上原記念生命科学財団研究報告集, 33 (2019)

上原記念生命科学財団研究報告集, 33（2019）20. 安定同位体呼気試験によるビタミン A 栄養状態の評価法
松浦 知和
東京慈恵会医科大学 医学部 臨床検査医学講座
Key words：ビタミン A，安定同位体，呼気試験，栄養状態，質量分析法

緒 言ビタミン A（VA）欠乏症は、貧困、戦争といった社会情勢とも密接に関与しており、未だに、アフリカや南・東南アジアでは VA 欠乏症が蔓延している。WHO によると、世界では 980 万人の妊娠女性が VA 欠乏による眼球乾燥症を発症し、失明に至る事例も多い。また、およそ 1 億～1 億 4 千万人の子供が VA 欠乏状態で、毎年 25～50 万人が視力を失い、さらにその半数が失明後命を落としている［1］。免疫不全による易感染性によって、はしかや下痢性腸疾患、呼吸器感染症での乳幼児死亡率が極めて高くなる。一方、一見豊かな国・日本においてもまた、貧困・偏食・飲酒・消化器疾患などを原因とする VA 不足・欠乏が問題となっている。小児喘息と VA 不足の関係について、我々も報告してきた［2］。VA 欠乏・不足の診断は、夜盲症、眼球乾燥症といった臨床症状と、血中 VA であるレチノール（ROH）の高速液体クロマトグラフィー法（HPLC）による測定で行われる。しかし、生体では肝臓の VA 貯蔵細胞である星細胞（伊東細胞）に通常は 80～90%の VA がエステル型 VA（主に retinyl palmitate：R pal）として蓄えられており、そのリザーブされた VA が欠乏してはじめて血中 ROH レベルが低下する。このため、従来の血中 VA 測定方法では、VA 欠乏を末期状態でしか診断できない。
本研究では、肝臓における VA 貯蔵状態を評価することで、生体の VA の栄養状態（過剰・正常・不足・欠乏）を診断するための 13C-VA 呼気試験を新規に開発する。13C-VA 呼気試験は、簡便ではあるが、早期の VA 欠乏を検知できる可能性がある。新規 13C-VA 呼気試験によって、生体の VA の栄養状態を簡便に評価できれば、欠乏に至る前の潜在的不足患者への栄養改善に介入できる。日本では、VA 不足が疑われる乳幼児・貧困家庭学童・老人の VA 栄養状態を評価し、不足・欠乏があれば栄養指導・栄養補充で介入できる。世界的な VA 欠乏地域でも、地域の一定数の住民を抽出し、現場で 13C-VA 呼気を行えば、 地域の VA 栄養状態を明らかにして、VA サプリメントの投与などで介入できる。
13C-VA 呼気試験の原理であるが、通常は生体の 80～90%の VA を貯蔵する肝臓星細胞での R pal プールが小さい（VA 不足・欠乏状態）で、検査食とともに 13C-R pal を摂取すると、13C-R pal は、肝細胞で水酸化され 13C-ROH となり、さらに、13C-レチノイン酸（RA）に酸化され、最終的に 13CO2 となって呼気中に排出される。肝臓での VA プールが小さいと 13C-Rpal は肝臓での貯蔵に回らず、末梢で消費されるため、呼気の 13CO2 排出量は増加する（VA 栄養状。放射性同位元素で態不足・欠乏）。VA プールが大きいとその逆で呼気の 13CO2 排出量は低下する（VA 栄養状態正常）。本研究は、放射性ある 14C でラベルした R pal を投与すると、呼気に 14CO2 が検出されることが確認されている［3］
崩壊を起こさない安定同位体 13C が標識された R pal を用いる、安全で非侵襲的な検査法開発である。なお、実際の研究では、経口製剤として臨床でも服用され、retinol より安定で、R pal より合成が簡便な retinyl acetate（R ace）を用いることとした。

方 法
1.

13C-retinyl acetate の合成

呼気試験に用いる 13C-VA は、神戸薬科大学・和田昭盛教授によって合成された。VA の 13 位の炭素を 13C にラベルした 13C-retinyl acetate（13C-R ace）を合成した。
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2．13CO2 の測定
13CO2 の測定は、呼気ガス用質量分析装置 ブレスマス（日本金属化学株式会社）で行った。呼気バックに採取したガスを 5 mL ブレスマスに注入し、1 分間で測定し、データを出力。解析は日本 IBM の協力で行い、13CO2／12CO2 比の動態を比較した。
3．バイオ人工肝臓での 13C-VA 呼気試験シミュレーション
ヒト肝癌細胞 FLC-4 を、ハイドロキシアパタイトビーズ（アパセラム-AX GA-2(N)、HOYA-PENTAX）を細胞培養担体として充填した 5 mL 容量のラジアルフロー型バイオリアクター（RFB）（株式会社バイオット）に播種した。培養液は ASF-104N 無血清培養液（味の素株式会社）を用い、RFB のバイオ人工肝臓部と培養液がガス交換を行うリザーバー部を 150 mL の培養液が閉鎖系で還流された。リザーバーには 5%CO2・95%Air が注入され、液面でガス交換の上、注入と同量が排出路から排出された（図 1）。細胞が増殖し、安定したところで、13C-R ace 濃度が 100μM に調整した培養液にリザーバー内の培養液を交換し、還流を開始し、継時的に排気（呼気）を呼気バックで採取した。24 時
間還流後、再度 13C-R ace 濃度が 100μM の培養液に交換し、培養をさらに 24 時間継続し、排気を採取した。
FLC-4 細胞を培養したバイオ人工肝臓は同時に 2 台稼働させ、一台に 100μM の 13C-R ace を含有する培養液を還流し、もう一台には 13C-R ace を添加していない通常の培養液のみ還流した。リザーバーに注入される直前の 5%CO2・95%Air を各サンプル前に採取し、13CO2／12CO2 比を測定しベース値として、排気中の 13CO2／12CO2 比値からさし引いた［4］。

図 1．バイオ人工肝臓での 13C-retinyl acetate 呼気試験
FLC-4 細胞を RFB で高密度還流培養する。リザーバーの培養液に 13C-retinyl acetate を添加し、24 時間培養。
継時的に排気を採取し、13CO2／12CO2 比を質量分析装置で測定した。

結 果
FLC-4 細胞を培養したバイオ人工肝臓は同時に 2 台稼働させ、一台に 100μM の 13C-R ace を含有する培養液を還流し、もう一台には 13C-R ace を添加していない通常の培養液のみ還流した。継時的に採取した排気中の 13CO2／12CO2比値の動態を図 2 に示す。点線が排気中の 13CO2／12CO2 比値から注入した混合ガス中の 13CO2／12CO2 比値をさし引いた値である。赤の点線は 100μM の 13C-Race を添加したリアクターでの動態、青の点線は 13C-R ace 未添加の培養液を還流したリアクターでの動態を示す。100μM の 13C-R ace を添加すると 1 回目の還流では、13CO2／12CO2 比値は3 時間をピークに上昇し、その後、低下する。2 回目の添加では 3 時間の上昇は観察されなかった。一方、13C-R ace 未添加条件でも、1 回目はわずかに 13CO2／12CO2 比値は上昇したが、わずかであった。1 回目の VA 欠乏状態での還流では、3 時間目をピークとして、13C-Race がレチノイン酸を経て、 13CO2 まで代謝され代謝ガス中に排出されたと解釈された。

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図 2. 13C-retinyl acetate 還流実験における 13CO2／12CO2 比の動態
バイオ人工肝臓に 13C-retinyl acetate を添加し、24 時間還流。その後、2 回 VA 未添加の培養液で洗った後、2 回目の 13C-retinyl acetate の添加を行って、継時的に排気中の 13CO2／12CO2 比を測定した。赤の点線が、13C-retinyl acetate を添加したバイオ人工肝臓。
青の点線が未添加バイオ人工肝臓。

考 察
本シミュレーション実験によって、100μMの13C-R aceを添加すると、1回目の還流では3時間目をピークとして、13C-R aceがレチノイン酸を経て、13CO2まで代謝され代謝ガス中に排出されたと解釈される。FLC-4細胞は無血清培養で維持されており、ビタミンA欠乏状態で培養されている。このため、1回目の還流では、レチノイン酸に代謝され、さらに最終代謝産物である13CO2が検出されたと考えられる。一般に、血中レチノール濃度は2μMであり、今回添加した13C-R ace 100μMは大過剰量である。このため、1回目の還流でバイオ人工肝臓のVAは充足され、エステル型VAへの代謝経路が亢進した可能性がある。このため、2回目の添加では、レチノイン酸への代謝経路は低下し、3時間の13CO2／12CO2比値のピークが消失したと考えられる。
バイオ人工肝臓を用いた基礎研究の結果から、ヒトのVA栄養状態の評価法への実用化を図るために、以下の検討が必要であると考えた。1．安定同位体標識試薬の改善：検査の感度をあげるため、排出13CO2量を増やす必要がある。このため、Raceの炭素への13Cの標識数を増やす必要がある。2．13CO2の測定法の改善：本研究では、当初、臨床検査で用いる赤外分光光度計を用いて排出13CO2／12CO2比の測定を試みた。しかし、測定感度が十分でなく、質量分析法を採用した。ブレスマスは生体ガス内成分をカラムに吸着させる必要なく、ガスのまま機器に注入し、数分で測定を終了することができる。また、検出感度も高く、ガス内のCO2以外の成分も検出できる。臨床サンプル測定用にはさらに改善を進める必要がある。3．動物実験での確認：実験動物モデルを作製し、動物の呼気で検討する。動物モデルとしては、ラットVA欠乏モデル、ラット肝障害モデルを作製し、検討を進めている。
4．
ヒトでの臨床研究の推進の準備：13C-glucose
呼気試験は既に臨床応用されている［5］。また、R aceも製剤として臨床でも用いられており、安全性は高い。1～3の検討を行った後に、臨床実用化研究へ進むことは可能と考える。

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共同研究者・謝辞
本研究の共同研究者は、神戸薬科大学・生命有機化学の和田昭盛教授、東京農業大学国際食料情報学部国際食農科学科の古庄律教授、日本 IBM 東京基礎研究所の堀部晃啓、末岡邦昭、相原達研究員、日本金属化学（株）技術部の菅原純一技術員である。また、RFB での細胞培養、排気のサンプリングを行った中村まり子助教に深謝いたします。

文 献1) Micronutrient deficiencies. Vitamin A deficiency. WHO. https://www.who.int/nutrition/topics/vad/en/2) Mizuno Y, Furusho T, Matsuura T, et al. Serum vitamin A concentrations in asthmatic children in Japan.
Pediatr Int 2006, 48:261-264. DOI: 10.1111/j.1442-200X.2006.02200.x
3) Furusho T, Wada M, Yasuhara T, et al. Tissue specific-distribution and metabolism of vitamin A are affected bydietary protein levels in rats. Int J Vitam Nutr Res 1998, 68:287-292, PMID: 9789760
4) 松浦知和、目崎喜弘、政木隆博、松本喜弘、前橋はるか、中村まり子、中田浩二、朴ジョンヒョク、横山寛．バイオ人工肝臓開発から臨床検査医学へ‐空腹時 13C-glucose 呼気試験の開発－．臨床病理 2016, 64(5), 558-563.
5) 松浦知和、江崎敬裕、中村まり子、目崎喜弘、政木隆博．空腹時 13C-glucose 呼気試験による肝臓インスリン抵抗性の簡易診断法．RADIOISOTOPES 2019, 68:1-6, doi: 10.3769/radioisotopes.68.

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