上原記念生命科学財団研究報告集, 32 (2018)

上原記念生命科学財団研究報告集、 32（2018）63. アレルギーにおける ILC2 の獲得免疫活性化機構の解明
茂呂 和世
理化学研究所 統合生命医科学研究センター 自然免疫システム研究チーム
Key words：ILC2，IL-33，IL-4，IRF4，IgE

緒 言
2 型自然リンパ球（Group 2 innate lymphoid cell：ILC2）は、寄生虫・真菌感染やアレルギー性疾患で産生がみられる IL-25 や IL-33 に反応することで 2 型サイトカインである IL-5、IL-6、IL-13 を産生する。IL-5 は好酸球の浸潤を、IL-6 は B 細胞による抗体産生を、IL-13 は杯細胞過形成によるムチン産生を促進することで寄生虫・真菌感染では積極的な排除に働き、アレルギー性疾患では病態の悪化因子として働く。我々が ILC2 を報告するまでは、2 型ヘルパーT 細胞（Th2 細胞）が 2 型サイトカインの主な産生源であると考えられてきたが、ILC2 の発見によって生体内には2 種類の主要な 2 型サイトカイン産生細胞が存在し、ILC2 は自然免疫において、Th2 細胞は獲得免疫において 2 型免疫反応を誘導することが明らかになった。2 つの 2 型サイトカイン産生細胞の大きな相違点は、活性化のトリガーと、産生するサイトカイン種類であると考えられてきた。ILC2 は抗原認識受容体を持たないが、寄生虫や真菌、アレルゲンのもつ酵素が引き起こす上皮細胞のネクローシスに伴い産生される IL-33 によって活性化する。一方、抗原認識受容体を持つ Th2 細胞は寄生虫や真菌、アレルゲン自体を抗原として特異的に認識することで活性化する。どちらの細胞も IL-5、IL-6、IL-13 を産生するが、Th2 細胞が抗原刺激によって IL-4 を産生するのに対し、ILC2 は IL-33 刺激を受けてもIL-4を産生しないことがわかっている。
2型サイトカインの中でもIL-4は多様な細胞に影響を与えることから、その重要性は膨大な報告によって示されており、特に、Th2 細胞の分化誘導と、アレルギー診断の指標としても使われる IgE のクラススイッチに必須であることが知られている。Th2 細胞は IL-4 を産生し IgE 産生を誘導することが知られているが、Th2 細胞の分化自体にも IL-4 が必須であることから、Th2 細胞の分化を促す IL-4 の産生源については長きに渡り議論されてきた。好塩基球、メモリーT 細胞、NKT 細胞、肥満細胞などがその産生源として報告されてきたが、議論の決着には未だ至っていない。
ILC2 の IL-4 産生は IL-33 刺激で見られないものの、ChIP アッセイから IL-4 遺伝子座が常にオープンであること、また、非生理的刺激である PMA + ionomycin 刺激では IL-4 を産生することが in vitro の実験からわかっていた。生理的刺激によって ILC2 が IL-4 を産生する可能性を探るため、様々な条件検討を重ねた結果、喘息モデルマウスから分離した ILC2 に炎症時に産生される脂質メディエーターの 1 つであるロイコトリエン D4（LTD4）で刺激すると IL-4産生が見られることが明らかになった。IL-4 産生はナイーブなマウスから分離した ILC2 では見られないことから、アレルギー発症によって誘導される何らかの因子が ILC2 の IL-4 産生能に寄与することが示唆された。また、ナイーブ
な ILC2 は LTD4 受容体である cysLTr1 を発現しないが、IL-2 や IL-7 刺激によって受容体発現が誘導されること、さらに受容体発現には IRF4 シグナルが必須であることが明らかになった。ILC2 の IRF4 発現を促進する因子については明らかになっていなかった。
自然免疫系の細胞である ILC2 による 2 型サイトカイン産生は Th2 細胞と比べて非常に早いことを特徴とし、好酸球の浸潤に必須である IL-5 に関しては恒常的に少量ずつ、短時間の IL-33 刺激で多量に産生する。これまでの研究か
ら、アレルゲンが体内に侵入すると酵素活性により上皮細胞が傷害され、IL-33 を産生させることで急速な ILC2 の IL5 産生を誘導し、好酸球の浸潤が起こることがわかっていた。好酸球性炎症の結果上昇した IL-2、IL-7 発現が cysLTr1を発現させると予想された。さらに好酸球性炎症では LTD4 の産生が起こることが知られていたため、これらの刺激を受けた ILC2 が IL-4 を産生し始めると考えられた。このようにして ILC2 の産生する IL-4 が 5 日前後で立ち上がる
Th2 細胞や B 細胞からの IgE 産生などの獲得免疫反応を誘導すると予想された。ILC2 の IL-4 産生能については国内
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外の多数のグループが検討を重ねてきたが、生理的条件下での産生は未だ明らかになっていない。本研究ではこれまで得られた知見をもとに、ILC2 の IL-4 産生機構を明らかにし、ILC2 の IL-4 が獲得免疫系へ与える影響を明らかにすることを目的とした。

方 法
1．ILC2 による IL-4 産生機構の解明
ILC2 の IL-4 産生には LTD4、IL-2 や IL-7、IRF4 の発現が必要であることが明らかになっていたが、これらの因子がどのような相互作用を持つことで最終的に IL-4 産生へと至るのかは明らかになっていなかった。そこで、in vitro の系やノックアウトマウスを用いた解析を行うことで、ILC2 の IL-4 産生機構の全貌を明らかにした。
2．ILC2 による IL-4 を介した獲得免疫誘導機構の解明
ILC2 の IL-4 産生機構が明らかになった後、ILC2 の産生する IL-4 がどのような役割を持つかを明らかにするために、IL-4 が誘導する獲得免疫反応に着目し解析を行った。IL-4 は多様な機能を持つが、特に Th2 細胞の分化誘導と B細胞による IgE 産生での重要性はよく知られている。そこで、Th2 細胞については in vitro の系を用いて、B 細胞について in vitro と in vivo の両方の系を用いて解析した。

結果および考察1．ILC2 による IL-4 産生機構の解明
ILC2 の IL-4 産生には IRF4 発現が必須であることが IRF4 欠損マウスを用いた解析から明らかになっていたが、ILC2 の IRF4 がどのようにして発現するかが明らかになっていなかったため、肺のナイーブな ILC2 を分離し、様々なサイトカイン刺激を行ったところ、IL-33刺激によってILC2のIRF4発現が上昇することが明らかになった（図1a）。
生理的な条件下で ILC2 の IRF4 発現が IL-33 依存的に誘導されるかを調べるために IL-33 欠損マウスや IL-33 同様ILC2 の 2 型サイトカイン産生を誘導することが知られている IL-25 欠損マウスを用いて papain 誘導性喘息モデルマ
ウスを作製したところ、IL-33 の欠損によって ILC2 の IRF4 発現が消失することが確認できた（図 1b）。さらに papain誘導性喘息モデルマウスで出現する IL-4 陽性 IRF4 陽性 ILC2 が IL-33 欠損マウスでは消失することも確認した（図1c）。

図 1．ILC2 の IRF4 発現は IL-33 によって誘導される
a）ILC2 にサイトカイン刺激を行った際の IRF4 発現b）サイトカイン欠損マウスを用いた papain 誘導性喘息における肺の ILC2 の IRF4 発現c）サイトカイン欠損マウスを用いた papain 誘導性喘息における肺の IL-4＋ILC2 の数（統計：One way ANOVA）

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気管支喘息では上皮細胞がネクローシスを起こすことで IL-33 が放出されることが分かっていたが、この IL-33 はILC2 の IRF4 発現を亢進することで ILC2 からの IL-4 産生を誘導することが明らかになった。その際、IL-33 刺激によって ILC2 が IL-5 を産生することで好酸球が浸潤し、この好酸球が LTD4 を産生する。ILC2 が LTD4 刺激を受け取るためには LTD4 受容体である cysLTr1 を発現しなくてはいけないがこれは IL-2 刺激によって誘導される。これらの結果は、ILC2 の IL-4 産生は IL-2 と IL-33 というサイトカインのみで誘導可能であることを示している。そこで、
抗原非依存的にサイトカインのみで本当に ILC2 が生体内で IL-4 を産生できるのかを調べるために、IL-4／GFP レポーターマウスの肺にリコンビナント IL-2 と IL-33 投与を行った。その結果、ILC2 による IL-5 や IL-13 産生は早期に起こることが知られているのに対し、IL-4 産生は 4 日以上の時間をかけて産生されることが明らかになった（図２）。
獲得免疫系は 5～7 日の時間をかけて誘導されることが知られていることから、サイトカインによって誘導される ILC2の IL-4 産生が獲得免疫系に影響を当たれる可能性が強く示唆された。

図 2．ILC2 の IL-4 産生は抗原非依存的にサイトカインによって誘導される
リコンビナント IL-2 と IL-33 を経鼻的に肺に 3 回投与した結果、Lineage 陰性で KLRG1 を発現する ILC2 が 4 日目から IL-4 を産生することが IL-4／GFP レポーターマウスを用いることで明らかになった。

2．ILC2 による獲得免疫活性化機構の解明
ILC2 の IL-4 産生の意義を調べるためにまず T 細胞の Th2 細胞への分化に注目した。papain 誘導性喘息モデルマウ
スの肺から分離した ILC2 をナイーブマウスの脾臓から分離した T 細胞と LTD4 存在下で共培養し、5 日目の T 細胞をフローサイトメトリー解析によって評価した。Th2 細胞は GATA3 と CD4 を共発現することが知られているが、GATA3＋CD4＋T 細胞がポジティブコントロールとして用いた IL-4 添加サンプルと ILC2 と LTD4 添加したサンプルで著明に増加した（図 3）。一方、抗 IL-4 抗体を添加した ILC2 と LTD4 添加サンプルでは Th2 細胞は検出されなかった。この結果は ILC2 が LTD4 存在下で IL-4 産生を促進することで Th2 細胞分化を誘導することを示した（図 3）。

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図 3．ILC2 の IL-4 産生は T 細胞を Th2 細胞へと分化させる
papain 誘導喘息モデルマウスから活性化した ILC2 を分離し、脾臓 T 細胞との共培養を行った。GATA3 を発現するTh2 細胞が LTD4 刺激を受けた ILC2 との共培養で誘導された。
（統計：One way ANOVA，****P < 0.0001）

次に ILC2 の IL-4 産生が B 細胞の抗体産生にどのような影響を与えるかを調べるために、野生型および IL-4 欠損マウスの肺に IL-2 および IL-33 を投与し血清中の抗体産生を確認した。IL-2 と IL-33 投与を行った野生型マウスで特異的に IgE 産生が誘導されたことから、これらのサイトカインに反応する ILC2 が IL-4 依存的に IgE 産生を誘導することが示唆された。一方、IL-4 依存的に産生される IgG1 については恒常的な産生が見られることが確認された（図 4）。
ILC2 の産生する IL-4 が B 細胞の IgE 産生に関わることが明らかになったが、この IgE 産生は B1 細胞が産生源であること、さらに B1 細胞の産生する IgE が好塩基球や肥満細胞などの Fcε 受容体を持つ細胞の生存に寄与することが明らかになった。

図 4．IL-2 と IL-33 の肺への投与は IL-4 依存的に血清 IgE 産生を促進する
以上の結果から、本研究では ILC2 による IL-4 産生機構が明らかになり、この IL-4 産生が Th2 細胞や B1 細胞による IgE 産生といった獲得免疫機構の誘導に重要であることが分かった。自然免疫系の細胞である ILC2 が獲得免疫系を誘導し、さらにそれによって出された IgE がまた自然免疫系の細胞であるミエロイド系細胞の生存に寄与することは興味深い。IL-4、IgE、LTD4 は現在、誘導メカニズムが明らかになっていない NSAID 過敏症（アスピリン喘息など）で高発現する共通因子である。NSAID 過敏症は抗原非依存的に起こるアレルギーとして知られているが、ILC2 による IL-4 産生がこの病態を誘導するのではないかと考えさらなる解析を行っている。

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共同研究者・謝辞
本研究は理化学研究所生命医科学研究センター自然免疫システム研究チーム本村泰隆が行った。共同研究者は、理化学研究所生命医科学研究センター免疫細胞システム研究グループの小安重夫、長崎大学大学院医師役総合研究科免疫学分野の由井克之先生である。

文 献1） Satoshi Koga, Katsuto Hozumi, Ken-ichi Hirano, Masaki Yazawa, Tommy Terooatea, Aki Minoda, TakashiNagasawa,Shigeo Koyasu, Kazuyo Moro Peripheral PDGFRα+gp38+ mesenchymal cells support thedifferentiation of fetal liver–derived ILC2. J Exp Med. 2018 in press
2） Kojo S, Tanaka H, Endo TA, Muroi S, Liu Y, Seo W, et al. Priming of lineage-specifying genes by Bcl11b isrequired for lineage choice in post-selection thymocytes. Nat Commun. 2017;8(1):702. Epub 2017/09/28.
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5） Moro K, Koyasu S. Innate lymphoid cells, possible interaction with microbiota. Semin Immunopathol.
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