Photon Factory Activity Report 2022 #40 (2023)

BL-5A, AR-NE3A, AR-NW12A/2015G625

ヘテロ六量体型芳香環二水酸化酵素における電子受容機構の構造基盤
Structural basis of the electron transfer mechanism in heterohexamer-typering-hydroxylating oxygenases
水口 千穂 1,2, 蔡 弼丞 1, 寺田 透 1,2, 野尻 秀昭 1,2,*
1
東京大学大学院農学生命科学研究科附属アグロバイオテクノロジー研究センター
2
東京大学微生物科学イノベーション連携研究機構〒113-8657 東京都文京区弥生 1-1-1
Chiho SUZUKI-MINAKUCHI1,2, Pi-Cheng TSAI1, Tohru TERADA1,2, and Hideaki NOJIRI1,2,*
1Agro-Biotechnology Research Center, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The
University of Tokyo
2
Collaborative Research Institute for Innovative Microbiology, The University of Tokyo
1-1-1 Yayoi, Bunkyo-ku, Tokyo 113-8657, Japan
1 はじめにRieske non-heme iron dioxygenase (RO) は，様々な芳香族化合物の分解において初発反応を担うことが知られている [1]。クメンジオキシゲナーゼ (CumDO)
は Pseudomonas fluorescens IP01 株 の ク メ ン(isopropylbenzene) 分解経路の初発反応を担う酵素であり，反応を触媒する酸 化酵素 (CumDO-O) と，NAD(P)H からの電子を CumDO-O に渡すための電子伝達酵素 [還元酵素 (CumDO-R) と，CumDO-R から
CumDO-O に 電 子 を 受 け 渡 す フ ェ レ ド キ シ ン(CumDO-F)] から構成される [2]。CumDO-O を含むRO の酸化酵素の多くは，各 3 つの α, β サブユニットから成るヘテロ六量体型の構造をとる。我々は過去に共同研究として CumDO-O の結晶構造を報告した[3]。一方，CumDO-F については結晶構造の報告は無い。本研究では CumDO-F の CumDO-O に対する結合位置を明らかにするため，両者の共結晶構造の取得を試みた。また，CumDO-O のアラニン置換体を用いることで，CumDO-O が CumDO-F から電子を受け取るために重要な残基の同定を行った。

れたため，精製した CumDO-O と CumDO-F をモル比で 1:3 となるように混合し，結晶化条件のスクリーニングを行った。
一方，CumDO-O の結晶構造と CumDO-F のモデル構造を用いたドッキングシミュレーションからは，CumDO-F の結合位置として，CumDO-O の上部（図1 左）と側面（図 1 右，α サブユニットと β サブユニットの境界面）の二箇所が予測された。

2 実験
CumDO-O については大腸菌 JM109(DE3)株を宿主とし，α サブユニットと β サブユニットを同一のベクターpUC118 から発現させた。α サブユニットの C末端側に 6 × His-tag を付加し，固定化金属アフィニ
ティクロマトグラフィーにより β サブユニットとの共精製を行った。さらにゲルろ過クロマトグラフィーを行うことで，SDS-PAGE で α, β サブユニットがほぼ単一のバンドとなっていることを確認した。
CumDO-F については大腸菌 BL21(DE3)株を宿主とし，N 末端側に 6 × His-tag を付加した形で pET26b(+)から発現させ，CumDO-O と同様に精製した。過去の研究 [4] から，CumDO-O 六量体一分子に対して CumDO-F 単量体は三分子結合すると考えら

そこで，CumDO-O の上部に位置する α サブユニット表面の 8 つのアミノ酸残基と，側面に位置するα, β サブユニット表面の 8 つのアミノ酸残基について ア ラ ニ ン 置 換 体 を 作 製 し た 。CumDO-O がCumDO-F から電子を受け取り還元されると，波長457 nm の吸光度が低下することを利用し，CumDOO アラニン置換体への電子伝達効率を評価した。分
光 光 度 計 内 の キ ュ ベ ッ ト に CumDO-R, CumDO-F,CumDO-O 混合溶液を入れ，攪拌しながら NADH を添加し，波長 457 nm の吸光度の変化を測定した。
NADH 添加直後に吸光度が低下する際の直線の傾きを CumDO-O の還元効率（CumDO-F から CumDO-Oへの電子伝達効率）として評価した。

図 1：ドッキングシミュレーションから予測された
CumDO-F の結合位置。CumDO-F を青色のリボンモ
デルで，CumDO-O の表面構造を赤紫色（α サブユニット）と緑色（β サブユニット）で示した。

3 結果および考察Photon Factory Activity Report 2022 #40 (2023)

スクリーニングの結果，0.1 M MES (pH6.4~6.5) また は 0.1 M HEPES (pH6.6~6.8)，1.4~1.6 M sodiummalonate，0.7% (v/v) Jeffamine ED-2001 を含む結晶化
試薬と CumDO-O, CumDO-F 混合溶液を 1:1 で混合し，蒸気拡散法を用いて 20℃で 3~5 日静置することで結晶が得られた。しかし，これらの結晶について
Photon Factory にて X 線回折データを取得し構造決定を行ったところ，いずれも CumDO-O のみから成る結晶であることが明らかとなった。なお，後述する
電子伝達効率が低下した CumDO-O アラニン置換体を用いたスクリーニングも同様に実施したが，
CumDO-F を含む共結晶は得られなかった。
CumDO-O アラニン置換体を用いた電子伝達効率の評価では，CumDO-O の上部に位置するアミノ酸残基をアラニンに置換した際には顕著な変化が見られなかった。一方，側面に位置する K117 (α サブユニット，以下 αK117 と表記) と R65 (β サブユニット，以下 βR65 と表記) をアラニンに置換した際には，それぞれ 21%，46%まで CumDO-O の還元効率が低下した。両アミノ酸残基をアラニンに置換した二重置換体では、CumDO-O の還元効率は 20%未満まで低下した。CumDO-O 側面の α, β サブユニット境界面には，αK117 と βR65 を含む領域に窪みが存在しており（図 2），ここに CumDO-F が結合すると推測された。また，CumDO-O の αK117 と βR65 はトルエンジオキシゲナーゼ [5], ビフェニルジオキシゲナーゼ[6], ナフタレンジオキシゲナーゼ [7] など，CumDOO と同様にヘテロ六量体型の構造をとり，かつ電子供与体が Rieske 型フェレドキシンである酸化酵素ででも保存されていた。

図 2：CumDO-O の側面に位置する CumDO-F の予想結合位置。CumDO-O の表面構造を赤紫色（α サブユニット）と深緑色（β サブユニット）で，CumDO-Fの予想結合位置を橙色で示した。また，αK117 とβR65 の位置を黄色で示した。
上述の結果より CumDO-F は CumDO-O の側面に結合することが強く示唆されたため，両者が結合しているモデル構造を作成し，CumDO-F から CumDO-Oへの電子伝達経路を予測した。作成したモデル構造
では，CumDO-F の鉄硫黄クラスターから CumDO-Oの活性中心である非ヘム鉄までの距離は 19 Ǻ であり，CumDO-O の鉄硫黄クラスターまでの距離 (15 Ǻ) より も 長 か っ た （ 図 3） 。 こ の こ と か ら ， 電 子 は
CumDO-F から CumDO-O の鉄硫黄クラスターを介して非ヘム鉄へと伝達すると考えられた（図 3）。

図 3：CumDO-F，CumDO-O のモデル構造から予測された電子伝達経路。CumDO-F の鉄硫黄クラスタ
ー，CumDO-O の鉄硫黄クラスターと非ヘム鉄の間の距離を図中に示した。また，電子伝達に関与すると考えられる水素結合を赤色の破線で示した。
4 まとめ
本研究では残念ながら CumDO-O と CumDO-F の共結晶構造の取得には至らなかった。しかし，
CumDO-O ア ラ ニ ン 置 換 体 を 用 い た 解 析 か ら ，CumDO-F の結合位置が CumDO-O 側面であることが強く示唆された。また，αK117 と βR65 が他の酸化酵素でも保存されていたことから，本研究で見出した
CumDO-F と CumDO-O の結合様式は類似の構造と電子伝達様式を持つヘテロ六量体型芳香環二水酸化酵素に共通するものであると考えられた。一般に，フェレドキシンと酸化酵素は短時間で何回も結合・解離を繰り返すと言われており，この結合・解離の速さが CumDO-O と CumDO-F の共結晶が得られなかった原因となっている可能性がある。今後，
CumDO-F が CumDO-O の側面に結合することを直接的に証明するためには，化学的に両者を架橋して結合位置を調べるなどの工夫が必要だろう。
参考文献[1] D.J. Ferraro et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.
338, 175-90 (2005).
[2] H. Aoki et al., J. Ferment. Bioeng. 81, 187-96 (1996).
[3] X. Dong et al., J. Bacteriol. 187, 2483-90 (2005).
[4] Y. Ashikawa et al., Structure 14, 1779-89 (2006).
[5] R. Friemann et al., Acta Crystallogr. D Biol.
Crystallogr. 65, 24-33 (2009).

Photon Factory Activity Report 2022 #40 (2023)[6] Y. Furusawa et al., J. Mol. Biol. 342, 1041-52 (2004).
[7] B. Kauppi et al., Structure 6, 571-86 (1998).
成果
1. P.C. Tsai et al., Appl. Environ. Microbiol. 88,e0083522 (2022).
* anojiri@g.ecc.u-tokyo.ac.jp