行解析
パイプライン

既存のメタ16S・
メタゲノムの解析済みデータを取得

本研究開発で開発した
Webアプリケーション

MeGAPMicrobeDB.jp

MeGAP

メタゲノムDB

MicrobeDB.jp中の既存メタ16S・
メタゲノムデータとの比較解析結果

アップロード

メタ16S・
メタゲノム
配列データ(fastq形式)

MeGAPから得られた系統組成・ホモログ組成(tsv形式)

系統組成(Genus, Family,Order, Class, Phylum)
遺伝子機能組成(ホモログ、代謝パスウェイ)

ユーザMeGAP (MetaGenome Annotation Pipeline)
http://fs2.bio.titech.ac.jp/megap/9配列の前処理 (目的: メタゲノムとメタ16Sデータの区別 & 高精度配列データの抽出)
ユーザがメタ16S or メタゲノムの情報を入力
FASTQ ファイル
Nを含む配列除去

3’端のQuality Trim (Quality value < 17)
配列長でフィルタリング(< 50 base)Qualityでフィルタリング
Quality Average > 25

高精度
メタゲノム配列データ

高精度メタ16S
配列データ

10

メタ16S解析パイプライン

高精度メタ16S
配列データ

UCLUST
Identity > 97%, cov > 90%

OTU代表配列

Reference 16S rRNA
gene database

UCHIME Reference mode
でキメラを検出

UCHIME De novo mode
でキメラを検出

両modeでキメラとされた
OTUをキメラと判定、そのOTUを構成する全リードを除去

キメラ除去済みOTURDP Classifierを用いてbootstrap cutoff >= 50%
で各OTUの代表配列を系統アサインメント

Genus-Phylumレベルの系統組成

11

系統組成

12

メタゲノム解析パイプライン

高精度メタゲノム
配列データ

Refseq Prokaryote
GenomeCLASTGPUを用いた配列相同性検索

Top Hitのみ抽出
各株の遺伝子ごとにHit数を集計
全体のリード数で補正

KEGG Pathway
KEGG Ortholog

OrthologごとにHit数を集計

遺伝子機能組成
代謝パスウェイ組成
結果は全て行列データで出力

StrainレベルでHit数を集計

系統組成

系統組成

遺伝子機能組成

代謝パスウェイ組成14

MeGAP-MicrobeDB.jp
http://fs2.bio.titech.ac.jp/megaptomicrobedb.jp/

15

MicrobeDB.jp中の既存サンプルとの比較解析
ユーザのサンプルのGenus組成・KO組成

メタゲノムDB
既存メタ16SサンプルのGenus組成
既存メタゲノムサンプルのKO組成サンプルとの距離行列計算

ユークリッド距離
1-Pearson相関係数

類似した100サンプルを抽出
階層的クラスタリング
組成の可視化

Complete Linkage法

上記の各ステップはRで実行 16類似した100サンプルとのKO組成 （メタゲノム）

類似した100サンプルとのGenus組成 （メタ16S）

17

Genus組成によるサンプル間階層的クラスタリングの結果 （メタ16S）

18

KO組成によるサンプル間階層的クラスタリングの結果 （メタゲノム)19まとめ・ メタ16S・メタゲノム解析データから、容易に系統組成および遺伝子機能組成の情報を抽出したい
MeGAP

http://fs2.bio.titech.ac.jp/megap/

・ 組成情報を既存のメタ16S・メタゲノム解析サンプルと比較したい
MeGAP-MicrobeDB.jp

http://fs2.bio.titech.ac.jp/megaptomicrobedb.jp/

その環境の細菌群集は他のサンプルと比較するとどのような共通性・違いがあるか？
その環境のメタデータと自分のサンプルのメタデータを比べて、何が異なるのか？
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