上原記念生命科学財団研究報告集, 32 (2018)

上原記念生命科学財団研究報告集、 xx （20xx）

139. トランスクリプトーム解析による神経変性疾患間の比較
杉江 淳
新潟大学 研究推進機構 超域学術院 脳病態解析分野
Key words：ショウジョウバエ，神経変性疾患

緒 言
脳の広範囲で神経細胞の変性が進行する疾患として、タウオパチー、シヌクレオパチー、ポリグルタミン病等がよく知られているが、根本的な治療法はまだ存在していない。年齢依存的に発症率が増加するこれらの疾患は、超高齢化社会である我が国においてますます深刻になる為、喫緊の社会的問題であると言える。このことから多くの研究がこれまでになされ、それぞれの疾患に対応する原因タンパク質が特定されてきている。例えば、アルツハイマー型認知症に関与する Aβやリン酸化 Tau をはじめ、パーキンソン病に関与するα-synuclein、ハンチントン病に関与するポリグルタミン鎖が伸長した Huntingtin 等が挙げられる。しかしながら、これらの異なる疾患タンパク質によって引き起こされる神経変性の病態機序の共通性または相違性について比較した研究は少なく、ほとんど分かっていなかった。本研究では、61%の遺伝子がヒトとの間に保存されており、中心的な神経の機能や分子の働きが保存されている
ショウジョウバエを用いて、特定細胞における変性の進行を疾患間で比較をすることによって、神経変性の共通性と相違性を見いだすことを目的とした。

方 法
1．ショウジョウバエの疾患タンパク質発現系統
タウオパチーに関して、OK107-Gal4 ドライバー［1］を用いて GFP と共に野生型のヒト Tau［2］、リン酸化サイトを阻害した TauS2A［3］、病気型 TauV337M［2］をキノコ体で発現させた。シヌクレオパチーに関して、OK107-Gal4ドライバーを用いて GFP と共に野生型のヒトα-synuclein［4］、α-synucleinA30P［4］、α-synucleinA53T［4］をキノコ体で発現させた。ポリグルタミン病に関して、OK107-Gal4 ドライバーを用いて GFP と共にポリグルタミン化していないヒト HuntingtinQ0［5］またはポリグルタミン化したヒト HuntingtinQ128［5］をキノコ体で発現させた。
2．抗体免疫染色
キノコ体で疾患タンパク質を発現させ、成虫になってから 1 週間、5 週間、または 6 週間経ったショウジョウバエの脳をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で解剖し、4%ホルムアルデヒドで 50 分間固定した。その後、0.3% PBT 中に 400 倍希釈した抗 Tau 抗体（T46）（Thermo Fisher Scientific）、抗α-synuclein 抗体（ミリポア）、または抗Huntingtin 抗体（Enzo）により 4℃で一晩インキュベーションした。
次に、0.3% PBT で 3 回洗浄したのち、0.3% PBT中に 400 倍希釈した二次抗体 mouse alexa568（Thermo Fisher Scientific）、または rabbit alexa568（Thermo FisherScientific）により 4℃で一晩インキュベーションした。0.3% PBT で 3 回洗浄してからマウント剤 Vectashield に解剖脳を包埋し、スライドガラス上にマウントした。そして、共焦点顕微鏡 A1R（ニコン株式会社）を用いてスキャニングを行った。その後 Fiji の z-projection 機能により画像の三次元構築を行った。

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結果および考察1．キノコ体における疾患タンパク質を発現に対する神経変性の表現型及び疾患タンパク質の局在パターン
タウオパチーの疾患原因因子として、野生型ヒト Tau、2 か所のセリン残基のリン酸化サイトをアラニンに置換した TauS2A、そして病気型の TauV337M をそれぞれキノコ体で発現させた。そして、キノコ体を細胞膜に局在する GFPで可視化し、抗 Tau 抗体を用いて Tau タンパク質の細胞内の局在を観察した（図 1A～H）。その結果、成虫に羽化してから 1 週間の段階では、軸索においても樹状突起においても構造の異常は見られなかった（図 1A～D 軸索；図1E-H 樹状突起）。TauS2A では軸索でも樹状突起でも Tau タンパクの局在が観察されたのに対し（図 1C，1G）、野生型 Tau 及び TauV337M では樹状突起での局在は見られたが（図 1F～G）、軸索での局在は非常に弱かった（図 1B，1D）。これらの結果から、Tau の軸索への局在はリン酸化されないことが重要であることが示された。また、野生型
Tau 及び TauV337M では GFP の発現が見られない多くの領域でも観察された。これは Tau のターンオーバーの期間が非常に長いため、発生段階で発現している細胞に残った Tau のシグナルであることがわかった（data not shown）。
このことから、Tau のターンオーバーの期間もリン酸化状態が関係していることが示唆された。
シヌクレオパチーの疾患原因因子として、野生型ヒトα-synuclein、病気型のα-synucleinA30P、またはα-synucleinA53T をそれぞれキノコ体で発現させた。そして、キノコ体を細胞膜に局在する GFP で可視化し、抗α-synuclein 抗体を用いてα-synuclein タンパク質の細胞内の局在を観察した（図 2A～H）。その結果、成虫に羽化してから 1 週間の段階では、軸索においても樹状突起においても構造の異常は見られなかった（図 2A～D 軸索；図 2E～H 樹状突起）。そして、どのタイプのα-synuclein も軸索でも樹状突起でもα-synuclein タンパクの局在が観察された（図 2B’～D’軸索；2F’～2H’樹状突起）。
ポリグルタミン病の疾患原因因子として、ポリグルタミン化していないヒト HuntingtinQ0、ポリグルタミン化した
HuntingtinQ128 をそれぞれキノコ体で発現させた。そして、キノコ体を細胞膜に局在する GFP で可視化し、抗Huntingtin 抗体を用いて Huntingtin タンパク質の細胞内の局在を観察した（図 3A～F）。その結果、HuntingtinQ128において軸索及び樹状突起の構造が矮小化する異常が見られた（図 3C 軸索；図 3F 樹状突起）。HuntingtinQ0 では軸索でも樹状突起でも Huntingtin タンパクの局在が観察されたのに対し（図 3B’軸索，3E’樹状突起）、HuntingtinQ128
では軸索及び樹状突起での凝集した発現パターンが観察された（図 3C’軸索，3F’樹状突起）。これらの結果から、Huntingtin の凝集はポリグルタミン化が必要であり、ポリグルタミン化 Huntingtin は細胞へ毒性を示すことが明らかになった。
2．長期的な疾患タンパク質発現によるキノコ体神経細胞の変性キノコ体でそれぞれ疾患タンパク質を発現させ、経時的（1 週間、5 または 6 週間）にキノコ体を観察し、樹状突起、軸索で起こる構造異常を調べた。
タウオパチーに関して、どのタイプの Tau でも成虫に羽化してから 1 週間の段階では、軸索においても樹状突起においても構造の異常は見られなかった（図 4A～D 軸索；図 4E～H 樹状突起）。6 週間後になると、病気型 TauV337Mで軸索が矮小化する表現系が確認された（図 4D’矢頭）。しかしながら、樹状突起は異常な構造を取ることは確認されなかった（図 4H’）。これらの結果から、病気型 Tau は長期的な発現により、特に軸索への毒性を発揮するということが明らかになった。
シヌクレオパチーに関して、どのタイプのα-synuclein においても、軸索及び樹状突起の構造異常は見られなかった（図 5A～5H）。羽化してから 5 週間後の個体においても、同様に構造異常は観察されなかった（図 5A’～5H’）。
過剰発現による細胞への毒性が効果的でなかったのは、α-synuclein がショウジョウバエではホモログが存在しないため、生理学的にα-synuclein と関与する分子メカニズムがないことが可能性として考えられた。
ポリグルタミン病に関して、ポリグルタミン化していないヒト HuntingtinQ0 では 6 週間後でも軸索及び樹状突起に構造異常が認められなかった（図 6B’，6E’）。一方、ポリグルタミン化した HuntingtinQ128 では軸索は 1 週間後では異常が見られなかったものの（図 6C）、6 週間後では軸索の矮小化が観察された（図 6C’矢頭）。樹状突起においては 1 週間後からすでに空洞化が起こっており（図 6F 矢頭）、6 週間後では空洞化及び矮小化していた（図 6F’矢頭）。

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以上から、ポリグルタミン化した Huntingtin は早い段階で樹状突起に毒性を発揮し、次第に軸索でも変性を誘導することが示唆された。
本研究から、疾患原因因子によって引き起こされる神経変性細胞死において、軸索、樹状突起それぞれの異変が経時的に記載された。これらの結果から、これまでに発見されなかった神経変性疾患間で共通する、または疾患特異的に変性を起こしやすい部位が明らかになり、神経変性の病態分子メカニズムの知見を得ることが期待できる。この経時的な構造異常プロファイルをもとに、今後は神経細胞が変性を起こしていない若い時期から変性を起こす老齢の時期まで複数のタイムポイントでキノコ体の細胞体を直接解剖して、RNA シークエンシングを行い、長鎖ノンコーディ
ング RNA を含む全 mRNA のプロファイリングを得る。そして発現に変動がある RNA を網羅的に解析することによって、細胞が健常な状態からそれぞれの異常タンパク質が変性を引き起こすまでにどのようなことが起こっているのかを詳細に記述する。また、細胞死が起こる前から死ぬまでの間で、今までに知られていない細胞死に関与する因子を特定する。さらに、特定した候補因子の機能解析を行うことによって新たな関与因子が絡んだ神経変性の病態分子メカニズムの知見を得ることができ、早い段階で変動する因子群については特異的なまたは疾患共通に神経変性疾患への早期介入のためのターゲットとして期待ができる。

図 1．ショウジョウバエキノコ体におけるタウオパチーの疾患原因因子の発現パターン（A～H）キノコ体の軸索（A～D）及び樹状突起領域（E～H）を細胞膜に局在する GFP で可視化した（A～H 緑）。そして、野生型ヒト Tau（B，F）、TauS2A（C，G）、病気型 TauV337M（D，H）をそれぞれキノコ体で発現させ、抗 Tau 抗体を用いて Tau タンパク質の細胞内の局在を可視化した（A～H赤，A’～H’白）。スケールバーは 30 µm。

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図 2．ショウジョウバエキノコ体におけるシヌクレオパチーの疾患原因因子の発現パターン（A～H）キノコ体の軸索（A～D）及び樹状突起領域（E～H）を細胞膜に局在する GFP で可視化した（A～H 緑）。そして、野生型ヒト α-synuclein（B，F）、α-synucleinA30P（C，G）、α-synucleinTauA53T（D，H）をそれぞれキノコ体で発現させ、抗 α-synuclein 抗体を用いて α-synuclein タンパク質の細胞内の局在を可視化した（A～H 赤，A’～H’白）。スケールバーは 30 µm。

図 3．ショウジョウバエキノコ体におけるポリグルタミン病の疾患原因因子の発現パターン（A～F）キノコ体の軸索（A～C）及び樹状突起領域（D～F）を細胞膜に局在する GFP で可視化した（A～F 緑）。そして、非ポリグルタミン化ヒト Huntingtin（B，E）、ポリグルタミン化ヒト Huntingtin（C，F）をそれぞれキノコ体で発現させ、抗 Huntingtin 抗体を用いて Huntingtin タンパク質の細胞内の局在を可視化した（A～F 赤，A’～F’白）。スケールバー 30 µm。

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図 4．タウオパチーの疾患原因因子の発現による経時的なキノコ体構造変化（A～H）キノコ体の軸索（A～D）及び樹状突起領域（E～H）を細胞膜に局在する GFP で可視化した（A～H 緑）。そして、野生型ヒト Tau（B，F）、TauS2A（C，G）、病気型 TauV337M（D，H）をそれぞれキノコ体で発現させ、抗 Tau 抗体を用いて Tau タンパク質の細胞内の局在を可視化した（A～H
赤，A’～H’白）。スケールバーは 30 µm。

図 5．シヌクレオパチーの疾患原因因子の発現による経時的なキノコ体構造変化（A～H）キノコ体の軸索（A～D）及び樹状突起領域（E～H）を細胞膜に局在する GFP で可視化した（A～H 緑）。そして、野生型ヒト α-synuclein（B，F）、α-synucleinA40P（C，G）、α-synucleinA53T（D，H）をそれぞれキノコ体で発現させた。羽化後 1 週間のキノコ体（A～H）と 5 週間後のキノコ体（A’～H’）。スケールバーは 30 µm。

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図 6．シヌクレオパチーの疾患原因因子の発現による経時的なキノコ体構造変化（A～F）キノコ体の軸索（A～C）及び樹状突起 3 領域（D～F）を細胞膜に局在する GFP で可視化した（A～F 緑）。そして、非ポリグルタミン化ヒト Huntingtin（B，E）、ポリグルタミン化ヒト Huntingtin（C，F）をそれぞれキノコ体で発現させた。羽化後 1 週間のキノコ体（A～F）と 6 週間後のキノコ体（A’～F’）。スケールバーは 30 µm。

文 献1） Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three
distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 1999 126(18): 4065--4076. PMID: 10457015
2） Wittmann CW, Wszolek MF, Shulman JM, Salvaterra PM, Lewis J, Hutton M, Feany MB. Tauopathy inDrosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles. Science. 2001 Jul 27;293(5530):711-714.
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PMID:18930955 DOI:10.1093/hmg/ddn326
4） Feany, M.B., Bender, W.W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature. 2000 404(6776): 394--398.
PMID:10746727 DOI:10.1038/35006074
5） Wyan-Ching Mimi Lee, Motojiro Yoshihara, J. Troy Littleton. (2004) Cytoplasmic aggregates trap
polyglutamine-containing proteins and block axonal transport in a Drosophila model of Huntington's disease.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Mar 2; 101(9): 3224–3229. PMID:14978262 DOI:10.1073/pnas.0400243101

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