X 線顕微鏡によるホヤ血液細胞内のバナジウムマイクロ分布観察と XANES 解析
竹本邦子
木原 裕

関西医科大学物理学教室〒5731136 大阪府枚方市宇山東町1889

関西医科大学物理学教室〒5731136 大阪府枚方市宇山東町1889

要旨
ホヤ血球内におけるバナジウムのマイクロ分布と化学状態を，ESRF の走査型 X 線顕微鏡ビームライン（ID21）で測定した。マイクロ XANES 解析の結果，加圧凍結法で凍結し，生きた状態を保ったままのシグネットリング細胞の液胞は 3 価のバナジウムで満たされており，さらにその液胞内には，4 価のバナジウムからなる微粒子が存在していることが分かった。

.

はじめに
生物はある種の金属元素を進化の過程で取り入れ，機能Table 1(mM ).

Concentration of vanadium in tissues of several ascidiansに利用してきた。鉄，銅，マンガンなど呼吸系や光合成系

A. gemmata A. ahodori A. sydneiensis Halocynthia
samea
roretziに多く利用されている。バナジウムもゴカイの仲間のエラ
Tunic

N.D.

2.40

0.06

0.010

Mantle

N.D.

11.20

0.700.001

Branchialbasket

N.D.

12.90

1.400.004

Blood cells
Serum347.20
N.D.

59.90
1.00

12.80
0.05

0.007
0.001

コ1) やベニテングダケ2) などいくつかの生物に含まれており，なかでもある種のホヤの中では海水中の 1000 万倍もの高濃度で蓄積されている3)。しかし，その生理的な意味は全く理解されていない。
ホヤは，主に浅い海にすむ無脊椎動物で，地球上に広く生息し，これまでに少なくとも 3,000 種が同定されていN.D. not determinedる。

Table 1 に，バナジウムを高濃度に濃縮している代表的な 3 種 の ホ ヤ （ Ascidia gemmata  バ ナ ジ ウ ム ボ ヤ ， A.

10 種類に区分されている。バナジウムがどの細胞に選択

Ahodori ナツメボヤ， A. sydneiensis sameaスジキレボ的に含まれるかも興味の深いところである。

ヤ）と，食用にされるマボヤ（ Halocynthia roretzi ）の各

我々は，走査型 X 線顕微鏡をホヤの血液細胞観察に応組織中のバナジウム濃度を示す。表から明らかなように，用し，世界で初めて，生きた状態を保ったホヤの血液細胞

3 種のホヤの血球中にはきわめて高濃度のバナジウムが蓄中のバナジウム分布を可視化することに成功した6)。さら積されている。特に，バナジウムボヤという和名を持つに，そのバナジウムの化学的状態を測定することができ

A. Gemmata の血球には，バナジウムが，海水に溶解してた7)。本稿では，走査型 X 線顕微鏡で行われた，「生きている濃度 35 nM の 1000 万倍に相当する 350 mM という高いる」状態に近いホヤの血液細胞内におきているバナジウ

濃度で濃縮している4,5) 。比較的濃縮され易いとされていムのマイクロ分布の測定およびマイクロ XANES 解析にる鉄においても，褐藻中に濃縮されている鉄の濃度は海水ついて紹介する。の 1 万倍程度であることからも，ホヤの体内に濃縮しているバナジウムの濃度がいかに高いかということが分か.

ESRF 走査型 X 線顕微鏡

本 実 験が 行 わ れ た ESRF の X 線顕 微 鏡 ビ ーム ラ イ ンる。
では，なぜホヤだけが，これほど高い濃度のバナジウム（ ID21 ）は，数 keV 領域の走査型 X 線顕微鏡の研究を行

イオンを体内に濃縮するようになったのか，その濃縮機構うことのできる世界で唯一の施設である。このエネルギーは，またその生理的役割は何であるか。これらの答えは未領域ではバナジウム，硫黄，リン，マグネシウム，シリコだ得られていない。

ンなどの吸収端を利用した XANES を行うことができる8)。

バナジウムは多元価元素で，水溶液中では， 5 価， 4Fig. 1 に X 線顕微鏡ビームライン（ ID21 ）の光学系を価，3 価， 2 価の価数をとりうる。海水中では，一般に 5示す。Si(111)モノクロメータで分光された X 線は，ゾー価の陰イオン（HVO24－）として存在している。

ンプレートで集光され，試料に照射される。試料を掃引しホヤの血液細胞は，形態学的分類により，シグネットリながら透過光および蛍光を検出することにより，吸収像おング細胞，モルーラ細胞，コンパートメント細胞などほぼよび蛍光像を得ることができる。試料ステージは，ステッ100 ● May 2004 Vol.17 No.3
(C) 2004 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Research

生命科学特集 ■ X 線顕微鏡によるホヤ血液細胞内のバナジウムマイクロ分布観察と XANES 解析

Figure 1. Diagram of the scanning x-ray microscope installed at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)
ID21 beamline. The x-ray beam from the undulator at the storage ring is monochromated by a ˆxed exit double crystal
monochromator and focused on the sample by a zone plate objective lens and a small pinhole aperture.

ピングモーターとピエゾ素子を組み合わせた機構を採用し，広い駆動範囲（± 5 mm ）と，高い位置分解能（ 10nm ）を持つ。透過光の検出器には，PIN フォトダイオードを，蛍光の検出器には，ゲルマニウム半導体検出器を用いている。試料チャンバーは，減圧することも可能で，またクライオノズルの導入により，凍結試料（ステージ表面温度－ 120 °C ）の観察も行うことができる。試料チャンバー内の試料ステージと，ハッチの外にある微分干渉型光学顕微鏡の XY ステージとの間には，高精度の位置決め機構が整備されている。これを利用することにより，光学顕微鏡で決定した場所は， X 線線顕微鏡でも的確に指定することができ，迅速な測定が可能となっている。
本実験では，バナジウムの K 端吸収端よりもやや高エFigure 2. Light microscope image of blood cell suspension. SRC:signet ring cell. MC: morula cell.

ネルギーである5.5 keV の X 線を用い，吸収像と，バナジウムの蛍光像を同時に撮影した。ビームサイズの最小直径は1 mm，試料スキャンの最小ステップは0.5 mm である。

学顕微鏡で同定した，シグネットリング細胞，モルーラ細胞，コンパートメント細胞，アメーボ細胞の全ての細胞に.

バナドサイトの同定とバナジウムの細胞内分布対応した透過像が，良好なコントラストで確認できる。し実験には，地中海産のホヤ Phallusia mammillata およかし，バナジウムの蛍光像では，シグネットリング細胞とび日本産のホヤ Ascidia sydneiensis samea を用いた。血球アメーボ細胞に対応した細胞しか確認できなかった。以上は，密度勾配遠心法により，各細胞集団に分離した後，4の結果より，シグネットリング細胞とアメーボ細胞がバナ°Cの培地の中で保存された。血球はこの状態で，約 1 週間ジウムを濃縮している細胞（バナドサイト）であると同定

生きつづけることができる6)。

された。

Fig. 2 は，懸濁液の光学顕微鏡写真である。全体の約次にシグネットリング細胞内の，バナジウムの細胞内分70 がシグネットリング細胞，残りはモルーラ細胞等か布を調べるため，細胞を，凍結乾燥法と浸漬凍結法で固定らなっている。シグネットリング細胞は，そのほとんどがした試料についてバナジウムの蛍光像の観察を行った。

液胞で，細胞膜周辺部に核を有した指輪型の形をしていることが分かる。

Fig. 4 は，凍結乾燥試料の X 線顕微鏡像である。バナジウムの分布が， A は液胞内にほぼ均一に分布している

Fig. 3 は，ウエットな状態の血液細胞の光学顕微鏡像，のに対し， B は細胞膜周辺部にバナジウムが分布していX 線顕微鏡透過像，バナジウムからの蛍光像である。光る。これは，凍結乾燥を行う過程において，液胞内のバナMay 2004 Vol.17 No.3 ● 101

Figure 3. Phallusia mammillata blood cells observed by diŠerential interference contrast light microscopy (A), by x-ray
microscopy in transmission mode (B), and in the ‰uorescence mode for vanadium (C) and ‰uorescence spectra emitted
from the blood cells. Transmission and ‰uorescence images were taken by scanning cells with a 5.500 keV x-ray at a 1 mm
×1 mm resolution. Vanadium is accumulated in signet ring cells (SRC, shown by arrows) and in a vacuolated amoebocyte (VA), but not in morula cells (MC) and compartment cells (CC). Argon peak comes from air.

Figure 4. Freeze-dried Phallusia mammillata blood cells as shownby x-ray microscopy in transmission (left hand side) and ‰uorescence mode for vanadium concentration (right hand side). Transmission and ‰uorescence image was taken by scanning cells with a5.500 keV x-ray at 0.5 mm×0.5 mm resolution. Vanadium was located in signet ring cells (SRC, shown by arrows).

ジウムが流失した可能性を示唆している。

Figure 5. Fluorescence image of vanadium in immersion cryo-ˆxation by isopentane Ascidia sydneiensis samea blood cells.

Fig. 5 は，液体イソペンタン中で浸漬凍結した血液細胞の X 線顕微鏡写真である。バナジウムの分布状態に統一性はなく，凍結乾燥した試料でも観察された細胞周辺部

ウムの化学状態を生きた状態で保ったまま凍結できる方法

への濃縮や，複数の内部の高い濃縮部分の存在，液胞内均として，加圧凍結法を用いて試料調整を行うことにした。

一分布などが，同じ視野内に見られる。これは，浸漬凍結

加圧凍結法とは， 210 MPa の高圧液体窒素を試料に一法で実現できた凍結状態に幅があったことを示している。

気に吹き付けることにより，生物試料を生きた状態に近い以上の結果より，ホヤの血球を生きた状態を保ったまま状態で固定する方法である9)。加圧凍結法では，試料を両で凍結するには，浸漬凍結法は充分ではないことが分かっ

面から冷却させることにより，大型の試料（～ 600 mm ）た。そこで我々は，血球が破裂しないで，細胞内のバナジを，ガラス状態に保ったまま凍結することができる10)。

102 ● May 2004 Vol.17 No.3

生命科学特集 ■ X 線顕微鏡によるホヤ血液細胞内のバナジウムマイクロ分布観察と XANES 解析

Figure 6. Fluorescence image of vanadium in high pressure cryoˆxation Ascidia sydneiensis samea. Bools cells.

凍 結 試 料 は ， 加 圧 凍 結 装 置 （ BAL TEC 社 製HPM010)11)を用い作製した。懸濁液を滴下し，しばらく置いたコロジオン膜の張られた電顕メッシュを，専用の銅製の試料セル 2 枚で挟み，加圧凍結装置で凍結する。凍結後は，液体窒素中で保管し，試料ホルダーへの取り付けも液体窒素中で行われた。

Fig. 6 は ， 加 圧 凍 結し た 細 胞 の X 線 顕 微 鏡 写 真で あFigure 7. Vanadium K-edge XANES spectrum of whole bloodcells and micro XANES spectra in vacuole and from the micro-granule. Black line: whole blood cells, red line: vacuole (Fig. 6 spot A),
blue line: vacuole (Fig. 6 spot B), green line: micro-granule (Fig. 6spot C). Beam size of XAFS is 100 mm and micro XAFS is 1 mm.
C. X-ray energy was 5.500 keV. FluoresSamples were kept at －120°
cence yields were normalized to 1 at the energy above the main absorption edge, 50 eV. Pre-edge peak energy shift, ▲ : 3.4 eV, △ : 1.8eV.

る。液胞内は，バナジウムで満たされていることが分かる。その液胞内には，直径約 3 mm の大きさの高いコントラストを示す微粒子が確認できる。そのバナジウム蛍光強よるバナジウムの同定を行った。 A と B 点のプレエッジ

度は，液胞内バナジウムの 4 倍以上を示している。このピークは， 3.4 eV と 1.8 eV の 2 つのピークからなり， C微粒子は，全てのシグネットリング細胞の液胞内で観察で点は 3.4 eV のピークからなる。 Frank 等の結果から， 3.4きた。

eV のピークは，4 価のバナジウム，1.8 eV のピークは，3価のバナジウムと推定することができる。

.

血液細胞内バナジウムのマイクロ XANES 解析

ここで，液胞と微粒子に存在するバナジウムの全てが，加圧凍結したシグネットリング細胞の液胞内のバナジウ

それぞれ全て 3 価と 4 価であると仮定すると，1 個のシグムと，バナジウムの高い蛍光強度を示した微粒子内のバナネットリング細胞に存在するバナジウムの存在比は，細胞ジウムについてマイクロ XANES 解析を行った。 Fig. 7

液胞と微粒子の占める体積率から換算することができ，は マ ク ロ XANES と マ イ ク ロ XANES ス ペ ク ト ル で あ98  2 という値が求まる。この値は， ESR と放射化学分る。マイクロ XANES のビームサイズは， 1 mm で，液胞析法から求まった値97.62.4と非常によく一致する17)。

内（A, B ）と高い集積を示す部位（C）で測定を行った。

ところが， 100 mm のビームを用いて，同じ加圧凍結試

横軸は金属バナジウム箔から得られたエッジからのエネル料の XANES 測定では，ほとんどが 4 価のバナジウムとギーシフト量を，縦軸はバナジウム蛍光強度を表す。蛍光いう結果が得られた7)。この結果は，懸濁液中には，血液強度は，バナジウムの K 吸収端から 50 eV 以上離れた強細胞内に存在しているバナジウム以外にバナジウム元素が度で規格化してある12)。

存在している可能性を示すものである。Frank 等も，採取バナジウムのプレエッジは，価数に大変敏感で，例え場所の異なるホヤの血球細胞では，バナジウムの 3 価と 4

ば，酸化バナジウムは，価数が高いほど，金属バナジウム価の存在比が異なるという結果を得ており16) ，このことのエッジからのエネルギーシフト量が大きくなり，また強は今後の検討課題であるといえる。

度が高くなる13,14)。また，バナジウム錯体の配位子（リガところで，液胞内に存在している微粒子（グラニュール）ンド）や対称性も，吸収端とプレエッジのエネルギーシフの存在については，これまでも研究者等には知られておト量および蛍光強度の変化に強く反映される。 Frank 等

り，光学顕微鏡で観察することもできる。また，分析電子は，ホヤの血球集団の XAFS を行い，存在する可能性の顕微鏡観察において，この微粒子からバナジウムが検出さある様々な種類のバナジウム錯体の標準 XANES 測定をれたという報告もある18) 。これより，我々が検出した主行ってきた1416) 。これらのデータを元に，プレエッジにに 4 価のバナジウムからなる直径約 3 mm の微粒子は，上May 2004 Vol.17 No.3 ● 103

述のグラニュールと同じものである可能性がある。
10)

.

まとめ

11)

走査型 X 線顕微鏡を用いて，ホヤの血球細胞の中で，シグネットリング細胞とアメーボ細胞がバナドサイトと同定することができた。シグネットリング細胞の液胞は，主に 3 価のバナジウムで満たされており，その中に，主に 4価のバナジウムからなる直径 3 mm 程度の微粒子（グラニュール）が存在していることが分かった。
今後は，バナジウム化合物の配位構造の決定に大きな手がかりを与えると考えられる硫黄をターゲット元素として，マイクロ XANES 解析を行う予定である。
謝辞
本稿は，広島大学理学部附属臨海実験所の道端齊教授，

12)
13)
14)
15)
16)
17)
18)

Electron Microscopy 2, 33 (1968).
R. Dahl and L. A. Staehelin: J. Electron Microsc. Tech. 13,165 (1989).
H. Moor: Cryotechniques in biological electron microscopy(R. A. Steinvrecht and Z. Zierold, editors. Springer-Verlag/
Germany, Berlin, 1987) 175.
J. Wong, F. W. Lytle, R. P. Messmer and D. H. Maylotte:Phys. Rev. B. 30, 5596 (1984).
T. D. Tullius, W. O. Gillum, R. M. K. Carlson and K. O.
Hodgson: J. Am. Chem. Soc. 102, 5670 (1980).
P. Frank, K. O. Hodgson, K. Kustin and W. E. Robinson: J.
Biol. Chem. 273, 24498 (1998).
P. Frank and K. O. Hodgson: Inorg. Chem. 39, 6018 (2000).
P. Frank, R. M. K. Carlson, E. J. Carlson and K. O. Hodgson: J. Inorg. Biochem. 94, 59 (2003).
J. Hirata and H. Michibata: J. Exp. Zool. 257, 160 (1991).
L. S. Botte, S. Scippa and M. de Vincentiis: Experientia 35,1228 (1979).

著者紹介

植木龍也助教授，ESRF の Dr. J. Susini, Dr. F. Barbara,

竹本邦子

Dr. M. Salom áe，長浜バイオ大学の山本章嗣教授，東京慈関西医科大学物理学教室

恵医科大学の佐々木博之博士らとの共同研究の内容をまとE-mail: takemoto＠makino.kmu.ac.jp

めたものである。ホヤの採取にあたっては，東京大学海洋研究所大槌臨海研究センター（現国際沿岸海洋研究センター）の盛田孝一技官をはじめとするスタッフおよびナポ
リの Stazione Zoologica `Anton Dohrn' のスタッフの方々にお世話になった。改めて深く感謝の意を表したい。

略歴
東京工業大学理工学研究課金属工学専攻博士課程終了。博

参考文献士（工学）。1995年関西医科大学物理学教室助手を経て，

1)

現在，同教室講師。放射光を光源とした X 線顕微鏡の開

2)
3)
4)
5)
6)

7)

8)

9)

T. Ishii, I. Nakai, C. Numako, K. Okoshi and K. Okamoto:
Naturwissenschaften 80, 268 (1993).
H. Kenifel and E. Bayer: J. Am. Chrm. Soc. 108, 3075
(1986).
M. Henze: Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 72, 494 (1911).
H. Michibata, T. Terada, N. Anada, K. Yamakawa and T.
Numakunai: Biol. Bull. 171, 672 (1986).
H. Michibata, Y. Iwata and J. Hirata: J. Exp. Zool. 257, 306(1991).
T. Ueki, K. Takemoto, B. Fayard, M. Salom áe, A. Yamamoto, H. Kihara, J. Susini, S. Scippa, T. Uyama and H.
Michibata: Zool. Sci. 19, 27 (2002).
K. Takemoto, T. Ueki, B. Fayard, M. Salom áe, J. Susini, A.
Yamamoto, H. Kihara, S. Scippa and H. Michibata: X-Ray
Microscopy (Proceedings of the 7th International Confer336.
ence, J. Susini et al., ed., EDP Sicences, 2003) 333J. Susini, R. Barrett, B. Kaulich, S. Oestreich and M.
Salom áe: X-Ray Microscopy (Proceedings of the 6th International Conference, Meyer-Ilse, W., Warwick, T. and Attwood, D.: editors, AIP Conference Proceeding, 1999) 19.
H. Moor and U. Riehle: Proc. 4th European Reg. Conf. of104 ● May 2004 Vol.17 No.3

発および応用研究に従事。主に，立命館大学 SR センター

X 線顕微鏡ビームライン（BL12）利用。

木原裕

関西医科大学物理学教室
E-mail: kihar＠makino.kmu.ac.jp

略歴
東京大学理学系研究科物理学専門課程単位取得退学，理学博士。自治医科大学講師等を経て，現在関西医科大学物理学教室教授。専門 X 線顕微鏡，蛋白質のフォールディング。

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Micro XANES Study on Vanadium in Ascidians Alive Blood Cells Investigated by Fluorescence Scanning X-Ray Microscopy at ID21 at ESRF
Kuniko TAKEMOTO
Hiroshi KIHARA

Department of Physics, Kansai Medical University,
1889 Uyama-Higashi, Hirakara, Osaka, 5731136, Japan
Department of Physics, Kansai Medical University,
1889 Uyama-Higashi, Hirakara, Osaka, 5731136, Japan

Abstract
X-ray microscope installed at the beam line ID21 at European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) was used tothe elucidation of micro-distribution and chemical states of vanadium in ascidians. In combination with a high pressure cryo-ˆxation technique, we have succeeded in observing uniform distribution of vanadium in the vacuole, in
identifying the 3rd valency in the signet ring cell, and more importantly in ˆnding granules rich in vanadium of the4th valency

May 2004 Vol.17 No.3 ● 105