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高効率リアルタイムPCR用マスターミックス®

KOD SYBR qPCR Mix■期間：2013年1月15日〜2013年3月29日（ご注文分）

融解曲線解析によるマルチプレックスPCR解析などに最適。
KOD SYBR® qPCR Mixは、KOD DNA polymerase（KOD）を使用したSYBR® GreenⅠ
検出系によるリアルタイムPCR用マスターミックスです。3 →5 エキソヌクレアーゼ活性（校正活性）を除去したKOD exo（−）DNA polymeraseと最適化されたバッファー条件を組み合わせることで、KODの『優れた合成能』や『クルード成分の阻害を受けにくい』という性質を最大限に発揮し、様々な用途で安定したリアルタイムPCR解析が可能になりました。

特長1 長鎖ターゲット（〜2kb）に対応
KOD FXやKOD -Plus- シリーズなどの通常のPCR用に設計したプライマーをそのままご使用頂けます。長鎖ターゲットでも増幅できるためプライマーの選択幅を格段に広げることができます。

M

12

約2kbのフラグメントを用いて解析可能

3

従来のTaq DNA polymeraseを用いる方法では解析不能

増幅曲線解析

104 103 102101100コピー

1.9kb同一のプライマーを使用

融解曲線解析

電気泳動解析
1： KOD FX Neo
2： KOD FX
3： KOD -Plus- Ver.2
M： 1kbラダー
Template：Human gDNA
Target：TGFβ（1918bp）

弊社従来品
THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix

KOD SYBR® qPCR Mix

図1．長鎖ターゲットに対するリアルタイムPCR（ABI StepOnePlusTM使用）
KOD FXシリーズやKOD-Plus-シリーズで増幅可能なプライマーを用い、約2kbのターゲットの増幅を実施しました。その結果、Taq DNAポリメラーゼを用いる従来品では増幅困難な約2kbのターゲットでも本製品では定量的な増幅が認められました。

2kbまでの様々なターゲット長を選択できるため、幅広い融解曲線解析が可能です。プライマーダイマーの発生領域（短鎖領域）を外して増幅領域を選べるため、エンドポイントアッセイでの多型解析、マルチプレックスPCR解析などに有利です。

（a）電気泳動解析

〔bp〕（b）融解曲線解析（c）増幅長とTm値

至適解析領域
KOD
TaqM

増幅長
（bp）
6094
141199357552
1061

1061552357
1991419460606065707594 141 199 357 552 1061 (bp)80Temperature（℃）

859095ACT
予測Tm値 実測Tm値（℃）（℃）
747277.5
76797982
82858486868788※予測Tm値が実測Tm値と一致しない場合もあります。

プライマーダイマーの発生領域
Taq DNA polymeraseを用いる場合の解析領域
KOD DNA polymeraseを用いる場合の解析領域

M：100bpラダー

図2．増幅長が異なるターゲットを用いた解析（ABI7500使用）
ヒトゲノムDNAを鋳型にβ-アクチン遺伝子上の増幅長が異なるターゲットの増幅、及び融解曲線解析を実施しました。その結果、60bp〜約1kbまでの増幅産物が得られ、74〜87℃の幅広い温度域で今回増幅した増幅産物の識別が可能でした。そのため、増幅長を変え融解温度に差異が生じるようにプライマーを設計することでワンチューブで複数のターゲットの検出が可能となります。この融解曲線の差異はGC含有量に左右されますが、増幅産物のTm値を計算することで予測可能です。

20137

No.100_'13.qx 12.12.11 18:54 ページ 8

特長2 クルードサンプルを用いるエンドポイント解析に対応
植物ライセート、血液、マウステールアルカリ熱抽出液などのクルードサンプルを用いて直接検出することができます。SYBR®
GreenⅠアッセイを応用することで、煩雑だった多型解析やSNP解析を簡便化することができます。
①増幅長多型を用いるジェノタイピング解析
2つの増幅産物の増幅長を変え、Tm値に差異が生じるようにプライマーを設計するだけでワンチューブでマウスのジェノタイピングを行うことができます（特長1参照）。
短鎖長primer
増幅長：100bp/予測Tm値：79℃【マウステールアルカリ熱抽出液】
マウステール（約3mm）

Wild type（WT）

マイクロチューブへ1

共通 primer

2
CreER knock-in（KI）

50mM NaOH 180μl添加
Vortexにて良く攪拌CreER
共通 primer 長鎖長primer
増幅長：341bp/予測Tm値：84℃

3KI/KI

95℃・10min.
1M Tris-HCl（pH8.0） 20μl添加

WT/WT

Vortexにて良く攪拌4

遠心（12,000rpm, 10min.）

WT/KI

20μl反応系に上清0.5〜2μlを添加（マウステールは完全には溶解しません）

560

65707580859095※本実験で使用したトランスジェニッ
クマウスのマウステールは、東京大学分子細胞生物学研究所 情報伝達研究分野 平林祐介先生
よりご供与いただきました。

Temperature（℃）

図3．融解曲線解析を用いるワンチューブマウスジェノタイピング（ABI 7500使用）
マウステールアルカリ熱抽出液を用いワンチューブでジェノタイピング解析を実施しました。WT特異的増幅産物とknock-in特異的増幅産物の増幅長を変えることで、計算上、増幅産物のTm値に差異が生じるように設計しました。WT特異的プライマーは、CreER knock-inに対しては、増幅長が長いため、伸長時間を30秒と短くすることで増幅できないようにしています。また、ヘテロ検出におけるピーク比のバランスをとるために、WT特異的プライマー：knock-in特異的プライマー=1:3として検出の結果、すべてのタイプで増幅が認められジェノタイピングを実施することができました。

②ASP（Allele specific primer）-PCRを用いるSNP（Single nucleotide polymorphism）解析
一方のプライマーの5 末端にGC tailを付加することにより、同サイズのターゲットの識別を融解曲線解析により行うことができます。様々な原理のASP-PCRに応用可能です。以下では、3 末端から2塩基目にSNP部位、3塩基目にミスマッチ部位となるように設計し、解析を行いました。
（A）
共通 primer

5共通 primer5

増幅長：110bp/予測Tm値：84℃
G特異的primer GC tail×3×3

Primer Sequence

共通 Primer
5'-CAGTCACCCTTTGGTGGCTAC-3'G
増幅長：98bp/予測Tm値：81℃ G特異的 Primer 5'-GCCGCCCTGCCCGCCACACTCACAGTTTTCACTGCA-3'
A特異的primer
A特異的 Primer 5'-CCCACACTCACAGTTTTCACTATA-3'

A※下線：GC tail、
赤字：SNP部位、
緑字：ミスマッチ部位

（B）
口腔粘膜

血液
綿棒により口腔粘膜を採取

G/GA/A

G/GA/A

↓

血液2μl

↓

200μlの滅菌水
で懸濁G/A100μlの滅菌水で希釈↓↓20μl反応系に2〜5μl添加

20μl反応系に2〜5μl添加

606570758085Temperature
（℃）

9095

G/A

606570758085
Temperature
（℃）

9095

図4．血液や口腔粘膜からの検出（ABI 7500使用）
一方のアレル特異的プライマーにGC tail（下線部）（A）ALDH2 SNP検出に用いたプライマーを示しています。ワンチューブで遺伝子型の識別を可能にするために、を付加し、増幅産物の融解温度（Tm値）に差異が生じるように設計しました。GC tail付加による融解温度の上昇を大きくするため、増幅長を100bp以下にしています。また、
この実施例においては、アレル特異的プライマーとして3 側から2塩基目をSNP部位（赤）、3塩基目をミスマッチ（緑）になるように設計しました。
（B）血液の水希釈液、口腔粘膜の水懸濁液を20μl反応系に5μl添加し、検出を行いました。その結果、遺伝子型の判定が可能でした。

82013

No.100_'13.qx 12.12.11 18:54 ページ 9③クルードサンプル中のターゲットの検出
従来品のTaq DNA polymeraseを使用したリアルタイムPCR試薬では増幅困難であったクルードサンプルにおいても解析が可能となりました。
【ワンステップ法】（A）短鎖Target: イネrbcL（257bp）

1Buffer A
100μl添加Vortexにて良く攪拌

従来型リアルタイムPCR試薬（Taq使用）KOD SYBR® qPCR Mix

マイクロチューブへ葉（3mm角）2

ワンステップ法
抽出液

精製DNA

Buffer A:
100mM Tris-HCl（pH9.5）
1M KCl10mM EDTA[THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix]

精製DNA
ワンステップ法
抽出液
No-templatecontrol

No-templatecontrol

360

95℃・10 min.

65707580859095606570Temperature（℃）

4Vortexにて良く攪拌

7580859095

Temperature（℃）（B）長鎖Target: イネ・タバコ葉rbcL（1.3kb）

KOD SYBR® qPCR Mix

上清を滅菌水で1/10希釈

ワンステップ法抽出液（イネ）

20μl反応系に0.5〜2μl添加

ワンステップ法抽出液
（タバコ）

5

参考文献：Bio Techniques, 19: 394（1995）

No-templatecontrol

60

65707580859095

Temperature（℃）

図5．クルードサンプルからのリアルタイムPCR検出（ABI 7500使用）（A）ワンステップ法にて作製したイネライセート及び精製DNAを用いて、弊社従来品と本製品の比較を行いました。その結果、本製品ではライセートを用いて特異的な増幅が認められましたが、Taq DNA polymeraseを使用している従来品では増幅が認められませんでした。
（B）増幅長が1.3kbのターゲットについて、増幅を実施しました。その結果、本製品ではライセートをサンプルとした場合においても特異的な増幅が認められました。

特長3 GC含有率が70％を超えるターゲットに強い
従来品では困難であったGC含有率が70%を超えるターゲットにおいても、定量的な増幅が認められます。

IGF2R（GC含有率：83％、鋳型：cDNA）

KOD SYBR® qPCR Mix

Ａ社製リアルタイムPCR試薬（GC含有率70％以上対応）

5-1希釈

5-1希釈

5-1希釈
5-5希釈

-55 希釈弊社従来品
THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix

5-5希釈

図6．GCリッチなターゲットに対するリアルタイムPCR（ABI StepOnePlusTM使用）
GC含有率が70％を超えるターゲットに対し、各リアルタイムPCR試薬による反応性の比較を行いました。鋳型には、弊社の高性能逆転写反応用試薬「ReverTra Ace® qPCR RT Kit（Code No. FSQ-101）」により合成したHeLa細胞total RNA由来のcDNAを用い、cDNAの5倍希釈（5段階）について、反応を実施しました。その結果、弊社従来品では、増幅困難であったGCリッチなターゲットに対しても、定量的な増幅が認められました。また、反応特異性が高く、プライマーダイマーが生じにくいため、低コピーまでの幅広い定量可能域を得ることができました。

2013

9No.100_'13.qx 12.12.11 18:54 ページ 10

特長4 高い特異性
プライマーダイマーなどの非特異的反応を抑えることで、低コピー域までの幅広い定量が可能です。また、弊社リアルタイム
PCR用cDNA合成キット「ReverTra Ace® qPCR RTシリーズ」を併用することで安定した検出を得ることができます。

KOD SYBR® qPCR Mix

Ａ社製リアルタイムPCR試薬◆ターゲットKRT10（156bp / GC : 43%）
10-1 希釈10-1 希釈

10-5
NTC

10-5

◆鋳型
弊社の高性能逆転写反応用試薬「ReverTraAce® qPCR RT kit（Code No. FSQ-101）」
により合成したHeLa細胞total RNA由来のcDNAを用い、cDNAの10倍希釈（5段階）とno-template control（NTC）について、反応を実施。

プライマーダイマー

NTC

図7．他社リアルタイムPCR試薬との反応特異性比較（ABI StepOnePlusTM使用）
プライマーダイマーが生じやすいターゲットにおいてリアルタイムPCRを行いました。その結果、本製品では、低コピーサンプルやno-templatecontrol（NTC）においてもプライマーダイマーが抑制され、良好な結果を得ることができました。

特長5 様々な機器に対応ブロックタイプの機器（Fast Modeにも対応）のほか、ガラスキャピラリーを用いる高速サイクラーにも対応しています。また50×ROX reference dyeが別添付されているため、パッシブリファレンスを必要とする機器においても各機器に適したROX濃度でご使用頂けます。
【対応可能機器例】

機

ROX最終濃度（添加量）器

Applied Biosystems 7000、7300、7700、7900HT、StepOne™、StepOnePlus™

1X（1/50量）

Applied Biosystems 7500、7500Fast、Agilent Technologies Mx3000P、Mx3005P、Mx4000®

0.1X（1/500量）®

Roche社製機器（LightCycler 2.0、LightCycler Nanoなど）、Bio-Rad社製機器（MiniOpticon™、CFX96 Touch™など）、BioFlux Line Geneなど

不要■キャンペーン期間：2013年1月15日〜2013年3月29日（ご注文分）
装保存温度

Code No.

通常価格

キャンペーン価格

1ml×1本〔40回用〕-20℃

QKD-201T¥9,800対象外

1.67ml×3本〔200回用〕-20℃

QKD-201¥32,000¥16,000

包

品名および内容
KOD SYBR® qPCR Mix
・KOD SYBR® qPCR Mix
・50×ROX reference dye※50×ROX reference dyeがマスターミックスとは、別添付されています。
※包装欄に記載の反応回数は、50μl反応時のものです。容量は、KOD SYBR® qPCR Mixのみ示しています。

ウインターキャンペーン対象品 2012年11月26日〜2013年3月22日（ご注文分）
装保存温度

Code No.

通常価格

キャンペーン価格

ReverTra Ace® qPCR RT Kit

200回用-20℃

FSQ-101¥38,000￥22,800

リアルタイムPCR用cDNA合成キット
完全プレミックスタイプ

200回用-20℃

FSQ-201¥38,000¥19,000

200回用-20℃

FSQ-301¥40,000¥20,000

品

名包リアルタイムPCR用cDNA合成キット

ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix
リアルタイムPCR用cDNA合成キット
完全プレミックスタイプ（ゲノムDNA除去試薬付き）

ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover※包装欄に記載の反応回数は、10μl反応時のものです。

102013