上原記念生命科学財団研究報告集, 33 (2019)

上原記念生命科学財団研究報告集, 33（2019）119. 超難水溶性薬物を製剤化する非晶質ナノ懸濁液の開発
東 顕二郎
千葉大学 大学院薬学研究院 製剤工学研究室
Key words：非晶質ナノ粒子，相溶性，中空粒子，Cryo-TEM，物理的安定性

緒 言
近年開発される候補化合物の 70%以上は低い溶解性を示し、溶解性の改善が必要不可欠となるケースが多い［1］。そのため、難水溶性薬物の溶解性を向上させる製剤学的手法が様々開発されており、薬物非晶質ナノ粒子の調製は新しい手法として注目されている［2］。薬物非晶質ナノ粒子では、ナノ粒子化に伴う比表面積の増大により、溶出速度が向上する。さらに、薬物が非晶質状態で存在するため、水中に分散させた際に、薬物結晶の溶解度より高い薬物濃度を示す過飽和状態を形成する。これまでに、薬物非晶質ナノ粒子は薬物ナノ結晶及び薬物非晶質マイクロ粒子と比較して、経口・経肺投与時の薬物吸収性が顕著に増大することが報告されている［3］。
非晶質ナノ粒子の調製、溶解性及び吸収性については数多くの報告がある。一方で、非晶質ナノ粒子の構造や形成・安定化メカニズムに関する報告は限られる。本研究は、モデル薬物としてスルホニルウレア系糖血糖降下薬のglibenclamide（GLB）を、安定化剤として HPMC を用い、antisolvent 法により薬物ナノ懸濁液を調製した。ここでは、異なる 2 種類の HPMC 添加方法を用いた。そして、得られた薬物非晶質ナノ粒子の形態及び分子状態を各種分析手法を用いて評価した。懸濁液中のナノ粒子の形態観察には cryo-TEM 測定を用いた。凍結乾燥ナノ粒子中の薬物及び添加剤の分子状態評価には、固体１３C NMR 測定及び溶液１H NMR 測定を用いた。また、ナノ粒子中の GLB 非晶質の安定性を DSC 測定及び保存安定性試験により評価した。
最後に、得られた薬物非晶質ナノ粒子の形態や分子状態から、ナノ非晶質粒子形成メカニズムについて考察した［4］。

方 法
1． Nano-A 及び nano-B 懸濁液の調製
Antisolvent 法により 2 種の方法で nano-A 及び nano-B 懸濁液を調製した。調製法 A では、GLB を溶解させた
DMSO 溶液を HPMC 水溶液に対して 5%（v/v）で注入し、nano-A 懸濁液を得た。調製法 B では GLB 及び HPMCを共に溶解させた DMSO 溶液を蒸留水に対し注入し、nano-B 懸濁液を得た。
2． Nano-A 及び nano-B の調製
Nano-A 及び nano-B 懸濁液を凍結乾燥することで nano-A 及び nano-B を調製した。Nano-A 及び nano-B 懸濁液
を 40 分間超遠心処理（150,000×g）した後、上清を取り除くことで溶解成分を除去した。沈殿物を凍結乾燥させ、nanoA 及び nano-B を得た。

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結 果
1．Nano-A 及び nano-B 懸濁液の粒子径及び形状測定
Nano-A 及び nano-B 懸濁液の調製直後の体積平均粒子径はそれぞれ約 120 nm、及び約 110 nm であり、その粒度分布はいずれも単峰性であった。このことから、安定化剤として HPMC を用いて異なる 2 種 antisolvent 法により調製した懸濁液は、いずれもナノ懸濁液となることが明らかとなった。また、両懸濁液を 4ºC で 24 時間静置保存した場合においても、調製直後とほぼ同様の粒度分布が確認された。以上の結果より、両懸濁液は、いずれもナノサイズの粒子径を保持することが示された。調製直後の懸濁液について cryo-TEM 測定によるナノ粒子の形態観察を行った（図1a、c）。観察された粒子の形状及びサイズは nano-A 懸濁液及び nano-B 懸濁液で異なっており、nano-A 懸濁液においては粒子径 80～140 nm の球形の粒子が観察された。また、粒子中心部のコントラストが低いことから、粒子中心の厚さが薄い、または内部に中空形状を有する粒子であると考察した。一方、nano-B 懸濁液においては均一なコントラストの非球形の粒子が観察された。nano-B 懸濁液の粒子径は nano-A 懸濁液と比較してやや小さく、50～110 nm であった。両懸濁液を 4ºC で 24 時間静置保存した場合においても、粒子の形状及びサイズは調製直後とほぼ同様であった（図 1b、d）。以上の結果より、両懸濁液中のナノ粒子の形態は安定化剤として用いた HPMC の添加方法により異なり、その形態は保存後も維持されることが明らかとなった。

図 1．
（a、b）Nano-A 及び（c、d）nano-B 懸濁液の Cryo-TEM 像（a、c）はそれぞれ調製直後、（b、d）は 4 C・24 時間保存後の画像である。
スケールバーは 200 nm を示す。

2．Nano-A 及び nano-B の NMR 測定
図 2 に Nano-A 及び Nano-B の 65～175 ppm における固体 13C NMR スペクトルを示す。Nano-A 及び nano-B のGLB ピークはいずれも非晶質 GLB と同様ブロードなピークを示した。また、GLB のカルボニル基に由来するピークが結晶 GLB（167 ppm）と比較して nano-A（164 ppm）及び nano-B（164 ppm）では高磁場側へシフトした。ここで観察されたケミカルシフトの変化はアミド‐イミド酸の互変異性を伴う GLB の非晶質化に由来するものである。これらの結果より、nano-A 及び nano-B の GLB は非晶質状態として存在することが示された。また、GLB 由来のピークに加えて 70～110 ppm 付近に HPMC に由来するピークが観察された（図 2 の拡大図）。Nano-A 及び nano-B は凍結乾燥処理前に 150,000×g の超遠心処理を行っているため、ここで観察された HPMC はナノ粒子表面に弱く吸着したものではないと推察される。Antisolvent 法においては、GLB が溶媒に溶解した状態から粒子の析出が起こる。GLB2

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が非晶質としてナノ粒子化する際に水溶液中もしくは有機溶媒中に溶解している HPMC が粒子中に強く取り込まれたものと考察した。Nano-A 及び nano-B を DMSO-d6 に溶解し、溶液 1H NMR 測定を行った。Nano-A 及び nano-B のスペクトルにおいては、GLB 及び HPMC に由来するピークが両方観察された。GLB のピークに対する HPMC の相対ピーク強度は nano-B の方が nano-A と比較して大きく、nano-B はより多くの HPMC を含有することが示唆された。さらに、内部標準物質ピークに対する GLB メトキシ基ピークの相対面積強度より GLB 溶解量を求めた。そしてGLB 溶解量と仕込みの粉末量に基づいてナノ粒子中の GLB/HPMC 質量比を算出した。得られた GLB/HPMC の質量比は nano-A 及び nano-B においてそれぞれ 89.0：11.0 及び 84.3：15.7 であった。この結果より、nano-B は nano-Aと比較してより多くの HPMC を含有していることが定量的に示された。

図 2．
（a）GLB 結晶、（b）HPMC、（c）GLB 非晶質、（d）nano-A、(e) nano-B の固体 13C NMR スペクトル3．Nano-A 及び nano-B の物理的安定性の評価
結晶 GLB の DSC 曲線では約 170ºC 付近に融解ピークが観察された（図 3a）。非晶質 GLB では 73ºC 付近のガラス転移ピーク、130ºC 付近の結晶化ピーク、170ºC 付近の GLB 結晶の融解ピークが観察された（図 3c）。Nano-A においては 63ºC 付近のガラス転移ピーク、130ºC 付近の結晶化ピーク、170ºC 付近の GLB 結晶の融解ピークが観察された（図 3d）。一方、nano-B では 63ºC 付近のガラス転移ピークは観察されたものの、結晶化ピーク及び GLB 結晶の融解ピークは顕著に小さくなった（図 3e）。非晶質 GLB（72.8ºC）と比較して nano-A（62.5ºC）及び nano-B（63.0ºC）ではガラス転移温度（Tg）が低下した。ここで観察された Tg の低下はナノ粒子化に伴う比表面積の増大によるものと考察した［5］。一方、nano-A 及び nano-B では Tg の低下にも関わらず結晶化エンタルピー及び融解エンタルピーはいずれも非晶質 GLB 単独と比較して減少した。これは昇温過程における非晶質 GLB の結晶化が nano-A 及び nano-B では HPMC の混和により抑制されたためと考察した。Nano-A 及び nano-B を比較した結果、特に nano-B においてより強い GLB 結晶化抑制が認められた。一般に、薬物及びポリマー間の混和性が上昇すると非晶質薬物の結晶化が抑制されることが知られている。HPMC 含有量は nano-A では 11.0%であるのに対し、nano-B では 15.7%と有意に多い。
すなわちHPMC 含有量の高い nano-B では GLB と HPMC の混和性が高くなり、これが昇温過程における非晶質 GLBの安定性を向上させたと考察した。

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Nano-A 及び nano-B を 25ºC、60%RH 及び 40ºC、75%RH 条件下で調湿保存し、非晶質 GLB の保存安定性を評価した。Nano-A では両条件下においても 7 日経過後に GLB の結晶化が認められ、4 週間経過後にはさらに GLB の結晶化が進行した。一方、nano-B では両条件下において 4 週間経過後も結晶化は認められず、GLB の非晶質状態が維持された。このことから、nano-B の方が nano-A よりも非晶質 GLB の保存安定性が高いことが示された。この結果は DSC
測定の昇温過程においても、nano-B の方が nano-A より非晶質 GLB の結晶化が抑制されている結果と一致した。
(a)(b)

Endothermic(c)(d)(e)

3050100150
Temperature (ºC)

200

図 3．
（a）GLB 結晶、（b）HPMC、（c）GLB 非晶質、
（d）nano-A、（e）nano-B の DSC 曲線

考 察
各測定結果に基づき、GLB 非晶質ナノ粒子形成メカニズムを考察した（図 4）。Nano-A の形成過程では、DMSO の水への拡散速度が薬物分子の液滴内部への拡散速度より速いため、先に粒子外側界面で固化が起こる。その後、DMSOの拡散と同時に水が浸入するため、中空粒子が形成したと推察された。粒子が形成される界面近傍においては、水溶液中の HPMC が GLB ナノ粒子形成時に取り込まれ、粒子表面近傍に HPMC を含有した GLB ナノ粒子が形成されたと考察した。一方、nano-B の形成過程では、DMSO 中に HPMC が存在するため DMSO の水への拡散速度が遅くなり、DMSO の拡散と共に薬物は粒子内部へ拡散する。その結果、nano-A より小さい粒子が形成されたと考察した。また、
DMSO がゆっくりと拡散するにつれて液滴界面近傍で部分的に粒子化が起こるため粒子形状は非球形になったと考察した。加えて、DMSO 中に GLB と HPMC が共に溶解しているため、ナノ粒子表面に加えて粒子内部にも HPMC が分布した混和性の高いナノ粒子が形成したと推察された。
近年、薬物が水溶液中で非晶質溶解度を超えると、liquid-liquid phase separation（LLPS）あるいは glass-liquidphase separation（GLPS）が起き、ナノサイズの粒子が形成されることが報告されている［6］。DSC 測定により求めた nano-A 及び nano-B の Tg はそれぞれ 62.5ºC と 63.0ºC と比較的高い。そのため、水溶液中で水（Tg = －138ºC）の存在により Tg が低下したとしても、調製時の温度（20～25℃）よりも nano-A 及び nano-B の Tg は高いと考えられる。
このことから、ナノ懸濁液中の nano-A 及び nano-B の形成は LLPS ではなく GLPS によるものと考察した。LLPS では流動性が高いため球形の粒子が形成されると推察されるのに対し、cryo-TEM により観察された粒子の形態は中空（nano-A）あるいは非球形（nano-B)と特徴的な形を示しており、この考察を支持するものであった。

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図 4．Antisolvent 法による（a）nano-A と（b）nano-B 形成の模式図
本研究では、GLB非晶質ナノ粒子の形態及び分子状態を各種分析手法により詳細に評価することで、antisolvent法による非晶質ナノ粒子形成メカニズムを明らかとした。非晶質ナノ粒子の形態評価にはcryo-TEM評価が、分子状態及び混和性評価にはNMR測定及びDSC測定が有用であることが示された。本研究で得られた知見は、未だトライ＆エラーの状況にある薬物非晶質ナノ粒子製剤の開発において有用な指針になると期待される。

共同研究者・謝辞
本研究の共同研究者は、千葉大学大学院薬学研究院製剤工学研究室森部久仁一教授、植田圭祐助教である。

文 献1)

Williams HD, Trevaskis NL, Charman SA, Shanker RM, Charman WN, Pouton CW, et al. Strategies to address
low drug solubility in discovery and development. Pharmacol Rev. 2013;65(1):315-499. Epub 2013/02/07.
PubMed PMID: 23383426.

2)

Jog R, Burgess DJ. Pharmaceutical amorphous nanoparticles. J Pharm Sci. 2017;106(1):39-65. Epub2016/11/07. PubMed PMID: 27816266. doi: 10.1016/j.xphs.2016.09.014.

3)

Kumar S, Shen J, Burgess DJ. Nano-amorphous spray dried powder to improve oral bioavailability ofitraconazole. J Control Release. 2014;192:95-102. Epub 2014/07/11. PubMed PMID: 25009979. doi:
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4)

Yonashiro H, Higashi K, Morikawa C, Ueda K, Itoh T, Ito M, et al. Morphological and physicochemicalevaluation of two distinct glibenclamide/hypromellose amorphous nanoparticles prepared by the antisolvent
method.

MolPharm.

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Epub2018/03/06.

PubMedPMID:29502422.

doi:10.1021/acs.molpharmaceut.7b01122.
5)

Guo Y, Zhang C, Lai C, Priestley RD, D'Acunzi M, Fytas G. Structural relaxation of polymer nanospheres undersoft and hard confinement: isobaric versus isochoric conditions. ACS Nano. 2011;5(7):5365-73. Epub 2011/07/02.
PubMed PMID: 21718051. doi: 10.1021/nn201751m.

6)Mosquera-Giraldo LI, Taylor LS. Glass-liquid phase separation in highly supersaturated aqueous solutions oftelaprevir. Mol Pharm. 2015;12(2):496-503. Epub 2014/12/30. PubMed PMID: 25541813. doi:
10.1021/mp500573z.
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