上原記念生命科学財団研究報告集, 35（2021）

上原記念生命科学財団研究報告集, 35 (2021)

146. ヒト iPS 由来造血前駆細胞のストレス制御因子の同定
杉村 竜一
京都大学 iPS 細胞研究所 斎藤潤研究室
Key words：Organs-on-chips，Hematopoiesis，Pluripotent stem cells，Hematopoietic stem and progenitor cells

緒 言
Aorta-Gonad-Mesonephros（AGM）-on-a-chip は造血発達中の細胞相互作用の理解に貢献すると期待されている［1］。
造血発達を理解することは、ヒト造血幹細胞及び前駆細胞の誘導に必要である［2］。フィーダー細胞の存在は造血 発達に寄与すると示唆されているが、細胞相互作用の関与は不明であった［3］。本研究では AGM-on-a-chip を構築する
ことで細胞間の相互関係を理解することを目指した。

方法、結果および考察
1．AGM-on-a-chip の構築
AGM-on-a-chip は、構造の点で生体を模倣している。ヒト人工多能性幹細胞（Human Induced Pluripotent StemCell：hiPSC）由来の造血内皮細胞（Hemogenic endothelium：HE）である hiPSC-HE 細胞、内皮のモデルとしての HUVEC、及びフィーダー細胞として AGM の 3 細胞を chip に組み込んだ（図 1b）。デバイスは 3μm の多孔質によって分離された二つの PDMS マイクロチャネルの膜で構成されており、これにより細胞間の相互作用を可能にした（図 1c、d）。

図1．大動脈の構造-性腺-中腎（AGM）-on-aチップa） AGMのスキーム。AGMは造血性内皮細胞（HE）、間葉系間質（MS）及び内皮細胞（EC）の3種の細胞から構成される。
b） AGM-on-a-chipのスキーム。上の層にHEとAGMの3種の細胞（AGMS-3）を配置し、下の層にはHUVECを配置した。
c） AGM-on-a-chipの構造。上層と下層のポリジメチルシロキサン（dimethylpolysiloxane：PDMS）にサンドイッチされた多孔質膜。培地は管から注入した。リザーバー（直径6 mm）。
d）AGM-on-a-chipの写真。スケールバー＝10 mm

12．造
造血発達の評価
造血仕様を検討した AGM-on-a-chip の hiPSC-HE 細胞を図 2 に示す。CD34 を発現する丸い形の細胞は、培養 6 日後に CD45 を発現した（図 2a、b）。hiPSC-HE 細胞は CD45 を発現しておらず、造血マイクロ流体チップで CD45 陽性の造血前駆細胞（Hematopoietic Progenitor Cell：HPC）への遷移が誘導された。図 2c に AGM-on-a-chip の断面画像を示す。GFP-hiPSC-HE 細胞（グリーン）の発現は直接維持され、トップチャネルの MS 細胞（マゼンタ）及び血管－膜の下側に形成された内皮（シアン）が認められた（図 2c）。細胞は 3.0μm の細孔を含む膜層間で互いに接触していた。全体として CD45 を発現する GFP 陽性細胞が形成されたことを確認した。

図 2．AGM-on-a-chip の細胞部分a） 明視野の顕微鏡像。フィーダー細胞なしで HE をチップに播種すると、培養 6 日後に丸い形の造血前駆細胞が観察された。
b） 免疫蛍光顕微鏡像。CD34（グリーン）を発現する HE から CD45（オレンジ）を発現する造血前駆細胞への遷移が認められた（免疫蛍光顕微鏡写真）。
c） AGM-on-a-chip の共焦点蛍光顕微鏡写真。GFP 陽性 HE 細胞（グリーン）、mCD13 陽性 AGMS-3細胞（マゼンタ）、及び RFP 陽性 HUVEC（シアン）。クロス断面画像を右及び下に示した。スケー
ルバー＝100μm

3．フィーダー細胞の寄与
次に、造血促進の指標として内皮造血転換（Endothelial to Hematopoietic Transition：EHT）について、懸濁液及び AGM-on-a-chip で検討した（図 3a）。フィーダー細胞の存在は、HPC への転換（数）を大幅に促進した（図 3b）。
また、コロニー形成単位（Colony Forming Unit：CFU）について検討したところ、HPC 数と同様にフィーダー細胞による促進効果が認められた（図 3b）。2 週間の培養でフィーダー細胞の存在（図 3c）は、機能的な HPC を維持する上で重要であると示された。この発見は、MS と EC がゼブラフィッシュ HE の造血を促進することと一致する（Tamplin et al.2015）。さらに、CFU の比較においては、フィーダー細胞による EHT 促進効果は、1 週間と 2 週間の両方において浮遊培養に比して AGM-on-a-chip で高いことが明らかとなった（図 3c）。これらのデータは、AGMon-a-chip の利点を示していると考えられる。
続いて EHT における微小環境の影響について評価した。図 4a に示したように、AGM-on-a-chip からの HPC の生産を評価するチップで、マイクロ蠕動ポンプを使用して培地を灌流し、デバイスから流出した細胞をについてフローサ
イトメトリーによる分析を行ったところ、流出した細胞の平均 47％は CD34＋CD45＋であったが、一部フィーダー細胞も存在していた（図 4b）。デバイス内の細胞のフローサイトメトリー分析により、ほぼすべての HPC が流体せん断応力を加えることにより、チップから収穫することができた（約 0.25 ダイン cm-2）。また、コロニー形成を確認したところ、チップ内に新しく形成された HPC が灌流を利用することで、チップから継続的に収集された（図 4b、c）。これ
らのデータは、AGM-on-a-chip は、HPC を引き出して造血源としての他のタイプの Organs-on-chip と組み合わることが可能であることを示唆した。

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図 3．AGM-on-a-の EHT チップa） 実験スキーム。HE細胞にまたはを播種した。フィーダーセルなし・あり（AGMS-3及びHUVEC。
b、c）1〜2週間の培養後、チップから全細胞を収集して分析した。HPCマーカー（CD34及びCD45）及びメチルセルロースによるCFU造血アッセイを行った。

図4．AGM-on-a-chipの流出からのHPCの収集
a） 実験スキーム。GFP陽性HE細胞、AGMS-3細胞及びHUVECをデバイスに播種した。
b） 1週間の培養後、HPCマーカー（CD34及びCD45）とCFU造血アッセイで分析した。フローサ
イトメトリーによる分析はHPCマーカーを発現している細胞を測定し、デバイスあたりの流出液中のHPCの割合の平均を示した。
c） コロニーの蛍光顕微鏡像。スケールバー＝200μm。

本研究では、in vitro での AGM-on-a-chip を紹介した。血球が産生できる生体模倣 AGM としてのチッププラットフォームの開発は、ヒト iPS からの血球産生に貢献することが期待できる。AGM-on-a-chip は、浮遊細胞培養よりも3効率よく EHT を誘導した。コロニー形成能力を評価する試験管内アッセイではフィーダー細胞が血球産生にポジティブに働くことが示唆された。

共同研究者
本研究の共同研究者は、京都大学大学院工学部の鳥澤勇介である。

文 献1） Blaser BW, Zon LI. Making HSCs in vitro: don't forget the hemogenic endothelium. Blood 132, 1372–1378 (2018)
Blood. 2018 Sep 27;132(13):1372-1378. doi: 10.1182/blood-2018-04-784140
2） Diaz MF, Li N, Lee HJ, Adamo L, Evans SM, Willey HE, Arora N, Torisawa YS, Vickers DA, Morris SA,Naveiras O, Murthy SK, Ingber DE, Daley GQ, García-Cardeña G, Wenzel PL. Biomechanical forces promote
blood development through prostaglandin E2 and the cAMP-PKA signaling axis. J Exp Med. 2015 May
4;212(5):665-80. doi: 10.1084/jem.20142235.
3） Dzierzak E, Bigas A. Blood development: Hematopoietic stem cell dependence and Independence. Cell Stem
Cell. 2018 May 3;22(5):639-651. doi: 10.1016/j.stem.2018.04.015.

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