上原記念生命科学財団研究報告集, 33 (2019)

上原記念生命科学財団研究報告集, 33（2019）152. 代謝抑制剤としてのエンドサイトーシス阻害剤の検証
渋谷 周作
山口大学 共同獣医学部 獣医衛生学分野
Key words：mTORC1，アミノ酸，エンドサイトーシス，シグナル伝達

緒 言
Mechanistic target of rapamycin complex 1（mTORC1）は、アミノ酸－タンパク質代謝を担う主要なシグナル複合体であり、がんや老化の進行に関係が深いと考えられている。mTORC1 は細胞外のアミノ酸によって活性化されることが知られていたが、近年、アミノ酸が mTORC1 を活性化するメカニズムが急速に明らかになりつつある［1］。細胞外のアミノ酸は、リソソームの内腔に到達した後、細胞質の mTORC1 のリソソームへの移動を誘導することによってmTORC1 を活性化する。
この活性化は、リソソーム膜上の mTORC1 活性化因子である Ras homolog enriched in brain（Rheb）と mTORC1 が出会うことによる。しかし、細胞外のアミノ酸がどのようにしてリソソーム内腔に到達するのかは不明瞭な点が多かった。我々は最近の報告において「細胞外液取り込み機構であるエンドサイトーシスによりアミノ酸が細胞内に取り込まれ、mTORC1 を活性化する」というメカニズムを明らかにし［2］、この発見により、エンドサイトーシス阻害剤が mTORC1 阻害剤として機能する可能性が示された。
過去の報告では、mTORC1 を適度に抑制すると様々な細胞内シグナル伝達経路が活性化し、一般的に生体にとって望ましい反応が起こることが知られている（オートファジーの亢進、タンパク質・脂質合成の低下、炭水化物の利用低下、インスリン感受性の増加、寿命の延長）［3］。実際に、既存の mTORC1 阻害剤がすでに免疫抑制剤、抗がん剤として臨床応用されているが、mTORC1 をターゲットとした阻害剤を細胞に投与すると、代償性の栄養利用（外界からの栄養取り込み亢進・オートファジーによる栄養素生成の亢進）が起こる［4］。このことが、阻害剤としての完全性を損ねている。エンドサイトーシス阻害剤はこれらの代償性反応をも阻害するため、効率よく細胞の栄養利用を阻害することができると考えられる。また、mTORC1 阻害剤は長期投与すると、近縁の mTORC2 も阻害してしまう。mTORC1阻害剤はこのオフターゲット効果（mTORC2 阻害）により、インスリン抵抗性の増悪などの副作用を引き起こすことが知られている［3］。一方、エンドサイトーシス阻害剤はその作用メカニズムから考えて mTORC2 に影響を及ぼさないと考えられ、実際に影響しないことが確認されている［2］。
本研究においては「過栄養を原因とする疾患の治療・予防に向けたエンドサイトーシス制御」という新しいアプロー
チの実現に向けて、細胞レベルでの栄養取り込み阻害剤としてのエンドサイトーシス阻害剤が、細胞に及ぼす影響を明らかにすることを目的とする。

方 法
1． 細胞
HEK293T（293T）細胞は理化学研究所から購入し、10% fetal bovine serum（FBS）および 1×ストレプトマイシン／ペニシリンを含む DMEM 培地（Wako）内で 5% CO2 インキュベーターを用いて培養した。
2． ウエスタンブロット
293T 細胞を 10% Nu-serum（Thermo Fisher）を含む RPMI 培地（Wako）に懸濁し、コラーゲン（Cellmatrix typeI-C、新田ゼラチン）でコートした 12 ウェルプレートに 2×10５ cells/well で播種した。ダイナミン阻害剤 Dynasore（ダイナソア）（Abcam）は FBS 中のアルブミンによって不活化されることが報告されているため［5］、ダイナソア処理時には FBS の代わりに Nu-serum を用いた。細胞を CO2 インキュベーター内で 18～21 時間培養した後、各図に記
1

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載の通りに細胞を処理した。その後、細胞を Phosphate-buffered saline（PBS）にて洗浄し、氷冷した Lysis バッファー（20 mM Tris-HCl（pH 7.5）
、50 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、2.5 mM Pyrophosphate、1 mM βglycerophosphate、1 mM Orthovanadate、1% Triton X-100、protease inhibitor cocktail（cOmplete, Sigma-Aldrich））を加えて細胞を溶解した。細胞溶解液は 14,000 rpm、4℃で 10 分間遠心し、上清を SDS-PAGE サンプルバッファーと混合した後、95℃で 5 分間処理した。サンプルは 10%または 15%アクリルアミドゲルを用いた SDS-PAGE にて分離し、PVDF メンブレンに転写した。メンブレンはブロッキングバッファー（0.1% Tween 20 および 2%スキムミルクを含む Tris-buffered saline）で処理し、目的のタンパク質を特異的な一次抗体および二次抗体で検出した。検出にはEzWestLumi plus（Atto）と LuminoGraph I（Atto）を用いた。
3． 細胞数の測定
293T 細胞を 10% Nu-serum を含む RPMI 培地に懸濁し、コラーゲン（Cellmatrix type I-C）でコートした 6 ウェルプレートに 2×10５ cells/well で播種した。細胞を CO2 インキュベーター内で 20.5～21 時間培養した後、各図に記載の薬剤で 24 時間処理した。その後、細胞を 500μl の 0.05%トリプシンで剥離し、500μl の 10% Nu-serum 含 RPMI培地を加えて懸濁した。さらに等量の 0.4%トリパンブルーを加え、TC20 全自動セルカウンター（Bio-Rad）を用いて細胞数を測定した。得られた結果は、Prism 7（GraphPad Software）を用いた ANOVA および Dunnett の多重比較検定により統計解析を行った。
4． Water-soluble Tetrazolium salts （WST）アッセイ
細胞の代謝活性を測定するために、Cell Counting Kit-8（同仁化学）を用いた WST アッセイを行った。293T 細胞を 10% Nu-serum を含む RPMI 培地に懸濁し、96 ウェルプレートに 1×10４ cells/well で播種した。細胞を CO2 インキュベーター内で 20.5～21 時間培養した後、各図に記載の薬剤で 24 時間処理した。各処理は 3 ウェル分行い、平均値を算出した。薬剤処理後、10μl の Cell Counting Kit 試薬を各ウェルに加え、プレートを CO2 インキュベーター内で 2 時間静置し、iMark プレートリーダー（Bio-Rad）を用いて 450 nm の吸光度を測定した。薬剤自体が 450 nm 吸光度値をもつ場合があるため、細胞を含まず薬剤のみ加えたウェルの 450 nm 吸光度値をバックグラウンド値として用いた。得られた結果は、Prism 7（GraphPad Software）を用いた ANOVA および Dunnett の多重比較検定により統計解析を行った。
5． フローサイトメトリー
上述の「細胞数の測定」と同様の方法で、293T 細胞を 6 ウェルプレート内で培養し、各図に記載の薬剤で 24 時間処理した。その後、細胞を 500μl の 0.05%トリプシンで剥離し、500μl の 10% Nu-serum 含 RPMI 培地を加えて懸濁した。細胞を 1.5 ml チューブに移し、1,500 rpm（200×g）で 3 分間遠心し、上清を除去したのち、細胞を 1 ml の氷冷した 70%エタノールに懸濁し、氷上で 30 分間静置して固定した。その後、細胞を 2,500 rpm（500×g）、4℃で 2 分間遠心し、上清を除去し、0.2% gelatin を含む PBS で洗浄した後、50μl の 100μg/ml DNase-free RNase と 300μlの 50μg/ml ヨウ化プロピジウムを加えて核を染色した。染色後の細胞は BD Accuri C6 フローサイトメーター（BDBiosciences）を用いて測定した。

結果および考察1． エンドサイトーシス阻害剤はラパマイシン非感受性の 4E-BP1 リン酸化サイトの脱リン酸化を誘導する。
mTORC1 はセリン・スレオニンキナーゼ複合体である。過去の研究において、mTORC1 阻害剤であるラパマイシンは mTORC1 によるリン酸化サイトの一部のみを脱リン酸化することが明らかにされている［6］。我々は以前の研究において、ダイナソアによるエンドサイトーシス阻害が、mTORC1 活性の抑制を引き起こすことを示した［2］。しかし、これはラパマイシン感受性の（比較的脱リン酸化されやすい）リン酸化サイトである S6K（Thr389）を用いた実験によるものであったため、ラパマイシン非感受性の（脱リン酸化されにくい）リン酸化サイトについてはエンドサイトーシス阻害の効果は不明であった。本研究において我々は、まずラパマイシン感受性サイトである S6K（Thr389）が 80μM のダイナソアによって脱リン酸化されることを再確認した（図 1）。同様に、mTORC1 阻害剤であるラパマ
イシン、mTORC1/2 阻害剤である Torin 1、アミノ酸飢餓によっても S6K（Thr389）の脱リン酸化が確認された（図2上原記念生命科学財団研究報告集, 33（2019）1）。
続いて、ラパマイシン非感受性の 4E-BP1（Thr37/46）リン酸化サイトについても調べた。過去の報告と一致するように ［7］、4E-BP1（Thr37/46）は 50 nM および 250 nM Torin 1 やアミノ酸飢餓によって脱リン酸化されたが、ラパマイシン処理では脱リン酸化されなかった（図 1）。一方、80 μM ダイナソアによって 4E-BP1（Thr37/46）は脱リン酸化された。よって、ダイナソアによるエンドサイトーシス阻害は、Torin 1 やアミノ酸飢餓と同様に、比較的脱リン酸化されにくいラパマイシン非感受性リン酸化サイトをも脱リン酸化することが明らかとなった。
mTORC2 によってリン酸化される Akt（Ser473）は、Torin 1 によって脱リン酸化されたが、ダイナソア、アミノ酸飢餓、ラパマイシンいずれによっても脱リン酸化されないことが確認された（図 1）。
以上の結果より、ダイナソアおよびアミノ酸飢餓は、ラパマイシン非感受性リン酸化サイトである 4E-BP1（Thr37/46）の脱リン酸化を誘導することから、Torin 1 と同様に強力な mTORC1 抑制作用を持つが、mTORC2 活性には影響を与えずに mTORC1 特異的である点において Torin 1 とは異なることが示された。リソソーム内のアミノ酸は v-ATPase や SLC38A9 などの分子を介してリソソーム膜上の Rag GTPase を活性化し、Rag と mTORC1 の結合を開始させることで mTORC1 をリソソームにトラップし、リソソーム上の mTORC1 活性化因子である Rheb による mTORC1 活性化を促進する ［1］。ダイナソアによるエンドサイトーシス阻害は、細胞外のアミノ酸がリソソーム内腔に輸送されるのを防ぎ、アミノ酸飢餓と同様の結果をもたらしたと推測される。

図 1．ダイナソアはラパマイシン非感受性のリン酸化サイト 4E-BP1（Thr37/46）を脱リン酸化する
293T 細胞を 0.1% DMSO （vehicle）、ダイナソア、ラパマイシン、Torin 1 で 24 時間処理した。
または、10%の透析済み Nu-Serum を含むアミノ酸不含 RPMI1640 培地で 24 時間処理し、アミノ酸飢餓を行った。3 回の独立した実験の代表例を示す。

2． エンドサイトーシス阻害剤は細胞の増殖および代謝を抑制する。
以上の結果より、エンドサイトーシス阻害剤により mTORC1 活性が強力に抑制されることが明らかとなった。その結果、細胞機能にどのような影響があるのかを調べるため、我々はまず、エンドサイトーシス阻害が細胞増殖に及ぼす結果を検証した。過去の報告により、Torin 1 はラパマイシンよりも強く細胞増殖を抑制し、その細胞増殖抑制はmTORC2 に非依存的であることが示されている［7］。この報告と一致するように、24 時間の Torin 1 処理により、薬剤濃度依存的に細胞数が減少したが、ラパマイシンは細胞数にはほとんど影響しなかった（図 2A）。一方、ダイナソアによるエンドサイトーシス阻害およびアミノ酸飢餓は、細胞数を大きく減少させた（図 2A）。トリパンブルー染色により細胞の生存率を測定したところ、すべての処置群において明らかな細胞死は確認されなかった（図 2B）。したがって、3

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図 2A でみられた細胞数の減少は細胞死の誘導によるものではなく、細胞増殖の抑制によるものだと推測された。
続いて、細胞の代謝活性を測定する WST アッセイを行った。WST 試薬は細胞内の NADH や NADPH により還元されることで発色するため、細胞の代謝活性の指標として用いられる。図 2C に示すように、ダイナソアと Torin 1 は同様に濃度依存的に細胞代謝を抑制した。アミノ酸飢餓も細胞代謝を強く抑制した。一方、ラパマイシンは濃度非依存的に代謝を抑制した。
ラパマイシン非感受性のリン酸化サイトを有する 4E-BP1 は、細胞周期の制御因子の発現に関与することが示されている［7］。このことと一致するように、4E-BP1 の脱リン酸化を誘導したダイナソア、アミノ酸飢餓、および Torin 1は強く細胞増殖および細胞代謝を抑制し、4E-BP1 脱リン酸化を誘導できないラパマイシンは細胞代謝のみ抑制し、増殖は抑制しなかった。

図 2．ダイナソアは細胞の代謝と増殖を抑制する
3 回の独立した実験の平均±標準偏差を示す。
A)

293T 細胞を 0.1% DMSO（vehicle）、ダイナソア、ラパマイシン、Torin 1、アミノ酸不含培地で 24 時間処理した後、トリパンブルーで染色されなかった生細胞数を測定した。
コントロール群（vehicle）と比較して、****：p < 0.0001。

B)

293T 細胞を（A）と同様に処理し、トリパンブルーで染色されなかった生細胞の、全細胞数における割合を生細胞率として算出した。

C)

293T 細胞を（A）と同様に処理し、細胞の代謝活性を WST アッセイにより測定した。
コントロール群（vehicle）と比較して、**：p < 0.01、****：p < 0.0001。

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3． エンドサイトーシス阻害剤はアミノ酸飢餓と同様に S 期における細胞周期停滞を誘導する
ダイナソア、アミノ酸飢餓、Torin 1 が細胞増殖を抑制することが判明したため（図 2A）、次に、フローサイトメトリーを用いて細胞周期をより詳細に調べた。その結果、24 時間のアミノ酸飢餓を行った細胞においては、S 期の細胞が増加し、G2/M 期の細胞が減少していた（図 3）。アミノ酸飢餓と同様に、ダイナソアで 24 時間処理した細胞においても、薬剤濃度依存的に S 期の増加と G2/M 期の減少が認められた（図 3）。250 nM の Torin 1 で処理した細胞においても S 期の増加が認められたが、10 nM および 50 nM の Torin 1 では S 期の増加は認められなかった。したがって、細胞数測定で細胞増殖抑制が認められたすべての条件（アミノ酸飢餓、20～80 μM ダイナソア、250 nM Torin 1）（図2A）において、S 期の増加が認められた（図 3）。対照的に、ラパマイシンは S 期の増加は認められなかった（図 3）。
これらの結果より、ダイナソア、アミノ酸飢餓、Torin 1 で認められた細胞増殖の抑制は、S 期での停滞が原因である可能性が考えられた。mTORC1 は細胞周期制御因子の発現の調節だけでなく、DNA の生合成を促進することが知られている［8］。強力な mTORC1 抑制の結果、S 期における DNA 複製に必要な DNA 分子が十分に供給されなくなり、S 期での停滞が起こったのかも知れない。

図 3．ダイナソアは S 期における細胞周期停滞を誘導する
293T 細胞を 0.1% DMSO（vehicle）、ダイナソア、ラパマイシン、Torin 1、アミノ酸不含培地
で 24 時間処理した後、固定し、ヨウ化プロピジウムで核を染色した。
A)

染色した細胞をフローサイトメトリーで解析した。3 回の独立した実験の代表例を示す。

B)

細胞周期プロファイルを G1、S、G2/M 期に分けて定量した。3 回の独立した実験の平均±標準偏差を示す。

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4. まとめ阻害剤を用いたダイナミン依存的エンドサイトーシスの阻害は、mTORC1 を強力に抑制することが明らかとなった。
これは、アミノ酸のエンドサイトーシスを阻害することにより細胞にアミノ酸飢餓を引き起こした結果であると推測される［2］。さらに、エンドサイトーシス阻害剤、アミノ酸飢餓、Torin 1 など強力に mTORC1 を抑制する条件においては、細胞周期の S 期における停滞が引き起こされることが明らかとなった。
薬剤を用いた mTORC1 の抑制は、がんや老化の進行を抑制する手段として検討されている。しかし、mTORC1 自体をターゲットとした阻害剤は、mTORC1 阻害の結果としてオートファジーを誘導してしまう。誘導されたオートフ
ァジーはタンパク質を含む細胞質成分の分解による栄養素生成という代償性の反応を引き起こす［9］。さらに、
mTORC1 の阻害はエンドサイトーシスを誘導することが知られており、その結果として代償性の細胞外の栄養素の取り込みを誘導してしまう［4］。エンドサイトーシス阻害剤はこれらの代償性のオートファジーおよびエンドサイトーシス誘導を伴わないため［2］、強力な栄養取り込み阻害剤として機能すると考えられる。また、哺乳類においては、血中のアミノ酸濃度は厳密に制御されており、空腹時においても安定している。このことから、人為的なアミノ酸摂取抑制によりアミノ酸飢餓状態を作り出すのは難しい。この点において、エンドサイトーシス阻害剤によるアミノ酸の取り込み抑制は、細胞レベルにおけるアミノ酸飢餓誘導剤として過栄養を原因とする疾病に対して有効な手段となり得るかも知れない。

共同研究者・謝辞
山口大学共同獣医学部獣医衛生学研究室の岩田祐之教授をはじめとし、研究に協力してくださった研究室のメンバーに御礼申し上げます。

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