上原記念生命科学財団研究報告集, 35 (2021)

上原記念生命科学財団研究報告集, 35（2021）

23. 腸内細菌に対する免疫応答に重要な M 細胞の総合的理解
大野 博司
理化学研究所 生命医科学研究センター 粘膜システム研究チーム
Key words：M 細胞，パイエル板，Rab32，リソソーム関連オルガネラ，オルガノイド

緒 言
腸内には非常に多くの腸内共生細菌が常在している。一方で、食物の摂取に伴い腸管には病原性細菌やウイルスなど身体にとって有害な病原体が侵入してくる可能性もある。このように腸管粘膜は多くの抗原に曝されていることから腸管にはこれらの抗原を監視し、適切な免疫応答を発動させて腸管から排除しなければならない。そのため腸管にはパイエル板をはじめとする腸管関連リンパ組織が発達し、腸管における免疫応答の誘導において中心的な役割を担っている。
パイエル板の粘膜面を覆う濾胞随伴上皮細胞層（follicle-associated epithelium：FAE）には抗原の取り込みと輸送に特化した上皮細胞である M 細胞が分布している。M 細胞は腸管内の抗原を捕捉して取り込み、トランスサイトーシスと呼ばれる細胞内輸送系によって抗原をパイエル板の樹状細胞に受け渡す。この結果抗原に対する免疫応答が誘導されることから、M 細胞は腸管免疫応答の開始点であるといえる。
これまでに筆者は M 細胞に GP2 をはじめとする分子が発現することを見出し、これらが特定の細菌の取り込み受容体として機能することを明らかにした［1］。他にも様々な分子が M 細胞に発現することが見出されているが、その殆どが M 細胞の機能と結びつけられておらず、特にトランスサイトーシスに関わる分子は全く同定されていない。
そこで筆者は M 細胞のトランスサイトーシスの仕組みを明らかにするため、細胞内の小胞輸送を制御する低分子量 Gタンパク質である Rab ファミリーに着目した。M 細胞が分布する FAE と M 細胞が分布しない絨毛上皮との遺伝子発現を比較解析したデータセットにおいて、Rab ファミリー低分子量 G タンパク質をコードする遺伝子の発現量を調べたところ、Rab32 が FAE において高発現することが見出された。本研究では Rab32 の M 細胞における Rab32 の発現解析を行った。

方 法
1．M 細胞の RNA-sequence 解析
小腸遠位部に分布するパイエル板を採取し、30 mM EDTA で 15 分処理した後、26G の注射針を用いて FAE を単離した［2］。FAE から RNA 抽出後、illumina 社の TruSeq RNA library Prep Kit v2 でライブラリーを調製し、HiSeq1500（50-bp single-end）でシークエンス解析を行った。得られたシークエンスデータを STAR によってゲノムへマッピングを行い、featureCounts でカウント値を算出した。カウント値を DESeq2 パッケージで正規化した後、FAE に高発現する遺伝子を抽出した。
2．Rab32 の発現解析単離した FAE を lysis buffer に懸濁し 15 分間氷上で静置したのち遠心し、上清を回収することで細胞質タンパク質画分（cell lysate）を精製した。この cell lysate をサンプルとして抗 Rab32 抗体を用いた western blotting を行った。
また、M 細胞における Rab32 の発現様式を解析するため抗 Rab32 抗体を用いてパイエル板組織のホールマウント免疫染色およびパイエル板組織切片の免疫染色を行った。

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3．小腸オルガノイドの作製とオルガノイドにおける M 細胞分化誘導
小腸の近位部および遠位部を採取して PBS で洗浄後、粘膜面の絨毛をスライドグラスで除去する。再度 PBS で洗浄後、4℃に保った状態で 2 mM EDTA/PBS 中で 30 分間ゆっくり転倒混和する。50 mL tube へ移し、激しくシェイクすることで小腸陰窩（クリプト）を単離し、マトリジェルに埋め込み既報に従い培養してオルガノイドを作製した［3］。
作製したオルガノイドに RANKL を添加し、M 細胞を誘導した。

結 果
1． Rab32 は FAE において高発現するFAE と絨毛上皮（villous epithelium：VE）の遺伝子発現を RNA-sequence によって比較解析した。FAE サンプルにおいて既知の M 細胞マーカー遺伝子の発現が高いことが確認された（図 1）。このデータセットにおいて Rab ファミリーの遺伝子発現を解析したところ、Rab31、Rab32 および Rab42 が FAE において高発現することが明らかとなった。Rab32 は他の研究グループの報告においても M 細胞で高発現する可能性が示されている［4］。これらのことを踏まえて本研究では Rab32 に着目した。M 細胞における Rab32 のタンパク質レベルでの発現を評価するため、パイエル板から単離した FAE をサンプルとして western blotting を行ったところ、25 kDa 付近に明瞭なバンドが確認されたことから、M 細胞を含む FAE において Rab32 がタンパク質レベルで発現することが示唆された（図 2A）。

図1．FAEのRNA-sequence解析
A） パイエル板から採取した FAE と VE の遺伝子発現を解析し、Volcano plot に表した。縦軸は DESeq2 による二群間比較の p-value を表し、横軸は発現量の違いの fold change（FC）を表している。赤いプロットは p＜10－６、FC＞2 を示す。また、既知の M 細胞
マーカー遺伝子をラベルした。
B） A の Volcano plot から Rab ファミリーおよびそのパートナー遺伝子を抽出した。赤いプロットは p＜10－２、FC＞1 を示す。

2． M 細胞は Rab32 を発現する
FAE における Rab32 タンパク質の発現様式をパイエル板のホールマウント免疫染色によって観察したところ、GP2を発現する成熟 M 細胞において Rab32 が発現することが確認された（図 2B）。Rab32 の発現は GP2 を発現していない細胞においても発現することが確認されたことから、Rab32 は成熟前の M 細胞においても発現することが示唆された。M 細胞分化に必須である転写因子 Spi-B 欠損マウスの FAE においても Rab32-mRNA の発現は観察されたことから、Rab32 は Spi-B の標的遺伝子では無いことが明らかとなった（図 2C）。

2図2．FAEおよびM細胞におけるRab32の発現解析
A） パイエル板から採取した FAE と VE から cell lysate を調製し、抗 Rab32 抗体による westernblotting を行った。内部標準として beta-actin の blotting を行った。
B） パイエル板を採取し、抗 GP2 抗体（青）および抗 Rab32 抗体（緑）によるホールマウント免疫染色を行った。
（スケールバー：20μm）C） Spi-B 欠損マウス（Spib 遺伝子を腸管上皮細胞特定機に欠損するマウス: SpibΔIEC）およびコントロールマウス（Spib F／F）から FAE と VE を採取し、Rab32 の mRNA を定量した。

3．Rab32 は M 細胞のリソソーム関連オルガネラに局在するRab32 の M 細胞内における局在を調べるため、パイエル板組織切片の免疫染色を行った。Rab32 はメラノサイト、マクロファージや樹状細胞においてリソソーム関連オルガネラ（lysosome-related organelle：LROs）に局在することが報告されている［5，6］。そこで Rab32 とリソソームおよび LROs のマーカーである Lamp1 の細胞内局在を観察したところ、Rab32 は細胞の頂端側の小胞状のオルガネラに分布し、Lamp-1 が共局在することが明らかとなった（図 3A）。リソソームが発達する樹状細胞においても Rab32 のシグナルが検出されるが、M 細胞のような小胞状のオルガネラへの局在は観察されなかった。M 細胞にはリソソームが発達しないと考えられているため［7］、M 細胞において Rab32 は LROs に局在することが推測示唆された。なお小腸より作製したオルガノイドから誘導した M 細胞もRab32 を発現することが確認された（図 3B）。今後は in vivo および in vitro の試験系を組み合わせ、Rab32 の細胞内局在を詳細に明らかにする。

3図3．M細胞におけるRab32の細胞内局在A） パイエル板の組織切片を抗 Rab32 抗体（緑）および抗 Lamp-1 抗体（赤）による免疫染色を行った（スケールバー：5μm）。核の対比染色は DAPI で行った（白）。
破線は FAE を示し、矢印は M 細胞において Rab32 と Lamp-1 が共局在する部分を示す。
B） オルガノイドを 3 日間 RANKL で刺激して M 細胞を誘導し、抗 Rab32 抗体によるホールマウント免疫染色を行った（スケールバー：10μm）。核の対比染色はDAPI で行った（青）。矢印は Rab32 タンパク質が多く見られる部分を示し、*はリソソームを多く形成する樹状細胞を示す。

考 察
Rab32 はマクロファージや樹状細胞の LMO に局在し、Salmonella 属菌の感染に対する感受性の違いを規定する因子であることが報告されている［8］。マウスにとって Salmonella Typhimurium の感染は致死的であるが、ヒトにおいて腸チフスを引き起こす Salmonella Typhi の感染に対しては耐性を有する。Rab32 は細胞内に感染した S. Typhi を取り囲むように局在し、抗菌活性を有する LROs へ S. Typhi を輸送すると考えられている。一方で S. Typhimurium

は Rab32 に取り囲まれることは無く、これは S. Typhimurium が Rab32 を不活性型にするタンパク質 SopD2 および分解する GtgE を発現するからであることが報告された［6，8］。本研究では Rab32 が M 細胞において LROs を形成することを示唆された。これまで M 細胞は取り込んだ細菌抗原をそのまま樹状細胞に受け渡すと考えられてきたが、M 細胞の細胞内において病原性細菌を排除する仕組みが備わっていることが推測された。

共同研究者
本研究の共同研究者は、東北大学大学院生命科学研究科膜輸送機構解析分野の福田光則教授である。

文 献1） Hase K, Kawano K, Nochi T, Pontes GS, Fukuda S, Ebisawa M, et al. Uptake through glycoprotein 2 ofFimH(+) bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 2009;462: 226–230.
doi:10.1038/nature08529
2） Hase K, Ohshima S, Kawano K, Hashimoto N, Matsumoto K, Saito H, et al. Distinct gene expression

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profiles characterize cellular phenotypes of follicle-associated epithelium and M cells. DNA research : aninternational journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 2005;12: 127–137.
doi:10.1093/dnares/12.2.127
3） Sato T, Vries RG, Snippert HJ, Wetering M van de, Barker N, Stange DE, et al. Single Lgr5 stem cells
build crypt–villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 2009;459: 262–265.
doi:10.1038/nature07935
4） Haber AL, Biton M, Rogel N, Herbst RH, Shekhar K, Smillie C, et al. A single-cell survey of the small
intestinal epithelium. Nature. 2017;551: 333–339. doi:10.1038/nature24489
5） Marks MS, Heijnen HFG, Raposo G. Lysosome-related organelles: unusual compartments become
mainstream. Current opinion in cell biology. 2013;25: 495–505. doi:10.1016/j.ceb.2013.04.008
6） Spanò S, Galán JE. A Rab32-dependent pathway contributes to Salmonella typhi host restriction. Science(New York, NY). 2012;338: 960–963. doi:10.1126/science.1229224
7） Kraehenbuhl J-P, Neutra MR. EPITHELIAL M CELLS: Differentiation and Function. Annu Rev CellDev Biol. 2003. doi:10.1146/annurev.cellbio.16.1.301
8） Spanò S, Gao X, Galán JE, Hannemann S. A Bacterial Pathogen Targets a Host Rab-Family GTPaseDefense Pathway with a GAP. Cell Host & Microbe. 2016;19: 216–226. doi:10.1016/j.chom.2016.01.004

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