精神医学のフロンティア：ASD 多発罹患家系の全エクソームシークエンスおよびフォローアップ研究
精 神 神 経 学 雑 誌 第 119 巻 第 1 号（2017） 3‒₈ 頁
3

精神医学のフロンティア
自閉スペクトラム症多発罹患家系の全エクソームシークエンスおよびフォローアップ研究井上絵美子1），渡部雄一郎1,2），江川 純1,3），杉本篤言1,4），布川綾子1,5）
澁谷雅子1,6），井桁裕文1），染矢俊幸1）
Emiko Inoue, Yuichiro Watanabe, Jun Egawa, Atsunori Sugimoto, Ayako Nunokawa,
Masako Shibuya, Hirofumi Igeta, Toshiyuki Someya

自閉スペクトラム症の多発罹患家系において，稀な変異が発症に重要な役割を果たすことが示
唆されている．自閉スペクトラム症の稀なリスク変異を同定するため，われわれは 4 人の罹患者（同胞 2 人，母方いとこ 2 人）を有する多発罹患家系の全エクソームシークエンスおよび症例・対照サンプル（243 対 667）を用いたフォローアップ研究を実施した．多発罹患家系の 4 人（発端者，罹患同胞，非罹患同胞，保因者と推定される母）について全エクソームシークエンスを行ったところ，2 つの稀な短縮型変異（RPS24 遺伝子 Q191X 変異と CD300LF 遺伝子 P261fsX266 変異）を同定した．これらの変異は，フォローアップ研究の 910 サンプルでは検出されなかった．
本研究により，2 つの稀な短縮型変異（RPS24 遺伝子 Q191X 変異と CD300LF 遺伝子 P261fsX266変異）が自閉スペクトラム症の候補リスク変異であることが示唆された．
＜索引用語：自閉スペクトラム症，全エクソームシークエンス，多発罹患家系，短縮型変異＞

はじめにとから，ASD の病態解明につながる分子基盤を自閉スペクトラム症（autism spectrum disor-得るには，頻度は稀だが相対危険度の高い変異をder：ASD）は，社会的コミュニケーションの欠同定することが重要と考えられる．

陥，限定され反復的な行動や興味の様式などの特近年では高速シークエンサーの普及に伴い，ゲ徴をもつ神経発達障害である．その病態は不明でノム中の全エクソンを網羅的にシークエンスするあるが，遺伝要因と環境要因が相互に影響して発全 エ ク ソ ー ム シ ー ク エ ン ス（whole‒exome症に至る多因子疾患であり，遺伝率は 52.4％と見sequencing：WES）が実施され，ASD の発症に積もられ，その大部分は頻度の高いリスク多型に大きな影響をもつリスク変異を効率的に同定でき起因すると推定されている ．しかし，個々のリるようになった．発端者・両親トリオの WES 研

スク多型が ASD の発症に与える影響は小さいこ

究では，稀な de novo 変異が ASD の発症に重要9）

著者所属：1）新潟大学大学院医歯学総合研究科精神医学分野
精神科担当

2）新潟大学医歯学総合病院魚沼地域医療教育センター

3）新潟大学大学院医歯学総合研究科「システム脳病態学の確立とそれを用いた臨床研究推進事業」

4）新潟大学大学院医歯学総合研究科地域精神医療学寄附講座

5）大島病院

6）新潟大学医学部医学科総合医学教育センター
本論文は，PCN 誌に掲載された最新の研究論文11）を編集委員会の依頼により，著者の 1 人が日本語で書き改め，その意義と展望などにつき加筆したものである．

精 神 経 誌（2017）119 巻 1 号

4な役割を果たすことが示された13,17,18,20）．ASD の発症に大きな影響を与えるリスク変異が存在する

I12場合には，家系内に複数の罹患者が認められる可能性が高いと考えられるため，多発罹患家系を用いた WES 研究を行うことも重要である．しかし

II

123†

123†

4†

ASD 多発罹患家系の WES 研究はほとんど実施されていない22,24）．血族婚家系では，ホモ接合体および複合ヘテロ接合体変異が ASD と共分離していた24）．ASD 多発罹患 10 家系では，両親から罹患同胞に伝達されたヘテロ接合体短縮型変異の数は，伝達されなかったものよりも有意に多かったと報告されている22）．これらのことから，ASD 多発罹患家系では両親から伝達された稀な変異がASD の発症に関与することが示唆されているが，結論を得るにはさらなる研究が必要である．
そこでわれわれは，ASD 多発罹患家系の WES

III4†

5†

図 1 自閉スペクトラム症多発罹患家系■：ASD 罹患者 □○：ASD 非罹患者□○の中に●：罹患状態不明の者，†：ゲノム DNA サンプルが得られた者
発端者（Ⅲ‒3）：自閉性障害，境界知能罹患同胞（Ⅲ‒5）：特定不能の広汎性発達障害
母方いとこ（Ⅲ‒1）：特定不能の広汎性発達障害，最重度知的能力障害
母方いとこ（Ⅲ‒2）：特定不能の広汎性発達障害，重度知的能力障害，てんかん（文献 11 より引用）

研究を実施するとともに，症例・対照サンプルを用いたフォローアップ研究を行った．
フォローアップ研究の対象者は ASD 患者 243
Ⅰ．研究の方法および結果

人（男性 191 人，女性 52 人，平均年齢 18.1±8.6

1．対象および方法歳）と対照 667 人（男性 341 人，女性 326 人，平本研究は新潟大学医学部遺伝子倫理審査委員会

均年齢 38.3±10.8 歳）からなる．患者群の診断内で承認されており，全ての対象者およびその家族

訳は，自閉性障害 72 人，アスペルガー障害 107

から書面にて研究参加の同意を得た．対象者は全人，特定不能の広汎性発達障害 64 人である．て日本人である．

多発罹患家系のなかでは，発端者（Ⅲ‒3），非罹ASD 多発罹患家系（図 1）には 4 人の罹患者が患同胞（Ⅲ‒4），罹患同胞（Ⅲ‒5），非罹患両親いる．自閉性障害と境界知能をもつ発端者（Ⅲ‒（Ⅱ‒3，Ⅱ‒4）の DNA サンプルが得られた．発端3），特定不能の広汎性発達障害をもつ同胞（Ⅲ‒者（Ⅲ‒3），非罹患同胞（Ⅲ‒4），罹患同胞（Ⅲ‒5），特定不能の広汎性発達障害と最重度知的能力5），保因者と推定される母（Ⅱ‒4）について WES障害をもつ母方いとこ（Ⅲ‒1），特定不能の広汎性を実施した．SureSelect Human All Exon V5 Kit

発達障害，重度知的能力障害，てんかんをもつ母（アジレント社）を用いて全エクソン領域を濃縮方いとこ（Ⅲ‒2）である．罹患者の診断は，精神し，HiSeq2000（イルミナ社）によりシークエン疾患の診断・統計マニュアル第 4 版（Diagnosticスを行った．シークエンスリードは，Burrows‒

and Statistical Manual of Mental Disorders,Wheeler Aligner（http://biobwa.sourceforge.

Fourth Edition：DSM‒Ⅳ）に従って，児童精神科

net/）を用いて参照ヒトゲノム（UCSC19）にマッ医により患者や家族の非構造化面接などに基づいピングされた．PCR 産物の重複は Picard（http://てなされた．発端者の両親（Ⅱ‒3，Ⅱ‒4）は児童picard.sourceforge.net/）を用いて取り除かれた．

精神科医の非構造化面接により非罹患者と確認さ変異は Genome Analysis Toolkit（http://www.

れた．他の家族（Ⅰ‒1，Ⅰ‒2，Ⅱ‒1，Ⅱ‒2）は面broadinstitute.org/gatk/）を用いて検出され，接できなかったため罹患状態を不明とした．

SnpEff（http://snpeff.sourceforge.net/）により注

精神医学のフロンティア：ASD 多発罹患家系の全エクソームシークエンスおよびフォローアップ研究

5サンプル（243 対 667）を用いたフォローアップ研釈づけされた．
変異を絞り込むため，次のフィルタリング手順究を行った．RPS24 遺伝子 Q191X 変異は Taq-を適用した（表 1）．①当該塩基をカバーするシーMan 法（ ア プ ラ イ ド バ イ オ シ ス テ ム ズ 社 ），クエンスリードの数が 10 未満の変異を除外する．

CD300LF 遺伝子 P261fsX266 変異はフラグメント②発端者（Ⅲ‒3）と罹患同胞（Ⅲ‒5）が共有する．

解析を用いてタイピングされた．

③非罹患同胞（Ⅲ‒4）は保有しない．④保因者と推定される母（Ⅱ‒4）から伝達された可能性のあ

2．結果る変異を含める．⑤SnpEff を用いて高影響と予測

多発罹患家系の 4 人の WES では合計で 202,401された変異を含める．⑥Human Genetic Varia-個の変異が検出された（表 1）．フィルタリング手tion Database（http://www.genome.med.kyotou.

順を適用し，われわれは 2 つの稀な短縮型変異を

ac.jp/SnpDB/）
または Ensembl Genome Browser

同定した（表 2）．1 つは RPS24 遺伝子の一塩基変（http://asia.ensembl.org/index.html）
上の 1000 人異（chr10：g.79814469C＞T）で，本来はグルタゲノムプロジェクトの日本人データにおいて変異ミン（Q）を指定する 191 番目のコドンが終止コ

アレル頻度が 0.01 未満の変異を選ぶ．以上の手順

ドン（X）となる．もう 1 つは，CD300LF 遺伝子により絞り込まれた 2 つの短縮型変異（RPS24 遺の 14 塩基欠失（chr17：g.72691313_72691326delG

伝子 Q191X 変異と CD300LF 遺伝子 P261fsX266

TTGCAGTAGGTCG）で，本来はプロリン（P）変異）について，サンガーシークエンスにより存を指定する 261 番目のコドンからフレームシフト在を確認した．

（fs）を起こし 266 番目のコドンが終止コドン（X）

次に，多発罹患家系の WES で同定された稀な変異と ASD との関連を調べるため，症例・対照となる．これらの変異はサンガーシークエンスにより確認された．
次に，われわれは患者 243 人と対照 667 人について RPS24 遺伝子 Q191X 変異と CD300LF 遺伝

表1

子 P261fsX266 変異をタイピングしたが，910 人全全エクソームシークエンスにおける変異フィルタリング手順

員が変異アレルを保有していなかった．

フィルタリング

残った変異の数

全検出
カバーリード 10 以上
発端者と罹患同胞が共有
非罹患同胞は保有しない
母から伝達
高影響
変異アレル頻度 0.01 未満

202,401
101,832
57,6296,3424,047
222Ⅱ．考1．考察

察

本研究では，ASD 多発罹患家系の WES によって 2 つの稀な短縮型変異（RPS24 遺伝子 Q191X 変
異と CD300LF 遺伝子 P261fsX266 変異）が同定されたが，フォローアップ研究の 910 人ではこれらの変異は検出されなかった．RPS24 遺伝子 Q191X（文献 11 より引用）

表2

全エクソームシークエンスにより同定された稀な短縮型変異

染色体座位†

変異

遺伝子

タンパク質

101779814469
72691313_72691326

C＞T
delGTTGCAGTAGGTCG

RPS24CD300LF

Q191X
P261fsX266†

座位は GRCh37 に基づく．
（文献 11 より引用）

精 神 経 誌（2017）119 巻 1 号

6

変異と CD300LF 遺伝子 P261fsX266 変異は多発罹

P261fsX266 変異保有者において脳脊髄炎の既往患家系のみに同定されたことから，これらの変異は認めなかった．CLM‒1 の過剰発現は，ラットのが特定の家系では ASD の発症に重要な役割を果線条体と大脳皮質への N‒methyl‒D‒aspartate 注たす可能性が示唆された．

入による急性脳障害を軽減した19）．このことか

RPS24 遺伝子は，リボソーム新生に関与するリら，CLM‒1 は神経炎症に対して保護的作用を有ボソームタンパク 24（RPS24）をコードしていするといえる．脳内の慢性炎症が ASD の病態にる ．別のリボソームタンパク遺伝子である関与することを示唆する報告もある6）．これらのRPL10 遺伝子の稀なミスセンス変異（L206M 変異

知見から，CD300LF 遺伝子 P261fsX266 変異が慢と H213Q 変異）もまた，ASD 罹患同胞を有する性神経炎症を引き起こす結果として，ASD 発症

2 つの異なる家系で同定されている ．また，こに至るのかもしれない．

3）

14）

れらの変異はリボソームサブユニットの生成に変化をきたすことも明らかにされている14）．した

2．苦労・工夫したことがって，リボソーム新生の機能不全が ASD 発症

ASD の WES 研究に関して日本は後れをとってに関与するものと考えられる．RPS24 遺伝子はいるが，ASD 発症に大きな影響をもつ稀なリス

Diamond‒Blackfan 貧血 3（DBA3）の原因遺伝子

ク変異を同定できるよう，本研究では優れた研究であり，患者では以下の 4 つのヘテロ接合変異がデザインを組むように工夫した．多発罹患家系の報告されている． す な わ ち，Q106X 変 異WES 研究は疾患発症リスクに大きな影響をもつ（rs104894188），R16X 変異（rs104894189），エク稀な変異の同定に有用と考えられている4）．そのソン 2 のスキップを生じるイントロン 1 とエクソため，本研究では 4 人の ASD 罹患者を有する家

ン 2 境界の欠失・挿入（rs116840806），エクソン系サンプルを収集し WES を実施した．ただし，

1・2 およびエクソン 3 の一部を含む欠失である．

罹患者である母方いとこ 2 人のゲノム DNA サン

ASD 多発罹患家系において，発端者，罹患同胞，プルを得られず，彼らが RPS24 遺伝子 Q191X 変

母親は Q191X 変異のヘテロ接合体であるが，異と CD300LF 遺伝子 P261fsX266 変異を保有してDBA3 の特徴的症候（貧血，骨髄赤芽球減少症，いるか否かを確認できなかった．また，多発罹患10,15）先天奇形など）は認めなかった．このことから，家系の WES により同定された候補リスク変異と

Q191X 変異は DBA3 の原因変異ではないと考え疾患との関連を，独立サンプルを用いて確認するられる．RPS24 遺伝子の mRNA 発現レベルは，ことも重要である5）．そこで，症例・対照サンプ

胎児脳で高く成人脳では低い10）．この胎児優位なル（243 対 667）を用いたフォローアップ研究によ発現パターンは，症候性神経発達障害，知的能力り，RPS24 遺伝子 Q191X 変異と CD300LF 遺伝子

障害，ASD に関連する遺伝子群の発現パターン

P261fsX266 変異が特定の家系のみでなく一般にと一致する ．以上のことから，RPS24 遺伝子

ASD の発症リスクに大きな影響を有しているこ

Q191X 変異が，ASD の基底をなすある種の神経との確認を試みた．これらの変異は計 910 サンプ発達機能障害を引き起こしうると推測される．しルでは同定されなかったが，変異アレル頻度が極かしその機能的意義は依然解明されていない．

めて低く，フォローアップ研究のサンプルサイズ

1）

CD300LF 遺伝子は CD300 遺伝子複合体の 1 つであり，CMRF35 様分子 1（CLM‒1）をコードが十分ではないために検出できなかった可能性がある．

し，CD300f とも呼ばれる2）．CLM‒1 は骨髄細胞に発現する免疫受容体であり，Cd300lf 遺伝子

3．意

ノックアウトマウスは，重篤な自己免疫性脳脊髄本研究では ASD 発症に大きな影響を有する可炎を生じる． し か し，C D 3 0 0 L F 遺 伝 子

2 3）

義

能性のある 2 つの稀な短縮型変異（RPS24 遺伝子

精神医学のフロンティア：ASD 多発罹患家系の全エクソームシークエンスおよびフォローアップ研究

Q191X 変異と CD300LF 遺伝子 P261fsX266 変異）を見出した．
おわりに―今後の課題および方向性―
われわれは ASD 罹患者が複数いる他の家系についても WES 研究を進めている．ASD 罹患状態
一致一卵性双生児を有する 1 家系の WES 研究で

謝

辞

7

研究に参加いただいたすべての方々に謝意を表します．
文献1）Birnbaum, R., Jaffe, A. E., Hyde, T. M., et al.：Prenatal expression patterns of genes associated withneuropsychiatric disorders. Am J Psychiatry, 171；758‒
767, 2014
2）Borrego, F.：The CD300 molecules：An emerg-

は，3 つ の 稀 な 短 縮 型 変 異（PCDHA9 遺 伝 子

ing family of regulators of the immune system. Blood,L840fs 変 異，WDR90 遺 伝 子 V1125fs 変 異，121；1951‒1960, 2013

EFCAB5 遺伝子 L1210fs 変異）が同定された7）．
このうち WDR90 遺伝子 V1125fs 変異と EFCAB5
遺伝子 L1210fs 変異は症例・対照サンプル（257 対667）でタイピング可能であったが，変異アレルは検出されなかった．また，ASD 罹患同胞 3 人を有する 2 家系の WES 研究では，6 つの稀なミスセンス変異が同定され，そのうち CLN8 遺伝子 R24H3）Choesmel, V., Fribourg, S., Aguissa‒Touré, A. H.,et al.：Mutation of ribosomal protein RPS24 in Diamond‒Blackfan anemia results in a ribosome biogenesis disorder. Hum Mol Genet, 17；1253‒1263, 2008
4）Cirulli, E. T., Goldstein, D. B.：Uncovering theroles of rare variants in common disease through whole‒genome sequencing. Nat Rev Genet, 11；415‒425, 20105）Cruchaga, C., Karch, C. M., Jin, S. C., et al.：Rare

変異は 1 つの家系で罹患者である父から罹患同胞

coding variants in the phospholipase D3 gene confer risk

3 人へ伝達していた8）．さらに ASD 罹患者 256 人

for Alzheimer’s disease. Nature, 505；550‒554, 2014

で CLN8 遺伝子コード領域をリシークエンスした
ところ，5 つの稀なミスセンス変異を同定した（R24H 変異，F39L 変異，R97H 変異，T108M 変異，N152S 変異）12）．しかし，症例・対照サンプル（568 対 1,017）を用いた関連解析ではいずれの変異も ASD との有意な関連を認めなかった．サンプルサイズが十分とはいえないことから，より

6）Depino, A. M.：Peripheral and central inflammation in autism spectrum disorders. Mol Cell Neurosci,
53；69‒76, 20137）Egawa, J., Watanabe, Y., Sugimoto, A., et al.：Whole‒exome sequencing in a family with a monozygotic
twin pair concordant for autism spectrum disorder and afollow‒up study. Psychiatry Res, 229；599‒601, 20158）Egawa, J., Watanabe, Y., Wang, C., et al.：Novel

多くの施設との共同研究を行うことで，検出力のrare missense variations and risk of autism spectrum dis-向上をはかる必要がある．

order：whole‒exome sequencing in two families with

ASD の発症に大きな影響を及ぼすリスク変異を同定した後には，機能解析を行い発症機序解明に結びつけることが重要である．ヒト多能性幹細胞16）や変異ノックインマウスを用いたモデル研究21）などへと展開することで，ASD の発症機序を解明し，さらには新たな診断・治療法の開発や療育のオーダーメイド化につなげることが最終目標と考えている．
本研究は科学研究費補助金（No. 26860917）の助成を受けて行われた．
なお，本論文に関連して開示すべき利益相反はない．

affected siblings and a two‒stage follow‒up study in aJapanese population. PLoS One, 10；e0119413, 20159）Gaugler, T., Klei, L., Sanders, S. J., et al.：Most
genetic risk for autism resides with common variation.
Nat Genet, 46；881‒885, 201410）Gazda, H. T., Grabowska, A., Merida‒Long, L. B.,
et al.：Ribosomal protein S24 gene is mutated in Diamond‒Blackfan anemia. Am J Hum Genet, 79；1110‒
1118, 200611）Inoue, E., Watanabe, Y., Egawa, J., et al.：Rareheterozygous truncating variations and risk of autism
spectrum disorder：Whole‒exome sequencing of a multiplex family and follow‒up study in a Japanese population.

Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

精 神 経 誌（2017）119 巻 1 号

8
Psychiatry Clin Neurosci, 69；472‒476, 201512）Inoue, E., Watanabe, Y., Xing, J., et al.：Rese-tein network of de novo mutations. Nature, 485；246‒250,
2012

quencing and association analysis of CLN8 with autism19）Peluffo, H., Alí‒Ruiz, D., Ejarque‒Ortíz, A., etspectrum disorder in a japanese population. PLoS One,al.：Overexpression of the immunoreceptor CD300f has a10；e0144624, 2015

neuroprotective role in a model of acute brain injury.

13）Iossifov, I., Ronemus, M., Levy, D., et al.：De novo
gene disruptions in children on the autistic spectrum.
Neuron, 74；285‒299, 201214）Klauck, S. M., Felder, B., Kolb‒Kokocinski, A., etal.：Mutations in the ribosomal protein gene RPL10 suggest a novel modulating disease mechanism for autism.
Mol Psychiatry, 11；1073‒1084, 200615）Landowski, M., O’Donohue, M. F., Buros, C., etal.：Novel deletion of RPL15 identified by array‒comparative genomic hybridization in Diamond‒Blackfan anemia. Hum Genet, 132；1265‒1274, 201316）Mariani, J., Coppola, G., Zhang, P., et al.：FOXG1‒
dependent dysregulation of GABA/Glutamate neuron
differentiation in autism spectrum disorders. Cell, 162；375‒390, 201517）Neale, B. M., Kou, Y., Liu, L., et al.：Patterns andrates of exonic de novo mutations in autism spectrumdisorders. Nature, 485；242‒245, 201218）O’Roak, B. J., Vives, L., Girirajan, S., et al.：Sporadic autism exomes reveal a highly interconnected pro-Brain Pathol, 22；318‒328, 201220）Sanders, S. J., Murtha, M. T., Gupta, A. R., et al.：De novo mutations revealed by whole‒exome sequencing
are strongly associated with autism. Nature, 485；237‒
241, 201221）Tabuchi, K., Blundell, J., Etherton, M. R., et al.：Aneuroligin‒3 mutation implicated in autism increases
inhibitory synaptic transmission in mice. Science, 318；
71‒76, 200722）Toma, C., Torrico, B., Hervás, A., et al.：Exomesequencing in multiplex autism families suggests a majorrole for heterozygous truncating mutations. Mol Psychiatry, 19；784‒790, 201423）Xi, H., Katschke, K. J. Jr., Helmy, K. Y., et al.：Negative regulation of autoimmune demyelination by theinhibitory receptor CLM‒1. J Exp Med, 207；7‒16, 201024）Yu, T. W., Chahrour, M. H., Coulter, M. E., et al.：Using whole‒exome sequencing to identify inherited
causes of autism. Neuron, 77；259‒273, 2013