放線菌における二次代謝遺伝子を指標とした新たな分類基準の構築に関する研究
春成 円十朗 （富山県立大学工学部）
背景、目的

２．データベースによる検証

Salinispora属などいくつかの放線菌では属や種に特異的な二次代謝遺伝子を有している。このことから、多種多様な二次代謝産物を生産する放線菌の場合、進化情報は二次代謝遺伝子にも強く保存されていると推定し、次の2点を仮定した。

16S rRNA系統樹における二次代謝遺伝子の分布
放線菌の二次代謝遺伝子が16S rRNAに基づいた系統樹においてどのように分布しているのかを解析した。
１．遺伝子配列による検索（MIBiG, BLAST, antiSMASH）
２．化合物からの検索（Dictionary of Natural Products）

1. 二次代謝遺伝子による分類が可能である
2. 新奇性の高い化合物の生産菌は新規分類群である
以上の仮定を検証するため、本研究では新規骨格化合物を放線菌より探索し、生産菌の同定および二次代謝遺伝子の解析を計画した。

Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属のみに分布

１．新規化合物による検証
小笠原土壌からの放線菌分離誕生以来、他の大陸に接していない海洋島として高度に隔離され、植物をはじめ多くの固有種を有する小笠原諸島の土壌を分離源として選定した。
小笠原を代表する2地域10点の土壌から分離した194株を3種類の培地で培養し、ブタノール抽出物に含まれる化合物は、UVスペクトルを指標とした物
理化学的スクリーニングにより、新規性の判定を行った。

複数の科、属に分布

Actinosynnema
Saccharothrix
Kutzneria
Streptoalloteichus
Amycolatopsis
Actinokineospora
Kibdelosporangium

2地域10点の土壌

Nocardiaceae

放線菌194株

1000 km

Actinopolysporaceae科
Pseudonocardiaceae科
Halopolyspora
Actinopolyspora

Pseudonocardia
Saccharopolyspora
Corynebacterium
Dietzia
Rhodococcus
Tsukamurella
Nocardia
科
Williamsia
Gordonia
Mycobacterium
SkermaniaAeromicrobium
Nocardioides
KribbellaFriedmanniella
Luteococcus
Propionibacterium
Actinoplanes
Micromonospora
Salinispora
Dactylosporangium
Nakamurella
Cryptosporangium
Blastococcus
Geodermatophilus
Sporichthya
Acidothermus
Frankia
Allosalinactinospora
Nocardiopsis
Thermobifida
Actinomadura
Spirillospora
Thermomonospora
Nonomuraea
Planomonospora
Streptosporangium
Herbidospora
Microbispora
Microtetraspora
Kitasatospora
Streptomyces
科
Brevibacterium
Leifsonia
Microbacterium
Agromyces
Intrasporangium
Cellulomonas
Rarobacter
Sanguibacter
Micrococcus
Renibacterium
Arthrobacter
RothiaDermatophilus
Kytococcus
Demetria
Dermacoccus
Jonesia
Brachybacterium
Dermabacter
Bogoriella
Promicromonospora
Actinobaculum
Arcanobacterium
Actinomyces
Glycomyces
Bifidobacterium

ISP 4、 HV 培地● 東京

tetracycline
4科6属

erythromycin
4科4属

液体培地3種BuOH抽出Streptomycetaceae

● 小笠原

新規化合物
スクリーニング

Actinosynnema
Saccharothrix
Kutzneria
Streptoalloteichus
Amycolatopsis
Actinokineospora
Kibdelosporangium

vancomycin
5科5属
Actinosynnema
Saccharothrix
Kutzneria
Streptoalloteichus
Amycolatopsis
Actinokineospora
Kibdelosporangium

Pseudonocardiaceae科

Pseudonocardiaceae科

Halopolyspora
Actinopolyspora
Pseudonocardia
Saccharopolyspora
Corynebacterium
DietziaRhodococcus
Tsukamurella
Nocardia
Williamsia
Gordonia
Mycobacterium
Skermania
Aeromicrobium
Nocardioides
KribbellaFriedmanniella
Luteococcus
Propionibacterium
Actinoplanes
Micromonospora
Salinispora
Dactylosporangium
Nakamurella
Cryptosporangium
Blastococcus
Geodermatophilus
Sporichthya
Acidothermus
Frankia
Allosalinactinospora
Nocardiopsis
Thermobifida
Actinomadura
Spirillospora
Thermomonospora
Nonomuraea
Planomonospora
Streptosporangium
Herbidospora
Microbispora
Microtetraspora
Kitasatospora
Streptomyces
科
Brevibacterium
Leifsonia
Microbacterium
Agromyces
Intrasporangium
Cellulomonas
Rarobacter
Sanguibacter
Micrococcus
Renibacterium
Arthrobacter
RothiaDermatophilus
Kytococcus
Demetria
Dermacoccus
Jonesia
Brachybacterium
Dermabacter
Bogoriella
Promicromonospora
Actinobaculum
Arcanobacterium
Actinomyces
Glycomyces
Bifidobacterium

Micromonosporaceae科

Actinosynnemataceae科

Streptomycetaceae

Halopolyspora
Actinopolyspora
Pseudonocardia
Saccharopolyspora
Corynebacterium
Dietzia
Rhodococcus
Tsukamurella
Nocardia
科
Williamsia
Gordonia
Mycobacterium
Skermania
Aeromicrobium
Nocardioides
KribbellaFriedmanniella
Luteococcus
Propionibacterium
Actinoplanes
科
Micromonospora
Salinispora
Dactylosporangium
Nakamurella
Cryptosporangium
Blastococcus
Geodermatophilus
Sporichthya
Acidothermus
Frankia
Allosalinactinospora
Nocardiopsis
Thermobifida
Actinomadura
Spirillospora
Thermomonospora
Nonomuraea
科
Planomonospora
Streptosporangium
Herbidospora
Microbispora
Microtetraspora
Kitasatospora
Streptomyces
科
Brevibacterium
Leifsonia
Microbacterium
Agromyces
Intrasporangium
Cellulomonas
Rarobacter
Sanguibacter
Micrococcus
Renibacterium
Arthrobacter
RothiaDermatophilus
Kytococcus
Demetria
Dermacoccus
Jonesia
Brachybacterium
Dermabacter
Bogoriella
Promicromonospora
Actinobaculum
Arcanobacterium
Actinomyces
Glycomyces
Bifidobacterium

Nocardiaceae

Micromonosporaceae

Streptosporangiaceae

Streptomycetaceae

0.010.01

スクリーニング結果

0.01

bafilomycin
3科4属

194株のうち7株は新規と推定される化合物を生産していたが、解析の結果、いずれも陸上放線菌の既知化合物、もしくはその類縁体であると決定・推定された。本スクリーニングによって得られた新規化合物の生産候補株は全体の約3.7％と低いことや、既知化合物を生産している可能性が高いことから、計画していた「新規骨格化合物生産菌の取得および二次代謝遺伝子の解析」を遂行することは困難であると判断し、本計画を中止した。

Actinosynnema
Saccharothrix
Kutzneria
Streptoalloteichus
Amycolatopsis
Actinokineospora
Kibdelosporangium

Actinosynnema
Saccharothrix
Kutzneria
Streptoalloteichus
Amycolatopsis
Actinokineospora
Kibdelosporangium

Halopolyspora
Actinopolyspora
Pseudonocardia
Saccharopolyspora
Corynebacterium
Dietzia
Rhodococcus
Tsukamurella
Nocardia
科
Williamsia
Gordonia
Mycobacterium
Skermania
Aeromicrobium
Nocardioides
KribbellaFriedmanniella
Luteococcus
Propionibacterium
Actinoplanes
Micromonospora
Salinispora
Dactylosporangium
Nakamurella
Cryptosporangium
Blastococcus
Geodermatophilus
Sporichthya
Acidothermus
Frankia
Allosalinactinospora
Nocardiopsis
Thermobifida
Actinomadura
Spirillospora
Thermomonospora
Nonomuraea
Planomonospora
Streptosporangium
Herbidospora
Microbispora
Microtetraspora
Kitasatospora
科
Streptomyces
Brevibacterium
Leifsonia
Microbacterium
Agromyces
Intrasporangium
CellulomonasRarobacter
Sanguibacter
Micrococcus
Renibacterium
Arthrobacter
RothiaDermatophilus
Kytococcus
Demetria
Dermacoccus
Jonesia
Brachybacterium
Dermabacter
Bogoriella
Promicromonospora
Actinobaculum
Arcanobacterium
Actinomyces
Glycomyces
Bifidobacterium

Nocardiaceae

Micromonosporaceae科

海洋島、小笠原諸島という特殊な分離源であっても、陸上放線菌から新規化合物を得ることは困難であった。

Streptomycetaceae

生産が確認された既知化合物、類縁体

Halopolyspora
Actinopolyspora

Micromonosporaceae科

Actinosynnemataceae科
Thermomonosporaceae科

Streptomycetaceae

小笠原土壌（2地域10点）

放線菌
194株

培養・抽出
スクリーニング

新規化合物生産候補

海洋深層水（富山県入善）

放線菌52株

培養・抽出
スクリーニング

新規化合物生産候補7株（4％）

16株（31％）

Micromonosporaceae科

Streptomycetaceae

Halopolyspora
Actinopolyspora
Pseudonocardia
Saccharopolyspora
Corynebacterium
Dietzia
Rhodococcus
Tsukamurella
Nocardia
Williamsia
Gordonia
Mycobacterium
Skermania
Aeromicrobium
Nocardioides
KribbellaFriedmanniella
Luteococcus
Propionibacterium
Actinoplanes
Micromonospora
Salinispora
Dactylosporangium
Nakamurella
Cryptosporangium
Blastococcus
Geodermatophilus
Sporichthya
Acidothermus
Frankia
Allosalinactinospora
Nocardiopsis
Thermobifida
Actinomadura
Spirillospora
Thermomonospora
Nonomuraea
Planomonospora
Streptosporangium
Herbidospora
Microbispora
MicrotetrasporaKitasatospora
科
Streptomyces
Brevibacterium
Leifsonia
Microbacterium
Agromyces
Intrasporangium
Cellulomonas
Rarobacter
Sanguibacter
Micrococcus
Renibacterium
Arthrobacter
RothiaDermatophilus
Kytococcus
Demetria
Dermacoccus
Jonesia
Brachybacterium
Dermabacter
Bogoriella
Promicromonospora
Actinobaculum
Arcanobacterium
Actinomyces
Glycomyces
Bifidobacterium

Micromonosporaceae科

Streptomycetaceae

0.01

Actinosynnema
Saccharothrix
Kutzneria
Streptoalloteichus
Amycolatopsis
Actinokineospora
Kibdelosporangium

Actinosynnemataceae科

Pseudonocardia
Saccharopolyspora
Corynebacterium
Dietzia
Rhodococcus
Tsukamurella
NocardiaWilliamsia
Gordonia
Mycobacterium
Skermania
Aeromicrobium
Nocardioides
KribbellaFriedmanniella
Luteococcus
Propionibacterium
Actinoplanes
Micromonospora
Salinispora
Dactylosporangium
Nakamurella
Cryptosporangium
Blastococcus
Geodermatophilus
Sporichthya
Acidothermus
Frankia
Allosalinactinospora
Nocardiopsis
Thermobifida
Actinomadura
Spirillospora
Thermomonospora
Nonomuraea
Planomonospora
Streptosporangium
Herbidospora
Microbispora
Microtetraspora
Kitasatospora
Streptomyces
科
Brevibacterium
Leifsonia
Microbacterium
Agromyces
Intrasporangium
Cellulomonas
Rarobacter
Sanguibacter
Micrococcus
Renibacterium
Arthrobacter
RothiaDermatophilus
Kytococcus
Demetria
Dermacoccus
Jonesia
Brachybacterium
Dermabacter
Bogoriella
Promicromonospora
Actinobaculum
Arcanobacterium
Actinomyces
Glycomyces
Bifidobacterium

海洋深層水由来の放線菌との比較

Halopolyspora
Actinopolyspora
Pseudonocardia
Saccharopolyspora
Corynebacterium
Dietzia
Rhodococcus
Tsukamurella
Nocardia
Williamsia
Gordonia
Mycobacterium
Skermania
Aeromicrobium
Nocardioides
KribbellaFriedmanniella
Luteococcus
Propionibacterium
Actinoplanes
Micromonospora
Salinispora
Dactylosporangium
Nakamurella
Cryptosporangium
Blastococcus
Geodermatophilus
Sporichthya
Acidothermus
Frankia
Allosalinactinospora
Nocardiopsis
Thermobifida
Actinomadura
Spirillospora
Thermomonospora
Nonomuraea
Planomonospora
Streptosporangium
Herbidospora
Microbispora
Microtetraspora
Kitasatospora
Streptomyces
科
Brevibacterium
Leifsonia
Microbacterium
Agromyces
Intrasporangium
Cellulomonas
Rarobacter
Sanguibacter
Micrococcus
Renibacterium
Arthrobacter
RothiaDermatophilus
Kytococcus
Demetria
Dermacoccus
Jonesia
Brachybacterium
Dermabacter
Bogoriella
Promicromonospora
Actinobaculum
Arcanobacterium
Actinomyces
Glycomyces
Bifidobacterium

kinamycin
3科5属

staurosporine
4科5属
Actinosynnema
Saccharothrix
Kutzneria
Streptoalloteichus
Amycolatopsis
Actinokineospora
Kibdelosporangium

Actinosynnema
Saccharothrix
Kutzneria
Streptoalloteichus
Amycolatopsis
Actinokineospora
Kibdelosporangium

Pseudonocardiaceae科

0.01

0.01

0.01

kanamycin
3科4属

rubromycin
2科3属

0.01

Halopolyspora
Actinopolyspora

Pseudonocardia
Saccharopolyspora
Corynebacterium
Dietzia
Rhodococcus
Tsukamurella
Nocardia
Williamsia
Gordonia
Mycobacterium
Skermania
Aeromicrobium
Nocardioides
KribbellaFriedmanniella
Luteococcus
Propionibacterium
Actinoplanes
Micromonospora
Salinispora
Dactylosporangium
Nakamurella
Cryptosporangium
Blastococcus
Geodermatophilus
SporichthyaAcidothermus
Frankia
Allosalinactinospora
Nocardiopsis
Thermobifida
Actinomadura
Spirillospora
Thermomonospora
Nonomuraea
Planomonospora
Streptosporangium
Herbidospora
Microbispora
Microtetraspora
Kitasatospora
科
Streptomyces
Brevibacterium
Leifsonia
Microbacterium
Agromyces
Intrasporangium
Cellulomonas
Rarobacter
Sanguibacter
Micrococcus
Renibacterium
Arthrobacter
RothiaDermatophilus
Kytococcus
Demetria
Dermacoccus
Jonesia
Brachybacterium
Dermabacter
Bogoriella
Promicromonospora
Actinobaculum
Arcanobacterium
Actinomyces
Glycomyces
Bifidobacterium

Micromonosporaceae科

Streptomycetaceae

rakicidin
3科5属ActinosynnemaSaccharothrix
Kutzneria
Streptoalloteichus
Amycolatopsis
Actinokineospora
Kibdelosporangium

Halopolyspora
Actinopolyspora
Pseudonocardia
Saccharopolyspora
Corynebacterium
Dietzia
Rhodococcus
Tsukamurella
Nocardia
Williamsia
Gordonia
Mycobacterium
Skermania
Aeromicrobium
Nocardioides
KribbellaFriedmanniella
Luteococcus
Propionibacterium
Actinoplanes
Micromonospora
Salinispora
Dactylosporangium
Nakamurella
Cryptosporangium
Blastococcus
Geodermatophilus
Sporichthya
Acidothermus
科Frankia
Allosalinactinospora
Nocardiopsis
Thermobifida
Actinomadura
Spirillospora
Thermomonospora
Nonomuraea
Planomonospora
Streptosporangium
Herbidospora
Microbispora
Microtetraspora
Kitasatospora
科
Streptomyces
Brevibacterium
Leifsonia
Microbacterium
Agromyces
Intrasporangium
Cellulomonas
Rarobacter
Sanguibacter
Micrococcus
Renibacterium
Arthrobacter
RothiaDermatophilus
Kytococcus
Demetria
Dermacoccus
Jonesia
Brachybacterium
Dermabacter
Bogoriella
Promicromonospora
Actinobaculum
Arcanobacterium
Actinomyces
Glycomyces
Bifidobacterium

Micromonosporaceae科

Frankiaceae

Streptomycetaceae

0.01

３０化合物の二次代謝遺伝子の分布を解析
放線菌：Actinomycetales目43科のうち、これらの二次代謝遺伝子を保有しているのは6亜目9科のみであり、このうち4亜目7科が主要なグループであった。
本グループはStreptomyces属やMicromonospora属をはじめとする、主要な生理活性物質の生産属で占められており、Corynebacterineae亜目（Corinebacterium属）やMicrococcineae亜目（Micrococcus属、Microbacterium属）などに属する非菌糸状のグループには存在しなかった。
放線菌の多くの二次代謝遺伝子は、16S rRNAによる系統樹とは異なる偏った分布をしており、本遺伝子を指標とした新たな分類基準の存在を示唆するものであった。