上原記念生命科学財団研究報告集, 35 (2021)

56. Ⅱ型肺胞上皮細胞の組織幹細胞としての不均一性の解明
荒屋 潤
東京慈恵会医科大学 内科学講座 呼吸器内科
Key words：Ⅱ型肺胞上皮細胞，3 次元培養，オルガノイド，慢性閉塞性肺疾患

緒 言
肺胞上皮細胞は肺胞内腔を覆っており、肺胞壁の約 95％を占める扁平な I 型肺胞上皮細胞（AT1）はガス交換を行い、約 5％を占める立方形の II 型肺胞上皮細胞（AT2）は肺胞表面活性物質のサーファクタント産生によって肺の虚脱を防いでいる。AT2 は増殖能を持ち、幹細胞としての stemness を含め不均一な表現型の細胞集団であり、加齢に伴い発症する呼吸器疾患である慢性閉塞性肺疾患（COPD）において、AT2 でのオートファジーなど蛋白恒常性維持機構の破綻と、それに伴うアポトーシスやネクロトーシスといった細胞死、細胞老化の亢進、さらに治癒過程における機能異常などが病態進展に関与する可能性は過去に示されている。AT2 の表現型不均一性の変化や stemness の低下が病態進展に関与する可能性はあるが、その詳細は解明されていない。近年の single-cell transcriptomic analysis 手法の確立により、個々の細胞における遺伝子発現の違いによる cell clustering を用いた表現型の詳細な評価が可能となり、様々な病態に関与する新規細胞集団が同定されている。患者由来の肺から分離した AT2 を用いた single-cell transcriptomicanalysis により COPD 病態を反映する形で、生理的な AT2 の不均一性を細胞内恒常維持機構、細胞老化、stemnessの点から明らかにすることは、病態を理解する上での重要な知見となる。AT2 の不均一性の機序の詳細を十分に検討するには、AT2 の大量培養系が必要になる。近年、肺組織から AT2 を分離し、AT2 の形質を維持しながら細胞増殖が可能なオルガノイド 3 次元培養系の存在が報告されている。そこで AT2 の stemness を含む表現型不均一性を評価するため、3D ドーム構造を形成する 3 次元培養系に single-cell transcriptomic analysis を組み合わせた検討を行う方針とした。3D ドーム構造による 3 次元培養系に関して、これまで複数の阻害剤や growth factor を組み合わせた方法がいくつか報告されているが、それぞれの方法の比較検討は行われていない。そこでまずは最も効率的に AT2 増殖が得られる 3 次元培養方法を見出し、肺組織からプライマリーAT2 の培養系を確立することを本研究の目的とした。

方 法
1．肺組織から分離したⅡ型肺胞上皮細胞の 3D ドーム構造による 3 次元培養法
手術末梢肺検体から胸膜を剥離した後、肺組織を数 mm 程度まで細かくなるように処理した。その後、Lung
Dissociation Kit、mouse の溶液内に検体を入れ、gentle MACS dissociator を使用し 37℃、42 分間反応させ、singlecell suspension を作製した。フィルターを通し、RBC lysis buffer にて赤血球除去し、CD45microbeads、LS columns、MACS separator を用いて血球成分を除去した。血球成分を除去した single cell suspension を MACS buffer（PBS＋
0.5％ BSA＋2 mM EDTA）で溶解し、上皮細胞マーカーEPCAM と AT2 に特異度の高いモノクローナル抗体 HT2280 にて蛍光標識した AT2 細胞分画を cell sorter にて回収した。3D ドーム構造の作製は、medium 35μl に回収した
AT2 細胞を懸濁し、マトリゲル 35μl（細胞懸濁液：マトリゲル＝1：1）を混合し、計 70μl の懸濁液を作製して、24 well dish の中心に 3D ドームを作製した。37℃で 20 分間、CO2 インキュベーター内でマトリゲルを固形化した後、それぞれの Medium を 500μl 投与し培養を開始した（図 1）
。

1

AT
basal
Dissociatio
Lungn

AT2

ExtracellularCell sorter（HT2-280⁺,EpCAM⁺）

matrixAT2mediumclub
AT

Single cell suspension

3D culturebasal club

図 1．肺組織からⅡ型肺胞上皮細胞を分離して回収、3D ドーム構造による 3 次元培養までの流れ
2．3D ドーム構造による 3 次元培養法の培養液の違い
肺組織から AT2 を分離し、3D ドーム構造による 3 次元培養を施行した過去の 3 つの報告から、より効率的に増殖が得られる Medium、Inhibitor、Growth factor の組み合わせを検討した［1～3］。患者検体から分離し回収した AT2 を3 等分にし、計 70μl の懸濁液（細胞懸濁液：マトリゲル＝1：1）にて 3D ドームを作製した。
（1）SAGM を Mediumに使用し 3 日毎に medium 交換する方法［1］、（2）Advanced DMEM/F-12 を Medium に使用し 3 日毎に medium交換する方法［2］、（3）Advanced DMEM/F-12 を Medium に使用し 2 日毎に medium 交換する方法［3］（表 1）について、21 日目における 10 個の平均オルガノイド径の大きさと colony-forming efficiency（CFE、細胞増殖が得られた細胞比率）を計測することにより、増殖能を評価した。オルガノイド径は dish 内の大きいオルガノイドから 10 個を測定し、平均値を計算した。CFE に関しては、オルガノイド形成した細胞数と seeding した AT2 細胞数の比率で算出した。
表 1．各培養法の Medium、Inhibitor、Growth factor などの違い(1)
SAGM (except epinephrine)
Name
DosePeriod
Inhibitor CHIR99021
3 µMall
Noggin
100 ng/ml all
SB431542
10 µMallY-27632
10 µM
0-3daysMediumGrowthFactor

Human FGF-7 100 ng/ml all

OthersJagged-1

1 µM

(2)
(3)
Advanced DMEM/F-12
Advanced DMEM/F-12
Name
Dose
Period Name
Dose
Period
A83-01500 nM
all
BIRB796
1 µM
all
Noggin
100 ng/ml all
CHIR99021
3 µM
all
DMH-1
1 µM
all
SB431542
10 µM
all
Noggin10 ng/ml all
Y-27632
10 µM
0-4days
Human EGF

mixed with
B-27 supplement
matrigelGlutaMAX-1
HEPES
N-acetylcysteine
Nicotinamide
Pen/Strep
Glutamine

50 ng/mlall

Human EGF

50 ng/ml all

1×all

10 ng/ml all

all
all
all
all

Mouse FGF-10
Antibiotic-Antimycotic
B-27 supplement
GlutaMAX-1
HeparinHEPES

1×1 mM
1 mM
10 mM
1×all

mouse IL-1β

10 ng/ml 0-8days

1×all

1×1×5 µg/ml
15 mM

all
all
all
all

N-acetylcysteine 1.25 mM

all使用している Medium、Inhibitor、Growth factor、その他の培養液に使用している製剤の濃度、使用期間を記載。
（FGF：Fibroblast Growth factor、EGF：Epidermal Growth factor）

3．増殖したⅡ型肺胞上皮細胞の形態評価
3D ドーム構造による 3 次元培養法で増殖が得られた細胞を、day28～42 の間にマトリゲルごと回収した。PBSEDTA にて細胞を分離させ、トリプシン処理を施行した。マトリゲルを溶解した後、FCS を含む Medium にてトリプシンを不活化し、遠心して細胞ペレットを得た。ペレットを数μl の medium で懸濁し、smear gel を用いてスライド上に得られた細胞を撹拌した。細胞を固定し、AT2 マーカーである SFTPC と HT2-280 の蛍光免疫染色を施行した。
電動オールインワン顕微鏡と共焦点レーザー顕微鏡にて染色性を評価した。

2結 果
1． Ⅱ型肺胞上皮細胞の 3D ドーム構造による 3 次元培養
分離回収した AT2 を 3D ドーム構造による 3 次元培養を用いて培養開始した。
（1）～（3）のすべての方法でオルガノイド形成を認め、経時的な細胞増殖が得られた。検体毎に増殖能に差を認めたが、年齢、切除部位、疾患など患者背景の増殖能への影響に関して、検討範囲内では一定の傾向を認められなかった。

Day0Day7Day14Day21Day28

図 2．Ⅱ型肺胞上皮細胞の増殖経過の一例
3．の方法を用いた3次元培養。オルガノイド形成し細胞増殖認める（倍率×4、スケールバー：100μm）。

2． 増殖した細胞の形態学的評価
3 次元培養にて増殖したオルガノイドを day28～42 の間に回収し、蛍光免疫染色を施行し形態学的に評価した。
細胞集団を立体的に形成しており、細胞膜に存在する HT2-280、細胞質に存在する SFTPC がすべての細胞で染色され、AT2 の形態を維持して細胞増殖していることを確認した。
（1）～（3）のすべての方法で同様な結果を得た。

図 3．3 次元培養にて増殖したオルガノイドの蛍光免疫染色
共焦点レーザー顕微鏡による観察。緑：HT2-280、赤：SFTPC、青：Hoechst33342（倍率×40、スケールバー：50μm）。
a）通常の撮影画像。
b）Z-Stackで撮影した3D画像。

3．複数の培養方法による増殖能の評価同一検体で同じ細胞数の 3D ドーム構造による 3 次元培養を用いて、（1）～（3）の方法による増殖能を比較検討した。すべての培養法で AT2 の増殖は得られたが、（3）の方法がオルガノイドの平均径、CFE において他の方法と比較し有意差をもって効率的な細胞増殖が得られた。以上の結果から（3）の方法が、より増殖能が高く AT2 の 3 次元培養系であることが明らかとなった。

3図 4．3 つの培養方法による細胞増殖能の比較
Day21時点でのオルガノイド径及びCFEの比較。
a）（1）～（3）の 3 次元培養の比較画像と CFE（倍率×4、スケールバー：100μm）。
b）（1）～（3）の 3 次元培養のオルガノイド径の比較（1 元配置分散分析、多重比較法による）。

考 察
今回手術肺検体から分離した AT2 を使用し、より効率的な増殖がえられる 3 次元培養系を確立した。今後は、正常、COPD 肺組織から分離し、3 次元培養系で増殖させた AT2 を single-cell transcriptomic analysis を用いて検討し、病態進展に特異的に関与しうる AT2 cell cluster を同定し、AT2 の不均一性を評価することによって、蛋白恒常性維持機構、細胞老化、stemness などの違いを明らかにできる可能性があると考える。さらに AT2 培養系を用いて、細胞死や細胞老化に係る蛋白恒常性維持機構能異常とその役割を検討する。これら検討により、病態解明だけでなく、創薬につながるような重要な知見が得られる可能性があると考えている。

共同研究者
本研究の共同研究者は、東京慈恵会医科大学外科学講座呼吸器外科の大塚崇教授である

文 献1） Kazushige Shiraishi, Takuya Nakajima, Shigeyuki Shichino, et al. In vitro expansion of endogenous humanalvelolar epithelial type II cells in fibroblast-free spheroid culture. Biochem Biophys Res Commun. 2019 Aug
6;515(4):579-585. Epub 2019 Jun 6. PMID: 31178143 DOI: 10.1016/j.bbrc.2019.05.187
2） Ameen A Salahudeen, Shannon S Choi, Arjun Rustagi, et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2
infection in human distal lung organoids. Nature. 2020 Dec;588(7839):670-675. Epub 2020 Nov 25. PMID:33238290 DOI: 10.1038/s41586-020-3014-1
3） Hiroaki Katsura, Vishwaraj Sontake, Aleksandra Tata, et al. Human Lung Stem Cell- Based Alveolospheres
Provide Insights into SARS-CoV-2-Mediated Interferon Responses and Pneumocyte Dysfunction. Cell StemCell. 2020 Dec 3;27(6):890-904.e8. Epub 2020 Oct 21. PMID: 33128895 DOI: 10.1016/j.stem.2020.10.005

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