上原記念生命科学財団研究報告集, 37 (2023)

51. 白血病の根治を目指した新規放射免疫療法の開発
池添 隆之
福島県立医科大学 医学部 血液内科学講座
Key words：急性骨髄性白血病，白血病幹細胞，CD82，アスタチン-211，放射免疫療法

緒 言
急性骨髄性白血病（Acute myeloid leukemia：AML）の長期生存率は未だ 5 割に届かない。その主な原因は抗がん剤治療後も骨髄中の骨芽細胞や血管内皮細胞などから構成される微小環境（ニッチ）に留まる白血病幹細胞（Leukemia
stem cell：LSC）が治療抵抗性を獲得し、再発に関与しているためと考えられている。
我々は、抗がん剤治療後も骨髄に残存する LSC（CD34＋/CD38－の白血病細胞集団）が正常造血幹細胞と比較して、CD82 抗原を高発現していることを突き止め［1］、CD82 は STAT5 の活性化を介して抗アポトーシス蛋白 Bcl2L12 の発現を誘導し、LSC の治療抵抗性の獲得や生存維持並びにニッチへの接着に中心的な役割を果たしていることを明らかにした［2］。
治療抵抗性又は再発性の AML に対する有効な治療薬として、CD33 抗原を標的とする抗体薬物複合体治療薬
Gemtuzumab ozogamicin（GO）が 2001 年に FDA により承認されたが、期待されていた全生存率の改善が得られなかったため、2011 年には承認が取り消された。その後 GO は、AML を対象とするダウノルビシン及びシタラビンとの併用剤や CD33 陽性の AML を対象とする単剤治療薬として、2017 年に再度承認された［3］が、その効果は限定的で根治を達成するものではない。したがって、既存の治療のみでは治療抵抗性・再発 AML の治癒が困難なため、根治に向けた革新的な治療薬の開発が必要である。
本研究では、骨髄中のニッチに存在する白血病細胞をα線放出核種により選択的に傷害すれば、休眠中の白血病幹細胞を死滅することが可能となり、治療抵抗性又は再発性の急性白血病に対する新たな治療方法となり得るという着想を得た。α線はベータ線と比べて組織内飛程が非常に短く、単位長さ当りの組織に与えるエネルギー（LET）が極めて大きいことが知られている。α線は、この性質に基づき DNA の 2 本鎖を同時に切断することが可能であり、細胞周期等の細胞の状態に依存せず不逆的な殺細胞効果を有する。その一方、組織内飛程が非常に短いため、周囲の正常細胞に対する障害を低く抑えられる利点も備えている。α線放出核種の中でも、アスタチン-211（２１１At）は中型サイクロトロンで製造でき、理想的な半減期（7.2 時間）を有するため、副作用の制御の面からも有効な治療が期待されている［4］。
そこで本研究では、CD82 抗原を標的とした抗体をα線放出核種２１１At で標識した抗体薬を作製し、白血病幹細胞の根絶を目指した新規放射免疫療法を開発することを目的とした。

方法、結果および考察
1．AML 細胞・AML 細胞皮下移植担癌組織・AML 細胞骨髄担癌組織における CD82 発現
AML 細胞（U937 細胞株、ATCC CRL-1593.2）、AML 細胞皮下移植担癌モデルマウスの腫瘍組織および AML 細胞
移植ヒト化骨髄担癌モデルマウスの腫瘍組織における CD82 発現レベルについて、Anti-human CD82 マウスモノクローナル抗体（Anti-CD82 抗体[TS82b]-BSA and Azide free (ab59509)、Anti-human mouse mAb、Abcam）を用いた免疫染色にて確認した。その結果、AML 細胞（U937 細胞株）
、AML 細胞皮下移植担癌モデルマウスの腫瘍組織および AML 細胞移植ヒト化骨髄担癌モデルマウスの腫瘍組織において、CD82 の高発現が認められた。

1

2．AML 細胞へのヨウ素-125（１２５I）標識抗 CD82 抗体（１２５I-CD82）の特異的結合
アブカムの Anti-human mouse mAb が AML 細胞に発現している CD82 に特異的結合することを確認するため、

in vitro 実験を行った。96 穴プレートに AML 培養細胞 U937 1×10６個を加えた。その後、ヨウ素-125（１２５I）標識抗、又は１２５I-CD82 に 20 倍量の非標識 CD82 を混ぜたものを、96 穴プレートに加え、37℃下CD82 抗体（１２５I-CD82）
で 30 分、1 時間、3 時間インキュベートし、その後遠心し、上澄みを吸い取り、PBS（－）で 2 回洗浄した後、PBS（－）で U937 細胞を回収して、γカウンターでその放射能を測定した。その後、各穴の U937 細胞に結合したI-CD82 の放射能が添加した放射能の割合（％ID/10６ cells）を計算した。その結果、U937 細胞への１２５I-CD82 の１２５取り込みは、時間とともに増加した。また U937 細胞への１２５-CD82 の取り込みは、非標識 CD82 によって、各時間点I-CD82 の取り込みの 82％まで著明に抑制された。これらの結果より、１２５I-CD82 は U937 細胞に発現してい１２５でる CD82 に特異的に結合したことが示唆された（図 1）。

図 1．AML 細胞への１２５I-CD82 の特異的結合
青色：１２５I-CD82 集積、赤色：１２５I-CD82 集積＋非標識 CD82 抗体 20 倍添加。

3．AML 細胞皮下移植担癌モデルマウスの腫瘍組織への１２５I-CD82/２１１At-CD82 の集積比較
AML 細胞皮下移植担癌モデルマウスの腫瘍組織へ１２５I-CD82 と２１１At-CD82 の移行性を検証するため、AML 細胞皮下移植担癌モデルマウスにおける１２５I-CD82 と２１１At-CD82 の集積を比較した。雄性の BALB/c ヌードマウスの右上背側の皮下に U937 細胞 5×10６を移植し、移植後 14 日目に U937 細胞皮下移植担癌モデルマウスの尾静脈よりI-CD82 又は２１１At-CD82 を投与した。１２５I-CD82 又は２１１At-CD82 を投与後、1 分、1 時間、6 時間、12 時間お１２５よび 24 時間に、心臓より全採血し、マウスを安楽死させた。その後、各臓器・組織および腫瘍組織を摘出し、γカウンターを用いて、その放射能を測定した。その後、各臓器・組織および腫瘍組織への単位重量当たりの１２５I-CD82 又はAt-CD82 の放射能が投与放射能の割合（％ID/g）を計算し、各時間点における腫瘍組織への１２５I-CD82 と２１１At-CD82 の集積を比較した。その結果、U937 細胞皮下移植担癌モデルマウスにおける２１１At-CD82 の体内動態は２１１-CD82 の場合と類似した。U937 細胞皮下移植担癌モデルの腫瘍組織への１２５I-CD82 と２１１At-CD82 の集積は、１２５

両者とも時間とともに増加した（図 2）。

2図 2．U937 細胞皮下移植担癌モデルの腫瘍組織への１２５-CD82 と２１１At-CD82 の集積比較
青色：１２５I-CD82 集積、緑色：２１１At-CD82 集積。

4．AML 細胞皮下移植担癌モデルマウスにおける２１１At-CD82 の腫瘍生長抑制効果
AML 細胞皮下移植担癌モデルマウスにおける２１１At-CD82 の腫瘍生長抑制効果を検証するため、U937 細胞5×10６を BALB/c ヌードマウスの右上背側の皮下に移植し、AML 細胞皮下移植担癌モデルを作製した。U937 細胞移
植後 5 日目に担癌マウスを治療群（n＝3）と対照群（n＝3）に群分けし、腫瘍サイズと体重の測定を行った。腫瘍サイ
ズは、ノギスを用いて、腫瘍の長径（mm）と短径（mm）を測り、以下の式により腫瘍体積を計算した。腫瘍体積（mm３）＝π／6×長径（mm）×短径（mm）２。治療群には、２１１At-CD82 1.11 MBq/0.1 ml を、対照群には、CD82溶液（２１１At-CD82 の同量抗体溶媒）を尾静脈より投与した。投与日を day 0 とした。その後 2 日ごとに腫瘍サイズの測定を行い、腫瘍体積を計算し、治療群と対照群の比較を行った。Day16 に対照群の腫瘍が大きくなり、皮膚が破れた
ため、マウスの心臓より全採血し、マウスを安楽死させた。その結果、対照群の腫瘍体積は時間とともに増大したのに対し、２１１At-CD82 の治療群の腫瘍体積は顕著に抑制された。これらの結果より、AML 細胞皮下移植担癌モデルマウ。
スにおいて、２１１At-CD82 の治療により有効かつ顕著な腫瘍生長抑制効果が認められた（図 3）

図 3．U937 細胞皮下移植担癌モデルマウスにおける２１１At-CD82 の抗腫瘍効果
上：抗 CD82 抗体投与群（対照群）、下：２１１At-CD82 抗体投与の腫瘍生長曲線。

5．AML 細胞移植ヒト化骨髄担癌モデルマウスの作製
本研究の最終的な目的は、ヒト化 AML 骨髄担癌モデルマウスにおける２１１At-CD82 治療によるマウスの寿命延長効果を検証することである。U937 細胞を完全免疫不全マウス（NRG マウス）に投与することによりヒト化 AML 骨髄3

担癌モデルを作製し、2 日目より経時的に大腿骨の HE 染色と抗 CD82 抗体を用いた免疫染色を行い、U937 細胞の大腿骨への接着・浸潤による大腿骨骨髄の病変を評価した。その結果、U937 細胞移植後、4 日目までには大腿骨骨髄の病変が認められなかった。U937 細胞移植後、8 日目以降は時間とともに大腿骨骨髄の病変が広範囲に広がっていることが認められた。U937 細胞移植後、12 日目には、大腿骨骨髄のほぼ全領域が病変で占められることが確認できた。
6．AML 細胞移植ヒト化骨髄担癌モデルマウスの骨髄組織への２１１At-CD82 の集積
AML 細胞移植ヒト化骨髄担癌モデルマウスの骨髄組織への２１１At-CD82 の移行性を検証するため、U937 細胞移植
後 8 日目、又は 12 日目にマウスの尾静脈より２１１At-CD82 を投与した。２１１At-CD82 の投与後、6 時間と 24 時間に心臓より採血し、マウスを安楽死させた。その後、大腿骨を摘出し、γカウンターを用いて、その放射能を測定した。
その後大腿骨への単位重量当たりの２１１At-CD82 の放射能の投与放射能に対する割合（％ID/g）を計算し、各時間点における大腿骨への２１１At-CD82 の集積を計算した。骨髄への％ID/g を計算するため、大腿骨への％ID/g については、骨髄重量で補正した。その結果、U937 細胞移植後 12 日目への 6 時間と 24 時間における骨髄への２１１At-CD82 の集積は重量 39.6％ID/g と 35.9％ID/g であった。一方、U937 細胞移植後 8 日目への 6 時間と 24 時間における骨髄へのAt-CD82 の集積は各々各々9.7％ID/g と 13.4％ID/g であった。

２１１7．AML 細胞移植骨髄担癌モデルマウスにおける２１１At-CD82 治療による寿命延長効果
AML 細胞移植ヒト化骨髄担癌モデルマウスの骨髄組織への２１１At-CD82 の集積の結果に基づいて、２１１At-CD82 治療による寿命延長効果には U937 細胞移植後 12 日目の担癌モデルマウスを選択した。U937 細胞移植後、12 日目にヒト化 AML 骨髄担癌マウスを治療群（n＝6）と対照群（n＝3）に群分けした。また治療群は、さらに 0.37 MBq 投与群と 1.11 MBq 投与群に分けた。治療群には、２１１At-CD82 0.37 MBq/0.1 ml 又は 1.11 MBq/0.1 ml を、対照群には、CD82 溶液（２１１At-CD82 の同量抗体溶媒）を尾静脈より投与した。投与後、ヒト化 AML 骨髄担癌モデルマウスが死亡するまで一般状態観察と体重測定を行った。その後、Kaplan-Meier 法を用いて、生存率曲線を作製し、統計解析を行った。その結果、U937 移植後 12 日目に治療を開始したところ、対照群は U937 移植後 16 日間まで全部死亡した。
治療群では、投与量依存的にヒト化 AML 骨髄担癌モデルマウスの生存が有意に延長された（p＜0.001）。U937 移植後12 日目に治療を開始した治療群の大腿骨の骨髄はほぼ腫瘍細胞で占めされたため、1.11 MBq の２１１At-CD82 治療により生存期間は対照群より 7 日間の延長しか見られなかった。8 日目に治療を開始した治療群の大腿骨の骨髄では、U937移植後、骨髄の一部の局所が腫瘍細胞で占めされている早期治療により担癌マウスの生存期間がもっと長くなることが期待される（図 4）。

図 4．U937 移植後 12 日目に２１１At-CD82 治療を開始した生存曲線
左：HE 染色（上）、HE 拡大図（下）。
右：生存曲線、濃青色：対照群、緑色：0.37 MBq 群、明青色：1.11 MBq 群。

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8．新規抗 hCD82 ラットモノクローナル抗体作製
DNA 免疫法により福島県立医科大学のオリジナル抗 hCD82 ラットモノクローナル抗体（FMU-3H10H4）を作製し、FMU-3H10H4 を用いた免疫染色法より急性骨髄性白血病細胞株において、CD82 タンパク質を検出する能力について、対照抗体（抗 hCD82 マウスモノクローナル抗体、ab59509、Abcam）と比較検討した。その結果、FMU-3H10H4の CD82 タンパク質を検出する能力は対照抗体より強かった。
9．新規抗 hCD82 ヒトキメラモノクローナル抗体作製
DNA 免疫法により福島県立医科大学のオリジナル抗 hCD82 ヒトキメラモノクローナル抗体を作製し、抗 hCD82 ヒトキメラモノクローナル抗体を用いた免疫染色法より急性骨髄性白血病細胞株において、CD82 タンパク質を検出する能力について、対照抗体（抗 hCD82 マウスモノクローナル抗体、ab59509、：Abcam）およびと FMU-3H10H4 モノクローナル抗体と比較検討した。その結果、抗 hCD82 ヒトキメラモノクローナル抗体の CD82 タンパク質を検出する
能力は対照抗体並びに FMU-3H10H4 より強かった（知財関係でデータを省略する）［5］。

共同研究者・謝辞
本研究の共同研究者は、福島県立医科大学ふくしま国際医療科学センター先端臨床研究センターの趙松吉と織内昇並びに東京大学アイソトープ総合センターの杉山暁である。

文 献
1） Nishioka C, Ikezoe T, Yang J, et al. CD82 regulates STAT5/IL-10 and supports survival of acute myelogenous
leukemia cells. Int J Cancer. 2013 Jan 1; 134(1):55-64. PMID: 23797738. DOI: 10.1002/ijc.28348
2） Nishioka C, Ikezoe T, Takeuchi A, et al. The novel function of CD82 and its impact on BCL2L12 via AKT/STAT5
signal pathway in acute myelogenous leukemia cells. Leukemia. 2015 Dec;29(12):2296-306. PMID: 26260387.
DOI: 10.1038/leu.2015.219
3） Jen EY, Ko CW, Lee JE, et al. FDA Approval: Gemtuzumab Ozogamicin for the Treatment of Adults with
Newly Diagnosed CD33-Positive Acute Myeloid Leukemia. Clin Cancer Res. 2018 Jul 15;24(14):3242-3246.
PMID: 29476018. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-17-3179
4） Zalutsky MR, Vaidyanathan G. Astatine-211-labeled radiotherapeutics: an emerging approach to targetedalpha-particle

radiotherapy.

CurrPharmDes.

2000

Sep;6(14):1433-55.

PMID: 10903402.

DOI: 10.2174/1381612003399275
5） 発明者：池添隆之、趙松吉、織内昇、鈴木美穂、西嶋剣一、髙橋和弘、鷲山幸信、右近直之、下山彩希（福島県立医科大学）、立花太郎、波田千彰、王彩霞（株式会社細胞工学研究所）。発明名称：α線放出核種で標識された抗CD82 抗体。出願日：2022 年 7 月 4 日。出願番号：特願 2022-108025。

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