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高効率・高成功率PCR酵素

念発売記 ーンペキャン

KOD FX Neo

f40%of

難配列・Long PCR・
クルードサンプルにお薦め■期間：2010年10月20日〜2011年3月31日（ご注文分）

伸長性、及びクルードサンプルからの増幅効率が格段にアップしました。
KOD DNA polymerase＊は、優れた伸長性を有し、また比較的クル

KOD FX Neoード成分の阻害に強いといった特長を持っています。
「KOD FX」は、この酵素の特性を利用して開発された高成功率PCR酵素であり、難配列やクルードサンプルからの増幅などにおいてご好評いただいております。
しかし、従来のPCR酵素は、20〜30サイクル以降、増幅が持続しなくなる〈プラトー現象〉が生じるため、PCR機能が完全には発揮できてい01020ないと考えられていました。KOD FX Neoは「KOD FX」の技術に、弊30社で新たに開発した「伸長エンハンサー」などの技術を応用することで、40〈プラトー現象〉を抑え、長鎖ターゲット・難配列ターゲットの増幅やクル

図1．伸長エンハンサーの効果

ードサンプルからの増幅の効率をさらに向上させることに成功しました。
＊M. Takagi et al., Appl. Environ. Microbiol., 63：4504-4510（1997）

特長1 伸長性アップ
・ゲノムDNAを鋳型として最大40kbの増幅が可能
・30sec./kbの高速サイクルを実現（クルードサンプルでは1min./kbをお薦めしております）
・高GCターゲットなどの難配列の増幅に最適

実施例1 ヒトゲノムDNAを用いた増幅長の比較

実施例2 検出感度の比較従来困難であった、40kbの遺伝子の増幅が可能でした。

ヒトゲノムDNAを鋳型として検出感度の比較を行いましまた、従来品に比べ約半分の時間で増幅が完了しました。

M

123（従来品）

M

123の向上を認めました。

A社
Long PCR酵素

KOD FX

KOD FX Neo

た。その結果、KOD FX Neoは、従来品に比べ約一桁感度

M

12KOD FX

KOD FX Neo

3M

12（従来品）M

128.5kb〈伸長時間〉

30sec./ kb

60sec./ kb≦30sec./ kb

M：λ/Hin d Ⅲ Marker
1： tPA 24kb
2： HBg 32kb
3： HBg 40kb

〈伸長時間〉

30sec./ kb

60sec./ kb

M： 1kb DNAラダー
1： 0.1ng
2： 0.01ng

Template：ヒトゲノムDNA 200ng/50μl

Template：ヒトゲノムDNA
Target：Human β-globin 8.5kb【サイクル条件】
KOD FX Neo

KOD FX【サイクル条件】

94℃, 2min.

94℃, 2min.

KOD FX Neo

KOD FX

98℃, 10sec.

98℃, 10sec.

94℃, 2min.

94℃, 2min.

74℃, 30sec./kb
98℃, 10sec.
72℃, 30sec./kb
98℃, 10sec.
70℃, 30sec./kb
98℃, 10sec.
68℃, 30sec./kb

2010

5 cycles5 cycles5 cycles20 cycles

74℃, 60sec./kb
98℃, 10sec.
72℃, 60sec./kb
98℃, 10sec.
70℃, 60sec./kb
98℃, 10sec.
68℃, 60sec./kb

68℃, 7min.

68℃, 7min.

4℃, Hold

4℃, Hold

5 cycles98℃, 10sec.
68℃, 4.5min.

5 cycles5 cycles20 cycles

14℃, Hold

40 cycles

98℃, 10sec.
68℃, 9min.
4℃, Hold

40 cyclesNo.96_'10.qx 10.11.1 19:29 ページ 2

特長2 クルードサンプルからの増幅性能アップ
・植物ライセートやマウステールなどからの増幅効率を向上

・従来品同様、グラム陽性菌や酵母、カビなどからの直接PCRが・土壌成分や食品成分などのPCR阻害効果を低減

可能

実施例3 植物のライセートを用いた増幅実施例4 マウステールライセートを用いた増幅の比較

ワンステップ法で調製したタバコの葉のライセートをサンプ

アルカリ溶解法を用いて調製したマウステールライセー

ルとして検討を行いました。今回は、今までの検討で、35サイ

トをサンプルとして、3種類のマウス遺伝子の増幅をクルの条件ではあまり増幅の良くなかった2.2kb及び4.6kb行いました。その結果、KOD FXとKOD FXのターゲットを増幅しました。その結果、KOD FX Neoを用いNeoでのみ全ターゲットについて良好な増幅ることで、明瞭な増幅を確認することができました。

が認められました。また、増幅効率はKOD FX

2.2kbM12M

1Neoの方が良好でした。

●前処理法（ワンステップ法）

4.6kb
212

M

4.6kb

123123123123

マイクロチューブへ葉（3mm角）精米（1粒）

2.2kb

A社
A社
クルードサンプル クルードサンプル
対応PCR酵素1 対応PCR酵素2

FX
KOD FX Neo KOD（従来品）

Buffer A 100μl添加し、Vortexにて良く攪拌

3

Buffer A: 100mM Tris-HCl（pH9.5）
1M KCl10mM EDTA

M： 1kb DNAラダー
1： KOD FX（従来品）
2： KOD FX Neo

95℃・10 min.
Vortexにて良く攪拌

Template：
タバコ葉ライセート（ワンステップ法）
1μl
Target：rbcmtT）

598℃, 10sec.
68℃, 1min./kb【サイクル条件】

Template：マウステールライセート（アルカリ溶解法）0.5μl

68℃, 1min./kb

右：精米

98℃, 10sec.

30 cycles

マウステール（3mm程度）を96穴プレートに入れる↓ ←50mM NaOH 180μlを加え、蓋をしてVortexにて良く攪拌する↓ スピンダウン（軽く振って液を下に落とす程度でも問題ありません）↓ 95℃, 10min.インキュベート（サーマルサイクラーを使用）↓ ←1M Tris-HCl（pH 8.0）20μlを加え、蓋をしてVortexにて良く攪拌する↓ スピンダウン（軽く振って液を下に落とす程度でも問題ありません）
上清（テンプレート）⇒0.5〜2μlをPCR反応液50μlに添加

35 cycles

4℃, Hold※マウステール切片は、液に浸るようにカットしてください。 ※熱アルカリにご注意ください。
※処理後、マウステールは完全には溶解しません。マウステールの表面が溶ける程度です。
※本方法は、1.5mlマイクロチューブなどを用いても可能です。

a p.7 User's Noteもご参照ください

実施例5 ジャム（食品）添加実験

実施例6 フミン酸添加実験

加工食品の一例として、ジャムの懸濁液をPCR反応液に添

フミン酸（humic acid）は、植物などの成分が腐植土や加してPCRの阻害の検討を行いました。果物には、多糖をは土壌などにおいて微生物などによって形成されるアルカリじめとするPCRを阻害する物質が含まれています。その結果、に可溶で、酸で沈殿する赤褐色ないし黒褐色を呈する、有機KOD FX Neoが最も阻害に強いことが明らかとなりました。

物であり、PCRを阻害することが知られています。ここでは、

KOD FX

KOD FX Neo
M

94℃, 2min.

96ウェルPCRプレートを用いるマウステール処理法（アルカリ溶解法）【参考文献】
BioTechniques, 19：394（1995）

94℃, 2min.

M： 100 bp DNA ラダー, 1 kb DNA ラダー
1： Mouse TATA box binding protein（TBP）0.5 kb
2： Mouse transferrin receptor（Tfr）1.5 kb
3： Mouse membrane glycoprotein（Thy-1）2.6 kb

4℃, Hold

上清1 μlをPCR反応液に添加（植物組織は完全には溶解しません）
左：葉【サイクル条件】

412（従来品）

3 4 M

12 3 4例としてヒトゲノムDNAにフミン酸を混合し、PCRの阻害

A社クルードサンプル
B社
対応PCR酵素 Long PCR酵素
M 1 2 3 4 M 1 2 3 4に関する評価を行いました。その結果、KOD FX Neoが最もフミン酸の阻害に強い傾向があることが分かりました。
A社
B社クルードサンプル
Long PCR酵素
対応PCR酵素FX
KOD FX Neo KOD
（従来品）
M

123M

123M

123M

1231.3kb3.6kb
M： 1kb DNA ラダー
1：ジャム上清0μl
2：ジャム上清2μl
3：ジャム上清4μl
4：ジャム上清6μl

添加PCR阻害物質：
イチゴジャム0.3gに100μlのTEバッファーを添加し遠心上清を添加【サイクル条件】

M： 1kb DNAラダー
1：フミン酸添加量＊ 0μl
2：フミン酸添加量＊ 2μl
3：フミン酸添加量＊ 4μl

94℃, 2min.
Template：10ng ヒトゲノムDNA
Target：Human β-globin 1.3kb

98℃, 10sec.
68℃, 1.5min.

30 cycles＊フミン酸：OD280＝1の溶液を使用

4℃, Hold

Template：10ngヒトゲノムDNA
Target：Human β-globin 3.6kb2【サイクル条件】
94℃, 2min.
98℃, 10sec.
68℃, 4min.

30 cycles

4℃, Hold2010No.96_'10.qx 10.11.1 19:29 ページ 3

実施例7 コンポスト（堆肥）を用いたメタゲノム解析
コンポスト（堆肥）から、様々な方法を用いて粗抽出したDNA溶液（処理上清）をサンプルとして、原核生物共通プライマーを用いてKOD FX Neo【ターゲット】16s rDNA

M

【プライマー】
Fwd GTTTGATCCTGGCTCA
Rev TACCAGGGTATCTAATCC

123rDNAの増幅を行いました。その結果、アルカリ溶解法とワンステップ法で調製したサンプルを用いた検討において、一般的に広く行われて【サイクル条件】
94℃, 2min.
98℃, 10sec.
55℃, 30sec.
68℃, 1min./kb
4℃, Hold

いるCTAB法と同程度の増幅を確認することができました（右図）。
続いて、KOD FX NeoのPCRプロダクトは末端が平滑化されているため、専用のTAクローニング試薬「TArget CloneTM -Plus-」を用いてクローニングし、シーケンス解析を行いました。その結果、解析した各96クローンにおいて、良好なシーケンス解析を行うことができました。また解析結果より、それぞれの粗抽出法によって得られた配列は、24〜26 cycles

1 アルカリ溶解法×24 cycles

ほぼ同様の傾向を示しました（アルカリ溶解法やワンステップ法は大2 ワンステップ法×24 cycles

変簡便な方法ですが、はじめて使用される場合は、検出される菌の傾3 CTAB法×26 cycles

向等について、従来の方法と比較などの事前検討をお薦めします）。

M： 100bp DNA ラダー
1： アルカリ溶解法
2：ワンステップ法
3： CTAB法（従来法）

また、アルカリ溶解法によって調製した上清を用いて、様々な増幅試薬を用いて、3種類の共通プライマーを用いてrDNAの増幅を行った
結果、KOD FX Neoが最も良好な結果を示すことが分かりました（下図）。

【ターゲット】16s rDNA
A社
A社
B社
クルードサンプル クルードサンプル クルードサンプル
対応PCR酵素1 対応PCR酵素2 対応PCR酵素

KOD FX Neo KOD FX
M

123M

123M

123M

123 M

123

【プライマー】
1: Fwd ATTAGATACCCTDGTAGTCC
Rev TACCTTGTTACGACTT
2: Fwd AGGGTCATTGGAAACTGGG
Rev CGTGTTGTAGCCCAGGTCATA
3: Fwd GGCCTTCGGGTTGTAAACC
700bp
600bp
Rev CTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGC
550bp

M：100bp DNAラダー
1：原核生物由来rDNA（700 bp）
2：Bacillus sp.由来rDNA（600 bp）
3：High G/C グラム陽性菌由来rDNA（550 bp）

アルカリ溶解法
土壌100mg↓ ←50mM NaOH 180μl↓ Vortexにて良く攪拌↓ 95℃, 10min.インキュベート↓ ←1M Tris-HCl（pH8.0）20μl↓ Vortexにて良く攪拌↓ 遠心12,000rpm, 5min.
上清↓
滅菌水で10倍に希釈し、1μlをPCR反応液50μlに添加

品名および内容【サイクル条件】
94℃, 2min.
98℃, 10sec.
X℃, 30sec. Y cycles
68℃, 30sec.
1 X：50℃ Y：23 cycles
4℃, Hold2 X：60℃ Y：33 cycles
3 X：65℃ Y：33 cycles

ワンステップ法
土壌100 mg
↓ ←Buffer A＊ 100μl↓ Vortexにて良く攪拌↓ 95℃, 10 min.インキュベート↓ 遠心12,000rpm, 5min.
上清↓
滅菌水で10倍に希釈し、1μlをPCR反応液50μlに添加

CTAB法
下記論文に従って実施しました。
J. Zhou et al., DNA Recovery from Soilsof Diverse Composition. Appl. Environ.
Microbiol. 62：316-322（1996）＊Buffer A：100mM Tris-HCl（pH9.5）
1M KCl10mM EDTA

包装保存温度

Code No.

価格-20℃

KFX-201￥35,000￥21,000-20℃

KFX-201X5￥140,000

対象外

キャンペーン価格

高効率・高成功率PCR酵素＊
200U×1本［200回用］
KOD FX Neo
KOD FX Neo（1.0U/μl）
2×PCR Buffer for KOD FX Neo＊（200U×1本）
×5［1,000回用］
2mM dNTP＊50μl反応を行ったときの反応回数で表示しています。
品名

高効率TAクローニングキット（KOD用）

TArget Clone™ -Plus-

装保存温度

Code No.

価10回用-20℃

TAK-201￥16,000

包格

KOD FX Neoによって増幅されたDNAの末端は平滑化されていますので、末端を制限酵素処理するか、平滑末端クローニングの手法を用いてクローニングを行う必要があります。また専用のTAクローニングキット「TArget CloneTM -Plus-（Code No. TAK-201）」を用いることで増幅産物に直接Aを付加し、そのまま容易にTAクローニングを行うことができます。

2010

3