第7575回日本生物工学会大会回日本生物工学会大会 Topics
Topics ofof 20232023
第乳製品加工残渣を栄養源とし緑藻を培養した際の細胞応答についての解析と評価
蓬田1

美紗樹 1・堀本智仁 2・中西昭仁 1,3＊

東京工科大学大学院バイオ・情報メディア研究科，2 株式会社明治，3 東京工科大学応用生物学部〒192-0982

八王子市片倉町 1404-1

学校法人片柳学園 東京工科大学 片柳研究所棟 KW306
Tel: 042-637-2427

E-mail: nakanishiah@stf.teu.ac.jp

乳製品の製造工程で得られるホエイはタンパク質やミネラルなどの栄養素を豊富に含む残渣である。一般的に、フィルター濾過後の残渣はプロテインパウダー等の使用用途があるが一定数廃棄する成分があることから十分に活用しきれておらず、これの有効活用が期待されている。そこで物
質生産性の高い緑藻に濾物 WPC34 を与えて、バイオマス生産量とともに遺伝子転写量を解析し、WPC34 の利用有効性について細胞応答と物質生産の観点から論じた。

1. はじめにチーズの製造工程において、1 kg のチーズの作製には 10 L の生乳が必要であり、ここから 80%以上もの容量のホエイが副産物として得られる 1)。それゆえ、世界のチーズ製造産業では年間 180×106 トン以上ものホエイが生産されており、その半分は使用されずに廃棄されている 2)。そのため廃棄されるホエイに有効活用方法を見出したいが、他国と比較して日本ではホエイのロット生産量が少ないため、その精製・加工にかかる費用コストを差し引いても利益を生むことのできる活用方法が求められる。従って、ホエイを高付加価値な物質に変換することが利用法の開拓に必須であった。
そこで本研究では、ホエイを加工した乳製品加工残渣を栄養源として利用し、一般的な陸生植物より 10-50倍高い炭酸固定能を持つ緑藻にボタニカルな物質を生産させるための培養条件を検討した。

2. 材料・方法
緑藻細胞には Chlamydomonas reinhardtii を選んだ。
培養における栄養源には、乳製品加工残渣として、ホ60

エイを限外濾過に供した際の濾物である「WPC34」と、ホエイを乾燥させた「ホエイパウダー」を用いた。実際の培養では、従属栄養系の合成培地である TAP 培地を基盤に単一窒素源である NH4Cl (400 mg·L−1) をWPC34 (1 g·L−1、3 g·L−1、6 g·L−1、10 g·L−1) とホエイパウダー (5 g·L−1、10 g·L−1、20 g·L−1、30 g·L−1) に置換した。C. reinhardtii の乳製品加工残渣の利用能は、これの培養時の比増殖速度と最大細胞密度から、細胞増殖を解析することによって解析・評価された。
具体的には、培地に含まれる乳製品加工残渣の濃度とOD (濁度) で示される細胞密度が培養時間ごとにプロットされ、近似直線が求められることでそれらの相関性が解析・評価された。また、C. reinhardtii の生育に与える影響を調べるため、乳製品加工残渣に対して、炭水化物、タンパク質、油脂、ミネラルの定量評価がなされた。その上で、濃縮されたタンパク質を指標にホエイから WPC34 への加工で変化のあった成分が解析され、細胞の増殖性と対比することで、それらの影響が評価された。

3. 結果・考察
WPC34 とホエイパウダーを栄養源にしたときの C.

reinhardtii の増殖能を解析したところ、ホエイパウダーと WPC34 のどちらにおいても増殖が確認された。
このことから、ホエイパウダーと WPC34 は窒素源として培地成分に利用可能であることが明らかになった(図 1)。また、ホエイのタンパク質濃縮を目的とした
WPC34 ではタンパク質が 352 (mg∙g−1)、一方ホエイパウダーでは 117 (mg∙g−1) であるのでおよそ 3 倍に濃縮されている (表 1)。そこで、6 g·L−1 WPC34 と 20 g·L⁻1 ホ
エイパウダーにおける細胞増殖を比較したところ、培養 72 時間から 96 時間の比増殖速度は 0.0119 と 0.0381、最大細胞密度を示す OD700 が 0.220 と 0.678 であった。
ホエイパウダーの方が高い細胞増殖性が示されたので、濾過工程により、WPC34 はホエイパウダーと比較してC. reinhardtii の増殖に必要な栄養素が減少している、もしくは、WPC34 の因子が増殖を抑えるレベルまで濃縮されている可能性が示唆された。に比べ C. reinhardtii の増殖に必要な栄養素が減少していることが強く示唆された。

図 2 培地中 WPC34 濃度と細胞増殖の相関性
次に、WPC34 はホエイの濾過工程によりどういった栄養素が流出したのかを解析した(表 2)。タンパク質が 3 倍に濃縮されているとしたときに同倍率で濃縮されているかを評価した結果、鉄や亜鉛、銅といった金属元素は濃縮維持率が 90%以上であった一方、存在量の多いカリウムやリンが 30%程度の濃縮維持率に留まるなど濾過による流出が窺われた。従って、これらのミネラル成分が増殖に影響を与えている可能性が示唆された。
表 2 ミネラルの濃縮維持率−1sample

図 1 乳製品加工残渣を栄養源として生育した
C. reinhardtii の細胞密度の変化

WPC34
ホエイパウダー
濃縮維持率 (%)

K
1,120
1,34027.9

Mineral (mg·100mg )
CaP
Na
708
575
305
546
581
521
43.2
33.0
19.5

Fe
0.36
0.1392.3Zn
0.34
0.1294.4

表 1 乳製品加工残渣の組成
Carbohydrate
sampleWPC34
ホエイパウダー−1(g·100g )
52.9
80.0

ProteinLipid−1

Mineral−1

sampleAsh−1−1(g·100g ) (g·100g ) (g·100g ) (g·100g )
35.2
11.7

3.8
1.5

2.83.12.02.2

そこでこれらの可能性のどちらが正しいかを明らかに す る た め 、 培 地 中 WPC34 の 濃 度 を 振 っ て C.
reinhardtii の細胞増殖性が評価された (図 2)。その結果、培養時間が長くなるにつれて近似直線の傾きが大きくなるともに、R 2 値は培養 72 時間で 0.9 を超え、培養 120 時間以降では 0.95 を超えたことが明らかになった。また、3 g·L⁻1 と 6 g·L⁻1 の WPC34 では、培養時間が長くなるほどプロットが詰まっているため、これらの濃度では細胞増殖に必要な栄養が不足していることが伺えた。10 g·L⁻1 WPC34 では培養時間が長いところでもプロットが詰まっていないため、細胞増殖に充分な栄養源が存在していたと考えた。以上のように、培地中 WPC34 の濃度と OD が示唆する細胞密度には相関 性 が 見 ら れ 、 同 じ 培 養 時間 に お け る 細 胞密 度 はWPC34 の濃度依存的に変化することが示された。従って、濾過工程により、WPC34 の因子が増殖を抑えるレベルまで濃縮されているのではなく、ホエイパウダー

WPC34
ホエイパウダー
濃縮維持率 (%)

Mg
105
98.4
35.6

Mineral (mg·100mg−1)
Mo
Cu
Mn
0.080
0.03
N. D.
0.053
0.01
N. D.
50.3
100.0-

Co
N. D.
N. D.
-

現在、流出が疑われたミネラルの中で、まずは一般的に植物に必要とされる元素である「リン」「カリウム」が細胞応答に関与するか評価するために、窒素源をWPC34 に代替した TAP 培地にカリウムとリンを添加して緑藻を培養し細胞応答を評価するとともに、定量
PCR による代謝応答も併せて評価している。
本研究により乳製品加工残渣が緑藻の生育に利用できることを明らかにし、乳製品製造工場の製造プロセスと連続的に接続、乳製品加工残渣に加え廃熱を利用することで、生産プロセスのカーボンニュートラルに寄与し、クリーン・プロダクションの実現が望まれる。

4. 文献
1) Prazeres, A.R., et al.: Waste Manege., 110,48-68, Elsevier (2012)2) Ibarruri, J., Hernández, I.: Bioprocess
Biosyst. Eng., 42, 1285-1300, Springer (2019)61