上原記念生命科学財団研究報告集, 35 (2021)

上原記念生命科学財団研究報告集, 35（2021）

141. 感染とヒトの疾患をつなぐ新規因子 Luple の解明
幸脇 貴久
熊本大学 大学院生命科学研究部 免疫学講座
Key words：自然免疫，感染症，Luple緒 言
新興・再興感染症の流行は、21 世紀に生きる人類にとって最大の脅威となることは今回の新型コロナウイルスの世界的大流行によって証明されている。ウイルス感染症は人類の生命を奪い、社会的、経済的な混乱を引き起こし停滞させることから、その解決は急務である。ウイルス感染時の免疫応答を解明することは、ワクチンや新たな治療薬を開発するための重要な基礎データとなる。筆者はこれまでウイルス感染時の自然免疫応答の研究をしており、このウイルス感染初期の自然免疫の分子機構について研究を進めてきた［1，2］。
ウイルス感染後、細胞質内のウイルス RNA は RIG-I 分子により認識され、ミトコンドリア外膜に存在する MAVS分子を介して、TBK1 などのリン酸化酵素や TRAF などのユビキチンリガーゼなどを活性化させる。これにより、IRF3や NFκB などの転写因子を活性化させることで、I 型インターフェロンや IL-6 などの炎症性サイトカインの産生を誘導する（図 1）。
ウイルス感染に対する自然免疫では、このような分子機構が明らかとなっているが、既知の分子だけでは自然免疫応答は説明できず、未知の分子やメカニズムが存在すると考えられる。
そこで本研究では、麻疹ウイルスを樹状細胞に感染させ、遺伝子の発現を網羅的に解析した。その結果、機能未知の分子を発見し、Luple と名付けた。本研究では Luple 分子に焦点を当て、その分子機構と、生体内での重要性を解明することを目的とする。

RNA
RIG-I

MDA5MAVS

TBK1

TRAF

IRF3

NF-κB

IFNα/βIL-6

図 1．RIG-I 様受容体による自然免疫応答の模式図1

方 法
本研究課題では、ウイルス感染時の自然免疫応答における Luple 分子の役割を明らかにするために以下の方法で実験を行った。
1． ウイルス感染時の自然免疫におけるサイトカイン産生制御の新たなメカニズムの解明
・インターフェロン刺激による Luple の発現制御の解析
・Luple 遺伝子の siRNA によるノックダウンでサイトカイン産生能の解析
・サイトカイン産生のどの経路に関与するのかの解明
・Luple の細胞内局在の解析
2．生体内における、Luple 分子を介した自然免疫応答の役割と重要性の解明
・Luple ノックアウトマウスの作製
・Luple ノックアウト MEF にセンダイウイルスを感染させ、遺伝子発現をマイクロアレイで解析

結 果
1． Luple はウイルス感染に対するインターフェロン産生に応答して発現誘導される
ウイルス感染に対する Luple の発現誘導の有無を調べるために、HEK293 細胞をインターフェロンαで刺激した。

Figure 1

その結果、Luple はインターフェロンによって発現誘導されることがわかった（図 2）。

D[10-4]B

LBA1 mRNA

Relative expression

30201510[10-3]50454035302520151050[10-5]65432100HEK293

5A549

Lung

Relative expression

25Luple mRNAmRNALBA1IP-10 mRNA0246 hr0246 hr

Time after IFN-α treatment

図 2．インターフェロン刺激に対するサイトカインと Luple の発現誘導

E HEK293orter)左）インターフェロンα刺激に対する IP−10 の発現誘導を定量 PCR 法で定量した。
右）インターフェロンα刺激に対する Luple の発現誘導を定量 PCR 法で定量した。

LBA1 mRNA[10-4]

IFN-β mRNA

IL-6 mRNA[10-5]

60
40
20

Relative expression

800siRNA

A1

Relative expression

Relative expression (%)

14mock 次に、120si NC
si NC
Luple 遺伝子の siRNA
40 によるノックダウンを行い、RIG-I リガンドの poly（I:C）で刺激した。その結果、
poly I:CsiLBA1
si LBA1
12100Luple がサイトカイン産生を促進していることが判明した（図3）。
3530252015105NC LBA100246 hr

108642002Time after poly I:C stimulation

2H46 hrRelative expression

2520E HEK293

80604020ENC LBA125luc (IFN-β reporter)*

35

5 150246 hr

246 hrTime after IFN-α treatment

42002LBA1 mRNA Time afterIFN-βmRNA
poly I:Cstimulation

p125luc (IFN-β reporter)
3080 の変化を定量した。

2546 hr[10-5]IL-6 mRNA

10860Lupleの遺伝子ノックダウン条件下でpoly右）（I:C） 刺激に対するLupleの応答性の
202.56siNC1540 変化を定量した。
24si LBA11020RLU

0000

ター分子
MyD88 およびTLR3 のアダプター分子 TICAM-1
siRNA 1 NC LBA10 は、
2 ウイルスを認識した後のシグナル伝達に必須のタンパ
46 hr
02 46 hr
LBA1ク質として知られている。Luple の siRNA によるノックダウンを行い、MAVS、MyD88 および TICAM-1 を過剰発現
0.5Time after poly I:C stimulationさせインターフェロンβ遺伝子のレポーター法でインターフェロン誘導能を調べた。その結果、Luple は、MAVS、0MyD88、TICAM-1。
612 24 hr の下流で働くことを確認した（図 4）GTime after HSV-1 infection

IL-6 mRNA

25p125luc (IFN-β reporter)
2.5si NC
si LBA120si NC
si Luple
LBA1
si2151050H

1.510.5061224 hr

Time after HSV-1 infection

0TICAM-1Vector

MyD8800
HEK29360

TICAM-1

55MAVS

CA1101086 hr

25
ウイルスの核酸を認識する1.5
RIG-I 様受容体のアダプター分子
MAVS、それと TLR9（Toll-like receptor 9）のアダプ

Fold increase

015Empty

Fold increase
1020122 10 4左）Lupleの遺伝子ノックダウン条件下でpoly（I:C） 刺激に対するIFN-βの応答性

si NC
si LBA115 20025

MyD88202530

si NC
siLBA1si Luple

140MAVS25

si NC 1siLBA1si Luple

35IL-6 mRNA

[10-5]

2[10-3]5045403530252015105012014mock
si NC
si NC
40LupleノックダウンによるインターフェロンおよびIL−6 の発現制御 si LBA1
図3．
poly I:C
siLBA1
12H
100
35

IL-6 mRNA

30

3Relative expression

40
G4

Relative expression

[10 ]

45

5IFN-β mRNA

RLU

50

6[10-4]

Relative expression (%)

-2

4000
siRNALBA1

5Relative expression

100[10 ]-4A549

Relative expression (%)

Lung

120

10Emptyrmock
poly I:CSpleenThymus*LBA1 mRNA

[10 ]HEK293β reporter)

15

Time-5 after IFN-α treatment

Relative expression

SHE

Relative expression30

図 4．自然免疫シグナル経路と Luple との関わりの検討
Luple の siRNA によるノックダウン条件下で MAVS、MyD88、TICAM-1 によるIFN-β遺伝子のレポーター法を行った。

さらに、Luple は細胞核にも局在することをウエスタンブロッティングで確認した（図 5）。

3FluFlupoly I:C

C0 hr

si LBA1NPNS

PNS

N

12 hr
N

PNS

N
anti-LBA1
anti-Luple

anti-LBA1250

anti-Tublin

5075

anti-Lamin B150

anti-Tublin

anti-Lamin B1図 5．Luple の細胞内局在の検討
Luple タンパク質の細胞内局在を調べるために、細胞質と細胞核を分子後ウエスタンブロッティングで Luple タンパク質を検出した。

2．Luple は遺伝子 X の産生に関与している生体内での Luple の機能を明らかにするために Luple ノックアウトマウスを作製した。Luple ノックアウトマウスから作製した Mouse Embryonic Fibroblast（MEF）にウイルスを感染させマイクロアレイ法を用いて遺伝子発現を網羅的に解析した結果、遺伝子 X の発現が低下していた（図 6）。

図 6．Luple ノックアウト MEF の遺伝子発現解析
WT MEF と Luple KO MEF にセンダイウイルスを感染させ、感染後 24 時間での遺伝子発現をマイクロアレイ法で解析した。遺伝子名は未発表のため伏せている。

次に我々は、Luple が遺伝子 X のプロモーター領域に直接結合するかどうかを ChiP 法で確認した。その結果、Lupleは自然免疫応答に反応して 遺伝子 X のプロモーター領域に結合していることを明らかとした（図 7）。

4Control IgG

anti-Luple antibody
25000

Fold increase

Fold increase

1.51.00.5

20000
15000
10000
50000.0kpoly(I:C))ocC

M

Poly(I:Mock0

図 7．Luple の遺伝子 X プロモーター領域への結合の検討
左）RIG-I のリガンドで細胞を刺激後、コントロール抗体を用いて ChiP を行い遺伝子X の上流のプロモーター領域に対する定量 PCR を行った。
右）RIG-I のリガンドで細胞を刺激後、Luple 抗体を用いて ChiP を行い遺伝子 X の上流のプロモーター領域に対する定量 PCR を行った。

考 察
当該研究では、ウイルスに対する自然免疫応答において、サイトカイン遺伝子のプロモーター領域に Luple 分子が結合することによりサイトカイン遺伝子の転写が活性化するという自然免疫の新たな分子メカニズムの解明につながる成果を挙げることができた。ウイルスは宿主の自然免疫関連分子を抑制することで、宿主免疫応答から逃れることが知られている。ウイルスによる Luple 分子の抑制機構の有無については、今後の検討課題として取り組む。Luple 分子の過剰な発現は、ウイルスに対する防御に働くと期待される。そのため、Luple の発現を誘導する化合物のスクリーニングをすることで、新たな抗ウイルス薬の開発につながると期待される。
共同研究者・謝辞
当該研究は、熊本大学大学院生命科学研究部免疫学講座の押海裕之教授のご指導のもと行われた。この場を借りて御礼申し上げます。

文 献1） Wang G, Kouwaki T, Okamoto M, Oshiumi H. Attenuation of the innate immune response against viral
infection due to ZNF598-promoted binding of FAT10 to RIG-I. Cell Reports 2019 Aug 20;28 (8):1961-1970.e4.
PMID: 31433974 DOI:10.1016/j.celrep.2019.07.0812） Kouwaki T, Okamoto M, Tsukamoto H, Fukushima Y, Matsumoto M, Seya T, Oshiumi H. Zyxin stabilizes RIGI and MAVS interactions and promotes type I interferon response. Scientific reports 2017 Sep 19;7(1):11905
PMID: 28928438 DOI: 10.1038/s41598-017-12224-7

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