次世代シーケンサーデータの解析手法 第 9 回
ゲノムアノテーションとその可視化、DDBJ への登録
谷澤 靖洋、真島 淳、藤澤 貴智、李 慶範、
中村 保一、清水 謙多郎、門田 幸二

日本乳酸菌学会誌
Vol. 28

No. 1

3 ～ 11（2017）

Japanese Journal of Lactic Acid Bacteria
Copyright © 2017, Japan Society for Lactic Acid Bacteria

解説

次世代シーケンサーデータの解析手法 第 9 回
ゲノムアノテーションとその可視化、DDBJ への登録
谷澤 靖洋 1、真島 淳 2、藤澤 貴智 1、李 慶範 2、
中村 保一 1*、清水 謙多郎 3、門田 幸二 3*1

国立遺伝学研究所生命情報研究センター
2
国立遺伝学研究所 DDBJ センター
3
東京大学大学院農学生命科学研究科

論文発表は研究の一部である。そして多くの学術雑誌は、論文発表される塩基配列を国際塩基配列
データベース（International Nucleotide Sequence Database Collaboration; INSDC）に登録することを義務付けている。この意味において、これまで本連載で述べてきた解析手法に関する事柄とは若干スタンスが異なるが、ゲノム配列の登録作業もまた研究の一環といえる。第 9 回は、前回までに構築したゲノム配列 Lactobacillus hokkaidonensis LOOC260T の総仕上げとして、染色体複製開始点の同定と回転、ゲノムアノテーション、INSDC を構成する日米欧三極の一つである DNA Data Bank of Japan（DDBJ）への登録、そして DNAPlotter を用いたアノテーション結果の描画について解説する。ウェブ
サイト（R で）塩基配列解析（URL: http://www.iu.a.u-tokyo.ac.jp/~kadota/r_seq.html）中に本連載をまとめた項目（URL: http://www.iu.a.u-tokyo.ac.jp/~kadota/r_seq.html#about_book_JSLAB）が存在する。ウェブ資料（以下、W）や関連ウェブサイトなどを効率的に活用してほしい。
Key words：replication origin, annotation, INSDC, DDBJ

はじめに

Desktop/mac_share」上で作業を行う［W1-1］。

第 9 回は、前回最後に作成した計 3 配列からなる LH_

複製開始点の同定

draft2.fa（2,400,619 bytes； 約 2.4MB； 第 8 回 W28） を利用する 1-2）。Bio-Linux 3） 環境下での主な作業は、最初

DNA 二重らせんモデルの提唱へとつながったシャルガの 1 項目（複製開始点の同定）のみであり、LH_draft2.fa

フの法則 4）は、「細胞内における A と T および C と G のファイルのみ手元にあればよい。また、必ずしも第 8 回終塩基の量比がそれぞれほぼ等しい（%A＝%T および %C

了時点の解析環境をスタート地点とする必要はないため、＝%G）」というものである。この法則は、後に DNA １

wget コマンドを用いて LH_draft2.fa を任意の作業ディレ

本鎖に対しても適用可能であることがわかり、第 2 項

クトリ上にダウンロードしておけば、例えば連載第 4 回終（Chargaff’s second parity rule 5））［W1-2］として付け加了時点の解析環境下でもよい。本稿では、共有フォルダ「~/えられている。しかし乳酸菌を含む多くのバクテリアにおいて、DNA の複製が始まる点（origin of replication；以下、＊To whom correspondence should be addressed.
Phone ： +81-3-5841-2395
Fax ： +81-3-5841-1136
E-mail ：	yn@nig.ac.jp or kadota@bi.a.u-tokyo.ac.jp

oriC ）の近傍では局所的に偏りが見られ、C が多い領域
から G が多い領域に切り替わることが知られている 6-11）。
GC skew は、この偏りを（G－C）/（G＋C）で表したものであり 7）、値の正負が入れ替わるポイントから oriC を—3—

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Japanese Journal of Lactic Acid Bacteria

検出する指標として用いることができる。また、oriC 領

るかの議論は行わないが、異なって予測されうるという点

域近辺には複製開始に関与する DnaA タンパク質をコーには留意するべきであろう。ここでは将来的に訂正を行う

ドする遺伝子が存在し、その上流には DnaA box と呼ばdnaA 遺伝子の翻訳開始位置（1,437,325
可能性を踏まえて、れる DnaA の結合領域となる反復配列が存在することも番目）よりも多少上流側（例えば 100 塩基上流側の 1,437,425

oriC 同定の手がかりとなる 12-14）。GC skew は（C－G）/（G番目）に起点を設定する方針にした。

＋C）として定義される場合もあるが 、符号が逆転する

具 体 的 な 手 順 と し て は、 ま ず dnaA 遺 伝 子 を 含 む 領

ポイントという意味では同じであり、どちらの数式が正統

域［1, 1437425 bp］とそれ以外の領域［1437426, 2277983

であるかといった議論は本質的ではない 11）。

bp］を入れ替えた（回転させた）後に、相補鎖変換を行

6）環状ゲノムの場合、どこを配列の起点として表記する

えばよい［W4-4］。ここでは、アドホックな Python スク

かは明確にルールが決まっているわけではないが、慣例

リプトを実行するやり方［W4-5］、および Linux コマンとして dnaA 遺伝子が配列の先頭となるように “ 回転 ”

ドと EMBOSS 18） の revseq プログラムを併用するやり方

させておくことが多い。前回予備的に行った LH_hgap.fa［W4-8］を示した。

の DFAST 15） アノテーション結果を眺めると、染色体に相当する sequence1 上のみに dnaA がコードされていた

ゲノムアノテーション［W2-1］。LH_draft2.fa を入力として再度予備的に行った
DFAST アノテーション結果においては、chromosome 上

ゲノム分野におけるアノテーションとは、塩基配列にの相補鎖側の［1436009, 1437325 bp］に dnaA がコードさ対する生物学的意味を注釈付けすることである。大まか

れていた［W2-2］。これは、oriC が dnaA 遺伝子の翻訳には塩基配列から遺伝子をコードする領域を見つけ出す

開始位置である 1,437,325 番目の塩基周辺となるであろう

構造アノテーション 19）、そしてその領域が果たす役割にことを意味する。

関する情報を付加する機能アノテーション 20）に分けられを用いて oriC の同定を行る。構造アノテーションでは、アミノ酸に翻訳される領域

う［W3-1］。Ori-Finder は、① GC skew を効率的に計算（coding sequence；CDS）や、tRNA、rRNA などの遺伝する方法の 1 つである Z-curve 法 17）、② DnaA box の分子をコードする領域をはじめ、リピート領域やオペロン構布、そして③ dnaA 遺伝子の予測結果を総合的に評価し造、真核生物であればエクソン構造といった様々な構造情ている。Ori-Finder の入力は 1 配列のみからなる single-

報の推定も行われることがある。機能アノテーションでは、

FASTA 形式ファイルである（プログラム開発者との確認

BLAST 検索による配列類似性や、Pfam・Rfam などによ済み）。ここでは multi-FASTA ファイル（LH_draft2.fa）

る配列モチーフ、タンパク質ドメイン構造予測結果を基にから、染色体配列に相当する最初の 1 件分（つまり 2 行分）

した遺伝子産物名の推定が中心的な作業となる。また、そのみを抽出した single-FASTA ファイル（seq1_draft.fa；の推定がどのような根拠に基づいているかといった信頼度［W3-2］）を入力として Ori-Finder を実行した［W3-3］。

に関する情報や、外部のデータベース（以下、DB）への

Ori-Finder 実行結果として、3 つの oriC 候補領域が得ら

参照情報の追加も含まれる。

ウェブツール Ori-Finder

16）

れ た［W3-4］： ①［1396338, 1396990 bp］、 ②［1435834,

一般に、あるデータに対して注釈付けされた（アノテー1436008 bp］、③［1437326, 1438021 bp］。我々は、3 番目

ションされた）付随情報のことを、データについてのデーの oriC 候補領域の先頭部分（1,437,326 番目の塩基）が前タという意味でメタデータと呼ぶ 21）。INSDC を構成する

述の DFAST アノテーション結果から得られた dnaA 遺DDBJ 21）・GenBank 22）・ENA 23）に登録された配列データ

伝子の翻訳開始位置（1,437,325 番目の塩基）と近接してにおいては、次のような配列自体に対する付随情報を指しいたことから、基本的には 1,437,325 番目の塩基を起点とて特にメタデータと呼ぶ場合が多い。これらも広義のアノ

して回転させればよいと判断した。

テーションといえる。

若干本題からずれるが、予測された dnaA 遺伝子の開・登録者情報（誰がどのような研究プロジェクトによって始コドンは、一般的によく知られている ATG ではなくGTG になっている［W4-1］。バクテリアの場合は GTG

登録したか）
・生物種に関する情報（どのような生物に由来する配列の（や TTG）も開始コドンをコードしているため、この結果ものであるか）は間違いではない［W4-2］。但し、使用する遺伝子領域予・実験条件（どのような方法で決定された配列であるか）

測ソフト次第で開始コドンが異なる位置になることは珍し・文献情報（その配列がどのような文献で述べられている

くない。実際、我々以外にも L. hokkaidonensis の基準株

か）のゲノムを解読し公開しているグループが存在するが、彼

尚、INSDC 設 立 当 初 は 現 在 の 正 式 な DB 名 で あ る

らの結果（アクセッション番号：JQCH01000005.1）では、ENA ではなく、EMBL（European Molecular Biology

今回の結果よりも上流側に存在する ATG を翻訳開始点とLaboratory）という組織が提供する（塩基配列 DB の通して予測している［W4-3］。どちらが真の翻訳開始点であ称 と し て の ）EMBL で あ っ た。 こ れ は DDBJ と い う 組—4—Jpn. J. Lactic Acid Bact.		

Vol. 28, No. 1

織（DDBJ センター）が運営する（塩基配列 DB として

ddbj.nig.ac.jp/getentry/na/U00096.3）。U00096 は こ のの）DDBJ と同じような位置づけである。ENA は DB 名

entry の識別子（アクセッション番号）を表し、ピリオド

であり、運営主体は EMBL 傘下の EBI（The Europeanの後の 3 はバージョン番号を示す［W5-1］。これは、配列

Bioinformatics Institute） で あ る。GenBank が DB 名 でが最初の登録後から 2 回更新されていることを意味する。

あることは広く知られているが、その運営主体は NCBI

登録直後は U00096.1、1 回目の更新後に U00096.2、そし（National Center for Biotechnology Information）である。

て 2 回目の更新後に U00096.3 となる。上から順に見ていこれらの理由により、運営主体と DB 名を連結した NCBI

くと、生物種名とともに登録者情報や文献情報といった

GenBank、EMBL-EBI ENA といった表現もよくなされメタデータが記載されている［W5-2］。U00096 は、大腸る。連載第 3 回 24）で紹介した次世代シークエンサデータ

菌の中でもモデル株といえる K-12 株のものである。この25）

もまた、INSDC を構成する三極（DDBJ・

entry には計 18 件の REFERENCE が記載されており、1

NCBI・EMBL-EBI）で運用されている。特に説明もな

件目のものは本菌株のゲノムが最初に解読された 1997 年

く DDBJ SRA（ 通 称 DRA）・EMBL-EBI ENA（ 通 称

の原著論文

リポジトリ

30）

である。

ENA）・NCBI SRA（通称 SRA）と記載したが、運営主体

続いてこの entry にアノテーションされた feature がと DB 名を連結した表記であったことがわかる。INSDC

並 ぶ［W5-3］。source feature は、 配 列 全 体 に 対 す る 記の三極はデータの共有を行っているため、1 つの機関で登述を行う特別な feature であり、基本的には各 entry の最録されたデータは他の機関にも同期される。しかし、次初 に 1 つ だ け 存 在 す る［W5-4］。gene feature は CDS・節でも述べるようにデータの書式は DB ごとに異なって

rRNA・tRNA などの遺伝子領域を記載する際に用いられ、いる。

次の CDS feature はタンパク質をコードする領域について記載している［W5-5］。バクテリアは通常 1 遺伝子 1 タ

INSDC フラットファイルの構成

ンパク質であるため、わざわざ gene feature を記載する
意味合いが感じられないかもしれない。しかしながら、真INSDC に登録されたゲノムとアノテーション情報の記

核生物でスプライスバリアントがある場合には、1 つの載内容について述べる。INSDC のデータ公開形式はフラッgene feature に対して複数の CDS feature が結びつけられ

ト フ ァ イ ル と 呼 ば れ、entry・feature・qualifier の 3 つることを想像してもらえれば納得できるであろう。

の階層構造からなる。GenBank のフラットファイル形式

CDS feature の 内 容 を さ ら に 細 か く 記 述 し た も の が（GenBank 形式と呼ばれる）は、多くのソフトウェアが対

qualifier で あ り、 そ の 具 体 例 が 遺 伝 子 シ ン ボ ル を 示 す

応している標準的な形式である。DDBJ は、GenBank とgene qualifier、 遺 伝 子 産 物 名 を 示 す product qualifier、似た形式である DDBJ 形式を採用している。ENA のフラッ

翻 訳 さ れ た ア ミ ノ 酸 配 列 を 表 す translation qualifier な

トファイル形式は、他とはやや異なっており独自の情報もど で あ る［W5-6］。 こ の エ ン ト リ 中 に は な い も の の、追加されている。また、歴史的経緯から ENA 形式ではな

experiment qualifier によって実験的に裏付けがなされてく EMBL 形式と呼ばれる。この階層構造はいずれの形式

いることが示されているものもある［W5-7］。

においても共通であり、自作プログラムでフラットファイ

gene や CDS 以 外 の feature の 種 類 と し て は、tRNA

ルから情報を抽出する場合や、INSDC へ配列を登録する

feature、rRNA feature、repeat_region feature［W5-8］、

場合にもこの構造を理解しておくことが重要である。もncRNA feature［W5-9］ な ど が 存 在 し、 そ れ ぞ れ を 特

ちろんこれらのファイル形式を取り扱うためのプログラ

徴付ける qualifier によって詳細な情報が記述されてい18）
ム群は整備されている。それが EMBOSS （の seqret プ

る。 各 feature の 記 載 方 法 は、INSDC の Feature Table

ログラム）や、連載第 1 回 26） でも紹介した BioPerl 27）・

Definition で定められている［W5-10］。他にどのようなBiopython 28）・BioRuby 29）などである。

種 類 の feature が あ る か や、feature ご と に ど の よ う な

階層の最上位である entry は、塩基配列の登録単位を表す。単一の遺伝子の塩基配列が 1 つの entry を構成するこ

qualifier が使えるかに関する情報は、DDBJ が公開している対応表がわかりやすいだろう［W5-11］。

ともあれば、コンプリートゲノムのように 1 本の染色体で1 つの entry を構成することもある。ドラフトゲノムではlocus_tag について

1 本のコンティグやスキャッフォールドが１つの entry となる。entry 中の注釈付けされた各領域のことを feature

locus_tag と い う qualifier は、 ア ノ テ ー シ ョ ン さ れと呼ぶ。feature には、ゲノム中での位置を示すためのた遺伝子領域を指し示すための一意な識別子である

location 情報、および feature の内容をさらに細かく記述［W6-1］。 大 腸 菌 K-12 株 の 染 色 体 配 列（U00096） 中 でするためのいくつかの qualifier が含まれている。

も locus_tag qualifier が 見 ら れ る が、 こ の ゲ ノ ム は 古

DDBJ 形 式 の entry の 具 体 例 と し て、 大 腸 菌 K-12 株

くに登録されたものであり現在の locus_tag の形式とはの染色体配列の登録内容を示す（図 1；http://getentry.

異 な っ て い る［W6-2］。 現 在 は、3 文 字 以 上 の 英 数 字—5—Vol. 28, No. 1		

Japanese Journal of Lactic Acid Bacteria

図 1．DDBJ フラットファイル形式の例
大腸菌 K-12 株の染色体配列。① gene feature* は、CDS、rRNA、tRNA などの遺伝子領域に対してつけられる。真核生物でスプライスバリアントがある場合には、
1 つの gene feature に対して複数の CDS feature が結びつけられることがある。

—6—

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からなる locus_tag の prefix と、登録者が任意に決めら

Vol. 28, No. 1を得ることができる。

れる英数字（tag）とをアンダースコアでつないだ形式

Prokka は、CDS、rRNA、tRNA の 予 測 と い っ た 基（prefix_tag）に決められている。例えば、2014 年に登録

本 的 な ア ノ テ ー シ ョ ン に 加 え て、CRISPR（Clustered

さ れ た L. hokkaidonensis 1） の GenBank accession 番 号

regularly interspaced short palindromic repeats）32） やAP014680 を 眺 め る と、1 つ め の feature の locus_tag がシグナルペプチドの検出機能を備えている。Prokka の高LOOC260_100010 となっており、現在の形式と合致して速なアノテーションは、予測された CDS を複数の参照アいる［W6-3］。prefix は、同一ゲノム内では同じものを

ミノ酸配列 DB に対して段階的に検索していくことで実用いる必要がある。また、アノテーションされたゲノム

現されている。はじめに近縁種から得られた配列を中心

を INSDC に登録する際には、他のゲノムで使用されていに構成されたより信頼できる参照 DB に対して BLAST

ない locus_tag prefix を予め取得しておかねばならない。

検索を行い、そこでヒットしなかった遺伝子はより包括

AP014680 の場合は、菌株名と同じ LOOC260 がそれに相的な参照 DB を用いて検索される。そこでもヒットしな当する。アノテーションをつけずに配列のみを登録する場

かった遺伝子については、最終的に隠れマルコフモデル

合には、locus_tag prefix の取得は不必要である。tag はゲを用いたモチーフ・ドメイン検索ソフト HMMER3 33） をノム中での出現順に通し番号を使用することが多いが、後使って Pfam 34） や TIGRFAMs 35） などの DB に対して検から追加・挿入されることを想定して 10 飛びの値を使う索を行う。DFAST は、第 1 段階目の検索を乳酸菌（主にこともある［W6-4］。また、tRNA には t0001、rRNA に

Lactobacillus 属および Pediococcus 属）用に独自に用意しは r0001 など区別して割り当てることもある。

た参照 DB に対して行うことで、DDBJ にそのまま登録可

他には、gene feature とそれに対応する CDS feature な

能なレベルのアノテーションが可能となっている。現在のどの間では同じ locus_tag を割り当てなければならないな

DFAST は、大腸菌やシアノバクテリアなどの生物種にもどの決まりがある。locus_tag の用法に関する公式情報に同様の参照 DB を拡張したほか、他の系統群のバクテリアも目を通しておくとよいだろう［W6-5］。尚、DDBJ やにも使用できる汎用的な参照 DB を用意している。

ENA では登録時に gene feature を要求していないため、

DFAST 独自の機能として、CheckM 36） を用いたゲノ

これらの 2 機関で登録されたデータには gene feature がム の ク オ リ テ ィ チ ェ ッ ク と average nucleotide identity

存在しないものがある。しかし、GenBank にデータが同（ANI）を使った系統名のチェックもオプションで行う

期される際には GenBank 上で自動的に gene feature が付ことができる［W7-2］。CheckM は、系統群ごとにマー加される［W6-6］。逆に、GenBank で登録されたデータ

カーとして用いる遺伝子セットを定義しており、このマーについては、DDBJ や ENA 上で眺めても gene feature がカーの有無を調べることによってゲノムの completeness

存在する。

や contamination といった指標を算出している［W7-3］。
マーカーには、通常 1 つのゲノムに 1 つのコピーのみ存

DFAST を用いたゲノムアノテーション

在する遺伝子が選ばれている。このため、入力ゲノム配列中に同定できたマーカーの数が少ないと completenessdnaA 遺伝子（の転写開始点上流 100 塩基）が先頭とが低く報告され、同じマーカーがゲノム中に複数コピーなるように変換した乳酸菌コンプリートゲノムファイル

同 定 さ れ る と contamination の 値 が 高 く 報 告 さ れ る 傾

15）向となる。以前我々が Lactobacillaceae 科乳酸菌ゲノムを用いた本番のゲノムアノテーションを行う［W7-1］。

743 件について CheckM を実行したところ、743 件中 654

DFAST は、バクテリア用ゲノムアノテーションパイプ

件（約 88%）が CheckM 内で示された基準（95% 以上のラインである Prokka 31）をベースとして、乳酸菌用に整備

completeness と 5% 未 満 の contamination） を 満 た し た。

（LH_complete.fa;［W4-6］） を 入 力 と し て、DFAST

2）

された参照データベースを組み合わせたものである 。ま高い completeness に越したことはないという一方で、ゲ

た、アノテーションされたゲノム配列を DDBJ に登録す

ノムサイズが小さく縮退が進んでいるような菌種では低いるための支援機能をもつ（正確には登録に必要なファイル傾向にあるという報告もある 37-38）。値の解釈に迷ったときを半自動生成できる）のが特徴である。我々はこれまで

は、同種のゲノムと比較検討するとよいだろう。

DFAST 経由で 10 件以上の Lactobacillus 属ゲノム配列の系統名のチェックに用いられる ANI は、全ゲノム情報

DDBJ への登録を行ってきたが、いずれも手作業での修正を用いた種同定のための指標であり、2 つのゲノム間のをほとんど必要とせずに完了できている。これまでの予備

アラインメントにおいて相同性が認められた領域の平均的なアノテーション（W2-2；第 8 回の W4）作業の手順

塩基一致度から算出される。ANI は同じ菌種に属するゲからもわかるように、ログインなど事前登録の必要なく無ノムであれば、概ね 95% 以上の値を示すことが知られて償で利用可能であり、DDBJ への登録を行わずにアノテーいる 39）。DFAST では、基準株を中心に選定した 185 菌種（亜ションのみを行うこともできる。ゲノムサイズ 2 〜 3Mbp

種も含む）の representative genomes を対象として ANI程度の典型的なサイズの乳酸菌であれば、5 分ほどで結果を計算することで、アップロードしたゲノムの系統的位置—7—

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Japanese Journal of Lactic Acid Bacteria

付けのチェックが可能である［W7-4］。Lactobacillus 属［W8-1］。 入 力 フ ァ イ ル（LH_complete.fa） は、dnaA 遺には、plantarum グループや casei グループのように 16S

伝子の翻訳開始位置よりも 100 塩基上流が配列の先頭になrRNA の配列を用いた種同定が難しい菌種が含まれているように変換したものであった［W4］。アノテーション結るが、ANI を用いることで十分な分解能で Lactobacillus

果が実際にそうなっていることの確認は行っておくべきで属 の ゲ ノ ム を 同 定 で き る こ と が 確 か め ら れ て い る 15）。

あろう［W8-2］。Feature table の View ボタンを押すとDFAST では、誤った情報が公共 DB に登録されることを予測された遺伝子の塩基配列やアミノ酸に翻訳した配列が事前に防ぐ目的で、このような菌種同定ツールを提供し確認でき［W8-3］、そのまま NCBI の BLAST ウェブサーている（図 2）。また、DFAST の関連 DB である DAGA

ビスに対して検索をかけることもできる［W8-4］。Edit（DFAST Archive of Genome Annotation）では、公開さボタンを押すと、アノテーションされた遺伝子名、遺伝子れている乳酸菌ゲノムデータに対し系統名や品質の査定

シンボルを編集することができる。また、Note 欄に特記を行った上で DFAST による再アノテーション情報を提事項を加えることもできる［W8-5］。これらの編集した情供している。前述の representative genomes についても、報はダウンロードされる結果ファイルにも反映されるた

DAGA で参照することができる。

め、画面上でも正しく反映されているか確認しておくとDFAST 実行結果画面の "Features" タブをクリックすよい。

ると、アノテーションされた feature の一覧が見られる

図 2．DFAST 実行結果画面
dnaA 遺伝子（の転写開始点上流 100 塩基）が先頭となるように変換した乳酸菌
コンプリートゲノムファイル（LH_complete.fa;［W4-6］）を入力として DFAST を実行した結果画面［W7］。① Genome Statistics のところで、入力配列の基本統計
量などの情報が得られる。② Download Files および Genome Assessment のとこ
ろで、アノテーション結果や ANI および CheckM 実行結果ファイルをダウンロー
ドすることができる。③ Genbank 形式の DFAST アノテーション結果ファイル（annotation.gbk）は、図 3 の入力として使われている。
—8—

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DDBJ 登録用ファイルの作成

Vol. 28, No. 1

ある［W6-3］。これらの情報を取得しておかないと、「2.
Input Metadata」で行うメタデータ情報の実際の入力段

DFAST 実行結果画面の "DDBJ Submission" タブをク

階で行き詰まる［W9-4］。ここでは、作業後に得られるリックすると、DDBJ への登録ファイルを作成する画面がDDBJ 形式ファイルのイメージを掴むべく、仮の値を入力表示される［W9-1］。ここでは、ゲノムを登録するためにして最後まで作業を進めた［W10］。画面の指示に従って必要な登録者情報や文献情報などのメタデータを入力する

入力項目を埋めていくことで、実際に公開されているもことができる。画面の指示に従って入力項目を埋めていけの（AP014680）とほぼ同じ形式のものが得られることをば、登録用ファイルを作成できるようになっている。今実感できるであろう［W10-12］。W10 の内容については、

回のようなコンプリートゲノムの登録の場合は、はじめ

DDBJ への登録の説明と合わせて第 10 回でも改めて解説に各配列の名称（entry 名）、種別（染色体またはプラス

する予定である。

ミドなど）、形状（直鎖または環状）の指定を行う必要がある［W9-2］。ドラフトゲノムの場合には、デフォルト

アノテーション結果の描画

では sequence## となっている配列の接頭辞を、例えば
contig## のように変更することができる。

最後に、DNAPlotter

40）を用いた L. hokkaidonensis の以降の作業は通常、DDBJ への登録と並行して行う。具

染色体マップを示す（図 3；W12）。入力は、Genbank 形

体 的 に は、DDBJ の 登 録 ア カ ウ ン ト の 取 得、BioProject

式の DFAST アノテーション結果ファイル（annotation.

の登録、BioSample の登録などである。locus_tag prefixgbk）である。①時計の 0 時に相当する部分が複製開始点

は、BioProject または BioSample の登録時に取得可能でである。一番外側から、②順鎖上および相補鎖上の CDS、

図 3．L. hokkaidonensis LOOC260T の染色体マップ
Genbank 形式の DFAST アノテーション結果ファイル（annotation.gbk）を入力として、DNAPlotter を用いて染色体配列に相当する sequence1 のアノテーション
結果のみを表示［W12］。①複製開始点。②外側が順鎖上の CDS、内側が相補鎖上の CDS［W12-4］。③ tRNA［W12-6］。④ GC 含量［W12-11］。⑤ GC skew［W12-18］。
①の複製開始点付近において、C が多い領域から G が多い領域に切り替わっているのがわかる。
—9—

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Japanese Journal of Lactic Acid Bacteria③ tRNA、④ GC 含量、そして⑤（G－C）/（G＋C）で定防ぐため、そしてプラスミド配列に相当する 2 番目のみ、義した GC skew が示されている。実際の複製では、①のあるいは 3 番目のみの配列を入力としたプラスミドマップ

複製開始点から時計回りに進む順鎖側、そして反時計回りを作成できるようにするためである。ここでは 1 番目のみに進む相補鎖側がリーディング鎖となる。リーディングの配列を抽出する目的で awk コマンドを［W14］、2 番目

鎖により多くの遺伝子が存在している傾向が、② CDS の以降の配列を抽出する目的で grep・head・tail・パイプコ

密度の違いから確認できる。また、入力配列は dnaA 遺

マンドを併用する例 24） を示した。これらもまた、Linux伝子が先頭に来るように配列を回転させたものであるた

コマンドを実際の現場で利用する好例であろう。

め、①の複製開始点付近において C が多い領域から G が多い領域に時計回り方向で切り替わっているのがわかる。

謝

辞

1）

本連載の一部は、科学技術振興機構 バイオサイエンスの Fig. 1A と本質的に同じであることもわかるであろう

データベースセンター（JST-NBDC）、および情報・シ［W12-20］。

ステム研究機構 国立遺伝学研究所（遺伝研）との共同研

使用プログラムおよび色の違いはあるものの、原著論文

今回は、DNAPlotter が 3 配列からなる annotation.gbk

究（2012-2088, 2013-2070）の成果によるものです。また、を読み込んでも、染色体配列に相当する 1 番目の配列のみ

JSPS 科研費 JP25712032, JP15K06919 の助成を受けたものしか認識しないことを逆手にとって染色体マップを作成しです。農業・食品産業技術総合研究機構 畜産草地研究所

た。しかし、DNAPlotter のように 1 番目の配列しか認識の遠野雅徳先生には、本稿で用いた乳酸菌ゲノム配列解読

しないことがわかっているようなプログラムを利用する場

論文の責任著者として、また編集委員会委員として本連載

合には、描画したい単一の配列情報のみを抽出したファイの円滑な執筆環境構築に尽力いただきました。

ルを作成・利用する。第一義的には想定外の挙動やバグを		
参 考 文 献1）	Tanizawa Y, Tohno M, Kaminuma E, Nakamura Y, Arita
M. (2015) Complete genome sequence and analysis of
Lactobacillus hokkaidonensis LOOC260T, a psychrotrophic
lactic acid bacterium isolated from silage. BMC Genomics
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2）	谷澤靖洋，神沼英里，中村保一，遠野雅徳、寺田朋子、清水
謙多郎，門田幸二（2016）次世代シーケンサーデータの解析
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3）	Field D, Tiwari B, Booth T, Houten S, Swan D, et al. (2006)
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4）	Chargaff E. (1951) Structure and function of nucleic acids ascell constituents. Fed Proc 10: 654-659.
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11）	Arakawa K, Tomita M. (2012) Measures of compositional
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17）	Zhang R, Zhang CT. (1994) Z curves, an intutive tool for
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19）	De Bodt S1, Raes J, Florquin K, Rombauts S, Rouzé P, et al.
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23）	Toribio AL, Alako B, Amid C, Cerdeño-Tarrága A, Clarke L.
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Jpn. J. Lactic Acid Bact.		

Res 45: D32-D36.
24）	孫建強，三浦文，清水謙多郎，門田幸二（2015）次世代シーケ ン サ ー デ ー タ の 解 析 手 法： 第 3 回 Linux 環 境 構 築 か ら
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26）	門田幸二，孫建強，湯敏，西岡輔，清水謙多郎（2014）次世
代シーケンサーデータの解析手法：第 1 回イントロダクショ
ン．日本乳酸菌学会誌 25：87-94．
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programming language. Bioinformatics 26: 2617-2619.
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35）	Haft DH, Selengut JD, Richter RA, Harkins D, Basu MK,
et al. (2013) TIGRFAMs and Genome Properties in 2013.
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symbiont Lactobacillus kunkeei reveals its niche-specificadaptation. Syst Appl Microbiol 39: 516-526.
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40）	Carver T, Thomson N, Bleasby A, Berriman M, Parkhill J.
(2009) DNAPlotter: circular and linear interactive genome
visualization. Bioinformatics 25: 119-120.

Methods for analyzing next-generation sequencing data
IX. Genome annotation, visualization, and registration to
DDBJ
Yasuhiro Tanizawa1, Jun Mashima2, Takatomo Fujisawa1,
Kyungbum Lee2, Yasukazu Nakamura1, Kentaro Shimizu3,
and Koji Kadota3
Center for Information Biology, National Institute of Genetics.
2
DDBJ Center, National Institute of Genetics.
3
Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo.
1

Genome annotation is a fundamental process in the sequence analysis, through which biologicalknowledge is generated from sequenced genomic data. Good annotation not only enhances our own
downstream analyses but also promotes subsequent researches by others because it can propagate
through public sequence databases. In this article, we will show how annotated genomic data aredescribed in the public databases. And then, we will introduce how to use the bacterial annotation
pipeline DFAST (DDBJ Fast Annotation and Submission Tool). DFAST is developed to facilitatequick and accurate genome annotation as well as data submission to DDBJ. It was originally designed
specific for lactic acid bacteria and now extended to other organism groups. We finally present a
method to visualize chromosome maps from DFAST annotation results. Supplementary materials areavailable at our web site, http://www.iu.a.u-tokyo.ac.jp/~kadota/r_seq.html#about_book_JSLAB.
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