2021 年度 若手・女性研究者奨励金 レポート

研究課題

オートファジー活性を制御する代謝物の検索と制御機構の解明

キーワード①オートファジー、②代謝、③スクリーニング

研究者の所属・氏名等
フリガナ
氏 名
配付時の所属先・職位等（令和 3 年 4 月 1 日現在）

現在の所属先・職位等（令和 4 年 7 月 1 日現在）

プロフィール

1．研究の概要

フナコシ

船越

トモコ

智子

順天堂大学

医学部 特任助教

順天堂大学

医学部 特任助教

学生の頃に面白いと思って以来、所属を 10 回程変えながら基礎研究に携わってきた。その度、ゼロからのスタートを繰り返すことになったが、興味ある多くのテーマにトライすることができたことは貴重な経験であった。オートファジーは博士課程で取り組んだ研究テーマであった。現在、オートファジー研究の分野が大きく発展したことを体感しながら、再び新しい事象に遭遇したい思いで取り組んでいる。

オートファジーは、細胞内のタンパク質や凝集体、さらにはミトコンドリアのような細胞内小器官や外部から侵入したバクテリアをも標的とする細胞内分解機構である(図１)。基本的な細胞内代謝に貢献するにも関わらず、代謝中間体によるオートファジーの制御機構については、まだ分からないことが多く残されている。本研究では、代謝中間体の標品を人工的に細胞内に導入し、オートファジー活性に影響を及ぼす代謝中間体のスクリーニングを試みた。スクリーニングには 2 種類の蛍光タンパク質 RFP と GFP を LC3 のアミノ末端に繋いだ融合タンパク質 (tandem fluorescent図１ オートファジーの模式図
tagged LC3、以下 tfLC3)を利用した。GFP は酸性下で蛍光を失うが RFP は酸性化においても赤色蛍光を維持するという性質を利用して、オートファジーの進行を tfLC3 の GFP と RFP の蛍光輝度の変化として捉えることができる（図 2）。
上記スクリーニングにより、オートファジーを促進する候補を 1 種、抑制する候補 を 5 種、得ることができた。同定することができた。候補標品の 1 候補に関しては、幕透過修飾型を合成して、培養細胞のオートファジー活性への影響を生化学的に解析し、オートファジー経路のどのステップに作用するか検証を試みた。

2．研究の動機、目的単位面積あたりのRFP顆粒数 (h)研究の動機：出芽酵母の遺伝学的手法によってオートファジーに関わる ATG(AuTophaGy)遺伝子群が単離されたことを契機に、ヒトをはじめ様々な生物種を対象としたオートファジー研究が精力的に進められてきた。これまでの研究結果の蓄積によって、オートファジーは栄養飢餓に応じたアミノ酸プールの維持のみならず、変性タンパク質や余剰あるいは異常な細胞小器官の分解を担うことで細胞の恒常性、個体としての健康維持に貢献することがわかってきた。さらに、発生や老化といった高次生命現象や、がん、神経変性疾患などの難治性疾患との関連が明らかになり、創薬ターゲットとしても注目されはじめている。
現在も国内外を問わず、オートファジー研究はオートファジーを駆動する主要分子群（ATGタンパク質群）を中心とした研究が推し進められている。所属研究室では、メタボロームやリピドームといった包括的な解析によって、オートファジーが糖、アミノ酸、脂肪酸代謝を制御することが明らかにされた。生体内代謝機構には代謝中間体によるフィードバック機構が存在するため、オートファジーが代謝中間体に制御される可能性があるが、これまで詳細な知見はない。これには、主に二つの本質的な問題として「代謝中間体の標品がなかった」こと、そして「それらを細胞に導入する方法がなかった」ことが挙げられる。細胞機能を制御する可能性のある代謝中間体の標品ライ
オートファジーの進行に伴うtfLC3の局在と蛍光輝度の変化
ブラリーを、セミインタクト・リシ
オートライソソーム
オートファゴソーム
隔離膜ーリング技術によって細胞内に導RFP GFP LC3
RFP GFP LC3
RFP GFP LC3
RFP GFP LC3
入することで上記問題を解消できると考えた。
酸性環境下
分解
I型
II 型
セミインタクト・リシーリング
GFP消光
RFPも消光法は、細胞の細胞膜に開けた小孔
オートファジー活性の経時的変化を介して、細胞膜を透過しない物
Torin1
Bafilomycin A1
代謝中間体 X
代謝中間体 Y
質を細胞内に導入する手法であ溶媒溶媒溶媒溶媒る。
細胞内の小器官や構造物はその経過時間 (h)まま維持されており、開けた孔を閉
2 オートファジー活性の定量化じること（リシーリング）が可能な tfLC3 の RFP,GFP図の蛍光輝度比を指標としてオートライソソーム数を算ため、導入後も一定時間培養して観 出する。例) X(誘導型)、Y(抑制型)代謝中間体の測定結果。Torin1 (オート察することが可能である。代謝中間 ファジー活性化剤), Bafilomycin A1(リソソーム酸性化阻害剤: リソソーム酵素が阻害されるため tfLC3 の GFP が消光しない。酸性化で機能する分体標品と tfLC3 を同時に細胞に導 解酵素が阻害される。)
入して継時的に蛍光を観察すれば、オートファジー活性を変化させる候補中間体を同定できると考えた（図２）。
研究の目的：134 種の代謝中間体標品をセミインタクト・リシーリング技術によって細胞内に導入し、蛍光プローブの蛍光輝度を指標としたスクリーニングによって、オートファジー活性に影響を及ぼす代謝中間体を同定する。オートファジーのアロステリックな制御について知見を得ることを目指す。
0.120.120.120.120.1

0.1

0.1

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0.08

0.08

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00005101520051015200.02

005101520

05101520

3．研究の結果

細胞面積(� m2)あたりのオートライソソーム数

134 種の代謝中間体標品、蛍光Water
AB
C
プローブ tfLC3 を含む細胞質画分をセミインタクト化した HeLa細胞に導入した後、リシールした。リシーリング後、共焦点蛍光HClDE
F
顕微鏡で GFP と RFP の蛍光画像を継時的に取得した。GFP は酸性下で消光するため RFP/GFP 輝度比が高い顆粒（=オートライソソ時間 (h)ーム）の数の変化は、オートファ
図 3 代謝中間体標品導入後のオートファジー活性の継時的変化ジーの進行程度を意味する。細
単位面積当たりのオートライソソーム数の継時的変化を示す(n=3)。標品
胞面積あたりのオートライソソ(橙色)、各溶媒(水:水色,もしくは 0.1N HCl:緑色)。
ーム数を算出し継時的変化を比較した。134 種の代謝中間体の内、各溶媒と比較してオートファジーを促進する候補を 1 種(A)、抑制する候補 を 5 種(B-F)同定した（図 3）。6 候補の中でも、リシール直後から 18 時間後まで活性抑制が観察された候補 E に着目して解析を進めた。
リシーリルされた細胞には、内在性の LC3II 型(膜結合型)が残存しているため生化学的解析には適さなかった。そこで、膜透過が期待できる修飾型 E を化学合成して、培養細胞での検証を試みた。HeLa 細胞にアデノウイルスベクターで tfLC3 を一過性に発現させ、培養液に修飾型E を添加して GFP、RFP 蛍光を継時的に観察した。溶媒のみを加えた場合と比較して修飾型 E を加えた際に、RFP/GFP 輝度比が添加濃度依存的に低下した。一方、修飾していない標品 E を添加しても RFP/GFP 値の低下は観察されなかった。以上から、修飾型 E は細胞膜透過性を有し、tfLC3 を指標としたオートファジーを抑制するこ標品E(mM)修飾型E(mM)と示唆された。ウェスタンブロット解析により、1010媒 0.001
媒 0.001
HeLa 細胞に修飾型 E を添加すると、オートファジのみのみーの分解基質である LC3、p62 が細胞内に蓄積する
I型
LC3B
II 型ことがわかった（図 3 上段）。次に、リソソーム活性への影響を調べるため、DQ-BSA を用いて検証し1.41.4た。DQ-BSA はウシアルブミン(BSA)に蛍光色素であ1.21.2
る BODIPY が付加されており、細胞内で分解をされ1.01.0て初めて蛍光を発する特徴を持つ。HeLa 細胞の培0.80.8
養液に DQ-BSA を添加した後、修飾型 E を加え DQ0.60.6
BSA の蛍光を観察した。リソソーム機能を阻害する
理
0.40.4
Bafilomycin A1 や塩化アンモニウムに比較すると溶 0.20.2
弱いながらも、溶媒のみのコントロールの約 70%ま0.00.0で DQ-BSA の蛍光輝度値が低下した（図 4）。修飾型
0 0.01 0.1 1 10 BafA1 NH4Cl
0 0.01 0.1 1 10
標品E(mM)
修飾型E(mM)
E による抑制効果は、部分的なリソソーム活性阻害、もしくはオーファゴソームとリソソームの融合
図 4 標品 E と膜透過修飾型 E の抑制効果過程の阻害によると考えられる。今後は、上記の可(上段) LC3B のウエスタンブロット: 修飾型 E (10 mM)
能性を検証するとともに、スクリーニングで得られ 添加で LC3B の蓄積が認められた。（下段）DQ-BSA を用いたリソソーム活性測定:細胞あたりの活性リソソームた他の候補についても解析を進めたい。
0.120.12

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0.020051015200051015205101520051015200.02051015200溶

溶

DQ-BSA蛍光顆粒の細胞あたりの数（ 媒処 の値に対する比）

000.12数を溶媒(0 mM)に対する比で表した。修飾型 E (10 mM)添加でリソソーム活性抑制が認められた。BafA1: 100
nM Bafilomycin A1, NH4Cl: 10 mM 塩化アンモニウム。

4．研究者としてのこれからの展望

先人の方々に隅々まで開拓された分野でも、よく見るとまだ面白い事象が残されているようです。目の前にある研究対象に向き合い、常識にとらわれ拘ることなく、まだ知られていない生命現象を見つける垣間見ることができる眼を持てるよう心がけたい。

5．支援者（寄付企業等や社会一般）等へのメッセージ

本研究課題に対して助成いただきましてありがとうございました。予想通り、予定通りに研究は進みません。壁の前で右往左往している時間がほとんどかもしれません。このようなご支援をいただき、大きな励みとなりました。重ねて御礼申し上げます。ありがとうございました。