HILIC？逆相？
2本目に選ぶなら どのカラム？
C18とは分離を変えたいそんな時
クロマニックテクノロジーズ
塚本友康 長江徳和
Email: info@chromanik.co.jp
http://chromanik.co.jp

1HILIC
親水性相互作用クロマトグラフィ
2HILICの分離メカニズム
H2O

O
O

Si
O

Si

O

OH

O
Si

HOO

O

Si

O

O

O
O

O

O

Si

O

O
O

O

O

O

O

O

Si

O

Si
O

O

Hydrophilic
Partitioning

H2O

O-

O

H2O

OH

Si

O

O

HO

OH

H2O O

O

H2O O

Si

O

H2O
Si

O

Si

O

H2O

OH

OH

H2O

Si

ODS silica
(RP)

21-O

OH

H2O
Si

HOO

H2O
Si

Analyte

H2O

O

Si

O

O

AnalyteOO

SiOOOH

SiO

O

H2O

Si

O
Si2-

O

Si

1O

SiO

SiO

O

O

H2O

SiO

Silica gel(HILIC)

OH

H2O

Si

SiO

SiSiO
OOSiO

O

OH
Si

H2O

O

O

O

O

SiO

Mobile Phase

H2O

O

O

O

O

Si-O

H2O

 HILICの特徴として･･･➢ 逆相系に用いる極性溶媒が使用可能である。
➢ 固定相に形成された水和層との分配によって分離が起こると言われている。
➢ 親水性が高い化合物ほど保持される特徴がある。

3

HILICカラムに使用される官能器
未修飾シリカ◼ アミドシリカ◼ ジオール結合型シリカ◼ 両性イオン結合型シリカ

トリアゾール結合型シリカ◼ アミノシリカ◼ スクシンイミド誘導体結合型シリカ◼

◼

親水性相互作用

静電的相互作用-OO

S

両性イオン基O

イオン交換相互作用陰イオン交換基

N+陽イオン
交換基
OO-S

水素結合ジオール基OHOOH+N

CH3OH

アミド基
NOCH34親水性の比較

データ提供：池上亨先生

分析条件：Mobile phase: Acetonitrile/ammonium acetate buffer (20 mM, pH = 4.76) = 90:10 [v/v]Linear velocity; 1.0 mm/s, UV detection wave length; 254 nm, Column oven temperature; 30 ℃

ColumnZIC-HILIC (5 mm)
ZIC-HILIC (3.5 mm)
Nucleodur HILIC (3 mm)
Amide-80 (5 mm)
XBridge Amide (3.5 mm)
PolySULFOETHYL (3 mm)
PolyHYDROXYETHYL (3 mm)
CYCLOBOND I (5 mm)LiChrospher Diol (5 mm)
Chromolith Si
HALO HILIC (2.7 mm)
COSMOSIL HILIC (5 mm)
Sugar-D (5 mm)
NH2 -MS (5 mm)
SunShell HILIC-Amide (2.6 mm)

Uk (U)
2.11
2.10
2.20
3.30
2.55
1.58
3.92
0.70
1.50
0.31
0.64
1.60
1.58
2.44
2.93

AVk (A) k (V)1.55 2.32
1.51 2.28
2.33 3.40 ウリジン（U） アデノシン（A） ビダラビン（V）
3.80 4.90
2.81 3.64 ウリジンの保持から充填剤
1.15 1.39の親水性を評価
3.75 4.93
1.36 1.68
2.50 3.30
保持が大きいほど充填剤
0.73 0.85の親水性が高い
1.59 1.872.20 3.00
1.88 2.72
2.13 2.90 同じHILICカラムであっても、3.55 4.84

親水性の違いが大きい

逆相カラムのように使い分ける必要がある

5イオン交換性の比較
SPTSk (SPTS)a(SPTS/U)

ZIC-HILIC (5 mm)
ZIC-HILIC (3.5 mm)
Nucleodur HILIC (3 mm)
Amide-80 (5 mm)
XBridge Amide (3.5 mm)
PolySULFOETHYL (3 mm)
PolyHYDROXYETHYL (3 mm)
CYCLOBOND I (5 mm)
LiChrospher Diol (5 mm)
Chromolith Si
HALO HILIC (2.7 mm)
COSMOSIL HILIC (5 mm)
Sugar-D (5 mm)
NH2-MS (5 mm)

Uk (U)
20 mM
2.11
2.102.20
3.30
2.55
1.58
3.92
0.70
1.50
0.31
0.64
1.60
1.58
2.44

0.69
0.56
1.13
0.89
0.74
0.25
0.87
3.32
0.95
0.06
0.20
1.28
3.00
2.01

SunShell HILIC-Amide (2.6 mm)

2.93

1.29

ColumnSodium p-toluenesulfonate (SPTS)

TMPAC
k (TMPAC)a(TMPAC/U)

0.33
0.27
0.51
0.27
0.29
0.16
0.22
4.73
0.63
0.19
0.31
0.80
1.90
0.82

Uk (U)
20 mM
2.11
2.10
2.20
3.30
2.55
1.58
3.92
0.70
1.50
0.31
0.64
1.60
1.58
2.44

3.32
3.45
3.14
4.57
1.89
1.38
3.34
0.45
1.73
5.25
9.03
0.78
0.39
0.69

1.57
1.64
1.43
1.38
0.74
0.87
0.85
0.63
1.16
16.94
14.11
0.49
0.25
0.28

0.48

2.93

1.18

0.44

aの値により充填剤のイオン交換性が評価できる値が小さいほどイオン交換
Trimethylphenylammonium chloride (TMPAC)
性が低い

Amide等電荷がない官能基のaの値は低くアニオン、カチオン交換ともに小さくなる

6二次相互作用の働き
疎水基 (主効果)
吸着性基(二次効果相互作用)

既存の分離剤
主効果(疎水基)

二次効果相互作用
制御型分離剤
主効果
(疎水基)

二次効果
(吸着等)

第二主効果を持つ
二足型分離剤
主効果
(疎水基)

制御された
二次効果

第二の主効果7

いざ使用してみると・・・・◼ 考えていたものより・・・

保持が短い？保持しない
保持時間の再現性が・・・
理論段数が低い気が・・・

HILICはどうも使いづらい
8

HILICを使用するうえでの注意点◼ 保持が短い・保持がない場合⚫

サンプル• 移動相もしくは水割合が低い溶媒で調整する⚫

移動相• 有機溶媒の割合を増やす• 塩の濃度を上げる、塩の種類を変える◼ 理論段数が低い場合⚫

サンプル• 負荷量を減らす⚫

移動相• 流速を遅くする

逆相クロマトグラフィと比べ、試料中の溶媒(水)の影響を大きく受ける傾向がある
最適流速も逆相クロマトグラフィより、低速になる傾向がある
9いざ使用してみると・・・・

保持時間の再現性が・・・

インジェクションによるベースラインの乱れ

UVで見てるけどそんなことはないけど10水10μL注入時のヒリックカラムのクロマトグラム
移動相：5mM酢酸アンモニウム/アセトニトリル(20:80)
検出：UV@220nm（青），RI (赤）水

水10mL注入により固定相の状態が乱れている
固定相の平衡化完了

UVRI
6.6min05

UVとRIのタイムラグ0.5分

7.1min101520TIME (min)UVでは観察できないベースラインの変化が起きている!!

11HILICカラムのラインナップ
SunShell HILIC-Amide

SunShell HILIC-S

12核酸塩基の分離
21435SunShell Amide

Column:SunShell Amide 2.6 mm : 100 x 4.6 mm,
Acentice Express OH5 2.6 mm : 100 x 4.6 mm
Acentice Express HILIC 2.6 mm : 100 x 4.6 mm,
Mobile phase: acetonitrile :20 mM ammonium acetate(pH4.7) =8:2
Flow rate: 1.0 mL/min ,Temperature: 40 oC
Detection: UV@250 nm,
Sample:1. tymine, 2. uracil, 3. uridine, 4. cytosine, 5. cytidine

24315

他社HILICカラム(ポリオール)
21345

他社HILICカラム(シリカ)13配糖体の分離

1Column:
SunShell Amide 2.6 mm : 100 x 4.6 mm,
Mobile phase: acetonitrile :25 mM phosphate Ammonium (pH4.9) =8:2
Flow rate: 1.0 mL/min ,Temperature: 室温
Detection: UV@215 nm,Sample:
1. Helicin, 2. Salicin, 3. Arbutin 4. Rutin

324

1. Helicin,

2. Salicin,

3. Arbutin

4. Rutin14アミノ酸のHILIC–ESI-MS
標準品

ダイエットサプリ

LC–MS System: Agilent 1100er LC system
and Thermo Fisher LTQ™ equipped with aHESI source, operated in positive ionization
mode for analysis of standards. For the dietarysupplement, an Orbitrap™ Exactive classic
equipped with a HESI source and operated inpositive ionization mode.
Column: 150 × 2.1 mm, 3.5-μm iHILICFusion(+)
Gradient Elution: A) acetonitrile–water–1 M
ammonium acetate, pH 5.75 (90:5:5); B)
water–acetonitrile–1 M ammonium acetate, pH
5.75 (90:5:5); 0–0.5 min (90:10) A–B; 0.5 to 25
min, gradient elution from (90:10) A–B to(60:40) A–B.
Flow Rate: 0.3 mL/min
Column Temperature: 40 °C
Injection Volume: 5 μL
Amino Acids: Arginine, asparagine, asparticacid, glutamic acid, glutamine, hydroxyl-proline,isoleucine, leucine, lysine, phenylalanine,proline, tryptophan, tyrosine, and valine. 50 μM
of each amino acid was dissolved in water–acetonitrile (25:75) solution.

15

Biphenyl• 疎水性相互作用• 水素結合性• π-π相互作用
45度ねじれていることでPhenyl基とは異なった分離特性を示す

一般的な逆相カラムと比べると水素結合性が強い

16標準試料の分離例（コアシェル）
12SunShell Biphenyl (9 nm)
4301 2535106464541Biphenyl1.82

1.44

1.28(16 nm)

RP-AQUA

0.52

1.52

1.30

SunShell Phenyl

Phenyl

1.00

1.48

1.01

PFP

1.00

1.31

2.38

PFP&C181.00

1.47

2.64

C80.32

1.46

1.08

C180.39

1.60

1.46(9nm)(9 nm)

76(9 nm)
SunShell PFP (9nm)

SunShell PFP＆C18 (9 nm)
52,3764

立体選択性

2015

SunShell RP-AQUA
5, 7

疎水性

(Caffeine/ (Amylbenzene/ (Triphenylene/Phenol)
Butylbenzene) o-Terphenyl)

75

1 2,3

1 2,3

水素結合性

7657

12754

SunShell C8 (9 nm)

631230Column dimension: 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil, 2 = Caffeine, 3 = Phenol, 4 = Butylbenzene
5 = o-Terphenyl, 6 = Amylbenzene, 7 = Triphenylene

7SunShell C18546(9 nm)
51015Retention time/min

20253017その他の逆相カラムとの分離比較
Column: SunShell C18 2.6 μm 100 x 2.1 mm
SunShell C8 2.6 μm 100 x 2.1 mm
SunShell Phenyl 2.6 μm 100 x 2.1 mm
SunShell Biphenyl 2.6 μm 100 x 2.1 mmMobile phase:
2-Propanol/20 mM Ammonium acetate pH6.8=3/97
Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 40 oC
Detection: UV@230 nm
Sample: 1 = Creatinine,

2 = Mandelic aci

3 = Hippuric acid
OOH

NH

HNO

OH

H3COH

NH

NO

O

4 = o-Methylhippuric acid,

5 = p-Metylhippuric acid,
OO
OH

NH

O

O
CH3OH

NH
H3C

6 = m-Methylhippuric acid
O
OH

NH
O
CH318

有機溶媒による分離の変化

Biphenylのみ溶出順が入れ替わる

Column: SunShell C18 2.6 μm 150 x 4.6 mm
SunShell C30 2.6 μm 150 x 2.1 mm
SunShell Phenyl 2.6 μm 150 x 4.6 mm
SunShell Biphenyl 2.6 μm 150 x 4.6 mm

Mobile phase: Organic solvent/25 mM phosphate buffer pH3.0ortho O
Flow rate: 1.0 mL/min, 0.2 mL/min for only C30
Temperature: 40 oC
NHDetection: UV@230 nm
CH3
Sample: o-, m-, p-Methylhippuric acidmetaO

paraOHNHOH

OH

NH

OO

OO

CH3

H3C

Biphenylカラムはアセトニトリルとﾒﾀﾉｰﾙで分離が大きく変化する

19有機溶媒による分離の変化２Biphenylのみ溶出順が入れ替わる

Column: SunShell C18 2.6 μm 150 x 4.6 mm
SunShell C30 2.6 μm 150 x 2.1 mm
SunShell Phenyl 2.6 μm 150 x 4.6 mm
SunShell Biphenyl 2.6 μm 150 x 4.6 mm
Mobile phase: Organic solvent/25 mM phosphate buffer pH3.0
Flow rate: 1.0 mL/min, 0.2 mL/min for only C30
Temperature: 40 oC
Detection: UV@230 nm
Sample: o-, m-, p-Methylhippuric acid

THFでは多くの逆相カラムで分離が改善される

20核酸塩基の分離比較2A) Methanol/10 mM ammoniumacetate pH6.8=20/80

k5=0.58

6R5,6=1.05223650C18

1

30243

3,4

k5=0.76
R5,6=3.6

65022643668Column:
SunShell C18 2.6 μm, 150 x 4.6 mm
SunShell RP-AQUA 2.6 μm, 150 x 4.6 mm
SunShell Biphenyl 2.6 μm, 150 x 4.6
Flow rate: 1.0 mL / min,Temperature: 40 oC
Detection: UV@250 nm
1. NaNO2

12Retention time/min

30OO

5. Thymine

6Retention time/min

8H2NH
NNO

6. Adenine

OO4NHN
H

NH

4. Guanine542

3. Uracil

NH2N

HN0

2. Cytosine

k5=5.00612

1時間送液停止後の保持係数の維持率: 96%

Biphenyl

18k6=4.4754120

1時間送液停止後の保持係数の維持率: 99%

RP-AQUA

4261 46542 3k5=0.37
R5,6=2.55k6=4.53111

1時間送液停止後の保持係数の変化: 15% まで減少

3413k6=0.68
2230B) 10 mM ammonium acetate pH6.8

NH3CNH2NHNHONHNN

N

21

他社カラムとの分離比較
1364275SunShell C18

13k5=3.23

5467Company ABiphenyl
21.8 MPa

7Company BBiphenyl
19.3 MPa

21354k5=3.086比較に用いたカラム
1. Kinetex Biphenyl, 2.6 μm
2. Halo Biphenyl, 2.7 μm
3. Raptor Biphenyl, 2.7 μm
4. SunShell Biphenyl, 2.6 μm2Column: Company A Biphenyl, 2.6 μm 150 x 4.6 mm
Company B Biphenyl, 2.7 μm 150 x 4.6 mm
Company C Biphenyl, 2.7 μm 150 x 4.6 mm
SunShell Biphenyl, 2.6 μm 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min, Temperature: 40 ºCSample: 1 = Uracil, 2 = Phenol, 3 = Caffeine, 4 = Butylbenzene

354k5=3.216Company CBiphenyl
22.8 MPa72O

H3CNHN
H1OHOONOCH3NCH3N

N

CH35 = Amylbenzene, 6 = o-Terphenyl, 7 = Triphenylene
CH313k5=5.38
4200557651010Retention time/min

1515SunShell
Biphenyl19.2 MPa
2020

SunShell C18Company A
BiphenylCompany B
BiphenylCompany C
Biphenyl
SunShellBiphenyl

疎水性
立体選択性
水素結合性
α(Caffeine/ α(Amylbenzene/ α(TriphenylenePhenol) Butylbenzene) /o-Terphenyl)
0.39
1.60
1.46
2.69

1.39

1.45

2.52

1.37

1.46

3.07

1.38

1.45

1.82

1.44

1.28

22

オキシンのピーク比較
Company A
Biphenyl

Column dimension: 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3CN/20mM H3PO4=10/90
Flow rate: 1.0 mL/min,
Temperature: 40 ºC,
Detection: UV@250nm
Sample: 1 = 8-Quinolinol (Oxine), 2 = Caffeine

212Company BBiphenyl

121Company CBiphenyl

21SunShellBiphenyl
0246810

他社Biphenylカラムと比べ金属配位性のある化合物のピーク形状が良い

23

アミトリプチリンのピーク比較

比較に用いたカラム
1. Kinetex Biphenyl, 2.6 μm
2. Halo Biphenyl, 2.7 μm
3. Raptor Biphenyl, 2.7 μm
4. SunShell Biphenyl, 2.6 μm

4224

TF4=2.63

TF4=3.15

Company ABiphenyl

Company BBiphenyl

6810024Retention time/min

322Company CBiphenyl
46Retention time/min81044TF4=3.0726Retention time/min

1041103238103TF4=1.80
SunShellBiphenyl10246810Retention time/minColumn dimension: 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3CN/20 mM Phosphate buffer pH 7.0=60/40
Flow rate: 1.0 mL/min Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250 nm
Sample: 1 = Uracil, 2 = Propranolol, 3 = Nortriptyline, 4 = Amitriptyline

他社Biphenylカラムと比べ塩基性化合物のピーク形状が良い

24

メチル馬尿酸の異性体の分離比較
7% 2-Propanol

0246810p-m-o-10% Tetrahydrofuran pCompany A Biphenylo-=1.054
1214161820240Company B Biphenyl

p-m-o-

2222468101214161822p-m-o-

202402424681012141618m-o-

20

22p-

22468101214161820

Retention time/minp-624248p-

82410m-=1.050o010m-=1.028

SunShell Biphenyl

2210m-=1.02264=1.066
08p-o-=1.05106o-Company C Biphenyl

0=1.023

4=1.0670m-

68Retention time/min

SunShell Biphenylカラムは移動相の有機溶媒を変えても分離が維持できる1025

塩基性条件下の耐久性耐久性試験条件
Column dimension: 50 x 2.1 mm
Mobile phase:20 mM Sodium
phosphate pH 8.0
Flow rate: 0.2 mL/min
Temperature: 40 ºC

相対理論段数/%10080

理論段数測定条件

60

Mobile phase: CH3CN/H2O=50/50
Flow rate: 0.2 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250 nm
Sample: Butylbenzene

40200050100150200250300

通液時間/hSunShell Biphenylカラムは高い耐塩基性を有している

26

酸性条件におけるブリード
80

Absorbance/mAU

70

SunShell Biphenyl
Company A Biphenyl
Company B Biphenyl
Company C Biphenyl

6050403020

3サイクル目のグラジエントにおけるクロマトグラム

100-1056789101112Retention time/min
ブリード試験条件
Column dimension: 50 x 2.1 mm
Flow rate: 0.3 mL/min
Mobile phase: A) 1% H3PO4 (pH 1.2) Temperature: 40 ºCB) Acetonitrile
Detection: UV@250 nm
Gradient program

SunShell Biphenylカラムは他社と比較して高い耐酸性
27まとめ◼ HILICカラムは逆相カラムと同様に、官能基によってその特性が異なる◼ HILICモードで分析を行う場合、一般的な逆相モードより、サンプルの調整等、注意が必要な点が多い◼ HILICモードで連続分析を行う場合、インジェクションによるベースラインの乱れを考慮する必要がある◼ Biphenylカラムは、逆相カラムの中でも水素結合性が強く発現する◼ BiphenylカラムやPhenylカラムは、移動相にアセトニトリルを用いるとパイ電子に基づく相互作用が機能しなくなる◼ Biphenylカラムは水系移動相のみでも安定して使用可能である
28Memo29キャンペーンセール期間:
2020/11/16~2021/3/31

汎用のHPLC装置を用いて比較
12SunShell C18 5 μm8MPa

31 2314

N6=20,000

6

SunShell C18 3.5 μm513 MPa

7

N6=28,000

642（内径 0.25 mm の配管を使用）

SunShell C18 2.6 μm522 MPa307524684107

N6=32,000

61214Column size: 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºCSample: 1 = Uracil
2 = Caffeine
3 = Phenol
4 = Butylbenzene
5 = o-Terphenyl
6 = Amylbenzene
7 = Triphenylene
HPLC: 汎用コンベンショナル装置

1618202224Retention time/min

SunShell
3.5μmμmカラム新発売
カラム新発売SunShell C18,C18, 3.5
全多孔性 3μmカラムより低圧で，HPLCでも十分な性能発揮!!

SunShell Biphenyl, 2.6 μm カラム新発売 裏面参照!
クロマニックテクノロジーズ

粒子径の異なるコアシェルカラムの比較
1

SunShell C18 5 mm

28 MPa3754

N6=20,000

61 2

SunShell C18 3.5 mm

31764

N6=28,000

2

SunShell C18 2.6 mm
3013 MPa

5222 MPa

46481075N6=32,000

6121416182022Column size: 150 x 4.6 mm
Mobile phase:
CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil
2 = Caffeine
3 = Phenol
4 = Butylbenzene
5 = o-Terphenyl
6 = Amylbenzene
7 = Triphenylene
HPLC: Hitachi LaChrom ELITE(Tubing, 0.25 mm i.d.)

24

Retention time/min

汎用HPLCでも使用しやすい20MPa以下で使用可能な粒子径3.5µmを新発売

株式会社 クロマニックテクノロジーズ
552-0001 大阪府大阪市港区波除6-3-1
TEL: 06-6581-0885 FAX: 06-6581-0890
E-mail: info@chromanik.co.jp
32
URL: http://chromanik.co.jp