iDeal ChIP-qPCR kit
Cat. No. C01010180 (24 rxns)

USER GUIDE
Version 2 10_06_2017

目次
はじめに

4

キットの概要と所要時間

5

構成品

6

本キット以外に用意するもの

7始める前の注意点

9

プロトコル

15

実験結果の例

32

断片化クロマチンの分析プロトコル

34

FAQ

36

関連製品

39

3

はじめに
タンパク質とDNAは、遺伝子転写、エピジェネティックサイレンシン
グ、および多くの重要な細胞機能を制御する機構に大きな影響を与えています。そのためこれらの相互作用、およびそれらが遺伝子調節経路および細胞増殖を制御または誘導する機構を理解することは重要です。 クロマチン免疫沈降（ChIP）は、特定のゲノム領域とのタンパク質の相互作用を分析する技術です。 ChIPは、エピジェネティックな特性やクロマチン再構成、特定のゲノム領域に結合する転写調節因子の変化などを研究するために使用することができます。
iDeal ChIP-qPCRキットは、細胞や組織をサンプルとし、ヒストンおよびクロマチンに作用する転写因子などのタンパク質を研究するために適した実験キットです。このプロトコルでは、まずはホルムアルデ
ヒドによりタンパク質とDNAを架橋し、細胞溶解の後、架橋されたクロマチンの断片化を行います。その後のクロマチンの免疫沈降は、標的タンパク質に特異的な抗体（ユーザーが指定する）を用います。プ
ロテインA磁気ビーズを用いて目的のタンパク質-DNA複合体を単離し、その後、免疫沈降したDNAを溶出します。 溶出されたDNAはqPCR分
析に適しています。
本キットが持つ優れた点は以下の通りです :• 細胞および組織どちらからでも、迅速かつ高感度にChIP-qPCRができるようなプロトコルを提供します• 磁気ビーズを使用することで、高速で再現性の高い簡単なChIPを行うことができます• 当社の ChIP用抗体を組み合わせることにより、優れた特異性と感度で高い収量を得ることができます• qPCR分析に適したDNAを溶出できます4

キットの概要と所要時間
所要時間

細胞および組織採取、DNA-タンパク質架橋反応

細胞溶解およびクロマチ
ンの断片化

30 分

1―2
時間

日数

1

1

磁気免疫沈降DNA精製および脱架橋

ライブラリー調製および次世代シーケンシングの前に行う定量PCRおよびデータ
解析

5

一晩

1-2

30 分

2

2 ―3
時間

2

構成品
iDeal ChIP-qPCRキットには、4種類のクロマチン調製、24種類のクロ
マチン免疫沈降、32種類のDNA分離を行うのに十分な試薬が含まれています。
キットの内容は表1に記載されています。本キットを受け取った後は、示された温度にて構成品を保管してください。
表1. 本キットの構成品
内容

容量

保管温度

Protease inhibitor cocktail

80 µl

-20°C

5% BSA (DNA free)

784 µl-20°C

Proteinase K

32 µl

-20°C

Rabbit IgG

8 µg

-20°C

Glycine

8.8 ml4°C

Shearing Buffer iS1b

9 ml

4°C

DiaMag protein A-coated magnetic beads

720 µl4°C,
凍結不可

Wash Buffer iW1

8.4 ml4°C

Wash Buffer iW2

8.4 ml4°C

Wash Buffer iW3

8.4 ml4°C

Wash Buffer iW4

8.4 ml4°C

ChIP-seq grade water

26.6 ml

4°C

Fixation Buffer

8 ml

4°C

DNA isolation Buffer (DIB)

3,2 ml4°C

5x ChIP Buffer iC1b

6.9 ml

4°C

Lysis Buffer iL1b

100 ml

4°C

Lysis Buffer iL2

60 ml

4°C

Elution Buffer iE1

220 µl4°C

Elution Buffer iE2

20 µl

4°C

6

本キット以外に用意するもの
道具および試薬類• 手袋（すべての段階で着用すること）• RNase/DNase-free 1.5 ml チューブ• ホルムアルデヒド 37% （分子生物学用）• Phosphate buffered saline (PBS)• qPCR SYBR® Green マスターミックス• ChIP用 抗体 – www.diagenode.com• ChIP用プライマー - www.diagenode.com• スクレーパー (接着細胞用)• Reagents for DNA purification, required for chromatin shearing
assessmentDNA精製用試薬: クロマチンの断片化評価に必要 (eg.
IPure kit v.2, Diagenode, Cat. No. C03010014 or MicroChIP
DiaPure columns, Diagenode Cat. No. C03040001)
組織採取を行う場合に必要なもの:• Protease 阻害剤カクテル(Diagenode, Cat. No. C12010011 orC12010012) (100 µl per chromatin preparation)• 外科用メス• ペトリ皿装置類• DiaMag 1.5 magnetic rack (Diagenode, Cat. No. B04000003)• Picoruptor (Diagenode, Cat. No. B01060001) と 1.5 ml
Picoruptor® Microtubes with Caps (Cat. No. C30010016)• 冷却遠心機 ：1.5 mlと 15 ml チューブ
• DiaMag Rotator (Rotating wheel) (Diagenode, Cat. No. B05000001)• Vortex• Thermomixer• qPCR cycler7オプション• Chromatin Shearing Optimization kit - Low SDS (iDeal Kit for TFs)
(Diagenode, Cat. No. C01020013)• 1M Sodium butyrate (NaBu) (Diagenode, Cat. No. C12020010)• ChIP Cross-link Gold (Diagenode, Cat. No. C01019027)• RNase カクテル (e.g. Ambion, AM2286A)；クロマチンの断片化評
価に必要• 蛍光原理を用いたDNA濃度測定機器
例. Qubit dsDNA BR Assay Kit (Life Technologies #Q32853)• Qubit® Fluorometer (ThermoFisher Scientific)

8

始める前の注意点
1. 細胞数
このプロトコルでは、6回分のIP反応と、インプットサンプルおよび断片化クロマチンの評価を各1サンプルずつ行うために十分なクロマチン
サンプルのバッチ調製量を記載しています。 1バッチあたりに必要なスタートサンプルの細胞数は、研究対象となる標的に依存します（ヒストンマークは、転写因子よりも少ない細胞数を必要とします）。 ターゲットに応じて、以下の量の細胞数で作業することをお勧めします。
標的

1バッチあ
たりの細胞
数

1IPあたり
の細胞数

IP数

転写因子

25,000,000~ 4,000,000

6 IPs +
1 INPUT +1 shearing assessment

ヒストン

7,000,000

1,000,000

6 IPs +
1 INPUT +1 shearing assessment

1バッチあたりの細胞数は実験計画に合わせて調整します。
記載されたプロトコルでは、細胞培養プレートにて細胞を直接固定する方法を使用していることに注意してください。この場合、固定細胞とスクレイプされた細胞は正確にはカウントできません。これは、接着細胞の場合、プレートあたりの細胞数の概算を使用する必要があることを意味します。あるいは、固定前に計数のための追加の平行板を準備して懸濁細胞を数えることもできます。
標的の存在量、抗体の特異性、および利用可能な細胞数に依存して、IPあたりの細胞数をスケールアップまたはスケールダウンすることができます。もしくはより小さいまたはより大きなバッチの細胞数で開始することも可能です。
IPあたりの細胞数をより少なくするには、推奨バッチで開始し、クロマチン断片化ステップまで行います。 次に、IP反応に進む前に、

9Shearing Buffer iS1bで断片化されたクロマチンを希釈します。 最適な細胞数が含まれる希釈クロマチンの最終容量は、1IP反応あたり250μlでなければならないことに留意してください。
標準プロトコルと異なる量の細胞数で開始する場合、またはIPごとにより多くの細胞を使用する場合は、最初にIPごとに使用する細胞数とIPの総数を決定します。標準プロトコルで説明されているように細胞を固定します。細胞の回収および溶解のために、100万個の細胞当たり1mLのiL1bと0.6mlのIL2bを目安にして、iL1bおよびiL2バッファーの容量をスケールアップまたはスケールダウンしてください。Shearing
Buffer iS1bの量は、以下が必要であることを考慮して決定してください：• 1IPごとに250 µl の断片化クロマチン(最適な量の細胞が含まれる)• 1インプットごとに2.5 µl の断片化クロマチン• 断片化クロマチン分析のための50 µl の断片化クロマチン• 5% のiS1b余剰量
必要量のShearing Buffer iS1bに細胞を再懸濁し、標準プロトコルに従います。
Shearing Buffer中の細胞濃度が増加または減少すると、断片化効率に影響を及ぼします。そのため、断片化条件のさらなる最適化が必要とされる可能性があります。
同じバッチでヒストンと転写因子の両方を研究する場合は、TFの推奨事項を参照してください。 次いで、ヒストンマークについては、
Shearing Buffer iS1b中のサンプルを希釈して、1IPあたり細胞数が100万個になるように調整してください。
このプロトコルは、総量350μlのChIP反応において、断片化されたクロマチン250μlを使用するように最適化されています。最適な結果を得る
ためには、これらのボリュームを一定に保つことが重要です。
2. 組織量このプロトコルでは、6回分のIP反応と、インプットサンプルおよび断片化
クロマチン評価を各1サンプルずつ行うために十分なクロマチンサンプルの10バッチ調製量を記載しています。1バッチあたりに必要な組織のスタート量
は、研究対象となる標的に依存します：一般にヒストンマークは、転写因子よりも少ないスタート量で行うことができます。ターゲットに応じて、以下の組織量で作業することをお勧めします。
1バッチあたりの組織量1IPあたりの組織量

転写因子200 mg~30 mg

6 IPs +
1 INPUT +1 shearing assessment

ヒストン

40 mg

~7 mg

6 IPs +
1 INPUT +1 shearing assessment

標的

IP数

1バッチあたりの組織量は実験計画に合わせて調整します。
標的の存在量、抗体の特異性、および利用可能な組織量に依存して、IPあたりの組織量をスケールアップまたはスケールダウンすることができます。もしくはより小さいまたはより大きなバッチの組織量で開始することも可能です。
IPあたりの組織量をより少なくするには、推奨された組織量で開始し、クロマチン断片化ステップまで行うことができます。 次に、IP反応に進む前に、Shearing Buffer iS1bで断片化されたクロマチンを希釈します。 最適な組織量が含まれる希釈クロマチンの最終容量は、1IP反応あたり250μlでなければならないことに留意してください。
標準プロトコルと異なる量の組織量で開始する場合、またはIPごとにより多くの組織を使用する場合は、最初にIPごとに使用する組織量とIPの総数を決定します。
標準プロトコルに記載されているように組織を固定します。組織の固定、採取および溶解は標準プロトコルに従ってください。使用する組織量に関わらず、Lysis Buffer iL1bおよびiL2は標準プロトコルと同量を使ってください。Shearing Buffer iS1bの量は、以下が必要であることを考慮して決定してください：• 1IPごとに250 µl の断片化クロマチン(最適な量の細胞が含まれる)• 1インプットごとに2.5 µl の断片化クロマチン• 断片化クロマチン分析のための50 µl の断片化クロマチン
11• 5% のiS1b余剰量
必要量のShearing Buffer iS1bに組織を再懸濁し、標準プロトコールに従います。
Shearing Buffer中の組織濃度が増加または減少すると、断片化効率に影響を及ぼします。そのため、断片化条件のさらなる最適化が必要とされる可能性があります。
組織サンプルから架橋クロマチンを採取する場合、クロマチンの収量は組織タイプによって大きく異なる可能性があります。ヒストンマー
クの1 IPあたりのクロマチン量は、0.5〜3μgの範囲にあるべきですが、転写因子にはより高い量（3〜10μg）が必要です。パイロット実験を行い、組織の最適量を決定することを推奨します。一度量を決定したら、その量を実験間で一定に保ってください。
このプロトコルは、総量350μlのChIP反応において、断片化クロマチン
250μlを使用するように最適化されています。最適な結果を得るためには、これらのボリュームを一定に保つことが重要です。
3. 固定最適化
ホルムアルデヒドは、直接相互作用する2分子を固定する際、最も一般的に使用される理想的な架橋試薬です。固定時間はターゲットに依存するため、追加の最適化が必要な場合があります。一般的に、標準的な固定プロトコルを使用した場合、転写因子（10〜20分）よりもヒス
トンマーク（8〜10分）の方が固定時間は短くなります。 固定時間が長くなると、超音波処理をしてもクロマチンが断片化されにくくなる
ため、注意してください。
しかしながら、より高次の相互作用、または動的な相互作用について
は、効率的なタンパク質 - タンパク質固定化のために他の架橋剤を考慮する必要があります。その場合、革新的なデュアルクロスリンク
ChIP 固 定 試 薬 で あ る 、 Diagenode ChIP Cross-link Gold
（Diagenode、カタログ番号C01019027）をおすすめします。

12

4. 断片化の最適化
クロマチン断片化は、ChIP手順における最も重要なステップの1つです。
ChIP実験に理想的なのは 100〜600bpの間のクロマチン断片です。最適な超音波処理時間は、細胞型、細胞密度、試料量、固定時間などの多くの要因に依存します。したがって、新しいChIPプロジェクトごとに超音波処理
条件を最適化することが重要です。
本キットは、クロマチン断片化を最適化するための十分な試薬を含有しておりません。断片化条件を最適化するには、iDeal ChIP-qPCR kitに適合するクロマチン調製に必要なすべてのバッファーを含むLow SDS（iDeal
Kit for TFs）（カタログ番号C01020013）を使用することをお勧めします。
このキットに含まれる試薬を使うことで、最適化された断片化条件でクロマチンを調製することができます。
Picoruptorを使用する場合は、超音波処理の最初のタイムコース実験を5-10-15回の30 "ON / 30" OFFサイクルで行うことををお勧めします。
詳しくはPicoruptor（https://www.diagenode.com/files/protocols/bioruptor-picochromatin- preparation-guide.pdf）のクロマチン調製についてのガ
イドを参照してください。

なるべく短い時間で、効率的にクロマチンを断片化するように超音波処理を行ってください。 過剰な超音波処理はChIPの効率を低下させる可能性があります。
5. 磁気ビーズ
このキットには、DiaMag Protein Aでコーティングされた磁気ビーズが含まれています。 乾燥すると性能が低下するため、実験中にビーズが乾かないようにしてください。 ピペッティングするときはいつも懸濁液中でビーズが均一になるように注意してください。ビーズの量の変動は再現性を低下させます。また、ビーズを凍らせないでください。
DiaMag Protein A-coated magnetic beads は、ウサギ、モルモッ
ト、イヌおよびブタポリクローナルおよびモノクローナルAb、
マウスIgG2a、IgG2bおよびIgAおよびヒトIgG1、IgG2およびIgG4の免疫沈降に適しています。
13

6. ChIP用抗体
ChIPで使用される抗体の品質は、実験の成功に大きく影響します。
ChIP検証済み（妥当性確認）で、標的を特異的に認識する抗体のみを使用することをお勧めします。当社では、ChIP / ChIP-seqで特異性が確認されている、広範に検証された高性能抗体を提供しています。 各
バッチで検証され、バッチ固有のデータはウェブサイト
www.diagenode.comで入手できます7. インプット
インプットサンプルは、免疫選択を行わずに、全てのChIP手順を経たサンプルで、完全なゲノムDNAに対応します。インプットサンプルは、
ChIP手順の終了時に回収率を計算するための基準として使用されます。
ChIP実験ごとに1つのインプットサンプルを含めることをお勧めします。
8. ネガティブコントロール
このキットにはネガティブIgG抗体が含まれています。 ChIP反応の各シリーズに1つのネガティブIgGコントロールを含めることを推奨します。
9. 定量PCR 分析
当社では少なくとも 1 つの陽性対照領域および 1 つの陰性対照領域を用いて SYBR®Green qPCR によりインプットおよび免疫沈降したサンプルを分析して濃縮度を決定することを推奨しています。 各特異的抗体は、ユーザーによって設計された特異的プライマーを必要とします。
各プライマー対について、免疫沈降した試料と並行してインプット
DNA を使用します。異常値同定するために triplicate の PCR 反応が推奨されますが、少なくとも duplicate で PCR 反応を行うことをおすす
めします。

14

PROTOCOLCELLS
TISSUESCELLS & TISSUESSTEP 1 –細胞採取およびDNA-タンパク質架橋反応（培養細胞）

17

STEP 2 –細胞溶解およびクロマチン断片化（培養細胞）

18

STEP 1 –組織解離およびDNA−タンパク質架橋反応（組織）21

STEP 2 - 細胞溶解およびクロマチン断片化（組織）23

STEP 3 –磁気免疫沈降

26

STEP 4 – DNA精製および脱架橋

28

STEP 5 –定量PCR解析

3015プロトコル
iDeal ChIP-qPCRkit は、染色体の調製や、細胞や組織からの免疫沈降や、転写因子や転写因子に適しています。 ステップ1「DNA-タンパク質架橋」および
ステップ2「細胞溶解およびクロマチン断片化」のプロトコルは、細胞および組織で異なります。 それぞれ対応するセクションを参照してください。 ステップ3「磁気免疫沈降」以降は、両方のサンプルタイプについて同じプロトコルです。プロトコルは、6回分のIP反応と、インプットサンプルおよび断片化
クロマチンの評価を各1サンプルずつ行うために十分なクロマチンサンプルのバッチ調製量を記載しています。スタートサンプルの正確な量は、標的タンパ
ク質に依存します。以下の表では、ヒストンおよび非ヒストンタンパク質の1バッチあたりおよび1 IPあたりの推奨される細胞または組織の量を示します。
それに応じて1バッチあたりの細胞/組織の量を実験計画に合わせてください。

Table 2. 推奨細胞数
標的

1バッチあたりの細胞数1IPあたりの
細胞数

IP数

転写因子

25,000,000~ 4,000,000

6 IPs +
1 INPUT +1 shearing assessment

ヒストン

7,000,000

1,000,000

6 IPs +
1 INPUT +1 shearing assessment

1バッチあたりの組織量1IPあたりの
組織量200 mg~30 mg

6 IPs +
1 INPUT +1 shearing assessment~7 mg

6 IPs +
1 INPUT +1 shearing assessment

Table 3. 推奨組織量
標的

転写因子

ヒストン

40 mg

16

IP数

細胞採取
およびDNA-タンパク質架橋反応Day 1

30 minutes

培養細胞を使用する場合
1.1. 使用前にFixation Bufferを室温に戻します。
1.2. Cross-Linking Solutionを調製します。ヒュームフード内で、ホルムア
ルデヒドが最終濃度11％になるように、Fixation bufferに添加します。
例えば、37％ホルムアルデヒド0.6mlをFixation buffer1.4mlに加えます。次にCross-Linking Solutionを1:10の割合で細胞培養培地に直接加えます。例えば20 mlの細胞培養には、2 mlのCross-Linking Solution
を添加します。

1.3. 穏やかに振とうしながら室温で10分間細胞をインキュベートします。
NOTE:固定時間は、さらに最適化が必要な場合があります。「始める前の注意点」を参照

してください。

1.4. 1: 10の割合でGlycineを細胞培養培地に添加して固定を停止します（例
えば、20mlの細胞培養液で開始したときに2.2mlのGlycineを加える）。
穏やかに振とうしながら室温で5 分間インキュベートします。その後すぐに次のステップに進んでください。
NOTE: ChIPの前に行う断片化クロマチンの調製には、新しく固定した細胞を使用することを強くお勧めします。それが難しい場合、固定細胞は-80℃で最大4ヶ月間保存することができます。細胞を凍結する
ために、培地を除去し、20mlのPBSで細胞を1回洗浄します。次に別の5mlのPBSを添加し、スクレイピン
グまたは500xgで5分間、4℃で遠心分離し上清を捨て細胞を回収し、細胞ペレットを-80℃で保存します。
17

PROTOCOL

STEP 1STEP 2
細胞溶解
およびクロマチン断片化
Day 1

1 to 2 hours

培養細胞を使用する場合
接着細胞の場合:
2.1. 培地を除去し、20mlのPBSで細胞を1回洗浄して、PBSを捨てます。
4℃または氷上ですべてを保管してください。

2.2. 5mlの 氷冷 Lysis buffer iL1bをプレートに加えます。細胞をスクレイピングして収集し、50mlチューブに移す。

2.3. 下の表で推奨する量のLysis Buffer iL1bでフラスコをすすぎ、これを50mlチューブに加えます。
Buffer iL1b
転写因子(25.000.000 cells)

20 ml

ヒストン (7.000.000 cells)

2 ml(スケールアップまたはダウンする際は、100万個の細胞あたり1mlのLysis Buffer iL1bを目安にして使用してください)

すぐにStep2.4へ進んでください。
浮遊細胞の場合:

2.1. 細胞を50mlチューブに移します。500×gおよび4℃で5 分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清の細胞培養培地を捨てます。
18

し、上清を静かに捨てます。 4℃または氷上ですべてを保管してください。

2.3. 氷冷したLysis Buffer iL1b 1 mlに細胞を数回上下にピペッティングして再懸濁します。 以下の表に示す量のLysis Buffer iL1bを追加します。
その後すぐにStep 2.4に進んでください。
Buffer iL1b
転写因子(25,000,000 cells)

24 ml

ヒストン(7,000,000 cells)

6 ml（スケールアップまたはダウンするにはに、100万個の細胞あたり1mlのiL1bを使用してください）2.4. DiaMag Rotatorで穏やかに混合しながら4℃で20 分間インキュベート
します。 500×gおよび4℃で5 分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を捨てます。

2.5. 1mlの氷冷Lysis Buffer iL2に細胞ペレットを再懸濁させ、数回ピペッティングします。 下の表にしめす量のLysis Buffer iL2を追加します。
Buffer iL2
転写因子(25.000.000 cells)

14 ml

ヒストン(7.000.000 cells)

3.2 mlスケールアップまたはダウンするには、100万個の細胞当たり600μlの
buffer iL2を使用してください。

2.6. DiaMag Rotatorで穏やかに混合しながら4℃で10分間インキュベート
します。 細胞を500×gおよび4℃で5分間遠心分離して再度ペレット化
し、上清を捨てます。

2.7. 1.67ml の Shearing Buffer iS1b に 8.4μl の 200xprotease inhibitor
cocktailを加えます。氷上においてください。

2.8. 調製したShearing Buffer iS1bを細胞ペレットに加えます。 Shearing
Buffer 中の細胞濃度は以下の様になるように調整してください：
転写因子

1.5 million cells per 100 µl iS1b

ヒストン

420.000 cells per 100 µl iS1b
19

PROTOCOL

2.2. 氷冷PBS 20 mlに細胞を再懸濁し、500 x gおよび4℃で5 分間遠心分離

2.9. ピペットで上下に数回細胞を再懸濁し、氷上で10分間インキュベート
します。細胞懸濁液を最大300μlずつ、適切な超音波破砕用マイクロチ
ューブに分注します。

• Picoruptorを使用する場合は、1.5 mlのPicoruptor
Microtubes with Caps（カタログ番号 C30010016）を使用してください。
NOTE: Picoruptor®による断片化の最大容量は、1.5mlのマイクロチューブあたり300μlです。 超音波処理の効率を上げるために、必ず正しいタイプのマイクロチューブを使用してください。

2.10. Picoruptorを用いた超音波処理でクロマチンを断片化します。 お使いのデバイスに適合したプロトコルを選択してください：• 30秒間 "ON"、30秒間 "OFF"で5〜12回の断片化処理を行ってください。
NOTE: Chromatin Shearing Optimization kit – Low SDS（iDeal Kit for TFs） （カタログ
番号C01020013）を使用して、新しいサンプルタイプごとにパイロット実験を行うことをお勧めします。

2.11. サンプル中の液体を15秒間短くスピンダウンします。サンプルを新し
い1.5 mlチューブに移し、16,000 x g、4℃で10分間遠心します。断片
化されたクロマチンを含む上清をプールします。

2.12. 別のセクション「クロマチン断片化分析のプロトコル」に記載されているように、断片化評価のために断片化クロマチン50μlを取り分けておきます。
NOTE: クロマチンの各バッチの断片化解析をお勧めします。このステップは、目的の実

験条件に対する最適な超音波処理設定（細胞型、細胞数および固定）が以前に確立されている場合は省くことができます。

2.13. 免疫沈降（Step3 磁気免疫沈降）に進みます。すぐに使用しない場合、クロマチンは-80°Cで最大二ヶ月間保存することができます。

20

組織解離および
DNA-タンパク質架橋反応Day 1

30 minutes

組織を使用する場合
1.1. 使用前にFixation Bufferを室温に戻します。
1.2. ヒュームフード内で、37％ホルムアルデヒド54μlを、最終濃度1％になるように、2mlのFixation Bufferに添加し、Cross-Linking Solution
を調製します。1つのクロマチン調製に2 mlのFixation Bufferを使用します。

1.3. 氷上でペトリ皿に新鮮または凍結組織（200mgまで）を必要量入れます。 サンプルは常に氷上に置き、サンプルの劣化を防ぐために操作時間を最小限に抑えてください。

1.4. メスの刃を使用して組織を小さな断片（1〜3 mm3）に切り、ダウンス型ホモジナイザーに移します。Fixation Bufferで希釈したホルムア
ルデヒド1 mlを加えます。

1.5. 均一な懸濁液を得るために、ダウンス型ホモジナイザーを用いて組織を直ちにホモジナイズします。 総固定時間10 分間のタイマーを設定します。この時点から固定時間の計測を開始します。
NOTE : 固定時間は、さらに最適化が必要な場合があります。 「始める前の注意点」を参照してください。

21

PROTOCOL

STEP 1

1.6. 組織懸濁液を15mlチューブに移します。ダウンス型ホモジナイザーに希釈したホルムアルデヒド1 mlを追加して洗い流し、同じ15 mlチュー
ブにサンプルをプールします。

1.7. 室温で、DiaMag Rotatorで穏やかに回転させながら、Step 1.5から開始した固定時間が合計で10分間になるまでインキュベートします。

1.8. 組織懸濁液に200μlのGlycineを加えて固定を停止します。DiaMag
Rotatorで穏やかに混合しながら室温で5分間インキュベートします。
すぐに次のステップに進んでください。
NOTE: 断片化クロマチンの調製には、新しく固定した組織を使用することを強くお勧めします。それが難しい場合、固定組織は-80℃で最大4ヶ月間保存することができます。
組織を凍結するには、培地を除去し、2mlのPBSで組織を1回洗浄し、組織ペレットを80℃で保存します

22

細胞溶解
およびクロマチン断片化
Day 1

1 to 2 hours

組織を使用する場合
NOTE: 本キットとは別に、1つのクロマチン調製物につき100μlのプロテアーゼ阻害剤カクテルが必要です2.1. サンプルを4℃で5 分間、850 x gで遠心分離します。静かに上清を捨てペレットを残しておきます。
2.2. ペレットを10 mlの氷冷PBSで洗浄し、4℃で5分間850 x g で遠心し、静かに上清を捨てます。 4℃または氷上ですべてを保管してください。
2.3. 200x protease inhibitor cocktail 50μlを10mlの氷冷Lysis Buffer
iL1bに添加します。
2.4. 氷冷したLysis Buffer iL1b 1mlをペレットに添加し、数回ピペットで再懸濁します。その後残りの9mLのiL1bを追加します。
2.5. DiaMag Rotatorで穏やかに混合しながら4℃で20分間インキュベートします。
2.6. 4℃で850 x gで5分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を捨てます。
23

PROTOCOL

STEP 2

2.7. 200x protease inhibitor cocktail 50μlを10mlの氷冷Lysis Buffer
iL2に添加します。氷冷したLysis Buffer iL2 1mlを細胞ペレットに添加し、数回ピペッティングすることにより細胞を再懸濁します。
その後残りの9mLのBuffer iL2を追加します。
2.8. DiaMag Rotatorで10分間穏やかに混合しながら4℃でインキュベートします。
2.9. 4℃で850 x gで5分間遠心分離して細胞を再びペレット化し、上清を捨てます。
2.10. 1.67mlのShearing Buffer iS1bに8.4μlの200xprotease inhibitor
cocktailを加えます。氷上で操作してください。
2.11. ペレットに完成したShearing Buffer iS1bを添加します。ピペットで上下に数回細胞を再懸濁し、バウンスホモジナイザー（タイトなペッスル）を用いてホモジナイズします。氷上で10分間インキュベートしてください。
2.12. 細胞懸濁液を最大300μlずつ、適切な超音波破砕用マイクロチュー
ブに分注します。
• Picoruptorを使用する場合は、1.5 mlのPicoruptor
Microtubes with Caps（カタログ番号 C30010016）
を使用してください。
NOTE: Picoruptor®によるせん断の最大容量は、1. 5mlのマイクロチューブあたり300μl です。超音波処理の効率を上げるために、必ず正しいタイプのマイクロチューブを使用してください。

2.13. Picoruptorを用いた超音波処理でクロマチンを切断します。 お使
いのデバイスに適合したプロトコルを選択してください：• Picoruptorを使用する場合、30秒間 "ON"、30秒間 "OFF"で5〜12回の断片化処理を行ってください。
NOTE: Chromatin Shearing Optimization kit - Low SDS（iDeal Kit for TFs）（カタログ
番号C01020013）を使用して、新しいサンプルタイプごとにパイロット実験を行うことをお勧めします。

24

2.15. （オプション）この段階で上清中のDNA濃度を定量することができます。 蛍光定量（例えば、Qubitアッセイ、ThermoFischer
Scientific）を使用することを推奨します。
2.16. 断片化評価のために、断片化したクロマチン50μLを取り分けておきます。クロマチン断片化分析のプロトコルは、別セクション「クロマチン断片化分析のプロトコル」を参照してください。
NOTE: クロマチンの各バッチの断片化解析をお勧めします。所定の実験条件（細胞型、細胞数および固定）に対する最適な超音波処理の設定が以前に行われている場合、このステップを省略することができます。

2.17. 免疫沈降（Step 3 磁気免疫沈降）に進みます。すぐに使用しない
場合、クロマチンは-80℃で最大2ヶ月間保存することができます。

25

PROTOCOL

2.14. サンプル中の液体を15秒間短くスピンダウンします。サンプルを新しい1.5 mlチューブに移し、16,000 x gで4℃、10分間遠心します。断片化されたクロマチンを含む上清をプールします。

STEP 3
磁気免疫沈降Day 1-2

Overnight

培養細胞および組織（共通）
3.1. ネガティブコントロールIP（IgG）を含む、IP反応の総数を決定します。
1IPあたり30μlのDiaMag Protein A-coated magnetic beadsを取り、新しい1.5 mlチューブに移します。

3.2. 以下の試薬を混合して1x ChIP Buffer iC1b 4 mlを調製します :• 3.2 ml ChIP-seq grade water• 0.8 ml 5x ChIP Buffer iC1b
• 80 µl of 5% BSA
希釈した1x ChIP Buffer iC1b は氷上に置いてください。
NOTE : 1x ChIP Buffer iC1b 4 mlで最大6IP分のビーズを洗浄できます

3.3. 1mlの氷冷1×ChIP Buffer iC1bでビーズを3回洗浄します。ビーズを洗浄す
るには、ビーズ懸濁液に直接1x ChIP Buffer iC1b 1 mlを加え、ピペットで数回上下させてビーズを再懸濁し、4℃で5分間振とうしながらインキュベートします。チューブをスピンダウンさせ、1.5 ml Diagenode磁気ラック（DiaMag1.5）に入れます。1分間待ってビーズを磁石に捕捉させ上清を除去します。これを2回繰り返します。

3.4. 最後の洗浄後、ビーズの元の容量（IPあたり30μl）を加えて1x ChIP
Buffer iC1bにビーズを再懸濁します。

3.5. 必要な数の1.5mlチューブ（1 IPあたり1本）に、30μlの洗浄したビーズを各チューブに加えます 。
26

+0.5] 回のようにIP数を設定し、スケールアップしてください。
NOTE: 異なる抗体または異なる量の抗体を使用する場合は、それぞれ別々のChIP reaction mixを準備してください。
• 6 µl of BSA• 1.8 µl 200x protease inhibitor cocktail• 20 µl 5x iC1b Buffer• (42.2 µl –x µl) water• Add x µl of ChIP-grade antibody
The total volume of the ChIP reaction mix per IP is 70 µl
NOTE: IPあたりの抗体の必要量は変わることがあります。 サプライヤーの推奨をチェックするか、抗体の量を変えて滴定曲線を作成してください。 ネガティブコントロールIPには1μgのIgG（ネガティブコントロール抗体）を使用します。必要に応じて、NaBu（最終濃度20mM）または他のHDAC阻害剤を添加することもできます。

3.7. 70μl の ChIP reaction mix を 30μl の 洗 浄 し た Protein A-coatedmagnetic beadsが分注されたそれぞれのチューブに加えます。チューブを4℃で2〜4時間インキュベートし、DiaMag Rotatorで一定回転下でインキュベートします。

3.8. ChIP reaction mixを入れたチューブを軽くスピンダウンし、断片化したクロマチン 250μlを加えます。チューブを4℃で一晩DiaMag
Rotatorで回転させ、インキュベートします。また、Step 4.3から始まるインプットサンプルとして使用するために、断片化したクロマチン
2.5μlを取り分け4℃で保存してください。

3.9. 以 下 の よ う に 洗 浄 を 行 い ま す ： チ ュ ー ブ を 短 く ス ピ ン ダ ウ ン さ せ て
DiaMag1.5に入れます。1分間待って上清を除去します。Wash Buffer iW1
350μlを加えます：ビーズを再懸濁するためにチューブを静かに振とうし、4℃
でDiaMag Rotatorで5分間インキュベートします。

3.10. Wash Buffer iW2、iW3および iW4をそれぞれ用いて、上記の洗浄工程を1回ずつ繰り返します。

27

PROTOCOL

3.6. 以下に1IP分のChIP reaction mixの調製法を記載します。[必要なIP数

STEP 4
DNA精製および
脱架橋
Day 2

30 minutes

培養細胞および組織（共通）
4.1. 100μlのDIB Bufferに1μlのProteinase Kを加えて、完全なDIB Bufferを調製します。 インプットサンプルを含むサンプル数に応じてスケールアップまたはダウンします（IPサンプルあたり100μl、
インプットには97.5μl必要です）。

4.2. IPサンプルが入っているチューブをスピンダウンし、DiaMag1.5にセットします。 1分間待って上清を除去します。

4.3. インプットサンプルを軽く遠心分離し、この時点以降のIPサンプルと並行して処理します。

4.4. 磁気ラックからチューブを取り外し、100μlの完全なDIB BufferをIPサ
ンプルに加えます。 ピペットで上下に数回ビーズを再懸濁します。並行して97.5μlの完全なDIB Bufferをインプットサンプルに加えます。

4.5. 55℃で15分間インキュベートし、続いて100℃で15分間
インキュベートします。

4.6. チューブを短くスピンダウンして、蓋についた液体を落とします。
4.7. チューブをDiaMag1.5にセットし、1分間待ちます。

28

4.8. DNAを含む上清を、ラベルした新しいチューブに移します。各サンプルについてqPCRによって分析される領域の総数を決定し、qPCR分析に必要な量をとります。
NOTE : 使用したマスターミックスおよびqPCRサイクラーの感度に応じて、サンプルは
PCR前に希釈することができ、PCRあたりの容量は変わることがあります

4.9. その後の使用まで-20℃で残りのDNAを保存します。

29

STEP 5
定量PCR解析Day 2

2 to 3 hours

培養細胞および組織（共通）NOTE: 各プライマー対について、免疫沈降した試料およびネガティブIgGコントロールと一緒にINPUT DNAを流してください。

5.1. 免疫沈降したDNAと対応するインプットサンプルを取り分けます（Step 4.8参照）
5.2. 次のようにqPCR mixを調製します。ユーザーが用意するプライ
マー対を使用して20μlの反応量となります：• 10 µl of a 2x SYBR® Green qPCR master mix• 1 µl of primer pair
• 4 µl of PCR-grade water• 5 µl of IP’d or INPUT DNA
5.3. 次のようにPCR プログラムを設定します:
NOTE: これらの条件は、マスターミックスの種類、使用するqPCRシステムおよびユーザーが準備するプライマー対の種類に応じて最適化が必要な場合があります。
ステップ

時間/サイクル数

温度

1. 熱変性3-10 min*

95°C

30 seconds
2. 増幅

30 seconds

95°C
40 cycles

30 seconds
3. 融解曲線**

60°C
72°C (acquire fluorescence data)

製造会社の推奨事項に従ってください* Taqポリメラーゼ活性化時間に関するサプライヤーの推奨事項をよく確認してく

ださい。
30

ださい。

5.4. IP DNAサンプルおよびインプット、それぞれのプライマーについて、
qPCRの指数関数的増幅域から閾値サイクル（Ct値）を記録します
5.5. 以下の式を使用して、対照領域のINPUT DNAと比較した免疫沈降したDNAの相対量（回収率）を計算します：% recovery = 2^((Ctinput – 6.64) - Ctsample) * 100%
• CtsampleとCtinputは、それぞれIPサンプルのDNAサンプルとINPUTのqPCRの指数関数的増幅域から得られる閾値サイクルです。
• 2 は増幅効率です。
• 6.64 は入力希釈を補正するための補正係数です
NOTE: この方程式は、PCRが100％効率的であると仮定しています（増幅効率=2）。正確な結果を得るには、所定のプライマー対を用いた増幅効率は100％に近くなければならず、各サイクルにおいて生成物の量は2倍（E＝2）であることを意味しています。実際の増幅効率が既知の場合は、その数値を使用する必要があります。 この式では、INPUTの1％がプロトコルで示唆されているように使用されていることが考慮されています（2.5 μl INPUTとIPあたり250 μlのクロマチン）。 使
用されるINPUTの量が1％と異なる場合、以下のように入力希釈（x）を補正するた
めに、式に補正係数を導入する必要があります：%recovery = 2^ [(Ctinput - log2 (X) - Ctsample)] x 100%
Where: log2 (X) accounts for the INPUT dilution
Example: 1IPあたり250 μlのクロマチンから5μLのINPUTを使用する場合は、50倍希釈に相当します。補正係数はlog2（50）= 5.64に等しく、回収を計算する四季は次のようになります：%recovery = 2^ [(Ct input - 5.64 Ct sample )] x 100%.

ChIP-seq実験やバイオインフォマティクスデータ分析の設計に関するご質問がある場合は、弊社のカスタマーサポートチームまでお気軽にお問い
合わせください。
custsupport@diagenode.com

EXPERTScustsupport.na@diagenode.com

31

PROTOCOL** プライマー対が単一の特定の産物のみを増幅することを確実にするために、
qPCR機器メーカーが推奨するプロトコルに基づいて融解曲線を含め解析してく

実験結果の例
A.

B.

Figure 1. PicoruptorおよびiDeal ChIP-qPCR kitを使用しクロマ
チン断片化に成功した例
HeLa細胞をホルムアルデヒドで固定し、iDeal ChIP-qPCRプロトコルに従って染色体を調製した。 Picoruptorを使用して、30サイクルON / 30秒
OFFの8サイクルにわたってサンプルを超音波処理した。 100bpのはしご
をサイズ標準として装填した。 パネルA：アガロースゲル電気泳動による断 片 サ イ ズ 評 価 。 パ ネ ル B ： フ ラ グ メ ン ト 分 析 装 置 （ Advanced
Analytical ） を 用 い た フ ラ グ メ ン ト サ イ ズ 評 価 。

32

A. 18,0
16,0
14,0
12,0
10,0
8,0
6,0
4,0
2,0
0,0

B.

EIF4A2TSH2B

myo exH19

gap in8

myo-ex

7
6
5
4
3
2
1
0

Figure 2. H3K4me4（A）およびCTCF抗体（B）を用いたクロマチン免
疫沈降分析
ChIPは、H3K4me4（カタログ番号C15410003）およびCTCF（カタログ番号C15410210）抗体を用いてヒトHeLa細胞上で実施した。 IgGをネガ
ティブコントロールとして使用した。 IP化されたDNAは、陽性対照として使用されるEIF4A2、およびH3K4me3の陰性対照として使用されるTHS2Bお
よびミオグロビンエクソン2を用いてqPCRによって分析された。 H19イン
プリンティングコントロール領域およびGAPDHイントロン8（ポジティブ
コントロールとして使用）、およびMyoglobinエキソン２（CTCFのネガ
ティブコントロールとして使用）。図は、入力の％（qPCR分析後の入力
DNAと比較した免疫沈降したDNAの相対量）として表される回収を示す。

33

クロマチン断片化分析プロトコル
概要
断片化サイズを評価するために、アガロースゲル分析またはフラグメ
ントアナライザー（Advanced Analytical）の使用を推奨します。
クロマチン断片の正確なサイズ決定のために、RNase処理およびその後のDNA精製を含む脱架橋が推奨されます。脱架橋をしない場合、クロマチン断片のサイズ推定は正確ではありません。架橋の存在は、電気泳動移動を遅らせるので、フラグメントサイズの誤解を招きます。
RNase処理は、分解されたRNAに起因するバックグラウンドを有意に減少させ、断片化の視覚的評価を改善するでしょう。
ワークフロー:• RNAse処理（1時間、オプションですが、正確なサイズ評価に強く推奨されます）• 脱架橋（4時間または一晩）• 選択した方法（例：IPure beads（v.2）• DiaPureカラムまたはフェノール - クロロホルム抽出）を使用したDNA精製。 試薬はキットに含まれていません• フラグメントサイズ分析（アガロースゲルまたはフラグメントアナライザー）（1時間）
RNAse treatment
NOTE: 本キットには、RNase カクテル（Ambion, AM2286Aなど）は付属していません。

1. 断片化したクロマチン50μl（細胞についてはステップ2.12、プロト
コルでは組織についてはステップ2.16）を採取し、1.5mlマイクロチューブに移します。
2. 1μlのRNaseカクテル（例えばAmbion、AM2286A）を150μlのChIP grade water中に希釈します。

34

3. 希釈したRNaseカクテル2μlを分注した断片化クロマチンに加えます。
4. 37°Cで1時間インキュベートします。
脱架橋
5. 50 µl の Elution Buffer iE1 を加えます。
6. 4 µl の Elution Buffer iE2 を加え、よく混ぜます。
7. サンプルを 65°C で 4 時間 (もしくは 一晩) インキュベートします。
DNA 精製
選択した方法（例えば、IPurekit v.2、DiaPureカラムまたはフェノール クロロホルム抽出）を用いてDNAを精製し、精製DNAを1.5％アガロース
ゲルで分析します。 最適な分離および可視化のために約300ngのDNAをロードします。また、フラグメントアナライザー（Advanced Analytical、
標準感度NGSフラグメント分析キット（DNF-473））を使用することもで
きます。

35

FAQ
IP後に沈殿するDNA量はどれくらいですか？
沈殿するDNAの量は、使用する抗体と細胞の種類によって大きく異なります。一般に、ヒストン修飾に対する抗体は、他の標的に対する抗体よりも多くの量のDNAを沈殿させます。CTCF抗体の場合、その量は4百万個のHeLa細胞から約20ngです。 転写因子の典型的な収量は、1〜5ngの範囲内であると推定されています。
1IPにつきどれくらいの量の抗体が必要ですか？
必要とされる抗体の量は、幾つかの要因によって変わりますが、主に抗体自身に依存します。Diagenode ChIPグレードの抗体のほとんどは、最適な量を決定するために異なる濃度で試験されており、抗体の推奨量はデータシートに記載されています。 ただし、これはアッセイに依存する可能性があり、実験設定ごとに最適化する必要があるかもしれないことに注意してください。抗体が他の会社の抗体である場合
は、対応する技術データシートを参照してください。必要量の抗体が与えられない場合は、滴定実験を行うことを推奨します。最も低いバックグラウンドシグナルを与える抗体の量を選択することが重要です。
DiaMag Protein A-coated magnetic beads の結合能力はどれくらいですか？
30μlのビーズで、10μgまでの抗体に結合することができます。
ビーズは何に特異性がありますか？
ウサギ、モルモット、イヌおよびブタのポリクローナルおよびモノクローナル
抗体、マウスIgG2a、IgG2bおよびIgAならびにヒトIgG1、IgG2およびIgG4を効率的に捕捉します。 目的の抗体が異なるクラスの免疫グロブリン（マウス
IgG1およびIgG3、ラットまたはヤギポリクローナルAbおよびヒトIgG3）に属する場合、プロテインAでコーティングしたビーズの代わりにDiaMagプロ
テインGコーティング磁性ビーズを使用する必要があります。 これらのビーズは別売です（C03010021）。

36

ChIP実験にモノクローナル抗体を使うことができますか？
ChIPは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかを用いて行うことができます。一般に、ポリクローナル抗体集団は、単一エピトープを認識するモノクローナル抗体とは対照的に、多数の異なるエピトープを認識するでしょう。モノクローナルは標的タンパク質上の単一のエピトープを認識する
ので、高レベルの特異性、低い非特異的結合および低いバックグラウンドシグ
ナルを提供することが多いです。モノクローナル抗体の主な欠点は、1つのエピトープのみの認識であり、これは架橋によって隠蔽され、免疫沈降の効率を低下させます。
なぜアガロースゲルとバイオアナライザーで異なるDNAサイズのせん断したクロマチンが観察されるのですか？
せん断されたクロマチンの正確なサイズ評価には、アガロースゲルまたはフラグメントアナライザー（Advanced Analytical）の使用を推奨します。
Agilent BioAnalyzer 2100はNGSのライブラリー作製前にDNA断片のサイズ評価に広く使用されていますが、この技術はせん断されたクロマチンの分析にはあまり適していません。例えば、アガロースゲルとBioAnalyzer 2100プロファイルの間にいくつかの不一致が記録されています。それはマイクロ流体チップが残留分子（イオン、SDS、タンパ
ク質、DNA沈殿などに使用される担体等）に対して反応性が高いこと、
オーバーロード、もしくは、固定反応および脱架橋で完全には緩和されていないDNA分子の構造/空間構造が関係している可能性も考えられます。
更に、BioAnalyzer 2100のトレースはログに基づいているため、大きな分子量のフラグメントの分布は、小さなサイズのフラグメントと比較してトレースのより小さな領域に圧縮され、フラグメント分布の視覚的誤解を招きます。
別の重要なポイントは、BioAnalyzer 2100ピークの定量に関するものです。特定の範囲内の分子数を表すモル濃度を用いて各領域を計算すると、低分子量領域ではかなり高いレベルの分子が見出されます（下記の図を参照）。

37

A.

B.

500 bpC.

D.

Figure 3. アガロースゲルおよびBioAnalyzerを用いた断片化クロ
マチンのサイズ評価。
HeLa細胞をホルムアルデヒドで固定し、染色体をDiagenodeのプロトコールに従って調製した。 サンプルを、Picoruptorの30サイクル
ON / 30 秒 OFF で 1.5 ml Picoruptor Microtubes with Caps
（C30010016）を用いて超音波処理し、アガロースゲルA）、またはBioAnanlyzer、High Sens Agilent DNAキット（パネルB）によって測定した。 500bp以下および500bp超のフラグメント含有量を全表面積のパーセンテージとして算出した（パネルC）。パネルDはモル濃度として計算されたフラグメント含有量を示す（BioAnalyzerトレースのみ）。
キットに含まれる緩衝液の組成は何ですか？
バッファーの構成は独自のものす。

38

関連製品
製品

カタログ番号

用量

ChIP Cross-link Gold

C01019027

600 µlChromatin shearing optimization kit – Low SDS (iDeal Kit
for TFs)

C01020013

100 million cells

iDeal ChIP-seq kit for Transcription Factors

C01010054

10 rxns

iDeal ChIP-seq kit for Transcription Factors

C01010055

24 rxns

iDeal ChIP-seq kit for Transcription Factors

C01010170

100 rxns

iDeal ChIP-seq kit for Histones

C01010050

10 rxns

iDeal ChIP-seq kit for Histones

C01010051

24 rxns

iDeal ChIP-seq kit for Histonesh

C01010059

100 rxns

MicroChIP DiaPure columns

C03040001

50 rxns

IPure kit v2

C03010014

24 rxns

IPure kit v2

C03010015

100 rxns

Picoruptor

B01060001

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ChIP用 抗体

カタログ番号

ChIP用 抗体

カタログ番号

AML1-ETO polyclonal antibody

C15310197

H3K4me3 pAb

C15410003

Pol II mAb

C1520000

H3K27me3 pAb

C15410069

CTCF pAb

C15410210

H3pan mAb (clone 1B1B2)

C15200011

TBP mAbC15200002

H3R8me2(asym) pAb

C15410286

ER alpha mAb

C15100066

H3K27ac pAb

C15410196

ETO pAbC15310001

H3K9me3 pAb

C15410193

FOXA1 pAb

C15410231

H3K4me1 pAb

C15410194

FOXM1 pAb

C15410232

H4K20me3 pAb

C15410207

GR mAb

C15200010

H2A.Z pAb

C15410201

GTF2E2 pAb

C15410264

H4K5ac pAb

C15410025

39研究用途にのみ使用してください。
いかなる動物および人の治療または診断用途に使用しないでください。
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