S M 0 Nのウイノレス学的研究

井上幸重，西部陽子，中村良子（京都大学ウイルス 研究所）
木村輝男（大阪市立衛生研究所）

I序

われわれは以下に述べる研究結果から，SMON患者糞便よりBAT-6細胞 に高率に分離された新しいウイルスをSMO Nの病因ウイノレスとして推定するに至った。 こLにその初段階の 研究のみ報告する。

II

研究材料並びに方法
1. SMO N患者材料：岡山のSMO N患者の 糞便並びに血清は岡山 大学医学部俵教授から分与載き，大阪のSMO N並びに非SMO N患者の 脊髄液は大阪，北野病院神経内科の木島部長から分与載いた。
まだ北海道のS MO N患者脊髄液は札幌医 大の金光教授から分与して載いた。
2.

BAT-6細胞とその取り扱い：B AT- 6細胞はわれわれ の研究室で樹立されたもので，ウシ

adenov ir us 3型により形成されたハムスタ ー 皮下腫蕩のクロ ー ン化継代細胞 である。
i）保存継代：Growth rneium は5 % fetal calf ser um加Eagle MEMでpHは 6. 5
継代は普通 4 日毎。 先ずg r ow t h medium を捨てた後室温のo. 2 5 % tr y p s i n i n O. 5 %lactaldumin hydr olys ate Ear le 液 を中角瓶の場合 l0M加えて室温で 30秒 ～1分間作用させて捨て る。 残ったわずかのt rypsin液で振り乍ら細胞を消化する。 細胞がはがれたら遠心することなく4倍量のgrowth med i四n lこ suspendして分注培養する。
II) tube の作り方： cell susp ens ion を0.5 me 宛tuh e に分注して培養。

2日自に

1 meの maintenance mediwnで交換する。 maintenance mediumは2 %fetalcalf

se r田n並びに0.1%y east extr act (Difeo）加Eagle MEMでpHは6.5 0

tub eはmainte nance medium に変えてその日のうちに供試する。感染後6日間の観察を行う。
Iii) C PEの観察：細胞変性効果（CPE）は弱拡大（ 40倍）で広い cell s hee tを全体的に読む様にする。 C p Eはcell s heet の上部より始まる inc amp le te C P Eである。（第1図参照）
iv) mycop 1 asma 対策：B AT- 6細胞或いは糞便由来材料に みられるmycoplasma の汚染はmediumにl eu comyc in (Toyo Zyozo Co·)
-31-2r/m.e添加により防除すること が出来る。
4.

抗ウイ ノレス 免 疫血清：ウイルス感染B AT-6 細胞培養液のみ採取して 5, o o o r pm 3 o 分遠心上清をウイルス抗原としてウサギを免疫した 。免疫方法は Freundcompleteadjuvan t と共に皮下注射，その後ウイルス抗原のみ静脈内注射をくり返して免疫した。
5,

中和試験：ウイ／レス 30 ～ 1 O OTCD soに対する血清稀釈法によって行った。反応時聞は 3 7 ℃ 1時間。

直結1.

果
岡山地方 SMON 患者糞便からのウイルス分離：第l表に示す如く，ウイルスは5例の SMON

患者糞便乳剤全例よりB AT-6 細胞に同種の細胞変性効果（ CPE ）を示して初代で分離された。その一 つ佐藤株は連続継代培養を行って代表株とした。 これに対し健康者2例の糞便材料からは同 一 方法でウイノレスは分離されなかった。
第1

表

Results of virus isolotiom from stool andspinalandNo. of

fluid of SMON patients in Okayama

OsakaDote 。 fResidence

pofienfonce!

Dole ofDofe ofsfoolSF。
collecfed collecfed

Seo. 18,'69 No 机， s;&s234Okoyom。
Prefect.

Aug. 4,'69

助以， s;&sJun. 13， 包 9Nov. 19:69

Ocf. 27, 69

Resulfvirus。15!0lot，。n bt C＋

Nov. 19， ’＇69＋5M。y 21,'69糊19，回

6

Dec 28 ，回

Moに5,'70

7

Mer. 30,'68

Feb. 4,70+d8

Jun. 15 ， ち 9

Feb. 4;70＋目＋9Aug. 27， 包 9

Feb. 4知＋

10

Feb. 20,7oJun. I宮内＋

Osoko
Prefect.

1960

Jun. 15,'70＋

12Mor. 20,70

Jun. IS,7o＋13Jυ 札 13，＇ゎ

Jul. 15,70

14M。y 10,70

Jul. 15,70＋15

Jul. 10片Jul.23＋

11o. SF: spinol fluid。

：ゎ且All sfroins W町e culliv ted more lhon 2肉店内回 ．
c. Soto sfroin, prototype from stool，問s culfivoted mo陀竹田n
2 posso ges.
d. Konoyo stro,n, prototype from SF, wos cullivofed more !hon10 p ssoges.

。

。

-3 2 一2.

大阪地方 SMON 患者脊髄 液からのウイノレス分離：第 1 表に同じく示す如く， 1 0 例の SMON

患者脊髄液 のうち 8 例から B AT-6 細胞に C p E を示すウイ ルスが分離さ れた。 この中 には発病後 10年に及んでなお入院中の陳旧例の脊髄液からウイノレス分離が陽性であった事実が含まれている。 これらのうち金谷株 を代表株として連続継代培養を行った。
3北海道地方 SMO N 患者脊髄液からのウイノレス分離：第 2 表に示す如く， 2 9 例の SMON患者脊髄液のうち 2 3 例からウイルスが分離された。 %9 6 株を代表株として連続継代培養を行った。
第2表

Results of virus isolation from spinal fluidof SMON patients in ト何 kkoido
No. ofpotienl

Dole ofonce!

5-F61924
33
38
47
51
55
56
59
81
82

90

94
96
104
108
11 2113
11 4159
180
187
191
196
202

20G：

Sep. I ち9Mロr. � '70
Mロy 8, '70’Dec.
69
Moy 5，’’ 70
Jun. 17， 70

Dロle of SFcollecte dJun. 15 , 70
Mor.
’69
Jロn.
'70
’70
Apr.
Jun. 20,'70
Moy 29,'70

Apr. 4, '70
Apr. 4, '70
Moy 28 ，’ 70
Jun. 4, ' 70
Jun. 23 ，’ 70
Jun. 24，’ 70
Jun. 9，’70
Jun . 26, ' 70
Jun. 23 ，’70
Jul. 2, '70
Jul. 2, '70’70Jul.
Jul. 24, '70

MロyMoyAug. I 0, 70
Aug. I 0, '70

Jun.

Nov.

'70
'70

'70

’69

Aug. 6, '70
Aug. 6，ワoAug. 6, '70
Aug 6, '70
Sep. 5, '70
Aug. 6，’70
Aug. 5 ，’70
Oct. I, '70
Oct. 8, '70
Oct. 28, '70
Oct. 30, 70

Resu It of virus向siliver o te 。
isolotion＋＋＋＋＋＋＋＋．

2拾9＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋。陶. of positive / No. of person tested

4.

非 SMON 患者脊髄液からのウイルス分躍：大阪地方の非 SMO N 患者脊髄液 1・ 8 例から BAT-6 細胞にウイルスは 全く分離されなか った。
5.

分離ウイルスの同定： B AT-6 細胞はこれまでのテストから多くのヒトの腸内ウイルスに感受性を示さないことが明らかであり ，そのウイルス分離はかなり選択的である。 しかして ，岡山の SM)N
患者糞便由来の佐藤株ウイルス に対する抗血清で大阪並びに北海道の SlV.lO N 患者脊髄液由来の全ウイ
ルス は 中和されることから ， B AT-6 細胞に同種のC p E を示して分離さ れたウイルスは血清学的に-3 3ー

同ーとみなされる。
6SMO N 患者血清の中和抗体価：第 3 表に示す如く， S MO N 患者血清では 1 5 例中 1 3 例に血清稀釈5 ～ 1 0倍と言う低い中 和抗体を証明出来るが ，非流行地の健康者成人血清1 0例の中和抗体はいずれも5倍以下であった。
3第表

Positive rote of neutralizing antibody
in normal and pa tient sero
Sero

Days ofter

Result of向sitive

testedonce!

NT testrote 0No.of po↑ient
2
3
678
9161718
1920212223+b6284
159
67676234
161
14961( 3677( 2867137(17230450112＋_c＋＋＋＋＋13Jis＋(工+ (5 )+ (10)(＋＋＋

No. of normol odult
0/10l～10

ロ No. of問sitive / No. of person testedb + : 50%endpoint of serum dilution ogoinst
30 ～ 100 TCD50 wos 5～10
C - : <51.

SMO N と無菌性髄膜炎の関係：第4表に示した大阪地方の無菌性髄膜炎患者2例の脊髄離から

BAT-6 細胞に C p E を示すウイルスがそれぞれ分 d された。 しかし ，初代サ／レ腎細胞， He La
胞には向 ー 材料から C p E を示すウイルスは分峰出来なかったコ
第Patient4

表materials

of aseptic meningitis

AgeSex

Dote ofonce!

Oロte ofspinol fluid
col lected

Dote ofserum
collected

Prognosis

63♂

Jul. 2，’70

Jul. 20，’70

Aug. 19,'70

cure

Moy 6,'70

Jul. 13，’70

Aug. 3，’70

cure43-34 ー細第表

5

Cross reactions among viruses isolated
from patients of SMON and aseptic meningitis

Vi「usAntiserum

usedNormal serum

Nogoo
patientInouepatientrabbit

human
adult

50

320

160

<5<5。sep↑ic meningi↑is50

320

N.D.b

く5<5st roi「1osept』c meningitis

50

320

160

く5

く5

Sotorabbit。

strainONstrain。 ， sor. endpoint of serum dilution against
b. Notdetermined30

却100 TCD50

分離されたウイルスの血清学的性状は第5表に示す如〈中和試験により佐藤株ウイルスと完全に同 ーであった。 そして無菌性髄膜炎患者の依復期血清中和抗体価は3 2 0倍並びに1 6 0倍と言う高い価を示した。
8.

分離ウイノレスの2 . 3の性状：この様にしてSMO N患者の糞便並びに脊髄液から高率に分離されたウイノレスの性状に関する詳細は次報にゆずるが， 2 • 3の知見は以下の様である。
i) He :.a細胞，初代サル腎細胞， ヒト胎児腎細胞に対するC p E：第6表に示す如く上記培養細胞に対するC p Eは認められたい。
第表

6Cytopothic effect of the virus
to different cells
Source of virus
Virus grown
S↑001 susp.
in BAT 6 cells

Cel Is tested
0BAT-6 cells
Helo＋b＋cells

Monkey kidneycells
Human embryonic _kidney cellso. Homster tuπ下or cells induced by type 3 bovine
odenovirus
b. Determined by CPE.

-35ーN 考察

岡山の SMO N患者糞便から分離され た ウイルスは大阪並びに北海道の SMO N 患者しかもその1.

髄液に高率に証明された 。非 SMO N患者脊髄液から同ウイノレスは通常証明されない。従って，SMONとこのウイノレスの関係は地域によって異な ることなく明瞭であ る。
2. 例外的に非S MO N患者髄液にウイルスの証明された2例は無菌性髄膜炎患者であり ，回復期患者血清は高い中和抗体価を示した。 これに対し SMO N 患者の 極めて低い中和抗体産生状況をみるとき

SMO Nを免疫反応不全に伴う新種ウイノレス感染症と考える。
SMO N患者からウイルス分離が高率であることは免疫反応不全にもとづく持続性ウイ／レス感染

3.のためと考えられ， SMO N症状の亜急性経過或いは再燃にもつら なる点であろう。

SMO N 患者糞便由来のウイノレスは そのエーテノレ感受性，特異な host4.

range 等から新種のウイルスと推定される。 その性状は病原性を含めて今後の報告で明らかにする予定である。

SMO Nの病型或いは疫学の 全貌はこの新種ウイルスとの関連において明らかにされねばならな

s.

u、。
SMO Nのウイルス学的研究を進めるに はまず旧来の常識にとらわれない研究 の姿勢が必要であ6る。 B AT-6 細胞にみられる弱い C p E の判定をめぐって努力扱きの不毛の論議が行われるのは患者不在の研究者のエゴイズムに よるものと考える。

V結論

岡山の SMO N患者糞便より既知の腸内ウイルスと性状を異 にする新しいウイノレスが高率に分離された。 同種ウイノレスは地域を異にする大医並びに北海道の SMO N 患 者の脊髄液からも高率に分離される。
同ウイルスに対して SMO N 患者血清は極めて低い中和抗体価を示すが，健康者成人血清には証明されない。 また 非S MO N 患者の脊髄液から同種ウイルスは通常分離出来ない。 しか し，例外的に 2例の 成
人の無菌性髄膜炎患者の脊髄液から同ウイルスが分離され，回復期患者血清は高い中和抗体価を示し た。
故に， SMO N を免疫反応不全に伴う新種ウイ／レス感染症と考える。 SMO N の病型或いは疫学の全貌はこの新種ウイルスとの関連において追求されねばならない。 分離ウイノレスの性状はその病原性を含めて ，今後の報告で明らかにする予定である。
文1.

献井上孝重，西部陽子，中村良子：スモン患者糞使より高率分離された新 しいウイルス。 医学のあゆ
み ， 7 2 : 3 2 1 へ�3 2 2 , 197 02.

井上幸重 J西部陽子，中村良子：スモン患者糞便より高率に分離された新しいウイルス（第 2 報）
医学のあゆム， 7 3 そ 68 , 1970
-38 ー［付JSMO N 病原のネガチフ染色の電子顕微鏡的研究

東昇 （京大ウイノレス研究所〉

実験材料は井上，西部らによるスモンウイルス佐藤株，B AT-6細胞系で得られたf luid
1,0 0 omeを濃縮（1/1.000) し，Csc l 濃度勾配（ 2 0 ～ 4 o % , W/V）遠心で精製したものである。
鏡検フラクシヨンは 3 Hーチミジンのとりこみのあるもので且つ感染性と 一 致するフ。 ラクシヨン である。
1 ヲら agar plate 上で試料を乾操させ，ついで0. 7 %コロジオン液を乾燥寒天の上におき，水面にコロジオン膜を剥離す る c 膜 上にメッシユを のせて，すくい上げる。 乾燥後P T Aをのせ1分間乾燥させる。 PT A液（ 1% ）は之に0. 0 0 1 %のc rystall ine bovine serum を加えたものである。

写真説明
図1 矢印の粒子（大きさs 3mµ）はベプロスで囲まれ， 且つスバイクが放射状に突出している 。
スパイクの先端はknob に終っている。断線矢印の粒子は部分的破壊を示す。 なお，二重矢印の部分’は高度 の粒子破壊を示し，サブユニットだけが認められる。 さ らにサフ ユエツトは視野 一 面に散在している。 ウイノレス粒子は本実験におけ る処理法に対し，かなり不安定であ る ことを示す 一方，ある程度粒子の護縮には成功しているようである。

図2.

大きさ，55 , 70 , lOOmµの 粒子（矢印）を認める。 本図 ではスバイクを認め難い。 本図でも粒子崩壊 ，散在性サブユニッ トを認 め る。

図3.

粒子の大きさ9 Omµ,n aked virio n も認められる。

図4._

enveloped vi rion,

naked vi rio n， 崩壊した virion を認める。 ベプロス ，スパイクはかなり本実験処理に対し不安定であ ので，目下検討中である。
る-4 5 一図4- 48 -

BAT

6

細胞に関する追試実験成績

甲野礼作，吉井孝雄，石井慶蔵（国立予研ウイルス中央検査部）I

はじめにわれわれは SMO Nがウイルス性疾患の可能性がある と考え，数年前より各地の患者材料よりのウイルス分離を種々の細胞を用いて試みた。その成績はすでに発表したように，すべて陰性に終ったコ 1)

1 9 6 9年末に京大ウイルス研の井上幸重博士がウシのアデノ3型ウイノレスでt ransformした ハムスター由来の B AT-6 細胞を用いて SMON 患者材料からC PEagentを分離しりその追試を依頼された。早速同博士より BAT-6 細胞と分離された agentの代表株である佐藤株の分与をうけて，ウイルス分離，佐藤株の性状及び同株による中和試験を行ったのでその知見について述べる 。
なおこの実験は 1 9 7 0 年 5 月までに行ったものである。

II

実験材料及び方法a）細胞とその培養： BAT-6 細胞は 1 O%fetal℃で増殖させ，維持液としては2%fetal

bovin e血清加イ ー グノレMEMを用い 37bovin e血清加イ ー グルMEM培養液を用い， 3 7℃に静置培養した。なおイークソレ rvIEM培地は初め KM 加日水製を，後半に おいては KMを含まない大五栄i養製を用い不Ib）ウイルス分離用被検材料：表1に示したように，岡山県井原市，岡大入院患者（うち1例は湯原恥の患者

l 糞使である。これら材料は岡大島田助教授，緒方教授，俵教授及び東大神経内科井形博士の御好意で入｜手し，予研において 一 7 0 ℃に使用まで密栓保存したものである。なお表にみられるように材料は神経症状銅山の…一一一上向

l 分離に成功した患者

CPE

g n tのの材料も含まれている。また対照として東京において採取した白色便下痢症の糞便1 0件でもウイルス分離を試みた。

-49 一

表1地区者

患／／

ウイノレス分離用SMO N患者材料
性発病年月日7 3M

9 ・ 2 8' 68／／

／／／／

35岡／／

山／／

県／／

井〆／

原

採取年月日

年令

M

8月

1 0, 2 6 ' 68

’ 6 8 1 o. 30 ' 68
12.

6' 68

20 ' 68

12.

6 ' 6868

11.

1 ' 6812.

6 I 68

／／

／／

4 0F

93 3F

71 7／／

／／

3 3

M

／／

II

5 7

F／／／／／／

11. 17 1 68

19F

11 .27 ' 6 8

11. 3 0 1 68

M

10月

1／／

9,I 68

3168

' 68

M
37

30 1 68M

8.

F

11 ,29 1 6 8

入院

東

3 ’ 68

11. 10 1 68

1 2.

3' 68

1 2.

3 1 6811, 2 9 I 68
12.
11.

F

大

1 0, 2 5 1 68
12.

／／

1 0月

4 1 6828168

3 I 68

38F

8月

’5 7F

10月

I 68

67

M

11. 1 9 1 6 94 5F／／

5 3F／／

39F／／

61

F

28F

1 0 月

5 0M

11 ,10 1 6 8

3 5F

11.

4168／／

28

F

11 .14

168／／

68

1 2.

11. 20 1 68

11.

so ー

考4' 68／／

市岡

12.

備

I 68

115 I 6929168

12. 11 1 68

脊髄

湯原地区

代に継代，3代継代しC p E を生じないものを陰性としたe なお糞便は Pc ,SM 加 L E液で1 Q ＂乳剤O"にし，常法の如く遠心した上清を採種したce）中和試験：被検血清を5 6℃ 3 0分非働化し，1 : 4血清稀釈から2倍階段稀釈し，この稀釈系・列に 2 0 01℃ D so の a gent を等量混合し， 3 7 c2 時間反応させた。 つぎにその血清ウイノレス混合の 0. 2 meづつを各 2 本の細胞培養チュ ー プに接種， 6 日間培養，観察した．
直成績a ）ウイルス分離試験：表 l に示した SMO N患者糞便 2 7 例，患者脊髄 1 例，対照患者 1 0 例の糞便を接種し， 3～ 5代継代観察した がすべてウイルス分離陰性に終った。この材料の大部分について後に KMを含まな いイ ー 〆ル MEMに培養液を代えて反覆分離実験を行ったが，結果は同様であった。

b）中和試験： SMO N 患者1 0例血清2 3検体〔表2 ）及び対照血清1 0検体について中和試噴を行 ったが，その抗体価はすべて＜ 1:4 であった。

c）佐藤株の性状I ）感染価佐藤株のC p E は分与された当初はあまり明瞭でなかった。 継代を重ねて明瞭となり，予研で 5 代以上継代したものは安定し， 1 0 J ・5 T CD s o/ o. 2 mtであった。
！｜〉細胞に対する感 受性 佐藤株をヒト胎児腎細砲とヒト胎児肺2倍体細胞に接種したが，C PEを認めることはできなかった。

Iii) 'Ip過試験

ミリポアフィルタ 一 H A(450mµ ）とG S(22omµ ）を用いて a gen t の大きさを判定した。 その結果，H A'Jfa過では感染価がi 0 g で1. 0低下し，G s F過ではi戸液に感染性が認められなかった。
IV）クロロホルム感受性試験

佐麗慌のl dにクロロホルム 0. 0 5meを加え，振歯，室温1 0 分放置，遠心した上清の1 0倍稀釈液に感染性が認められなかった。 対照は1 0s・5 TC Dであったので・

1 0 4 ・ 5 の感染価の低下があり感性と判定された。

v ）抗生物質に対する感受性 佐巌株接種 B AT

5 0/ o. 2 me

6 細胞では C p E のみられるほか，培養液がうすく緑色を帯びることが読奈された。 この着色は C p E の終末点とほ立 一 致し，毎常明瞭に認められ，佐藤株がウイルス以外の a gen t である可能性が措定された。 そこでテトラサイクリ（ TC ），クロラムフエニコール（ C p ） を 培養液に5 r /me加え感受性を調べた。 その結果T c,c P共に加えた培養では佐藤株は B AT-6 細胞に C p E も形成せず，また着色もみられなかった。

Vi ) P P L O - Aga r へ の培養

佐藤抹培養液を東大医科研本間教授のもとで培養を試ム，定型的マイコプラズマのコロニ ー を形成し，との集落を浮遊させ，再び B AT- 6 細胞に接種した。 その結果細胞継代株と同様のC p E を生じ，培養液も繰色を呈した。 このマイコプラズマは後に東大農学部尾形教授の教室でlVf hy·コrhinis と同定された今 また未接極のB AT-6 細胞に も当時oral e のあったことが明らかにされた。3)-5 2 ーM.

V結び

スモソ患者の糞便，血液，髄液（リコール）よりウイノレス分離を試みた。
1.

糞便

4 1例につきミドリ猿腎細胞（GMK），人胎児腎細胞（HEK）， ハ ムスター腎細胞（ Ham K)
ハムスター胎児細胞C Ham E）を用いてウイルス分離を試みた。 向れも数代のb lind passageをしたが3代以上継代し得るC p （細胞変性） agen t
2.

は見つからたかった。

血液患者血液1 0例をGMKに接種しウイノレス分離を試みたが，全部陰性であった。 叉患者5名から1週間隔で2回採血し5頭のカニクイ猿に2田ずつ静脈内注射し ，6ヶ 月間観察したが震には向等の変化も見られなかった G
3.

リコ ー ル

1 3 s amp 1 eをGMK ,HKに接種したが3代以上継代し得るC P-5 7-agen t は認められなかった。