遺伝子検査前処理デバイス
DnaCapture 使用例集

一般社団法人 生命科学教育研究所

説明及びキーワード
サンプル：全血、血清、血漿、唾液、鼻ぬぐい液など液体検体
対象：細胞、白血球、ウイルス、微生物など
遺伝子：DNA ／ RNAサンプリング方法：滴下または塗布
試料保存方法：乾燥後、室温保存可能（数ヶ月）
ウイルス・微生物の不活化：加熱（70℃、20 分間）
遺伝子抽出精製不要：Without Extraction and Purification for DNA ／ RNA
ダイレクト PCR：Direct-to-PCR
ダイレクトリアルタイム PCR：Direct-to-real time PCR
ダイレクト逆転写 PCR：Direct-to-reverse transcription PCR
前処理方法①：2 ㎜Φディスク ( を 100 μ L-DW 中で 95℃
5 分間加熱処理した溶液をテンプレート（鋳型）として使用する。
前処理方法②：1 ㎜Φディスクを 20 μ L-PCR マスターミックス中に添加してPCR 検査を開始する。
サンプルディスク採取方法：生検トレパン（貝印）使用
DnaCapture 素材：水溶紙（Water Soluble Paper）
水溶紙：カルボキシメチルセルロース 配合製紙
カルボキシメチルセルロース：Carboxy Methyl Cellulose (CMC)

DnaCapture 関連論文
一塩基多型解析:SNP−アルコール代謝 ALDH2, ADH1B−
１． 新規な遺伝子検査プロトコール開発とアルコール代謝関連遺伝子多型への応用
https://www.jstage.jst.go.jp/article/yakushi/139/8/139_19-00016/_pdf/-char/ja

要

旨：水溶性紙に付着させた乾燥唾液試料から一般的な DNA 抽出・精製工程を経ずに、生体試料を直接 TaqMan PCR のテンプレートとして用いる新しい一塩基多型（SNP）遺伝子型判定法を開発・検証した。この方法は、簡単にセットアップでき、データ解釈を含む PCR 解析を 2 時間以内に完了することができ、さらに低コストで大規模な臨床研究、診断、疫学研究に適用できる利点がある。具体的には、乾燥唾液を用いた TaqMan PCR 法により、アルコール代謝関連遺伝子 ADH1B(rs1229984) と ALDH2 (rs671) の SNP ジェノタイピングを実証した。このプロトコールでは、実験操作の簡略化・効率化、時間と手間のかかる DNA 精製工程の省略・簡略化により、実験時間の短縮とコンタミネーション等のヒューマンエラーのリスクを低減することが可能である。さらに、大幅なコストダウンも可能になりました。市販のリアルタイム TaqMan PCR 用マスターミックス試薬による SNP ゲノタイピングの判定率、精度を飛躍的に向上させることに成功した。また、反応系に安定的に鋳型 DNA を導入することが可能となり、TaqMan プローブ法によるコピー数変動（CNV）への応用が可能となる。この最適化された水溶性紙を用いた SNP 解析プロセスは、薬物代謝酵素遺伝子 CYP の遺伝子多型解析などに応用され、個別化医療の実現に貢献することが期待される。
２． 女子大学生におけるエタノールパッチテストの反応性と ALDH2 および ADH1B 遺伝子多型との関連
https://www.jstage.jst.go.jp/article/jjh/70/2/70_134/_pdf
３． Direct Detection of Single Nucleotide Polymorphism (SNP) by the TaqMan PCR Assay Using Dried
Saliva on Water-soluble Paper and Hair-roots, without DNA Extraction
https://www.jstage.jst.go.jp/article/analsci/30/3/30_427/_pdf/-char/en
４． Genotyping of Polymorphisms in Alcohol and Aldehyde Dehydrogenase Genes by Direct Applicationof PCR-RFLP on Dried Blood without DNA Extraction
https://www.jstage.jst.go.jp/article/analsci/26/4/26_4_503/_pdf/-char/en
５． 飲酒と健康 ―アルコール体質検査と飲酒の功罪―
https://www.jstage.jst.go.jp/article/jbrewsocjapan/109/1/109_2/_pdf/-char/en
６． Single-Tube Genotyping from a Human Hair Root by Direct PCR
７． 乾燥唾液を用いたアルコール代謝関連遺伝子 ADH1B および ALDH2 の SNP タイピング解析法の検証実験と妥当性確認。臨 床 病 理 63(11): 1253 -1258 2015－1－

−薬物代謝 CYPs−
８． Combination Analysis in Genetic Polymorphisms of Drug-Metabolizing Enzymes CYP1A2, CYP2C9,CYP2C19, CYP2D6 and CYP3A5 in the Japanese Population
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4278879/pdf/ijmsv12p0078.pdf
９． Unique Genotyping Protocol of CYP2D6 Allele Frequency Using Real Time Quantitative PCR fromJapanese Healthy Women
https://www.jstage.jst.go.jp/article/bpb/43/5/43_b19-00512/_pdf/-char/ja

要

旨：CYP2D6 は、一般に処方される薬物の 20-25％の代謝に関与する重要な薬物代謝酵素である。

CYP の遺伝子多型は、患者の薬物代謝能に関与する臨床的に重要な遺伝子多型と考えられています。
CYP2D6 遺伝子はコピー数変異（CNV）や一塩基多型（SNP）が多く、CYP2D6 の活性は特に遺伝的要因に依存すると考えられている。本研究では、日本人女性健常者 216 名を対象に、CYP2D6 遺伝子型の頻度を調査することを目的とした。日本人女性健常者 216 名を対象に、CNV Exon 9 および 4 つのCYP2D6 遺伝子変異（*2、*5、*10、*14、*41）について TaqMan® genotyping assay による遺伝子型判定を行い、CYP2D6 遺伝子変異を判定した。コピー数多型（CNV）のアレル頻度は、2 コピーで 82.9％、1 コピーで 11.6％、3 コピーで 4.6％、0 コピーで 0.9％であった。CYP2D6*1, *2, *5, *10, *14,*41 の頻度は、それぞれ 38.7, 16.7, 6.3, 34.7, 0.2, 1.2％であった。一般に、ジェノタイピン
グは労力、時間、コストがかかる。我々は、新規に CYP2D6 遺伝子の CNV と SNP を TaqMan プローブを応用したリアルタイム PCR 装置を用いた最適化されたプロトコルを報告する。これにより、コストを下げ、CYP2D6 遺伝子の CNV と SNP を正確に判定し、大規模な疫学的サンプルにおける疾患予測の信頼性の高い推定を可能にすることができた。
１０． 薬物代謝酵素 CYP2C9 およびビタミン K エポキシド還元酵素複合体 1 VKORC1 の高効率的な一塩基遺伝子多型解析法の開発
https://www.jstage.jst.go.jp/article/jjphcs/40/7/40_402/_pdf
１１． 唾液中カフェイン薬物動態に薬物代謝酵素 CYP1A2 遺伝子多型が及ぼす影響に関する研究 武庫川女子大紀要 65, 1-5. 2017

コピー数多系:Copy Number Variation (CNV)
１２． Development of an Inexpensive and Rapid Operation Device for High-Throughput Real-Time
Quantitative PCR-Based CYP2D6 CNV Genotyping
https://www.jstage.jst.go.jp/article/bpb/42/10/42_b19-00120/_pdf/-char/ja
要

旨：CYP2D6 遺伝子は、薬物代謝に関与する最もよく知られた遺伝子であり、遺伝子重複型と欠失型の両方の変異があることが知られています。我々は、CYP2D6 遺伝子のコピー数変異（CNV）を、リアルタイム定量 PCR のための新しい精製プロセスによって最適化した方法を報告する。この方法
は、CYP2D6 遺伝子の CNV を正確に測定することができ、大規模な疫学的サンプルにおける疾患予測の信頼性の高い推定を可能にするものである。

－2－

結論：乾燥唾液サンプルを使用し、液体処理プラットフォーム DnaCapture を組み合わせた場合、ジェノタイピングプロセス全体をさらに迅速化できることが分かった。この方法を用いることで、現在のジェノタイピング法を簡略化し、TaqMan®コピー数アッセイによるリアルタイム定量 PCR を用いて毎日多くのサンプルを分析する診断現場でのさらなる利用を可能にする。今回の結果は、本技術が CNV ジェノタイピングの低コスト化に有効であることを示した。この新しい方法論がハイスループットなジェノタイピングに応用されることを期待している。
１３． Long PCR-based Genotyping for a Deleted CYP2D6 Gene without DNA Extraction
https://www.jstage.jst.go.jp/article/dmpk/29/3/29_DMPK-13-NT-116/_pdf/-char/ja

熱融解分析:Melting Curve Analysis
１４． Rapid and Cost-Effective Genotyping Protocol for Angiotensin- Converting Enzyme
Insertion/Deletion (Ins/Del) Polymorphism from Saliva
https://www.jstage.jst.go.jp/article/bpb/42/8/42_b19-00110/_pdf/-char/ja

要

旨：一般に、PCR アッセイには DNA の抽出・精製が必要とされている。我々は、生体試料を直接テンプレートとして使用し、融解曲線解析を伴うリアルタイム PCR を行う新しいプロトコルを実証した。特にアンジオテンシン変換酵素（ACE）遺伝子の挿入/欠失（Ins/Del）多型の同定に融解曲線解析が適していることが確認された。私たちが開発した新しいプロトコルは、データの解釈を含む簡単な PCR 解析で 4 時間以内にセットアップでき、さらに低コストで大規模な臨床研究、診断、疫学研究に適用できる利点がある。
結果：－3－アルコール体質検査プロトコル
ALDH2&ADH1B
１． 唾液サンプリング① サンプリングキットを受け取る。
DnaCapture、スワブ、簡易滅菌パウチ② 唾液を口腔ケア用スワブ使用してサンプリングする。
③ 唾液をスワブから下図のように DnaCapture に塗布する。
④ 簡易滅菌パウチ内に DnaCapture を入れ提出する。
⑤ 使用済のスワブは被験者自らオートクレーブバッグに捨てる。
⑥ サンプルは室温で自然乾燥（一昼夜）させる。

サンプリングプロセス

２． PCR 検査用試薬の調製（１０μL 系：４８名分）
ALDH2/ADH1B
Hot Start TTx DNA Polymerase（東洋紡社製）

6

ALDH2 or ADH1B Master Mix (TTx Buffer+TaqMan Probe & Primer+ROX)

474

Total

480

ALDH2 or ADH1B Master Mix (TTx Buffer+TaqMan Probe & Primer+ROX)

L

2×Buffer for rTth/TTx (DNA)24050× ROX reference dye（東洋紡社製）ABI RT-PCR 装置使用の場合

9.6

20× ALDH2 TaqMan Probe & ALDH2 Primer Mix (ABI 社製:C_11703892_10)

24

DW

200.4

Total

474
９６ウェルの場合－4－

３． サンプル前処理及び PCR 反応
乾燥したサンプルを生検トレパン（貝印：BPP-20F
乾燥したサンプルを⽣検トレパン（⾙印︓BPP-20F 2.0mm、202.0mmF、20 本 10,000 円 ）でパンチする。４８名分のパンチ片を４８穴ンチする。４８名分のパンチ⽚を４８⽳ PCR プレートの２ヶ所に投入する。PCRプレートの２ヶ所に投⼊する。PCR マス

ターミックスを各ウェルに分注して、PCR 反応を開始する。なお、サンプルパンチ作
業は、人数分連続で行ってもコンタミネーションは起こさない（参考文献参照）。
業は、⼈数分連続で⾏ってもコンタミネーションは起こさない（参考⽂献参照）1116

YAKUGAKU ZASSHI

Vol. 139, No. 8 (2019)

Table 2. Phenotype Frequencies for Alcohol-related Gene
４．
Types PCR 検査

ADH1B

装㈙
10㈙1ALDH2TypeNɓ置：
ThermalCycler
9700同等機種
置︓㈙10㈙1A3
1.5㈙㈙10㈙14610㈙2
反応条件：PCR酵素の初期化50°C5分、熱変性95°C 10 分後、50 サイクルの熱変性95°C
反応条件︓PCR酵素の初期化50°C
B
46.6㈙20㈙2㈙10㈙1㈙
10㈙1㈙10㈙250C
4
1.915 秒，アニーリング及び伸長反応60°C
30 秒にて実施する。
秒，アニーリング及び伸⻑反応60°C㈙
10㈙2
YAKUGAKU ZASSHI㈙10㈙2Vol.41
139, No. 8 (2019)

D45.6
PCR 装置にてエンドポイント解析で実施する。
SNP
タイピング︓リアルタイム㈙㈙10㈙220㈙2 タイピング：リアルタイム
53

lcohol-related GeneN

ɓ

3

1.5

4650
441
53

46.6
1.9
45.6

㈙20㈙2㈙
10㈙2㈙20㈙2㈙
20㈙2㈙20㈙20E

24.4

7‫ ૽ ڎ‬ତ ͉㈙1 0㈙
1 ͉ 7 ྴ Ȫ 3.4 ɓ ȫȄ㈙1 0㈙2 ͉ 89 ྴ
Ȫ43.2ɓȫȄ㈙20㈙2 ͉ 110 ྴȪ53.4ɓȫ̜́ͤȄ㈙1͂㈙2 ͈ ͺ τ σ ອ ഽ ͉ 0.250 ͂ 0.750 ́ ̜ ̽ ̹ ȅALDH2 ‫ ͍ݞ‬ADH1B ͈֒ഥঊ߿ͤ͢Ȅࣖள‫ͬ଻ڰ‬ே೰̱ A㏏E ͈ 5 ਅ႒͈֩ਈͅచ̳ͥఘৗ߿ͬ୭೰02㈙
10㈙14.4

Fig. 5.

Veriˆcation of Cross Contamination between Dried

Saliva Samples
５．
PCR 検査費⽤（１名分）１０μL
検査費用（１名分）１０μL) A系* ADH1B ɟȇ㈙2 0㈙2 Ȅɣȇ㈙1 0㈙2 Ȅ ȇ㈙1 0㈙1 ȅ) B * ALDH24. ‫ޞ‬ᙉȽɻɟɳ⫻ȷɵɁȻɻɇɧɕʀȿɯɻǽ
10,12,13*̱̞̀ͥȪTable 2ȫȅ

ɜ

7

ɟȇ㈙
10㈙
1Ȅɣȇ㈙
10㈙
2Ȅɜȇ㈙
20㈙
2.

‫ڠ‬୆ 206 ྴಎ 40 ྴ͈‫ۋ‬௓఍‫ס‬΍ϋίσͬ

ホットスタート TTx DNA Polymerase 20 LµL 系 1 回Ꮀ▩஖఼̱Ȅ୆࠿ΠτΩϋ͈࢐۟ྌ͉୶౤͈૿໐໦͈૑

96 円௩໙ެ஌̦ං̹ͣͦȮPCR
ȫȄ㈙1 0㈙2 ͉ 89 ྴ ̧͉֚৾ͤ୨̴࣐ͩȄႲ௽എͅ΍ϋίσ಺ୋͬ৘ঔ
Taqman Probe＆Primers mix ABI（375 回分73400 円） Fig. 6)B*^ȅ
392円฽؊͉́ 1΍ͼ·σ̮͂ͅ DNA ̦ 2 ෼̴̾௩໙̯ͦȄ௩໙ॲɓȫ̜́ͤȄ㈙1 ͂ ̱̹ȅ̷͈ࠫ‫ض‬Ȅ Fig. 5 ͈̠͢ͅȄ ADH1B ‫͍ݞ‬

口腔ケアスワブ
⼝腔ケアスワブ͈ SNP ΗͼάϋΈࠫ‫͉ض‬ஜ੆͈ࠫ‫ ض‬2. ͈750 ́ ̜ ̽ ̹ ȅ ALDH2ͤ͢Ȅࣖள‫΀ ͬ଻ڰ‬ϋΡεͼϋΠ TaqMan PCR ٜଢ଼ࠫ‫ۖ͂ض‬஠֚ͅ
DnaCapture 水溶紙（販売予定価格）
⽔溶紙（販売予定価格）
̳ͥఘৗ߿ͬ୭೰ ౿̱Ȅ௩໙ެ஌̤̞̀͜ͅ։ુ͉͙̥̹ͣͦ̈́̽ȅ
Fig. 5. Veriˆcation of Cross Contamination between Driedᑙᛡሞἠǽΰ༔‫ڽ‬Ȃ̊ᡷ‫ޞ‬ᙉɎɻɟɴʀɐǽ
5. SalivaSamples

その他30 円 10 ෼̴໤͉ 2n Ȫ n ͉΍ͼ·σତȫ͂̈́ͥȅ͉ࣽٝ̾౲‫ܛٴ‬৷࣐̹ͬ̽ঌ์ΊΦθ DNA ဣ‫ͬס‬ဥ̞̹円
̹͛Ȅ2n Ɂ 10 ͬࠗॳ̳ͥ͂ n Ɂ2003.3 ͂̈́ͤȄ࿩3.3

΍ͼ·σ̴̴͈͉̾ͦͥၑაഎͅດ੔ެ஌Ȫ y Ɂ20 円) A * ADH1B ɟȇ㈙2 0㈙2 Ȅɣȇ㈙1 0㈙2 Ȅɜ ȇ㈙1 0㈙1 ȅ) B * ALDH2໌ࡩ୼੫ঊఱ‫ڠڠ‬୆
206 ྴ͈‫ۋ‬௓఍‫ס‬΍ϋɇɧɕʀȿɯɻǽ ઻⦖ɟȇ㈙10㈙1Ȅɣȇ㈙10㈙2Ȅɜȇ㈙20㈙2.
௓఍‫ס‬΍ϋίσͬ ίσͬဥ̞̀΋άȜତఉ߿͈ඤ໐΋ϋΠυȜσ͈͈‫ۋ‬௓఍‫࠿ס‬ఘȪ 206 ྴȫͬঀဥ̱̹௩໙ެ஌͈

୶౤͈૿໐໦͈૑ RNase P ͬςͺσΗͼθκΣΗςϋΈ̱̹௩໙ެ
37 ྴ໦ͬ Fig.
PCR ௩ 1ϋίσ಺ୋͬ৘ঔ ஌͈֚໐࠿ఘ௩໙ެ஌̦ං̹ͣͦȮ*^ȅPCR ฽؊͉́Fig.66))A
B*ͅা̳ȅତ͉ȄΐͿΦΗͼάϋΈ́ၑேഎ̈́ 104㏏105 ΋άȜȽ 3.13x ȼ 44.07ȫ̦ං̹ͣͦȮFig. 6)Cȫȯȅུࡄ‫ݪ‬

合計 738 円

Ct ౵Ȫ30.5 Ⱦ 1.3 ΍ͼ·σȫ̥ͣॳ੄̯ͦͥ΋άȜ໙ॲ໤ၾ̦ࠖ࢕࠿੄̧́ͥၾͅో̳ͥ͂௩໙ެ஌̦ͅ໦ື̱̞̹̀ȅͅȄ ADH1B ‫͍ݞ‬参考文献：新規な遺伝子検査プロトコール開発とアルコール代謝関連遺伝子多型への応用
΍ͼ·σ̮͂ͅ DNA ̦ 2 ෼̴̾௩໙̯ͦȄ௩໙ॲ
参考⽂献︓新規な遺伝⼦検査プロトコール開発とアルコール代謝関連遺伝⼦多型への応⽤ࠫ‫ض‬
6. ȪɳȻʀɳΧ✤⣻Ό੿ᎰዶǽȻɁɐ
໤͉ 2n Ȫn ͉΍ͼ·σତȫ͂̈́ͥȅ͉ࣽٝ 10 ෼̴ஜ੆͈ࠫ‫ ض‬2. ͈ ၛ̻ષ̦ͤই͛Ȅঐତ‫۾‬ତഎͅΏΈ΢σ̦ષઌ̱̹

https://www.jstage.jst.go.jp/article/yakushi/139/8/139_19-00016/_pdf/-char/ja
2. ܱͅ੆̱̹̠͢ͅȄ‫ڠ‬୆ 40 ྴ໦͈‫ۋ‬௓఍‫ס‬΍ϋ̾౲‫ܛٴ‬৷࣐̹ͬ̽ঌ์ΊΦθDNAଢ଼ࠫ‫ۖ͂ض‬஠֚ͅ ͈̻ȄίρΠȜͅో̳ͥȅ੝อ͈ဣ‫ͬס‬ဥ̞̹
DNA ၾ̦ఉ̞͕͙̥̹ͣͦ̈́̽ȅ ̓Ȅ௩໙ॲ໤ၾ்͉̩࠿੄‫خ‬ෝ̈́ၾͅో̳͈ͥ́Ȅ̹͛Ȅ2n Ɂ 10 ͬࠗॳ̳ͥ͂ n Ɂ 3.3 ͂̈́ͤȄ࿩ 3.3

ί σ ͬ ဥ ̞ ̹ ͺ σ ΋ Ȝ σ ఘ ৗ ֒ ഥ ঊ Ȫ ADH1B,ALDH2 ȫ͈ஜੜၑ̥ͣࠫ‫ض‬฻೰͈́͘ਫ਼ါশ‫ۼ‬ᙉɎɻɟɴʀɐǽ ௩໙ެ஌̦௸̞΍ͼ·σ́ၛ̻ષ̦ͥȅུ৘ࡑ́΍ͼ·σ̴̴͈͉̾ͦͥၑაഎͅດ੔ެ஌Ȫ y Ɂဣ‫ס‬ȪHumanFig.
DNAGenomicDNAȫ
Ƚ 3.13x ȼ 44.07
ྴ͈‫ۋ‬௓఍‫ס‬΍ϋ ͉Ȅঌ์ΊΦθȫ̦ං̹ͣͦȮ6)Cȫȯȅུࡄ‫ݪ‬͉Ȅ̷̤͢ 2 শ‫ ۼ‬30 ໦̜ͥḙ͈֚̏Ⴒ͈ௌैͅါ

106 copy 0 mL ͈ΑΗϋΘȜΡဣ‫಺ͬס‬ୋ̱Ȅ໐΋ϋΠυȜσ͈ ̥͈ͣ‫ۋ‬௓఍‫࠿ס‬ఘȪ
206 ྴȫͬঀဥ̱̹௩໙ެ஌͈
105 ㏏103 copy 0 mL ͈ဣ‫͉ס‬౲‫ܛٴ‬৷̱̀ैୋ̱̹ȅ޲૖֥ 1 ྴͬ฼඾Ȫ4 শ‫ۼ‬ȫࡹဥ̱̹ાࣣ͈૽࠯๯

2－ 51－ྴ໦͈΍ϋίσ͈௶೰๯ဥͬ‫̹̱ॳٽ‬ȅ๱ુ̳ͥDnaCapture 使用例集
2022 年 3 月 1 日発行

一般社団法人 生命科学教育研究所
出版元／一般社団法人 生命科学教育研究所〒533-0033
大阪府大阪市東淀川区東中島1-21-33 俵ビル702号室

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