東洋鋼鈑Vol.42

骨髄異形成症候群に関連したSF3B1 遺伝子変異検査キットの開発
高光 恵美＊１・森弘 惇一＊２・大場 光芳＊3
Development of Screening Kit for SF3B1 Gene Mutations Related to Myelodysplastic Syndromes
Emi TAKAMITSU，Junichi MORIHIRO，Mitsuyoshi OHBA

S y n o p s i s ： Myelodysplastic syndromes （MDS） are refractory hematopoietic tumors caused byclonal abnormalities of hematopoietic cells, and the number of patients is increasing inJapan as the population ages. Many of the causative genetic abnormalities have been
identified. According to the revised 4th edition of the WHO classification, presence ofSF3B1 mutations is one of the diagnostic criteria for MDS. However, in Japan, there are
only a limited number of laboratories that can test for SF3B1 mutations. Therefore, wedeveloped a kit that can simultaneously test for multiple SF3B1 mutations associatedwith MDS.
SF3B1 mutation sites were amplified with fluoresce-labeled primers by multiplex PCR.
The PCR products were hybridized to DNA chips bonded with specific probes for thesewild or mutated sequences in the presence of oligonucleotide blockers. After washing toremove unhybridized products, the fluorescence intensity of each probe was detected.
Index defined as fluorescence intensity ratio [mutant probe intensity / （wild probeintensity + mutant probe intensity）] were used to analyze these mutations.
By optimizing the probe sequence and hybridization conditions, and by suppressing
nonspecific hybridization reactions with oligonucleotide blockers, a detection sensitivity
of 5% was achieved for all SF3B1 mutations to be analyzed. In addition, analysis of MDS
patient samples showed that the results of this product were consistent with those of theexisting method, direct sequencing. Thus, our microarray-based assay kit is useful foridentifying SF3B1 mutations in patients with suspected MDS.
K e y W o r d s ： myelodysplastic syndromes（MDS）; SF3B1 mutation; DNA chip analysis
子解析技術の進歩とともに原因となる遺伝子異常の多く

１．はじめにが明らかとなってきた4, 5）．WHO 分類改訂第4 版6）にて
骨 髄 異 形 成 症 候 群（myelodysplastic syndromes,MDS の診断基準にSF3B1 遺伝子変異が取り入れられたMDS）は，造血細胞のクローン性異常によって発症する疾が，これに続きWHO 分類第5 版7）では遺伝子異常で定義

患1）であり，造血不全と急性骨髄性白血病への移行を特徴されるMDS と形態異常で定義されるMDS に病型が区分とする．貧血，倦怠感，発熱などを伴うが，症状がほとんどされ，遺伝子異常は疾患を特徴づける情報として重要性なく健康診断などの血液検査結果の異常をきっかけに診が増している．とくに，環状鉄芽球を伴うMDS について断される場合もある．本邦では高齢化に伴い患者数が増はWHO 分類第5 版にて形態学的特徴よりもSF3B1 遺伝

加している2）とされる難治性の造血器腫瘍である．

子変異との関連がより強調されることとなった．SF3B1

MDS の確定診断には，骨髄検査によって骨髄細胞に骨遺伝子変異は，コドン700 における変異であるK700E の髄異形成の形態異常および骨髄細胞の染色体検査で核型頻度が最も高く，コドン700 の他，変異のホットスポット異常を同定することが必要である3）が，近年の網羅的遺伝＊１ 技術研究所 機能化技術研究部 ライフサイエンス技術グループ 遺伝子診断薬チーム チームリーダー＊２ 事業推進室 ライフサイエンス事業グループ＊３ 技術研究所 機能化技術技術部 ライフサイエンス技術グループ グループリーダー

43東洋鋼鈑としてコドン666，662，622 及び625 が報告されている

Vol.42（https://sg.idtdna.com/calc/analyzer）を用いた．DNA8-10）

チップの作製方法は前報13）に記されたとおりとした．

．またMDS に伴う貧血の治療薬であるluspatercept（2024年1月承認）はSF3B1 遺伝子変異を持つ環状鉄芽球を伴うMDS（MDS-RS）では有効性が高いとされる11）.

２．２

PCR 反応しかしながら，本邦では検査が可能な施設は設備の整っ

SF3B1 遺伝子の解析対象領域（エクソン14 およびエた大規模な大学病院などに限られ，SF3B1 遺伝子変異のクソン15）を2plex PCR により同時増幅した．DNA プ

有無は診断に重要な情報であるにも関わらず，検査を受ローブとハイブリダイズする鎖のプライマーの5’末端をけられていないケースが多いと予想される．そこで，我々予め蛍光色素で標識することによりDNA プローブにハイ12）を応用し，ブリダイズする増幅産物の5’末端を蛍光色素で標識した．

MDS に関連した複数種類のSF3B1 遺伝子変異の有無をPCR 反応は95℃で5 分間，酵素を活性化後，95℃で30同時検査が可能なキット（以下，本品）を開発した．本稿

秒，60℃で30 秒，72℃で90 秒を40 サイクル繰り返した．

では同時検査のためのプローブ設計やハイブリダイズ条その後，72℃で10 分間伸長させ，4℃で静置した．PCRの保有するジーンシリコンDNA チップ技術件の最適化，ブロッカーによる非特異的ハイブリダイズに はApplied Biosystems Veriti サ ー マ ル サ イ ク ラ ー

反応の抑制等の検討結果や，既存法との比較を含む本品（Thermo Fisher Scientific 社）を用いた．

の性能について記述する．
２．３

ハイブリダイズ反応と蛍光強度の検出

PCR 反応後の反応液とブロッカーオリゴDNA を添加

２．方法

した2.25 ×SSC，0.225%SDS を含むハイブリダイズ緩衝
２．１

材料液とを2:1 で混合し，ハイブリダイズサンプルとした．

プローブ，プライマー，ブロッカーとして用いたオリ

ハイブリダイズサンプル中でDNA チップを49.5℃で

ゴ ヌ ク レ オ チ ドDNA はThermo Fisher Scientific 社

30 分間静置し，増幅産物とプローブをハイブリダイズしから購入した．プライマーの蛍光色素標識にはIC5-OSu

た．0.1 ×SSC，0.1％SDS 溶液で洗浄し未反応のサンプ（N-Ethyl-N'-[5-（N''-succinimidyloxycarbonyl）

ルを除去後，1 ×SSC 溶液中にてDNA チップ上の各ス

pentyl]-3,3,3',3'-tetramethyl-2,2'-indodicarbocyanine

ポットの蛍光強度を検出した（励起波長640nm）．ハイiodide, 株式会社同仁化学研究所）
を用いた．
健常人末梢血ブリダイズ反応および蛍光強度検出は遺伝子解析装置

由来ゲノムDNA はBiochain 社から購入した．
PCR 試薬BIOSHOT HT-32（東洋鋼鈑株式会社）を用いた14）．

はFastStart Taq DNA ポリメラーゼ，dNTPack（SigmaAldrich 社）を用いた．オリゴヌクレオチドDNA の融解

２．４

温 度（Tm）計 算 に はIDT 社 の 提 供 す るOligoAnalyzer

判定

遺 伝 子 解 析 装 置BIOSHOT HT-32 が 検 出 し た 各 ス

Table 1 Detection target mutations in SF3B1 gene.

ポットの蛍光強度から判定値（Index ＝変異型検出プ
ローブ蛍光強度/ 野生型検出プローブと変異型検出プローブの和）を算出した．検査検体の判定値が予め設定したカットオフ値以上の場合，変異陽性と判定した．カットオフ値は5％の変異が存在する状態を模した変異モデル
検体の判定値のバラつきを考慮し，設定した．

３．結果
３．１

解析対象領域の遺伝子増幅

遺伝子変異情報データベース（COSMIC）にてSF3B1
遺伝子変異を調べた．データベース上の発生頻度や文献情報等を元に本品での解析対象変異を決定した（Table 1）．
Table 2 Primer sequences.

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骨髄異形成症候群に関連した SF3B1 遺伝子変異検査キットの開発

SF3B1 遺伝子配列から解析対象変異が含まれるエクSF3B1 遺伝子の野生型および変異型配列からそれぞれのソン14 およびエクソン15 領域を増幅するプライマーを検出用プローブを設計した．プローブ配列をTable 3 にそれぞれ設計した．増幅に用いたプライマーをTable 2示した．これらをDNA チップ上にスポットし，健常人末に示した．蛍光色素標識と非標識のプライマー濃度比を梢血由来ゲノムDNA およびK700E 変異を有するMDS9：1 とした非対称PCR にてこれら2 領域を同時増幅した．

患者由来ゲノムDNA を解析した．DNA チップレイアウ

増幅産物を電気泳動したところ，副産物を生成すること

ト，検出画像をFig.2 に示した．対応するスポットで良好なく2 領域をバランスよく増幅可能であることを確認しな蛍光強度を検出した．

た（Fig.1）．
３．２

プローブの設計

Table 3 Probe sequences.

全ての解析対象変異にて同時にハイブリダイズ反応を可能とするため，Tm（℃）が近い値となるよう野生型および変異型を検出するためのプローブを設計した．

Fig.1 PCR amplification of SF3B1 gene exon14 and exon15.
Left lane; molecular size marker, Middle lane; water（negative control）, Right lane; genome DNA.

Fig.2 SF3B1 chip analysis.
A） Spotting layout of SF3B1 chip. B） Scanning image of SF3B1 chip after hybridization. Left panel;
Wildtype genome DNA sample from healthy donor. Right panel; K700E mutation genome DNA sample
from a patient affected with MDS.

45

東洋鋼鈑３．３

プローブ配列に含まれるSNPの影響

Vol.42

３．４

ブロッカーの設計

データベース上の遺伝子配列は多数を占める代表的なハイブリダイズ反応において，変異量が低い検体では配列であり，その塩基配列には個人差がある（遺伝子多野生型配列由来の増幅産物が大部分を占めるため，野生型）ことが知られている．遺伝子多型による塩基配列の型由来の増幅産物が変異型検出プローブへ非特異的にハ違いによりプローブの反応性に差異が生じ，変異判定結イブリダイズし変異検出を妨げる場合がある．そこで，ハ果に影響する可能性がある．そこで，一塩基多型（Single

イブリダイズ反応液へブロッカー（野生型配列と相補的Nucleotide Polymorphism, SNP）
，1 ～数塩基の置換，なオリゴヌクレオチドDNA）を添加し野生型増幅産物と挿 入/ 欠 失，反 復 等 の 情 報 を 集 約 し た デ ー タ ベ ー スの2 本鎖を形成させ，野生型増幅産物の変異型検出プロー（dbSNP；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/）にてプ

ブへの非特異的ハイブリダイズを抑制することで検出感

ライマー及びプローブ配列付近に存在する遺伝子多型を度の向上を試みた．
SF3B1 遺伝子では，MDS 関連遺伝子変異はE622D と調査したところ，K700E 変異周辺にSNP（rs16865307，C>A，日本人集団の頻度は約0.3%）が認められた．

R625L のように近傍に存在するものが報告されている．

SNP の影響を調べるため，当該SNP 配列にマイナーア

従来，ブロッカーは変異型増幅産物とのミスマッチ塩基レルであるA およびT 塩基を有する人工遺伝子を作製し，が中央になるように設計していたが，E622D とR625Lプローブとハイブリダイズ反応したところ，野生型検出のように近傍に存在する変異をターゲットとするブロップローブ，変異型検出プローブともに蛍光強度が大きくカーは相互に作用し合うことが予想された．

減少した（Fig.3，B）．メジャーアレル（CC）以外の配列

そこで，従来の方法と同様に変異型配列とのミスマッ

では当該SNP 配列にプローブとのミスマッチが生じたた

チ塩基が中央となるようにE622 とR625 の変異をターめと考えられた．そこで，プローブの当該SNP 配列にユニゲットとしてそれぞれ別に設計したブロッカーと，両バーサル塩基として知られるデオキシイノシンを組み込方の変異箇所を単独でカバーするブロッカーを設計しA），ミスマッチの解消を試みた．その結果，デみ（Fig.3，（Fig.4, A），性 能 を 比 較 し た．E622D，
R625L 変 異 と もオキシイノシンを組み込んだプローブでは大幅な改善がに，それぞれの変異のみをターゲットにして従来の方法認められ，検査に十分な蛍光強度を得た（Fig.3，C）．本品で設計したブロッカーでは，野生型検出プローブ，変異型の解析対象のうち最も発生頻度の高いK700E 変異では，検出プローブともにブロッカー濃度に伴い判定値は向上

プローブ中のSNP 配列にデオキシイノシンを採用するこしたものの蛍光強度が大きく減少した（Fig.4, B, D）．

とで個人差のあるSNP の影響を可能な限り排除して検査

一方，一つで両方の変異箇所をカバーするよう設計したが可能となった．

ブロッカーでは，E622D，R625L 変異ともにブロッカー

Fig.3 Correlation between fluorescence intensity and rs16865307 genotype.
A） Probe sequences for K700E mutation. SNP （rs16865307） position is indicated. B） Deoxyinosinefree probes at SNP position base. C） Deoxyinosine containing probes at SNP position base. Open bar
represents stabilized fluorescence intensity detected by wildtype probe,shaded bar represents
stabilized fluorescence intensity detected by mutant probe.Model samples were used which containing（CC）or（TT）or（AA）at SNP position, and also 5% SF3B1 gene K700E mutant allele.

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骨髄異形成症候群に関連した SF3B1 遺伝子変異検査キットの開発

濃度に伴い変異型検出プローブの蛍光強度は保ったまま３．５

カットオフ値の設定判定値が向上した（Fig.4, C, E）．以上の検討結果から，本品の目標検出感度は５% としたため，野生型配列おH662，K666 の変異をターゲットにしたブロッカーでもよび変異型配列を有する人工DNA を作製し，これらを混同様に両方の変異箇所をカバーするように設計し，配列合して5% 変異が存在する状態を模した変異モデル検体を最適化した．決定したブロッカーオリゴヌクレオチドを調製した．この変異モデル検体を用いて，野生型配列をDNA の配列をTable 4 に示した．

有する健常人末梢血由来ゲノムDNA とともに繰り返し

Fig.4 Relationship of fluorescence intensity and index to blocker sequences and concentrations.
A）E622D fluorescence intensity and index to blocker for E622D mutation, B）E622D fluorescence intensity
and index to blocker for E622D and R625L mutation, C） R625L fluorescence intensity and index to blocker
for R625L mutation, D） R625L fluorescence intensity and index to blocker for E622D and R625L mutation.
Open bar represents stabilized fluorescence intensity（FI）detected by wildtype probe, shaded bar represents
stabilized fluorescence intensity detected by mutant probe, filled circle represents index. Index were calculated
as follows:（FI of mutant prove）/（sum of Fls of both proves）. E）Comparative sequences of the SF3B1 gene
wild type and blocker oligonucleotides.

Table 4 Blocker sequences.

47東洋鋼鈑試験を行った．結果をFig.5 に示した．また，これらの結Vol.42

４．終わりに果から判定値の平均値及び標準偏差を算出し，測定のバMDS に関連したSF3B1 遺伝子変異の有無を判定するラツキを考慮して変異の有無を判定するためのカットオキットを開発した．SF3B1 遺伝子にはエクソン15 の700フ値を設定した．設定したカットオフ値と野生型検体の位のほか，エクソン14 に位置する620 ～666 位のアミノ判定値のバラツキは重複しなかったことから，野生型検酸にも様々な変異が報告されている．本品では解析対象体を偽陽性と誤判定することなく変異の有無判定が可能とした2 つの領域の同時増幅，DNA チップに搭載した各と考えられる．MDS 患者の骨髄液から抽出されたゲノム変異型検出プローブの最適化とブロッカーによる非特異DNA を用いて検査を実施したところ，設定したカットオ的ハイブリダイズ反応の抑制により14 種類の遺伝子変フ値以上の判定値が得られ，これらの検体ではSF3B1 変異の同時解析を可能とした．また，本品の解析対象遺伝子異陽性と判定された．

変異のうち最も発生頻度の高いK700E 変異では個人に３．６

よって遺伝子配列に差のあるSNP が変異近傍に存在する既存法との比較が，プローブ中のSNP 配列にデオキシイノシンを採用す

前項のMDS 患者検体を用いた本品による変異の有無ることでSNP の影響を可能な限り排除して検査が可能と判定の結果を，一般的な遺伝子変異解析法であるダイレなった．

クトシーケンス法の結果と比較した．結果をTable 5 に本品の性能について，SF3B1 遺伝子変異の検査方法と示した．両法ともに検査を実施したすべての検体で変異して一般的な方法であるダイレクトシーケンス法と比較が検出された．また，検出された変異は本品と既存法で一したところ，両法の解析結果は解析例の全てで一致した．

致した．以上の結果から，本品は既存法と同様に変異検出ダイレクトシーケンス法は設計したプライマーセットのが可能であることを確認した．

範囲内に存在する変異であれば原理的にはどのような変Fig.5 Distribution of determination value.
Filled circles represent genome DNA from healthy donors. Open circles
represent mutant model sample containing 5% mutant allele. Gray triangles
represent genome DNA from MDS patients. Bars are threshold values foreach mutations.

Table 5 Correlation between SF3B1 gene mutation analysis resultsfrom our DNA chip and conventional assay.

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骨髄異形成症候群に関連した SF3B1 遺伝子変異検査キットの開発

異も検出できるが，検出感度は10％とされ，波形として表示された解析結果は目視による確認が必要である．また，エクソン14 とエクソン15 を同時に解析することはできない．一方，本品は設計した14 種類の変異型プローブに解析対象変異は限られるものの，検出感度は5% 以上を達成しており，エクソン14 とエクソン15 は同時に検査が可能である．また，専用ソフトにより変異の判定が自動化されており，結果の確認が容易という利点がある．以上か
ら，本品は既存法と同等以上の検出感度で複数領域の遺伝子変異の同時解析が可能であり，判定の自動化は目視での結果読み取りに伴う人為的エラーを防止し，検査所要時間の短縮に寄与すると考えられる．現在，本品は研究用として臨床受託検査に利用されている．
謝辞
本品の開発にあたりまして，山口大学大学院医学系研究科病態検査学講座湯尻俊昭教授には終始多大な御助言と御協力を賜りました．ここに深謝いたします．また，岡山直子先生をはじめ山口大学医学部附属病院臨床検査部の皆様にも御協力を頂きましたこと，感謝申し上げます．
引用文献
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