微生物共生を活用する物質生産

菩提酛のメカニズムと微生物の遷移松澤菩提酛は，室町時代中期に，奈良市の郊外にある菩提菩提酛の製造方法

山正暦寺において創製された酒母で，現在普及している速醸酛や生酛系酒母の原型であると考えられている 1–3)．
この酒母の製造法は，気温の高い時期や温暖な地域にお一幸｢御酒之日記｣ に記述されている菩提酛の製造法を，
図 1 に示す．

いて比較的安全に酒造りが可能なものとして広く普及し

この酒母製造には，現在の清酒造りには見られない次のていたとされており，菩提酛，水酛，漬け酛，笊籠酛（いような特徴が見られる．①清酒製造は通常冬場に行われてかきもと），菊酛，被酛（かぶりもと）など，いろいろいるが，菩提酛は温暖な環境で製造される．②清酒の酒母な名称で呼ばれていた 2)．しかし，明治になって乳酸をの原料米はすべて蒸してから使用されているが，菩提酛使用する速醸酛の技術が開発され，酒母の製造操作が容では生米を使用し，そこに少量の飯米を加えて乳酸発酵易，かつ安全，しかも短期間に製造できるようになり，を行う．この乳酸発酵酸性液を「そやし水」と呼び，このこの速醸酛の技術が全国に普及して，菩提酛は大正時代水を仕込み水として利用している．現在の清酒製造法にはに姿を消したとされている 4)．そのため菩提酛に関する見られない，これらの特徴的な製造方法を科学的に究明

研究については数が少なく 4,5)，これらの研究は，いずしたことが菩提酛の製造メカニズムの解明につながった．

れも研究室の環境下で総米 1 kg 程度の規模で実験が行われている．その結論として，自然集積する微生物を利用

菩提酛における微生物の遷移する菩提酛造りでは，混入する微生物によって酒質が大幻と考えられていた菩提酛が，神社庁の委託を受けてきく変動することが欠点であり，それが菩提酛の衰滅し昭和初期から連綿と，奈良県内の酒造場で一般の本格的た原因の一つであると指摘されている 4)．

な清酒製造に先がけて毎年 10 月中旬の比較的温暖な時

この幻となっていた菩提酛を用いた清酒（菩提酛清酒）期に，総米 1 トンの規模で御神酒用濁酒の酒母として育を再現，復活させるため，1996 年に奈良県内の酒造会成され利用されてきた．このことを知り，1999 年 10 月

社有志・正暦寺・奈良県工業技術センターをメンバーと実態調査を行った 6)．図 2 にそやし水工程における微生して ｢奈良県菩提酛による清酒製造研究会｣ が立ち上げ

物の経時変化を示す．生米を水に浸漬する温 度 は 約られた．また，関係機関・関係者の協力を受けながら活20qC で，一般細菌数は 24 時間後に 107 cfu/ml に増殖し動を続け，1998 年に菩提酛清酒を再現，復活することた．乳酸菌は 32 時間後に 107 cfu/ml になり，その後も増ができて，現在商品化している．

殖を続け 90 時間後には 108 cfu/ml 以上になった．そして，

図 1．菩提酛の製造法
著者紹介

図 2．そやし水における微生物の経時変化．●，乳酸菌；○，酵母；△，一般細菌．

奈良県工業技術センター（統括主任研究員） E-mail: matsuzawa-kazuyuki@of¿ce.pref.nara.lg.jp

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そやし水の pH が 4 まで低下すると一般細菌数は激減し4.3）まで低下し菌数は漸減，Lb. paracasei は pH 3.2（酸た．一方，発酵性の強い酵母はそやし水の初期には観察

度 3.7）まで低下しても菌数変化は認められなかった．

されず，100 時間目以降に出現した．

次に，アルコールをファクターとして培養した時の経酒母工程においては，酵母は 10 cfu/ml から 4 日目に時変化を図 4 に示す．GYP 培地にアルコールを添加し，108 cfu/ml に増殖し，酸度 7.3，アルコールが 6.6％蓄積されると，乳酸菌は 10 の 1 に減少した．一方，一般細7％と 15％に調整して 30qC で培養した結果，7％ではLc. lactis と Leu. citreum は 3 日目には減少が認められ，菌数は 2 日目以降 103 cfu/ml 以下であった．

5 日目には死滅した．一方，Lb. pentosus では漸減傾向が7

醪工程においては，酵母は 108 cfu/ml で推移した．品認められた．Lb. paracasei では減少が認められずアル温が高かったため 3 日目でアルコールが 14％まで増加すコール耐性が強い株であることを確認した．15％ではると，乳酸菌は 10 cfu/ml から 10 cfu/ml に減少した後すべての菌株が減少したが，菌株によって菌数の減少ス

6 日間菌数変化は認められなかった．しかし，アルコーピードが異なることを確認した．

65ルが 16％以上に増加すると急減した．
濁酒の製造過程における乳酸菌叢の変化

以上の結果から，菩提酛製造の各工程における乳酸菌
乳酸菌はそやし水初期に 10 cfu/ml まで増殖し，その主要菌叢は7Lactococcus lactis であった．そやし水後期には菌数はの遷移は，微生物が有する特性と，その増殖環境にあると説明することができる．
歴史のある蔵内で古い木桶（図 5）を使い，70 年余り10 cfu/ml に増加し，乳酸が蓄積し pH4，酸度 3.2 とな
8

ると菌叢が変化し，Lc. lactis と Leuconostoc citreum が混在した．酒母工程になると Lc. lactis が減少し，一方Leu. citreum が増加して 4 × 108 cfu/ml となり主要菌叢となった．酒母工程後期（酸度 7.3，アルコール 6.6％）には菌数は 5 × 107 cfu/ml に減少して Lactobacillus pentosusが主要菌叢となった．醪中の変化については，初期菌数は 107 cfu/ml で Lb. pentosus と Lactobacillus paracasei
が主要菌叢として混在した．発酵終了時には 104 cfu/mlに低下して Lb. paracasei が主要菌叢であった．
これらの乳酸菌叢の遷移原因について検討するため，pHをファクターとして培養した時の経時変化を図 3 に示す．

GYP 培地を pH 4 に調整し 30qC で培養すると，Lc. lactis
は 7 日目に pH 3.7（酸度 1.7）まで低下して菌数は激減した．Leu. citreum は pH 3.6（酸度 2.3）まで低下し菌数の減少が認められた．一方，Lb. pentosus は pH 3.1（酸度

図 3．初発 pH4 における菌数経時変化．●，Lc. lactis；○，Leuc.
citreum；▲，Lb. pentosus；△，Lb. paracasei．

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図 4．濁酒乳酸菌のアルコール耐性．●，Lc. lactis；○，Leuc.
citreum；▲，Lb. pentosus；△，Lb. paracasei．

図 5．木桶生物工学第89巻

微生物共生を活用する物質生産も連綿と製造されてきた濁酒造りでは，毎年のように酒

表 1.

正暦寺由来の乳酸菌の特性
形態
サイズ
グラム染色
カタラーゼ
発酵形式
生成乳酸
＜生育特性＞
10qC
45qC
6.5％食塩質が異なるという．まさに，目に見えないところで，蔵付き微生物の複雑な遷移，生存競争が行われているのであろう．
菩提酛製造のメカニズム
そやし水製造工程における有用乳酸菌の探索

1996 年から菩提酛清酒の再現に取り組み，試行錯誤しpH 9.6ながら調査・研究を繰り返した．

：：：：
：
：

球菌（二連卵型）
0.7 〜 1.0 Pm
陽性
陰性
ホモ発酵
L型

：：：
：＋−＋＋

その中で，菩提酛製造のメカニズムを究明する上で重要な役割を果たしたのが，正暦寺境内の山水より分離した乳酸菌であった．この乳酸菌は，前述の御神酒用濁酒製造工程の実態調査でも確認されたが，次の実験の中でた．表 1 にこの菌の諸性質を示す．また，これらの諸性偶然に発見したものであった．

質の他，アピ 50CHL および遺伝子塩基配列による同定安定したそやし水（乳酸酸性水）を製造することが菩提酛製造の特徴であり，また必須要件であると考えた．
そこで生酛や山廃酛では重要な役割を果たしているの結果，正暦寺の山水由来の乳酸菌は，Lactococcus lactis

subsp. lactis であることを確認した．
乳酸菌の特性

生米浸漬液中で正暦寺由来の乳酸菌

Lactobacillus sakei（IFO 3541）を，生米浸漬時に 106 cfu/Lc. lactis subsp. lactis（以下，正暦寺乳酸菌），Lb. sakei,ml 添加しそやし水の製造を行った．この実験で乳酸菌

Leuconostoc mesenteroides について乳酸生成量の経時変数は，仕込み後 12 時間目に 2 × 107 cfu/ml まで増殖した化を図 7 に示す．正暦寺乳酸菌は，清酒醪中で観察され後，24 時間目まで菌数は停滞した．その時の pH は 4.6，る他の乳酸菌と比べ，速やかに乳酸を生産していた．

酸度は 0.3 であった．30 時間後になると 4 × 10 cfu/ml ま

そやし水の初期に正暦寺乳酸菌を添加した場合，短時で急増し，pH の低下と酸度の増加が観察された（pH 4.0，間で正暦寺乳酸菌が増加し速やかに乳酸が生成されるた．菌数変化に注目して経時的に乳酸菌の菌叢を酸度 0.8）め，そやし水の pH を 4 以下に低下させることで細菌数観察したところ，仕込み初期は Lb. sakei と認められるグを激減させるメカニズムを確認した（図 8）．また，この

ラム陽性の桿菌であったが，24 時間後にはグラム陽性正暦寺乳酸菌は，前述した濁酒製造工程の初期で確認さ8．の球菌に主要菌叢が変化していた（図 6）
このグラム陽性球菌の由来を調査した結果，仕込み水として使用した正暦寺の山水に生育していることを認め

図 6．Lb. sakei 添加．そやし水の経時変化．●，乳酸菌；△，細菌；＊，pH．

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れた Lc. lactis と一致したことから，温暖な環境におけるそやし水の製造に重要な役割を担っているものと判断された．

図 7．乳酸菌の生酸性比較．培養条件：培地，殺菌生米（70％精 米 ） 浸 漬 液； 温 度，30qC． ●， 正 暦 寺 乳 酸 菌； ○，Leu.
mesenteroides（NRIC1517）；△，Lb. sakei（IFO15893）．

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特集

図 8．正暦寺乳酸菌添加そやし水の経時変化．●，乳酸菌；△，細菌；＊，pH．条件：乳酸菌，正暦寺乳酸菌添加；培地，生米（70％精米）浸漬液；温度，30qC．
図 10．糖生成に及ぼす pH の影響．条件：30qC，3 日；原料米，ヒノヒカリ（70％精白）．

菩提酛製造の最大の中に含有される D-glucosidase が重要な役割を果たして特徴は，そやし水工程で生米を使用することである．ないると推察し，生米中の D-glucosidase の分離・精製をぜ蒸米ではなく生米なのか？

その疑問解決の糸口は，試みた．酵素の分離は，生米を磨砕しリン酸バッファー

生米を 30qC で pH 4 の酢酸緩衝液に浸しておくとグルコーで抽出，硫安分画後，CM-Cellulose, SephadexG-100,スが生成することから，生米中の酵素が関与しているもDEAE-Cellulose の各カラムクロマトグラフィーを用いのと考えた．そこで pH 4 の酢酸緩衝液に生米の精米歩合て酵素を精製した．なお，D-glucosidase 活性は 4- ニトを 90％から 30％まで変化させて，30qC で 3 日間浸漬しロフェニル D-D-グルコピラノシドを使用して測定した．

グルコース生成量を測定した．その結果，いずれの精米

その結果，生米中の D-glucosidase は分子量 88 kDa，至適歩合の生米においても 1％以上のグルコース生成を確認

pH 4.3（図 11），耐熱性 50qC の特性を有した．

生米に含有される酵素と特性した（図 9）．また，他に 11 品種の白米についても同様の実験を行い，同じ結果を得た．

そやし水に飯米を添加する効果

古文書によれば，そやし水の製造に生米に 1 割の飯米（D 化した米）を添

生米浸漬液の pH を 3 から 7 に変化させ生成する糖組加している．その理由について確認するため，生米だけ成を分析した結果，生成グルコース量は pH 4 から 5 で最で調整したそやし水と，生米に蒸米を加えたそやし水で大となり，pH 7 では 2 分の 1 以下に減少した．マルトース．pH 4，30qC生成するグルコース量を比較した（図 12）は pH 5 では検出されず，pH 7 では少量生成した（図 10）．

で放置したとき 1 日目の生成量は生米だけの場合の 5 倍

千葉らは生米中に D-glucosidase が存在すると報告し量であったことから，飯米はグルコース生産に寄与してている 7)．そやし水に生米を使用する理由として，生米

図 9．生米からグルコースの生成．pH 4 酢酸緩衝液中，30qC，3 日反応．

476いることを確認した．

図 11．生米より分離した D-glucosidase の pH 特性

生物工学

第89巻

微生物共生を活用する物質生産

図 12．蒸米添加とグルコースの生成．条件：温度，30qC；原；生米：水：蒸米＝ 20：30：3．
料米，ヒノヒカリ（70％精白）

菩提酛製造のメカニズム

以上の結果から，菩提酛

図 13．菩提酛のメカニズム

濁酒の製造過程における乳酸菌叢の変化においても述

製造のメカニズムは，べたように，関与する乳酸菌は Lc. lactis だけでなく，数①生米が温暖な条件で浸漬液中に乳酸菌 Lc. lactis が混入

多くの乳酸菌がそれぞれの特性に応じて遷移している．

する．
②生米には酵素が存在し，デンプンからグルコース，マルトースを製造する．

一般にこれらの乳酸菌と酵母は共生の関係にあると考えるが，火落菌などの有害乳酸菌が混入した場合には深刻な事態となるであろうし，過去には深刻な事態を引き起③生成した糖を乳酸菌が利用し，増殖と乳酸の生産を行う．

こしたこともあろう．幸いなことに，正暦寺では菩提酛

④乳酸蓄積により pH が 5.0 以下にすばやく低下する．

復元以来 13 年間無事に酒母を提供することができてい⑤生米中の D-glucosidase が活性化される．
⑥ D 化されたデンプンから，よりたくさんのグルコースる．このことは，菩提酛の製造法が全国に広まった事実を裏づけているものと考える．

が供給される．
⑦ pH が 4.0 以下となり有害菌が激減する．
⑧ pH 低下と十分なグルコースの供給により酵母が増殖し，良質の酒母が完成する．
以上のメカニズムを図 13 に示す．
このように，中世に創製された菩提酛は現在普及している速醸酛の原型であり，温暖な環境下，生米浸漬液中の乳酸菌の特性，生米酵素の関与などの絶妙な関係を保

文

1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)

献

花岡正庸：実験清酒醸造法講義，丸亀税務監督局 (1917).
加藤百一：酒は諸白，p. 189，平凡社 (1989).
梅田紀彦：最新酒造講本，p. 84，日本醸造協会 (1989).
秋山裕一ら：醸協, 75, 314 (1980).
河合正人：醸協, 91, 311 (1996).
松澤一幸：醸協, 97, 734 (2002).

Chiba, S. et al.: Agr. Biol. Chem., 35, 2015 (1971).

ちながら酵母が純粋培養され，いわゆる酒母が完成する．

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