２つのマーカー遺伝子を指定し、その両方が発現する細胞だけを除去可能なマウス（VeDTRシステム）のご紹介

研究に必要なのは、広範囲に影響を及ぼす「遺伝子」のKOではなく研究対象「細胞」のKOではないですか？

山本 雅裕
Laboratory of Immunoparasitology, IFReC, Osaka University
Department of Immunoparasitology, RIMD, Osaka University
CIDER, Osaka University

例えばCD4 T細胞は近年、更に多くのサブセットに分画されます
では細分化された細胞（例：Th1-Treg）「だけ」をKOして解析するには？
Naïve CD4+
T cell (Th0)

CD4+
Tcell

Th1

Th2

Treg

Th17

Tfh

Tbet

Gata3

Foxp3

Rorγt

Bcl6

Th1-Treg

Th2-TregTh17-Treg

Tfh-Treg

Foxp3

Foxp3

Tbet

Gata3

Foxp3
Rorgt

Foxp3
Bcl6

Treg cell subsets（Subset of CD4+ T cellsubset）

Tbet

Tbet KO×Foxp3 KO

＝ダブルKOマウス？
→多くの細胞が巻き添えでKO

Tbet KO
Foxp3

Foxp3

ココだけを精密にKOしたい

Tbetだけ、Foxp3だけを発現する多くの細胞も巻き添え
Tbet とFoxp3両方が発現した細胞のみを狙いたい2

Cre-loxP と Flp-FRT を使い、両方が発現した細胞だけがTbet
蛍光を発する、または薬剤で除去可能（VeDTRシステム）
Treg

全部

Foxp3

Th1

全部
ここだけKO可能

VeDTR mouse×

Promoter X- Cre×

Promoter Y- Flp=

狙った細胞だけが蛍光を発し、ジフテリア毒素投与で死滅するマウス

発生、成長は通常マウスと同じ、蛍光ラベルされた細胞の解析が可能
ジフテリア毒素の投与によって狙った細胞のみの除去が可能
発明の名称：特定の細胞を特異的に除去することが可能な非ヒト生物（PCT/JP2023/025274）

3どんな細胞画分でも、その細胞を規定する特徴的な遺伝子２組が見つかれば細胞特異的なKOが可能です。
Gene X

Various immune cells

Gene Y<Models>
Infection
Tumor

X and Y

DiseaseGene X Gene Y

Currently, it is difficult to elucidate thefunction of the cell subset of interest

Novel
VeDTR mouse system

Gene X-Cre
Gene Y-Flp
VeDTR mouse
Targeted labeling and disruptionof thecell subset
4蛍光を指標に目当ての細胞のさらに詳しい解析が可能です
spleenFoxp3-Cre / Tbx21-Flp
VeDTR mice
vs
YFPα-CD3/CD28

125vs
YFP+401003

Sorting ofCD4+ CD25+
T cells

Isolation of
YFP+ or YFPTreg

Prf1

perforin 1 (pore forming protein)

Mt3

metallothionein 3

Ctla2bcytotoxic T lymphocyte-associated protein 2 beta

Cd68

CD68 antigen

Lat2"linker for activation of T cells family, member 2"

Spp1

secreted phosphoprotein 1 （オステオポンチン）

Ifnginterferon gamma

Srxn1

sulfiredoxin 1 homolog (S. cerevisiae)

Havcr2

hepatitis A virus cellular receptor 2

Prdm1"PR domain containing 1, with ZNF domain"

Ccl3

chemokine (C-C motif) ligand 3

Il10interleukin 10

Adam8a disintegrin and metallopeptidase domain 8

Ccr5chemokine (C-C motif) receptor 5

Ccl4

chemokine (C-C motif) ligand 4

Ttc39ctetratricopeptide repeat domain 39C

Tnfrsf8"tumor necrosis factor receptor superfamily, member 8"

Gzmb

granzyme B

Mt2

metallothionein 2

Nfil3"nuclear factor, interleukin 3, regulated"Tigit

T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains

Pcyt1a"phosphate cytidylyltransferase 1, choline, alpha isoform"

Mt1

metallothionein 1

Tubb6"tubulin, beta 6 class V"

Il1r2"interleukin 1 receptor, type II"

Adap1ArfGAP with dual PH domains 1

Nkg7

natural killer cell group 7 sequence

Dgat1

diacylglycerol O-acyltransferase 1Ptpn5"protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 5"

α-CD3/α-CD28
刺激

Bulk RNAseq

疾患病変部などに集まった細胞の特徴的なマーカー探索も可能です5

目当ての細胞をDT投与により除去し、その影響観察も可能です

Foxp3-Cre / Tbx21-Flp
VeDTR mice

B16F10 melanoma
Subcutaneous implant

A

B

CD4

CD4+T

YFP+ / CD4+

4030

1.94

**

1200
800
400%

DTPBS (n=8)
DT (n=9)

1600

✱✱✱

5035.3

B16F102000

mm3 (+SEM)

PBS

FACS
andmeasurement ofTumor volumePBSorDT treatment
from Day 1020010YFP

101112131415Days post tumor inoculation

160PBSDT

Th1-Tregの除去は腫瘍（B12melanoma）の増殖をもたらす
6技術ライセンスだけでなく、新たな共同研究も可能です

・細分化された免疫細胞の特定のサブセットの解析が蛍光及びKOで可能です

VeDTR mouse・発生などには影響を与えず、任意のタイミングで除去可能です
・標的とする細胞は免疫系に限りません
・新たな病態モデルマウスの作製にも利用できます
ご希望をお聞かせください。

Cell Reports Volume 42, Issue 7, 25 July 2023, 112813
doi: 10.1016/j.celrep.2023.112813. Epub 2023 Jul 12.

A genetic method specifically delineates Th1-type Treg cells andtheir roles
in tumor immunity
7