上原記念生命科学財団研究報告集, 35 (2021)

44. 細菌の非コード RNA の生化学的解析と創薬への展開
沼田 倫征
九州大学 大学院農学研究院 生物機能分子化学講座 生物化学分野
Key words：非コード RNA，リボスイッチ，遺伝子発現調節，細菌，抗生剤

緒 言
多くの細菌はリボスイッチとよばれる RNA 領域（非コード RNA の一種）を mRNA の 5’非翻訳領域にコードしている［1, 2］。リボスイッチはそれに対応するリガンド（アミノ酸、補酵素、核酸塩基とその誘導体、イオンなど）を特異的に認識・結合し、リボスイッチの下流に配置された当該リガンドの生合成や輸送に関わる遺伝子の発現を転写レベルもしくは翻訳レベルで調節する［1，2］。このように、RNA とリガンドのみによって遺伝子の発現スイッチを調節することからリボスイッチ（RIBOnucleic acid と SWITCH を組み合わせた造語）とよばれており、細菌では 4％程度の遺伝子の発現をリボスイッチが調節すると見積もられている。
PreQ1 リボスイッチは、PreQ1（7 アミノメチル 7 デアザグアニン：遊離塩基でキューオシンの前駆体物質：図 1 左）の生合成に関わる遺伝子の発現を PreQ1 濃度に応じて調節するリボスイッチである［3］。キューオシンは tRNA のアンチコドン部分に存在する修飾ヌクレオシドで、細菌と真核生物に普遍的に存在し、tRNA アンチコドンによる mRNAコドンの認識、すなわち正確なタンパク質合成を保障するという重要な役割を担っている［4］。また、キューオシンは病原微生物の病原因子としても報告されており、その形成を阻害することで病原性が低下または消失することが知られている。細菌では、PreQ1 が遊離塩基として合成された後［5］、tRNA グアニントランスグルコシラーゼが tRNA アンチコドン部分にあるグアニン塩基と PreQ1 との交換反応を触媒して tRNA に PreQ1 が取り込まれ、さらに修飾されてキューオシンに変換される。一方、真核生物には PreQ1 の生合成経路がなく、食餌や腸内細菌からキューオシンを摂取している。このように、PreQ1 は細菌に特有の遺伝子産物によって合成される。したがって、PreQ1 リボスイッチと特異的に結合する合成化合物を取得すれば、当該化合物が細菌のタンパク質合成にとって重要なキューオシンの形成を抑制し、RNA を標的とした新たな抗生剤の開発に繋がる可能性が期待できる。
これまでの研究において、低分子マイクロアレイを用いて PreQ1 リボスイッチと結合する合成化合物をスクリーニングし、ジベンゾフラン環を含む化合物（図 1 右）がリボスイッチと特異的に結合することを見出した［6］。さらに、この化合物がリボスイッチの下流遺伝子の転写を抑制することを明らかにするとともに、リボスイッチと結合した複合体の結晶構造を決定して相互作用機構を解明していた［6］。取得したジベンゾフラン化合物は下流遺伝子の発現を抑制する一方、その活性（EC５０：359μM）は天然のリガンドである PreQ1（EC５０：36 nM）と比較して微弱であった。
本研究では、PreQ1 リボスイッチとジベンゾフラン化合物との複合体の結晶構造に基づいて第二世代の合成化合物を設計し、転写抑制活性が上昇する化合物の取得を目指した。
まず、複合体の立体構造とジベンゾフラン化合物（親化合物）の化学構造をもとにして 10 種類の誘導体を合成した。
次に、in vitro における転写終結活性を測定し、親化合物と比較して転写抑制活性が 30～75 倍に上昇する 4 種類の誘導体を取得した。また、これら誘導体化合物と PreQ1 リボスイッチとの複合体結晶を作製して結晶構造を決定した。
その結果、誘導体化合物は天然のリガンドである PreQ1 と同じ部位に結合していることが明らかとなり、主としてPreQ1 リボスイッチで保存されている塩基とのスタッキングおよび水素結合により安定化されていることが判明した。
今回の実験で得られた複合体の立体構造を基盤にしてさらに化合物の化学構造を改変し、転写抑制効果の高い化合物の取得を目指す。

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図1．PreQ1およびジベンゾフラン化合物の化学構造
天然のリガンドである PreQ1（左）と低分子マイクロアレイスクリーニングにより同定した PreQ1 リボスイッチと結合するジベンゾフラン化合物（右）の化学構造。

方 法
1．PreQ1 リボスイッチの調製

Thermoanaerobacter tengcongensis 由来 PreQ1 リボスイッチ RNA（33 ヌクレオチド）については、Dharmaconに合成を依頼した。購入した PreQ1 リボスイッチの 2’-OH 基は保護されていたため、脱保護緩衝液（100 mM 酢酸バッファー、TEMED にて pH を 3.8 に調整した緩衝液）を加えて 60℃で 30 分間インキュベーションした。真空乾燥により溶媒を除去した後、水に溶解して PreQ1 リボスイッチ溶液を作製し、使用するまで－25℃にて保存した。
2．合成化合物の作製
これまでに低分子マイクロアレイを用いたスクリーニングによって PreQ1 リボスイッチと結合するジベンゾフラン骨格を持った合成化合物（図 1 右）を同定していた。この合成化合物を親化合物として、ジベンゾフラン環から他の複素環への置換、複素環への窒素、酸素、硫黄の導入、側鎖長の変更、メチル基などの導入により 10 種類の誘導体化合物を合成した。これらの化合物の合成は、National Cancer Institute/NIH の Schneekloth 博士との共同研究により行った。なお、未発表データであるため、これら誘導体化合物の化学構造を本報告書では公表しない。
3．リボスイッチ下流遺伝子の転写終結活性の測定
λPR プロモーターと 26-nt C-less 配列、続いて Staphylococcus saprophyticus 由来 PreQ1 リボスイッチとその下流DNA配列をpIDTSMART-AMPにクローニングした。
このプラスミドを用いて転写終結活性の測定に用いる鋳型DNAを PCR により増幅し、アガロースゲル電気泳動を行った後、ゲルから抽出して調製した。転写終結活性の測定において、まず、1×転写バッファー（20 mM Tris-HCl（pH 8.0）
、2 mM NaCl、1 mM MgCl2、4％グリセロール、0.1 mM
DTT および 0.1 mM EDTA）を用いて、1μM GTP、5μM ATP、5μM UTP、100μM ApU、[α-32P] GTP、75 nM
鋳型 DNA、0.0167 U/μL 大腸菌 RNA ポリメラーゼホロ酵素を混合し、鋳型 DNA 上で停止した転写複合体を再構成した。次に、26 nt の C-less 配列に相補的な DNA オリゴヌクレオチドを最終濃度 1.1μM で反応溶液に添加し、室温で 5 分間インキュベートした。9μL の上記反応溶液、3μL の化合物溶液および 3μL の NTP 溶液を添加して RNA
伸長反応を再開し、37℃で 20 分間インキュベートした。鋳型 DNA を除去するために、0.5 U の RNase-Free DNase
を反応溶液に加え、37℃で 10 分間インキュベートした。等量のローディング溶液（2×TBE、8 M 尿素、20％スクロース、0.05％ブロモフェノールブルー、0.05％キシレンシアノール）を添加して反応を停止させた後、反応混合物を 8％
変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（変性 PAGE）で分離してホスホイメージャーで可視化した。
4．PreQ1 リボスイッチと合成化合物との複合体の結晶構造解析
11.8 mM カコジル酸ナトリウム（pH 7.0）を含む T. tengcongensis PreQ1 リボスイッチ溶液を、65℃で 2 分間加熱した。次に、MgCl2 と合成化合物をそれぞれ終濃度が 10 mM と 0.5 mM になるように添加した。この溶液を 65°C で3 分間インキュベーションした後、徐々に室温まで冷却した。結晶化は、1μL の RNA 溶液（10 mM カコジル酸ナトリウム（pH 7.0）、0.38 mM RNA、10 mM MgCl2、0.5 mM 合成化合物）を 1μL のリザーバー溶液と混合し、20℃2にてハンギングドロップ蒸気拡散法により行った。最終的に、10 mM 酢酸マグネシウム、50 mM MES（pH 5.6）、2.5M 硫酸アンモニウムをリザーバーとした条件において、結晶構造解析に適した複合体の結晶を取得した。データ収集のために、RNA 結晶を 10 mM 酢酸マグネシウム、27.5 mM MES（pH 5.6）
、2.15 M 硫酸リチウムを含むクライオ溶液にソーキングした。その後、RNA 結晶を液体窒素に浸して急速冷凍した。X 線回折データは、SPring-8 のビームラ
イン BL45XU およびフォトンファクトリーのビームライン BL-17A にて収集した。プログラム XDS を用いて回折データを処理した。
4 種類の合成化合物（化合物 A～D）と結合した PreQ1 リボスイッチの結晶構造を、プログラム PHASER を用いた分子置換法により決定した。プログラム COOT を用いて原子構造モデルを構築し、プログラム PHENIX により構造の精密化を行った。得られた電子密度マップから合成化合物の結合部位も判明した。最終的に、分解能 2.25、2.37、2.59、2.10 Å にて Rfree が 21.3、18.6、18.6、25.1％で結晶構造を決定した。

結果および考察1．誘導体化合物の転写終結活性
ジベンゾフラン化合物の化学構造（図 1 右）を基盤にして 10 種類の誘導体化合物（化合物 A～J）を合成した（論文未発表のため合成化合物の化学構造は本報告書では表示していない）。これら誘導体化合物について、in vitro における転写終結効率を測定した。この実験では、RNA ポリメラーゼが合成した S. saprophyticus PreQ1 リボスイッチおよびその下流にある mRNA を変性 PAGE で分析した。リガンド（PreQ1 もしくは合成化合物）の添加によって PreQ1 リボスイッチの直下で転写が終結した場合には、下流の mRNA は合成されず短い RNA が産生される。一方、リガンド濃度が低い場合もしくはリガンドの転写終結活性が弱い場合には、リボスイッチの下流にある mRNA が合成され長いRNA が産生される。変性 PAGE による分析画像の一例として、図 2 に化合物 A による転写終結実験の結果を示す。

図2．in vitroにおける化合物Aによる転写終結活性化合物 A の濃度を徐々に上げて測定した。（RT）：鋳型 DNA の末端まで合成されたRNA。（T）：途中で転写が終結した RNA。

転写産物を変性 PAGE で分析しリガンドによる転写抑制活性を評価した結果、四種類の誘導体化合物 A～D のEC５０値は 4.8～11μM 程度であった。親化合物の EC５０値が 359μM であったことから、これら四種類の誘導体の転写抑制効率は親化合物と比較して 30～75 倍程度にまで上昇していることが明らかとなった。したがって、親化合物の化学構造を変更することによって転写抑制活性を調節できることが明らかになった。さらに、これら化合物が細菌のタンパク質合成にとって重要な遺伝子の発現を抑制すると期待でき、新規な抗生剤の候補物質となりえると考えられる。
一方、化合物 A～D の EC５０値は依然として天然リガンドである PreQ1 と比較して大きい。今後、これら誘導体の化学構造を基盤にしてさらに転写抑制効果の大きな化合物の創製を目指す。

32．誘導体化合物と結合した PreQ1 リボスイッチの結晶構造
化合物 A、B、C、D と結合した T. tengcongensis PreQ1 リボスイッチの結晶構造を分解能 2.25、2.37、2.59、2.10
Å で決定した。結晶構造を解析した結果、これら化合物はいずれも天然のリガンドである PreQ1 と類似した部位に結合していることが判明した。一例として、化合物 A と結合した PreQ1 リボスイッチの結晶構造を図 3 に示す。化合物
A から D は親化合物の化学構造を基盤として合成したため、天然リガンドである PreQ1 と比較するとヘテロ原子の数が少なく疎水性が高い。そのため、誘導体化合物は主に PreQ1 リボスイッチで保存された塩基とのスタッキング相互作用により結合が安定化されていた。また、少数ではあるが保存された塩基との間に水素結合も形成していた。親化合物が結合した PreQ1 リボスイッチの立体構造と比較すると類似していたが、化合物の化学構造の変化に伴って結合部位が少しシフトし、水素結合のパターンが異なることが明らかとなった。この構造の違いが転写抑制効率の上昇と関連すると考えられる。今後、これら誘導体が結合した PreQ1 リボスイッチの立体構造を基盤にして更なる誘導体の作製を試み、細菌の遺伝子発現を効率よく調節する化合物の創製を目指す。

図3．リガンドと結合したPreQ1リボスイッチの結晶構造の表面分子モデルa） PreQ1 と結合した PreQ1 リボスイッチの結晶構造。PreQ1 をマジェンタで表示した。
b） 化合物 A と結合した PreQ1 リボスイッチの結晶構造。化合物 A をマジェンタで表示した。

共同研究者
本成果は、Chemical Biology Laboratory, National Cancer Institute, NIH の John S. Schneekloth, Jr.博士との共同研究である。

文 献
1） Breaker R.R. Riboswitches and the RNA world. Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 2012, Feb 1;4(2):a003566.
PMID: 21106649 DOI: 10.1101/cshperspect.a003566
2） Roth A., Breaker R.R. The structural and functional diversity of metabolite-binding riboswitches. Annu. Rev.
Biochem., 2009, 78:305-34. PMID: 19298181 DOI: 10.1146/annurev.biochem.78.070507.135656

43） Roth A., Winkler W.C., Regulski E.E., Lee B.W., Lim J., Jona I., Barrick J.E., Ritwik A., Kim J.N., Welz R.,
Iwata-Reuyl D., Breaker R.R. A riboswitch selective for the queuosine precursor preQ1 contains an unusuallysmall aptamer domain. Nat. Struct. Mol. Biol., 2007, Apr;14(4):308-17. Epub 2007 Mar 25. PMID: 17384645
DOI: 10.1038/nsmb12244） Meier F., Suter B., Grosjean H., Keith G., Kubli, E. Queuosine modification of the wobble base in tRNAHis
influences 'in vivo' decoding properties. EMBO J., 1985, Mar;4(3):823-7. PMID: 2988936 PMCID: PMC554263
5） Hutinet G., Swarjo M.A., de Crécy-Lagard V. Deazaguanine derivatives, examples of crosstalk between RNAand DNA modification pathways. RNA Biol., 2017, Sep 2;14(9):1175-1184. Epub 2016 Dec 12. PMID: 27937735
DOI: 10.1080/15476286.2016.1265200
6） Connelly C.M., Numata T., Boer R.E., Moon M.H., Sinniah R.S., Barchi J.J. Ferré-D’Amaré A.R., Schneekloth
Jr. J.S. Synthetic ligands for PreQ 1 riboswitches provide structural and mechanistic insights into targeting
RNA tertiary structure. Nat. Commun., 2019, Apr 2;10(1):1501. PMID: 30940810 DOI: 10.1038/s41467-01909493-3

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