焼酎麹菌のクエン酸高生産機構の鍵となるクエン酸トランスポーターの同定と機能解析

P-13

二神 泰基 （鹿児島大学 農学部 附属焼酎・発酵学教育研究センター）

目的

考察
細胞外

白麹菌（Aspergillus luchuensis mut. kawachii）は、主に焼酎の製造に使用されている麹菌である。クエン酸を高度に分泌生産する性質をもち、醪（もろみ）のpHを下げることで雑菌の増殖を防ぐ。類縁菌のAspergillus nigerは、クエン酸の工業生産に利用され、そのメカニズムは精力的に研究されてきた。しかし、クエン酸の排出機構等の不明な点が残されている。

白麹菌

ミトコンドリア

リンゴ酸
CtpA

homocysteinesynthase CysD

AKAW_02593
AKAW_06497

クエン酸

クエン酸合成関連遺伝子クラスター

YhmA

リンゴ酸
2-オキソグルタル酸

nrdA

citA

yhmA

推定RNA
結合タンパク質

クエン酸合成酵素

推定クエン酸オキソグルタル酸
交換輸送体① CtpAとYhmAは、クエン酸高分泌生産に必要なミトコンドリア局在型クエン酸輸送体である。
+②yhmA破壊株は、細胞質のNADPH/NADPリンゴ酸比が減少することから、NADPHの再生に関与ｱｺﾆﾀｰｾﾞしている。
③ ctpAとyhmAの二重破壊が最少培地で合成
クエン酸
イソクエン酸致死となったが、最少培地にリジンを添加するとNADP ｲｿｸｴﾝ酸
ctpAとyhmAの二重破壊条件でも生育できた。
NADPH ﾃﾞﾋﾄﾞﾛｹﾞﾅｰｾﾞ
リンゴ酸
したがって、ミトコンドリアから細胞質へのクエン2-オキソグルタル酸酸輸送はリジン合成にも関与する。細胞質でα-アミノアジピン酸経路は、クエン酸の一部が2-オキソグルタル酸へと変換され、α-アミノアジピン酸経路によるリジン合リジン成に使われている可能性がある。

細胞質

ubiquinolcytochrome Creductase
complex coreprotein 2+

AKAW_02496

白麹菌におけるクエン酸輸送体（CtpAとYhmA）とNADPHの再生、リジン合成との関係

白麹菌のクエン酸高生産機構の解明を目的として、クエン酸トランスポーター（CtpAとYhmA）を解析した。なお、yhmAはクエン酸合成酵素遺伝子の下流に高度に保存されている点で、注目した。

方法・結果
CtpA-Sのクエン酸輸送活性

単独遺伝子破壊株、相補株のコロニー

オキサロ酢酸Control

コハク酸
cis-アコニット酸

01 mM [14C]クエン酸(18.5 kBq)

37℃で30 min
インキュベート

基質内包型プロテオリポソーム

ゲルろ過により外部基質を除去

ゲルろ過により外部基質を除去

リポソーム内部の[14C]クエン酸を5101525°C

20

クエン酸輸送活性(pmol/min/ng protein)

オキサロ酢酸
コハク酸
cis-アコニット酸
クエン酸
2-オキソグルタル酸
リンゴ酸
基質なし

37°C
070500400300200*100*080*6050403020100

2-オキソグルタル酸(mmol/g wet mycelia)

70070*605040302010* *0

細胞内の有機酸濃度
201481812710654*

321086420***

2-オキソグルタル酸(mmol/g wet mycelia)

9リンゴ酸(mmol/g wet mycelia)

クエン酸(mmol/g wet mycelia)

100.1

*0.08

102030Amino acids(μmol/g wetmycelia)
Asp
Ser
Glu
GlyAla
Ile
Leu
Tyr
Phe
His
Lys
Arg
MetVal

0.04
0.02
040

ctpA遺伝子破壊株、yhmA遺伝子破壊株、yhmA遺伝子破壊株におけるctpA遺伝子のコンディショナ
ル発現株（Ptet-ctpA-S ΔyhmA）を構築した。Ptet-ctpA-S ΔyhmA株はドキシサイクリン（Dox）非存在下でコロニー形成が抑制されたため、ctpAとyhmAの二重破壊が最少培地で合成致死となることが示唆された。

各種アミノ酸がPtet-ctpA-S ΔyhmA株の生育に及ぼす影響

Strains
ControlΔctpA

ΔyhmA

Ptet-ctpA-S ΔyhmA

2.78 ± 0.47 1.85 ± 0.17 1.96 ± 0.083 1.19 ± 0.18*
2.87 ± 0.70 2.26 ± 0.14 2.69 ± 0.37 1.58 ± 0.18
7.37 ± 0.80 6.38 ± 0.92 7.63 ± 0.38 3.16 ± 0.80*
4.47 ± 1.06 4.41 ± 0.24 4.95 ± 0.74 1.55 ± 0.19*
39.49 ± 8.85 39.74 ± 2.25 43.26 ± 4.57 9.77 ± 0.78*
1.66 ± 0.96 1.07 ± 0.087 1.12 ± 0.076 0.24 ± 0.43
5.20 ± 0.26 2.82 ± 0.62 2.90 ± 0.35 1.67 ± 0.51
3.05 ± 0.65 2.31 ± 0.19 2.33 ± 0.12 0.56 ± 0.98*
3.78 ± 0.73 2.991 ± 0.32 2.94 ± 0.18 2.22 ± 0.20
7.08 ± 0.99 4.71 ± 0.34 4.80 ± 0.14 3.58 ± 0.26*
11.30 ± 2.01 3.52 ± 1.03* 4.48 ± 0.52* 2.53 ± 0.82*
31.86 ± 9.33 19.06 ± 0.98 14.69 ± 0.46 11.55 ± 1.210.70 ± 0.30 0.44 ± 0.08 0.38 ± 0.06 0.29 ± 0.13
2.61 ± 0.63 1.91 ± 0.23 1.63 ± 0.24 0.84 ± 0.29*

M

M + Dox

M + Pro1412108**

有機酸を起点とするアミノ酸合成に着目し、分析した。各破壊株の細胞内のアミノ酸濃度を分析した結果、共通してリジンが減少していた。

64

アミノ酸は全て0.5% (wt/vol)M + Arg

M + Glu

M + Lys

コロニー形態

control

ΔctpA

最少培地における局在

ctpA-gfp

DIC

ΔyhmA

YhmA-GFP

merge

yhmA-gfp

リジンがPtet-ctpA-S ΔyhmA株の生育に及ぼす影響M

M + DoxM + 0.2 mM Lys M + 2 mM Lys M + 10 mM Lys M + 27 mM Lys

最少培地にリジンを添加するとctpAとyhmAの二重破壊条件でも生育できることが明らかになった。

最少培地での生育曲線
0.350.30.25
0.20.15
0.10.050010203040Time (h)細胞内のレドックスバランス
Control
ΔctpA
ΔyhmA

DIC

MitoTracker

YhmA-GFP

merge

DIC

MitoTracker

CtpA-GFP

merge

Relative copy number of ctpA

0.25

NADPH + NADP+(µmol/g wet cell)
18.88 ± 0.96
18.80 ± 1.62
22.64 ± 1.4250*

0.20.15
0.10.05024303648Time (h)yhmA遺伝子破壊株において、NADPH/NADP+ 比が顕著に低下した。
YhmAはNADPHの再生に関わっている可能性が示唆された。

分生子からのRNA抽出の評価

60

700.12*

0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0

ctpAとyhmAの遺伝子発現

クエン酸生産培地における局在

StrainM + His0MitoTracker

NADPH/NADP+ratio
1.04 ± 0.0047
1.43 ± 0.31
0.55 ± 0.17*

M + Phe2control

NADH + NAD+(µmol/g wet cell)
4.49 ± 0.53
5.31 ± 0.14
4.26 ± 0.23

M + Asp16

各株を最小培地で前培養（30℃、36時間）した後、菌体をクエン酸生産培地に移してさらに培養（30℃、48時間）した。ctpAとyhmAを破壊すると細胞外のクエン酸が減少し、リンゴ酸と2-オキソグルタル酸は上昇する傾向が見られた。一方、細胞内の有機酸は、ctpAとyhmAの破壊によりいずれも減少した。

NADH/NAD+
ratio
1.07 ± 0.21
0.98 ± 0.20
1.17 ± 0.22

*0.06

Ptet-ctpA-S ΔyhmA株のコロニー
Doxなし
Dox (1 μg/ml)

42°C

細胞内のアミノ酸濃度
リンゴ酸(mmol/g wet mycelia)

クエン酸(mmol/g wet mycelia)

細胞外の有機酸濃度800.12

クエン酸輸送活性(pmol/min/ng protein)

液体シンチレーションカウンターで測定

8000.14

YhmA-Sのクエン酸輸送活性

白麹菌からCtpAとYhmAを精製してリポソームに再構成し、[14C]クエン酸を用いてクエン酸輸送活性を測定した。
いずれも交換輸送体であることが示唆された。CtpAはリンゴ酸とcis-アコニット酸を対向基質としてクエン酸輸送活性を示し、一方、YhmAはリンゴ酸、cis-アコニット酸、オキソグルタル酸、オキサロ酢酸、コハク酸といった幅広い対向基質でクエン酸輸送活性を示した。

600

30°C

0.16

Relative copy number of wetA

凍結融解
超音波処理

ΔyhmA ΔctpA+ yhmA + ctpA

0.18

CtpAとYhmAにGFPを付加して蛍光顕微鏡により観察した結果、CtpAとYhmAが少なくともミトコンドリアに局在することが示唆された。

60

Relative copy number of yhmA

リポソーム

ΔctpA

Freeze dried mycelial wight (g)

対向基質

ΔyhmA

クエン酸
2-オキソグルタル酸
リンゴ酸
基質なし

精製したYhmA
あるいはCtpA

単独遺伝子破壊株、相補株の分生子形成能
Conidia (×105) percolony area (cm2)

クエン酸輸送活性の測定方法

0.8*0.70.6
0.5
0.4
0.30.20.102430364860

Time (h)ctpAは分生子、yhmAは栄養増殖中の菌糸（定常期）において高発現した。