上原記念生命科学財団研究報告集, 35 (2021)

上原記念生命科学財団研究報告集, 35（2021）

46. 分子モーターの遺伝子変異による神経難病病態生理の研究
廣川 信隆
東京大学 大学院医学系研究科 分子構造・動態・病態学講座
Key words：KIF1A，キネシン分子モーター，遺伝子変異，シャルコー・マリー・トゥース病，CMT2緒 言
KIF1A は、軸索輸送における主要なキネシンスーパーファミリーモーター分子群のひとつで、シナプス小胞前駆体や TrkA 含有小胞を細胞体から軸索先端に輸送する［1～3］。マウス後根神経節（DRG）ニューロンでは、KIF1A がTrkA を細胞表面に提示することにより、PI3 キナーゼシグナル伝達経路を介したカプサイシン受容体 TRPV1 の活性が調節される［3］。このため KIF1A は痛みの発症に関与し、Kif1a＋／－マウスは進行性の感覚障害の表現型を持つ。このように KIF1A は神経の健康に必須であり、KIF1A の遺伝子変異はヒトの軸索神経障害および様々な神経症状と密接に関連している［4］。
シャルコー・マリー・トゥース病（CMT）は、下肢から始まる筋萎縮と感覚障害が上肢にまで進行し著しい QOL 低下をもたらす末梢神経性の神経変性疾患である。有病率は 1／2,500 人で、世界中に約 260 万人もの患者がいる［5］。
CMT の発症メカニズムの全貌は未だ解明されておらず、CMT 特異的に効果のある治療法は開発されていない［6］。
今回、米国の研究協力者により軸索型 CMT（CMT2）を発症する家系において、KIF1A に一塩基ミスセンス変異が見つかった。この変異アミノ酸は、KIF1A モータードメインの中のβ7 領域にあり、β7 領域の電荷の逆転を生じる。
β7 領域は、カーゴ結合・認識部位、ATP 結合部位、微小管結合部位などの KIF 分子内で重要と思われている構造要素とは離れており［7］、これまでにこの領域の変異が疾患に関わっていることは知られていなかった。我々が以前に解いたキネシンの三次元構造［8，9］から予測すると、β7 領域は、ATP 結合時にネックリンカー領域と相互作用すると推定されるが、その機能は不明である。そこで本研究では、未解明の KIF1A 分子内相互作用が予想されるβ7 領域とネックリンカーの結合を探索し、キネシンの駆動メカニズムの理解を深めるとともに、β7 領域の異常がどのようにCMT2 の発症に繋がるのかを明らかにする。

方 法
1．マウス DRG ニューロンの初代培養
DRG は 9〜12 ヶ月齢のオスの Kif1a＋／＋および Kif1a＋／－マウスから単離した。単離された DRG 細胞をラミニンでプレコートした 8 ウェル Lab-Tek II チャンバーカバーグラス（Thermo Scientific）に撒いた。12 時間の培養後に培地を交換し、5％CO２中 37℃で維持した。
2．マウス DRG ニューロンのライブイメージング
12 ヶ月齢の Kif1a＋／＋マウスから単離された培養 DRG ニューロンに、DIV 4 で WT-EGFP および Mut-EGFP をコードするアデノウイルスベクターを形質導入した。アデノウイルスベクターによる形質導入の 24〜30 時間後に、共焦点レーザー走査顕微鏡（Airyscan, LSM780; Zeiss）を使用し、細胞体から約 150μm 離れた軸索輸送を視覚化した。
画像は、567 ミリ秒間隔で 250 フレーム取得した。データ分析とカイモグラフの作成は、Fiji ソフトウェアを使用した。
粒子の速度と方向性は、カイモグラフの傾きから計算した。

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3．DRG ニューロンにおける TrkA, TRPV1 の免疫細胞化学
9〜11 ヶ月齢の Kif1a＋／＋および Kif1a＋／－マウスから分離された DRG ニューロンに、DIV 5 で WT-EGFP およびMut-EGFP をコードするアデノウイルスベクターを形質導入し、DIV 7 で固定・染色した。細胞表面の TrkA およびTRPV1 を染色するために、透過処理のプロセスはスキップした。DRG ニューロンの軸索は、共焦点レーザー走査顕微鏡（Airyscan、LSM780、Zeiss）を使用し観察した。
4．KIF1A コンストラクトとタンパク質サンプルの準備
野生型、変異型 KIF1A モータードメイン（aa 1～382）を大腸菌系で発現させ、アフィニティー精製、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーにより高純度で精製した。チューブリンはブタの脳から精製し、高モル濃度の Pipes バッファーを使用し重合・脱重合のサイクルを 6 回繰り返すことにより微小管関連タンパク質を除去した。
5．ATPase アッセイ
EnzChek リン酸アッセイキット（Molecular Probes）を使用し、分光光度計（V630-Bio、JASCO）を用いて 27℃で測定した。
6．微小管滑走アッセイ
スライドガラスとカバーガラスから組み立てたフローチャンバー上に、ペンタ-His 抗体を用いて KIF1A を結合させた。そこにローダミン標識微小管溶液を注入し、微小管の動きを観察した。タイムラプス画像は、ELYRAP.1 システム
TIRF 顕微鏡で 37℃で取得した。微小管滑走速度は、Fiji プラグイン Multi-kymograph で作成したカイモグラフの傾きから計算した。

結果および考察1．CMT2 患者家系における KIF1A 変異
CMT2 患者家系において見つかった変異は、KIF1A タンパク質のモータードメインのβ7 シート内にある（図 1）。
β7 は進化的に高度に保存されており、キネシン 3 ファミリーメンバータンパク質で共通であった［10］。

図1．KIF1Aのドメイン構造
KIF1Aタンパク質は、N末に推進力を生み出すモータードメインとネックドメイン、C末にカーゴとの結合ドメインを持つ。モータードメインにはATP結合部位や微小管結合部位変異が含まれるが、今回変異が見つかったβ7領域は、これらの部位とは離れていた。

22．KIF1A 変異体によるカーゴ輸送能の低下
β7 変異体が CMT2 患者の感覚神経にどのように影響するか明らかにするため、EGFP タグ付き野生型 KIF1A（WT-EGFP）とβ7 変異体（Mut-EGFP）を Kif1a＋／＋ DRG ニューロンと Kif1a＋／－ DRG ニューロンに発現させ、軸索における TrkA と TRPV1 の局在を調べた。その結果、細胞表面の TrkA シグナルは、Kif1a＋／＋よりも Kif1a＋／－の DRG ニューロンで有意に低く、この表現型は、WT-EGFP の過剰発現によってレスキューされたが、Mut-EGFP の過剰発現では WT-EGFP ほどレスキューされなかった（図 2A）。
同様に、NGF-TrkA シグナル伝達系によって細胞表面に提示されるカプサイシン受容体 TRPV1 の発現も、Kif1a＋／－では Kif1a＋／＋よりも有意に減少した。この表現型も WT-EGFP でレスキューできるのに対し、Mut-EGFP
ではレスキューされなかった（図 2B）。これらの結果は、β7 変異が Kif1a＋/—軸索の表現型を十分にレスキューすることができないことを示しており、β7 変異体がカーゴの適切な局在化を損なうことを示唆している［10］。

図2．WTおよびβ7変異体によるTrkA、TRPV1の軸索輸送
DRGニューロンの軸索表面におけるTrkA（A）、TRPV1（B）の免疫細胞化学および定量化グラフ。
ns：p＞0.05、*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001（Welch’s t test）。エラーバーはSEMを示す。 スケールバー：2μm。

3．β7 変異体による軸索輸送スピードの低下
WT とβ7 変異体の軸索輸送活性の違いを調べるため、DRG ニューロンに発現させた WT-EGFP と Mut-EGFP のライブイメージングを実施した。その結果、野生型、変異型ともに KIF1A の動きが観察できた（図 3A）。速度は MutEGFP の方が WT-EGFP の速度より約 25％遅かった（図 3B）。動きの方向性に違いはなかった（図 3C）［10］。

3図3．WTとβ7変異体のライブイメージングA） WT-EGFP および Mut-EGFP を発現する DRG ニューロンの小胞運動のカイモグラフ。
B） カイモグラフの傾きから計算された小胞の速度。 3 つの独立した実験からの平均と SD。 ****, p <0.0001; unpaired t test.
C） 観察開始時の小胞の方向。 ns：p = 0.1484（カイ二乗検定）。

4．β7 変異体の in vitro 運動活性の低下
KIF1A 運動活性に対するβ7 変異の影響をより詳細に明らかにするため、モータードメインコンストラクトを用いて in vitro 微小管滑走アッセイを実施した。その結果、β7 変異体による微小管の滑走速度は野生型による滑走速度よりも約 22％遅かった（図 4A）。
次に、微小管存在下でモータードメインコンストラクトの ATPase 活性を測定し、β7 変異体の速度の低下が ATP加水分解活性の低下によるものかを検証した。その結果、β7 変異体の ATPase 活性は WT よりも約 27％低かった（図 4B）。この結果は微小管の滑走速度とほぼ相関しており、β7 変異体のモーター運動が遅いことを説明できた。
一方、β7 変異体のミカエリスメンテン定数（Km）から、微小管結合親和性は W T とβ7 変異体に違いはなかった。
これらの in vitro のデータは、β7 変異体が微小管結合親和性の変化を誘発しないが、ATP 加水分解サイクルの遅延を引き起こすことを示していた［10］。

図4．WTとβ7変異体のライブイメージングA） WT および Mut による微小管滑走速度。
B） 微小管存在下における WT および Mut の ATPase 活性。4 つの独立した試験からの平均と SD。****p＜0.0001（two-way ANOVA）。

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共同研究者・謝辞
本研究の共同研究者は、東京大学医学系研究科の森川真夏氏、小川覚之助教（現・獨協医科大学先端医科学研究センター）、森川桃氏（現・筑波大学医学医療系）、田中庸介講師です。CMT2 変異に関する臨床情報については、
University of Iowa の Nivedita Uberoi Jerath 氏にお世話になりました。本研究に対し多大なご援助を頂きました
上原記念生命科学財団に厚く御礼申し上げます。

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