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100号

祝！ 創 刊

KOD SYBR® qPCR Mix→本誌p.7〜10に詳細記事がございます。

1 UPLOAD100号発刊にあたって

SPECIAL REVIEW
3 極限環境微生物とその利用

ミックス
7 高効率リアルタイムPCR用マスター®

KOD SYBR qPCR Mix

11 Emerald Lucリポーターアッセイシステム用1液検出試薬
Emerald Luc Luciferase Assay
Reagent Neo

TECHNICAL REVIEW
12 Emerald Lucを用いたスプリットルシフェラーゼによるタンパク質相互作用検出系の構築と
GPCRリガンドスクリーニングアッセイへの応用

2013 Januar y

100

VOL.

S

No.100_'13.qx 12.12.11 18:53 ページ 1

UPLOAD100号発刊にあたって
ご愛読いただいております弊社情報誌「UPLOAD」は記念すべき100号を迎えました。また昨年、東洋紡は会社創立130年、及び研究用試薬事業を開始してから30年という節目の年でもありました。弊社は1882年に繊維事業から出発し、1952年に
生化学関連研究に着手、1982年に診断薬用酵素開発で培った技術を用いて制限酵
素の販売を開始しました。これが、現在の研究用試薬事業の基点となり、現在に至って研究を始めた当時の酵母培養槽

います。振り返ってみますと、1953年にワトソン・クリックがDNAの二重らせんモデルを提唱してから現在に至るめまぐるしい進歩の中、弊社も時代の流れに沿った形で様々な製品をお客さまに提供して参りました。
その中、新製品を中心としてお客さま方に弊社の商品を分かりやすく紹介しようという趣旨で産まれたのが情報誌「UPLOAD」でした。情報をアップロードするという言
葉は今でこそ一般化していますが、創刊した1990年当時はインターネットもほとん
ど普及していない時代でした。

敦賀バイオ研究所（現在）

山中先生がノーベル生理学・医学賞を受賞

２０１３

研究用試薬事業﹁ＵＰＬＯＡＤ﹂１００号発刊

周年

２０１２

２００７

山中先生がｉＰＳ細胞を発表 ２００６

２００４

１９９９

１９９８

ヒトゲノムプロジェクト完了 ２００３

ファイアー等がＲＮＡ干渉現象を発見

１９９７

情報誌
﹁ＵＰＬＯＡＤ﹂創刊

制限酵素の販売を開始

PCR酵素
PCR酵
「KOD FX」
発売

自動核酸抽出装置「MFX」発売

PCR酵素「Tth DNA
ポリメラーゼ」を発売

30

リアルタイムPCR試薬発売

PCR酵素「KOD DNA
ポリメラーゼ」を発売
改変型逆転写酵素「ReverTra Ace®」発売

研究用試薬事業の歴史は
ここから

印刷

製本

UPLOAD印刷工程

2013

１９９６

１９９５

１９８９

ヒトゲノムプロジェクト開始 １９９０

カッペキ等がノックアウトマウスを作製

１９８７

１９８２

１９７７

診断薬事業を開始

シータス社のマリスがＰＣＲ法を発表

サンガーがジデオキシ法
によるシーケンス法を発表

１９７２

診断薬用酵素事業を開始

１９６８

酵母の利用研究を開始

ＴＯＹＯＢＯバイオ年表

１９７０

スミス等が制限酵素発見

１９５３

１９５２

ワトソン・クリックが二重らせんモデルを提唱

世界バイオ年表

PCR酵素
PC
「K
「KOD
-Plus- 」
発売

1

免疫反応促進試薬「Can Get Signal ®」発売

仕上げ

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それでは少し創刊当時を振り返ってみることにします。
創刊号では今でも販売を継続していますコンピテントセルが新製品として掲載されていました。コンピテントセルは未だに良く使用する試薬の一つですね。そのあたりの事情はあまり変わっていないようです。

UPLOAD創刊号（1990年7月号）

コンピテントセルの記事
UPLOAD創刊号（1990年7月号）

この当時はバイオの黎明期で2ヵ月に一回情報誌を発刊していました。内容を覗いてみると、当時需要が増していたシーケンシングに関する情報が多かったようです。
下左の写真は当時取り扱っていたUSB社のSequenase ®を使ったシーケンシングの紹介記事です。当時、この酵素を使ってシーケンス反応を行い、A, G, T, Cとそれぞれについて電気泳動した後に、オートラジオグラフィーによって得られたラダーを解析する方法が主流でした。ラジオアイソトープを使わなくてはならず、本当に面倒な実験でした。シーケンス用ゲルの作り方もそれぞれコツがあり、どれくらい読めるかもそれにかかっていたような記憶があります。その後オートシーケンサーが発売され、バンドを読む必要がなくなり、本当に便利になりました。写真右は弊社が開発したTth（Thermus Thermophilus）DNAポ
リメラーゼをオートシーケンサーに応用した事例の紹介記事です。当時、オートシーケンサーはあまり普及していませんでしたが、その後の、キャピ
ラリーを用いたシーケンサーの登場で一気に広がりました。
そのほか、当時、クローニングといえばライブラリー、発現解析といえばノーザンブロットでした。それに関連した商品も数多く紹介させていただい
USB社Sequenase®の記事（1990年9月号）

Tth DNAポリメラーゼをオートシーケ
ンサーに応用した事例紹介（1990年9月号）ていました。

1995年の33号になると表紙はフルカラーになります。この号の目玉はKOD DNAポリメラーゼです。
当時は何と言ってもTaq DNAポリメラーゼが主流でしたが、正確性が悪く、クローニングに苦労していました。その中、発売されたのがKOD DNA
ポリメラーゼでした。Taq DNAポリメラーゼは、好熱細菌由来でFamily Aに分類され、いわゆる校正活性(3 →5 エキソヌクレアーゼ活性）は備わっていません。一方、KODはArchaea由来のFamily Bに分類されるポリメ
ラーゼであり、校正活性を有し優れた正確性を示すため、クローニングなどに大変有利です。
KODの名前の起源は、鹿児島県の小宝島に由来しますが、当時、King ofDNAポリメラーゼとして販促していたことを思い出します（右写真）。
そのKODも、お客さま方の要望にお応えする形で、1999年にKOD-Plus-、2007年にKOD FXなどの改良品を開発、ここ数年もNeoシリーズ

UPLOAD 33号（1995年12月号）

KOD DNAポリメラーゼ新発売（1995年12月号）を発売するなど、現在も進化を続けています。

今号で紹介しました、
コンピテントセル、Tth DNAポリメラーゼ、及びKOD DNAポリメラーゼはすべて日本の先生方からご指導を受けたり、菌株を分与いただいた経緯があります。これらの商品は日本発の試薬として、海外へも販売され、世界中のライフサイエンス研
究の発展を支援しています。
今後、
ライフサイエンス研究は再生医学の進展などとともに益々発展していく分野であると考えられます。弊社といたしましては益々皆様のお役に立てる製品を開発して参る所存です。今後とも変わらぬご愛顧を宜しくお願いいたします。

最後に、今回は特集の一環としまして、KOD DNAポリメラーゼ開発において多大なるご指導をいただきました今中忠行先生に総説をご執筆いただいております。大変分かりやすい解説になっておりますので、是非、ご一読ください。

2

2013

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SPECIAL REVIEW
極限環境微生物とその利用
立命館大学 生命科学部 教授 今中 忠行

生物の分類

発や産業プロセスへの応用が期待できることである（4）。

生物を分類する基準として、永らく①形や大きさなどの形態学的われわれは、鹿児島県小宝島の硫気坑から100℃でも生育でき

基準と、②基質や生産物など代謝的特徴をふまえた生理学的基準がる超好熱始原菌Thermococcus kodakaraensis KOD1（図2）

用いられてきたが、遺伝子工学の発展をもとに16S rRNA（真核生を分離し、多くの耐熱性酵素に物では18S rRNA）などの特定遺伝子の塩基配列を比較する③遺ついて検討してきた。ここでは、伝学的基準が採用され現在に至っている。現在のすべての生物は耐熱性DNAポリメラーゼの利細菌、始原菌、真核生物の3つのドメインに分けられる（図1）（1）。

用について述べてみたい。

もちろん細菌、始原菌は原核生物であり、始原菌から真核生物が進化してきたと考えられている。また生命の源流は超好熱菌であり一般的に高温、嫌気的条件下で生育する特徴をもつ。
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図2. Thermococcus kodakaraensis
KOD1の電子顕微鏡写真

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⢋Ⳟ㢦

䝋䜧䝛䝱䝦䝎䜽

ポ メ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応（PCR）法 の 開 発
シータス社のK. MullisがPCR法を開発（5）してから四半世紀が経った。簡単に遺伝子の特定領域を100万倍以上に増幅できる⣵Ⳟ䜴䝭䝤㝟ᛮⳞ
䝛䝱䝊䜮䝔䜳䝊䝮䜦䝙䝭䝠䝔䜳䝊䝮䜦
䜻䜦䝒䝔䜳䝮䜦

この技術は、微量遺伝子の検出など生命科学の研究に不可欠な技ጙཋⳞ⥫Ⰵ㟸◪㯜⣵Ⳟ
Desulfurococcus
Thermotoga Pyrodictium術であるだけでなく、法医学、親子鑑定、環境中の微生物モニタリン

Sulfolobus

グ、食品工場での雑菌汚染の早期発見など応用面でも幅広く利用さ

Thermofilum
Thermoproteus
Pyrobaculum
Pyrococcus, Thermococcus
Methanothermus
Methanothermobacter
Archaeoglobus

れている。彼はこの業績が認められて1993年にノーベル賞を受賞している。PCR法の概略を示したのが図3である。①まず95℃程度の高温で二本鎖DNAを一本鎖に解離（変性）させ、②その後55〜60℃でプライマー（別途化学合成した相補的オリゴヌクレオチド）

Methanopyrus

Aquifex㉰ይ⇍Ⳟ
図1.

Halobacterium
Halococcus
Methanoplanus
1 Methanocaldococcus Methanosarcina
Methanospirillum
2 Methanotoris
3 Methanothermococcusを結合させ（このプロセスを「アニーリング」という）、③最後に60〜72℃でDNA鎖の伸長反応が進む。この3つの工程を25〜30回繰り返すことにより試料DNAを指数関数的に増幅させることができる。厳密にいえば、両末端が整った目的一本鎖断片が生じるのは2サイクル目を終了した時点であり、3サイクル目から目的二本鎖断

全生物の進化系統樹

片が指数関数的に増えることになる。最終的に電気遊動で単一バンドが目視できるまでに増幅（100倍以上）されることになる。

好熱菌の発見開発当初は大腸菌のDNAポリメラーゼが使われていたが、高温処1980年代前半、
ドイツのK. Stetterらを中心に100℃以上でも理が含まれているためサイクル毎に酵素を添加する必要があった。

生育する微生物が分離された（2）。その後も高温環境で生育する

この煩雑さから逃れるために、耐熱性のDNAポリメラーゼが利用さ微生物の分離が続けられているが、これらは既存の好熱菌よりさられるようになったのである。
PCRをうまく行うためには、サイクル数、温度、時間、プライマー、に高い温度域で生育することから超好熱菌（hyperthermophile）

緩衝液など、それぞれについて最適な条件を検討する必要がある。

と呼ばれている。
現在、超好熱菌とは、一般に90℃以上で生育する微生物、あるいはおおよその指標として、DNA増幅が認められない場合には、アニー

至適生育温度が80℃以上の微生物として定義されている。すでにリング温度を下げる、反応時間を延ばす、熱変性時間を長くするな

この定義に当てはまる微生物は100種以上分離・同定されており、どの方法が有効である。
一方、目的のDNA以外の非特異的な増幅が認められる場合には、122℃が今までの生育最高温度として報告されている（3）。

アニーリング温度を上げる、合成時間を短くする、プライマーのデザ

超好熱菌は、二つの観点からとくに注目を集めている。一つは2013

超好熱菌が進化系統樹の源流に位置するので、生物進化の流れをインを変更する（繰り返し配列を避ける）などの方法が有効である。

理解するために重要であること。もう一つは、それらが生産するタン

これらの方法でも改善が認められない場合には、緩衝液中のMgイ

パク質が高い耐熱性あるいは好熱性を示すという点で、従来の酵素オン濃度を変化させる（1〜6mM）とよい結果が得られる場合がと比べて広い温度範囲で長期間使用可能なことから、新しい技術開ある。

3

No.100_'13.qx 12.12.11 18:53 ページ 4

されることが判明した。そこで、赤色の3つの遺伝子部分のみを連

1st cycle

2nd cycle
primers

結させた（2つのエンドヌクレアーゼ部分を除去した）ポリメラーゼ

3rd cycle遺伝子を構築し、以後の実験に供した。この遺伝子を宿主である大腸菌内でクローニングし、大量発現させた後、菌体を破砕し、高温処

template

95䁯C

理をすれば、ほとんどのホストたんぱく質は熱変性して沈殿し、耐熱

denature

性のポリメラーゼは溶解したままなので、精製が容易である。このあとイオン交換カラムクロマトグラフイーにかければ、ほぼ純品の酵

55䁯C

annealing72䁯Celongation

素が得られる。

4th cycle

Transcription
5010 bp(DNA polymerase)

intein-11080 bp

intein-2
1608 bp

Translation

図3．PCR法の実際
Protein splicing

DNAポリメラーゼの種類
PCRは優れた遺伝子増幅方法であるが、前述のように増幅が認められない、あるいは非特異的増幅などのトラブルはもちろんのEndonuclease I

こと、反応速度や正確性などにおいて改善すべき点も多く残され

KOD polymerase Endonuclease II

図4．KOD1株のDNAポリメラーゼ遺伝子ている。
反応条件の至適化だけでなく、酵素であるDNAポリメラーゼを

KODポリメラーゼについて、PCRに使う場合の諸特性を他の市改良する試みも多くなされてきた。PCR用酵素として使用されてい販されている酵素と比較したのが図5である。本酵素は、より長く、るDNAポリメラーゼは、細菌由来のPolⅠ型酵素と、始原菌由来

より速く伸長反応が進み、最も忠実度が高い（正確な）という三冠王

DNAポリメラーゼを含むα型酵素に大きく分けることができる。

の酵素であることが明らかになった（10，11）。

Taq DNAポリメラーゼに代表されるPolⅠ型酵素は、DNA合成
Pyrococcus属

活性が高いが、校正機能としての3'→5'エキソヌクレアーゼ活性が<20 bp<20 bp由来酵素A

Pfu

ない場合が多く、増幅の際の正確性に問題がある。

Processivity (Bases/Reaction)

300 bpKOD

α型酵素は強い3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有しており、正

0

100

200

300

400

確な増幅反応をおこなえるが、一般的に伸長活性は低い場合が多い。
Taq

したがって目的に応じた酵素の使用が望ましい。

61

Pyrococcus属

Extension efficiency (Bases/sec)

23

由来酵素A

25

Pfu

138

KOD

KOD1株の耐熱性DNAポリメラーゼとその特性

0

50

100

150

200

好熱菌の酵素なら耐熱性が高いはずであると考え、シータス社がTaq

Thermus aquaticus のポリメラーゼをTaqポリメラーゼとして

Pyrococcus属

1.16

由来酵素A

最初に商品化した。しかしこのTaqポリメラーゼは伸長反応の速度Pfu

は速いが、エキソヌクレアーゼ活性が低いため校正機能が弱く、忠KOD

実度（正確性）が悪いという欠点がある。そこでThermusよりさら

KOD-Plusキア）に属するPyrococcus furiosusの酵素（Pfuポリメラーゼ）

Mutation frequency (%)

0.15
0.09
0

に高温（90℃以上）で生育する超好熱菌が探索され、始原菌（アー

7.39

0.63

2

4

6

8

図5．KOD DNAポリメラーゼのPCRにおける性能比較が商品化された。この酵素は、Taqポリメラーゼと比較して、耐熱性は高く忠実度も良いのだが、合成速度が遅いという欠点があった。

DNAポリメラーゼの立体構造

そこで私たちは、新たに超好熱菌を自然界から分離し、より良質のポリメラーゼを探索することにした。鹿児島県小宝島の硫気坑か

KODポリメラーゼの結晶が得られたので、X線回折によりこの

ら超好熱性始原菌を分離し、Thermococcus kodakaraensis

立体構造を決定した（図6）（12，13）。ポリメラーゼ活性領域を示

KOD1と名付けた（6，7）。本菌のDNAポリメラーゼ（KODポリメしたのが図7である。活性中心は3つのアスパラギン酸で構成されラーゼ）遺伝子の構造（8）を図4に示す。ポリメラーゼ構造遺伝子ており、その近傍にはリジンやアルギニンの正荷電アミノ酸が壁をの中にin frameで2つのインテインが含まれていた（9）。この遺伝成している。DNA合成反応の基質は負荷電のヌクレオシド三リン酸子が転写・翻訳されて大きなポリペポチドが合成され、自発的に折りであるから、正荷電の壁の方へ容易に近づくことができ、局部的にたたまれた際にタンパク質スプライシングが起こり、2つのエンド

基質濃度が高くなるために、反応が早く進むのであろう。エキソヌク

ヌクレアーゼが生じる。その時に、ポリメラーゼ部分（3つの赤色のレアーゼ活性領域を示したのが図8である。この図のフォークポイ

ペプチド部分）が自動的に連結され正常なKODポリメラーゼが生成

ントには7つのアルギニン残基がある。他の同種酵素で7つあるも

4

2013

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SPECIAL REVIEWのはまだ見つかっていない。DNAは当然負に荷電しているから、正ホットスタートPCRに荷電しているアルギニンとはうまく認識し合って長いDNA合成が通常のPCRを行うと、最初の昇温時にどうしてもミスマッチプラ

可能になっているものと考えられる。またこのアルギニンの一つをイマーのアニーリングやプライマーダイマーが生じてしまい、目的

他のアミノ酸に置換すると忠実度が低下するので、正確性も7つの外のDNA断片が増幅されることがある。そこで、最初の昇温時にアルギニン残基のお陰であろう。また酵素の立体構造に基づいて、

DNAポリメラーゼの活性をマスクし、高温になってからPCRがスタ

ポリメラーゼ活性と校正機能の協働作用を論じることができるのもートするようにすれば、上述の問題を回避することができる。これが構造生物学の利点であろう（14）。

ホットスタートPCRである（図9）。
Denaturation

Temperature
profile䜘䠃䠂䠂୒ಶ

Extension
AnnealingἪ䛵௧୕䛱⠾༟䛱ቌᖕ䛭䛓䜑䚯䛙䛴᪁Ἢ䛱䜎䜐䚮のᏄ㚯ᏽ䚮≚⨝ᤒᰕ䚮⎌ሾ䝦䝏䝃䝮䝷䜴䚮㣏ဗ䛴㞟Ⳟỗ᯹᳠ᰕ䛰䛯䛒DNA polymerase䛭䛓䜑䚯
activity profile

Mismatch primer
annealing
Primer-dimer
formation

Normal PCR䜘ቌᖕ䛟䜑䛥䜇䛱ᚪこ䛭䛈䜑䛴䛒⪇⇍ᛮ㓕⣪

Exact primer
annealing

Hot start PCR⌟ᅹ䚮ୠ⏲୯䛭ᕰ㈅䛛䜒 Hot start PCR prevents undesirable extension
ይビ䜘༡䛝䛬䛊䜑䚯from inspecific annealing
図6．KOD DNAポリメラーゼの立体構造
図9．ホットスタートPCRの特性

われわれはまず抗DNAポリメラーゼ モノクローナル抗体を作製し、その中から酵素活性を阻害する抗体を選択することにした。
まず精製したKODポリメラーゼを用いてマウスを免疫し、その脾臓細胞（抗体を生産することができるが、増殖し続けることができない）と、抗体は作れないが増殖し続けることができる癌細胞を融合させ、抗体産生能力があり増殖することができるハイブリドーマを16株得た（15）。それぞれが独自のモノクローナル抗体を産生するので、それらがポリメラーゼ活性を阻害するかどうかを調べた。特に阻害度が強力な2種の抗体が得られたので、それらについてエピトープ
解析を行った。すなわち、抗体が抗原タンパク質のどの位置に結合しているのかを調べたのである。3G8抗体はDNAポリメラーゼ活性を示す保存領域に結合し、βG1抗体は3'→5'エキソヌクレアーゼ
活性の保存領域に結合することが明らかになった。2つの抗体を同時に添加すると、低温域ではポリメラーゼ活性をほぼ完全に阻害し、

図7．KOD DNAポリメラーゼのポリメラーゼ領域

高温域になるとマウス由来のタンパク質であるため熱変性してポリメラーゼからはずれて酵素活性が回復する（図10）。商品化したキット（KOD-Plus-）には、
これらのモノクローナル抗体が添加されている。

3 →5 エキソヌクレアーゼ DNAポリメラーゼ
ドメイン
ドメイン

DNAポリメラーゼ

DNAポリメラーゼ（活性型）
熱
DNAポリメラーゼ（不活性型）
反応液中
で混合

モノクローナル抗体

モノクローナル抗体（変性物）

図8．KOD DNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ領域
図10. ホットスタートPCRにおけるモノクローナル抗体の役割

2013

5

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KOD FXの凄さ
KODポリメラーゼの特性はいろいろな人からも指摘されてきた。例えば理化学研究所の林崎氏は、いろいろな生物種の遺伝子を紙に浸み込ませたDNA bookを作られたが、そこからPCRで遺伝子増幅できるのはKODポリメラーゼだけであるといわれた。また感染症研究所で出されている病原菌の検出マニュアルの中で、わざわざKODポリメラーゼでPCRを行うように記載されている例もある。さらには最近では、高性能PCR試薬としてKOD FXが開発され、東洋紡（株）から発売されている。その特徴は、①高い成功率、②抜群の増幅効率、③優れた伸長性（増幅可能鎖長）、④高い正確性、である。さらにこの酵素は、血液、マウステールライゼート、植物抽出液などの天然試料についてDNAを抽出することなく、そのままPCRにかけることが可能である。また通常はDNAを抽出しがたい酵母やカビなどのコロニーPCRも簡単に行え
るし、GC含量が90％以上のプライマーを使用してもPCRが可能である。このような特徴は他の酵素では不可能であるため、多検体試料を高速処理するために必要な自動化などの場合には、その有用性が際立つことであろう。
実施例につきましては、オンラインUpload vol.99をご覧ください

参考文献
1） 工学系のための生化学

左右田健次・今中忠行・谷澤克行

編著

化学同人

2012

2） Stetter K：Nature, 300, 258-260（1982）
3） Takai K, Nakamura K, Toki T, Tsunogai U, Miyazaki M, Miyazaki J, Hirayama H, Nakagawa S, Nunoura T,
Horikoshi K：Prod. Natl. Acad. Sci. USA, 105（31）, 10949-10954（2008）
4） 跡見晴幸、今中忠行：生化学 75, 561-575（2003）
5） Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H： Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 51（Pt 1）,
263-273（1986）
6） Morikawa M, Izawa Y, Rashid N, Hoaki T, Imanaka T：Appl. Environ. Microbiol., 60, 4559-4566（1994）
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8） Takagi M, Nishioka M, Kakihara H, Kitabayashi M, Inoue H, Kawakami B, Oka M, Imanaka T： Appl.

Environ.Microbiol., 63, 4504 -4510（1997）
9） Nishioka M, Fujiwara S, Takagi M, Imanaka T：Nucleic Acids Res., 26, 4409-4412（1998）
10）Nishioka M, Mizuguchi H, Fujiwara S, Komatsubara S, Kitabayashi M, Uemura H, Takagi M, Imanaka T： J.

Biotechnol., 88, 141 -149（2001）11）Imanaka T, Takagi M：J. Chin. Inst. Chem, Engrs. 32, 277-288（2001）
12）Hashimoto H, Matsumoto T, Nishioka M, Yuasa T, Takeuchi S, Inoue T, Fujiwara S, Takagi M, Imanaka T,
Kai Y：J. Biochem., 125, 983-986（1999）
13）Hashimoto H, Nishioka M, Fujiwara S, Takagi M, Imanaka T, Inoue T, Kai Y： J. Mol. Biol., 306, 469 -477
（2001）
14）Kuroita T, Matsumura H, Yokota N, Kitabayashi M, Hashimoto H, Inoue T, Imanaka T, Kai Y： J. Mol. Biol.,
351, 291-298（2005）15）Mizuguchi H, Nakatsuji M, Fujiwara S, Takagi M, Imanaka T：J. Biochem., 126, 762-768（1999）

経歴
1967年 大阪大学工学部醗酵工学科卒業
1969年 同大学院工学研究科醗酵工学専攻修士課程修了
1969年 同大学院工学研究科醗酵工学専攻博士課程中退
1973年 工学博士
1989年 大阪大学工学部教授
1996年 京都大学大学院工学研究科合成・生物化学専攻教授
2004〜2005年 第46次南極地域観測隊員
2008年 京都大学名誉教授（現職）2008年 立命館大学生命科学部生物工学科教授（現職）日本醗酵工学会斉藤賞、日本生物工学会論文賞、日本生物工学会生物工学賞、有馬啓記念バイオイ
ンダストリー協会賞、日本化学会賞、環境バイオテクノロジー学会賞受賞、紫綬褒章受章
アメリカ微生物学アカデミーフェロー、20期・21期日本学術会議会員、日本化学会フェロー

6

2013

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発売記 ーン
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高効率リアルタイムPCR用マスターミックス®

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約2kbのフラグメントを用いて解析可能

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2： KOD FX
3： KOD -Plus- Ver.2
M： 1kbラダー
Template：Human gDNA
Target：TGFβ（1918bp）

弊社従来品
THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix

KOD SYBR® qPCR Mix

図1．長鎖ターゲットに対するリアルタイムPCR（ABI StepOnePlusTM使用）
KOD FXシリーズやKOD-Plus-シリーズで増幅可能なプライマーを用い、約2kbのターゲットの増幅を実施しました。その結果、Taq DNAポリメラーゼを用いる従来品では増幅困難な約2kbのターゲットでも本製品では定量的な増幅が認められました。

2kbまでの様々なターゲット長を選択できるため、幅広い融解曲線解析が可能です。プライマーダイマーの発生領域（短鎖領域）
を外して増幅領域を選べるため、エンドポイントアッセイでの多型解析、マルチプレックスPCR解析などに有利です。

（a）電気泳動解析

〔bp〕（b）融解曲線解析（c）増幅長とTm値

至適解析領域
KOD
Taq

M

増幅長
（bp）
60
94
141
199
357
552
1061

1061

552
357
199
141
94
60

60
60

65

70

75

94 141 199 357 552 1061 (bp)80Temperature
（℃）

85

90

95

ACT
予測Tm値 実測Tm値
（℃）
（℃）
74
72
77.5
76
79
79
82
82
85
84
86
86
87
88

※予測Tm値が実測Tm値と一致しない場
合もあります。

プライマーダイマーの発生領域
Taq DNA polymeraseを用いる場合の解析領域
KOD DNA polymeraseを用いる場合の解析領域

M：100bpラダー

図2．増幅長が異なるターゲットを用いた解析（ABI7500使用）
ヒトゲノムDNAを鋳型にβ-アクチン遺伝子上の増幅長が異なるターゲットの増幅、及び融解曲線解析を実施しました。その結果、60bp〜約1kbまでの増幅産物が得られ、74〜87℃の幅広い温度域で今回増幅した増幅産物の識別が可能でした。そのため、増幅長を変え融解温度に差異が生じるようにプライマーを設計することでワンチューブで複数のターゲットの検出が可能となります。この融解曲線の差異はGC含有量に左右されますが、増幅産物のTm値を計算することで予測可能です。

2013

7

No.100_'13.qx 12.12.11 18:54 ページ 8

特長2 クルードサンプルを用いるエンドポイント解析に対応
植物ライセート、血液、マウステールアルカリ熱抽出液などのクルードサンプルを用いて直接検出することができます。SYBR®
GreenⅠアッセイを応用することで、煩雑だった多型解析やSNP解析を簡便化することができます。
①増幅長多型を用いるジェノタイピング解析
2つの増幅産物の増幅長を変え、Tm値に差異が生じるようにプライマーを設計するだけでワンチューブでマウスのジェノタ
イピングを行うことができます（特長1参照）。
短鎖長primer
増幅長：100bp/予測Tm値：79℃【マウステールアルカリ熱抽出液】
マウス
テール（約3mm）

Wild type
（WT）

マイクロ
チューブへ

1

共通 primer

2
CreER knock-in（KI）

50mM NaOH 180μl添加
Vortexにて良く攪拌CreER
共通 primer 長鎖長primer
増幅長：341bp/予測Tm値：84℃

3

KI/KI

95℃・10min.
1M Tris-HCl（pH8.0） 20μl添加

WT/WT

Vortexにて良く攪拌4

遠心（12,000rpm, 10min.）

WT/KI

20μl反応系に上清0.5〜2μlを添加（マウステールは完全には溶解しません）

5

60

65

70

75

80

85

90

95

※本実験で使用したトランスジェニッ
クマウスのマウステールは、東京大学分子細胞生物学研究所 情報伝達研究分野 平林祐介先生
よりご供与いただきました。

Temperature（℃）

図3．融解曲線解析を用いるワンチューブマウスジェノタイピング（ABI 7500使用）
マウステールアルカリ熱抽出液を用いワンチューブでジェノタイピング解析を実施しました。WT特異的増幅産物とknock-in特異的増幅産物の増幅長を変えることで、計算上、増幅産物のTm値に差異が生じるように設計しました。WT特異的プライマーは、CreER knock-inに対しては、増幅長が長いため、伸長時間を30秒と短くすることで増幅できないようにしています。また、ヘテロ検出におけるピーク比のバランスをとるために、WT特異的プライマー：knock-in特異的プライマー=1:3として検出の結果、すべてのタイプで増幅が認められジェノタイピングを実施することができました。

②ASP（Allele specific primer）-PCRを用いるSNP（Single nucleotide polymorphism）解析
一方のプライマーの5 末端にGC tailを付加することにより、同サイズのターゲットの識別を融解曲線解析により行うことができます。様々な原理のASP-PCRに応用可能です。以下では、3 末端から2塩基目にSNP部位、3塩基目にミスマッチ部位となるように設計し、解析を行いました。
（A）
共通 primer

5
共通 primer5

増幅長：110bp/予測Tm値：84℃
G特異的primer GC tail

×

3

×

3

Primer Sequence

共通 Primer
5'-CAGTCACCCTTTGGTGGCTAC-3'G
増幅長：98bp/予測Tm値：81℃ G特異的 Primer 5'-GCCGCCCTGCCCGCCACACTCACAGTTTTCACTGCA-3'
A特異的primer
A特異的 Primer 5'-CCCACACTCACAGTTTTCACTATA-3'

A※下線：GC tail、
赤字：SNP部位、
緑字：
ミスマッチ部位

（B）
口腔粘膜

血液
綿棒により
口腔粘膜を採取

G/G
A/A

G/G
A/A

↓

血液2μl

↓

200μlの滅菌水
で懸濁G/A100μlの滅菌水で希釈↓↓20μl反応系に2〜5μl添加20μl反応系に2〜5μl添加

60

65

70

75
80
85
Temperature
（℃）

90

95

G/A

60

65

70

75
80
85
Temperature
（℃）

90

95

図4．血液や口腔粘膜からの検出（ABI 7500使用）
一方のアレル特異的プライマーにGC tail（下線部）（A）ALDH2 SNP検出に用いたプライマーを示しています。ワンチューブで遺伝子型の識別を可能にするために、を付加し、増幅産物の融解温度（Tm値）に差異が生じるように設計しました。GC tail付加による融解温度の上昇を大きくするため、増幅長を100bp以下にしています。また、
この実施例においては、アレル特異的プライマーとして3 側から2塩基目をSNP部位（赤）、3塩基目をミスマッチ（緑）になるように設計しました。
（B）血液の水希釈液、口腔粘膜の水懸濁液を20μl反応系に5μl添加し、検出を行いました。その結果、遺伝子型の判定が可能でした。

8

2013

No.100_'13.qx 12.12.11 18:54 ページ 9③クルードサンプル中のターゲットの検出
従来品のTaq DNA polymeraseを使用したリアルタイムPCR試薬では増幅困難であったクルードサンプルにおいても解析が可能となりました。
【ワンステップ法】（A）短鎖Target: イネrbcL（257bp）

1
Buffer A
100μl添加Vortexにて良く攪拌

従来型リアルタイムPCR試薬（Taq使用）KOD SYBR® qPCR Mix

マイクロ
チューブへ

葉
（3mm角）

2

ワンステップ法
抽出液

精製DNA

Buffer A:
100mM Tris-HCl（pH9.5）
1M KCl10mM EDTA[THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix]

精製DNA
ワンステップ法
抽出液
No-templatecontrol

No-templatecontrol3
60

95℃・10 min.

65

70

75

80

85

90

95

60

65

70

Temperature（℃）

4

Vortexにて良く攪拌

75

80

85

90

95

Temperature（℃）（B）長鎖Target: イネ・タバコ葉rbcL（1.3kb）

KOD SYBR® qPCR Mix

上清を滅菌水で1/10希釈

ワンステップ法抽出液（イネ）

20μl反応系に0.5〜2μl添加

ワンステップ法抽出液
（タバコ）

5

参考文献：Bio Techniques, 19: 394（1995）

No-templatecontrol

60

65

70

75

80

85

90

95

Temperature（℃）

図5．クルードサンプルからのリアルタイムPCR検出（ABI 7500使用）（A）ワンステップ法にて作製したイネライセート及び精製DNAを用いて、弊社従来品と本製品の比較を行いました。その結果、本製品ではライセートを用いて特異的な増幅が認められましたが、Taq DNA polymeraseを使用している従来品では増幅が認められませんでした。
（B）増幅長が1.3kbのターゲットについて、増幅を実施しました。その結果、本製品ではライセートをサンプルとした場合においても特異的な増幅が認められました。

特長3 GC含有率が70％を超えるターゲットに強い
従来品では困難であったGC含有率が70%を超えるターゲットにおいても、定量的な増幅が認められます。

IGF2R（GC含有率：83％、鋳型：cDNA）

KOD SYBR® qPCR Mix

Ａ社製リアルタイムPCR試薬（GC含有率70％以上対応）

5-1希釈

5-1希釈

5-1希釈
5-5希釈

-5

5 希釈

弊社従来品
THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix

5-5
希釈

図6．GCリッチなターゲットに対するリアルタイムPCR（ABI StepOnePlusTM使用）
GC含有率が70％を超えるターゲットに対し、各リアルタイムPCR試薬による反応性の比較を行いました。鋳型には、弊社の高性能逆転写反応用試薬「ReverTra Ace® qPCR RT Kit（Code No. FSQ-101）」により合成したHeLa細胞total RNA由来のcDNAを用い、cDNAの5倍希釈（5段階）について、反応を実施しました。その結果、弊社従来品では、増幅困難であったGCリッチなターゲットに対しても、定量的な増幅が認められました。また、反応特異性が高く、プライマーダイマーが生じにくいため、低コピーまでの幅広い定量可能域を得ることができました。

2013

9

No.100_'13.qx 12.12.11 18:54 ページ 10

特長4 高い特異性
プライマーダイマーなどの非特異的反応を抑えることで、低コピー域までの幅広い定量が可能です。また、弊社リアルタイム
PCR用cDNA合成キット「ReverTra Ace® qPCR RTシリーズ」を併用することで安定した検出を得ることができます。

KOD SYBR® qPCR Mix

Ａ社製リアルタイムPCR試薬◆ターゲットKRT10（156bp / GC : 43%）
10-1 希釈10-1 希釈

10-5
NTC

10-5

◆鋳型
弊社の高性能逆転写反応用試薬「ReverTra
Ace® qPCR RT kit（Code No. FSQ-101）」
により合成したHeLa細胞total RNA由来の
cDNAを用い、cDNAの10倍希釈（5段階）とno-template control（NTC）
について、反応を実施。

プライマーダイマー

NTC

図7．他社リアルタイムPCR試薬との反応特異性比較（ABI StepOnePlusTM使用）
プライマーダイマーが生じやすいターゲットにおいてリアルタイムPCRを行いました。その結果、本製品では、低コピーサンプルやno-templatecontrol（NTC）においてもプライマーダイマーが抑制され、良好な結果を得ることができました。

特長5 様々な機器に対応
ブロックタイプの機器（Fast Modeにも対応）のほか、ガラスキャピラリーを用いる高速サイクラーにも対応しています。また50×ROX reference dyeが別添付されているため、パッシブリファレンスを必要とする機器においても各機器に適したROX濃度でご使用頂けます。
【対応可能機器例】

機

ROX最終濃度（添加量）

器

Applied Biosystems 7000、7300、7700、7900HT、StepOne™、StepOnePlus™

1X（1/50量）

Applied Biosystems 7500、7500Fast、Agilent Technologies Mx3000P、Mx3005P、Mx4000®

0.1X（1/500量）®

Roche社製機器（LightCycler 2.0、LightCycler Nanoなど）、
Bio-Rad社製機器（MiniOpticon™、CFX96 Touch™など）、BioFlux Line Geneなど

不要■キャンペーン期間：2013年1月15日〜2013年3月29日（ご注文分）
装

保存温度

Code No.

通常価格

キャンペーン価格

1ml×1本〔40回用〕-20℃

QKD-201T¥9,800対象外

1.67ml×3本〔200回用〕-20℃

QKD-201¥32,000¥16,000

包

品名および内容
KOD SYBR® qPCR Mix
・KOD SYBR® qPCR Mix
・50×ROX reference dye※50×ROX reference dyeがマスターミックスとは、別添付されています。
※包装欄に記載の反応回数は、50μl反応時のものです。容量は、KOD SYBR® qPCR Mixのみ示しています。

ウインターキャンペーン対象品 2012年11月26日〜2013年3月22日（ご注文分）
装

保存温度

Code No.

通常価格

キャンペーン価格

ReverTra Ace® qPCR RT Kit

200回用

-20℃

FSQ-101¥38,000￥22,800

リアルタイムPCR用cDNA合成キット
完全プレミックスタイプ

200回用

-20℃

FSQ-201¥38,000¥19,000

200回用

-20℃

FSQ-301¥40,000¥20,000

品

名包リアルタイムPCR用cDNA合成キット

ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix
リアルタイムPCR用cDNA合成キット
完全プレミックスタイプ（ゲノムDNA除去試薬付き）

ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover※包装欄に記載の反応回数は、10μl反応時のものです。

10

2013

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Emerald Lucリポーターアッセイシステム用1液検出試薬

Emerald Luc Luciferase Assay
Reagent Neo
ルシフェラーゼアッセイ用試薬の発光強度がアップしました。
Emerald Lucシステムは、ブラジル産ヒカリコメツキムシ由来のルシフェラーゼEmerald Lucを用いたリポーターシステムです。Emerald Lucルシフェラーゼは、
ホタルルシフェラーゼと比べ、

96または384
ウェルプレート

90mmディッシュ
24ウェルプレート（1step法）（2step法）

安定で強い発光が特長です。

Emerald Luc㐿ఎᏄᙟ㈹㌷ᥦ⣵⬂

本試薬は従来のEmerald Luc Luciferase Assay Reagentの長持続性の特長を活かしながら、さらに発光強度を向上させた発

ᇰᆀ㝎ཡ

䐖

光試薬です。

䐗ᇰᆀ䛴୕䛑䜏
├᥃῟ຊ

⣵⬂⁈ゆ

ῼᏽᐖჹ䛾

䐖

Ⓠක᳠ฝ

Ⓠක᳠ฝ
図3．Emerald Lucシステム破壊系アッセイフロー①Emerald Luc Luciferase Assay Reagent Neo（Code No. ELA-301）②Emerald Luc Lysis Solution（Code No. ELA-201）

図2．製品外観

図1．Emerald Lucの発光特長1 高い発光強度

特長2 長い発光持続性

・従来品の約1.4倍の高い発光シグナルが得られます。微・発光試薬添加後、1時間経過しても8割以上の発光が認弱なシグナルを示すサンプルの検出にお薦めします。使

められます。

用方法は従来品と同様です。
2.0E+05
1.8E+05

1.0E+06

6.0E+05

RLU

RLU

Emereld Luc/ᮇ⿿ဗ

1.6E+05
1.4E+05

8.0E+05ṟᏋὩᛮ81%

1.2E+05
1.0E+05䝟䝃䝯䝯䜻䝙䜫䝭䞀䝀/௙♣ムⷾA䝟䝃䝯䝯䜻䝙䜫䝭䞀䝀/௙♣ムⷾB

8.0E+04

4.0E+05

6.0E+04
4.0E+04

2.0E+05ṟᏋὩᛮ57%ṟᏋὩᛮ29%2.0E+04
0.0E+00

0.0E+00
ᮇဗᚉᮮဗ

図4．従来品との発光強度比較
96ウェルプレートに播種したHeLa S3細胞にSV40プロモーター下にELuc遺伝子を連結したプラスミドをトランスフェクションし、翌日、培地はそのまま、等量（100μl）の発光試薬を添加し、5分後に発光を測定しました。

Emerald Luc Luciferase Assay Reagent Neo

10

20

30
min

40

50

60

図5．ホタルルシフェラーゼ検出系との比較
96ウェルプレートに播種したHeLa細胞にSV40プロモーターに連結された
Emerald Luc遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子をトランスフェクションし、翌日、それぞれの発光試薬を加え、5分後より5分間隔で発光を測定した。

品名および内容
Emerald Lucリポーターアッセイシステム用1液検出試薬

0

包

装

保存温度

Code No.

-80℃

ELA-301

装保存温度

Code No.

10μg

-20℃

ELV-101￥35,000

10μg

-20℃

ELV-201￥35,000

10ml×1本-80℃

ELA-101￥15,000

100ml×1本-20℃

ELA-201￥9,000

10ml×1本価

格￥17,000＊96ウェルプレートの場合、10mlは100反応（約1枚分）に相当します。

品名および内容

包

Emerald Lucプロモーター挿入用ベクター

pELuc-test
Emerald Luc-Short lifeタイプ-プロモーター挿入用ベクター

pELuc（PEST）-test
Emerald Lucリポーターアッセイシステム用1液検出試薬

Emerald Luc Luciferase Assay Reagent
Emerald Lucシステム細胞溶解剤

Emerald Luc Lysis Solution

2013

11

価

格

No.100_'13.qx 12.12.11 18:54 ページ 12

Emerald Lucを用いたスプリットルシフェラーゼによるタンパク質相互作用検出系の構築とGPCRリガンドスクリーニングアッセイへの応用
株式会社Probe X 三浦 研二
はじめ に
ルシフェラーゼリポーターアッセイは、in vitroアッセイ、セルベースアッセイ、in vivoイメージングなどに幅広く応用可能な基盤技術として発展を続けています。東洋紡が販売するEmerald Lucリポーターアッセイシステムは、発光強度が強くしかも長時間安定な発光を得ることができる特長があります。このたび、ProbeXではこのEmerald Lucを用いたスプリットルシフェラーゼによるタンパ
ク質相互作用検出システムを開発し、販売を開始しました。スプリットルシフェラーゼとは、ルシフェラーゼ分子を2つの分子に分割（スプリット）し活性を失わせたものです。それらが再会合すると活性が復元することを利用し、時空間レベルでタンパク質相互作用を検出することができます。
1. Emerald Lucを用いたスプリットルシフェラーゼの構築
スプリットルシフェラーゼを構築する場合は、
β-ガラクトシダーゼのような他のタンパク質相補型システムと異なり、スプリット
位置に重なりを持たせることが必要であることが知られています。しかし、強い発光を得るための最適な切断位置については詳細な知見がありませんでした。そこで、ProbeXではEmerald Lucについて種々の切断位置でスプリットした分子を作製し、網羅的な解析を行いました（文献1）。N-末端側分子として、1から406番目のアミノ酸までの分子をはじめとして一つずつアミノ酸を伸ばして、1から417番目のアミノ酸までの12種類の長さの異なる分子を発現する遺伝子を構築しました。また、C-末端側分子として、389番目のアミノ酸からC-末端までをはじめとして、やはり一つずつアミノ酸の長さを変えて413番目までのアミノ酸からC-末端までの25種類の長さの異なる分子を
Emerald Luc-N
1- 406FKBP

1- 407FKBP

1- 417発現する遺伝子を構築しました。そして、相互作

Emerald Luc-C

12⛸㢦

FKBP

× 25⛸㢦

ධ䛬䛴⤄䜅ྙ䜕䛡䛭⣵⬂හ䛱ᑙථ

FRB

389 - 542

FRB

390 - 542

用するタンパク質として、N末端側分子とFKBP、
C末端側分子とFRBの融合タンパク質を発現す
るDNAをそれぞれ作製しました。これらの全て

FRBの組み合わせ全300通りをHEK293細胞にトラ

413 - 542

ンスフェクションし、ラパ マイシン 刺 激により
FKBPとFRBの相互作用を惹起し、スプリットル
シフェラーゼが会合して示す発光強度を測定しました（図1）。その結果、N末端側1−415アミノ酸（ 以後Emerald Luc-Nとします）C末端側
394−542アミノ酸（以後Emerald Luc-Cとし䝭䝕䝢䜨䜻䝷FKBP

FRBます）の組み合わせが最も強い発光を与えることⓆකEmerald Luc-N

Emerald Luc-C්ఌྙ䛝䛥Emerald Luc

がわかりました（図2）。
このEmerald Luc-NとEmerald Luc-Cのそ
れぞれについて、目的のタンパク質との融合タン
パク質を発現させるベクターを構築しました（図図1．Emerald Lucのスプリット位置の評価系3）。これらを用いることにより、様々なタンパク質の相互作用を検出する系を構築することがで
きようになりました。

図2．Emerald Luc各種スプリット位置の組合せによる発光量（文献1より引用）

12

EF1䃇
䝛䝱䝦䞀䝃䞀

Emerald Luc-N MCS

EF1䃇䝛䝱䝦䞀䝃䞀MCS

Emerald Luc-C

Myc+HisSV40䜬䝷䝓䝷䜹䞀

Amp(r)ori

V5 +HisSV40䜬䝷䝓䝷䜹䞀

Amp(r)

ori

図3．スプリットルシフェラーゼ融合タンパク質発現用DNAコンストラクト

2013No.100_'13.qx 12.12.11 18:54 ページ 13

2. GPCRリガンドアッセイ系への応用
GPCRは様々な生体内のシグナル伝達に関与し、創薬の標的分子として注目を集めています。GPCRは細胞外ドメインにリガンドが結合すると細胞内ドメインにβ-アレスチンが結合しシグナルが伝達されます。ProbeXでは、
このGPCRとβ-アレスチンの相互作用とスプリットルシフェラーゼを組み合わせたGPCRリガンドアッセイ系を構築しました（文献1）。図4に示すように、目的とするGPCRのC末端にEmerald Luc-Cを融合した遺伝子、およびβ-アレスチンのN末端にEmerald Luc-Nを融合した遺伝子を作製して、両者を同時に細胞内に発現させます。この細胞にリガンドを添加すると、GPCRとβ-アレスチンの相互作用によりス
プリットルシフェラーゼが再会合し、発光がおこります。SSTR2についてのアッセイ系を構築し、リガンドとしてソマトスタチンを添加したところ、濃度に対して用量依存性の曲線を描くことができました（図5）。また、抗体組織染色法により分子の分布を調べると、リガンド刺激前のGPCR＋Emerald
Luc-C分子は細胞膜に、
Emerald LucN＋β-アレスチン分子は細胞質にそれぞ

䝮䜰䝷䝍

㻪㻳㻦㻵
䝮䜰䝷䝍

れ分布していましたが、リガンド添加により細胞質にあったEmerald Luc-N＋β-ア
レスチンは細胞膜に集まることが観察さ䃈㻐䜦䝰䜽䝅䝷㻑

れました。また、その後、GPCRが細胞質に移行することも観察されました（図6）。

䃈㻐䜦䝰䜽䝅䝷㻑

Ⓠක

㻨㼐㼈㼕㼄㼏㼇㻃㻯㼘㼆㻐㻦

これはルシフェラーゼ融合タンパク質を利用したアッセイ系がGPCR-β-アレスチ
ン複合体の生体内の挙動を反映していることを示唆しています。

㻨㼐㼈㼕㼄㼏㼇㻃㻯㼘㼆㻐㻱
図4．スプリットルシフェラーゼを用いたGPCRリガンドアッセイ

SSTR2᯹Ⰵ

図5．SSTR2に対するソマトスタチンの用量反応曲線（文献1より引用）䃈㻐䜦䝰䜽䝅䝷᯹Ⰵ䝁䝢䝌䜽䝃䝅䝷῟ຊ๑䝁䝢䝌䜽䝃䝅䝷῟ຊᚃ

図6．ソマトスタチン添加によるSSTR2とβ-アレスチンの局在変化（文献1より引用）

3. ハイスループットスクリーニング系への応用
このGPCRリガンドアッセイ系をハイスループットスクリーニング（HTS）に適用するため、発光試薬とアッセイプロトコールの開発をおこないました。より高いS/B比を得るため、持続的に強い発光を可能とする試薬を東洋紡の協力を得て開発しました。す
なわち、スプリットルシフェラーゼは、その発光強度に対する添加成分の影響が野生型ルシフェラーゼとは異なるため、スプリット
ルシフェラーゼ専用に成分調整を行ったSPLIT GLOW Cell Assay Reagentを開発しました。本試薬の発光は90分以上持続し（図7）、多数の検体を処理する場合でも、プレート内およびプレート間のバラツキを抑えることができます。また、96ウェルプレートに対応したプロトコールの最適化を行いました。この結果、ADBR2およびSSTR2のリガンドアッセイ系においていずれも、
Z'が0.75以上となり、HTSに適用できることが示唆されました（表1）。

2013

13

No.100_'13.qx 12.12.11 18:54 ページ 14

図7．SPLIT GLOW Cell Assay Reagentの発光持続性表1．スプリットルシフェラーゼを用いたGPCRリガンドアッセイの性能

シグナル値
平均

標準偏差

CV（%）

Z

SSTR2

陰性
陽性

1,072
87,300

132
6,344

12.3
7.3

0.77

ADRB2

陰性
陽性

510
47,433

67
3,318

13.1
7.0

0.78

4. ProbeXのスプリットルシフェラーゼタンパク質相互作用アッセイ系

表2．ProbeXのGPCRリガンドアッセイ用安定発現細胞株

サービス
ProbeXでは種々のGPCRについてリガンドアッセイ用安定発現細胞株をご用意しております（表2）。ほとんどの細胞でS/B比は40以上となっており安定的にアッセイを行っていただけます。その他の
GPCRについても、ProbeXにて安定発現細胞株の作製を受託いた
します。また、GPCR-リガンドアッセイ系以外にも、Hif1αおよびHif1βの会合のような細胞質タンパク質同士の相互作用検出などで実績があります。ご希望のアッセイ系を作製いたしますので、是非ご相談ください。

GPCR

Class

ADCYAP1R1
ADRA2AADRB2
AGTR1
AGTRL1
CCKBR
EDG1
EDG3
ENDRA
ENDRB
OPRM1
SSTR2

Gs
Gi
Gs
Gq
Gi
Gq
Gi
Gi
Gq
Gq
Gi
Gi

S/B
ARRB1

ARRB2

42.8
−
74.4
271.0
117.2
−
47.5
−
107.2
45.2
982.2
166.8

−
11.8
71.9
9.8
90.5
46.0
32.4
41.9
44.5
46.2
52.1
105.5

おわりに
ルシフェラーゼによる発光をリポーターとする検出系は、蛍光をリポーターとする検出系と異なり励起光を必要とせず、また長波長の光を利用できることから、in vivoイメージングにも適しています。ProbeXではスプリットルシフェラーゼタンパク質
相互作用アッセイをin vivoイメージングに適用する取り組みも行っています。今後も本アッセイ系は多様な分野での活用が期待されています。

文献

1. N.Misawa, A.K.M. Kafi, M. Hattori, K. Miura, K. Masuda and T. Ozawa, Anal.

Chem., 82, 2552-2560（2010）

お問合わせ先株式会社 ProbeX
東京都文京区本郷4丁目1番4号 コスモス本郷ビル4F
tel：03-5842-3204
mail：info@probex.jp

14

2013

No.100_'13.qx 12.12.11 18:54 ページ 15

新発売

高効率リアルタイムPCR用マスターミックス

KOD SYBR® qPCR Mix

50
5

キャンペーン【期間：2013年1月15日〜
2013年3月29日（ご注文分）】

ゲット ルードサンプル
ロングター
ク

マウステールアルカリ熱抽出液

難配列

マウス
テール
（約3mm）

マイクロ
チューブへ

1

2

KOD FXやKOD -Plus- シリーズなど、通常のPCRで設計したプライマーをそのまま用いてSYBR® Green Ⅰアッセイを行うことができます。融解曲線解析を用いて、マウステールライセートからのワンチューブでのジェノタイピング解析などを行うことができます。

50mM NaOH 180μl添加
Vortexにて良く攪拌3⇒本誌p7-10に詳細記事がございます。
KI/KI

95℃・10min.

短鎖長primer
増幅長：100bp/予測Tm値：79℃

Wild type
（WT）

WT/WT

共通 primer

1M Tris-HCl（pH8.0） 20μl添加
Vortexにて良く攪拌

WT/KI

CreER knock-in（KI）

遠心（12,000rpm, 10min.）

CreER

20μl反応系に上清0.5〜2μlを添加（マウステールは完全には溶解しません）

長鎖長primer
増幅長：341bp/予測Tm値：84℃

共通 primer

60

65

70

75
80
Temperature
（℃）

85

90

95

5

図. 融解曲線解析を用いるワンチューブマウスジェノタイピング（ABI 7500使用）

プレゼント
付き

バイオ・クロスワードパズル 〜代謝編〜
4

5h
g

ヨ
コ
の
カ
ギ

6

b
j

1i

a

2

タ
テ
の
カ
ギ

c

3

4

f
d
e

1. アセチルCoAから、テルペノイドやステロイド合成の出発物質であるイソペンテニル二リン酸
およびジメチルアリル二リン酸を合成する生合成反応経路。
Pathway。
2.グルコースがピルビン酸にまで分解されること。1モルのグルコースから正味2モルのATPが合成されます。嫌気状態でも起こりうる代謝系の代表的なものです。

3. 光合成の初期の過程であり、光のエネルギーを利用して水が酸素に変換されるとともに、二酸化炭素の還元に必要なNADPHとATPをつくり出します。
reaction。
4.ゲノム（genome）
は細胞内の全遺伝子（gene＋ome）
を指しますが、この言葉は細胞内の酵素が産生する全代謝物質を指します。
5. ATPやNADH、NADPHなどの構成成分の一つとして、エネルギー輸送や生合成系などに広く関与する重要な物質です。遺伝物質としても欠かせない成分の一つです。
6. 糖質および脂質の代謝障害により、体内のケトン体が異常に増え、臨床症状を呈する状態を言います。
【以下の選択肢の中から選んでください】

a

b

c

d

e

f

g

h

i

j

PHOTO GLYCO DARK LIGHT KETOSIS AEROBIC CITRIC ELECTRONSALVAGE ANABOLISM METABOLISM CATABOLISM GLYCOLYSIS
ADENOSINE MEVALONATE METABOLOME NICOTINAMIDE TRICARBOXYLIC

バイオクロスワードパズルの解答に加え、UPLOADのアンケート（下記クイズコーナーに記載）にご回答いただいた方から抽選で、5名様に2,000円分の図書カードをご進呈いたします。

ご応募はこちらから※ご応募期間 2013年1月22日〜2013年3月29日

弊社ウェブページ
1 （www.toyobo.co.jp/bio）

2

読者のコーナー3

クイズコーナー

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