上原記念生命科学財団研究報告集, 32 (2018)

上原記念生命科学財団研究報告集、 xx （20xx）

126. T 細胞 SASP の代謝・エピゲノム制御機構の解明
桑原 誠
愛媛大学 大学院医学系研究科 免疫学講座
Key words：T 細胞老化，SASP，Bach2，Batf，グルタミン代謝

緒 言
老化 T 細胞は、sensescence-associated secretory phonotype（SASP）様の形質を獲得し、炎症性サイトカイン、炎症性ケモカイン、血管新生誘導因子、細胞外マトリックスリモデリング因子などを高産生する。T 細胞 SASP によって誘発される前炎症状態は、加齢に伴う自己免疫疾患、発がん、心血管疾患、神経変性疾患の増加や易感染性と密接に関連している［1］。
私たちは、腫瘍抑制因子 Menin を欠失した T 細胞が活性化後のごく早期に SASP をはじめとした老化細胞様の形質を獲得することを見いだした。Menin 欠損 T 細胞における SASP 誘導メカニズムを解析した結果、転写抑制因子
Bach2 の発現低下が T 細胞 SASP を引き起こすことが明らかとなった［2］。Bach2 は DNA 結合型の転写抑制因子であるが、単独では DNA 結合能を持たない。そこで、Bach2 と会合して DNA 結合活性を付与する転写調節因子を探索し、Batf ファミリー分子を新たに同定した［3］。Bach2-Batf 複合体は AP-1 コンセンサス DNA 配列に結合し、AP-1依存的な転写活性化を抑制していることがわかった。しかしながら、Bach2-Batf 複合体の SASP 制御における役割は未だ明らかとなっていない。そこで本研究では、T 細胞 SASP における Bach2-Batf 複合体による SASP 制御について代謝・エピゲノム調節の側面から解明を試みた。
本研究では、T 細胞特異的 Menin 欠損-Bach2 トランスジェニックマウスの解析から、Menin-Bach2 経路が OPN、IL-6、IL-10 などの SASP 因子の発現を抑制していることが明らかになった。また、Menin-Batf 二重欠損およびBach2 -Batf 二重欠損活性化 CD4 T 細胞では SASP 因子の誘導が抑制された。これらの結果から、Bach2-Batf 複合体は T 細胞 SASP を制御していることが明らかになった。さらに、Menin 欠損活性化 T 細胞ではグルタミン代謝が亢進しており、ヒストン脱メチル化酵素 Utx による抑制性ヒストン H3K27me2/3 の脱メチル化により老化 T細胞形質の獲得が制御されていることがわかった。

方 法
Menin-flox、Bach2-flox、Batf-flox、Utx-flox, Bach2-transgenic（TG）、マウスを CD4-Cre TG（CD4 プロモータ
ー支配下に Cre 遺伝子を配したシステム）マウスと交配し、T 細胞特異的遺伝子改変マウスを作製した。WT および細胞を IL-2（10 ng/ml）
T 細胞特異的遺伝子改変マウスの脾臓由来ナイーブ CD4 T（CD44low CD62Lhigh CD25negative）
存在下で anti-TCR-β mAb（3 μg/ml）および anti-CD28 mAb（10 μg/ml）により 2 日間刺激した。TCR 刺激した細胞を新しいプレートに移し、IL-2（10 ng/ml）存在下で 5 日間培養した。刺激培養 7 日目 の活性化 CD4 T 細胞における細胞表面抗原を染色した。また、この細胞を anti-TCR-β mAb（3 μg/ml）で再刺激（ 2 μM Monensin 存在下、6 時間）して細胞内サイトカインを染色した。刺激培養 7 日目 の活性化 CD4 T 細胞を anti-TCR-β mAb（3μg/ml）で再刺激（16 時間）し、ELISA を実施した。

11

上原記念生命科学財団研究報告集、 xx （20xx）

結 果
1．Menin-Bach2 経路による T 細胞 SASP の制御
T 細胞特異的 Menin 欠損（KO）ナイーブ CD4 T 細胞は TCR 刺激によって活性化すると、老化した T 細胞の一般的特徴である CD27/CD62L の発現低下、PD-1 の発現上昇、OPN、IL-6、IL-10 産生亢進（SASP 因子）が確認、T 細胞老化制された（図 1b、c、d）。Menin KO 活性化 T 細胞では、Bach2 の発現が減弱することから（図 1a）
御における Bach2 の役割を検討した。Menin KO-Bach2 TG naïve CD4 T 細胞では、Menin KO 活性化 CD4 T 細胞における T 細胞老化形質（CD27/CD62L 発現低下、PD-1 発現上昇、OPN、IL-6、IL-10 産生亢進）が抑制された（図 1b、c、d）。したがって、Menin-Bach2 経路は T 細胞老化形質の一部を抑制していることが明らかになった。

b2106

WT KO
Bach21WT KOcMenin KO

Menin KOBach2 TG

81.9

14.0

3.7

21.8

45.7

7.8

77.9

4.416.1

16.4104

-Tubulin
06.6

WT105

CD27

Bach2 mRNA (relative)

a103

3.7102102 103 104 105 106

CD62Ld1000

60800

OPN

**

**

3040IL-10**

400
2000102 103 104 105 106

PD-1

WTMenin KOMenin KO-Bch2 TG
Ctrl Ig(ng/ml)600

Events

IL-6

30

1500
WT

Menin KO

20n.d.

0n.d.

n.d.

Menin KO-Bach2 TG**P<0.01 (Student’s t-test, n=3) n.d.: not detected

図 1．Menin-Bach2 経路は T 細胞老化形質の獲得を制御する
WT、Menin KO、Menin KO-Bach2 TG ナイーブ CD4 T 細胞を TCR 刺激により活性化し、IL-2存在下で培養した。初期刺激から 7 日目の活性化 CD4 T 細胞を用いて T 細胞老化形質を解析した。a）WT、Menin KO（KO）活性化 CD4 T 細胞における Bach2 の発現、b）CD62L/CD27 のFACS 解析（CD28low CD27low：老化 T 細胞集団）、c）PD-1 の FACS 解析、d）活性化 CD4
T 細胞を TCR 再刺激し、OPN、IL-6、IL-10 産生を ELISA 法により測定した（**P < 0.01、Student’s t-test、n = 3）。

2．Bach2-Batf 経路による T 細胞 SASP の制御
続いて、Menin-Bach2 経路による T 細胞老化制御における Batf の関与を検討した。Menin KO 活性化 CD4 T細胞における CD27/CD28 発現低下、OPN、IL-6、IL-10（SASP 因子）産生亢進は Batf 欠損により抑制された（図2a、b、c）。また、Bach2 KO 活性化 T 細胞における OPN、IL-6、IL-10 産生増加は Batf 欠損により有意に減少した（図 2a、b、c）。これらの結果から、Bach2-Batf 複合体は T 細胞 SASP の誘導を抑制していることが示された。

22

上原記念生命科学財団研究報告集、 xx （20xx）

a106

WT

0.3

Menin KO

83.1

6.9

15.7

17.4

Menin-Batf dKO

29.7

0.3

45.2

2.3

52.3

105

CD27104103

0.9102102 103 104 105 10646.0

CD28b70

OPN
**

**

IL-630(ng/ml)

**
3560

IL-10**

**

15**

WT30

Menin KO
Menin-Batf dKO

00**P<0.01(Student’s t-test, n=3)0c8OPN(ng/ml)**

IL-650IL-10****432.50**1.5n.d.

0WTn.d.

Bach2 KO
Bach2-Batf dKO**P<0.01(Student’s t-test, n=3)

図 2．Bach2-Batf 複合体は T 細胞 SASP を抑制する
WT、Menin KO、Menin KO-Batf KO（Menin-Batf dKO）
、Bach2 KO-Batf KO（Menin-Batf dKO）ナイーブ CD4 T 細胞を TCR 刺激により活性化し、IL-2 存在下で培養した。初期刺激から 7 日目の活性化 CD4T 細胞を用いて T 細胞老化形質を解析した。a）CD28/CD27 の FACS 解析（CD28low CD27low：老化 T 細胞集団）、b）および c）活性化 CD4 T 細胞を TCR 再刺激し、OPN、IL-6、IL-10 産生を ELISA 法により測定した（**P < 0.01、 Student’s t-test、n = 3）。

3．細胞内代謝変化調節を介した SASP 制御
私たちは Menin KO 活性化 CD8 T 細胞の老化形質獲得にグルタミン代謝が関与していることを明らかにした（現在論文投稿中）。メタボリックプロファイリングの結果から Menin KO 活性化 CD8 T 細胞ではグルタミン代謝経路が活性化していた。T 細胞老化におけるグルタミン代謝の役割を検討するために、完全培地（4 mM glutamine） に比べてグルタミン濃度を低下させた培地（0.05 mM glutamine：ウシ血清に由来する glutamine 量）を用いたところ、Menin 欠損による T 細胞老化形質が誘導されなかった。また、グルタミン代謝産物である α-ketoglutaric acid(α-KG) をグルタミン低濃度培地に添加すると、T 細胞老化形質が誘導された。Alpha-KG はクエンサンサイクルの代謝中間産物であるだけでなく、ヒストン脱メチル化酵素 Utx（ヒストン H3K27me2/3 の脱メチル化酵素）の補因子として機能することが知られている。そこで、グルタミン代謝を介したヒストン H3K27me2/3（抑制性ヒストンマーク）の脱メチル化が T 細胞老化形質の獲得に関与しているかを検討した。グルタミン代謝が活性化している Menin
KO 活性化 CD8 T 細胞ではヒストン H3K27me2/3（抑制性ヒストンマーク）レベルが低下していた。また、Menin 欠損による OPN、IL-6、IL-10 産生亢進（SASP）は Utx 欠損によって抑制された。これらの結果から、T 細胞老化形質の獲得（SASP）に Glutamin-α-KG 経路による H3K27me2/3 の脱メチル化が関与していることが示唆された。

33

上原記念生命科学財団研究報告集、 xx （20xx）

考 察
私たちは、これまでに、Bach2-Batf 複合体が Th2 サイトカイン遺伝子座の AP-1 結合配列に結合し、AP-1 複合体の活性を阻害し、Th2 細胞分化および Th2 サイトカイン産生を抑制していることを報告している［3］。また、AP-1複合体は SASP 因子を誘導することが知られている［1］。従って、Bach2-Batf 複合体は AP-1 機能阻害を介して T細胞 SASP を抑制していると考えられる。Bach2-Batf 複合体による OPN 発現抑制は部分的であった（図 2c）。最近、転写因子 C/EBPβ が OPN の発現を誘導していることが報告された［5］。また、C/EBP は basic-region leucinezipper（bZIP）を有する転写因子 ATF ファミリーと会合し遺伝子発現を制御することが知られている［6］。私たちは、ATF ファミリーに属する Atf-3 も Bach2 結合候補分子として同定していることから、Bach2-Atf3 複合体がAtf3-C/EBPβ 複合体に拮抗し、OPN の発現を制御している可能性が考えられる。
また、Glutamin-α-KG 経路がヒストン脱メチル化酵素 Utx によるヒストン H3K27me2/3 の脱メチル化を促進し、T 細胞老化形質獲得に関与することがわかった。これまでに、C. elegans において加齢に伴いヒストン H3K27me3レベルが増加し、ヒストン H3K27 脱メチル化酵素 UTX-1 の欠損により、H3K27me3 の脱メチル化が抑制されることでナイーブエピジェネティック状態が維持されることが報告されている［7］。従って、ヒストン H3K27me3 レベルが老化マーカーの 1 つとして重要であり、持続的なグルタミン代謝の活性化に伴うエピジェネティック変化が細胞老化の一因であると考えられる。

共同研究者・謝辞
本研究の共同研究者は、愛媛大学大学院医学系研究科免疫学教室教授の山下政克博士、助教の鈴木淳平博士である。
本研究の遂行に協力頂いた両博士に感謝する。Bach2-flox マウスおよび Bach2 TG マウスを分与して頂いた、大阪大学免疫学フロンティア研究センター教授の黒崎知博博士（分化制御）に感謝する。

文 献1） Haynes L, Lefebvre JS. Age-related Deficiencies in Antigen-Specific CD4 T Cell Responses: Lessons fromMouse Models. Aging Dis. 2011 Oct;2(5):374-81. Epub 2011 Oct 28. PMID: 22396889
2） Kuwahara M, Suzuki J, Tofukuji S, Yamada T, Kanoh M, Matsumoto A, Maruyama S, Kometani K,Kurosaki T, Ohara O, Nakayama T, Yamashita M. The Menin-Bach2 axis is critical for regulating CD4 T-cellsenescence and cytokine homeostasis. Nat Commun. 2014 Apr 2; 5:3555. PMID: 24694524 DOI:
10.1038/ncomms4555
3） Kuwahara M, Ise W, Ochi M, Suzuki J, Kometani K, Maruyama S, Izumoto M, Matsumoto A, Takemori N,Takemori A, Shinoda K, Nakayama T, Ohara O, Yasukawa M, Sawasaki T, Kurosaki T, Yamashita M.
Bach2-Batf interactions control Th2-type immune response by regulating the IL-4 amplification loop. Nat
Commun. 2016 Sep 1; 7:12596. PMID: 27581382 DOI: 10.1038/ncomms12596
4） Flanagan KC, Alspach E, Pazolli E, Parajuli S, Ren Q, Arthur LL, Tapia R, Stewart SA. c-Myb and C/EBPβ
regulate OPN and other senescence-associated secretory phenotype factors. Oncotarget. 2017 Dec
5;9(1):21-36. eCollection 2018 Jan 2. PMID: 29416593 DOI: 10.18632/oncotarget.22940
5） Pakos-Zebrucka K, Koryga I, Mnich K, Ljujic M, Samali A, Gorman AM. The integrated stress response.
EMBO Rep. 2016

Oct;17(10):1374-1395.

Epub2016

Sep

14.

PMID:27629041

DOI:

10.15252/embr.201642195
6） Jin C1, Li J, Green CD, Yu X, Tang X, Han D, Xian B, Wang D, Huang X, Cao X, Yan Z, Hou L, Liu J,Shukeir N, Khaitovich P, Chen CD, Zhang H, Jenuwein T, Han JD. Histone demethylase UTX-1 regulates C.
elegans life span by targeting the insulin/IGF-1 signaling pathway. Cell Metab. 2011 Aug 3;14(2):161-72.
4

4

上原記念生命科学財団研究報告集、 xx （20xx）

PMID: 21803287 DOI: 10.1016/j.cmet.2011.07.001

55