上原記念生命科学財団研究報告集, 35 (2021)

上原記念生命科学財団研究報告集, 35（2021）

212. 腫瘍免疫活性化のためのポリカルボン酸結合抗体の創製
弓場 英司
大阪府立大学 大学院工学研究科 応用化学分野 生体高分子化学研究グループ
Key words：チェックポイント阻害抗体，ポリカルボン酸，アジュバント，CD47，リポソーム

緒 言
近年、免疫チェックポイント阻害剤の成功によってがん免疫療法に注目が集まっている。しかし、現在実用化されている免疫チェックポイント阻害剤で治療効果が得られる患者は 30％程度とされている［1］。この事実は、多くのがん患者において CTLA-4 や PD-1 とは異なる免疫チェックポイント分子ががん免疫を抑制していることを強く示唆している。新たに提案されている免疫チェックポイント分子として CD47 が挙げられる。がん細胞に発現する CD47 は、マクロファージ上の SIRPαと相互作用することで、マクロファージに対して“Don’t eat me”シグナルを与え、マクロファージはがん細胞を貪食したり、攻撃したりすることができない。この現象を踏まえ、CD47 に対する抗体を用いてマクロファージによるがん細胞の貪食・攻撃を促進しようという試みが行われ、現在臨床試験が行われている［2～4］。
著者らはこれまで、ポリグリシドールや多糖をベースにしたポリカルボン酸の開発を精力的に行ってきた。これらのポリカルボン酸は、弱酸性 pH でカルボキシ基がプロトン化されると高分子が疎水化し、脂質膜を不安定化する性質をもつ。これまでの検討において、ポリカルボン酸を修飾したリポソームががん抗原を抗原提示細胞の内部に効果的に導入し、細胞性免疫を誘導できることを明らかにしてきた［5～7］。また、ポリカルボン酸が樹状細胞やマクロファージ上のスカベンジャー受容体に効果的に認識されることも見出している。さらには、多糖をベースとしたポリカルボン酸が、樹状細胞やマクロファージを極めて効果的に成熟化させ、サイトカインの産生を促すことがわかっている［7］。
これらの背景を踏まえ、本研究では、CD47 などの新規免疫チェックポイント分子に対する抗体医薬の治療作用をさらに高めることを目的に、抗体医薬へのポリカルボン酸の結合を検討した。ポリカルボン酸はマクロファージに効果的に認識されるため、ポリカルボン酸結合抗体ががん細胞上の免疫チェックポイント分子に結合したあと、ポリカルボン酸が認識されることでマクロファージをがん細胞近傍へ誘引することができる。さらに、ポリカルボン酸のもつ抗原提示細胞の成熟化作用によって、集まってきたマクロファージを活性化することで、がん細胞を貪食したあとの抗原提示やがん免疫応答の促進が期待される。
本研究ではまず、ポリカルボン酸誘導体の合成を行うとともに、これらをコンジュゲートした抗体医薬の合成を行った。しかしながら、種々の合成反応の検討の結果、主としてその高分子量（抗体医薬の 5 倍以上）のために、ポリカルボン酸を直接抗体医薬にコンジュゲートすることは困難であることが明らかとなった。そこで、抗体医薬とポリカルボン酸を一つの粒子上に修飾させることで、当初の設計と同様の効果が得られるのではと考え、代表的な脂質ナノ粒子であるリポソームに両者を修飾した。ところが、この場合は主としてポリエチレングリコール（PEG）による立体障害によってポリカルボン酸に由来する免疫活性化作用が減弱することがわかった。そこで、抗体医薬・ポリカルボン酸をそれぞれ修飾したリポソームを用いた評価を行ったところ、ポリカルボン酸修飾リポソームは免疫担当細胞を強力に活性化するとともに、抗体医薬修飾リポソームはフリーの抗体医薬に比べて効果的にがん細胞へと結合したことから、両者を組み合わせることでチェックポイント分子の効果的な阻害によるがん細胞の貪食促進と、がん免疫応答の強力活性化を実現できることが示唆された。

1方 法
1．ポリカルボン酸誘導体の合成
アジュバント作用をもつ多糖として知られるβグルカン（カードラン、およびアクアβ）［8］をポリカルボン酸主鎖として利用した。βグルカンの水酸基と 3-メチルグルタル酸無水物を反応させることで、カルボキシ基を導入した。
続いて、エチレンジアミンまたはヘキサメチレンジアミンを一部カルボキシ基と反応させることで、アミノ基の導入を行った。各化合物の同定は１H NMR により行った。
2．ポリカルボン酸結合タンパク質の作製と機能評価
抗体へのポリカルボン酸結合条件を調査するため、まずはモデルタンパク質（オボアルブミン：OVA）を用いて検討を行った。2-イミノチオランを OVA のリシン残基に反応させ、脱塩精製することで、チオール基の導入を行った。
一方、ポリカルボン酸誘導体に一部導入したアミノ基に、ヘテロ 2 官能性リンカー（Sulfo-KMUS または Sulfo-SMCC）を反応させることで、マレイミド基を導入した。その後、チオール基導入 OVA を混合することで両者を反応させ、SDS-PAGE によって結合の確認を行った。
3．抗体医薬とポリカルボン酸を修飾したリポソームの作製と機能評価
卵黄ホスファチジルコリン（EYPC）、コレステロール、ポリエチレングリコール（PEG）脂質、マレイミド基修飾
PEG 脂質、ポリカルボン酸誘導体からなるリポソームを、薄膜水和法により作製した。2-イミノチオランによってチオール基を導入した抗体医薬をリポソーム分散液に加え、マレイミド基との反応により修飾を行った。得られたリポソームの脂質濃度、抗体修飾量、粒子サイズ、ゼータ電位を測定した。また各種リポソームをマウス樹状細胞株 DC2.4細胞に添加し、所定時間インキュベーションしたあと、培養液中の炎症性サイトカイン量を ELISA 法により定量した。
また、蛍光ラベル化した抗体医薬を修飾したリポソームまたはフリーの抗体医薬をマウスメラノーマ B16F10 細胞に添加し、4℃で 30 分混和した。洗浄後、細胞の蛍光強度をフローサイトメトリーにより評価した。

結果および考察
1．ポリカルボン酸結合タンパク質の作製と機能評価
βグルカンへのカルボキシ基、アミノ基の導入（図 1a）については、1H NMR より多糖主鎖由来のプロトンピークとともに、カルボキシ基ユニット、アミノ基ユニットに由来するプロトンが確認されたことから、各官能基の導入を確認した。各ピーク比から導入率を求め、水酸基の 70％にカルボキシ基ユニット、約 10％にアミノ基ユニットがそれぞれ導入されたことを確認した。このアミノ基に対して sulfo-NHS 基とマレイミド基を一分子中に有するヘテロ 2 官
能性リンカーを反応させることでマレイミド基を導入したのち、チオール基を導入したタンパク質と混合することで、両者のコンジュゲーションを試みた。しかし、SDS-PAGE の結果によると、一部の実験条件において高分子量側のバンドが多少濃くなったことが観察されるものの、フリーのタンパク質由来のバンドのシグナルがフリーの場合に比べてほとんど変化がなく、コンジュゲーションがほとんど進行していないことが明らかとなった（図 1b）。アミノ基のリンカー構造（エチレンジアミン／ヘキサメチレンジアミン）、ヘテロ 2 官能性リンカーの鎖長などの反応条件を調整しても改善は認められなかった。この原因として、今回使用したβグルカンの分子量が 200 kDa 以上と、タンパク質の分子量（43 kDa）に比べて極めて大きいことが挙げられる。既存研究において、タンパク質より数倍大きな高分子とのコンジュゲートの作製は前例がなく、反応自体が難しいものと考えられる［9］。改善策として、酸などを利用してβグルカンの分子量をコンジュゲーションに適した値まで小さくすることが考えられたが、分子量の制御が困難であるとともに、低分子量のβグルカン誘導体が従来報告通りのアジュバント作用を有するかについても予め検証する必要があったことから、本研究期間中における検討は困難と判断した。各種合成の検討自体は引き続き実施していくが、ここでは代替案として、次項に示す抗体医薬とポリカルボン酸誘導体を修飾したナノ粒子を用いた検討を行った。

2図 1．ポリカルボン酸結合タンパク質の合成と機能評価a） βグルカンへのカルボキシ基ユニット導入とそれに続くアミノ基ユニット導入の合成スキーム。
ここでは代表としてカードランを多糖主鎖に用いたポリカルボン酸誘導体の例を示す。
b） ポリカルボン酸誘導体とタンパク質の結合のSDS-PAGE を用いた確認。
レーン1：分子量マーカー、
レーン 2：アミノ基導入カードラン誘導体、レーン 3：OVA、レーン 4：sulfo-KMUS を用いた OVAとアミノ基導入カードラン誘導体の反応溶液、レーン 5：sulfo-SMCC を用いた OVA とアミノ基導入カードラン誘導体の反応溶液。アミノ基導入カードラン誘導体（分子量 200 kDa 以上）も CBB染色された。レーン 4 の高分子量側のバンドが若干濃くなり、一部の OVA が結合したことが示唆されるが、ほとんどの OVA はフリーの状態で泳動されているため、コンジュゲーションの反応効率は極めて低いことがわかった。

2．抗体医薬とポリカルボン酸を修飾したリポソームの作製と機能評価
本研究のコンセプトは、抗体医薬とポリカルボン酸を利用してがん細胞と抗原提示細胞を近接させ、チェックポイント分子の阻害と抗原提示細胞の活性化を同時に実現することである。そこで、抗体医薬とポリカルボン酸を直接結合するのではなく、一つのナノ粒子上に修飾することによっても同様の効果が得られるのではないかと考えた。そこで、
EYPC とコレステロールを基盤とするリポソームに、抗体医薬とポリカルボン酸誘導体を修飾した。両分子のリポソー
ムへの修飾は、タンパク質定量と、リポソームのゼータ電位がポリカルボン酸修飾によって低下したことから確認した。
また、作製したリポソームは 100 nm 程度の粒子サイズであり、細胞同士の近接を起こせるサイズに収まっていた。
このリポソームのアジュバント作用を調べるため、リポソームで処理した樹状細胞株からのサイトカイン産生量をELISA 法により定量したところ、ポリカルボン酸誘導体・抗体医薬両方を修飾したリポソームはサイトカイン産生をほとんど誘導しなかった（図 2a）。これは、リポソーム上に PEG が修飾されていることで、ポリカルボン酸誘導体が樹状細胞上の活性化受容体に認識されなくなったことを示唆している。一方、ポリカルボン酸誘導体だけを修飾したリポソームは、有意に高いサイトカイン産生能を示した（図 2a）。したがって、抗体医薬とポリカルボン酸誘導体がその機能を発現するためには、異なるリポソームに修飾する必要があることがわかった。
最後に、抗体医薬を修飾したリポソームのターゲットがん細胞との相互作用について検討を行った。蛍光ラベル化した抗体医薬、または抗体医薬を修飾したリポソームを、CD47 を発現するがん細胞（B16F10 細胞）に添加し、その結合量を評価した。まず、フリーの CD47 抗体は、アイソタイプコントロールよりも高い蛍光強度を示したことから、この抗体医薬ががん細胞上の CD47 分子と相互作用したことが示唆された（図 2b）。さらに、CD47 抗体を修飾したリポソームはさらに高い蛍光強度を示したことから（図 2b）、ナノ粒子上に抗体医薬を修飾することで、多価効果によりターゲット分子との相互作用を有意に高められることが判明した。

3

以上のように、当初計画のポリカルボン酸－抗体医薬コンジュゲートの作製は計画期間中に実現できなかったが、①抗体医薬をナノ粒子上に修飾することによるがん細胞との相互作用の向上、②ポリカルボン酸修飾リポソームによる免疫担当細胞の活性化、という点を新たな知見として得ることができた。今後、ポリカルボン酸－抗体医薬コンジュゲートの合成法の検討を進めるとともに、二つの修飾リポソームを併用することで、がん細胞上のチェックポイント分子を効果的に阻害すると同時に、免疫担当細胞を強力に活性化してがん免疫を誘導する、新たな免疫誘導システムの開発に向けて検討を行っていく。

図 2．ポリカルボン誘導体・抗体医薬修飾リポソームの機能評価a） 樹状細胞からのサイトカイン（TNF-α）の産生量。リポ多糖（LPS）処理によってサイトカイン産生が誘導されたことから、系が動いていることを確認した。アクアβ誘導体（MGlu56-Aquaβ-C10）を修飾した EYPC リポソームは PBS 処理群に比べ、有意に高いサイトカイン産生を促進した。しかしながら、CD47 抗体を同じリポソームに修飾するとサイトカイン産生能が減弱した。
CD47 抗体修飾リポソーム自体はサイトカイン産生促進能を持たない。GraphPad Prism 8 を用いた one-way ANOVA と Tukey’s HSD post hoc test により統計処理した。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001。
b） 蛍光ラベル化した抗体の B16F10 細胞への結合量。FITC で蛍光ラベル化した CD47 抗体、アイソタイプコントロール、およびそれらを結合したリポソームと細胞を 4℃で 30 分混和し、洗浄後、フローサイトメトリーにより細胞の蛍光強度を測定した。サンプル毎の蛍光強度は別途蛍光分光光度計により測定し、補正した。CD47 抗体は B16F10 細胞に結合するとともに、その効果はリポソームに結合することでさらに促進された。

共同研究者・謝辞
本研究の遂行にあたり、公益財団法人 上原記念生命科学財団よりご支援を賜りました。心から感謝申し上げます。
また、コロナ禍にともなう実験制限の中にもかかわらず本研究を精力的にサポートいただいた、大阪府立大学大学院工学研究科生体高分子化学研究グループの佐々木光一博士（現・インペリアルカレッジロンドン博士研究員）にこの場を借りて御礼申し上げます。

4文 献1） Tumeh PC, Harview CL, Yearley JH, Shintaku IP, Taylor EJM, Robert L, Chmielowski B, Spasic M, Henry G,Ciobanu V, West AN, Carmona M, Kivork C, Seja E, Cherry G, Gutierrez AJ, Grogan TR, Mateus C, Tomasic
G, Glaspy JA, Emerson RO, Robins H, Pierce RH, Elashoff DA, Robert C, Ribas A. PD-1 blockade induces
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