上原記念生命科学財団研究報告集, 33 (2019)

上原記念生命科学財団研究報告集, 33（2019）177. ターゲット抗体医療を目指した BacBomb システムの開発
馬橋 英章
お茶の水女子大学 基幹研究院 自然科学系 食物栄養学科 応用栄養学研究室
Key words：バキュロウイルス，ドラッグデリバリー，抗体医療緒 言
抗体医薬は病原体やがんマーカー分子に対する組換え体モノクローナル抗体であり、特にがんに対する有効な、副作用の少ない医薬品である。IgG に存在する N 型糖鎖構造からコアフコースを取り除くことで antibody-dependent cellmediated cytotoxicity（ADCC）が著しく上昇することが明らかになったことから、各製薬会社は競って糖鎖改変型抗体医薬の開発を行っている。一方で抗体医薬は高額な薬価が問題であり、将来的な抗体医療システムを安定的に維持できるかどうかが不安視されている。
そこで本研究ではこの問題を解決すべく、精製したモノクローナル抗体を抗体医薬として用いるのではなく、患者のがん細胞特異的に自らを認識する抗体医薬をがん細胞自身に産生させ、さらには抗体医薬の糖鎖構造の改変も同時に行い、効率的な ADCC を誘導してがん細胞を死滅させる、新しい抗体医療法を提案し、その確立を目指す。
このシステム（以下 BacBomb とする）の構築には 3 つの遺伝子を異なるタイミングで制御することが要求される。
それに適しているのが哺乳類細胞に遺伝子誘導を可能とするバキュロウイルスを用いた BacMam システムである［1］。
通常 BacMam は VSV-G をウイルス表面に発現させることで哺乳類細胞への高効率での形質導入を達成しているが、BacBomb では VSV-G をがんマーカー特異的な scFv（今回の場合は anti-HER2 scFv, 4D5 または DARPin 9_5_G）に置換することで、ウイルス粒子を効率よくがん細胞へデリバリーすること、またターゲットとしたがん細胞への特異的な遺伝子誘導を可能とする。さらに Rmd の発現によりがん細胞内の GDP-フコースを枯渇させ、IgG の N 糖鎖へのコアフコースの付加を低減し［2］、同時に自身を認識する IgG（例えば Trastuzumab）を産生させる。
BacBomb が正しく機能するのであれば、高濃度な抗体医薬の投与は不要となり、効率的で特異的ながん細胞の排除が可能となる。

方法および結果
1． バキュロウイルス表面に提示する HER2 特異的結合タンパク質の選定
バキュロウイルス表面にタンパク質を提示する方法は複数報告があるが、最も用いられているものは、バキュロウイ
ルスのウイルス表面に存在する Gp64 タンパク質のシグナルペプチドと C 末端近傍の膜貫通領域から下流を組み合わせたタンパク質断片（以下 Gp64 断片）とのキメラを作製する方法である。今回はモデルがん細胞として HER2 を高発現したものを設定し、HER2 を特異的に認識する分子として、scFv である 4D5［3］と、2 つの異なる DARPin を融合させた DARPin 9_5_G［4］の 2 種類を採用し、これらを Gp64 断片とキメラにすることでバキュロウイルス表面に提示することとした。どちらもファージディスプレイ法により HER2 特異的に結合する分子として単離されたものであり、特に DARPin 9_5_G はその分子自体だけでも HER2 発現細胞の生存効率を下げることが可能である。これらの分子がウイルス表面に提示されることにより、ウイルス粒子がHER2 を高発現する細胞に効率よくデリバリーされ、またその後細胞内へと侵入し、ウイルスゲノムに組み込まれた外来遺伝子を導入できると期待した。

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2．HER2 を特異的に認識し、形質導入を可能とする組換え体バキュロウイルスの単離
まず、組換え体ウイルス作製に必要な、バキュロウイルストランスファーベクターの作製を行った。このベクターには 2 つの遺伝子発現カセットが組み込まれており、片側の発現カセットはウイルス表面に提示する HER2 を特異的に認識するタンパク質を発現するもの、もう片方の発現カセットには、がん細胞（哺乳類細胞）にウイルス粒子が侵入後、その侵入を簡便に検出するために哺乳類細胞でのみ発現する蛍光タンパク質が組み込まれるように設計した。4D5
scFv または DARPin 9_5_G をコードする遺伝子配列は、バキュロウイルス粒子が形成される時点でウイルス表面に提示される必要があるため、昆虫細胞で恒常的に活性をもつ Opie2 プロモーターの下流に接続した。またこれらの遺伝子は昆虫培養細胞 Sf9 にて高発現することを期待して、これらのコドンを Sf9 ゲノムの賓用コドンに最適化した。一方、もう片方の発現カセットには、ウイルス粒子ががん細胞に侵入したことを確認するため、哺乳類細胞で活性をもち、昆虫細胞では活性を示さない CMV プロモーターの下流に強い蛍光をもつ mNeonGreen を接続した。
mNeonGreen の配列はヒトのコドンに最適化したものを合成した。
これらの遺伝子発現カセットは、pAcP（-）FASTR ベクターをベースとして、段階的に連結した。最終的に
mNeonGreen と Gp64 断片-4D5 scFv キメラタンパク質をコードする pAcP（-）mNG_Gp64-4D5scFv（図 1）と、
mNeonGreen と Gp64 断片-DARPin 9_5_G キメラタンパク質をコードする pAcP（-）mNG_Gp64-DARPin95G を単離することができた。

図 1．pAcP（-）mNG_Gp64-4D5scFv のベクターマップ
バキュロウイルス hr5 エンハンサーを中心として、左側に CMV プロモーターと mNeonGreen が、右側にOpie2 プロモーターと Gp64 断片、4D5 scFv の融合タンパク質が連結されている。pAcP（-）mNG_Gp64DARPin95G では、4D5 scFv 部分が DARPin 9_5_G の配列に置き換わっている。

作製したバキュロウイルストランスファーベクターを、バキュロウイルスゲノム DNA と共に Sf9 細胞にトランスフェクションし、相同組み換えを行った。組換え体ウイルス候補プラークをそれぞれ複数単離し、それぞれ想定した外来遺伝子が挿入されていることを確認した（図 2）。

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図 2．組換え体ウイルス候補分子のスクリーニング
組換え体ウイルス候補のゲノム DNA を抽出し、相同組み換えにより挿入される外来遺伝子の 330 bp 断片を PCR にて増幅した。

考 察
がん細胞を特異的に認識し、遺伝子導入を行い、がん細胞自身に医療抗体を発現させるシステムを作製するため、
HER2 発現細胞をモデルとし、HER2 発現細胞を特異的に認識し、遺伝子導入を行うための組換え体バキュロウイルスを作製した。HER2 を特異的に認識する分子として、4D5 scFv と DARPin 9_5_G を採用し、これらをバキュロウイルス粒子の膜状に提示するようにデザインした。想定したバキュロウイルストランスファーベクターを作製し、組換え体ウイルス候補の単離に至った。今後は、このウイルス粒子が実際に HER2 発現細胞に侵入し、外来遺伝子であるmNeonGreen を発現するかを確認する必要がある。

文 献
1） Mansouri M, Berger P. Baculovirus for gene delivery to mammalian cells: Past, present and future. Plasmid.
2018 Jun;98:1-7. doi: 10.1016/j.plasmid.2018.05.002. Epub 2018 May 26.
2） von Horsten HH, Ogorek C, Blanchard V, Demmler C, Giese C, Winkler K, Kaup M, Berger M, Jordan I, Sandig
V. Production of non-fucosylated antibodies by co-expression of heterologous GDP-6-deoxy-D-lyxo-4-hexulose
reductase. Glycobiology. 2010 Dec;20(12):1607-18. doi: 10.1093/glycob/cwq109. Epub 2010 Jul 15.
3） Carter P, Kelley RF, Rodrigues ML, Snedecor B, Covarrubias M, Velligan MD, Wong WL, Rowland AM, Kotts
CE, Carver ME, et al. High level Escherichia coli expression and production of a bivalent humanized antibodyfragment. Biotechnology (N Y). 1992 Feb;10(2):163-7. PubMed PMID: 1368228.
4） Jost C, Schilling J, Tamaskovic R, Schwill M, Honegger A, Plückthun A. Structural basis for eliciting a cytotoxic
effect in HER2-overexpressing cancer cells via binding to the extracellular domain of HER2. Structure. 2013
Nov 5;21(11):1979-91. doi: 10.1016/j.str.2013.08.020. Epub 2013 Oct 3. PubMed PMID:24095059.

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