上原記念生命科学財団研究報告集, 33 (2019)

上原記念生命科学財団研究報告集, 33（2019）164. 急性肝障害における DNAM-1 の役割
鍋倉 宰＊

筑波大学 生命領域学際研究センター 免疫学研究室

Key words：免疫学，急性肝障害，ILC1，DNAM-1，IFN-γ緒 言
急性肝障害は、急激かつ高度の肝細胞機能障害に基づいて肝不全症状をきたし、多臓器不全に繋がる事も多い致死率の高い疾患である［1］。先進国では非肝炎ウイルス性の化学物質や薬物を原因とする急性肝障害が殆どである。これら
非ウイルス性急性肝障害の発症と増悪に関し、肝細胞死・炎症・免疫応答が関与している事は広く知られている［2］。
しかし急性肝障害発症や増悪の分子機序、特に免疫細胞受容体の関与については未だ完全には解明されていない。
近年、新しい免疫細胞サブセットとして自然リンパ球（ILC）が同定された。ILC は抗原受容体を発現せず、活性化後に特定のサイトカインの産生で特徴付けられる免疫細胞である［3，4］。ILC のうちグループ 1 ILC（ILC1）は肝臓にのみ多く存在し、高いインターフェロンγ（IFN-γ）産生能を持つナチュラルキラー（NK）細胞様の免疫細胞である ［3，4］。しかしながら肝臓 ILC1 の活性化機序のみならず、肝臓の恒常性維持並びに肝障害や肝再生における肝臓ILC1 の生理的・病理的な役割は未だ全く明らかになっていない。
DNAM-1 は NK 細胞の細胞傷害に関与し、CD8 陽性 T 細胞の IFN-γ産生の共刺激分子として作用する活性化受容体である［5，6］。著者らは肝臓 ILC1 が DNAM-1 を非常に強く発現する事を見出した。次に野生型（WT）及び DNAM-1 欠損（Cd226-－/－）マウスに対して四塩化炭素（CCl4）を投与して急性肝障害を誘導した結果、Cd226-－/－マウスに於いて肝障害が増悪した。この肝障害の差は T 細胞・B 細胞・NKT 細胞が存在しない Rag-1 欠損（Rag1－/－）マウスとRag-1・DNAM-1 両欠損（Rag1－/－Cd226-－/－）マウスの間でも観察された。また、ILC1 と NK 細胞を除去出来る抗NK1.1 抗体（PK136）投与にて CCl4 誘導肝障害が増悪した。更に in vitro で肝臓 ILC1 の DNAM-1 を架橋刺激した
結果、肺と腎臓で組織障害を抑制する事が報告されている IFN-γの産生が亢進した。故に、肝臓 ILC1 が発現する
DNAM-1 が IFN-γ産生を促進し、肝障害を抑制している事が強く示唆された。
上記の結果から、CCl4 誘導急性肝障害モデルに於いて、肝臓 ILC1 が発現する DNAM-1 が IFN-γを促進し、急性肝障害を抑制している事が強く示唆された。従って、当該研究課題では急性肝障害における肝臓 ILC1 が発現するDNAM-1 の役割を解明する事を目的とした。この結果を受けて以下の 3 点を明らかにする。
（1） ILC1 が急性肝障害の抑制に寄与する免疫細胞である（2） DNAM-1 が ILC1 の活性化や IFN-γ産生等の機能に必須である（3） IFN-γが急性肝障害の抑制に重要な役割を果たしている

方 法
1． WT マウスと Cd226-－/－マウスに於ける CCl4 誘導急性肝障害の重症度の比較

WT 及び Cd226-－/－マウスに対して CCl4 を投与し、血漿 ALT 値にて急性肝障害の重症度を比較し、Cd226-－/－マウスに於いて CCl4 誘導急性肝障害が増悪する事を確認した。更に、適応免疫細胞であるαβT 細胞・γδT 細胞・NKT細胞が発現する DNAM-1 が急性肝障害の増悪に必要なのか、自然免疫細胞である NK 細胞・ILC1 が発現する DNAM1 が急性肝障害の増悪に必要なのかを決定する為、Rag1－/－マウスと Rag1－/－Cd226-－/－マウスに於ける CCl4 誘導急性肝障害を比較した。
*現在の所属：筑波大学 生存ダイナミクス研究センター 免疫学研究室
現在の所属：筑波大学 生存ダイナミクス研究センター 免疫学研究室

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2．NK 細胞且つ又は ILC1 の除去による CCl4 誘導急性肝障害の重症度の比較
ILC1 は残存するが、NK 細胞を優先的に除去する抗 asialo GM1 抗体の量と投与経路を検討した。その後、抗 asialo
GM1 抗体の投与により NK 細胞を選択的に除去されたマウスと、ILC1 と NK 細胞の両方を除去する抗 NK1.1 抗体（PK136）の投与されたマウスに対し CCl4 を投与して急性肝障害を誘導した。両群の血漿 ALT 値を比較し、ILC1 が肝障害抑制に寄与する細胞である可能性を検討した。
3．CCl4 投与後の WT 及び Cd226-－/－マウスの肝臓 ILC1 の評価
WT 及び Cd226－/－マウスに CCl4 を投与し、肝臓 ILC1 の存在率・細胞数・詳細な表現型（活性化マーカー・細胞傷害分子・サイトカイン受容体等）・IFN-γ産生をフローサイトメトリーで評価した。
4．肝臓 ILC1 に対する DNAM-1 刺激
WT マウスから肝臓 ILC1 を単離し、in vitro に於いて肝臓 ILC1 の DNAM-1 を抗 DNAM-1 抗体で架橋刺激し、IFN-γの産生を評価した。
5．IFN-γ中和による CCl4 誘導急性肝障害の重症度の評価
WT マウスに対し IFN-γ中和抗体を投与後に CCl4 を投与し、急性肝障害の重症度を評価した。

結 果
1．WT マウスと Cd226-－/－マウスに於ける CCl4 誘導急性肝障害の重症度の比較
WT 及び Cd226－/－マウスに対して CCl4 を投与した結果、WT マウスと比較して Cd226－/－マウスは高い血漿 ALT 値。更に、Rag1－/－マウスと Rag1－/－Cd226－/－マウスに於を示し、CCl4 誘導急性肝障害が増悪した事が示された（図 1A）

ける CCl4 誘導急性肝障害を比較した所、Rag1－/－と比較して Rag1－/－Cd226－/－マウスは高い血漿 ALT 値を示し、急性肝障害が増悪した事が示された（図 1B）。従って、DNAM-1 は CCl4 誘導急性肝障害の軽快に寄与する事が明らかとなった。

図 1．自然免疫細胞の DNAM-1 は CCl4 誘導急性肝障害の軽快に寄与するマウスへ CCl4 を投与後、1 日後に肝障害を血漿 ALT 値にて評価した。
（A）

WT 及び Cd226－/－マウスに於ける ALT 値。*p < 0.005 vs. WT、CCl4（t 検定）（B）

Rag1－/－及び Rag1－/－Cd226-－/－マウスに於ける ALT 値。*p < 0.005 vs. Rag1－/－、CCl4（t 検定）

2．NK 細胞且つ又は ILC1 の除去による CCl4 誘導急性肝障害の重症度の比較
抗 asialo GM1 抗体の投与により NK 細胞を選択的に除去された WT マウスと、ILC1 と NK 細胞の両方を除去する
抗 NK1.1 抗体（PK136）を投与された WT マウスに対し CCl4 を投与した。その結果、抗 asialo GM1 抗体投与にて急性肝障害は軽快・増悪ともに確認されなかった一方で、PK136 投与では急性肝障害が増悪した（図 2）。従って、肝臓ILC1 が肝障害抑制に寄与する細胞である事が強く示唆された。

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図 2．ILC1 は CCl4 誘導急性肝障害の軽快に寄与する
WT マウスに抗asialo GM1 抗体或いはPK136 を投与した。
その後CCl4 を投与し、1 日後に急性肝障害を血漿 ALT 値にて評価した。
*p < 0.005 vs. 抗体投与無し・抗 asialo GM1 抗体（t 検定）

3．CCl4 投与後の WT 及び Cd226-－/－マウスの肝臓 ILC1 の評価

WT 及び Cd226－/－マウスに CCl4 を投与し、1 日後の肝臓 ILC1 の表現型をフローサイトメトリーにて評価した。両群の間で肝臓 ILC1 の存在率や細胞数には変化がなかった。未処置 WT マウスの肝臓 ILC1 と比較し、CCl4 を投与された WT マウスの肝臓 ILC1 は活性化マーカーCD69 の発現を上昇させている事が確認された（図 3A）。しかしなが。更に、未ら、Cd226-－/－マウスでは CCl4 を投与後に肝臓 ILC1 に於ける CD69 の発現上昇が障害されていた（図 3A）
処置及び CCl4 を投与された WT 及び Cd226-－/－マウスから肝臓 ILC1 を単離し、in vitro で培養して IFN-γ産生を評価した。未処置 WT マウスの肝臓 ILC1 と比較し、CCl4 を投与された WT マウスの肝臓 ILC1 は IFN-γを産生した。従（図 3B）。一方、CCl4 を投与された Cd226-－/－マウスの肝臓 ILC1 は著しく低い IFN-γ産生能を示した（図 3B）って、DNAM-1 は CCl4 誘導急性肝障害に於ける肝臓 ILC1 の活性化及び IFN-γ産生に必須の役割を果たしている事が明らかになった。

図 3．DNAM-1 は CCl4 誘導急性肝障害に於ける肝臓 ILC1 の活性化と IFN-γ産生に必要である WT 及びCd226－/－マウスに CCl4 を投与し、1 日後に肝臓 ILC1 をフローサイトメトリーにて評価した。
（A）肝臓 ILC1 に於ける活性化マーカーCD69 の発現。*p < 0.05 vs. WT、CCl4（t 検定）（B）IFN-γ陽性肝臓 ILC1 の割合。*p < 0.005 vs. WT、CCl4（t 検定）

4．肝臓 ILC1 に対する DNAM-1 刺激
WT マウスから肝臓 ILC1 を単離し、インターロイキン 2 にて 1 日間培養した。単離直後の未処置肝臓 ILC1 とこれら活性化肝臓 ILC1 とを in vitro に於いて肝臓 ILC1 を抗 DNAM-1 抗体或いはアイソタイプ抗体で架橋刺激し、フローサイトメトリーにて IFN-γの産生を評価した。その結果、アイソタイプ抗体刺激と比較し、DNAM-1 を架橋刺激された肝臓 ILC1 は IFN-γ産生を亢進する事が示された（図 4）。従って、DNAM-1 は肝臓 ILC1 の IFN-γ産生を亢進する機能を持つ事が明らかになった。
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図 4．DNAM-1 は肝臓 ILC1 の IFN-γ産生を亢進する
未処置肝臓 ILC1 と活性化肝臓 ILC1 を in vitro に於いてアイソタイプ抗体或いは抗 DNAM-1 抗体で架橋刺激し、フローサイトメトリーにて IFN-γの産生を評価した。*p < 0.05、**p < 0.005（t 検定）

5．IFN-γ中和による CCl4 誘導急性肝障害の重症度の評価
WT マウスに対し IFN-γ中和抗体或いはアイソタイプ抗体を投与後に CCl4 を投与し、急性肝障害の重症度を評価した。その結果、アイソタイプ抗体投与後に CCl4 を投与されたマウスと比較し、IFN-γ中和抗体投与後に CCl4 を投与されたマウスでは急性肝障害が増悪した（図 5）。従って、CCl4 誘導急性肝障害に於いて IFN-γが急性肝障害の軽快に寄与する事が明らかになった。

図 5．IFN-γは CCl4 誘導急性肝障害の軽快に寄与する
WT マウスにアイソタイプ抗体或いは抗 IFN-γ中和抗体を投与した。その後 CCl4 を投与し、1 日後に急性肝障害を血漿 ALT 値にて評価した。*p < 0.005 vs. アイソタイプ抗体（t 検定）

考 察
ILC1 は肝臓にのみ多く存在し、in vitro に於いて高い IFN-γ産生能を持つ事が知られている。しかしながら、肝臓ILC1 の肝恒常性維持或いは肝障害や肝再生に於ける生理的・病理的な役割はこれまでに明らかになっていなかった。
本研究の結果から以下の 3 点が明らかになった。
（1） CCl4 誘導急性肝障害に於いて肝臓 ILC1 は急性肝障害の抑制に寄与する免疫細胞である（2） DNAM-1 は肝臓 ILC1 の活性化及び IFN-γ産生に決定的な役割を果たす活性化受容体である（3） IFN-γは CCl4 誘導急性肝障害の抑制に寄与する
従って CCl4 誘導急性肝障害モデルに於いて、肝臓 ILC1 が発現する DNAM-1 は肝臓 ILC1 の活性化及び IFN-γ産生を促進し、急性肝障害を抑制している事が強く示唆された（図 6）。
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図 6．DNAM-1 は肝臓 ILC の活性化と IFN-γ産生の亢進し、CCl4 誘導急性肝障害の軽快に寄与する
今後、CCl4 投与後に肝臓 ILC1 の活性化に伴って発現が上昇する分子群を特定する。これら分子に対する除去抗体が利用可能な場合、これら除去抗体を用いて肝臓 ILC1 を選択的に除去し、その後 CCl4 誘導急性肝障害を誘導し、肝臓ILC1 が急性肝障害の抑制に寄与する免疫細胞である事を証明する。更に、全てのリンパ球が存在しない Rag-2・IL-2Rγ両欠損マウスへ WT マウス由来肝臓 ILC1 を移入し、その CCl4 誘導急性肝障害を誘導し、肝臓 ILC1 が急性肝障害の抑制に寄与する免疫細胞である事を証明する。加えて、CCl4 誘導急性肝障害に於ける肝臓 ILC1 の活性化に必要な可溶性因子（炎症性サイトカインや損傷関連分子パターン分子）及びこれらの産生細胞を特定する。
これまでの ILC の研究では、ILC の活性化やサイトカイン産生の制御機構として炎症性サイトカインや損傷関連分子パターンに注目する研究が殆どであった。しかし本研究では、ILC が発現する活性化受容体の機能の一端を解明した。
肝臓 ILC1 は NK 細胞との機能的な類似点を多く持つ。従って、ウイルス感染・がん・代謝疾患を含めた種々の病態モデルに於いて、肝臓 ILC1 が発現する免疫受容体による更なる ILC1 活性化制御機構の解明が必要である。
本研究では急性肝障害のモデルとして確立され広く実験的に用いられている CCl4 誘導急性肝障害を用いた。本研究で得られた研究成果が急性肝障害全般に一般化出来るか否か、他の薬物性急性肝障害モデル（アセトアミノフェン中毒モデルなど）を用いて検討する必要がある。更に、ウイルス性慢性肝炎モデルマウス（C 型肝炎モデルマウス［7］）等を用い、本研究成果の発展性を評価する。

共同研究者・謝辞
筑波大学生存ダイナミクス研究センター免疫学研究室の各位には研究遂行に当たり日頃より有益な御助言と御討論を頂いた。ここに感謝の意を表する。

文 献1)

Bernal W, Auzinger G, Dhawan A, Wendon J. Acute liver failure. Lancet. 2010 Jul 17;376(9736):190-201.
PMID: 20638564 DOI: 10.1016/S0140-6736(10)60274-7

2)

Bernal W, Wendon J. Acute liver failure. N Engl J Med. 2013 Dec 26;369(26):2525-34. PMID: 24369077 DOI:
10.1056/NEJMra1208937

3)

Sojka DK, Plougastel-Douglas B, Yang L, Pak-Wittel MA, Artyomov MN, Ivanova Y, Zhong C, Chase JM,Rothman PB, Yu J, Riley JK, Zhu J, Tian Z, Yokoyama WM. Tissue-resident natural killer (NK) cells are celllineages distinct from thymic and conventional splenic NK cells. Elife. 2014 Jan 1;3:e01659. PMID: 24714492
DOI: 10.7554/eLife.01659

5上原記念生命科学財団研究報告集, 33（2019）

4)

Spits H, Bernink JH, Lanier L. NK cells and type 1 innate lymphoid cells: partners in host defense. NatImmunol. 2016 Jun 21;17(7):758-64. PMID: 27328005 DOI: 10.1038/ni.3482

5)Shibuya A1, Campbell D, Hannum C, Yssel H, Franz-Bacon K, McClanahan T, Kitamura T, Nicholl J,Sutherland GR, Lanier LL, Phillips JH. DNAM-1, a novel adhesion molecule involved in the cytolytic functionof T lymphocytes. Immunity. 1996 Jun;4(6):573-81. PMID: 8673704

6)

Nabekura T, Shibuya K, Takenaka E, Kai H, Shibata K, Yamashita Y, Harada K, Tahara-Hanaoka S, Honda
S, Shibuya A. Critical role of DNAX accessory molecule-1 (DNAM-1) in the development of acute graft-versushost disease in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Oct 26;107(43):18593-8. PMID: 20937876 DOI:
10.1073/pnas.1005582107

7)

Sekiguchi S, Kimura K, Chiyo T, Ohtsuki T, Tobita Y, Tokunaga Y, Yasui F, Tsukiyama-Kohara K, Wakita T,Tanaka T, Miyasaka M, Mizuno K, Hayashi Y, Hishima T, Matsushima K, Kohara M. Immunization with arecombinant vaccinia virus that encodes nonstructural proteins of the hepatitis C virus suppresses viral protein
levels in mouse liver. PLoS One. 2012;7(12):e51656. Epub 2012 Dec 17. PMID: 23284733 DOI:
10.1371/journal.pone.0051656

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