心身科学 第 7 巻第 1 号（49┉55）（2015）

ブレビバチルス BIC 発現系を用いたエンビジンの部位特異的組換えタンパク質の発現と精製
市原啓子＊1）

エンビジンはタンパク質の構造的な特徴からイムノグロブリン（Ig）スーパーファミリーに分類される細胞表面の １ 回膜貫通型糖タンパク質である．モノカルボン酸輸送体 ２ の協同因子や，神経筋
接合部位の形成における調節因子として機能することが報告されているが，実際のエンビジンの機能は良くわかっていない．さらに，細胞内ドメインの結合タンパク質に関しては知見がない．膜タンパ
ク質の相互作用を研究するにあたり，膜タンパク質全体を精製することが困難なことから，部位特異的な組換えタンパク質が広く用いられている．
エンビジンについては，pNC-HisT を発現ベクターとし I-set ドメインを含む領域をブレビバチルス
発現系で rEmb55 タンパク質として発現させることに成功しているが，その収量は文献的に報告されている他のタンパク質と比較して低かった．近年，ブレビバチルスでは brevibacillus in vivo cloninng（BIC）法が開発されている．タンパク質を効率よく細胞外に分泌させるためには，適切な分泌シグナ
ルを目的とするタンパク質と組み合せることが重要である．BIC 法では，それぞれが異なる分泌シグ
ナルを含む ４ 種類の直線状発現ベクターを利用することができるので，目的とするタンパク質を高発現するクローンを簡便に選択することができる．本研究では，ヒスチジンタグ付きのタンパク質として， ２ つの組換えエンビジンタンパク質を BIG 法で作成した．一つは I-set ドメイン，もう一つは
細胞内ドメインの組換えタンパク質である．
I-set ドメインの場合には，最も強い発現は pBIC 4 の分泌シグナルだった．これは pNC-HisT と同じ分泌シグナルである．BIC 系での rEmb55_BIC の収量は，rEmb55 の収量と同等だった．形質転換菌の増殖中やカラム精製の間，rEmb_BIC は分解が起こっていた可能性が高い．このような不安定性が
収量の低さの理由と考えられる．細胞内ドメインの組換えエンビジンタンパク質の場合，pBIC 3 の分
泌シグナルをもつクローン（BIC 3 - 8 ）で最も発現量が多かった．BIC 3 - 8 を 100 ml の 2 SY 培地で培養すると，カラム精製のあとの組換えタンパク質 rEmb_Ct の収量は 20 mg だった．
以上の結果から，BIC 法は部位特異的な組換えタンパク質の産生には都合のよい方法であるが，タンパク質の収量そのものはそれ自身のアミノ酸組成や構造的な安定性に関係することがわかった．
キーワード：エンビジン，ブレビバチルス，組換えタンパク質発現

パク質である １ ）．マウスでは発生初期に発現が高く．類縁タンパク質であるベイシジンと同様，モノ

I．はじめに1,2）カルボン酸輸送体の協同因子として報告されている

エンビジンはイムノグロブリン（Ig）スーパーファ
ミリーに分類される細胞表面の １ 回膜貫通型糖タン＊ 1 ）愛知学院大学心身科学部 健康栄養学科（連絡先）〒 470-0195 愛知県日進市岩崎町阿良池１２．エンビジンは，培養細胞で強制発現させるとフ3,4）ィブロネクチンへの接着能が向上すること 2 , 5 ），新規

E-mai: kichi@dpc.agu.ac.jp

─ 49 ─

市原啓子の神経筋接合部位で発現上昇すること ６ ） などが報告されているが，機能に関しては不明な点が多い．
エンビジンは，N 末端側から I-set ドメイン，Ig ド

ビバチルス発現系において菌体内相同組換えを利用した BIC（Brevibacillus in vivo cloning）法が開発されてメイン，膜貫通ドメイン，細胞内ドメインから構成さいる 11）．BIC 系では，直鎖状ベクターと目的タンパク質をコードする遺伝子 DNA を混合し，ブレビバチル

れ，細胞外や細胞内で他のタンパク質分子と相互作用

ス宿主菌を形質転換することで １ ステップで発現プすることが予想される．膜タンパク質は精製が難しい

ラスミドが作成できる．さらに，ひとつの組換えタンため，結合タンパク質の探索には分子全体でなく，一パク質を発現させたい場合，異なる分泌シグナルをもつ発現ベクター（pBIC 1 , pBIC 2 , pBIC 3 , pBIC 4 ）を般的に，部位特異的な組換えタンパク質を利用することが多い．筆者は，グラム陽性細菌であるブレビ
バチルス Brevibacillus choshinensis の細胞外へ分泌タかで最も効率の良い発現プラスミドを選択できること

ンパク質として組換えタンパク質を発現させる発現系
7 , 8 ）を利用し，エンビジンの細胞外領域の I-set ドから，簡便で効率的な組換えタンパク質の発現系として着目されている．本研究では，ブレビバチルス BIC

メインを可溶性の組換えタンパク質 rEmb55 として単発現系において，異なる分泌シグナルをコードする発
現ベクターを利用して，エンビジンの細胞外 I-set ド

独で発現させた 9 ）．ブレビバチルスは，組換えタンパ
ク質の効率の良い発現系で １ リットルの培養液から100 mg 以上のタンパク質が精製される 10,11,12,13）が，エ

利用すれば（図 １ ，A）， ４ 種類の分泌シグナルのな

メインおよび細胞内ドメインについて，部位特異的な組換えタンパク質を作成することを試みた．

ンビジン rEmb55 では 0.5 mg 以下だった．近年，ブレ図１

ブレビバチルス発現ベクターの分泌シグナルとマウスエンビジンのアミノ酸配列

A. 4 種の pBIC 発現ベクターと pNC-HisT ベクターのシグナル部分のアミノ酸配列を示す．pBIC ベ
クターではエンテロキナーゼ認識配列 (DDDDK) が，pNC-HisT ではトロンビン認識配列（LVPRGS)が目的とするタンパク質の配列と連結する．
B. マウスエンビジンは，26 アミノ酸残基のシグナル配列（囲み）をもつ．I-set ドメインは一本線の下線，細胞内ドメインは二本線の下線，斜字体は膜貫通部分である．
A，B ともに矢印はシグナル配列の切断部位を示す．

─ 50 ─

ブレビバチルス BIC 発現系による組換えエンビジンタンパク質の発現と精製

培養上清を SDS- ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で分離し，ゲルから PVDF 膜（孔径II．材料と方法

0.22 μ m）にタンパク質を転写した 14）．抗 Penta-His

1． 材料

抗体（マウスモノクローン抗体，キアゲン社）を一
次抗体，HRP 標識抗マウス IgG 抗体を二次抗体とし，ス培養用の ２ SY 培地および TM 培地はキットの説明

プチャー（アトー社）で検出した．

本研究では，タカラバイオ社のブレビバチルス発現
系キットおよび PCR 試薬を使用した．ブレビバチル

ECL-Prime（GE ヘルスケア社）で発光させライトキャ

書に従って調製した．

エンビジンタンパク質の精製では，組換えタンパク質を高発現するブレビバチルスのクローンを選び，グリセロールストックを100 ml の ２ SY /Nm 培地に植え，

2． 方法

１）発現ベクターの作成とブレビバチルスの形質転換
マウスエンビジン cDNA を鋳型とし，I-set ドメインに

30 ℃，120 rpm で 60 時間培養した．培養液を 5000 x g，

ついては，mEmb_BIC89_F, 5 ʼ-GATGACGATGACAAACGCCCTGATCCGGCTGAG 3 ʼ と mEmb_BIC555_Rv,

ガロースカラム（キアゲン社）をカラムバッファー（50mM リン酸ナトリウム緩衝液 pH 7.2, 0.3 M NaCl, 10

5 ʼ-CATCCTGTTAAGCTT CACTTCAGCACAGTAGAAT
3 ʼ，細胞内ドメインについては mEmb_BIC862_F, 5 ʼ

mM イミダゾール）で平衡化し，培養上清を通過させ４ ℃で 15 分間遠心し，培養上清を得た．Ni-NTA ア-GATGACGATGACAAA GAAGTGTACACACACAAG

20 ml のカラムバッファーで洗浄した．溶出には，た後，カラムバッファーに，それぞれ 100 mM，200 mM，300

3 ʼ と mEmb_BIC999_Rv, 5 ʼ-CATCCTGTTAAGCTT

mM のイミダゾールを添加した溶出液を用いた．溶出CACTGATCTGCAGAGTCAG 3 ʼ をプライマーとして画分を一部とって SDS-PAGE を行い，銀染色によりPrime Script taq ポリメラーゼにより PCR 反応を行っタンパク質のバンドを確認した ９ ）．得られた組換えタ

た．反応生成物をそれぞれアガロースゲル電気泳動で精製し DNA 濃度を測定した．pBIC DNA（50 ng）とンパク質は Pierce 660nm Protein Assay kit（サーモサイ
エンティフィック社）で定量した．

PCR 生成物をモル比で 1 : 2 になるよう混合し，キッ
トの説明書にしたがってブレビバチルスコンピテン
トセルを形質転換し，ネオマイシン入りの MT 寒天培地にまき 37℃で一晩培養した．pBIC ベクターに共通する配列を利用して，6 個から 12 個のコロニーに対して PCR を行いインサートの長さを確かめ，正しいものだけをネオマイシン（終濃度 25 μ g/ ml）を含む
3 ml の ２ SY 培地（ 2 SY/Nm）および TM 培地（TM/III．結果１．エンビジン I-set ドメインの組換え体（rEmb55_
BIC）の発現4 種類の pBIC ベクターのそれぞれに同一の DNA

断片を同時にクローニングし，形質転換されたブレNm）にそれぞれ植菌し，30℃，120 rpm で培養した．

ビバチルス菌のコロニーを得た．エンビジン遺伝子をもつプラスミドが含まれるかどうかを PCR 法で調菌体から得られたプラスミド DNA を用い，BigDye
Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit で 反 応 さ せ た 後，

ニーあたり 2 ，10，6 ，5 個だった．同じベクター由来

DNA シ ー ケ ン サ ー ABI PRISM 3100 Avant Genetic
Analyzer（Applied Biosystems）で塩基配列を確認した．
２）組換えエンビジンタンパク質の発現確認，カラムによる精製

べたところ，pBIC 1 ，2 ，3 ，4 でそれぞれ 12 個のコロの形質転換菌を ３ クローンずつ液体培養し，発現の高いものを １ つ選択した．シグナル配列による組換
えタンパク質の発現量を比較するため同一の条件で培養し SDS-PAGE とウェスタンブロット法で比較した（図 ２ ，A）．I-set ドメインでは，4 つのベクターのい

液体培養開始後 24 時間で，TM/ Nm 培地での菌懸濁ずれにおいても組換えタンパク質が産生されていたが液から 0.3ml をとりだし等量の LB/40 % グリセロール（図 ２ ，A，下段），BIC 4 のクローンが最も発現が高
く，BIC 2 のクローンで発現が低かった．この組換えと混和してグリセロールストックとし，−80℃で保存した．48 時間目では，各培養液から 0.1ml をとりだし，
2 x SDS-PAGE サンプルバッファーと混和し，98℃，3分間加熱し電気泳動用試料を作成した．60 時間後に培養を終了し，培養の上清のみを冷凍保存した．

タンパク質のアミノ酸配列（図 １ ，B）は，rEmb55と同一であるが，BIC ベクターより生成されることから rEmb55_BIC と命名した．組換えエンビジンの産生量は，TM/Nm 液体培地の方が ２ SY/Nm 液体培地を

─ 51 ─

市原啓子

TM/ Nm 培地

２SY/ Nm 培地

A

BIC BIC BIC
1２ ３

BIC BIC BIC
1 ２ ３

BIC4

BIC4

Mr

(kDa)
75
50
37
25
20

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

(kDa)
75
50
37
25
20

B

CM FT M

100mM
W

1

2

3

200mM

300mM

4

7 8

5 6

(kDa)
67
37
29
20
14

図２

エンビジンの BIC 法 I-set ドメイン組換えタンパク質の発現とカラム精製

図２ エンビジンの BIC 法 I-set ドメイン組換えタンパク質の発現とカラム精製
A ．BIC ベクターごとの発現． 上段は CBB 染色したゲル，下段は，膜に転写後の抗 Penta-His 抗体によるウェ
A. BIC ベクターごとの発現。
CBB 染色したゲル、下段は、膜に転写後5 )，レーン
2 と 7（BIC 2 - 3 )，レーン 3 と 8（BIC 3 - 4 )，レーン 4
スタンブロット．レーン
１ と ６ （BIC 1 -上段は2 )，レーン
510
4
8).
と 9（BIC 4 -の抗と（BIC
矢印は，発現した組換えタンパク質を示す．
Penta-His 抗体によるウェスタンブロット。レーン１と６（BIC1-5)、レー
B ．BIC 4 - 2 クローンを用いた I-set ドメイン組換えタンパク質のカラム精製培養上清（CM)，カラム通過（FT)，
ン 2 と 7（BIC2-3)、レーン 3 と 8（BIC3-4)、レーン 4 と 9（BIC4-2)、レーン 5
洗浄（W)， １ から ８ は，溶出画分．矢頭は，溶出された組換えタンパク質 rEmb55_BIC を示す．と 10（BIC4-8). 矢印は、発現した組換えタンパク質を示す。
B．BIC4-2 クローンを用いた I-set ドメイン組換えタンパク質のカラム精製
培養上清（CM)、カラム通過（FT)、洗浄（W)、１から８は、溶出画分。矢頭は、２．エンビジン細胞内ドメインの組換え体（rEmb_
用いた場合より多かった（図２ ，A, 上段）
．しかしな
溶出された組換えタンパク質 rEmb55_BIC を示す。
がら，TM/Nm 培地で培養した場合には，カラムクロ

マトグラフィーを行うと予想されるサイズより小さいところに複数本のバンドが認められ，本来の組換
えタンパク質の収量が少いことがわかった．そこで，
２ SY/Nm 液体培地で BIC 4 - 2 を培養しカラム精製をCt）の発現
I-set ドメインの場合と同様，4 種類の pBIC ベクターのそれぞれに同一の DNA 断片を同時にクローニング

し，形質転換されたブレビバチルス菌のコロニーを得た．エンビジン遺伝子をもつプラスミドが含まれるか市原、等倍で印刷してください

行った（図 ２ ，B）．BIC 4 - 2 由来の組換えエンビジン
rEmb55_BIC は，すでに報告した rEmb55 と同様，100

どうかを PCR 法で調べたところ，pBIC 1 ，2 ，3 ，4 でmM イミダゾールで溶出され，SDS-PAGE では 19 kDa

それぞれ ６ 個のコロニーあたり 3 ，3 ，6 ，2 個だった．
TM/Nm 液体培地で培養し，培養上清中に含まれる組のサイズを示した．収量は，培養ごとにばらつきがあり，100 ml の培養液 あたり 20 から 40 μ g だった．

換え体を SDS-PAGE とウェスタンブロット法で調べた（図 3 ，A）．細胞内ドメインとして 46 アミノ酸残基発現させているが，CBB 染色でも抗 Penta-His 抗体
でもバンドとして検出することができた．TM/ Nm と─ 52 ─

ブレビバチルス BIC 発現系による組換えエンビジンタンパク質の発現と精製

A

BIC1

BIC2

BIC3

BIC4

Mr

(kDa)

44

20
14
6.5

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

(kDa)

44

20
14
6.5
100mM

200mM 300mM

B CM FT M w 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (kDa)
44
20
14
6.5

図3

エンビジンの BIC 法細胞内ドメイン組換えタンパク質の発現とカラム精製

A ．BIC ベクターごとの発現． 上段は CBB 染色したゲル，下段は，膜に転写後の抗 Penta-His 抗体によるウェ
図 3 エンビジンの1 (BICBIC
1 - 7法細胞内ドメイン組換えタンパク質の発現とカラム精製)，レーン 2 (BIC 1 - 8 )，レーン 3 (BIC 1 - 8 )，レーン 4 (BIC 2 - 2 )，レー
スタンブロット．レーン
2 - BIC5 )，レーン
6
(BIC
2
6
)，レーン
7 (BIC3 -染色したゲル、下段は、膜に転写後の7 )，レーン 8 (BIC 3 - 8 )，レーン 10 (BIC 4 -10). 矢印は，
ン 5 (BICA.
CBB
ベクターごとの発現。上段は発現した組換えタンパク質を示す．
抗 Penta-His 抗体によるウェスタンブロット。レーン 1 (BIC1-7)、レーン 2
B ．BIC 3 - 8 クローンを用いた細胞内ドメイン組換えタンパク質のカラム精製培養上清（CM)，カラム通過（FT)，(BIC1-8)、レーン 3 (BIC1-8)、レーン 4 (BIC2-2)、レーン 5 (BIC2-5)、レーン 6
洗浄（W)， １ から ８ は，溶出画分．矢頭は，溶出された組換えタンパク質 rEmb_Ct を示す．

(BIC2-6)、レーン 7 (BIC3-7)、レーン 8 (BIC3-8)、レーン 10 (BIC4-10). 矢印は、発現した組換えタンパク質を示す。
B．BIC3-8 クローンを用いた細胞内ドメイン組換えタンパク質のカラム精製

培養上清（CM)、カラム通過（FT)、洗浄（W)、１から８は、溶出画分。矢頭は、
2 SY/ Nm の ２ 種類の培養液でそれぞれ
BIC 3 - 8 を培る．特に，タンパク質の部分配列を人工的に組換えタ溶出された組換えタンパク質 rEmb_Ct を示す。
ンパク質として発現させる場合には，適切なシグナル
養したところ，TM/ Nm培地の方が発現量が多く，分解はおこっていなかった．そこで，TM/ Nm 液体培地
配列が必要である 9 ,15）．

I-set ドメインの組換えタンパク質として rEmb55_
で BIC 3 - 8 を培養し，カラムクロマトグラフィーで組
市原、等倍で印刷してください
BIC を作成した．産生量の最も多い形質転換菌は，
換えタンパク質 rEmb_Ct を精製した（図
３ ，B）
．100

mM イミダゾールで溶出され，100 ml の培養液で 20

pBIC 4 由来の分泌シグナルをもつ BIC 4 - 2 だった．こmg を回収することができた．これは I-set ドメインのの分泌シグナルは pNC-HisT ベクターでコードされる

場合の 1000 倍の発現量である．

配列と同一である．結果として，rEmb55 を超える収IV．考察

量をもつ菌を得ることができなかった．rEmb55_BICを産生する形質転換菌 BIC 4 - 2 は，MT/ Nm 培地で効率よく組換え体を分泌した（図 ２ ，A）．しかしながら，今回，BIC 法を用い ２ つの組換えエンビジンタン

大量培養では分解産物や組換え体と関係のないタンパ

パク質を発現させることができた．分泌シグナルは，

ク質が同時に分泌されてカラム精製が困難だった．ブ

タンパク質の分泌効率に大きな影響を及ぼす要素であレビバチルス発現系で使用する菌はプロテアーゼ活性る．目的タンパク質と相性のよい分泌シグナルを選ぶが低いことが特徴であるが，rEmb55 では組換え体はC 末端側が欠落し短くなった分子がカラムで精製されことが効率的なタンパク質の発現と精製には必要であ─ 53 ─

市原啓子てきた ９ ）．I-set ドメインの組換えタンパク質がブレ

Halestrap AP.（2005）J Biol Chem. 280, 27213-21. Basigin

ビバチルス菌体内あるいは培養液中において，不安（CD147）is the target for organomercurial inhibition of

定で分解されやすい性質をもつと考えられる．一方，
pNC-HisT ベクターを利用した組換えタンパク質を発

protein for the insensitive MCT 2 is EMBIGIN（gp70）.

monocarboxylate transporter isoforms 1 and 4 : the ancillary4 ）Mannowetz N, Wandernoth P, Wennemuth G.（2012）J Cell

現では １ リットルで 0.5 g の収量があることが報告さ

Physiol. 227, 2154-62. Basigin interacts with both MCT 1 andれてる 10）．以上の結果から，I-set ドメイン組換えタン

MCT 2 in murine spermatozoa.
5 ）市原啓子，村松喬（2009）. 第 82 回日本生化学会大会抄録

パク質の発現効率の低さは分泌シグナルによるものではなく，目的とするポリペプチド自体の構造的特性に

集 . エンビジンによるフィブロネクチン基質への細胞接着よるものと考えられる．
細胞内ドメイン 46 アミノ酸残基をもつエンビジン

6 ）Lain E, Carnejac S, Escher P, Wilson MC, Lømo T, Gajendran能の向上 .
N, Brenner HR.（2009）J Biol Chem. 284, 8930-9. A novel role

組換えタンパク質 rEmb_Ct は，pBIC 3 の分泌シグナ
ルが最も効果的だった．組換えタンパク質は，100 ml

for embigin to promote sprouting of motor nerve terminals at theneuromuscular junction.
7 ）Takagi H, Kadowaki K, Udaka S.（1989）Agric. Biol. Chem.,の培養液からカラムで一度に 20 mg 精製することがで

53, 691-699. Screening and Characterization of Protein-

き十分な量であった．
BIC 法はクローニング用の DNA 断片が準備できれ

Hyperproducing Bacteria without Detectable Exoprotease
Activity.

ば直線状のベクターとまぜて形質転換を行うことで形8 ）Miyauchi A, Ozawa M, Mizukami M, Yashiro K, Ebisu S, Tojo T,

質転換菌を得ることができる．さらに ２ − ３ 日の液Fujii T, Takagi H.（1999）Biosci Biotechnol Biochem. 63, 1965-

体培養を行うことで， ４ 種類の発現ベクターごとの1969. Structural conversion from non-native to native form ofrecombinant human epidermal growth factor by Brevibacillus

組換えタンパク質の発現量の比較までできた．形質転choshinensis.

換菌のプレートは低温保存ができないため，最初の液9 ）市原啓子（2014）心身科学 6 巻（ 1 ）,119-124．ブレビバチ体培養の一部をグリセロールストックとして−８０℃

ルス発現系によるエンビジン組換えタンパク質の発現と精で保存することが重要であった．大量培養はグリセロ
ールストックがあればいつでも可能であった．BIC 法

製．
10）Yashiro K, Lowenthal JW, O'Neil TE, Ebisu S, Takagi H, Moore
RJ.（2001）Protein Expression and Purification 23, 113-120.

は，簡便で効率的に組換えタンパク質を産生させるよ

High-Level Production of Recombinant Chicken Interferon- γ

い方法と思われるが，実際の収量は目的とするポリペ
プチドのアミノ酸組成や高次構造の安定性に関係があることがわかった．

by Brevibacillus choshinensis.
11） Mizukami M, Hanagata H, Miyauchi A.（2010）Curr Pharm
Biotechnol. 11（ 3 ）: 251-8. Brevibacillus expression system:
host-vector system for efﬁcient production of secretory proteins.

謝辞12）Onishi H, Mizukami M, Hanagata H, Tokunaga M, Arakawa
T, Miyauchi A.（2013）Protein Expression and Purification
91, 184–191. Efficient production of anti-fluorescein andDNA シーケンサーの使用に際して，愛知学院大学

anti-lysozyme as single-chain anti-body fragments（scFv）by

歯学部吉村文信教授の協力と支援をうけたことに深く謝意を表する．

Brevibacillus expression system.
13）Mizukami M, Tokunaga H, Onishi H, Ueno Y, Hanagata H,
Miyazaki N, Kiyose N, Ito Y, Ishibashi M, Hagihara Y, Arakawa
T, Miyauchi A, Tokunaga M（2014）Protein Expr Purif. 105C,

文献

23-32. Highly efﬁcient production of VHH antibody fragments

1 ）Huang RP, Ozawa M, Kadomatsu K, Muramatsu T.（1990）
Differentiation. 45, 76-83. Developmentally regulated expressionof embigin, a member of the immunoglobulin superfamily foundin Brevibacillus choshinensis expression system.
14）Ichihara-Tanaka K, Oohira A, Rumsby M, Muramatsu T.（2006）
J Biol Chem. 281, 30857-64. Neuroglycan C is a novel midkine

in embryonal carcinoma cells.

receptor involved in process elongation of oligodendroglial

2 ）Huang RP, Ozawa M, Kadomatsu K, Muramatsu T.（1993）Dev
Biol. 155, 307-14. Embigin, a member of the immunoglobulin
superfamily expressed in embryonic cells, enhances cell-

precursor-like cells.
15）Ichihara-Tanaka K, Titani K, Sekiguchi K.（1990）J Biol Chem.

substratum adhesion.
3 ）Wilson MC, Meredith D, Fox JE, Manoharan C, Davies AJ,

265, 401-7. Recombinant carboxyl-terminal fibrin-binding
domain of human ﬁbronectin expressed in mouse L cells.
（最終版平成 26 年 12 月 31 日受理）

─ 54 ─

Journal of the Institute for Psychological and Physical Science, Vol. 7 , No. 1 , 49┉55, 2015

Expression and puriﬁcation of domain-speciﬁc recombinant embigin proteins using
Brevibacillus in vivo cloning system
Keiko Ichihara-Tanaka
Abstract
Embigin is a cell surface transmembrane glycoprotein belonging to the immunoglobulin (Ig) superfamily.
Embigin is reported as the cofactor of monocarboxylate transporter 2 , and described as the modulator ofnuromuscular junction formation, but its function is not fully understood. In addition, it is not known what
proteins are associated with embigin in the cytoplasmic region. To elucidate the molecular interaction of
membrane protein with other proteins, domain-speciﬁc recombinant proteins are widey used, because the whole
molecule of transmembrane protein is hard to purify.
As previously reported, the recombinant embigin protein containing I-set domain (rEmb55) was successfully
produced using expression vector pNC-HisT with brevibacillus expression system, but the yield was low
compared to the other proteins reported. Recently Brevivacillus in vivo cloning (BIC) system has beendeveloped. Taking advantage of four liniarized expression vectors encoding the different signal sequence, highexpression clones can be easily screened, because combination with the appropriate signal sequence is essential
for the effective secretion of proteins outside cells. In this study, the author have made two recombinant embigin
proteins with a histidine tag sequence with brevibacillus expression system. One contains the I-set domain, andthe other contains the cytoplasmic domain.
In the case of the I-set domain, the most effective secretion signal was pBIC 4 , the same sequence as pNCHisT. The yield of rEmb55_BIC was similar to rEmb55 as reported. During the bacterial culture and protein
puriﬁcation, rEmb55_BIC could well make degradation. This instability is likely the reason for the low yield.
In the case of the cytoplasmic domain, pBIC 3 expression plasmicd (clone BIC 3 - 8 ) was the highest level.
From the culture of BIC 3 - 8 in the 100 ml 2 SY medium rEmb_Ct protein was yielded at 20 mg after column
puriﬁcation.
In conclusion, although the BIC expression system is a convenient tool for the production of domain speciﬁcrecombinant proteins, the amount of protein yield is likely to be affected by the amino acid composition and/or
structural stability of the polypeptide itself.
Keywords: embigin, Brevibacillus choshinensis, recombinant, expression, purification, brevibacillus in vivo
cloning method

─ 55 ─