2023.8.30

AJACSオンライン17

質量分析データを解析に活用する

新潟大学大学院 医歯学総合研究科
オミクス生物学分野
松本 雅記

遺伝子はタンパク質の設計図である
セントラルドグマ

ゲノム

トランスクリプトーム

プロテオームゲノムを基盤とする生命システムの成り立ち
遺伝子 (DNA→mRNA)

タンパク質

細胞・組織 などの生命システム

その他の物質(核酸・脂質・糖質・金属など）

ゲノム情報と分子計測技術の組み合わせが可能にしたポストゲノム研究

核酸

タンパク質
Created with BioRender

蓄積するプロテオームデータ

個々のタンパク質情報の検索１

個々のタンパク質情報の検索２

Isoform 1
Isoform 2

実験グループ(slice)間の比較：sliceの作成

サンプル群間で発現変化するタンパク質の探索
Spectral counting-based quantification between fibroblasts and iPS cells

リポジトリにあるrawデータを活用するには？
こんな場合に有効• 検索対象データベースを変えたい (mutation, riboseqから作成したfastaなど）• 自分のデータや異なるプロジェクトのデータを同一条件で比較したい• 異なる解析プラットフォームを使いたい• 装置や測定手法によって得られるデータは多様。
• 実験的な前処理法との組み合わせによる複雑化。
• リポジトリにおけるメタデータの不足や誤りが多い◼ 質量分析計によるプロテオーム解析の原理の理解◼ データの種類やデータ解析手法の理解

質量分析計によるプロテオーム解析の原理

質量分析計の概要
Pump
Vacuum

Ion source

Sample loading
Separation(LC, CE etc)

(Ionization)
MALDI, ESI, FAB etc

Analyzer(Ion separation)
TOF, Quad., IT, etc

Detector

Dataprocessingソフトイオン化法
Matrix Assisted Laser
Desorption Ionization (MALDI)MS
Laser pulse

Electro Spray Ionization (ESI)Spray tip

H+Gas phase

H+

H+

H+

H+
H+

H+

H+

H+H+H+

H+H+H+H+H+H+H+H+H+H+H+H+H+H+ H+ +H+
H
H + + H+H

H++ ++ +++ +H+H+Liquid phase

High voltage+• 成分数が少ない場合に有効• １サンプルあたりの計測時間が短い• 多検体の解析が可能-MS•

HPLC等とのオンライン化が容易である。

•

装置の中に溶媒が入るため、装置の汚染を招きやすい。

タンデム質量分析計

複数のイオン分離系を組み合わせてMS/MSを取得可能

質量分析計の横軸：m/z (m over z)
ある質量Mを持った物質に水素等が付加してイオン化した場合＝ポジティブイオン

プロトン化イオンの一般式： [M+nH]n+[M+H]1+

１価イオン[M+2H]2+２価イオン[M+3H]3+３価イオン[M+nH]m/z=n1Hの質量数＝1.007825

例えば分子質量数500の分子に2つのプロトンが付加した場合
m/z=[500 + 2*1.007825]/2＝251.0078

多価イオン• ESI法では多くの場合、多価イオンを生じ傾向がある。
• プロテオミクスにおいて解析するペプチドはトリプシン消化によって生じているものが多く、N末端のアミノ基とC末端のリジンあるいはアルギニンの側鎖に存在するアミノ基の影響で２価や３価イオンを生じやすい。
20100412bsa_03 #6805 RT: 34.43 AV: 1 NL: 3.02E7
T: FTMS + p NSI Full ms [300.00-2000.00]
582.3199
1009590◼ 天然の物質は同位体を一定の割合で含んでいる。

858075◼ そのため、元素の同位体分布に従って質量が1Daのずれを持つ同位体クラスターが観測される。

70

Relative Abundance

65582.8195

605550◼ この同位体クラスターの間隔は１価イオンなら1.0 m/zであるが、２価イオンなら0.5 m/zであり、３価イオンなら0.33 m/zである。

4540353025583.3203◼ 従って、この同位体ピーク間の幅からイオンの価数可能。逆に言えば価数判定ができないと、実測されるm／zから質量を算出できない。

201510583.8220
50580.3262
580

584.3229

581.3218 581.8201
581582

583
m/z

584585.2609 585.8627
585586

質量分析計を基盤とするプロテオミクスの概要⚫ ショットガン(ボトムアップ）：ペプチドにして解析⚫ トップダウン：タンパク質のまま解析
プロテオミクスにはボトムアップとトップダウンの二種類の戦略がある

ショットガンプロテオミクスにはタンパク質の断片化（ペプチド化が必須）

Trypsin

特定のアミノ酸で切断されることが重要！

----KXXXXXXKXXXXXXXXXXRXXXXXXX---必然的に末端のアミノ酸配列が決められるTrypsinの場合はC末端がK か R

LC-MS/MSにおける測定モードの多様化

Data-dependent acquisition (DDA)モードによるLC-MS/MS測定
RT: 5.00 - 50.00
32.41
695.45100

NL:
1.10E9TIC MS
20100720
MM_01

95
90
85
80
13.63
310.2215.28
527.3017.18
572.8375
70
65

Relative Abundance

60
55
50

25.26
573.8525.38
573.8523.84
530.3118.88
681.3822.03
535.3130.27
621.8334.18
738.7834.40
738.7825.77
535.9736.71
512.3213.28
648.354540.01
651.06403540.40
535.6243.48
642.4030
2548.34642.7410.93
445.2720151059.76445.12051015202530Time (min)35404550Isolation
20100720MM_01 #3729 RT: 16.30 AV: 1T: FTMS + p NSI Full ms [300.00-2000.00]
459.2625
10095

Target ion

9085

2010 720MM_01 #3729 RT: 16.30 AV: 1 NL: 3.64E6
T: FTMS +p NSIFul ms [30 .0 -20 0.0 ]62 .808
10MS

NL: 8.54E6MS/MS
20100720MM_01 #3711 RT: 16.26 AV: 1 NL: 2.07E5
T: ITMS + c NSI d Full ms2 622.81@cid35.00 [160.00-1260.00]
614.0574
10095987.5527

959090858580808075

75

75

70

70
65

65

A bundance

60
55

45

R el ati ve

557.7960

50

622.8088

40

5
50
45
40

Relative Abundance

518.294460

746.449870

65623.3104874.5157

60
55
50
45
40

258.2128930.5557

35

35

35

30

30

30

25

25

20
15
917.517351054.5745

1244.6110
1345.9216
1501.8054

1651.2224

1981.5781

0
400

600

800

1510

1000

1200
m/z

1400

1600

1800

2000

5621.848 62 .31 7499.3404

20

15

720.431910371.316625

623.81 7

20624.3146

10

623.9 91 624.8167

50
62 .0 62 .5 623.0 623.5 624.0 624.5 625.0m/z

1041.4924

315.2908
689.4623

1098.5924
1171.8068

0200

300

400

500

600

700m/z

800

900

1000

11001200

DDAによるタンパク質同定の原理
In silico (database)0904_A15-MM #528 RT: 11.96 AV: 1 NL: 7.27E6
F: + c NSI Full ms [ 450.00-2000.00]
709.8
100
95908075

Precursor ion spectra(MS)7065

Relative AbundancePrecursor ion

実測質量から候補ペプチドの選定（数十から数千の候補）

85

6055

SAVGHEYVAEVEK

504540710.7

906.4

353025721.6

201417.5

1510900.3

907.4

756.1 809.4924.0742.4
467.9 565.7

667.6

51043.4

1130.7 1167.5

1419.41309.11636.91508.71755.7 1826.8 1915.7

0600

800

1000

1200m/z

1400

1600

1800

2000

Isolation
CID

Database search(MASCOT etc)

Fragment ionsb-ion

0904_A15-MM #527 RT: 11.93 AV: 1 NL: 2.61E5
T: + c d Full ms2 709.75@35.00 [ 185.00-2000.00]
581.0
100
90837.2
966.3

80
70
Relative Abundance

Product ion spectra(MS/MS)60

552.6

フラグメントの質量で照合

630.3

50967.3

40843.2
630.9

30914.2

258.1

1142.4 1271.4

744.2

434.201272.3

700.6

20101044.2

1160.3

S AVGHEYVAEVEKSA VGHEYVAEVEKSAV GHEYVAEVEK

324.1 423.5

825.3

541.1

1254.6 1289.3
1680.0

213.1
200

400

600

800

1000m/z

1200

1400

1600

1800

Identify

y-ionラベル化しない定量法

ラベル化による定量法

Public dataの活用：jPOST Repository測定方法に応じた検体-raw file対応
Single shot/label-free：
１検体/1 raw file

Fractionation/label-free：
１raw fileには単一検体のみ
ただし、複数raw fileが発生（fractionationの数だけ）

Fractionation/Multiplex (labeled samples) ：１raw fileに複数検体が含まれる
複数raw fileが存在
残念ながらpublic repositoryのメタデータはあまり信用できない（適当な登録が多い）。
論文からメタデータを引っ張り出した方が正しい。
→ データジャーナルの活用(Journal of Proteome Data and Methods)プロジェクト検索とメタデータの確認Isobaric tag定量のメタデータ

DDAのデータ解析

DDA data の解析ワークフロー
Raw files (vender specific)

Universal format
Peak picking

Peak picking

Peak lists

Vender specificなものから汎用的なものまで多数。
有償版だけでなく無償のものもある。

Peptide-spectrum match (PSM)
Unique peptides
Validation
Protein inferenceValidation

Result files

Search tool

FASTA files広く使われているMS/MSデータ解析ソフト

MascotMaxQuant• 最もポピュラーな検索エンジン(有償）• 操作がシンプルで使いやすい• スペクトル帰属図などが見やすい• フリーソフト• タンパク質同定(Andromeda)から定量まで実施可能• スペクトルの可視化などが重い• 結果の統合や定量は別ソフトが必要

Vender specificなソフトの利用も一般的(ProteomeDiscover, ProteinPilot など）• フリーソフトウェア• 検索が早い• Open search が現実的に可能→ 網羅的な翻訳後修
飾の解析が可能• 他のツールとFragPipe のプラットフォーム内で連携

FragPipeの設定• MSfragerは基本FragPipeの中で動く。
• 定量やバリデーションなどで働くツールをFragPipeの中で動かす。

Workflowの呼び出しとrawデータの指定• 多くのアプリケーションに対応したワークフローのテンプレが揃えられている。
• 基本的なものはこれから選べばOK(もちろん質量分析計の測定モード等の条件依存）。
• カスタムを作成して保存も可能。
• Raw fileの指定の際、サンプルグループやレプリケートのタグ付が可能。

検索条件の設定• 酵素の選定• 翻訳後修飾などを入力• 装置の質量精度に応じてトレランスを設定

FASTAの準備• FASTAファイルを読み込んでindex化• FDR計算のためにdecoy 配列もここで作成

Validation• Validation toolの選択• FDRフィルターの設定• PTMのvalidationも可能

定量モードLabel-free or isotopic-label 定量

Isobaric-label定量 (TMT/iTRAQ）

DIAのデータ解析

DIAデータ解析の基本
DIA spectra(混合MS/MS)
Spectra library

Fragment ion extracted
chromatography質量分析プロテオームデータ解析のアプローチ

DIA解析ソフトの発展
Library search Library free-search
Spectracentric⚫ OpenSWATH⚫ DIA-Umpire⚫ PECAN⚫ Skyline⚫ EncyclopeDIA⚫ DIA-NN⚫ DIAmeter⚫ MaxDIA

○○○
○
○
○
○○

◼ Spectronaut◼ Scafold-DIA◼ PEAKS○○○

Peptidecentric

○○
○
○
○○○○?
Demichev, V et al. Nat. Methods 17, 41–44 (2020).

DIA-NNによるライブラリーフリーサーチ
ライブラリーフリーサーチとは？
FASTAファイルから予測スペクトルライブラリーを直接構築して解析• Raw fileとFastaファイルを指定して、Precursor iongenerationにチェックを入れてスタートするだけ。
• 修飾はリン酸化とユビキチン化に対応済み• 一旦作った予測ライブラリーは使い回し可能• １ペプチドあたりの修飾部位数やミス切断数を増やすと終わらないので注意が必要。

DIA Umpire SE effectively enhances identification of phosphopeptides
DIA raw file
FragPipe
DIA-NN(Lib-free mode)

DIA UmpireSE

MSFragger

DIA-NN(Lib mode)

多様化するプロテオーム研究

Created by BioRenderTake home messageまとめ• 単純な発現比較や個々のタンパク質情報の収集にはReposotryと連動したプロテオームデータベースの活用が有効• Repositoryにあるデータを再解析等をするには実験方法のある程度の理解が必要• フリーソフトも多数あるので、誰でも再解析は可能
展望• 今後ますます大規模化が促進 (1データセット数百検体時代に）• 他のオミクスデータも充実し統合が可能• データサイエンスもChatGPTなどを活用すれば誰でも可能