上原記念生命科学財団研究報告集, 30 (2016)

92. がんのシグナル脂質変換酵素遺伝子異常とその臨床応用鈴木拓

札幌医科大学 医学部 分子生物学講座
Key words：大腸がん，ジアシルグリセロールキナーゼ，DNA メチル化，がん抑制遺伝子

緒言

ジアシルグリセロールキナーゼ（DGK）は、ジアシルグリセロール（DG）とホスファチジン酸（PA）の２つの脂質間の均衡を調節する酵素であり、細胞内情報伝達において重要な役割を担っている １）。DG はホスホリパーゼ C（PLC）により、ホスファチジルイノシトール 4,5－二リン酸（PIP2）から産生され、DGK により PA にリン酸化される。DG はプロテインキナーゼ C（PKC）と結合して活性化するセカンドメッセンジャーとして知られる。さらに DGKは、PA を介した Raf kinase や mTOR などの活性調節にも関与すると考えられており、広範囲で多彩な生理機能制御に関与するとされる。いくつかの DGK ファミリーとがんとの関連も知られており、例えば DGKα は乳がん、肝がん、グリオーマなどにおいてがん遺伝子的に機能することが報告されている２-４）。しかしそれ以外の DGK ファミリーとがんとの関わりはあまり知られておらず、DGK ファミリー遺伝子の変異やメチル化異常はこれまで報告がない。これまで我々は大腸がんにおけるエピジェネティクス異常を解析し、多くのがん関連遺伝子の DNA メチル化異常を明らかにしてきた５,６）。今回我々は、DGK ファミリー遺伝子の DNA メチル化異常を明らかにすることを目的とした。

方法

１．大腸がん細胞株及び臨床検体
大腸がん細胞株（CaCO2、Colo320、DLD1、HCT116、HT29、LoVo、RKO、SW48、SW480）からゲノム DNA および RNA を抽出した。DNA 脱メチル化による遺伝子発現回復を検証する目的で、大腸がん細胞株を 2μM の DNAメチル化酵素阻害剤 5-aza-2'-deoxycytidine（5-aza-dC）で 72 時間処理した。大腸腺腫 177 検体、大腸がん 141 検体、非がん部正常大腸組織 97 検体よりゲノム DNA を抽出した。臨床検体の解析については札幌医科大学の承認を得ている。
２．DNA メチル化および発現解析
DGK ファミリー遺伝子のプロモーター CpG アイランドのメチル化を、メチル化特異的 PCR（MSP）法、バイサルファイト･パイロシークエンス法、バイサルファイト･シークエンス法により解析した。DGKG 遺伝子発現を、TaqManプローブを用いた定量 RT-PCR 法によって解析した。
３．DGKγ の機能解析
野生型 DGKγ および constitutively-active（CA）型、kinase-dead（KD）型の DGKγ を発現するアデノウイルスベ
クターを構築した。大腸がん細胞株にこれらのアデノウイルスベクターを感染後、MTT アッセイ、細胞遊走アッセイ、マトリゲル浸潤アッセイを行った。また RhoA および Rac1 活性を G-LISA アッセイキットを用いて測定した。

結果

１．DGK ファミリー遺伝子の DNA メチル化解析
10 種類ある DGK ファミリー遺伝子のうち、プロモーター領域に CpG アイランドがある 8 遺伝子（DGKA、DGKE、DGKG、DGKH、DGKI、DGKK、DGKQ、DGKZ ）の DNA メチル化を、MSP 法により解析した。その結果、5 遺伝

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子（DGKA、DGKG、DGKI、DGKK 、DGKZ ）が複数の大腸がん細胞においてメチル化していた。中でも DGKG とDGKZ は全ての大腸がん細胞株でメチル化していたが、正常大腸組織でのメチル化はごくわずかであることから、がん特異的なメチル化であると推測された。
２．DGKG 遺伝子のメチル化と発現解析

DGKZ 遺伝子がコードする DGKζ は転移性大腸がん細胞において高発現し、浸潤を促進するという結果が最近報告されている。そこで我々は、癌との関係がほとんど知られていない DGKG（DGKγ）に着目し、解析を進めた。DGKGは正常大腸組織では発現しているが、大腸がん細胞株ではいずれも発現が消失あるいは低下していることが定量 RTPCR 解析から明らかとなった。また大腸がん細胞を DNA メチル化酵素阻害剤 5-aza-dC で処理することにより、
DGKG 発現が回復することから、DNA メチル化が発現抑制に関わっていると考えられた。臨床検体を用いた解析では、DGKG メチル化は大腸がんの 51.8 %、大腸腺腫の 50.3 %に認められたが、正常大腸組織からは検出されなかった。
これらのことから、DGKG 遺伝子は大腸がんにおいて高頻度にメチル化によって転写抑制されており、かつ DGKG のメチル化は大腸発癌過程の早期に起きることが示された。

図 1． 大腸がん細胞株における DGKG メチル化および発現解析（A）DGKG 遺伝子の転写開始点領域の模式図。MSP、バイサルファイト・シークエンス、パイロシークエンスで解析した範囲を併せて示している。
（B）大腸がん細胞株および正常大腸組織における DGKG 遺伝子メチル化をバイサルファイト・パイロシークエンスで解析した結果。DNA メチル化酵素をノックアウトした大腸がん細胞（DNMTs KO）を非メチル化のコントールとして併せて示している。
（C）大腸がん細胞 HCT116 と正常大腸をバイサルファイト・シークエンスで解析した結果。
（D）大腸がん細胞株および正常大腸における DGKG 発現の定量 RT-PCR 解析。（E）DNMT 阻害剤 5-aza-dC 処理による発現回復を定量 RT-PCR 解析した結果。

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図 2． 臨床検体における DGKG メチル化解析（A）大腸がん（141 検体）、大腸腺腫（177 検体）、正常大腸（97 検体）における DGKG 遺伝子メチル化をバイ
サルファイト・パイロシークエンス解析した結果。（B）代表的な大腸癌検体におけるバイサルファイト・シー
クエンス解析結果。
３．DGKγ の機能解析
DGKγ の大腸がんにおける役割を明らかにするため、野生型 DGKγ ならびに CA 型と KD 型の 2 種類の変異型
DGKγ を発現するアデノウイルスベクターを大腸がん細胞株（HCT116、DLD1、RKO）に感染させ、細胞増殖を MTTアッセイにより解析した。その結果、野生型 DGKγ の過剰発現は大腸がん細胞の増殖に影響を与えなかったが、CA型および KD 型 DGKγ による増殖抑制効果が確認された。遊走アッセイおよびマトリゲル浸潤アッセイの結果、野生型および 2 つの変異型 DGKγ により、大腸がん細胞の遊走･浸潤が抑制されることが示され、特に CA 型 DGKγ が最も高い抑制効果を示した。
細胞の遊走および浸潤には Rho ファミリー small G 蛋白の活性化が関与していることが知られている。また
DGKγ が GTPase-activating potein（GAP）である β2-chimaerin を活性化することで Rac1 を抑制することが報告されている。そこで大腸がん細胞において DGKγ が Rac1 と RhoA の活性に与える影響を解析した結果、野生型およびCA 型 DGKγ が Rac1 活性を抑制することを明らかにした。

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図 3． 大腸がん細胞における DGKγ の機能解析（A）大腸がん細胞 HCT116 に野生型（WT）、kinase-dead（KD）型、constitutively-active（CA）型 DGKγ を過剰発現させ、細胞増殖への影響を MTT アッセイで解析した結果。コントロールとして LacZ を用いた。（B）
遊走能への影響を解析した結果。**P < 0.01、***P < 0.001、統計解析は t 検定を用いた。（C）マトリゲル浸潤アッセイの結果。***P < 0.001、統計解析は t 検定を用いた。（D）Rac1 活性への影響を G-LISA アッセイキットで解析した結果。**P < 0.01、***P < 0.001、統計解析は t 検定を用いた。

考察

DGK ファミリーの中で、これまでがんとの関わりが報告されているのは DGKα、DGKη、DGKζ が挙げられるが、いずれもがんにおいて高発現し、がん遺伝子として機能するという報告が多い４,７,８）。今回我々は、DGKγ をコードする DGKG 遺伝子が、大腸がんにおいて高頻度にエピジェネティックに不活性化されていることを明らかにした。

DGKG のメチル化は大腸腫瘍においても高頻度に認められることから、大腸がんのリスク診断や早期診断マーカーとして有用と考えられる。また DGKγ の過剰発現が大腸がん細胞の増殖、遊走、浸潤を抑制したことから、がん抑制遺伝子として機能することが示唆された。増殖、遊走、浸潤の抑制効果は CA 型 DGKγ が最も高いことから、キナーゼ活性がこれらの腫瘍抑制効果に関わっていることが示唆される。しかし一方、KD 型 DGKγ も類似の効果を示したことから、キナーゼ活性とは別の分子機能が腫瘍抑制に関わっている可能性も示唆された。がんにおける DGKγ の機能をさらに明らかにすることで、新たな治療法開発につながる事が期待される。

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共同研究者
本研究の共同研究者は、札幌医科大学医学部分子生物学講座の甲斐正広である。本研究を援助いただいた上原記念生
命科学財団に深く感謝する。

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