厚生

省

神経疾患研究委託費

筋ジストロフィー症の

基礎的研究
江 橋：旺
昭和55年度研究報告書

昭和56年3月

研究報告書の作成に当って厚生省神経疾患研究委託費による「筋ジストロフィー症の基礎的研究」班の第3年目の研究報告集を発刊することになりました。
本年は現在の組織における研究班の最後の年でありまして，研究の一つの区切りであります。過去3年間，現代の基礎医学や生物学を基盤として筋ジストロフィーの病因を理解することをさし当っての目標とし，終局的には本疾患の根本的治療法の確立と根絶とを目ざして努力を続けて参りました。
もとより本疾患は難病中の難病であり，また原疾患を実験的に取扱うのは非常に困難であります。われわれは，原疾患との病像の差が存在することは充分に理解しておりま
すが，ひとまず筋ジストロフィー鶏を一つの重要な研究材料として，その病態の解明を当面の目標の一つとして参りました。そして各班員およびその協力者はこの面においても顕著な業績を挙げて参りました。しかし未解決の問題がまだ山積していることも事実であり，これらの解決には優れた研究者と研究費と時間が必要であります。
しかしながら過去における研究は報告書に現われた業績以外に，研究の過程を通じて筋ジストロフィー症の研究者としての優れた能力と自覚とを持った中堅研究者を育てて来ており，将来に大きな期待をいだかせるものであります。これらの厚みと質の高さを持った研究者に充分な研究環境が与えられることを希望して，本姓のしめくくりとしての第3年目の報告集をお送り致します。
本年度も班会議後わずかの問に報告集をまとめることができました。多忙な中を執筆された班員の方々に感謝します。終りに本委託金の取扱いに色々とお骨折り下さった厚生省医務局療養所課，国立武蔵療養所，日本筋ジストロフィー協会の各位に御礼申し上
げます。
昭和56年

3

月

班

長

江

橋

節

郎

目

次

I Whole Animal

1．下垂体性小人症遺伝子（dw）による筋ジストロフィー症遺伝子（dy）の潜在化（マウス）
戸

3

塚

武

2．ジストロフィー筋肉のヌードマウスへの異種移植に関する研究

10

寺

尾

寿

夫

3．ジストロフィーおよび正常チキンにおける
16

長橈横側手根伸筋の交換移植
大

Ⅱ

細

胞

培

塚

正

徳

養

4.筋細胞の異所的Ectopicな発生

23

岡

田

節

人

5．遺伝子挿入細胞の選別に関する新しい試み

26

岡

田

善

雄

6．組織培養法による筋ジストロフィー症の研究

29

米

沢

猛

7．正常及び筋ジストロフィーマウス再生筋細胞の分裂能の比較
香

34

川

務

8．培養骨格筋における活動電位の発達に関与する
神経性因子について

40

加

濃

正

明

ⅳ

目

次

9．培養筋細胞の成長に及ぼす各種血清の作用について

45

小 沢 鍈二郎

Ⅲ

微

細

形

態

10．チキン骨格筋筋細胞膜の凍結割断像

53

岩

崎

祐

三

11．ニワトリ筋の微組形態上の多様性

59

石

川

春

律

12．心筋および骨格筋における筋調節蛋白質の分化

65

嶋

田

裕

13．幼若筋ジストロフィーチキン胸筋の抗トロポニン染色

71

大

Ⅳ

生

理

概

磐

男

学

14．筋の生理学的性質の発生的研究

79

高 橋 国太郎
15. 筋ジストロフィー鶏骨格筋skinned fiberの短縮速度
遠

84

藤

実

16．培養法による鶏ジストロフィー筋の電気生理的,

形態的及び代謝的特性について

89

堀

田

健

17. Myotoniaラットにおける筋細胞膜と神経筋伝達の性質について

97

栗 山

熙

目

Ⅴ

生

ⅴ

次

化

学

18．ジストロフィー鶏筋における蛋白合成能上昇の機構について
真

崎

103

知

生

19．幼若筋及び筋ジストロフィー筋の筋蛋白質についての研究

108

大日方

昂

20．ジストロフィー鶏筋の構造蛋白114

野々村 禎 昭21．ラットミオシン分化に対する神経の影響

124

杉

田

秀

夫

22．筋肉の弾性蛋白質コネクチン

131

丸

山

工

作

23. ジストロフィー成鶏胸筋小胞体膜のCa‑取り込み能と,その膜構成について

136

酒

井

敏

夫

24. 筋ジス･マウスの中枢神経組織におけるミエリン局在酵素(CEHおよびCNP)活性の日令変化
松

144

下

宏

Ⅵ 蛋白分解酵素25. カテプシンBによる筋蛋白分解の
蛋白化学的ならびに形態学的研究

153

勝

沼

信

彦

26．筋ジスニワトリおよびマウス筋肉内の各種酵素活性の対比

159

青

柳

高

明

ⅵ

目

次

27. 筋組織の中性プロテアーゼに関する研究

166

高

橋

健

治

28. カルシウム依存性中性プロテアーゼ(CAMP)に対するCa2+の役割

172

今

堀

和

友

29．筋蛋白質代謝回転に及ぼす蛋白質分解酵素阻害剤の影響
江

177

橋

節

郎

I Whole Animal

1 下垂体性小人症遺伝子（dw）による筋ジストロフィー症遺伝子（dy）の潜在化（マウス）32

ジストロフィー筋肉のヌードマウスへの異種移植に関する研究10

3ジストロフィーおよび正常チキンにおける長横側手根伸筋の交換移植16

1下垂体性小人症遺伝子（dw）による筋ジス
トロフィー症遺伝子（dy）の潜在化（マウス）

戸 塚

武＊

研究協力者 渡 辺 貴 美＊ 清 野 茂 博＊

6）筋ジストロフィー症（dy）マウスで，重症の後骨の成長は緩やかで小さい（正常マウスでも）こと，

肢と軽症の前肢を比較研究することは，dy症の発などを明らかにした。また，前肢筋，後肢筋とも1生機構の解明のための重要な手掛りを与えてくれる

月齢頃を境に成長が停止してしまい，後肢筋でみるだろうと考え，一連の研究を行ってきた。外見上正かぎりそれは筋細胞の肥大伸長成長が停止するため

常にみえる前肢も耐久力は弱っている1とと，前肢筋であることが分かった。これらの結果から，マウスを生化学的に調べたところ後肢歳芝ほとんど同様にのdy症の発生機構に関して図1のような作業仮説

異常であ君と，後肢の骨は急成長するのに前肢のを提唱した。

7）

十什dy／dy⑪ 心

Genedy→・？⇒ arrestthegrowthofskeLmuscle（nc貯aSein叩P．Cdlvol・）Hor● −Receptor−Colbgen．
Chotesterol？

Bone−MusClelmbalance：
Progress 0t the Disease

PossibleSymptomaticTreatment？
Hypophysectomy？（genedWbrp．bm？）

図1筋ジストロフィー症マウスの発症機構に関する作業仮説。

本研究では，dyマウスの自発運軌前肢筋の組織

材料と方法

像，下垂体機能（成長促進に関する），がどうであ

dyマウス（C57BL／6J−dyのdy／dy個体），

るか，また，下垂体性小人症遺伝子（dw）を導入しdwマウス（DW／Jのdw／dw個体），両珠の雑種てdyマウスの成長を停止させることでdy症状を緩第2代のマウスを用いた。自発運動は，Animex

和できるか，を調べた。

（type S）セ行った（10分毎のカウント数を連
続48時間記録）。組織検索は，摘出筋（前肢trト
ceps，後肢biceps）のパラフィン連続切片（厚さ7／）を1枚おきにHE，Azan染色し，光学顕微鏡（直接倍率：×200）で行った。dyマウスの下垂＊愛知県心身障害者コロニー．発達障害研究所

体機能検査として，摘出した下垂体を生理食塩水中

Ⅰ

WhOle

Animal結でホモジナイズ（ガラスーテフロン）し，成長停止
後のdwマウス（体毛尾長からみて10−15日齢の正常マウスに匹適）に投与（腹腔内，隔日）し，dwマウスに対する成長促進効果，成長したdwマウスの運動能力，を調べた。

果

自発運動

2−3月齢の雄dyマウス（後肢はほとんど麻痺）も正常対照マウスと同様に，明期（6−18時）に低く暗期（18−翌朝6時）に高い自発運動の日周パターンを示した（図2A）。各個体の明期と時期の総

DystrophiC

Norlnil

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＞【

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12：00

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Dystrophic

Z

2

1

2

4

6

Day （xdCOuntS）

図22−3月齢の筋ジストロフィー症マウスの自発運動o
A：日周パターン（典型例）。B：昼と夜の運動量の関係。
C：運動のピーク時の，個体（上），日（下）による変動。

1下垂休性小人症遺伝子（dw）による筋ジストロフィー症遺伝子（dy）の潜在化（マウス）

運動量の関係は図2Bのようになった。これから分ウスの値の6割くらいに低下していた。

かるように，dyマウスの自発運動活性は，対照マウ

前肢筋の組織所見

スに比べてそれほど際立った低下をしていなくて，

5dyマウスの後肢筋の組織像において筋細胞の大小

症状のひどさを考えると予想外によく保持されてい不同，中心核，変性細胞，結合織と脂肪織の浸潤，た。ただ図2Aでも一部みられるように，dyマウスなどが観察されることは，多くの研究報告により明のパターンは，活動期と静止期の区別がはっきりしらかにされてきた。そこでまず，あまり報告のないない傾向を示した。実際．明期における運動のピー

1月齢以前の発症初期（発症は2過齢頃）のdyマ

ク時を調べたところ，対照マウスではきれいな約2

ウスの後肢筋を調べてみたところ，3月齢くらいの時間毎の周期性がみられたのに，dyマウスではそれものに比べると軽度ではあるけれど，同様な異常像がかなり乱れていた。このことは，個体によってもが部分的に認められた。つぎにdyマウスの前肢筋の（図2C，上），日によっても（図2C，下），同

組織検索をしたところ，前肢筋の組織像は，時期的様であった。dyマウスは集中的持続的運動をしないにみても，程度からみても．後肢筋でみられるのとためであると考えられ，実際10分間の最高カウント

同様に異常であった（図3）。Azan染色では，異数をみても，明期，暗期ともdyマウス功直は対照マ

常に多い線維組織の存在を認め，しかも，筋細胞の

A：3月齢
（横断）

B：1月齢
（縦断）

Ⅰ

Whole

Animal

C：0．5月齢（横断）

図5 筋ジストロフィー症マウスの前肢筋の光顕像。

周囲でも肥厚した線維像（徽 後肢筋とも）を認めは，両群（各2匹のdwマウス）の体重尾長間相対成た。このような組織像は，0．5月齢のdyマウスでも長曲線である。実験群，対照群ともほぼ同様な成長

軽度ながら認められた。

性を示した。50日間程で成長が止まったため，注射dyマウスの下垂体投与によるdwマウスの成長を中止した。その後7月齢の時点で金網登りテスト

下垂体投与開始後8日日頃から実験群（dyマウス

によって運動能力を調べた（対照群2匹のうち1匹の下垂体投与），対照群とも成長が始まった。図4

は6月齢で死亡した）ところ，実験群の運動能力もNorrTBINouseHypophysis Oystrophic MouseHypophysis︵三一五首妄言○心

．●：i・

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3

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（cm）

5

Timo

（min）

図4筋ジストロフィー症マウスの下垂体投与による下垂性小人症マウスの成長（左）と成長後の小人症マウスの金網登り能力（右：E，実験群）。WNCTime：金網登りの累積時間。

1下垂体性小人症遺伝子（dw）による筋ジストロフィー症遺伝子（dy）の潜在化（マウス）7dy−dwマウスにおけるdy 症状の潜在化はば正常であった（dyマウスでは1月齢を境に急激に金網登り能力を失う）。テスト後，脳湿垂，後肢

dyとdwの両退伝子をヘテロに持つ個休（dy／十一・筋湿重，脛骨長を測定した。対照マウスの体重（10．

dw／＋）同志を交配したところ，表現型的に正常な5g），脳湿垂（0．322g），筋湿垂（1後肢あたり

個体，dy個体，dw個体が生まれた。dy−dw個体

0．209g），脛骨長（1．30cm）と比べて，実験群の体（dy／dy・dw／dw）も出現するはず（理論的には1重（10．6と11．0g），脳湿重（0．312と0．329g），／16の確率で）なのに，それらしい個体は1匹もみ

筋湿重（0．246と0．213g），脛骨長（1．30と1．27

つからなかった（5匹の母獣，計10回出産の結果）。

m）に特に異常は認められなかった。脛骨長の三乗

金網登りテストでも，測定した全個体（dy個体を除に対する後肢筋湿重も，実験群で112と104（m釘いて）がほぼ正常な運動能力をもっていた（図5）。

虎）となり，ほぼ正常であった（重症のdyマウス

ただ，dw個体の一部に，加齢とともに眼に異常（dyでは40か汐／廊くらい）。

マウスの特徴の1つ）が現われてくるものがあり，

GH十七＞156day●叫︐t3︵∪盲︶む∈F UZき140day（4．5m．）lTime（min）

Time（min）

f

2

m

3

BWt．HirdkgMuscLe

7．6g

l1．5g

0．26g／leg

9．1

ll．8

0．30

f

O．
N 1

臥Wt．

f

4

8．3

＞

11．9

0．21

8．3

〉

10．9

0．22

Dystrophic
図5重複疾患マウス（筋ジストロフィー症，下垂体性小人症）の金網登り能九4・5月齢でもほぼ正常であった（左図：黒丸印，3と4）が，GHと¶投与で成長するにつれて衰えた（右図）。f，m：雌，雄。

I Whole

8

Anima1dy−dw個体が潜在することが予想された。実際このことは，以下の実験によって証明された。ウシGH

高濃度に含まれることが分かっている。これらは，（約100pg／回）とT4（約10pg／回）をdw個体

害が，結合織の異常増殖による可能性も考えられる（体重約8g）の腹腔内に投与した（隔日，20日間ことを示唆している。

程）。注射開始後数日して成長が始まり，さらに数罷患後肢筋において観察された筋細胞の肥大伸長阻dyマウスで，動物の成長を司る下垂体の発育が悪
12）

13）

日して体重が10gを越える頃になって，一部の個体

く，しかも下垂体中のGH含量が相対的に低いけれ

で後肢のひきずり症状が出現し，金網登り能力も低

ど，GHとT4の大量投与でもdyマウスの症状を軽下した（図5）。このことから，典型的なdy症状減することはできなかった。本研究では，dyマウスのない見掛け上dw個体と思われるものの中に，たの下垂体を投与することで，dwマウスをはば正常に

しかにdy−dw個体がいることが明らかとなった。

成長させることができた。これらのことから，dyマ

現在までに，5匹のdy−dw個体を観察した。

ウスの発症機構において，下垂体機能（成長に関する）異常の直接的関与はないだろうことが示唆され

考察

耐久力が弱っているとはいえ，外見上も，自発運た。ただ，筋側のGHレセプターなどに異常のある可能性は考えられる。

動でも，一応の機能を果している前肢で，筋異常は結

重症の後肢とほとんど同様であることが，組織学的論にも確かめられた。我々は，前肢の骨の伸長成長が

1）2−3月齢の筋ジストロフィー症マウス（雄）後肢の骨の伸長成長に比べて際立って低い（正常マで，自発運動活性は比較的よく保持されていたけ

ウスでも）ことが前肢の軽症の原因であり，骨の伸れど，自発運動の周期性に一部乱れが認められた。

長成長を止めてやればdyマウス後肢の症状も前肢な

2）筋ジストロフィー症マウスで，軽症の前肢の筋

みに軽くなるだろうと考えた。実際，骨を含めて体の組織所見は，重症の後肢の筋とはぼ同様に（時全体の成長をdw遺伝子で止めてやることにより，期的にも）異常であった。

典型的なdy症状が後肢でも出現しないdy−dwマ3）筋ジストロフィー症マウスの下垂体は，正常マウスを作出することができた。dw遺伝子のかわりに，

ウスの下垂体とはぼ同様に，下垂休性小人症マウ

下垂体切除を行うことも考えられる。しかし，症状

スを成長させる能力をもっていた。

が抑えられたとしても，いずれの場合もマウスの健

4）筋ジストロフィー症遺伝子と下垂体性小人症遺康状態は比較的悪く短命である（dwマウスの寿命約

伝子をともにホモに持ったマウスを作出した。こ

6カ月）ことが予想されるので，GHやT4の一喝的のようなマウスでは，筋ジストロフィー症は潜在投与による健康維持の方法を今後考える必要がある。

化した。

骨の伸長成長を特異的にしかも適度に抑制することがもっとも良いだろうと考え，現在dy−bmマウスとdy−brpマウス（bm，短型症：brp，短脚症）の作出を行っている（骨の成長を特異的に抑制する
薬物は見あたらない：CB−154は試してみる必要がありそうである）。
若いdyマウスの前肢鼠後肢筋において線維組織が異常に多く，しかも筋細胞の周囲でも肥厚した線
維組織像が認められた（図3C）。生化学的にも，後肢の発症時すでに前肢筋でもコラーゲンが異常に文

献1）渡辺真美，戸塚 武：筋ジストロフィーハツカネズ
ミ前肢の耐久力の加齢に伴う減衰．医学と生物学．
99：171−173．（1979）2）戸塚 武∴渡辺貴美：筋ジストロフィーハツカネズ
ミの生後発達に伴う後肢筋中ハイドロキシプロリン
含量の変化．同94：327−329．（1977）
3）戸塚 武，渡辺真美：筋ジストロフィーハツカネズ
ミの後肢筋における中性プロテアーゼ活性の生後発達に伴う変動．同97：乃5−237．（1978）
4）戸塚 武，渡辺貴美：筋ジストロフィーハツカネズ
ミの前肢筋における中性プロテアーゼ活性の生後発達に伴う変動．同粥：149−152．（1979）

1下垂体性小人症遺伝子（dw）による筋ジストロフィー症遺伝子（dy）の潜在化（マウス）5）渡辺真美，戸塚 武：筋ジストロフィーハツカネズ
ミの心臓と前肢筋のコラーゲン含量の生後発達に伴う変動．同98：257−2の．（1979）
6）戸塚 武，渡辺真美：筋ジストロフィーハツカネズ
ミの病状進行の機構と対症療法の開発に関する一作
業仮説．同99：1−5．（1979）
7）渡辺真美．戸塚 武：筋ジストロフィーハツカネズ
ミの程患後肢筋組織細胞の発達障害．同93：203−
206．（1976）

8）渡辺真美，戸塚 武：筋ジストロフィーハツカネズ
ミの後肢の運動能力を指標とした病状遅行の病期分類．同95：237−239．（1977）
9）戸塚 武，渡辺真美：遺伝的背景を変えることによる筋ジストロフィー症ハツカネズミの症状の軽政
同101：41−44．（1！冶0）

910）戸塚 武，渡辺真美，吉田 豪：筋ジストロフィー
マウスの病状進行の機構について．昭和53年度本研究班報告書．p88−92．（1979）
11）戸塚 武，渡辺貴美：筋ジストロフィー症ハツカネ
ズミと下垂体位保儒症ハツカネズミに対する成長ホ
ルモンとチ口車シンの影響．医学と生物学．
99：335−337．（1979）12）戸塚 武，渡辺真美：筋ジストロフィー症ハツカネ
ズミと下垂体性保儒症ハツカネズミの発達障害にみられる類似性．同調：225−227．（1979）
13）渡辺貴美，戸塚 武：筋ジストロフィー症ハツカネ
ズミ脳下垂体の塩可溶性分画のポリペプチド成分．
同99：317−319．（1979）2

ジストロフィー筋肉のヌードマウスへの異種移植に関する研究
3H−Thymidineを用いたAutoradiographyによる研究

寺 尾 寿 夫＊
研究協力者 大 沢 仲 昭＊＊

方
且

的

法

筋の移植は，広中らの方法により，ddyマウスの一連の本研究は，ジストロフィーなどの筋肉を，EDL（extensor digitorumlongus）を取りヌードマウスに異種移植して，その再生を観察した

去り，この部位に他のddyマウスのEDLを移植しものであるが，再生してきた筋についてみると，光た（homotransplantation）。移植後，▲2日目

顕を主とする現在までの研究では，ジストロフィーと7日目のマウスを用いて実験を行なった。

筋からのものと，正常コントロールからのものとは使用したアイソトープはメチルの位置に3Hをラ

明瞭な差はみられない。しかし，これらの差異につベルしたthymidine

いては，さらに詳細な観察が必要と思われる。

〃C腹腔内に注射した。

筋の再生がsatellite ceH

で，これを体重1g当り5に由来することはアイソトープ注射6時間後に，エーテル麻酔下によく知られており，これに関しては，幼若な動物でマウスをSacrificeし，移植筋を取り出し，標本作のin vivoにおける研究や，組織培養によるin

製後，dipping法でautoradiographyを行な

Vitroでの観察など，多くの研究がある。また，若った。露出時間は，2週間前後とした。また，後染山らはDuchenne型の筋ジストロフィーの筋で色はH−Eを主として行なった。

Sate11ite cellの数を数えることにより，これ結が正常より多いことを報告している。

果

しかし，成熟したジストロフィー筋を他動物に移まず，ddyマウスのhomotransplantationの植して，再生筋のsatellite ceHの能力を研究

場合の筋の再生についてみると，従来報告してきた

した報告はすくない。

ニワトリの筋の異種移植やminced fragment

われわれは，ヒトなどのジストロフィー筋の法による各種の筋の移植の場合にくらべて，再生は

Sate＝ite cellの再生能力をautoradiography

きわめて良好である。第1図はEDL移植後1ケ月法等を用いて研究中であるが，本報告は，まず，正目のものを示すが，同一方向に揃った筋線経が再生

常マウスを用いてhomotransplantationを行い，し，結合組織の増殖はすくないのがわかる。また，

その再生筋のautoradiography
したものである。

を作製して観察

graftの周辺程，再生が良好で，中心部は空洞または脂肪によって置きかえられている。これらの1
ケ月目の再生筋線経は，ほとんどが中心核を有して＊帝京大学医学部第二「内科学教室＊＊東京大学医学部第三内科学教室

いる（第2図）。

2 ジストロフィー筋肉のヌードマウスへの異種移植に関する研究

第1図

ddyマウスのEDLのhomotransphntation後1ケ月目の再生筋（低倍率）。

第2図l血yマウスのEDLのhomotrans頭mtaticn後1ケ月目の再生筋。

11

I Wも01e

12

Animal

しかし，移植後，日の浅い場合には，第3図の移

このように移植したEDLの中心部の血流を水素

植2日目のH−E染色でみられる様に，移植筋は変クリアランス法を用いて測定すると，移植する前の性を起し，構紋ははっきりせず，核の膨化がみられ正常のEDLの血流は100g当り1分間平均86mBる。移植後1週を経ても，graftの中心部では，同であったが，移植直後は0となり，これは徐々に回様に変性した筋線経がみられるが，周辺部では盛ん

復し，移植後2日目には約40畑．7日目には約70な筋の再生がみられる。

7舶となる。

第5図

ddyマウスのEDLのhomotrans画mtation後2日目の筋（H−E染色）0

り込んだ多数の核より成る層がある。ここではAutoradiography
EDL移植後2E］目の筋を取り出し，autO−

myotubeがすでに形成されている。第5図は，こradiographyを作製したものが，第4図である。

の層の多数の3H−thymidine

これにみられるように，構紋は消失し，無構造にな示している。この様な核は，maCrOphage，った筋線経の周辺の核には3H−thymidineに

fibroblast，Satellite cellなど種々のもの

よるsilver grainはみられず，わずかにback−があると考えられるが，この染色方法ではそれらのground程度のgrainが証明されるのみである。

区別は出来ない。また，第6図は，この層内の各所に形

しかし，移植後，7Elを経たものではthymidineの取り込みは全く異なってくる。
Thymidineの取り込みからみると，7日目の移成されたmyotubeを示すが，この様に新たに形成された鎖状核は，3H−thymidineを全く取り込
まず，この時期には核の分裂は起らないことを示し

植筋は大体3層に分れている。

ている。

1）外層

2）中間層

graftの一番外側には3H−thymidineを取を取り込んだ核をこの外側の層の内側では，donorの筋が残ってお2 ジストロフィー筋肉のヌードマウスへの異種移植に関する研究「・ワ

ニ一一j謄＝ノー▲r止r勝二㌔付加で五山1・■ノ

13＝汀■炉「￣￣￣コ胤こ「iぶ・−￣￣∴￣て警打、￣「￣▼▼J
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第4図

EDL移植後2日目の筋の3H−thymidineによるautoradiography．

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．呈 亡 鴫二二二±二
第5図

移植後7日目の筋の外層のautOradiography13Hthymidineを取り込んだ多数の核がみられる。

14

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第6図移植後7日目の外層のautoradiographymyotubeの核は3H−thymidineを取り込まない。

L芦■

サ志学料

毎恕

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農

瑚

第7図

欝∴∵準

▲1

移植後7日目の筋の和一thymidineによるautoradiogra由y仲間層）

2 ジストロフィー筋肉のヌードマウスへの異種移植に関する研究

15

も
、−●

第8図 移植後7日目の筋のautoradiographyの強拡大。

り，ここでは大部分の核は3H−thymidineをとも考えられるが，水素のクリアランス法による血取り込んでいない。しかし，筋線経のなかには，流の測定では，移植7日目では，血流は中心部でもthymidineをいちじるしく取り込んだ核を有する

かなり回復を示していた。

ものがある（．第7，第8図）。このうちのあるもの

今後，これらのthymidineのuptakeのいちはsatellite cellと考えられるが，勿論その他

じるしい核の中から，Satellite cellを選んでのものもある。この区別は光顕で可能という報告も追求するには電顕またはそれに代る確実な方法が必あるが，電顕による観察を行なう方が確実である。

要と考えられる。

3）内層
これは，graftの最内層，すなわち中心層であり，この中にはdonor側の変性した筋線経が多数みられるが，3H−thymidineによるgrainを有す
る核はほとんど認められなかった。

考案

EDLの移植筋の再生初期におけるsatellite
Cellの活性化が．02の不足によって起るのか，筋の分解物の刺激によるのか，遊走細胞の接触によるのかは明らかでないが，thymidineのuptake
は再生の盛んな周辺部ほど強い。この場合，中心部では血流不足によりthymidine の濃度の低いこ文献1）Snow，M．H．：0rigin ofrcgeneratingmyoblastsin
mammalian skeletalmuscle．1nMuscIeregeneTZZtion（edited by Mauro，A．）Raven Press，New York，
1978，p91．
2）Bischoff，R．：Tissue culture studies onthc oI鹿in
Of myogenic cens during mllSCle regeneration h
血erat．蕗嵐p13．
3）Hsu，L．andTrupin，G．L．：Theroleofsate皿itecens

and myonuclei du血g myogenesis h vitro．ibd．
p115．
4）Xon鹿Sberg，Ⅰ．R．：Re辞nerationorsingle muscle
fibeISincultureaJldinvivo．ibLd．p41．

5）Wakayama，Y．and Schotland，D．L．：Muscle
SatellitecellpopulationsinDuchennedystrophyinmusd￠fegeneration．仏紙p121．
6）Hironaka，T．and Miyata，Y．：Tr，anSPlantationof
永eletalmusclein normaland dystrophicmice．
且甲．肋〟和乙，47：1，1975．

3

ジストロフィーおよび正常チキンにおける
長棟側手根伸筋の交換移殖

＊

徳治 平

＊

＊

五十里 良 生＊＊

＊

正 哲雄

塚中 田

大弘宮

研究協力者

神経と筋の間にはtrophicな相互作用が存在すの変化が筋原性であるかまたは神経原性（厳密な意ることを示す多くの実験がある。従ってジストロフ

味では筋外性）であるか，あるいはどちらの要因がィー症に見られる筋および神経における異常所見かより重要であるかを明確にする目的で以下の実験をらだけでは，その原因が筋の中に存在するのかある行なった。

いは神経側に存在するのかを結論することはできな

本実験で特に留意した点は以下の如くである。

い。筋ジストロフィーの発症の原因を究明する有力な

1）他の筋を傷つけることなく容易に分離できる筋手段の一つは筋あるいは神経の移植実験である。こを用いる。2）ホスト側の筋と移植した筋の混同をの移植実験から得られた結果は筋原性を示唆するもさけるためにまわりの筋となるべく分離した筋を使のと神経原性を示唆するものがあり，ニワトリの筋用する。3）移植筋の収縮をin situ で測定する

3）−5）

ジストロフィーに限ってみても前者を思わせるもののを容易にするために神経および血管がなるべく近と後者を思わせるものに分かれる。この一見矛盾し位端より侵入している筋を用いる。4）移植筋へのた結果はgenetic disorderが両方に存在するこ神経の再支配を図る。一定期間内に全筋への神経再とに起因しているように思われる。

支配を成立させるためになるべく小さな筋を使用す

そこで我々は人の筋ジストロフィー症のモデル実る。5）より定量的に再生筋を得るために，また周験の立場からその度合をより直接的にあらわすと思観組織との癒着を妨げる目的でミンスしないで筋をわれる筋のdynamic propertiesと重量の変化

移植する（cflHironaka＆Miyata，1973a）。

を主な指標にしてより定量的な移植実験を試みた。

これらの条件を満たすものとして生後2〜3日目

先に我々はマウスの長址伸筋を用いて，ミンスすのヒヨコの長槙側手根伸筋（ECRL）を移植筋としることなく全筋を二つの個体の間で交換移植するこて選んだ。

とができ，再生した筋はドナーの筋の殆んど完全な方

replicaであることを示した。この実験系をマウ

法

スの筋ジストロフィー症の原因の解明に適用し，マ将化後2〜3日目のヒヨコをアトロピンで前処置

ウスの筋ジストロフィー症では神経原性の要因がよした後エーテルで麻酔し，背位で羽根を固定，実体

8）9）

り重要であることを示唆する結果を報告した。この

顕微鏡下にECRL筋を露出した。ECRL筋に侵入す

実験方法をニワトリの筋ジストロフィー症に用い，る神経をなるべく筋に近い所で切断した後全筍をとニワトリの筋ジストロフィーにおける筋収縮の性質

り出し，他のヒヨコのそれと交換して移植筋が一定＊東京医科歯科大学医学部薬理学教室＝帝京大学医学部薬理学教室の張力を保った状態で両端を固定した。手術は無菌的に行なった。

17

3 ジストロフィーおよび正常チキンにおける長換側手根伸筋の交換移植

移植後60〜65日目に，アトロピン前処置（100た。神経支配の成立は神経刺激による収縮あるいはpg／kg，i．p．）後，酸素吸入下にエーテル麻酔を

コリンエステレーズ活性の組織化学的証明により確

行ない等尺性筋収縮をオッシロスコープ上に観察し，認した。

Ⅹ−Yレコーダーに記録した。麻酔の深度は眼球運動の停止と一定の呼吸運動を目安に調節した。背位に固定したニワトリの皮膚を切り開きこの皮膚を用結

果非移植ECRL筋の性質：移植に用いたECRL筋

いてパラフィンプールをつくり筋の温度を41〜42の移植前の重量は正常のヒヨコで10．2±0．54mク℃に保った。

（mean±SEM，n＝15），ジストロフィーのヒヨ筋および神経の刺激には白金電極を用い，tWitch

コでは10．3±0．48鱒グ（n＝17）であった。これら

tensionには持続0．5msecでsupramaximalの値の間には統計上の有意差は見られなかった。術の強度の矩形波刺激を与え，tetanuS tenSion

後60−65日目の正常チキンの非移植ECRL筋の重量には上記パルスを100cpsの頻度で200msecの問は1040±28．8mク（n＝21），ジストロフィーチキ与えた。

ンのそれは1104±36．8mグ（n＝33）であり，ジス収縮を観察した後，筋重量を測定し，すみやかに凍結して組織化学的検策に供した後，ホルマリンで固定，HE染色を行ない筋の横断面積の測定に用いトロフィー筋はやや肥大の傾向を示したが，有意差はなかった。
術後60〜65日目に相当する非移植ECRL筋の収表1正常およびジストロフィーチキン非移植ECRL筋の収縮の性質

TWitchTetanic Twitch
tension，tenSion Tetanus（kg／cm2）

Normal1．14！0．1838nDystrophyn

0．44
士0．0516

3．14‡0．2530．38±0．0748

7

1．63±0．1400．27
士0．0186

6

CT

1／2RT Pn／pm（msec）

29

！2．0
8

27
±1．2
7

20

±2．3

0．96

±0．023

8

18
±1．5

8

1．01
±0．0327

7

術後60日〜65日目 Pnは神経刺激による収縮，Pmは筋直接刺激による収縮，nは例数を示す。CT：contraction time，1／2RT：half relaxation time．

桁の性質は表1にまとめてある。ジストロフィーチ

り小さい値を示した。一方contraction time

キンのtwitch t。nSi。nは正常の約40％であり，（CT）およびhalf relaxation time（1／2tetanus tensionは約50％であった。Twitch RT）は両者で有意差を認めなかった。またPn／−tetanuS ratio

はジストロフィーチキンがよ

Pmがジストロフィーチキンではぼ1に近い値を示

I Whole

18

Animal

し機能的には除神経が存在しないことが示唆された。

移植ECRL筋の収縮力は非移植ECRL筋のそれ

この事実はマウスのジストロフィーではPn／Pmはにくらべいずれの場合も小さい値を示したが（表1，

著明な減少を示したことと対照的であった。

3），tWitch tension，tetanuS tenSion，

移植ECRL筋の性質：表2は移植筋の重量に関twitch−tetanuS ratioともにホストが正常であする結果をまとめたものである。ホストが正常の場

るかジストロフィーであるかにより大きな差を生じ

合約60％において移植に成功したが ジストロフィ

ドナーの筋の違いによってはあまり差を生じないとーの場合は約40％であった。移植に成功した例についう結果であった。一方CT，1／2RTでは非移植筋

いての筋重量の平均値もホストが正常である場合は，のそれにくらべ，平均的には，やや速くなる傾向を

よりよい成績を示し，ドナー筋が正常であるかジス示したが，移植筋のタイプの違いによる系統的な差

トロフィーであるかは結果にあまり差を与えなかった。

は見られなかった。

表2筋重量に対する移植の影響
Type oftransplantation

Number of Survival rate ofOperation

Muscle weightmuscle60−65days for successful
after operation transplant
（宅）

Nn

19

58

（mg）

444

±

99．8

n＝11

Nd

25

60

344

士

72．9

n＝15

25

Dn

36

241‡81．O
n＝9

Dd

19

37

235‡62．7
n＝7

mean！S．E．
術後60−65日日

Nn，Nd，Dn，Dd：N，Dはそれぞれ正常，ジストロフィーのホストを示し，n，dはドナーを示す。

考察いがある。ミンスして移植する方法では筋の再生能

表2の移植筋重量に関する結果および表3の移植が強調された結果になるように思われる。人の筋ジ筋の収縮の性質に関する結果はニワトリのジストロ

ストロフィー症のモデル実験としてはある程度出来フィー症においても筋外性の要因が重要であること

上った筋が維持されていく過程を追求することがよを示唆している。筋重畳に関するデータは筋原性要り重要であろう。

3）

因を示唆する他の移植実験と異なるものであるが，機能的な立場から表3に示された収縮力を滅弱さ両実験には扱った筋（3）は胸筋）と移植の方法に違せる筋外性の要因がジストロフィーのホスト側に存

3 ジストロフィーおよび正常チキンにおける良枝側手根伸筋の交換移植

19

表5移植ECRL筋の収縮の性質
Twitch Tetanic Twitch
Type of muscle tension tension
Tetanus

Cで←（msec）（g／cm2）
n

＝

1／2RT

7

Nn

45
±19．4

150
±49．1

0．35
±0．003

24
±1．7

18
±0．7

Nd

83
±34．3

247
±82二8

0．34
±0．020

26
士1．2

16
‡1．1

Dn

15
±5．3

62
±19．9

0．23
士0．046

24
±2．8

19
±1．6

Dd

17
±6．6

55
±23．0

0．25
±0．05126
20±2．3・‡3．6

術後60〜65日日 Nn，Nd，Dn，Dd：N，Dはそれぞれ正常，ジストロフィーのホストを示し，n．dはドナーを示す。

在する事実は興味あることであろう。この筋外性のBanker，R．J．Przybylski，J．P．Van der Meulen，

要因は，ジストロフィーチキンの非移植ECRL筋で

and M．Victor，pP．149−162，Excerpta Medica，
Amsterdam．

除神経はないが収縮力が低下している事実（表1）から，何らかの神経に由来する因子の欠損が示唆される。ジストロフィーの筋が正常のホストで正常の筋と殆んど同じ性質を獲得することから（表2，3），
ジストロフィーの筋が神経性の調節に適切に反応出来ないとする考えは本実験で扱ったパラメタ一に関するかぎりあてはまらないようである。

4）Linkha∫t，T．A．，Yee，G．W．andW止son，B．W．（1975）．
Myogenic．defectinacetylcholinesteraseregulationin muscular dystrophy of the chicken．Science
14：549−551．

5）Linkhart，T．A．，Yee，G．W．，NiebeTg，P．S．and
Wilson，B．W．（1976）．Myogenicdefectinmuscular
dystrophy of the chicken．Devek）PmenlqL BわL．
48：447457．
6）Rathbone，M．P．，Stewart，P．A．and Vetrano，F．
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abnormal thymidine kinase activityin normal
muscles．∫cfe〝Ce189：1106−1107．

7）Hironaka，T．andMiyata，Y．（1973a）・TranSPlanta・tion ofan entire muscleinmice．Experien砲29：
文献1）Gutmann，E．（1962）． 7伽伽〝e′yJred〟〟∫CJe
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2）Guth L．（1968）．Trophicinfluences、Ofnerve on
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3）Cosmos，E．and Butler，J．（1972）．Differentiationof muscle transplanted between normal anddystrophic chickens．in TResearchin 肋scte
peyめpmeが〃〃dJ加〟〟∫Cね郎加dk eds・B・Q・

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8）Hironaka，T．and Miyata，Y．（1973b）．Muscle
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9）Hironaka，T．and Miyata，Y．（1975）．Transplanta・tion ofskeletalmuscleinnormaland dystrophic
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10）Karnovsky，M．J．andRoots，L．（1964）．A
COloring

direct・thiocholine method for cholinesterases．

√助Joc加れq′わCカgm．12：219−221．

Ⅰ

細

胞

培

養

4 筋細胞の異所的Ectopic な発生 23

5 遺伝子挿入細胞の選別に関する新しい試み 26
6

組織培養法による筋ジストロフィー症の研究

29

7 正常及び筋ジストロフィーマウス再生筋細胞の分裂能の比較 34
8 培養骨格筋における活動電位の発達に関与する神経性因子について 40
9 培養筋細胞の成長に及ぼす各種血清の作用について 45

4 筋細胞の異所的Ectopicな発生
培養ラット松果体からの筋分化

岡
研究協力者

渡

田
辺

節
憲

人＊
二＊＊

青

山

裕

彦＊＊

ある組織・器官の中に，全く別の機能をもった細皿のうら側からマーカー・ペンによってマークし，胞が予想外に発生してくる場合がときおり報告されこれらのマークされた部域内で起こるその後の変化

るが，このような場合をいうのに，ある細胞が「異を記録していった。

所的ectopic」に発生した，と表現する。例えば，20日間以上径過した培養は，プアン液で固定しヒトの肺癌などに内分泌機能をもった細胞が出現すて光学けんび鏡の観察に供する。またある培養は，るという，思いがけない事例があり，これらは「異電子けんび鏡観察用に固定・包埋し，培養底面と平所性ホルモン産生」と呼ばれて病理学上の注目を惹

行の方向に超薄切片を製作して電子けんび鏡によっいている。筋肉細胞が，全く予想外の場所に分化すて観察した。

る例として，こ、では松果体という内分泌器官の細結胞培養で分化してくる例を報告し，その意味を考察

果

ペトリ皿にまいた細胞のうち，約50％が，24するご）時間以内に培養基貧に接着する。以後の観察はこれ

材料と方法

らの細胞についてのみ行なわれることとなる。接着

材料はラット新生児である。松果体を注意深く摘した細胞は直ちに扁平となり，上皮細胞様の形状を出し，それらをコラゲナーゼで虞理してから，実体呈する。

けんび鏡下で，松果体茎，被膜をきれいに除去する。

2−3日後には，明らかに区別できる2つのタイ

残った純粋な松果体は，組織観察によると殆んどがプの細胞が認められる。第一のタイプは著しく扁平

単一タイプの細胞の均一な集団からなっている。こであって，培養基質に直接に接着しているものであれらを，コラゲナーゼとトリプシンの混合液で約30る。かなり大形の細胞であって，お互いがかなり密分間虞理してから，ピペッティングによって細胞けに接触している個所もある。しかし，隣りの細胞とんだく液とちる。

へだたった，細胞のfreeな細胞縁からは，このタ培養は，ファルコン・プラスチック・ペトリ皿を

イプの細胞に特徴的な毛様の突起を出している。こ剛、，■培地は6％牛胎児血清を含むイーグルMEM

れら毛様突起の形状，それらが突出してくる細胞表である。37℃，5％CO2−95％空気の条件下で面での位置は刻々と変化している。

約20日間培養を行ない，その間で起こる変化を日

第2のタイプの細胞は，第1のタイプのものより々観察を続ける。その途次に，ある特別なタイプのはずっと小形である。形状は球形であって，直接培の集団が出現しているような場所があれば，ペトリ

養基質に接着することなく，第一のタイプの扁平細＊京都大学理学部＊＊福井医科大学解剖学教室

胞の上にのっかっている。これらの球形細胞の中には小油滴を含むものがある。

24

皿

細

胞

培

養

培養後2週間を径ると，あらたに2つのタイプのもう一つの分化した細胞タイプは，双極性の神経

顕著な細胞の分化がある。その一つは横紋筋繊維で細胞である。これは，培養初期に出現する2つの細あって，これは第一のタイプである扇平細胞から由胞タイプのうちの第2のもの，つまり球形の小形細来するらしい。図1A，Bに示すようにこれらは典胞から由来するらしいことが，連続観察によって判型的な筋繊維の構造を備えている。筋繊維は培養皿っている。これらの神経様の細胞は集合して，細胞の中で，島を作って出現し，そこでは束状・格子状

体がロゼット様の構造を作っていることが多い。そに分布していて，刺戟によって不規則な収縮を繰返

して各細胞間は，ノイロンと思われる長い突起でおした。

互いに連絡している。

図1A．松果体細胞を14日間培養したもの。培養中の生細胞の位相差顕微鏡写真。×160。
発達した筋繊維が見られる。
（矢印でその一例を示す。）
B．松果体細胞を30日間培養した後，ブアン液で固定した標本の位相差顕微鏡写真。
×500。横紋筋繊維に独特の横紋がよく観察される。

4 筋細胞の異所的Ectopicな発生

考

察

25

は，正常の発生において胸腺中に筋分化が起こってラットの培養松果体細胞からの筋繊維の分化は，いるのではないか，という可能性より，胸腺にはリ

けっして量的に数多く起こるものではないが，今ま

ンパ球にも筋織経にも分化できる多筋性をもった幹で行なってきた培養では常にみられる。そもそも松細胞が存在しているのであらう，と解釈された。

果体は系統発生の過程において，光受容器から内分

胸腺の筋分化については，最近鳥類胚を用いて詳泌器官へと変化してきたものと考えられている。哺細な研究が行なわれた。それによると胸腺は，正常

乳頬では，胎生期，幼若期には光受容の機能を示喚の発生において明らかに筋原細胞をもっており，しする構造が一時的に観察されるとはいえ，純粋な内かも興味深いことにこの胸腺筋原細胞は，胸腺のリ分泌器官である。いずれにせよ，このような器官のンパ細胞はもちろん，一般の筋原細胞とも発生的起細胞培養で筋分化の起こることは，予想外といわね

源を全く異にしていて，神経冠（提）から由来する

ばなるまい。

というのであるご）では，培養で分化してくる筋細胞の起原はどこで松果体についても，おそらく松果体の筋繊維ともあるのだらうか？たまたま，松果体摘出時に筋原いうべきものが，正常の発生においても分化してく細胞がまざれこみ，そのまゝ培養されたのではない

るのではないか，と想像される。胸腺の場合と同じか，という可能性は否定されねばならない。なぜなく，こうした異所的な筋肉の発生的起源が，神経冠ら，どの培養例であっても，筋分化は常に起こるかである可能性はある。

らである。

松果体にせよ，胸腺にせよ，このような異所的にすると，筋織経は松果体そのものの含む細胞から発生した筋は数も少ないことであろう。だが，これ分化してきたはずだ，ということになる。では次のらは一体どのような機能をもっているのであらうか？

問題は，松果体内には正常発生においても筋繊維にたとえ少数であっても，それらの異所的筋繊維の異分化するような「松果体筋原細胞」ともいうべきも常が重大な疾病の要因をなす可能性は充分にある。

のが存在しているのか，それとも，本来は内分泌機筍ジストロフィーと関係しても，今後研究されるべ能を行なうべく分化している細胞が，分化転換をしき新しい問題であらう。

て筋繊維を形成したのか，ということになる。第一の可能性を示喚する事実が歴史的にいくらかある。
それは，過去の文献の中に正常の生体の松果体内に少数ではあるが，筋績経の存在を見出したという報
告が，いくらかの材料についてあるのである。もちろん，これらは一例報告的な記載にしか過ぎず，また系統的な研究の対象ともされていない。
予想外の，異所的に分化した筋織経の例としては，
ラットやマウスの胸腺を培養して筋分化か高率に起こることが報告されている㌔）この予想外の実験結果

文

献1）K．Watanabe，R．Nojyo，H．Aoyama，T．Matsuura
and T．S．Okada上）eyめpGrOWrJM〃dβ肋，23：（inpress）

2）H．Wekerle，B．Paterson，U．−P．Ketelsen and M．
Feldman肋餌′ち256：493−394．（1975）
3）H．Nakamura，C．LivreandN．LeDouarin．Personal
COmmunicaiton．

5 遺伝子挿入細胞の選別に関する新しい試み
善

田

＊

輔之寛
＊

＊
＊

英 一 正

口

宏＊

田 田 浦

野

秀嘉志

川

夫＊

目杉 石

＊

＊
＊

焼

田

岡内 須原 河

研究協力者

雄＊ト＊＊

−＊＊

に実用的で具体的成果がすでに色々報告されている。
目的

然し残念ながらこの選別方法は遺伝病細胞に直接利ヒトを含む哺乳類細胞に遺伝子を人為的に挿入し用はできない＿。なんとなれば，この方法は授容細胞とて機能発現を観察する新しい分野がこの数年急速にしてTK￣変異株を利用せねばならないが，ヒト初展開してきている。この方法はヒト遺伝病解析にも

代培養細胞からTK￣変異株を採取することが非常新しい有力な手段を提供してくれる。即ち機能欠損にむつかしいからである。

を示す遺伝病細胞に正常細胞由来の遺伝子を挿入し私達は以上の考慮のもとでTK指標の代りに使えて欠損修復を観察する方向から欠損遺伝子のクローてしかも野生型の培養細胞に利用できる指標遺伝子

ニングを含む基礎的な解析にまで研究が進められるを選択したいと考えた。選んだ遺伝子はジフテリヤ

道になりそうに思われる。

毒素でADPリボシル化を受けないような構造変化

然し残念ながら現状では1つの壁があって遺伝病を示すEF2を生産する遺伝子がある。もしこのよ

細胞研究に直接利用することは困難である。それはうな遺伝子が存在し挿入された細胞内で発現があれ

挿入遺伝子の発現頻度が低く大体10￣6程度である

ば，この遺伝子産物はデフテリヤ毒素耐性という指ために如何に細胞選別が行えるかという難問題が要標に関して優性因子であるから，デフテリヤ毒素に求されるからである。即ち遺伝子発現のない106

よる選別を行なえば生残ってくれる可能性が考えら

ケの細胞を選択的に除去できてはじめて実験が成立れる。もし可能ならこの遺伝子を指標遺伝子としてするのである。

TK遺伝子の代りに用いることでヒト遺伝病細胞解

この陸路を除去する工夫が現在1つ報告されている。
それは授容細胞としてTK￣L株細胞を用い，大量の目的の遺伝子に少量のTK遺伝子を含めた混合遺析に新しい道が拓けることになる。
本研究は以上の思考に立って可能性の有無を検討したものである。

伝子を挿入したのちTK十の表現型に変化した細胞だけをHAT培地で選別してくると，この選別クロ

材料と方法

ーン群では面白いことに同時挿入した目的の遺伝子

デフテリヤ毒素耐性細胞はヒト羊膜由来の株化Fも発現している頻度が異常に高いという現象である。

L細胞から採取された。単層培養FL細胞に紫外線

この現象をCO−tranSformationと呼ぶが，非常照射（15J／㍍）で変異率を上昇さす処理をしたの＊大阪大学微生物病研究所＊＊国立基礎生物学研究所

ち0．1Lfのデフテリヤ毒素存在下で生き残るクローンを採取した。

5 遺伝子挿入細胞の選別に関する新しい試み

27

デフテリヤ毒素による細胞の蛋白合成阻害はす0125mMになるように加えたのち出現するリン酸カ分間の3H−ロイシンの酸不溶性分画へのとり込み

ルシウムゲルを単層培養細胞に添加し37℃17時間量として測定された。

置いた。その後DMSO処理（最終濃度10％）或はデフテリヤ毒素によるEF2のADPリボシル化

不徳化HVJ処理（2，000HAd）を行ったのち3日の定量は細胞をDTT存在下でオクチールアルコー

間培養し，トリプシン処理で細胞を再分散させるとルで可溶化し遠心上滋にPMSFを加えたのちバッ

同時に0．001Lレ／mβのデフテリヤ毒素を培地に加ラァーA（107nM・トリスHCB．507nMKCB，1．5

えて選別を行った。

7nM−DTT，2．57nMEDTA，5％ダリセリ1pH
7．5）で透析したのち14C−NAD及びヂフテリヤ毒

結果と考察

素フラグメントAを加え37015分反応後の酸不溶ヂフテリヤ毒素はよく知られているように2つの性分画中のカウントとして計測された。

サブユニットから成立っている。フラグメントBは染色体の採取は分裂期細胞をTCS液（0．001M，−トリスHC4

細胞表面の毒素レセプターと反応する部域であり，37nMCaCC2，0．1％サポニン）でフラグメソトAは細胞質内でEF2をADPリボシル化

37020分処理したのちダウンスホモジュナイザー

してその活性をうばい蛋白合成を阻害し細胞を殺す。

で細胞をこわし，IM庶糖液に重層して900r．p皿

したがってデフテリヤ毒素耐性細胞がとれるとす

10分遠心上滋を採取したのち，3．000r．p．m20

れば常識的に2種頬の変異が考え得る。1つは毒素分遠心で染色体を集めた。最終的にはHBS液（NaCB

レセプターに変化を示すもので他はEF2がフラグ

8．0才／B，KCBo．379／B，Na2HPO4・12H2b

メソトAによってADPリボシル化を受けないよう

l才／B，Dextrose1g／β，Hepes5み／β，pHに変化するものである。

7．1）に浮遊させた。

我々はデフテリヤ毒素耐性FL細胞を28抹採取

染色体の細胞内への挿入にはCa法を用いた。Hした。之等変異株の毒素に対する蛋白合成阻害度をBSに浮遊させた染色体試料にCaC02を最終濃度

野生株と比較してみると第1図のように2種類の型

一4

−3

−2

Concentratjon

第一図

−1

ofl■iphtheria

01

toxjn（10g

デフテリヤ毒素耐性FL細胞の毒素による蛋白合成阻害度

Lf／ml）

28

Ⅱ

細

胞

培

養

に分類されてしまった。28株の半数ずつがはは等分

200ケほどの耐性コロニーが出現したが，この頻度に両型に分類された。1つの型は毒素の低濃度では蛋はTK￣L細胞に野生型染色体を挿入してHAT選

白合成阻害に耐性であるが10￣3Lf／混あたりか

別で生き残る率よりも大きい値であった。

ら阻害が急速に現われるもので毒素レセプターに変以上の結果はこのEF2遺伝子を用いてCO−化を示すものらしかった。他の型は毒素低濃度域でtransfarmation を期待してヒト遺伝病細胞の遺は野性型細胞と同じような感受性を示すが，約50伝子解析が可能である事を示している。今後の作業％阻害のレベルからは毒素濃度を高くしても低下しとして染色体の代りにDNAを用いて研究を進め最ない性格を示した。後者がEF2構造に変異をもつ

終的には変異EF2遺伝子のクローニングを行う事可能性が強いと判断され，その確認が行われた。無になる。こゝまで進めばいよいよ遺伝病細胞の解析

細胞系で後者の変異細胞のEF2がフラグメソAでに進むことができる。

ADPリボシル化をおこす量を測定してみると約50％のEF2しかリボシル化をうけない事が示された。さらにこの細胞の表面レセプター量を測定してみると野生株と等しかった。以上の考察から後者

第一表EF2変異を示すデフテリヤ毒素耐性FL細胞由来の染色体導入による野性型FL細胞の毒素耐性発現。

の型では2セット存在するEF2遺伝子の1つに変試料

耐 性 コ ロ ニ ー数異がおこっているものと結論された。
次にこの変異細胞の遺伝子を野性型FL細胞に挿入した場合にヂフテリヤ毒素に抵抗性を穫得し得る

染 色 体 な しの 対 照
染色 休 導 入（H V J 処 理 ）181．
7 コロニ「 パ 0 6 細 胞

染色 体 導 入（M S q 処 理 ）231．
0 コロニ「 ハ 0 6 細 胞

かどうかが検討された。変異細胞由来の染色体をリ
ン酸カルシウムゲルに封じて野生型細胞に挿入した
のちデフテリヤ毒素で生き残るコロニー数が測定された。第一表はその結果である。106 細胞あたり3．
3 コロニ「 ハ 0 6 細 胞

6 組織培養法による筋ジストロフィー症の研究
ヒトのジストロフィー筋の培養

米

沢

猛

研究協力者 岡 部 英 俊

我々は，ヒト生検筋を材料として，Duchenne

活発な増殖を示した後，互いに融合を開始し，12型ジストロフィー（DMD）及びその保因者筋の筋

日日頃までには合胞性の多核の筋管細胞（図1）が芽細胞増殖から筋管形成，神経支配に至るまでの経多数形成されてくる。また，この頃までに，運動神

過を器官培養を用いて検討し，この過程のなかでジ

経軸索と新たに形成されてきた筋管との間に接触がストロフィー所見の有無を検索することを試みた。

見られる（図1）。この接触部位では軸索先端は丸

また，筋芽細胞の増殖から筋菅形成にいたるまでのく腫大し，時にはその腫大部が分葉を示すことがあ初期の過程を細胞培養を用いて定量的に解析する試る。3週末頃には筋芽細胞の分裂増殖は減少し，筋みを開始したので，その過程を併せて報告する。

管細胞は緩徐に肥大延長をつづけ，その胞体の長軸Ⅰ）器官培養方向に多数の筋原綿経を認めるようになる。4週を終るころには，少数ながら横紋を有する筋線経の出
実験材料および方法

1〜10才までの正常者DMD患者並びに保因者

現をみるが（図2），数ケ月余を経て未だ同期収縮等の完全な成熟の徴候はみられていない。

生検筋を0，5m角に細切し，コラーゲン塗布カバー

これに対し，脊髄片を加えることなく，筋組織片グラス上に一部はそのまま培養し，また一部は1−のみを単独で培養した場合には，約1週後に，組織

4E］後にWistelr系ラッテまたはICR系マウス胎

片周岡に少数の線維芽細胞が遅出と増殖を示すが，仔（胎齢13−15日）の脊髄横断薄切片を筋組織移植片そのものはほぼ全体にわたり横紋を失なうこ

近傍に添加して培養した。用いた手技はMaximowとなく数週の間保たれていた。しかし，移植片作成

2重カバーグラス法で．培養液組成および液交換はにあたって筋緑経を割断した部位には局所的に変性

既に報告した方法1）に準じておこなった。

が生じ，2週目半ば頃には，その部より筋芽細胞の遊出と増殖が生じ 3週末までには筋菅形成がみら

結果1）対照筋：筋移植片近傍に脊髄を添加すると，1−2日のうちに脊髄より軸索が急速に伸長し筋組れ，一部は移植片筋緑経と融合するに至る。しかしその再生現象は，脊髄を加えた場合に比し，はるかに貧弱である。

織に到達する。これにともなって，それまで極めて

2）DMD筋：DMDについては6例について検良好に保たれていた移植片の筋線経は横紋を失ない索を行ったが，脊髄を加えた場合，筋芽細胞の遊出

急速に融解する。そして移植片周囲に筋の衛星細胞から筋管形成，運動神経軸索との接触に至るまでの由来と思われる紡錘形の筋芽細胞が遊出し，その後

時間的経過は，健康筋の場合とほぼ同様であるが，形成されてくる筋管は対照のそれに比して少数かつ＊京都府立医科大学病理学教室

貧弱であった。また，4週を終える頃より少数の筋

30

Ⅱ

細

胞

図1

図2

培

養

6 組織培養法による筋ジストロフィー症の研究

31

管細胞に槙紋が認められた。このような所見に加て，また移植片筋線経も対照同様数週にわたり良好に保DMD筋では培養開始後1月半を経る頃より，神経存されていた。
3）保因者筋：現在まで1例のみの経験ではある

支配の有無にかかわらず，筋管表面に大小の孔や，部分的な変性像を認め（図3），その所見は既報のが，その所見は全般的に対照とはぼ等しい。しかし，

筋ジストロフィー鶏のものと同一変化と思われる。

脊髄添加の場合，2ケ月を越す頃より，少数ではあまた非特異的ではあるがDMD筋管は対照のそれにるが筋管表面膜にDMD筋同様の細孔の出現とその比して早く変性消失する傾向がみられた。

部の筋栄の顆粒状変性を認めることがある。

筋単独培養の場合の再生過程の時間的経過とそのⅡ）細胞培養程度には対照との間に著しい差はみられなかった。

図る

実験材料および方法った。2代目以降は以下に示す方法ZJで，保因者お兄妹のDMD患者および保因者の各1例より同時よびDMD患者の両培養から同時に筋芽細胞を分離に生検した筋を0．5m角に細切の後，各20コづつし各代5×105Viable cell／dish（5cc）植込み

プラスチック培養ビンおよびペトリ皿に入れて炭酸観察した。

ガス培養器（CO25％，Air95％）内で培養した。

Trypsinization（0．125％，forlOmin．at

培養液は，L15（85％）＋胎仔牛血清（15％）37℃）

を標準として用い，一部の系列はこれに鶏胚抽出液

J10％を加えて使用した。液交換は3日毎におこな

Wash＆Centrifuge（1．0008，2min．×3）

Ⅱ

32

細

胞

培

養

、l

壊されて再生過程が惹起される。又，Maximow法

Filter through1ens paper for elimina

以外では，筋単独培養でもかなりの再生現象がみら

tion of myotube

れるが，この場合も植付けた筋線維そのものは比較l

的早く変性する。このように，筋組織の再生には母Incubationin feeding medium（40min．

体となる筋線経の破壊という唱程が必須の条件であat37℃）

ると思われる。In vitro では脊髄運動神経は移（＝absorption of fibroblasts）

植片中の筋線経との接触は，in vivoの場合のよl

うにre−irmervationがそのまま生じることはなく，

Collection of floating cells

むしろ筋の破壊再生を促すという事実は．どのようIな機構にもとずく現象であるのか今後の検討課題でCultivationin CO2incubatorある。

継代は2代目が20日，3代目は14日目，4代目は24日目におこない，現在4代目観察中である。

また，現在までヒトの生検筋のinvitroでの再生にもとずく完全な成熟は未だ報告されていない

3）

が，この再生過程が組織発生の繰返しであること，
結

果

かつまたヒトの組織発生がかなり長時間を要するも

1）初代：保因者およびDMD何れもはぼ同様ののであることを考え併せると，培養そのものを相当

時間経過をとって発育を示した。即ち，4日目に移長期にわたって維持することにより筋の成熟が見ら

植片よりの筋芽細胞遊出を認め，10日目〜17日

れるものと思われる。従って，今後更に技術的な検目にかけて筋管形成が進行した。

討を加えて長期培養を行う必要がある。

2）2代目：保因者筋芽細胞は継代後2日日頃よ

しかしながら現在までの段階で，DMD筋には，り活発な増殖を示し，4日目には10核以上の筋管

対照筋，保因者筋に比して，筋菅形成が貧弱で槙紋細胞を多数形成したのに対し，DMD筋は，分裂像構造の出現は極めて少いなどの点で差があり，inを示す筋芽細胞は少なく，10核以上の筋管は6日

vitroでは再生そのものがより不完全であることが目まで認められず，その出現頻度も保因者筋に比し示された。また，細胞培養による予備的実験の結果て少なかった。3代目へ移行時の細胞核の増加は保もこの所見を支持しているが，この再生に関する異因者の方がDMDより約2．4倍多かった。

常は，成熟筋のDystrOphi）病変と同様のDMDの3）3代目：2代目と同様の傾向がさらに顕著と遺伝的欠陥による膜の異常5）の一次的な表現である

なり，保因者では4日目に10核以上の筋管が多数のか，あるいは単にin vivo での筋破壊と再生に形成されたのに対し，DMDでは細胞の増殖はほとよる筋芽細胞の疲幣の結果によるものなのかは更にんどみられず，融合の遅延も顕著で，24日を経て慎重な検討を要するものと思われる。

なお最高で8核の中筋管を少数認めるのみである。

さらに，DMD筋管において高頻度にみられた空4代目継代時の細核の増加は，保因者の方がDMD

胞形成と細胞質の部分的変成は，DMDの筋変性がの約4倍多かった。

筋管レベルの成熟に達すれば惹起し得る可能性を示
唆するものと考えられる。今後，筋管の成熟の度合

考

按Maximow法による器官培養で筋を単独に培養しと病変出現との関連性を追求することにより，DM
D解明の新しい手がかりが得られるものと思われる。

た場合には，移植片の変性崩壊がごくわずかに留る
ために再生現象はあまり活発に生じないが，脊髄を加えた場合には軸索との接触により成熟筋組織が破

ま

と

め

以上，ヒトの生検筋を用いてin vitroで筋の再6 組綴培養法による筋ジストロフィー症の研究

生過程の解析をおこない，あわせてDMD筋の再生
ならびに病変形成と筋組織の成熟度の関係につき検索した。今後さらに技術的検討を加えて，in vitro
でヒト骨格筋の発生乃至再生過程を神経支配による完全な成熟にまで至らせ，この過程との関連において，DMDに特異的な病変の成立を解明するとともに，細胞培養を併用してDMD筋芽細胞のふるまいを明らかにする予定である。

文

33

献

1）米沢 猛，有薗直樹，長谷川通規，西明真理：培養法による筋ジストロフィー症の研究。厚生省神経疾患研究委託乳筋ジストロフィー症の基礎的研究（江橋班）昭和53年度報告書，PlO2．
2）Yaffe，D．：Retention ofdifferentiation potential
during prolonged cultivation of myogenic cells．
〝oc．血沈gc上月〝dり61：477，1968．
3）Witokowski，J．A．：Diseasedmuscleceusinculture．
且bL凡卯．，52：431，1970．
4）Morki，B．＆Engel，A．G．：Duchenne dystrophy；
Electron microscopicfindings painting to abasic
Or early abnormalityin the plasma membrane ofthemuscle爪ber・〟e〟′0日〝血甜p．ノ，25：111，1975．
5）Rowland，LP．：BiochemistryofmusclemembfaneS
induchennemusculardystrophy．MuscZe＆NeTye．
3：3，1980．

6）Witkow永i，J．A．，Durbidge，M．＆Dubowitz，V．：
Growth of human musclein tissue culture．An
impfOVedTechnique．血nJm，12：98，1976．

7 「正常成熟（」ソ与）及び筋ジストロフイ発症（dl／aめ
マウス再生筋由来細胞の五九山王γ0 における分裂能の比較」

香

川務＊

研究協力者 智 片 英 治

各種動物で見られる筋ジストロフイ曜患動物の筋，その他 諸組織の形態的仁機能的異常は多彩且つ複

浜 野 理一郎

再生筋由来各単核細胞の，in vitroにおける細胞分裂能を定量的に比較したので報告する。

雑である。我々は，最も顕著な変化を示す筋組織に研究対象を絞り，より単純な条件下で解析を行う為

材料と方法に，正常成熟（十／勾及び筋ジストロフイ発症（dy／

再生筋，8−12週令の正常に57Bl／61／十）dy）マウスから，単核筋細胞を分離し，それらのin及び筋ジストロフィ発症（C57Bl／6J dル旬y）マ

vitroに於ける筋線維分化の実験系を開発した。1・2）

ウス大腿直筋に20％食塩水を注射（正常マウスでこの実験系を用い，筋細胞の増殖，筋線経の分化は各0．1ml／肢，1）筋ジスマウスでは各0．05ml／肢）

筋線経の維持の各段階に於て，in vitroにおける

し，3日後に同筋を採り，再生筋として，以下の各正常筋と筋ジストロ71筋の比較を行い：両者の相実験に用いた。なお，各実験内で用いた．正常 筋

違点を明らかにし，ジストロフィ遺伝子発現による，

ジスマウスの日令の違いは14日以内である。

筋における一次的欠損を知る目的の下に，研究を進

単核細胞の分離 各再生筋を細切し，10mlのめている。我々は既に，（1正常成熟（七4−）及び筋

Fresh mediuml）を入れた硝子遠心管に加え，ピペ

ジストロフィ発症（d〃匂y）マウス由来の各単核筋

ット接伴法6）で，単樹田胞を遊離し，白金網（150細胞は，いづれも，in vitroに於て，収縮性を持−meSh）でろ過，各再生筋由来単核細胞浮遊液を得っ槙紋筋線維分化能を示す事，1・2）（2）dy遺伝子発現た。Fresh mediumの結果とされて来た，筋ジストロフイ筋（dy／凋y）／mlの各細胞浮遊液を調製し，以下の各培養に用いた。

のinvitroにおけるPseudostrap形成3）は，dy

を適宜加え，細胞数100個遺伝子を持たない正常筋（七／十）の培養に於ても，培養方法 0．2％ゼラチン処理，7）60m一mlcon

培養条件によっては見られる乳 について報告し培養皿を用い細胞培養を行った。培養開始24時間た。昭和54年度には，我々は実験系を更に単純化

後，各5mlのGrowthmediuml）で培地交換を行し，正常及び筋ジストロフイ筋細胞の詰性質を定量

い，更に5日間培養し，固定した。培養条件は37

的に比較する目的で，正常及び筋ジストロフイ再生℃，湿度100％，CO25％，空気95％である。

筋由来単核細胞のクローン培養及び同筋細胞の純培
養の技術を開発し報告したミ）今回はこの前者の方法
を用い，正常（−レ与）及び筋ジストロフィ（dy匂y）＊国立療養所刀根山病院

培地の組成（1）Freshmedium EaglgsMEM85％
馬

血

清

10％

鶏胚抽出液

5％

（2）Growthmediuml）※条件培地

90％

7「正常成熟（七年）及び筋ジストロフィー発症（dy／旬y）マウス再生筋由来細胞の宜花山亡γ0における分裂能の比較」

35

10％細胞（筋ジス筋細胞と略す）では5．38±1．13，そのFresh mediumを正常マウス再生

差は1．55であり，有意であった（P＜0．001）（Table

筋由来細胞培養に加え，24時間培養した後，培地2）。正常再生筋由来線維芽細胞（正常緑維芽細を回収し，3000rpm20分間遠心沈殿を行い，胞と略す）の分裂回数は450±0．90，筋ジス再生筋

上宿を条件培地として使用した。なおこの実験で用由来緑維芽細胞（筋ジス線維芽細胞と略す）の分裂

いたEagleもMEM（阪大微研），馬血清（阪大微

回数は4．23±0．84，その差は0．27であり，この差は研），牛胎児血清（M．B．A．）は，各々，同じロッ筋細胞の分裂回数の差に比較し，少さいが，これもト番号のものを使用した。

有意であった（P＜0．02）（Table3）。

牛胎児血清
※条件培地

細胞分裂回数の算定 前記期間培養した各細胞培

実験2 この実験は実験1と同じである。正常，養の培地を棄て，室温で約30分間風乾した後，100

筋ジス培養共，各培養皿当り，500個の細胞を播き，％エタノールで5分間固定し，へマトキシリンで核各11枚づつ培養した。正常培養では．145個の筋染色を行い，筋細胞，線維芽細胞の各コロニ毎に核細胞コロニーと，127個の線維芽細胞コロニーが得数を算定した。核数の正確な算定の困難なコロニー

られ，EE．は4．9％であった（Tablel）。筋ジスは除外した。次の式で定義される×を細胞分裂回数

培養では，52個の筋細胞コロニーと，158個の緑とした。

維芽細胞コロニーが形成され，EE．は3．8％であlogN
X＝7有㌃ N：コロニー当りの核数

った（Tablel）。
正常筋細胞の分裂回数は6．14±1．39，筋ジス筋細結

果胞のそれは5．16±1．15，その差は0．98で，有意であ

実験1正常再生筋由来細胞培養（正常培養と略った（P＜0．001）（Table2）。線維芽細胞の分す）。各培養皿当り，500個の細胞を播き，合計11裂回数は，正常培養では4．44±1．12，筋ジス培養で枚の培養を行い，その結果，392個の筋細胞コロニは4．22±1．05であり，その差は0．22で有意ではな

ーと160個の緑維芽細胞コロニーが形成され，Plat−

かった（Table3）。

ing efficiency（P．E．）は10・0％であったO

実験3 実験1，実験2では，培養皿当り形成さ（Tablel）。

れたコロニーの数は，いづれも，正常培養でより多筋ジストロフィ再生筋由来細胞培養（筋ジス培養

く（Tablel），この事が正常培養中の筋細胞の細と略す）。各培養皿当り，500個の細胞を播き，・合胞分裂を増加せしめた可能性がある。この可能性を計10枚の培養を行い，139個の筋細胞コロニーと検討する為に，実験3を計画した。

115個の緑維芽細胞コロニーを寝た。P．E．は5．1％であった。（Tablel）。

正常培養 培養皿当り，500，250，125の各細胞密度で，各々，10枚づつの培養を行った。各細細胞分裂回数 上記正常及び筋ジス各培養に於け胞密度の培養で得られたコロニーの培養皿当り平均る筋及び線維芽細胞の分裂回数を，各々，各コロニ

数は，各々，18．0，12．1，6．7 であった（Table

ー毎に求め，ヒストグラムに表示し，細胞分裂回数l）。各細胞密度における筋細胞の分裂回数は，各の分布を求めた（Figs．1，2）。正常，筋ジス各々，6．99±1．29，6．89±121，7．00±1・53（Table

培養での筋細胞，線維芽細胞の各細胞分裂回数は，

2），線維芽細胞の分裂回数は，各々，4．41±

いづれも．正規分布に近い分布を示したので，各々1．07，4．32±1．12，4．00±1．33（Table3）であの平均値と標準偏差を求め，平均値の差の検定を行った。筋細胞，緑推芽細胞のいづれにおいても，各った（t一検定）。

々の細胞密度における各細胞分裂回数相互間で，有細胞分裂回数は，正常再生筋由来筋細胞（正常筋細胞と略す）では6．93±1．21，筋ジス再生筋由来筋

意差を認めなかった。
筋ジス培養 正常培養と同様，培養皿当り，500，

エ

36

細

胞

培

養

でable lPlating efficiency and number of coionies fomed per dishin each series of experiment．
Series of e

Source of ce11S

加CL11um Size

恥唱t工．

500

500

500

l（b．of cultures l1

10Pl．efficien

5．1（亀）10．0

Nb．of c01．／ 1．

50．2

500

500

250

125

500

250

11

11

10

10

10

12

10

4．9

3．8

3．6

4．8

5．3

6．8

6．4

8．0

25．4

24．7

19．1

18．0

12．1

6．7

33．8

16．1

10．0

9．1

4．1

12．3

6．3

3．5

2．6

21．5

9．8

6．5

13．9

13．2

4．7

12．9

14．6

11．5、

11．5

14．4

5．1

3．0

5

6

8

9

0
3

35．6

Fiもrこね1ast

0
2
0
ュ

SUTuOTOU uO hUqEnE

極めblast4

7

Number of cell division

1258

7「正常成熟（七4）及び筋ジストロフィー発症（dy／dy）マウス再生筋由来細胞の乃γわγ0における分裂能の比較」

つ ん

4

5

0

⊥

2．

0

SUJuOJOU 叫O hUqEnZ

Figure

2

3

Table

6

7

2

Number of Cell Division of Myoblasts

Series Zncmiunsize Noml（Xn）Pystr・（㌔）㌔一Xd d・f t−Stat・f exDlt．
Of

explt・＿

B甲1t．1SIZe

500

6．93士1．21（373）

5．38±1．13

1．55

510

〆0．001（139）

叫1七・2 500 6・認了9 5・‡笥15 0・98173 pく0・001
取plt．3500

6．99±1．29
（116）

250

6．89＋1．21

（盲3）
125

空：nOrmal・

7．00士1．53（27）

4．98±1．20

2．01

254

pく0．001

1．67

139

pく0．00151

pく0．001（140）
5．22土1．34（58）
4．8！壮1．19
（26）

2．11

d：dystrophy・

Ⅹ：Average number of cell division．
t−Stat．：t−Statistics． d．f：degree of free．
（）：Number of colonies used for the count of nuJttber
Of cell division．

37

Ⅱ

38

細

でable

胞

培

養

3

Number of Cell Division of Fibroblasts
Series工mlum

size
山山ull恥ml（㌔）Of explt・

B甲1t．1500

4．50士0．90（155）

4．23土0．84
（115）

0．27

268

pく0．02

4．44士1．12（121）

4．22士1．05

0．22

275

N．S．

500

4．41士1．07（50）

4．11士1．18
（53）

0．30

301

N．S．

250

4．32士1．12

4．15士1．10
（97）

0．17

123

N．S．

4．32士1．24
（51）

−0．32

71

N．S．

E）甲1t．2

B甲1t．3町Str・（㌔）㌔￣㌔ d・f t−ぬ七・

500

（28）

125

4．00士1．33（22）

旦：nOrmal・（156）

d：dYStrOPhy・

Ⅹ：Average number of ce11division．
t−Stat．：t−Statistics． d．f：degree of free．
（）：Number of c010nies used for the count of nuJ止〉erof cell division．

N．S．：nOt Significant．

250，125の各細胞密度で，各々，12枚，10枚，回数は，正常成熟マウス（セ与）由来筋細胞の分裂

8枚づつ培養を行った。各細胞密度の培養において，回数に比較し，有意に少く，一万，線維芽細胞の分得られたコロニーの培養皿当り平均数は，各々，33．8，

裂回数は，正常，筋ジス両者の間で，殆んど，差を16．1．10．0（Tablel），各細胞密度における細胞分裂回数は，筋細胞では，各々，4．98士1．20，5．22

認めなかった。dyジストロフイマウス筋のinVitroにおける形態的標識とされて来たPseudo−±1．34，4．89±1．19（Table2），線維芽細胞では，

strap形成3）が，培養条件によっては，dy遺伝子

各々，4．11±1．18，4．15±1．10，4．32±1．24（Table

を持たない正常マウス筋によっても，見られる事が3）であり，筋細胞，線維芽細胞のいづれにおい証明されて4）以来，未だ，invitroにおける標識ても，各細胞密度における細胞分裂回数相互間に有が見出されていないdyジストロフイ筋にとって，意の差を認めなかった。以上の結果から．正常，筋筋細胞分裂回数の減少は極めて注目すべき現象であジスのいづれの培養においても，筋細晩線維芽細る。しかし，これが今後の筋ジストロフイ症研究の胞の分裂回数は，少くとも，此の実験で形成された一つの手がかりになるか否かについては，次の三つ

コロゴーの数の範囲では，コロニー密度と関係はなの問題について，明らかにしてからでないと，結論

いと結論出来る。更に．いづれの細胞密度においてを下す事は出来ない。

も，筋ジス筋細胞の分裂回数は正常筋細胞の分裂回日）同一培養期間中に於ける筋ジス筋細胞の分裂回数より有意に′トさく（Table2），線維芽細胞の分数が正常筋細胞のそれより少いのは，筋ジス筋細胞

裂回数は，正常培養，筋ジス培養の間で，有意差をの世代時間が，正常筋細胞のそれに比較し，長い事認めなかった（Table3）。

によるのか，又は，筋ジス筋細胞の細胞分裂が，正常筋細胞のそれより，早く終了する事によるのか。

検討■

以上の各実験結果から，この培養条件では，筋ジストロフイ発症マウス（dル旬y）由来筋細胞の分裂（2衝ジス筋細胞の分裂回数の減少（上記いづ叫の原因によるものであっても）はdy遺伝子発現の直接の結果であるか。

7 「正常成熟（七年）及び筋ジストロフィー発症（dy／dy）マウス再生筋由来細胞の 花γわγ0における 39
分裂能の比較」
文

ほ筋ジス筋細胞の分裂回数の減少は筋ジス筋（dy／dy）に見られる各種異常（筋線経の大小不同，筋線経の断裂，変性等）の直接の原因であるか。
以上の各問題について，今後解析を進め，筋細胞分
裂回数減少の，筋ジストロフイ症（dル旬y）発症に於ける，意義を明らかにして行く予定である。
まとめ

正常成熟（一レ与）及び筋ジストロフイ発症（dn／dy）マウス再生筋由来単核細胞のin vitroに於ける各細胞分裂能を比較した。筋ジストロフィ発症マ
ウス由来筋細胞の分裂回数は，正常マウス由来筋細胞の分裂回数よりも．有意に減少していた。一万，線椎芽細胞の分裂回数は／正常と筋ジスの間で，殆んど，差を認めなかった。

献1）Kagawa，T．，Chikata，E．，and Tani，J．DeveklP．
βわ止55；402，1977．
2）Kagawa，T．，Chikata，E．，Tani，J．，andTsutamune，
T．peygわp．βわ7．65：526，1978．
3）Parsons，R．凡打〟re251：621，1974．

4）香川 務：第12回日本発生生物学会講演要旨集，118．（1979）

5）香川 務：第13回日本発生生物学会講演要旨集，
20A4．（1980）
6）香川 務，智片英治，谷 淳吉，蔦宗俊明：第知回
日本細胞生物学会予稿集，A−28．（1977）

7）Richler，C．，and Yaffe，D．DeyebP．BわL23：1，
1970．

8 培養骨格筋における活動電位の発達に関与する神経性因子について
＊

＊

吉

諦

藤

佐

＊
＊

明 夫 恵

正 捨 三

濃崎本

加 山 山

研究協力者

成熟脊椎動物の骨格筋が発生する活動電位はテト

ベられているものと殆んど同じである。すなわち，

ロドトキシン（TTX）により完全に遮断され，T僻卵11日目のニワトリ胚の胸筋をトリプシン処理

TX感受性Naチャンネルの作用によるものである。

することによってえられる筋原細胞を，コラーゲン

しかし骨格筋が神経支配を断たれると，その発生す塗布したプラスチック培養皿に単層培養する。用いる活動電位はTTX感受性を失う。l）また生れた直後た基本培養液はイーグルの合成培養液にウマ血清

では，骨格筋の活動電位はTTX感受性がなく，生（10％），ニワトリ胚抽出液（2〜5％），L−

後次第に，神経支配に関連してTTX感受性が増しグルタミン（lmM）および抗生物質を加えたものてくる。2）すなわち，骨格尉田胞膜におけるTTX感である。今回用いたニワトリ胚抽出液は，普通に用受性Naチャンネルの発達や維持は支配神経によるいられているニワトリ胚全体からの抽出液ではなく，栄養的影響下にあると考えられる。

神経組織を除いた胚からの抽出液である。すなわち，ニワトリ胚由来細胞培養骨格筋を用いてのこれま聯卵10日目のニワトリから頭取 および脊髄を含での実験か㌃5）TTX感受性Naチャンネルは，

んだままの脊柱を取り除き，残りの部分を2倍量の筋細胞の分化成熟につれて，神経支配なしの状態にタイロイド液と共にホモジナイズし，これを2β00

おいても，筋細胞膜におけるその密度が増加し，骨×タ，10分間遠心してえられた上活である。

格筋細胞の興奮性細胞としての分化を遂げること，

神経組寿軒由出液は，辟卵19日目のニワトリ胚のおよびこのような神経支配なしでのTTX感受性

脳を2倍量のタイロイド液と共にホモジナイズした

Naチャンネルの分化発達には，神経組織からの抽

のち，乙000×タ，10分間遠心してえた。この脳出液が神経支配に代って重要な役割を果しているこ抽出液をさらに，高速遠心あるいは超遠心した上清となどが確かめられている。神経組織抽出液の中に，を，硫安塩折，透晩各種酵素処乳酸処理した後，神経支配を代行しうるいわゆる栄養物質が含まれて筋培養に加えて培養筋細胞膜におけるTTX感受性いると考えられる。今回はこの神経組織抽出液中のNaチャンネルの発達に対する栄養的効果を検定し栄養物質の化学的性質を明らかにすべく実験を行な

た。

った。

単層培養された筋原細胞は分裂して増殖した後，融合をくりかえして多核の筋管とよばれる細胞にな
実

験

方

法

細胞培養の方法は昭和53年度研究報告書3）に述る。培養1週目頃より筋管内に形成された筋原線経による槙紋がみられるようになり，筋細胞にまで分化威熟したことがわかる。培養2週目の筋細胞につ＊北里大学医学部生理学教室

いて，TTX感受性活動電位の発達を調べた。

8 培養骨格筋における活動電位の発達に関与する神経性因子について

41

培養液を塩類溶液に置換した後，倒立顕微鏡下で，の最大値をTTX感受性Naチャンネルの，その筋1本の培養筋細胞に2本のガラス管微少電極を刺入

細胞膜における密度の指標として用いた。

し，その一方を通じて脱分極性のパルス電流を通電

TTX感受性Naチャンネルの静止電位での不活して刺激し，それに応じて発生するTTX感受性の性化を除き，最大の活動電位応答をうるために，細活動電位を他方の電極で導出し，これを電気回路で胞膜に定電流通電を行ない，予め−80mVの基準の微分して，その活動電位の立上り速度を測定し，そ

膜電位にまで過分極した状態で刺激を行った。

表1培養骨格筋のTTX感受性活動電位の最大立上がり速度に対する栄養効果

Fractionadded 7こ轟T Maximum（漂cYfrise
Contro1（59／4）73．8±3．2

2000xG sup．

300

（56／4）84．3±3．0★

20KxG ppt．

40

（31／2）59．8±2．5

20KxG sup．

260

（62／4）96．8±3．4★

Saltrated（Amm．sulf．）
100
0 − 40％（63／4）96．4±3．1★

40 − 60％

50（6り4）87．5±3．2★

Djalyzed
Inner sol．

240

（35／2）91．1±4．2★

Outer sol．

10

（61／4）65．3±3．0

Mean±SE．★indicates a statistically slgnificantincY・eaSefrom the control．
培養液に加えた量は培養皿1枚（3mlの培養液を含む）に対して脳湿重量約50喝に相当する量であり，Lowry法で測定したタンパク量を培養液1ml当りのLLg量で示してある。
括孤内の数は計測した筋細胞数と培養皿数である。

成

果られる。培養液に加えておくことによってTTX感

表1に示めす如く，基本培養液で培養した筋細胞

受性Naチャンネルの発達を促がす活性は．脳抽出（control）におけるTTX感受性活動電位の最大

液を高速遠心（20Kxg，60分）した上清に，また立上り速度の値に比し，脳抽出液（2，000×牙，Sup）

この高速遠心上清を硫安塩析してえられる沈殿画分を加えて培養した筋細胞における値は有意に高い値に回収された。表1には，0−40％および40−であった。TTX感受性Naチャンネルの発達を促

60％飽和硫安分画の効果を示してあるが，両者のがす栄養物質が脳抽出液の中に存在するものと考え間に活性の差はみられなかった。しかしこれは脳湿

Ⅱ

42

細

胞

培

養

重量約50嘲こ相当する量を培養皿1枚当り（3mg

0−33％，33−50％および50−67％飽の培養液を含む）に加えた場合であり，加えた分画

和硫安分画についてタンパ量当りの活性をみると表のタンパク濃度は培養液1mg当りそれぞれ100／げ2に示すどとく，50−67％飽和硫安分画においおよび50／岬であった。

て活性が強かった。

表2 培養骨格筋のTTX感受性活動電位の最大立上がり速度に対する硫安分画のタンパク量
当りの栄養効果

Dilution

1
10

0−

33

％

（27）103．4±4．3（27）108．7±4．5

33

−

50

％

50

−

67

％

（28）100．8±3．8（28）114．0±3．6★

（28）102．8±3．4（28）113．8±4．8★

Mean±SE（V／SeC）．＊Significantlyincreasedin comparison withthe value for controI cultures（95．6±4．7，N：28）at p＜0．01．

Lowry法で測定したタンパク量に基づき，培養液lml当り3．3JL9になるように加えた
場合を稀釈1として示してある。その1／10量の場合が稀釈10である。括弧内の数は計測した筋細胞数である。

高速遠心上宿を透析して透析内液と外液の活性を回収され，可溶性成分であると考えられる。これは調べると，活性は内液のみに認められ外液には認め

透析膜を通過せず，硫安で塩折され，酸処租 タンられなかった（表1）。

パク分解酵素処理で失活する。以上の成績からこの脳抽出液中の活性は超遠心（100Kxg，60分）し活性物質はタンパク質であろうと推定される。このた場合もやはり上宿に回収される（表3，100Kx

物質の分離精製は現在進行中である。生体内での神g，Sup）。この超遠心上宿を各種の固定化酵素を経支配によるTTX感受性Naチャンネルの発達や用いて，37℃で60分間処理したところ，Tryp−維持に対する栄養効果の担い手としてこのようなタ

sinおよびProtease処理では失宿し，RNaseお

ンパク質が働らいているものと考えられる。

よびDNase処理では活性は保たれた（表3）。

筋ジストロフィーのニワトリの骨格筋ではTTX

また超遠心上宿を酢酸処理（pH＝4．3）してえら

感受性活動電位の立上り速度が遅く，6）TTX感受性

れる上清と沈殿を，凍結乾燥して酢酸を除き，再びNaチャンネルの筋細胞膜における密度の低いこと

塩類溶液に溶解した後，培養に加えて活性を調べたが予想される。TTX感受性Naチャンネルの発達が，上清分画にも沈殿分画にも活性は認められず，や維持を担う栄養物質が神経組織中で欠損している酸で失括することがわかった（表4）。

のではないかと考え，筋ジストロフィー系統（413系統）と正常系統（412系統）を用いて同様の筋培

考察

脳抽出液中に含まれる活性物質は，超遠心上宿に養を行ない，TTX感受性活動電位の最大立上り速度を比較した。その成績は昨年度報告したが，7）412

8 培養骨格筋における活動電位の発達に関与する神経性因子について
表5

TTX感受性活動電位の最大立上がり速度に対する栄養効果および酵素処理によるその活性の変化

Maximum rate of rise

Treatment（V／SeC）
Control（8）70．9±5．0

lOOKxG Sup．
Non−incubated（16）113．8±3．5★

Incubated（16）99．8±3．7★

DNase Treated（16）93．9±5．4★

RNase Treated（12）88．7±2．9★

T一ツPSin Treated（16）68．6±4．3

Protease Treated（14）67．3±4．6

Mean±SE・★indicates a statisticallySlgnificantincrease from the control．
培養液に加えた量は培養皿1枚に対して脳湿重量約50喝に相当する量である。酵素処理
は固定化酵素を用い，37℃で60分間行なった。遠心によって固定化酵素を除いた後培養に加えた。酵素を加えずに同様の対照処理を行ったもの（IrlCubtd）についても活性を調べた。括孤内の数は計測した筋細胞数である。

表4脳抽出液のTTX感受性活動電位の最大立上がり速度に対する栄養効果の酢酸処理による変化

Dllution

Supernatant

PrecIpltate1（53）87．4±2．7（49）81．6±3．310（53）83．7±3．9（52）86．7±4．3100（52）85．0±4．0（糾）83．5±3．3

Mean±SE（V／SeC）．Control：82．l±3．9，N＝55．

脳抽出液の超遠心上宿（100Kx9，60分）を酢酸で処理（PH＝4．3）した後遠心（20Kx9，30分）して上宿と沈殿に分画し，これらを凍結乾燥して酢酸を除き，塩類溶液に再び溶解してそれらの活性を調べた。Lowry法で測定したタンバク量に基づき，培養液
lml当り3．3ル9になるように加えた場合を稀釈1として示してある。また括孤内の数は計測した筋細胞数である。

43

44

Ⅱ

細

胞

培

養

文

系統および413系統からの脳抽出液で，TTX感受性活動電位の最大立上り速度に対する栄養効果の活性に関して差は全く認められなかった。また筋ジス
トロフィー系統からの培養筋を長期培養すると（3過）活動電位の最大立上り速度は減少した。今回培養4週についても調べてみたが同様の成績であった。
これは昨年度報告書7）に述べた如く，神経の栄養効
果の欠損によるものでなく，筋原性の膜異常によるものと推定される。

献1）Redfem，P．＆Tneslerr，S．Acね劫γ如上∫α〃止，82：
70−78，1971．

2）Harris，J．B．＆MafSh山，M．W．〟〃拍re〃ewβ0軋
234；191−192，1973．

3）加濃正明，鈴木信之，山崎捨夫，小島久幸，山本三恵：筋ジストロフィー症の基礎的研究（江橋粧）昭和53年度研究報告書，118−122．
4）Kano，M．＆Yamamoto，M．J．CbLZ．LuysioL，90：
439444，1977．
5）Kano，M．，Suzuki，N．＆qima，H．J．αtLLnysioL，
99：327・332．
6）Albuquerque，E．X．＆Warnick，J．E．Science，
172：1260・1263，1971．

7）加濃正明，山崎捨夫，佐藤諦吉，山本三恵：筋ジス
トロフィー症の基礎的研究（江橋班）昭和54年度研究報告書，鉱一89．

9 培養筋細胞の成長に及ぼす各種血清の作用について

小 沢 瑛二郎華
研究協力者

木

村

ニワトリ骨格筋の培養には，多くの場合塩頓や栄

一

郎＊

萩

原

康

子＊

EEに代り得るものである。

養物を含むいわゆる合成培地，例えばEagleの

MTFはニワトリ血清の一成分であり，しかもE

minimum essentialmedium（MEM）やHam

Eに代って，MEMとウマ血清を成分とする液にニのF12などと，ウマ血清とニワトリ胚抽出物（EE）

ワトリ筋細胞の成長を促す効果を与えるということとを混合した培地が用いられる。このような培養液を考慮すると，ウマ血清とニワトリ血清とは何か質中で培養されると筋芽細胞は増殖した後，融合して的に異る物質を含んでいるということが考えられる。

筋管細胞を作り大きなネットワークを作る。また筋

このことは，ニワトリ筋細胞はMEMとニワトリ血細胞に比較的特異的に大量に含まれている酵素にク

清とでできている培養液中では大きく成長し得るこ

レアチンキナーゼ（CK）がある。CKは筋芽細胞とからもうかがわれる。

には殆んど含まれないが，筋管細胞には多く含まれ血清の筋細胞へ及ぼす影響を色々な動物の種に渡ているご 従ってCKの活性は筋管細胞の発達の程度って広く観察することはまだ行われていない。これを示す指標となり得るから，培養液の効果を判定すらのことはMTFのヒトにおける研究の基礎データ

る指標と考えてもかまわない。

として非常に重要であるので，我々は各種鳥類及び上に述べた培養液からEEを除いた液すなわちM

哺乳類の血清について研究を行った。そしてある程EMとウマ血清でできている培養液中でニワトリの度の例外はあるものの，類特異性が存在することを筋芽細胞を培養しても，筋管細胞の発達はみられな認めたので報告する。

い。てれに少量のEEを加えると筋菅細胞の発達がみられるが，このEEの作用は少量のニワトリ血清

材料と方法で代用し得るご）このようなMEMとウマ血清の液にウシ胎児，仔ウシ，ウシ，ウサギ，ブタ，ウマ，

何等かの物質を加えることによって筋管細胞の成長

サル，ニワトリの血清はFlou Ladoratoryよりの程度，いいかえればCK活性をマーカーとして，購入した。コシャモ，チャボ，ウズラ，キンケィ，

その物質のmyogenesisI＿こ及ぼす効果を判定する

キジ，シチメンチョウ，ホロホロチョウ，アヒル

ことが可能である。

ガチョウ，セグロカモメ，ドバト，トビの血清は北

我々はこの方法を指標としてニワトリ血清の中に

大獣医学部大賀，喜田，名大農学部近藤，佐藤教授，

存在し，ニワトリ筋細胞のin vitroでの成長に必都試験場田中分場長からの贈与を受けた。ラット，

要な物質（筋成長因子，MTF）の精製を行った。

ドハト，イヌ，ヒト血清は動物から採取した。

MTFは筋芽細胞の分裂や筋管細胞の成長を促し，MTFの精製法は既に報告した方法に従ったご）

従ってCK活性の蓄積を促すという意味においては，

ニワトリ筋芽細胞は，脛卵11−12日胚の胸筋をコラゲナーゼ処理し単細胞を得た後，differen−＊国立武蔵療養所神経センター機能研究部

ial adhesion 法によって精製して用いた。

Ⅱ

46

細

胞

培

養

に従ったご）の

ラット筋芽細胞は，新生児後肢を細切後，トリプ
シン処理して単細胞を得て用いた。

結培養液：ニワトリ細胞は，85％MEM，15％ウマ

果

血清でできている培養液2．5mのこ他の血清を0．1mg加

ニワトリ筋細胞に対する効果：15％ウマ血清存

えた液で培養した。これと異る場合には別に記した。

在下で各種動物の血清濃度を色々にかえてCK活性ラット細胞は，80％MEM20％ニワトリ血清

蓄積に及ぼす効果について調べた。血清濃度の変化

あるいは90％MEMlO％ニワトリ血清2．5爪βに分はMEM濃度の変化でおぎなった。ニワトリ血清

他の血清0．1mgを加えた液で培養した。

は0．1％あれば有効で，濃度が増すにつれてCKは培養期間はニワトリ細胞では4日，ラット細胞で上昇した。アヒル血清の有効濃度はニワトリよりも高いが，似たような曲線を描いた。ドバト血清は最低は5日であった。

有効濃度は3％と高いが，曲線は急速に上昇した。

細胞の集め方やCK測定法は，既に報告した方法

Etteds ot Vorious Sem

狐伽︵エS至り盲二〇EuE︶と三一UくどU

on chick Myogenic Ceu Growth

Duck
Jr

′′−￣
′′ロ

＿○

●

′′

′′

／

′′職qltbvine
ノr

′
′

ノ
／
′

／

Jr

Bovine．＿．〇一・■〉

083

m

83

1

3

101520ConcentrQtion of Serurn（％）

図1

また胎児ウジは10％以上ではかなり有効であった。

種の血清の濃度一作用曲線が平行でないことは，ここれに反してウシ血清は殆んど有効でなかった。

れらの曲線を用いて平行線検定法等の通常の検定法

20％ではCKを測り得る大きさに迄は成長しなかの適用が容易でないことを示している。従って以下ったものの，顕微鏡下で中程度の筋管細胞の成長がの実験では定量的な比較を行わず，半定量的な表示

観察され，ある程度は有効であると思われた。しかを行った。

し有効濃度差が非常に大きいということは，やはり種々の血清を適当な濃度でMEM−ウマ血清培養

質的に違っていると思われる。また有効であった四液に加えて培養後，生えた細胞中に含まれるCK活9 培養筋細胞の成長に及ぼす各種血清の作用について

47

性を測定した。ニワトリやアヒル血清ではCK活性 存在する場合のCK値を換算した。3．8％ニワトリ
は図1からすると大まかには血清の対数濃度にはヾ 血清の値を1，000として800以上を酎㍑ 200から
直線的に増加することから，すべての血清が3．8％

表1400朝川，30から100を州で表わしたところ表1

Effects of Various Sera on Chick
Myogenic Cell Growthin vitro

︶

︵

︶

︵

十

︶
l

十
︶

︵

︶

︵
■

︵

︶

．

十

■

︵

︶

十

■

■

／

︵
■

︶

︶

十

一

︵

︶

＋

︶

Monkey
Human

︶

ヽ

＋

Dog
Rat
Rabblt
Swjne

■

︶

十

︶

＋

︶

＋
＋

⁝

︶

Herrlng Gull
Dove
Kite

＋ −−

十

︶

TurkeyGuinea FowI
Duck
Goose

︶

︶

＋ ＋
︵ ︵

Korean Pheasant

Mammals
Fetal Bovine
Calf
Bovjne︵＋＋︵＋ ＋ ＋ ＋︵︵／l／l＋ ＋︵Japanese QuailGolden Pheasant

＋
︵

Birds
Chick
Cochin−China FowI
Bantam︶対してホロロチョウ，キジ，シチメンチョウ，キンの結果が得られた。

哺乳類の血清は3．8％ではニワトリの成長には有 ケイの血清はあまり効果はなかった。それに反して効でなかった。たヾし胎児ウシ血清はわずかに有効 ガンカモ目のアヒル，ガチョウ血清はかなり有効でであった。一方鳥類の血清は多かれ少なかれ有効であった。

あった。同じキジ巨でも鶏鶉類は非常に有効なのにAge Effects of Bovine Serum
On Chick Myogenic Cell Growth

Fetal

Young

Adult

0

20

40

60

80

CK Activity（Pi nmol／min／dish）

図2

︵忘苛︑∪盲二戸亡uld︶と盲；UくゞU

Chick

81

O．3

1

3

10

30

100

400800ConcentrQtionof MTF（yg／mt）
図5【ffects of ht SeruM On Rat Myogenlc Cell GroVth5

H【Mhys o†Incubatloll

M【M

90l

ChjCk Serum lO鷺

901

ChjCk Serum lOまRat Serum O．06鷺

図4

49

9 培養筋細胞の成長に及ぼす各種血清の作用について

以上から上記の条件下でニワトリ筋の成長には烏にはニワトリは胎児ウシの約30倍である。これら

頬の血清は有効であるが，哺乳頬の血清は有効でなのことは胎児ウシ血清が有効なのはMTF以外の成いということができる。我々は既にウマ血清の濃度分がニワトリ筋の成長に関与していることを示唆しをいくら高めてもニワトリ筋の成長に有効でないこている。

とを認めている。しかしウシ血清は特例かもしれな

ラット筋細胞に対する効果：図4に示すように，

いと考え，胎児ウシ，仔ウシ，あるいはウシ血清

ラット筋芽細胞は90％MEMl O％ニワトリ血清

20％とMEM80％の培養液の効果を調べたとこから成る培養液中では殆んど成長しなかった。これ

ろ，図2に示すように胎児ウシ血清のみが有効であは80％MEM20％ニワトリ血清中でも同じであった。しかし，MTFをニワトリ，胎児ウシあるいった。しかしこれに微量のラット血清を加えると筋はウシ血清から精製して比較したところ，胎児ウシ

菅細胞が発達する。これらの事実は，ニワトリ筋細とウシのMTFの有効濃度はほぼ同じであり，しか胞の場合と同様の実験系を組むことができるが，こもニワトリのMTFの有効濃度の400倍以上であっの際ウマ血清の代りにニワトリ血清を用いるとよいた。一方図1から分るように，血清で比較する場合ことが分る。

表2

Effects of Various Sera on Rat
Myogenic Ce11Growthin vitro
Bjrds
（＋＋）
︵

︶
︶

1
−

‡
︶
l

■
一

t
■
一
一

●・王

■

各種の動物の血清の比較をニワトリの場合と同様

︶

（＋＋）

︶

（十十）

Korean Pheasant
TurkeyGuinea FowI
Duck
Goose
Dove

・士−

問
問

Japanese QuailGolden Pheasant︵ ︵ ︵ ︵ 〜 l t ︵ ︵tMonkey
Human

t

Horse

■

S両ne

■

Dog

′

Rabbit

︶︶
エT ＋
＋ ＋

Fetal Bovine
BovjneChick Embryo Extract
Chjck

︶︶
＋ ⊥▲
︵︵

MammalsRat

異るようである。

に行った。表2にみられるように哺乳類の血清はラ

哺乳類の場合もこの効果はMTFによるものか否

ット簡細胞の成長に有効であり，鳥類の血清は殆んかを検討するためにニワトリ，ウサギのMTFを精ど有効ではなかった。たヾ鳥類のうちでFEやドバ製して同様の実験を行った（図5）。ウサギのMT

トがやゝ有効かもしれなかった。哺乳頬の血清がす

Fは8JLわ／nleで有効であるのに，ニワトリのMTF

べて同じ程度に有効なわけではないがすべて糾柁示は250／lみ／mgでも有効でなかった。

してある。これは，測定を3．8％の血清存在下で行ったのであまり差が大きく開かなかったためである。

考察

しかしブタ，り了，ラットの血清は特に有効であっ以上の事実から，原則としてニワトリの筋を成長た。しかしこれらの効果も，血清のロットによってさせるためには烏頬の血清が，ラットの筋を成長さ

Ⅱ

50

細

胞

培

養

Effects of Mu〜〔le Trophic Factor

On Rat Myogenic Ce11Growth

5DayIncubation

咋M

76．

Chjck Serum20：！

0．9芳NaC1

4亡

MEM

76繋

Chjck Serum

20号

Rabbjt mF

4誓

MEM

76†▼

Chick Serum
Chick MTF

（8Jg／mり20ミニ
4で・（250二jq／ml）

図5
せるためには哺乳頬の血清が必要であり，その最もらず筋管細胞に変性が起ることは，MTFの類特異重要な部分はそれぞれの頬のMTFであることが分性のためにウマ血清中に当然含まれるウマMTFはる。一方胎児牛血清やEEが槙の特異性を越えて有ニワトリ筋に対してほ無効であるためと考えられる。

効であるように見えるが，胎児牛の場合について示したようにMTFでは類を超えて作用する能力が血清に比してずっと低いことを考えると，胎児牛血清の中にはMTF以外の何物かがあることが推測される。
我々は既に報告したように，3）一度成長したニワト

文献1）Ohtsuki，Ⅰ．＆Ozawa，E．：αJJg汁〟CJ〟reα〝d凡乃C−rわ乃2；367−370，1977．
2）Ozawa，E．＆Kohama，K∴jケoc．血pα乃A甜d．49：
852−856，1973．

とによって変性し再び培養液にニワトリMTF

3）小沢瑛二郎：本研究班昭和53年度報告書，
PP25−31．（1979）
4）Ozawa，E．：伽Vdbp．，Growr力点か脾．20：179−189，

を加えることによって再成長することをみている。

5）Ozawa，E．，Hagiwa∫a，Y．＆Kimura，I．ibid．inpress．

リ筋管細胞は，培養液からニワトリMTFを除くこ

この際MTFを除いた培養液はMEMとウマ血清からできているので血清は存在する。それにもか、わ

1978．

Ⅲ

微

細

形

態

10 チキン骨格筋筋細胞膜の凍結割断像 53

11 ニワトリ筋の微細形態上の多様性 59
12 心筋および骨格筋における筋調節蛋白質の分化 65
13

幼者筋ジストロフィーチキン胸筋の抗トロポニン染色

71

10 チキン骨格筋筋細胞膜の凍結割断像

岩 崎 祐 三＊研究協力者 石 井 弘 子＊

ジストロフィーチキン骨格筋の筋細胞膜の凍結割

粒子密度の測定には40．000倍で撮影した写真を3

断像を報告する。貯化直後，照化後2および5週目

倍に引き伸したものを用いた。電顎写真のcaveolaのジストロフィー鶏（413株）とその対照健常鶏

および膜内粒子の密度の測定，光顕写真の筋線経の（412株）の浅胸筋と後肢外転筋について検索を行

直径の測定には，コントロン社製画像解析装置を用ない，各筋群について，筋細胞膜のcaveolaeの密いた。

度とその分布様式について検討した。、
結

果

材料と方法

今回，検索に用いた筋の筋線経の直径を計測した班長より供与されたジストロフィー鶏および対照結果を表1に示す。5週令でジストロフィ鶏の筋繰

鶏の受精卵を回転照卵器で婿化後，当神経センター

経の径が対照鶏のそれに比らべ大きい傾向が見られで飼育した幼鶏を検索の対象とした。筋組織はネン

るが，筋線経の直径のばらつきは対照鶏のそれと大ブタール麻酔下に採取，リン酸緩衝液（pH7．4，285

差ない。またトルイジンブルー染色標本についてのmOsm）で稀釈した2．5％グルタールアルデヒドで組織学的検索でも，ジストロフィー矧こおける筋線固定した。グルタールアルデヒド固定筋試料を二分経の変性は比較的軽く，少数の脂肪顆粒はみられた

し，一部は凍結割断法による細胞膜構築の検索に用が，筋線経の空胞化や，明白な筋細胞の再生像はみい，一部はオスミウム酸により後同定ののち，エポられず，今回検索の対象とした組織は変性の初期にキシ樹脂に包埋し，光顕的および竃領的観察用切片ある筋組織であると考えられた。

の作製に用いた。凍結割断のためには細切したグル

図1は，鶏化直後の浅胸筋である。表1からも明タールアルデヒド固定筋を25％グリセリンで処理

らかなどとく，鶏化時の浅胸廟は，他の筋にくらべしたのち，銅製試料台にのせ，液体窒素で冷却した線経の径が小さく，またその横断面をみても，円形

フレオン12中で急速に凍結した。凍結試料はエイまたは楕円形のものが多く，成熟した筋線経の多角

コー社製凍結試料作製装置を用いて，試料台温度−形の断面とは明らかに異なる。このような未熟な筋

115℃，真空度1〜2×10

Torrで割断し，割椎の細胞膜の特徴は，CaVeOlaeの配列に規則性が断面に直ちに白金パラジウムの電子線蒸着とカーみられないことである。また，5ないし8個のcav

ボンの蒸着を行なった。割断面のレプリカはハイタ

eolaeの集笈の存在もこのような未熟な筋線維膜のーで処理後，蒸留水で洗い，300メッシュにのせ，特徴のように思われた。⊥方，後肢筋についてみる

加速電圧100KVで写真撮影を行なった。CaVeOlaと，婿化時，筋繰経の横断面は多角形で成熟筋線経の密度の測定には直接倍率1．500〜3．000倍，膜内の形態を示しており，浅胸筋の形態とは異なる。更に，その細胞膜の凍結割断像をみると，CaVeOlae＊ 国立武蔵療養所神経センターの単位面積当りの密度は貯化時の浅胸筋のそれに近

54

Ⅲ

微

細

形

態

図1賂化直後の浅胸筋の凍結割断像
A：対照鶏
B：ジストロフィー鶏

倍率 ×6，000

10 チキン骨格筋筋細胞膜の凍結割断像

表155

Diameters of muscie fibers

Breast muscle

2

day O
Control

Dystrophic

2．7

2．4

＋

＋

0．2★

10．2

0．2

8．8

5

wks．

＋

＋

wks．

0．7

26．8

＋1．3★★

0．5

31．3

＋1．9

★★

pく0．1●

Leg muscle

Conヒrol

8．3

Dysヒrophic

＋

0．2

7．1＋

0．4

★mean

＋

表2

S．E．

11．3

11．1＋

N

＝

＋

0．6

30

0．4

26．6

30．8

★★★

＋1．★＝

＋

2．2

pく0．05

Densities of caveoles（perlOJm2）

B re a st m u sc l e

d ay

O
2 w e ek s

5 veeks

C on t ro ll0 8 ．
6 ＋ 3．
6

1 28 ．
1 ＋ 14．
8

140．
1 ＋ 4．
0D y st rop h ic

ll l ・
5 ＋ 5．
3

1 99 ．
7 ＋ 17．
3

24 1 ．
5 ＋ 5．
2

p く0 ・
5

p＜ 0 ．
01

p で0 ・
001

L eq m u sc l e

C on t ro llO 6 ．
4 ＋ 1．
4

1 40 ．
0 ＋ 9．
2

1 39 ．
7 ＋ 8．
0D y st rOp h ic

lO 5 ．
3 ＋ 2．
9

1 31 ・
1 ＋ 9・
3

26 1 ．
8 ＋ 11 ．
7

P で0 ．
5

p く0 ・
5

p く0 ．
0 01

Ⅲ

56

微

細

形

態

図2賠化後5週目の後肢外転筋
A：対照筋

B：ジストロフィー鶏

倍率 ×15，000

10 チキン骨格筋筋細胞膜の凍結割断像

57

いが，その配列様式は，後述する対照成熟鶏の配列るのに対しジストロフィ鶏ではcaveolaeは膜面にに類似した規則性を示すものが多い。このような所一様に分布しており，単位面積当りのcaveolaeの

見はジストロフィー鶏と対照鶏に共通の所見である。

密度もジストロフィー鶏のそれは，同週令の対照鶏貯化後2週間目の幼鶏の筋細胞膜のcaveolaeのに比らべ有意に増加している（表2）。

密度と配列を後肢筋についてみると，対照鶏とジス

図2は5週令のジストロフィー鶏と対照鶏の筋細トロフィー鶏との間に差異を認めず，いずれにおい胞膜であるが，5過令では浅胸筋，後肢筋ともジスても，対照成鶏に類似した規則性を示している。とトロフィー鶏と対照鶏の問に明白な差異がみられる。

ころが浅胸筋では両者の間に明白な差がみられる。

対照鶏にみられるcaveolaeの規則的な配列はジス

つまり，対照鶏ではcaveolaeの配列が規則的であ

トロフィー鶏では全く失なわれており，ジストロフ

蔓

図5

5準令対照鶏の後肢外転筋
倍率 ×犯000T−SyStemの開口部を矢印，画10CytOticvesicle
を三角で示す。

皿

58

微

細

形

態

イー鶏ではcaveolaeはほぼ一様に配列しており，

eolaeの単位面積当りの密度がジストロフィー筋で単位面積当りのcaveolaeの密度も対照鶏のそれには電顕で観察される筋胞体の変化に先行して，変化

比らべ，著しく増加している（表2）。
図3に，筋線経の透過電顕像と凍結割断像の対比していることは確かなことのように思われる。次に，
このようなcaveolaeの密度の増加が再生筋についを示すが，ここでみられるどとく，凍結割断像でてみられるのか，あるいは変性筋にみられる現象で

caveolaeとしてみとめられる構造は，透過竃顕像

あるのかの点についても，再生筋が，ほとんどないでみられる，T−SyStemの開口部とpinocytoticと考えられる2週令の浅胸筋においてみられること

vesicleに相当するものと思われるが，両者が形態から，変性の初期変化と考えてよいように思われる。

学的に同一のものか否か，更に検討を要するものと更に再生筋の変化をとらえるために，高い過令の動思われる。

物についての検索をすすめている。

考

案

結

論

筋ジストロフィー症における筋細胞膜の異常が示

凍結割断法により明らかにされる，ニワトリ骨格

唆されて久しいが，凍結割断法による筋細胞膜の構

筋，筋膜のcaveolaeの密度と分布は，僻化時には築に関する報告は少ない。Duchenne 型ジストロジストロフィー鶏と対照鶏の間に有意の差が認めら

フィー症については，Schotlandらが膜内粒子の密れないが，ジストロフィー鶏の浅胸筋では餌化後2度に注目して報告を行なってきたが，膜内粒子密度

週目，後肢筋では僻化後5週目に採取した試料におの計測には幾多の技術的困難性があることは，Sch

いて，対照鶏のそれに比らべ，有意な密度の増加とotland自身のdataをみても，初期に発表された配列の乱れがみられ，ジストロフィー鶏の骨格筋では，

datal）と最近の報告2）との問に大きな違いがあるこ筋胞休の変性に先行して．筋細胞膜の変化がおきてとからも明白である。しかも，そのような差異を生いることが推測された。

じた原因について充分な説明がなされていない。したがって，膜構築の異常を膜内粒子の密度を指標として論ずるのは慎重であらねばならぬと思われる。
一方，今回，われわれが指標としたcaveolaeの密度については，凍結割断の技術的影響を受けにくく，膜構築の変化をみる指標としては，膜内粒子の密度に比らべ，より信頼性の高いものと考えられる。しかしながら，CaVeOlaeに重点をおいた，筋細胞膜の凍結割断法による研究報告は少なく予4）特にニワトリの骨格筋についての報告は，われわれの知る限り皆無である。したがって，今回われわれの観察結果についても慎重に論じなければいけないが，CaV

文献1）Schotland，D．L．，Boniua，E．and van Meter，M：
DuchenneDystrophy：Alterationinmuscleplasma
membrane strtlCture．Science，196：1005−1007，
1977．
2）Schotland，D．L．，Bonilla，E．and Wakayama，Y．：
Applicationofthefreezefracturetechmiquetothe
study orIluman neuIOmuSCula∫disease．〟〟JCね
α乃dAkrye，3：21−27，1980．

3）Dulhunty，A．F．and Franzini・ATmStrOng，C．：The
relative contributions of the folds and caveolae
to the surface membraneoffrog skeletalmuscle
fibersatdifferentsarcomerelengths．J．Physibk）gy，
250：513−539，1975．
4）Shanq S．A．，Leung，B．・and Schutta，H．S．：A
freeze−fracture study of fiber types innormal
humanmuscle．エ〟e〟′0エ∫Cえ42：129−138，1979．

11ニワトリ筋の微細形態上の多様性

石 川 春 律＊
研究協力者

月

田

承一郎＊

月

田

早智子＊

筋ジストロフィーにおいて，擢患性は筋の種顎に体筋）について検索した。構細管系の全体的な発達

よって異なるが，その要因についてはまだ明らかに程度，走行の規則性や横走レベルは筋の種類によっされていない。他方，筋緑椎の形態は筋の種類によて多様であった。

り多様である。この形態の多様性を詳細に分析する

筋は横細管の走行レベルから，2種に大別できる。

ことは擢患筋選択性の局所的要因の解明につながる

Z板レベルを横走する筋（Z桟細管系）と，A−Ⅰと考えられる。われわれはこの観点に立って，さき境界レベルを槙走する筋（A−1構細管系）とがあにマウス同一個体内の多数の筋について電子顕微鏡る。ニワトリでは，検索された限り，大胸筋（外層的に検索した。

部のみ検索）のみがZ横細管系に属し（図1），他

今回，ニワトリの各種骨格筋について，筋繰維内のすべての筋は A−Ⅰ細管系に分類できた（図2，

膜系を中心に微細形態的多様性を検索したので，そ3，4）。同一動物の骨格筋において，このようにの結果を報告する。

横細管のレベルを異にする2種の筋が存在することはすでにニワトリのみでなく㌍）ハトでも記載され材料および方法ているご）ゎれわれが今回検索したキンカチョウでも材料として，成熟白色レグホン（1．0−1．8kg体

同じ結果で，鳥類に共通した特性と考えられる。こ重，雄）および，成熟キンカチョウ（雄）を用いた。

のような所見は機能的のみならず進化上の観点からネンプタール腹腔内麻酔で，全身各部から筋組織をも興味深いことで，さらに，ジストロフィーチキン

切り出し，伸展位で，2．5％グルタルアルデヒド・で大陶筋が主な曜患筋である事実との関連で注目さ2％ホルムアルデヒド混合液（カコジル酸ナトリウれる。

ム緩衝液，pH7．3）で前固定を行なった。1％四酸

韻細管の発達程度や走行の規則性も筋の種類によ化オスミウムで後固定ののち，エタノール脱水 エって大いに異なる。同一筋内で線維型による差もあボン812樹脂に包埋した。筋線椎は縦断切片像およるが，筋の種類による差が大きい。ニワトリでは，

び横断切片像として透過電子顕微鏡で観察した。

大胸臥 下肢筋，後広背筋が規則的走行をとるのに対し（図1，2，3），外眼孔毛様体筋は中等皮結果および考察（図4），前広背筋は最も規則性が悪い。キンカチ

1．槙細管系

ョウでは，下肢筋が比較的規則正しい走行を示し，ニワトリ筋では，大胸筋（外層部），前広背筋，

量的にも発達が良好なのに対し，大胸筋や後広背筋

後広背筋，下腿筋（前脛骨筋・総址伸筋），大腿筋

では規則性や発達程度は中等度であった。前広背筋（縫工筋・恥坐大腿骨筋）．眼筋（内側直筋・毛様は不規則な走行を示した。
構細管の走行や発達程度は超薄切片のみの観察で＊東京大学医学部解剖学教室

不十分な場合がある。遅筋として知られる前広背筋

皿

60

微

細

形

態

図1琵監誓墓誌も詣忘禁讐警慧慧している。
では超薄切片にて走行が非常に不規則で，基本的横度と密接に関係していると信じられている。

走レベルを決定するのは困難である。三つ組のレベ

筋小胞体の網目の正面像は筋原線維表面を通る縦ルが多くA−1境界レベルに位置することから推論

断切片にて示されるのみである（図2，3）。同じできるのみである。しかし，硝酸ランタンなどを横縦断切片での筋原線維間に見られる筋小胞体プロフ

細管トレーサーとして，厚さ1仰の切片を超高圧電

ィルを合わせて，立体的構成を推論することができ

子顕微鏡で観察すると槙走レベルが判定できる。不る。しかし，この方法では数多くの筋線経について

規則な走行で縦走する構細管部分が多い中に，短かの量的分析は困難である。われわれは筋線維横断切い巨離ではあるがA−1帯を横走する部分が散在的片で分析することを目標に，上記縦断切片像との対に観察できる。Z板やA幕中央域を横走する所見が比を行なった。

ほとんどないことから，この筋も本質的にはA−1筋′ト胞体網のパターンは基本的には横細管レベル

横細管系であると判定した。

に対応して2型に分類される。ニワトリの大胸筋で2．筋′ト胞体と三つ組

はZ坂のレベルに三つ組が形成され，拡張した筋小筋小胞体の全体的な発達程度や筋筋レベルの形態

胞体終末槽から連続して，A帯に向う比較的一定し分化は筋の種類により多様であった。筋′ト胞体は筋た直径の管状／ト胞体が認められる。この管状小胞体

原線維間にあり，そのおのおのを取り巻くように網はA帯中央で合して，扁平な有窓部をなす（図2α）。

目をなしている。筋′ト胞体の発達程度は横細管系の￣

三つ組を除き，構紋のレベルによる発達の大きな差

発達と相まって，筋線経の収縮活軌 とくに収縮速はない。この筋小胞体網は横断切片像での膜プロイ11ニワトリ筋の微細形態上の多様性

図2ニワトリ筋の筋小胞休正面像
a．大胸筋
b．総址伸筋
筋原線維表面を通る縦断切片で，筋小胞体（旦釘の網目が正面像として観察できる。横細管（整嬰）は大胸筋ではZ板のレベル，総址伸筋ではA一Ⅰ境界のレベルを構走する。

ルとよく対応する。筋原線経の横断レベルとの関連 し，筋′ト胞体がⅠ帯（Z坂を含む）のレベルで著しで，Ⅰ帯やA帯（周辺部と中央部）に一一致した膜形 く良く発達しているのが特徴的である（図2あ，3α）。
態がA帯中央部の有窓性小胞体を含めて明瞭に観察 横断切片像で，Ⅰ帯では筋原線推問に2層の筋小胞できる0体網が形成されていることが多い（図3b，5）。しかニワトリ下肢筋では，三つ組はA−Ⅰ境界に位置 し，A帯では筋小胞体の発達は悪く，H帯でわずか

Ⅲ

62

微

細

形

態

に増加するのみで，筋原線維間の境界は不明瞭であ界のレベルに縦向きに位置しており，それに対応しる（図5）。しばしば，隣接筋原線維相互が連続すた筋小胞休網を示す。三つ組の位置・方向も横断切る像が認められる。後広背筋では三つ組の両側，す片像で判定できる。キンカチョウでも同様の判定がなわち，Ⅰ帯およびA帯ともよく発達した筋／ト胞体できる。

網を示す。前広背筋では3つ組の大多数がA−1境嵩だノ∴・＼■∴∴ヽ㌣∵㌦パ■三二三1

図るニワトリ縫工筋線維
a．縦断切片像
b．横断切片像
縦断切片で見るように，構細管（T） はA−Ⅰ境界のレベルを走り，筋小胞体はⅠ帯（1）のみに発達している。この所見は横断切片像で明瞭に確認できるo A帯（A）では筋小胞体プロフィル（生印）が少なく，筋原線維相互の境界も不明確である。

11 ニワトリ筋の微細形態上の多様性

図4縦断切片で見る外眼筋線維
構細管（室些）はA￣Ⅰ境界のレベルを構走しているが，別、胞体はA帯，Ⅰ帯ともほぼ一様に分布している。内側直筋。

図5横断切片で見るニワトリ総址伸筋線維
横断切片像で，筋小胞体（整印）がⅠ帯（1）で極めて良く発達し，しばしば2層に配列しているのに対し，A帯（A）では発達が比較的悪い。

63

皿

64

結

微

論

ニワトリ骨格筋について，梼細管系および筋小胞体を中心に，微細形態上の多様性を検索した。横細

細

形

態

文

献

1）Mende11，T．R．：UnusualfeaturesoftheT−SyStemOf
thepectralismuscleofthechicken・J・UltrvstTuCt・Re∫り37：383−387，1971．

管系の走行レベルの差により，筋は2系，すなわち，

2）MacNaughton，A．F．：AnultrastruCturalandhisto−

Z槙細管系とA−1槙細管系に大別される。検索さchemical study of the fibre typesin pectralis
thoracica andiliofibulaJis muscles of the fowl

れた限り，大胸筋のみがZ横細管系に属した。この性質は鳥類に共通のものと考えられるが，さらに多種の筋について検索していきたい。
筋小胞体の発達程度や積紋レベルの形態分化は筋（仇肋断お肌融加めJJ血れ118：171−181，1974・
3）徳臣晴比古，上野 洋，植川和利，安藤正幸，出田透：筋の発生過程における変化一特に筋ジストロ
フィーチキンにおける構細管系について−「筋ジストロフィー症の臨床病態および疾学的研究：昭和㍊年度研究成果報告書」，336−343，1979．

の種類により多様であった。筋線維縦断切片像で見

4）Crowe，LM．and Baskin，R．J．：Freeze−fracture of
infact sarcotubulaL membranes．J．UttTDStruct．

る筋小胞体網は，横断切片像における膜プロフィル

月田り62：147−154，1978．
5）Ashhust，D．E．：ThefinestruCtureOfpigeonbreast
muscle．乃∫∫〟e＆CbJJ，1：485−496，1969．

によく反映されていることが確認された。このように，横断切片像から筋小胞体網の発達程度や分布パターンが判定できることから，今後，筋′ト胞体を定量的に観察していきたい。

12 心筋および骨格筋における筋調節蛋白質の分化

嶋 田

裕＊

研究協力者 豊 田 直 二＊筋原線経を構成する筋蛋白質は，骨格筋，心筋お心筋はウサギにより，骨格筋はモルモットにより抗よび平滑筋では，それぞれ抗原性，電気泳動度等の血清を作製した。抗血清の特異性を高める目的で抗性質が異なる型を呈していることが知られているご）心簡TN−T，ⅠおよびC血清は2回骨格筋の筋原

また骨格筋のなかでも速筋と遅筋，2）さらに胸筋と足線経で吸収し，さらにIgGに分離してから骨格筋

筋3）においては，蛋白質が相違していて，異なったのTN−T，ⅠおよびC成分をそれぞれ結合させた型をもっていることが明らかにされている。心筋のシアノゲンブロマイド（CNBr）活性化Sepharose

場合においても，心房筋，心室筋およびPurkinje

4Bカラムにより2−3回吸収した。骨格筋のTN

線経ではmyosinisozymeの型が異なっているこ

各成分の抗体についても，心筋筋原線経と心筋TNとが知られているご）成分を用いて，同様な吸収操作を行った。

一方，胚の骨格筋の蛋白質は成体のものと異なり，ニワトリ胚子のstage9〜38までは胚子全体を発生が進むにつれてその型を変化させ，最終的に成グリセリン処置し，アセトン固定ののち，パラフィ体と同じ性質を持った筋蛋白質に分化していくこと

ン包埋し，全身縦断連続切片を作製した。Stageが明らかにされつつある。5・7）しかし心筋の筋蛋白質

39以上の胚子については，グリセリン処置ののちの分化については，myOSin について調べられて

10／Jmの凍結横断連続切片を作製し，アセトン固定いるのみで，他の蛋白質については未だ詳細には解をした。これらの切片は心筋および骨格筋の各TN

明されていない。

成分より作製した抗体を用いて，FITCを用いた間本研究では，筋の収縮弛緩に関与する調節蛋白質

接蛍光抗体法によって観察した。

troponin（TN）の各成分（TN−T，Iおよび結C）を指標として，発生期における心筋と骨格筋において，それらは個体発生のどのような時期に出現

果

このような抗体を用いて，ニワトリ胚子の切片をし，どのような性質をもち，さらには発生につれて蛍光顕微鏡で観察した結果を表1に示す。Stage

性質に変換がみられるか等の問題について，免疫組l Oより抗心筋のTN抗体によって心臓領域が染色織学的方法を用いて追求した結果について報告する。

され始めた（図1）。同一胚子の連続切片は，抗心筋TN−T，ⅠおよびCの3つの抗体で同時に染色材料と方法された。また胚子の心筋は，骨格筋の抗TN−Ⅰ抗成体ニワトリの心筋（心室筋）および骨格筋（胸体とも反応した。この時期には，骨格筋は未だ形成筋）から，TNの各成分（TN−T，IおよびC）されていないので，いずれの抗体によっても染色さを分離精製し，これらのTN各成分を抗原として，れなかった。
stage14から骨格筋は抗骨格筋TN−T，Ⅰお＊千葉大学医学部解剖学教室

よびC抗体によって同時に染色された（図2）。ま三⊥ここ 芋

66

Ⅲ

微

細

形

態

﹂一二−﹁∴一⁚

図1StagelO（HaTrhrgerrHamilton）のニワトリ胚における心筋と骨格筋。心筋は抗心筋TN−T抗体（a），
Ⅰ抗休（b）およびC抗体（C），さらに骨格筋のTN−
Ⅰに対する抗体（e）によって染色された。骨格筋はいずれの抗体とも反応しなかった。（g一g）。

12 心筋および骨格筋における筋調節蛋白質の分化

図2Stage20のニワト．）胚の矢状断。心筋は抗心筋TN−T抗体（a），Ⅰ抗体（b）およびC抗体（C）・さらに抗骨格筋TN一Ⅰ抗体（e）によって染色された。骨格筋は抗骨格筋TN−T抗体（d）・Ⅰ抗体（e）およびC抗体（f），さらに抗心筋TN−T抗体（a）およびC抗体（C）
によって染色された。

67

68

皿

微

細

形

態

図る S呵野45のニワトリ掛こおける心筋と骨格筋。心筋は抗心筋TN抗体（a，抗TN−T染色；b，抗TN一Ⅰ染色；C，抗TN−C染色）のみと反応した。骨格
筋は抗骨格筋TN抗体（j，抗TN−T染色；k，抗TN−Ⅰ染色；2，抗TN−C染色）および心筋のTN−
TとCに対する抗体（g，i）によって染色された。

69

12 心筋および骨格筋における筋調節蛋白質の分化た胚子の骨格筋は抗心筋TN−TおよびC抗体によ抗体に対する反応性 および骨格筋の抗心筋TN−っても染色された。

TとC抗体に対する反応性の消失期は胚子によって心筋の抗骨格筋TN一Ⅰ抗体に対する反応性は照異なっていた。また骨格筋の抗心筋TNの2つの抗化前のstage38には消失した（図3）。骨格筋の体に対する反応性は，ある胚子ではC抗体の消失が抗心筋TN−TおよびCの2抗体に対する反応性はT抗体の消失より先であり，また別の胚子ではそのstage45以後も残っていたが，貯化後4日までに逆であり，さらに別の胚子ではほぼ同時期に消失すは完全に消失した。しかし心筋の抗骨格筋TN一Ⅰ

るというように個体差が大きかった。

表1ニワトリ胚子の心筋と骨格筋におけるTNの分化。心筋は抗心筋のTN抗体によって細邸10から染色され始めた。また胚子の心筋は，StagelOから婿化前まで骨格筋のTN−Ⅰ抗体によっても染色された。骨格筋は抗骨格筋TN抗体によってStage14から染色され始めた○さらに胚子の骨格筋は抗心筋TN−TおよびC抗体とも反応した。好化後，心筋と骨格筋はそれぞれ心筋と骨格筋のTN抗体とのみ反応した。

Stages（Hatnburger−tlaTnllton）of Chlcken Embryos

TissueAntlbody

agalnst

10

45

Adult

＋

＋

＋

十

＋

＋

＋

十

＋

−

−

一

●

＋

＋

●

1

−

−

一

−

＋

＋

±

●

●

■

±

●

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

−

TN一c

＋

muscle Skeletal TN−T＋＋

Cardiac TN−I
Cardlac20（33−38hr）（50−53hr）（70−72hr）（19−20days）

Cardlac TW−T

Cardiac14

Skeletal TN−工■

Skeletal TN−C

Cardlac TN−T一＋tnuscle Skeletal TN−T

十

＋

十

＋

Skeletal TN−C

十Skeletal TN一工＋■

Skeletal Cardiac TN−C

十Cardlac TN−工

Ⅲ

70

考

微

察

心筋のTN出現はstagelOから観察されたが，この時期より心臓拍動の開始することが知られてお

細

形

態

疫学的に異なった性質をもっており，発生が進むにつれてそれぞれのタイプの筋特有の調節蛋白質に分化してゆくことが明らかとなった。

り8）また筋原線経の形成も観察されているご）このこ

以上の結果から，細胞内における遺伝子の発現機とから心臓における調節蛋白質の出現と収縮構造の構は，心筋および骨格筋の発生において変化してい形成，さらには拍動の開始時期とはよく一致していることが想像される。すなわち，細胞は初期には免ることが明らかとなった。心筋においてTNの出現

疫学的に心筋と骨格筋とを識別することが不可能なが骨格筋より早いのは，心臓の機能開始時期が骨格

一部の蛋白質成分を合成しているが，次第にそれぞ筋より早いためであると考えられる。

れの組織に特有な蛋白質成分のみを合成するように同一胚子の心筋あるいは骨格筋は，TNの3成分なる。しかしなぜ心筋のTN−Ⅰおよび骨格筋のTの抗体により同時に染色が開始された。このことは

N−TとCは発生段階でその型を変化させるが，他TNの各成分の合成の開始は，同一タイプの組織内のTN成分は変化させないのかについては明らかででは同調していることを示している。また胚子期にはない。おそらく高度に複雑な機構が遺伝子の発現は一方のタイプの筋のTNのある成分は，他方のタを制御しているのではないかと考えられる。

イプの筋のTNの同一成分に対する抗体にも反応性を示していた（すなわち，心筋は心筋と骨格筋のT
N−Ⅰの抗体と，また骨格筋は心筋と骨格筋のTN−TとCに対する抗体と反応した）が，このように異なったタイプの筋の抗体に対する反応性は貯化期頃には消失した。骨格筋において心筋TNの2成分

文

献1）Weeds，A．G．andFrank，G．：StruCturalstudieson
tlle ught cha血s or myosh．（わ〟gpr加g肋rb0′
みmp．eM〟．βわエ37：pp9−14，1972．
2）Gauthier，G．F．and Lowey，S．：Distribution of
myosinisoenzymes among skeletalfiber types．
エ（セ〃βわ止81：10−25，1979．

の抗体に対する反応性の消失が必ずしも同調してい3）Wikinson，J．M．：Components oftroponinfrom
chicken fast skeletal muscle．Bibchem．J．169：

ない甲は，合成開始の遺伝情報の発現は各TN成分とも同時であるが，代謝回転速度は各TN成分間に229−238，1978．
4）Whalen，R．，Thorne11，L．E．andEriksson，A．：Heart
Purkinje fibers contain both atria1−embryomiCand

多少の相違があることによるのではないかと考えら

Ventriculartypemyosinlightchains．EuTIOP．J．CbEt

れる。

βわと22；319，1980．（Abstract）．

N−Iと抗原性を共有し．また骨格筋のTN−Tお5）Dhoot，G．K．andPerry，S・V・：Thecomponentsof the tropomin complex and developmentin
skeletalmuscle．血岬．C封月e．127：75−87，1980・
6）Masaki，T．and Yoshizaki，C．：Differentiation of

よびCは心筋のものと抗原性を共有していることがmyosininchick embryos．L Bわchem．rTbkyq）
76：123−131，1974．

本研究によって胚子の心筋TN−Ⅰは骨格筋のT

明らかとなった。しかし胚子期において，1つのT
N成分が2つの抗体（すなわち．心筋と骨格筋にそれぞれ特異的なTN成分の抗体）と反応しているのか，あるいは1つの組織に心筋の抗体と骨格筋の抗体に反応するTN成分が2種あるのかについては明
らかではない。このように，胚子の心筋TN−Ⅰお
よび骨格筋TN−TとCは，親に存在するものと免

7）Roy，R．K．，Sreter，A．F．andSarkar，S．：ChaI唱eS
intropomyosinsubunitsand myosin1ight chains
duringdeYelopmentofchickenandrabbit striatedmuscles．βeyebp．βわJ．69；15・30，1978．
8）DeHaan，R．L．：MorphogenesisoftheVertebrate
Heart．0曙αJ∽ge月e血DeHaan，R．LandUTSprung，H．，eds．，pp．377−419，Holt，Reinhart＆Winston，
NewYork，1965．
9）Manasek，F．J．：Histogenesis of the embryonicmyocardiumdm．J Cbrdわエ25；149−168，1970．

13

幼君筋ジストロフィーチキン胸筋の抗トロポニン染色

大 槻 磐 男＊

トロポニンは骨格筋の細いフィラメント全長にわ

2．抗トロポニン染色 サポニン法と解離フィラメ

たって38mm間隔で分布することがわかっている。成

ント法の二つを併用した。a）サポニン法 胸筋の細鶏胸筋においては，細いフィラメントは約1／Jの一束を解離溶液（0．1MKCBlOmM K−Phosphate

定の長さに揃っており，抗トロポニン処理によって（pH7．0），10mM MgCe2，5mM ATP，OAITM

常に24本の横縞が形成されることも見出されている。

GEDTA）中で，サポニン処理（10，49／me）して，一方細いフィラメントがこのように一定の長さに細胞膜に小孔をあけたのち，やはり解離溶液に溶か揃う過程については，従来適当な手法がないまま，した抗トロポニン抗体で3−5時間処理した。処理不明のまま残されていたが，最近細胞免疫化学的な後によく洗赦し，固定包埋した。b）解離フィラメ手法として，サポニン法が案出され，形成途上の純一

ント法 グリセリン処理筋の細束を解離溶液中でホいフィラメントのトロポニン局在を細胞内で観察す

モジナイズすることによって解離フィラメント標本

ることができるようになった。その結果ニワトリ胚を作製する。これに抗トロポニン処理を施して，カ

胸筋では，細いフィラメント上のトロポニン局在部

ーボン蒸着を施したマイクログリッド上に採った。

位が成鶏に比べて多いこと，すなわち細いフィラメ

3．電子顕微鏡観察 包埋標本はミクロトームで超ントが長いことがこれまでに明らかにされている。

薄切片として，酢酸ウランと鉛で二重染色を施してそして僻化後数週を経て何らかの過程によってはじ観察した。解離フィラメント標本は酢酸ウランでネめて一定の長さに揃った細いフィラメントが完成す

ガティブ染色を施した。

るものと，現在のところ考えられている。
ここでは筋ジストロフィーチキン及びコントロー

結果・考察

ルチキンの幼若胸筋を用いて，抗トロポニン局在部

まずコントロールチキンにつき観察した。その結位を電子顕微鏡的に検索することにより，細いフィ

束第1週の胸筋の抗トロポニン染色では，明らかラメント長の構造形成の過程を追跡し，それらの特にトロポニンの局在部位は一本の細いフィラメント

徴を検討した。

上で24個より多く，最大33個の横縞まで観察することができた。24個の縞をもつものは認められなかっ方法た。けれども3週を経たニワトリ胸筋では，サポニ

1．材料 筋ジストロフィーチキン（413）及び，コン法，解離フィラメント法両方で調べたところ，共ントロールチキン（412）の照化後1遇から5遇までに全例が一本の細いフィラメントに24個の抗トロポの胸筋を使用した。またこれらから，グリセリン筋

ニン縞を形成していることが見出された。この結果も作製した。

は照化後，3週以内に細いフィラメントの短縮化が完成するという従来の観察に一致するものであった。

＊九州大学医学部臨床薬理学教室

一方，ジストロフィーチキンでは，1週めの標本

72

Ⅲ

微

細

形

態

■ † J ⁚ ▼第1図好化後3過コントロールチキン胸筋の抗トロポニン染色（解離フィラメント法）40，000倍
抗トロポニンは，中央のZ帯から左右にのびる細いフィラメント上に24本の横縞を形成する。（図の左右の数字は横縞の数を示す）

13

幼若筋ジストロフィーチキン胸筋の抗トロポニン染色

転義縫盛感

ぎ巧揖I・三吉丁‥‥￣㌻
第2区l婿イヒ後1週ジストロフィーチキン胸筋の抗トロポニン染色（サポニン法）40，000倍
細いフィラメント東上に抗トロポニンによって形成される25〜28本の横縞が見られる9

73

74

Ⅲ

微

細

形

態

第5図解化後4週ジストロフィーチキン胸筋の抗卜。ポニン染色（サポニン法）40，000倍
抗トロポニンが・細いフィラメント束に24本の構縞を形成している。

13 幼若筋ジストロフィーチキン胸筋の抗トロボニン染色

▲鼠訟FL
26

24

24

26

第4図

貯化後5週ジストロフィーチキンの抗トロポニン染色（解離フィラ
メント法）45，000倍
抗トロポニンは24〜26本の縞を細いフィラメント上に形成する。

75

76

Ⅲ

微

細

形

態

においては，細いフィラメント束に形成される抗トのの，少数の24より数の多いフィラメントの存在を

ロポニンの縞の数は，25ないし30であって，やはり認めることができた。

24より大であることが見出された。一つの束の中で以上の結果は，筋ジストロフィーチキン胸筋にお長さが必ずしも揃っているのではなく，部分的には

いては，細いフィラメントの短縮化の過程が，コン揃っているが，全体として種々の長さが共存するこ

トロールチキンに比べて明らかに遅延していることとが観察された。ただ槙縞の数が24またはそれ以下を示すものである。この差異と発症との間の関係をのものは観察することができなかった。コントロー

明らかにするためには，今後筋ジストロフィーチキ

ルチキンの例でも同様であった。そして，2過，3ンのフィラメント形成の過程を，さらに詳細に，ま週と週を経ても大約同じ傾向が観察されたが，4過た異った部位の数種の筋肉について追跡する必要がの標本になると，細いフィラメントの長さが比較的あるものと考えられる。

良く揃ってきて，抗トロポニンの縞数が24個のものが明瞭に認められるようになった。24より数の多い場合も共存した。5週浸なっても，抗トロポニン
縞数が24より多いものが存在することが認められた。
なお，約3ケ月を経たジストロフィーチキン胸筋でも，24本縞の細いフィラメントが大多数を占めるも

文

献1）I．Ohtsuki，T．Masaki，Y．NonomuraandS・Ebashi
JβわC加m．61：817・819，1967．
2）Ⅰ．Ohtsubエβぬぐ加〝も75：755−765，1974
3）I．Ohtsuki，R．M．Manzi，G・E・PaladeandJ・D・
Jamiesonβわエα仇，31：119−126，1978．
4）Ⅰ．OhtsukiJβわC触れ85：1377−1378，1979・

Ⅳ

生

理

学

14

筋の生理学的性質の発生的研究

79

15筋ジストロフィー鶏骨格筋skinned fiberの短縮速度

84

16 培養法による鶏ジストロフィー筋の
電気生理的，形態的及び代謝的特性について 89

17Myotoniaラットにおける筋細胞膜と神経筋伝達の性質について97

14 筋の生理学的性質の発生的研究

高 橋 国太郎＊

Ca活動電位は最初甲殻類の横紋筋細胞膜におい問で受精をおこなった。この時点を発生時間零として発見され，その後心筋細胞膜，平滑筋細胞膜，内た。受精卵を10±0．5℃の恒温槽中に入れたシャー分泌細胞，神経終末部とくに伝達物質放出箇所附近

レ中で飼育した。この発生卵を8・16細胞期のそれなど多くの興奮殿田胞膜に見出だされている三）一方，ぞれの時期でlpク／mβのサイトカラシンBを含む海細胞分化の起始点である卵細胞膜においても，ホヤ

水に入れ，さらに対照の卵からオタマジャクシ幼生

卵・ヒトデ卵・マウス卵・ハムスター卵など多くのが貯化するまでの期間飼育した。その後，この分裂2）場合についてCa活動電位が見出だされている。

停止胚のコリオン膜をプロネース10mグ／血βを含む

ところで細胞内Ca2＋は筋収縮・伝達物質の放出

海水に入れて除去した。ただちに牛血清アルブミン

発生時における受精変化・細胞分裂など各種の細胞内運動系の制御に役立つと考えられており，とくに

10m〆7畑を含む10℃人工海水に入れて実験をおこなった。実験は定電流刺激により活動電位を観察す

細胞膜に作用してCa2＋透過性を高めるCaイオノフ

る方法，および膜電位固定法により膜電流を解析すォアにより細胞内運動系の変化がおこることが種々る方法によりおこなった。実験にもちいた標準の人報告されている。したがって天然のCaイオノフォア

工海水の成分は100mMSrCB2，400mMNaCB，であるCaチャンネルが特真的な細胞内運動系として10mMKCB，5mMPIPES−Na（pH7．0）で必要の筋細胞にとって重要な膜特性であることは想像にに応じSrをCaに置換し，Naをコリンに置換した。

かたくない。とりわけホヤ幼生の横紋筋細胞では筋

また標準の人工海水としてSr海水をもちいたのはCa

細線経が細胞表層にのみ存在し，表面からのCa2＋

チャンネルの電流を増加して観察するためである。

流入によって収縮の抑制がかなりの程度おこなわれている様に思われる。したがって筋細胞膜の分化形

研 究 成 果質としてCaチャンネルに注目し，Ca電流を解析する

1）ホヤ分裂停止16細胞胚におけるCa電流の発達。

ことにより筋細胞の胚細胞からの分化過程を調べる

初期胚で分裂を停止したホヤ発生卵においても興奮ことを目的とした。

性膜は分化し，NaおよびCl活動電位が出現することはすでに報告した。とくに16細胞胚で分裂を停止

研 究 方 法した場合には個々の割球も大きく，膜の分化過程の4℃の低温海水槽に抱卵したマポヤを保存し，・必

どの時点でも膜電位固定法によりCa電流を解析す

要に応じて1個づっ12℃の小型海水槽にうつして，ることができる。また分裂停止胚においても正常の翌日放卵・放精させた。この卵精子海水から卵と精対馬胚・幼生と同じく発生のある段階までは（オタ子をナイロン網で分離し，異個体からの卵と精子のマ．ジャクシ幼生の初期∴9℃海水中で受精後50時間），細胞間の電気的連結が強く，胚は電気的に一＊東京大学医学部脳研究所神経生物学研究室

つの細胞のように振舞う。したがって膜電位固定下

Ⅳ

釦

生

理

学

CA CuRRENT
xl√9A
−15

▲

●0

0 ⑳◎

0

ノ

○

●
●
●

ー5

㌧＿．。。＿
ノ
二転トト「−…㌫
ACh′E

ACh−r

Syn

区‖ ホヤ分裂停16細胞胚におけるCa電流の発達。胚を30mMCa2＋を含む人工海水中におき，膜電位因定法により，最大のCa電流振巾をもとめた（縦軸）。15℃における受精後の発生時間である。

で測定されるNa電流およびGl電流は全胚表面での含む割球でもB5＿2は殆んどCa電流をしめさず，総和となる。この分裂停止16細胞胚におけるCa電A5＿1，A5＿2（いずれも植物半球側）割球も膜電位依流の最大値を縦軸に発生時間（15℃における）を横

存性の電流を示さなかった（図2のnon−Ex type軸にとって示したのが図1である。白丸は卵細胞膜参照）。動物半球側のb5＿3，b5＿4等を含む小割球群にあったCa電流が発生初期に一端減少することをは互に電気的に連結して遅延整流性K電流を殆んど示し，興奮性膜の分化につれて再びCa電流が増加

伴なわない純粋のCa電流を示した。この割球群は古してくる様子が黒丸で示されている。

典的に表皮細胞になることが知られているものであ

先にのべた森な分裂停止した16細胞胚にあった細る。この予定表皮細胞割球群にみられる活動電位は

胞間連結は発生50時間後になると一部割球間では切K電流が殆んどないので極めて持続長く2〜3秒もり離されて，割球個々の興奮膜特性を調べることがあるのが特徴である。なお，a5−3，a5−4の割球はあできる。古典的に初期胚の各割球には名前がつけらる頻度（60％ぐらいの胚で）で表皮細胞型小割球群

れており，その発生予定運命もわかっている。このと電気的に離れ遅延整流性K電流を伴うNa電流を

分裂停止16細胞胚についてCa電流の出現する割球示した。これらの割球は古典的にオタマジャクシ幼を調べてみると次のことがわかった。植物半球側に生の脳胞になるものでNa電流は神経細胞型の活動あって予定筋細胞域を含むB5−1割球は100％の頻電位に対応することがわかった。また表皮細胞型の度で遅延整流性K電流を伴うCa電流を示し（図2，

割球群にもNa電流がわずかに見られたが，このNa

Muscle type参照），定電流刺激に対しては正常

電流は神経細胞型のものとは異り，活性化の閉値がのオタマジャクシ幼生にみられるものと同一のCa

10血Ⅴ以上も低く，卵細胞膜にみられるNa電流とスパイクを発生した。しかし同様に予定筋細胞域を同一のものである。したがって動物半球側には卵細14 筋の生理学的性質の発生的研究

81

B4二1（8−Cell）
EpitheL．type MuscLetypenon−ExcitQbte（42％）（29％）（29γ。）

38mV L
18mV

SurfGCe Areq

EpithcL．type
Muscle typenon−ExcitQble
0

0．25

0．5

0．75mm

図2上図はホヤ分裂停止8細胞胚における膜電流の三型を示したもの。記録した割球は植物半球側のB4−1。％は記録した胚の総数の中における出現頻度。下図は膜電流の三型に対応す
るB小一1。割球の全膜容量。

胞由来のNaチャンネルが残っているものと思われた。

では筋細胞に見られるものと同一のCaスパイクを発

2）ホヤ分裂停止8細胞胚におけるCa電流の発達。

生した。またBHは約40％の頻度で動物半球側の細胞分裂を8細胞期のときに停止した場合でも植物

小割球群a4＿2（×2），b4−2（×2）と電気的に連結し，半球にある大割球のうち尾側にあるもの，すなわち全体としてK電流を伴わない表皮細胞型のCa活動

B4＿lは約30％頻度で遅延整流性K電流を伴うCa

電位を発生した（図2，Epithel type）。ときに電流（図2，Muscle type）を示し，定電流刺激

B4＿1は電気的には単離していても興奮性を示さず非

82

Ⅳ

生

理

学

A23187−treQted．ControI
B5−1（16cclL）B51（16ccll）

ロ巴くりUロー﹂⊃S
0UUDLUISUエリ＜

図5上図はホヤ分裂停止16細胞胚Bト1割球の筋細胞型への分化阻害を示したもの（本文参照）。中図はその時の割球の全膜容量。下図はアセチルユリンエステレーズ
活性の出現の頻度である。

興奮型になった場合もあった。なお小割球群のうちえていた。これはB4＿1の筋細胞型の分化に他、表面

a4＿1はときに電気的に単離して神経細胞型のNa電膜の陥人等の変化がおこっていることを示唆した。

流を示すことがあった。B4＿1割球は上にのべたよう

表皮型に分化したB4＿1割球も容量が増大したが，こに筋細胞型・表皮型′非興奮型と三つの分化形式をれは動物半球側の小割球と電気的に連結し，見掛けとることがあったが，筋細胞型になった場合はアセ上の表面積が増加しているためであることがわかった。

チルコリンエステレース活性がみられ膜容量からみ3）筋細胞型への分化と細胞内Ca2十の影響。分裂ると細胞表面積が非興奮型にくらべて5倍近くもふ停止した16細胞胚のB5＿1割球はつねに筋細胞型に

14 筋の生理学的性質の発生的研究

83

分化することを確めたので，この割球をもちいて細胞胚となっており，一つの割球がモザイク的に分Ca2＋が筋細胞の分化に影響を及ぼすかどうかにつ化することがないように思われた。一万16細胞胚のいて実験をおこなった。まず発生卵を16細胞期でB5＿1割球は正常胚では予定筋細胞領域のはかにかな

サイトカラシンBを含む海水中に入れ分裂を停止す

りの部分の内胚葉性の領域を含んでいる。したがっる。さらに対照の正常胚が神経胚となった時点で，てこのB5＿1割球が100％筋細胞型になるということ

このサイトカラシンBを含む海水中に20J上Mの濃は割球内に2つ以上の分化因子を含んでいても結果度でA23187を加える。そして対照の正常のオタマとしては一種類の分化形式しか示さないことを意味

ジャクシ幼生が脛化した時点でA23187を加えたもした。さらに8細胞胚で分裂を停止した場合は，B41のと加えないものの胚のB5＿1割球を比較した。図3

割球は40％の頻度で小割球群と連結して表皮型にに示すように，A23187を加えた場合はB5＿1の筋細分化する場合もあるが一晩B4＿1が筋細胞型に分化

胞型への分化は全然みられず非興奮性細胞型となっする場合は16細胞胚のB5＿1とまったく同一一のCaた。一方A23187を入れなかった場合は著明なCa内

スパイクを発生し，アセチルユリンエステレース活

向き電流と遅延整流性K電流を示した。この様な筋性は割球全体で陽性となった。したがって，ある割細胞型への分化の阻害に伴って膜表面積の増加をし球の筋細胞型の分化は割球を一つの単位として表現

めす容量の増加も見られず，筋細胞型への分化の特され，分化の発現はある意味でaH or none

徴の一つでありアセチルコリンエステレース活性もおこなわれているものと考えられた。

に殆んど出現しなかった。
文

研究の考察
分裂停止した16細胞胚のB5＿1割球あるいは8細胞胚のB4＿1割球では筋細胞型への分化にともない電気的興奮性からみるとCaスパイクが発生し，またコ
リン感受性細胞膜の特徴であるアセチルコリンエス
テレースの活性が見られた。また予備的な電子顕微／鏡による観察からも割球全体にホヤ筋細胞の特徴である細胞膜直下への筋細線経の集積とミトコンドリ
アの包理がみとめられた。つまり割球全体として筋

献

1）Reuter，H．Divalent cations as charge carriersin
excitable membranes．丹0＆βわp々γ且 椚○エβわ上，25‥㌻43，1973・」
2）Okamoto，H．，Takahashi，K．and Yamashita，N．
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5）Takahashi，K and Yoshii，M．Development of
Sodium，Calcium and Potassium channelsin the
CleaYage−arreStedembryoofanascidia．JIPhysibL．
inpress．

15筋ジストロフィー鶏骨格筋Skinned fibenの短縮速度
＊

実忍徹

＊

典輔

＊

内

康桂

田

＊

角 堀

＊

藤木塚

遠 八 石

研究協力者

、江橋，大槻はジストロフィーチキン胸筋の細いフ緩液に浸す。このとき一過性収縮を起こすが，筋がィラメントにおいては抗トロポニン抗体結合の結果短縮しないよう長さは一定に保った。実体顕微鏡下の横縞の数が正常よりも多い（すなわちジストロフに，上記のサポニン添加弛緩液中で単一筋線経を分ィー筋の細いフィラメントは正常筋よりも長い）こ離し，その筋節長が一様な約3mmの部分を選んで用とが多く，この点で胚の筋肉に類似していることをいた。実験はサポニンを含まない液中で行ったが，1）2）報告した。一方，我々が先に見出したことであるが，筋線経はすべて30分以上サポニン含有液中に浸って骨格筋の長さ−張力関係はCa濃度によって非常にいるので，いずれも十分chemically skinned

異なり，ことに筋節長が約2〝m以下でフィラメント

fiberの状態になっていると考えてよい。

同士の重なりが過剰になる領域においては，高Ca

線経の両端は絹糸でしぼり，その糸をそれぞれ2濃度による発生張力は筋節長が短くなってもそれほ片の両面スコッチテープ問にはさんで固定する。一ど小さくならないのに対し，比較的低いCa濃度に方のスコッチテープはストレーンゲージ（Uゲージ，

よる発生張力は筋節長が短くなると著しく小さくな

100才用，新興通信）に接続して線経の発生する張ることが分っている。この張力の結果に対応して，力を記録し，他方はマイクロアンメーターの指針の筋の最大短縮速度（Vmax）も，比較的低いCa濃

先に接続し，以下の方法でVmaxを測定した。

3）

度により収縮させたときのVmaxは筋節長約2〝m

上記のマイクロアンメーターに，線経を引き伸ば以下の領域で非常に小さくなる。これらの事実からす向きに指針がふれるような方向の電流を十分に流我々は，過剰なフィラメント同士の重なりが，ジス

し，かつ実際の指針はストッパーで動かぬよう止め

トロフィー筋においてはより長い筋節長から始まるておくと，等尺性の条件が得られる。こうしておいとすれば，比較的低いCa濃皮下におけるVmaxもて液中のCa濃度を上げて線経を収縮させ，等尺性より長い筋節長から小さくなり始めるのではないか，

張力の大きさが定常状態に達したら，マイクロアンと考えて以下の実験を行った。

メーターに流す電流の向きを逆転させて，指針を第2のストッパー・の位置まで急激に動かすことによっ

実

験

方

法

て，線経を一定の長さだけ急激に縮める。この縮め筋ジストロフィー成鶏（ニューハンプシャー，の速度はVmaxより大きいので線経は一たんたわみ，413）およびコントロール（同412）から後広背筋

張力はゼロに落ちる。その直後，線経は無負荷状態を分離し，直ちにサポニン100／上タカ戒を加えた弛

にあるのでVmaxの速度で短縮し，上記の急激に縮められた短縮距離を短縮し終えた時点から，ふたた＊東北大学医学部薬理学第一教室

び張力を発生し始める。この張力再発生が始まるま15筋ジストロフィー鶏骨格筋Skinned fibenの短縮速度

85

3．0−2．1〃m

2．9−2．OJ」m

0．5mN

：

；

1sec
図1急速短縮後の張力の時間経過。サルコメア長を図に記した通り急激に変えた。張
力再発生の時点は比較的明瞭である。ジストロフィー筋。

Ⅳ

86

生

理

学

mSeC

ー24pm

−2．21」m−2．01Jm

図2サルコメア当り0．9mル急速短縮後張力再発生までの時間とサルコメア長。短縮終了点でのサルコメア長を下に記してある。平均±S．E．

での時間と短縮距離とからVmaxを測定した。厳密（20℃）の水で実験槽直下を流し，この温度下でに言えば短縮距離を上記の時間で割った値は正確な行った。室温も約20℃であらた。

Vmaxではない可能性が強い。というのは，たるま弛緩液の組成は87mMメタンスルフォン酸カリウ

せた距離を丁度短縮し終えてから張力再発生開始か

ム，4mMATP，4mMメタンスルフォン酸マグネ

検出されるまでには一定の時間を要すると考えられ

シウム，10mMEGTA（エチレングリコールビス

るからである。しかし，本実験においては，正確な（β−アミノエチルエーテル）−NN′一四酢酸），20汀M

Vmaxの値ではなく，それが条件を変えたときに変トリスー20mMマレイン酸で，pHは苛性カリによ動するか否かのみを問題にしているので，この点をり6．80に合わせた。ただし，筋を取り出してから単注意して議論すれば差しつかえないと考えられる。

一筋線経を分離するまでのサポニン含有弛緩液には

筋節長は光学顕微鏡下に測定し，それが線経の全20mMATP，16．6mMメタンスルフォン酸マグネ

長と比例して変ることを確かめた。実験は一定温度

シウム，10〜20mMEGTA，20mMトリスー20

15筋ジストロフィー鶏骨格筋Skinned fibenの短絡速度●▲

87

Dystrophy

OA ContrOl

▲

▲
▲●

○△●△●

l

0

▲
念△●①

0

ー2．2JJm−2．0〃m

図5 3．1→2．1mルおよび2．9→2．0町の短縮時間と3．3→2．4町の短縮時
間との比。
○，●：1本の線経の第1実験の結果，△，▲：同第2実験の結果。
その他の説明は本文参照。

mMマレイン酸（pH6．80）を用いた。Caを含む収変えて実験を行った。したがって，短縮し始めとし縮系活性化溶液は，初めに挙げた弛緩液（ただし，終りのサルコメア長が種々に異なるわけである。図メタンスルフォン酸カリウムは69mM）に6mMメ

1に実際のジストロフィー鶏からの緑椎の張力記録

タンスルフォン酸カルシウムを加えたもの（pH6．

の例を示す。この例は同時に，サルコメア長か僅か80）を用いた。この液の遊離Ca濃度は，CaEGTAに異なっただけで，Vmaxが非常に異なり得ること

5）のpH6．8における見かけの結合定数を5×105M￣1を示している。すなわち，上のトレースではサルコと仮定すると，3×10￣づMと計算される。

メア長を3．0〝仇から2．1／〟花に急激に縮め，張力が再発生するまでに約320ミリ秒を要しているが，下結

果のトレースに見られるように同じ線経を2．9／〟花か

Vmaxで短縮させる距離をすべての線経について

ら2．0／仇まで縮めたときには，同じ距離の短縮でサルコメア当り0．9〝仇に国定し，サルコメア長をあるにもかかわらず，張力再発生までに約620ミリ

Ⅳ

88

生

理

学

では2．2／〝托近辺から落ち始めることを示唆している。

秒を要している。
図1のような実験を3．3→2．4／爪，3．1→2．2／〟叫

しかし，これを確実に結論するためには，〝実験方法〝

2．9→2．OJ爪の3つの領域において行い，急激な短の項に述べた問題があるので，本実験とは逆に短縮

縮から張力再発生までの時間をプロットしたのが図

終了点のサルコメアを固定し，短縮距離を変化させ2である。線経は収縮一弛緩をくり返すと次第に劣る実験結果を待つべきで，これも現在進行中である。

悪化するので，図2の結果は各線経について最初のところでVmaxが上記のように変ったとしても，そ収縮のデータのみを集めたものである。図2から，れが我々の当初考えた，ジストロフィー筋では過剰

正常筋では3．3→2．4〝mと3．1→2．2〝仇での短縮時

なフィラメントの重なりが長いサルコメアから始ま間はあまり変らないが，2．9→2．0／′mでの短縮時間

るからだ，という可能性は小さいと考えられる。とはやや長くなる傾向が見られる。ジストロフィー筋

いうのは，我々は生後約2年の成鶏を実験に用いたでは，3．3→2．4〝仇の短縮時間がそもそも正常筋よのであるが，大槻（私信）によれば，その時期にはりやや長めではあるが大きくは正常筋と変らないの

少なくとも胸筋においては，正常よりも長いフィラに反し，3．1→2．2／Jm，および2．9→2．0／〝花での短

メントは非常に稀にしか見出せなくなっているとい

縮時間は著明に長くなっていることが分る。

うことだからである。

線維間のバラツキが比較的大きいので，上記の結一つの可能性として，本実験の結果は，ジストロ

果を確かめるために，同一線経で異なったサルコメ

フィー筋収縮系のCa感受性がCa3×10￣6M近辺でア長において実験をくり返し，3．1→2．2〝mおよび正常筋よりも僅かに低いということで説明できるか

2．9→2．0〝仇の短縮時間と3．3→2．4〝肌の短縮時間も知れない。高木はジストロフィー鶏skinnedとの比をプロットしたものが図3である。この場合，fiberのCa感受性が正常筋とほとんど変らない，

くり返しによる劣悪化をできるだけ補正するために，と報告しているが，張力測定よりも本実験の方がは

3，1→2．2〝仇または2．9→2．0〝肌の実験の前後に．るかに差を検出し易いことを考えると，この可能性

はすべて3．3→2．4／爪の実験を行って，その平均値は否定できない。今後の検討が必要である。

に対して比をとった。図3に見られるように，やは

しかし，そもそも，比較的低Ca濃度で何故にVり3．1→2．2Jmおよび2．9→2．0′爪の短縮時間はmaxがサルコメア長2．0／〝托前後から急激に落ちる

3．3→2．4〝仇のそれに比べて，ジストロフィー筋でかは明らかではない。筋収縮制御機構を解明する上正常筋よりも著明に長いと言えそうである。

で今後追究されるべき重要な問題の1つである。

考察

我々は先に，筋ジストロフィーマウス骨格筋
skinned fiberのVmaxをサルコメ72．5〜3．1〝m→2．0〝仇の範囲で測定し，正常マウスのそれと文

献1）江橋節貼大槻磐男（1979）厚生省神経疾患研究委
託費 筋ジストロフィー症の基礎的研究（江橋班）昭和欝年度研究報告書，152−154．
2）遠藤 実：生物物理，15．247−259．（1975）

ほとんど差がないことを報告した。しかし，これは3）Endo，M．＆Iho，M．√肋∫Ck Re￡Cと〟〟か丑，
1；89−100，1980．

高Ca濃度下での実験でもあり，もちろん本報告と

4）遠藤 実：生化学実験講座，15∴筋肉，江橋・丸山編，東京化学同人，東京，PR295−312．（1975）

6）は矛盾しない。マウスにおける低Ca濃度，チキンにおける高Ca濃度での実験は現在進行中である。
本実験結果は，当初我々が予想したのと同じ方向に出た。すなわち，本実験の結果はCa3×10￣8M
下におけるVmaxが正常筋ではサルコメア長2．0〝机あたりから落ち始めるのに対し，ジストロフィー筋

5）Ogawa，Y．Jβぬぐ加〃164；255−257，1968．

6）遠藤 実：厚生省神経疾患研究委託費，筋ジストロ
フィー症の基礎的研究（江橋班）昭和53年度研究報
告書，47−52．（1979）

16 培養法による鶏ジストロフィー筋の電気生
理的，形態的及び代謝的特性について

堀 田
研究協力者

冨

田

健＊■
伸

子＊

杉

山

博

之＊＊

われわれは従来からジストロフィー筋の形態的・

抗は常時抵抗計によってcheckした。膜電位が電極

生理的特性を鶏から得た筋緑維及び組織培養標本を抵抗の変化による人工産物でないことを確める基準

用い，正常筋との比較において追求してきた。今迄

として（1）電極が入ったと思われるとき，急に電位がにジストロフィー筋の膜電位はやや低く，かつ興奮変化し，一定時間以上保持しっづけること。（2）電極から張力発生までの時間が長くかかること，又膜電抵抗が刺入前後に変化していないこと。（3卜週間以

位のちがいは筋細胞が形成されてから間もなくあら上培養し，ある程度生長したときには20〜30／上Aゎれることなどを報告し震 今回は膜電位の測定をの通電によって興奮があり，活動電位が観察され，

myotubule形成直後から15日ごろまでの組織培かつ収縮があること。等を満足することとして，そ養標本について行い，かつ竃顕による形態観察も加れらを満さない測定値はDataから除外した。

えた。また筋細胞膜の代謝過程に相違があるかどう

電子顕微鏡観察：組織培養によって得た標品を生かを細胞培養した試料を用い，アセチルコリンレセ

長過程毎にグルタルアルデヒド固定ののち，小口ら

プターの代謝速度を指標として確めることを試みた。

の方法に従って硝酸ランタンを含む緩衝液で約1時
間浸し，T−システムを特異的に染色する処理を行

材料及び方法った。オスミック酸で後固定後エボン包埋し，厚さ組織培養：Dystrophy（NH413）及びControl

0．5／仇の切片を作った。これを高圧電子顕微鏡（日（412）Chickの受精卵を37．5℃に6日間貯化した

本電子，200KV）で観察，細胞内部構造の発達を追のち胚をとり出し，その脊髄の細片をコラーゲンを跡した。

塗布したカバーグラス上でMaximowの二重カバー

アセチルコリンレセプターの代謝速度：この測定

グラス法に従い培養を開始した。2，4，6，8，10，15には37℃で10日間野化した卵の胸部筋をとり出し日経過したところでとり出し，膜電位測定を行い，て細胞培養した標品を用いた。液（第1図）は3日

かつ竃顕のための試料固定を行った。培養液及び電日毎に交換し，実験には6日間培養したものを使用

位測定のための溶液の組成は前報に述べた。

した。代謝速度の測定には先ず標品に3Hでラベル

膜電位測定：培養標本をカバーグラスのまゝ測定

したエラブトキシンb（Etb）を作用させ，レセプ

セルに入れ，37℃で20〜30M凸の電極を刺入し，ターに結合させる。過剰のトキシンを洗礁後新らし

出力を増巾器（日本光電MEZ8201）を通してメモい培養液を加え，一定時間毎に液を交換する。そのリー（岩通DM−305）に導き，よみとった。電極抵

とき交換液中にあらわれる3Hの畳から試料のなか＊名古屋市立大学医学部 第一生理学教室＊＊生物科学総合研究機構 生理学研究所生体膜部門に残留しているエラブトキシンを計算し，代謝速度をうる。実際の実験手続きは第1図に示す。

Ⅳ

90

生

理

学

EXPERI班ENTAL PROCf：DURE

Breast muscie ceii
（6−7

daYSin culture）

←mEM

←HEH
Alb

Alb
Etb（30Etb（30 n叶）

nH）

dTC（0・．5 mM）（3H）

i h・370C・5％CO2（back ground）

Washin9With
比EM． 5 times

1

Medium＝ncubationin Med

30

min．

l
Change of Med→Discard

85亀 MEM
10亀 HS
3篭 FCS
2亀 CEE12h−〉Counting

Etb；
ERAB TOX工N b

1（3H Labelled）
5

h

一一

〉Counting19h〉CountingdTC；
d一Tubocurarine

1
27h

一

一＞Countingl・SDS
Residue；Counting

第1図 細胞培養液の組成とアセチルコリンレセプターの代謝測定手順
MEM：E咤le MEM HS：馬血清
FCS：仔牛血清
CEE：鶏胚抽出液
Alb：アルブミン

16 培養法による鶏ジストロフィー筋の電気生理的，形態的及び代謝的特性について

91

92

C

第2図 組織培養標本の位相差顕微鏡写真
入卵後6E相の胚より得たmyotome（N．H．412）
a．植付直後 （×200）
b．植付後1日経過したもの （×200）
C．培養開始後1週間経過したもの （×200）

自発収縮があらわれ，横紋が出来るころには50mV
結果前後になる。通電による興奮もみられ、N㌔チャネル

組織培養細胞の発達過程：第2図aにみられるよが形成されていると思われる。14〜15日目には70

うに植付けた脊髄には外側に多くのmyoblastが付

mvとなり，成鶏のそれに近づくがそれ以後あまり着している。このmyoblastはお互いに癒着（fuse）

増加せず，かえって減少する場合が多かった。

してmyotubuleを形成し，急速に外に向って成長

Dystrophyの胚からの標品は測定の最初の時期かする（outgrowth）。第2図bは植付け後約1日をら膜電位がやや低く，4日目の試料において同じ期経過したもので．この間著しいmyotubuleの形成間培養したNormalとの間で有意の差があった有がみられる。7日目こ−ろには構紋が現われはじめ，

意差の検定はペアで行い，母集団の分散が同じ場合

自発性の収縮が顕微鏡下でみとめられるようになる

はt検定を，異る場合にはWelchの検定を行い，棄（第2図C）。以後前報にのべたような経過をたど却限界が5％以下である場合を有意とした。これにって15〜16日ごろには成長が完了し，それからは変

ょれば6日以降はすべて有意の差があり，2週後の性がはじまり，かえって構紋が全体的にぼやけてく

値は正常67．2±3．1mVに対してDystrophy60・7る。発達の過程及び完成された筋線経について，位±5．7mVであった。なお同じ期間培養して得た相差顕微鏡でみる限り，DystrophyとNormal

Broiler 標品の膜電位差も測定したが，N．H．412の筋の間に目立った差異はみとめられなかった。

との間に有意差はなかった。

電極の刺人が可能になるのはmyotubuleが形成

アセチルコリンレセプターの代謝速度：10日間婿される植付後2日目あたりで，この時期には−15〜

化 6日間培養した胸筋を材料として3Hラベルの20mVの膜電位が観察される。第3図に示すようにEtbを作用させ，過剰のEtbを洗い流すと，「股に日数の経過とともに膜電位は上昇し，5〜6日後のDystrophy筋に結合しているEtbがNormalに

16 培養法による鶏ジストロフィー筋の電気生理的，形態的及び代謝的特性について

93

JqHhNH↑Oh H書式竺苧扇喜15
DAYS IN CLILTUIu：

第5図 組織培養標本の膜電位発達過程
N．H．412N．H．413（cmtrol）（Dystro由y）
数字は測定数を示す。★P＜0．05（有意差あり）

Broiler（control）

比して少なかった。これは膜に局在するアセチルコとその内部に細い線維状の構造物があらわれる。第リンレセプターの数が少ないことを意味する。また

4図aは第2図bに対応するものである。線経は培

3Hの放射能より計算される結合Etbの減少率は養経過に従い太くなりmyofibrilに成長する。ここNormalの方が少なく，従ってレセプター代謝の半で用いた標品は組織培養で層があつく，又走行方向減期も長いことが知られた。然しながらこの結果はも一定でない上に厚切りなのでこれによってmyo−

例数が少なく，preliminary であるので定量的なfibrilの走行についての明らかな所見は得られな論議は今後にまたねばならない。

かった。第4図bは10日間培養の正常筋であるがA培養細胞の竃顕所見：myotubuleが形成される帯，Ⅰ帯の区別はよく分らず，又Tシステム状の構

94

Ⅳ

生

理

学

16 培養法による鶏ジストロフィー筋の電気生理的，形態的及び代謝的特性について

95

第4図組織培養標本及び成鶏広背筋の電子顕微鏡写真（厚さ0．5．叫）
a．培養開始後3日目（×44，000）b．培養開始後7日目（×15，000）
C．成鶏（×15，000）

造もところどころにみられるが，成鶏の広背筋を固筋の細胞内部構造は成鶏の筋に比して不規則で電顕定したもの（第4図C）に比し，構造が軟弱で細胞的にfilamentの配列やT−SyStern，小胞体など

内構造物（Tシステム，SR等）の詳細をDystrophyの微細構造を見極めることは困難で，Dystrophy

筋と正常筋の比較においてとらえることは出来なかとNormalの差異を見出すことはむずかしいと思わた。技術の改良が今後の課題である。

れる。これは培養法の技術的な問題であるのか，それとも組織培養標本を用いる際の本質的なものであ考察るのかは今後検討しなければならない。

ここに示された結果は昨年発表したpreliminary

preliminaryではあるがアセチルコリンレセプの結果−Dystrophy筋の膜電位は発生の極めてターの代謝される速さはDystrophy筋の方が速い

初期より正常筋に比して低い−をより早い時期かという知見が得られた。これが膜の代謝速度を反映

ら，より多くの試料について確めたものである。第

しているとすればDystrophy筋では，細胞内蛋白3図に示すように培養筋の膜電位は急速に深くなる

分解酵素の活性や蛋白合成能が元進しているというがThomsonとDrydenは10日間醇化の胚から得事実と同じ方向である。今後培養期間をかえ，又異た筋の膜電位を培養開始後から追跡すると，3日目

る部位からの筋について実験をかさね，その意義をでは20mVであったものが5日目では70血Ⅴ

Dystrophy発症との関連においてとらえたい。

に達することを報告している。われわれの場合こんなに急激に発達することはなかったが，僻化条件及び培養法のちがいを考慮すると実質的に同じであるということが出来，われわれの方法で培養された筋は順調な発達をしていると考えられる。然しながら培養

文献1）堀田 健，大羽利治，越田 信，西原己栄子，小鹿
幸生：ジストロフィー筋の生理学的研究，筋ジスト
ロフィー症の基礎的研究（江橋班）昭和53年度報告書，53−58．（1979）

96

Ⅳ

生

2）堀田 健，小鹿幸生，村瀬幹雄：発生初期におけるジストロフィー筋の電気生理学的性質，筋ジストロ
フィー症の基礎的研究（江橋班）昭和舅年度報告書
90−94，（1980）

3）小口菩三尺．塚越 広：Ducl nne型進行性筋ジストロフィー症における横細管系の高圧電子顕微鏡による研究，神経内科，11．280−282．（1979）

理学4）C．M．ThomsonandW．F．Dryden：DeYelopmentof
membraneconductanceofchickmuscleinculture，
αれ上川γ血工期gr〝MCO158：600−605，1980．

17

Myotoniaラットにおける筋細胞膜と神経筋伝達の性質について
＊

構 進 之

じ

め

に

＊
RH
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＊

方
は

健

田

＼
■一
′

＊

祐

山永東

栗是伊

研究協力者

法

Anthracene−9−Carboxylicacid（Anth−

Myotoniaは筋細胞膜が間接刺激や膜の脱分極

racene）をラット（Wister king，250−300の後反復性に放電し，筋拘桁を引き起こす症状であg）腹腔内に2〜3日間250mg／day／kg投与Lる。このような症状は人間（Lipicky，Bryant＆myotoniaを発症させ，直径100pの筋電図用電Salmon1971）やある種のやぎ（Bryant1969，

極を大腿二頭筋に刺入し，プレアンプ（日本光電

1973）に疾病として存在するが，20，25Tdiaza−

MZ3B）を通して筋電図波形をオシロスコープ上でCholesterol，2，4−Dichlorophenoxyacetic

観察した。増強および減衰を伴ういわゆる急降下爆acid（2，4−D）やAnthracene−9−Carboxylic

撃型（dive−bomber pattern）筋電図がmyoT

acidなどの急性又は慢性投下により同様の症状がtoniaの重要な特徴であり発症の基準とした。in

作り出されることが知られている。このような症状

vivo又はin vitroで微小電極法を用い静止膜の原因は主に筋細胞膜のCβコンタフタンスの著しい電位，活動電位および神経筋接合部の微小終板電位低下によるものと考えられている。しかしmyoto−（m．e．p．p．）を細胞内記録した。一方漂流実験でnia発症の原因について神経原性か筋肉原性か今なはAnthracenelO，2〜10￣6g／mBを用いて，お明確でない。たとえばCaccia等（1975）は除Anthraceneの筋細胞膜，神経一筋伝達に及ぼす神経した筋肉ではこれらの薬剤によってmyotonia

効果を観察した。この実験には横隔膜および長指伸を作ることができないと報告し，一方Eyzaguirre筋（EDL）をin vitroで用いた。膜定数はHodg−（1948）たちは10日間の除神経にもかかわらず2，

kin＆Rushton（1946）による方法で求めた。

4−D処理によってmyotoniaが発症すると主張し電極は3MKCβでみたした微小ガラス管で30−50ている。最近になりEberstein（1979）らはmの電極抵抗のものを細胞内及び通電電極として

myotoniaの重症度は除神経期間の長さによって変用いた。

ると報告している。我々はAnthracene投与によりラットで観察されるmyotonia発症時の神経筋

結果接合部および筋細胞膜の電気的性質を微小電極法おAnthraceneを1日250mg／kg，3日間ラッ

よび筋電図を用いて検討し，さらにmyotonia発トの腹腔内に投与すると，15匹すべてのラットに於症に及ぼす除神経の効果を観察した。

てヒトmyotoniaと同様の臨床症状，たとえば機械的刺激に対して断続的な筋肉の拘桁を示すなどが観＊九州大学医学部薬理学教室察された。筋電図をmyotonia ratの大腰二頭筋

98

Ⅳ

生

理

学

より記録するとヒトのmyotoniaと同様の所見す

46．9mVから54．8mVに（10例の平均値），長指なわち自発的筋活動が見られた。多くの例で筋電図

伸筋で48．2mVから54．8mVにそれぞれ減少した。

は増強および減衰を伴う「連の放電現象をくり返し

閉値以上の通電により正常筋細胞では一発の活動電示し，これはヒトのmyotoniaに典型的といわれる位しか発生しないのに対し，Anthracene濯流後

急降下爆撃型（dive−bomber pattern）に酷似

多発する傾向がみられた。AnthracenelO 4g／

していた。そこで微小電極を用いてmyotonia ラ

TJ適の潅流による筋細胞膜の電気的定数の変化を横ットの大腿二頭筋よりin vivoで細胞内記録を行

隔膜と長指伸筋で観察した。横隔膜ではAnthra−うと，心筋のペースメーカー細胞におけるようなゆ

cene港流後，入力抵抗（Rin）が約1．5倍に，長っくりとしたprepotentialを伴って活動電位のさ定数（A）が約2倍に，個有膜抵抗（Rm）が約4倍

連発が始まり，それとともに活動電位の閥値が上昇に，そして膜時定数（ぐ）が約3倍にそれぞれ増加しし，大きさは不活性化により次第に減少し，その後たが，内部抵抗（Ri）および個有膜容量（cm）はほ

膜は徐々に再分極し，約1〜2秒後に静止レベルにとんど変化しなかった。長指伸筋ではこの傾向がよ到達した。筋電図における一連の放電現象の間，個り著明であった。同じく槙隔膜と長指伸筋を用いて々の筋細胞においてこのような電気現象が発生して神経筋接合部の微小終板電位（me．p．p．）に及ぼすいると考えられる。又，myOtOniaラットは自発的

Anthracene濯流の効果を一連の記録で観察した。

な筋の活動だけでなく神経刺激によっても特徴的な

1015／mCのAnthraceneを港流後，m．e．p．p．

反応を示した。すなわち正常ラットでは一回の坐骨の大きさは約1．5倍に，そして時間経過は正常の神経刺激に対し，数msecの二屈性の筋電図が大脳1．5倍に増加した。AnthracenelO→9／mC

二頭筋から記録されたが，myOtOniaラットでは一VagostigminelOJ 6才／仇βを同時に投与すると発の刺激に対し数秒間続くburst状の放電現象がみ

m．e．p．p．の大きさおよび時間経過がさらに大幅に増られた。そこでmyOtOnia症状に対する支配神経の関与を調べるため坐骨神経切断とd−tCを用いて加した。さらにAnthracenelO，49／mBとd−tC

その効果を大腿二頭筋の筋電図を指標として観察し消失した。すなわちAnthraceneは少くとも抗コた。坐骨神経切断ではmyotoniaラットの自発筋

リンエステラーゼ作用やシナプス後膜の受容器の感電図は全く影響を受けなかった。d−tC投与では周受性を介してme．p．p．の大きさや時間経過を変化さ期的に発生する一連の放電現象は影響を受けない。

せているのではなく，この現象は入力抵抗（Rin）

しかしこの群発放電の問に散発的に発生する単発性や時定数（ぐ）などの膜定数の変化のためと考えられの電気現象は完全に消失した。次に濯流実験においた。rne．p．p．の大きさのHistogramは正常てAnthraceneの正常ラットの横隔膜の筋細胞膜

Krebs液中ではいわゆるベル型を示し，Anth−および神経一筋伝達に及ぼす効果を細胞内記録法にracene涯流後これが右方に平行移動するのが観察より観察した。AnthracenelO．4才／mCの濯流

されその右端においては9〜10mV以上のme．p．

とlO￣6才／n諺を同時に濯流するとm．e．p．p．は完全に投与によっても筋細胞膜の自発活動が発生し，そのp．（いわゆるGiant m．e．p．p．）がときどき出現す

自発活動電位は2種に分頬出来た。1つはゆっくりるのが観察された。Anthracenel0−4g／Wを濯したprepotentialを伴う連発する自発活動であ流中，活動電位発生の閲値が6〜7mV減少するこり，もう1つは立ち上りにhumpがみられる単発性とから，m．e．p．p．によって活動電位が発生することの活動電位であった。ただし後者は終坂近くの筋膜は可能であり，終板近くの筋膜で記録されたhump

のみにおいて記録された。同じく潅流実験で微小電をもった単発性の活動電位や筋電図においてみられ極法による通電実験を行い活動電位発生閥値を調べたd−tC投与によって消失する早発性の電気現象はると，AnthracenelO．4ghLC濯流後，横隔膜でAnthracene投与によって発生する巨大なm．e．p．

17 Myotoniaラットにおける筋細胞膜と神経筋伝達の性質について

99

p．によって発生した活動電位であると推定出来た。

るものと思われる。又彼らは一連の連発する活動電一本の筋細胞において，終板部，終板部より1皿，位の原因について，表面筋膜におけるCD conduc−および2m離れた筋細胞膜に微小電極を刺入Lm．e．

tance の著しい低下によって，膜の活動時におけp．p．を記録した。AnthracenelO．49／mDの濯るtransverse tubular systemへのK＋の蓄流以前では，終板より1m離れたところではm．e．p．

積が膜電位に大きく関与するようになるためと説明

p．は全く記録出来ない。しかしAnthracene．濯流

している。本実験に於ても，個有膜抵抗と時定数の後では終板より2Ⅲm離れた筋細胞膜においても0．2

著しい増大が観察され，myOtOniaの発症の原因は〜0．4mVの大きさのm．e．p．p．が記録できた。これ

主に膜性質の変化にあり筋原性のものであると考えは長さ定数（A）や入力抵抗（Rin）の増加によるもられる。しかし神経要素を完全に無視することはでのである。myOtOnia発症に及ぼす神経要因の効果きない。なぜなら少数ではあるが神経筋接合部のをしらべる目的で除神経のmyotoniaの発症に対

me．p．p．によって活動電位が十分に発生し得ることする効果をラット大腿二頭筋からの筋電図記録によや，30日以上除神経したラットでは，臨床症状ではって検討してみた。すなわち除神経期間を種々変化

明らかにmyotoniaの症状を示したにもかかわらさせ（3日〜40日），その後Anthraceneを3Elず，その筋電図では典型的なdive−bomber

間250mg／kgで腹腔内に投与してmyotonia発

patternが記録できなかったことを考えあわせる症に対する除神経期間の効果を観察した。一週間のと，神経要因が一次的ではないにせよ，二次的に除神経ののちAnthraceneを投与したものは臨床

myotoniaの発症に関与している可能性があると症状，筋電図所見とも除神経を行わないmyotonia

考えられる。

ラットと差異なかったが，30日以上除神経したもの
では臨床症状はmyotonia症状を示すにもかかわらず，筋電図では典型的な急降下爆撃型は全く観察されずdiffuseなburst状の電気現象のみ記録できた。ただし30日以上除神経を行っただけでAnthraceneの処置をしていないラットの大腰二頭筋において低頻度ではあるが散発性の電気現象が筋電図にみられた。これは除神経効果による筋肉の攣柿によるものではないかと思われた。

考

察

■

Monocarboxylic・aCidの一つであるAnthra−
ceneを用いて正常及び除神経された骨格筋に
myotonia症状を発症出来ることがこの実験によって確認できた。この症状の発症に主に関与しているのは筋膜性質の変化すなわちAdrianやBry−antらが報告しているCD conductance
な低下とK＋conductanceの著明の上昇が関与してい文

献1）Lipicky，R．J．，Bryant，S．H．＆Salmon，J．H．Cable
parameters，SOdium potassiumand chloride aJld
Water COntent and potassium effluxinisolated
externalintercostalmuscle of normalvolunteers
and patients with myotonia congenita・J．CtLn．
JWe∫r．50：2091−2103，1971．
2）Bryant，S．H．（1969）．Cable properties ofexternal
intefCOStal muscle fibres from myotonic andnomalgoats．上物めた204：539−550．
3）Bryant，S．H．（1973）．The electrophysiology of
myotoniawithareYiewofcongenitalmyotoniaof
goats．In〟ewpeyめpme〃r∫加gkcJmJり′OJmp妙〃〝d α加αJ〃e〟mpカツ∫わbgγ，ed．Desmedt．1：
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7）Hodgkin，A．L．Z．＆Rushton，W．A．H．TheelectriCal
COnStantS Ofa cruStaCean nerVe fibre．L＞oc．Roy．
ぬぐ．且133：444−448，1946．

Ⅴ

生

化

学

18

ジストロフィー鶏筋における蛋白合成能上昇の機構について10319幼若筋及び筋ジストロフィー筋の筋蛋白質についての研究108

20

ジストロフィー鶏筋の構造蛋白21

ラットミオシン分化に対する神経の影響

22

筋肉の弾性蛋白質コネクチン131

114

124

23 ジストロフィー成鶏胸筋小胞体膜のCa−取り込み能と，その膜構成について136
24 筋ジス・マウスの中枢神経組織におけるミエリン局酵素（CEHおよびCNP）活性の日令変化144

18

ジストロフィー鶏筋における蛋白合成能上昇の機構について

真崎

研究協力者 吉 川

筋ジストロフィー症において最も著名な変化は疾

知

生＊
昭＊＊

白合成能上昇のひとつの原因が，いわゆる300，000

病の進行に伴ない骨格筋細胞の崩壊と消失がおこる

Xg上宿中の蛋白合成に必要な蛋白因子の量的な変ことである。最近のこの分野における研究があきら

化に帰せられる可能性を示唆するデータが得られた

かにしているような細胞の膜系における異常がこのので報告する。

筋の変性とどのような関係にあるかはまだ明らかではないが，いづれにしてもこの筋組織の崩壊がこの材料と方法

疾病の直接的な症状発現の原因となっていることはジストロフィー鶏と正常鶏は前回通りNew

まちがいない。さてこの筋細胞の消失はこれを構成

Hampshireline413および412をそれぞれ用している筋蛋白の消失が重要な役割を果しており，いた。この受精卵を38℃の照卵器中におき，僻卵13

またこれは筋細胞における蛋白の合成と分解の平衡

日目の胸筋あるいは心筋より通常の方法によりポリの上になりたっている蛋白の代謝回転の総決算の結ゾームを得た。つまり胚の胸筋を2倍塁の溶液A

果おこる現象である。したがってジストロフィー筋（0．25MKCB，10mM MgCD2，10mMTris−

を正常筋とくらべた場合，蛋白合成が低下している

HCB（pH7．4），6mMβ−メルカプトエタノール）のか，あるいは蛋白分解が増加しているのかという中でダウンスホモジェナイザーを用い5回ホモジェことが当然問題になる。最近の結果によればジストナイズする。このホモジェネートを10，000Ⅹgで15ロフィー筋ではある種の蛋白分解酵素の活性が増加

分間遠心し，その上清を溶液A中の87畑の2Mおしているという報告がいくつかある。

よび57畑の0．5Mの不連続密度勾配上にのせ，約

しかしジストロフィー筋における蛋白合成に関す

300，000Ⅹgで4時間遠心する。沈澱として得られる報告の結果は必ずしも一致していない。我々はこたポリゾームはもう一皮同様の不連続密度勾配にかの点に関してこの数年来研究を進め，少くともジス

けて精製する。この密度勾配遠心後その上清の2／5

トロフィー鶏の筋に関しては蛋白合成能が上昇してほどをとり溶液B（0．1MKCB，10mM MgCC2，いるという結果を出している。我々のこの結果は最10mM Tris−HCD（pH7．4），6mM

近外国の文献で出されたジストロフィーハムスター

カプトエタノール）に十分透析する。その後さらにを用いての実験結果と一致している。今回の報告で300，000Ⅹgで90分程遠心し，その上清を300，000

は，前年度までに報告したジストロフィー鶏におけ

Xg上宿として実験に用いた。

るデータを整理して得られた結論と同時に，この蛋り4C−標識アミノ酸，14C一標識アミノアシル＊筑波大学基礎医学系＊＊東京都臨床医学総合研究所

β−メルtRNA，ビューロマイシン処理リポゾームの調製法
およびこれら各因子存在下での種々の条件下におけ

学

レし
イ

生

Ⅴ

6
N
■

O

L
V

D

ノ

S

／︸

︷C−0−×∈dU一つ⊥SP膏OU雇IUJL IO UO＝DLOdLOUUH

104

10

20

30
（min）

図1ァミノアシルtRNA合成酵素活性
14C一標識アミノ酸から14C−アミノアシルtRNAへのとり込みの反応開始後の時間変化050︷？〇二∈dU︶
くZ∝→2㌢UごーO uO竜LOdLOUUl

0

3

Crude EF tmg／ml）
図2粗延長因子活性の濃度依存性
14C一標織フェニルアラニルtRNAからポリフェニルアラニンへの取り込みを種々の濃度の粗延長因子の存在下で測定したもの。

18 ジストロフィー鶏筋における蛋白合成能上昇の機構について

105

る14C−アミノ酸のポリペプチドへの取り込みの測 よりポリゾームを調製し，同時に得られる300，000
定法については，前年度までの報告書および他の論 Ⅹg上宿を用いて14C−標識アミノ酸からポリペプ
文に詳しく記載した通りに行った。

チドへの取り込み実験を行った。ジストロフィー筋，
正常筋それぞれのポリゾームによる取り込みの値の結果比をとってみると多かれ少なかれジストロフィー筋

僻卵13日目の正常およびジストロフィー鶏の胸筋 によるものの方が高くなっている。表Ⅰには過去に

表Ⅰポリゾームと3恥000×g上宿による14C標識アミノ酸の取り込み僻卵13日目，胸筋（Breast）および心筋（Cardiac）ポ
リゾームとそれぞれの300，000×g上宿による14C−標識アミノ酸のとり込み。ジ不トロフィー筋由来のポリゾ
ーム，300，000×g上清による値を正常筋由来のそれで除した値。

Dystrophy／Nomal

Breast l．35±0．10（S．E．n＝10）

Cardiac O．96±0．03（S．E．n＝10）行った実験の中から信頼出来るもの10回の結果を示

そこで筋に2倍量の溶液Aを加え，これからしてある。同時に行った心筋ポリゾームによる結果

30仇000Ⅹgの上宿を調製，その蛋白濃度を測定すの値がほぼ1であることとくらべると胸筋ポリゾーる。ジストロフィー筋の上宿について得られた値をムによる1．35は有意の差である。なお昨年度報告し正常筋のそれで除した値が表Ⅱに示してある。これたように，正常筋の可溶性蛋自分画には蛋白合成をからわかるように婿化後約5遇で発症し，筋萎縮が抑制する因子が含まれているため，この影響を一十分進行するに従いジストロフィー筋では300，000Xgに除くよう・に300，000Ⅹgの上宿を用いた。

上宿中の蛋白濃度が減少してゆくことがわかる。ジしかしながら，この胸筋のポリゾームによる蛋白

ストロフィー筋と正常筋の300，000Ⅹg上宿中の蛋合成の活性化の程度には標本毎の差がかなりある。

白濃度がほぼ等しい時期は僻化の前後であって，胚また一方，ジストロフィー筋の筋萎縮が進行するにの時代にはジストロフィー筋の300，000Xg上宿中

したがって筋細胞が他の細胞におきかえられる。その蛋白濃度はむしろ増加している。したがってこのこでその筋以外の細胞が蛋白合成に必要な因子を筋

結果からは筋萎縮の進行した際の300，000Xg上清細胞と同程度含んでおり，しかもその細胞質に含まによる蛋白合成促進効果が前述のようなみかけ上のれる可溶性蛋白がかなり少ないと仮定すると，ジス

効果によるものでないとは言いきれないが，胚の時トロフィー筋の300，000Xg上宿中には蛋白合成に

代から筋萎縮の出現するまでの蛋白合成促進効果に必要な因子が相対的に多く含まれていると考えられ

っいてはこれがみかけ上の効果でないということをる。つまりみかけ上蛋白合成促進効果があることが示唆するデータである。
しかしながら，表Ⅱからはより興味深い事実がう期待される。
●

Ⅴ

生

化

学

︵？〇二∈dU︶

S賀︒S︒qこ︒−くZ∝TS子ぎー︒gp蓋

106

0

1

2

3

4

5

Crude EF tmg／ml）
図5種々の濃度の粗延長因子存在下におけるGMP−PCP存在下の14C−リジルtRNAのビューロマイシン処理リボゾームへの結合

after hatch

embryo13th daY
l・48‡0．39（n＝4）

19th day2−3

day l week

3−4

week

7−8week adult

1．29±0．09

0．95±0．11

0．76±0．08

0．82±0．07

0．68iO．04

0．54‡0．06

（n＝3）

（n＝2）

（n＝2）

（n＝6）

（n＝5）

（n＝5）

表Ⅱ好化前後の各発達段階における筋の3吼000×g上清の蛋白濃度の正常筋の値に対するジストロフィー筋の値の比（曙Strq）hic／Normel）

かがえる。ジストロフィー筋における上宿の蛋白濃原因がこのポリゾーム側の因子によるものなのか，

度が正常筋のそれよりも高く，次第に減少して行く

上宿側の因子によるものなのかという問題は，まだという事実である。このことはジストロフィー筋が完全に解決してはいない。しかし昨年度までの報告

筋萎縮のあらわれる以前にすでに正常筋と異なる蛋書に示したようにこの原因のかなりの部分は上宿側白の代謝回転の機構を持っていることを示唆している。

にあることは確実である。

ジストロフィー筋におけるこの蛋白合成能上昇のまた昨年度までの報告書の中に示したように

107

18 ジストロフィー鶏筋における蛋白合成能上昇の機構について

300，000Ⅹg 上清中の蛋白合成促進因子の原因と上宿にみられる蛋白合成促進効果は少くともアミノ

して現在までにアミノアシルtRNA合成酵素の活性

アシルtRNA合成酵素および延長因子の活性化に化および延長因子の活性化の2つがわかっている。

よるものであり，この活性化とはEFlがジストロ

図1に示したようにジストロフィー筋および正常筋

フィー筋で量的に増加していることが少くともそのの300，000Xg上宿中のアミノアシルtRNA合成一因である。この事実を含めて蛋白合成に必要な蛋

酵素の活性の時間変化を追ってみると．その初速度

白因子がジストロフィー筋で増加していることが強はジストロフィー筋の方が高い。このことはこの酵く示唆される。しかし発症後の萎縮筋では300，000

素量が正常筋よりジストロフィー筋の上宿中に多い

Xg上宿中の蛋白濃度が減少しているため，みかけことを示唆している。

上の蛋白因子の量的増加がおこっているようにも見

300，000Xg上宿の50〜70％飽和硫安の分画をえる。しかしジストロフィー筋の組織学的な所見，

集め，溶液D（20mM Tris−HCB（pH7．5），0．1

あるいは非筋細胞の細胞質中の蛋白濃度等を考え合MkcD，1mM EDm，6mMβTメルカプトエタ

わせると，これは単なるみかけ上の蛋白因子の増加

ノールおよび0．25M庶糖）に透析後300，000Ⅹgででなく萎縮筋において蛋白合成に必要な蛋白因子が90分間超遠心する。その後これをハイドロキシアパ

増加していることが推察される。しかも表2からあタイトに吸着させ，0．05M−0．3Mのカリウムリン

きらかなようにこの蛋白合成に必須な蛋白因子の増酸緩衝液（pH7．0）で溶出して来る部分を集め粗延加はジストロフィー筋に固有な性質で発症のかなり長因子とする。ビューロマイシン処理リボゾーム，

以前から筋細胞にそなわっている性質と考えられる。

polyUを用い14C標識フェニルアラニルtRNA
よりポリフェニルアラニンへの14C標識アミノ酸の取り込みをみたのが図2である。前年度の報告書で述べたように，この図をみると正常筋とジストロフ
ィー筋で延長因子の量に差があるように思えるが必
ずしも確実ではない。そこで14C−標識リジルt
RNAのビューロマイシン処理リポゾームへの結合を
この粗延長因子およびグアニル（β，γ−メチレン）
ジフオスフォネイト（GMP−PCP）存在のもとで測定した。このGMP−PCPの存在下では，1モルの14C標識tRNAが1モルのリポゾームに結合した段階で蛋白合成反応は停止する。14C標識リジンのリボゾームへの結合は延長因子の増加と共に増加する。図3にみられるようにジストロフィー筋と正常筋の上宿による値は平行線をなす。この結果から計算するとジストロフィー筋の粗延長因子分画中のEFlの量は正常筋中のそれにくらべて約3倍量にあることがわかる。同様な結果はジフテリア毒素を用いた結果からもわかった。

考察

以上の結果からジストロフィー筋の300，000Ⅹg

文献1）真崎知生二ジストロフィーチキンの発生過程における蛋白合成能の変化，筋ジストロフィー症の病因に関する研究，昭和52年度報告書，P39．（1978）2）真崎知生：ジストロフィーチキン骨格筋の蛋白合成能，筋ジストロフィー症の基礎的研究，昭和53年度研究報告書，P7．（1979）
3）T．Masaki，A．Yoshikawa，N．Haradaand H．
SIlinozaki：仇〝g〝f如∫e肌泊血肋JC〟血r pγ乱ム4朗〟二22；1978．
4）T．MasakiandA．Yoshikawa：Ch〝enlReseaTChin

肋加椚Jね′砂∫J．〟朗凡32：1979．
5）真崎知生：ジストロフィーチキンの蛋白合成因子の変化，筋ジストロフィー症の基礎的研究，昭和54年度研究報告書，Plll．（1979）
6）T．Masakiand A．Yoshikawa：IncreaseofProtein
SyntheticActivityinchickenMuscularDystrophy（hpreperation）．
7）T．Masaki and A．Yoshikawa：Muscle Protein
SynthesisinDystrophicChickenL＞oceedingqfthe
ⅣmpO血mOJI肋∫α血rqy∫Jmp々yhpress．

19

幼君筋及び筋ジストロフィー筋の筋蛋白質についての研究大日方

昂＊

研究協力者 大 室 弘 美＊＊ 清 水 法 子＊

筋蛋白質分化をめぐる問題として，タンパク質のの操作を行ない，トリスーグリシン緩衝液系を用い合成から筋原綿経の規則的構造への諸蛋白質の集合てSDS−アクリルアミドゲル電気泳動法により（詳まで様々の問題がある。これらの中で2つの問題，

しくは文献5）参照），TN−Tのタイプ及びミオシン

幼若筋から成熟筋に至る間の蛋白質の変異と蛋白質

L鎖を調べた。一方，トロポニンについては，筋小モノマーから構造への集合について，正常筋と筋ジ片から加熱SDS溶液で直接蛋白質抽出を行ない，ストロフィー（以下筋ジスと略）筋の場合についてこれをSDS十デル電気泳動により分離した後，抗T検討してきた。最近までの多くの研究は，筋の発生・

N−T抗体及び抗トロポミオシン抗体を用いた免疫成長過程で筋蛋白質のタイプが著しく変化していく

拡散を行なうことによる解析も実施した。

5）

ことを示してきた。又，筋蛋白質のタイプは正常筋

アクチンの濃度及び重合度の測定：筋を3倍量のと筋ジストロフィー筋の間で違いのあることがトロ

生理的塩溶液（0．1MKCL7，2mMMgCB2，5mMイミ

1）

2）3）

ポミオシン，ミオシンL鎖について指摘された。我ダゾールpH7．0，0．5％TritonX−100，1mM々も，前年度までにトロポニン及びミオシンアイソ

2−メルカプトエタノーJLi O．5mMATP，0．05mM

ザイムが正常鼠 筋ジス筋とで差異のあることを見

PMSF）でホモジェナイズし，一部は，105Ⅹg，1hr

出してきた。一方，発生途上の筋細胞内での筋蛋白

遠心し，上清をモノマーアクチン（G一アクチン）質の集合についての研究はあまりなされていない。

濃度の測定に用い，又遠心前のホモジェネートの一書閤こ

本年度の研究においては，筋ジス筋と正常筋の成は0．6MKI（又は，0．5Mグアニジン塩酸）を加え

長過程でのトロポニンT（以下TN−Tと略）のタイてポリマーアクチン（F−アクチン）を脱重合させ，プの変化における違いを更に詳しく検討し，又ミオ

アクチン総量の測定に用いた。アクチン濃度測定は，

シンアイソザイムのパターンの変化と関連させてミG−アクチンがDNaseIの活性を特異的に抑制す

オシンL鎖の変化 更に筋成長にともなう筋細胞内ることを利用して行なった。

6）

でのアクチンの重合皮の変化についても調べた。

結果と考案
実 験 方 法1．筋構造蛋白質のタイプの変化

トロポニン及びミオシンの解析：ふ化後の種々のi）トロポニンTの変化について

時期の正常（412）及び筋ジス（413）鶏の浅胸筋よ図1に種々の成長段階の正常及び筋ジス筋のトロ

り定法によりトロポニン及びミオシンを抽出・精製

ポニンの電気泳動パターンを示す。ふ化後の比較的＊千葉大学理学部生物学科＊＊東京都臨床医学総合研究所

若い時期（ふ化後2週令つから十分成長した1年令のものまで，筋ジス鶏の胸筋には足型TN−Tが存在19 幼若筋及び筋ジストロフィー筋の筋蛋白質についての研究■−￣蒜￣ ．nt，「￣＿＿＿＿二＿＿￣￣二二．

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2W IM

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3M IY

N

D

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D

N

一一C

N

図1正常鶏・筋ジス鶏胸筋のトロポニン成分のSDSアクリルアミドゲル電気泳動パターン。婿化2過（2W），1カ月（lM），3カ月（3M）及び1年（lY）令の正常（N）と筋ジ
ス鶏（D）よりトロポニンを抽出した。Tb，胸型TN−T；Tl，足型TN−T；I，トロ
ポニンC；C，トロポニンC。

することが認められた。それに反し，正常鶏では，出物に対して抗トロポミオシン抗体を作用させた時

ふ化後2週，1カ凡1年令などの胸筋には胸型T生ずる沈降線の位置にはぼ一致し，他方は抗トロポ

N−Tのみが検出され，足型TN−Tはみられなか

ミオシン抗体により生じた沈降線より高分子量側にった。正常鶏の胸筋の抽出物にも，暗により足型T生じた。このような，生じた沈降線の位置的関係か

N−Tにはぼ一致するバンドがみられる場合がある

ら，筋ジス筋にはトロポミオシンとほぼ同分子量の（図1，1MN）が，これは足型TN．Tとほぼ同分子

足型TN−Tと，それより分子量のやや大きい胸型

量をもつトロポミオシンの混入によるバンドである

TN−Tとが筋の成長期を通じて共存することが結と考えられる。筋組織中に存在するTN−Tのタイプ

論づけられる。又，この方法を用いて調べてみると，を厳密に同定するために，SDS−アクリルアミドゲ

抽出・精製操作の過程で生じたと思われるTN−T

ル電気泳動と組合わせた免疫拡散法は有効な方法での分解産物がトロポニン分画に共存していることがある恥 種々の時期のニワトリ胸筋の小片から，95わかった（図2，C）。特に，筋ジス筋からのトロ℃に加熟したSDS溶液でタンパク質を抽出し，まずポニンの場合に目立つ様である。このような点から

SDS−アクリルアミドゲル電気泳動を行ない，抗Tすれば，筋からの加熱SDS溶液を用いた粗抽出物

N−T抗体及び比較のために抗トロポミオシン抗体

を直接，電気泳動法で解析する方法は，TN−Tのを用いて免疫拡散を行なって調べてみると，筋ジスタイプの同定には好都合の面がある。

筋からの抽出物は抗トロポニン抗体に対して2本の沈ii）ミオシンL鎖の変化

降線を生じた（図2A，B）。このうちの1本は，筋抽

ふ化の種々の時期の正常及び筋ジス胸筋から得た

Ⅴ

110

生

化

学

も Tl

−abTM

ーabT

−abl●MtTl 下．
図2

SDS−ゲル電気泳動と組合わせた免疫拡散法によるトロポニンTのタイプの解析。4過（A）及び1年令（B）の胸筋からのSDS抽出物，及び3カ月令の胸筋からのトロポニン
分画を電気泳動した後，抗TN−T抗体（abrT）又は抗トロポミオシン抗体（ab−TM）
を拡散させ調べた。N，正常鶏；D，筋ジス鶏；TM，トロポミオシン；Th，TN−Tの分解産物。他のシンボルは図1と同じ。

ミオシンのL鎖のパターンを図3に示す。比較的若ーンは，幼若期の正常及び筋ジス鶏のパターンに類い時期には筋ジス筋・正常筋間で，ミオシンL鎖の似している。ただし，アクチンについては，筋ジス

パターンの違いは，はっきりしない。しかし，成長筋でのアクチン種の変化は検出されていない。又，の進んだふ化後7週，1年令では正常・筋ジス筋の蛋白質のタイプの変化の時間的経過は蛋白質の種類

間でのL鎖パターンの違いが顕在化している。特徴

によりややことなっているように思われる。

的なことは，筋ジス筋ではFL3の量が相対的に減少

2．アクチンモノマー・ポリマーの量的変化

していることである。L鎖パターンの変化は，先にニワトリの発生過程での胸筋に存在するアクチン

報告したミオシンアイソザイムのパターンの変化と総量（筋湿重量当り）及び非重合モノマーアクチン

相応している。

の量的変化を図3に示す。アクチン総量は，10日胚iii）筋ジス筋と正常筋の筋蛋白質の比較のまとめ。

からふ化2カ月のニワトリまで，成長につれて急速

表1に現在まで我々が調べた結果の要点を示す。

に増す。ところが，モノマーアクチンの濃度は逆に

全般的に，成長の進んだ筋ジス鶏の筋蛋白質のパタ

若い筋程高い。ふ化後2カ月目ではふ卵10日日胚の19 幼若筋及び筋ジストロフィー筋の筋蛋白質についての研究

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DN

D

図る正常鶏と筋ジス鶏胸筋のミオシンL鎖の比較。賂化後2日（2D），4日（4D），7過（7W）．1年（lY）の正常（N）と筋ジス（D）鶏からのミオシンを調べた。

表1正常鶏，筋ジス鶏の発生，成長にともなう筋構造蛋白質の変化。

EMBRYOMYOSIN
IsozYMESN FMPFM3

YoUNG

MATURE

FMl＜FM3

FMl＞FM3

FMl＜FM3

FMl＜FM3

MYOSIN FL−5
LIGHT CHAINSTROPONIN一T

N

LEG−TYPELEG−TYPE＋＋

BREAST−TYPE（BREAST−TYPE）BREAST−TYPE
LEG−TYPELEG−TYPE

十＋BREAST−TYPE BREAST−TYPE
AcTIN

N
D

α，β，T

Ⅴ

112

生

化

学

表22カ月令の正常及び筋ジス鶏の胸筋におけるアクチン全量及びモノマーアクチン
宜の比較。比較のために20日胚（20D）のアクチン量も示した○

2M
2M
NoRMAL DYSTROPHYToTAL PROTEIN

81．5

222

172

（mg／mg vet veight）
0．56

0．1句

10．叫

訓．8

G−AcTIN

0．q5

くmg／mg wet weight）

ToTAL AcTIN

2句．8（mg／mg wet welght）
G−AcTIN／ToTAL AcTIN

句．5

0．q l．75（認）AcTIN−TYPE

瓜（β，7）

約1／8に下がっている（10日胚の数値は示してなα抑制する因子の存在することを示唆している。

い）。この違いは，総アクチン量に対するモノマー

一方，正常筋と筋ジス筋とを比較した軌 両者でアクチンの割合でみると更に顕著で，10日胚では全アクチンの重合度にやや差のあることが認められた。

アクチンの約40％がモノマー，ふ化後2カ月のニ

即ち，ふ化後2カ月の正常及び筋ジス鶏の胸筋におワトリでは1％以下がモノマーとしてあるにすぎな

けるモノマーアクチンの濃度及び総アクチン量に対い。精製されたアクチンは生理的塩濃度の存在下でするモノマーアクチンの塁比を調べた所，表2に示は速かに童合してフィラメントとなり，共存するア

すように両者の間で差があった。筋ジス筋ではモノ

クチンモノマーの濃度は著しく低い（0．05mg／hβ

マーアクチンの濃度がかなり高まっている。言いか程度）ことがよく知られている。所が，若い胚の筋

えれば，筋ジス筋では，アクチンのモノマーからポ細胞質からの抽出物には，生理的濃度の塩（0．1M

リマーへの重合を抑制するか，あるいはアクチンフ

KCB，2mMMgCB2）が存在してもなお高濃度のィラメントをモノマーへ脱重合させる要因が高めら

アクチンモノマーが存在する。しかし，胚の筋かられているのではないかと推測される。

得た非重合モノマーアクチンをDEAEセルロース，
硫安分画を併用して精製を進めると次第に重合するようになる。又，胚の筋アセトンパウダーから抽出・精製されたアクチンは正常な垂合性をもつ。これらの事実は，幼若な筋には，アクチンの重合を調節・

19 幼若筋及び筋ジストロフィー筋の筋蛋白質についての研究

113

GrActin／lbtalActin（％）・・・●・・・・

図4ニワトリ胸筋中のアクチン全量及びモノマーアクチン量の発生にともなう変化○

文献1）Takeda，S．and Nonomura，Y．βわmea Reg．1；
176−179，1980．
2）JoIln，H．A．fTβ∫上g払64：116−124，1976．
3）McGowan，E．B．，Siemankowski，L．，Shafiq，S．A．
and Stracher，A．in Lbthogenesis qf mLman
肋seuhTTLDstnphEes（Rowland，LP．ed）EIservier／ExcerptaMedica，Amsterdam，NewYork．1976，
4）大日方昂：筋ジストロフィー症の基礎的研究（江橋班）昭和舅年度研究報告書，114−120．（1980）5）Obinata，T．，Takan0−Ohmuro，H．andMatsuda，R．
闇∫上e〝．120：195−198，1980．
6）Blikstad，Ⅰ．，Markey，F．，Carlsson，L．，Persson，T．

andLhdberg，U．Cb玖15：935・943，1978．
7）Matsuda，R．，Obinata，T．andShimada，Y．Devebp．
βわ止81：1981，hpress．

20

ジストロフィー鶏筋の構造蛋白
IEF・SDS二次元電気泳動による分析

野々村 禎 昭＊
研究協力者

武

田

伸

一＊

Dystrophy鶏（Dy鶏）の顕著な発症筋である

mMMgC12，20mMHEPES pH7．0の組成の胸筋については，筋構造蛋白のlevelで異常を認め

solution中でteaseL，Single fiberを得1）一石）たとする報告が幾つかある。

た。このfiberについては，光顕で観察し，一部の我々は，Dy幼鶏の胸筋では，trOpOmyOSinのfiberについては，標本の半分をグルタールアルデ

β−Subunitの減少〜消失に遅延があり，Dy成鶏

ヒド，オスミュウム二重国定後，エポキシレジンに

胸筋には，対照成鶏には無いβ−Subunitが再び存

包埋し，竃顕下で観察し，Single fiberである

2−3）

在する事を示した。

事を確認してから，以下の検索を行なった。

今回は，等電点電気泳動（IEF）及び非平衡pH

上記2系統のsampleは9．5MUrea，2％Non巨

勾配ゲル電気泳動（NEpHGE）から，SDSポリア

date（P−40），2％Ampholine（1．6％pH5−7，

クリルアミドゲル電気泳動（SDSPAGE）への二次

0．4％pH3．5−10），5％β−merCaptOethanol

元電気泳動を用いる事により，Whole myofibri−の組成のsample buffer下で，micro dissec−

11ar proteinの中でDy鶏筋の特性を検討した。

ting homogenizerを用いて，充分homoge−

更にDy鶏の胸筋からsingle fiberを作製し，1つのcellの中で筋構造蛋白の異常がどのように表

nize L，以下の電気泳動的検索を行なった。

現されているのかを知る事を目的とした。

（acrylamide14．5％）は，基本的に0′Farre11

IEF及びNEpHGEからのSDS二次元電気泳動の原法に従ったが，装置は全判閻ヒしたも品用いた。

方法

対照鶏（line412），Dy鶏（Iine413）の貯化
後1，5，10，15，25，28，35，46，60，70，120日日

一部のsampleについては，Urea系（7M）からSDS系への二次元電気泳動も行なった。
蛋白の検出には，通常のCoomassie brilliT

鶏及び成鶏の各々数羽を使用。頭部を叩打，脱血後，

ant blueによる蛋白染色の他に，Single

直ちに浅胸筋，前広背筋（ALD），後広背筋（PLD）

fiberの場合には，Switzerらにより始められ，梨状筋のPars caudofemoralis（大腿内側の深Oakleyらにより簡略化された銀染色を用いた。

層にある白筋）を摘出した。
別に，対照及びDy成鶏胸筋からグリセリン筋を作

結果

製し，Mikawaらの方法にならって，筋のbundle

1）IEF及びNEpHGEからSDS系への二次元電を．実体顕微鏡下，．0．1MKCl，4mMEGTA，3

気泳動のpattern：
図1に，対照成鶏浅胸筋のIEF→SDS，NEpHGE＊東京大学医学部薬理学教室→SDSへの二次元電気泳動のpatternを示した。

20 ジストロフィー鶏筋の構造蛋白

basic
l

＝：F

→

aCidさC

115

basic

一−NE

T■「

S凸S−−⊥▼TM

bTNイ言．露●LCtacidic
＿⊥こ

＝二．＝′

‥

′

、、

一

●

●
1■

TN−C

TN−1

LC2・●

LC3

図1対照成鶏浅胸筋のIEF→SDS，NEpHGE→SDSへの二次元電気泳動のpatternを示す。左側の等電点電気泳動（IEF）から・SDS系への二次元電気泳動では，MyosinのIightchainl・2・3（LCl，LC2，LC3），Actin（A），Tropmyosin（TM），取0匹山
一C（TN−C）を区別する事ができる。Tropomyosinに関しては，ほとんどがa−S血itから成る。
一万・右側の非平衡pH勾配ゲル電気泳動（NE）からSDS系への二次元電気泳動では，胸型のnop血−T（bTN−T）及びTtopninーⅠ（TN−Ⅰ）を識別することができる。

蛋白の同定については，IEF→SDSでは，既知のた。MyosinのLCについて比較すると，PLDには主要構造蛋白の等電点と，SDSPAGE上の移動度

LC3が存在し，LCl，LC2についても，fastとを根拠とし，Myosinの1ight chain（LC），

slowでは存在型が異なる事が判る。Actin は両Actin，Tropomyosin，Trponin−Cを同定す

者に共通するが，Troponin−T，Ⅰ，Cについてる事ができた。一方，NEpHGE→SDSへの二次元

は，それぞれfast typeとslow typeを判別

電気泳動では，一次元の電気泳動において，basic

できた。この比較では，TropomyosinとTro−な方向に向って移動していく蛋白の流れを，任意のponinTについては問題が残る。従来，Tropo一

時間で停めてそのpatternを観察すると言う電気

myosinに関しては，α−Subunit は主として泳動の性質上 蛋白の持つ等電点を，その同定に利fast muscleに，βLSubunitは主として用する事ができない。今回は，既知の蛋白を抽軋

Slow muscleに存在するのではないかとされて純化し．co−migrationを行なう事により，きた。今回の検索では，PLD，ALD共に，それぞれTroponin−T，Ⅰを同定した。

fast，Slow muscleの純粋な型である事が，2）対鱒成鶏主要筋の二次元電気泳動上のpattern：

Tropomyosin以外の蛋白の存在型から予想されDy 筋の異常について検討するためには，対照るのにも拘らず，Tropomyosinについては，両鶏の筋 について，その拡がりを知る事が必要であ筋共に，α，βsubunitが存在している。Tro−る。鶏の骨格筋は，大きくfast muscle（速筋）

ponin−Tに関しては，fast muscleにおける存とSlow muscle（遅筋）に分けることができる。

在型に，胸型と脚型のある事纂問題となる。

図2には，fast muscleの代表としてPLDを挙Dy鶏ではfast muscleの選択的な雁患性がげ，Slow muscleの代表として，PLDと解剖学問題とされているが，fast muscle相互の違いを的に近接しているALDを挙げて，両者の比較を示し明らかにするために，図3に対照鶏の浅胸筋，PLD，

Ⅴ

116

生

化

学

TM
f

AL D

SLCl
STN−1
SLC2

sTN−C

も＿／、

ヘヤ′■、

■p′

bTNイ

r

ITNイモ．−

PL D
fLCI

tTN−1
fLC2＿

fTN−C

tLC3

TM
■■

MI X．
SLCl

STN−I
fLCl
SLC2

●

一

tTlト】
sTN−C

tLC2●
lLC3、tTN−C

図2 対照成鶏のfast musCleとSlowmuscleの二次元電気泳動を示す。
Slowmuscleの代表としてALDを，fastmuscleの代表としてPLDを挙げ，最下段に両者のmiXture（MIX）を示した。各spotが，fastmuscle（f）由来のものか，Slowmuscle（S）由来のものかを示した。PLDには，胸型のTroponinrT（bTN，T）の他に脚型のTroponin−T（1TN−T）が存在する。（以下の図について．電気泳動の方向及びspotの名称は図1に同じ）梨状筋のPars caudfemoralisの比較を示した0事は，Troponin−Ⅰ，及びCについても言えるo

MyosinのLCを見ると，どの筋肉でもLC3が存ところがTropomyosinとTroponinLTは・そ

在し，LCl，2共にfast typeであり，何れもかれぞれの筋肉で異なっている。Tropomyosinになり純粋なfast muscleであると言える。同じ

ついて検討すると，浅胸筋の場合，α−Subunitの

20 ジストロフィー鶏筋の構造蛋白117

bTN一丁●
1■−
A

TM

i●

●

廿．

fLCl●

Pect．

f TN−CfLC2・●
fLC3

一

丁M
●

bTNイ

ご

一丁N・丁子．￣

PLD
−

●

TM
▲

義TN一丁

LEG

図5

対照成鶏の代表的なfastmuscleである洩胞乱（Pect．）PLD，梨状筋のPars caudofemoralis（LEG）の二次元電気泳動のPatternを示す。
MyosinのLC，Actin，Troponin−Ⅰ．Cが各筋に共通してfast
typeであるのに対し，TropomyosinのsubtmitとTroponin−Tが各筋ごとに異なる事を示す。

みから成るのに対し，PLD及び梨状筋では，

くとも二つ認められる。1つは，Tropomyosin

α−Subunitと共にβ−Subunitが存在している。

であって，対照鶏はa L Subunitのみからな

Troponin−Tについては，浅胸筋が胸型のTro−るのに対して，Dy鶏では，αと共にβ−ponin−Tだけから成るのに対し，梨状筋は脚型のsubunitが存在している。これは我々が報告

Troponin−Tだけから成る。一方，PLDには，胸してきた結貞苦し致している。2つ目はTr。p。nin型と脚型のTroponin−Tが，両方存在することが−TでDy鶏では，胸型と共に脚型が存在して明らかとなった。

いる。TropomyosinとTroponin，Tは，前3）対照，Dy成鶏胸筋の比較：項のように，同じfast muscleの中でも，各図4に対照成鶏とDy成鶏の浅胸筋の二次元電気

筋肉ごとにその存在型が異なっていた事が想起

泳動による比較を示した。両者が基本的にfastされる。しかも，この2つの蛋白のDy鶏でのmuscleである事は，MyosinのLC，Troponin

存在型は，対照成鶏のPLDで認められたpattern−Ⅰ，Cから明らかである。両者が異なる点は，少なである事も注目される。

Ⅴ

118

生

化

学

NE

IEF

丁目

bTNl．〜●

Control

●
1■

●●

雷

感欝

が
●

−

丁目
●

言二詣暮 ■

Dystrophy
増■■

図4対照，Dy成鶏の浅胸筋の二次元電気泳動による比較を示す0対照鶏（Control）のnopmyosin（TM）
がa−Sl血litのみから成るのに対して，Dy鶏（Dystrophy）は，β−S血mitが存在するoTrq氾nin
一Tに関しては，対照鶏が胸型Tmpo血−T（bTN−T）から成るのに対し，Dy鶏では胸型の甘0Ⅰ血n−Tが減少し，脚型のTtopoI血−T（lTN−T）が存在する。

対照鶏とDy鶏との差異については，他にも幾つか

以降再び増加に転じ こうした再増加が，Dy成鶏浅の候補があるが，何れも定量的な扱いが必要である。

胸筋におけるβ−Subunitの存在と連絡する事が明

4）胸筋Tropomyosin subunitの時間的経過：

らかとなった。

前項で認められたTropomyosinの異常の時間

図5−Bには，これまでの検索とは独立に，一次的経過を明らかにするために，経時的に採取した浅元にUrea gelを行ない，Tropomyosinを含む

胸筋について二次元電気泳動を行なった。図5−A部分だけを切り出し，二次元のSDSPAGEに展開に，IEF→SDSの二次元電気泳動のTropomyo−

した結果を示した。この方法を用いても，上の3つ

sinの部分だけを示した。この結果は，基本的に我の結果が確認された。

々の行なってきた報告に一致するもので，以下の35）single teased fiberの検索

っの点が明らかになった。1つは，対照鶏浅胸筋で前項までで明らかとなったDy鶏胸筋におけるは貯化後早期にP−Subunitが減少〜消失する0Tropomyosinの異常が，1つのcellの1evelで14）次に，対照鶏でみられた減少一消失の過程がはどのように表現されているのかを明らかにするた

Dy鶏では遅延する。更にDy鶏では，β−Subunit
は一度減少し，貯化後25−30日で極小比をとるが，めに，Single fiberを作製し，IEF→SDSへの
二次元電気泳動を行ない，銀染色法によりspotの20 ジストロフィー鶏筋の構造蛋白

Co〔trOl

図5−A

j

115

25

35

●

＿

●

119

頻

るO d叩§●●

対乳Dy鶏浅胸筋の甘opmyosinsubmitの経時的変化を示す。対照（Control），
Dy（Dystrophy）鶏の婿化後，1，15，25，35，46．60E］目の浅胸筋のIEF−SDS
への二次元電気泳動のTropomyosinの部分だけを示す。対照鶏では，15日目で6−Subunitが消失するが・Dy鶏では残り，25−35日日極小比を取った後，再び増加し
ている。

1d
一・

C

5
一・・ム

ー

15
●

●

28

●

●

●

D

35d

図5−B

10

−

●

C

D

46
●

●

70
…

『■

120

A

●

●

D

D

対照，Dy鶏浅胸筋の廿opomyoshsuburitの経時的変化を，Urea系からSDS系への二次元電気泳動の結果として示す。将化後，1，5，10，15，28，35，46，
70，120日目及び成鶏（心の対照鶏（C）及び取鶏（D）晩irで示す。図5−Aに
基本的に一致する結果である。

Ⅴ

120

生

化

学

ては，直径30／上仇以下のより細いfiberが同じ蛋
白組成を持つのかどうかが1つの問題である。更に，
Tropomyosinのα−Subunitに対するβ−Sub−unitの比率が，fiberごとに，どのように隔たるかという点も一つの興味である。

考

察
ナ）￣3）

Dy鶏筋の構造蛋白については，Tropomyosln，Troponin−T，MyosinのLC等について異常があるのではないかとされて来た。こうした異常のもつ意味については，幼若性の残存あるいは，Dy鶏が発症するのに伴う幼若性の獲得などが考えられる。
我々が検索を進めて来たTropomyosinを例に挙げて考えてみると，解化後早期の対照鶏胸筋におけるβ−Subunitの減少〜消失が，Dy鶏で遅延し，その後再び存在比の上で増加する事から，幼君性の残存だけでは説明できず次の2つの可能性がある。1つは，胸筋を構成するfast fiberが，従来β−Su−
bunitが主として存在するとされてきたslow
fiberに変換を遂げる事であり，2つ目は，言わゆ
図6−A Single teased fitx：rの光顕像（×100）

る再生現象による幼若要素の再出現である。これらの可能性に対して，今回，我々の得た結果は幾つかの示唆を与える。まず，Slow fiberへの変換に検出を行なった。
については，形態

ついては，前提となるTropomyosinの存在様式

学的に，一つのcellである事を確認してから，電気自体が問題となる。従来の，α，Subunitがfast

泳動的検索を行なった。図6−ABに，teaSeされmuscleに，β−Subunitがslow muscleにとたfiberの光顕像と電顛像の例を示した。何れも，いう図式は，今回示した組織のレベル（fastteaseしたsingle fiber

12）

そのfiberが一つのcellから成る事を示している。

muscleであるPLDにも脚筋にもP−Subunitは対照鶏胸筋については，TropomyOSinのα−存在する）でも，細胞のレベノ鍵も成立しない事がsubunitのみから成るfiberが殆んどである事が明らかになりつつある。従って，P−Subunitがあ

既に明らかにされているので，Dy鶏のfiberを中るからと言ってSlow fiberを考えるという前提が心に示す。図7に，Dy鶏胸筋から得られたsingle

危いと言える。Dy鶏胸筋ではTropomyosin以外

fiberの直径についてのdistributionを示した。

の蛋白についても，SlowmuscleのComponent

このグラフは，検索されたfiberが直径100／J仇を中が，少なくともmajorなspotとしては存在しな

心に，大きな片よりなく分布する事を示している。

い事が今回の検索で明らかとなっている。

図8に，こうしたfiberのIEF→SDSへの二次では，幼君性の再出現，更には再生現象との関連

元電気泳動の銀染色によるpatternを示した。こはどうだろうか。今回のsingle fiberの分析でのfiberには，Tropomyosinに関しては，αとは，検索した限りのfiberから，Tropomyosin

共にβ−Subunitが存在している。今後の問題としに関しては，α−Subunitと共にβ−Subunitが

20 ジストロフィー鶏筋の構造蛋白121

図6−B Si曙1eteasedfiberの横断像（×3，000）
光軌電顛像共にt飽S。されたfiberが1つのCellか克る事を示している。
（左上のbarは10〟mを示すう

検出された。こうしたβ−Subunitの分布は，組織つ事を示すと共に，胸筋という特殊な筋肉だけに特

化学的に散在性と言われている再生線経の分布とは有なTropomyosinの変換機構が存在する事を示

異なっている。少なくとも，綿織化学的にみた再生

唆するものである。このTropomyosinの変換機

線維だけがβ−Subunitを持つという確率は低いの構の追究は，細胞生物学的な段階を経て，geneのではないかと考えられる。むしろ，Dy鶏胸筋のlevelで解明されるであろう。遺伝子疾患としてのfiberの1本1本が，対照鶏の胸筋には無いsub−

Dy鶏の異常の1つが，この変換機横にあるとすれunitを持ち，恐らくは合成されていると考えられば，異常の原因もまたgeneの1evelに求められるのである。ここで注目される事が2つある。1つる事になる。こうした予想は，我々が進めてきた筋

は，僻化後早期の胸筋にはβ一Subunitが存在する

構造蛋白の解析が，Dy鶏のgeneのlevelの解析が，何らかの機構に従って減少〜消失してしまう事の1つのいとぐちである事を示している。

である。もう1点は，同じfast muscleでも，一方，他の筋構造蛋白，殊にTroponin−Tにつ

PLDや脚筋には成鶏でもβLSubunitが存在する

いては，Tropomyosin と同じく，婿化後早期に事である。この2つの点は，Tropomyosinの合変換を生C．fast muscleの分析でもflexible

成が，他の蛋白合成に比べてflexibleな要素を持

な要素を持つだけに，今後の研究が重要である。

Ⅴ

122

結

生

化

学

梨状筋を比較すると，MyosinのLC，Tropo−

語

nin−Ⅰ，Cが，それぞれのfast typeで

鶏の骨格筋の構造蛋白を，IEF→SDS．NEIⅢGE→SDSへの二次元電気泳動を用いて分析し，次のよ

uniformに対応するのに対し，Tropomyosin，

うな結果を得た。

Troponin−Tは，筋肉ごとにその存在型が異な

1．fast muscleの代表として，浅胸筋，PLp，

っていた。

■⊃

α︺山王⊃Z

50−m
l■■■
〇〇
一Jl■つ
■■■l
沌l∽

9
0−110

川−90

50−乃

3010
5

FIBER DIAMETER

図7Dy鶏胸筋の検索されたsinglemusclefiberの，直径に対する分布を示す090−110／上mを中心こ，特に片寄りなく分布している事を示す○

2．対照鶏の野化後早期の胸筋では，Tropomyo−

3．秒鶏胸筋のsingle fiberを作製したが，sinのβ−Subunitの減少〜消失があるが，Dy

Tropomyosinに関しては検索した限りの全て

鶏では減少に遅延があり，貯化後25−35日に極小のfiberから，・αと共にβ−Subunitが検出さ比を取った後，再び増加していた。

れた。

20 ジストロフィー鶏筋の構造蛋白

123

頑毒草

〜！・l｛トL．●＼＼、＿−＿．＿＿一一一一＿▲．−・−●一・・：
TM＼：二七

fLCl
t■ト

fLC2

TN−C

欄繭■恥

増馳

増齢顧

図8Dy鶏胸筋のsi喝1efitxrのIEF→SDS系への二次元電気泳動の銀染色による例を示す。Tro卯myOSinに関しては，αと共にβ一Submitが存在している。
文献1）野々村禎昭，武田伸一：筋ジス動物の微細形態学一
ジストロフィー鶏胸筋の僻化後比較的早期の経時的変化一一。筋ジストロフィー症の基礎的研究（江楕班）昭和53年度研究報告書。
2）野々村禎昭，武田伸一：筋ジス動物の微細形態学−
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ニットの存在様式−。筋ジストロフィー症の基礎的研究（江橋班）昭和54年度研究報告書。
3）Takeda，S．＆ Nonomura，Y．：Presence of thetropomyo＄inβ−Chainindystrophicchickenbreast

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5）Obinata，T．，Takan0−Ohmuro，H．＆Matsuda，R．：
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〟yAαd．gcと，317：349−369，1979．
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Farren，P．H．：HighresolutiontwoJimensional

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9）0 Fa汀ell，P・Z．，Goodman，R M．＆0，Fa∫托皿，
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12）Dhoot，G．K．＆Perry，S．V．：Distribution of
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13）Perry．S．V．＆Cole，H．A．：PhosphoTylationof
troponinaJld the effbct＄Ofinteractionsbetween

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14）Roy，R．K．，Sreter，F．A．＆Safkar，S．：Changesin
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トロフィー鶏骨格筋の組織学的，組織化学的研究。
神経内科．11：259−269．（1979）21ラットミオシン分化に対する神経の影響
＊
＊

夫 一 隆

中

＊

埜

秀幸

結
は

じ

め

に

征 哉＊

＊
＊

田 浦 川

杉石 三

研究協力者

果

表1に，SOleus筋とEDL筋の湿重量変化を示

種々の動物の骨格筋の中でラットは特に未分化のした。双方共，約70％の減少を見ることから脱神経段階で誕生することが知られている。生後，Slowの効果は明らかであった。脱神経筋ではほとんどすmuscleであるsoleus筋は組織学的にタイプⅠのべての筋線経の萎縮が見られ，grOuped hyper−

形質を獲得する。Fast muscleであるextensor

trophyが見られないことから，re−innervation

digitorumlongus（EDL）muscleは同様にしてタイプ2となる。我々は，筋の分化に対する神はないと考えられた。

経の影響を調べるため，生後1日目のラットの坐骨筋の筋タンパク組成を単一筋線維二次元電気泳動法

神経を切断し，分化に及ぼす影響について観察した。

で調べた。図1は，正常の成熟ラット（150日）の分化の程度はミオシンのL鋭並びにミオシンATP

slow fiber（A）並びにfast fiber（B）の電ase染色を指標として検討した。

気泳動像である。正常の骨格筋では明らかに1本のまず脱神経の効果を見る前に，正常のラット骨格筋線経に1種類のタイプのミオシンしかないことが方法

11匹のラット（生後1日）の左坐骨神経を5mmの明らかである。ラットではトロポミオシンのα，β各成分にはタイプ特異性がない。図2にslow，

長さにわたって切除した。30日後，SOleus とfast各1本ずつの混合泳動パターンを示した。

EDLを腱と共に摘出し，湿重量を測定した。

LlとL2には明らかに分子量及びpIのタイプ差がとり出した骨格筋はグリセリン溶液（20mM

りることがわかる。図にXで示したのはSlow

Tris−HCB，pH7．0，0．1MKCB，5mMEGTA，

muscleに特異的に存在するもので．LIs′と言われ50％glycerol，0．2mMleupeptin，pepStatin・ているタンパクであるが，これがSlow myosin

E−64，bestatin）に入れ−20℃に2週間以上保のL鎖であるかどうかは，まだ不明である。

存した。
単一筋線維電気泳動並びに銀染色は三川の方法を改変して使用した。

次に筋全体のタンパク質のパターンを1次元電気泳動（図3）と2次元電気泳動（図4）を使用して検討した。出生直後のSOleusにはLIs，Llf，
L2S，L2f，L3すべてが存在し，Slowとfast両方のミオシンがほぼ等量ずつあることがわかる。

＊東京大学医学部神経内科＊＊国立武蔵療養所神経センター疾病1部

一方，ミオシンATPase染色ではすべての筋線経が一様に染色されることより誕生時では，Slow fi−

21 ラットミオシン分化に対する神経の影響
Muscle wet weightControI Soleus（red）
Denervated Soleus
Contr01EDL（white）
Denervated EDL（after

20．2

＋

125

30

daYS）

3．8

m9

5．4！1．8m9（27篭）
21．5

＋

6．3

3．8

m9

＋1．1m9（29宅）

表1脱神経による筋湿重量の変化

図1成熟ラット（150日）の単一筋線維二次元電気泳動図。Aはslowfiter，Bはfast fikr．銀染色。

（十）

く−）

雷ETM

′掬章≒画嗜†

X

●

L，S●‖
●Lltこ

L2＄ヽL2fl L3

図2図1の2本の単一筋線経をまぜて泳動したもの。銀染色。

Ⅴ

126

生

化

学

neonatal EDL

L2S

L18Llt

L2t

L3

Soleu＄

EDL

図5生後1E］目のSoleus．EDL筋及び生後30日目のものを一次元電気泳動したもの0CBB染色後，600nmでトレース した。

berとfast fiberが等しい数だけ存在するので

図4で明らかなように，embryoniclight

はなく，1本のfiberの中に両タイプのミオシンがchain（矢印）らしきものも見えるが，未同定で混在すると考えた方が妥当である。このことは，泳ある。

動に使用した筋線経の本数を変化させても両タイプ

図5に脱神経30日後のsoleus及びEDLの筋組の比率が変化しないことからも証明される。成長に軌並びに健側の同じ筋肉の組織像を示す。表2に従ってLIs，L2Sの量が多くなり逆にLlf，L2f，

ミオシンATPase染色で見た筋線経のタイプ別本数

L3の量が減少する（図4B）。しかしながら生後を同時に示した。まずSOleusを見ると健側では6130日日のSOleusでは約20730％のミオシンが％がTypel，39％がType2になっているが，脱fastタイプである。30日目になるとATPase染

神経筋ではすべてがType2に分化していることが色で両タイプがはっきりと分別され，1本の筋線経

わかる（図6の5）。同時に筋萎縮が顕著である。

には1つのタイプのミオシンしか存在しなくなると

一方，EDLでは健側の96％がType2に，残り4言える。

％がTypelになっているが，脱神経側ではType

EDLでは同様に出生直後ではATPase染色で筋2線経がその割合は変わらないもののすべて萎縮し線維問に差は認められないが，生後30日たつと，はていることがわかる。しかしながら本来Typelにっきりとslow，fast の区別がつくようになる0なるべき数％の線経が完全なTypelではなく中間

図3より，ミオシンL鎖は生後1日においてかなり型になって（図5D星印），しかも萎縮せずに存在

fast typeに分化しているように見えるが，少量する。この筋線維1本の電気泳動像が図6の6であのLIs，L2Sも確認できる。生後30日ではほとんる。これで明らかなように，Ll鎖が2種存在し，各どfastタイプのみしか検出できない。

々がLIsとLlfに相当する。つまり1本の筋線維

21 ラットミオシン分化に対する神経の影響

127

図4図3と同じサンプルを二次元に泳動したもの。Aは1日目
Soleus．Bは30El目Soleus，Cは1日目EDL，Dは30日
日EDL。矢印はembryordclight chainと思われるもの。

表2
PERCENTAGE DZSTRZBUTZON OF EACH FZBER TYPE

TYPel Zntermediate TypeS01eus C．

61
D．

ED工一

2

C．

D．

0

4

0

（After neonatal denervation）

Ⅴ

128

生

化

学

の中に2つのタイフ切ミオシンが存在することになる。

化するように運命づけられていようがslowに分化

以上の事実より，骨格筋が未分化の段階で神経のするように運命づけられていようが，必ずfastタ

影響を断ち切ると，骨格筋はそれが以後fastに分イプに分化することが判明した。

●▼●

嘲

r日︐．㍍欄
図5脱神経筋のミオシンATPase染色（〆‡9．4）。Aは健側のSOleus Bは脱神経筋のSOleus
Cは健側のEDL，Dは脱神経筋のEDL。1はタイプ1線経。2はタイプ2線経。

考察

まず第1に，未分化な筋線経はslowとfast両

ミオシン分子のタイプによる相異を利用してタイタイプのミオシンを持っていることは非常に興味あプの変化を検討する試みが広く行われている。通常

る事実である。Soleusではほぼ等量だけslowとは発生段階を追ってそのタイプの変化と分化の程度

fastが混在するのに対し，EDLではfast優位でが比例することから，非常に優れた指標の1つでああるが，どちらともそのミオシンが艶 アルカリにると考えられる。

比較的耐性で組織学的に均一なタイプ2Cである。

一方，哺乳類の筋の分化は神経支配によることが第2に神経支配が除かれると，骨格筋は脱分化を大であるが，鳥類のように胎生期からの観察が容易

起こして胎生型に戻るのではなく，完全にfastタ

でないことから筋の分化と神経との関連は十分追求

イプに成熟することである。これは，脱神経筋の電されていないのが現状である。成長した動物では筋気泳動図でミオシンL3が明らかに判別できることは十分に分化しており，脱神経の効果はすぐには現で証明される。

れない。ラットの出生直後の骨格筋は他の動物と違第3にこの実験により，筋のファイバータイプのってかなり未分化であると考えられる証拠がいくつ

変化は1本の筋線経が萎縮してなくなり新しく他のかある。そこで我々は，未分化な段階で脱神経を行

タイプの筋線経ができるのではなく，1本の筋線経

うと，神経を除去した効果が即座に表われることをの中でタイプ変化が起こることが示された。

期待し本実験を行った。

図7にミオシンL鎖の変化をまとめた。

4空等 二﹁3彗雷雷⊥︳﹁
2竿等卜

1竿と■21 ラットミオシン分化に対する神経の影響

Ll t｝■−

二＿二＿

L2I『『−

129

L3

図6脱神経筋の電気泳動図。1，2は健足のsoleus筋線維束，6は脱神経足EDLの肥大中間型
単一筋線経。

DIFFERENTIATZON OF MYOSZN L工GHT CHAINS

Neonatal

Embryo

Llf′

Llf′L2f′L3f

L2f（LIs・L25）（LIs・L2S）＝￣

Llf′L2f′L3f

モ

EDL ♂
LIs′L2S

Llf′L2f（LIs・L25）

くLlf・L2f′

こLIs′L2S＋きL3f）

SOLEUSNORMAL DEVELOpMENで≡

DEpERVATION

図7脱神経によるミオシンの分化スキーム。

き

Ⅴ

130

文

生

献

1）S．Ishiura，Ⅰ．Nonaka，H．Sugita，T．Mikawa：Effect

Ofthedenervation ofneonatalsciaticneTYeOnthe
differentiationofmyosininasinglemusclefiber．

化学軸．〃g〟′0エ1981hpreSS．
2）T・Mikawa，T・Shimizu，S・Takeda：DifferentiatioI1
0f chick myofibrmar proteinsJ．Biochemin
pIeparation．

22

筋肉の弾性蛋白質コネクチン

丸

山

工

作

コネクチンは，骨格筋の弾性構造を形成する骨格

コネクチンのカラムを通したのち，1MMgC02で蛋白質で，筋原綿経の機械的性質にあづかっている。

溶出して得られた。このグロブリン溶液でニワトリ

最初，ミオシンやアクチンなどを抽出した残恋から

筋原繰経を処理したのち，FITCラベルの抗ウサギ

得られていたが，筋原綿経を直接SDSに溶かしてか

グロブリン・ヤギグロブリンで蛍光染色して蛍光顕らゲルろ過法で見かけの分子量100万という高分子

微鏡下で観察した。

量成分として純化できるようになった。

プロテアーゼの作用

ジストロフィー筋では，コネクチン含量が低下す

ニワトリ筋原線経を直接プロテアーゼ処理し，Sることから，弱化した筋機能の原因のひとつである

DSゲル電気泳動法によってコネクチンバンドの変可能性がある。ジストロフィー筋では，カルシウム化を追跡した。カルシウム活性プロテアーゼ（東大依存性プロテアーゼの活性増加が示されており，こ医鈴木紘一助教授の提供）は，20mMTris，pHの酵素のコネクチン構造に及ぼす作用は，生理的に8．0，5mMCaCB2，5mM2−メルカプトエタノー

みて興味がある。本研究では，コネクテン構造につル存在下で処理した。セリン・プロテアーゼ（徳島

いての基礎的な検討とともに，種々のプロテアーゼ

大勝沼信彦教授の提供）は，0．25Mリン酸，pH8．0．の効果がしらべられた。

存在下でしらべられた。

実 験 方 法実 験 結 果コネクテンの単離コネクチンの電気泳動パターン

ニワトリ胸筋を50mMKCB，5mMEGTA，1m

図1に示すように，筋原線経に含まれる蛋白質中

MNaHCO3溶液でホモジナイズし，よく洗う。筋では，コネクチンのダブレット・バンドが，もっと原線経を等量のSDS溶液（10％SDS，40mMDD

も泳動移動度がおそい。このダブレット・バンドは，T，20mMTris，pH8．0，5mMEDTA）に溶かし，筋原線維調製時に5rnMEGTAを用いないと，しば

不溶成分を遠心によって除き，上宿をBioge150

しば明らかにみられない（これはカルシウム活性プ

Amにかけ，高分子量成分を分離する。3％SDS

ロテアーゼなどのためであろう）。また，1％SDS

ゲル電気泳動でチェックした。

中で不安定であり，37℃，2日間で完全に消失する。

コネクチンの抗体

そのさい，ぼんやりした低分子量（ミオシンより大単離したコネクチンをウサギに注射して，抗血清きい）成分があらわれてくる。ただし，0℃では分を得た。1回に0．3mgあて，4回注射した。免疫グ

解されない。1％SDS存在下で超音波処理を30秒かロブリンは；抗血清をアクリルアミドに分散させた

けると，同様に分解する。これらのことは，比較的不安定な架橋結合によってポリペプチド鎖が多数架＊千葉大学理学部生物学教室

橋されて巨大なコネクチンが形成されていることを

Ⅴ

132

生

鬱

化

学

＝

Doublet−．＿＿／・−No．3＝− ＼ 一一No．4『「−Myosin」−−■■l一一一α−Actinin■llL−Actin

図1ニワトリ胸筋の筋原線維全部のSDSゲル電気泳動パターン（ダブレットがコネクチン）示唆する。
筋原線経におけるコネクチンの局在れる。今回は，カルシウム活性プロテアーゼ（CANP）とセリンプロテアーゼの作用を研究した。

抗コネクチンで筋原線経を染色すると，A−Ⅰ接CANPは筋原線経と重量比で100：1で，コネク合部がつよく蛍光を発する（図2a）。1サルコメ

テンのダブレットの上のバンドをすみやかに分解し，ア内のその間隔は1．7〝肌で，A帯の1．5／Jmより幅

下のバンドはなかなか分解しない（図3a）。20分

がひろい。他のA苗，Ⅰ帯はごく弱く染色される。

処理後では，もとと同じようなダブレットがみえる

HasselbachqSchneider溶液でミオシンを抽ようになる。このことは1，2，5，10，20分と処理出すると，Z線をはさむⅠ帯の両端部がやや濃くみ

時間を変えたパターンを比較すると了解される。こえ，その部分がつよく染色される（図2b）。さられに対して図1のバンド3（N2線蛋白質）はCANPに，0．6MKIで処理してアクチンを抽出すると，Zによってすみやかに消失する。

線の両側に蛋白質があつまり，その部分がつよく蛍

セリン・70．ロテアーゼは，CANPとちがって，コ

光を発する（図2C）。ここでは，サルコメア内にネクテンを速く分解するが，バンド3には作用しな蛍光をだすフィラメントが走っている。ただし，Zい（図3b）。

線そのものは染色されていない。これらのことは，引きのばした筋原線経ではっきりと見える（図2d）。
プロテアーゼによるコネクテン分解
コネクチンは，トリプシンによって容易に分解さ考察

コネクチンは，直径2nmのごく細いフィラメント
のからまりあった網目構造を形成する。しかし，分22 筋肉の弾性蛋白質コネクテン

133■叫棋繁書聖禦璧
いい日暮日日日暮憂さl憂毒手‡義喜¶「′r r貞J．

㌍炉端照㌻濁

潟 温 慧

「

ゝ

」靡

ー

轟

鴨

雷

図2抗コネクチンで処理した筋原線維
a．対照
b．Hasseltnch−SchTだider溶液で抽出后
C．0．6MKIで処理后
d．Cと同じ。上は位相差顕微鏡像で，下は蛍光顛微鏡像−は10′上m

Ⅴ

134

a O

1

生

化

学

2

5

10
■

｝

■

−

．‥

州、

−
『→−

♯

欝

廿

︸

■●● ■■

■

20

せ

b O

1

2

5

10

︑

恥・山一

∴

−

『■

図るプロテアーゼ処理筋原綿経のSDSゲル電気泳動パターン
a．カルシウム依存性プロテアーゼ（1：100）
b．セリン・プロテアーゼ（1：100）

数字は処理時間（分）を示す。

20

22 筋肉の弾性蛋白質コネクチン

135

子量100万のバンドがどのようなモノマーからできかい。多少限定分解するが，トリプシンやセリン・ているか，また架橋結合からできているかはわかっ

プロテアーゼのように全部分解しない。CANP処理

2）7）

ていない。
蛍光抗体法で明らかになったことは，コネクチン

筋原線経とジストロフィー筋原線経との注意ぶかい
比較検討もこれから行う予定である。

は，ミオシンフィラメントの両端部にとくに多く存在していることである。ミオシンを抽出したのちら，なお，アクチンフィラメントの自由端近くに存在する。0．6MKIでアクチンフィラメントを抽出すると，
Z線のまわりに集る傾向がある。これらの観察は，コネクチン網がミオシンフィラメントをサルコメア
中央部に位置させるのにあづかっていることを示唆する。このことは，Lockerのttgap filament
8）

説と一致する。事実，我々は，Hasselbach−Schneider抽出液から少量ではあるが，コネクチ
ンを回収することができた。なお，KI残値の線維状のコネクチンは，よりあっまったものと思われる。
コネクチンはZ線内には存在せず，サルコメア内で
Z緑間をつないでいるものとみなされる。
プロテアーゼの作用では，CANPの効果が興味ぶ

文献1）Maruyama，K．，Natori，R．，and Nonomura，Y．
此れre262：58−60，1976．．
2）Maruyama，K．，Matsubara，S．，Natori，R．，
Nonomura，Y．，Kimura，S．，Murakami，F．，Ohashi，
K．，Handa，S．，and Eguchi，G．，J．Bわche〃182：
317−337，1977．
3）Toyoda，N．and Maruyama，K．J．Bibchem．84；
239−241，1978．

4）Wang，K．，McCure，J．，and Tu，A．，E＞oc．Nbt．
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5）Maruyama，K．and

Yamamoto，K．

CrossBridge

MecIlanismin肋∬k Cb那加Crわが ed．H．Sugi
and G．H．Pollockpp319・328，1979，Univ．Tokyo
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6）Wang，K．andWnliamson，C．L．丹oc．Nat．Aeqd．
gcと扶且」．77：3254・3258，1980．
7）Maruyama，K．，Kimura，S．，Ohashi，K．andKuwano，Y．上月ぬぐ如刑．1981，inpress．
8）Locker，R．H．and Daines，CJ．＝FibrousProteins，，

ed D．A．D．PaLry and L．K．Creamer pp43−55，
1980，AcademicPress．

23

ジストロフィー成鶏胸筋小胞体膜のCa一取り込み能と，その膜構成について
＊

夫明 之

＊

行恒

＊
＊

孝丞

井垣

＊

今岩

＊

敏博雅

井島辺

酒西渡

研究協力者

ジストロフィー筋の筋収縮能は著しく滅弱してい（pH6．8）で洗浄し，細切した後，筋1g当り2．Oる事が知られている。ところが，神経・筋接合部にmBの割合量の20mMTris−HCB buffer（pHおける性質である電気生理学的現象には大きな変化

7．4）中でホモジネイトする。ワーリングブレンダー

が兄い出されていない。われわれは，筋収縮・弛緩

回転数は250〜300rpmとし，20秒毎にpH6．8〜機構の過程で，筋構成内部膜である筋′ト胞体の機能

7．0となる様に5mMTris−HCB buffer（醍Ⅰ7．5）に着目し，膜構成脂質，蛋白質，およびCa取り込みを摘下し，筋肉泥となる様にホモジナイズする。こ能について検討してきた。われわれは，従来筋小胞のホモジネイトを粗穴テフロン網でロ過し，ロ液を体膜構成脂質の著明な変化，特にcholesterolの

遠心し，筋小胞体膜を得る。分離したSRのfruc−

増大，または膜phospholipid（特にlecitin）

tionは従来我々が用いている8650〜36600×Gの減少などを報告してきた。しかし，われわれの方のfractionをH−FSRfractionとし，これ以上法で分離したジストロフィー成鶏胸筋小胞体のCa−

65000×GまでのfractionをL−FSR fraction

uptake能は，正常成鶏胸筋から分離した筋小胞体とした。得られた各FSRを20mMTris−maleate（C−FSR）と大差なく，uptake rateの遅延がbuffer（pH6．8）で2回洗浄した。

示されたにすぎなかった。これは，ジストロフィー

3．Ca−uptake能の測定

筋には機能の異常な筋線経と正常なものとが混在しCa一取り込み能は従来我々が用いている方法ている事実から考えると，正常な筋小胞体のみを分（Nishijima et al）によった。反応溶液条件は離していた可能性がある。

0．1MKCB，3mMMgCB2，20mMTris−male−

今回，従来の分離法を若干変更し，筋小胞体膜をatepH6．8，0．1mM45cacB2，1．OmMATP，

分離し，このCa−uptake能と，構成膜脂質およびTemp．20℃で行った。 尚，反応はミリポア法によ膜蛋白を分離したので報告する。

って停止し，FSRに取り込まれた45払量を液体シンテレーション法によって測定した。

材料及び方法
1．ジストロフィー成鶏（413）及びコントロール

4．組織標本の作製
胸筋小片をドライアイス・イソペンタンで直ちに（412）の浅胸筋を使用した。

凍結し，クリオスタットで均10／上の厚さの切片とし，2．分離筋小胞体の調整

HE，Trichrome染色を行った。

胸筋を15℃前後の20mMTris−HCB buffer

5．筋および筋小胞体膜構成脂質の測定＊東京慈恵会医科大学第二生理学教室＊＊東海大学体育学部体育生理各構成脂質の抽出はFoIch等の方法を用いた。尚，
中性脂質，ステロールの展開溶媒はへブタン：石油

23 ジストロフィー成鶏胸筋小胞体膜のCa−取り込み能と，その膜構成について

図1正常成鶏胸筋の組織像

137

図2 ジストロフィー成鶏胸筋の組織像

エーテル：エーテル：酢酸−60：20：20：1（1㍍事から（図1，2）ホモジナイズ時に著明な液性んん），また燐脂質はクロロホルム：メタノール：の変動が有る為と思われる。我々はこの点に留意し，

アンモニアー14：6：1（YVん）を用いた。これら

適切な液性の補正を行なうと，正常成鶏胸筋からのの抽出液を薄層クロマトグラフィーによって分離し，小胞体膜の分離収量より明らかに増大していた（1もー

各脂質をW．Morison and L．M Smithの方法blel）。これはジストロフィー胸筋は前回報告しによってmethylationL，ガスクロマトグラフィ

た様に筋組織内膜様構造物の破壊の進行が有る事かー（FLD163）で分析した。

ら，通常のホモジナイズ条件では正常筋のそれよりも破壊されやすく，結果的に膜様構造物の抽出量が

結果と

考察

1．筋小胞体の分離

増大したものと考えられる。
2．Ca−uptake能と膜構成成分について

ジストロフィー成鶏（413）の胸筋からの筋小胞体

正常成鶏胸筋から分離したH−fraction（C−Hの分離は筋組織内脂肪量の増大と思われる状態を呈−FSR）のCa−uptake能は他の温血動物の下肢筋し，正常成鶏胸筋の場合と同様な分離法では収量のから分離したFSRのCa−uptake能と同様なup−

著しい減少が示された。これはジストロフィー胸筋

take能を示し，反応開始後均租秒で最大量を示し

組織内脂肪が多く正常筋細胞の減少は明らかであるていた。しかしジストロフィー成鶏胸筋から分離し

Ⅴ

138

生

化

学

︵∪彗OJdm∈︑S茎∈もモ竜宮DU
一〇一

COntrOI H−fraction

一〇一
一△一

Dys−H−fraction
COntrOl−L−fractbn

一△−

恥S−；L−fraction

たH−fraction（dys−H−FSR）では前回報告しよりも明らかにCa−uptake能の低下が示され，そた様にuptake能はC−H−FSRの15％程度の減少の最大量を示すのは反応開始後150秒以降と考えらを示しているにすぎない。これはジストロフィー筋

れる。しかし，D．scales等（1977）はジストロの小胞体機能が正常か，又は若干の機能低下がある

フィー成鶏（5〜6W）のbreast muscleのFSRのみであろうと考えられる。しかし，我々の採取しではCa−uPtake量は正常FSRより極かに少いのたdys−H−FSRは正常か又はそれに近いFSRのみ

みでuptake能の低下は示さないと言う。また，を分離している可能性を有している。事実我々は

total（Ca−Mg）ATPase activity等のCa−

H−fractionより軽いL−fractionのCa−up−

pump機能は正常FSRと同様であると報告していtake能を測定すると，COntrOIL−FSRのそれる。また，A．Gideon et al（1979）はoxalaT6）

23 ジストロフィー成鶏胸筋小胞体膜のCa−取り込み能と，その膜構成について

139

表1胸筋からの筋小胞体膜の収量
H−fraction L−fraction
Control O．46

0．23

町skOphy O．98

0．41
（rrgprotein／／hgm闇Cle〕

図4分離別、胸膜構成蛋白のpolyacryhmidegelによる分離
分離法はLaemmii（1970）によった。
A：controI HT fraction

te（＋）によるCa−uptake能は正常FSRの3倍にがdys−L−FSRでは著しく減少していた。この蛋上昇している。特にMg−Ca ATPase活性はジスト

白bandはR．E．Mark and R．J．Baskin

ロフィー筋FSRで上昇すると報告している。そこで（1978）によるとFSRの主bandであり，（CaJMg）

我々はFig3に示したdys−FSRのCa−uptake

ATPaseであるとしている。S．D．Hanna and能の低下を説明する事が出来ないので，FSRを構成

R．J．Baskin（1978）はジストロフィー成鶏胸筋する蛋白質の分離を試みた。その結見 G．Meiss−のFSRの（Ca＋Mg）ATPaseは正常FSRと同じ

ner（1975）によるCa−pump prOteinに相当であるがCa−ATPase活性は減少していると報告しする100，000〜110，000dal．の蛋白質はdys−H−ている。これは図3に示したようにdysFSRのFSRにおいてcontrol−H−FSRと同様であった

Ca−uptake能の減少を説明出来るものと思われる。

学

レし

′l

Ⅴ

生

B：controI LT fraction

さ■−｛▲′1架かり∴・、●‥

図5ジストロフィー筋分離筋小胞体膜構成蛋白のpolyacrylamidegelによる分離
B：dys−L−fraction

23 ジストロフィー成鶏胸別、胞休膜の由一取り込み能と，その膜構成について

141

晦二三≡曇等＿．王
．●
●

●
●

●

A：dys−H−fraction

また，図5では65，000daltonの蛋白質はdys−
FSRで減少し，特にdys−LqFSRでは著明に滅ているものと推定される。
次に，この様な筋小胞体膜の機能を論ずる場合，

7）

少している。これはG．Meissner（1975）によるその機能低下の一因として，D．Kunze（1973），

Ca−binding proteinに相当している。上述のB．P．Hughes（1973）等によって報告されている事から，我々はジストロフィー筋の筋小胞体Ca−様に，膜構成脂質の変動が推定される。我々は前回

uptake能は通常の分離法によるH−fractionでdys−FSRではtotal−phosphalipidの減少，は正常筋小胞体と同様な機能を持ち，Ca−binding

特にsphingomyelinの増大とphosphatidyl−

prdteinの若干の減少に伴ってuptake能の低下

cholinの減少が特徴的である事を報告した。これを示す。さらに，L−fractionでは（Ca＋Mg）

等の変動はdys−L−FSRに著明で，Ca−uptake

ATPaseの減少，binding proteinの減少に伴能の低下と比例的関係を有していた。我々はこの膜って，その機能の低下は著明となっている事を示し

構成脂質の代謝系を追求しているが，今回，筋組織

学

ヒ
イ

生

Ⅴ

142

、b

：○ ￣

．N．

D．

C14

．616

C

C22

it．．＝

図る成鶏胸筋の全脂質脂酸構成
N：正常成鶏胸筋
D：ジストロフィー成鶏胸筋

N．FSR（L）

ゴ

、1−

1

、−、

■

一一一

一−一・・■、一・l

一

一・一−

0

○

0

nFSR（L）

一一一二▼】￣wl

N．FSR（H）○

D．FSRくH）
3

C●

ち

・

ら

も

も

N
O

ら

G掴C如
3

C符

図7分離筋小胞体膜構成脂酸￣

23 ジストロフィー成鶏胸筋小胞体膜のCa−取り込み能と，その膜構成について143自体から，C8〜C9に相当する脂酸の増大 C20〜

Ca−uptake能と膜構成脂質について。筋ジストロ

C22に相当する脂酸の増大が，dys−FSRに特徴的

フィー症の基礎的研究（江橋班）昭和55年報告書，に認められた（図6）。この脂酸の増大は前回報

125−132．（1980）

告した結果と合わせて考察すると，C8〜C9の鎖の短い脂酸の増大はdys−HFSRに観られ、C20〜C22の長い鎖の脂酸はdysqL−FSRに観られる事が判った（図7）。現在我々はこの筋小胞体膜を構成している各脂質の脂酸構成から，ジストロフィー筋小胞体膜の脂質代謝系を追求中である。
文

献1）Kuriyama．et al．：ジストロフィーチキン骨格筋の神経筋持合部と筋性質の研究一筋ジストロフィーの基礎的研究班53年度報告書，114−117．（1978）
2）Nishjima etal−OntheabilityofCa−uptakein
the fragmented Sariophsmic reticulun extracted
ffom the gulnea Pig warticatory muscle pTOC．
Jpmdα♂．49：367−371，1973．
3）Foech，J．etal．Asimplemethodfbrthcisolation
andpuri缶cationoftotallipidesfromanimaltissue．
JβわJC触れ226：497・509，1957．
4）S血i．et al．：ジストロフィー成鶏胸筋小胞体膜の5）D．Scales，etal．TheinvoIvement ofsarcotubular
membranes in genetic muscular dystrophy
Biochem．BiophysActa．465：535・549，1977・
6）Gideon，A．etal．Adenylatecyclaseinmusclelar
dystrophy．Ann．NewYorkAcad．ScLvol・670−691・
7）G．Meissner：Ⅰ岳01ationandcha∫aCterizationoftwo

typesofsarcoplasmicreticulumvesicles・BわChim
月中妙∫dcね．389；51−68，1975・
8）R．E．Mrak and R．J．Baskin．CalciumTranSpOr
and phospllOenZyme fbrmationin dystrophic
mouse 弧rCOplasmic reticuluss・βわC加m加J〃gdfc加e二19：47・70，1978．
9）S．D．Hannaand R．J．Baskin：COmpafison ofthe（CatMg）ATPaseprotein ffomnomalanddystro−
phic chicken sarcoplasmic reticulum・Biochim
肋p妙見Acta．540：144−150，1978・
10）D．Kunze：Lopid compasition and phospholipid
methabolism of muscleinprogressive muscular
dystrophy．In助sicResench加hb，Obgy，Pt・Ed・
byKakulas．Amsterdam，Excepta，Medica161−176，
1973．

11）B．P．Hughes：LipidChangeSinmuscledisorders
andtheirrelationtomaturation．In助sicResench
加 Ab，OLbgy，pt Ed．by Kakulas・Amsterdam，
Exepta．Medica155t160，1973．

24 筋ジストロフィー・マウスの中枢神経組織におけるミエリン局在酵素（CNP，CEH）活性の日令変化

松下

研究協力者 辻宏＊
繁 勝＊

生后1−2ケ月で軽症の筋ジストロフィー・マウ

3回繰返し洗漑した上澄を集め，0．32M，0．85M

スでは脊髄神経組織中のミエリン含量が正常対照マの庶糖非連続濃度勾配によって75．000g，30分間

ウスと比較して著しく減少していること，並びにセ

遠心沈殿し，Crude myelinを分離する。これをレプロシド或いはコレステロールなどのミエリン構

更に蒸留水中に浮遊させ（タ／10mg），1時間低張液成脂質にも量的変化が認められること，などに就い処理を行なった後．75．000g，15分間遠心沈殿すては既に確かめられているご）更に昨年度はミエリンる。沈殿物を蒸留水中でホモジナイズした後，12．000

分画に局在する2，3−CyClic nucleotide3−g，10分間の遠心沈殿操作を3回繰返して洗赦しphosphohydrolase（CNP）及びcholester−

た沈殿物を再び0．32M庶糖液に浮遊させる。最后

01−eSter hydrolase（CEH）の2酵素の活性が再び0．32M，0．8Mの庶糖非連続濃度勾配によって1−2ケ月令の筋ジストロフィー・マウスの脊髄組

75・0009，30分間遠心分離してpurified mye
linを得る。

織中のミエリン分画においていずれも著しく低下していることを報告したご）本年度はこれ等の事実を更に詳細に追求する目的で，筋ジストロフィー・マウ

puridiedmyelin分画は更に0．3呼／加のTrit
on X−100液に入れ，1時間放置して膜の破壊をス中枢神経組織中のミエリン局在CNP及びCEH行い浮遊液を軽くホモジナイズした後CNP活性測

両酵素の活性を発病初期から日令順に追跡し，活性定用の酵素標品として使用した。又CEH活性測定

変化と発病との関連に就いて検討を行なった。

用の酵素標品にはpurifiedmyelinを2／lmOles／hgのタウロコール酸を含むリン酸緩衝液に浮遊さ材料及び方法
実験に使用した動物は当教室で自家繁殖を行っているC57BL／6J−by系の筋ジストロフィー症マウス及びその同腹正常対照マウスである。
動物を断頭潟血した後速やかに嗅脳を除いた脳及せ，1時間放置後軽くホモジナィズしたものを使用した。
cNP酵素の活性測定は01afson法4）に準じた
2′，3′−CyClicAMPを基質とする方法に加えてび脊髄神経組織を採出し，それぞれ20倍容の水冷

sogin法5）による2，3−CyClicNADPを基質とする方法を併用した。即ち1m MES緩衝液の0．32M庶糖液を加えてテフロンホモジナイザー（pH6．0）中に57TLMglucose−6−phosphate

でホモジナイズする。以下Norton等の方法3）に従307nM Mgc12，0・6units G6PDH，17nMってpurifiedmyelin分画を得た。即ちホモジネ

Sodium cyclic NADPを含んだ反応液に10ートを9∞タ，10分間遠心沈殿し，その上澄及びJLeの酵素標品を加え25℃で，NADPの遊離による封OmJlの吸光度変イ睦測定し，酵素活性を算定し＊和歌山県立医科大学第二生理学教室

た。CEH酵素の活性測定にはコレステロール・オ

24 筋ジストロフィー・マウスの中枢神経組軌こおけるミエリン局在酵素（CNP，CEH）活性の日令変化 145

レイン酸エステルを基質として酵素を反応させ，遊結果離したオレイン酸をクロロフォルムで抽出し，Itaya

CNP活性に就いて，出来るだけ発症の初期に逆−UiによるNEFA測定法6）に従って比色定量す

のぼって，筋ジストロフィー・マウスの脊髄及び脳る方法が用いられた。酵素標品中の蛋白定量はLow

中のミエリン局在CNP活性を測定し，ミエリン総

ry法に従って行った。

蛋白量当りの活性値を日令順に並べ，正常対照マウスのそれと比較した。図1は脊髄に於ける変化を示

表1

Myelin2㌧

3L CyClic nucleotlde3㌧Phosphohydrolasein brain
and splnal cord of dystrophic mice
Dystrophjc

Normal

D／N

xlOO

Pr．

Brain
Total aclHvity l1．52
5pecifjc activlty

0．90

17．28

±1．63

66．7

Pく0．01

土1．10

4．77

土1．56

92．9

N．S．

土l．44

15．21±

2．30

68．1

Pく0．01

土1．11

98．6

N．S．

±

4．43

Splnal cord
Total activity lO．36

Spec†fic acいvjty

4．14‡0．83

4．20

2霊漂31；；eN3号P黒t黒鳥r：：…j措7描鍔e器：n・したものであるが，発症直後の2週令で既に正常個

最大活性値が正常対照よりもやや低くなっているこ

体よりもかなり低い活性を示し，最大活性値に達すとが判った。更に最大活性値に達する時期が脊髄でる30日令頃には，正常対照の約を程度の活性にななっていることが判った。図2は同様に脳中のミエは正常対照と同じく18日令前後であるのに対して，
脳では筋ジストロフィー・マウスが正常対照より1

リン分画に於けるCNP活性の変化を示したもので週間程遅れ，25日令頃に最大活性値に達している

あるが，この場合は発症初期には正常対照マウスとことが認められた。

全く同じ活性上昇を示し，ほぼ最大活性値に達する

以上の如く筋ジストロフィー・マウスに見られた

4過令頃から急激に活性が低下していることが認めミエリンCNP活性の変化を再確認する目的で，られ，40日令に至ると，正常対照の約毎に活性が低下している。これらの結果は筋ジストロフィー・

CyClic NADPを基質とする別の方法によって測定を行った。表1は2ケ月令の筋ジストロフィー・

マウスの脊髄ではミエリン形成期の始めに既にCN

マウス及び正常対照マウス各8頭に就いて測定した

P活性の顕著な低下が見られるのに対して脳では一活性値の平均値を示したものであるが，脳，脊髄共旦最大活性値に至るまでCNP活性が上昇した後，にミキリン総蛋白量当りの活性値では筋ジストロフ

急激に活性低下が起ることを示している。一九 Cィー・マウスが有意に活性低下を示しているのに対NP活性を単位蛋白量当りで換算した値で表示する

して，単位蛋白量当りの活性値では有意な差が見らと，図3及び図4の如くになり，筋ジストロフィー

れなくなっていることが確かめられた。

・マウスの脊髄及び脳ではいずれも，2ケ月令に至次にミエリン局在のもう一つの酵素であるCEH

ると正常対照との問に宿性差は見られなくなり，又に就いても同様に日令を追って活性測定を行った。

Ⅴ

146

生

化

学

表2 Myelin cholesterol−eSter hydrolasein brain and spinal cord
Of dystrophic mjce
Dystrophic

Normal

D／N

xlOO

Pr・

Rrajn
Total activity

14．32

Speclfjc actjvity

5．65

±0．69
±

2．52

25．71土3・43

55．7

Pく0．0110．81±2・73

52．3

Pく0．0145．9

Pく0．0155．4

Pく0．015pinal cord
Total actjvity

21．57

Speclfjc acいvlty

5．47

土4．26

46．98

土1．94

±11・259．88！1・81

Unjt；．PM oleate／total protein or mg protein／min・
Averaged age of the mice are57．8（41−75）days・

7 0
6 0
5 0
4 0
0
3
0
2
0
1

u芯言Ld u 聖2■ て三〇ミコ．き；；U巾 崇ヱ≡

10

20

30

40

50

60

70

80

Age，days after blrth

図1 Myelin CNPase activityin the developjng and maturing spinal cords
Of dystrophic and normal mice

24 筋ジストロフィー・マウスの中枢神経組鰍こおけるミエリン局在酵素（CNP，CEH）活性の日令変化 147

7−3OLd u 翼E l一言ミ三吉；；U一票よ≡
10

20

30

40

50

60

70

80

Age（days after blrth）

図2

Myelin CNPase activity jn the deve10Ping and maturing brains
Of dystrophic and normal mice︵．亡盲︑亡−30Ld冒︑三ゝぎ；；E∴デ 岩倉
10

20

30

40

50

60

70

Age．血ys after blrth

図5Speclfic activlty of myelln CNPasein the developing and maturing
SPinal cords of dystrophic and normal mice

Ⅴ

生

化

学

Tu盲︑uI30Ld 2︑三 ヽごヱ︺U疇UこすU監S
10

20

30

40

50

60

70

80

Age．days after blrth

図4 specifi：aCtivity of myelin CNPasein the devel0Ping and maturing
brains of dystrophic and normal miceu−ヱOLd−〇g︑コ．ヽご三lU巾芝芸︼U
10

20

30

40

50

60

70

80

Age．days dfter blrth

図5 Myelln cholesterol−eSter hydrolase actjvityin the deve10P・jng andmaturjng splnal cords of dystrophjc and normal mice

24 筋ジストロフイT・マウスの中枢神経組軌こおけるミエリン局在酵素（CNP，CEH）活性のE］令変化149

図5は脊髄組織中のミエリンCEH活性を日令順にの活性変化の現れる時乳 及びその発現機序が異なプロットしたものであるがCNP活性と同様に発病っていることを示しているものと考えられる。又2

直後で，且つミエリン形成の最も盛んに行なほれてケ月令の筋ジストロフィー・マウスの中枢神経組織

いる2過令の時期に既に筋ジストロフィー・マウス

では絵ミエリン蛋白量当りでは両酵素共に正常対照での活性値が正常対照の考程度に低くなっていることが認められた。又最大活性値に達する時期が正常に比較して有意な活性低下を示しているが，単位蛋対照と同じく20日令頃であり，CNP活性の場合

並びにCEH活性に就いては依然として有意な低下

30日令以後に最大活性値に達したのと比較してかが認められることなどの結果から，CNP活性の低なり早期であることが注目される。又，脳中のミエ下は特異的な変化ではなく，むしろミエリン全体のリンCEH活性の日令変化は図6の如く3退令迄は量的変化に伴って現われる二次的な現象と考えられ

筋ジストロフィー・マウスも正常対照と全く同じ経る。一方CEH活性の変化はマウス神経組織に於け過をたどって活性上昇を示しているが，22日令頃

るこの酵素の活性がミエリン形成期の始めに既に最から急速に活性低下が起り，40日令に至ると，正大活性値に達していることと併せて考えると，筋ジ常対照の活性値の約身こなっていることが巌た。
表Ⅱは2ケ月令の筋ジストロフィー・マウス8頭

ストロフィー・マウスに於けるCEH酵素の活性変化或いはコレステロール代謝の異常が，これら臓器に就いて中枢神経組織中のミエリンCEH活性を測において極めて早い時期に起っているものと推測さ

定しその平均値を正常同腹対照マウスの活性値と比れ，この異常がミエリン形成不全の原因の一つにな較したものであるが，脳，脊髄両組織で共にミエリっている可能性が示唆される。

白量当りではCNP活性値に有意差が無くなること

ン総蛋白量当りでも単位蛋白量当りでも筋ジストロ

筋ジストロフィー・マウスにおけるコレステロー

フィー・マウスの活性値の方が有意に低い値を示し

ル代謝の異常に関してはKadara9）或いはRadinoていることが認められた。

witglO）等が報告している。彼等はアイソトプを用いた取込み実験によって，筋ジストロフィー・マ

考察

ウス骨格筋及び脳に著しいコレステロール代謝の異軽症の時期の筋ジストロフィー・マウスでは脊髄常が存在すること，就中，脳ではコレステロール含神経組織において著しいミエリン欠乏状態が存在す

量が増加しており，特に遊離型が著しく増加していることが並にミエリン構成脂質に量的変化が見られるのに，エステル型は逆に減少していること，又コること，更にミエリン分画に局在し，ミエリン存在

レステロール全体の合成速度は正常対照マウスに比のマーカー酵素として知られているCNP及びCE

較して促進が見られるのにも均らず，エステル化のHの活性が著しく低下していることに就いては既に速度は正常よりむしろ遅くなっていること，などを報告した予8）今回は上記2酵素の筋ジストロフ．一

報告している。今回の我々の結果は，これ等の報告

・マウス中枢神経系での活性変化と発病との関連にとよく一致しており，筋ジストロフィー・マウス中就いて更に詳細に検討する目的で日令別に活性の測

枢神経組織においてはコレステロール代謝に著しい定を行った。その結果筋ジストロフィー・マウスの異常があり，これがミエリン形成不全，更には一般

脊髄では両酵素共に発症直後の2週令で既に正常対的な膜機能異常の原因の一つになっている可能性を照に比較して著しい低活性を示しており，最大活性示唆しているものと思はれる。

時には正常値の約みこなっているのに対して脳では両酵素共に最大活性値に至るまでは正常対照とほぼ

要

約

同じ経過をたどり，その後急速に活性低下が起るこ（1）2ケ月令の筋ジストロフィー・マウス中枢神経組とが認められた。この事実は脊髄と脳とでは両酵素

織ではミエリン分画中のCNP酵素並びにCEH

Ⅴ

生

化

学

uIヱOJd−Oか∈︑コ．ヽご三︺U巾 だ芸uU
10

20

30

40

50

60

70

80

Age．days after blrth

図6 Myelin cholesterol−eSter hydrolase activityin the developing
and maturing brains of dystrophic and normal rTlice

酵素の総活性が正常対照マウスに比較して有意に低下していた。然し単位蛋白量当りで換算するとCNP活性には有意差が見られなくなった。
（2）日令順に活性変化を追跡すると筋ジストロフィー

p47−48，1979．
3）Norton，W．T．and Poduslo，S．E．：Mye止nation
is rat brain：Method of myelinisolation．J．

血相dem．21：749−757，1973．
4）01afson，R．W．，Drummond，G．Ⅰ．and
Studies・マウス脊髄組織ではCNP及びCEH両酵素共に発症初期の2週令で既に正常同腹マウスのそれよりも低い活性値を示し，最高値では正常の鴫に低下しているのに対して，脳組織では筋ジスト

on

2

，3

−CyClic

nucleatidehydrolase hom bfah．αJMd，上961・966，1969．
5）Sogin，D．C．：2

for

2

，3

，3

−CyClic−CyClic

nucleotide

3

Lee，J．F．
3−Phospho−

月わC加爪．，47：
NADP

as

a

substrate−Phosphohydrolase，J〃e〟me九g桝．27：1333−1337，1976．
6）Itaya，K．and Ui，M．：Col打imetric determination

ロフィー●マウスの場合も最高値に至る迄は正常

Of fatty acidsinbiologiCalfLuids．Jl中M Res．

対照マウスとほぼ同じ経過をたどり，その後急激

7）辻 繁勝，松下 宏：筋萎縮症マウス神経組掛こ見られるミエリン形成不全について。第14回日本実験動物学会口演抄録集，28，（1979）
8）辻 繁勝，松下 宏：筋萎縮症マウス神経組織中のミエリン局在酵素（CNP及びCEH）の活性変化，
日本生理学推誌，42．282．（1980）に活性低下が起ることが明らかになった。
文

献1）Tsuji，S．and Matsu血ita，H．：Alteration oflipid
COmPOSitioninbrainand spinalcord of mousewith muscukJdystrophy．In ChTrentReseqrchin〟山川血′勒∫加pわ′，血騨札p60−61，1977．
2）Tsttii，S．and Matshita，H．：2
3，3

ヾyClic nucleatide−Phosphohydrolaseandcholesterolesterhydrolase

inbrainand spinalcord of dystrophic mice．In
仇〝朗JRe∫e〝Cあわ〟〟∫α由′砂かOP妙，血pα札

6：16−20，1965．

9）Kabara，J．J．：BraincholesteroIVII．The effectof
hereditaJy dystrophia muscularis onl2−14C）
meralonic andl2−3H］acetate

incorporation・

知郎Rep．βわん〟ed22：143・151，1964．
10）Rabinowitz，J．L．：Enzymic studies ondystrophic
mice and theirlittermates（lipogenesis andCholesterolgenesis）．BLbchim．Biophys．Acto．43：
337・338，1960．

Ⅵ

蛋白分解酵素25 カテプシンBによる筋蛋白分解の蛋白化学的ならびに形態学的研究153
26

筋ジス・ニワトリおよびマウス筋肉内の各種酵素活性の対比15927

筋組織の中性プロテアーゼに関する研究166

28

カルシウム依存性プロテアーゼ（CAMP）に対するCa2十の役割17229 筋蛋白質代謝回転に及ぼす蛋白質分解酵素阻害剤の影響177

25

カテプシンBによる筋蛋白分解の
蛋白化学的ならびに形態学的研究
勝 沼 信 彦＊研究協力者 野 田

隆＊

磯

貝

和

秀＊

−アクチニンは責崎・高市の方法で精製した。
はじ

め

易水解性の測定に筋ジストロフィー症進行過程に見られる萎縮とい各筋原繰維構成蛋白は10M，カテプシソBはう現象について考える際，蛋白分解酵素の異常によ

10−7Mとなるように調整し，pH6．0の酢酸緩衝液

る筋蛋白崩壊を抜きにしては考えられない。また筋蛋白

57nMメルカプトエタノール，17nMEDTA存在

崩壊の過程には，分解される側の間違（易水解陸，修飾等）

下で37℃において反応させ，上清に遊離するアミ

分解する側の問題（活性化トランスロケーション等）

ノ酸・ペプチドの量を測定した。

ならびに形態変化（hypercontraction，membrane

分解様式の検討

disorder）等に関する構造上の問題が含まれていSDS−ゲル電気泳動上で分解像を解析した。蛋る。我々はまず蛋白分解酵素の側から，この筋蛋白

白量は20Jgとした。反応液組成は上記と同様で，崩壊現象を追求してみた。既に我々は，筋組織中の反応の停止はE−64を用いた。

マストセル・セリーンプロテアーゼによる筋蛋白に

形態学的観察対する分解様式を報告してきた。1）今回は本症患者な

グリセリン筋は，家兎腸腰筋から調整したもらびにジストロフィーマウス，2）ジフトロフィーチキのも東大・江橋研より供与されたものを用い，ン3）の萎縮筋中で活性が上昇するカテプシンBによ

電顕，位相差額微鏡による実験は，神経センターのる筋蛋白分解の様式を蛋白化学的ならびに形態学的

埜中・石浦両博士の・御協力を得て行なった。反応

方法で研究した。

はスライドグラス上で，室温で行なったものを，位相差顕微鏡で観察し，試験管内で反応を進行させた
実験材料及び方法

ものは，E−64で反応を停止したのち，遠心し，カテプシンB精製法

上清に遊離してきた蛋白はSDS−ゲル電気泳動でラット肝より，唐渡らの方法4）で精製し，比活性分別し，沈殿は電顕用の試料とした。

が結晶酵素と同じものを用いた。
筋原線維構成蛋白質の調整
家兎骨格筋を用い，ミオシンはPerryらの方法で抽出し，Richardsらの方法で精製したものを用い

結果及び考察筋原線維構成蛋白のカテプシソBに対する易水解

生た。アクチンはMorrmaertの方法で精製した。ト麦1に示すように，ミオシン≫トロポニン＞トロ

ロポニンは江橋ら，トロポミオシンはMuellelα

ポミオシン≫＞アクチンの順にカテプシンBによって水解されるが，α一アクチニンは分解されない。ミ＊徳島大学酵素化学教室

オシンの水解速度ははやく，かつ30分までは直線

Ⅵ 蛋白分解酵素

154

蓑1susceptibilities ofvariousmyofibrillarproteins to cathepsinBa
Incuhation time（min）

SubstraLte
1530

Myosin

54．4

72．1

88．1

TTOpOnin

14．5

23．5

43．3

Tropomyosin

17．1

21．5

23．9

10．8

12．8

（1

n

ACtin

3．3

Q−ACtinin

∩

6n

90

46．6

120

48．3

aThe molar ratio of cathPl−Sin B to suhstratein the reaction mixture wasl：100

的に進行するが，それ以後は反応速度は徐々に遅く

クチンほどくわずかの重しかアミノ酸・ペプチドをなる。トロポニンは60分まで大体直線的に反応は遊離しない。次に示す分解像と合わせて考えると，進むがその後は徐々に遅くなる。またトロポミオシ

ミオシン，トロポニン，トロポミオシンはカテプシ

ンはミオシンとよく似た反応速度の変化を示す。ア

ソBによって限定的に分解されると考えられる。

Cathepsin B Effect onlsolated州yofibriIs．−曾■−t亀町や

拶●問●・●瞥CathepsinB treatment
601

CathepsinB treatment
Ol●●●ll●■●ヽ
Contro1CathepsinBtreatment151

0I′●■ヽ●嶋、hContro1CathepsinB treatment
301

601

図2

25 カテプシソBによる筋蛋白分解の蛋白化学的ならびに形態学的研究
a

b

c

【

−、

【

d

o

【

f

【

g

h

【

【

−ヽ

H 攣攣｝｛攣
J

一

一

一

一

一

J

、

155

J 75，000−−170，000、￣160，000′−−445，000

夢

師藩壇邁静

朋

a

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野竹晶・感

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一一■−′←−■→8，000
彰＊凝 −12，800

a

l

b

ll

c

I

d

l

e

f

g

h

lミ￣

TTOpOmyOSin tっトけ司一日憎磨れ減封I＿32，。。。

図1sDS gel electrophoretic patterns of myosin，trOPOnin
and tropomyosin afterincubation vith and vithout cathepsin B
a：0，b：15，C：30and d：60（min）without cathepsin B
e：0，f：15，g：30and h：60（min）with cathepsin B

Ⅵ 蛋白分解酵素

156

カテプシンBによる筋原線維構成蛋白分解様式

カテプシンBによる筋原綿経の形態変化

図1に，ミオシン，トロポニン，トロボミオシン

図2に示すように，カテプシソB処理により，筋のカテプシンBによる分解像を，経時的に示した。

原線維はまず軽度の膨潤を示し，まずZ線の密度がミオシンは，分子量175．000，170．000，160．000，減少する。同時にA帯の密度が低下し，あたかもH

145．000の分解産物を形成するが，分子量より考え帯が開大したかの如く見られる。60分も反応させて，おそらくミオシン垂鎖の限定分解産物であろう○

ると，一部では崩壊像が見られ全体の長さも伸長す

しかし，マストセル・セリーンプロテアーゼと同様

るが，全体の構造は大体よく保たれている。比較的に，軽鎖は殆んど分解しない。トロポニンはTN−

thin filamentの損傷は少ない事をうかがわせる。

TとTN−Ⅰのみ分解され，出現経過と分子量から電顕によるカテプシソB処理後の筋原線経の形態

考えて，分子量30．000と12．800の分解産物はトロ
ポニンーTより生じたと思われる。トロポニンーⅠ墾但
図3に示す通り，カテプシソB処理後30分には，の分解産物はトロポニンーCとほぼ同様の分子量をZ線が消失し，A帯が膨潤し，A帯・H帯・M等の持つため，トロポニンーCのバンドと重なり，経時密度の差が不明瞭になってくる。60分後には，Z的にトロポニンーCに相当するバンドの濃度が増加

線は完全に消失し，M線も消失する。そして，A帯すると思われる。トロポミオシンは，分子量約は断裂を起こす。しかし，A帯とⅠ帯の境界はかな

32．000，の分解産物を生ずる。ここでは示していなり明瞭に残っているので．ミオシン・アクチン間のいが，表1の結果より想像されるように，SDS−

接触は破壊されないであろう。

ゲル電気泳動上で，アクチンのバンドの減少は見ら

筋原線経より遊離する蛋白の解析れなかった。

図4に示す如く，筋原線維からは，カテプシンB

Ol
r

刃l

W

60■

ControI

一一！
1

一・・一1−，−−−1

一「翳州yosinO−Actininb Actin
■l■

■■

図4

SDS gel electrophoregram ofliberated products fromisolated myofibTils duringincubation with cathepsin B

25 カテプシンBによる筋蛋白分解の蛋白化学的ならびに形態学的研究

157

Cathepsin B Effect onlsolated Ntyofibrils

攣幽寂票攣攣攣
ヾ ．

図る
処理後5分には，分子量96．000のα−アクチニン

バンドは，コントロールの筋原線維構成蛋白と比較と思われる蛋白が遊出してくる。しかも，その蛋白してみると，易動産の違いから，他の蛋白の分解産はα−アクチニンの抗休と反応することから，表1物と考えられる。またバンドの数が，60分後でもで示した様に，カテプシソBによって殆んど切断を増加しない事から，前にも述べた様に限定分解産物

受けていないα−アクチニンと思われる。その他のであることが推察される。

Ⅵ 蛋白分解酵素

158

結

語

謝

辞

従来多くの蛋白分解酵素が，筋ジストロフィー症

本研究の形態学的観察の実験について，御助言・患者及びジストロフィー動物筋中にその活性を増加

御指導を賜りました神経センターの杉田先生・石浦

し，かつ筋原線維構成蛋白質の分解に関与するとさ先生・埜中先生に謝意を表します。

れ，その分解酵素側の特異性を明らかにしてきたが，正常の立体構造を保持している場合には分解されや
すい蛋白というのは，カルシウム依存性中性プロテアーゼでも今回のカテプシソBでも類似性が高く，

文

献それらの分解酵素の基質特異性はかなり重複していると考えられる。そこで今後はendopeptidase
のみではなく，従来exopeptidaseと考えられている酵素も含めて基質側の修飾にどう関与しているか，また蛋白分解酵素相互の協調作用についても検討していきたい。

1）Yaso甲Wa・N・・Sanada，Y・and Katunuma，N・，Jβめぐ如刑，83：1355−1360，1978．
2）Sanada，Y．，Yasogawa，N．and Katunuma，N・，エβぬぐ加桝．83：27−33，1978．
3）Simon，E．，Groos，C．S．andLessell，Ⅰ・M・，Arch・

βぬぐ加爪．βわp坤∫．96：41−46，1962・
4）Towatari，T．andKatunuma，N．，BLochem．Bibphys・
ReJ．CbJ乃椚〟仇83；513−520，1978．

26筋ジスニワトリおよびマウス筋肉内の各種酵素活性の対比

青 柳 高 明＊
研究協力者 和 田 孝 雄＊

Sphate buffer saline，PH7．2）の中でUltr−
目

的

この数年間，筋ジストロフィー症におけるプロテ

aturraxで1分間ホモジナイズした。試験液としては5000rpm，20分の遠心上宿を用いた。

ァーゼの役割が注目されて来た。またそれと同時に

Glu−NA（Glutamic acidP−naphthyla

本疾患の病態解明および治療という面から．ロイペ

mide），Arg−NA，Gly−NA，Ala−NA，

プチン，E−64などプロテァーゼインヒビターの

Ser−NA．Pro−NA，Leu−NA，Met−N

有用性ということが検討されはじめている。このこ

A，f．Met−NA，Phe−NA，Trp−NA，とは，たしかにこの分野における新しい研究の方向

Gly−Pro−NA，Gly−Pro−Leu−NA，を示すものであり，各種の期待が持たれるところで

Gly−His−Lys−NAを基質として用い，アミもある。しかしまた，他方において，本疾患におけノペプチターゼ活性（arylamidase活路）を測るcatabolic enzymesの役割を論ずる場合に，定した。Glycosidaseの基質としてはp−nitro−

あるいくつかの限定されたプロテァーゼ及びそれにpheny1−2−D−glucopyranoside（NP−対するインヒビターという面にのみ目がうばわれて

2TD−GIc），NP−β−D−Gal，NP−2−D

しまうことは，必ずしも得策ではない。こういう観−GIc），NP−β−D−Gal，NP−2−D

点に立ち，我々はより広い範囲の酵素群に日をむけ−ManとNP−N−Ac−P−D−GIcNH2を用いた。

て研究を行って来た。またそれと同時に，筋肉内のまた各種endopeptidase活性の測定には，N−2

代謝異常のみならず，全身諸臓器内における代謝に−benzoyl−LTarginine ethyl ester（BA

対しても追究を行って来た。今回はこれらの報告にEE），N−aCetyl−L−tyrOSine ethyl

基づき，筋ジスマウスならびに筋ジスニワトリの筋

ester（ATEE），aCetyl−L−alanyl−L−alan

肉内酵素活性変化を対比させ，これらの疾患モデル

ine methyl ester（Ac−（Ala）3ME），L−としての意義についての考察を行った。

Seryl−L−tyrOSine−P−NA（Ser−Tyr−NA）とhemoglodinを基質と・して用いた。さ方法

らにesterase活性の測定にはNP−aCetate，

実験動物としては，正常ならびに筋ジストロフィ

phosphataseの活性測定にはNP−phosphate，ーマウス（C57BL／6N）および正常ならびに

RNaseの活性測定には酵母RNAをそれぞれ基質

筋ジストロフィーチキン（Line412，413）を用として用い選・㊥いた。各種筋肉を摘出し，10倍量のPBS（pho結＊微生物化学研究所

果正常および筋ジスマウスにおけるアミノペプチダ

Ⅵ 蛋白分解酵素

160

表1 C叩arls。nS．betWeenCOntrOIsanddystrophlcmlce，Ofamlnop印tjdasesln muiCle
Actlvltles

土SD（N事4）

t−Value S1gn川CanCe
Of朋fference

ControI Dystrophy

AP−A

Pく0．01O．73±0．08

1．68±0．32

5．76

5．02±1．11

5．38土1．14

0．45

NS

O．65±0．17

2．10土0．27

9．07

Pく0．001

AP＿8
61ツーAPP

く0．00114．13土0．50

15．42

Ser−AP

O．51±0．18

0．85±0．17

2．72

Pro−AP

l．10±0．50

1．08土0．43−0．06

Leu−AP

3．59土0．31

7．70±0．20

22．26

P

鵬t＿Ap

4．64土0．5111．以）土0．60

18．26

Pく0．001

Ala−AP

5．77±0．96

Pく

0．05
NS
く0．001

仲kt−AP

5．32±1．31

4．58土0．34−1．10

Phe−AP

4．97±0．70

12．40±0．80

13．59

P

Trp−AP

0．96土0．15

3．18±0．05

27．42

P

く0．001

Gly−Pro−AP

0．52土0．03

0．85±0．13

4．94

P

く

0．01

Gly−Pro−Leu−AP

0．50±0．14

0．80±0．14

3．04

P

く

0．05

Gly−His−Lys−AP

0．09土0．04

0．40±0．00

14．48

P

く0．001NS
く0．001【nZy職aCt…いes areexpressedasnml／mln／咽PrOteln・

表2 co叩arlsons．between…trOIsand4ystrophlHhlck帥S，Of
amlnopeptldasesln muscle

Contr01

町StrOPhy

18．17土5．66

P

く0．01

P

く0．01

7

1．73土0．59

9．17土

一

0．65土0．19

Signlftcance
OflHfference0っ

6．38±2．70

4

7

8．45

Pro−AP

4．67土

Leu−AP±

0．75

4．30土1．73

10．30土2．40

Met−AP

7．62

±

2．48

16．80

4．30

f・Ikt−AP

0．45土

0．21

0．52±

Phe−AP

8．75土3．51

Trp−AP

1．82土

7．28

Gly−Pro−AP

0．35±

0．15

Pく0．01004．58±1．38

5

5．20

′

13．00±

03

2．18

Pく0．01

3

1．70

8

3

Ser−APPく0．01

6

24．60±

Pく0．017

11．70±4．67

32．02±0．97

Ala−AP

3

Gly−AP

2

3．66

3

AP−8

土S．D．（H三6）

▲ ﹁

AP＿A

Act…Hes★

P

く0．01

P

く0．01

の 0
′ 0

P

く

6
9

P

く0．01

4
1
1
0

土

3
5
2

0．16

3

18．30土7．00

NS
0．05

1

3．77士1．04
10．09

0．30土0．09

4
′

土

0．16
0．12

NS
HS

6
0

0．20

0．45土
0．72±

1

Gly−HIs−Lys−AP

0．58土0．16

q 一
9

Gly−Pr〇一Leu−AP

09★EnZyme aCtivHHes are expressed as n mol／min／mg protejn．

P

く0．1

26 筋ジスニワトリおよびマウス筋肉内の各種酵素活性の対比−ゼ活性を表1に示す。14種類のアミノペプチダ

161てよいと思われる。

ーゼ活性のうち，AP−B，Pro−AP，f・Met

さて，これらのニワトリとマウスのアミノペプチ−APを除いたものは全て，ジストロフィー群におダーゼ活性を比較してみたい。図1にはニワトリといて有意に活性上昇を示した。この時のt−Value

マウスのコントロール同士（左図）とジストロフィ（stlldent′st−teSt）を見ると，ほとんどがプラー同士（右図）にて，酵素活性を比較してある。左スの値を取っており，この大きさはジストロフィー

右の図を比較すると一見して，回帰曲線がほヾ同じ群と正常群の差を示すindicator として用いられる

傾きを示している。この場合の酵素活性は蛋白量でことがわかる。

補正した比活性（nmol／品／呼prOteim）とし

表2には筋ジスニワトリのアミノペプチダーゼ活て表わしてあるが，この単位で比較してみるかぎり，性を示す。この時にもマウスと同様にほとんどの酵

両者のジストロフィー群においても，コントロール

素活性においてジストロフィー群で有意の上昇が見群同士の相関関係が保たれていることがわかる。

られた。しかしPhe−AP，Gly−Pro−AP，

しかし一方，図2に示すように，酵素活性を臓器

Gly−Pro−Leu−APでは有意差はなく，Gly

重量単位あたり（nmol／ぬ／9wetweight）に−His−Lys−APでは10％以下の危険率での補正すると，この関係がくづれて来る。図2の左，

み有意であった。こういう点で筋ジスマウスの動き

右のグラフにおける回帰曲線が可成り異っていることは多少異なるという印象を与えるが，この点をよとから見ると，臓器重量単位あたりの蛋白量は，コ

り定量的に表わすことを考えねばならない。そこでントロール同士における場合と，ジストロフィー同t−Valueを見ると，筋ジスマウスの場合と同様に士における関係とでかなり異っているのではないか

ほとんどプラスの値を取って居り，これも筋ジスニと考えられる。このことはジストロフィー症におけワトリとコントロールの差を表わすirxlicatorとしる蛋白合成系の異常と結びつけて考えると，興味深

図1Comparison．between Chickensand Mice，。flntrarnuscular
Activities per rngProtein．

Ytl．35X◆0．57＿ControI Y−0．77（Pく0．0日

SuヱU芸U
12

2

4

6

81012

MIce

Results are expressed as n moJ／min／nEPrOtein．
1）AP−A 2）AP・B3）Gry−AP 4）Ala−AP 5）Ser−AP6）Pro−AP 7）Leu−AP 8）Met−AP 9）f・Met−APlO）Phe−APIT）Trp−AP12）Gly−Pro−AP 73）Gly・Pro−Leu−AP14）Gry・His−Lys−AP

Ⅵ 蛋白分解酵素

162

図2 Comparison，between Chickens and Mice，OflntramuscularAminopeptidase Activities per g Tissue．

12′

200

Y＝1．95X

十29

400

600

Mjce

200

4r）0

600

Mice

ResuLts are expressed as n mol／min／g（wet weight）．
1）AP・A・2）AP・B 3）Gly・AP 4）Ala・AP 5）Ser・AP
6）Pro・AP 7）Leu・AP 8）Met−AP 9）f・Met・APlO）Phe−AP ‖）Trp−AP12）Gly・Pro・AP13）Gly・Pro−Leu・AP
14）Gly−His・Lys・AP

図5 Aminopeptidase Activity Changesin Dystrophic Chickens
as compared to Thosein Dystrophic Mice26 筋ジスニワトリおよびマウス筋肉内の各種酵素活性の対比

163

い問題をふくんでいる。しかし，それにしても，蛋られた（r＝0．55，P＜0．05）。しかしactivity

白量によって補正を行うことによって図1に示すど／9wet weightとして表わした場合には有意なとき，正常同士の関係に立ち戻るというは，この二相関は見られなかった。このことはアミノペプチダ

種類のモデルの間における頬似性を示すものである。

ーゼ活性という面から見ると，両モデルの間に類似

さて，次にもう一つの異ったアプローチにより，した酵素活性の変動が見られるということを示唆す

ジストロフィー群とコントロール群の差をマウスとる。

ニワトリのモデルで比較してみたい予4）そのためにそこで次に，アミノペプチダーゼ以外の酵素活性は，すでに表1，表2について論じたごとく，t−についても同様な検討を行ったり表3はマウスの筋

valueをジストロフィー群とコントロール群の差の

肉内の各種酵素活性のコントロール群とジストロフ

irxlicatorとして用い得よう。このt−Valueは平ィー群における比較である。この場合にも一見して均値の差の程度を標準誤差によって補正したものでわかるように，ほとんどの場合において，t−Val

ある。したがって【Standardized degree of

ueがプラスの値を取り，その大部分は推計学的に

differenceとも呼ぶべきもので，差の有意性を有意性を示している。このことはジストロフィーマ

示すindicatorとなり得る。図3はⅩ軸上にマウス

ウスにおける各種酵素活性の上昇を意味する。これの差を，Y軸にはニワトリの差をt−Valueとしてに対して表4に示したニワトリ筋肉内の各種酵素活

とり，14種類のアミノペプチダーゼに相当する点

性を見ると。可成り異った動きを示している。最もをプロットしてみたものである。興味あることに，顕著なものは各種の糖に関する酵素活性であり，tactivity／mg proteinとして酵素活性を表わし−Valueはマイナスの値を取り，しかも推計学的にた時には，マウスとニワトリの問に有意な相関がみ有意である。このことは，これらの酵素活性につい表5 Co甲rlsons．b抽eencontrolanddystrophlcmlce．of
VarlつuS enZy¶モSln muscle

ActlYjtjes◆±SD（N≡4）

t＿Value Slgn…C帥Ce
町StrOPhy ofがffer即CeControl
Trypsjnljke

17．∝〉±10．70

8．40±

3．74

・1．51

Chy−tryljke

12．20土

4．80

18．60土

2．40

2．39

HS
P

く0．1

Elastaseljke

8．12

±

8．95

15．60±

6．90

1．33

NS

Cathepsin C

0．41±

0．09

1．53±

0．36

6．02

Pく0．01Cathepsjn Ot★

0．00

±

0．00

0．01土

0．00

3．27

Pく0．05α−D−Glucosjdase

0．20

±

0．10

0．43±

0．05

5．20

Pく0．01

8−D−Galacto〜idase

0．04

±

0．05

0．20±

0．08

3．28

Pく0．05

α−D−Mannosjdase

0．08土

0．09

0．20土

0．00

2．87

Pく0．05

0．17±

0．05

0．98±

0．10

14．72

Pく0．001

1．25

0．30

N−Ac−β−D−
gluCOSaminjdase
Phosphatase【sterasemase（free）★■■

14．10

±

土16．00

1．08土

0．17

1．78±

0．53

1．72

±

45．40

2．74

5．53土

0．70

12．30

80．10

NS
P
P

く0．05
く

0．001

★Enzyme actlvjtles8re eXPreSSed as n mol／mln／mg protein・＊＊Cathepsin DactMtyls expressedas absorbance（at280nm）／rnin／mg proteln・・■★RNase a〔tlv圧1es are expressed as un代／mg proteれ1unltls equivalent to
仙e act…ty ofl ng standard RNase from boYtne pancIでaS・

Ⅶ 蛋白分解酵素

164

表4 C叩arjs帥S，betweencontroIsanddystrophl＝hlcbns，Of
Various enヱ∫陀S h muscle

Actlvltlest 土S．〕．帥朝
Control
Trypslnllke

5．38土

4．06

1．31

NS

ChylⅦtlTPSlnljke

5．37±2．21

11．77±4．90

2．92

Pく0．05【1astasellke

5．80土

12．58土5．92

2．36

Cathepsln C

1．17土0．67

1．75土0．46

1．74

HS

Cathepsln D★■

0．002土0．0005

0．006±0．001

6．17

Pく0．018−0−Glucosj血Se

0．37±

0．10

0．10±

0．09

−4．75

Pく9．01

6−D−Galactosldase

0．04±

0．01

0．00±

0．00

−8．16

Pく0．01

0．03土

0．01

0．00±0．00−5．21

Pく0．01

0．25

±

0．05

0．41土0．19

2．00

Pく0．1

Phosphatase

2．08±

0．50

4．18±

P

【sterase

12．98±2．55

mase（free）★｛

0．08±

O＿D−Iknnosjdase

N−Ac−6−0−

0．79

SlgnlflCanCe

Of刑fferenCe

町StrOPhy

3．83

7．60±

P

く0．05

91ucosamjnidase

0．02

2．04

2．45

24．70±6．20

4．31

0．19±0．13

2．03

く0．05
Pく0．01P

く0．1

・【nZyl把aCtlvjtjes打eeXPreSSedas nmol／m紬／mgprOteh・・・CathepsjnDactiv吋1s expressedasabsorbance（at280nm）／mln／ngprotejn・＊＊・RNase actlvltles are expressed as unlt／mg proteln．1unjtls equlvalent tothe actjvjV Ofl ng Standard RNase from bov ne pancreas・ていえば，マウスとニワトリのモデルでは全く逆の的な酵素活性異常へのアプローチが可能になる。

動きをしているという事を意味する。このことを反それによって，代謝異常と酵素活性異常との関連

映して，表3，表4に示したt−Valueの相関性をを綜合的に追求することが出来るという捨てがたい

図3におけると同様に推計してみると，推計学的に長所を持っている。事象 我々がこれらの酵素活性有意な相関性は見られなかった。

を多変量解析という手法を用いて研究する過程において，各種酵素活性問の相互のつながりを示唆する

考察

知見が得られつつある。これは純粋に化学的なアプ

筋ジストロフィー症のモデル動物として，最も一ローチのみでは解明し得なかった諸現象を解くため

般的なものは，現在のところマウスとニワトリのモの手がかりを与える可能性を示すものである。また

デルである。これらはヒトの筋ジストロフィーに可本研究では推計学的手法により，二種のモデル動物

成り類似した筋肉変化を示すものとして，基礎的研間の類似性及び相違性を，ある程度定量的に示すこ究に広汎に利用されて来た。しかし，これらモデルとが出来た。このことは，これらモデル動物の有用がヒトの代用として用いられるためには，少くとも

性と共にその限界をも示すものである。ことにモデ

両者の有する代謝異常に共通性がなくてはならない。

ル動物に関して得られた知見を，ヒトの疾患にあて

今回，我々は広範囲な酵素活性変化の面から両者のはめ，さらに治療面に応用するということになると，類似性を検討した。我々の取ったアプローチはpur

モデル動物とヒトにおける疾患との差が当然問題にifyした酵素について一つ一つ検討するのとは異ななる。しかし，それ以前に少くともモデル動物間にり，Sl血trate specificityなどの面から見ると，おける代謝の相関性を充分に検討しておくことは，

多少の問題点がないとはいえない。しかし多少の特非常に有用である。そこで今后，コンピュータを用異性に関する疑問はあったとしても，こういうスク

いて，この二極のモデルの対比を多変量的に行うこリーニング的な簡易法を採用することにより，多面とを計画している。

26 筋ジスニワトリおよびマウス筋肉内の各種酵素活性の対比

結筋ジストロフィー症の動物モデルであるジストロ
フィーマウスとニワトリについて，Catabolic

enzymesと代謝との関連性という面から比較を行った。両者間にはアミノペプチダーゼという面からは類似性が見られたが，他の酵素面では2−3の明らかな相違点も見られた。これらの所見の意味する
ところは，今后，各種のアプローチによって明らかにして行きたいと考えている。

文

論

165

献

1）Aoyagi，T．，Suda，H・，Nagai，M・，Ogawa，K・，Suzuki，J．，Takeuchi，T・andUmezawa，H・Aminopeptidase
activities on the suげace or mamma鮎n cells．
βぬぐ鋸れβわp妙見Acta．452；131・143，1976・
2）Aoyagi，T．andUmezawa，H・，HydrolyticenZymeS
onthe ceuulaTSurfaceand theirinhibitorsfbund
h microorganisms・InJhh蝕吻イ〃那r C肋庇扉

助町肋血即．VOL61．（ed．L．J．Vitale andV・
Simeoh），p．89．FederationofEuropeanBioche−
micalSodeties，1979．
3）Aoyagi，T．，Wada，T．，Kojima，F・，Nagai，M・and
Umezawa，H．，Variousenzymeactivitiesinmuscle
and other organs of dystrophicmice・J・CLin・
血ye比67：5ト59，1981．
4）Wada，T．，Kqjima，F．，Harada，S・，Aoyagi，T・and
Umezawa，H．，IntramuscularenZymeabnormalities
of dystrophic chickens compa∫ed to those ofdystrophic mice．J．LyzGrm．Lb／n．4：184−190，1981．

27 筋組織の中性プロテアーゼに関する研究

高 橋 健 治＊
研究協力者

市

原

慶

和＊

十

川

和

博＊

最近，筋組織をはじめ種々の動物組織のミクロゾ

溶部分のα−アミノ基をフルオレッサミンにより蛍ーム分画に膜と強く結合し，界面活性剤の存在下で光測定する方法1）によった。アミノペプチダーゼ活

ないと可液化されない中性プロテアーゼの存在が知

性はL−ロイシンクーニトロアニリドを主に用いてられて来ているご￣3）筋組織のミク。ゾーム分画の膜

pH7．0，37℃で測定したご）他の合成基質に対する結合中性プロテアーゼについては，その可溶化と部感受性も同様な条件下で測定した。

分満製をラット骨格筋を用いて行ない，若干の性質をすでに明らかにしているご）この部分精製標品は

実 験 結 果カゼイン等の蛋白質に対するエンドペプチダーゼ活1．ラット骨格筋ミクロゾーム分画の膜結合中性性とアミノペプチダーゼ活性を含んでおり，数種のプロテアーゼの各種プロテアーゼ阻害剤に対

プロテアーゼの混合物であると推定される。本年度

する感受性と基質特異性

は，第一にこのラット骨格筋ミクロゾームの膜結合

ラット骨各筋ミクロゾーム分画をIMKCl

プロテアーゼについて，各種阻害剤の活性に対するった標品より1％コール酸ナトリウムで可液化し，影響をさらにくわしく調べるとともに，基質特異性をセファロースCL−6Bカラムに通して得た主分画比較検索した。また第二に，正常および筋ジストロ（前報4）参照）について，カゼイン分解活性およびフィー症ニワトリ胸筋について，ミクロゾーム膜結アミノペプチダーゼ活性に対する種々のプロテアー

プロテアーゼおよび可液性プロテアーゼ，特にアミゼ阻害剤の影響を比較検索し，表1に示した結果をノペプチダーゼの活性および基質特異性を比較検索得た。カゼイン分解活性は，前回の結果に加えて，した。

フェニルメタンスルホニルフルオリド（PMSF）

で洗

TLCK，TPCKがかなり顕著な阻害作用を示す

実験材料および方法点が注目され，活性発現にセリン残基およびSH基

ラット骨格筋ミクロゾーム分画は，肝臓の細胞分が関与することが支持される。エラスタチナールは画法に準じ前回記載した方法4）で調製した。また，

ロイペプチンと同程度に若干の阻害作用を示したが，ニワトリ（正常および筋ジストロフィー症成鶏）胸ジチオトレイトール（DTT），小豆プロテアーゼ

筋ミクロゾーム分画もこれに準じて調製した。また

インヒビターⅠ，ヘパリン等は阻害効果を示さなか

この場合，100，000×旦90分間遠心してミクロゾった。一方，アミノペプチダーゼ活性に対する阻害ーム分画を沈殿させた後の上活を上宿分画とした。

効果をみると，ジイソプロピルフルオロリン酸（D中性プロテアーゼ活性は熟変性カゼインを基質としFP），フェニルメタンスルホニルフルオリド，Tて，pH8．0，25℃で反応させ，トリクロル酢酸可

LCK，TPCK等の阻害効果がカゼイン分解活性に対するよりも顕著に小さい点，0−フェナントロ

＊京都大学霊長類研究所生化学研究部門

リンにより強く阻害される点等が特徴的であり，カ27 筋組織の中性プロテアーゼに関する研究

167

表1ラット骨格筋ミクロゾームの膜結合中性プロテアーゼに対する各種プロテアーゼ阻害剤の影響

残 存 活 性（％）
試

カゼイン分解 アミノペプチ
活性 ダーゼ活性

薬

10

州

′

［朗

9

1

2

鵬

9

10

0
3

3
0

0

20 円／ml0

Bestatjn

3

200 円／m1
20 円／m10

Antipajn

2

9

4
7

0

9
6

7

6
9

6
0

7

5
6

1
★

4

1
0
1

5
2

4
1

0
9

7
4

9

0
9

＊未測定

州

b

0．1

3

口羽

4

1

5

【椚

MgC12
0−Phenanthroline

8

5

6

打朗

5

5

2

州

一

l

0

1rM

5

10

3

n劇

5
6

1

1
6

l鵬

1

■1

O

0

6
7

2
0

O rg／ml

0

0

2

200

Elastatjnal

0

0
1

9

Leupeptin

88Adzuki bean proteinaseinhibitorI

200 円／ml
20 円／ml

★

6

pg／m1

EDTA

5

︶

200

Soybean trypsininhibitor

9
1

4

rg／m1

Hepa「in7

ヽ20

Pepstatin

pg／m1

6

rg／m1

5

200

ChyTnOStatin

0
9
1

［削

8

l

7

PCMPS

7

1nM

■

1

5

TPCK

▲﹁

1鵬

2

1

一b▼

TICK

5

州

1

1

2
0

汀州

9

5
8

1

DTT

7

8
4

PMSF

Ⅵ 蛋白分解酵素

168

表2 ラット骨格筋ミクロゾームの膜結合中性プロテアーゼの尿素
変性蛋白基質に対する作用

基

質

相対活性

HjstoneProtamlne sulfate

Hemo910bh
CaselnMyosin B

F柏r紬ogenr−Globulin
Bovine serum albumjn
Ovalbumin
Myosin A

ゼイン分解活性でみた中性エンド型プロテアーゼとアミノペプチダーゼが異なった酵素であることが明らかである。

2．正常および筋ジストロフィー症ニワトリ胸筋の中性プロテアーゼ活性の比較
ラット骨格筋ミクロゾームの場合と同様にして調次に，若干の尿素変性蛋白基質に対する作用特異

製したミクロゾーム分画をIMKClで洗った不溶性性を検索した結果を表2に示してある。ヒストンに

残恋（IMKCl処理ミクロゾーム）の量はラットの最も強く作用し，次いでプロタミン，ヘモグロビン，場合に比較してかなり少なかった。この試料につきカゼインの順序で作用しており，ミオシンBにはあカゼイン分解活性を測定すると，筋ジストロフィーる程度作用するが，ミオシンAにはほとんど作用しの方が正常にくらべてタンパク質当り，および組織ていない。これらの結果からみて，本中性プロテア

重量当りとも若干高い活性を示したが，その差は2ーゼは主にトリプシン様の特異性を有するものと思倍以下であった。同様にして数種の合成基質に対すわれる。一方，合成基質に対するアミノペプチダー

るアミノペプチダーゼ活性を測定した結果を表4に

ゼ活性を測定した結果を表3に示してある。Gly−

示した。この結果から，まず正常筋についてラット

Pro−メチルクマリンアミドに対する活性が非常に

ミクロゾームの場合と，各基質に対する相対活性が高いが，これはミクロゾーム膜結合性のジペプチジ

非常に異なっていることが分かる。これは種属差にルアミノペプチダーゼⅣに主によるものであろう。

よるところが大きいと思われる。次に正常と筋ジス

他のいくつかのモノアミノ酸の2−ナフチルアミド

ロフィーのニワトリ間では，タンパク重量当り，組にも作用することから，複数のアミノペプチダーゼ

織重量当りとも，筋ジストロフィーの方が活性が顕が混在している可能性が大きい。

著に高くなっていること，また特にArg−2NAに

27 筋組織の中性プロテアーゼに関する研究

169

表5ラット骨格筋ミクロゾームの膜結合中性プロテアーゼ標品中のアミノペプチダーゼ活性

基

質

（蕊羞晶）

Gly−Pro−MCA
Ala−2NA
Leu−2NA
Ar9−2NA
Gly−Phe−2NA
Cystine−d1−2NA
Pr0−2NA

MCA：メチルクマリンアミド
2NA：2−ナプチルアミド

対する活性の上昇が顕著であることなどが分かる。

うなことは無いように思われる。一方．カルシウム

比較のために，上宿分画について同様な測定を行な依存性プロテアーゼ活性を測定したところ，正常でった結果を表5に示した。この場合も正常ニワトリ

は分子量約47，000の位置にピークがあらわれたが，で，ミクロゾームと上宿では各アミノペプチダーゼ

筋ジストロフィーの場合には分子量約100，000のの相対活性が異なっているが，いずれの活性も筋ジ位置に主ピークがあり，分子量約47，000の位置にストロフィーでは上昇している。なお，このほかカ肩がみられ，みかけ上明らかな相違が溶出曲線上にルシウム依存性プロテアーゼおよびカテプシンDにみられた。

ついても筋ジストフィーの場合に活性の上昇が認められた。
上宿分画をセファロースCL−6Bカラム（1．7考察

×150cm）に通して，Gly−Phe−2、NA，Arg−

ラット骨格筋ミクロゾーム分画の中性プロテアー

2NA，およびLeu−2−ニトロアニリドに対するゼの性状と機能をさらに明らかにするためには，今アミノペプチダーゼ活性およびカテプシンD活性を後共存するプロテアーゼ類を相互に分離・精製し，測定したところ，正常および筋ジストロフィーの場

均一なプロテアーゼ標品についてさらにくわしい性

合とも，アミノペプチダーゼ活性は分子量約63，000

状の検索を行なわねばならない。また，筋組織を構の位置に，またカテプシンDは分子量約30，000−

成する各種蛋白質に対する．作用特異性や，特に限定

35，000の位置に単一のほぼ重なるピークとして溶分解作用の有無等を注意深く測定する必要がある。

出することが知られた。したがって，分子量が異な

また，さらにそれらの存在部位についても今後の検る分子種が筋ジストロフィー症の場合生じているよ

索が必要である。筋ジストロフィー症との関連では．

Ⅵ 蛋白分解酵素

170

表4正常および筋ジストロフィー症ニワトリ胸筋のlMKCl−ム分画のアミノペプチダーゼ活性

比活性（nモル／hr／叫蛋白質）
基

質

正

常（N）

筋ジストロフィー（D）

D／N

Ar9−2NA67527

7．9（11．5）

Gly−Pro−MCA

1666

4．1（6．0）

Leu−2NA

153

490

3．2（4．7）

Ala−2NA

125

391

3．1（4．6）

Pr0−2NA2143

2．0（3．0）

Gly−Phe−ZNA

83

116

1．4（2．0）

Cystine−dト2NA

2530

1．2（1．7）＊（）内の値は組織重量当りの比活性のD／N値。

表5正常および筋ジストロフィー症ニワトリ胸筋の上宿分画のアミノペプチダーゼ活性比活性（nモル／hr／喝蛋白質）
基

質

正

常（N）

筋スジトロフィー（D）

2

13

6．5（2．5）

186873

4．7（1．8）

93

397

4．3（1．7）

Ala−2NA

1220

4510

3．7（1．4）

Ar9−2NA766

2730

3．6（1．4）

Leu−2NA

560

2020

3．6（1．4）

Cystjne−dト2NA

30772．6（1．0）

Gly−Pro−MCA
Pr0−2NA
Gly−Phe−2NA

D／N＊（）内の値は組織重量当りの比活性のD／N値。

27

筋組織の中性プロテアーゼに関する研究

171

今回は正常および筋ジストロフィー症ニワトリにつ−ゼの分子量は約80，000と報告されており，5）今回

いて比較検索を試みたが，ミクロゾーム膜結合プロ得られたゲルろ過の溶出パターンとみかけ上若干矛

テアーゼについては，IMKCl

処理ミクロゾーム

盾する点もあるが，これはおそらくカルシウム依存の収量がラット骨格筋にくらべて相当に低いので，性プロテアーゼのインヒビターの共存の影響による

細胞分画そのものについてもニワトリで基礎的検討

可能性がある。正常と筋ジストロフィー症のニワトをある程覆しておく必要があるように思われる。ラ

リ間で，この天然のインヒビター含量に相違がある

ットとニワトリでは種属差がかなり大きいので，筋か否かという点も含めて，今後慎重に検討する必要

ジストロフィーマウス等についても同様な検索を行があろう。

なうことが望ましいであろう。なお，今回のニワト
リを用いた実験で，種々のプロテアーゼ活性が筋ジストロフィー症で上昇するという結果が得られたが，これは従来，マウス，ヒトなどで報告されている結果とも矛盾しない。筋ジストロフィー症では−「椴に各唾プロテアーゼ活性の上昇により．筋蛋白質の分解が促進されると考えられるが，最初のひさがねになるような作用をどのプロテアーゼが演じているかについてはまだ不明の点が多く，膜構造の変化等の問題を考えると，膜結合性プロテアーゼについてもさらにくわしく検索を進める必要があろう。なお，
筋ジストロフィー症ニワトリのカルシウム依存性プ
ロテアーゼのセファロースカラムでの溶出パターン
が正常の場合と一見異なるという結果を得た。一方，
ニワトリから精製されたカルシウム依存性プロテア

文献l）K．Sogawa，K．Takahashi：Evidence for the
Presence ofaSerineProteinase（めAssociatedwith
the Microsomal．MembranesofRat LiYer，L Bio・C如桝．84：763・770，1978．
2）K．Sogawa，K．Takahashi：A NewtralProteinase
Of Monkey Liver Microsomes，Solubilization，PartialPurification，and Properties，J．Bibchem．
86：1313−1322，1979．

3）市原慶和，十川和博，高橋健治：ラット骨格筋ミク
ロソーム分画の膜結合性中性プロティナーゼの性状，
生化学51，649．（1979）
4）高橋健治，市原慶机十川和博：筋中性蛋白分解酵
素の生化学的研究，筋ジストロフィー症の基礎的研究，（江橋班）昭和舅年度報告書，pp154−158．
（1979）

5）S．Ishiura，H．Muro餌shi，K．Suzuki，K．Imahod：
Studies of a Calcium ActiYated NeutralProteascfrom chicken Muscle．Ⅰ．Purification and Charac−terkation，上月めぐ加〝も84：225−230，1978．

28 カルシウム依存性中性プロテアーゼ
に対するCa2＋の役割

今堀

Ca2＋依存性中性プロテァーゼ（CANP）は，

和

友

準じたご）

a）筋肉のZバンドを特異的に消失させること，

CANPのヨード酢酸（以下IAAと記す）によb）リソゾーム中ではなく，可溶性画分やZバンド

るカルポキシメチル化の概略を次に示す。0．2呼／等に存在すること2）などから筋タンパク質の崩壊の

meのCANP溶液（20mMトリス，塩酸緩衝液，引き金を引く酵素ではないかと考えられている。我0．1M塩化ナトリウム，5mMメルカプトエタノー々は，筋ジストロフィー症に本酵素が何らかの関与

ル，1mMEDTA）に終濃度4j唱／meのIAArをしているものと考えて以前より研究を行なってきNa（pH7．0）を2時間おきに加え，30℃5時間

たご）反応させた。その後，未反応のIAAを透析により昨年度までの研究で，ニワトリならびに種々の哺除き，そのCANPが失活をしていることを確認し乳類の骨格筋のCANPを精製し，その酵素学的なた上で，それをCM−CANPとしてそれぞれの実

性質や分子量，サブユニット組成などを調べてきた。

電釦こ供した。

4・5）その結果，本酵素はチオールプロテァーゼであ

セルロースアセテート膜（6×6cm）を用いた電りながら活性発現にCa2＋（もしくはSr2＋）を特異

気泳動は酢酸ナトリウム緩衝液を用い80V／‥mで的に要求すること，しかも，それに必要なCa2十濃20分間行なった。染色剤はボンソーSを用いた。

度は生理的な条件から大きくはなれてmM程度の濃CDの測定は1m〜1．0仇のセルを用い，日本分度が必要であることが明らかになってきた。現在，

光のJ−40Aで測定した。ノイズレベルの大きい

この点に関して多方面から多くの関心を集めている

時は付属のデータ処理装置を用い積算をすることにのが現状であるご）cANPの細胞内での機能・役割

よりSN比の改善を行なった。CD測定後，活性のを考える上で，Ca2十の役割を明らかにすることは測定できる試料は失宿してないことを確認した。用枢要であると考え，本年度我々はこの点についてさいた溶媒は，20mMトリスー塩酸緩衝液，0．1M

まざまな検討を行なった。

塩化ナトリウム，0．1mMジチオスライトール，0．1
mMEDTA，pH7．5である。

材料および方法

UV差スペクトルはユニオン技研のスペクトロメ

ゥサギ骨格筋のCANPはヒト4）の酵素の精製法

ーターを用いて測定し，CDと同じ溶媒系を用いた。

に準じた方法で精製した。プロテァーゼのタンパク
実 験 結 果量は吸光係数（Ei慧（2釦00）＝14・2）を用いて求めた。酵素活性測定法は，アルカリ変性カゼイ

1．カルポキンメチル化CANP（以下CM−CA

ンを基質とし，ニワトリ骨格筋のCANPのそれにNP）の特徴CANPに活性発現に十分な濃度のCa2十を作用＊東京大学医学部生化学教室

させると瞬時に自己消化をおこし，Ca2＋の役割を

28 カルシウム依存性中性プロテアーゼに対するCa2＋の役割

173

表1CANPとCM−CANPのSH基の存在様式

分

類

CANP
一

餌K

CM−CANP
30K

IAAによりCM化されたSH基1）−80K

1．31．430K

0DTNBで滴定できるSH基
丹

9
1

q

6
0

1
2

1

6
2

0
1

0
0

クラスⅢ2）

合

7
4

l0
4
・0

クラスⅡ2）

973
302

918
511

クラスⅠ2）

計

8．8 6．9 1．4

1）14C−IAAの取り込まれる数から求めた
2）本文参照検討することが事実上不可能となる。しかし，過剰Ⅲ）である。ウサギ骨格筋のCANPについても同（モル比にして100倍以上）のE−64存在下で様であり，CM−CANPについてもはば同様であは自己消化はほとんどおさえられる。この条件った。ただしクラスⅠのSH基一個がCM化されて下でCANPはCa2＋存在，非存在下で大きくいる点が異なっていた。このSH基が活性に強く関その挙動を異にすることが，ディスク電気泳動与しているものと考えられる。本酵素は分子量8万（pH8・3）ならびにDEAE−セルロース（pH7．5）（80K）と3万（30K）のサブユニットよりなによるクロマトグラフで明らかになった。そして，っていることは昨年報告した。80K，30K，そとの現象は（1）Ca2＋（S，2＋）に特異的である

れぞれを単離し，再構成系を用いて処理したそれぞこと，（2）IAAでSH基を修飾し，失活させたれのサブユニットに関する結果もあわせて示した。

CANP（CM−CANP）についても全く同様に

CM−CANPの場合でも，またCM−80Kのおこることが明らかとなった。種々の実験を行なう

場合でもいずれもクラスⅡのSH基が存僅する。ま

にあたって，IAAはさまざまな支障をもたらすこ

た表1の結果以外にも後で述べるように等電点，Cとが考えられる。できればIAAは存在しない方がDスペクトルなどで，CM−CANPと未修飾のC望ましい。そこで，CM−CANPを用いていくつ

ANPとの間に有意差は見られなかった。すなわち，かの検討を行なうこととした。その前にCM−CA

CM−CANPはその触媒活性がおさえられてはいNPを用いることが妥当か否かの検討を行なった。

るものの，以上調べた範囲では，未修飾のCANP

CM−CANPと未修飾のCANPとを主にSH基とほとんど異ならないと考えられる。そこで，CMの存在様式を調べ比較した結果を表1に示す。

−CANPを用いて触媒活性に関する以外のCa2ニワトリ骨格筋のCANPのSH基をDTNBで修飾すると三種頬に分頬できることは以前報告した。

の役割を調べてもさしつかえないと考えられ，以下の検討を行なった。

4）すなわち，容易に滴定できるグループ（クラスⅠ），

2．Ca2＋による（CM−）CANPの構造変化

Ca2＋存在下で滴定可能となるグループ（クラスⅡ），

2−1．等電点の変化：前項で述べたようにディスク変性させてはじめて滴定のできるグループ（クラス

電気泳動の移動皮ならびにDEAE−セルロースのⅥ 蛋白分解酵素

174

El鱒trOPhoretlcMobllltles ofCANPs

cDSpectr80fCANPswlthorwlthoutC02◆（‖ 2 1 0 −2 5 0 n m

0辺 型◆ち m M lC o 2 ＋点

虻

＼ β

●
、、・
、・
、．
．
．

讃

●
●、・
・
域
〟
Jy
＃
〟
β

−

︵5︶u〇一害こ空≡−○むUuD︸S岩c M −C A N Pq56n ・ 〇 一 X O

PH

図1

●

cDSpectroofCANPswlthorwlthoutCq2＋

、差

●
g
∫
f
ゼ
ぞ
だ
ゼ
Iご
ガ
ゼ
〟
▲′
と ㌔■

（
Ⅰ
‖
2
6
0
−
訓
0n
m
∫
N
a
t
l
v
eC
心
J
P
′
．
′
■
（
M
＿
C
心
肝
．．
〆
＝
義
こ
．
′t
も・
、
′
′
、
ノ
′
￣
く
尋
ね
2
・

、N clt lv e C A N P

210

250

250

Wovelength（nm）

図2はおよそ0．5ほど等電点が動いていることが明らかとなった。
Ca2十が酵素分子上の負イオンを打ち消し見かけ
▲
斡 ∠…

K

上等電点を上げていることも考えられるが，表1に

′
一
一
一
一
一
■
￣
￣
′
・
転 ．
．
。
炉
＼C
：
こ
：
2
・
K（
細り

も示したようにCa2＋存在下で新たに一つのSH基が修飾可能となることからも，Ca2十がプロテアー
ゼに何らかの変化をおこさせ，その結果として等電点が変化したものとも考えられる。実際にどのよう

260

3nO

540

な変化がもたらされるものか検討を行なった。そのWnvelength（nm）

結果を以下に示す。

図る

2−2．CDスペクトルの変化：二次構造の情報の得

クロマトグラフがCa2＋存在，非存在によって大きられる波長領域（200〜250nm）では，CANPな

く異なることから，Ca2十存在下で酵素の等電点がらびにCM−CANPいずれもほぼ同じCDスペク

変化することが予想される。事実，図1に示した如トルを与える（図2）。また，5mMのCa2＋（活く，等電点の変化が認められた。各pHにおけるセ性発現に十分な濃度）存在下でも顕著な変化は見ら

ルロースアセテート膜上での泳動距離から等電点をれなかった。すなわち，Ca2十によって二次構造が求めると，CANPとCM−CANPはほとんど同

大きく変化することはないものと考えられる。また，

じ等電点を示すが，Ca2存在下ではCM−CANP

Trp，Tyr，Phe，Cys−Cys残基の存在状態につ28 カルシウム依存性中性プロテアーゼに対するCa2＋の役割

175

いての情報が得られる波長領域（250−340nm）に
三三lUく賢一lロl虔01

おける各CANPのCDスペクトルを図3に示す。
ここでもCANPならびにCM−CANPいずれもほぼ同じCDスペクトルを与える。⊥方，活性発現に十分な濃度のCa2＋が存在するとCM−CANPのCDは大きく変化した。297nmの山は無くなり，
270，278，292nmの谷の深さが変化し，Tyrも

しくはTyI残基の環境が変化したことを示し，Kd≒1．2mMの一段階の変化であることを図4は示している。そして，このCa2＋依存性は同一条件下におけるCANPの活性のCa2＋依存性とよく一致した（図4）。また，この変化のpH依存性を調べて見るとこれも活性のそれとよく一致した（図5）。
以上の結果は，CD変化をもたらす構造変化は活性0．01の発現と関連があることを示唆している。

0．1

1

図4

2−3．UV差スペクトル：CDで見られたCa2＋依

5

5

州Co2ト

存性の変化はUV差スペクトルでも確認でき（図6）
活性のそれとよく対応していた。

・

2−4．30Kとの関連：以上の実験事実から，Ca2
によりCANPは何らかの構造変化をおこすこと，

UV dlfference sDeCtrUm

250

270

290

叩

そして，その変化は活性の発現に関与していることが考えられる。ところで昨年報告したように本酵素 20
は80Kと30Kのサブユニットから成っている。
図3に示したように，80K単独でもCa2によるCD変化は見られ．また，表1に示したように一つ三一三︸Uく賢一lDl崖 り

0．01

0．1

15

5

州Co2＋

図8
のSH基が外へ露出してくることから，2−1−2−3で述べた結果は，80Kと30Kへの解離を反映しているのではなく，80K側の何らかの構造変化を示しているものと考えられる。

Ⅵ 蛋白分解酵素

176

以上の結果をまとめると，CANPはCa2十と相最近，低濃度Ca2＋により活性化される第二のCA互作用をすることにより，80K側に構造変化が生NPの存在が明らかとなり，7）このCANPとの関連

じ，その結果として，等電点，TyrかつまたはTrp

をも含めて現在詳細に検討中である。

残基ならびに一つのSH基の環境が変化し，その結果として活性を発現するようになるものと考えられ
る。

文

献

1）Dayton，W．R．，Goll，D．E．，Stromer，M．H．，ReYille，
W．J．，Zeece，M．G．，＆Robson，R．H．：Some pro−考案

修飾した酵素を使っての解析は，酵素本来の性質ではなく修飾酵素にのみ見られるいわばアーティフ
ァクトを得る場合がある。我々の場合は以下の事実によりアーティファクトを観測しているのではないと考えている。
（1）未修飾のCANPでもE−64存在下で同じ結果が得られること，（2）未修飾のCANPとCM−CANPとの問に有意な差は，活性以外には何ら兄い出せないこと，以上二点である。したがって，我々はCANPが本来的に持っている性質，すなわち，
Ca2＋によって不活性型から活性型への構造変化がもたらされることを明らかにしたものと考えている。
ところで，この変換にはほぼ数mM程度のCa2＋濃度が必要で細胞内で通常みられるCa2＋濃度とは隔りがある。このためCANPが細胞内で作用する
ためには，CANPの構造変化をもたらすような何らかの未知の因子の存在が十分に考えられる。また

perties of a Ca勤しactivated protease thatmaybe

involvedinmyofibrillarproteinturnover．hoteases
and Bわわgicat CbTZtnt ed．by Reich，E．，Rifkin，
D．B．，and Show，E．，pp551，Cold SpringHarboTbboratofy，1975．
2）Ishiura，S．，Sugita，H．，Nonaka，Ⅰ．＆Imahori，K．：
Calcium−aCtivatedneutralprotease．Itslocalization
in myonbr軋especially at the Z−band．J．Biochen
87；343，1980．

3）今堀和友：筋肉のCa汁依存性プロテアーゼ，代乱
16，139．（1979）

4）Ishiura，S・，MuIO餌帆H・，Suzuki，K・，鱒Imahod，
K・：StudiesofacalciumactiYatedneutralproteasefrom chicken muscle．I．Purificationand charac−terizationJIBbchem，84：225，1978．
5）Suzuki，K．，Ishiura，S．，Tsltii，S．，Katamoto，T．，
Sugita，H．，＆Imal10r，K．：CalciumactiYatedneutral
PrOfease from human skeletal muscle．FEBS
上erJr∫，104：355，1979．
6）Barlett．AJ．：Introduction：the classification ofproteinases．Protein

degradationinhealth amd

disease・αbdゐ〟〃血書わ〃みmpo血仇75：pp．1，
1980．
7）Mengren，R．L．：Canine cardiaccalciumJependent
PrOteaSeS：Rosolutionoftwofomswithdiffernet
requirements for calcium．EEBS LetteTS．109：
129，1980．

29 筋蛋白質代謝回転に及ぼす蛋白質
分解酵素阻害剤の影響
＊

＊

明

智

尾

白

＊
＊

素阻害剤を生筋に細胞膜を介して投与した場合の効郎弘平

低濃度（1〜5×10−6タ／mg）の蛋白質分解酵

節 一 呂

橋浜谷

江小 三

研究協力者

にしたい。
2）筋構造蛋白質分解速度に及ぼす影響
ニワトリ胚胸筋より筋芽細胞を遊離し，同一細胞

果を，蛋白質代謝回転を指標に検討した。
1）総蛋白質分解速度に及ぼす影響数を数多くの培養皿に播種した（2）。培養皿上筋

成熟堆ラットのひらめ筋を腱をつけたまま両足よ細胞を十分に増殖させたのち（約3日後），H3ラ

り遊離した。一方は0．5mM シクロへキシミドを含ベルのロイシンを筋細胞にとり込ませた。培養皿をむリンゲル液（3mg）中に，他方は2．5×10g

二群に等分し，一方は，アイソトープを含まない培／mgの蛋白質分解酵素阻害剤及び0．5mM シクロへ養液にて，他方はアイソトープを含まないがE64

キシミドを含むリンゲル液（3mg）中に加え，95

Cを1×lJ6g／mg含む培養液にてさらに2日間％酸素−5％炭酸ガスを通気しながら38℃で振と培養を継続した。培養皿ごとに筋細胞を収穫Ll

う保温した（2時間）。リンゲル液中に筋細胞より

mMジイソプロビール・フルオロフオスフェイト

もれ出るチロシソ量を測定した。これは筋総蛋白質（DFP）を含む0．1MKCl

分解速度をあらわすと考えられている（1）。

た。10，000×glO分間の遠心をすると，筋構造中にて細胞を破壊し

表1に示されるどとく，E64C（2．5×10

蛋白質は沈殿する。沈殿を0．2NNaOHに溶解し，g／mg）の存在下では，遊離されたテロシソ量は有液体シンチレーション・カウンターにより放射能を意（P＜0．05）に低下していた。即ち，E64Cは測定した。蛋白質の放射能総量の多いことは．それ

細胞内での総蛋白質分解を抑制すると結論される。

だけ筋細胞内で構造蛋白質の分解が抑制されている

E64Cを含まない場合に遊離されるチロシソ量ことを意味する。

に対するそれを含む場合に遊離されるチロシソ量の表2に示されるどとく，構造蛋白質にはE64C

比は，表1より0．83である。ペブスタチン（2．5×（1×10￣6g／mg）存在下では非存在下よりも有10−6g／mg）．ロイペプシン（2．5×10￣6g／

意（P＜0．01）に多くの放射能が保持された。即ち，mg）E64（2．5×10￣6g／mg），E64C（2．5

E64Cは構造蛋白質の分解を抑制すると結論され

×10￣7g／mg）存在下の同様のチロシソ量比はそる。

れぞれ，0．76，1．16，0．90及び0．66であっ

3）アクチン及びミオシンH鎖の分解速度に及ぼすた。E64C（2．5×1√6g／mg）以外のものに影響

ついても，今後例数をふやして効果の有無を明らか

2）に示したプログラムで培養された筋細胞を収穫する際，培養皿ごとに個別に収穫するのではなく，＊東京大学医学部薬理学教室

E64Cを含むものと含まないものとに大別して筋Ⅵ 蛋白分解酵素

178

Actin

Myosin

蜘出出
￣

j

￣

1．0

図1アクチン及びミオシンH鎖の分解速度に及ぼすE朗C（5×1け￣6g．／局）の影響
表2の説明通りに3Hロイシンでパルス・チ
ェーンされた倍養筋細胞より，アクチン及びミオシンH鎖を遊離した。これら蛋白質に残在する比放射能（任意単位）を示す。

細胞をプールした。細胞をその重量の5倍畳の1mM

図1は各蛋白質の比放射能を示す。アクチン及びDFPを含むグバ・ストラウプ液にてアクト・ミオ

ミオシンH鎖の比放射能は，培養液にE64C（5シンを抽出した。粗製アクト・ミオシンはグバ・ス

×1d￣6g／爪のが存在すると，存在しない場合にトラウプ液の9倍の冷水を加えることによって沈殿比較して高い。蛋白質分解酵素によるこれら蛋白質

させた（3）。沈殿蛋白質をSDS存在下のポリアクの筋細胞内での分解が抑制されていると考えられる

クリル・アミド・ゲル中に電気泳動し（4），クマが，今後例数を重ねて結論を下したい。

ジー・ブリリアント・ブルー（CBB）にて染色した。アクチン（分子量43，000ダルトン）及びミオ

謝シンH鎖（分子量23帥00ダルトン）のバンドをカ辞

ミソリで切り出した。蛋白質量は蛋白質に結合して表1に示したチロシン測定による筋総蛋白質分解

いるCBBを25％どリジンで抽出したのち比色に速度の測定法を御教示下さった亀山恒夫先生（順天より，そして放射能はポリアクリルアミド・ゲルを・医），表2の要因分析をブロック・デザインによ過酸化水素水にて溶解したのち液休シンチレーショ

り計算して下さった佐久間昭先生（医歯大・難研）

ン・カウンターにより測定した。

に感謝します。

179

29 筋蛋白質代謝回転に及ぼす蛋白質分解酵素阻害剤の影響
B ／V

C

E

C

1

252

103

E

84 2

78 2

2

388

292

3

195

199

8 38

869

4

203

180

8 02

834

5

188

184

77 3

843

6

447

362

8 16

878

7

230

2 14

8

22 1

246

773

97 1

866

9

283

870

117

9 18

875

10

209

228

907

9 15

11

168

166

8 37

930

12

112

103

8 69

90 9

13

170

156

列和

3066

2550

実験 1

実験 2

実験 3

79 7

95 5

92 5

1肌 0

8 85

99 2

9 33
1011
要 因

SS

′

Ⅴ
10 24 1＊

Ⅴ

16241

1

B

143 677

12

B XV

17900

12

B V

1778 1825

1492

Ral＝10241／1492＝6．86＞F壬2（0．05）

表1チロシン測定による総蛋白質量の分解速度に及ぼすE64C（2．5×1『6g／〟）の影響
表は行なったすべて実験データを集計したもので．筋単位重量（m9）当りリ
ンゲル液中に放出されたチロシンの総量（nImles）を示す。下表中C及びEは．それぞれE64Cを含まない
もの及びそれを2．5×1√ig／混含
むものを示す。Bの列の数は実験回数を示す。下表は要因分析表を示す。計
算F値（Fcal）は6．86でF検定上5％水準で有意な薬効が認められた。

Fcal＝8．56＞F墨4（0．01）

蓑2構造蛋白質の分解速度に及
ぼすE64C（1×1〔「6g／イ疋）の影響
組織倍養された構造蛋白質にH3ロイシンをパルスした
チェース時にE64Cの不存在下（E）と存在下（C）の2群に分けた。表は行なったすべての実験データを示し，構造蛋白質全体中に残存する放射能（10もpm／dish）を示す。くり返しのある2元配置でかつデータ一に欠損のある要因分析をブロック・
デザインを用いて行なった（5）計算されたF値（Fcal）
は8屈で，F検定上1％水準で有意な薬効が認められ
た。

文

献

1）FuuCS，R．M．，Li，J．B．andGoldberg，A．L．JIBわt．
C微em．250：292，1975．
2）Kohama，K．andOZ：aWa，E．I）evelop．，G′OWth．Qnd

碑．19：139，1977．

3）kohama，K．弧d HoltZer，H．：⊥βぬぐ触れ．89：
341，1981．

4）Laemmli，U．K．肋ture227：680，1970．
5）佐久間昭：薬効評価一計画と分析一Ⅰ，東京大学
出版（1977）

181「筋ジストロフィー症の基礎的研究」班分担研究者一覧
氏

名

所

属

班長

江橋

節郎

東京大学医学部薬理学教室

幹事

今堀

和友

東京大学医学部生化学教室

勝沼信彦

徳島大学医学部酵素研究施設

穿掌

住
〒
113

113

所

東京都文京区本郷 7 −3 −1
03 （8 12 ）2111
東京都文京区本郷 7 −3 −1

野 々村禎昭東京大学医学部薬理学教室

03 （8 12 ）
2 111

小 沢瑛二郎

国立武蔵療養所神経センター
機能研究部

0423 （
4 1）
271 1

監事

米沢 ■ 猛京都府立医科大学病理学教室

602
770

京都市上京区
徳島市蔵本町河原町通広小路上
3 −18 −15
る梶柵 465 075 （
251 ）
5320

班員

青柳

高明

微生物化学研究所

14 1

東京都品Jtl区上大崎31 4−2 3石川春律

東京大学医学部解剖学教室

岩崎祐三

国立武蔵療養所神経セ ンター
微細構造研究部遠藤実

東北大学医学部薬理学教室

980
113

仙台市星陵町2 −17 −3 −1
東京都文京区本郷0222 （74）111 1

大塚正徳

東京医科歯科大学医学部薬理学教室

113

大 日方

昂

千葉大学理学部生物学教室

1■
13
260

東京都文京区湯島 1−5 −45
03 （8 13）611 1
東京都文京区本郷 7 −3 −1
千葉市弥生町 1−33
03 （8 12）21 110472 （51）111 1

岡田節人

京都大学理学部生物物理学教室

60 6

京都市左京区北白川
075 （751）211 1

大阪大学微生物病研究所 ′565

吹田市大宇山田上
06 （877）512 1
03
（
12 ）
211 1
豊中市刀根山5 −18−1
東京都小平市小川東町
2620
06 （
853）200 1

岡 田 善雄一国立療養所刀根山病院

03 （44 1）4173
0886 （3 1）3111
0423 （41）271 1

香川

務

加濃

正明

北里大学医学部生理学教室

228

相模原市北里 1 −15 −1
042 7 （78 ）9158栗山

構

九州大学医学部薬理学教室

8 12

福岡市東区馬出3 −1 −1
092 （641）1151

酒井敏夫

東京慈恵会医科大学生理学教室

105

東京都港区西新橋 3 −2 5 −803 （433）1111

嶋田裕

千葉大学医学部解剖学教室

280
187

千葉市亥鼻
1 −8 −1 2620
東京都小平市小川東町
047 2 （22）7171

東京大学医学部脳研神経内科

113

東京都文京区本郷 7 −3 −1
03 （812）2111

国立武蔵療養所神経センター
疾病研究第一郡187

東京都小平市小川東町 2620
042 3 （41）2711

京都大学霊長類研究所
生化学研究部門484

愛知県犬山市宮林0568 （61）28 91

杉田 秀夫

高橋

健治

56
1870

182

氏

名

所

班員 高橋国太郎

属

東京大学医学部脳研神経生物学教室

住所〒
113 ．東京都文京区本郷7−3−1
03（
812）
2111
173
東京都板橋区加賀2−11−1
03（
964）
1211

寺尾 寿夫

帝京大学医学部第一内科学教室

戸塚武

愛知県心身障害者コロニー，発達障研4約−旧 愛知県春日井市神屋町713−1
0568（
88）
0811

堀田

健

名古屋市立大医学部生理学教室

467

真崎 知生

筑波大学基礎医学系

3α）−31 茨城県新治郡桜村
0298（
53）
3061

松下

和歌山県立医科大学生理学教室

640

和歌山市九番丁9
0734（
31）
2151

千葉大学理学部生物学教室

280

千葉市弥生町1−33
0478（
51）
1111

九州大学医学部臨床薬理学教室

812

福岡市東区馬出3−1−1
092（
641）
1151

宏

丸山 工作
釜責 大槻 磐男

愛知県名古屋市瑞穂区Jl陸町1
052（
851）
5511