RESEARCH COMMUNICATIONS

No.

36

2 0 2 2I N S T I T U T E F O R F E R M E N TAT I O N , O S A K A ( I F O )Published by
INSTITUTE FOR FERMENTATION, OSAKA
17 — 85, JUSO — HONMACHI 2 — CHOMEYODOGAWA — KU, OSAKA 532 — 8686, JAPAN公益財団法人発酵研究所

理 事 長

中濱

一雄

常務理事

樽井

直樹

理

事

左子 芳彦
鈴木健一朗
原山 重明
松下 一信

清水
原島
古川
横田

昌
俊
謙介
篤

監

事

下元

高文

藤井

智幸

大島 敏久
笹川 千尋
関 達治
谷 吉樹
藤田 正憲

北本
下田
武田
土屋
吉田

勝ひこ
親
直久
英子
敏臣

評 議 員

目

次
正憲

1

単細胞紅藻シゾンにおけるゲノム編集とマルチプレックスオルガネラ
イメージングを実現するハイスループット遺伝子改変技術の確立…………… 吉田大和

3

環境中の未培養原生生物種の 1 細胞ゲノム解読手法の確立 …………………… 本郷裕一

15

電気で微生物の代謝を制御する：電気遺伝学の創生…………………………… 渡邉

一哉

29

海洋分解性プラスチックの基材開発に資する
アーキアポリ- γ -グルタミン酸 …………………………………………………… 芦内

誠

35

植物バイオマス生産を制御する微生物由来気相コミュニケーション
物質に関する包括的研究…………………………………………………………… 上田晃弘

43

ゲノム編集システムを利用した有機酸輸送系の改変による高効率クエン酸生産糸状菌の育種………………………………………………… 桐村光太郎

51

巻頭言………………………………………………………………………………… 藤田■ 2020年度大型研究助成■ 2016年度寄付講座助成
細菌の環境適応・機能進化機構の包括的理解と環境細菌の高度利用
および未開拓潜在機能開発への応用
細菌の環境適応・機能進化機構の包括的理解と環境細菌の高度利用
および未開拓潜在機能開発への応用………………………………………… 永田裕二

63

特殊性の高い遺伝子の起源と細菌がそれら遺伝子を獲得する機構…………………………………………………… 加藤

広海，永田

裕二

75

脱ハロゲン酵素の機能進化…………………………………… 佐藤優花里，永田裕二

93

細菌の環境適応・進化に関する細胞機能…………………… 佐藤優花里，永田

裕二

109

細菌集団の形成と進化………………………… 矢野

裕二

123

大和，加藤

広海，永田

■ 2020年度 一般研究助成
国内の異なる積雪環境に適応した担子菌ガマノホタケ科
Typhulaceae の多様性とその環境適応能の評価 ……………………………… 星野保

139

Fungi 界に特有なペプチド性化合物生合成因子の生物学的機能解明 ………… 梅村

舞子

140

難培養微生物の培養を目指した新規共培養法の構築…………………………… 雪

真弘

141

一大未知生物群“深海・外洋性ディプロネマ類”の実体と多様性の理解，および分類体系の整理…………………………………………… 矢吹

彬憲

142

白癬菌における分類体系の再検討と薬剤耐性との関連性に関する研究……… 山田

剛

143

好熱性シアノバクテリアの系統分類体系と菌株コレクションの確立………… 春田伸

144

酢酸菌群の光に対する適応応答の包括的理解…………………………………… 髙野

英晃

145

脂質非対称バイオセンサーの開発を通した生体膜研究のボトルネック解消と細胞外物理化学変数の感知機構に関する
新奇概念の提唱……………………………………………………………………… 小原

圭介

146

病原性細菌における毒素遺伝子保有ファージを誘発する因子
およびファージ獲得機構の解析…………………………………………………… 島村

裕子

147

腸内細菌科細菌における新規カルバペネム高度耐性機構の解明……………… 多田

達哉

148

オートファジーから逃れるタンパク質の網羅的解析…………………………… 古川健太郎

149

細菌べん毛成長端の機能構造解析に基づくべん毛形成機構の解明…………… 今田

勝巳

150

液胞よる染色体・核小体の核内配置制御の解析………………………………… 丑丸

敬史

151

糖消費速度をモニタリングするフラックスセンサーの探索…………………… 柘植

陽太

152

耐熱性酵母 Kluyveromyces marxianus の高温下での脂質代謝変化の解析 …… 星田

尚司

153

海藻（褐藻）分解小動物の腸管と腸内複合微生物の協同による褐藻の完全分解系の解明……………………………………………… 河井

重幸

154

昆虫共生細菌による殺虫剤の腸内解毒機構の解明……………………………… 菊池

義智

155

低グルコースに対する分裂酵母の適応戦略……………………………………… 中岡

秀憲

156

新規機能性 DNA 断片を介した酵母の適正なゲノム構造維持機構の解明 …… 飯田

哲史

157

ゲノム DNA は，細菌細胞内ではどのように折りたたまれているのか：
HU タンパク質による細菌ゲノム DNA 折り畳み機構 ………………………… 大島拓

158

グラム陽性菌に見いだされた新規電子受容体と超低栄養生育との関連性…… 吉田

信行

159

一細胞力学操作を用いた病原性細菌の細胞侵入における定量的解析：
細菌感染を支配する力学的メカニズムの解明…………………………………… 久保田寛顕

160

好熱性細菌 Thermus thermophilus におけるコエンザイム A
生合成経路の制御機構の解明と CoA 製造への応用 …………………………… 本田

孝祐

161

植物免疫を活性化する微生物の新規評価法の確立と探索への応用…………… 古屋

俊樹

162

バイオ医薬品の次世代製造宿主を指向した
光発現誘導システム導入ブレビバチルス菌の創製……………………………… 浅野竜太郎

163

長期間持続可能なインジゴ還元発酵液の新規調整方法の開発………………… 湯本

勳

164

病原性細菌の毒素産生を阻害するプロバイオティクスの探索
ならびにその作用機構の解明……………………………………………………… 野田

正文

165

酵母 FLO assay を基盤とした真菌二次代謝産物からのエピジェネティック機能探索……………………………………………………… 杉山

圭一

166

発酵食品中の微生物間相互作用を仲介する酵母プリオン様因子[GAR+]の作用機序に関する研究 ………………………………………………… 渡辺

大輔

167

柑橘類の優れた芳香族化合物生産能を利用した酵母によるtrans -ケイ皮酸の発酵生産 ………………………………………………………… 大橋

貴生

168

Nrf2/SKN-1 制御系を活性化する乳酸菌体成分の探索と長寿機構の解明 …… 小村

智美

169

進化解析に基づく高機能 PET 加水分解酵素の創出 …………………………… 吉田

昭介

170

乳酸菌が産生する菌体外多糖の免疫増強活性に寄与する酵素の構造基盤の解明……………………………………………………………… 松﨑

千秋

171

共生微生物によるダイズ黒根腐病防除機構の解明……………………………… 岡崎伸172

新コンセプト「電子伝達体キノンの構成改変による代謝調節」の実証……… 中澤

昌美

173

リグニンの主要結合を開裂する微生物の探索とリグニンからのポリマー原料生産への応用………………………………………………………… 上村

直史

174

単一の細胞が精巧で微小な構造物を構築する原理の解明……………………… 野村

真未

175

■ 2019年度若手研究者助成
彩雪をもたらす氷雪性緑藻の種の全世界的な解明：
培養株の多面的解析と野外サンプルとの比較分子解析………………………… 松﨑

令177

少数細菌の検出を可能とする深層化 16S メタゲノム解析法の開発 ………… 後藤

愛那

179

グラム陰性菌外膜タンパク質アセンブリー機構の解析………………………… 塩田

拓也

180

原核微生物が持つエピジェネティクスの理解に向けた
海洋細菌群集の DNA メチル化修飾の系統網羅的解析 ………………………… 平岡

聡史

181

病原性染色体による宿主特異性の決定・分化機構の解明……………………… 鮎川侑182

大腸菌の外膜品質管理に関わる 2 機能性タンパク質 BepA の基質認識・選別機構の解明………………………………………………………… 宮崎

亮次

183

DPANN 群に属する新奇アーキアの共生機構の解明…………………………… 酒井

博之

184

■ 2020年度若手研究者助成

巻

巻

頭

言

頭

言
藤

田

正

憲＊

最近，国内の任期付き研究者が大量に雇止めになり，研究に支障をきたすようになる，また日本の科学技術論文数が減り，世界ランキングを落としている，など景気の悪いニュースが目についた．そこで，世界の研究開発費（ OECD 調べ）を見ると，GDP とおなじで 3 位であるが，人口当たりに換算するとなんと 14 位となる．論文は総数では 4 位であるが，注目論文数になるとインドに抜かれ 10 位となっている．法人化後，運営費交付金が漸減し，特に教育研究費に困っている地方国立大学教員の話を聞くが，上記の統計がそれを裏付けているかもしれない．お金があってもいい研究はできないと反論されそうであるが，微生物学に関する研究でも，最新の研究設備を駆使しなければ，世界トップレベルの研究成果を出せない場合が多い．
質の高い論文を GDP ランキングと同じレベルで発表し続けるという命題を即席で解決する方法は浮かばないが，研究費が多ければ最新設備購入等にも余裕ができ，注目される論文作成につながると考えられる．国内の公募研究費の種類は多いが，研究者当たりの額が先に述べたように少ないのであれば，研究費獲得の一手段として企業との共同研究が考えられる．
例えば大阪大学には「大阪大学共創機構」があり，企業と学内研究者との共同研究や起業化を推進している．そこの共同研究支援室長に企業を退職して就任した教え子の K 君がいる．
仕事内容は大学内の研究成果を企業と結び付け，実用化等のための共同研究のお手伝いをすることである．一定の要件を満たせば，大学が関与して会社を設立することも可能になっている．
自然科学特に微生物学に携わる研究者は常に実用化を意識して研究テーマを決め，実施しているとは限らない．やはり自分が興味を持っている対象や材料，あるいはそこに秘められている未知の現象の解明など，基礎的な研究に絞られることが多いだろう．現役時代，水環
境分野へのバイオテクノロジーの応用を目指してきた筆者は，日本の生産が世界トップクラスであった半導体産業で大量に使われる非イオン界面活性剤の，河川汚染や下水処理場での挙動に興味を持ち，その一貫で好気環境下での分解微生物の探索を手掛けた．分解菌は普遍的に存在したが，当該物質がすべて炭酸ガスと水に分解されるのではなく，最終産物としてノニルフェノールが残った．当時カナダの大学と水環境に関するワークショップを行っており，そこで本成果を発表したところ，この物質が今欧米で話題になっている“環境ホルモン”
であると指摘された（不勉強で初めて聞く言葉でした）．帰国後環境ホルモンに興味を持ち，非イオン界面活性剤とともにビスフェノールＡの環境内挙動に関する研究を進めていたとこ
ろ，Ｔ社の方から共同研究の申し入れが入った．私には本研究が実用化と結びつくことが理解できなかったが，Ｔ社が得意の免疫化学を用いたイムノアッセイによる簡易分析法を開発するので，共同で進めたいとのことでした．研究室では学生が HPLC，GC/MS などの機器＊

藤田正憲
大阪大学名誉教授・元国立高知工業高等専門学校長，公益財団法人発酵研究所評議員

－1－

藤

田

正

憲

を駆使して分析していたが，それを当たり前のように考えていたので，簡便化は思いもよらなかった発想であった．当時，水道や下水道の水質分析室には，このような高価な分析機器を整備することができなかったのが理由である．その後実用化に結び付き，高い評価を受けた．本共同研究を通して，企業は大学とは異なった視点から，研究成果を見ていたことを勉強した．
そこで K 君に，学内で共同研究をマッチングさせる立場として，なにが難しく，また進めるための心がけなどを質問した．答えは，企業は自社の事業のために必要な技術開発を，自社のみではできないあるいは自社で行うと長期間かかり好機を逃すなどと判断した場合，大学・公的研究所等との共同研究を模索する．一方，研究者は自分の研究は実用的ではないと考えているが，企業側は例えばその研究成果を応用・加工すれば，これまでにない新しい製品，
サービスにつながると考える．また，企業も基礎研究を進めており，企業側の方向と一致す
れば，基礎研究を発展させるために共同で実施したいと考えている．少し前に流行った“ミドリムシ”の実用化，また昆虫食が注目され始めたが，これも基礎研究の発展型といえよう．
共同研究で大切なことは，シーズとしての研究と企業のニーズのマッチングであるが，すぐに学会・研究集会など，分野を同じくする研究者の集まりが思い浮かぶ．これは従来型のマッチング法で，大学という組織が係らないかつ研究者が受け身の形の共同研究であるが，近年は各大学が積極的に共同研究を推進する部局を作り，学内のシーズを掘り起こし，かつそれらを外に向けて積極的に発信することで，共同研究を促進している．もちろん，中小企業を含む企業からの相談案件にも組織的に対応しているそうである．大学も本気で外部資金を獲得する努力をしていると思った．
最近，政府は“国際卓越研究大学”構想を打ち出し，その要件が明らかになり始めた．内容は，①研究実績，②民間との連携，③財政基盤の３要件から選抜するというものである．
財政基盤は，運営費公費金や授業料を除く外部資金となっている．研究は国から交付される
運営費交付金や科研費だけに頼ってはならないということである．当然であるが上記 3 要件を満足させるためにがんばらなければならない主たる人材は，大学の構成員である教員・研究員である．
共同研究を進めるにもシーズとなる研究成果が求められるので，若手研究者には“鶏と卵”の話になってしまいそうであるが，国のみならず民間の財団等からも，優れた発想には支援の手が差し伸べられている．例えば，科研費では戦略的研究（萌芽），若手研究，研究活動
スタート支援，奨励研究など，若手を手厚く支援しているので，アイディア段階でも研究費を獲得できる．微生物学に限れば，公益財団法人発酵研究所の“一般研究助成”も，面白い発想の研究を求めている．また，本年度から実施された地方大学の“研究室助成制度”は，教育・研究財源に困っている地方の大学にとって，朗報であったといえる．
冒頭に記したように，注目論文数で代表される我が国の科学技術力が，世界のトップから置いて行かれる状況は，先進技術で維持してきた我々の生活，例えばコロナ対策を含む先進的な医療制度，ハード及びソフト面で安全・安心な都市，地域及び地球環境の保全，地球温暖化対策などに技術・財政の両面から大きな影響を与えることになるだろう．
一人当たりの研究費の少ないことに愚痴を言わず，微生物の無限の可能性を信じ，斬新な発想で研究を発展させ，そこから共同研究や起業を含め，外部資金を獲得するとともに，その成果を社会実装して世界をリードしてほしいと願っている．
－2－

2020 年度大型研究助成の研究報告
助成期間:2020 年 4 月～ 2022 年 3 月

IFO Res.Commun. 36
3-14, 2022

単細胞紅藻シゾンにおけるゲノム編集とマルチプレックス
オルガネライメージングを実現するハイスループット
遺伝子改変技術の確立
吉

田

大

和

東京大学大学院理学系研究科生物科学専攻〒113-0033

東京都文京区本郷7-3-1

Development of a high-throughput gene targeting system consisting of CRISPR genome
editing and multiplex organelle imaging in unicellular alga Cyanidioschyzon merolae
Yamato Yoshida
Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo
7-3-1 Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo 113-0033
The simple cellular structure of the unicellular alga Cyanidioschyzon merolae consists of one nucleus, one
mitochondrion, one chloroplast, and one peroxisome per cell and of fers unique advantages to investigate
mechanisms of organellar/cell proliferation and the cell cycle. In this study, we developed an engineered clustered,regularly interspaced, short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) system, CZON-cutter, forsimultaneous genome editing and organellar visualization. We engineered a C. merolae strain named YMT1
expressing a nuclear-localized Cas9-Venus nuclease which can cause a DNA double-strand break at a locus definedby a single-guide RNA (sgRNA). By using the YMT1 strain, we then successfully edited the C. merolae genome
and visualized the mitochondrion and peroxisome in transformants by fluorescent protein reporters with different
excitation wavelengths. Fluorescent protein labeling of organelles in living transformants allows validation ofphenotypes associated with organellar proliferation and the cell cycle, even when the edited gene is essential.
Combined with the exceptional biological features of C. merolae, CZON-cutter will be instrumental for investigating
cellular and organellar division in a high-throughput manner.
Key words: CRISPR-Cas9 gene editing, multiplexed organelle imaging, rhodophyta, Cyanidioschyzon merolae,organelle division

真核生物は原核生物が成し遂げられなかったこのような

緒言爆発的な進化を遂げることができたのか．この理由の一つとして，ミトコンドリアや葉緑体と言った細胞内共生

地質学的な証拠に基づくと，地球上に生命が誕生した

オルガネラを獲得したことによる細胞構造の革新が挙げのは今から約 35 億年前の太古代だと考えられているられる( Mereschkowsky, 1905; Gray, 1992 )．これらの( Brasier et al., 2006 )．地球上で誕生した最初の生物はオルガネラは細胞に膨大な生体エネルギーを供給し，真バクテリアやアーキアといった原核生物であったが，約核生物が多様な遺伝子を保持することを可能とし，新た21 億年前の原生代には真核生物が誕生した( Strassert

な細胞機能を創出することに繋がったと考えられる

et al., 2021 )．真核生物が誕生してから最初の 10 億年の間に，地球を実験場とした壮大な細胞生物学的な挑戦が( Lane and Martin, 2010 )．アルファプロテオバクテリア

試みられ，門や綱を超えた分類群である 8 つのスーパー

いう進化的起源をもつため，これらのオルガネラは独自グループを構成するに至った(Burki et al., 2020 )．なぜ，のゲノム DNA と遺伝子発現システムを備えており，細E-mail: yamato.yoshida@bs.s.u-tokyo.ac.jp

et al., 1994 )．このため真核生物の細胞機能を維持する

およびシアノバクテリアの祖先細胞による細胞内共生と胞内で新たにゼロから創り出すことはできない(Gillham

－3－

吉

田

大

和

ためには，これらのオルガネラの機能を制御する機構に

解析対象遺伝子の数には制限があった( Ohnuma et al.,加え，オルガネラの分裂増殖機構，さらにオルガネラの2008; Imamura et al., 2009; Fujiwara et al., 2015, 2017 )．

分配機構を正確に機能させることが必須となる

また，葉緑体は明視野およびクロロフィル自家蛍光に( Kuroiwa et al., 2008 )．しかし，過去半世紀に渡り様々

よって即座に観察することが出来るが，その他のオルガなモデル生物を用いてこれらのしくみの理解を目的としネラを観察するためには，特定の蛍光染色試薬によってた研究が行われてきたが，未だこれらの分子機構の全貌

組織染色を行う必要がある．このため，対象となった遺は明らかではない．

伝子機能を破壊した際には，いずれのオルガネラの分裂

こうした真核生物の根幹をなすオルガネラの制御機構

増殖に影響が生じているのかを検証するためには複数種を解くため，単細胞紅藻であるシアニディオシゾンが注類の蛍光組織染色を行う必要があった．また染色による目されている( Kuroiwa, 1998; Matsuzaki et al., 2004 )．

生細胞へのダメージも無視できず，長時間の蛍光タイム

シゾンは，単独で生育可能な真核生物としては最小セッラプス観察は困難であった．

トのオルガネラである 1 つの細胞核，1 つのミトコンド

今回，本研究ではこれらの技術的制約を打破し，シゾ

リア，1 つの葉緑体，1 つのペルオキシソーム，1 つのンを用いて真核生物におけるオルガネラ制御機構の真のゴルジ体，数個の液胞，そして単純な形態の小胞体しか分子メカニズムを解明するため，CRISPR( Clustered

保持していない．さらにゲノム解読の結果，シゾンは細Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats ) お よ

胞構造だけでなく，ゲノム DNA 構造も極めてシンプル

び Cas9( CRISPR-associated nuclease 9 )を基盤としたで あ る こ と が わ か っ て い る( Matsuzaki et al., 2004;

ハイスループット遺伝子ターゲティングシステムの開発

Nozaki et al., 2007 )．ゲノム DNA は 20 本の染色体からを試みた．確立したゲノム編集・オルガネライメージン構成され，全長は 16.5 メガ塩基対である．ゲノムにコー

グシステム“シゾン・カッター”を用いることによって，ドされた遺伝子数は真核生物としては最小の 4775 遺伝

ゲノム編集と同時に複数種類のオルガネラを蛍光タンパ

子のみである．さらにイントロンを含む遺伝子は僅かにク 質 に よ る ラ ベ ル 化 が 可 能 と な っ た( Tanaka et al.,14 遺伝子のみであり，殆どの遺伝子がスプライシング

2021 )．同技術は高い正確性と効率性，広い汎用性，さを受けない．そして葉緑体を持つ単細胞藻類に多く見ららに圧倒的なハイスループット解析力を実現した．新たれる有用な性質として，光による明暗周期培養を行うこに 確 立 し た シ ゾ ン の 標 準 株 Cyanidioschyzon merolaeとによって細胞周期を高度に同調化することが可能であYMT1 に加えて，シゾン・カッターを実行するための基る( Suzuki et al., 1994 )．シゾンが持つこれらの特性を

準 コ ン ス ト ラ ク ト DNA で あ る pGuide-mitoScarlet と基盤として，これまでに多くのミトコンドリアや葉緑体

pCer3-PTS1 なども様々な研究機関へ分与しており，現の分裂制御機構の一端が明らかとなってきた( Yoshida

在急速に同手法を利用する研究者が増加している．

et al., 2006, 2009, 2010, 2017; Yoshida & Mogi, 2019 )．またこうした特性を基盤として，近年ではシゾンの細胞周実験方法

期トランスクリプトーム解析が行われており，そのゲノ( Fujiwara et al., 2009, 2020 )．同トランスクリプトーム

C. merolae YMT1 株の作製
核局在 Venus 融合 Cas9 を恒常的に発現するシゾン株

ムレベルでの遺伝子発現動態が明らかとなってきている
データを詳細に分析した結果，454 遺伝子(全遺伝子のを構築するため，EF1A プロモーター領域( 1 kb )，1 つ

9.5 %)がオルガネラ・細胞分裂期に特異的に発現して目の核局在配列(Nuclear localization signal, NLS )，ヒト

いることが明らかとなり，この中には真核生物に広く保コドン最適化 cas9，2 つ目の NLS，シゾンコドン最適化

存されている機能不明 181 遺伝子が含まれていた．これ

Venus，さらにクロラムフェニコール耐性遺伝子カセッ
トを含む DNA 配列をウラシル要求性株であるシゾン M4らの遺伝子群には未だ知られていないオルガネラの分裂
増殖・分配の制御機構に関与する鍵因子が含まれている

株へポリエチレングリコール( PEG )法による相同組換可能性が高く，これらの全候補遺伝子を対象とした遺伝えによって導入した．得られた形質転換体は，ウラシル

子機能解析が急務となっている．

要求性・クロラムフェニコール耐性となり，恒常的に核遺伝子機能を明らかにするためには，遺伝子ターゲ

局在 Cas9-Venus を発現するシゾン YMT1 株が得られた．

ティング法が極めて重要な技術となる．既にシゾンにおける遺伝子ターゲティング法としては相同組換え法が確

sgRNA 発現ベクターの構築

立しているが，同技術の精度は高い反面，遺伝子ターゲ

sgRNA およびミトコンドリア蛍光レポーターを発現

ティングを行うために必要なコンストラクト DNA を構するベクター( pGuide-mitoScarlet )を作製するため，築するための分子生物学的な作業に時間がかかるため，

シ ゾ ン の U6 プ ロ モ ー タ ー 領 域 と 一 本 鎖 ガ イ ド RNA－4－

単細胞紅藻シゾンにおけるゲノム編集とマルチプレックスオルガネライメージングの同時実現( single guide RNA，sgRNA )スキャフォールドを含む

必要配列部分の PCR アンプリコンを得た．各標的遺伝

DNA 配列を合成した．またミトコンドリア蛍光レポー子に対する遺伝子カセットノックインを行うにあたり，

ターとして，シゾンコドン使用率に合わせた赤色蛍光タ

pGuide-mitoScarlet と pCer3-PTS1 から得られた PCR ア

ンパク質である mScarlet 遺伝子に，ミトコンドリア EF-tu

ンプリコンを混合し，シゾン YMT1 へ導入した．

のミトコンドリア移行シグナルを融合した mitoScarlet
遺伝子を作製した．これらの DNA フラグメントを導入

蛍光顕微鏡

し，pGuide-mitoScarlet ベクターを構築した．sgRNA の蛍光観察を行うため，油浸対物レンズ( 100×，NA

先頭部分に含まれる Cas9 によって切断される標的配列

1.45 )を備えたオリンパス IX83 倒立蛍光顕微鏡を用いた．

は，CRISPRdirect ウ ェ ブ サ イ ト( https://crispr.dbcls.

蛍光光源は水銀ランプ(オリンパス U-HGLGPS )を使用

jp/ )を用いて決定することができる．同ウェブサイト

し，光学励起フィルターとして 490-500HQ( Venus 蛍において，sgRNA 配列の特異性は，対象となるデータ

光観察)，FF01-549/12-25( mScarlet 蛍光観察)，FF01-

ベ ー ス と し て「 Red alga( Cyanidioschyzon merolae )427/10-25( mCerulean3 蛍光観察)，FF01-405/10-25(葉genome, ASM9120v1( Nov, 2008 )」 を 選 択 す る こ と に

緑体蛍光観察)を使用した．カスタムダイクロイックミ

よって検討が可能である．標的配列を含む sgRNA スキャ

ラ ー は Di03-R514-t1-25×36( Venus 蛍 光 観 察 )，Di03-

フ ォ ー ル ド を 合 成 し，pGuide-mitoScarlet ベ ク タ ー を

R561-t1-25×36( mScarlet 蛍 光 観 察 )，FF458-Di02-25×

DNA テンプレートとして得られた PCR アンプリコンと36( mCerulean3 蛍光観察)，T455lp(葉緑体蛍光観察)

ギブソンアセンブリによる組換えを行うことで標的配列を使用した．蛍光フィルターは FF02-531/22-25( Venus

毎の pGuide-mitoScarlet ベクターを構築した．

蛍 光 観 察 )，FF02-585/29-25( mScarlet 蛍 光 観 察 )，シゾンコドンに最適化された mCerulean3 遺伝子にペFF01-474/27-25( mCerulean3 蛍光観察)，FF02-617/73-25

ルオキシソーム移行配列 PTS1 を融合した perCerulean3( 葉 緑 体 蛍 光 観 察 ) を 使 用 し た． 観 察 像 は Zyla 4.2

遺伝子，さらに恒常発現プロモーターである ApcC プロ

sCMOS カメラ( Andor )によって取得し，MetaMorph

モーター配列，さらに β チューブリン遺伝子( TUBB 遺

ソフトウェア( Molecular Devices )によって制御した．

伝 子 ) の 3' UTR 領 域 を pUC57 ベ ク タ ー に 組 み 込 み，

実行ピクセルサイズは 65.2 nm×65.2 nm であった．

perCerulean3 遺 伝 子 カ セ ッ ト を 持 つ pCer3-PTS1 ベ ク
ターを構築した．

結

い ず れ の プ ラ ス ミ ド に お い て も，PCR 増 幅 お よ び

果DNA フラグメントの結合は，Platinum SuperFi II DNA

Cas9-Venus 発現シゾン YMT1 株の樹立とミトコンドリ

polymerase(Thermo Fisher Scientific)および NEBuilder

アレポーターを含む sgRNA プラスミドテンプレートのHiFi DNA assembly cloning kit( New England Biolabs )

開発

を用いた．

CRISPR および Cas9 は，近年，革命的な遺伝子改変技 術 と し て 注 目 さ れ て い る( Sander & Joung, 2014;

ゲノム編集

Jiang & Doudna, 2017; Adli, 2018 )．この CRISPR ゲノム

クリプトクロム( cryptochrome )をコードする CRY

編集技術は，化膿性レンサ球菌 Streptococcus pyogenes か遺伝子に対するゲノム編集を行うため，CRY 遺伝子のら単離された cas9 遺伝子に由来する Cas9 ヌクレアーゼ

232-254 塩 基 を 標 的 と し た sgRNA 配 列 を 持 つ pGuide-が，20 塩基のスペーサー配列と，3 塩基のプロトスペー

CRY232-254 -mitoScarlet をテンプレートとして sgRNA を含む DNA 配列を増幅した．得られた PCR アンプリコンにサー隣接モチーフ( Proto-spacer Adjacent Motif，PAM )加え，さらに両端に 30 塩基の相同領域と中央に 20 塩基される sgRNA と複合体を形成し，標的 DNA 配列を切断

配列，さらに 76 塩基のスキャフォールド配列から構成の 改 変 標 的 領 域 を 含 む 80 塩 基 の 一 本 鎖 オ リ ゴ DNA

するしくみを利用している( Nishimasu et al., 2014 )．

(ssODN)を混合し，シゾン YMT1 株へ導入した．pGuide-Cas9 と 一 本 鎖 ガ イ ド RNA に よ っ て 引 き 起 こ さ れ た

ACTIN239-261-mitoScarlet，pGuide-MDR1254-276 -mitoScarlet，
pGuide-TUBG863-885 -mitoScarlet を用いた遺伝子カセット( Non-homologous end joining，NHEJ ) ま た は 相 同 末

ノックインに関しても，必要配列部分の PCR アンプリ

端修復機構( Homology-directed repair，HDR )によっ

DNA 二 本 鎖 切 断 部 位 は， 非 相 同 末 端 修 復 機 構

コンを得た．また pCer3-PTS1 を鋳型として ACTIN 遺て修復される．この時，NHEJ は高い確率で塩基挿入あ伝子，CRY 遺伝子，ミトコンドリア分裂リング遺伝子

るいは欠損などを起こすため，標的となった遺伝子の( MDR1 遺伝子)，また γ チューブリン遺伝子( TUBG 遺

オープンリーディングフレームを壊すことが期待でき伝子)に対する遺伝子カセットノックインを行うためにる．また DNA 二本鎖切断の際に外来のドナー DNA を共

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存させることによって，HDR を介して標的配列の任意

施し，形質転換体における複数オルガネラの動態変化をな DNA 配列へと改変することも可能となっている．こ

即座に確認できる実験系とすることを目標とした．

うした CRISPR ゲノム編集技術が高い注目を集める理由

同目標を達成するため，先ず Cas9 ヌクレアーゼを発の一つは，ゲノム DNA の切断という現象を sgRNA およ

現するシゾン株の構築を試みた．Cas9 遺伝子に核局在

び Cas9 だけで完結することが可能であり，様々な生物

シ グ ナ ル と 黄 色 蛍 光 タ ン パ ク 質 Venus を 融 合 し た

種の細胞内において再現可能であることが挙げられる．
これまでシゾンにおけるゲノム編集法は確立されていNLS-Cas9-NLS-Venus 遺伝子をウラシル要求株( M4 株)に導入し，クロラムフェニコール選抜によって形質転換なかったが，CRISPR-Cas9 によるゲノム編集を基盤と体を得た(Fig. 1A, B)．野生株(10D 株)と YMT1 株(ウした実験系を構築することによって，シゾンの全遺伝子

ラシル要求性・クロラムフェニコール耐性)を比較してを解析対象とすることさえも可能なハイスループット・も，細胞形態や細胞増殖能力に関して検出可能な異常は遺伝子ターゲティング法の確立が可能であると考えた．

なく，Cas9 が恒常的に発現していることによる影響は

またさらに蛍光レポーター遺伝子を使ったオルガネライ

ないことを確認している( Fig. 1C )．こうして確立したメージングを組み込むことによって，遺伝子ターゲティ

シゾン YMT1 株は，核局在 Cas9-Venus によって細胞核

ングに加えて主要オルガネラの蛍光ラベル化を同時に実を視認することが可能な細胞株となった( Fig. 1D )．

Fig.1. Development of the C. merolae YMT1 strain expressing Cas9-Venus. (A) Schematic diagram of insertion of the S.
pyogenes Cas9 gene fused to Venus (Cas9-Venus) and the selection marker CAT into the safe harbor site byhomologous recombination. PCR amplicon, introduced linear DNA; M4 strain chromosome, genomic structureof the parental uracil-auxotrophic M4 strain, with the HR integration site. YMT1 strain chromosome, structureof the inserted Cas9-Venus and CAT cassettes in C. merolae strain YMT1. The Cas9-Venus cassette includes a
1-kb fragment of the EF1A promoter and 278 bp of the UBQ3 (polyubiquitin 3) 3′ untranslated region (UTR) for
constitutive expression. Cas9-Venus was fused to two copies of a nuclear localization sequence (NLS) from the
SV40 T antigen to localize the Cas9-Venus fusion protein to the nucleus. CAT is driven by the constitutive ApcC
promoter with transcription termination by the TUBB ( β-tubulin) 3′ UTR. The CAT coding sequence ispreceded by a chloroplast transit peptide (CTP). (B) Schematic illustration of the C. merolae YMT1 strain. (C)Growth curves for the wild-type 10D and YMT1 strains. The 10D strain was cultured in 2× Allen's medium.
M4 and YMT1 strains were cultured in 2× Allen's medium supplemented with uracil. Results are mean±s.d.
(n=3 from cell culture replicates). (D) Imaging of a dividing cell (left) and a non-dividing cell (right) of C.
merolae YMT1 strain. Scale bar: 2 μm.

－6－単細胞紅藻シゾンにおけるゲノム編集とマルチプレックスオルガネライメージングの同時実現

ゲノム編集を行った形質転換体を得た際に，直ぐにミシゾンにおける CRISPR ゲノム編集

トコンドリアの蛍光観察を可能とするために，sgRNA

シゾン YMT1 株と pGuide-mitoScarlet ベクターを用いとミトコンドリアレポーターをコードする DNA 配列をて，CRISPR-Cas9 ゲノム編集を試みた．評価にあたり

含むプラスミド DNA を構築した( Fig. 2A )．sgRNA 配

クリプトクロムをコードすると推定される CRY 遺伝子

列は，標的となるゲノム DNA 領域に相同な 20 塩基のスをゲノム編集の対象として選んだ．クリプトクロムは，

ペーサー配列と，3 塩基からなる PAM 配列，76 塩基か

ショウジョウバエなどの昆虫において概日リズムに関与らなるスキャフォールド領域，さらに 6 塩基の転写終結

する青色光受容体として機能することが知られている

シ グ ナル 配 列を 含 む( Fig. 2B )． この sgRNA 配 列は，( Chaves et al., 2011 )．また動物におけるクリプトクロ

シゾンゲノムにコードされた U6 核内低分子 RNA の推ムに関しては，青色光受容能力は失われているが，やは定プロモーター配列( 593 塩基)を利用し，RNA ポリ

り概日リズムの制御機構に組み込まれている( Öztürk

メラーゼ III によって転写されるように設計した．また

et al., 2007 )． 分 子 系 統 解 析 を 行 っ た 結 果， シ ゾ ン のミトコンドリアレポーターとしては，赤色(橙色)蛍光タンパク質としては現状最も高輝度かつ高光耐性として

CRY 遺伝子は昆虫や動物の CRY 遺伝子群と近縁である
ことが分かったため，シゾンの CRY 遺伝子を不活性化知られる mScarlet 遺伝子にミトコンドリア移行シグナ

した場合，明暗周期培養による細胞分裂の同調化が崩れルを融合した mitoScarlet 遺伝子を用いた．これら 2 つることが予想された．そこで，CRY 遺伝子内の標的配の遺伝子カセットを組み込んだプラスミド DNA ベク

列を Cas9 によって切断し，エラーが生じやすい NHEJ

ターである pGuide-mitoScarlet を作製したことにより，を 利 用 し た ゲ ノ ム DNA 配 列 の 改 変 を 試 み た． 先 ず

スペーサー配列と PAM 配列を含む標的 DNA 配列部分

CRISPRdirect ウ ェ ブ サ イ ト( https://crispr.dbcls.jp/ )を入れ換えるだけで，シゾンゲノム上の任意の場所をゲ( Naito et al., 2015 )を用いて，CRY 遺伝子を標的としノム編集によって DNA 配列を改変することが可能とた sgRNA をデザインし pGuide-mitoScarlet-CRY を構築なった．

した．僅か 16 Mbp というシゾンゲノムのシンプルさに

Fig. 2. Design and implementation of CRISPR-based genome editing in Cyanidioschyzon merolae. (A) Site-specific insertion of gene cassettes containing a sgRNA, a mitochondrion-targeted red fluorescent protein(mitoScarlet) and the selection marker URA5.3. A synthetic sgRNA is combined with a linearized
plasmid to generate pGuide-mitoScarlet. A PCR amplicon from pGuide-mitoScarlet is then inserted into
the region downstream of Cas9-Venus in the YMT1 strain by homologous recombination. MTS, mitochondrial targeting signal. (B) Design of the sgRNA and the target site for the CRY locus. (C) Principleof Cas9-mediated precise genome editing of the CRY locus. The arrowhead indicates the putative Cas9
cleavage site. An 80-nt single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor template was designed toinsert a stop codon and eliminate the PAM sequence in the CRY locus. The ssODN contains two 30-nt
homology sequences (underlined).

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より，Cas9 標的配列である 20 塩基+PAM 配列を選んアレポーターを含む DNA フラグメントと，上記 ssODNだ際に，意識せずとも殆どの場合はゲノム中に 1 か所しを同時にシゾン YMT1 株へ導入した結果，今度はポジ

かない配列となる．このためシロイヌナズナなどのモデ

ティブクローンを得ることに成功した．確認した全てのル生物を使ってゲノム編集を行う場合とは大きく異なポジティブクローン株において，ミトコンドリアレポー

り，所謂オフターゲット(標的としている箇所以外のゲターは想定通りに機能しており，細胞核(核局在 Cas9-

ノム DNA 領域にゲノム編集が発生してしまうこと)に

Venus )に加えてミトコンドリアも mitoScarlet タンパ

ついては殆ど心配する必要が無い．これは今後，シゾン

ク質によって蛍光可視化されていることが確認されたの CRISPR ゲノム編集技術を用いて分子生物学・分子遺( Fig. 3A )．以上の結果から，シゾンにおける HDR を介

伝学的な研究を進める際には，特に重要な利点となる．

したゲノム編集と 2 オルガネラの蛍光可視化を同時に実

pGuide-mitoScarlet-CRY から必要な DNA 領域を増幅

施 す る 方 法 が 確 立 し， 同 手 法 を“ シ ゾ ン・ カ ッ タ ーし，PEG を用いたシゾン形質転換法を用いてシゾン( CZON-cutter )”と命名した．

YMT1 株へ相同組換えによる導入を試みた．しかしながら CRY 遺伝子を破壊したことによる致死性は低いと

CRISPR ゲノム編集によって構築した CRY ノックアウト

想定されるにもかかわらず，予想に反してポジティブク

株の表現型評価
シゾン・カッターによって得られた CRY ノックアウ

ローンを得ることが出来なかった．さらに他の遺伝子を標的として実施した場合も，同様に同手法ではポジティ

ト株( cry )において，概日リズムと細胞周期の進行にブクローンを得ることができなかった．唯一，形質転換影響があるか，同調培養法による評価を試みた．cry 株体を得られたケースは，ゲノム上に標的となる配列が存との比較には，ウラシル含有培地で培養することにより在しない“誤った sgRNA 配列”を使った場合だけであっ

代謝状態および細胞周期進行に影響を及ぼしている可能た．さらにシゾンゲノムにコードされた DNA 修復に関性がある YMT1 株ではなく，cry 株と同様の非ウラシル

与する遺伝子を探索した結果，シゾンゲノムには NHEJ含有培地で培養可能な野生株( 10D 株)を用いた．光

における主要因子として知られる Ku70 および Ku80 遺合 成 放 射 束 密 度 を そ れ ぞ れ 約 30 PFD( Photon flux

伝子が存在しないことがわかった．これら一連の結果をdensity )に合わせ，10D 株と cry 株を 12 時間間隔の明考慮すると，シゾンには NHEJ が備わっていない，ある

暗周期による同調培養を行い，細胞分裂同調率を計測しいは NHEJ 活性が低いため，Cas9 によって DNA 二本鎖た．測定の結果，10D 株では細胞分裂同調率が 53.8 %と切断が生じた細胞は死滅してしまっている可能性が考えなった一方で cry 株は 28.2 %となり，有意に低くなってられた．一方，既にシゾンの形質転換法として利用されいた( Fig. 3B 左)．この結果は，CRY 遺伝子がシゾンにており，DNA 二本差切断修復機構として機能しているおいても概日リズムを制御し，細胞周期の進行に関わっことが明らかな HDR を利用したゲノム編集の可能性をている可能性を示唆する．またクリプトクロムは青色光検討した．HDR を利用したゲノム編集では，DNA 二本受容タンパク質であることから，次に光色による影響の鎖切断個所の周辺配列と相同な領域(マイクロホモロ

評価を試みた．いずれの場合も光合成放射束密度を約ジー領域)を含むドナー DNA を共存させることによっ

30 PFD として同調培養を行った．その結果，シゾンはて，ドナー DNA の配列に準じた修復が行われる．ラン

赤色光のみでは殆ど同調せず，10D 株および cry 株の細ダムに生じる修復エラーに頼った NHEJ ではなく HDR

胞 分 裂 同 調 率 は そ れ ぞ れ 22.4 % と 22.5 % に 留 ま っ た

による CRISPR ゲノム編集が可能であれば，「ゲノム上( Fig. 3B 右 )． 赤 色 光 に 加 え て 青 色 光 が あ る 場 合 は，の DNA 配列を任意の配列へと自由に改変する」ことが10D 株では細胞分裂同調率が 53.6 %となり，白色光の場可能になるため，極めて利便性が高い．HDR によるゲ合とほぼ同じ頻度となった( Fig. 3 中央)．一方，cry 株

ノム編集法を試みるため，CRY 遺伝子のオープンリー

では 42.3 %となり，10D 株と比較すると依然として有意ディングフレームにストップコドンを生じさせる配列に低いものの白色光のみの場合よりも細胞分裂同調率は(アルギニンのコドンである AGA からストップコドンで高くなった．また青色光のみでは野生株も cry 株も殆どある TGA に変更)と，PAM 配列を消失させた塩基配列

増殖せず，細胞分裂同調率が測定することができなかっ( NGG が Cas9 認識配列なので，GGG から CGC に変更)た．これら一連の結果から，cry 株は青色光への応答能を含む DNA をデザインした．この改変 DNA 配列の両力が完全に失われているのではなく，低下した状態であ端には，相同領域として 30 塩基程度のマイクロホモロると考えられる．シゾンにおいてもクリプトクロムが青ジ ー 領 域 を 配 置 し， 計 80 塩 基 長 の ssODN を ド ナ ー

色光受容能を持ち，概日リズムの制御に関与しているこDNA と し た( Fig. 2C )．pGuide-mitoScarlet-CRY か らとを示すと共に，今回の遺伝子ターゲティングでノック

PCR 増幅によって得られた sgRNA およびミトコンドリアウトした CRY 遺伝子以外に，シゾンゲノムに存在す－8－

単細胞紅藻シゾンにおけるゲノム編集とマルチプレックスオルガネライメージングの同時実現

る他の CRY 様遺伝子も青色光応答を通じた概日リズム

子が存在する可能性が高いため，現在これら機能未知遺の制御に寄与している可能性が示唆される．

伝子群の詳細な機能解析を行っている( Fig. 3D )．

次に CRY 遺伝子をノックアウトしたことによるゲノムレベルでの転写状態への影響を評価するため，cry 株

シゾン・カッターによる標的ゲノム領域への遺伝子カのトランスクリプトーム解析を行った( Fig. 3C )．遺伝

セットノックインとペルオキシソームの蛍光可視化

子発現が変化した遺伝子群を分析すると，リーディング

シゾン・カッターによるゲノム編集およびオルガネラ

フレーム中にストップコドンが挿入されている CRY 変

蛍光可視化法の基本的な手法は確立したが，さらに利便

異遺伝子自体も遺伝子発現が上昇していることが分かっ性を高めるため，次に標的としたゲノム DNA 領域へのた．これは CRY 遺伝子の正常な翻訳産物が供給されない

遺伝子カセットノックイン法の確立を試みた．ノックイ

ことを検知し，CRY 遺伝子の転写産物量を補償する機構

ン法が確立すれば，標的遺伝子の周辺ゲノム DNA 配列が働いている可能性がある．また概日リズムの制御におを大きく改変することなく標的とする遺伝子へ任意のタ

いて CRY 遺伝子と拮抗的に機能することが知られていグ配列を導入することも可能となるため，より野生株にる COP1( CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1)

近い状態の遺伝子発現状態を維持しつつ様々な細胞生物

遺伝子の発現も減少していた．これらの結果からも，シ学的解析へと利用することが容易となる．青色蛍光タン

ゾンにおいても CRY 遺伝子は概日リズム制御の中核をパク質によるペルオキシソームレポーターをコードするなしていることを強く示唆する．

遺伝子カセットを標的遺伝子領域へノックインすること

興味深いことに CRY 遺伝子をノックアウトしたことによって，ペルオキシソームの蛍光可視化と標的遺伝子によって発現が変動した遺伝子の中には，機能が不明なのノックアウトを両立させることを目標とした(Fig. 4)．

遺伝子がおよそ 40 %も含まれていた．これらの遺伝子

遺伝子カセットノックインを実現するため，新たなプラ群の中には，未だ知られていない概日リズム制御の鍵因

スミド DNA コンストラクトとして pCer3-PTS1 を構築しFig. 3. CRY-dependent circadian clock entrainment by blue light stimuli in Cyanidioschyzon merolae. (A) Imaging of anon-dividing cell (left) and a dividing cell (right) in the CRY knockout (cry) strain. Scale bar: 2 μm. (B)Percentage of dividing cells in synchronized cultures for wild-type (WT) and cry strains under distinct light
conditions. Total photon flux density (PFD) of blue, green, and red lights was kept at ～ 30 μmolm−2 s−1 in eachlight condition. Data are represented as means±s.d. (n=3 from individual experiments). P-values are from a
two-tailed unpaired Student's t-test. (C) MA plot of the fold-change [log2(KO/WT)] versus average expressionof log 2(TPM) from wild-type (W T) and cry (KO) samples. (D) Light-dependent expression changes of
CMB087C and CMB081C. Black, WT strain; gray, CDKA (cyclin-dependent kinase A) knockdown strain; lightgray, RBR (retinoblastoma related) knockout strain. Mean expression values in each strain were extracted froma time course (n=2) (Fujiwara et al., 2020).

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た( Fig. 4A )．また CRISPR ノックイン法の標的遺伝子

complex )を用いた分子機構で行われていることが示唆として，ACTIN 遺伝子を選択した．これまでの研究から，されている(Yagisawa et al., 2020 )．ノックイン法によっ

シゾンの ACTIN 遺伝子は発現しておらず，偽遺伝子化てシゾンの ACTIN 遺伝子発現を不可能とし，シゾンにしていると考えられている．実際，シゾンの細胞分裂はおけるアクチンによらない細胞分裂機構の存在を直接的

アクチンではなく，細胞膜リモデリング機構 ESCRTに示すことが出来れば，原始的な真核生物における( Endosomal Sorting Complex Required for Transport

ESCRT を基盤としたアーキア様細胞分裂機構の存在をFig. 4. Site-specific knock-in of a cassette encoding mCerulean3 fused to a peroxisomal targeting signal by CZON-cutter.
(A) PCR amplification of a gene cassette encoding mCerulean3 with a peroxisomal targeting signal. The doublestranded DNA fragment containing the ApcC promoter, the mCerulean3 coding sequence with a peroxisomal
targeting signal (PTS1), and the TUBB 3′ UTR and ～ 50-bp microhomology arms on either side (total length:1626 bp) were amplified by PCR. (B) Principle behind knocking in a fluorescent reporter expression cassette at the
ACTIN locus. (C) Principle of Cas9-mediated gene cassette knock-in at the ACTIN locus. The arrowheads indicate
the putative Cas9 cleavage site. Flanking microhomology sequences of the perCerulean3 cassette are shown inboxes. (D) Confirmation of the knock-in event at the ACTIN locus by PCR. The wild-type strain was used as anegative control. (E) Growth curves of the wild-type strain and the ACTIN knockout (actin) strain. Data are shownas means (n=3 from cell culture replicates). (F) Representative images of a non-dividing cell (top) and a dividing
cell (bottom) of the actin strain. (G) Representative image of a single cell from the actin strain at the cytokinetic
abscission stage. Scale bars: 2 μm.

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単細胞紅藻シゾンにおけるゲノム編集とマルチプレックスオルガネライメージングの同時実現

明らかにすることが出来る( Fig. 4B )．pCer3-PTS1 は，る．あるいは，形質転換細胞をセルソーターやマイクロ恒常発現プロモーターである ApcC プロモーターの下流

マニピュレーターによって選抜することによって，細胞に，ペルオキシソーム移行シグナルである PTS1 を融合

内で起きている現象を分析することも可能になる．このした青色蛍光タンパク質 mCerulean3 遺伝子を配置した

アイデアに基づき，ミトコンドリア分裂のカギ遺伝子でperCerulean3 遺伝子カセットを含む．このプラスミド
DNA テンプレートを，Cas9 で切断する標的部位近傍のある MDR1 遺伝子と，紡錘体を形成する上で重要な役割を果たす γ チューブリンをコードする TUBG 遺伝子

50 塩基程度のマイクロホモロジー配列を含むオリゴを標的遺伝子として実験を行った．

DNA プライマーで増幅することによって，ノックイン

シゾン・カッター法によって perCerulea3 遺伝子カセッ

用の二本鎖 DNA 断片を得た( Fig. 4C )．pCer3-PTS1 おトをそれぞれ MDR1 と TUBG 遺伝子領域へ挿入する形

よび pGuide-mitoScarlet-ACTIN から PCR 増幅した二種

質転換を行い，回復培地で 2 日間の培養を行った後，そ類の DNA 断片をシゾン YMT1 株へ導入し，ポジティブ

れぞれの細胞を観察した．MDR1 遺伝子がノックアウト

クローンを得ることに成功した( Fig. 4D )．

された場合は，細胞はミトコンドリア分裂の異常を示す得られた ACTIN ノックアウト株( actin )の DNA 配と予想され，また TUBG 遺伝子がノックアウトされた列をサンガーシーケンス法によって調べた結果，ACTIN

場合は，細胞分裂異常の表現型を示すことが予想された．

遺伝子領域の想定した位置に perCerulean3 遺伝子カセッ

観察の結果，どちらの遺伝子を標的とした際も 0.1 %以

トが正確に挿入されていることを確認した．10D 株と下の低い割合ではあるが，各オルガネラレポーターの蛍

actin 株の生育速度には有意な差は認められず，顕微鏡観察からも細胞分裂に異常は見られなかった(Fig. 4F, D)．

これらの細胞では，遺伝子ターゲティングの標的である

また蛍光顕微鏡法によって観察した結果，細胞核(黄色:光シグナルを示す形質転換体が確認された(Fig. 5A, B)．

Venus )，ミトコンドリア(橙色:mitoScarlet )，葉緑体

MDR1 遺伝子( Fig. 5A )および TUBG 遺伝子( Fig. 5B )に応じてミトコンドリア分裂異常，あるいは細胞核の分裂(赤色:クロロフィル自家蛍光)に加えて，perCerulean3異常などが確認されたことから，想定通りに perCerulean3に由来する青色蛍光シグナルによってペルオキシソーム

遺伝子カセットが挿入されたことによって標的遺伝子がを検出することに成功し，またそれぞれのオルガネラの破壊されていると考えられた．興味深いことに，これら分裂増殖に影響がないことを確認した( Fig. 4F )．これの細胞では標的となったオルガネラの分裂異常だけでならの結果から，シゾンにおいてアクチンは細胞分裂およく，細胞核の分裂やペルオキシソームの分裂，さらに細び細胞骨格として必要ではないと結論付けた．同様の遺胞質分裂の停止などが確認された．この結果は，細胞内伝子カセットノックイン法を CRY 遺伝子についても実でのオルガネラの分裂は順序が決まっており，各オルガ

施し，ポジティブクローンが得られた．挿入位置や蛍光ネラの分裂と細胞分裂周期のあいだには相互に依存したシグナルも同様に問題は見られなかったため，同手法が分子機構が存在することを示す．一連の結果から，シゾ遺伝子によらず極めて高い精度で実施可能であることをン・カッター法を利用すれば，恒常的な遺伝子ノックア

確認している．以上の結果から，シゾン・カッター法はウト株の構築のみならず，必須遺伝子であっても遺伝子50 塩基程度のマイクロホモロジー領域を付加すること

ノックアウトによる影響を評価することが可能であるこ

で任意の二本鎖 DNA 断片をゲノムに挿入可能であることが分かった．

とが示された．

考

シゾン・カッターによる必須遺伝子の破壊とその影響の評価

察

近年の分子時計による進化系統解析から，シゾンは中最後に，シゾン・カッター法を利用して，生存に必須

期原生代の約 15 -12 億年前を起源とする極めて古い系と考えられる遺伝子を破壊した細胞の評価を試みた．細統であることが確認されている( Strassert et al., 2021 )．

胞分裂などに異常が起きた場合は，細胞が増殖できない

シンプルな細胞構造やゲノム構造，さらに温泉環境に生ためポジティブクローンが得られない．だがそうした現育することによるシゾンタンパク質の構造的安定性と象に関連する遺伝子を破壊した後，ミトコンドリアレ

いった非常にユニークな特徴を持つシゾンは，細胞生物

ポーター( mitoScarlet )とペルオキシソームレポーター

学のみならず構造生物学的な研究分野においても重要な( perCerulean3 )のシグナルに基づいてゲノム編集が起

モデル生物となってきている．一方で，従来のシゾンにきた細胞を特定し，細胞が死滅する前に観察することがおける相同組換えによる遺伝子ターゲティングでは，相出来れば，標的遺伝子を破壊した影響がどのように分裂

同組換え領域を目的 DNA 断片の両側に付加するプロセなどの機能に影響を与えているのか分析することができスで多くの作業を必要とした．このため，光合成真核生－ 11 －

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Fig. 5. Essential genes for organellar and cellular division can be targeted by CZON-cutter. (A, B) Representative
images of a MDR1 knockout (mdr1) cell and a TUBG knockout (tubg) cell. The cells were imaged 2 days
after transformation. As these are living cells, they floated in the mounting medium and shifted slightly
during imaging; the transformed cell (arrowhead) is shown in the center of the field, while non-transformed
cells are indicated with asterisks. Each gene was knocked out by inserting the perCerulean3 cassette at thetarget locus. Scale bars: 2 μm.

物として最もシンプルな構造を持つという特徴を持つにらに加えて，さらにシゾン・カッターに“光”を利用しもかかわらず，煩雑な遺伝子ターゲティングが原因とた遺伝子機能制御システムの導入を試みている．細胞周なって，シゾンを利用したゲノムワイドな解析は実現し期を同調化することが可能なシゾンの特徴に加えて光遺ていなかった．また，シンプルなゲノム構造であるため

伝学的アプローチを組み合わせることで，他のモデル生

一般的なモデル生物と比べると遺伝子間距離が短いた物では実現することが不可能な極めて正確かつ限定的なめ，相同組換えによるセレクションマーカーを含む長い条件の下で細胞周期や細胞分裂，オルガネラ分裂・分配

DNA 断片を挿入すると，周辺の遺伝子発現制御などに予に関わる因子の機能を解析することが可能となる．既に期しない影響が生じる可能性が排除できなかった．これ改良型の CRISPR シゾン株( YMT2 および YMT3)のは未だ十分に研究が進んでいないため，近い将来に非常開発が進んでおり，初期的な解析を開始している．

に重要な研究分野となることが間違いない遺伝子発現制

こうしたシゾン・カッターを活用すべき研究課題も御機構，さらに染色体構造解析においては極めて重要な次々と発見されている．特に細胞が分裂増殖する S 期か問題点であった．しかし今回，我々が確立した CRISPRら M 期にかけて特異的に発現する保存性の高い機能不ゲノム編集を基盤とするシゾン・カッター法は，完全に明遺伝子群の解析から，幾つか非常に興味深い機能をシステム化されたアプローチによって，ゲノム上の常に担っている遺伝子が見つかっている．例えば我々が新た同じ領域に sgRNA とレポーター遺伝子を挿入し，標的に同定した分裂期ミトコンドリア核様体に局在する新奇遺伝子を最小のゲノム DNA 配列の改変することが可能

タンパク質 MiMS は，細胞が分裂増殖する際，細胞をとなった．また同時に形質転換された生細胞のオルガネ倍加させるためにタンパク翻訳量を増大させる“タンパラ動態を即座に確認することができるため，細胞の分裂

ク質翻訳バースト”を引き起こすカギ因子であることが増殖に関わる機能を解析する速度が飛躍的に向上した．

わかってきている．これは従来の遺伝子の転写・翻訳と今回は報告することが出来なかったが，本研究においいう生物における基本的な仕組みであるセントラルドグて開発したシゾン・カッター(version 1 )の改良も始まっ

マの中に，未だ認識されていない未知の遺伝子発現制御ている．現段階で行うことが出来るゲノム DNA 配列のシステムが介在していることを示唆する．MiMS がどの

改変による遺伝子ノックアウト・ノックイン，さらに標ようにしてタンパク質翻訳バーストを起こしているの的領域への DNA フラグメントノックインは，言わば分か，その分子メカニズムを解析するため，シゾン・カッ

子生物学的な解析を行う上での必須ツールである．これ

ターを用いた様々な点変異を MiMS 遺伝子に導入し，－ 12 －

単細胞紅藻シゾンにおけるゲノム編集とマルチプレックスオルガネライメージングの同時実現

詳細な分析を進めている( Mogi et al., in preparation )．

果を懸念する必要性は極めて低い．シゾン・カッターがこのようなアプローチは，従来のコンストラクト DNA

実現する独創性と汎用性は，遺伝子機能の解析によって作成から行う相同組換えによる方法では非常に多くの作

細胞の生命原理を明らかにする上で強力な分子生物学

業時間を要するため，実現が難しかった．またこの他，

ツールになるだろう．

未知の分裂増殖因子が複数同定されている( Yabe et al.,

本助成で得られた研究成果の報告

in preparation )．これらは細胞核に局在することから転写因子として機能していると考えられるが，特筆すべきはそのタンパク質コピー数の少なさである．精製した蛍光タンパク質 Venus を一分子蛍光顕微鏡によって正確に輝度を測定し，Venus タンパク質 1 分子が放出する蛍光シグナル量を基準として算出すると，これらの機能不明
転写因子は，細胞核において僅か 10 コピー以下の分子数しか存在しないことがわかっている．またタンパク質
コピー数が非常に少ないにもかかわらず，これらの遺伝子をノックアウトすると致死となることから，細胞の生存に必須であることもわかっている．通常の転写因子は，酵母程度の細胞サイズであっても数百タンパク質コピー数を備えており，10 タンパク質コピー数以下で機能するこれらの転写因子を解析することは，細胞分裂増殖時
における制御システムを理解する上では特に重要になる．これらの極少数タンパク質コピー数で機能する新奇分裂増殖因子の機能を解析するためには，転写時期や転写量を調整するプロモーター領域の役割も重要なため，長大な遺伝子断片を挿入する相同組換え法ではなく，ゲノム DNA 配列をピンポイントで改変可能なシゾン・カッ
ターによる解析が特に効果的な手法となっている．今後，遺伝子機能をこれまで以上の分解能で解析する際には，
シゾン・カッターの有効性がさらに高まると思われる．

要約今回，本研究によってオルガネラと細胞の分裂増殖に関わる遺伝子機能を解析する新手法として，シゾンに最適化した CRISPR-Cas9 システム“シゾン・カッター”を確立した．シゾン・カッターは，ゲノム編集と同時に細胞核・ミトコンドリア・葉緑体・ペルオキシソームを異なる蛍光波長によって観察することが出来る．この新たに確立したシゾン・カッターを用いることによって，高い効率，広い汎用性，さらにハイスループットな遺伝
子機能の解析が，単一オルガネラレベルで実現すること

口頭発表
1) 茂木祐子，西川尚吾，東山哲也，吉田大和．2020．分裂期特異的ミトコンドリア核様体タンパク質の同定と機能の解析．日本植物学会第84回大会(9月19-21日，名古屋)
2) 田中尚人，茂木祐子，外山侑穂，東山哲也，吉田大和．
2020．原始紅藻シゾンにおけるゲノム編集ツールCZONcutterの確立．日本植物学会第84回大会(9月19-21日，名古屋)3) 吉田大和．2021．蛍光シグナルを通じてオルガネラ分裂装置のキネティクスを解く．日本植物学会第85回大会(9月16-21日，八王子)
4) 矢部寛之助，茂木祐子，東山哲也，吉田大和．2021．真核生物に広く保存された未知の分裂増殖遺伝子群の同定と機能解析．日本植物学会第85回大会(9月16-21日，八王子)5) 茂木祐子，東山哲也，吉田大和．2021．新規ミトコンド
リアタンパク質による細胞周期依存的な翻訳制御機構．
日本植物学会第85回大会(9月16-21日，八王子)
6) 矢部寛之助，茂木祐子，東山哲也，吉田大和．2021．最小ゲノム真核生物シゾンを用いた蛍光顕微鏡観察を基盤とした未知の分裂増殖因子群の探索．日本植物形態学会
第33回大会(9月17日，東京)
7) 茂木祐子，田中尚人，藤原崇之，矢部寛之助，外山侑穂，
東山哲也，吉田大和．2021．シゾンカッター:ゲノム編
集とオルガネラ多重可視化を可能にするCRISPR- Cas9シ
ステムの開発．日本植物形態学会第33回大会(9月17日，
東京)8) 吉田大和．2022．シゾンカッター:ゲノム編集と多重オ
ルガネラ蛍光観察を同時に実現するCRISPRイメージング技術の確立．日本ゲノム編集学会第7回大会(6月6-8日，
オンライン)
原著論文
1) Tanaka, N., Mogi, Y., Fujiwara, T., Yabe, K., Toyama, Y.,
Higashiyama, T. & Yoshida, Y. 2021. CZON- cutter – a
CRISPR-Cas9 system for multiplexed organelle imaging in a
simple unicellular alga. J. Cell Sci. 134: jcs.258948.
2) Tanaka, N. & Yoshida, Y. 2022. Development of a CRISPRcas9 system "CZON- cutter" for multiplexed organelle
imaging in a simple unicellular alga. Plant Morph. in press.

が可能となった( Tanaka et al., 2021 )．CRISPR ゲノム
編集としても，ゲノム DNA 配列を指定配列へと塩基改謝変できるだけでなく，タグ配列付加や遺伝子カセットといった数 kbp の DNA 断片の挿入も可能である．新たに構築した Cas9-Venus を発現するシゾン YMT1 株には検出可能な異常は確認されず，またシゾンのコンパクトな辞

本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．

ゲノムでは CRISPR ゲノム編集によるオフターゲット効－ 13 －

吉

文

田

献

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－ 14 －

IFO Res.Commun. 36
15-27, 2022

環境中の未培養原生生物種の 1 細胞ゲノム解読手法の確立
本

郷

裕

一

東京工業大学生命理工学院〒152-8550

東京都目黒区大岡山2-12-1 W3-48

Single-cell genomics of uncultured protists in environments
Yuichi Hongoh
School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology
2-12-1 W3-48, Ookayama, Meguro-ku, Tokyo 152-8550
In this study, we aimed to establish the method to obtain a high-quality genome sequence of an uncultured protist.
We chose Stephanonympha sp. (Parabasalia) as the target, which is a cellulolytic symbiotic protist in the termite
gut and multi-nucleated (>100). We prepared a single-cell DNA sample by isothermal whole genome amplification
as well as cDNA from the same cell with the SMART method. After massive efforts to eliminating contaminating
sequences derived from bacteria and also from eukaryotes, we obtained ca. 147 Mb-size draft genome sequence,the estimated completeness of which was comparable to those of known genomes of pathogenic parabasalids. Our
genome analyses revealed an outline of the metabolic pathway of Stephanonympha, and we predicted the symbiotic
relationship with its endosymbiotic bacteria.
Key words: single-cell, gut protist, protozoa, genome, insect緒

言そこで，微生物を 1 細胞ごとに分離してゲノム解析を行う 1 細胞ゲノミクスの開発に期待が集まり，現在では環境中の微生物群集は，既存の手法では培養不能ある

手法もかなり確立されている(本郷裕一，2017 )．またいは困難な，難培養性種を多く含むことが知られている．

メタゲノミクスにおいても，隣接塩基パターンや配列断片

そうした微生物種を研究対象とするには，培養を介さな被覆率，既知配列との相同性などの情報を基に断片を微い手法が必須となる．1990 年代に，ユニバーサルプラ

生物種ごとに分類する「ビニング」と呼ばれる情報解析手

イマーで PCR 増幅した rRNA 遺伝子配列に基づく分子法が開発され，群集内で優占する微生物種については個々

系統解析と，取得した rRNA 配列を持つ微生物細胞を特の機能推定が可能となっている( Albertsen et al., 2013 )．

異 的 に 検 出 す る 蛍 光 in situ ハ イ リ ブ ダ イ ゼ ー ション

しかしながら，こうしたメタゲノム・ビニングや 1 細胞ゲノ

( FISH:fluorescence in situ hybridization )法が普及し，ミクスは基本的には原核生物(細菌・アーキア)を対象と数多くの未培養微生物系統群の存在が明らかとなった．

して開発・実践されてきたものであり，単細胞真核生物(原2000 年代後半には，次世代 DNA シーケンサーを用いた生生物)を対象とするには多くの困難が伴う．真核生物は微生物群集全体のゲノム(メタゲノム)のショットガン

ゲノムサイズが大きく，ゲノム解析には相当なシーケンシン

配列解析法が確立し，微生物群集全体としての機能を遺グのコストと情報解析技術・労力が必要である．真核生物

伝子ベースで予測することも可能となった．ただし，メの遺伝子はイントロンを含むため，より正確な遺伝子予測

タゲノム配列解析では個々の微生物種の機能予測は困難には，網羅的な転写産物配列の情報も欠かせない．
こうした状況下において，近年，メタゲノム中の真で，得られる成果には限界があった．

核生物由来配列を識別する情報解析ツールの開発が試
E-mail: yhong@bio.titech.ac.jp
共同研究者:伊藤 武彦(東京工業大学生命理工学院)，
桑原 宏和(東京工業大学生命理工学院)，
猪飼桂(東京工業大学生命理工学院)．

みられているが( Karin et al., 2020; Pronk and Medema,
2022 )，識別精度が高いとはいえず，マニュアルでの十分な精査が必要となる( West et al., 2018 )．また海洋原生生物群集のメタゲノム・ビニングに既存の原核生物用－ 15 －

本郷

ツールを使用して効果があったという報告もあるが裕

一

頼度は高くない．

( Delmont et al., 2022 )，例外的に莫大なシーケンスデー

本研究においては，ゲノム解析例が皆無であるシロア

タを用いており( Tara Oceans Project )，また，やはりマ

リ腸内 Parabasalia 門原生生物のうち，コウシュンシロ

ニュアルでの精査に多大な労力が必要だったようである．

アリ( Neotermes koshunensis )腸内に共生する多核種のより現実的な未培養原生生物種の機能推定の試みとしては，1 細胞網羅的転写産物解析がある．1 細胞網羅的

Stephanonympha sp. NkSt を標的として，1 細胞ゲノミ
クスと網羅的転写産物解析を行って代謝機能を推定し，転写産物解析は，主にモデル真核生物を対象に近年急速

哺乳類腸内あるいは膣内病原性種である Parabasalia 門 3に普及しており，フリューダイム社の C1 をはじめとす

種の既知ゲノム配列と比較した．

る専用の装置も各社から販売され，微量 RNA からの次

実験方法

世代シーケンサー用ライブラリ調製キットも市販されている(本郷裕一，2017 )．しかし，こうしたツールは，取得した転写産物配列を参照ゲノム配列にマッピングしシロアリ採集と腸内原生生物細胞の単離て解析することを前提としている．参照ゲノム配列が存

コウシュンシロアリは沖縄県で採集し，研究室内で営在せず，de novo での転写産物配列再構築が必須な未培

巣木ごと飼育した．腸をピンセットで取り出し，緩衝液

養原生生物に適用しても，信頼度の高い結果を得るのはTrager's solution U(Trager, 1934 )に内容物を懸濁した．

難しい．そもそも原理的に，発現量の低い遺伝子は網羅

Leica AM6000 マイクロマニピュレーションシステムをできない上に，環境中の多様な原核生物や真核生物の核使用して Stephanonympha sp. NkSt の細胞を単離し，緩酸が混入するので，それを識別して除去しなければなら

衝液の液滴で数回洗浄した．1 細胞ゲノミクスおよびない．しかし，転写産物配列ごとにその由来を特定する

網 羅 的 転 写 産 物 解 析 用 に は，0.1 % Triton X と RNaseのは困難であり，やはりゲノム配列を取得しなければ，

inhibitor(タカラバイオ)1.6 U/μL を加えた同緩衝液中

正確な配列識別と網羅的な生理機能の理解は難しい．

で細胞膜を壊し，核の集合体(Fig. 1 )をマイクロマニピュ

本研究では，シロアリ腸内原生生物群集を材料として
1 細胞ゲノミクスを試み，未培養原生生物種のゲノム解

レーションシステムで回収した．残りの細胞質画分はRNA 解析用とした．

析手法の確立を試みた．シロアリは枯死材のみを餌とする大害虫として知られるが，その高効率な木質分解能力

全ゲノム増幅，ゲノム配列取得および試料選別の大部分を腸内に共生する原生生物群集に依存してい採取した多核画分から，EquiPhi29 DNA polymerase

る．1 種類のシロアリが数種～ 10 種以上の特定の原生生( Thermo Fisher Scientific ) を 用 い て，42 ℃ で 4 時 間，

物 種 を ほ ぼ 必 ず 保 有 し( Igai et al., 2022 )， そ れ ら は

100 μL ス ケ ー ル で 等 温 全 ゲ ノ ム 増 幅 を 行 っ た．

Parabasalia 門か Preaxostyla 門のいずれかに属する．これら原生生物種の培養は非常に難しく，純粋培養成功はStephanonympha sp. NkSt の 1 細胞ゲノム解析用試料は4 個 調 製 し， そ れ ぞ れ に つ い て，Nextera XT DNA

1 例のみで( Odelson and Breznak, 1985a )，その株も現Library Prep Kit( Illumina )でライブラリを作成した．

存しない．同株での培養実験では，原生生物がセルロー

4 試料同時に Illumina MiSeq でペアエンド配列( 300 bp

スを水素，二酸化炭素，酢酸に発酵することが証明され×2 )を取得した．各試料の配列(リード)数を 1 千万ている( Odelson and Breznak, 1985b )．その後，シロ本に揃えた上で SPAdes v.3.15.3( Bankevich et al., 2012 )アリ腸内の各種原生生物から PCR 法でセルラーゼ遺伝

でアセンブルし，形成されたコンティグ上の遺伝子の子が取得されたり( Inoue et al., 2005 )，腸内原生生物

データベース配列への相同性を，Contig Annotation Tool

群集のメタ転写産物解析で多様な糖質分解酵素( GH:(CAT )v.5.1.2(von Meijenfeldt et al., 2019 )で評価した．

glycoside hydrolase )遺伝子群が検出されたりしている

原核生物由来と判定したコンティグを除外し，残りを(Todaka et al., 2010)．また最近，Nishimura et al.( 2020)

gVolante v.2.0.0( Nishimura et al., 2017 )を使用してゲによって，イエシロアリ( Coptotermes formosanus )腸ノム完成度推定などを行った．最も数値が良かった 1 細

内 Parabasalia 門原生生物 4 種の 1 細胞網羅的転写産物

胞試料を選抜し，国立遺伝学研究所の豊田敦・特任教授

解析が報告され，原生生物種間での GH レパートリーのに依頼して，Illumina NovaSeq6000 でペアエンド配列違いなどが示された．Treitli et al.( 2019 )は，シロア( 250 bp×2 )を取得した．

リ( Zootermopsis angusticollis )腸内の Preaxostyla 門原
生生物である Streblomastix strix の細胞共生細菌叢を含

転写産物配列の網羅的取得

む 1 細胞ゲノミクスと網羅的転写産物解析を実施し，原多核を採取した残りの細胞質画分は，4 U/µL の RNase

生生物ゲノムの解読も試みているが，完成度も低く，信inhibitor を含む 2 μL の RNase-free water(タカラバイオ)－ 16 －

環境中の未培養原生生物種の 1 細胞ゲノム解読手法の確立

Fig.1. A cell of Stephanonympha sp. NkSt from the gut of Neotermes koshunensis. (A) Phase contrast image.
Arrow indicates a mass of wood particles contained in the cell. (B) DAPI-stained image. Inset shows
pleiomorphic multiple nuclei and numerous endosymbiotic bacteria. Hair-like ectosymbiotic bacteria
are also seen. Bar indicates 50 μm (A and B) and 10 μm (inset).

に 回 収 し，SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for

ASV 配列はさらに DECIPHER R package(Wright, 2016 )Sequencing( Clontech )を用いて cDNA 合成および増を 用 い て，99 % の 配 列 相 同 性 で 定 義 し た operational

幅を行なった．産物を AMpure XP(Beckman )で精製後，taxonomic unit( OTU )に分類した．

Agilent 2100 バイオアナライザーで配列長と濃度を確認した．SMART-Seq キットの推奨量である 100 pg の産物

ゲノム情報解析を用いて，Nextera XT DNA Library Prep Kit でライブラ

NovaSeq6000 で取得したゲノム配列断片を，標準的な

リー調製した．これを 6 ～ 8 回行った後で 1 つにまとめ，クォリティチェック後に SPAdes v.3.15.3 でアセンブルしロータリーエバポレーターで 3 ～ 4 倍に濃縮した．アガてコンティグを生成した．500 bp 未満のコンティグを除

ロースゲル電気泳動で DNA ライブラリーの配列長を確

去後，MetaEuk( Karin et al., 2020 )で遺伝子(エクソン)

認 し，400 - 550 bp, 550 - 700 bp, 700 - 850 bp の 断 片 をを同定した．MetaEuk で原核生物あるいはウイルスと

MinElute Gel Extraction Kit( Qiagen )を用いてそれぞ判定され，かつ NCBI nr-nt/nr-aa データベース中の真核れ回収した．これらのうち 550 - 700 bp と 700 - 850 bp の生物配列に相同性を持たず，さらにイントロンが存在しライブラリーについて，MiSeq でペアエンド配列(300 bp

ない遺伝子配列を含むコンティグを混入配列として除外

×2 )を取得した．

した．nr-nt データベースとの相同性検索では BLASTn を

16S rRNA 遺伝子アンプリコン解析

た．nr-aa データベースとの相同性検索では DIAMOND

Stephanonympha sp. NkSt 細胞に共生する細菌群集構造 を 明 ら か に す る た め， 単 離 し た 原 生 生 物 細 胞 を( Buchfink et al., 2015 )を使用し，BLASTx-mode, 出力

illustra GenomiPhi V2 Kit( Cytiva )を用いて，30 ℃で 8ンの有無は，RNA-seq のリードを HISAT2( Kim et al.,時間の条件で等温全ゲノム増幅した．その産物を鋳型と2019 )でマップし，StringTie( Pertea et al., 2015 )によっ

し，原核生物 16S rRNA の V3 –V4 領域用のユニバーサルてエクソン/イントロン構造を予測した．遺伝子予測は，

プ ラ イ マ ー 341F( 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG) と

RNA-seq のリードを用いる以外に，Parabasalia 門の 3 種785R( 5′-GACTACHVGGGTATCTA ATCC) を 用 い て( Trichomonas vaginalis, Tritrichomonas foetus, Histomonas

PCR を行った( Murakami et al., 2017 )．Phusion High-meleagridis )の既知ゲノムで同定されている遺伝子配列との相同性にも基づいて行った．Trich. vaginalis と Tritric.

使用し，出力ヒット数 500，e-value ≤ 1e-5 の条件で判定しFidelity DNA Polymerase( New England BioLabs )を使用し，98 ℃ 30 秒 →( 98 ℃ 10 秒，55 ℃ 30 秒，72 ℃ 45 秒)

ヒット数 25, e-value ≤ 1e-5 の条件で判定した．イントロ

×20 回 → 72 ℃ 45 秒の条件で行った．Index PCR は 8 サ

foetus の ゲ ノ ム 配 列 と タ ン パ ク 遺 伝 子( CDS:coding
domain sequence)は TrichDB release 57( https://

イクル行った．MiSeq でペアエンド配列(300 bp×2 )を

trichdb.org/trichdb/app)より取得し，Hi. meleagridis の取得し，DADA2( Callahan et al., 2016 )で 1 塩基レベル

ゲノム配列は PRJNA594289 から取得した．

で amplicon sequence variant( ASV )への分類と SILVA

以上のように選別したコンティグ上の遺伝子を，KEGG

データベースでの細菌系統群の同定を行った．得られた

Automatic Annotation Ser ver( KAAS )( Moriya et al.,－ 17 －

本郷2007 )を用いて KEGG orthology( KO )に基づく機能注

裕一釈をしたところ，明らかに原核生物や他界の真核生物由al., 2018 ) を 使 用 し て CAZyme( carbohydrate-active
enzyme:GH や glycosyl transferase などの糖質分解関連

来の配列の混入が確認された．そこで，さらに CAT v.5.1.2

酵素を含む)を検索した．検出された CDS 配列をクエを使用して各コンティグの分類推定を行い，SPAdes が算リーとして，各種 GH を参照配列とした BLASTp による出する k-mer 被覆度が 30 未満かつ CAT で Parabasalia 門

相同性検索を行った( e-value ≤ e-3)．検出された配列の以外と判定されたコンティグは除外した．さらに，1,000 bp

中で，dbCAN での検索でも GH として同定され，かつ未満のコンティグで Parabasalia 門あるいは Preaxostyla

eggNOG-mapper v2.0.4 で何らかの機能注釈がなされたも門以外に判定されたものも被覆度に関わらず除外した．

のを GH 遺伝子と判断した．さらに(転写産物データ未取

また KEGG mapper による代謝系予測において，絶対嫌得の Hi. meleagridisを除いた)7 種類の原生生物間で TPM

気性真核生物である Parabasalia 門が保有するとは考えが多かった 25 種類の GH family の発現量を比較した．

難い遺伝子について，マニュアルで精査の上，除外した．

結果および考察

比較ゲノム・発現量解析
ゲノム配列と転写産物量の比較には，病原性 Parabasalia

ゲノム解析の標的とするシロアリ腸内 Parabasalia 門

門原生生物 Tric. vaginalis, Tritric. foetus, Hi. meleagridis の原生生物種の選定に当たっては，明らかに細胞内に木

ゲノム情報と，前 2 者の RNA-seq データ( Hi. meleagridis

片を取り込み，かつゲノムサイズが比較的小さいことのデータは取得できなかった)を用いた．RNA-seq デーを条件とした．その結果，コウシュンシロアリ腸内に

Tric. vaginalis については SRR2132589–SRR213291，
タは，

多 数 共 生 す る 多 核( 100 個 以 上 ) の 未 培 養 種 で あ る

Tritric. foetus については ERR4398931–ERR4398933 で取得した．また転写産物配列情報のみではあるが，イエシロ

Stephanonympha sp. NkSt を選択した( Fig. 1 )．同原生
生物はシロアリ腸内原生生物種のみで構成される

アリ腸内 Parabasalia 門原生生物 4 種(Pseudotrichonympha

Cristamonadea 綱に属し，ゲノム解読済みの動物腸内・

grassii, Cononympha leidyi, Holomastigotoides hartmanii,

膣 内 の 病 原 体 Tric. vaginalis( Trichomonadea 綱 ) やHolomastigotoides minor ) の デ ー タ( Nishimura et al.,2020 ) を https://doi.org/10.5061/dryad.05qfttf04 で 取

Tritric. foetus と Hi. meleagridis( Tritrichomonadea 綱 )とは綱レベルで異なる系統である( Noda et al., 2012 )得した．

( Fig. 2 )．Stephanonympha sp. NkSt の 1 細 胞 当 た り の比較解析のため，Stephanonympha sp. NkSt と上記のDNA 含量は 35 Gb もあるが(本郷ら，未発表)，多核で7 種の Parabasalia 門原生生物種の CDS について，KAASあるためハプロイド当たりのゲノムサイズは 300 Mb 程を用いて KO に基づく機能注釈を行った．この時，ゲノ

度かそれ以下と予想した．原生生物 1 細胞の核から等温

ム配列既知の各種原生生物とモデル真核および原核生物

全ゲノム増幅法で配列解析に十分な DNA 量( > 10 µg )を含む 32 種を選択して，相同性検索のためのデータベーを調製する必要があるが，同手法は一般にゲノム領域間スとした．また eggNOG-mapper v2.0.4( Cantalapiedraの極端な増幅バイアスを伴う．出発点の細胞数(本研究et al., 2021 ) を 用 い た 機 能 注 釈 結 果 も 参 考 に し た．
KEGG による機能カテゴリーの中でも，“Metabolism”，の場合は核の個数)が多いほど増幅バイアスは緩和され“Genetic information and processing”，“Environmentalの再構築が可能と考えた．ただし，Stephanonympha sp.

information processing”，“Cellular processes”に 含 ま れ

NkSt を含め，原生生物は細胞内や表面に原核生物が多るため，多核種を標的とすればより高品質なゲノム配列

る 25 の 下 位 分 類( 例 え ば“Carbohydrate metabolism,

数共生していることが多いので，ゲノム解析時にはそれ“ Translation”“Signal transduction”など)に着目し，そら共生細菌叢の把握と，可能な限り各原核生物種のゲノ

れぞれに属する( KO を付された)CDS を抽出した．各

ム配列を再構築しておく必要がある．

下位分類に属する CDS の総数を，同 25 下位分類全体の上記の 25 下位分類の発現量比較においては，Salmon

Stephanonympha sp. NkSt の細胞共生細菌叢
本研究で標的とした Stephanonympha sp. NkSt には，

v.1.3.0( Patro et al., 2017 )を用いて，各原生生物種のFig. 1B に示したように，細胞内外に高密度に原核生物

RNA-seq リードを CDS に整列し，100 万リード中の各遺が共生している．ゲノム解析に先立ち，共生細菌叢を

CDS 総数で割った比率を比較した．

伝子転写産物 1 kb 当たりのリード数( TPM:transcripts

把握するため 16S rRNA 遺伝子アンプリコン解析を行っper million )を算出した．RNA-seq データが複数ある原た( Fig. 3 )．1 細 胞 全 ゲ ノ ム 増 幅 試 料 8 個 に つ い て，

生生物種においては，平均値を使用した．

それぞれ約 1 万～ 3 万 5 千リードペアを解析し，合計

GH 遺伝子の同定では，まず dbCAN v.3.0.4( Zhang etで 12 種 類 の 細 菌 OTU を 検 出 し た． そ の う ち 4 OTU－ 18 －

環境中の未培養原生生物種の 1 細胞ゲノム解読手法の確立

Fig. 2. Phylogenetic tree showing the relationships of Stephanonympha sp. NkSt and other representative
parabasalids. The tree was originally published by Noda et al. (2012) and slightly modified here. A
maximum-likelihood tree was constructed based on a concatenated dataset comprising amino acidsequences of GAPDH, actin and EF-1α, and the 18S rRNA gene sequences. Bootstrap value andBayesian posterior probability are shown. Classes Cristamonadea, Spirotrichonymphea, andTrichonymphea exclusively consist of species from termite guts, whereas other classes are widelydistributed in intestinal and/or genital tracts of various animals. The draft genome sequences ofthree pathogenic species, Trichomonas vaginalis, Tritrichomonas foetus and Histomonas meleagridis
have previously been reported (see Table 1).

Fig. 3. Taxonomic composition of bacteria associated with single cells of Stephanonympha sp. NkSt basedon 16S rRNA gene amplicon sequences. Eight single-cell samples prepared by whole genome amplification were used. Twelve bacterial operational taxonomic units (OTU: defined with 99 % sequence
identity) from seven genera or orders were identified. Four OTUs (Endomicrobium, Treponema,
Holosporales, and Bacteroidales) were consistently detected while others were facultative.

－ 19 －

本

郷

裕

一

( Endomicrobium 属，Treponema 属，Bacteroidales 目，

チェック作業後に残った約 330 Gb の配列をアセンブル，Holosporales 目)は 8 細胞全てから検出されたが，8 OTU( Endomicrobium 属，Ancillula 属，Bacteroidales 目，

ビニングした．この時，真核生物配列識別機能を持つ

Oscillospirales 目，Treponema 属 2 種，“Nucleococcus”属2 種)は日和見的に感染していた．詳細は省略するが，

al., 2018 )も試したが，いずれの場合も，明らかに原核生物由来と見られる多くのコンティグが除去されていな

FISH 法 に よ る 局 在 解 析 の 結 果，Treponema 属 とかったため，「実験方法」に記したような煩雑なビニン

Bacteroidales 目は細胞表面に毛状に付着共生し，他は“Nucleococcus”属 1 種が核内共生体であったのを除いて，グ作業を追加で行った．Tric. vaginalis など病原性培養

細胞質中に検出された．これらのゲノム解析は進行中で目などの嫌気性原核生物由来の水平伝播遺伝子を数多くあるが，他のシロアリ腸内原生生物種に特異的に共生す保有していることが示されており(Carlton et al., 2007 )，MetaEuk( Karin et al., 2020 )の他に，EukRep( West et株のゲノム解読結果から，Parabasalia 門は Bacteroidales

る近縁種において，それぞれゲノム解読済みであり一つの遺伝子が系統的に真核生物に近いかあるいは原核( Hongoh et al., 2008a; Hongoh et al., 2008b; Ohkuma et生物に近いかだけでは，その由来を判断するのは難しい．

al., 2015; Yuki et al., 2015; Strassert et al., 2016; Utami et

また，真核生物の網羅的転写産物解析では poly-T カラ

al., 2019 )(ほか未発表)，今回はそれらを参考にしてゲ
ノム配列断片のビニングと代謝系の考察を行った．

ムを用いた poly A 選別を行うのが一般的だが，実際には原核生物由来の配列，特に AT 含量の多い細胞内共生
細菌由来の配列が大量に混入してしまう(本郷ら，未発Stephanonympha sp. NkSt ゲノム配列取得と基本情報
予備実験として MiSeq でペアエンド配列を取得した表)．したがって，より正確なビニングは，やはり転写

Stephanonympha sp. NkSt 核由来の 4 試料のうち，簡易
ビニング後の BUSCO( Simao et al., 2015 )による推定

ントロンなどの真核生物特有の配列情報から判断するべ産物のみでは困難で，長いゲノム配列断片を取得し，イきである．

完成度，全塩基数，コンティグ長 N50，同一細胞由来

ビニング後の Stephanonympha sp. NkSt のドラフトゲ

RNA-seq リードのマップ率などで最も数値の良かった

ノム基本情報を Table 1 に示した．総塩基長は約 147 Mb

試料( ST3)を選択して，NovaSeq6000 による大量配で，BUSCO による推定完成度は約 74 %(コンティグ配列取得を行った．低品質配列の除去などのクォリティ列に基づく)か約 52 %(CDS 配列に基づく)程度であっ

Table 1. General features of the draft genome of Stephanonympha sp. NkSt-3 and known parabasalid species.
Features

NkSt-3Trichomonas
vaginalis*3

Tritrichomonas
foetus*4

Histomonas
meleagridis*5

Total length (bp)Completeness (%)*1
Completeness (%)*2

146,928,559
73.8
52.1
12,933
325,793
27,42728,077
11,495
325
1.41
53.6

176,420,065
73.0
58.8
64,769584,929
27,122
59,679
58
189
1.00
32.8

67,585,742
74.6
55.3
3,299
406,868
86,531
25,030
0
NA
1.00
31.2

43,414,808
73.8
56.9
187
3,384,422
673,467
11,119
573
633
1.05
28.7

Number of contigs
Largest contig (bp)Contig N50 (bp)
Number of CDSs
Number of introns
Mean intron size (bp)Exon(s) per gene
G+C content (%)*1 Calculated using BUSCO based on contig sequences.
*2 Calculated using BUSCO based on CDSs.
*3 Carlton et al (2007).
*4 Benchimol et al (2017). The latest sequence of this species has been deposited as GCA_905133005
and its total length was 147,002,103 bp, but without gene annotation.
*5 Palmieri et al (2021).

－ 20 －

環境中の未培養原生生物種の 1 細胞ゲノム解読手法の確立も同様である．おそらく，BUSCO で計算の基礎として

Stephanonympha sp. NkSt の代謝系予測
KEGG mapper などを用いて基本的な代謝系を予測しいる「真核生物保存遺伝子」の一部が Parabasalia 門生

たところ，解糖発酵系，核酸・アミノ酸・補酵素合成系

物では存在しないか，配列相同性が低くて検出されないなどの基幹代謝系は，Tric. vaginalis と Tritric. foetus にのかもしれない．いずれにしても，Parabasalia 門の既酷似していた( Fig. 4 )．木質分解性の相利共生体で大知ゲノムと同等の高い完成度が得られていると推察されきな細胞を持つシロアリ腸内原生生物は，Tric. vaginalis

たが，既知培養 3 種の BUSCO による推定ゲノム完成度

る．ただし，コンティグ長 N50 は約 29,000 bp で，これや Tritric. foetus のような，同じ Parabasalia 門ではあっは Oxford Nanopore のロングリード配列も使用して最近ても綱レベルで異なり，かつ宿主組織片や細菌を主食と取 得 さ れ た Hi. meleagridis の 約 670,000 bp( Palmieri et

する小型の病原体とは大きく異なる生理機能を持つこと

al., 2021 )と比較してかなり低い．今後，ロングリード
配列を追加してより長いコンティグを再構築できれば，も想定していたが，そうではなかった．解糖系( Emden-

ビニングの精度も上がるはずである．

ゲンを貯蔵できる．Tric. vaginalis と Tritric. foetus で知Stephanonympha sp. NkSt と寄生性 Parabasalia 門原生生物との大きな相違は，イントロンの数に見られたられているように，リンゴ酸を介してヒドロゲノソーム( Table 1 )．これまで Parabasalia 門にはイントロンがほる( Müller et al., 2012 )．この際，Tric. vaginalis での生

Meyerhof-Parnas 経路)と糖新生経路は完全で，グリコー

で酢酸・二酸化炭素・水素へと発酵し，ATP を生産すとんど存在しないとされ，実際に Tritric. foetus では全理学的実験に基づき，acetate:succinate CoA-transferase

く 無 く( Benchimol et al., 2017 )，Tric. vaginalis と Hi.

[EC.2.8.3.18]でコハク酸とアセチル CoA を基質としてmeleagridis で も 少 数 で あ っ た( Carlton et al., 2007;
Palmieri et al., 2021 )．しかし，Stephanonympha sp. NkSt

酢酸とサクシニル CoA を生産し，succinyl- CoA synthetaseではエクソン当たりのイントロン数は 1.4 と，イントロると考えられている( Müller et al., 2012 )．ところが，

でサクシニル CoA をコハク酸に戻す時に ATP を産生すンを持つ遺伝子も少なくないことが判明した．また，

succinyl- CoA synthetase はあるものの，acetate:succinate

GC 含量も 54 %と，30 %前後の Tric. vaginalis などの既CoA-transferase[EC.2.8.3.18]は同定できず，代わりに

知ゲノム配列よりもかなり高かった．

acetyl-CoA hydrolase[EC:3.1.2.1]が 存 在 す る． 実 は，

Fig. 4. Outline of predicted metabolic pathways of Stephanonympha sp. NkSt. An obligate endosymbiont Endomicrobium
sp., a facultative endosymbiont Nucleococcus sp. and an obligate ectosymbiont Treponema sp. were included in
the pathway. The functions of these symbionts were predicted based on genome sequences of their closely
related phylotypes obtained from other protist species (see main text).

－ 21 －

本

郷

裕

一

さらに今回の解析で，Tric. vaginalis と同様にアンモTric. vaginalis のゲノム解析においても同じ問題が指摘されており( Carlton et al., 2007 )，配列相同性からは

ニア・尿素・尿酸が Stephanonympha sp. NkSt の窒素老acetyl-CoA hydrolase[EC:3.1.2.1]と同定される酵素の廃物であると推定された．Pseudotrichonympha 属原生生

性質を検証する必要があるかもしれない．

物の細胞内共生細菌である“Candidatus Azobacteroides

水素産生については，Tric. vaginalis( Carlton et al.,pseudotrichonymphae”や Eucomonympha 属原生生物の2007 )やイエシロアリ腸内原生生物 P. grassii( Inoue et

細胞内共生細菌である“Candidatus Treponema intracel-al., 2007 )と同様に，鉄ヒドロゲナーゼが複数存在している．ただし，Tric. vaginalis が保有する，細胞質に局

lularis”などはアンモニアと尿素を輸入して多様な窒素

在して水素酸化を行うという最近報告された鉄ヒドロゲ

さ れ て い た が( Hongoh et al., 2008b; Ohkuma et al.,ナーゼ( Smutna et al., 2022 )の有無については，さら2015 )，それらが原生生物の老廃物を介した窒素再利用に精査が必要である．

系であることが確認できた．

非酸化的ペントースリン酸回路によってホスホリボシ

化合物を合成する能力があることがゲノム解析から予測

ルピロリン酸( PRPP )は合成可能だが，PRPP から先

Endomicrobium のような絶対相利共生細菌が存在する
一方で，Stephanonympha sp. NkSt を含む多くのシロアリの核酸 de novo 合成系を欠いており，ヌクレオシドか核

腸内原生生物は，複数の日和見的片利共生ないし寄生性

酸塩基を摂取する必要がある．補酵素類の de novo 合成細菌が細胞質や核内に共生していることが多い(本郷・は全くできない( Fig. 4 )．クエン酸回路の酵素をほと

桑原ら，未発表)．その代表として，“Nucleococcus”( Satoんど欠いているために 2-オキソグルタル酸を合成不能でet al., 2014 ) を Fig. 4 の 代 謝 系 に 含 め た が， こ ち ら はあり，アミノ酸も de novo 合成はできない．ただし，グルタミン酸があれば，グルタミン，アスパラギン，シスEndomicrobium とは異なり，宿主細胞から核酸・アミノ酸・補酵素に加えて，グリセロール 3 リン酸を摂取してテイン，アラニンは合成できるし，スレオニンがあれば，いることが，“Nucleococcus”のゲノム解析から予想されグリシンとセリン，アルギニンがあれば，プロリンは合ている(本郷・桑原ら，未発表)．

成できる．メチオニン，芳香族アミノ酸，分岐鎖アミノ酸，リジンは合成不能である( Fig. 4 )．つまり，多く

遺伝子機能カテゴリーと発現量の比較の栄養素を外部からの摂取に依存する寄生性あるいは細上 述 の よ う に，Stephanonympha sp. NkSt は Tric.

菌捕食性の性質を，Tric. vaginalis や Tritric. foetus など

vaginalis などの病原性 Parabasalia 門原生生物と基幹代謝系を共有していたが，ゲノム全体の遺伝子機能カテゴと共有したまま，シロアリとの絶対的な相利共生関係を

リーの比率においても，顕著な差異は見られなかった持つ木質分解者に進化したことになる．
興味深いことに，Stephanonympha sp. NkSt を含む多( Fig. 5 )．Stephanonympha sp. NkSt は，Tric. vaginalis

様なシロアリ腸内原生生物の細胞内絶対共生細菌であるなどが持たない糖質分解酵素や関連遺伝子群を保有する

Endomicrobium では，グルタミン合成酵素が偽遺伝子化している他，アスパラギン，システイン，セリン，プロものの，生命の根幹を支えるシステムは，生態にかかわらず共有されているということであろう．一方，転写産

リン，アラニンを合成できないが，スレオニン，アルギ

物量の比較では，原生生物種間で大きな相違があった

ニンの他，いわゆる動物の必須アミノ酸については，メ( Fig. 6 )．Stephanonympha sp. NkSt では，セルラーゼやチオニン以外は合成可能である( Hongoh et al., 2008a )．

ヘミセルラーゼなどの糖質分解酵素を含む“Carbohydrate

また核酸や多くの補酵素も de novo 合成可能である．即

metabolism”が特に大きな比率を占めるということはなく，ち，シロアリ腸内原生生物は，木質食性に特化する過程

イエシロアリ腸内原生生物 4 種のうちの C. leidyi と同程

で各種窒素化合物を合成できる細菌を細胞内に常に共生

度だが，P. grassii と Holomastigotoides 属 2 種よりは低かっ

させ，栄養補給を受けられるような進化を遂げたと考えた．他と比較して顕著に比率が高かったのは“Folding,

られる．また Endomicrobium 属共生細菌はゲノムサイズ

sorting, degradation”と“Transport and catabolism”で，が 1 Mb 程度と，シロアリ腸内自由遊泳型の近縁種であ

特にポリユビキチン関連遺伝子が発現上位で目立ったる Endomicrobium proavitum の 1.6 Mb のゲノム( Zheng

が，その生理学的な意味はよくわからない．いずれにしet al., 2017 )よりも縮小している．多くの代謝系が冗長性を失って流線形化する過程で，宿主が(前駆体は必要ても，今回は転写産物データは 1 例しかとっておらず，だが)合成可能なグルタミンやアラニン，プロリンなど

幅時にバイアスがかかりやすく，定量性については信頼のアミノ酸合成能力を喪失し，相補的な栄養関係を築い性が低いので，今後，追加データを取得していく必要がたと推察される．

ある．

参考データに留まる．1 細胞転写産物解析では cDNA 増－ 22 －

環境中の未培養原生生物種の 1 細胞ゲノム解読手法の確立

Fig. 5. Functional categories of protein-coding genes (CDSs) of Stephanonympha sp. NkSt and other parabasalids.
The functional categories were assigned based on KEGG orthology (KO). ST3: Stephanonympha sp. NkSt;
TFO: Tritrichomonas foetus; TVA: Trichomonas vaginalis; HME: Histomonas meleagridis.

Fig. 6. Relative abundance of functional categories of protein-coding gene (CDS) transcripts in Stephanonympha
sp. NkSt and other parabasalids. The abundance was calculated as transcripts per million (TPM). The
functional categories were assigned based on KEGG orthology (KO). ST3: Stephanonympha sp. NkSt;
TFO: Tritrichomonas foetus; T VA: Trichomonas vaginalis; PGR: Pseudotrichonympha grassii; CLE:
Cononympha leidyi; HHA: Holomastigotoides hartmanii; HMI: Holomastigotoides minor. Averaged data were
presented when there were multiple transcriptome data.

－ 23 －

本

郷

裕

一

GH 遺伝子の種類と発現量の比較

今後の展望

Stephanonympha sp. NkSt は常に大量の木片を細胞内に抱えており(Fig. 1A の矢印で示した不定形の破片群)，の謎であったシロアリ腸内木質分解性原生生物の基本代

時間をかけて消化しているためか，シロアリを木片から謝系を解明できたという点で，非常に意義深いものとセルロース飼育に切り替えても木片は短期間では消失しなった．これまで，シロアリ腸内原生生物の細胞内外にない．木質分解を行っていることは明らかと思われるが，共生する各種原核生物のゲノム解析を多数行ってきた

実 際，endoglucanase( GH45, GH5 )，cellobiohydrolase

が，宿主の代謝系が不明であったため，真の共生関係推( GH7 )，beta-glucosidase( GH3 )などの発現が多く定は困難であった．今回の成果を過去の共生細菌の知見

今回のゲノム解析はまだ予備的な部分も多いが，長年見られた( Fig. 7 )．これは，宿主細胞や細菌細胞を主と照合することで，より正確な共生関係を理解すること食とする Tric. vaginalis や Tritric. foetus とは大きく異ができる．ゲノム解析上の課題としては，予想以上に他る一方，イエシロアリ腸内原生生物である P. grassii と種の混入配列が多く，しかも原核生物だけではなく真核類似していた．遺伝子全体での発現量順位においても生物由来の混入も多数見られたため，その識別法を最適(データ省略)，各種 GH のうち，GH45 の 2 遺伝子が化していく必要がある．未培養原生生物の場合，1 細胞

14 位と 24 位，GH3 が 61 位，GH7 の 2 遺伝子が 70 位とから全ゲノム増幅で DNA を調製する選択肢と，同種と72 位となっていた．ちなみに 1 位はポリユビキチン遺見られる細胞を多数回収してゲノム増幅を経ずに DNA

伝子で，その他ではアクチンやチューブリンなどの細胞調製する選択肢があるが，後者の場合には異なる系統の骨 格 遺 伝 子 に 加 え，fructose-1,6-bisphosphate aldolase

ゲノムが混在するため，配列のアセンブルが困難を極めや glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ，malate

る．一方，前者の場合はゲノム増幅バイアスが生じるた

dehydrogenase などの解糖発酵系の各種遺伝子の複数のめに，配列断片の被覆度を利用した混入配列識別が難し

ホモログが上位に見られた．グルタミン合成酵素も 58

くなる．しかしながら 1 細胞由来であれば，得られたホ

位に入っていた．

モログ配列がゲノム内多型なのか，系統間多型なのか，

Fig.7. Abundance of transcripts of glycoside hydrolase (GH) genes in Stephanonympha sp. NkSt andother parabasalids. A heatmap shows transcripts per million (TPM). See the legend to Fig. 6 forabbreviations of protist species.

－ 24 －

環境中の未培養原生生物種の 1 細胞ゲノム解読手法の確立
貴，澤村岩風，雪真弘，大熊盛也，本郷裕一．2021．比較ゲノム解析による細胞内共生Endomicrobium属細菌の多様性と進化過程の考察. 日本微生物生態学会第34回大会(10月30日–11月2日，新潟薬科大・オンライン)
6) 傅潔洋，桑原宏和，木原久美子，大熊盛也，本郷裕一．
2021．シロアリ腸内原生生物Mixotricha paradoxa細胞表面
共生Bacteroidales目細菌のゲノム解析. 日本微生物生態学会第34回大会(10月30日–11月2日，新潟薬科大・オンライン)7) 吉岡拓哉，伊澤和輝，桑原宏和，竹内真理子，加藤大貴，澤村岩風，雪真弘，大熊盛也，本郷裕一．2021．細
胞内共生Endomicrobium属細菌の基幹代謝系の差異と進化過程の考察．日本共生生物学会第5回大会(11月27–28
日，オンライン)8) 高橋一樹，桑原宏和，堀川雄太郎，伊澤和輝，雪真弘，
大熊盛也，本郷裕一．2021．細胞内寄生性Clostridiales目
細菌の生存戦略と進化プロセス. 日本共生生物学会第5回大会（11月27–28日，オンライン)といった疑問を排除できるので，格段に解釈がしやすいという利点がある．本研究のように，同一細胞からの転写産物情報を取得すれば，より正確な遺伝子同定も可能である．今後さらに試行錯誤を重ねながら，最適な手法を模索していきたい．

要

約

本研究では，未培養原生生物の 1 細胞ゲノム解読手法の確立のため，シロアリ腸内木質分解性原生生物の 1 種
で多核の Stephanonympha sp. NkSt を材料として，ゲノム解析を試みた．単一細胞から等温全ゲノム増幅およびSMART 法での cDNA 増幅を行い，Illumina シーケンサー
で配列を取得した結果，既知の寄生性 Parabasalia 門原
生生物に匹敵する完成度のドラフトゲノム配列を得ることに成功した．総塩基数は約 147 Mb で，遺伝子数は約28,000 であった．代謝系を推定したところ，木質分解性の相利共生体と宿主細胞・細菌細胞食性の病原体という生態の相違はあるものの，解糖発酵系・核酸合成系・アミノ酸合成系などにはほとんど相違がないことが判明し

原著論文
1) Igai, K., Kitade, O., Fu, J., Omata, K., Yonezawa, T., Ohkuma
M. & Hongoh Y. 2022. Fine-scale genetic diversity and putative
ecotypes of oxymonad protists coinhabiting the hindgut of
Reticulitermes speratus. Mol. Ecol. 31: 1317–1331.

た．核酸の de novo 合成や多くのアミノ酸合成が不能で謝あることが明らかとなったため，シロアリ腸内原生生物に普遍的に見られる細胞内・表面の共生細菌の必要性を辞

初めて証明することができた．今回の解析時における最本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公

大の障害は，細胞共生細菌を含む多様な原核生物に加え益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．また，植物・真菌類などの真核生物由来の DNA 混入が大量に

NovaSeq での配列解析を実施していただいた国立遺伝学あったことで，試料中の混入配列の物理的除去と情報解研究所の豊田敦特任教授と技術員の方々，サンガー配列

析的な識別手法の確立が今後の重要な課題となる．

解析を実施していただいた理化学研究所バイオリソース
センター JCM の大熊盛也室長と脳神経科学研究セン

本助成で得られた研究成果の報告

ターの技術員の方々，また東京工業大学本郷研究室の学

口頭発表
1) 傅潔洋，桑原宏和，木原久美子，大熊盛也，本郷裕一．
2021．シロアリ腸内原生生物Mixotricha paradoxa細胞表面
共生Bacteroidales目細菌のゲノム解析. 第15回日本ゲノム
微生物学会年会(3月4–6日，九大・オンライン)
2) 高橋一樹，桑原宏和，堀川雄太郎，伊澤和輝，雪真弘，
大熊盛也，本郷裕一．2021．シロアリ腸内原生生物に細胞内共生するClostridiales目細菌の比較ゲノム解析. 第15回日本ゲノム微生物学会年会(3月4–6日，九大・オンライン)3) Yiting Liu，桑原宏和, 間渕貴子，木原久美子，大熊盛也，
本郷裕一．2021．シロアリ腸内原生生物運動共生スピロ
ヘータのゲノム解析. 第15回日本ゲノム微生物学会年会（3月4–6日，九大・オンライン)
4) 高橋一樹，桑原宏和，堀川雄太郎，伊澤和輝，雪真弘，
大熊盛也，本郷裕一．2021．シロアリ腸内原生生物に細胞内共生するClostridiales目細菌の機能と進化. 日本微生物生態学会第34回大会(10月30日–11月2日，新潟薬科大・オンライン)5) 吉岡拓哉，伊澤和輝，桑原宏和，竹内真理子，加藤大生諸氏に感謝の意を表します．

文

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IFO Res.Commun. 36
29-34, 2022

電気で微生物の代謝を制御する：電気遺伝学の創生
渡

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東京薬科大学生命科学部〒192-0392

東京都八王子市堀之内1432-1

Control of microbial metabolisms using electricity: the development of electrogenetics
Kazuya Watanabe
School of Life Sciences, Tokyo University of Pharmacy and Life Sciences,1432-1 Horinouchi, Hachioji-shi, Tokyo 192-0392
Electrochemically active bacteria (EAB) have extracellular electron transport pathways that facilitate direct
exchange of electrons between intracellular metabolisms and extracellular solid conductive materials, such as
electrodes. EAB are expected to be used for a variety of bioelectrochemical technologies, such as microbial fuelcells and microbial electrosynthesis systems. Studies have shown that EAB, such as Shewanella oneidensis MR-1,
perceive electrode potentials and regulate the expression of their catabolic genes, thereby conserving appropriate
amounts of energy depending on electromotive forces of catabolic reactions. It was considered that such an abilityof EA B would be applicable to the development of a technology, termed “electrogenetics”, which enables
electrode-controlled expression of genes for biotechnological purposes, such as electrofermentaion of value-added
chemicals. In the present work, in order to establish fundamentals of electrogenetics, we identified promoter
sequences that promote the expression of downstream genes in response to changes in electrode potentials, andone of these promoters, Pnqr1 that promotes the expression of Nqr1 NADH dehydrogenase under reduced
conditions, was demonstrated to be useful for expressing anaerobic fluorescent protein in strain MR-1 in thepresence of a low-potential electrode. It is suggested that electrogenetics will become a promising technology thatfacilitates application of EAB to the production of value-added chemicals with the aid of electric energy supplied
from electrodes.
Key words: electrochemically active bacteria, extracellular electron transport pathway, Arc system, microbial
electrosynthesis, electrofermentation

緒

言ることが待たれている．
近年，細胞質と細胞外を電気的につなぐ細胞外電子伝

バイオテクノロジーは，健康・医療からグリーン産業

達系(extracellular electron transport pathway, EET 経路)まで広く我々の社会の発展に貢献するものであり，新しをもち，細胞外の電極と細胞内の代謝反応の間で電子をい技術の開発が活発な分野である．中でも最近，光遺伝

やり取りしながら増殖できる電気化学活性細菌(electro-

学( Optogenetics ) が 注 目 を 集 め て い る( Aravanis etchemically active bacteria, EAB)が発見され，様々な形

al., 2007 )．これは，細菌の光受容チャンネルタンパク質等を発現させて細胞機能を光により操ろうとするもの

で の 産 業 応 用 が 期 待 さ れ て い る( Logan & Rabaey,

で，神経科学分野などを大きく発展させている．開発者

化代謝経路の分子生物学解析が行われ，分子機構が明らのスタンフォード大学ダイセロス博士らは，ノーベル賞

かになりつつある．このような EAB の代表として，シュ候補に挙げられている．同様に，細胞機能を制御する新ワ ネ ラ( Shewanella ) が 挙 げ ら れ る( Kouzuma et al.,

たな技術が出現し，バイオテクノロジーが大きく発展す2015 )．

2012 )．一方，幾つかの EAB については EET 経路や異

近年，モデル EAB として多くの研究に用いられていE-mail: kazuyaw@toyaku.ac.jp
共同研究者:高妻 篤史(東京薬科大学生命科学部)．

る Shewanella oneidensis MR-1 株が隣接する電極の電位を認識し，これにより遺伝子発現の制御と代謝機能の調－ 29 －

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節を行っていることが発見された( Hirose et al. 2018 )．

RNeasy Mini kit と RNase-free DNase Set( QIAGEN )この研究では，EET 経路により，細胞膜のキノンの酸化で 精 製 し た． 抽 出 し た RNA の 品 質 は Agilent 2100

還元状態が電極電位に応答して変化し，キノンの酸化還Bioanalyzer と RNA pico Chips( Agilent )を使用し，付元状態を認識する 2 成分制御系のセンサーキナーゼ ArcS

属 の プ ロ ト コ ル に 従 っ て 確 認 し た．qRT-PCR はのレスポンスレギュレーター ArcA をリン酸化／脱リンLightCycler 1.5 instrument と LightCycler SYBR Green I

酸化する活性が変化することが示された( Figure 1 )．

( Roche )を使用して行った．PCR 反応液は 15 ng total

ArcA はリン酸化されると DNA の特定配列に結合するよ

RNA ，1.3 µL 50 mM Mn(OAc)2 ，7.5 µl RNA Master

うになるため，総合して電極電位応答の遺伝子発現が起SYBR Green I，0.15 µM プライマーを含むように調製しこることが明らかになった．MR-1 株においては，高電た．nuo, ndh, nqr1, nqr2 の各遺伝子用プライマーとして，

位(+0.5 V vs. standard hydrogen electrode 以 上 ) で 発

nuo( qR T-nuoF-F, AT T TAGCA ACGC T CGAGCAG;
q R T- n u o F - R , A T T T A A T G G C G C T G G C A A G C )，現が誘導される遺伝子が 274 個，低電位(－0.1 V 以下)
で誘導される遺伝子が 48 個トランスクリプトーム解析
により検出され，その多くは ArcSA 依存的に電位応答した( Hirose et al., 2018 )．
そこで我々は，「シュワネラ等 EAB の細胞外電子伝達系と Arc 制御系を使えば遺伝子発現や代謝活性を電極にndh( qR T-ndh-F, T GC T T GC T T TAGG T GG T G T C;
q R T- n d h - R , A G G G C A T C C A A G A G C T T T T G )，nqr1( qRT-nqrF-1-F, AGCCGCTGAGA ATGACA ACT;qR T- nqrF -1- R , AC C G AG G AG T T C AT G AT T G G )，より制御でき，新たなバイオテクノロジー“電気遺伝学”

nqr2( qRT-nqrF-2-F, GCGCT TACTCGATGGCTA AC;
qRT-nqrF-2-R, ACCGA ATGGACCAGA A AT TG )を用が創生できる．」と考えた．本助成における研究では，いた．各遺伝子の発現量は 16S rRNA の発現量で標準化

この仮説を実証するため，電位応答に応答して下流の遺した．

伝子の発現を誘導するプロモーターを同定し，それを用プロモーター活性測定

いて外来遺伝子を発現させることとした．

nuo, ndh, nqr1, nqr2 の各遺伝子の上流領域を PCR に
よって増幅した．PCR 産物をプロモーターレスプラス

実験方法

ミド pMElacZ( Endoh et al., 2003 )のプロモーター領

使用株，プラスミド，培養条件域にクローニングした．作製したプラスミドはシーケン

S. oneidensis MR-1(野生株，WT )，S. oneidensis MR-1の arcS 破壊株( ΔarcS )( Hirose et al., 2018 )の前培養

ス解析を行うことでインサート配列の確認をした．S.

には LB 培地を用いた．嫌気培養の際は，電子受容体

oneidensis MR-1 株へのレポータープラスミドの導入はKasai et al.( 2015 )の方法で行った．

としてフマル酸ナトリウムを 40 mM となるよう加え

プ ロ モ ー タ ー 活 性 の 測 定 は β -ガ ラ ク ト シ ダ ー ゼ 法

た．増殖実験には 10 mM 乳酸ナトリウムまたは 10 mM( Kasai et al., 2015 )によりおこなった．18 mL 容三電極

N-アセチルグルコサミン( NAG )を唯一の炭素源とし系電気化学リアクターで培養したレポーター株を回収た最少培地( MM )を用いた．MM 培地( pH7.4 )は，し， こ の 培 養 液 500 µl に Z buffer( 60 mM Na2HPO4 ，9 mM(NH 4)
2 SO4 ，5.7 mM K 2 HPO4 ，3.3 mM KH 2PO4 ，40 mM NaH2PO4・2H2O ，10 mM KCl ，MgSO4・7H2O ，

30 mM HEPES-NaOH を含む．好気培養では 5 mL の培

50 mM 2-メルカプトエタノール)を 500 μL，クロロホル

地 を 30 mL の 試 験 管 に 添 加 し，MR-1 株 を OD600＝0.05

ムを 15 μL，0.1 % SDS を 10 μL 加え，15 秒間ボルテックで植菌し，シリコ栓で蓋をした．30 ℃，180 rpm で振とスした．5 min 静置の後，200 μL 2-ニトロフェニル-β-ガ

うし，定常期に入るまで培養を行った．嫌気培養ではラクトピラノシド( ONPG )を添加した．反応液が黄8 ml の培地を 13 mL のねじ口試験管へ添加し，MR-1 株

色く呈色したところで，Stop solution( 1 M Na2CO3 )をを OD600＝0.01 になるように植菌し，ブチルゴムとスク加えて反応を停止した．OPNG 添加から Stop solution

リューキャップで密栓した．窒素ガスパージを 5 min 行

添加までの時間を反応時間として計測した．その後反い，内部を嫌気条件にした後，30 ℃で静置培養した．

応 液 を 遠 心 分 離( 12,000×g，2 min，4 ℃) し， 上 清

OD600 の測定は Spectrophotometer UH5300( HITACHI )300 μL をマイクロウェルプレートに分注した．マイクロまたは mini photo518R photometer(タイテック)を用い，プレートリーダー( SH-1200，コロナ電気)を使用し，

1 h または 24 h 毎に測定した．

420 nm の吸光度( A 420 )を測定した．β -ガラクトシダー
ゼの活性は Miller unit ＝（1000×A 420 ）/（ 反応時間[min]定量的逆転写 PCR（ qRT-PCR ）×サンプル量[mL]×OD600 )として計算した．本試験

Total RNA の抽出は Trizol( Invitrogen )によって行い，は全て 3 連以上の反復サンプルを用いて行った．

－ 30 －

電気で微生物の代謝を制御する：電気遺伝学の創生

レポーター株の作製

個検出されている( Hirose et al., 2018 )．このなかで特pHSG298 にある遺伝子発現制御機構である lac プロ

筆することは，MR-1 株は 4 つの NADH dehydrogenase

モーターを除去し，そこに nqr1 のプロモーター( Pnqr1 )遺伝子( nuo, ndh, nqr1, nqr2 )をもつが，これらの発現を挿入して pUPN298 を作製した．この下流にレポーターは電位応答しており，MR-1 株が電位に応じて NADH

遺伝子として嫌気性 green fluorescent protein(anaerobic

dehydrogenase を使い分けていることである．そこで，

fluorescent protein; AFP )( Kitayama et al., 2017 )を導

この現象を確かめるため，qRT-PCR 系および遺伝子発入し，pUPN-afp を作製した．構築したプラスミドをエ

現レポーター系を構築し，電子受容体や電極電位に応じレクトロポレーション法によって MR-1 株に導入した．

てこれら NADH dehydrogenase の発電の電位応答性を同様に，AFP 遺伝子の代わりに dgcS( Matsumoto et al.,

調査した．
まず，電子受容体として酸素またはフマル酸を用いて

2021 )を導入したプラスミド( pUPN-dgcS )を構築し，呼吸を行った際の各遺伝子の相対発現量を qRT-PCR に

MR-1 株に導入した．

より調査した．酸素の還元反応(酸素呼吸)の標準酸化微生物電気化学システム

還元電位は約+0.8 V であり高電位の電極に匹敵する．

qRT-PCR 用菌体調製には，18 mL 容三電極系電気化

一方フマル酸の還元反応(フマル酸呼吸)の電位は－0.1 V

学リアクターを用いた( Hirose et al., 2018 )．作用極は程度であり，低電位の電極に匹敵する．この条件で各遺グラファイトフェルト( 1.5 cm×1.5 cm; 2.25 cm )，対伝子の相対発現量を調査した結果を Fig. 1 に示す．4 つ

2極は白金線( 10 cm, ニラコ)，参照極は Ag/AgCl(飽和の NADH dehydrogenase 遺伝子のうち，酸素呼吸条件

KCl )( HX-R5, 北斗電工)を使用した．リアクターをおよびフマル酸呼吸条件ともに最も相対発現量が高かっ

VMP3( Biologic ) に 接 続 し，+0.5 V ま た は－0.6 V vs.

たのは ndh 遺伝子であった．この遺伝子の産物はポンプ

Ag/AgCl(+0.7 V，－0.4 V vs. 標準水素電極)の電極電活性をもたない NADH dehydrogenase と推定されるが，位で運転を行った．リアクターに電解液として 170 mM

この酵素の MR-1 株などの EAB における役割はあまり議NaCl を加えた MM を添加し，菌体を OD600＝0.1 となる論されておらず，MR-1 がなぜこの遺伝子を高発現してように加えた後，窒素ガスで 10 min バブリングを行っいるか不明である．今後この遺伝子の破壊実験などを行た．プロモーター活性が著しく高いものについては

い，MR-1 株における重要性や役割を解明していきたい．

OD600＝0.05 で植菌した．これを 30 ℃でインキュベート

4 つの NADH dehydrogenase 遺伝子のうち，酸素呼吸

し，電流を生成させた．電流値は VMP3 で測定し，作条件でフマル酸呼吸条件より発現量が大きかったものは用極面積( 2.25 cm2 )で割ることで電流密度を求めた．

nuo と nqr2 であった．一方，フマル酸呼吸条件で酸素呼吸条件より発現量が大きかったものは nqr1 であった．

AFP の発現の調査には，Kitayama et al.( 2017 )で用いられた三電極式電気化学セルを用いた．作用極にはグラファイトプレート電極( 50 cm2 )，参照極には Ag/

ndh は高発現していたものの，両条件で発現量に大きな差は見られなかった．プロトンポンプ活性をもつ酵素をAgCl( HX-R5, Hokuto Denko )，対極にはチタンメッシュ( 50 cm2 ) を 用 い た． 電 気 化 学 セ ル に は MM に 初 期
OD600 が 0.03 となるように植菌し，窒素置換を行い嫌気条件にした後 24 時間静置することで菌体をグラファイ
トプレートに付着させた．その後電位を印加し，蛍光を発する細胞の観察を正立型共焦点レーザー顕微鏡( confocal laser scanning microscopy; CLSM, FV1200
BX61WI, Olympus )を用いて行った．また，一細胞あたりの蛍光強度を付属ソフトを用いて定量化した( n =100 )．

結果および考察
これまでの研究において MR-1 株の電位応答トランス
クリプトーム解析が行われ，高電位(+0.5 V vs. standardhydrogen electrode 以上)で発現が誘導される遺伝子が274 個，低電位(－0.1 V 以下)で誘導される遺伝子が 48－ 31 －

Fig.1. Expression levels of genes coding for 4 NADH
dehydrogenases under oxygen-respiring andfumarate-respiring conditions.

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コードする nuo が高電位条件で高発現し，その結果高電は低電極電位での発現誘導活性があること，この発現誘位条件でより大きなプロトン能動勾配が形成されること

導には Arc システムが関与することが確かめられた．

で ATP 合 成 量 が 増 加 す る と い う 考 え が 以 前 の 研 究

次に，電位シフト後に発現誘導がかかる時間を調査す( Hirose et al., 2018 )において示されている．本結果は，る目的で，Pnqr1 を用いて AFP を発現させるシステムを

この考えをサポートするものである．一方，MR-1 株は構築した．電位を印加していないグラファイトプレート

酸素呼吸条件とフマル酸呼吸条件でナトリウムポンプ型の作用極上に Pnqr1 下に AFP を発現する MR-1 株を定着の NADH dehydrogenase( nqr1 および nqr2 の産物)をさ せ， そ の 後 作 用 極 を－0.4 V vs. SHE に 印 加 し た

使い分けている可能性が示されたことは興味深い．一つ( Fig. 3 )．この図に示すように，AFP は電位の印加ととの可能性としては，Nqr1 は低電位の電子伝達物質メナ

もに発現し，印加後 60 分まで蛍光強度が上昇した．こキノンを利用し，Nqr2 は高電位の電子伝達物質ユビキ

れは一般的な誘導発現タンパク質の誘導時間と同等のレノンを利用することが考えられる．この点については，

ベルと考えられる．つまり，電位依存的遺伝子発現誘導

今後それぞれの酵素学的性質を調査して明らかにしてい(電気遺伝学)はバイオテクノロジーの一つの選択肢ときたい．

なりうると考えられる．

電気制御発酵は，還元的物質生産においてより有望な技術である．このためには，低電位で下流の遺伝子(発酵生産にかかわる遺伝子など)を発現誘導するプロモーターの利用が考えられる．上記の 4 つの NADH dehydrogenase 遺伝子のうち，低電位の電子受容体であるフマル酸を用いた呼吸の条件で発現上昇したのは nqr1 であった．そこでこの遺伝子が低電位電極存在下で発現上昇するか，また以前の研究で示唆されたようにこの発現誘導には Arc システムが関与するかを調査する目的で，
nqr1 のプロモーターである Pnqr1 の下流に lacZ 遺伝子を連結したレポータープラスミドを構築し，これを用いてMR-1 株を形質転換した．この株を高電位電極(+0.7 V
vs. standard hydrogen electrode, SHE )存在下および低電 位 電 極(－0.4 V vs. standard hydrogen electrode ) 存
在下，電気化学セルで培養し，得られた菌体を用いてレポーターアッセイを行った( Fig. 2 )．その結果，Pnqr1

Fig. 2. Comparison of the Pnqr1 promoter activity in the
W T and ΔarcA strains in the presence of
low-potential (-0.4 V) or high-potential (+0.7 V)
electrode.

Fig. 3. Photos taken using CLSM showing MR-1 cells expressing AFP under the control of Pnqr1 in bioelectrochemicalcells. Times after the electrode potential was poised at -0.4 V are shown.

－ 32 －

電気で微生物の代謝を制御する：電気遺伝学の創生

Fig. 4. CLSM photos showing biofilms on electrodes formed by MR-1 cells expressing dgcS under the control of Pnqr1.
The cells constitutively expressed AFP．

電気遺伝学を行うためには，細胞が電極に付着してバフィルムを形成し，その後電気遺伝学を利用して低電位

イオフィルムを形成していることが望ましい．担体に付電極存在下に還元的物質生産を行うスキームを検討して着した細胞を用いれば培地が流動する連続培養系の物質

いきたい( Hirose et. al., 2019 )．

生産が可能になるが，このようなシステムにおいては培要

養槽に発現誘導物質を保持することは難しく，大量の発現誘導物質が必要になる．このような場合には，電気化学活性菌を電極上に保持して行う電気遺伝学が有用と考約

本研究では，電気遺伝学の基盤を確立することを目的えられる．しかし，MR-1 株などの EAB は低電位電極上に検討を行い，Pnqr1 などの電位応答性プロモーターを同には十分なバイオフィルムを形成しないことが知られて定した．Pnqr1 を使い AFP などの外来遺伝子を EAB の代いる( Kitayama et al., 2017 )．そこで，低電位電極上へ表株である S. oneidensis MR-1 において電極電位依存的のバイオフィルム形成を促進できないかと考え，MR-1に発現させることに成功し，低電位での発現を誘導や電株においてバイオフィルム形成促進タンパク質として同位シフトからのレスポンス時間などを把握した．今後は，定された dgcS( Koga et al., 2020; Matsumoto et al., 2021 )これらのプロモーターを代謝系遺伝子の発現に用い，電を Pnqr1 下に低電位存在下で発現させる系の検証を行う

気制御発酵などの高効率化に役立てていきたい．

こととした．dgcS は，cyclic-di-GMP( c-di-GMP )を合

本助成で得られた研究成果の報告成するグアニル酸シクラーゼであり，バイオフィルム中で発現上昇し，この遺伝子を破壊するとバイオフィルムが形成されにくくなることが知られている( Matsumoto
et al., 2021 )．そこで AFP を構成的に発現する MR-1 株
を Pnqr1 下に dgcS を発現させるプラスミドで形質転換し，低電位でのバイオフィルム形成を観察した．その結果，－0.4 V の低電位では，Pnqr1 下に dgcS を発現させても十分なバイオフィルム形成は観察できなかった．一方，
0 V においては，dgcS 誘導発現株の方が非誘導発現株よりバイオフィルム量が増していた( Fig. 4 )．また，0 Vと+0.4 V において形成されるバイオフィルムの量を比較すると，0 V においてバイオフィルム量が多かった．
以上の結果は，電気遺伝学によりバイオフィルム形成を制御できる可能性を示すものである．しかしその程度
は十分とは言えず，今後より効果的な電気遺伝学の手法

口頭発表
1) 田中 勇吾, 富岡 優樹, 鈴木 志野, 石井 俊一, 高妻 篤史, 渡邉一哉. 電気制御発酵に向けたShewanella oneidensis MR-1株の電子受容能力の向上. 日本農芸化学会2021年度大会(3月20日– 23日, オンライン)
2) 高妻篤史, 廣瀬篤弥, 渡邉一哉. 電気を感じるバクテリア:
電気化学活性細菌の電位応答機構とその応用. 日本農芸化学会2021年度大会(3月20日– 23日, オンライン)
3) Tanaka Y, Hirose A, Kouzuma A, Watanabe K. Developmentof electrogenetics for facilitating electro -fermentation.
World Microbe Forum(2021年6月20日– 25日, オンライン)4) 田中勇吾, 廣瀬篤弥, 高妻篤史, 渡邉一哉. 電気遺伝学の開発に向けた電極電位応答性プロモーターの同定. 環境バイ
オテクノロジー学会2021年度大会(9月1日– 4日, オンライン)の開発が必要と考えられる．また，高電位条件でバイオ－ 33 －

渡邉

その他(総説・書籍・特許など)
1) Ikeda S, Takamatsu Y, Tsuchiya M, Suga K, Tanaka Y,
Kouzuma A, Watanabe K . 2021. Shewanella oneidensis MR-1
as a bacterial platform for electro-biotechnology. Essays
Biochem. 65: 355-364.
2) Yamada S, Takamatsu Y, Ikeda S, Kouzuma A, Watanabe K.
2022. Towards application of electro-fermentation for the
production of value-added chemicals from biomass feedstocks.
Front. Chem. 9: 805597.

謝辞

本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．また，本研究の遂行にご協力いただいた東京薬科大学生命科学部の高妻篤史博士ならびに学生諸氏に感謝の意を表しま
す．

文

献

Aravanis, A.M., Wang, L.P., Zhang, F., et al. 2007. An opticalneural interface: in vivo control of rodent motor cortex withintegrated fiberoptic and optogenetic technology. J. NeuralEng. 4: S143-S156.
Endoh T, Habe H, Yoshida T, Nojiri H, Omori T. 2003. A CysBregulated and σ54-dependent regulator, SfnR, is essential for
dimethyl sulfone metabolism of Pseudomonas putida strain DS1.
Microbiology 149: 991-1000.

一哉
Hirose A, Kasai T, Aoki M, Umemura T, Watanabe K, Kouzuma A.
2018. Electrochemically active bacteria sense electrode potentials
for regulating catabolic pathways. Nat. Commun. 9: 1083.
Hirose A, Kouzuma A, Watanabe K. 2019. Towards developmentof electrogenetics using electrochemically active bacteria.
Biotechnol. Adv. 37: 107351.
Kasai T, Kouzuma A, Nojiri H, Watanabe K. 2015. Transcriptional
mechanisms for differential expression of outer membrane
cytochrome genes omcA and mtrC in Shewanella oneidensis
MR-1. BMC Microbiol. 15: 68.
Kitayama M, Koga R, Kasai T, Kouzuma A, Watanabe K. 2017.
Structures, compositions, and activities of live Shewanella
biofilms formed on graphite electrodes in electrochemical flow
cells. Appl. Environ. Microbiol. 83: 1-11.
Koga R, Matsumoto A, Kouzuma A, Watanabe K. 2020.
Identification of an ECF sigma factor that facilitates c-type
cytochrome maturation and current generation under electrolyteflow conditions in Shewanella oneidensis MR-1. Environ.
Microbiol. 22: 3671-3684.
Kouzuma A, Kasai T, Hirose A, Watanabe K. 2015. Catabolic andregulatory systems in Shewanella oneidensis MR-1 involved inelectricity generation in microbial fuel cells. Front Microbiol.
6: 609.
Logan BE, Rabaey K. 2012. Conversion of wastes into bioelectricity
and chemicals by using microbial electrochemical technologies.
Science 337: 686-690.
Matsumoto A, Koga R, Kanaly R, Kouzuma A, Watanabe K. 2021.
Identification of a diguanylate cyclase that facilitates biofilm
formation on electrodes by Shewanella oneidensis MR-1. Appl.
Environ. Microbiol. 87: e00201-21.

－ 34 －

IFO Res.Commun. 36
35-42, 2022

海洋分解性プラスチックの基材開発に資するアーキアポリ- γ -グルタミン酸
芦内誠

高知大学農林海洋科学部〒783-8502

高知県南国市物部乙200Archaeal poly-γ-glutamate, making for eco-friendly plastics development
Makoto Ashiuchi
Faculty of Agriculture and Marine Science, Kochi University
200, Monobe, Nankoku, Kochi 783-8502
Synthetic polymers, such as nylons and acrylic materials, are derived from petrochemicals, and plastic materials
that are improperly disposed of are serious sources of environmental pollution. Our ultimate goal is hence to create
earth-friendly plastics, making for both the curb of the greenhouse effect and the development of eco-compatible
processes. On the other hand, as increasing concern for microbial infection prophylaxis, the development of highperformance plastics possessing antiviral activity as well as biodegradability (or biocompatibility) has become arequisite to date. Hybrid-type polymer with a nylon-like backbone and polyacrylate-like side-chain structures, i.e.,
poly-γ-glutamate (PGA), was focused on, because of its reasonable biodegradability and good biocompatibility.
Here, high throughput cloning of archaeal PGA synthesis operon was carried out using the methylene bluestaining method, and the polymer productivities of several microbes (including Escherichia coli clones) wereassayed under the liquid- and solid-culture conditions. Hygroscopic PGAs were successfully plasticized via a
simple but effective chemo-transformation, which are called PGA ion-complexes (PGAICs). PGAIC had thepotential to serve as a functional plastic showing a broad spectrum of antimicrobial activity (against food-poisoning
bacteria, a prevalent species of Candida, and filamentous fungi), indicating its versatility in hygiene technology.
PGAIC-coating agent further contributed to the inactivation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2.
Because PGAIC was easily transformed into a nanofiberplastic, it would serve to hygienic control in public facilities
such as schools, hospitals, hotels, and transportations, resulting in a decreased risk of airborne infection,
contagion, and lethal pneumonia. It can also aid against an unforeseen epidemic of new viral infectors. In thisstudy, a biodegradable plastic (aliphatic polyester-based) film was laminated with non-woven cloths from electrospun PGAIC (as a moisture-induced glue) and subjected to the antimicrobial assay after soaked in sea water,
implying its “switching” potential to rapidly transform into marine-degradable plastics. Such the assessments oflaminated plastics are now in progress via the ISO-recommended procedures.
Key words: archaea, poly-γ-glutamate, ion-complex, infection-prophylactic plastics, marine-friendly nanofiber緒

言『 2030 年に世界最先端のバイオエコノミー社会(バイオファースト)を実現する』という到達目標が示された．

パリ協定や SDGs 等を通じて持続的成長や社会課題の解決が叫ばれる中，「バイオ戦略 2019 」が策定された．

国内産業のバイオ化推進の機運も急速な高まりを見せている．バーゼル条約／第 14 回締約国会議( COP14:
2019.4.19–2019.5.10 )において有害廃棄物の国境を超え

E-mail: ashiuchi@kochi-u.ac.jp
共同研究者:岩田 忠久(東京大学大学院農学生命科学研究科)
石井 大輔(東京農業大学生命科学部)
粕谷 健一(群馬大学大学院理工学府)
大田ゆかり(群馬大学食健康科学教育研究センター)る 移 動 制 限 の 追 加 が 可 決 さ れ た．G20 サ ミ ッ ト( 2019.6.28–2019.6.29 )では我が国のプラスチックの資源循環を総合的に推進するための戦略「プラスチック資源循環戦略」が各国に向けて発信された．海洋プラスチッ
クごみ，地球温暖化，資源・廃棄物制約，アジア各国に－ 35 －

芦内誠

よる廃棄物の輸入規制等，多岐にわたる課題に対応する(連動性)に加え，触媒ユニットの構造特性が PGA の立ための第 4 次循環型社会形成推進基本計画を踏まえた方

体化学性に影響すると考えられている．さて，納豆菌と針【 3R+Renewable(再生可能資源への代替)】を基本は異なり，超好塩アーキア Natrialba aegyptiaca は「立原則としている．EU での「 EU プラスチック戦略」，ア

体規則性 PGA 」を菌体外に生産する( Ashiuchi, 2013 )．

メリカの「包括的物品調達ガイドライン( CPG )」，「バ本アーキアのゲノム情報に従えば，既知(納豆菌等)のイオプリファードプログラム」，アジア諸国での廃プラ

PGA 合成オペロンは存在しない．翻って考えれば，立スチックの輸入規制，タイ政府では廃プラだけでなく，体規則性 PGA 生合成マシナリーの同定が新たな生化学

電子廃棄物の制限も強化された．プラスチックのデファメカニズムの発見と理解深化にも繋がる可能性が高い．

クト・スタンダードを獲るとして代替素材メーカーの動

本著では，アーキア PGA 合成遺伝子群のハイスルー

きも活発化している．バイオパップ(イタリア)の生分

プットクローニング，並びに発酵 PGA の効率回収に資解性・リサイクル可能・肥料化可能なトレーの製造，プ

する「油水二相反応システム」の導入事例を紹介する．

ラスティロール(フィンランド)の完全分解性で透明なPGA の画期的なプラスチック機能化技術とその利便性

パッケージフィルムの製造等，産学の連携のもと，世界等についても検討したので報告する．

規模の環境問題の解決に資する「ボトムアップ型新素材」

実験方法の開発が加速している．
環境機能新素材の開発戦略として，汎用材料の微細加工で高性能化を図る「トップダウン方式」と分子・素子

PGA 合成遺伝子群のハイスループットクローニングに間の自己組織化能を利用した「ボトムアップ方式」が提資する「メチレンブルースクリーニング」法

案されている．ボトムアップ方式は複雑な生命の成立に

長期凍結保存していた N. aegyptiaca ゲノムライブラ

も関わるとされる．精巧組織化や超機能化が期待されるリーを復元した．具体的には，大腸菌 DH10B 株を宿主

ボトムアップ方式にはさらなる技術革新の余地が残されとする独立クローン約 50,000 個／mL からなるライブラている．芦内らは，超好塩アーキアが環境適応因子としリー保存液を本研究に使用した．PGA の視覚化のため，て生産する「立体規則性ポリ- γ -グルタミン酸( PGA )」メ チ レ ン ブ ル ー 染 色 液( メ チ レ ン ブ ル ー 3 水 和 物，

をボトムアップ型新素材の開発に資するバイオ系基材の0.25 vol%；無水エタノール，5 vol%；酢酸，1.5 vol%；第一候補に定めた．

蒸留水，93.5 vol%)を調製した．

今日，生物合成可能な天然高分子は脱石油や CO2 削

酢酸セルロースに対するタンパク質の付着性は乏し

減の切り札的な存在になっている．PGA は持続可能ない．実際．接着性の高い牛血清アルブミンでもほとんど

天然高分子でありながら，石油化学合成される「ナイロ

接着しないことが分かる( Fig. 1 )．これまでのタンパ

ンとポリアクリル酸」の双方の優れた構造特性をも有す

ク質研究の経験知に反して，分子接着性に優れた PGA

る唯一無二のハイブリッド材料である．納豆ネバの主成の場合，酢酸セルロースにも強固に接着するとされてい分であることを背景に食品用途化が進み，PGA に対する．電気的に陰性であるカルボキシ基側鎖を多数有する

る安全性や生体適合性の認知度も高い．納豆菌の PGAPGA が塩基性色素のメチレンブルーで選択的に視覚化合成装置( PgsBCAE )の場合，PGA 伸長鎖のカルボキできることから，アーキア PGA 合成遺伝子群のハイス

シ基末端のリン酸化(活性化)ユニット[(大腸菌からループットクローニングに資する「メチレンブルーによ

ヒトまで普遍的に存在する)葉酸:PGA 連結酵素類縁

る陽性クローン選抜法」を考案した( Fig. 2 )．具体的にの PgsB ]，末端リン酸基脱離に伴うグルタミン酸の転は，上述のゲノムライブラリーをブルーホワイトセレク

移(伸長)因子[( PGA 合成装置特異的な)N -アシルグ

ション用培地に植菌し，37 ℃で一晩静置培養後，白色

ルタミン酸シンターゼに類縁の(疎水性)膜貫通型

コロニーを単離した．識別化した各クローンを PGA 合

PgsC ]，分泌・局在化関連の表層タンパク質[(大腸菌成用 GS 培地( Fig. 2 )に移植した後，PGA 生産誘導をからヒトまで存在する)膜アンカー因子に類縁の確実にするため 48 時間まで培養を継続した．該培地表

PgsA ]，複合体安定化因子[( PGA 合成装置特異的な)面を酢酸セルロース膜(孔径，0.45 μm；直径，80 mm )ユビキチンリガーゼ複合体の楔(くさび)因子に類縁ので覆い，細胞表層に蓄積した高分子物質を転写した

PgsE ]が成熟型(分子量 100 万クラスの)PGA を合成( Fig. 2, step a )．転写膜を風乾した後，低分子量の夾雑

す る た め の「 ミ ニ マ ム ユ ニ ッ ト 」 と さ れ て い る

物を取り除くために水洗した．続いてメチレンブルー染( Nascimento & Nair, 2020.; Ashiuchi, 2013 )．PGA 生 産

色液に 1 分間浸した( Fig. 2, step b )．染色された転写膜

における「触媒ユニット」と「エクスポータ」の必須性

を蒸留水で脱色した後，再度乾燥して分析に供した．

－ 36 －

海洋分解性プラスチックの基材開発に資するアーキアポリ- γ -グルタミン酸

陽性クローンが保持するプラスミドベクターの調製とクローン化 DNA 断片の塩基配列決定
メチレンブルースクリーニングにより得られた陽性ク
ローンの各々をアンピシリン添加 LB 培地 5 mL に植菌，
37 ℃ で 16 時 間 培 養 後， 遠 心 分 離 で 菌 体 を 回 収 し た．
High Pure Plasmid Isolation Kit を用い，回収した菌体か
ら プ ラ ス ミ ド 溶 液 100 μL を 得 た． 次 い で BigDye®
Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit と PCR Thermal
Cycler を用いてシーケンス PCR を実施した．Sephadex
G–50 Fine DNA Grade を TE 緩 衝 液 で 膨 張 さ せ Micro
Bio–Spin Chromatography Column に充填した脱塩カラムを作製．PCR プロダクトを供試し 4200 rpm／4 ℃／5分間の遠心分離条件下で脱塩した．脱塩 DNA 溶液 10 μLと等量の Hi–Di Formamide 溶液を混合した．遺伝子解析装置 ABI PRISM 3100–Avant Genetic Analyzer 10G/50に供試し．クローン化 DNA 断片の塩基配列を決定した．

Fig.1. Potent adhesion of poly- γ - glutamate tocellulose acetate membrane. Bovine serum
albumin and poly- γ - glutamate solutions
were prepared at the concentrations of
10 and 1.0 mg/mL , respectively. One mLof the solutions was dropped on themembrane, followed by water-soaking andair-dr ying. Coomassie brilliant blue- andmethylene blue staining methods wereapplied to the visualization of adhered
protein and poly-γ -glutamate, respectively.

PGA 生産能に関する相対的評価基準の設定（標準化）
納豆菌の一般的な PGA 生産要件(菌体用量，10 9 細胞
／mL 培地；培養温度，30 ℃)における 1 細胞当たりのPGA 生産能( 10 pg／細胞)を「 1 」と定義することで，多種多様な PGA 合成微生物との能力比較ができるようになった．また，使用する微生物によって PGA 合成に要する時間が異なるものの，これまでに「納豆菌 72 時間」「アーキア 360 時間」「大腸菌クローン 24 時間」が平均的な所要時間であることを認めている．本件，かかる相対評価の値が 10-2 を下回った場合，独自開発の PGA マ
イクロ精製プロセス( Ashiuchi & Misono, 2007 )を介

Fig. 2. a, a cellulose acetate membrane was put on an agar plate containing GS medium, where colonies of the library clonesof E. coli developed after the cultivation at 30 ℃ for 48 h, to transfer extracellular poly-γ -glutamate from E. coli cells
onto the membrane; and b, the method of methylene blue staining to visualize poly-γ -glutamate on the membrane.

－ 37 －

芦内

誠

結果および考察入させた後に再評価する．なお，今回宿主として用いた大腸菌には高分子量(成熟型)PGA を合成する能力もアーキア PGA 合成遺伝子群のハイスループットクロー

分解する能力も持たないことが分かっている．

ニング
発酵 PGA の効率回収

ショットガンクローニング／酢酸セルロース膜レプリ

先行開発された特許公開技術(芦内ら，2020 )に準拠して行われた．

カ／メチレンブルー染色の各手法を組み合わせたハイス
ループットクローニング法( Fig. 2 )を開発し，これまで に 2 株 の 陽 性 ク ロ ー ン を 得 て い る( Fig. 3A,

PGA イオンコンプレックス（ PGAIC ）の効率製造

PC1&PC2)．両株共通の読み枠( Fig. 3B, orfAB )とし先行開発された特許出願技術(芦内ら，2022 )に準拠して行われた．

て「ペプチドグリカン合成酵素」に推定構造上の類似性が示唆される「 OrfB」を発見したが，アーキアは一般にペプチドグリカンを要しない．PGA はペプチドグリ

PGAIC の抗菌性評価試験

カンの部分構造にみられる「イソペプチド結合」で主鎖先行開発された特許登録技術(柴谷ら，2019 )に準を成すバイオポリマーであることを背景に，両株共通の拠して行われた．

読み枠には「アーキア PGA 」合成装置の中核部位がコー

PGAIC による新型コロナウイルス不活化試験および細( Bacillus subtilis )，好塩アーキア( N. aegyptiaca )，納胞毒性試験

豆菌の PGA 合成遺伝子群 pgsBCAE を保持する大腸菌ク

ドされているとの作業仮説を立てた．次いで納豆菌

新型コロナウイルス(Severe acute respiratory syndrome

ローン( PGS )，並びに上記のアーキア PGA を合成す

coronavirus 2(SARS–CoV–2)JPN／TY／WK–521 )不活化試験およびヒト細胞( VeroE6／TMPRSS2 JCRB1819 )る大腸菌クローン( PC1&PC2 )の 1 細胞当たりの PGA

毒性試験は「 ISO 21702 」に準拠して行われた(芦内ら，養( Liquid )と固体静置培養( Solid )の違いにより該

2022 )．また，本試験では「プラーク測定法」に基づい

PGA 合成能に差が生じるかどうかについても調査した．

て感染価を算出した．

合成能を精査比較した( Fig. 3C )．さらに，液体振盪培

まず，好塩アーキアでは Solid 条件のみ PGA を生産し，
こ れ ま で の 情 報 と 矛 盾 し な い 結 果 に な っ た．Solid,

PGAIC のナノファイバー化

Liquid のいずれの条件でも PGA 生産が認められる納豆

先行開発された特許登録技術(西村・芦内，2015 )に準拠して行われた．

菌でも本質的には Solid 条件の方が 1 細胞あたりの PGA合成能が高いことが示された．大腸菌クローンを用いたFig. 3. Identification and functional analysis of archaeal poly-γ -glutamate synthesis operon. Panels A, positive
clones; B, cloned operon structures; and C, poly-γ -glutamate productivities (x10 pg/cell) of several
microbes under the culture conditions.

－ 38 －

海洋分解性プラスチックの基材開発に資するアーキアポリ- γ -グルタミン酸

比較実験の結果はさらに興味深いものになった．実際，きる濃度域であることを考えれば，PGA の発酵合成を

納豆菌由来の該遺伝子群を持つ PGS クローンでの場合，司る分子装置の発現量(転写翻訳等)を高めても実質的培養の形態に関わらず PGA を合成したが，好塩アーキ

な PGA の増産には繋がらないという結果は想像に難く

ア由来の該遺伝子群を持つ PC クローンにはともに Solid

ない．言い換えれば，ワンバッチ当たりの生産性に重き

条件下でのみ PGA を生産するという性質が引き継がれを置く従来型の戦略が(産業展開が期待されている)発ていた．さらに，PGS クローンよりも大量に PGA が合酵バイオポリマー( PGA 等)の低コスト化・汎用化に成できることも分かった．これまで PGA 研究に携わっはさほど有効ではないということを意味する．一方で現てきた本件代表者の私信として Liquid 条件でも無理な行の PGA 回収方法には改良の余地が残されていた．実く PGA を生産する納豆菌やその近縁種の方がむしろ稀際，エタノール等の大量投入とそれに伴う処理液容量の有な存在で，それ以外の PGA 生産種( Ashiuchi et al.,

増大，混入した大量の不純物を除去するための多段階精2006 )では一般に Solid 条件依存的であると考えている．

製プロセス等，コスト高に繋がる多くの課題が解決でき

現在，Solid 条件依存的な生産特性を打破する新機能遺ずにいた．芦内らは，歯磨き粉の薬用成分「ヘキサデシ

伝子の同定と単離を図るため，納豆菌とアーキアの PGA

ル ピ リ ジ ニ ウ ム カ チ オ ン( HDP + )」 と「 ア ニ オ ン 性合成遺伝子群を基礎とするクロスハイブリッドオペロン

PGA 」の間で発生する選択性の高い(協同的)会合現の作製と大規模な塩基配列の改変による微生物細胞の生象「イオンコンプレックス( IC )化」を見いだすとと

産機能拡張という新たな研究課題にも取り組んでいる．

もに( Ashiuchi et al., 2018 )，反応原理に基づき簡便・迅速，かつ特異的な発酵 PGA の連続回収法を完成させ

発酵 PGA の効率回収を可能にする「油水二相反応シスている(芦内ら，2020 )．新製のイオン結合性複合体は，テム」の導入「 PGA イオンコンプレックス( PGAIC )」と呼ばれていアーキア PGA 合成遺伝子群のハイスループットクる( Fig. 4A )．アニオン性 PGA が(水に易溶・アルコー

ローニングという課題に取り組む一方，低分子のファイ

ルに絶対不溶の)超親水性ポリマーとして振る舞うのにンケミカルや微小量の酵素タンパク質の増産で成功して対し，PGAIC の方は(水に絶対不溶の)耐水性超分子いる遺伝子工学がバイオポリマーにもそのまま適用可能物質として回収することができる．低級・中級アルコーと み る 風 潮 に は 注 意 が 必 要 と 考 え る． 実 際， 成熟型

ルには超溶解性を示すことも分かっている．実際にPGA の発酵合成は培地総重量の 1 %程度で限界を迎える

PGAIC／エタノール溶液ならば，該重量(wt)%(容量が，かかる制限は PGA 自体の物理化学特性(粘性等)(vol)%ではない)換算で最大 80 %に達し，溶剤にゾル・によるところが大きい．一般の納豆菌でも容易に到達でゲル性を帯びさせることも可能である．今回，PGA・Fig. 4. Synthesis and properties of poly-γ -glutamate ion-complex. Panel A, formation of γ -glutamate ion-complex
from poly-γ -glutamate and hexadecyl pyridinium cation; B, recovery of poly-γ -glutamate as poly-γ-glutamate
ion-complex; and C, viscous nature of poly-γ -glutamate ion-complex in alcohol.

－ 39 －芦内誠

PGAIC 間で認められる劇的な溶解特性の変化を利用しに増殖することを許容する代償としての「生分解性」をた「油水二相反応システム」が PGA 発酵生産プロセス

謳うこれまでのバイオプラスチックでは，公衆衛生の強にも導入できるかどうかの検討を重ねた( Fig. 4B )．結化が求められる今日，いわゆる「ウィズコロナ」の時代

果，発酵 PGA の反復回収と油相中での PGAIC の連続濃においては産業化や社会実装に寄せられた期待も小さく縮が可能になるものと示唆された( Fig. 4C；芦内ら，萎む恐れがある．コロナパンデミックと環境汚染・気象

2020 )．本システムを構築する上で「油相形成に用いる変動といった地球レベルの難題に曝される現代社会におアルコール種の選定」が最重要課題になるとの推測がな

いて，殺菌(微生物活動の排除)と生分解(微生物活動されていた．本件の選定にあたっては，①相分離特性；の促進)という明らかに相反するとされてきた機能の両②水への溶解度；③飽和水の殺菌能；④ PGAIC の溶解度；立を可能にする稀有のバイオ新素材「 PGAIC」の早期の 4 点を検討事項とした．脂肪族一級アルコール類を対実用化を求める声が日増しに高まっている．本著では，

象に調査したところ，ペンタノール[①あり；②(疎水先進機能性超分子部材等としての新用途の開発にも繋がパラメータからの換算値として)2.2 wt%；③(バシラスるような画期的な事例を紹介する．

に対する MKC として）＞ 2.2 wt%；④ ～ 50 wt%]が好現下の世界的な情勢や期待を鑑み，超広域抗菌スペク

適溶媒として選定された．また，②と③の数値からペントルを具備する PGAIC を部材とするポリマーコーティ

タノール飽和水の殺菌力は乏しいが静菌的な効果が現れ

ング剤(芦内ら，2022 )が新型コロナウイルス( SARS–

る可能性は避けられないため，使用した PGA 生産菌のCoV–2)にも不活化効果が発揮できるかどうかを調べた．

増殖可能菌体数を逐次追跡する工程を組み込むことで最プラスチック表面( PET 等)で SARS–CoV–2 は長時間新の特許公開技術(芦内ら，2020 )にまで仕上げるこにわたり感染性を維持するとされていたが，本試験でもとができた．参考までに，エタノールの場合，③の数値

これまでの知見に矛盾しない結果が得られた(Fig. 5A )．

は＞ 50 wt%と高濃度を要するが，実際には②が任意

これに対し PGAIC でコーティングされた PET フィルム(＜∞)であるが故に，殺菌力のある(ウイルス不活化で試験した場合，SARS–CoV–2 は事実上完全に不活化も可能な)アルコール溶液として広く利用されている．

されていることが明らかになった( Fig. 5B；細胞無毒性も同時に確認)．2020 年 10 月 29 日，国際機関 IPBESPGA のイオンコンプレックス化と先進機能性超分子部

は 170 万種のウイルスが未発見であり，最大 85 万種が材等としての新用途開発

ヒトに感染しうると報告した．未知ウイルスの拡散抑止

わが国でも持続可能な開発目標 SDGs への関心が高(広範な捕捉や不活化を介した)のための「零次の防御壁」

まっている．PGA・PGAIC は，『 17 』の世界目標のうを開発し，ポストコロナの社会構造やインフラ(鉄道・ちでも 12 番目「つくる責任・つかう責任」との親和性

学校・病院・住宅等)においては，標準的な生活機能とが高い．さらに，13 番目の気象変動(地球温暖化等)

して導入を急ぐ必要がある．これを「社会免疫」(芦内，対策では「グリーントランスフォーメーション( GX )」2021 )と呼ぶ．変異しやすい遺伝子産物(新型コロナが切り札的存在になりつつあるが，「脱炭素・脱化石資源」のスパイクタンパク質等)を標的とする特異点重視(ワの方向性にも適う PGAIC プラスチックには GX ビジョンクチン等)の戦術とは一線を画す構想であり，「エンベを支える新たな社会基盤材料としての価値顕在化に期待ロープ」と呼ばれる(新興・再興ウイルスに多い)共通が持てる．ポストコロナ世代が中心となる「人新世・ポスト SDGs 」の時代には，さらに「こわす責任」まで意識できるような環境配慮社会へと成長することが望まれる．過日のエレン・マッカーサー財団による『 2050 年には海洋プラスチックごみの総重量が魚を超える』とした
報告書は世界に衝撃を与えた( ELLEN MACARTHUR
FOUNDATION, 2016 )．利便性・経済性を重んじ「こわす責任」を放棄し続けてきたプラスチックの開発戦略
が「海の豊かさ」を守ろうとする 14 番目の目標を脅かしている．一方，飲料水や医療品を貧困な地域にも行き渡らせるとした第 3 番目の目標「ユニバーサル・ヘルス・
カバレッジ」に照らせば，安くて軽い化成プラスチックに求められる役割はポストコロナの社会でも変わらず大きくなると予想される．逆に自然環境中の微生物が活発－ 40 －

Fig. 5. Inactivation of severe acute respiratory syndrome
coronavirus 2 by poly-γ -glutamate ion-complex
agent. Panels A, plaque formation of SARS-CoV-2
sur vived on PE T films; and B, that on polyγ -glutamate ion-complex-coated PET films.

海洋分解性プラスチックの基材開発に資するアーキアポリ- γ -グルタミン酸

点を叩くことのできる PGAIC プラスチック部材の社会

温(～ 25 ℃)で 2 時間浸漬後，代表的な水系微生物「大実装を進め，未知のウイルス感染症の侵入等に対しても腸菌」(柴谷ら，2019；Hakumai et al., 2016 )の培養基に零次の段階で「防御する」ことを提案する．

投入したところ，本重層フィルムにも優れた抗菌性が認

今日のコロナ禍では，感染拡大阻止に資する新技術がめられる一方( step b )，海水中ではごく短時間(実験室強く求められる一方，ポストコロナに入ると，より多面条件で数分程度)で生分解性に復帰する「スイッチング

的な解決策が求められ，環境や持続可能性にも配慮した機能」が発揮されていることが示された(step c )．今後，

新成長戦略が必要になる．微生物やウイルスの捉え方に

海洋生分解性評価試験( ISO 標準化；Fig. 6, step d )を活も変化が生まれる．例えば，共有結合で重合した(従来用しながら，分解加速現象の立証に繋がるような画期的型の)プラスチックが PGAIC と同程度の「抗菌・抗ウな成果を取得する等，本件のより一層の進展が待たれる．

イルス効果」と半永久的な「環境(外部刺激)耐久性」

要を持ち得た場合，自然流出により，分解者そのものの活力を根本から奪う恐れがある．特に，難培養微生物が大約半を占める海洋においては，一元的な発想に頼って作り

微生物は肉眼では見ることのできない微小な存在であ続けられる抗菌・抗ウイルス製品が別次元の海洋破壊のるが，地球上のあらゆる環境に生息し，地球の成り立ち

引き金になる恐れがある．PGAIC に「環境配慮型」超や私たちの生活にも密接な関わりをもっている．事実，分子材料としての適性が確認されている( Ashiuchi et

熱水が噴出する海底の高温環境，極地等の低温環境，深al., 2018 )．ここでは PGAIC のさらなる高性能化と汎用化を図るため，量産型ナノファイバー部材の開発に着手

海のような高圧／超貧栄養環境，塩湖のような高塩環境
等，極限環境に適応している．地球外生命探索のモデル

した．種々検討の結果，PGAIC 50 g からナノファイバーにもなりそうな「(アーキアを含む)極限環境微生物」

塗布シート(規格，90 cm×4.0 m；目付，0.6 g/m 2；基材，の適応戦略に関する理解を深め，終局，「新産業成長分

PET 不織布)にしてワンロール分が製造できるまでに野の創出」や「今日的課題の克服」にも繋げようとするなった( Fig. 6 )．PGAIC ナノファイバーは耐水性だが，学術構想への期待は大きい．一方，極限環境微生物は，水中に置くと材質不問の接着性を回復することが分かっその特殊な培養条件等から，汎用的な「バイオ変換工場」ている．かかる「水中接着性」を利用し，生分解性プラ

としての応用には不向きとされ，環境配慮型プラスチッスチック(脂肪族ポリエステル製)との重層フィルムをク基材として期待される「アーキア PGA 」についてもそ調製した( Fig. 6, step a )．次いで重層フィルムを水道の生合成を司る分子装置に関する知見は皆無であること

水( Fig. 6, step b )と海水( Fig. 6, step c )の各々に室等，多くの課題が残されていた．本研究では，まずアー

Fig. 6. Mass-fabrication of poly-γ -glutamate ion-complex and its application to prepare absorbent non-woven cloths
made out of electro-spun. Steps a, an aliphatic polyester-based biodegradable plastic film was laminated with
poly-γ -glutamate ion-complex as a hydrophilic coating agent; b, the antimicrobial activities of the laminatedfilm against E. coli were assayed in tap water; c, or in sea water; and d, the assessment of the degradability of
the laminated film in marine environment according to ISO standards is now in progress.

－ 41 －

芦

内誠
酸イオンコンプレックスの製造方法．特願2022– 060467（国立大学法人高知大学, 東洋濾紙株式会社)

キア PGA 合成遺伝子群のハイスループットクローニン
グに着手した．単離した遺伝子群のインビボ分析から，
アーキア PGA 合成装置は「固体培養に依存した機能発現

謝調節機構」に支配されている可能性が示唆された．以後，
納豆菌とアーキアの PGA 合成遺伝子群に基づいたクロス辞ハイブリッドオペロンの作製とそれを利用した PGA 生

本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公産機構の全容解明が求められるようになった．最近，ワ益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．また，

ンバッチ当たりの生産性向上に重きを置く従来の方法論

本研究の遂行にご協力いただいた東洋濾紙株式会社・小が発酵バイオポリマー( PGA 等)の低コスト化・汎用

野寺正孝氏(新型コロナ不活化試験等)，シンワ株式会社・

化には有効ではなく，むしろ PGA 回収技術の方に改良

塩見健太( PGAIC ナノファイバー量産化等)，高知大学の余地が残されていることが分かってきた．今回，発酵

農林海洋科学部・環境バイオマテリアル学研究室(旧生PGA の効率回収に資する「油水二相反応システム」の物工学研究室)の学生諸氏に感謝の意を表します．

導入事例を紹介した．本件は最新の特許公開技術(芦内文ら，2020 )にまで仕上げることができた．また，この反応プロセスで新製されたイオン結合性複合体「 PGAIC 」
は，コロナパンデミックと環境汚染・気象変動といった地球レベルの難題に曝される現代社会において，殺菌(微生物活動の排除)と生分解(微生物活動の促進)という明らかに相反するとされてきた機能の両立を可能にする
稀有のバイオ新素材という位置づけにあることが分かってきた．実際，PGAIC を含むポリマーコーティング剤
が新型コロナウイルス( SARS–CoV–2)に対する不活化効果を発揮することに加え，環境先進的なスイッチン
グ機能を備えた PGAIC ナノファイバーの量産化と接着
繊維性部材としての新たな応用例についても触れた．現下の世界的な情勢を鑑み，アーキア PGA から創り出す
ことのできる環境配慮型「メディシナルプラスチックス」(芦内，2021 )の実装化を急ぐ必要がある．今後，異分野融合技術の導入を視野にあらゆる試みに挑戦する．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表
1) 白米優一, 芦内 誠．2020．イオンコンプレックス化による
ポリ- ε -リジンの抗菌性能強化．日本生化学会大会(9月
14-16日，オンライン)
2) 芦内 誠, 白米優一．2020．メディシナルバイオプラスチッ
クスと，「社会免疫」(ソーシャル・イムニティー)という新たな可能性について．日本人工臓器学会大会(11月
12–14日，高知)
3) 芦内 誠, 白米優一．2020．抗菌性と生分解性の両立を可能にするスイッチング・バイオプラスチック新素材の開発．日本生物工学会西日本支部大会(11月14日，岡山)
その他(総説・書籍・特許など)
1) 芦内 誠, 白米優一, 大岩聖佳, 石原 悠 2020．イオン性ポリマーの製造方法．特開2020–158677(国立大学法人高知大学, 出光興産株式会社)
2) 芦内 誠, 白米優一, 大成冬真 2021．接着剤と接着方法．特願2021–059214(国立大学法人高知大学)
3) 芦内 誠, 白米優一, 小野寺正孝 2022．ポリ- γ -グルタミン

献

Ashiuchi, M. 2013. Microbial production and chemical transformation of poly-γ -glutamate. Microb. Biotechnol. 6: 664–674.
芦内 誠 2021. メディシナルバイオプラスチックスと，「社会免疫」(ソーシャル・イムニティー)という新たな可能性について．人工臓器 50: 22–25．
芦内 誠, 白米優一, 大岩聖佳, 石原 悠 2020．イオン性ポリマーの製造方法．特開2020 –158677(国立大学法人高知大学, 出光興産株式会社)
芦内 誠, 白米優一, 小野寺正孝 2022．ポリ- γ -グルタミン酸イ
オンコンプレックスの製造方法．特願2022–060467(国立大学法人高知大学, 東洋濾紙株式会社)
Ashiuchi, M., Hakumai, Y., Nakayama, S., Higashiuchi, H. &Shimada, K. 2018. Engineering antimicrobial coating ofarchaeal poly-γ -glutamate-based materials using non-covalentcrosslinkages. Sci. Rep. 8: 4645 [p. 1–9].
Ashiuchi, M. & Misono, H. 2007. Micro-purification and structural
assays of poly- γ -glutamate, a D - amino acid - containing
biopolymer, In Konno, R., Brückner, H., D'Aniello, A., Fisher,G., Fujii, N. & Honma, H. (eds.), D -Amino Acids: A New
Frontier in Amino Acid and Protein Research–Practical
Methods and Protocols, p. 403– 407 (Chap. 5.7), NY, Nova
Science Publishers.
Ashiuchi, M., Nakamura, H., Yamamoto M. & Misono, H. 2006.
Novel poly- γ -glutamate - processing enzyme catalyzing
γ -glutamyl DD-amidohydrolysis. J. Biosci. Bioeng. 102: 60–65.
ELLEN MACARTHUR FOUNDATION 2016. The New Plastics
Economy: Rethinking the Future Plastics.
Hakumai, Y., Yamaguchi, K., Nakayama, S. & Ashiuchi, M. 2016.
Effective elimination of water-borne Escherichia coli usingarchaeal poly- γ -glutamate-based materials. AIMS Microbiology
2: 222–229.
Nascimento, B.M. & Nair, N.U. 2020. Characterization of amembrane enzymatic complex for heterologous production ofpoly-γ -glutamate in E. coli. Metab. Eng. Commun. 11: e00144.
西村浩和, 芦内 誠 2015. 繊維とその製造方法．特許第5709158号（東洋紡株式会社, 国立大学法人高知大学)
柴谷滋郎, 中森雅彦, 白馬弘文, 宝田 裕, 芦内 誠 2019. 抗真菌剤
およびコーティング剤．特許第6488473号(東洋紡株式会社,
国立大学法人高知大学)－ 42 －

IFO Res.Commun. 36
43-50, 2022

植物バイオマス生産を制御する微生物由来
気相コミュニケーション物質に関する包括的研究
上

田

晃

弘

広島大学大学院統合生命科学研究科〒739-8528

東広島市鏡山1-4-4Comprehensive research on microbial substances in gas phase communication
to regulate plant biomass production
Akihiro Ueda
Graduate School of Integrated Sciences for Life, Hiroshima University
1-4-4 Kagamiyama, Higashi-Hiroshima, Hiroshima, 739-8528
This research was aimed to understand indirect interactions between plants and microbes through comprehensive
identification of microbial substances in gas phase communication to regulate plant biomass production. Indirectinteractions between plants and microbes were studied by cultivating both organisms in the same petri dishwithout direct contact. Bacterial species isolated from different environments showed either beneficial or
detrimental effects on Arabidopsis growth. Some of the microbial volatile organic compounds (mVOCs) emitted
from beneficial bacteria had growth promoting effects on Arabidopsis. Thirty-four differentially expressed genes
were identified in response to 2-undecanone, one of the beneficial mVOCs. 2-Undecanone treatment highly
induced expression of the OSR1 gene whose product functions in enlarging organ size in Arabidopsis. Thesefindings implied that Arabidopsis growth promotion may be controlled by the OSR1 function through2-undecanone mediated transcriptional activation.
Key words: Plant growth promotion, Plant-microbe interaction, 2-Undecanone, Volatile organic compounds

リサイクル技術の開発も不可欠である．

緒言

このような情勢の中，化学肥料や化学農薬に頼らない，
あるいはその使用量を低減させることを目的とした微生

近年，持続的な植物生産体制構築への関心が高まりつ

物資材の開発やその利活用が注目されつつある

つある．開発途上国を中心とした人口増加に伴う食料需( Mahanty et al., 2017 )．微生物資材とは，農業生産現場要の増加に対応するためには，農耕地面積の拡大か，植において植物の生産性の増加や安定化を図ることを目的

物生産の効率化を図る必要がある．しかしながら，世界として使用される微生物(群)を資材化したものである．

的な砂漠化や土壌の劣化が進む中で農耕地面積の大幅な微生物資材として使用される微生物は，植物の生育促進増加は見込めないため，作物品種や肥培管理技術の改良に資する能力を持つことから植物生育促進微生物(Plant

による植物の生産性向上のための技術開発に期待が寄せ

Growth Promoting Microbe, PGPM )とも呼ばれる．最られている．温暖化やゲリラ豪雨，海面上昇等の気候変も普及した微生物資材の 1 つに根粒菌資材が挙げられ動にも対応しつつ，自然生態系や環境にも配慮した農業

る．マメ科植物と双利共生関係を築き，大気中の窒素固活動が求められている．また，国際情勢の悪化による肥定能を有する根粒菌はマメ科植物栽培時の窒素施肥量の料資源や燃料資源の高騰は農業生産を不安定にする(清軽減に役立つ．他にも様々な属種や能力を持った PGPM

水，2010；俵谷・和崎，2012 )．これらの資源は有限でが単離され，その生理学的特性の解明や微生物資材化のあるため，その効率的な利用方法や環境中における資源研究が進んでいる．例えば，植物の必須元素のうち，リンや鉄は植物が容易に利用できない形態で土壌中に存在

E-mail: akiueda@hiroshima-u.ac.jp

することが多いが，ある種の微生物には土壌中で金属類－ 43 －

上

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と結合して難利用性となったリンの可溶化能や微生物等産に影響を与える mVOCs の網羅的な同定により，有用の利用により有機態リンとなったフィチン分解能，また，植物の生産性を向上させる栽培技術の確立の基盤を構築

難溶性の鉄やカリウムの可溶化能が見られる．これらのする．

能力を有した微生物の生理活性が活発な土壌では，難利実験方法

用性の必須元素が植物に吸収されることで必須元素の循環化が促進される．その他，植物の生育促進に資する植物ホルモン(様)物質の生産や植物病原性微生物への拮

自然環境からの微生物の単離抗作用(染谷ら，2017 )，植物の環境ストレス耐性の向様々な環境の土壌や植物，水サンプルから培養可能な上( Mani et al., 2016; Nautiyal et al., 2013 )など，様々微生物の単離を行った．サンプル採取は，高塩環境(広な微生物の単離事例が報告されている( Gouda et al.,

島県安芸津市，岡山県瀬戸内市，北海道厚岸町，沖縄県

2018 )．

石垣市)や高温・低 pH 環境(大分県別府市)，貧栄養

上述のような PGPM の単離手法は植物や土壌根圏へ

環境(広島県東広島市，北海道清里町)などで行った．

の微生物の直接接種が主流であった．植物細胞内への侵土壌サンプルは 10 倍量の滅菌生理食塩水中で 24 時間激入力が弱い細菌の場合には，植物に傷をつけたり，圧力

しく振盪し，その上清を微生物の単離に用いた．植物サ

調整によるインフィルトレーション法で植物内部へと細ンプルは乳棒と乳鉢ですりつぶした後に 10 倍量の滅菌

菌を侵入させたりすることで感染を成立させる．このよ

生理食塩水を添加して 24 時間激しく振盪し，その上清

うに植物と微生物が直接近傍で物質の授受を介して相互を微生物の単離に用いた．それぞれの上清や水サンプ

作用することを直接的相互作用という．植物－微生物直

ルは LB 培地( 1 %(w/v)Tryptone，0.5 %(w/v)Yeast

接的相互作用では，近接する植物細胞と微生物間で主とExtract ，1 %(w/v)NaCl)や PDA 培地( 3.9 %(w/v)

してアミノ酸やタンパク質，糖類などの水溶性物質が互Difco PDA, 0.01 %(w/v)Chloramphenicol )に適当な倍いに影響を及ぼす．マメ科植物が根粒菌との共生関係を率で希釈後に塗布し，培養可能な細菌や真菌のシングル成立させるときに放出するフラボノイド類，微生物が放コロニーの単離を行った．

出する植物の根の生長を促進させるオーキシン様物質，
病原性微生物が植物細胞内に分泌するエフェクター分子

シロイヌナズナとの隔離共培養系を用いた植物生育促進などはこの一例である．植物－微生物相互作用の理解は

微生物のスクリーニング

直接的相互作用研究によって多くの知見がもたらされて

2 分 割 シ ャ ー レ 内 の 片 側 に 1/2 濃 度 の MS 培 地

きたのが現状であるが，近年，植物と微生物は間接的に( Murashige & Skoog, 1962 )，もう片側に LB 培地あるも相互作用しうる事例が報告されてきた( Park et al.,

いは PDA 培地を作成した．シロイヌナズナ( Col-0 )の2015; 上田ら，2019 )．間接的相互作用では植物と微生

種子は 1 滴の Tween-20 を添加した 2 %( v/w )次亜塩素

物間には隔たりがあるため，双方が放出するガス状物質

酸ナトリウム溶液中で 15 分間表面殺菌を行った後，滅(主に揮発性物質)がコミュニケーションツールとして菌水で数回洗浄後に 4 ℃で 5 日間の春化処理を行った．

使われる．ガス状物質の中には，他の生物種の生理状態

1/2 濃度の MS 培地上にシロイヌナズナの種子 10 ～ 15に影響を及ぼすものがあることも分かってきた．例えば，粒を播種し，LB 培地あるいは PDA 培地上には単離済み

細 菌 が 放 出 す る 2-undecanone は 植 物 生 育 促 進 作 用，の細菌あるいは真菌を接種した．2 分割シャーレはパラ

dimethyl disulfide は植物生育抑制作用をそれぞれ持つフィルムとサージカルテープで密閉し，23 ℃，16 時間( Ledger et al., 2016; Plyuta et al., 2021 )．しかしながら，

日長，光強度 100 µmol/m 2/s の条件下でシロイヌナズナ

微生物がなぜそのような物質を放出するのか，どのようと微生物の隔離共培養を行った．約 15 日間培養後，シな環境刺激によりその生産を加速させるのか，またガス

ロイヌナズナの乾物重量を測定した．微生物非接種区の状物質を放出する生態的意義など，全貌は明らかとなっシロイヌナズナの乾物重量をベースとして，微生物接種ていない．本研究では，植物－微生物間接的相互作用の区の相対乾物重量を評価した．植物生育促進効果を示し検出をベースとして，植物のバイオマス生産を制御しうた細菌種の同定については定法に従って，16S rDNA 配る微生物由来の気相コミュニケーション物質(微生物由

列の解読と BLASTn 解析により行った．

来 揮 発 性 物 質，microbial volatile organic compounds,
mVOCs )が存在するのかを検証し，気相コミュニケー

GC-MS 分析

ション物質の同定やそれを生産する微生物種の同定を行

植物生育促進効果を持つ細菌シングルコロニーをかきい，微生物由来の気相コミュニケーション物質による植とり，20 mL の LB 液体培地内で増殖させた．恒温振盪

物生育促進機構の解明を目的とした．植物バイオマス生培養器内で 28 ℃，回転数 120 min-1 で 24 時間振とう培養－ 44 －

植物バイオマス生産を制御する微生物由来気相コミュニケーション物質に関する包括的研究

後，新鮮な 20 mL の LB 培地に濁度( OD600 )が 0.01 と静置(スプレー処理)した．その後，葉から Total RNA

なるように再懸濁して再度，24 時間振とう培養を行っを抽出して BGI 株式会社の RNA sequence 解析に供試した．培養フラスコ上部の気相に蓄積された細菌由来のガ

た．反復は各処理区から独立した 2 サンプルを供試し，

ス状物質は SPME 法により 15 分間，捕集・濃縮した．

発現量に有意な差が見られた遺伝子群の抽出を行った．

SPME ファイバーに捕集されたガス状物質は，ガスクロ結果および考察マトグラフ－質量分析器( GC-MS )による定性分析に供試した．得られたマススペクトラムを用いて化合物ラ

間接的相互作用によりシロイヌナズナの生育を制御する

イブラリー検索を行った．

微生物群のスクリーニング
揮発性物質を用いたシロイヌナズナの生育促進作用の検証

2 分割シャーレを用いた隔離共培養をベースとした植

2 分割シャーレ内の片側に 1/2 濃度の MS 培地を作成

物－微生物間接的相互作用系を用いて，植物生育促進効

し，もう片側には GC-MS により同定された揮発性物質

果を持つ微生物群のスクリーニングを行った．細菌 800

を様々な濃度で十分に湿らせた 1 cm2 のろ紙を置いた．

種類を隔離共培養した時のシロイヌナズナの相対乾物重1/2 濃度の MS 培地上にシロイヌナズナの種子 10 ～ 15を評価した(図 1 )．一次スクリーニングの結果，132 種

粒を播種し，シャーレをパラフィルムとサージカルテー類の細菌がシロイヌナズナの乾物重量を 1.5 倍以上に増プで密閉し，23 ℃，16 時間日長，光強度 100 µmol/m /s加，253 種類の細菌が 0.5 倍以下に減少させたことが分の条件下で培養を行った．約 15 日間培養後，シロイヌ

かった．シロイヌナズナの生育抑制作用を持つ細菌群のナズナの乾物重量を測定した．揮発性物質の植物生育促

うち，201 種類はシロイヌナズナの発芽そのものを抑制

進効果はイネを用いた温室内の土耕でも検証した．水稲

し，52 種類は発芽後の実生の生育を抑制していた(図 1 )．

育苗用粒状培土でイネを 1 か月間栽培した．ミルサーでこの観察結果から，細菌が放出する揮発性物質には発芽粉砕した乾物サンプル( 50 mg )は 2 mL 硝酸と 1 mL 過抑制と実生の生育抑制と 2 つの異なる生理作用を持つも酸化水素水中で 120 ℃，3 時間酸分解してろ過後，誘導のが存在することが推察された．生育促進作用を示した

結合プラズマ発光分光分析器( ICP-OES )を用いた元細菌群は再現性を検証するために二次スクリーニングに

2

素分析に供試した．網羅的遺伝子発現解析のために，バー供試した結果，43 種類まで絞り込むことができた．真ミキュライトを用いた土耕ポット栽培を行った 1 か月齢菌については，自然環境から単離した 150 種類についてのシロイヌナズナ個体を 100 µM 2-undecanone を充満さ同様のスクリーニングを実施したが，シロイヌナズナのせた 2 L 容器内に 24 時間静置(揮発処理)，あるいは生育を顕著に増加させる種を見つけることができなかっ2-undecanone 溶液を葉面散布して 2 L 容器内に 24 時間

た．生育促進および生育抑制効果を示したシロイヌナズ

Fig.1 Screening of plant growth promoting bacteria through indirect interactions between Arabidopsis and bacteria.
Eight hundreds bacterial species isolated from different natural environments were screened to test whether eachbacterium can affect Arabidopsis growth. Arabidopsis relative dry weight was evaluated by the ratio of dry weightcultivated with bacteria to dry weight cultivated without bacteria.

－ 45 －

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田

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育促進に資する微生物由来の気相コミュニケーション物

ナと細菌の隔離共培養の様子を図 2 に示した．
スクリーニングにより得られた 43 種類の細菌群につ質(ガス状物質)の同定を試みた．微生物の体内で生産いて，16S rDNA 配列に基づいた菌種同定を行った．そされて気相に充満する物質であることから，揮発性物質の結果，間接的にシロイヌナズナの生育を促進させるも多く存在することが予想されるが，実際にはどのよう

26 種類の細菌群の属種が明らかとなった(表 1 )．多様な物質が放出されているのか不明である．そこで微生物な細菌群がシロイヌナズナの生育促進作用を持つことが培養フラスコ内の上部気相部分に放出されたガス状物質

分かった一方で，Pseudomonas syringae のように一般的を多く検出するために SPME 法を用いた．SPME 法でには植物病原性細菌に分類される菌種も同定された．

はガス状物質を捕集するためのファイバー材質を変える
ことで，分子量や揮発性，極性等，性質が異なる様々な

気相コミュニケーション物質の同定

物質の検出が可能になる(表 2 )．様々な SPME ファイ

次に，植物―微生物間接的相互作用において植物の生バーを用いて 26 種類の細菌由来のガス状物質の定性分

Fig. 2 Arabidopsis growth without bacteria (left), with plant growth promoting bacteria (middle),
and with plant growth inhibiting bacteria.

Table 1 Plant growth promoting bacteria isolated in this study.
Acinetobacter calcoaceticus
Aeromonas veronii
Bacillus sp.
Bacillus subtilis
Bacillus muralis
Curtobacterium flaccumfaciensEnterobacteriaceae bacterium
Erwinia persicina
Escherichia sp.
Kluyvera intermedia
Microbacterium maritypicum
Moraxella osloensis
Neobacillus drentensis sp.

Pantoea agglomerans
Pseudarthrobacter equi
Pseudomonas azotoformans
Pseudomonas veronii
Pseudomonas chlororaphis
Pseudomonas syringae
Pseudomonas sp.
Pseudomonas fragi
Rahnella aquatilis
Salinicola tamaricis
Stakelama sp.
Staphylococcus epidermidis
Stenotrophomonas maltophilia

Table 2 SPME fibers used to detect microbial substances in gas phase communication
Fiber

Target substance

Molecular weight

Polydimethylsiloxane

Volatile compounds

60－600Polyacrylate

Nonpolar semivolatile compounds

80－300Polyethylene glycol

Alcohols

40－275

Polydimethylsiloxane/Divinylbenzene

Volatiles, Amines, Aromatic nitro compounds

50－300Carboxen / Polydimethylsiloxane

Gas compounds, low molecular weight compounds

30－225

Divinylbenzene / Carboxen / Polydimethylsiloxane

C3 ～ C20 volatiles

40－275－ 46 －

植物バイオマス生産を制御する微生物由来気相コミュニケーション物質に関する包括的研究析を行った結果の一部を表 3 に示した．計 63 種類の物

微生物由来揮発性物質を用いた植物生育促進機構の解明

質が検出され，その多くは長鎖の炭水化物や揮発性が高検出された微生物由来揮発性物質すべてが植物の生育い物質が多くみられた．また，1 種類の細菌から複数の促進に寄与しているかどうかは不明である．そこで種類のガス状物質が放出されることや，いくつかの物質

2-undecanone を含めたいくつかの揮発性物質存在下でについては複数の細菌種からの放出が確認された．

のシロイヌナズナの生育調査を行った(図 3)．その結果，Table 3 Identified mVOCs
Substance name

Molecular
weightChemicalformula3-Methyl-1-buthanol88

C 5H12O

Dimethyl disulfide

94

C 2 H6 S 2

2-Nonanone

142

C 9H18O

2-Undecanone

170

C11H 22O

2-Tridecanone

198

C13H 26O

Structural formulaFig. 3 Arabidopsis growth with mVOCs (compounds A, B, C, D, and 2-undecanone (2-UD)).

－ 47 －

上

田

晃

弘

Fig. 4 Venn diagram of differentially expressed genes in Arabidopsis
in response to 2-undecanone treatment.

化合物 A や 2-undecanone，化合物 C のようにシロイヌ

イネ個体の重量の増加が確認された(図 5 )．この時のナズナの生育促進作用を持つものや，化合物 B や化合

イネ体内の必須元素のうち，主要なものについて分析を物 D のように生育には影響を与えない，あるいは生育行ったところ，P や K，Ca や Mg 等の元素の蓄積量のを抑制するものが存在していた．1 種類の細菌から複数増 加 が 確 認 さ れ た( 図 5 )． こ の こ と か ら，2-undeca-のガス状物質が放出された結果を併せて考えると，シロnone がもたらす植物の生育促進効果は特定の必須元素

イヌナズナの生育促進に寄与する細菌種からは，①生育の蓄積量の増加ではないことが示唆された．同様の傾向

促進ガス状物質が 1 種類あるいは複数種類，高濃度で放は 2-undecanone 処理を行ったシロイヌナズナでも観察出されていた，②生育抑制ガス状物質も放出されていたされたため，2-undecanone による植物の生育促進にはが，生育促進ガス状物質の種類が多い，あるいは濃度が器官サイズの増加が起こった後に，培地から生育に必要高かった，などの事例が考えられ，複数種の細菌由来のとなる必須元素の吸収が引き起こされた可能性が示唆さ

ガス状物質がシロイヌナズナの生育に複合的に影響を与れた．

えていた可能性が示唆された．

要

細菌由来のガス状物質によるシロイヌナズナの生育促
進機構についての理解を深めるために，2-undecanone

約( C11H22O, 分 子 量 170 ) を 用 い た 機 能 解 析 を 進 め た．

本研究では，植物バイオマス生産を制御する微生物由

2-undecanone 作用下でのシロイヌナズナの葉における来のガス状コミュニケーション物質の同定を行い，植物

遺伝子発現応答を調べるために，2-undecanone を揮発－微生物間接的相互作用の解明を行った．自然環境から処理した場合とスプレー噴霧した場合の RNA sequence

単離した細菌の一部は，接触せずとも植物の生育を促進

解析を行った．その結果，揮発処理の場合には 547 遺伝

あるいは抑制する作用を持つ種が存在することが明らか

子，スプレー処理の場合には 68 遺伝子の発現変動が確となった．これらの細菌からは様々なガス状物質が放出認された(図 4 )．両方の処理により共通して発現変動されており，その一部には植物の生育を促進する作用がした遺伝子群は，発現量が増加したものは 23 遺伝子，見られた．植物生育促進作用を持つガス状物質の 1 つで発現量が減少したものは 11 遺伝子であった．共通してある 2-undecanone をシロイヌナズナに作用させた場合，発現量が増加した遺伝子群の中には，発現量が増加した

様々な遺伝子群の発現変動が見られた．特に，器官サイ際にはシロイヌナズナの生育促進に寄与するものが含まズの増大を制御する OSR1 の発現誘導が見られたことかれていた(表 4 )．特に，最も発現量が増加(Log2 比で 5.0 )ら，2-undecanone 処 理 に よ る 植 物 の 生 育 促 進 機 構 はした OSR1 遺伝子( At2g41230)はシロイヌナズナの器

OSR1 による器官サイズの制御によってもたらされてい官サイズ制御に関わる転写因子である．OSR1 による器る可能性が示唆された．

官サイズの制御は細胞肥大によってもたらされることが本助成で得られた研究成果の報告示されているため，2-undecanone によるシロイヌナズ
ナの生育促進機構の一部は OSR1 による器官サイズの増大が関わっている可能性が示唆された．
2-undecanone を用いた植物生育促進作用について，
イ ネ を 用 い た 温 室 で の 土 耕 栽 培 で も 検 証 を 行 っ た．
2-undecanone を用いて 1 か月間，イネを栽培した結果，

口頭発表
1) 上田晃弘．2021．植物生育促進細菌をもっと使えるように．日本農芸化学会日本農芸化学会中四国支部 支部創立20周年記念 第31回若手研究者シンポジウム．（招待講演)－ 48 －

植物バイオマス生産を制御する微生物由来気相コミュニケーション物質に関する包括的研究
Table 4 Differentially expressed genes in Arabidopsis in response to 2-undecanone treatment
Gene ID

Protein Name/Function

Volatilized
Log2 ratio

SprayedLog2 ratio

At2g41230
At1g30135

Organ size related 1 (OSR1)

5.0

2.5

Jasmonate-zim-domain protein 8

4.2

2.0

At1g77640

DREB transcription factor

4.2

1.8

At4g08950

Exordium

4.0

2.3

At3g10040

Hypoxia response attenuator 1

3.8

2.8

At1g75450

Cytokinin oxidase 5

3.0

1.4

At5g56870

Beta-galactosidase 4

2.8

2.9

At1g36060

DREB transcription factor

2.8

2.0

At3g16670

Pollen Ole e 1 allergen and extensin

2.7

1.0

At1g72060

Serine-type endopeptidase inhibitor

2.6

2.1

At5g12050

Auxin-regulated growth promotion/Rho GTPase-activating protein

2.4

1.4

At3g47340

Glutamine-dependent asparagine synthase 1

2.3

1.9

At1g05020

Anth protein 180

2.3

1.7

At1g11260

Sugar transporter 1

2.2

2.5

At5g18030

SAUR-like auxin-responsive protein family

2.2

1.5

At5g07000

Sulfotransferase 2B

2.0

1.4

At4g15233

ATP-binding cassette G42

1.9

1.3

At4g27450

Hypoxia response protein

1.9

2.4

At3g45590

Senescence associated gene 1

1.7

2.4

At4g36850

PQ-loop repeat family protein

1.6

4.1

At3g13450

Branched chain alpha-keto acid dehydrogenase E1 beta

1.5

1.4

At1g30820

Cytidine triphosphate synthase

1.4

1.5

At5g13740

Zinc induced facilitator 1

1.3

1.2

At5g46830

NaCl-inducible gene 1

-3.6

-5.1

At5g48850

Sulphur deficienxy induced 1

-2.8

-2.6

At3g49570

Response to low sulfur 3

-2.4

-2.0

At3g28270

Unknown

-2.4

-2.1

At4g01080

Trichome birefringence like 26

-2.3

-1.9

At5g24660

Response to low sulfur 2

-2.3

-2.3

At3g49580

Response to low sulfur 1

-2.3

-2.1

At2g15020

Unknown

-2.2

-2.8

At1g75280

Unknown

-1.9

-2.0

At3g22550

Unknown

-1.7

-1.7

At5g26220

Gamma-glutamyl cyclotransferase 2;1

-1.6

-2.2

Fig. 5 Rice growth promotion with 2-undecanone treatment (A). Accumulation of essential elements such as P (B), K (C),Ca (D), and Mg (E) were analyzed in rice shoots.

－ 49 －

上

謝

田

辞

本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．また，本研究の遂行にご協力いただいた広島大学大学院統合生
命科学研究科植物栄養生理学研究室の学生諸氏に感謝の意を表します．

文

献Gouda, S., Kerry, R.G., Das, G., Paramithiotis, S., Shin, H.S., Patra,
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－ 50 －

IFO Res.Commun. 36
51-62, 2022

ゲノム編集システムを利用した有機酸輸送系の改変による高効率クエン酸生産糸状菌の育種
桐

村

光太郎

早稲田大学理工学術院先進理工学部応用化学科〒169-8555

新宿区大久保3-4-1

Breeding of citric acid hyper-producers in Aspergillus tubingensis ( A. niger)
by modifying the organic acids transport systems using the genome editing system
Kohtaro Kirimura
Faculty of Science and Engineering, Waseda University
3-4-1 Ohkubo, Shinjuku-ku, Tokyo 169-8555, Japan
With the objective to generate citric acid hyper-producing strains by modifying the organic acids transportsystems, functional analyses on the genes encoding mitochondrial organic acids-transporter proteins such as cocAand ctpA and the citrate exporter gene (cexA) were performed in Aspergillus tubingensis ( A. niger) by the genome
editing system. Genome sequencing analyses and metabolites analysis using high-precision LC-MS/MS revealed
no productions of mycotoxins such as ochratoxins and fumonisins by A. tubingensis WU-2223L, a parental citricacid-producing strain. Under the conditions of citric acid production, 7 genes encoding mitochondrial organic
acids-transporter proteins were transcribed. Thus, knock-out strains were generated by disruption of each geneby the genome editing system. Among 7 knock-out strains, only the cocA-knockout strain showed drastic decreaseof citric acid production, indicating that COCA protein encoded by cocA must be the main transporting system
concerning citric acid hyper-production. On the other hands, the cexA-knock out strain produced no citric acid,indicating that CEXA protein encoded by cexA is the only citrate exporter from cytosol to extracellular fraction(culture broth). The cexA-high expression strain using tef promoter produced high amount of citric acid incomparison to the parental strain WU-2223L. Thus, our results in this research clearly indicate that breeding of
hyper citric acid-producing strains is possible by modifying the organic acids-transport systems using the genome
editing system.
Key words: Aspergillus, citrate exporter, citric acid fermentation, genome editing system, mitochondrial organic
acids-transporter緒

言2019 )，2016 年にはクエン酸の世界的年間生産量は 210
万トンに達している( Kirimura & Yoshioka 2019 )．こ

クエン酸は，食品や飲料の酸味料，医薬品や化成品のの量は，エタノール，グルタミン酸ナトリウムに次ぐも安定(化)剤や pH 調整剤，化学工業の分野では機能性

ので，クエン酸は工業的な発酵生産物の代表例である．

樹脂等の原料などとして広く利用されている( Kirimura

現 在 の 主 要 な ク エ ン 酸 生 産 会 社 は，Archer Daniels& Yoshioka 2019 )． ク エ ン 酸 は そ の す べ て が 糸 状 菌

Midland Company ，Cargill Incorporated ATP Group ，Aspergillus niger( ク ロ コ ウ ジ カ ビ， 現 在 の Aspergillus
Section Nigri に属する菌株)による工業的発酵生産にTate & Lyle PLC などで，これらでは 2015 年頃から工場

よ っ て 供 給 さ れ( Bennett 2010; Kirimura & Yoshioka

大手製薬企業がクエン酸生産工場を新設するなど供給体の増設や新設も進んでいる．また，自社向けのようだが制にも変化が見られる．一方，日本の年間クエン酸需要

E-mail: kkohtaro@waseda.jp
共同研究者:矢口 貴志(千葉大学真菌医学研究センター)．

は約 6 万トンと見積もられ，純国産は 200 - 300 kg で，ほぼ全量が中国からの輸入品である．
－ 51 －

桐村

筆者らは，糸状菌(カビ)A. niger( Aspergillus Section
Nigri )によるクエン酸をはじめとする有機酸の生産とその機構解明に関して研究を展開してきた( Kirimura et光太郎

変に基づく新規なクエン酸生産糸状菌の育種を目的として実施した．

実験方法

al. 2016, 2019; Kirimura & Yoshioka 2019; Kobayashi etal., 2014, 2016; Yoshioka et al. 2020a )．とくに，研究室
保 有 の ク エ ン 酸 生 産 糸 状 菌 A. tubingensis WU-2223L

使用菌株と培地，代謝産物の分析( NBRC111403 ) に つ い て は， ゲ ノ ム 配 列 を 決 定 し

クエン酸高生産糸状菌として，Aspergillus tubingensis( Yoshioka, et al. 2020b )，当該菌株の育種に適したゲノ

WU-2223L を主として使用した．WU-2223L 株は，宇佐ム編集システムを構築している( Yoshioka and Kirimura

美が日本の土壌より単離したもので，当時の分類基準に2021 )．rDNA の D1/D2 領域や ITS 領域，カルモジュリ

基づいて便宜的に A. niger と同定されていた( Usami

ンをコードする領域等の DNA 分類指標( Nakamura et1978 )． 筆 者 ら は， 最 新 の 分 類 指 標 に 準 拠 し て

al. 2017; 矢口 2009 )に準拠して作成した WU-2223L 株の分類学的な系統樹を Fig. 1 に示す．Aspergillus Section

WU-2223L 株を A. tubingensis と再同定し，ゲノム配列をNigri の中で A. tubingensis は焼酎製造に使用される(商品では黒麹菌と表示されることが多い)A. luchuensis と組換えやゲノム編集には，WU-2223L 株から作製した亜近縁にある( Fig. 1(A))．クエン酸生産糸状菌について
は，A. niger ATCC 1015 のようにゲノム比較研究が行わ

et al. 2016, 2019; Kirimura & Yoshioka 2019 )，非相同組
込 み が 起 こ り に く い kueA 破 壊 株 で あ る DKL-2P 株

れたものもあるが，クエン酸生産能力をゲノム情報から( Honda et al. 2011 )などを使用した．最少寒天培地と決定し登録した( Yoshioka et al. 2020b ). また，遺伝子
硝酸非資化性の niaD 欠損株としての LND-1 株(Kirimura

類推することは困難であった( Andersen et al. 2011 )．一

しては 30 g/L グルコースを炭素源とする Czapek-Dox 培

方，従来の研究例ではクエン酸生産糸状菌は A. niger と地に 20 g/L 細菌培養用寒天を添加して固化させたもの

して表記されることが多かった( Bennett 2010; Kirimuraを使用した．比較のための形態観察には，CYA 培地や& Yoshioka 2019 )． し か し， 本 研 究 の 供 試 菌 で あ る

MEA 培地を使用し、25 ℃または 37 ℃で静置培養を行っ

WU-2223L 株は種としては A. niger と近縁だが別種であた(矢口 2009)．クエン酸生産には，とくに記載しない

り，クエン酸生産菌が種として A. niger だけに偏在してかぎりクエン酸生産の促進剤として 2 %(v/v)メタノー

いるわけではないことがわかる．また，
WU-2223L 株は A.

ルを添加した SLZ 培地を使用した(Kirimura et al. 2016,tubingensis の標準菌株である CBS134.48 株とはやや異なる 位 置 に あ る(Fig. 1(B))．Table 1 に 示 す よ う に，

2019; Kirimura & Yoshioka 2021)．SLZ 培 地 の 組 成 は，

WU-2223L 株のゲノムサイズは 35.0 Mb で，11,493 個の1 g/L KH 2 PO 4 ，0.5 g/L MgSO4・7H 2 O ，0.014 g/L

推定遺伝子( gene model )が見出されている．ゲノム

MnSO 4・5H 2 O ，0.01 g/L FeCl 3 ・6H 2 O ，0.075 mg/L

配列が既知の近縁の標準菌株との比較も Table 1 に示す

ZnCl2 をイオン交換水に溶解し，pH 3.0 に HCl で調整し120 g/L グ ル コ ー ス，3 g/L(NH4)2SO4 ，1 g/L K2HPO4 ，が，A. luchuensis NBRC4314( Yamada et al. 2016 )や A.

たもの．培養には，500 mL 容の肩付き(坂口)フラス

tubingensis CBS134.48 とゲノムの大きさはほぼ同じである．
筆者らは，WU-2223L 株を供試菌として，世界に先駆

コに 60 mL SLZ 培地を分注し，分生子を接種後，30 ℃

けてクエン酸やシュウ酸の生産において有機酸の輸送系

培養し，クエン酸生産量やグルコース消費量を HPLC にが極めて重要な役割を担っていることを明らかにしたよ り 測 定 し た( Kirimura et al. 2016, 2019; Kirimura &( Kirimura et al. 2016, 2019 )．さらに，ミトコンドリア

Yoshioka 2021 )．マイコトキシンの高精度分析は，既報

にて所定時間往復振とう培養した．標準的には 12 日間からサイトゾルへのクエン酸の輸送の主経路としてミトに準じて LC-MS/MS を使用して行った( Nakagawa et

コンドリア局在型の有機酸輸送体( COCA と略，Fig. 2 )al. 2020 )．

を特定した( Kirimura et al. 2019 )．Fig. 2 に，WU-2223L
株についてのクエン酸生産の想定図を示すが，本研究でDNA や RNA の調製，プラスミドの作製や保存，遺伝子はミトコンドリア局在型の有機酸輸送体およびサイトゾ

操作

ルから細胞外へのクエン酸排出系( CEXA，これをコードする遺伝子が cexA )についても研究を進めた．

DNA，RNA，cDNA の調製や取り扱い，PCR による
DNA の 増 幅 は 既 報 に 準 じ て 行 っ た( Kirimura et al.

本研究では，WU-2223L 株がマイコトキシン非生産性

2016, 2019; Kirimura & Yoshioka 2021 )．また，遺伝子組であることを明らかにし，ゲノム編集システムの改良を

換 え の 宿 主 と し て は，Eschericia coli K-12 株 由 来 の行った．さらに，クエン酸の輸送系をコードする遺伝子

JM109, DH5α 等の各種菌株を使用した( Kirimura et al.

群を解析し，ゲノム編集システムを利用した輸送系の改2016, 2019; Kirimura & Yoshioka 2021 )．

－ 52 －

ゲノム編集システムを利用した有機酸輸送系の改変による高効率クエン酸生産糸状菌の育種

(A)

(B)
Fig.1. Classification of Aspergillus tubingensis WU-2223L based on gene and genome. (A) Phylogenetic tree of fungal strains
belonging to Aspergillus section Nigri, to re-identify strain WU-2223L. The tree was generated based on the sequencesof rDNA-ITS, β-tubulin and calmodulin genes using MEGA X (Kumar et al. 2018), in accordance with the reported
method (Hong et al. 2013). The sequences of these genes excluding those of strain WU-2223L originated from thetype strains belonging to Aspergillus section Nigri (Hong et al. 2013; Varga et al. 2011) and Aspergillus oryzae (Frisvad
et al. 2019). (B) Genome comparison among typical Aspergillus section Nigri strains. The phylogenetic tree was
generated based on the similarity of conserved protein-encoding genes by Orthofinder (Emms & Kelly 2015). The
number of strain-specific genes were described as the sum of "unassigned gene" and "species-specific orthologues",
which were annotated by Orthofinder.

－ 53 －

桐

村光太郎

Table 1 Genome sequence of A. tubingensis WU-2223L
A. tubingensis
WU-2223L

A. tubingensis
CBS134.48 1)

A. luchuensis
NBRC4314 2)

Genome Size

35.0 Mb

35.2 Mb

34.7 Mb

G+C content

49.3 %

49.2 %

50.4 %

Gene models

11,493

12,322

11,691

Protein length

501

475

484

Exons per gene

3.2

3.2

2.8

Exon length465 bp495 bp660 bp1) The genome sequence analyzed by de Vries et al. (2017) was used.
2) The genome sequence and statistics were cited from Yamada et al. (2016).

Fig. 2. Metabolic pathway for production of citric acid by Aspergillus tubingensis WU-2223L.
Abbreviations: CS, citrate synthase; TP, glucose transporter.

糸状菌の形質転換とゲノム編集

転写解析と qPCR による遺伝子コピー数の決定

糸状菌の形質転換や CRISPR/Cas9 system とguideRNA(gRNA)expression cassettes を使用するゲノム編集は，

cexA の転写解析は，Thermal Cycler Dice ® Real Time
System Lite(Takara)および TBGreen® Premix Ex Taq™

既報に準じて行った( Kirimura et al. 2016, 2019; Yoshioka

II(Tli RNaseH Plus)(Takara)を使用した RT-qPCR 法に& Kirimura, 2021 )．

よって行った．cexA cDNA は ISOGEN II（ニッポンジー－ 54 －

ゲノム編集システムを利用した有機酸輸送系の改変による高効率クエン酸生産糸状菌の育種

ン）と GeneAce cDNA Synthesis Kit（ニッポンジーン）を使用して調製し(Yoshioka & Kirimura, 2021)，cexA のコ

al. 2020)の両面からそれらの非生産性を検証した．まず，
WU-2223L 株のゲノム情報より各マイコトキシンの生合

ピー数は，cexA 増幅のために設計した cexA_F3 および成遺伝子クラスターを探索した．アフラトキシンとパツ

cexA_R3 primers を使用して行った(未発表)．

リンでは，該当する遺伝子が存在しなかった．つぎに，
オクラトキシンとフモニシンでは，Fig. 3 および Fig. 4

実験結果に示すように，それぞれの生産菌の有する完全長のクラスターと比べて数十 kb に渡る大規模な欠損が存在する

マイコトキシン非生産性の検証

ことを明らかにした．また，該当箇所を検出するための食 品 や 医 薬 品 製 造 の 分 野 で は，Aspergillus Section

プライマーを作製し，PCR によって得られた増幅産物

Nigri に属する菌株は安全性が高いとみなされており，
アメリカ食品医薬品局( FDA )より食品添加物に与えの長さを調べた．Fig. 3(B)と Fig. 4(B)に示すように ,ら れ る 安 全 基 準 合 格 証 と し て の GRAS(Generally

増幅産物の塩基配列を決定し，ゲノム情報との一致を確

Recognized As Safe)の認定も受けている．しかし，一認した．なお，WU-2223L 株のゲノム配列を精査し，微部の菌株のゲノムには，マイコトキシン生合成の遺伝子生物が産生する毒素(いわゆる生物毒)をコードするよクラスターが存在するとの指摘があり( Frisvad et al.

うな遺伝子が存在しないことも確認した．一方 , 代謝産

2011; Susca et al. 2014, 2016 )，工業微生物については安物の解析として，クエン酸生産培地にて培養した培養液

全性の観点からマイコトキシン生産性の有無を判別する

上清を濃縮して LC-MS/MS による高精度分析に供し，ことが重要な課題となっている．そこで，WU-2223L 株

いずれのマイコトキシンも不検出(検出限界未満)であのマイコトキシン生産性について検証した．Aspergillus

ることを確認した((独)農業・食品産業技術総合研究

属糸状菌で懸念されるマイコトキシンは，オクラトキシ

機構，食品総合研究所，中川博之主任研究員との共同研

ン，フモニシン，アフラトキシンおよびパツリンである

究として実施)．以上より，A. tubingensis WU-2223L がため，WU-2223L 株のゲノム情報クエン酸生産糸状菌

マイコトキシン非生産性の安全なクエン酸高生産菌であ( Yoshioka, et al. 2020 )と代謝産物解析( Nakagawa et

ることを明らかにした(Yoshioka et al. 2022)．

これらはゲノム情報の通りの大きさを示した．さらに，

(A)

(B)

Fig. 3. PCR amplification of the ochratoxin biosynthetic gene cluster. (A) Schematic image of the ochratoxin biosynthetic
gene cluster in an ochratoxin-producing strain (A. niger CBS 513.88) and nonproducing strain (A. luchuensis
NBRC 4314). PCR target described the region amplified by PCR, i.e., the primers annealing sites. (B) Agarose gelelectrophoresis of PCR products. Lane M represents the molecular weight marker (λ/StyI) digest. Lanes 1 and 2
represent the PCR products amplified from the genomic DNA of strain WU-2223L and A. luchuensis NBRC 4314,
respectively. Note that the region between ota1 and ANI_1_1838134 was partially conserved, but its intermediate
sequences were not found in the genome sequences of strain WU-2223L or A. luchuensis.
PCR conditions are the followings:
The primer pair Pr1 and Pr2 was used for the amplification of the putative ochratoxin biosynthetic gene cluster inthe genome of A. tubingensis WU-2223L by KOD FX Neo (Toyobo, Osaka, Japan). The PCR amplification program
was as follows: denaturation at 94 ℃ for 2 min, followed by 35 cycles of denaturation at 98 ℃ for 10 s, annealing at
61 ℃ for 30 s, and extension at 68 ℃ for 2 min.
Pr1: TRY GRK RGC RGA AGG GGR TGC KTA W
Pr2: AYT GGA AGG TMR YR A GGT MYG GCR G－ 55 －

桐

村

光太郎

(A)

(B)

Fig. 4. PCR amplification of the fumonisin biosynthetic gene cluster. (A) Schematic image of the fumonisin biosynthetic genecluster in an ochratoxin-producing strain (A. niger ATCC1015) and nonproducing strain (A. luchuensis NBRC 4314).
PCR target described the region amplified by PCR, i.e., the primers annealing sites. (B) Agarose gel electrophoresisof PCR products. Lane M represents the molecular weight marker (λ/StyI) digest. Lanes 1 and 2 represent the PCR
products amplified from the genomic DNA of strain WU-2223L and A. luchuensis NBRC 4314, respectively.
The primer pair Pr3 and Pr4 was used for the amplification of the putative fumonisin biosynthetic gene cluster in the
genome of A. tubingensis WU-2223L by KOD FX Neo (Toyobo, Osaka, Japan). The PCR amplification program was asfollows: denaturation at 94 ℃ for 2 min, followed by 35 cycles of denaturation at 98 ℃ for 10 s, annealing at 63 ℃ for
30 s, and extension at 68 ℃ for 3 min. The genomic DNA of A. luchuensis NBRC 4314, a ochratoxin- and fumonisin-noproducing safe strain used for brewing was also used under the same conditions as the positive control.
Pr3: ATG CGC CT T CA A T T T CAT CC
Pr4: CAT A AT ACG CGC CAG T T T ATC G

Table 2 Genes encoding mitochondrial organic acids transporter in the genome of strain WU-2223L
Gene

Locus tag in
A. tubingensis
WU-2223L

Locus tag in
A. niger
CBS513.88

Putative transport substrates

cocA

AtWU_10869

ANI_1_874084

Citrate/2-oxoglutarate

ctpA

AtWU_07281

ANI_1_1474094

Citrate/malate

dicA

AtWU_06197

ANI_1_234024

Dicarboxylate

dicB

AtWU_06565

ANI_1_356094

2-Oxoglutarate/malate

ggcA

AtWU_07325

ANI_1_1282064

2-Oxoglutarate/malate

oacA

AtWU_01160

ANI_1_942124

Oxaloacetate

odcA

AtWU_08996

ANI_1_206074

2-Oxoglutarate

ミトコンドリア局在型の有機酸輸送体をコードする遺伝でゲノム配列が登録されている A. niger CBS513.88 のも子群の解析のを対照として示す．これらの遺伝子は locus tag の番

WU-2223L 株のゲノム情報より，ミトコンドリアから

号から明らかなように，ゲノム上にクラスターとして局

サイトゾルへのクエン酸の輸送に関わるミトコンドリア

在するわけではなく，ゲノム上の各所に分散しているこ

局在型の有機酸輸送体(対向輸送を行うと想定されるもとがわかる．本研究では，Table 2 に示す各遺伝子につの)をコードする遺伝子は 12 個存在することが判明しいてノックアウト株を作製し，作製した種々の株についた．さらに，クエン酸発酵条件下ではその中で 7 個が転ては表現型(寒天培地上での形態や分生子の形状)を調写されていた．Table 2 に推定される基質とともに各遺べた．遺伝子 cocA はクエン酸と 2 -オキソグルタル酸等

伝子と locus tag，cocA や ctpA のような(遺伝子の)略の対向輸送体( COCA )を，遺伝子 ctpA はクエン酸と号を示す．locus tag については，クエン酸生産糸状菌

リンゴ酸の対向輸送体( CTPA )をコードすると想定さ－ 56 －

ゲノム編集システムを利用した有機酸輸送系の改変による高効率クエン酸生産糸状菌の育種

れ，クエン酸生産と密接に関連すると想定された．これ察されなかった．しかし，個々の分生子表層の状態を電らの遺伝子ノックアウト株と原株である WU-2223L 株の子顕微鏡で観察すると一部の菌株には相違が認められた

固体寒天培地上での生育や電子顕微鏡による分生子形成ことから，現在さらに詳細に検討している(未発表)．

の比較を行った．Fig. 5(A)に示すように，寒天培地上

他の 5 種の遺伝子ノックアウト株については，表現型ので は WU-2223L 株 と 比 較 し て ctpA ノ ッ ク ア ウ ト 株

相違は認められなかった(未発表)．

( ΔctpA )については大きな相違は観察されなかったが，cocA ノックアウト株( ΔcocA )ではどの培地を使用した
場合にも生育遅延が観察された．一方，Fig. 5(B)に示

遺伝子ノックアウト株のクエン酸生産性

すように，分生子形成については 3 株について変化は観地を使用したクエン酸発酵試験を行った．6 種の遺伝子

7 種の各遺伝子ノックアウト株について，SLZ 液体培

(A)

(B)
Fig. 5. The phenotype of A. tubingensis strains, WU-2223L, cocA-knockout strain (ΔcocA) and ctpA-knockout strain(ΔctpA). (A) The growth on agar medium. The conidia of each strain were inoculated onto MEA or CYA agar
medium and incubated at 25 ℃ or 37 ℃ . The legend of each sample is shown in white box at bottom right.
(B) The microscopic image of conidiophore in each strain. The scale bar represents 100 μm.

－ 57 －

桐

村光太郎

ノックアウト株についてはクエン酸生産量に大きな変化の遺伝子のノックアウトと外来のマーカー遺伝子の消去は認められなかったが，cocA ノックアウト株についてを同時に実行可能なゲノム編集システムの開発に成功しはクエン酸生産量が激減した．筆者らは，既報で薬剤耐た(未発表)．本研究で用いた方法では，sC 遺伝子に予性遺伝子の挿入による cocA 遺伝子破壊でクエン酸生産

め ptrA を 挿 入 し た ノ ッ ク ア ウ ト 株 を 作 製 し て お き，量が激減することを明らかにしているが，本研究ではゲノム編集により得られたマーカー遺伝子非挿入かつ対象

ptrA と標的遺伝子に対してゲノム編集を行い sC 遺伝子座へのノックインによる相補で形質転換体を選抜した．

遺伝子( open reading frame )を完全に欠失した株を用

本法は各ミトコンドリア輸送体のノックアウト，さらにいてこの点を再確認したことになる．また，クエン酸と細胞膜に存在するミトコンドリア排出系 cexA の遺伝子

リンゴ酸の対向輸送を行うとされる ctpA ノックアウト

ノックアウトおよび cexA 高発現株の作製に当該方法を株ではクエン酸生産量に変化が見られなかった(未発適用した．

表)．すなわち，WU-2223L 株では，クエン酸生産に関与する輸送系遺伝子は ctpA ではなく cocA であることをメタノール効果非依存性のクエン酸高生産株の作製

遺伝子破壊による方法( Kirimura et al. 2016, 2019 )のクエン酸をサイトゾルから細胞外に排出するタンパク

みならずゲノム編集システムによる遺伝子ノックアウト

質をコードする遺伝子に関しては，ゲノム比較研究を基で再確認したことになる．

に独立した 2 つの研究グループから発表された(Odoni

ゲノム編集システムの改良

et al. 2019; Steiger et al. 2019)．特定の Aspergillus 属糸状菌のゲノムに遍在する当該遺伝子は，現在ではクエン酸

筆者らは，安定性や改変の容易さに優れた DNA を排出体( citrate exporter )をコードするものとして cexA

gRNA 源として利用することに着目し，WU-2223L 株のと呼称されている．しかし，クエン酸を大量に生産する育種に適したゲノム編集システムを作製している菌株で cexA が唯一のサイトゾルから細胞外への排出系(Yoshioka & Kirimura, 2021)．選択マーカーとしては，

遺 伝 子 で あ る か ど う か は 不 明 で あ っ た． 一 方，ATP スルフリラーゼをコードする sC 遺伝子や硝酸還元

WU-2223L 株ではゲノム上に cexA が 1 個存在し，オル

酵素をコードする niaD 遺伝子を使用している．本研究

ソログは存在しなかった．そこで，本研究で新規に開発

では，複数の gRNA 配列を 1 つの DNA 断片として糸状したゲノム編集システムを駆使して，WU-2223L 株由来

菌細胞に導入することで，複数の遺伝子が高効率で同時の cexA 遺伝子ノックアウト株を作製し，クエン酸生産に置換されることを想定し，sC および硝酸還元酵素を試験を実施した．当該 cexA 遺伝子ノックアウト株では，コードする niaD 遺伝子を標的に遺伝子ノックインを利当然のことながら cexA 遺伝子の転写はないことを確認

用して遺伝子ノックアウトを行った．sC に対してはピリした．さらに，cexA 遺伝子ノックアウト株では培地へ

チアミン耐性遺伝子( ptrA )の挿入，niaD に対してはのクエン酸の排出は認められなかった．すなわち，cexA

プロモーターと ORF を含む約 1.6 kb の欠失を起こすノッのノックアウトによってクエン酸非生産株が作製されたクインドナー DNA を使用した．予想通り，WU-2223Lこと，換言すればサイトゾルから細胞外へのクエン酸輸

株由来の相同組換え効率向上株を宿主として，セレン酸

送系をコードする遺伝子が cexA だけであることが明ら

耐性株として単離された．また，sC のノックアウト株かになった．一方，本研究では 2 %(v/v)メタノール添は全てその遺伝子座に ptrA が挿入されており，それら加条件下でのグルコース 120 g/L からのクエン酸生産をの 95 %以上が niaD も同時に(意図したとおりにノック

標準条件としている．Table 3 に示すように，WU-2223L

インによって)ノックアウトされていた．また，遺伝子株はグルコースを炭素源とした場合には 2 %(v/v)メタ

置換株の選択マーカーとして利用する sC 遺伝子に関し

ノール添加条件下でクエン酸を高生産する．なお，従来て分子内相同組換えを利用して sC 遺伝子の相補(復帰)はこのメタノール効果の標的がどこにあるのかが不明でによるマーカーレスキューが可能なノックインドナーをあったが，筆者らは cexA がこの標的の 1 つと予想した．

作製した(Yoshioka & Kirimura, 2021)．さらに，本研究

すなわち，グルコースを炭素源とした場合には異化抑制

では後述の研究に適するように改良を加え，遺伝子置換によって cexA の発現が抑制されること，2 %(v/v)メタに際して繰り返し利用可能なマーカーレスキュー法を開ノール添加によってこれが解除されることを作業仮説と発した．すなわち，上記の方法で取得した目的の遺伝子

し，この点について検証することとした．グルコース存

変異を有する sC ノックアウト株において分子内相同組

在下で機能する高発現プロモーターの 1 つに tef プロモー換えによりワンステップで sC +(メチオニン非要求性)

タ ー が 知 ら れ て い る( Nakari-Settälä & Pnettilä 1995;となるノックインドナーを構築した．また，より簡便な

Kitamoto 1998 )．筆者らは，tef プロモーターの下流に遺伝子ノックアウト法として Fig. 6 に示すように，特定cexA 遺 伝 子 を 配 置 し た 遺 伝 子 カ セ ッ ト を 作 製 し－ 58 －

ゲノム編集システムを利用した有機酸輸送系の改変による高効率クエン酸生産糸状菌の育種

(A)

(B)
Fig. 6. Schematic representation of genome editing for knock-out of genes encoding mitochondrial transporters.
(A) The marker gene, which leads to auxotroph by its knock-out, was disrupted by insertion of uniquegene such as drug-resistant marker in advance. In this study, sC gene encoding ATP-sulfurylase was used
as "marker gene", and the resultant host strain exhibited sulfate-auxotrophy and pyrithiamine-resistancedue to insertion of ptrA into sC. (B) Scheme of seamless disruption to omitting total ORF region in targe
gene (mitochondrial transporter gene) by co-genome editing. The gRNA targeting both target and ptrA
genes were introduced into fungal protoplast with Cas9 nuclease and knock-in donors (vector DNA forsC-complementation and replacement of target gene). double strand break (DSB) was induced in these gene
locus. Subsequently, the gene knock-out for complementation of marker gene and disruption of target geneoccurred by homologous recombination (HR), i.e., in this study, sC was complemented by re-introduction of
intact sC by donor DNA containing flanking region and ORF. Finally, the objective transformant was isolated
as prototrophic strain: in this study, sulfate-assimilating isolate derived from sC-complementation.

Table 3 Effects of methanol on citric acid production
StrainCitric acid (g/L)

WU-2223L 株に導入したところ，当該遺伝子カセットが2 個導入された組換え株 LhC-2 を取得した．Table 3 に示すように，LhC-2 株は，2 %(v/v)メタノール添加条
件でも無添加条件でも高いクエン酸生産を示し，しかもWU-2223L
with methanol67

2 %(v/v)メタノール添加条件下の WU-2223L 株より高without methanol

19

いクエン酸生産量を示した．すなわち，cexA 高発現株を作製することによって，メタノール無添加条件下でもLhC-2
with methanol

78

クエン酸高生産が可能な株，すなわちメタノール効果非

without methanol

74

依存性のクエン酸高生産株の作製に成功した．

Under the standard conditions, 2 % (v/v) methanol wasadded to the synthetic medium (SL Z medium)
containing 120 g/L glucose as sole carbon source.
Cultivations were per formed by shake culture in
500 mL-Sakaguchi flasks containing 60 mL medium at
30 ℃ for 12 days.

考察

本研究では，ゲノム情報に基づくマイコトキシン遺伝
子群の解析と代謝産物の高精度分析の両者の検討から，
A. tubingensis WU-2223L がマイコトキシン非生産性の安－ 59 －

桐

村光太郎

全なクエン酸高生産菌であることを明らかにした．また，イトゾルへのクエン酸の輸送が対向輸送型で，サイトゾ

適切なプライマーを使用した PCR による解析を併せてルから細胞外へのクエン酸の排出が ATP 利用型，すな

実施し，ゲノム情報から予想される大きさ(だけ)に増わちエネルギー消費型の輸送系であることは，供試菌に幅産物が現れることを明らかにした．これらの結果は，

おいてはクエン酸輸送の使い分けがなされていることをゲ ノ ム 解 析 に 基 づ く 検 証 を 明 確 に 支 持 す る． な お，意味する．クエン酸発酵という特異な現象は，クエン酸

Fig. 3(B)と Fig. 4(B)に示すように，非特異的な増幅産の輸送に関しては，ミトコンドリアからサイトゾル，サ物が検出されないことから，プライマー設計と PCR 条

イトゾルから細胞外への 2 つの輸送系の協調によって成件が極めて適切に設定されたことがわかる．ゲノム配列立していると考えられる．今後の課題として，CEXA へが明らかにされていない Aspergillus 属糸状菌に関してのエネルギー供給(あるいは ATP 供給)がどのようにも，当該 PCR 条件を適用すれば，オクラトキシンとフ行われているのかを解明することが重要である．特異的モニシンの生合成遺伝子クラスターの検出が可能と考えな仕組み( machinery )をコードする cexA およびそのられる．

遺伝子産物である CEXA の両者の機能を解明することに本研究では，ミトコンドリア局在型の有機酸輸送体に関する 7 種の遺伝子ノックアウト株を作製し，cocA 遺よって，クエン酸発酵の機構がより明確になると考えられる．

伝子の重要性を再確認することができた．現在，各ノッ

以上より，本研究の結果は，ゲノム編集システムを利クアウト株における(ノックアウトした遺伝子以外の)用した有機酸輸送系の改変による高効率クエン酸生産糸

他の有機酸輸送体遺伝子の転写状況を検討中である．さ

状菌の育種が可能なことを明らかにしている．

らに，cocA と ctpA の二重ノックアウト株を作成すると，

要増殖が極めて遅延すること，クエン酸が全く生産されなくなることを見出した(未発表)．すなわち，cocA ノッ

約

クアウト株では ctpA 遺伝子が cocA の欠損を相補してい本研究では，ゲノム編集システムを利用した有機酸輸

ること，cocA と ctpA の二重ノックアウト株ではミトコ

送系の改変による高効率クエン酸生産糸状菌の育種を目

ンドリアからサイトゾルへのクエン酸の輸送が極めて困的とした研究を実施した．供試菌としては Aspergillus

難になり生育への大きな悪影響があることを予想していSection Nigri に 属 す る Aspergillus tubingensis WU-2223Lる．本研究で取得した種々のノックアウト株を有効に使株を使用した．Aspergillus 属糸状菌で懸念されるマイコ

用して，ミトコンドリア局在型の有機酸輸送体に関する

トキシンは，オクラトキシン，フモニシン，アフラトキ

詳細な機構解明を進める予定である．

シンおよびパツリンであるが，ゲノム情報と LC-MS/

クエン酸発酵におけるメタノール効果に関しては，坂MS を使用した高精度代謝産物解析の両面からの検証を口と馬場( 1942 )，Moyer( 1953a, b )が独立して発表行い，WU-2223L 株がこれら 4 種のマイコトキシン非生している．メタノール効果(培地へのメタノール添加)産性であることを明らかにした．クエン酸生産条件下でによって細胞内外に種々の変化が認められるが( Usami

は，ミトコンドリアからサイトゾルへのクエン酸の輸送

1978; Maddox et al. 1986 )，その本質は明らかにされてに関わるミトコンドリア局在型の有機酸輸送体(対向輸いなかった．本研究で使用した WU-2223L 株は 2 %(v/v)

送を行うと想定されるもの)をコードする遺伝子 12 個

メタノール添加条件下でグルコースからのクエン酸生産の中で 7 個が転写されていることを確認したため，ゲノ量が高い(メタノール効果を示す)が，cexA 高発現株

ム編集システムを利用して各遺伝子のノックアウト株をである LhC-2 株はメタノール無添加条件下でもクエン作製した．7 種のノックアウト株の中で，クエン酸と酸生産量が高く，メタノール効果非依存性の生産株の作

2-オキソグルタル酸の対向輸送を行うと想定されるタン製に成功した．本研究で，メタノール効果にクエン酸排パクをコードする遺伝子 cocA ノックアウト株でクエン

出系タンパクをコードする cexA が関与することを初め酸生産が激減した．したがって，ミトコンドリアの有機て明らかにしたことは意義深いと考えている．とくに，酸輸送体では，COCA タンパクがクエン酸生産に貢献しcexA 高発現株の作製によってメタノール効果非依存性の生産株の作製，さらにグルコースによる異化抑制を解ていると考えられる．Aspergillus 属糸状菌では，クエン除したクエン酸生産糸状菌の育種を可能にしたことは他する遺伝子が cexA とされるが，WU-2223L 株ゲノムにの有機酸発酵研究全般への波及効果は極めて大きい．

も cexA が存在する．そこで，ゲノム編集システムによcexA の遺伝子解析から(結果省略)，CEXA はプロト
ン流入共役型の排出タンパク質と想定され，敷衍すれば

り cexA ノックアウト株を作製し諸性質を検討したとこ

間接的には ATP 利用型である．ミトコンドリアからサ

わち，cexA のノックアウトによってクエン酸非生産株

酸をサイトゾルから細胞外に排出するタンパクをコード

ろ，培地へのクエン酸の排出は認められなかった．すな－ 60 －

ゲノム編集システムを利用した有機酸輸送系の改変による高効率クエン酸生産糸状菌の育種が作製されたこと，換言すればサイトゾルから細胞外へ

for enhanced glucose consumption in oxalic acid producing
Aspergillus niger expressing oxaloacetate hydrolase gene. J.
Biosci. Bioengineer. 129: 172-176.
2) Yoshioka, I. & Kirimura, K. 2021. Rapid and marker-freegene replacement in citric acid-producing Aspergillus
tubingensis (A. niger) WU-2223L by the CRISPR/Cas9
system -based genome editing technique using DNA
fragments encoding sgRNAs. J. Biosci. Bioengineer. 131:579-588.
3) Yoshioka, I., Nakagawa, H. & Kirimura, K. 2022.
Nonproduction of mycotoxins by citric acid hyperproducer
Aspergillus tubingensis (A. niger) WU-2223L: Evidence forits biosafety based on the analyses of genome sequence andmetabolites. JSM Mycotoxins. (paper submitted)のクエン酸輸送系をコードする遺伝子が cexA だけであることが明らかになった．つぎに，グルコース存在下で高発現が可能な tef プロモーターの下流に cexA 遺伝子を配置した遺伝子カセットを作製し WU-2223L 株に導入
し，高発現株を作製した．cexA 遺伝子が 2 個導入された組換え株 LhC-2 は，親株 WU-2223L 株より高いクエン酸生産量を示した．以上より，本研究の結果は，ゲノム編集システムを利用した有機酸輸送系の改変による高効率クエン酸生産糸状菌の育種が可能なことを明らかにしている．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表1) 吉岡 育哲, 桐村 光太郎．クエン酸生産糸状菌Aspergillus
tubingensis (A. niger) WU-2223Lを宿主としたCRISPR/
Cas9システムによる高効率かつ迅速な遺伝子置換. 日本農芸化学会2020年度大会(福岡), 講演要旨集 3A08a09 (2020年3月).
2) 小田 祐之亮, 滝口 有沙, 吉岡 育哲, 桐村 光太郎．タンパク
質データベースを利用したin silico解析による新規アコ
ニット酸イソメラーゼの探索と活性の検出. 日本農芸化学会2020年度大会(福岡), 講演要旨集 3C03p02(2020年3月).
3) 飯塚 恭平, 佐伯 詩歩, 石井 義孝, 桐村 光太郎．Aspergillus
niger NRRL328由来Ⅲ型PKS An-CryAを利用した新規ポリケチドの合成．日本化学会第100回春季年会(千葉), 講演
予稿集 2PC-158 (2020年3月).
4) 吉岡 育哲, 高橋 弘喜, 楠屋 陽子, 矢口 貴志, 桐村 光太郎．
クエン酸高生産菌Aspergillus tubingensis WU-2223Lのドラ
フトゲノムの決定．日本農芸化学会2021年度大会（仙台）,
講演要旨集 2A03-03 79 (2021年3月).
5) 大浦 智之, 吉岡 育哲, 脇本 紗梨, 桐村 光太郎．ゲノム編集システムを用いたクエン酸生産糸状菌におるミトコンド
リア局在型クエン酸輸送体遺伝子ノックアウト株の作製と性能評価,日本農芸化学会2021年度大会（仙台）, 講演要旨
集 2B02-01 123 (2021年3月).
6) 飯塚 恭平, 石井 義孝, 桐村 光太郎．III型PKSを利用した
methylmalonyl-CoA からの新規多置換芳香族化合物の合成. 日本農芸化学会2021年度大会（仙台）, 講演要旨集
2A01-01 60 (2021年3月).
7) 吉岡 育哲, 桐村 光太郎．クエン酸高生産糸状菌Aspergillus
tubingensis (A. niger) WU -2223Lの育種を目的とした
CRISPR/Cas9システムを利用した遺伝子置換法の開発．
第73回日本生物工学会大会(オンライン), 講演要旨集
G2H4 (2021年10月).
8) 柴田 朗, 吉岡, 育哲, 中川, 博之, 桐村 光太郎．ゲノムおよび代謝産物の分析に基づくクエン酸高生産菌Aspergillus
tubingensis WU-2223Lのマイコトキシン非生産性の検証.
日本農芸化学会2022年度大会(オンライン), 講演要旨集
4B02-11 (2022年3月).
原著論文
1) Yoshioka, I., Kobayashi, K. & Kirimura, K. 2020.
Overexpression of the gene encoding alternative oxidase謝

辞本研究は，公益財団法人発酵研究所 2020 年度 大型研
究助成(課題番号L-2020-3-021 )を得て実施しました．

本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所ならびに関連各位に深く感謝の意を表し，厚く御礼申し上げます．マイコトキシンを含む代謝産物の高精度分析について共同研究を実施していただ
いた(独)農業・食品産業技術総合研究機構，食品総合研究所の中川博之主任研究員に感謝の意を表します．

文

献Andersen, M.R., Salazar, M.P., Schaap, P.J., et al. 2011.
Comparative genomics of citric-acid-producing Aspergillus
niger ATCC 1015 versus enzyme -producing CBS 513.88.
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Bennett, J.W. 2010. An overview of the genus Aspergillus, p 1–17.
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Emms, D.M. & Kelly, S. 2015. OrthoFinder: solving fundamental
biases in whole genome comparisons dramatically improves
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Frisvad, J.C., Hubka, V., Ezekiel, C.N., Hong, S.B., Nováková,A., Chen, A.J., Arzanlou, M., L arsen, T.O., Sklená ř , F.,
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aflatoxins, ochratoxins and other mycotoxins. Studies in
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－ 62 －

2016 年度寄付講座助成の研究報告
助成期間:2016 年 10 月～ 2022 年 3 月

IFO Res.Commun. 36
63-73, 2022

細菌の環境適応・機能進化機構の包括的理解と環境細菌の高度利用
および未開拓潜在機能開発への応用
永

田

裕

二

東北大学大学院生命科学研究科微生物進化機能開発寄附講座〒980-8577

仙台市青葉区片平2-1-1

Comprehensive studies on bacterial adaptation and evolution mechanisms
and development of advanced technologies to use unexplored bacterial functions
Yuji Nagata
Graduate School of Life Sciences, Tohoku University
2-1-1 Katahira, Aoba-ku, Sendai 980-8577
The main purposes of this study were (i) to understand comprehensively the evolutionary mechanisms behind theemergence of artificially synthesized environmental pollutants-metabolizing bacteria and (ii) to develop newtechnologies to use unexplored microbial functions. We focused on γ -HCH-degrading bacteria, and conductedstudies at the gene (genome), enzyme, cell, and population levels. At the gene (genome) level, it was demonstrated
that genome evolution related to γ -HCH metabolic function in the soil microbial population is ongoing. In addition,
it was suggested that MV may function as a reser voir of genetic information. At the enzyme level, the highpotential of dehalogenases and their usefulness as materials for functional development were demonstrated. At thecell level, structural information on ABC transporter essential for γ -HCH utilization was obtained. In addition, theCO2-dependent high-yield growth under oligotrophic conditions (HYGO phenotype) was found, and its mechanism
was partially revealed. At population level, it was obser ved that a clonal population diversified and coexisted
through experimental evolution, and the involvement of TBDR in the coexistence was demonstrated. In addition,
the importance of non-degrading bacteria in the γ -HCH-degrading bacterial community was demonstrated, andsome mechanisms we found in this study are directly applicable for practical application such as bioremediation.

第一章

はじめに

遺伝子群は，発現制御系を備えたセットとして存在し，可動性遺伝因子に載って環境細菌中に流布していること

人類の活動によって，様々な化学物質が環境中に放出が明らかになっている（ Tsuda et al., 1999 ）．これに対され，深刻な環境問題を引き起こしている一方で，人為して，人工農薬などの高度に難分解性の環境汚染物質に起源の難分解性物質をも分解・資化する微生物の存在がついては，完全分解細菌の報告例はあるものの（ Janssen

知られている（ Janssen et al., 2005 ）．それら微生物は，
比較的短期間で新奇物質代謝能を獲得したと考えられ，

et al., 2005; Nagata et al., 2016 ），それら細菌がどのように新奇代謝能力を獲得したのかは不明な点が多い．

環境浄化への応用だけなく，生物の環境適応・進化機構

有機塩素系殺虫剤 γ - ヘキサクロロシクロヘキサンの解明という基礎学問的にも優れた研究対象である．こ（ γ -HCH ）は人為起源の難分解性物質であり，ストック

れまでに，様々な環境汚染物質分解資化細菌に関する研

ホ ル ム 条 約 に よ り 残 留 性 有 機 汚 染 物 質（ Persistent

究が行われ，難分解性の環境汚染物質の中では比較的易Organic Pollutants, POPs ）にも指定され，その汚染に分解性である芳香族化合物の分解資化細菌の分解代謝系

対する国際的な取り組みが求められている．HCH にはE-mail: aynaga@ig.tohoku.ac.jp
教員:永田 裕二（現，東北大学大学院生命科学研究科）．
矢野 大和（現，国立感染症研究所）．
加藤 広海（現，東北大学大学院生命科学研究科）．
佐藤 優花里（現，東北大学大学院生命科学研究科）．

8 つの異性体（鏡像異性体を含めると 9 つ）が存在する．
殺虫活性を有するのは γ -HCH のみであるが，工業生産の際に，主に 4 つの異性体 α-，β-，γ -，δ- 体が生じ，これら異性体の全てが環境中に残留し，汚染物質として問題になっている（ Vijgen et al., 2011 ）．中でも β-HCH は－ 63 －

永田

塩素原子の全てがシクロヘキサン環のエクアトリアルの裕

二位置に存在するために化学的に最も安定である．

γ -HCH の完全分解が可能であるが，代謝過程で有毒な
dead-end 産 物 を 生 じ る（ Fig. 1 ）． ま た，linA，linB，

γ -HCH 分解資化細菌 Sphingobium japonicum UT26 株
は，γ -HCH が 12 年間散布された日本の試験圃場から単linC は構成的に発現している（ Nagata et al., 2007 ）．さらに，lin 遺伝子群はゲノム中に散在し，第一染色体に離 さ れ た（ Imai et al., 1989; Senoo et al., 1989 ）．UT26存在する linA，linB，linC はオペロンを形成していない

株は γ -HCH を唯一炭素源として生育し，その代謝経路（ Nagata et al., 2011 ）．linA，linC および linRED クラスと代謝反応を触媒する酵素，およびそれら酵素をコード

ターの近傍には挿入配列 IS6100 が存在し，lin 遺伝子群する lin 遺伝子群が解明された（ Fig. 1 ）．

の遺伝的不安定さの主要因となっている．このように，本代謝経路において，γ -HCH は各種芳香族化合物代謝

UT26 株の γ -HCH 代謝経路は洗練度が低く，成立して経路における共通の中間代謝産物である β-ケトアジピン酸

間もない代謝系であることを示唆する多くの特徴を有しを 経 て 代 謝 さ れ る た め，LinA（ γ -HCH dehydrochlori-ている（ Nagata et al., 2019 ）．

nase ），LinB（ 1,4-TCDN halidohydrolase ），LinC（ 2,5-

UT26 株以外にも，γ -HCH を分解資化する細菌株が世DDOL dehydrogenase ），LinD（ 2,5-DCHQ reductive

界各地の汚染環境から単離されているが，分解に関与す

dehalogenase ），LinE（ CHQ 1,2-dioxygenase ），LinF（マる酵素遺伝子が解明されている γ -HCH 分解資化菌は，

レイル酢酸 reductase ）の 6 つの代謝酵素によって担わほぼ全てスフィンゴモナッド細菌群に属する（ Lal et al.,れる β -ケトアジピン酸までの代謝が γ -HCH 分解に特異2010）．スフィンゴモナッド細菌群は Alphaproteobacteria

的な反応と考えられる（Nagata et al., 2007）．UT26 株は，に属するグラム陰性菌で，外膜にリポ多糖を持たずにス

Fig.1 Functions necessar y for γ -HCH utilization in sphingomonads (Nagata et al., 2019). β-Ketoadipate
pathway is common pathway for the degradation of aromatic compounds and is widely distributed among
environmental bacteria. 1,2,4-TCB and 2,5-DCP are dead-end products, and 2,5-DCP has toxic effect on
the cells. The LinKLNM-type ABC transporter, which is an inherent function in sphingomonads, isinvolved in the tolerance for the toxic effect of 2,5-DCP.

－ 64 －

細菌の環境適応・機能進化機構の包括的理解と環境細菌の高度利用および未開拓潜在機能開発への応用

フィンゴ糖脂質を持ち（ Kawahara et al., 1990 ），多様なず，γ -HCH 分解能を持たないスフィンゴモナッド株に難分解性物質の分解能を有する株が単離されていることも保存されており，スフィンゴモナッド細菌群がコア機から，潜在的に多彩な物質代謝能を有する細菌群と考え能として有する γ -HCH 分解に必要な因子と考えられて

ら れ て い る（ Stolz, 2009 ）． 我 々 の 研 究 グ ル ー プ は，いる（ Endo et al., 2007 ）．すなわち，適当な遺伝的背景

UT26 株に加えて，γ -HCH 分解資化細菌 Sphingomonasを持つ細菌株が特殊性の高い酵素をコードする lin 遺伝

sp. MM-1 株，Sphingobium sp. MI1205 株，Sphingobium

子群を獲得し，代表的な γ -HCH 分解細菌 Sphingobium

sp. TKS 株の全ゲノム配列を完全決定した（ Tabata etjaponicum UT26 株で解明された代謝経路で γ -HCH を分解資化すると考えられる．さらに，多様化と選択の過程

al., 2016）．
これらの株は，
16S rRNA 遺伝子の解析により，互いに系統学的にある程度離れているが，γ -HCH 分解に関しては，UT26 株の linA から linE とほぼ同一の遺を経て，進化型の γ -HCH 分解資化細菌が生まれると推察される（ Fig. 2 ）（ Nagata et al., 2019 ）．

伝子を利用する．このことは，同一起源の γ -HCH 分解

しかし，このモデルにはまだまだ多くの謎が残ってい細菌株が世界中に広まったのではなく，複数の祖先株がる．そもそも，特殊遺伝子をどこから，どのように獲得ほぼ同一の γ -HCH 代謝に必要な「特殊遺伝子」を獲得し，したのか？酵素進化のメカニズムはどのようなものなの

γ -HCH 分解細菌株が世界各地で「独立に」誕生したことを強く示唆する．また，代謝酵素遺伝子以外にも，UT26

か？進化に重要な細胞機能とはどのようなものなのか？

株の γ -HCH 分解資化には linKLMN がコードする ABC

状況は考え難く，他細菌細胞との相互作用も重要なはず

ト ラ ン ス ポ ー タ ー が 必 須 で あ る（ Endo et al., 2007 ）．

である．すなわち，集団の形成と集団としての進化はど

linKLMN ホモログは，他の γ -HCH 分解細菌株のみならのようなものなのか？

また，実際の環境中では分解細菌が単独で存在している

以上の背景を踏まえ，本寄付講座では，γ -HCH 分解
資化細菌を主な研究対象として，遺伝子（ゲノム）・酵素・細胞・集団の各レベルから細菌が有する「特殊」機能を多面的に解析することで，細菌の環境適応・機能進化機構の本質を包括的に理解し，得られる知見を元に細菌の実環境での高度利用，および画期的な未開拓潜在機能開発に応用するための基盤を確立することを目的として，研究を実施した．

第二章

研究成果の概要

1．特殊性の高い遺伝子の起源と細菌がそれら遺伝子を獲得する機構細菌が人工化合物の分解等で利用する特殊性の高い遺伝子の起源と，細菌がそれら遺伝子を獲得する機構の解
明 を 目 的 と し て，γ -HCH 分 解 資 化 細 菌 Sphingobium
japonicum UT26 株の土壌環境中でのゲノム進化に関する解析，γ -HCH 代謝における鍵反応を触媒する 2 種類の脱ハロゲン酵素 LinA と LinB をコードする遺伝子のFig. 2 Proposed model for the emergence and evolutionof γ - HCH -degrading sphingomonad strains(Nagata et al., 2019). Ancestral various nonγ -HCH-degrading sphingomonad strains with corefunctions, e.g. LinK LMN-type A BC transporterand β-ketoadipate pathway turned to be primitiveγ -HCH degraders by the acquisition of specific
lin genes using sphingomonads-specific multiple
plasmids and I S 610 0. The primitive γ - HCH
degraders were diversified by the involvement of
IS6100 and other mutations. The selective pressure
may produce the 'evolved' γ -HCH degraders.

キャプチャリング系の構築を実施すると共に，メンブレ
ンベシクル（ MV ）が遺伝情報リザーバーとしての機能する可能性について検討した．
かつて UT26 株が単離された土壌（ Imai et al., 1989;
Senoo et al., 1989 ）を γ -HCH で再汚染化したところ，菌叢が変化し，メタゲノム中の γ -HCH 分解関連遺伝子の割合が顕著に増加した．γ -HCH 分解細菌株が増加したと考えられたため，本再汚染化土壌から γ -HCH 分解細菌株を単離した．単離株の代表株である TA15 株は，
UT26 株とゲノムの基本骨格は同一であったが，lin 遺－ 65 －

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田

裕

二

伝子群の構成と存在様式が異なっていた（ Kato et al.,ある（ Tabata et al., 2016 ）．そこで，UT26 株ではゲノ

2022 ）（ Fig. 3 ）．

ム中に散在する linA から linF 遺伝子をクラスター化し特に，lin 遺伝子群の集中化と linB 遺伝子のコピー数て IS6100 を持たない他のスフィンゴモナッド株に導入の増加という顕著な違いが観察され，γ -HCH 分解機能することで，人工的な γ -HCH 分解細菌を構築した．作に関する UT26 株との違いが予想された．そこで，本株製した人工株の中には，明らかな γ -HCH 資化能を示し，の γ -HCH 分解機能を検討したところ，本株は UT26 株

dead-end 産物の蓄積量が天然株より少ないものもあり，に比べて dead-end 産物の蓄積量が少なく，γ -HCH の代

今後，天然株には存在しない発現制御系を備えさせるな

謝バランスの観点から，UT26 株に比べて進化型である

ど，本研究で得られた知見を元にして，より改良型の人可能性が示唆された（ Kato et al., 2022 ）．以上，実際の工株の作製が期待できる．さらに，これら人工株を元に土壌中で，γ -HCH 分解機能に関するゲノム進化が進行中であることを提示した．ただし，両者のゲノムの異なlinA と linB のキャプチャリング株を構築し，これら株が，当該遺伝子導入により γ -HCH 資化能を回復するこる点を詳細に解析した結果，IS6100 の転移により「UT26とを確認した．

株の構造から TA15 株の構造に変化したヶ所」だけでな

新たに蛍光標識するなどして作製した天然株由来のく，「 TA15 株の構造から UT26 株の構造に変化したヶ所」
も存在し，単純に「 UT26 株から TA15 株に変異した」

linA と linB のキャプチャリング株と，上記の人工株由来のキャプチャリング株を各種環境試料と混合し，当該のではなく，両者は共通の先祖型株から派生した株であ遺伝子の取得を試みたが，期間内で目的の遺伝子取得株ると考えられる（ Kato et al., 2022 ）．

は得られなかった．本研究で作製した既存株で，さらに一方，天然の γ -HCH 分解細菌では，分解に関与する実験を行う必要がある．しかし，本研究でのスクリーニ

lin 遺 伝 子 群 が ゲ ノ ム 中 に 散 在 し， 近 傍 に 存 在 す る
IS6100 等の影響で遺伝的に不安定であるという問題がングの過程で，明確な γ -HCH 資化能を示さないにも関わらず，γ -HCH 培地上でわずかながらクリアゾーンを

Fig. 3 Genome evolution related to the γ -HCH metabolic function in the soil microbial population (Kato et al., 2022).
γ -HCH-degrading strain, Sphingobium sp. TA15, was newly isolated from an experimental field soil from which
the archetypal γ -HCH-degrading strain, S. japonicum UT26, was isolated previously. Comparison of thecomplete genome sequences of these 2 strains revealed that TA15 shares the same basic genome backbone
with UT26, but also has the variable regions that are presumed to have changed either from UT26 or from aputative common ancestor. Organization and localization of lin genes of TA15 were different from those of
UT26. It was inferred that transposition of IS6100 had played a crucial role in these genome rearrangements.
The accumulation of toxic dead-end products in TA15 was lower than in UT26, suggesting that TA15 utilizes
γ -HCH more effectively than UT26. These results suggested that genome evolution related to the γ -HCH
metabolic function in the soil microbial population is ongoing.

－ 66 －

細菌の環境適応・機能進化機構の包括的理解と環境細菌の高度利用および未開拓潜在機能開発への応用

形成して生育する株が土壌環境試料に存在し，スクリー

2．脱ハロゲン酵素の機能進化

ニングを阻害した．このようなノイズを排除するために，脱ハロゲン酵素は，有機ハロゲン系化合物の分解の鍵

キャプチャリング株の改良を含め，さらなる取得系の改となる酵素であり，有機ハロゲン系化合物が環境汚染物

良が望まれる．

質や工業副産物など，主要な有害物質グループのひとつ

本研究では，近年，環境中で「遺伝情報のリザーバー」

であることから，応用的な観点から極めて重要な酵素でや「水平伝播のベクター」として機能することが示唆さある（ Fetzner, 1998 ）．また，様々な人工的に合成されれている MV に着目した（ Toyofuku et al., 2019; Guerrero-

た有機ハロゲン化合物が存在することから，それらに直Mandujano et al., 2017 ）．まず，γ -HCH 分解細菌 UT26

接アタックするする脱ハロゲン酵素は，酵素の起源や進株が MV を産生することを明らかにした．また，γ -HCH化，構造-機能相関関係の研究にも適した研究材料であ資化に必須の ABCトランスポーター LinKLMN 遺伝子る（ Nagata et al., 2016 ）．本研究では，脱ハロゲン酵素

破壊株では，野生株より多量の MV を産出した．さらに，の 機 能 進 化 に 関 す る 知 見 を 得 る こ と を 目 的 と し て，

UT26 株 の MV に は DNase に よ る 分 解 を 受 け に く い

γ -HCH 代謝系に関与する脱ハロゲン酵素のうち，類似酵素が知られていないユニークな脱塩化水素酵素 LinA

linA 遺伝子が含まれることを示し（ Fig. 4 ），MV が遺伝情報リザーバーとして機能する可能性を提示した．今後，（ Imai et al., 1991; Nagata et al., 1993a; Nagata et al.,

UT26 株が産出する MV に存在する遺伝情報が，実際に2016 ）と，多くの類似酵素が知られており，構造-機能

細菌細胞に取り込まれて機能するか，検討する必要がある．

相関の研究に適した HLD の一員である LinB（ Nagata
et al., 1993b; Nagata et al., 1997; Nagata et al., 2015;
Nagata et al., 2016 ）に関する解析を行った．
γ -HCH 代謝に関わる LinB は，細菌が広く有し，基質特異性が広く，活性特性が変化しやすいという特徴を有する HLD の一員である（ Moriuchi et al., 2014 ）が，既知の γ -HCH 分解菌で利用されている HLD は LinB のみである．本研究では，γ -HCH 分解細菌 UT26 株の linB
遺伝子を他の HLD あるいは HLD ホモログ遺伝子に置換した株を作製し，LinB 以外の HLD も γ -HCH 代謝に関与し得ることを明示した．さらに，HLD の γ -HCH 代
謝機能に関する実験進化系を構築し（ Fig. 5 ），特に，
error-prone PCR により変異を導入する in vitro 進化実験系において，実際に，dead-end 産物を蓄積しにくいという γ -HCH 代謝における機能が向上したと考えられる
進化型酵素の取得に成功した．
以上，in vivo での生育を指標としたスクリーニングを用いる本実験進化系は良好に機能し，γ -HCH 資化に対する HLD の進化過程の一端を観察することができたと結論した．今後，得られた進化型酵素のより詳細な解析で，LinB 型の活性の鍵となるアミノ酸残基の機能解明が期待できる．
ポ リ 塩 化 ビ フ ェ ニ ル（ PCB ）/biphenyl 分 解 細 菌
Acidovorax sp. KKS102 株（ Kimbara et al., 1989 ）は，
Betaproteobacteria に属し，全ゲノム配列も決定されてい る（ Ohtsubo et al., 2012 ）．KKS102 株 の ゲ ノ ム に，N 末 端 側 に Escherichia coli K12 株 の tRNA adenosine
deaminase（ TadA ）（ Wolf et al., 2002 ）と有意な相同性

Fig. 4 Membrane vesicle (MV) produced by UT26 haspotential as genetic information reservoir. Effectof DNase treatment on abundance of linA genein genomic DNA solution (a) and in membrane
vesicle fraction (b) was analyzed by qPCR.

を示す CDA 領域，C 末端側に HLD と相同性を示す融合タンパク質をコードする遺伝子を見出し，dahX と命名
して解析を行った．遺伝子破壊株の解析から，本酵素のCDA 領域は，通常の増殖に必須ではないが，重要であ－ 67 －

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田

裕

二

Fig. 5 Strategy for experimental evolution of haloalkane dehalogenase (HLD) and its related proteins toward γ -HCH utilization.

Fig. 6 tRNA-editing activity of DahX and its derivatives. tRNAArg_A 34CG was incubated with purified DahX and its
derivatives, and the change of A 34 to I was detected by Sanger sequencing. Note that I is sequenced as G in thissystem. Concentration of proteins and ratio of the editing (％) are shown at the top of each wave form data.

ることが明らかになった．本酵素の HLD 領域は，新奇以上，通常の増殖にも重要な tRNA-specific deaminaseの基質特性を有する HLD 活性を示した．また，CDA 領

活性を有する酵素と融合して存在する新奇な HLD を発

域は tRNA-specific deaminase 活性を示し，HLD と融合見した．

すること，および HLD 活性が tRNA-specific deaminase

さらに，酵素としても，コードする遺伝子としてもユ活性にも影響を及ぼしていると示唆された（ Fig. 6 ）．

ニークな脱塩化水素酵素である LinA が，γ -HCH 関連物－ 68 －

細菌の環境適応・機能進化機構の包括的理解と環境細菌の高度利用および未開拓潜在機能開発への応用

質だけでなく，重要な環境汚染物質である人工殺虫剤

し，（iv）大腸菌で発現・精製した LinM にリン脂質が結

DDT を DDE に変換する活性も有することを明らかにし合していると示唆された．以上の結果は，LinKLMN はた．すなわち，人工化学物質の分解に関わるユニークな

細胞膜成分の輸送を介して細胞外膜の integrity に関与す

脱ハロゲン酵素の新たな潜在能力を提示した．以上，本るという仮説を支持する．一方，LinM と LinN がそれ研究において，脱ハロゲン酵素の潜在能力の高さと機能ぞれ多量体を形成し，互いに相互作用する可能性を示唆

開発の素材としての有用性を提示することができた．

する結果が精製蛋白質のゲルろ過クロマトグラフィー解析により得られた．特に LinN については，構造学的解
析を進め，8 量体構造であることが TEM 解析により強3．細菌の環境適応・進化に関する細胞機能
細菌の環境適応・進化に関する細胞機能に関する知見をく示唆された（ Fig. 7 ）．

得ることを目的として，γ -HCH 分解資化細菌 Sphingobium

これらの結果は，LinM と LinN の多量体の内部のチャ

japonicum UT26 株の分解代謝酵素以外の γ -HCH 資化に必須な因子である ABCトランスポーター LinKLMN と，ンネルを輸送基質が通過するという LinKLMN の予想モ

本株の低栄養環境での増殖現象について解析を行った．

UT26 株は Alphaproteobacteria に属する従属栄養細菌

UT26 株の LinKLMN に関する以前の研究では，薬剤であり，生育に有機炭素源を必要とし，炭素源を添加しな耐性遺伝子で当該遺伝子を破壊した株が用いられていた

い無機塩培地では生育しないが，本株がアルコールデヒド

デル図（ Fig. 1 ）と矛盾しない．

（ Endo et al., 2007 ）ため，本研究では，当該領域のみをロゲナーゼをコードする adhX 遺伝子の高発現で炭素源非マーカーレスで完全欠失した linKLMN 破壊株を新たに添加の無機培地で CO2 依存的に細胞増殖する現象（HYGO

作製し，新たに作製した相補用プラスミドを持つ相補株表現型）を見出した（ Fig. 8 ）（ Inaba et al., 2020 ）．

と 合 わ せ て 解 析 を 行 っ た． そ の 結 果， 破 壊 株 で は，

本現象は，広く環境細菌が有する機能である可能性が（ i ）コハク酸を唯一炭素源とした際の生育能が上昇する示唆され，また，UT26 株は独立栄養細菌の CO2 固定機

こと，（ii）細胞染色剤の取り込み能が上昇すること，

構の鍵酵素遺伝子ホモログは有しておらず，HYGO 表（iii）野生株に比べて多量の MV を産生すること，が明ら現型において新規の CO2 固定経路が機能している可能かになった．さらに，LinKLMN 特有の機能を規定する性も考えられたため，機構解明を進めた．特に，より定因子と考えられる LinM と LinN の生化学的解析を実施

量的な解析が可能な qTn-Seq 法を開発し，HYGO 表現型に関与する遺伝子の網羅的同定を行った．その結果，
HYGO 表現型株は，低栄養環境下でグリオキシル酸回路
で CO2 の放出を抑えつつ，環境中に低濃度で存在するエタノールを主な基質として利用して増殖している可能性が示唆された．今後，HYGO 表現型のより詳細な機構が解明されれば，多くの環境細菌が有する常温・常圧環境

Fig. 8 CO2 -dependent high-yield growth underoligotrophic conditions (HYGO) phenotypeof Sphingobium japonicum UT26 (Inaba etal., 2020). A heterotrophic bacterium
strain UT26 can grow under oligotrophic
conditions by expression of the adhX geneencoding alcohol dehydrogenase.

Fig.7 Multimer structure of LinN, a component of
LinK LMN A BC transpor ter system. Purified
His-LinN expressed in E. coli was analyzed by
TEM (A), and 3D structure model of His-LinN
was constr ucted by using single molecules
observed by TEM analysis (B).

－ 69 －

永

田

裕

二

での CO2 固定機構として生態学的意義が大きいだけでなのある平板培地上で世代交代を繰り返した結果，染色体

く，CO2 削減問題への展開も期待できる．また，発酵産の部分欠失を持つ系統が自然発生し，その欠失をもたな業において，有用微生物を培養し物質生産するための培い系統と共存し続ける現象が観察された（ Fig. 9 ）．

地の費用は抑えるに越したことはない．従属栄養細菌がそれら系統のゲノム解析と集団のメタゲノム解析か

低栄養環境で生残し，積極的に増殖する機構が解明されら，異なる系統の共存の機構のひとつとして，TBDR ホ

れば，こうした有用細菌の培養において，栄養源の添加

モログ遺伝子に変異が起こり，膜の透過性の向上と凝集量を抑えた効率的な培養法が開発できるかもしれない．

性を獲得することが重要であることが明らかになった．

一方，浄水や工業パイプライン，医療器具など，低栄養

総じて，染色体欠失を保有する株と保有していない株のと思われる環境でも有害細菌が増殖し，問題となるケー

共存は，資源または空間のニッチ分割が保証されることスが多い．HYGO 表現型の機構は，こうした有害細菌ので成立していることが示唆された．

低栄養環境での増殖機構とも関連している可能性が考えられ，有害細菌の増殖抑制による汚染防止技術への展開

γ -HCH 分解細菌を環境試料から単離する場合，γ -HCHによる集積培養を行い，固体培地上でのシングルコロも期待できる．さらに，環境バイオテクノロジーの観点

ニーアイソレーションで分解菌を単離する．その際，一からは，分解菌が汚染環境に定着せず，十分な分解能を見シングルコロニーと思われる細胞集団の中に γ -HCH

発揮しないことがしばしば問題となっており（ Ramos et

分解細菌だけでなく非分解細菌が共存し続けることがあal., 2011 ），本現象は，分解菌を汚染環境に接種するバイ
オオーグメンテーションへの直接的応用が期待できる．

り，純粋分離に種々の培地が必要になるケースがある．
このような現象は γ -HCH 分解細菌の場合だけでなく，様々な分解細菌の分離の際にしばしば観察される現象である．本研究では，このような経緯で取得したヘテロな4．細菌集団の形成と進化
細菌集団の形成と進化に関する原理を理解し，バイオ
レメディエーションなどの実際の応用技術にも資する基

γ -HCH 分解細菌集団について解析を行った．その結果，（ i ）γ -HCH を唯一の炭素源とした液体培地による継代培礎知見を得るために，有機塩素系殺虫剤 γ -HCH 分解能

養を繰り返しても，分解菌が優占種とならないこと，力を有する細菌細胞集団を対象とした研究を実施した．

（ii）γ -HCH を唯一の炭素源とした固体培地上で，非分解

U26 株 の linA 遺 伝 子 下 流 に 緑 色 蛍 光 タ ン パ ク 質細菌の存在により長期持続的な巨大コロニーを形成する

ZsGreen1 を挿入した SHY12 株を構築し，これを祖先株こと，から非分解細菌の重要性が明らかになった．さらとして，クローナルな γ -HCH 分解細胞集団を空間構造に，本集団より単離した細菌株の解析により，非分解細Fig. 9 Coexistence of nonfluorescent and fluorescent cells in evolving populations. (A) Five population lineages evolved
on γ -HCH minimal agar plates. (B) Five population lineages evolved on glucose minimal agar plates. Up to 5％
cells in each population can be regarded as nonfluorescent cell due to the nature of data analysis.

－ 70 －

細菌の環境適応・機能進化機構の包括的理解と環境細菌の高度利用および未開拓潜在機能開発への応用

菌 が 分 解 細 菌 に コ ロ ニ ー 伸 長 す る directional colony

さらに，NKL2 株との共培養が UT26 株の土壌環境でgrowth(DCG)現象を見出すと共に，本表現型を示すの生残性の向上に寄与することが示唆された（ Fig. 10 C ）．

Cupriavidus 株が巨大コロニー形成にも重要であることを明らかにした．また，移動性細菌を利用して非移動性

すなわち，本現象のバイオレメディエーションへの直接細菌が棲息域を拡大するヒッチハイク現象（Finkelshtein

構成過程に関する多くのデータを持っており，その中で，et al., 2015; Shrivastava et al., 2018 ） が，γ -HCH 分 解 細菌で観察された．すなわち，非移動性の γ -HCH 分解細土壌細菌叢の初期形成における移動性細菌の重要性が示菌 UT26 株を移動性の Paenibacillus sp. NKL2 株と固体

多糖類（ EPS）を生産することから，易培養性細菌が EPS

培地上に共接種すると，UT26 株の棲息域拡大と広領域

を介して様々な土壌細菌と相互作用している可能性が考の γ -HCH の分解が観察された（ Fig. 10 A B ）．

えられた．そこで易培養性の Burkholderia multivorans

的な応用が期待できる．一方，我々は，土壌細菌叢の再唆されている．これら細菌種の多くが易培養性で細胞外ATCC 17616 株が生産する EPS を唯一の炭素源とする液体培地を用いて土壌微生物集団を集積培養した結果，難培養性の Verrucomicrobia 門細菌群の増殖を選択的に促進することを見出し，新たな細菌間の相互作用を利用した難培養性細菌の培養手法を提示した．

第三章

おわりに

人工の化学物質である γ -HCH を分解資化する能力を有する細菌を主な研究対象として，遺伝子（ゲノム）・
酵素・細胞・集団の各レベルから研究を実施し，遺伝子（ゲノム）レベルでは，γ -HCH 代謝機能に関するゲノム進化が実際の土壌環境中で進行中であることを明示すると共に，MV の遺伝情報のリザーバーとしての機能の可能性を提示した．酵素レベルでは，γ -HCH 分解に関与する脱ハロゲン酵素および HLD の潜在能力の高さと，自然界にはまだまだ新奇性の高い類似酵素が存在することを示した．細胞レベルでは，スフィンゴモナッド細菌
群の多彩な代謝能力を支える重要な機能と考えられる
ABCトランスポーターの機能解明に繋がる知見を得ると共に，低栄養環境での CO2 固定を伴う増殖（ HYGO
表現型）という新奇性の高い現象を見出し，その機構に関しても一定の知見を得た．HYGO 表現型は，進化において「多様化」と「選択」が必須であることを考えると，低栄養環境でも何とか細胞数を増やすことで新奇代謝能力の獲得の可能性が広がり，環境適応という観点だ
Fig.10 Paenibacillus sp. NK L 2 promoted growth of
Sphingobium japonicum UT26. Colony formationof monoculture of non-swarming UT26 (A) andco-culture of UT26 and a swarming bacterium
Paenibacillus sp. NKL2 (B) on 1/3LB plate with
γ -HCH. Clear zone around the large colony on
the plate with cloudy color derived from γ -HCH
particles indicates area where UT26 degradedγ -HCH. Ef fect of co-culturing with NK L 2 onsurvivability of UT26 (monitored by CFU) in soil
sterilized by γ-irradiation (C). Monoculture of
UT26 (cross) and co-culture of UT26 and NKL2
(circle)けでなく，進化的観点からも重要な因子であると考えられれる．集団レベルにおいては，クローナルな集団が実験進化により多様化し共存することを観察でき，共存の機構に関しても TBDR の関与を示すことができた．また，
γ -HCH 分解細菌株単独より，非分解細菌株を含む集団の方が長期持続的に γ -HCH を分解すること，およびその集団形成における Cupriavidus 株の重要性を示すと共に，移動性のある Paenibacillus 株との共存で γ -HCH 細菌株が固相での棲息域を拡げ，土壌での生残性も上昇することを示した．このような集団レベルで得られた知見
は，実際のバイオレメディエーションへの応用にも直結－ 71 －

永

田

裕

二

推進センター（ TUMUG）が実施する TUMUG 支援事する成果である．
個々の研究は，各レベルごとに行ったが，様々なレベルで解析したことにより，包括的な知見も得られた．例

業（男女共同参画・女性研究者支援事業）の支援（佐藤優花里）にも感謝致します．

えば，TBDR が HYGO 表現型にも，遺伝的に多様化し文た集団の共存にも鍵になる因子であること，γ -HCH 代
謝において，dead-end 産物の蓄積を抑えるという適応が，細菌細胞において酵素レベルでもゲノムレベルでも起こっていること，などを提示することができた．後者に関しては，さらに，γ -HCH 分解細菌集団における非分解細菌の共存の意義として，発現制御系を備えない
γ -HCH 分解細菌単独では，分解活性が細胞集団全体として強すぎる結果，dead-end 産物が溜まりやすいのに対して，非分解細菌が共存することで強すぎる活性のブレーキの役割を果たし，dead-end 産物の蓄積を抑制している可能性が予想される．すなわち，分解菌単独では不足している調節機能を他細胞の存在で補っている，と捉えることもできる．このような包括的な知見が得られたのも，本寄付講座のような体制で研究を実施することができた成果であると考えている．
なお，各論では触れられなかったが，植物発現用に改変した合成 linA 遺伝子（ Nanasato et al., 2016 ）をシロ
イヌナズナに導入し，γ -HCH 耐性および分解活性を示す形質転換完全植物体の作製に成功するなどの成果（ Deng et al., unpublished data ）を挙げることもできた．
以上，人工化学物質代謝能を有する細菌を軸として様々な角度から多様な研究を実施し，今後の関連分野の研究の発展・展開に繋がる多くの成果を挙げることができたと考えている．

謝辞本研究は公益財団法人発酵研究所の平成 28 年度寄付講座助成で行われたもので，ここに感謝の意を表します．
そして，寄付講座特任研究員（野々山翔太，現，東京工業大学）の協力のもとに実施しました．また，東北大学
大学院生命科学研究科の津田雅孝教授（定年退職），大坪嘉行准教授，東谷篤志教授，田中良和教授，渡辺正夫
教授，高田美信技術研究員，東京大学農学生命科学研究科の妹尾啓史教授，大塚重人准教授，筑波大学生命環境系の野村暢彦教授，豊福雅典准教授，山本達也博士，チェコ Masaryk 大学の Jiri Damborsky 教授，Zbynek Prokop
教授，のご支援とご協力，東北大学大学院生命科学研究
科微生物進化機能開発講座に在籍した大学院生の皆さんの協力の賜物です．あわせて感謝します．また，文部科
学省科学研究費補助金

基 盤 研 究（B）
（永田裕二

19H02865 ），挑戦的萌芽研究（永田裕二 16K14877；佐藤優花里 16K14908 ），ならびに東北大学男女共同参画

献Endo, R., Ohtsubo, Y., Tsuda, M. & Nagata, Y. (2007).
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－ 72 －

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略語一覧
ABC transporter: ATP-binding cassette transporter
CDA: cytidine deaminase
DDE: 1,1,1-dichloro-2,2-bis(4-chlorophenyl)-ethylene
DDT: 1,1,1-Trichloro-2,2-bis(4-chlorophenyl)-ethane
ECD: electron capture detector
GC: gas chromatography
GST: glutathione S-transferase
HCH: hexachlorocyclohexane
HLD: haloalkane dehalogenase
HYGO: high-yield growth under oligotrophic conditions
MV: membrane vesicle
PCB: polychlorinated biphenyl
POPs: persistent organic pollutants
TBDR: TonB-dependent receptor－ 73 －

IFO Res.Commun. 36
75-92, 2022

特殊性の高い遺伝子の起源と細菌がそれら遺伝子を獲得する機構
加藤

広海，永田

裕二

東北大学大学院生命科学研究科微生物進化機能開発寄付講座〒980-8577

仙台市青葉区片平2-1-1

Origin of highly specific genes and the mechanism by which bacteria acquire these genes
Hiromi Kato, Yuji Nagata
Laboratory of Microbial Evolution and Function Research,
Graduate School of Life Sciences, Tohoku University
2-1-1 Katahira, Aoba-ku, Sendai 980,-8577
To gain insight into the origin of highly specific genes that are used by bacteria in the degradation of artificial
compounds and the mechanism by which bacteria acquire these genes, studies were conducted on γ -HCHdegrading Sphingobium japonicum strain UT26. When the soil from which UT26 was isolated was re-contaminatedwith γ -HCH, the bacterial flora changed and the propor tion of γ -HCH degradation-related genes in the
metagenome increased. The γ -HCH-degrading bacterium strain TA15 isolated from the re-contaminated soil had
the same basic genome structure as UT26, but the organization and localization of the lin genes for the γ -HCH
degradation were different. Furthermore, TA15 may be more evolved strain than UT26 in terms of the metabolicbalance of γ -HCH. On the other hand, ar tificial γ -HCH-degrading bacterial strains were constructed byintroduction of the lin gene cluster that consists of linA to linF genes, which are dispersed on the UT26 genome,
into other sphingomonad strains. Furthermore, we constructed strains for capturing of linA/linB genes, andmixed them with various environmental samples, but did not obtain any gene-acquired strains. We demonstrated
that UT26 produces membrane vesicle (MV), and its linKLMN-deletion mutant produces larger amount of MV
than wild-type strain. The linKLMN genes encode components of ABC transporter essential for the γ -HCH
utilization. MV of UT26 contained the linA gene tolerant toward DNase, suggesting that MV may function as areservoir of genetic information.
Key words: γ -hexachlorocyclohexane, genome, metagenome, membrane vesicle, evolution

浄化に利用するという応用学的な観点の両面から研究が

緒言進められている．
有 機 塩 素 系 殺 虫 剤 γ -ヘ キ サ ク ロ ロ シ ク ロ ヘ キ サ ン

化学工業の発展に伴い，人工合成の生体異物（ xenobiotic ）（ γ -HCH ）は人為起源の難分解性物質であり，ストックが大量に製造・使用され，環境に放出された．それら化

ホ ル ム 条 約 に よ り 残 留 性 有 機 汚 染 物 質（ Persistent

学物質は，化学的な安定性のために生態系に蓄積し，ヒOrganic Pollutants, POPs ）にも指定され，その汚染にトや環境に棲息する生物に有害な影響を与え，深刻な汚対する国際的な取り組みが求められている．本物質を分染問題を引き起こしている．一方，それら物質をも分解

解 資 化 す る 細 菌 Sphingobium japonicum UT26 株 は，資化する能力を持つ微生物が存在し，生物の環境適応・

γ -HCH が 12 年間散布された日本の試験圃場から単離された（ Imai et al., 1989; Senoo et al., 1989 ）．UT26 株は進化という基礎学問的な観点，およびそれら能力を環境
E-mail: aynaga@ige.tohoku.ac.jp
共同研究者:妹尾 啓史（東京大学農学生命科学研究科）．
大塚 重人（東京大学農学生命科学研究科）．
野村 暢彦（筑波大学生命環境系）．
豊福 雅典（筑波大学生命環境系）．

γ -HCH を唯一炭素源として生育し，その代謝経路と代謝反応を触媒する酵素，およびそれら酵素をコードする
lin 遺伝子群が解明された（ Fig. 1 ）．
本代謝経路において，γ -HCH は各種芳香族化合物代謝経路における共通の中間代謝産物である β -ケトアジピ－ 75 －

加藤

広海，永田

裕二

Fig.1 Degradation pathway of γ -HCH in S. japonicum UT26. TCA, citrate/tricarboxylic acid cycle; GSH, glutathione(reduced form); GS-SG, glutathione (oxidized form). Square brackets show unstable compounds that have
yet to be detected

ン酸を経て代謝される．多くの環境細菌が本物質の代謝

有機ハロゲン化合物に対して活性を示す（ Nagata et al.,能を有するため，β -ケトアジピン酸までの代謝が γ -HCH

2015 ）．

分解に特異的な反応と考えられる．γ -HCH の β -ケトアジ

UT26 株は，γ -HCH の完全分解が可能であるが，代謝ピン酸への変換には，linA，linB，linC，linD，linE，linF

過程で有毒な dead-end 産物である 1,2,4 -トリクロロベン

遺伝子がコードする LinA（ γ -HCH dehydrochlorinase ），ゼン（1,2,4-TCB）と 2,5 -ジクロロフェノール（2,5-DCP ）LinB（ 1,4-TCDN halidohydrolase ），LinC（ 2,5-DDOLを生じる（ Fig. 1 ）．また，linA，linB，linC は構成的にdehydrogenase ），LinD（ 2,5-DCHQ reductive dehaloge-

発現している（ Nagata et al., 2007 ）．さらに，lin 遺伝子

nase ），LinE（ CHQ 1,2-dioxygenase ），LinF（ マ レ イ

群はゲノム中に散在し，第一染色体に存在する linA，

ル 酢 酸 reductase ） の 6 つ の 代 謝 酵 素 が 必 要 で あ る．

linB，linC はオペロンを形成していない（ Nagata et al.,2011 ）．プラスミド pCHQ1 に存在する下流代謝経路遺LinA の基質特異性は狭く，検討された基質の中では
γ -HCH ，γ -PCCH ，α-HCH ，δ-HCH に 対 し て の み 活 性が検出され，β-HCH や他の検討された塩素化合物には

伝子 linD，linE はオペロンを形成し，近傍に存在する

活 性 を 示 さ な か っ た（ Nagata et al., 1993a ）． ま た，

linR がコードする LysR タイプの転写制御因子により発現誘導を受ける（ Miyauchi et al., 2002 ）．linA，linC お

LinA は触媒に補因子が必要ではなく，類似酵素の報告

よび linRED クラスターの近傍には挿入配列 IS6100 ががなく，特殊性が高い新規の脱塩化水素酵素と考えられ存在し，lin 遺伝子群の遺伝的不安定さの主要因となっるが，立体構造的な観点から反応機構が明らかになってている（ Nagata et al., 2011 ）．このように，UT26 株のい る（ Okai et al., 2010 ）．LinB は α/β­ hydrolase foldfamily に 属 す る 加 水 分 解 酵 素 で あ り（ Nagata et al.,γ -HCH 代謝経路は洗練度が低く，成立して間もない代謝系であることを示唆する多くの特徴を有している

1993b; Nagata et al., 1997 ），細菌に広く存在するハロア（ Nagata et al., 2019 ）．

ルカンデハロゲナーゼ(HLD)の一員である（ Nagata et

UT26 株以外にも，γ -HCH を分解資化する細菌株が世al., 2015 ）．一般的に HLD は基質特異性が広く，様々な
有 機 ハ ロ ゲ ン 化 合 物 に 活 性 を 示 し，LinB も α-HCH ，

界各地の汚染環境から単離されているが，分解に関与す

β-HCH，δ-HCH などの HCH 関連物質以外にも，様々なほぼ全てスフィンゴモナッド細菌群に属する（ Lal et al.,る酵素遺伝子が解明されている γ -HCH 分解資化菌は，－ 76 －

特殊性の高い遺伝子の起源と細菌がそれら遺伝子を獲得する機構

2010）．スフィンゴモナッド細菌群は Alphaproteobacteria

く未解明である．このように，人為起源の汚染物質によに属するグラム陰性菌で，外膜にリポ多糖を持たずにスる選択圧によって細菌の代謝機能が進化することはもは

フィンゴ糖脂質を持ち（ Kawahara et al., 1990 ），多様なや明らかといえるが，その機構については不明な点が多難分解性物質の分解能を有する株が単離されていること

い．近年，分子遺伝学，分子生態学やゲノム科学の研究から，潜在的に多彩な物質代謝能を有する細菌群と考えが進み，遺伝子水平伝播の重要性が改めて注目されていら れ て い る（ Stolz, 2009 ）． 我 々 の 研 究 グ ル ー プ は，る．環境汚染物質分解においても，分解遺伝子伝播の重UT26 株に加えて，γ -HCH 分解資化細菌 Sphingomonas

要性が，以下の知見から指摘されている．（ i ）系統的に

sp. MM-1 株，Sphingobium sp. MI1205 株，Sphingobium

近い分解遺伝子あるいは遺伝子クラスターが地理的に遠sp. TKS 株の全ゲノム配列を完全決定した（ Tabata etい地域から分離された細菌株から見出されている

al., 2016 ）．これらの株は，16S rRNA 遺伝子の解析により，互いに系統学的にある程度離れているが，γ -HCH

（ Whyte et al., 2002 ）．（ii）同じ汚染物を分解できる違う菌株の分解遺伝子の系統関係は宿主菌の 16S rRNA 遺伝

分解に関しては，UT26 株の linA から linE とほぼ同一

子 の 系 統 関 係 と 一 致 し て い な い（ McGowan et al.,の遺伝子を利用する．このことは，同一起源の γ -HCH

1998 ）．（iii）分解遺伝子あるいは遺伝子クラスターと宿分解細菌株が世界中に広まったのではなく，複数の祖先

主菌のゲノムの G+C 含量は明らかに差がある（ Fong et株がほぼ同一の γ -HCH 代謝に必要な「特殊遺伝子」をal., 2000 ）．（iv）汚染物分解遺伝子が MGE 上に位置する（ Top et al., 2002 ）．

獲得し，γ -HCH 分解細菌株が世界各地で「独立に」誕生したことを強く示唆する．また，代謝酵素遺伝子以外

これまでに同定された環境汚染物質分解酵素遺伝子のにも，UT26 株の γ -HCH 分解資化には linKLMN がコー

多くは純粋培養された分解菌株由来であるが，自然環境

ドする ABCトランスポーターが必須である（ Endo et

中の微生物の 99％以上は単離培養が困難と考えられてal., 2007 ）．linKLMN ホモログは，他の γ -HCH 分解細菌
株のみならず，γ -HCH 分解能を持たないスフィンゴモ

おり（ Amann et al., 1995 ），これらの難培養性微生物由

ナッド株にも保存されており，スフィンゴモナッド細菌

は 2,4 -ジクロロフェノキシ酢酸（ 2,4-D ）分解プラスミ

群がコア機能として有する γ -HCH 分解に必要な因子とド pJP4 の tfdA 遺伝子を欠失させ，当該プラスミド保有

来の遺伝子資源の開発と利用も期待されている．Top ら考えられている（ Endo et al., 2007 ）．すなわち，適当な株による 2,4-D 汚染土壌からの tfdA 遺伝子の獲得に成功

遺伝的背景を持つ細菌株が特殊性の高い酵素をコードすしている（ Top et al., 1996 ）．また，我々は，UT26 株のる lin 遺 伝 子 群 を 獲 得 し， 代 表 的 な γ -HCH 分 解 細 菌

linB 破壊株を γ -HCH 汚染土壌由来の細菌集団と混合し，Sphingobium japonicum UT26 株で解明された代謝経路
で γ -HCH を分解資化すると考えられる（ Nagata et al.,linB を有するプラスミド pLB1 を獲得した（ Miyazaki et2019 ）．一方，天然の γ -HCH 分解細菌株は，UT26 株同al., 2006 ）．これらの例は，環境において汚染物質の分解遺伝子が様々な MGEs に担われて転移し，微生物の様に，（ i ）lin 遺伝子群がゲノム中に散在し，近傍に存

汚染物質に対する適応・進化に大きく貢献していること

在する挿入配列 IS6100 の影響で遺伝的に不安定であり，を強く示唆する．すなわち，逆に，こうした能力を利用

γ -HCH 分解資化能が安定維持されない，（ii）γ -HCH 代
謝 過 程 に お い て dead-end 産 物 で あ る 1,2,4-TCB として環境中の遺伝子資源を取得することも可能であると

2,5-DCP を生じる，という適応の不十分さを強く示唆すを高感度で効率的に行うには，取得対象以外の関連遺伝

る特徴を有している．これら特徴は γ -HCH 分解細菌株

子を安定に保持するなど，優れた受容菌細胞の利用が望の環境浄化への応用や，遺伝子キャプチャリングの宿主

まれる．

考えられる．このような遺伝子のキャプチャリング実験としての利用の際に問題となり，天然株より安定かつ効

難培養性細菌とそれらが保持する遺伝子を解析する手

率的に γ -HCH 分解資化能を発揮する組換え細菌株の育法として，近年，メタゲノム解析が用いられている．本種が望まれる．

手法では，菌株を単離培養する過程を経ずに，環境試料

難分解性物質の分解遺伝子が可動性遺伝因子（ mobile

あるいは細菌集団から直接ゲノム DNA を抽出し，シー

genetic element, MGE ）に乗って微生物集団に伝播する

ケンスを行う．HCH 類汚染土壌に関してもメタゲノム

ことは良く知られているが，それらは，芳香族化合物代

解析がなされている．Sangwan ら（ 2012 ）は，HCH 濃

謝系の遺伝子が制御系を備えたクラスターという「セッ

度が 450,000 ppm という非常に高レベルの汚染土壌のメト」として転移するケースがほとんどであり（ Tsuda et

タゲノム解析により，本環境では HCH 分解能を有する

al., 1999 ），γ -HCH 分解代謝遺伝子群のようにゲノム上に散在する遺伝子群がどのように伝播するのか，また，

株 の 報 告 例 の あ る Pseudomonas 属，Sphingomonas 属，そもそも特殊性が極めて高い linA の起源については全

Novosphingobium 属，Sphingopyxis 属が高い割合を占めていたことを解明した．また，HCH 類による高濃度，－ 77 －

加藤

広海，永田

裕二

および低濃度の汚染土壌のメタゲノム中の構成遺伝子の来の DNA 断片，RNA など様々な細胞内成分を内包して存在比率を比較した結果，高濃度汚染土壌では lin 遺伝

おり，それら成分を細胞外に分泌，あるいは他細胞に輸子群の中でも linA，linB，および linC がより多く検出送している（ Toyofuku et al., 2019; Guerrero-Mandujano

され，また，lin 遺伝子群以外にも，芳香族化合物代謝やストレス耐性，運動性・走化性に関わるタンパク質をet al., 2017 ）．また，内包する化合物の量や種類は生育条件や外界環境によって変化する．これらの点から MV

コードする遺伝子の存在割合が明らかに高かったは，微生物の分泌システムのひとつであると考えられて（ Sangwan et al., 2012 ）．さらに，高濃度汚染土壌では水いる（ Guerrero-Mandujano et al., 2017 ）．細胞外に放出

平伝達に関する遺伝子も多く存在し，当該環境においてされる化合物は MV に内包されることで分解から保護さ

遺伝的流動性（ genetic mobility ）が上昇していることれる．例えば DNA は MV に内包されることで DNase にが示唆された．なお，HCH 類汚染土壌のメタゲノムデー

よる分解から保護される（ Rumbo et al., 2011 ）．また，タから HCH 分解資化菌である B90A 株と UT26 株の祖

MV は 代 謝 産 物 の 輸 送 以 外 に も 遺 伝 子 の 水 平 伝 播，

先株 genotype の再構築が試みられている（ Sangwan et

ファージの感染抑制，細菌間コミュニケーションなど細al., 2014 ）． 構 築 さ れ た 祖 先 株 の genotype の サ イ ズ は
B90A 株および UT26 株のゲノムサイズよりも小さく，菌の生態に広く関与している．MV を介した水平伝播は，抗生物質カルバペネムの耐性遺伝子を含むプラスミドがこの祖先株が linA と linC を水平伝播によって獲得したMV を 介 し て 非 耐 性 菌 に 移 る こ と が Acinetobacterと考えられた．ただし，HCH 汚染土壌の経時的なメタゲノム解析は行われておらず，HCH 汚染によりどのよ

baumannii 株で初めて報告された（ Rumbo et al., 2011 ）．
ほぼ同一の lin 遺伝子群を保持し，複数の祖先株からうな時間スケールで土壌メタゲノムが変化していくの

進化した考えられる γ -HCH 分解細菌株が単離されていか，その変動過程は不明である．その変動過程の解析にるが，これら株の γ -HCH 資化能と分解活性は，体系立

より，HCH 汚染と HCH 分解に関する遺伝子及び菌株のてて比較されていない．また，天然の γ -HCH 分解細菌

関係を解明すること，および，環境中に豊富になった分

株は γ -HCH 代謝への適応が不十分であり，環境浄化へ

解細菌株の単離及びゲノム解析により，これら菌株のの応用や，遺伝子キャプチャリングの宿主としての利用

HCH に対する適応・進化過程を解明することが期待さの際に問題となる．一方，祖先株が，どこからどのようれる．

にして lin 遺伝子群を獲得したかは依然として不明であγ -HCH 分解細菌について様々な研究が行われてきたが，lin 遺伝子群が環境中でどのように存在するのかはる．以上の背景を踏まえ，本研究では，高機能分解資化
細菌株の育種手法および未開拓遺伝子資源の有効利用法

未解明のままである．これまでの環境メタゲノミクスのの確立も見据え，（ i ）実験室環境下で γ -HCH で再汚染化

研究によって，微生物の DNA は必ずしも微生物細胞内した土壌における γ -HCH 分解細菌の量的・質的変動ののゲノムとして存在しているとは限らず，細胞外の溶液

解析，（ii）天然株より安定かつ効率的に γ -HCH 分解資化中に浮遊したり，鉱物や有機物等に吸着した状態で存在能を発揮する組換え細菌株の育種，（iii）環境試料から特していることが知られており，細胞外 DNA と呼ばれて殊性の高い lin 遺伝子である linA と linB の機能を有するいる（ Nagler et al., 2018 ）．このような無機化合物や有遺伝子を取得することを具体的な課題とした．さらに，

機化合物に付着した DNA は分解されにくくなることが（iv）γ -HCH 分解細菌の MV の遺伝情報のリザーバーと

報 告 さ れ て い る（ Levy-Booth et al., 2007 ）． 例 え ば，しての機能についても検討した．

DNA が砂や粘土の微粒子，バイオフィルムやメンブレ

実験方法

ンベシクル（ MV ）に吸着すると，比較的安定に存在できる（ Agnelli et al., 2007; Nielsen et al., 2007; Vorkapic
et al., 2016; Schwechheimer and Kuehn, 2015 ）．これらの点から，lin 遺伝子群も環境中において何らかの構造

実験室環境下で γ -HCH で再汚染化した土壌における物に付着した状態で存在している可能性がある．特に本γ -HCH を分解資化する細菌株 Sphingobium japonicum
UT26 株 が 単 離 さ れ た 土 壌（ Imai et al., 1989; Senoo et

研究では，近年，環境中で「遺伝情報のリザーバー」や「水平伝播のベクター」として機能することが示唆され

γ -HCH 分解細菌の量的・質的変動の解析ている MV に着目した．MV の直径については様々な報

al., 1989 ）を人工的に γ -HCH で再汚染化し，メタゲノ
ム解析により経時的に γ -HCH の存在による土壌中の微告があるが，おおよそ 20 - 400 nm である（ Toyofuku et

生物群集や γ -HCH 分解代謝に関与する遺伝子の変動をal., 2019; Guerrero-Mandujano et al., 2017 ）．MV は外膜タンパク質，ペリプラズムタンパク質，細胞質タンパク観察した．本汚染土壌（以下 TH と呼称）は，1973 年から 2008 年 6 月まで 10 ppm の γ -HCH を年 1 回土壌に投与

質，酵素，細菌毒素，抗原，プラスミド DNA，染色体由した．3 年目以降に高い分解活性が観察され，1986 年に－ 78 －

特殊性の高い遺伝子の起源と細菌がそれら遺伝子を獲得する機構

本土壌試料から集積培養を経て UT26 株の由来株が単離た（ Buchfink et al., 2015 ）．DIAMOND のデフォルトのされた（ Imai et al., 1989; Senoo et al., 1989 ）．また同土条件で得られたリードに対して，identity 98％以上，ク壌の γ -HCH 汚染経験のないコントロール土壌を TC とエリカバレッジ 30％以上のものをヒットリードとしてした．本研究では 2009 年 12 月に採取し，-80 ℃で凍結集計し，各遺伝子にヒットしたリード数をデータベース

保存したものを暗所，室温で一晩放置して融解させて使中の各アミノ酸の長さで除し，さらにサンプル間の存在

用した．採取時点の TH では γ -HCH 濃度が検出下限未量を比較するためにトータルリード数で除し，これを各満であり，γ -HCH 分解細菌の密度も低いと考えられた．

遺伝子の存在量（gene abundance ）として比較解析した．

TH を γ -HCH で再汚染することで，γ -HCH 汚染に伴う

γ -HCH 分解代謝細菌株の存在の可能性が高い試料か
ら，γ -HCH 分解代謝細菌株の単離を行った．汚染土壌

lin 関連遺伝子群の動態を調べた．ガラス製の容器に150 g の TH を 移 し， 土 壌 の γ -HCH 濃 度 が 1,000 ppmの懸濁液を γ -HCH を含む寒天培地に接種して培養し，（ TH-L ） ま た は 10,000 ppm（ TH-H ） に な る よ う にコロニー周辺に γ -HCH 分解の指標であるクリアゾーン

γ -HCH を添加した．HCH を再添加しない TH をコント
ロ ー ル と し た（ TH-C）．TH-L ，TH-H ，TH-C を 暗 所を形成した株を純粋分離した．単離した株のうち，新規株と推定された株について，生理的及び分子生物学的な25 ℃で培養し，適宜土壌を少量採取し，HCH 濃度測定

解析を行い，UT26 株と比較した．新規株の全ゲノム決とメタゲノム解析に供した．土壌（ TC，TH ，TH-C，

定では，イルミナ社によるショートリードシーケンスとTH-L および TH-H ）からのメタゲノム DNA の抽出にはOxford Nanopore によるロングリードシーケンスを合わ

DNeasy PowerSoil Kit（ Qiagen 社）を用いた．土壌メタせたハイブリッドアセンブリーを採用した．

ゲノム DNA のショットガンシーケンスのライブラリー（ insert size 350 ～ 500 bp ）を作製し，NovaSeq 6000（イルミナ社）プラットフォームにて，データ量が 15 Gb 以
上（ 150 bp，pair-end ）になるようにシーケンスした．各γ -HCH 代謝酵素遺伝子人工クラスターを利用した天然株より優れた資化細菌の育種

サンプルのリードデータについて，Metaxa 2 version2.2

γ -HCH を各種芳香族化合物代謝経路における共通の中間代謝産物である β -ケトアジピン酸にまで変換する（ Bengtsson-Palme et al., 2015 ）を用いて，small subunit

過程（ Fig. 1 ）が γ -HCH 分解に特異的な反応と考えられ(SSU: 16S/18S)rRNA 遺伝子のリードを抽出し，系統アるため，本変換過程に必要な linA から linF の 6 つの酵

サインを行った．またメタゲノムリード中の γ -HCH 分

素遺伝子を並べた人工 lin 遺伝子クラスターを作製した

解関連酵素遺伝子 linA ～ linJ および挿入配列 IS6100 の（ Fig. 2 ）．

tnp の存在量を調査した．UT26 株が有する上記遺伝子のアミノ酸配列をデータベースに，メタゲノムリードをLinA の活性が次段階に作用する LinB の活性より相対的クエリに設定し，相同性解析を行った．相同性解析には，に強いと，より多くの dead-end 産物を生じることを考BLSTX よりも高速で解析が可能な DIAMOND を使用し

慮し，linB と linA をクラスターの先頭と最後尾にそれ

本クラスターでは，γ -HCH 初発分解反応を触媒する

Fig. 2 Construction of lin gene clusters used in this study.

－ 79 －

加藤広海，永田ぞれ配置した．まず，挿入したクラスターの発現が，ベ裕二

クターとして用いる広宿主域プラスミド pBBR1 MCS-5

linA, linB をそれぞれ含まない lin 遺伝子人工クラス
ター上流に Pu プロモーターを配した linA 欠失プラスミ（ Kovach et al., 1995 ）由来のプロモーターからの影響を

ド pSL53 と，linB 欠 失 プ ラ ス ミ ド pSL63 を 作 製 し た

受けることを考慮し，クラスター挿入予定位置の上流に（ Fig. 2 ）．これらを Sphingobium chlorophenolicum L-1 株

T1 ターミネーターを導入したプラスミド pBBR5T を作と Sphingomonas sangiunis IAM12578 株 に 導 入 し，製した．次に，pBBR5T にクラスターを導入して pSL42

L-1(pSL53)株，L-1(pSL63)株 と IAM1578(pSL53)株，を作製した（Fig. 2 ）．さらに，pSL42 では，T1 ターミネー

IAM12578(pSL63)株を作製した．これら株に linA 発現

ター下流にリンカー DNA 配列を導入しており，本配列

プ ラ ス ミ ド pKSLA あ る い は linB 発 現 プ ラ ス ミ ドを利用して，強い構成的発現プロモーター Pu（ NagatapKSLBH を導入し，各遺伝子相補による γ -HCH 資化能

et al., 1999 ） と， 弱 い 構 成 的 発 現 プ ロ モ ー タ ー Prpm
（ Kaczmarczyk et al., 2013 ）を挿入したプラスミドを作を確認した．

製し，それぞれ pSL43，pSL44 と命名した（ Fig. 2 ）．

γ -HCH 分解遺伝子 MV の遺伝情報リザーバーとしての機能

γ -HCH 分解活性の評価には検出器として ECD を装備したガスクロマトグラフィー（ GC ）を用いた．また，

UT26 株の培養上清から，超遠心および密度勾配遠心

γ -HCH 資化能は，1/10W 無機培地（ Inaba et al., 2020 ）に γ -HCH を 750 mg/L と な る よ う に 加 え て 作 製 し た（ 10 ～ 45％のイオジキサノール）により推定 MV 画分を

γ -HCH 固体培地に菌体をスポットし，30 ℃で培養して評価した（スポットアッセイ）．

合 し 発 色 す る 蛍 光 色 素（ FM4-64 ま た は FM1-43 ，調製した．MV の検出や定量には脂質二重膜特異的に結Thermo Fisher Scientific 社）を用いた．さらに画分に含まれる粒子状物質の粒径分布を測定すると共に，透過型

環境試料からの linA および linB 機能を有する遺伝子の電子顕微鏡（ TEM ）で観察した．MV 画分中に lin 関連

取得の試み

遺伝子をコードする DNA 断片が含まれているか調べる

UT26 株はアルコールデヒドロゲナーゼをコードする

ために，画分を鋳型とした linA および IS6100 を対象と

adhX 遺伝子の高発現突然変異により炭素源非添加無機固体培地での生育が可能となる（ Inaba et al., 2020 ）．本

した PCR を行い，産物の増幅を電気泳動で確認した．

突然変異は比較的高頻度で起こるため，γ -HCH プレー

たは内包された状態の DNA ）由来なのか，それ以外の

さらに，この増幅が MV-associated DNA（ MV に吸着まトでの生育を指標に目的株をスクリーニングする際の障フリー DNA 由来なのかを調べた．フリー DNA を除去

害となる．そこで，UT26 株由来の linA を欠失した YO5するために MV 画分を DNase 処理し，その際，DNase

株，linB を欠失した UTDB2 株の adhX 破壊株を pAK405

処理と未処理のサンプルでの DNA 量の変化を，linA 特（ Kaczmarczyk et al., 2012 ）を用いた相同組換えにより異的なプライマーを用いて qPCR で分析した．

作製し，それぞれ YO5DAX 株，UTDB2DAX 株と命名

結果および考察した．さらに，キャプチャリング株の挙動が観察し易い
よ う に，YO5DAX 株 の linB 遺 伝 子 の 下 流 に dsRed2sj，
UTDB2DAX 株 の 元 株 で linB が 存 在 し た 部 位 に
zsGreen1sj を挿入し，蛍光タンパク質を構成的に発現す
る YO5DAXR 株と UTDB2DAXG 株を作製した．
土壌試料として，愛媛県の農業試験場の非汚染土壌に
γ -HCH を添加し，2 年以上静置した土壌（ H 土壌）と，
非汚染土壌（ C 土壌）を用いた．本土壌は当研究室で細実験室環境下で γ -HCH で再汚染化した土壌における
γ -HCH 分解細菌の量的・質的変動の解析

γ -HCH 汚染歴がある TH 土壌を環境試料とした．凍結保存した TH 土壌を融解し，γ -HCH 濃度を測定した
結果，残留 γ -HCH は検出限界以下であった．10 ppm の菌の土壌中での挙動の解明を目的とした様々な研究に使γ -HCH の 年 1 回 投 与 の 操 作 が 最 後 に 行 わ れ た 2008 年
6 月から 2009 年 12 月までに γ -HCH がほぼ完全に分解さわれており，知見が蓄積されている（ Nishiyama et al.,れたと考えられる．また，R2A 培地で CFU 法により菌2010; Nishiyama et al., 2012; Nagata et al., 2014; Nagayama

体数を測定したところ，コロニーを形成する細菌細胞数

et al., 2015; Kato et al., 2015 ）．YO5DAXR 株を接種した
H 土壌，C 土壌をそれぞれ HY，CY，UTDB2DAXG 株

は接種後 1 日目では 7.4×106 CFU/g soil，7 日目では 5.25を接種した H 土壌，C 土壌をそれぞれ HU，CU とした．

γ -HCH 再汚染初濃度を 1000 ppm に調整した TH-L 土
壌，10000 ppm に調整した TH-H 土壌を 0 日目，157 日目，

γ -HCH 分解菌のスクリーニングは，γ -HCH 固体培地に試料を塗布し，本培地上で生育し，周囲にクリアゾー
ンを形成するコロニーを選抜した．

×107 CFU/g soil であった．

230 日目にサンプリングし，γ -HCH の濃度を測定した．
その結果，汚染 0 日目の γ -HCH 濃度測定値は TH-L で－ 80 －

特殊性の高い遺伝子の起源と細菌がそれら遺伝子を獲得する機構

1,313 ppm，TH-H で 9,994 ppm で，ほぼ理論値通りであった．TH-L の γ -HCH 濃度は 157 日目に 18 ppm，230 日目

γ -HCH の再添加で γ -HCH 分解細菌の数も増加したと示唆される．顕著な γ -HCH 分解が観察されなかったに 3 ppm まで減少した一方，TH-H の γ -HCH 濃度は 230

TH-H でもこれら遺伝子は TH-L より増加しており，今日目経っても 10,000 ppm レベルを維持し，顕著な減少

後大規模な γ -HCH の分解が起こる可能性も考えられる．

は観察されなかった．この結果は，本土壌に γ -HCH を

また，TH-H では linA 及び IS6100 の存在量が顕著に上分解できる微生物は存在しているが，非常に高濃度で汚昇していた．γ -HCH 代謝経路の初発分解遺伝子である

染した場合には，γ -HCH の分解が抑制される可能性を示唆する．なお，TH-C の γ -HCH 濃度は検出限界以下

linA と，γ -HCH 分解代謝遺伝子の水平伝達に重要な役割を果たすと考えられている IS6100 が顕著に増加してであった．

いることは，TH-H 土壌において単に既存の分解細菌株

TH 土 壌 及 び 再 汚 染 開 始 か ら 157 日 目 の TH-L ，が増殖したのではなく，γ -HCH に対して直接的に作用

TH-H，TH-C 土壌からメタゲノム DNA を回収し，ショッする分解酵素遺伝子の増幅と水平伝播が γ -HCH 濃度依ト ガ ン シ ー ケ ン ス に よ っ て γ -HCH 代 謝 に 特 異 的 な存的に活発に進行していることを示唆する．
土壌細菌叢の系統組成を解明するため，各土壌試料

γ -HCH から β-ケトアジピン酸までの反応を触媒する酵素遺伝子 linA ～ linF 及び IS6100 の存在量を解析した．

由来のメタゲノムデータに対して Metaxa2 による解各土壌試料のサンプルでは，全て 1 億リード以上，合計

析 を 行 っ た． ま ず，class レ ベ ル で は，TH-C，TH1，

15 Gb 以上のデータが取得できた．Diamond を用いた

TH2 の間に大きな違いはなかったが，TH-L と TH-H

blastx 解析を行った結果，TH-C 由来のメタゲノム DNA

で は Alphaproteobacteria 綱 や Actinobacteria 綱 が 多 く，からは lin 遺伝子及び IS6100 は検出できず，TH 由来の

Acidobacteria 綱が少なかった（ Fig. 4 a ）．
さらに，family レベルでは，TH-L と TH-H においてメ タ ゲ ノ ム DNA で linA を 1 read，IS6100 を 2 reads 検
出した．これに対して，γ -HCH を添加した土壌 TH-L ，
TH-H 由来のメタゲノム DNA からは多くのこれら遺伝

Sphingomonadaceae 科の存在割合が TH-C，TH と比較して顕著に高かった（ Fig. 4 b ）．また，Sphingomonadaceae

子の reads を検出できた．各遺伝子のアミノ酸残基数お科の genus 組成では，TH-C，TH では Sphingobium 属のよび合計リード数で標準化した遺伝子の存在割合を比較

割合が非常に低いレベルであったが，TH-L と TH-H でした結果，157 日目の TH-L と TH-H で，TH-C より明らは Sphingobium 属の割合が高かった（Fig. 4 c ）．TH-C でか に lin 遺 伝 子 と IS6100 の 存 在 割 合 が 高 く， ま た，

は TH と class および family レベルではほとんど変化がTH-L と比べ，γ -HCH が高濃度添加された TH-H の方がなかったことから，25 ℃，暗室での長期のインキューベ

これら遺伝子の存在割合が高かった（ Fig. 3 ）．

ションでもほとんど菌叢は変化しないと考えられる．一方，Fig. 3 Gene abundance of lin genes and IS6100 in the γ -HCH re-polluted soils, based on diamond blastx analysisof the shotgun metagenomic sequencing data.

－ 81 －

加藤

広海，永田

裕二

Fig. 4 Taxonomic composition at class (a), family level (b) and genera composition within the family Sphingomonadaceae(c) in the γ -HCH re-polluted soils, based on Metaxa2 analysis of the shotgun metagenomic sequencing data.

－ 82 －

特殊性の高い遺伝子の起源と細菌がそれら遺伝子を獲得する機構

TH-L と TH-H ではこれまで HCH 分解細菌が多数報告さて比較した結果（ Kato et al., 2022 ），TA15 株の 5 つのれている Alphaproteobacteria 綱 Sphingomonadaceae 科のレプリコンは一部に重複 ･ 挿入 ･ 欠失が確認されたが，割合の増加が観察され，特に汚染に伴って Sphingobium

UT26 株の第 1 染色体，第 2 染色体，pCHQ1，pUT1，

属の割合が増加したことから，γ -HCH 汚染に対して主pUT2 と 極 め て 高 い 相 同 性 を 示 し た．lin 遺 伝 子 群 とに Sphingobium 属が応答していると推察される．

IS6100 に着目して比較した結果，TA15 株は，UT26 株

γ -HCH 再 汚 染 化 後 222 日 目 及 び 239 日 目 の TH-L ，
TH-H 土壌から，γ -HCH 寒天培地上で γ -HCH 分解活性とほぼ同一の γ -HCH 代謝酵素遺伝子 linA から linJ を有の指標であるクリアゾーン形成を伴って生育する株を複の に 対 し て，TA15 株 は 2 コ ピ ー 有 し て い た． ま た，

していた．しかし，UT26 株では linB が 1 コピーである

数単離した．これら単離株の 16S rRNA 遺伝子の塩基配

UT26 株では lin 遺伝子群がゲノム上に散在しているの列は，UT26 株のものと 99％以上の identity を示した．

に対して，TA15 株では linA と linC の位置が近く，さらさらに，これら単離株のうちの代表として，TA15 株のに，下流代謝系の遺伝子クラスター linRED がプラスミ

ゲノム配列決定を決定した（ Kato et al., 2022 ）．

ドではなく，第 1 染色体上の linA, linC 近傍領域に存在

TA15 株と UT26 株のゲノムについて，TA15 株は 16S

していた（ Fig. 5 ）．

rRNA 遺伝子の塩基配列が UT26 株のものと 100％同一

TA15 株の γ -HCH の分解能について定量的な評価をで，5 つ の 環 状 レ プ リ コ ン を 有 し て い た（ Kato et al.,

行った（ Kato et al., 2022 ）．低濃度(10 ppm)γ -HCH 培地

2022 ）．GenomeMatcher（ Ohtsubo et al., 2008 ）を用い

において γ -HCH の分解速度を測定した結果，UT26 株

Fig. 5 Localization of lin genes and IS6100 in genomes of UT26 and TA15 (Kato et al. 2022). Specific
lin genes (linA, linB, linC, and linRED) for the specific pathway for γ -HCH degradation are
shown in bold. The distance between genes in the same replicon reflects the actual scale, but thesize between replicons does not reflects the actual scale. Plasmid types of pTA15-1, pTA15-2,
and pTA15-3 are those of pCHQ1, pUT1, and pUT2, respectively (Nagata et al. 2019).

－ 83 －

加藤

広海，永田が分解開始 30 分の時点で γ -HCH を 90％以上分解し，60分で γ -HCH をほぼ完全分解した一方で，TA15 株は 30分で約 50％の γ -HCH しか分解せず，残りの γ -HCH を完全分解するのには約 180 分以上かかった（ Fig. 6 a ）．
すなわち，TA15 株の γ -HCH 分解速度は UT26 株より裕二

γ -HCH 代謝酵素遺伝子人工クラスターを利用した天然株より優れた資化細菌の育種
γ -HCH を β -ケトアジピン酸にまで変換する過程に必
要な linA から linF の 6 つの酵素遺伝子を並べた人工 lin
遺伝子クラスターを作製し，導入株における lin genes

遅かった．しかし，高濃度（ 50 ppm ）の γ -HCH 培地にの 発 現 が，
( i )pSL43:高 い レ ベ ル で 構 成 的 に 発 現，

お い て，γ -HCH 代 謝 過 程 で LinA 活 性 だ け で 生 じ る(ii)pSL44:比較的低レベルで構成的に発現，(iii)pSL42:

dead-end 産物の 1,2,4-TCB と，LinA 活性と LinB 活性で極めて低レベルで発現，となることが期待される 3 種の生じる dead-end 産物の 2,5-DCP の産出量を検討したとプラスミドを作製した（ Fig. 2 ）．
宿 主 菌 株 と し て，β -ケ ト ア ジ ピ ン 酸 代 謝 能 を 有 しころ，TA15 株では UT26 株よりいずれの dead-end 産物

IS6100 を保持しない 2 種の環境細菌株（ Sphingobiumの蓄積量も少なかった（ Fig. 6 b ）．
以上，TH 土壌の γ -HCH による再汚染により，γ -HCH
に対する土壌細菌叢及び γ -HCH 分解関連遺伝子の変動

chlorophenolicum L -1 株，Sphingomonas sangiunis
IAM12578 株）を選び，これらの株に pSL43 ，pSL44 ，を観察すると共に，新規な γ -HCH 分解細菌 TA15 株を

pSL42 を導入した．1/10W_γ -HCH 培地，及び炭素源を単離できた．TA15 株は，γ -HCH 代謝能における lin 遺加えない 1/10W 培地での菌体生育試験の結果を Fig. 7 a

伝子群の構成・存在様式と代謝バランスの観点から，に示した．

UT26 株に比べて「進化型」である可能性が考えられる．

IAM12578 株は，炭素源の添加と lin 遺伝子を有する

ただし，両者のゲノムの異なる点を詳細に解析した結果，

プラスミドの導入の有無にかかわらず生育した．ただし，

IS6100 の転移により「 UT26 株の構造から TA15 株の構

これら IAM12578 人工株のうち，高強度プロモーター

造に変化したヶ所」だけでなく，「 TA15 株の構造から

Pu を有するプラスミド pSL43 を導入した株のみ明らか

UT26 株の構造に変化したヶ所」も存在し，単純に「UT26に γ -HCH 分解活性を示した．一方，L-1 株では，pSL43

株から TA15 株に変異した」のではなく，両者は共通のを導入した株で明らかな γ -HCH 寒天培地上での生育と先祖型株から派生した株であると考えられる（ Kato et

γ -HCH 分解活性が観察できた．また，pSL44 を導入した L-1 株でも弱い γ -HCH 分解活性が観察された．次に，

al., 2022 ）．

pSL43 を導入した IAM12578 株と L-1 株の γ -HCH 分解活

Fig. 6 γ -HCH degradation properties of UT26 and TA15 (Kato et al. 2022). (a) For estimating
the γ -HCH degradation speed, resting cells of UT26 and TA15 were incubated in 1/10W
with 10 ppm of γ -HCH, and residual γ -HCH was measured by GC(ECD). (b) To assess
the accumulation of the dead-end products clearly, resting cells of UT26 and TA15 wereincubated in 1/10W with 50 ppm of γ -HCH for 6 hours. At the time point γ -HCH wascompletely degraded in both the strains, and concentration of 1,2,4-TCB and 2,5-DCP wasdetermined by GC(ECD). The means of three independent experiments and SD are
shown by the error bar. The ** denotes statistically significant differences between
groups (P < 0.01).

－ 84 －

特殊性の高い遺伝子の起源と細菌がそれら遺伝子を獲得する機構

Fig.7 Properties of artificial HCH-degrading bacteria. (a) Cell suspensions of L-1- and IAM12578-derived strains,whose OD660 was adjusted to 1.0, and their dilutions were spotted on 1/10W_γ -HCH and 1/10W medium andincubated for 20 days (L-1 derived strains) and 5 days (IAM12578 strains). (b) Degradation of γ -HCH (10 ppm)
in UT26, L-1(pSL43), and IAM12578(pSL43). (c) Accumulation of dead-end products (1,2,4-TCB and 2,5-DCP)in UT26, MM-1, MI1205, L-1(pSL43), and IAM12578(pSL43) during degradation of 50 ppm of γ -HCH.

性 を GC に よ り 測 定 し，UT26 株 と 比 較 し た 結 果 を環境試料からの linA および linB 機能を有する遺伝子のFig. 7 b に 示 し た．IAM12578(pSL43)株 は， 良 好 な

取得の試み

γ -HCH 分解活性を示し，90 分後に γ -HCH を 95％以上分解した．一方，L-1(pSL43)株の分解効率は非常に低く，ク質を構成的に発現する YO5DAXR 株と UTDB2DAXG

180 分 後 で も γ -HCH を 分 解 し な か っ た． た だ し，株を作製した．これら株を γ -HCH を添加し，2 年以上

IAM12578(pSL43)株と L-1(pSL43)株の dead-end 産物

静置した土壌（ H 土壌）と，非汚染土壌（ C 土壌）にの蓄積量は検討した γ -HCH 分解細菌 3 株より少なかっ接種した．YO5DAXR 株を接種した H 土壌，C 土壌をそた（Fig. 7 c）．以上の結果より，天然株より優れた γ -HCH

れぞれ HY，CY，UTDB2DAXG 株を接種した H 土壌，

分解細菌株の構築の実現性を示せた．

C 土壌をそれぞれ HU，CU とした．接種した際の菌液

UT26 株由来の linA および linB を欠失し，蛍光タンパ－ 85 －

加藤

広海，永田

裕二

の菌体数を CFU 法により測定したところ，YO5DAXR 株

UT26DLKN 株の培養上清を超遠心分離した際に生じたの菌液濃度が 2.5×108 CFU/mL ，UTDB2DAXG 株の菌ペレットを MV 画分とした（ Fig. 8 a 矢印）．

液濃度が 2.6×108 CFU/mL であり，土壌には YO5DAXR

この MV 画分とした黄色のペレットは，UT26 株と株は 1.313×10 CFU/g soil，UTDB2DAXG 株は 1.369×

UT26DLKN 株の両方で確認できた．MV の抽出に用い107 CFU/g soil となるように接種したことになる．接種した培養液の OD660 の値は，UT26 株では UT26DLKN 株

7て 10 日後に，蛍光顕微鏡により試料を観察したが，4 種に比して約 1.5 倍の値であり，少なくとも菌体総量は類の土壌由来の試料いずれからも蛍光標識された細菌細UT26 株の方が多いと考えられるが，培養上清を超遠心

胞は検出されなかった．すなわち，接種した YO5DAXR

し て 生 じ た ペ レ ッ ト（ MV 画 分 ） の 量 は 明 ら か に

株と UTDB2DAXG 株が土壌中で迅速に死滅し，これら

UT26DLKN 株の方が多かった（Fig. 8 a 矢印）．すなわち，

株が，少なくとも今回の実験系ではキャプチャリング株

UT26DLKN 株が野生株より MV を多く産出するというとして適当でないことが示唆された．しかし，全ての試

これまでの予備的知見と一致する結果が得られた．さら料から γ -HCH 固体培地上で生育し，周囲にクリアゾーに，本 MV 画分を密度勾配遠心した結果，UT26DLKN

ンを形成するコロニーが観察された．HY，HU 試料由

株では 4 バンドが確認できた（ Fig. 7 b ）．UT26 株由来

来のコロニーのクリアゾーン形成は γ -HCH 固体培地にのサンプルでは，UT26DLKN 株の b3 とほぼ同位置に存

接種後 2 週間以内で観察できたが，CY，CU 試料由来の在するバンドのみが目視で確認できたが，UT26DLKN

コロニーのクリアゾーン形成は 2 週間以上かかった．さ株の b1，b2，b4 と同位置の層も回収した．また，各バらに，4 種類の土壌由来の試料いずれにおいても，20 日

ンドをそれぞれの回収量の 1/10 倍量ずつ混合したサン

後，30 日後，40 日後由来の試料からも同様に γ -HCH 固

プルを調製し，UT26_All，UT26DLKN_All として以下体培地でクリアゾーンを形成するコロニーが観察できの解析に用いた．脂質二重膜に特異的に結合する蛍光色

た．これらからいくつかを選抜し，解析を行ったが，こ素を用いて，各バンドの脂質量を測定した結果，全てのれら株は，（ i ）UT26 由来株ではない，（ii）linA あるい

サンプルで蛍光が観測され，脂質二重膜の存在が確認では linB を保持しない，（iii）明確な γ -HCH 分解活性が観きた．すなわち，MV は脂質二重膜からなるため，得ら察されない，ことから，それ以上の解析を行わなかった．

れ た サ ン プ ル に MV が 存 在 す る こ と が 示 唆 さ れ た．

linA, linB をそれぞれ含まない lin 遺伝子人工クラスター
pSL53 と pSL63（Fig. 2 ）を Sphingobium chlorophenolicum

UT26DLKN 株では UT26 株に比べて全てのバンドで高い脂質量を示した．例えば，UT26DLKN_All は UT26_

L-1 株と Sphingomonas sangiunis IAM12578 株に導入し，All の 41 倍の脂質量を示した．以上の結果，UT26DLKN

L-1(pSL53)株，L-1(pSL63)株 と IAM1578(pSL53)株，

株は野生株に比べて多くの MV を放出すると結論した．

IAM12578(pSL63)株を作製した．これら株に linA 発現

さ ら に，UT26DLKN_All と UT26_All の 2 サ ン プ ル に

プ ラ ス ミ ド pKSLA あ る い は linB 発 現 プ ラ ス ミ ド

ついて，粒度分布測定を行った結果，最大ピークは，

pKSLBH を導入したところ，各遺伝子相補株は γ -HCH

UT26DLKN 株 で 99 nm，UT26 株 で 95 nm で あ り， 最資化能を示した．そこで，L-1 株由来キャプチャリング

頻 粒 子 の 粒 子 径 に 顕 著 な 差 は な か っ た． た だ し，

株を，（ i ）TH-L 及び TH-H 土壌に接種，（ii）TH-H 集積

UT26DLKN 株では UT26 株に比べて，127 nm のピーク

培養液由来の固体画分と混合，（iii）天然 γ -HCH 分解細が高く，MV 画分中で該当粒子径の粒子の割合が高いと菌の UT26 株，MM-1 株，MI1205 株，TKS 株と混合し，予想される．粒子濃度は，UT26DLKN 株は UT26 株のγ -HCH 資化能を獲得した遺伝子受容菌株をスクリーニ
ン グ し た．TKS 株 と L-1(pSL53)株 を 混 合 し た 際 に，6 倍の値を示し，この結果からも UT26DLKN 株が野生株より多くの MV を放出することが支持された．UT26

linA 遺伝子を取得した可能性の高い株が得られ，本系の有効性が示唆されたが，環境試料との混合実験では，明株および UT26DLKN 株の b2，b3，All サンプルの TEM

確な相補株の取得には至らなかった．

察できなかった．両株の b3，All サンプルの TEM 観察

による観察を試みたが，b2 はサンプル調製が困難で観の結果，全てのサンプルで MV と予想される球状あるいγ -HCH 分解遺伝子 MV の遺伝情報リザーバーとしての機能は球状に近い形態の粒子が観察された（Fig. 8 c d）．また，

UT26 株の γ -HCH 資化に必須の ABCトランスポーター

多く，脂質二重膜の相対定量結果と一致する傾向がみらをコードする linKLMN 遺伝子を破壊した UT26DLKN

視野内の粒子数は UT26DLKN 株由来のサンプルの方がれた．
以上，（ i ）調製した MV 画分の脂質二重膜定量，（ii）粒株では外膜が異常になり，MV を野生株より多量に産出
す る 可 能 性 が 示 唆 さ れ て い た． そ こ で，UT26 株 と径分布，（iii）TEM による観察結果から，UT26 株およUT26DLKN 株 か ら MV の 分 離 を 行 っ た．UT26 株，

び UT26DLKN 株 が 粒 径 100 ～ 200 nm 程 度 の MV を 産－ 86 －

特殊性の高い遺伝子の起源と細菌がそれら遺伝子を獲得する機構

Fig. 8 Purification of membrane vesicles (MV) from UT26 and UT26DLKN. (a) Precipitation of pellets (indicatedwith arrows) after ultracentrifugation of supernatant of the culture of UT26 (left) and UT26DLKN (right).
The pellets including MV were fractionated (indicated with arrows) by density gradient centrifugation (b).
MV fractions of UT26 (c) and UT26DLKN (d) were analyzed by TEM.

出すると結論した．これまでにスフィンゴモナッド細色素が多量に漏出する（ Endo et al., 2007; Endo et al.,菌群の MV 産生については，多環芳香族化合物分解菌

unpublished data ）．本研究で得られた結果は，これら化の Novosphingobium pentaromativorans US6 -1 株や合物が MV を介して漏出するという仮説を強く支持する

Novosphingobium sp. PP1Y 株 で 報 告 さ れ て い る（ De
Lise et al., 2019; Yun et al., 2017 ）が，Sphingobium 属あものである．Roier らは，Haemophilus influenzae およびるいは γ -HCH 分解能を有する細菌の MV 産生は，本研

Vibrio cholerae で，リン脂質トランスポーターとして機能する ABCトランスポーター VacJ/Yrb 遺伝子を破壊

究で初めて明示した．

することで MV 放出量が 2 - 4 倍程度上昇することを報

UT26 株 の γ -HCH 資 化 に 必 須 の ABCト ラ ン ス ポ ー

告している（ Roier et al., 2016 ）．ただし，当該遺伝子破ターをコードする linKLMN を欠損させた UT26DLKN壊により外膜の integrity は変化しておらず，MV 放出量

株では，野生株よりも多量の MV を産生した．linKLMNの増加は外膜の integrity に由来するものではないと結論

は，外膜成分を輸送し，細胞膜の integrity（構築と安定付けている．また，H. influenzae の ΔvacJ 株，ΔyrbE 株性 ） に 関 与 す る こ と が 示 唆 さ れ て い る（ Endo et al.,の外膜のリン脂質量は野生株と同程度であるが，MV の2007; 各論 3 参照）．linKLMN を破壊した株では，菌体

リン脂質量は野生株の約 2 倍であった．この結果から，培養上清中にスフィンゴ糖脂質や外膜タンパク質，黄色Roeir らは「 vacJ（または yrbE ）の欠損によって外膜外－ 87 －

加藤

広海，永田

裕二

葉にリン脂質が蓄積した結果，外膜の blebbing が誘発

これに伴い培養液中の「 DNase がアクセスできない状

されリン脂質に富む MV が形成される」と論じている．

態の DNA 」の量も MV-associated DNA という形で増え

UT26 株の場合は，linKLMN の破壊で細胞膜の integrity

続ける可能性がある．現段階ではそのような DNA がが低下することから，MV 放出量の増加は膜の integrity

MV の表面に吸着しているのか，MV に内包されているの低下に大きく依存していると推測される．ただし，の か は 不 明 で あ る が，MV 内 部 に 存 在 す る DNA は

Roier らが提示したようなメカニズムに起因している可DNase による分解から保護されることが報告されており（ Bitto et al., 2017 ），本研究で観察された当該 DNA

能性もあり，さらなる解析が必要である．
また，UT26 株における生育段階と MV 放出量の関係

も MV に内包されている可能性が高い．染色体由来の性についても検討を行った．UT26 株の LB 培地での各DNA を 内 包 す る MV は，cell lysis を 介 し て 生 成 す る

生育段階で回収した MV を定量した結果，MV 量は培養

（Toyofuku et al., 2019）．また，DNA を内包しない MV は，

時間の経過と共に増加し続け，培養開始から少なくとも多くの場合は外膜が blebbing することで生じる OMV で174 時間までは減少しないことが判明した．

あ る．UT26 株 の MV 画 分 で は， 全 DNA の う ち 0.06 -UT26 株由来の MV 画分中に linA や IS6100 が含まれ0.08％が分解から保護されると推定されていることか

るか，PCR によって分析した．その結果，linA およびら，多くの MV は DNA を内包していないと推察され，

IS6100 に由来すると推測される増幅産物が確認できた．

UT26 株の主たる MV 形成機構は外膜の blebbing による

しかし，この増幅産物が MV-associated DNA（ MV に吸ものかもしれない．N. pentaromativorans US6-1 株の MV

着または内包された状態の DNA ）由来なのか，それ以外のフリー DNA 由来なのかは分からない．そこで，フリー DNA を除去するために，MV 画分を DNase 処理し，linA 特異的なプライマーを用いた qPCR で，linA 遺伝子の 存 在 量 を DNase 未 処 理 の サ ン プ ル と 比 較 し た（ Fig. 9 ）．
ま た， コ ン ト ロ ー ル と し て UT26 株 の ゲ ノ ム DNA（ gDNA ）も同様に DNase 処理し，解析を行った．その結果，gDNA を DNase 処理した場合，少なくとも 40 サ
イクルでは増幅は確認できず（ Fig. 9 a ），フリー DNA
は本条件の DNase 処理で検出限界以下まで分解できる
ことがわかった．一方，MV 画分を同様に DNase 処理
した際には，増幅産物が確認された（ Fig. 9 b ）．未処理
条件と比較して Cq 値が増加しており，DNA がある程度分解されたと考えられるが，60 分間 DNase 処理した際の Cq 値と 1，2，5，10，30 分間処理をした際の値がほぼ同じだったことから，DNase 処理は十分であると判断した（Fig. 9 b）．すなわち，フリー DNA が DNase によって完全に分解される条件でも，MV 画分には linA を含む
DNA が存在し続けることが示された．また，各処理時
間 の DNase 非 添 加 条 件 の DNA 量 を 100 と す る と，
DNase 添加条件の DNA の残存量は 0.06 - 0.08％程度と見積もられた．
以上，本研究において，MV に吸着もしくは内包された MV-associated DNA には「 DNase がアクセスできない状態の DNA 」が存在することを示した．本研究は，
UT26 株の MV の「遺伝情報の reservoir 」としての可能性を検討することを目的としており，DNase がアクセスできない MV-associated DNA から linA 遺伝子が検出できたことは，極めて重要な知見である．UT26 株のMV 量は培養時間の経過と共に増加し続けることから，－ 88 －

Fig. 9 Membrane vesicle (MV) produced by UT26 haspotential as genetic information reservoir. Effect of
DNase treatment on abundance of linA gene ingenomic DNA solution (a) and in membrane vesicle
fraction (b) was analyzed by qPCR.

特殊性の高い遺伝子の起源と細菌がそれら遺伝子を獲得する機構が放出される様子が TEM で観察されており（ Yun etal., 2017 ），外膜の blebbing による MV 放出が示唆されている．また，MV の DNase 処理後に残存する DNA 量は，
Shewanella vesiculosa M7 株では 85％（ Pérez-Cruz et al.,2013 ），Salmonella typhimurium SL1344 株では約 13％，Porphyromonas gingivalis W50 株 で は 約 15 ％ で あ っ た（ Bitto et al., 2017 で 報 告 さ れ て い る 値 を 元 に 概 算 ）．
DNA の定量方法や DNase 処理の条件が異なるため，単純な比較はできないが，UT26 株では DNase から保護される DNA の割合は，これらと比べて低いようである．

要

約

本研究では，細菌が人工化合物の分解等で利用する特殊性の高い遺伝子の起源と，細菌がそれら遺伝子を獲得
す る 機 構 の 解 明 を 目 的 と し て，γ -HCH 分 解 資 化 細 菌
Sphingobium japonicum UT26 株の土壌環境中でのゲノム進化に関する解析，γ -HCH 代謝における鍵反応を触媒する 2 種類の脱ハロゲン酵素 LinA と LinB をコードする遺伝子のキャプチャリング系の構築を実施すると共に，メンブレンベシクル（ MV ）が遺伝情報リザーバーとしての機能する可能性について検討した．かつて
UT26 株が単離された土壌を γ -HCH で再汚染化したところ，菌叢が変化し，メタゲノム中の γ -HCH 分解関連
遺伝子の割合が増加した．本再汚染化土壌から単離した
γ -HCH 分解細菌 TA15 株は，UT26 株とゲノムの基本骨格は同一であったが，lin 遺伝子群の構成と存在様式が異なっていた．さらに，本株は γ -HCH の代謝バランスの観点から，UT26 株に比べて進化型である可能性が示唆された．一方，UT26 株ではゲノム中に散在する linAから linF 遺伝子をクラスター化して他のスフィンゴモ
ナッド株に導入することで，人工的な γ -HCH 分解細菌を構築した．さらに，これら人工株や天然株を利用した
linA と linB のキャプチャリング株を構築し，各種環境
試料と混合したが，遺伝子取得株は得られなかった．
UT26 株は MV を産生し，γ -HCH 資化に必須の ABCト
ランスポーター LinKLMN 遺伝子破壊株では，野生株より多量の MV を産出した．さらに，UT26 株の MV には
DNase による分解を受けにくい linA 遺伝子が含まれることを示し，MV が遺伝情報リザーバーとして機能する可能性を提示した．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表・ポスター発表
1) 永田裕二．2017．環境汚染物質を食べる細菌から微生物進化を探る～細菌の進化機構の解明と微生物機能開発への応用～日本農芸化学会東北支部シンポジウム「多様な－ 89 －

広がりで魅せる微生物研究」（6月24日，弘前）
2) 永田裕二．2018．高度難分解性環境汚染物質分解細菌から微生物進化を探る．日本農芸化学会2018年度大会（3月
15-18日，名古屋）シンポジウム「微生物の多様性ーIFO
寄付講座10年の歩み」
3) 蘇立俊，加藤広海，大坪嘉行，津田雅孝，永田裕二．
2018．代謝酵素遺伝子群の人工クラスターを利用した有機塩素系殺虫剤資化細菌の育種．日本農芸化学会2018年度大会（3月15-18日，名古屋）
4) 永田裕二．人為起源環境汚染物質分解微生物から進化に迫る．2018．東北大学大学院生命科学研究科改組記念講演会（7月4日，仙台）
5) Su, L., Kato, H., Ohtsubo, Y., Tsuda, M. & Nagata, Y. 2018.
人工クラスターによる高効率有機塩素殺虫剤資化菌の構築 Constr uction of Ef ficient Organochlorine Pesticide
Degraders by Using an Artificial Gene Cluster. 日本微生物生態学会第31回大会（7月11-13日，沖縄）
6) 永田裕二．2018．環境浄化で活躍する微生物．Visionar y
農芸化学100シンポジウム・「微生物と私たちの健康・暮
らし・環境 ～世界に誇る日本の微生物研究～」（12月15日，仙台）7) 永田裕二．2019．細菌の進化機構の理解と環境浄化への応用．社会にインパクトある研究F-1「生命の奇跡のプロ
セスに学ぶイノベーション」キックオフシンポジウム（2月22日，仙台）
8) 蘇立俊，加藤広海，大坪嘉行，津田雅孝，永田裕二．
2019．人工汚染化土壌からの有機塩素殺虫剤分解酵素遺伝子取得の試み．日本本農芸化学会2019年度大会（3月
24-27日，東京）
9) 蘇立俊，加藤広海，大坪嘉行，津田雅孝，永田裕二．
2019．人工の代謝酵素遺伝子クラスターを利用した高機
能有機塩素殺虫剤資化細菌の育種．日本微生物生態学会
第33回大会（9月10-13日，甲府）
10) 大坪嘉行，永田裕二，津田雅孝．2020．キャピラリー
シーケンサーとTraceViewerを用いたDNA解析のススメ．
第14回日本ゲノム微生物学会年会（3月6-8日，名古屋）
11) 蘇立俊，加藤広海，大坪嘉行，津田雅孝，永田裕二．
2020．有機塩素殺虫剤分解酵素遺伝子取得のための人工キャプチャリング株の構築．第14回日本ゲノム微生物学会年会（3月6-8日，名古屋）
12) 蘇立俊，加藤広海，大坪嘉行，津田雅孝，永田裕二．
2020．人工遺伝子クラスターを利用した有機塩素殺虫剤
分解酵素遺伝子キャプチャリング株の作製．日本農芸化学会2020年度大会（3月25-28日，福岡）13) 鈴木達也，相馬隆光，加藤広海，豊福雅典，野村暢彦，
永田裕二．2021．有機塩素系殺虫剤分解能を持つスフィ
ンゴモナッド細菌株のmembrane vesicle形成とvesicleが有するDNA．日本農芸化学会2021年度大会（3月18-21日，
オンライン）
14) 勝保奈実，田中彩美，加藤広海，永田裕二．2021．土壌
環境中でのγ -HCH分解細菌の多様性と進化．微生物生態学会34回大会（10月31日 -11月2日，オンライン）
15) 加藤広海，勝保奈実，永田裕二．2021．メタゲノムから見た土壌環境の分解細菌の多様性．微生物生態学会34回
大会（10月31日-11月2日，オンライン）
16) Kato, H., Suzuki, T., Ishihara, T., Soma, T., Toyofuku, M.,
Nomura, N. & Nagata, Y. 2021. Membrane vesicle production
and vesicle-related DNA of sphingomonad strain capable of

加藤

広海，永田

degrading organochlorine pesticide. EMBO Workshop
Bacterial membrane vesicles: Biogenesis, functions andmedical applications（November 23-26, Tsukuba-online,
hybrid）
17) 勝保奈実，蘇立俊，田中彩美，加藤広海，大坪嘉行，永田裕二．2022．土壌環境中での γ -HCH分解細菌の多様性と進化．第16回日本ゲノム微生物学会年会（3月2-4日，オンライン）
18) 石原知行，加藤広海，大坪嘉行，永田裕二．2022．有機塩素系殺虫剤分解細菌が産生するmembrane vesicleに含まれるDNA．日本農芸化学会2022年度大会（3月15-18日，
オンライン）
原著論文
1) Kato H., Su L., Tanaka A., Katsu H., Ohtsubo Y., Otsuka S.,
Kenoo K., Nagata Y. 2022. Genome evolution related toγ-hexachlorocyclohexane metabolic function in the soil
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その他（総説・書籍・特許など）
1) Nagata Y., Kato H., Ohtsubo, Y. & Tsuda M. 2019. Mobile
genetic elements involved in the evolution of bacteria that
degrade recalcitrant xenobiotic compounds, Chapter 9. pp
215-244. In Nishida H and Oshima T (ed), DNA Traffic in
the Environment. Springer
2) Nagata Y., Kato H., Ohtsubo, Y. & Tsuda M. 2019. Lessons
from the genomes of lindane-degrading sphingomonads.
Environ. Microbiol. Rep. 11: 630-644.
3) Ohtsubo Y., Hirose Y. & Nagata Y. 2022. Algorisms used forin silico finishing of bacterial genomes based on short-read
assemblage implemented in GenoFinisher, AceFileViewer,and ShortReadManager. Biosci. Biotechnol. Biochem. 86:
693-703.

謝辞

本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．また，本研究の遂行にご協力いただいた東北大学大学院生命科
学研究科の学生諸氏に感謝の意を表します．また，文部科学省科学研究費補助金

基 盤 研 究（B）
（永田裕二

19H02865 ），挑戦的萌芽研究（永田裕二 16K14877 ）の支援にも感謝致します．

文

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略語一覧
ABC transporter: ATP-binding cassette transporter
CFU: colony forming unit
2,4-D: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid
DCP: dichlorophenol
ECD: electron capture detector
GC: gas chromatography
HCH: hexachlorocyclohexane
HLD: haloalkane dehalogenase
MGE: mobile genetic element
MV: membrane vesicle
POPs: persistent organic pollutants
TCB: trichlorobenzene
TEM: transmission electron microscope－ 92 －

IFO Res.Commun. 36
93-107, 2022

脱ハロゲン酵素の機能進化佐藤優花里，永田裕二

東北大学大学院生命科学研究科微生物進化機能開発寄付講座〒980-8577

仙台市青葉区片平2-1-1

Functional evolution of dehalogenases
Yukari Sato, Yuji Nagata
Laboratory of Microbial Evolution and Function Research,
Graduate School of Life Sciences, Tohoku University
2-1-1 Katahira, Aoba-ku, Sendai 980,-8577
To gain insight into functional evolution of dehalogenases, we conducted researches related to two dehalogenases,
Lin A and LinB, which catalyze key reactions in bacterial γ -HCH-degradation. We found that a uniquedehydrochlorinase LinA has the activity to convert not only HCH-related substances but also DDT, a notorious
environmental pollutant. On the other hand, we constructed γ -HCH-degrader-derived strains in which the linB
gene was replaced with other HLDs or HLD homologues, and demonstrated that HLDs other than LinB can also
be involved in γ -HCH metabolism. Fur thermore, we constructed an experimental evolution system andsuccessfully obtained evolved enzymes with improved functions related to γ -HCH metabolism. In addition, we
discovered a novel HLD that exists in fusion with an enzyme with tRNA-specific deaminase activity, which isimportant for normal growth. This enzyme also has novel substrate specificity as an HLD. In conclusion, we
demonstrated the high potential of dehalogenases and their usefulness as materials for functional development.
Key words: dehalogenase, γ -hexachlorocyclohexane, DDT, tRNA-specific deaminase, evolution

緒言LinA，加水分解的脱ハロゲン酵素でハロアルカンデハ
ロゲナーゼ（ HLD）の一員である LinB，グルタチオン

脱ハロゲン酵素は，有機ハロゲン系化合物の分解の鍵

依存的な還元的脱ハロゲン酵素 LinD の 3 種の脱ハロゲとなる酵素であり，有機ハロゲン系化合物が環境汚染物

ン酵素に加えて，反応の過程で脱ハロゲンを伴う酸素添

質や工業副産物など，主要な有害物質グループのひとつ

加酵素 LinE と，基質によっては脱ハロゲンを伴う還元であることから，応用的な観点から極めて重要な酵素で

酵素 LinF の 2 種の広義の脱ハロゲン酵素も加えると，ある（ Fetzner, 1998 ）．また，様々な人工的に合成され実に 5 種類の反応機構の異なる脱ハロゲン酵素が関与した有機ハロゲン化合物が存在することから，それらに直ている（ Fig. 1 ）（ Nagata et al., 2007 ）．

接アタックするする脱ハロゲン酵素は，酵素の起源や進このうち，本研究では，類似酵素が知られていないユ化，構造-機能相関関係の研究にも適した研究材料であニークな脱塩化水素酵素 LinA（ Imai et al., 1991; Nagata

る（ Nagata et al., 2016 ）．実際，様々な反応機構の異な

et al., 1993a; Nagata et al., 2016 ）と，多くの類似酵素が知られており，構造-機能相関の研究に適した HLD のる脱ハロゲン酵素が知られている．一分子に塩素を 6 個含む有機塩素系殺虫剤 γ - ヘキサクロロシクロヘキサン

一 員 で あ る LinB（ Nagata et al., 1993b; Nagata et al.,（ γ -HCH ） 細 菌 の 分 解 代 謝 系 に は， 脱 塩 化 水 素 酵 素1997; Nagata et al., 2015; Nagata et al., 2016 ）に注目した．

E-mail: aynaga@ige.tohoku.ac.jp
共同研究者:Jiri Damborsky（ Masaryk University ）．
Zbynek Prokop（ Masaryk University ）．
宮内 啓介（東北学院大学）．

γ -HCH の初発分解反応を触媒する脱塩化水素酵素 LinA
は，コードする遺伝子の起源が不明なだけでなく，酵素自体も，類似酵素の報告例のない極めてユニークな酵素である（ Nagata et al., 1993a; Nagata et al., 2016 ）．立体構造モデルから，類似の立体構造を持つタンパク質の存－ 93 －

佐藤

優花里，永田裕二

Fig.1 Degradation pathway of γ -HCH and 2,6-dichlorohydroquinone (2,6-DCHQ) in S. japonicum
UT26. Compounds: 1, γ -hexachlorocyclohexane (γ -HCH); 2, pentachlorocyclohexene (γ -PCCH);
3, 1,3,4,6-tetrachloro-1,4-cyclohexadiene (1,4-TCDN); 4, 1,2,4-trichlorobenzene (1,2,4-TCB);
5, 2,4,5-trichloro-2,5-cyclohexadiene-1-ol (2,4,5-DNOL); 6, 2,5-dichlorophenol (2,5-DCP);
7, 2,5-dichloro-2,5-cyclohexadiene-1,4-diol (2,5-DDOL); 8, 2,5-dichlorohydroquinone (2,5-DCHQ);
9, chlorohydroquinone (CHQ); 10, hydroquinone (HQ); 11, acylchloride; 12, γ-hydroxymuconic
semialdehyde; 13, maleylacetate (MA); 14, β-ketoadipate; 15, 2,6-dichlorohydroquinone (2,6DCHQ); and 16, 2-chloromaleylacetate (2-CMA). TCA, citrate/tricarboxylic acid cycle; GSH,
glutathione (reduced form); GS-SG, glutathione (oxidized form). Square brackets show unstablecompounds that have yet to be detected. Enzymes categorized as dehalogenase are bolded.

在が明らかになり，ある種の脱水酵素と立体構造と活性生じる反応を触媒する（ Nagata et al., 2015 ）．求核置換

中心アミノ酸残基が保存されていることから，脱塩化水反応（ SN2 反応）により，基質 - 酵素がエステル結合し素酵素 LinA は，脱水酵素から進化した可能性が提案さたアルキル中間体を生じ，これが活性中心で活性化されれた（Nagata et al., 2001; Trantirek et al., 2001 ）．さらに，た水によって加水分解される．従って，求核性のアミノ

実験的にも立体構造が解かれ，立体構造モデルと推定反酸残基と，水を活性化するためのヒスチジンと酸からな応機構の正当性が支持された（ Okai et al., 2010 ）．LinA

る catalytic triad が反応に必須である．さらに，遊離したの基質特異性は狭いと考えられているが（ Nagata et al.,

ハロゲンイオン X - を一時的に安定化させるためのアミ

1993a ），HCH 関連部物質以外の基質としてヘキサブロノ酸残基も反応に必要であり，これらを含めて catalytic

モシクロドデカンが報告されており（Heeb et al., 2019），

pentad と総称することもある．逆に，こうしたアミノ

他のハロゲン化合物に対しても活性を示す可能性はある．

酸残基を有することが HLD の特徴といえる．HLD は，

一方，LinB は，α/β-hydrolase family に属する加水分（ i ）加水分解による反応機構の詳細が明らかになってい解酵素である HLD（ EC 3.8.1.5 ）の一員である（ Nagata

る，（ii）約 30 kD の比較的低分子の単量体であり，コン

et al., 1993b; Nagata et al., 1997; Nagata et al., 2015;
Nagata et al., 2016 ）．HLD は，水を利用して基質のハロピューター解析が比較的容易である，（iii）基質となるハ
ロアルカン類の種類が多く，それらの構造が多様性に富ゲンを水酸基に置換し，アルコールとハロゲン化水素をむ，（iv）基質特異性の異なる複数の酵素の立体構造が既－ 94 －

脱ハロゲン酵素の機能進化に解かれている，などの理由により，酵素の構造-機能

176 mM の γ -HCH を含む W 培地をアッセイ溶液として，相関の研究に最も適した材料のひとつとなっている

分析は検出器として ECD を装備したガスクロマトグラ（ Nagata et al., 2015 ）．広い基質域を持つ本酵素は，応フィー（ GC）を用いた．γ -HCH 資化能は，菌体を湿重用面でも注目されている（ Nagata et al., 2015 ）．まず，量 100，10，1 mg/mL と な る よ う に 調 整 し た 菌 液 を有機塩素系農薬などの様々なハロアルカン系環境汚染物

W-γ -HCH 固体培地に 10 µL ずつスポットし，30 ℃で 5質の分解に応用可能で，本酵素活性を有する細菌細胞を日以上培養して評価した（スポットアッセイ）．

固定化させたバイオリアクターが欧州では実用化されてUT26 由来株にプラスミドで遺伝子を導入する場合いる．また，有用物質の化学合成の際に生じる反応副産

は，広宿主域プラスミド pBBR1-MCS-5（ Kovach et al.,物の除去や，毒ガス（マスタードガス）の分解への応用

1995 ）を用いた．遺伝子へのランダム変異の導入は Taqも可能である．さらに，脱ハロゲン反応により酸が生じ

DNA ポ リ メ ラ ー ゼ を 用 い た error-prone PCR で 行 い，ることを利用して，pH メーターと本酵素を組み合わせ，Mn+ 濃度（ 0.2 ～ 0.3％）で変異導入率を調整した．ラン

ハロゲン系物質による汚染を感知するためのバイオセン

ダムに変異を導入した PCR 増幅産物は，pBBR1-MCS-5サーとしての利用も検討されている．一方，アルキル中を 元 に 作 製 し た pBBR5TP に ク ロ ー ン グ し，E. coli

間体を加水分解できない変異酵素を目的のタンパク質とDH5α 株に変異型酵素遺伝子ライブラリーを構築した．

融合させ，長鎖アルカン系の蛍光物質を咬ませることに本ライブラリーから抽出したプラスミドを UT26 株由来

よりそのタンパク質の局在を明らかにする真核細胞用のの linB 完全欠失株である UT26DB2 株にエレクトロポー

分子生物学ツールとしても用いられるなど，用途は様々

レーションで導入し，Sphingobium 株のライブラリーとである．このような応用面を考えても，本酵素の反応機した．本ライブラリーを W-γ -HCH 固体培地に塗布し，構の詳細および構造-機能相関を明らかにすることは重30 ℃で培養後，良好に生育するクローンを選択した．

要である．また，HLD ホモログが全ゲノム配列が解読

タンパク質の発現には，発現用プラスミド pET22b(+)

された根粒菌や結核菌およびその類縁菌などに比較的広と E. coli BL21StarTM(DE3)株を用いた．目的酵素の発く分布していることが明らかになり，その生理的意義や現誘導を確認後，目的酵素が有する His タグを用いてア酵素進化の観点からも興味が持たれている（ Nagata et

フィニティ精製を行った．精製酵素の γ -HCH 代謝におal., 2015 ）．HLD は一般に基質特異性が広く，また，数アミノ酸残基の違いで反応特性が大きく変わる

ける LinB 活性は，精製した LinA の共存下で γ -HCH と（ Moriuchi et al., 2014 ）ことからも，多くの細菌が，「何

1,3 -ジブロモプロパンに対する HLD 活性は，チオシア

反応させ，代謝産物を GC(ECD)で解析して評価した．

者にもなり得る潜在的な機能」として HLD ホモログを

ン酸第二水銀比色定量法（ Iwasaki et al., 1952 ）により，有している可能性も考えられる．

遊離ハロゲンイオン濃度を定量することで評価した．

実験方法

PCB/biphenyl 分解細菌が有する新規 HLD
Acidovorax sp. KKS102 由来株は，1/3LB 培地（ Inaba

HLD の実験進化系の構築と進化型 HLD の取得
Sphigobium japonicum UT26 株由来の株の培養には，完全培地として 1/3LB 培地（ Inaba et al., 2020 ），無機塩培地として W 培地（ Imai et al., 1989 ）を使用し，炭et al., 2020 ） を 用 い て 30 ℃ で 培 養 し た．DNA 操 作，
PCR，DNA 塩基配列決定，エレクトロポーレーション
等は常法に従った（ Sambrook et al., 1989 ）．大腸菌の培
養には LB 培地を用い，適宜抗生物質を添加した．固体

素源としてグルコースを 0.2％，γ -HCH を 750 mg/L と培地には，寒天を 1.5％となるように加えた．KKS102

なるように加えた．大腸菌の培養には LB 培地を用い，

株の dahX 破壊株は，dahX 遺伝子の内部のほぼ全域をカ

適宜抗生物質を添加した．固体培地には，寒天を 1.5％

ナマイシン耐性遺伝子で置換した DNA 断片を KKS102となるように加えた．UT26 由来株は 30 ℃，大腸菌は株に導入し，相同組換えを誘発することで作製した．

37 ℃で培養した．菌株を長期保存する場合には，15％タンパク質の発現には，pET22b(+)と E. coli BL21StarTMのグリセロールを添加し，-80 ℃で保存した．DNA 操作，(DE3)株を用い，His タグを利用してアフィニティ精製

PCR，DNA 塩基配列決定，エレクトロポーレーションを行った．1,3 -ジブロモプロパンに対する HLD 活性は，等は常法に従った（ Sambrook et al., 1989 ）．

チオシアン酸第二水銀比色定量法（ Iwasaki et al., 1952 ）linB 完全欠失株の作製には pK18mobsacB（ Schweizer

により，遊離ハロゲンイオン濃度を定量することで評価

et al., 1992 ）を，各種 HLD および HLD モホログ遺伝子の導入には pAK405（ Kaczmarczyk et al., 2012 ）を用い，した．HLD 活性の 1 U は 37 ℃で毎分 1 µmol のハロゲン相同組換えにより行った．γ -HCH 分解活性の評価には対する基質特異性の検討は，共同研究者の Masaryk 大

イオンを遊離する酵素量と定義した．27 種類の基質に－ 95 －

佐藤

優花里，永田裕二

結果と考察

学の Zbynek Prokop 教授と Jiri Damborsky 教授により，マイクロ流路を利用したハイスループットの手法

HLD の実験進化系の構築と進化型 HLD の取得（ Buryska et al., 2019 ）で実施された．
tRNA-specific deaminase 活性は，PCR 増幅・精製した

HLD は一般に基質特異性が広く，数アミノ酸残基のDNA を 鋳 型 と し て，in vitro 転 写 反 応 で 合 成 し た違いで反応特性が大きく変わる（ Moriuchi et al., 2014;

tRNAArg_A 34CG を用いて，反応産物の塩基配列をサン

Nagata et al., 2015 ） か ら， 多 く の 細 菌 に 見 出 さ れ る

ガー法で解読することで評価した．tRNAArg_A 34CG の編

HLD ホモログは，特定の機能に特化した酵素ではなく，集レベルは，シーケンスクロマトグラムから測定した

環境変動に応じて「何者にもなり得る潜在的な機能」と

A/G 頂高比（ A/G peak height ratio ）により見積もりして働いている可能性が考えられる．また，γ -HCH 代（ Jepson & Reenan, 2007 ），G の み 観 察 さ れ た 場 合 を謝経路において HLD が利用されるが，既知の γ -HCH 分

100 ％，A のみ観察された場合を 0 ％とした．

解菌で利用されている HLD は LinB のみである（ Tabata

LinA による DDT の分解

et al., 2016; Nagata et al., 2019 ）．そこで，本研究では，( i )LinB 以外の HLD も γ -HCH 代謝に関与し得るのでタンパク質の発現には，pET22b(+)と E. coli BL21StarTMはないか，(ii)LinB 以外の HLD が γ -HCH 代謝に適応・(DE3)株を用いた．目的酵素の発現誘導を確認後，目的

進化していく過程を実験室で追跡することが可能なので酵素が有する His タグを用いてアフィニティ精製を行った．

はないか，という仮説を立て，それらの検証を行った．

Sphigobium japonicum UT26 株由来の株の培養には，1/3LB 培地（ Inaba et al., 2020 ）を用い，プラスミド

た UTDB2 株を作製した．本株の linB が存在した部位

で 遺 伝 子 を 導 入 す る 場 合 は， 広 宿 主 域 プ ラ ス ミ ドに LinB 以外の HLD および HLD ホモログ遺伝子を導入

pBBR1-MCS-5（ Kovach et al., 1995 ）を用いた．

した株を作製した．用いた HLD および HLD ホモログ

DDT 分解活性は，10 mg/L の DDT を含むアッセイ溶

UT26 株の linB 遺伝子をマーカーレスで完全欠失させ遺伝子の系統関係を Fig. 2 に示す．
具体的には，Sphingobium sp. MI1205 株由来の LinBMI

液と試料を混合し，代謝産物を GC(ECD)で解析して評価した．

（ Ito et al., 2007 ）， 根 粒 菌 Bradyrhizobium japonicum

Fig. 2 Phylogenetic tree of HLDs (Nagata et al. 2015). A neighbor-joining phylogenetic tree of the conserved sites in
20 biochemically characterized HLDs and Renilla-luciferin 2-monooxygenase (Rluc) was constructed using the
program MAFFT (http://mafft.cbrc.jp/alignment/software/) and visualized by Njplot software. Haloacetate
dehalogenase (DehH1) from Moraxella sp. B was used as an out-of group sequence. Bootstrap values calculated
from 1,000 resamplings using neighbor-joining are shown at the respective nodes. The length of lines reflects
the relative evolutionary distances among the sequences. Enzymes used in this study are bolded. Phylogenetic
positions of ancestral proteins used in this study are shown by black dot.

－ 96 －

脱ハロゲン酵素の機能進化

USDA110 株由来の DbjA（ Sato et al., 2005 ），マリンメ

Rluc_anc は，人工的にデザインした推定先祖型酵素でタゲノム由来の DmmA（ Gehret et al., 2012 ），結核菌ある（ Chaloupkova et al., 2019 ）が，系統的に LinB に

Mycobacterium 由 来 の HLD で あ る DmbA（ Jesenska et

近いことから，LinB 活性を有する可能性が高く，活性al., 2005 ）と LinB の推定先祖型酵素 DmbA_anc，ウミ
シ イ タ ケ Renilla reniformis 由 来 の Renilla-luciferinを示さなかった場合でも，LinB 型への変化が比較的容易に起こると期待された．なお，Rluc は，アミノ酸配2-monooxygenase である Rluc（ Lorenz et al., 1991 ），お列上は LinB と類縁性が比較的高いが，HLD ではなく，

よ び，Rluc と LinB の 推 定 先 祖 型 酵 素 Rluc_anc

酸素添加酵素であり，先祖型酵素 Rluc_anc は両活性を（ Chaloupkova et al., 2019 ）とその作製の過程で 1 アミ

有 す る（ Chaloupkova et al., 2019 ）． 以 上，UT26 株 のノ酸残基の変異（ R7P ）が生じた Rluc_ancM をそれぞ

linBUT 遺 伝 子 の 代 わ り に，linBMI, dbjA, dmmA, dmbA_

れコードする遺伝子である．LinBMI は，UT26 株由来の
LinBUT と 296 ア ミ ノ 酸 残 基 中 7 ア ミ ノ 酸 残 基 異 な り

anc, rluc, rluc_anc, rluc_ancM を そ れ ぞ れ 有 す る 株 を
UTBM1，UTBJ1，UTMM1，UTBA1，UTRL1，UTLA1，(98％ identical)，β-HCH に対しては LinBUT より顕著に

UTLA2 と命名した．

強い活性を示すが，γ -HCH 代謝においては同等の機能作製した株について，ポジティブコントロールのを有する（ Ito et al., 2007 ）．DbjA は嵩高い基質を好み

UT26 株，ネガティブコントロールの UTDB2 株と共に，（ Sato et al., 2005 ），DmmA は既知 HLD で最も広い基質特異性を有する（ Gehret et al., 2012 ）ことから，LinB

γ -HCH 分 解 活 性 を GC(ECD)で 検 討 し た と こ ろ，
UT26S 株，UTBM1 株に加えて，UTMM1 株，UTLA1 株，

活性を有する可能性が期待された．また，DmbA_anc とUTLA2 株で，2,5-DCHQ が検出された（ Fig. 3 A ）．

Fig. 3 Characterization of the linB-replacement strains. (A) Metabolites of γ -HCH were detected by GC(ECD). (B) γ -HCH
utilization activity was estimated by spot assay. Cells were spotted on the W_γ -HCH medium and incubated for 14 days.

－ 97 －

佐藤

優花里，永田裕二

ま た，UTMM1 株 と UTLA2 株 で は，2,5 -DCP も 検

で進化型 HLD を取得する in vivo 実験進化系（ Fig. 4 上）出された（ Fig. 3 A ）．γ -HCH から 2,5-DCP，2,5-DDOL ，を試みたところ，元の株より良好にコロニー形成するク

2,5-DCHQ が生じるには LinB 活性が必要であり（ Fig. 1 ），ローンが得られた．

DmmA，Rluc_anc，Rluc_ancM は LinB 活性を有するこ

しかし，当該クローンの HLD 遺伝子に変異は入ってとが明らかになった．さらに，これら株の γ -HCH 資化

おらず，HLD 遺伝子以外の比較的起こりやすい変異が能を 3 種類の濃度（ 100, 10, 1 mg 湿重量菌体/mL ）の菌良好にコロニー形成する要因となっていると考えられた液を γ -HCH を唯一の炭素源として含む固体培地（γ -HCH

ため，本系でのスクリーニングは中止し，in vitro で変プレート）上にスポットして培養することで検討した

異 を 導 入 し た HLD 遺 伝 子 を UTDB2 株 に 導 入 し，（ Fig. 3 B ）． 培 養 14 日 後，UT26 ，UTBM1 株 は 菌 体 濃

γ -HCH プレートで良好に生育するクローンを選択する

度 10，1 mg/mL で，γ -HCH 分解の指標であるクリアゾーンを形成し，明らかに増殖した．菌体濃度 100 mg/mL

in vitro 実験進化系（ Fig. 4 下）を試みた．上記各遺伝子を鋳型とした error-prone PCR でランダムに変異を導入で増殖しないのは，菌体濃度が濃く，高濃度の dead-end

し，それぞれ 1,000 クローン弱からなる HLD 遺伝子変産 物 を 蓄 積 し た た め と 推 測 さ れ る． こ れ に 対 し て，

異ライブラリーを大腸菌中に作製した．ランダムに抽出

UTDB2 ，UTBJ1，UTRL1 株は全ての菌濃度で増殖しした各 20 程度のクローンの解析により，全てのライブ

なかった．これら株の菌体濃度 100 mg/mL で，UT26 ，

ラリーで半数以上のクローンに変異が入っていることを

UTBM1 株に比べて若干のクリアゾーンが観察される確認した．変異導入率は 0.2 ～ 0.4％程度であった．このは，菌体濃度は濃いが，γ -HCH が分解されないため

れらライブラリーを UTDB2 株に導入し，γ -HCH プレーに dead-end 産物も蓄積せず，接種菌が死滅しないため

ト上で良好に生育するクローンを選択した．次に，それに，LinA の効果で γ -HCH の分解が起こったものと考えらクローンより抽出した HLD 遺伝子を有するプラスミ

られる．また，UTLA2 は，菌体濃度 10 mg/mL で増殖

ドを UTDB2 株に再導入し，これら株が変異導入前の遺した．さらに，UTMM1，UTLA1，UTBA1 は菌体濃度伝子を持つ株より良好に生育することが確認できたもの

100 mg/mL で，ネガティブコントロールの UTDB2 株とについて，シーケンス解析により変異部位を同定した．

比べて明らかに大きなクリアゾーンを形成し，増殖しRluc は monooxygenase であり，HLD 活性を示さないが，た． 以 上 の 結 果 は，DmmA，Rluc_anc，Rluc_ancM，

わ ず か 3 箇 所 の 変 異（ E132D, E151G, E211G ） を 持 つ

DmbA_anc が，LinBUT ，LinBMI ほ ど で は な い も の の，

Rluc-43 が LinB 活性を示す可能性があることは大変興味

弱い LinB 活性を有していることを示している．なお，深い．さらに，8 つの候補遺伝子（ linBUT -52, linBMI -45,

スポットアッセイの結果は代表的な例を示すが，数回linB MI -63, rluc-43, rluc_anc-4, rluc_anc-8, dmbA_anc-3,

行った実験で，同じ傾向を示した．
これら linB 置換株について，γ -HCH プレートに塗布

dmbA_anc-5 ）について，同様の変異導入とスクリーニ
ングにより第 2 次スクリーニングを実施した．その結果，し，元の株より良好に生育するクローンを選択する方法

rluc_anc-8 由来の 12 の候補遺伝子を取得した．次に，第Fig. 4 Strategy for experimental evolution of HLD and its related proteins toward γ -HCH utilization.

－ 98 －

脱ハロゲン酵素の機能進化

1 次，第 2 次スクリーニングでそれぞれ得られた 8 個と，は，2,5-DDOL より 2,5-DCP の蓄積量が多いのに対して，

12 個，合計 20 種の酵素を大腸菌で発現して精製し，活第 2 次スクリーニングで得られた進化型酵素である性の評価を行った．まず，一般的に HLD の良い基質で

Rluc_anc-8-6 と Rluc_anc-8-37 は，2,5-DCP より 2,5-DDOL

ある 1,3 -ジブロモプロパンに対する活性をチオシアン酸の 蓄 積 量 の 方 が 多 か っ た．2,5-DCP は 細 胞 に 有 害 な

第二水銀比色定量法で遊離塩素イオン濃度を定量し，評dead-end 産物であるのに対して，2,5-DDOL は LinC 以

価したところ，進化型酵素は概して先祖型酵素より高い下の代謝系を有する UT26 株細胞内で炭素源・エネル

HLD 活性を示した．次に，γ -HCH 代謝系における LinB

ギー源として資化される（ Fig. 1 ）ことを考えると，第活性を評価した．γ -HCH 代謝系における LinB の基質は化

2 次スクリーニングで，第 1 次スクリーニングで得られ学的に不安定で試薬として調製できないため（ Fig. 1 ），精たものより γ -HCH 代謝において進化型の HLD が取得で製した LinA との共存下で，γ -HCH から生じる 2,5 -DCP お

きたと考えられる．以上，in vivo での生育を指標とし

よび 2,5 -DDOL の量で LinB 活性を評価した．Rluc_anc，

たスクリーニングを用いる本実験進化系は良好に機能

Rluc_anc-8，Rluc_anc-8-6，Rluc_anc-8-37 の当該活性をし，γ -HCH 資化に対する HLD の進化過程の一端を観察比較した結果を Fig. 5 に示す．

することができたと結論した．今後，得られた進化型酵得られた進化型酵素は，いずれも先祖型の Rluc_anc より，2,5-DCP，2,5-DDOL を蓄積した．さらに，第 1 次ス

素のより詳細な解析で，LinB 型の活性の鍵となるアミノ酸残基の機能解明が期待できる．

クリーニングで得られた進化型酵素である Rluc_amc-8

Fig. 5 Characterization of enzymes obtained by the experimental evolution system. The putative evolved
enzymes were incubated with LinA and γ -HCH, and metabolites of γ -HCH, 2,5-DCP (A) and
2,5-DDOL (B), were detected by GC(ECD).

－ 99 －

佐藤

優花里，永田

PCB/biphenyl 分解細菌が有する新規 HLD

裕二

た．これらの値は，代表的な HLD である DhlA，DhaA，

ポ リ 塩 化 ビ フ ェ ニ ル（ PCB ）/biphenyl 分 解 細 菌

LinB と同程度だった．さらに，Masaryk 大学の Zbynek

Acidovorax sp. KKS102 株（ Kimbara et al., 1989 ）は，

Prokop 教授と Jiri Damborsky 教授に協力を得て，DahX

Betaproteobacteria に属し，全ゲノム配列も決定されている（ Ohtsubo et al., 2012 ）．KKS102 株のゲノム配列に対の HLD とより厳密な比較が可能なシステムを用いて検して，LinB をクエリとして BLAST による相同性検索

討した．得られた結果を，1 -ブロモブタンの活性値を 1を行ったところ，アミノ酸レベルで 33％の identity を示とした相対活性に換算した結果を Fig. 7 A に示す．

及び HLD 領域の 27 種類の基質に対する基質特異性を他すホモログ遺伝子がヒットし，本遺伝子を dahX と命名

DahX と HLD 領域の基質特異性は，一部の基質を除いした．立体構造と生化学機能が既知のタンパク質から成て，ほぼ同様の傾向を示した．DahX は 1 -ブロモブタン

るデータベースに対して DahX をクエリとして BLAST

や 1 -ヨードブタンをはじめとしたブロモ基やヨード基による相同性検索を行ったところ，2 種類の領域が存在を有する基質に対して高い特異性を示した．また，DbjA

し て い た．N 末 端 側（ CDA 領 域 ） は Escherichia coliなど一部の酵素にしか分解できない難分解性の物質とし

K12 株 の tRNA adenosine deaminase（ TadA ）（ Wolf etて知られている 1,2 -ジクロロプロパンに対して比較的強al., 2002 ）と最も高い identity（ 52％）を示した．TadA（ EC 3.5.4.33 ） は cytidine deaminase-like superfamily にい活性を示した．一般に，HLD はアミノ酸配列の相同性により，HLD-I ～ III の 3 つの subfamily に分類するこ属する deoxytidylate deaminase-like family に分類される．

とができ（ Fig. 2 ），DahX の HLD 領域は，最も identity

C 末 端 側（ HLD 領 域 ） は，Plesiocystis pacifica SIR-1 株の高い DhlA と同じ HLD-I に分類される．しかし，現時

由来の HLD である DppA と最も高い identity（ 53％）を点では HLD のアミノ酸配列と基質特異性の相関は明ら示した．本領域は HLD-I subfamily に属する DhlA ともかになっていない．そこで，Koudelakova らが提案して有意な identity（ 48％）を示した．すなわち，DahX は N

いる SSGs(Substrate Specificity Groups)（Koudelakova

末端に TadA と有意な相同性を示す領域が融合した新規
HLD であることが示唆された．このような融合タンパ

et al., 2011 ）において，DahX 及び HLD 領域がどのグループに属するかを明らかにするため，本実験で得られた基ク質ホモログは，KKS102 株が属する Comamonadaceae

質特異性の情報に基づき，PCA 解析を行った．その結果，に属する細菌群に見出され，少なくとも当該細菌群ではDahX と HLD 領 域 は い ず れ も SSG-IV に 分 類 さ れ た

何らかの生理的意義があり，保存されているものと考え（ Fig. 7 B ）．SSG-Ⅳには，有機ブロモ化合物，有機ヨウ素化合物の分解に優れる HLD が分類されるが，DahXられる．
TadA は大腸菌において，生育に必須の因子であり及 び HLD 領 域 も 同 様 の 性 質 を 示 す． な お，SSG-I と（ Wolf et al., 2002 ），KKS102 株の生育にも重要な因子でSSG-II を決定する場合 2 -ヨードブタンに対する特異性ある可能性が考えられた．そこで，KKS102 株の dahXをカナマイシン耐性遺伝子で置換し欠失させた株の作製を試みたところ，当該株が作製できたため，dahX は
KKS102 株において生育に必須の因子ではないことが明らかになった．しかし，30 ℃の 1/3LB 液体培地で 48 時
間培養したところ，野生型に比べ，明らかに OD660 値の上昇に遅れが生じた（ Fig. 6 ）．
さらに，この生育能の低下は DahX 全域および CDA領域を発現するプラスミドの導入によって回復したことから（ Fig. 6 ），CDA 領 域 は，KKS102 株 の 通 常 の生育に必須ではないものの，重要な役割を有していると考えられる．なお，HLD 領域のみを導入したものの生育は回復しなかった（ Fig. 6 ）ことから，本領域は通常の生育には重要ではないと考えられる．
DahX の HLD 活性について検討した．まず，HLD の一般的な基質である 1,3 -ジブロモプロパンを基質として，DahX 及び HLD 領域の HLD 活性を測定したところ，
精製直後の DahX 及び HLD 領域は，1.88±0.28 U/mg of
enzyme 及び 3.20±0.20 U/mg of enzyme の比活性を示し－ 100 －

Fig. 6 OD660 of cultures of KKS102 (WT) and its derivatives
in 1/3LB medium. WT, wild type ( ■ , black); DdahX,
dahX disruptant (▲ , gray); DdahX(pDahX), dahX
disruptant harboring plasmid carr ying dahX (×,gray); DdahX(pCDA), dahX disruptant harboringplasmid carr ying CDA region of dahX (×, black);
DdahX(pHLD), dahX disruptant harboring plasmidcarrying HLD region of dahX ( ● , gray).

脱ハロゲン酵素の機能進化

Fig.7 Substrate specificity of DahX and its HLD region. (A) Relative activities to 1-bromobutane toward
27 substrates are shown. (B) PCA analysis of substrate specificity of HLDs demonstrated that
DahX and its HLD region (Hld-dom) are categorized into SSG-IV group.

が決定因子になるが，本実験では本基質に対する活性をえられる．以上，DahX は HLD 活性自体がユニークで測定していないため，SSG-I と SSG-II を分けることがであることが明らかになった．今後，構造解析を行い，構き な か っ た． い ず れ に せ よ，DahX は 配 列 上 近 縁 の造-機能相関について詳細な解析を行う必要がある．

DhlA とは異なるグループに分類され，配列上は近縁で大腸菌の TadA は，tRNAArg_A34CG の 34 位のアデニン

ない DatA や DbeA と基質特異性の傾向が類似していた．

（A）を脱アミノ化してイノシン（ I ）に変換する tRNA 編

よって，DahX の HLD 領域の立体構造は，DhlA よりも，集活性を有する（ Wolf et al., 2002 ）．DahX の CDA 領域

基質特異性が似ている DatA や DbeA に近い可能性が考が TadA と 有 意 な 相 同 性 を 示 す こ と か ら，DahX の－ 101 －

佐藤

優花里，永田裕二

tRNA-specific deaminase 活性について検討した．大腸菌

た．すなわち，HLD と融合タンパク質として存在するで 発 現・ 精 製 し た DahX を in vitro 合 成 し た tRNAArg_

ことが，KKS102 株の生体内においても DahX の tRNA

A34CG と混合し，34 位の A が I に変換されるか検討した．

編集活性に影響を及ぼしている可能性が示唆された．

RNA の逆転写反応により cDNA が合成されると，I はシ

以上，通常の増殖に関与する tRNA-specific deaminase

トシンと塩基対を形成するため，サンガーシーケンスで活性を有する酵素と融合して存在する新奇な HLD を発は I はグアニン（G）として検出される．したがって，A見した．本酵素 DahX は，HLD としても新奇な基質特のピークが編集されると G のピークとして検出される．

異性を有し，HLD と融合すること，および HLD 活性がその結果，DahX の濃度依存的に tRNA 編集活性が検出

tRNA-specific deaminase 活性にも影響を及ぼしているとされた（ Fig. 8 ）．

示唆された．

次に，CDA 領域のみの DahX(1-168)，TadA 活性に必須 の ア ミ ノ 酸 残 基 に 変 異 を 導 入 し た DahX(E57A)，

LinA による DDT の分解

HLD 活 性 に 必 須 の ア ミ ノ 酸 残 基 に 変 異 を 導 入 し た

1,1,1-Trichloro-2,2-bis(4-chlorophenyl)-ethane(DDT)DahX(D288A)を大腸菌で発現・精製し，同様に tRNAは，最も知られた有機塩素系殺虫剤であり，レイチェル・編 集 活 性 を 検 討 し た． そ の 結 果，DahX(1-168)とカーソンの「沈黙の春」で，その有害性が広く知られる

DahX(D288A)は，濃度依存的に tRNA 編集活性が検出ようになった．DDT の微生物分解については，嫌気的されたが，DahX(E57A)では tRNA 編集活性が全く検出な条件下での還元的な脱塩素反応による分解の報告が多されなかった（ Fig. 8 ）．従って，CDA ドメインが DahX

い（ Nagata et al., 2016 ）．好気的な条件下では，PCB/の tRNA 編集活性を担い，必須のアミノ酸残基も TadA

biphenyl 分解と同様の芳香環への酸素添加反応・環開裂と同様であることが明らかになった．さらに，DahX

反応により分解されると考えられている（ Nagata et al.,(1-168)と DahX(D288A)は DahX よりも低い活性を示し

2016 ）．また，Glutathione S-transferase(GST)が DDT を（ Fig. 8 ），本活性における HLDドメインの寄与が示され

1,1,1-dichloro-2,2-bis(4-chlorophenyl)-ethylene(DDE)に

Fig. 8 tRNA-editing activity of DahX and its derivatives. tRNAArg_A 34CG was incubated with purified DahX and its
derivatives, and the change of A 34 to I was detected by Sanger sequencing. Note that I is sequenced as G in thissystem. Concentration of proteins and ratio of the editing (％ ) are shown at the top of each wave form data.

－ 102 －

脱ハロゲン酵素の機能進化

変換するという報告もある（ Nagata et al., 2016 ）．本研性を失った LinA(D25N)，野生型酵素と同等の γ -HCH

究では，γ -HCH dehydrochlorinase LinA が DDT を DDE

dehydrochlorinase 活性を有し，立体構造上大きな化合に変換する活性を有する可能性について検討した．

物を基質とする可能性が考えられる LinA(Y50A)につい大腸菌で発現・精製した LinA を DDT と反応させ，て も 活 性 を 検 討 し た． そ の 結 果，LinA 野 生 型 酵 素，

GC(ECD)で分解活性を検討した．その際，我々が以前

LinA(K20M)，LinA(Y50A)で DDT のピークの減少とに行った LinA の推定立体構造の正当性を評価する研究

DDE のピークの上昇が観察され，LinA(D25N)ではピー（ Nagata et al., 2001 ）において，既に多くの LinA 変位

クの変化は観察されなかった（ Fig. 9 ）．

型酵素を作製していたため，野生型の LinA に加えて，

すなわち，LinA に DDT を DDE に変換する活性があ野生型と同等の γ -HCH dehydrochlorinase 活性を有し，ること，また，その基本的な反応機構は γ -HCH を基質

大腸菌で多量に発現する LinA(K20M)，活性中心アミとする場合と同様であることが示された．

ノ酸残基に変異を導入して γ -HCH dehydrochlorinase 活

将来的に DDT を完全分解する細菌細胞の育種を見据

Fig. 9 DDT degradation by LinA and its mutants, LinA(K20M), LinA(D25N), and LinA(Y50A). Purified
His-tagged enzymes were incubated with DDT for 1 hr and metabolites were analyzed by GC(ECD).
Dieldrin was added as internal standard for quantification of the activity.

－ 103 －

佐藤

優花里，永田本助成で得られた研究成果の報告

え，LinA を構成的に発現する UT26 株の DDT 分解活性について，休止菌体や粗酵素抽出液等，様々な条件で検討したが，明瞭な活性は検出されなかった．野生株ではLinA の発現量が，検出可能なレベルの DDT 分解活性を示すには不十分である可能性が考えられたため，UT26
株の linA 欠失株である YO5 株（ Nagata et al., 1999 ）に，
LinA およびその変異型酵素遺伝子をクローニングした
発現用プラスミドを導入し，LinA の発現を SDS-PAGEで検討した．その結果，野生型 LinA と LinA(K20M)の
発現用プラスミドを導入した株で，UT26 株より顕著に多量の LinA の発現が確認された（ Fig. 10 A ）．
そこで，これら株の DDT 分解活性を GC(ECD)で検討したところ，野生型 LinA と LinA(K20M)の発現用プラスミドを導入した株で DDT のピークの減少と DDEのピークの上昇が観察された（ Fig. 10 B ）．以上，LinAを高発現させることで DDT 分解活性を有する細菌細胞の育種に成功し，LinA を利用した DDT の生分解系の構築の可能性を提示することができた．

要

約

本研究では，脱ハロゲン酵素の機能進化に関する知見を得ることを目的として，細菌の γ -HCH 分解代謝における鍵反応を触媒する 2 種類の脱ハロゲン酵素 LinA とLinB に関する解析を行った．その結果，酵素としても，コードする遺伝子としてもユニークな脱塩化水素酵素である LinA が，γ -HCH 関連物質だけでなく，重要な環境汚染物質である人工殺虫剤 DDT を DDE に変換する活性も有することを明らかにした．すなわち，人工化学物
質の分解に関わるユニークな脱ハロゲン酵素の新たな潜在能力を提示した．一方，LinB は，細菌が広く有し，
基質特異性が広く，活性特性が変化しやすいという特徴を有する HLD の一員であるが，既知の γ -HCH 分解菌で利用されている HLD は LinB のみである．本研究では，
γ -HCH 分 解 細 菌 の linB 遺 伝 子 を 他 の HLD あ る い は
HLD ホモログ遺伝子に置換した株を作製し，LinB 以外の HLD も γ -HCH 代謝に関与し得ることを明示した．さらに，実験進化系を構築し，実際に，γ -HCH 代謝に関する機能が向上した進化型酵素の取得に成功した．また，通常の増殖に関与する tRNA-specific deaminase 活性を有する酵素と融合して存在する新奇な HLD を発見した．
本 酵 素 は，HLD と し て も 新 奇 な 基 質 特 異 性 を 有 し，HLD と融合すること，および HLD 活性が tRNA-specificdeaminase 活性にも影響を及ぼしていると示唆された．
以上，本研究において，脱ハロゲン酵素の潜在能力の高さと機能開発の素材としての有用性を提示することができた．

裕二

口頭発表・ポスター発表
1) 佐藤あや華，加藤広海，大坪嘉行，津田雅孝，永田裕二．2017．細菌由来のデアミナーゼ―デハロゲナーゼ融合タンパク質の機能解析．日本農芸化学会2017年度大会（3月17-20日，京都）
2) 佐藤優花里，中鉢千尋，永田裕二．2017．二種類の酵素
ドメインから構成される融合タンパク質の示差走査蛍光定量解析．2017年度生命科学系学会合同年次大会
ConBio2017（12月6-9日，神戸）
3) 陳楠楠，大坪嘉行，津田雅孝，永田裕二．2018．In vivo
evolution system for haloalkane dehalogenases towarddegradation of a man-made pesticide．第12回日本ゲノム微生物学会年会（3月5-7日，京都）
4) 中鉢千尋，佐藤優花里，大坪嘉行，津田雅孝，永田裕二．2018．デアミナーゼと融合した新規デハロゲナーゼの特徴．日本農芸化学会2018年度大会（3月15-18日，名古屋）5) 永田裕二．2018．HCH脱塩素反応を触媒するハロアルカ
ンデハロゲナーゼの多様性とバイオレメディエーションへの応用．第36回農薬環境科学研究会（11月8-9日，甲府）シンポジウム「POPs等の難分解性農薬の微生物分解」
6) 陳楠楠，大坪嘉行，津田雅孝．永田裕二．2018．人工農薬
分解に対するハロアルカンデハロゲナーゼの実験進化系の構築．第36回農薬環境科学研究会（11月8-9日，甲府）
7) Chen, N., Otsubo, Y., Tsuda, M., & Nagata, Y. 2019.
Experimental evolution of haloalkane dehalogenases towarddegradation of an organochlorine pesticide．日本本農芸化学会2019年度大会（3月24-27日，東京）
8) 中鉢千尋，佐藤優花里，大坪嘉行，津田雅孝，永田裕二．
2019．デアミナーゼ及びハロアルカンデハロゲナーゼド
メイン から成る新規融合タンパク質の酵素学的研究．日
本本農芸化学会2019年度大会（3月24-27日，東京）
9) 鄧文昊，サガリアナポリラクシマ，陳楠楠，加藤広海，
大坪嘉行，津田雅孝，シダヴァタムダヤナンダ，永田裕二．2019．有機リン系殺虫剤分解細菌 Sphingopyxis wildii
株の有機塩素系殺虫剤分解能に関する研究．日本本農芸化学会2019年度大会（3月24-27日，東京）
10) 鄧文昊，Sagar, A.L., 陳楠楠，加藤広海，大坪嘉行，津田雅孝，Siddavattam, D. 永田裕二．2020．有機リン系殺虫剤分解細菌Sphingopyxis wildii株由来の2種のハロアルカ
ンデハロゲナーゼの解析．日本農芸化学会2020年度大会（3月25-28日，福岡）11) 高橋由紀子，中鉢千尋，野々山翔太，佐藤優花里，永田裕二．2020．Acidovorax sp. KKS102株が有する融合酵素
DahXのtRNA編集活性．日本農芸化学会2020年度大会（3月25-28日，福岡）
12) Chen, N., Ohtsubo, Y., Tsuda, M., & Nagata, Y．2020．
Construction of experimental evolution system of haloalkane
dehalogenases and characterization of the evolved
enzymes．日本農芸化学会2020年度大会（3月25-28日，福岡）13) Takahashi, Y., Chubachi, C., Nonoyama, S., Sato, Y. &Nagata, Y. 2020. Bifunctional activity of a fusion enzyme
DahX. 2020 World Conference on Protein Science（July
6-10札幌）－ 104 －

脱ハロゲン酵素の機能進化

Fig.10 Construction of genetically engineered strains degrading DDT. (A) SDS-PAGE analysis of total proteins of
Sphingobium japonicum UT26, YO5 (linA-deletion mutant of UT26) harboring empty vector, and YO5-derived
strains expressing LinA_WT, LinA_K20M, LinA_D25N, and LinA_Y50A. Triangle indicates LinA and its
mutants. (b) Those UT26 -derived strains were incubated with DDT for 24 or 47 hr and metabolites wereanalyzed by GC(ECD). Dieldrin was added as internal standard for quantification of the activity.

－ 105 －

佐藤

優花里，永田14) Sato, Y., Ogata, T. & Nagata, Y. 2020. Oligomeric states of
MCE transpor ter components L i n M and L i n N from
Sphingobium japonicum UT26. 2020 World Conference on
Protein Science（July 6-10札幌）
15) 陳楠楠，大坪嘉行，永田裕二．2021．実験進化系で得られた人工殺虫剤分解に関与する進化型 ハロアルカンデハ
ロゲナーゼ．日本農芸化学会2021年度大会（3月18-21
日，オンライン）16) 高橋由紀子，佐藤優花里，中鉢千尋，野々山翔太，永田裕二．2021．ハロアルカンデハロゲナーゼ及びデアミナーゼからなる融合酵素DahXのtRNA編集活性．日本農芸化学会2021年度大会（3月18-21日，オンライン）
17) 伊藤蓮，カファヤユスフ，宮内啓介，大坪嘉行，永田裕二．2022．gamma-HCH脱塩化水素酵素LinAによるDDTの分解．日本農芸化学会2022年度大会（3月15-18日，オンライン）18) 鄧文昊，高田美信，大坪嘉行，渡辺正夫，永田裕二．
2022．細菌由来の有機塩素系殺虫剤分解に関わるデハロ
ゲナーゼを発現するシロイヌナズナ植物の作製．日本農芸化学会2022年度大会（3月15-18日，オンライン）
原著論文
1) Marek M., Chaloupkova R., Pr udnikova T., Sato Y.,
Rezacova P., Nagata Y., Smatanova I.K. & Damborsky J.
2020. Structural and catalytic effects of surface loop-helix
transplantation within haloalkane dehalogenase family.
Comp Struct Biotechnol J 18: 1352-1362.
その他（総説・書籍・特許など）
1) Nagata Y., Kato H., Ohtsubo, Y. & Tsuda M. 2019. Lessons
from the genomes of lindane-degrading sphingomonads.
Environ. Microbiol. Rep. 11: 630-644.

謝辞

本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．また，本研究の遂行にご協力いただいた東北大学大学院生命科
学研究科の野々山翔太博士（現東京工業大学）ならびに学生諸氏に感謝の意を表します．また，文部科学省科学研究費補助金

基盤研究（B）（永田裕二 19H02865 ），挑 戦 的 萌 芽 研 究（ 永 田 裕 二 16K14877； 佐 藤 優 花 里
16K14908 ），ならびに東北大学男女共同参画推進セン
ター（ TUMUG ）が実施する TUMUG 支援事業（男女共同参画・女性研究者支援事業）の支援（佐藤優花里）にも感謝致します．

文

献Buryska, T., Vasina, M., Gielen, F., et al. (2019). Controlled oil/water partitioning of hydrophobic substrates extending thebioanalytical applications of droplet-based microfluidics. Anal
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略語一覧
CDA: cytidine deaminase
DDE: 1,1,1-dichloro-2,2-bis(4-chlorophenyl)-ethylene
DDT: 1,1,1-Trichloro-2,2-bis(4-chlorophenyl)-ethane
ECD: electron capture detector
GC: gas chromatography
GST: glutathione S-transferase
HCH: hexachlorocyclohexane
HLD: haloalkane dehalogenase
PCA: principal component analysis
PCB: polychlorinated biphenyl
SSGs: substrate specificity groups－ 107 －

IFO Res.Commun. 36
109-122, 2022

細菌の環境適応・進化に関する細胞機能佐藤

優花里，永田裕二

東北大学大学院生命科学研究科微生物進化機能開発寄付講座〒980-8577

仙台市青葉区片平2-1-1

Bacterial cellular functions related to environmental adaptation and evolution
Yukari Sato, Yuji Nagata
Laboratory of Microbial Evolution and Function Research,
Graduate School of Life Sciences, Tohoku University
2-1-1 Katahira, Aoba-ku, Sendai 980,-8577
To gain insight into cellular functions related to environmental adaptation and evolution, we analyzed the ABCtransporter LinKLMN essential for the γ -HCH utilization in γ -HCH-degrading Sphingobium japonicum strain
UT26, and its growth phenomenon under oligotrophic conditions. The hypothesis that LinKLMN is involved in
the integrity of the cellular membrane through the transport of membrane component(s) was supported by someresults. Furthermore, LinM and LinN were suggested to form multimers and interact with each other. In
particular, TEM analysis strongly suggested that LinN has an octameric structure. On the other hand, we foundthat UT26 exhibits CO2 -dependent high-yield growth under oligotrophic conditions (HYGO phenotype) byexpression of the adhX gene encoding alcohol dehydrogenase. Some results suggested that HYGO phenotype is a
general function in environmental bacteria. To elucidate its mechanism, we have developed a new qTn-Seq method
and conducted some other analyses. At this stage, it was suggested that the HYGO phenotype strain grows underoligotrophic conditions by suppressing CO2 release through a glyoxylate circuit and using ethanol, which ispresent at low concentrations in the environment, as the main carbon source.
Key words: sphingomonads, ABC transporter, oligotroph, CO2 fixation, alcohol dehydrogenase緒

言

ターも必須である（ Endo et al., 2007 ），という点が挙げられる．linKLMN ホモログは，他の γ -HCH 分解細菌株

人工合成した有機塩素系殺虫剤 γ - ヘキサクロロシクのみならず，γ -HCH 分解能を持たないスフィンゴモナッ

ロヘキサン(γ -HCH)分解細菌は，生物の環境適応・進ド株にも保存されており，本機能は γ -HCH 代謝に特異化機構を解明する上で優れた研究対象である（ Nagata et的な機能ではなく，スフィンゴモナッド細菌群がコア機

al., 2019 ）．γ -HCH 分解資化細菌 Sphingobium japonicum
UT26 株を対象とした研究で，本株の分解代謝経路，分（ Endo et al., 2007 ）．すなわち，適当な遺伝的背景を持解に関わる酵素・遺伝子，ゲノム構造が明らかになり，つ細菌株が特殊性の高い酵素をコードする lin 遺伝子群

能として有する γ -HCH 分解に必要な因子と考えられる

本株が実際に γ -HCH 分解資化細菌として成立して間もを獲得し，UT26 株に代表される γ -HCH 分解資化細菌

ない多くの特徴を有していることが明らかになったが誕生したと考えられる（ Nagata et al., 2019 ）．スフィ（Nagata et al., 2019）．その中で重要な点のひとつとして，

ンゴモナッド細菌群には，γ -HCH 分解細菌のみならず，

本株の γ -HCH 分解資化には，直接の代謝酵素遺伝子だ

他の様々な疎水性の難分解性物質を分解する細菌が存在けでなく，linKLMN がコードする ABCトランスポー

することから（ Stolz, 2009; Stolz, 2014 ），LinKLMN 機
能は，本細菌群の環境適応・進化の鍵のひとつであると

E-mail: aynaga@ige.tohoku.ac.jp
共同研究者:田中 良和（東北大学大学院生命科学研究科）．
大坪 嘉行（東北大学大学院生命科学研究科）．

考えられる．
UT26 株の linKLMN 遺伝子は，トランスポゾン（ Tn ）挿入実験により，γ -HCH を唯一炭素源として添加した－ 109 －

佐藤

優花里，永田裕二

無機培地で生育できない変異株の Tn 挿入部位の解析にているからである（ Lundstedt et al., 2021 ）．すなわち，

より同定された（ Endo et al., 2007 ）．LinKLMN は 4 つリン脂質輸送 ABCトランスポーターは依然としてそののタンパク質により構成される複合体であり，各タンパ

メカニズムに不明な点が多く，更なる理解が求められてク質は次のように特徴づけられている．LinK:相同タ

いる．本研究で対象とする UT26 株が属するスフィンゴ

ンパク質は ATPase 遺伝子とセットになって ABCトラ

モナッド細菌群においては，Sphingomonas sp. A1 が有ンスポーターのコアを構成していることから，ABCト

するアルギン酸トランスポーターである Alg タンパク質

ランスポーターを構成する膜タンパク質であると予想さ（ Hisano et al., 1996 ）や，Sphingomonas melonis TY が有れる．LinL:ABCトランスポーターの ATPase コンポー

するニコチントランスポーターである NdpT（ Wang et

ネントと相同性を示し，一般に保存されるモチーフを有す る た め，ATPase コ ン ポ ー ネ ン ト と 予 想 さ れ る．

al., 2018 ）など，いくつか ABCトランスポーターの報
告がされているが，脂質輸送 ABCトランスポーターの

LinM:脂質結合性が示唆される Mammalian Cell Entry

報告はまだない．上述のように，LinKLMN は，脂質輸(MCE)ドメイン（ Casali and Riley, 2007 ）を保持してい送を介して細胞膜の構築と安定性に関与する ABCトラ

る．大腸菌が有する 3 種の MCE タンパク質（ MlaD，

ンスポーターであると示唆されており，LinKLMN の輸

PqiB，LetB）は，それぞれ脂質輸送に関与すると推定

送基質・構造・作用機構の解明により，スフィンゴモナッ

される ABCトランスポーターを構成するペリプラズム

ド細菌群の外膜の構成原理の理解に繋がることが期待さ

タンパク質であり，疎水性物質であるリン脂質など外膜れる．さらに，スフィンゴモナッド細菌群は大腸菌などを構成する脂質を親水性のペリプラズム領域で輸送する

他のグラム陰性細菌と異なり，リポ多糖の代わりにス役割を担うと示唆される（ Ekiert et al., 2017 ）．LinN:

フィンゴ糖脂質を有する特異な外膜構造をしている

N 末端にシグナルアンカーペプチドを有する，機能未知（ White et al., 1996 ）ことから，生物学的にも新たな知のリポタンパク質と予想される．LinN はペリプラズム見が得られると期待される．そこで，本研究では，新規側から外膜にアンカーされた，LinM と相互作用する膜性の高い LinKLMN について，遺伝学的，生化学的，おタンパク質であると予想される．さらに，UT26 株のよび構造学的アプローチにより解析し，脂質輸送を担う

linKLMN 遺伝子破壊株では，UT26 株より，（ i ）γ -HCHを 迅 速 に 分 解 し， よ り 多 く の dead-end 産 物 で あ る

ABCトランスポーター複合体に関する新たな知見を得

2,5 -DCP を蓄積する，（ii）2,5 -DCP による生育阻害効果

一方，生物にとって，生育や増殖に必要な栄養源が十ることを目的とした．

が強くなる，（iii）疎水性物質の取り込み能が上昇する，

分でない低栄養環境は身近に存在する「極限環境」であ（iv）有機溶媒耐性能が低くなる，（v）外膜成分を培養液ると同時に「日常的な環境」でもある．従って，当該環に多く漏出させる，こと（ Endo et al., 2007; Endo et al.,

境下での振る舞いは生物にとって極めて重要であり，

unpublished data ）から，LinKLMN は，細胞膜成分の様々な低栄養環境適応機構が存在すると考えられる．と輸送を介して細胞外膜の integrity（構築と安定性）に関りわけ，増殖に有機炭素源を必要とする従属栄養細菌は与する ABCトランスポーターシステムであると推定さ栄養源が枯渇しがちである．一般に細菌は低栄養環境でれる．

は増殖を停止し，消極的に耐え忍んでいると考えられてABCトランスポーターは，細菌の外膜形成や薬剤耐

おり，いわゆる飢餓応答機構が詳細に研究されている性，多細胞真核生物のホルモン分泌など，様々な基本的（ White et al., 1996 ）．しかし，ただ「耐え忍ぶ」だけでな生体機能に関与しており，特に大腸菌では Mla タンは増殖による多様化が起こらず，新しい代謝能の獲得なパク質など，リン脂質輸送を担うとされる ABCトラン

どの進化も起こり得ない．従って，低栄養環境下でもスポーターの研究が数多くなされている．リン脂質は大「消極的に」増殖を停止するだけなく，「積極的に」増殖

腸菌などのグラム陰性細菌において主要な外膜構成物質するための適応機構も存在するはずである．実際，低栄であり，リン脂質輸送能力を失うと細胞の不安定化や死養環境で増殖する細菌（ oligotroph ）が環境中に広く存滅を引き起こすため，グラム陰性菌にとって重要な脂質在することは古くから知られている（ Kuznetsov et al.,である．しかし，リン脂質輸送については，LPS や膜タ

1979 ）．また，従属栄養細菌が独立栄養細菌が利用する

ンパク質など他の外膜成分の輸送メカニズムに比べて，既知の CO2 固定経路を有さないにもかかわらず，低栄

ほとんど理解されていない．これはいくつかのシステム

養環境下で独立栄養細菌のように振る舞い，CO2 依存的がリン脂質輸送を媒介できると示唆されており，ひとつに細胞増殖する現象も見出されている（ Ohhata et al.,の推定リン脂質トランスポーターを欠失させても表現型

2007 ）．しかし，このような現象は再現性の問題や低栄として表れにくいなど，機能的冗長性が新規リン脂質輸

養環境での培養という技術的な困難もあり，詳細な機構

送 ABCトランスポーターの発見と特性評価を困難にし解明には至っていない．我々は，γ -HCH 分解資化細菌－ 110 －

細菌の環境適応・進化に関する細胞機能

Sphingobium japonicum UT26 株の遺伝学的解析の過程
で，本細菌株の CO2 依存的な低栄養環境適応現象を見

それらを組み合わせて三次元平均化を行い立体構造モデル図を得た．

出し，その現象の特徴の解析と機構の解明を進めた．
超低栄養環境での従属栄養細菌の細胞増殖現象

実験方法

Sphigobium japonicum UT26 株由来の株の培養には，完全培地として 1/3LB 培地（ Inaba et al., 2020 ），無機

γ -HCH 資化に必須な ABCトランスポーター LinKLMNの遺伝学的・構造学的解析
Sphigobium japonicum UT26 株由来の株の培養には，完全培地として 1/3LB 培地（ Inaba et al., 2020 ），無機

塩 培 地 と し て W 培 地（ Imai et al., 1989 ）， あ る い は
1/10W 培地（ Inaba et al., 2020 ）を使用し，炭素源を添加する場合にはグルコースを 0.2％加えた．大腸菌の培
養には LB 培地を用い，適宜抗生物質を添加した．完全塩培地として W 培地（ Imai et al., 1989 ）を使用し，炭培地の固体培地には，寒天を 1.5％となるように加えた．

素 源 と し て グ ル コ ー ス を 0.2 ％， コ ハ ク 酸 を 0.5 ％，無機培地の固体培地には高純度の精製寒天 1.5％，ある

γ -HCH を 750 mg/L となるように加えた．大腸菌の培養には LB 培地を用い，適宜抗生物質を添加した．固体培

いはゲランガム 0.4％を用いた．UT26 由来株は 30 ℃，

地には，寒天を 1.5％となるように加えた．UT26 由来

は，15％のグリセロールを添加し，-80 ℃で保存した．

大腸菌は 37 ℃で培養した．菌株を長期保存する場合に株は 30 ℃，大腸菌は 37 ℃で培養した．菌株を長期保存

DNA 操作，PCR，DNA 塩基配列決定，エレクトロポー

する場合には，15％のグリセロールを添加し，-80 ℃でレーション等は常法に従った（ Sambrook et al., 1989 ）．

保存した．DNA 操作，PCR ，DNA 塩基配列決定，エレ

adhX 遺伝子への部位指定変異導入は確立した手法を用いた（ Ito et al., 2007 ）．

クトロポーレーション等は常法に従った（ Sambrook et

固体培地上での生育評価はスポットアッセイにて行っ

al., 1989 ）．
UT26 株の linKLMN 遺伝子完全欠失株（ UT26DLKNた．CO2 依存性を評価する場合には，プラスチックバッ

株）は，pAK405（ Kaczmarczyk et al., 2012 ）を用い，

グ中に CO2 吸着剤であるソーダ石灰を共存させ，密閉相同組換えによりマーカーレスとなるように作製した．

して生育を観察した．CO2 の取り込みは，NaH14CO3 と相補用のプラスミドの作製には広宿主域ベクター

H2SO4 を混合して発生させた 14CO2 の取り込み量で評価

pKS13P（ Endo et al., 2007 ）を用いた．

した．

細胞の細胞膜透過性を調べるための蛍光色素として，

UT26 株のプラスポゾン pTnMod-OKm（ Dennis et al.,FM-4-64 と SYTOX Green を 用 い た．DNA 染 色 剤 の1998 ）を用いた Tn 変異株ライブラリーの構築と解析は，

DAPI をバックグラウンド検出用に用いた．これら染色既報に従った（ Endo et al., 2005; Endo et al., 2007 ）．

液と細菌細胞を混合し，蛍光顕微鏡で観察を行った．画像処理には ImageJ を用いた．

UT26 株 の 各 種 遺 伝 子 完 全 欠 失 株 は，pAK405（ Kaczmarczyk et al., 2012 ）を用いて相同組換えによりLinM の 発 現 に は， 発 現 用 プ ラ ス ミ ド pRSF-1b

マーカーレスとなるように作製した．adhX 高発現用プ（ Merck ），LinN の発現には発現用プラスミド pOPTH

ラ ス ミ ド は 広 宿 主 域 ベ ク タ ー pKS13P（ Endo et al.,（ Ohashi et al., 2016 ），発現用の大腸菌株として E. coli

2007 ）， あ る い は pBBR1-MCS-5（ Kovach et al., 1995 ）BL21Star (DE3)株を用いた．目的酵素の発現誘導を確を用いて作製した．他の遺伝子相補用のプラスミドは，認後，目的酵素が有する HN タグおよび His タグを用い

pKS13P を用いて作製した．Hypermutator 株は，変異型てアフィニティ精製を行った．さらに，ゲルろ過クロマ
トグラフィーにより多量体構造に応じた分画を行った．

dnaQ 遺伝子を用いた不均衡変異導入法（ Itakura et al.,2008 ）により作製した．

大腸菌で発現・精製した HN-LinM をクロロホルム -タンパク質の発現には，pET22b(+)と E. coli BL21StarTM

メタノールで抽出し，抽出物を薄層クロマトグラフィー(DE3)株を用い，His タグを利用してアフィニティ精製で展開し，リン脂質の検出試薬である Dittmer-Lester 試を行った．アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH ）活性は，薬で青色に発色するか検討した．また，大腸菌で発現・NAD+ と基質を添加した際の NADH の生成量を分光光精製した HN-LinM および His-LinN をゲルろ過クロマ度測定で定量することで評価した．

TM

トグラフィーで分画し，EM ステイナーとリンタングス

qTn-Seq 法に用いる Tn カセットを HYGO 表現型株にテン酸により染色して透過型電子顕微鏡（ TEM ）で観察した（田中良和教授の研究室で実施）．His-LinN 試料

in vivo で転移させ，約 11,000 クローンからなる qTn-Seq
用 Tn 変異株ライブラリーを作製した．本ライブラリーから得られた TEM 画像中の粒子をピックアップし，単を 1/3LB，1/10W-グルコース，1/10W 寒天培地で培養

粒子解析を行ない，二次元平均化モデルを得た．さらにした．培養後の菌体を掻き取り，DNA 抽出・精製を行なっ－ 111 －

佐藤

優花里，永田裕二

た．精製 DNA を T4 DNA ポリメラーゼとエキソヌクレ

めには，当該領域のみをマーカーレスで完全欠失した株

アーゼ III で処理し，DNA 断片の末端を修復後，M-MLVを用いることが望ましい．また，以前に作製された

逆転写酵素により，DNA の 5' 末端に G 塩基を付加すると共に，固有識別タグを含むアダプター配列を付加した．

linKLMN 相補用プラスミドでは，linK の開始コドンが最新のアノテーション配列の開始コドンよりも 60 アミ

最後に，PCR でイルミナ社の NGS でシーケンスを行う

ノ酸残基分も後方の ATG で設計されており，linK が完ために必要な配列を付加し，NGS 解析を行なった．得全に相補されていない可能性があることが判明した．そられたリードデータを固有識別タグにより標準化した後こで本研究では，新たに linKLMN のマーカーレス完全に，UT26 株ゲノムへのマッピングを行った．

欠失株(UT26DLKN 株)と，linK の開始コドンを最新のものとした linKLMN 相補用プラスミドを作製し，解析

結果と考察

に用いた．
UT26DLKN 株は，野生株と比べて，通常の栄養培地

γ -HCH 資化に必須な ABCトランスポーター LinKLMNの遺伝学的・構造学的解析（ 1/3LB 培地）およびグルコースを炭素源とした無機培
地（ W_Glu 培地）での生育には顕著な違いが観察されUT26 株の LinKLMN に関する以前の研究では，薬剤なかったが，W_γ -HCH 培地では生育せず，コハク酸を耐性遺伝子で当該遺伝子を破壊した株が用いられていた

炭 素 源 と し た W_Suc 培 地 で は 生 育 が 良 く な っ た（ Endo et al., 2007 ）．しかし，詳細な機能解析を行うた（ Fig. 1 A ）．

Fig.1 Phenotypes of linKLMN-deletion mutant (UT26DLKN) of Sphingobum japonicum UT26. (A) Growth on W medium
with glucose, γ -HCH, and succinate. pHS1 is a plasmid for complementation of linKLMN genes that was constructedfrom broad-host-range vector pKS13P. (B) Staining of UT26 and UT26DLKN cells with FM4-68 and SYTOX-Green.

－ 112 －

細菌の環境適応・進化に関する細胞機能

なお，相補株では野生株と同様の表現型を示した．まぞれ，または，同じ大腸菌細胞で発現させ，アフィニティ

た，UT26DLKN 株は野生株より細胞染色剤の取り込み精製を行った．精製後の各タンパク質についてゲルろ過能が上昇した（ Fig. 1 B ）．一方，大腸菌で発現・精製しク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 解 析 を 行 っ た 結 果，HN-LinM，

た LinM 抽出物を薄層クロマトグラフィーで解析したとHis-LinN 共 に 多 量 体 を 形 成 し， か つ HN-LinM ところ，リン脂質の検出試薬である Dittmer-Lester 試薬でHis-LinN が複合体を形成する可能性が示唆された．さ

青色に発色し，大腸菌で発現した LinM にリン脂質が結らに，精製後の HN-LinM と His-LinN，および両者を共合していると示唆された．また，UT26DLKN 株は，野発現・精製した試料について，ネガティブ染色による生株に比べて多量の membrane vesicle（ MV ）を産生しTEM 観察を行った結果，His-LinN について，His-LinNた（各論 1 参照）．以上，LinKLMN は，細胞膜成分の多量体と推定される粒径約 15 nm の均一な粒子が観察さ輸送を介して細胞外膜の integrity に関与するという仮説れた（ Fig. 2 A ）．
得られた TEM 画像を用いて単粒子解析を行った結を支持する結果が得られた．
LinKLMN の構成因子のうち，LinK と LinL は，他の果，二次元平均化モデルを得，さらにそれらを組み合わ

ABCトランスポーターの当該因子との相同性が比較的せて三次元平均化を行い立体構造モデル図を得た

高く，ABCトランスポーター共通の基本機能を担うと（ Fig. 2 B ）．本モデルは表面の 6 ヶ所に孔を有する正六考えられる．これに対して，LinM と LinN は，解析の面体構造であり，AlphaFold による His-LinN 構造予測進んでいるリン脂質トランスポーターとの相同性が低と組み合わせた結果，His-LinN の 8 量体 x 6 面 ＝ 48 量

く，LinKLMN 特有の機能を規定する因子であると考え体と示唆された．His-LinN はシグナルアンカー配列をられる．そこで，LinM と LinN がどのような構造体と除去しており，当該配列を介して外膜と接触していた疎して機能しているかを解明するために，これらの生化学

水性面同士が水溶液中で結合して本モデルのような粒子的・構造学的解析を行った．N 末端の膜結合配列を除いが形成されたのではないかと考えられる．実際，8 量体て HN タグを付与した LinM，N 末端のシグナルアンカー

x 2 ＝ 16 量体と推測される粒子も観察されており，多面ペプチド配列を除いて His タグを付与した LinN をそれ

体構造は実験で生じた人工物である可能性が高い．しかし，LinN が生体内でも 8 量体構造を形成し，内部のチャンネルを輸送基質が通過する可能性が強く示唆された．
今後，クライオ電顕でより詳細な解析を実施する予定であるが，今回得られた結果は，少なくとも LinKLMN 予
想モデル図（ Fig. 3 ）と矛盾しない．

Fig. 2 Multimer structure of LinN, a component of
LinK LMN A BC transpor ter system. Purified
His-LinN expressed in E. coli was analyzed by
TEM (A), and 3D structure model of His-LinN
was constr ucted by using single molecules
observed by TEM analysis (B).

Fig. 3 Proposed model of LinKLMN ABC transporter system
in UT26. LinM and LinN form multimeric complexes,
and the LinK LMN system transports unknown outermembrane component(s) (black diamonds) such as lipid
in an ATP-dependent manner.

－ 113 －

佐藤

優花里，永田超低栄養環境での従属栄養細菌の細胞増殖現象

裕二であった．そこで，HYGO 株クローンの Tn 挿入部位をUT26 株は Alphaproteobacteria に属する従属栄養細菌

野生型株に導入し，当該変異を再現したところ，やはりであり，生育に有機炭素源を必要とし，炭素源を添加し

HYGO 表現型を示したことから，本表現型は遺伝子破ない無機塩培地では生育しないため，γ -HCH の資化能

壊による効果ではなく，Tn 挿入部位に近接する亜鉛依についても γ -HCH を唯一の炭素源として添加した無機

存的アルコールデヒドロゲナーゼ（ ADH ）と有意な相塩培地（ γ -HCH 培地）で評価できる．すなわち，本株

同性を示すタンパク質をコードする遺伝子（ adhX と命の Tn 変異株ライブラリーを作製し，グルコースを添加名）が Tn 由来のプロモーターで構成的に発現したことした無機塩培地では生育し，γ -HCH 培地では生育しなが HYGO 表現型を引き起こしたと推定された（ Inaba et

いクローンを選択すれば，γ -HCH 資化に必須な遺伝子

al., 2020 ）．実際，野生型株に adhX を構成的に発現するプラスミドを導入しても HYGO 表現型が観察された．

に Tn が挿入されたクローンが選択できる．本手法を用いて，γ -HCH 代謝系の下流遺伝子や（ Endo et al., 2005;

さらに，後述するように，adhX を高発現する自然突然

Nagata et al., 2007 ），上述の γ -HCH 資化に必須な ABC

変異株も低頻度ながら出現し，野生株を用いた解析では，

トランスポーター遺伝子 linKLMN（ Endo et al., 2007 ）内在する adhX 遺伝子高発現の自然突然変異が実験結果を 同 定 し た． こ の よ う な ス ク リ ー ニ ン グ の 過 程 で，に影響を与える場合が生じたため，adhX を完全欠失し

γ -HCH 培地で活発に増殖し，野生株より大きなクリア
ゾーンを形成するクローンを見出した．クリアゾーンはた UT26DAX 株を作製し，以降の解析に用いた．adhX

γ -HCH の分解により生じるため，当初，本クローンはでは特別な表現型は示さなかった．なお，UT26DAX 株

γ -HCH 代謝能が増強した株と考えられたが，炭素源非添加の無機塩培地で培養したところ，野生株は全く生育由来の hypermutator 株（後述）では，HYGO 表現型株は出現せず，本表現型ににおける adhX の必須性を支持しないのに対して，本クローンはコロニーが可視化できする（ Inaba et al., 2020 ）．UT26DAX 株で adhX を高発るほど活発に増殖し（ Fig. 4 ），γ -HCH 代謝能自体には現させた株も HYGO 表現型を示し（ Fig. 4 ），adhX の発変化がなかった．

現が本表現型を引き起こす直接の要因であると結論しすなわち，γ -HCH を炭素源としなくても増殖できるたは生育に必須ではなく，UT26DAX 株は通常の培養条件た．さらに，CO2 吸着剤であるソーダ石灰を用いた解析

め，結果的に培地中の γ -HCH をより多く分解したと考から，HYGO 表現型には大気濃度レベルの CO2 が必要えられた．本現象を high-yield growth under oligotrophicであり（ Fig. 4 ），また，HYGO 表現型での細胞増殖のconditions（ HYGO）と命名し，解析を行った．

際に 14CO2 の取込が観察されたことからも本表現型はTn 挿入変異株ライブラリー由来の HYGO 株の Tn 挿

CO2 依存的であると結論した（ Inaba et al., 2020 ）．

入部位を決定したところ，遺伝子間領域への Tn の挿入

HYGO 表現型株は液体培養では明らかな濁度上昇がFig. 4 The CO2 -dependent HYGO phenotype was induced by the expression of the adhX gene in UT26 (Inabaet al., 2020). UT 26 (W T), Tn-induced HYGO mutant (UT1130), and UT 26DA X(pKS13P-adhX)(adhX+) cells were incubated on 1/3 LB (nutrition-rich) and 1/10 W (oligotrophic) medium for 3 days
at 30 ℃ under CO2 -limited (with soda lime) and non-limited (without soda lime) conditions.

－ 114 －

細菌の環境適応・進化に関する細胞機能

みられず，固体培地の支持体を資化している可能性も考以上，HYGO 表現型では大気中の CO2 などの成分を主えられた．しかし，精製寒天以外に，より純度の高いアな炭素源として増殖している可能性が高いと考えられた．

ガロースやゲランガムを支持体として用いても同様の現大腸菌で発現・精製した adhX 産物の AdhX は，メタ象が観察されること，また，支持体を資化する場合に観ノールやエタノールなどのアルコールに対して ADH 活

察される菌体増殖に伴う固体培地の陥没現象もみられな性を示した（ Inaba et al., 2020 ）．また，ADH 活性に重い こ と か ら， そ の 可 能 性 は 低 い と 思 わ れ た． 実 際，

要なアミノ酸残基に変異を導入し，ADH 活性を失った

colony forming unit（ cfu ）を測定することで，液体培地

AdhX(C42A)および AdhX(T44A)を発現する UT26DAX

でも HYGO 表現型が観察された（ Fig. 5 ）．

株 は HYGO 表 現 型 を 示 さ ず， 弱 い ADH 活 性 を 持 つさらに，液体培地で継代培養を行っても HYGO 表現

AdhX(H43R)を発現する UT26DAX 株は弱い HYGO 表型が観察されることから，栄養培地で増殖した際の細胞現型を示した（ Inaba et al., 2020 ）．すなわち，AdhX の内の蓄積物が OG 表現型に必要である可能性も否定され

ADH 活性の強さと HYGO 表現型には相関関係があり，た（ Fig. 6 ）．

AdhX の ADH 活性が HYGO 表現型に必要であると考え

Fig. 5 Growth of H YGO strains in liquid medium(Inaba et al., 2020). U T 26 (W T ), U T1130,
U T 2 6DA X and U T 2 6DA X(pKS13P-adhX)(adhX+) cells precultured on 1/3 LB agar plate
were incubated in 1/10 W with glucose (A) andwithout the addition of any organic carbon
sources (B), and the number of colony-forming
units (c.f.u.) was counted. The means of three
independent experiments and sd are shown.

Fig. 6 Serial transfer culture of the H YGO strain in
liquid medium (Inaba et al., 2020). UT26 (WT)and UT26DA X(pBBR_Pu_adhX) (adhX+) cells
precultured on 1/3 LB agar plate were incubatedin 1/10 W with glucose (A) and without the addition of any organic carbon sources (B), and thenumber of colony-forming units (c.f.u.) was
counted. The means of three independent experiments and sd are shown. One per cent (v/v) of
the culture was transferred to the same fresh
medium at the time points shown by the arrows.

－ 115 －

佐藤

優花里，永田裕二

ドは元々同じ DNA 分子に由来すると考えてリードデー

られる．
UT26 株は独立栄養細菌の CO2 固定機構の鍵酵素遺伝

タを処理することで，より定量的な解析が可能である．

子ホモログは有しておらず，HYGO 表現型において新

なお，本手法の開発にあたり，DNA 分子に固有識別タ

規の CO2 固定経路が機能している可能性も考えられる．

グを効率的に付与するために，核酸関連酵素の特徴を明そこで，HYGO 表現型に関与する遺伝子の網羅的同定

らかにした（ Ohtsubo et al., 2017a; Ohtsubo et al., 2017b;を行った．NGS を用いて Tn 変異株ライブラリー中のOhtsubo et al., 2018; Ohtsubo et al., 2019 ）．約 11,000 ク

Tn カセットの挿入位置を一括して同定可能な Tn-Seq 法

ローンからなる HYGO 表現型株の Tn 変異株ライブラが広く用いられている．しかし，従来の Tn-Seq 法は，シーリーを作製し，1/3LB（栄養培地），1/10W（無機培地）

ケンスライブラリー調製の際に PCR 増幅を行うために，+ グルコース，1/10W で培養し，それぞれの条件下で2 本の同じリードが元々 2 つの鋳型 DNA に由来するの増殖した細胞集団の Tn カセット挿入部位を NGS 解析しか，ひとつの鋳型 DNA に由来するのか区別がつかない，

た．リードデータを元に固有識別タグによる標準化とゲという定量的な欠点がある．そこで，PCR 増幅の前にノムへのマッピングを行った．その特徴的な一部を固有識別タグを連結する quantitative Tn-Seq（ qTn-Seq ）Fig. 7 に示す．

法を開発した．本手法では，同じ固有識別タグを持つリー

1/10W 培養細胞特異的にリード数が減少している遺Fig.7 Examples of qTn-Seq analysis. Abundance of Tn-insertion mutants among cells cultured on 1/3LB,
1/10W_Glucose, and 1/10W were visualized and compared. Genes indicated by black (A) andwhite triangles (B) are proposed genes important and harmful for HYGO phenotype, respectively.

－ 116 －

細菌の環境適応・進化に関する細胞機能
Table 1 Genes identified by qTn-Seq as ones involved in the HYGO phenotype
Locus Taggene

product

SJA_C1-17770

ppdk

pyruvate, phosphate dikinase

SJA_C1-21600

aceB

malate synthase G

SJA_C1-27790

gcvPB

glycine dehydrogenase (aminomethyl-transferring)

SJA_C1-27800

gcvPA

glycine dehydrogenase (aminomethyl-transferring)

SJA_C1-28310

aceA

isocitrate lyase

Chromosome 1

SJA_C1-28320

XRE family transcriptional regulator

SJA_C1-31210

XRE family transcriptional regulator

SJA_C1-33580

ppc

phosphoenolpyruvate carboxylase

SJA_C1-33720

acetyl-coenzyme A synthetase

SJA_C1-34420

TonB-dependent receptor

Chromosome 2
SJA_C2-01170

TonB-dependent receptor

SJA_C2-01390

urea carboxylase

SJA_C2-01660

pntB

NAD(P) transhydrogenase subunit beta

SJA_C2-01670

pntA

pyridine nucleotide transhydrogenase subunit alpha

SJA_C2-04280
SJA_C2-05630

class II aldolase
acs

acetyl-coenzyme A synthetase

SJA_C2-05640

pseudoazurin

SJA_C2-05740

DNA-binding response regulator

SJA_C2-05750

GCN5 family N-acetyltransferase

SJA_C2-05790

hybrid sensor histidine kinase/response regulator

SJA_C2-05800
SJA_C2-05820

hypothetical protein
aldH

aldehyde dehydrogenase family protein

伝子が HYGO 表現型に関与する遺伝子の候補となる．

とが重要であることが判明した．一方，AdhX がアルコー同定された候補遺伝子のリストを Table 1 に示す．

ルデヒドロゲナーゼであることから，アルコール類・ア

このうち，aceA, aceB, ppdk 遺伝子は，HYGO 表現型

セトアルデヒド・酢酸資化能と HYGO 表現型との関係

株の当該遺伝子破壊株・相補株を作製し，スポットアッ性を検討した．その結果，野生株では資化できないエタ

セイにより HYGO 表現型におけるそれら遺伝子の必須

ノールが，HYGO 表現型株の生育を著しく促進し，ア性 を 確 認 し た（ Nonoyama et al., unpublished data ）．

セトアルデヒドと酢酸による生育は adhX 高発現に依存

aceA と aceB はグリオキシル酸回路を構成する因子であり（ Fig. 8 ），HYGO 表現型へのグリオキシル酸回路のしなかった（ Fig. 9 ）．

関与が明らかになった．

株でも実施したところ，エタノールによる生育促進とさらに，同様の実験を aceA, aceB, ppdk 破壊株・相補

な お，aceA と aceB は，RNA-Seq 解 析 に お い て も，

これら遺伝子とに明らかな関係性が観察された1/10W 培 地 で の 増 殖 細 胞 で 特 異 的 に 発 現 し て い た（ Nonoyama et al., unpublished data ）．以上の結果をま（ Nonoyama et al., unpublished data ）． ま た，ppdk 遺 伝

とめると，HYGO 株は低栄養環境下でグリオキシル酸

子が HYGO 表現型に必須であり，かつ pdhAB 遺伝子の回路で CO2 の放出を抑えつつ，環境中に低濃度で存在

破壊が HYGO 表現型で有利である（破壊株の割合がするエタノールを主な基質として利用していると考えら

HYGO 条件下で増加する）ことも qTn-Seq 解析から明れる．CO2 を固定ステップとしては，ホスホエノールピ

らかになっており（ Fig. 7 B ），ピルビン酸はアセチル

ル ビ ン 酸 カ ル ボ キ シ ラ ー ゼ(Ppc)な ど の ア ナ プ レ ロ

CoA ではなく，ホスホエノールピルビン酸に流れるこ

ティック反応での固定に加えて，ピルビン酸デカルボキ－ 117 －

佐藤

優花里，永田裕二

Fig. 8 Metabolic map related to the HYGO phenotype.

Fig. 9 The HYGO phenotype is related to ethanol utilization. UT26, UT26DA X, and UT26DA X(pBBR_Pu_adhX)(adhX+) cells were incubated on 1/10 W medium with ethanol, acetaldehyde, acetate, and glucose.

－ 118 －

細菌の環境適応・進化に関する細胞機能

シラーゼ(IlvB)の逆反応や，グリシンデヒドロゲナーゼ

ログを UT26DAX 株で発現させても OG 表現型を示すこ(GcvP)などが考えられるが（ Fig. 8 ），より詳細な解析と（ Sakai et al., unpublished data ）などから，基本的なが必要である．また，これら代謝酵素に加えて，TonB-

機構自体は，スフィンゴモナッド細菌群だけでなく，多dependent receptor like protein(TBDR)をコードする遺くの環境細菌が利用する普遍性の高いものである可能性

伝子が HYGO 表現型に重要な遺伝子として同定されたも考えられる．

ことも興味深い．さらに，制御因子をコードする遺伝子

以上，HYGO 表現型における CO2 固定経路は新規かも同定されており，これらについても，今後解析する必つ普遍的なものである可能性があり，詳細な機構が解明要がある．

されれば，多くの環境細菌が有する常温・常圧環境での

HYGO 表現型は，Tn 変異を導入した人工株で最初にCO2 固定機構として生態学的意義が大きいだけでなく，観察された現象であり，そもそも細菌にとって生理的にCO2 削減問題への展開も期待できる．また，発酵産業に意味のある現象なのかは不明であった．しかし，不均衡おいて，有用微生物を培養し物質生産するための培地の変異導入法（ Itakura et al., 2008 ）を適用した UT26 株

費用は抑えるに越したことはない．従属栄養細菌が低栄由来の hypermutator 株を有機炭素源非添加無機固体培

養環境で生残し，積極的に増殖する機構が解明されれば，地で培養すると，adhX を高発現して HYGO 表現型を示

こうした有用細菌の培養において，栄養源の添加量を抑す突然変異株が比較的高頻度で出現した（ Inaba et al.,

えた効率的な培養法が開発できるかもしれない．一方，

2020 ）．さらに，hypermutator 株でなくても低頻度なが浄水や工業パイプライン，医療器具など，低栄養と思わら HYGO 表現型株は得られ，これら株のリシーケンシれる環境でも有害細菌が増殖し，問題となるケースが多ングの結果，二成分制御因子の関与が強く示唆された

い．HYGO 表現型の機構は，こうした有害細菌の低栄（ Inaba et al., unpublished data ）．また，レポーター遺伝

養環境での増殖機構とも関連している可能性が考えら子を用いた解析で，adhX の高発現突然変異は転写抑制

れ，有害細菌の増殖抑制による汚染防止技術への展開も因子の脱抑制変異である可能性が強く示唆されている期待できる．さらに，環境バイオテクノロジーの観点か（ Inaba et al., unpublished data ）． こ れ ら の 結 果 か ら，らは，分解菌を汚染環境に接種するバイオオーグメン

adhX 高発現突然変異は比較的起こりやすい変異であり，かつ通常は制御因子の制御下にあると考えられる．すな

テーションへの直接的応用が期待できる．実際，HYGO

わち，HYGO 表現型は低栄養環境適応機構として生理されたものであり，先述のように adhX が UT26 株の土的に意義のある現象であることが強く示唆される．実際，

壌での生残に重要であるという予備的知見も得られていUT26DAX 株の土壌中での生残性が野生型株より劣るとる．バイオオーグメンテーションでは，分解菌が汚染環

い う 予 備 的 知 見 も 得 ら れ て お り（ Kato et al., unpub-

境に定着せず，十分な分解能を発揮しないことがしばし

表現型株は，そもそも γ -HCH 高効率分解株として単離

lished data ），何らかの条件下で adhX が高発現することば問題となっており（ Ramos et al., 2011 ），そうした問が重要な環境適応戦略なのかもしれない．一方，様々な題解決の切り札となるかもしれない．

identity のレベルの adhX 遺伝子ホモログが生物界に広要く存在し，adhX と 99％以上の identity を示すほぼ同一の遺伝子も環境に常在するスフィンゴモナッド細菌群の約他株に見出される（ Inaba et al., 2020 ）．すなわち，ほぼ本研究では，細菌の環境適応・進化に関する細胞機能同一の adhX が 16S rRNA 遺伝子の系統関係を超えて存に関する知見を得ることを目的として，γ -HCH 分解資在し，かつ，それらの多くがプラスミド上に存在するこ化細菌 Sphingobium japonicum UT26 株の分解代謝酵素とから，近縁種間での水平伝播が強く示唆される．なお，以外の γ -HCH 資化に必須な因子である ABCトランス

UT26 株では adhX 遺伝子は染色体上に存在するが，内ポーター LinKLMN と，本株の低栄養環境での増殖現象

在性の Tn に挟まれた領域に存在するため，同様に水平について解析を行った．その結果，LinKLMN は，細胞伝播が示唆される．さらに，UT26 株の adhX を高発現

膜成分の輸送を介して細胞外膜の integrity に関与するとさ せ る こ と で HYGO 表 現 型 を 示 す 他 株 が 存 在 す るいう仮説が支持された．さらに，LinKLMN 特有の機能（ Inaba et al., 2020 ）ことからも，本現象は本細菌群が比を規定する因子と考えられる LinM と LinN が，それぞ較的最近獲得し，環境中で伝播しつつある低栄養環境適れ多量体を形成し，互いに相互作用する可能性を示唆す

応 機 構 な の か も し れ な い． た だ し， 類 縁 性 の 低 いる結果が得られた．特に LinN については，8 量体構造

Betaproteobacteria 株でも UT26 株の adhX を高発現させることで OG 表現型を示す株が存在すること（ Inaba et

であることが TEM 解析により強く示唆された．一方，

al., 2020 ），他株由来の比較的 identity の低い adhX ホモ

adhX 遺伝子の高発現で炭素源非添加の無機培地で CO2

UT26 株がアルコールデヒドロゲナーゼをコードする－ 119 －

佐藤

優花里，永田依存的に細胞増殖する現象（HYGO 表現型）を見出した．
本現象は，広く環境細菌が有する機能である可能性が示唆された．独自に開発した qTn-Seq 法などにより機構解明を進めたところ，HYGO 表現型株は，低栄養環境
下でグリオキシル酸回路で CO2 の放出を抑えつつ，環境中に低濃度で存在するエタノールを主な基質として利用して増殖している可能性が示唆された．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表・ポスター発表
1) 大坪嘉行，永田裕二，津田雅孝．2017．逆転写酵素の強いtailing活性と解析ソフトTraceViewer．第11回日本ゲノム微生物学会年会（3月2-4日，藤沢）
2) 大坪嘉行，永田裕二，津田雅孝．2017．マウス白血病
ウィルス由来逆転写酵素のN-tailing活性と解析ツール
TraceViewer．日本農芸化学会2017年度大会（3月17-20
日，京都）3) 稲葉慎之介，加藤広海，大坪嘉行，津田雅孝，永田裕二．2017．環境常在細菌に見出された新規低栄養環境適応機構に関する研究．日本農芸化学会2017年度大会（3月
17-20日，京都）
4) Inaba, S., Kato, H., Ohtsubo, Y., Tsuda, M. & Nagata, Y.
2017. Expression of an alcohol dehydrogenase gene in aheterotrophic bacterium induces the oligotrophic growthwith carbon dioxide fixation. The 7th Congress of European
Microbiologists (FEMS 2017)（July 6-13, Valencia, Spain）
5) Ohtsubo, Y., Nagata, Y. & Tsuda, M. Strong N-tailing activity
and specific enhancers of Moloney murine leukemia virus
reverse transcriptase toward blunt DNA ends. 15th
Inter national Union of Microbiological Societies(IUMS2017)（July 17-21, Singapore）
6) 大坪嘉行，永田裕二，津田雅孝．2017．定量的TnSeq解析法の構築とPCB分解細菌Acidovorax sp. KKS102株の全必須遺伝子の同定．第2回環境微生物系学会合同大会2017（8
月29-31日，仙台）
7) 稲葉慎之介，加藤広海，大坪嘉行，津田雅孝，永田裕二．2017．極貧栄養環境での生育能を獲得した好気性従属栄養細菌突然変異株の解析．第2回環境微生物系学会合
同大会2017（8月29-31日，仙台）
8) 大坪嘉行，佐々木春菜，永田裕二，津田雅孝．2018．逆転写酵素を用いたトランスポゾン変異株ライブラリーの定量的解析手法の確立．第12回日本ゲノム微生物学会年会（3月5-7日，京都）
9) 稲葉慎之介，加藤広海，大坪嘉行，津田雅孝，永田裕二．2018．好気性従属栄養細菌における極貧栄養環境適
応変異株の解析．第12回日本ゲノム微生物学会年会（3月5-7日，京都）
10) 稲葉慎之介，加藤広海，大坪嘉行，津田雅孝，永田裕二．2018．好気性従属栄養細菌株由来の極貧栄養環境での生育能を獲得した突然変異株の解析．日本農芸化学会
2018年度大会（3月15-18日，名古屋）
11) 佐藤緋奈子，中鉢千尋，佐藤優花里，矢野大和，大坪嘉行，津田雅孝，永田裕二．2018．細菌の有機塩素系殺虫剤資化に必須なA BCトランスポーターホモログの機能解析．日本農芸化学会2018年度大会（3月15-18日，名古屋）

裕二12) 大坪嘉行，佐々木春菜，永田裕二，津田雅孝．2018．逆転写酵素のtailing活性と新規TSLR反応を用いたトランス
ポゾン変異株ライブラリーの定量的解析．日本農芸化学会2018年度大会（3月15-18日，名古屋）
13) Inaba S., Kato, H., Ohtsubo, Y., Tsuda, M. & Nagata, Y.
2018. 従属栄養性土壌細菌の超貧栄養環境に対する適応機
構Adaptive mechanism of heterotrophic soil bacteria toward
ultra-oligotrophic conditions. 日本微生物生態学会第31回大会（7月11-13日，沖縄）
14) 大坪嘉行，永田裕二，津田雅孝．2019．超音波処理剪断
DNAの3'末端の高効率修復．第13回日本ゲノム微生物学会年会（3月6-8日，東京）
15) 稲葉慎之介，酒井洋範，加藤広海，大坪嘉行，津田雅孝，永田 裕二．2019．従属栄養細菌の栄養源制限下における適応増殖メカニズム．第13回日本ゲノム微生物学会
年会（3月6-8日，東京）
16) 酒井洋範，稲葉慎之介，加藤広海，大坪嘉行，津田雅孝，永田裕二．2019．アルコールデヒドロゲナーゼAdhX
遺伝子依存的貧栄養 環境適応機構の普遍性．日本農芸化学会2019年度大会（3月24-27日，東京）
17) 大坪嘉行，永田裕二，津田雅孝．2019．qTnSeq法の開発とPCB分解細菌への適用．日本本農芸化学会2019年度大会（3月24-27日，東京）
18) 尾形拓哉，中鉢千尋，佐藤優花里，大坪嘉行，津田雅孝，永田裕二．2019．有機塩素系殺虫剤の微生物分解に関わるMCE super fam ilyタンパク質LinMはホモオリゴ
マー複合体を形成する．日本本農芸化学会2019年度大会（3月24-27日，東京）
19) 尾形拓哉，佐藤優花里，永田裕二．2019．Sphingobium
japonicum UT26株の有機塩素系殺虫剤分解に関わるABC
トランスポーターの解析．日本生化学会東北支部第85回
例会（6月8-9日）
20) 酒井洋範，加藤広海，大坪嘉行，津田雅孝，永田裕二．
2019．環境細菌におけるadhX遺伝子が関与する貧栄養環
境適応機構の普遍性．日本微生物生態学会第33回大会（9月10-13日，甲府）
21) 逸見裕太郎，永田裕二，津田雅孝，大坪嘉行．2020．
qTnSeq法を利用したPCB/ビフェニル分解菌の分解制限要因の同定と排除．第14回日本ゲノム微生物学会年会（3月6-8日，名古屋）
22) 鈴木達也，相馬隆光，加藤広海，豊福雅典，野村暢彦，
永田裕二．2020．有機塩素系殺虫剤分解能を持つスフィ
ンゴモナッド細菌株のmembrane vesicle形成．日本農芸化学会2020年度大会（3月25-28日，福岡）23) 酒井洋範，加藤広海，大坪嘉行，津田雅孝，永田裕二．
2020．培養条件検討からadhX遺伝子依存的貧栄養環境生育機構に迫る．日本農芸化学会2020年度大会（3月25-28日，福岡）24) 大坪嘉行，酒井啓一郎，永田裕二，津田雅孝．2020．超音波で断片化したDNAの3'端と効率的修復．日本農芸化学会2020年度大会（3月25-28日，福岡）25) 逸見裕太郎，永田裕二，大坪嘉行．2021．新規 qTnSeq 法の開発:PCB/ビフェニル分解菌への適用と 2 つの指標値の導入．第15回日本ゲノム微生物学会年会（3月5-6日，オンライン）
26) 永田裕二．2021．従属栄養細菌の極貧栄養環境でのCO2依
存的な増殖現象．日本農芸化学会2021年度大会（3 月
18-21日，オンライン）シンポジウム「細菌の低栄養環境－ 120 －

細菌の環境適応・進化に関する細胞機能に対する増殖を伴う適応機構」
27) 野々山翔太，柳熙盟，加藤広海，大坪嘉行，永田裕二．
2022．qTn-Seq法を用いたSphingobium japonicum UT26株の超低栄養環境での増殖に関わる遺伝子の同定．日本農芸化学会2022年度大会（3月15-18日，オンライン）
原著論文
1) Ohtsubo Y., Nagata Y. & Tsuda M. 2017. Efficient N-tailingof blunt DNA ends by Moloney murine leukemia virus
reverse transcriptase. Scientific Reports 7: 41769.
2) Ohtsubo Y., Nagata Y. & Tsuda M. 2017. Compounds thatenhance the tailing activity of Moloney murine leukemia
virus reverse transcriptase. Scientific Reports 7: 6520.
3) Ohtsubo Y., Sasaki H., Nagata Y. & Tsuda M. 2018.
Optimization of single strand DNA incorporation reaction
by Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase.
DNA Research 25: 477-487.
4) Ohtsubo Y., Sasaki H., Nagata Y. & Tsuda M. 2019.
Proper ties and ef ficient scrap-and-build repairing of
mechanically sheared 3' DNA ends. Communications
Biology 2: 409.
5) Inaba S., Sakai H., Kato H., Horiuchi T., Yano H., Ohtsubo
Y., Tsuda M. & Nagata Y. 2020. Expression of an alcohol
dehydrogenase gene in a heterotrophic bacterium inducescarbon dioxide-dependent high-yield growth under oligotrophic conditions. Microbiology 166: 531-545.
その他（総説・書籍・特許など）
1) 永田裕二 従属栄養細菌のCO 2依存的な極貧栄養環境適応．2020. バイオサイエンスとインダストリー 78:
498-500．
2) 永田裕二，加藤広海，大坪嘉行 従属栄養細菌の極貧影
響環境でのCO2依存的な増殖現象．2022. 環境バイオテク
ノロジー学会誌 22: in press.

謝辞本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．また，本研究の遂行にご協力いただいた東北大学大学院生命科
学研究科の野々山翔太博士（現東京工業大学），ちとせ研究所の堀内貴之氏，釘宮理恵氏，ならびに学生諸氏に感謝の意を表します．また，文部科学省科学研究費補
助金

基盤研究（B）（ 永田裕二 19H02865 ），挑戦的萌芽研究（永田裕二 16K14877；佐藤優花里 16K14908 ），な
らびに東北大学男女共同参画推進センター（ TUMUG ）が実施する TUMUG 支援事業（男女共同参画・女性研
究者支援事業）の支援（佐藤優花里）にも感謝致します．

文

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佐藤

優花里，永田from the genomes of lindane-degrading sphingomonads.
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reverse transcriptase. Sci Rep 7: 6520.
Ohtsubo, Y., Nagata, Y. & Tsuda, M. (2017b). Efficient N-tailingof blunt DNA ends by Moloney murine leukemia virus reverse
transcriptase. Sci Rep 7: 41769.
Ohtsubo, Y., Sakai, K., Nagata, Y. & Tsuda, M. (2019). Properties
and efficient scrap-and-build repairing of mechanically sheared
3' DNA ends. Commun Biol 2: 409.
Ohtsubo, Y., Sasaki, H., Nagata, Y. & Tsuda, M. (2018).
Optimization of single strand DNA incorporation reaction by
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Laborator y research aimed at closing the gaps in microbial
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略語一覧
ABC transporter: ATP-binding cassette transporter
ADH: alcohol dehydrogenase
HCH: hexachlorocyclohexane
HYGO: high-yield growth under oligotrophic conditions
LPS: lipopolysaccharide
MCE: mammalian cell entry
TBDR: TonB-dependent receptor
TEM: transmission electron microscope
Tn: transposon－ 122 －

IFO Res.Commun. 36
123-137, 2022

細菌集団の形成と進化
矢野

大和，加藤

広海，永田

裕二

東北大学大学院生命科学研究科微生物進化機能開発寄付講座〒980 - 8577

仙台市青葉区片平2 - 1 - 1

Formation and evolution of bacterial populations
Hirokazu Yano, Hiromi Kato, Yuji Nagata
Laboratory of Microbial Evolution and Function Research,
Graduate School of Life Sciences, Tohoku University
2-1-1 Katahira, Aoba-ku, Sendai 980,-8577
To gain insight into principles of bacterial population formation and evolution and to obtain basic knowledge that willcontribute to practical applied technologies such as bioremediation, we investigated bacterial cell populations capableof degrading organochlorine pesticide, γ-HCH. The clonal γ-HCH-degrading bacterial cell population was repeatedly
subcultured on spatially structured solid medium, and cell lines with partial chromosomal deletions spontaneously
emerged and continued to coexist with ones without such deletions. One of the mechanisms underlying thecoexistence of different cell lines was the mutation of the TBDR homologue gene, which results in increased
membrane permeability and aggregation of cells. In general, our results suggest that the coexistence of cell lines withpartial chromosomal deletions with ones without such deletions is established by the guaranteed niche partitioningof resources or space. On the other hand, in a heterogeneous population of γ -HCH-degrading bacteria, (i) the
degrading bacteria did not become the dominant genus even after repeated subculturing in liquid medium with
γ-HCH as the sole carbon source, and (ii) the giant colonies showing the long-term γ-HCH degradation activity wereformed only when non-degrading bacteria coexisted on solid medium with γ -HCH as the sole carbon source,
indicating the importance of non-degrading bacteria in the γ -HCH-degrading bacterial community. Analysis ofbacterial strains isolated from this community revealed the phenomenon of directional colony growth (DCG), in
which non-degrading bacteria prolong their colonies toward the degrading bacteria. A Cupriavidus strain exhibiting
DCG was also important for the giant colony formation. The hitchhiking phenomenon, in which non-migratory
bacteria use migratory bacteria to expand their habitat, contributed to the expansion of the habitat of γ -HCHdegrading bacteria on solid medium, and was also suggested to be involved in their survival in soil environments,
showing the potential of this phenomenon for bioremediation. Furthermore, we found that EPS produced by easily
culturable Burkholderia selectively promoted the growth of Verrucomicrobia, whose cultivation is difficult. This is a
new strategy to cultivate non-culturable bacteria by using interaction mechanisms underlying the bacterial population.
Key words: bacterial population, population genetics, bioremediation

緒

言の研究においても，単独で当該物質を分解資化できる細菌株が主な研究対象であった．しかし，実際の環境中で従来の微生物の研究は，単離培養が基本であり，単独は単独の株で存在している状況は考え難く，他株との相の株の機能解析が中心であった．環境汚染物質分解細菌

互作用の中での機能発現について検討する必要がある．

E-mail: taro.hakko@hakko-u.ac.jp
共同研究者:野村 暢彦（筑波大学山本 達也（筑波大学
津田 雅孝（東北大学
大塚 重人（東京大学

また，細菌が新規物質代謝能など，新しい機能を獲得す
生命環境系）．
生命環境系）
大学院生命科学研究科）．
農学生命科学研究科）．

る際にも，単独の株では適応が不十分の機能を他の生物あるいは細胞によって補うケースも考えられる．すなわ
ち，細菌の環境適応・進化を集団としての進化の観点からも考える必要がある．

－ 123 －

矢野

大和，加藤

広海，永田

裕二

化学物質の微生物分解研究においては，分離培養可能

し，これら 10 株は 10 ppm の γ -HCH の分解活性を有しなクローンの同定と，その後の責任遺伝子同定を目的とていること，コミュニティでは 300 ppm の γ -HCH を 108した研究の報告例が多い．しかし，「毒性のある化学物

時間で分解できたこと，などを報告している．また，質を分解しながら持続的に増殖する細胞集団」を構築しGebreil と Abraham（ 2016 ）は，殺虫剤や除草剤工場付ようとする場合，現在までに蓄積された科学的知見に基近の土壌を接種源として，γ -HCH の微結晶上に形成さづき，最適化されたゲノムをデザインすることは難しい．

れたバイオフィルムを DGGE 解析し，Sphingomonas 属，生物に普遍的な性質として，遺伝情報を複製して次世代に継承する際，エラー（変異）を導入する性質がある．

Pseudomonas 属，および Burkholderia 属などの細菌株が存在していることを明らかにした．これら HCH のコミュ

それが時間経過に伴う生物種の集団の性質の変化（＝進

ニティにおける既存研究では構成員に関する情報はある化）の根源となっている．人工環境で微生物培養をする

ものの，コミュニティ内のどの細菌が分解菌なのか遺伝場合，微生物集団の性質がどのように変化するのか，ま学的レベルで明確に分かっていないケースも多く，またたその過程で集団中にどのような相互作用が生じやすい

コミュニティとしての生物学的意義を検証している研究のか知っておく必要がある．現在，実験設備を比較的選は少ない．将来的に γ -HCH による環境汚染の浄化へのばない微生物実験進化研究が全盛を誇っており，細菌や応用に結びつけるためには，遺伝学的レベルで HCH 分

ウイルスの適応力の高さと，それらが最初から保有して解コミュニティを解析することで，コミュニティにおけいる遺伝子の機能的可塑性に注目が集まっているる分解菌と非分解菌それぞれの役割を明らかにすること（ Lenski, 2017 ）．実験進化を使用すれば，「化学物質をが求められている．我々は，HCH 汚染土壌を接種源と分解しながら持続的に増殖する細胞集団」の構築方法にして γ -HCH を唯一の炭素源とした無機塩培地で集積培

ついて手がかりを得ることができるかもしれない．しか養することで，HCH 分解活性を有する細菌コミュニティ

し，意外なことに，これまで難分解性化学物質分解微生

EB2 を取得した．これまでに，EB2 から分離された細物や Alphaproteobacteria 綱細菌を利用した実験進化研究

菌株の解析やショットガンメタゲノム解析によって，は報告がない．我々は，γ -HCH を唯一の炭素源として

lin 遺伝子群を有する Sphingobium sp. TKS 株（ Tabata

利用できる Sphingobium japonicum UT26 株の 1 クロー
ンが IS コピー間の相同組換えや，IS の転移により染色

et al., 2016 ）が EB2 の主要な分解菌と考えられること，
EB2 から Cupriavidus sp. TKC 株や Pseudomonas sp. TKP

体の一部を欠失した変異体を生み出すことを見出してい株（ Ohtsubo et al., 2014 ）など HCH 分解活性を示さなる（ Nagata et al., 2013 ）．転移活性のある IS を保有してい細菌株も単離されること，が明らかになった．分解菌

いる本細菌を利用し，遺伝的多様性を集団内に維持しやTKS 株を HCH 寒天培地で単独で培養すると，分解活性

すいといわれている空間構造がある環境を利用すれば，が弱く小さな褐色のコロニーを形成したが，EB2 を培養

比較的短期間に自然生態系で見られるような細胞間の依すると活性を長期維持する不定形の大きなコロニーを形存関係が誕生すると期待された．そこで，我々は，本細成した．これらは分解菌と周囲の非分解菌との間に何ら菌の 1 クローンを出発点とする実験進化を，毒性のあるかの相互関係があることを示唆するが，どのような関係

化学物質（すなわち γ -HCH ）を含む平板培地，さらに性が形成され得るかに関する知見はほぼ皆無である．そグルコースがある平板培地の 2 種類の条件で行い，細菌こで本研究では，HCH 分解細菌コミュニティ EB2 に着集団の多様化のパターンに法則性が見つけられるかどう

目し，その複合微生物系の系統的・機能的安定性や，か検証した．

TKS 株と非分解細菌株との関係性を明らかにすること

これまでに，複数細菌叢からなる HCH 集積培養系の研究は数が少ないものの幾つか報告されている．Mohn

で，EB2 コミュニティの形成原理を明らかにすることを目的とした．

（ 2006 ）らの研究では，スペインの HCH 汚染土壌から土壌環境は優占種・希少種含め数万種以上の細菌種が得られたサンプルを HCH で集積培養した結果，γ -HCH

存在しているが，人類が純粋培養に成功した細菌種は極分解菌として Sphingomonas 属細菌株が分離され，集積めて偏った分類群の一部にしか過ぎない（ Amann et al.,

培養系においてこれら Sphingomonas 属や Pseudomonas

1995 ）．微生物機能の解析や有効利用のためには，目的属，Methylobacterium 属 が 優 占 し て い る こ と が DGGEの株を純粋分離できれば大きなアドバンテージとなる．

（ Denaturing Gradient Gel Electrophoresis ）によって明純粋培養できない主因のひとつとして，微生物間の相互

ら か に さ れ た．Elcey と Kunhi（ 2010 ） は，HCH 汚 染作用が十分に理解されていないことがあげられる．すな

土 壌 か ら Pseudomonas 属，Burkholderia 属，Vibrio 属，わち，微生物間の相互作用の原理を理解することで，新

お よ び Acinetobacter 属 に 帰 属 さ れ た 9 株 と 糸 状 菌

しい難培養細菌の純粋分離法を開発することも可能であFusarium 属の 1 株から構成されるコミュニティを取得ると考えられる．我々は，土壌細菌叢の再構成過程に関－ 124 －

細菌集団の形成と進化する多くのデータを持っており，その中で，易培養性の用した実験では 1 週間おきに，グルコースを使用した実

Burkholderia の次に難培養性の Verrucomicrobia が割合を増やすことに注目した．Verrucomicrobia は土壌環境をは験では 2 日おきに植え継ぎをし，それを 27 回繰り返した．

じめ淡水，海洋，地熱，高塩分およびヒトの腸内などさ

LSM880 を用いた．コロニー全体を観察するために物体

まざまな環境において世界的に分布している一方で，分

表 面 か ら の 反 射 光（ 照 射 波 長:543 nm, 検 出 波 長:

離培養に成功した例は極めて多様な系統の中のごく一部

526 nm -553 nm ），緑色蛍光をもつ細胞を検出するために限られている．Verrucomicrobia をはじめ，Acidobacteriaの 蛍 光 観 察（ 照 射 波 長:488 nm, 検 出 波 長:491 nm（ Kalam et al., 2020 ） や PVC グ ル ー プ(Planctomycete，- 580 nm ）を行なった．1 細胞レベルで細菌の蛍光を検Verrucomicrobia ，Chlamydiae)（ Wagner & Horn, 2006 ;Wong et al., 2020 ）などは土壌細菌叢の中で優占してい出する際は，平板培地上で生育させたコロニーを PBS

るにも関わらず，分離培養例がほとんどないことから，

濁液をスライドグラスに載せカーバーグラスで封じた

コ ロ ニ ー そ の も の の 観 察 に は Zeiss の 正 立 顕 微 鏡に懸濁し，DAPI による核酸の染色を行ったのち細胞懸存在のみが確認されている微生物，いわゆる microbial

後，Zeiss 倒立顕微鏡 LSM710 を使用して細胞の DAPI

dark matter として知られている．これら難培養性細菌

および緑色蛍光の検出をした．解析対象サンプルと並行については，メタゲノムの情報を応用することで微生物して，祖先株を対照群として培養し集団内の緑色蛍光ののゲノム解析と純粋培養をより促進させることが期待さ分布を調べた．細胞の膜透過性を評価する場合は，顕微れている（Handelsman, 2004）本研究では，Burkholderia

鏡観察前に細胞を DAPI と SYTOX-Orange で染色した．

と Verrucomicrobia の間にどのような相互作用が存在す

画像内の細胞の座標の同定と蛍光シグナルの検出にはるのか，特に Burkholderia の細胞外マトリクスの構成要

ImageJ マクロの NucTracer（ Syvertsson et al., 2016 ）を素 で あ る 細 胞 外 多 糖 類（ extracellular polysaccharide:

使用した．
同じ進化実験系列の集団から分離された 2 つの進化型

EPS）を介した相互作用について検討した．

クローン（蛍光タンパク質 ZsGreen1 を保有するものと実験方法保有しないもの）のペアが平板または液体培地で共存できるかを調査した．対象となるクローンそれぞれをクローナルな γ -HCH 分解細菌集団の実験進化

1/3LB 液体培地で 2 日間培養した後 PBS で洗浄し，初Sphingobium japonicum U26 株の linA 遺伝子下流に緑色蛍光タンパク質 ZsGreen1 を挿入した SHY12 株を構築

期濃度が培地あたり 107 ，かつクローンの比率が 9:1 まし，これを祖先株とした．染色体断片（ linA 領域）をた．その後クローンを進化実験と同様の条件で培養し植保有している系統から当該領域を欠失した系統が派生しえ継ぎを行った．蛍光タンパク質を発現するクローンとた際，蛍光顕微鏡観察により，コロニー内の区画として，しないクローンの存在比を調べるため，植え継ぎを行う

そ れ ら の 細 胞 集 団 を 検 出 で き る． 使 用 し た 培 地 は，際，細胞集団を PBS に希釈してプレーティングし，コ

1/3LB 液体培地，グルコース最小培地（グルコース濃度:

ロニーを形成させ，実体顕微鏡を利用して蛍光をもつコ

93.8 µg/mL ），γ -HCH 最 小 培 地（ γ -HCH 濃 度:75 µg/

ロニーの同定を行った．

たは 999:1 になるようクローンを混合し最小培地に入れmL ）である．さらに，細胞が放出する物質に他の細胞

実験進化の過程で集団内に出現した進化型アレルを検の増殖を促進する効果があるかどうか調べるため，グル出するため，進化型クローンとタックタイムポイントのコース最小液体培地で特定のクローンを 4 日間生育させ集団全体のリシーケンシングを行った．ゲノム DNA のて得た培養液を濾過して得た溶液を，最終濃度 40％に調製には Qiagen Genomic Buffer set と Qiagen Genomic

なるようにグルコース最小培地に加えることで作製した

tip 100-G を一貫して使用した．NGS ライブラリーの構

スペント培地を使用した．

築 に は Illumina TruSeq PCR free kit，NGS プ ラ ッ ト

平板培地上で祖先株を培養し続けた際，細胞密度が最フォームには NovaSeq 6000 を一貫して使用した．NGS

9
大で 10（cells/plate）に到達するように炭素源（グルコー

リードのトリミングから進化型アレルの検出までの一連

スまたは γ -HCH ）の濃度を調整した最小培地の平板培の作業に BreSeq v0.32.1（ Deatherage et al., 2014 ）を使地を使用した．各培地につき，祖先集団を 5 つ用意し，用した．

それぞれ独立して，細胞集団の継代培養を行なった．細SHY125 株 が 保 有 し て い た TonB-dependent receptor

胞集団を植え継ぐ際に，平板培地上のコロニーを 2 mL

（ TBDR ）様タンパク質をコードする遺伝子(locus_tag:のリン酸緩衝液（ PBS ）にプールし，そのうち 20 µL を

SJA_RS16255)の進化型アレルを含む 2-kb の領域をス

新しい培地に移し，残りをグリセロールと混合してフフィンゴモナス属細菌の対立遺伝子置換用ベクター

リーザーアーカイブとして冷凍保存した．γ -HCH を使

pAK405（Kaczmarczyk et al., 2012 ）にクローニングした．

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構築したプラスミドをエレクトロポレーション法によりニーを形成することから，EB2 は固体培地表面上におい祖先株に導入し，プラスミドが染色体に組み込まれたカて何らかの相互作用が存在すると予想される．そこで分

ナマイシン耐性株を得た．さらにストレプトマイシンに解 菌 で あ る TKS 株 と 非 分 解 菌 で あ る TKP 株 ま た は

よ る カ ウ ン タ ー セ レ ク シ ョ ン を 経 て locus_tag: SJA_TKC 株を R2A 寒天培地で混合培養し，実体顕微鏡下にRS16255 を進化型アレル（ D3 ）に置換したクローンをおいて各コロニーの生長を観察した．

複数取得し，それらを SHY170, SHY173, SHY177 と命名

非分解菌による分解菌のコロニー拡大をさらに検討すした．液体培地で培養した際の凝集性および膜透過性を，るために，高い swarming（固体培地上で集団で移動す

これらの組換え体と祖先株，さらに進化株との間で比較る現象）活性を示す細菌株との混合培養を行った．畑地

した．

土壌の懸濁液を寒天培地に接種して培養し，swarming

祖先株と進化株の平板培地の上での適応度を CFU

活 性 の あ る 細 菌 株 を 分 離 し た． 分 離 株 と TKS 株 を(Colony forming unit)を指標にした増殖曲線解析によっ

1/3LB 寒天培地または γ -HCH を添加した 1/3LB 寒天培て評価した．あらかじめグルコース最小平板培地に順応

地上で混合培養し，TKS 株のコロニー拡大範囲を純粋させた細胞の冷凍ストックをグルコース最小液体培地に培養と比較した．さらに swarming 活性のある細菌株と移し 2 日間培養した後，培地あたり 10 程度になるようの混合培養が TKS 株の土壌での生残性に与える影響をに一株につき 13 枚以上の平板培地に塗布した．平板培評価した．ガンマ線滅菌した畑地土壌に分離株と TKS

地上の生細胞数を推定するため，8 時間おきに平板培地

株 を 混 合 接 種 し， 両 株 の 生 残 性 を CFU（ Colony

を 1 枚取り出し，平板培地上の細胞集団を PBS に懸濁Forming Unit ）で測定し，純粋培養の場合と比較した．

して段階希釈液を作り，それを新しい 1/3LB 培地にス

Burkholderia には細胞外多糖類（ extracellular polysaccharide:EPS）を産生する株が多く存在する．そこで B.

7

ポ ッ ト し て 培 養 し た． 培 養 2 日 後 に 1/3LB 培 地 上 の
CFU を元にグルーコース最小培地上の CFU を推定した．
平板培地での培養は 96 時間継続し，13 タイムポイント

caribensis Bcrs1W 株の EPS を添加した無機塩培地を用いて，難培養性細菌株の分離を試みた．EPS を添加しの CFU 測定を行った．これを 3 種類の培地:（A）グルコーた無機塩固体培地に畑地土壌の懸濁液を接種し，長期間ス最小培地，（B）SHY125 スペント培地，（C）SHY126 ス

培養した．形成された様々なコロニーに対して，単コロ

ペント培地について行い，各株につき 3 つの複製実験を

ニ ー 分 離 を 繰 り 返 し て 純 粋 分 離 株 を 取 得 し た．16S

行った．R の Grofit Package(v 1.1.1)を用いた増殖曲線

rRNA 遺伝子配列を解読することで純粋培養した株の系
統分類を行った．Burkholderia 細菌株が生産する EPS に解析を用いて各株の最大増殖速度を求めた．

よって集積される土壌細菌の系統学的特徴を明らかにす
ヘテロな細菌集団の構成原理と応用への展開る目的で，土壌から抽出した微生物群集を EPS を唯一

γ -HCH 分解能を有する細菌集団 EB2 のコミュニティ
としての安定性を調べるために，EB2 を γ -HCH を唯一

ンプリコンシーケンシングによって細菌叢解析を行っの炭素源とする無機塩液体培地で 5 代にわたり継代培養

た．培養時の細菌叢の増加を濁度によって測定するためし，各代の培養集団について分解活性（機能），菌叢構造，に，B. multivorans ATCC 17616 株が生産する透明度のおよび γ -HCH 分解関連遺伝子の存在量を調べ，EB2 の高い EPS を基質として使用した．集積培養系から経時

系 統 的・ 機 能 的 安 定 性 に つ い て 検 討 し た．50 ppm の的 に 菌 液 を 採 取 し て メ タ ゲ ノ ム DNA を 抽 出 し，16S

γ -HCH を含む無機塩液体培地 10 mL に EB2 を接種して25 ℃で振盪培養した．γ -HCH が分解された時点で培養

rRNA のアンプリコンシーケンスによる菌叢構造の解析の炭素源とする無機塩培地で集積培養し，16S rRNA アを行った．

液 100 mL を新しい培地に接種することで継代を行った．

結果と考察

5 つ の 並 列 サ ン プ ル に つ い て 5 代 ま で 継 代 を 行 い，
γ -HCH 分解時点の培養液からメタゲノム DNA を抽出し，16S rRNA 遺伝子のアンプリコンシーケンスによる菌 叢 解 析 を 行 っ た．16S rRNA 遺 伝 子 の V3-V4 領 域 をクローナルな γ -HCH 分解細菌集団の実験進化
染色体の linA 遺伝子座のレポーターとして緑色蛍光

PCR 増幅し，イルミナ社製 MiSeq によるシーケンスを

タ ン パ ク 質 遺 伝 子 を 挿 入 し た 株 SHY12 を 構 築 し た．

実施し，得られたリードのクオリティフィルタリング，

linA 遺 伝 子 座 周 辺 の 保 持 は， 環 境 条 件 に よ っ て は

97％相同性による OTU（ Operational Taxonomical Unit ）クラスタリング，RDP classifier（ Wang et al., 2007 ）にSphingobium japonicum のクローン集団の適応度に，正，負，または中立に働くと予想される．linA 領域を保有しよる各 OTU の系統アサインを行った．EB2 を培養するていることに基本的に正の選択が働くと想定されると γ -HCH 分解活性を長期維持する不定形の大きなコロ

γ -HCH 最小培地，および単独培養時に linA 遺伝子座周－ 126 －

細菌集団の形成と進化

辺の保持に対し，正，負どちらの選択が働くか不明なグ加で行ったフローサイトメーターを用いたスクリーニン

ルコース最小培地の 2 種類の平板培地を用い，各培地にグで完全に蛍光を失った細胞が得られることはなかった．

つき独立した 5 つのバッチを準備し，各バッチで生育さタイムポイント T27 の 10 の進化後集団のゲノムシー

せた細胞集団の植え継ぎを繰り返した．一回の植え継ぎ

ケ ン シ ン グ を 行 っ た と こ ろ，Glu-A，Glu-B， お よ び

で，集団は平均して 6.6 世代経る．

Glu-C において UT26 株の TBDR 様タンパク質をコード

本研究では，平板培地上のコロニー内の蛍光分布を，する遺伝子（ locus_tag: SJA_RS16255 ）のコード領域へ

共焦点顕微鏡を用いて調べることで集団内に染色体の部のフレーム内欠失を含む NGS リードが検出された．こ分欠失を持つ株が出現し，その頻度を増やした時点の検のことから，ある平板培地環境では，TBDR が自然選択

討をつけ，27 回目の植え継ぎを終えるまで，合計 28 タの標的となりやすいことが示された．さらに Glu-A，

イムポイントの集団のフリーザーアーカイブを作製しGlu-B 系列の全てのフリーザーアーカイブのリシーケン

た．10 タイムポイントの細胞集団に対し，1 細胞レベル

シングを行ったところ，TBDR 変異は集団内の代表的なでの蛍光顕微鏡観をおこない，得られた画像の解析によ変異であり，進化実験の初期で生じた後，中程度の頻度

り緑色蛍光を持つクローンが占める割合を定量した．そで集団内に維持され続けていることが判明した（Fig. 2 ）．

の 結 果，10 系 列 の う ち 7 系 列（ HCH-B，HCH-D，

また TBDR の進化型アレルを保有する株は，祖先株

Glu-A，Glu-B，Glu-C，Glu-D，Glu-E ）においては複数

よりも凝集しやすく，膜の透過性が高いという性質を有のタイムポイントで蛍光を持たない細胞が出現していたしていた（ Fig. 2 B C ）．
緑色蛍光を持たないコロニー区画が生じていた 6 つの（ Fig. 1 ）．
系列 Glu-E，Glu-D ではタイムポイント T27 までに蛍

系列から分離した，蛍光を持たない複数の進化型クロー

光を持たない系統が集団を占拠した．系列 Glu-A，Glu-B，ンのゲノム解読を行ったところ，それらのクローンは，

Glu-C および HCH-B では蛍光をもつ細胞と蛍光を持たな

想定通り，linA を含む 30 kb や 56 kb の領域の欠失を保い細胞の共存が続いていた．他の系列では，顕微鏡観察有していたが，ゲノムの他の部分においては，大規模なで蛍光が非常に弱い細胞が見つかることはあったが，追欠失は観察されなかった．また，HCH-B 系列から分離

Fig.1 Coexistence of nonfluorescent and fluorescent cells in evolving populations. (A) Five population lineages
evolved on g-HCH minimal agar plates. (B) Five population lineages evolved on glucose minimal agar
plates. Up to 5 ％ cells in each population can be regarded as nonfluorescent cell due to the nature ofdata analysis.

－ 127 －

矢野

大和，加藤

広海，永田

裕二

Fig. 2 Parallel evolution of TonB-dependent receptor homolog. (A) Frequency of newly emerged alleles.
Evolved DTBR allele exceed 20 ％ before time point T9 in both Glu-A and Glu-B. Delta linA region
denotes the value of (1 - median of linA coverage)/ median of chromosome 1 coverage. (B) Appearanceof liquid cultures of ancestral and evolved clones. SHY12, ancestor; SHY125, evolved clone carrying
TBDR ∆3; SHY126, evolved clone carrying chrososomal deletion; SHY170-SHY177, SHY12 recombiants
carrying ∆3 allele . (C) Distribution of single-cell level fluorescence intensity. Binwidth is 0.1. Y axis ofhistograms are shown as density.

された，強い緑色蛍光を発する進化型クローンの NGS

領域に欠失を持つクローンが，集団が γ -HCH 最小培地

データには linA 領域の情報量の増加が観察された．こに適応する過程で出現した」こと，および「染色体の不れは細胞集団全体の中には，linA 領域が欠失したものだ

要な部分を失ったクローンが集団内に出現しても，そのけでなく，重複したものも生じていることを示唆する．

ようなクローンが集団内を占拠できない」ことの 2 点でまた，集団内で誕生した linA 領域の欠失をもつ変異体ある．このような集団の複雑化と，複雑性の維持が細胞が，おそらく偶然ではなく，なんらかの機能の獲得に対間の依存関係により成立しているのだろうか，それともする自然選択の結果，比較的短い期間で蛍光顕微鏡観察

ニッチ分割で説明できるのだろうか．この疑問に答えるやゲノム解析で検出が可能な，集団内の 10％以上の頻ために，まず 2 系統以上が共存していることが明らかに度にまで数を増やすことが，2 種類の培地のどちらでもなった系列 Glu-A と HCH-B の進化後集団から，蛍光を起きることが判明した．TBDR と linA 領域以外には，持つクローンと蛍光を持たないクローンのペアを分離

系列間で共通して変異が起きた遺伝子座はなかった．

し，それらの共存が再現できるか検証した．Glu-A 系列

本研究において，もっとも意外性のあった現象は「 linAから分離した進化型クローン SHY125（ TBDR 変異あり）－ 128 －

細菌集団の形成と進化

および SHY126（ Glu-A 由来，linA 領域欠失)を，初期は，平板培地へ塗沫時の初期配置に関連した SHY125 に比率を変えて混合し，グルコース平板培地で継代培養し対する資源の保証，すなわち空間ニッチの分割が 2 者のたところ，行った 18 回の共培養実験のうちすべてで両共存に必須であることを示唆する．一方，HCH-B 系列

者の共存が再現できた（ Fig. 3 A:初期比率 1:9 の 6 つのから分離した進化型クローン SHY115（ linA 領域あり）

複製実験の結果を示した）．

と SHY82（ linA 領域欠失，rpoD 変異あり）を γ -HCH 平

両者を資源が拡散する液体培地/振とう条件で継代培板培地で共培養したところ，12 回の実験中，2 回でのみ養すると，12 回の実験全てにおいて，SHY125 の排除がSHY115 と SHY82 の共存が再現できた（ Fig. 3 D:初期

観察された（ Fig. 3 B:初期比率 999:1 の 6 つの複製実比率 9:1 の 6 つの複製実験の結果を示した）．SHY82 は験の結果を示した）．SHY125 が単独で液体培地で増殖できるかどうか確認すると，単独で増殖できることが確

linA 遺伝子をもたないため，HCH 平板培地上で数を増やすには，他者の生産する HCH 代謝産物に依存して増認された（ Fig. 3 C ）．資源や細胞が拡散しにくい平板培

殖するか，培地や大気中に含まれる微量の炭素源を利用

地上では SHY125 は SHY126 と共存できるが，資源や細し て 生 育 す る Oligotrophic Growth（ OG ）（ Gray et al.,

胞 が 拡 散 す る 液 体 培 地/振 と う 条 件 で は，SHY125 が2019 ）， ま た は High yield Growth under Oligotrophic

SHY126 との競争に負けて存在できなくなっていること

condition（ HYGO）（ Inaba et al., 2020 ）と呼ばれる表

Fig. 3 Coculture experiments of a pair of evolved clones. (A) Coculture of SHY125 and SHY126 on glucose
minimal agar plates. (B) Coculture of SHY125 and SHY126 on glucose minimal liquid medium in thepresence of agitation. (C) Culture of SHY125 alone in glucose minimal liquid medium. (D) Coculture of
SHY115 and SHY82 on HCH minimal agar plates. (E) Culture SHY82 on HCH minimal agar plates.
Operon circles indicate that CFU was below detection limit. Batch culture transfer performed following
the protocol of experimental evolution.

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裕二

現型を発現し，増殖するかのどちらかの手段を利用して

SHY12(Anc)，進化株 SHY125，SHY126 の間で最大増いることになる．SHY82 を単独で HCH 平板培地で継代殖速度に有意な差は認められなかった（ Fig. 4 A ）．
グルコースに加えて SHY125 スペント培地を添加した

培養したところ，培養初期では，際立った増殖を示さな
かった細胞集団が，ある時点で突然活発に増殖しはじめ

培地では，SHY125 の最大増殖速度がもっとも高かったる現象が 6 回の実験のうち 5 回で観察された（ Fig. 3 E ）．

（ Fig. 4 B ）．SHY126 スペント培地を加えた培地では，3

この観察パターンは「 SHY82 が HYGO 表現型を潜在的者間で最大増殖速度に有意な差は認められなかった．すに持っているが，それを全ての細胞で恒常的に発現する

なわち，SHY126 や SHY12 は他のクローンの増殖を促進ことができてない」ことを示唆する．SHY82 が SHY115も阻害もしないが，TBDR 変異をもつ SHY125 は自身のに排除されるまでに，HYGO 表現型を発現することがコピーに対してのみ増殖促進効果を持つことが判明しで き れ ば， 炭 素 源 の 食 い 分 け（ 資 源 分 割:resource

た．また，SHY125 と SHY126 の間には依存関係は認め

partitioning ）により，Fig. 3 D のパネル Rep 3 のようにられなかった．SHY125 は，直接接触せずとも，空間内両者の共存が成立すると推測できる．

の自身の密度が高いところでは，他のクローンより適応

2 つの進化型クローン間の依存関係の有無は，ニッチ

度 が 高 く な る 性 質 を 持 つ と 推 定 さ れ た． さ ら に，分割の成立の有無とは独立した問題である．そこで，比SHY125 の定常期培養液を新しい培地に移すと長いラグ

較的表現型が安定している SHY125 と SHY126 のペア間フェーズや低い CFU が観察される傾向がみられた．

に依存関係があるか，スペント培地（培養液上清）を培

本研究では，自然生態系で見られるような複雑な相互地に加えた条件での増殖曲線解析によって検証した．こ作用をもつ微生物群集の形成が，化学物質の継続的微生

こで，各クローンの適応度の指標として平板培地での単物分解にも必須であるという考え方に立脚し，土壌細菌

独培養時の最大増殖速度を利用した．クローン間で依存の 1 クローンが空間構造がある条件で多様化するパター関係がある場合，資源（グルコース）が保証されている

ンや集団内で生まれる細胞間相互作用に法則性が見つか状況下で，他者が分泌する「何か」が付加的に環境に存るかどうか検証することを目指した実験進化を行った．

在すると相対的な適応度が変化すると期待される．培地

平板培地のバッチ培養では，植え継ぎの際に，細胞が空に炭素源としてグルコースしか存在しない場合，祖先株

間上の離れた場所に配置され，攪拌ありの液体培地条件

Fig. 4 Growth pattern of ancestral and evolved clones on three types of agar plate. (A) glucose minimal agar
plate. (B) glucose minimal agar supplemented with SHY125 spent medium. (C) glucose minimal agar
supplemented with SHY126 spent medium. ( i ) CFU row data. Three separate lines of each color indicate
replicate experiments. (ii) Relative maximum growth rate of evolved clones to ancestor.

－ 130 －

細菌集団の形成と進化と比較して，資源と細胞の拡散の速度が遅いため，少な同種細胞同士が接着する能力を高める現象を観察した．

くとも一時的には多くの細胞に資源を保証することがで進化型アレルが物質の透過性を高めていることと，細胞きる，空間ニッチ分割（棲み分け）が人為的に作り出さが「自身が環境に放出した何か」を感知して増殖速度をれた状態になる．そのため，一部の系統が短期間で集団

高 め て い る こ と は 直 接 関 連 し て い る よ う に 見 え る．

全体を占めるような状況にはなりにくいと推定された．

Lenski ら の グ ル ー プ の 大 腸 菌 実 験 進 化（ Blout et al.,

また細胞の密度が空間上で不均一になるため，細胞密度

2008; Blout et al., 2012 ）で観察された，グルコース利用

依存の機能が進化する可能性があった．2 つの培地条件

系統集団からクエン酸利用系統が出現し，資源分割が発のうち，どちらでも染色体の一部を失った系統が出現し，生したケースでは，オペロンの重複によるクエン酸トラ

欠失をもつ系統と持たない系統が共存しつづける現象がンスポーターの過剰発現が集団の多様化における重要な起 き て い た が， 共 存 の メ カ ニ ズ ム は 系 列 HCH-B と出来事になっていた．本研究により，クローナル集団の

Glu-A では異なっていた．HCH-B では linA 領域を失っ

多様化には，細胞の物質の取り込み能の変化が先行してた系統の SHY82 が炭素源として HCH を使用しないかわ

起こるという知見がさらに増えたことになる．一方，現りに HYGO 表現型を発現して増殖する現象が起きてい在のところ，細胞外膜の接着性自体が，進化型クローン

た．現時点では，集団内部で HYGO 表現型の獲得との他系統との共存にどう貢献しているのかは不明である．

linA 領域の欠失のどちらが先に起きたのかは明らかになっていない．環境細菌を不均一な環境に置くと，比較

ヘテロな細菌集団の構成原理と応用への展開

的すぐに新しいニッチを見つけ出して多様化するという現象が，Pseudomonas fluorescence 1 クローンと静置液体

γ -HCH 分解細菌を環境試料から単離する場合，γ -HCHによる集積培養を行い，固体培地上でのシングルコロ

培養を使用した実験進化系での観察に基づいて報告されニーアイソレーションで分解菌を単離する．その際，一ていたが（ Rainey & Travisano, 1998 ），今回 HCH-B で観見シングルコロニーと思われる細胞集団の中に γ -HCH

察された細胞の多様化と多様化した細胞の共存も資源分分解細菌だけでなく非分解細菌が共存し続けることがあ割というニッチ分割の一例として説明できるだろう．

り，純粋分離に種々の培地が必要になるケースがある．

一方で，Glu-A，Glu-B，Glu-C で観察された TBDR の

このような現象は γ -HCH 分解細菌の場合だけでなく，進化が関連する集団の複雑化と複数系統の共存の機構を

様々な分解細菌の分離の際にしばしば観察される現象で説明することは比較的難しい．図 4，図 5 の結果を総合ある．γ -HCH 分解コミュニティ EB2 は，γ -HCH によるして考察すると，平板培地での細胞の初期配置に依存し集積培養と単コロニー分離を経て取得されたものの，分た資源確保と，進化型 TBDR アレルによる同系統増殖

解細菌 Sphingobium sp. TKS 株以外にも γ -HCH 分解活促進効果の恩恵を受けて SHY125 は実験進化初期過程に性を持たない Cupriavidus sp. TKC 株や Pseudomonas sp.

頻度を増やしたと推測されるが，TBDR アレルを持つ系

TKP 株など数種類の非分解細菌が共存する．そこで，

統が集団をすぐに占拠できない理由は，長いラグフェー

EB2 を γ -HCH を唯一の炭素源とする液体培地で 5 代にズや高い死亡率という TBDR 変異に関連する負の性質

わたり継代培養し，EB2 の機能的・構造的安定性についの獲得があると推察される．今後，空間内の局所的な細て検討した．EB2 による 50 ppm の γ -HCH 分解を経時的胞密度と，複数の増殖パラメータを考慮したシミュレーにモニタリングした結果，継代 1 代目は 99％分解する

ションにより，進化型 TBDR アレル保有株と他系統ののに 3 日間を要した（ Fig. 5 A ）．
2 代目では，植え継ぎ 1 日後で 90％以上が分解され，共存のメカニズムについての考察の妥当性を検証する必

分解速度の上昇が認められ，以降 5 代目までの継代培養要がある．
TBDR ホモログは，ポーリンと同様の β バレル型膜タにおいて，これら高い分解活性が維持された．16S rRNA

ンパク質で，グラム陰性細菌の外膜に埋め込まれている

アンプリコンシーケンスにより EB2 の細菌叢構造を調

小分子の通り道であるが，ある細菌種では，同種細胞がべた結果，Pseudomonas が 75％で最も多く，Cupriavidus

ペリクルバイオフィルムをつくるために，細胞外膜表面と Sphingobium がそれぞれ 11％と 8％と続き，これら 3のポーリンが head-to-head ダイマーを形成して細胞同士属 で コ ミ ュ ニ テ ィ の 90 ％ を 占 め る こ と が わ か っ たを接着させていることが明らかになった（ El-Khatib et（Fig. 5 B ）．5 つの並列サンプルでは共に Sphingobium のal., 2018 ）．そのため，TBDR ホモログは物質の取り込
みと同種凝集体の形成という 2 種類の一見関連しない機

割合が 2 代目までに 40％程度まで上昇したのち，3 から能を潜在的に有していると考えられる．本研究では，実ベルを維持した．γ -HCH の分解速度が 2 代目で上昇し験進化の過程で，TBDR ホモログ遺伝子にフレーム内欠た が， こ れ は 1 代 目 か ら 2 代 目 に 分 解 菌 が 含 ま れ る

失が入ることで，細胞がその機能を完全には失わずに，

Sphingobium 属の割合が増加し，その後 25％前後で安定

5 代目にかけて徐々に減少しながらも概ね 25％前後のレ－ 131 －

矢野

大和，加藤

広海，永田

Fig. 5 Functional and structural stability of γ -HCH-degrading
EB2 community during five-times subculturing. Timecourse of γ -HCH degradation (A) and 16S rRNA (V3-V4)
amplicon sequencing (B) of the subcultures of EB2
community.

裕二

Fig. 6 Colony formation of γ -HCH-degrading
Sphingobium sp. T K S and EB2 on aminimum agar plate with γ -HCH as asole carbon source. While small colonies
of TKS monoculture (white arrowhead)
lost the degrading activity (A), EB2
occasionally forms a large colony (blackarrowhead) that maintains the activity
for a long period (B).

したことから説明できる．興味深いことに，継代を繰り返しても分解菌が含まれる Sphingobium 属が菌叢の単独
優占種にはならず，他属が 70％前後の割合で安定的に共存し続けた．
単離した分解細菌 TKS 株は，γ -HCH を唯一の炭素源とした寒天培地上でコロニー形成できるが，小さなコロ
ニーしか形成せず，褐変してすぐに死滅してしまう（ Fig. 6 A ）．
これに対して，コミュニティ状態で γ -HCH 寒天培地にまくと，不定型で大きなコロニーを形成することがあり，この巨大コロニーは，長期持続的に γ -HCH 分解活性を示す（ Fig. 6 B ）．固体培地上での相互作用を探るた
め，分解菌と非分解菌を固体培地で混合培養し，実体顕
微鏡下において各コロニーの形成状況を比較した結果，
R2A など低栄養の寒天培地上で近くに TKS 株コロニーが存在する場合，TKC 株のコロニー辺縁部が TKS コロ
ニーに向かって方向性を持って生長した（ Fig. 7 ）．
－ 132 －

Fig.7 Directional colony growth (DCG) of
Cupriavidus sp. TKC towards Sphingobium
sp. TKS. Peripheral area (indicated byarrows) of TKC colonies grew towards a
TKS colony.

細菌集団の形成と進化

本現象は非分解菌と分解菌が積極的にコミュニティ

Capnocytophaga 等 で 報 告 さ れ て い る（ Finkelshtein etを形成する初期ステップとして捉えられることから，
本 現 象 を directional colony growth(DCG)現 象 と 命 名al., 2015; Shrivastava et al., 2018 ）． ま た，UT26 株 は，滅菌土壌に単独で接種した場合，7 日後の生残性は低い

し， 解 析 を 進 め た．TKC 株 は 系 統 的 に 異 な る 7 株 のが，Paenibacillus 株と共接種することで土壌中での生残sphingomonads 細菌株に対して DCG 活性を示す一方で，性 が 飛 躍 的 に 上 昇 し た（ Fig. 9 C ）． こ の 効 果 が

E. coli や，Pseudomonas 属や Mycobacterium 属の細菌株に対しては明確な DCG 活性を示さないことから，何ら

Paenibacillus 株の移動性と関係があるかは，より詳細な解析をする必要があるが，このようなヒッチハイク現象

かの選択性が存在すると考えられる．一方，TKC 株がのバイオレメディエーションへの応用への可能性を提示

DCG によって TKS 株コロニーに接触した後に，TKS
株の棲息域を増大させる傾向も観察された．TKS 株自体には固体表面での運動性が認められないことから，
DCG 活性は移動性に乏しい分解菌の棲息範囲の拡大にも寄与すると考えられる．また，様々な割合で TKC 株と TKS 株 を 混 合 し て γ -HCH 寒 天 培 地 に 接 種 す る と，
TKC 株が 90％を超える場合に稀に TKS 株のコロニーが拡大し，γ -HCH 分解範囲も拡大できることがわかった（ Fig. 8 ）．
この結果は，TKC 株が EB2 で観察された長期分解活性を維持する巨大コロニーの形成に関与していたことを強く示唆する．
γ -HCH 分解細菌である UT26 株単独では，γ -HCH 寒天培地上でコロニーが広がらず，狭い領域の γ -HCH しか分解できない（ Fig. 9 A ）．
これに対して，土壌から高い swarming 活性のある
Paenibacillus 細菌株を分離し，UT26 株と共接種すると，
UT26 株はプレート上で棲息域を拡げて，より広い範囲の γ -HCH を分解した（ Fig. 9 B ）．これまでにも，固体表面で移動性のある微生物が別の微生物を輸送する
現 象， い わ ゆ る ヒ ッ チ ハ イ ク 現 象 が Paenibacillus やFig. 9 Paenibacillus sp. NK L 2 promoted growth of
Sphingobium japonicum UT26. Colony formationof monoculture of non-swarming UT26 (A) andco-culture of UT26 and a swarming bacterium
Paenibacillus sp. NKL2 (B) on 1/3LB plate with
γ -HCH. Clear zone around the large colony on
the plate with cloudy color derived from γ -HCH
particles indicates area where UT26 degradedγ -HCH. Ef fect of co-culturing with NK L2 onsurvivability of UT26 (monitored by CFU) in soil
sterilized by γ-irradiated (C). Monoculture of
UT26 (cross) and co-culture of UT26 and NKL2
(circle)Fig. 8 Large multi-species colony of TKC and TKS The
pie char t indicates ratio of TKC and TKS in
mixture of an inoculum.

－ 133 －

矢野

大和，加藤

することができた．

広海，永田

裕二

遺伝子配列は現在登録されている分離株に最大でも我々は，土壌細菌集団を滅菌土壌に移植し，菌叢の時

92 - 93％の相同性しか示さず，新規性が極めて高い分離

系 列 変 化 を 追 跡 す る 研 究 を 実 施 し， 易 培 養 性 の株の取得に成功した．Verrucomicrobia 門 Spartobacteria

Burkholderia の次に難培養性の Verrucomicrobia が割合を増やす結果を得た（ Fig. 10 A ）．

綱を含む多数の株の取得に成功した．世界規模で実施

土壌細菌 B. caribensis の EPS は団粒構造に影響を与えSpartobacteria 綱には世界中の草原土壌で最も優占する系統である DA101 clade が含まれていることが知られてることが報告されているため（Vanhaverbeke et al., 2003），

さ れ て い る 土 壌 細 菌 叢 の メ タ ゲ ノ ム 解 析 に よ っ て，

Burkholderia が生産する EPS を用いることで難培養性細菌 の 分 離 及 び 培 養 が で き る の で は な い か と 考 え た．

いる（ Brewer et al., 2017 ）．土壌メタゲノム解析を効果

Burkholderia の EPS を添加した培地に土壌の懸濁液を接種して培養したところ，培養 2 - 3 週間後に様々な形状のが極めて重要になるため，RefSoil などの土壌細菌のゲノコロニーが形成され，シングルコロニーアイソレーショ
ンを繰り返することで 50 株の分離株を取得した．取得株

et al., 2017 ）． そ の 中 で も Spartobacteria 綱 は「 mostwanted OTU」 と し て 挙 げ ら れ て い る microbial darkの 16S rRNA 遺伝子を解析した結果，Actinobacteria 門細matter の代表的な一群である（ Choi et al., 2017 ）．本研

菌株が 14 株，Firmicutes 門細菌株が 15 株，Proteobacteria

究で得られた Spartobacteria 細菌 5p 株は既知株と 92％

的に実施するには土壌細菌のリファレンスゲノムの充実
ムデータベース構築プロジェクトが進行している（ Choi門細菌株が 8 株，そして Verrucomicrobia 門細菌株を 13の相同性しか示さない極めて新規性の高い株であること株取得した．特に Verrucomicrobia 門では Spartobacteriaが明らかとなった．今後これら分離株の培養実験から得綱に分類される株が多く取得され，これら株の 16S rRNA

られるであろう情報は，土壌細菌叢の生態学や遺伝学の発展に資すると期待できる．次に，畑地土壌から抽出した微生物集団を，B. multivorans ATCC 17616 株の EPS
画分を炭素源とする無機塩液体培地で振とう培養し，増殖した細菌叢の網羅的系統解析を行った．また対照として，植物由来の多糖類である水溶性デンプンを炭素源とした培養も行なった．濁度による生育曲線では，デンプン添加区に比べて，EPS 画分添加区では生育速度が遅いものの，
70 時間前後には菌叢解析に十分な菌体量が得られるまでに生育した．16S rRNA（ V3-V4 領域）アンプリコンシーケ
ンスによる菌叢解析の結果（ Fig. 10 B ），デンプン添加区
では Bacillus 属等の Firmicutes 門や Flavobacterium 属等の Bacteroidetes 門および Proteobacteria 門が優占していた 一 方 で，EPS 画 分 添 加 区 で は Acinetobacter 属 等 のProteobacteria 門や Prosthecobacter 属等の Verrucomicrobia
門が優占していた．EPS 画分添加によって 5P 株が含まれる Spartobacteria 綱自体の増殖はわずかであったものの，Verrucomicrobia 門としては 50％を超える割合にまで増殖し，最も増殖した系統は藻類培養成分によって分離培養された P. algae EBTL04 株（ Lee et al., 2014 ）と高い相同性を示した．これまでの Verrucomicrobia 門細菌株の研究によって，この分類群のゲノムには多糖類の加水分解酵素遺伝子が多数存在していることが知られて
おり，環境中における潜在的な多糖類分解菌ではないかと予想されている（ Martinez-Garcia et al., 2012 ）．本結果によってバクテリア由来の EPS と Verrucomicrobia 門

Fig.10 Microbial community succussion in γ-irradiatedsoil (A) and polysaccharide-enrichment cultures(B). Genus-level taxonomic composition was
based on 16S rRNA gene (V3 -V4) ampliconsequencing.

の強い関連性が支持された．以上の結果は，細菌間の相互作用を利用した難培養性細菌の培養技術の開発という位置付けができる．

－ 134 －

細菌集団の形成と進化

要約本研究では，細菌集団の形成と進化に関する原理を理解し，バイオレメディエーションなどの実際の応用技術にも資する基礎知見を得るために，有機塩素系殺虫剤
γ -HCH 分解能力を有する細菌細胞集団を対象とした研究を実施した．クローナルな γ -HCH 分解細胞集団を空間構造のある平板培地上で世代交代を繰り返した結果，染色体の部分欠失を持つ系統が自然発生し，その欠失をもたない系統と共存し続ける現象が観察された．異なる系統の共存の機構のひとつとして，TBDR ホモログ遺伝
子に変異が起こり，膜の透過性の向上と凝集性を獲得することが重要であることが明らかになった．総じて，染色体欠失を保有する株と保有していない株の共存は，資源または空間のニッチ分割が保証されることで成立していることが示唆された．一方，ヘテロな γ -HCH 分解細菌集団において，（ i ）γ -HCH を唯一の炭素源とした液体培地による継代培養を繰り返しても，分解菌が優占種とならないこと，（ii）γ -HCH を唯一の炭素源とした固体培
地上で，非分解細菌の存在により長期持続的な巨大コロニーを形成すること，から非分解細菌の重要性が明らかになった．本コミュニティより単離した細菌株の解析により，非分解細菌が分解細菌にコロニー伸長する directional colony growth(DCG)現象を見出すと共に，本表現型を示す Cupriavidus 株が巨大コロニー形成にも重要であることを明らかにした．また，移動性細菌を利用して非移動性細菌が棲息域を拡大するヒッチハイク現象
が，γ -HCH 分解細菌の固体培地上での棲息域拡大に貢献すると共に，土壌環境での生残性への関与も示唆され，本現象のバイオレメディエーションへの応用への可能性を提示した．さらに，易培養性の Burkholderia が生産す
る EPS が難培養性の Verrucomicrobia の増殖を選択的に促進することを見出し，新たな細菌間の相互作用を利用した難培養性細菌の培養手法を提示した．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表・ポスター発表
1) 加藤広海，大坪嘉行，津田雅孝，永田裕二．2017．難分
解性有機塩素系殺虫剤の分解細菌コミュニティにおける非分解菌の役割．日本農芸化学会2017年度大会（3 月
17-20日，京都）
2) 加藤広海，小川なつみ，大坪嘉行，永田裕二, 津田雅孝．
2017．利用する:汚染物質分解コンソーシアムにおける非分解菌の役割．第2回環境微生物系学会合同大会2017（8月29-31日，仙台）シンポジウム「微生物のサバイバ
ルゲーム」
3) 加藤広海，大坪嘉行，津田雅孝，永田裕二．2017．難分
解性有機塩素系殺虫剤分解細菌コミュニティに関する研究．第2回環境微生物系学会合同大会2017（8月29-31日，
仙台）4) 加藤広海，大坪嘉行，津田雅孝，永田裕二．2018．環境
汚染物質の分解細菌コミュニティにおける非分解菌コロ
ニーの分解菌コロニーへの接近現象．日本農芸化学会
2018年度大会（3月15-18日，名古屋）
5) 加藤広海，羽賀千晃，大坪嘉行，津田雅孝，永田 裕二．
2018．有機塩素系殺虫剤分解細菌コミュニティを構成す
る細菌間の関係性．環境バイオテクノロジー学会2018年度大会（6月26日，筑波）
6) Kato, H., Mori, H, Kurokawa, K., Tsuda, M. & Nagata, Y.
2018. 土壌細菌叢の形成プロセスにおける再現性
Reproducibility of reconstruction of soil microbial community.
日本微生物生態学会第31回大会（7月11-13日，沖縄）
7) Kato, H., Haga, C., Ohtsubo, Y., Tsuda, M. & Nagata, Y.
2018. γ -HCH分解細菌コミュニティから単離した細菌株間の関係性. Relationship between bacterial strains isolated
from a γ -HCH-degrading microbial community. 日本微生物生態学会第31回大会（7月11-13日，沖縄）
8) 羽賀千晃，加藤広海，大坪嘉行，津田雅孝，永田裕二．
2018．有機塩素系農薬の分解細菌コミュニティを構成す
る細菌間の関係性．第36回農薬環境科学研究会（11月8-9日，甲府）9) 矢野大和，山本達也，仁平賢，野村暢彦，永田裕二．
2019．微生物はなぜ群を作るのか？実験進化を用いた
BQHの検証．第13回日本ゲノム微生物学会年会（3月6-8日，東京）
10) 堀川慧太，池内倫子，小川なつみ，加藤広海，大坪嘉行，永田裕二，津田雅孝．2019．フェナントレン分解細菌Mycobacterium sp. EPa45の生育阻害因子の解析．第13回
日本ゲノム微生物学会年会（3月6-8日，東京）
11) 加藤広海，津田雅孝，永田裕二．2019．異なる土壌間における微生物集団の移植実験．日本農芸化学会2019年度
大会（3月24-27日，東京）
12) 高橋紳八，加藤広海，永田裕二，大塚重人，大坪嘉行，
津田雅孝．2019．難培養性細菌の培養における細胞外多糖の重要性．日本本農芸化学会2019年度大会（3月24-27日，東京）13) 羽賀千晃，加藤広海，大坪嘉行，津田雅孝，永田裕二．
2019．細菌間の接近と拡散が有機塩素系殺虫剤の分解コ
ミュニ ティに与える影響．日本本農芸化学会2019年度大会（3月24-27日，東京）
14) 仁平賢，山本達也，平野彰大，野村暢彦，永田裕二，矢野大和．2019．微生物はなぜ群れを作るのか？:平板培
地実験進化系を用いたBHQの検証．日本微生物生態学会
第33回大会（9月10-13日，甲府）
15) 東豊浩，加藤広海，長田穣，永田裕二，近藤倫生．2019．
土壌細菌叢の液体培養系における遷移の動態解析．日本
微生物生態学会第33回大会（9月10-13日，甲府）16) 加藤広海，津田雅孝，永田裕二．2019．土壌細菌叢の初期形成過程における移動性細菌の役割．日本微生物生態学会第33回大会（9月10-13日，甲府）
17) 仁平賢，山本達也，平野彰大，野村暢彦，永田裕二，矢野大和．2020．農薬分解細菌を用いた平板培地実験進化系の構築．第14回日本ゲノム微生物学会年会（3月6-8日，名古屋）
18) Yusuf, K., Kato, H., Tsuda, M., Nagata, Y．2020．
Survivability of a gamma-hexachlorocyclohexane-degrading－ 135 －

矢野

大和，加藤

sphingomonad strain in soil．日本農芸化学会2020年度大会（3月25-28日，福岡）19) 平野彰大，山本達也，仁平賢，野村暢彦，永田裕二，矢野大和．2021．平板培地を用いた実験進化により構築したモデル細菌集団内の多様性維持機構．第15回日本ゲノム微生物学会年会（3月5-6日，オンライン）
20) 加藤広海，田中彩美，永田裕二．2021．γ - Hexachlorocyclohexane （HCH）汚染土壌のメタゲノム解析．日本農芸化学会2021年度大会（3月18-21日，オンライン）
21) 岩本和音，Yusuf, K., 加藤広海，永田裕二．2021．バクテ
リアにおけるヒッチハイク現象の環境浄化技術への応用．
環境バイオテクノロジー学会（9月2-3日，オンライン）
22) 佐子川さやか，羽賀千晃，加藤広海，永田裕二．2021．
γ -HCH分解細菌コミュニティの固体培地上での異種複合
コロニー形成．微生物生態学会34回大会（10月31日-11月
2日，オンライン）23) 笹 川 航 ， 加 藤 広 海 ， 大 塚 重 人 ， 永 田 裕 二 ． 2 0 2 1 ．
Burkholderia株由来の細胞外多糖類による土壌細菌の選択的培養．微生物生態学会34回大会（10月31日-11月2日，
オンライン）
24) 笹 川 航 ， 加 藤 広 海 ， 大 坪 嘉 行 ， 永 田 裕 二 ． 2 0 2 2 ．
Burkholderia株由来の細胞外多糖類画分による難培養性
Verrucomicrobia門細菌の集積培養．日本農芸化学会2022
年度大会（3月15-18日，オンライン）
25) 岩本和音，加藤広海，大坪嘉行，永田裕二．2022．ヒッチハイク現象の環境汚染物質分解細菌への応用．日本農芸化学会2022年度大会（3月15-18日，オンライン）
26) 佐子川さやか，羽賀千晃，加藤広海，大坪嘉行，永田裕二．2022．γ -HCH 分解細菌コミュニティ形成におけるCupriavidus株の重要性．日本農芸化学会2022年度大会（3月15-18日，オンライン）
原著論文
1) Ogawa N., Kato, H., Kishida, K., Ichihashi, E., Ishige, T.,
Yoshikawa, H., Nagata, Y., Ohtsubo, Y., & Tsuda M. 2019.
Suppression of substrate inhibition in phenanthrene-degrading
Mycobacterium by co-cultivation with a non-degrading
Burkholderia strain. Microbiology 165:625–637.
その他（総説・書籍・特許など）
1) 加藤広海，小川なつみ，津田雅孝，永田裕二．2018．汚
染物質分解コンソーシアムにおけるキープレイヤーとオーディエンス 環境バイオテクノロジー学会誌 18:15-20.

謝辞

本研究の実施にあたり，多大なる助成を賜りました公益財団法人発酵研究所に心からお礼申し上げます．また，本研究の遂行にご協力いただいた東北大学大学院生命科
学研究科の野々山翔太博士（現東京工業大学），千葉大学の福世真樹先生，東北大学の岩嵜航先生，産総研の宮崎亮博士，大阪大学の細田一史先生，東北大学の経塚淳子先生，ならびに学生諸氏に感謝の意を表します．また，文部科学省科学研究費補助金

基盤研究（B）
（永田

広海，永田

裕二

裕二 19H02865 ），挑戦的萌芽研究（永田裕二 16K14877 ）の支援にも感謝致します．

文

献Amann, R. I., Ludwig, W. & Schleifer, K. H. (1995). Phylogenetic
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略語一覧
CFU: colony forming unit
DCG: directional colony growth
DGGE: denaturing gradient gel electrophoresis
EPS: extracellular polysaccharide
HCH: hexachlorocyclohexane
HYGO: high-yield growth under oligotrophic conditions
NGS: next generation sequencing
OTU: operational taxonomical unit
TBDR: TonB-dependent receptor－ 137 －

2020 年度一般研究助成の研究報告
助成期間:2020 年 4 月～ 2022 年 3 月

IFO Res.Commun. 36
2022

国内の異なる積雪環境に適応した担子菌ガマノホタケ科
Typhulaceae の多様性とその環境適応能の評価
星野

保【目的】豪雪地域が国土面積の半数を超える日本におい

ルガ地域では少数ながら分離されることから，本種の分て，寒冷地の冬季環境は生物相に大きな影響をおよぼし

布になんらかの地理的要因があることを見出した．今後ている．しかし，積雪あるいは土壌凍結に適応した菌類

さらに検討をおこなう予定である．

に関する研究は，雪腐病と称される積雪下，越冬性植物に対して病原性を示す種にほぼ限定されている．国内寒T. maritima は，鳥取県から北海道の日本海・オホーツ
ク海側に分布が知られている．青森・岩手両県にて本種

冷地の冬季に活動する腐生種に関する種多様性およびその分布調査をおこなった結果，日本海側のみならず陸奥の性質に関する情報は極めて断片的である．

湾・津軽海峡および太平洋岸の砂浜にも本種を確認した．

本研究では，国内の多雪から少雪・土壌凍結まで多様

本種は菌核が海水に浮くことで海流分散により，分布な冬季環境から，低温環境に適応し，培養可能な担子菌を拡大している可能性がある．このため菌核に模したセガマノホタケ科 Typhulaceae の分離・培養した．さらにルロース粒(φ4 mm )を太平洋側の採集地の一つであ

その生活史から低温環境への適応に必要な生理生態的特る青森県東通村の砂浜で散布し，その分散と回収率を計

徴の解明を目指した．得られた結果を既知種の生理的性測した．散布 1 週間後，セルロース粒は散布地点から質や環境適応能と比較し，どのような性質の獲得・強化

500 m 程度移動したことを確認した．その回収率は 1 日することにより，低温環境への進出が可能となったのか

後で 3％，1 週間後で 0.06％であった．浜辺への打ち上考察した．

げ後，砂丘への移動を考慮すると波浪による菌核の移動【方法】青森県を中心に北東北三県・北海道・長野県には，リスクの高い分散手段と判断した．

て担子菌 Typhulaceae の採集・分離培養をおこない，得本種は海浜性のイネ科植物を宿主とするが，北海道室られた分離菌株の ITS を遺伝子データベース( DDBJ/

蘭市および青森県沿岸では，キク科シロヨモギやマメ科

EMBL/GenBank )にて比較した．また，多雪環境適応

ハマエンドウより菌核を採集し，培養・遺伝子解析によ種 と し て Typhula ishikariensis， 少 雪 適 応 種 と し て T.

り本種であることを確認し，本種が双子葉植物を宿主に

maritima を代表とし，その生息域での生活史を比較した．
【結果・考察】分離菌株よりデータベース未登録の菌株することを見出した(図 1 )．特に青森県太平洋側(六を 7 種・12 株を得た．特に長野県からは，既知種と形イネ科植物に比較して大型であり，シロヨモギ葉柄に強態の異なる複数の Macrotyphula 属菌を得た．しかし，

く固着し，海水に沈むものがあった．これら結果から，

ガマノホタケ科菌の多くは，遺伝子情報が少なく，既知

青森県太平洋側の本種は，シロヨモギを宿主とし，日本

種との比較には，基準となる標本との形質の比較が必要

海側のイネ科植物を宿主とする系統とは異なる生存戦略となる．今回の分離菌株については，既存標本の範囲をを有する可能性を見出した．今後はさらに本種個体群の研究者が形態的特徴を基に同定したタイプ以外の標本に解析を検討している．

ケ所村～おいらせ町)で採集したシロヨモギの菌核は，も広げて，形態形質の比較をおこない，さらに種同定をおこなう．
T. ishikariensis は，交配型の異なる 3 系統が確認されている複合種である．今回国内で採集した菌株およびこれまでに北半球各地で採集した菌株を，形態・生理性質・交配型・分子系統を基に分類すると 3 種( T. ishikariensis,
T. canadensis, T. hyperborea )に大別され，さらに 2 亜種
( var. ishikariensis，var. idahoensis )とした．
国内の分離菌株はいずれも T. ishikariensis および T.
canadensis であり，凍結耐性の高い T. hyperborea は確認されなかった．過去の調査では，本種がカムチャッカ半島に分布すること，北海道と同様の緯度経度を有するボ所属

八戸工業大学工学部

E-mail: t-hoshino@hi-tech.ac.jp－ 139 －

図1

宿主に応じて異なるサイズの菌核を形成するスナ
ハマガマノホタケ．A:宿主植物はコウボウムギ．
B:宿主植物はシロヨモギ．△は菌核を示す．

IFO Res.Commun. 36
2022

Fungi 界に特有なペプチド性化合物生合成因子の生物学的機能解明
梅【目的】糸状菌の分類には有性生殖の有無と種類が重要

村

舞

子

【結果・考察】KEP 因子の周辺には，その繰り返し単位

だが，麹菌のように有性生殖が知られていないものも多であるペプチドを環化する UstYa ホモログ遺伝子が特異い．それらが生来有性生殖能を有していないのか，それ的に集積している．糸状菌 Aspergillus 属・Fusarium 属・とも極限られた環境条件下でのみ起こるため観察が難しいのかの判断は難しい．ところで最近我々は，新しい糸Penicillium 属・Colletotrichum 属・Trichoderma 属 に おける KEP 因子の系統樹上の分布を解析したところ，属状菌二次代謝経路クラスとして見出したペプチド性化合レベルで 1 ～ 2 種類程度，種レベルで平均 5 種類の KEP

物生合成因子(Kex2-processed repeat proteins; KEPs)を因子が保存されていた．しかしこの属・種レベルでの保存

ゲノム探索・分類し，本因子がほぼすべての Fungi 界菌性は，UstYa 環化因子を伴うものでは，伴わないものに比株に高い配列多様性を持って存在し(図 1 )，有性生殖

べて低下していた．一方酵母では，一株につき1～ 2 種類の，に関与する可能性を見出した(Umemura, Fungal Biol.

UstYa 環化因子を伴わない KEP 因子しか有さず，その分

Biotechnol., 7:11, 2020)．そこで本研究では，本因子の種類と分布から真菌類を分類し，本因子の糸状菌有性生殖類は系統樹上の属レベルとほぼ完全に一致していた．

への関与と役割，二次代謝因子への進化の可能性についAspergillus flavus NRRL3357 はヘテロタリックな菌株
形成株であり，15 の KEP 因子を持つ．各 KEP 遺伝子破て，ドライ・ウェット両面の解析からの解明を目指した．

壊株の菌核形成度を観察したところ，3 つについて菌核形
成が消失または著しく低下したが，これらはいずれも有性生殖の観察されていない Aspergillus oryzae 株で欠損しているものであった．ホモタリックな種である A. nidulans
および N. fischeri の子嚢殻形成度が異なる各 4 株について，ゲノム・全遺伝子発現解析を行ったところ，A. nidulans
における UstYa 環化因子を伴う 1 つの KEP 因子について，子嚢殻形成度と，配列繰り返し回数および遺伝子発現量が相関していた．そこで，子嚢殻形成株である A4
系統株において本 KEP 因子を破壊したところ，限定的結果ではあるが，子嚢殻形成能の消失を観察した(図 2 )．

図1

Fungi 界における KEP 因子の分布【方法】KEP 因子は，小胞体へのシグナルペプチドと，
アミノ酸配列における Kex2 プロテアーゼ認識サイトでの高い繰り返し構造を持つ．この特徴に基づき，公共デー

図2

タベースに登録された Fungi 界菌株の全ゲノム情報から，Aspergillus nidulans における KEP 因子破壊の影響

KEP 因子を探索・分類した．ついで，Ascomycota 門糸以上の結果は，極めて多様な種が存在するカビが，状菌の代表的な属および酵母について，単一コピーオーソ

KEP 由来直鎖ペプチドをフェロモンとして同属を認識

ログの集団から算出した系統樹に沿って，属・種レベルでし，種レベルで獲得された KEP 由来環状ペプチドによの KEP 因子の分布と保存性を解析した．また，Aspergillus

り有性生殖器官の分化等が誘導されるという我々の当初

flavus，Aspergillus niduans，Neosartorya fischeri について，
KEP 遺伝子破壊と子嚢殻形成観察等を行った．

の仮説に反しない．また，KEP 因子群の組み合わせは所属

産業技術総合研究所生物プロセス研究部門

種の重要な分類指標となりうることが示された．

E-mail: umemura-m@aist.go.jp－ 140 －

IFO Res.Commun. 36
2022

難培養微生物の培養を目指した新規共培養法の構築
雪真弘【目的】地球上の 99％の微生物が未だ培養することが出菌を AGM に包埋し，混合培養を行った．さらに AGM

来ていないと考えられている．もし，これらの難培養微内で細菌の増殖が確認された AGM をマイクロマニュピ

生物が培養可能になれば，莫大な微生物資源を利活用でレ ー タ ー で 分 取 後，Phi29 DNA polymerase を 用 い てき，様々な産業・学術分野において大きな変革をもたら

AGM 内で全ゲノム増幅し，MiSeq と Nanopore MinION
を組み合わせ，ゲノム解析を行った．

すことができると考える．
難培養の理由の一つとして，環境中の微生物が様々な【 結 果・ 考 察 】 モ デ ル 共 生 系 と し て P. faecium と B.

異種の微生物と栄養源等を介して相互作用関係にあり，

thetaiotaomicron を用いた実験では，AGM に包埋した P.

単独では培養することが難しいことが挙げられる．本研
究では , 複雑な環境中の相互作用関係を模倣した新規共

faecium の単独培養に比べて，B. thetaiotaomicron との共培養では顕微鏡観察において AGM 内の P. faecium の培養システムを構築し，難・未培養微生物の培養を目指

増殖が良くなることが確認された．この結果から，B.

した．共培養法は，これまでに様々な手法が開発されて

thetaiotaomicron が 産 生 し た 代 謝 産 物 を AGM 内 の P.

いる．例えば，寒天培地の上層，下層をフィルターで分け，相互作用する菌を共培養する方法があるが，液体培

faecium が受け取ったことにより増殖が良くなったと推察され，AGM が共培養に適応できることを確認した．

養でのみ生育する細菌を培養するのには適していない．

シロアリ腸内細菌叢を用いた培養では，新規性が高い

本研究では，新規共培養法として内部がゾル状態のア細菌を含む複数の細菌種を AGM 内で培養することに成

ガロースゲルマイクロカプセル( AGM )に注目した．

功した
(図 2)
．ゲノム解析の結果，Dysgonomonas 属細菌のAGM は外殻がアガロースゲルで構成されるため，培地4.24 Mbp の完全長ゲノム配列を取得し，ゲノム系統樹から成分や代謝物質やタンパク質を透過することが可能であ

新規性が高い細菌であることが示唆された．この AGM をる．多種多様な細菌を 1 細胞ずつ閉じ込めた AGM を培用いた方法は新規細菌の分離培養と少量の細胞からの完養することにより，各 AGM 間で相互作用することが予

全ゲノム解読に極めて有効であることが示唆された．

想される．この AGM の特性を活かした難培養微生物の新規共培養法の構築を目的とした(図 1)．

図1

AGM を用いた新規共培養システム【方法】モデル共生系としてヒト腸内細菌のPhascolarctobacterium faecium JCM 30894 と Bacteroides
thetaiotaomicron JCM 5827T を用いて実験を行った．P.
faecium は単独培養では増殖が弱いが，B. thetaiotaomicronと共培養することで，B. thetaiotaomicron が産生するコ

図2

ハク酸を受け取り増殖が良くなることが報告されている．まず AGM に P. faecium のみを包埋し，単独で液体培養した．次に AGM に包埋した P. faecium と包埋していない B. thetaiotaomicron と共培養した．

本研究は，理化学研究所バイオリソース研究センター

また，多種多様な細菌が共生しているシロアリ腸内細所属

細菌 1 細胞を包埋した AGM(A)，AGM 内で増殖した Dysgonomonas 属細菌(B)，Dysgonomonas 属細菌の系統関係(C)で実施された．

理化学研究所バイオリソース研究センター，現 アサヒクオリティーアンドイノベーションズ株式会社
asahi-qi.co.jp－ 141 －

E-mail: masahiro.yuki@

IFO Res.Commun. 36
2022

一大未知生物群“深海・外洋性ディプロネマ類”の実体と多様性の理解，および分類体系の整理
矢

吹

彬

憲

【目的】ディプロネマ綱(類)は，ミドリムシ等が含まて保存されている傾向があることや水温や濁度などの影れるユーグレノゾア門に含まれる真核微生物の一群であ響を受け変化する可能性があることが認められた．また，る．2014 年までは，わずか 2 属 12 種のみが含まれる規各サンプルより得られた多様性情報を比較することで，模の小さい生物群であったが，環境 DNA 解析からは海普遍的に分布する可能性が高い系統やサンプル特異的に

洋，特に深海において数多くの未記載種が生息している出現する系統に関する情報を得ることも出来た．特に普可能性が示されていた．それら実体が不明なメンバーの遍的に存在する系統は，より広い環境に生息可能である

理解は，海洋生物の真の多様性と海洋(微)生物生態系可能性も想定されるため，比較的に培養株として確立しの成り立ちをより正確に理解する上で重要であり，そのやすい可能性があると考えている．

促進が期待されていた．本研究では，それら未記載種の実際に培養株の確立を目指す取り組みとしては，目的

分布実態の把握と記載報告を目指すとともに，ディプロ

生物の存在が環境 DNA 解析から確認された新江ノ島水

ネマ綱全体の分類学的再整理を目指して研究を実施した．

族館に設置された深海生物の飼育水槽の水を用いた探索【方法】東京湾海面直下・相模湾水深 800 m・駿河湾水を行なった．その結果，光学顕微鏡観察から未記載のディ

深 397 m・新江ノ島水族館の飼育水槽より海水を収集し，プロネマ類と期待される 4 培養株を確立したが，配列解0.45 µm のフィルターで濾過後に環境 DNA の抽出を行

析からは新規性を示す結果が得られなかった．ここから，なった．一部の海水は，Hemi 培地を用いて培養し，光遺伝学的には極めて近くても形態的には区別可能な状態

学顕微鏡下での観察とディプロネマ類の単離を行い，培にある可能性が示唆されたが，その詳細把握には今後の養株確立に用いた．環境 DNA は新たに開発したプライより詳しい解析が必要である．また，これまでに確立しマーを用いてバーコード配列( 18S rRNA 遺伝子 V4 領ていた培養株の精査を進める中で，ディプロネマ綱全体

域約 470 bp )の増幅とシーケンスを行い，ディプロネマ

の形態的多様性に関する知見を再収集し，これまで類の分布実態の把握と解析手法の有効性を検討した．また，海水取得時に測定した水温・濁度・塩分等の環境パ

Diplonema 属としてまとめられていたメンバーを新たに
3 つの属に分けることなどディプロネマ綱全体の分類体

ラメータ情報と環境 DNA 解析から得られた群集構造情系を再整理した．

報との比較解析を行なった．確立した培養株からは形態情報と分子情報の収集を行い，その分類学的取り扱いについて検討した．
【結果・考察】相模湾・駿河湾の深層水由来の環境 DNA よりバーコー
ド配列の増幅と超並列シーケンサーによる配列取得を行なった結果，サンプル間で若干の違いはあるものの，全リード数のうち概ね 99％がディプロネマ類由来であった．このことより，新たに開発したプライマーはディプ
ロネマ類の配列を選択的に増幅し検出可能であることが確認された．実際にこの検出系を用いた解析から，東京湾の表層，相模湾と駿河湾の深海域，新江ノ島水族館の飼育水槽内に目的生物が分布・存在し，特に相模湾と駿河湾の深海には“深海・外洋性ディプロネマ類”が属す
DSPDH クレードに含まれる多様な系統が分布・存在していることを明らかになった(図 1 )．さらに環境 DNA
解析を進めた結果，駿河湾と相模湾の深海域におけるディプロネマ類の群集構造は，各サイト間で季節を通じ所属

海洋研究開発機構 地球環境部門

E-mail: yabukia@jamstec.go.jp－ 142 －

図1

相模湾および駿河湾の深海域より検出した系統( OTU - 数字で示す)を含むディプロネマ綱内の系統分岐関係

IFO Res.Commun. 362022

白癬菌における分類体系の再検討と薬剤耐性との関連性に関する研究
山田剛【目的】白癬菌 Trichophyton indotineae は白癬の原因菌のゾール低感受性化の新たな仕組みの存在が示唆された．そ1 つで，数年前に T. mentagrophytes/T. interdigitale 複合

こで 我 々は 再 度 qRT-PCR 法 を 用 い て CYP51A および群から独立した新種として提案がなされた．本菌では，アリル

CYP51B 遺伝子の発現量を比較解析したところ，全てのア
ゾール低感受性株で CYP51B 遺伝子の過剰発現が認めら

アミン系抗真菌薬，テルビナフィンの低感受性株に関する知見が散見される一方，アゾール剤への感受性に関する知見れた．そこで，TIMM20119 から単離した CYP51B 遺伝子は少ない．白癬菌の薬剤耐性化に関する研究で申請者と協の cDNA をアゾール感受性株 TIMM20114 で過剰発現さ力関係にあるスイスの研究グループは，スイス国外で分離させたところ，
アゾール感受性の低下が認められた．逆に，RNAれた T. indotineae を多数収集しライブラリー化している．そ干 渉 技 術 を 用 い て2 つ のアゾ ール 低 感 受 性 株

こで，ライブラリーに含まれる 30 株以上の T. indotineae を対( TIMM20116，20118 )における CYP51B 遺伝子の発現

象に，2 種類のアゾール，イトラコナゾール(以下，ITC )とボを抑制したところ，アゾール感受性が改善した．以上の結果

リコナゾール(以下，VRC )に対する感受性を調査した結果，から，T. indotineae におけるアゾ ール 低 感 受 性 化 へ の

複数の低感受性株が見出された．本研究では，これらの株

CYP51B 遺伝子の過剰発現の関与が予想された．そこで，
サザンハイブリダイゼーション法を用いて，6 株のゲノム中のに共通するアゾール低感受性化の原因の解明に取り組んだ．
【方法】CLSI broth microdilution method の変法による
ITC/VRC 感受性調査で見つかった 4 株のアゾール低感受CYP51B 遺伝子のコピー数を解析したところ，2 つのアゾー
ル感受性株( TIMM20114，20115 )とアゾール低感受性性株( TIMM20116 ～ 20119)と 2 株のアゾール感受性株

株 TIMM20117 では 1 コピー，その他 3 つのアゾール低感( TIMM20114 ，20115)を用いて，薬剤低感受性機構の受性株は複数コピーの CYP51B 遺伝子が存在すると予測さ解析を行った(表 1 )．解析は，過去に白癬菌で報告されれた．そこで，1 分子リアルタイム DNA シークエンス技術を用た 2 つの薬剤低感受性化の仕組み，（1）
薬剤の作用標的分

いて，これら 6 株の全ゲノムシークエンスを解析したところ，

子中のアミノ酸変異，（2）
アゾールを細胞外に排出するトラ

TIMM20114，
20115 および 20117 の CYP51B 遺伝子座にンスポーターの過剰発現，との関連を明らかにすることか

は 1 コピ ー の CYP51B 遺 伝 子 が 存 在 す る の に 対 し，ら開始した．

TIMM20116と20119 では 5 コピーの，そして TIMM20118【結果・考察】各菌株の菌糸からゲノム DNA を抽出し，アゾー

では 7 コピーの CYP51B 遺伝子がタンデムリピート化した状

ルの作用標的である CYP51AとCYP51B(共に lanosterol

態で CYP51B 遺伝子座に存在することが判明した(表 1 )．

14α-demethylase )をコードする CYP51A および CYP51B 遺伝子を PCR で増幅し，塩基配列を比較解析した．その結果，
3 つのアゾール低感受性株( TIMM20116, 20118，20119 )の CYP51B 遺伝子のコーディング領域中に，タンパク質の443 番目のアミノ酸，グリシン（G）
がグルタミン酸（E）に変異す
る点変異が見つかった．そこで，遺伝子操作しやすく，分子系統的に T. indotineae に近い T. mentagrophytes のアゾー
ル感受性株を宿主に用いて，先の G443E アミノ酸変異を含む CYP51B を発現する変異株を作出した．ところが，変異株のアゾール感受性に明確な変化は認められなかった．次に，
qRT-PCR 法を用いて，ITC や VRC の排出が示唆される 4以上の解析結果から，本研究で見出された T. indotineae

種類のアゾール排出トランスポーター( MDR1，2 および 3，のアゾール低感受性化の主な原因は，CYP51B 遺伝子に繰

MFS2 )の遺伝子発現量を比較解析した結果，TIMM20118

り返し重複が起こり，ゲノム上でタンデムリピート化したことにと20119 で MDR3 遺伝子の過剰発現が認められた．そこで，

よって CYP51B が過剰発現したことであると判明した．但し，これら 2 株の MDR3 遺伝子を破壊した変異株を作出したもTIMM20117 は CYP51B 遺伝子が 1 コピーであるにも関わのの，何れの変異株のアゾール感受性にも顕著な変化は認らずアゾール低感受性であることから，別の原因によるものとめられなかった．以上の結果から，T. indotineae におけるア

考えられ，更なる解析が待たれるところである．

所属

帝京大学医真菌研究センター

E-mail: tsyamada@main.teikyo-u.ac.jp－ 143 －

IFO Res.Commun. 36
2022

好熱性シアノバクテリアの系統分類体系と菌株コレクションの確立
春【目的】好熱性シアノバクテリアは，生物進化や光合成

田伸

これら Synechococcus 株の 16S rRNA 遺伝子塩基配列機構の研究，産業応用など多分野で有用な細菌である．

相同性は 87 ～ 88％であり，Average Nucleotide Identity

米国オレゴン大学では日本を含む世界中から収集した好(ANI)は 65 ～ 67％と低かった．また C9 株は窒素固定関

熱性シアノバクテリア株を保有していたが，主たる管理

連遺伝子のうち nifT 遺伝子を欠損していた．分子系統者であった Richard W. Castenholz 博士の没後，未整理解析の結果，C9 株は既知近縁種とは独立しており，シアの状態が続いている．これら菌株の多くは，ゲノム情報

ノバクテリアの起源に近い古い系統であると考えられた．

はおろか，16S rRNA 遺伝子の塩基配列情報も揃ってい次いで，系統分類研究が進んでいなかった糸状性シ

ない．本研究では，未整理の好熱性シアノバクテリアに

ア ノ バ ク テ リ ア Chlorogloeopsis に つ い て 解 析 し た．

ついて遺伝子塩基配列情報を取得し再分類・整理すると
ともに，系統学的に特徴づけることを目的とした．

Chlorogloeopsis についても古くから好熱性株の報告があり菌株保存機関に寄託されていた株もあるが，系統分類【方法】シアノバクテリア細胞から DNA を抽出し 16S

情報が不足しているばかりでなく，いくつかの菌株につrRNA 遺伝子断片を PCR 増幅した．増幅した DNA 断片

いてはすでに消失してしまっている．そこで，日本の温の塩基配列はサンガー法により決定した．ゲノム解析に泉から新たに好熱性株( ON57a 株)を分離し，菌株保は，DNBSEQ-G400(MGI Tech)および GridION(Oxford

存施設に寄託するとともに，既知近縁種との比較解析を

Nanopore Technologies)を用いた．シアノバクテリアの行った(表 2 )．

培養，形態・生理試験は常法に従い行った．アセチレン

表2( C2H2 )還元活性(エチレン生成量)の測定には，FID

Chlorogloeopsis 株の比較
ON57a

検出器搭載 GC( GC-2014 ，Shimadzu )を用いた．

Growthat 38 ℃at 50 ℃
under far-red lighton succinate
C2H2 reduction
Motility
Genome size(Mbp)
GC mol％nifHDK genes
vnfDG genes【結果・考察】細胞形態と培養温度以外の情報がなかったオレゴン大学コレクションの約 100 株について，16S rRNA
遺伝子塩基配列を解析した．系統解析の結果，これらは8 科 9 属( Synechococcus, Leptolyngbya，Neosynechococcus,
Halomicronema, Cymatolege, Acaryochloris, Desertifilum,
Limnothrix, Chroococcidiopsis )に分けられると考えられた．なかには既報配列との相同性が 90％以下と低い株もあった．
オレゴン大学コレクションの好熱性株のうち，古い系

+
+
－
－
+
+
4.90
42.4
+
+

PCC 7702 PCC 9212
+
+
－
－
－
－
4.90
41.9
+
－

+
－
+
+
+
+
7.65
41.5
+
－

+, positive; －, negative

統群に位置する単細胞性シアノバクテリア Synechococcus
sp. C9(=CCMEE 5213)株についてゲノム情報を取得・

生理・形態学的および遺伝学的な解析から，ON57a

解析した．近縁系統の好熱性 Synechococcus 株 JA3-3Ab，株を含む好熱性系統群( PCC 7702 株，PCC 7518 株)は，

JA-2-3B'a との比較結果を表 1 にまとめた．

広く生化学研究の進んでいた中温性株( PCC 9212 株，

表1

PCC 6912 株)と明確に区別できることが明らかになっ

Synechococcus 株の比較

Genome size(Mbp)
GC mol％No. of rRNAs
No. of tRNAs
nifHDK genes
nifT gene

た．また PCC 7702 株と PCC 7518 株にも，かつては窒素

C9JA-3-3Ab

JA-2-3B'a

2.96
52.9
1
44
+
－

3.05
58.5
2
47
+
+

2.93
60.2
2
44
+
+

固定活性および運動性が報告されていたが，今回の試験では検出されず，新たに分離した ON57a 株はこれらの性質を有していた．以上から，ON57a 株は Chlorogloeopsis
好熱性系統群の基準株として有効であると考えられる．

+, positive; －, negative

所属

東京都立大学大学院理学研究科生命科学専攻

E-mail: sharuta@tmu.ac.jp－ 144 －

IFO Res.Commun. 36
2022

酢酸菌群の光に対する適応応答の包括的理解
髙

野

英

晃

【目的】酢酸菌は好気的酸化により酢酸や機能性分子を生産する有用微生物であり，果実や花といった植物性炭水化物が多く含まれる環境から分離される．我々はビタミン B12 をクロモフォアとする新しい光センサー LitR
ファミリーの細菌における多様な分布を明らかにしてきた．しかし，酢酸菌における光応答に関する知見は見つからない．我々のゲノム情報に基づく予備調査によって，酢酸菌の一部は，(i)青色光センサー(LOV)と DNA 結合 ド メ イ ン(HTH)が 融 合 し た LOV-HTH タ ン パ ク 質(図 1 A )，(ii)ヒスチジンキナーゼ(HK)とレスポンスレ
ギュレーター(RR)が融合した LOV-HK-RR タンパク質のホモログを保有することが示唆され，クロモフォアで図1あるフラビンとの相互作用に必須なアミノ酸残基が保存されていたことから，青色光センサーとして働くことが

G. liquefaciens の光誘導モデル(A)，光誘導性転写活性(B)，LOV-HTH 認識配列(C)強く示唆された．本研究では，LOV 保有酢酸菌を対象

pCM130GUS を用いて G. liquefaciens における転写レとした遺伝子発現解析によって，光感知能力を持った酢

ベルの光誘導を解析した結果，phr プロモーター活性は酸菌の同定とその LOV 遺伝子の機能解明を目的とした．

光によって上昇した(図 1 B )．また，同プラスミド上へ【 方 法 】 研 究 対 象 と し た Gluconacetobacter liquefaciensの LOV-HTH 遺伝子の追加導入によって，その転写はさNBRC 12388，Komagataeibacter europaeus JCM 16935 はらに上昇し，生育必須遺伝子 rpoD プロモーター活性の

公 的 分 譲 機 関 よ り 取 寄 せ た． 遺 伝 子 発 現 解 析 に は，50％程度であった(図 1 B )．このことは LOV-HTH が phr(i)セミ定量 RT-PCR 法および(ii)β -グルクロニダーゼ

プロモーターに作用するアクチベーターであることを示

をレポーター酵素とする転写活性測定法を用いた．広宿している．また，本系を用いたプロモーターサブクロー

主域プラスミド pCM130 は米国 Addgene より取寄せた．

ニング実験によって，LOV-HTH 結合領域は，phr 開始コ【結果・考察】ドイツの酢酸発酵槽由来の K. europaeus

ドンから上流 40 から 50 bp 付近であることが示唆された

JCM16935 株，国内干し柿由来の G. liquefaciens NBRC

(図 1 C )．転写開始点はダナフォーム社の改良型 CAGE

12388 を明・暗条件において培養し，セミ RT-PCR 法に法によるゲノム全体の網羅的な決定によって，phr 遺伝

よる遺伝子発現解析を行った結果，LOV-HTH の発現は子開始コドン(ATG)の A であることを明らかにした．

構成的であったが，隣接する DNA 修復酵素遺伝子 phr

ゲノム比較解析によって，G. liquefaciens の LOV-HTHの発現は青色光によって顕著に誘導された．このことか近傍には，光酸化ストレスセンサーとして働くアンチ σ

ら，LOV-HTH が phr の発現に対して正に作用するアク因子 ChrR のホモログがコードされていることが判明しチベーターとして機能することが予想された(図 1 A )．

た．つまり，2 種類の光感知システム，(i)光を直接感

一方，LOV-HK-RR および近傍のカロテノイド合成遺伝

知する LOV-HTH ，(ii)細胞内光増感物質(ヘムなど)の子の発現は，暗条件に比べて明条件で転写レベルの若干

光受容に伴って発生する活性酸素種を感知する ChrR がの増加が確認された．

存 在 す る． 同 様 の 2 種 の 光 感 知 系 保 有 菌 と し て G.

次に G. liquefaciens NBRC 12388 の DNA 導入系を確立した．RK2 ori とテトラサイクリン耐性遺伝子を有する

dulcium LMG 1728 と G. diazotrophicus NBRC 110704 にも見られる．

pCM130 プラスミドが，酢酸菌群に一般的なエレクトポ

本成果は果実・花などに棲息する酢酸菌群の生態に新レーションおよび接合伝達によって効率的に本菌に導入たな知見をもたらすとともに，光によって遺伝子オンオ

可能であることが判明した．また，レポーターアッセイ

フを可逆的かつ非侵襲的に制御する光遺伝学への応用利ベクターとして pCM130 に大腸菌 β -グルクロニダーゼ用が見込まれる．現在，酢酸菌をホストとした光誘導型(GUS)を導入した pCM130GUS を構築した．

物質生産系の構築に取り組んでいる．

所属

日本大学生物資源科学部

E-mail: takano.hideaki@nihon-u.ac.jp－ 145 －

IFO Res.Commun. 362022

脂質非対称バイオセンサーの開発を通した生体膜研究のボトルネック解消と細胞外物理化学変数の感知機構に関する新奇概念の提唱
小

原

圭

介

【目的】細胞膜の脂質二重層では内外層で脂質組成が大Rim21C の組換えタンパク質を精製し，各種脂質分子きく異なる(図 1 )．その様な脂質非対称の維持と調節との結合を脂質オーバーレイアッセイ法により検証した．

は細胞の生存に必須である．しかし，現在では生きた細【結果・考察】GFP-Rim21C に系統的な点変異を導入し胞で脂質非対称の状態をモニターできず，研究のボトルた結果，センサーモチーフ近傍の保存領域に点変異を導ネックとなっている．私は出芽酵母を用いて，脂質非対入した Rim21C 変異体[Rim21C（mtA）]およびそれをタ

称の状態変化を感知して適応反応を引き起こす脂質非対

ンデムに連結した Rim21C（mtA x 2）を GFP に融合した称センサー Rim21 を同定した．また，そのセンサーモチー

際に，脂質非対称変化に対する挙動の変化(通常は細胞フを同定し，その部分を含む C 末端細胞質領域(Rim21C)

膜に結合し，脂質非対称変化に応じて細胞膜から解離すを切り出して GFP に融合することで，生きた酵母細胞

る)がより高いコントラストで検出できる様になったで脂質非対称変化を可視化できるバイオセンサーの雛型(図 2 )．この改良版および雛型を用いて様々なストレスを作製した．本研究では，1. バイオセンサーを改良し下で培養した酵母を観察したところ，外界の pH 上昇おS/N 比を向上する，2. 様々な環境下でバイオセンサーのよび高塩ストレスによって脂質非対称が変化している可挙動を追跡し，脂質非対称に影響を与える細胞外因子を能性が示された．外界の pH 上昇では，実際に脂質分子明らかにする，ことを目指した．

の内外層間反転移動が抑制されて脂質非対称が乱されていることも示唆された．興味深いことに Rim21 は外界の pH 上昇や高塩ストレスに対する適応に必要であった．つまり，これらのストレスが脂質非対称の変化を通して感知される可能性が示された．細胞膜全体が細胞外の物理化学ストレスのうちの少なくとも一部に対するセンサーの役割を担っているのかも知れない．
Rim21C が脂質非対称変化を感知する仕組みを明らかにするために Rim21C の組換えタンパク質を精製し，各種脂質との結合を調べたところ，酸性脂質の幾つかと結合することが明らかになった．これらの酸性脂質は，細胞内ではほとんどが内層側に存在することや Rim21C のセンサーモチーフでは正電荷を持つアミノ酸残基が細胞膜との結合に必要であることから，実際の細胞内での相図1

互 作 用 を 反 映 し て い る 可 能 性 が あ る． す な わ ち，

Rim21 による脂質非対称の感知とバイオセンサー

Rim21C は内層の酸性脂質の量やそれらが作り出す負の【方法】GFP-Rim21C を雛型として，Rim21C 内の荷電ア

表面電荷の強さをモニターすることで，脂質非対称の状

ミノ酸残基(脂質非対称の感知に関わると予想される)態変化を感知している可能性がある．

やセンサーモチーフ近傍の保存された領域に対して系統的な変異導入を行った．その変異 GFP-Rim21C あるいは変異を導入した Rim21C をタンデム連結して GFP に融合したコンストラクトを酵母細胞に導入し，脂質非対称の変化に応じた挙動を蛍光顕微鏡で観察した．
上記の変異解析で S/N 比が向上した改良版バイオセ
ンサーについて，その挙動を様々な細胞外ストレスに曝した酵母細胞で観察することで，脂質非対称の状態に影響を与える細胞外ストレスを探索した．
所属

名古屋大学大学院理学研究科

図2

E-mail: obara.keisuke.r2@f.mail.nagoya-u.ac.jp－ 146 －

脂質非対称バイオセンサーの雛型と改良版

IFO Res.Commun. 36
2022

病原性細菌における毒素遺伝子保有ファージを誘発する因子およびファージ獲得機構の解析
島

村

裕

子

【目的】Staphylococcus aureus(黄色ブドウ球菌)が産生とにより，溶血毒素( β-hemolysin )が MVs に内包されす る 毒 素( staphylococcal enterotoxin A;SEA ) は， 毒

た． 溶 菌 を 誘 導 し た No.29 株 由 来 MVs 内 で は，delta-

素型食中毒を引き起こすだけでなく，感染症やアトピー

aminolevulinic acid dehydratase ，Fe/B 12 periplasmic

性皮膚炎等の誘発および悪化に関与する．この SEA 遺binding protein 等の溶血活性や遊離鉄の取り込みに関わ伝子は，テンペレートファージ上に存在していることかる 複 数 の タ ン パ ク 質 の 増 加 が 認 め ら れ た．No.29 株

ら，SEA に起因する食中毒や感染症等の疾病を防止す( SEA+ )と No.77 株( SEA- )を単独培養または透析共るためには，ファージによる SEA 遺伝子の伝播を抑制

培養した際の培養上清を LC/MS 分析にて比較したとこすることが重要である．本研究では，病原性細菌である

ろ，培地のみと各培養上清から検出されたピークに差が黄色ブドウ球菌の SEA 遺伝子の伝播機構の解明を目的認められなかったことから，培養上清の分画物をさらにに，SEA 遺伝子伝播株の性状および SEA 遺伝子を受容精製して溶菌誘導活性を確認する予定である．

する SEA 非産生株(レシピエント)の性状を解析した．

No.77 株(レシピエント)に No.29 株の SEA ファージ

【方法】SEA 遺伝子アクセプター株(レシピエント)とが挿入されると考えていたが，ドナー株とレシピエント

して SEA 非産生株 6 菌株を，SEA 遺伝子ドナー株として株の全ゲノムを解読したところ，No.77 株は，hlb 遺伝

No.29 株( SEA+ )を用いた．黄色ブドウ球菌が放出する菌子領域に既にファージが存在しており，SEA 遺伝子の体由来分子を包み込んだ膜小胞(メンブレンベシクル;

伝播が確認された No.77-L22 株では，元のファージのMVs )の構造は，ファージと似ていることから，バクテ

挿入位置に No.29 株の SEA ファージ配列が挿入されていリオファージ関連遺伝子と密接な関係があることが示唆た( 図 1 )． こ の No.77 株 の 保 有 す る フ ァ ー ジ は，されている．そこで，SEA 非産生株の培養上清を加えてenterotoxin type A/P を保有するφBU01 と類似した配列

溶菌を誘導した No.29 株(SEA+ )の培養上清から 0.2 µmを有していたが，既報のファージとは異なり，今後，さフィルターで菌体を除去した後，限外ろ過(100 kDa カッらに解析する必要がある．また，No.29 株の SEA 遺伝子

ト オ フ ) お よ び 超 遠 心 分 離( 150,000×g，3 h ) し てを受容する SEA 非産生株(レシピエント)の保有ファー

MVs(沈殿画分)を調製した．調製した MVs 中の SEAジ( SEA- )のタイピングを行ったところ，No.29 株がタンパク質，SEA ファージの有無および MVs を介した保有するファージテイル(φMu3A )と同様のタイプでSEA 非産生株( No.77 株)への SEA 遺伝子の伝播についあった．このことから，同様のファージテイルを保有すて検討した．また，溶菌を誘導した No.29 株から調製しる菌株間で SEA 遺伝子が伝播することが示唆された．

た MVs の粒子径，溶血活性および内包タンパク質の変化を調べた．No.77 株(レシピエント)の培養上清に含まれる溶菌誘導物質を探索するために，No.29 株(SEA+ )と No.77 株( SEA- )を単独培養または透析共培養した際の培養上清について LC/MS 分析を行った．さらに，
SEA 遺伝子伝播を受容する SEA 非産生株の特徴を明らかにするために，次世代シーケンサーを用いて No.29 株( SEA+ ，ドナー株)，No.77 株( SEA- ，レシピエント株)
および No.29 株由来の SEA 遺伝子が No.77 株に伝播した No.77-L22 株( SEA+ )の全ゲノム解析を行った．
【結果・考察】No.29 株由来の MVs には，SEA タンパク図1

質および SEA ファージが内包されていた．この MVs を

SEA 遺伝子保有ファージの挿入

EDTA 処理により破壊して，No.77 株( SEA- )に添加

本研究の成果および今後のさらなる研究により，SEAしたところ，SEA 遺伝子の伝播が認められた．また，遺伝子伝播の全容を明らかにすることで，細菌の進化の溶菌を誘導した No.29 株では，MVs の粒子径が大きく

メカニズムの解明および SEA に起因する食中毒等の疾なり，病原因子を制御する agr システムが活性化するこ病の有効な予防・治療法の開発が期待される．

所属

静岡県立大学食品栄養科学部

E-mail: shimamura@u-shizuoka-ken.ac.jp－ 147 －

IFO Res.Commun. 362022

腸内細菌科細菌における新規カルバペネム高度耐性機構の解明
多

田

達

哉

【目的】カルバペネム耐性腸内細菌科細菌 CRE(carbap-

流 295 番目の塩基が A から C に変異)に変異が確認され，

enem-resistant Enterobacteriaceae の略)が地球規模で医それが原因で hemB 発現を上昇させていることが示唆さ

療安全を脅かしている．我々はこれまでのアジア諸国でれた．hemB は細菌におけるヘミン合成に関与しており，分離された CRE が種々のカルバペネム耐性因子を保有し，ポルフィリン合成経路の一端を担っている．その他のそれらの因子が医療施設で蔓延していることを明らかに

hem 遺伝子の発現を解析したところ，hemF は上昇し，してきた．ほとんどの CRE はカルバペネマーゼを産生す

hemH 及 び hemX で は 減 少 し て い た( 図 1 )．hemA，る CPE( carbapenemase-producing Enterobacteriaceae の略)であるが，一部の CRE はカルバペネマーゼをコー

hemC，hemD，hemE，hemG，hemL，hemN 及 び hemY
においては僅かな変化は見られたものの，有意差は見らドする遺伝子を保持していないにもかかわらず，カルバれなかった．

ペネム高度耐性を示すものが存在する．本研究の目的はカルバペネマーゼ非産生型 CRE の新規カルバペネム耐mutS 欠損大腸菌株において，継代前と継代後の増殖速度を比較した結果，継代後の増殖は僅かに低下したも性メカニズムを明らかにすることである．

のの大きな差は見られなかった．

【方法】大腸菌 DH5α を用いて mutS 遺伝子欠損大腸菌株を作製し，カルバペネム系薬であるメロペネムの濃度

hem 遺伝子の欠損が菌の増殖に影響を与えることにより，特定の薬剤に耐性を示す研究はいくつか報告されてを段階的に増加させた培地で継代培養した．継代前及びいる．しかし，β -ラクタム系でもセフェム系及びイミペ

継代後の mutS 欠損大腸菌を用いてカルバペネム系薬，ネムを除くカルバペネム系薬に対して感受性を低下させ

セフェム系薬およびモノバクタムを含む β -ラクタマー

る遺伝子欠損あるいは遺伝子変異は報告されていない．

ゼ，アミノグリコシド系薬及びキノロン系薬に対する薬本研究から hem 遺伝子変異が β -ラクタム系の耐性にも剤感受性プロファイルを作成した．薬剤耐性獲得前と薬影響を与えることが示唆された．

剤耐性獲得後の大腸菌のゲノムを抽出し，次世代シーケ
ンサを用いて全ゲノム配列を決定し，比較ゲノム解析に

表1より変異部位を特定した．薬剤耐性獲得前と薬剤耐性獲得後の大腸菌から RNA を抽出し，RNA-Seq 解析によりRNA 発現を比較した．
【結果・考察】大腸菌 DH5α を用いて mutS 破壊株を作製し，メロペネム含有培地で継代した結果，10 代継代
でメロペネム耐性「最小発育阻止濃度( MIC )4 μg/ml以上」となり，耐性化した．この継代株における各種
β -ラクタム剤の最小発育阻止濃度を決定したところ，セフェム系薬及びイミペネムを除くカルバペネム系薬で有薬剤感受性試験

最小発育阻止濃度(μg/ml)
各種抗菌薬

DH5

ΔmutS 継代前ΔmutS 継代後

Penicillin
Cefradine
Ceftazidime
Imipenem
Meropenem
Aztreonam
Amikacin
Ciprofloxacin

32
16
0.25
0.5
0.06
0.5
0.5
< 0.063

32
16
0.25
0.5
0.06
0.5
0.5
< 0.063

32
128
4
0.5
4
4
0.5
< 0.063

意に上昇がみられたが，ペニシリン系薬に対する MIC
値に変化は見られなかった(表 1 )．アミノグリコシド
及びキノロン系薬に対する MIC に変化は見られなかった(表 1 )．さらに，本破壊株において継代前の株と 10
代継代株の全ゲノム解析を行ったところ，115 塩基の置換あるいは欠損が見られた．RNAseq を行ったところ，内・外膜に関与する遺伝子( ompA, ompT, ompX )及び鉄代謝に関与する遺伝子( hemB, marA/B/R )の発現が有意に発現上昇していた．さらに，これらの内，mutSによる遺伝子変異と関連して発現量が変化した遺伝子はhemB であると考えられた．hemB のプロモータ領域(上所属順天堂大学大学院医学研究科微生物学

図1

E-mail: t-tada@juntendo.ac.jp－ 148 －

mutS 遺伝子欠損株における継代前及び 10 代継代後の hem 遺伝子の発現量の変化

IFO Res.Commun. 36
2022

オートファジーから逃れるタンパク質の網羅的解析
古

川

健太郎

【目的】オートファジーは，酵母からヒトまで保存された細胞内タンパク質やオルガネラの分解およびリサイク
ル機構である．栄養飢餓など様々なストレスによってオートファジーが誘導されると，細胞質内に隔離膜と呼ばれるカップ状の膜構造が出現し，伸展とともに細胞質成分を包み込み，膜が閉じることによって二重膜のオー
トファゴソームが形成される．引き続き，オートファゴ
ソームはリソソーム(酵母や植物では液胞)と融合し，

図2取り込まれた細胞質成分は加水分解酵素の作用によってオートファジーの検出方法

アミノ酸・核酸・脂肪酸にまで分解され，最終的に細胞【結果・考察】本研究で解析した GFP 融合タンパク質の質へ戻され再利用される(図 1 )．

パターンとして，①高発現タンパク質は GFP 単体が容オートファジーにおいて，通常のタンパク質は無作為

易に検出されたことから，オートファジーによって無作に分解されると考えられている．しかしながら，特定の為に分解されやすいタンパク質とその発現レベルは正のタンパク質は分解から積極的に逃れることによって，生相関があると考えられた．しかしながら，ヒストンなど

理機能を発揮した方が有利な状況もあるはずだが，そのの高発現タンパク質であっても，オートファジーの標的ような概念(図 1:オートファジーエスケープ，以下エになりにくい核内などに局在する場合は分解されにくいスケープ)はほとんど検証されていない．本研究では，ことが確認された．②低発現タンパク質はウェスタンブ

酵母 Saccharomyces cerevisiae を用いてオートファジーか

ロットでも蛍光顕微鏡でも明瞭な結果が得られない傾向

ら逃れるタンパク質を同定し，エスケープの概念を実証があり，オートファジーの標的となっているのか判断ですることを目的とした．

きなかった．強力なプロモーター制御下で再検討した結果，分解が確認されるケースが見られたことから，やはり，発現レベルとの相関があるという結論に至った．
本研究における解析の中から，オートファゴソーム形
成因子に焦点を当てた結果を紹介したい．オートファ
ゴソーム形成因子は，その機能から 6 つのグループ，(a)Atg1 プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼ 複 合 体，(b)Atg9 小 胞，(c)PI3 キ ナ ー ゼ 複 合 体，(d)Atg2-Atg18 複 合 体，

図1(e)Atg8 結合反応系，(f)Atg12 結合反応系に分類されオートファジーエスケープの概念

る．これらの因子は，オートファゴソーム直下もしくは【方法】エスケープタンパク質を同定するため，内在性

近傍に局在することから，オートファジーによって分解プロモーター制御下で GFP 融合タンパク質を発現させされやすいと予想した．実際，(b)～(e)のグループにた．オートファジーにより GFP 融合タンパク質が液胞属する因子のほぼ全ての分解が確認されたが，(a)に属に運ばれると，タンパク質は速やかに分解されるが，GFPする因子(Atg1-13-17-29-31)のうち Atg1 以外は分解さそのものは液胞内でも安定であるため分解されにくく，れにくいことが分かった．Atg1 以外の因子は再利用をウェスタンブロット解析で検出される(図 2 A)．そこで，目的として分解されにくい可能性が考えられるが，それラパマイシン添加によるオートファジー誘導後に分解さではなぜ Atg1 は分解されるのだろうか？ Atg1 は Atg8

れない，すなわち GFP 単体が検出されない融合タンパ

結合モチーフを有するため，複合体を形成せずにフリー

ク質を網羅的に探索した．発現レベルの低さが原因でで存在している Atg1 が Atg8 に補足されて分解された可GFP 単体の検出が困難な場合，蛍光顕微鏡を用いた液胞能性，Atg1 を複合体から切り離して分解することがオー

内 GFP 蛍光の有無による判断(図 2 B )，あるいは，強力トファジーの負の制御となっている可能性などが考えらなプロモーターへの置換によって発現量を増加させた．

れ，更なる検証が必要である．

所属

新潟大学大学院医歯学総合研究科

E-mail: furukawa@med.niigata-u.ac.jp－ 149 －

IFO Res.Commun. 362022

細菌べん毛成長端の機能構造解析に基づくべん毛形成機構の解明
今

田

勝

巳

【目的】多くの細菌は，繊維状の運動器官であるべん毛を用いて自身に適した環境へ移動する．べん毛運動性を失うと病原性は極端に低下し，バイオフィルム形成も阻害されるなど，べん毛は細菌の生存・感染に重要である．
べん毛は約 30 種類の蛋白質が多数集合してできた超分子複合体である．その大部分を占めるべん毛繊維は，約2 万個のフラジェリン分子( FliC)で構成されるらせん状 集 合 体 で， 先 端 に 5 個 の FliD 蛋 白 質 で で き た 蓋

図 1 べん毛先端に結合した FliD の構造モデル(A)FliD サブユニットの構造．
(B)FliD 5 量体の構造．
(C)べん毛先端の構造．

(キャップ)が存在する．べん毛はパイプ様の中空構造を持ち，菌体内で合成された FliC はこのパイプを通って先端まで運ばれ，キャップ直下でべん毛に組込まれる．
しかし，キャップが先端に結合した状態でどのように連

べん毛繊維中央のパイプに深く突き刺さり，ヘリックス

続して FliC を組込むのか，FliC の folding と結合はどのの集まる先端は閉じてゲートを形成していた．このゲーように起こるのか，といったべん毛伸長の分子機構は不トの存在により，folding の場所に複数の分子が入るこ明である．また，11 本の素繊維から成るらせん対称性とを防いでいると考えられる．
べん毛先端で各 FliD サブユニットは，繊維先端のを持つべん毛繊維と 5 回回転対称性を持つキャップがシンメトリーミスマッチを克服して安定に結合するしくみ

FliC サブユニットに沿うようにらせん状に配置していたも謎である．そこで，サルモネラべん毛先端部の構造を(図 2 )．このため，次の FliC が組込まれる繊維先端のX 線結晶構造解析とクライオ電子顕微鏡解析を用いて原

一番低い場所の左にキャップにも段差が生じ，外に向子レベルで解明し，べん毛繊維形成の分子構造基盤を解かって大きな隙間ができていた．また，FliD と FliC は，明することを目指した．

段差の右側以外は密に結合していた．この構造に基づき，【方法】大腸菌 BL21(DE3)で発現したサルモネラ FliD

以下にべん毛成長モデルを提唱する(図 2 )．新たなを精製・結晶化し，結晶構造を 3.2 Å 分解能で解析した．

FliC が隙間に組み込まれるとキャップの段差位置が移次に，FliC の発現を制御できるようにした R 型直線べ動する．段差の移動時には隙間の両側の FliD サブユニッ

ん毛サルモネラ変異体を用いて短いべん毛を持つ菌体をトと FliC の結合が変化する．一方で他の FliD サブユニッ

作成し，密度勾配遠心法でべん毛を基部体ごと精製した．

トと FliC の結合は変化しない．従って，FliC の組込にこの試料をクライオ電子顕微鏡で撮影して 3 次元再構成

よる構造変化は段差両側の FliD サブユニットに限られを行い，1,772 個のべん毛先端の画像から 8.5 Å 分解能のる．このため，キャップが安定に結合したまま FliC を

密度図を得た．FliD の結晶構造と既知の R 型直線べん

挿入することができ，段差の伝播により連続した FliC

毛構造を参考に，この密度図を用いてサルモネラべん毛の挿入が起こると考えられる．

先端部の原子構造モデルを構築した．
【結果・考察】FliD は 3 個の球状ドメインと長く伸びた
コイルドコイルを形成する 2 本のヘリックスから形成されていた(図 1 A )．FliD キャップ 5 量体は結晶構造では 5 回回転対称性を有していたが，べん毛先端に結合したキャップ 5 量体は，段差を持つ非対称な鳥カゴ状構造を形成していた(図 1 B )．2 個の球状ドメインはべん毛
先端で歪んだプレート状構造を形成し，その直下には運ばれてきた FliC が folding する場所と考えられる幅 40 Å
深さ 80 Å の空間があった．キャップ 5 量体の 1 つのドメ
インとコイルドコイルを形成する 2 本のヘリックスは，
所属

大阪大学大学院理学研究科

図 2 べん毛繊維の成長メカニズム
FliD サブユニット 5 のみ FliC サブユニットとの相互作用が異なる(A)．FliC サブユニットの挿入により段差部分のFliD サブユニットが持上がる(B)．段差が移動する(C)．
FliC サブユニットの挿入前後で FliD サブユニット 1,2,3 とFliC サブユニットの相互作用は変化しない．

E-mail: kimada@chem.sci.osaka-u.ac.jp－ 150 －

IFO Res.Commun. 36
2022

液胞よる染色体・核小体の核内配置制御の解析
丑【目的】出芽酵母で栄養源飢餓により誘導されるヌクレ
オファジー(核を分解するオートファジー)では核小体

丸

敬

史

nvj1∆ nvj2∆ nvj3 mdm1∆ 株(NVJ∆ )の提供を受け用いた．
予想通り，この欠損株ではミクロヌクレオファジーが消タンパク質が選択的に分解されるが，核小体内にある失した．それに加え，核内イベントである rDNA 凝縮，

rDNA 領域も含め染色体 DNA は分解されない．ミクロ

rDNA と核小体タンパク質との分離も消失した．このこと

ヌクレオファジーにおいて，この分解は液胞と核の接触

は，rDNA 凝縮に伴う核小体リモデリングという核内イベ部( NVJ )が液胞内に陥入し取り込まれることによりントを液胞が核外から NVJ を介して指令することを示す．

起こる(図 1 )．その際，分解される核小体タンパク質

次にこれを受けて，NVJ 局在性タンパク質を網羅的には NVJ に近寄り，分解されない rDNA は凝縮しつつ核調べ，核小体リモデリングの動力源となると予想される

小体タンパク質から分離して NVJ より遠ざかる．本申

rDNA 凝縮に必要な因子の同定を試みた．その結果，既請研究では，NVJ がこの染色体・核小体の核内配置を制知因子 Nvj1 に加えて，Mdm1 を同定した．mdm1∆ 細胞

御する分子基盤を明らかにすることを目的とした．

では，rDNA 凝縮，核小体タンパク質と rDNA の NVJ に対する定方向性の運動が消失した．その結果，ミクロヌ
クレオファジーによる核小体タンパク質の分解が抑制され，飢餓後の生存が著しく低下した．以上の結果から，飢餓誘導性の核小体リモデリングのモデルを提唱した(図 2)．

図1

飢餓時の NVJ による核小体のリモデリング【方法】rDNA 結合性タンパク質，核小体タンパク質体に蛍光タンパク質を融合させた出芽酵母 Saccharomyces
cerevisiae で NVJ を欠く欠損株 nvj1∆ nvj2∆ nvj3 mdm1∆，
NVJ に 局 在 す る タ ン パ ク 質 遺 伝 子 欠 損 株( nvj1∆，
mdm1∆ 等)，Cdc14 フォスファターゼ変異株 cdc14-1，
トポイソメラーゼ II 変異株 top2，コンデンシン変異株
ycs4-2，ヒストン脱アセチル化酵素欠損株 rpd3∆，CLIP
欠損株 heh1∆，cohibin 欠損株 lrs4∆ を用いて，顕微鏡観図2

察により核小体リモデリングを評価した．それらの因子

飢餓時の核小体リモデリングに関与する因子

さらに，分裂期の rDNA 凝縮に必要な Cdc14 フォス

に関して，その存在量，局在，飢餓後の生存への関与等を評価した．

ファターゼとトポイソメラーゼ II が飢餓誘導性の核小【結果・考察】研究代表者は，NVJ に対しての核小体タ体リモデリングに必要であることを，蛍光タンパク質をンパク質と rDNA の定方向性の運動性が rDNA 凝縮(コ

融合した核小体タンパク質を観察して見出した．

ンデンシンとヒストン H1 様タンパク質 Hmo1 による)

上記の実験結果は全て対数増殖期細胞を飢餓処理してを必要とすること，rDNA の核内膜繋留( CLIP 複合体，得られたものである．分裂期因子であるコンデンシンやcohibin を介して)を必要とすることをすでに明らかに

Cdc14 フォスファターゼが間期の飢餓誘導性 rDNA 凝縮

してきた．本研究はそれを受け，以下の研究を行った．

に関しても必要であるかを疑い，それを検証した．その出芽酵母では，核と液胞は常に NVJ でコンタクトし

結果，間期における飢餓誘導性 rDNA 凝縮は Cdc14 をている．液胞が NVJ を介して核外から核小体リモデリ

必要とするが，コンデンシンは関与しないことを明らか

ングを制御するのかを証明するため，NVJ を持たないにし，間期染色体凝縮の新たなシステムを見出した．

所属

静岡大学理学部

E-mail: ushimaru.takashi@shizuoka.ac.jp－ 151 －

IFO Res.Commun. 362022

糖消費速度をモニタリングするフラックスセンサーの探索
柘

植

陽

太

【目的】微生物を用いた有用物質の生産には速い糖消費なった．一方，ペントースリン酸経路( PPP )では，グ速度が必要である．現在，糖消費速度の向上のために代

ルコース消費速度が増加すると代謝物レベルが全体的に謝遺伝子の高発現などが行われているが，糖消費速度と低下した．このことから，グルコース消費速度が上がる

ハウスキーピング遺伝子である中央代謝経路の遺伝子発と PPP への代謝フローが弱まり，解糖系及び TCA 回路

現レベルの関係については未だ不明な点が多い．もし中への代謝フローが強まる可能性が示唆された．一方，糖央代謝経路の遺伝子の発現レベルが糖消費速度と連動し消費速度と細胞内濃度が正の相関を示す代謝物としてホて変化するのであれば，糖消費速度を感知するセンサー

スホエノールピルビン酸，ピルビン酸，イソクエン酸，が存在する可能性がある．そこで本研究ではアミノ酸生

フマル酸，コハク酸の 5 つが見出された(図 1 )．

産菌として工業利用されているコリネ型細菌をモデルとして糖消費速度を感知するフラックスセンサーを探索することを目的とした．
【 方 法 】 コ リ ネ 型 細 菌( Corynebacterium glutamicum )の ATCC 13032( WT 株)に加えて，グルコース消費速
度が増加する株として H+ -ATPase 活性が低下する atpG
一塩基置換株(atpG t817c 株)を使用した(Sawada et al., J.
Biosci. Bioeng., 2012 )．また，グルコース消費速度が低下する株として，グルコースの取り込みとリン酸化に関わるホスホトランスフェラーゼシステムの遺伝子(ptsG )の欠損株を使用した．各株を 30 ℃, 180 rpm で 24 h 前培
養後，グルコースを単一炭素源とする合成培地に初期OD600=0.5 となるように植え継ぎ，対数増殖期で転写解
析，代謝解析用のサンプリングを行った．転写解析用の菌体は mRNA を抽出後，qRT-PCR 解析を行った．代謝解析用の菌体はメタノール・クロロホルム法により代謝物を抽出し，液体クロマトグラフ質量分析計( LC-MS)
で中央代謝経路の代謝物を分析した．
【結果・考察】3 株の単位菌体量あたりのグルコース消費速度を算出した結果，atpG t817c 株は野生株より 125％

図1増加し，ptsG 株は野生株より 79％減少したため，目的の糖消費速度の変動を確認した．各株における転写解析

コリネ型細菌の中央代謝経路と糖消費速度と連動して細胞内濃度が変動した代謝物(黒枠)の結果，中央代謝経路の 41 遺伝子のうち 15 遺伝子の発コリネ型細菌では中央代謝経路の遺伝子群の転写制御

現レベルが糖消費速度と正の相関を示し，3 遺伝子の発ネットワークが詳細に解明されている．また，代謝物は現レベルが負の相関を示した．従って，本種では糖消費

転写因子と直接結合して，転写因子が制御する遺伝子の速度の変化に連動して中央代謝経路の遺伝子の発現レベ発現を調節する場合がある．従って，本研究でグルコー

ルが変動することが明らかになった．これは細胞が糖消ス消費速度の変動に合わせて細胞内濃度が変化した 5 つ

費速度を感知してその発現レベルを調整している可能性の代謝物の中に，転写因子との結合を通して中央代謝経を示唆している．糖消費速度を感知するセンサーとして路の遺伝子群の発現を調節しているフラックスセンサー

は代謝物である可能性がある．そこで次に LC-MS を用が存在する可能性が示唆された．今後は 5 つの代謝物といて代謝解析を行い，中央代謝経路の代謝物の濃度を分中央代謝経路の遺伝子発現を制御する転写因子群との結析した．その結果，グルコース消費速度が増加すると，合を調べることでフラックスセンサーシステムの分子機解糖系や TCA サイクルの代謝物濃度が全体的に高く構の解明に取り組む．

所属

金沢大学新学術創成研究機構

E-mail: ytsuge@staff.kanazawa-u.ac.jp－ 152 －

IFO Res.Commun. 362022

耐熱性酵母 Kluyveromyces marxianus の高温下での脂質代謝変化の解析
星

田

尚

司

【目的】酵母 Kluyveromyces marxianus は 50 ℃近い高温

Sct1 のアイソザイムをコードする GPT2 の発現が 1.7 倍でも増殖可能な耐熱性を持つ．しかし，このレベルの耐程度に増加していたことから，高温下において TAG 合

熱性を K. marxianus に与える分子レベルの機構は全く成に関わる酵素の発現が転写レベルで増加することが明明らかになっていない．細胞膜は生物に必須の構造であらかになった．一方で，蓄積した TAG を分解する酵素

り，その主成分であるリン脂質に対する生育温度に応じをコードする TGL3, TGL4 の発現が増加しており，単純た適応機構がよく知られている．K. marxianus においてに合成経路の活性化の結果として TAG が蓄積するわけ

細胞膜構成成分が耐熱性に関与しているかどうかを明らではないことが示唆された．合成経路の各遺伝子のプロ

かにする目的で網羅的な脂質解析を行ったが，リン脂質モーターに相当する領域の配列を赤色蛍光タンパク質遺を構成する脂肪酸の種類に培養温度の違いによる明確な

伝子の上流クローニングしたレポータープラスミドを用差は認められなかった．一方で，高温で培養した細胞でいた解析でも，網羅的な解析と同様，高温で転写活性がは，リン脂質量が減少し，中性脂質であるトリグリセラ

低下するプロモーターは少なく，リン脂質からジアシルイド(TAG )蓄積量が増加していた．そこで本研究では，グリセロールに脂肪酸を転移する酵素 Lro1 や脂肪酸合

K. marxianus が高温で TAG 蓄積量を増加させる機構とその高温での増殖に対する効果を解析した．

成に向かう酵素の Slc1, Dga1，Gpt2 の各遺伝子のプロ
モーター活性が 40 ℃，あるいは 45 ℃で増加していた．

【方法】K. marxianus の培養には酵母の一般的な培地で発現が増加した遺伝子が高温での TAG 蓄積に関与しある YPD を使用し，24 ウェルプレートに 1 mL の培地ているかどうかを明らかにするために遺伝子破壊を行っを入れ，各温度で振とう培養した．次世代シークエンサー

た．GPT2 ，ALE1，DGA1，TGL4，LRO1 の 5 つ の 遺を用いた網羅的発現解析では，フラスコを用いて 50 mL

伝子破壊株を構築した．これらの株を培養し増殖との培地で 30 ℃及び 45 ℃で培養した細胞から RNA を抽

TAG 蓄積量を野生株と比較した．その結果，DAG1 と出し，解析した．レポータープラスミドの構築及び，
CRISPR-Cas9 を用いた遺伝子破壊では，必要な DNA は

TGL4 の破壊株では 40 ℃での細胞の増殖が野生株と比べて大きくなり，また，細胞(濁度)当たりの TAG 蓄

染色体 DNA またはプラスミド DNA をテンプレートと積量が野生株に比べて低下した．この結果から，高温下して PCR で増幅し，K. marxianus へこれらを導入した．

での TAG の蓄積は，ストレス状況において，炭素源お

形質転換体の選択にはウラシルまたはロイシンを欠損さよびエネルギー源を一時的に脂質として確保するためのせた合成培地を用いた．TAG の定量では，一定量の細機構ではないかと考えている．

胞をグラスビーズで十分に破砕し，得られた破砕液に含まれる TAG の濃度をラボアッセイ™ トリグリセライド(富士フィルムワコー)を用いて定量した．細胞の増殖は 600 nm の濁度で評価した．レポーターアッセイの蛍
光強度は培養液を 96 ウェルプレートに入れ，プレート
リーダーで測定した．
【結果・考察】K. marxianus のゲノムから，TAG 合成
経路遺伝子が明らかになっている酵母 Saccharomyces
cerevisiae の遺伝子と相同性のある遺伝子を探索した結果，TAG 合成経路遺伝子が保存されており，代謝経路は基本的に同じであることが示唆された．これらの遺伝子の発現が高温での TAG 蓄積量の増加に関与しているかを知るために，次世代シークエンスによる RNA 解析を行った．TAG 合成に関わる 22 の遺伝子のうち 30 ℃に比べ 45 ℃で 2 分の 1 以下に発現低下した遺伝子は SCT1だけで，多くの遺伝子の発現が増加していた(図 1 )．
所属

山口大学大学院創成科学研究科

E-mail: hoshida@yamaguchi-u.ac.jp－ 153 －

図 1 K. marxianus の 脂質代謝経路と高温での発現変化
遺伝子名の前の矢印が30 ℃に対する 45 ℃での発現変化を示す．2 倍以上の増加，↑ ; 半分以下の低下，↓ ; Ac，アシル ;Actl ，アセチル ; DAG ; ジアシルグリセロール;
DHAP，ジヒドロキシア
セ ト ン リ ン 酸 ; FFA，遊離 脂 肪 酸 ; Gro，グ リ セ
ロール ; MAG; モノアシ
ルグリセロール ; P，リン酸 ; PA，ホスファチジン
酸 ; PL，リン脂質 ; TAG;
トリアシルグリセロール

IFO Res.Commun. 36
2022

海藻（褐藻）分解小動物の腸管と腸内複合微生物の協同による褐藻の完全分解系の解明
河

井

重

幸

【目的】ハマトビムシ( Platorchestia joi )(図 1 )は，砂抗生物質がハマトビムシの寿命に与える影響を調べるた

浜生態系の一次生産物である漂着海藻バイオマスの主要

めに，褐藻を餌としてハマトビムシを抗生物質添加また分解小動物(直径 8 mm 程度)である．砂浜生態系の一は非添加条件で飼育し，生存数を計測した．

次生産物である漂着海藻の分解系の解明は，砂浜生態系

褐藻または紙を食したハマトビムシに対する RNA-seq

および海洋炭素循環を理解する上で，更には褐藻の新た褐藻または紙を餌とした実験区でハマトビムシを飼育な利用方法の開発において重要であるが，その詳細は不し，個体から RNA を抽出した．RNA-seq は FASMAC 社

明である．著者は褐藻を餌とするハマトビムシ腸管部位に依頼し，得られた生データを Trinity で de novo アセンから，褐藻主要炭素源アルギン酸(難分解性高分子)を

ブリし，Kallisto と TransDecoder を使用して転写産物資化する細菌( Vibrio, Paracoccus 各属細菌など)を単発現量の推定と CDS 配列の抽出を行い，BLASTP で解離している．

析した．この RNA-seq 解析を独立して 2 回実施した．
【結果・考察】これらの事実から，ハマト
ビムシの腸管では，腸管側代ハマトビムシの腸管メタゲノム解析および抗生物質介入

謝系のみならず，腸内複合微試験

生物群も協同して関わる「褐

物叢が検出されることを期待したが，ハマトビムシの腸藻の完全分解系」が機能して管内微生物叢は飼育条件に依存せず個体ごとに大きく異いると推察される．本研究のなっていた．また漂着褐藻の微生物叢とも大きく異なっ

目的は，ハマトビムシ腸管にていた．一方，これらの実験区のハマトビムシの腸管における，この褐藻の完全分解系の解明である．

図1

は Paracoccus 属や Vibrio 属の細菌が検出された．特にハマトビムシVibrio 属の細菌は実験区 A から G 由来のすべてのサンプ
ルで検出され，36 サンプル中 10 サンプルで 30％以上の【方法】
ハマトビムシの腸管メタゲノム解析

餌や環境等の飼育条件によって固有の腸管内微生

褐藻または紙を微生物組成比を示した．

食しているハマトビムシを同定および解剖し，腸管を採抗生物質介入試験の結果，抗生物質添加区のハマトビ取した．採取した腸管(計 35 サンプル)から DNA を抽

ムシは抗生物質を添加しない対照区と同程度の速度で餌出し，1 匹分ずつメタゲノム解析( 16S ，ITS2 ，およびを食べ，抗生物質添加および非添加条件のハマトビムシ

18S に対するアンプリコン解析で FASMAC 社に依頼)

生存数は両者同様に生存数が減少した．すなわち，抗生を行い，腸管内微生物叢を明らかにした．ただし，ハマ

物質介入の，褐藻摂食と寿命に対する明瞭な効果は観察

トビムシの飼育条件を，滅菌の有無，飼育日数( 1，2

されなかった．一方，腸管メタゲノム解析では，抗生物週間)，餌(褐藻，紙)，漂着海藻群( α，β )で分けて実質添加区の腸管内微生物叢は単純化して餌に依存した微験区 B から G として設定し，それぞれの飼育条件に依生物叢を示し，Paracoccus 属や Vibrio 属の細菌は検出さ存した特徴的な腸管内微生物叢が形成されるかどうかをれなかった．
褐藻または紙を食するハマトビムシに対する RNA-seq

確認した．また漂着褐藻そのもののメタゲノム解析も

褐藻または紙を餌とするハマトビムシで発現する遺伝行った(実験区 A )．
滅菌環境の実験区 H(褐藻で飼育，子のリストを得た．両者でセルラーゼが検出された．褐

抗生物質非添加)，I(褐藻で飼育，抗生物質添加)，お藻を食するハマトビムシからアルギン酸の資化に関わる

よび J(紙で飼育，抗生物質添加)を作製して観察後，遺伝子は現在のところ検出されていない．抗生物質介入

これら実験区で飼育したハマトビムシの腸管メタゲノム

試験の結果も考え併せると，褐藻完全分解のためにセル解析( 16S および ITS2)を行った．なお，すべてのメ

ロース成分は腸管セルラーゼにより，アルギン酸は腸内

タゲノム解析データは Qiime2(ver. 2020.2 )で解析した．

細菌により分解資化されていると推察された．

抗生物質介入試験

また，実験区 I の腸管由来の微生物も単離した．さらに，

所属

石川県立大学生物資源工学研究所

E-mail: kawais@ishikawa-pu.ac.jp－ 154 －

IFO Res.Commun. 362022

昆虫共生細菌による殺虫剤の腸内解毒機構の解明
菊

池

義

智

【目的】異なる 2 種が共生することで，ときに生物は全養およびカメムシへの感染実験によって，宿主害虫へのく新しい機能を獲得する．これまでの研究で我々は，農

農薬抵抗性賦与に関わる責任遺伝子を特定した．また，

業害虫のカメムシ類が農薬分解菌を体内に共生させるこ

それら分解遺伝子群についてカメムシ共生時のトランスとで，昆虫自身までも農薬抵抗性化するという現象を見

クリプトーム解析を行い，体内における分解プロセスの出してきた．気候変動や人口増加による食料難が叫ばれ解明を行った．加えて糞の化学分析を行い，MEP 分解

るなか，食料の安定供給のために農薬の重要性はますま

産物がどのような形で排泄されているか調査した．

す高まっている．一方で，単一の農薬を連続して使用す【結果・考察】SFA1 株のゲノムサイズは約 9.5 Mb であった．

ると，農薬抵抗性を持つ害虫が出現することが大きな問

MEP 分解に関わる遺伝子群については他の細菌において題となっている．このような農薬抵抗性は昆虫自身の遺既報があり，それら情報と MEP 培地培養時のトランスク

伝子で決まる性質であると常識のように考えられてきたが，リプトーム解析結果と照らし合わせて，SFA1 では 7 つの遺近年，我々の研究によって，昆虫体内の共生細菌が農薬

伝子によって MEP が分解され資化されていることが明らの解毒に重要な役割を果たしていることが分かってきた．

かとなった．カメムシに共生した際の SFA1 のトランスクリ

我々の報告の後，世界中で同様の現象が報告されてきた．

プトーム解析を行ったところ，興味深いことに MEP 分解

しかし，これまで共生細菌を介した農薬の解毒メカニズム

経路の第 1 番目の遺伝子( mpd )のみが発現していた．こは解明されていなかった．本研究では，共生細菌のゲノムの mpd の欠損株を作成したところ，MEP 分解能および宿解析，遺伝子発現解析，遺伝子ノックアウト解析により共主カメムシへの抵抗性賦与能力を完全に失っていた．一方，

生細菌の農薬分解遺伝子を特定し，昆虫体内における解毒プロセスを解明することに成功したので報告する．

mpd 相補株ではこれらの能力が回復していたことから，この第 1 番目の遺伝子が農薬抵抗性賦与の責任遺伝子であ【方法】本研究で対象とするのは大豆の害虫として知らることが証明された．mpd による MEP の分解産物である

れるホソヘリカメムシ(Riptortus pedestris)
である
(図 1)
．

3 -メチル- 4 - ニトロフェノール(3M4N )は害虫に無毒であこのカメムシは消化管に「盲嚢」と呼ばれる袋状組織をる一方，面白いことに 3M4N は共生細菌に対して非常に多数発達させており，その内腔中に Burkholderia 属細菌

高い殺菌活性を示すことが明らかになった．カメムシ体内を特異的に共生させている．この害虫は，孵化後しばらでの 3M4N の代謝過程を HPLC により調査したところ，

くたってから共生細菌を環境土壌中から獲得することが3M4N はほとんど代謝されることなく速やかに糞とともに知られている．土壌中には様々な機能(遺伝子型)を持っ体外に排出されることが明らかとなった．つまり，宿主害た共生細菌が生息しているが，中には有機リン系農薬で虫にとって有害な農薬( MEP)を共生細菌が分解し，共あるフェニトロチオン(MEP )を分解できる系統もおり，生細菌にとって有害な農薬分解産物(3M4N )を宿主害虫

そのような農薬分解共生細菌をホソヘリカメムシが獲得が速やかに除去するという，相互解毒ともいうべき共生シすると，たちどころに MEP 抵抗性になってしまう．

ステムによって，共生細菌を介した農薬抵抗性が成立してMEP 分解共生細菌である Burkholderia sp. SFA1 株をいることが明らかとなった(図 2)．

対象に全ゲノム解読を行い，同時に培養液に MEP を添加した際のトランスクリプトーム解析を行い，MEP 分
解経路および関与遺伝子群の特定を行った．特定された
MEP 分解遺伝子群について遺伝子欠損株を作成し，培図2

今回発見された害虫と共生細菌の相互解毒機構．

本研究は共生細菌を介した農薬抵抗性について，体内の解毒プロセスを明らかにした世界初の成果であり，害
図1
所属

ホソヘリカメムシとその共生器官．

産業技術総合研究所生物プロセス研究部門

虫の進化における共生細菌の重要性を示すものである．

E-mail: y-kikuchi@aist.go.jp－ 155 －

IFO Res.Commun. 36
2022

低グルコースに対する分裂酵母の適応戦略
中【目的】炭素源枯渇は細胞死に直結するストレスである．
特に分裂酵母はグルコースに対する依存性が高く，増殖中の細胞をグルコース非含有培地に移すと 24 時間程度でほぼ死滅する．しかし低濃度(標準濃度の 1/100 程度)グル
コース含有培地で馴化させた細胞は，その後の炭素源枯渇に対して耐性をもつことが報告されている．自然界における微生物は栄養の少ない厳しい環境に晒されることも多いと考えられるため，このような馴化応答が重要な生存戦略であると推察される．環境ストレスに関する研究は広く行われているものの，比較的短時間の強いストレス条件における細胞表現型が研究対象とされることが多く，慢性的な低容量ストレスに対する細胞生理状態についての知見は不足している．そこで本研究では，低濃度グルコース培地に対する馴化過程における分裂酵母細胞の生理状態変化を様々な角度から特徴付けることを目的とした．
【方法】マイクロ流体デバイスによる長期ライブイメージング:
多数の独立した一細胞系列をトラッキングできるように独自開発したデバイスを用いた長期タイムラプスによって，低グルコース培地条件(0.02％グルコース含有 Edinburgh 最少培地，30 ℃)における恒常発現蛍光蛋白質の輝度変化を観察した．また，馴化過程における細胞質 pH の変化を測定するために，pH センサーである pHluorin2 を発現する
Schizosaccharomyces pombe 株を作成し，pH 測定イメージングを行った．
細胞質流動性の計測:鳥ウイルス由来の µNS 蛋白質は凝集しやすいことが知られており，蛍光蛋白質と融合させた µNS を発現させた分裂酵母株の細胞質では凝集蛋白
質塊の輝点が観察される．この輝点のブラウン運動様の動態をタイムラプスによって追尾し，その実行的な運動範囲を定量することによって細胞質の流動性を評価した．
蛋白質凝集傾向の観察:古細菌のエンカプスリン足場蛋
白質の一種である GEM に蛍光蛋白質を融合したものを発現する株を構築し，その凝集に対応する輝点の生成を低グ
ルコース環境下でモニターすることによって蛋白質凝集の生じやすさを評価した．
定量位相イメージングによる細胞内部の密度測定:定量
位相イメージングの一種であるデジタルホログラフィック顕微鏡技術を利用して，細胞質の密度計測を行った．デジタ
ルホログラフィーは光の干渉を利用することによって試料に由来する光の位相変化を定量的に検出する方法であり，位相変化が光路長に対応することから，試料厚みが既知であれば細胞の屈折率分布(≒細胞内物質密度)をイメージングによって推定できる．本研究では細胞が楕円体であるとのモデルに基づいて厚み推定を行い，屈折率分布を算出した．本手法による計測は東京大学大学院理学研究科の井
手口拓郎研究室の協力の下で行った．
【結果・考察】図 1 に示すように，低グルコース(0.02％)含有培地で培養した分裂酵母細胞の細胞質 pH の変動は 4日程度かけてプラトー(6.0 - 6.5 程度)に達することが分かった．また，その pH の値は急速なグルコース飢餓条件
所属

図1

岡

秀

憲

低グルコース環境における細胞質 pH の変動(0％グルコース)によって到達する pH(約 5.5)の値と比べて高いレベルであった．
pH の低下による帰結として細胞質における蛋白質の凝集の促進およびそれに伴う細胞質の固化が想定される．実際，急速なグルコース飢餓によって pH が 5.5 程度まで低下した細胞においては Sup35 プリオンの凝集や µNS のブラウン運動が停止するなどの結果が得られた．しかし，µNSの運動解析の結果から，低グルコース濃度での馴化を経た細胞では，その後グルコースの厳密な飢餓条件に移した場
合であっても細胞質流動性がある程度保たれることが明らかとなった．また，GEM-T-Sapphire の凝集体をモニターし

図2

細胞の水含有率推定値

た結果も，馴化細胞では蛋白質凝集が抑制されていることを示唆していた．
一方で，定量位相イメージングによる細胞質の物質密度推定の結果，低グルコース馴化過程において物質密度の上昇が示唆された(図 2 ．水含有率の低下は水以外の物質密度が上昇していると解釈できることに注意)．興味深いことに，
厳密なグルコース飢餓条件では物質密度が低下するものの，馴化を経験した細胞群ではその低下程度が抑えられている可能性がある(図 2)．このことが細胞の生存を保証することに繋がっているのかどうかは今後の研究課題の一つである．
また，トレハロース合成やオートファジーなどの，炭素源
飢餓応答に必要であると思われる活性が，本研究で観察された生理現象にどのように関与するのかについてもさらなる研究が必要である．

東京大学大学院総合文化研究科，現 京都大学大学院生命科学研究科－ 156 －

E-mail: nakaoka.hidenori.6n@kyoto-u.ac.jp

IFO Res.Commun. 36
2022

新規機能性 DNA 断片を介した酵母の適正なゲノム構造維持機構の解明
飯

田

哲

史

【目的】ゲノムの不安定化によって引き起こされる遺伝

析は，遺伝子領域の欠失変異体を作成し，接合試験およ子のコピー数変化は，様々な細胞異常を引き起こす．リびハンチントン病原因タンパク質 HttQ103QP-GFP の凝

ボゾーム RNA 遺伝子( rDNA )は，複数コピーがリピー集体形成の観察により行った．

トとして各生物に適正なコピー数で維持されている．出

【結果・考察】SIR2 の発現抑制が解除される変異体を網芽酵母( Saccharomyces cerevisiae )の研究から，rDNA

羅的にスクリーニングした結果，SIR2 の発現抑制が部の低コピー化が DNA 損傷感受性を誘導することがわ

分的に解除される複数の相補グループに分かれる変異体

かっている．したがって，適正な rDNA コピー数の維持を 単 離 し た．NGS を 用 い た 原 因 変 異 の 同 定 に よ り，は正常な細胞機能に重要である．我々は，S. cerevisiae

UAF 以外の複数の遺伝子が脱ユビキチン化サブ複合体の rRNA 転写の活性化因子 UAF が，適正なコピー数(150を構成するサブユニットをコードするものであり，転写コピー)からのコピー数減少を感知し，rDNA の安定性活性化に関わる SAGA 複合体が SIR2 の発現抑制に関与を維持する Sir2 の発現量を抑制することで，適正なコすることが示された．これまでに，UAF 変異体で完全ピー数への回復を促す機構を明らかにしてきた(図 1 )．

に SIR2 の発現抑制が解除されること，SIR2 の発現抑制

本研究では，SIR2 プロモーター領域における遺伝子発現には Sir2 タンパク質も部分的に関与していること見出制御の機構を明らかにするとともに，SIR2 プロモーターしている．さらに，SAGA が Sir2 と相互作用する報告も領域で見つかった DNA 断片の機能の解明を目的とした．

あることから，UAF の下流で，Sir2 と SAGA が協調して SIR2 の発現抑制を行っている可能性が示唆された(図 1 )．今後は，転写活性化因子である SAGA がどのよ
うに SIR2 の転写を抑制するのかを明らかにするのが課題である．
SIR2 プロモーターの研究過程で，NGS を用いた解析から，SIR2 の 5' 領域と上流の遺伝子 NAT1 に掛けての756 塩基に対応する二本鎖 DNA が染色体外の DNA として発現していることを見出した．我々は，二本鎖 DNA

図1

を specDNA( short priared extra-chromosomal DNA )SIR2 プロモーターにおける遺伝子発現制御と名付け，相互作用するタンパク質の精製と同定を試み【方法】SIR2 プロモーター領域における遺伝子発現制御

た．specDNA を含む複合体を精製し相互作用するタン因子の同定は，S. cerevisiae の FOB1 遺伝子破壊株をもパク質の同定を行ったところ，タンパク脱リン酸化酵素とに rDNA のコピー数が野生型の 150 コピーから 15 コ

Glc7 が specDNA と複合体形成していることが明らかと

SIR2 プロモー
ピーまで減少した変異体(低コピー株)に，なった．specDNA と SIR2 に関連する遺伝子領域の変異

ターにハイグロマイシン B 耐性遺伝子を連結したレポー

体を用いてその表現型を解析した結果，Sir2 タンパク質

ター遺伝子を導入し遺伝学的スクリーニングを行った．

を発現し接合能を有する specDNA 部分欠失変異体で，野生型株に較べて低コピー株は DNA ハイグロマイシン

異常タンパク質 HttQ103QP-GFP の細胞質凝集体形成がB 感受性となるが，SIR2 の転写抑制因子の機能欠損変促進すること，SIR2 欠失変異体と同様に接合不能とな異体はハイグロマイシン B に耐性となる抑圧変異体とる SIR2 の部分欠失変異体で，specDNA 領域を維持してして単離できる．得られた変異体は，相補グループに分いる変異体では，HttQ103QP-GFP の細胞質凝集体形成

類した後，次世代シークエンサー( NGS )で原因変異の促進が観察されないことから，specDNA が Sir2 の機を同定した．

能とは独立した形で，凝集体形成の抑制に関わることがSIR2 プロモーター領域から発現する DNA は，NGS
解析により発現領域を同定し，サザン解析により確認し明らかとなった(図 1 )．今後は，specDNA の発現がた．DNA と相互作用するタンパク質は，複合体の精製

SIR2 の発現制御や rDNA コピー数制御，異常タンパク
質凝集体形成とどのように関わっているのかを明らかにを行ったのち質量分析により同定した．DNA の機能解するのが課題である．

所属

東京大学定量生命科学研究所，現 理化学研究所バイオリソース研究センター－ 157 －

E-mail: tetsushi.iida.nu@riken.jp

IFO Res.Commun. 362022

ゲノム DNA は，細菌細胞内ではどのように折りたたまれているのか：
HU タンパク質による細菌ゲノム DNA 折り畳み機構
大【目的】生物のゲノム DNA の長さは，細胞に比べ長大で，折りたたまない限り細胞内に格納することは難しい．しかし，無秩序に折りたためば，遺伝子発現や複製の制御に不都合が生じるかもしれない．実際に真核生物では，
ゲノム DNA はヒストンと相互作用して規則的に折りたたまれ，さらにゲノム上の機能領域の違いによって異なる形をとる．ここからも，ゲノム DNA には「折りたたみ方」があることが示唆される．しかし，真核生物と異なり，細菌と古細菌の一部の種にはヒストンが存在しな
い．その代わり，核様体タンパク質(Nucleoid AssociatedProtein=NAPs)と呼ばれるタンパク質群が存在する．

図1

NAPs の大腸菌ゲノム上の分布

これまでも，NAPs がヒストンに代わり原核生物のゲ
ノム DNA を折りたたむ，と提案され続けてきた．しかし，その「折りたたみ方」は明らかになっていない．本研究では NAPs の解析が最も進んだ大腸菌をモデルとし，高解像度 ChIP-seq を用い，細菌のゲノム DNA の「折りたたみ方」の解明を目指した．
【方法】大腸菌の主要 NAPs(HU, IHF. Fis, H-NS)を，ヒ
スチジンタグを付加した形で発現するようにゲノム改変した大腸菌株を作成し，LB 培地で対数増殖期まで培養した．ゲノム DNA を DNaseI で部分消化した後，NAPsとのタンパク質- DNA 複合体を精製し，その複合体から
DNA 断片を回収して，次世代シーケンシングを行い，精密な主要 NAPs のゲノム結合地図を作製した(GeF-seq
法:図 1)．DNaseI による断片化で，結合位置の検出精度の向上以外の影響が出ないことは，通常の ChIP-seqとの比較で検証した．同時に，HU と IHF を同時に欠損した株を作成し(hupAhupBihfA 欠損株)を作成し，その表現型を解析した．変異株が温度感受性を示したため，
その抑圧変異を分離し，ゲノムシーケンスにより変異箇所を決定した．
【結果・考察】大腸菌には，HU と IHF という 2 種類の所属

富山県立大学工学部生物工学科

島拓

HU 型 NAPs が存在する．一方，枯草菌などの細菌種には，
HU が一種類しか存在せず，生育に必須である．興味深いことに，大腸菌の HU と IHF の 2 重欠損株は，温度感受性を示した．その抑圧変異株を分離したところ，トポ
イソメラーゼと RNA ポリメラーゼに変異が生じていた．
このことは，HU と IHF が，ゲノム DNA 全体の超らせん構造の維持と転写に強くかかわることを示している．
さらに，GeF-seq により，NAPs の詳細な結合地図を決定したところ，HU はゲノム DNA 全体に弱く均一に結合しており，Fis の結合パターンも HU とよく似ていた．
それとは対照的に，H-NS はゲノムの一部に強く結合し，さらに IHF は，特定の部位に鋭く大きなピークを示した．
このことは，H-NS と IHF がゲノムの領域あるいは配列特異的に結合することを示している．さらに興味深いことに，H-NS の結合領域では，HU と Fis の結合が非常に弱いことがわかった．IHF の結合部位の DNA 配列を抽出し，認識配列を決定したところ，ほぼすべての結合部
位にこれまで報告されて IHF のコンセンサス配列が見
つかり，IHF の結合は，HU とは全く異なり塩基配列特異的であることが判明した．同時に IHF の結合が転写制
御領域に偏って存在するかを解析したところ，IHF の結合部位の 80％以上は遺伝子コード領域に存在していた．

図2

NAPs の大腸菌ゲノム上の分布

これらの観察結果と，IHF の結合により DNA が強力に屈曲することを考慮し，IHF が転写制御因子としてではなく，核様体の構造タンパク質として大腸菌ゲノムの「折りたたまれ方」を決定するモデルを考えた(図 2 )．
1. HU(Fis)が ゲ ノ ム DNA に 結 合 し 基 盤 構 造 を 作 る．
2. IHF が特異的な部位に結合しゲノム DNA を湾曲させる．3. ゲノムの一部では，IHF の結合により湾曲した領域に H-NS が結合し架橋構造を作り，HU(Fis)の結合を阻害して転写抑制領域を形成する．今後は，精製した
HU, IHF, Fis, H-NS を用いた試験管内再構成を進め，本モデルの妥当性を試験管内で示していく予定である．

E-mail: taku@pu-toyama.ac.jp－ 158 －

IFO Res.Commun. 36
2022

グラム陽性菌に見いだされた新規電子受容体と超低栄養生育との関連性
吉

田

信

行

【目的】私たちは，炭素源を含まず，独立栄養性細菌(オートトローフ)を培養する際に必要な光，金属，水素などの還元力も加えない培地( BM 培地)を用いて，自然界からの微生物の単離を試みている．寒天やシリカゲル，
あるいはスポンジを支持体として用いれば，そのような条件でも驚くほど簡単に単離することができ，そのよう

図1な細菌を超低栄養性細菌(スーパーオリゴトローフ)とN9T-4 株ゲノム上で aldA-mnoA 間に存在する低栄養性遺伝子クラスター領域呼んでいる．Rhodococcus erythropolis N9T-4 株は最初に見つけた超低栄養性細菌であり，CO2 を要求することが【結果・考察】今回，初めて mnoA 欠損株( ΔmnoA 株)

分かっている．さらに興味深いのは，炭素源のみならず，の取得に成功し，その欠損株の低栄養生育能が著しく低窒素源を含まない無機塩固体培地上で良好な生育を示下したことから，aldA 同様本菌の生育に重要な役割をす．本菌の CO2 固定系についてはその意義も含めて不果たすことが明らかとなった(図 2 )．さらに，MFT の明であるが，プロテオーム，トランスクリプトーム解析

前駆体ペプチドをコードする mftA，MFT に糖鎖を付加

から炭素・窒素代謝の大まかな流れは明らかになりつつする糖転移酵素をコードする mftF の欠損株は低栄養生ある．aldAと mnoA は本菌を低栄養条件で生育させた際，育能をほとんど失ったが，これも MFT のメチル化に関最も発現する遺伝子であり，それぞれ NAD 依存性のア

与すると予想されている mftM の欠損株は親株と同様のルデヒド脱水素酵素( NAD-ALDH)と N, N´- ジメチル

生育を示した．

-4-ニトロソアニリン依存性メタノール脱水素酵素( NDMA-MDH )をコードする．このうち aldA の方はmnoA の遺伝子産物( NDMA-MDH )の機能解析を行うため，まず大腸菌を用いて発現を試みたが，活性なタ

その欠損株が低栄養性を失うことが早くから分かっておンパク質を得ることができなかった．そこで，N9T-4 株

り，詳細に検討を進めてきたが，mnoA の方は検討が遅内で発現させた MnoA の酵素活性を測定したところ，れていた．本研究では，mnoA およびその電子受容体のNDMA 依存的にエタノールを酸化する活性が認められ生合成に関わる遺伝子と，N9T-4 株の超低栄養生育とのたが，メタノールに対する活性は検出できなかった．

関係を調べた．
【方法】NDMA-MDH は，グラム陽性のメタノール資化

mnoA 欠損株および mftA 欠損株はエタノールを炭素源とする液体培地で生育を示さなくなることから，MnoA性菌(メチロトローフ)に存在し，メタノール資化の初の機能に MFT が関与する，つまり電子受容体である可発酵素と考えられている．最近，グラム陽性メチロトロー能性が示唆された．現在，MFT の N9T-4 株からの単離，フ で あ る Mycobacterium smegmatis の MDH に お い て，あるいは有機合成を試みており，今後 MFT が実際にマイコファクトシン(MFT)という化合物が電子受容体

MnoA の電子受容体となるか検討する予定である．

であることを示唆する報告があった．MFT はペプチド前駆体から PQQ 類似の経路で生合成されることから，グラム陰性菌における PQQ と同様の生理活性を持つものと予想されているが，酵素の電子受容体となる直接的な証拠を示した例はない．興味深いことに，N9T-4 株ゲ
ノム上において，aldA と mnoA の間に MFT 生合成系の遺伝子が全て存在していた(図 1 )．この低栄養性遺伝子
クラスターに存在する遺伝子を sacB を用いた相同組換
えにより欠損させた株を作成し，その低栄養生育を評価した．また，mnoA については His タグをつけて N9T-4株内で発現させ，その精製タンパク質の機能を解析した．

所属

静岡大学大学院総合科学技術研究科

図 2 低栄養性に関与する遺伝子欠損株の生育

E-mail: yoshida.nobuyuki@shizuoka.ac.jp－ 159 －

IFO Res.Commun. 36
2022

一細胞力学操作を用いた病原性細菌の細胞侵入における定量的解析：
細菌感染を支配する力学的メカニズムの解明
久保田

寛

顕

【目的】腸内細菌科細菌にはサルモネラ属菌のように，
腸内上皮細胞に接着するとともに組織内に侵入し，感染を確立することで強い病原性を生む菌種が存在する．このような菌は上皮細胞に侵入する際に細胞質内に注射器のような形状をしたⅢ型分泌装置を介し，エフェクターと呼ばれるタンパク質群を注入する．その後，アクチン
細胞骨格の再編成による細胞表面の局所的な変化が菌を引き込むような挙動を示し，侵入の効率が向上するとされている．これまで細胞骨格を介した細菌侵入について
は主に分子生物学的，あるいは細胞生物学的手法を用いて深く研究されており，多くのエフェクターとそれらが相互作用する細胞内のタンパク質群が同定されてきた．
本研究では，過去に調べられてこなかった力学的な情報に焦点を当て，生物物理学的手法である光ピンセット法
を用いた一細胞操作による顕微力学解析を駆使し，細胞侵 入 時 に 発 生 す る 力 の 計 測 を 試 み た． 具 体 的 に は，

図1

Salmonella typhimurium の細胞侵入時に発生する波打ち現象( Membrane Ruffling )を研究対象とし，細菌侵入

光ピンセットを用いた実験系と波打ち現象のメカニズムを探る第一歩とした．この波打ち現象はア【結果・考察】図 1 に示すように，ビーズを介して捕捉

クチン骨格の再編成による細胞表面の局所的な形状変化した菌により波打ち現象を誘発することに成功した．波の一種であるが，例えば消化管の動きや消化管内の流れ打ち現象は全ての個体からは誘発されることはなく，多によって想定されるような力学的負荷に対する安定性なくの個体は数分間細胞表面に配置しても接着すらしな

ど，動的な性質にはまだまだ未解明な点が残されている．

かった．その一方，一部の個体は細胞表面に移動すると【方法】過去に細胞侵入性が報告されているS. typhimurium

同時に接着し，速やかに波打ち現象を誘発した．また，

SL1344 株を研究材料とした．サルモネラ共通構造抗原

本実験を行うにあたり，釣菌した SL1344 株のコロニー( CSA-1 )特異的抗体をアミンカップリングにより固定

を Luria-Bertani( LB)液体培地により培養したが，接着・した直径 1 ミクロンのポリスチレンビーズを光ピンセッ

波打ち現象の誘発には培養時の NaCl 濃度が大きく影響

トで操作し，同じく観察セル内に分散させた SL1344 株

し た． 具 体 的 に は，LB 培 地 中 の NaCl 濃 度 を 5 g/L

一個体に結合させることにより間接的な菌体の捕捉，菌( Lennox 組成)とした場合は 100 個体ほど試行してもこが発生する力の定量を可能とした．顕微鏡下でビーズとのような現象を観察できなかったのに対し，15 g/L にす菌を結合させる際は素早い鞭毛運動が障害となるため，ると 10％から 20％程度の割合で観察することが可能で相誘導血清( i )により運動性を抑えた．ビーズを介しあった．培養時の NaCl 濃度はⅢ型分泌装置を構成する遺て 菌 を 捕 捉 し た 後 は， 観 察 セ ル の 底 面 に 培 養 し た

伝子群を含むサルモネラ病原性アイランド(SPI )-1 の発

Madin-Darby Canine Kidney( MDCK )細胞上に移動し，現を左右することが知られており，本実験でも SPI-1 が接着及び波打ち構造の形成を観察した．観察には 100 倍

ON となる個体の割合に大きく影響したと考えられた．

の対物レンズを用い，輝度重心リアルタイム追跡機能を

今後は波打ち現象で見られる繊維上の影(図 1 )がア備えた自作の画像(動画)取り込みプログラムにより位クチン骨格であるか否かについて蛍光標識により判別す

相差像を取得した．

るとともに，力学的負荷を加えることで波打ち現象の力
学的安定性を調べていく予定である．

所属

東京都健康安全研究センター微生物部

E-mail: Hiroaki_Kubota@member.metro.tokyo.jp－ 160 －

IFO Res.Commun. 36
2022

好熱性細菌 Thermus thermophilus におけるコエンザイム A
生合成経路の制御機構の解明と CoA 製造への応用
本

田

孝

祐

【背景と目的】Coenzyme A(CoA)はあらゆる生物で普を適当な比率で混合し，2.0 mM パンテテイン，6.0 mM

遍的に用いられる補酵素であり，診断用酵素の補助剤やATP を含む溶液中で 70 ℃にて反応させた．HPLC にて

化粧品添加剤などとして商業的にも利用されている．真

経時的に反応液を分析し，CoA の生産を確認した．

核生物や細菌において CoA は，パントテン酸を前駆体【結果・考察】T. thermophilus は本来，PanK を初発反応とする 5 段階の酵素反応により生合成される(図 1 )．

とした 5 ステップの酵素反応により CoA を生合成する．

その初発反応を触媒するパントテン酸キナーゼ( PanK )一方，多くの PanK は本来の基質であるパントテン酸のは一次構造に基づき，type I ～ III の 3 つのファミリーにほか，これがシステアミンアミド化されたパンテテイン

分 類 さ れ る． こ の う ち type III PanK は，2005 年 にに対しても活性を有し，PPAT の基質であるホスホパン

Helicobacter pylori より見出された比較的研究歴の浅い酵素である．Type I，II PanK が CoA によるフィードバッ

テテインを生産する．T. thermophilus 由来 PanK でも同ク阻害を受け，細胞内 CoA 濃度の恒常性維持に寄与す

ンを出発原料とした 3 ステップでの CoA 生産を実施しることが知られる一方で，type III PanK は CoA に対す

た． こ の 結 果，2.0 mM パ ン テ テ イ ン よ り， モ ル 収 率る感受性を示さない．本研究では，好熱性細菌 Thermus

47％で CoA を得ることができた．ここで十分な収率がthermophilus が type III PanK を有することに着目し，同菌由来の耐熱性 CoA 生合成酵素群からなるカスケード( PPAT および DPCK )が CoA に感受性を示す可能性が反応を in vitro で構築し，これを用いた CoA 生産試験に考えられたことから，その検証に取り組んだ．この結果，取り組んだ．また，T. thermophilus における CoA 生合成

1.0 mM CoA の存在下で PPAT の活性が CoA 非存在下のの調節機構解明の足掛かりとすべく，当該試験の過程で20％弱にまで低減することを見出した(図 2 )．以上の様の活性が認められたことから，本研究ではパンテテイ

得られなかった原因として，PanK 以外の 2 つの酵素得られた酵素群の CoA に対する感受性を評価した．

結果より，T. thermophilus では，PPAT に対するフィー【 方 法 】T. thermophilus 由 来 の PanK ，pantetheine-

ドバック阻害により CoA の生合成が制御されているこ

phosphate adenylyltransferase(PPAT)，dephospho-CoAと，また今後，CoA による阻害を被らない耐熱性 PPAT

kinase(DPCK)遺伝子を大腸菌内に導入し，得られた組を利用することで，より高濃度，高収率での CoA 生産が換え菌体の無細胞抽出液を 70 ℃，30 分間の熱処理に供可能なカスケード反応が構築できる可能性が示された．

することで粗精製酵素標品を得た．得られた 3 つの酵素

図 2 CoA が T. thermophilus 由来 CoA 生合成酵素の活性に
及ぼす影響
図1

所属

一般的な CoA 生産試験

大阪大学生物工学国際交流センター

E-mail: honda@icb.osaka-u.ac.jp－ 161 －

IFO Res.Commun. 36
2022

植物免疫を活性化する微生物の新規評価法の確立と探索への応用
古【目的】近年，植物病原菌や病害虫に対して防除効果を

屋

俊

樹

加時の ROS 生成が高まるだろうという原理である．

示す微生物を農薬として利用する微生物農薬が注目され具体的には，BY-2 細胞の懸濁液に微生物を接種後，ている．とくに，植物の免疫システムを活性化する微生

4 時間振とうした．その後，この時点までに BY-2 細胞物は，植物と相互作用することによりその病害抵抗性をや微生物により生成された物質を除去するために，遠心高められるため，次世代の微生物農薬として期待されて分離して上清を除去した．さらに，BY-2 細胞を緩衝液いる．しかし，植物免疫活性化微生物を新たに自然界かに再懸濁後，クリプトゲインを添加し，ROS 生成を化ら発見することは難しい．従来の当該微生物のスクリー

学発光試薬と発光測定装置で計測した．

ニング手法は，温室等で育成した植物体を用いた煩雑な【結果・考察】まず，有機栽培で育てられたコマツナか菌の接種試験に依存しており，多くの時間と労力を要す

ら内生菌の分離を試みた．有機栽培では化学農薬を使用る．そこで本研究では，植物の免疫システムを活性化す

せずに，長年の経験を通して植物が病気にかかりにくいる微生物の簡便な評価手法を考案した．さらに，開発し栽培手法を確立している．有機栽培で育てられたコマツ

た手法を利用して，実際にコマツナの内部から当該微生

ナの内部には，植物免疫を活性化する微生物が住みつい物を探索した．

ているのではないかと予想した．そこで，東京都立川市【 方 法 】 タ バ コ の 培 養 細 胞 BY-2 は， 病 原 性 卵 菌の鈴木農園の協力を得て，有機栽培で育てられたコマツ

Phytophthora cryptogea 由来のタンパク質性エリシターであるクリプトゲインを受容すると免疫応答を示すが，活ナをサンプルとした．表面を次亜塩素酸ナトリウムとエ性酸素種( ROS )の生成量と防御応答の強さに正の相関とにより内生菌の分離を試みた結果，コマツナから約があることが知られている．そこで，微生物を BY-2 細胞

30 株の細菌を取得できた．

タノールにより殺菌後，内部を固体培地に接触させること試験管内で接触させた後，クリプトゲインを添加して分離した約 30 株のコマツナ内生菌を，方法に示した

ROS 生成を計測することにより，微生物の植物免疫活評価手法に供した．その結果，多くの細菌は BY-2 細胞性化能を評価できるのではという着想に至った(図 1 )．

に影響を及ぼさないのに対して，一部の細菌は BY-2 細もし微生物が植物免疫活性化能を有していれば，微生物

胞のクリプトゲイン誘導性の ROS 生成を亢進することを接触させていないときと比較して，クリプトゲイン添がわかった．ROS 生成の亢進を指標とする本手法を利用すると，微生物が植物免疫を活性化するポテンシャルを有するかどうかを，わずか数時間で判定することができる．
この一次評価で陽性を示した細菌 Delftia sp. BR1R-2
株と Arthrobacter sp. BR2S-6 株をモデル植物であるシロ
イヌナズナの幼苗の根に接触させたところ，シロイヌナ
ズナの生育に影響を与えずに内生した．さらに，内生させたシロイヌナズナにトマト斑葉細菌病菌と軟腐病菌を感染させたところ，BR1R-2 株と BR2S-6 株はどちらもシロイヌナズナに両病原菌に対する抵抗性を付与することができた．シロイヌナズナに感染したトマト斑葉細菌病菌の数を計測したところ，内生させていない対照と比較して BR1R-2 株を内生させた場合には 0.9％，BR2S-6

図 1 微生物の植物免疫活性化能を評価する新しい手法．
ROS は活性酸素種を表す．右のグラフでは，微生物を添加してないサンプル(△)と比較して，添加したサンプル(〇)では，微生物との相互作用により植物培養細胞のROS 生成が高まっている．
所属

東京理科大学理工学部

株を内生させた場合には 7.4％まで減少していた．また，
BR1R-2 株に関しては遺伝子レベルでの解析も実施し，免疫応答に関わる防御関連遺伝子( PR-1，PR-5，PDF1.2 )の発現が高まっていることを確認できた．発見した細菌はコマツナにも耐病性を付与できた．

E-mail: tfuruya@rs.tus.ac.jp－ 162 －

IFO Res.Commun. 36
2022

バイオ医薬品の次世代製造宿主を指向した
光発現誘導システム導入ブレビバチルス菌の創製
浅【目的】大腸菌に比べ，グラム陽性菌である Brevibacillus

野竜太郎

築した(図 2 上)．得られたベクターを用いてブレビバ(ブレビバチルス菌)は，タンパク質分泌能の高さに加チルス菌を形質転換した後，PcpcG2 が活性化する緑色光

えて，菌体外プロテアーゼ活性が低いことなどから次世を含む白色光照射下，および不活性化する赤色光照射下

代微生物宿主として期待されている．大腸菌発現に於いの 2 条件に加え，PCB 産生の補助となる FeCl3 を添加して問題となるエンドトキシンの除去工程も必要ないたない条件( Fe(-))，および添加した条件( Fe(+))で培

め，治療薬を指向した分子の製造コストの低減も見込ま養を行った．遺伝子発現制御能は GFP 由来の蛍光強度れる．しかしながら，ブレビバチルス菌を用いた実用的の経時変化を指標として評価した．さらに導入したな発現誘導システムは未確立であるため，宿主に成長阻害をもたらすような目的タンパク質の場合，形質転換体

ccaS，ccaR，ho1，pcyA 遺伝子の転写解析を行うことで，制御系の構成因子の発現評価を行った．

すら得られない．

【結果・考察】ブレビバチルス菌の蛍光強度を測定した

そこで本研究では，ブレビバチルス菌に対して，化合

結果，FeCl3 添加により GFP 由来の蛍光強度の明確な増物の添加を必要としない非侵襲的な発現誘導法である光加が観察された(図 2 下)．これは，PCB の基質である発現誘導システムの導入を目指した．具体的には，シアHeme が増加したためであると考えらえる．一方で，照ノバクテリア Synechocystis sp. PCC 6803 が有する，緑色

射光の違いに依存した蛍光強度の差は観察されなかっ光で転写促進し赤色光で抑制する CcaS/CcaR 二成分制

た．転写解析の結果，期待通り各構成遺伝子の転写が確御システムのブレビバチルス菌への導入を検討した

認され，また条件間の差も確認されなかった．このため(図 1 )．

蛍光強度の差が確認されない原因として菌体に十分に光が行き届いていない，あるいは各遺伝子の転写レベルが低いことが考えられる．これらの結果から，ブレビバチ
ルス菌において，シアノバクテリア由来 CcaS/CcaR 二成分制御システムを用いた発現は可能であることが示されたものの，発現の制御には至らなかった．今後は，光強度や各遺伝子の転写レベルの検討をプロモーターの改変などと併せて行うことで光に応答した遺伝子発現制御が可能となることが期待される．

図1

CcaS/CcaR 二成分制御システム【方法】図 1 に示した光発現誘導システムの導入に向け，
ブ レ ビ バ チ ル ス 菌 で 機 能 す る こ と が 既 知 の Bacillus
subtilis 由来プロモーター PserA 下流に緑色光センサタン
パク質をコードする ccaS 遺伝子と転写因子をコードする ccaR 遺伝子，および恒常性プロモーター P5 下流にCcaS の補因子であるフィコシアノビリン( PCB )の生
合 成 に 関 与 す る ho1 遺 伝 子 と pcyA 遺 伝 子， さ ら に
CcaS/CcaR により制御されるプロモーター PcpcG2 下流にGFP(緑色蛍光タンパク質)をコードする gfp 遺伝子，をそれぞれコードするベクター pNCMO2-PCB-GSS を構所属

東京農工大学大学院工学研究院

E-mail: ryutaroa@cc.tuat.ac.jp－ 163 －

図2

構築した発現ベクター(上)と形質転換したブレビ
バチルス菌の蛍光強度測定結果(下)IFO Res.Commun. 36
2022

長期間持続可能なインジゴ還元発酵液の新規調整方法の開発
湯【目的】インジゴ還元発酵の原料はスクモと呼ばれる蓼本

勳モ(後期[115 - 226])発酵に対して LP を添加した結果，藍をコンポスト化したもので，この製造過程で植物体に染 色 の 開 始 に 18 - 53 日 の 差 が 見 ら れ た． 一 方， 中 期

含まれていたインジカンは水不溶性のインジゴに変換さ( 39 - 94 日)解析用のバッチでは，初期の染色の開始にれる(図 1 )．さらに，このインジゴは灰汁の中での液LP 添加とコントロールに明確な差は見られなかった．

体発酵過程でスクモ由来の微生物による還元力によって初期( 1 - 72 日)D -スクモのコントロールバッチでは 5

水溶性のロイコインジゴになり，染色可能になる．藍染

日目に Bacillaceae が LP 添加バッチと比較してかなり菌

めは発酵液に存在する色素であるインジゴを還元する微叢中の比率が低下しており，Proteinivoraceae が優先し生物叢の維持によって運用されている．この発酵液の中ていた．10 日目以降に Bacillaceae が約 20％を占め，58の微生物は仕込みの方法やスクモに存在する微生物に

日目に Alkalihalobacillus hemicellulosilyticus 類似( 98.1 -よって変化し，これらの要因が仕込みから還元開始まで

99.7％相同性)細菌が優先(38.1％)し明瞭な染色が見らの時間を左右する．そこで本研究では仕込みからインジれ た． 一 方，LP 添 加 バ ッ チ に お い て は 5 日 目 に はゴの還元が起こるまでの期間を短縮した長期間持続可能

Bacillaceae が 30％以上を占め 25 日目に染色が低下するが， そ の 後 A. hemicellulosilyticu お よ び Polygonibacillus

な発酵液の調整方法を検討した．

indicireducens 類似( 97.9％)細菌が優先し，再び明瞭な染色が見られた．以上の結果から，LP 添加とコント
ロールに大きな差が見られたバッチにおいては発酵初日の pH が 11.5 以上であったことから，LP 添加により，含まれるフラボノイドやポリフェノール等のファイトケ
ミカルと低 ORP との相乗効果により，よりインジゴの還元の開始に有利な微生物が選択されたことが示唆される．LP 無添加のバッチでは本来 ORP の低下に貢献する
酸素代謝能を持った Bacillaceae が pH11.5 によって生育図 1 発酵法による藍染の工程(A)蓼藍収穫後の工程．
(B)蓼藍の中のインジカンが可溶性のロイコインジゴへの変換過程．

が阻害されるが，pH10 前後では ORP 低下に寄与することを示唆していた．PCoA 解析の結果 LP 添加により，微生物叢の変化速度が増加した．また発酵 25 日前後ま【方法】インジゴ還元発酵液の長期安定化にはインジゴ

では，スクモ由来の比較的容易に利用可能な基質がインが還元された時に安定な微生物叢が形成されていること

ジゴ還元に寄与している一方，25 日以降はスクモ由来

がその長期安定に重要である．本研究の目的はインジゴの分解しにくい基質がインジゴ還元のエネルギーとなっの発酵液のインジゴの還元を確実にかつ仕込みからのイている可能性が示唆された．発酵 5 日目に LP 添加によ

ンジゴの還元までの日数を短縮することであることから，

り染色に明確な効果が見られたことから，メタゲノム予

初期( 1 - 72 日)および中期( 39 - 94 日)解析用に通常

測 を お こ な っ た こ と こ ろ，Phosphotransferase system

よりも還元が起こりにくい D -スクモを使用した．後期(PTS)が LP 添加によりコントロールと比べ約 5 倍高く，

( 115 - 226 日)解析用には還元が起こりやすい T-スクモ

糖質の取り込みがインジゴ還元のエネルギーであることを使用した．発酵促進させる目的で，インド藍粉(LP)を示唆していた．中期および後期解析用バッチにおいてを 0.1％添加した．発酵液はサンプリング時に pH，ORP

は P. indicireducens 類似( 97.7 - 98.6％)細菌の存在比が(酸化還元電位)および染色し，インジゴ還元度合いを

LP 添加バッチでコントロールより多い等，微生物叢に見積った．細菌叢の解析には発酵液から DNA を回収後，差が見られ，染色強度は強く，検討した全期間を通じて

16S rDNA V3-V4 領域を PCR 増幅した．PCR 産物を精LP の効果を確認する事が出来た．以上，インジゴ還元発

製後，Illumina Miseq を用いたシークエンス解析を行い酵液の仕込み時の LP の添加は発酵初期の確実な ORP の

その結果を BLASTN により細菌種同定をおこなった．

低下を引き起こし，より確実にインジゴ還元が起こるた【結果・考察】初期( 1 - 72 日)D -スクモおよび T-スク

めに必要な微生物叢へと誘導することが明らかになった．

所属

産業技術総合研究所生物プロセス研究部門

E-mail: i.yumoto@aist.go.jp－ 164 －

IFO Res.Commun. 36
2022

病原性細菌の毒素産生を阻害するプロバイオティクスの探索ならびにその作用機構の解明
野

田

正

文

【目的】細菌感染症の治療において薬剤耐性菌の出現は違いについて，定量 PCR 法により解析した．

深刻な問題であり，それに対処するための新戦略の策定【結果・考察】研究室保存株ならびに新規に分離・同定が急務である．近年，薬剤耐性菌に対抗する新たな戦略

した計 649 株を対象としたスクリーニングの結果，QSとして，細胞間情報伝達機構のひとつである Quorum

阻害候補株として 28 株を見出すことができた．それらのsensing( QS )機構の阻害が注目を集めている．QS 阻株における，P. gingivalis 及び A. actinomycetemcomitans

害剤は，従来の抗生物質とは異なり，殺菌・静菌作用をに対するバイオフィルム形成阻害能を調査したところ，示さず，病原因子の産生のみを特異的に阻害する抗病原No. 403 株( Leuconostoc pseudomesenteroides ) 及 び No.

性物質として効果を発揮できるため，薬剤耐性菌の出現

372 株( Enterococcus faecalis )の培養液上清に，それぞ頻度を抑えることが期待できる．最近その構造が明らかれ強い阻害活性が観察された．なお，双方ともに生育へになったシグナル分子 auto-inducer-3( AI-3)のシグナの影響は認められていない．現在までのところ，両株のル受容体として最初に発見された QseC 受容体は，少な

培養液上清からの活性物質の精製はできていないが，有くとも 25 種類の病原性細菌に存在するとされており，

機溶媒抽出によって得られた分画における阻害活性を比

これまでに二成分制御系 QseBC 系を介した経路が機能較する限りにおいては，No. 403 株では水～メタノール

している病原性細菌として，腸管出血性大腸菌や野兎病に溶解し易く，No. 372 株では有機溶媒層に移行しにく

菌，腸炎ビブリオ，ネズミチフス菌などが知られている．

い物質が本体であると予測されている．

当研究室における先行研究として，大腸菌の宿主・ベク

続いて，両株の抽出画分を用い，バイオフィルム形成

ター系を用いた AI-3 のシグナル伝達阻害物質のスクリー阻害下における，両歯周病起因菌の遺伝子発現状況につニング系を開発している(図 1 )．本研究では，この系いて調査した(図 2 )．P. gingivalis では，阻害剤の添加にを利用して QS 阻害物質を産生する乳酸菌株を探索した．

よってvimA 遺伝子において顕著な低下がみられた．VimA
は P. gingivalis の産生する毒素ジンジパインの活性化にも必要とされる多機能タンパク質で，本菌の病原性制御に関与するとされる．また，A. actinomycetemcomitans
では，毒素タンパク質をコードする cdtB および ltxA 遺伝子の発現がやや低下している様子が観察された．これ
らの結果から，今回見出された 2 株には，病原性細菌の生育に影響を与えることなく，その毒素産生を抑制する

図1

AI-3 を介した QseBC 系により制御される flhDC 遺伝子のプロモーターを利用したアッセイ法の模式図．

活性が存在することが示唆された．

【方法】QseBC によって調節を受ける flhDC 遺伝子プロ
モーターの支配下に β-gal 遺伝子を配したアッセイ用プ
ラスミド pLES-AQSA を保有する大腸菌株をスクリーニ
ング用の菌株として用いた．スクリーニング対象となる各乳酸菌株の培養液上清を滅菌後，X-gal を含む LB 培
地に添加してスクリーニング用の菌株を培養し，青色素産生阻害の有無によって QS 阻害の可能性を判断した．
次に，QS 阻害候補株が実際に活性を示すか調査すべ
く，QseBC 系がそのバイオフィルム形成を制御するとされる 2 種の歯周病起因菌 Porphyromonas gingivalis 及び Aggregatibacter actinomycetemcomitans に 対 し， 実 験を行った．また，同時に病原性関連遺伝子の発現状況の所属

広島大学大学院医系科学研究科

図 2 バイオフィルム形成阻害時における各遺伝子発現の変化．
( A )P. gingivalis，( B )A. actinomycetemcomitans．

E-mail: bel@hiroshima-u.ac.jp－ 165 －

IFO Res.Commun. 362022

酵母 FLO assay を基盤とした真菌二次代謝産物からのエピジェネティック機能探索㓝ẕ FLO assay ࢆᇶ┙࡜ࡋࡓ┿⳦஧ḟ௦ㅰ⏘≀࠿ࡽࡢ࢚ࣆࢪ࢙ࢿࢸ࢕ࢵࢡᶵ⬟᥈⣴【目的】申請者はヒト DNA methyltransferase( DNMT )

杉

山

圭

一

ᮡ ᒣ ᆂ ୍
ルは対数増殖期における培養液を用いGreen fluorescentprotein( GFP )の蛍光強度( Excitation, 485 nm; Emission,
遺伝子形質転換酵母(ヒト DNMT 酵母)が凝集性を獲㓝ẕ FLO assay㸦DNMT㸧ࢆᇶ┙࡜ࡋࡓ┿⳦஧ḟ௦ㅰ⏘≀࠿ࡽࡢ࢚ࣆࢪ࢙ࢿࢸ࢕ࢵࢡᶵ⬟᥈⣴࠙┠ⓗࠚ⏦ㄳ⪅ࡣࣄࢺ DNA methyltransferase㌿෗ࣞ࣋ࣝࡣᑐᩘቑṪᮇ࡟࠾ࡅࡿᇵ㣴ᾮࢆ⏝࠸ Green535 nm )を指標とした FLO1 レポーターアッセイにより得し，凝集遺伝子 FLO1 遺伝子の mRNA レベルが亢進㑇ఏᏊᙧ㉁㌿᥮㓝ẕ㸦ࣄࢺ DNMT 㓝ẕ㸧ࡀจ㞟ᛶࢆ⋓ᚓ

fluorescent protein㸦GFP㸧ࡢ⺯ගᙉᗘ㸦Excitation, 485 nm;ᮡ ᒣ ᆂ ୍ࡋ㸪จ㞟㑇ఏᏊ FLO1 㑇ఏᏊࡢ mRNA ࣞ࣋ࣝࡀஹ㐍ࡋ

Emission, 535 nm㸧ࢆᣦᶆ࡜ࡋࡓ FLO1 ࣏࣮ࣞࢱ࣮࢔ࢵࢭ

࡚࠸ࡿࡇ࡜ࢆ᫂ࡽ࠿࡟ࡋ࡚࠸ࡿ㸬ࡲࡓ㸪ࡇࡢจ㞟ᛶࡣ࢚࢖࡟ࡼࡾ᳨ウࡋࡓ㸬

していることを明らかにしている．また，この凝集性は検討した．

【結果・考察】本研究では，まずはFLO assay の妥当性
エピドラッグでもある DNMT
阻害剤とヒストン脱アセ࠙┠ⓗࠚ⏦ㄳ⪅ࡣࣄࢺ DNA methyltransferase 㸦DNMT㸧㌿෗ࣞ࣋ࣝࡣᑐᩘቑṪᮇ࡟࠾ࡅࡿᇵ㣴ᾮࢆ⏝࠸ Greenを検証することを目的に，かび毒フモニシン
B1 のエピチル化酵素阻害剤に可逆的に応答し，エピジェネティッ
㑇ఏᏊᙧ㉁㌿᥮㓝ẕ㸦ࣄࢺ
DNMT 㓝ẕ㸧ࡀจ㞟ᛶࢆ⋓ᚓ
fluorescent protein㸦GFP㸧ࡢ⺯ගᙉᗘ㸦Excitation,
485 nm;ࣆࢻࣛࢵࢢ࡛ࡶ࠶ࡿ DNMT㜼ᐖ๣࡜ࣄࢫࢺࣥ⬺࢔ࢭࢳ࠙⤖ᯝ࣭⪃ᐹࠚᮏ◊✲࡛ࡣ㸪ࡲࡎࡣ
FLO assay ࡢጇᙜᛶジェネティック作用について予備的な検討を行なった．
ク制御下にあることも発見した．この酵母凝集性とࡋ㸪จ㞟㑇ఏᏊ FLO1 㑇ఏᏊࡢ mRNA ࣞ࣋ࣝࡀஹ㐍ࡋ
Emission, 535 nm㸧ࢆᣦᶆ࡜ࡋࡓ
FLO1 ࣏࣮ࣞࢱ࣮࢔ࢵࢭ
ࣝ໬㓝⣲㜼ᐖ๣࡟ྍ㏫ⓗ࡟ᛂ⟅ࡋ㸪࢚ࣆࢪ࢙ࢿࢸ࢕ࢵࢡࢆ᳨ドࡍࡿࡇ࡜ࢆ┠ⓗ࡟㸪࠿ࡧẘࣇࣔࢽࢩࣥ
B1 ࡢ࢚ࣆ
࡚࠸ࡿࡇ࡜ࢆ᫂ࡽ࠿࡟ࡋ࡚࠸ࡿ㸬ࡲࡓ㸪ࡇࡢจ㞟ᛶࡣ࢚࢖࡟ࡼࡾ᳨ウࡋࡓ㸬
その結果，培地中にフモニシン
B1 を添加することで，FLO1 遺伝子発現を指標に，微生物ベースのエピ変異原ไᚚୗ࡟࠶ࡿࡇ࡜ࡶⓎぢࡋࡓ㸬ࡇࡢ㓝ẕจ㞟ᛶ࡜
FLO1ࢪ࢙ࢿࢸ࢕ࢵࢡస⏝࡟ࡘ࠸࡚ணഛⓗ࡞᳨ウࢆ⾜࡞ࡗࡓ㸬ࣆࢻࣛࢵࢢ࡛ࡶ࠶ࡿ1DNMT࠙⤖ᯝ࣭⪃ᐹࠚᮏ◊✲࡛ࡣ㸪ࡲࡎࡣ
FLO assay ࡢጇᙜᛶ
酵母凝集性がフモニシン
B1 の濃度依存的に促進される
検出系「FLO assay 」を構築した(図)． 㜼ᐖ๣࡜ࣄࢫࢺࣥ⬺࢔ࢭࢳ㑇ఏᏊⓎ⌧ࢆᣦᶆ࡟㸪ᚤ⏕≀࣮࣋ࢫࡢ࢚ࣆኚ␗ཎ᳨ฟ⣔ࡑࡢ⤖ᯝ㸪ᇵᆅ୰࡟ࣇࣔࢽࢩࣥ
B1 ࢆῧຍࡍࡿࡇ࡜࡛㸪ࣝ໬㓝⣲㜼ᐖ๣࡟ྍ㏫ⓗ࡟ᛂ⟅ࡋ㸪࢚ࣆࢪ࢙ࢿࢸ࢕ࢵࢡࢆ᳨ドࡍࡿࡇ࡜ࢆ┠ⓗ࡟㸪࠿ࡧẘࣇࣔࢽࢩࣥ
B1 ࡢ࢚ࣆ
ࠕFLO assayࠖࢆᵓ⠏ࡋࡓ㸦ᅗ1㸧㸬㓝ẕจ㞟ᛶࡀࣇࣔࢽࢩࣥ
B1 ࡢ⃰ᗘ౫Ꮡⓗ࡟ಁ㐍ࡉࢀࡿ
可能性を認めた．発がん性が懸念されるかび毒オクラトไᚚୗ࡟࠶ࡿࡇ࡜ࡶⓎぢࡋࡓ㸬ࡇࡢ㓝ẕจ㞟ᛶ࡜
FLO1ࢪ࢙ࢿࢸ࢕ࢵࢡస⏝࡟ࡘ࠸࡚ணഛⓗ࡞᳨ウࢆ⾜࡞ࡗࡓ㸬
DNMT㓝ẕ
ϐηφϱ୦ΠιοϩԿ
DNMT૏֒ࡐ
ྍ⬟ᛶࢆㄆࡵࡓ㸬Ⓨࡀࢇᛶࡀᠱᛕࡉࢀࡿ࠿ࡧẘ࢜ࢡࣛࢺ߮ો૏֒ࡐ
キシン A やシトリニンと同様に，フモニシン B1 につい㑇ఏᏊⓎ⌧ࢆᣦᶆ࡟㸪ᚤ⏕≀࣮࣋ࢫࡢ࢚ࣆኚ␗ཎ᳨ฟ⣔ࡑࡢ⤖ᯝ㸪ᇵᆅ୰࡟ࣇࣔࢽࢩࣥ B1 ࢆῧຍࡍࡿࡇ࡜࡛㸪࢟ࢩࣥ A ࡸࢩࢺࣜࢽࣥ࡜ྠᵝ࡟㸪ࣇࣔࢽࢩࣥ
B1 ࡟ࡘ࠸
ても毒性として発がん性が懸念されている．予備試験結ࠕFLO assayࠖࢆᵓ⠏ࡋࡓ㸦ᅗ 1㸧㸬㓝ẕจ㞟ᛶࡀࣇࣔࢽࢩࣥ B1 ࡢ⃰ᗘ౫Ꮡⓗ࡟ಁ㐍ࡉࢀࡿ࡚ࡶẘᛶ࡜ࡋ࡚Ⓨࡀࢇᛶࡀᠱᛕࡉࢀ࡚࠸ࡿ㸬ணഛヨ㦂⤖
DNMT㓝ẕ
ϐηφϱ୦ΠιοϩԿ
DNMT૏֒ࡐ
果ではあるものの，
フモニシン B1 の発がん性にエピジェྍ⬟ᛶࢆㄆࡵࡓ㸬Ⓨࡀࢇᛶࡀᠱᛕࡉࢀࡿ࠿ࡧẘ࢜ࢡࣛࢺ߮ો૏֒ࡐᯝ࡛ࡣ࠶ࡿࡶࡢࡢ㸪ࣇࣔࢽࢩࣥ B1 ࡢⓎࡀࢇᛶ࡟࢚ࣆࢪ
ネティック作用が関与する可能性と，FLO
assay の妥当
࢟ࢩࣥ A ࡸࢩࢺࣜࢽࣥ࡜ྠᵝ࡟㸪ࣇࣔࢽࢩࣥ B1 ࡟ࡘ࠸࢙ࢿࢸ࢕ࢵࢡస⏝ࡀ㛵୚ࡍࡿྍ⬟ᛶ࡜㸪FLO assay ࡢጇᙜ࡚ࡶẘᛶ࡜ࡋ࡚Ⓨࡀࢇᛶࡀᠱᛕࡉࢀ࡚࠸ࡿ㸬ணഛヨ㦂⤖性を支持する結果が今回得られたと考える．
ᛶࢆᨭᣢࡍࡿ⤖ᯝࡀ௒ᅇᚓࡽࢀࡓ࡜⪃࠼ࡿ㸬‫ݩࢾॄڿ‬
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B1 ࡢⓎࡀࢇᛶ࡟࢚ࣆࢪ
FLO1
次に，振とう培養から静置培養に変更した場合のFLO
GFP
promoterḟ࡟㸪᣺࡜࠺ᇵ㣴࠿ࡽ㟼⨨ᇵ㣴࡟ኚ᭦ࡋࡓሙྜࡢ FLO࢙ࢿࢸ࢕ࢵࢡస⏝ࡀ㛵୚ࡍࡿྍ⬟ᛶ࡜㸪FLO assay ࡢጇᙜ
FLO1 レポーターアッセイを指標に検討
assay の感度を，)/2DVVD\
assay ࡢឤᗘࢆ㸪FLO1
࣏࣮ࣞࢱ࣮࢔ࢵࢭ࢖ࢆᣦᶆ࡟᳨ウ＋ ‫ݩࢾॄڿ‬‫ॄڿ‬ᛶࢆᨭᣢࡍࡿ⤖ᯝࡀ௒ᅇᚓࡽࢀࡓ࡜⪃࠼ࡿ㸬
したところ，静置培養において同等以上の感度が得られ
FLO1
GFPࡋࡓ࡜ࡇࢁ㸪㟼⨨ᇵ㣴࡟࠾࠸࡚ྠ➼௨ୖࡢឤᗘࡀᚓࡽࢀ
promoterḟ࡟㸪᣺࡜࠺ᇵ㣴࠿ࡽ㟼⨨ᇵ㣴࡟ኚ᭦ࡋࡓሙྜࡢ FLO
FLO1

FLO1

FLO1

FLO1

FLO1

FLO1

る可能性を認めた．本結果は，FLO
assay の簡便さを高ࡿྍ⬟ᛶࢆㄆࡵࡓ㸬ᮏ⤖ᯝࡣ㸪
FLO assay ࡢ⡆౽ࡉࢆ㧗ࡵ
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assay
ࡢឤᗘࢆ㸪FLO1࣏࣮ࣞࢱ࣮࢔ࢵࢭ࢖ࢆᣦᶆ࡟᳨ウ
めハイスループット性の向上に繋がるものと期待できる．
ࣁ࢖ࢫ࣮ࣝࣉࢵࢺᛶࡢྥୖ࡟⧅ࡀࡿࡶࡢ࡜ᮇᚅ࡛ࡁࡿ㸬ࡋࡓ࡜ࡇࢁ㸪㟼⨨ᇵ㣴࡟࠾࠸࡚ྠ➼௨ୖࡢឤᗘࡀᚓࡽࢀ

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‫ॄڿ‬ն┿⳦ࡢ஧ḟ௦ㅰ⏘≀࠿ࡽ࢚ࣆࢪ࢙ࢿࢸ࢕ࢵࢡస⏝ࢆ♧
真菌の二次代謝産物からエピジェネティック作用を示ࡿྍ⬟ᛶࢆㄆࡵࡓ㸬ᮏ⤖ᯝࡣ㸪FLO assay ࡢ⡆౽ࡉࢆ㧗ࡵࡢ࠿ࡃ஘ࡣ㸪DNA ࣓ࢳࣝ໬ࡸࣄࢫࢺࣥಟ㣭㸪ࡲࡓࡑࢀࡽࡍ໬Ꮫ≀㉁ࡢྠᐃ࡟ࡘ࠸࡚ࡣ㸪ᕷ㈍ࡉࢀ࡚࠸ࡿྠ௦ㅰ⏘ᅗ 1 DNMT㓝ẕ࡜ FLO assayࣁ࢖ࢫ࣮ࣝࣉࢵࢺᛶࡢྥୖ࡟⧅ࡀࡿࡶࡢ࡜ᮇᚅ࡛ࡁࡿ㸬
す化学物質の同定については，市販されている同代謝産
エピ変異原により誘発されるエピジェネティック制御ಟ㣭࡟㐃ືࡍࡿࢡ࣐ࣟࢳࣥᵓ㐀࡟ᙳ㡪ࢆ୚࠼ࡿ࡜ண᝿ࡉ
≀⩌ࢆ⿕᳨≀㉁࡜ࡋ࡚㸪ࡑࢀࡽࢆFLO assay ࡟౪ヨࡋ࢚FLO assay に供試しエ࢚ࣆኚ␗ཎ࡟ࡼࡾㄏⓎࡉࢀࡿ࢚ࣆࢪ࢙ࢿࢸ࢕ࢵࢡไᚚ
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物群を被検物質として，それらをのかく乱は，DNAメチル化やヒストン修飾，またそれࡢ࠿ࡃ஘ࡣ㸪DNA ࣓ࢳࣝ໬ࡸࣄࢫࢺࣥಟ㣭㸪ࡲࡓࡑࢀࡽ

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ピジェネティック作用のスクリーニングを行なった．ス
ら修飾に連動するクロマチン構造に影響を与えると予想ಟ㣭࡟㐃ືࡍࡿࢡ࣐ࣟࢳࣥᵓ㐀࡟ᙳ㡪ࢆ୚࠼ࡿ࡜ண᝿ࡉ
FLO assay ࡟౪ヨࡋ࢚࡝ࢆ௓ࡋ࡚Ⓨࡀࢇࢆಁ㐍ࡍࡿ࡜⪃࠼ࡽࢀ࡚࠸ࡿ㸬ᐇ㝿࡟㸪ࢡ࣮ࣜࢽࣥࢢ࡟ࡣ㸪≀⩌ࢆ⿕᳨≀㉁࡜ࡋ࡚㸪ࡑࢀࡽࢆFLO assay ࡜ࡋ࡚ࣁ࢖ࢫ࣮ࣝࣉࢵࢺᛶ

される．したがって，エピ変異原はプロモーション作用

クリーニングには，FLO assay としてハイスループットࢀࡿ㸬ࡋࡓࡀࡗ࡚㸪࢚ࣆኚ␗ཎࡣࣉ࣮ࣟࣔࢩࣙࣥస⏝࡞ࣆࢪ࢙ࢿࢸ࢕ࢵࢡస⏝ࡢࢫࢡ࣮ࣜࢽࣥࢢࢆ⾜࡞ࡗࡓ㸬ࢫ┿⳦஧ḟ௦ㅰ⏘≀ࡢ࠺ࡕ㸪Ⓨࡀࢇᛶ࡞࡝ẘᛶࢆ᭷ࡍࡿྍ
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FLO1 㑇ఏᏊⓎ⌧ࢆᣦᶆ࡜ࡋࡓ

FLO1 遺伝子発現を指標とし性に優れている静置培養となどを介して発がんを促進すると考えられている．実際࡝ࢆ௓ࡋ࡚Ⓨࡀࢇࢆಁ㐍ࡍࡿ࡜⪃࠼ࡽࢀ࡚࠸ࡿ㸬ᐇ㝿࡟㸪ࢡ࣮ࣜࢽࣥࢢ࡟ࡣ㸪FLO assay ࡜ࡋ࡚ࣁ࢖ࢫ࣮ࣝࣉࢵࢺᛶ
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FLO1 ࣏࣮ࣞࢱ࣮άᛶࢆ⏝࠸ࡓ㸬ࡑࡢ⤖ᯝ㸪౪ヨࡋࡓ┿⳦

た FLO1
レポーター活性を用いた．その結果，供試したに，真菌二次代謝産物のうち，発がん性など毒性を有す┿⳦஧ḟ௦ㅰ⏘≀ࡢ࠺ࡕ㸪Ⓨࡀࢇᛶ࡞࡝ẘᛶࢆ᭷ࡍࡿྍ
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FLO1 㑇ఏᏊⓎ⌧ࢆᣦᶆ࡜ࡋࡓ

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FLO1 ࣏࣮ࣞࢱ࣮άᛶࢆ⏝࠸ࡓ㸬
真菌の二次代謝産物
23 剤のうち，約30％の 7 剤がエピる可能性のある化学物質はかび毒と総称されるが，申請ኚ␗ཎ᳨ฟ⣔ࠕFLO assayࠖ࡟ࡼࡾⓎࡀࢇᛶࡀᠱᛕࡉࢀࡿ
ࢿࢸ࢕ࢵࢡస⏝ࢆ♧ࡍྍ⬟ᛶࢆㄆࡵࡓ㸦ᅗ2㸧㸬 ࡑࡢ⤖ᯝ㸪౪ヨࡋࡓ┿⳦㓝ẕจ㞟཯ᛂࢆᣦᶆ࡟⊂⮬㛤Ⓨࡋࡓ࢚ࣆࢪ࢙ࢿࢸ࢕ࢵࢡ
ࡢ஧ḟ௦ㅰ⏘≀ 23 ๣୰ࡢ࠺ࡕ⣙ 30㸣ࡢ 7 ๣ࡀ࢚ࣆࢪ࢙ 2 )ジェネティック作用を示す可能性を認めた(図．
者は，酵母凝集反応を指標に独自開発したエピジェネ࠿ࡧẘ࠿ࡽ࢚ࣆࢪ࢙ࢿࢸ࢕ࢵࢡస⏝ࡢ᳨ฟ࡟ᡂຌࡋ࡚࠸
ኚ␗ཎ᳨ฟ⣔ࠕFLO assayࠖ࡟ࡼࡾⓎࡀࢇᛶࡀᠱᛕࡉࢀࡿ
ティック変異原検出系「FLO assay 」により発がん性がࡿ㸬ࡇࡢࡼ࠺࡞⫼ᬒࡢඖ㸪ᮏ◊✲ㄢ㢟࡟࠾࠸࡚ࡣ㸪FLO
真菌二次࠿ࡧẘ࠿ࡽ࢚ࣆࢪ࢙ࢿࢸ࢕ࢵࢡస⏝ࡢ᳨ฟ࡟ᡂຌࡋ࡚࠸
代謝産物群

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懸念されるかび毒からエピジェネティック作用の検出にࢿࢸ࢕ࢵࢡస⏝ࢆ♧ࡍྍ⬟ᛶࢆㄆࡵࡓ㸦ᅗ 2㸧
㸬
FLO
assay

（23剤）
ࡿ㸬ࡇࡢࡼ࠺࡞⫼ᬒࡢඖ㸪ᮏ◊✲ㄢ㢟࡟࠾࠸࡚ࡣ㸪FLO≀㉁ࡢ᥈⣴ࢆ┠ⓗ࡟┿⳦ࡢ஧ḟ௦ㅰ⏘≀࠿ࡽ࢚ࣆࢪ࢙ࢿ
成功している．このような背景の元，本研究課題においエピジェネティック
修飾剤候補
（7剤）
FLO
assay

真菌二次
代謝産物群
（23剤）
ᅗ 2 FLO assay ࡟ࡼࡿࢫࢡ࣮ࣜࢽࣥࢢ⤖ᯝ

assay ࢆᢏ⾡ⓗ࢔ࢻࣂࣥࢸ࣮ࢪ࡜ࡋ࡚㸪࢚ࣆࢻࣛࢵࢢೃ⿵

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ては，FLO
assay を技術的アドバンテージとして，
エピド≀㉁ࡢ᥈⣴ࢆ┠ⓗ࡟┿⳦ࡢ஧ḟ௦ㅰ⏘≀࠿ࡽ࢚ࣆࢪ࢙ࢿ

エピジェネティック
修飾剤候補
（7剤）

࠙᪉ἲࠚࣄࢺ DNMT 㓝ẕ࡟ࡣ㸪DNA ⥔ᣢ࣓ࢳࣝ໬㓝⣲௨ୖ㸪୍㐃ࡢ◊✲࠿ࡽ㸪FLO assay ࡣ┿⳦ࡢ஧ḟ௦ㅰ⏘
ラッグ候補物質の探索を目的に真菌の二次代謝産物からࢸ࢕ࢵࢡస⏝ࢆ♧ࡍ໬Ꮫ≀㉁ࡢྠᐃࢆヨࡳࡓ㸬
FLOassay
assay ࡟ࡼࡿࢫࢡ࣮ࣜࢽࣥࢢ⤖ᯝ
図 2ᅗ 2
FLO
によるスクリーニング結果
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௨ୖ㸪୍㐃ࡢ◊✲࠿ࡽ㸪FLO assay ࡣ┿⳦ࡢ஧ḟ௦ㅰ⏘࣑ࢻࢆฟⱆ㓝ẕ Saccharomyces
cerevisiae
YPH250ᰴ࡟ྠ࣮ࢽࣥࢢ࡛ࡁࡿྍ⬟ᛶࡀ࠶ࡿ࡜⪃࠼ࡽࢀࡓ㸬௒ᚋࡣ㸪ࡇ
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࠙᪉ἲࠚࣄࢺ DNMT 㓝ẕ࡟ࡣ㸪DNA ⥔ᣢ࣓ࢳࣝ໬㓝⣲
エピジェネティック作用を示す化学物質の同定を試みた．

【方法】ヒト DNMT 酵母には，DNA 維持メチル化酵素

以上，一連の研究から，FLO assay は真菌の二次代謝

᫬ᙧ㉁㌿᥮ࡋࡓᰴࢆ౑⏝ࡋࡓ㸬ᇵ㣴࡟⏝࠸ࡓᇵᆅࡣ
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ࢀࡽ FLO
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YPH250ᰴ࡟ྠ࣮ࢽࣥࢢ࡛ࡁࡿྍ⬟ᛶࡀ࠶ࡿ࡜⪃࠼ࡽࢀࡓ㸬௒ᚋࡣ㸪ࡇ
産物からエピジェネティック作用を示す化学物質をスク
DNMT1 と新規メチル化酵素
DNMT3B 遺伝子発現プラᇵᆅ㸦᭱ᑡᇵᆅ㸧ࢆ⏝࠸30ºC࡟࡚ᇵ㣴ࡋࡓ㸬จ㞟ᛶࡢᰝࡋࡓ࠺࠼࡛ศᏊ࣓࢝ࢽࢬ࣒ゎᯒࢆ㐍ࡵ㸪࢚ࣆࢻࣛࢵࢢ
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ࢀࡽ FLO assay 㝧ᛶ≀㉁ࡢ࢚ࣆࢪ࢙ࢿࢸ࢕ࢵࢡస⏝ࢆ⢭

Saccharomyces cerevisiae YPH250 株にリーニングできる可能性があると考えられた．今後は，スミドを出芽酵母☜ㄆࡣᐃᖖᮇึᮇࡢᇵ㣴ᾮ࡛⾜࡞ࡗࡓ㸬FLO1 㑇ఏᏊࡢ࡜ࡋ࡚ࡢྍ⬟ᛶࢆ᥈ࡾࡓ࠸㸬ᇵᆅ㸦᭱ᑡᇵᆅ㸧ࢆ⏝࠸ 30 ºC ࡟࡚ᇵ㣴ࡋࡓ㸬จ㞟ᛶࡢᰝࡋࡓ࠺࠼࡛ศᏊ࣓࢝ࢽࢬ࣒ゎᯒࢆ㐍ࡵ㸪࢚ࣆࢻࣛࢵࢢ

これら࡜ࡋ࡚ࡢྍ⬟ᛶࢆ᥈ࡾࡓ࠸㸬FLO assay 陽性物質のエピジェネティック作用を同時形質転換した株を使用した．培養にはSD 培地(最☜ㄆࡣᐃᖖᮇึᮇࡢᇵ㣴ᾮ࡛⾜࡞ࡗࡓ㸬FLO1 㑇ఏᏊࡢ少培地)を用い30 ℃にて培養した．凝集性の確認は定ᡤᒓ ᅜ❧་⸆ရ㣗ရ⾨⏕◊✲ᡤኚ␗㑇ఏ㒊 E-mail: sugiyama@nihs.go.jp

精査したうえで分子メカニズム解析を進め，エピドラッ                                             1

ᡤᒓ ᅜ❧་⸆ရ㣗ရ⾨⏕◊✲ᡤኚ␗㑇ఏ㒊 E-mail: sugiyama@nihs.go.jp
グとしての可能性を探りたい．
常期初期の培養液で行なった．FLO1
遺伝子の転写レベ                                             1

所属

国立医薬品食品衛生研究所 変異遺伝部

E-mail: sugiyama@nihs.go.jp－ 166 －

IFO Res.Commun. 362022

発酵食品中の微生物間相互作用を仲介する酵母プリオン様因子+[GAR ] の作用機序に関する研究
渡

辺

大

輔

【目的】伝統的発酵食品の製造において，酵母と乳酸菌が抑制されていた．以上の結果から，[GAR +]により酵の共存が広く認められており，その際，酵母が推定上の母のグルコースシグナル伝達の鍵を握る転写コリプレッ

プリオン[GAR +]の働きを介して炭素代謝プロファイル

サー複合体 Cyc8p-Tup1p 複合体の機能が欠損する可能を変化させることが明らかにされている．その結果，毒性が示唆された．Cyc8p-Tup1p 複合体は，グルコース抑性の高いエタノールの産生が抑えられ，酵母と乳酸菌の制を司る Mig1p や，ヘキソーストランスポーターの発相利共生に貢献する．本研究では，本現象に関わる作用

現抑制に必須な Rgt1p，Hog1p 下流遺伝子の発現調節に機序を分子レベルで理解し，発酵食品中の微生物間相互関与する Sko1p などと相互作用し，グルコースに応答

作用の新たな意義を探ることを目的とする．

する遺伝子発現をグローバルに制御している．Cyc8p お【方法】酵母プリオン様因子[GAR +]の分子的実体に関

よ び Tup1p は い ず れ も プ リ オ ン の 形 成 に 必 須 な QN-する手掛かりを得るため，RNA-seq によるトランスクリ

リッチドメインを有することから，乳酸菌との共存によ

プトーム解析を実施した．酵母 Saccharomyces cerevisiae

りこれらの酵母タンパク質がプリオンを形成し本来の転X2180 株を親株([gar-]株)とし，[GAR +]を形成した写調節機能を欠損するというモデルが考えられた株が選択的に生育可能となる YPGly + GlcN 寒天培地上(図 1 )．Cyc8p または Tup1p の機能欠損によりアルコー

で自発的にコロニーを形成した株([GAR +]株)を解析

ル発酵力が低下したことからも，[GAR +]との関連が支に用いた．
[gar ]株および[GAR ]株を，非発酵性炭素持された．以上の結果を通して，酵母と乳酸菌の相利共源であるグリセロールを単一炭素源とする YPGly 培地

生に関与する新規微生物間相互作用の標的因子の候補をで対数増殖期まで生育させた後，グルコースアナログで明らかにすることができた．今後は，乳酸菌との共培養あるグルコサミンを終濃度 0.05％となるように添加し，による酵母 Cyc8p-Tup1p 複合体の状態変化とその作用

3 時間培養した．グルコサミン添加前後の細胞からトー機序をさらに調べていく必要がある．Tup1p は，酵母かタル RNA を抽出し，RNA-seq 解析に供した．

らヒトに至るまで真核生物に広く保存されていることか【結果・考察】[gar ]株と[GAR ]株の遺伝子発現プロ

ら，原核-真核生物間相互作用において中心的な役割を

ファイルを比較した結果，以下の 3 つの傾向が見出され果たす重要な因子かもしれない．本研究成果は，我々のた．(I)通常，酵母はグルコースに応答してグルコース

生活に深く根付いた発酵食品内の微生物間相互作用の分以外の炭素源の利用に関連する遺伝子の発現を抑制する

子メカニズムを解明するための重要な手掛かりになると(グルコース抑制)．本研究で用いた[gar-]株においても，期待される．

-+-+

グルコースアナログの添加により，スクロースを分解するインベルターゼ Suc2p，マルトースを分解するマル
ターゼ Mal32p，エタノール資化に用いられるアルコー
ルデヒドロゲナーゼ Adh2p などをコードする遺伝子の発現レベルが顕著に低下した．これに対し，[GAR +]株
ではグルコース抑制が部分的に解除されていた．(II)グ
ルコースを細胞内に取り込むヘキソーストランスポー
ターのうち，Hxt3p や Hxt4p をコードする遺伝子はグル
コースにより発現が誘導される．
[GAR +]株では，グル
コースアナログの添加の有無に関わらず両遺伝子ともに高い発現レベルを示し，グルコース誘導性が失われていた．(III)[gar-]株では，グルコースアナログの添加により，浸透圧ストレス応答のマスターレギュレーターである Hog1p プロテインキナーゼの下流遺伝子の発現レベルが上昇したが，[GAR ]株ではこの遺伝子発現誘導
+

所属

図1

Cyc8p-Tup1p 複合体を介した酵母と乳酸菌の相利共生に関するモデル

京都大学大学院農学研究科，現 奈良先端科学技術大学院大学先端科学技術研究科－ 167 －

E-mail: watanabe.daisuke@bs.naist.jp

IFO Res.Commun. 362022

柑橘類の優れた芳香族化合物生産能を利用した酵母によるtrans - ケイ皮酸の発酵生産
大【目的】油性担子菌酵母 Rhodotorula toruloides は，乾燥

橋

貴

生

菌体重量辺り 70％近くの中性脂肪を貯める油性酵母とCsPAL1，CsPAL3 および CsPAL4 遺伝子断片を PCR 増
幅した調製した遺伝子断片を酢酸リチウム法によりして知られており，バイオディーゼル生産，バイオプラ

NBRC0559 株に導入し，PAL 遺伝子過剰発現形質転換体

スチック生産，カロテノイドなどの有用物質の生産宿主を得た．本形質転換法では，遺伝子断片が非相同末端結として，近年多くの研究成果が報告されている．遺伝子合により，酵母染色体上にランダムに挿入される．その工学技術も拡充しつつあり，2017 年には簡便な形質転ため，遺伝子断片が挿入された染色体上の位置により，換技術も開発された．trans -ケイ皮酸( tCA )は最も高遺伝子発現に影響がでることが予想されたため，酵母コ

耐熱なバイオプラスチックであるポリイミドモノマーのロニー PCR により，各断片が導入された形質転換体を前駆体として，またフラボノイド生合成前駆体として非5 株ずつ単離し，以降の tCA 生産実験に用いた．各形質

常に有用である．そこで高い脂溶性化合物生産ポテン

転 換 体 を YM 培 地 で 培 養 し，1 日 後 に 菌 体 を 回 収 し，

シャルに着目し，油性酵母 R. toruloides を tCA の発酵生

tCA 生産量を調査した(図 1 左)．PAL 過剰発現株群では，産宿主として利用することにした．

コントロール株である Shble 導入株と比較して約 3 倍程

フラボノイドを多量に蓄積する柑橘系植物は tCA を度生産量が増加していたものの，0.40 mg/L であった．

合成する酵素としてフェニルアラニンアンモニアリアー

さらに tCA 生産量を亢進するため，菌の生育に依存

ゼ( PAL )の高生産活性を持つことが期待される．本しない休止菌体を生体触媒として用いた tCA 生産を試研究では，柑橘系植物であるオレンジ( Citrus sinensis )みた．休止菌体と Phe を混合し反応させたところ，tCA

由 来 の PAL 遺 伝 子 を R. toruloides に 異 種 発 現 さ せ て，生産量は大幅に亢進され，PAL 遺伝子発現株においてtCA を生産することを試みた．

29 - 34 mg/mL の生産量を示した(図 1 右)．Shble 導入株【 方 法 】3 種 類 の オ レ ン ジ 由 来 PAL 遺 伝 子( CsPAL1，と各 PAL 遺伝子発現株の平均での比較においても，PAL

CsPAL3，CsPAL4 )，高活性が報告されている放線菌由来 SmEncP 遺 伝 子 を R. toruloides 由 来 高 発 現 プ ロ モ ー

遺伝子発現株において，tCA 生産量はそれぞれ 4.6 - 5.3ターの下流に連結し，酵母発現ベクターを構築した．R.

Phe 含有脂質生産用 MinRL3 培地を用いることで YM 培

toruloides NBRC0559 株 に こ れ ら の PAL 遺 伝 子 発 現 カ
セットを導入し，PAL 発現形質転換体を作成した．形質地の場合の 80 - 172 倍の生産量を達成することができた．

転換体を YM 培地で培養し，菌の増殖に依存しない休止せることにより，最大 34 mg/L の tCA 生産を達成する

倍の上昇が見られた(図 1 )．PAL 遺伝子発現静止菌体と油性酵母 R. toruloides に異種 PAL 遺伝子を過剰発現さ菌体を調製し，L -フェニルアラニン( Phe)を含有することに成功した．この成果は，本酵母の tCA 生産宿主

MinRL3 培地で培養し，tCA 生産を行った．懸濁培養液としてのポテンシャルを証明しており，今後の本酵母をを採取し，等量のメタノールを添加して反応を停止させ利用したフラボノイドやポリイミドモノマー生産のためた．反応停止後に遠心分離を行って得た上清を用いて，の基盤となる．

逆相 HPLC 分析を行い，tCA の定量を行った．
【結果・考察】R. toruloides において，1 kb 以上の遺伝子を過剰発現させる際に，イントロンを含まない cDNAを用いるとほとんど発現されないことが分かっていた．
一方で，イントロン除去に関わるスプライシング機構は生物種により少しずつ異なるため，柑橘系植物のゲノム由来配列を用いた場合に，効率的にイントロンが除去されない懸念があった．そこで，本研究ではプロモーター
領域にイントロンを持つ高発現プロモーターの下流にPAL 遺伝子を連結し，異種発現させることにした．
Shble 遺 伝 子，Shble 遺 伝 子 を 連 結 し た SmEncP，
所属

摂南大学理工学部

E-mail: takao.ohashi@lif.setsunan.ac.jp－ 168 －

図1

PAL 遺伝子発現株の tCA 生産量

IFO Res.Commun. 36
2022

Nrf2/SKN-1 制御系を活性化する乳酸菌体成分の探索と長寿機構の解明
小【目的】我が国は長寿大国であるものの高齢化に伴い認

村

智

美

【結果・考察】乳酸菌を線虫に与えると，線虫の寿命が知症など加齢性疾患の罹患数が増加の一途を辿り，老化有意に延長した．また加齢に伴う運動機能低下抑制に関する課題も多い．そこで当研究室では，乳酸菌など(図 1 )や化学走性低下抑制を有意に示した．これらの食品微生物を介して老化や加齢性疾患を制御できる可能

作用機序の一端を解明するために，skn-1 変異型線虫を性に着目している．動物実験を行う場合，一般的にマウ用いて解析したところ，skn-1 変異型線虫に乳酸菌を与スやラットを用いるものの長期の実験期間を要し，動物

えると寿命延長が消失し，化学走性低下の改善も認めら愛護の観点から代替法を考慮した実験が望まれる．

れなかった．これらのことから，乳酸菌を摂取した線虫

そ こ で 本 研 究 は モ デ ル 生 物 の 一 種 Caenorhabditis

は，skn-1 を介して寿命延長や化学走性低下を抑制する

elegans(線虫)を用いて，乳酸菌投与が宿主の寿命に及ぼす影響と寿命制御機構の一端を解明することを目的とことが示唆された．

した．

満効果などの機能性を有している．そこで乳酸菌から菌乳酸菌が産生する菌体外多糖は，免疫賦活作用や抗肥特に，宿主の抗炎症や抗酸化，解毒代謝に関わるスト

体外多糖を抽出し，リポソームを用いて線虫に経口投与

レス応答性転写因子 SKN-1(哺乳類では Nrf2 に対応)

し生存分析を実施した．生存分析 3 回の p 値は 0.422，に着目し，SKN-1 が線虫の寿命延長に関わるのか否か検0.054，0.009 であり，菌体給餌時よりも寿命延長率は低証を行った．また乳酸菌の有効な菌体成分の探索を試み

く菌体外多糖以外の成分も寿命制御に関与することが考た．さらに哺乳細胞を用いて乳酸菌における Nrf2 活性

えられる．そこで乳酸菌の有効成分を網羅的に探索する化を検証することで，哺乳類へ応用できる可能性を探る

ため，乳酸菌にトランスポゾンを挿入したランダム変異こととした．

株を作製し，線虫を用いたレポーターアッセイを試みた【方法】まず乳酸菌を与えた野生型線虫における生存分が，現在のところ寿命制御する変異株の同定には至って

析と運動性，化学走性を調べた．運動性は 4 段階(A～D )いない．今後も変異株を用いて探索を続ける予定である．

評価し，経日的に観察した．A は自発運動を行っていた

マウスマクロファージ様細胞株に乳酸菌または菌体外

線虫，B は自発運動できないが線虫用ピッカーで尾部を多糖を処理すると，Nrf2 標的遺伝子 HO-1 の発現上昇がつつくと前後に動き出す線虫，C はピッカーで尾部をつ認められた．

ついても動き出すことなく頭部あるいは尾部のみ動かす

以上のことから乳酸菌および菌体外多糖は，宿主の線虫，D は死亡と判定した線虫，以上 4 評価に分けて記

Nrf2 を活性化することで，長寿や抗老化作用に関わる録した．化学走性は，線虫が好む匂いの方へ寄り付く行ことが考えられる．

動のことをいう．線虫飼育培地に線虫が好む芳香族アルデヒドまたは，その溶媒のエタノールをスポットした．
そして培地中央に線虫をおき，芳香族アルデヒドへ誘引される線虫の割合を評価した．
乳酸菌摂取における線虫の作用機序解明のために，
skn-1 を欠如させた変異型線虫を用いて，上記同様の生
存分析および化学走性を実施した．寿命制御に寄与する
菌体成分の探索は，乳酸菌の菌体成分の抽出を行い，線虫の寿命に与える影響を調べた．また乳酸菌にトランス
ポゾンを挿入した変異株の作製とアッセイ系の開発を試みた．
哺乳細胞を用いた乳酸菌における Nrf2 活性化有無は，
マウスマクロファージ様細胞株 J774.1 用いた Nrf2 制御
遺伝子 HO-1 の発現量を測定した．

所属

図1

奈良女子大学 研究院生活環境科学系，現 兵庫県立大学 環境人間学部－ 169 －

線虫の加齢に伴う運動性

E-mail: komuratomomi@gmail.com

IFO Res.Commun. 362022

進化解析に基づく高機能 PET 加水分解酵素の創出
吉

田

昭

介

【目的】ペットボトルや繊維などに利用されるポリエチ

C239A 変異を含む変異体を除き，野生型と同等であった

レンテレフタレート(PET)は生分解性が低いため，環(図 2 b )．LCC に PETase 由来アミノ酸を導入した変異

境中に蓄積し，生態系や景観の破壊を引き起こしている．

体のうち，F243S 変異体( L-F243S)は，PET 加水分

申請者らは，PET 分解・代謝細菌 Ideonella sakaiensis を解活性が野生型と比べ 3.5 倍，PET 特異性が 4.1 倍向上

発見し，本菌が有するユニークな PET 加水分解酵素

し た( 図 2 c )．4 残 基 す べ て を 置 換 し た LCC 変 異 体

PETase を同定した(Yoshida et al., Science, 2016)．細菌

( L-H164W/A207C/A244C/F243S) は，PET 加 水 分 解

由来の PET 加水分解性酵素(PHE)は系統的に 3 つのグ

活性は 54％まで低下したが，PET 特異性は 62 倍と顕著

ループに分かれる(図 1 )．Type IIb に属する PETaseに増加した．いずれもわずかな耐熱性の低下が認められは Type I 酵素と比べ，高い分解活性と基質特異性を示た． ま た，L-A207C/A244C 変 異 体 と 比 べ，L-H164W/

す一方で，耐熱性が低く，利用への障害となっている．

A207C/A244C/F243S 変異体で顕著な分子内ジスルフィ

本研究では，Type I 酵素の安定骨格に PETase 由来アミド結合の増加が認められたことから，A207C-A244C 間ノ酸を導入することで，高活性と高安定性を併せ持つ酵のジスルフィド結合は H164W/F243S 変異により促進さ素の創出を目指した．

れたと考えられた．以上の結果から，PETase の活性部
位周辺に認められる固有のアミノ酸が高い PET 加水分
解活性や PET 基質特異性に貢献していることが明らかとなった．これを利用し，耐熱性 Type I 酵素に高い PET
分解活性と PET 特異性を付与しうることが示された．

図 1 PHE の進化系統樹
葉部分は酵素の由来生物を示す．

【方法】Type IIb 酵素と Type I 酵素のアライメントおよび結晶構造の重ね合わせにより見いだされる活性部位周辺の 4 つの非相同なアミノ酸残基( PETase において，
W159, S238, C203, C239 )に着目した．これら 4 つのアミノ酸を PET 加水分解能を有する耐熱性クチナーゼ
LCC(Type I)の相同部位に単独，複数置換導入した変異体を作成した．また，LCC における同部位のアミノ酸
を PETase にも置換導入した．これら変異体の PET 分
解活性，脂肪酸エステル分解活性，耐熱性を調べた．タ
ンパク質の分子内ジスルフィド結合は，DT T 存在/非存

図2

在下で熱処理し，SDS-PAGE で分離することで調べた．
【結果・考察】PETase に LCC 由来アミノ酸を導入した
変異体は総じて，PET 分解活性が低下した(図 2 a )．
一方で，脂肪酸エステルに対する分解活性は，C203A/
所属

奈良先端科学技術大学院大学 研究推進機構/バイオサイエンス領域－ 170 －

PETase，LCC，およびそれらの変異体の PET 加水分解活性と特異性．
(a)PET 加水分解活性(b)パラ
ニトロフェノール(pNP)- 脂肪酸エステルに対する加水分活性 C2, pNP-acetate;C4, pNP-butyrate;C6,
pNP-caproate;C8, pNP-caprylate(c)a と b の値の比を PET 加水分解特異性として算出した．

E-mail: ssk-yoshida@bs.naist.jp

IFO Res.Commun. 36
2022

乳酸菌が産生する菌体外多糖の免疫増強活性に寄与する酵素の構造基盤の解明
松【目的】プロバイオティクスとは，ヒトが摂取した際に身体に有益な影響を与えてくれる生きた微生物であり，高齢で低下する免疫力を増強するプロバイオティクスの利用は，高齢化社会に直面している現在，医薬・食品産業から高い注目を集めている．しかしながら社会的ニーズの高まりにも関わらず，これらプロバイオティクス乳酸菌の免疫誘導成分の分子レベルでの知見は乏しく，産業応用への妨げとなっている．乳酸菌の産生する菌体外多糖には粘膜免疫を増強する効果が知られているが，多糖のどのような物理化学的構造が活性に寄与しているのか，詳細な解明はなされていなかった．我々はこれまでに，乳酸菌の持つ糖質加水分解酵素ファミリー 70( GH70)に属する酵素グルコシルト
ランスフェラーゼによって合成されたグルコース鎖が，粘膜を病原体から保護する役割をもつ免疫イムノグロブリンA( IgA )の産生誘導に寄与していることを見出している．そこで本研究では，グルコース鎖のどのような構造成分が IgAの誘導に寄与しているのか明らかにすることを目的とした．
【方法】比較に用いたグルコシルトランスフェラーゼは，
IgA 産 生 誘 導 能 の 高 い 菌 体 外 多 糖 を 産 生 す る 乳 酸 菌
Leuconostoc mesenteroides NTM048 株由来の Gtf1と Gtf2，
L. mesenteroides 基 準 株 JCM6124T 由 来 の LEUM1752 とLEUM1747，L. mesenteroides NRRL B-512F 由来の DsrS，
L. mesenteroides NRRL B-1335 由来のアルタナン合成酵
素 ASR である．各グルコシルトランスフェラーゼ遺伝
子を乳酸菌ゲノムからクローニングし，大腸菌による組み換え酵素発現系を構築し，各酵素の発現と酵素精製を行った．得られた 6 種の精製酵素からグルコース鎖を合成し，GC-MS および 1H-NMR による構造解析を行うとともに，マウスパイエル板細胞およびマウス生体を用いて IgA 産生誘導能を検証した．
【結果・考察】合成される多糖の構造が明らかになっている 11 種類のグルコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を用いて，本研究に用いた 6 種の酵素の系統樹解析を行った．その結果 Gtf2 ，LEUM1752 そして α-1,6/1,3結合グルコース鎖を合成する酵素 DsrT5 の間に高い相同性が認められ，Gtf2 および LEUM1752 は α-1,6 結合にα-1,3 結合側鎖を有するグルコース鎖を合成することが予測された．また Gtf1，LEUM1747 そして α-1,6 結合グ
ルコース鎖を合成する酵素 DsrS との間にも高い相同性が認められ，Gtf1 および LEUM1747 は，α-1,6 結合グル
コース鎖を合成することが予測された．
大腸菌発現系にて精製した 6 種の組換え酵素から，ス
クロースを基質にグルコース鎖を合成して，その多糖構
所属

石川県立大学 生物資源工学研究所

﨑

千

秋

造を解析した．その結果，アミノ酸配列から予測されたとおり，Gtf2 および LEUM1752 は α-1,6 結合に α-1,3 結
合 側 鎖 を 有 す る グ ル コ ー ス 鎖 を 合 成 し，Gtf1 お よ び
LEUM1747 は α-1,6 結合グルコース鎖を合成した(表 1 )．
表1

酵素合成多糖の糖鎖結合様式の割合
グルコース鎖結合様式（％）**

酵素名(多糖名*)

T-Glcp-(1→Gtf1(Gtf1-S)
LEUM1747(LEUM1747-S)
DsrS(DsrS-S)
Gtf2(Gtf2-S)
Gtf2(Gtf2-P)
LEUM1752(LEUM1752-S)
LEUM1752(LEUM1752-P)
ASR(ASR-S)→3-Glcp-(1→

9
8
7
8
6
13
8
13

3
43
44
32
51
30

→6-Glcp-(1→ →3,6-Glcp-(1 →
81
80
77
45
39
49
36
45

10
12
13
4
11
6
5
12

* S（上清画分）P（沈殿画分）, ** - , not present

IgA 産生誘導能の高いことが報告されている NTM048
株由来の菌体外多糖と，得られた酵素合成多糖について，
マウスパイエル板細胞からの IgA 産生誘導能を比較した．
その結果，α-1,6 結合に α-1,3 結合側鎖を有するグルコース
鎖で，α-1,6 結合と α-1,3 結合の比が約 1:1 の糖鎖( Gtf2-S
および LEUM1752-S)が強くIgA 産生量を増強した(図1)．
また α-1,6 と α-1,3 の 2 糖繰り返し構造を有するアルタナン
ASR-S には強い誘導は見られなかったことから，α-1,6 および α-1,3 の連続した結合の重要性が明らかとなった．

図1

菌体外多糖(NTM048 多糖)および酵素合成多糖の，IgA 産生誘導能の比較．生食水:ネガティブコント
ロール．LPS:リポ多糖(ポジティブコントロール)．
異なるアルファベット間で有意差あり( P < 0.05 )．

最も高い IgA 産生誘導能を有していた Gtf2-S について，病原体に対する感染防御効果の高い，抗原特異的
IgA 誘導能を評価した．オボアルブミン抗原を用いたマ
ウス経鼻感作モデルにて，粘膜上の抗原特異的 IgA 量を測定した結果，下気道および鼻粘膜上に誘導を確認した．
病原体に対する感染防御効果のある機能性食品素材としての利用と共に，医療分野では粘膜ワクチンの効果を高める免疫増強剤としての利用が期待できる結果であった．

E-mail: chiaki@ishikawa-pu.ac.jp－ 171 －

IFO Res.Commun. 362022

共生微生物によるダイズ黒根腐病防除機構の解明
岡崎伸【目的】ダイズ黒根腐病は我が国の大豆栽培において最次に，農業生物資源ジーンバンクから日本各地の黒根も深刻な病害の一つである．発病した場合，ダイズの生腐病菌株を入手し，TUAT1 株による生育抑制が採取地

育が抑制され，深刻な場合は生育途上で枯死し，大豆収の異なる黒根腐病菌でも認められるかを検討した結果，量が大きく低下する．これまでのところ本病害に有効な

生育阻害効果には菌株間差があったものの，試験した 8

農薬はなく，効果的な防除法はない状況である．そこ

株全てにおいて TUAT1 株による生育阻害効果が認めらで本研究では，黒根腐病菌の増殖を抑えるダイズ共生微れた．以上の結果から，TUAT1 株は日本各地で分離され生物に着目し，共生微生物によるダイズ黒根腐病菌の生た黒根腐病菌株の生育を抑えることが明らかとなった．

育抑制力の評価，およびダイズ栽培時における病害抑制（2）TUAT1 株によるダイズ黒根腐病防除効果の評価
次に，TUAT1 株により実際に黒根腐病が防除できる効果の解析を行った．
【方法】

かどうかを，ポット試験で検討した．その結果，病原菌（1）寒天培地上でのダイズ黒根腐病菌の生育抑制

のみの接種では発病頻度が 75％であったが，TUAT1 株

AG 平板培地の下側半分に種々の細菌株を塗布してを接種した場合は発病頻度が 25％～ 33％に低下した．

28 ℃暗黒条件下で 3 日間培養後，PDA 培地で培養した

この結果から TUAT1 株が実際にダイズに感染する黒根

ダイズ黒根腐病菌を培地上側に置き，28 ℃で 10 日間培

腐病菌を抑制できることが示唆された．次に，日本各地養した．黒根腐病菌の生育の差を比較することで各細菌から分離された黒根腐病菌を用いて同様の試験を行った株による阻害を比較した．

結果，菌株によって発病度と TUAT1 株による抑制程度（2）共生微生物によるダイズ黒根腐病防除効果の評価に差があることが判明した(図 2 )．

共生微生物の接種により黒根腐病が防除できるかどうかを，ポット試験で検討した．ふすま培地で 1 週間培養した黒根腐病菌 2 g を滅菌土壌 200 ml と混和して汚染土壌とし，これを小型プラスチックポット( 250 ml 容)に充填し，ダイズ品種タチナガハの種子を播種し，同時に拮抗微生物を接種した．栽培は温度 28 ℃，湿度 70％で行なった．播種後 20 日時点での発病指数( 0:無発病，
1:根部・地際部の褐変，2:主根，地際部全体の褐変，
3:主根の腐朽，4:枯死)と発病頻度を判定し，これにより共生微生物による黒根腐病防除効果を評価した．
【結果・考察】（1）寒天培地上でのダイズ黒根腐病菌の生育抑制
各種細菌によるダイズ黒根腐病菌抑制効果を検討した

図2

TUAT1 株接種時の発病頻度の比較

結果，大腸菌，根粒菌，アグロバクテリウムでは黒根腐病菌の生育は抑制されなかったが，イネの共生微生物でS-1 株，S-10 株，GF168 株などでは TUAT1 株によるある Bacillus pumillus TUAT1 株でもっとも強い生育阻抑制効果が見られ，特に長野県分離株 S-10，広島県分

害が認められた(図 1 )．

離株 GF168 株に対しては，TUAT1 株が発病頻度がそれぞれ顕著に低下しており，TUAT1 株の抑制効果が高い
ことが明らかとなった．一方，茨城県分離株 K A1-47 株
については TUAT1 株の有無により発病頻度が変化しなかった．菌株によって TUAT1 株による抑制程度に差があ る 原 因 に つ い て は 今 後 解 析 す る 必 要 が あ る が，
TUAT1 株の効果をより明確にするような接種方法を検図1
所属討する必要性が考えられた．

各細菌によるダイズ黒根腐病菌抑制効果

東京農工大学大学院農学研究院

E-mail: sokazaki@cc.tuat.ac.jp－ 172 －

IFO Res.Commun. 36
2022

新コンセプト「電子伝達体キノンの構成改変による代謝調節」の実証
中

澤

昌

美

【目的】「電子伝達体キノンの構成改変による代謝調節」

ク タ ー の 系 で R. rubrum 由 来 rquA 遺 伝 子( Rr_rquA )という新たな代謝改変コンセプトを提唱し，モデル微生

および Eg_rquA を発現させた．シゾンでは，ウラシル物で実証することを本研究の目的とした．低い酸化還元

合成遺伝子(ura )に機能欠失変異を有する M4 株を用い，電位を持つ「ロドキノン( RQ )」はユーグレナや線虫，ura 遺伝子座への相同組換えにより目的遺伝子を挿入した．Rr_rquA および Eg_rquA には，発現産物の C 末端

Rhodospirillum rubrum など非常に限られた生物にのみ存在するが，近年の研究により rquA 遺伝子の異種発現により，ユビキノン( UQ )から合成できることが明ら側に 3xHA タグを付加し，恒常発現プロモーターである
APCC プロモーター制御下に配置した．

かとなった．しかし，生物が新たに RQ 合成能を獲得し細胞内の UQ および RQ の定量は，FeCl3 で酸化したた際に，細胞内での代謝に及ぶ影響は全く不明である．

後 LC/MS により行った．有機酸量は酸性条件下でのイ

本研究では，RQ 合成能付与により細胞内の電子授受をオン排除クロマトグラフィーにより分離し，ポストカラ

変化させ，各種酸化還元反応の速度や反応の向きを改変

ム緩衝法でイオン化した後，電気伝導度計で検出した．

する，新たな方法論を開拓することを目指した(図 1 )．

【結果・考察】酵母ミトコンドリアに rquA 遺伝子を発現

特に，嫌気下で生じる余剰還元力を還元的代謝に供給すさせたところ，ロドキノン合成量はユビキノン量の 5％る能力を強化できる可能性を視野に入れ，還元反応が律以下と非常に低く，代謝への影響の測定は困難であった．

速となる有用物質生産系への促進効果を中心に検証した．

今後発現系の改良が必要であると考えている．一方，大腸菌およびシゾンにおいては，RQ 量が UQ 量を大きく上回る株の取得に成功した(図 2 左)．得られた RQ 合成株が，嫌気条件下で合成するコハク酸量を比べたとこ
ろ，両生物でコントロール株に比べ大きくコハク酸合成が増加していた(図 2 右)．これらの結果から，RQ 合成
能の付与は，嫌気下で生じる余剰還元力を還元的代謝に供給する際に効果を発揮し，還元反応が律速であるコハ

図1

ク酸生産が促進されたと結論した．

本研究の概要【方法】RQ 合成能の付与による代謝調節というコンセ
プトが多様な物質生産宿主で利用可能であるかを検証するために，本研究ではモデル生物を用いた実験を行った．
原核生物モデルとして大腸菌，真核生物モデルとして出
芽酵母おおび分裂酵母，真核光合成生物のモデルとして
Cyanidioschyzon merolae(シゾン)を用いた．ロドキノン
合成系関連遺伝子として同定された rquA 遺伝子のテン
プレートとして，R. rubrum 由来および Euglena gracilis
由来の 2 種を用いた．これらを真核生物に導入する際には，各宿主生物で既知のミトコンドリア移行シグナルを付加し，さらにコドン使用頻度を最適化した配列を設計
後，人工合成した．各生物における異種発現は以下の通りに行った．大腸菌では pET ベクター( BE21(DE3)株使用時)および pBAD24 ベクター( ΔmenA 株使用時)を用いて E. gracilis 由来 rquA 遺伝子(以下 Eg_rquA )を発
現させ，それぞれアラビノース，IPTG で発現誘導した．
出芽酵母では pYES ベクター，分裂酵母では pREP1 ベ
所属

大阪府立大学大学院生命環境科学研究科

E-mail: mami@omu.ac.jp－ 173 －

図2

rquA 遺伝子の発現による RQ 合成能獲得とコハク酸合成能変化

IFO Res.Commun. 362022

リグニンの主要結合を開裂する微生物の探索とリグニンからのポリマー原料生産への応用
上

村

直

史

【目的】木質成分のリグニンは年間 200 億トン生産され，【結果・考察】ハイスループットな β-O-4 結合開裂細菌

プラスチック製品の化石代替原料として十分な賦存量をのスクリーニング方法構築のため，β-O-4 結合を有する有します．現在，リグニンの利用方法として，化学触媒

蛍光基質の GOU を合成しました(図 1 )．環境試料からを用いた低分子化処理とこれにより生成する芳香族モノ

バニリン酸またはシリンガ酸で生育できるバクテリアをマー・オリゴマーからのポリマー原料化合物の発酵生産

918 株単離し，GOU を基質とした β-O-4 結合開裂能のスが期待されています．リグニンはヘテロ高分子ですが，

クリーニングにより β-O-4 結合開裂能を有する候補株をその約 50％は β -アリールエーテル(β-O-4)結合で連結し45 株獲得しました．これらのうち 10 株が GGE を基質ています．β-O-4 結合の開裂酵素は，リグニン由来化合とした場合でも β-O-4 結合開裂能を示しました．各株に物分解菌の Sphingobium sp. SYK-6 株を含む α -プロテオ

おいて GGE は Cα 位の酸化を受けて MPHPV に変換さバクテリアにしかほとんど例がなく，いずれもグルタチれた後に β-O-4 結合開裂を受けることが示唆されましオン S -トランスフェラーゼ(GST)です．本研究ではリた．16S rRNA 遺伝子配列の解析から各株は α -プロテ

グニンからのポリマー原料生産に有益な新規または高活オバクテリアの Sphingobium 属と Novosphingobium 属，性の β-O-4 結合開裂酵素の発見を狙い，β-O-4 結合開裂
細菌の探索と解析を行いました．

β -プロテオバクテリアの Delftia 属等であることが同定されました．これらのうち，Sphingobium sp. AzN-1 株，【方法】β-O-4 結合開裂菌のスクリーニングのため，本Sphingobium sp. G14-4 株，Novosphingobium sp. G26-1 株，結合の開裂により蛍光物質である 4 -メチルウンベリフェ

Delftia sp. NB13-2 株のゲノムシークエンス解析を行い，ロン(4MU)を生成する蛍光基質(GOU)を合成しました

β-O-4 結合開裂に関わると推定される酵素遺伝子の保存
Sphingobium sp. AzN-1 株，
性を調査しました．その結果，(図 1 )．細菌において重要なリグニン代謝中間体として知られるバニリン酸とシリンガ酸を単一炭素源として生育する菌株を単離し，96 ウェルプレートにて GOU を含Sphingobium sp. G14-4 株，及び Novosphingobium sp. G26-1
株はいずれも既知の Cα-dehydrogenase および β-O-4 結

むバニリン酸またはシリンガ酸で培養し，蛍光プレート

合開裂を担う GST と 75％以上のアミノ酸配列相同性をリーダーにより 4MU に由来する蛍光をモニターしまし示す遺伝子を保持していました．また，これらの株はた．β-O-4 結合開裂能の調査は，バニリン酸またはシリンガ酸で培養した菌体の休止細胞を β-O-4 結合のモデル

β-O-4 結合開裂以降の代謝経路を担う酵素遺伝子を全て保持していました．AzN-1 株と G14-4 株は，既知のリグ

二 量 体 化 合 物 で あ る guaiacylglycerol-β-guaiacyl ether

ニン由来化合物分解菌の Sphingobium sp. SYK-6 株より(GGE)とインキュベートし，反応産物を液体クロマト

も β-O-4 開裂能に優れており，かつバニリン酸，シリン

グラフィー(HPLC)により分析することで行いました．

ガ酸，p -ヒドロキシ安息香酸等の様々なリグニン由来芳菌株の同定は 16S rRNA 遺伝子配列を基にした系統解析

香族化合物に加えて SYK-6 株が利用できないグルコーにより行いました．β-O-4 開裂酵素のグルタチオン要求スで生育できたことから，リグニンからの有価物生産の性は，超音波破砕により調製した細胞抽出液をグルタチ宿主として期待されます．一方，β -プロテオバクテリア

オ ン 存 在 下， 非 存 在 下 で GGE の Cα 位 酸 化 物 で あ るの NB13-2 株は β-O-4 開裂反応においてグルタチオン要

MPHPV とインキュベートし，MPHPV の変換を HPLC

求性が見られたことから，本株の β-O-4 開裂酵素は既知

により分析することで調べました．

と同様に GST であることが強く示唆されました．しかしながら，NB13-2 株のゲノムには既知の β-O-4 結合開裂 GST との相同遺伝子は見出されず，新しいタイプの
β-O-4 結合開裂 GST の存在が示唆されました．Delftia
属の細菌における β-O-4 結合開裂能の発見は本研究が初めてであり，NB13-2 株の β-O-4 結合開裂 GST を同定・機能解明することにより，自然界におけるリグニン分解

図1
所属

蛍光基質 GOU の β-O-4 開裂反応長岡技術科学大学物質生物工学系への理解を深めることができると期待されます．

E-mail: zkami@vos.nagaokaut.ac.jp－ 174 －

IFO Res.Commun. 362022

単一の細胞が精巧で微小な構造物を構築する原理の解明
野

村

真

未

【目的】単細胞生物の有殻アメーバは実に精巧な母細胞と同型の被殻を細胞外の鋳型のない空間に構築することが知られている．しかし，現在有殻アメーバの利用可能な培養株は世界中でたった 6 株しか存在せず，被殻構築様式の研究は進んでいない．そこで，本研究では有殻アメーバの培養株を確立し，その被殻構築様式を形態学・分子生物学的に解析することで，共通する細胞行動や遺伝子発現から被殻構築の基本原理を明らかにすることを

図 1 Paulinella indentata の被殻
A. 光学顕微鏡像． 開口部付近に葉状の仮足(矢印)と，細胞体(白矢頭)から遠く離れ長く伸びる糸状の仮足(矢頭)が観察された．
scale bar : 20 μm
B. 走査型電子顕微鏡像．細胞後方の特徴的な棘状の鱗片が観察された．scale bar : 2 μm目的とした．
【方法】各地で採集を行い，マイクロピペット法により単一細胞を洗浄，単離を行った．また，カナダ Dalhousie
大学の Eglit 氏から有殻アメーバ Paulinella sp. を含む粗培養株を提供していただいた．走査型電子顕微鏡を用いた形態観察により，確立した培養株の分類を行った．また，被殻構築に関与する遺伝子を特定するため，total
RNA および単細胞 RNA シーケンスを行った．単細胞に至る進化を明らかにするために重要な手がかりを得たRNA シーケンスの手法の一つである SMART-seq2 法をと言える．

改良し，増幅した cDNA を定量 PCR 法で確認した．

そこで，次に YE-3 株を用いて，比較 RNA シーケン

【結果・考察】本研究において新たに 4 株の培養株を確スによる被殻構築関連遺伝子の探索に着手した．今回確

立することに成功した．Eglit 氏が確立したクルード培

立された培養株は増殖速度が非常に遅く，細胞が密に増養株には Paulinella sp. の他，バクテリアとストラメノ

えることがないため，単細胞 RNA シーケンスによる遺パイルに属すると思われる鞭毛虫が混在していたため，

伝子発現解析が必要であると考えた．そこで，まずは基マイクロピペット法により真核生物が Paulinella sp. 単盤となるデータベースを構築するため，total RNA を抽一のクローンとなるように単離を行い，培養株 YE-3 お出し RNA シーケンス解析を行った．Blast 検索により

よび YF-1 株を作成した．YE-3 および YF-1 株の被殻を

18S rRNA 遺伝子配列を収集し，近縁な有殻アメーバの走査型電子顕微鏡により観察した結果，鱗片の形態的特配列とともに系統解析を行った結果，P. indentata 由来

徴からどちらの株も Paulinella indentata であることがの配列が取得できていることを確認した．次に，単細胞明らかとなった(図 1 )．P. indentata の被殻は縦長の楕RNA シーケンスを行う際に，硬い被殻をもつ有殻アメー

円体であり，20 ～ 30 枚程の鱗片から構築されている．被バから RNA を抽出するため，目的の細胞をマイクロピ

殻の中間層に位置する鱗片は長方形で，長辺の中央は凹

ペット法により界面活性剤の入った細胞溶解バッファーんでいるのに対し，長辺側部は張り出ていた．また，凸に単離し，液体窒素による凍結と 98 ℃に温めたヒートブ

凹のない部分の鱗片表面には小さな孔が空いていた．開

ロックによる融解を 3 回繰り返した．改良 SMART-seq2

口部を構成する鱗片の凹凸はほとんどない一方で，細胞法により増幅した cDNA を定量 PCR で確認したところ，後方の鱗片は鱗片長辺の出っ張りが激しく棘状になって単離した 11 細胞すべてから RNA の抽出および cDNA のいる．この棘状の鱗片は光学顕微鏡でははっきりと観察

増幅ができていることがわかった．cDNA の増幅が確認ができず，電子顕微鏡レベルの特徴と言える．本研究にできたサンプルについてシーケンスを行った結果，3 サ

おいて，有殻アメーバのなかでは分子情報が豊富な独立

ンプルのうち 2 サンプルで良好にシーケンスを行うこと

栄養性の Paulinella chromatophora と Paulinella microporaができた．今後，独立栄養性 Paulinella との発現比較をと同属の培養株を確立できた．本株を用いた研究によっ行っていきたい．

て，被殻構築解明だけではなく，光合成オルガネラ獲得

所属

京都大学人間環境学研究科，現 山形大学理学部

E-mail: mami_nomura_4p@sci.kj.yamagata-u.ac.jp－ 175 －

2019 年度若手研究者助成の研究報告
助成期間:2019 年 4 月～ 2022 年 3 月

IFO Res.Commun. 36
2022

彩雪をもたらす氷雪性緑藻の種の全世界的な解明：
培養株の多面的解析と野外サンプルとの比較分子解析松﨑

令【目的】極域や山岳地域において，融雪期に雪原や氷河

子解析の結果から，それぞれ未記載種であると考えられが緑色や赤色などに色付く「彩雪」現象は，雪氷環境にた．また，氷雪性クロロモナス属において実験的に有性適応した微細藻類(氷雪藻)が雪氷中でブルームを形成生殖を誘導して接合子を形成させることは C. tughillensis

することによって主に引き起こされる．彩雪中には氷雪でしか成功していなかったが，手法の改良と新規培養株

藻だけでなく，従属栄養性の原生生物や微小動物，菌類の利用により，新たに 3 種で有性生殖を誘導して接合子やバクテリアなどもみられるため，氷雪藻を生産者とすを形成させることに成功した．分子同定した野外サンプ

る食物網が形成されていると考えられている．寒冷かつル中の接合子と比較した結果，培養株由来の接合子の形

貧栄養な雪氷環境における生態系は生物学的に非常に興態は，天然で形成されたものと同様であることが示唆さ

味深く，また，彩雪は鉱物粒子や黒色炭素などと同様にれた．

氷河や雪原の融解を促進しているという近年の研究によ

続いて，日本を含む北半球とオーストラリアの彩雪かり，氷雪藻は注目を集めている．彩雪サンプルのアンプ

ら繰り返し報告されていた雪氷微生物 Chionaster nivalis

リコン解析は多様な氷雪藻の存在を示唆しているが，その分子解析を実施した．本種は単細胞性で，細胞壁にみの実体はほとんど分かっていない．そこで本研究では，られる 3 - 5 の突起により星型の形状をとる(図 1)．細胞

氷雪藻の種多様性と系統を全世界的に解明することを目が無色であることから非光合成の藻類もしくは菌類とさ的とし，新規培養株と世界各地のカルチャーコレクショれてきたが，培養株や分子データの報告はなく，科以上ンが保有する培養株，並びに野外サンプル中の接合子をの分類学的位置は記載から 100 年以上経っても不明なま用いて，申請者が近年確立した形態と分子情報を結合しまだった．本種の分離培養は成功しなかったが，キャピた種レベルの分類学的同定手法を実施した．

ラリーピペットを用いて日本産彩雪サンプルから本種と【方法】融雪期(4 月中旬～ 6 月上旬)に八甲田山(青森同定できる細胞を 200 以上回収・洗浄し，それらから抽県)，月山(山形県)，尾瀬国立公園(群馬県側)，および出した DNA を用いることで，本種のリボソーム DNA

立山(富山県)において採集した彩雪サンプルから，ピの配列データを得ることに成功した．分子系統解析の結ペット洗浄法を用いて氷雪藻の新規培養株を確立した．

果，本種は担子菌門に位置すること，およびハラタケ亜

海外での野外調査は新型コロナウイルスの感染拡大によ門内で独立した系統をなす Bartheletia paradoxa(バルテ

り実施できなかった．また，国内外のカルチャーコレク

レティア綱)の姉妹系統であることが明らかとなったションから氷雪藻の未同定培養株を購入し，比較形態解(図 1)．また，GenBank に登録されていた彩雪のアンプ

析と分子系統に供した．野外サンプルと培養株は 5 ℃，

リコン解析データを調査した結果，北半球の複数の地点

明期:暗期=14 h:10 h，光量子束密度 35 - 90 μmol m-2 s-1

だけでなく，これまで C. nivalis の報告がなかった南極の条件で保存された．DNA 抽出，塩基配列のシーケンス，

からも本種のものと考えられる配列が検出され，本種のおよび分子系統解析は Matsuzaki et al. の手法と同様に広域分布が分子データからも支持された．

実施された．
【結果・考察】彩雪の主要な原因藻類である緑藻クロロ
モナス属(Chloromonas)の培養株を日本の彩雪サンプルから約 60 株確立し，国内外のカルチャーコレクションから購入した日本，北米，北極域，および南極産の未同
定株約 10 株とともに分子系統解析を行った．その結果，13 の新規系統が明らかとなった．残念ながら全ての系
統の分類学的研究を助成期間内に完結させることはできなかったが，Chloromonas sp. NIES 未公開株(日本産)，
お よ び Chloromonas cf. granulata CCCryo 281-06 株( 南図1

担子菌門における Chionaster nivalis の位置

極産)は栄養細胞と無性生殖の比較形態解析，並びに分所属

筑波大学生命環境系，現 国立環境研究所生物多様性領域

E-mail: matsuzaki.ryo@nies.go.jp－ 177 －

2020 年度若手研究者助成の研究報告
助成期間:2020 年 4 月～ 2022 年 3 月

IFO Res.Commun. 362022

少数細菌の検出を可能とする深層化 16S メタゲノム解析法の開発【目的】地球上の多種多様の細菌は，「細菌叢」という複乳児で減少した．個体別でみる雑な一群を成し，自然環境や共生生物などに重要な影響と，DRIP で 新 た に 出 現 し た のを及ぼす．これら細菌叢解析には，細菌ゲノム中の 16S

は 7 種(中央値)であった．また，

rDNA 配列を PCR 増幅し，次世代シーケンサー( NGS )元の Bifidobacterium 属比率が多で解析する 16S メタゲノム解析が一般に用いられている．

いほど DRIP での検出種数増加

本手法の解析可能最大リード数は 1010 リード程度であるが多くなる傾向であり，除去さ

後

藤

愛

那

図1

乳児糞便由来ゲノムにおける DRIP 適用例

ため，腸内や土壌に存在する 10 /g 個を超える細菌の一れた Bifidobacterium 属アンプリ部を抜き出し，菌叢中の優勢種にフォーカスして全体像コン分が他菌種検出に宛がわれをとらえるアプローチとしてたいへん強力である．そのた と 考 え ら れ る． こ の と き，

一方，存在比が低い種が菌叢全体に影響を及ぼす事例もControl と DRIP 間の Bray-Curtis

複数報告されている．本研究は，菌叢をより深く正確に非類似係数は 0.049 と低値である把握すべく，希少種に焦点を絞った新規 16S メタゲノム

ことから，除外ターゲット以外

解 析 手 法 DRIP( Deeper Resolution using an Inhibitoryの菌叢組成を保った結果が得ら

Primer )の開発を目的とするものである．

れていることが確認された．また，DRIP により新たに【方法】DRIP では，現行の NGS 解析手法をベースに，検出された菌種のひとつである F. prausnitzii を一例に，ライブラリ作成段階で主要菌由来アンプリコンを除くこMGS メタゲノム解析と qPCR それぞれによって算出さとで，希少種由来のアンプリコンの検出頻度を上昇させれ た 菌 数 を 比 較 し た． そ の 結 果，qPCR 定 量 F. praus-

る．検討モデルとして Bifidobacterium が優勢となる乳

nitzii 菌数は，Control( NGS )とは相関していなかったが( r = -0.158, p = 0.64 )，DRIP( NGS )とは正相関して13

児の腸内細菌叢の解析を実施した．
まず，Bifidobacterium 属細菌の 16S rDNA 特異的な配い た( r = 0.987, p = 1.8×10-8 )( 図 2 )． 従 来の方法では，列を持つ，ビオチン付加阻害プライマーを設計した．

希少菌種数のMock( 14 菌種精製ゲノムの混合)および乳児糞便由来

定量性が低いDNA をテンプレートとして V3－V4 領域を増幅する 1st

こ と が 懸 念・PCR を，通常条件( Control )と本阻害プライマー添加

指摘されてき条 件( DRIP ) で 行 っ た． ア ビ ジ ン で ビ オ チ ン 付 加

たBifidobacterium 属由来アンプリコンのみを除いた後，
Miseq 解析用バーコードタグ付きプライマーを用いたはそれを解決2nd PCR を行った．Miseq platform に基づき，NGS 解析，とを強く示唆

QIME2 を用いてクラスタリングと分類分析，次いで統している．

が，DRIP可能であるこ計解析を行った．

図 2 F. prausnitzii 菌数測定結果比較

以 上 よ り，

総 細 菌 数 お よ び Faecalibacterium prausnitzii の rRNA

DRIP はこれまで検出頻度自体や正確な定量に課題があ

遺伝子数は，それぞれユニバーサル配列あるいは種特異るとされてきた希少菌種にフォーカスした分析を実現可

配列プライマーを用いた qPCR により測定した．

能であることが示された．本方法の重要な意義は，(1)【結果・考察】Mock を用いた予備検討では，除外対象

従来の NGS メタゲノム解析フロー(基本的手法，機器，である Bifidobacterium 属 3 種の存在比が減少し( 19.0％

ソフトウェア)の中で実施可能であること，(2)DRIP→ 2.3％)，阻害ターゲット特異的にアンプリコンを除去で得られた情報は，従来の解析方法と組み合わせる，す可能であることが示された．

なわちターゲット菌除去前の菌叢情報を再反映すること

11 人の乳児糞便由来ゲノムについても同様の方法でで初めて「真の細菌叢」に近づけることができるという解析したところ，Bifidobacterium 属のアンプリコンシー

2 点である．今後，技術面で残された課題(特異性等)

ケンスバリアント( ASV )が大幅に減少した(図 1 )．

を解決することで，環境細菌叢理解に幅広く応用される

それに伴い，検出種数は DRIP により 6 乳児で増加，4ことを期待する．

所属

京都大学大学院生命科学研究科

E-mail: aina.g1985@gmail.com－ 179 －

IFO Res.Commun. 36
2022

グラム陰性菌外膜タンパク質アセンブリー機構の解析
塩

田

拓

也

【目的】グラム陰性菌は，外膜というバリアを持つため抗菌薬が効きにくいという性質を持つ．外膜は，タンパ
ク質が 50％以上を占める硬いバリアを形成する．グラ
ム陰性菌の外膜タンパク質は，ほとんど全てが β バレル型膜タンパク質である．β バレルの複雑な立体構造形成と外膜への組込み(アセンブリー)を行っているのが，BAM 複合体である．BAM 複合体は，外膜の弱体化という 観 点 か ら 魅 力 的 な 薬 剤 標 的 で あ る． 本 研 究 で は，BAM 複合体と輸送するタンパク質(基質)の相互作用

図1部分を標的とした薬剤開発のための基盤研究として，
BAM 複合体が認識する配列の決定を目指した．
【方法】① BAM 複合体が認識する基質の配列を決定するために，基質を断片化したペプチドライブラリーを用いた競合阻害実験を行なった．具体的には，大腸菌で最A. 阻害ペプチドによる親和性領域探索．B. 有効阻害ペプチドの配列と，類似部分．C. 阻害ペプチドを有する β ストランドの配向性．黒色と灰色はそれぞれ同じ配向を示す．

なシグナルとして機能していることが明らかになった．

も多い外膜タンパク質である OmpC をモデル基質とし次に，これらのシグナルが in vivo でアセンブリーに

これらを 17 残基ずつのペプチドとして合成した．これ

どのように影響しているかを調べるため，大腸菌でシグらを個別に，我々が開発した in vitro 再構築実験系「EMM

ナル変異体を発現した．シグナル領域で重要な残基としアセンブリーアッセイ」に添加し，BAM 複合体を介して，Phe280 と Tyr286 がある．これらを個別，もしくはたアセンブリーへの影響を調べた．EMM アセンブリー

両方同時にアラニンに置換したところ，二重変異体はア

アッセイは，大腸菌の高比重膜画分( E. coli Microsomal

センブリー効率が低下した(図 2 A )．次に，シグナル

Membrane: EMM )に放射性ラベルした基質タンパク質

変異体発現が，外膜のバリア機能に与える影響を調べるを添加することで，ラジオイメージングによりアセンブ

ため．細胞壁の合成阻害剤，バンコマイシン( VCN )リーを追跡できる手法である．

を添加して生育を比較した．VCN は，分子量が大きく②シグナル部分に変異を加えた OmpC を大腸菌内で通常は外膜を透過できず生育を阻害しないが，外膜の堅発現し，そのアセンブリーを BN-PAGE で解析した．ま牢性が低下すると作用できる．二重変異体を発現した株

た，抗菌薬を加えストレス条件で培養し，バリアの堅牢では，VCN に対する感受性が増加していた(図 2 B)．我々

性を調べた．

は，別の解析から，新規シグナルの変異体が，BAM 複【結果・考察】OmpC ペプチドとの競合阻害に用いる基合体で詰まってしまうことを見出している．すなわち，質には，腸内出血性大腸菌の毒素タンパク質 EspP を用

新規シグナルは，迅速なアセンブリーを実現し，基質のいた．EspP は，BAM 複合体を介して外膜にアセンブリー

停滞を防ぐことで，外膜のバリア形成に重要な役割をされると自己切断を起こし分子量が低下する．切断型担っていることを明らかにした．

( m )の量からペプチドの阻害効率を見積もった．その結果，4, 10, 17, 18, 21, 23 番目のペプチドが EspP のアセ
ンブリーを阻害した(図 1 A )．23 番目は既知のシグナルである β シグナルを含む領域であり，アッセイが正しく競合阻害を評価できていることを確認できた．阻害効
果が大きかった 18, 21 番は，配列が 23 番目と類似しており，また立体構造上で β ストランドの配向が同じであった(図 1 B, C )．すなわち，同様の構造・配列が複数回続いていることが明らかになった．変異解析から，
この 18 番 21 番のペプチド領域にはアセンブリーに必要所属

図2

A. in vivo での新規シグナルの変異体のアセンブリーの
BN-PAGE での比較．B. シグナル変異体を VCN 存在下で培養した際の生育比較．FY は二重変異体を示す．

宮崎大学 キャリアマネジメント推進機構 テニュアトラック推進室 , JST 創発－ 180 －

E-mail: takuya.shio@cc.miyazaki-u.ac.jp

IFO Res.Commun. 362022

原核微生物が持つエピジェネティクスの理解に向けた
海洋細菌群集の DNA メチル化修飾の系統網羅的解析
平

岡

聡

史

【目的】細菌や古細菌，二本鎖 DNA ウイルスは，ヒト

ドラフトゲノム(P-MAG)と 163 の二本鎖 DNA ウイルスなどの真核生物と同様に，生体内でゲノム DNA に化学のドラフトゲノム(V-MAG)を取得し，PacBio のリード修飾が起きることが知られており，生理学的に重要な役を利用してこれらゲノム上の DNA 化学修飾の検出と修割を担うと考えられている．そのため微生物の生理生態

飾モチーフの予測を行った．さらに DNA 化学修飾酵素を理解する上で，ゲノム情報や遺伝子情報とあわせてエ遺伝子を探索し，モチーフと酵素の対応関係を予想した．

ピゲノム情報を取得しその機能を明らかにしていくこと

特に新規性が高いと予想された酵素については，人工遺は重要である．しかしながら DNA 化学修飾を観測する

伝子合成と大腸菌を用いた異種発現系と，制限酵素を用技術的な難しさのために，エピゲノムの研究例はごく一いた認識モチーフのアッセイ系から，酵素活性の性質を部の分離培養株に限られており，他の大半の分離培養株測定した．

はもとより，環境中の微生物叢の大半を占める未培養系【結果・考察】微生物ゲノム上から，新規のものを数多統が持つエピゲノムについては研究が進んでいない．本く含む計 220 の多様な修飾モチーフを発見した．興味深研究ではメタゲノム解析とエピゲノム解析を組み合わせ

いことに，系統的に近しいゲノム間でも大きく異なるエ

た「メタエピゲノム解析」と呼ばれる非培養的手法を利ピゲノムを持つ場合もあれば，比較的遠い系統内でも高用し，未培養系統が優占する海洋環境を対象に，微生物度に類似したエピゲノムを持つ系統群，DNA 化学修飾

叢が持つ DNA 化学修飾を大規模に解析した(図 1 )．

が全く検出されない系統群など，さまざまなパターンが観察された．この結果は，各微生物系統群においてエピ
ゲノムが持つ役割が異なっており，エピゲノムが生理生態と密接にリンクしていることを予想させるものである．
次に DNA メチル化修飾に着目して解析したところ，
計 276 の DNA メチル化酵素( MTase)遺伝子が予測された．そして大腸菌を用いた in vivo の実験や，分離精製した酵素を用いた in vitro の実験などから，5 つの新規モチーフを特異的に認識する酵素を含む，計 11 のMTase 酵素を新規に同定した．
さらに海洋中に最も多く存在する微生物系統群である
Alphaproteobacteria 綱に着目してより詳細なゲノム解析を行ったところ，この系統群では進化の途中で DNA メ
チル化酵素の認識モチーフが変化し，その変化にあわせてゲノム全体の塩基出現パターンも変化していることを

図1見出した．このことはエピゲノムとゲノムが共進化してメタエピゲノム解析の概要．画像素材として，Togo
Picture Gallery(© 2016 DBCLS TogoTV)を利用．

きたことを示唆する，興味深い結果である．
本研究は今日まで解析対象とされてこなかった海洋細

【方法】2019 年 9 月，海洋研究開発機構の海底広域研究

菌叢・ウイルス叢が持つエピゲノムを大規模に解析し，船「かいめい」を用いて房総半島沖合 50 km の海域から多様な未知の DNA 化学修飾モチーフの存在を明らかに大量採水とフィルター濾過をを行い，表層 5 m から深層したとともに，エピゲノムが海洋微生物の生態や進化に300 m に至る 4 層の微生物試料を採取した．この試料を広範な影響を与えている可能性を示した初の成果であ

対象に，PacBio Sequel ，Nanopore GridION ，Illumina

る．今後，深海堆積物や陸上環境などの幅広い微生物叢

MiSeq の 3 種類のシーケンサーを用いたショットガン

を対象に解析を実施し知見を積み重ねていくことで，微シーケンスを行い，配列データを取得した．そして各種生物が持つエピゲノムへの理解が深まることが期待されのバイオインフォマティクス解析から 233 の原核生物のる．(Hiraoka et al., Nucleic Acids Research., 2022)

所属

海洋研究開発機構海洋機能利用部門

E-mail: hiraokas@jamstec.go.jp－ 181 －

IFO Res.Commun. 362022

病原性染色体による宿主特異性の決定・分化機構の解明
鮎川

侑

【目的】土壌病原菌 Fusarium oxysporum は，100 種以上の植物に対して病原性を示すものの，菌株によって宿主が異なるため，各菌株は宿主植物に基づいて分化型に区別される．いくつかの分化型から，生存に必須でないが病原性に必要な染色体(病原性染色体)が特定され，病原性染色体が宿主決定に関与すると考えられている．しかしながら，病原性染色体に座乗する宿主決定遺伝子は特定されていない．本研究では，シロイヌナズナに病原性を示す分化型であるキャベツ萎黄病菌(F. oxysporum f.
sp. conglutinans )Cong:1-1 の病原性染色体，および宿主決定遺伝子の特定を試みた．
【方法】Cong:1-1 野生株( WT )から作出されたハイグ
ロマイシン B 耐性の SIX4 破壊株( ΔSIX4 )に，紡錘糸

図1

シロイヌナズナに対する HS5 の病原性形成阻害剤ベノミルを処理することで染色体異常を誘導
後，ハイグロマイシン B 感受性株を選抜し，病原性染のトランスクリプトーム解析を行い，HS5 が失ったゲノ

色体喪失候補株とした．病原性染色体喪失候補株のゲノム領域上で高発現する 2 つのエフェクター候補遺伝子をムシーケンスを行い，得られたリードを WT のゲノムに見出した．2 つのエフェクター候補遺伝子のうちの 1 つマッピングし，喪失したゲノム領域を特定した．病原性はトマトに感染する分化型から同定された SIX8 の相動

染色体喪失候補株の病原性を調査するために，シロイヌ

遺伝子であった．もう一方の遺伝子は未知遺伝子(PSE1

ナズナ Col-0 WT および，アブラナ科植物特有のトリプと命名)であり，Cong:1-1 のゲノム塩基配列上で SIX8

トファン由来の生体防御物質を合成できない cyp79b2/b3
二重変異株に接種した．病原性染色体喪失候補株が欠失の近傍に位置した(図 2 a )．そこで，両遺伝子を HS5に導入した形質転換体 HS5 +SIX8-PSE1 を作出した．当したゲノム領域上のエフェクター候補遺伝子の発現を確

該形質転換体をシロイヌナズナに接種したところ，シロ

認するために，シロイヌナズナ感染時の遺伝子発現解析

イヌナズナに対して病原性を示した(図 2 b )．SIX8 まを行った．喪失したゲノム領域に座乗するエフェクター

たは PSE1 いずれかの導入では，HS5 の病原性は復帰し候補遺伝子の中から，感染時に高発現した遺伝子を，病なかった(図 2 b )．以上より，キャベツ萎黄病菌の宿主

原性染色体喪失候補株に導入し病原性が復帰するか調査

決定には，SIX8 および PSE1 による，CYP79B2/B3 をした．

介した宿主免疫の抑圧を要することが示唆された．

【結果・考察】ΔSIX4 にベノミルを処理し，ハイグロマ
イシン B 感受性株 HS5 を得た．HS5 の全ゲノムシーケン
スを行い，得られたリードを WT のゲノムにマッピングしたところ，いくつかのゲノム領域が喪失していることを確認した．HS5 の病原性を調査するために，シロイヌ
ナズナを用いた接種試験を行った．その結果，HS5 のシ
ロイヌナズナに対する病原性は，親株と比較して低下した(図 1 a )．一方で，cyp79b2/b3 二重変異株を用いて接種試験を行ったところ，HS5 は病原性を示した(図 1 b )．
こ れ ら の 結 果 か ら，HS5 が 失 っ た ゲ ノ ム 領 域 に は
CYP79B2/B3 依存的な免疫抑制に必要な遺伝子が存在することが示唆された．HS5 が失ったゲノム領域から病原性遺伝子を特定するために，シロイヌナズナ感染時
所属

理化学研究所環境資源科学研究センター

図2

E-mail: yu.ayukawa@riken.jp－ 182 －

SIX8-PSE1 導入による HS5 の病原性への影響

IFO Res.Commun. 362022

大腸菌の外膜品質管理に関わる 2 機能性タンパク質 BepAの基質認識・選別機構の解明
宮

崎

亮

次

【目的】グラム陰性細菌の外膜は，抗生物質や化学物質試みた．BepA のプロテアーゼ活性部位近傍の分子内部等に対する防御障壁として細胞生存に重要な役割を持には，edge-strand と呼ばれる保存された β-strand 領域

つ．大腸菌の BepA は，外膜機能維持に関与する 2 機能がある．この領域に着目した変異解析により，この領域性のプロテアーゼであり，生育に必須の外膜タンパク質が LptD の分解だけでなく成熟化促進にも重要な役割を

LptD の分解だけでなく外膜へのアセンブリーに働く．

果たすことを見出した．加えて，光架橋解析により，こLptD は，外膜に輸送されたリポ多糖の組込みに関わる因の領域が LptD と直接相互作用することを示した．これ子である．BepA は外膜タンパク質の膜組込み装置 BAMらの結果から，BepA の edge-strand が LptD の選別に重複合体近傍で，成熟途上の LptD と相互作用し，通常時要な役割を果たすことが示された．

は分子シャペロン様機能により LptD 成熟化(フォール

また，BepA と相互作用する際の LptD 成熟中間体のディングとアセンブリー)を促進する一方で，成熟化過構造状態を明らかにするために，LptD 全領域を対象と程で蓄積した異常な LptD 成熟中間体は分解・除去する

した系統的な光架橋解析を行なった．その結果，LptD(図 1 )．しかしながら，BepA が正常な LptD と異常なの β バレルドメインの N 末端側領域に BepA の近接部位

LptD のそれぞれを認識し，選別する機構は明らかではが集中していること，その一部が BepA の edge-strand

ない．本研究では，その分子機構の解明を目的とする．

と直接相互作用することを見出した．同定した LptD のBepA 相互作用部位を，成熟後の LptD β バレル構造にマップすると，それらはバレル構造の内側，外側の両方に向いていたことから，BepA と相互作用する際には，そのような高次構造を形成していないと推測される．
さらに，詳細な架橋解析から，LptD 成熟中間体がBepA と相互作用すると同時に，β バレルドメインの C
末端側領域が BAM 複合体の基質認識に関わる構成因子
BamA，BamD と相互作用することを示した．この結果
は，BepA が BAM 複合体上で外膜に組み込まれている
途上の LptD 成熟中間体と相互作用することを強く示唆する(図 2 )．このように BepA が外膜に組込み途上の

図1

LptD 成熟中間体と相互作用することで，LptD は以降のLptD 成熟化促進と分解に働く BepA プロテアーゼ

成熟化に適した構造状態が安定化され，その結果として【方法】BepA による LptD の成熟化促進・分解におけるBepA は LptD の成熟化を促進しているのかもしれない．

基質認識・選別には，そのプロテアーゼ活性部位領域がまた，このステップで BAM 複合体上に異常停滞した

関与することが示唆される．一方，BepA 結晶構造では，LptD は BepA により分解・除去されると考えられる．

この領域は通常は分子内部に深く埋もれており，基質を認識するには露出される必要がある．また，LptD は
BepA よりも大きな最終構造を取るため，BepA 活性部
位に提示される際には，部分的にそれとは異なる「中間体構造」を取ると推測される．それらを検証し，BepA
が基質を認識し，選択的に異なる経路へと導く機構を明らかにするために，in vivo 光架橋解析を中心とした解析により細胞内での BepA と LptD 成熟中間体の相互作用様式をアミノ酸レベルの高空間分解能で解析した．
【結果・考察】最初に，BepA の LptD 認識部位の同定を奈良先端科学技術大学院大学 先端科学技術研究科

図2

BepA と LptD 成熟中間体の相互作用モデル

E-mail: m.ryoji@bs.naist.kp－ 183 －

IFO Res.Commun. 36
2022

DPANN 群に属する新奇アーキアの共生機構の解明
酒

井

博

之

【目的】近年，培養を介さないメタゲノム DNA 解析によ多くの場合，宿主の増殖が停止すると ARM-1 株も増殖

り，DPANN 群と呼ばれる未知のアーキアが，水圏からを停止した．このことは，活発に増殖している宿主細胞

動物の体内まで，極めて多様な自然環境中に生息するこが ARM-1 株の増殖に重要であることを強く示唆していとが明らかとなった．DPANN 群は，地球上のアーキア

る．純粋培養系と共培養系における宿主の増殖を比較す

多様性の約半分を占める生物群であり，進化的に最も古ると，共培養系では誘導期が 1 日長く，最終細胞密度もい起源を持つアーキアであることが示唆されている．最約 2 分の 1 となった．ARM-1 株は 814,439 bp のゲノムを大の特徴は，細胞およびゲノムが非常に小さく，中央代有し，完全な TCA 回路を持つ一方で解糖系/糖新生，核謝に関わる多くの遺伝子を持たない点である(例:TCA酸/アミノ酸/ビタミンの生合成に関わる多くの遺伝子

回路/解糖系/糖新生など)．そのためDPANN アーキアは，を欠如していた．そのため ARM-1 株は，これらの代謝

他種微生物(宿主)の代謝に依存して増殖する寄生性アーを宿主に依存して増殖していると考えられた．蛍光顕微

キアだと考えられている．また，DPANN アーキアは宿鏡観察の結果，ARM-1 株は直径 0.5 μm 未満の極小細胞

主の活動・代謝に影響を与えることで生物地球化学的物を持ち，直径 1 - 2 μm の宿主細胞とは明確に区別された．

質循環にも大きく寄与する可能性が示唆されている．以

対数期には多くの ARM-1 細胞が宿主細胞に張り付いて上のことは，DPANN アーキアの生理生態を理解するこいた一方で(図 1 )，定常期には多くの ARM-1 細胞が宿とが，地球規模での微生物生態系，生物の初期進化，更主から離れていた．このことから ARM-1 株は，宿主細には生物地球化学的物質循環を理解する上で重要な要素

胞に張り付いている際に栄養素を受け取り増殖し，増殖であることを示している．しかし，培養成功例が数例し後には宿主細胞から離れる生活環を持つことが示唆されかないため，本群の生理生態はほとんど未知である．報た．電子顕微鏡観察の結果，ARM-1 株と宿主の細胞間

告者は，本群に属する新奇アーキア( ARM-1 株)を，単に繊維状構造物が確認され(図 1 )，この構造物を利用

一の宿主( Metallosphaera sp. AS-7 株)と共に培養する

して物質の授受を行っている可能性が示唆された．また，ことに成功した．本研究では，ARM-1 株の共生機構を理

メンブレンベシクル( MV )様の構造物も確認された解するため，培養実験に基づく増殖特性の解析，蛍光顕(図 1 )．好熱好酸性アーキアが産生する MV にはタンパ

微鏡観察，電子顕微鏡観察，及びゲノム解析を実施した．

ク質や DNA が含まれており，窒素・炭素源となる可能【方法】宿主 Metallosphaera sp. AS-7 株との共培養下にお性が報告されている．そのため，この MV 様構造物が，ける ARM-1 株の増殖特性(生育温度・pH 範囲，炭素源

アミノ酸，核酸，窒素源，及び炭素源等の供給源となっ利用性，独立栄養性など)を定量 PCR 法により明らかている可能性が示唆された．本研究により，ARM-1 株にした．共培養液から抽出した DNA を Illumina MiSeqの増殖には活発に増殖する宿主細胞が重要であること，および PacBio RS II シークエンサーに供し，ショットガ

ARM-1 株は解糖系/糖新生，及び核酸/アミノ酸/ビタミ

ンゲノムシークエンシングを実施した．塩基配列断片

ンの生合成を宿主に依存していること，繊維状構造物をデ ー タ を Unicycler に よ り ア セ ン ブ リ 後，PROKKA，

用いて物質の授受を行っている可能性があること，MV

DFAST，及び RAST を用いて遺伝子情報を付与した．

様構造物がアミノ酸，核酸，窒素源，及び炭素源等の供

全遺伝子情報に基づき ARM-1 株の代謝経路を推定した．

給源となっている可能性があることが確認された．

蛍光顕微鏡観察，透過型及び走査型電子顕微鏡観察により，ARM-1 株の細胞形態を明らかにすると共に，宿主との細胞間相互作用について調査した．
【結果・考察】ARM-1 株の生育温度範囲は 50 - 75 ℃，生育 pH 範囲は 1.5 - 4.5 であった．本株は炭素源として酵
母エキス，ペプトン，トリプトン，カザミノ酸，グルコー
ス，またはスクロースを含む有機培地，更には有機物の代わりに元素硫黄や黄鉄鉱を加えた無機培地でも増殖した．ARM-1 株の増殖は宿主の増殖後に遅れて開始し，所属

創価大学理工学部 共生創造理工学科

図1

E-mail: shiroyuki@soka.ac.jp－ 184 －

ARM-1 株の電子顕微鏡写真．A:ネガティブ染色法，
B:超薄切片法，MV:メンブレンベシクル様構造物．

発酵研究所助成研究報告集
2022 年 12 月 10 日
2022 年 12 月 20 日
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第 36 号【非売品】
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左子芳彦
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樽井直樹
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