No.

30

2 0 1 6

Published by
INSTITUTE FOR FERMENTATION, OSAKA
17 — 85, JUSO — HONMACHI 2 — CHOMEYODOGAWA — KU, OSAKA 532 — 8686, JAPAN公益財団法人発酵研究所

理 事 長

波多野和德

常務理事

中濱

一雄

理

事

木村
冨田
中瀬
古川

光
房男
崇
謙介

武田
永井
原島
本田

光子
和夫
俊
武司

監

事

下元

高文

藤井

智幸

評 議 員

今田 哲
北本勝ひこ
関 達治
武田 直久
土屋 英子

顧

坂野

問

勲

魚住 武司
下田 親
竹内 昌男
谷 吉樹
吉田 敏臣

目

次

発酵研究所の活動－発酵研究所を継いだ人たち（1995.4～2001.3）－ …………………………… 竹内昌男

1

第10回助成研究報告会の開催 …………………………………………………… 横田明

17

熱帯に生息する超希少微生物の分離探索基盤の構築…………………………… 早川正幸

21

発酵菌による細胞リプログラミング機構の解明………………………………… 太田

訓正

39

胆汁酸を責任分子と想定した西欧食による
腸内細菌叢崩壊機構の解明………………………………………………………… 横田篤

47

難培養性アナモックス細菌の生理・生態学の全容解明に向けてのポストゲノム解析…………………………………………… 岡部

聡

57

裕

69

相同性から機能が推定されている超好熱アーキアの蛋白質・酵素の機能解明
河原林 裕………………………………………………………………………………

79

活性を指標とした超好熱アーキアの新規蛋白質・酵素の単離とその解析
石野 園子，モハマド ダダシプール，河原林 裕………………………………

89

極限環境微生物遺伝子資源の応用
石野 園子，鈴木 宏和，河原林103■ 平成26年度大型研究助成■ 平成22年度寄付講座助成
極限環境微生物のゲノムに認められる機能未知遺伝子の機能解析とその応用………………………………………………………………… 河原林

裕………………………………………………

■ 平成26年度一般研究助成
汽水湖に生息する孔径 0.22μm のメンブレンフィルターを通過可能な極微小微生物の分離と，地理分布，系統学的多様性
およびその生態の解明……………………………………………………………… 新谷

政己

119

倒木に発生する変形菌類の窒素炭素安定同位体比分析による食性解析と，変形菌類が倒木中の養分無機化および樹木実生の生長に果たす役割の解明……………………………………………… 深澤

遊

120

従属栄養性珪藻類の進化・多様性と分子生態学的研究基盤の確立…………… 神川

龍馬

120

植物寄生菌の熱帯環境への適応進化の解明……………………………………… 高松進

121

運動性乳酸菌の選択分離法の開発とその応用：
運動性乳酸菌の多様性の解析……………………………………………………… 乙黒

美彩

122

高濃度塩泉水・鹿塩温泉における好塩微生物相の解析………………………… 峯岸

宏明

123

温泉に生育する真菌の分離培養方法の確立と系統分類および二次代謝産物生産能の解析……………………………………… 内田

龍児

123

ダイズ根粒菌の生態学的特性と環境因子による群集構造の構築および亜酸化窒素発生抑制に関する研究……………………… 佐伯

雄一

124

嫌気的湖沼環境に潜む菌類様初期真核微生物群の多様性解明と培養への挑戦………………………………………………………… 長濱

統彦

125

メタゲノム解析及び生元素の安定同位体解析を用いた温泉バイオマットにおける微生物群集構造と代謝の化学的特徴付け………… 中川麻悠子

126

海洋性菌類の生態に関する研究…………………………………………………… 澤山

茂樹

127

上部消化管内優勢乳酸桿菌種のペプチド要求性に関する研究………………… 荒川

健佑

127

中枢代謝，ATP 生産能，蛋白質発現量を強化した微生物宿主による
有用ポリケタイドの発酵生産……………………………………………………… 鮒

信学

128

単一バクテリア内 ATP の絶対濃度計測法によるエネルギー代謝と増殖の解析……………………………………………………… 今村

博臣

129

大腸菌におけるメタボリックスイッチ制御機構の解明………………………… 島田

友裕

130

シロアリ消化管内共生バクテリアによる木質分解機構………………………… 徳田岳

130

微生物による有機物の化学エネルギーから電気エネルギーへの変換能力解明に向けた基礎的研究………………………………………………… 井上

謙吾

131

カビの細胞内レドックス変化に応答したエピジェネティック制御による遺伝子発現調節機構の解明………………………………………………………… 志水

元亨

132

過酷な生育環境から単離された微細藻類がもつ新奇な有用機能に関する研究……………………………………………………… 川﨑

信治

133

イノシトール遊離能をもつ細菌由来フィターゼ：Klebsiella pneumoniae 9-3B 株由来フィターゼの解析と新規フィターゼの開発……………………………………………………………… 曾根

輝雄

133

CO2 から石油を高生産するシアノバクテリア株コレクションの構築 ………… 寺本

真紀

134

第 3 の生体運動，戦車のように動くバクテリアの運動メカニズム ………… 中根

大介

135

白色腐朽菌の順遺伝学：
担子菌特有の酸化酵素の分泌メカニズムの理解にむけて……………………… 中沢

威人

136

細菌毒素を認識する RNA アプタマーの創製と検査，診断および治療への応用………………………………………………………………… 伊藤佐生智136

医学・農学的応用を見据えた細胞膜脂質非対称センサーの分子解剖及びエンジニアリング…………………………………………………… 小原

圭介

137

微生物が持つ高次機能の解析：
大規模ゲノム操作技術が拓く新たな遺伝子工学………………………………… 柿澤

茂行

138

酵母を利用した翻訳過程不全によるミトコンドリア病の分子メカニズムの研究……………………………………………………………… 行木

信一

139

組織血液型決定抗原様物質を保持する腸内細菌がヒトノロウイルスの環境中動態に与える影響の解明…………………………… 佐野

大輔

139

大腸菌縮小ゲノムシステムによる潜在的必須遺伝子群の同定解析と合成生物学的手法による「光合成大腸菌」の作製……………………………… 加藤

潤一

140

バクテリアの無機炭素濃縮機構とポリアミンの関わり………………………… 安元

剛141

プロテオーム解析法を用いた未分化能を有する
歯肉上皮系前駆細胞における歯周病菌産生毒素の標的膜タンパク質の探索…………………………………………………………… 中山

真彰

142

丈典

143

■ 平成25年度若手研究者助成
鉄酸化細菌によるアスベスト分解メカニズムの解明と応用…………………… 石田

IFO Res.Commun. 30
1-16, 2016

発酵研究所の活動−発酵研究所を継いだ人たち（1995.4〜2001.3）−

発酵研究所の活動−発酵研究所を継いだ人たち（1995.4〜2001.3）−
竹

内

昌

男

プロローグ

1994年，発酵研究所は設立から50周年を迎えた．その活地球上の多種多様な環境の下に多種多様な微生物が生年記念号）に記されている．ここまで 5 人の所長が研究息しており，人類はそれらを巧みに利用してきた．微生所をつないだ．IFO の設立から1975年までの活動記録は物が生物資源 として意義づけられたのは，1800年代，

長谷川武治氏2）が，1976年から1989年までは飯島貞二氏

ヨーロッパの王立機関が微生物を単離し保存する事業をが4），その後1995年までは長谷川徹氏が5），それぞれ残動の記録が IFO Research Communications vol.17（50周1）

始めたことに遡る ．それが現代まで collection としてしている．以下に述べる報告は1995年 4 月から2001年 3

継続し維持されてきたのは，微生物が人類の物的，知的月までの IFO の活動の記録であり，（Ⅰ）生物資源保存

利益になりうる可能性が認識されていたことと，時代と活動のバックグランド，（Ⅱ）
IFO の事業，（Ⅲ）発酵研究

ともに進歩する科学的手法に基づいた微生物の特性化が所の生物資源保存事業を取り巻く状況，などについて記あったからである．collection の質を高めるには，分子載する．また，継続的な財団運営には，IFO の経済的側

生物学を基本とした微生物の科学的特性を明らかにし，面と武田薬品から受けてきた経済的なサポートについて

研究者本人の努力は勿論であるが，多くの研究者 com-

も触れなければならない．これらのことを踏まえ，1995

munity の協力とその collection を経済的に支える環境が年 4 月（平成 7 年 4 月）から2001年 3 月（平成13年 3 月）

不可欠である．発展し続ける生命科学の研究を支えるた

まで研究所の運営の一部を担当した者として7, 8, 9），そのめには，微生物を含む生物資源の質の高い生物資源保存

期間に IFO の活動に携わった研究者たちにフォーカス

機関（Culture Collection）が必要である．生物資源保存をあてて，IFO の活動の歴史の一時期を記述する．

2）

機関は保存した生物資源を研究者に分譲する機関であ

生物資源保存活動のバックグランド

る．研究者に研究材料として提供するには信頼できうる
高品質の生物資源であることが求められる．
1990年までの世界の Culture Collection の活動については，前任者らの詳しい記載がある

1）Public Culture Collection としての IFO．それらの報Public Culture Collection は日本語の公的保存機関に告によると国内では1960年代まで財団法人発酵研究所

あたる．ここで言う public culture collection とはその生（Institute for Fermentation, Osaka（IFO））が唯一の pub-

物資源保存機関の主な業務である生物資源の収集・品質

lic culture collection（公的生物資源保存機関）であった．

管理・保存・分譲が保存機関の外部の利用者（研究者）に

これらの機関の活動の規模と信頼性を示す指標として，衡平に行うことである6）．経済的支援を受けている組織・一般の研究者に分譲した生物資源の分譲数がある．世界研究者に分譲を優遇してはいけない制約がある．IFO ののトップレベルは米国の American Type Culture Collec-

運営はこれにあたる．一方，private culture collection はtion（ATCC）， オ ラ ン ダ の Centraalbureau voor Schim-

私的保存機関で，当該保存機関が属している上部組織やmelcultures（CBS），そして日本の IFO であった．1970

経済的支援を受けている組織に分譲などのサービスを優

年以降，国内では国が膨大な予算によって生物資源保存

遇することは随意である．

2, 3, 4, 5）機関を整備しようとしたにもかかわらず，2000年代まで
IFO が分譲数でトップを保っていた．その理由はいくつ

2）生物資源保存活動の継続性

かある．一つには，IFO の活動に多くの学者の意見が反生物資源保存機関の活動の指標として生物資源の保存

映されていた．それは，学術的な意見だけに限らず，運数とそれらの分譲数がよく用いられる．長谷川武治氏の営方針などの広範囲な意見が提案されていた．例えば，

報告2）によると，1960年頃，世界ではアメリカの ATCC

生物資源保存機関の活動におけるサービスの衡平性 ，が指標のトップの座にあり， 2 位がオランダの CBS で，

米国の ATCC のように民間組織であること，科学研究のIFO はその次にランクされていた．設立当時から2000年基盤となる事業であるにもかかわず，国の科学研究費なまでの約50年間の IFO の活動を振り返ると，発展できしの活動などを柱とする IFO の活動姿勢にまで及んだ．

た要因として 3 つ挙げることができる．まず活動の中心

6）

−1−

竹

内

となる有能な研究者が居ること，それを支える活動資金

昌男よりデータを消失してしまう危険もある．そこで，菌株を提供する個人または機関があること．さらにこの活動名と受け入れ日，IFO 番号などの最小限の情報を記録しをサポートする研究者集団がいること，などの条件が揃た紙書類の保管管理方式も併用してきた．IFO ではコンうことが鍵になる．オランダではデルフトの工科大学にピューターがどんなに発展し，情報がデータベース化さ設置されて発展したのは研究者集団のサポートが CBS

れても，この記録方式を継続した．飯島氏の報告に詳細の発展の基礎になった2）．ATCC は民間機関であるが，にも記載されている10）．IFO では受け入れた菌株にそれ

国立研究所・NIH の多額の研究費が投入されてきた．

ぞれの固有の IFO 番号を付けている．世界にただ一つ

また，活動が大きく発展するごとに，連邦政府や州政府の番号である．

などの公的機関が資金の援助をしてきた．しかしながら世界で初めてそれぞれの菌株を研究資源として価値あATCC は民間組織であり，政府とは無関係に独自に活動

ることを IFO 自ら表現したもので，将来継続的にこのしてきた．生物資源保存事業に対するオランダや米国の菌株の品質について責任を持っていることを意味する．

卓越した見識をうかがうことができる ．

すなわち，IFO 番号の付いた生物資源を使用した研究者

2）に対し，研究成果が再現性のあることを IFO が責任を
3）菌株保存番号（IFO 番号）の保管管理

持って保障することを意味する．研究論文の記述には生下図は IFO が受け入れた菌株の第一号が記載されたノートのページである．1941に記録が始まり，その後す物資源株名と並列に IFO 番号が付いているのは，このことを意味する．

べての受け入れ菌株には IFO 番号を着け，記録を続け，2000年までの数は約20冊にもなった．1980年以降，飯島

4）武田薬品工業㈱の経済的支援

貞二氏がコンピューターを使い情報の電子化を始めた．

生物資源保存機関は独立した経済的自立が困難であコンピューターを利用して記載するのは便利であるが，る．現在，世界最大の機関である米国の ATCC は民間組

常に機器が破損する危険がある．また，運用の間違いに織である（日本では ATCC が公的機関であるとしばしば

図1

IFO に最初に受け入れた菌株を記載したページ．1941年 Nakazawa の Beer yeast（Burton）菌株を受け入れた，と読み取れる．IFO 番号はまだ付けていない．

−2−

発酵研究所の活動−発酵研究所を継いだ人たち（1995.4〜2001.3）−

間違われる）．それゆえ，政府関係の世界会議，たとえば

誉教授），別府輝彦（東京大学名誉教授），岡見吉郎（財Organization for Economic Co-operation and Development

団法人微生物化学研究会理事），駒形和男（東大名誉教（OECD）の会議には米国の代表として ATCC は参加し授），らの先生方の熱弁が特に印象に残っている．先生ていない．組織運営も国・州の政府機関から完全に独立方は，生物資源保存事業の特質を国際的見地から見て，しているから，年間数10万株の分譲による分譲代金収入

国の研究機関よりも IFO のような民間の機関による運だけでは，経済的な運用は不可能である．そこには，米営が生物資源を利用する研究者にとって最適であると主国独自の運営形態があり，ATCC が発展する時期には，張していた．これは，IFO の所員にとってどんなに心強

必ず多額の公的資金が投入されていた．例えば，1960年

く感じたことであったか．

代以降 Stevenson が ATCC の責任者のときには連邦政府からの補助があり，また，1990年代にはメリーランド

5）武田薬品の人材支援と IFO の研究活動

州の Bethesda からバージニア州の Manassas に施設を

武田薬品・本社の人事部，経営企画部，経理部，総務移転した時には州政府から土地代を含め多額の無償援助

部，特許部との意見交換も頻繁に行われた．IFO の運営があった．米国には ATCC 以外にもいくつかの生物資

資金を援助してきた武田薬品では，その本社の経営会議

源保存機関があるが，政府行政機関はそれらにも必要に（会長，社長，副社長その他の取締役の出席）で IFO へ

応じて重点的に援助をしている．米政府の ATCC へのの経済的サポートに関し討議になることもあった．IFO

援助はこれだけではない．ATCC は NIH や他の政府機は武田薬品・研究所の施設を借用していたこともあり，

関の研究プロジェクトに生物資源保存機関として参加

研究者間の意見や技術交流が十分行える環境にあった．

し，生物資源の収集・品質管理・保存・分譲作業を分担

人事評価は武田薬品の評価法に従っていたが，武田薬品

することにより経済的収入を得ている．先に述べた2000

も変遷する時代に合わせて評価基準の見直しがあっ

年の OECD の会議でも話題になっていたが，世界中のた.それに従って IFO の人事評価法も見直された．武田

生物資源保存機関を列挙してみると，いわゆる経済的な薬品の全体の評価基準から見ると，IFO の業務は微生物

先進国は政府機関から独立している現状が報告されていを大量に培養して，それらを小分けし，分譲する業務とた．政府・一般社会・研究者社会によく理解されている

位置付けられた．しかし，IFO の業務はそのような単純一例が ATCC であると言える．

労働ではないことを主張した．微生物・細胞など生物資

ATCC の例を見ても明らかなように，生物資源保存機

源株は生物として絶えず変化する恐れがあるので，固有関を経済的に支えることができる外部組織の存在がこのの性状を備えた標準株を維持するには，高い専門知識と活動に不可欠である．ATCC と同様に IFO も武田薬品

技術が不可欠であり，それを応用できる人材の育成こそ工業㈱ならびに六代目武田長兵衛氏やその一族からの個が新たな生物資源の開発につながるからである．この主人的資産による多額の援助を受けて活動してきたこと

張を武田薬品の人事部は良く理解してくれた．このようは，これまでの報告書2, 4）にも記載されている．経済的にして得られた IFO の研究者の位置づけは，研究所のには毎年全面的に武田薬品に依存してきたにもかかわら運営にとって給与の面ではなく，IFO の事業に対する意ず，public culture collection としての性格・機能を長期識の面で大きい出来事であったと思う．
管理部門である事務長の役割は多義に渡ることから，間維持できたのには理由がある．各氏の報告書をご覧に末永なれば理解できるが，再度記載しておきたい．

格主席研究員を武田薬品から出向してもらった．

オーナーである武田薬品工業にとって，生物資源株のその後，経理の専門家である吉田正憲が，高丸龍二郎の保存事業は企業活動とは程遠いことから，IFO の事業は定年退職に伴って IFO に参加し，従来の佐藤邦子，塩企業の宣伝活動ではなく，企業利益の社会還元の一つと山邦子とともに経理・庶務・特許管理・データベースの考えられてきた．このことにより資金援助を続けてきた．

データ管理等の事務作業を補強した．このように，経済IFO の初代理事長である六代目武田長兵衛氏，二代目理的なサポートだけでなく，人事の面でも十分な支援を受事長の小西新兵衛氏および三代目理事長の森田桂は，けた．また，IFO の研究活動に対しても武田薬品には十共に IFO で開催された理事会・評議員会や講演会を通

分な理解を得ることができた．しかし1997年頃に，武田して，理事・評議員の先生方の忌憚のないご意見に快く

薬品は IFO への資金援助の削減を提案してきた．その耳を傾け，武田薬品の外部の研究者でしかも，国内外の理由として環境の大きな変化が2つあった．一つは1995

第一線で活躍されていた先生方との意見交流を盛んにさ年に起きた阪神淡路地震による研究所建物のダメージのれていたという．この関係は著者の担当していた期間でため武田薬品研究所の全面的な建て替えを検討していたも受け継がれていた．早石修（京都大学名誉教授），ことである．毎年 1 億7500万円の IFO への援助は大き田村學造（東京大学名誉教授），岡田善雄（大阪大学名

な負担であったからと思う．他の一つは，当時，文部省，

−3−

竹
表1

内

昌

男

研究発表数の経緯

表2

各年度の収入と支出

科学技術省，経済産業省や厚生省などが国の方針として
国際的に生物資源を収集・管理し，国の研究・産業の基盤となる研究資源の確保に力を入れつつあった．この社
会的背景の変化が武田薬品の決断に影響を及ぼしたと考えられた．しかし，実に感謝に尽きるが，武田薬品の姿
勢は変わりなく，2000年（平成12年度）までは同額の年活動している財団に対しても事業税（生物資源を国内の間 1 億7500万の寄付を続けて受けることができた．当時，基礎研究者に提供する業務が企業活動と同等の経済的活

IFO は国の種々研究機関から研究プロジェクトへの参加

動と見なした）が課されるようになった．財団運営の専の要請を受けた．IFO の研究実績や生物資源保存株につ門家の解説では，財団運営費における人件費の割合が70

いてのデータの蓄積および研究者の人材が国の事業を遂パーセント以上では運営が危機の状態にあり，継続的に行するのに魅力的であったからだと思う．これらの研究運営するためには少なくとも 60 % 以下に抑えることがプロジェクトに参画した IFO の各研究者には，生物資望ましいと，説明されていた．その意味では当財団は源の科学的な品質管理法の改善，定期的な報告書の提出，

1995，1996年が経済的に危機の状態であった（表 2 ）．

学会発表や論文発表，学会開催など年間の研究活動がこ

その後，公的研究費による補助が大きく寄与したためれまでにないほど大きな使命になり，大きな負担を掛け1998年から経済的に改善された．そのプロジェクトの内ることになった．しかし，懸命な対応の成果が表に示し容については後述する．

たとおりである（表 1 ）．

IFO の事業

6）IFO の経済状況
IFO の事業は事務部門を含み 6 部門にわかれていた．

1）国内保存機関の生物資源株の収集・保存・品質管理・総員，約25名前後である．年間の運営費は約 3 億5,000

分譲万円であった（表 2 ）．収入のうち，菌株の分譲から約

日本微生物保存連盟（JFCC）に所属する国内の生物

7,000万円でほぼ毎年一定である．寄付金（武田薬品か

資源保存機関の1998年の年間実績を一部改訂して表 3 にらの毎年約 1 億7,500万円の寄付金や基本財産からの利示した11）．当時 IFO から利用された生物資源株（微生子収入等）は約 2 億2,000万円，それと公的機関からの物株と動物細胞株等を含む）は8,900株である．現在（2015

研究費が数千万円あった．これらの収入に対し，人件費年）でも，この実績数に匹敵する他の国内機関はなさそ

2 億2,000万円，実験費と施設使用代（光熱費，武田薬うである．生物資源の保存数だけをみれば，IFO より大品からの実験室使用代を含む）約6,000万円であった．

きい機関はある．保存数が大きいことは，その機関は，

1999年，2000年の支出の変動は知的財産の拡充を目指し研究者が必要に応じて多いだけの対応ができるはずであたプロジェクトの実施のために国の研究費補助を受けた

る．しかし，保存数の多い機関が分譲数が多いとは限らからである．

ない結果がでている（表 3 ，太字）．当該保存機関に所これについては後述する．この表 2 からも分かるよう属している以外の研究者が利用できる程度の品質が保たに， 1 人当たりの支出が1,700万円弱である．この額はれていないことが，その原因の一つであろう．大学に設当時の私立大学の研究者あたりの運営費に相当する．

置された保存機関では，外部研究者の使用に対応できる

1990年頃から日本経済が下降していた時期であり，当時，程の品質管理に費やす時間はまず無いであろう．IFO は

幾つかの国内の公益財団の解散を耳にした時期でもあ

資金援助機関にだけ利用し易い保存機関ではない．国内

る．さらに，この時期は国の税制も変更された．消費税外のいずれの研究者にも衡平な6）条件での運用が IFO のだけでなく，IFO のように公益性が高く，しかも寄付金

基本姿勢であり1），また特に厳しい品質管理への信頼が（寄付金が免税対象であったのは昔の話である）により膨大な分譲数に反映している．

−4−

発酵研究所の活動
表3−発酵研究所を継いだ人たち（1995.4〜2001.3）−

1998年度の国内の主な生物資源保存機関の実績11）

表4

各年度に保存した生物資源数と分譲数の推移

2）IFO における 5 年間の生物資源株の保存と分譲
特許寄託株は法定に従い保管管理し，International
Streptomyces Project（ISP）株の管理は日本放線菌学会の所定の委員会と共同で実施した．生物資源株について，
表 4 に記載した通り，保存株総数は 6 年間で1,000株程度増えたが，分譲数は殆ど変動なく，高い数値を推移した（表 4 ）．微生物株については，分類学上の命名を見直し，新種の記載などを IFO Research Communications,
各種の専門の Journal や IFO List of Cultureなどに明記
し，研究者の利用に供した．
また，動物細胞株については，2000年 3 月末に特許寄託株保存事業以外のバンク事業を終了し，ヒューマンサ

的知識に長けている担当者に育てる伝統があった．IFO

イエンス振興財団に移管したので，後で少し詳しく記載には年間約1,000件近い問い合わせがあり，それらに科する．

学的に適切に対応している．IFO には細菌類，酵母菌，
糸状菌，放線菌，動物細胞などの部門があり，各微生物

3） 3 人のキューレーター

部門はそれぞれ各数千種にも及ぶ微生物株を担当した．

欧米の博物館にはキューレーターと言って各保存品にIFO では専門的な知識と技術を持つ研究者を育成するた精通している研究者がいる．国内の博物館などでは最近，

めに大学でも，企業でも類を見ない人材育成を行ってき

学芸員という専門職名で紹介されることがある．生物資た．時期を越えて多くの担当者が育っていった3, 4）．こ源保存機関においても，分類学・細胞学・保存学・生息

こでは紙面の都合で 3 人のキューレーターに限って述べ

域状況などを含めた保存株の特質について，一般の研究

たい．IFO には，上述したように分類および保存の都合者と同等な知識を持ち，外部の専門の研究者と議論がで上（科学的な理由はあると思っている），酵母グループ（Ｇきる担当者のことをキューレーターと称し，このようなと略す）には見方洪三郎，細菌Ｇには坂根人が常駐することがその保存機関の発展に重要な役割を

Ｇには伊藤忠義がそれぞれ担当した．L-乾燥法の確立へ果たす．IFO では入所後，10年から20年をかけて，専門の寄与により，坂根

−5−

健，糸状菌

健に日本微生物資源学会から研究

竹

内

昌

男

ISP 標準株を担当していた西井忠止や，長谷川建夫，黒島健一などが在籍していた．これらの研究者の共通している活動のスタンドポイントは，ユーザーのクレームを良く聞き，それをユーザーの希望事項として対応したことである．これらのユーザーへの適切な対応が分譲数の増加にも繋がり，IFO は国内外の研究者コミュニテーからの信頼を継続して得ることができたのはこのような優れた研究者あってのことである．
1998年〜1999年頃，糸状菌を担当していた伊藤忠義はAspergillus 属に分類学的に所属する IFO 保存菌株の分類学的整理を行っていた．この Aspergillus 属に属する種
図2

は数百種が知られており，かび毒を生産する菌種も多い．
IFO に保存している Aspergillus 属の 2 菌株（Aspergillus

日本微生物資源学会の1997年度（平成19）技術賞

parasiticus IFO 30179; Aspergillus flavus IFO 30180）がア
フラトキシンを産生していることが判り，データベース
技術賞（1997年）が与えられた（図 2 ）．この技術は IFOに記録した．分類学的にはかび毒を産生するかどうかは，Aspergillus 属の重要な化学的分類指標であった．一方，の坂根豊が長年研究を続け

食品産業では古くから Aspergillus 属の菌を多くの発酵にた結果，確立した技術である ．微生物の長期保存法と利用してきた．発酵は清酒，味噌・醤油を製造する日本古

して広く世界の研究者に採用されている．
3 者とも共通していることは，入社してから退職する

来の大事な食文化の一つであるし，安全な食品であることは我々の実生活から証明されてきた．この Aspergillus

までの長期間，微生物資源の管理を担当したことと，保属でありながらトキシンを産生しないという分類学上の存と分譲の作業の能率化のため基盤的技術の改善に貢献

矛盾があった．その当時（1999年 3 月），千葉大学の西村したことである．さらに，その時代に即応した分類学を和子教授らを IFO にお招きし，講演をしていただいた．

マスターし，生物資源の利用を希望した研究者に常に同教授らの話では，トキシン遺伝子の解析結果から遺伝子一品質の微生物試料を分譲することに努力した．分類学に変異があり，トキシンの ｍRNA が産生されていないが進歩するにつれ保存している微生物株の学術名も変化していく．見方洪三郎は IFO に保存している酵母株をことをみつけたとのことであった．その後，Aspergillus
olyzae のアフラトキシン生合成遺伝子が機能していない

新しい分類基準に従って再分類し，その結果を学会誌，ことによってトキシンが合成されてないことが分かった13），

健，坂野勲および坂本12）

IFO Research Communications や List of Cultures に記載

なお，このトキシン遺伝子を解析した際,世界の生物資した．微生物乾燥標品を自動的にアンプルに保存日を印

源 保 存 機 関 が 提 供 し た 数 多 く の Aspergillus 菌 株 が 役

字して封入し，4 ℃ で保存するシステムを構築し，約20立ったことを明記しておきたい．

万本の資源株を整理した．このシステムは後に，国の機関でも採用され，運用されている．カビ・糸状菌の分類

4）動物細胞株の移動と保存を担当した伊藤忠義は最新の分類基準に合わせて時代を遡るが，IFO が動物細胞株の保存事業を始めた

数百の保存株を再分類した．糸状菌の寄生した植物標本のは，1984年である．生命科学の急速な発展が企業の活（Herbarium）を管理し，国内外の分類学の研究者の利動にも影響を与え，知的財産である特許の取得の必要が用に供した．湿度と温度を一定に管理し，定期的に標本生じてきた．その特許申請の保証品として，公的に認定を挟んでいる濾紙を取り換える地味な作業であるが，こされた保存機関に動物細胞を寄託しなければならなくの標本群は植物病理学上重要な標本になっているので，なった．国内では該当する機関がなく，海外の ATCC

海外の研究者からの利用もある．

かパスツール研究所に送付する必要があった．その輸送

見方洪三郎，坂根健および伊藤忠義はそれぞれ保存し費等には約数百万円必要であるため，企業の負担が大きていた微生物株の性質を精査し，それらの結果を IFO

かった．そこで，IFO はヨーロッパ特許庁（EPO）からResearch Communications の各号に英文で記載している

微生物の特許寄託の保存機関として承認されていたのので，海外からの記述の問い合わせにも対応している．

で，書類審査の結果，動物細胞の保存機関としても承認

いつかは，PDF 化されて，ネットで検索される日も来を受けることができた．2000年までに約200株の培養細るであろう．IFO には，このようなタイプの研究者は胞株を特許寄託株として保存した．

−6−

発酵研究所の活動−発酵研究所を継いだ人たち（1995.4〜2001.3）−

動物細胞株も微生物株と同様に厳しい品質管理が要求の細胞株（AP-16 IFO 50424, MA-89 IFO 50293）を樹立し,される．特に他の細胞混入の汚染には細心の注意が必要

細胞バンクに登録した．中垣内弓子はマウス脳神経幹細である．動物培養細胞の汚染で多いのはマイコプラズマ胞株（MEB5 IFO 50472），竹内昌男はマウス脳グリア細汚染である．図 3 はマイコプラズマに汚染された CKT-1

胞株（KT-5 IFO 50161）を樹立した．佐藤元信は mouse（IFO 50003）細胞の走査電子顕微鏡像である．吉田東歩

olfactory cell（DBC1.2 IFO 50484）を初めて単離し，まの研究課題であり，この写真は当時の朝日新聞に掲載さた既存の細胞株に生化学的なマーカーを入れた細胞株れたものである．1993年われわれは国内の主な研究機関（Neuro-2aTG IFO 50495, PC-12TG IFO 50496）を樹立し，で使用している培養細胞のマイコプラズマ汚染を調査しバンクに登録した．久野晴彦16）や辻

た．結果は驚いたことに約 50 % がマイコプラズマに汚質を精査した結果を論文に発表した．黒田（現姓，岡田）

染されていた14）．その後，日本組織培養学会が中心とな暁子は多くの図表と表紙のイラストやカタログの装丁なり，国内研究者にマイコプラズマ汚染の実情を訴えるどに携わった．多くの細胞株が細胞バンクのリストに記

キャンペーンを展開し，マイコプラズマに汚染していな載できたのは，これらの人たちの熱意に満ちた研究の賜

い培養細胞や，由来動物種の同定された細胞株のみを分物である．

憲吾は細胞株の性譲することが国内の主要な細胞バンクの品質管理の原則

2001年 3 月，厚生省からの要請により，分譲可能な細となった．このように我々の汚染検査は誤った研究結果

胞株，約250株はヒューマンサイエンス振興財団の動物を食い止めるのに大いに貢献した．マイコプラズマ汚染

細胞バンクに移動した17）．IFO 番号を付けたまま，ヒュー細胞の論文掲載の中止や，汚染細胞を用いたために研究

マンサイエンス研究資源バンクから世界の研究者に分譲

プロジェクトが中止になった例もある．汚染検査のもうすることになった．この移設に関しては，ヒューマンサ

一つの重要な項目に細胞の由来動物種の同定である．こイエンス振興財団の竹中浩治理事長と神崎俊彦専務理事の件でも忘れることが出来ないことがあった．大きな学の尽力による．特許寄託株については，30年間発酵研究

術賞を受けた論文に記載されたヒト細胞株が，依頼を受所が保管する責任があるので，末永けた我々の検査結果からヒトではなく，ハムスター細胞保管を継続し，同時にそれまでの特許寄託・保管業務関由来であることを判明し，その研究結果は学術界から抹係の書類を全て整理した．

格が責任者として消されることになった（和光純薬の会報にコラムとして4 回掲載）．これらのことから細胞バンクは言うまでも5）受賞なく，研究者自らも不十分な品質管理は研究生命までも奪ってしまうことを肝に銘じなければならない ．

国内の学会から表彰された事例を報告する（表 5 ）．
IFO の事業は最先端の研究を支え，基盤となる，地味な

15）

動物細胞部門を設立してから16年間の活動の中でいく仕事である．このような表彰は，本人にとってももちろ

つかの新規の細胞株を樹立した．吉田東歩は脳組織関係

んのこと研究所にとっても大きな誇りであり，財産でもある．
坂根健の業績についは既に記載した．中桐昭は糸状菌の分類学の専門家である．特に，汽水領域に生息するマングローブ群生林に寄生する糸状菌を海岸，河川域など広範囲の地域から単離し，多くの新種を発見した．それ
ら糸状菌の生活環を明らかにした．田村朋彦は国内各地
や中国の土壌から放線菌を多数単離し，多くの新種を発見した．伊藤忠義はマングローブ生息域や国内各地の燃
焼した土壌から多数の糸状菌を単離し，分類学的研究を行った．これらの研究が評価された．

表5
図3

Mycoplasma hyorhinis に汚染した CKT-1 細胞．（A）非汚染細胞（B）マイコプラズマに汚染した細胞．吉田東歩が撮影した．当時の朝日新聞の科学欄に掲載された原画を
修正した．

−7−

1995年から1999までの受賞

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男

年にカプセルは再び開封される（図 4 ）．その時，だれが，6）タイムカプセル
1970に開催された大阪万国博覧会（EXPO70）のイベン

これらの菌株の生存試験を行う幸運を掴むのだろう．そトのひとつとして生活文化の記録保存を行った．図 4Aの時，担当研究者が100年以上も前の我々の感動と同じに示すように Time Capsule EXPO ʼ70 ｢記録書｣ に記載

喜びを味わうことであろう．

されているが，「生物資源の生命体の保存とその情報の保存の象徴」とも言われた18）．飯島貞二の記録（発酵研7）研究プロジェクトでの活躍

究所の歴史）には発酵研究所の役割について記述されて文部省，科学技術庁，厚生省や経済産業省などの公的いる4）．当時国内の研究室で長期保存可能となっていた

研究費による研究や，日本放線菌学会の ISP 菌株の保存10種類以上の微生物株を国内の各担当研究室で調製し，事業など，研究所の所員は多くの研究班に参加し，活躍

アンプルに封入し，それらの標品を特製カプセルの中にした（表 6 ）．

保存した．それから30年後の2000年にカプセル内で保存

表 6 は研究所の所員全員が参加した通産省，科学技術していたアンプルから各微生物株を取り出して，生存の庁などの研究プロジェクトである．ここでは1997から有無を調べた．その結果は発酵研究所が担当していた 3

2000まで行った文科省・科学研究費による保存株のデー

微生物株（コウジカビ IFO 4290，納豆菌 IFO 13169，あタベース作製事業と経済産業省の新エネルギー・産業技

おかび IFO 5754）だけの生存を確認することができた．

術総合開発機構（NEDO）による情報管理システムの構

武内真理子，伊藤忠義がそれぞれ細菌株と糸状菌を担当

築事業について，述べる．このプロジェクトの目的はしたものである．これによって，1970年当時，発酵研究

IFOBRDB を構築するだけでなく，フィールドワークに所で開発し，微生物の保存・分譲に運用していた L-乾燥よる菌叢の解析や単離した新菌種の微生物株を法は微生物の長期保存 に優れているということが見事

IFOBRDB に登録し，また，構築した IFOBRDB に収容に実証された．この30年の眠りから起こされ，再び培養された情報を利用することにより IFOBRDB の有効性をされたこうじ菌から小西酒造㈱が日本酒を醸造し，タイ

検証することにある．これらのプロジェクトの内容は 4

ムカプセル記念パーテー（2000.11.23）の席上で参加者，つに分類される．① IFO 所内に保存している全ての菌

数百人にこのお酒が振る舞われた．伊藤忠義と共にパー株についてのデータをデータベース（IFOBRDB）化する．

テイに参加し，1970に嗜まれていた清酒の味を2000年に②データベース（IFOBRDB）の利用方法として，a）菌も再び味わえた感動は，長期保存技術の成功とともに格株の検索のシステムの試作，b）IFOBRDB から保存資源

別のものであった．科学的には，1970に作製した微生物の自動カタログの作成，c）外部の保存機関と on line で株の生物学的性質が30年間保存されたことになる．IFO

接続し菌株のデータベースを相互利用可能なシステムのの生物資源保存機関として運用していた微生物保存株の構築，などがある．③海外の生物資源保存機関との共同

品質管理の信頼性を科学的に証明したことになる．この研究による収集システムの検証．④海外の生物資源保存

社会的貢献が，何にも優る出来事であった．次回，2100

機関の情報収集．以下，それぞれについて少し詳しく記

12）

載したい．
7-1）IFO Biological Resources Data Base（IFOBRDB）の作製
本プロジェクトは文部省 MEXT と通産省 NEDO から
3 年間で総額約 1 億6000万円の資金援助と IFO の予算で実施した．当時は Windows 95 が開発されて，これに関連したコンピュータソフトウエアが盛んに開発されていた．従来の DOS のコマンドから開放されつつあった時期でもある．国内には生物資源の汎用性の高いデータベースを本格的に構築した生物資源保存機関がなかった．
IFO では1980年代から，飯島貞二，坂野

勲氏らが生

物資源の情報をノート記載（Fig. 1）からコンピューターに よ る 電 子 化 を 開 始 し て い た10）． ヨ ー ロ ッ パ 特 許 庁（EPO）の特許寄託株を保管していたこともあり，情報のセキュリテーの観点からも電子ファイルの管理が必要で
図4

タイムカプセル事業の2000年時の報告書（A）とカプセルに再び包埋された 3 種の菌株（B）．

あった．その後，佐藤邦子が引き継ぎ AS400（IBM 製）を運用していた．今回のプロジェクトでは，セキュリテー性−8−

発酵研究所の活動
表6−発酵研究所を継いだ人たち（1995.4〜2001.3）−

1995年度から2000年度まで導入した主な研究費能の高い AS400 と汎用性の高い PC を併用し，研究所にIFO の 希 望 を 理 解 と 熱 意 で も っ て 受 け て く だ さ っ た

保管している16,235株についての生物資源情報を一括管IBM の担当グループがあってのことである．感謝にた

理 可 能 な デ ー タ ベ ー ス（IFOBRDB）を 構 築 し た（ 図えない．後になって，担当者の一人であるプログラム専

5A）．微生物株は中桐門の野尻逸予氏が IFOBRDB を作成に寄与した功績によ

昭，西村久美子，中川恭好，田村朋彦など，動物細胞株は佐藤元信，特許株には佐藤邦り，IBM 社から社内表彰された，と聞いた．

子などが全所員の希望を採り入れた基本設計を作成する

このデータベースの運用の一環として，データのため，データベースの「要件定義」について IBM 担当

output 機能を使いカタログ作成を自動化した．Microor-

者と半年以上かけて相談し， 2 年近くの年月を経て IF-

ganisms –第11版（2001）とAnimal cells –第 6 版（2000）

OBRDB を完成させた9）．

はこの IFOBRDB から作成した（Fig. 6）．ハードコピー

7-2）IFOBRDB の運用のカタログの他，検索機能の優れた CD-ROM も作製し，所内の作業は従来複数個の PC で保管していたデータ

ハードコピーに添付して国内外の研究者に配布した．

のすべてを IFOBRDB に収納することから始まり，新規

Output 機能の利用のもう一つは外部研究者から生物資

データのインプットと保存データの修正後，完成した

源株の最新の情報を検索閲覧できるように構築すること

DB を閲覧，印刷することなどである．各グループのデーである．各組織や機関ではインターネットを通して，各タ記載内容にはそれぞれ特徴がある．細菌のように性質

組織の活動状況を real time で世界に発信し，それらをを数値化，アルファベット化し易い分野と酵母，糸状菌

外部から閲覧可能になり始めた時代である．ホームペーのような形態の記載が重要である分野がある．培養細胞

ジ（HP）を持っていない組織は家 ｢ホーム｣ を持っていなも後者の部類に入る．IFOBRDB のデザインから運用がいのと同等な意味である，と冗談で言われていた．IFO

始まるまで，実に 2 年がかりの大仕事だったが，これまにとって外部の人に組織の活動内容を知らせるもっともでのすべての記録を同一 DB に収容できたことは業務の速やかな方法の 1 つでもある．IFOBRDB から作成した情運用におおきな力になり，次なる発展を感じた．これも報の一部を1998年，試験的に Nacsis のサーバー（http://

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図 5 IFOBRDB と所内ネットワークの構成
A. システム構成 B. IFOのホームページ C. 生物資源株の検索システム
D. 放線菌群の分類学用データベースの検索モデル

www.soc.nacsis.ac.jp/ifo/index.html）から発信した．そ状菌グループ）が試料採取に参加した．研究所に持ち帰っの後，2000年に IFO ホームページ（http://www.ifo.or.jp）て，杉本美香，西井忠止など加わり，まさに所員全員でを作成し，IFO が独自に情報を発信した（図 5B）．さら微生物株の単離，品質管理を行うことにより，多数の新に，データベースの情報はデータの新規登録，訂正を遠種の発見ができた．その成果を IFO Research Communi-

隔地で行ったり，複数の研究機関で情報の共有するバー

cations や関係する Journal に記載した．このフィールド

チャルな DB（CORBA と言って，複数の DB サーバー

ワークの経験を活かして，タイ国の研究者と共同でタイをあたかも一か所にある一個のサーバーと見えるような国のフィールドワークを行った．IFO の糸状菌グループ

DB サーバー）の作成を国立遺伝学研究所の菅原秀明教の中桐授と共同で構築した19）．

イ・カセサート大，タイ・Biotech）と「熱帯マングロー

昭，伊藤忠義，岡根泉らが Leica Manoch（タこのようにして生物資源に関する情報を DB 管理したブ域に生息する微生物に関する共同研究」を実施した．

が，さらに，生物資源保存機関として重要な情報管理は

多くの新種を発見し，これらを IFOBRDB に登録した．

保存資源の在庫管理である．所内には約20万アンプルの7-4）海外の保存機関（米国 ATCC および NRRL）の視察

生物資源株が保管されている．L 乾燥品の作成法，印字

生物資源保存事業における IFO の役割と将来の発展

法，アンプル収納・保管方法を改良し，この保管庫の管のため，他機関を見学・調査し，IFO の活動と比較検討

理を含めた在庫管理とそのデータを IFOBRDB の中で一することが一つの指針を与える場合がある．当該事業の括管理できるようにシステム化した．これにより，正確

先 人 の 一 つ と 認 め ら れ て い る 米 国 の American Typeな分譲作業がスムースに実施できるようになった．

Culture Collection（ATCC）（R. Hay, S-C. Jong）,NRRL（C.

7-3）タイ・カセサート大との共同研究

Kurtzman, D.P. Labeda），や Coriell Institute for Medical

沖縄西表島でのフィールドワークを糸状菌グループのResearch（CIMR），National Disease Research Inter-昭が主体となって毎年実施してきた．それを IFO

change（NDRI）などの研究所を見学し，IFO の今後の全体のプロジェクトと位置づけて，田村朋彦（放線菌グ活動の参考とした．それぞれの機関の運営及び活動が独ループ），中川恭好，内野圭仁（細菌グループ），見方洪

創的であり，生物資源保存事業が着実に発展しているこ三郎（酵母グループ），伊藤忠義，中桐とが判った．また，これらの研究機関は米国政府の資金

中桐

昭，岡根

泉（糸

− 10 −

発酵研究所の活動−発酵研究所を継いだ人たち（1995.4〜2001.3）−

援助を受けているが，政府の行政機構から独立した運営

9）国内研究会の開催および外部研究者との交流

国際形態が保たれているようだ．詳細は波多野和徳，吉田東学会・会議への参加

歩の報告書に記載されている（1998. 9, 波多野和徳，吉1995〜2000年の間 IFO の主催での学会の開催は，日
本微生物資源学会年会（1998），第16回微生物化学分類

田東歩の私信）．

研究会（1996.11），日本組織培養学会シンポジュウム「神経細胞の発生・分化・機能の解析」（1997.11）であった．

8）出版物
隔年ごと，IFO Research Communications を発行した．

口頭・ポスター発表（海外を含む）と論文発表の総数

各 2 年間の活動の総括や，所内での生物資源の単離や分は表 1 に記載した．国際学会などへの参加は，竹内昌男

類学的研究などの original reports を記載した．研究所

が WFCC の理事会のため，伊藤忠義が研究発表のためを紹介する英文・和文パンフレットを随時，カタログ

ICCC-8（オランダ，平成 8 年）へ，竹内昌男，波多野（ハードコピー，及び一部 CD-ROM）は約 3 年ごとに発和徳，中川恭好が研究発表のため ICCC-9（オーストラ

行した．主な出版物は以下のようである．②，③についリア・ブリスべーン，平成12年）などである．国際会議ては，Fig. 6 に示した．

として竹内昌男，波多野和徳が OECD の会合に（フラ① IFO Res. Commun. 17, 1995; 18, 1997; 19, 1999; 20,

ンス，平成12年），その他，竹内昌男が台湾食品工業発展研究所（台湾，新竹，1999）へ，田村朋彦が中国へ，

2001.
② LIST OF CULTURES, MICROORGANISMS, 10th ed.

武内真理子が韓国へ，各国の研究者との会合に出席した．

1996; 11th ed. 2001.
③ LIST OF CULTURES, ANIMAL CELL LINES, 5th ed.

10）国内外からの来訪者
1995.4（平成13年度）〜2001.3（平成18年度），国内外から1997; 6th ed. 2000.
④ Institute for Fermentation, Osaka (English Leaflet)

研究者を含む多数の来訪者があり，講演および情報交換を行った．国外来訪者の一部の方々は以下の通りである．

1995; 2000.
⑤ 財団法人発酵研究所（和文リーフレット）1995; 2000.

① Dr. L. Manoch (Kasetsar t Univ.), M. Tanticharoen(NCGEB), P. Pitakpaivann (Dept. Agriculture), P.
Atthasampunna, W. Potacharoen, and V. Arunpairojana,
and A. Mahakhant, (Thailand Institute of Scientific andTechnological Research), Thailand② Dr. C. Kurtzman (NRRL), R.J. Hay (American Type
Culture Collection) and Dr.T. Myoda (Rockland), M.C.
Aime (Virginia Polytechnic and State Univ.), U.S.A.
③ Dr. N.L. Dung, P. Van Ty, T.B. Thuanand and N.T.
Thanh (Hanoi Univ.), Vietnam④ Dr. D. -H, Lee (Forestry Research Institute), J.-D. Lee(Pusan Univ.), Y.-H. Park, Y.-K. Sim (KCTC), J. -H. Yu(Yonsei Univ.) and S.-K. Kim (Souzan National Univ.),
Korea⑤ Dr. I. Gandjar, M. Asturi (Univ. of Indonesia), and P.
Lisdiyanti (Indonesia Institute of Science), Indonesia⑥ Dr. K. Kerstern, P.A.R. Vandamme), and J. Swings(Univ. Ghent), Belgium⑦ Dr. C-Y. Chen (Culture Collection and Research Center)
Taiwan⑧ Dr. M. Guangzhen and Z. Peijin (China Academy of

図6

A. カタログ類．左からList of Culture, Microorganisms
10th ed. 1996; 11th ed. 2000, List of Cultures, Animal cellLines, 5th ed. 1996; 6th ed. 2001.
B. CD-ROM Catalog, List of Cultures, Microorganisms
11th ed. 2000.

Sciences) China⑨ Dr. J-F. Bernardet (Centre de echerches INRA) France⑩ Dr. J. Kaiser (Max-Plank Institute) Germany⑪ S. Vikineswar y (Univ. Malaya) and C. Nyor ya, S.A.

− 11 −

Alias (Univ. Malaysia), Malaysia

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HS は大阪泉南地区に建物をつくったが，運営形⑫ R.A. Grzybowski (Inst. Agricultural food and Biotech-

態はどのようになるのか．特に，IFO との関係とnology), Poland

その他の Culture Collection の活動とのバランスを⑬ L-M. Branchini (Univ. Campinas), Brazil

どのように調整する計画か．

⑭ G.D. Castro-Bernas (Philipin Univ.), Philipin.J. Lehocki（ 4 ）ＳＮ理事：(NCIAM), Hungary

ここで表示された通産省・BRC 構想の中に，IFO が BRC 機関に矢印で示しているが，⑮ H. Prilinger (Univ. Bodenkultur), Austria

これは IFO が通産省 BRC に取り込まれることを

発酵研究所の生物資源保存事業を取り巻く状況示しているのか．微生物 Culture Collection はそれ
ぞれ特色を持って発展してきた．通産省の BRC は
どのような特色を保持する機関を想定し，その具国内の生物資源保存事業の状況の変化に伴い，IFO も体的な方針はなにか．

対応にせまわれた．特記すべき下記の 2 項目について記（ 5 ）ＴＮ評議員：

載する．

大阪泉南地区に細胞・遺伝子・ヒト組織・胚のバンク機能を持つ組織を建設した．
1）発酵研究所の生物資源保存事業を取り巻く状況に対2000年 9 月に建物を完成，2001年から運営， 3 年する意見交換後からは，独立して運営する予定であり．今後も当財団の2000年 3 月の理事会・評議員会の終了後，最IFO の技術的支援をお願いしたい．

近の通産省で構想している Biological Resources Center（ 6 ）ＳＮ理事：

IFO の研究計画の中に，ヒト脳神経

幹細胞の樹立とあるが，法的問題はクリアしてい（BRC）について意見交換を行った（2000.3.16）．冒頭，
「通

るのか．

産省 BRC 構想」に関するメモが配布された．その会合（ 7 ）ＴＵ理事：の要旨を記載する．

海外から入手し，予備的実験を進めている．国内の材料については，インフォームド―【通産省 BRC 構想】に関する㈶発酵研究所

コンセント等，倫理規定に遵守して得られた試料

理事・監事・評議員による自由意見の要旨―の入手が当面の課題である．

本日，国家プロジェクトとしての通産省 BRC 構想に（ 8 ）ＦＮ理事：

タケダの経営企画部で検討した際，ついての解説をお聞きし，発酵研究所の今後の活動を進

動物細胞 G の運営に経費がかかり過ぎて，IFO のめていくためにも大変参考になる内容であったと思いま

運営を悪化させたと指摘されいている．また，タす．理事・評議員の方々には，懇親会開催までのしばら

ケダ側の立場から発言すると，「武田が永久的にくの時間を自由な意見交換の機会としたいと存じます．

IFO を支援する」という約束はできない．
（ 9 ）ＳＮ理事：

先生方の忌憚のない御意見をお願い致します．
（ 1 ）ＩＪ理事：

動物 G の設立の際，タケダからそれ

IFO の運営にとって職員の採用の仕なりの資金を投入したはずである．（注：1984年に組みを作ったことは意義がある．しかし，①事業

動物 G が IFO にできたが，その際4,500万円を追所開設に伴い事務業務の負担が大きくならないか．

加して 1 億7,500万円を毎年寄付されることになっ②タケダからの出向者との労働条件の違いによる

た．1984年以来継続している．また，経営に影響

研究所の運営に影響がないか．③職員採用に関すを与えないために1986年には基本財産として 2 億円をタケダから受けている．）

る，理事会の役割は？
（ 2 ）ＴＵ理事：①非常に大きい．しかし，研究者を（10）ＴＴ評議員：

バイオ産業とその発展を支える基確保することが研究所運営に急務である．②タケ

礎となる微生物 Culture Collection Center を考え

ダの出向者の報酬は実績主義の評価になっている．

るとき，熱帯地域は微生物の宝庫であり，それら

IFO職員も同じ実績主義の評価基準を適合する．

の地域の国々との協力関係を推進するためにも日③「寄付行為」によると，理事会の承認事項になっ本を代表する BRC の建設が急務である．これからている．

作られる通産省の BRC は独立行政法人組織で運営（ 3 ）ＯＤ理事：

通産省のかずさに作る BRC に IFOすることになると考えている．同時に Culture Col-が参加するという図がかいてあるが，新しい BRC

lection は national な面を持つ研究組織であること

は独自に運営するのか．官主導で先ず建物を作り，と，国際支援の中で活動できることが求められて中身（運営費や研究内容）についての議論が伴わいる．このような条件を満たすためには，現在活ない状態で IFO が組み込まれる（後での発言をこ動している JCM や IFO の協力は欠かせない．現こで纏めて記載した）ことに危惧を感じる．厚生省・在建設中の「かずさアカデミーパーク内の BRC 専− 12 −

発酵研究所の活動−発酵研究所を継いだ人たち（1995.4〜2001.3）−

用施設の予算60億円が，従来の単年度予算の域をに活動するかが重要である．海外からの視点にたっ越えて 3 年間の予算として承認されている．このて，今後のあるべき BRC の姿を考え，それに IFO

ような施設とそれを運営する組織は日本の将来をとしても協力して行くべきである．
（14）ＴＴ評議員： 通産省 BRC の情報の開示について考えるとき必要である．
（11）ＯＭ理事：

今まで，それぞれの Culture Collec-

は懸念している．IFO, JCM の役割については，こtion は独自の特色を出しながら活動してきた．今れから 2 年間で（建物ができるのは 2 年後である）
十分検討されることが必要である．

後， 各 Culture Collection と の give and take の 調
整はどのようにしていくのか．また，IFO は民間（15）ＮＳ評議員：

BRC の内容については通産省のの組織として flexibility の高い活動をしてきた．通言っていることがころころ変わるので，方針がよ

産省主導のこれまでのやり方を見る限り，「先ず国くわからないし，いまのところ，具体性のあるもありき」で，これが今後，通産省の独立法人としのはでていないように感じている．理研に参加すてその中に取り込まれ，運営すると仮定するなら，るように依頼されたことはない（理研の上層部おIFO が培ってきた「よさ」が失われるおそれはな

よび JCM にもないし，理研の上層部からも聞いていのか．そして，national としての機能の要件は？

いない）．この通産省の BRC の中身（活動内容）を

通産ベースで計画して良いのか？文部省は？厚生

決定する委員会（open）を作ることが大切である．

省は？他からの協力はどのようにする計画か？

その場で，日本の Culture Collection はどうあるべ（12）Ｂ Ｐ 理 事：

きかという “内容” の問題を検討すべきである．

通 産 省 の 情 報 開 示 が 少 な す ぎ る．

Culture Collection の事業は各 collection が独自に（16）ＭＴ理事：

IFO に通産省から具体的な申し入れ

活動してきた．Culture Collection は文化事業と言はない（タケダの方にあっただけである）．

える．研究者が主体的に活動しないと成功しない．

（17）ＴＮ評議員： 国の仕組みとして，国が BRC を建

この場合，national とは？，JCM とはどういう文設しようという気になったことは，BRC をある程化の整合性を採るのか？IFO，または JCM だけが度理解してきたという点では評価したいし，今回，変わり，それで日本の Culture Collection という文景気対策として補正予算を執行したというのは，化が決まる（成功裏に発展する）ものではない．

それなりに予算を獲得するという観点では重要で日本全体の文化としての研究活動の整合性を採るある．ただ，この計画が上手く国の科学技術の発必要がある．また，地球環境の理解を踏まえた上展のため，どのように企画・実行するかが重要ででの微生物の研究が必要である（注：地球上に生ある．そのためには，学者，研究者が initiative を息する微生物のまだ1％しか学問的に明らかにされとり，積極的に運営に参加し，実行することが大切である．

ていない）．
（13）ＫＧ評議員：

Culture Collection は生物資源とそ（18）ＩＪ理事：

2 つのポイントについて意見を述べれの情報の両者が並行して整備される必要がある．

る．JCM が設立されたのは1981年である．その際，通産省が建物を作っただけでは問題解決にはなら

タケダの上層部からの意見として，近い将来にはない．国内の Culture Collection をどのように整備

IFO が必要無くなるではないか，という意見があっするか？関係者のコンセンサスを作成することがた．しかし，その後18年を過ぎ，JCM と IFO は共先決である．また，海外の研究者からみて「日本に好ましい競争相手としながら，共に発展し，日の Culture Collection の窓口はどこか判らない」と本および世界の Culture Collection 事業に寄与しての苦情を聞く（注：Culture Collection に関する問きた．日本のなかで，この大きい 2 つの機関が独い合わせの手紙を受け，正確な対応をする国の組

立 に 存 在 す る こ と の 意 義 は 大 き い． す な わ ち，

織がない）．この通産省の BRC がこの業務を担当

JCM は日本のナショナルコレクションとして設立するというのか．また，IFO の観点からは，① IFO

され，今日まで発展してきている．今回の通産省の55年間の歴史がどのように総括されるのか？②

BRC 構想はこの JCM と機能や役割の面でどう分

研究者処遇をどうするのか？③保存している生物

担するかがハッキリしていない．単にナショナル

資源をどのように質を高めていく計画か？これら

コレクションで規模が大きいものを作るという説の要素に基づき IFO 及び日本の Culture Collection

明だけでは，JCM や IFO に加えて新しく設立されの発展のため，明確な立案をする必要がある．一る意義が認識できない．BRC が国の管理下になる

カ所の Culture Collection の問題ではなく，日本全と，品質管理という Culture Collection に必須な研体の問題であり，海外とどのように co-operative

究が，研究費管理のもとで管理され，研究の質が− 13 −

竹内損なわれかねないことも危惧することである．も昌

男

ら話がはじまるべきと思います．これでは OD 理事と同う一つの点は，動物細胞 G が IFO の経営を悪化さ様に危惧の念を感じざるを得ません．IN 監事がいわれせたという見方は正しくない．動物細胞 G が設立る様に通産省主導の BRC の建設は産業育成の姿勢が優された時，タケダから 2 億円の基本財産積み増し先されるとすれば懸念材料と思います．通産省が景気対があった（注：それだけではなく，毎年4,500万円策でまず建物をたてると言うのでは問題です．運営も独の寄付の増額があり， 1 億7,500万円の寄付はそれ

立行政法人で行うと言うことのようですが独法化後も中以後2000年まで続いている）．動物細胞 G ができ期目標（ 3 〜 5 年）をきめて評価すると言うことですし，たのは1984年であり，1990年まで単年度黒字を続

長期の10年〜50年と言う計画はむずかしいでしょう．理

けている．赤字経営が続いたのは1995年以前の数

事長，所長が委員に加わると言うことですので，おかし年前からである．その原因は1991年から単年度のなことにはならないとは思いますが，今のままでは問題

赤字財政になりながら，人件費の増加を続けたこと思います．文化の破壊にならない事を祈ります．いずとが原因である．

れにせよ発酵研究所の一層のご発展を心より御祈り致し（19）ＭＢ評議員：

その新しい組織の性格は，そこの

ます．

敬具】

責任者，すなわち所長の人事により大いに左右されるので，通産省・BRC の初代所長に望ましい人

2）文部省及び通産省による共同所管
IFO の活動は監督官庁の文部省の範囲を超え，科学技物の就任が実現できるよう働きかけることが最も術庁，通産省，厚生省などの管轄範囲に拡大してきた．

現実対応として有効な方策である．
（20）ＩＮ監事：

IFO の所員はどのような希望をもっ監督官庁を文部省と通産省の共同管轄とする案を検討ているか知らないし，また，現時点では，通産省

し，平成12年12月の臨時理事会・評議員会の了承を得て，の BRC についての情報が少なすぎるので判断しが所管官庁に提出した書類の審査の結果，両官庁から承認

たい．通産省主導での BRC の建設は産業育成へのを得た．この際，IFO の「寄付行為」の改定手続きや各姿勢が優先するため，IFO のような Culture Col-

省に提出する書類作成に，吉田正憲が尽力した．
文部省と通産省による共同所管に関し，IFO の理事のlection を続ける上で懸念材料となる．
（21）ＯＳ監事：

大学の Culture Collection が通産省のCulture Collection に吸収されるのであれば，生物方々の考えがメモの中に適切に表現されていたので．その要旨を記載しておきたい．

資源がそれなりに利用されるという点では有意義【（財団法人）発酵研究所のありかたについて】なことである．
理事長：

大変有意義なご意見ありがとうございました．

Culture Collection 事業は「有用な生物資源とくにそ

それでは，この議論は懇親会の際にでもまたの基準となる生物株を収集，保存，分譲することによっ続けることにして終了したいと思います．

て公共的な学術，産業に資する事業」であると理解いた
しますと営利を目的としない公共性の高い事業でありま

追記：

後に田村學造先生からご意見をいただいたので，す．とくに事業の対象となる生物株は多種多様で多種多その要旨を記載しておきたい．

様の学術，産業と行政官庁に密接な関係があり（文部省，

陽春の候

益々ご清祥の御事大慶に存じます．

科学技術庁，通産省，農林水産省，環境庁，厚生省，建御恵送賜りました通産省BRC構想についての意見メモを設省などの官界と，学会では農，工，医，理の学会，ま拝読致しました．

た産業界では農業，工業，医薬業，食品業と密接な関係【拝啓BP 理事，IN 監事と同意見でありましたので敢えて申しませんでしたが発酵研究所は55年の歴史を担い研究にがある），また国内のみならず国際的な存在と活動があり国際的な視点での運営維持も要求されます．

裏づけられた保存事業をつづけてこられたと思います．

このように非営利事業の運営には公共的な資金援助やBP 理事が言われました様に culture collection は既に文財政援助が不可欠でありとくに武田薬品が営利を離れて化であると思います．また，IN 監事が言われました様

公共的で高邁な理念のもとに長年にわたり支持と援助をに坂口謹一郎先生が御指導され武田長兵衛社長が全面的してこられたことは世界に誇るべき大きな貢献でありまにバックアップされて発酵研究所が発展して来られたもした．そして官の認定する法人であっても官に属する法のと存じます．IFO と言えば世界にそのまま通用すると人機関ではなく民間法人として競争原理のもとに業務を思います．通産省がかずさアカデミーパーク内に60億円行ってきた発酵研究所は国内外の産・官・学の user にで建物だけをつくると言うのはいささか本末転倒の感がも高い評価を得てきたのであります．

あると思います．文化は中身であり，まず中身のことか− 14 −

この面での先進国であるアメリカでは農林省や健康保発酵研究所の活動−発酵研究所を継いだ人たち（1995.4〜2001.3）−

エピローグ

険省に属する Culture Collection 事業（例えば NRRL；
世界的に著名な評価がある農林省の北部地域研究所でのCulture Collection）がある一方，民間の Culture Collection
事業として財団 ATCC
（American Type Culture Collection）
は運営財源として収集保存生物株を有料分譲するとともに国立 NIH（National Institute of Health）などからの支援援助を得て研究運営を長年維持続行しております．特に生物株の分譲は民間事業の理念のもとでの運営と業務が世界的に user の高い評価を得ており,営利性がないためにしばしば直面する経済的経営困難を乗り越えて長年存続しております．
従って世界の現況を踏まえると，我が国においても文部省，通産省，農林省，科学技術庁など官に属する研究所での Culture Collection の運営のほかに，発酵研究所のように官の一省庁に属することなく民間法人として事業を行う研究所の運営と活動の存在が望ましいと考えられます．また多岐ににわたる産官学との密接な関係にも拘わらずこれまで文部省のみの認可団体として運営されてきました発酵研究所はこの転機にあたり通産省などの他の省庁の認可団体としても認可，支持，援助のもとに運営され活動することがわが国にとっても世界的にも貢献が大きいと考えられます．（平成12年秋）

発酵研究所の組織（1999年12月）
年間， 2 回の役員会が開かれ，年度末 3 月には前年 4月から12月までの活動の実績と次年度の計画について，
また 6 月の役員会では前年度一年間の活動が報告される．同時に，経営内容が審議・修正の上，承認を得ている．役員の構成は以下の通りである．発酵研究所には 5研究部門と管理部門から構成されている．

表7

発酵研究所の組織（1999年12月）

理 事 長：森田 桂
常務理事：竹内 昌男
理
事：別府 輝彦
岡田 善雄
監事：磯野 正雄
評 議 員：古川 謙介
松原 謙一
武田 六郎
豊島久眞男
研究所
所
長：竹内
管理部門：吉田
情報管理：末永

昌男
正憲
格

研究部門
糸 状 菌：伊藤 忠義
酵
母：見方洪三郎
細菌：武内真理子
放 線 菌：波多野和徳
動物細胞：吉田 東歩

藤野 政彦
岡見 吉郎
大嶋 泰治
本郷 次雄
目黒 寛治
竹中 浩治
椿
啓介

早石 修
杉野 幸夫

飯島 貞二
山田 秀明

木村 光
中瀬 崇
田村 學造

駒形 和男
大村栄之助
冨田 房男

佐藤

邦子

塩山

絹子

山下

中桐 昭
西村久美子
中川 恭好
西井 忠止
佐藤 元信

岡根
杉本
内野
田村
辻

泉
美香
圭仁
朋彦
憲吾

幸恵

当研究所は1944年に設立され，微生物等の生物資源の保存事業を継続してきた．当事業の業績については，いままでの長谷川武治氏，飯島貞二氏らの報告2, 4）に十分記載されている．退職してから約20年ともなり，私が所長として在籍していた期間（1995年から 6 年間）の一部の記録も飯島貞二氏らの報告には記載されていることか
ら，部分的な重複があることを了解していただきたい．
ここでは，歴史的な報告と言うより，発酵研究所を継いだ人たちについての感想文であることをご理解いただき
たい．発酵研究所に直接に携わらなかった研究者や，特に生物資源保存機関に関わっていない研究者の方々にも一読していただければ幸いである．米国の ATCC を除
いて，IFO のような民間の機関でここまで発展できる生物資源保存機関は今後現れないかも知れない20）．タイム
カプセルが次回に開封される2100年の時代の生物資源保存事業を取り巻く社会的状況を見たいものである．
在職中は研究所の事業への協力や研究指導など研究所の運営について多くの先生方々に指導していただいた．
財団の理事・評議員・監事の方々には多大な指導をいた
だいた．お礼を申し上げても言い尽くせないほどである．
発酵研究所を離れて20年近くなると，今は他界されてしまわれた先生方，森田 桂，藤野政彦，飯島貞二，岡田善雄，福井三郎，早石 修，磯野正雄，大村栄之助，田村學造，椿 啓介，本郷次雄，長谷川武治，三輪谷俊夫，
原田篤也，磯野正雄 諸氏には特にこの場を借りてお礼を申し上げることをお許しいただきたい．木崎良平監事には幾度となく研究所運営の倫理的・歴史的史観についてご教授頂いた．また，小生の在職中，やむをえず他の研究機関に移動しなければならなかった研究者，今井紘，坂根 健，長谷川建夫，黒嶋健一，中垣内弓子，久野晴彦などの所員の方々については，発酵研究所での経験と実績を基にそれぞれの新しい職場でご活躍されていることを時折耳にしたが，彼らの他機関への移動の経緯について忘れたことがない．IFOBRDB の仕上げにはさらに 1 年を要したが，この難解な作業を発酵研究所のメンバーに託することになった．坂野 勲氏には研究所に入所した時から退職するまでの期間，多くの課題について教示して戴いた．特に，Culture Collection の原理・原則についてのご指導には感謝にたえない．どうにか退職するまで健康を維持できたのも坂野勲氏はじめ，理事・評議員による指導や，IFO 所員およびその関係者のお陰であると感謝している．

参考資料，文献および注釈
1） 生命科学研究用の試料として微生物，動物・植物細胞，
DNA，その他，生物に関わる試料を含めて生物研究資源

山口やよい− 15 −

竹

内昌（略して，生物資源）と呼ばれている．本稿では，実験室で培養（複製）可能な試料を生物資源，また微生物や動物細胞に限って．個々の試料を指すときには，微生物株，動物細胞株などと記した．
2） 長 谷 川 武 治，「 微 生 物 保 存 事 業 と IFO」IFO ResearchCommunications, 17, 9 – 18.（1995）
3） 長谷川武治，A History of Microbial Culture Collections inJapan「日本の微生物保存事業」IFO Research Communications, 19: 83 – 115.（1999）
4） 飯島貞二，A history of Institute for Fermentation, Osaka,
IFO Research Communications, 20: 15 – 33.（2001）
5） 長谷川 徹，発酵研究所の歴史，IFO Research Communications, 28: 1 – 10.（2014）6） 衡平な：情報の公開性，利用料の均一性，など当該機関のサービスが経済的サポートしているかどうかにより差別をしないことを意味する．当該機関が提供するサービ
スに関し，資金提供者（国や企業）の研究者と提供していない研究者との間に差別しないことを意味する．
7） Masao Takeuchi, Report of the Director, IFO ResearchCommunications, 18, 1 – 6.（1997）
8） Masao Takeuchi, Report of the Director, IFO ResearchCommunications, 19, 1 – 5.（1999）
9） Masao Takeuchi, Report of the Director, IFO ResearchCommunications, 20, 1 – 14.（2001）
10） 飯島貞二，発酵研究所における情報管理 Research Communications, 17, 44 – 53.（1995）
11） 1998年度 JSCC 機関会員事業報告．日本微生物資源学会
誌．15, 32.（1999）− 16 −男
12） 坂根 健，坂野 勲，L-乾燥票品の長期保存．凍結及び乾燥研究会誌．26, 96 – 100.（1980）
13） 山田 修，黄麹菌 Aspergillus oryzae のアフラトキシン生合成系遺伝子は機能しない−アフラトキシン生合成遺伝
子ホモログクラスタの解析−，化学と生物．50: 560.（2012）14） M.Takeuchi et. al,（1993）Survey of Mycoplasmal contamination in animal cell lines collected by three cell banks inJapan. Bull JFCC, 9, 13 – 18.
15） 竹内昌男，吉田東歩ら，和光純薬時報，60（3）25; 60（4）25（1992）; 61（1）25; 61（3）25.（1994）16） H. Kuno et al.（1999）A simple and rapid reverse transcriptase assay for the detection of retroviruses in cell cultures.
Cytotechnology 29, 221 – 227.
17） IFO に保存した動物細胞株（5001から50525）までのうち，特許寄託株を除く193株が㈶ヒューマンサイエンス振興
財 団 に 移 設 さ れ，2001年 4 月 か ら 分 譲 が 開 始 さ れ た．
2014年，国立研究開発法人・医薬基盤研究所に組織変更
され，IFO 番号を付けたままで研究者に分譲されている．
18） タイム・カプセル EXPO ʼ70 開封委員会（2001.11），Recordof First time capsule opening, Message to the people of2100. Time Capsule EXPO ʼ70 ｢記録書｣（1970）．
19） Bio-Resource ｢ 生 物 系 研 究 資 材 の デ ー タ ベ ー ス 化 及びネットワークシステム構築のための基盤的研究開発｣ 科
学技術振興事業団．（平成10年度〜平成13年度）
20） 小生が IFO を退職した数年後，国のある当時の BRC 担
当課長に学会でお会いしたことがある．その際，IFO のような研究者・技術者が育っていないことを聞いた．皆が理解している一事象「人材を育てるには，長い時間が必要である」，と感じた．

第 10 回助成研究報告会の開催
平成 28 年 6 月 10 日千里ライフサイエンスセンター 5 階ホールにおいて第 10 回助成研究報告会を開催し，2 年間の助成を受けた大型研究助成 4 件の研究成果の口頭発表，5.5 年間の助成を受けた寄付講座助成 1 件の研究成果の口頭発表，ならびに 2 年間の助成を受けた一般研究助成 31 件および 1 年間の助成を受けた若手研究者助成 1 件の研究成果のポスター発表が行われた．参加者は大学，国公立研究所，企業の研究者，大学院生など総数 235 名であった（このうち大学院生は 40 名）．
報告会に先立ち波多野和德理事長から挨拶があった．報告会では大型研究助成 4 件のうち
「熱帯に生息する超希少微生物の分離探索基盤の構築」（早川正幸）の 1 題は徳増征二

元筑波大学教授の座長のもとに，「発酵菌による細胞リプログラミング機構の解明」（太田訓正）の 1 題は阪井康能 京都大学大学院農学研究科教授の座長のもとに，「胆汁酸を責任分子と想定した西欧食による腸内細菌叢崩壊機構の解明」（横田篤）および「難培養性アナモック

ス細菌の生理・生態学の全容解明に向けてのポストゲノム解析」（岡部聡）の 2 題は熊谷英彦 石川県立大学学長の座長のもとに，口頭発表が行われた．また，寄付講座助成の 1 題「極限環境微生物のゲノムに認められる機能未知遺伝子の機能解析とその応用」（河原林は波多野和德裕）

発酵研究所理事長の座長のもとに口頭発表が行われた．各研究発表に対して活発な討議がなされ，示唆に富んだ意見も出るなど実りのある発表となった．発表の内容は全文が本報告集に収録されている．なお，寄付講座助成の報告は総論 1 報と各論 3 報に分けて報告されている．
引き続いて一般研究助成 31 件および若手研究者助成 1 件はポスター展示による発表がなされた．各ポスターの前で参加者と熱心な質疑が交わされた．さらにこの後行われた懇親会の時間にもお酒を片手にポスターの前で討論する姿が見られて，ポスター発表内容について十分に議論されたようであった．一般助成研究および若手研究者助成の研究成果は本報告集
ではページ数の関係で要約のみを掲載した．
懇親会には報告会参加者のほとんどが参加した．先ずは永井和夫理事（東京工業大学名誉教授）の挨拶があり，次いで北本勝ひこ評議員（東京大学名誉教授）のご発声で乾杯を行った．
懇親会では，参加者の間で和やかに歓談が持たれたのに加えて，報告会では十分に出来なかった質疑応答も行われ，また当財団からの寄付により設置された東北大学の寄付講座の永田裕二教授からの挨拶などもあって，異なる分野の研究者の間で賑やかな交換が見られた．特に，今回の報告会および懇親会には若手の研究者が多数参加され，新旧の研究者の交流の場としても十分役だったものと思われる．参加された皆様のご協力に心から感謝致します．
来年の第 11 回助成研究報告会は平成 29 年 6 月 9 日（金）に同じ会場で開催致する．
以下に報告会，ポスター展示，懇親会の模様の一部を写真で紹介する．
（文）横田− 17 −明

RESEARCH COMMUNICATIONS

開会挨拶
波多野和徳 理事長

座長

座長

波多野和徳 理事長

岡部

徳増

早川

聡 氏

征二 先生

座長

正幸 氏

阪井

太田

河原林

裕 氏

講

会

演

− 18 −

康能 先生

訓正 氏

中濱

座長

熊谷

英彦 先生

横田

篤 氏

司会
一雄 常務理事

RESEARCH COMMUNICATIONS

ポスター発表

挨拶

永井

和夫 理事

乾杯

北本勝ひこ 評議員

懇− 19 −

親会

IFO Res.Commun. 30
21-38, 2016

熱帯に生息する超希少微生物の分離探索基盤の構築

熱帯に生息する超希少微生物の分離探索基盤の構築
早

川

正

幸

山梨大学生命環境学部〒 400-8511

甲府市武田 4-3-11

Construction of the Foundation of Screening Strategies for
Extremely Rare Microorganisms from Tropical Areas
Masayuki Hayakawa
Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Yamanashi
Takeda-4, Kofu 400-8511, Japan
This study assessed the effectiveness of isolation and screening strategies for rare microbial resources, such as actinomycetes and lactic acid bacteria, from tropical regions. Application of the rehydration and centrifugation method developed by Hayakawa et al. (2000) resulted in the selective isolation of 632 rare actinomycetes from 113 soil
samples from Myanmar. 16S rDNA sequence analysis revealed that the actinomycete isolates were particularly diverse, consisting of 17 families, 48 genera and 128 species. The most frequently isolated genus was Actinoplanes,
followed by Krasilnikovia. Of the 632 isolates, 210 strains (33 %) were new species candidates with 16S rDNA similarities of less than 98.7 % compared to the most homologous prototype species. Forty-six strains (84 %) of the 55
new-species candidates exhibited antimicrobial activity or had genes that encoded nonribosomal peptide synthetases or type I polyketide synthases. The findings showed that rare actinomycetes from tropical regions have potential for producing useful and novel metabolites. A total of 253 lactic acid bacteria were isolated from 55 traditional fermented foods using a newly developed method involving co-culture with yeast strains and a conventional
dilution plating technique. These isolates belonged to four families, eight genera and 30 species. Lactobacillus was
the most frequently isolated genus, followed by Weissella. Several species, including L. futsaii and L. plajomi, reportedly isolated from other tropical regions, were also isolated among the Myanmar isolates examined in thisstudy. Most of the 253 lactic acid bacteria isolates exhibited the capacity to actively ferment mono- or di-saccharides.
Key words: actinomycetes, lactic acid bacteria, taxonomic diversity, ecology

緒言要となっている．このような中，我が国では製品評価技
術基盤機構（NITE）が東南アジアを中心とした各国と近年，世界各地の熱帯域で土壌，植物，伝統的発酵食のアクセススキームを構築し，生物多様性条約に則った品などにおける有用微生物の探索が行なわれているが微生物菌株の移転が可能になっている．東南アジアは，（Azevedo et al., 2000; Hong et al., 2009; Lan et al.; 2013），
分離技術が未開拓な菌群も多く，その分布は未だに不明

熱帯特有の気候や植生，食文化を有し，今般，東南アジ
ア産の新種微生物が次々と発表されている（Hamada et

な点が多い．また微生物を含む遺伝資源に対しては，生al., 2015; Nurkanto et al., 2016）．このことは同地域が医物多様性条約の発効により原産国の主権的権利が認めら

薬品や酵素の生産菌，発酵食品といった微生物遺伝子資れ，利用者は原産国政府から事前の合意を取ることが必

源保有地域として潜在的な価値が非常に高いと考えられる．その中でミャンマー連邦はごく最近になってから微E-mail: mhayakawa@yamanashi.ac.jp
共同研究者：柳田藤寿（山梨大学ワイン科学研究センター），
岸本宗和（山梨大学ワイン科学研究センター），
乙黒美彩（山梨大学ワイン科学研究センター），
山村英樹（山梨大学生命環境学部）

生物探索が可能になった国である．そこで，本研究ではNITE が構築したミャンマー連邦との共同研究プロジェ
クトに参画することで，同国における微生物の分離探索基盤を構築することとした．具体的には，医薬品の生産− 21 −

早

川

正

幸

菌として重要な放線菌や発酵食品に利用可能な乳酸菌を

リ地方域のダウェイ，ベイ，コータウンから土壌29点を取り上げ，希少種や固有種の分離方法の構築と多様性，収集した（2014年11月）．この地域はケッペンの気候区

さらに有用性を明らかにすることを目的とした．

分によると熱帯モンスーン気候に属しており，例えば放線菌は Waksman らによるストレプトマイシンの発ミャンマー最南端のコータウンの月別最高気温の年平均見を契機に，世界中の研究者によって広く環境中から分は 32.3 ℃，月別最低気温の年平均は 23.7 ℃となってい離が行われ，抗菌薬や抗寄生虫薬，抗癌剤，免疫抑制剤

る（http://www.worldweatheronline.com/）． ま た， 同など多様な生理活性物質が発見・実用化されている．放線菌の中でも Streptomyces 属からは極めて多くの生理活

時に分類試験に供試した NITE 保有ミャンマー株は，性物質が報告されており，例えば Streptomyces avermeti-

州から採取された土壌試料84点を分離源としたものであlis の生産物より開発されたイベルメクチンはアフリカ

る．一方，我が国の本州，利尻島，西表島より採取した諸国のオンコセルカ症の特効薬として，さらにフィラリ

土壌試料105点を対照の温帯域土壌として供試した．土

ア症や疥癬（かいせん）にまで効果を示し，広く人類の壌試料は孔径 2 mm の篩を通し，室温で風乾したのち放生活と健康に恩恵をもたらしている（Omura, 2008）．放線菌の分離に供試した．

ミャンマー中北部に位地するマンダレー地方域及びチン線菌の分離に関しては，希釈平板法や SDS-YE 法（Haya-

乳酸菌の分離源としてミャンマー中南部に位地する

kawa & Nonomura, 1989）によって土壌中の優占種である Streptomyces 属を分離することができるが，分布密度

エーヤワディ地方域のパテイン地区より29点の発酵食品を入手して供試した（2014年11月）．また分類試験に同時に供試した NITE 保有乳酸菌は，ミャンマー中北部のの低い希少放線菌は何らかの選択分離方法を用いなければ取得する事が出来ない．例えば Hayakawa et al.（2000）

チン州タウンジー地区より入手した26点の発酵食品を分よって考案された再水和−遠心沈殿法は，運動性をもつ離源とするものである．これらのサンプルの種類は，野希少放線菌を効率的に分離することが可能である．本研

菜の漬物21点，エビや魚の馴れ鮨11点，発酵ペースト 9

究では日本では分離が困難であるが，熱帯特有の環境か点，発酵米麺 4 点，発酵茶 2 点，納豆 1 点，エビの佃煮，ら分離できる放線菌を超希少放線菌として捉え，再水和

米発酵酒，納豆せんべい，甘酒，蜂蜜，豆板醤を各 1 点−遠心沈殿法及びその改良法を適用し，分離された希少ずつである．

放線菌の多様性や有用性を評価した．
一方，日本をはじめとするアジア諸国は，独自に発達

分離した伝統的な発酵文化を有しており，様々な発酵食品に放線菌の分離培地は Humic acid-vitamin agar（HV agar;

共存，共生している微生物群には非常に興味が引かれる．

Hayakawa & Nonomura, 1987）を基本培地とし，これにミャンマーには，エビやカニ，魚などの甲殻類や魚類，

抗カビ剤としてシクロヘキシミド 50 mg/l，カビサイジ

豆や野菜などの植物を使用した発酵食品が多く，例えば

ン 5 mg/l，抗細菌剤としてナリジキシン酸 20 mg/l を添

モヒンガ（発酵麺），ンガピ（小エビを発酵させたペー

加したものを用いた．分離方法としては再水和−遠心沈殿法（Hayakawa et al., 2000）を用い遊走温度を通常のスト状の調味料），パゾンチン（エビの馴れ鮨），発酵茶などが知られている．これらは多民族国家であるミャン

30 ℃と 38 ℃に変更した 2 段階で行った．分離平板は室マーにおいては部族や民族ごとに受け継がれており，多温（約 25 ℃）で 2 週間培養し，Yeast extract-Starch 培

様性に富んでいる．本研究では，ミャンマーの発酵食品

地にて純化を行い，コロニー形態や色などから放線菌

から日本では入手困難な希少種を含む多様な乳酸菌を取

282株を選抜し，日本に持ち帰った．同定試験，有用性

得し，有用性を評価することを目的とした．発酵食品か試験には，同じ再水和−遠心沈殿法により2004年にミャら乳酸菌を分離する際には，一般的に試料の一部を液体ンマーから分離された NITE 保有の放線菌351株を加え培地中で前培養したのち希釈平板法が適用されるが，優た総計633株を供試した．また，対照として，再水和−

勢種が集積されて分離されることが多い．そこで分離に

遠心沈殿法により我が国の土壌から分離した放線菌530

あたっては，前培養の際に特定の酵母を添加して乳酸菌株を供試した．
乳酸菌の分離には MRS 寒天培地（Difco 社製）を基の希少種を増菌させ平板分離する新たな手法の開発を目本培地として，これに抗カビ剤としてシクロヘキシミド

指した．

50 mg/l と炭酸カルシウム 0.1 g/l を添加したものを用い実験方法

た．培養は 30 ℃にてアネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）を用いて嫌気培養を行った．各サンプル 1 g

分離源

を 0.75 % 生理食塩水に懸濁しサンプル希釈液を作製し放線菌の分離源としてミャンマー南東部のタニンダー

た．希釈平板法はサンプル希釈液を段階希釈後，各溶液− 22 −

熱帯に生息する超希少微生物の分離探索基盤の構築

100μl を分離培地に塗布した．分離平板は48時間嫌気培

H' は群集に含まれる種の豊富さ（数）と均等度（各種養後にコロニーの生育を確認した．共培養法は，酵母 3
属 3 種（Saccharomyces cerevisiae RIFY 1001, Klyveromy-

間の個体数の等しさ）を考慮に入れたもので，次の式により表される．H'＝−ΣPiInPi：ここで Pi は i 番目の種のces marxianus RIFY 4040, Pichia fermentans RIFY 4078）

個体数が群集の全個体数に占める割合．Shannon 指数のを 30 ℃で 2 日間培養したものを本培養とし，各酵母培

評価は Wilcoxon 符号付順位和検定により行った（Flanagan et al., 2007）．

養 液 50μl と サ ン プ ル 希 釈 液 50μl を，MRS 液 体 培 地
2 ml を分注した12ウェルプレート（Thermo Scientific 社
製）に接種し，30 ℃で48時間嫌気培養を行った．希釈

分離株の有用性調査

平板法と同様に培養液 100μl を分離培地に塗布した後，放線菌の医薬品探索源としての評価を行うため，抗菌再び 30℃で48時間嫌気培養し，コロニーの生育を確認

活性試験を行った．即ち，ミャンマーで分離された Actinoplanes 属のうち，新種推定株55株（既知種との 16S

した．各分離法により生育したコロニーを色，形状の違
炭酸カルシウムを含んだ MRS 高層寒天培地に穿刺培養

rDNA 塩基配列の相同性 98.7 % 未満）について，真菌 4株（Aspergillus niger NBRC 9642, Colletotrichum orbicu-

したものを持ち帰った．同定試験，有用性試験には，

lare NBRC 33130, Candida albicans NBRC 1385, Saccha-

2004年に希釈法によりミャンマーの発酵食品から分離さ

romyces cerevisiae NBRC 10217），グラム陽性菌 3 株（Ba-れた NITE 保有乳酸菌105株を加えた253株を供試した．

cillus subtilis NBRC 13719, Clavibacter michiganensis

同定試験

NBRC 13762, Staphylococcus aureus NBRC 14462），グラ
ム陰性菌 2 株（Escherichia coli NBRC 13762, Pseudomo-

いから選択し，総計148株を単離，純化した．日本へは

放 線 菌 お よ び 乳 酸 菌 分 離 株 ゲ ノ ム DNA の 抽 出 は

nas fluorescens NBRC 14160）に対する抗菌活性を寒天重PrepMan ultra reagent（Applied Biosystems, CA, USA）

層法（Goodfellow et al., 1990）にて行った．さらに，遺を用いる定法により行った．これを鋳型 DNA として伝子レベルで各菌株が生理活性物質を生産する可能性に

PCR にてほぼ全長の 16S rDNA を増幅させ，ダイレク

つ い て I 型 ポ リ ケ タ イ ド 合 成 酵 素（PKS-I: Type - I

トシーケンスにて塩基配列を決定した . 各菌株の塩基配

polyketide synthases）遺伝子および非リボソーマル型ペ

列は ATGC（ゼネティックス）でアッセンブルを行い，1,200 bp 以上の塩基配列については EzTaxon（Kim et al.,プ チ ド 合 成 酵 素（NRPS: nonribosomal peptide synthe-2012）にて相同性検索を行った .

®

tases）遺伝子を PCR にて増幅し，検出することで評価

放線菌については，Drancourt et al.（2000）およびを行った．PKS-I，NRPS 各遺伝子の増幅，検出の手法
は Gonzalez et al.（2005）に従った．

Stackebrandt & Ebers（2006）の研究結果に準じ，分離

乳酸菌を発酵分野へ応用するため，糖類発酵性試験を株の 16S rDNA 塩基配列の相同性が 97 % および 98.7 %行った．即ち，糖類発酵性試験では単糖類，二糖類，糖以上の場合，便宜的に既知の属および種へ配属した．まアルコールなど17種類の糖源について発酵性を調査した , 相同性が 97 ％以下の放線菌株や希少性の高い菌株た．なお，供試菌株は共培養法などを用いて分離した菌については電子顕微鏡による形態観察，さらに分子系統

株と NBRC から分譲を受けたミャンマー発酵食品由来

解析によっても同定の評価を行った．即ち，分離株の基の乳酸菌，計253株を用いた．MRS 液体培地で前培養を生菌糸，気菌糸，胞子連鎖の形成の有無と形態等を確認するとともに，CLUSTAL_X program（Thompson et al.,

行った供試菌株を滅菌生理食塩水で10倍に希釈し，希釈液 20μl を 各 糖 源 を 添 加 し た GYP 培 地（Hagi et al.,1997）により分離株とデータベース中の 16S rDNA 塩基2004）に接種した．30 ℃，3 日間培養後，pH 測定と生配 列 の ア ラ イ ン メ ン ト を 行 い，NJ 法（Saitou & Nei,

育度の肉眼観察を行った．

1987）によって分子系統樹を構築して解析した．

結

乳酸菌については相同性が 99 % 以上を既知種へ配属した．それらについてさらに，位相差顕微鏡（CX-41，
オリンパス社製）を用いて形態観察を行った．また，代【放線菌】

表株については走査型電子顕微鏡による観察も行った．

同定結果

果

分離株毎の 16S rDNA 塩基配列の相同性検索の結果か多様性の解析

ら ≧97 % および ≧98.7 % の相同性をそれぞれ属および同定された放線菌の種の多様性は多様度指数（Shan-

種の同定基準として同定を行った（Table 1, Table 2）．

non 指数 ; Shannon & Weaver, 1949）を算出することにその結果，ミャンマー分離株633株は18科，47属，128種，

よって定量的に評価，比較した．Shannon の多様度指数

日本分離株は19科，46属，1557 と，それぞれ多様な分− 23 −

早
Table 1

Table 2

川正

幸Taxonomic diversity of actinomycetes isolated from Myanmar
soils (118 samples) and Japanese soils (120 samples) using
the rehydration and centrifugation methoda)

Species composition of actinomycetes found in Myanmar and Japan.

− 24 −

熱帯に生息する超希少微生物の分離探索基盤の構築
Table 2

continued− 25 −

早

川

Table 2

正幸

continued− 26 −

熱帯に生息する超希少微生物の分離探索基盤の構築
Table 2

continued− 27 −

早

川

Table 2

正幸

continued− 28 −

熱帯に生息する超希少微生物の分離探索基盤の構築
Table 2

continued− 29 −

早

川

Table 2

正幸

continued

類群へ配属された．種レベルの多様性（豊富さと均等度）
を定量的に比べるため，Shannon 指数を求めると，ミャンマー 3.7，日本 3.8 となり，Wilcoxon 符号付順位和検
定では両国間の放線菌の多様性に有意な差は無かった．
なお，既知属へ配属できない新属推定株（既知種との16S rDNA 塩基配列の相同性 97.0 % 未満）はミャンマー
分離株中にのみ11株（1.7 %）認められた．また，新種推定株（既知種との 16S rDNA 塩基配列の相同性 98.7 % 未満）はミャンマー分離株中210株（33.2 %），日本分離株
中141株（26.4 %）であり，その割合はミャンマーで有意Fig. 1

Taxonomic overlaps of actinomycetes between Myanmar and Japan. The arabic numerals on the graph are
the numbers of taxa.

Fig. 2

Incidences of actinomycete genera in Myanmar and Japan. The percentages on the graphs are the frequenciesof genera (above 3 % are indicated).

（p＜0.01：χ2 検定）に高かった．
属種の比較
ミャンマーと日本で分離された放線菌の簡易同定の結果から分類名に基づいて属および種レベルの重複について両国間で比較を行ったところ（Fig. 1），属レベルでは総計68属中27属（39.7 %），種レベルでは総計233種中52
種（22.3 %）しか重複しておらず，放線菌の種類分布は両地域で大きく異なっていることが示された．
両方の国で共通して検出された主要属の分離頻度（各地域の全分離株中に占める割合）についてみると（Table 2,
Fig. 2），Actinoplanes 属 が 最 も 高 く， ミ ャ ン マ ー で は
29.4 %（186株），日本では 33.0 %（176株）であった．また，Actinoplanes 属の中で新種と推定される菌株はミャン
マーでは 66.7 %，日本は 44.3 % であり，ミャンマーの方が明らかに高かった（Table 2）．他の属で分離頻度の高かっ− 30 −

熱帯に生息する超希少微生物の分離探索基盤の構築

Fig. 3

Scanning electron micrographs of Krasilnikovia cinnamonea MN14-A1084 isolated
from Myanmar. a, a colony on HV agar. b, sporangium-like structures. White bars:
a, 100μm; b, 2μm.

たのは Krasilnikovia 属，Streptomyces 属，Micromonospora
属，Couchioplanes 属，Nocardia 属，Luedemannella 属，Dactylosporangium 属などであった．これらの属の内，Krasilnikovia 属，Micromonospora 属，Couchioplanes 属，Nocardia 属，Luedemannella 属の分離頻度はミャンマー
で高く，逆に Streptomyces 属，と Dactylosporangium 属の分離頻度は日本の方が高い傾向が見られた．ミャンマー
でのみ出現した放線菌属は，Mycobacterium 属（ 1 株），
Kineosporiaceae 科の新属推定株（ 4 株），Micrococcus 属，Isoptericola 属（ 6 株），Actinocatenispora 属（ 1 株），Catel-

Fig. 4

liglobosispora 属（ 1 株），Hamadaea 属（ 2 株），Planosporangium 属（ 1 株），Phytohabitans 属（ 2 株），Micromonosporaceae 科の新属推定株（ 4 株），Mumia 属（ 1 株），
Actinophytocola 属（ 4 株），Kibdelosporangium 属（ 1 株），

Percentages of strains exhibiting antimicrobial activity
and/or having gens that encode nonribosomal peptide
synthetases (NRPS) or type I polyketide synthases(PKS - I) in 55 new-species candidates＊ of Actinoplanes
from Myanmar. ＊ Strains exhibiting ＜98.7 % 16S rDNA
sequence similarity with a deposited sequence.

Kutzneria 属（ 1 株 ），Saccharopolyspora 属（ 1 株 ），Pseud（ 3 株），Planobispora 属（ 1 株），Planomonospora 属（ 6を行っている．Planomonospora 属の新種については放線菌学会で発表を行い，この他に Virgisporangium 属の株），Streptosporangiaceae 科の新属候補株（ 1 株），Actinoallomurus 属（ 1 株）であった．

新種，Krasilnikovia 属の新種，Kineosporiaceae 科の新属，Frankineae 亜目の新科または新属について，学術雑誌

種のレベルで分離頻度の高かったのは Actinoplanes
brasiliensis，Actinoplanes digitatis，Couchioplanes caeru-

International Journal of Systematic and Evolutionary Mi-

leus，Krasilnikovia cinnamonea，Luedemannella flava で予定である．

あり，これらの内，後者の 3 種はミャンマーの方で明らかに分離頻度が高かった．Krasilnikovia cinnamonea 分

抗菌活性onocardiaceae 科の新属候補（ 1 株），Streptoacidiphilus 属

crobiology および Journal of Antibiotics 上で提案を行う

離株の SEM 像を Fig. 3 に示した．菌糸状に胞子のクラミャンマーから分離された Actinoplanes 属には多くのスターを形成する特徴が示されている．また，ミャンマー
からのみ分離された種には Cryptosporangium minutispo-

新種推定株が存在しており，これらの有用性を調査する

rangium，Catenuloplanes nepalensis，Dactylosporangium（PKS-I，NRPS 遺伝子）の確認を PCR 法にて行った．

tropicum，Planomonospora sphaerica 等，熱帯特有の種

その結果，55株中30株（57 %）が被試験菌（カビ，酵母，（Tamura et al., 1995）が含まれていた．

細菌）のいずれかに対して抗菌活性を有しており，二次ため抗菌活性および二次代謝産物生合成関連遺伝子

代謝産物生合成関連遺伝子は32株（59 %）が保有し，抗新属新種の提案

菌活性もしくは二次代謝産物生合成関連遺伝子のいずれ

新規性の高い一部の分離株については詳細な分類試験かを有する数は46株（83 %）に及んだ（Fig. 4）．

− 31 −

早

川

正

幸

【乳酸菌】

bacillus farciminis（23株）等の分離頻度が高かった．また，共培養分離法の有効性

Lactobacillus futsaii，Lactobacillus plajomi といった熱帯共培養分離法と希釈平板法をミャンマーの同一サンプ

地域特有の種（Chao et al., 2012; Miyashita et al., 2015）

ル（エビのなれ鮨）に適用し，乳酸菌を分離した結果をも分離された（Fig. 5b）．なお，253分離株のうち12株は，Table 3 に示した．共培養法を用いると通常の希釈平板法では得られない Lactobacillus 属の既知種株や新種推定あり，新種推定株とした．253株を分離方法別の内訳を株が分離できることがわかった．

みるとコントロールとした希釈平板法から 7 属23種，共既知種との 16S rDNA 塩基配列の相同性が 99.0 % 未満で培養法から 5 属20種が認められた．一方，我々が独自に同定結果

サンプリング，分離した結果（148株）のみを比較すると，分離株につき 16S rDNA 塩基配列の相同性検索の結果
から ≧99 % の相同性を種の同定基準として同定を行っ希釈平板法から 5 属14種，共培養法から 4 属22種が認められ，このうち共培養法で分離されたのは Lactobacillus

た（Table 4，Table 5）．その結果分離株253株は 4 科，

mudanjiangensis, Weissella cibaria な ど の14種 で あ っ た

8 属，30種と多様な分類群に配属された．属のランクでは Lactobacillus 属菌の分離頻度が最も高く，分離株の（data not shown）．

80 %（202株）を占め，次いで Weissella，Enterococcus，Pediococcus，Leuconostoc，Lactococcus，Streptococcus，

糖類発酵性
分離株253株につき17種類の糖類の発酵能を調べた結Vagococcus 属菌の順に多く分離された（Fig. 5a）．種のラ

果 を Fig. 6 に 示 し た． 生 育 度 を 観 察 し た 結 果，137株

ンクでは Lactobacillus pentosus（53株），Lactobacillus fermentum（28株），Lactobacillus plantarum（26株），Lacto-（54.2 %）が全ての糖類で生育が認められた．糖類のうち，単糖類，二糖類では228株（90.1 %）の分離株が pH を 4

Table 3

Effect of co-culture method for the isolation of lactic acid bacteria from a food productof fermented shrimp and rice (Pazon Chin) in Myanmar

Table 4

Taxonomic diversity of lactic acid bacteria isolated from traditional fermented foods in
Myanmar＊− 32 −

熱帯に生息する超希少微生物の分離探索基盤の構築
Table 5Genera and species of lactic acid bacteria found in traditional fermented foods in Myanmar− 33 −

早

川

正

幸

以下に低下させる強い発酵能を示した．最も pH が低下したのはグルコースを糖源とした時の Lactobacillus min-考察densis RD524199 株で，培養に pH は 3.11 まで低下した . 本

1993年の生物多様性条約の発効により微生物を含む遺菌はラクトースやメリビオースなどの二糖類，メレチ

伝資源へのアクセスするためには遺伝資源提供国への

トース，ラフィノースなどの三糖類，マンニトールやソ「事前情報に基づく同意」と「利益配分」を行う事が基

ルビトールなどの糖アルコールに対する発酵能は非常に本原則となった．その後，利益配分については2014年の低かったが，フルクトースやマンノースといった単糖類

名古屋議定書によって遺伝資源提供国と遺伝資源利用国には高い発酵能を示した．

の双方に義務を課した国際的な取り決めが行われた（井上 2015）．これに伴い，本研究においてミャンマーの遺伝資源である放線菌および乳酸菌の収集とその解析を行うためにはこの生物多様性条約に則ったアクセスを行う必要がある．そこで，我々は製品評価技術基盤機構（NITE）の「ミャンマーにおける生物遺伝資源の保全と持続可能な利用に関する共同事業」に参画し，ミャン
マー・パテイン大学を共同事業先として研究を開始した．
【放線菌】
東南アジアの熱帯地域における放線菌の生態および多様性に関する研究は，中国雲南（Xu et al., 1996），シン
ガポールの熱帯雨林（Wang et al., 1999），マレーシア（Muramatsu et al., 2003）インドネシア（Lisdiyanti et al.,2012; Widyastuti et al., 2012），ベトナム（Hop et al., 2011）
で行われており，ミャンマーからの報告はない．一方，
分類学的な研究として新属新種の提案は熱帯域を起源とする報告は近年になってから比較的多くなっており，例
えば，バングラデシュからは Krasilnikovia 属（Ara & Kudo,
2007a），Luedemannella 属（Ara & Kudo, 2007b），Pseudosporangium 属（Ara et al., 2008）が提案され，タイから は Actinocatenispora 属（Thawai et al., 2006），Actinophytocola 属（Indananda et al., 2010）の提案が行われてFig. 5 Incidences of lactic acid bacteria genera (a) and Lactobacillus species (b) in traditional fermented foods in
Myanmar. The percentages on the graphs are the frequencies of genera (a) and species (b).

いる．これら放線菌についてみると Krasilnikovia 属，Luedemannella 属，Pseudosporangium 属は本研究で日本からも分離されているが，ミャンマー連邦における分離頻度が非常に高く（Table 2），Actinocatenispora 属，Actinophytocola 属についてはミャンマー連邦でのみ分離さ
れ て い る． ま た，Planomonospora 属（Thiemann et al.,1967）は発表から50年近く経過しているにも関わらず僅か 4 種のみが報告されている超希少放線菌属である．そして，興味深い事にこれら菌株はインド（P. sphaeria），
スーダン（P. alba），ベネズエラ（P. venezuelensis），チリ（P. parontospora subsp. parontospora），アルゼンチン（P.
parontospora subsp. antibiotica）といった熱帯域を起源としている．今回，熱帯域であるミャンマーからは Planomonospora 属が分離されているが，日本からの分離例

Fig. 6 Assimilability of carbon sources by lactic acid bacteria
isolates (253 strains).

は無かった．一方，種レベルの特徴としては，Krasilnikovia cinnamonea，Couchioplanes caeruleus，Pseudosporangium ferrugineum，Luedemannella flava は日本と− 34 −

熱帯に生息する超希少微生物の分離探索基盤の構築

比較してミャンマーでの分離頻度が高く，また Catenuloplanes nepalensis，Cryptosporangium minutisporangi-

研究に関する報告はない．

um，Dactylosporangium tropicum，Planomonospora

発酵茶，大豆製品，野菜の漬物など多様な発酵食品55点

sphaerica 等はミャンマーからのみ分離されている．
新規分類群については既知種との 16S rDNA 相同性がから乳酸菌を分離し，253株，4 科，8 属，30種におよぶ乳酸菌を取得した．宮下ら（Miyashita et al., 2012）は98.7 % 未満を新属もしくは新種推定株としており，ミャ

タイの発酵食品114サンプルから945株を分離し，410株

ンマー産放線菌分離株633株中の210株（33 %）にも達し，について 16S rDNA 塩基配列を行い，6 属が認められた中には科，属レベルで新規性が高い株もあった．特にFrankineae 亜目からは新科，新属と推定される菌株がことを報告しているが，供試した試料数，分離株数がか分離されている．この他に，Micromonosporaceae 科，
Pseudonocardiaceae 科，Streptosporangiaceae 科からも新多様な乳酸菌が分離できたと考えられた .

属と推定される放線菌株が分離されている．一方，日本特性の一つである．本研究では分離株の17種類の糖源にからは新属となるような候補株は見出すことはできな

対する発酵性を調査した．供試菌株の約 80 % を占める
Lactobacillus 属にはラフィノースやメレチトース等に発かったことから，熱帯には日本では分離困難な「超希少本研究では魚を原料とする発酵ペーストや馴れずし，なり少ないのにもかかわらず本研究では極めて効率的に乳酸菌を食品等に利用する上で糖源の発酵性は重要な微生物」が存在していると考えられる．なお，これらの酵 能 を 示 さ な い 種 が 多 数 存 在 す る（Khedida, et al.,

新科・新属候補の放線菌株については現在詳細な分類学

2006）が，本調査では 65 % 以上の分離株がラフィノー的な研究を行っている．

スやメレチトースに発酵能を示し，pH 4.0 以下となった．

放線菌の有用性を評価する方法として，抗菌活性など

またグルコースやフルクトース等の単糖類，スクロースのバイオアッセイ法が用いられてきたが，二次代謝生合やラクトース等の二糖類では 90 % 以上の分離株が pH 4.0

成遺伝子（NRPS や PKS - I, - II, - III）を PCR で検出する以下となった．スターチおよびグルコン酸ナトリウムを遺伝子検出法との併用が現在では主流になりつつある（Meklat et al., 2011; Kim et al., 2011; Bredholdt et al.,

除くと，最も低い発酵能を示したメレチトースでも 71 %2007）．本研究では，ミャンマー産の希少放線菌 Actinoplanes 属の中で新種推定株55株を選抜し，抗菌活性とマーの発酵食品由来乳酸菌は全体的に発酵能が高いと考の分離株に発酵能が認められた．この結果からミャンえられる．

NRPS 遺伝子および I 型 PKS 遺伝子の検出によって有用要性の評価を行った．その結果，抗菌活性と二次代謝遺伝

約子のいずれかを持つ菌株の割合は 84 % にも上った．これまでに Actinoplanes 属からは120以上の抗生物質の報

近年，熱帯域の各地で有用微生物の探索が始まってお告（Lazzarini et al., 2001）があることから，ミャンマー

り，熱帯由来の新種が数多く記載されてきている．しか産の新種と推定される Actinoplanes 属は新規創薬資源とし分離技術が未開拓な菌群も多く，その分布は未だに不して高いポテンシャルを有していると考えられる．

明な点が多い．本研究では，放線菌及び乳酸菌を対象とし，ミャンマーの土壌や伝統的発酵食品から希少種や固【乳酸菌】

有種の選択的分離法を構築するとともに，分離株の分類

発酵食品に関わる乳酸菌の多様性の研究はヨーロッパ

学的多様性や有用性を評価した．

やアジアなどの伝統的な発酵食品が多く食されている地域で多数報告されている（Tamang et al., 2016）．特に野【放線菌】 ミャンマー各地の土壌113点から再水和−遠沈法（Hayakawa et al., 2000）とその変法（Maeno et al.,

菜や魚介類を用いた発酵食品文化を有するアジア圏においては台湾の豆鼓や酸菜（Chen et al., 2010, 2012），韓2015）により希少放線菌633株（NITE 保有株も含む）を国のキムチ（Nam et al., 2009; Jung et al., 2011），タイの分離株は17科，48属，127種と多様な属種に配属された．

からし菜やフウチョウソウ（Phithakpol et al., 1995）の同様な手法で日本から分離された希少放線菌相（19科，乳酸菌について多くの研究報告がある．また，発酵乳に

47属，155種）と比べると，属のランクでは 40 %，種の関してはインド（Dewan & Tamang, 2006, 2007; Tamang
et al., 2000）やモンゴル（Watanabe et al., 2008, 2009; Yu

ランクでは 22 % しか重複しておらず，ミャンマーの希et al., 2011）などで行われている．

得た．形態及び 16S rDNA 解析による簡易同定の結果，少放線菌の種類組成は日本と明らかに異なっていることがわかった．属レベルでは Krassilnikovia 属菌の割合が一方，ミャンマーの発酵食品に関してはンガチンと呼顕著に高く，Planomonospora，Actinophytocola 各属菌はばれる小魚の馴れずしから乳酸菌を分離した報告がある
が（Thwe et al., 2011; Moe et al., 2015），網羅的な多様性

ミャンマー試料のみから得られた．種のランクでは日本に比べて K. cinnamonea，Couchioplanes caeruleus，Pseu-− 35 −

早

川

正

幸

dosporangium ferrugineum 等の分離頻度が高く，Catenu-

2） Maeda, K., Otoguro, M., Kishimoto, M., Hayakawa, M.,
Ando, K., Pay, N. & Yanagida, F. 2015. Development of new
isolation method of lactic acid bacteria by co-culture. The
Second Myanmar-Japan Symposium (Pathein, Myanmar).
3） Yamamura, H., Miyazaki, S., Hamada, M., Ando, K., Pay, N.
& Hayakawa, M. 2015. Taxonomical study of Planomonospora sp. RD501994 isolated from Myanmar. The Second
Myanmar-Japan Symposium (Pathein, Myanmar).
4） 前田康太郎，乙黒美彩，岸本宗和，柳田藤寿．2015．共培養による乳酸菌の新規分離法の開発（酵母エンハンス法）．日本農芸化学会2015年度大会（岡山）．
5） 生 駒 航 大， 山 村 英 樹， 中 川 洋 史， 安 藤 勝 彦，Nyunt
Phay，早川正幸．2015．ミャンマーで分離された希少放線菌における分類学的な多様性と二次代謝産物生合成遺伝子の分布．日本放線菌学会2015年度大会（富山）．
6） 宮崎頌矢，生駒航大，山村英樹，中川洋史，安藤勝彦，
Nyunt Phay，早川正幸．2015．ミャンマーで分離された
運動性希少放線菌 RD501994 の同定．日本放線菌学会
2015年度大会（富山）．
7） 乙黒美彩，前田康太郎，標 智仁，岸本宗和，安藤勝彦，
Nyunt Phay，早川正幸，柳田藤寿．2016．ミャンマー発
酵食品からの共培養による乳酸菌の分離とその発酵特性．日本農芸化学会2016年度大会（札幌）．

loplanes nepalensis，Cryptosporangium minutisporangium，Dactylosporangium tropicum，Planomonospora
sphaerica 等がミャンマーのみから分離された．また，既知種との 16S rDNA 相同性が 98.7 % 未満の新種推定株（超希少微生物）が633株中210株（33 %）にも達し，中には科，属レベルで新規性が高い株もあった．新種推定
株は 84 %（供試55株中46株）が抗菌活性もしくは二次代
謝産物生合成関連遺伝子（PKS - I または NRPS 遺伝子）を有しており，新規創薬資源として期待される．なお，
一部の菌株については詳細な分類試験（形態，化学組成，
生理生化学的性状，DNA 解析に基づく多相分類）が進
行中であり，新種等として提案する予定である．
【乳酸菌】 既知種（乳酸菌15種，酵母 6 種）を用いた予備実験において，乳酸菌は特定の酵母とともに共培養す
ると，その生育が促進あるいは抑制される場合があることがわかった．このことから乳酸菌分離源の試料を Saccharomyces cerevisiae 等の酵母とともに液体培地中で前培養し，次いで平板分離する新法を構築した．この共培
養法を発酵食品に適用することで，通常の集積培養法で謝は分離することができない乳酸菌種が得られることがわかった．ミャンマーの発酵食品55点（野菜の漬物，魚や辞

エビのなれ鮨，発酵ペースト，発酵米麹，豆板醤等）か

本研究に対し，2 年間研究助成を頂いた公益財団法人

ら，酵母との共培養法及び集積培養法により253株（NITE

発酵研究所に感謝申し上げます．また，ミャンマー連邦

保有株も含む）の乳酸菌を分離し，上記同様に 16S rDNA

におけるサンプリングおよび共同事業においてミャン

解析による簡易同定を行なったところ，4 科，8 属，30

マー・パテイン大学の Nyunt Pay 学長ならびに（独）製品評

種に配属された．Lactobacillus 属菌が最も多く 80 %（202

価技術基盤機構の安藤勝彦博士と職員の方々に多大なご株）を占め，Weissella，Enterococcus，Pediococcus，Leuconostoc 属菌等がそれに続いた．Lactobacillus 属分離株

協力を賜りましたことに感謝申し上げます．

文の中には熱帯域の台湾やタイの発酵食品から分離例のある L. futsaii や L. plajomi が含まれていた．16S rDNA 解析に基づく新種推定株は12株（5 %）であった．有用性試験においては，253株中137株（54 %）が17種類の供試
糖類全てを資化した．また，228株（90 %）が単糖類，
二糖類の高い発酵能（培地 pH 4 以下への低下）を示した．
さらにバクテリオシン様の抗菌活性を持つ株も 5 株（2 %）あった．以上のように，ミャンマー産乳酸菌は分類学的に多様であり，発酵能が強いことから，新たな発酵食品
開発への利用が期待できる．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表
1） Maeno, M., Miyazaki, S., Ikoma, K., Ando, K., Pay, N. &Hayakawa, M. 2015. Isolation of motile actinomycetes byusing modified RC method from Japan and Myanmar. The
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早川

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− 38 −

IFO Res.Commun. 30
39-45, 2016

発酵菌による細胞リプログラミング機構の解明

発酵菌による細胞リプログラミング機構の解明
太

田

訓

正

熊本大学大学院生命科学研究部〒860-8556

熊本市中央区本荘 1-1-1

Molecular mechanism of cellular reprogramming by bacteria
Kunimasa Ohta
Department of Developmental Neurobiology, Graduate School of Life Sciences,
Kumamoto University
1-1-1 Honjo, Chuo-ku, Kumamoto 860-8556, Japan
Previously, we demonstrated cellular reprogramming by introducing lactobacilli into human dermal fibroblasts(HDFs), which could then differentiate into cells of the three germ layers in vivo and in vitro (Ohta et al., 2012).
The bacilli that causes leprosy had also been reported to expand their infection by the machinery of cellular reprogramming (Masaki et al., 2013). Although the phenomenon of bacterial reprogramming has been reported, themolecules capable of determining the fate of human cells have not been identified (Ito & Ohta, 2015).
Here, we showed that the molecule of somatic cell reprogramming is ribosomes. The treatment of ribosomes to
HDFs form cell clusters expressing stemness markers and inducible to trigerm layers derived cells. The ribosomes are incorporated to the cytoplasm and nucleus by activating endocytosis. As ribosomes are present in almost all living cells, their involvement in release of cell fate restraint suggests a new concept in the plasticity of celldifferentiation, evolution, and generation.
Key words: Lactic acid bacteria, reprogramming, multipotency, stem cell

諸言

宿主細胞の遺伝子発現に影響を与える可能性が示されている（Hooper et al., 2001）．しかしながら，腸内細菌に

腸の中では，様々な種類の菌が共生し一つの生態系を形作っている．乳酸菌とは，糖を分解して乳酸を生成す

よる腸上皮細胞機能への直接的影響などの基礎的情報
は，ほとんど明らかになっていない．

る細菌類の総称であり，腸内フローラを構成する善玉菌

我々は，「乳酸菌のような善玉菌を細胞に取り込ませ（人体に有用な働きをする菌の総称）の一つである．乳ると，宿主細胞に何らかの変化をもたらすはずである」

酸菌には腸の働きをよくするだけでなく，アレルギーをというアイデアから本研究をスタートし，乳酸菌をヒト

抑え，細菌やウイルス，癌に対する抵抗力を高める力が皮膚細胞に取り込ませることにより，宿主細胞にリプロある．乳酸菌やビフィズス菌がアトピー性皮膚炎や花粉

グラミングが起こり，乳酸菌を取り込んだ細胞が分化多症に予防効果があること，ヨーグルトを食べるとインフ能性を獲得するという発見を世界に先駆けて報告した（Ohta et al., 2012）．興味深いことに，「ヒト成人由来のルエンザにかかりにくくなるといった報告から，腸内細なる可能性を持っている．また，一般的な腸内細菌を無シュワン細胞は，ライ菌（Mycobacterium leprae）に感染すると多能性を獲得する」という論文（Masaki et al.,菌マウスの腸に過剰投与すると，腸の重要な機能（栄養2013）が発表されたことから，現在では，我々の研究が吸収，粘膜防御など）に関わる様々な遺伝子の発現が変ブレイクスルーとなり，1）バクテリアが細胞に感染する

化することから，腸内フローラ内における腸内細菌が，こと，2）取り込まれたバクテリアは宿主細胞をリプログ

菌は「現代医療のトップランナー」と言われるほど未知

ラムし，その遺伝子発現に影響を与え，多能性を付与す
E-mail: ohta9203@gpo.kumamoto-u.ac.jp
共同研究者：伊藤尚文（熊本大学大学院・生命科学研究部）

ることが認識されている（Ito & Ohta, 2015）．
本申請において，我々は，乳酸菌由来のリプログラミ− 39 −

太

田

訓

正

ング因子の同定を試み，その分子実体がリボソームであることを見出した（Ito et al., 投稿中）
．今振り返ってみ鏡で細胞が壊れているのを確認した．8,000 rpm, 5 min

ると，「ヒト皮膚細胞が生きた乳酸菌を取り込むと細胞42,000 rpm, 30 min, 4 ℃ で遠心し，上清を回収する．次塊を形成し，多能性を獲得する」という現象は，乳酸菌に 36,000 rpm, 6 hr, 4 ℃ で遠心後，上清を廃棄する．沈で遠心し，上清を回収する．0.45μm filter をとおした後，体内に充満するリボソームに起因する結果であったと考殿 を TMA-I 500μl で 溶 解 し た 後，Suc30 TMA-I（30 %えれば得心がいく．今後，マーギュリスが提唱した細胞

sucrose in TMA-I）3.5 ml に 500μl を重層した．最後に，内共生説（Margulis, 1970；嫌気性真核生物が好気性細36,000 rpm, 15 hr, 4 ℃ で遠心した後，上清を廃棄し，沈菌を飲み込むことにより共生し，現在の真核細胞へと進殿を 2 ml TMA-I buffer に溶解して，液体窒素で急速凍化した）を実験的に検証することで，「細菌を飲み込む

結後 −80 ℃ で保存した．

ことにより細胞内にミトコンドリアや葉緑体といった独自にエネルギーを生み出す小器官をもつ真核細胞の起源

細胞塊形成実験10 cm シャーレで HDF 細胞を Fibroblast Growth Me-の解明」が期待できる．

dium（Cell Applications, Inc） で 培 養 し た．10 ml の実験方法

CMF（Ca2＋ Mg2＋ フリーバッファー）で細胞を洗浄した．
0.25 % トリプシン溶液（1 mM EDTA 含有）を 1 ml 加え細胞と菌株て全体にいきわたらせ，CO2 インキュベーター（37 ℃）

HDF 細胞（Human Dermal Fibroblast cells, Cell Applica-に 5 分間入れた後，トリプシン阻害溶液（Cell Applica-

tions, Inc. Cat No.106-05a）
乳酸菌（Lactobacillus acidophilus JCM 1021）

tion Inc.）3 ml を加え懸濁し，細胞数を計数した．あらかじめ 24 well plate にサンプルを入れておき，1×105 の大腸菌（Escherichia coli JE28）

HDF 細胞を加えた．そのまま 37 ℃，5 % CO2 インキュベータで培養し，数日後，細胞塊形成を確認した．

乳酸菌由来画分の調製
MRS 培地を高圧蒸気殺菌後，乳酸菌（Lactobacillus
acidophilus JCM1021）を MRS 培地 20 ml に植菌し，37 ℃

多能性マーカーの誘導で 2 − 3 日間振盪培養した．次に，滅菌済みの前記培地

い て 細 胞 塊 を 形 成 し た． 培 養 2 週 間 後， マ ウ ス 抗

1 L を含んだ 3 L 振盪フラスコに植菌し，37 ℃ で 3 − 4α-Nanog 抗体（ReproCELL），ラット抗 Oct3/4 抗体（R&D），

乳酸菌から 70S リボソームを調製し，HDF 細胞を用

日間，振盪培養した．得られた培養液 1 L から遠心分離

マウス抗 TRA-1-60 抗体（Life Technologies），マウス抗（10,000 rpm, 10 min） に よ り 菌 体 を 集 め た．Phos-

SSEA4 抗 体（Life Technologies）， ラ ッ ト 抗 Sox2 抗 体

phate-Buffered Saline（PBS）に懸濁，遠心分離を 3 回繰（Life Technologies）で染色した．

り返して菌体を洗浄後，PBS（pH 7.0）30 ml に懸濁した．
菌体懸濁液を Branson ソニケーター 250D 超音波破砕装

細胞分化実験

置（Branson）で破砕した．得られた細胞抽出液に硫酸

HDF 細胞に乳酸菌由来の 70S リボソームを接触させアンモニウム（硫安）を添加し，4 ℃ で 2 時間冷却後，た後，2 週間後に細胞塊を取り出し，脂肪細胞，骨細胞，

遠心分離により菌体残渣を除いた．上清を回収後，一晩軟骨細胞に分化を誘導する培養液（GIBCO; A10072-01,

冷蔵庫で冷却した．サンプルを遠心分離（10,000 rpm,

A10070-01, A10071-01）に交換し，さらに 3 週間（ 3 日間

20 min, 4 ℃）により，タンパク質を沈殿させた．沈殿をおきに培養液を半分量交換）培養した．各々の細胞塊をTEA 緩衝液（pH 7.5）に溶解し，透析膜に入れ，一晩 4 ℃

Oil Red O 染色法（脂肪），Alizarin Red S 染色法（骨），で TEA 緩衝液に対して透析を行い，低分子の物質を取Alcian Blue 染色法（軟骨）により染色し，細胞の分化り除いた．透析したサンプルを回収し，限外ろ過フィル誘導を確認した．

ター（Millipore）でろ過した後，膜を透過しなかった濃縮サンプルを回収し，乳酸菌由来画分とした．

エンドサイトーシス阻害実験

リボソームの精製の割合で入れ，HDF 細胞（20,000 cells / 100μl）を加えた．

96 well plate に 70S リボソームを（0.5μg / 50μl / well）
集 菌（1 L あ た り 2.5−3.0 g） し た 乳 酸 菌 を TMA-I

各々のエンドサイトーシス阻害剤（50μl）を加えた後，

buffer（10 mM Tris-HCl pH 7.8, 30 mM NH4Cl, 10 mM

CO2 incubator で 2 日間培養した．細胞塊形成数を測定

MgCl2, 6 mM 2-メルカプトエタノール）40 ml に懸濁し後，MTT アッセイによる細胞死を測定した．

た．Sonication（GTC 1 hr, output 4, duty 50 %）後，顕微− 40 −

発酵菌による細胞リプログラミング機構の解明

結果と考察

ラクションを別のイオン交換カラム（ReQ）にとおすと，
シングルピーク（No. 11）に細胞塊形成能が存在するこ

乳酸菌由来のリプログラム物質の探索とを見出した（Fig. 2）．このフラクションを SDS- PAGE

我々の研究グループは，ヒト皮膚細胞（Human Dermal

にかけてタンパク質を分離し，各々のバンドを切り出し

Fibroblasts）をトリプシン処理後，生きた乳酸菌（Lactobacillus acidophilus JCM 1021）と混ぜると，ヒト皮膚細胞た後，質量分析解析法によりタンパク質を同定した．他が乳酸菌を取り込むことにより細胞塊を形成し，三胚葉ムを構成するタンパク質が幾つか見られたことから，リ由来の細胞へと分化できる多能性を獲得することを報告した（Fig. 1; Ohta et al., 2012）．次なる重要な問題は，ボソームがリプログラミングに関与しているのではと推

乳酸菌由来の何がヒト皮膚細胞に多能性を付与するの（L12）を産生しない KO マウスを作製すると分化と形か？ということである．乳酸菌を大量培養後，硫安沈殿態が異常になり，リボソームを構成する個々のタンパク

後のある画分を，最初のイオン交換カラム（QFF）にと質は初期のかたち作りにおいて様々な機能を有することが示唆されているからである（Kondrashov et al., 2011）．

おして細胞塊形成能を調べた．細胞塊形成活性が観察さの得られたタンパク質リストを眺めていると，リボソー

測した．何故なら，リボソームを構成するタンパク質

れたフラクション（No. 9）をピックアップし，次のゲ
ルろ過交換カラム（GelF）にとおして，細胞塊形成活

乳酸菌由来リボソームによる細胞塊形成
リボソームは，現存するすべての生命に共通したタン性があるピーク（No. 14）を見出した．さらに，このフパク質合成マシーンであると認識されている（Topisirovic & Sonenberg, 2011）．リボソームは，50種類以上のタンパク質と少なくとも 3 種類の RNA との複合体からなる細胞内で最も大型で複雑な構造物で，大小 2 つのサブユニットから構成され，3 分の 2 が RNA，3 分の 1
がタンパク質である．我々は，超遠心法を用いて乳酸菌
からリボソームタンパク質を精製し，細胞塊形成実験を行ったところ，Fig. 3 に示すように細胞塊が形成された．

Fig. 1 Microorganisms reprogram the host cells. Cell clusters
induced by LAB were transformed into cells of the threegerm layers by cultivating under appropriate differentiation conditions (Ohta et al., 2012).

Fig. 3Fig. 2 Identification of cell cluster formation activity from LAB.
We fractioned the LAB lysate and observed the cell cluster forming activity by performing three column chromatography, SDS-PAGE, and LC/MS/MS analyses.

− 41 −

Ribosomes have the cell cluster formation activity. From
Fig. 2 analyses, we speculated that ribosomes are thecandidate reprogramming material and performed thecell cluster formation analysis. Note the formation of ribosomes-induced cell clusters from HDFs.

太

田

遺伝子発現解析訓正

索が白く染まっている），脂肪細胞へ分化誘導された細ヒト皮膚細胞に，乳酸菌由来リボソームを取り込ませ胞は Oil Red O 染色法により染色された（黒く染まってて作製した細胞塊が，多能性を獲得したかを調べるためいる細胞が脂肪細胞）．これらの結果は，リボソームをに，遺伝子発現解析を行い，コントロールのヒト皮膚細取り込んだ細胞は，多能性を獲得し，培養条件を変える胞と細胞塊間における多能性遺伝子の発現を比較した．

ことにより他の種類の細胞へと分化できることを示してFig. 4 に示す遺伝子群は多能性マーカーであるが，上グいる．

ループの遺伝子群はコントロールのヒト皮膚細胞では発現が弱いが，細胞塊ではそれらの発現量が上昇している．

大腸菌由来リボソームによる細胞塊形成と細胞分化

逆に，下グループでは，ヒト皮膚細胞での発現が強く，今までの実験では，主に超遠心法で精製した乳酸菌由

細胞塊では発現量が減少している．この結果は，取り込

来リボソームを用いていたが，他のバクテリア由来のリ

まれたリボソームは宿主細胞の遺伝子発現に影響を与えボソームでも同様の細胞塊形成能があるのかを検討しることを示している．

た．スエーデンの Sanyal 研究グループが，人工的にリリボソームを取り込んだ細胞塊の細胞分化
リボソームを取り込んだ細胞塊が多能性を有するのであれば，培養条件を変えることで様々な細胞へと分化できるはずである．そこで，リボソームを取り込ませて細胞塊を形成後，神経細胞または脂肪細胞へと分化誘導する培養液で細胞塊を培養し，その分化を観察した．神経細胞への分化は，神経マーカーである Tuj 1 抗体を用いた免疫細胞染色法，脂肪細胞への分化は Oil Red O 染色法により調べた．Fig. 5 に示すように，神経細胞へ分化誘導を行った細胞は Tuj 1 抗体により認識され（神経軸Fig. 4 Global gene-expression profiles in LAB-ribosomes-induced cell clusters for genes involved in stem cell maintenance. Fold-change in expression of differentially expressed genes between LAB-ribosomes induced cellclusters and control HDFs.

Fig. 5

Schematic drawing of cell cluster formation and cell differentiation procedure. LAB-ribosomes-induced cellclusters transformed into neuronal cells and adipocytes
by cultivating under appropriate differentiation conditions.

Fig. 6

Cell cluster formation and cell dif ferentiation. Ribosomes derived from Escherichia coli also induced cellclusters and they were transformed into adipocytes, osteoblasts, and chondrocytes by cultivating under appropriate differentiation conditions.

− 42 −

発酵菌による細胞リプログラミング機構の解明

ボソームタンパク質 L12 に His タグを付けた大腸菌を作製し，その精製方法を報告していた（Ederth et al.,を混合してみると，細胞質に多くの蛍光ビーズが取り込

2009）．彼らから，この大腸菌（ JE28）の供与を受け，えたリボソームは，エンドサイトーシスとトリプシン処

His タグカラムを用いたアフィニティークロマトグラ

理の相乗作用により細胞内に取り込まれることを示してフィーを実施してリボソームを精製し，同様の細胞塊形

いる．

まれていた（Fig. 7B）．これらの結果は，細胞外から加成実験を行った．Fig. 6 に示すように，大腸菌由来のリ要

ボソームを取り込んだヒト皮膚細胞は，細胞塊を形成し，培養条件を変えることにより脂肪細胞，骨細胞，軟骨細約胞へと分化した．また，本実験により，我々が超遠心法

本申請では，乳酸菌由来のリプログラミング因子の同で精製した乳酸菌由来リボソームに何かが混入している定を目標とし，その分子実体がリボソームであることを可能性も排除できた．

見出した．ヒト皮膚細胞がリボソームを取り込むと，細胞塊を形成し，多能性マーカーの発現を誘導した．また，リボソームを細胞内に取り込むメカニズム

細胞塊を様々な分化誘導培養液で培養すると，三胚葉由

細胞外物質が細胞内に取り込まれるメカニズムとし来の細胞へと分化した．さらに，リボソームはエンドサて，エンドサイトーシスの関与が考えられる．そこで，イトーシスとトリプシン処理による相乗効果により細胞5 種類のエンドサイトーシス阻害剤の存在下で細胞塊形

内に取り込まれ，リボソームは細胞質だけでなく核内に成実験を行った．Fig. 7A に示すように，すべてのエン

局在していた．乳酸菌以外にも，超遠心法やアフィニ

ドサイトーシス阻害剤は細胞塊形成を約 50 % 抑制した．

ティークロマトグラフィーにより精製された大腸菌由来

100 % 抑制まで検討できなかったのは，阻害剤の濃度をリボソームでも，同様の細胞塊形成能を発揮した．興味あげると細胞が死んでしまうからである．Geloen 研究

深いことに，ヒト皮膚細胞から精製したリボソームをヒグループが，トリプシン処理後の細胞は，細胞外からのト皮膚細胞に取り込ませても細胞塊が形成されることか物質の取り込みが増強されるという論文を発表していたら，リボソームによる多能製獲得は普遍的な現象である（Serdiuk et al., 2014）．我々は，直径が 50 nm である蛍光と考えられる．

ビーズを培養中のヒト皮膚細胞に直接加えてみたが，細本研究報告は，確固たる実験結果に基づく提案であり，胞質内への取り込みはほとんど観察されなかった．とこ

リボソームの発生・細胞生物学における新しい原理の発ろが，トリプシン処理直後のヒト皮膚細胞に蛍光ビーズ

展に結びつく発展性がある．例えば，約20億年前に古細Fig. 7 Incorporation of ribosomes into the cell is enhanced by
endocytosis and trypsinization. (A) Cell cluster formation was performed in the presence of the five endocytosis inhibitors. Note that the numbers of cell clusters
were decreased with inhibitors. filipin (FP), genistein(GS), cytochalasin B (CC), 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-amiloride (EA), bafilomycin A1 (BM), concanamycin A(CM). (B) The incorporation of fluorescence beads (diameter: 50 nm) was enhanced by trypsinization.

Fig. 8− 43 −

Schematic drawing of LAB incorporation into the cell.
The alive LAB were applied to the trypsinized HDFs extracellularly and they were incorporated into the cell by
the endocytosis and the trypsin treatment. The cell wallof the incorporated LAB breaks down and the ribosomes
flow out from the bacterial body, resulting in the localization of ribosomes in the nucleus as well as the cytoplasmic region.

太

田

訓

正

菌と真正細菌の共生関係を経て誕生した真核細胞が，ミsearch (ISSCR), June 24 – 27, 2015, Stockholm, Sweden.
14） 太田訓正．乳酸菌由来のリプログラム物質の固定とその特 徴， 第17回 日 本 RNA 学 会 年 会， 札 幌，2015年 7 月
15 – 17日
15） 太田訓正，伊藤尚文．乳酸菌由来天然物質によるヒト繊維芽細胞の多能性細胞への変換，日本プロテオーム学会
2015年会，熊本，2015年 7 月23 – 24日16） 太田訓正．Tsukushi を用いた体性幹細胞研究から，乳酸菌由来リプログラム因子を用いた多能性細胞の創造へ，
さきがけ研究会2015，沖縄，2015年 9 月20 – 22日17） 太田訓正．リボゾームによる細胞の多能性獲得機構，創薬分子プロファイルング研究センターセミナー，東京，2015年 9 月29日
18） Ohta, K. Stem cell-based tissue regeneration research andeducation unit, development and adult Neurogenesis in
the central ner vous system2015, Oct,5 – 7, 2015, Baeza,
Spain.
19） 太田訓正．乳酸菌由来物質による癌細胞リプログラミン
グ機構，㈶アステラス病態代謝研究会，東京，2015年10月16 – 17日
20） 太田訓正．リボソームによるヒト皮膚細胞の多能性獲得
機 構， 第38回 日 本 分 子 生 物 学 会， 神 戸，2015年12月
2 – 3日21） 太田訓正．リボソームによる細胞の多能性獲得機構，
2015年度ヒト幹細胞情報化推進事業 SKIP セミナー #23，
東京，2015年12月12 – 13日22） 太田訓正．Ribosome converts human fibroblasts to mutipotent cells, CiRA/ISSCR 2016 International Symposia，
京都，
2016年 3 月22 – 24日

トコンドリアやクロロプラストを獲得した細胞内共生説（Margulis, 1970）と同様に，リボソームによる細胞リプ
ログラミングが低頻度ながらも進化の潮流になっている可能性がある．つまり，真核細胞は絶えず様々なバクテ
リアの感染に晒され，そのリボソームを細胞質や核内に取り込むことにより，細胞をリプログラミングしてより良い性質を有する細胞を進化させてきたのかもしれない（Fig. 8）．今後，リボソーム内に存在するリプログラミ
ング機能ドメインを同定し，リボソーム構成タンパク質の新たな機能的一面を解き明かせれば，発生・進化学に大きなインパクトを与えられると確信している．

本助成で得られた研究成果報告
口頭発表1） 伊 藤 尚 文， 河 野 利 恵， 太 田 訓 正．Human fibroblast reprogramming by lactic acid bacteria，第47回日本発生生物学会年会，名古屋，2014年 5 月27 – 30日
2） 太田訓正，河野利恵，伊藤尚文．Lactic acid bacteria convert human fibroblasts to multipotential Cells， 第12回 幹細胞シンポジウム，福岡，2014年 5 月30 – 31日
3） 太田訓正．バクテリアと相互作用を介した細胞プログラ
ミング，北海道大学遺伝子病制御研究所セミナー，札幌，
2014年 6 月 2 日
4） Ohta, K. Lactic acid bacteria convert human fibroblasts tomultipotent cells, 12th Annual Meeting of the International
Society for Stem Cell Research (ISSCR), June.18 – 21, 2014,
Vancouver, Canada.
5） 太田訓正．バクテリアとの相互作用を介した細胞プログ
ラミング，金沢大学がん進展制御研究所セミナー，金沢，
2014年 7 月25日
6） 太田訓正．乳酸菌による細胞のプログラミング，東京大学大学院 第998回生物科学セミナー，東京，2014年 9 月
22日7） 太 田 訓 正．Lactic acid bacteria よ る ヒ ト 皮 膚 細 胞 のreprograming， 第 7 回 Retina Research Meeting， 東 京，
2014年11月22日
8） 太田訓正．バクテリア由来物質による細胞プログラミン
グ，第37回日本分子生物学会，横浜，2014年11月25 – 27日
9） 太田訓正．乳酸菌による細胞のプログラミング，九州大
学 理学部セミナー，福岡，2014年12月 9 日10） 太田訓正．乳酸菌を用いた繊維芽細胞を多能性細胞に転換する技術とそのリプログラミング因子，平成26年度バ
イオビジネスアワード，大阪，2015年 2 月 9 日11） 太田訓正．Lactic acid bacteria – derived materials convert
human fibroblasts to multipotent cells，第13回幹細胞シンポジウム，東京，2015年 5 月29 – 30日12） 太田訓正．Human cell reprogramming by defined factors
isolated from lactic acid bacteria，第48回日本発生生物学会年会，つくば，2015年 6 月 2 – 5 日13） Ohta, K. Natural factors derived from lactic acid bacteria
convert human fibroblasts to multipotent cells, 13th Annual Meeting of the International Society for Stem Cell Re-

原著論文
1） Ito, N. & Ohta, K. 2015. Reprogramming of human somatic
cells by bacteria. Develop. Growth Differ. 57: 305 – 312.
2） 太田訓正．2014．乳酸菌による多能性細胞の創造．日本
乳酸菌学会誌 25: 13 – 17.
特許出願1） 太田訓正，伊藤尚文：細胞の再プログラミング誘導法，および多能性細胞の製造方法 特願2014 - 98213
2） 太田訓正，伊藤尚文：細胞の再プログラミングを誘導する組成物，及び該組成物を用いた多能性細胞の製造方法
特願2015 - 223656

謝辞本研究に対し，研究助成を頂いた公益財団法人発酵研究所に深く感謝致します．

文

献Ederth, J., Mandava, C.S., Dasgupta, S. & Sanyal, S. 2009. A single-step method for purification of active His-tagged ribosomesfrom a genetically engineered Escherichia coli. Nucleic Acids
Res. 37: e15.
Hooper, L.V., Wong, M.H., Thelin, A., Hansson, L., Falk P.G. &− 44 −

発酵菌による細胞リプログラミング機構の解明
Gordon, J.I. 2001. Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine. Science 291: 881 – 884.
Ito, N. & Ohta, K. 2015. Reprogramming of human somatic cellsby bacteria. Develop. Growth Differ. 57: 305 – 312.
Kondrashov, N., Pusic, A., Stumpf, C.R., Shimizu, K., Hsieh, A.C.,
Xue, S., Ishijima, J., Shiroishi, T. & Barna, M. 2011. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell 145: 383 – 397.
Margulis, L. 1970. Recombination of non-chromosomal genes inChlamydomonas: assor tment of mitochondria and chloroplasts? J Theor Biol 26: 337-342.

Masaki, T., Qu, J., Cholewa-Waclaw, J., Burr, K., Raaum, R. &Rambukkana, A. 2013. Reprogramming adult schwann cells tostem cell-like cells by leprosy bacilli promotes dissemination of
infection. Cell 152: 51-67.
Ohta, K., Kawano, R. & Ito, N. 2012. Lactic acid bacteria convert
human fibroblasts to multipotent cells. PLoS ONE 7: e51866.
Serdiuk, T., Alekseev, S., Lysenko, V., Skryshensky, V. & Geloen,
A. 2014. Trypsinization-dependent cell labeling with fluorescent nanoparticles. Nanoscale Res. Lett. 9: 568.
Topisirovic, I. & Sonenberg, N. 2011. Translational control by the
eukaryotic ribosome. Cell 145: 333 – 334.

− 45 −

IFO Res.Commun. 30
47-56, 2016

胆汁酸を責任分子と想定した西欧食による腸内細菌叢崩壊機構の解明

胆汁酸を責任分子と想定した西欧食による
腸内細菌叢崩壊機構の解明
横田篤

北海道大学大学院農学研究院〒060-8589

北海道札幌市北区北 9 条西 9 丁目

Clarification of the Mechanism Underlying Gut Microbiota Alteration
by Western Diet Hypothesizing a Bile Acid as the Responsible Molecule
Atsushi Yokota
Laboratory of Microbial Physiology, Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University
Sapporo, Hokkaido 060-8589, Japan
We have previously demonstrated that some bile acids, especially deoxycholic acid (DCA) have strong antimicrobial activity and regulate the composition of cecal microbiota in rats. As increased intestinal bile acid flow occurs in
response to the administration of a high fat diet, bile acids may function as a selective pressure to alter the gut microbiota composition in response to a high fat diet, which we term the bile acid hypothesis. To evaluate bile acid asa host regulatory factor for gut microbiota composition, detailed information on the bactericidal activities of the diverse molecular species of bile acid in humans and rodents is required. We investigated the toxicity of 14 free bile
acids (FBAs) in humans and rodents by monitoring intracellular pH, membrane integrity, and viability of a representative intestinal bacterium, Bifidobacterium breve JCM 1192T, upon exposure to these FBAs. Among them,ω-muricholic acid (ωMCA) showed the highest toxicity, approximately 10 times stronger than DCA. Based on thebactericidal activity of each FBA and their in vivo concentrations in rat feces, FBAs, particularly, ωMCA, β-muricholic acid (βMCA), hyodeoxycholic acid, and DCA, may exhibit selective pressure and control the bacterial populations in the rodent intestine.
Next, the effects of high-fat diets on the bile acid secretion and the microbiota composition in rat cecum were studied. WKAH/Hkm Slc rats continuously fed high-lard (HL) diet exhibited the prominent increase in the amount of
ωMCA, DCA and βMCA compared to Control diet. HL diets induced phylum level alterations in the composition of
the gut microbiota; Firmicutes predominated at the expense of Bacteroides. Analysis of operational taxonomic units(OTUs) revealed that specific bacteria at the genus levels from Firmicutes were highly concentrated in the HLgroup. In addition, we successfully isolated the member of OTUs corresponding to the genus Blautia, Clostridium,
Ruminococcus, Eisenbergiella and Lactobacillus, which showed significantly higher proportions in HL group, andthat of those corresponding the genus Bacteroides and Parabacteroides from Bacteroidetes, which showed low proportions in HL group. In DCA resistance test, those bacterial isolates belonging to the phylum Firmicutes showed
higher resistance to DCA (in terms of IC50 values) than those belong to the phylum Bacteroidetes. In correlation
analysis between the total concentration of ωMCA, DCA and βMCA and proportion of isolated intestinal bacteria
in the whole population, the OTUs corresponding to the genus Clostridium and Lactobacillus were positively correlated with the total concentration of ωMCA, DCA and βMCA in rat cecal contents fed HL and control diet, while
the OTU corresponding to the genus Bacteroides were negatively correlated. The common OTUs that significantly
increased or decreased in response to both the HL diet and cholic acid supplemented diet were detected. These
results strongly supported the “bile acid hypothesis”
Key words: bile acids, high-fat diets, gut microbiota, host-microbe interaction, bile acid hypothesis.

− 47 −

横田

篤

Abbreviations: αMCA, α-muricholic acid; βMCA, β-muricholic acid; CA, cholic acid; 5(6)-CFDA-SE, 5-(and 6)-carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester; CDCA, chenodeoxycholic acid; DCA, deoxycholic acid; HL, highlard; LC/MS, liquid chromatography/ mass spectrometry; ωMCA, ω-muricholic acid; λMCA, λ-muricholic acid;SD rat, Sprague-Dawley rat; IC50, inhibitor y concentration 50; OTU, operational taxonomic unit; 3-oxo-12α3-oxo-12α-hydroxy-5β-cholan-24-oic acid; 7-oxo-DCA, 7-oxo-deoxycholic acid; 7-oxo-LCA, 7-oxo-lithocholic acid;12-oxo-LCA, 12-oxo-lithocholic acid; QIIME, Quantitative Insights Into Microbial Ecology; UCA, ursocholic acid;
UDCA, ursodeoxycholic acid; WKAH rat, Wistar King A Hokkaido rat

諸言に示した），これらは最終的に24位のカルボキシル基にタウリンあるいはグリシンがアミド結合した抱合胆汁酸

今から約10年前に，肥満の発症に伴い腸内細菌叢の構として胆汁の構成成分となる．胆汁酸はその強い界面活成バランスが崩れることが動物モデルやヒト介入試験に性作用により小腸で食事中の脂質や脂溶性ビタミン成分

より報告されて以来，腸内細菌叢と健康の関係に注目がを乳化し，それらの消化吸収を補助する役割を担ってい

集まっている．その後次世代シークエンサーの普及に伴る．高脂肪食を摂取すると，その分余分に胆汁酸が必要

い，臨床研究においても肥満のみならず， 2 型糖尿病，になるので，より多量の胆汁が分泌される．役目を終え大腸がん，炎症性腸疾患など様々な疾病の発症に伴う菌た抱合胆汁酸は腸管循環により，小腸下部から再吸収さ

叢構成の変化が明らかにされてきた．現在は腸内細菌叢れ肝臓に戻される．しかし，ごく一部（全体の 5 %）のの変化と疾病発症の因果関係の解明に力が注がれてい胆汁酸は大腸へ流入し糞便と共に体外へ排泄される．こる．とりわけ高脂肪食摂取に伴う肥満，それに連なる糖代謝異常，高脂血症，高血圧などのメタボリックシンド
ロームの発症に注目すると，菌叢変化と病態発症の関連性については未だに不明な点が多い．翻って考えるなら
ば，高脂肪食の摂取により菌叢構成のバランスが変化す
る機構についてすら未だ不明なのである．そこで我々は微生物学研究者の責務として，高脂肪食摂取に伴う菌叢
構成バランスの変化を引き起こす機構を解明することとした．我々はそのための作業仮説として胆汁酸の関与を推定した．なぜなら，胆汁酸は強い殺菌活性を持ち，高脂肪食摂取により分泌量が増大するため，高脂肪食摂取
時に腸内細菌に対する選択圧として作用することが予想されたためである．胆汁酸の殺菌活性は古くから知られていたが，これが腸内細菌叢全体にどのような影響を与えているかについては，後述する我々の先行研究まで一
世紀以上にわたって検討すらされていなかった．
ここで胆汁酸について簡単に説明する．胆汁酸は肝臓でコレステロールから合成され，十二指腸に胆汁の主成分として分泌されるステロイド化合物であり，24位の炭素がカルボキシル基であるコラン酸を基本骨格としている．ヒトでは肝臓でコール酸（CA）とケノデオキシコー
ル酸（CDCA）が合成され（各胆汁酸の構造式は Fig. 1
E-mail: yokota@chem.agr.hokudai.ac.jp
共同研究者：吹谷 智（北海道大学大学院農学研究院），
林 哲也（九州大学大学院医学研究院），
小椋義俊（九州大学大学院医学研究院），
石塚 敏（北海道大学大学院農学研究院），
萩尾真人（東洋大学生命科学部）

Fig. 1− 48 −

Structures of the tested free bile acids.

胆汁酸を責任分子と想定した西欧食による腸内細菌叢崩壊機構の解明の間に胆汁酸は大腸内の腸内細菌によってまず脱抱合さのみで，齧歯類に存在する MCA 分子種を含めた包括的れてタウリンあるいはグリシンが外れ遊離胆汁酸になった後，さらにデオキシコール酸（DCA）やリトコール

な解析は行われていない．そこで本研究では，腸内細菌
Bifidobacterium breve JCM 1192T を指標菌として，ヒト酸（LCA），オキソ型やβ型の二次胆汁酸に変換される．

や齧歯類に存在する14種の胆汁酸分子の殺菌活性を決定

遊離胆汁酸や二次胆汁酸は分子の疎水性が増大するた

した．次にこれらの実験結果を踏まえてラットモデルにめ，一般に強い殺菌活性を示すようになる．これは胆汁酸がリン脂質から構成される細菌の細胞膜に作用して膜よる高脂肪食投与試験を行い，菌叢変化と胆汁酸分泌の関連性を in vivo で解析することで，胆汁酸仮説の証明

損傷を起こすためである．中でも二次胆汁酸とりわを試みた．

け DCA の 殺 菌 活 性 は 極 め て 強 力 で，Lactobacillus や
Bifidobacterium 属細菌を用いた試験では CA の約10倍の実験方法

殺 菌 活 性 を 有 す る こ と が 示 さ れ て い る（Kurdi et al.,2006）．また，DCA の殺菌活性は動物モデルやヒトの腸試薬

内の生理濃度で発揮される．以上のことから我々は，高コール酸ナトリウム（CA），デオキシコール酸ナトリ

脂肪食を摂取すると大腸内の DCA 濃度が高まり，それウム（DCA）および CDCA は Sigma-Aldrich（St. Louis,が選択圧となって菌叢構成が変化するのではないかと想MO, USA）から，ウルソデオキシコール酸ナトリウム定し，上述の作業仮説に至ったものである．

（UDCA）および 7-oxo-LCA は Tokyo Chemical Industry

事実，先行実験として我々はまず，胆汁酸が腸内細菌

Co., Ltd.（Tokyo, Japan）， ウ ル ソ コ ー ル 酸（UCA） は叢を制御する宿主因子であることを見出した（Islam etal., 2011）．すなわち CA を添加した胆汁酸添加食をラッSanta Cruz Biotechnology. Inc.，（Dallas, TX, USA）からトに与えたところ，糞便中の総胆汁酸量および DCA 量が増大し，盲腸内において Firmicutes 門の上昇およびHDCA，7-oxo-DCA, 12-oxo-LCA お よ び 12α-hydroxy-3-

Bacteroidetes 門の減少が観察された．興味深いことに，

port, RI, USA）から購入した．

これは高脂肪食を摂取させたマウスモデルにおける変化（Hildebrandt et al., 2009; Turnbaugh et al., 2008, 2009）

細胞内 pH 測定による胆汁酸の細胞膜損傷能の予測

そ れ ぞ れ 購 入 し た．α-MCA, β-MCA, ω-MCA, λ-MCA,
oxo-5β-cholanic acid（3-oxo-12α）は Steraloids, Inc.（New-と類似しており，両モデルで Clostridia 綱や Erysipelotrichi

我々はこれまで，遊離胆汁酸の殺菌活性の機構は細胞綱の増加が観察されている．以上の結果から，我々は高膜損傷作用であることを明らかにしている（Kurdi et al.,

脂肪食摂取による菌叢バランスの崩壊要因は，胆汁酸に2006）．この研究において我々は遊離胆汁酸による細胞よる選択圧の増大であることを強く確信し，これを「胆汁酸仮説」として提唱した（Yokota et al., 2012）．今回膜損傷を評価する効果的な手法を確立している．それは細胞膜を隔てた水素イオンの濃度勾配を，B. breve JCMの助成研究の目的は「胆汁酸仮説」を証明することであ1192T の細胞内 pH を蛍光法により測定することによりる．本仮説が証明できれば，菌叢変化と肥満やメタボリッ

経時的に追跡する方法である．この方法では，まず本菌

クシンドロームなどの病態発症との因果関係を解明する

をグルコースによりエネルギー的に活性化する．この時，上で有益な視点となる可能性がある．

解糖反応により生成された ATP がプロトンポンプを駆本助成研究では，ラットを用いた動物試験により本仮動して細胞外にプロトンを排出するので，細胞内が細胞説の証明を試みた．検討の流れとして，まずマウスやラッ

外に比べて相対的にアルカリ性になり，細胞内外に pH

トなどの齧歯類モデルの腸内に存在する様々な胆汁酸分
子種の腸内細菌への殺菌活性（細胞毒性）を in vitro で差（ΔpH）が確立される．続いて遊離胆汁酸を細胞外にの実験で検討した．齧歯類では固有の一次胆汁酸分子種

細胞膜を容易に通過し細胞内でプロトンを放出して細胞与えると，非解離型の遊離胆汁酸は疎水性が強いため,として CA や CDCA に加え，α-ムリコール酸（αMCA）

内 pH を低下させる．これを繰り返すと最終的に ΔpHや β-ムリコール酸（βMCA）が肝臓で合成され，腸内が消失する．このとき水素イオン以外のイオンや代謝中

細菌により ω-ムリコール酸（ωMCA）やλ-ムリコール

間体が損傷した細胞膜を通して細胞外に漏出し，細胞死酸（λ-MCA），ヒオデオキシコール酸（HDCA）などのがおこる．従って ΔpH を消去する遊離胆汁酸濃度を決

二次胆汁酸に変換されるため，ヒトよりも多種多様な胆定することで，その胆汁酸が本菌に対して毒性を発揮す

汁酸が存在する．これまでに胆汁酸の殺菌活性についてる濃度域を予測することができる．本実験系を用いて，は，CA, DCA, CDCA, 7-oxo-DCA, 3β-DCA の腸内細菌等

これまで我々は DCA および CDCA が CA の 1/10 の濃への作用が報告されている（Stacey & Webb, 1947; Flochet al., 1972; Kurdi et al., 2006; Devlin & Fischbach, 2015）

度で ΔpH を消失させること，すなわち DCA や CDCA
は CA よりも10倍高い細胞膜損傷作用を示すことを明ら− 49 −

横田篤

た．LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit（Thermo

かにしている．
細胞内 pH の測定試験は Kurdi et al.（2006）の方法に

Fisher Scientific）の SYTO9 と PI を等量混合した染色液

基づいて行った．B. breve JCM 1192T 株を 0.025 % L-シス

を加えて 37 ℃ で 15 min 保持した．蛍光光度計を使用しテイン塩酸塩を含む 1/2 MRS 培地（Becton, Dickinsonて 480 nm で励起後，500−530 nm の面積（Live area）とand Company, Franklin Lakes, NJ, USA）で 37 ℃ で嫌気

620−650 nm の面積（Dead area）を測定し，Live/Dead

的に一晩前培養した．菌体を接種したネジ口試験管を比を算出した．各時間の未処理の Live/Dead 比を基準値

N2：CO2：H2＝8：1：1 の混合ガスで置換することで嫌と し て， 各 培 養 時 間 に お け る membrane integrity（%）

気条件にした．この前培養菌体を初期 OD660 が 0.05 にを算出した．

なるように同培地に接種し，本培養を行った．OD660 が0.6 付近に達するまで同条件で 37 ℃ で嫌気的に培養後，生残率測定試験培養液を遠心分離して菌体を回収した．Buffer 1（50 mM

生残率測定試験は Kurdi et al.（2006）の方法に基づい

リ ン 酸 カ リ ウ ム（pH 6.5），1 mM 硫 酸 マ グ ネ シ ウ ム，て行った．細胞膜損傷試験と同様の方法で調製した細胞

0.1 U/ml 西洋わさびペルオキシダーゼ）にて遠心洗浄後，懸濁液 100μL を回収してプレートに添加し，0.025 % シ

Buffer 2（150 mM リン酸カリウム（pH 6.5），1 mM 硫酸

ステイン塩酸塩を含む 1/2 MRS 培地を加えて混釈培養

マグネシウム，1.0 U/ml 西洋わさびペルオキシダーゼ）を行った．嫌気パウチを入れたアネロパックを用いて48

にて OD660 が 0.5 となるように懸濁した．細胞懸濁液に時間以上嫌気培養した．各時間の未処理サンプルの CFU

膜透過性の pH プローブ（5（and 6）-carboxyfluorescein

を生残率 100 % として，各培養時間における生残率を算

diacetate, succinimidyl ester（5（6）-CFDA-SE）（Thermo

出した．

Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA）を終濃度 4μMとなるように添加後，37 ℃ で 30 min 培養してプローブ

動物実験を細胞内に導入した．遠心分離後，Buffer 2 にて再懸濁

3 週齢の雄 SD ラットおよび WKAH/Hkm Slc ラット

し，グルコースを終濃度 10 mM となるように添加してを用いて，デキストリン食による 2 週間の予備飼育後，37 ℃ で 1 時間培養することで，細胞内に結合しなかっ

2 群（n＝5〜6）に分け，それぞれにデキストリン食あたプローブを細胞外に排出させた．細胞懸濁液を遠心分

るいはデキストリン食に 23 % のラードを添加したデキ

離後，Buffer 2 にて遠心洗浄した．等量の Buffer 2 にて

ストリン-高ラード食を与えて， 8 週間の長期投与試験

再懸濁後，氷冷で保持して細胞内 pH 測定に供した．石を 行 っ た（ そ れ ぞ れ 対 照 群，HL 群 ）． 食 事 の 組 成 は英キュベットに調製した細胞懸濁液 2 mL を添加後，蛍Table 1 に示した．盲腸内容物を採取後，LC/MS を用い

光光度計（PerkinElmer LS-50B）を用いて細胞内の蛍光た胆汁酸分析およびメタ 16S 菌叢解析を行った．この強度を測定した．測定の際には，スターラーバーで撹拌しながら 37 ℃ で保持し，混合ガス（100〜200 mL/min）

Table 1

を 流 し た． 蛍 光 強 度 が 安 定 後， グ ル コ ー ス を 終濃度

Compositions of control diet and HL diet.

10 mM になるように添加した．蛍光強度が安定後，各胆 汁 酸 を 蛍 光 強 度 が 変 化 し な く な る ま で 添 加 し た．
20μM Valinomycin 2μL（ 膜 電 位 ΔΨ を 消 去 ） お よび
0.2 mM Nigericin 2μL（ΔpH を消去）を添加し，ΔpH の消失を確認した．測定終了ごとに各 pH における蛍光強度を測定し，検量線を作成し，それを用いて細胞内 pHを求めた．
細胞膜損傷試験
細胞膜損傷試験は Kurdi et al.（2006）の方法に基づいて行った．細胞内 pH 測定試験と同様の方法で菌体を培養後，遠心分離により菌体を回収し，Buffer 2 にて遠心洗浄した．Buffer 2 にて OD660 が 0.3 となるように懸濁後，グルコース（終濃度 10 mM）および各種胆汁酸を添加して 37 ℃ で 1 時間および 3 時間培養した．細胞懸濁

ab

液を回収して遠心分離後，等量の Buffer 2 にて再懸濁し− 50 −

Standard (Control) diet consisted mainly of dextrin.
High-lard (HL) diet prepared by adding 230 g/kg lard to thestandard diet at the expense of dextrin.

胆汁酸を責任分子と想定した西欧食による腸内細菌叢崩壊機構の解明

間，体重，摂食量，肝臓および脂肪重量などの宿主の基液体培地に接種し，嫌気チャンバーにて 37 ℃ で 2 日間

礎データを取得した．

嫌気培養した．アルカリボイル法により培養液より
DNA を抽出後，前述のメタ16S菌叢解析と同じ方法によLC/MS を用いた胆汁酸分析
胆汁酸分析は Hagio et al.（2009）の方法に基づいて

り 16S rRNA 遺伝子シーケンスを行った．

行った．盲腸内容物 200 mg にエタノールとノルデオキ

DCA 耐性試験

シコール酸（終濃度 1μM）を内部標準として加えた．

胆 汁 酸 を 含 ま な い GAM-0.1 M MOPS 培 地（pH 7.0）

撹拌後，60 ℃ で30分，85 ℃ で 3 分間加熱した．遠心分

5 mL に各分離株を接種し，嫌気チャンバーにて 37 ℃ で離後，上清を回収して遠心濃縮した．上清の回収を 3 回

嫌気的に一晩前培養を行った．初期 OD660＝0.05 になる繰り返した後，メタノールに懸濁し固相抽出カラムにてように 0, 0.5, 0.75, 1.0 および 1.5 mM DCA を含む GAM-精製した．遠心濃縮後，メタノールに懸濁し，盲腸内容

0.1 M MOPS 培地 5 mL に接種し同様の条件下で培養し物中の胆汁酸量を LC/MS（Waters Quattro Premier XE

た．経時的に菌未接種の培地をブランクとして OD660 を

tandem quadrupole mass spectrometer）で定量した．

測定した．0 mM DCA の対数増殖後期もしくは定常期の培養液の OD660 を 50 % に低下させる DCA 濃度を IC50

メタ16S菌叢解析値として算出した．

DNA 抽出は Yu & Morrison（2004）の方法に基づいて結果および考察行った．盲腸内容物 100 mg を Washing Buffer（200 mM
Tris-HCl, 80 mM EDTA-2Na, pH 9.0）にて洗浄後，滅菌
ビ ー ズ（ 直 径 0.1 mm） と Lysis buffer（500 mM NaCl,

細胞内 pH 測定による胆汁酸の細胞膜損傷能の予測

50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, 4 % SDS, pH 8.0）を加え

本研究ではこの実験系を用いてオキソ型やβ型もしくてビーズショッカーにより菌体破砕した．遠心分離後，は MCA を含むヒトや齧歯類に存在する14種類の胆汁酸

上清を酢酸アンモニウム処理後，遠心して上清を回収し，分子の細胞膜損傷能を網羅的に評価した．Fig. 1 にはそ

RNase A を 終 濃 度 100μg/mL と な る よ う に 添 加 し てれらの構造を示した．また，Fig. 2 には代表例として CA

37 ℃ で一晩反応させた．フェノールクロロホルムおよおよび DCA の細胞内 pH の測定結果を示した．その結びエタノール沈殿により精製後，TE buffer に溶解した．
分光光度計にて DNA 濃度を測定し，電気泳動にてバンドを確認した．
細菌の 16S rRNA 遺伝子の V3-V4 領域を増幅後，宮崎大学フロンティア科学実験総合センターにおいてメタ 16S
菌叢解析を行った．シーケンスには Roche diagnostics
社の 454 GS Junior を使用し，解析ソフトフェア QIIME（Quantitative Insights Into Microbial Ecology）を用いて
メタ 16S 菌叢解析を行った．SD ラットでは平均 7168
リードの配列が決定され，総計 78850 リードの配列を取得し，WKAH ラットでは平均 10330 リードの配列が決定され，総計 113637 リードの配列を取得した．

Fig. 2

盲腸内容物からの腸内細菌の分離と同定
胆汁酸耐性もしくは胆汁酸感受性を有する腸内細菌を分離するため，盲腸内容物を PBS（140 mM NaCl, 7.7 mM
Na2HPO4・12H2O, 2 mM NaH2PO4・2H2O, pH 7.2）にて希釈後，1 mM DCA を添加もしくは無添加の 2μg/ml
コリスチン含有 EG 寒天培地および Brucella 寒天培地
（Becton, Dickinson and Company）寒天培地に接種し，
N2：CO2：H2＝8：1：1 の混合ガスで置換した嫌気チャンバーにて 37 ℃ で 4 日間嫌気培養した．生育した各コ
ロニーを GAM（日水製薬；東京）-0.1 M MOPS（pH 7.0）
− 51 −

Effects of free bile acid on the intracellular pH of Bifidobacterium breve JCM 1192T. Internal pH measurements
wer e conducted by fluor escence method using
5(6)-CFDA-SE. After cells were cultured until mid-exponential phase in 1/2 MRS medium containing 0.025 %L-cysteine, har vested cells were preloaded with
5(6)-CFDA-SE and energized with 10 mM glucose (indicated as “Glc”) in Buffer 2 (pH 6.5) to build up ΔpH. The
free bile acid was then added at the indicated final concentrations. Valinomycin (Val) and nigericin (Nig) wereadded to confirm complete dissipation of membrane potential and ΔpH, respectively. The pH values were calculated based on the calibration curve created by measuring the fluorescence intensity of the deenergized cells at
pH values between 6 and 8.

横

田

篤

果，次に示す 8 種類の胆汁酸において ΔpH の完全な消すること，HDCA, 3-oxo-12α, βMCA, 7-oxo-LCA, λMCA,

失が認められた（括弧内はそれぞれの ΔpH 消失濃度を12-oxo-LCA お よ び UDCA が DCA, CDCA と CA の 間 の

示す）
；DCA
（0.6 mM）, CDCA（0.6 mM）, HDCA（2.0 mM）,

中 程 度 の 細 胞 膜 損 傷 作 用 を 示 す こ と， ま た αMCA,

3-oxo-12α（2.0 mM）, βMCA（〜2.5 mM）, λMCA（3.0 mM）,

7-oxo-DCA および UCA は細胞膜損傷作用を殆ど示さな

12-oxo-LCA（4.0 mM）, CA（4.0〜6.0 mM）． 一方で次に示

いこと，などが予測された．

す胆汁酸では ΔpH は顕著に低下したが，括弧内に示す
添加濃度以上で沈殿が認められたため，それ以上の添加

B. breve JCM 1192T に対する胆汁酸の細胞膜および生残は行わなかった；ωMCA（0.15 mM）, 7-oxo-LCA（1.5 mM）,

率への影響

UDCA（2.0 mM），また，次の胆汁酸では試験した濃度範

上述の各胆汁酸分子種の ΔpH 消失濃度に基づいて，

囲で沈殿は起こらなかったが，ΔpH 低下作用が極めてLive/Dead 染色法による細胞膜損傷解析および生残率測

弱く，ΔpH に殆ど影響を与えなかった（括弧内は試験し定試験を行った．その結果，14種類中 8 種類の胆汁酸にた最大濃度を示す）；αMCA（5 mM）, 7-oxo-DCA（10 mM）,

おいて ΔpH 消失濃度付近で高い細胞膜損傷作用およびUCA（3 mM）．これらの結果から，ωMCA がこれまで最大幅な生残率の低下が認められた（括弧内の数値は生残も 強 力 な 殺 菌 活 性 を 持 つ と 考 え ら れ て い た DCA や率が 20 % 以下に低下する濃度を示す）（Table 2 には代表

CDCA よりもさらに10倍程度強い細胞膜損傷作用を有例 と し て CA お よ び DCA の 結 果 を 示 し た ）；DCA

Table 2

Membrane integrity and viability of B. breve JCM 1192T upon exposure to freebile acids.

Data are means of two independent experiments that gave similar results.
aCells were cultured until mid-exponential phase in 1/2 MRS medium containing 0.025%
L-cysteine and harvested cells were washed with Buffer 2 and re-suspended in the same
buffer. After this cell suspension was incubated with the free bile acid at the indicatedconcentrations for 1 h or 3 h, membrane integrity was monitored using the LIVE/DEAD
BacLight Bacterial Viability Kit.
b
The same cell suspension as that used for the measurement of the membrane integrity
was appropriately diluted to monitor its viability by pour plate method using 1/2 MRS
agar plates containing 0.025% L-cysteine.

− 52 −

胆汁酸を責任分子と想定した西欧食による腸内細菌叢崩壊機構の解明（1.0 mM）, 3-oxo-12α（1.0 mM）, λMCA（3.0 mM）, 12-oxo-

すことが明らかになった．
Hagio et al.（2011）は 6 週齢の DA/Slc ラットを通常食

LCA（2.0 mM）, CA（6.0〜8.0 mM）．また，次の 3 種類ので7週間飼育したときの糞便中の各胆汁酸濃度を測定し胆汁酸については最大溶解濃度（括弧内の数値）においている．そこで, 本試験により明らかにした各胆汁酸のて高い細胞膜損傷作用を示し，生残率が 20 % 以下に減殺菌活性を示す濃度と糞中に存在する濃度（括弧内）と少した；ωMCA（0.08 mM）, 7-oxo-LCA（1.5 mM）, UDCA

を比較したところ，ωMCA（2.79±0.80 mM）, DCA（0.58±（0.6 mM）, CDCA（0.6 mM）, βMCA（1.0 mM）, HDCA

（2.0 mM）．一方で，細胞内 pH 試験で弱い細胞毒性を示

0.14 mM）, βMCA（0.60±0.17 mM）お よ び HDCA（1.96

した次の胆汁酸では，括弧内に示す添加濃度において細±0.63 mM）が生理的濃度で強い細胞毒性を示す胆汁酸

胞膜損傷および生残率の低下はほとんど認められなかっであることが示唆された．すなわちラットの盲腸内では，た：αMCA（2.0 mM）, 7-oxo-DCA（10 mM）, UCA（3.0 mM）．

ωMCA, DCA, βMCA および HDCA が in vivo においてこのように，試験した胆汁酸分子種が細胞膜を損傷する

菌叢変化の選択圧として寄与していると予想された．

濃度と生残率を低下させる濃度が一致することから，これまで報告されている胆汁酸の殺菌メカニズムは，CA

動物試験

や DCA などのα型の胆汁酸だけでなく，β型やオキソ

次に胆汁酸仮説を検証するため，SD ラットと WKAH

型の胆汁酸，またラットに存在する MCA にも適用でき

ラットの 2 種類のラットを用い，通常食（対照群群）もることが明らかとなった．生残率測定試験に基づき，胆しくは高ラード食（HL 群）を投与した 8 週間の長期高汁酸の殺菌活性を 5 段階に区分した一覧表を Table 3 に脂肪食投与試験を行った． 8 週飼育後の体重は SD ラッ示 し た． こ れ ら の 結 果 よ り， 試 験 し た 胆 汁 酸 の中でト で は 対 照 群 群 に 比 べ て HL 群 で 有 意 に 増 加 し た がωMCA が最も高い殺菌活性を示すこと，α型の胆汁酸（469.92±7.21⇒534.18±19.22 g），WKAH ラットでは対（CA, DCA および CDCA）は β型の胆汁酸（UCA および照群群と HL 群間で有意差はなかった（348.00±10.22⇒

UDCA） や オ キ ソ 型 の 胆 汁 酸（7-oxo-DCA, 3-oxo-12α,355.28±13.88 g）．摂食量は両ラットともに対照群群と12-oxo-LCA および 7-oxo-LCA）よりも高い殺菌活性を示比較して HL 群で有意に減少した（SD：1419.18±26.53⇒ 1282.52 ± 33.81 g, WKAH：1014.29 ± 51.30 ⇒ 750.22 ±23.07 g）．一方で，肝臓重量は両ラットともに対照群とTable 3

Classification of human and rodent free bile acids according to their bactericidal activities on B. breve JCM
1192T cells.

HL 群 で 有 意 な 差 を 示 さ ず（SD：4.25±0.16⇒4.03±
0.14 g/100 g body weight, WKAH：3.43 ± 0.44 ⇒ 3.51 ±0.09 g/100 g body weight），脂肪組織重量も対照群と HL群で増加したものの有意な差を示さなかった（SD：2.29±0.20⇒2.94±0.35 g/100 g body weight, WKAH：2.68±
0.16⇒2.87±0.10 g/100 g body weight）．一方で，肝臓にはいずれのラットにおいてもHL群で脂肪の蓄積が認められ，脂肪肝の症状が観察された（data not shown）．
胆汁酸組成分析
LC/MS に て 盲 腸 内 胆 汁 酸 濃 度 を 測 定 し た 結 果 をTable 4 に示した．SD ラットでは対照群と比べ HL 群で総胆汁酸濃度の有意な変化は観察されなかった（対照群：2.026±0.215⇒HL 群：2.572±0.093μmol/g）．また生理濃度で殺菌活性を示す胆汁酸については，DCA およびβMCA で増加傾向が認められるものの（DCA，対照群：
0.585±0.058⇒HL 群：0.746±0.091μmol/g）（βMCA, 対
照 群：0.493±0.056⇒HL 群：0.595±0.058μmol/g）， 殺菌活性の強い ωMCA は顕著な変化を示さなかった（対aBased on the results of viability test in Table 2, “Concentrationfor viability loss (mM)” was defined as the free bile acid concentration that gave a viability ＜ 20% of that of the untreated cells
after exposure to the free bile acid for 3 h.

照 群：0.433±0.087⇒HL 群：0.477±0.131μmol/g）． 一
方で，WKAH ラットでは対照群と比べ HL 群で総胆汁酸量濃度の有意な増加が認められ（1.336±0.264⇒3.210±0.566μmol/g），ωMCA, DCA および βMCA の増加傾

− 53 −

横Table 4

田篤

Effect of high-fat diet feeding on cecal bile acid composition in SD and WKAH rats.

After SD and WKAH rats were continuously fed Control or HL diets for 8 weeks, cecal bile acidcomposition was analyzed using LC/MS. Each value represents mean±SEM (n＝5-6). ＊p＜0.05
vs control group.

向が観察された（ωMCA, 対照群：0.412±0.086⇒HL 群：

増加が少ない SD ラットでは菌叢変化が認められないこ

0.653±0.124μmol/g）（DCA, 対照群：0.318±0.077⇒HLとが明らかになった．すなわち，ラットの系統の差をこ

群：0.481±0.081μmol/g）（ βMCA, 対 照 群：0.333±

えて胆汁酸濃度の変動が菌叢変化に結びつく可能性が示

0.080⇒HL 群：0.770±0.178μmol/g）． こ の 結 果 よ り，

唆された．WKAH ラットについて operational taxonomic

対照群と HL 群間の ωMCA, DCA および βMCA 総濃度

unit（OTU）解析を行ったところ，1 ラットあたりの対照の変化は SD ラットよりも WKAH ラットにおいてより群と HL 群の総リード数が10リード以上の OTU は71個大きいことが示された．対照群と HL 群間の胆汁酸濃度存在した．その中で対照群より HL 群において増加する
Firmicutes 門に属する OTU は39/48個であり，そのうちの変化が，SD ラットと WKAH ラットにおいて異なる
理由については不明であるが，WKAH ラットは近交系であることが影響しているかもしれない．

有意に増加する OTU は15個存在した．一方で，対照群
より HL 群において減少する Bacteroidetes 門に属する
OTU は20/23個であり，そのうち有意に減少する OTU

腸内細菌叢解析が12個存在した．この結果より，高脂肪食摂取による胆SD および WKAH ラットの盲腸内容物から DNA を抽

汁酸濃度の増大により，存在比が変化した OTU が数多

出し，16S rRNA 遺伝子の V3-V4 領域を増幅後，メタ 16S
菌叢解析を行った．その結果，SD ラットでは Firmicutes

く検出され，胆汁酸が門さらには属を超え，OTU レベ

門の割合や Bacteroidetes 門の割合は群間で差異は認めら

本試験では腸内細菌叢の変動と肥満との関連性は認めれなかった（Firmicutes 門, 対照群：58.82±4.33⇒HL 群：

られなかった．菌叢変化による宿主への影響について，

62.18±5.25 %）（Bacteroidetes 門：対照群 33.92±3.99⇒HL
群：32.10±4.72 %）．また，属レベルにおいても Firmicutes

遺伝的に過食性のマウス（ob/ob）では腸内細菌叢が門レベルで変化し，Bacteroidetes 門に対する Firmicutes 門

ルで菌叢構成に影響する可能性が示唆された．

門細菌の上昇および Bacteroidtes 門細菌の有意な減少はの比率（F/B）が増大すること（Turnbaugh et al., 2006），

認められなかった（data not shown）．一方，WKAH ラッ
Bacteroidetes
トでは Firmicutes 門の割合が有意に上昇し，肥満のヒトを脂質制限低カロリーダイエット食により減

門 の 割 合 が 有 意 に 減 少 し た（Firmicutes 門, 対 照 群：
31.22±1.89⇒HL 群：76.77±5.36 %）（Bacteroidtes 門, 対
照群：59.00±1.89⇒HL 群：19.42±4.98 %）．属レベルに
お い て もFirumicutes 門 の Blautia 属 が 有 意 に 増 加 し，量させたところ，腸内細菌叢の F/B 比が低下して痩せ
形のヒトの F/B 比に近づいたこと（Ley et al., 2006），野生型マウスに高脂肪食を与えて肥満を誘起すると腸内細菌叢の F/B 比が増大すること（Turnbaugh et al., 2008），など，肥満と F/B 比の増大が相関することが示されてBacteroidetes 門 の Bacteroides 属 お よ び Parabacteroides

いる．本試験では 8 週間の投与試験により解析を行った属が有意に減少した（data not shown）．これらの結果よが，WKAH ラットではさらに長期の高脂肪食摂取により，高脂肪食摂取により腸内の胆汁酸濃度が増加する

り肥満になることが判明している（unpublished data）．

WKAH ラットでは菌叢変化が認められ，胆汁酸濃度の今後，肥満時のラットの菌叢構成を明らかにすることで，− 54 −

胆汁酸を責任分子と想定した西欧食による腸内細菌叢崩壊機構の解明

菌叢変化と肥満の因果関係が明らかになると思われる．

門細菌の各 OTU の存在比との相関解析をおこなった．
その結果，Firmicutes 門の C. hathewayi（OTU1049）（p＜

高脂肪食摂取により選択される特徴的な腸内細菌の分離

0.05, R2＝0.483）および L. taiwanensis（OTU517）（p＜0.01,

上記の解析により，高脂肪食摂取により盲腸内胆汁酸

R2＝0.728）の 2 株において正の相関が認められ，Bacteroidetes 門の B. acidifaciens（OTU1528）（p＜0.05, R2＝0.313）

濃度と盲腸内細菌叢の変化が観察されたが，Firmicutes
門が Bacteroidetes 門に比べて優勢になる理由は明らかでない．そこで高脂肪食摂取により増減を示す Firmicutes
門および Bacteroidetes 門の OTU に対応する腸内細菌のにおいて負の相関が認められた．
胆汁酸添加食投与試験との比較分離を試みた．盲腸内容物を PBS に懸濁後，コリスチン

我々は先行研究において，スクロースを糖原とした胆を添加した EG および Brucella 寒天培地にて培養した．

汁酸（CA）添加食をラットに投与し，いくつかの OTU

生育した約 700 コロニーについて，コリスチンを添加しに属する菌株が異常増殖することを報告している（Islamet al., 2011）．そこで本試験の高脂肪食投与試験と先行た GAM＋MOPS 培地にて液体培養後，生育が認められた約 300 株について 16S rRNA 遺伝子のシーケンス（V3-V4領域）を行った．同定した部分配列をもとにメタ 16S 菌

実験の胆汁酸添加食投与試験の結果を比較したところ，B. gluceracea（OTU1564）および C. symbiosum（OTU517）

叢解析の OTU に帰属させたところ，対照群より HL 群
で増加する Firmicutes 門細菌として Blautia gluceracea（OTU214）および B. acidifaciens（OTU1528）が減少す（OTU1564）, Clostridium symbiosum（OTU517）, Clostridium
hathewayi（OTU1049）, Lactobacillus taiwanensi（OTU517）,
Ruminococcus gnavus（OTU218）, Eisenbergiella tayi
（OTU85）が胆汁酸添加食においても盲腸内で増加し，P. distasonis
ることが判明した．高脂肪食投与によって増減する複数の菌株が胆汁酸投与においても一致した挙動を示すこと
から，胆汁酸に対する耐性度が相対的に強い Firmicutes

および Clostridium orbiscindens（OTU1288）を同定し，対照群より HL 群で減少する Bacteroidetes 門細菌として門の細菌が胆汁酸による選択圧を駆動力として腸内細菌

Bacteroides sartorii（OTU1353）, Parabacteroides distasonis（OTU214）, Bacteroides acidifaciens（OTU1528）, Bacteroides
nordii（OTU86）を同定した．

するものと結論づけた．

DCA 耐性試験
Firmicutes 門と Bacteroidetes 門の分離株において胆汁

ヒトやげっ歯類に存在する14種類の胆汁酸について
B. breve JCM 1192T を指標菌として毒性試験を行い，全酸耐性に違いがあるかを検証するため，in vitro におけるての胆汁酸の殺菌活性を明らかにすると共に，
ωMCA がDCA 耐性試験を行い，50 % 生育阻害濃度（IC50）を算出

これまで殺菌性が強いと考えられていた DCA や CDCAした．その結果，7 種の Firmicutes 門細菌［B. gluceracea（OTU1564）, C. symbiosum（OTU517）, C. hathewayi

よりも約10倍強い殺菌活性を示すことを見出した．胆汁（OTU1049）, L. taiwanensis（OTU517）, R. gnavus（OTU218）,
E. tayi（OTU85）および C. orbiscindens（OTU1288）］の IC50

叢で優勢になるものと推測され，「胆汁酸仮説」が成立

要

約酸のラット盲腸内の生理濃度と殺菌活性との比較により，in vivo では DCA に加え ωMCA やβMCA, HDCA が菌叢制御に関与している可能性が示唆された．ラットを値（0.6〜1.5 mM）は 3 種の Bacteroidetes 門細菌［B. sartorii（OTU1353）, P. distasonis（OTU214）, B. nordii（OTU86）］

用いた高脂肪食投与試験を行い，WKAH ラットでは対の IC50 値（0.3〜0.5 mM）に比べて有意に 2 〜 5 倍の高照群に比べて HL 群において，DCA に加え ωMCA やい値を示した．Bacteroidetes 門細菌の IC50 値は高脂肪食

βMCA さらに総胆汁酸濃度が増大し，Bacteroidetes 門細菌に対する Firmicutes 門細菌の比が顕著に増大した．盲

摂取において増加する DCA 濃度（0.481 mM）で十分に生腸内容物の菌叢解析により，HL 群において有意に増減

育阻害される濃度である．本結果は高脂肪食摂取によりFirmicutes 門細菌が優勢になることと矛盾せず，胆汁酸

分離し，16S rRNA 遺伝子の部分配列を決定し，菌叢解する OTU が検出された．盲腸内容物より多数の菌株を耐性の違いが菌叢変化に寄与することが明らかになった．

析の OTU に帰属させた．その結果，HL 群において有意に増加する OTU に対応する株として Firmicutes 門では胆汁酸組成と腸内細菌叢の組成の相関

Blautia, Clostridium, Ruminococcus, Eisenbergiella およびラットの個体別の胆汁酸濃度と腸内細菌の盲腸内存在

Lactobacillus 属細菌を，減少する OTU に対応する株とし比との関連性を検討するため，盲腸内濃度が殺菌活性をて Bacteroidetes 門細菌では Bacteroides および Parabacteroides 属細菌をそれぞれ同定した．分離株について示す濃度に達している ωMCA, DCA および βMCA の胆
Firmicutes 門細菌および Bacteroidetes
汁酸濃度の総和と，DCA 耐性試験を行ったところ，Firmicutes 門細菌の IC50

− 55 −

横

田

篤

文

は Bacteroidetes 門細菌の IC50 に比べて有意に高い値を示し，前者は後者よりも高い DCA 耐性を有することが判明した．ラットの個体別で見た DCA, ωMCA, βMCA
総濃度に対するこれらの OTU 存在比においても，Clostridium および Lactobacillus 属細菌の二つの OTU では正の相関が，Bacteroides 属細菌の一つの OTU では負の相関が見られた．先行研究の胆汁酸添加食投与試験との比較により，分離株の中で B. gluceracea および C. symbiosum に相当する OTU が高脂肪食および胆汁酸添加食で共に増加し，P. distasonis および B. acidifaciens に相当
する OTU が共に減少することが判明した．これらの結果は「胆汁酸仮説」を強く支持しており，菌叢制御因子
として胆汁酸が重要な役割を果たすことが示唆された．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表1） 渡辺真通，萩尾真人，藤田祐己，李 慈英，馬場菜那子，
小椋義俊，林 哲也，清水英寿，石塚 敏，吹谷 智，
横田 篤．2015．高脂肪食摂取がラット盲腸内容物の胆汁酸分泌および菌叢変化に与える影響．日本農芸化学会
2015年度大会（岡山）2） 渡辺真通，吹谷 智，横田 篤．2015．Bifidobacterium
breve JCM 1192T を指標菌としたラット腸内に存在する胆汁酸分子種の細胞毒性評価. 日本農芸化学会北海道支部会2015年度大会（札幌）3） 渡辺真通，萩尾真人，李 慈英，小椋義俊，林 哲也，
清水英寿，石塚 敏，吹谷 智，横田 篤．2016．高脂肪食ラットの盲腸内菌叢の変化における腸内細菌の胆汁
酸耐性の寄与．日本農芸化学会2016年度大会（札幌）4） 渡辺真通，萩尾真人，李 慈英，小椋義俊，林 哲也，
清水英寿，石塚 敏，吹谷 智，横田 篤．2016．高脂肪食摂取ラットの盲腸内菌叢の変化における胆汁酸の寄
与：「胆汁酸仮説」の証明にむけて．第20回腸内細菌学
会（東京）

謝

辞

本研究の遂行にあたり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に深く感謝いたします．また，本研究の遂行に当たり多大なご尽力をいただいた北海道大学大学院農学研究院連携研究部門特任助教の渡辺真通先生に深謝致します．

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− 56 −

IFO Res.Commun. 30
57-68, 2016
難培養性アナモックス細菌の生理・生態学の全容解明に向けてのポストゲノム解析

難培養性アナモックス細菌の生理・生態学の全容解明に向けてのポストゲノム解析
岡部

聡

北海道大学大学院工学研究院環境創生工学部門〒060-8628

札幌市北区北13条西 8 丁目

Post-genome Research on Ecophysiology of Anaerobic Ammonium-oxidizing(Anammox) Bacteria
Satoshi Okabe
Division of Environmental Engineering, Faculty of Engineering, Hokkaido University
North-13, West-8, Kita-ku, Sapporo Hokkaido, 060-8628, Japan
Anaerobic ammonium-oxidizing (anammox) bacteria are ubiquitously distributed in natural and engineered ecosystems and significantly contributing to the global nitrogen cycle. So far, about 20 different anammox species divided over five genera have been proposed, but none of these are in pure culture. Although nitrogen metabolism of
anammox bacteria have been studied using an enrichment culture of “Candidatus Kuenenia stuttgartiensis”, thoseof other anammox bacteria are still poorly understood. Draft genome sequences have been determined for themembers of “Ca. Kuenenia”, “Ca. Brocadia”, “Ca. Jettenia” and “Ca. Scalindua”, which accelerate our understanding of anammox bacterial physiology. Here, we studied the anammox metabolism of “Ca. Brocadia sinica” that
does not possess the genes encoding canonical NO-forming nitrite reductases (NirS or NirK) in its genome. It is
proposed that “Ca. K. stuttgartiensis” reduces NO2− to NO, which is catalysed by NirS. However, this study revealed that “Ca. B. sinica” reduces NO2− to hydroxylamine (NH2OH) with as yet unidentified nitrite reductases. We
attempted to purify and identify the as yet unidentified “Ca. B. sinica” nitrite reductase; however it was unfortunately failed. Furthermore, we investigated the hydrazine (N2 H4 ) synthesis, which is a downstream reaction of NO2−
reduction in anammox metabolism. “Ca. B. sinica” hydrazine synthase (Hzs) and cells could utilize NH2OH andNH4＋, but not NO and NH4＋, for N2 H4 synthesis. These results clearly demonstrate that the metabolic pathway of“Ca. B. sinica” is NH2OH-dependent and different from the one of “Ca. K. stuttgartiensis”, indicating metabolic diversity of anammox bacteria.
Key words: anammox bacteria, enrichment cultures, nitrite reductase, hydrazine synthase, hydroxylamine

諸言アナモックス反応を担う細菌は，Planctomycetes 門に属する独立栄養嫌気性細菌であり，海洋，湖沼，下水処理

嫌気性アンモニア酸化（アナモックス）反応は，嫌気条件下でアンモニアを電子供与体，亜硝酸を電子受容体

場など様々な環境中に幅広く存在している．これまでに5 属 約20種 が 報 告 さ れ て い る が（Jetten et al., 2009）としてヒドラジン（N2H4 ）を中間生成物として直接窒素（Fig. 1），その難培養性および増殖速度の遅さから，未ガス（N2 ）へ変換する微生物反応であり，以下の化学量論式で示される（Strous et al., 1999; Lotti et al., 2014）．

だ純粋培養株は得られていない．また集積培養系の確立も困難であり，その生理生態は依然として未解明な部分が多い．アナモックス細菌は，原核生物でありながらラ

1 NH4＋＋1.146 NO2−＋0.071 HCO3−＋0.057 H＋ →0.986 N2＋0.161 NO3−＋0.071 CH1.74O0.31N0.20＋2.002 H2O

ダラン脂質で囲まれた anammoxosome と呼ばれる細胞
内小器官を有するユニークな特徴を持っている（Damste
et al., 2002; van Niftrik et al., 2008）（Fig. 2A）．
アナモックス反応の詳細な代謝経路は，Strous et al.

E-mail: sokabe@eng.hokudai.ac.jp− 57 −

岡Fig. 1

部聡

Phylogeny of anammox bacteria estimated based on partial 16S rRNA gene sequence. 16SrRNA gene sequences were aligned using the ClustalW program (version 1.83). The tree wasconstructed with the maximum likelihood (ML), neighbour joining (NJ), and maximum parsimony (MP) method using MEGA 6.06 software. The ML tree is shown here. Pie charts at
nodes represent the confidence of branch topology, and bootstrap values greater than 80% areshown in black. Scale bar represents 2% sequence divergence. Anammox species with ＊ and ＊＊indicate available enrichment cultures in our lab (i.e., “Ca. Brocadia sinica”, “Ca. Jettenia caeni” and “Ca. Scalindua japonica”) and Prof. Jettenʼs lab in the Netherland (i.e., “Ca. Kuenenia
stuttgartiensis”), respectively.

Fig. 2 Cell structure of “Ca. B. sinica”. A transmission electron micrograph and corresponding
diagram were overlayed (A). Proposed anammox metabolism by “Ca. K. stuttgartiensis”(B), which is considered to occur in anammoxosome. Anammox metabolisms by other
anammox species have not been investigated yet.

− 58 −

難培養性アナモックス細菌の生理・生態学の全容解明に向けてのポストゲノム解析
Table 1

Summary of the reported draft genomes of different anammox bacteria.

（1998）が集積培養した “Candidatus Kuenenia stuttgartiensis” を対象とし，メタゲノム解析に基づき見いだされた遺伝子群から推定されている（Strous et al., 2006）．
“Ca. K. Stuttgartiensis” のアナモックス反応は，三段階；1）亜 硝 酸 塩（NO2− ） の 一 酸 化 窒 素（NO） へ の 還 元，2）生成された NO とアンモニア（NH4＋）からヒドラジン（N2 H4 ）の生成，3）N2 H4 の窒素ガス（N2 ）への酸化，で anammoxosome の 中 で 進 行 す る と 推 察 さ れ た（Fig. 2B）． 近 年，Kartal et al.（2013） は，1）“Ca. K.
Stuttgartiensis” の細胞内に NO が存在する，2）NO 生成を阻害した場合アナモックス活性が消失する，3）アナモックス反応をアセチレンで阻害すると NO の蓄積が生じる，4）NO と NH4＋ を基質として N2 H4 が合成されることを実証した．これらの研究成果により，当初，推察されたようにアナモックス反応は，NO2− は NO を経て N2 H4 に変換されると考えられている．
このように，“Ca. K. stuttgartiensis” の窒素代謝に関Fig. 3

して研究は進行しているが，他のアナモックス細菌については全く研究されていない．この理由として，“Ca. K.
stuttgartiensis” 以外のアナモックス細菌の集積培養系が確立されていないことが挙げられる.著者らはこれま
でに，膜分離型リアクター（Oshiki et al., 2013）を用いて，Venn diagram analysis for comparison of the genetic
background among “Ca. B. sinica” (red), “Ca. K. stuttgartiensis” (yellow) and “Ca. J. caeni” (formerly Planctomycetes KSU-1) (blue): The homology search was performed for the amino acid sequences by the BLAST
search (blastP threshold: ＞ 25 % identity and ＞ 30 %overlap ratio in amino acid sequences).

3 種類のアナモックス細菌；“Ca. Brocadia sinica”，“Ca.
Jettenica caeni” および “Ca. Scalindua japonica” の集積培養に成功した（Fig. 1）．これらの集積培養系を用いて，生理生態学的特徴付けおよびメタゲノム解析を行った（Table 1）（Ali et al., 2015; Awata et al., 2013; Oshiki etal., 2011; Oshiki et al., 2015）．

1 rrn，保存遺伝子の有無に基づく推定完成度 ＞ 98 %）を再構築することに成功した（Oshiki et al., 2015）．“Ca.
K. Stuttgartiensis” と “Ca. J. Caeni” のゲノムと比較した
結果，1,247 CDS（全 CDS の 31.9 %）は，“Ca. B. sinica” の集積培養に成功した “Ca. B. sinica” は，他のアナモッ

固有遺伝子であり，アナモックス細菌の遺伝的多様性のクス細菌と比べて増殖速度が速く基質親和性が低いという特徴を有する（Oshiki et al., 2011）．集積バイオマス

高さを示している．さらに，プロテオーム解析を行った結
果，1,175 CDS のタンパク質発現が確認された（Fig. 3）．

を用いたメタゲノム解析の結果， 3 つのコンティグからゲノム情報に基づいて窒素代謝関遺伝子を探索した結成 る ド ラ フ ト ゲ ノ ム（4,07 Mb, 3912 CDS, 47 tRNAs,

果，“Ca. B. sinica” は,これまでに報告されている NO 生

− 59 −

岡部

聡

成を伴う亜硝酸還元酵素（NIR）をコードする遺伝子
nirK および nirS のいずれも保有しておらず，新規の亜から採取したバイオマスは，Percoll（GE ヘルスケア）

硝酸還元酵素が関与していると考えられた．確認のため
従属栄養性脱窒細菌（Braker et al., 1998）またはアナモッ

た．この操作により，“Ca. B. sinica” の純度はバイオマを用いた密度勾配遠心分離し得られたバイオマスを用い
ス全体の 99.9 % 以上であった．

クス菌の nirS および nirK 遺伝子に特異的なプライマーを用いてそれぞれ PCR を行なったが，“Ca. B. sinica” のゲノム DNA から nirK および nirS を検出することは出

バイアル試験
“Ca. B. sinica” によるアナモックス反応の第一段階で来なかった．この結果は，“Ca. B. sinica” は，nirS を保ある，NO2− 還元反応の中間代謝物を同定する（NO で−2

有 し NOを NO へ 還 元 す る “Ca. K. Stuttgartiensis”

はなく NH2OH が中間代謝物質であることを証明する）（Kartal et al., 2011）とは異なる代謝機構でアナモックス

ために， 4 種類の試験；1）NO 生成阻害剤（PTIO）添反応を行なっている可能性を示唆している．

加試験，2）NO 染色剤（DAF）による細胞内 NO の検出，

そこで本研究では，“Ca. B. sinica” の窒素代謝経路の解明を目的とし，1）アナモックス反応の第一段階である−
23）アセチレン阻害試験，4）15NO および NH2OH トレー
サー試験を行なった．

還元反応の中間代謝物の同定，2）この反応を触媒

バイオマスを無機栄養塩培地（MgSO4 7H2O 1.2 mM,する亜硝酸還元酵素の単離・同定を試みた．さらに，ア

CaCl 2 2H 2O 1.2 mM, KH 2 PO 4 0.2 mM, KHCO 3 5 mM,

ナモックス反応の第二段階であるヒドラジン（N2 H4 ）Trace element solution 1 ml L−1, HEPES（pH 7.6）2 mM）（van de Graaf et al., 1995）に懸濁させ，血清ガラスバイ

NO合成を触媒する酵素（Hzs）の基質特異性についても検討した．本稿に記した内容の一部は，Oshiki et al.（2016）
で報告済みである．

アル（10 ml）へ分注した．バイアルのヘッドスペースをヘリウムガス（G1 グレード，＋0.5 atm）で置換した後，37 ℃ で一晩培養した．翌日，アナモックス基質を添加し，実験方法

スターラーによる撹拌を行ないながら 37 ℃ で所定時間培養した．バイアル試験で用いた 15N 標識化合物およびバイオマスの培養および採取標識率は以下の通りであり，SI サイエンス社より入手

アナモックスバイオマスは，上向流カラムリアクター（Tsushima et al., 2007） ま た は 膜 分 離 型 リ ア ク タ ー

し た：15NO2Na＞98 %, 15NH4Cl 99 %, 15NH2OH HCl 98 %,NO ガス 98 %, 15−15N2 ガス 98 %．

15（MBR）（Oshiki et al., 2013） か ら 採 取 し た（Fig. 4）．
上向流カラムリアクターにおいてバイオマスはグラ

NO 生成阻害剤（PTIO）添加試験

ニュール状で存在しており，スターラー撹拌によって微PTIO（Carboxyl-PTIO, 2-（4-Carboxyphenyl）-4,4,5,5-

細化した後，回分試験へ供した．なお，グラニュールバ

tetramethylimidazoline-1-oxyl-3 -oxide, sodium salt）（同仁

イオマスにおいて，“Ca. B. sinica” がバイオマス全体の化学）は，NO を瞬時に NO2− へ転換（消去）する．従っ

95 % 以上を占めることを FISH 解析で確認した．MBRて，PTIO 存在下では NO が生成しても PTIO により瞬時に消去されるため，見かけ上 NO が存在しないような状況となる（Kartal et al., 2011）．
バイアルに 15NH4＋ と 14NO2−（終濃度各 2.5 mM）および PTIO（終濃度 0.1 または 2.5 mM）となるよう添加した． 6 時間の培養過程における 29N2 の生成をモニタリ
ングしガス生成速度を比較した．実験には上向流カラム
リアクターのバイオマスを用いた．
NO 染色剤を用いた細胞内 NO の検出
Diaminofluorescein-FM（DAF-FM）（積水メディカル）は細胞透過性試薬であり，細胞内へ透過後，細胞内エス
テラーゼ活性によって細胞内に保持される．この際，NO が細胞内で生成した場合，NO と DAF が反応し蛍光応答型に変化する（Kojima et al., 1999）．

Fig. 4 Schematic diagrms of a up-flow column reactor and amembrane biorecator (MBR) used in this study.

バイアルへ 15NH4＋ と 14NO2−（終濃度各 2.5 mM）を添加し，37 ℃ で 30 min 培養した．ヘッドスペースガスを− 60 −

難培養性アナモックス細菌の生理・生態学の全容解明に向けてのポストゲノム解析

分析し，29N2 ガスの生成および NO2− の残存を確認した
後，DAF を投与し細胞染色を説明書に従って行なった．

比色法により定量した．微小電極法ではバイアルを嫌気チャンバー内で開栓し，NO 微小電極（Schreiber et al.,

DAF 染色のポジティブコントロールとして，脱窒反応2008）（Unisense，検出下限 0.1μM）を液相へ挿入し電過 程 で NO を 生 成 す る こ と が 明 ら か と な っ て い る
Pseudomonas aeruginosa PAO1 を亜硝酸塩培地，30 ℃ で流値の測定を行なった．ミオグロビン比色法は Hogg &培養し，対数増殖期に採取した細胞を用いた．

オン酸で還元した後，Sephadex G-25 担体（GE ヘルス

Kalyanaraman（1998）に従った．ミオグロビンを亜ニチケア）によって精製し，密栓ガラスセル（光路長 1 cm，アセチレン阻害による中間代謝物の同定・定量

GL サイエンス）へ分注した．ガラスセルを He ガス置アセチレンは低濃度（4μM）において好気性アンモ換した後，試料を 100μl ずつ添加し 580 nm の吸光度変

ニア酸化細菌の ammonia monooxygenase を阻害し，高化を測定した．検量線作成には NO 飽和水を用い，モル濃度（0.3−4 mM）においては従属栄養性脱窒細菌の吸光度係数には Δε＝10,300 M−1cm−1 を用いた．本法のnitrous oxide reductase を阻害することが知られている．

検出下限値は 20μM である．分析過程における NO のまた，詳細な阻害機構は明らかではないが，30μM 程度

自然酸化を防止するため，培養後のバイアルを 50 ml 遠のアセチレン存在下でアナモックス細菌の N2 生成活性が消失することが報告されている（Jensen et al., 2007）．

心 管 に 入 れ， ス イ ン グ バ ケ ッ ト ロ ー タ ー を 用 い て

バイアルにアセチレン飽和水（40 mM, TOC 濃度測定

沈殿を乱さぬように遠心管からバイアルを取り出し，菌により確認）を終濃度 5μM または 50μM となるよう体を含まない上澄をガスタイトシリンジで採取し測定へに 添 加 し， 5 分 間 静 置 し た 後， 基 質（14NH4＋ お よ び

供した．

29

1000×g, 10 min, 4 ℃ で遠心分離し菌体を沈殿させた．

−
2NO ）を添加した．37 ℃ で45分間培養し，15分間隔

NH2OH 濃 度 は 比 色 法 ま た は GC/MS 法 で 測 定 し た

でヘッドスペースガスおよび液体試料を採取した．ヘッ（Peng et al., 1999）．比色法は Frear & Burrell（1955）にドスペースガスは（N2: m/z 28, 29, 30, 15NO: m/z 31）に従って行なった．試料とアセトンを混合し，混合試料

15

−
2

ついて分析を行った．液体試料については，NO , NO,

1μl を GC/MS へスプリットレス注入した．分析では

NH2OH 濃度の定量を行なった．実験には，MBR から採NH2OH とアセトンが反応して精製するアセトンオキシ

取し Percoll 密度勾配遠心分離によって精製したバイオム（MW＝73）を定量するため，m/z＝73.1 および 74.1

マスを用いた．なお，NH2OH の蓄積を検証する場合にを SCAN モードでモニタリングした．本法の定量下限

は，プール化合物として，非標識の NH2OH を 100μM

値は数 μM オーダーであり，検量線は段階希釈した非標識の NH2OH を試料と同様に処理・分析することで作で添加した．

成した．NO2− および N2 H4 濃度は，それぞれナフチル
15

NO または 15NH2OH によるトレーサー試験

エ チ レ ン ジ ア ミ ン 法（Association & Federation, 2005）

NO または NH2OH の利用性を検証するため，安定同および Watt & Chrisp（1952）の方法により測定した．

位体標識化合物を用いたバイアル試験を行い，生成したN2 ガ ス 種 を 分 析 し た． バ イ ア ル へ 14NH4＋（3 mM） とNH2OH 生成を伴う亜硝酸塩還元酵素の精製

NH2OH（3 mM）または 15NO（液相中で 2.5 mM 相当）“Ca. B. sinica” のバイオマスをテフロンホモジナイザ

を添加し，37 ℃ で培養した．経時的にヘッドスペース

で分散し，抽出バッファー A（20 mM リン酸カリウム

15

ガスおよび液体試料を採取した．ヘッドスペースガスはバッファー pH 7.5, 0.2 M KCl, 1 % コール酸ナトリウム，（N2: m/z＝28, 29, 30）について，液体試料については，

1 mM DTT）に懸濁させ，4 ℃ で 1 時間撹拌した．懸濁物を遠心分離（10,000×g, 60 min, 4 ℃）し，可溶性およNH2OH, NO, N2 H4 について比色分析を行なった．

び不溶性画分を分離した．ここで得られた不溶性画分に
化学分析

ついて，以下の通り再抽出操作を行なった．不溶性画分

ヘッドスペースガス分析には GC/MS 装置（QP-2010を抽出バッファー B（20 mM リン酸カリウムバッファー

SE，島津製作所）を用いた．キャピラリーカラムにはpH 7.5, 1 mg/ml Lysozyme, 1 mM DTT）に懸濁させ，4℃

CP-PoraBOND Q（Varian）を用いた．分析条件は既報の条件に従った（Isobe et al., 2011; Waki et al., 2010）．ヘッ

で 1 時間撹拌した．その後，n-Octyl-β-D-glucoside を終ドスペースガス 50μl をスプリット注入し，m/z＝28,を遠心分離（10,000×g, 60 min, 4 ℃）後，得られた可溶

29, 30, 31 についてモニタリングを行なった．検量線は性画分を crude extract とし，以下の精製試験へ供した．

15−15

濃度 1 %（w/v）添加し，さらに 1 時間撹拌した．懸濁物

初期精製に陰イオン交換，中間精製に疎水性相互作用

N2 ガスを用いて作成した．

液相中の NO 濃度は，微小電極法またはミオグロビン

カラム，最終精製にゲル濾過クロマトグラフィーを用い− 61 −

岡部

た．陰イオン交換では，Seqharose Q XL 担体を充填した

聡

インターフェイス 220 ℃，スプリットレス 1μl 注入，

HiTrap Q XL カラム（5 ml 容積，強陰イオン性）を用いた．

キャリアガス He（1 ml/min）．定量する場合は，
SIM モー

Crude extract をアプライした後，20 mM Tris-HCl バッ

ドにて m/z 73.1（C6 H 914NO2）および 74.1（C6 H 915NO2）

ファー（pH 7.5, 0.1 % n-Octyl-β-D-glucoside, 1 mM DTT）

をモニタリングした．検量線は市販のヒドロキシルアミ

を 5 カラムボリューム（CV）通水し，未吸着タンパク質

ン塩酸塩（試薬特級，Wako）を段階希釈し，アセトンにを溶出させた．吸着タンパク質の溶出は，0−1 M NaCl

よって誘導体化した試料を用いて作成した．タンパク質のリニアグラジエントによって行なった．溶出フラク

濃度の定量は Lowry 法または Bradford 法で行ない，標ションを回収し，ヒドロキシルアミン生成活性を測定し準物質として牛血清アルブミンを用いた．

た．活性が高いフラクションを混合し中間精製へ供した．
中間精製には，高分離能を持つ陰イオン交換担体

タンパク質の同定（Source Q15） が 充 填 さ れ た Resource Q カ ラ ム（1 ml

SDS-PAGE を行なった後，N 末アミノ酸配列の決定に容積）を用いた．初期精製で回収したフラクションを

よってタンパク質の同定を行なった．SDS-PAGE には

20 mM Tris-HCl バ ッ フ ァ ー（pH 7.5, 0.1% n-Octyl-β-D

NuPAGE 泳動装置（Invitrogen）を用いた．試料を 4×-glucoside, 1 mM DTT）で 5 倍希釈しカラムへアプライ

LDS buffer および DTT 溶液と混合後，70 ℃ 10 min でした．20 mM Tris バッファー（pH 7.5, 0.1 % n-Octyl-β-D

還元処理を行なった．還元処理済みのサンプルを 10 %-glucoside, 1 mM DTT）を 5 CV 通水し未吸着タンパク

BisTris ゲルへアプライし泳動を行なった．分子量マー

質を溶出させた．吸着タンパク質の溶出は，0−1 M NaCl

カーには Novex Sharp PS PROT STD を用いた．泳動ゲのリニアグラジエントによって行なった．溶出フラク

ル か ら タ ン パ ク 質 を PVDF 膜 へ 転 写 し，PVDF 膜 をションを回収し，ヒドロキシルアミン生成活性を測定し

CBB 染色（0.1 % CBB-R250）し，検出されたバンドをカッた．活性が高いフラクションを混合し最終精製へ供した．

ターナイフで切り出した．切り出した膜片について，脱最終精製には Superdex 200 担体充填カラム（HiLoad

色操作（25 mM NH 4 HCO3 , 30 % アセトニトリル）を行

16/60 Superdex 200）を用いた．中間精製で回収したフなった後，エドマン分解法による N 末アミノ酸配列決ラクションをカラムへアプライし，50 mM リン酸ナト

定を行なった．

リ ウ ム バ ッ フ ァ ー（pH 7.5, 0.15 M NaCl, 0.1 % Octyl-β-D-glucoside, 1 mM DTT） を 通 水 す る こ と で 溶 出 を 行

ヒドラジン合成酵素（Hzs）の精製，比活性試験なった．溶出フラクションのヒドロキシルアミン生成活“Ca. B. sinica” バイオマス（20 g-wet）を，50 mLのリン性を測定し，最も高い活性を示したフラクションを最終酸バッファー（20 mM, pH 7）に懸濁した（0.4 g-wet ml−1）．

精製物とした．また，分子量サイズを推定するため，分

ビーズビーディング（5,000 rpm, 1 min, 3 回）によって子量マーカー kit（12−200 kDa, Sigma）付属タンパク質，菌体を破砕した後，遠心分離（13,400×g, 60 min, 4 ℃）

カ タ ラ ー ゼ（232 kDa），Ferritin（440 kDa） を 用 い て，により上澄みを回収した．初期精製には陰イオン交換

溶出ボリュームと分子量について検量線を作成した．

（Q sepharose XL 担体）を用いた．20 mM Tris-HCl バッ

亜硝酸塩還元 NH2OH 生成活性の測定

で担体と結合した Hzs を溶出させ，限外濾過（30 kDa）

ファー（pH 8）中の NaCl 濃度を段階的に上昇させること
以下の組成となるように活性測定溶液を調製した；によって濃縮した．最終精製にはゲル濾過クロマトグラ

90μl 50 mM Tris-HCl バッファー（pH 7.5），試料（6μgフィーを（Superdex 200 担体）を用い，20 mM リン酸バッ-BSA），cytocyrome C（ウマ心臓由来，25μM），sodium

ファー（pH 7.5, 0.15 M NaCl）を通水することで Hzs を

dithionite（20 mM）． 活 性 測 定 溶 液 を 37 ℃ で 2 分 間溶出させた．回収した Hzs を限外濾過（30 kDa）によっ

保 温 し た 後，10μl の 反 応 基 質（2 mM 15NO2−, 200μMて濃縮し最終精製物とした．Hzs の純度は SDS-PAGE

14

NH2OH）を添加し反応を開始させた．37 ℃ で20分反によって確認し，nanoLC/MS/MS 解析によってタンパ応させた後， 5 分間激しく撹拌することで反応を停止さ

ク質同定を行った．

せた．反応物とアセトン 4μl を混合し，ヒドロキシルア

Hzs の比活性を測定するため，NH2OH または NO をミンをアセトンオキシム（C6 H 9 NO2）へ誘導体化した後，
GC/MS によって定量分析を行なった（van de Graaf et al.,（2.6 mg Hzs, 50 μM cytochrome c, 1 mM 15NH4＋, 1 mM

基 質 と し て 培 養 を 行 っ た.ア ッ セ イ バ ッ フ ァ ー 1 ml

1997）．分析には GC/MS-QP2010SE（Shimadzu），カラ

14

ム に は CP-PoraBOND Q Fused Silica（25 m×0.32 mm）

た後，29N2 ガス生成を GC/MS により測定した．また，（Varian）を，分析条件は以下の通りとした；50 ℃ 1 min

NH2OH の代わりに 300μl の 14NO を基質として同様にから 15 ℃/min で 200 ℃ まで昇温，injecter 80 ℃，MS

培養を行った．

NH2OH）を 1.8 ml バイアルへ分注し，37 ℃ で培養し− 62 −

難培養性アナモックス細菌の生理・生態学の全容解明に向けてのポストゲノム解析
Table 2

Effects of PTIO addition on 29N2 gas production rates of “Ca. B. sinica”.

結果および考察NO 生成阻害剤（PTIO）添加試験
NO 生成阻害剤である PTIO を添加し，非添加系とのN2 ガス生成速度を比較した．PTIO 添加系および非添29加系において，29N2 ガス生成速度に有意な差は認められなかった（Table 2）．既往の研究で nirS を保有することが確認されている “Ca. Scalindua japonica” では，PTIO
添加系では 29N2 ガスの生成が完全に阻害された．このFig. 5“Ca. B. sinica” was anoxically incubated with 2 mM
NH4＋, 2 mM 15NO2−, 0.1 mM 14NH2OH and 50 mM acetylene. The concentration of 15NO2− decreased concurrently with increasing 15NH2OH concentration. 15NO2−
was reduced to 15 NH 2 OH, and the pool substrate,
14
NH2OH, was concomitantly consumed under this condition, which resulted in an increase in the 15N/14N isotopic ratio of NH2OH. Error bars indicate the standard deviations of triplicate vials. (This figure is slightly
modified from Figure 1 (Oshiki et al., 2016))
14

結果は，“Ca. B. sinica” による亜硝酸塩還元反応の中間代謝物はNO以外であることを示唆するものである．
NO 染色剤を用いた細胞内 NO の検出
活発な 29N2 ガス生成を確認した “Ca. B. sinica” バイ
オマスおよび亜硝酸呼吸条件で培養した P. aeruginosa
PAO1 を，NO 蛍光染色剤である DAF によって染色し，顕 微 鏡 観 察 を 行 な っ た．P. aeruginosa の 菌 体 か ら は
DAF の蛍光を検出することができたが，“Ca. B. sinica”の菌体からはできなかった．この結果は，アナモックス上阻害されていた．15NO2− の消費に伴い 15NH2OH が蓄反応の中間代謝物として NO が細胞内で生成していな

積し，15NH2OH/14NH2OH 比も増加した．培養開始30分

いことを示すものである．しかしながら，アナモックス間で消費された 15NO2− の 10−31 % は，15NH2OH として反応は，細胞内の anammoxosome と呼ばれる小器官で蓄積した．この転換率は，15NH2OH の消費が完全に阻生ずると考えられており，NO が生成していたのであれ

害されているわけではないので，過小評価されている可ば anammoxosome 内に存在したと考えられる．DAF の能性がある．29N2 H4 および 30N2 H4 の蓄積は確認されな

膜 透 過 性 は 通 常 細 菌 の 細 胞 膜 で 確 認 さ れ て い る が，かった．また，気相および液相中の 15NO 濃度を GC/MS

anammoxosome に対する透過性は現在のところ不明で法（検出限界値＜5 ppm），微小電極法（＜0.1μM），ミオ

あり，さらなる検討が必要であると考えられる．

グロビン法（＜20μM）で測定したが，いずれも検出下限値以下であった．この結果は “Ca. B. sinica” の窒素

アセチレン阻害による中間代謝物の同定

代謝は NO を中間代謝物とせず，“Ca. K. Stuttgartiensis”

アセチレンによりアナモックス反応を阻害した際，
NH2OH が蓄積するか否かを検討した．“Ca. B. sinica”＋
4の窒素代謝（NO の蓄積が確認）とは異なることを示唆するものである．

および NO , 各 2 mM）と一方，15NH4＋ および 14NO2− を基質として培養した場

ア セ チ レ（50μM） が 含 ま れ る 培 地 で 培 養 し た．

合は，15NH2OH の蓄積が認められなかった．これは，バイオマスを基質（ NH
14

15

15

−
2

NH2OH の 変 換 速 度 が 速 い た め プ ー ル 化 合 物 として

NH2OH が 15NO2− の還元によって生成したことを示し

15

NH2OH（0.1 mM）を添加し，15NH2OH の蓄積を容易に確認できるようにした（Fig. 5）．アセチレン添加系ている．また，バイオマス非添加および滅菌バイオマス

では，29N2 ガスの生成量が非添加系と比較して 90 % 以

上の結果より，15NH2OH の蓄積は生物学的反応に由来

14

添加系では，15NH2OH の蓄積は認められなかった．以− 63 −

岡部

聡するものである．さらに同様の培養をプール化合物とし時変化を測定した（Fig. 7）．NH2OH が消費されるに伴って NO（10μM）を添加して行った結果，還元された

29て，
N2 および 30N2 ガスが生成した．29N2 ガスの生成は，

14

−
2

15

NO

の僅か 2 % が NO として検出された．

NH2OH がアナモックス反応の電子受容体として利用さ

15

上記の実験結果はすべて，“Ca. B. sinica” によるアナ

れ た こ と を 示 し て い る． ま た，30N2 ガ ス の 生 成 はモックス反応の中間代謝物は，NO ではなく NH2OH で15あるということを示唆すものであり，メタゲノム解析において NO 生成を伴う亜硝酸塩還元酵素 nirS 遺伝子がいる．この反応は過去にも報告があり（Hu et al., 2011），

検出されなかった結果と一致する．

低いことに起因すると考えられている.

NO および 15NH2OH の利用性評価

モックス反応において，1）NO2− が還元される過程で

NH2OH 二分子から N2 ガスを生成することを示唆して

N2 H4 の生成を担うヒドラジン合成酵素の基質特異性が以上の結果を総合すると，“Ca. B. sinica” によるアナ

15

NO の 利 用 性 を 評 価 す る た め に，“Ca. B. sinica” を＋
4

NH2OH が蓄積すること，2）NH2OH がアナモックス反および NO を基質として培養し，生成する N2応の基質として利用され，N2 ガスを生成することが実と 30N2 ガスおよび液相中の NO 濃度の経時変化を測定した（Fig. 6）．培養 6 時間における 29N2 ガスの生成速験で証明された．従って，“Ca. B. sinica” によるアナモッ

度を求めた結果，“Ca. B. sinica” バイオマス添加系である可能性が高い．この結果は，アナッモクス細菌発見
時の Van der Graaf et al.（1997）による報告と一致する．

14

NH

15

29

0.123±0.0045（s.d, n＝4），
非添加系で 0.120±0.0190（s.d,n＝4）mM h−1 vial−1 であり，有意な差は認められなかっクス反応では，中間代謝物質は NO ではなく NH2OH でた．この結果は，“Ca. B. sinica” が NO をアナモックス

しかし，Strous et al.（2006）によって提唱され，Kartal
et al.（2011）によって検証された “Ca. K. Stuttgartiensis”

反応の基質として利用できないことを示している．

の代謝経路とは異なり，アナモックス反応の代謝経路に

次に，“Ca. B. sinica” の NH2OH 利用性を評価するたは少なくとも 2 つのパターンが存在する．こうした窒素

め，14NH4＋ および 15NH2OH を基質として培養し，生成代謝経路の違いが環境中での生存やニッチ分化に及ぼすする N2 と N2 ガスおよび液相中の NH2OH 濃度の経影響は現在のところ不明であるが，アナモックス細菌の2930

多様な代謝の一部を明らかにすることができた．
次に，“Ca. B. sinica” による NO2− の NH2OH への還元反応を触媒する酵素の単離・同定を試みた．
亜硝酸還元 NH2OH 生成酵素の精製
各精製工程におけるタンパク質および 15NH2OH 生成
活性の回収率を Table 3 に示した．最終生成物である
Superdex 200 elute において，単位タンパク質当りの活性値が80倍まで上昇した．Superdex 200 elute の溶出時

Fig. 6 “Ca. B. sinica” was anoxically incubated with 15NO gas
and 3 mM 14NH4＋. An arrow indicates when the substrates were added. Error bar indicates the standard deviations of triplicate measurements of NO concentrationin liquid phase by the myoglobin absorbance measurement. Abiotic production of 29N2 gas occurred in the vial
without the cells of “Ca. B. sinica”, due to the high reactivity of NO. (This figure is slightly modified from Figure S2 (Oshiki et al., 2016))

Fig. 7− 64 −“Ca. B. sinica” was anoxically incubated with 1.5 mM
NH2OH and 3 mM 14NH4＋. 15N-labeled N2H4 was produced from 15NH2OH and 14NH4＋, which leads the production of 29N2 or 30N2 gas. Error bars indicate the standard deviations of triplicate vials.
15難培養性アナモックス細菌の生理・生態学の全容解明に向けてのポストゲノム解析
Table 3

Recovery of total protein and 15NH2OH production activity during the protein purification

The purified protein (6 mg-BSA) was incubated at 37 ℃ and pH 7.5 with the addition of 2 mM 15NO2−, 0.2 mM 14NH2OH, 25mM cytochrome c and 20 mM sodium dithionite. After 20 minutes of incubation, the sample was mixed with acetone forthe derivatization of NH2OH. The concentration of 15NH2OH derivatives was determined by the GC-MS analysis.

間から，目的タンパク質の分子量サイズを推定したとこ
ろ，280−420 kDa の範囲に存在すると予想された．
精製されたタンパク質は cytochrome c を電子供与体として 15NO2− を 15NH2OH へ還元する活性を有し，その活性は 1 mM EDTA, 1 mM アジ化ナトリウムまたは 4 ℃
以下および 70 ℃ 以上で失活した．そこで，精製タンパ
ク質を減圧濃縮し，SDS-PAGE 解析を行なった.その結果，Superdex 200 elute の泳動レーンからほぼ単一と見な し う る バ ン ド が 150±10 kDa の 位 置 に 検 出 さ れ た（Fig. 8）．このバンドの N 末端アミノ酸配列解析を行ない，相同性検索を行なった結果，“Ca. B. sinica” のゲノムから見いだされた brosi_1236 遺伝子にコードされるタ
ンパク質と一致した．NCBI に登録されている全タンパ
ク質を対象に blastP 検索を行なったところ，brosi_1236のホモログ遺伝子は “Ca. K. Stuttgartiensis” のゲノムかFig. 8

らのみ見いだされた．“Ca. K. Stuttgartiensis” が保有する kustd1514 遺 伝 子 と の 相 同 性 は， ア ミ ノ 酸 配 列 で43.4 % であった．
一 方， 他 の anammox 細 菌，“Ca. B. fulgida” お よ び“Ca. Scalindua sp.” からはホモログ遺伝子は検出されなかった．brosi_1236 はシグナルペプチドであり，シグナ
ルペプチド部位を除いた分子量サイズは 154 kDa であった．ゲル濾過カラムにおける推定分子量は 280−420 kDa
であったことから，目的タンパク質は brosi_1236 の 2 量体（308 kDa）であると考えられる．また，シグナルペ
プチドであることから，anammox 反応の反応場である
anammoxosome 内に局在すると考えられる．brosi_1236
遺伝子のタンパク質発現レベル（1,175 CDS 中，上位48番 目 ） と ホ モ ロ グ 遺 伝 子 で あ る kustd1514 遺 伝 子 のmRNA 転写レベルが極めて高いことから，本遺伝子は，“Ca. B. sinica” および “Ca. K. Stuttgartiensis” の代謝に強く関与していると考えられる．
しかしながら，van Teeseling et al.（2014）の報告によ− 65 −

An attempt to purify and identify as yet unknown nitrite
reductase from “Ca. B. sinica”. SDS-PAGE analysis was
per formed with the molecular size standard marker(lane M, unit: kDa), the crude extract (lane C) and the
3rd purified protein fraction (A). A major protein band
appeared in the lane P at 150 ± 10 kDa and subsequently
identified to be the brosi_A1236 protein by determining
the N-terminal amino acid sequence and the peptide
mass fingerprints (B). The brosi_A1236 gene is illustrated as an arrow-shaped box, and the regions highlighted
with green or brown color represent where the aminoacid sequence matched with the N-terminal amino acidsequence or peptide mass fingerprints determined fromthe 3rd purified protein, respectively. A black arrow represents the signal peptide cleavage site. Scale bar indicates the 3,000 bp of nucleotide sequences. However,the brosi_A1236 protein is most likely localized in themembrane S-layer (i.e., outermost cell compartment)
and thus is not a nitrite reductase (for more details, see
results and discussion).

岡

部

聡

要

れ ば，kustd1514 タ ン パ ク は， グ リ コ シ ル 化 さ れ た
S-layer タンパク質であり，アナモックス反応が生じて約いると考えられている anammoxosome とは存在する位“Ca. K. stuttgartiensis” の窒素代謝に関して研究は進置が異なる．さらに，Pfam によるドメイン解析の結果，行しているものの，他のアナモックス細菌については全

brosi_A1236 タンパク質は，既存の補酵素やコファク

く研究されていない．そこで本研究では，“Ca. B. sinica”

ターの結合サイトを有していないことが明らかとなっの窒素代謝経路の解明を目的とし，1）アナモックス反応

た．これらの知見を総合的に判断すると，brosi_A1236の第一段階である NO2− 還元反応の中間代謝物の同定，

タンパク質を含有する画分は，高い NH2OH 生成活性を

2）この反応を触媒する亜硝酸還元酵素の単離・同定，−2

を NH2OH へ

3）アナモックス反応の第二段階であるヒドラジン（N2 H 4 ）還元する機能を持っていない酵素であると考えられる．

合成を触媒する酵素の基質特異性についても検討した．

今後，更なる新規亜硝酸還元酵素の解析が必要である．

その結果，“Ca. B. sinica” のアナモックス反応機構は以示したが，brosi_A1236 タンパク質は NO

下のように要約される．
ヒドラジン合成酵素（Hzs）の精製，比活性試験

1）亜硝酸塩（NO2−）はヒドロキシルアミン（NH 2OH）

“Ca. B. sinica” によるアナモックス反応の第一段階に還元される．

で，NO2− は NH2OH へ還元されることが明らかとなっ

2）NO と NH4＋ ではなく，NH 2OH と NH4＋ から N2 H 4

た．この結果を受けて，後段であるヒドラジン（N2 H4 ）を合成する（NO をアナモックス反応の基質として合成において，“Ca. B. sinica” は NH2OH と NH＋
4

利用できない）．

から

N2 H4 を合成可能か検証した．実験方法に従い “Ca. B.

“Ca. B. sinica” は NO2− を NH 2OH に還元し，生成されsinica” の Hzs を抽出・精製し，基質特異性を評価した．

た NH 2OH と NH4＋ から N2 H 4 を合成し，最終的に N2 H 4

精製タンパク質から 3 本のバンド（B1, B2, B3）が観を N2 に酸化する．この反応機構はこれまでに報告され察 さ れ，nanoLC/MS/MS 解 析 に よ っ て， そ れ ぞ れ，ている “Ca. K. stuttgartiensis” のアナモックス反応機構

hydrazine synthase subunit α, β, γであると同定された．
Hzs に 14NH2OH, 15NH4＋ , cytochrome c を添加し培養をとは異なる．また，“Ca. B. sinica” は NO 生成を伴う亜硝酸還元酵素 nir S および nir K のいずれも保有してい行った結果，29N2 ガスが生成し，培養中にヒドラジンがないというゲノム情報に一致する．“Ca. B. sinica” の0.086 mM 程度蓄積した．これは “Ca. B. sinica” の Hzs がNH 2OH 生成を伴う亜硝酸還元酵素の単離・同定を試み

NH2OH と 15NH4＋ から 29N2 H4 を合成し，さらに 29N2 H4たが，最終的に単離には至らなかった．抽出，精製条件

を N2 ガ ス ま で 酸 化 し た こ と を 示 し て い る． 一 方，等を再度検討し，単離・同定する予定である．このよう

NH 2OHではなく，14NO を基質とした場合は，29N2 ガに，アナモックス細菌の集積培養系を構築し，ゲノム情スの生成は確認されなかった．以上の結果より，“Ca. B.

報をもとに未解明である窒素および炭素代謝経路を明ら

sinica” の Hzs は，NO ではなく NH 2OH を基質とする

かにすることは，今後の重要な研究課題である.

14

29

14

ことが明らかとなった．この結果は上述の NH 2OH 生成

本助成で得られた研究成果の報告を伴う亜硝酸還元反応の結果と一致する．
“Ca. K. stuttgartiensis” が保有するヒドラジン合成酵
素（Hzs）は基質特異性が異なり，NH 2OH と HN4＋ から N2 H4 を合成することができない（Kartal et al., 2011）．
しかし，昨年，“Ca. K. stuttgartiensis” のヒドラジン合成酵素（Hzs）が単離され，x 線結晶構造解析によりその反応機構が推定された（Dietl et al., 2015）．この報告によれば，“Ca. K. stuttgartiensis” のヒドラジン合成は
2 ス テ ッ プ，1）NO の NH 2OH へ の 還 元，2）
NH 2OH と
NH 3 の縮合による N2 H4 の生成で進行すると考えられている．すなわち，“Ca. B. sinica” と “Ca. K. Stuttgartiensis”の Hzs の基質はともに NH 2OH であるが，NH 2OH の供給経路が異なる．“Ca. B. sinica” の hzsBGA 遺伝子は，“Ca. K. stuttgartiensis” の 遺 伝 子 と そ れ ぞ れ 79 %, 86 %,82 % の相同性を有していることから，“Ca. B. sinica” の
Hzs の構造解析も待ち望まれる．

口頭発表1） 成田柚子，Lei Zhang, Muhammad Ali，岡部 聡．2016.
Anammox細菌 “Candidatus Brocadia sp. 40” の生理学的特性．（ポスター発表）第50回日本水環境学会年会（ 3 月
16 – 18日，徳島）
2） 小林香苗，押木 守，金田一智規，眞壁明子，岡部 聡．
2016. Anammox 細菌の窒素同位体分別に関する研究.（ポスター発表）第50回日本水環境学会年会（ 3 月16 – 18日，
徳島）3） Okabe, S. 2015. Advances in innovative nitrogen removalfrom wastewaters: Anammox-based technologies.
IEEC2015, Keynote Speech. BEXCO, Busan, Korea.
4） Okabe, S. 2015. Anammox Process: from microbiology topractical application. Peradeniya University International
Research Sessions (iPURSE 2015), Keynote Speech. University of Peradeniya, Sri Lanka.
5） Okabe, S. & Ali, M. 2015. Ef ficient star t-up of anam-− 66 −

難培養性アナモックス細菌の生理・生態学の全容解明に向けてのポストゲノム解析
mox-based nitrogen removal processes. Deammonification 2015: State-of-the-art and future perspectives. Chung
Yuan Christian University, Taoyuan, Taiwan.
6） Okabe, S. 2015. Ecophysiology of anaerobic ammonium-oxidizing bacteria in engineered systems. ICoN4. University of Alberta, Edmonton, Alberta, Canada.
7） Okabe, S. & Ali, M. 2015. Rapid development of anammox
process with a minimum amount of biomass. IANAS 2015.
CBEAD, Dalian, China.
8） Lei, Z. Ali, M. & Okabe, S. 2015. Rapid achievement of anammox planktonic cells in membrane bioreactor. IANAS
2015, CBEAD, Dalian, China, Aug. 7 – 9.
9） Lei, Z. Oshiki, M. Ali, M. & Okabe, S. 2015. Competition
between “Candidatus Brocadia sinica” and “Candidatus Jettenia caeni”,The 3rd International Life-Science Symposium, Hokkaido University Conference Hall, Sapporo,
Japan. Nov. 26.
原著論文1） Oshiki, M., Ali, M., Shinyako-Hata, K., Satoh, H., & Okabe, S.
2016. Hydroxylamine-dependent anaerobic ammonium oxidation (anammox) by “Candidatus Brocadia sinica”. Environ. Microbiol. accepted. DOI: 10.1111/1462 – 2920. 13355
2） Oshiki, M., Satoh, H. & Okabe, S. 2016. Ecology and physiology of anaerobic ammonium oxidizing (anammox) bacteria. Environ. Microbiol. accepted. DOI: 10.1111/1462 –2920.13134
3） Ali, M. & Okabe, S. 2015. Anammox-based technologies
for nitrogen removal: Advances in process start-up andremaining issues. Chemosphere 141: 144 – 153.
4） Ali, M., Oshiki, M., Rathnayake, L., Ishii, S., Satoh, H. &Okabe, S. 2015. Rapid and successful start-up of anammox
process by immobilizing the minimal quantity of biomass
in PVA-SA gel beads. Water Res. 79: 147 – 157.

謝辞本研究の遂行にあたり，助成いただきました公益財団
法人発酵研究所に深く感謝いたします．タンパク質抽出・精製にあたって，森川正章教授（北海道大学環境科学院）には精製装置の使用や貴重なご助言をいただきました．
ここに記して深く感謝いたします．

文

献Ali, M., Oshiki, M., Awata, T., Isobe, K., Kimura, Z., Yoshikawa,
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IFO Res.Commun. 30
69-77, 2016

極限環境微生物のゲノムに認められる機能未知遺伝子の機能解析とその応用

極限環境微生物のゲノムに認められる機能未知遺伝子の機能解析とその応用
河 原 林

裕

九州大学大学院農学研究院極限環境微生物ゲノム機能開発学〒812-8581

福岡県福岡市東区箱崎6-10-1

Functional analyses of the hypothetical gene detected within the genomic dataof extremophiles and its application
Yutaka Kawarabayasi
Laboratory of Functional Genomics of Extremophiles, Graduate School of Agriculture, Kyushu University
Hakozaki 6-10-1, Higashi-ku, Fukuoka, Fukuoka 812-8581, Japan
In the entire genomic data of microorganisms, many hypothetical genes were identified. To elucidate their actual
function or activities, two different groups of genes were chosen: the one is genes annotated by sequence similarity, and the other is hypothetical genes without similarity to any data in database. Among genes annotated in hyperthermophilic archaea Sulfolobus tokodaii and Pyrococcus horikoshii, three genes encoding glutamine:fructose-6-phosphate aminotransferase, phosphoglucosamine mutase and bifunctional protein with phosphomannose
isomerase/mannose-1-phosphate guanylyltransferase activities were chosen as targets for analyses. These wereexpressed in E. coli and purified proteins were used for analyses of their activity or function. The first one indicated that only three-residue shorter form exhibited the expected activity. The candidate protein predicted as phosphomannomutase/phosphoglucomutase protein exhibited phosphoglucosamine mutase activity. It was shown thatthe sugar-1-phosphate nucleotidylyltransferase activity on P. horikoshii bifunctional protein, PH0925 protein, wascapable of catalyzing glucose-1-phosphate and glucosamine-1-phosphate as well as mannose-1-phosphate. Alsofructokinase and phosphorylated amino-sugar epimerase activities, which were not predicted by sequence similarity, were purified from the S. tokodaii cell free extract. The novel nuclease, EndoQ, was detected and purified fromcell free extract of Pyrococcus furiosus. The enzymatic activities of the protein identified from thermophilic archaea
were successfully improved by introduction of single substitution, deletion or insertion. Also the expression system using bacterial cell was developed for efficient expression of thermostable proteins from extremophiles.

第1章

研究の背景と研究の設定上した．それでもこの頃の塩基配列解読では，クローニ

生物が有する遺伝子の本体である DNA の塩基配列の世代シーケンサーでの作業に比べると格段に多くの労力

ングや鋳型プラスミドの調製等の作業があり，現在の次解読を簡便に行える様にしたのが同時期に発表されたマと長い時間とを要するものであった．

クサム・ギルバート法とサンガー法であった．その後，約25年前，微生物ゲノムの全塩基配列を解読する際に，使いやすい M13 系や pUC 系のベクター並びにダイデオ

ホールゲノムショットガン法という，微生物のゲノム

キシ法などの簡便な反応系の開発が進み，DNA 分子のDNA をランダムに切断した分子の塩基配列を解読し，塩基配列解読は一般的な技術として普及してきた．しか得られたデータをコンピュータ上で結合していくというし，1990年位までは，一つの遺伝子の塩基配列を決定す戦略が用いられるようになった．従来要していたサブクるのが一般的であった．その後スラブゲルを用いる自動

ローン・ライブラリの構築・各プラスミド等の調製・反シーケンサーが，次いでキャピラリー自動シーケンサー

応・自動シーケンサーによる塩基配列の解読とデータ収が開発され，DNA の塩基配列解読の効率が飛躍的に向集というステップの内，サブクローン・ライブラリの構築がこの戦略を用いることで必要なくなった．大量のE-mail: kawarabayasi.yutaka@nifty.com

データを収集し，コンピュータ上で連結し，データが不− 69 −

河 原 林裕

足してつながらない部分については別の作業としてつな

これらの機能未知蛋白質の中には各微生物の中で非常にげていき，完全な塩基配列を構築するというものである．

重要な機能を有しているものも隠れている可能性があ

この方法の普及により微生物のゲノム塩基配列は効率的

る．まだわれわれヒトがその機能を見出せずにいるものに決定されるようになった．この決定された塩基配列かも多数存在する．そこで，これら機能未知遺伝子・蛋白らは，遺伝子情報を抽出する必要がある．塩基配列その質の機能の解明と得られた遺伝子資源の応用を課題としものが遺伝子の情報となるリボソーム RNA，トランスて当寄付講座は研究をスタートした．

ファー RNA，その他の小さな RNA 等をコードする遺伝
子は，配列の比較から見出すことが出来る．しかしなが

1）相同性から機能が推定されている超好熱アーキアのら本来最も必要としている情報は，蛋白質をコードして蛋白質・酵素の機能解明

いる遺伝子の情報で，まず遺伝子の位置を特定する必要

前段で機能が全く推定できない，「機能未知遺伝子」

がある．微生物の場合，蛋白質をコードする遺伝子の大がゲノム中に見いだされてくることを示した．しかし，部分にはイントロンがないので，比較的容易に遺伝子領

蛋白質の機能が相同性から推定されていても，実際の実域を推定することが出来る．遺伝子領域を推定したら次験的な解析で得られる機能・活性については，相同性かは各遺伝子がコードする蛋白質が有している機能を推定

らの推定と反応特異性，基質特異性，補酵素・金属特異

しなくてはならない．通常このステップでは，各遺伝子性などが異なる場合などが，特に超好熱アーキアの蛋白にコードされている蛋白質のアミノ酸配列を，過去に機質で数多く見出されてきた．

能が解明されている蛋白質のアミノ酸配列と比較し，配例えば，超好熱アーキアから単離されたホスホフルク

列が似ていれば機能も似ているものとして，ゲノム情報

トキナーゼやヘキソキナーゼでは，バクテリア由来の類から見いだされた遺伝子産物の機能を推定する．この段縁酵素が ATP を用いるのと異なり，ADP をリン酸供与

階で，データベース中の機能が明らかになっている蛋白体として用いることが，実際の組換え蛋白質の実験的解
析から明らかにされてきた（Sakuraba et al., 2002）．また，質と相同性が見いだされない場合，その蛋白質の機能をない「機能未知蛋白質」，それをコードする遺伝子は「機我々のグループが過去に報告した超好熱アーキア
Sulfolobus tokodaii 由来の糖-1-リン酸ヌクレオチド転移/

能未知遺伝子」と呼ばれる．筆者がゲノム解析に携わっ

アミノ糖-1-リン酸アセチル基転移酵素は，データベースていた当時 3 か月から半年という膨大な時間と労力を要との相同性の結果では，グルコース-1-リン酸と TTP をして決定した 3 種の超好熱アーキアのゲノム情報をTable 1 に ま と め た（Kawarabayasi et al., 1998; Kawara-

結合する活性を有することが推定されていた．しかし，推定することができない．この蛋白質は機能が推定でき

bayasi et al., 1999; Kawarabayasi et al., 2001）．機能未知

実際に大腸菌内で生産させた組換え蛋白質についての実験的解析から N- アセチルグルコサミン-1-リン酸と UTP

伝子の機能が推定出来ないものであった．次世代シーケを結合させる活性も有していることが明らかとなっている（Zhang et al., 2005）．

ンサーが普及した現在，4,000 個程度の微生物ゲノムのこれらの例が示すように，過去に機能が解明された蛋

全塩基配列が決定されているが，これらのどの微生物か

白質やそれをコードする遺伝子との相同性が存在して機らも機能未知遺伝子は一定の割合で見いだされてくる．

能や酵素活性が推定されていたとしても，実際に組換え遺伝子とのみ相同性を有するものを含めて約 60 % の遺蛋白質として生産した蛋白質の実験的な解析から得られた酵素活性や機能は異なっていることがある．この様なTable 1

Summary of the genome analysis data of three hyperthermophilic archaea

遺伝子も実際の機能や酵素活性が明らかとなっていないという意味では，一種の「機能未知遺伝子」の状態だと考えられる．これら相同性から機能が推定されている遺伝
子・蛋白質であっても，地道な実験的機能解明を行うことは重要な課題だと考えられる．特に超好熱アーキア由来の遺伝子・蛋白質の場合，必須の課題だと考えられる．
そこで，超好熱アーキア S. tokodaii, Pyrococcus horikoshii
等が有している遺伝子がコードしている蛋白質を材料として，その機能・酵素活性を明らかにする取り組み「相同性から機能が推定されている超好熱アーキアの蛋白
質・酵素の機能解明」を第 1 研究課題として設定した．
その中では，当グループでの S. tokodaii 由来糖-1-リン酸− 70 −

極限環境微生物のゲノムに認められる機能未知遺伝子の機能解析とその応用

Fig. 1

Outline of the predicted metabolic pathway of phosphoglucosamine and phosphogalactosamine in Sulfolobus tokodaii. PMI, PMM/PGM and RmlA to D indicate
respectively phosphomannnose isomerase, phosphomannomutase/phosphoglucomutase
and enzymes catalyzing each step of the TDP-rhamnose biosynthetic pathway.

ヌクレオチド転移/アミノ糖-1-リン酸アセチル基転移酵性が見いだされてこない，いわゆる機能未知蛋白質・酵素の実験的解析から推定された UDP-N- アセチルグルコ

素について，特定の機能未知蛋白質・酵素を選択してそサミン生合成経路の中の初発（Fig. 1 中の（I））と 2 番目の蛋白質の機能に辿り着くのは想像以上に困難だと思わの酵素（Fig. 1 中の（II））についてゲノム情報から見出れる．大腸菌や枯草菌では，機能が相同性の比較からはされてきた候補遺伝子を対象とした．各遺伝子情報を元推定出来ない未知遺伝子を含む全ての遺伝子について，に当該蛋白質・酵素を大腸菌内で生産し，この組換え蛋

各遺伝子を個々に破壊した遺伝子破壊株コレクションの白質を用いて詳細な機能・酵素活性の解析に取り組んだ．
さらに，超好熱アーキア P. horikoshii には，生育して作製が，すでにゲノム解析初期の頃に取り組まれた（Baba & Mori, 2008; Baba et al., 2008; Ogasawara, 2000）．

いる自然環境中の温度・浸透圧等の急激な変化に対応す

しかしながら機能未知遺伝子を個々に破壊していくと，る為に生体内でフルクトース-6-リン酸から 5 段階の反応

細胞の生存に必要な遺伝子の場合には破壊することで致によって生合成されるマンノシルグリセレートという化

死となることから破壊株は作製することができない．ま合物が知られている．この生合成経路の内，最後の 2 種

た破壊株の多くでは，表現型に顕著な違いは見出されて類の反応を触媒する酵素については，既にポルトガルのこなかった．残念ながら，網羅的な遺伝子破壊を行ってグループから実験的解析結果が報告されている（Empadinhas et al., 2001）．また， 2 番目の反応を触媒も機能未知遺伝子の機能の解明に結びついた例はそう多するマンノースに結合したリン酸基の位置を変換するムの発現及び発現量を解析するトランスクリプトーム解析

ターゼ酵素についても既に我々のグループが実験的解析
結果を報告している（Akutsu et al., 2005）．そこで，こやマイクロアレーを用いた mRNA 発現量の解析，全ての生合成代謝経路の最初の反応であるフルクトース-6-リン酸をマンノース-6-リン酸へと変換する反応及び 3 番目

もゲノムの塩基配列が決定された微生物では取り組まれてきた（Iwanaga et al., 2014）．それらの大掛かりな解析の反応であるマンノースと GTP から GDP- マンノースに取り組んでも，機能未知蛋白質・酵素・遺伝子の機能を合成する反応の両方の反応を触媒すると推定された蛋にたどり着くのは容易なことではないと感じられる．

くないのが現状である．その他に転写産物である mRNAの代謝物の動態を解析するメタボロームといわれる解析

当寄付講座の対象とした極限環境微生物，特に超好熱

白質についても組換え蛋白質を用いて実際の機能・酵素

アーキアは，真正細菌である大腸菌・枯草菌に比してそ活性の解析に取り組んだ．

のゲノムサイズが小さく，ゲノムにコードされている遺2）活性を指標とした超好熱アーキアの新規蛋白質・酵

伝子重複が少なく欠損変異体で類縁遺伝子による表現型

素の単離とその解析相補がおこり難いというメリットがあると思われる．しすでに機能が明らかな蛋白質・遺伝子と配列上の相同かし，遺伝子破壊株の作製が可能な超好熱アーキアは− 71 −

河 原 林裕

Thermococcus kodakarensis のみで（Sato et al., 2005），他

見出されたり，全く新規の酵素活性の存在が確認されるの超好熱アーキアでは遺伝子破壊・遺伝子導入とも非常ことが示された．これらは，ゲノム情報からだけでは得に難しいのが現状である．異なる条件下での培養で発現ることが出来ない貴重な超好熱アーキア由来の遺伝子資量が変動する遺伝子群を明らかにすることで機能未知遺源である．超好熱アーキア由来の蛋白質・酵素は，高温伝子の機能に迫れるのではないかという考えがある．そ等に対して高い安定性を示すことから，酵素学や基礎科こで当寄付講座でも，含有する糖の種類（グルコース，

学的な興味の他に，物質生産等の応用での利用にも注目

ラムノース等）を変えた培地中での培養から得た全されている．超好熱アーキア由来酵素では，Km 値がバ

RNA を用いたマイクロアレー解析に取り組んだ．このクテリア由来の酵素のものと比べると小さい場合があ解析の結果，発現が変動する遺伝子を見出すことは出来る．これは反応に用いられる基質は非常に薄い濃度のもたが，同一の発現変動を示す遺伝子群が全て機能未知遺のでも利用できることを示し，超好熱アーキア由来酵素での有利な点である．しかしながら，一方の kcat 値に伝子であったり，非常に多数の遺伝子が同一の発現変動
けでは，機能未知遺伝子の機能に辿り着くことは非常についても，バクテリア由来の酵素のものと比較するとこ
ちらも小さい場合がある（Zhang et al., 2007）．このこ困難であることが明らかになった．

とは，反応の進行はバクテリア由来の酵素を用いた場合を示すことから，このマイクロアレー解析の結果からだ

次に，再度ゲノム情報とゲノム情報から構築されていよりも非常に遅いということを示している．超好熱アーる代謝経路の情報を比較したところ，代謝上必要だと思

キア由来の酵素の有する最大の利点である耐熱性・高いわれる遺伝子・酵素がゲノム情報中には見出されていな安定性を維持したまま反応効率を上げることが出来れい場合があると思われた．例えば，元々超好熱アーキア
S. tokodaii のゲノム情報中には相同性の解析結果からフば，応用面で非常に有利になると考えられる．また，超ルクトースをリン酸化する機能を有するフルクトキナー

用いても比較的容易に発現が成功する場合が多い．しかゼの存在が推定されていた．しかしながら，本遺伝子産しさらに効率的な発現系が存在するとさらに応用面でも物を大腸菌内で生産した組換え蛋白質からは，予測され有利となることが推測される．そこで，これら応用を目たフルクトキナーゼ活性は検出されず，2-ケト-3-デオキ

指した酵素活性の向上，生産性向上を目指した発現系の好熱アーキア由来蛋白質は大腸菌を宿主とした発現系を

シグルコネートキナーゼ活性が実験的に確認された構築を課題とした「極限環境微生物遺伝子資源の応用」（Ohshima et al., 2007）．この実験結果とゲノム情報を総を第 3 の研究課題として設定した．ここでは，Fig. 1 に合すると，本超好熱アーキアにはフルクトキナーゼが存在しないことになる．本超好熱アーキア S. tokodaii は，示した糖-1-リン酸ヌクレオチド転移/アミノ糖-1-リン酸

本来グルコースを分解してエネルギーを獲得する際にグ-3-リン酸とを結合する反応（一重枠で囲った反応）におルコースをリン酸化しない特殊な代謝経路を用いている

いて，その触媒能の改善に取り組んだ．さらに同一蛋白

アセチル基転移酵素が有する糖-1-リン酸とヌクレオシド

ことが知られている（Kim & Lee, 2005）．また，ゲノム質が有するリン酸化アミノ糖アセチル基転移酵素活性

情報中にはグルコキナーゼ遺伝子は相同性からは見出さ（Fig. 1 の二重枠で囲った反応）についても，その触媒

れてこなかった．しかし，活性から精製に取り組むと実能の改善に取り組んだ．

は機能未知遺伝子がコードする蛋白質がグルコキナーゼ

第2章の活性を有することがすでに報告されている（Nishimasu
et al., 2006）．同様に，ゲノム情報では見出されてこな
いが，代謝上重要な酵素活性を指標に精製・遺伝子同定

研究成果の概要

1）相同性から機能が推定されている超好熱アーキアのを行うことで，機能未知蛋白質・酵素・遺伝子にたどり

蛋白質・酵素の機能解明

着けるのではないかと考え，第 2 の研究課題として「活これまでの解析から，超好熱アーキア S. tokodaii のゲ性を指標とした超好熱アーキアの新規蛋白質・酵素の単ノム情報から見出された糖-1-リン酸ヌクレオチド転移/

離とその解析」を設定した．そこでは，Fig. 1 に示すフアミノ糖-1-リン酸アセチル基転移酵素の実験的解析か

ルクトキナーゼ（a）及びホスホグルコサミンとホスホガ
ラクトサミンを変換するエピメラーゼ（b）を主なター

ら，本蛋白質はグルコース-1-リン酸と TTP を，さらにN-アセチルグルコサミン-1-リン酸並びに N-アセチルガ

ゲットに選択した．

ラクトサミン-1-リン酸と UTP を結合させ，各々 TDP-グ
ルコース，UDP-N-アセチルグルコサミン，UDP-N-アセ

前述の1），2）で示す研究課題を実際に遂行することで，チルガラクトサミンを生成する反応を触媒出来ることが示されてきた（Zhang et al., 2010）．さらに，本糖-1-リン

既知の酵素では明らかになっていなかった基質特異性が酸ヌクレオチド転移/アミノ糖-1-リン酸アセチル基転移3）極限環境微生物遺伝子資源の応用− 72 −

極限環境微生物のゲノムに認められる機能未知遺伝子の機能解析とその応用

酵素は，グルコサミン-1-リン酸のみならずガラクトサミとが確認された．

ン-1-リン酸にもアセチル CoA のアセチル基を転移させ，N-アセチルグルコサミン-1-リン酸，N-アセチルガラクト

ターゼについても大腸菌内で容易に耐熱性・可溶性の蛋

サミン-1-リン酸を生成する活性を有していることが実験

白質として発現させることが出来た．推定されたマン的解析から明らかとなった．このことは，バクテリアがノース及びグルコースに結合しているリン酸基の位置を有するフルクトース-6-リン酸から UDP-N-アセチルグル

変換する活性を有することが確認された．次に，推定さコサミンを生成する生合成経路と同様の生合成経路が超好熱アーキア S. tokodaii 中に存在していることを示唆しリン酸基転移活性についてカップリング系を用いて検出ている．

を試みた．グルコサミン-6-リン酸を基質とし本候補蛋白二番目の反応を触媒すると推定されたリン酸化糖ムれたグルコサミン-6-リン酸とグルコサミン-1-リン酸間のそこで，既にバクテリアで良く解析されている本質とアセチル CoA，UTP，糖-1-リン酸ヌクレオチド転

UDP-N-アセチルグルコサミン生合成経路中の反応を触移/アミノ糖-1-リン酸アセチル基転移酵素をカップリン

媒することが推定された蛋白質を最初の実験的解析ターグさせて反応させると，グルコサミン-1-リン酸がムター

ゲットに選定した．バクテリアでの本生合成経路の初発

ゼ活性によって生成された時だけ UDP-N-アセチルグル

反応は，グルタミンを供与体としてフルクトース-6-リンコサミンが検出される．反応の進行に伴って予想された酸にアミノ基を転移させてグルコサミン-6-リン酸を生成

UDP-N-アセチルグルコサミン分子が検出されたことかする反応で，グルタミン：フルクトース-6-リン酸アミノ

ら，本候補蛋白質は相同性から推定されていたホスホマ

基転移酵素が触媒することが知られている（Fig. 1 の（I）

ンノムターゼ・ホスホグルコムターゼ活性の他にホスホの反応）．二番目の反応は，上記グルコサミン-6-リン酸

グルコサミンムターゼ活性も有していることが示されのリン酸の位置を 6 位から 1 位に変換する反応で，リンた．これまでに，幾つかのアーキアからリン酸化糖ムター
ゼが見いだされている．T. kodakarensis から見出された

酸化糖ムターゼにより触媒されることが知られている（Fig. 1 の（II）の反応）．これら二つの反応を触媒する酵
素・蛋白質について，超好熱アーキア S. tokodaii のゲノ

リン酸化糖ムターゼは，リン酸化グルコース・リン酸化

ム情報を検索したところ，最初のグルタミン：フルクトー

マンノースを基質とすることができるが，リン酸化グル
コサミンを基質とすることが出来ない（Rashid et al.,ス-6-リン酸アミノ基転移酵素については，相同性から 1

2004）．P. horikoshii から見出されたリン酸化ムターゼで個の遺伝子が候補として見出されてきた．一方，グルコ

は，リン酸化グルコース・リン酸化マンノースを基質とす る こ と が 報 告 さ れ て い る（Akutsu et al., 2005）．S.

サミンに結合しているリン酸基の位置を変換するムター
ゼに関連する蛋白質としては，ホスホマンノムターゼ・

tokodaii と同じ属である Sulfolobus solfataricus から見出

ホスホグルコムターゼがゲノム情報中から見出されてきされたリン酸化糖ムターゼは，リン酸化グルコース・リた．これら二つの見出されてきた候補蛋白質に関して，

ン酸化マンノースを基質とするが，リン酸化グルコサミ

これらの蛋白質をコードする遺伝子を発現ベクターに導入し，大腸菌を用いて組換え蛋白質として生産させた．

ン・リン酸化アセチルグルコサミンを基質として用いることはできない（Ray et al., 2005）．Methanococcus mari-まず，グルタミン：フルクトース-6-リン酸アミノ基転

paludis から見出されたリン酸化糖ムターゼは，リン酸化移酵素候補蛋白質は，容易に大腸菌内で可溶性・耐熱性

グルコース・リン酸化グルコサミンを基質として用いる

蛋白質として生産された．そこで，酵素活性の測定を，ことが報告されている（Namboori & Graham, 2008）が，反応により生成するグルタミン酸を検出して行った．しリン酸化マンノースを基質として用いることは報告されかし，全く検出されなかった．そこで再度，N 末端配列ていない．これらのアーキアには複数のリン酸化糖ムを検討したところ，元々のメチオニンの 3 残基 C 末端

ターゼ候補遺伝子がゲノム情報中から相同性により見出側にバリンをコードする GTG コドンが見出されてきた．この GTG は微生物遺伝子では，スタートコドンとされてくることから，それらには機能的役割分担がある
ことも考えられる．これらの報告を見ても，S. tokodaii

して利用される場合がある．そこで， 3 残基・ 9 塩基分から見出された本酵素の解析結果は， 3 種類のリン酸化

C 末端側の GTG をスタートコドンである ATG に置き換えた 3 残基短い蛋白質を大腸菌で生産させたところ，

糖ムターゼ活性を有するという非常に希少な酵素が超好熱アーキア S. tokodaii 中に存在することを示している．

この短い蛋白質も大腸菌の中で耐熱性・可溶性の蛋白質

さらに，以上の実験的な確認から本超好熱アーキア中にとして生産された．さらに，この短いフォームの蛋白質

はフルクトース-6-リン酸から UDP-N-アセチルグルコサ

では， 3 残基長いフォームと異なり，反応進行に伴うグミンを合成するバクテリア型代謝経路が確かに存在する

ルタミン酸の生成が検出されたことから，本ショート

ことが確認された．

フォームの蛋白質は予想された酵素活性を有しているこ− 73 −

一方，超好熱アーキアの Pyrokoccus 属には，同じフ河 原 林裕

ルクトース-6-リン酸を出発材料とするマンノシルグリセ

未知生成物の合成を確認した．その結果，グルコサミン

レート生合成経路の存在が知られている（Empadinhas
et al., 2001）． そ こ で 超 好 熱 ア ー キ ア Pyrococcus-6-リン酸を反応系に加えた場合のみ，非常に微量なガラ

horikoshii のゲノム情報から，最初の反応と 3 番目の反中に見いだされたリン酸化アミノ糖エピメラーゼ活性を応を担うバイファンクショナルな酵素の存在が推定され指標にして，本活性を有する蛋白質を精製することが出た．大腸菌の中で生産された耐熱性・可溶性蛋白質を用来た．その N 末端のアミノ酸配列から特定された遺伝いた解析から，本候補蛋白質は予想通りのホスホマン

子情報から，発現プラスミドを構築し発現させた耐熱性・

ノースイソメラーゼ活性を有していることが確認され可溶性蛋白質から，本リン酸化アミノ糖エピメラーゼ活

クトサミン-6-リン酸の存在が確認された．無細胞抽出液

た．さらに 3 番目の反応である GDP-マンノース生成活性が検出できたことから，本活性を有する蛋白質の本体性についても，生成物の HPLC による分析から確認さを確認することが出来た．これまで，どの生物からもグれた．さらに興味深いことに，本蛋白質はマンノース-1-

ルコサミン-6-リン酸とガラクトサミン-6-リン酸を変換す

リン酸を糖基質とした場合，全ての NTP 並びにデオキ
シ GTP（dGTP）も基質として利用できることが示されるエピメラーゼ活性は検出されていないことから，本超
好熱アーキア S. tokodaii から全く新規な酵素を見出すこた．さらにグルコース-1-リン酸およびグルコサミン-1-リとが出来た．

ン酸も GTP または dGTP と結合させる反応を触媒出来

次に，超好熱アーキア S. tokodaii 中の幾つかの糖や糖ることが明らかとなった．これら 3 種類の糖-1-リン酸基

ヌクレオチド生合成経路に必要なフルクトース-6-リン酸質を利用でき，多種類のヌクレオシド-3-リン酸基質を利用できる酵素・蛋白質で，ホスホマンノースイソメラー

をフルクトースから生成するフルクトキナーゼは，相同性の解析結果から本超好熱アーキア S. tokodaii のゲノム

ゼ活性も有しているバイファンクショナルな酵素・蛋白情報中に見出されていた．しかし，その遺伝子産物からはフルクトキナーゼ活性は検出されず，実は 2-ケト-3-デ

質はこれまでに見出されていない．
遺伝子の配列比較からは推定出来なかった多様な活性やオキシグルコネートキナーゼ活性であることが明らかとなった（Ohshima et al., 2007）．このことはゲノム情報

特徴を見出すことができた．このことは，たとえゲノム

中にはフルクトキナーゼが存在しないことを示す．そこ

塩基配列・ゲノム情報が明らかになったとしても，それはで，本アーキアの無細胞抽出液の中にフルクトキナーゼ

単なるスタートであり，実際の実験的な機能・活性・特徴

活性が存在するか確認した．その結果，こちらも弱いなの解明への取り組みが重要だということを示している．

がらもリン酸化されたフルクトースが検出されてきた．

以上，本研究課題において取り組んだ解析結果から，各そこで，本活性を指標にして無細胞抽出液中から，数蛋2）活性を指標とした超好熱アーキアの新規蛋白質・酵

白質が含まれる画分にまで精製を行うことが出来た．各素の単離とその解析

蛋白質のN末端アミノ酸配列の解読を行ったので，順次前述の様に，糖-1-リン酸ヌクレオチド転移/アミノ糖

組換え蛋白質として生産して，どの蛋白質が本フルクト-1-リン酸アセチル基転移酵素の実験的解析から本アーキ
ア S. tokodaii には，バクテリア型 UDP-N-アセチルグル

キナーゼの本体か確認を行う予定である．

コサミン生合成経路と同様の UDP-N-アセチルガラクト

因でダメージを受ける．例えば，化学物質・紫外線・放サミン生合成経路の存在が推定された．本糖-1-リン酸ヌ

射線等によって DNA には損傷が入る．その損傷を除去

クレオチド転移/アミノ糖-1-リン酸アセチル基転移酵素

して修復する為に，EndonucleaseV というものが知られている．しかし，超好熱アーキア Pyrococcus furiosus のは Fig. 1 に示すように，その最後の 2 段階の反応を触媒

生物が有する遺伝子の本体である DNA は，様々な要することが出来ると考えられる．しかし，UDP-N-アセ

無細胞抽出液と損傷モデル DNA を反応させると，このチルグルコサミンの生合成経路と同様の独立した代謝経

EndnucleaseV が切断する位置と異なる位置での切断が路が存在するとすれば，初発物質であるフルクトース-6-

確認された．そこで，この切断活性を精製し N 末端のアリン酸に対応するリン酸化糖が存在することとなる．しミノ酸配列を決定して遺伝子を同定したところ，元々のかし，このリン酸化糖は，フルクトースの様な一般的な相同性による機能推定では機能未知遺伝子であった．こ糖ではなく希少な糖となってしまう．そこで，UDP-N-の新規 DNA 損傷修復に機能するであろう Endnuclease

アセチルグルコサミン生合成経路の中間産物であるリン

活性は九州大学での成果ということで EndnucleaseQ と酸化グルコサミンがリン酸化ガラクトサミンに変換する名付けられた．また，この蛋白質の配列の比較から細胞可能性があるのではないかと推定した．可能性がある「グ増殖時に起こる DNA 複製で重要な機能を有する PCNA

ルコサミン-6-リン酸」及び「グルコサミン-1-リン酸」に，
超好熱アーキア S. tokodaii の無細胞抽出液を反応させてとの相互作用機能を有すると想定される領域が同定された．そこで，大腸菌の中で生産した組換え蛋白質を用い− 74 −

極限環境微生物のゲノムに認められる機能未知遺伝子の機能解析とその応用て本 EndnucleaseQ と PCNA が相互作用するか確認し菌の類縁酵素活性と比してまだまだ低いものであった．

た と こ ろ，PCNA 存 在 下 で 本 EndonucleaseQ の 損 傷

そこで， 5 種類の変異を複数組み合わせることで，さDNA 切断活性が促進されることが示された．本アーキ

らなる活性の上昇の可能性を検討した．残念ながら全て

ア細胞中では両蛋白質は相互作用して，DNA 損傷の際の複合変異体糖-1-リン酸ヌクレオチド転移/アミノ糖-1-の修復を効率的に進めていることが推測される．

リン酸アセチル基転移酵素では，野生型の 10 % 程度以

リボヌクレアーゼ P（RNase P）は，RNA と蛋白質の下の活性が検出されたのみであった．このことは，二つ複合体で，主な機能は遺伝子から転写された tRNA 分子

以上の変異を同時に一つの糖-1-リン酸ヌクレオチド転移の 5ʼ 末端に存在するリーダー配列を除去するために切断/アミノ糖-1-リン酸アセチル基転移酵素に導入すると，することである．この RNase P は，真正細菌・真核生物

活性の極端な低下をもたらすことを示した．

にも存在し，同様の tRNA 転写産物のリーダー領域の除

次に，単一変異の際に最も活性が上昇した97番目の去を行う．しかし，真正細菌・真核生物では tRNA 以外

Tyr を，他の全てのアミノ酸に置換した変異体の作成をにも多様な RNA 分子の切断に関与していることが知ら試みた．その結果， 6 種類の変異体では UDP-N-アセチ

れている．しかし，アーキアの RNase P が tRNA リーダー

ルグルコサミンおよび UDP-グルコース両方の合成活性

領域切断以外のどの様な機能を有しているかは明らかにの上昇が確認された．この中でも Y97N では野生型活性なっていない．そこで，アーキアにおける本 RNase P のと比して約 4.5 倍の活性を示した．また 8 種類の変異体

新たな基質の探索を目指した．本 RNase P が基質とする蛋白質では，UDP-N-アセチルグルコサミン合成活性のRNA を探索する為に，この RNase P の機能を低下させみが促進されていた．

た変異株を作成した．野生型との比較から変異株においこれらの活性が促進された変異体糖-1-リン酸ヌクレオて量が増加する RNA が新たな RNase P の基質だと考え

チド転移/アミノ糖-1-リン酸アセチル基転移酵素の中でられる．そこで，生育速度が 25 % 減少した RNase P 変
異株と野生株から RNA を抽出し，その存在比の異なる

特徴的な Y97N，Y97M および Y97V について，その見かけの Km，kcat 値を解析した結果，活性の上昇には kcat 値

分子を次世代シーケンサーによる塩基配列解読で検索しの上昇が関与していることが示された．今回の変異体にた．その結果，12の遺伝子の RNA 量が変異株で 2 倍以

ついての解析結果から，本糖-1-リン酸ヌクレオチド転移上に増加していることが明らかとなった．さらに興味あ/アミノ糖-1-リン酸アセチル基転移酵素が有する糖ヌクることに，その内10の遺伝子は 3 つの遺伝子クラスター

レオチド合成活性については，一つのアミノ酸残基に変として存在することが明らかとなった．現在，RNase P

異を導入することで，大きく促進できることが示された．

がこれらクラスターの RNA を切断するという直接的証

また，同じ糖-1-リン酸ヌクレオチド転移/アミノ糖-1-

拠は得られていないが，さらに詳細な解析で，RNase P

リン酸アセチル基転移酵素の C 末端側にコードされてのターゲットとなる分子の解明に取り組みたい．

いるアミノ糖-1-リン酸アセチル基転移活性の促進についても検討を行った．C 末端のアミノ酸残基を数アミノ酸
欠失させることで，大きくグルコサミン-1-リン酸アセチ3）極限環境微生物遺伝子資源の応用
伝子・蛋白質・酵素が見出されてきている．これらは，ル基転移活性が上昇することが確認された．見かけのKm，kcat 値の解析を行った結果，これらの変異体でも基礎科学的・酵素学的・蛋白質科学的な興味ある材料で大きく上昇していたのは，kcat 値であった．

これまでの解析の中で，新規な機能や特徴を有する遺ある．一方，新規反応を触媒する酵素・蛋白質は，これ

ホスホマンノースイソメラーゼとマンノース-1-リン酸

まで生物学的生産が困難であった物質の生産という応用と GTP を結合させる活性の二つを有する超好熱アーキ
ア P. horikoshii が 有 す る バ イ フ ァ ン ク シ ョ ナ ル 酵 素の可能性が考えられる．しかし，超好熱アーキア由来の酵素活性の中には Km 値・kcat 値どちらもバクテリア由PH0925 蛋白質についても，C 末端側のアミノ酸残基を来類縁酵素のものと比較して小さい場合がある．kcat 値

100 残基程度欠失させることで，野生型蛋白質の活性のが小さいということは，反応の進行速度が遅いというこ

3.5 倍高いマンノース-1-リン酸と GTP を結合させる活性とで，応用面を考慮すると反応速度が速いほうが適してを示すことが明らかとなった．
以上の様に超好熱アーキア由来酵素では，活性中心へいる．そこで，耐熱性に優れた酵素・蛋白質の有していの変異の導入，或いは適度な長さの欠失の導入により，る触媒能の改善に取り組んだ．
当研究室では，糖-1-リン酸ヌクレオチド転移/アミノ糖

活性を大きく上昇させることが可能だということが示さ-1-リン酸アセチル基転移酵素について 5 個の変異体で活性が 1.3〜1.5 倍上昇することを確認してきた（Zhang et al.,

れた．

2007）．しかし，この上昇した活性でもバクテリア・大腸

知・新規 DNA ポリメラーゼの断片を得ることが出来た．

近年，環境から回収された DNA を鋳型に用いて，未− 75 −

河 原 林裕

この断片を Taq DNA ポリメラーゼの相当する領域と交解析技術では完全に推定・確定出来ないものが機能未知換した変異体を作製して，それらの変異体蛋白質の有し遺伝子ではないかと考えた．特に超好熱アーキア由来のている活性を解析した結果，プライマー伸長活性および酵素・蛋白質では，これまでにも相同性から推定されてDNA 結合活性が野生型の Taq DNA ポリメラーゼよりいた機能が実際の組換え蛋白質からは検出されず，異も促進されているものが見出されてきた．これらの二つなった機能・活性が検出されるという例が数多く見出さの活性が促進されている変異体のアミノ酸配列と野生型

れてきている．さらに推定されていた活性は有している

Taq DNA ポリメラーゼのアミノ酸配列とを比較するとが，基質特異性がバクテリア由来の酵素・蛋白質と異な9 アミノ酸の挿入が検出された．そこで，本 9 アミノ酸

り多様な基質を代謝することが出来るという性質も数多の領域を野生型 Taq DNA ポリメラーゼに挿入してそのく見出されてきている．この特徴自体，酵素学や基礎科

影響を解析した．その結果，本断片の挿入により，PCR

学的な観点から興味を引くものであるが，当寄付講座の産物の約 3 倍の増加，DNA 結合能の向上が観察された．

課題との関連で考えると，超好熱アーキア由来酵素・蛋

このことは，本 9 アミノ酸長の領域が Taq DNA ポリメ

白質についてゲノム情報からアノテートされた活性・機

ラーゼの機能を促進する能力を有していることを示して能は，たとえ既知の蛋白質・酵素との相同性が見いださいる．今後，類似の機能を有するアミノ酸断片がさらにれていたとしてもそれは単なる推定であって，その推定得られるか，さらに強力に DNA ポリメラーゼの活性をされた機能・活性は確定されたものではない，という見促進する断片が存在するかについても研究を進めていき方が必要だと思われる．このことは，たとえ相同性からたい．

機能・活性が推定されていたとしても，実験的な解析が以上，超好熱アーキア由来の酵素やその他の酵素につ行われるまでは機能・活性は確定出来ない，つまり機能いてそれらの応用に近づける為に各酵素・蛋白質の機能・未知な蛋白質・酵素・遺伝子だと考えざるを得ないこと

活性を促進することが可能なこと，さらには実際の活性を示している．その点で，今回の取り組みで対象にしたの促進例を示した．しかし，これら酵素・蛋白質の応用「相同性から機能が推定されていた蛋白質・酵素・遺伝子」

について考えると，酵素・蛋白質自身の活性の促進は重については，相同性の情報からは予測出来ない基質を代

要な取り組みであるが，一方でそれらの蛋白質の効率的謝出来る活性を有する等の特徴が見出されてきたことやな生産も重要な課題である．そこで，好熱性のバクテリ

N 末端のアミノ酸によって完全に活性が抑制されるとアを用いた発現系の確立に取り組んだ．宿主候補に選択したのは Geobacillus kaustophilus HTA426 株で，生育温いう点など，相同性の解析だけでは見出すことが不可能な性質を明らかにすることが出来，非常に重要な意味の度が 60 ℃ と高温なため，超好熱アーキア由来耐熱性蛋

あるものであったと考えられる．一方で，現在ゲノム配白質の生産に適していると推定された．効率的なプロ列は15年前と比較にならない位に高速に安価に決定するモーターを有し，生産された蛋白質の精製を容易にすることが可能になってきている．その得られたゲノム情報

ために His タグを有する形で蛋白質が生産されるベクについては，単なる材料の一部が提供されただけと言うターを構築した．幾つかの，由来の種が異なる遺伝子に様な観点で利用し，実際の実験的な解析を重視することついて本発現系を用いた効率的生産に成功した．さらに，が必要なのではないかと思われる．
また，対象をうまく選択することで活性や機能を指標

効率的に発現された蛋白質は機能を表す形で生産されてにしたアプローチから元々機能未知であった蛋白質・酵

いた．
以上，超好熱アーキア由来の耐熱性を有する蛋白質・素・遺伝子の機能を解明することが可能だという例を示

酵素の活性の促進法の確立，実際の活性の促進を行った．

すことが出来たことは大きな成果だと考える．とかくゲ

さらに効率的発現系としてバクテリアを用いた系を構築

ノム情報が存在する中で伝統的な生化学の手法でのアプすることが出来，今後の応用で有用だと思われる．

ローチは，全く泥臭く効率的でないような印象をもたれ第3章る可能性もある．しかしながら，網羅的な手法によって終わりに機能未知蛋白質・酵素・遺伝子の機能を解明することは現在の技術ではまだまだ不可能なことから，コツコツと本寄付講座には「極限環境微生物ゲノム情報中の未知した生化学的アプローチが一番早くて確実な方法ではな

遺伝子の機能解明とその利用」という課題が与えられていかと思われる．それでも，どの活性を対象に選ぶのかいた．では，ゲノム情報中に存在する機能未知遺伝子には非常に重要な要素だと思われるので，その際にはゲノはどの様な遺伝子が含まれるのか，それらにはどの様なム情報や代謝経路の情報，その他利用できるのであれば，違いがあるのかということがまず課題として浮かび上

転写量の変化の情報，生体内での分子の変化の情報（メ

がってきた．本来持っている機能を，現在のゲノム情報

タボローム），遺伝子の位置関係の情報など，手に入れ− 76 −

極限環境微生物のゲノムに認められる機能未知遺伝子の機能解析とその応用られる情報は以前に比べて格段に多いので，それらをうまく利用することで，効率的な探索が可能になるのではないかと考える．

謝辞

本研究は，公益財団法人発酵研究所の寄付金による援助のもと行われたもので，ここに感謝の意を表したい．
また，本研究への九州大学大学院農学研究院大島敏久教
授のご支援とご協力に感謝の意を表したい．さらに本研
究は，協力講座（微生物遺伝子資源学分野，生物化学分野，蛋白質科学分野）の皆様，当寄付講座に在籍したポスドク・技術補佐員等の職員並びに教官の皆さん，当分野で実質的な研究を行った大学院生・学部生の皆さんのご協力の元で成し遂げられたもので，ここに感謝の意を
表したい．

文

献

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Zhang, Z., Tsujimura, M., Akutsu, J., Sasaki, M., Tajima, H. &Kawarabayasi, Y. 2005. Identification of an extremely thermostable enzyme with dual sugar-1-phosphate nucleotidylyltransferase activities from an acidothermophilic archaeon, Sulfolobus
tokodaii strain 7. J. Biol. Chem. 280: 9698 – 9705.
Zhang, Z., Akutsu, J., Tsujimura, M. & Kawarabayasi, Y. 2007. Increasing in archaeal GlcNAc-1-P uridyltransferase activity bytargeted mutagenesis while retaining its extreme thermostability. J. Biochem. 141: 553 – 562.
Zhang, Z., Akutsu, J. & Kawarabayasi, Y. 2010. Identification ofnovel acetyltransferase activity on the thermostable protein
ST0452 from Sulfolobus tokodaii strain 7. J. Bacteriol. 192:
3287 – 3293.

− 77 −

IFO Res.Commun. 30
79-87, 2016

相同性から機能が推定されている超好熱アーキアの蛋白質・酵素の機能解明

相同性から機能が推定されている超好熱アーキアの蛋白質・酵素の機能解明
河 原 林

裕

九州大学大学院農学研究院極限環境微生物ゲノム機能開発学〒812-8581

福岡県福岡市東区箱崎6-10-1

Functional analyses of the proteins or enzymes whose function was predictedfrom similarity analyses
Yutaka Kawarabayasi
Laboratory of Functional Genomics of Extremophiles, Graduate School of Agriculture, Kyushu University
Hakozaki 6-10-1, Higashi-ku, Fukuoka, Fukuoka 812-8581, JapanThe functions or activities of genes assigned in the genomic data have been usually determined from results of sequence similarity analyses. However, during progress of experimental analysis of genes predicted within the genomic data, it was found that in some case actual function or activity was different from those predicted by sequence similarity. To elucidate the actual activity, function or feature of three gene products predicted as sugar
metabolic enzymes, these genes were expressed in Escherichia coli and the purified recombinant proteins wereused for experimentally functional analysis. It was found that full size of glutamine:fructose-6-phosphate aminotransferase did not exhibit the predicted activity, but its truncated form of three amino acid residues from N-terminus exhibited the expected activity. Detailed analyses indicated that this activity did not catalyze reverse directionof the reaction and was not subject to feedback regulation by the downstream products. The sole candidate protein
for phospho-sugar mutase detected within the Sulfolobus tokodaii genomic data exhibited phospho-glucosamine
mutase activity as well as phosphomannomutase and phosphoglucomutase activities. This is the first identificationof thermostable protein with multiple phospho-sugar mutase activities. Both phosphomannose isomerase and mannose-1-phosphate guanylyltransferase activities of the bifunctional enzyme predicted within the mannosylglyceratebiosynthetic pathway in P. horikoshii were experimentally confirmed. Also glucose-1-phosphate guanylyltransferase
and glucosamine-1-phosphate guanylyltransferase activities were detected on this protein as well as mannose-1-phosphate guanylyltransferase activity. These observations indicated that the experimental analyses werevery important for recognition of the actual activity of the gene products predicted from the genomic data, even
their functions or activities were predicted by sequence similarity analyses.
Key words: glutamine:fructose-6-phosphate aminotransferase, phosphoglucosamine mutase, phosphomannose
isomerase/mannose-1-phosphate guanylyltransferase, thermostable protein, thermophilic archaea

諸言いた反応を触媒する場合，これまでに知られているものとは異なった物質を反応に用いる場合などが，特に超好ゲノム情報中に見いだされる遺伝子の生化学的機能が熱アーキアの蛋白質・酵素で数多く見出されてきている．

相同性の比較から推定されていても，実際の実験的な解

例えば，超好熱アーキアから単離されたホスホフルク

析で確認される機能・活性については，相同性で推定さトキナーゼやヘキソキナーゼでは，バクテリアに存在す

れていた機能と異なる機能である場合，異なる基質を用

る類縁酵素が ATP を用いるのと異なり，ADP をリン酸

E-mail: kawarabayasi.yutaka@nifty.com
共同研究者：大島敏久，森田理日斗，岩本真梨子，林（九州大学大学院農学研究院）

供与体として用いることが，組換え蛋白質の実験的解析
から明らかにされてきた（Sakuraba et al., 2002）．また，知宏

我々のグループが過去に報告した超好熱アーキア
S. tokodaii 由来の糖-1-リン酸ヌクレオチド転移/アミノ− 79 −

河 原 林糖-1-リン酸アセチル基転移酵素は，データベースとの相裕（EcoR I, Xho I, BamH I）で切断し，同じ制限酵素で切同性解析の結果では，グルコース-1-リン酸と TTP を結断された pET21a, pET28a および pET28a ベクターにお合する活性を有することが推定されていた．しかし，実のおの挿入した．塩基配列解読により最終的な確認を行際に大腸菌内で発現させた組換え蛋白質についての実験的解析から N-アセチルグルコサミン-1-リン酸と UTP をい，各発現ベクターとした．

結合する活性も有していることが明らかとなった（Zhang et al., 2005）．

組換え蛋白質の生産
塩基配列を確認されたグルタミン：フルクトース-6-リ

これらの例が示すように，過去に機能が解明された蛋

ン酸アミノ基転移酵素発現ベクターは大腸菌 Rosetta2

白質・酵素やそれをコードする遺伝子との相同性が存在（DE3）pLysS 株に，その他の蛋白質の発現ベクターはして機能や酵素活性が推定されていたとしても，実際に

BL21-CodonPlus-（DE3）-RIL 株 に 形 質 転 換 す る こ と で，組換え蛋白質として生産した蛋白質の実験的な解析から組換え蛋白質として目的の遺伝子産物を生産させた．グ

得られた酵素活性や機能が異なることが数多く見出されルタミン：フルクトース-6-リン酸アミノ基転移酵素発現ている．この様なゲノム情報中の遺伝子・遺伝子産物もベクターを形質転換した大腸菌はアンピシリンを加えた

実際の機能や酵素活性が明らかとなっていないという意

液体LB培地中で，他の蛋白質用の発現ベクターで形質

味では，一種の「機能未知遺伝子」の状態だと考えられ転換した大腸菌 BL21-CodonPlus-（DE3）-RIL は，カナマる．これら相同性から機能が推定されている遺伝子・蛋

イ シ ン と ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー ル を 含 む LB 培 地 中 で白質であっても，地道な実験的機能解明を行うことは重37 ℃ で培養し，波長 600 nm での吸光度が 0.6−0.8 にな

要な課題だと考えられる．特に超好熱アーキア由来の遺るまで生育させ，そこに終濃度 23.8μg/mL になるよう

伝子・蛋白質の場合，必須の課題だと考える．

に IPTG を加え，さらに 37 ℃ で 6 時間培養を継続して，そこで，本報告では，相同性の比較から機能が推定さ

蛋白質発現の誘導を行った．培養終了後各菌体を 10,000

れていた糖代謝関連蛋白質・酵素であるグルタミン：フ×g，15分間の遠心分離で集菌し，洗浄後，菌体の 4 倍

ルクトース-6-リン酸アミノ基転移酵素，リン酸化糖ム量の緩衝液に懸濁後超音波処理により菌体を破砕した．

ターゼ酵素，リン酸化マンノースイソメラーゼ/マン破砕液を 15,000×g，15分間遠心分離し，上清を 80 ℃

ノース-1-リン酸グアニル酸結合酵素についての解析結果

10分間の加熱処理を行った．再度 15,000×g，15分間遠を示す．

心分離した．
His タグを有する蛋白質については，その後 Ni キレー

実験方法

トカラムを用いた精製を行った．
His タグを有しないグルタミン：フルクトース-6-リン材料

酸アミノ基転移酵素蛋白質については，硫酸アンモニウ

遺伝子源の微生物として超好熱アーキア S. tokodaii
JCM 10545（Suzuki et al., 2002）を用いた．
ゲノム DNA は，

ム沈殿，疎水性クロマトグラフィー，陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製を行った．

既に報告されている方法（Yamagishi & Oshima, 1990）

蛋白質濃度は，BCA 蛋白質アッセイキットを用いてにより調製した．組換え蛋白質の発現のため大腸菌測定した．精製度については，SDS-ポリアクリルアミ

Rosetta2（DE3）pLysS 株 及 び BL21-CodonPlus-（DE3）ドゲル電気泳動によって確認した．

-RIL 株を用いた．
酵素活性の測定
発現ベクターの構築

グルタミン：フルクトース-6-リン酸アミノ基転移酵素

各候補遺伝子の N 末端および C 末端領域の配列からに つ い て は，50 mM HEPES buffer（pH 7.5），200 mM

プライマーを設計し，5ʼ 末端に相当するプライマーにはKCl，2 mM DTT，0.5 mM フルクトース-6-リン酸，0.5 mM

開始コドンのとなりに Nde I 部位を，3ʼ 末端に相当する

L-グルタミンを含む反応液 100μL をあらかじめ 80 ℃ でプライマーにはグルタミン：フルクトース-6-リン酸アミ

5 分間保温したのち，6.6 ng の精製酵素を加えさらにノ基転移酵素では EcoR I 部位を，リン酸化糖ムターゼ酵

80 ℃ で反応を継続した．生成されたグルタミン酸は，

素では Xho I 部位を，リン酸化マンノースイソメラーゼ

蛍光誘導化し，ODS カラム（AccQ-Tag Ultra 2.1×100 mm/マンノース-1-リン酸グアニル酸結合酵素では BamH I

Columm）を装着した UPLC を用いて分離し，励起波長部位を付加する形のプライマーを設計した．各遺伝子に350 nm，測定波長 450 nm で測定し定量した．

適したプライマーセットで PCR 増幅させた各遺伝子領

リン酸化糖ムターゼ酵素活性については，各反応によって測定方法が異なる（Akutsu et al., 2005）．ホスホ

域断片をおのおの Nde I および C 末端側の各制限酵素− 80 −

相同性から機能が推定されている超好熱アーキアの蛋白質・酵素の機能解明

グルコムターゼの場合，50 mM MOPS buffer（pH 7.6），

白質，2μg 精製酵素を含む反応液 2 mL をあらかじめ

2 mM MgSO4，10μM グ ル コ ー ス-1,6-二 リ ン 酸，1 mM
NADP＋，1 U Geobacillus stearothermophilus 由来グルコー

分間保温後，グルコサミン-6-リン酸を加えることで反応

ス-6-リン酸脱水素酵素，2μg の精製酵素を含む反応液を進行させた．生成された UDP-N-アセチルグルコサミ

2 mL をあらかじめカップリング酵素である G. stearothermophilus 由来グルコース-6-リン酸脱水素酵素の至適

カップリング酵素も含め至適反応温度である 80 ℃ で 1

ンは HPLC によって分離し 257 nm の吸光度により検反応温度である 65 ℃ で 3 分間保温した後，グルコース

出・定量した．
Pyrococcus horikoshii 由来バイファンクショナル酵素-1-リン酸を終濃度 0.4 mM になるように加えて反応をスのホスホマンノースイソメラーゼ活性は，50 mM MOPS

タートさせ，さらに 65 ℃ で10分間反応を進行させた．
この時，反応が進行すると生成されるグルコース-6-リン

buf fer（pH 7.6），2 mM MgSO 4，1 mM NADP＋，1 U
G. stearothermophilus 由来グルコース-6-リン酸脱水素酵

酸がカップリング酵素である NADP 依存性のグルコー

素，1 U G. stearothermophilus 由来ホスホグルコースイ

ス-6-リン酸脱水素酵素の働きにより酸化され，その結果

ソメラーゼ（fructose-6-P <=> glucose-6-P），2.0μg の精生成される NADPH の量により測定するというもので製酵素を含む反応液 2 mL をあらかじめカップリング酵

ある．波長 340 nm の吸光度の変化によって NADPH の素の至適反応温度である 65 ℃ で 3 分間保温した後，終生成速度を測定した．ホスホマンノムターゼの場合，カッ

濃度 0.4 mM になるようにマンノース-6-リン酸を加える

プリング酵素としてグルコース-6-リン酸脱水素酵素の他ことで反応をスタートさせた．フルクトース-6-リン酸をにホスホグルコースイソメラーゼ（fructose-6-P <=> glu-

生成する反応の進行は，340 nm の吸光度の上昇により

cose-6-P）およびホスホマンノースイソメラーゼ（man-NADPH の生成速度を測定した．本蛋白質のもう一つの

nose-6-P <=> fructose-6-P）を反応系に加えることで，基反応，糖-1-リン酸と NTP を結合する活性については，

質であるマンノース-1-リン酸から生成されたマンノース

50 mM MOPS buffer（pH 7.6），2 mM MgSO4，0.05 mM-6-リン酸を最終的にグルコース-6-リン酸に変換して検出

NTP，1.0 mM 糖-1-リン酸を含む反応液 10μL をあらかするものである．50 mM MOPS buffer（pH 7.6），2 mM

じめ 85 ℃ で 1 分間保温した後，1 ng の精製蛋白質を加MgSO4，10μM グルコース-1,6-二リン酸，1 mM NADP＋，
1 U G. stearothermophilus 由来グルコース-6-リン酸脱水

えることで反応をスタートさせた．反応を 85 ℃ で進行

素酵素，1 U 酵母由来ホスホグルコースイソメラーゼ，

さ せ， 生 成 物 を Wakosil 5C18-200 カ ラ ム を 装 着 し た
HPLC で分析・定量を行った（Akutsu et al., 2015）．

1 U 大腸菌由来ホスホマンノースイソメラーゼ，20μgの精製酵素を含む反応液 2 mL をあらかじめ酵母および詳細な性質およびキネティクスの解析
上記の反応を，異なる pH，異なる温度で行い，至適大腸菌由来カップリング酵素の至適反応温度である
37 ℃ で 3 分間保温した後，マンノース-1-リン酸を終濃

条件等を決定した．

度 0.4 mM になるように加えることで反応をスタートさ

また，各酵素活性のキネティクスを求めるために，逆せた．上記と同様に生成される NADPH について，波数プロットによる見かけの Km および kcat 値を求めた．

長 340 nm の吸光度の変化によって NADPH の生成速度

結果および考察を測定した．ホスホグルコサミンムターゼ活性について
は，以下の方法で検出した．グルコサミン-1-リン酸は糖-1-リン酸ヌクレオチド転移/アミノ糖-1-リン酸アセチル

グルタミン：フルクトース-6-リン酸アミノ基転移酵素

基転移酵素をカップリング酵素として，アセチル CoA，

超好熱アーキアのゲノム情報中から相同性によって見UTP と共に反応系に加えると UDP-N-アセチルグルコサ

出されたグルタミン：フルクトース-6-リン酸アミノ基転ミンを生成する．しかし，グルコサミン-6-リン酸が存在移酵素と推定された蛋白質は，大腸菌の中で耐熱性可溶

しても UDP-N-アセチルグルコサミンは生成しない．そ性蛋白質として生産された（Fig. 1L）．しかし，この蛋

こで，グルコサミン-6-リン酸を基質として用いた反応系

白質を用いた反応からは，Fig. 2A に示す様にこの反応

では，もしムターゼ反応が進行した時のみ UDP-N-アセ系中に存在するグルタミンを用いた反応が進んだ場合現

チルグルコサミンのピークが HPLC で検出されることれるグルタミン酸が全く検出されなかった．このことは，になる．このピークの検出がホスホグルコサミンムター

本蛋白質は，相同性から予測されていた活性が全くない

ゼ活性存在の証拠となる．50 mM MOPS buffer（pH 7.6），

ことを示している．そこで，本蛋白質の N 末端の配列

2 mM MgSO4，20μM グ ル コ ー ス-1,6-二 リ ン 酸，2 mMを再度検討したところ，スタートコドンとして用いていアセチル CoA，0.5 mM UTP，1μg 精製糖-1-リン酸ヌク

た Met をコードする ATG の 3 残基 C 末端側に微生物のレオチド転移/アミノ糖-1-リン酸アセチル基転移酵素蛋

場合マイナースタートとして用いられる Val をコードす− 81 −

河 原 林裕

る GTG が存在していた．この GTG を ATG に置換した形で 3 残基分 N 末端のアミノ酸を欠いた形の蛋白質を大腸菌で生産させてみた．こちらの短いフォームの蛋白質も，大腸菌の中で，耐熱性・可溶性蛋白質として，発現させることが出来た（Fig. 1S）．この短いフォームの蛋白質で反応を行ってみたところ，Fig. 2B に示す様に反応時間に従ってグルタミン酸の生産が確認された．このことは，N 末端が 3 残基短い蛋白質には，想定していた活性が存在するということを示している．この結果は，相同性の解析からは予想出来ないもので，実験的な解析を行うことで初めて得られるものである．
さらなる詳細な解析から，本酵素は正方向の反応しか触媒せず，逆反応を触媒しないこと，本 UDP-N-アセチル
Fig. 1 SDS-PAGE analysis of purified predicted glutamine:fructose-6-phosphate aminotransferase protein. The recombinant protein was expressed in E. coli.
Lane M, L and S indicate molecular markers, long formof the recombinant protein and short form of the recombinant protein, respectively.

グルコサミン生合成経路のグルコサミン-6-リン酸以外の下流の産物を反応系に加えても本酵素活性は阻害されない（Table 1）ことから，グルコサミン-6-リン酸以外の産物によるフィードバック制御を受けていないことが明らかとなった．今後は，本蛋白質がどの様な形で本超好熱アーキア S. tokodaii 中に存在するのか確認と検証を進めていきたい．
リン酸化糖ムターゼ
本超好熱アーキア S. tokodaii ゲノム情報中に唯一見出された，糖に結合するリン酸基の位置を変換するムター
ゼ活性を有すると推定された蛋白質の大腸菌での発現を試みた．本蛋白質も容易に大腸菌の中で，耐熱性・可溶性蛋白質として生産されることが判った（Fig. 3）．そこFig. 2 HPLC elution profile of glutamine and glutamatein the reaction performed by long form（A）andshort form（B）of the recombinant protein. The top
panel of the B indicates the elution profile of the standard molecule of glutamine and glutamate.

Table 1

Relative activity under presence ofeach downstream productFig. 3− 82 −SDS-PAGE analysis of purified predicted mutase
protein. The recombinant mutase protein expressed in
E. coli. Lanes M and 1 respectively indicate molecularmarkers and purified mutase protein.

相同性から機能が推定されている超好熱アーキアの蛋白質・酵素の機能解明

で，本蛋白質を用いて有している活性の検出を試みた．

ン酸を変換する反応である．そこで，グルコサミン-1-リ

まず，ホスホグルコムターゼ活性の検出を試みた．Fig.

ン酸がグルコサミン-6-リン酸から生成された時にだけ，

4A に示すように，反応時間が経過するのに従って，吸生成されたグルコサミン-1-リン酸を検出する系を構築した．同じ超好熱アーキア S. tokodaii が有する糖-1-リン酸

光度の上昇がみられることから，本蛋白質は，確かにホスホグルコムターゼ活性を有していることが判る．また，ヌクレオチド転移/アミノ糖-1-リン酸アセチル基転移酵

ホスホマンノムターゼ活性についても，Fig. 4B に示す
ように，反応時間が経過するのに従って，吸光度の上昇

素は，グルコサミン-1-リン酸に対してアセチル CoA からアセチル基を転移させて N-アセチルグルコサミンにが確認された．以上の結果から，本蛋白質は，相同性か変換する活性を有している．しかし，グルコサミン-6-リ

ら推定された二つの活性を有することが確かに実験的にン酸はこの蛋白質が触媒するアセチル基転移反応の基質になることは出来ないことが知られている（Zhang et al.,

確認された．
超好熱アーキア S. tokodaii のゲノム情報中には，この2010）．しかし，単体の糖の変化を見出す為には特殊な蛋白質が糖に結合しているリン酸の位置を変換するム装置が必要とされる．だが，この糖-1-リン酸ヌクレオチ

ターゼ活性を有する唯一の蛋白質として同定されていド転移/アミノ糖-1-リン酸アセチル基転移酵素は，N-アる．そこで，本蛋白質が，相同性からは推定されないが，

セ チ ル グ ル コ サ ミ ン-1-リ ン 酸 と UTP を 結 合 し て

実際にはホスホグルコサミンムターゼ活性を有している

UDP-N-アセチルグルコサミンを生成することが出来るのではないかと推定された．そこで，この活性の検出を（Zhang et al., 2005）．この分子は HPLC において紫外線試みた．グルコースやマンノースの場合と異なり，ホスでの吸収で検出することが出来る．そこで，反応系でのホグルコサミンムターゼ活性は簡便なカップリング反応

基質としてはグルコサミン-6-リン酸を加え，カップリン
グ酵素として同じ超好熱アーキア S. tokodaii 由来の糖-1-での検出は出来なかった．そこで，まず検出系の構築に取り組んだ．ホスホグルコサミンムターゼ反応は，Fig. 5

リン酸ヌクレオチド転移/アミノ糖-1-リン酸アセチル基に（I）で示すグルコサミン-6-リン酸とグルコサミン-1-リ転移酵素，必要な化合物としてアセチル CoA およびUTP を反応系に加えて，本ムターゼ候補蛋白質を反応させた．反応前は UTP のピークしか見出されないが，反応後のサンプルからは，UDP-N-アセチルグルコサミ
ンのピークが検出された（Fig. 6）．このことは，本蛋白質がグルコース・マンノースの他にグルコサミンに結合しているリン酸基の位置を分子内で変換する活性を有していることを示している．この活性は，これまでにアーFig. 4 Increase of absorbance at 340 nm during phosphoglucomutase（A）and phosphomannomutase（B）reactions. Absorbance at 340 nm was measured after incubation periods indicated. The closed squares（■）and closed circles（●）respectively indicate absorbance for the reaction in the presence (0.03 U of the recombinant protein for PGM, 0.1 U for PMM) or absenceof the predicted mutase protein.

Fig. 5− 83 −The reaction catalyzed by phosphoglucosaminmutase and scheme of detection of glucosamine-1-phosphate. Glucosamine-6-phsphate is not
catalyzed by the ST0452 protein, but glucosamine-1-phosphate is changed to UDP-N-acetylglucosamine by coupling reaction of the ST0452 protein under presence ofAcetyl-CoA and UTP.（I）indicates the reaction catalyzed
by mutase activity.

河 原 林裕

キアから見出されたリン酸化糖ムターゼで確認されていた活性（Akutsu et al., 2005; Namboori & Graham, 2008;（Empadinhas et al., 2001）．このマンノシルグリセレート

Ray et al., 2005; Rashid et al., 2004）と異なり，さらに相ことが知られている．さらに，これらの反応を触媒する生合成経路は，Fig. 7 に示すような 5 段階の反応である

同性から想定されたものではなく，実際の実験的解析に4 種の酵素は，Pyrococcus 属アーキアのゲノム中で一つ

よってはじめて明らかとなったものである．

のクラスターを構成していることが判っている（Fig. 8）．
また，このクラスター内の各遺伝子の並び順は保存されリン酸化マンノースイソメラーゼ/マンノース-1-リン酸
グアニル酸結合酵素
超好熱アーキア Pyrococcus 属には，生育環境中の温度ており，個々の遺伝子産物の配列の一致度は 70−90 %Pyrococcus 属アーと高い値を示す．この生合成経路の内，キア特有の反応は最後の二つの反応で，P. horikoshii 由や浸透圧の急激な変化に対応するためにマンノシルグリ

来のこれら二つの酵素については，da Costa らのグルー

セレートという化合物を合成することが知られている

プによって実験的な解析が行われ，すでに報告されている（Empadinhas et al., 2001）．また，この生合成経路の2 番目の反応を司る酵素であるホスホマンノムターゼ蛋
白質については，当研究グループによって P. horikoshii

Fig. 7
Fig. 6 HPLC elution profile of product by coupling reaction with the ST0452 protein. Elution profiles for
products before incubation（A）and after incubation（B）
of the reaction mixture with the ST0452 protein. Elution
profile of UTP and UDP-GlcNAc standard molecules（C）.

Fig. 8Predicted biosynthetic pathway of mannosylglycerate in genus Pyrococcus. PMI, PMM, Man-1-P GTase,
MPGS and MPGP indicate phosphomannose isomerase,
phosphomannomutase, mannose-1-phosphate guanylyltransferase, mannosyl-3-phosphoglycerate phosphataseand mannosyl-3-phosphoglycerate synthase, respectively.

Gene cluster for mannosylglycerate biosynthetic pathway predicted in genus Pyrococcus.
In this figure gene clusters from three Pyrococcus species are shown. Within the arrows in top line,
sizes of gene products are indicated. Within the arrows in the second and third lines identity ofeach similar gene in P. horikoshii is shown. Under each arrow gene ID is shown.

− 84 −

相同性から機能が推定されている超好熱アーキアの蛋白質・酵素の機能解明

由来のものについて実験的解析に取り組み，すでに報告を行ってきた（Akutsu et al., 2005）．以上のゲノム情報

ついても，生成物である GDP-マンノースが検出されたの実験的解析から，P. horikoshii で本生合成経路が機能ことから，本 PH0925 蛋白質がこの活性を有しているこ

一方，マンノース-1-リン酸と GTP を結合する活性にしていることは十分予想されるが，最後に残った最初ととが確認された．さらに興味あることに，Table 2 に示

三番目の反応を触媒するバイファンクショナルな蛋白

すように，この PH0925 蛋白質は，マンノース-1-リン酸

質・酵素として，相同性の比較から一つの候補蛋白質

を糖-1-リン酸基質とした場合，全ての NTP およびデオ

PH0925 蛋白質が見いだされてきた．この PH0925 蛋白質

キシ GTP（dGTP）も基質として利用できることが明らが有している酵素活性の一つ，ホスホマンノースイソメ

かとなった．さらに本 PH0925 蛋白質は，糖-1-リン酸基ラーゼ活性についての実験的解析結果を示す．Fig. 9 に質としてグルコース-1-リン酸およびグルコサミン-1-リン示す様に，本 PH0925 蛋白質を反応液に加えた場合のみ，酸を GTP および dGTP と結合させることが出来ること反応時間に従って吸光度の上昇がみられることから，本も明らかになった．グルコサミン-1-リン酸と GTP を結PH0925 蛋白質は，確かにホスホマンノースイソメラーゼ活性を有していることが示された（Akutsu et al., 2015）．そ合する酵素活性およびグルコース-1-リン酸と GTP を結−1−1の比活性は 28.8±1.8μmol・min ・mg protein であった．

合する活性は，本来予測されたマンノース-1-リン酸とGTP を結合する活性の約 70 %，50 % 程度の活性としてFig. 9 Absorbance at 340 nm during PMI reaction. Absorbance at 340 nm was measured after incubation periods
indicated. The closed（●）and open circles（○）respectively indicate absorbance for the reaction in the presence or absence of the PH0925 protein (2 μg, 0.058 U).
All experiments were repeated three times.

Table 2

Substrate specificity of the for ward reaction of theSugar-1-phosphate nucleotidylyltransferaseactivity of
the PH0925 protein

Fig. 10− 85 −

Sugar-1-P nucleotidylyltransferase activity of therecombinant PH0925 protein in the presence ofdif ferent metal ions. The Sugar-1-P nucleotidylyltransferase activity for three substrates, Man-1-P（A）,
Glc-1-P（B）and GlcN-1-P（C）, were measured. Relative activity is shown as a percentage of the maximum
activity obtained for each substrate. C, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
and EDTA indicate addition of no metal ions, additionof Mg2＋, Mn2＋, Co2＋, Ca2＋, Ni2＋, Cu2＋, Zn2＋ and EDTA,
respectively. All experiments were repeated threetimes.

河 原 林裕

見出されてきた．これら多様な基質を代謝できる性質を

GTP を結合する活性を有すると推定された PH0925 蛋有することは，配列の相同性からだけでは見出すことが出来ない特徴である（Akutsu et al., 2015）．

白質からはホスホマンノースイソメラーゼ活性と共に，
マンノース-1-リン酸・グルコース-1-リン酸・グルコサミ

さらに，この糖-1-リン酸と GTP とを結合する活性に

ン-1-リン酸という複数の基質を GTP 或いは dGTP と結は 2 価の金属イオンの存在が必須であるが，Cu2＋ や Zn2＋合する活性が見いだされた．これらの実験的解析で得らという金属イオンによって活性が大きく促進されるといれた機能や酵素活性に関するデータから，たとえ相同性う特徴を有する．この特徴はバクテリア由来の類縁酵素からその機能が推定されていても実験的解析が重要だとが有する性質と大きく異なるものである．また，基質のいうことが示された．

種類によって金属イオンによる影響の違いが見られる．

本助成で得られた研究成果の報告

Fig. 10 に示すように，例えばマンノース-1-リン酸を基質にする場合には，Mg2＋ の添加で大きな活性の促進が見られるが，他の二つの基質では Mg2＋ はほとんど有効に機能しない．一方，グルコース-1-リン酸と GTP を結合する活性の促進に最も有効に働くのは，Cu2＋ だが，
グルコサミン-1-リン酸と GTP を結合する活性の場合には，Zn2＋ が最も活性を促進する．これらの特徴も配列の相同性からは推定出来ない特徴であり，実験的な解析・活性の確認を行って初めて明らかになったことである．
これら 3 つの蛋白質の例で示された様に塩基配列が決定されて，その中に見出された遺伝子の機能を推定するために，配列をデータベースと比較することは重要な取組の一つであるが，実際にその遺伝子産物を生産・精製して実際の機能を実験的に解明することは容易にゲノム情報が決定出来る現在でも非常に重要なものだと言える．今回の解析から，たとえ相同性の比較から機能が推定されていたとしても，それは機能未知遺伝子だと言えるのではないかと考える．

要約

ゲノム情報中に見出される遺伝子の機能は既存のデー
タとの配列比較で，似た配列が存在すると機能も似ていると推定している．しかし，この相同性解析で推定されている機能・酵素活性と実際に実験的に解析された機能・酵素活性が異なる例が数多く見出されてきている．そこで，超好熱アーキアが有する糖代謝関連酵素の内で相同性によって機能が推定されているものについて，実験的な解析を行い本来の機能・酵素活性・特徴を明らかにした．グルタミン：フルクトース-6-リン酸アミノ基転移酵素については，遺伝子上の開始コドンの 3 残基分 C 末端側に存在する GTG コドンから生産した組換え蛋白質からのみ活性が見いだされた．また，超好熱アーキア
S. tokodaii に見いだされた唯一のリン酸化糖ムターゼ蛋
白質には，ホスホグルコ・ホスホマンノムターゼの他にホスホグルコサミンムターゼ活性も存在することが確認された．また，超好熱アーキア P. horikoshii 由来のホス
ホ マ ン ノ ー ス イ ソ メ ラ ー ゼ と マ ン ノ ー ス-1-リ ン 酸と口頭発表
1） Kawarabayasi, Y. The thermostable and multi-functional
enzymes catalyzing sugar molecules identified from thermophilic Archaea, International Conference on Microorganisms in Environmental Management and Biotechnology, July 2011. Bhopal, India
2） Kawarabayasi, Y. Characterization of the thermostable enzymes contributing to the sugar-nucleotide molecule production from acidothermophilic Archaeon, Sulfolobus
tokodaii, and its application, Thermophiles 2013, September 2013. Regensburg, Germany
3） Kawarabayasi, Y, Characterization of Archaeal enzymes
with thermostablility for enzymatic production of nucleotide-sugar molecules, Enzyme Engineering XXII, September 2013. Toyama, Japan4） 河原林 裕．アーキアゲノム情報に基づく糖代謝経路の解明，第14回極限環境生物学会，2013年10月，川崎
5） Kawarabayasi, Y. Genome based analyses of the sugar metabolism in thermophilic Archaea, 54th Annual Conferenceof Association of Microbiologists of India (AMI), November 2013. Rohtak, India
6） 河原林 裕．極限環境微生物ゲノム情報に隠れている
様々な情報の探索・発掘，第 5 回寄付分野「微生物新機
能開発学研究室」講演会，2014年 2 月，札幌
7） 河原林 裕．極限環境微生物ゲノム情報を用いた新規糖代謝関連酵素の開発，未来創生微生物学寄附講座シンポジウム，2014年 4 月，福岡
8） Kawarabayasi, Y. Confirmation of the UDP-GlcNAc biosynthesis pathway in Archaea by experimental analyses of enzymatic activities, Molecular Biology of Archaea 4, May
2014. Paris, France9） 河原林 裕．ゲノム情報中には見出されない代謝系の実
験 的 同 定，UDP-GlcNAc 生 合 成 系 を 例 に， 第27回 日 本
Archaea 研究会講演会，2014年 7 月，草津，滋賀
10） Kawarabayasi, Y. Experimental confirmation of the archaeal UDP-GlcNAc biosynthetic pathway unpredictedfrom the genomic data, 7th International Congress on Biocatalysis Biocat2014, September 2014. Hamburg, Germany11） Kawarabayasi, Y. Experimental confirmation of the
UDP-GlcNAc biosynthetic pathway, which was not predicted from the genomic data of thermophilic archaeon, Sulfolobus tokodaii, International Conference on Emerging
Trends in Biotechnology, November 2014. New Delhi,
India− 86 −

相同性から機能が推定されている超好熱アーキアの蛋白質・酵素の機能解明
12） Kawarabayasi, Y. Characterization of the UDP-GlcNAc biosynthetic pathway in Archaea by experimental confirmation of each enzymatic activity, 2014 SFG & JSCR Joint
Meeting, November 2014. Hawaii, USA
13） Kawarabayasi, Y. Experimental discovery of the UDP-GlcNAc biosynthetic pathway unpredicted from the genomic
data of a Crenarchaeon, Sulfolobus tokodaii, Active Enzyme
Molecule 2014, December 2014. Toyama, Japan14） Kawarabayasi, Y. Confirmation of the sugar metabolic
pathway by functional analysis of the estimated enzymes
within the genomic information of the thermophilic archaea, Thermophiles 2015, September 2015. Santiago,
Chili15） Kawarabayasi, Y. Importance of the functional analyses on
enzymatic activities and metabolic pathways for utilizationof the thermophilic archaeal genomic data, Molecular Biology Society of Japan, December 2015. Kobe, Japan16） 河原林 裕．超好熱アーキア由来糖代謝関連酵素のユ
ニークな特徴，微生物学の新たな発展，ゲノムから機能・実用に関する九州シンポジウム，2015年12月，宮崎原著論文
1） Akutsu, J., Zhang, Z., Morita, R., & Kawarabayasi, Y. 2015.
Identification and characterization of a thermostable bifunctional enzyme with phosphomannose isomerase andsugar-1-phosphate nucleotidylyltransferase activities froma hyperthermophilic archaeon, Pyrococcus horikoshii OT3.
Extremophiles 19: 1077 – 1085.
総説
1） Yoshimune, K., and Kawarabayasi, Y. 2013. Sugar Metabolic Enzymes In Thermophilic Microbes in Environmental
and Industrial Biotechnology, ed. Satyanarayana, T., Littlechild, J. & Kawarabayasi, Y., Springer, pp. 589 – 610.
2） 河原林 裕．2012．耐熱性糖代謝酵素の解析と応用，極限環境生物の産業展開 第 5 章第 6 節，今中忠行監修，シーエムシー出版，pp.160 – 176．
3） Kawarabayasi, Y. 2012. The Thermostable and Multi-functional Enzymes Catalyzing Carbohydrate Molecules Identified from Thermophilic Archaea In “Microorganisms in
Sustainable Agriculture and Biotechnology” ed.
Satyanarayana, T., Johri B. N., & A. Prakash, A. Springer,
pp. 469 – 485.

謝辞

本研究は，公益財団法人発酵研究所の寄付金による援助のもと行われたもので，ここに感謝の意を表したい．
また，本研究への九州大学大学院農学研究院大島敏久教
授のご支援とご協力に感謝の意を表したい．さらに本研
究は，協力講座（微生物遺伝子資源学分野，生物化学分野，蛋白質科学分野）の皆様，当寄付講座に在籍したポスドク・技術補佐員等の職員並びに教官の皆さん，当分ご協力の元で成し遂げられたもので，ここに感謝の意を
表したい．

文

献

Akutsu, J., Zhang, Z., Tsujimura, M., Sasaki, M., Yohda, M. &Kawarabayasi, Y. 2005. Characterization of a thermostable enzyme with phosphomannomutase/phosphoglucomutase activities from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii
OT3. J. Biochem. 138: 159 – 166.
Akutsu, J., Zhang, Z., Morita, R. & Kawarabayasi, Y. 2015. Identification and characterization of a thermostable bifunctional enzyme with phosphomannose isomerase and sugar-1-phosphate
nucleotidylyltransferase activities from a hyperthermophilicarchaeon, Pyrococcus horikoshii OT3. Extremophiles 19: 1077 –1085.
Empadinhas, N., Marugg, J., Borges, N., Santos, H. & da Costa,
MS. 2001. Pathway for the synthesis of mannosylglycerate in
the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii. Biochemical and genetic characterization of key enzymes. J. Biol.
Chem. 276: 43580 – 43588.
Namboori, S.C. & Graham, D.E. 2008. Acetamido sugar biosynthesis in the Euryarchaea. J. Bacteriol. 190: 2987 – 2996.
Rashid, N., Kanai, T., Atomi, H. & Imanaka, T. 2004. Among multiple phosphomannomutase gene orthologues, only one geneencodes a protein with phosphoglucomutase and phosphomannomutase activities in Thermococcus kodakaraensis. J. Bacteriol. 186: 6070 – 6076.
Ray, W.K., Keith, S.M., DeSantis, A.M., Hunt, J.P., Larson, T.J.,
Helm, R.F. & Kennelly, P.J. 2005. A phosphohexomutase fromthe archaeon Sulfolobus solfataricus is covalently modified byphosphorylation on serine. J. Bacteriol. 187: 4270 – 4275.
Sakuraba, H., Yoshioka, I., Koga, S., Takahashi, M., Kitahama, Y.,
Satomura, T., Kawakami, R. & Ohshima, T. 2002. ADP-dependent glucokinase/phosphofructokinase, a novel bifunctional
enzyme from the hyperthermophilic archaeon Methanococcus
jannaschii. J. Biol. Chem. 277: 12495 – 12498.
Suzuki, T., Iwasaki, T., Uzawa, T., Hara, K., Nemoto, N., Kon, T.,
Ueki, T., Yamagishi, A. & Oshima, T. 2002. Sulfolobus tokodaii
sp. nov. (f. Sulfolobus sp. strain 7), a new member of the genus
Sulfolobus isolated from Beppu Hot Springs, Japan. Extremophiles 6: 39 – 44.
Yamagishi, A. & Oshima, T. 1990. Circular chromosomal DNA in
the sulfur-dependent archaebacterium Sulfolobus acidocaldarius.
Nucleic Acids Res. 18: 1133 – 1136.
Zhang, Z., Tsujimura, M., Akutsu, J., Sasaki, M., Tajima, H. &Kawarabayasi, Y. 2005. Identification of an extremely thermostable enzyme with dual sugar-1-phosphate nucleotidylyltransferase activities from an acidothermophilic archaeon, Sulfolobus
tokodaii strain 7. J. Biol. Chem. 280: 9698 – 9705.
Zhang, Z., Akutsu, J. & Kawarabayasi, Y. 2010. Identification ofnovel acetyltransferase activity on the thermostable protein
ST0452 from Sulfolobus tokodaii strain 7. J. Bacteriol. 192:
3287 – 3293.

野で実質的な研究を行った大学院生・学部生の皆さんの− 87 −

IFO Res.Commun. 30
89-102, 2016

活性を指標とした超好熱アーキアの新規蛋白質・酵素の単離とその解析

活性を指標とした超好熱アーキアの新規蛋白質・酵素の単離とその解析
石野園子，モハマド

ダダシプール，河原林裕

九州大学大学院農学研究院極限環境微生物ゲノム機能開発学〒812-8581

福岡県福岡市東区箱崎6-10-1

Identification of novel proteins or enzymes by using necessaryor detected activity or functions
Sonoko Ishino, Mohammad Dadashipour, Yutaka Kawarabayasi
Laboratory of Functional Genomics of Extremophiles, Graduate School of Agriculture, Kyushu University
Hakozaki 6-10-1, Higashi-ku, Fukuoka, Fukuoka 812-8581, Japan
In the genomic data of thermophilic archaea, some necessary genes are missing when compare to the metabolic
pathway. As the missing genes fructokinase and epimerase linked between phosphoglucosamine pathway andphosphogalactosamine pathway were detected in the cell-free extract of Sulfolobus tokodaii. Thus purification ofthese proteins was attempted. Phospho amino-sugar epimerase was successfully purified and the encoding gene
was identified from N-terminus sequence. As this activity has not been detected from any organisms so far, this is
the first isolation of this novel activity. This result indicates that biochemical approach is important and powerfulfor recognition on the genomic data.
To maintain genome stability, all living organisms have DNA repair systems. We discovered a novel endonuclease,which cleaves the 5ʼ side of deoxyinosine (dI), from the hyperthermophilic archaeon, Pyrococcus furiosus. The novel endonuclease, designated as Endonulcease Q (EndoQ), recognizes uracil, abasic site and xanthine, as well as
hypoxanthine, and cuts the phosphodiester bond at their 5ʼ sides. To understand the functional process involving
EndoQ, we searched for interacting partners of EndoQ and identified Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA).
The EndoQ activity was clearly enhanced by addition of PCNA in vitro. The physical interaction between the two
proteins through a PIP-motif of EndoQ is important. These findings provide us a clue to elucidate a unique DNA
repair system in Archaea.
Ribonuclease P (RNase P) is a ribonucleoprotein that catalyzes the processing of 5ʼ leader sequences from tRNAprecursors (pre-tRNAs) in all living cells. Recent studies have revealed that eukaryotic RNase Ps are involved inprocessing of small and long non-coding RNAs (ncRNAs), and also act as a transcription factor of RNA polymerases I and III. To gain insight into biological functions of archaeal RNase Ps, we prepared archaeal mutants KUW∆P3,
KUW∆P8, and KUW∆P16, in which the gene segments encoding stem-loops containing helices P3, P8 and P16 in
RNase P RNA (TkopRNA) of the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakarensis KUW1 were deleted, respectively. Phenotypic analysis showed that KUW∆P3 and KUW∆P16 grew slowly as compared to the wild-typestrain KUW1, while KUW∆P8 had no difference from the wild-type KUW1. Moreover, quantitative RT-PCR (qRTPCR) and Northern blots analysis of KUW∆P3 showed that the accumulation of unprocessed transcripts for pre-tRNAs to a larger extent than that of the wild-type KUW1. Whole-transcriptome analysis of KUW∆P3 identified three
gene clusters whose transcripts accumulated to larger amount in KUW∆P3 than wild-type. A further study on thethree gene clusters will allow us to establish the functions of archaeal RNase Ps.
Key words: hyperthermophilic archaea, genome information, purification, DNA repair, Ribonuclease P

E-mail: sonoko@agr.kyushu-u.ac.jp，dadashi_2000@yahoo.com，
kawarabayasi.yutaka@nifty.com
共同研究者：石野良純，山上 健，上田俊史，末松光太郎，
中島 崇，木村 誠（九州大学大学院農学研究院）− 89 −

石野園子，モハマド

本報告には， 3 つの項目が含まれるので，それぞれにダダシプール，河原林裕

非常に多数の遺伝子が同じ発現変動パターンを示すことから，このマイクロアレー解析の結果からだけでは，機ついて諸言・実験方法・結果および考察を記す．

能未知遺伝子の機能に辿り着くことは出来なかった．
そこで，再度ゲノム情報とゲノム情報から構築されて［Ⅰ］超好熱アーキア Sulfolobus tokodaii からの糖代謝関いる代謝経路の情報を比較したところ，代謝上必要だと連酵素の単離諸思われる遺伝子・酵素がゲノム情報中には見出されてい言

な い 場 合 が あ っ た． 例 え ば， 元 々 超 好 熱 ア ー キ ア
S. tokodaii のゲノム情報中には相同性の比較からフルク

すでに機能が明らかとなっている蛋白質・遺伝子と配トースをリン酸化する機能を有するであろうフルクトキ

列上の相同性が見いだされてこない，いわゆる機能未知

ナーゼの存在が推定されていた．しかしながら，本遺伝

蛋白質・酵素について，ある一つの機能未知蛋白質・酵

子産物を大腸菌内で生産した組換え蛋白質からは，予測素を選択してその蛋白質の機能に辿り着くのは想像以上されたフルクトキナーゼ活性は検出されず，2-ケト-3-デに困難だと思われる．大腸菌や枯草菌では，相同性の比

オキシグルコネートキナーゼ活性が実験的に確認された（Ohshima et al., 2007）．この実験結果とゲノム情報を総較からは機能が推定出来ない未知遺伝子を含む全ての遺伝子について，各遺伝子を個々に破壊した遺伝子破壊株
コレクションの作製がすでにゲノム解析初期に取り組まれ た（Baba & Mori, 2008; Baba et al., 2008; Ogasawara,

合すると，本超好熱アーキアにはフルクトキナーゼが存在しないことになる．一方，本超好熱アーキア S. tokodaii
は，本来グルコースを分解してエネルギーを獲得する際

2000）．しかしながら機能未知遺伝子を個々に破壊してにグルコースをリン酸化しない特殊な代謝経路を用いても，細胞の生存に必要な遺伝子の場合には破壊することいることが知られていた（Kim & Lee, 2005）．また，ゲで致死となることから破壊株は作製することができな

ノム情報中にはグルコキナーゼ遺伝子は相同性からは見い．また破壊株の多くでは，表現型に顕著な違いは見出出されてこなかった．しかし，活性から精製に取り組ん

されてこなかった．残念ながら，網羅的な遺伝子破壊をだところ，実は機能未知遺伝子がコードする蛋白質がグ行っても機能未知遺伝子の機能の解明に結びついた例はルコキナーゼの活性を有することがすでに報告されている（Nishimasu et al., 2006）．

多くないのが現状である．その他に転写産物である
mRNA の発現及び発現量をマイクロアレーを用いて解析するトランスクリプトーム解析（Iwanaga et al., 2014）

一方，糖-1-リン酸ヌクレオチド転移/アミノ糖-1-リン

や，全ての代謝物の動態を解析するメタボローム解析も酸アセチル基転移酵素の実験的解析から本アーキア
S. tokodaii には UDP-N-アセチルガラクトサミンを生合

ゲノムの全塩基配列が決定された微生物では取り組まれ成する代謝経路が，一般的なバクテリアに存在するてきた．それらの大掛かりな解析に取り組んでも，機能未知蛋白質・酵素・遺伝子の機能にたどり着くのは容易

UDP-N-アセチルグルコサミン生合成経路と同様に存在することが推定された（Zhang et al., 2010）．本糖-1-リン

なことではないと感じられる．

酸ヌクレオチド転移/アミノ糖-1-リン酸アセチル基転移

当寄付講座が研究対象とした極限環境微生物，特に超好熱アーキアは，大腸菌・枯草菌等の真正細菌に比して酵素はその最後の 2 段階の反応，ガラクトサミン-1-リン酸にアセチル CoA のアセチル基を転移させて N-アセチ

伝子重複が少なく欠損変異体で類縁遺伝子による表現型

ルガラクトサミン-1-リン酸を生成する反応，およびそのN-アセチルガラクトサミン-1-リン酸と UTP とを結合さ相補がおこり難いというメリットがあると思われる．しせて UDP-N-アセチルガラクトサミンを合成する反応をかし，遺伝子破壊株の作製が可能な超好熱アーキアはThermococcus kodakarensis のみ（Sato et al., 2003）で，他触媒することが出来る．Fig. 1 の二重線内に示す代謝経の超好熱アーキアでは遺伝子破壊・遺伝子導入とも非常に難しく，ほぼ不可能である．また，条件の異なる培養

セチル基転移酵素の実験的機能解析の結果，超好熱アー
キ ア S. tokodaii 内 に 存 在 す る こ と が 示 唆 さ れ て い る

下で発現量が変動する遺伝子群を明らかにすることで機

UDP-N-アセチルガラクトサミン生合成代謝経路である．

能未知遺伝子の機能に迫れるのではないかという考えか

UDP-N-アセチルグルコサミンの生合成経路と同様の反ら，含有する糖の種類（グルコース，ラムノース等）を応が，ガラクトサミン-1-リン酸代謝経路についても存在変えた培地中での培養から得た全 RNA を用いたマイク

するとすれば，現在までに実験的に確認されているガラ

ロアレー解析に取り組んだ．しかしこの解析からは，発クトサミン-1-リン酸の上流にガラクトサミン-6-リン酸，

現が変動する遺伝子を見出すことは出来たが，同じ発現

さらにその上流に UDP-N-アセチルグルコサミン生合成

変動を示す遺伝子群が全て機能未知遺伝子であったり，経路でのフルクトース-6-リン酸に対応するリン酸化糖がそのゲノムサイズが小さくゲノムにコードされている遺路が糖-1-リン酸ヌクレオチド転移/アミノ糖-1-リン酸ア− 90 −

活性を指標とした超好熱アーキアの新規蛋白質・酵素の単離とその解析

スを含む溶液 135μl を 80 ℃ で 3 分保温後，無細胞抽出液またはクロマト分画液 15μl を加えて反応を開始した．この反応液を 80 ℃ で15分保温後，氷冷により反応を停止させた．この反応液から蛋白成分を除くために，
ミリポア（Amicon Ultra-0.5 centrifugal Filter）で限外濾
過後の透過サンプルをイオンクロマトグラフィーでの分析に供した．
リ ン 酸 化 ア ミ ノ 糖 エ ピ メ ラ ー ゼ 活 性 に つ い て は，
50 mM Tris-HCl（pH 8.0），1 mM MgCl2，1 mM リ ン 酸
化アミノ糖を含む溶液 135μl を 80 ℃ で 3 分保温後，無細胞抽出液またはクロマト分画液 15μl を加えて反応をFig. 1 Predicted metabolic pathway of glucosamine andgalactosamine derivatives in Sulfolobus tokodaii.
The pathways shown within the single and double box
respectively indicate UDP-N-acetylglucosamine and
UDP-N-acetylgalactosamine biosynthetic pathways.

開始した．この反応液を 80 ℃ で15分保温後，氷冷により反応を停止させた．この反応液から蛋白成分を除くた
めに，ミリポア（Amicon Ultra-0.5 centrifugal Filter）で限外濾過後の透過サンプルをイオンクロマトグラフィー
での分析に供した．
サーモフィッシャー社製，電気化学検出器を装着した
イオンクロマトグラフィー装置に CarboPac PA10 カラムを装着して，メーカー推奨の方法で分析を行った．

存在することとなる．しかし，このリン酸化糖は，フル
クトースの様な一般的な糖ではなく希少な糖となる．そ

精製手法

こで，可能性として UDP-N-アセチルグルコサミン生合

フルクトキナーゼについては，硫安沈殿，Toyope-

成経路の中間産物が UDP-N-アセチルガラクトサミン生

arl-DEAE カラム，HiTrap Q カラム，HiTrap-Phenyl カラ

合成経路で利用される可能性があるのではないかと推定

ム，Toyopeal-Butyl カラム，Mono Q カラムを用いて精した．

製を進めた．
リン酸化アミノ糖エピメラーゼについては，硫安沈殿，以上，超好熱アーキア S. tokodaii には，必要だと推定される酵素・蛋白質の中で糖代謝に関連するものとして，Toyopearl-DEAE カラム，HiTrap Q カラム，HiTrap-Phenyl

フルクトキナーゼおよびリン酸化グルコサミンとリン酸

カラムを用いて精製を行った．これらのカラムについて

化ガラクトサミンを変換するエピメラーゼ酵素の存在がは，メーカーの推奨の条件で使用した．

推定された．そこで，これらの酵素・蛋白質が実際にS. tokodaii の菌体中に存在するか？存在するのなら精製

蛋白質の N 末端アミノ酸配列の決定することで，これまで機能未知であった遺伝子・蛋白質

SDS-PAGE 法で分離した蛋白質を PVDF 膜に転写し，の機能を解明できると期待されたので，これらの精製にその膜を用いて島津の自動アミノ酸シーケンサーで分析取り組んだ．

を行った．反応・分析条件はメーカー推奨の条件で行っ
た．

実験方法

組換え体蛋白質の生産

材料

自動シーケンサーを用いて得られた N 末端のアミノ

精製元のアーキアとして超好熱アーキア S. tokodaii

酸配列から推定された遺伝子の塩基配列を元に，遺伝子JCM 10545（Suzuki et al., 2002）を用いた．ゲノム DNA

領域 PCR 増幅用プライマーを設計した．5ʼ 末端に相当

は， 既 に 報 告 さ れ て い る 方 法（Yamagishi & Oshima,

するプライマーには開始コドンのとなりに Nco I 部位1990）により調製した．組換え蛋白質の発現のため大腸を，3ʼ 末端に相当するプライマーには制限酵素 Xho I 部

菌 BL21-CodonPlus（DE3）-RIL 株を用いた．

位を付加する形のプライマーを設計した．PCR 増幅させた遺伝子領域断片を制限酵素 Nco I および Xho I で切活性の検出方法

断し，同じ制限酵素で切断された pET23d ベクターに挿フルクトキナーゼ活性については，100 mM Tris-HCl（pH 7.5），4 mM MgCl2，2 mM ATP，5 mM フルクトー

入した．塩基配列解読により最終的な確認を行い，各発
現ベクターとした．

− 91 −

石野園子，モハマド

ダダシプール，河原林裕

塩基配列を確認された本エピメラーゼをコードする遺の際の溶出パターンに全く変化がなかった．しかし，グ伝子を持つ発現ベクターを大腸菌 BL21-CodonPlus-（DE3）

ルコサミン-6-リン酸を基質として加えた反応系では，未-RIL 株に形質転換することで，組換え蛋白質として目的

知のピークが検出された．

の遺伝子産物を生産させた．アンピシリンを加えた液体

現在，ガラクトサミン-6-リン酸は市販されていない．

LB 培 地 中 で， 形 質 転 換 し た 大 腸 菌 BL21-CodonPlus-

そこで，市販の標品を標準物質として利用し，溶出パター（DE3）-RIL を 37 ℃ で培養し，波長 600 nm での吸光度がンの同一性から本反応の生成物を同定する手法を用いる

0.6−0.8 になるまで生育させ，そこに終濃度 23.8μg/mLことが出来なかった．そこで，本超好熱アーキアが有すになるように IPTG を加え，さらに 37 ℃ で 6 時間培養

るリン酸化糖ムターゼが様々な基質のリン酸基の位置をを継続して，蛋白質発現の誘導を行った．10,000×g，変換できることから，Fig. （2 2）に示す反応を進行させ15分の遠心分離で菌体を集菌し，洗浄後，菌体の 4 倍量ることが可能ではないかと期待した．グルコサミン-6-リの緩衝液に懸濁した後，この菌体懸濁液を超音波処理にン酸を基質とした場合に期待されている反応は Fig. 2 により破砕した．破砕液を 15,000×g，15分間遠心分離し，（1）で示す反応である．市販されているガラクトサミン

上 清 に 対 し 80 ℃ 10分 間 の 加 熱 処 理 を 行 っ た． 再 度
15,000×g，15分間遠心分離した．His タグを有する蛋白-1-リン酸とムターゼ酵素を反応させた際の生成物とグル
コサミン-6-リン酸に超好熱アーキア S. tokodaii の無細胞質なので，その後 Ni キレートカラムを用いた精製を

抽出液を反応させた際の生成物の溶出位置を比較した．

行った．

同一の位置に溶出された場合には，無細胞抽出液中に確かに Fig. 2 の（1）の反応を司る酵素が存在することを示

結果および考察

すことが出来る．そこで，ガラクトサミン-1-リン酸にムターゼを反応させた生成物の分析を行った．結果をフルクトキナーゼFig. 3 に示すが，（1）および（2）はおのおの，未反応の本アーキアの無細胞抽出液の中にフルクトキナーゼ活

ガラクトサミン-1-リン酸，グルコサミン-6-リン酸を分析性が存在するか確認したところ，リン酸化フルクトース

したものである．（3）にガラクトサミン-1-リン酸にムをわずかながらも検出したので，精製に取り組んだ．

ターゼ酵素を反応させた場合の生成物の分析結果を示し

DEAE カラムでは 12−17 番目のフラクションに，次のたが矢印の位置に新たにピークが表れていることが判

HiTrap Q カラムでは，24−31 番目のフラクションに，る．（4）に，グルコサミン-6-リン酸に無細胞抽出液を反そ の 後 HiTrap-Phenyl カ ラ ム，HiTrap-Butyl カ ラ ム，

応させた場合の生成物の分析結果を示したが基質である

Mono Q カラムによる精製を行ったが，この段階で，活グルコサミン-6-リン酸のピークの右に新たなピークが確性のある画分に含まれる蛋白質の種類は余り減らなかった．各蛋白質を PVDF 膜にブロットして切り出し，別々のサンプルとして，自動アミノ酸シーケンサーで各蛋白質の N 末端のアミノ酸配列を決定した．その結果，すでにヘキソキナーゼとして報告されている蛋白質はこの画分には含まれていないことが判った．このことは，本フルクトキナーゼは，これまでに知られていない全くの新規遺伝子だと推測される．今後，N 末端の配列から推定される遺伝子を組換え蛋白質として生産させ，どの遺伝子が実際にフルクトキナーゼ活性を有しているかの確認を行っていく予定である．
リン酸化アミノ糖エピメラーゼ
最初に無細胞抽出液中にリン酸化アミノ糖の糖部分を変換するエピメラーゼ活性があるか確認を行った．その際には，グルコサミン-6-リン酸とグルコサミン-1-リン酸という二つの候補が考えられた．そこで，グルコサミン-1-リン酸または，グルコサミン-6-リン酸を反応系に加えた場合の反応を進行させ，活性の確認を行った結果，グルコサミン-1-リン酸を基質として加えた場合には，分析

Fig. 2− 92 −The expected metabolic pathway used for HPLC
analyses.

活性を指標とした超好熱アーキアの新規蛋白質・酵素の単離とその解析認された．（3）と（4）の反応で生成された生成物が同一のものか確認するために，別々に反応させた（3）と（4）の反応液を混合して分析した．その結果を（5）に示すが，想定したピークは全く同じ位置に重なったことから，同一の生成物が二つの異なる反応で生成していることが示された．つまり，想定通り Fig. 2 に示す（1）の反応を触媒する酵素が無細胞抽出液中に存在することが確認された．そこで，本活性を指標に無細胞抽出液から本活性を有する蛋白質の精製を試みた．
本活性は DEAE カラムの洗浄画分に，次の HiTrap Q
カラムでは 14−20 画分に，次の Hitrap-Phenyl カラムでも洗浄画分に回収された．しかし，この画分には主に 2種類の蛋白質が含まれているだけだった（Fig. 4）ので，両方の蛋白質の N 末端のアミノ酸配列を解読した．得られたアミノ酸配列から同定された遺伝子の発現ベクターを構築したところ，耐熱性・可溶性の組換え蛋白質が容易に得られた．本組換え蛋白質に予想通りの活性がFig. 3 HPLC elution profile of products with two different
proteins. Standard galactosamine-1-phosphate is shown
in（1）, standard glucosamine-6-phosphate is shown in（2）, products from galactosamine-1-phosphate by mutase is shown in（3）, products from glucosamine-6-phosphate by extract is shown in（4）, and mixed product of（3）and（4）is shown in（5）.

あるか確認したところ，Fig. 5 に示す様に組換え蛋白質を用いて反応を進めた場合には，明らかに顕著なピークが確認できたことから，超好熱アーキア S. tokodaii 中には全く新規なグルコサミン-6-リン酸とガラクトサミン-6リン酸を変換することが出来るエピメラーゼ活性を有す
る蛋白質の存在が確認された．
今回確認された新規リン酸化アミノ糖エピメラーゼ蛋
白質をコードする遺伝子は，当初のゲノム情報公開時には機能未知遺伝子とされていたものであった．この，代Fig. 4 SDS-PAGE analysis of the protein containing in thefraction purified as phosphor ylated amino-sugar
epimerase activity. Lane M and 1 indicate molecularmarkers and the proteins in the fraction purified as phosphorylated amino-sugar epimerase activity, respectively.

Fig. 5− 93 −

HPLC elution profiles of products with native andrecombinant proteins.

石野園子，モハマド

ダダシプール，河原林裕

菌体無細胞抽出液から活性で精製するという古典的な生Plus-RIL 株（Agilent 社，東京）を用いて，既報（Cannet al., 1999; Shiraishi et al., 2015）の通りに複数のカラム

化学の手法が，現在の様なゲノム情報が多数存在する時

クロマトグラフィーを経て高純度標品を得た．組換え蛋代であっても有効なことが示された．本活性はこれまで

白質の濃度は 280 nm における吸光度を測定し，モル吸

市販されていなかったガラクトサミン-6-リン酸を生産す

光係数より算出した．計算に用いたモル吸光係数はるという応用的な面での開発にも期待が持たれる．

PfuEndoQ WT，PfuEndoQ ΔPIP，および PfuPCNA がそ

謝経路情報とゲノム情報を組み合わせて候補を選択してれぞれ 47120，45630，および 7450 M−1 cm−1 である．
［Ⅱ］新規 DNA 修復関連ヌクレアーゼ（EndoQ）の単離
表面プラズモン分析（SPR）

諸言

相互作用を解析するために Biacore J システム（GE
ヘルスケア）を用いて，精製した PfuPCNA 組換え蛋白高温環境下においては，DNA の損傷が起きやすい．

質を CM5- チップに固定した．溶液 10 mM HEPES（pH

特に塩基の脱アミノ化によりシトシンがウラシルに，ア7.4），0.2 M NaCl，0.005 % Tween20 を用いて PfuEndoQ

デニンがヒポキサンチンに，グアニンがキサンチンにな

WT および PfuEndoQ ΔPIP を様々な濃度で添加した．

ると複製時に変異導入の原因となる（Lindahl, 1993）．
しかし超好熱菌は常温生物と同じように突然変異率を低DNA 基質および切断反応

く抑え太古の昔から現在まで自らの種を保存してきていデオキシイノシンを含むオリゴヌクレオチドの 5ʼ 末る．そのためには超好熱菌細胞の中で特殊な DNA 修復

端 に Cy5 を 付 加 し た 45-I25（5ʼ-dCGAACTGCCTGGAA機構が働いているのではないかと想像される．我々はこTCCTGACGACITGTAGCGAACGATCACCTCA） お よ び

れまで他の生物では知られていなかった新規のヌクレアーゼを発見した．Pyrococcus furiosus の無細胞抽出液

CAGGATTCC AGGCAGTTCG）をシグマジェネシスに合中にヒポキサンチンの 5ʼ 側の DNA 鎖を切断する活性を成依頼した．基質となる二本鎖 DNA は 45-I25 と 45R を発見しその活性を示す蛋白質を同定した．この酵素はヒ0.5 mM 酢酸マグネシウムを含む 40 mM Tris-acetate（pHポキサンチンだけでなく，他の脱アミノ化塩基であるウ7.8）溶液中でアニールして用いた．切断反応は 50 mM

ラシルやキサンチンについても同様に認識することがわ
かり Thermococcales の細胞の中で脱アミノ化塩基の修

Tween20，0.4 M NaCl を含む 20μL の反応溶液に，10 nM

相補鎖 45R（5ʼ-dTGAGGTGATCGTTCGCTACATGTCGT

Tris-HCl（pH 8.0），1 mM DTT，1 mM MgCl2，0.01 %復を担う酵素群の一つであると予想される．これまでに

基質 DNA と 2 nM PfuEndoQ WT または 2 nM PfuEndoQ

知られている酵素とは相同性がなく新規の酵素として∆PIP を加えておこなった．PfuPCNA を用いる場合は三Endonuclease Q（EndoQ）と名付けた．Proliferating cell

量 体 と し て 0，5，10，25，50，100 nM を 添 加 し た．

nuclear antigen（PCNA）は DNA 鎖上をスライドしなが75 ℃ で 5 分間反応させた後，40μL のホルムアミドをら表面に DNA に作用する蛋白質を結合してそれらが加 え て TBE（89 mM Tris-borate，2.5 mM EDTA） 溶 液

DNA に作用する際の足場を提供すると考えられている中で 8 M 尿素を含む 12 % アクリルアミドゲル電気泳動（Warbrick, 2000）．Pyrococcus abyssi で は EndoQ ホ モ ロに供して分離し Typhoon image analyzer（GE ヘルスケ

グが PCNA と相互作用する可能性が示唆されているア）で可視化した．

（Pluchon et al., 2013）．そこで P. furiosus の EndoQ を用

結果および考察いて PCNA との相互作用を詳細に調べた．

実験方法

EndoQ ホモログに見出される PIP-box モチーフ
アーキア由来 EndoQ ホモログのアミノ酸配列のアラ

遺伝子クローニングおよび組換え蛋白質の調製
P. furiosus 由来 EndoQ（PfuEndoQ）をコードする遺伝

インメントを作成して調べたところ Methanomicrobiales
を 除 く 種 の C 末 端 領 域 に は PIP-box 様 の 配 列 が 見 つ

子 を 挿 入 し た プ ラ ス ミ ド pET-PF1551（Shiraishi et al.,

かった（Fig. 6）．EndoQ はこのモチーフを介して PCNA

2015）を用いて site-directed mutagenesis kit（Agilent 社，と相互作用することが推定されたので，相互作用の様式

東京）により C 末端（411−424）欠失変異体（PfuEndoQ

およびそれが機能にどのように関与しているかについて∆PIP）をコードする遺伝子を作製した．PfuEndoQ WT，
PfuEndoQ ∆PIP および P. furiosus 由来 PCNA（PfuPCNA）

せた変異体を作製し PfuEndoQ ΔPIP とした．

調べるため PfuEndoQ の C 末端（411−424）を欠失さの組換え蛋白質の産生には大腸菌 BL21（DE3）Codon− 94 −

活性を指標とした超好熱アーキアの新規蛋白質・酵素の単離とその解析

Fig. 7

Physical interaction between PfuEndoQ proteinsand PfuPCNA. SPR analysis were conducted using a
BiacoreJ system. PfuEndoQ WT at various concentrations (0, 50, 100, 200, 400 and 800 nM; solid lines) and
ΔPIP (800 nM, a dotted line) were injected on the chip
immobilized with PfuPCNA WT for 120 s in 10 mM
HEPES, pH 7.4, 0.005% Tween20 and 0.2 M NaCl.

PfuEndoQ と PfuPCNA 間の物理的相互作用
Fig. 6 Putative PIP-boxes in EndoQ homologs in
Archaea. PIP-box consensus sequence is shown on the
top of the panel: Q, a glutamine residue (black background); x, any amino acid; h, hydrophobic residues (L,I or M; gray background); A, aromatic residues (F, Y or
W; gray background). The residues consistent with the
PIP-box consensus sequence were indicatde by thesame color. Tko, Thermococcus kodakarensis KOD1
(BAD85076); Ton, Thermococcus onnurineus NA1(ACJ15906); Pfu, Pyrococcus furiosus DSM 3638
(AAL81675); Pab, Pyrococcus abyssi GE5 (CAB49547);
Mac, Methanosarcina acetivorans C2A (AAM04083);
Mma, Methanosarcina mazei Go1 (AAM31501); Mba,
Methanosarcina barkeri str. Fusaro (AAZ70511); Mja,
Methanocaldococcus jannaschii DSM 2661 (AAB98023);
Mig, Methanotorris igneus Kol 5 (AEF96206); Mae, Methanococcus aeolicus Nankai-3 (ABR56895); Mmari, Methanococcus maripaludis C5 (ABO35878); Mvo, Methanococcus voltae A3 (ADI37103); Mth, Methanothermobacter
thermautotrophicus str. Delta H (AAB85783); Msm,
Methanobrevibacter smithii ATCC 35061 (ABQ87334);
Mka, Methanopyrus kandleri AV19 (AAM01639); Nar,
Nanoarchaeota archaeon SCGC AAA011-K22(WP_039268096); Aar, Aenigmarchaeota archaeon JGI0000106-F11 (WP_042665925). The sequences werealigned by ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/
msa/clustalw2/). Amino acid residue numbers of starting and end of PIP-boxes are indicated on the right andleft of the sequences, respectively.

表面プラズモン分析において PfuPCNA を固定したチップを用いて PfuEndoQ WT および PfuEndoQ ΔPIP
を 添 加 し て 相 互 作 用 を 解 析 し た．Fig. 7 に 示 す 通 り，
PfuEndoQ WT は明らかな陽性の応答を示し，濃度依存的にセンサーグラムの強度が増大した．一方 PfuEndoQΔPIP は 800 nM の高濃度で添加してもまったく応答を示さなかった．これらの結果より PfuEndoQ の C 末端に存在する PIP-box 様配列が，PfuEndoQ との相互作用に重要であることがわかった．
PfuPCNA による PfuEndoQ の切断活性の促進
EndoQ と PCNA の相互作用が細胞内のゲノム安定性
維持にどのように働くのかを知るために PfuPCNA 存在
下での PfuEndoQ WT および PfuEndoQ ΔPIP のデオキ
シイノシンを含む二本鎖 DNA 基質に対する切断反応を調べた．PfuEndoQ WT が基質 DNA の 11 % を切断する条件に対して PfuPCNA を添加していくと，濃度依存的に約 7 倍まで促進が見られた．一方 PfuEndoQ ΔPIP による基質 DNA の切断は PfuEndoQ WT と同等の 10 % であるが，PfuPCNA による促進はまったく見られず，むしろ阻害に働いた（Fig. 8）．これらの結果は，PfuPCNA が
PIP-box 様配列を介して PfuEndoQ の機能を促進することを示しており，細胞内においても両者は共に働くことが示唆される．EndoQ が関与する DNA 修復には PCNA
が関わり効率的な修復に寄与していると予想される．

− 95 −

石野園子，モハマド

ダダシプール，河原林裕

multiple endocrine neoplasia b（MEN-b）などの tRNA 様な構造を持つ RNA を基質とすることや（Wilusz et al.,2008; Sunwoo et al., 2009），RNA Polymelase I および IIIの転写制御因子として機能することが報告されている（Reiner et al., 2006; Ishiguro et al., 2002）．真正細菌および真核生物の RNase P については機能的な報告が多数なされているが，本研究対象であるアーキア RNase Pについてはそのような報告がまだない．
本研究では，アーキア RNase P の機能解明のために，
遺伝子操作系が確立されている超好熱性アーキア
Thermococcus kodakarensis（Tko） を 実 験 対 象 と し（Morikawa et al., 1994; Sato et al., 2003; Takemasa et al.,2011），遺伝子操作により生体内に存在する RNase P のFig. 8 Cleavage activity of PfuEndoQ WT and ΔPIP in thepresence and absence of PfuPCNA. 5ʼ-Cy5-labeled
49-I25 dsDNA substrates (10 nM) were incubated at
75 ˚C for 5 min. −, no enzyme (lane 1 and 14); WT, 2 nM
PfuEndoQ WT (lane 2−7); ΔPIP, 2 nM PfuEndoQ ΔPIP
(lane 8−13); the concentration of PfuPCNA was varied
as indicated. Cleavage products were separated by 8 Murea−12% PAGE and visualized by an image analyzer,
Typhoon Trio＋ (GE Healthcare) and cleavage efficiencies were quantified by the software, ImageQuant TL(GE Healthcare).

活性を低下させた変異株の作製を試みた．
我々は T. kodakarensis と同じテルモコッカス属で遺伝学的に非常に近縁である超好熱性アーキア Pyrococcus
horikoshii OT3（Pho）由来 RNase P を研究対象にし，そのサブユニットの構造と機能に関する研究を進めてきた．これまでの実験結果から，P. horikoshii 由来 RNase Pの触媒中心を担う PhopRNA のステムループ構造の欠損が試験管内の再構築系において pre-tRNA 切断活性に寄与することを見出した（Ueda et al., 2014）．さらに，末松らは，T. kodakarensis RNase P（TkoRNase P）の構成蛋白質が P. horikoshii RNase P（PhoRNase P）の相同蛋白質と切断活性において交換可能であることや，結晶構造解析
から相同蛋白質間で高い構造相関を持つことを見出した（Suematsu et al., 2015）．以上のことから，P. horikoshii［Ⅲ］超好熱アーキアからの新規 RNase P 基質の探索

諸で蓄積してきた生化学的情報を T. kodakarensis に反映

言し，遺伝子操作実験を行うことが可能であると考えた．

Ribonuclease P（RNase P）は真正細菌，アーキア，そして真核生物にいたる 3 つの進化系統ドメインに存在

すなわち，変異株の作製に際し以前の生化学的な実験結果を T. kodakarensis 生体内の TkopRNA に適用することにした．

し，前駆体 tRNA（pre-tRNA）の 5ʼ 末端のプロセシング反実験方法

応を触媒している（Walker & Engelke, 2006; Torres-Larios
et al., 2006）．RNase P は，触媒中心を担う一分子の機能
トから構成されるリボ核蛋白質複合体である（Guerrier-

野生株および変異株の培養条件
T. kodakarensis KOD1 株およびその変異株は，85 ℃

Takada et al., 1983）．近年の研究結果から真正細菌や真の嫌気性条件下において培養した．培地には ASW-YT

核生物において RNase P は pre-tRNA のプロセシングを培地（0.8×人工海水，酵母エキス 5.0 g/L，トリプトン

触媒するだけではなく，その他の機能を持つことが報告

5.0 g/L）を用い，実験条件に応じて硫黄粉末 S˚ あるい

されている．例えば，真正細菌の RNase P では，ヒスはピルビン酸 5.0 g/L を添加した．また，培地を嫌気条性 RNA（pRNA）と触媒活性を補助する蛋白質サブユニッ

チジンの生合成やラクトースの分解に関与するオペロン件に保つために Na2S・9H2O 試薬を終濃度 0.05 % になるの mRNA や，前駆体 4.5S RNA，リボスイッチなどのように加え，嫌気条件の確認にはレザズリン試薬を用い

non-coding RNA（ncRNA）を基質として切断することがた．プレート操作には，ゲルライト 10 g/L（和光純薬，大報告されている（Esakova & Krasilnikov, 2010）．また，阪）を用いた．培養液の濁度測定には，UV spectrometer

真核生物では，5S rRNA and 7SL RNA などの ncRNA のmini photo 518R（タイテック，越谷）を使用し，OD 660 nm

他 に，lung adenocarcinoma transcript 1（MALAT1） やを測定することで細胞増殖を評価した．

− 96 −

活性を指標とした超好熱アーキアの新規蛋白質・酵素の単離とその解析相同組替え用のプラスミドの構築

RPR∆P16-R）を用いて PCR を行い，相同組替え用のプ

マーカー遺伝子である PyrF 遺伝子と TrpE 遺伝子をラスミド pUD∆P3，pUD∆P8，そして pUD∆P16 を構築

遺 伝 子 工 学 的 な 手 法 に よ り 欠 損 し た T. kodakarensis

した．TkopRNA 遺伝子上の欠損領域は，それぞれ ∆P3

KUW1 株から，相同組替え法により TkopRNA 遺伝子のは 24−34，∆P8 は 68−79，そして ∆P16 は 240−261 で各ステムループを欠損させるためにプラスミド

ある．また，マーカー遺伝子である PyrF 遺伝子を目的

pUD∆P3，pUD∆P8，そして pUD∆P16 を構築した．目的

遺伝子である TkopRNA 遺伝子の上流に来るように設計

遺伝子である TkopRNA 遺伝子（326 bp）の 5ʼ 側の相同した．

領域（TK1793, 930 bp）と TkopRNA 遺伝子とそのプロ
モーター領域（150 bp）を含んだ 3ʼ 側の相同領域（TK1791

TkopRNA 遺伝子の変異株の作製と TK1792, 930 bp）を，Table 1 に示したプライマーセッ

KUW1 株 に 対 し て 上 記 で 作 成 し た プ ラ ス ミ ドト（5FLG-F/5FLG-R と 3FLG-F/3FLG-R）を用いて PCRにより増幅した．増幅したフラグメントを Hind III/Pst I

pUD∆P3，pUD∆P8，および pUD∆P16 を Sato らの論文を参考にして形質転換した（Sato et al., 2003）．相同組と BamH I/EcoR I で制限酵素処理した後，pU-Ryo ベク

替えが行われたかの確認には，PyrF 遺伝子の導入の有ターにクローニングし pUDRPR プラスミドを作製した．

無 と TkopRNA 遺 伝 子 に 特 異 的 な プ ラ イ マ ー セ ッ ト

pUDRPR プラスミド上から TkopRNA 遺伝子の各ステム（PFL-F/PFL-R と RPR-F/RPR-R）を用いて PCR を行うこ

ループを欠損するためにプライマーセット（RPR∆P3-F/とでそれぞれ確認した．次に，各ステムループが欠損さ

RPR∆P3-R，RPR∆P8-F/RPR∆P8-R， そ し て RPR∆P16-F/れた菌体から，PyrF 遺伝子を除去するためにプラスミ
ド pUDPyrF∆P3，pUDPyrF∆P8， お よ び pUDPyrF∆P16

Table 1

Primer sets in this experiment

を形質転換した．相同組替え株の選択には，形質転換した菌株を 0.75 % 5-フルオロオロチン酸と 60 mM NaOH
を 含 ん だ ASW-YT 固 形 培 地 で 生 育 さ せ た 後 コ ロ ニ ー
PCR を行うことで確認した．
KUW1 野生株および変異株からのトータル RNA の抽出各菌株を ASW-YT+S˚ 培地に植菌し 85 ℃ で一晩前培養した．再度，培養液を ASW-YT＋ピルビン酸培地に植菌し，目的の生育期まで 85 ℃ で静置培養した後に，4 ℃
で 5,000 rpm，20 min 遠心し集菌した．集菌した菌体をTRIzol 試薬（Life Technologies, Carlsbad, USA）に溶菌
し −80 ℃ で保存した．トータル RNA の抽出は，TRIzol
試薬に溶菌したサンプルをキット推奨の手順に従い抽出した．
定量 RT-PCR 法による解析
抽出したトータル RNA に対して，Table 1 に示した目
的 遺 伝 子 に 特 異 的 な プ ラ イ マ ー を 用 い て，Prime
ScriptTM Reverse Transcriptase kit（タカラバイオ，草津）で逆転写を行った後，LightCycler Nano System（ロシュ・
ダイアグノスティックス，東京）を用いて SYBR Green I法により検出した．また，解析にはサイクル比較法（∆∆Ct 法）を採用し，遺伝子間の発現量の比較には相対定量法を導入した．その際，コントロール遺伝子として
16S rRNA を用いた．
ノーザンブロット法による解析
抽出したトータル RNA から，より短い RNA フラグメ
ントを分取するために NucleoSpin® miRNA（Macherey− 97 −

石野園子，モハマド

ダダシプール，河原林裕

Nagel, Germany）を用いた．抽出したサンプルを 8 M

からトータル RNA を抽出し，Macrogen 社に次世代シー

尿素を含んだ 15 % アクリルアミド変性ゲルに展開し，クエンサーによる網羅的塩基配列を委託した．

Trans-Blot® TurboTM Transfer System（Bio-Rad, USA）

結果および考察を用いて Hybond-N＋ positively charged nylon membranes（GE healthcare, USA） に 転 写 し た． ま た 検 出 に は，されたプローブでハイブリダイゼーションを行った後，

RNase P の活性を低下させた変異株の作製
P. horikoshii 由来 RNase P の再構成実験の結果から，Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit

TkopRNA 上の P3，P8，そして P16 ステムループ構造（Thermo Scientific, USA）をキット推奨の手順に従い検の欠損が生体内の切断活性を僅かに低下するのに適して出した．

い る と 考 え， 相 同 組 替 え 用 の プ ラ ス ミ ド（pUD∆P3，

tRNATyr のアンチコドンループに特異的なビオチン化

pUD∆P8，そして pUD∆P16）を作製し KUW1 株に対し次世代シークエンスによるトランスクリプトーム解析て形質転換を行った（Fig. 9A）．プラスミド上にはマー

KUW1 野生株と KUW∆P3 株の対数増殖期（7.5 hrs）

カー遺伝子を導入しており，その有無で形質転換および

KWΔP strains KUWΔP strains

KUWΔP strains

Fig. 9 Preparation of T. kodakarensis mutants with TkopRNA deleted stem-loop. A, Design of the plasmid for deletions of the
TkopRNA gene by double-crossover recombination and PyrF gene Pop-out recombination. In the construct, the gene segment
encoding TkopRNA was placed downstream of the pyrF gene. The genes encoding TkopRNA and its deletion mutants are shownin dark grey and light grey boxes, respectively, and other flanking genes including PyrF are in white boxes. PFL and RPR primer
sets indicated by black and grey arrows were designed in the 5ʼ and 3ʼ flanking regions of PyrF and TkopRNA genes, respectively（Table 1）. B and C, PCR analysis of PyrF locus（B）and the gene encoding TkopRNA（C）confirming deletion of the gene segments in KW∆P and KUW∆P strains. DNA size markers were run in lane M, and their sizes（bp）are indicated to the left of thegels. The results of PCR with T. kodakarensis KOD1 and KUW1 are indicated in lanes KOD and KUW, respectively. The results of
PCR with KUW∆P3, KUW∆P8, and KUW∆P16 are indicated in lanes P3, P8, and P16, respectively.

− 98 −

活性を指標とした超好熱アーキアの新規蛋白質・酵素の単離とその解析相同組替えが行われたかの確認を行った．得られたと KUW∆P16 では，相対的な生育速度がそれぞれ 76 %KW∆P 変異株（KW∆P3，KW∆P8，KW∆P16）に対してと 92 % まで減少していた．以下の実験では，生育速度

プライマーセット（PFL-F/PFL-R）を用いて PCR を行っに有意な差の見られた KUW∆P3 を対象とし実験を進めた結果，野生株よりも PCR 断片が長いことから目的のていくこととした．

位置に PyrF 遺伝子が導入されていることが確認できた（Fig. 9B）．次に，得られた KW∆P 変異株から PyrF 遺

Pre-tRNA の蓄積量の検討

伝 子 を 除 去 す る た め に プ ラ ス ミ ド（pUDPyrF∆P3，

生体内における RNase P の切断活性が低下しているか

pUDPyrF∆P8，そして pUDPyrF∆P16）を形質転換したの確認には，KUW1 野生株および KUW∆P3 からトータル（Fig. 10A）． 得 ら れ た KUW∆P 変 異 株（KUW∆P3，

RNA を抽出し，定量 RT-PCR 法およびノーザンブロッ

KUW∆P8，KUW∆P16）に対して同様のプライマーセッ

ト法により評価を行った．ターゲットとなる pre-tRNAトを用いて PCR を行った結果，PCR 断片が短くなっての選定には，codon usage data base（http://www.kazusa.

いることから PyrF 遺伝子が除去されたことが確認でき

or.jp/codon/）を参考にそのコドンの使用頻度から選定た（Fig. 10B）．また，ステムループ構造が欠損されてした．

いるかの確認を行うために TkopRNA に特異的なプライ

対数増殖期（7.5 hrs）まで培養した菌体からトータル

マーセット（RPR-F/RPR-R）を用いて PCR を行った結果，

RNA を 抽 出 し， 定 量 RT-PCR 法 に よ り pre-tRNAGlu

野 生 株 よ り も 僅 か に 短 い PCR 断 片 が 確 認 で き た（GAG），pre-tRNAVal（GUC），そして pre-tRNATyr（UAG）（Fig. 9C）．そこで，得られた変異株 KUW∆P3，
KUW∆P8，を対象に蓄積量を比較した．その結果，KUW∆P3 におそして KUW∆P16 に対して，DNA シークエンシングにいて pre-tRNAVal と pre-tRNATyr が約 1.3〜1.8 倍蓄積しより TkopRNA の配列を確認したところそれぞれ目的のていることが確認できた（Fig. 11A）．また，pre-tRNAGlu

ステムループ領域のみが欠損されていた．
生育速度の比較
野生株および得られた変異株の生育速度を比較した結果，KUW∆P8 については KUW1 野生株と比較して有意な違いが見られなかった（Fig. 10）．しかし，KUW∆P3

Fig. 11

Fig. 10 Growth profiles of wild-type KUW1 and its mutants. ■, Wild-type KUW1; □, KUW∆P3; ●, KUW∆P8; ◯, KUW∆P16.

− 99 −

qR T-PCR and Northern blots analyses of pretRNA transcripts in wild-type KUW1 and KUW∆P3. A, qRT-PCR analysis of pre-tRNA transcripts,
pre-tRNAGlu, pre-tRNAVal, and pre-tRNATyr. Wildtype KUW1 and KUW∆P3 is shown black and grey bar,
respectively. B, Northern blots of transcripts using a
specific primer（Biotin-Tyr）complementary to the anticodon stem-loop sequence of tRNATyr（Table 1）.
Approximately, 200 ng of the small RNA fractions/lane
was separated on 10% denatured polyacrylamide gels
containing 8 M urea, stained with ethidium bromide asshown in the lower panel, and transferred onto Hybond-N+ positively charged nylon membranes, as described in “Materials and Methods”. Pre-tRNATyr (0.2ng) or tRNATyr (0.2 ng) prepared by in vitro transcription were used as standards and are indicated by Preand Mat-, respectively.

石野園子，モハマド

ダダシプール，河原林裕については KUW1 野生株および KUW∆P3 間で有意なンチン特異的エンドヌクレアーゼ活性が促進された．こ差は見られなかった．

の特異的相互作用は PIP box 様配列を欠失した変異体で更なる検証を行うために tRNATyr のアンチコドンは観察されなくなった．EndoQ が関与する DNA 修復にループに特異的なプローブを用いてノーザンブロット法

は PCNA が関わり効率的な修復に寄与していると予想に よ り 評 価 を 行 っ た．KUW∆P3 で は 前 駆 体 で あ るされる．

pre-tRNATyr のバンドと成熟型である tRNATyr のバンドを検出することができた．一方で，野生株では前駆体

ア ー キ ア RNase P の 機 能 解 明 を 目 的 と し て，P.
horikoshii と遺伝学的に近縁種であり遺伝子組換え系がで あ る pre-tRNATyr が 僅 か に 検 出 さ れ た（Fig. 11B）．

確立されている T. kodakarensis KUW1 株を用い，RNase P

以上のことから，KUW∆P3 株内において RNase P の切の切断活性を減少させた変異株を作製した．変異株の作断活性が低下していることを確認することができた．

製 に は PhopRNA 変 異 体 に 関 す る 研 究 結 果 に 基 づ き，TkopRNA 遺伝子の各ステムループ構造を欠損した変異

次世代シークエンサーによる新規基質の探索

株を調製した．種々の相同組替え用プラスミドを形質転KUW1 野生株と KUW∆P3 株の対数増殖期（7.5 hrs）

換することで，それぞれ各ステムループ構造 P3，P8，

からトータル RNA を抽出し，次世代シークエンサーにそ し て P16 を 欠 損 し た 変 異 株 KUW∆P3，KUW∆P8，より塩基配列を網羅的に解析した．現在までに， 3 種の

KUW∆P16 が作製されていることを確認した．得られた

遺 伝 子 ク ラ ス タ ー（TK0179-TK0180-TK0181，TK1103-

変 異 株 と KUW1 野 性 株 の 生 育 曲 線 を 比 較 し た 結 果，

TK1104-TK1105-TK1106，TK2018-TK2019-TK2020）から

KUW∆P8 は 野 性 株 と 同 様 に 生 育 し た が，KUW∆P3 と転写された RNA が，KUW∆P3 において野生株 KUW1
より多く蓄積していることが示された．今後は，これら

KUW∆P16 においては生育速度がわずかに減少していた（76 %〜92 %）．さらに，T. kodakarensis KOD1 株のコドの遺伝子クラスター転写産物の RNase P による切断活

ン頻度を考慮して比較的使用頻度の高いコドンに対する性の有無と，その他の転写産物の変化について解析を進

アンチコドンを持つ tRNAGlu，tRNAVal，tRNATyr を対めていく．

象 と し て，KUW∆P3 に お け る pre-tRNA の 蓄 積 量 を

要

qRT-PCR により検討した．その結果，最も使用頻度の約高い tRNAGlu では顕著な差は見られなかったものの，tRNAVal と tRNATyr に つ い て は 野 性 株 と 比 較 し て

代謝経路とゲノム情報の比較解析から，細胞中で必要

KUW∆P3 においてその蓄積量が約 1.3〜1.8 倍に増加しな反応だと思われる反応を触媒する酵素が見出されていていた．最後に，KUW∆P3 と KUW1 野性株の RNA 塩

ない場合，活性を指標に無細胞抽出液から精製を行うこ

基配列決定によるトランスクリプトーム解析の結果，とは新規活性を有する蛋白質の探索に有効なことが示された．今回，超好熱アーキア Sulfolobus tokodaii の無細KUW∆P3 において優位に蓄積されている12種の遺伝子

胞抽出液からフルクトキナーゼはほぼ精製まで，リン酸ンを形成していることを見出した．今後，これらのオペ

化アミノ糖エピメラーゼ蛋白質については遺伝子の同定

ロンに対する RNase P の解析が期待される．

が検出され，それらのうち10種の遺伝子が 3 つのオペロまで行うことが出来た．

本助成で得られた研究成果の報告

DNA 塩基の脱アミノ化は生体内で効率良く修復されなければならない．我々は超好熱性アーキア Pyrococcus
furiosus から発見した Endonuclease Q（EndoQ）は DNA
中のヒポキサンチン，ウラシルおよびキサンチンの 5ʼ 側のリン酸ジエステル結合を特異的に切断するので脱アミノ化 DNA の効率的な修復に貢献していると予想している．Proliferating cell nuclear antigen（PCNA）は DNA 鎖
上をスライドしながら表面に DNA に作用する蛋白質を結合してそれらが DNA に作用する際の足場を提供すると考えられている．EndoQ は配列内に PCNA と相互作用するための配列モチーフ（PIP box）候補を有しており P. furiosus の EndoQ を用いてそれぞれの PCNA との相互作用を詳細に調べた．その結果 EndoQ-PCNA 特異的結合が観察され PCNA の存在下で EndoQ のヒポキサ

口頭発表
1） Ueda, T., Ishino, S., Sumatsu, K., Nakashima, T., Kakuta, Y.,
Ishino, Y., Kimura, M. & Kawarabayasi, Y. 2015. Characterization of the in vivo function of the RNase P with domain-truncating RNase P RNA genes in the hyperthermophilic archaeon T. kodakarensis KOD1, Themophiles 2015,
September, 2015. Santiago, Chili
2） 上田敏史，石野園子，中島 崇，角田佳充，石野良純，
木村 誠，河原林 裕，変異体を用いたアーキア RNase Pの in vivo 機能の解析，第38回日本分子生物学会年会 第88回日本生化学会大会 合同大会，2015年12月，神戸ポートアイランド，神戸
3） Ishino, S., Miyazono, K., Yamagami, T., Hamasuna, T., Shirai, T., Tomita, H., Kanai, T., Atomi, H., Tanokura, M., &− 100 −

活性を指標とした超好熱アーキアの新規蛋白質・酵素の単離とその解析
Ishino, Y. Structure and functions of the Thermococcal-specific exonuclease. International Chemical Congress of Pacific Basin Societies. December, 2015, Honolulu, Hawaii,USA4） Ishino, S., Ogino, H., Nagata, M., Kobayashi, K., Oyama, O.,
Yamagami, T., Simmons, J.R., Kanai, T., Atomi, H., Kawarabayasi, Y. & Ishino, Y. Structure and functions of the replicative helicase complex in Archaea. Workshop “Molecular
dynamics of higher-order complexes for initiation of DNA
replication: diversity and universality” 第38回日本分子生物学会年会 第88回日本生化学会大会 合同大会，2015
年12月，神戸ポートアイランド神戸
原著論文
1） Ishino, S., Nishi, Y., Oda, S., Uemori, T., Sagara, T., Takatsu, N., Yamagami, T., Shirai, T. & Ishino, Y. 2016. Identification of a mismatch-specific endonuclease in hyperthermophilic Archaea. Nucleic Acids Res. 44: 2977 – 2986.
2） Shiraishi, M., Ishino, S., Yoshida, K., Yamagami, T., Cann, I.
& Ishino, Y. 2016. PCNA is involved in the EndoQ-mediated DNA repair process in Thermococcales. Sci. Rep. 6:25532.
3） Ueda, T., Ishino, S., Suematsu, K., Nakashima, T., Kakuta,
Y., Kawarabayasi, Y., Ishino, Y. & Kimura, M. 2015. Mutation of the gene encoding the ribonuclease P RNA in thehyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakarensis
causes decreased growth rate and impaired processing oftRNA precursors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 468:
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4） Ishino, S., Makita, N., Shiraishi, M., Yamagami, T. & Ishino, Y. 2015. EndoQ and EndoV work individually for damaged DNA base repair in Pyrococcus furiosus. Biochimie
118: 264 – 269.

謝辞

本研究は，公益財団法人発酵研究所の寄付金による援助のもと行われたもので，ここに感謝の意を表したい．
本研究への九州大学大学院農学研究院大島敏久教授のご支援とご協力に感謝の意を表したい．さらに本研究は，協力講座（微生物遺伝子資源学分野，生物化学分野，蛋白質科学分野）の皆様，当寄付講座に在籍したポスドク・
技術補佐員等の職員並びに教官の皆さん，当分野で実質的な研究を行った大学院生・学部生の皆さんのご協力の元で成し遂げられたもので，ここに感謝の意を表したい．
また，EndoQ 解析の機能解析実験をおこなっていただ
いた九州大学生物資源環境科学府の白石都氏と吉田光太郎氏に感謝の意を表したい．

文

献Baba, T. & Mori, H. 2008. The construction of systematic inframe, single-gene knockout mutant collection in Escherichia

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石野園子，モハマド

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− 102 −

IFO Res.Commun. 30
103-117, 2016

極限環境微生物遺伝子資源の応用

極限環境微生物遺伝子資源の応用
石野

園子，鈴木

宏和1），河原林裕

九州大学大学院農学研究院極限環境微生物ゲノム機能開発学〒812-8581

福岡県福岡市東区箱崎6-10-1

Application of the gene resources identified within extremophiles
Sonoko Ishino, Hirokazu Suzuki, Yutaka Kawarabayasi
Laboratory of Functional Genomics of Extremophiles, Graduate School of Agriculture, Kyushu University
Hakozaki 6-10-1, Higashi-ku, Fukuoka, Fukuoka 812-8581, Japan
Some enzymes identified from thermophilic archaea exhibited lower Km and kcat values than those of the bacterial
counterpart enzymes. Sugar-1-phosphate nucleotidylyltransferase activity of the ST0452 protein was successfullyincreased by introduction of single substitution into the amino acid residue located at the reaction center. Also introduction of the short deletion at the C-terminus increased the amino-sugar-1-P acetyltransferase activity of theST0452 protein. Also it was shown that truncation of C-terminus region enhanced the sugar-1-P nucleotidylyltransferase activity encoded on the N-terminus of the PH0925 protein. These results indicate the improvability of archaeal thermophilic enzyme, and their usefulness in application.
The DNA polymerase from Thermus aquaticus (Taq polymerase) has been used globally for PCR technology. We
attempted to develop chimeric or mutant Taq polymerases with improved PCR performance by utilizing information obtained from the metagenomic analysis. Some chimeric and mutant Taq polymerases displayed higher primer-extension rates and higher affinity to the DNA substrate than those of WT Taq polymerase. Based on the properties of these chimeric enzymes and their sequences, the mutant Taq polymerases with superior speed for theprimer extension reaction were designed. These mutant Taq polymerases displayed enhanced PCR performance.
Genetic tools useful for functional analysis of heterologous thermophile genes in a thermophilic bacterium, Geobacillus kaustophilus HTA426, were developed. An upstream region of GK0704 gene of the strain HTA426 (Pgk704)
served as a substantial and maltose-inducible promoter in G. kaustophilus. Using the promoter, various genes fromheterologous thermophiles were successfully expressed, conferring remarkable properties to G. kaustophilus, although some of the genes hardly expressed in Escherichia coli. This result suggests that the expression system using G. kaustophilus is more practical than that using mesophiles for in vivo analysis of thermophile genes. This
study also generated new selection markers functional in G. kaustophilus (chloramphenicol and thiostrepton resistance genes) and a new strain, G. kaustophilus MK244 that accepts DNA from most E. coli strains due to the deficiency in DNA restriction–modification systems. The strain MK244 enables to construct large chromosomal libraries of heterologous thermophiles. New selection markers facilitate complex genetic modification, including
multiple gene expression, in G. kaustophilus. Therefore, these genetic tools, as well as Pgk704, can contribute to invivo analysis of heterologous genes from various thermophiles.
Key words: thermophilic archaea, thermostable enzyme, host-vector system, DNA polymerase, PCR

E-mail: sonoko@agr.kyushu-u.ac.jp，
hirokazusuzuki@bio.tottori-u.ac.jp，
kawarabayasi.yutaka@nifty.com
1）
現 鳥取大学大学院工学研究科
共同研究者：石野良純，山上 健，大島敏久，土居克実，
本田裕樹，臧
茜（九州大学農学研究院）− 103 −

石野

園子，鈴木

本報告には， 3 つの項目が含まれるので，それぞれに

宏和，河原林裕

変異体作製手法
点変異，欠失変異を導入するために適切なオーバー

ついて諸言・実験方法・結果および考察を記す．

ラップを有するプライマーを設計し，PCR によって変異を導入した．得られたクローンについては，塩基配列［Ⅰ］超好熱アーキア由来糖代謝関連酵素活性の促進

諸を解読することで予定した変異が導入されているか確認

言

を行った．

最初の研究課題「相同性から機能が推定されている超変異体蛋白質の生産

好熱アーキアの蛋白質・酵素の機能解明」および二番目

塩基配列を確認された各変異遺伝子を持つ発現ベクの研究課題「活性を指標とした超好熱アーキアの新規蛋

ターを大腸菌 BL21-CodonPlus-（DE3）-RIL 株に形質転換

白質・酵素の単離とその解析」を実際に遂行することで，することで，組換え蛋白質として目的の変異遺伝子産物

これまで既知の酵素では明らかになっていなかった酵素を生産させた．糖-1-リン酸ヌクレオチド転移/アミノ糖活性が見出されたり，全く新規の酵素分子・酵素活性の-1-リン酸アセチル基転移酵素発現ベクターの場合はアン存在が確認されてきた．これらは，ゲノム情報からだけ

ピシリン，PH0925 蛋白質発現ベクターの場合はカナマでは推定することが出来ないもので，実験的解析で初めイシンを加えた液体 LB 培地中で，形質転換した大腸菌て得られる貴重な超好熱アーキア由来の遺伝子資源であBL21-CodonPlus-（DE3）-RIL を 37 ℃ で 培 養 し， 波 長る．超好熱アーキア由来の蛋白質・酵素は，高温等に対600 nm での吸光度が 0.6−0.8 になるまで生育させ，そして高い安定性を示すことから，酵素学や基礎科学的な

こに終濃度 23.8μg/mL になるように IPTG を加え，さ興味の他に，物質生産等の応用での利用にも注目されてらに 37 ℃ で 6 時間培養を継続して，蛋白質発現の誘導

いる．超好熱アーキア由来酵素の中には糖-1-リン酸ヌクを行った．菌体を 10,000×g，15分の遠心分離で集菌し，レオチド転移/アミノ糖-1-リン酸アセチル基転移酵素（Zhang et al., 2007）の様に，Km 値がバクテリア由来の洗浄後，菌体の 4 倍量の緩衝液に懸濁した後，その懸濁酵素のものと比べると小さい場合がある．これは反応に

15,000×g，15分間遠心分離し，上清を 80 ℃ で10分間の加用いられる基質は薄い濃度でも利用できることを示し，

熱処理を行った．再度 15,000×g，15分間遠心分離した．

液を超音波処理することで菌体を破砕した．破砕液をHis タグを有する蛋白質については，その後 Ni キレー

超好熱アーキア由来酵素での有利な点である．しかしながら，kcat 値についてもバクテリア由来酵素のものと互

トカラムを用いた精製を行った．

いの最適条件下での値を比較した場合，こちらも小さい場合がある（Zhang et al., 2007）．このことは，反応の進測定した．精製度については，SDS-ポリアクリルアミ

行はバクテリア由来の酵素を用いた時よりも遅いという

ドゲル電気泳動によって確認した．

蛋白質濃度は，BCA 蛋白質アッセイキットを用いてことを示している．超好熱アーキア由来酵素の有する最大の利点である耐熱性・高い安定性を維持したまま反応

活性の検出方法

速度を上げることが出来れば，応用面で非常に有利にな

糖-1-リン酸ヌクレオチド転移/アミノ糖-1-リン酸アセると考えられる．そこで，個々の蛋白質・酵素の有するチル基転移酵素，PH925 両蛋白質の有する糖-1-リン酸と NTP を 結 合 す る 活 性 に つ い て は，50 mM Tris-HCl

活性の促進に取り組んだ．

（pH 7.5），2 mM MgCl2，10 mM NTP，0.1 mM 糖-1-リン酸

実験方法を含む反応液 30μL をあらかじめ 80 ℃ で 2 分間保温した後，50 ng の精製蛋白質を加えることで反応をスター材料トさせた．反応を 80 ℃ で進行させ，生成物を Wakosil

超好熱アーキア Sulfolobus tokodaii JCM 10545（Suzuki
et al., 2002）を用いた．ゲノム DNA は，既に報告され

5C18-200 カラムを装着した HPLC で分析・定量を行った（Zhang et al., 2005）．

ている方法（Yamagishi & Oshima, 1990）により調製し

糖-1-リン酸ヌクレオチド転移/アミノ糖-1-リン酸アセ

た．組換え蛋白質の発現のため大腸菌 BL21-CodonPlus-

チル基転移酵素が有するもう一つの活性である，アミノ（DE3）-RIL 株を用いた．ダブル変異株作製の際には，以糖-1-リン酸アセチル基転移活性については，アセチル基前作製した変異蛋白質をコードしているプラスミド
DNA（Zhang et al., 2007）を鋳型として用いた．

のドナーであるアセチル CoA から，反応の進行に従って生成される CoA の生成量を用いて測定した．この反応では，50 mM Tris-HCl（pH 7.5），2 mM MgCl2，2 mM
アセチル CoA，2 mM アミノ糖-1-リン酸を含む反応液− 104 −

極限環境微生物遺伝子資源の応用

10μL をあらかじめ 80 ℃ で 2 分間保温した後，50 ng の示すように，単独であれば活性の上昇が確認できる変異

精製蛋白質を加えることで反応をスタートさせた．反応でも二重変異体に組み込んだ場合には，残念ながら全て終了後 50 mM Tris-HCl（pH 7.5），6.4 M グアニジン塩酸の二重変異体糖-1-リン酸ヌクレオチド転移/アミノ糖-1-

溶 液 40μL を 加 え， そ こ に 50 mM Tris-HCl（pH 7.5），

リン酸アセチル基転移酵素からは野生型の 10 % 程度以

1 mM EDTA，0.5 mM DTNB 溶液 50μL を加え，412 nm下の活性しか検出されなかった．この結果は，二つ以上の吸光度を測定して，反応を定量的に測定した．

の変異が同時に一つの糖-1-リン酸ヌクレオチド転移/ア
ミノ糖-1-リン酸アセチル基転移酵素に導入されると，活キネティクスの解析性が極端に低下することを示している．
そこで，異なった方法での活性促進の可能性について

各酵素活性のキネティクスを求めるために，逆数プ検討を行った．単一変異の際に最も活性の上昇が高かっ

ロットによる見かけの Km および kcat 値を求めた．

たのは97番目の Tyr を Ala に変換した変異体糖-1-リン酸

結果および考察

ヌクレオチド転移/アミノ糖-1-リン酸アセチル基転移酵素であった．この97番目の Tyr を他の全ての種類のア変異による糖代謝関連酵素活性の促進

ミノ酸に置換した変異体の作製を試みた．大腸菌での発糖-1-リン酸ヌクレオチド転移/アミノ糖-1-リン酸アセ現の結果，全ての変異体が耐熱性・可溶性蛋白質としてチル基転移酵素が有するN-アセチルグルコサミン-1-リン酸と UTP を結合する活性については，活性中心のアミ生産された．そこで，各変異体糖-1-リン酸ヌクレオチド
転移/アミノ糖-1-リン酸アセチル基転移酵素の N-アセチノ酸をアラニン等に変換することで野生型蛋白質よりもルグルコサミン-1-リン酸およびグルコース-1-リン酸と1.3−1.5 倍高い活性を示す 5 種類の変異体について既に報告してきた（Zhang et al., 2007）．しかし，この上昇し

UTP の結合活性について測定を行った．その結果をた活性でもバクテリア・大腸菌の類似の酵素活性と比し方の活性の上昇が確認された．この中で最も活性が促進

Fig. 2 に示した．一重枠で囲った 6 種類の変異体では両された Y97N では野生型糖-1-リン酸ヌクレオチド転移/てまだまだ低いものであった．
1 個の変異を導入することで活性を上昇させることがアミノ糖-1-リン酸アセチル基転移酵素が有している活性

できた 5 種類の変異を複数組み合わせることで，さらにと比して約4.5倍高い活性を示した．また Y97M 変異体

活性を上昇させることが出来るのではないかと推測し蛋白質では，N-アセチルグルコサミン-1-リン酸と UTPた．そこで，二種類の変異を同一クローンに導入した二を結合する活性が促進された比率よりも，グルコース-1-

重変異体糖-1-リン酸ヌクレオチド転移/アミノ糖-1-リンリン酸と UTP を結合する活性が促進された比率のほう

酸アセチル基転移酵素を構築した．その結果，Fig. 1 にが大きいという特徴が見いだされた．また，二重枠で囲っFig. 2
Fig. 1 Relative activity of the wild type, single substitution and double substitution mutant ST0452 proteins. Specific activity of the wild type ST0452 protein is
2.2±0.1μmole・min−1・mg protein−1.

− 105 −

Two sugar-1-phosphate nucleotidylyltransferase
activities of wild type and mutant ST0452 proteins. Open bars and hatched bars indicate GlcNAc-1-P
UTase and Glc-1-P UTase activities. Relative activity isshown as a ratio of each activity detected on the wild
type (wt) ST0452 protein.

石野

園子，鈴木

宏和，河原林裕

た8種類の変異体蛋白質では，N-アセチルグルコサミン

制している可能性を示唆している．これらアセチル基転-1-リン酸と UTP との結合活性のみが促進されていた．
これらの活性の上昇がどの様な要因によって引き起こ

移酵素活性が促進された 2 つの欠失変異体蛋白質について，活性の逆数プロットによる見かけの Km および kcat

されているのかを明らかにするために活性が促進された値の解析を行った．その結果を Table 2 II に示すが，こ変異体の中の代表的な変異体について，その活性の逆数プロットによる見かけの Km および kcat 値の解析に取れらの変異体でも大きく促進されていたのは，kcat 値でり組んだ．活性が促進された変異体糖-1-リン酸ヌクレオ

クレオチド転移/アミノ糖-1-リン酸アセチル基転移酵素
では，グルコサミン-1-リン酸アセチル基転移活性の kcat

チド転移/アミノ糖-1-リン酸アセチル基転移酵素の中あった． 5 残基・11残基欠失させた変異体糖-1-リン酸ヌ

Y97M（グルコース-1-リン酸と UTP を結合する活性の促

値がそれぞれ約 4 倍・18.8倍上昇していた．
超好熱アーキア Pyrococcus horikoshii が有する，ホス進比率の最も高い変異体）および Y97V（N-アセチルグル

ホマンノースイソメラーゼとマンノース-1-リン酸とコサミン-1-リン酸と UTP を結合する活性のみ上昇した

GTP を結合させる活性の二つを有するバイファンク変異体）について，その活性の逆数プロットによる見かけの Km および kcat 値を解析した．その結果を Table 1

ショナル酵素 PH0925 蛋白質についても，マンノース-1-に示すが，Y97N では両方の活性の，Y97V では N-アセ

その結果を Table 3 に示した．本 PH0925 蛋白質を C 末チルグルコサミン-1-リン酸と UTP を結合する活性のみの kcat 値が上昇していた．一方，Y97M では両方の活性端から順に欠失させた変異体蛋白質の発現ベクターを構の kcat 値の上昇が確認されたが，グルコース-1-リン酸と UTP を結合する活性では Km 値の上昇が 2 倍程度な性・可溶性蛋白質として生産が確認された．C 末端側かで，特徴的な Y97N（両方の活性が最も上昇した変異体），

リン酸と GTP を結合する活性が促進できるか試みた．

築した．これらの欠失変異体蛋白質も大腸菌内で，耐熱
ら14アミノ酸残基欠失させると野生型 PH0925 蛋白質がのに，N-アセチルグルコサミン-1-リン酸と UTP を結合示す活性の約1.2倍の活性が，さらに C 末端から114残基させる活性では，Km 値が10倍以上大きくなっていた．

のアミノ酸を欠失させると野生型蛋白質が有する活性のこのことからグルコース-1-リン酸と UTP を結合する活性の方が活性の上昇比率が大きくなって現れたものと思われる．今回の変異体についての解析結果から，本糖-1-

Table 1

Kinetic parameters of the typical three mutant ST0452
proteins

Table 2

Specific activities（ I ）and kinetic parameters（ II ）of
the N-acetylglucosamine-1-phosphate uridyltransferase
and amino-sugar-1-phosphate acetyltransferase activities of the wild-type and mutant ST0452 protein

リン酸ヌクレオチド転移/アミノ糖-1-リン酸アセチル基転移酵素が有する糖-1-リン酸と NTP との結合活性については，一つのアミノ酸残基に変異を導入することで，大きく促進できることが示された．
次に，同じ糖-1-リン酸ヌクレオチド転移/アミノ糖-1リン酸アセチル基転移酵素の C 末領域にコードされているアミノ糖-1-リン酸アセチル基転移活性についても，促進することが可能か取り組んだ．活性中心への変異の導入でも活性の促進は見られたが，顕著ではなかった．
それに比して，C 末端のアミノ酸残基を数残基欠失させることで，大きくグルコサミン-1-リン酸アセチル基転移活性が上昇することが確認された（Table 2 I）．C 末端から5残基欠失させた場合，本活性は4.8倍，11残基欠失させた場合，実に16.8倍上昇した．一方，ガラクトサミン-1-リン酸アセチル基転移活性については， 5 残基および11残基の欠失によりわずかながら低下がみられた．また
N 末領域にコードされている N-アセチルグルコサミン-1-リン酸と UTP を結合する活性については，この欠失による影響はほとんど見られなかった．このことは，本糖-1-リン酸ヌクレオチド転移/アミノ糖-1-リン酸アセチ
ル基転移酵素の C 末端5-11残基の領域は本糖-1-リン酸ヌ
クレオチド転移/アミノ糖-1-リン酸アセチル基転移酵素
が C 末領域にコードしているアセチル基転移活性を抑− 106 −

極限環境微生物遺伝子資源の応用
Table 3

実験方法

Specific and relative activity of the wild type and truncated form of the PH0925 protein

キメラ Taq ポリメラーゼの産生プラスミド作製
日本各地の温泉土壌より抽出した環境メタゲノム
DNA を鋳型に用いて，プライマーセットに，5ʼ-dCGCAGGCTAAGCAGCTCCGAYCCHAACYTSCARAAYATHCC
および 5ʼ-dGAGYAAGATCTCRTCGTGNACYTG を用いてPCR をおこなった．下線部分は制限酵素 Blp I および
Bgl II の認識配列である．また縮重コドンは，Y が C お
よび T；H が A, C, および T；S が C および G；R が A および G；N が A, G, C, および T を示す．これらのプライマー
配列はファミリー A 型 DNA ポリメラーゼに保存された
アミノ酸配列，DPNLQNIP および QVHDEIL をコードする遺伝子に相当する．pTV118 プラスミド上の野生型
約3.5倍の活性を示すことが明らかとなった．しかし，

TaqDNA ポリメラーゼをコードする遺伝子にも同様の

さらに 5 残基欠失させると活性は野生型の 8 割へと減少

部位に Blp I および Bgl II の認識配列をあらかじめ導入

することから，この 5 アミノ酸残基の領域に本 PH0925

しており，それらを用いて，環境 DNA より増幅された蛋白質のコードするマンノース-1-リン酸と GTP を結合

約 600 bp の DNA 断片と組換えて，キメラ遺伝子を作製する活性を制御する機能があると思われる．またこのした．

PH0925 蛋 白 質 の C 末 端 か ら100残 基 の 領 域 は， 本PH0925 蛋白質の N 末端領域に存在するマンノース-1-リ

組換え蛋白質の調製
野生型およびキメラ Taq ポリメラーゼの組換え蛋白

ン酸と GTP を結合する活性を抑制する機能を持つと推質の産生には大腸菌 JM109 株にプラスミドを用いて形定される．
以上，示した 3 つの例の様に超好熱アーキア由来酵素

質転換し，37 ℃ で培養し OD（600 nm）が 0.3 に達した

では，活性中心への変異の導入あるいは適度な長さの欠とき，IPTG を終濃度 1 mM になるよう添加して，さら失の導入により，元来有している活性を大きく上昇させに 6 時間培養して大量産生させた．アミノ酸 9 残基の挿ることが可能だということが示された．今後，超好熱アー

入 変 異 体 を 産 生 す る プ ラ ス ミ ド は，Agilent 社 の site

キア由来の他の酵素でも同様の手法で活性の上昇が可能

directed mutagenesis kit を用いて pTV118 に挿入されたか確認をおこなってゆきたい．また，活性を上昇させる

野生型 Taq ポリメラーゼ遺伝子より作製し，野生型 Taq

ことが出来た変異蛋白質は，今後の物質生産での応用に

ポリメラーゼと同様の方法で大腸菌を培養して産生させも供していきたい．

た．大腸菌の粗抽出液を 75 ℃ で30分間処理し，耐熱画分をポリエチレンイミン処理で除核酸して，硫酸アンモ
ニウムで塩析して蛋白質を回収した．その後 HiTrap［Ⅱ］配列の挿入による DNA ポリメラーゼ活性の促進

諸Heparin HP カ ラ ム（GE ヘ ル ス ケ ア ） お よ び HiTrap

言

Phenyl HP カラム（GEヘルスケア）を用いたクロマト
グラフィーをおこない，高純度標品を得た．

耐熱性 DNA ポリメラーゼは遺伝子クローニングや配列解析，PCR 等の遺伝子操作技術に多大な貢献をしてきた（Perler et al., 1996; Terpe, 2013; Ishino & Ishino, 2014）．

プライマー伸長反応

より有用な PCR 酵素を得るために微生物から新規酵素

同位元素でラベルしたプライマーをアニールしてを探索する試みは長年にわたって続けられているが，培20 mM Tris−HCl（pH 8.8），5 mM MgCl2，14 mM 2-メル

養技術および精製技術の限界があり限られた生物資源しカプトエタノール，および 0.2 mM dNTP を含む反応液

か利用されていない．そこで培養困難な未知の微生物由中で 0.0025 unit/μl キメラ酵素または 0.08 nM 野生型お来の遺伝子資源を利用することで，未同定の遺伝子の一よび変異型酵素を用いて 74 ℃ で反応し，伸長産物を部を既知酵素の遺伝子と融合させて，遺伝子産物の酵素

0.7 % アルカリアガロースゲル電気泳動で展開した後，活性を直接分析し，高い酵素活性を発揮する遺伝子の選

オートラジオグラフィーにより検出した．

鋳型に M13mp18 一本鎖 DNA を用いて，P-32 放射性択をおこなう方法をとった．
− 107 −

石野

園子，鈴木

宏和，河原林裕

DNA 結合活性（Electrophoresis Mobility Shift Assay（EMSA））

残基をコードする DNA を環境 DNA から得られた断片

鋳型−プライマーDNA（3 nM）を 0.4, 1.6, 6, 25, 100,に置換し，キメラ酵素を作製した（Fig. 3）．それらのプおよび 400 nM の Taq ポリメラーゼと混合し，0.1×TAE

ライマー伸長活性を分析した結果，いくつかのキメラ酵

中 1 % アガロースゲル電気泳動で展開した後，オートラ

素が野生型の酵素より高い伸長活性を示した．それらのジオグラフィーにより検出した．

塩基配列を解析した結果，活性が上昇したクローンには野生型に比べて 9 アミノ酸残基（GPGQAPRRL）の挿入
配列が存在することがわかった．代表的なクローンのPCR
鋳型にλDNA を用いて，2 kbp の増幅産物が得られる

196残基のアミノ酸配列の中で挿入配列を有する領域のようプライマーを設計した．鋳型 DNA 2 ng と 20 pmol

一次配列アラインメントを Fig. 4 に示す．この 9 アミノの プ ラ イ マ ー セ ッ ト を 用 い て，50μL の PCR 反 応 液

酸残基が基質 DNA への高い結合をもたらしたと思われ（10 mM Tris−HCl（pH 8.3）
, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2,

る．Taq ポリメラーゼの結晶構造では，この挿入部分は0.2 mM dNTP）に 8 nM の Taq ポリメラーゼを加えて，フィンガーサブドメインの 2 本のα-ヘリックスの間のループに位置することがわかった（Eom et al., 1996）．

94 ℃ で10秒間と 64 ℃ で15秒間の反応を20サイクル実施した．反応産物をアガロースゲル電気泳動に供し，エチジウムブロマイド染色で検出したバンド強度をイメー
ジアナライザ（LAS-3000 mini フジフィルム）で定量した．

結果および考察ファミリー A DNA ポリメラーゼのフィンガーサブドメ
インに見られる配列の特徴
野生型 Taq ポリメラーゼの Val586 から Leu781 の 196

Fig. 4

Fig. 3 Schematic diagram of the construction of the expression plasmid for chimeric Taq polymerase.
The recognition sites for Blp I (GCTNAGC) and Bgl II(AGATCT) were created in the Taq pol structural gene(gray arrow). The introduced gene fragments (black)also have the recognition sequences for these two enzymes from the PCR primers, and the substitution of
the DNA fragments can be performed directly on thisplasmid (upper panel). The produced chimeric protein isshown by a bar (lower panel). The replaced region was
indicated in black. The motifs conser ved in family A
DNA polymerases are indicated by white lines.

− 108 −

Alignment of the amino acid sequences in the region with the 9 aa insertions of chimeric Taq polymerases. The chimeric Taq polymerases with faster extension rates than that of WT were analyzed. The
alignment was performed with MAFFT (http://mafft.
cbrc.jp/alignment/software/). The consensus residues
in motif 6 are indicated in white on a black background.
The numbers on the top indicate the amino acidpositions of WT Taq polymerase. The distinctive region
obser ved in this alignment is indicated by a line with
two arrow heads. The basic cluster is indicated by aline. The DDBJ accession numbers of the nt sequencesof the clones are LC002849, 73-4; LC002850, KA13-8;
LC002851, 66-20; LC002852, 21G-13; LC002853, 66-13;
LC002854, 58-11; LC002855, KA13-9; LC002856, A3-3;
LC002857, B8-8; LC002858, B9-8; LC002859, B9-17;
LC002860, B8-4; LC002861, A3-9; LC002862, C3-19;
LC002863, B2-16; LC002864, 23-4; LC002865, B8-2;
LC002866, B3-3; LC002867, B3-17; LC002868, 26-4;
LC002869, 26-35; LC002870, 26-7; LC002871, B1-8;
LC002872, B1-10; LC002873, B1-1; LC002874, 66-2.

極限環境微生物遺伝子資源の応用

組換え蛋白質のプライマー伸長活性および DNA 結合活性Taq に差は見られなかった．EMSA により DNA 結合活

二つのクローン，KA13-8 および A3-9 から作製したキ性を調べたところ，Ins1-Taq および Ins2-Taq が野生型

メラ酵素をさらに PCR に応用することを検討したが，に比べてあきらかに高い活性を示した．環境 DNA 由来

実用的な熱安定性が認められなかった．そこで 9 アミノの挿入アミノ酸配列に見られる二つの Arg 残基が高い

酸残基を野生型 Taq ポリメラーゼの Arg736 と Val737

DNA 結合をもたらしていると考えられ，Ins2 でさらにの間に挿入した変異体を作製した．これを Ins1-Taq と追加した二つの塩基性アミノ酸による効果は見られなする．さらに DNA に対する結合能を上げるため，挿入かった．

配列の第 3 番目および第 4 番目の Gly-Gln を Arg-Arg に置換した（Ins2-Taq）．これら変異型の Taq ポリメラー

組換え蛋白質を用いた PCR

ゼの組換え蛋白質を野生型と同様に調製し，酵素活性を二 種 類 の 9 ア ミ ノ 酸 配 列，GPGQAPRRL（Ins1）

評価した．プライマー伸長反応の結果，Ins1-Taq および

GPRRAPRRL（Ins2），を挿入した変異型 Taq ポリメラー

Ins2-Taq の伸長産物の長さは野生型による産物より長

ゼは，精製過程での熱処理における挙動からも野生型とかった（Fig. 5）．しかし予想に反して Ins1-Taq と Ins2-

同様に耐熱性を保持していることが期待されたので，様々な長さの増幅産物が得られるようなプライマーセッ
ト を 用 い て PCR を 実 施 し た． 代 表 的 な 結 果 と し て，
2 kbp の目的領域の増幅に対して，15秒という短い伸長
時間で産物が得られた例を Fig. 6A に示す．増幅された
DNA 量を比較した結果（Fig. 6B），Ins1-Taq と Ins2-Taqの間に差は見られなかったが， 9 アミノ酸の挿入が Taq
ポリメラーゼをより有用な PCR 酵素に改変したと言える．このことは挿入配列中の塩基性アミノ酸が DNA 結合に寄与して，PCR における DNA 合成反応がより速くなるように働いたと考えられる．

Fig. 6
Fig. 5 Activities of the WT and mutant Taq polymerases.
A, Primer extension activities of the recombinant Taq
polymerases were analyzed. The names of the Taq polymerases and the reaction time are indicated on the top.
The sizes indicated on the left are from 1 kb DNA Ladder(NEB) labeled with P-32 at each 5ʼ end. B, DNA binding
abilities of the recombinant Taq polymerases. The
names of the Taq polymerases are indicated on the top.

− 109 −

PCR performances of WT and mutant Taq polymerases. A, The amplified products (2 kb) were analyzed by 1% agarose gel electrophoresis. The names of
the Taq polymerases are indicated on the top. Lane m is
a 1 kb DNA Ladder (NEB). B, Quantification of the band
intensities was performed by scanning the EtdBr-stainedgel, using an image analyzer (LAS-3000 mini; Fuji Film,
Tokyo, Japan). The relative amounts of the products
were calculated from three independent experiments,
and are shown with standard errors.

石野

園子，鈴木

［Ⅲ］異種好熱菌遺伝子の細胞内分析に有用な Geobacillus
kaustophilus HTA426 の遺伝学的ツールの開発

諸宏和，河原林裕とが多く，大腸菌などの常温菌中では機能しない場合がある．このことから，好熱菌遺伝子の細胞内分析には好熱菌を宿主とすることが望ましいが，好熱菌の遺伝子改言

変技術は限定的であるため，そのような分析はあまり行

好熱菌は，高温環境を好んで生育する極限環境微生物

われていない．
G. kaustophilus HTA426 は，マリアナ海溝の深海底泥で，それらが保有する未知遺伝子は，活発な研究対象とから単離された好気性のグラム陽性桿菌で（Takami et al.,

なっている．未知遺伝子の機能を解析する場合，大きく

1997, 2004a），中温から高温にかけての広域温度範囲で分けて 2 種類のアプローチが利用される． 1 つ目のアプ

迅速に増殖できる（生育可能温度，42−74 ℃；生育至適

ローチでは，対象遺伝子の発現産物（および酵素）を
Escherichia coli（大腸菌）などで産生し，得られた酵素

温度，60 ℃；LB 培地中の倍化時間，約 20 min）．本菌は，生物学的知見が蓄積された Bacillus subtilis（枯草菌）と分子を抽出さらには精製した上で，その機能を試験管内分析する． 2 つ目のアプローチは細胞内分析で，対象遺近縁で，Geobacillus 属としては最初に全ゲノム配列が公開された（Takami et al., 2004b）．GC 含量は中庸で，伝子を大腸菌などのモデル微生物に導入し，それによっプ ラ ス ミ ド に よ る 形 質 転 換 も 可 能 で あ る（Suzuki &て起こる大腸菌の表現型変化を分析することで，その機Yoshida, 2012）．つまり HTA426 株は，遺伝学的に解析能を予測する．試験管内分析は，遺伝子機能が予測できしやすい好熱菌の 1 つであり，異種好熱菌遺伝子を細胞る場合に有効で，決定的な機能解明に至ることができる．
細胞内分析は，遺伝子機能の大まかな分析に有効で，遺内分析するための汎用的宿主として有用と期待できる．
そこで本研究では，G. kaustophilus HTA426 の遺伝学的伝子機能が全くわからない場合や，対象遺伝子が酵素以

ツールを広く開発し，その有用性について検証した．

外をコードする場合にも広く利用できる．本来，これら

実験方法

2 種類のアプローチは表裏一体の関係にあり，微生物学
においては両アプローチから遺伝子機能の解明に至るのが通例である．好熱菌の未知遺伝子についても，試験管菌株，培養条件，およびプラスミド

内分析と細胞内分析の両アプローチから解析されるべき使用したプラスミドおよび菌株を Table 4 にまとめた．
G. kaustophilus は，Luria−Bertani（LB）培地もしくはだが，好熱菌の酵素は反応至適温度が高温領域にあるこTable 4

Plasmids and bacterial strains− 110 −

極限環境微生物遺伝子資源の応用最少培地を用いて培養した．特記のない限り，培養は60 ℃ で行った．最少培地は，以下の化合物を含む：硫酸カリウム（終濃度，0.3 g L−1），リン酸水素二ナトリウ
ム十二水和物（2.5 g L−1），塩化アンモニウム（1 g L−1），
硫酸マグネシウム（0.4 g L−1），塩化マンガン四水和物（3 mg L−1），塩化カルシウム二水和物（5 mg L−1），塩化鉄（III）六水和物（7 mg L−1），硫酸亜鉛七水和物（0.4 g L−1），
ホ ウ 酸（10 mg L−1）， 塩 化 コ バ ル ト（II）（50 mg L−1），
硫酸銅（II）（0.2 g L−1），塩化ニッケル（II）（10 mg L−1），
エチレンジアミン四酢酸（0.25 mg L−1），およびトリス
ヒドロキシメチルアミノメタン塩酸緩衝液（10 mM，
pH 7.0）．必要に応じて D-グルコース（10 g L−1）
，カザ
ミノ酸（1 g L−1）．カナマイシン（5 mg L−1），およびウラシル（10 mg L−1）を添加した．G. kaustophilus を利用した蛋白質生産には，酵母エキス（10 g L−1）を含む最少培地（MY 培地）を使用した．
G. kaustophilus へのプラスミド導入
G. kaustophilus へのプラスミドの導入には，E. coli からの二者接合伝達（Suzuki & Yoshida, 2012）もしくは三者接合伝達（Suzuki et al., 2013）を利用した．二者接合伝達の場合は，核酸供与体に E. coli BR408（Suzuki &Yoshida, 2012）を利用した．核酸供与体（E. coli BR408）

Fig. 7と核酸受容体（G. kaustophilus）を菌体濁度（OD600）が0.3 になるまで培養し，細胞を混合後，遠心分離により細胞を濃縮した．混合細胞は，LB 固形培地上にスポッ
トし，37 ℃ で 4 時間から一晩培養した後，回収した．
回収した菌体は，適切な選択培地に塗布し，60 ℃ で一晩培養することで形質転換体を得た．三者接合伝達においては，核酸供与体に E. coli DH5α，接合伝達ヘルパー

Str uctures of the plasmids pGAM46 （A）andpGKE75（B）. pGAM46 is a vector for gene integration
into GK0707 locus. pGKE75 autonomously replicates in
G. kaustophilus. Abbreviations: GK0707ʼ, GK0707 upstream region; ʼGK0707, GK0707 downstream region;
AmpR, ampicillin resistance gene; pUC, pUC replicon
for E. coli; pBST1, pBST1 replicon for G. kaustophilus;
oriT, conjugative transfer origin; pyrF, pyrF selection
marker; TK101, kanamycin resistance gene functional in
G. kaustophilus; Pgk704, a promoter functional in G.
kaustophilus.

に E. coli DH5α［pUB307］を利用した（大括弧はプラス
ミド保有状態を示す）．核酸供与体（E. coli DH5α），核酸受容体（G. kaustophilus），および接合伝達ヘルパー（E. coli DH5α［pUB307］）を菌体濁度が 0.3 になるまで

G. kaustophilus 染色体の GK0707 locus に挿入した．得

培養し，細胞を混合後，二者接合伝達と同様な工程を経られた変異株を炭素源が異なる様々な最少培地中で培養て形質転換体を得た．

し，培養菌体から粗酵素抽出液を調製した．粗酵素抽出
液中の BgaB 量は，パラニトロフェニルガラクトピラノ

G. kaustophilus で機能するプロモーターの探索

シド（p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside）を基質としB. subtilis に関する知見を利用しながら，HTA426 株

た酵素活性分析により定量した． 1 ユニットは， 1 分間

ゲノム中の糖質代謝関連遺伝子を予想し，その推定プロあたりに 1 nmol のパラニトロフェノール（p-nitrophenol）

モーター領域を PCR で増幅した．得られた増幅断片をプ ラ ス ミ ド pGAM46（Fig. 7A） の Hind III−Sph I サイを遊離させる酵素量と定義した．

ト間に挿入し，つづいてプロモーター領域下流の Sph I−
BamH Iサイト間に耐熱性 β-ガラクトシダーゼの遺伝子（bgaB）を挿入した．これにより得られた bgaB 発現カ

G. kaustophilus における異種遺伝子の発現領域（Pgk704）を PCR で増幅し，pGAM46 の Hind III−Sph I

セットを，ウラシルおよび 5-フルオロオロチン酸を利用し た カ ウ ン タ ー 選 択（Suzuki et al., 2012） を 用 い て，

サイト間に挿入することで，pGAM48 を得た．つづいて
pGAM48 の Sph I−Bam HI サイト間に，様々な異種好熱

G. kaustophilus の GK0704 遺伝子上流のプロモーター− 111 −

石野

園子，鈴木

宏和，河原林裕

菌遺伝子（bgaB，amyE，PH0380，PH1171，PCAL1307，
および ST0649；Table 5）を挿入した．得られたプラス

る BgaB 量を比較したところ，推定マルトース異化遺伝

ミド中の発現カセットを，ウラシルおよび 5-フルオロオ
ロチン酸を利用したカウンター選択（Suzuki et al., 2012）

ルトース存在下において高発現することがわかった（Fig. 8A）．その際の BgaB 比活性は，マルトースを含まによって，G. kaustophilus MK72 染色体の GK0707 locus

ない培地中で培養した場合よりも10倍以上高く，本プロに挿入した．また各発現カセットを高コピーベクター

モーターはマルトースにより誘導されることが示唆され

pSTE33T（Suzuki &Yoshida, 2012）にサブクローニング
し，G. kaustophilus MK72 を形質転換した．形質転換体で向上し（Fig. 8B），高コピープラスミド pSTE33T を用は，MY 培地中で菌体濁度が 0.5 になるまで培養し，ついて発現させることで更に向上した．このようにして最づいて異種遺伝子の発現を誘導するために終濃度 1 % の
マルトースを培地に添加した．さらに20時間培養を続け適化された発現方法を用いて，様々な異種好熱菌の酵素遺伝子を G. kaustophilus 中で発現させたところ，amyE，た後，培養菌体から粗酵素抽出液を調製した．それに含PH1171，および PCAL1307 遺伝子が機能的に発現し，子群（GK0704−GK0707）の上流領域（Pgk704）が，マた．産生される BgaB 比活性は，MY 培地を用いること

まれる異種好熱菌遺伝子の発現産物は，SDS−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を用いて分析した．
G. kaustophilus の高効率形質転換株の作製
G. kaustophilus HTA426 のゲノム中には，数多くの制限修飾系遺伝子（hsdM1S1R1，hsdM2S2R2，mcrB1，mcrB2，
mrr，GKP08，および GKP09）が見出される．それら遺伝子の上流および下流領域を pGAM46 にクローニング
し，構築したプラスミドとウラシルおよび 5-フルオロオ
ロチン酸に基づくカウンター選択（Suzuki et al., 2012）を 用 い て，G. kaustophilus MK72 の 制 限 修 飾 系 遺 伝 子（hsdM1S1R1，hsdM2S2R2，mcrB1，mcrB2，mrr）を破壊した．得られた派生株は MK244 と命名した．
G. kaustophilus で機能する新たな薬剤選択マーカーの開発
チオストレプトン耐性遺伝子（tsr；Table 5）を，自律複製型プラスミド pGKE75（Fig. 7B）の Pgk704 下流にク
ローニングすることで，pGKE75-tsr を得た．またクロラ
ムフェニコール耐性遺伝子（cat；Table 5）を pGKE75の Pgk704 下流にクローニングすることで，pGKE75-cat を
得 た．pGKE75-tsr と pGKE75-cat を 高 変 異 性 好 熱 菌（G. kaustophilus MK480）に導入し，得られた形質転換
体をチオストレプトンとクロラムフェニコールを含む
LB 培地中で各々継代培養することで，高温機能性のチ

Fig. 8オストレプトン耐性遺伝子ならびにクロラムフェニコー
ル耐性遺伝子を発生させた．

結果および考察
G. kaustophilus における異種遺伝子発現
G. kaustophilus で機能する高発現プロモーターを同定するために，HTA426 ゲノム中の推定プロモーター領域
を bgaB 遺伝子の上流に挿入し，当該発現カセットを
G. kaustophilus MK72 に導入した．得られた形質転換体
を炭素源が異なる様々な最少培地中で培養し，産生され− 112 −

bgaB expression in G. kaustophilus.（A）G. kaustophilus strains that harbor bgaB gene in chromosome
under the control of Pgk704 (solid bars) and PsigA (hollow bars) was cultured in minimum media supplemented
with the indicated sugar. Crude extracts were preparedfrom the resulting cells and analyzed for BgaB specificactivity.（B）G. kaustophilus strain that harbors bgaB inchromosome under the control of Pgk704 was cultured
in MY medium. When OD600 reached 0.5, maltose wasadded to the medium at a final concentration of 1% (solid
circles). After the medium was further incubated for theindicated period, crude extracts were prepared from theresulting cells and analyzed for BgaB specific activity.
The culture without maltose was used as control (hollow
circles).

極限環境微生物遺伝子資源の応用
Table 5

Expression of heterologous genes in Geobacillus kaustophilus

それによってデンプン分解能，セルロース分解能，およびトリブチリン分解能が各々 G. kaustophilus に付与されTable 6

Transformation efficiencies of Geobacillus kaustophilus
using conjugation

た（Table 5）．amyE と PH1171 の発現産物は細胞外に有意に生産された．酵素活性は確認していないが，PH0380
および ST0649 の発現産物が G. kaustophilus 細胞内に産生されることも確認した．以上の結果は，G. kaustophilus
において異種好熱菌遺伝子が広く発現すること，そして好熱菌遺伝子の探索や細胞内分析において，G. kaustophilus を宿主とした発現系が有用であることを示唆している．また PH0380 発現産物は，大腸菌中では産生されなかったことから，G. kaustophilus 発現系は大腸菌発現系よりも，好熱菌遺伝子の発現に有利と言える．

合伝達を利用した本株の形質転換を検証した．E. coli

G. kaustophilus の高効率形質転換株の作製

DH5αは広く利用される大腸菌株で，形質転換効率も高いことから，E. coli DH5αからの接合伝達が可能であれある好熱菌のゲノムライブラリーを G. kaustophilus を宿主として構築できれば，その好熱菌の未知遺伝子を細胞内分析によって同定しやすくなる．G. kaustophilus へのプラスミド導入は，E. coli BR408 からの二者接合伝達
によって行えるため（Suzuki & Yoshida, 2012），E. coli
BR408 を 宿 主 と し た ラ イ ブ ラ リ ー が 構 築 で き れ ば，
G. kaustophilus を宿主としたゲノムライブラリーの構築
も理論上は可能である．しかしながら，E. coli BR408 の低い形質転換効率を理由に，E. coli BR408 株ひいてはば，G. kaustophilus を宿主としたゲノムライブラリーの構築も容易になる．期待通り，MK244 株は E. coli DH5αから転移してきた接合伝達プラスミドを効率よく受容した（Table 6）．その際の形質転換効率は，E. coli BR408
株を用いた接合伝達によるものと同程度で，接合伝達ヘ
ルパーを用いた三者接合伝達においても，MK244 株はプラスミドを効率よく受容した．さらに三者接合伝達を用いたプラスミド導入によって，G. kaustophilus MK244を宿主とした好熱菌ゲノムの高規模ライブラリーも構築

G. kaustophilus を宿主としたゲノムライブラリーの構築できた．得られた MK244 ライブラリーをウラシル原栄

は，非常に困難であった．そこで本研究では，DNA 制

養性に基づきスクリーニングしたところ，複数の異種好熱菌の pyrF 遺伝子が同定できた（Table 5）．本結果は，

限修飾系を欠失させることで形質転換効率を向上させた
G. kaustophilus MK244 を作製し，E. coli DH5αからの接G. kaustophilus MK244 を利用することで好熱菌 DNA の− 113 −

石野

園子，鈴木

宏和，河原林ライブラリーが構築できること，ならびに当該ライブラ

裕

高温機能性クロラムフェニコール耐性遺伝子の創出

リーが好熱菌遺伝子の活性スクリーニングに有効である

クロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）は，Geobacillus

ことを示す．注目すべきことに，ここで同定された一部の pyrF 遺伝子は，大腸菌内では発現しなかった（Table 5）．

属細菌の形質転換に利用される薬剤選択マーカーの 1 つ

よって G. kaustophilus は，好熱菌遺伝子の細胞内分析のだが，機能温度が低いため，その利便性は低い．そこで
本研究では，G. kaustophilus 細胞内の自発的変異を利用ための宿主として，常温菌よりも有利といえる．

した耐熱化指向性の遺伝子変異（Suzuki et al., 2015）を

高温機能性チオストレプトン耐性遺伝子の創出

用いて，より高温で機能するクロラムフェニコール耐性マーカーの開発に取り組んだ．pGKE75-cat で G. kaus-

微生物の複雑な遺伝子改変は，複数の薬剤選択マーカーがあると容易になる．しかし，Geobacillus 属細菌でtophilus MK480 を形質転換し，クロラムフェニコールを使用される薬剤選択マーカーは，カナマイシン耐性遺伝にクロラムフェニコール耐性を示す株が得られた．それらは cat 発現産物の A138T 置換体をコードする変異遺子とクロラムフェニコール耐性遺伝子に限られており，これは Geobacillus 属細菌の高度な遺伝的改変を制限する含有する培地上で継代培養したところ，60 ℃ でも安定

伝 子（catA138T） を 有 し て い た．G. kaustophilus MK242

原因となっている．そこで本研究では，G. kaustophilus［pGKE75-catA138T］も，60 ℃ では効率的なクロラムフェ

細胞内の自発的変異を利用した耐熱化指向性の遺伝子変異（Suzuki et al., 2015）を利用して，G. kaustophilus でニコール耐性を示した（Table 7）．しかし 65 ℃ ではク

機能するチオストレプトン耐性マーカーの開発に取り組ん だ．pGKE75-tsr で 高 変 異 性 好 熱 菌（G. kaustophilus

で機能するクロラムフェニコール耐性マーカーの発生を目的とし，G. kaustophilus MK480［pGKE75-catA138T］をク

MK480）を形質転換し，形質転換体をチオストレプトン

ロラムフェニコール含有培地上で継代培養したところ，含有培地上で継代培養したところ，60 ℃ でチオストレプ

65 ℃ でも安定にクロラムフェニコール耐性を示す株が得トン耐性を示す株が得られた．それらの株は，tsr 発現

ロラムフェニコール感受性であったことから，より高温

産物の H258Y 置換体をコードする変異遺伝子（tsrH258Y）られた．それが有するプラスミド pGKE75mut-catA138T は，
G. kaustophilus MK242 にも 65 ℃ におけるクロラムフェを有していた．G. kaustophilus MK242［pGKE75-tsr］は，ニコール耐性を付与した（Table 7）．pGKE75mut-catA138T

50 ℃ ではチオストレプトン耐性を示したが，55 ℃ で示の全塩基配列を解析したところ，大腸菌内複製に必要なさ な か っ た． そ れ に 対 し G. kaustophilus MK242

pUC レプリコン領域内に 2 ヶ所の変異が見出された．

［pGKE75-tsrH258Y］は，55℃でもチオストレプトン耐性

これら変異は，いずれも高温クロラムフェニコール耐性を示した（Table 7）．また pGKE75-tsrH258Y は，チオストに重要で，どちらか一方の変異だけでは高温クロラム

レプトンを選択薬剤とした G. kaustophilus の形質転換にフェニコール耐性の効率は低下した．pGKE75mut-catA138T

利用でき，それに要するチオストレプトン濃度も低いものであった（G. kaustophilus に対するチオストレプトン

もしくはその親プラスミド pGKE75-catA138T を保有する
G. kaustophilus を液体培養した場合は，それら細胞内にの半数阻害濃度，約 50μg l−1）．以上の結果は，チオスおける CAT 活性，プラスミドコピー数，およびアセチ

トレプトンが選択薬剤として実用的であること，そして
tsrH258Y 遺伝子が G. kaustophilus の遺伝子改変に有用でル CoA 濃度に大きな差異は見られなかった．しかし平板培養した場合は，G. kaustophilus［pGKE75mut-catA138T］

あることを示す．

Table 7の CAT 活性は，G. kaustophilus［pGKE75-catA138T］のもAntibiotic resistance of Geobacillus kaustophilus carrying the indicated plasmid

Plasmid

Antibiotic

pGKE75-tsr
pGKE75-tsrH258Y
pGKE75-cat
pGKE75-catA138T
pGKE75mut-catA138T

Culture temperature (ºC)

Thiostrepton
Thiostrepton
Chloramphenicol
Chloramphenicol
Chloramphenicol

50

55

60

65

70

+
+
+
+
+

−
+
+
+
+

−
−
±
+
+

−
−
−
−
+

−
−
−
−
−

+, substantial resistance; ±, weak resistance; −, negligible resistance− 114 −

極限環境微生物遺伝子資源の応用の よ り も 顕 著 に 高 く， 一 方 で pGKE75mut-catA138T の
G. kaustophilus 内プラスミドコピー数は，pGKE75-catA138T

して有利といえる．また本研究では，E. coli DH5αからの三者接合伝達による G. kaustophilus 形質転換法を確立のものよりも低い傾向が見られた．どうやら pUC レプリ
コン内の変異が G. kaustophilus 細胞内におけるプラスミ

した．さらに，より高温で機能するチオストレプトン耐

ド複製に影響を与え，
pGKE75mut-catA138T の G. kaustophilus性遺伝子やクロラムフェニコール耐性遺伝子も創出した．これらは，G. kaustophilus を宿主とした好熱菌ゲノ

内コピー数を減少させたらしい．そして，そのコピー数

ムライブラリーの構築や，G. kaustophilus の複雑な遺伝減少がプラスミド維持エネルギーを減少させ，高温条件

子改変を可能にする．以上のように確立された遺伝学的下における CAT 蛋白質産生の向上ひいてはクロラム

ツールは，より幅広い好熱菌遺伝子の分析に貢献するとフェニコール耐性効率の向上を引き起こしたと考えられる．注目すべきことに，pGKE75mut-catA138T は catA138T 遺期待できる．

本助成で得られた研究成果の報告

伝子を選択マーカーとして G. kaustophilus を形質転換することができた．よって本プラスミドも，G. kaustophilusの遺伝子改変に有用と期待できる．

要約

超好熱アーキア Sulfolobus tokodaii 由来の糖代謝関連酵素の中には，大腸菌の類似酵素と比して，低い濃度の基質を代謝出来るが，その反応速度が遅いものが存在する．
そこで，活性中心に位置する単一のアミノ酸残基に変異を導入することで，活性が促進された変異体の創製に成功した．また，C-末端のアミノ酸領域に欠失を導入することでも活性の上昇が確認された．これらの方法で作製された変異体酵素は応用面での利用に期待が持てる．
温泉土壌より得られた未知の微生物由来の遺伝子資源を 用 い て， 既 存 の 耐 熱 性 DNA ポ リ メ ラ ー ゼ で あ る
Thermus aquaticus 由来 DNA ポリメラーゼ（Taq ポリメラーゼ）の一部に未知の配列を融合させたキメラ酵素を創製し，活性スクリーニングにより，野生型より速い
DNA 合成活性を持つ酵素を同定した．挿入された未同定遺伝子の配列を解析したところ，DNA ポリメラーゼのフィンガーサブドメインに相当する部位に挿入された
9 アミノ酸が DNA 鎖伸長活性を促進する可能性を見出した．野生型 Taq ポリメラーゼの相当する部位に 9 ア
ミノ酸を挿入した組換え蛋白質を作製し機能解析した結果，DNA 結合能が上がりより速い DNA 合成活性を有しており，しかも耐熱性を保持して PCR に応用できる
酵素の創製に成功した．
また，様々な好熱菌遺伝子を容易に細胞内分析することを目的とし，G. kaustophilus HTA426 の遺伝学的ツー
ルを広く開発した．Pgk704 は，HTA426 株中で機能する
高発現プロモーターとして有用で，これを用いると様々な異種好熱菌遺伝子を発現できた．それら好熱菌遺伝子の多くは機能的に発現し，様々な機能を G. kaustophilusに付与した．一部の好熱菌遺伝子は，大腸菌中では機能的に発現しなかったことから，本発現システムは常温菌
発現システムよりも好熱菌遺伝子の細胞内分析ツールと口頭発表
1） Kawarabayasi, Y. The hyper thermophilic enzymes involved in carbohydrate metabolism as valuable resourcefor engineering, The 16th Japan-Germany Workshop on
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2） Kawarabayasi, Y. Characterization of the novel carbohydrate metabolic enzymes from the thermophilic archaea
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3） 鈴木宏和．好熱菌 Geobacillus kaustophilus を利用した高温バイオプロセス基盤の創出．第12回 極限環境生物学会
シンポジウム，2011年 6 月，つくば市
4） 鈴木宏和，吉田健一，大島敏久，河原林 裕．好熱性グ
ラム陽性桿菌 Geobacillus kaustophilus HTA426 の分子育種基盤の構築．第12回 極限環境生物学会年会，2011年11月，長崎
5） 鈴木宏和，大島敏久，河原林 裕．好熱菌 Geobacillus
kaustophilus HTA426 における異種耐熱性酵素遺伝子の発現．2012年度 日本農芸化学会大会，2012年 3 月，京都
6） Kawarabayasi, Y. Genome-based identification and improvement of novel activity on the thermostable sugar
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7） 河原林 裕，好熱性アーキア酵素のアミノ酸置換による活性促進，2012年度 酵素補酵素研究会，2012年 7 月，名古屋8） Suzuki, H., Ohshima, T. & Kawarabayasi, Y. Heterologous
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Seminar, July, 2012. New Delhi, India
10） 鈴木宏和，古川 恵．Geobacillus kaustophilus HTA426 において DNA 変異を誘発する遺伝子改変．2013年度 日本
農芸化学会大会，2013年 3 月，仙台
11） 鈴木宏和，和田圭介，古川 恵，土居克己，大島敏久．
三者接合法による Geobacillus kaustophilus HTA426 への高効率プラスミド導入．2013年度 日本生物工学会，2013
年 9 月，広島
12） Suzuki, H., Kobayashi, J., Wada, K., Furukawa, M. & Doi,
K. 2013. Thermostabilization-directed gene evolution using− 115 −

石野

園子，鈴木

adaptive mutations in the thermophile Geobacillus kaustophilus HTA426. BioMicroWorld. , 2013. Madrid, Spain13） Kawarabayasi, Y. Characterization of Archaeal Enzymes
with Thermostablility for Enzymatic Production of Nucleotide-Sugar Molecules, Enzyme Engineering XXII, November, 2013. Toyama, Japan14） 鈴 木 宏 和， 小 林 淳 平， 古 川 恵． 好 熱 菌 Geobacillus
kaustophilus HTA426 における DNA 修復系遺伝子の発現変化．2014年度 日本農芸化学会年会，2014年 3 月，東京
15） 和田圭介，小林淳平，古川 恵，土居克実，鈴木宏和．
好熱菌 Geobacillus kaustophilus HTA426 の高変異性株を利用した耐熱化指向性の酵素遺伝子変異．2014年度 日本
農芸化学会年会，2014年 3 月，東京
16） 小 林 淳 平， 古 川 恵， 鈴 木 宏 和． 好 熱 菌 Geobacillus
kaustophilus HTA426 で機能するクロラムフェニコール
耐性プラスミドの創出．2014年度 日本農芸化学会年会，
2014年 3 月，東京
17） 本田裕樹，藏 茜（Qian Zang），清水泰博，大島敏久，
張 子蓮，河原林 裕，超好熱アーキア Sulfolobus tokodaii strain 7 由来 ST0452 タンパク質へ導入された変異のUDP-GlcNAc 合成活性に与える影響の解析，日本農芸化学会，2015年 3 月，岡山
18） Kawarabayasi, Y. Importance of the functional analyses on
enzymatic activities and metabolic pathways for utilizationof the thermophilic archaeal genomic data, Molecular Biology Society of Japan, December, 2015. Kobe, Japan19） Ishino, S., Kajitani, Y., Watanabe, N., Yamagami, T. & Ishino, Y. 2015. Development of genetic engineering enzymes
derived from research on DNA transactions of microorganisms. Workshop “The novel microbial functions basedon variety and specificity and their applications.” 第38回
日本分子生物学会年会 第88回日本生化学会大会 合同大会，2015年12月，神戸
20） 河原林 裕．超好熱アーキア由来糖代謝関連酵素のユ
ニークな特徴，微生物学の新たな発展，ゲノムから機能・実用に関する九州シンポジウム，2015年12月，宮崎
原著論文
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宏和，河原林裕

5） Suzuki, H., Kobayashi, J., Wada, K., Furukawa, M. & Doi,
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2） 鈴木宏和，大島敏久，2012. 第 5 章 5 節 高温バイオプロ
セスのための好熱菌宿主の開発，極限環境生物の産業展
開，p.153 – 159，シーエムシー出版．
3） Kawarabayasi, Y. 2013. “Improvement of Thermostable Enzyme with Sugar Metabolic Activity by Targeted Mutagenesis” In Advances in Enzyme Biotechnology, ed. Shukla, P.
& Pletschke, B. Springer, pp 1 – 8.

謝辞

本研究は，公益財団法人発酵研究所の寄付金による援助のもと行われたもので，ここに感謝の意を表したい．
また，本研究への九州大学大学院農学研究院大島敏久教
授のご支援とご協力に感謝の意を表したい．さらに本研
究は，協力講座（微生物遺伝子資源学分野，生物化学分野，蛋白質科学分野）の皆様，当寄付講座に在籍したポスドク・技術補佐員等の職員並びに教官の皆さん，当分野で実質的な研究を行った大学院生・学部生の皆さんのご協力の元で成し遂げられたもので，ここに感謝の意を表したい．
機能解析実験をおこなっていただいた九州大学生物資源環境科学府の松川博昭氏と恒川冴恵氏に感謝の意を表したい．
当該プロジェクト［Ⅲ］に参画していただいた小林淳
平博士（現：神戸大学），古川恵技術補佐員，および学生の皆様，ならびに好熱菌遺伝子操作の技術開発にあたり多大な協力を賜りました吉田健一教授（神戸大学）に心より感謝したい．

文

献Eom, S.H., Wang, J. & Steitz, T.A. 1996. Structure of Taq polymerase with DNA at the polymerase active site. Nature 382:
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Ishino, S. & Ishino, Y. 2014. DNA polymerase as a useful reagent− 116 −

極限環境微生物遺伝子資源の応用
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− 117 −

IFO Res.Commun. 30
2016

れた．Bacteroidetes 門に属する菌株 M8−2，M15，M34

汽水湖に生息する孔径 0.22μm のメンブレンフィルターを通過可能な
極微小微生物の分離と，地理分布，
系統学的多様性およびその生態の解明
新谷

政

株は，それぞれ Algoriphagus 属，Flavobacterium 属やAquiflexum 属細菌の基準株と 16S rRNA 遺伝子が類似していたが，特に M15 および M34 株はその一致度が92−93% と低かった．またいずれも近縁種とは異なる

己

基質を代謝可能で，特に M15 株が，近縁種より多くの

静岡大学学術院工学領域
shintani.masaki@shizuoka.ac.jp

基質を代謝できることが示唆された．３株のゲノム配列を解読したところ，それぞれ 3.88 Mb（M8-2 株），

目的：静岡県浜松市の佐鳴湖は，水深が浅く，川で連4.89 Mb（M15 株），2.91 Mb（M34 株）であり，各近結された下流の浜名湖から潮汐の影響で塩濃度の高い縁種と比べると，ゲノムサイズは比較的小さかった．

水が遡上するため，滞留時間の長い（40日前後）汽水

また Proteobacteria 門の新目候補株についても，ゲノム湖である．先行研究で，本湖から孔径 0.22μm のフィ

サイズが 3.65 Mb と小さかった．

ルターを通過し，培養可能な極微小微生物が存在する

一方，湖水中の細菌を孔径 0.22μm フィルターに捕ことが示されたため，本研究では，本湖とその周囲に集した試料（通常サイズの微生物），濾過液をさらに生息する極小微生物の分布と種類を明らかにすること

孔径 0.1μm フィルター上に捕集した試料（極微小微を目的として行った．

生物）について，菌叢解析を行った．その結果，通常

方法：佐鳴湖とその周辺の環境水から，0.22μm のフのサイズの微生物の試料と比較して，極微小微生物のィルターを通過可能な微生物を，栄養源の種類・濃度

試料中の細菌叢は，いずれの地点でも Proteobacteria

を変えた培地を用いて単離後，16S rRNA 遺伝子配列

門・Bacteroidetes 門が優占化しており，両者の合計は，を解読し，系統学的解析を行った．また単離株につい試料の細菌叢の 90% 以上を占めた．上流域では Bac-て，透過型電子顕微鏡観察を行うとともに，様々な炭

teroidetes 門の占める割合がより高く，佐鳴湖下流の新素源や，異なる塩濃度・温度の培養条件下で生育試験

川との接続地点を境に Proteobacteria 門の割合が高くなを行った．新種と推定される菌株については全ゲノムっていた．どの地点においても，Bacteroidetes 門の 90%

配列を解読し，その新奇性について検証を行った．さ以上を Flavobacterium 綱が占めており，顕著にフィルらに，佐鳴湖とその周辺（上流の段子川，下流の新川，ターを通過することが示唆された．Proteobacteria 門におよび下流でつながる浜名湖）の各環境試料を濾過し，ついては，上流域では Alphaproteobacteria および Be-

濾過前後の試料から全 DNA を抽出後，16S rRNA 遺伝

taproteobacteria 綱が，中流では Gammaproteobacteria子を増幅し，産物の塩基配列を解読して菌叢比較を行綱が，下流域では Alphaproteobacteria 綱の細菌が優占った．

化しており，上流・中流・下流域で異なる極微小微生結果・考察：これまでに 385 コロニーを得て，そのう物が生息する可能性が示された．

ち 145 株については単離後，16S rRNA 遺伝子配列に基づく系統分類学的解析を行った．得られた菌株は，Proteobacteria 門（74株），Bacteroidetes 門（44株），Firmicutes 門（18株），Actinobacteria 門（９株）に属すると 推 定 さ れ た ． こ の う ち Proteobacteria 門 と Bacteroidetes 門に属する一部の菌株は，新目，新属細菌と推定され，いずれもフィルターを通過しうると示唆さ− 119 −

IFO Res.Commun. 30
2016（Oudemansiella sp.），スギヒラタケ（Pleurocybella por-

倒木に発生する変形菌類の窒素炭素安定同位体比分析による食性解析と，変形菌類が倒木中の養分無機化および樹木実生の生長に果たす役割の解明
深澤rigens），マツオウジ（Neolentinus suffrutescens），クヌ
ギタケ属菌（Mycena spp.），ムラサキゴムタケ（Ascocoryne sarcoides）と変形菌のタチフンホコリ（Cribraria
cribrarioides）およびシロウツボホコリ（Arcyria cinerea）

遊

は，倒木分解の比較的後期に同じ倒木に発生する傾向

東北大学大学院農学研究科
fukasawayuu@gmail.com

があった．変形菌の炭素安定同位体比はサンプルにより大きくばらついたが，平均 23.5‰ で，真菌の 22.9‰

目的：森林生態系において倒木など植物遺体中に広くと近い値であった．一方，腐朽材の 13C 炭素安定同位生息する変形菌類は，細菌や菌類を摂食することで養体比は 26.5‰ と，変形菌や真菌の値とは大きく異なっ

分を無機化し，物質循環に重要な役割を果たしている

たことから，変形菌は腐朽材よりもむしろ真菌を炭素と予想されるが，その食性や養分無機化機能を評価し源としている可能性が示唆された．また，変形菌のた研究は少なく，生態系の中での役割はよくわかって15

いない．本研究では，様々な分解段階の倒木に発生す度高く，やはり変形菌が真菌を摂食している可能性がる多種の変形菌および菌類の窒素炭素安定同位体比を示唆された．さらにミクロコズム実験では，イタモジ

網羅的に解析することで，倒木に発生する変形菌の食

ホコリの生きた変形体を入れた木紛でナトリウム，硝性を明らかにすると共に，室内実験により変形菌の無酸，マグネシウム，カルシウムの各イオン濃度が増加

機化機能を明らかにすることを目的とした．

しており，変形体の働きによる無機化が起こった可能

方法：山形県千歳山国有林のアカマツとコナラが優占性が示唆された．以上の結果は，枯死木中において変する二次林において，様々な分解段階のアカマツ倒木

形菌が真菌を摂食し，養分の無機化に貢献しているこに発生する変形菌と餌候補である真菌の子実体発生パとを示唆している．

N 窒素安定同位体比は真菌の値よりも平均で 1.2‰ 程

ターンを2013年から2015年にかけて調査し，結果を座標付け分析により解析した．また，採集した変形菌16

従属栄養性珪藻類の進化・多様性と分子生態学的研究基盤の確立

種34サンプル，真菌11種29サンプル，およびアカマツ
倒木の材について，窒素炭素安定同位体比を測定した．

神

さらに，枯死木上によく見られ，真菌の子実体を摂食

川

龍

馬

京都大学大学院地球環境学堂/人間・環境学研究科
kamikawa.ryoma.7v@kyoto-u.ac.jp

している様子が観察されている変形菌であるイタモジ
ホコリ（Physarum rigidum）の変形体を用いたミクロ
コズム実験を用いて，木紛中での変形体の活動による目的：一次生産の 20% を担うと報告されている珪藻類

養分無機化について検証した．

は最も記載された種数の多い藻類の一つであり，水圏

結果・考察：アカマツ倒木上に発生した変形菌と真菌生態系の重要な一次生産者として生態系の維持に貢献の子実体について，共通した発生パターンを示す組みしている．これは珪藻類が非常に効率の良い二酸化炭

合わせを複数見いだした．例えば，真菌のニガクリタ

素濃縮機構を有しているためと考えられている．このケ（Hypholoma fasciculare）と変形菌のトビゲウツボホ

ように，主要な一次生産者として知られている珪藻類

コリ（Arcyria ferruginea）は，倒木分解の初期に同じであるが，一次生産者であるはずの珪藻類において偏倒木に発生する傾向があった．また，真菌のチャホウ

性従属栄養性を示す種が知られている．従属栄養性珪

キ タ ケ モ ド キ （ Ramaria apiculata）， ツ エ タ ケ 属 菌

藻類が担う生態的役割および一次生産者から分解者へ− 120 −

IFO Res.Commun. 30
2016の進化過程を理解するため，従属栄養性珪藻類培養株

植物寄生菌の熱帯環境への適応進化の解明の詳細な形態観察ならびに分子情報の蓄積および分子系統解析を行った．

高

方法：サンプリングは沖縄県石垣市にあるマングロー

松進

三重大学大学院生物資源学研究科
takamatu@bio.mie-u.ac.jp

ブ林にて行い，環境サンプルから従属栄養性珪藻類をマイクロピペッティング法にて単離した．単離・株化
した従属栄養性珪藻類は，光学顕微鏡，蛍光顕微鏡，

目的：重要な植物寄生菌の一つであるうどんこ病菌は走査型電子顕微鏡，透過型電子顕微鏡にて観察した．

北半球高緯度地域で最初に分化し，初期の宿主である

得 ら れ た 株 の 核 コ ー ド 28S rRNA 遺 伝 子 お よ び 16S

広葉落葉樹とともに新生代第三紀の地球の冷涼化に伴rRNA 遺伝子配列を PCR 増幅後，サンガー法にて決定って南方に移動したと考えられる．その後，一部の種した．分子系統解析は最尤法およびベイズ法を用いてが熱帯，亜熱帯地域へと分布を拡大したのであろう．

行った．得られた従属栄養性珪藻類の葉緑体ゲノムを

私たちは数年前から東南アジアを中心とする熱帯地域

次世代シーケンサーで解読した．

に生息するうどんこ病菌の系統解析を行った結果，温結果・考察：従属栄養性珪藻類の形態観察の結果，こ帯地域では見ることのできない特異な菌が多く分布すれまでに得られている株は披針形や S 字など形態的特ることが明らかになってきた．これは熱帯という温帯

徴に多様性が見られた．透過型電子顕微鏡観察の結果，とは全く異なる環境にうどんこ病菌が適応して進化し４重膜に包まれた構造が観察され，この構造は縮退した結果生まれてきた菌類であると考えている．しかし，た葉緑体であると考えられた．従属栄養性珪藻類へのそれらの全貌については未だに明らかではないので，進化を解析するため，従属栄養性珪藻類の 28S rRNA

本研究ではうどんこ病菌の熱帯環境への適応進化の実

遺伝子配列を決定した．珪藻類の 28S rRNA 遺伝子分

態とその要因について明らかにしようとした．本研究

子系統解析では，従属栄養性珪藻類は単系統群を形成の目的は大きく二つに分けられる．1）広範囲の熱帯

せず，少なくとも３つの独立したクレードを形成した．

果樹・樹木類に寄生するうどんこ病菌は同一種なのか

このことは，従属栄養性珪藻類が比較的最近になって，を明らかにする．2）東南アジアおよびわが国を含む

複数回独立して光合成性から従属栄養性への進化を遂

東アジアにおける未記録種を探索する．

げたことを示唆している．これらの株からは葉緑体

方法：インドネシアやタイなどの東南アジア熱帯地域

16S rRNA 遺伝子が決定できたため，従属栄養性珪藻および日本を含む東アジア地域でうどんこ病罹病標本

類が葉緑体を有している可能性がさらに支持された．

を採集し，分子系統解析および形態観察に供した．分

これらの配列は，光合成性種の配列と比較して進化速子系統解析では，キレックス法により全 DNA を抽出

度が非常に大きく，塩基配列進化における機能的な制し，PCR 法により rDNA ITS 領域，28S rDNA D1/D2

約が緩んでいることを示唆している．独立して生じた領域および IGS 領域を増幅した．増幅領域の DNA シ

光合成能の喪失進化が葉緑体ゲノムに及ぼした影響をークエンスを決定し，最大節約法および最尤法により解析するため，系統的に遠縁な２株の従属栄養性珪藻

系統樹を作成した．分生子世代の形態観察では，Shin類の葉緑体ゲノムを比較解析した．その結果，ゲノム& La（1993）の方法により乳酸を用いて乾燥標本から上に存在する遺伝子は２ゲノム間に違いが見られたもの形状復元を行い，分生子，分生子柄，付着器，発芽のの，光合成に関連する遺伝子はほぼ欠失している点

管のサイズ，形状を記録した．閉子のう殻がある場合が共通しており，従属栄養性生物への収斂的ゲノム進

は 3% 水酸化ナトリウム水溶液にマウントし，閉子のう化が観察された．

殻，付属糸，子のう，子のう胞子の数，サイズ，形状− 121 −

IFO Res.Commun. 30
2016等を記録した．

sumensis JCM 12392, L. vini JCM 14280, L. curvatus

結果・考察：東南アジアで採集した熱帯果樹類うどん

NBRC 15884）の運動性を soft agar 法により判定した．

こ病菌の分子系統解析と形態観察を行った結果，ドリ次に 0.1 M リン酸緩衝液に乳酸菌を懸濁し，経時的に

アン，ランブータン，ブーヒニアに寄生するうどんこ

顕鏡し運動性の発現にかかる時間を調査した．また，病菌が同一種であることが明らかになった．既往の研L. ghanensis，L. nagelii，非運動性の L. plantarum NRIC

究から，パラゴムノキ，マンゴー，カンキツ，カシュ

1067 を用い運動性と非運動性細胞の差別化のために遠ーナッツ，アカシア，ベニノキにも同種菌が寄生し，心条件を検討した．これらの結果をもとに分離法を設

また台湾で２種の植物に同種菌が寄生することが報告

定し，ワイン醸造過程中のもろみより運動性乳酸菌のされている．この結果，広範囲の植物科にまたがる11

分離を試みた．

種の熱帯果樹，樹木類に同種うどんこ病菌が寄生し，結果・考察：L. ghanensis， L. mali， L. nagelii， L. sat-

この菌は温帯でコナラ属植物に寄生する Erysiphe quer-

sumensis の４種は soft agar 法で運動性を確認すること

cicola であることがわかった．うどんこ病菌は植物のができた．L. vini は soft agar 法では運動性を確認でき

絶対寄生菌であるため宿主範囲は狭く，宿主範囲は近なかったが，顕鏡下では運動性を確認でき，L. vini の縁な植物に限定されると考えられてきた．今回の結果

運動性は他の菌種と比較して非常に弱いと考えられは熱帯地域ではこのような常識を再考する必要性があた．一方，L. curvatus，L. agilis はいずれの方法でも運ることを示唆している．また，インドネシアおよび日

動性は確認できなかった．

本において未記載種を発見し，Phyllactinia poinsettiae，

リン酸緩衝液に菌体を懸濁し15分後には全ての株でE. baliensis， E. sidae， E. viburni-plicati， E. kissiana お

運動性が認められ，90分後にも持続していた． L. gha-

よび Podosphaera photiniae の６種を新種として記載，

nensis および L. nageli と非運動性の L. plantarum を用発表した．

い遠心分離条件を検討した．700×g・10分間の遠心処
理後の細胞の回収率は運動性乳酸菌で約 54〜57%，L.
plantarum で 50% 以下となり遠心分離により非運動性と運動性乳酸菌の選択分離法の開発とその応用：
運動性乳酸菌の多様性の解析
乙黒美運動性細胞の差別化は低効率だが可能であると考えた．
以上より分離源をリン酸緩衝液に懸濁後 30℃ で１時間保温し，溶液の一部を 700×g・10分間遠心分離して彩

上清を分離培地に塗布する分離法を設定した．本法を山梨大学大学院総合研究部
motoguro@yamanashi.ac.jp

ブドウもろみに適用し運動性乳酸菌の分離を試みたが，得られた分離株はワイン中の主要な乳酸菌である

目的：乳酸菌は運動性を持たないと言われているが，L. brevis が大半を占めた．

近年，運動性乳酸菌の分離例が増加している．しかし

本研究では遠心分離が運動性乳酸菌の分離に利用で運動性を持つ既知種が少ないため運動性と系統の相関きる可能性を示したが，ブドウもろみからは分離できは不明である．本研究では運動性乳酸菌を効率的に分なかった．今後は遠心分離技術と集積培養を組み合わ離できる分離法を構築し，ワイン醸造過程や自然界かせるなど分離頻度を向上させるための検討を進めていく．

ら分離することを目的とした．
方法：対照株として運動性が報告されている Lactobacillus 属７種（L. agilis JCM 1187, L. ghanensis JCM
15611, L. mali NBRC 102159, L. nagelli JCM 12492, L. sat− 122 −IFO Res.Commun. 30
2016

リコン細菌叢解析の結果，どのサンプルにおいても高濃度塩泉水・鹿塩温泉における好塩微生物相の解析
峯岸宏Proteobacteria 門が優占していた．古細菌叢は，Well では Thaumarchaeota 門の Marine Group I が最も多く，明

Pump では Methanomicrobia 綱，Bath ではそのほとん

海洋研究開発機構 深海・地殻内生物圏研究分野
minegishih@jamstec.go.jp

どが Woesearchaeota 門であった．これらの結果より
Well，Pump では中央構造線で発生した断層水素と温目的：長野県下伊那郡大鹿村にある鹿塩温泉は，無機

泉中の炭酸カルシウムが固体として沈殿するときに生塩類の違いはあるが，その塩分濃度は海水とほぼ同等

ずる二酸化炭素からメタン菌がメタン生成を行い，さから２倍程度の塩泉である．その由来はスラブ起源のらに生成されたメタンを資化する細菌が優占したとい

熱水ではないかと推定されている．しかしながら，そう図式が考えられた．クローン解析においてもほぼ同の起源は未だ謎に包まれており，また微生物叢解析の様の結果が得られた．マリンブロス2216培地による分報告も皆無である．そこで本研究では，鹿塩温泉にお離では，塩濃度 15% で増殖できる中度好塩菌の分離にける微生物多様性を理解するために網羅的なアプロー成功した．これら分離株の 16S rRNA 遺伝子塩基配列チを行った．

を解析した結果，海洋性細菌が多く分離できているこ

方法：本研究では鹿塩温泉湯元・山塩館の協力の下，とが分かった．海洋から遠く離れた南アルプスに囲ま

山塩館側の手押しポンプ（Well）と風呂場吐水口（Bath），

れた場所から海洋性細菌が分離できたことは非常に興塩川対岸からの自動ポンプ（Pump）による３カ所か味深い． 現代の海水がこのような場所に染みこんでくら採水した．採取したサンプルに関して温泉成分のガることはないと考えられるので，このような海洋性細ス・化学組成解析，水素酸素同位体比解析を行った．

菌は太古の昔に断層の隙間に綴じ込まれたものが，現また微生物叢の確認は，各種培地による直接分離，ク代の環境に適応して生き残ったとも考えられる．また，

ローン解析（PCR 増幅した DNA 断片を挿入したプラ

分離株の中には既知種との相同性が低く，非常に新規

スミドを大腸菌に形質転換し，得られたプラスミド性が高い株も存在し，これらは鹿塩温泉に特有なもの

DNA 中の 16SrRNA 遺伝子配列を解析：約 1500 bp）おと考えられた．

よび次世代シークエンサーによるメタ 16S rRNA 遺伝
子解析（試料から抽出した微生物 DNA にプローブを温泉に生育する真菌の分離培養方法の確立と系統分類および二次代謝産物生産能の解析

付加し塩基配列を解読：約 350 bp）を行った．
結果・考察：サンプル時における温度は各サンプルと内

も 12℃ 付近であり，pH は 7.5 付近であった．特筆すべ

田

龍

児

北里大学薬学部
uchidar@pharm.kitasato-u.sc.jp

きはリチウムイオン濃度が高いことであり，これは鹿塩温泉の起源が熱水であった可能性を示している．さらに水素・酸素同位体比を測定した結果，鹿塩温泉の目的：真菌は有用な微生物資源の一つであり，医薬品

由来は化石海水およびマグマ水ではないことが示唆さをはじめとする様々な生物活性物質の探索源として利れた．また，各サイトの比率は天水線から離れていた用されている．地球上に生息する真菌は 150 万種と推ため，天水の混入は少なく純粋な温泉水であることが定されているが，実際の発見数はその約 5% と僅かで未示唆された．温泉ガス分析の結果，鹿塩温泉は各採水

開拓な真菌が殆どである．そこで本研究では，真菌のサイトいずれもメタンが非常に多いことが分かった．

新たな分離源を開拓し，新規生物活性物質の発見に繋次世代シークエンサーによる 16S rRNA 遺伝子アンプげることを目的とし，これまでに分離報告例が少なく− 123 −

IFO Res.Commun. 30
2016

日本に数多く分布する温泉（硫黄泉）に着目して真菌たものは６株（9%）と少なかった．このことは真菌のの分離およびその二次代謝産物の解析を試みた.

分離時と異なり，二次代謝産物の生産には湯の花が必方法：まず，硫黄泉を模倣するために湯の花を用いた要成分でない可能性を示唆している．さらに Penicil-

分離方法を検討した．箱根大湧谷，霧島硫黄谷およびlium adametzii BF-0003 株 が 生 産 す る 新 規 抗 酸 化 剤

登別地獄谷の源泉の高温噴出口から採取した土壌の懸pyranonigrin L および Aspergillus nidulans BF-0142 株が濁液を，酸性度（pH 3 および６）および湯の花の添加生産する新規物質 helvafuranone の発見に繋げること

量（終濃度 0.2 および 2.0 mg/mL）の異なる４種類のに 成 功 し （ 論 文 投 稿 中 ）， 現 在 ， Acidomyces 属 ，分離培地に塗布した．これを 27℃ および 40℃ で２週

Ochoroconis 属および Acrodontium 属等の温泉特有真菌間培養し，生育した真菌を釣菌した．また，分離株にの二次代謝産物の解析を継続している．以上の結果よ

ついて，D1/D2 26S rDNA 領域の塩基配列に基づく遺り，温泉は未利用な真菌を取得できる有効な分離源と伝子の相同性検索により属種の推定を行った．次に分して十分期待され，硫黄泉以外の源泉に生育する真菌離株の二次代謝産物の生産性を調べるために，湯の花にも興味がもたれる．

添加および無添加の培地を用いた生産培養を行い，その EtOH 抽出液を HPLC（ODS カラム）で分析した．

ダイズ根粒菌の生態学的特性と環境因子による群集構造の構築および亜酸化窒素発生抑制に関する研究

また，抽出液の生物活性（抗菌活性および細胞毒性）についても測定した．さらに所属研究室で試験できる10項目の生物活性のスクリーニング系にも供した．

佐

伯

雄

一

結果・考察：分離方法の検討においては，湯の花：
宮崎大学農学部
yt-saeki@cc.miyazaki-u.ac.jp

2.0 mg/mL（終濃度），酸性度：pH 3，培養温度：27℃
で良好にコロニーが生育し，これを硫黄泉からの分離方法として確立した．この方法を用い，３箇所の硫黄

目的：ダイズ根粒菌は，ゲノム多型からいくつかのタ

泉土壌から66株（12属）の真菌を取得し，その内訳はイプに分類され，その地理的分布において緯度に沿っ

Acidomyces 属が全体の 38% を占め，次いで Penicillium

たニッチを示す．さらに，水田転換畑において特定の属（24%），Aspergillus 属および Ochoroconis 属（共に 4.5%）

ゲノムタイプの根粒菌の優占性が観察される．この根の順で得られた．この内訳は日本本土の一般土壌

粒菌は Bradyrhizobium japonicum USDA110 クラスター（Penicillium 属：24%，Trichoderma 属：8.1%，Fusar-に属する菌株群で，窒素固定能が高く有用根粒菌としium 属：5.2%，Aspergillus 属：2.9% の順）とは異なり，て農業利用が期待されている．さらに，USDA110 クラ

中でも Acidomyces 属，Ochoroconis 属および Acrodon-

スター株の多くは，完全脱窒能を有し，亜酸化窒素

tium 属（1.5%）などは一般土壌では分離されていない（N2O）を放出せずに窒素まで還元する能力を有する．

真菌だった．次に，二次代謝産物の生産性およびその近年，不完全脱窒能を示す根粒菌の共生に伴うダイズ

生物活性を解析した結果，湯の花を添加した生産培地

根圏からの N2O 放出が問題視されており，有用根粒菌

で ， Penicillium 属 （ ４ 株 ）， Acidomyces 属 （ ２ 株 ），の根粒占有率を高めることの重要性が認識されていLecythophora 属（１株）および未同定株（１株）の計る．本研究では，転換畑土壌に完全脱窒能を示す根粒８株（12%）で，二次代謝産物の生産性に於いて顕著菌が優占していることに着目し，環境因子として温度な変化を示した．また生物活性については66株中26株と湛水状態および nosZ 遺伝子の有無が，根粒菌群集（39%：８株が未同定真菌）の培養液が生物活性を示し，構造に及ぼす影響を解析し，根粒菌の生態的特性と機その中で湯の花を添加した培地でのみ生物活性を示し能を利用した根粒菌群集の人為的コントロールの可能− 124 −

IFO Res.Commun. 30
2016

性を検討した．

嫌気的湖沼環境に潜む菌類様初期真核微生物群の多様性解明と培養への挑戦

方 法 ： 滅 菌 土 壌 （ 黒 ボ ク 土 ・ 灰 色 低 地 土 ） に ， B.
japonicum USDA110 野生（wt）株と，完全脱窒能に必長

要な N2O 還元酵素遺伝子である nosZ 遺伝子を破壊し

濱

統

彦

ノートルダム清心女子大学人間生活学部
mail:nghm@post.ndsu.ac.jp

た B. japonicum USDA110ΔnosZ 株，および土着根粒菌の代表株として B. japonicum USDA6 株（N2O 発生型），
B. japonicum USDA123 株 （ 非 脱 窒 型 ）， B. elkanii

目的：深海，湖底堆積物などの嫌気的環境においては，

USDA76 株（NO2-生成型）を混和してマイクロコズム

クリプト菌門（Cryptomycota，Rozellomycota）やそれ土壌を調製した．土壌水分を好気的条件と湛水条件にらを含むAphelids - Rozella - Microsporidia（ARM）クレ

調整したマイクロコズムを，三段階の培養温度（20，25，ードなど，難培養性の原始的系統群が優占菌類として30℃ ） で 30− 60 日 間 共 存 培 養 し た ． 土 壌 か ら 環 境

現れることがある．これらの国内湖沼堆積物におけるDNA を抽出し，根粒菌の 16S-23S rRNA 遺伝子 ITS 領

遺伝的多様性と地理学的分布の解明を通じて，分離培

域の多型を利用した変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法に養に向けての知見の蓄積を試みた．

よって各菌株の優占度を評価し，完全脱窒能の有無と方法：西日本の10湖沼 [赤湖（兵庫県），岡山県総合グ

土壌の温度・酸化還元状態が根粒菌群集構造に及ぼす

ラウンド池（岡山県），藤波池（岡山県），大芦池（岡影響を解析した．また，リアルタイム PCR によって根山県），東郷池（鳥取県），常盤池（山口県），豊田湖

粒形成遺伝子発現の温度依存性を解析した．

（山口県），小田の池（大分県），志高湖（大分県），御結果・考察：B. japonicum USDA110wt 株は土壌の種類

池（宮崎県）] において，エクマン・バージ採泥器もしにかかわらず湛水条件下において優占化したが，好気

くは柱状採泥器を用いて，堆積物のサンプリングを実的 条 件 に お け る 優 占 化 は 認 め ら れ ず ， USDA6 株 や施した．一部のサンプルについては，培地，松花粉，

USDA76 株が優占化した．また，USDA123 株は好気的

バルサ材による集積培養を試みた．サンプルは直接観かつ低温環境下で優占化する傾向が認められた．

察すると同時に，速やかに凍結し，ISOIL for Beads

USDA110ΔnosZ 株は何れの条件でも優占化は認められ

Beating（Nippon Gene）を用いて，核酸の抽出を行っなかった．リアルタイム PCR による根粒形成遺伝子発た．抽出した核酸を基に，菌類を特異的に増幅する

現の温度依存性解析の結果，B. elkanii は高温で強く発

PCR プライマー（nu-SSU-817, nu-SSU-1536）を用いて，現し，B. japonicum は中温において強い発現が認めら小サブユニット rRNA（SSU rDNA）遺伝子約 750 塩基れた．しかしながら，北日本で優占する USDA123 株を増幅した．加えて，大サブユニット rRNA（LSU rDNA）

は低温において強い発現を示した．これらの根粒菌群

遺伝子を増幅するプライマー（12組）の評価を行った．

集構造の環境因子依存的遷移は土着根粒菌の地理的分

さらに，10湖沼において最も普遍的に出現した ARM

布と一致していた．主成分分析の結果，根粒菌群集構系統に特異的な PCR プライマーをデザインし，その有造に影響を及ぼす環境因子は，まず湛水条件，次いで効性を評価した．増幅産物は，精製後 pTAKN-2 プラ

温度が挙げられた．以上の結果より，nosZ 遺伝子を有スミド（BioDynamics）に組み込み，形質転換後，各する有用根粒菌の土着化に関して，土壌の湛水処理にクローン配列をサンガーシーケンシングにより決定しよる完全脱窒能の発現によって高窒素固定能を有し亜た．決定した DNA 配列は，代表的な菌類系統，およ酸化窒素を放出しない有用根粒菌を人為的に優占化さび Blast による近縁配列と共に webPRANK を用いて整せ得る土壌管理技術開発の可能性が示唆された．

列され，gBLOCK により配列を抽出，TOPALi に含まれている PhyML および MrBayes を用いて，BIC 基準− 125 −

IFO Res.Commun. 30
2016による最適進化モデルに基づく最尤樹および各配列のトが形成されている．バイオマットを構成する微生物

系統分類学的位置が推定された．

種は進化系統樹の始原生物に系統的に近いことが報告

結果・考察：サンプリングを行った堆積物の全てからされており，初期生態系のモダンアナログといえる．

菌類 SSU rDNA の特異的増幅が確認され，その全てか

バイオマット生態系が安定に形成される過程においら ARM クレードは検出された．一方，菌類外真核生て，どのような環境変動が，どのような微生物種の繁物の混入は数％であった．環境サンプルを用いて既知栄を促し，どのような物質代謝を獲得することで，安の菌類共通 LSU rDNA プライマー（LR3, LR5, LR6, LR7，

定化するのかは明らかになっていない．そこで本研究

Vilgalys lab. webpage より）による PCR クローンの菌では，バイオマット中微生物群集がバイオマスの形成

類多様性を評価したところ，LR7 は ARM クレードをにどのように寄与しているのか，メタゲノム解析及び効率よく増幅するが，LR3，LR5，LR6 は，ほぼ増幅し脂質脂肪酸の炭素, 水素同位体比解析（δ13CFA・δ2HFA）ないことが明らかになった．ARM クレードの割合は，による定量を試みた．

全菌類中平均約３割であり，各湖沼の間で 3%〜78% と方法：水温の影響をみるため，中房温泉湯川の異なる

大きく変動していた．うち１割ほどが複数の淡水湖沼

水温域（63−77℃）で形成される特徴的なバイオマッに共通して表れていた．そのうち，最も普遍的なトを分析した．次に，層状バイオマット形成過程を追ARM 系統を検出する PCR プライマーを作成し，特異うため，55℃ における層状バイオマットを引き剥がし，的検出を確認した．加えて，湖沼堆積物コアの鉛直分

1，9，13，35日後に形成されたバイオマットを 1 mm

布を調べたところ，表層と 5 cm 以深の間で，ARM ク

層毎に分析を行った．メタゲノム解析では微生物相とレードの出現割合にはそれほど大きな変化は見られな

炭素固定回路毎（カルビン，還元的 TCA，3-ヒドロキ

かった．一方，ARM クレードの菌類多様性を見ると，

シプロピオン酸（3-HP），還元的アセチル CoA）の鍵

表層とそれ以外の間で大きな質的変化が見られ，5 cm

酵素について解析した．δ13CFA・δ2HFA 解析に関して，以深に特異的に現れる新規 ARM 系統群も確認された．

主な構成微生物が生成する脂肪酸種及び代謝毎の同位

また，東郷池サンプルを用いて，培地や木材を用いた体比分布を先行研究からまとめ，バイオマスへの各微集積培養を行ったところ，木材中にも ARM クレード

生物・各代謝の寄与率を計算した．

は増殖していることが確認された．ARM クレードの結果・考察：異なる水温域におけるバイオマットの何

一部は，プランクトン寄生性のみならず，陸上植物な

れかで 0.1% 以上占める細菌は好熱性細菌を中心に８門

どの難分解物質の分解にも関与している可能性を見出16属であった．炭素固定回路の鍵酵素について，カルした．

ビン回路は Cyanobacteria，還元的 TCA 回路は Aquificae，3-HP 回路は Chloroflexi，還元的アセチル CoA 経
路は Thermodesulfobacteria から検出された．各微生物

メタゲノム解析及び生元素の安定同位体
解析を用いた温泉バイオマットにおける微生物群集構造と代謝の化学的特徴付け
中川で特徴的に多く生成する脂肪酸種とδ13CFA・δ2HFA 値分
布から 75℃ 以上では化学合成独立栄養がバイオマス有機 物 生 成 に 関 し て 優 占 し て お り ， 水 温 が 75℃ か ら

麻悠子

63℃ へ下がるとともに光合成独立栄養による寄与が大東京工業大学環境エネルギー協創教育院，
現 東京工業大学地球生命研究所
nakagawa.m.ae@m.titech.ac.jp

きくなった．また，55℃ における層構造バイオマット
に関してはまず Chloroflexi が優占した緑色の光合成マ

目的：長野県中房温泉から流れた湯川では，水温，光ットが生成し，９日後，その下に Firmicutes などの従

環境，溶存酸素濃度が変化し，異なる色のバイオマッ

属栄養細菌マットが形成された．１ヶ月後，表層の緑− 126 −

IFO Res.Commun. 30
2016

色マットは脂肪酸種とδ13CFA 値が増加したことから従の内，MS1 株と MS2 株の PD 寒天プレートからメロ

属栄養細菌が加わり多様性が増したことが示唆されン様香が認められた．MS1 株と MS2 株の培養液気相た．更に Deinococcus/Thermus などの従属栄養細菌を部をガスクロマトグラフィーによって分析した結果，中心とした従属栄養的な中層マットが形成された．本

メロン香の４つの主成分である 3,6-ノナジエン-1-オー

研究では複雑な微生物生態系に対しゲノム解析と同位ル等を産生していることが推定された．更に 26S rRNA体比解析を併用することで，独立的にも従属的にも生遺伝子 D1/D2 領域及び ITS 領域の塩基配列を解析し息可能な微生物がどちらの栄養段階で寄与しているかて分子系統樹を作成した結果，MS1 株と MS2 株は Ge-を示すことができた．

otrichum candidum に近縁であった．両株は特に，G.
candidum のチーズ製造スターター酵母株と ITS 領域塩基配列の相同性が高いことが分かった．
MS1 株と MS2 株が，メロン様香を発するのは何ら

海洋性菌類の生態に関する研究
澤山

茂

かの誘引物質である可能性が考えられる．MS1 株と樹

MS2 株 は，特に運動性は認められないことから，メ

京都大学大学院農学研究科
sawayama@kais.kyoto-u.ac.jp

ロン様香が有性生殖に関連しているとは考えにくく，生理・生態学的な働きについては今後の研究の進展が目的：菌類は，エタノール発酵やセルラーゼ等の酵素期待される．芳香産生を生かした何らかの形での産業

生産微生物として，広く産業利用されている．通常菌利用が想定できることから，理化学研究所バイオリソ類の分離源としては，土壌等の陸上域が多く，水圏特ースセンターに MS1 株（JCM 31318）の寄託を行った．

に海洋域での分離・研究例は比較的少ない．海洋では，また，ナンキョクオキアミ排泄物からは，Trichosporon

塩分濃度が高いことと比較的嫌気性になりやすいこと

属酵母株が比較的多く単離された．

が，分離例が少ない原因と考えられる．そこで本研究では，海洋環境から広義の海洋性菌類を分離し，その上部消化管内優勢乳酸桿菌種のペプチド要求性に関する研究

性状・特性等を解析することにより，単離した海洋性菌類についてその生態や産業利用の可能性に関する知

荒

川

健

佑

見を得ることを目的とした．
岡山大学大学院環境生命科学研究科
karakawa@okayama-u.ac.jp

方法：舞鶴湾（京都府）の海底堆積物表層サンプル，
竹原市海岸の潮間帯木片等，ナンキョクオキアミ排泄物を採取し，PD 寒天プレートを用いて菌類様コロニ

目的：ヒト小腸内優勢の乳酸桿菌 Lactobacillus gasseri

ーを単離した．単離したコロニーから DNA を精製し，（以下 L. gasseri とする）は，様々な保健機能が知られPCR 法・Dye Terminator 法を用いて，18S rRNA 遺伝

る有用なプロバイオティクスであるが，乳などの食品

子，23S rRNA 遺伝子 D1/D2 領域，ITS 領域の塩基配素材中で良好に生育しないことから，その利用性は制列を解析した．メロン香の分析は，バイアルで培養し限されている．本研究では，L. gasseri のペプチド要求

た気層について，ガスクロマトグラフィーを用いて標性を明らかにし，乳中で生育可能な培養法（発酵乳製

準物質と比較することで行った．

造法）の確立を試みた．

結果・考察：舞鶴サンプルから16株，竹原サンプルか

方法：窒素源を除いた MRS 培地成分にカゼイン（乳ら３株，ナンキョクオキアミサンプルから16株の菌類

タンパク質），トリプトン（酵素分解カゼイン；ペプ様コロニーを単離した．舞鶴サンプルから単離した株

チド混合物）およびカザミノ酸（酸分解物カゼイン；− 127 −

IFO Res.Commun. 30
2016

遊離アミノ酸混合物）をそれぞれ添加し，各培地中でく，他の L. gasseri４菌株に対しても認められた．

の L. gasseri３菌株の生育度を測定した．また，還元脱L. gasseri 基準株の乳中生育性を向上させる共培養乳

脂乳をベースとした同様の試験を行い，同菌種のペプ酸球菌として，Lactococcus lactis subsp. lactis 4B254 お

チド要求性を評価した．

よび Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum OR-1

次いで，L. gasseri を用いた発酵乳製造に向けて，発酵基材のプロテアーゼ処理の有効性を以下のようにしを選抜した．両共培養菌株は，基準株だけでなく，他の L. gasseri 菌株の乳中生育も促進した．

て評価した．還元脱脂乳を食品利用可能な７種のプロ

以上，本研究では，L. gasseri のペプチド要求性を明

テアーゼ（ペプシン，トリプシン，α-キモトリプシン，

らかにし，ペプチド添加に頼らない L. gasseri 発酵乳製

レンネット，フィシン，ブロメライン，パパイン）で造法として，発酵基材のプロテアーゼ処理法および乳処理し，各プロテアーゼ処理乳中での L. gasseri 基準株

酸球菌との共培養法を確立した．

の生育度を測定した．ペプシンによる処理は他の乳素
材（全乳，ヒト母乳，還元チーズホエー，酸ホエー培

中枢代謝，ATP 生産能，蛋白質発現量を強化した微生物宿主による
有用ポリケタイドの発酵生産

地，カゼイン培地）についても行い，同様に基準株の生育度測定を行った．また，ペプシン処理全乳における生育度試験は，他の L. gasseri４菌株に対しても実施

鮒

信

学

した．
静岡県立大学食品栄養科学部
funa@u-shizuoka-ken.ac.jp

乳素材のプロテアーゼ処理とは異なる L. gasseri 発酵
乳製造法として，乳酸球菌との乳中共培養を試みた．
まず，当研究室保有の乳酸球菌59菌株から，37℃ 共培

目的：本研究では，生命にとって必須である脂肪酸合

養下で L. gasseri 基準株の乳中生育を促進する菌株を選成酵素（FAS）を阻害することにより，マロニル-CoA

抜・同定した．次に，選抜菌株を他の L. gasseri４菌株の代謝プールを増強し，二次代謝産物の生産に適したとの乳中共培養試験に供し，L. gasseri 発酵乳製造に向Escherichia coli（大腸菌）の宿主を開発する．

けた選抜菌株との共培養法の有用性を評価した．

方法：FAS の阻害は，FabB/F を阻害するセルレニン

結果：供試 L. gasseri３菌株はいずれも，トリプトンをを用いた．また，λRed recombinase および Cre/loxP

添加することにより，窒素源を除いた MRS 培地およを用い，大腸菌の FAS 遺伝子 fabH， fabF， fabB の in-

び還元脱脂乳で良好に生育したが，カゼインもしくはframe mutant を作製した．また，fabB/fabH，fabH/fabF

カザミノ酸の添加ではほとんど生育しなかった．本結の二重破壊株も作製した．アセチル-CoAおよびマロニ

果により，L. gasseri は窒素源としてタンパク質や遊離ル-CoA 量は LC-MS を用い定量した．また，マロニル-

アミノ酸ではなく，ペプチドを要求することが明らか

CoA 量は III 型 PKS・RppA およびモノオキシゲナーゼとなった．

MomA によりフラビオリンに変換し，定量した．遺伝L. gasseri のペプチド要求性が示されたことから，そ子の転写量は RT-PCR により，解析した．

の生育度に与える乳素材のプロテアーゼ処理の影響を結果・考察：脂肪酸はマロニル-CoA を前駆体として脂試験したところ，レンネットを除く６種のプロテアー

肪酸合成酵素により合成される．大腸菌の脂肪酸生合

ゼ処理によって基準株の乳中生育度は向上した．特に，成経路において FabH，FabF，FabB はマロニル-CoA

ペプシン処理の影響は顕著で，還元脱脂乳だけでなく，を消費する酵素である．6.3μg/ml のセルレニンの投

他の乳素材においても同様に高い生育促進効果が見ら

与により，103μg/ml のフラビオリンが蓄積した．以れた．また，ペプシン処理の効果は，基準株だけでな

上より，脂肪酸合成酵素を阻害すると，ポリケタイド− 128 −

IFO Res.Commun. 30
2016

るものの，その多様性については検討されていなかっの生産量が増えることが明らかになった．
fabB/fabH 破壊株において 113μg/ml と親株と比較た．特に ATP 濃度は細胞のエネルギー状態を規定し，して37倍のフラビオリンを生産していることが判明し様々な代謝経路に作用して，その流量を制御している

た．細胞内アセチル-CoA およびマロニル-CoA を定量ため，非常に重要なパラメータであると考えられる．

した結果，fabH/fabF 破壊株においてアセチル-CoA，

本研究では，バクテリア内 ATP 濃度を個々の細胞ごと

マロニル-CoA の生体内量は親株と比較してそれぞれ６に決定する技術を確立し，その技術を用いて ATP 濃度倍，45倍であった．

と増殖の関係を明らかにすることを目指した．

FadR は脂肪酸の生合成を正に制御する制御因子で方法：ATP 結合タンパク質である枯草菌 ATP 合成酵

ある．FAS 破壊株では親株と比較して FadR の転写量

素εサブユニットの N 末端側 107 アミノ酸残基と C 末が顕著に増加していた．実際，FAS 破壊株では親株と端側24アミノ酸残基の間に，円順列変異 GFP を融合さ比較して FAS 遺伝子の転写量が増加していた．FadR

せた人工タンパク質を作成した．εサブユニットと円は，アセチル-CoA カルボキシラーゼ（AccABCD）と順列変異 GFP を繋ぐリンカーを検討し，ATP 結合にグリオキシル酸回路の負の転写因子 IclR の転写も活性より蛍光励起スペクトルが大きく変化するクローンを化する．実際，FAS 破壊株では親株と比較して Ac-

選抜し「QUEEN」と名付けた．QUEEN は 405 nm とcABCD，IclR の転写量が増加していた．IclR の転写量

490 nm に２つの励起ピーク，510 nm に蛍光ピークをの増加に伴い，グリオキシル酸回路の AceA，AceB の有しており，ATP 濃度が上昇するに従って 490 nm の転写量は減少していた．AceA，AceB はアセチル-CoA

励起ピークが低下し，逆に 405 nm の励起ピークが上を消費する酵素であるため，これらの転写量が減じた

昇した．すなわち，490 nm で励起した場合と，405 nm

ことがアセチル-CoA 量が増えた理由であると考えられで励起した場合の 510 nm における蛍光強度の比を求る．また，AccABCD はアセチル-CoA からマロニル-

めることで ATP 濃度を見積もることが可能であること

CoA の合成を触媒する酵素であるため，マロニル-CoAが示された．QUEEN を発現する大腸菌の解析から，量が増えたと考えられる．

QUEEN の蛍光シグナルは増殖速度に非依存的である
こと，そして QUEEN の蛍光シグナルから高い定量性で細胞内 ATP 濃度を算出できることが示された．次に，単一バクテリア内 ATP の絶対濃度計測法によるエネルギー代謝と増殖の解析
今村博

QUEEN を発現する大腸菌をイメージングすることに
よって大腸菌内 ATP の絶対濃度を個々の細胞ごとに決定することに成功した．その結果，全く同一のゲノム臣を持つ大腸菌を同一環境で培養した場合であっても，京都大学白眉センター，
現 京都大学大学院生命科学研究科
imamura@lif.kyoto-u.ac.jp

細胞集団における実際の ATP 濃度の分布は大きな広がりを持ち，かつ正規分布をとらないことが明らかとな目的：近年の研究から，遺伝的に同一な細胞集団であった．ATP 濃度と細胞増殖の関係を調べたところ，興っても個々の細胞内部の mRNA やタンパク質の数は驚

味深いことに，ATP 濃度が高い細胞より，平均に近い

くほど多様である事がわかって来た．このような確率ATP 濃度を持つ細胞が最も増殖が速いという現象が観的な振る舞いに基づいた多様性は，個々の細胞を異な察された．

る戦略に導き，集団としてのリスクを減らしていると

考察：QUEEN を用いた ATP イメージング技術によっ考えられている．一方，細胞の代謝物については，そて，単一細胞レベルでエネルギー代謝を議論する道がの濃度が細胞の振る舞いを大きく左右すると想定され開けた．集団の平均を解析する従来法では調べること− 129 −

IFO Res.Commun. 30
2016が困難な，休眠細胞などのエネルギー代謝を解析する化を測定したところ，フリーの CoA の濃度が一過的に手法として非常に有効であると考えられる．

上昇していることが観察された．その一方で pta 欠損株においては CoA 類の総量は野生株と同等であるものの，フリーの CoA の濃度の上昇は観察されなかった．

大腸菌におけるメタボリックスイッチ
制御機構の解明島田友

そこで，pta 欠損株において CoA の前駆体であるパン
トテン酸を添加したところ，増殖の停滞が部分的に回裕復した．さらに，解糖系および TCA cycle 上の各酵素

東京工業大学資源化学研究所
tshimada@res.titech.ac.jpの遺伝子発現を誘導した影響を観察したところ，Pyruvate dehydrogenase（PDH）または 2-Oxoglutarate De-

目的：代謝系は全ての生物に普遍性が高く，自在にそhydrogenase（OGDH）の特定のサブユニットを過剰の流れを変えながら，様々な局面で重要な生命現象を発現させることで pta 欠損株における増殖の停滞が部引き起こしている．しかし，代謝制御に関わる知見が分的に回復した．そこで，これら二つの酵素の活性を蓄積した今日でも，代謝フローの方向性を細胞が操る

経時的に測定したところ，野生株では Metabolic Tran-

機構は明確でなく，任意の人為操作が可能となる目処

sition Phase を境に PDH 活性が低下し，OGDH 活性がも立っていない．そこで，研究の背景となる情報に富上昇していたが，pta 欠損株においては PDH 活性が低んだ大腸菌を材料とし，代謝フローの転換を引き起こ

下しない一方で，OGDH 活性が増殖停滞の間に著しくす分子機構の「枠組み」を明らかにすることを目的と上昇していた．これらの事から PDH に対する OGDH

して研究を行った．

の活性比が一定以上になることが Glycolysis Phase か

方法：グルコースを主要な炭素源とした最小培地での

ら TCA cycle/Gluconeogenesis Phase への遷移を規定しバッチ培養系を用いて，炭素源代謝ステートがグルコている事が示唆された．

ース酸化により解糖系を中心にエネルギーを獲得する

本研究から，Glycolysis phase から TCA cycle/Gluco-

代謝ステート（Glycolysis Phase）から，酢酸やアミノ

neogenesis Phase への遷移にはフリーの CoA の生産，酸を利用して TCA cycle 中心にエネルギーを獲得し，

お よ び ， PDH/OGDH 活 性 比 を 切 り 替 え る た め の糖新生を行う代謝ステート（TCA cycle/Gluconeogene-

Metabolic Transition Phase が存在する事が示唆された．

sis Phase）へと順次遷移していく実験系を確立した．
その際の中間代謝産物の細胞内濃度を測定した．さらシロアリ消化管内共生バクテリアによる木質分解機構に，代謝経路の活性の遷移に関与する遺伝子の同定を試みた．

徳

結果・考察：Acetyl-CoA を酢酸へ変換する Acetate ex-

田岳

琉球大学熱帯生物圏研究センター
tokuda@comb.u-ryukyu.ac.jp

cretion pathway を構成する Phosphate acetyltransferase（pta）または Acetate kinase（ackA）を欠損させると，Glycolysis Phase から TCA cycle/Gluconeogenesis Phase

目的：系統的に下等なシロアリ類の消化管内では，共への切り替える際に，細胞増殖が著しく停滞すること

生原生生物が木質分解に主要な働きを示すことが知らが観察された．この事から，Acetate excretion pathway

れているが，高等シロアリでは腸内に分布する共生バを利用した代謝を切り替えるための遷移期（Metabolic

クテリアが木質分解に関与することが示唆されていTransition Phase）が存在する事が示唆された．また，る．しかし，木質分解に関わる酵素はメタゲノム解析

その際の野生株における細胞内中間代謝産物の濃度変によって断片的に明らかになっているだけで，高等シ− 130 −

IFO Res.Commun. 30
2016

ロアリにおける木質分解のメカニズムはほとんど明らを構成する発現遺伝子群のうち３つの遺伝子のみで総かになっていない．本研究ではシロアリ腸内で木質分

発 現 量 の 60％ を 占 め て お り ， CBM（ Carbohydrate-

解に関わるバクテリア叢を単離し，その種類と遺伝子

binding Module）36に属するキシラン結合ドメインを情報を網羅的に解析することによって，有用な微生物有していた．今後，これらのヘミセルロース分解酵素

遺伝子資源を取得することを目的とした．

の機能解析を実施していくことで，効率的なヘミセル

方法：本研究では西表島よりタカサゴシロアリ（Nasu-

ロース分解系の構築の足がかりとなることが期待される．

titermes takasagoensis）を採集し，後腸膨大部より腸内容物を回収した．Percoll 密度勾配遠心によって木片付微生物による有機物の化学エネルギーから
電気エネルギーへの変換能力解明に向けた基礎的研究

着バクテリア叢のみを精製し，抽出した DNA を用いて HiSeq2000 による 16S rDNA およびメタゲノム解析を実施した．さらに同様の方法で調製したバクテリア

井より抽出した RNA を用い，３つの独立したサンプル

上

謙

吾

宮崎大学農学部
kinoue@cc.miyazaki-u.ac.jp

についてメタトランスクリプトーム解析を併せて実施
した．
結果・考察：16S rDNA によるバクテリア叢の解析を目的：鉄還元菌による高効率な細胞外電子伝達に必須

行 っ た 結 果 ， Fibrobacteres（ 全 体 の 約 40％ ） お よ び

な最小単位の遺伝子セットを解明する．

Spirochaetes（全体の約 44％）が主に認められた．それ

方法：鉄還元菌 Geobacter sulfurreducens PCA 株は有機らに次いで，TG3 門に属するバクテリアも比較的多く

物分解によって細胞内に生じた電子を細胞外に存在す（約 7％）認められた．メタゲノム解析の結果，約2100

る酸化鉄や電極などの電子受容体へ伝達する能力を持

万のペアドエンドリードから，12万７千個のコンティ

つ．本株は発電時に c 型シトクロム（OmcZ など）をグを得た．得られた遺伝子配列のうち，全体の 2.3％

細胞外へ分泌する．

が糖代謝関連酵素遺伝子であった．BLAST サーチによPCA 株ゲノム内には２つの II 型分泌系遺伝子群が存り1552個の糖質加水分解酵素遺伝子が見つかり，これ在する．それぞれの II 型分泌系遺伝子における機能にらのうち 1/3 がセルロース分解に寄与する遺伝子であ必須な遺伝子を破壊した株，gspCDEF 遺伝子破壊株，ると推定され，1/3 がヘミセルロース分解に関与する

oxpG 破壊株について，その全生産タンパク質と分泌タと想定された．さらにメタトランスクリプトーム解析

ンパク質のプロファイルを SDS-PAGE に続くヘム染の結果，各サンプルあたり約13万個の転写物が得られ

色，抗 OmcZ 抗体を用いたウエスタンブロッティング

た．このうち明らかにタンパク質をコードしている12解析を行った．また，それぞれの破壊株について微生

万個について dbCAN による糖代謝関連酵素遺伝子の物燃料電池での発電能力について調べた．

同定を試みた結果，2661個（全体の 2.2％）が糖代謝関

OmcZ は微生物燃料電池での発電に必須な c 型シト連酵素遺伝子の転写物であると推定された．これら転クロムである．OmcZ は 50 kDa と 30 kDa の大小二つ

写物の発現レベル（FPKM）について検討したところ，の サ イ ズ で 存 在 す る （ そ れ ぞ れ OmcZL， OmcZS）．

興味深いことに GH11 に属する遺伝子群の転写レベル

OmcZ 遺伝子の下流にあるズブチリシン様プロテアー

が全体の約 40％ を占めていた．GH11 はヘミセルロー

ゼ（Ozp）の遺伝子破壊株を作製し，生産されるタンスの主要成分であるキシランを分解する酵素（キシラ

パク質を解析し，微生物燃料電池での発電能力を調べ

ナーゼ：EC 3.2.1.8）を含むファミリーとして知られてた．また，Ozp を過剰発現する大腸菌を作製し，再構いる．さらに興味深いことに，GH11 のキシラナーゼ

成系での OmcZL に対する切断活性を調べた．

− 131 −

IFO Res.Commun. 30
2016

著者らが分離した新規分離発電株 YM18 株につい

剰な PAR 化が引き起こされ細胞死が誘導される．これて，全ゲノムを決定し，既報の発電株 G. sulfurreducens

は，過剰な PAR の合成に大量の NAD＋ を使用すること

PCA 株，KN400 株との比較ゲノム解析を行った．

で NAD＋ が枯渇するため，ATP の生成が抑制され細胞

結果・考察：gspCDEF 破壊株は生産タンパク質につい死を引き起こすと考えられている．また，NAD＋ を基ては，野生株と変化は見られなかったが，発電能力は質にすることから，PAR の合成および分解は，細胞内失われていた．一方，oxpG 遺伝子破壊株については，のレドックスと密接に関係していることが考えられ

OmcZS の生産量が著しく低下し，発電能力も失われてた．さらに，PARP による PAR 化のターゲットタンパ

いた．これらのことから，gsp 遺伝子は c 型シトクロ

ク質は主に核内に存在しており，ヒストンもターゲッ

ム以外の発電に関わる何らかのタンパク質の分泌に関トであることから，PAR 化によるエピジェネティック

わること，oxpG は OmcZ の細胞外分泌に関わる遺伝な遺伝子発現の制御が存在していることも考えられ子であることが示唆された．

た．しかしながら，糸状菌 Aspergillus nidulans のゲノ

ozp 遺伝子破壊株は，OmcZS を全く生産せず，発電

ム中には parp の ortholog が１つ存在するが，酵母お能力を失っていた．また，Ozp を過剰発現する大腸菌

よび A. nidulans を含む糸状菌のゲノムの中には，既知の粗酵素抽出液は OmcZL を切断する活性を持っていの parg の ortholog は見出されない．本研究では，糸た．このことから，Ozp は OmcZL を切断し，OmcZS を状菌の parg 遺伝子を特定し，その生理学的役割を明ら生産する役割を担っていることが示された．

かにすることを目的とした．

YM18 株 の 全 ゲ ノ ム 配 列 を 決 定 し た と こ ろ ， 約

方法：A. nidulans のゲノム情報から parg 候補遺伝子を3.7 Mbp で，3,354 の ORF を持っており，PCA 株に対７種（NdxA，B，C，D，NppA，B および HP）選抜

して，122,022 個の SNPs を有していた．発電能力がし，リコンビナントタンパク質を調製した．調製した

PCA 株よりも高い YM18 株と KN400 株のみに共通す７種のリコンビナントについて PARG 活性を測定しる遺伝子が35個見いだされ，これらの遺伝子が高い発た．PAR の分解産物は LC-MS/MS にて解析した．ま電能力に何らかの役割を果たしている可能性が考えらた， Δfparg 株を作製し，DNA 損傷剤に対する感受性れた．

を検討した．
結果・考察：７種の parg 候補のリコンビナントタンパ
ク 質 を 調 製 し PARG 活 性 を 測 定 し た と こ ろ ， ヒ ト

カビの細胞内レドックス変化に応答した
エピジェネティック制御による遺伝子発現調節機構の解明
志水

元

PARG（hPARG）と同様に，HP のみ Mg2＋ 依存的にPAR を分解した．PAR の分解産物を LC-MS/MS にて解析したところ，ADP-リボースが検出されたことから，

亨

このタンパク質を fungal PARG（fPARG）と命名した．

名城大学農学部
moshimi@meijo-u.ac.jp

次に，Δfparg 株を作製し，３種の DNA 損傷剤に対する影響を検討した．その結果，野性株に比べて，Δ

目的：ポリ（ADP-リボース）（PAR）化は真核生物にfparg 株は DNA 損傷剤に対して感受性を示した．また，特異的なタンパク質の可逆的翻訳後修飾である．このfPARG の細胞内局在を解析したところ，主として核に反応には，NAD を基質として PAR を合成する poly

局在していた．さらに，PAR の分解を経時的に追跡し(ADP-ribose) polymerase（ PARP） と 分 解 す る poly

たところ， Δfparg 株では PAR の分解活性が顕著に低(ADP-ribose) glycohydrolase（PARG）が関与する．高

下していることが示された．現在，二次代謝物の生産

等真核生物において，parg をノックダウンさせると過に対する影響を検討している．

＋− 132 −

IFO Res.Commun. 30
2016以上のことから，糸状菌では fPARG が PARG とし

結果・考察：クラミドモナスやクロレラなどのモデルて機能しており，DNA 修復機構などに関与しているこ

真核藻類や Ki-4 株と近縁のセネデスムス属などの微細とが明らかになった．

藻類を用いて水溶性カロテノイド結合タンパク質の生産能を調査した．その結果，近縁種でのみ AstaP 類似タンパク質の発現が検出されたが，その発現量は顕著

過酷な生育環境から単離された微細藻類がもつ新奇な有用機能に関する研究川﨑信に低かった．遺伝子を解析したところ AstaP と高い相同性を有するタンパク質であることが判明し，一次構

治

造内のモチーフも類似していたことから進化の過程で
東京農業大学応用生物科学部
kawashin@nodai.ac.jp

近縁種に広く保存されたタンパク質であることが推定された． 極限環境に生息する有用微細藻類のさらなる

目的：植物は強光が付随する環境ストレス下では，活単離と解析を行った．助成期間中に複数回のスクリー

性酸素の生成を伴う光酸化ストレスを発生し枯死にいニングを行い，約20株の微細藻類の単離に成功した．

たる．筆者らは一般植物の生育が困難な過酷な生育環

単離株のうち１株は Ki-4 株に匹敵する優れた AstaP 類

境から微細藻類の探索を行い，70株ほどの真核微細藻

似タンパク質の生産能を有していた．また特定のカロ類を単離・保有している．これら極限藻類は淡水性でテノイドを大量に蓄積する微細藻類が単離されたためありながら強い耐塩性を示し，強光下の水分が 0% の環

分子生物学的な解析を行っている．

境で数ヶ月間生存するなど優れた環境ストレス抵抗性を示すことから，一般植物には無い環境ストレス耐性

イノシトール遊離能をもつ細菌由来フィターゼ：Klebsiella pneumoniae 9-3B 株由来
フィターゼの解析と新規フィターゼの開発機構の存在が示唆された．真夏のアスファルトから単離した微細藻類 Ki-4 株において，強光が付随する環境
ストレス下でアスタキサンチンを結合する新奇な水溶性タンパク質（AstaP）が大量に発現することが発見曾され，2013年に報告した．水溶性のカロテノイド結合

根

輝

雄

北海道大学大学院農学研究院
sonet@chem.agr.hokudai.ac.jp

タンパク質は真核の植物界には分布しないと考えられていたことから，極限藻類がもつ研究材料としての新奇性が示された．そこで本研究では，極限藻類がもつ

目的：フィチン酸（イノシトール６リン酸）は植物の優れた物質生産能力の調査とさらなる微細藻類の探索

リンの主要貯蔵形態である．フィターゼはフィチン酸を目的とした．

からリン酸基を遊離する酵素である．フィターゼは飼方法：AstaP はカロテノイドを水溶化する能力がある

料添加物，あるいはフィチン酸からのイノシトールのタンパク質であるが，その生物分布は不明である．そ生産に有用である．筆者らは細菌由来で初めてのイノ

こで研究室の単離株やモデル藻類を用いて AstaP の分

シトール遊離能を持つ Klebsiella pneumoniae 9-3B 株由布調査を行い，加えてストレス耐性能力の評価やプロ

来 フ ィ タ ー ゼ （ Phy9-3B） を 発 見 し た （ Escobin-

テオーム解析，HPLC による生体成分解析などを行っ

Mopera et al., 2012）．一方，本酵素の応用に関しては，た． また極限藻類からの新奇な能力の探索を目的とし由来菌が BS レベル２であり，より安全性の高い菌種て，自然界からサンプリングした試料を用いてスクリ由来の同様の酵素の発見が求められている．本研究でーニングを行い，微細藻類の単離と有用機能の発見をは，Phy9-3B のイノシトール遊離能に関与する構造的目指した．

特徴を明らかにすること，またそれにより安全性の高− 133 −

IFO Res.Commun. 30
2016

い細菌由来のフィターゼを開発することを目的とした．

CO から石油を高生産する
シアノバクテリア株コレクションの構築

方法：K. pneumoniae ゲノムから PCR で増幅を行い，

2

大腸菌用発現ベクター pET28(b) にクローニングした．

寺

本

真

紀

組換えフィターゼはアフィニティー，疎水性相互作用，
高知大学総合研究センター
maki.teramoto@kochi-u.ac.jp

サイズ排除の各クロマトグラフィーにより精製を行っ
た．精製酵素を 0.2 M 酢酸カルシウム， 20%(w/v) PEG
3350，懸滴法で17日間 20℃ インキュベートし，得られ目的：本研究では，アルカン系炭化水素を細胞内で高た結晶を用いて X 線解析を行った．

蓄積生産できる Proteobacteria 門の新規細菌 A 株から

結果：K. pneumoniae9-3B ゲノムから 3-フィターゼと相

この炭化水素高生産遺伝子を単離し，炭化水素生産能

同な遺伝子を増幅し，大腸菌にて発現を行い，同酵素に優れた高増殖性シアノバクテリアに導入することから Phy9-3B と同様にイノシトール遊離活性を確認しで，CO2 から炭化水素を高生産できるシアノバクテリ

た．精製酵素は 498 U/mg と，大腸菌由来のフィター

ア株コレクションを構築することを目的とした．

ゼに相当する高い比活性を示した．また，Phy9-3B は

方法：アルカン系炭化水素の構造は，反応試薬と標品

２量体を形成していた．組換え Phy9-3B の結晶化に成を用い GC-MS 解析にて同定した．炭化水素高生産遺功し，X 線構造解析により既知の E. coli 由来のフィタ

伝子は，A 株の全ゲノム解析をおこない，炭化水素のーゼ AppA と類似した構造が明らかとなったが，活性構造から合成に関わる遺伝子を推定し，大腸菌で発現中心においてはTyr238残基が異なっており（AppA でさせ，生産物を GC-MS 解析することで同定した．シは Phe），イノシトール遊離能との関連が期待された．

アノバクテリア株の調査は，国立環境研究所のシアノ

インドネシアの発酵食品テンペ，タペを用いてイノバクテリア株のうち増殖性が比較的高い60株についシトール遊離フィターゼのスクリーニングを行い５株て，増殖した（培地あたりの）湿重量を調べ，GC-MSのイノシトール遊離フィターゼを生産するバクテリア

解析により炭化水素生産能を調べた．

が得られたが，いずれも K. pneumoniae であった．

結果・考察：本研究により，A 株の生産するアルカン

考察：E. coli AppA との活性部位の比較から，Tyr238

系炭化水素の構造の同定に成功し，またこの高生産遺残基に Phy9-3B のイノシトール遊離能との関連が指摘

伝子の取得に成功した．この高生産には２つの遺伝子された．これについては現在変異導入解析を行っていが必要で，これらは隣接していた．１つの遺伝子（phsA）

る．また，新規フィターゼのスクリーニング系として，は還元酵素遺伝子と相同性を示し，phsA の発現のみでイノシトール資化能をもつ B. subtilis をホストとして炭化水素の生産が見られたが生産量は少なかった．もメタゲノム由来 DNA を導入し，フィチン酸を単一炭う１つの遺伝子（phsB）を phsA と同時に発現させる素源とする培地での生育を指標とする系を構築するたと，炭化水素の生産量が格段に増加した．これらのこめ，ベクターの改良を行っている．

となどから，PhsB は PhsA の基質を生産すると推定された．また phsA は，シアノバクテリア由来の炭化水
素生産遺伝子である PCC7942_orf1594（還元酵素遺伝子）と PCC7942_orf1593（還元酵素遺伝子と相似性を示す脱カルボニル化酵素遺伝子）とアミノ酸レベルで比較して，16% 以下の相同性と 69% 以下の相似性を示すことから，新しいタイプの炭化水素生産遺伝子であることが分かった．また phsAB 遺伝子群のすぐ上流に− 134 −

IFO Res.Commun. 30
2016

炭化水素生産を抑える DNA 領域があることも明らか

方法：筆者らは，バクテリアの培養液を寒天上にスポにした．さらに phsAB 遺伝子群の下流には，細胞の増ットすると，滑走運動によって表面上を広がり，20-30

殖を遅くする DNA 領域があることが示唆された．

時間後には，自身の1000倍にもなる複雑な渦状パター

一方シアノバクテリア株については，測定した60株ンを形成することを見出した．この集団運動の様子を全てからアルカンが検出されたことから，シアノバク

渦形成の開始から終焉まで，低倍率の位相差顕微鏡でテリアは一般的にアルカン生産能をもつことが示唆さ

30時間以上連続的に観察した．超安定性光学システム

れた．最も増殖性が高かった株は Spirulina 属で，こを改良し，パターン形成の観察に特化した手法を検討の株が生産した炭化水素はほぼヘプタデカンであっすることで，渦の中に含まれるバクテリア１匹１匹をた．しかしこの炭化水素生産量は，A 株と乾重量あた

観察できるまでに条件を調整した．

りで比較して 1/22 になると推定された．２番目に増殖

結果・考察：バクテリアの複雑な高次構造を簡易に観性が高かった株は Calothrix 属で，この株が生産した炭察する実験系を構築することに成功した．この複雑な化水素はほぼペンタデカンであった．近い将来，これパターンは最大で 3 mm にも達し，バクテリア１個体

ら株を含む

高増殖し炭化水素生産能に優れたシアノ（5μm）の1000倍近くにも達した．この渦形成過程時

バクテリア株に，A 株の phsAB を導入して炭化水素をには，ほとんどすべての個体が左に回転しながら 0.3

高生産させることで，CO2 から炭化水素を画期的に高μm/s の速さでダイナミックな挙動を示した．この高生産できる株の構築が期待できる．

度に組織化された集団運動は，バクテリア１個体の動きの特性によって決定されていると仮定した．そこで，バクテリア１個体の動きを最適な関数で近似して，そ第３の生体運動，戦車のように動く
バクテリアの運動メカニズム
中根

大の中心位置や角度を関数のパラメーターとして所得した．興味深いことに，バクテリア１個体が左旋回しな介

がら運動する傾向を持つことを見出した．このような学習院大学理学部
daisuke.nakane@gakushuin.ac.jp

渦形成時の左回転および１個体の左旋回の特性は，飢餓状態に特異的であり，グルコースを加えるとパター

目的：バクテロイデテス門に属する土壌細菌

ン形成および左旋回の動きの特性が消失した．

Flavobacterium johnsoniae は，ガラスなどの固形物表面

では，左回転と左旋回はどのような仕組みで生じて上で前進・後進・反転・回転する複雑な運動をおこないるのだろうか．申請者らはタンパク質の動きに依存う．この動きはべん毛や線毛など既知の生体運動とはしていると考えている．つまり，運動に必須の表面タ全く異なっており，詳細な運動メカニズムはほとんどンパク質が左巻きらせんに動くことで，１個体・集団解明されていない．私たちは一見，複雑に見える上記レベルでの対称性の破れが生じる，というモデルであの運動様式が実は簡単な２つの要素，つまり 1. 表面タる．しかし，これはあくまで仮説であるので，今後はンパク質が左巻きらせんのループに沿って外膜上を動バクテリア１個体の上で，１個の分子機械の動きを３き回ること，2. 表面タンパク質が固形物表面との接着

次元的に，高時間分解能，高位置決定能で検出できる

力を変えること，で生じるという運動モデルを提案し光学顕微鏡を用いて，ナノメーターレベルで，表面タた．これは戦車の走行装置である『無限軌道（キャタ

ンパク質の挙動を追跡する必要があるだろう．

ピラ）』とよく似ている．本研究課題では，筆者らが提案した無限軌道モデルを拡張し，バクテリアの自己組織化メカニズムを解明することに挑戦した．
− 135 −

IFO Res.Commun. 30
2016

ム・リシーケンスの結果，その絞り込んだ領域に変異

白色腐朽菌の順遺伝学：
担子菌特有の酸化酵素の分泌メカニズムの理解にむけて中沢威した遺伝子が発見できた（これを推定原因変異遺伝子とした）．相補形質転換および遺伝子破壊実験を行った結果，現在までに４種類の原因変異遺伝子を確定す人るに至った．
京都大学大学院農学研究科
tnakazaw@kais.kyoto-u.ac.jp

考察：今回確定できた原因変異遺伝子の４遺伝子のうち，転写以降（翻訳後修飾〜）の段階に関わると考え

目的：担子菌の一部

白色腐朽菌

は，木質中の難分られる遺伝子が２種類あった．よって，本実験系が目

解性高分子リグニンを生分解（単独で無機化）できる的達成のために有効に機能していることが示された．

地球上唯一の存在である．その特殊能力の正体は，白今後は，本実験系を用いた遺伝子の決定を行うことで色腐朽菌のみが分泌生産する酸化酵素［リグニン・ペ「なぜリグニン分解酵素が異種生産できないのか？

ルオキシダーゼ（Lip）およびマンガン・ペルオキシダ

その原因はどこにあるのか？」に迫ることを新たな目ーゼ（MnP）］であると言われている．一方で担子菌標とする．

では，他微生物とは異なる特殊なタンパク質の糖鎖修
飾様式・分泌経路の存在が先行研究によって示唆され細菌毒素を認識する RNA アプタマーの創製と検査，診断および治療への応用ている．また，上記のリグニンとリグニン分解酵素の関係は，一般的な基質と酵素の関係とは異なり，それ伊を取り巻く「反応場（環境）の構築」が重要であるこ

藤佐生智

名古屋市立大学大学院薬学研究科
s-itoh@phar.nagoya-cu.ac.jp

とも色々と示唆されている．そのような特殊な機構が存在するためか，リグニン分解酵素を活性ある状態で異種生産することが極めて難しい．そこで本研究では，

目的：一本鎖 RNA は転移 RNA やリボソーム RNA の白色腐朽菌ヒラタケ（Pleurotus ostreatus）野生株から例から示されるように配列に依存した高次構造を取り

リグニン分解酵素の活性が消失した突然変異体を分離

うる．ランダムな配列の RNA プールは無数の立体構

し，その原因変異遺伝子を同定する順遺伝学アプロー

造をとる RNA を含み，これを標的分子でスクリーニ

チによって，担子菌特有の翻訳後修飾?分泌に関わる因

ングすることで，標的分子に特異的に結合する RNA，子を同定することを目的とした．

RNA アプタマー

方法：ゲノム解読済みの PC9 株に対して，致死率 90％

タマーは抗体のように標的を特異的に認識し，かつ物になるように UV 照射を行い，変異を導入した．その理・化学的に安定で合成可能など抗体にはない優れた後，リグニン分解能力と相関がある色素脱色能力を指性質を持つ．一方で細菌毒素は病原性の発現に重要な標として，突然変異体のスクリーニングを行った．

役割を果たしており，毒素の検出，中和は細菌感染症

結果：150 株に１株の割合で，色素脱色能力不全をきのコントロールの重要な位置を占める．病原性細菌のたす突然変異体を獲得できた．その後，交配可能な別中でも，黄色ブドウ球菌は多彩なタンパク質毒素を産の野生株との交雑から得た F1 子孫の解析から，単一生し，毒素が病原性の発現に寄与している．また本菌（もしくは隣接する複数）遺伝子変異が原因で，変異は食品や医療現場における汚染が問題となっている公

表現型になったであろうことを確認した後，新たに作衆衛生上重要な細菌である．本研究では黄色ブドウ球

成した遺伝解析系（遺伝マーカー）を用いて，原因変菌毒素の中でも全ての分離株において保有されてお異遺伝子が存在するゲノム領域を絞り込んだ．ゲノり，病原性への寄与も高いα毒素に対する RNA アプ− 136 −を創製することできる．RNA アプ

IFO Res.Commun. 30
2016

タマーの創製を目指した．

医学・農学的応用を見据えた
細胞膜脂質非対称センサーの分子解剖及びエンジニアリング

方法：α毒素に結合する RNA の取得は試験管内分子進化法（Systematic Evolution of Ligands by EXponential
enrichment， SELEX 法 ） に よ り 行 っ た ． 両 側 に T4

小RNA ポリメラーゼ転写開始配列およびプライマー配列

原

圭

介

北海道大学大学院薬学研究院
obarak@pharm.hokudai.ac.jpを持つ 40mer のランダム配列からなる２本鎖 DNA を
鋳型に T4 RNA ポリメラーゼで転写させることでランダム RNA プール（1014 種類）を得た．Ni セファロース

目的：細胞膜の脂質二重層では，その内層と外層で脂に 6xHis タグを介して結合あるいは NHS 活性化セフ

質組成や役割が異なる．その様な「脂質非対称」は真ァロースを用いて共有結合したα毒素またはニトロセ

核細胞の生存に必須である．ヒトでは脂質非対称の部

ルロース膜に固相化したα毒素を用いて RNA を結合

分的な破綻でさえ様々な疾患を引き起こす．筆者らは，させ，洗浄したのち，イミダゾール，フェノール，フ出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae に於いてその様な脂リーのα毒素のいずれかを用いて RNA を溶出，回収

質非対称の状態を感知する脂質非対称センサー Rim21

し，逆転写後 PCR を行い鋳型 DNA を得た．結合・溶を同定した．Rim21 は Rim101 経路という情報伝達経

出条件を変動させながらこのサイクルを繰り返すこと路の最上流に位置している．Rim101 経路は病原性真でα毒素に特異的に結合する RNA を濃縮した．α毒菌が宿主内で増殖するのに必要である．その様な背景

素を用いないコントロール実験と比較して特異的結合の下，本研究では Rim21 による脂質非対称感知機構のが十分増加したところで PCR 産物をクローニングし，解明および医学・農学的応用に向けた知的基盤の形成

塩基配列を解析した．

を目指した．

結果・考察：サイクルごとに RNA とα毒素のモル比

方法：出芽酵母を用いて，Rim21 の変異解析を行った．

を調整し，かつ RNA の結合と溶出の条件を変化させ作製した Rim21 変異体の機能は，Rim101 経路の活性て，SELEX 法を行った．８サイクルの選別ののち，対化能の有無で評価した．また，Rim21 の C 末端細胞質

照実験に比べて特異的に結合する RNA を取得するこ領域（Rim21C）部分のみを GFP と融合すると（GFP-とができた．これをプラスミドにサブクローニングしRim21C），通常は細胞膜に結合し，脂質非対称の変化

塩基配列を解析した結果，取得された配列の集団は相に応じて解離することを既に見出している．この性質同性から３つのグループに収束していた．今後これらを利用して，変異を導入したアミノ酸残基が細胞膜との RNA と毒素の結合親和性を表面プラズモン共鳴なの相互作用に直接的に関わるか否かを検証した．また，どで測定し，α毒素の溶血活性に対する中和能，黄色大腸菌で Rim21C の組換えタンパク質を作製し，各種ブドウ球菌培養上清や検体などに存在する野生型のα脂質をスポットしたニトロセルロース膜との結合実験

毒素の検出の可否を確認する予定である．今回の研究を行った．病原性真菌 Candida glabrata の Rim21C とにより，細菌毒素に結合する RNA の創製法を確立す

GFP の融合タンパク質を発現し，脂質非対称変化に際ることができた．今後様々な細菌毒素を対象に RNAした挙動を追跡した．

アプタマーの創製に取り組む予定である．

結果・考察：Rim21C 前半部に位置する３つの連続したグルタミン酸残基（3E 配列）をアラニンに置換した
Rim21 変異タンパク質は機能を失っていた．この 3E
配列は，Rim21 の細胞内局在や他因子とのセンサー複合体の形成には関与していなかった．しかし，3E 配列− 137 −

IFO Res.Commun. 30
2016に変異を有する GFP-Rim21C は，脂質非対称が変化し類などに感染する病原性細菌であり，らせん形状をした際も細胞膜から解離しなかった．即ち，3E 配列は脂ており，回転しながら宿主の体液中を泳ぐことが知ら

質非対称の感知に直接的に関わり，細胞膜からの反発れている．興味深い例として，スピロプラズマがショ力を生み出していた．また，その直前にある正電荷ク

ウジョウバエに感染すると雌のみが生まれる「オス殺ラスター（RK 配列）は，3E 配列とは逆に細胞膜へのし」現象が知られている．これらの感染・病原性発結合力を生み出していることも判明した．脂質結合実

現・運動等の機構は興味深い高次機能であるが，スピ験では，Rim21C 組換えタンパク質は，細胞膜内層にロプラズマの培養と遺伝子操作は困難である例が多豊富に存在する負に荷電した脂質と結合した．また，く，そのメカニズムはほとんど解明されていないのがC. glabrata の Rim21C は出芽酵母の Rim21C と同様に現状である．本研究は，大規模ゲノム操作技術を活用

脂質非対称変化に応じて細胞膜から解離した．

し，スピロプラズマの全ゲノムをクローニングするこ

結果を総合すると，Rim21 は柔軟性の高い Rim21Cとでその機能の解明を行うことを目指す．

を触角の様に用い，細胞膜内層との相互作用を繰り返方法：まずは培養可能なスピロプラズマ（Spiroplasma

しながら脂質非対称を感知していると考えられる．RK

chrysopicola）を用いた．細菌から環状のゲノムを抽出

配列と負荷電脂質との親和性と 3E 配列による反発力するため，菌体をアガロースゲルに包埋し，その中での拮抗作用は，通常は親和性が優勢であるが，脂質非タンパク質と脂質の分解を行った．その後，ゲル中で対称が変化し負荷電脂質が細胞膜内層から減少すると制限酵素処理を行い，パルスフィールドゲル電気泳動

反発力が優勢となり，Rim21C が解離してシグナルがによりゲノムサイズを確認した．全ゲノムクローニン

発せられると考えられる．この様な「触角仮説」は C.

グのためのベクターは，すでに開発されている酵母人

glabrata にも適用できると考えられる．

工染色体ベクターを用いた．このベクターには，酵母のセントロメア領域・酵母の選択マーカー・マイコプ
ラズマの選択マーカー等の遺伝子が含まれる．また酵微生物が持つ高次機能の解析：
大規模ゲノム操作技術が拓く
新たな遺伝子工学柿澤茂

母の形質転換法としては，酵母の細胞壁を除いてから
ポリエチレングリコールを用いるスフェロプラスト形
質転換法を用いた．

行

結果：スピロプラズマゲノムを抽出・切断し，ゲノム
産業技術総合研究所生物プロセス研究部門
s.kakizawa@aist.go.jpの長さを確認すると共に，クローニング領域を選定した．３種類の制限酵素（I-CeuI，SfiI，AscI）で切断し目的：微生物は，感染性・病原性・運動性など，多数た断片と，１つの制限酵素で切断した全ゲノムのクロの遺伝子が連動することによって発現する「高次機能」

ーニングを行い，すべてクローニングに成功した．得を多く持つ．これら高次機能の全貌解明は微生物学のられたクローンの選抜には，新たに確立したマルチプ

大きな命題であるが，その手法は極めて限られていレックス PCR の系を用いた．その後，パルスフィールる．

ドゲル電気泳動にてインサートサイズを調べ，目的の本研究は，近年開発された「大規模ゲノム操作技術」

サイズのゲノムがクローニングできていることが確認を用いることで細菌が持つ高次機能の全容を解明しよできた．

うとするものである．対象とする細菌は Class Molli-

考察：酵母を用いたゲノムクローニングでは，より小cutes（モリキューテス綱）に属するスピロプラズマをさな断片のほうが効率よくクローニング出来ることが用いる．スピロプラズマは哺乳類・植物・昆虫・甲殻分かった．200−300 kbp 程度までは非常に高い効率で− 138 −

IFO Res.Commun. 30
2016

クローニング可能であり，インサートサイズが長くなはないが，寿命解析を行うと野生株より短くなり，かると効率が少しずつ下がる傾向にあった．しかし

つその影響はΔylr281c 株の方が大きかった．YPG 培地

1 Mbp を超える配列でも問題なくクローニングできるでの対数増殖期の細胞周期解析では，Δyol114c 株はことがわかり，今後の機能解明に向けた研究を行うこG2 期に移行できず S 期でトラップされ，一方，Δとが出来た．

ylr281c 株は S 期に移行できず G0/G1 期でトラップされていた．また，定常期では２つの欠損株は S 期でトラップされていた．さらに，２つの欠損株は対数増殖酵母を利用した翻訳過程不全によるミトコンドリア病の分子メカニズムの研究
行木信期，定常期ともにミトコンドリア膜電位が低下した．
この原因をミトコンドリアに限定して考察するなら

一ば，Δyol114c 株ではミトコンドリアの分離が正常に行群馬大学大学院理工学府
nameki@gunma-u.ac.jp

われないことが示唆され，一方，Δylr281c 株ではミトコンドリアの融合が正常に行われていないか，あるい

目的：リボソームが終止コドンのない mRNA を翻訳しは異常なミトコンドリアを積極的に排除する機構が活てしまうなど様々な理由により，翻訳は停滞する．最発化していることが示唆される．一方，定常期では２近になりミトコンドリアの翻訳系における停滞解消に

つの欠損株は細胞周期の S 期で滞り，ミトコンドリア

は，ICT1 蛋白質（翻訳停滞解消因子）がリボソーム上が分離することができない状況にあること，もしくはで機能することが明らかにされた．興味深いことに，融合したまま機能しようとするミトコンドリアが多い

ミトコンドリアではさらにもう一つの翻訳停滞解消因

ことが示唆される．本研究により，培養細胞の系では

子 C12orf65 蛋白質が必須なことが報告され，その欠損明確にできなかった yol114c の欠損と ylr281c の欠損とはヒトではミトコンドリア病を引き起こすことが示さの影響の相違点が初めて明らかになった．さらに，れた．この２つの因子は酵母からヒトまで普遍的に保ylr281c の欠損によりミトコンドリアの融合が正常に行存されていることから細胞にとって必須なことは明らわれていないことが，ヒトのミトコンドリア病の患者かであるが，ミトコンドリア特有の翻訳停滞状況に対で同様に起きているか検証する必要があり，発症メカ

し，ICT1 と C12orf65 がどのよう役割分担し機能するニズム解明の手掛かりとなると考えられる．

のか未知である．本研究の目的は，出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae の系によるミトコンドリアでの翻訳

組織血液型決定抗原様物質を保持する
腸内細菌がヒトノロウイルスの
環境中動態に与える影響の解明

停滞解消機構の解明である．それらの因子の欠損が細胞およびミトコンドリアにどのような影響を与えるのかを詳細に調べ，ミトコンドリア病の発症メカニズム

佐

野

大

輔

の解明に結びつける．
北海道大学大学院工学研究院
dsano@eng.hokudai.ac.jp

方法：出芽酵母における ict1 欠損株（Δyol114c 株）および c12orf65 欠損株（Δylr281c 株）について Flow cytometry を用いて細胞そしてミトコンドリアへの影響

目的：ノロウィルス（NoV）は感染の第一段階であるを様々な角度から調べた．

宿主細胞への吸着の際に，細胞表面に提示された組織

結果・考察：ミトコンドリアの機能が必須な非発酵性

血液型抗原（histo-blood group antigen: HBGA）との相培地（炭素源がグリセロール，以下 YPG 培地）にお互作用を利用すると考えられているが，申請者らはいて，２つの欠損株に野生株との増殖能（濁度）の差

HBGA 様物質を細胞外に有する腸内細菌 Enterobacter− 139 −

IFO Res.Commun. 30
2016

sp. SENG-6 が NoV を特異的に捕捉することが可能で観察された．以上の結果より，NoV は HBGA 陽性細あることを報告した．本研究では，HBGA 様物質を保菌との共存下において，菌体に捕捉された状態と菌体

持した腸内細菌が水環境中にどの程度存在しているのから離れ SMP に覆われた状態のどちらかの形態で存か，また細菌由来 HBGA 様物質に捕捉された NoV は在しうるといえる．

どのような形態で存在するのかを明らかにすることを目的とした．

大腸菌縮小ゲノムシステムによる潜在的必須遺伝子群の同定解析と合成生物学的手法による「光合成大腸菌」の作製

方法：膜分離活性汚泥処理槽から得られた未処理下水
サンプルをソースとし，抗 HBGA 抗体（抗 A 抗原抗体，抗 B 抗原抗体，抗 H 抗原抗体）を固定した96ウェ
ルプレートを用いて HBGA 陽性腸内細菌のスクリーニ

加ング・単離を行った．菌株の単離後，血液型検査キッ

藤

潤

一

首都大学東京大学院理工学研究科
jkato@tmu.ac.jp

ト（鎌倉テクノサイエンス）を用いて HBGA 様物質の有無を判定した．さらに単離株の 16S rRNA 遺伝子シーケンス解析及び BD BBL クリスタル E/NF（Becton,

目的：大腸菌は分子レベルで最もよく理解されている

Dickinson and Company）により菌種同定を行った．菌

モデル生物であるが，臨床的には病原菌でもあり，一体由来の HBGA 様物質を検出するためにウェスタンブ

方産業面では広く利用されている宿主でもあり，種々

ロッティングを行い，NoV の細菌への吸着状況の観察の面から重要な生物である．その大腸菌を用いた先端するために菌株とノロウイルス様粒子（norovirus-like

的なゲノムサイエンスを基盤として，次世代の抗生物

particle: NoVLP）の混合液を透過型電子顕微鏡（Trans-

質の新規な標的と成り得る遺伝子群を同定して解析す

mission electron microscope: TEM）にて観察した．

る．また合成生物学的手法により「光合成大腸菌」の結 果 ・ 考 察 ： 今 回 単 離 さ れ た HBGA 陽 性 細 菌 株 は作製を試みる．

Klebsiella spp.，Enterobacter spp.，Acinetobacter spp.，も方法：16S rRNA 前駆体のプロセシングに関与する必須

しくは Stenotrophomonas sp. に属するものであり，３遺伝子 yqgF がコードする YqgF タンパク質を精製し科４属に分類されたことから，下水および活性汚泥中て，in vitro で 16S rRNA 前駆体を基質とした RNase 活には多様な HBGA 陽性細菌が存在することが明らかと性を調べた．また yqgF ts 変異株のリボソームの構成タンなった．ウェスタンブロッティングにより細菌由来

パク質を LC-MS/MS で調べた．さらに 16S rRNA 前駆

HBGA 様 物 質 を 検 出 し た と こ ろ ， リ ポ 多 糖 か ら は

体の 5’ leader の欠失変異を作製して表現型を調べた．

HBGA 様物質が検出されなかったのに対し，培地中にまた我々がこれまでに作製してきた大腸菌染色体の分泌された溶解性微生物代謝産物（Soluble microbial

広域欠失変異株群，ゲノム縮小株群を利用して，潜在

products: SMP）及び細胞外物質（Extracellular poly-

的な必須遺伝子を同定して調べた．

meric substances: EPS）が HBGA 様物質を含んでいた．

光合成に必要なクロロフィル合成の再構成を，紅色

これらの結果は，HBGA 陽性細菌との共存下における光合成細菌の光合成関連遺伝子群

NoV の存在形態として，菌体に捕捉された状態と菌体現するように導入することによって試みた．またこれから離れた状態の両方を考慮する必要があることを示らの合成に重要となる大腸菌のヘム合成経路の解析をしている．TEM 観察の結果，上清中から菌体から離進め，中間体増産株の作製，機能未知関連遺伝子群のれ SMP に覆われた状態の NoVLP が観察され，ペレッ

解析を行った．

ト再懸濁液中からは菌体に吸着した状態の NoVLP が結果・考察：精製した YqgF タンパク質が，Mg2＋ では− 140 −などを大腸菌で発IFO Res.Commun. 30
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なく Mn2＋ 存在下で 16S rRNA 前駆体を分解することをであるため，ポリアミンがシアノバクテリアの光合成

示し，RNase であることを明らかにした．また yqgF tsにも寄与している可能性は高い．そこで本研究では，

変異株のリボソームでは S1 タンパク質が欠損してい光合成における CO2 固定酵素であるルビスコのカルボ

ることがわかり，16S rRNA 前駆体の 5’ leader はリボ

キシレーション反応に，ポリアミンが取り込んだ CO2

ソームの形成に重要であると同時に，S1 タンパク質のが供給されるのかを検証するとともに，シアノバクテ

リボソームへのアセンブリを阻害することを示した．

リア培養液にポリアミン生合成阻害およびポリアミン

YqgF タンパク質は，細胞内で形成されている間に不輸送体阻害剤を添加し，増殖と光合成速度に与える影

活性型で存在していたリボソームを，形成後に活性型

響を明らかにすることを目的とした．

に変換するスイッチとして働いている可能性が考えら

方法：0.1 M の各種ポリアミン（プトレシン，スペルれた．

ミジン，スペルミン）水溶液を２日間静置し空気中の潜在的な必須遺伝子を，合成致死関連遺伝子群としCO2 を吸収させた．このポリアミン溶液を市販の精製て探索するシステムを構築し，実際に DNA ポリメラ

ルビスコの反応溶液に添加し，酵素活性を測定した．

ーゼ III のサブユニットと相互作用する，DNA 修復に

ま た ， シ ア ノ バ ク テ リ ア の Synechocystis sp. ATCC

関与する新規遺伝子 yoaA を同定した．さらに広い意

27184TM を，25℃，光量 40μmol m-2 s-1 条件下，BG11 培

味での酸化ストレス耐性に関与する遺伝子群の同定に地で培養し，合成したポリアミン生合成阻害α-ジフルも成功した．

オロメチルオルニチン（DFMO）およびポリアミン輸

系統的に離れた紅色光合成細菌の多数の光合成関連

送体阻害剤 L-Lys(palmitoyl)-N1-spermine（PTI-1）を添

遺伝子群を大腸菌で発現するように導入することによ加した．所定の期間培養したのち蛍光強度から細胞数り，クロロフィル合成の中間体であるクロロフィライを算出した．増殖阻害がみられた阻害剤については，

ド a の合成に成功した．またこれらの合成に重要とな

添加後に光合成活性を温度制御機能付液相酸素測定装る大腸菌のヘム合成経路の解析を進め，中間体増産株

置（ハンザテック OXYT-1）で測定した．測定条件はを作製し，機能未知関連遺伝子 hemX, hemY 遺伝子の温 度 25℃ ， 光 量 約 500μmol m-2s-1 と し ， 培 養 液 に

機能解析を行った．

NaHCO3 を 5 mM となるよう添加した直後に測定を行った．
結果・考察：市販ルビスコに空気中の CO2 を吸収させバクテリアの無機炭素濃縮機構とポリアミンの関わり
安元

た各種ポリアミン溶液を添加すると顕著なカルボキシ
レーション反応が見られた．空気中の CO2 を吸収した

剛

各種ポリアミン溶液は，in vitro でルビスコに CO2 を供

北里大学海洋生命科学部
yasumoto@kitasato-u.ac.jp

給できることが明らかになった．ポリアミンは細胞内に高濃度で存在していることが知られているが，ポリ

目的：ポリアミンは分子内に複数のアミノ基をもつ低アミンと CO2 との高い親和性は知られておらず，CO2分子化合物の総称で，バクテリアの細胞内には特に多濃縮や光合成との関与は明らかにされていない．そこく存在し，「普遍的かつ高濃度で存在する」という点で，高い CO2 濃縮能を有することが知られているシアで他の生体アミンとは異なる．我々はこのポリアミン

ノバクテリアの培養液に合成した DFMO および PTI-1

が空気中の二酸化炭素（CO2）と高い親和性を有し，を添加し，増殖や光合成速度に及ぼす影響を調べた．

CO2 を溶液中に取り込み海洋細菌の石灰化に寄与する

その結果，ポリアミン生合成阻害には強い増殖阻害がことを明らかにした．CO2 取り込みは光合成にも必須なかったのに対し，PTI-1 を 60〜80μM 付与するとシ− 141 −

IFO Res.Commun. 30
2016

アノバクテリアの増殖は有意に抑制され，光合成活性よる沈降後，p85 の検出を行った．次に，HGEP の膜（酸素発生速度）も添加後に減少した．DFMO は動物

タンパク質をビオチン標識し，細菌感染後のビオチン

細胞中のポリアミン量を減少させることは知られてい化膜タンパク質の変化を調べ．変化が得られたタンパ

るが，藻類のポリアミン量を減少させるにはその他のク質の MALDI-TOF 質量分析（Bruker 社）を行なった．

ポリアミン生合成阻害剤を用いる必要があることが示

異なるアプローチとして，既報の中から Pg が切断す唆される．PTI-1 はシアノバクテリアに対する増殖阻る膜タンパク質の検索を行ない，上皮成長因子受容体

害と光合成速度を減少させることが明らかになった．

（EGFR）の報告があったことから EGFR と p85 の結合本研究により，シアノバクテリアの新たな CO2 濃縮機を調べた．

構を提唱することが出来た．今後より詳細に検証して結果・考察：WT 株と MT 株を HGEP に感染させ，ビいく予定である．

オチンラベルした膜タンパク質と p85 との結合を調べた結果，WT 株の感染では複合沈殿物から p85 が認められなかった．MT 株の感染では p85 が検出された．

プロテオーム解析法を用いた未分化能を有する歯肉上皮系前駆細胞における歯周病菌産生毒素の標的膜タンパク質の探索
中山真

p85 と結合している膜タンパク質を Gp が切断することが，PI3K の活性抑制とその伝達カスケードの撹乱に繋がっていると考えられた．WT 株と MT 株の HGEP

彰への感染における，ビオチンラベルされた膜タンパク
岡山大学大学院医歯薬学総合研究科
nakay-m@okayama-u.ac.jp

質 の 変 化 を 調 べ た ． そ の 結 果 ， お よ そ 100 kDa,
110 kDa, 120 kDa 付近の３つの膜タンパク質の消失が目的：歯周病菌の長期感染による歯周病は，口腔機能認められたため，MALDI-TOF 質量分析を行なったが，の顕著な低下に繋がる．本研究では，歯周病菌 Porphy-

明確な結果が得られなかった．従って，実験法を改善

romonas gingivalis（Pg）の感染による歯周病の病態発し，今後も継続して実験を行なう予定である．EGFR症の解明のために，Pg が産生する病原性プロテアーゼと p85 の結合に対する Gp の影響を調べた結果，菌株“ジンジパイン（Gp）” に着目し，Gp の宿主細胞への毒の感染・未感染のいずれも EGFR と p85 の結合は認め性発現機序の解析を行った．我々は，Pg の感染によりられなかった．Gp による PI3K の抑制と EGFR の切断

宿主細胞の多様な生理的機能を制御するホスファチジとは関係性がないと考えられた．以上から，Gp によルイノシトール 3-キナーゼ（PI3K）/Akt の抑制を見出る PI3K 抑制のメカニズム，および Gp の標的膜タンパした．そこで，Gp による歯周組織破壊の分子作用機ク質の解析を継続し，歯周病態形成に繋がる Gp の病序を明らかにするために，PI3K/Akt 抑制の分子機序と原性発現機序を明らかにしていく．

Gp の宿主細胞に対する標的膜タンパク質を解析した．
方法：PI3K/Akt の活性抑制の分子機序を明らかにするために，歯肉上皮前駆細胞（HGEP）を用いて，Pg
ATCC33277 標準株（WT 株）と Gp 欠損株（MT 株）を感染させ，比較実験を行った．Gp による PI3K の活性抑制における膜タンパク質と PI3K の調節サブユニ
ット p85 との結合への影響を検討した．アビジン-ビオ
チン標識法を用いて，膜タンパク質のビオチンラベル
を行ない，感染後に細胞を破砕し，アビジンビーズに− 142 −

平成25年度若手研究者助成の研究報告
助成期間：平成25年 4 月〜平成28年 3 月

IFO Res.Commun. 30
2016とは難しくアスベストの繊維構造を完全に分解するこ

鉄酸化細菌によるアスベスト
分解メカニズムの解明と応用
石

田丈とはできなかった．
アスベスト小体の分解を目指し検討を行なった．ア典

スベスト小体の鉄の被覆物は，主にフェリチン由来の
広島大学大学院先端物質科学研究科
tishishi@hiroshima-u.ac.jp

水酸化鉄であることが知られている．予備検討として，水酸化鉄を溶解する物質を探索したところ，鉄キレー

目的：アスベストは，悪性中皮腫を引き起こすことがト作用を持つトリポリリン酸が酸性条件で水酸化鉄を明らかとなりその使用が全面禁止になったものの，ま溶解することが分かった．そこで，患者から分離しただ問題が解決したわけではない．建物の解体によるア

アスベスト小体と，酸性条件でトリポリリン酸を混合

スベスト含有廃棄物量の増加や，これまでのアスベスしたところ，５日でアスベスト小体の鉄の被覆物をほトの暴露によって今後2030年前後までに約10万人の中

ぼ完全に溶解できることが分かった．しかし，生体内皮腫の発症が予測されている．鉄酸化細菌とアスベス

は中性であるため，中性条件でアスベスト小体を分解

トを混合して培養したところ，結晶構造が壊れているすることが望ましい．トリポリリン酸は，中性条件で様子が電子顕微鏡により観察された．そこで，本研究はアスベスト小体を分解することができなかった．そでは，鉄酸化細菌を用いたアスベストの分解を目指し

こで，中性条件でアスベスト小体を分解できる物質のた．また，アスベストは肺に吸引されると分解されず探索した結果，アスコルビン酸が中性条件でアスベス

体内に蓄積し，周囲の鉄または鉄含有タンパク質（フト小体の鉄の被覆物をほぼ完全に溶解できることが分ェリチン）を吸着しアスベスト小体を形成する．このかった．アスコルビン酸（ビタミン C）は，安価で生アスベスト小体の形成による鉄の沈着は，生体内の鉄体毒性も低いためアスベストによる悪性中皮腫の予防の恒常性を壊し，活性酸素の発生を増加させており，に応用できる可能性がある．

これが癌化の一因と考えられている．アスベスト小体の鉄の被覆物を溶解し取り除くことができれば，鉄による活性酸素の発生を抑制することができ癌化のリスクを低減させることができるのではないかと考えた．
そこで，本研究では，人の肺中アスベスト（アスベスト小体）を分解することも目指した．
方法：鉄酸化細菌を，アスベストと黄鉄鉱を添加した培地で，28℃ の条件で培養を行なった．アスベストの分解は形状の変化を顕微鏡で観察することにより評価した．アスベスト小体の分解は，患者から分離したア
スベスト小体に 50 mM に調製した供試物を添加して，アスベスト小体の鉄の被覆物が溶解するかを顕微鏡で観察し評価した．
結果・考察：Acidithiobacillus ferrooxidans とアスベストと混合して培養を行ない，アスベストを電子顕微鏡で観察した結果，アスベストの表面の結晶構造が壊れている様子が観察された．しかし，それ以上分解するこ− 143 −

発酵研究所助成研究報告第30号【非売品】

平成28年12月10日
平成28年12月20日
編集委員長
編集委員

発行人
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発行

中瀬 崇
伊藤忠義，大島敏久，熊谷英彦
徳増征二，阪井康能，左子芳彦
坂野 勲，横田 明
中濱一雄
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