上原記念生命科学財団研究報告集, 33 (2019)

上原記念生命科学財団研究報告集, 33（2019）46. トリプルネガティブ乳癌の新規抗がん剤の開発
島田 緑＊

山口大学 共同獣医学部 生体機能学講座 生化学教室

Key words：カルシニューリン，サイクリン D1，乳癌，細胞周期緒 言
乳癌は日本人女性が罹患する悪性腫瘍の第 1 位であり、その罹患数及び死亡数は増加の一途をたどっている。乳癌の70%にはホルモン療法が有効であるが、その後に治療抵抗性である再発性乳癌が起こるという重大な課題がある。また、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、HER2 全てが陰性のいわゆるトリプルネガティブ乳癌に対しては、薬物療法は化学療法に限定され、その予後は極めて不良である。したがって乳癌に対する有効な分子標的治療の開発が緊急課題となっている。カルシニューリンは Ca２＋／カルモジュリン依存性に活性化される Ser／Thr 脱リン酸化酵素である。最近カルシニューリンが乳癌検体、特にトリプルネガティブ乳癌において活性化していると報告されており［1］、カルシニューリンは乳癌治療における新規バイオマーカーとして期待される。また、細胞周期 G1／S 期の進行に重要であるサイクリン D1 はトリプルネガティブ乳癌を含め、多くのがんで高発現しており、その主な原因としてはタンパク質分解異常であると考えられている［2，3］。カルシニューリンは細胞周期の進行に重要であることが報告されており［4］、カルシニューリン阻害作用のあるシクロスポリン A、タクロリムス（FK506）によりサイクリン D1 発現への影響を示唆する報告が複数ある。しかしながらその詳細はほとんど分かっていない。サイクリン D1 は Thr286 がリン酸化されると、SCF（Skp、Cullin、F-box containing）E3 ユビキチンリガーゼによりユビキチン化され分解される。
Thr286 をリン酸化する酵素としては GSK3β、ERK、p38 が報告されているが［5］、脱リン酸化の制御については不明である。本研究ではカルシニューリンが Thr286 を脱リン酸化することによってサイクリン D1 の分解を抑制し、G1/S 期の進行を制御していることを明らかとした。

方 法
1． カルシニューリン阻害薬である FK506、CN585 を用いた細胞周期制御の解析
トリプルネガティブ乳癌細胞株 Hs578T および MDA-MB-231 を 10μM、50μM FK506、25μM、50μM CN585で処理し、細胞増殖への影響と、FACS を用いた細胞周期の解析を行った。細胞周期調節に重要であるサイクリン A2、B1、D1、E、Rb、Cdk4 などについてウエスタンブロッティングにより発現状態を検討した。同様にアポトーシスのマーカーである cleaved caspase3、cleaved PARP1［6］の発現状態を検討した。またダブルチミジンブロックによる G1／S 期同調下で FK506、CN585 を添加し、G1/S 期からリリースさせ FACS による細胞周期の進行およびウェスタンブロットによるタンパク発現量を検討した。
2． カルシニューリン阻害薬によるサイクリン D1 発現抑制の解析
カルシニューリン阻害薬によるサイクリン D1 の発現減少について、FK506 と同時にプロテアソーム阻害薬 MG132で処理し、サイクリン D1 発現量への影響をウエスタンブロッティングで解析した。
3． カルシニューリン阻害薬存在下におけるサイクリン D1 過剰発現による細胞周期制御の解析
Flag-サイクリン D1 をドキシサイクリン添加により過剰発現できる Hs578T を作製し、ダブルチミジンブロック法により細胞周期を G1/S 期に同調させ、細胞周期の進行を FACS により解析した。

*現在の所属：山口大学 共同獣医学部 生体機能学講座 獣医生化学教室
現在の所属：山口大学 共同獣医学部 生体機能学講座 獣医生化学教室

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4． in vitro ホスファターゼアッセイを用いた、カルシニューリンによるサイクリン D1 の Thr286 脱リン酸化解析
レンチウイルスベクターを用いて Flag タグ付きサイクリン D1 を Hs578T に発現させた。回収した細胞からタンパク質を抽出し、Flag pull down 法を用いて Flag-サイクリン D1 を精製した。リコンビナントカルシニューリンと反応させ、サイクリン D1 の Thr286 脱リン酸化への影響についてサイクリン D1 Thr286 リン酸化抗体を用いてウェスタンブロットにより解析した。
5． カルシニューリンノックダウンによるサイクリン D1 発現への検証
Hs578T、MCF7 細胞においてカルシニューリンをターゲットにした shRNA をレンチウイルスの系を用いて発現させ、カルシニューリンノックダウンによるサイクリン D1 発現への影響をウェスタンブロットにより解析した。

結 果
1． カルシニューリン阻害薬である FK506、CN585 を用いた細胞周期制御の解析
FK506 は FKBP12 との結合を介する間接的なカルシニューリン阻害薬［7］、CN585 は直接的なカルシニューリン脱リン酸化酵素阻害薬として報告されている［8］。Hs578T を FK506、カルシニューリン酵素活性阻害薬 CN585 で処理すると細胞増殖は顕著に抑制され、処理後 24 時間では細胞死が誘導されていることが判明した。そこで詳細な細胞周期への影響について FACS を用い検討すると、カルシニューリン阻害薬存在下では S 期細胞が減少し、細胞死集団を意味する Sub G1 期細胞が増加することが分かった。細胞周期の進行に必須な複数のサイクリン、Cdk などの発現をウエスタンブロッティングで検討したところ、G1／S 期の進行に必要なサイクリン D1 の発現が減少し、サイクリンD1／Cdk4 の標的である Rb の Ser780 リン酸化［9］が減少することが分かった。ダブルチミジンブロック法を用いてG1／S 期に細胞を同調させ FK506 で処理後にリリースすると、G1／S 期の進行が顕著に遅延した。G1／S 期に同調した系においてもサイクリン D1 の発現減少および Rb の Ser780 リン酸化が減少することが分かった。CN585 を用いた場合においても、サイクリン D1 の発現減少、G1/S 期の進行が遅延するなど、同様の結果が得られた。以上のことから、カルシニューリンはサイクリン D1 の発現および G1/S 期の進行に重要である可能性が示唆された。また、FK506
処理により cleaved caspase 3、cleaved PARP1 が増加し、アポトーシスが誘導されていることが判明した（図 1）。
2． カルシニューリン阻害薬によるサイクリン D1 発現抑制の解析
カルシニューリン阻害によりサイクリン D1 タンパク質分解が亢進することで、サイクリン D1 の発現が減少している可能性について、プロテアソーム阻害剤 MG132 を用いて検討した。その結果、MG132 存在下では FK506 によるサイクリン D1 の発現減少が抑制されることが分かった（図 2）。従ってカルシニューリンはサイクリン D1 のタンパク分解を抑制している可能性が示唆された。また細胞周期への影響を検討するために、M 期のマーカーであるヒストン
H3-Ser10 のリン酸化状態を調べると、FK506 処理で減少していた H3-Ser10 のリン酸化は、MG132 を同時に処理することにより回復した。このことからサイクリン D1 の分解を抑制することにより、細胞周期の異常も回復することが示唆された。
3． カルシニューリン阻害薬存在下におけるサイクリン D1 過剰発現による細胞周期制御の解析
カルシニューリン阻害によりサイクリン D1 の発現が減少することにより、G1／S 期の進行が遅延する可能性を検証するために、ドキシサイクリン添加により Flag-サイクリン D1 を過剰発現させ細胞周期の進行を FACS 解析により検討した。ダブルチミジンブロックで G1/S 期に同調させリリースすると、FK506 存在下においてサイクリン D1 を発現させると部分的に G1／S 期の進行遅延が回復した。この結果からカルシニューリンを阻害するとサイクリン D1 の発現が減少することにより、G1/S 期の進行が遅延する可能性が示された。
4． in vitro ホスファターゼアッセイを用いた、カルシニューリンによるサイクリン D1 の Thr286 脱リン酸化解析
カルシニューリン阻害薬 in vitro ホスファターゼアッセイを行った結果、カルシニューリン存在下においてサイクリン D1-Thr286 のリン酸化が減少した。従ってカルシニューリンがサイクリン D1 を直接的に脱リン酸化する可能性が示され、カルシニューリンはこれまで未同定だったサイクリン D1 の脱リン酸化酵素であることが示唆された。

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上原記念生命科学財団研究報告集, 33（2019）5． カルシニューリンノックダウンによるサイクリン D1 発現への検証
シクロスポリン A と FK506 は、それぞれ細胞内でシクロフィリンまたは FKBP（FK506 binding protein）と呼ばれる一群のタンパク質と結合し、複合体となってカルシニューリンの活性を阻害する特性をもつ。従ってこれまで阻害剤を用いて発見されてきた現象がカルシニューリンの生理機能を阻害しているのか、他の分子の阻害によるものであるかを厳密に検証する必要がある。そこで我々はレンチウイルスの系を用いてカルシニューリンをノックダウンし、カルシニューリンがサイクリン D1 の発現に与える影響を検討した。その結果、カルシニューリン阻害によりサイクリン D1の発現が減少したことから、カルシニューリンがサイクリン D1 の発現に必要であることが分かった。

図 1．カルシニューリン阻害による細胞周期への影響解析
A)

Hs578T、MCF7 を FK506 で処理したときの細胞増殖曲線を示している。Hs578T、MCF7 ともに FK506
10μM での変化はわずかだが、50μM では増殖が抑制された。

B)

FK506 50μM 24 h 処理し FACS を用いた解析を行った結果を示している。SubG1 細胞の増加、G1 期細胞の増加と S 期細胞の減少を認めている。

C)

ダブルチミジンブロック法を用いて Hs578T 細胞を同調し FK506 50μM 存在下でリリースし FACS で細胞周期解析を行った結果を示している。4 h、8 h にて FK506 存在下では G1/S 期進行の遅延がみられる。

D、E) FK506 50μM 24 h 処理し FACS を用いた解析を行った結果を示している。Cleaved caspase3、cleaved
PARP1 が増加したことからアポトーシスが誘導されたと考えられる。サイクリン D1 とその下流である Rb-Ser780 のリン酸化が減少した。

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上原記念生命科学財団研究報告集, 33（2019）図 2．カルシニューリンによるサイクリン D1 発現制御の解析
Hs578T 細胞を FK506、MG132 で処理したサンプルでウエスタンブロッティングを行った結果を示している。MG132 存在下では FK506 によるサイクリン D1 の発現減少が抑制され、Thr286 のリン酸化が増加した。

考 察
カルシニューリンは免疫応答の活性化、細胞の分裂など多様な生命現象に関わり、Ca２＋シグナルを仲介する重要なシグナル伝達分子である。カルシニューリン阻害作用を持つシクロスポリン A、FK506 を用いた研究により、カルシニューリンがサイクリン D1 の転写に重要であることが報告されている［4］。本研究においても長時間 FK506 を投与
すると、サイクリン D1 の転写を抑制することを確認したが、短時間処理により転写に影響を与えない場合でも、サイクリン D1 のタンパク量は減少した。詳細な解析の結果、カルシニューリンはサイクリン D1 の転写活性化以外にも、タンパク分解を阻害することで G1／S 期の進行を促進する作用を持つことを見出した。サイクリン D1-Thr286 のリン酸化は複数のリン酸化酵素が関与することが報告されているが［5］、脱リン酸化酵素についてはこれまで報告されていなかった。本研究によりトリプルネガティブ乳癌で高活性化しているカルシニューリンがサイクリン D1 の発現制御に関与することが明らかとなった。カルシニューリン阻害により、サイクリン D1 の発現低下、細胞増殖抑制を引き起こすことができるため、カルシニューリンは新たなトリプルネガティブ乳癌の標的となる可能性が期待できる。

共同研究者・謝辞
本研究は、名古屋市立大学医学研究科細胞生化学分野の加藤洋一教授との共同研究で行いました。この場をお借りして深く御礼申し上げます。

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文 献1） Quang CT, Leoucher S, Passaro D, Fuhrmann L, Nourieh M, Vincent-Salomon A, et al. The calcineurin/NFAT
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