上原記念生命科学財団研究報告集, 32 (2018)

上原記念生命科学財団研究報告集、 xx （20xx）

180. 新規の接着因子、JCAD による血栓形成制御機構の解明
原 哲也
神戸大学 大学院医学研究科 内科学講座 循環器内科学分野
Key words：深部静脈血栓症，JCAD，血管内皮緒 言（i）新規の血管内皮接着因子、JCAD とは
近年のヒトゲノムワイド関連研究（GWAS）によって、心筋梗塞に関連する新規の分子として JCAD（Junctionalprotein associated with coronary artery disease）が同定された［1，2］。それと同時期に、我々と共同研究グループは新規接着因子の同定、という全く異なる生化学的アプローチから、独自に JCAD を同定し［3］、JCAD の生理的機能として、血管新生を制御していることを明らかにした［4］。JCAD は血管内皮細胞に発現し、VE-Cadherin 依存的に細胞接着部位に局在することを報告したが（図 1）、JCAD が心筋梗塞を制御する機序は不明である。そのような中で、JCAD はトロンビン刺激でリン酸化修飾をうけることが網羅的解析によって偶然明らかになった［5］。すなわち、JCAD は血管内皮における、トロンビン刺激による血栓形成カスケードを制御することで、心筋梗塞を含む、血栓症の発症に関与しているのではないかと着想した。

図 1 JCAD の局在（ii）本研究で新たに解決しようとするもの
1．JCAD が血栓形成を制御していることを JCAD－/－マウスを用いて、直接的に明らかにする- 各種血栓モデル（DVT モデル、動脈血栓モデル）を作製し、JCAD－/－マウスでは血栓サイズが野生型マウスと比較して、大型化、ないしは縮小することを証明する。
- 分子イメージングを用いて、炎症細胞浸潤、炎症活性、血栓関連分子の発現を生体下で比較検討する。
2．培養細胞を用いて、JCAD の血栓形成にかかわる分子メカニズムを明らかにする- 培養ヒト血管内皮細胞に siRNA 等を用いて JCAD 特異的なノックダウンや過剰発現を誘導しトロンビン刺激による血管内皮細胞の血栓性変化に関わる分子（組織因子、PAI-1 等）の変化を解明する。
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上原記念生命科学財団研究報告集、 xx （20xx）（iii）本研究の特色
我々の研究室は生化学的なアプローチで JCAD を同定し、JCAD に対する抗体も独自に作製しており［6］、さらに、JCAD－/－マウスも独自に作製しており［4］JCAD 研究に関して世界をリードしている。一方、「血栓症」を対象とし「血た研究は、全世界的に、凝固因子や血小板に注目した in vitro でのいわゆる「血液内科学」的な研究が主であるが、栓症」は Virchow の 3 徴（血流うっ滞、血管壁の傷害、血液凝固能の亢進）が示すように、生体内での統合的、複合的な抗血栓作用のバランスの破綻により発症することは古くから知られており、in vivo での個体レベルでの研究が重要である。そのような中で、我々は DVT 作製の手術手技を確立し、さらに in vivo での各種分子の動態を生体下において分子レベルで明らかにする分子イメージング手法（図 2）も習得し論文報告［7，8］している。そこで JCAD ノックアウトマウスに我々の「血栓症の生体イメージング」技術を最大限活かした研究を計画した。

図 2．蛍光顕微鏡による分子イメージングの例

方 法
1．JCAD－/－マウスを用いた血栓症の発生における JCAD の影響の解明
独自に作製した JCAD－/－マウスにおいて、申請者が近年、独自に開発した頚静脈結紮モデル［7］や、wire injury による大腿動脈血栓モデルにより、マウスに血栓を作製した。形成された血栓のサイズを野生型マウスと JCAD－/－マウスで比較することによって、JCAD が静脈および動脈血栓形成を制御することを直接的に明らかにする。
2．培養細胞を用いた JCAD の血栓形成にかかわる分子メカニズムの解明
培養ヒト血管内皮細胞（HUVEC など）に siRNA 等を用いて JCAD 特異的なノックダウンや過剰発現を誘導し、トロンビン刺激による血管内皮細胞の血栓性変化に関わる影響を分子細胞学的に検討する。具体的にはトロンビン刺激後の組織因子などの血栓性分子の発現変化や、Erk などのシグナル伝達経路を比較する。
3．生体血栓イメージングモデルの開発とそれを用いた静脈血栓の病態の解明
蛍光顕微鏡を用いた、生体血栓イメージングモデルを開発し、それを用いて、生体下に各種分子、細胞の挙動を可視化することによって、これまで不明であった深部静脈血栓症の形成機序を解明する。

結 果
1．JCAD－/－マウスを用いた血栓症の発生における JCAD の影響の解明
我々と共同研究グループは独自に JCAD を同定し、血管内皮の接着部位に発現することを報告した。さらに、
JCAD－/－マウスの作製にも既に成功している。その JCAD－/－マウスにおいて、下大静脈に DVT を作製したところ、。すなわち、JCAD は抗血栓的に働く分子であることが生体で明JCAD－/－マウスでは大型の DVT が作製された（図 3）らかとなった。

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2．培養細胞を用いた JCAD の血栓形成にかかわる分子メカニズムの解明
培養ヒト血管内皮細胞（HUVEC など）に siRNA 等を用いて JCAD 特異的なノックダウンや過剰発現を誘導し、トロンビン刺激による血管内皮細胞の血栓性変化に関わる影響を分子細胞学的に検討した。VEGF 刺激による ERK のリン酸化は JCAD の特異的ノックダウンにより抑制されたが一方、AKT のリン酸化経路は抑制されなかった。
また JCAD特異的ノックダウンにより VEGFR のリン酸化とその発現レベル自体も抑制された。
3．生体血栓イメージングモデルの開発
蛍光顕微鏡による血栓形成過程を観察する中で、我々は偶然、血流低下状態においては、光感作物質の投与なしでも、蛍光顕微鏡観察に伴う光照射によって血栓形成が秒単位で形成されることを発見した。具体的にはマウスの大腿静脈を皮膚切開により露出し、中枢部を外科的に結紮する。結紮後も大腿静脈には複数の分枝が存在するため、それらを介して血流自体は遮断されず、血流低下のみが起こる。その状態で蛍光顕微鏡において大腿静脈を観察すると、秒単位で血栓が形成されていく過程が観察される。これは、蛍光顕微鏡による励起光照射という観察行為そのものが、血栓形成のトリガーとなるため、誘発と観察が同時に可能となる、画期的な生体イメージング法である。今後は、このモデルを用いて深部静脈血栓症の病態解明をすすめていく。

図 3．JCAD ノックアウトマウスにおける大型 DVT の形成

考 察
今回、我々はトロンビン刺激後のシグナル伝達における JCAD の役割において、特に ERK のリン酸化経路に影響していることを明らかにした。そして JCAD 発現の減少は、ノックダウンによる in vitro の実験結果によればトロンビン刺激による ERK のリン酸化を抑制し、組織因子の発現が亢進された。
これはおそらく、JCAD はトロンビン刺激による血管内皮細胞の向血栓性変化の negative feedback 機構に何らかの機序を介して関わっており、トロンビン刺激のブレーキ的な役割を果たしていることが予想される。このブレーキである JCAD が生活習慣病による炎症性刺激で発現が低下することが、動脈硬化による動脈血栓、すなわち心筋梗塞の発症に影響するという、GWAS 結果を説明しうる機序であると推測された。今後はより詳細な分子機序の解明により、この JCAD 機能を制御することによる動脈硬化、血栓症の新規治療法の開発が望まれる。
今後は、本モデルで形成された血栓を経時的に生体下に観察を行い、その後の肺組織を解析することによって、肺塞栓の存在を明らかにし、世界初の実臨床に類似した肺塞栓症のモデルを確立することを目標にする。
さらに、本モデルの特徴であるリアルタイム生体イメージングという利点を最大限活用し、血栓が遊離する前後のMMP 活性の局所性、塞栓症発症前後での変化など、血栓の各種分子の挙動の時空間的制御機構を明らかにすることによって、深部静脈血栓症の病態生理を解明することにつなげたい。

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