バイオリファイナリーの今，そして未来

バイオリファイナリーに向けた酵母物質生産系の開発
玉川英幸・生嶋茂仁・吉田聡*

一般に基礎研究で用いられる実験室酵母は，ヘテロタ

たとえば，高温で発酵することができれば，冷却コスリックなパン酵母 Saccharomyces cerevisiae や分裂酵母トを削減でき，酵素反応も効率よく行うことができる．

Schizosaccharomyces pombe であり，安定に一倍体の状

さらに，酵母での生産を考えると発酵槽に溜まったエタ態で増殖することができ，遺伝子操作法も確立されていノールによる酵母の増殖阻害が問題となることから，エる．しかし，これらの酵母がそのまま実用化されることタノール耐性も重要となる．以上のような課題を克服すはほとんどなく，実生産に使われている酵母は，たとえるには，S. cerevisiae 以外の酵母を用いることも有効でばホモタリックなビール酵母やワイン酵母，清酒酵母なある．近年，Kluyveromyces marxianus と呼ばれる酵母どである．また，有用物質を生産するために開発されたの中に，45qC という高温条件で S. cerevisiae 並みのエタ

実用酵母としては，メタノール資化性の Pichia 酵母やノール生産性を示す株が見いだされた 4)．その他，エタCandida 酵母などが知られている．しかしながら，これノール耐性に関与する遺伝子や，その耐性メカニズムにらの実用酵母は倍数性が高く，さらに遺伝子操作も実験ついての研究も近年盛んに行われており，さまざまなエ室酵母ほど容易ではないことが多い．

タノール耐性酵母が育種されている．

パン酵母 S. cerevisiae S288C 株は 1996 年に全ゲノム

エタノールより炭素鎖が長いブタノールもオクタン価が解読され，分裂酵母も 2002 年に解読された．そして，が高く，燃料として優れている．ブタノール発酵菌としそれらの遺伝子情報を基に，全ゲノムを対象とした研究て，嫌気性菌である Clostridium 属細菌による ABE 発酵が始まり，マイクロアレイが作製され網羅的な遺伝子発が挙げられるが，培養の煩雑さや副産物の多さという問現解析や染色体構造解析が可能となってきた．また，全題点がある．それらの問題を回避するために大腸菌など遺伝子破壊株や全タンパク質発現株の構築なども行わの微生物に Clostridium 属細菌由来の遺伝子を導入してれ，表現型解析も含んだオミックス解析が始まった．一ブタノールを作らせる取組みも報告されている 5)．一方，方，実験室酵母の後を追うように実用酵母のゲノム解析もオクタン価，ガソリンへの親和性などの特徴からイソブ盛んに進められてきている．たとえば，ゲノム情報が公開

タノールがエタノールに替わるバイオ燃料として注目さされたものとして，2007 年の Pichia stipitis1)，2009 年のれている．近年，新規な代謝経路を利用した効率的な微2)ビール酵母 Saccharomyces pastorianus ，メタノール資生物を用いたイソブタノール生産法が確立され，大腸菌，

3)化性酵母 Pichia pastoris などがあり，これらの酵母でマコリネ菌，酵母，藻類などでの成果が報告されている 6)．

イクロアレイ解析も行われるようになってきた．

また，DuPont 社は BP 社と Butamax 社というベンチャー

酵母によるバイオエネルギー生産
酵母を用いて作られるエネルギーとしては，バイオエタノール，バイオブタノール，バイオディーゼルなどが会社を設立し，酵母によるイソブタノール発酵の実用化の試験段階に入っており，さらに別の米国ベンチャー会
社の Gevo 社はガソリンへの添加適応性の試験も行っている．

挙げられる．バイオエタノールの生産には，S. cerevisiae

一方，バイオディーゼルに関しては，近年，藻類を用を筆頭にさまざまな酵母が用いられており，また，同じいた生産の報告が多数なされているが，酵母においてはS. cerevisiaeでも多様な菌株が用いられている．エタノー

その主成分である脂肪酸の生産に関して，油性酵母

ル発酵については，酒類製造という観点から日本には技術的な蓄積もある一方で，燃料用エタノール発酵では飲

Yarrowia lipolyticaによる油脂生産の報告がある7)．また，
S. cerevisiae を用いた生産という点では，トヨタ社のプ料に求められるような優れた香味ではなく，低コスト・レニルアルコール（ゲラニルゲラニオール，ファルネソー低エネルギー消費につながる高効率のバイオマスの糖化ルなど）の生産が報告されている 8)．このようにエタノー法や生産物の精製法，さらには大量生産法がきわめて重ルの次の世代のバイオ燃料として，脂質や高級アルコー要である．つまり，これらバイオリファイナリーは，醸ルなどの提案が多数なされており，競争は激化の一途を造とは異なる技術体系をなしていると言える．

辿っている．

* 著者紹介 キリンホールディングス・フロンティア技術研究所（主任研究員）（現：キリンビール㈱（主査））
E-mail: satoshiy@kirin.co.jp
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筆者らはこのような状況の中で，non-conventional な酵母を用いたバイオエタノール生産に注目して，いくつかの取組みを行ってきた．その中の 1 つとして，ビール製造過程の副産物であるビール仕込み粕の有効利用を目的とした，P. stipitis によるキシロースからのバイオエタノール生産がある 9)．なお，このビール仕込み粕糖化液
中の主な単糖はグルコース，キシロース，アラビノースである 9, 10)．P. stipitis は，キシロースを糖源としてエタノールを生産できる酵母の 1 つであり，実際に野生型 P.

stipitis 株によるビール仕込み粕糖化液を用いたエタノール発酵を行ったところ，1.26% のエタノールを作ることに成功した．さらに，キシロース資化に関与する 3 つの遺伝子を過剰発現させたところ，コントロールの親株に

図 1．キシロースからのエタノール生産．（A）キシロース，およびグルコースからのエタノール生産経路，（B）キシロース，およびキシリトールからのエタノール生産．

比べてエタノールの生産効率が 20% 上昇した 9)．一方，これらの取組みの過程で P. stipitis は酸などのストレスに対して，他の酵母と比べるとその耐性が弱いという欠点からエタノールを高効率で生産させるための取組みを紹も明らかになった．バイオマスのセルロース成分からは介する．

フランやフルフラール類，ヘミセルロース成分からは酢

まず初めに，C. utilis がキシロースを資化できるが，酸，そしてリグニン成分からはフェノール類が発酵阻害

エタノールなどを発酵生産できない原因を探るために，物質として生成されるので，これらの物質に対する酵母キシロース，およびキシルロースを唯一の炭素源としたの耐性の強化が重要な課題となっている．そこで，筆者発酵生産を試みた．文献情報どおり，キシロースからエらはバイオマス利用を視野に入れ，生産宿主としてストタノールはまったくできなかったが，50 g/l のキシルレス耐性能の高い Candida utilis を用いたキシロースかロースからは 20 g/l のエタノールが生産された．この結らのエタノール生産を試みた．

果から，C. utilis がキシロースからエタノールを生産する

Candida utilis によるキシロースからのエタノール生産ことができないのは，キシロースを効率よくキシルロースへ変換できていないことが原因であることが示唆さ

C. utilis は最新の酵母分類学の教科書（The Yeast 5thedition，2011 年刊）によると，Lindnera jadinii に分類される．C. utilisは，他の酵母と比べて増殖が旺盛であり，れた（図 1）．そこで，筆者らはキシロースからキシルロー

強い発酵力を有している．また，十分な酸素を与えた条ある．さらに，アメリカ食品医薬局（FDA）が食品添XR），キシリトール脱水素酵素（xylitol dehydrogenase,XDH），キシルロースリン酸化酵素（xylulose kinase,XK）によりキシルロース 5 リン酸に変換され，これが加物として安全性を認めている酵母でもあり，リボ核酸ペントースリン酸経路を介して解糖系に入り，代謝されやグルタチオンの生産に用いられている．そして，遺伝ていく．そこで，筆者らはまず初めに，前述の P. stipitis

子組換え系も整備されており，これまでにも異種タンパの場合と同様に，これらの 3 種の遺伝子を C. utilis で過剰ク質や乳酸の大量発現に使用された実績がある．その他発現した．その際，XR，XDH は Candida shehatae 由に，キシロースを唯一の炭素源として増殖することがで来の遺伝子を用い，XK は P. stipitis 由来の遺伝子を用い件ではエタノールを生成しないクラブツリー効果陰性でスの変換に注目することにした．
キシロースは，キシロース還元酵素（xylose reductase,きる特徴を持つ．以上のことから，C. utilis はモノづくた．発酵試験を行った結果，P. stipitis とは異なりキシりに非常に有用な特徴を有していると言える．一方，燃ロースからのエタノール生産は改善されなかった．そこ

料生産において食糧と競合しないバイオマスを用いるこで，筆者らはキシロース代謝経路上のこれらの酵素の補酵とが求められているが，野生型の C. utilis はキシロース素要求性に注目し（図 2A），C. shehatae の XR は NADPHからエタノールを生産することができず，このことは解に親和性が高く，また XDH は NAD+ に親和性が高いた決すべき課題である．そこで，筆者らは遺伝子組換え技めに，NADH/NADPH の酸化還元状態のインバランス術を用いた代謝改変を行うことにより，C. utilis へのキが生じ，その結果としてキシロースからキシルロースまシロース発酵能の付与を試みた．本章では，キシロースでの代謝が進まないという仮説を立てた．そしてまず，

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生物工学

第90巻

バイオリファイナリーの未来
XR について NADH に親和性が高くなると考えられる変異体を 3 種類（XR K275R, XR K275R/N277D, XRR281H），XDH について NADP+ に親和性が高くなると考えられる変異体を 1 種類（ARSdR; D207A/I208R/F209S/
N211R）作製し，それらの酵素活性を調査した．その結果，XR については native な酵素と比較して，NADH 存在下での酵素活性が 1.3 倍から 5.4 倍高い株を作製することができた．また，XDH については NADP+ 存在下で約 730 倍酵素活性が高い株を作製することができた（図 2B）．そして，元々の native な酵素も含めて，さまざまな補酵素親和性をもった組合せの XR，XDH を発現する C. utilis 形質転換体を作製した．
そして，これらの変異酵素を持った C. utilis 形質転換体 を 用 い て 発 酵 試 験 を 行 っ た． そ の 結 果，XDH をNADP+ 親和型に変えて，XR と XDH との間での NADPHのリサイクリングにより理論上の酸化還元バランスの収支が合うようにした形質転換体ではエタノール生産量に微増の影響しか与えなかった．一方，XR を NADH 親和型に変えた形質転換体では，エタノール生産性が大きく 改 善 さ れ た（ 図 3）11)． こ の こ と か ら，NADPH よ り

NADH が細胞質でのリサイクリングに優位であることが示唆された．酵母で外来遺伝子を発現させ，有用物質を生産させる際は，NADH 親和性のタイプが成功する可能性が高いかもしれない．

図 2．キシロース代謝経路の遺伝子の改変．（A）キシロース代謝に関与する 3 つの遺伝子の変異体の作製，（B）キシロース代謝酵素変異体を持った株での各種酵素の in vitro の酵素活性と補酵素親和性．破線の囲みは，XR は本来 NADPH 親和型であるが，そこに変異を入れると NADH 親和型に変わったことを示す．実線の囲み左側は，変異の入っていない XDH では
NAD+ に親和性が高く，実線の囲み右下側は XDH に ARSdRの変異を入れると NADP+ に親和性が高くなることを示す．

図 3．補酵素親和性を改変したキシロース代謝酵素を発現している組換え C. utilis 株のエタノール生産性．
（A）NAD+ 親和型 XDH を用いたときのエタノール生産，（B）NADP+ 親和型 XDH を用いたときのエタノール生産．

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微生物による乳酸生産
プラスチックは世界で年間約 1 億 5 千万トン生産されており，その原料のほとんどは化石資源に依存している．

らに，遺伝子組換えツールが開発されていることから，遺伝子組換え体の作製が容易であるという点も魅力の 1つといえる．そのため，現在までに 15 年以上さまざまな酵母を用いた乳酸生産が試みられてきた．

近年，低炭素社会の実現，カーボンニュートラルな技術

たとえば，過去の知見では，S. cerevisiae を用いた L-開発という環境に配慮した取組みが求められている中

乳酸生産において，48 時間で 99.9% 以上の光学純度ので，新たなプラスチックの素材として，ポリ乳酸が注目

L-乳酸を122 g/l生産させることができているされ，有望素材としてすでに用いられている．ポリ乳酸

このとき同時に 40 g/l のエタノールも副産物として生産は乳酸を重合させることにより作られるが，原料となるされてしまっていた．この原因としては，ピルビン酸か乳酸の製造については，化学合成と発酵生産の 2 通りのらアセトアルデヒドを作るピルビン酸脱炭酸酵素 PDC手法があり，化学合成では一般的に L 体と D 体の両方がの影響が考えられる．PDC をコードしている遺伝子は作られる．一方，発酵生産では L 体のみ，もしくは D 体み，もしくは D 体のみの光学異性体だけからなるポリ乳PDC1, 5, 6 であり，このときはその中の PDC1 遺伝子のみを破壊してその株にウシ由来 L-LDH を導入しており，残りの 2 つの PDC 遺伝子は破壊されていないため酸の融点は 180qC 近くであるが，L 体，D 体の両方からにエタノールが副産物として合成されたと考えられる．

なるステレオコンプレックス構造を持ったポリ乳酸の融さらに，ここで PDC5 遺伝子も破壊して PDC1 と PDC5

点は 230qC 近くになるため，耐久性にも優れたプラスの 2 つの遺伝子を破壊したところ，100 g/l のグルコースのみを作ることが可能である．ところで，単一の L 体の12)．しかし，チックとなりうる．そのため，L 体のみ，もしくは D 体から 82.3 g/l の L- 乳酸を生産することができ，しかも副のみを高効率で発酵生産させることが重要となってきて産物のエタノール生産量は 2.8 g/l と低下させることがでいる．

きた．しかし，増殖速度，糖消費速度が共に大きく低下

乳酸の発酵生産に関しては，乳酸菌や Rizopus oryzae

し，乳酸生産が一定になるまでに 192 時間を要するといのような好気性糸状菌が用いられている．これらの微生う結果であった 13)．このように，S. cerevisiae の場合は，物を用いた発酵法では組換え体を用いていないという利PDC 遺伝子をすべて破壊すると致死となるために，副点があるが，D 体と L 体の両方を作ってしまう場合が多産物のエタノール生産，増殖欠損を抑えることが技術的い．さらには，エタノールなどの副産物を生産してしまに大きな壁になっている．

うために乳酸の収率が低いという欠点がある．また，乳また，Kluyveromyces lactis においては，副産物である酸菌については培養時に，嫌気条件が必要であったり，エタノールを生産しないように，PDC をコードしてい生育にホエーやコーンスティープリカーなどの天然栄養る PDC1 遺伝子を破壊したところ，PDC 活性をほとん源を必要としたりする場合がある．一方，Rizopus につど失ったが，目立った増殖遅延は起こらなかった．そしいては，溶存酸素濃度を高く維持するために必要な高通て，この株に L-LDH 遺伝子を導入したところ，予想通気条件が培養のハンドリングの煩雑さにつながっていりエタノールの生産は見られなかったが，その乳酸生産る．これらのことは，発酵による乳酸生産の実用化への効率は 60% 程度にとどまっていた 14)．さらに，この株大きな障壁となっている．

で同時にピルビン酸脱水素酵素のサブユニットをコード

微生物を用いた乳酸生産の宿主としては，上記の乳酸している PDA1 遺伝子も破壊すると，乳酸生産効率が菌，糸状菌以外に大腸菌，コリネ菌，酵母が挙げられる．
換えにより対糖収率 95% 以上で L- 乳酸を生産させるこ85% に上昇した．しかし，PDA1 の破壊により増殖速度が低下し，S. cerevisiae の場合と同様，L- 乳酸 60 g/l の生産のために 500 時間という長い時間がかかってしまとができた．しかし，その生成量，生産性は乳酸菌に比い，生産収率，副産物抑制はクリアしたが増殖遅延はク

べ て 低 か っ た．また， コ リ ネ 菌 は 酸 素 抑 制 条 件下でリアできなかった 15)．

大腸菌は嫌気条件下で D- 乳酸を生産するが，遺伝子組RITE プロセスにより，高い生産性で L- 乳酸を生産させることに成功している．

さらに，P. stipitis について，この酵母はスクロースを炭素源とした発酵はできないが，前述のようにキシロー

一方，酵母はそのままでは乳酸を生産することはほとスを用いた発酵を行うことができる．そこで，この酵母

んどないが，発酵反応液から菌体を分離することが容易に乳酸菌の L-LDH を導入し，糖源としてグルコースとであり，酸に対するストレスが高く，増殖速度が速く，94 g/lのグルコーキシロースを用いて発酵させたところ，しかも培地も一般的に安価であるなどの利点がある．さスから 41 g/l，101 g/l のキシロースから 58 g/l の L- 乳酸

404生物工学第90巻

バイオリファイナリーの未来を生産することに成功した 16)．このとき用いた株では，次に筆者らは，キシロースから乳酸を生産することにPDC 遺伝子は破壊されておらず，今後，バイオマス利取り組んだ．具体的には，先に構築した乳酸高生産株に，用を視野に入れた研究として，この酵母を用いた乳酸生キシロースを代謝するために必要な遺伝子改変を行うこ産も期待されるところである．とによる，キシロースからの乳酸高生産を試みた（図なお，Candida boidinii を用いた L- 乳酸生産について

4A）．なお，先に構築した乳酸生産株でキシロースからは別の総説に記したので，そちらを参照していただきたの乳酸生産能を評価したところ，ほとんど乳酸は生産さ

い 9)．

れなかった（図 4B）．一方，エタノール生産で作製した時と同様に，キシロース代謝の酸化還元バランスが最適

Candida 酵母によるキシロースからの乳酸生産化された変異遺伝子を導入したところ，キシロースから最後に筆者らが取り組んできた C. utilis での乳酸生産

L- 乳酸を高効率で生産させることができた（図 4C）

19)．

について紹介する．C. utilis において，Cre-loxP システ

さらに，引き続き，バイオマスの有効利用の具体的なムを利用して PDC をコードするすべての遺伝子を欠損取組みとして，ビール仕込み粕糖化液を用いた L- 乳酸させた株を作製したところ，K. lactis と同じく致死には発酵を試みた．その結果，25 g/l グルコース，20 g/l キシならず，増殖することができた．そして，この株にウシ

ロース，10 g/l アラビノースを含むビール仕込み粕糖化

L-LDH を導入することにより，C. utilis において L- 乳酸液から 36 g/l の L- 乳酸を生産することに成功した（図 5）．

を生産することに成功した．その生産性は，108.7 g/l の

このように C. utilis はバイオマス糖化液からも L- 乳酸をグルコースから 103.3 g/l の L- 乳酸を光学純度 99.9% 以生産することができ，ある程度の夾雑物の入った培地に17)上で生産できるというものであった（収率 95.1%） ．

おいても，発酵能を低下させることなく，有用物質を生さらに，この PDC 欠損株に L-LDH の代わりに，乳酸菌産することができる可能性が示された．

Lactobacillus helveticusのD-LDHを導入することにより，185 g/l の糖を含むモラセス（スクロースが主な糖源）から 163 g/l の D- 乳酸を生産させることにも成功した 18)．

今後の酵母による乳酸生産の課題としては，酸性度の高い条件下での発酵を可能にすることで，中和剤コストを削減し，微生物の汚染リスクを低減させることが挙げられる．今まで紹介してきた酵母での乳酸生産はほとん
どすべて炭酸カルシウム等の中和剤を添加して行っている．乳酸菌を用いて生産させた場合もやはり中和剤が用いられている．これらの中和剤は添加コストとして費用がかかるが，中和によって生じる廃棄物の処理についても費用がかかる．一方，乳酸は pH3.0 以下ではほとんど電離せず，酸度の高い培地で生産された乳酸は，培地のpH に与える影響は小さいと考えられるため，低 pH で

図 4．C. utilis を用いたキシロースからの L- 乳酸生産．（A）キ（B）キシロー
シロースからの L- 乳酸生産のための育種戦略，
ス代謝に関与する 3 つの XYL 遺伝子を過剰発現させた株での L乳酸生産，（C）変異を入れて最適化したキシロース代謝に関与する 3 つの XYL 遺伝子を過剰発現させた株での L- 乳酸生産．

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図 5．ビール仕込み粕糖化液を用いた L- 乳酸生産

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の生産ができればコストの削減は可能である．このよう中にはまだ知られていない酵母も多数あると考えられ，に，中和剤不添加による生産は大きな課題となっている．

そのような生物多様性からの新たな実用酵母の発見も期

また，今後，バイオマスの利用が求められてくる中で，待される．酵母は古いが，新しさも秘めた微生物と言える．

グルコースなどの六単糖とキシロースなどの五単糖の両文方とも原料として用いて L- 乳酸を生産させることが必要である．先の章で紹介した P. stipitis はその能力を持っている酵母である．しかし，ストレスに弱いという欠点もあり，それらを克服する必要がある．今後は，乳酸ス

1)
2)
3)
4)

トレスに強く，六単糖と五単糖を同時に発酵させることができ，しかも発酵能が強い，これらすべての長所を兼ね備えた酵母の育種が求められている．
実用酵母による物質生産の今後の課題と展望
文頭にも述べたが実用酵母は，実験室酵母に比べて増殖性等，工業生産に優れた特徴を持っているが，倍数性

5)
6)
7)
8)
9)
10)
11)が高いなどの欠点がある．しかし，全ゲノムが解読され，さまざまな酵母の知見を集結することで，遺伝子改変も12)以前と比べて容易になってきたのも事実である．また，

13)

今回見られたように PDC を完全破壊しても増殖できる酵母，できない酵母も存在しており，個々の酵母種の間に違いが生まれる原因については不明な点も多い．これ
らの原因を解明し，遺伝子組換えの容易な実験室酵母に実用酵母の利点をすべて集結させて，さまざまな有用物質を高生産する株を作製する夢もある．また，実用酵母の倍数性を低くして，実験室酵母並みに改変が容易にで

14)
15)
16)
17)
18)
19)

献

Jeffries, T. W. et al.: Nat. Biotechnol., 25, 319 (2007).
Nakao, Y. et al.: DNA Res., 16, 115 (2009).
De Schutter, K. et al.: Nat. Biotechnol., 27, 561(2009).
Nonklang, S. et al.: Appl. Environ. Microbiol., 74, 7514
(2008).
Atsumi, S. et al.: Metab. Eng., 10, 305 (2008).
Atsumi, S. et al.: Nature, 451, 86 (2008).
Sabirova, J. S. et al.: Microb. Biotechnol., 4, 47 (2011).
Ohto, C. et al.: Appl. Microbiol. Biotechnol., 87, 1327
(2010).
吉田 聡ら : 生物工学 , 90, 179 (2012).
White, J. S. et al.: FEMS Yeast Res., 8, 1175 (2008).
Tamakawa, H. et al.: Biosci. Biotechnol. Biochem., 75,
1994 (2011).
Ishida, N. et al.: Appl. Biochem. Biotechnol., 131, 795(2006).
Ishida, N. et al.: Biosci. Biotechnol. Biochem., 70, 1148
(2006).
Porro, D. et al.: Appl. Einviron. Microbiol., 65, 4211 (1999).
Bianchi, M. M. et al.: Appl. Einviron. Microbiol., 67, 5621
(2001).
Ilmen, M. et al.: Appl. Einviron. Microbiol., 73, 117 (2007).
Ikushima, S. et al.: Biosci. Biotechnol. Biochem., 73, 1818(2009).
堀江 暁，生嶋茂仁：バイオインダストリー，6, 11 (2011).
Tamakawa, H. et al.: J. Biosci. Bioeng., 113, 73 (2012).

きるようになれば，同様にさまざまな有用物質を高生産する株を短時間で作製することができる．さらに，世の406

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