上原記念生命科学財団研究報告集, 32 (2018)

上原記念生命科学財団研究報告集、xx（20xx）

84. 心筋ミトコンドリア局在蛋白キナーゼ系の構成と機能
三浦 哲嗣
札幌医科大学 医学部 循環器・腎臓・代謝内分泌内科学講座
Key words：細胞死，DUSP5，ミトコンドリア，ミトコンドリア蛋白キナーゼ系，蛋白ホスファターゼ

緒 言
心疾患による死亡原因として最も重要な急性心筋梗塞と慢性心不全のいずれにおいても、経時的に進行する心筋細胞死が病態の不可逆性に寄与していること、またその細胞死に複数の機序（ネクローシス、アポトーシス、ネクロプトーシスなど）が関与することが近年明らかにされ、ミトコンドリアはこれらいずれの細胞死の機序にも関与している［1,2］。心筋細胞のネクローシスには、ミトコンドリア内膜に存在する透過性遷移孔（mitochondrial permeability transitionpore、mPTP）の開口が直接的な機序として関与している［3］。mPTP は活性酸素ならびにミトコンドリア Ca2＋過負荷によって不可逆的に開口し、ミトコンドリア膜電位を消失させて細胞死を誘導する。mPTP の開口閾値は複数の因子によって制御されており、そのひとつに GSK-3がある。我々は、酸化ストレスによって、細胞質内の GSK-3がその活性依存的に VDAC2 と結合してミトコンドリアに移行し、mPTP と結合することでその開口閾値を低下させることを最近報告した［4］。一方、G 蛋白連関受容体や受容体チロシンキナーゼには、細胞を細胞死から保護するシグナル伝達を起動するものが存在し、その細胞保護には Akt などの蛋白キナーゼのミトコンドリア移行や、ミトコンドリアにおけるERK や GSK-3リン酸化を伴っていることが、我々を含め複数のグループによって観察されている［3～6］。しかし、蛋白キナーゼ系がどのようにミトコンドリア内に局在し、細胞死誘導刺激や細胞保護シグナルの活性化とどのような機能関連があるのかについて系統的に解析した結果は報告されていない。
本研究では、細胞保護に寄与する蛋白キナーゼとして虚血プレコンデイショニング（ischemic preconditioning、IPC）の心筋保護効果に寄与が知られている Akt、ERK、GSK-3、［3, 5］に注目し、蛋白ホスファターゼと併せて、細胞保護シグナルならびに酸化ストレスによる細胞死誘導に対してどのように応答し、機能関連しているかを解析した。実験には、培養心筋細胞株 H9c2 細胞、HEK293 細胞、ラット心室筋細胞から単離したミトコンドリアを用い、細胞保護シグナルの活性化には IPC mimetic の一つである insulin-like growth factor-1（IGF-1）を、酸化ストレスによる細胞死（ネクローシス）の誘導にはミトコンドリア complex Ⅲ阻害薬である antimycin A（AA）を用いた。

方法および結果
1．ミトコンドリアの単離とミトコンドリアサブフラクションの解析
心筋細胞株 H9c2 細胞、HEK293 細胞、ラット心筋サンプルを用い、ミトコンドリア単離キットならびに段階的遠心分離法によってミトコンドリアを単離した。培養細胞からのミトコンドリアを用い、トリプシン 0～1,000 g/ml による段階的な膜分解を行い、ミトコンドリア外膜、内膜、マトリックスそれぞれのマーカー蛋白として、TOMM20、prohibitin、cyclophilin D を用い、外膜溶解、内膜溶解、マトリックス蛋白溶解後のサンプルを調整した（図 1）。図 1 の結果から、トリプシン 0 g/ml 処理と 1 g/ml 処理の差をミトコンドリア外膜でのレベル、1 g/ml 処理と 1,000 g/ml 処理の差をミトコンドリア内膜レベルと評価した。Akt、ERK、GSK-3と関連ホスファターゼのミトコンドリア内分布を Westernblotting で同定した。

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図 1．単離ミトコンドリアの段階的膜分解によるミトコンドリアサブフラクションの解析
トリプシン 0～1,000 g/ml 処理後のミトコンドリアサンプルにおける GSK-3と、ミトコンドリア外膜、内膜、マトリックスそれぞれのマーカー蛋白レベル。最下段はミトコンドリア部分分解の模式図。

2．細胞保護シグナルの活性化ならびに酸化ストレスが、ミトコンドリア局在蛋白キナーゼに及ぼす影響
細胞保護シグナル活性化には、培養細胞を IGF-1（50 nM）で 45 分間処理し、酸化ストレス誘導には、細胞を AA（100M）に 30 分間暴露した。また IGF-1 と AA の両者で処理した群も設けた。IGF-1 処理により、GSK-3、Akt、ERKすべてのミトコンドリア移行とリン酸化が増加し、ミトコンドリア内膜でのリン酸化 ERK、リン酸化 GSK-3レベルが有意に上昇した（図 2）。一方、AA 処置によって GSK-3、ERK のミトコンドリア移行が誘導されたが、ERK、Akt、GSK-3全てのリン酸化レベルが有意に減少した。AA 処置による Akt、GSK-3の脱リン酸化は、IGF-1 前処置によって軽減したが、ERK の脱リン酸化には影響が見られなかった（図 2）。また、その Akt、GSK-3の脱リン酸化に対するIGF-1 の抑制効果は、主にミトコンドリア外膜で認められた。
3．酸化ストレスによるミトコンドリア局在蛋白ホスファターゼの変化
酸化ストレスにより、ミトコンドリアに局在する ERK、Akt、GSK-3のリン酸化レベルが低下したことと（図 2）、
GSK-3は Akt、ERK によってリン酸化される器質であることから、Akt、ERK それぞれの蛋白ホスファターゼである
PHLPP1、DUSP5 のミトコンドリア局在を検討した。PHLPP1 は主にミトコンドリア外膜に存在し、AA 処理によりPHLPP1 のミトコンドリア移行が誘導され、外膜の PHLPP1 は約 2 倍に増加した。また、これまで DUSP5 は核のみに局在するとされていたが、ミトコンドリアにも存在することを単離ミトコンドリアサンプルの Western blotting、培養細胞に発現させた GFP-DUSP5 とミトコンドリアとの共局在から示すことが出来た。DUSP5 も PHLPP1 同様に、主にミトコンドリア外膜に存在し、AA 処理により約 1.5 倍に増加した。DUSP5 のミトコンドリア局在は、ラット心室筋細胞においても確認した。
4．酸化ストレスによる細胞死における DUSP5 の寄与
AA 処置による細胞死を培養液中の LDH 量として定量した。AA 処置後の細胞死は、siRNA を用いた DUSP5 のノックダウンによって約 40％減少した。この細胞死抑制効果は、IGF-1 前処置の効果とほぼ同等であった。

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図 2．細胞保護シグナル活性化、酸化ストレスによるミトコンドリア蛋白キナーゼの局在変化とリン酸化
IGF-1 = insulin-like growth factor-1, AA = antimycin A, *p < 0.05（one-way ANOVA）

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考 察
我々は、酸化ストレスによる心筋細胞のネクローシスには、恒常活性型である Ser9 非リン酸化 GSK-3がミトコンンドリアに移行し、ミトコンドリア内膜上の mPTP との相互作用することが mPTP 開口に寄与すること、また IPC やその mimetics による細胞保護シグナルの活性化は、PKC と Akt を介した GSK-3-Ser9 のリン酸化をもたらし、そのリン酸化 GSK-3と mPTP の結合が、mPTP 開口閾値の上昇や、開口した mPTP の再閉鎖の促進に寄与することを報告してきた［3～6］。しかし、生理的には主に細胞質に存在する GSK-3が、細胞保護シグナルの活性化により細胞内のどの部位でリン酸化を受け、mPTP との相互作用を制御をされているのかは不明であった。本研究の成績から、IGF-1 を用いた細胞保護シグナルの起動によって、GSK-3だけでなく、GSK-3リン酸化を制御する Akt、ERK がミトコンドリ
アに移行し、いずれも主にミトコンドリア外膜領域で蛋白レベルが増加することが示された。さらに、リン酸化 Akt は主にミトコンドリア外膜領域で、リン酸化 ERK は主にミトコンドリア内膜領域で増加し、GSK-3リン酸化をもたらす蛋白キナーゼが、GSK-3のミトコンドリア内局在によって異なることが示唆された。すなわち、ミトコンドリアに新たに移行した GSK-3のリン酸化にはミトコンドリア外膜の Akt が、mPTP と既に結合している GSK-3のリン酸化にはミトコンドリア内膜の ERK が重要であると考えられる。
本研究では、DUSP5 が核だけではなくミトコンドリアにも局在することを初めて明らかにし、酸化ストレスによるDUSP5 のミトコンドリア移行が、細胞保護的な ERK-GSK-3シグナルの抑制と細胞死誘導に関連することを見出した。
また、PHLPP1 も酸化ストレスによってミトコンドリア移行が増加し、Akt 脱リン酸化と関連していた。これらの知見は、酸化ストレスの細胞傷害性に、ミトコンドリア内での細胞保護シグナルの遮断が関与することを示すものであり、
DUSP5 や PHLPP1 のミトコンドリア移行を阻害することが新たな細胞保護のアプローチとなる可能性が考えられる。

共同研究者
本研究の共同研究者は、札幌医科大学医学部循環器・腎臓・代謝内分泌内科学講座の大和田渉研究生、丹野雅也准教授である。

文 献1)

Moe GW, Marin-Garcia. Role of cell death in the progression of heart failure. Heart Fail Rev. 2016 Mar;21(2):157-67. doi: 10.1007/s10741-016-9532-0. PMID: 26872675

2)

Adameova A, Goncalvesova E, Szobi A, Dhalla NS. Necroptotic cell death in failing heart: relevance andproposed mechanisms. Heart Fail Rev. 2016 Mar;21(2):213-21. doi: 10.1007/s10741-016-9537-8. PubMed
PMID: 26872672.

3)

Miura T, Tanno M. The mPTP and its regulatory proteins: final common targets of signalling pathways forprotection against necrosis. Cardiovasc Res. 2012 May 1;94(2):181-9. doi: 10.1093/cvr/cvr302. Epub 2011 Nov 9.
PubMed PMID: 22072634

4)

Tanno M, Kuno A, Ishikawa S, Miki T, Kouzu H, Yano T, Murase H, Tobisawa T, Ogasawara M, Horio Y,Miura T. Translocation of glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β), a trigger of permeability transition, is kinase
activity-dependent and mediated by interaction with voltage-dependent anion channel 2 (VDAC2). J BiolChem. 2014 Oct 17;289(42):29285-96. doi: 10.1074/jbc.M114.563924. Epub 2014 Sep3. PubMed PMID:251875185)

Miura T, Tanno M, Sato T. Mitochondrial kinase signalling pathways in myocardial protection fromischaemia/reperfusion-induced necrosis. Cardiovasc Res. 2010 Oct 1;88(1):7-15. doi: 10.1093/cvr/cvq206. Epub2010 Jun 18. PubMed PMID: 20562423

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6)

Sunaga D, Tanno M, Kuno A, Ishikawa S, Ogasawara M, Yano T, Miki T, Miura T. Accelerated recovery of
mitochondrial membrane potential by GSK-3β inactivation affords cardiomyocytes protection from oxidantinduced necrosis. PLoS One. 2014 Nov 12;9(11):e112529. doi: 10.1371/journal.pone.0112529. eCollection 2014.
PubMed PMID: 25390651

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