2019 年 6 月 7 日

公益財団法人発酵研究所 第 13 回 助成研究報告会 ( 千里ライフサイエンスセンター )嫌気性バルキング原因菌の微生物機能情報の解明と高速メタン
発酵リアクターのバルキングメカニズムの理解

P-32

山田 剛史
豊橋技術科学大学 環境・生命工学系
連絡先 E.mail: tyamada@chem.tut.ac.jp
スピアマンの順位相関係数を用いた嫌気性バルキング原因菌同士や他の構成微生物との相関関係の評価
Firmicutes

研究背景と研究目的
EGSB リアクターの立ち上げ時に発生した嫌気性バルキング現象

OTU 15

バルキングした汚泥の電子顕微鏡写真
バルク中のフロック汚泥全体像
グラニュール汚泥全体像

Expanded granular sludge bed (EGSB) リアクター

グラニュール汚泥切片像
Surface

研究目的
本研究では、その発生メカニズムを推定するため、バルキング原因菌の微生物機能情報を明らかにすることを目的とする。

研究結果と考察

Taxonomy
Euryarchaeota

30

線の太さは、相関係数の強さを示す。
Speaman s correlation coeﬃcient > 0.7
Chloroflexi Statistically signiﬁcant (p-value) < 0.01
嫌気性バルキング原因微生物
OTU 9
バルキング汚泥で増加した微生物

OTU 19バルキング原因微生物間の正の相関
バルキング原因微生物と増加した微生物との正の相関
他の微生物同士の正の相関

OTU 8

OTU 7

OTU 6

OTU 23Bacteroidetes

OTU 5
OTU 4

OTU 24OTU 25OTU 3
OTU 26

Spirochaetes

OTU 1

Verrucomicrobia

Aegiribacteria

OTU 2

Euryarchaeota

・嫌気性バルキング原因微生物同士に強い正の相関があり、同一の要因 ( 運転条件や環境要因の変化 ) によって異常増殖した可能性がある。
・バルキング汚泥において増加が確認された糸状性の形態を有していない微生物とバルキング原因微生物の間には、強い正の相関が得られた。・これらの結果はバルキング原因微生物の異常増殖のみならず、他の構成微生物の異常増殖と複合的に発生していたことを示唆していた。

健全なグラニュール汚泥におけるバルキング原因菌の空間分布

16S rRNA 遺伝子アンプリコン解析によるバルキング汚泥と健全な汚泥内微生物群集構造の比較
OTU 115OTU 10

Proteobacteria

・EGSB 法の普及やそれに伴う適用廃水種の拡大に伴って、EGSB リアクター内の汚泥が突発的に浮上して流出する現象 ( 嫌気性バルキング ) が確認されてきている。当該リアクターで確認された嫌気性バルキング汚泥は、健全なグラニュール汚泥に比べて汚泥沈降が 3 倍程度沈降性が悪化していた。ひとたび嫌気性バルキングが発生すると、処理効率が低下するのみならず、リアクターを停止せざるえない事態が生じる。しかしながら、その発生メカニズムはおろか原因菌すら不明であり、即効性の高い対策が立てられずにいる。

phylumOTU 18OTU 22

1 cm

5OTU 11OTU 21

InsideOTU ID

1OTU 20

グラニュール汚泥表面像

EGSB-AOTU 12OTU 17

Nitrospirae

Detection rate (%)

Dependentiae

OTU 13OTU 16

Latescibacteria
Modulibacteria

バルキング汚泥
SVI : 42.9 (mL・g-1)

OTU 14

order
Methanobacteriales

familyMethanobacteriaceae

Bulkinggenus

SVI:45.1mL･g-VSS

Healthy

SVI:19.0mL･g-VSS-1

OutsideHealthy

SVI:20.0mL･g-VSS-1

Methanobacterium

OTU 2

Euryarchaeota

Methanomicrobiales Methanocorpusculaceae Methanocorpusculum

OTU 3

Euryarchaeota

Methanosaecinales

Methanosaetaceae

OTU 4Aegiribacteria

OTU 5Bacteroidetes

Bacteroidales

VadinHA17OTU 6Bacteroidetes

Ignavibacteriales

Melioribacteraceae

OTU 7Bacteroidetes

SJA-28OTU 8Chloroflexi

Anaerolineales

Anaerolineaceae

Anaerolinea

OTU 9Chloroflexi

Anaerolineales

Anaerolineaceae

UCG-001

OTU 10Chloroflexi

RBG-13-54-9

OTU 11Chloroflexi

SBR1031OTU 12

Dependentiae

Babeliales

OTU 13Firmicutes

Clostridiales

Caldicoprobacteraceae Caldicoprobacter

OTU 14

Firmicutes

Clostridiales

family_XIV

OTU 15Firmicutes

D8A-2

OTU 16

Firmicutes

DTU014OTU 17

Latescibacteria

OTU 18Modulibacteria

OTU 19

Nitrospirae

OTU 20Proteobacteria

Desulfovibrionales

OTU 21

Proteobacteria

Desulfuromonadales Geobacteraceae

GeobacterOTU 22

Proteobacteria

Syntrophobacterales Syntrophaceae

Smithella

OTU 23

Proteobacteria

Syntrophobacterales Syntrophaceae

OTU 24

Proteobacteria

Syntrophobacterales Syntrophobacteraceae

OTU 25

Spirochaetes

Spirochaetales

Spirochaetaceae

OTU 26

Verrucomicrobia

Pedosphaerales

Pedosphaeraceae

Moduliflexales-1

緑 : GNSB941 ( 標的 : Chloroﬂexi 門細菌 )赤 : MX825 ( 標的 : Methanosaeta 属アーキア )UPUPMethanosaeta

InsideUPUP

Moduliflexaceae

Desulfovibrionaceae

100 µm・メタノサエタ属アーキアとクロロフレキシ門細菌に特異的な DNA プローブを用いた Fluorescence insitu hybridization 法を適用した。クロロフレキシ門細菌は汚泥表面に存在し、メタノサエタ属アーキアは汚泥内部に存在することが分かった。
・クロロフレキシ門細菌の異常増殖はグラニュール汚泥の表面形状を変え、メタノサエタ属アーキアの異常増殖はグラニュール汚泥内部からの破壊をもたらしたため、懸濁性物質が多く形成されたことを示唆された。

バルキング汚泥に存在するアナエロリネア綱細菌の分離・培養

Candidatus Moduliflexus

J3 集積培養系

LiquidDesulfovibrioUPUPUP

Syntrophobacter

Temparature : 35 °C
pH : 7.0Method : Serial dilution method
Substrate : Glucose (10 mM), yeast extract (0.1%)
Incubation time : 10 days

全体の1%以下のリード配列は除去

Detection rate (%)

151530(bar : 10 µm)

16S rRNA 遺伝子アンプリコン解析を行ったところ、嫌気性バルキング汚泥において、健全なグラニュール汚泥に対して有意に増加していた微生物種は、ユリアーキオータ門 (2 種 )、クロロフレキシ門 (2 種 ) およびプロテオバクテリア門 (3 種 ) に属する微生物種であった。

Strain J3 in a enrichment culture

高感度微生物検出法である In situ DNA-HCR 法を用いた嫌気性バルキング原因微生物の同定
緑 : GNSB941 ( 標的 : Chloroﬂexi 門細菌 )赤 : MX825 ( 標的 : Methanosaeta 属アーキア )0.02

Leptolinea tardivitalis YMTK-2T (AB109438)
Longilinea arvoryzae KOME-1T (AB243673)
Levilinea saccharolytica KIBI-1T (AB109439)
Bellilinea caldifistulae GOMI-1T (AB243672)
Pelolinea submarina MO-CFX1T (AB598277)
Anaerolinea thermolimosa IMO-1T (AB109437)
Anaerolinea thermophila strain UNI−1T (AP012029)
Flexilinea flocculi strain TC1T (LC049585)
T
Ornatilinea apprima P3M-1 (JQ292916)
Thermanaerothrix daxensis strain GNS-1T (LGKO01000002)
Thermomarinilinea lacunifontana strain KCTC5908T (AB669272)

>95%

>85%

>75%

・バルキング原因菌の空間分布調査の結果、アナエロリネア綱細菌は、糖のような発酵過程の比較的初期の有機物を利用することが示唆されたため、グルコースと酵母抽出液で集積培養を行った。
・バルキング汚泥を植種源とした集積培養では、新規のクロロフレキシ門アナエロリネア綱細菌 J3 株( バルキング原因菌 ) を集積させることに成功した。16S rRNA 遺伝子アンプリコン解析では、J3 株の集積度は約 50% であった。
・ J3 株は、バルキング原因菌と推定される OTU9 と同一の塩基配列を有していた。

結論

・メタノサエタ属とアナエロリネア綱に属する複数種の微生物が糸状性の形態をしていることから、嫌気性バルキングに関与していることが示唆された。
(bar: 10 µm)

糸状性の形態を示すメタノサエタ属アーキアとクロロフレキシ門細菌が嫌気性バルキング汚泥に多数存在しており、嫌気性バルキングに強く関与していることを示していた。

・嫌気性バルキングのバルキング原因菌の異常増殖は、同一の要因 ( 運転条件や環境要因の変化 ) によって発生した可能性がある。
・空間分布調査と集積培養法を用いることによって、バルキング原因菌の一つである新たなアナエロリネア綱細菌の集積に成功した。