上原記念生命科学財団研究報告集, 33 (2019)

上原記念生命科学財団研究報告集，33（2019）10. 深部静脈血栓形成における分子法医病理学的研究
近藤 稔和
和歌山県立医科大学 医学部 法医学講座
Key words：突然死，法医病理学，肺動脈血栓塞栓症，深部静脈血栓，腫瘍壊死因子

緒 言
突然死とは、発症後 24 時間以内の自然死（内因死）と定義され、我が国における突然死の発生頻度は、全自然死の14〜17％である。突然死は、いつでもどこででも発生し、その殆どが法医解剖により死因が究明される。突然死の死因を医学的に究明することは、死亡者の個人の尊厳を擁護するとともに、その後に発生してくる種々の社会的問題を解決するための手段であり、法医学の使命である。
近年、突然死の原因疾患の代表である肺動脈血栓塞栓症に対する関心が高まってきたものの、塞栓子の 90%以上を占める深部静脈血栓の発症・融解の機序については未だ解明されていない点が多い。深部静脈血栓形成・融解機序は、血栓内への炎症細胞浸潤と血管内皮細胞のサイトカインを通じたクロストークが重要とされている［1］。
そこで、本研究では TNF-αのレセプターである I 型 TNF レセプター（TNFRp55）遺伝子欠損マウス（TNFRp55KO）マウスを用いて血栓形成・融解の分子メカニズムを解析し、TNF-α-TNFRp55 が、深部静脈血栓治療の有用な分子標的となり得ることが示唆された［2］。

方 法
1．マウス深部静脈血栓塞栓症モデル作製法の確立

TNFRp55KO マウスおよび野生型マウス（WT）マウスを麻酔下で開腹し、下大静脈を結紮することによって静脈血栓を形成した［3］。結紮後経時的に血栓を採取し、重量及び長さを測定する。
2．病理組織学的および免疫組織化学検索
採取した血栓試料ついて、ヘマトキシリン・エオジン染色およびマッソン・トリクローム染色を施施し。さらに血栓内マクロファージについて免疫染色を行った。
3．遺伝子発現解析
血栓試料から総 RNA を抽出し、血栓融解の促進因子であるマトリックスメタロプロテアーゼー2（matrixmetalloproteinase 2、MMP-2）、MMP-9 およびウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベータ（urokinase-type
plasminogen activator、PLAU）の遺伝子発現を検索した。
4．腹腔内マクロファージ単離・解析

TNFRp55KO マウスおよび WT マウスにチオグリコレートを腹腔内投与し、マクロファージを単離後、TNF-α添加による、MMP-2、MMP-9 および PLAU の遺伝子発現を検索した。
5．TNF-αおよび TNF-α抑制剤投与
WT マウスにおいて IVC 結紮後、TNF-αまたは TNF-α抑制剤（抗 TNF-α抗体または Etanercept）腹腔内投与し、血栓の状況を検討した。
6．統計的解析結果については、平均±標準誤差を算出し、2 元配置分散分析または Student t test で解析し、p < 0.05 を統計学的に有意とした。

1

上原記念生命科学財団研究報告集，33（2019）

結 果
1．TNFRp55 遺伝子欠損の血栓形成・融解への影響について
IVC 結紮後 3 日までは TNFRp55KO マウスおよび WT マウスで血栓の大きさに差はなかったが、5 日目以降ではTNFRp55KO マウスの方が WT マウスよりも明らかに血栓重量が大きく、血流の再開通が遅延していた（図 1A からC）
。また、TNFRp55KO マウスで血栓の器質化は顕著で、コラーゲン成分であるハイドロキシプロリン含有量も多かった（図 1D から F）。これらのことから、TNFRp55KO マウスでは血栓の融解が遅延することが判明した。

図 1．TNFRp55KO マウスおよび WT マウスの下大静脈結紮による静脈血栓形成（A）血栓重量（B）下大静脈血流量（C）血栓肉眼像（D）血栓のヘマトキシリン・エオジン染色像（E）血栓のマッソン・トリクローム染色像（F）血栓内ハイドロキシプロリン含有量**P < 0.01、*P < 0.05、Two-way ANOVA by Dunnett post hoc test

2．TNFRp55 遺伝子欠損の血栓融解因子は発現への影響について
血栓融解には MMP-2、MMP-9 および PLAU が密接に関与していることが知られている［3］。そこで、TNFRp55KOマウスおよび WT マウスについて、これら血栓融解因子の遺伝子発現について検討したところ、TNFRp55KO マウス
では、血栓中における MMP-2、MMP-9 および PLAU の遺伝子発現が WT マウスと比較して有意に減弱していた。

2

上原記念生命科学財団研究報告集，33（2019）

図 2．TNFRp55KO マウスおよび WT マウスにおける血栓内の MMP-2、MMP-9 および PLAU の遺伝子発現（A）MMP-2（B）MMP-9（C）PLAU（D）PAI-1**P < 0.01、*P < 0.05、Two-way ANOVA by Dunnett post hoc test

3．TNFRp55 遺伝子欠損の血栓内の白血球数への影響について血栓融解に関与する MMP-2、MMP-9 および PLAU はマクロファージから産生されることが知られている［4、5］。
そこで、TNFRp55KO マウスおよび WT マウスの血栓内のマクロファージについて検討したところ、両群間でマクロファージ数に差は認められなかった。

図 3．TNFRp55KO マウスおよび WT マウスにおける血栓内マクロファージ浸潤（A）血栓内マクロファージの免疫染色像（B）血栓内マクロファージ数

4．血栓融解因子発現に関する TNFRp55 の依存性について

TNFRp55KO マウスおよび WT マウスから腹腔内マクロファージを単離し、MMP-2、MMP-9 および PLAU の遺伝子が TNFRp55 依存的に発現しているのか否かについて検討したとこ。WT マウス由来のマクロファージでは TNFα添加によって MMP-2、MMP-9 および PLAU の遺伝子発現が著明に上昇したが、TNFRp55KO マウス由来のマクロファージでは TNF-α添加しても MMP-2、MMP-9 および PLAU の遺伝子発現に変化は認められなかった。したがって、TNF-αは TNFRp55 を介して血栓融解因子である MMP-2、MMP-9 および PLAU 発現を誘導することが明らかとなった。

3

上原記念生命科学財団研究報告集，33（2019）

図 4．マクロファージにおける TNF-α添加による血栓融解因子の遺伝子発現（A）MMP-2（B）MMP-9（C）PLAU（D）PAI *P < 0.05、Student t test

5．TNF-αおよび TNF-α抑制剤によるの血栓形成・融解への影響について
WT マウスの IVC 結紮後に、TNF-αまたは TNF-α抑制剤（抗 TNF-α抗体または Etanercept）を投与して、血栓形成・融解への影響を検討したところ、TNF-α投与群ではコントロール群と比較して有意に血栓が小さかった。一方、
抗 TNF-α抗体または Etanercept の TNF-α抑制剤投与群では、投与群ではコントロール群と比較して有意に血栓が大きく、TNFRp55KO マウスと同様の傾向を示した。

図 5．TNF-αおよび TNF-α抑制剤の効果（A）血栓重量 （B）下大静脈血流量 **P < 0.01、*P < 0.05、Student t test

考 察
突然死例の死因究明だけにとどまらず、突然死及びそれに関連する研究を通じて突然死の原因疾患についての予知・予防並びに治療法開発のための情報を提供することも、これからの法医学の重要且つ新たな使命であると考える。
特に、肺動脈血栓塞栓症の原因である深部静脈血栓の発症・融解の機序については未だ解明されていない点が多いた
め、臨床的には抗凝固剤などの対症療法しかないのが実態である。
そこで、TNFRp55 KO マウスを用いて血栓形成・融解の分子メカニズムを解析したところ、TNFRp55KO マウスでは、血栓中における MMP-2、MMP-9 および PLAU 発現を抑制することによって血栓融解を阻害すると考えられた。
さらに、腹腔内マクロファージを培養し、TNF-αを添加したところ、WT マクロファージでは MMP-2、MMP-9 および PLAU の遺伝子発現が亢進したが、TNFRp55 KO マクロファージではこれらの遺伝子に変化が認められなかった。
以上のことから、TNF-α-TNFRp55 が、深部静脈血栓治療の有用な分子標的となり得ることが示唆された。さらに、法医学実務で遭遇する疾患について、分子生物学的アプローチを施すことにより、法医学が臨床医学と基礎医学の架け橋的役割を務め、さらには法医学を発信源とする医科学の発展に寄与するものと考える。
4

上原記念生命科学財団研究報告集，33（2019）

共同研究者・謝辞
本研究の共同研究者は、和歌山県立医科大学法医学講座の野坂みずほ、石田裕子、木村章彦、國中由美、同循環器内科学講座の樽谷玲、同臨沂検査医学講座の古田眞智、金沢大学がん進展制御研究所の向田直史である。

文 献1） Wakefield TW、 Myers DD、 Henke PK. Mechanisms of venous thrombosis and resolution. ArteriosclerThromb Vasc Biol. 2008 Mar;28(3):387-91. doi:10.1161/ATVBAHA.108.162289. PubMed PMID: 18296594.
2） Nosaka M、Ishida Y、Kimura A、Kuninaka Y、Taruya A、Furuta M、Mukaida N、Kondo T. Contributionof the TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α)-TNF-Rp55 (Tumor Necrosis Factor Receptor p55) Axis in theResolution of Venous Thrombus. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2018 Nov;38(11):2638-2650.doi:
10.1161/ATVBAHA.118.311194. PMID: 30354252.
3） Nosaka M、Ishida Y、Kimura A、Kuninaka Y、Inui M、Mukaida N、Kondo T. Absence of IFN-γ accelerates
thrombus resolution through enhanced MMP-9 and VEGF expression in mice. J Clin Invest. 2011
Jul;121(7):2911-20. doi:10.1172/JCI40782. PMID: 21646723.
4） Nosaka M、 Ishida Y、 Kuninaka Y、 Kimura A、 Kondo T. Immunohistochemical detection of uPA、 tPA、and PAI-1 in a stasis-induced deep vein thrombosis model and its application to thrombus age estimation. Int
J Legal Med. 2012 May;126(3):421-5. doi: 10.1007/s00414-012-0680-z. PMID: 22361951.
5） Nosaka M、 Ishida Y、 Kimura A、 Kondo T. Immunohistochemical detection of MMP-2 and MMP-9 in astasis-induced deep vein thrombosis model and its application to thrombus age estimation. Int J Legal Med.
2010 Sep;124(5):439-44. doi:10.1007/s00414-010-0484-y. PubMed PMID: 20623133.

5