心身科学 第５巻第１号（17‒22）（2013）

防風通聖散が Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) ラットのインスリンシグナル伝達系のタンパク量に及ぼす影響小林亮平＊1） 庄秋栄＊1） 長崎

大＊1, 2） 宇野智子＊1, 3） 佐藤祐造＊1, 2）

背景：メタボリックシンドロームの基盤にある肥満はインスリン抵抗性を誘発する最も重要な危険因子である．先行研究において，漢方処方である防風通聖散（BTS）は抗肥満作用のあることが認められている．しかしながら，インスリンシグナル伝達系の影響については，ほとんど明らかにされていない．そこで本研究では，Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) ラットを用いて，インスリン
シグナル伝達系のタンパク量に及ぼす影響について検討した．
方法：13週齢の雄性 OLETF ラットおよび，その対照である雄性 Long-Evans Tokushima Otsuka (LETO)
ラットを無作為に４群に分けた：LETO＋saline，LETO＋BTS，OLETF＋saline，OLETF＋BTS．生理
食塩水と BTS の経口投与を４週間実施した．血清 FFA とインスリンシグナル伝達系のタンパク量を測定した．インスリンシグナル伝達系（IR-β，IRS-1，PI 3-kinase，Akt）のタンパク量は，Western
blot 法により定量した．
結果：血清 FFA とインスリンシグナル伝達系（IR-β，IRS-1，PI 3-kinase，Akt）のタンパク量には有意差を認めなかった．
結論：これらの結果から，OLETF ラットにおける BTS の４週間の経口投与は，インスリンシグナル
伝達系（IR-β，IRS-1，PI 3-kinase，Akt）のタンパク量には影響を及ぼさないことが示唆された．
キーワード：bofutsushosan, insulin-signaling, Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) rat, skeletal
muscle, Western blot techniqueⅠ．背景

リン抵抗性関連の全ての生活習慣病および動脈硬化性
心血管障害の予防・治療に有用である4）．しかしながう運動不足（sedentary life）により，メタボリックシ

ら，糖尿病予防プログラム（Diabetes Prevention Pro5）
gram; DPP）
で明らかなように，食事・運動などの生ンドローム（MS）が急激に増加している1）．MS の基

活習慣是正の長期に亘る継続的実施は極めて困難であ盤にある肥満はインスリン抵抗性2, 3）を誘発する．イ

る．

近年，食生活の欧米化やライフスタイルの変化に伴ンスリン抵抗性は糖代謝異常，脂質異常症，高血圧と一方，数千年の歴史と伝統により，選択されてきたいった病態の基盤になり，心筋梗塞，脳卒中などの動漢方薬は，よほど適応を誤らない限り副作用をもたら

脈硬化性疾患へとつながるため，最も重要な危険因子

す可能性は少なく，しかもエキス剤化され，利便性が1）高くなっている6）．さらに，漢方薬は複数の有効成分である ．
食事の適正化と身体トレーニングの実施という生活が含まれているため，多様な症状に有効性を示すとい

習慣の偏りの是正は，筋肉のトレーニングになるとともに，内臓脂肪を効率的に減少させ，個体のインスリ

うことが大きな特徴である．このことから，複数の症状を併発する MS に対しても有用性が期待されていン抵抗性改善を介し，MS，２型糖尿病などのインスる．

＊１）愛知学院大学大学院心身科学研究科健康科学専攻＊２）愛知学院大学心身科学部健康科学科＊３）愛知学院大学心身科学部健康栄養学科（連絡先）〒 470‒0195 愛知県日進市岩崎町阿良池 12 E-mail: K0ba84agu@yahoo.co.jp

─ 17 ─

小林 亮平，庄秋栄，長崎大，宇野 智子，佐藤 祐造

Ⅱ．方

防風通聖散（BTS）は，防風，黄䊫など18 種類の生法薬で構成されており（表１），実証，卒中体質者で上効能・効果としては高血圧の随伴症状（動悸，肩こり，

１．実験動物と漢方薬
実 験 に は 雄 性 Otsuka Long Evans Tokushima Fattyのぼせ），肥満症，むくみ，便秘となっており，脂肪(OLETF) ラットおよび，その対照である雄性 Long-

組織を選択的に減少させ，抗肥満作用のあることが報

Evans Tokushima Otsuka (LETO) ラットを大塚製薬株式

告されている8‒12）．

会社徳島研究所から供給を受け，６週齢より飼育を開

半身肥満のいわゆる “固太り” に投与されている7）．

表１

防風通聖散構成生薬

Crude drugs
Scutellariae Radix
Glycyrrhizae Radix
Platycodi Radix
Gypsum Fibrosum
Atractylodis Rhizoma
Rhei Rhizoma
Schizonepetae Spica
Gardeniae Fructus
Paeoniae Radix
Cnidii Rhizoma
Angelicae Radix
Menthae Herba
Saposhnikoviae Radix
Ephedrae Herba
Forsythiae Fructus
Zingiberis Rhizoma
TalcumNatrium Sulfuricum

生薬名
黄䊫
甘草
桔梗
石膏
白朮
大黄
荊芥
山梔子
芍薬
川芎
当帰
薄荷
防風
麻黄
連翹
生姜
滑石
芒硝

始 し た． 動 物 は， 個 別 ゲ ー ジ 内 で 飼 育 し， 飼 料 はCE‒2（日本クレア，東京）を与え，水は自由摂取と必要量（g）
44.4
44.4
44.4
44.4
44.4
33.3
26.7
26.7
26.7
26.7
26.7
26.7
26.7
26.7
26.7
6.7
66.7
15.6

した．飼育室は，室温23 ± 1℃，湿度 50 ± 10％，12時
間明暗サイクル（点灯；AM８：00，消灯；PM８：00）の条件に設定した．本研究は愛知学院大学心身科学部
動物実験委員会指針に従って実施した．漢方薬は株式
会社ツムラ（東京）より提供された医療用防風通聖散エキス粉末（TJ‒62）を用いた．
２．実験プロトコール
６週齢より OLETF ラットと LETO ラットを無作為に４群に分けた，正常群として LETO＋saline（n＝5)と LETO＋BTS（n＝5），肥満群として OLETF＋saline（n＝5）と OLETF＋BTS（n＝5）とした．BTS は生理
食塩水（大塚製薬株式会社，東京）で希釈し，800
mg/kg BW の投与用溶液を作製した．この溶液を１日
１回，5 ml/kg BW の用量で４週間経口投与した．解防風通聖散エキス100g を調整するために要する生薬の量
13, 14）

すでに，我々の研究室では，牛車腎気丸，桂枝

加朮附湯15）とその構成生薬シナモン16）が，ストレプト

剖後，直ちに腓腹筋を摘出し，‒85℃で保存した．摘出した腓腹筋を Western blot 法により，インスリンシ

ゾトシン（STZ）誘発糖尿病モデルラットのインスリ

グナル伝達系のインスリン受容体（insulin receptor;
IR）-β，インスリン受容体基質（IR substrate; IRS）-1，

ン抵抗性を改善させることを確認している．牛車腎気丸において，インスリンシグナル伝達系である IR-βホスファチジルイノシトール３キナーゼ（phosphatidyl
inositol 3-kinase; PI 3-kinase），Akt のタンパク量を定量

タンパク量，IRS-1タンパク量の改善が確認されてお

した．

り

13）

，桂枝加朮附湯では，IR-βタンパク量，IRS-1

タンパク量の改善も確認されている15）．さらに，BTS

３．血清 FFA の測定

が肥満誘発性２型糖尿病モデルラットにおいて，インスリン抵抗性の指標である glucose infusion rate (GIR)投与４週間後，尾静脈より採血を行った．採血後，遠心分離器にて血清サンプルを採取し，血清 FFA のを改善させることも確認されている17）．

測定のために ‒85℃で保存した．血清 FFA の測定は血清 FFA 測定キット（NEFA C‒ テストワコー，和光純

しかしながら，BTS によるインスリン抵抗性改善の分子生物学的メカニズムについては不明である．そ薬工業株式会社，大阪）を使用して測定した．

こで本研究では，BTS が肥満誘発性２型糖尿病モデ
ルラットのインスリンシグナル伝達系のタンパク量に及ぼす影響を検討した．

４．SDS-PAGE，Western blot 法
冷凍した筋肉（200ml）は，Qinら14‒16）の方法を用いて， １ ml の 溶 解 液（20 mM Tris-Cl，150 mM NaCl，
1% NP40，10 mM NaF，10 mM Na3VO4，10 mM EDTA，
1 μg/ml Leupeptin，1 μg/ml Aprotinin，1 mM PMSF）
内にてホモジナイザーを使用して粉砕した．粉砕後，─ 18 ─

防風通聖散の 4 週間経口投与とインスリンシグナル伝達系のタンパク量

氷上で１時間静置し，4℃，130000 G，１時間の遠心分差はみられなかった．

離を行った（日立分離用小形超遠心機：CS150GXL，
ロータ：S80AT3）．分離後，上澄みを採取した．分光
光度計（Molecular Devices）で各上澄みのタンパク量２．防風通聖散の経口投与が IR-βタンパク量に及ぼす影響（図２）IR-βタンパク量は LETO＋saline 群を 100％とする濃度を測定し，‒85℃で保存した．
タンパク質（40μg）をサンプルとして SDS-PAGE（7.5％ ~10％ acrylamide gel）によって分画した．分画
後，PVDF 膜に転写し，3％ BSA でブロッキングし，と，LETO＋BTS 群（115％），OLETF＋saline 群（114％），
OLETF＋BTS 群（156％）であった．しかしながら，各群間に有意差はみられなかった．

１ 次 抗 体 と し て 抗 IR-β 抗 体（1：600）， 抗 IRS-1 抗
250.0

Protein (% of LETO + saline)体（1：2000），抗 PI 3-kinase 抗体（1：2000），抗 Akt4℃で一昼夜反応させた．PVDF
抗体（1：5000）にて膜洗浄後，２次抗体として Goat Anti-Rabbit IgG（1：5000）を用いて，室温で１時間反応させた．反応後，ECL Plus Western Blotting Detection Regents に PDVF 膜を浸透し，生じた化学発光を Light Caputure（AE-6971
Light Capture，アトー株式会社，東京）にて検出した．
バンドの数値化は画像処理解析ソフト Scion Image を

200.0
150.0
100.0
50.0
0.0

用いて行った．

LETO+saline

図２５．統計分析
得られたデータは平均値±標準誤差（mean±SE）で表記した．統計解析は一元配置分散分析を用いて，
Tukey あるいは Games-Howell により多重比較を行った．各測定項目は危険率５％未満を統計学的に有意差ありと判定した．データは SPSS（19.0 J for Windows）
を用いて解析した．

LETO+BTS OLETF+saline OLETF+BTS

防風通聖散の経口投与が IR-βタンパク量に及ぼす影響

３．防風通聖散の経口投与が IRS-1タンパク量に及ぼす影響（図３）
IRS-1タンパク量は LETO＋saline 群を 100％とする
OLETF＋saline 群（112％），と LETO＋BTS 群（105％），
OLETF＋BTS 群（101％）であった．しかしながら，各群間に有意差はみられなかった．

Ⅲ．結

果
140.0
Protein (% of LETO + saline)

１．防風通聖散の経口投与が血清 FFA に及ぼす影響（図１）
血 清 FFA は LETO＋saline 群（1.1 mEq/l），LETO＋BTS 群（1.1 mEq/l），OLETF＋saline 群（1.6 mEq/l），
OLETF＋BTS 群（1.3 mEq/l）であり，各群間に有意
2.1

120.0
100.0
80.0
60.0
40.0
20.0

1.8

0.0
LETO+saline

FFA (mEq/l)

1.5

図３

1.2
0.9

LETO+BTS OLETF+saline OLETF+BTS

防風通聖散の経口投与が IRS-1 タンパク量に及ぼす影響

0.6

４．防風通聖散の経口投与が PI 3-kinase タンパク量0.3に及ぼす影響（図４）PI 3-kinase タンパク量は LETO＋saline 群を 100％と0
LETO+saline

図１

LETO+BTS OLETF+saline OLETF+BTS

防風通聖散の経口投与が血清 FFA に及ぼす影響

OLETF＋saline 群（41すると LETO＋BTS 群（157％），

─ 19 ─

小林 亮平，庄秋栄，長崎大，宇野 智子，佐藤 祐造％），OLETF＋BTS 群（135％）であった．しかしな

3-kinase，Akt タンパク量に各群間で有意差を認めな

がら，各群間に有意差はみられなかった．

かった．先行研究によると，シナモンの投与では IR-β，IRS-1，PI 3-kinase タンパク量に有意差がみられなかったことが報告されている15）．さらに，他の先行研究

Protein (% of LETO + saline)

300.0の漢方薬でも，インスリンシグナル伝達系のタンパク250.0

量に対しては影響を認めていないことと同様に，BTS

200.0の４週間経口投与では，インスリンシグナル伝達系のタンパク量には影響がないことが示唆された．一方，

150.0

インスリンの細胞内シグナル伝達機構については，チ
100.0

ロシンリン酸化が重要であるとする興味深い先行研究

50.0が報告されている．シナモン投与によって，IR-β，IRS-1チロシンリン酸化，IRS-1/PI 3-kinase association

0.0
LETO+saline

図４

LETO+BTS OLETF+saline OLETF+BTSが有意に増大したことが確認されている16）．同様に牛防風通聖散の経口投与が PI 3-kinase タンパク量に及ぼす影響

車腎気丸13），桂枝加朮附湯15）においても IR-β，IRS-1のチロシンリン酸化が増加することが報告されており，インスリン抵抗性に対する漢方薬の影響はインス

５．防風通聖散の経口投与が Akt タンパク量に及ぼ

リンシグナル伝達系のタンパク量ではなく，チロシン

す影響（図５）
Akt タンパク量は LETO＋saline 群を 100％とするとリン酸化に対する影響が大きいことが示唆された．

LETO＋BTS 群（280 ％），OLETF＋saline 群（23 ％），OLETF＋BTS 群（104％）であった．しかしながら，チン，TNF-α，レジスチンなどのアディポサイトカ
インが分泌される．脂肪分解により産生された FFA

各群間に有意差はみられなかった．

とアディポサイトカインである TNF-α，レジスチン

肥満状態では肥大化した脂肪細胞からアディポネクなどはインスリン抵抗性を惹起させることが報告されている18, 19）．本研究では血清 FFA に対して，影響をProtein (% of LETO + saline)

350.0

認めないことが示唆された．インスリンシグナル伝達系に及ぼす要因として FFA だけではなく，アディポ

300.0
250.0

ネクチン20），TNF-α，レジスチンなどのアディポサ

200.0

イトカインについても検討していくことが課題となっ

150.0

た．

100.0

今回の実験成績からインスリンシグナル伝達系であ50.0

る GLUT4 タンパク量，IR-βチロシンリン酸化，IRS1 チロシンリン酸化，PI 3-kinase チロシンリン酸化，

0.0
LETO+saline

LETO+BTS OLETF+saline OLETF+BTS

Akt チロシンリン酸化が BTS 投与によるインスリン

図 5 防風通聖散の経口投与が Akt タンパク量に及ぼす影響

抵抗性改善の機序として影響していることが推察され，今後検討を加える予定である．

Ⅳ．考

察
Ⅴ．まとめ

本研究では，BTS が肥満誘発性２型糖尿病モデル
ラットのインスリンシグナル伝達系に及ぼす影響を検討した．４週間の経口投与後，血清 FFA とインスリ

肥満誘発性２型糖尿病モデル（OLETF）ラットに対し，BTS を４週間の経口投与を行った結果，インス リ ン シ グ ナ ル 伝 達 系 で あ る IR-β，IRS-1，PI

ン シ グ ナ ル 伝 達 系 の タ ン パ ク 量（IR-β，IRS-1，PI
3-kinase，Akt）を測定した．本研究の結果から，BTS

3-kinase，Akt のタンパク量には影響を認めなかった．

投与よってインスリンシグナル伝達系のタンパク量に今後，GLUT4タンパク量を測定するとともに，インは影響を認めないことが示唆された．
４ 週 間 の BTS の 経 口 投 与 で は，IR-β，IRS-1，PI

スリンシグナル伝達系チロシンリン酸化についても検討を加える予定である．また，TNF-α，アディポネ

─ 20 ─

防風通聖散の 4週間経口投与とインスリンシグナル伝達系のタンパク量

クチン，レジスチンについても検索を加えたい．
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adiponectin reverses insulin resistance associated with both
lipoatrophy and obesity. Nature Medicine, 7, 941‒946.
最終版平成 24年 12月 26日受理

─ 21 ─

Journal of the Institute for Psychological and Physical Science, Vol. 5, No. 1, 17‒22, 2013

Effect of Bofutsushosan on Protein Content of Insulin-Signaling in Otsuka Long-Evans
Tokushima Fatty (OLETF) rats
Ryohei KOBAYASHI, Qiurong ZHUANG, Masaru NAGASAKI, Tomoko UNO, Yuzo SATO
Abstract
BACKGROUND: Obesity is a key factor in the development of metabolic syndrome and is the most importantrisk factor for the development of insulin resistance. Previous studies have shown that bofutsushosan (BTS), a
Kampo medicine has an anti-obesity effect. However, it remains unclear whether BTS could ameliorate insulinsignaling. In the current study, we investigated the effects of bofutsushosan on the protein content of insulinsignaling in Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) rats.
METHODS: Male OLETF rats and their lean counterparts Long-Evans Tokushima Otsuka (LETO) rats aged 13
weeks were randomly divided into four groups: LETO + saline, LETO + BTS, OLETF + saline, and OLETF +BTS. Saline and BTS were orally administered for 4 weeks. Serum FFA and insulin-signaling protein content
were evaluated. Protein content of insulin-signaling intermediates (insulin receptor-β:IR-β, IR substrate-1:IRS-1,
phosphatidylinositol 3-kinase:PI 3-k and Akt) were determined by the Western blot technique.
RESULTS: The serum FFA concentrations and the protein content of insulin-signaling (IR-β, IRS-1, PI
3-kinase, Akt) didn’t show any significant differences in 4 groups.
CONCLUSIONS: These results suggest that the four-week oral administration of BTS in OLETF rats didn’t
affect the protein content of insulin-signaling (IR-β, IRS-1, PI 3-kinase, Akt).
Keywords: bofutsushosan, insulin-signaling, Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) rat, skeletal
muscle, Western blot technique─ 22 ─