上原記念生命科学財団研究報告集, 32 (2018)

上原記念生命科学財団研究報告集、32 （2018）150. 好塩基球の分子制御メカニズムの解明
二宮 一茂
千葉大学 大学院医学研究院 先進気道アレルギー学寄附講座
Key words：アレルギー，好塩基球，寄生虫

緒 言
好塩基球は最も数の多い末梢血中でも 0.5%と非常に数の少ない細胞集団の一つであるが、近年我々を中心として好塩基球特異的な抗体、欠損マウスの樹立、好塩基球のイメージング技術が確立され、好塩基球がアレルギー疾患や寄生虫感染防御応答において重要な役割を果たしていることが明らかになった［1～3］。しかしながら、好塩基球の分子生物学的解析となると数の少なさがハードルとなり、明らかになっていないことが多い。我々は、マウス好塩基球を制御する転写制御因子の解析に取り組み、分子制御メカニズムを明らかにした。

方 法
1．マウス
BALB/c background のdblGATA マウスを Jackson laboratory より購入し、実験に用いた。
2．定量 PCR 法（qRT-PCR）
フェノールクロロホルム法を用いて RNA を抽出し、cDNA を作製した。得られた cDNA を Hprt および Gata1 の遺伝子発現をサイバーグリーン法で測定し、相対値を測定した［2，3］。
3．フローサイトメトリー実験
細胞を single cell suspension し、任意の抗体で染色後、CantoII（BD）にて解析を行った。データはソフトウェア
FlowJo を利用した［2，3］。
4．in vivo 試験
マウスにそれぞれ抗原特異的 IgE（抗 TNP-IgE）100g を静脈内投与し、翌日に抗原（TNP-OVA）およびコントロール抗原（OVA）30 g をそれぞれ耳介皮内に投与し、耳介の厚さを経日的に測定した。値は（TNP-OVA 投与の耳の厚さ）－（OVA 投与の耳の厚さ）で示した［1］。

結 果
1．好塩基球は GATA1 を発現する
転写因子GATA1は赤血球および顆粒球の一つである好酸球の分化制御因子として知られている［2］。
しかしながら、
好塩基球の機能に GATA1 が関与するかについては十分に解析されていなかった。

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図 1．好塩基球は GATA1 を発現する
正常マウスの骨髄細胞から好塩基球、好酸球、好中球を単離し、
qRT-PCR にて GATA1 の発現を比較した。Student t-test。

そこで我々は、マウスより好塩基球を単離し、GATA1 の発現を好酸球および GATA1 を発現してないとされる好中球と比較した。その結果、好塩基球は GATA1 を好酸球ほどではないが、好中球よりも強く発現していることが明らかとなった（図 1）。
2．GATA1 の発現は好塩基球の分化に重要である
次に、GATA1 の転写調節領域に遺伝子変異の入ったdblGATA マウスを用いて好塩基球の GATA1 の発現を調べた
ところ、GATA1 の発現が低下していた。また、驚いたことに好塩基球の数が低下していることも見出した。
そこで、コントロールマウスおよびdblGATA マウスの骨髄を in vitro においてサイトカインである TSLP 存在下で培養し、好塩基球の誘導実験を行った。TSLP は IL-33 と同様に非免疫系の細胞などから産生されることで知られている［4］。dblGATA マウス由来の骨髄からは誘導される好塩基球の数が、正常マウス由来の骨髄に比べて著明に減少した（図 2）。また、dblGATA マウスでは好塩基球の前駆細胞である BaP の数も減少していた。このことから、GATA1は好塩基球の分化に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。

図 2．GATA1 の発現が低下すると、好塩基球の分化が抑制される。
コントロールマウスおよびdblGATAマウスの骨髄細胞をTSLP存在下で5日間培養し、好塩基球の細胞数をカウントした。Student t-test。

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3. GATA1 の発現は in vivo および in vitro の好塩基球の機能に重要である

さらに、GATA1 による好塩基球の機能制御を調べる目的で、siRNA を用いて Gata1 をノックダウンした好塩基球を抗原特異的 IgE と抗原で刺激した。その結果、control siRNA を投与した好塩基球に比べて、GATA1 をノックダウ
ンした好塩基球では、抗原刺激によるサイトカイン IL-4 および IL-6 の産生が著しく低下し、脱顆粒率も低下した。

図 3．GATA1 の発現が低下すると、好塩基球の機能が抑制される
コントロールマウスおよびdblGATA マウス由来の好塩基球それぞれ抗原特異的 IgE（抗 TNP-IgE 抗体）および抗原（TNP-OVA）およびコントロール抗原（OVA）で刺激し、細胞内のサイトカイン量をフローサイトメトリーにて解析した。

このことはdblGATA マウス由来の好塩基球でも同様にコントロールマウスの好塩基球に比べてサイトカイン産生、脱顆粒反応が低下した（図 3）。以上のことから、GATA1 は好塩基球の機能に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。さらに、in vivo における GATA1 の好塩基球の機能制御について解析する目的で、すでに好塩基球依存性の反応が起こることが明らかとなっている IgE 誘導性慢性アレルギー性炎症（IgE-CAI）のモデルを用いて解析した［1］。

図 4．GATA1 の発現が低下した好塩基球は in vivo での機能が抑制される
コントロールマウスおよびdblGATA マウスにそれぞれ抗原特異的 IgE（抗 TNP-IgE）100g を静脈内投与し、翌日に抗原（TNP-OVA）およびコントロール抗原（OVA）30 g をそれぞれ耳介皮内に投与し、耳介の厚さを経日的に測定した。値は（TNP-OVA 投与の耳の厚さ）－（OVA 投与の耳の厚さ）で示した。Student t-test。*p < 0.05, **p < 0.01, *** p < 0.001.

具体的にはdblGATA マウスとコントロールマウスを用いて IgE-CAI を誘導した。その結果、コントロールマウスに比べて、dblGATA マウスでは IgE-CAI の炎症が優位に低下した（図 4）。以上のことから、GATA1 は数と機能の面から好塩基球の機能を制御していることがわかった。

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考 察
好塩基球の分子制御に関与する分子として、転写因子 GATA1 を見出した。GATA1 は好塩基球の分化だけでなく、機能を制御することが明らかとなった。今回の研究から、好塩基球の GATA1 を利用したアレルギー疾患および寄生虫
感染症の新たな治療薬、ワクチンの開発が非常に有意義であることが示唆された。
また、通常好酸球欠損マウスとして用いられてきたdblGATA マウスが好塩基球も数の面でも機能の面でも欠損したマウスであることが明らかとなった。このことから、dblGATA マウスによって見出される実験結果は好塩基球欠損マ
ウスもしくはその他の好酸球欠損マウスで検討をすることが有意義であることを強く示唆された。

共同研究者・謝辞
本研究の共同研究者は、東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科免疫アレルギー学分野の根井雄一郎、烏山一教授
である。

文 献
1） Obata K, Mukai K, Tsujimura Y, Ishiwata K, Kawano Y, Minegishi Y, Watanabe N, and Karasuyama H.:
Basophils are essential initiators of a novel type of chronic allergic inflammation. Blood. 2007;110(3):913-920.
(doi: 10.1182/blood-2007-01-068718)
2） Nei Y, Obata-Ninomiya K, Tsutsui H, Ishiwata K, Miyasaka M, Matsumoto K, Nakae S, Kanuka H, Inase N,
and Karasuyama H.: GATA-1 regulates the generation and function of basophils. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.
2013;110(46):18620-18625, *equally contributed (doi: 10.1073/pnas.1311668110)
3） Obata-Ninomiya K, Ishiwata K, Tsutsui H, Nei Y, Yoshikawa S, Kawano Y, Minegishi Y, Ohta N, Watanabe
N, Kanuka H, and Karasuyama H.: The skin is an important bulwark of acquired immunity against intestinal
helminthes. J Exp Med. 2013;210(12):2583-2595. (doi: 10.1084/jem.20130761)
4） Seki T.*, Obata-Ninomiya K.*, Shimogawara-Furushima R., Arai T., Akao N., Hoshino T., Ohta N.: IL-33/ST2
controbites to severe symptoms in Plasmodium chabaudi-infected BALB/c mice. Parasitol. Int.,
2017;67(1):64-49, *equally contributed (doi: 10.1016/j.parint/.2017.03.008)

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