上原記念生命科学財団研究報告集, 35 (2021)

上原記念生命科学財団研究報告集, 35（2021）

168. 新規ミトコンドリア・小胞体連関維持機構の解析
渡邊 征爾
名古屋大学 環境医学研究所 病態神経科学分野
Key words：ミトコンドリア･小胞体膜間領域（MAM），σ1 受容体，ATAD3A，筋萎縮性側索硬化症（ALS）

緒 言
筋萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis：ALS）は、運動神経細胞が選択的に傷害される神経変性疾患である。著者は、これまでに ALS モデルマウスである変異 SOD1 マウスを用いた研究から、ミトコンドリアと小胞体の近接部位（mitochondria-associated membranes：MAM）の機能的・構造的な破綻が ALS において重要な病理的変化であることを明らかにしてきた［1］。近年、MAM の異常化はアルツハイマー病やハンチントン病など、様々な神経変性疾患と関連していることが明らかにされており、MAM の生理機能もオートファジーの隔離膜形成からインスリン抵抗性など、多岐に渡ることが明らかとなってきた［2］。しかし、MAM の破綻が様々な疾患で指摘される一方、その機序については必ずしも明らかでない。
本研究では、MAM の維持に必須であるσ1 受容体（Sig1R）と相互作用する分子としてミトコンドリア膜タンパク質である ATAD3A（ATPase AAA domain-containing protein 3A）を同定したことから、Sig1R と ATAD3A の相互作用を解析することによって、新規の MAM 維持機構を分子レベルで明らかにすることを目指した。

方法および結果
マウス神経芽腫細胞株 Neuro2a（N2a）に HA タグを付加したヒト ATAD3A と FLAG タグを付加した Sig1R を発現させ、抗 FLAG 抗体により共免疫沈降を行ったところ、ATAD3A が Sig1R と相互作用することを確認できた（図 1A）。また、これと同様の方法により、ATAD3A の機能的ドメインとされる Proline-Rich ドメイン（PR）、CoiledCoil ドメイン 1（CC1）、Coiled-Coil ドメイン 2（CC2）、および AAA ATPase ドメイン（AAA）の各ドメインを欠損した変異体（図 1B、C）で検討したところ、CC1、CC2 欠損変異体では共沈せず、N 末端側の Coiled-Coil ドメインが両者の相互作用に必須であることが明らかになった（図 1D）。

1

B- + - +- - + +Sig1R-FLAG
ATAD3A-HA- + - +- - + +Wild-type∆PR

IB: FLAG

CC1

CC2

mito

AAA ATPase

CC1

CC2

mito

AAA ATPase

AAA ATPase

2872

mito

CC2

mito

AAA ATPase

∆AAA

PR

CC1

CC2

mito

AAA ATPase (A3)

2AC

∆A
A

1C

∆C

ATAD3A-HA∆CSig 1R-FLAGSig 1R-FLAGmock
∆P
R

DCC2

CC1

1

ATAD3A-HAmock WT ∆PR ∆CC1 ∆CC2 ∆AAA

CC1PRC2∆AAAC

IP: FLAGPR∆CC2CInput∆CC1∆C52∆C74

IB: HA

IB: HA

PRmock∆PRA

IB: FLAG

52
43

IB: actin

IB: HA

43

Input

IP: FLAG

図 1．ATAD3A は N 末端側の CC1/CC2 ドメインを介して Sig1R と相互作用するA）

Sig1R-FLAG による ATAD3A-HA との共免疫沈降。N2a 細胞にそれぞれの発現用プラスミドをトランスフェクションし、抗 FLAG 抗体で沈降させた。

B、C）作製した ATAD3A のドメイン欠損変異体（B）。各変異体はイムノブロットで目的長に正しく発現することを確認した（C）。PR：Proline-rich、CC1/2：Coiled-Coil 1/2、mito：
mitochondria import signal、AAA：AAA ATPase。
D）

ATAD3A のドメイン欠損変異体と Sig1R-FLAG との共免疫沈降。CC1 または CC2 を欠損した ATAD3A は Sig1R と共沈せず、Sig1R との相互作用には CC1／CC2 のドメインが必要であると判明した。

次に、Sig1R と ATAD3A の相互作用が MAM の形成に与える影響を検証するため、著者らが独自に開発した MAMのレポーターMAMtracker-Luc（図 2A）を N2a 細胞に発現させて、MAM の定量的評価を行った。MAMtracker-Luc
は、分割型ルシフェラーゼである Nano-Bit®（Promega）を構成する LgBit と SmBit を各々小胞体膜上とミトコンドリア膜上に発現させるシステムであり、可逆的に MAM の増減を定量評価できる（図 2B）。この MAMtracker-Luc を用いた検討の結果、野生型 ATAD3A は非常に強く MAM の形成を誘導した一方、予想に反して、ATAD3A を強制発現させた N2a 細胞では、siRNA によって Sig1R をノックダウンしても MAM の量にはほとんど影響しなかった（図 2C）。これは ATAD3A が Sig1R のみならず、小胞体膜上の別のタンパク質とも結合して MAM を維持している可能性を示唆している。また、CC1、CC2 もしくは A3 のドメインを欠損した変異体では MAM の誘導が全く生じなかった（図 2D）。このときの細胞内における ATAD3A 変異体の局在を免疫染色によって確認したところ、CC1 またはCC2 の欠損変異体はミトコンドリアに、AAA 欠損変異体は小胞体にそれぞれ局在した（図 3）。以上の結果は、ATAD3Aの N 末端側が小胞体膜上のタンパク質と相互作用し、C 末端側はミトコンドリア膜に埋め込まれることで、ATAD3Aがリンカーとして両オルガネラをつないでいることを示唆している。さらに、変異 SOD1 マウスと Sig1R 欠損マウス
で ATAD3A の異常化が見られるか検討を行ったところ、それぞれのマウスの脳では ATAD3A の二量体化が促進されていることが判明した。このことから、Sig1R は ATAD3A の単量体化の維持に貢献している可能性が考えられた。

2

図 2．ATAD3A は MAM の形成を顕著に促進する
A） MAM の定量評価に用いた MAMtracker-Luc。小胞体（ER）側の LgBit とミトコンドリア側の SmBit が会合する（Kd＝190 mM）とルシフェラーゼが再構成され発光する。
B） 会合時の解離定数が大きいため、MAMtracker-Luc は可逆的に MAM をモニターできる。
C） MAMtracker-Luc によるATAD3A またはSig1R の有無がMAM に与える影響の評価。
Sig1Rと比較しても、ATAD3A は顕著に MAM の量を増加させた。siSig1R で ATAD3A によるMAM 増加を相殺できなかった一方、siAtad3a では Sig1R による MAM 増加を相殺できた
ので、Sig1R による MAM の増加は ATAD3A によるが ATAD3A の相互作用相手は Sig1Rに限らないと推測される。
D） ATAD3A のドメイン欠損変異体が細胞内の MAM 量に与える影響。Sig1R との結合に重要なCC1/2 の欠損のみならず、酵素活性に重要な AAA ドメインの欠損でも MAM の増加は抑制された。
一元配置分散分析（ANOVA）の実施後、Tukey の方法により多重比較を行った（*p＜0.05、****p＜0.0001、ns：p＜0.05）
（C、D）
。

3

図 3．ATAD3A ドメイン欠損変異体の細胞内局在
HEK293 細胞に各変異体を発現させ、免疫染色を行った。∆AAA 変異体のみ、ミトコンドリアと全く局在が一致しなかった。このことから、ミトコンドリア膜への挿入には AAA ATPase活性が必要であり、∆AAA 変異体で MAM が増加しないのは変異体がミトコンドリアに局在できないためと考えられた（スケールバー：10μm）。

考 察
本研究では、ATAD3A が小胞体膜上の分子である Sig1R と N 末端側 Coiled‐Coil ドメインを介して結合することを初めて示した。ATAD3A の強制発現が MAM を大きく増強したことを併せて考えると、ATAD3A が小胞体とミトコンドリアを直接的に結びつける、MAM のリンカー分子であることが明らかとなった。ATAD3A は Sig1R と相互作用する一方で Sig1R の抑制によっては MAM の増強作用が失われなかったことから、別の結合相手も小胞体膜上に存在すると考えられた。Coiled‐Coil ドメインは同じ Coiled‐Coil ドメイン同士でヘテロ二量体を形成する傾向が強く、MAM でも MFN2 が Coiled‐Coil ドメインによるリンカー分子として機能することが知られている［3］。従って、ATAD3A と結合する Coiled‐Coil ドメインをもった小胞体タンパク質が Sig1R とは別に存在すると考えられる。
一方、Sig1R 欠損マウスや ALS モデルマウスである変異 SOD1 マウスでは、ATAD3A の二量体化が促進されていた。
ATAD3A の二量体化はハンチントン病においてミトコンドリア機能異常の原因となることが指摘されており［4］、Sig1R は ATAD3A を単量体状態に維持することによってミトコンドリアの機能維持に貢献しているものと考えられた。
ALS における ATAD3A の多量体化制御の詳細を解明することが、今後、MAM を標的とした治療戦略を開発する上で重要になると考えられた。

共同研究者・謝辞
本研究の共同研究者は、名古屋大学環境医学研究所の山中宏二教授である。最後に、本研究に御支援を賜りました
上原記念生命科学財団に深謝致します。

4

文 献1） Watanabe S, Ilieva H, Tamada H, Nomura H, Komine O, Endo F, Jin S, Mancias P, Kiyama H, Yamanaka K.
Mitochondria-associated membrane collapse is a common pathomechanism in SIGMAR1- and SOD1-linked
ALS. EMBO Mol Med. 2016 Dec 1;8(12):1421-1437. doi: 10.15252/emmm.201606403. PMID: 27821430;
PMCID: PMC5167132.
2） Simoes ICM, Morciano G, Lebiedzinska-Arciszewska M, Aguiari G, Pinton P, Potes Y, Wieckowski MR. The
mystery of mitochondria-ER contact sites in physiology and pathology: A cancer perspective. Biochim Biophys
Acta Mol Basis Dis. 2020 Oct 1;1866(10):165834. doi: 10.1016/j.bbadis.2020.165834. Epub 2020 May 11. PMID:32437958.
3） Merkwirth C, Langer T. Mitofusin 2 builds a bridge between ER and mitochondria. Cell. 2008 Dec
26;135(7):1165-7. doi: 10.1016/j.cell.2008.12.005. PMID: 19109886.
4） Zhao Y, Sun X, Hu D, Prosdocimo DA, Hoppel C, Jain MK, Ramachandran R, Qi X. ATAD3A oligomerization
causes neurodegeneration by coupling mitochondrial fragmentation and bioenergetics defects. Nat Commun.
2019 Mar 26;10(1):1371. doi: 10.1038/s41467-019-09291-x. PMID: 30914652; PMCID: PMC6435701.

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