上原記念生命科学財団研究報告集, 37 (2023)

200. 小児脳腫瘍の epigenetic な発がん機構の解明
川内 大輔
国立精神・神経医療研究センター 神経研究所 病態生化学研究部
Key words：小児脳腫瘍，マウスモデル，電気穿孔法，クロマチン制御因子，エピゲノム

緒 言
小児脳腫瘍は小児がんで死亡する原因で第一位である重篤な疾患であり、脳が発生する時期に生じる遺伝子変異など、遺伝子プログラムの破綻によって脳細胞が異常増殖することによって生じると考えられている。近年、がんの根本的な治療に向け、世界的ながんゲノム解読プロジェクトが発足、展開され、小児脳腫瘍に特徴的な遺伝子変異が次々と報告されている。一方で、個々の腫瘍は同じ遺伝子変異を常に持つわけではなく、遺伝子変異や遺伝子発現プロファイルをベースに腫瘍の亜群が定義され、それに対応した個別化治療の必要性が提唱されている。
髄芽腫は小児悪性脳腫瘍のうち最も高頻度で見られるがんの一つであり、最も分子解析が進んでいる。遺伝子発現やゲノム変異、DNA メチル化、タンパク発現などの多階層マルチオミクス解析により、大きく 4 つの亜群（WNT・SHH・Group3・Group4）に分けられる［1，2］。そのうち、本研究で扱うソニックヘッジホッグ（SHH）型髄芽腫は、髄芽腫全体の約 30％を占め、細胞増殖シグナルとして知られる SHH シグナルが小脳顆粒細胞で異常活性することが原因で生じるとされる。実際に、SHH 型髄芽腫では SHH シグナルが活性化しており、SHH阻害剤が化学療法の第一選択と考えられた時期もあった。しかし、実際に多くの SHH 型髄芽腫は SHH 阻害剤に抵抗性であり、SHH 阻害剤の骨形成への副作用もあるため、遺伝子変異に応じたさらなる分子標的薬が望まれている。
我々は現在までに国際的な脳腫瘍ゲノム解読プロジェクトに参画し［3，4］、ヒト髄芽腫に高頻度で見られる遺伝子変異データから特にクロマチン制御因子の変異に着目して研究を進めてきた。近年では、がんモデル動物を用いて、ヒストン修飾を行うポリコーム複合体の足場タンパク質である BCOR の機能欠損変異により、epigenetic な機構により SHH 型髄芽腫の形成過程で細胞増殖を刺激するインスリン様成長因子（IGF）2 の発現が数十倍に上昇して腫瘍進展が加速することを報告したが［5］、BCOR の変異が全ての SHH 型髄芽腫で見られるわけではなく、他のクロマチン制御因子の変異がいかに腫瘍形成に関わっているのか、その知見はいまだ十分ではない。
本研究では、モデルマウスにおいて SHH 型髄芽腫の腫瘍増殖に影響をもたらすクロマチン制御因子を迅速かつ網羅的に解析する方法を開発し、それを用いたスクリーニングにより、がん抑制遺伝子として機能する新しいクロマチン制御因子の同定を目指す。

方 法
SHH 型髄芽腫はマウス小脳顆粒細胞より SHH シグナルの異常活性により派生する。そこで我々は生体内電気穿孔法と CRIRPR/Cas9 によるゲノム編集技術を組み合わせ［6］、小脳顆粒細胞を GFP で遺伝学的に標識した生後 5 日目の Atoh1EGFP マウスの小脳に直接 Ptch1 sgRNA（sgPtch1）と Cas9 遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子を導入して SHH 髄芽腫を誘導できるかどうかを検証した。特に標的とする遺伝子の sgRNA の配列については、ゲノム編集実験のウェブツールである CHOPCHOP（https://chopchop.cbu.uib.no/）を用いて設計し、1

px330 プラスミドベクターに組み込んで使用した。遺伝子導入されたマウスは 2 日後に遺伝子導入が成功したことをルシフェラーゼの発現を指標に生物発光イメージングを用いて確認し、生後 28 日目あるいは神経疾患の症状が観察されるまで飼育された。
これらの腫瘍が SHH 型髄芽腫であることを比較検証するために、SHH 髄芽腫を生じる Ptch1 ヘテロマウスと過去に我々が報告した MYC 型髄芽腫モデルを用いた。MYC 型髄芽腫モデルの作出は具体的には生後 7 日目の小脳顆粒細胞を密度勾配遠心で単離したのち、MYC 遺伝子および TRP53 ドミネガ体をコードした遺伝子をレトロウイルスで導入し［7］、免疫不全マウスである成体 NSG マウスに 1×10６個ずつ移植した。これらのマウスは神経疾患の症状が観察されるまで飼育された。腫瘍を形成したマウスの脳はホルマリン固定後に、免疫染色により免疫組織化学的に解析された。いくつかの実験では、腫瘍組織は固定前に単離され、ゲノム DNA と Total
RNA が抽出された。腫瘍のゲノム DNA は CRIPSR により、目的の遺伝子が正しくノックアウトされているかどうかを調べる目的に PCR の鋳型として使用された。また total RNA は SHH シグナルの関連遺伝子の発現を解析する目的で定量 PCR に使用された。

結 果
1．生体内電気穿孔法を用いた新規 SHH 型髄芽腫モデルの開発
まず我々は、開発した生体内電気穿孔法により生後 5 日目の Atoh1EGFP マウスの小脳顆粒細胞に直接 sgPtch1と Cas9 遺伝子を導入した。その結果、生後 28 日目に前がん状態が観察され、最終的に 32％（n＝10／31）のマウスで腫瘍形成が認められた。腫瘍の発達過程で EGFP を発現する細胞は分裂細胞のマーカーである Ki67 を発現していた（図 1）。
次に、sgPtch1 によって作出された腫瘍が SHH 型髄芽腫であることを確認するために、Ptch1 ヘテロマウス由来の腫瘍と MYC 型髄芽腫モデルをそれぞれポジティブ、ネガティブコントロールとして使用し、SHH シグナ
ルの下流遺伝子である Gli1 および Mycn、さらには SHH 髄芽腫に特徴的な Atoh1 および Sfrp1 の発現レベルを qRT-PCR により解析した。その結果、sgPtch1 により誘導されたがんにおける遺伝子の発現は Ptch1 ヘテロマウス由来のものと同様、MYC 型髄芽腫モデルと比較して高い発現レベルを示した（図 2A）。また免疫組織化学染色により、SHH 型髄芽腫に特徴的な中程度の増殖細胞（Ki67 陽性）と YAP1 シグナルの細胞核への凝集が観察された（図 2B、C）。これらの結果は、本研究で開発した方法論が、新生仔マウスから SHH 型髄芽腫を生み出すことが可能であることを証明している。
2．髄芽腫形成に関連するクロマチン制御因子の機能的スクリーニング
この方法がクロマチン制御因子のスクリーニングに使用できるかどうかを検証するため、我々は SHH 型髄芽腫の進展を加速させることで知られるがん抑制遺伝子 Trp53 変異を誘導した。その結果 sgTrp53 単独では腫瘍を誘導しなかったものの、sgPtch1 と sgTrp53 を同時に導入した場合には sgPtch1 単独と比較して腫瘍の進展速度が上昇し、67％（n＝12／18）のマウスで腫瘍が形成された（図 3、赤曲線）。このように sgPtch1 に加えて二次的に遺伝子をノックアウトする我々の方法では腫瘍進展の加速が観察されることが明らかになった。
以上の結果を踏まえ、我々はこれまでに共同研究者であるドイツがん研究センターから報告された SHH 型髄芽腫におけるクロマチン制御因子の変異のうち、機能欠損変異であるナンセンス変異とフレームシフト変異を持つもの 12 遺伝子を抽出し、現在そのうちの 5 遺伝子に関して機能解析の結果を得た。そのうちの一つの遺伝子
X に対する sgGeneX と sgPtch1 を導入した結果、腫瘍形成の促進が観察された（図 3、青曲線）。

2図 1．Ptch1 ノックアウトによる SHH 型髄芽腫モデル
Atoh1EGFP マウスの生後 7 日目小脳（左）、Ptch1 sgRNA を生後 5 日目に導入した
生後 28 日目小脳（中）、がんを発症した成体小脳（右）の抗 GFP 抗体（緑）および抗 Ki67 抗体（赤）による免疫組織化学染色。矢状断面。スケールバー：100μm。

図 2．Ptch1 sgRNA により誘導した SHH 型髄芽腫モデルの分子解析
A） 定量化 PCR による腫瘍ごとの遺伝子発現量の比較。各腫瘍を 3 サンプルずつ使用して標準偏差をエラーバーで示している。
B） SHH 型髄芽腫の HE 染色および免疫組織化学染色像。スケールバー：100μm。
YAP1 パネルにおける Inset に対しては 50μm。
C） MYC 型髄芽腫の HE 染色および免疫組織化学染色像。スケールバー：100μm。
YAP1 パネルにおける Inset に対しては 50μm。

3図 3．sgPtch1 により誘導した SHH 型髄芽腫モデルの分子解析
sgPtch1 とクロマチン制御因子の sgRNA を共に導入した Atoh1EGFP マウスの生存曲線。sgTrp53（赤、ポジティブコントロール）および sgGeneX（青）を導入した場合にコントロール（紫）と比較して腫瘍発生が亢進している。

考 察
本研究で開発した方法論は、高い成功率で小脳顆粒細胞に遺伝子を導入し SHH 型脳腫瘍を作出することが可能であり、Ptch1 を含む複数の遺伝子を同時にノックアウトすることで、腫瘍に影響を与える遺伝子を効率的に同定できる。我々は本研究でこの方法を用いて、新規がん抑制遺伝子 GeneX を同定しているが、この遺伝子は白血病などでも機能欠損していることが知られていることから、共通したがん抑制機能があると考えられ、今後の研究進展が期待される。

共同研究者・謝辞
本研究の共同研究者は、国立精神・神経医療研究センター病態生化学研究部の星野幹雄部長である。また、本研究を手伝っていただいた学術振興会特別研究員の白石椋さん、大学院生の王万晨さん、技術補佐員の蛇見真紀さんに感謝の意を表したい。

文 献1） Northcott PA, Buchhalter I, Morrissy AS, Hovestadt V, Weischenfeldt J, Ehrenberger T, Gröbner S,Segura-Wang M, Zichner T, Rudneva VA, Warnatz HJ, Sidiropoulos N, Phillips AH, Schumacher S,
Kleinheinz K, Waszak SM, Erkek S, Jones DTW, Worst BC, Kool M, Zapatka M, Jäger N, Chavez L,
Hutter B, Bieg M, Paramasivam N, Heinold M, Gu Z, Ishaque N, Jäger-Schmidt C, Imbusch CD, JugoldA, Hübschmann D, Risch T, Amstislavskiy V, Gonzalez FGR, Weber UD, Wolf S, Robinson GW, Zhou X,Wu G, Finkelstein D, Liu Y, Cavalli FMG, Luu B, Ramaswamy V, Wu X, Koster J, Ryzhova M, Cho YJ,Pomeroy SL, Herold-Mende C, Schuhmann M, Ebinger M, Liau LM, Mora J, McLendon RE, Jabado N,Kumabe T, Chuah E, Ma Y, Moore RA, Mungall AJ, Mungall KL, Thiessen N, Tse K, Wong T, JonesSJM, Witt O, Milde T, Von Deimling A, Capper D, Korshunov A, Yaspo ML, Kriwacki R, Gajjar A, ZhangJ, Beroukhim R, Fraenkel E, Korbel JO, Brors B, Schlesner M, Eils R, Marra MA, Pfister SM, TaylorMD, Lichter P. The whole-genome landscape of medulloblastoma subtypes. Nature. 2017 Jul 19;547（7663）:311-317. doi: 10.1038/nature22973. PMID: 28726821

42） Forget A, Martignetti L, Puget S, Calzone L, Brabetz S, Picard D, Montagud A, Liva S, Sta A, Dingli F,Arras G, Rivera J, Loew D, Besnard A, Lacombe J, Pagès M, Varlet P, Dufour C, Yu H, Mercier AL,Indersie E, Chivet A, Leboucher S, Sieber L, Beccaria K, Gombert M, Meyer FD, Qin N, Bartl J, Chavez
L, Okonechnikov K, Sharma T, Thatikonda V, Bourdeaut F, Pouponnot C, Ramaswamy V, Korshunov A,Borkhardt A, Reifenberger G, Poullet P, Taylor MD, Kool M, Pfister SM, Kawauchi D, Barillot E, Remke
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J, Schumacher SE, Beroukhim R, Ellison DW, Marshall CR, Lionel AC, Mack S, Dubuc A, Yao Y,Ramaswamy V, Luu B, Rolider A, Cavalli FM, Wang X, Remke M, Wu X, Chiu RY, Chu A, Chuah E,Corbett RD, Hoad GR, Jackman SD, Li Y, Lo A, Mungall KL, Nip KM, Qian JQ, Raymond AG, Thiessen
NT, Varhol RJ, Birol I, Moore RA, Mungall AJ, Holt R, Kawauchi D, Roussel MF, Kool M, Jones DT, WittH, Fernandez-L A, Kenney AM, Wechsler-Reya RJ, Dirks P, Aviv T, Grajkowska WA, Perek-Polnik M,Haberler CC, Delattre O, Reynaud SS, Doz FF, Pernet-Fattet SS, Cho BK, Kim SK, Wang KC, ScheurlenW, Eberhart CG, Fèvre-Montange M, Jouvet A, Pollack IF, Fan X, Muraszko KM, Gillespie GY, Di Rocco
C, Massimi L, Michiels EM, Kloosterhof NK, French PJ, Kros JM, Olson JM, Ellenbogen RG, Zitterbart
K, Kren L, Thompson RC, Cooper MK, Lach B, McLendon RE, Bigner DD, Fontebasso A, Albrecht S,Jabado N, Lindsey JC, Bailey S, Gupta N, Weiss WA, Bognár L, Klekner A, Van Meter TE, Kumabe T,Tominaga T, Elbabaa SK, Leonard JR, Rubin JB, Liau LM, Van Meir EG, Fouladi M, Nakamura H,Cinalli G, Garami M, Hauser P, Saad AG, Iolascon A,… Subgroup-specific structural variation across
1,000

medulloblastoma

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