Japanese Journal of Lactic Acid Bacteria
Copyright © 2017, Japan Society for Lactic Acid Bacteria

解説

次世代シーケンサーデータの解析手法 第 10 回
DDBJ への塩基配列の登録（実践編）
谷澤 靖洋 1、藤澤 貴智 1、真島 淳 2、李 慶範 2、遠野 雅徳 3*、
坂本 光央 4, 5、大熊 盛也 4、中村 保一 1, 2*、清水 謙多郎 6、
門田 幸二 6*1

国立遺伝学研究所 生命情報研究センター
2
国立遺伝学研究所 DDBJ センター
3
農業・食品産業技術総合研究機構 畜産研究部門
4
理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室
5
日本医療研究開発機構 PRIME
6東京大学 大学院農学生命科学研究科
多くの学術雑誌は、その論文中で決定された塩基配列を国際塩基配列データベース（InternationalNucleotide Sequence Database Collaboration; INSDC）に登録することを掲載の条件としている。DNA
Data Bank of Japan（DDBJ）は、INSDC を構成する日米欧三極の 1 つである。本稿では、DDBJ への登録用アカウントの取得から、Lactobacillus acidipiscis JCM 10692T 株のゲノム配列登録作業について解説する。ウェブサイト（R で）塩基配列解析（URL: http://www.iu.a.u-tokyo.ac.jp/~kadota/r_seq.html）
中 に 本 連 載 を ま と め た 項 目（URL: http://www.iu.a.u-tokyo.ac.jp/~kadota/r_seq.html#about_book_
JSLAB）が存在する。ウェブ資料（以下、W）や関連ウェブサイトなどを効率的に活用してほしい。
Key words：D-way, INSDC, DDBJ, MSS, JCM

はじめに

Annotation and Submission Tool（DFAST）3） に よ る ゲ
ノムアノテーションを行った結果を用いて DDBJ 4）への登

本稿で用いる L. acidipiscis は、魚を塩漬けした発酵食録作業を行う。尚、生のリードデータの DDBJ Sequence

品プラーラー（Pla-ra）から分離され、2000 年に新種としRead Archive（DRA）5） への登録は任意であるため、今て提唱された乳酸菌である 1）。今回は、この基準株 JCM回は行わない。したがって、DDBJ への登録に必要な情報

10692T のドラフトゲノムの登録を行う。これは、Illumina

は、図 1 に示す DFAST 実行結果が基本となる［W1-1］。

MiSeq から出力された長さ 300 bp のペアエンドリードを、DDBJ へ の 塩 基 配 列 の 登 録 に 必 要 な ア カ ウ ン ト は、バクテリア用 de novo アセンブリプログラム Platanus_

DDBJ の登録ポータルである D-way（DDBJ Submission

B（ver. 1.1.0）2）を実行して得られたものであり、全部でPortal D-way; https://trace.ddbj.nig.ac.jp/D-way/）から327 件のコンティグ配列からなる。本稿では、DDBJ Fast

取得できる［W2-1］。「Register for a new account」のリンク先から、新規アカウントの取得およびパスワードの＊To whom correspondence should be addressed.
Phone ： +81-3-5841-2395
Fax ： +81-3-5841-1136
E-mail ： yn@nig.ac.jp、tohno@affrc.go.jp			 kadota@bi.a.u-tokyo.ac.jp

設定を行うことで、D-way にログインすることができる。
DRA にデータを登録する場合は、取得したアカウントにcenter name と公開鍵を予め登録しておく（紐づけしておく）必要があるので注意されたい［W4-2］。DRA への登録の詳細については、DRA のトップページから辿れるハ— 94 —

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図 1．DFAST 実行結果画面
Platanus_B（ver. 1.1.0）による de novo アセンブリ実行結果から、300 bp 以下の配列がフィルタリングされたものが DFAST の入力として与えれている。①その配列の総塩基数は2,594,548 bp、配列数は 327 個である。入力配列情報は、② genome.fna の中身と同じである。

ンドブックを参考にしてほしい［W4-3］。

り、単独の遺伝子配列など小規模な登録に適している。そしてもう 1 つは、ゲノム全体の配列など大規模な登録に適DDBJ への登録の概要

し た Mass Submission System（MSS; http://www.ddbj.
nig.ac.jp/sub/mss_flow-j.html）である［W4-5］。DFASTDDBJ センターでは、目的に合わせて複数のデータベーで作成可能な DDBJ 登録用ファイルは MSS 用のものであス（以下、DB）が運用されている。単独の遺伝子配列やり、本稿でも MSS を利用した DDBJ への登録手順につい本稿で扱うドラフトゲノムは、DDBJ センターが提供すて解説する。論文を投稿する直前に登録手続きを行おうとる塩基配列 DB としての（狭義の）DDBJ への登録対象としても、予想外に時間がかかってしまうこともある。このなる。これは NCBI が提供している塩基配列 DB である

ため、全体像を理解し早めに登録を終えておくことが大切

GenBank6）に相当するものであり、DDBJ センターで運である。登録の手順は、大まかに以下の通りである：

用されている他の DB と区別する意味で traditional DDBJとも呼ばれる。他の DB の例としては、次世代シーケン

1．BioProject の登録サーの生データを扱う DRA や、主として従来のキャピラ

2．BioSample の登録リ式シーケンサーの生データを扱う DDBJ Trace Archive

3．MSS への登録ファイルの送付（DTA）、 そ し て 後 述 す る BioProject や BioSample な どが挙げられる。

BioProject（http://trace.ddbj.nig.ac.jp/bioproject/index.

DDBJ へ の 塩 基 配 列 登 録 手 段 は 2 つ あ る。1 つ は、html）は、研究プロジェクトとそのプロジェクトに由来す

DDBJ Nucleotide Sequence Submission System（NSSS;

るデータをまとめるための DB である［W4-6］。近年、大http://www.ddbj.nig.ac.jp/sub/websub-j.html）と呼ばれ規模な研究プロジェクトが増え、大量のデータが生み出さる対話型の web 版塩基配列登録システムである［W4-4］。

れている。それに伴い、データの種類に応じて複数の関連記載する内容がそれほど多くない場合に有効なツールであDB に分散して登録されることも増えてきた。BioProject— 95 —

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Japanese Journal of Lactic Acid Bacteriaのメリットは、これらのデータを包括的に扱えるという点チェックを入れる［W5-11］。それ以外の項目についてもである。例えば比較ゲノムのプロジェクトであれば、プロプルダウンメニューやチェックボックスから該当する選ジェクト内に複数のゲノムデータが紐付けられることにな択肢を選んでいけばよい。第 9 回 8） で述べた Locus tagる。RNA-seq のプロジェクトであれば、例えば転写産物のprefix の取得申請もできるので、希望のもの（ここでは配列と発現量データが紐付けられることになる。

Lacidipiscis とした）を入力する［W6-1］。TARGET タ

BioSample（http://trace.ddbj.nig.ac.jp/biosample/index.

ブでは、対象生物に関する情報を入力する。単独のゲノムhtml）は、データが由来するサンプルについての情報を収であれば、その生物種名を記入すればよい。比較ゲノムの集した DB である［W4-7］。BioSample に登録されたデー

プロジェクトであれば、属名など共通する階層までの分類タには、生物種名だけでなく、その生物試料が採取された名を記入するケースもあるだろう。生物種名情報は最低限環境、疾患や個人の医学的情報といった表現型情報を記必要であるが、オプションとしてグラム染色性・運動性・述するためのサンプル属性が含まれる。現在、この属性細胞形態なども記入することができる［W6-2］。原著論

名は Genomics Standard Consortium（GSC）が規定した文があれば、PubMed ID や DOI 情報を入力する。全体をMinimum Information about any（x）Sequence（MIxS）

チェックし、問題がなければ Submit ボタンを押して終了

7）に準拠した詳細な記述ができるようになっている ［W4-となる［W6-6］。このときは、約 2 日後に BioProject の8］。以下では、最もシンプルな登録形態として、1 つのアクセッション番号 PRJDB5682 が発行された［W6-7］。

BioProject の下に 1 つの BioSample データとそれに由来するゲノム塩基配列が存在する場合の登録手順を紹介する。

BioSample の登録

BioProject の登録

引 き 続 き BioSample の 登 録 を 行 う。 登 録 作 業 中 に
BioProject ID を 指 定 す る 欄 が あ る の で、 先 に 取 得 しBioProject の登録は、D-way を通して行う（W5-1；図 2）。

た PRJDB5682 を 入 力 す る。 こ れ に よ り BioProject とログイン後、BioProject の New submission ボタンを押し、BioSample が紐づけられる。なお、BioProject ID につい必要事項をフォームに入力しながら進めていく。主な登録内て は 登 録 途 中 で 発 行 さ れ る PSUB で 始 ま る Submission

容は、登録者名［W5-3］、プロジェクト名とその説明、文献

ID（ 今 回 の 場 合 は "PSUB007096"［W5-2］） を 仮 ID と情報（通常は投稿する予定の論文の情報）などである。必して入力することができるため、登録手続き完了を待つ

要であればグラント情報を記入することもできるので、事前ことなく BioSample の登録を並行して進めることができにグラントの課題番号などを手元に用意しておくとよい。

る。 登 録 手 続 き は、BioProject と 同 様 に D-way に ロ グ

PROJECT TYPE タブでは、プロジェクトの種類を指イ ン 後、BioSample の New submission ボ タ ン を 押 し て定する［W5-10］。今回我々はゲノム配列データを登録す

開 始 す る［W7-1］。SUBMITTER と GENERAL INFO

るので、Project data type では "Genome Sequencing" にについては、BioProject と同じ要領で進めていけばよい

図 2．D-way ログイン後の画面① BioProject と② BioSample の登録はここから行う。
— 96 —

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Vol. 28, No. 2［W7-3］。SAMPLE TYPE では、前述の MIxS 7） に準拠を選択することになる［W10-3］。Complete genome の場

した Core Package と Environmental Package を候補の中合は、系統分類に基づく登録区分に割り振られる。バクから選択する［W7-4］。今回のように単離した菌株のゲテリアの complete genome の場合は、BCT DIVISION へ

ノムデータの場合、Core Package については「Genome,の登録となる［W10-7］。今回のデータが該当する draft

metagenome or marker sequences」、 そ し て「Cultured

genome の場合は、Whole Genome Shotgun（WGS）エン

Bacterial/Archaeal Genomic Sequences」を選択すればよトリとして取り扱われる［W10-8］。WGS は、整理が不い。Environmental Package については、「miscellaneous十分な段階の大量の DNA 断片を対象とした登録区分であor artificial」を選択した。

る。アクセッション番号も他の登録区分とは異なる書式でATTRIBUTE で は、 サ ン プ ル 属 性 情 報 の 登 録 を 行う［W8-1］。サンプル属性の種類は、前の画面で指定し与えられ、アノテーション情報を含まない塩基配列のみの登録も可能である。

た package によって異なる。入力項目数も非常に多いた

ギャップを含んだドラフトゲノムの場合は、2 通りの登め、画面での入力ではなくひな形となるファイル（MIGS.

録方法がある。1 つめは、ギャップを除いて分割した配列ba.miscellaneous.txt）をダウンロードして記入後にアップを WGS エントリとして登録し、エントリ間の連結情報をロードする形態となっている。ファイルはタブ区切りテキ

AGP ファイルによって登録する方法（CON エントリといスト形式なので、著者らは Excel で読み込んで作業を行うう）である［W10-9］。そしてもう 1 つは、ギャップを含［W8-2］。属性ごとの定義と書式に関する説明などを参考

んだ配列のまま WGS エントリとして登録し、assembly_にしながら［W8-3］、必須項目を中心に埋めていく［W8-gap feature を用いてギャップ情報を記載する最近可能と5］。入力すべき内容が不明な場合には、"not applicable" やなった方法である。DFAST を用いたドラフトゲノムの登"missing" などを使い分けて入力すればよい［W8-7］。非録は、後者の手順に沿って行う。一通りの入力を終えて送必須項目においても、株名（strain）や菌株保存機関に信すると［W10-6］、ほどなくして DDBJ から手順の詳細おける登録番号などは記入しておいたほうがいいだろうに関するメールが届く［W11-1］。メール本文中には「MSS［W8-9］。菌株登録番号は、culture_collection という項目関連資料、および、ツールダウンロード」および「MSSに入力することが推奨されている。この属性はテンプレー用データファイル作成」手順に関する URL を参照しながトには含まれていないが、自分で項目を追加して記入するら登録作業を行うように書かれているが、これらの作業はことができる。使用可能なサンプル属性の一覧は、ヘルプ

DFAST 上で行うことができる［W11-2］。

画面で "List all sample attributes" を押せばよい［W8-3］。

第 9 回でも解説したように、DFAST 実行結果画面の一通り入力を終えたタブ区切りテキストファイル"DDBJ Submission" タブをクリックし、画面の指示に従っ（MIGS.ba.miscellaneous_after.txt［W8-10］）をアップローて入力項目を埋めていけば登録用ファイルを作成できる。

ドし、全体をチェックして問題がなければ、Submit ボタ

前回との違いは、Locus Tag Prefix、BioProject、そしてンを押して終了となる［W8-13］。このときは、約 2 日後BioSample の項目に、仮ではなく本物の情報を入力した点に BioSample のアクセッション番号 SAMD00078754 が発である［W11-4］。最後の Format Check の結果として、行された［W9-1］。メール本文をよく見ると、DDBJ ア

翻訳されたアミノ酸配列の 2 か所で不明アミノ酸残基（X）

ノテーターによって属性の計 3 か所で修正がなされていが含まれている旨の警告が出た［W11-11］。これは不明塩ることがわかる［W9-2］。今回の submission では、ひな基 N を含む領域に遺伝子が予測された場合に起こりうる。

形には存在していなかった isolation_source という項目にDFAST は、X が連続して 2 つ以上並んだ場合には登録に"fermented fish（Pla-ra）" が、 そ し て type_strain と いは不適切として結果から削除している。このため、X が含う項目に "yes" が追加された。また、host という項目中にまれていたとしても最大で 1 アミノ酸残基である。X の数記載していた "fermented fish" が削除された。isolation_が多いと DDBJ のアノテーターから修正を要求されるこ

source はサンプルの分離源を表すものであり、微生物サとがあるが、この程度であれば通常は許容範囲である。

ンプルの登録においては使用頻度の高い項目といえる。次チェックが済んだ塩基配列およびアノテーションファイ回以降同様の登録を行う場合は、これらを予め追記しておルは、ダウンロード後に添付ファイルとして DDBJ にメー

くとよいだろう。

ルで送付するのが一般的な手順である。今回はファイルサイズが大きいこともあり、DFAST の結果ページの URL

MSS への登録ファイルの送付を DDBJ にメールで伝える方法で行った［W11-13］。

MSS を利用した塩基配列およびアノテーション情報のDDBJ とのやりとり、そして公開登録を行うべく、「MSS 申し込みフォーム」上で必要事項を入力していく［W10-1］。ゲノム配列を登録する場合は、メール送信の約 2 日後、DDBJ より登録内容をチェック

データ種別の欄で complete genome または draft genome

した結果が返されてきた。今回の DDBJ からの問い合わ— 97 —

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せ内容は、下記の 3 点であった［W12-2］：

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る。投稿した論文が受理されるまでは非公開扱いにするという指定方法が一般的であろう。

1．ア センブリに用いたソフトウェア Platanus のバー
ジョンは "B 1.1.0" でよいか？

DDBJ からは下記のような返信が寄せられ、この段階でやり取りは終了した［W12-4］：

2．rRNA において 5S rRNA のみ予測されているが 16Sや 23S は予測できなかったのか？

1．
「Platanus_Bv. 1.1.0」のように記載する。

3．今回のデータは登録完了後、即日公開でよいか？

2．rRNA 領域の予測について承知した。
3．登録データと BioProject/BioSample が連携されてい我々は下記のように回答した［W12-3］：るので連動公開される。

1．ア センブリに使用されたソフトは Platanus_B であり、version は 1.1.0。

今 回 登 録 し た の は、327 コ ン テ ィ グ か ら な る 塩 基 配列 で あ る。 ア ク セ ッ シ ョ ン 番 号 は 配 列 ご と に 与 え ら

2．予 測ソフト Barrnap を用いたところ、検出されたものは 5S のみでした。

れ、DDBJ か ら の 定 型 メ ー ル に 添 付 さ れ た フ ァ イ ル（SAMD00078754_JCM10692.acclist.txt［W12-5］） の 中 身

3．登 録完了後、即日公開でお願いします。BioProjectが、配列ごとのアクセッション番号リストとなっている。

および BioSample ID についても同じタイミングで公

今回は、4 月 21 日（金）の夜に DDBJ にメールし［W11-開してください。

13］、4 月 25 日（火）の夕方に一連のやりとりが終了した［W12-5］。 そ し て 4 月 27 日（ 木 ） の 未 明 に BioSample

尚、1. については単純に我々の誤記であり、3. についてID（SAMD00078754［W13-2］） お よ び BioProject ID

はデータ公開予定日（Hold Date）を指定していなかった（PRJDB5682［W13-4］）が公開された旨のメールが届いために確認された事項である。Hold Date を指定すると、た。図 3 は、DDBJ のデータベース検索ツール getentry

指定日になるか公開申請手続きを行うまでは非公開とな［W13-5］を用いて、最初のコンティグのアクセッション

図 3．公開されたアクセッション番号 BDQH01000001①このコンティグの配列長は 3,747 bp。②公開日時は 2017 年 4 月 26 日。
③ BioProject および BioSample ID もみられる。④ DDBJ とのやりとりで修正された内容も正しく反映されていることがわかる。
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番号（BDQH01000001）で検索した結果である［W13-6］。

は学術雑誌への論文掲載に付随する義務である 9）。この2017 年 4 月 26日付の公開になっており、DDBJ とのやり

考 え は、GenBank の 前 身 で あ る Los Alamos Sequence

とりで修正された内容になっていることもわかる。

Database の設立メンバーの Walter Goad らの提案に基づ

本稿での登録作業はこれで終わりとなるが、論文投稿にくものである。彼らはまた、登録された塩基配列は公知のともなって配列の登録を行った場合には、論文が公開されものであり、誰でもその情報を入手して利用可能にすべきた後に論文タイトル・雑誌名・巻および頁番号などの文献だと主張した。この考えは、科学的知見は人類共通の財産情報の更新依頼を行う。これは DDBJ ホームページ上のであるというオープンサイエンスの基礎となる理念へと継申し込みフォームから行うことができる。

承されてきた。正しい形式でのファイルの準備や細かな情報の記述は、登録者側からすれば手間である。しかし、正おわりに確で詳細な記述は研究結果の再現性の担保やデータ再利用の促進へとつながり、ひいては登録者自身の研究意義を高

本稿では、L. acidipiscis JCM 10692 の de novo アセンTめることにもなるであろう。

ブリおよび DFAST 実行結果を用いて DDBJ に登録する一連の手順を解説した。DDBJ は登録依頼に対し 5 営業日

謝辞以内に何らかの応答を返すことを目安としているが、登録本連載の一部は、情報・システム研究機構国立遺伝学の集中する時期には対応が追いつかないこともあり得る点

研究所（遺伝研）との共同研究（2012-2088，2013-2070）に注意してほしい。今回の登録に要した日数は、1 つの目の成果によるものです。また、JSPS 科研費 JP25712032,安である。

JP15K06919 の助成を受けたものです。

第 9 回でも述べた通り、塩基配列の INSDC への登録		
参 考 文 献1）	Tanasupawat S, Shida O, Okada S, Komagata K. (2000)
Lactobacillus acidipiscis sp. nov. and Weissella thailandensis
sp. nov., isolated from fermented fish in Thailand. Int J Syst
Evol Microbiol 50: 1479-1485.
2）	Kajitani R, Toshimoto K, Noguchi H, Toyoda A, Ogura Y, etal. (2014) Efficient de novo assembly of highly heterozygous
genomes from whole-genome shotgun short reads. GenomeRes 24: 1384-1395.
3）	Tanizawa Y, Fujisawa T, Kaminuma E, Nakamura Y.,Arita M. (2016) DFAST and DAGA: Web-based integrated
genome annotation tools and resources. Biosci Microbiota
Food Health 35: 173-184.
4）	Mashima J, Kodama Y, Fujisawa T, Katayama T, Okuda Y,
et al. (2017) DNA Data Bank of Japan. Nucleic Acids Res 45:
D25-D31.

5）	Kodama Y, Shumway M, Leinonen R; International
Nucleotide Sequence Database Collaboration. (2012) TheSequence Read Archive: explosive growth of sequencing
data. Nucleic Acids Res 40: D54-56.
6）	Benson DA, Cavanaugh M, Clark K, Karsch-Mizrachi I,Lipman DJ. (2017) GenBank. Nucleic Acids Res 45: D37-D42.
7）	Yilmaz P, Kottmann R, Field D, Knight R, Cole JR, et al.
(2011) Minimum information about a marker gene sequence(MIMARKS) and minimum information about any (x)sequence (MIxS) specifications. Nat Biotechnol 29: 415-420.
8）	谷澤靖洋，真島 淳，藤澤貴智，李 慶範，中村保一，清水謙多郎，門田幸二（2017）次世代シーケンサーデータの解析手法：第 9 回ゲノムアノテーションとその可視化、DDBJ への登録．日本乳酸菌学会誌 28：3-11.
9）	Strasser BJ. (2008) Genetics. GenBank--Natural history in
the 21st Century? Science 322: 537-538.

— 99 —

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Methods for analyzing next-generation sequencing data
X. Registration to DDBJ through Mass Submission
SystemYasuhiro Tanizawa1, Takatomo Fujisawa1, Jun Mashima2,
Kyungbum Lee2, Masanori Tohno3, Mitsuo Sakamoto4,5,Moriya Ohkuma4, Yasukazu Nakamura1,2, Kentaro Shimizu6,
and Koji Kadota6
Center for Information Biology, National Institute of Genetics.
2DDBJ Center, National Institute of Genetics.
3
Institute of Livestock and Grassland Science, National Agriculture andFood Research Organization.
4
Microbe Division/Japan Collection of Microorganisms,
RIKEN BioResource Center.
5
PRIME, Japan Agency for Medical Research and Development (AMED).
6
Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo.
1		

Abstract

The International Nucleotide Sequence Database Collaboration (INSDC) has maintained a primary
sequence database that collects experimentally-determined nucleotide sequence data directly fromresearchers. Now data deposition to the INSDC is mandatory for research publication at most of thescientific journals. However, the procedure to deposit data to the INSDC is a big burden, especiallyfor those who are not familiar with computer skills. Recently, we have developed a genome annotation
pipeline DFAST, which also assists data deposition to the INSDC. In this article, we show theinstruction to deposit annotated genome sequence data using the DFAST web service. Supplementarymaterials are available at our web site, http://www.iu.a.u-tokyo.ac.jp/~kadota/r_seq.html#about_book_JSLAB.

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