上原記念生命科学財団研究報告集, 32 (2018)

上原記念生命科学財団研究報告集、32（2018）

45. GATA1 遺伝子異常による巨核芽球性白血病発症機構
清水 律子
東北大学 大学院医学系研究科 分子血液学分野
Key words：白血病，転写因子，GATA1緒 言
GATA1 は赤血球や巨核球分化に重要な転写因子である。GATA1 は、アミノ末端側とカルボキシ末端側に二つの転写活性化領域をもち、それぞれ、独立して機能している［1］。ダウン症候群に高頻度に発症する巨核芽性白血病のほぼ全例で GATA1 遺伝子の体細胞性変異が存在し、アミノ末端側の転写活性化領域を欠失した短型 GATA1（GATA1s）が発現していること［2］、また、同 GATA1s を産生するような遺伝子多型が Diamond-Blackfan 貧血発症に関与していることが明らかになり［3］、GATA1 転写因子の機能異常による血液疾患発症機構が注目されてきている。
ダウン症群患児の約 10%において、胎生期または出生直後に一過性骨髄異常増殖症（TMD）を発症する。TMD は、白血病芽球に酷似した細胞が異常増殖すること、また、臓器浸潤による患児の早期死亡もまれではないことから、病態的には急性白血病と鑑別が困難であるが、生後三ヶ月程度で自然退縮するため無治療で寛解する患児も多い。ところが、TMD 発症の既往を持つダウン症群患児の約 20%程度が数ヶ月後から数年後に、今度は真の巨核芽性白血病（AMKL）する［4］。この TMD 発症、自然寛解、白血病発症の形質転換にどのような分子メカニズムが関与しているかについては、いまだ、詳細は明らかにされていない。
私たちは、以前、GATA1 欠失マウスに GATA1s を発現するトランスジーンを外来的に導入することで、TMD 病態マウスの樹立に成功した［5］。本マウスでは、ヒトダウン症 21 染色体トリソミーに相当する染色体数異常はなくGATA1s 変異のみを有することから、TMD の病態形成には GATA1s が第一義的に関与することが示唆される。そこで本研究では、GATA1s 変異に起因する一連の白血病発症機構について、本モデル系を用いて解析することを目的とする。

方 法
1．動物実験、フローサイトメトリー、胞体突起形成
全ての実験は、東北大学遺伝子組換え実験安全専門委員会及び動物実験専門委員会の承認を得た後、規定に従って行った。血算は、吸入麻酔下で成獣眼窩静脈叢より採取した末梢血、または、リン酸鑑賞生理食塩水（PBS）で 6 倍に希釈した胎児血を、日本光電の自動血球計数器を用いて測定した。胎児肝臓または骨髄のフローサイトメトリー解析は、単核球を分離したあと、蛍光標識された抗 CD41 抗体、抗 CD61 抗体、及び、抗 cKit 抗体（eBioscience）に反応させ、FACSCalibur を用いて解析した。胎児肝臓または骨髄の巨核球の巨核球胞体突起形成能は、CATCH メディウム［6］に懸濁した単核球を、2%、3%、4%、16%の不連続アルブミン溶液上に重層し、密度勾配を利用して大型単核球を沈降させたあと、Nutridoma-SP（ベーリンガー）を含む IMDM メディウム 2ml に再懸濁した。24 時間後に胞体突起を形成した巨核球を算定した。
2．遺伝子発現解析
胎児肝臓の単核球をビオチン化抗 CD41 抗体（eBioscience）に反応させ、ストレプトアビジンコートのマグネットビーズ（Invitorgen）で単離した。単離した細胞から ISOGEN（Nippon gene）を用いて RNA 抽出した。マイクロチ
ップ型電気泳動装置 2100 バイオアナライザー（Agilent）を用いて RNA の品質確認を行ったあと、RAN Integrity
Number 値が 8 以上の RNA のみを、ReverTra Ace qPCR kit（TOYOBO）を用いて cDNA を合成した。網羅的遺伝
子発現解析はプロトコールに従って 4×44K 全マウスゲノムオリゴマイクロアレイスライド（Agilent）にハイブリダイ
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ズし、GeneSpring GX12（Agilent）を用いて解析した。野生型での遺伝子発現量を基準にΔNTR-H およびΔNTR-Mにおける発現量変化が 1.5 倍以上を示す遺伝子群とした。
3．遺伝子発現解析
実験結果の統計解析には、マン・ホイットニーの U 検定を用いた。

結果および考察1．GATA1s を導入したマウスは一過性骨髄異常増殖症様病態を呈する
G1HRD（Gata1-hematopoietic regulatory domain）制御領域を用いたトランスジェニックマウスの利点は、トランスジーンの挿入領域によりトランスジーン由来 GATA1s の発現量の異なるマウスラインを用いることができる点である。私たちは、GATA1s 発現量の異なるトランスジェニックマウス系統 2 種（ΔNT-H、および、ΔNT-M）の雄とGATA1 遺伝子改変マウス系統の雌（G1KD/X）を交配し、トランスジーンをもつ GATA1 遺伝子改変マウス系統の雌（G1KD/Y）を作成した。Gata1 遺伝子は X 染色体上に存在するので、トランスジーンを持たない G1KD/Y は GATA1欠失による赤血球造血不全により胎生致死となるが、トランスジーン由来のタンパク質が欠失している機能を補うこと。GATA1 のカルボキシ末端側転写活性化領域が、アミノができれば G1KD/Y の胎生致死を回避することができる［7］末端転写活性化領域が欠失したことによる機能欠失を部分的に代償することができるので［1］、GATA1s を発現させる。ΔNT-H、または、ことでその発現量依存的に G1KD/Y の胎生致死を回避することができることがわかっている［7］ΔNT-M トランスジーンにより出生した G1KD/Y マウスを、それぞれ、ΔNTR-H、ΔNTR-M と呼ぶ。ΔNTR-H では野生型マウスの GATA1 の 5〜6 倍程度の GATA1s が、ΔNTR-M では同等程度の GATA1s が発現していた。
私たちは、ΔNTR-H マウスが、胎児期に一過性に未熟な巨核球が増加するが、出生後にその異常増殖が徐々に収束することを報告した［5］。さらに、本研究でΔNTR-M もまた、胎児期に一過性に未熟な巨核球が増加するが、その異常増殖が出生後に収束することを確認した。染色体数異常がないΔNTR-H やΔNTR-M においても TMD 病態が見られることから、ヒトダウン症患児に好発するTMDの病態形成には21番染色体のトリソミーは必ずしも必須ではなく、GATA1 の機能異常が関与していることが考えられた。
TMD 病態から回復したΔNTR-H やΔNTR-M 新生児は成長して成獣になることができる。
特にΔNTR-H マウスは、GATA1 の機能欠失を大量の GATA1s により代償することができるので、末梢血所見で有意な異常は認めない。一方、
ΔNTR-M マウスは貧血と血小板減少を呈していた（表 1）。このことから、健常マウスの GATA1 と同程度の GATA1sの発現では、GATA1 の機能欠失を完全には代償できないことが考えられる。
表 1．ΔNTR-M マウスの血算球球

ヘマトクリット(%)

ヘモグロビン濃度(g/dl)

血小板数(104/µl)

白血 数(103/µl)

型79039.313.06797

ΔNTR-M42727.09.134105

野生

赤血 数(104/µl)

20日齢同腹マウスの血算を示す。ΔNTR-Mマウスは野生型マウスに比べて、貧血と血小板減少を示す。

胎児期では、ΔNTR-M 胎児は、ΔNTR-H 胎児と同様に、未熟な巨核球が著明に増多していた。また、ΔNTR-H マ
ウスと同様に、出生後に未熟な巨核球が増多は軽減したが、成獣期においても軽度の巨核球数増多が認められた。
2．GATA1s を導入したマウスの一部は巨核芽球性白血病を発症する
TMD 発症の既往を持つダウン症群患児の約 20%程度が数ヶ月後から数年後に、今度は真の巨核芽性白血病する。そこで、全例で TMD 様病態の既往を有するΔNTR-H マウスやΔNTR-M マウスを長期飼育し、白血病発症の有無について検討した。ΔNTR-M マウスでは二ヶ月齢ごろより高頻度に白血病を発症するのに対し、ΔNTR-H マウスは全く白血病を発症しなかった。白血病細胞は cKit（肝細胞増殖因子受容体）、CD41（血小板 IIb 抗原）、CD71（トランス23上原記念生命科学財団研究報告集、32（2018）

フェリン受容体）の表面抗原を持ち、赤芽球系列と巨核球系列の両方の性質を有していた。円形または不整形の核を持ち、核網は粗荒で、細胞質には突起が見られ（図 1）、形態的には急性巨核芽球性白血病に酷似していた。

図 1．ΔNTR-M に発症した白血病の芽球
生後50日齢で白血病を発症したΔNTR-Mマウスの末梢血に出現した芽球の形態。核網は粗荒で不整形の核を持ち、細胞質には突起がみられる。

3．白血病を発症するマウスでは巨核球の分化が障害されている
ΔNTR-H マウスもΔNTR-M マウスも、胎児期にいずれも TMD 病態を呈するにもかかわらず、ΔNTR-H 成獣マウ
スでは白血病を発症しないがΔNTR-M 成獣マウスは高率に白血病を発症する。この違いを検証するために、胎齢 18.5日の胎児の末梢血所見を検討した。ΔNTR-H マウスでは、血小板数値が同腹仔よりも高いのに対し、ΔNTR-M マウスでは、同等か若干低下していた。また、成獣 NTR-H マウスは血小板数値が野生型と同等であったが、成獣 NTR-Mマウスは血小板減少を呈した（図 2）。

図 2．18.5 日齢胎児と成獣の血小板数値の比較
ΔNTR-H胎児は、巨核球数の増多を反映して血小板数が増加する傾向にあるが、ΔNTR-M胎児は、巨核球数が増多しているにも関わらず、血小板数値は増加していない。巨核球数増多がみられない成獣期には、ΔNTR-H
マウスの血小板数は野生型と同等であるが、ΔNTR-Hマウスは血小板数値が減少している。

前述したようにΔNTR-H 胎児やΔNTR-M 胎児は未熟巨核球が増加しているので、ΔNTR-H マウスの血小板数値の上昇は増加した未熟巨核球が分化して血小板産生に至っているからだと思われる。一方、ΔNTR-M マウスでは、未熟巨核球が著増しているのにもかかわらず血小板数値が上昇しないことから、ΔNTR-M マウスで増多した巨核球は分化が障害されていると考えられる。
そこで、マウス胎児肝臓および成獣骨髄より、アルブミン不連続密度勾配沈降法を用いて巨核球を分取し、巨核球胞体突起形成能を検討した。胎児肝臓由来の巨核球は、ΔNTR-H マウスやΔNTR-M マウスの胎児肝臓由来巨核球は、いずれも、野生型胎児のそれと比べて胞体突起形成能が低下していた。ΔNTR-H マウスでは若干ΔNTR-M マウスよりも形成能が勝っていたが、統計学的な有意差はなかった。一方、成獣骨髄由来の巨核球は、ΔNTR-H マウスでは胞体突起形成能が保たれていたが、ΔNTR-M マウスではほとんど胞体突起が形成されなかった。このことは、ΔNTR-Mマウスの巨核球は血小板産生能が減弱している事を示している。

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4．白血病を発症するマウス巨核球の遺伝子発現解析
ΔNTR マウスは、GATA1s の発現量に関係なく，胎児期に一過性に巨核球が増多するが、出生後にその表現型は消失する。一方、ΔNTR-H マウスは白血病を発症しないが ΔNTR-M マウスでは白血病を発症しない。この発症の有無には、GATA1s 量の多寡に起因する GATA1 標的遺伝子の発現異常が関与している可能性が考えられる。そこで、ΔNTR-H 胎児の巨核球（将来白血病を発症しない）とΔNTR-M の巨核球（将来白血病を発症する）を分取し、遺伝子発現解析を行った。Gata1 遺伝子の発現は、ΔNTR-H では野生型の 14.6 倍、ΔNTR-M では 5.8 倍と、大きく増加していた。一方、Rasal1 遺伝子の発現は、ΔNTR-H では野生型の 1.5 倍程度であったにもかかわらず、ΔNTR-M では76 倍も上昇していた。また、アポトーシスや巨核球分化に関わる遺伝子の中に、その発現がΔNTR-M とΔNTR-H で大きく乖離している遺伝子が見いだされた。

Rasal1 遺伝子は GAP1 ファミリーに属する GTPase 活性化タンパク質で、Ras-GTP を Ras-GDP に変換して Rasシグナルを負に制御する機能を持っている。GATA1 が Ras 依存的な巨核球の分化に関与することが報告されていることから［8］、ΔNTR-H 胎児やΔNTR-M 胎児では GATA1s 変異により未熟巨核球が異常増殖するが、GATA1s が大量にあるΔNTR-H マウスでは巨核球が分化できるために白血病に至らないが、ΔNTR-M では巨核球が分化できないまま蓄積し、残存した巨核球に新たな遺伝子異常が蓄積しやすく、そのため白血病を発症すると考えられる（図 3）。

図 3．GATA1s 変異による巨核球分化異常と白血病発症
GATA1s変異があると未熟巨核球が異常増殖する。GATA1sが大量あれば巨核球が分化できるために白血病に至らないが、GATA1s量が不十分だと巨核球が分化できない。未分化なまま蓄積した巨核球には新たな遺伝子異常が蓄積しやすく、そのため白血病を発症する。

共同研究者・謝辞
本研究の共同研究者は、東北大学大学大学院医学系研究科分子血液学分野の長谷川敦史博士、平野育生博士、および、石原大嗣氏である。

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